JP2010534195A - アルテミン及び関連するリガンドについてのポリペプチド及びポリヌクレオチド、並びにその使用方法 - Google Patents

アルテミン及び関連するリガンドについてのポリペプチド及びポリヌクレオチド、並びにその使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、アルテミン、およびパーセフィン（ＰＳＰＮ）を含む関連リガンドに対する、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体を包含する。本発明はまた、これらのポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体を産生するための発現ベクターおよび宿主細胞を包含する。本発明は、さらに、診断および治療法、特に癌、特には乳癌、結腸癌、前立腺癌、子宮内膜癌、肺癌、胃癌、肝臓癌その他のための診断および治療法であって、１以上の開示されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、発現ベクター、宿主細胞、またはその組成物を含む、方法を包含する。特に包含されるのは、アルテミンおよび／または関連するリガンドの阻害剤およびこれらの阻害剤の使用である。

Description

本発明は、アルテミン（Artemin：ＡＲＴＮ）及びパーセフィン（Persephin：ＰＳＰＮ）についてのポリペプチド、ポリヌクレオチド、及び抗体に関する。本発明はまた、これらのポリペプチド、ポリヌクレオチド、又は抗体を産生するための発現ベクター及び宿主細胞に関する。本発明はさらに、開示されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、発現ベクター、宿主細胞、又はその組成物のうちの一つ又はそれ以上を用いる、診断及び治療のための、特に、癌、特に、乳癌、結腸癌、前立腺癌、子宮内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌、及びその他のための方法に関する。特に関連するのは、アルテミン及び／又は関連するリガンドの阻害剤、並びにこれらの阻害剤の使用である。
制御されていない足場非依存性の細胞増殖は癌の特徴であり、転移は癌が関連する死亡の原因である。現在、細胞増殖及び移動／侵入に関与する特定の経路を標的とするために使用され得る新薬が探し求められている。これにより、従来の方法、例えば、放射線療法、化学療法、及び性ホルモン療法と比較して、より毒性が少なく、より耐容性が高い、癌の治療のための代替的戦略が提供される。従来の化学療法剤が、健常細胞と癌細胞の両方に毒性を有することは周知である。さらに、化学療法への長期の曝露は、薬剤耐性細胞の選択をもたらすことになる。
特定のシグナル伝達分子を標的とする抗癌剤の例としては、タイケルブ（登録商標）（ラパチニブ）及びハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）が挙げられる。タイケルブ（登録商標）は、固形癌、例えば、乳癌及び肺癌の治療薬として、GlaxoSmithKlineにより開発された、上皮増殖因子受容体（epidermal growth factor receptor：ＥＧＦＲ）及びヒト上皮増殖因子受容体２（human epidermal growth factor receptor 2：ＨＥＲ−２）に対するデュアルチロシンキナーゼ阻害剤である。ハーセプチン（登録商標）は、ＨＥＲ２の機能を標的にして、ブロックするように設計されたヒト化モノクローナル抗体である。ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２受容体に対する、ますます多くの化合物が、臨床開発段階に入り、現在臨床治験中である。
グリア細胞株由来神経栄養因子（Glial-cell-line-derived neurotrophic factor：ＧＤＮＦ）は、形質転換増殖因子βスーパーファミリーの遠いメンバーであり、ＧＤＮＦファミリーリガンド（GDNF family ligand：ＧＦＬ）の基本メンバーである。このファミリーは、４つのメンバー：ＧＤＮＦ、ニュールツリン（Neurturin：ＮＲＴＮ）、アルテミン（ＡＲＴＮ）及びパーセフィン（ＰＳＰＮ）から構成され、これらの全てが強力な神経栄養因子である（例えば、非特許文献１を参照されたい）。ＧＤＮＦファミリーメンバーは、シグナルペプチドを含む分泌タンパク質である。それぞれは、約１４０アミノ酸残基の成熟タンパク質配列を有し、７ヶ所の保存された残基と同間隔のシステイン残基とを含む。このファミリーメンバーは、互いに約４０％のアミノ酸同一性を示す（非特許文献２〜３）
ＧＤＮＦファミリーメンバーは、リガンド結合成分としてのグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型共受容体（ＧＦＲα）及び共通のシグナル伝達成分としてのＲＥＴ受容体チロシンキナーゼを含む固有の多成分受容体複合体（multicomponent receptor complex）を通じてシグナル伝達すると考えられている（非特許文献３）。ＲＥＴは、典型的な細胞内キナーゼドメインを有し、下流の標的とＲａｓ／ＥＲＫ−、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ−、ｐ３８／ＭＡＰＫ−、及びＪＮＫ−経路において相互作用して、細胞成育、分化、生存、及びアポトーシスと影響を及ぼす（非特許文献４〜５）。しかしながら、その細胞外ドメインは、その他の受容体チロシンキナーゼとは大きく異なる。ＲＥＴは、４つのカドヘリン様ドメイン（ＲＴＫでは見かけない）と一つのシステインに富むドメインとを含む（非特許文献６〜７）。
その他の既知の受容体チロシンキナーゼと異なり、ＲＥＴは、そのリガンドと直接的には結合せず、細胞表面に結合したＧＦＲαを共受容体として必要とする。重要なことに、共受容体は、リガンドの受容体複合体への結合のためのシグナル伝達特異性を提供する。ＧＤＮＦはＧＦＲα１と、ＮＲＴＮはＧＦＲα２と、ＡＲＴＮはＧＦＲα３と、ＰＳＰＮはＧＦＲα４と、選択的に結合する（非特許文献１）。しかしながら、これらの結合の特異性は独占的ではない。例えば、ＧＤＮＦは、より低い親和性ではあるが、ＧＦＲα２及びＧＦＲα３と結合することができ、ＲＥＴを活性化することができる。このシグナル伝達が生理学的意義を有するか否かは、今のところ分かっていない（非特許文献８）。
ＧＤＮＦファミリーメンバーは、成長期及び成人期に、ＣＮＳの多くの領域で発現される。それらは神経細胞の多くのタイプの生存を強力に促進することが知られている。最も顕著には、それらはドーパミン作動性及び運動神経細胞の生存を支援することができる。これらの神経細胞群は、それぞれ、パーキンソン病及び筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis：ＡＬＳ）の過程で死滅する。それらの主要な役割が、腸壁神経系の発達及び腎臓の形態形成の調節であることが、ＧＤＮＦノックアウトマウスを用いた研究によって示唆された。
ＧＤＮＦファミリーメンバーは、パーキンソン病（非特許文献９）、アルツハイマー病（非特許文献１０〜１１）及びＡＬＳ（非特許文献１２）の治療に対する臨床上の重要性を有すると考えられている。その他の臨床的用途としては、アルコール依存症（非特許文献１３）慢性疼痛（非特許文献１４）、卒中（非特許文献１５）、てんかん（非特許文献１６）及び薬物依存症（非特許文献１７）の治療のための新しい標的として使用されることが挙げられる。例えば、ＧＤＮＦ及びニュールツリンは、パーキソン病の臨床試験において有望であることが示されており、アルテミンは現在、慢性疼痛治療に対する臨床試験が行われている（非特許文献８）。最近、ＧＤＮＦ及びアルテミンは、膵炎及び膵臓癌を患う患者における神経侵入に影響することが示されている（非特許文献１８〜２０）
医学においては、新しい抗癌剤等の新しい治療薬に対する継続的必要性が存在する。特に、癌細胞を阻害するために標的とされ得る特異的遺伝子及びタンパク質を同定する必要性が存在する。
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（発明の要約）
本発明は、細胞性リガンドのアルテミンの活性の発見に基づいており、特に、アルテミンは、癌細胞の足場非依存性増殖、コロニー形成、生存、移動、及び侵入を促進するように作用する。かかるものとして、アルテミン及び関連するリガンドは、癌治療のための理想的な治療標的を提供する。アルテミン及び／又はこれらの関連するリガンドの生物学的活性を阻害するいずれの試薬も、癌、例えば、癌の発症、進行、転移、又は再発、の治療のための可能性を有するであろう。
本発明は、アルテミン又は関連するリガンドに対する単離されたポリヌクレオチドを特徴とする。単離されたポリヌクレオチドは、センス配列、相補鎖（complement）、逆相補鎖、逆方向配列、又はその任意の修飾配列を含んでもよい。一態様において、ポリヌクレオチドは、アルテミンまたは関連リガンドに対するヌクレオチド配列、例えば配列番号３５〜１７１またはその修飾配列を対象とするアンチセンスポリヌクレオチドを含む。一態様において、ポリヌクレオチドは、アルテミン又は関連するリガンドに対するヌクレオチド配列、例えば、配列番号３５〜１７１、又はその修飾配列とハイブリダイズする。特定の態様において、アンチセンスポリヌクレオチドは、配列番号３５〜１７１の任意のアンチセンス配列からなる群より選択される。さらなる態様において、ポリヌクレオチドは、アルテミン又は関連するリガンドに対するヌクレオチド配列、例えば、配列番号３５〜４２、又はその修飾配列を対象とするｉＲＮＡを含む。一層さらなる態様において、ｉＲＮＡは、アルテミン又は関連するリガンドに対するヌクレオチド配列、例えば、配列番号３５〜４２、又はその修飾配列をサイレンシングする。特定の態様において、ｉＲＮＡ配列は、配列番号４６、４７、５０、５１からなる群より選択される。かかるアンチセンスポリヌクレオチド及びｉＲＮＡ、特に、ｓｉＲＮＡは、アルテミン又は関連するリガンドに対するポリヌクレオチド、例えば、配列番号３５〜４２、又はその修飾配列の発現を阻害することができる。
本発明はまた、アルテミン又は関連するリガンドに対するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを特徴とする。発現ベクターは、センス配列、相補鎖、逆相補鎖、逆方向配列、又はその任意の修飾配列を含んでもよい。一態様において、発現ベクターは、アルテミン又は関連するリガンドに対するヌクレオチド配列、例えば、配列番号３５〜１７１、又はその修飾配列を対象とするアンチセンスポリヌクレオチドを含む。一態様において、ポリヌクレオチドは、アルテミン又は関連するリガンドに対するヌクレオチド配列、例えば、配列番号３５〜１７１、又はその修飾配列とハイブリダイズする。特定の態様において、アンチセンスポリヌクレオチドは、配列番号３５〜１７１の任意のアンチセンス配列からなる群より選択される。別の態様において、発現ベクターは、アルテミン又は関連するリガンドに対する配列、例えば、配列番号３５〜４２、又はその修飾配列を対象とするｉＲＮＡを含む。さらなる態様において、ｉＲＮＡは、アルテミン又は関連するリガンドに対するヌクレオチド配列、例えば、配列番号３５〜４２、又はその修飾配列をサイレンシングする。特定の態様において、ｉＲＮＡ配列は、配列番号４６、４７、５０、５１からなる群より選択される。かかる発現ベクターを用いて、アルテミン又は関連するリガンドに対するポリヌクレオチド、例えば、配列番号３５〜１７１、又はその修飾配列の発現を阻害することができる。
本発明はまた、少なくとも一つの発現ベクターを含む宿主細胞、例えば、微生物又は哺乳動物宿主細胞を特徴とする。
本発明はまた、アルテミン又は関連するリガンドに対する単離されたポリペプチドを特徴とする。ポリペプチドはアルテミン又は関連するリガンドに対するタンパク質又はペプチド配列、又はその任意の修飾配列を含んでもよい。一態様において、ポリペプチドは、アルテミン又は関連するリガンドに対するアミノ酸配列、例えば、配列番号１〜３４を含む。特定の態様において、ポリペプチドは、アルテミン又は関連するリガンドに対する特定のアミノ酸配列、例えば、配列番号１〜３、又はその修飾配列を含む。さらなる態様において、ポリペプチドは、アルテミン又は関連するリガンドに対するアミノ酸配列、例えば、配列番号１〜３４の抗原性配列を含む。別の態様において、ポリペプチドは、フラグメントであり、このフラグメントは、例えば、アルテミン又は関連するリガンドに対する成熟配列、例えば、配列番号１〜３を含む、少なくとも一つのアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、ポリペプチドは、アルテミン又は関連するリガンドに対するアミノ酸配列、例えば、配列番号１〜３、又はその修飾配列を含み、本明細書において詳細に記載されるような異種性の薬剤との融合体又は包合体（conjugate）を含む。
別の特徴として、本発明は、アルテミン及び／又は関連するリガンドに対する抗体を含む。抗体は、本明細書中において詳細に記載されているような、例えば、ポリクローナル若しくはモノクローナル抗体、又は任意の修飾された抗体であってもよい。一態様において、抗体は、アルテミン又は関連するリガンドに対するアミノ酸配列、例えば、配列番号１〜３４、又はその修飾配列を対象とする。一態様において、抗体は、アルテミン又は関連するリガンドに対するアミノ酸配列、例えば、配列番号１〜３４、又はその修飾配列と結合する。特定の態様において、抗体は、アルテミン又は関連するリガンドに対するアミノ酸配列、例えば、配列番号１〜３４の抗原性部分（aspect）と結合する。さらなる態様において、抗体は、アルテミン又は関連するリガンドに対するヌクレオチド配列、例えば、配列番号３５〜１７１、又はその修飾配列を対象とする。一層さらなる態様において、抗体は、アルテミン又は関連するリガンドに対するヌクレオチド配列、例えば、配列番号３５〜１７１、又はその修飾配列と結合する。特定の態様において、抗体は、アルテミン又は関連するリガンドに対するヌクレオチド配列、例えば、配列番号３５〜４２と結合する。
本発明は、アルテミン又は関連するリガンドに対する単離されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は抗体を含む組成物を特徴とする。代替的態様において、組成物は、本発明による、発現ベクター、又は発現ベクターを含む宿主細胞を含んでもよい。組成物は、本明細書に記載される生物学的活性修飾体のいずれか一つを含んでもよい。組成物は、少なくとも一つの融合体又は包合体を含んでもよい。組成物は、本明細書において詳細に記載されるように、例えば、医薬組成物として、製剤化され得る。
本発明はまた、開示される方法による、診断又は治療のための、特に、癌、特に、乳癌、結腸癌、前立腺癌、子宮内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌、又は別の癌の診断又は治療のためのキットの一部としての本発明の組成物を特徴とする。キットは、ａ）本明細書において示されるような、アルテミン又は関連するリガンドに対する少なくとも一つの成分（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、又は抗体）；及び、ｂ）場合による、例えば、癌の診断又は治療における、使用説明書、を含んでもよい。
本発明はさらに、アルテミン又は関連するリガンドに対するポリペプチドのレベルを検出及び／又は測定する方法であって、１）対象（subject）からのサンプルを、ポリペプチド（例えば、配列番号１〜３４のうちの少なくとも一つ、又はその修飾配列）又は対応するペプチドに対する抗体と接触させる工程；及び、２）サンプル中で対応するペプチド又はポリペプチドにより形成される抗体複合体の存在又はレベルを測定する工程、を含む、方法を特徴とする。かかる方法は、本明細書において詳細に記載されるように、対象中の癌を診断するために用いられ得る。
本発明はまた、アルテミン又は関連するリガンドに対するポリヌクレオチドのレベルを検出及び／又は測定する方法であって、１）対象からのサンプルを、相補的ポリヌクレオチド（例えば、配列番号３５〜１７１のうちのいずれか一つと相補的な配列、又はその修飾配列）と接触させる工程；及び、２）サンプルにおいてポリヌクレオチドにより形成されるハイブリダイゼーション複合体の存在又はレベルを測定する工程、を含む方法を特徴とする。かかる方法は、本明細書において詳細に記載されるように、対象の癌を診断するために用いられ得る。
さらに、本発明は、本明細書において記載されるようなアルテミン及び／又は関連するリガンドに対する少なくとも一つの阻害剤（例えば、ポリヌクレオチド又は抗体）を使用することによる、癌細胞、特に、乳癌、結腸癌、前立腺癌、子宮内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌、又は別の癌からの癌細胞を阻害する（例えば、細胞の増殖、細胞の生存、細胞の運動性、及び／又は発癌性を阻害する）方法であって、細胞をその阻害剤と接触させる工程を含む方法を特徴とする。特定の態様において、阻害剤は、化合物（例えば、小分子）、アンタゴニスト、抗体、アンチセンスポリヌクレオチド、及びｉＲＮＡから選択される。
さらなる特徴として、本発明は、対象における癌、特に、乳癌、結腸癌、前立腺癌、子宮内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌、又は別の癌、を治療する方法であって、アルテミン及び／又は関連するリガンドに対する少なくとも１種の阻害剤（例えば、ポリヌクレオチド又は抗体）、又はその組成物、例えば、医薬組成物、を対象に投与することを含む、方法を包含する。特定の態様において、阻害剤は、化合物（例えば、小分子）、アンタゴニスト、抗体、アンチセンスポリヌクレオチド、及びｉＲＮＡからなる群より選択される。
別の特徴として、本発明は、対象における癌、特に、乳癌、結腸癌、前立腺癌、子宮内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌、又は別の癌を診断又はモニタリングする方法であって、本明細書において記載されるような少なくとも一つの抗体を、対象からのサンプルと接触させる工程；及び、サンプル中における、アルテミン及び／又は関連するリガンドのポリペプチド、例えば、配列番号１〜３、のレベルを測定する工程、を含む方法を包含する。
さらなる特徴として、本発明は、対象における癌、特に、乳癌、結腸癌、前立腺癌、子宮内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌、又は別の癌を診断又はモニタリングする方法であって、本明細書において記載されるような少なくとも一つのポリヌクレオチド（例えば、プローブ又はプライマー）を、対象からのサンプルと接触させる工程；及び、サンプル中における、アルテミン及び／又は関連するリガンドのポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）、例えば、配列番号３５〜４２、のレベルを測定する工程、を含む方法を包含する。
様々な態様において、本発明の方法は、インビボ又はインビトロ発現系を利用する。その他の態様において、本方法は、組み換え、合成、又は半合成手段により産生されたポリヌクレオチド若しくはポリペプチド、又は、内因的手段により産生されたポリヌクレオチド若しくはポリペプチド（例えば、天然成分）を使用する。
本発明は、本願明細書において言及される又は示される部分、要素及び特徴に、個別に又は総体的に存し、２つ以上のそれらの部分、要素又は特徴の任意の又は全ての組み合わせに存しているように、かつ、特定の完全体（integer）が本明細書に記載されており、それが、本発明が関連する当該技術において同等なものである場合、かかる既知の同等物は、個々に示されているように本明細書に組み入れられると見なされるように広く解釈され得る。
本発明のその他の態様及び実施形態は、以下、本明細書において記載される。
本発明のこれらの及びその他の態様は、その態様全てにおいて考慮されるべきであり、添付の図面を参照しながら、例示のみを目的として示される以下の記載から明らかとなるであろう。
図１Ａ〜Ｃ。ヒト正常組織及び癌細胞株におけるヒトアルテミンのｍＲＮＡ発現パターン。（Ａ）乳癌ＭＣＦ−７細胞におけるアルテミン及びパーセフィンの発現。全ＲＮＡをＭＣＦ−７細胞から単離した。アルテミン及びパーセフィンの発現は、Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、特異的プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲにより検出された。矢印（→）は、増幅した特定のバンドを示す。Ｍ，１ｋｂ＋ＤＮＡラダー（Invitrogen）。（Ｂ）アルテミンを、異なるヒト組織から作製されたｃＤＮＡのパネル（Primgen）において特異的プライマーを用いてＰＣＲにより増幅させた。組織の起源を各レーンの上部に示す。β２−ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子を、ｃＤＮＡ投入コントロールとして使用した。（Ｃ）ヒト癌細胞株におけるアルテミンの発現を、Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（QIAGEN）を使用して、同じアルテミン特異的プライマー対を用いるＲＴ−ＰＣＲにより測定した。β−アクチンを、ＲＮＡ投入コントロールとして含有させた。（Ｄ）（Ｂ）と同様のＲＴ−ＰＣＲによる、３つの乳癌細胞株におけるＧＦＲα１〜４及びＲＥＴの発現。ＰＣＲサイクル数を図の左側に示す。 図２Ａ〜Ｇ。乳癌ＭＣＦ−７細胞におけるアルテミンの強制的発現の効果の特性決定。細胞を、示されるように、アルテミンを発現するプラスミド（ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ）又はコントロールとして空のベクタープラスミド（ＭＣＦ７−Ｖｅｃ）を用いて安定的にトランスフェクトフェクトした。（Ａ）総ＲＮＡを単離し、アルテミン及びβ−アクチンのｍＲＮＡレベルを、Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（Qiagen）を使用するＲＴ−ＰＣＲにより検出した。（Ｂ）ＭＣＦ−７細胞におけるアルテミンの強制的発現及び分泌のウェスタンブロッティング分析。可溶性の全細胞抽出物又は濃縮調節された培地を、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に走らせ、ニトロセルロースに転写し、ヤギ抗アルテミンポリクローナル抗体（R&D Systems）を用いてイムノブロッティングした。β−アクチンを、細胞溶解物のためのローディングコントロールとして使用した。（Ｃ，Ｄ）総細胞数アッセイ。ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ（ＡＲＴＮ）及びＭＣＦ７−Ｖｅｃ（ベクター）細胞を、３連で、６ウェルのプレートに、（Ｃ）１０％ＦＢＳ（血清含有）又は（Ｄ）低濃度血清（０．２％）（血清不含）を含む３ｍｌのＲＰＭＩ１６４０中、１ウェルあたり５０，０００細胞の密度で播種した。１日おきに培地を交換しながら、最大８日間、細胞を培養した。１日おきにトリプシン処理をした後に、細胞数を測定した。（Ｅ）BrdU取り込みアッセイ。ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ（ＡＲＴＮ）及びＭＣＦ７−Ｖｅｃ（ベクター）細胞を、完全培地を含む６ウェルプレート中のカバーガラススリップ上に播種し、一晩インキュベートした後に、血清不含培地中で１８時間、血清飢餓状態においた。次に、細胞を、BrdUを用いてパルス標識した。キット（Zymed）を使用することにより、抗BrdUマウスモノクローナル抗体を用いてBrdU染色により増殖した細胞を検出した。細胞核を、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。暗褐色に核が染色された細胞を、BrdU標識細胞として計数した。全体の細胞核数に対するBrdU陽性細胞核の割合（％）を、カバースリップあたり１０ヶ所のランダムな領域から計算した。（Ｆ，Ｇ）アポトーシスアッセイ。ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ（ＡＲＴＮ）及びＭＣＦ７−Ｖｅｃ（ベクター）細胞を、１０％血清を含有する完全ＲＰＭＩ培地を含む６ウェルプレート中に播種した。１日後、細胞を２４時間にわたって血清飢餓状態においた。次に、細胞を固定し、Hoechst（登録商標）33258色素（Ｆ）、又は蛍光イソチオシアネート包合AnnexinV（ＡＶ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｇ）のいずれかにより、アポトーシスの評価のために染色した。Hoechst（登録商標）33258染色細胞の核の形態を、ＵＶ可視蛍光顕微鏡によって調べた。核凝縮及び断片化等のアポトーシスの核の特徴を有する細胞を、アポトーシスとして記録した。初期（ＡＶ陽性及びＰＩ陰性；網かけ四角）及び後期（ＡＶ及びＰＩ陽性；白色四角）アポトーシスを、百分率を用いて表した。＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１。 図３Ａ〜Ｆ。アルテミンの強制的過剰発現は、足場非依存性増殖を有意に促進し、細胞の移動及び侵入を増進させる。（Ａ）懸濁培養。ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ（ＡＲＴＮ）及びＭＣＦ７−Ｖｅｃ（ベクター）細胞を、細胞の付着を防ぐためにポリＨＥＭＡで予めコーティングされた６ウェルプレートの各ウェルに入れた。示された時間に、生存細胞を、血球計算器を用いて計数した。（Ｂ）軟寒天アッセイ。細胞を、３連で、６ウェルプレート中に１０％血清を含有する、完全ＲＰＭＩ１６４０培地中０．３５％アガロースに３通りに播種した。形成されたコロニーを、１４日間のインキュベーション後に計数した。（Ｃ）マトリゲル（登録商標）中での細胞の増殖により形成されたコロニーの代表的顕微鏡写真画像。（Ｄ）ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ及びＭＣＦ７−Ｖｅｃ細胞のファロイジン染色。（Ｅ）移動／侵入アッセイ。血清不含培地中の細胞を、コーティングされていない（移動）又はマトリゲル（登録商標）コーティングされた（侵入）８μｍの細孔サイズのトランスウェル（登録商標）インサートの上部チャンバに負荷し、これらを、１０％ＦＢＳを含有する完全培地を含む下部チャンバ中に入れた。負荷されたチャンバを２４時間又は４８時間インキュベートした。上部チャンバの細胞を綿棒で取り出し、内部チャンバの下面に移動した細胞を、クリスタルバイオレットで染色した後、顕微鏡で同定した。（Ｆ）創傷治癒アッセイ。細胞を、培地中で密集させるために、組織培養用ペトリ皿で増殖させた。滅菌ピペットチップを用いて細胞単層をこすり取ることにより、「引っかき」傷をインビトロで作製した。示された時点で写真を撮影した。＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊＊，ｐ＜０．００１。 図４Ａ〜Ｄ。ＭＣＦ−７ゼログラフィック（xerographic）ヌードマウスのインビボ増殖に及ぼすアルテミンの強制的発現の影響。マトリゲル（登録商標）中の、アルテミンを過剰発現するＭＣＦ７−ＡＲＴＮ細胞株又はＭＣＦ７−Ｖｅｃコントロール細胞株のいずれかの細胞（５×１０６個）を、免疫不全ヌードマウスの脇腹に皮下注射により移植した。腫瘍の長さ及び幅を１週間に２度測定し、体積を計算した。（Ａ）手術日に関連する腫瘍体積を示す。（Ｂ）ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いた代表的腫瘍の組織染色。（Ｃ，Ｄ）細胞増殖は、実験終了時におけるＢｒｄＵ取り込みにより評価され、アポトーシスは、ＴＵＮＥＬ標識により測定された。＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊＊，ｐ＜０．００１。 図５Ａ〜Ｅ。アルテミンの強制的過剰発現は、Ｔ４７Ｄ及びＢＴ５４９細胞において、足場非依存性増殖、細胞移動及び侵入を有意に増大させる。Ｔ４７Ｄ及びＢＴ５４９細胞に、アルテミンを発現するプラスミド（Ｔ４７Ｄ−ＡＲＴＮ及びＢＴ５４９−ＡＲＴＮ）又はコントロールとしての空のベクタープラスミド（Ｔ４７Ｄ−Ｖｅｃ及びＢＴ５４９−Ｖｅｃ）を安定的にトランスフェクトした。これらの細胞株において、アルテミンの発現をＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロット（Ａ）によって確認した。軟寒天（Ｂ）、移動及び侵入（Ｃ，Ｄ）アッセイはアルテミンを安定的に過剰発現するＴ４７Ｄ−ＡＲＴＮ及びそのコントロールＴ４７Ｄ−Ｖｅｃ；並びにＢＴ５４９−ＡＲＴＮ及びそのコントロールＢＴ５４９−Ｖｅｃ細胞を用いて、図３に記載されるようにして実施された。ＢＴ５４９−ＡＲＴＮ及びＢＴ５４９−Ｖｅｃ細胞の形態も示される（Ｅ）。＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊＊，ｐ＜０．００１。 図６Ａ〜Ｆ。ＭＣＦ−７細胞において、ｓｉＲＮＡによる内因性アルテミンｍＲＮＡの枯渇は、血清飢餓状態にある乳癌細胞増殖の生存を低減させ、アポトーシス細胞死を有意に増大させる。（Ａ）ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ＡＲＴＮプラスミド（ＡＲＴＮ−ｓｉＲＮＡ）（アルテミン転写物を標的とするｓｉＲＮＡをコードしている）、又はネガティブコントロールｓｉＲＮＡプラスミド、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ＣＫ（ＣＫ−ｓｉＲＮＡ）を、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター（ＥＧＦＰ）又はｐＥＧＦＰ−ＡＲＴＮプラスミド（ＥＧＦＰ−ＡＲＴＮ）と共に、ＭＣＦ−７細胞に一過性にトランスフェクトし、この場合、アルテミンｃＤＮＡは、ＥＧＦＰコード配列の３’ＵＴＲ内に挿入された。トランスフェクションの２４時間後、ＥＧＦＰの発現を、ＵＶ可視蛍光顕微鏡を用いることにより視覚化した。（Ｂ）ＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタンブロット。ＭＣＦ−７細胞に、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ＡＲＴＮプラスミド（ＭＣＦ７−ｓｉＲＮＡ）又はネガティブコントロールｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ＣＫプラスミド（ＭＣＦ７−ＣＫ）を安定的にトランスフェクトした。総ＲＮＡを単離し、アルテミン及びβ−アクチンのｍＲＮＡレベルを、Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（Qiagen）を使用するＲＴ−ＰＣＲにより検出した。可溶性の全細胞抽出物は、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に走らせ、ニトロセルロースに転写し、ヤギ抗アルテミンポリクローナル抗体（R&D Systems）を用いてイムノブロットした。β−アクチンを、細胞溶解物のためのローディングコントロールとして使用した。（Ｃ，Ｄ）総細胞数アッセイ。ＭＣＦ７−ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びＭＣＦ７−ＣＫ（ＣＫ）細胞を、６ウェルのプレートに、（Ｃ）１０％ＦＢＳ（血清含有）又は（Ｄ）低濃度血清（０．２％）（血清不含）を含む３ｍｌのＲＰＭＩ１６４０中、１ウェルあたり５０，０００細胞の密度で３通りに播種した。１日おきに培地を交換しながら、最大８日間、細胞を培養した。１日おきにトリプシン処理をした後に、細胞数を測定した。（Ｅ，Ｆ）アポトーシスアッセイ。細胞を、１０％血清を含有する完全ＲＰＭＩ培地中の６ウェルプレートに播種した。１日後、細胞を２４時間、血清飢餓状態においた。次に、細胞を固定し、Hoechst（登録商標）33258色素（Ｅ）、又は蛍光イソチオシアネート包合AnnexinV（ＡＶ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｆ）のいずれかにより、アポトーシスの評価のために染色した。Hoechst（登録商標）33258で染色された細胞の核の形態を、ＵＶ可視蛍光顕微鏡によって調べた。核凝縮及び断片化等のアポトーシスの核の特徴を有する細胞を、アポトーシスとして記録した。初期（ＡＶ陽性及びＰＩ陰性；網かけ四角）及び後期（ＡＶ及びＰＩ陽性；白色四角）アポトーシスを、百分率を用いて表した。＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１。 図７Ａ〜Ｄ。ｓｉＲＮＡによる内因性アルテミンの枯渇は、足場非依存性増殖を有意に低減させ、細胞の移動及び侵入を低下させる。（Ａ）軟寒天アッセイ。ＭＣＦ７−ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びＭＣＦ７−ＣＫ（ＣＫ）細胞を、６ウェルプレート中に１０％血清を含有する完全ＲＰＭＩ１６４０培地中０．３５％アガロース中に３通りに播種した。形成されたコロニーを、１４日間のインキュベーション後に計数した。（Ｂ）マトリゲル（登録商標）中での細胞の増殖により形成されたコロニーの代表的顕微鏡写真画像。（Ｃ）移動／侵入アッセイ。血清不含培地中の細胞を、コーティングされていない（移動）又はマトリゲル（登録商標）コーティングされた（侵入）トランスウェル（登録商標）インサート（８μｍ細孔サイズ）の上部チャンバに負荷した。これらを、１０％ＦＢＳを含有する完全培地を含む下部チャンバ中に入れた。負荷されたチャンバを２４時間インキュベートした。上部チャンバの細胞を綿棒で取り出し、内部チャンバの下面に移動した細胞を、クリスタルバイオレットで染色した後、顕微鏡で同定した。（Ｄ）創傷治癒アッセイ。細胞を、培地中で密集させるために、組織培養用ペトリ皿で増殖させた。滅菌ピペットチップを用いて細胞単層をこすり取ることにより、「引っかき」傷をインビトロで作製した。示された時点で写真を撮影した。＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１。 図８Ａ〜Ｃ。細菌中での組み換えヒトアルテミンタンパク質の産生。（Ａ）ｐＱＥ３０−ＡＲＴＮプラスミドを細菌中にトランスフォームし、Ｈｉｓ−アルテミンの発現をＩＰＴＧの添加により誘導した。全細胞溶解物（誘導前及び誘導後）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、クマシーブルー染色により視覚化した。（Ｂ）ヤギ抗アルテミンポリクローナル抗体（R&D Systems）を用いたウェスタンブロッティングによる、全細胞溶解物（誘導前及び誘導後）中におけるＨｉｓ−アルテミンの検出。（Ｃ）Ｈｉｓ−アルテミンタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡ（Qiagen）を用いて溶解物から精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、クマシーブルー染色により視覚化した。矢印は、Ｈｉｓ−アルテミンの１３．５ｋＤａのバンドを示す。分子量マーカーも、図の左側のバーにより単位ｋＤａで示される。 図９Ａ〜Ｄ。アルテミンに対するウサギポリクローナル抗体は、ＭＣＦ−７細胞の生存率を低減させ、侵入を阻害する。（Ａ）抗血清の特性決定。アルテミンを発現するＭＣＦ７−ＡＲＴＮ及びコントロールのＭＣＦ７−Ｖｅｃ安定細胞を、ウサギポリクローナル抗体を用いるウェスタンブロット分析に供した。（Ｂ，Ｃ）細胞生存率は、５００μｇ／ｍｌのウサギポリクローナル抗体（抗体）又はウサギコントロールＩｇＧ（コントロールＩｇＧ）を使用して、以下本明細書に記載される手順を用いる比色ＭＴＴアッセイにより評価された。細胞生存率は、抗体を含まない処理群（ＰＢＳ）に対して表された。（Ｄ）ウサギポリクローナル抗血清によるＭＣＦ−７細胞の侵入の阻害。＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１。 図１０。アルテミンに対するニワトリポリクローナル抗体の特性決定。アルテミンを過剰発現するＢＴ５４９−ＡＲＴＮ及びコントロールのＢＴ５４９−Ｖｅｃ安定細胞を、アルテミンに対するニワトリポリクローナル抗体を用いるウェスタンブロット分析に供した。 図１１Ａ〜Ｃ。アルテミンに対するニワトリポリクローナル抗体は、ＭＣＦ−７細胞の細胞生存率及び足場非依存性増殖を低減させ、侵入を阻害する。（Ａ）低濃度血清（０．２％）を含む培地中で３日間増殖させた細胞の細胞生存率は、アルテミンに対するニワトリポリクローナル抗体（抗ＡＲＴＮ）又は免疫前ニワトリコントロールＩｇＹを示された濃度で使用して、以下本明細書に記載される手順を用いる比色ＭＴＴアッセイにより評価された。細胞生存率は、抗体を含まないＰＢＳ処理群に対して表された。（Ｂ）軟寒天コロニー形成アッセイは、示された濃度のアルテミンに対するニワトリポリクローナル抗体（抗ＡＲＴＮ）又は免疫前コントロールＩｇＹの存在下、ＭＣＦ−７細胞を含む９６ウェルプレート中で行われた。次に、細胞生存率は、以下本明細書に記載される手順を用いる比色ＭＴＴアッセイにより評価され、いずれの処理も含まないＰＢＳコントロール群に対する百分率として表された。（Ｃ）アルテミンに対するニワトリポリクローナル抗体によるＭＣＦ−７細胞の侵入の阻害。＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊＊，ｐ＜０．００１。 図１２。タモキシフェン耐性ＭＣＦ−７細胞におけるアルテミン発現のアップレギュレーション。ＭＣＦ７細胞は通常、タモキシフェン感受性（ＴＡＭＳ）である。この薬物に濃度を増大させながら連続的に曝露すると、タモキシフェン耐性（ＴＡＭＲ）ＭＣＦ−７細胞が確立された。アルテミンの発現は、総ＲＮＡ投入コントロールとしてのβ−アクチンを用いてＲＴ−ＰＣＲにより測定された。 図１３Ａ〜Ｃ。アルテミンの強制的過剰発現は、化学療法薬により引き起こされる死亡を有意に減らす。ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ（ＡＲＴＮ）及びＭＣＦ７−Ｖｅｃ（ベクター）細胞を、示された濃度のタモキシフェン（Ａ）、ドキソルビシン（Ｂ）又はタキソール（Ｃ）の存在下又は非存在下、１０％血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地中、９６ウェルのマイクロプレートにおいてウェルあたり１０，０００細胞の密度で３通りに播種した。細胞生存率は、薬物を含まない処理群に対する、以下本明細書に記載される手順を用いる比色ＭＴＴアッセイにより評価された。＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊＊，ｐ＜０．００１。 図１４Ａ〜Ｃ。アルテミンの強制的過剰発現は、タモキシフェンの存在下、足場非依存性増殖を有意に増大させる。軟寒天アッセイは、１０％血清を含有する完全ＲＰＭＩ１６４０培地中０．３５％アガロース中の細胞を、タモキシフェンの存在下、６ウェルのプレートに、示された濃度で３通りに播種することにより、ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ（ＡＲＴＮ）及びＭＣＦ７−Ｖｅｃ（ベクター）細胞を用いて行われた。形成されたコロニーを、１４日間のインキュベーション後に計数し、（Ａ）に表された。