TWI621629B - 用於對抗血管新生及腫瘤標靶治療之對抗第二型血管內皮生長受體之人類抗體 - Google Patents

用於對抗血管新生及腫瘤標靶治療之對抗第二型血管內皮生長受體之人類抗體 Download PDF

Info

Publication number
TWI621629B
TWI621629B TW105111564A TW105111564A TWI621629B TW I621629 B TWI621629 B TW I621629B TW 105111564 A TW105111564 A TW 105111564A TW 105111564 A TW105111564 A TW 105111564A TW I621629 B TWI621629 B TW I621629B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
vegfr2
seq
antibody
antigen
amino acid
Prior art date
Application number
TW105111564A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201712033A (zh
Inventor
吳漢忠
呂瑞旻
邱瓊儀
劉怡如
張育綾
Original Assignee
中央研究院
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 中央研究院 filed Critical 中央研究院
Publication of TW201712033A publication Critical patent/TW201712033A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI621629B publication Critical patent/TWI621629B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Abstract

本發明揭露一種分離的抗體或其抗原結合片段，其對位於人類血管內皮生長因子受體2(VEGFR2；SEQ ID NO：74)之結構域1或結構域3內的抗原決定位具有特異性結合親和力。VEGFR2之結構域3內的抗原決定位係位於SEQ ID NO：74之第250個胺基酸殘基和第270個胺基酸殘基之間。本發明還揭露此抗體或其抗原結合片段用於製造在有此需要的個體中用以抑制腫瘤生長、腫瘤血管新生和/或誘導癌細胞之細胞毒性的藥物的用途。另外，本發明還揭露一種偵測生物樣品中位在腫瘤血管內皮細胞或癌細胞上VEGFR2存在的方法。

Description

用於對抗血管新生及腫瘤標靶治療之對抗第二型血管內 皮生長受體之人類抗體
本發明一般涉及具有抗癌活性的抗體，並且更具體地涉及抗VEGFR2抗體。
血管新生很少發生於成年人的健康組織中。相較於腫瘤相關內皮細胞，血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)很少表現，且於正常的內皮細胞中以低量表現。於腫瘤血管的VEGFR2表現量較正常血管中高出3至5倍。於癌症患者活體組織檢查的免疫組織化學染色進一步證實，相較於鄰近腫瘤區域之正常組織的血管內皮，於腫瘤血管中的VEGFR2表現量顯著地上升。值得注意的是，高轉移性腫瘤血管的VEGFR2表現量高於低轉移性腫瘤血管者。
起初顯示VEGFR2表現被限制於腫瘤組織的血管中。然而，最近的研究提供證據顯示VEGFR2也出現於惡性腫瘤細胞中。發現乳癌患者血液中循環的腫瘤內皮細胞表現VEGFR2，因此，此種表現與腫瘤的轉移和預後有 關。所以，將阻斷VEGFR2介導的訊息傳遞以附隨地抑制腫瘤內皮和惡性細胞視為是研發抗癌治療劑的優良策略。
臨床研究結果指出針對VEGFR2的全人類治療性抗體具有安全性和良好的耐受性。希望透過阻斷腫瘤血管新生以作為癌症的新興治療方法。因此，發展具有增強治療功效之新穎的抗VEGFR2人類抗體將有利於癌症患者。
在本發明一範疇是關於一種分離的抗體或其抗原結合片段，其針對於位於人類血管內皮生長因子受體2(VEGFR2；SEQ ID NO：74)之結構域1或結構域3內的抗原決定位具有特異性結合親和力，其中位於VEGFR2之結構域3內的抗原決定位係位於SEQ ID NO：74之第250個胺基酸殘基和第270個胺基酸殘基之間。
在本發明的一個實施例中，此抗原決定位包含NWEYPS的胺基酸序列(SEQ ID NO：66)。此抗原決定位不包含GID、KH或GLMTK的胺基酸序列(SEQ ID NO：75)。
在本發明的其他實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段對腫瘤血管內皮細胞展現特異性結合親和力。
本發明抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，此VH包含VH CDR1、VH CDR2，以及VH CDR3，且此VL包含VL CDR1、VL CDR2，以及VL CDR3， (i)其中：此VH CDR1、VH CDR2，以及VH CDR3分別包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，以及SEQ ID NO：3的胺基酸序列；且此VL CDR1、VL CDR2，以及VL CDR3分別包含SEQ ID NO：4、Ala Ala Ser，以及SEQ ID NO：5的胺基酸序列；或(ii)其中：此VH CDR1、VH CDR2，以及VH CDR3分別包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7，以及SEQ ID NO：8的胺基酸序列；且此VL CDR1、VL CDR2，以及VL CDR3分別包含SEQ ID NO：9、Asp Ala Ser，以及SEQ ID NO：10或73的胺基酸序列；或(iii)其中：此VH CDR1、VH CDR2，以及VH CDR3分別包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12，以及SEQ ID NO：13的胺基酸序列；且此VL CDR1、VL CDR2，以及VL CDR3分別包含SEQ ID NO：14、Asp Ala Ser，以及SEQ ID NO：15的胺基酸序列；或(iv)其中：此VH CDR1、VH CDR2，以及VH CDR3分別包含SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17，以及SEQ ID NO：18的胺基酸序列；且此VL CDR1、VL CDR2，以及VL CDR3分別包含SEQ ID NO：19、Gly Ala Ser，以及SEQ ID NO：20的胺基酸序列；或(v)其中： 此VH CDR1、VH CDR2，以及VH CDR3分別包含SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22，以及SEQ ID NO：23的胺基酸序列；且此VL CDR1、VL CDR2，以及VL CDR3分別包含SEQ ID NO：24、Asp Ala Ser，以及SEQ ID NO：25的胺基酸序列。
