CN107827983A - 一种靶向artn的单链抗体、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种新的可与人肿瘤组织中ARTN蛋白特异性结合的单链抗体。所述的抗人ARTN的单链抗体，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ NO:1；其具有较强的靶向性，可以特异性地结合于肿瘤细胞表面的ARTN蛋白，通过抑制肿瘤细胞增殖来限制肿瘤的恶性增长。单链抗体1A8靶向性强，具有一定抑癌作用的潜质，可以后续构建成重组抗体或抗体药物偶联物。

Description

一种靶向ARTN的单链抗体、制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种新的可与人肿瘤组织中ARTN蛋白特异性结合的单链抗体1A8，其具有较强的靶向性，可以特异性地结合于肿瘤细胞表面的ARTN蛋白，通过抑制肿瘤细胞增殖来限制肿瘤的恶性增长。单链抗体1A8靶向性强，具有一定抑癌作用的潜质，可以后续构建成重组抗体或抗体药物偶联物。

背景技术

肿瘤相关性抗原ARTN

ARTN 蛋白是神经胶质细胞源性神经营养因子 ( glial cell line-derivedneurotrophic factor，GDNF)家族配体( GFL) 的一个亚型，也属于转化生长因子β( TGF-β)超家族。最近几年的研究表明，ARTN蛋白具有促进细胞趋化、黏附和迁移的作用，因此它在介导肿瘤细胞侵袭、肿瘤转移中具有重要的意义。

人ARTN基因包含3个外显子和2个内含子，位于染色体1p32-33区，ARTN蛋白一级结构与GDNF、NTN、PSP相似，相对位置具有相同的7个保守的半胱氨酸残基，全长约3.9 kb，经不同剪切形成4种mRNA，其大小分别为1408 bp、1892bp、1162 bp和1161 bp。人ARTN基因开放阅读框分别编码237个、228个及220个氨基酸长度的前体蛋白，该前体蛋白N端为信号肽，是由39个氨基酸组成，其后为前体区，在202位存在1个N-糖基化位点（NSTW），经蛋白酶在RAAR识别位点处切割后，可加工成113个氨基酸长度的成熟ARTN蛋白。

ARTN是一种雌激素诱导型基因，有几项研究报道，ARTN在肝细胞癌，胰腺癌，乳腺癌，子宫内膜癌，甲状腺癌，乳腺癌，结肠癌，食道癌和非小细胞肺癌等癌症中被观察到异常表达。此外，ARTN对胰腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、食道癌等人类恶性肿瘤的致癌性，肿瘤生长和侵袭性具有促进作用。

最近也有一项研究表明，ARTN在肿瘤发生、侵袭和对某些化学疗法的耐药性方面起关键作用。此外，ARTN也可以介导HER2阳性乳腺癌细胞对Trastuzumab以及子宫内膜癌细胞对多柔比星、紫杉醇的获得性抗性。还显示ARTN与降低莫昔芬治疗的ER+MC患者的生存率相关。

噬菌体展示技术

噬菌体展示是将外源蛋白质或多肽的基因表达产物与噬菌体衣壳蛋白融合，并在其表面展示，同时将其遗传密码信息整合到个体噬菌体的基因组中。该技术的最大优点是直接地将可现的表型与其基因型联系起来，再利用其配体的特异性亲和力，将所感兴趣的蛋白质或多肽挑选出来。

发明内容

发明目的

本发明提供一种具有潜在抗肿瘤药效的抗人ARTN单链抗体1A8。本发明中的单链抗体1A8具有对ARTN的高亲和力，在体外能够抑制人肝癌细胞BEL-7402的增殖。

技术方案

一种抗人ARTN的单链抗体，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ NO:1。

一种编码权利要求1所述的抗人ARTN的单链抗体的核酸，其特征在于所述的核酸的核苷酸序列为SEQ NO:2。

一种表达载体，含有所述的核酸。

一种重组宿主细胞，含有所述的表达载体。

所述的一种抗人ARTN的单链抗体在制备选择性地与人ARTN结合药物中的应用。

所述的抗人ARTN的单链抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。。

发明进一步说明：

本发明中单链抗体基因序列全长861个核苷酸。

含有本发明抗人ARTN 单链抗体1A8基因的表达载体和宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增本发明单链抗体基因的任意片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种可以表达和纯化上述单链抗体1A8的方法。