相対的コロニー形成を、タモキシフェンの非存在下で形成されるコロニー数を１００％として示し、（Ｂ）に表した。（Ｃ）示された濃度でのタモキシフェンの存在下又は非存在下、マトリゲル（登録商標）中に形成されたコロニーの３Ｄ構造。＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１。 図１５Ａ〜Ｂ。抗エストロゲン薬と組み合わせた、アルテミンに対するニワトリポリクローナル抗体によるＭＣＦ−７細胞の足場非依存性増殖の相乗的阻害。軟寒天コロニー形成アッセイは、濃度１μＭの抗エストロゲン薬タモキシフェン（ＴＡＭ）（Ａ）又は濃度１００ｎＭのＦａｓｌｏｄｅｘ（ＩＣＩ １８２，７８０）（ＩＣＩ）（Ｂ）の存在下又は非存在下、これ単独で又は、アルテミンに対するニワトリポリクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ＡＲＴＮ）又は免疫前コントロールＩｇＹ（両方とも４００μｇ／ｍｌの濃度）と共に、ＭＣＦ−７細胞を含む９６ウェルプレート中で行われた。細胞の生存率は、以下本明細書に記載される手順を用いる比色ＭＴＴアッセイにより評価され、コントロールＩｇＹを用いた治療群に対する百分率として表された。 図１６。アルテミンの増大した又は減少した発現を示す子宮内膜癌細胞株の特性決定。アルテミンの発現を強制するために、ＲＬ９５−２及びＡＮ３細胞に、アルテミンを発現するプラスミドであるｐＩＲＥＳｎｅｏ３−ＡＲＴＮ（それぞれ、ＲＬ９５−２−ＡＲＴＮ及びＡＮ３−ＡＲＴＮと表される細胞）、又はコントロールとしての空のｐＩＲＥＳｎｅｏ３ベクター（ＲＬ９５−２−ＣＫ及びＡＮ３−ＣＫと表される細胞）のいずれかを、安定的にトランスフェクトした。内因性のアルテミンの発現を枯渇させるために、細胞に、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ＡＲＴＮプラスミド（ＲＬ９５−２−ｓｉＡＲＴＮ及びＡＮ３−ｓｉＡＲＴＮと表される細胞）又はネガティブコントロールｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ＣＫプラスミド（ＲＬ９５−２−ｓｉＣＫ及びＡＮ３−ｓｉＣＫと表される細胞）を安定的にトランスフェクトした。アルテミン（ＡＲＴＮ）の発現は、示されたように、ＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡレベルで、ウェスタンブロットによりタンパク質レベルで測定された。β−アクチンを対照として使用した。 図１７Ａ〜Ｅ。アルテミンの強制的発現は、ヒト子宮内膜癌ＲＬ９５−２細胞の細胞増殖を増大させ、アポトーシスを減少させる。（Ａ）総細胞数アッセイ。アルテミンを過剰発現するＲＬ９５−２−ＡＲＴＮ細胞並びにＲＬ９５−２−ＣＫコントロール細胞を、３連で、１０％ＦＢＳを含む３ｍｌの完全増殖培地中、６ウェルのプレート中のウェルあたり５０，０００細胞の密度で３通りに播種した。１日おきに培地を交換しながら、最大１４日間、細胞を培養した。２日ごとにトリプシン処理をした後に、総細胞数を測定した。（Ｂ）ＢｒｄＵ取り込みアッセイ。細胞を、カバーガラススリップ上の、６ウェルプレート中に、血清不含培地又は１０％血清（ＦＢＳ）を含有する完全培地中で播種し、一晩インキュベートした後に、血清不含培地中で１８時間、血清飢餓状態においた。次に、細胞を、ＢｒｄＵを用いてパルス標識した。増殖している細胞を、抗ＢｒｄＵマウスモノクローナル抗体を用いるＢｒｄＵ染色により検出した。（Ｃ）アポトーシスアッセイ。細胞を、６ウェルプレート中に、１０％血清を含有する完全成育培地中で播種した。１日後、細胞を４８時間、血清飢餓状態においた。次に、細胞を固定し、蛍光イソチオシアネート包合AnnexinV（ＡＶ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）により、アポトーシスの評価のために染色した。初期（ＡＶ陽性及びＰＩ陰性；網かけ棒図）及び後期（ＡＶ及びＰＩ陽性；黒色棒図）のアポトーシスが表される。（Ｄ，Ｅ）リアルタイムＰＣＲ。細胞周期調節及びＤＮＡ損傷修復（Ｄ）、並びにアポトーシス及び細胞老化（Ｅ）に関与するいくつかの主要なマーカーの相対的発現レベルを、リアルタイムＰＣＲにより測定した。コントロールＲＬ９５−２−ＣＫ細胞に対するＲＬ９５−２−ＡＲＴＮ細胞における相対的発現レベルを倍数表現（fold expression）により表した。＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．００１。 図１８Ａ〜Ｅ。アルテミンの強制的発現は、ヒト子宮内膜癌ＲＬ９５−２細胞の足場非依存性増殖を増大させる。（Ａ）軟寒天アッセイ。アルテミンを過剰発現するＲＬ９５−２−ＡＲＴＮ細胞並びにＲＬ９５−２−ＣＫコントロール細胞を、１０％血清を含有する完全培地中０．３５％アガロース中で６ウェルプレート中に３通りに播種した。形成されたコロニーを、１４日間のインキュベーション後に計数した。細胞の増殖により形成されたコロニーの代表的顕微鏡写真画像を右に示す。（Ｂ）懸濁培養。細胞を、細胞の付着を防ぐためにポリＨＥＭＡで予めコーティングされた６ウェルプレートの各ウェルに入れた。示された時点で、生存細胞を、血球計算器を用いて計数した。（Ｃ，Ｄ）コロニーの形態。細胞を、増殖因子を減少させたマトリゲル（登録商標）中（Ｃ）又はマトリゲル（登録商標）をコーティングしたプレート上（Ｄ）で増殖させた。プレーティング後、示された時点で、位相差顕微鏡画像を取得した。（Ｅ）フォーカス形成アッセイ。細胞を、１０％血清を含有する完全培地中で増殖させ、０．２％クリスタルバイオレットを含む７０％エタノールを用いて染色し、写真を撮影した。＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．００１。 図１９Ａ〜Ｅ。アルテミンの強制的発現は、ヒト子宮内膜癌ＲＬ９５−２細胞の移動及び侵入を増大させる。（Ａ）アルテミンを過剰発現するＲＬ９５−２−ＡＲＴＮ細胞並びにＲＬ９５−２−ＣＫコントロール細胞を、組織培養処理されたプラスチック製ペトリ皿において１０％ＦＢＳを含む完全培地中において培養した。細胞成育を、示された時点でモニタリングし、写真撮影した。（Ｂ）移動／侵入アッセイ。血清不含培地中の細胞を、コーティングされていない（移動）又はマトリゲル（登録商標）コーティングされた（侵入）トランスウェル（登録商標）インサート（８μｍの細孔サイズ）の上部チャンバに負荷した。これらを、１０％ＦＢＳを含有する完全培地を含む下部チャンバ中に入れた。負荷されたチャンバを２４時間インキュベートした。上部チャンバの細胞を綿棒で取り出し、内部チャンバの下面に移動した細胞を、クリスタルバイオレットで染色した後、顕微鏡で同定した。（Ｃ，Ｄ）リアルタイムＰＣＲ。侵入及び転移（Ｃ）、並びに細胞リモデリング（Ｄ）に関与するいくつかの主要なマーカーの相対的発現レベルを、リアルタイムＰＣＲにより測定した。ＲＬ９５−２−ＣＫコントロール細胞に対するＲＬ９５−２−ＡＲＴＮ細胞における発現レベルを表した。（Ｅ）細胞はテトラメチルローダミンＢイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）包合ファロイジンを用いて染色され（緑色）、核はＤＡＰＩを用いて対比染色された（青色）。葉状仮足（赤色矢印）及び糸状仮足（白色矢印）の形成を示した。＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．００１。 図２０Ａ〜Ｅ。ｓｉＲＮＡによる内因性アルテミンの枯渇は、ヒト子宮内膜癌ＲＬ９５−２細胞の細胞発癌能を低下させる。（Ａ）総細胞数アッセイ。アルテミン枯渇ＲＬ９５−２−ｓｉＡＲＴＮ細胞並びにコントロールＲＬ９５−２−ｓｉＣＫ細胞を、１０％ＦＢＳを含む３ｍｌの完全培地中、６ウェルのプレート中のウェルあたり５０，０００細胞の密度で、３通りに播種した。１日おきに培地を交換しながら、最大１４日間、細胞を培養した。２日ごとにトリプシン処理をした後に、総細胞数を測定した。（Ｂ）ＢｒｄＵ取り込みアッセイ。細胞を、カバーガラススリップ上の６ウェルプレート中に、血清不含培地又は１０％血清（ＦＢＳ）を含有する完全培地中で播種し、一晩インキュベートした後に、血清不含培地中で１８時間、血清飢餓状態においた。次に、細胞を、ＢｒｄＵを用いてパルス標識した。増殖している細胞を、抗ＢｒｄＵマウスモノクローナル抗体を用いるＢｒｄＵ染色により検出した。（Ｃ）アポトーシスアッセイ。細胞を、６ウェルプレート中に１０％血清を含有する完全成育培地中で播種した。１日後、細胞を４８時間、血清飢餓状態においた。次に、細胞を固定し、蛍光イソチオシアネート包合AnnexinV（ＡＶ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）により、アポトーシスの評価のために染色した。初期（ＡＶ陽性及びＰＩ陰性；網かけ棒図）及び後期（ＡＶ及びＰＩ陽性；黒色棒図）アポトーシスを表した。（Ｄ）軟寒天アッセイ。細胞を、１０％血清を含有する完全培地中、０．３５％アガロース中で６ウェルプレートに３通りに播種した。形成されたコロニーを、１４日間のインキュベーション後に計数した。（Ｅ）移動／侵入アッセイ。血清不含培地中の細胞を、コーティングされていない（移動）又はマトリゲル（登録商標）コーティングされた（侵入）トランスウェル（登録商標）インサート（８μｍの細孔サイズ）の上部チャンバに負荷した。これらを、１０％ＦＢＳを含有する完全培地を含む下部チャンバ中に入れた。負荷されたチャンバを２４時間インキュベートした。上部チャンバの細胞を綿棒で取り出し、内部チャンバの下面に移動した細胞を、クリスタルバイオレットで染色した後、顕微鏡で同定した。＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．００１。 図２１Ａ〜Ｄ。アルテミンの発現は、子宮内膜癌ＡＮ３細胞において、足場非依存性増殖並びに細胞移動及び侵入と有意に相関する。（Ａ，Ｂ）軟寒天アッセイ。アルテミンを過剰発現するＡＮ３−ＡＲＴＮ細胞並びにＡＮ３−ＣＫコントロール細胞（Ａ）、又は、アルテミン枯渇ＡＮ３−ｓｉＡＲＴＮ細胞並びにコントロールＡＮ３−ｓｉＣＫ細胞を、１０％血清を含有する完全培地中、０．３５％アガロース中で６ウェルプレートに３通りに播種した。形成されたコロニーを、１４日間のインキュベーション後に計数した。細胞の増殖により形成されたコロニーの代表的顕微鏡写真画像を右に示す。（Ｃ，Ｄ）移動／侵入アッセイ。血清不含培地中の細胞を、コーティングされていない（移動）又はマトリゲル（登録商標）コーティングされた（侵入）トランスウェル（登録商標）インサート（８μｍ細孔サイズ）の上部チャンバに負荷した。これらを、１０％ＦＢＳを含有する完全培地を含む下部チャンバ中に入れた。負荷されたチャンバを２４時間インキュベートした。上部チャンバの細胞を綿棒で取り出し、内部チャンバの下面に移動した細胞を、クリスタルバイオレットで染色した後、顕微鏡で同定した。＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．００１。 図２２Ａ〜Ｃ。アルテミンに対するニワトリポリクローナル抗体は、細胞生存率及び足場非依存性増殖を低減させ、子宮内膜癌細胞の細胞侵入を阻害する。（Ａ）低濃度血清（０．２％）を含む培地中で３日間増殖したＲＬ９５−２細胞の細胞生存率は、アルテミンに対するニワトリポリクローナル抗体（抗ＡＲＴＮ）又は免疫前ニワトリコントロールＩｇＹを示された濃度で使用して、以下本明細書に記載される手順を用いる比色ＭＴＴアッセイにより評価された。細胞生存率は、抗体を含まない処理群に対して表された。（Ｂ）軟寒天コロニー形成アッセイは、４００μｇ／ｍｌのアルテミンに対するニワトリポリクローナル抗体（抗ＡＲＴＮ）又は免疫前コントロールＩｇＹの存在下、ＲＬ９５−２及びＡＮ３細胞を含む９６ウェルプレート中で行われた。次に、細胞生存率は、以下本明細書に記載される手順を用いる比色ＭＴＴアッセイにより評価され、いずれの処理も含まないコントロール群（ＰＢＳ）に対する百分率として表された。（Ｃ）アルテミンに対するニワトリポリクローナル抗体によるＭＣＦ−７細胞の侵入の阻害。＊＊，ｐ＜０．０１。 図２３Ａ〜Ｇ。アルテミンに対するポリヌクレオチド及びポリペプチドの配列情報。（Ａ）ヒトアルテミン（ＡＲＴＮ）転写物変異体１のｃＤＮＡのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００３９７６）。（Ｂ）ヒトアルテミン（ＡＲＴＮ）転写物変異体２のｃＤＮＡのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０５７０９１）。（Ｃ）ヒトアルテミン（ＡＲＴＮ）転写物変異体３のｃＤＮＡのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０５７１６０）。（Ｄ）ヒトアルテミン（ＡＲＴＮ）転写物変異体３のｃＤＮＡのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０５７０９０）。（Ｅ）小文字で示されたシグナルリードペプチド（signal leading peptide）を有する、転写物１及び２によってコードされたヒトアルテミン（ＡＲＴＮ）アイソフォーム１前駆体のアミノ酸配列（Ｅｎｔｒｅｚタンパク質ＩＤ：ＮＰ＿００３９６７及びＮＰ＿４７６４３２）。（Ｆ）小文字で示されたシグナルリードペプチドを有する、転写物３によってコードされたヒトアルテミン（ＡＲＴＮ）アイソフォーム２前駆体のアミノ酸配列（Ｅｎｔｒｅｚタンパク質ＩＤ：ＮＰ＿４７６５０１）。（Ｇ）小文字で示されたシグナルリードペプチドを有する、転写物４によってコードされたヒトアルテミン（ＡＲＴＮ）アイソフォーム３前駆体のアミノ酸配列（Ｅｎｔｒｅｚタンパク質ＩＤ：ＮＰ＿４７６４３１）。 図２４Ａ〜Ｄ。ヒトアルテミンｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列。配列は、クローン化ｃＤＮＡ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＢＣ０６２３７５）及びゲノム配列から推定された。（Ａ）転写物変異体１のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００３９７６）。（Ｂ）転写物変異体２のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０５７０９１）。（Ｃ）転写物変異体３のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０５７１６０）。（Ｄ）転写物変異体３のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０５７０９０）。開始コドンＡＵＧ及び終止コドンＵＧＡは、下線が引かれ、太字で示す。潜在的なポリアデニル化シグナルであるＵＵＵＡＵＵ（これはＡＡＵＡＡＡの相補配列である）にも下線を引き、イタリック体で示す。＊はポリ（Ａ）テールの可能な位置を示す。 図２５Ａ〜Ｂ。パーセフィンに対するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列情報。（Ａ）ヒトパーセフィン（ＰＳＰＮ）ｍＲＮＡのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００４１５８）。（Ｂ）ヒトパーセフィン（ＰＳＰＮ）前駆体のアミノ酸配列（Ｅｎｔｒｅｚタンパク質ＩＤ：ＮＰ＿００４１４９）。 図２６。ヒトパーセフィンｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列。配列は、クローン化ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００４５５８）から推定された。開始コドンＡＵＧ及び終止コドンＵＧＡは、下線が引かれ、太字で示す。
（発明の詳細な説明）
以下は本発明の説明であり、その好ましい実施形態を含み、一般的用語で示される。本発明はさらに、本発明及びその具体例を裏付ける実験データを提供する「実施例」の項に示される開示から明らかにされる。
（定義）
用語「抗体」は、可能な限り広い意味で理解されるべきであり、インタクトなモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を含むことが意図される。所望の生物学的活性を示す限り、改変された抗体を網羅することも意図される。抗体は、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的活性部分、すなわち、抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合性の部位を含む分子を包含する。これらは、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦａｂ２フラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリを含むが、これらに制限されない。抗体分子は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及びＩｇＤのいずれかに関連し、これらは、分子中に存在する重鎖の性質により互いに異なる。これらには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びその他等のサブクラスも同様に含まれる。軽鎖は、カッパ鎖であっても、ラムダ鎖であってもよい。本明細書において抗体と呼ぶものには、全てのクラス、サブクラス、及びタイプと呼ぶものが含まれる。キメラ抗体、例えば、二つ以上の起源、例えば、マウス又はヒトの配列に特異的であるモノクローナル抗体又はその改変体も含まれる。さらに、ラクダ科動物抗体又はナノボディ（nanobody）も含まれる。本明細書において「抗体」又は任意の同様の用語で呼ばれるそれぞれには、インタクトな抗体、並びにその任意の改変体が含まれることが理解されるであろう。
用語「アンチセンス」は、広義に解釈されるべきである。アルテミン及び／又は関連するリガンドに対する転写物と結合し得る任意の核酸（好ましくは、ＲＮＡであるが、一本鎖ＤＮＡを含む）を意味することが意図される。それは、ＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくは、ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズ可能な、オリゴヌクレオチド及びそれらの誘導体（及び、塩形成基が存在する場合、その塩）を含む。かかるオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド誘導体は、かかるハイブリダイゼーションを可能にするために数及び同一性において十分なヌクレオチドユニット又はそのヌクレオチド類似体／誘導体を含み得る。大抵の場合、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びそれらの誘導体は、ワトソン−クリック塩基対合により規定されているように、ＤＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ又は成熟ｍＲＮＡの相補配列と特異的に結合（ハイブリダイズ）する。
本明細書において使用される場合、「改変（Altered）」ポリヌクレオチドは、同一又は機能的に等価なものをコードするポリヌクレオチドをもたらす、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、又は置換を有するものを含む。ポリペプチド及び抗体もまた、「改変され」ていてもよく、アミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換を含み、これにより、サイレントな変化を生じ、機能的に等価な配列をもたらす。配列の少なくとも一つの生物学的活性（例えば、細胞増殖、細胞生存、細胞運動、及び／又は発癌性に及ぼす効果）又は免疫原性／免疫学的活性が保持されるかぎり、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の類似性に基づき、計画的なアミノ酸置換を行ってもよい。例えば、負に帯電するアミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含み得；正に帯電するアミノ酸は、リジン及びアルギニンを含み得；類似した親水性値を有する非帯電極性頭部基を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、及びバリン、グリシン及びアラニン、アスパラギン及びグルタミン、セリン及びスレオニン、及び、フェニルアラニン及びチロシンを含み得る。置換及び／又は欠失或いは置換又は付加を行う指針は、例えば、本明細書の図に示されるように、ホモログ、オーソログ、又はパラログの配列比較により、得られ得る。
用語「抗原結合部位」又は「抗原結合部分」とは、抗原相互作用に参加する免疫グロブリン分子の部分、又はそのフラグメント、又はその改変体のことをいう。抗原結合部位は、一般的に、重鎖（「Ｈ」）及び軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖及び軽鎖のＶ領域内の３つの高度に多岐に亘る領域（stretch）は、「超可変領域」といい、「フレームワーク領域」として知られる、より保存的な隣接領域間に介在する。したがって、用語「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」とは、免疫グロブリンの超可変領域間に、又は隣接して、自然に見られるアミノ酸配列のことをいう。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域及び重鎖の３つの超可変領域は、抗原結合表面を形成するために、三次元空間内に互いに相対的に位置されている。抗原結合表面は、一般的に、結合抗原の三次元表面に相補的であり、重鎖及び軽鎖のそれぞれ３つの超可変領域は、「相補性決定領域（complementarity-determinig region）」又は「ＣＤＲ」と呼ばれる。各ドメインに対するアミノ酸の割り当ては、許容される定義にしたがう。（例えば、Kabat sequence of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991；及びChothia&Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987, Chothia et al. Nature 342: 878-883, 1989を参照されたい）。
本明細書において使用される場合、「アミノ酸配列」とは、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又は抗体、及びその任意のフラグメントの配列、並びに、任意の天然、組み換え、合成、又は半合成の分子のことをいう。本発明の配列は、少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個のアミノ酸、好ましくは、少なくとも５〜１０個、５〜１５個、１０〜１５個、又は１２〜１５個のアミノ酸を含む。好ましくは、この配列は、オリジナルのアミノ酸配列の生物学的活性（例えば、細胞増殖、細胞生存、細胞運動、及び／又は発癌性に及ぼす効果）又は免疫原性／免疫学的活性を保持している。「アミノ酸配列」及び同様の用語は、全長分子が関連する完全なオリジナルの配列に限定されず、その任意の改変体も含むことが理解されるであろう。
本明細書において使用される場合、「アルテミン及び関連するリガンド」とは、アルテミン（ＡＲＴＮ）及びパーセフィン（ＰＳＰＮ）等のＧＤＮＦファミリーリガンド（ＧＦＬ）のことをいい、これらは、類似した配列及び／又は活性を含み得、例えば、限定するものではないが、アルテミン（ＡＲＴＮ）転写物変異体１、アルテミン（ＡＲＴＮ）転写物変異体２、アルテミン（ＡＲＴＮ）転写物変異体３、アルテミン（ＡＲＴＮ）転写物変異体３、アルテミン（ＡＲＴＮ）アイソフォーム１前駆体、アルテミン（ＡＲＴＮ）アイソフォーム２前駆体、アルテミン（ＡＲＴＮ）アイソフォーム３前駆体、パーセフィン（ＰＳＰＮ）、及びパーセフィン（ＰＳＰＮ）前駆体等が含まれる。本発明による使用のために、ヒトの配列が好ましいが、その他のホモログ及びオーソログを使用され得る。本明細書におけるこれらの因子（例えば、アルテミン（ＡＲＴＮ）及び関連するリガンド、例えば、パーセフィン（ＰＳＰＮ）、又は同様の用語）への言及は、全長配列、並びに、その任意のフラグメント又は改変体（変異体を含む）を含み得ることが理解されるであろう。
用語「癌」及び「癌性」とは、異常又は無秩序な細胞増殖、細胞生存、細胞運動、及び／又は発癌性によって通常特徴づけられる、哺乳動物における生理学的状態のことをいう。癌及び癌病態は、例えば、転移、隣接細胞の正常機能に対する干渉、異常レベルのサイトカイン又はその他の分泌産物の放出、炎症又は免疫反応の抑制又は悪化、新形成（neoplasia）、前悪性、悪性、周囲又は遠位組織又は器官（例えば、リンパ節）への侵入等と関連し得る。特に、癌及び前癌状態（例えば、乳癌）が含まれ、これには、上皮癌、非上皮癌、カルシノーマ（例えば、上皮内癌（carcinomas in situ））、並びに侵襲性乳癌が含まれ得る。特に、結腸癌、前立腺癌、子宮内膜癌、肺癌、胃癌、及び肝癌も含まれる。
本明細書において使用される場合、用語「相補的」又は「相補性」とは、塩基対合による、許容される塩及び温度条件下でのポリヌクレオチドの自然の結合のことをいう。配列Ａ−Ｇ−Ｔに関して、相補配列はＴ−Ｃ−Ａであり、逆相補配列はＡ−Ｃ−Ｔであり、逆配列はＴ−Ｇ−Ａである。二つの一本鎖分子間の相補性は部分的であってもよく、この場合、いくつかの核酸のみが結合しており、或いは、一本鎖分子間に全体的な相補性が存在する場合には、相補性は完全であり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に大きな影響を及ぼす。このことは、核酸鎖間の結合に依存する増幅反応、並びに、ｉＲＮＡ及びＰＮＡの設計及び使用に特に重要である。
本明細書において使用される場合、用語「誘導体」とは、ポリヌクレオチド、又はそれと相補的なポリヌクレオチドの化学的改変体のことをいう。かかる改変には、例えば、水素の、アルキル、アシル、又はアミノ基との置換が含まれる。好ましい態様において、ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的又は免疫学的機能を保持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチド又は抗体は、グリコシル化、ペグ化、又は任意の同様のプロセスによって改変されているものであり、これは、それが由来する配列の一つ以上の生物学的機能（例えば、細胞増殖、細胞生存、細胞運動、及び／又は発癌性に及ぼす効果）又は免疫原性／免疫学的機能を保持している。抗体に関して、用語「誘導体」は、例えば、ハイブリッド及び組み換え抗体を含む。「ハイブリッド」及び「組み換え」バージョンの抗体は、例えば、ヒト化抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、及び一本鎖抗体を含む。
本明細書において使用される場合、用語「エピトープ」は、免疫グロブリン、又は関連する分子、例えば、ｓｃＦｖ、又はＴ細胞受容体と特異的に結合し得る任意のポリペプチド又はペプチド決定基を含む。エピトープ決定基は、一般的に、アミノ酸及び／又は糖側鎖等の化学的に活性な表面分子群を含み、通常、特異的な三次元構造特性並びに特異的電荷特性を有する。エピトープは、大きく分けて二つの種類、すなわち、連続的エピトープ（sequential epitope：ＳＥ）（この場合、抗体は、ペプチド結合によって連結された、連続した一続きのアミノ酸残基と結合する）、及び立体配座エピトープ（conformational epitope：ＣＥ）（この場合、抗体は、ポリペプチド鎖の折り畳みによって一緒になった、非連続残基と結合する）を含む。立体配座エピトープは、本明細書において、天然エピトープとも呼ばれる。抗体によって認識されるためには、残基は、通常、相互作用するために接近可能である、すなわち、抗原表面近くに存在している必要があることは、抗原−抗体複合体の結晶構造の解析から知られている。ＳＥ及びＣＥを予測するために、市販のアルゴリズムを使用した。解離定数が、≦１μＭ；好ましくは、≦１００ｎＭ、最も好ましくは、≦１０ｎＭである場合、抗体は抗原と特異的に結合していると考えられている。特定の態様において、阻害剤は、本明細書において記載されるリガンドと特異的に結合又は反応することができる。抗体に関して、「特異的に結合する」又は「特異的に免疫反応する」とは、抗体が、所望の抗原の一つ以上の抗原決定基と反応し、その他のポリペプチドとは反応（すなわち、結合）しない、或いは、はるかに低い親和性（例えば、Ｋｄ＞１０−６）でその他のポリペプチドと結合することを意味する。
用語「発現」は、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの産生、特に、遺伝子又は遺伝子の一部からのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の産生を含み、ＲＮＡ又は遺伝子又は遺伝子の一部によってコードされるポリペプチドの産生、並びに、発現に伴われる検出可能な物質の出現を含む。例えば、複合体の形成（例えば、ポリペプチド−ポリペプチド相互作用、ポリペプチド−ヌクレオチド相互作用等による）は、用語「発現」の範囲内に含まれる。別の例は、結合リガンド、例えば、ハイブリダイゼーションプローブ又は抗体の、遺伝子又はその他のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド、ポリペプチド又はタンパク質フラグメントへの結合、並びに、結合リガンドの可視化である。それ故に、マイクロアレイ上、ノーザンブロット等のハイブリダイゼーションブロット上、又はウェスタンブロット等のイムノブロット上、又はビードアレイ上のスポットの増大した強度または又はＰＣＲ分析による増大した強度は、基本的な生物学的分子の用語「発現」の範囲内に含まれる。
本明細書において使用される場合、用語「相同性」とは、相補性の程度のことをいう。部分的相同性（すなわち、所定の％の同一性）又は完全相同性（すなわち、１００％の同一性）が存在し得る。同一の配列が標的核酸とハイブリダイズすることを少なくとも部分的に阻害する部分的相補配列は、機能的用語「実質的に相同な」を用いることを参照する。標的配列への完全相補配列のハイブリダイゼーションの阻害は、低緊縮性条件下でのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザン又はノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション等）を使用して調べられ得る。実質的に相同な配列又はハイブリダイゼーションプローブは、低緊縮性条件下で、完全相同配列が標的配列と結合することと競合し、阻害することになる。低緊縮性条件は、非特異的結合が許容されるようにされることを言っているわけではなく、低緊縮性条件は、二つの配列の互いの結合が特異的（すなわち、選択的）相互作用であることを必要とする。
本明細書において使用される場合、用語「ハイブリダイゼーション」とは、核酸鎖が塩基対合により相補鎖と結合する任意の工程のことをいう。
本明細書において使用される場合、「挿入」又は「付加」とは、天然の分子と比較した場合に、それぞれ、一つ以上のアミノ酸残基又はヌクレオチドの追加をもたらす、アミノ酸又はヌクレオチド配列の変更のことをいう。
アルテミン及び／又は関連するリガンドについて「阻害」又は「阻害すること」とは、これらのリガンドの生物学的活性及び／又はレベルをブロックする又は低減させることをいうことが意図される。活性を完全に阻害することが望ましい場合もあるが、このことが必須である必要はない。「阻害」は、発現及び産生のレベル（例えば、転写又は翻訳レベル）で、すなわち、例えば、機能を標的とすることにより、起こり得る。本明細書において使用される場合、アルテミン及び／又は関連するリガンドについての用語「阻害する」又は「阻害」とは、例えば、ＤＮＡレベル（例えば、ＤＮＡ合成の低減、ターンオーバー増加、及び／又は安定性低下）、ＲＮＡレベル（例えば、転写の減少、ターンオーバーの増加、及び／又は安定性の低下）、又は、ポリペプチドレベル（例えば、翻訳の減少、ターンオーバーの増加、及び／又は安定性の低下）又は活性、又は、翻訳後改変の低減のことをいう。阻害剤は、関連する経路の下流又は上流の薬剤の活性又は発現レベルも低減させ又はブロックし得る。特定の態様において、本発明の阻害剤は、細胞増殖、細胞生存、細胞運動、及び／又は発癌性を阻害するために、特に、本明細書において記載されるような癌細胞に対して有用である。特に、この薬剤は、細胞増殖の低減（例えば、細胞分裂の低減による）、細胞死の増大（例えば、アポトーシス又はネクローシスの増大による）、又は、細胞侵入及び／又は転移の低減（例えば、細胞骨格活性、細胞運動（cell motor）の低減による）のうちの一つ以上に有用であり得る。
用語「改変された」又は「改変」とは、本明細書において記載されるような、改変された配列及び配列フラグメント、変異体、及び誘導体のことをいう。この用語は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、及び本明細書において記載される同様の薬剤を含む。
本明細書において使用される場合、用語「モノクローナル抗体」、「ＭＡｂ」、又は「モノクローナル抗体組成物」とは、独特の軽鎖遺伝子産物及び独特の重鎖遺伝子産物を含む抗体分子からなる分子種を含む抗体分子群のことをいう。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（complementarity determining region：ＣＤＲ）は独特である。ＭＡｂは、それとの独特の結合親和性により特徴づけられる、抗原の特定のエピトープと免疫反応し得る抗原結合部位を含む。
本明細書において使用される場合、「核酸配列」又は「ヌクレオチド配列」とは、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、又はそのフラグメントの配列、並びに、天然、組み換え、合成又は半合成起源のＤＮＡ又はＲＮＡのことをいい、それらは、一本鎖若しくは二本鎖であり得、センス又はアンチセンス鎖、又はコード若しくは非コード領域を表し得る。本発明の配列は、好ましくは、少なくとも１５、２１、２７、３３、３６、３９、４５、５１、５７、又は６６ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも１５〜３６、１５〜６６、３６〜６６、又は４５〜６６ヌクレオチド、又は少なくとも１００ヌクレオチド、又は少なくとも１０００ヌクレオチドを含む。本明細書においてそれぞれ「核酸配列」又は「ヌクレオチド配列」と呼ぶものには、オリジナルの完全長配列、並びに、その任意の相補体又は改変体を含むことになることが理解されるであろう。特定の配列番号を有する「ポリヌクレオチド」（又は「オリゴヌクレオチド」、又は「プローブ」、又は「プライマー」等）と呼ばれるそれぞれは、ＤＮＡ及びカウンターパートＲＮＡ配列の両方を包含することになることがさらに理解されるであろう。
用語「オリゴヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチド、典型的には、プローブ又はプライマーのことをいい、例えば、限定するものではないが、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、及び二本鎖ＤＮＡを含む。オリゴヌクレオチド、例えば、一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドは、化学的方法により、例えば、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置を使用することにより、又は、インビトロ発現系、組み換え技術、及び細胞及び生物体における発現等の様々なその他の方法により合成されることが多い。
用語「患者」又は「対象」は、ヒト及び非ヒト動物を含む。非ヒト動物としては、限定するものではないが、鳥類及び哺乳類、特に、マウス、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、及びウマが挙げられる。
本明細書において使用される場合、「ペプチド核酸（peptide nucleic acid）」又は「ＰＮＡ」とは、ペプチド骨格を介して連結している塩基を含む、アンチセンス分子又はアンチジーン薬剤のことをいう。
本明細書において使用される場合、表現「薬学的に許容される希釈剤、担体、及び／又は賦形剤」は、医薬組成物を調製するのに有用であり、且つ、その意図される機能を果たすことを同時に可能にしながら、本発明の薬剤と共に投与してもよい物質を含むことが意図されている。これらは、一般的に、安全であって、非毒性であり、生物学的にも、その他の意味においても望ましくないものではない。薬学的に許容される希釈剤、担体、及び／又は賦形剤の例としては、溶液、溶媒、分散媒、遅延剤、乳剤等が挙げられる。希釈剤、担体、及び／又は賦形剤は、等張性及び化学的安定性を増大させる物質等の少量の添加剤を含んでもよい。
用語「ポリヌクレオチド」（例えば、ポリヌクレオチドを議論するために使用され得る「アルテミン又は関連するリガンド」）とは、単数形又は複数形で使用される場合、一般的に、任意の核酸配列、例えば、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドのことをいい、これらは、改変されていないＲＮＡ又はＤＮＡであっても、改変されているＲＮＡ又はＤＮＡであってもよい。これには、限定するものではないが、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、及び、一本鎖及び二本鎖領域を含むＲＮＡ、一本鎖、又は、より典型的には、二本鎖であり得る、或いは、一本鎖及び二本鎖領域を含み得る、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれる。ＲＮＡ又はＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三重鎖（triple-stranded）領域も含まれる。具体的には、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、及びゲノムＤＮＡ、及びその任意のフラグメントが含まれる。この用語は、一つ以上の、トリチウム化塩基等の改変塩基、又はイノシン等の非通常塩基を含むＤＮＡ及びＲＮＡを含む。本発明のポリヌクレオチドは、コード又は非コード配列、又はセンス又はアンチセンス配列、又は、ｓｉＲＮＡ等のｉＲＮＡを包含し得る。本明細書において「ポリヌクレオチド」又は同様の用語についてそれぞれ言及する場合、完全長配列並びにその任意の相補体又は改変体を含むことになることが理解されるであろう。
本明細書において使用される場合、「ポリペプチド」（例えば、ポリペプチドを議論するために使用され得る「アルテミン又は関連するリガンド」）とは、オリゴペプチド、ペプチド、若しくはタンパク質、又はそのフラグメントのことをいい、又、天然、組み換え、合成、若しくは、半合成分子のことをいう。天然のタンパク質分子のアミノ酸配列に言及するためにこれらの用語を本明細書において記載する場合、この用語は、アミノ酸配列を、全長分子の完全なオリジナルの配列に限定することを意図しない。本明細書において「ポリペプチド」又は同様の用語についてそれぞれ言及する場合、全長配列及びその任意の改変体を含むことになることが理解されるであろう。