在本發明的其他實施例中，此VH CDR1、VH CDR2，以及VH CDR3分別包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7，以及SEQ ID NO：8的胺基酸序列；且此VL CDR1、VL CDR2，以及VL CDR3分別包含SEQ ID NO：9、Asp Ala Ser，以及SEQ ID NO：10或73的胺基酸序列。
在本發明的其他實施例中，此抗體或其抗原結合片段包含：(a)包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)；以及(b)包含SEQ ID NO：77或78之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)。
在本發明的其他實施例中，此抗體或其抗原結合片段為單鏈可變片段、Fab片段或Fv片段。
在本發明的其他實施例中，此抗體或其抗原結合片段為全人類抗體。
在本發明的其他實施例中，此抗體或其抗原結合片段係以可偵測的化合物或酵素標記。
在本發明另一範疇是關於一種組成物，其包含治療上有效劑量之本發明抗體或其抗原結合片段以及藥學上可接受的載體或載劑。
在本發明的一個實施例中，此組成物進一步包含化學治療劑。在本發明的一個實施例中，此化學治療劑為歐洲紫杉醇(docetaxel)。
此外，在本發明另一範疇是關於本發明抗體或其抗原結合片段或組成物用於製造在有此需要的個體中用以抑制腫瘤生長、腫瘤血管新生和/或誘導癌細胞之細胞毒性的藥物的用途。
在本發明的一個實施例中，腫瘤和/或癌細胞表現VEGFR2。此抗體或其抗原結合片段之用途可進一步包含額外的化學治療劑(例如，歐洲紫杉醇)之使用，以用於製造在有此需要的個體中用以抑制腫瘤生長、腫瘤血管新生和/或誘導癌細胞之細胞毒性的藥物。
此外，本發明關於一種用於在有此需要的個體中抑制腫瘤生長、腫瘤血管新生和/或誘導癌細胞之細胞毒性的本發明抗體或其抗原結合片段或組成物。
本發明也關於一種用以抑制腫瘤生長、腫瘤血管新生和/或誘導癌細胞之細胞毒性的方法，包含：對有此需要的個體投予組成物，此組成物包含一治療上有效劑量之本發明分離的抗體或其抗原結合片段以及藥學上可接受的載劑，並藉此在有此需要的個體中抑制腫瘤生長、腫瘤血管新生和/或誘導癌細胞之細胞毒性。
本發明的方法可進一步包含對有此需要的個體投予組成物，此組成物包含一治療上有效劑量之化學治療劑(例如，歐洲紫杉醇)。在本發明的一個實施例中，此化學治療劑係同時投予有此需要的個體。
在本發明的一個實施例中，此腫瘤或癌症是選自由胰臟癌、乳癌、肺癌、白血病、前列腺癌和卵巢癌所組成群組中的至少一種。
更者，在本發明另一範疇是關於一種偵測生物樣品中位在腫瘤血管內皮細胞或癌細胞上VEGFR2存在的方法，包含：(i)混合本發明抗體或其抗原結合片段與該生物樣品；(ii)允許該抗體或其抗原結合片段與該生物樣品中位在該腫瘤血管內皮細胞或癌細胞上之該VEGFR2交互作用並形成一複合物；以及(iii)偵測位於該複合物中之位在該腫瘤血管內皮細胞或癌細胞上之該VEGFR2的存在。
在本發明的一個實施例中，生物樣品是來自患者的組織樣品。
在本發明的其他實施例中，利用免疫分析法偵測位於複合物中之位在腫瘤血管內皮細胞或癌細胞上之VEGFR2的存在。
雖然在此的變化和修飾可能在未脫離本發明新穎概念的精神和範圍下受到影響，但是從以下較佳實施例之描述結合下列附圖可明顯看出這些或其他範疇。
附圖說明了本發明的一或多個實施例，且與書面描述一同用於解釋本發明的原理。盡可能，整個附圖中使用的相同標號用以指出一個實施例中相同或相似的元件。
第1A-1E圖顯示針對VEGFR2之噬菌體呈現scFvs的篩選與鑑定結果。第1A圖顯示針對VEGFR2-Fc重組蛋白的噬菌體呈現篩選(phage display biopanning)。 在四輪篩選後，其噬菌體回收率超過第一輪，增加了3,455倍。Cfu為菌落形成單位(colony-forming units)。第1B圖顯示以1×109cfu噬菌體效價藉由ELISA比較VEGFR2-Fc蛋白對經篩選噬菌體選殖株的結合。第1C圖顯示以1×1010cfu的噬菌體效價藉由流式細胞儀於HUVECs上評估噬菌體選殖株之細胞VEGFR2結合親和力。第1D圖顯示純化可溶性抗VEGFR2 scFvs，並利用庫馬斯藍染色藉由SDS-PAGE進行分析。第1E圖顯示針對人類腫瘤血管的免疫螢光染色。利用抗VEGFR2 scFvs探測肺癌患者手術樣品的冷凍切片，之後利用抗E tag抗體和羅丹明結合的二級抗體染色。利用抗人類CD31抗體染色血管內皮細胞，再與FITC結合的二級抗體培養。利用DAPI染細胞核；Con-scFv為對照組scFv。
第2A-2F圖顯示抗VEGFR2 scFv可於HUVECs中抑制VEGF-A結合和VEGFR2的活化。第2A圖顯示利用ELISA進行抗VEGFR2 scFv與VEGF-A的競爭能力分析。將於缺乏競爭者情況下VEGF-A結合固定化VEGFR2的量視為100%。第2B圖顯示利用西方墨點法偵測以VEGF-A和scFv競爭者處理下於HUVECs中磷酸化VEGFR2(Pho.VEGFR2)的表現。基於螢光強度定量磷酸化VEGFR2，並以總VEGFR2進行標準化。第2C至2F圖顯示R2S12的抗原決定位定位(Epitope mapping)。第2C圖顯示人類(由SEQ ID NO：74的第221個胺基酸至第320個胺基酸)和小鼠(由SEQ ID NO：80的第223個胺基酸至第322個胺基酸)之VEGFR2結構域3(VEGFR2-D3)的序列比對。兩個物種之間不同的殘基以框線表示。涉及突變體M1和M2的殘基以底線表示。實心圓形和空心圓形分別用來指出與1121B和6.64抗體接觸之人類VEGFR2-D3殘基。第2D圖顯示VEGFR2-D3骨幹的圖形；將負責R2S12結合之NWEYPS(SEQ ID NO：66)殘基(M1)顯著標 示。第2E圖顯示VEGFR2-D3表面的模型。NWEYPS(SEQ ID NO：66)殘基(即M1區域)以黑線劃定表示。第2F圖顯示位於VEGFR2-D3表面上與1121B和6.64接觸的殘基。也指出1121B的接觸殘基，其位於M1區域。(N為胺基端；C為接基端)。