本发明通过将含有抗人ARTN 的单链抗体基因的重组质粒导入到大肠杆菌中筛选发酵得到能特异性结合人ARTN的单链抗体。IPTG诱导表达24h后，破碎大肠杆菌细胞，离心去除细胞碎片，将上清过镍亲和层析柱进行分离纯化；Western Blot鉴定分离纯化得到的1A8；ELISA分析单链抗体与ARTN的结合作用；利用MTT实验分析单链抗体对人肝癌细胞BEL-7402增殖的抑制作用；利用划痕实验分析单链抗体对人肝癌细胞BEL-7402迁移的抑制作用。

有益效果

本发明得到的融合抗体可以明显抑制肿瘤细胞的生长。本发明为治疗和诊断以人ARTN蛋白的表达，特别是过量表达为特征的疾病提供了基于抗体的疗法，相关疾病包括但不限于自身免疫病和癌症。

附图说明

图1 是单链抗体1A8的空间构象图，单链抗体1A8由287个氨基酸构成。

图2 是单链抗体1A8的Western Blot分析图，30μL和15μL的条带是指分别将洗脱自镍柱的蛋白溶液在Western Blot 聚丙烯酰胺凝胶梳孔中上样30μL和15μL而得到的条带。

图3 是不同浓度的1A8对人肝癌细胞BEL-7402的增殖抑制试验(MTT)结果图。

具体实施方式

实施例中涉及的百分比，其中固定试剂为重量体积百分比，液体试剂为体积百分比。

实施例1 抗人ARTN的1A8单链抗体的筛选

本发明采用噬菌体展示技术筛选抗人ARTN的1A8单链抗体。

1.制备具性纤毛的大肠杆菌宿主菌ER2738

取保存的大肠杆菌ER2738（购自凯基生物）在LB平板上划线后，倒置在37℃的烘箱培养一夜，保存在4℃，两周内可使用。挑一个克隆至10mL的2×TY培养基中，在37℃的摇床中摇12-16h。次日，将菌液转接到100倍体积的2×TY培养基中扩大培养，在37℃的摇床中养至对数期（OD600大概是0.5），即可用来噬菌体感染。(2×TY培养基配方：10 g酵母粉，16 g胰蛋白胨，ddH2O定容至1L。）

测定野生型M13噬菌体的滴度

按照1所示制备具有性纤毛的ER2738。铺带有卡那霉素抗性的下层平板TYE（含1.5 %琼脂粉）。梯度稀释野生型辅助噬菌体（VCS-M13，凯基生物），依10-2，10-4，10-6，10-8，10-10和10-12的浓度对VCS-M13进行6次百倍梯度稀释。190 μL对数期的ER2738中，水浴37℃下感染10 μL各稀释梯度的VCS-M13，感染30 min。100 μL各梯度菌液与3 mL微热液体状的上层培养基（0.7 %琼脂粉）混匀，涂在下层平板上，等到凝固后37℃培养一夜。通过读取各个梯度平板上的噬菌斑数目，推算出原始管中辅助噬菌体的数量。

2.制备大量辅助噬菌体

从以上步骤测定了滴度的平板中，挑取少量辅助噬菌体感染10 mL正处于对数期的ER2738，在37℃下摇床培养2 h。将其转接至500 mL的2×TY液体培养基中，再培养1h后加入卡那霉素再培养8～16h。卡那霉素终浓度50～70μg/mL。4℃下，10800g冷冻离心15 min后收集上清，再加入1/5上清体积的PEG/NaCl（20% PEG，2.5mol/L NaCl，下同），在冰上放置30min以沉降辅助噬菌体。4℃下，10800g冷冻离心15 min，倒掉上清，加2mL PBS缓冲液，完全重悬后，过0.45μm膜除菌。依照步骤2所示测定VCS-M13滴度，调节滴度到1×10¹² pfu/mL。分装后存在-20℃待用。