本明細書において使用される場合、用語「緊縮性条件」又は「緊縮性」とは、核酸、塩、及び温度により規定されるハイブリダイゼーションの条件のことをいう。これらの条件は、当技術分野において周知であり、同一又は関連するポリヌクレオチド配列を同定又は検出するために変化させてもよい。例えば、Sambrook, J.et al.(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, and Ausubel, F. M.et al.(1989) Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley&Sons, New York, NY.を参照されたい。低又は高緊縮性のいずれかを含む多数の同等な条件は、配列の長さ及び性質（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）、標的の性質（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）、環境（例えば、溶液中又は固体基質上に固定されている）、塩及びその他の成分の濃度（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン及び／又はポリエチレングリコール）、及び反応温度（例えば、プローブの融点よりも約５℃低い温度から、融点よりも約２０℃〜２５℃低い範囲内）等の因子に依存する。上記条件とは異なるが、同等の低又は高緊縮性いずれかの条件を生じさせるために、一つ以上の因子を変更してもよい。
本明細書において言及される場合、「配列番号」は、各配列識別子を個々に、又は任意のその組み合わせを、又はかかる配列識別子全てを示し得る。
本明細書において使用される場合、用語「実質的に精製された」又は「単離された」とは、核酸又はアミノ酸配列であって、それらの細胞、組み換え、又は合成環境から取り出され、且つ、それらの環境に含まれるその他の成分を、少なくとも６０％、好ましくは７５％、最も好ましくは少なくとも９０％又は少なくとも９９％含まない、核酸又はアミノ酸配列のことをいう。「単離された」ポリヌクレオチド及びポリペプチドは、それらの自然の状態に含まれる少なくとも一つの夾雑な核酸分子から同定及び分離される。したがって、単離されたポリヌクレオチド及びポリペプチドは、自然において見つけられる形態又は状態とは異なる形態にあることが理解されるであろう。さらに、「単離された」は、配列が精製た正確な度合い（例えば、具体的百分率）を必ずしも反映している必要はないことが理解されるであろう。
「治療」及び同様の用語は、医学的障害（例えば、医学的疾患、状態、又は症候群）を予防、治癒、又は回復させるため、又は、かかる障害の少なくとも一つの症候を低減させるための方法及び組成物のことをいう。特に、これは、医学的障害の発症を予防又は遅延させるため；障害の身体又は成長への影響を治癒、修正、低減、遅延、又は回復させるため；及び／又は、障害により引き起こされる痛み又は苦痛を予防、終結、低減、又は回復させるための方法及び組成物を含む。用語「治療」は、その最大に広い状況で考えられるべきである。この用語は必ずしも、対象が完全に回復するまで治療されることを意味する必要はない。したがって、本明細書において使用される場合、「治療」は、例えば、癌、特に、乳癌、結腸癌、前立腺癌、子宮内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌、又は別の癌に対して、細胞増殖、細胞生存、細胞運動、及び／又は発癌性を阻害し、低減させ又は予防すること；細胞増殖、細胞生存、細胞運動、及び／又は発癌性の症候又は重篤性を回復させること；又は、細胞増殖、細胞生存、細胞運動、及び／又は発癌性を予防すること、さもなくは、発症リスクを低減させること等、広く含む。
本明細書において使用される場合、ポリペプチドの「変異体」とは、一つ以上のアミノ酸が変更されたアミノ酸配列のことをいう。同様に、変異抗体は、一つ以上のアミノ酸が変更されている。変異ポリヌクレオチドは、一つ以上のヌクレオチドが変更されている。変異は、「保存的」変化をもたらす場合があり、この場合、置換されたアミノ酸は類似した構造的又は化学的特徴を有する（例えば、ロイシンのイソロイシンとの置換）。より珍しくは、変異は、「非保存的」変化をもたらす場合がある（例えば、グリシンのトリプトファンとの置換）。同様の小さな変異は、アミノ酸の欠失又は挿入、又はその両方を含んでもよい。生物学的活性又は免疫原性を失わせずに、どのアミノ酸残基を置換、挿入、又は欠失している可能性があるかを調べる際の指針は、当技術分野において周知のコンピュータープログラム、例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いることにより見出され得る。
本発明はまた、（例えば、細胞増殖、細胞生存、細胞運動、及び／又は発癌性に影響を及ぼす）少なくとも一つの生物学的活性、又は免疫原性／免疫学的機能を保持する変異体を包含する。好ましい変異体は、開示された配列に対して、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するものである。最も好ましい変異体は、本明細書に開示された配列に対して、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するものである。同一性の割合（％）は、以下に記載されるように比較する二つの配列を整列させ、整列させた部分における同一残基の数を測定し、その数を、特許性（疑問が持たれる）配列中の全残基数で割り、その結果に１００を掛けることにより測定される。有用なアラインメントプログラムは、ＡｌｉｇｎＸ（Vector NTI）である。
本発明の実施は、別段の指示がない限り、当技術分野の範囲である、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、及び生化学における従来からある技術を使用することになる。かかる技術は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Sambrook et al., 1989; also, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Sambrook et al., 2000; Oligonucleotide Synthesis, MY Gait, ed., 1984; Animal Cell Culture, R.I. Freshney, ed., 1987; Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.; Handbook of Experimental Immunology, 4th edition, D .M. Weir & CC. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, JAM. Miller & MAP. Calos, eds., 1987; Current Protocols in Molecular Biology, FEM. Ausubel et al., eds., 1987; and PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al., eds., 1994.等の文献中に十分説明されている。
（アルテミン）
グリア細胞株由来神経栄養因子（glial cell line derived neurotrophic factor：ＧＤＮＦ）ファミリーは、４つのメンバー、すなわち、アルテミン、ニュールツリン、パーセフィン、及びＧＤＮＦから構成される。この分野の最新の理解では、このメンバーは、共受容体ＧＦＲαと結合することにより作用し、これによって、共通のチロシンキナーゼ受容体ＲＥＴを活性化してこれが下流の標的の引き金となり、次に、細胞成育、分化、生存、及びアポトーシスに影響を及ぼす（Baudet et al, 2000; Coulpier et al, 2002）。乳癌ＭＣＦ−７細胞は、ファミリーメンバーの全てを発現する。本開示は、アルテミンが、特に、足場非依存性増殖及びコロニー形成（すなわち、発癌性）を促進し、アポトーシスを減少させ、細胞移動／侵入を増大させることを立証する。ｓｉＲＮＡによるＭＣＦ−７細胞中の内因性アルテミンの枯渇は、強制的発現に対して逆の効果をもたらす。したがって、本研究は、アルテミンが（神経細胞におけるその通常の役割は別とする）、癌細胞のアポトーシス、移動、及び侵入、並びに、足場非依存性増殖及びコロニー形成（すなわち、発癌性）に影響を及ぼすことを示す。これらの生物学的機能の阻害を利用することにより、癌、特に、乳癌、結腸癌、前立腺癌、子宮内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌、又は別の癌の発症、進行、転移、及び再発を劇的に制限することができる。
それ故に、本明細書において開示されるデータは、アルテミンの発現が、足場非依存性増殖及びコロニー形成（すなわち、発癌性）に加えて、乳癌ＭＣＦ−７細胞の生存、移動及び侵入を促進すること、並びに、ｓｉＲＮＡを介してアルテミンの発現レベルを、又は抗体を介して活性を低減させることにより、これらの活性を有効に阻害し得ることを証明する。かかるものとして、アルテミン及び関連するリガンドは、癌治療及び診断のための、特に、乳癌、結腸癌、前立腺癌、子宮内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌、又は別の癌のための、理想的な新しい標的を表す。アルテミン及び／又は関連するリガンドの生物学的活性及び／又はレベルを阻害する試薬を用いることにより、例えば、癌細胞に対する、細胞増殖、細胞生存、細胞運動、及び／又は発癌性を阻害することができる。これらの試薬は、例えば、化合物（例えば、小分子）、アンタゴニスト、抗体、及びｉＲＮＡを含み得る。同様に、診断用薬剤（例えば、ポリヌクレオチド及び抗体）を用いることにより、アルテミン及び／又は関連するリガンドのレベルを測定し、癌の状態、例えば、癌の発症、進行、転移、又は再発を検出することができる。
（アルテミンポリヌクレオチド及びポリペプチド）
本発明は、アルテミン又は関連するリガンドに対するポリペプチドを包含し、配列番号１〜３６、１７２、１７３、及びその改変体のうちの少なくとも一つを含むものを含む。本発明はまた、癌、特に、乳癌、結腸癌、前立腺癌、子宮内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌、又は別の癌の診断における、これらのポリペプチドの使用を包含する。本発明はさらに、例えば、癌細胞に対する、細胞増殖、細胞生存、細胞運動、及び／又は発癌性を阻害するための、抗体を調製するためのポリペプチドの使用を包含する。本発明のポリペプチドは、それらの生物学的活性を測定するために、様々なアッセイにおいて発現され、使用されてもよい。ポリペプチドは、大量合成及び単離プロトコールのために、例えば、商業的生産のために、使用されてもよい。かかるポリペプチドを使用して、抗体を産生し、対応するアミノ酸配列を分離し、アミノ酸配列レベルを定量的に測定してもよい。本発明のポリペプチドは、組成物、例えば、医薬又はキット組成物としても使用され得る。本発明のポリペプチドは、健康上の利益をもたらすためにも使用され得る。かかる利益のために、ポリペプチドを用いて、抗体、及びその組成物を調製することができる。
本発明のポリペプチドは、（ａ）配列番号１〜３６、１７２、１７３からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列を含むポリペプチド又はその改変体；（ｂ）配列番号１〜３６、１７２、１７３からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列の機能性ドメインを含むポリペプチド又はその改変体；及び、（ｃ）配列番号１〜３６、１７２、１７３からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列のうちの少なくとも一つの特定の数の連続する残基を含むポリペプチド又はその改変体からなる群より選択される少なくとも一つの配列を含む。一特定の実施形態において、本発明は、配列番号１〜３６、１７２、１７３のうちの少なくとも一つのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを包含する。これらの配列の全てが、総称的に、本発明のポリペプチドと、本明細書において呼ばれる。
本発明は、アルテミン又は関連するリガンドに対するポリヌクレオチド、例えば、配列番号３７〜１７１、１７４で示されるもの、及び相補体、及びそれらの改変配列を包含する。本発明はまた、癌、特に、乳癌、結腸癌、前立腺癌、子宮内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌、又は別の癌の診断におけるこれらのポリヌクレオチドの使用を包含する。本発明はさらに、例えば、癌細胞の、細胞増殖、細胞生存、細胞運動、及び／又は発癌性の阻害のためのこれらのポリヌクレオチドの使用を包含する。したがって、本発明は、発現ベクター及び宿主細胞を調製するため、並びに、アンチセンスポリヌクレオチド及びｉＲＮＡを調製するためのポリヌクレオチドの使用を包含する。本発明の単離されたポリヌクレオチドはまた、程度の差はあるが関連する種の遺伝子の、ゲノムマッピングにおいて、物理的マッピングにおいて、クローニングにおいて有用性を有する。本発明のポリヌクレオチドを用いて設計されたプローブを使用することにより、当技術分野において周知の技術、例えば、スロットブロット技法又はマイクロアレイ分析を用いて、細胞中に十分に相同なＤＮＡ及びＲＮＡ配列を有する任意の生物における遺伝子の存在を検出し、発現パターンを調べてもよい。本発明のポリヌクレオチドを用いて設計されたプライマーは、配列決定及びＰＣＲ増幅のために使用されてもよい。本発明のポリヌクレオチドは、組成物、例えば、医薬組成物として使用され得る。本発明のポリヌクレオチドは、健康上の利益をもたらすために使用され得る。かかる利益のために、ポリヌクレオチドは、発現ベクター、又は発現ベクターを含む宿主細胞として提供され得る。
本発明のポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１〜３６、１７２、１７３からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列に対するコード配列を含む配列又はその修飾配列；（ｂ）配列番号１〜３６、１７２、１７３からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列に対するコード配列の相補体、逆配列、及び逆相補配列又はその改変配列；（ｃ）配列番号１〜３６、１７２、１７３からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列に対するコード配列中に含まれるオープンリーディングフレーム又はその改変体；（ｄ）配列番号１〜３６、１７２、１７３からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列に対するコード配列の機能性ドメイン又はその改変体；（ｅ）配列番号１〜３６、１７２、１７３からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列に対するコード配列のうちの少なくとも一つの特定の数の連続する残基を含む配列又はその改変配列；及び、（ｆ）配列番号３７〜１７１、１７４のうちの少なくとも一つの特定された数の連続するヌクレオチドを含む配列又はその相補体又はその改変配列、からなる群より選択される少なくとも一つの配列を含む。一特定の実施形態において、本発明は、配列番号１〜３６、１７２、１７３からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列に対するコード配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを包含する。別の特定の実施形態において、本発明は、配列番号１〜３６、１７２、１７３からなる群より選択される配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを包含する。オリゴヌクレオチドプローブ及びプライマー及びそれらの改変体も提供される。これらのポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドプローブ及びプライマーの全てが、総称的に、本発明のポリヌクレオチドと、本明細書において呼ばれる。
遺伝暗号の縮重の結果として、本発明のポリペプチドをコードする多数のヌクレオチド配列（いくつかは、任意の既知及び天然遺伝子のヌクレオチド配列と最小限の相同性を有する）が製造され得ることが、当業者に理解されるであろう。したがって、本発明は、可能なコドン選択に基づく組み合わせを選択することにより作られ得る、ありとあらゆる可能なバリエーションのヌクレオチド配列を意図する。これらの組み合わせは、天然のアミノ酸配列に適用される標準的三文字遺伝暗号（triplet genetic code）にしたがい作られ、全てのかかるバリエーションは、具体的に開示されているものとして見なされるべきである。
アルテミン又は関連するリガンドに対するヌクレオチド配列、又はその改変体は、好ましくは、適切に選択された緊縮性条件下で、天然の配列のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる。しかしながら、実質的に異なるコドン使用頻度を有するヌクレオチド配列、又はその改変体を作製することが有利である場合もある。特定のコドンがその宿主に利用される頻度にしたがい、特定の原核又は真核宿主においてポリペプチドの発現が起こる割合を増大させるように、コドンを選択してもよい。コードされるアミノ酸配列を変更することなく、ヌクレオチド配列及びその誘導体を実質的に変更するその他の理由としては、天然の配列から生じさせられる転写物よりも望ましい特性（例えば、より長い半減期）を有するＲＮＡ転写物の作製が挙げられる。
本発明はまた、完全に合成化学による、アルテミン又は関連するリガンドに対するポリヌクレオチド、又はその改変体の生成を包含する。生成後、合成配列は、当技術分野において周知の試薬を用いて、多くの利用可能な発現ベクター及び細胞系のうちのいずれかに挿入され得る。さらに、合成化学を用いて、ヌクレオチド配列、又はその任意の誘導体に変異を導入してもよい。また、特許請求の範囲に記載されるヌクレオチド配列、特に、配列番号３５〜１７１に示されるもの、又はその相補体、又はその改変配列と、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987; Methods Enzymol. 152:399- 407) and Kimmel, A. R. (1987; Methods Enzymol. 152:507-511に教示されるような様々な緊縮性条件下で、ハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列が、本発明に包含される。
当技術分野において周知且つ一般的に利用可能なＤＮＡ配列決定方法が、本発明の実施形態のいずれかを実施するためにも使用され得る。本方法は、ＤＮＡポリメラーゼＩのKlenowフラグメント、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（U.S.Biochemical Corp，Cleveland，OH）、Ｔａｑポリメラーゼ（Perkin Elmer）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，ＮＪ）、又は、ＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Life Technologies,Gaithersburg，ＭＤ）で見られるもの等のポリメラーゼとプルーフリーディングエキソヌクレアーゼの組み合わせ等の酵素を使用してもよい。好ましくは、この方法は、Hamilton Micro Lab 2200（Hamilton，Reno，ＮＶ）、Peltier Thermal Cycler（PTC200；MJ Research，Watertown，ＭＡ）ＡＢＩ触媒及び３７３及び３７７ＤＮＡ配列決定装置（Perkin Elmer）、又はGenome Sequencer 20（登録商標）（Roche Diagnostics）等の装置を用いて自動化される。
部分的ヌクレオチド配列を利用し、当技術分野において知られるプロモーター及び調節エレメント等の上流の配列を検出するための様々な方法を使用することによって、核酸配列を伸長させてもよい。例えば、使用され得る方法の一つ「制限部位（restriction-site）」ＰＣＲは、普遍的プライマーを使用して、既知の遺伝子座に隣接する未知の配列を取り出す（Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322）。特に、ゲノムＤＮＡは初めに、リンカー配列に対するプライマーと、既知の領域に特異的なプライマーの存在下で増幅させられる。次に、増幅した配列を、同じリンカープライマーと、最初のプライマーよりも内部の別の特異的プライマーを用いる、２回目のＰＣＲに供する。各回のＰＣＲ産物は、適当なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写され、逆転写酵素を用いて配列決定される。
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、配列決定又はＰＣＲ産物のサイズの分析又はヌクレオチド配列の確認をしてもよい。特に、キャピラリー配列決定は、電気泳動分離のための流動性ポリマー、４つの異なる蛍光色素（各ヌクレオチドに対して一つ）（これらはレーザーにより活性化される）、及び、電荷結合素子カメラによる、放射された波長の検出を使用し得る。出力／光強度は、適当なソフトウェア（例えば、ＧＥＮＯＴＹＰＥＲ及びＳｅｑｕｅｎｃｅ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ，Perkin Elmer）を用いて、電気シグナルに変換されてもよく、サンプルの添加からコンピューター分析及び電子データ表示までの方法全体をコンピューターによって制御してもよい。キャピラリー電気泳動は、特定のサンプル中に限られた量で存在し得る小片のＤＮＡの配列決定のために特に好ましい。
本発明の別の実施形態において、ポリヌクレオチド又はその改変体は、組み換えＤＮＡ分子において使用されて、適当な宿主細胞中において、アルテミン又は関連するリガンド、又はその改変体に対するポリペプチドの発現に向かわせてもよい。遺伝暗号の固有の縮重のため、実質的に同一な又は機能的に同等なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を作製してもよく、これらの配列を使用して、クローニングし、ポリペプチドを発現させてもよい。本発明のヌクレオチド配列は、例えば、限定するものではないが、クローニング、プロセシング、及び／又は遺伝子産物の発現を改変するといった変更等、様々な理由のためにアミノ酸コード配列を変更するために、当技術分野において一般的に知られている方法を用いて操作され得る。ランダムフラグメンテーションによるＤＮＡ混合（shuffling）及び遺伝子フラグメントのＰＣＲ再アセンブリ及び合成オリゴヌクレオチドを、ヌクレオチド配列を操作するために使用してもよい。例えば、新しい制限部位を挿入するため、グリコシル化パターンを変更するため、コドン選択性を変化させるため、変異を導入する等のために、部位特異的突然変異誘発を利用してもよい。
本発明の別の実施形態において、一つのポリペプチドをコードする天然の、改変の、又は組み換え核酸配列は、融合タンパク質をコードするために、異種配列に連結させてもよい。例えば、市販の抗体に認識され得るキメラ配列をコードすることは有用であり得る。融合タンパク質はまた、本発明のポリペプチドと異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように操作されてもよく、その結果、ポリペプチドは、異種部分から離れて切断され、精製され得る。
別の実施形態において、ヌクレオチド配列は、全体または一部において、当技術分野において周知の化学的方法を用いて、合成され得る（Caruthers, M. H. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, Horn, T. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225- 232を参照されたい）。或いは、ポリペプチド自体を、アミノ酸配列、又はその改変体を合成するための化学的方法を用いて、作製してもよい。例えば、ポリペプチド合成は、様々な固相技術（Roberge, J. Y. et al. (1995) Science 269:202-204; Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154）を用いて行われ得、例えば、ABI 431A Peptide Synthesizer（Perkin Elmer）を用いて、自動合成が達成され得る。全長分子を作製するための化学的方法を用いて、様々なポリペプチドフラグメントを、別々に又は一緒にして、化学的に合成してもよい。
新しく合成されるポリペプチドは、分取高速液体クロマトグラフィーにより単離され得る（例えば、Creighton, T. (1983) Proteins Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, NY）。合成ポリペプチドの組成は、アミノ酸分析又は配列決定によって確認され得る（例えば、エドマン分解法；Creighton，上掲）。さらに、ポリペプチド、又はその任意の部分のアミノ酸配列は、改変分子を作製するために、直接合成時に変更されてもよく、且つ／又は、化学的方法を用いて、他のタンパク質又はその任意の部分からの配列と組み合せされもよい。
生物学的に活性なポリペプチドを発現させるために、そのポリペプチド又は機能的同等物をコードするヌクレオチド配列を、適当な発現ベクター、例えば、挿入されるコード配列の転写及び翻訳のために必要なエレメントを含むベクター中に挿入してもよい。当業者に周知である方法を用いて、ポリペプチドをコードする配列並びに適当な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを構築してもよい。これらの方法としては、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ遺伝子組み換えが挙げられる。かかる技術は、Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY; also, Sambrook, J. et al. (2000) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, and Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY中に記載されている。
様々な発現ベクター／宿主系を、本発明のポリペプチドをコードする配列を含み、発現させるために利用してもよい。これらは、限定するものではないが、組み換えファージ、プラスミド、又はコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換させられた細菌；酵母発現ベクターを用いて形質転換させられた酵母；ウィルス発現ベクター（例えば、バキュロウィルス）を用いて感染させられた昆虫細胞系；ウィルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウィルス，ＣａＭＶ；タバコモザイクウィルス，ＴＭＶ）又は細菌発現ベクター（例えば、Ｔｉ又はｐＢＲ３２２プラスミド）を用いて形質転換させられた植物細胞系；又は動物細胞系等の生物を含む。細菌に対して、有用なプラスミドとしては、InvitrogenからのｐＥＴ、ｐＲＳＥＴ、ｐＴｒｃＨｉｓ２、及びｐＢＡＤプラスミド、NovagenからのｐＥＴ及びｐＣＤＦプラスミド、及びSigma-AldrichからのＤｉｒｅｃｔｏｒ（登録商標）プラスミドが挙げられる。特に、大腸菌は、発現ベクターｐＥＴにより使用され得る。本発明は、使用される発現ベクター又は宿主細胞に限定されない。
「調節エレメント」又は「制御配列」は、転写及び翻訳を行わせるために宿主細胞タンパク質と相互作用する非翻訳領域（例えば、エンハンサー、プロモーター、５’及び３’非翻訳領域）のことである。かかるエレメントは、その強度及び特異性が様々であり得る。使用されるベクター系及び宿主に応じて、任意の数の適当な転写及び翻訳エレメント（構成性及び誘導性プロモーターを含む）を使用してもよい。例えば、細菌系でクローニングする場合、誘導性プロモーター、例えば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Stratagene，LaJolla，ＣＡ）又はｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Life Technologies）等のハイブリッドｌａｃＺプロモーターを使用してもよい。バキュロウィルスポリヘドリンプロモーターを昆虫細胞中で使用してもよい。植物細胞のゲノム由来のプロモーター又はエンハンサー（例えば、熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ、及び保存タンパク質遺伝子）又は植物ウィルス由来（例えば、ウィルスプロモーター又はリーダー配列）をベクターにクローニングしてもよい。
細菌系においては、ポリペプチドの意図される用途に応じて、多数の発現ベクターが選択され得る。例えば、大量のポリペプチドが必要とされる場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現に向かわせるベクターが使用され得る。かかるベクターとしては、限定するものではないが、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Stratagene）等の多機能性大腸菌クローニング及び発現ベクター等を挙げることができ、この場合、ポリペプチドをコードする配列は、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔと続く７残基の配列を有するフレーム中にベクターに連結されてもよく、その結果、ハイブリッドタンパク質が産生される；ｐＩＮベクター（Van Heeke, G. and S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509）。
ｐＧＥＸベクター（Promega，Madison，ＷＩ）を使用して、ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含む融合タンパク質として発現させてもよい。通常、かかる融合タンパク質は、可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへ吸着させた後、遊離グルタチオンの存在下で溶出させることにより、溶解細胞から容易に精製され得る。かかる系において作製されるタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、又は第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含んで、対象となるクローニングされるポリペプチドが自由自在にＧＳＴ部分から放出され得るように設計されてもよい。酵母サッカロマイセス・セレビシエでは、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、及びＰＧＨ等の構成的又は誘導性プロモーターを含む多数のベクターを使用し得る。概説については、Ausubel et al. (上掲) and Grant et al. (1987) Methods Enzymol. 153:516-544を参照されたい。
本発明のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成させるために、特定の開始シグナルを使用してもよい。かかるシグナルは、ＡＴＧ開始コドン及び隣接する配列を含む。ポリペプチドをコードする配列、その開始コドン、及び上流配列を、適当な発現ベクター中に挿入した場合、さらなる転写又は翻訳調節シグナルは必要とされない場合もある。しかしながら、コード配列、又はその改変体のみが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドン等の外来の翻訳調節シグナルが提供されるべきである。さらに、開始コドンは、挿入体全体の翻訳を確実にするために、正しいリーディングフレーム中に入れるべきである。外来性の翻訳エレメント及び開始コドンは、天然及び合成の、様々な起源のものであり得る。発現の効率は、使用される特定の細胞系に適したエンハンサーを含有させることにより増大させられ得、例えば、そのようなエンハンサーが、文献に記載されている（Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162）。
さらに、宿主細胞は、挿入された配列の発現を調節するその能力、又は、発現されたポリペプチドを所望の様式にプロセシングするその能力に関して選択されてもよい。配列のかかる改変としては、限定するものではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、及びアシル化が挙げられる。正確な挿入、折り畳み、及び／又は機能を促進するために、「プレプロ」形態のポリペプチドを切断する翻訳後プロセシングも使用されてもよい。特定の細胞機構と、翻訳後活性のための特徴的機序とを有する様々な宿主細胞が、アメリカ培養細胞系統保存機関（american type culture collection：ＡＴＣＣ；Bethesda，ＭＤ）から入手可能であり、配列の正確な改変及びプロセシングを確実にするために選択され得る。具体的な宿主細胞としては、限定するものではないが、ロドトルラ（Rhodotorula）、オーレオバシジウム（Aureobasidium）、サッカロマイセス（Saccharomyces）、スポロボロマイセス（Sporobolomyces）、シュードモナス（Pseudomonas）、エルウィニア（Erwinia）及びフラボバクテリウム（Flavobacterium）；又は、エシェリキア（Escherichia）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、バチルス（Bacillus）、ストレプトマイセス（Streptomyces）等のその他の生物等が挙げられる。特定の宿主細胞としては、大腸菌（本発明により使用するのに特に適している）、サッカロマイセス・セレビシエ、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）等が挙げられる。
インビトロで培養された真核細胞へ核酸を導入するための複数の技術が存在する。これらには、化学的方法（Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:7413 7417 (1987); Bothwell et al., Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Eds., Jones and Bartlett Publishers Inc., Boston, Mass. (1990), Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, NY (1992); and Farhood, Annal. NY Acad. Sci., 716:23 34 (1994)), use of protoplasts (Bothwell, 上掲)）又は電気パルスの使用（Vatteroni et al., Mutn. Res., 291 :163 169 (1993); Sabelnikov, Prog. Biophys. MoI. Biol., 62: 119 152 (1994); Bothwell et al., 上掲; and Ausubel et al., 上掲）、弱毒ウィルスの使用（Davis et al., J. Virol. 1996, 70(6), 3781 3787; Brinster et al. J. Gen. Virol. 2002, 83(Pt 2), 369 381; Moss, Dev. Biol. Stan., 82:55 63 (1994); and Bothwell et al., 上掲），並びに、物理的方法（Fynan et al., 上掲; Johnston et al., Meth. Cell Biol., 43(Pt A):353 365 (1994); Bothwell et al., 上掲; and Ausubel et al., 上掲）が含まれる。
核酸の動物組織への成功する送達は、カチオン性リポソーム（Watanabe et al., MoI. Reprod. Dev., 38:268 274 (1994)）、ｎａｋｅｄ ＤＮＡ又はＲＮＡの動物筋肉組織への直接注入（Robinson et al., Vacc, 11:957 960 (1993); Hoffman et al., Vacc. 12:1529 1533; (1994); Xiang et al., Virol., 199:132 140 (1994); Webster et al., Vacc, 12:1495 1498 (1994); Davis et al., Vacc, 12:1503 1509 (1994); Davis et al., Hum. Molec. Gen., 2:1847 1851 (1993); Dalemans et al. Ann NY Acad. Sci. 1995, 772, 255 256. Conry, et al. Cancer Res. 1995, 55(7), 1397-1400)、及び胚（Naito et al., MoI. Reprod. Dev., 39:153 161 (1994); and Burdon et al., MoI. Reprod. Dev., 33:436 442 (1992)）、自己複製ＲＮＡワクチンの筋肉内注射（Davis et al., J Virol 1996, 70(6), 3781 3787; Balasuriya et al. Vaccine 2002, 20(11 12), 1609 1617）又は「遺伝子銃」技術を用いるＤＮＡの皮内注射（Johnston et al.，上掲）によって達成され得る。
タンパク質に対して特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いる、本発明のポリペプチドの発現を検出及び測定するための様々なプロトコールが、当技術分野において知られている。例えば、酵素結合免疫吸着測定法（enzyme-linked immunosorbent assay：ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（radioimmunoassay：ＲＩＡ）、及び蛍光標識細胞分取（fluorescence activated cell sorting：ＦＡＣＳ）が挙げられる。ポリペプチド上の２ヶ所の非干渉エピトープと反応するモノクローナル抗体を用いる、２部位のモノクローナルベースのイムノアッセイを利用することができるが、競合結合アッセイも利用され得る。これらの及びその他のアッセイは、特に、 Hampton, R. et al. (1990; Serological Methods, a laboratory Manual, APS Press, St Paul, MN) and Maddox, D. E. et al. (1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216).中に記載されている。