第3A-3D圖顯示抗VEGFR2 hAb的親和力成熟作用，以及抗VEGFR2-AF hAb活性的分析。第3A圖顯示R2S12(SEQ ID NO：10)和R2S12AF(SEQ ID NO：73)之CDR3的輕鏈可變結構域(VL-CDR3)的胺基酸。R2S12和R2S12AF之間不同的殘基以框線表示。第3B圖顯示抗VEGFR2和抗VEGFR2-AF hAb的動力學常數，使用純化的IgG和BIACORE T100TM進行測定。利用BIACORE T100TM評估軟體計算K d 數值。第3C圖顯示競爭性ELISA，其利用人類抗體檢視VEGF-A結合VEGFR2的劑量依賴性抑制。於缺乏競爭者情況下，將4nM VEGF-A對固定化VEGFR2的結合視為100%數值。以誤差槓(Error bar)代表標準偏差(SD)；n=4。第3D圖顯示利用流式細胞儀分析抗VEGFR2抗體對HUVEC的結合親和力。抗體濃度為0.1μg/ml。
第4A-4B圖顯示抗VEGFR2-AF hAb於HUVECs中可抑制VEGFR2訊息路徑並阻斷毛細血管結構形成。第4A圖顯示利用MATRIGEL®塗覆的μ-Slides進行毛細血管結構形成試驗。將HUVECs(每個孔洞4×104細胞)以0.2%胎牛血清(FBS)培養，並以40ng/ml VEGF-A，或40ng/ml VEGF-A連同NHIgG、IMC-1121B或抗VEGFR2-AF抗體，於37℃下處理5小時。在相位差顯微鏡下可觀察到細管狀的結構，且利用ImageJ軟體定量測定相對的出芽長度(sprout length)(下圖)和分支點(branching points)(上圖)。由三次獨立試驗獲得所有數據。第4B圖 顯示以50ng VEGF-A或100nM抗VEGFR2-AF或IMC-1121B於37℃下處理HUVECs 10分鐘。由經處理的HUVECs製備總蛋白質，並利用西方墨點法進行偵測。將α-微管素(α-tubulin)作為內部對照組。
第5A-5F圖顯示人類前列腺癌細胞中VEGFR2活性的特徵。第5A圖顯示利用定量RT-PCR於指定細胞株中的VEGFR2表現分析。以293T細胞作為陰性對照組。以GAPDH表現量對VEGFR2的表現量進行標準化。第5B圖顯示將以VEGF-A處理的PC-3細胞用於細胞群落形成(colony formation)、MTT和侵犯試驗測定。在每一組別中n=6。第5C圖顯示以VEGFR2靶向短髮夾RNA(VEGFR2-targeted shRNA(shVEGFR2))處理PC-3細胞，並利用定量RT-PCR分析VEGFR2表現。以螢光素酶的shRNA(shLuc)作為陰性對照組。第5D圖顯示進行MTT、細胞群落形成和轉移盤侵犯分析(Transwell invasion)試驗以分析經VEGF-A處理之shVEGFR2-PC-3細胞。第5E圖顯示於良性、原發性腫瘤和轉移性前列腺腫瘤之相對VEGFR2表現比較的箱型圖，利用公共微矩陣數據庫所測定。第5F圖顯示利用抗VEGFR2抗體(55B11,Cell Signaling)之人類前列腺癌組織陣列(PRC481,Pantomics)的免疫組織化學染色，以分析人類正常或腫瘤前列腺組織中VEGFR2蛋白的表現。
第6A-6E圖顯示於PC-3小鼠異種移植模型中抗VEGFR2-AF hAb的治療功效分析。第6A圖顯示治療時程表。第6B圖顯示每一組別小鼠的腫瘤生長概況。第6C圖顯示每一組別的體重。第6D圖顯示在治療期間結束時由每一隻小鼠解剖取得的實質腫塊(tumor mass)。第6E圖顯示在治療期間結束時所測得的腫瘤重量。 所有數據以每組別九隻小鼠的平均值表示；以誤差槓代表標準誤差(SE)；*代表P<0.05。
第7A-7E圖顯示抗VEGFR2-AF hAb於HL60小鼠異種移植模型中較IMC-1121B展現更高的抗腫瘤活性。第7A圖顯示每一組別小鼠的Kaplan-Meier存活分析。基於對數等級檢定(Log-rank test)，相較於IMC-1121B組，在抗VEGFR2-AF hAb組顯著地延長存活(P=0.0284)。第7B圖顯示每一組別小鼠的體重。第7C圖顯示在死亡後由每隻小鼠解剖取得的卵巢。將來自無白血病之NSG小鼠的卵巢作為正常對照組。第7D圖顯示以IMC-1121B或抗VEGFR2-AF處理之小鼠的卵巢體積。第7E圖顯示帶有白血病腫瘤小鼠之淋巴結(LN)變化的型態分析。由指定組別小鼠解剖取得已轉移至淋巴結的白血病細胞(在每一組別中n=9)。
第8圖顯示VEGFR2表現載體的構建。表現人類VEGFR2結構域之刪除或取代突變種的構建示意圖。在VEGFR2細胞外區域有七個類免疫球蛋白結構域，將其標記為I至VII。TM代表跨膜結構域。
第9A-9B圖顯示利用噬菌體呈現合成scFv庫篩選和鑑定針對VEGFR2之scFvs的結果。第9A圖顯示R2S12的親和力成熟作用。將噬菌體呈現之R2S12-VL-CDR3突變的scFv庫與固定在蛋白質G DYNABEADS®上的0.1μg VEGFR2-Fc於4℃下培養1小時。隨後，以含有1% TWEENTM 20之PBS清洗磁珠四次。在四輪篩選後，其噬菌體回收率超過第一輪，增加了929倍。第9B圖顯示指定濃度R2S12和R2S12-AF scFv對VEGFR2-Fc蛋白之結合活性的比較。此乃利用ELISA分析。以誤差槓代表標準誤差。
第10A-10C圖顯示抗VEGFR2-AF hAb於PC-3細胞中可拮抗VEGF-A介導的細胞活性。第10A圖顯示進行轉移盤分析以檢測作為指定處理之PC-3細胞的侵犯能力。上圖為具侵犯性細胞的吉姆薩染色(Giemsa staining)。100倍放大；在每一組別中n=3；比例尺為150μm。第10B圖顯示將總數為1×103 PC-3細胞種於六孔培養盤中，並以有或無100ng/ml VEGF-A和10μg/ml的NHIgG、IMC-1121B或抗VEGFR2-AF抗體處理。將培養盤培養7天以允許細胞群落形成。利用結晶紫染色顯現細胞群落。在洗去結晶紫溶液後計算在每一孔洞中細胞群落的相對數目。在每一組別中n=3。第10C圖顯示傷口癒合試驗。將PC-3細胞置於含有2% FBS的RPMI培養基中培養，並分別在呈現或缺乏10μg/ml NHIgG、IMC-1121B或抗VEGFR2-AF狀況下，利用100ng/ml VEGF-A處理以進行刺激。在0、16和36小時培養後拍攝照片。比例尺為150μm。在每一組別中n=3。以誤差槓代表標準誤差。
第11A-11B圖顯示在藥物處理後於腫瘤組織中之血管內皮細胞和凋亡細胞的研究。在治療期間結束時由每一組別的小鼠製備冷凍腫瘤切片。第11A圖顯示利用抗CD31抗體對切片進行染色，以顯現腫瘤血管。利用ImageJ軟體定量測定CD31陽性內皮細胞。第11B圖顯示利用TUNEL試驗分析在冷凍腫瘤切片中的凋亡細胞。利用ImageJ軟體定量凋亡細胞。利用DAPI對切片進行染色，以表示所有細胞。n=5；比例尺為100μm；200倍放大；以誤差槓代表標準誤差；**代表P<0.01；***代表P<0.001。