3.扩增噬菌体抗体库

3.1 取保存的噬菌体抗体库（参照《重组抗体》2005年科学出版社出版，作者沈倍奋，制备获得建立库）1 mL（要求库容在1×1010pfu左右），加到500 mL含1%葡萄糖、四环素与氨苄青霉素的2×TY培养基中37℃培养到对数期，大概1~2h。从中取约含1×1010个细菌的25 mL培养液，加入细菌数0.05倍的辅助噬菌体VCS-M13进行感染。余液依照下法制作次级噬菌体抗体库：

将剩余培养液在37℃的摇床中继续培养2 h。

4℃下3300g冷冻离心半小时，倒掉上清后，用含15%甘油的10mL 2×TY培养基重悬沉淀。并将悬液平均分装成10个小管保存在-70℃下。

3.2 将待感染辅助噬菌体的培养液置于37℃水浴中感染30 min。4℃，3300g冷冻离心10 min后，弃上清，用含有卡那霉素、四环素及氨苄青霉素的2×TY培养基30 mL重悬沉淀。将上述30 mL菌液加到470 mL含有卡那霉素、四环素及氨苄青霉素的2×TY培养基（已在37℃水浴锅中预温）中，在摇床中30℃过夜培养。

3.3 4℃下，10800g冷冻离心10min后保留上清，再加入100mL PEG/NaCl以沉降噬菌体，充分混匀后4℃下静置1h。再离心一次弃上清。

3.4 沉淀用20mL PBS充分重悬，再加入4 mL的PEG/NaCl的充分混匀，4℃静置至少30min。重复一次该步骤，再次充分重悬沉淀后，再重复一次该步骤，注意彻底吸弃上清。用5mL PBS充分重悬沉淀。4℃下11600g冷冻离心10min留上清以除去剩余菌体的碎片。所得噬菌体抗体库4℃保存（短期），或在含有15%甘油的PBS中-70℃保存（长期）。

3.5 测定所得噬菌体抗体库的滴度：所测滴度应约10¹²～10¹³ pfu/mL。

（1）吸取1μL噬菌体抗体库于1 mL的PBS中。

（2）从中吸1μL溶液感染处于对数期的ER2738。

（3）将菌液作梯度稀释，各吸取50μL铺含有1%葡萄糖、四环素与氨苄青霉素的TYE平板，并37℃培养一夜。

4. 固相亲和筛选

4.1将紫外灯下活化的酶条包被ARTN抗原，4℃包被一夜。之后，用PBS振荡洗涤5min，洗3次，注意洗后拆干。每孔加200 μL的5% MPBS以防止非特异性结合，封保鲜膜后37℃下封闭2h。

4.2 弃净上清后，用TPBS洗5 min去除孵育的溶液，再用PBS振荡洗涤5min去除去污剂。各洗3次，每次洗涤后拆干。在酶条每孔中加入扩增所得的噬菌体。37℃下孵育2 h，弃净上清。

4.3 第一轮筛选时，在PBS中添加0.1% Tween-20用于洗涤，中等转速振荡洗涤5min，洗5次（之后几轮依次增加次数提高筛选严格度）；继而用PBS洗去去污剂，5min洗涤3次。拆干后，每孔加入50μL三乙胺（酸性洗脱液）洗脱，以最大转速振荡10 min。结束后立即吸出洗脱液，加25μL Tris-HCl（1M，pH为7.4）中和。中和所得噬菌体4℃保存待用或用于感染ER2738。

4.4 将以上步骤中所得的噬菌体37℃水浴感染处于对数期的宿主菌30min。4℃，5000g冷冻离心10min后，加2×TY培养基1mL重悬菌体，从细菌悬液中取一部分做10倍系列稀释，再分别涂布到含1%葡萄糖、四环素和氨苄青霉素的TYE平板中，37℃过夜培养后数取菌落数并计算库容量。第二轮筛选库容量应在10⁹以上。再将剩余菌液涂布在含1%葡萄糖、四环素和氨苄青霉素的大型TYE平板。30℃烘箱，培养一夜。