広範な標識及び包合技術が当業者に知られており、様々な核酸及びアミノ酸アッセイにおいて用いられ得る。ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーション又はＰＣＲプローブを作製する手段としては、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識または標識ヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が挙げられる。或いは、配列、又はその任意の改変体を、ｍＲＮＡプローブの作製のために、ベクター中にクローニングしてもよい。かかるベクターは、当技術分野において公知であり、市販されており、Ｔ７、Ｔ３、又はＳＰ６等の適当なＲＮＡポリメラーゼと標識ヌクレオチドを添加することにより、インビトロでＲＮＡプローブを合成するために使用してもよい。これらの手順は、様々な市販のキット、Amersham Pharmacia Biotech，Promega、及びUS Biochemicalを用いて行われてもよい。検出を容易にするために使用され得る適当なレポーター分子又は標識としては、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、又は発色団、並びに、基質、補助因子、阻害剤、磁性粒子等が挙げられる。
発現ベクター、又は発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞は、発現と、培養物からのポリペプチドの回収とに適した条件下で、培養され得る。培養物は、インビトロ又はインビボ発現のための成分を含み得る。インビトロ発現成分としては、ウサギ網状赤血球溶解物、大腸菌溶解物、及びコムギ胚芽抽出物に対するもの、例えば、InvitrogenからのExpressway（登録商標）又はＲｉＰｓシステム、iNtRON BiotechnologyからのGenelator（登録商標）システム、NovagenからのEcoPro（登録商標）又はSTP3（登録商標）システム、PromegaからのTNT（登録商標）Quick Coupledシステム、及び、QIAGENからのEasyXpressシステム等が挙げられる。培養物から得られるポリペプチドは、使用される配列及び／又はベクターに応じて、分泌されても、細胞内に含有されてもよい。特定の態様において、ファージポリペプチドをコードする発現ベクターは、原核又は真核細胞膜を通じたポリペプチドの分泌を指示するシグナル配列を含むように設計され得る。
その他の構築物は、ポリペプチドの精製を容易にすることになるアミノ酸ドメインを含んでもよい。かかるドメインとしては、限定するものではないが、固定化金属上での精製を可能にする、ヒスチジン−トリプトファン（例えば、６Ｘ−ＨＩＳ）モジュール等の金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、及びＦＬＡＧ（登録商標）伸長／アフィニティー精製システム（Immunex Corp.，Seattle，ＷＡ）において利用されるドメイン等が挙げられる。有用なエピトープタグとしては、３Ｘ−ＦＬＡＧ（登録商標）、ＨＡ、ＶＳＶ−Ｇ、Ｖ５、ＨＳＶ、ＧＳＴ、ＧＦＰ、ＭＢＰ、ＧＡＬ４、及びβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。有用なプラスミドとしては、ビオチンタグ（例えば、PromegaからのPinPoint（登録商標）プラスミド）、カルモジュリン結合タンパク質（例えば、StratageneからのｐＣＡＬプラスミド）、ストレプトアビジン結合ペプチド（例えば、StratageneからのInterPlay（登録商標）プラスミド）、ｃ−ｍｙｃ又はＦＬＡＧ（登録商標）タグ（例えば、Sigma-Aldrichからの免疫沈降プラスミド）、又はヒスチジンタグ（例えば、QIAGENからのＱＩＡＥｘｐｒｅｓｓプラスミド）を含むものが挙げられる。
精製を容易にするために、発現ベクターは、切断可能なリンカー配列、第Ｘａ因子又はエンテロキナーゼ（Invitrogen，San Diego，ＣＡ）に対して特異的なものを含んでもよい。例えば、ベクターは、精製ドメインとポリペプチドとの間に、一つ以上のリンカーを含んでもよい。かかる発現ベクターの一つは、本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質と、チオレドキシン又はエンテロキナーゼ切断部位の前に６個のヒスチジン残基をコードする核酸との発現をもたらす。ヒスチジン残基は、ＩＭＡＣ（Porath, J. et al. (1992) Prot. Exp. Purif. 3: 263-281に記載の通りの固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）における精製を容易にし、さらに、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質からポリペプチドを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターについての考察が、Kroll, D. J. et al. (1993; DNA Cell Biol. 12:441-453).に提供される。
（アルテミン及び／又は関連するリガンドの阻害のためのポリヌクレオチド）
これまでに記載したように、一実施形態において、本発明にしたがい、アルテミン及び／又は関連するリガンドを阻害するために、ポリヌクレオチドを利用してもよい。かかるポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖、又は二本鎖であってもよい。本発明により使用するためのポリヌクレオチドは、本明細書において、「単離された」ポリヌクレオチドと呼ばれ得る。単離されたポリヌクレオチドは、当技術分野において知られる多数の技術を用いて取得され得る。例えば、組み換えＤＮＡ技術が、例えば、Sambrook., J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third 2nd edition), cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY and Sambrook and Russell (2000) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3r ) Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NYに記載されるように使用され得る。同様に、例えば、ホスホルアミダイト及び固相化学を用いる、化学合成を利用してもよい。ポリヌクレオチドは、以下、本明細書に例示され得るように、開示された核酸配列データ、ヌクレオチド塩基間の既知の相対的相互作用、既知の配列相同性、及び使用されるべき特定の核酸技術に基づいて、設計されてもよい。
一実施形態において、アルテミン及び／又は関連するリガンドを阻害するために、干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ）を利用してもよい。ｉＲＮＡ技術における用途のポリヌクレオチドは、典型的には、それらの標的に対して１００％の相補性を有することになる。しかしながら、ｉＲＮＡが、その標的に対する特異性と、翻訳をブロックする能力を保持するのであれば、必ずしもそうではないことを理解すべきである。例示的ｉＲＮＡ分子は、３’ジヌクレオチドオーバーハングを有する約１８〜２１ｂｐの二本鎖ＲＮＡの形態を取り得るが、より短い又はより長い分子も適当であり得る。ｉＲＮＡを適当な核酸ベクターによりインビボで作製する場合、ｉＲＮＡは、通常、ステム−ループ構造、例えば、３’末端に２〜３個のＵを有する約１９ヌクレオチドのステムと９ヌクレオチドのループ、を有するＲＮＡ分子の形態を取り得る。ｓｉＲＮＡを設計する際に使用するアルゴリズムは、Ｃｅｎｉｘ（Dresden，Germany，via Ambion，ＴＸ）から利用可能である。
アルテミンｓｉＲＮＡに対する例示的標的配列としては：
ＡＡＣＴＧＧＣＣＴＧＴＡＣＴＣＡＣＴＣＡＴ（配列番号４６）
が挙げられる。
アルテミンｓｉＲＮＡ発現ベクターに対する例示的挿入配列としては：
ＣＴＧＧＣＣＴＧＴＡＣＴＣＡＣＴＣＡＴＴＴＣＡＡＧＡＧＡＡＴＧＡＧＴＧＡＧＴＡＣＡＧＧＣＣＡＧＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡ（配列番号４７）
が挙げられる。
これらの挿入配列に関し、センス鎖は太字で示し、アンチセンス鎖は下線を引いて示し、ループ配列はイタリック体で示す。任意の配列を、これらの挿入配列の一端又は両端に結合させることができ、例えば、クローニングを容易にするために制限部位を結合させることができる。同様のｓｉＲＮＡ配列を、例えば、パーセフィンに対して、設計することができる。
ｉＲＮＡ分子は、本明細書において「実施例」と表題されたセクションに記載される技術にしたがって作製され得る。かかる分子の製造及び設計方法に関するさらなる情報は、例えば、McManus MT and Sharp PA (2002) Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nature Rev. Genet. 3: 737- 747; Dillin A (2003) The specifics of small interfering RNA specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(11): 6289-6291; and Tuschl T (2002) Expanding small RNA interference. Nature Biotechnol. 20: 446-448から得られ得る。
ｓｉＲＮＡとは、短い／小さい干渉ＲＮＡのことをいい、これらは、通常には２１〜２３塩基対を含む二本鎖ＲＮＡを含み、化学的に合成され得ることは、当業者に理解されるであろう。比較すると、ｓｈＲＮＡとは、短いヘアピンＲＮＡのことをいい、ベクターベースのｓｉＲＮＡとも呼ばれ、これらは、例えば、インビトロ又はインビボで転写される、一本鎖ＲＮＡを含む。典型的には、ｓｈＲＮＡは、標的ｍＲＮＡと相同な配列（センス配列）、「ループ」領域、及び標的配列と相補的な配列（アンチセンス配列）を含む。ｓｈＲＮＡは、ヘアピン二次構造を形成し、酵素ダイサーが、その構造を切断し、ヘアピンを取り除き、それをｓｉＲＮＡへと変換する。したがって、本明細書において開示される配列を用いて、ｓｈＲＮＡを作製し、次に、所望の通り、ｓｉＲＮＡに変換してもよい。
本発明の別の実施形態において、アンチセンス分子が使用される。本明細書において使用される場合、用語「アンチセンス」は広く解釈されるべきである。アルテミン及び／又は関連するリガンドに対する転写物と結合し得る任意の核酸（好ましくは、ＲＮＡであるが、一本鎖ＤＮＡを含む）を意味することが意図される。典型的には、アンチセンス分子又はオリゴヌクレオチドは、約１５〜２５個のヌクレオチドを含み、これらは、それらの標的ｍＲＮＡと完全に相補的である。しかしながら、より大きいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、全長配列を含んで使用され得ることを理解すべきである。また、それらが標的に対する特異性と、発現を阻害する能力とを保持するのであれば、標的に対して完全には相補的でないアンチセンス分子を利用してもよいことを理解すべきである。
本発明が関連する技術分野の当業者であれば、本明細書において記載される記述と、アルテミン及び関連するリガンドに対する利用可能な配列データとを考慮して、本発明において使用されるアンチセンス分子を理解するであろう。アンチセンス技術に関するさらなる情報は、例えば、Kandimalla ER, Manning A, Lathan C, Byrn RA, Agrawal S. Design, biochemical, biophysical and biological properties of cooperative antisense oligonucleotides; Nucleic Acids Res. 1995 Sep 11;23(17):3578- 84; Tseng BY, Brown KD. Antisense oligonucleotide technology in the development of cancer therapeutics; Cancer Gene Ther. 1994 Mar;l(l):65-71; Brysch W, Schlingensiepen KH. Design and application of antisense oligonucleotides in cell culture, in vivo, and as therapeutic agents; Cell MoI Neurobiol. 1994 Oct;14(5):557-68; Han J, Zhu Z, Hsu C, Finley WH. Selection of antisense oligonucleotides on the basis of genomic frequency of the target sequence; Antisense Res Dev. 1994 Spring;4(l):53-65から得られ得る。
本発明にしたがってアルテミン及び／又は関連するリガンドを阻害する場合に、ＤＮＡザイム、一本鎖ＤＮＡ、リボザイム、及び三重らせんＤＮＡも使用し得ることを理解すべきである。リボザイム、ＤＮＡザイム、三重らせん、及び一本鎖ＤＮＡは、本明細書において提供される説明、利用可能な配列データ、及び最新の方法を考慮することにより、本発明が関連する技術分野の当業者には容易に理解され得る。しかしながら、一例として、これらの技術と関連する方法が、Joseph Sambrook and David W. Russell. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY.に記載されている。
本発明において有用であるポリヌクレオチド（アンチセンス、ｉＲＮＡ、リボザイム及びＤＮＡザイムを含む）は、安定性を増大させるため、又は分解を防ぐため、又はその他の理由のために、化学的に改変され得る。例えば、核酸分子は、非天然塩基、改変糖（特に、リボースの２位における）、又は変更されたリン酸骨格を有する類似体を含んでもよい。本発明において有用であるポリヌクレオチドは、それらが結合する任意の転写物の目標とされる分解を可能にする配列も含んでよい。例えば、リボヌクレアーゼＨに対して特異的な配列も含まれ得る。もう一つの例は、アンチセンス分子が結合させられた転写物を消化するためにリボザイム（リボヌクレアーゼＰ）を動員し得る、外部ガイド配列（External Guide Sequence：ＥＧＳ）の使用である。
特定の細胞中のトランスクリプトーム、活性遺伝子の完全相補体、ｍＲＮＡ、又は転写物における他の配列との相同性に関して、候補配列をスクリーニングすることは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｉＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡザイム、及びｃＤＮＡと同様なものの特異性を確実にするために役立ち得る。また、当業者は、かかるポリヌクレオチドを設計し、特異性を確実なものにする場合に使用される、適切なアルゴリズムを理解し得る。
本発明において有用であるポリヌクレオチドは、インビトロで作製される核酸分子、例えば、一本鎖ＤＮＡ、ｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、又はＤＮＡザイムの形態で使用され得る。或いは、適切な場合には、それらは、適当な核酸、例えば、アンチセンス分子、ｉＲＮＡ、又はリボザイムを作製するために適合させたベクターの形態で使用され得る。本発明者等は、当技術分野において知られ得る任意のベクターの使用を意図している。例えば、ＣＭＶプロモーターを利用するネイキッドプラスミドを使用してもよい。ウィルスベクターも適当であり得る（例えば、アデノ随伴ウィルス（adeno-associated virus：ＡＡＶ）及びレンチウィルス）。適当なプロモーター及びウィルスベクターのその他の例を、以下、本明細書において記載する。かかるウィルスベクターを使用する利点の一つは、組織又は腫瘍への局所投与とは対照的に、全身投与を可能にし得ることである。
本発明において有用であるベクター又は構築物は、当技術分野において知られている、プロモーター、エンハンサー、複製開始点等の適切な遺伝子エレメントを含んでもよい（誘導性、構成性又は組織特異的プロモーターを含む）。特定の実施形態において、ベクターは、本発明の核酸（例えば、アンチセンス又は適当なｓｉＲＮＡ）をコードする領域と機能し得るように連結された誘導性プロモーターを含み、その結果、核酸の発現は、転写に対する適切な誘導因子の有無を調節することによって調節される。別の実施形態において、ゲノム中の所望の部位での相同組み換えを促進し、その結果、所望の核酸の染色体内組み込みをもたらす領域に、本発明の核酸分子は隣接する（Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438）。当然、ベクターは、染色体外に存在したままであってもよい。
本発明の別の実施形態において、ＰＮＡが使用される。ＰＮＡは、リン酸骨格が、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位から作られる光学不活性且つ中性の骨格と置換された、ペプチド−核酸ハイブリッドである（例えば、Eurekah Bioscience Collection. PNA and Oligonucleotide Inhibitors of Human Telomerase. G. Gavory and S. Balasubramanian, Landes Bioscience, 2003を参照されたい）。塩基Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃは、メチレンカルボニル結合を介して、骨格上のアミノ窒素と結合されている（P.E. Nielsen et al., Science 1991. 254: 1497-1500; M. Egholm et al., Nature 1993. 365: 566-568）。ＰＮＡは、類似のＤＮＡ又はＲＮＡと比較して、高い特異性と、より高い親和性とで、相補配列と結合する（M.Egholm et al.，上掲）。ＰＮＡ／ＤＮＡ又はＰＮＡ／ＲＮＡハイブリッドもまた、対応するＤＮＡ／ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖と比較して、より高い熱安定性を示す（M.Egholm et al.，上掲）。ヌクレアーゼ又はプロテアーゼによって認識されない非天然のアミド骨格のため、ＰＮＡは、高い化学的及び生物学的安定性も有する（V. Demidov et al., Biochem Pharmacol 1994. 48: 1310-1313）。典型的には、ＰＮＡは、少なくとも５塩基長であり、末端リジンを含む。ＰＮＡは、寿命をさらに伸ばすために、ペグ化されてもよい（Nielsen, P. E. et al. (1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63）。非限定的な例として、以下のアンチジーンＰＮＡは、アルテミン遺伝子のコードＤＮＡ鎖中の独特な配列に対して相補的であり、ｍＲＮＡ合成を阻害するように設計される。Ｈ−ＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＣＧＣＡＧ−ＮＨ２（配列番号４８）。同様のＰＮＡ配列を、例えば、ＧＤＮＦ、ニュールツリン、及び／又はパーセフィンに対して設計することができる。
ポリヌクレオチド阻害剤に加えて、小分子阻害剤を、アルテミン及び／又は関連するリガンドに対して同定することができる。特に、アルテミンの３Ｄ結晶構造及びアルテミン−ＧＦＲα３複合体の３Ｄ結晶構造は、アルテミン及び／又は関連するリガンド（ＧＤＮＦ、ニュールツリン、及び／又はパーセフィンを含む）を阻害し得る高度に特異的な小分子を設計するための指針として使用され得る（例えば、Silvian L, Jin P, Carmillo P, Boriack-Sjodin PA, Pelletier C, Rushe M, Gong B, Sah D, Pepinsky B, Rossomando A. Artemin crystal structure reveals insights into heparin sulfate binding. Biochemistry. 2006 Jun 6;45(22):6801-12; Wang X, Baloh RH, Milbrandt J, Garcia KC. Structure of artemin complexed with its receptor GFRalpha3: convergent recognition of glial cell line-derived neurotrophic factors. Structure. 2006 Jun; 14(6): 1083-92を参照されたい）。
（アルテミン及び／又は関連するリガンドの阻害のための抗体）
本発明は、アルテミン及び／又は関連するリガンドに対する抗体、例えば、それらの配列の少なくとも一部又は改変配列と結合する抗体を包含する。本発明の所定の態様において、これらのリガンドを阻害するために、抗体を使用してもよい。本発明の目的のために、抗体のフラグメント又はその他の改変体は、抗体として完全に機能する必要はないことが理解されるであろう。すなわち、フラグメント又は他の改変体は、インビボでアルテミンと結合する部位に、免疫系細胞を動員し得る必要はない。中和抗体を産生する必要はない。本発明が関連する技術分野の当業者は、抗体フラグメントを生じさせる方法を認識するだろう。本発明の抗体フラグメントは、一つのインタクトな抗体の一部分、通常は、抗体の抗原結合領域又は可変領域を包含し得る。しかしながら、一般的な例として、インタクトな抗体のタンパク分解消化を用いてもよく、又は、組み換え核酸技術により、フラグメントを直接作製してもよい。
基本的な抗体の構造単位は、四量体を含むことが知られていると理解される。各四量体は、二つの同一なペアのポリペプチド鎖から構成され、各ペアは、一つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と一つの「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う、約１００〜１１０個又はそれ以上のアミノ酸からなる可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う、定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、カッパ及びラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、又はイプシロンとして分類され、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとして、抗体のアイソフォームを規定する。軽鎖及び重鎖内において、可変領域及び定常領域は、約１２個又はそれ以上のアミノ酸からなる「Ｊ」領域によって結合されており、重鎖はまた、約１０個又はそれ以上のアミノ酸からなる「Ｄ」領域を含む。一般的には、Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ea., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))を参照されたい。各軽鎖／重鎖ペアの可変領域が、抗体結合部位を形成する。
本発明の抗体は、アイソフォーム及びエピトープマッピングに基づいて、また場合によっては、一つ以上の受容体へのアルテミン及び／又は関連するリガンドの結合をブロックするそれらの能力に基づいて、特徴付けられ得る。リガンドの結合又は活性化をブロックする試薬は、本明細書において開示されるような様々な障害の治療方法において用途を有する。アルテミン及び／又は関連するリガンドを認識するが、受容体との結合をブロックしない抗体も意図される。かかる抗体は、かかるリガンドを検出及び精製する場合において、並びに、以下、本明細書において詳述されるような、対象において障害の進行を診断及びモニタリングするための方法において、用途を見出す。かかる抗体は、リガンドの翻訳後改変、又はその他の修飾配列を分析する場合にも用途を見出し得る。
他の動物で生成された抗体の免疫原性を低減させるために、抗体のヒト化を利用してもよい。ヒト化抗体の作製又は抗体のヒト化は、当技術分野において公知の技術を用いて、例えば、マウス抗体のヒト化の場合には、エピトープガイド選択（epitope-guided selection）によって達成され得る。げっ歯類モノクローナル抗体のヒト化に最も頻繁に使用される戦略は、ＣＤＲグラフト法（Reichmann, L., M. Clark, H. Waldman, and G Winter. 1998. Reshaping human antibodies for therapy. Nature 332L323-327; Jones PT, Dear PH, Foote J, Neuberger MS, Winter G. 1986. Replacing the complementarity determining regions in a human antibody with those from a mouse. Nature 321:522-25）、及び、表面変換（resurfacing）法（Pedersen, J. T., A. H. Henry, S. J. Searle, B. C. Guild, M. Roguska, and A. R. Rees. 1994. Comparison of surface accessible residues in human and murine immunoglobulin Fv domains. Implication for humanization of murine antibodies. J. MoI. Biol. 235:959-973）である。抗体のヒト化は、エピトープガイド選択によっても達成され得る（Wang et al, J. Immunological Methods 241 : 171-184, 2000）。Maynard, J., and Georgiou, G 2000. Antibody engineering. Annu Rev Biomed Eng 2: 339-376の方法は、さらなる例を提供する。
ヒト化抗体は、合理的設計アプローチ及び反復最適化、すなわち、コンピューターモデリングを用いたフレームワーク残基の部位特異的突然変異誘発に基づき作製され得る。ファージディスプレイを使用するその他の選択的ヒト化戦略を使用してもよい（Baca, M., L. G. Presta, S. J. O'Connor, and J. A. Wells. 1997. Antibody humanization using monovalent phage display. J. Biol. Chem. 272:10678-10684; Hoogenboom, H. R., A. P. de Bruine, S. E. Hufton, R. M. Hoet, J. W. Arends, and R. C. Roovers. 1998. Antibody phage display technology and its applications. Immunotechnology. 4:1-20; Jespers, L. S., A. Roberts, S. M. Mahler, G. Winter, and H. R. Hoogenboom. 1994. Guiding the selection of human antibodies from phage display repertoires to a single epitope of an antigen. Biotechnology (NY) 12:899-903; Rader, C. and C. F. Barbas, III. 1997. Phage display of combinatorial antibody libraries. Curr. Opin. Biotechnol. 8:503-508; Rader, C, D. A. Cheresh, and C. F. Barbas, III. 1998. A phage display approach for rapid antibody humanization: designed combinatorial V gene libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 95:8910-8915; Rosok, M. J., D. E. Yelton, L. J. Harris, J. Bajorath, K. E. Hellstrom, I. Hellstrom, G. A. Cruz, K. Kristensson, H. Lin, W. D. Huse, and S. M. Glaser. 1996. A combinatorial library strategy for the rapid humanization of anticarcinoma BR96 Fab. J. Biol. Chem. 271 :22611-22618）。
その他の態様において、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を用いて再構成されたトランスジェニック動物系統、例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統を用いて作製され得る。かかる系統は、動物宿主中でヒト抗体を十分に作製することを可能にする（Mendez, M. J., L. L. et al. 1997. Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice. Nat. Gen. 15:146-156）。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ動物は、特に、それらのゲノム中に６６ヒト重鎖及び３２κ軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含む酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含み、そこでは、内因性重鎖及びκ遺伝子座が、ターゲット欠失により機能的に不活性化されている（Mendez et al.，上掲）。このマウスは、ヒトのμ、δ、γ２及びκ鎖と、マウスλ鎖を発現し、ヒトκ対マウスλの比率は、７５：１である（Mendez et al.，上掲）。
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ動物は、タンパク質抗原に対するヒト抗体を産生することがこれまでに示されており（Green, L. L., et al. 1994. Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs. Nat. Gen. 7:13-21; Mendez et al., 上掲）、多糖類等のＴ細胞非依存性抗原に対しても応答し得る。一例として、二つ以上の遺伝子的に別個のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ動物群を用いて抗体を作製してもよく、例えば、Ｘｍ２ａ−３系統（重鎖及び軽鎖遺伝子の両方を含むダブルＹＡＣにより再構成されたもの）、及び、Ｘｍ２ａ−５系統（一方が重鎖遺伝子を有し、他方が軽鎖遺伝子を有する２つのＹＡＣにより再構成されたもの）が挙げられる（Jakobovits, A. 1995. Production of fully human antibodies by transgenic mice. Curr. Opin. Biotechnol. 6:561- 566; see, also, Russell ND et al., Production of protective human antipneumococcal antibodies by transgenic mice with human immunoglobulin loci. Infect Immun. 2000 Apr;68(4): 1820-6）。
本発明が関連する技術分野の当業者は、用語「二重特異性抗体（diabody）」及び「三重特異性抗体（triabody）」を理解するであろう。これらは、短すぎるので同じ鎖の二つのドメイン同士では対合することができない、短いペプチドリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む分子である。これは、一つ以上の鎖の相補ドメインとの対合を促進し、二つ以上の機能性抗原結合部位を有する二量体又は三量体分子の形成を助長する。得られる抗体分子は、単一特異性又は多重特異性であり得る（例えば、二重特異性抗体の場合には二重特異性）。かかる抗体分子は、本発明が関連する技術分野において標準的な方法を用いて、二つ以上の抗体から作製されてもよい（例えば、Todorovska et al. Design and application of diabodies, triabodies, and tetrabodies for cancer targeting. J. Immunol. Methods. 2001 Feb l;248(l-2):47-66; Holliger P, Prospero T, and Winter G, Diabodies: small bivalent and bispecific antibody fragments, Proc Natl Acad Sci USA, 90, 6444-6448, 1993; and Tomlinson I and Holliger P, Methods for generating multivalent and bispecific antibody fragments, Methods Enzymol, 326, 461- 479, 2000を参照されたい）。
抗体作製は、当技術分野における標準的方法にしたがって行われ得る。例えば、ポリクローナル抗体の作製の場合、Beanによって記載される方法（Eric S. Bean (2001) Polyclonal Antibodies. In: Basic Methods in Antibody Production and Characterization antibodies. Howard, G, and Bethel D. (ed.), CRC Press, 5:21-50, 2000）を使用してもよい。モノクローナル抗体は、例えば、Stewartの方法（Sandy J. Stewart (2001) Monoclonal Antibody Production. In: Basic Methods in Antibody Production and Characterization antibodies. Howard, G. and Bethel D. (ed.), CRC Press, 6:51-68, 2000) or in "Monocolonal Antibody Production Techniques and Applications," Lawrence B Schook eds., Marcel Dekker Inc., New York, 1987に記載の方法にしたがって調製され得る。当技術分野における標準的技術を用いて、ハイブリドーマを、サブクローニングし、増殖し、維持してもよい。例えば、それらは、ＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０等の培地中、インビトロで、増殖し、維持し得る。或いは、このことは、選択した動物において、腹水腫瘍として、インビボでなされてもよい。
本発明において有用である抗体は、標準的な組み換え技術によっても作製され得る。例えば、Siegel (2002) Siegel DL, Recombinant monoclonal antibody technology, Transfus Clin Biol, 9(l):15-22 2002; Welschof, M., C. Christ, I. Hermes, A. Keller, C. Kleist, and M. Braunagel. 2003. Generation and screening of a modular human scFv expression library from multiple donors. Methods MoI. Biol. 207:103-121)を参照されたい。本発明者等は、組み換え技術が商業的規模で抗体を製造する好ましい手段であると考える。抗体をコードするポリヌクレオチドは、抗体のアミノ酸配列、遺伝暗号、及びそこで考えられる縮重に基づいて、容易に同定され得る。抗体をコードするポリヌクレオチドは、ハイブリドーマ細胞から単離され得、例えば、続いて、当技術分野において標準的な手順を用いて特徴付けられ得る。例えば、ポリヌクレオチドプローブを、抗体の一部のアミノ酸配列に基づいて設計し、次いで、抗体の重鎖及び／又は軽鎖をコードする遺伝子を単離するために使用してもよい。或いは、ポリヌクレオチドは、標準的化学合成方法によって、例えば、ホスホルアミダイト及び固相化学を用いて、作製され得る。本発明の抗体のアミノ酸配列は、標準的方法を用いて決定され得、例えば、エドマン分解及びＨＰＬＣ又は質量分光分析を使用することができる。
本発明は、本明細書において具体的に言及される、抗体のフラグメント及び改変体にも及ぶので、抗体をコードする核酸は適当に改変されていてもよいことを理解すべきである。例えば、重鎖及び軽鎖の定常ドメインに対するコード配列は、相同するヒトドメインと置換されてもよい。或いは、ＣＤＲ（complementarity determining region：相補性決定領域又は抗原結合部位）領域を、相同するヒトベータシートのフレームワークに移植してもよい。このようにして、抗体改変体、例えば、ヒト化抗体は、組み換え技術によって生じさせられ得る。本明細書において記載されるように、本発明の抗体は、標準的組み換え手順によって作製され得る。したがって、本発明は、抗体をコードするポリヌクレオチド、抗体フラグメント、又はその改変体、それを含む構築物、及びその構築物を含む宿主細胞にも及ぶ。本発明にしたがうポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はｃＤＮＡ、例えば、本明細書において記載されるような、二本鎖又は一本鎖、センス又はアンチセンス配列、であり得る。