第12A-12B圖顯示在抗體治療後於人類白血病異種移植小鼠卵巢的組織病理學表型。在以生理食鹽水、NHIgG、IMC-1121B或抗VEGFR2-AF hAb治療 後，由帶有HL-60腫瘤的小鼠收集卵巢。將組織切片並以蘇木精和伊紅(H&E)染色，以顯現具有白血病細胞的浸潤。在抗VEGFR2-AF治療的組別顯現較少的血管，並保留了一些初級卵母細胞。在每一組別中n=9。第12A圖顯示200倍放大的卵巢。比例尺為500μm。第12B圖的比例尺為150μm。
現在要詳細描述本發明的各種實施例。請參照附圖，相同的標號在整個觀點中表示相同的元件。如同在本文描述和在隨後整個申請專利範圍中所使用，除非上下文另有明確說明，否則“一”、“一個”和“該”的含義包含複數引用。此外，如同在本文描述和在隨後整個申請專利範圍中所使用，除非上下文另有明確說明，否則“在…裡”的含義包含“在…裡”和“在…上”。另外，以下更具體地定義本說明書中使用的一些術語。
定義
在本說明書中使用的術語通常在本領域中、在本發明上下文中，以及在使用每一個術語的特定上下文中，具有其通常的含義。在以下或是在本說明書中的其他地方討論用以描述本發明的某些術語，以提供關於本發明描述之對實施者的額外指導。為了方便起見，可利用例如斜體字和/或引號，以強調某些術語。強調的使用對術語的範圍和含義並無影響。無論受到強調與否，在相同情況下，術語的範圍和含義是相同的。應該理解的是，可以一種以上的方式說明相同的東西。因此，可對任一個或一個以上在此討論的術語使用替代語言和同義詞，無論是否在此闡述或討論術語，而無賦予術語任何特殊意義。提供了某些術語的同義詞。一個或多個同義詞的列舉並不排除其他同義詞 的使用。在本說明書中任一處實施例的使用(包含在此討論之任何術語的範例)僅為說明性的，且絕非用以限制本發明或任何例示之術語的範圍和含義。同樣地，本發明並不限定於在本說明書中給出的各種實施例。
除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有如同本發明所屬領域中具有通常知識者普遍理解的相同含義。若有衝突狀況，以本文件(包含定義)為準。
術語“治療”是指對有此需要的個體(此個體具有癌症或具有此疾病的症狀或傾向)投予化合物的有效劑量，對此疾病、其症狀或其傾向具有治癒、減輕、緩解、補救、改善或預防的目的。保健專家可基於來自任何合適診斷方法的結果識別此個體。
“有效劑量”是指於接受治療的個體給予治療效果所需活性化合物的量。如同由本領域技藝人士所認可者，根據給藥途徑、賦形劑使用，以及與其他治療處置共同使用的可能性，有效劑量會有所不同。
術語“化學治療劑”是指已知在癌症治療中使用的藥劑。
由美國衛生福利部食品藥物管理局出版的“Guidance for Industry and Reviewers Estimating the Safe Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers”揭露可由以下公式計算獲得“治療上有效劑量”：人體等效劑量(HED)=動物劑量(mg/kg)×(動物體重(kg)/人體重(kg))0.33。
雷莫蘆單抗(Ramucirumab)(即IMC-1121B)的商品名為CYRAMZA®。
人類血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)之結構域1是由第45個胺基酸至第110個胺基酸，而結構域3是由第224個胺基酸至第320個胺基酸。
序列標誌符(Sequence identifiers)：QQLDDIPIT(R2S12AF可變輕鏈CDR3；SEQ ID NO：73)；VGFR2(人類血管內皮生長因子受體2；SEQ ID NO：74)；GLMTKK(SEQ ID NO：75)；R2S12和R2S12-AF的VH區域相同(SEQ ID NO：76)： R2S12的VL區域(SEQ ID NO：77)： R2S12AF的VL區域(SEQ ID NO：78)： 以上R2S12 VL和R2S12AF VL之間不同的胺基酸殘基畫有底線。
人類IgG1恆定區(SEQ ID NO：79)；小鼠VEGFR2胺基酸序列(SEQ ID NO：80)。
縮寫：互補決定區域(CDRs)；Fab(片段，抗原結合區域)；Fv區域(可變結構域)。
【實施例】
以下依照本發明實施例所給出例示性儀器、裝置、方法和其相關結果並非意圖限制本發明之範圍。注意為了方便閱讀可於實施例中使用標題或副標題，絕不應該將其用以限制本發明的範圍。此外，在此提出或揭露某些理論；然而，只要是依照本發明可實施本發明而無需考慮任何特定理論或作用方案時，無論理論對錯與否，決不應該用以限制本發明的範圍。
材料與方法
由噬菌體呈現scFv庫中分離結合VEGFR2的噬菌體
將本實驗室先前建立的人類自然噬菌體呈現scFv庫(複雜性為6×1010)用於篩選。將scFv庫扣除與蛋白質GDYNABEADS®(Invitrogen)的非特異性結合，隨後將其與VEGFR2-Fc重組蛋白(R&D Systems)固定化的DYNABEADS®培養。在利用含有0.1% TWEENTM 20的PBS(PBST0.1)清洗後，藉由感染大腸桿菌TG1細胞回收結合VEGFR2-Fc的噬菌體。在測定噬菌體效價後，進行下一輪的篩選。
競爭性VEGF結合試驗
將各種濃度的抗VEGFR2 scFvs與3nM人類VEGF-A(Peprotech)混合且加入以1μg/ml VEGFR2-Fc塗覆的96孔培養盤中，並以1% BSA進行預先阻斷。在室溫下培養1小時後，利用PBST清洗，使用抗VEGF單株抗體(GeneTex)和HRP標誌山羊抗小鼠IgG偵測結合的VEGF分子。利用鄰苯二胺(OPD)和H2O2混合液進行呈色，隨後利用3N鹽酸終止反應。利用微量盤式分析儀測定波長490nm處的吸光值。
利用抗VEGFR2 scFvs對人類腫瘤血管染色
由國立台灣大學附設醫院病理部獲得人類肺癌手術樣品。以PBS清洗冷凍切片，並利用三聚甲醛固定。在以PBS清洗後，利用正常馬血清(Vector)對切片進行阻斷，並將其與scFv培養。在以PBST清洗後，加入兔抗E tag抗體(Bethyl Laboratories)和小鼠抗人類CD31單株抗體(BD)的混合液，並將切片培養1小時。利用FITC標誌抗小鼠IgG、羅丹明標誌山羊抗兔IgG和DAPI對切片染色1小時後，以倒立式螢光顯微鏡(Zeiss,Axiovert 200M)擷取影像。
管柱形成(tube formation)試驗