4.6进一步亲和筛选

将5 mL含15%甘油的2×TY培养基加入Nunc Bio-Assay Dish平板中，刮取所有菌落使其溶于液体培养基中。在100 mL含1%葡萄糖、四环素和氨苄青霉素的2×TY培养基加其中100 μL菌体悬液。剩下的悬液保存于-70℃中。37℃下摇床中培养约2 h至对数期。再加入1/20细菌数的M13进行感染。水浴37℃下静置30min以感染。4℃下，3300g冷冻离心10 min后，倒掉上清，用含卡那霉素、四环素和氨苄青霉素的2×TY培养基50 mL充分重悬菌体沉淀。30℃下在摇床中过夜培养。4℃下，10800g冷冻离心40mL过夜培养物10min。上清加入8mL的PEG/NaCl至上清以沉降噬菌体，混匀后4℃放置1 h。4℃下，10800g冷冻离心，添加40mL水及8mL PEG/NaCl中重悬噬菌体。4℃下，10800g冷冻离心，彻底吸弃上清。再用2mL PBS充分重悬噬菌体沉淀。同上冷冻离心收集上清，以除去残留菌体碎片。取上述步骤中所得的上清1mL用于下一轮亲和筛选，另1mL于4℃保存。重复步骤5和步骤6，共进行4轮筛选。

5. ELISA鉴定筛选结果

5.1 从第3轮、第4轮测滴度的平板上，随机挑取96个单克隆到在96孔细菌培养板中，每孔加500 μL含1%葡萄糖、四环素与氨苄青霉素的2×TY培养基。37℃，220r/min摇一夜。在新的96孔细菌培养板中，每孔同样添加500 μL含1%葡萄糖、四环素与氨苄青霉素的2×TY培养基，再加入前一步的过夜培养物5 μL。温度37℃下，转速220 r/min，摇床中培养1.5-2h。然后加甘油到第1块96孔细菌培养板至每孔甘油终浓度为15%，保鲜膜密封后-70℃保存。再向第2块96孔细菌培养板的各个孔中分别添加50 μL的辅助噬菌体稀释液（以辅助噬菌体：细菌数为1:20的比例稀释）。封闭后，37℃下放置半小时，同温摇床培养1 h。1800g离10min并吸除上清。用含卡那霉素、四环素和氨苄青霉素的2×TY培养基500 μL充分重悬菌体沉淀。30℃下摇床培养一夜。1800g，10 min离心，每孔吸取100 μL上清，4℃保存待用。

5.2 噬菌体ELISA检测步骤：

（1）紫外活化酶条30 min。

（2）包被抗原：每孔加靶蛋白——ARTN蛋白100 μL(靶蛋白需用NaHCO3缓冲液稀释至10μg/mL），封保鲜膜，4℃包被过夜。

（3）回收蛋白：加PBS后振荡仪洗5min，清洗3次，注意每次洗后拆干。

（4）封闭：每孔加200 μL的5% MPBS以防止非特异性结合，封保鲜膜后37℃下封闭2h。

（5）洗涤：弃净上清后，用TPBS洗5 min去除孵育的溶液，再用PBS振荡洗涤5min去除去污剂。各洗3次，每次洗涤后拆干。

（6）孵育一抗：在酶条各孔中加入100 μL步骤7.1所得的噬菌体上清作为一抗。并设置5% MPBS、PBS、辅助噬菌体、2×TY培养基（用含卡那霉素、四环素和氨苄青霉素）的阴性对照组。封保鲜膜，37℃孵2h。

（7）孵育后，洗涤，步骤同（5）。

（8）孵育二抗：将羊抗M13的多抗作为二抗，每孔加100 μL二抗（MPBS稀释至1/5000）。封保鲜膜，37℃孵2h。

（9）孵育后，洗涤，步骤同（5）。

（10）孵育三抗：以标记有HRP的兔抗羊抗体为三抗，每孔加100 μL三抗（用MPBS稀释到1/5000）。封保鲜膜，37℃孵2h。

（11）孵育后，洗涤，步骤同（5）。

（12）显色：每个孔加入显色溶液100 μL，置于37℃下15~30 min。

（13）检测：加稀硫酸终止液以使反应终止，每孔50 μL。用酶标仪测定在650nm及450nm下的OD值，最终检测结果为两者之差。

6. 测序及IMGT/V-QUEST数据库分析抗体序列

根据以上ELISA数据挑选最优的结果，从步骤7中保存的第一块96孔细菌培养板相应孔中吸取20 μL菌液，加至含氨苄青霉素和四环素的3mL 2×TY培养基中。37℃振荡培养一夜。取1mL新鲜菌液标记后测序。另外，-20℃甘油保存一管菌液。利用IMGT/V-QUEST数据库分析测序结果中抗人ARTN单链抗体序列。