本発明の抗体は、本発明が関連する技術分野において公知の標準的手順を用いて、例えば、培養上清、腹水、又は血清から単離されてもよい。かかる技術の例を、以下本明細書において示す。しかしながら、その他の例として、単離又は精製は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、チオ配向性ゲルクロマトグラフィー（thiophilic gel chromatography）、クロマトフォーカシング、プロテイン−Ａ又はＧセファロースカラム、ヒドロキシアパタイトカラム（hydroxyapatite column）、界面活性剤抽出（detergent extraction）、電気泳動、浸透圧ショック処理（osmotic shock treatment）、封入体精製（inclusion body purification）、硫安沈殿、液状ポリマーを用いた遠心分離、ろ過、及び透析等の手順の一つ以上によって、行ってもよい。本発明にしたがう組み換え抗体は、当技術分野において標準的である様々な技術を用いて、形質転換された宿主細胞、又は培養培地、又はトランスジェニック生物から回収されてもよい。本発明の抗体のアミノ酸配列は、標準的方法を用いて、例えば、エドマン分解及びＨＰＬＣ、又は質量分析法分析（M. W. Hunkapiller, R.M. Hewick, WJ. Dreyer, and L.E. Hood. 1983. High-Sequencing with a Gas-Phase Sequenator. Methods Enzymol. 91 : 399）を用いて決定され得ることが理解されるであろう。
抗体作製のために有用であるアミノ酸配列を同定するために、標準的方法を使用することができる。ポリペプチドの抗原性セグメントは、例えば、Abie Pro 3.0: Peptide Antibody Design (hypertext transfer protocol ://world wide web.changbioscience.com/abie/abie.html)によって予測され得る。より特定的には、抗原性セグメントは、Ｈｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓスケール（Hopp TP, Woods KR. Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 1981 Jun;78(6):3824-8）、及び／又はＫｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅスケール（Kyte J, Doolittle RF. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J MoI Biol. 1982 May 5;157(l):105-32）にしたがって予測され得る。特定のコンピュータープログラムとしては、ＭＡＰＡＧ（Aguilar RC, Retegui LA, Roguin LP Int J Biomed Comput. 1994 Nov-Dec;37(3):225-35); PEOPLE (Alix AJ. : Vaccine. 1999 Sep;18(3-4):311-4); and HYDRPHIL (E A Mesri et al. J Clin Microbiol. 1990 June; 28(6): 1219-1224）が挙げられる。かかるエピトープは、非連続残基を含み得、予測される抗原性配列の種々の部分（例えば、配列番号９〜３６のうちのいずれか一つの部分、以下参照）、又は、予測される抗原性配列の一つ以上の部分の組み合わせ（例えば、配列番号９〜３６のうちの一つ以上の組み合わせ）、又は、一つ以上の全長配列（例えば、配列番号９〜３６のうちの一つ以上）を構成し得るという点において、配座特異的（conformational specific）であり得る。抗原性配列は、天然のポリペプチドにおいて見出され得るような、類似した３−Ｄ構造（例えば、表面残基）を形成し得るアミノ酸又はそれらの誘導体の任意の組み合わせを含んでもよい。
アルテミン及び／又は関連するリガンドに関して、抗体作製のために有用である抗原性配列を予測するために配列分析を使用することができる。これらのリガンドに関する配列情報は広く入手可能である（例えば、Rosenblad C, Gronborg M, Hansen C, Blom N, Meyer M, Johansen J, Dago L, Kirik D, Patel UA, Lundberg C, Trono D, Bjorklund A, Johansen TE. In vivo protection of nigral dopamine neurons by lentiviral gene transfer of the novel GDNF-family member neublastin/artemin. MoI Cell Neurosci. 2000 Feb;15(2):199-214. Erratum in: MoI Cell Neurosci 2001 Sep;18(3):332-3を参照されたい）。例示的配列分析において、Abie Pro 3.0: Peptide Antibody Design (hypertext transfer protocol ://world wide web.changbioscience.com/abie/abie.html)は、Ｈｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓのスケール及びＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌｅのスケールにしたがう二つの高度に抗原性を有するセグメントを示す（Hopp TP, Woods KR. Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 1981 Jun;78(6):3824-8; Kyte J, Doolittle RF. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J MoI Biol. 1982 May5;157(l):105-32）。
アルテミンに対するこれらの抗原性配列としては、ＰＰＰＱＰＳＲＰＡＰＰＰＰＡＰＰＳＡＬＰＲＧＧＲＡＡＲＡＧＧＰＧＳＲＡＲＡＡＧＡＲＧ（１４０個のアミノ酸の最大にプロセシングされた成熟タンパク質に対して、残基１−４３；配列番号５）、及び、ＧＡＬＲＰＰＰＧＳＲＰＶＳＱＰ（残基９２−１０６；配列番号６）が挙げられる。さらに、１４個のアミノ酸の２７個の抗原性ペプチドが、以下の通り予測される：ＰＰＰＱＰＳＲＰＡＰＰＰＰＡ（残基１−１４；配列番号７）；ＰＰＱＰＳＲＰＡＰＰＰＰＡＰ（残基２−１５；配列番号８）；ＰＱＰＳＲＰＡＰＰＰＰＡＰＰ（残基３−１６；配列番号９）；ＱＰＳＲＰＡＰＰＰＰＡＰＰＳ（残基４−１７；配列番号１０）；ＰＳＲＰＡＰＰＰＰＡＰＰＳＡ（残基５−１８；配列番号１１）；ＳＲＰＡＰＰＰＰＡＰＰＳＡＬ（残基６−１９；配列番号１２）；ＲＰＡＰＰＰＰＡＰＰＳＡＬＰ（残基７−２０；配列番号１３）；ＰＡＰＰＰＰＡＰＰＳＡＬＰＲ（残基８−２１；配列番号１４）；ＡＰＰＰＰＡＰＰＳＡＬＰＲＧ（残基９−２２；配列番号１５）；ＰＰＰＰＡＰＰＳＡＬＰＲＧＧ（残基１０−２３；配列番号１６）；ＰＰＰＡＰＰＳＡＬＰＲＧＧＲ（残基１１−２４；配列番号１７）；ＰＰＡＰＰＳＡＬＰＲＧＧＲＡ（残基１２−２５；配列番号１８）；ＡＰＰＳＡＬＰＲＧＧＲＡＡＲ（残基１４−２７；配列番号１９）；ＰＰＳＡＬＰＲＧＧＲＡＡＲＡ（残基１５−２８；配列番号２０）；ＰＳＡＬＰＲＧＧＲＡＡＲＡＧ（残基１６−２９；配列番号２１）；ＬＰＲＧＧＲＡＡＲＡＧＧＰＧ（残基１９−３２；配列番号２１）；ＰＲＧＧＲＡＡＲＡＧＧＰＧＳ（残基２０−３３；配列番号２３）；ＲＧＧＲＡＡＲＡＧＧＰＧＳＲ（残基２１−３４；配列番号２４）；ＧＧＲＡＡＲＡＧＧＰＧＳＲＡ（残基２２−３５；配列番号２５）；ＧＲＡＡＲＡＧＧＰＧＳＲＡＲ（残基２３−３６；配列番号２６）；ＲＡＡＲＡＧＧＰＧＳＲＡＲＡ（残基２４−３７；配列番号２７）；ＡＲＡＧＧＰＧＳＲＡＲＡＡＧ（残基２６−３９；配列番号２８）；ＡＧＧＰＧＳＲＡＲＡＡＧＡＲ（残基２８−４１；配列番号２９）；ＧＧＰＧＳＲＡＲＡＡＧＡＲＧ（残基２９−４３；配列番号３０）；ＧＡＬＲＰＰＰＧＳＲＰＶＳＱ（残基９２−１０５；配列番号３１）；ＡＬＲＰＰＰＧＳＲＰＶＳＱＰ（残基９３−１０６；配列番号３２）。
治療的用途に加えて、アルテミン及び／又は関連するリガンドに対する抗体は、精製又は診断的適用において用途を見出し得る。例えば、抗体は、固相上に固定されてもよい。このことは、サンプル中のポリペプチド又はペプチドの精製及び／又はそのレベルの定量に役立つだろう。診断的手順及び精製の場合、抗体が、阻害剤活性を有する、又は、リガンドの発現レベルを低減させる必要はない。しかし、所定の適用に対して有用であり得るので、抗体は、検出可能なシグナルを提供する化合物を用いて標識することにより改変されてもよく、例えば、酵素、蛍光薬剤、及びラジオアイソトープを使用することができる。本発明が関連する技術分野の当業者は、かかる適当な標識システムを容易に同定するであろう。さらに、抗体は、例えば、毒素、放射性ヌクレオチド、アイソトープ、遺伝子、又は他の治療用分子を、治療に役立たせるために細胞又は組織に運搬するための担体として使用され得る。当業者は、細胞増殖、細胞生存、細胞運動、及び／又は発癌性を、予防し、低減させ、又は阻害する場合における、抗体の有効性を決定するための方法を容易に理解するであろう。しかしながら、一例として、本明細書の他の個所に記載される方法（実施例のセクションにおいて言及されるアッセイのうちの一つ以上を含む）を使用してもよい。
当然のことながら、抗体、又は抗体フラグメント、又はその改変体は、アルテミン及び／又は関連するリガンドの検出及び精製といった通常の目的のために使用され得る。リガンドは、天然又は人工起源（例えば、細胞培養物）であり得る。好ましくは、リガンドは、ヒト起源である。さらに、所定の適用に対して有用であり得るので、抗体は、検出可能なシグナルを提供する化合物を用いて標識することにより改変され得る。例えば、酵素、蛍光薬剤、及びラジオアイソトープを使用することができる。本発明が関連する技術分野の当業者は、かかる適当な標識システムを容易に同定するであろう。したがって、リガンドに対する抗体の治療的用途に加えて、抗体は、リガンドの精製又は診断的適用において用途を見出し得る。例えば、固相上に固定された抗体は、サンプル中のリガンドの精製及び／又はそのレベルの定量に役立つだろう。本発明が関連する技術分野の当業者は、このことを実施し得る技術を理解するであろう。しかしながら、一例として、クロマトグラフィー担体上に固定された、抗体、抗体フラグメント、又は改変体を用いるアフィニティークロマトグラフィーを使用してもよい。診断及び精製手順の場合、抗体は、阻害活性を有する必要はない。
ＥＬＩＳＡ又は同様のアッセイは、直接的及び間接的検出手段の両方を組み込み得ることと、本発明の抗体、又は抗体フラグメント、又はその改変体は、捕捉抗体又は検出抗体のいずれかとして使用され得ることが、理解されるであろう。当然のことながら、本発明の抗体の一つ以上を、単一アッセイにおいて使用してもよい。例えば、本発明の二つの抗体が、アルテミン及び／又は関連するリガンド上の同じ抗原性決定基を認識しない場合、一方の抗体を捕捉抗体として使用し、もう一方の抗体を検出抗体として使用してもよい。或いは、本発明の抗体は、リガンドに対して予め同定された抗体と組み合わされて使用され得る。当業者には明らかなように、ＥＬＩＳＡにおいて使用される検出抗体を、本明細書において記載されるような検出可能な標識に包合してもよい。ＥＬＩＳＡに加えて、他の有用なアッセイとしては、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、免疫細胞化学、免疫組織化学、フローサイトメトリー、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイ、及びサイトメトリービーズアレイが挙げられる。
対象の状態を診断又は通常モニタリングする場合に有用である情報は、試験サンプル中のアルテミン及び／又は関連するリガンドのレベルを、測定される基準レベル又は標準と直接比較することにより得られ得る。例えば、正常な対象（すなわち、本明細書において記載されるような医学的障害を表していないことが知られている対象）のリガンドの平均血清レベルを測定することができる。これらの濃度を基準レベルとして使用してもよく、この範囲を超える結果は医学的障害を示す。好ましくは、障害を示すのに必要とされるレベルは、正常と同定されている範囲よりも統計的に有意に増大している。しかしながら、統計的に有意な増大が存在しない場合であっても、得られる結果は、対象の状態についての価値ある情報を提供し得る。リガンドの正常範囲は、異なる体液及び組織において異なり得ることを理解すべきである。同様に、局在化されたリガンドの正常レベルは、血清中の正常レベルの範囲から外れ得る。
対象の状態の診断又は一般的測定は、試験サンプル中に存在するアルテミン及び／又は関連するリガンドのレベルを、一定の範囲の他の対象から得られた結果のデータベースに対して比較することによりなされ得ることを理解すべきである。多数の正常な対象から得られるリガンドの標準又は基準レベル濃度を利用する代わりに、基準レベル濃度は、医学的障害を表していないことが知られていた期間の間、又は、活性な医学的障害を表している期間の間に、単一の対象から測定され得る。このことは、対象の状態の継続的なモニタリングが要求される持続的及び／又は間欠的疾患発症又は障害の場合に特に適用可能であり得る。例えば、基準レベルは、障害からの寛解期の間に測定されてよく、状態を評価するために、その後、様々な時点で診断的手順が行われる。このことは、障害の進行に関連する価値ある情報を提供し得、又は、障害の治療が成功であることが分かるか否かを評価するのに役立ち得る。
本発明の一態様において、本発明の抗体は、免疫組織化学に基づく用途のために用いられ得る。例えば、抗体染色は、異常細胞、例えば、腫瘍中に見られるものの診断のため、又は、特定の細胞現象、例えば、細胞増殖又は細胞死の特徴付けのため、又は、生物学的組織中におけるタンパク質、例えば、アルテミン及び関連するリガンドの局在化及び示差的発現を評価するために使用され得る。免疫組織化学に関して、抗体−リガンド相互作用は、様々な手段によって視覚化され得る。特に、抗体は、発色反応を触媒し得る酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、に包合され得る。或いは、抗体は、ＦＩＴＣ、ローダミン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）、又はＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）Ｆｌｕｏｒ等のフルオロフォアにタグ付けされ得、これらは、免疫蛍光顕微鏡により見られ得る。フルオロフォアによるタグ付けは、高い感度を有し、複数のタンパク質間の相互作用を視覚化するために使用され得る共焦点レーザー走査顕微鏡に特に有用である。別のアプローチとして、抗体シグナルを増幅させるために、二次抗体を使用することができる。二次抗体は、例えば、ビオチン又はレポーター酵素、例えば、アルカリホスファターゼ又は西洋わさびペルオキシダーゼに対して、又は、本明細書において詳述されるような蛍光薬剤に対して、包合させることができる。免疫組織化学に関して、生検からの任意の細胞又は組織、又は本明細書において記載されるような任意の生物学的サンプルを使用することができる。
本明細書において記載されるように、本発明にしたがって作製された抗体は、治療剤としての、例えば、細胞増殖、細胞生存、細胞運動、及び／又は発癌性を予防し、低減させ、又は阻害するための、特定の用途を見出し得る。一つの広い実施形態において、本発明は、少なくとも一つのリガンドと一以上の受容体との相互作用をブロックする、又はより広義には、リガンドと結合薬剤との相互作用をブロックする方法であって、抗体、抗体フラグメント、又はその改変体を、本発明にしたがって接触させることを含む、方法を提供する。この方法は、インビボ又はインビトロで実施され得る。
（アルテミン及び／又は関連するリガンドの阻害のための組成物）
アルテミン及び／又は関連するリガンドを阻害する場合に有用である薬剤（例えば、小分子等の化合物、並びに、アンタゴニスト、抗体、アンチセンスポリヌクレオチド、及びｉＲＮＡ）がそれ自体で使用されてもよいし、一つ以上の薬学的に許容される希釈剤、担体、及び／又は賦形剤と組み合わせた組成物の形態で使用されてもよい。本発明が関連する技術分野の当業者は、本発明の組成物において使用され得る、様々な薬学的に許容される希釈剤、担体、及び／又は賦形剤を容易に理解するであろう。当然のことながら、かかる希釈剤、担体、及び／又は賦形剤の選択は、ある程度、使用されるべき薬剤の性質、組成物の意図される投与形態、及び投与様式によって影響され得る。一例として、ポリヌクレオチドの投与（例えば、アンチセンス又はｉＲＮＡを発現させるために適合させたベクター）の場合、適当な担体としては、等張溶液、水、生理食塩水、デキストロース水溶液等が挙げられる。
標準的な希釈剤、担体、及び／又は賦形剤に加えて、本発明の医薬組成物は、追加の構成成分と共に、薬剤の活性を増大させるように、又は、薬剤の完全性を保護するのに役立つようにして製剤化されてもよい。例えば、組成物は、対象への投与の際に、分解に対して保護する、又は薬剤の抗原性を低減させるアジュバントまたは構成成分をさらに含んでもよい。或いは、特定の細胞、組織、又は腫瘍を標的とすることを可能にするように薬剤を改変してもよい。
徐放システムを取り込むように薬剤を製剤化してもよい。この場合には、組成物は、造形品の半透過性のポリマーマトリクス、例えば、フィルム、又はマイクロカプセルを含み得る。徐放性マトリクスとしては、ポリ乳酸（U.S. Pat. No. 3,773,919; EP 58,481）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Sidman et al., 1983, Biopolymers: 22: 547-56）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res.: 15: 267）、エチレンビニルアセテート（Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res.: 15: 267）、又は、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（EP 133,988）が挙げられる。
本発明の薬剤は、リポソームに製剤化されてもよい。化合物を含むリポソームは、本発明が関連する技術分野における公知の技術を用いて調製され得る。一例として、DE 3,218,121, EP 52,322, EP 36,676, EP 88,046, EP 143,949, EP 142,641, Japanese Pat. Appln. 83-118008, U.S. Pat. Nos. 4,485,045 and 4,544,545, and EP 102,324を参照されたい。通常、リポソームは、小さい（約２００〜８００Å）単層型のものであり、リポソーム中、脂質含有物は約３０モルパーセントよりも多いコレステロールであり、選択される割合は、最も有効な治療のために調整される。本発明において有用である薬剤はまた、その寿命を増大させるためにペグ化されてもよい。
さらに、本発明にしたがう組成物は、特定の場合に対象に有効であり得るその他の成分と共に製剤化されてもよいことが意図される。例えば、適切な場合に、一つ以上の抗腫瘍剤を組み込ませる時、有効であり得る。かかる薬剤の例としては、アルキル化剤、例えば、クロラムブシル（例えば、Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、シクロホスファミド（例えば、Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｃｙｃｌｏｂｌａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、シクロホスファミド（登録商標））、イホスファミド（例えば、Ｈｏｌｏｘａｎ（登録商標）、Ｉｆｅｘ（登録商標）、Ｍｅｓｎｅｘ（登録商標））、チオテパ（例えば、Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標）、チオテパ（登録商標））；及び、代謝拮抗剤／Ｓ期阻害剤、例えば、メトトレキサートナトリウム（例えば、Ｆｏｌｅｘ（登録商標）、Ａｂｉｔｒｅｘａｔｅ（登録商標）、Ｅｄｅｒｔｒｅｘａｔｅ（登録商標））、５−フルオロウラシル（例えば、Ｅｆｕｄｉｘ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標））、ヒドロキシウレア（例えば、Ｄｒｏｘｉａ（登録商標）、ヒドロキシウレア、Ｈｙｄｒｅａ（登録商標））、アムサクリン、ゲムシタビン（例えば、Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、ダカルバジン、チオグアニン（例えば、Ｌａｎｖｉｓ（登録商標））が挙げられる。
代謝拮抗剤／細胞分裂毒、例えば、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ（登録商標）、エトポシド、Ｔｏｐｏｓａｒ（登録商標））、ビンブラスチン（例えば、Ｖｅｌｂｅ（登録商標）、Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、ビンデスチン（例えば、Ｅｌｄｅｓｉｎｅ（登録商標））、ビノレルビン（例えば、Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、パクリタキセル（例えば、Ｔａｘｏｌ（登録商標））；抗生物質型薬剤、例えば、ドキソルビシン（例えば、Ｒｕｂｅｘ（登録商標））、ブレオマイシン（例えば、Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））、ダクチノマイシン（例えば、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（登録商標））、ダウノルビシン（例えば、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎ（登録商標））、マイトマイシン（例えば、Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（登録商標））；ホルモン剤、例えば、アミノグルテチミド（例えば、Ｃｙｔａｄｒｅｎ（登録商標））、アナストロゾール（例えば、Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、エストラムスチン（例えば、Ｅｓｔｒａｃｙｔ（登録商標）、Ｅｍｃｙｔ（登録商標））、ゴセレリン（例えば、Ｚｏｌａｄｅｘ（登録商標））、ヘキサメチルメラニン（例えば、Ｈｅｘａｍｅｔ（登録商標））、レトロゾール（例えば、Ｆｅｍａｒａ（登録商標））、アナストロゾール（例えば、Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、及びタモキシフェン（例えば、Ｅｓｔｒｏｘｙｎ（登録商標）、Ｇｅｎｏｘ（登録商標）、Ｎｏｖａｌｄｅｘ（登録商標）、Ｓｏｌｔａｍｏｘ（登録商標）、Ｔａｍｏｆｅｎ（登録商標））も含まれる。
さらに、任意の二つ又はそれ以上の抗腫瘍剤の組み合わせ（例えば、アドリアマイシン／５−フルオロウラシル／シクロホスファミド（ＦＡＣ）；及び、シクロホスファミド／メトトレキサート／５−フルオロウラシル（ＣＭＦ））も含まれる。特に有用なのは、例えば、シクロホスファミド（例えば、ＣＹＴＯＸＡＮ）、メトトレキサート（例えば、ＲＨＥＵＭＡＴＲＥＸ）、５−フルオロウラシル（例えば、ＡＤＲＵＣＩＬ）、ドキソルビシン（例えば、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ）、及びシクロホスファミド（例えば、ＣＹＴＯＸＡＮ）等のうちの少なくとも二つの薬剤を含む組み合わせである。転移性疾患のために有用なのは、カペシタビン（例えば、ＸＥＬＯＤＡ）、ドキソルビシン（例えば、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ）（そのリポソーム製剤を含む）、ゲムシタビン（例えば、ＧＥＭＺＡＲ）、タキサン類（パクリタキセル（例えば、ＴＡＸＯＬ）及びドセタキセル（例えば、ＴＡＸＯＴＥＲＥ）を含む）、ビノレルビン（例えば、ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ）、及びトラスツズマブ（例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）等の薬剤である。本発明が関連する技術分野の当業者は、有効であり得るその他の薬剤の例を容易に理解するであろう。本発明の薬剤はまた、許容される医薬実務に従い、本明細書において具体的に言及されているもの以外の化合物及び薬剤と共に製剤化されてもよい。
当然のことながら、ポリヌクレオチドの投与の場合、それらは、ウィルス送達系中に詰め込まれてもよく、ウィルス系自体を、本明細書において記載されるような組成物に製剤化してもよい。本発明が関連する技術分野の当業者は、本明細書において記載される本発明の性質を考慮して、様々な適当なウィルスベクターを理解し得る。しかしながら、一例として、レトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、及びアデノ随伴ウィルス（adeno-associated virus：ＡＡＶ）を使用することができる。本発明が関連する技術分野の当業者は、本発明においてかかるベクターを使用するために用いられ得る方法を容易に理解するであろう。しかしながら、一例のみとして、レトロウィルスベクターの使用は、Miller et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599, and Boesen et al., 1994, Biotherapy 6:291-302に記載されており；アデノウィルスベクターの使用は、例えば、Kozarsky and Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503; Rosenfeld et al., 1991, Science 252:431-434; Rosenfeld et al., 1992, Cell 68:143-155; Mastrangeli et al., 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234; PCT Publication WO 94/12649; and Wang, et al., 1995, Gene Therapy 2:775-783に記載されており；ＡＡＶの使用は、Walsh et al., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300; U.S. Patent No. 5,436,146に記載されている。
使用されるべき投与様式、並びに、使用される適切な薬学的賦形剤、希釈剤及び／又は担体にしたがい、本発明の組成物は、通常の剤形、例えば、溶液、経口投与可能な液体、注射可能な液体、錠剤、コーティング錠、カプセル、丸剤、顆粒、坐剤、経皮パッチ、懸濁剤、乳剤、徐放剤、ゲル、エアロゾル、リポソーム、粉剤、及びイムノリポソーム等に適合され得る。選択される剤形は、使用が望まれる投与様式、治療されるべき障害、及び使用されるべき薬剤の性質を反映することになる。特に好ましい剤形としては、経口投与可能な錠剤、ゲル、丸剤、カプセル、半固体、粉剤、徐放剤、懸濁剤、エリキシル、エアロゾル、軟膏、又は局所投与用溶液、及び注射可能な液体が挙げられる。当業者は、適切な剤形及び製剤方法を容易に認識するであろう。一般的に、組成物は、特定の薬剤及び成分を互いに接触又は混合することにより調製される。次に、必要であれば、生成物を所望の製剤へと成形する。一例として、組成物を製剤化する特定の方法が、Gennaro AR: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2000等の参考文献中に見出され得る。
組成物中の本発明の薬剤の量は、組成物のタイプ、単位用量のサイズ、担体、希釈剤及び／又は賦形剤の種類、及び、当業者に周知のその他の因子に依存して、大きく変動し得る。一般的に、最終組成物は、０．０００１重量パーセント（％ｗ）〜１００％ｗの本発明の活性物質、好ましくは、０．００１％ｗ〜１０％ｗを含んでもよく、残りは、含まれる任意の他の活性薬剤及び／又は担体（単数または複数）、希釈剤（単数または複数）及び／又は賦形剤（単数または複数）である。
（治療方法）
本発明者等の主な研究は乳癌細胞に関連するが、アルテミン及び／又は関連するリガンドは、小腸及び腎臓において；心臓、前立腺、子宮、正常大腸、胃、皮膚、気管、脳、小脳、胎児脳、脊髄、胎盤、脂肪組織、軟骨において；及び、胸腺においても作用することが予測される。特に、これらのリガンドは、中でも、乳癌、結腸癌、前立腺癌、子宮内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌に作用することが予測される。したがって、本発明者等は、増大した若しくは異常な細胞増殖、細胞生存、細胞運動、及び／又は発癌性によって特徴付けられる様々な障害の治療に、アルテミン及び／又は関連するリガンドの阻害を適用し得ることを意図する。
一実施形態において、本発明は、アルテミン及び／又は関連するリガンドを阻害することによる、細胞増殖、細胞生存、及び／又は細胞運動を予防し、低減させ、又は阻害する方法に関する。好ましくは、この方法は、対象における異常な細胞増殖、細胞生存、及び／又は細胞運動によって特徴付けられる障害の治療を目的とする。これらの異常な特徴は、対象内一つ以上の細胞型において生じることがあり、転移性の障害を含み得る。特定の障害としては、例えば、癌（例えば、乳癌、結腸癌、前立腺癌、子宮内膜癌、肺癌、胃癌、又は肝癌）及び子宮内膜症が挙げられる。障害の例としては、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、骨肉腫、奇形癌等の癌、及び、副腎、膀胱、骨、脳、乳房、頸部、胆嚢、神経節、消化管、食道、胃、小腸、大腸、直腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、骨髄、筋肉、生殖器官、子宮、卵巣、陰茎、前立腺、膵臓、副甲状腺、唾液腺、皮膚、脾臓、睾丸、胸腺、及び甲状腺の癌等が挙げられる。
様々な実施形態において、障害は、乳房、前立腺、大腸、肺、膵臓、子宮内膜、若しくは卵巣の上皮性癌、又は扁平上皮癌、又は黒色腫、又は腎臓癌若しくは腫瘍である。乳癌に関して、これらは、上皮性腫瘍（例えば、管部又は小葉をライニングする細胞から）又は非上皮性腫瘍（例えば、間質基質から）、例えば、血管肉腫、原発性間質肉腫、及び葉状腫瘍を含み得る。乳癌は、上皮内癌及び浸潤癌等の癌も含み得る。上皮内癌は、管部又は小葉内での癌細胞の増殖を含み、間質組織への侵入を伴わない。小葉内癌（Lobular carcinoma in situ：ＬＣＩＳ）は、いずれかの乳房において続いて起こる浸潤癌の増大したリスクを示し得る触知不能の病変を含む。乳癌において、浸潤癌は、通常、腺癌を含み、多くは浸潤性の管タイプの癌を含み、残りは浸潤性の小葉癌を含む。珍しい形態の乳癌としては、髄様、粘液性、及び管状癌が挙げられる。乳癌による障害としては、乳首のパジェット病、及び転移性乳癌が挙げられる。
結腸癌に関して、これは、一般的に、大腸、直腸、及び／又は肛門の癌、特に、腺癌、及び上皮性癌（例えば、肛門管に発生した扁平上皮癌）、黒色腫、リンパ腫、及び肉腫を含み得る。類表皮（非角質化扁平上皮細胞又は類基底細胞）癌も含まれる。結腸癌は、特定のタイプのポリープ又はその他の病変、例えば、管状腺腫、腺管絨毛腺腫（例えば、絨毛腺管状ポリープ）、絨毛（例えば、乳頭）腺腫（腺癌を伴う又は伴わない）、過形成性ポリープ、過誤腫、若年性ポリープ、ポリープ状癌、偽ポリープ、脂肪腫又は平滑筋腫と関連し得る。この癌は、家族性ポリープ病、並びに、ガードナー症候群又はポイツ・イェガース症候群等の関連する症状と関連し得る。この癌は、例えば、慢性瘻孔、照射性肛門皮膚、白斑症、鼠径性病性リンパ肉芽腫、ボーエン病（上皮内癌）、尖圭コンジローム、又はヒトパピローマウィルスと関連し得る。その他の態様において、癌は、基底細胞癌、乳房外パジェット病、肛門管癌、又は悪性黒色腫と関連し得る。
子宮内膜癌に関して、これらは、腺癌を含み、又、乳頭漿液性、透明細胞、扁平上皮、及び粘液性癌も含み得る。子宮内膜増殖症等の前癌症状も含まれる。子宮内膜癌は、肥満、多嚢胞性卵巣症候群、未経産、遅発閉経、エストロゲン産生腫瘍、無排卵（卵巣機能不全）、及びプロゲステロンを使用しないエストロゲン療法、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌（hereditary nonpolyposis colorectal cancer：ＨＮＰＣＣ）症候群の一つ以上と関連し得る。
本発明が関連する技術分野の当業者は、特に、本明細書において記載されるアルテミンの発現を考慮して、本発明を適用し得る別のタイプの障害を理解し得る。さらに、本発明の性質と、本明細書において記載される結果を考慮して、本発明が様々な異なる動物に対して適用し得ることが、本発明が関連する技術分野の当業者に理解されるであろう。したがって、診断的細胞処理方法は、対象となる任意の動物に適用し得る。特に、本発明は、哺乳動物に、より特定的には、ヒトに適用し得る。
本発明が関連する技術分野の当業者は、アルテミン及び／又は関連するリガンドを阻害するのに使用するための様々な手段及び薬剤を理解するであろう。一例として、ｉＲＮＡ、アンチセンス、及び三重らせんＤＮＡ等の核酸技術が、発現を阻害するために使用され得る。或いは、アルテミン及び／又は関連するリガンドに対する抗体、又はかかる抗体の機能性誘導体を使用してもよい。例示的薬剤が本明細書において詳述されている。本発明において有用である薬剤は、好ましくは、以下の特徴のうちの一つ以上を示すことになる：１）細胞成育を予防し、低減させ又は阻害する能力；２）細胞増殖、細胞生存、細胞運動、及び／又は発癌性を予防し、低減させ又は阻害する能力；３）アルテミン及び／又は関連するリガンドの発現又は活性を予防し、低減させ又は阻害する能力；４）癌の転移を予防し、低減させ又は制御する能力。好ましくは、適当な薬剤は、これらの特徴のうちの二つ以上を示すことになる。
本明細書において示されるように、アルテミンは、特定の癌細胞において発現される細胞因子としてコードされており、又、少なくとも一つの正常な成人細胞サブセットによってもコードされている。したがって、アルテミン及び関連するリガンドは腫瘍関連抗原と見なされ得る。正常細胞及び癌細胞中での発現並びにアクセスの差に基づいて、これらのリガンドを標的とするために、いくつかのアプローチを使用することができる（一般的には、Paul, Fundamental Immunology, 1999, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA, Chapter 37に概説されている）。癌細胞は、はるかにより高いレベルで腫瘍関連抗原を発現する可能性が高く、正常細胞と癌細胞との間でのかかる発現レベルの差は、治療のために利用され得る（例えば、Brown JP, et al., Quantitative analysis of melanoma-associated antigen p97 in normal and neoplastic tissues. Proc Natl Acad Sci USA 1981;78:539-543を参照されたい）。正常細胞に対してと比較した、癌細胞に対する、抗原特異的エフェクター細胞のより良好なアクセス性のため、ターゲティングも達成され得る。例えば、癌細胞上に発現されているこれらの抗原は、不完全なグリコシル化のため、より結合に利用されやすい（例えば、上皮粘液の場合）。癌細胞に関して、ＭＨＣ分子の増大した発現は、腫瘍をＴ細胞に対する直接の標的とし得る（例えば、Uyttenhove C, et al. The expression of mouse gene PlA in testis does not prevent safe induction of cytolytic T cells against a PlA-encoded tumor antigen. Int J Cancer 1997;70:349-356を参照されたい）。
先天性又は後天性免疫を伴う多角的免疫療法戦略を、アルテミン及び／又は関連するリガンドと関連する癌を制御するために使用してもよく、例えば、かかる戦略としては、（ａ）生細菌ワクチン、例えば、ＢＣＧの局所投与；（ｂ）サイトカインの使用；（ｃ）アルテミンに対する能動免疫；（ｄ）アルテミン及び／又は関連するリガンドに対する抗体を用いた受動療法；及び、（ｅ）エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の養子移植が挙げられる。アルテミン及び／又は関連するリガンドに対する能動免疫は、アルテミン及び／若しくは関連するリガンドに対するマウスモノクローナル抗体を用いた免疫応答または受動免疫を誘導するために使用され得る。一般的指針として、例えば、Riethmuller G, et al., Monoclonal antibody therapy for resected Dukes' C colorectal cancer: seven-year outcome of a multicenter randomized trial. J Clin Oncol 1998; 16: 1788-1794; Riethmuller G, et al., Randomized trial of monoclonal antibody for adjuvant therapy of resected Dukes' C colorectal carcinoma. German Cancer Aid 17- IA Study Group. Lancet 1994;343:1177- 1183; Herlyn DM, et al., Inhibition of growth of colorectal carcinoma in nude mice by monoclonal antibody. Cancer Res 1980;40:717-721を参照されたい。
免疫接種に関し、先天性の免疫を刺激するために特定のアジュバントを使用しない限り、純粋な抗原は、後天性の（すなわち、抗原特異的な）免疫応答を誘導する場合に無効である場合が多い。したがって、化学的及び／又は細菌性薬剤の使用により、ワクチン接種部位における先天性の免疫を刺激するために、多数のアプローチが設計されている。ワクチンにおいて使用される合成ペプチドが特定のＭＨＣハプロタイプに対して設計され得る（例えば、Toes RE et al. Peptide vaccination can lead to enhanced tumor growth through specific T-cell tolerance induction. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:7855-7860を参照されたい）。熱ショックタンパク質上に（すなわち、組み換えウィルス様粒子として）抗原性ペプチドを負荷して、免疫接種の効果を増大させることができる。一般的に、免疫応答の効率的な誘導には、適当なヘルプ又は二次シグナルを提供する環境における抗原提示を必要とする。