將MATRIGEL®(BD Biosciences)於4℃隔夜解凍，並將10μl MATRIGEL®加入預冷的μ-Slide Angiogenesis(Ibidi)的每一孔洞中；然後，將培養盤於37℃培養15分鐘。將血清飢餓(Starved)的HUVECs(4×104細胞)加入具有或缺乏40ng/ml VEGF-A和抗VEGFR2抗體之含有0.2%血清的EBM-2培養基中。在培養24小時之後，利用OLYMPUS倒立式顯微鏡和數位相機(OLYMPUS,DP-12)評估內皮細胞管柱形成。利用ImageJ軟體定量評估管腔長度(tubular lengths)和分支點。將抗體抑制百分比表現為相對於無競爭者狀況下之VEGF-A處理組的百分比。
臨床數據集分析
由位於國家生物技術訊息中心(NCBI)網站上的基因表現數據資料庫(Gene Expression Omnibus)下載原始微矩陣數據。對原始數據進行標準化。將GEO profile GDS2545/1954_at/KDR用於轉移性前列腺癌分析。
抗VEGFR2人類抗體之構築和表現
利用AgeI和NheI切位，將R2S12、R2S12-AF和IMC-1121B的VH區域(Lu et al.,(2003)“Tailoring in vitro selection for a picomolar affinity human antibody directed against vascular endothelial growth factor receptor 2 for enhanced neutralizing activity”J Biol Chem 278,43496-43507)分別地選殖進入經修飾的表現載體pcDNA5-FRT-Gamma1中，此載體具有訊息胜肽和人類IgG1恆定區。此外，利用AgeI和EcoRV切位，將R2S12、R2S12-AF和IMC-1121B的VL區域分別地選殖進入經修飾的表現載體p-Kappa-HuGs中。將含有重鏈和輕鏈基因的質體組合成雙順反子載體(bicistronic vector)，以產生單一載體系統。將此載體轉染進入FLPINTM-CHO細胞(Invitrogen)。在2-3週後，利用潮黴素B(hygromycin B)篩選轉染的細胞，以建立穩定的轉殖株；將這些轉殖株於SFM4CHO培養基(Thermo Scientific)中培養以產生人類抗體。在2週培養之後，將穩定轉殖株的培養基收集、離心，並以0.45μm膜過濾。然後將上清液進行蛋白質G管柱層析(GE healthcare)以純化抗VEGFR2人類IgG。在以PBS對沖提液進行透析後，利用Bradford試劑(Thermo Scientific)和分光光度計評估抗體濃度。
抗VEGFR2人類IgG的親和力成熟作用
如先前所述執行親和力成熟作用。簡單來說，我們構築了包含R2S12之VH和VL基因譜型(gene repertoire)的合成噬菌體呈現scFv庫，其具有於VL-CDR3之七個胺基酸殘基引入的隨機突變。利用這個合成庫對於VEGFR2-Fc固定化的DYNABEADS®進行篩選。在生物體外進行四至五輪嚴格的篩選後，利用ELISA篩選並鑑定出陽性選殖株。透過與各自的親本選殖株(parental clone)比較，以鑑定出較好的VEGFR2結合選殖株。
結合動力學的測定
於BIACORE T100TM(GE healthcare)利用表面電漿共振(Surface Plasmon Resonance)測定抗VEGFR2抗體的親和力和動力學。將VEGFR2-Fc蛋白固定耦聯至位於BIACORE流路(flow cell)之EDC和NHS活化的CM5感應晶片上，然後依照說明書利用乙醇胺進行阻斷。利用濃度範圍介於0.1至100nM的抗體，在連續流動(30μl/min)下監測結合和解離階段，時間為5分鐘。利用再生緩衝液(0.2M NaCl,10mM glycine,pH 2.7)的注入進行晶片再生。為測定結合常數，利用BIAevaluation軟體(GE healthcare)，將感應圖(sensorgrams)以對樣品1：1交互作用的模式進行全域擬合。
動物模型
根據符合國家和國際法律和政策之中央研究院動物實驗管理小組的指導方針進行涉及動物和其照護的作法。由國家實驗動物中心(台灣)購得非肥胖型糖尿病與重症聯合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠。透過皮下注射2×106 PC-3細胞進入六週齡雄性小鼠的背側部以發展人類前列腺癌異種移植腫瘤模型。每天監測動物的整體健康狀況，並且每週測定體重兩次。利用滑動卡尺測量腫瘤大小，並依照長度×寬度2×0.52計算。將具有符合尺寸之腫瘤(50mm3)的小鼠隨機分配到不同治療組(n=9)，並且以正常人類IgG(NHIgG；Jackson ImmunoResearch)、IMC-1121B、抗VEGFR2-AF抗體，或等體積的PBS透過尾靜脈進行靜脈注射。以20mg/kg的抗體劑量每週注射兩次，為期四週。為了進行聯合治療，以5mg/kg劑量的歐洲紫杉醇(ScinoPharm Taiwan)每週靜脈注射一 次，為期三週。在試驗結束時，將腫瘤組織和內臟器官取出並固定以供組織學分析。
為了進行全身性白血病移植試驗，由中央研究院細胞與個體生物學研究所的動物中心獲得NOD/SCID/IL2Rγ-/-(NSG)小鼠。透過尾靜脈將5×106 HL-60細胞靜脈注射進入六週齡雌性小鼠中。每天監測動物的整體健康狀況，並且每週測定體重兩次。在腫瘤接種後3天，隨機選擇小鼠(n=9)以20mg/kg NHIgG、IMC-1121B、抗VEGFR2-AF抗體，或等體積的PBS靜脈注射，其頻率為每週兩次。每天觀察小鼠的毒性反應，並記錄存活時間。在試驗終點，將每隻小鼠的內臟器官取出並固定，以進一步供組織學檢查。
細胞培養
由LONZA購得HUVEC(人類臍靜脈血管內皮細胞)。由美國菌種保存中心(ATCC®)獲得HL-60(人類前骨髓性白血病)、PC-3(人類前列腺癌)、EA.hy926(人類臍靜脈內皮細胞株)和293T(人類胚胎腎臟細胞)細胞株。由WiCell購得hESC-H9(人類胚幹細胞)細胞株，而由Invitrogen獲得FLP-INTM-CHO細胞株。將HUVECs培養於內皮細胞生長培養基(EBM-2,LONZA)中。將HL-60和PC-3細胞培養於RPMI 1640培養基(GIBCOTM)中。將EA.hy926和293T細胞培養於DMEM(GIBCOTM)中。將FLP-INTM-CHO細胞維持在Ham’s F12培養基中。如前所述培養hESC-H9細胞株。於37℃、濕度固定、空氣成分含5%二氧化碳的培養箱中，將所有細胞株維持在具有10% FBS(GIBCOTM)和100μg/ml青黴素/鏈黴素(P/S；GIBCOTM)的條件培養基中。
利用ELISA篩選抗VEGFR2噬菌體選殖株