实施例2 1A8质粒的构建和转染

抗人ARTN的单链抗体1A8基因以pHEN2-1A8的形式扩增：扩增好的pHEN2-1A8用NcoI和NotI核酸酶消化，并用琼脂糖凝胶电泳分离，得到1A8单链抗体基因。单链抗体1A8基因用T4DNA连接酶与pET-22b载体相连接，形成pET22b-1A8，转化进入Ecoli BL21。转化产物涂布平板，阳性克隆在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板中挑取出来并测序。根据测序结果并结合MOE分析数据，我们绘制出了单链抗体1A8的空间构象。结果如图1所示。

实施例3 1A8单链抗体的表达和纯化

从30个阳性克隆中使用Dot-Blot挑选出高表达的克隆进行发酵。在10mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中接种测序正确的高表达单克隆，37℃下，220rpm培养一夜。次日，将菌液平均加至两瓶600mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，相同条件下摇至OD600值达0.8左右，约2-2.5h。添加1M 的IPTG至终浓度0.3mM，25℃，180rpm低温诱导20 h。诱导表达结束后，将菌液转移至离心杯。8000rpm，4℃下冷冻离心20min。将菌体沉淀完全刮至烧杯后，按1/10的比例添加Binding Buffer1以充分搅拌重悬菌体。加PMSF至终浓度达1mM以抑制蛋白酶活性。在冰上充分搅拌使菌体沉淀均匀，加溶菌酶溶液至终浓度1mg/mL溶菌。冰上充分搅拌10min，放置30min。加Triton X-100至终浓度0.2 %以释放周质蛋白，冰上搅拌至完全混匀，约5 min。再加入DNase至终浓度5 mg/mL降低溶液黏度，冰上充分搅拌。若黏度仍过高，则超声3-5 min进一步降低黏度以利于过滤。4℃下10000rpm离半小时，将上清过0.22μm滤膜除菌过滤，即获得单链抗体蛋白粗液。单链抗体蛋白粗液4℃静置1h。期间准备恒流泵与1mL镍柱。先用双蒸水冲洗镍柱10min，再用Binding Buffer2平衡柱子10min，冲洗的流速为1mL/min。接着，将单链抗体蛋白粗液上柱，控制流速为冲洗流速的一半。收集流出液，上完样后，再用Binding Buffer2平衡10min，此间流速为1mL/min。接着，分别用含有50mM，100mM，250mM，500mM咪唑的Elution Buffer洗脱挂在镍柱上的蛋白，每个浓度梯度收满8个1.5mL EP管。最后用双蒸水冲洗镍柱10min，再用20%乙醇冲洗10min，保存在4℃环境中。

实施例4 1A8单链抗体的的Western Blot鉴定

纯化得到的1A8 scFv进行变性SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为15%；4℃，20mA恒流转印1.5h，将蛋白转印到PVDF膜（购自Millipore）；转印结束，将膜在5%MTBS（含有5%脱脂牛奶的TBS）中37℃封闭2h；用5%MTBS稀释融合抗体，4℃过夜孵育，TBST（TBS中含有 0.05% Tween-20）洗涤3遍，每次10min；用anti-MICA的抗体37℃进行2h孵育后，用5%MTBS按1：5000稀释HRP-anti-Mouse二抗（购自Millipore），37℃孵育1.5h，TBS洗涤3遍，每次10min；用ECL溶液曝光，结果如图2所示。

实施例5 细胞增殖实验

在96孔板中，实验组和阴性对照组每孔加入100μL处于对数后期的BEL-7402细胞悬液（细胞悬液浓度为4×10⁴/mL，细胞以培养基重悬，培养基组成为DMEM+10%FBS)，在37℃，5%CO₂的培养箱中培养24h。弃去上清，实验组加入100μL含不同浓度（0nM,31.25nM, 62.5nM,125nM, 250nM, 500nM, 1000nM）1A8单链抗体的2%FBS+DMEM培养基，阴性对照组加入100μL2%FBS+DMEM培养基。培养48h后，弃去上清，每孔加入11μl MTT，37℃培养箱孵育4 h。弃去含有MTT的培养基，加入150μLDMSO，酶标仪（Thermo）在570nm和 630nm检测吸光度，分析实验结果，计算增殖抑制率。实验结果如图3所示。