いくつかの実験計画法は、ウィルス特異的又は腫瘍関連ペプチドを用いてパルスされた樹状細胞を使用して、腫瘍反応性Ｔ細胞と、移植された腫瘍細胞の拒絶とを誘導する。樹状細胞は、合成抗原性ペプチド又は組み換えタンパク質により負荷され得る。樹状細胞は、腫瘍細胞表面からはがされた天然ペプチド；腫瘍由来のペプチドを負荷した熱ショックタンパク質；腫瘍由来のｍＲＮＡ；又は融合腫瘍細胞のうちの一つ又はそれ以上を負荷され得る（概説に関しては、Shurin MR. Dendritic cells presenting tumor antigen. Cancer Immunol Immunother 1996;43: 158-164を参照されたい）。これらの戦略の利点の一つは、腫瘍抗原及び腫瘍関連抗原を（独自に）個々に識別するための、強力な免疫が誘導され得ることである。
アルテミン及び／又は関連するリガンドに対する抗原について、ワクシニア、リステリア、又はウィルス様粒子を用いて組み換えワクチンを開発することができる。別のアプローチにおいては、腫瘍抗原をコードするむきだしのＤＮＡプラスミド構築物を筋肉内に注射することによって遺伝子ワクチンを用いることができる（例えば、Donnelly JJ, Ulmer JB, Liu MA. DNA vaccines. Life Sci 1997;60: 163-172参照）。注射した部位における樹状細胞により抗原提示を向上させるために、ＧＭ−ＣＳＦを用いることもできる（例えば、Syrengelas AD, Chen TT, Levy R. DNA immunization induces protective immunity against B-cell lymphoma. Nat Med 1996;2:1038-1041参照）。別のアプローチでは、抗イディオタイプの抗体によるワクチン化を用いることができる。
さらなるアプローチとして、受動抗体療法又は腫瘍特異的Ｔ細胞の養子移植が用いられ得る。例えば、アルテミン及び／又は関連するリガンドに対する抗体による受動免疫化は腫瘍細胞によるチャレンジに対抗し、癌細胞のチャレンジを受けた直後に治療的であり得る（例えば、Riethmuller G, et al. Monoclonal antibody therapy for resected Dukes' C colorectal cancer: seven-year outcome of a multicenter randomized trial. J Clin Oncol 1998;16:1788-1794; Riethmuller G, et al. Randomized trial of monoclonal antibody for adjuvant therapy of resected Dukes' C colorectal carcinoma. German Cancer Aid 17- IA Study Group. Lancet 1994;343:1177- 1183; Herlyn DM, et al. Inhibition of growth of colorectal carcinoma in nude mice by monoclonal antibody. Cancer Res 1980;40:717-721参照）。
別のアプローチとして、抗イディオタイプ抗体処理を用いて癌細胞を持続的な休止状態にさせることを促進することができる（例えば、Miller RA, Maloney DG, Warnke R, Levy R. Treatment of B-cell lymphoma with monoclonal anti-idiotype antibody. N Engl J Med 1982;306:517-522参照）。さらに、腫瘍細胞に対する抗体を、サイトカイン、又は、放射化学物質又は天然毒等の細胞毒性剤のための担体として用いることができる（例えば、Ghetie V, Vitetta E. Immunotoxins in the therapy of cancer: from bench to clinic. Pharmacol Ther 1994;63:209-234; Reisfeld RA, Gillies SD. Recombinant antibody fusion proteins for cancer immunotherapy. Curr Top Microbiol Immunol 1996;213:27-53参照）。組み換え抗体−サイトカイン又は抗体−毒物融合タンパク質は、腫瘍細胞を取り巻く間質中にこれらの薬物を濃縮するために用いられ得る。代替として、二重特異性モノクローナル抗体を設計して癌細胞上にエフェクター細胞ならびに腫瘍抗原に結合させることができる。モノクローナル抗体もヒト化して患者による抗マウス抗体の中和の刺激を低減させことができる。一層さらなるアプローチとして、より長期にわたり確立された腫瘍の負荷により、Ｔ細胞の養子移植を用い得る。患者から単離されたＴ細胞を、ＩＬ−２によりインビトロで拡げ、次いで、ＩＬ−２を受ける患者へと同様に注入する（例えば、Smith CA, et al. Adoptive immunotherapy for Epstein- Barr virus-related lymphoma. Leuk Lymphoma 1996;23:213-220参照）。
本明細書中の本発明の記述および公知の方法論を考慮して、アルテミン及び／又は関連するリガンドを阻害する際の薬物の性能を決定することができる。例えば、薬物の性能は、そのリガンドの発現又はそのリガンドの１以上の機能的効果を予防し、低減させ、又は阻害する能力を観察することにより決定され得る。特定の例の方法により、細胞侵入、細胞の移動、遺伝子転写のレベル及びアルテミン及び／又は関連するリガンドに応答する遺伝子の１以上に対する薬物の影響を研究することができる。かかる研究はインビトロまたはインビボで行われ得る。
表題「実施例」のもと、以下本明細書において記載されるアッセイは、本発明による薬剤の適合性を決定するために使用され得る。具体的には、ＲＴ−ＰＣＲ及びノーザンブロット分析は、ｍＲＮＡレベルで発現を検出するために使用され得、ウェスタンブロッティング及び直接又は間接免疫染色は、タンパク質レベルで発現を検出するために使用され得る。活性を検出するために、細胞増殖、細胞生存、細胞運動、及び／又は発癌性に対する細胞ベースのアッセイを使用することができる。転移の阻害に関しては、例えば、Fidler, I. J. (1973) Nat. New Biol. 242, 148-149; and Price J. E. The biology of cancer metastasis. Prog. Clin. Biol. Res., 354A: 237-255, 1990, or Kerbel R. S. What is the optimal rodent model for anti-tumor drug testing? Cancer Metastasis Rev., 17: 301-304, 1998; Killion J. J., Radinsky R., Fidler I. J. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumours in mice. Cancer Metastasis Rev., 17: 279-284, 1998; and Price J. E. Analyzing the metastatic phenotype. J. Cell. Biochem., 56: 16-22, 1994に記載されているようなインビボアッセイを使用してもよい。
（投与経路／投与計画）
本発明者等は、所望の活性（例えば、アルテミン及び／又は関連するリガンドの阻害）を対象の体内の標的部位へ送達し得る任意の手段による、本発明の薬剤又は組成物のいずれかの投与を意図する。標的部位は、障害を有する又は障害の影響を受けやすい体内の任意の部位であり得、一つ以上の細胞、組織又は特定の腫瘍を含み得る。例えば、投与は、非経口投与経路、全身投与経路、経口及び局所投与を含み得る。投与は、例えば、注射、皮下、眼窩内、眼、髄腔内、嚢内、局所、点滴（例えば、低速放出装置又は浸透圧ポンプ等のミニポンプ又は皮膚パッチを用いる）、インプラント、エアロゾル、吸入、乱切、腹腔内、嚢内、筋肉内、腫瘍内、鼻腔内、経口、バッカル、経皮、経肺、直腸又は膣送達であり得る。当然のことながら、選択される投与経路は、対象の体内における標的部位の位置、並びに、使用される薬剤（例えば、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、又は抗体）又は組成物の性質に依存し得る。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドの場合、それらは、例えば、欠損型又は弱毒型レトロウィルス又はその他のウィルスベクターを用いるトランスフェクション（例えば、U.S. Patent No. 4,980,286参照）により、又は天然のＤＮＡの直接注入により、又は微粒子照射（microparticle bombardment）（例えば、遺伝子銃；Biolistic，DuPont）の使用により、又は脂質又は細胞表面受容体又はトランスフェクション剤によるコーティングにより；リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセル中への封入により；核へ進入することが知られているペプチドと結合させることにより；又は、受容体介在エンドサイトーシスに付されるリガンドと結合させてそれを投与することにより（例えば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432）（これは、受容体等を特異的に発現する細胞型を標的とするために使用され得る）、投与され得る。さらに、リガンドが、エンドソームを破壊するための融合ウィルスペプチドを含み、それにより、核酸分子のリポソームによる分解を防ぐことが可能となる、核酸−リガンド複合体が形成され得る。
さらに別の実施形態において、例えば以下に記載されるように、特異的受容体を標的とすることによって、細胞特異的な取り込み及び発現のために、ポリヌクレオチドは、インビボで標的とされ得る：WO 92/06180 dated April 16, 1992 (Wu et al.); WO 92/22635 dated December 23, 1992 (Wilson et al.); WO 92/20316 dated November 26, 1992 (Findeis et al.); WO 93/14188 dated July 22, 1993 (Clarke et al.); and, WO 93/20221 dated October 14, 1993 (Young)。或いは、ポリヌクレオチドは、細胞内導入され得、又、相同組み換えにより、発現のための宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得る（Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438）。本発明の目的のためにポリヌクレオチドを導入し得る細胞は、任意の所望の、利用可能な細胞型を包含する。適切な細胞型は、治療されるべき障害の性質に依存することになる。しかしながら、一例として、ポリヌクレオチドを、癌細胞中に導入することができる。
当然のことながら、投与される薬剤又は組成物の用量、投与期間、及び一般的投与計画は、治療される症状の性質、対象の症候の重篤度、治療されるべき任意の腫瘍の大きさ、治療されるべき標的部位、選択される投与様式、並びに、対象の年齢、性別及び／又は全体的健康等の可変因子に応じて、対象間で異なってもよい。本発明が関連する技術分野の当業者は、かかる因子を考慮して、適切な投与計画を容易に理解することになり又は決定し得る。投与は、１日１回投与、又は適切であり得る場合には、別個の分割された用量の複数回投与を含み得ることを理解すべきである。本発明者等は、異なる投与様式又は経路と組み合わせた投与計画も意図している。例えば、腫瘍内注射及び全身投与が組み合わされ得る。
本発明の方法は、治療されるべき症状を考慮して、対象に有効であり得る追加の薬剤又は組成物の投与等のさらなる工程を含み得ることを理解すべきである。例えば、増殖性障害を治療する場合に有用であるその他の薬剤（例えば、上記の抗腫瘍剤）を投与し得る。このような追加の薬剤及び組成物は、本発明の薬剤及び組成物と、同時に、又は逐次的に、投与され得ることを理解すべきである。例えば、追加の薬剤又は組成物は、本発明の薬剤又は組成物の投与前又は投与後に投与され得る。薬剤又は組成物の逐次的送達に関して、他方の後の一方の薬剤又は組成物の逐次的送達はすぐに起こる必要はないが、このことは好ましいことを理解すべきである。薬剤又は組成物の送達間に時間遅延があってもよい。遅延期間は、治療されるべき症状、及び送達される組成物又は薬剤の性質等の要素に依存することになる。しかしながら、一例として、本発明者等は、数時間から数日又は数ヶ月間の期間を意図している。
（診断方法及び組成物）
一実施形態において、本発明は、細胞増殖、細胞生存、細胞運動、及び／又は発癌性に関連する障害を診断する方法における、本発明の一つ以上の試薬の使用に関する。好ましくは、この方法は、対象における異常な細胞増殖、細胞生存、細胞運動、及び／又は発癌性により特徴づけられる障害の診断を目的とする。この異常な細胞生育及び／又は増殖は、対象における一つ以上の細胞型において生じる可能性があり、転移性又はその他の障害を含み得る。これらの障害としては、例えば、癌（例えば、乳癌、結腸癌、前立腺癌、子宮内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌）及び子宮内膜症を挙げることができる。例示的障害を本明細書において詳細に記載する。
本発明にしたがい、アルテミン及び／又は関連するリガンドと特異的に結合する抗体は、変化した発現によって特徴付けられる症状又は障害の診断のために、又は、これらのリガンドのうちの一つ以上に対する阻害剤を用いて治療される患者をモニタリングするためのアッセイにおいて、使用され得る。診断目的のために有用な抗体は、上記と同じようにして調製され得る。診断アッセイは、ヒト体液又は細胞若しくは組織抽出物中で対応するペプチド又はポリペプチドを検出するための抗体及び標識を利用する方法を含む。改変を含む又は含まない抗体を使用してよく、レポーター分子を、共有結合的に又は非共有結合的に結合させることにより標識され得る。当技術分野において知られている広範なレポーター分子を使用してもよく、それらのうちのいくつかについては、本明細書において記載されている。
ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及びＦＡＣＳ等の様々なプロトコールが、当技術分野において知られており、アルテミン及び／又は関連するリガンドの発現の変化した又は異常なレベルを診断するための基礎を提供する。発現の正常値又は標準値は、正常な哺乳動物対象、好ましくはヒトから採取された体液又は細胞抽出物を抗体と複合体の形成に適した条件下で混合することにより確立される。標準的な複合体形成量は、様々な方法によって定量可能であるが、好ましくは、測光的手段による。生検組織から採取した対象、コントロール、及び疾患のサンプルにおいて発現された量を標準値と比較する。標準値と対象値との偏差は、障害を診断するためのパラメーターを確立する。
本発明の別の実施形態において、アルテミン又は関連するリガンドに対するポリヌクレオチドを、診断目的のために使用してもよい。使用され得るポリヌクレオチドとしては、オリゴヌクレオチド、相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びＰＮＡ等が挙げられる。発現が障害と相関し得る生検組織において、遺伝子発現を検出及び定量するためにポリヌクレオチドを使用してもよい。治療的介入時における、発現の欠如、存在、及び変化を区別するため、並びに、発現レベルの調節をモニタリングするために、診断アッセイを使用してもよい。
一態様において、核酸ハイブリダイゼーションは、アルテミン又は関連するリガンドに対するポリヌクレオチド配列（ゲノム配列及び密接に関連する分子を含む）を検出し得るプローブ又はプライマー（例えば、ＰＣＲプライマー）を用いて行われ得る。プローブ又はプライマーの特異性（それが、高度に特異的な領域、例えば、５’調節領域中の１０個の独自のヌクレオチドから作られる場合であっても、より特異性の低い領域、例えば、特に３’コード領域から作られる場合であっても）、及びハイブリダイゼーション又は増幅の緊縮性（最高、高度、中程度、低度）は、プローブ又はプライマーが、天然の配列のみ、対立遺伝子、又は関連する配列を同定するか否かを決定することになる。プローブ及びプライマーは、関連する配列の検出のために使用されてもよく、好ましくは、任意の天然の配列からのヌクレオチドの少なくとも５０％を含むべきである。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよく、本発明のヌクレオチド配列、例えば、配列番号３５〜１７１、又は相補体、又は配列番号３５〜１７１の改変配列、又はゲノム配列（天然の配列のプロモーター、エンハンサーエレメント、及びイントロンを含む）に由来し得る。
アルテミン又は関連するリガンドのＤＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションプローブを作製する手段は、ｍＲＮＡプローブの作製のために、核酸配列又は改変配列のベクターへのクローニングを含む。かかるベクターは、当技術分野において公知であって、市販されており、適切なＲＮＡポリメラーゼと適切な標識ヌクレオチドの添加によって、インビトロでＲＮＡプローブを合成するために使用されてもよい。ハイブリダイゼーションプローブは、様々なレポーター基、例えば、放射性核種（例えば、３２Ｐ又は３５Ｓ）、又は酵素標識（例えば、アビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されるアルカリホスファターゼ）等によって標識され得る。
アルテミン又は関連するリガンドに対するポリヌクレオチド配列は、増大した又は減少した発現と関連する障害の診断のために使用されてもよい。ポリヌクレオチド配列は、変化した発現を検出するために、サザン又はノーザン分析；ドットブロット又はその他の膜ベースの技術；ＰＣＲ技術；又は、尿試験紙、ピン、ＥＬＩＳＡアッセイ；又は、患者の生検からの流体又は組織を利用するマイクロアレイにおいて使用され得る。かかる定性又は定量方法は、当技術分野において周知である。
特定の態様において、アルテミン又は関連するリガンドに対するヌクレオチド配列は、様々な癌、特に上記のものの活性化又は誘発を検出するアッセイにおいて有用であり得る。ヌクレオチド配列は、標準的方法によって標識されて、ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した条件下に、患者からの流体又は組織サンプルに添加されてもよい。適当なインキュベーション期間の後、サンプルを洗浄し、シグナルを定量して、標準値と比較する。生検又は抽出サンプル中のシグナル量が、比較コントロールサンプルの量と有意に変化している場合には、ヌクレオチド配列は、サンプル中のヌクレオチド配列とハイブリダイズしており、サンプル中の変化したレベルのヌクレオチド配列の存在は、関連する障害の存在を示す。かかるアッセイは、動物試験において、臨床試験において、又は、個々の患者に対する治療のモニタリングにおいて、特定の治療的処置計画の有効性を評価するために使用されてもよい。
アルテミン及び／又は関連するリガンドの発現に関連する障害の診断についての基礎を提供するために、発現の正常又は標準のプロファイルを確立する。このことは、正常な対象（動物又はヒトのいずれか）から採取された体液又は細胞抽出物をアルテミン又は関連するリガンドに対する配列、又はその改変体とハイブリダイゼーション又は増幅に適した条件下に混合することにより達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な対象から得られる値を、既知量の実質的に精製されたポリヌクレオチドを使用する実験からの値と比較することにより定量化され得る。正常サンプルから得られた標準値は、障害の症候を示す患者のサンプルから得られる値と比較されてもよい。標準値と対象値との偏差は、障害の存在を明らかにするために使用される。
一旦、障害が診断され、治療プロトコールが開始されたならば、患者の発現レベルが、通常の患者で観察されるレベルに近づき始めるか否かを評価するために、ハイブリダイゼーションアッセイは定期的に反復されてもよい。連続アッセイから得られる結果は、数日から数カ月の範囲の期間にわたる治療の有効性を示すために使用され得る。癌に関して、個体からの生検組織中における相対的に多量の転写物の存在は、障害の発症の素因を示し得るし、実際の臨床症状が現れる前に障害を検出するための手段を提供し得る。このタイプのより確定的な診断は、医療従事者が、予防的測定又は積極的治療を早期に行い、それにより、癌の発症又はさらなる進行を予防することを可能にし得る。
本発明のオリゴヌクレオチドのさらなる診断的用途は、ＰＣＲの使用を伴い得る。かかるオリゴマーは、化学的に合成されてもよく、酵素によって作製されてもよく、又は、インビトロで作製されてもよい。オリゴマーは、好ましくは、一方がセンス方向（５’→３’）を有し、もう一方がアンチセンス方向（３’→５’）を有する、二つのヌクレオチド配列から構成され、特定の遺伝子又は症状の同定のために最適化された条件下で使用される。同じ二つのオリゴマー、入れ子状態のオリゴマーセット、さらにオリゴマーの縮重プールを、密接に関連するＤＮＡ又はＲＮＡ配列の検出及び／又は定量のために、より緊縮性の低い条件下で使用してもよい。
アルテミン又は関連するリガンドの発現を定量するためにも使用され得る方法としては、放射標識又はビオチン化ヌクレオチド、コントロール核酸の同時増幅、実験結果が挿入される標準曲線等が挙げられる（Melby, P. C. et al. (1993) J. Immunol. Methods, 159:235-244; Duplaa, C. et al. (1993) Anal. Biochem. 229-236）。複数サンプルに対する定量の速度は、対象のオリゴマーを各種希釈液中に含有させ、分光光度法的又は比色分析的応答によって迅速な定量がもたらされるＥＬＩＳＡフォーマットのアッセイを行うことにより加速され得る。
さらなる実施形態において、オリゴヌクレオチド、又は、本明細書において記載されるポリヌクレオチド配列のいずれかに由来するより長い断片を、マイクロアレイ中の標的として使用してもよい。マイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニタリングするため（例えば、転写イメージを作製するため）、及び、遺伝子変異体、変異型及び多型を同定するために使用され得る。この情報は、遺伝子の機能を決定するため、障害の遺伝的根拠を理解するため、障害を診断するため、並びに、治療薬の開発及び治療薬の活性をモニタリングするために使用され得る。一実施形態において、マイクロアレイは、ＰＣＴ出願WO 95/11995 (Chee et al.), Lockhart, D. J. et al. (1996; Nat. Biotech. 14: 1675-1680) and Schena, M. et al. (1996; Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619に記載される方法等の、当技術分野において公知の方法にしたがって調製され、使用される。
マイクロアレイは、好ましくは、固体支持体に固定された、多数の独自の一本鎖核酸配列（通常は、合成アンチセンスオリゴヌクレオチド又はｃＤＮＡフラグメントのいずれかである）から構成される。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、約６〜６０ヌクレオチド長、より好ましくは、約１５〜３０ヌクレオチド長、最も好ましくは、約２０〜２５ヌクレオチド長である。特定のタイプのマイクロアレイに関しては、７〜１０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを使用することが好ましい場合がある。マイクロアレイは、既知の５’又は３’配列をカバーするオリゴヌクレオチドを含んでもよく、又は、全長配列をカバーする連続的オリゴヌクレオチド；又は配列の長さに沿って特定の領域から選択される独自のオリゴヌクレオチドを含んでもよい。
マイクロアレイにおいて使用されるポリヌクレオチドは、少なくとも配列のフラグメントが既知である単数または複数の対象遺伝子に特異的であるか、または、特定の細胞または組織タイプまたは正常な、発達的なまたは疾患の状態に共通である一つ以上の未同定ｃＤＮＡに特異的であるオリゴヌクレオチドであり得る。特定の状況において、マイクロアレイ上でオリゴヌクレオチド対を使用することが適当であり得る。この対は、一つのヌクレオチド、好ましくは、配列の中心に位置するヌクレオチドを除き、同一であることになる。対（一つが誤対合している）中の第２のオリゴヌクレオチドは、コントロールとして機能する。オリゴヌクレオチド対の数は、１〜１，０００，０００の範囲であり得る。
マイクロアレイのための既知配列へのオリゴヌクレオチドを作製するために、対象の遺伝子は、ヌクレオチド配列の５’末端から、より好ましくは３’末端から開始するコンピューターアルゴリズムを用いて調べられる。その遺伝子に独自であり、ハイブリダイゼーションに適した範囲内のＧＣ含量を有し、ハイブリダイゼーションに干渉し得る予測二次構造を欠如する、規定された長さのオリゴマーを、アルゴリズムは同定する。一態様において、オリゴマーは、光指向性化学プロセス（light-directed chemical process）を用いて、基質上の指定された領域で合成される。基質は、紙、ナイロン又は任意のその他のタイプの膜、フィルター、チップ、スライドガラス、又は任意のその他の適当な固体支持体であり得る。
一態様において、オリゴヌクレオチドは、化学的結合手順、及び、ＰＣＴ出願WO 95/251116 (Baldeschweiler et al)に記載されるもの等のインクジェット型塗布装置を用いて、基質表面上で合成され得る。別の態様において、真空システム、熱、ＵＶ、機械的又は化学的結合手順を用いて、ｃＤＮＡフラグメント又はオリゴヌクレオチドを基質表面上に整列させ、結合させるために、ドット又はスロットドットに類似する格子型アレイ（例えば、HYBRIDOT装置, Life Technologies）を使用してもよい。さらに別の態様において、アレイは、手製により、又は、利用可能な装置、材料、及び機械（多チャンネルピペット装置又はロボット装置；Brinkmann,Westbury,NYを含む）を用いて製造されてもよく、約８、２４、９６、３８４、１５３６又は６１４４個のオリゴヌクレオチド、又は２〜１，０００，０００個の任意の他の多重体（multiple）を含んでもよく、このことは、市販の装置の有効利用を可能にする。
マイクロアレイを用いてサンプル分析をするために、ポリヌクレオチドは生物学的サンプルから抽出される。生物学的サンプルは、任意の体液（例えば、血液、尿、唾液、粘液、胃液等）、培養細胞、生検、又はその他の組織標本から取得され得る。プローブを作製するために、サンプルから抽出されたポリヌクレオチドが使用されて、マイクロアレイ上のオリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列が作製される。マイクロアレイが、ｃＤＮＡから構成される場合には、アンチセンスＲＮＡが適当なプローブである。したがって、一態様において、ｍＲＮＡは、ｃＤＮＡを作製するために使用され、ｃＤＮＡは、今度は蛍光ヌクレオチドの存在下に、フラグメント又はオリゴヌクレオチドアンチセンスＲＮＡプローブを作製するために使用される。これらの蛍光標識プローブは、プローブ配列がマイクロアレイのｃＤＮＡオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように、マイクロアレイと共にインキュベートされる。別の態様において、プローブとして使用される核酸配列は、制限酵素、ＰＣＲ技術、及びオリゴ標識キット（Amersham Pharmacia Biotech）（これらはハイブリダイゼーション技術の分野において周知である）を用いて作製される、ポリヌクレオチド、フラグメント、及び相補体又はアンチセンス配列を含んでもよい。
ハイブリダイゼーションが、正確な相補的対合と共に、又は様々な程度のより低い相補性と共に起こるように、インキュベーション条件は調整される。ハイブリダイズしていないプローブの除去後、蛍光のレベル及びパターンを測定するためにスキャナーが使用される。スキャンされたイメージは、マイクロアレイ上の各オリゴヌクレオチド配列の相補性の程度及び相対量を決定するために調べられる。個別の配列全てに対するハイブリダイゼーションの不在、存在、及び量を同時に測定するために、検出システムを使用してもよい。このデータは、サンプルにおける配列、変異、変異体、又は多型の大規模相関試験又は機能解析のために使用され得る（Heller, R. A. et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-55）。
本発明の別の実施形態において、本発明の核酸配列は、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用であるハイブリダイゼーションプローブを作製するために使用され得る。この配列は、特定の染色体、染色体の特定の領域、又は人工染色体構築物、例えば、ヒト人工染色体（human artificial chromosome：ＨＡＣ）、酵母人工染色体（yeast artificial chromosome：ＹＡＣ）、細菌人工染色体（bacterial artificial chromosome：ＢＡＣ）、細菌Ｐ１構築物又は単一染色体ｃＤＮＡライブラリにマッピングされ得る（例えば、Price, C. M. (1993) Blood Rev. 7:127-134; Trask, B. J. (1991) Trends Genet. 7:149-154）。
蛍光インサイツハイブリダイゼーション（fluorescent in situ hybridization:：ＦＩＳＨ、例えば、Verma et al. (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, NYに記載される）は、他の物理的染色体マッピング技術及び遺伝子マップデータと相関され得る。遺伝子マップデータの例は、様々な科学雑誌中に、又はOnline Mendelian Inheritance in Man（ＯＭＩＭ）のサイトに見出され得る。物理的染色体マップ上のアルテミン又は関連するリガンドに対する遺伝子の位置と、特定の障害、又は特定の障害に対する素因との相関は、その障害に関連するＤＮＡの領域を画定するのに役立ち得る。本発明のヌクレオチド配列は、正常、保因者、及び罹患した個体間での遺伝子配列の相違を検出するために使用されてもよい。
染色体標本のインサイツハイブリダイゼーション及び物理的マッピング技術、確立された染色体マーカーを用いた連鎖解析は、遺伝子マップを拡張するために使用され得る。たとえ特定のヒト染色体アームの数が知られていない場合であっても、ネズミのような別の哺乳動物種の染色体上の遺伝子の位置によって、関連するマーカーが明らかとなり得ることが多い。新しい配列が、物理的マッピングによって、染色体アーム又はその一部に割り当てられ得る。このことは、ポジショナルクローニング、又は他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探索する研究者に、有益な情報を提供する。一旦、疾患が遺伝連鎖によって特定のゲノム領域、例えば、１１ｑ２２−２３に対するＡＴ（例えば、Gatti, R. A. et al. (1988) Nature 336:577-580）に大まかに局在化させられると、その領域への任意の配列マッピングは、さらなる調査のための関連遺伝子又は調節遺伝子を表し得る。本発明のヌクレオチド配列はまた、正常、保因者、及び罹患した個体間での、転座、反転等による、染色体位置の相違を検出するために使用され得る。
別の実施形態において、本発明の抗体は、免疫組織化学に基づく用途のために使用されてもよい。標準的免疫組織化学技術にしたがい、薄切片（例えば、約４〜４０μｍ）を、対象の組織から採取することができ、又は、組織全体を使用することができる。切片作製は、ミクロトームの使用により達成され得、切片はスライド上に載せられ得る。次に、細胞膜を破裂させるように、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００等の界面活性剤を用いて、組織を処理することができる。非特異的結合を最小にするためのブロッキング工程と同様に、さらなるアンマスキング工程も使用され得る。直接的免疫組織化学のために、対象の標識抗体（例えば、ＦＩＴＣ結合型抗血清）が組織切片中の抗原を結合させるために使用される。間接的免疫組織化学のために、非標識一次抗体が組織抗原を結合させるために使用され、標識二次抗体が一次抗体と反応させるために使用される。
本発明の別の実施形態において、アルテミン又は関連するリガンド、又はその機能性又は免疫原性のフラグメント又は改変体は、各種薬物スクリーニング技術のうちのいずれかにおいて、化合物ライブラリをスクリーニングするために使用され得る。かかるスクリーニングにおいて使用されるフラグメントは、溶液中に遊離していてもよく、固体支持体に貼り付けられていてもよく、細胞表面上に存在してもよく、又は、細胞内に位置してもよい。ポリペプチド又はペプチドと試験薬剤との間の結合複合体の形成を測定してもよい。さらなる実施形態において、アルテミン又は関連するリガンドと結合し得る中和抗体が、ポリペプチド又はペプチドとの結合に関して、試験化合物と特異的に競合する、競合薬スクリーニングアッセイを使用し得る。これと同様に、アルテミン及び／又は関連するリガンドとの一つ以上の抗原決定基を共有する任意のアミノ酸配列の存在を検出するために、抗体を使用することができる。
使用され得る薬物スクリーニングのための別の技術は、WO84/03564に記載されているような対象のタンパク質に対して適当な結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングを提供する。この方法では、アルテミン又は関連するリガンドに適用される場合、多数の異なる低分子試験化合物が固体基材、例えば、プラスチックピン又はいくつかのその他の表面上で合成される。試験化合物を、ポリペプチド、又はその改変体と反応させ、次いで、洗浄する。次に、結合したポリペプチド又はペプチドを、当技術分野において周知である方法で検出する。精製したポリペプチド又はペプチドは、上記薬物スクリーニング技術において使用するために、直接プレート上にコーティングされてもよい。或いは、ポリペプチド、又はその改変体を捕捉し、それを固体支持体上に固定するために、非中和抗体を使用することができる。
さらなる実施形態において、新しい技術が、現在知られているヌクレオチド配列の特性、例えば、限定するものではないが、三文字遺伝暗号（triplet genetic code）及び特異的塩基対相互作用等の特性に依存するのであれば、アルテミン又は関連するリガンドに対するヌクレオチド配列は、これから開発されなければならない任意の分子生物学技術において使用され得る。
（治療又は診断のためのキット）
本発明の薬剤及び組成物は、アルテミン及び／又は関連するリガンドを調節又は阻害するために、又は、本明細書において規定される障害の治療のために適したキットにおいて使用されてもよい。その他の態様において、この薬剤及び組成物は、診断キットにおいて使用されてもよい。キットは、適当な容器中に本発明の少なくとも一つの薬剤を含むことができる。この薬剤は、対象への直接投与に適するように、例えば、薬剤又は医薬組成物として製剤化されてもよい。或いは、キットは、一つの容器に一つ以上の薬剤を含み、他方に薬学的希釈剤、担体及び／又は賦形剤を含んでもよく、各容器の内容物は投与前に混合される。キットは、特定の適用のために必要とされ得る場合には、さらに別の容器にさらなる薬剤及び組成物を含んでもよい。薬剤又は組成物の保存及び／又は投与に適した任意の容器を、本発明のキットに使用してもよい。適切な容器は、当業者に理解されるであろう。例えば、かかる容器としては、バイアル及びシリンジが挙げられる。容器は、適切に滅菌され、密閉されてもよい。さらに、本発明のキットはまた、キットの成分の使用及び投与のための説明書を含んでもよい。本発明はさらに、以下の実施例を参照することにより、明らかにされる。
本明細書において記載される実施例は、本発明の実施形態を例証する目的のものである。他の実施形態、方法、及び分析のタイプは、分子診断技術の当業者の範囲内のものであり、本明細書中で詳述される必要がない。当該技術の範囲内の他の実施形態は、本発明の範囲の一部であると考えられる。
（実施例１：材料及び方法）
（細胞培養）
肺癌（Ａ５４９）、胃癌（ＡＧＳ）、結腸癌（Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ及びＤＬＤ−１）、前立腺癌（ＤＵ１４５及びＰＣ３）、膵臓癌（ＢｘＰＣ３）、子宮内膜癌（ＲＬ９５−２及びＡＮ３）、乳癌（ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、ＢＴ５４９、及びＭＤＡ−２３１）、及び肝癌（ＨｅｐＧ２）に関する全ての癌細胞株はＡＴＣＣから得られた。ＭＣＦ−７細胞株は加湿インキュベーター中５％ＣＯ２下３７℃で１０％の加熱失活ウシ胎仔血清（foetal bovine serum：ＦＢＳ）、１００ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養されたことを除いては、全ての細胞を推奨される条件下で培養した。
（プラスミド構築物）
アルテミン発現プラスミドを構築するために、ＩＭＡＧＥ ｃＤＮＡクローン５４５３６４２からのヒトアルテミン転写物変異体４（ＮＭ＿０５７０９０）のコード配列を含有するＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩフラグメントを、ｐＣＭＶ６−ＸＬ４におけるＢｇｌＩＩ部位にサブクローニングした。得られたプラスミドをｐＣＭＶ６−ＸＬ４−ＡＲＴＮと名付けた。安定的なトランスフェクションのためのアルテミン発現プラスミドを構築するために、２つのオリゴ物である5’-atcGCCGCCACCATGGaacttggacttggaggcctctccacgctgtcccactgcccctggc-3’（順方向、Ｋｏｚａｋ配列は大文字；配列番号４８）及び5’-ctaggccaggggcagtgggacagcgtggagaggcctccaagtccaagttccatggcggcggcgat-3’（逆方向；配列番号４９）をアニールし、Ｋｏｚａｋ配列をその５’末端で、及び、ＡｖｒＩＩオーバーハングをその３’末端で用いて、ヒトアルテミンの５’配列が形成された。これらのアニールされたオリゴ物を、ｐＣＭＶ６−ＸＬ４−ＡＲＴＮから放出された、ヒトアルテミンのコード配列の残りの部分を含有するＡｖｒＩＩ／ＡｇｅＩフラグメントと共に用いて、ｐＩＲＥＳｎｅｏ３ベクターにおけるＥｃｏＲＶとＡｇｅＩ部位の間でクローニングした。得られたプラスミドをｐＩＲＥＳｎｅｏ３−ＡＲＴＮと名付けた。
一過性のトランスフェクションのために、ｐＩＲＥＳｎｅｏ３−ＡＲＴＮのＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＣＭＶベクターにサブクローニングして、ｐＣＭＶ−ＡＲＴＮを得た。ｓｉＲＮＡのノックダウン効果を視覚化するために、アルテミンのｃＤＮＡをＥＧＦＰ発現ベクタープラスミドの３’ＵＴＲに挿入した。手短に言えば、アルテミンの完全長ｃＤＮＡを含有するＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩフラグメントをｐＣＭＶ６−ＸＬ４−ＡＲＴＮプラスミドから切り出し、挿入物及びベクターの両方のＥｃｏＲＩ部位を埋めた（filling-in）後で、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクターにおけるＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩ部位の間にサブクローニングした。２つの埋められたＥｃｏＲＩ末端をライゲーションして、３’−ＵＴＲ中に位置するアルテミンの配列によりＥＧＦＰのみが発現されるようにした後に停止コドンを作製した。簡便のため、このプラスミドをｐＥＧＦＰ−ＡＲＴＮと名付けた。