利用ELISA篩選進一步檢視所選擇的噬菌體。利用配製於0.1M碳酸氫鈉中之1μg/ml的VEGFR2-Fc、Met-Fc(R&D)或BSA(Sigma)蛋白塗覆96孔培養盤，並於4℃隔夜培養。在室溫下以配製於PBS中的1% BSA(w/v)進行阻斷2小時之後，將70個隨機選擇的噬菌體選植株以1：2之比例稀釋於1% BSA中以加入培養盤內，並於室溫下培養1小時。之後以PBST清洗，利用以1：2000比例稀釋的辣根過氧化酶(HRP)結合的小鼠抗M13噬菌體抗體(GE)與培養盤培養1小時。在以PBST清洗後，利用過氧化酶受質OPD(Sigma)加上H2O2呈色15分鐘，隨後加入3N鹽酸終止呈色反應。利用微量盤式分析儀(SpectraMax,Molecular Devices)測定波長490nm處的吸光值。分離陽性選殖株的質體DNA，並利用pCANTAB5定序用引子組進行定序。
質體構築
由Thermo Scientifics購得編碼全長VEGFR2序列(NM_002253.2)的人類cDNA選殖株，並作為以下構築的PCR模板。如下(也可參照第8圖)，構築具有訊息胜肽、跨膜結構域和截斷的細胞質結構域之不同長度的VEGFR2細胞外區域：VEGFR2(1-7)為VEGFR2的全長細胞外區域，包含從殘基Met1至Leu813的結構域1-7；VEGFR2(2-7)包含從殘基Ala111至Leu813的結構域2-7；VEGFR2(3-7)包含從殘基Ser208至Leu813的結構域3-7；VEGFR2(4-7)包含從殘基Phe321至Leu813的結構域4-7；VEGFR2(del2-3)，其中藉由接合編碼結構域1(Met1至Glu140)和結構域4-7(Phe321至Leu813)的兩個片段以刪除VEGFR2的結構域2和3；VEGFR2(del3)，其中藉由接合編碼結構域1-2(Met1至Arg222)和結構域4-7(Phe321至Leu813)的兩個片段以刪除VEGFR2的結構域3；VEGFR2(M1)為包含 VEGFR2之全長細胞外區域(Met1至Leu813)的所有七個結構域的突變構築，其中以小鼠同源物之261TWHSPP266取代位於結構域3的259NWEYPS264；以及VEGFR2(M2)為包含VEGFR2之全長細胞外區域(Met1至Leu813)的所有七個結構域的突變構築，其中以小鼠同源物之281PFPGTVA287取代位於結構域3的279TQSGSEM285。
可溶性scFv的表現和純化
利用抗VEGFR2 scFv噬菌體選殖株PC-8、12、28、29或45感染大腸桿菌菌株HB2151，並製備細菌的細胞間質層萃取物(periplasmic extracts)。依照說明書利用蛋白質L瓊脂糖管柱(Thermo Scientific)純化細胞間質層萃取物中的可溶性scFv。以PBS使純化的scFvs完全地透析，並利用還原性SDS-PAGE隨後以庫馬斯藍染色進行分析。
增生試驗
將總數為1×104 HUVECs種在96孔培養盤上並隔夜培養。然後將細胞置於無血清EBM-2培養基中隔夜培養使其飢餓。接著，將8μg/ml經選擇的scFv與配製於低血清EBM-2(0.2%)培養基中的40ng/ml VEGF一同加入孔洞中，培養48小時。依照說明書利用MTT試劑(Invitrogen)評估細胞增生。
流式細胞儀分析
將約1×104 HUVEC與經選擇的抗VEGFR2噬菌體選殖株置於FACS緩衝液(含有1% FBS之PBS)中於4℃下培養1小時。在以FACS緩衝液清洗細胞後，首先將細胞與小鼠抗M13噬菌體抗體於4℃下培養1小時，然後和R-藻紅素(phycoerythrin)結合的山羊抗小鼠IgG(Jackson Immuno Research)於4℃下培 養30分鐘。利用FACSCantoII(BD)進行流式細胞儀分析，並利用FACS Diva軟體(BD)測定發散螢光強度，以定量比較結合親和力。
利用慢病毒介導的短髮夾RNA(shRNA)弱化基因表現
慢病毒載體pLKO_TRCN0000199129，其編碼shRNA序列，ccggcgctgacatgtacggtc tat gctcgagca tag accgta cat gtcagcgttttttg(SEQ ID NO：70)，並針對人類VEGFR2，此慢病毒載體是由國家型干擾性核醣核酸核心設施(中央研究院，台灣)所提供。利用編碼針對螢火蟲螢光素酶(luciferase)之shRNA的pLKO_TRCN0000072249載體作為陰性對照組。為了產生病毒，利用LIPOFECTAMINE® 2000(Invitrogen)，將pLKO載體、外膜質體pMD.G和包裹質體pCMV-△R8.91以10：1：9的比例共轉染進入293T細胞。在轉染後18小時，以外加10% FBS和1% BSA的新鮮DMEM取代培養基。在培養24和48小時後收集含有病毒顆粒的上清液。
在慢病毒轉導(lentivirus transduction)後一天，將PC-3細胞以1×106細胞的密度種於60毫米培養皿中。將具有8μg/ml凝聚胺(polybrene)(Sigma-Aldrich)之含有病毒的培養基加入PC-3細胞並培養24小時。接著，利用於含有2μg/ml嘌黴素(puromycin)之生長培養基培養3天以篩選轉導的細胞。
免疫組織化學染色
如前所述進行免疫組織化學染色。簡單來說，利用Trilogy緩衝液(Cell Marque)將切片脫蠟和復水，並伴隨進行抗原修復。接著，藉由置於含有3% H2O2之甲醇中培養30分鐘以阻斷內生性過氧化酶活性。在以PBS清洗後，將切片與1% BSA培養30分鐘以阻斷非特異性結合。然後，將切片於室溫 下與抗VEGFR2抗體(55B11,Cell Signaling)培養1小時。在以PBST0.1清洗後，依據說明書以polymer-based Super Sensitive IHC detection system(Biogenex,San Ramon)處理切片。利用呈色受質鹽酸二氨基聯苯胺(diaminobenzidine hydrochloride(DAB))(0.02%)進行呈色以偵測辣根過氧化酶活性。將切片利用蘇木精(Sigma-Aldrich)稍微地複染色，以Permount(Fisher Scientific)封片，並以光學顯微鏡檢視。
西方墨點法分析
如前所述，利用標準方法進行西方墨點法。由Cell Signaling Technology購得一級抗體，並使用1,000倍稀釋供蛋白質偵測；使用的抗體如下：抗VEGFR2(選殖株55B11)、抗phospho-VEGFR2(Tyr1175；選殖株19A10)、抗FAK、抗phospho-FAK(Tyr397；選殖株D20B1)、抗p42/44 MAPK、抗phospho-p42/44 MAPK(Thr202/Tyr204；選殖株D13.14.4E)、抗Akt和抗phospho-Akt(Ser473)。