该靶点目前还没有阳性药，所以没有阳性对照药数据；我们是设有阴性组的，但阴性组的数据不会在图中显现出来，而是用计算增殖抑制率，最终以抑制率的形式展现出来。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 一种靶向ARTN的单链抗体、制备方法及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 574

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Leu Glu Ile Phe Asn Val Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val

1 5 10 15

Val Pro Phe Tyr Ala Ala Gln Pro Ala Met Gly Arg Gly Ala Ala Gly

20 25 30

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser

35 40 45

Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val

50 55 60

Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser

65 70 75 80

Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr

85 90 95

Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser

100 105 110

Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg His Pro His

115 120 125

Tyr Gly Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr

130 135 140

Val Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser

165 170 175

Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg

180 185 190

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala

195 200 205

Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe

210 215 220

Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val

225 230 235 240

Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gln His Trp Asn Tyr

245 250 255

Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala

260 265 270

Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Ala Ala Leu

275 280 285

Glu Ile Phe Asn Val Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val

290 295 300

Pro Phe Tyr Ala Ala Gln Pro Ala Met Gly Arg Gly Ala Ala Gly Glu

305 310 315 320

Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys

325 330 335

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg

340 345 350

Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly

355 360 365

Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

370 375 380

Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu

385 390 395 400

Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg His Pro His Tyr

405 410 415

Gly Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

420 425 430

Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

435 440 445

Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val

450 455 460

Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Thr

465 470 475 480

Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu

485 490 495

Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr

500 505 510

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln

515 520 525

Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gln His Trp Asn Tyr Pro

530 535 540

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Gly

545 550 555 560

Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Ala Ala

565 570

<210> 2

<211> 864

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

ttggagattt tcaacgtgaa aaaattatta ttcgcaattc ctttagttgt tcctttctat 60

gcggcccagc cggccatggg ccgaggtgca gctggtgagt ctgggggagg cttagtgaag 120

cctggagggt ccctgaaact ctcctgtgca gcctctggat tcactttcag tagctatgcc 180

atgtcttggg ttcgccagac tccggagaag aggctggagt gggtcgcaac cattagtagt 240

ggtggtagtt acacctacta tccagacagt gtgaaggggc gattcaccat ctccagagac 300

aatgccaaga acaccctgta cctgcaaatg agcagtctga ggtctgagga cacggccttg 360

tattactgtg caagacaccc ccactacggc tacgatgcta tggactactg gggtcaagga 420

acctcagtca ccgtgtcgac aggtggaggc ggctctggtg gcggtggcag tggcggcgga 480

ggttctgacg tcgtgatgac ccagtctcaa aaattcatgt ccacatcagt aggagacagg 540

gtcagcatca cctgtaaggc cagtcagaat gttcgtactg ctgtagcctg gtatcaacag 600

aaaccagggc agtctcctaa agcactgatt tacttggcat ccaaccggca cactggagtc 660

cctgatcgct tcacaggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat tagcaatgtg 720

caatctgaag acctggcaga ttatttctgt ctgcaacatt ggaattatcc cacattcgga 780

ggggggacca agttggaaat caagcgcgcg gccgcaggtg cgccggtgcc gtatccggat 840

ccgctggaac cgcgtgccgc atag 864

Claims (6)

1.一种抗人ARTN的单链抗体，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ NO:1。

2.一种编码权利要求1所述的抗人ARTN的单链抗体的核酸，其特征在于所述的核酸的核苷酸序列为SEQ NO:2。

3.一种表达载体，含有权利要求2所述的核酸。

4.一种重组宿主细胞，含有权利要求3所述的表达载体。

5.如权利要求1所述的一种抗人ARTN的单链抗体在制备选择性地与人ARTN结合药物中的应用。

6.如权利要求1所述的抗人ARTN的单链抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。