アルテミンを標的とするためのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために、ＤＮＡ配列ＡＡ（Ｎ１９）がAACTGGCCTGTACTCACTCAT（配列番号４５）として選択された。この配列は、４つのアルテミン転写物変異体全てに関し共通である。ヒトゲノム配列に対するＢＬＡＳＴ検索では、そのアルテミン遺伝子のみが標的とされるであろうことが示された。5’-gatccgctggcctgtactcactcatttcaagagaatgagtgagtacaggccagttttttggaaa-3’（順方向；配列番号５０）及び5’-agcttttccaaaaaactggcctgtactcactcattctcttgaaatgagtgagtcaggccagcg-3’（逆方向；配列番号５１）という一対のオリゴヌクレオチドを、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ２．１−Ｕ６ヒグロベクター（Ambion）へと、製造者の説明書に従ってクローニングした。得られたプラスミドをｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ＡＲＴＮと名付けた。ネガティブコントロールとして、ヒト遺伝子配列に類似する顕著な配列を何ら持たないｓｉＲＮＡをコードするためにｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ＣＫ（Ambion)を用いた。
大腸菌中で組み換えアルテミンタンパク質を製造するために、Amersham BiosciencesからのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Glutathione S-transferase：ＧＳＴ）遺伝子融合システムを用いた。１１３個のアミノ酸の成熟Ｃ末端ペプチドをコードするヒトアルテミンｃＤＮＡフラグメントをｐＧＥＸ−４Ｔ１ベクター（Amersham Biosciences）における５’ＢａｍＨＩ及び３’ＥｃｏＲＩ認識部位の間にクローニングし、プラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ１−ＡＲＴＮを作製した。これを大腸菌中でのＧＳＴ融合タンパク質の発現のために用いた。
ｐＧＥＸ−４Ｔ１−ＡＲＴＮのＢａｍＨＩフラグメントを、Ｎ末端のＨｉｓタグコード配列により、インフレームのｐＱＥ３０ベクター（Qiagen）にサブクローニングした。得られた構築物であるｐＱＥ３０−ＡＲＴＮは、１１３個のアミノ酸を含む成熟アルテミンタンパク質が後に続くMRGSHHHHHHGS（配列番号３３）のＮ末端ペプチドをコードする。各構築物に関し、挿入はＤＮＡ配列解析によって検証された。
（アルテミンを発現する安定的な細胞株の確立）
Ｓａｉｎｔ−Ｍｉｘトランスフェクション試薬（Synvolux Therapeutics B.V.、オランダ国）を用いて、細胞はｐＩＲＥＳｎｅｏ３−ＡＲＴＮプラスミドを安定的にトランスフェクトされた。コントロールとして、細胞は空のベクターであるｐＩＲＥＳｎｅｏ３も安定的にトランスフェクトされた。細胞クローンを、培地中のＧ４１８（Bio-Rad Laboratories、ＣＡ）を添加することにより選択した。トランスフェクトされた細胞株を陽性細胞クローンのプールとして作製した。確立された群におけるアルテミンの過剰発現は、ＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタンブロッティングにより確認された。
（プラスミドベースのｓｉＲＮＡによるアルテミン枯渇細胞株の確立）
アルテミンに特異的なｓｉＲＮＡの効率を試験するために、アルテミン転写物を標的化するためのｓｉＲＮＡをコードするｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ＡＲＴＮプラスミド、又は、ネガティブコントロールであるｓｉＲＮＡプラスミドであるｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ＣＫを、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター（ＥＧＦＰ）、又は、ＥＧＦＰコード配列の３’ＵＴＲ内部にアルテミンｃＤＮＡが挿入されたｐＥＧＦＰ−ＡＲＴＮプラスミドと共に用いて、アッセイを行った。プラスミドは、ＭＣＦ−７細胞に一過性にコトランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後、ＵＶ可視蛍光顕微鏡を用いてＥＧＦＰの発現を可視化した。
アルテミン枯渇細胞株を確立するために、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ＡＲＴＮプラスミド又はｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ＣＫプラスミドが安定的に細胞にトランスフェクトされた。細胞クローンは、培地中のハイグロマイシンの添加によって選択された。トランスフェクトされた細胞株を陽性細胞クローンのプールとして作製した。安定的なクローンにおけるアルテミンの発現を、ＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタンブロッティングにより測定した。
（全ＲＮＡの調製）
製造者の説明に従って、１ｍｌ／１０ｃｍ２のトリゾール試薬（Invitrogen）を用いて、培養細胞から全ＲＮＡを単離した。ジエチルピロカルボネート処理した核酸を含まない水の中にＲＮＡを再懸濁した。ＲＮＡサンプルをさらにＤＮａｓｅ Ｉにより３０分間にわたって３７℃にて処理した。２５ｍＭのＥＤＴＡを添加し、６５℃にて、１５分間インキュベーションを行い、反応を停止させた。次いで、フェノール／クロロホルム（ｐＨ５．２、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールが２５：２４：１）中での抽出と、さらなるクロロホルム抽出及びエタノール沈殿によりＲＮＡサンプルを精製した。ＲＮＡの量及び純度はＡ２６０／Ａ２８０の吸収により評価され、ＲＮＡの質はアガロースゲル電気泳動により評価された。１．６より大きいＡ２６０／Ａ２８０比を有するＲＮＡサンプルをさらなる分析のために−８０℃で保存した。
（逆転写ＰＣＲ）
遺伝子特異的プライマー（表１、さらに以下参照）を用いてＧＤＮＦリガンド（アルテミン及びパーセフィン）、ＧＦＲα１−４及びＲＥＴの存在を決定するために、一工程逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲキット（Qiagen）を使用した。ＲＴ−ＰＣＲのために、以下の手順を用いた。開始にあたり、サンプル操作のぶれを最小化するために、１μｇの全ＲＮＡを０．１μｇ／μｌに希釈した。この希釈物をＤＮａｓｅ Ｉにより１５分間にわたって処理し、次いで、ＥＤＴＡを５ｍＭまで添加して７０℃で１５分間にわたって加熱することによりＤＮａｓｅを不活化した。次いで、ＤＮａｓｅ処理されたＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲバッファーを含有するマスターカクテル、センス及びアンチセンスプライマー、ｄＮＴＰ、ＲＮａｓｅ阻害剤、逆転写酵素（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ及びＳｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ）を含有する酵素混合物及びＨｏｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと、製造者が推奨する濃度で混合し、最終容量５０μｌとした。
温度サイクルのプロトコールは以下を含む：逆転写反応のための５０℃での６０分間、次いで、ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼの変性及び活性化のための９５℃での１５分間、及び、９５℃で２０秒、５４〜６２℃で３０秒、及び７２℃で１分間というＰＣＲ増幅を３０サイクル。サイクルの最後における最後の延長は７２℃、５分間行った。β−アクチンは、０．２μｇの全ＲＮＡを内部標準として用いたＲＴ−ＰＣＲにより同様に増幅させられた。１０マイクロリットルのＲＴ−ＰＣＲ産物それぞれを、１％アガロースゲル上で分画した。ＲＴ−ＰＣＲ産物の同一性は大きさ、制限酵素の消化、及びＤＮＡ配列解析により確認された。
（ｍＲＮＡ発現アッセイ）
ｍＲＮＡ発現研究のために、各種ヒト組織からの第一鎖ｃＤＮＡ１０ｎｇからなるｃＤＮＡパネル（Primgen）を、アルテミン特異的プライマーによるＰＣＲによってスクリーニングした（表１、さらに以下参照）。製造者により推奨されるように、ヒトのベータ−２−ミクログロブリン遺伝子を、ｃＤＮＡのインプットコントロールとして使用した。各種の癌細胞株におけるアルテミンの発現もまた、ＲＴ−ＰＣＲにより測定された。細胞株は、Ａ５４９ヒト肺癌細胞；ＡＧＳヒト胃癌細胞；Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ及びＤＬＤ−１神経内分泌結腸癌細胞；ＤＵ１４５及びＰＣ３ヒト前立腺癌細胞；ＢｘＰＣ３膵臓癌；ＲＬ９５−２子宮内膜癌細胞；ＨｅｐＧ２ヒト肝癌細胞；及びＴ４７Ｄ、ＢＴ４５９、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−２３１ヒト乳癌細胞を含んでいた。
（イムノブロッティング）
細胞を氷冷リン酸緩衝生理食塩水（phosphate-buffered saline：ＰＢＳ）にて２回洗浄し、溶解バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１μｇ／ｍｌ プロテアーゼ阻害剤又はカクテル（GE Healthcare）及び０．１ｍＭ ＰＭＳＦ）中に、４°Ｃにて溶解させた。溶解液を次に超音波処理し、次いで１５，０００×ｇの１５分間にわたる４℃での遠心分離により清澄にした。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（polyacrylamide gel electrophoresis：ＰＡＧＥ）サンプルバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）；２％ＳＤＳ；２％β−メルカプトエタノール及びブロモフェノールブルー）を各サンプルに添加し、このサンプルを５分間にわたり煮沸した。サンプルを１２．５％の分離ゲルを用いた不連続ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、標準的なエレクトロブロッティングの手法を用いてニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ（登録商標） Ｃ−ｅｘｔｒａ）へと移した。５％の無脂肪乾燥ミルクの０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０含有ＰＢＳ溶液（ＰＢＳＴ）を用いて、膜を室温にて１時間ブロッキングした。ブロット物を次いで、１％の無脂肪乾燥ミルクを含有するＰＢＳＴ中の１次抗体を用いて、４℃で一晩免疫標識した。
室温にて適当な２次抗体と共にインキュベーションを行った後、製造者（GE Healthcare）により記載されるようにしてＥＣＬ ｐｌｕｓ（登録商標）ケミルミネッセンスによって免疫標識を検出した。ブロットは取り除かれ、β−アクチンに対するモノクローナル抗体によって再検出され、細胞溶解液のタンパク質が等量載せられていることを裏付けられた。ブロットは、６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．７）；２％ＳＤＳ；及び０．７％β−メルカプトエタノールを含有する溶液中、３０分間、５０℃にてインキュベーションすることにより取り除かれた。次いでブロットを、室温にてＰＢＳＴを複数回交換して３０分間洗浄した。取り除きの有効性は、ＥＣＬ ｐｌｕｓ（登録商標）への膜の再暴露により決定された。その後、ブロットを再度上述のようにブロックし、免疫標識した。
（細胞数アッセイ）
細胞を、１０％又は０．２％のＦＢＳを含有する３ｍｌの完全ＲＰＭＩ培地中、ウェルあたり５×１０４細胞となる密度で、３通りに６−ウェルプレート上に播いた。細胞をこれらの条件下で最長１０日間培養し、回収まで培地を１日おきに交換した。細胞増殖速度を比較するために、各ウェルの全細胞数を、血球計算器を用いて２日おきに計数した。細胞の生存率はトリパンブルーにより評価された。
（細胞増殖アッセイ）
細胞増殖を測定するために、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイを用いた。細胞を、１０％のＦＢＳを含有する１００μｌのＲＰＭＩ−１６４０培養培地中、５×１０３細胞／ウェルの濃度で、９６ウェル平底組織培養マイクロプレートに播いた。アッセイの日に、１０μｌのＭＴＴ標識試薬を最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌで各ウェルに加え、細胞をインキュベーター中で５時間標識した。インキュベーション期間の終了時に、培地を除去して、変換された色素を１００μｌの可溶化溶液（１０％ＳＤＳ水溶液中、０．０１Ｎ ＨＣｌ）を用いて可溶化した。プレートを次いで密閉し、３７℃で一晩置いて、紫のホルマザン結晶を完全に可溶化した。Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ ２５０ ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを用いて、変換された色素の吸収を、波長５７０ｎｍにおいて、６５０ｎｍにおけるバックグラウンドを差し引いて測定した。各処理は少なくとも３通りに行った。
ＢｒｄＵ染色キット（Zymed）を製造者の説明に従って用いたブロモデオキシウリジン（bromodeoxyuridine：ＢｒｄＵ）の取り込みにより、細胞周期の速度を測定した。手短に言えば、細胞を、完全培地中で、ガラス製のカバースリップ上の６ウェルプレート中に播き、無血清培地中で血清が欠乏した状態で１８時間まで一晩インキュベートした。次いで細胞を、無血清培地中１０μＭ濃度のＢｒｄＵにて４５分間、パルス標識した。固定、変性、及びブロッキングの後、ビオチン化した抗ＢｒｄＵマウスモノクローナル抗体と共に細胞をインキュベートした。細胞を次いでストレプトアビジン−ペルオキシダーゼと共にインキュベートし、その後、着色のために、過酸化水素の存在下でジアミノベンジジン（diaminobenzidine：ＤＡＢ）色原体溶液と共にインキュベートした。細胞核はヘマトキシリンを用いて対比染色された。核が暗褐色に染色された細胞をＢｒｄＵ標識された細胞として計数した。定量のため、１つのカバースリップあたり１０個のランダムな視野（倍率４０）を顕微鏡撮影により記録した。細胞核の総数に対するＢｒｄＵ陽性の細胞核の比率（％）を計算した。カバースリップあたり最低でも５００個の細胞を計数した。
（アポトーシスアッセイ）
細胞を６−ウェルプレート上に播き、２４時間血清が枯渇した状態にした。アポトーシスを検出するために、複数の方法を使用した。第一のセットの実験において、アポトーシス細胞死は、核親和性のＨｏｅｃｈｓｔ（登録商標） ３３２５８を用いた細胞ＤＮＡ染色パターンの蛍光顕微鏡分析により測定された（Del, B. G., Z. Darzynkiewicz, C. Degraef, R. Mosselmans, D. Fokan, and P. Galand. 1999. Comparison of methods based on annexin-V binding, DNA content or TUNEL for evaluating cell death in HL-60 and adherent MCF-7 cells. Cell Prolif. 32:25-37）。手短に言えば、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．６％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０にて浸透性を与え、Ｈｏｅｃｈｓｔ（登録商標） ３３２５８（1:10,000; Molecular Probes, Eugene, OR）にて室温、５分間染色した。ＰＢＳでの洗浄後、核の形態を、ＵＶ可視蛍光顕微鏡（４０倍対物レンズ）下で調べた。核凝縮及び断片化等のアポトーシスの核の特徴を有する細胞をアポトーシスとしてスコア化した。
第二のセットの実験においては、アポトーシス細胞は、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＬＵＯＳ染色キット（Roche Applied Science）を製造者の説明書に従って用い、蛍光イソチアシアネート包合アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（propidium iodide：ＰＩ）により染色された。サンプルは、蛍光顕微鏡下にホスファチジルセリン（phosphatidylserine：ＰＳ）の外在化について解析された。早期の及び後期のアポトーシスを決定するためにアネキシンＶ及びＰＩによる組合せ染色が用いられた。細胞は、それらがアネキシンＶ陽性かつＰＩ陰性の場合に早期のアポトーシスであると考えられ、また、アネキシンＶ及びＰＩの両方に陽性の場合、後期のアポトーシスであると考えられた。各処理について、２００−３００個の細胞を調べた。
（アノイキスアッセイ）
通常の細胞培養用６ウェルプレートに、Folkman及びMosconaにより報告された手順に従って、ポリＨＥＭＡのフィルムをコーティングした（Folkman, J. and Moscona, A. (1978). Role of cell shape in growth control. Nature 278, 345-349）。手短に言えば、１０ｍｇ／ｍｌのポリＨＥＭＡの９５％エタノール溶液を一晩混合した。これを８００×ｇで遠心分離して未溶解粒子を除去した。得られた溶液を培養プレート中に入れ、組織培養フード中で乾燥させた。これを１回繰り返した。使用前に、コーティングされた皿をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて２回洗浄した。
懸濁培養のために、通常のプラスチック製組織培養フラスコ上の近コンフルエント細胞（near-confluent cells）をトリプシン処理し、単一細胞懸濁液を製造した。１０％ＦＢＳの添加により、トリプシンを不活化した。トリプシン処理された細胞を次いで計数し、ポリＨＥＭＡでコーティングした６ウェルの皿を用いて、２ｍｌの生育培地中、ウェルあたり５０，０００細胞の密度で蒔いた。細胞に、新鮮な培地１ｍｌを１日おきに与えた。示された日に、細胞をピペッティングにより回収し、ＰＢＳで洗浄して、細胞塊を除去するようにトリプシンで処理を行った。トリパンブルー色素排除法を用いて、血球計算器において生存能力を有する細胞を計数した。
（コロニー形成に関する軟寒天アッセイ）
軟寒天コロニー形成アッセイのために、最初に１層の寒天（０．５％）でカバーされた６−ウェルプレート中に細胞を培養した。細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地中で生育させた。中間層は、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地中０．３５％の寒天中に５×１０３個の細胞を含んでいた。アガロースゲルの乾燥を防ぐために、表層として培地を加えた。プレートを加湿したインキュベーター中、３７℃にて１４日間インキュベートした。この後、細胞を、０．５ｍｌの０．００５％クリスタルバイオレットの蒸留水溶液により１時間染色し、水中で２時間変色させた。コロニーを検査し、写真撮影を行った。
（軟寒天生育アッセイ）
軟寒天コロニー形成アッセイを行うために、ベースの寒天層として、血清含有培地中０．５％アガロース５０μＬを９６ウェル平底マイクロプレートの各ウェルに蒔いた。次に、血清含有培地中０．３５％のアガロースの混合液１００μｌ中５×１０３個の細胞を、ベースの層の上に蒔いた。続いて、アガロースゲルの乾燥を防ぐために、１００μｌの培地を添加した。抗体治療のために、細胞を抗体に完全に曝すことを確実にするために、示された濃度の抗体を最上部の寒天層及びへ培養培地と添加した。プレートを、加湿したインキュベーター中で３７℃にてインキュベートした。抗体を含む最上部の培養培地は３日ごとに交換した。１０日後、２０μｌの５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ（Sigma Chemical Company, St Louis, MO, USA）を各ウェルに添加し、３７℃、４時間インキュベートして、次いで１００μｌの酸性化溶菌バッファー（１０％ＳＤＳ中、０．０１％ＨＣｌ）を添加した。均質組成物を確かにするためにプレートを４２℃でインキュベートした。プレートを短時間震盪し、次いで、Ｓｙｎｅｒｇｙ（登録商標） ２ Ｍｕｌｔｉ−Ｍｏｄｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（BioTek instruments, Inc., Vermont, USA）を用いて、５９５ｎｍ（試験波長）及び６９０ｎｍ（基準波長）において読み取った。
（創傷治癒アッセイ）
インビトロ創傷治癒アッセイのために、細胞を、単層として、通常の細胞培養皿上にコンフルエントになるまで、生育させた。コンフルエントな層に、滅菌ピペットチップで４ｍｍのこすり傷をつけた。はがされた細胞をＰＢＳで３回洗浄することにより取り出し、残りの細胞を新鮮な培養培地に浸した。培地を毎日交換した。創傷の端部を定期的に写真撮影した。
（細胞の移動及び侵入）
細胞の移動は、ポリカーボネート膜（組織培養処理済み、直径６．５ｍｍ、厚さ１０μｍ、８μｍ孔、トランスウェル（登録商標）；Costar, Cambridge，ＭＡ）を含有する改変ボイデンチャンバー（Boyden chamber）を用いて、先に記載されるように（Doerr, M. E. and J. I. Jones. 1996. The roles of integrins and extracellular matrix proteins in the insulin-like growth factor I-stimulated chemotaxis of human breast cancer cells. J. Biol. Chem. 271 :2443- 2447）、若干の改変を加えてアッセイされた。製造者の説明書に従って膜上にマトリゲル（登録商標）の層をポリマー化したことを除けば、同様のプロトコールを用いて、細胞侵入アッセイを行った。これは、細胞を上部のウェルへと加える前に行われた。
移動／侵入アッセイのための単一細胞懸濁液を確保するために、近コンフルエント細胞をアッセイ前日にトリプシン処理し、１８Ｇのニードルに複数回通し、アッセイ前に少なくとも１２時間インキュベートした。翌日、細胞をＰＢＳ中５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）により回収し、２回洗浄し、次いで無血清ＲＰＭＩ／ＢＳＡ中に懸濁させた。容量１００μｌの細胞（１．０×１０５）を、トランスウェル（登録商標）のインサートに負荷した。下側のチャンバを、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ６００μｌで満たした。負荷チャンバを、５％ＣＯ２の加湿空気中、３７℃のインキュベーター中に置いた。２４時間後、インサートを取り出し、次いで細胞を４％パラホルムアルデヒドを用いて固定した。上側表面の細胞（及びマトリゲル（登録商標））を綿棒（cotton swab）でこすることにより取り出した。膜の下表面に移動した細胞をクリスタルバイオレットで染色し、顕微鏡により同定した。
細胞の計数は、円形のフィルターの中央を横切る１列上の６つの格子中の全ての細胞を計数することによって得られた。これは、合計倍率１００×にて、顕微鏡下、Lovins Microslide field finder（Gurley, Troy, NY）を用いてなされた。それぞれの膜の代表的な視野から写真を撮影した。示される全てのデータは、３通りの分析の平均±標準偏差（standard deviation：ＳＤ）である。
（マトリゲル（登録商標）内部での３Ｄ培養）
３Ｄマトリゲル（登録商標）培養のために、単層成育細胞をトリプシン処理により回収し、完全培地中に入れて、パスツールピペットを複数回通過させることにより単一細胞懸濁液に分離した。この後、５，０００個の細胞を含有する５０μｌの完全培地を、２０％ＦＢＳを含む完全培地で１：１希釈した成長因子低減化マトリゲル（登録商標）（Becton Dickinson, Bedford, MA）１５０μｌに加えた。これを緩やかに混合し、マトリゲル（登録商標）を予めコーティングされたＮｕｎｃ社製の４ウェルのスライド上に載せ、マトリゲル（登録商標）が固化するまで３７℃でインキュベートした。細胞を次いで完全培地でカバーし、５％ＣＯ２下で、３７℃、２４日まで生育させて、培地を２日おきに交換した。光学顕微鏡を使用し、ランダムに選択した視野におけるオルガノイドの形成を計数した。
（リアルタイムＰＣＲ及び逆転写ＰＣＲ）
リアルタイムＰＣＲのために、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ｆｏｒ ｑＲＴ−ＰＣＲ（Invitrogen, CA）を製造者の説明書に従って用いて、全ＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。ＡＢＩ７７００（登録商標）リアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystems, USA）をこの分析のために用いた。ゲノム周辺に分布する複数の遺伝子マーカー及び３個のハウスキーピング遺伝子を、ＳＹＢＲ（登録商標） ＧｒｅｅｎＥＲ（登録商標） ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ｆｏｒ ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）（Invitrogen, CA）を用いるリアルタイムＰＣＲ分析に用いた。プライマーの配列情報を表２に列挙するので、以下参照されたい。反応のために、試験遺伝子及び内因性コントロール遺伝子の両方からの５ｎｇの全ｃＤＮＡを、ＳＹＢＲ（登録商標） ＧｒｅｅｎＥＲ（登録商標） ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ｆｏｒ ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）及び２００ｎＭの各プライマーを含有する２０μｌの反応混合物に添加した。９５℃、１０分間の最初の変性、続いて９５℃、２０秒間、及び６０℃、３０秒間の４０サイクルという２工程の増幅プログラムを用いて、３８４ウェルプレート中の各マーカーに対し、３通りの反応を行った。増幅の終了時に、９５℃、１分間の変性及び５５℃、１分間の再アニーリングからなる溶融曲線解析工程を行った。
未処理ｃＤＮＡの連続的な５倍希釈を用いて、各実験プレートから標準曲線を作り出した。各反応物のＣｔ値の相乗平均を計算した。式Ｅ＝１０（−１／傾き）に従って増幅効率が計算され（Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM (1996). Real time quantitative PCR. Genome Res 6: 986-94）、全遺伝子マーカーについて、９０〜１０４％の範囲であった。溶融曲線解析によって確認されたように、非特異的な増幅又はプライマーダイマーは、いずれの反応物中にも観察されなかった。マーカー間の潜在的な差異に対する補正を行うために、効率（Ｅ）値に基づいて相対的発現を計算し、一群のハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチン、ＨＰＲＴ、及びＧＡＰＤＨに対し規格化した。（例えば、相対的発現＝２−（Ｃｔ，サンプル−Ｃｔ，ＨＫＧ）−（Ｃｔ，コントロール−Ｃｔ，ＨＫＧ））及び対照に対するサンプルのＣｔの差（Δ）（ΔＤＣｔサンプル−コントロール）（例えば相対的発現＝２−ｄｄＣｔ）。
（細菌中での組み換えヒトアルテミンタンパク質の産生）
プラスミドｐＱＥ３０−ＡＲＴＮにより形質転換された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ（登録商標） Ｂ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳコンピテント細胞を、３７℃にて、Ａ６００が０．５に到達するまで、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有する１リットルのＬＢ中で生育させた。次いで、タンパク質の発現を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（isopropyl-β-D- thiogalactopyranoside：ＩＰＴＧ）を終濃度０．２ｍＭとなるように加えて誘導し、培養物をさらに５〜６時間にわたってインキュベートした。細胞を回収し、ペレットを５０ｍｌの２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム中に再懸濁させた。細胞を超音波処理により破砕し、続いて、１０，０００ｇ、３０分間、４℃にて遠心分離して、封入体を単離した。封入体を２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡ（２回）により洗浄し、次いで、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄して界面活性剤及びＥＤＴＡを除去した。
続いて、５０ｍｌの溶解バッファー（６Ｍの塩酸グアニジン、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０）中に封入体を可溶化し、４℃で一晩震盪した。１０，０００ｇ、３０分間、４℃にて遠心分離後、上清を５０％スラリーのＮｉ−ＮＴＡ（Qiagen）４ｍＬと混合し、４℃１時間にわたって震盪した。次いで可溶化液−樹脂混合物を空のカラムに負荷し、続いて２５ｍＭのイミダゾール２０ｍＬ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭのＮａＣｌ、８Ｍの尿素（ｐＨ８）により洗浄した。２５０ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、８Ｍの尿素（ｐＨ８．０）を含有する１ｍｌの溶出バッファーを用いて、タンパク質を溶出した。画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、クマシーブルー染色により視覚化した。精製されたタンパク質の収率をブラッドフォードアッセイにより推定した。
（ウサギポリクローナル抗体の産生）
Ｂｅａｎにより記載されたようにして、ウサギへの免疫原の皮下及び筋肉内注射を用いることによってヒトアルテミンに対するポリクローナル抗血清が作り出された（Eric S. Bean (2001) Polyclonal Antibodies. In: Basic Methods in Antibody Production and Characterization antibodies. Howard, G. and Bethel D. (ed.), CRC Press, 5:31-50, 2000）。標準的な方法論を用いて、抗体は抗血清から親和性精製された。
（アルテミンに対するニワトリポリクローナル抗体の産生）
免疫化：０日目に、フロイント完全アジュバントにより、ニワトリを組み換えヒトアルテミンに免疫を持つようにし（〜０．５ｍｇ／ニワトリ）、９、２９及び３９日目に再度追加免疫された（〜０．１７ｍｇ／ニワトリ）。免疫化前及び免疫化後に卵を回収した。
卵黄からのＩｇＹ抽出：卵を回収し、卵黄を分離しプールした。精製は４℃で行われた。卵黄を希釈し、遠心分離した。ＩｇＹを清澄な上清から沈殿させた。沈殿を遠心分離により分離し、ＰＢＳ中に溶解させた。免疫化前及び免疫化後のニワトリＩｇＹサンプルを濾過滅菌し、終濃度〜５ｍｇ／ｍｌ、純度９０％以上のものを得て、４℃にて保存した。
結果を以下に詳述する。
Figure 2010534195
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（実施例２：結果）
（アルテミンはヒト乳癌細胞に対し発癌性である）
（ヒト組織及び癌細胞株におけるアルテミンの発現）
乳癌（mammalian carcinoma）ＭＣＦ−７細胞中でのアルテミン及びパーセフィンの発現をＲＴ−ＰＣＲにより分析した。図１Ａに示されるように、ＭＣＦ−７細胞中にアルテミン及びパーセフィンの固有のバンドが観察された。各種のヒト組織からの市販の一群のｃＤＮＡを用いることによって、正常な組織中のアルテミンの発現プロファイルを究明した。ヒトアルテミンに特異的なプライマーを用いたＰＣＲによる、ｍＲＮＡの発現に関するスクリーニングにより、アルテミン遺伝子が多くの非神経組織中に発現されることが示された（図１Ｂ）。最も高い発現は小脳で観察され、次いで正常な結腸であった。発現は、前立腺、子宮、胃、腎臓、気管、胎児脳、脂肪及び軟骨中でも検出された。アルテミンの発現は、心臓、骨格筋、小腸、膵臓、胸腺、皮膚、肝臓、胎児肝臓、肺、脳、脊髄、胎盤、副腎、刺激末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、膵臓、唾液腺、甲状腺、臍帯、卵巣、又はＰＢＬにおいて観察されなかった。
多くのヒト癌細胞株中でのアルテミンの発現も、ＲＴ−ＰＣＲによって調べられた。図１Ｃに示すように、アルテミンは試験された全ての癌細胞株中で発現された。より高い発現は、ＤＬＤ−１結腸、ＰＣ３前立腺及びＲＬ９５−２子宮内膜癌細胞株中で検出された。中程度の発現は、ＢｘＰＣ３膵臓腫瘍細胞株、及び４つの乳癌細胞株（そのうちの２つ（Ｔ４７Ｄ及びＭＣＦ−７）はエストロゲン受容体陽性であり、２つ（ＢＴ５４９及びＭＤＡ−２３１）はエストロゲン受容体陰性である）中で観察された。わずかな発現は、Ａ５４９肺、ＡＧＳ胃、Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ結腸、ＤＵ１４５前立腺及びＨｅｐＧ２肝癌細胞株中で観察された。
ＧＦＲαアイソフォーム及びＲＥＴの発現も、ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ及びＢＴ５４９乳癌細胞において、ＲＴ−ＰＣＲによって究明された（図１Ｄ）。ＧＦＲα１及び３、及びＲＥＴのＭＣＦ−７細胞中での発現は容易に検出されたが、ＧＦＲα２は非常に低いレベルでしか発現されず、その発現を検出するために、より多くのサイクルを必要とした。図１Ｄにおいて観察されるように、３つの細胞株はいずれも、検出可能なレベルでＧＦＲα４を発現しなかった。Ｔ４７Ｄ及びＢＴ５４９細胞中でのこれらの受容体の発現パターンは、Ｔ４７Ｄがはるかにより低いレベルのＧＦＲα１の発現を示し、ＢＴ５４９が顕著により高いＧＦＲα２の発現を示すことを除いて、ＭＣＦ−７におけるものと非常に似通っていた。
（乳癌細胞数におけるアルテミンの強制的発現の効果）
乳癌細胞中でのアルテミンの発現の機能的重要性を究明するために、細胞モデル系を確立した。ＭＣＦ−７細胞に、アルテミン発現プラスミドｐＩＲＥＳｎｅｏ３−ＡＲＴＮ（ＭＣＦ７−ＡＲＴＮと名付けた）又は、空ベクターｐＩＲＥＳｎｅｏ３（ＭＣＦ７−Ｖｅｃと名付けた）を安定的にトランスフェクトした。ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ細胞中でのアルテミンの強制的発現を、コントロールＭＣＦ７−Ｖｅｃ細胞と比較して、ｍＲＮＡレベル（図２Ａ）及びタンパク質レベル（図２Ｂ、中段の図）で検証した。アルテミンの強制的発現はまた、調整培地中でのアルテミンタンパク質を増加させた（図２Ｂ、上段図）。
本発明者らは、アルテミンの強制的発現が単層培養におけるトータルの乳癌細胞数に影響するか否かをまず究明した。図２Ｃにおいて観察されるように、ＭＣＦ−７細胞中のアルテミンの強制的発現は、血清を十分に与えた条件においては、８日間にわたり顕著な細胞数の増加を示さなかった。しかしながら、血清が減少した（０．２％）培地では、ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ細胞は、ＭＣＦ７−Ｖｅｃ細胞に比較して数が顕著に増加した（図２Ｄ）。ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ細胞の総数は、８日間後、ＭＣＦ７−Ｖｅｃ細胞の総数より２３％多かった（ｐ＜０．０５）。乳癌細胞のＳ期へのエントリーにおけるアルテミンの強制的発現の効果は、ＢｒｄＵの取り込みにより評価された。図２Ｅにおいて観察されるように、ＭＣＦ−７細胞中のアルテミンの強制的発現は、ＢｒｄＵ取り込みを変化させなかった。
（アルテミンの強制的発現は細胞生存率を増大させる）
血清を与えない条件下でのＭＣＦ−７細胞の生存におけるアルテミンの強制的発現の効果を、２つの異なる方法を用いて調べた。Ｈｏｅｃｈｓｔ（登録商標）３３２５８色素によるアポトーシスの評価（図２Ｆ）は、ＭＣＦ７−Ｖｅｃ細胞に対するＭＣＦ７−ＡＲＴＮでのアポトーシスが顕著に低減していることを証明した（ｐ＜０．０５）。ホスファチジルセリンの外在化は、アポトーシスの固有のマーカーである。従って、蛍光イソチアシアネート包合アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて細胞を染色した。図２Ｇにおいて観察されるように、ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ細胞は、コントロールＭＣＦ７−Ｖｅｃ細胞と比較して、血清枯渇により誘導されるアポトーシスに対し抵抗性であった。アポトーシス細胞のうち、ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ細胞の２８％は早期アポトーシス（アネキシンＶ陽性かつＰＩ陰性の細胞）であり、それに対しＭＣＦ７−Ｖｅｃ細胞の４６％は、早期アポトーシスからのアルテミン保護細胞を示す。
（アルテミンの強制的発現はＢＣＬ２をアップレギュレートする）
細胞増殖及び生存に関与する鍵遺伝子の相対的発現レベルにおけるＡＲＴＮの効果を評価するために、リアルタイムＰＣＲ（表３、上述参照）を行った。アルテミンの強制的発現は、サイクリンＤ１及びＥ１、ＡＴＭ、ＣＤＣ２５Ａ及びＣＤＫ２及び４を含むほとんどの細胞周期に関連したマーカーの発現をごくわずか変化させたに過ぎなかったが、サイクリン依存性キナーゼインヒビター−２Ａ（cyclin-dependent kinase inhibitor-2A：ＣＤＫＮ２Ａ）の発現を顕著に減少させた。ｐ１６（ＩＮＫ４ａ）をコードするＣＤＫＮ２Ａは、サイクリン依存性キナーゼＣＤＫ４及びＣＤＫ６によるＲｂタンパク質のリン酸化を阻害することにより、Ｇ１細胞周期の停止を誘導する腫瘍抑制遺伝子として認識されている（Stott et al, 1998）。
ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ細胞におけるＢＣＬ２の発現は、コントロールＭＣＦ７−Ｖｅｃ細胞と比較して８．４倍増大した（表３、上述参照）。ＢＣＬ２は十分に記述されている生存遺伝子である（Zinkel et al, 2006）。アルテミンによって顕著に増加する別の遺伝子は、テロメラーゼ−逆転写酵素（telomerase- reverse transcriptase：ＴＥＲＴ）であった。ＴＥＲＴは、不死化におけるその役割に加えて、アポトーシスを抑制もする（Zhang et al, 2003）。γ−シヌクレイン（ＳＮＣＧ、乳癌−特異的遺伝子１とも称される）がアルテミンにより１．６７倍アップレギュレートされることは特筆に価する。ＳＮＣＧは腫瘍細胞をアポトーシスから保護し、細胞運動及び転移を刺激することが観察されている（Wu et al. , 2003）。
（アルテミンの強制的発現は足場非依存性増殖を促進する）
足場非依存性増殖におけるアルテミンの強制的発現の効果を、懸濁培養液中、及び、軟寒天中のコロニー形成により調べた。図３Ａにおいて観察されるように、ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ細胞は、懸濁培養液中で、コントロールＭＣＦ７−Ｖｅｃ細胞よりも速く生育した。ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ細胞の総数は、１０日後で、ＭＣＦ７−Ｖｅｃ細胞の総数よりも４２％多かった（ｐ＜０．０１）。ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ細胞を軟寒天中に蒔いた時に、形成されたコロニー数は、ＭＣＦ７−Ｖｅｃ細胞と比較して２倍顕著に増加した（図３Ｂ）。
ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ細胞及びＭＣＦ７−Ｖｅｃコントロール細胞を、３Ｄマトリゲル（登録商標）中でも培養した。軟寒天中のコロニー形成と調和して、ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ細胞に関し、ＭＣＦ７−Ｖｅｃ細胞と比較してコロニー数の増加が観察された（データ非掲載）。さらに、マトリゲル（登録商標）中でＭＣＦ７−ＡＲＴＮ細胞により形成されるコロニーは、ＭＣＦ７−Ｖｅｃ細胞により形成されるものと比較して、より大型で、コロニー中の細胞はより高い運動性及び侵入性の特徴を示した（図３Ｃ）。一方、ＭＣＦ７−Ｖｅｃ細胞は、限局性のコロニーを生じさせ、コロニーの大半の部分から拡がるＭＣＦ７−ＡＲＴＮ細胞の多数であり、アルテミンが局所的な侵入的挙動を促進することを示唆した。
（アルテミンの強制的発現は細胞の移動及び侵入を増進する）
糸状アクチンを視覚化するために、蛍光顕微鏡を用いた（図３Ｄ）。これは、ＭＣＦ７−Ｖｅｃ細胞が、典型的な上皮性の表現型である際立った細胞と細胞との接触を有する塊に生育することを示し、一方、ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ細胞は散在性でほとんど細胞間の接触を示さなかった。従って、細胞の移動性におけるアルテミンの効果は、まず標準的なトランスウェル（登録商標）チャンバーを用いることによって評価され、続いて創傷治癒アッセイにより評価した。本発明者らは、２４時間の期間にわたり、コントロールＭＣＦ−７−Ｖｅｃ細胞より２倍多くのＭＣＦ７−ＡＲＴＮ細胞が、トランスウェル（登録商標）インサートを通じて移動することを見出した（図３Ｅ）。
ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ細胞の侵入能力を、マトリゲル（登録商標）をコーティングされたトランスウェル（登録商標）チャンバーを用いてさらに評価した。ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ細胞の侵入は、４８時間の期間にわたり、コントロールＭＣＦ７−Ｖｅｃ細胞と比較して２倍増進された（図３Ｅ）。細胞移動をモニタリングするための別の方法として、創傷治癒アッセイを行った。図３Ｆにおいて観察されるように、ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ細胞の単層培養が７２時間以内の完全な創傷治癒を証明したのに対し、ＭＣＦ７−Ｖｅｃ細胞はそうでなかった。従って、アルテミンの強制的発現は、ＭＣＦ−７細胞の移動性及び侵入能力を増進する。この知見と調和して、リアルタイムＰＣＲにより、アルテミンの強制的発現は、ＭＭＰ１（マトリクスメタロプロテアーゼ１；７．６倍）、ＰＬＡＵ（３．８倍）及びＳＥＲＰＩＮＥ１（３．１倍）（表３、上述参照）を含む侵入及び転移に関与する多数の遺伝子の発現を顕著に増大させることが証明された。
（アルテミンの強制的発現は、インビボでＭＣＦ−７腫瘍異種移植片の生育を促進する）
上述のインビトロ研究からの証拠は、アルテミンに関する発癌的な役割を明白に示唆する。本発明者らは、アルテミンがインビボで腫瘍原性を増進し得るか否かを究明したいと考えた。このために、異種移植片モデルを用い、それによりＭＣＦ−７細胞を、免疫不全ヌードマウスの乳腺脂肪帯（mammary fat pad）に注射した。ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ及びＭＣＦ７−Ｖｅｃ細胞の両方が、明白で測定可能な腫瘍を形成した。しかしながら、ＭＣＦ７−Ｖｅｃコントロール細胞と比較して、ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ細胞により大きな腫瘍体積が観察された（図４Ａ）。統計学的に有意な腫瘍体積の増大が２週間で達成された（ｐ＝０．０２３）。ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ細胞により形成された腫瘍は、６週半後に、ＭＣＦ７−Ｖｅｃ細胞により形成された腫瘍の２倍以上の大きさであった。
ＭＣＦ−７は、そのエストロゲン依存的な生育に反映されるように、かなり十分に分化した腫瘍細胞株である。ヘマトキシリン及びエオシン組織学により、ＭＣＦ７−Ｖｅｃ細胞により形成された腫瘍が十分に分化されていることが証明された（図４Ｂ左側）が、一方、ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ細胞により形成されたものは分化特性に乏しいことが示された（図４Ｂ右側）。ＭＣＦ７−Ｖｅｃコントロール細胞は、通常に形状化されかつ均質な核、及び明確な細胞質境界を示した。対照的に、ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ細胞は、不規則で高クロマチン性の核、ならびに不明確な細胞質境界及びわずかな細胞質を有する小型の紡錘形の多形性の細胞を形成した。
腫瘍内の増殖及びアポトーシスを定量するために、腫瘍切片上にＢｒｄＵ取り込み及びＴＵＮＥＬ標識を行った。ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ腫瘍は、ＭＣＦ７−Ｖｅｃ腫瘍と比較して、ＢｒｄＵ標識された核の比率（％）がより高いことを示した（図４Ｃ）。ＴＵＮＥＬ標識により測定されたアポトーシスのレベルも、アルテミンが腫瘍細胞の生存を増進することを証明した。ＭＣＦ７−Ｖｅｃ腫瘍と比較して、ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ腫瘍におけるＴＵＮＥＬ−陽性細胞の数は顕著に少なかった（図４Ｄ）。
（アルテミンの強制的発現はＴ４７Ｄ及びＢＴ５４９細胞の足場非依存性増殖、細胞移動及び侵入を増進する）
本発明者らは、エストロゲン受容体陽性のＴ４７Ｄ、及び、エストロゲン受容体陰性のＢＴ５４９細胞中で、アルテミンの発現を安定的に強制した（図５Ａ）。図５Ｂ−Ｄにおいて観察されるように、アルテミンの強制的発現を伴うＴ４７Ｄ−ＡＲＴＮ及びＢＴ５４９−ＡＲＴＮ細胞はいずれも、コントロールＴ４７Ｄ−Ｖｅｃ及びＢＴ５４９−Ｖｅｃ細胞とそれぞれ比較して、軟寒天中のコロニー形成、及び、トランスウェル（登録商標）アッセイにおける移動及び侵入において、顕著な増加を示した。効果は、Ｔ４７Ｄ細胞中でよりもＢＴ５４９細胞中で、より顕著であった。Ｔ４７Ｄ−ＡＲＴＮ細胞は軟寒天中でＴ４７Ｄ−Ｖｅｃコントロール細胞よりも３５％多くコロニーを形成し、一方、ＢＴ５４９−ＡＲＴＮ細胞はＢＴ−５４９−Ｖｅｃコントロール細胞よりも６４％多くコロニーを形成した（図５Ｂ）。Ｔ４７Ｄ−Ｖｅｃ細胞と比較して、Ｔ４７Ｄ−ＡＲＴＮ細胞は、３７及び７４％多い移動及び侵入をそれぞれ示した（図５Ｃ）。しかしながら、ＢＴ５４９−Ｖｅｃコントロール細胞と比較して、ＢＴ５４９−ＡＲＴＮ細胞は、２７２及び１６９％のより多い移動及び侵入をそれぞれ示した（図５Ｄ）。さらに、アルテミンの強制的発現を伴うＢＴ５４９細胞は、コントロール細胞と比較してより間葉系の形態を呈した（図５Ｅ）。
（ｓｉＲＮＡによる内因性アルテミンの枯渇は、アポトーシス細胞死を顕著に増加させる）
本発明者らは、次に、プラスミド ベクターをベースとするｓｉＲＮＡによって内因性アルテミンを枯渇させ、ＭＣＦ−７細胞の挙動を調べた。ｓｉＲＮＡのノックダウン効率を究明するため、アルテミンのｃＤＮＡを、ＥＧＦＰ発現ベクターｐＥＧＦＰの３’ＵＴＲ内に挿入した（ｐＥＧＦＰ−ＡＲＴＮ）。アルテミン転写物を標的とするｓｉＲＮＡの効率を、蛍光顕微鏡を用いたＥＧＦＰタンパク質の発現レベルを試験することにより究明した。図６Ａにおいて観察されるように、アルテミン特異的ｓｉＲＮＡ（ＡＲＴＮ−ＲＮＡｉ）構築物は、ｓｉＲＮＡネガティブコントロール（ＣＫ−ＲＮＡｉ）と比較して、ｐＥＧＦＰ−ＡＲＴＮを一過性にトランスフェクトされた細胞におけるＥＧＦＰの蛍光を効果的に低減させた。ＡＲＴＮ−ＲＮＡｉは、ＣＫ−ＲＮＡｉと比較して、ｐＥＧＦＰトランスフェクト細胞中でのＥＧＦＰ発現を減少させなかった。
それぞれアルテミン特異的ｓｉＲＮＡプラスミド（ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ＡＲＴＮ）又はネガティブコントロールプラスミド（ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ＣＫ）のトランスフェクションにより、２つの安定的なＭＣＦ−７細胞株、ＭＣＦ７−ｓｉＲＮＡ及びＭＣＦ７−ＣＫを確立した。これらの細胞株中でのアルテミン発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタンブロットの両方により究明した。図６Ｂにおいて観察されるように、内因性アルテミンの発現は、ＭＣＦ７−ＣＫコントロール細胞と比較して、ｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方において、ＭＣＦ７−ｓｉＲＮＡ細胞中で減少した。
ｓｉＲＮＡによる内因性アルテミンの枯渇は、血清が十分に与えられた条件下ではＭＣＦ−７細胞の数に影響しなかったが、血清が減少した（０．２％）条件下では細胞数を顕著に減少させた（２０％）（図６Ｃ及びＤ）。予測通り、ｓｉＲＮＡによる内因性アルテミンの枯渇は、血清の枯渇により誘導されるアポトーシス細胞死を顕著に増大させた。Ｈｏｅｃｈｓｔ（登録商標） ３３２５８視覚化後の核の形態に基づいて、ＭＣＦ７−ｓｉＲＮＡ細胞の２０％に対し、わずか１３％のＭＣＦ７−ＣＫ細胞のみが、２４時間の血清枯渇後にアポトーシス性であると同定された（図６Ｅ）。同様の倍率の変化がアネキシン−Ｖ標識により観察された。図６Ｆにおいて見られるように、ＭＣＦ７−ｓｉＲＮＡ構築物に対する、ＭＣＦ７−ＣＫ構築物を伴うアポトーシス細胞の比率（％）は、アルテミンの枯渇の結果として、２倍の増加を示した。アポトーシス細胞のうち、早期及び後期のアポトーシスの比率は、ＭＣＦ７−ｓｉＲＮＡ細胞については約１対３．５５（２９％対７１％）であり；ＭＣＦ７−ＣＫ細胞については１対２．４５（２２％対７８％）であった。これは、内因性アルテミンの枯渇が早期アポトーシス細胞を優先的に増大させることをひとたび示唆した。
（ｓｉＲＮＡによる内因性アルテミンの枯渇はＭＣＦ−７細胞における足場非依存性増殖を顕著に阻害する）
本発明者らは、ＭＣＦ−７細胞におけるアルテミンのｓｉＲＮＡ介在枯渇が、これらの細胞における足場非依存性増殖を阻害したことも見出した。図７Ａにおいて観察されるように、ＭＣＦ７−ｓｉＲＮＡ細胞による軟寒天中で形成されるコロニーの数は、ＭＣＦ７−ＣＫコントロール細胞と比較して顕著に減少した（２４％）。３Ｄマトリゲル（登録商標）中で生育させたとき、ＭＣＦ７−ＣＫ細胞と比較してＭＣＦ７−ｓｉＲＮＡ細胞についてコロニー数の減少も観察された（データ非掲載）。さらに、マトリゲル（登録商標）中のＭＣＦ７−ｓｉＲＮＡ細胞により形成されるコロニーの形態は、ＭＣＦ７−ＣＫ細胞のものとは異なっていた（図７Ｂ）。アルテミン枯渇ＭＣＦ７−ｓｉＲＮＡ細胞は、萎縮した外観を伴うより小さなコロニーを形成し、一方、ＭＣＦ７−ＣＫコントロール細胞はより大きく、よりボリュームのあるコロニーを形成した。
（ｓｉＲＮＡによる内因性アルテミンの枯渇は細胞移動及び侵入を損なう）
本発明者らは、内因性アルテミンの枯渇がＭＣＦ−７細胞の移動／浸入を損なうか否かを評価した。図７Ｃにおいて観察されるように、トランスウェル（登録商標）インサートの非コーティング（移動）又はマトリゲル（登録商標）コーティングした（侵入）細孔性フィルターを通過して移動する細胞の数は、ＭＣＦ７−ＣＫコントロール細胞と比較して、アルテミン枯渇ＭＣＦ７−ｓｉＲＮＡ細胞において顕著に減少した。アルテミン枯渇ＭＣＦ７−ｓｉＲＮＡ細胞はまた、創傷誘導移動を顕著に減少させることを示した。図７Ｄにおいて示されるように、ＭＣＦ７−ｓｉＲＮＡの単層中に作り出された創傷は、ＭＣＦ７−ＣＫ細胞よりもゆっくりふさがった。
（細菌中での組み換えヒトアルテミンタンパク質の産生）
ｐＱＥ３０−ＡＲＴＮプラスミドを用いて、細菌中で、成熟アルテミンタンパク質配列をＨｉｓ−融合体（Ｈｉｓ−アルテミン）として発現させた。Ｈｉｓ−アルテミン融合体の産生は、ＩＰＴＧの添加によりうまく誘導された（図８Ａ）。タンパク質の同一性は、ヤギ抗アルテミンポリクローナル抗体（R&D Systems）によるウェスタンブロット分析により確認された（図８Ｂ）。誘導されたＨｉｓ−アルテミンタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡ（Qiagen）を用いて精製した。組み換えアルテミンタンパク質は、ｍｒｇｓｈｈｈｈｈｈｇｓＡＧＧＰＧＳＲＡＲＡＡＧＡＲＧＣＲＬＲＳＱＬＶＰＶＲＡＬＧＬＧＨＲＳＤＥＬＶＲＦＲＦＣＳＧＳＣＲＲＡＲＳＰＨＤＬＳＬＡＳＬＬＧＡＧＡＬＲＰＰＰＧＳＲＰＶＳＱＰＣＣＲＰＴＲＹＥＡＶＳＦＭＤＶＮＳＴＷＲＴＶＤＲＬＳＡＴＡＣＧＣＬＧ（配列番号３４；ｔａｇ配列は小文字で示される）の配列を有していた。精製されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、クマシーブルー染色により視覚化した。これにより、予測されたとおりに１３．５ｋＤａのバンドが示された（図８Ｃ）。
（アルテミンに対するウサギポリクローナル抗体はＭＣＦ−７細胞の生存率を減少させ、細胞侵入を阻害する）
アルテミンに対するウサギポリクローナル抗体を作製した。図９Ａにおいて示されるように、抗血清は、ＭＣＦ７−Ｖｅｃ細胞中の内因性アルテミンのみならず、ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ細胞中のアルテミンの強制的発現をも認識することができた。強制的発現からの観察と調和して、アルテミンに対するウサギ抗血清によるＭＣＦ−７細胞の処理は、血清を十分に与えた培地中で生育させた場合、単層におけるＭＣＦ−７細胞の数には影響しなかった（図９Ｂ）が、無血清培地中で生育させた場合、細胞数を顕著に減少させた（図９Ｃ）。これらの結果は、ｓｉＲＮＡによる内因性アルテミンの枯渇によって得られた結果とも一致する。さらに、アルテミンに対する抗血清はまた用量依存的にＭＣＦ−７細胞の侵入を阻害し得る（図９Ｄ）。２００μｇ／ｍｌ及び４００μｇ／ｍｌの抗体において、それぞれ５１．３％及び７４．６％の減少が観察された。抗体濃度をさらに増加させても、さらなる阻害は起こらなかった。
（アルテミンに対するニワトリポリクローナル抗体の産生）
本発明者らはまた、組み換えヒトアルテミンを用いて、ニワトリポリクローナル抗体を産生させた。図１０において示されるように、アルテミンに対するニワトリ抗体は、ＢＴ５４９−Ｖｅｃ細胞中の内因性アルテミンのみならず、ＢＴ５４９−ＡＲＴＮ細胞中の強制的なアルテミンの発現をも特異的に認識し得た。
（アルテミンに対するニワトリポリクローナル抗体は、ＭＣＦ−７細胞の細胞生存率及び足場非依存性増殖を減少させ、侵入を阻害する）
低血清（０．２％）含有培地中で生育したＭＣＦ−７細胞の生存率は、アルテミンに対するニワトリ抗体により顕著に減少した。免疫前のコントロールはほとんど効果を有していなかった一方、アルテミンに対するニワトリポリクローナル抗体は、用量依存的に細胞生存率を減少させた（図１１Ａ）。２００μｇ／ｍｌにおいて、細胞生存率は、ＩｇＹ免疫前コントロールと比較して６７．７％に減少した。４００μｇ／ｍｌにおいて、細胞生存率は、ＩｇＹ処理コントロールの５７．５％に減少した。８００μｇ／ｍｌにおいて、細胞生存率は、ＩｇＹ処理コントロールの４８．３％にさらに減少した。
アルテミンに対するニワトリポリクローナル抗体は、軟寒天中のＭＣＦ−７細胞の足場非依存性増殖を顕著に阻害した（図１１Ｂ）。本発明者らは抗体による用量依存的な阻害を観察した。２００μｇ／ｍｌにおいて、軟寒天での生育はＩｇＹ免疫前コントロールと比較して８３．９％に減少した。４００μｇ／ｍｌにおいて、軟寒天での生育はＩｇＹ処理コントロールの６６．０％に減少した。しかしながら、４００〜６００μｇ／ｍｌの濃度に対しては、さらなる減少は観察されなかった。
ＭＣＦ−７細胞の浸入性もまた、アルテミンに対するニワトリポリクローナル抗体により、用量依存的に損なわれた（図１１Ｃ）。６００μｇ／ｍｌの抗アルテミン抗体により、ＩｇＹ免疫前コントロールと比較して顕著な阻害が達成された。
（タモキシフェン抵抗性ＭＣＦ−７細胞におけるアルテミン発現のアップレギュレーション）
本発明者らは、アルテミンの発現レベルが化学療法薬の感受性を決定するかもしれないとの仮説を立てた。濃度を増加させながらタモキシフェンに徐々に曝した後に、ＭＣＦ−７細胞は高濃度のタモキシフェン中で生育する能力を獲得し、タモキシフェン耐性となった。図１２において示されるように、タモキシフェン耐性のＭＣＦ−７細胞中でのアルテミンの発現は、タモキシフェン感受性のＭＣＦ−７親細胞と比較して顕著に増大した。
（アルテミンの強制的発現は化学療法誘導死を顕著に抑制する）
ＭＣＦ−７細胞はＥＲ陽性であることが知られており、また、上述の通り、アルテミンは、これらの細胞をアポトーシスから保護することができた。タモキシフェンの作用におけるアルテミン発現の効果を、ＭＴＴアッセイによりさらに分析した。図１３Ａにおいて示されるように、タモキシフェンは、アルテミンの強制的発現を伴うＭＣＦ７−ＡＲＴＮ細胞、及び、ＭＣＦ７−Ｖｅｃコントロール細胞の両方において、用量依存的に細胞死を引き起こした。しかしながら、ＭＣＦ７−ＡＲＴＮ細胞は、０．１μＭを除く試験された全てのタモキシフェンの試験濃度において、顕著により高い生存率を示した。
この結果により、より低い濃度（０．１−１μＭ）にあるタモキシフェンが、細胞周期の停止を誘導することを示し、薬理学的濃度（５μＭ超）は、アポトーシスを誘導することを示すことが説明され得る（Otto A, Paddenberg R, Schubert S, Mannhertz H 1996 Cell-cycle arrest, micronucleus formation, and cell death in growth inhibition of MCF-7 breast cancer cells by tamoxifen and cisplatin. J Cancer Res Clin Oncol 22:603-612. Perry R, Kang Y, Greaves B 1995 Effects of tamoxifen on growth and apoptosis of estrogen- dependent and -independent human breast cancer cells. Ann Surg Oncol 2:238-245）。ドキソルビシン及びタキソール誘導細胞死におけるアルテミンの類似の保護効果も観察された（図１３Ｂ及び１３Ｃ）。これらの結果は、アルテミンの強制的過剰発現が、化学療法誘導細胞死を抑制することができることを示す。
（アルテミンの強制的過剰発現はタモキシフェン存在下で足場非依存性増殖を顕著に増加させる）
化学治療剤に対するアルテミンの保護効果を、軟寒天アッセイにおいてさらに評価した。上述の知見（例えば、図３Ｂを参照）と調和して、アルテミンの強制的発現は、コロニー形成においてタモキシフェン不存在下で２倍以上の増加をもたらした（図１４Ａ）。タモキシフェンは、１μＭ及び５μＭの濃度において、軟寒天中で形成されるコロニーの数を減少させた（図１４Ａ）。しかしながら、アルテミンの強制的発現は、この効果を抑制した（図１４Ｂ）。アルテミンの強制的発現はまた、マトリゲル（登録商標）中でのコロニー形成におけるタモキシフェンの効果も低減させた（図１４Ｃ）。
（アルテミンに対するニワトリポリクローナル抗体及び抗エストロゲン剤による、ＭＣＦ−７細胞の足場非依存性増殖における相乗的阻害）
図１５Ａ及び１５Ｂにおいて示されるように、抗エストロゲン剤であるタモキシフェン及びファスロデックス（ICI 182,780）の双方は、軟寒天中でのＭＣＦ−７細胞の足場非依存性増殖を効果的に阻害した。タモキシフェン（図１５Ａ）及びファスロデックス（図１５Ｂ）は、コントロールと比較してそれぞれ４０．４及び５５．８％に生育を低減させた。同様の実験条件下で、アルテミンに対するニワトリポリクローナル抗体は、免疫前コントロールと比較して７２．３％に生育を低減させた。さらに、軟寒天コロニー形成は、タモキシフェン（図１５Ａ）又はファスロデックス（図１５Ｂ）を抗アルテミン抗体と組み合わせることにより、劇的に減少した。ＭＣＦ−７の足場非依存性増殖は、抗アルテミン抗体をタモキシフェン（図１５Ａ）又はファスロデックス（図１５Ｂ）のいずれかと組み合わせることによってほとんど完全に阻害され、コロニー形成は、コントロールと比較してそれぞれ７．１及び１０．０％に減少した。
（実施例３：結果）
（アルテミンは子宮内膜癌細胞に対し発癌性である）
（自己分泌ＡＲＴＮの強制的産生はヒト子宮内膜癌細胞の細胞生育を誘導する）
ヒト子宮内膜癌ＲＬ９５−２細胞に、アルテミン発現プラスミドｐＩＲＥＳｎｅｏ３−ＡＲＴＮ（ＲＬ９５−２−ＡＲＴＮと名付ける）、又は、コントロールとしての空のｐＩＲＥＳｎｅｏ３ベクター（ＲＬ９５−２−ＣＫ）のいずれかを、安定的にトランスフェクトした。コントロールＲＬ９５−２−ＣＫ細胞と比較した、ＲＬ９５−２−ＡＲＴＮ細胞中での増大したアルテミンの発現を、ＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡレベルで、及び、ウェスタンブロット分析によりタンパク質レベルで検出した（図１６）。
ＲＬ９５−２細胞中でのＡＲＴＮの強制的発現は、全細胞アッセイにより示されるように、細胞の生育を顕著に増大させた（図１７Ａ）。細胞増殖の増大は、増大した細胞周期の進行及び／又はアポトーシスの減少の実際の結果からもたらされ得る。本発明者らは、ＲＬ−９５−２細胞におけるＡＲＴＮの強制的発現が、ＦＢＳの存在下または不存在下に有糸分裂誘発を顕著に増大させ（図１７Ｂ）、続いて、血清枯渇の結果としてＲＬ９５−２−ＣＫ細胞と比較してアポトーシス細胞死を減少させる（図１７Ｃ）ことをここに立証した。
転写調節遺伝子は細胞周期の進行に関与し、細胞の生存は、細胞の発癌性の挙動に関与し又は促進するシグナル経路の活性化に直接的に関連する（Evan and Littlewood, 1998; Nagasawa et al., 1985）。ＲＬ９５−２細胞によるアルテミンの強制的産生の機能的な結果を検証するために、本発明者らは、リアルタイムＰＣＲを利用して細胞周期の進行及び細胞生存に関与する各種遺伝子マーカーの転写レベルを評価した。ＲＬ９５−２細胞中でのアルテミンの強制的発現は、細胞周期の進行に必要とされる遺伝子であるＤＤＮＤ１、ＣＤＫ２、ＣＤＣ２５Ａ、ＢＲＣＡ１、ＣＨＥＫ２及びＲＢ１；及び抗アポトーシス遺伝子であるＢｃｌ−２及びＢＣＬ２Ｌ１；及びＴＥＲＴ（図１７Ｄ及び１７Ｅ）のｍＲＮＡ発現のアップレギュレーションをもたらした。アルテミンの強制的発現は、ＢＡＤ、ＢＡＸ、及びＣＡＳＰ７の発現のダウンレギュレーションももたらした（図１７Ｅ）。それ故に、アルテミンの強制的産生は、細胞周期の進行を増進し、アポトーシスを減少させた。それは次いで、増殖及び細胞生存の両方に必要とされる遺伝子を活性化し、子宮内膜癌細胞における細胞成育の増大をもたらす。
（子宮内膜癌細胞中でのＡＲＴＮの強制的発現は、足場非依存性増殖及び侵入能力を増進する）
本発明者らは次に、アルテミンの強制的発現によってＲＬ９５−２が軟寒天アッセイでコロニーを形成する能力に影響されるか否かを評価した。その結果は、ＲＬ９５−２−ＡＲＴＮ細胞は、ＲＬ９５−２−ＣＫ細胞と比較して軟寒天中でより多くのコロニーを形成したことを示した（図１８Ａ）。ＲＬ９５−２−ＡＲＴＮ細胞はまた、ＲＬ９５−２−ＣＫ細胞により形成されるものよりはるかに大きいコロニーを形成した。さらに、ＲＬ９５−２−ＡＲＴＮ細胞は、ＲＬ９５−２−ＣＫ細胞に比較して懸濁培養液において生育を増大することを証明し（図１８Ｂ）、劇的な病巣形成を呈した（図１８Ｅ）。このことは、アルテミンの発現がＲＬ９５−２細胞の足場非依存性増殖を促進したことを示唆した。
形態学的構造における、アルテミンの強制的発現の効果を調べるために、２Ｄ及び３Ｄのマトリゲル（登録商標）培養を行った。ＲＬ９５−２−ＡＲＴＮ細胞は、２Ｄ（図１８Ｄ）及び３Ｄ（図１８Ｃ）マトリゲル（登録商標）培養において、分枝形態を有するコロニーを形成した。ＲＬ９５−２−ＡＲＴＮ細胞は、２Ｄマトリゲル（登録商標）培養物中で間葉性の分枝した形態を呈した（図１８Ｄ）。
（子宮内膜癌細胞中の強制的発現ＡＲＴＮは、間葉性表現型を促進し、細胞移動及び侵入を増加させる）
ＲＬ９５−２細胞におけるアルテミンの形態学的な効果を詳しく調べるために、単一細胞の状態から開始して、コロニー形成を毎日モニタリングした。ＲＬ９５−２細胞中のアルテミンの強制的発現は、ＥＭＴ転移を誘導した。細胞は、際立った紡錘形の細胞形態を獲得し、このことは浸入能力が示唆される（図１９Ａ）。図１９Ｂにおいて示されるように、ＲＬ９５−２−ＣＫ細胞と比較して２倍以上の数のＲＬ９５−２−ＡＲＴＮ細胞が、移動および浸入の特徴を有することが観察された。
リアルタイムＰＣＲにより、複数の侵入及び転移に関与する遺伝子が、ＲＬ９５−２−ＣＫ細胞と比較してＲＬ９５−２−ＡＲＴＮ細胞中で増加することが分かったことが証明された（例えば、ＭＭＰ１、ＭＭＰ９、ＰＬＡＵＲ、ＳＥＲＰＩＮＢ５及びＳＥＲＰＩＮＥ１等を含む（図１９Ｃ））。間葉性表現型の特異的なマーカーであるビメンチンは、ＲＬ９５−２−ＣＫ細胞に対しＲＬ９５−２−ＡＲＴＮ細胞中で７倍アップレギュレートされた（図１９Ｄ）。
（子宮内膜癌細胞中のｓｉＲＮＡによるＡＲＴＮの枯渇は、癌表現型を減少させ、アポトーシスを誘導する）
ＡＲＴＮの発現を枯渇させるために、プラスミドをベースとするｓｉＲＮＡを用いた。ＲＬ９５−２細胞に、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ＡＲＴＮプラスミド（ＲＬ９５−２−ｓｉＡＲＴＮ）又はネガティブコントロールｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ＣＫプラスミド（ＲＬ９５−２−ｓｉＣＫ）を、安定的にトランスフェクトした。アルテミンの発現の枯渇は、ＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡレベルで、及びウェスタンブロット解析によりタンパク質レベルで確認された（図１６）。
全細胞数アッセイにより示されるように、ＲＬ９５−ｓｉＡＲＴＮ細胞の生育は、ＲＬ９５−２−ｓｉＣＫ細胞よりも顕著に遅かった（図２０Ａ）。ＢｒｄＵの取り込み及びアポトーシスアッセイにより、ＲＬ９５−２−ｓｉＡＲＴＮ細胞は、細胞周期エントリーの減少（図２０Ｂ）及びアポトーシスの増加（図２０Ｃ）を呈することが証明された。アルテミンの枯渇はまた、足場非依存性増殖（図２０Ｄ）、細胞移動及び侵入（図２０Ｅ）を損なった。
（アルテミンの強制的発現は子宮内膜癌ＡＮ３細胞の足場非依存性増殖、細胞移動及び侵入を増進し、一方、アルテミンの枯渇はこれらを損なう）
ＲＬ９５−２細胞における本発明者らの知見を他の子宮内膜癌細胞に拡張するために、ＡＮ３細胞に、アルテミン発現プラスミドｐＩＲＥＳｎｅｏ３−ＡＲＴＮ（ＡＮ３−ＡＲＴＮ）又はコントロールとしての空のｐＩＲＥＳｎｅｏ３ベクター（ＡＮ３−ＣＫ）のいずれかを安定的にトランスフェクトした。ＡＮ３−ＡＲＴＮ細胞中でのアルテミンの強制的発現は、ＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡレベルで、及びウェスタンブロット分析によりタンパク質レベルで確認された（図１６）。ＲＬ９５−２細胞と同様に、ＡＮ３細胞中のアルテミンの強制的発現は、足場非依存性増殖を増大させ（図２１Ａ）、細胞移動及び侵入を促進させた（図２１Ｃ）。
ＡＮ３細胞中での内因性のアルテミンの発現を枯渇させるために、細胞に、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ＡＲＴＮプラスミド（ＡＮ３−ｓｉＡＲＴＮ）又はネガティブコントロールｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−ＣＫプラスミド（ＡＮ３−ｓｉＣＫ）を、安定的にトランスフェクトした。ＡＮ３−ｓｉＡＲＴＮ細胞中でのアルテミンの発現の枯渇は、ＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡレベルで、及びウェスタンブロット分析によりタンパク質レベルで確認された（図１６）。強制的発現とは対照的に、ＡＮ３細胞中のアルテミンの枯渇は、足場非依存性増殖（図２１Ｂ）ならびに細胞移動及び侵入（図２１Ｄ）を減少させた。
（アルテミンに対するニワトリポリクローナル抗体は子宮内膜癌細胞の細胞生存率及び足場非依存性増殖を減少させ、侵入を阻害する）
低濃度の血清（０．２％）を含有する培地中で生育したＲＬ９５−２細胞の細胞生存率は、免疫前のコントロールＩｇＹにより顕著な影響を受けなかった。しかしながら、それは、アルテミンに対するニワトリポリクローナル抗体によって、用量依存的に顕著に減少した。２００μｇ／ｍｌにおいて、抗アルテミン抗体及び免疫前コントロールＩｇＹの両方は、ほぼ同程度に細胞生存率を減少させた（図２２Ａ）。しかしながら、４００、６００及び８００μｇ／ｍｌへと濃度が増大した場合に、細胞生存率におけるコントロールＩｇＹの効果は効果なしである一方で、抗アルテミン抗体は顕著な阻害効果を証明した。
軟寒天中でのＲＬ９５−２及びＡＮ３細胞の両方の足場非依存性増殖は、アルテミンに対するニワトリポリクローナル抗体により顕著に阻害された（図２２Ｂ）。４００μｇ／ｍｌの免疫前のコントロールＩｇＹは、ＰＢＳコントロールと比較してコロニー形成に顕著には影響しなかったが、抗アルテミン抗体は同様の濃度で、コロニー形成を顕著に減少させた。生存率は、コントロールＩｇＹと比較して、ＲＬ９５−２及びＡＮ３細胞に関し、それぞれ３７．１及び４６．１％減少した。
ＲＬ９５−２及びＡＮ３細胞のいずれの侵入も、トランスウェル（登録商標）侵入アッセイにおいて示されるように、アルテミンに対するニワトリポリクローナル抗体により顕著に阻害された（図２２Ｃ）。コントロールＩｇＹと比較して、抗アルテミン抗体は、ＲＬ９５−２及びＡＮ３細胞の侵入を、それぞれ４７．７及び２６．３％減少させた。
過度な実験を行うことなく読者が本発明を実践できるよう支援する目的で特定の好ましい実施形態を参照するとともに、本発明を本明細書中に記述してきた。しかしながら、当業者であれば、本発明の範囲を逸脱することなしに、一定の度合で多くの要素およびパラメーターを変化させ、あるいは改変し得るであろうことを容易に認識するであろう。さらに、表題、見出しその他は、本書面における読者の理解を促すために提供されており、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
上述の、及び、後述に必要に応じて引用される全ての特許出願、特許、及び刊行物の全ての開示は、それにより、それらの全体が参考として援用される。
本明細書にわたって、及び、それに続くいかなる請求項中においても、別の意味を必要とする状況がない限り、「含む」「包含する」等の語は、排他的な意味とは逆の包括的な意味、すなわち、「含むが、限定されるものでない」との意味に解釈される。
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Claims (28)

  1. 対象における癌の治療用の医薬の調製における、配列番号３５〜４２のいずれか１つの核酸配列と結合するアンチセンス分子または前記アンチセンス分子を発現するベクターまたは前記ベクターを含む宿主細胞の使用であって、該癌は、乳癌、子宮内膜癌、前立腺癌、肺癌および卵巣癌からなる群から選択される、使用。
  2. アンチセンス分子は、配列番号４９または配列番号５３の配列の核酸を含む、請求項１に記載の使用。
  3. 対象における癌の治療用の医薬の調製における、配列番号３５〜４２のいずれか１つの配列の核酸を発現停止させる干渉ＲＮＡ小分子または該干渉ＲＮＡ小分子を発現するベクター、または該ベクターを含む宿主細胞の使用であって、該癌は、乳癌、子宮内膜癌、前立腺癌、肺癌および卵巣癌からなる群から選択される、使用。
  4. 干渉ＲＮＡ小分子は、配列番号４６、４７、５０および５１のいずれか１つの配列の核酸を含む、請求項３に記載の使用。
  5. 対象における癌の治療用の医薬の調製における、配列番号１〜３、５〜３４からなる群から選択される配列のアミノ酸と結合する抗体分子、該抗体分子を発現するベクターまたは該ベクターを含む宿主細胞の使用であって、該癌は、乳癌、子宮内膜癌、前立腺癌、肺癌および卵巣癌からなる群から選択される、使用。
  6. 抗体分子はモノクローナルである、請求項５に記載の使用。
  7. 癌は、癌腫（carcinoma）である、請求項１〜６のいずれか１つに記載の使用。
  8. 癌は、転移癌である、請求項１〜７のいずれか１つに記載の使用。
  9. 対象における癌を治療する方法であって、配列番号３５〜４２のいずれか１つの配列の核酸に結合するアンチセンス分子、または該アンチセンス分子を発現するベクター、または該ベクターを含む宿主細胞を対象に投与して、癌を治療する工程を包含し、該癌は、乳癌、子宮内膜癌、前立腺癌、肺癌および卵巣癌からなる群から選択される、方法。
  10. アンチセンス分子は、配列番号４９または５３の配列の核酸を含む、請求項９に記載の方法。
  11. 対象における癌を治療する方法であって、配列番号３５〜４２のいずれか１つの配列の核酸を発現停止させる干渉ＲＮＡ小分子、該干渉ＲＮＡ小分子を発現するベクター、または該ベクターを含む宿主細胞を対象に投与して、癌を治療する工程を包含し、該癌は、乳癌、子宮内膜癌、前立腺癌、肺癌および卵巣癌からなる群から選択される、方法。
  12. 干渉ＲＮＡ小分子は、配列番号４６、４７、５０および５１のいずれか１つの配列の核酸を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 対象における癌を治療する方法であって、配列番号１〜３、５〜３４からなる群から選択される配列のアミノ酸と結合する抗体分子、該抗体分子を発現するベクター、または該ベクターを含む宿主細胞を対象に投与して、癌を治療する工程を包含し、該癌は、乳癌、子宮内膜癌、前立腺癌、肺癌および卵巣癌からなる群から選択される、方法。
  14. 抗体分子はモノクローナルである、請求項１３に記載の方法。
  15. 癌は、癌腫（carcinoma）である、請求項９〜１４のいずれか１つに記載の方法。
  16. 癌は、転移癌である、請求項９〜１５のいずれか１つに記載の方法。
  17. 対象における癌の存在を評価する方法であって、配列番号３５〜４２のいずれか１つの配列の核酸と結合する少なくとも１種のポリヌクレオチドを、対象からのサンプルと接触させる工程と、サンプル中の核酸配列のレベルを測定する工程とを包含し、コントロールに対するサンプル中の核酸配列のレベルの上昇が癌の存在を示し、該癌は、乳癌、子宮内膜癌、前立腺癌、肺癌および卵巣癌からなる群から選択される、方法。
  18. サンプルは腫瘍サンプルである、請求項１７に記載の方法。
  19. 癌は、癌腫（carcinoma）である、請求項１７または１８に記載の方法。
  20. 癌は転移癌である、請求項１７〜１９のいずれか１つに記載の方法。
  21. 対象における癌の存在を評価する方法であって、配列番号１〜３、５〜３４からなる群から選択される配列のアミノ酸と結合する少なくとも１種の抗体分子を、対象からのサンプルと接触させる工程と、サンプル中のアミノ酸配列のレベルを測定する工程とを包含し、コントロールサンプルに対するサンプル中のアミノ酸配列のレベルの上昇が、癌の存在を示し、該癌は、乳癌、子宮内膜癌、前立腺癌、肺癌および卵巣癌からなる群から選択される、方法。
  22. 前記サンプルは腫瘍サンプルである、請求項２１に記載の方法。
  23. 癌は、癌腫（carcinoma）である、請求項２１または２２に記載の方法。
  24. 癌は転移癌である、請求項２１〜２３のいずれか１つに記載の方法。
  25. 対象における上皮癌の治療用の医薬の調製における、ａ）配列番号３５〜４２のいずれか１つの配列の核酸と結合するアンチセンス分子；ｂ）配列番号３５〜４２のいずれか１つの配列の核酸を発現停止させる干渉ＲＮＡ小分子；ｃ）配列番号１〜３、５〜３４からなる群から選択される配列のアミノ酸と結合する抗体分子、または前記分子（ａ）〜（ｃ）を発現するベクター、または、前記ベクターを含む宿主細胞の使用。
  26. 対象における上皮癌治療のための方法であって、ａ）配列番号３７〜４０のいずれか１つの配列の核酸と結合するアンチセンス分子；ｂ）配列番号３７〜４０のいずれか１つの配列の核酸を発現停止させる干渉ＲＮＡ小分子；ｃ）配列番号１〜３、９〜３６および１７２〜１７３からなる群から選択される配列のアミノ酸と結合する抗体分子、または、前記分子（ａ）〜（ｃ）を発現するベクター、または、前記ベクターを含む宿主細胞を対象に投与して、腫瘍を治療する工程を包含する、方法。
  27. 対象における上皮癌の存在を評価する方法であって、配列番号３５〜４２のいずれか１つの配列の核酸配と結合する少なくとも１種のポリヌクレオチドを、対象からのサンプルと接触させる工程と、サンプル中の核酸配列のレベルを測定する工程とを包含し、コントロールサンプルに対するサンプル中の核酸配列のレベルの上昇が、癌の存在を示す、方法。
  28. 対象における上皮癌の存在を評価する方法であって、配列番号１〜３、５〜３４からなる群から選択される配列のアミノ酸と結合する少なくとも１種の抗体分子を、対象からのサンプルと接触させる工程と、サンプル中のアミノ酸配列のレベルを測定する工程とを包含し、コントロールサンプルに対するサンプル中のアミノ酸配列のレベルの上昇が、癌の存在を示す、方法。
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