冷凍組織切片的免疫螢光試驗
關於腫瘤血管的研究，將樣品固定於冷凍包埋劑(OCT)內。將冷凍塊切成50μm切片，並以1%三聚甲醛固定冷凍腫瘤組織切片，利用0.1% TRITONTM-X 100增加通透性，以正常馬血清(Vector)進行阻斷，且之後與1：100稀釋的一級抗體(兔抗小鼠CD31(PECAM-1)；BD Bioscience)於室溫下培養1小時。接著，將組織切片與Alexa 549結合的山羊抗大鼠抗體(Invitrogen)於室溫下培養1小時。利用DAPI對細胞核染色，且之後利用螢光封片溶液進行封片。利用Zeiss Axiovert 200M顯微鏡獲得免疫螢光影像。在低功率放大下，利用 ImageJ軟體，藉由像素面積計算，並以DAPI染色進行標準化，以定量CD31內皮細胞的陽性區域。
末端去氧核糖核酸轉移酶介導的dUTP切口末端標記技術(TUNEL)
在與TUNEL反應混合液(Roche Diagnostics)於37℃培養1小時之前，以1%三聚甲醛固定冷凍腫瘤組織切片，並利用0.1% TRITONTM-X 100增加通透性。在以PBS清洗三次後，將切片與FITC-抗DIG抗體(1：2000)和DAPI(1：500)培養。以封片溶液對切片進行封片，並將切片於螢光顯微鏡下顯像。由三個人獨立地檢視切片。利用ImageJ軟體，藉由像素面積計算，並以DAPI染色進行標準化，以定量具有TUNEL陽性細胞的區域。
蘇木精和伊紅(H&E)染色
由小鼠切下腫瘤和指定的器官，並置於4%三聚甲醛中隔夜固定。依照標準程序進行樣品的固定和處理。將樣品包埋在石蠟中並切成50μm的切片。將經復水的石蠟包埋組織切片以Mayer’s蘇木精染色液(Wako)染色5分鐘，並以水清洗1-2分鐘。然後將切片以伊紅溶液(Wako)染色10分鐘。利用類流式固態組織細胞儀(Tissue Gnostics microscopes)顯現組織。
定量反轉錄聚合酶連鎖反應
利用TrizolRNA分離試劑(Invitrogen)進行總RNA萃取。接著，依照說明書利用oligo(dT)引子(Fermentas)和Super Script III反轉錄酶(Invitrogen)合成cDNA。透過PCR以放大VEGFR2 cDNA所使用的正向引子和反向引子如以下所示：VEGFR2-F：gaacatttgggaaatctcttgc(SEQE ID NO：71)；VEGFR2-R： cggaagaacaatgtagtctttgc(SEQ ID NO：72)。利用LightCycler480系統(Roche Applied Science)進行定量PCR。以相同樣品中GAPDH轉錄量對VEGFR2轉錄量進行標準化。針對每一樣品相應地計算此比值。以三重複進行此反應。
結果
結合VEGFR2之噬菌體呈現scFv的鑑定
利用噬菌體呈現人類自然scFv庫去分離可結合VEGFR2重組蛋白的噬菌體。在四輪親和力篩選後，結合噬菌體的效價增加高達3,455倍(第1A圖)。透過ELISA篩選和DNA定序，鑑定出五個不同的噬菌體選殖株(R2PC8、R2PC12、R2PC28、R2PC29、R2PC45；表1)，其可與VEGFR2-Fc(而非c-Met-Fc對照組蛋白)高度結合(第1B圖)。然後，利用人類臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)進行FACS試驗，證實所有五個選殖株均具有能力去結合位於細胞表面上的VEGFR2，五個選殖株中以R2PC12展現最高的反應性(第1C圖)。表1顯示抗VEGFR2 scFvs之VH和VL結構域的胺基酸序列。
接著，由五個VEGFR2結合的噬菌體選殖株製造可溶性scFv蛋白，其命名為R2S8、R2S12、R2S28、R2S29和R2S45(第1D圖)。利用免疫螢光染色試驗，研究抗VEGFR2 scFvs對人類肺癌手術樣品中腫瘤血管內皮細胞的結合能力。觀察到抗VEGFR2 scFvs的螢光訊號顯然地與內皮細胞標記CD31位置重合(第1E圖)，顯示這些scFvs可特異性地辨識腫瘤血管。
抗VEGFR2 scFvs拮抗VEGF-A/VEGFR2交互作用和VEGF-A誘導的VEGFR2磷酸化
利用基於培養盤的競爭結合試驗，增加scFvs濃度與VEGF-A競爭結合至固定化的VEGFR2上，以測定抗VEGFR2 scFvs是否可阻斷VEGF-A結合至VEGFR2。R2S8和R2S12強烈地抑制VEGF-A和VEGFR2的交互作用，其半數最大抑制濃度(IC50)分別為7.03和3.26nM，而R2S28和R2S29展現出較弱的競爭能力(第2A圖)。接著，要研究scFvs是否可以於HUVECs中拮抗VEGF-A介導 的VEGFR2活化；R2S8和R2S12可顯然地抑制由VEGF-A所造成之VEGFR2的酪胺酸磷酸化，且R2S12展現最強的抑制活性(第2B圖)。
抗VEGFR2 scFv之結合抗原決定位的鑑定
我們產生一系列VEGFR2刪除突變，其由訊息胜肽和跨膜結構域所組成(第8圖)，以定位出負責抗VEGFR2 scFv的結合結構域。這些蛋白質突變體異位地表現於293T細胞中，並利用R2S8、R2S12和R2S28免疫螢光染色加以檢視(表2)。發現R2S28結合至表現VEGFR2(1-7)的細胞，而非表現VEGFR2(2-7)或VEGFR2(4-7)的細胞，顯示VEGFR2的結構域1對R2S28結合是必需的。R2S8和R2S12結合至表現VEGFR2(1-7)和VEGFR2(2-7)的293T細胞，而非表現缺乏結構域3構築的細胞，例如VEGFR2(4-7)、VEGFR2(del2-3)或VEGFR2(del3)，進一步指出其結合抗原決定位位於結構域3內。表2顯示抗VEGFR2 scFv的抗原決定位圖譜分析。
此外，我們發現中和scFvs，R2S8和R2S12，並不會與小鼠VEGFR2蛋白交叉反應。人類和小鼠VEGFR2間的胺基酸序列比對顯示其於結構域3只有67%一致性，其為VEGFR2細胞外區域之七個結構域中最具變異性的。因此，我們推測位於人類VEGFR2結構域3中之R2S8和R2S12的不同抗原決定位並未呈現於小鼠VEGFR2中。比較人類和小鼠的結構域3顯示有30個殘基不同，且這些殘基聚集為多個群組。為鑑定對R2S8和R2S12結合具關鍵性之位於結構域3的胺基酸殘基，我們選擇了兩個主要群組(M1和M2)進行突變，如以下所示：將人類NWEYPS(SEQ ID NO：66)和TQSGSEM(SEQ ID NO：67)殘基分別以小鼠TWHSPP(SEQ ID NO：68)和PFPGTVA(SEQ ID NO：69)殘基取代(第2C圖)。免疫螢光染色的結果顯示R2S8和R2S12不會辨識表現VEGFR2-M1突變蛋白的293T細胞。相反地，於VEGFR2的M2區域突變並不影響對R2S8和R2S12的結合(表2)。
由先前報導的晶體結構訊息和我們的突變數據，我們建立了VEGFR2結構域3的分子模型。條帶和表面模型顯示NWEYPS(SEQ ID NO：66)殘基(M1區域)位於VEGFR2結構域3的β-strand和中間表面(第2D圖和第2E圖)。中和抗VEGFR2抗體、IMC-1121B和6.64的接觸殘基和結合表面位於VEGFR2結構域3(第2C圖和第2F圖)。我們觀察到M1區域靠近IMC-1121B和6.64抗體的結合抗原決定位。發現IMC-1121B抗體的兩個結合殘基，Asn259和Glu261，位於M1區域。因此，我們的結果顯示R2S8和R2S12的結合抗原決定位最有可能不同於IMC-1121B和6.64抗體的結合抗原決定位。
進行R2S12的親和力成熟作用以產生具有較高結合活性的抗VEGFR2-AF人類抗體
具有高親和力的中和抗體對治療功效來說是重要的。因為R2S12在受檢視的scFvs中具有最強的結合和拮抗活性，所以我們利用基於噬菌體呈現的親和力成熟作用來進一步增加其結合活性。在四輪的生物體外嚴格篩選後，鑑別出具有較好結合活性的選植株(R2S12AF)(第9A圖至第9B圖)。R2S12-AF之VL-CDR3內的四個殘基有別於其親本選殖株R2S12(第3A圖)。已顯示scFv型式因為其短的血清半衰期(將近3.5小時)和無法引發人類效應物功能而限制其於臨床上的使用。為了克服這些挑戰，我們將R2S12和R2S12-AF scFv的編碼序列分子設計進入人類IgG1骨架以分別地產生抗VEGFR2和抗VEGFR2-AF全人類抗體(hAb)。
我們利用BIACORE T100TM分析兩個人類抗體對VEGFR2的親和力。抗體-抗原動力學參數的測定顯示抗VEGFR2-AF hAb具有sub-nmol/L的親和力常數(K d =0.264nM)，且抗VEGFR2-AF hAb的結合親和力超過其親本選殖株抗VEGFR2 hAb(K d =2.1nM)，有8倍的增加(第3B圖)。我們進行固相競爭試驗以定量評估藉由個別抗體對VEGF-A/VEGFR2結合的阻斷。第3C圖顯示對抗VEGFR2-AF hAb、抗VEGFR2 hAb和IMC-1121B而言，VEGF-A結合至VEGFR2的IC50數值分別為0.88nM、1.87nM和1.42nM。這些數據指出抗VEGFR2-AF hAb於阻斷VEGF/VEGFR2交互作用上優於IMC-1121B。HUVECs的FACS分析結果進一步證實抗VEGFR2-AF hAb相較於IMC-1121B對細胞表面VEGFR2展現較強的結合(第3D圖)。
抗VEGFR2-AF hAb於HUVECs中可抑制VEGFR2介導之訊息路徑的活化並阻斷毛細血管結構形成
為了說明抗VEGFR2-AF hAb的抗血管新生潛力，我們分析了抗VEGFR2-AF hAb對HUVEC生長、移動和管柱形成的影響。我們利用MTT和傷口癒合試驗分別地發現抗VEGFR2-AF hAb可抑制VEGF-A誘導的HUVEC增生和移動。為了研究抗VEGFR2-AF hAb對內皮細胞管柱形成(血管新生中的一個重要步驟)的影響，我們檢視在缺乏或具有VEGF-A和抗VEGFR2-AF hAb的狀況下位於MATRIGEL®層上的HUVECs(第4A圖)。利用倒立式照相顯微鏡(inverted photomicroscope)評估和定量內皮細胞移動和組織成為類毛細血管結構的能力。基於管腔長度和分支點數的測量，我們證實了抗VEGFR2-AF hAb在抑制VEGF-A引發的類毛細血管結構方面較IMC-1121B更為有效(第4A圖)。
為了研究抗VEGFR2-AF hAb之抗血管新生特性的分子機制，我們利用西方墨點法檢視訊息分子和路徑(第4B圖)。發現抗VEGFR2-AF hAb可有效地減少VEGFR-2之VEGF-A誘導的磷酸化和其下游訊息分子(例如Akt、MAPK和FAK)。特別地，於抗VEGFR2-AF處理的組別中，磷酸化VEGFR2、Akt和MAPK的量低於IMC-1121B處理的組別，然而以任一抗體處理僅略為減少FAK磷酸化(第4B圖)。此結果指出抗VEGFR2-AF hAb可顯著地抑制血管內皮細胞血管新生的幾個關鍵步驟，顯示此抗體於生物體內可具有抗血管新生的潛力。
抗VEGFR2-AF hAb於VEGFR2表現的人類前列腺癌細胞中抑制VEGF-A誘導的細胞功能
我們選擇人類前列腺癌細胞株PC-3作為模型以研究抗VEGFR2-AF hAb於抑制腫瘤生長的治療功效。我們進行定量反轉錄聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)分析以研究於PC-3細胞中VEGFR2的內生性表現(第5A圖)。已知HUVECs、EA.hy926和hESC-H9細胞高度表現VEGFR2 mRNA，且因此作為陽性對照組。我們發現VEGFR2 mRNA在PC-3細胞中很容易被偵測到，但在陰性對照組293T細胞中幾乎偵測不到。
為了描述VEGF-A/VEGFR2在PC-3細胞的功能意義之特徵，我們分析以VEGF-A處理後的PC-3細胞活性。發現以VEGF-A處理可增強PC-3細胞的各種細胞活性，包含增生、細胞群落形成和侵犯能力(第5B圖)。相較於以對照組shRNA(shLuc)感染的PC-3細胞(第5D圖)，我們利用慢病毒介導的shRNA(shVEGFR2)建立VEGFR2弱化的PC-3細胞(VEGFR2-knock down PC-3 cells)，並發現VEGFR2的弱化可減少PC-3細胞的增生、細胞群落形成和侵犯能力(第5C圖)。我們以抗VEGFR2-AF hAb處理PC-3細胞，並證實藉由抗VEGFR2-AF hAb可抑制VEGF-A誘導的細胞活性(第10A圖至第10C圖)。因此，這些數據顯示VEGF/VEGFR2軸對PC-3細胞之群落形成和腫瘤形成能力是重要的。
我們研究於相關微矩陣數據集中的VEGFR2表現模式。我們發現在轉移性前列腺腫瘤中相較於在原發性腫瘤中具較高的VEGFR2轉錄量。我們利用市售抗VEGFR2抗體對人類前列腺癌組織陣列進行染色，並顯示於腫瘤細胞中可偵測到VEGFR2，且相較於第I級，其於第III級前列腺腺癌(prostate adenocarcinoma)中的表現量上升(第5F圖)。在正常前列腺組織樣品中，VEGFR2是呈現於血管內皮細胞中，而非於正常前列腺細胞中。
抗VEGFR2-AF於人類前列腺癌異種移植中的治療功效
我們利用PC-3異種移植前列腺腫瘤模型說明抗VEGFR2-AF hAb相對IMC-1121B於生物體內的抗腫瘤活性。歐洲紫杉醇為用於轉移性閹割抗性前列腺癌(metastatic castration-resistant prostate cancer)患者的第一線化學治療劑。因此，我們也研究聯合歐洲紫杉醇和抗VEGFR2-AF hAb或IMC-1121B的治療效果。利用IMC-1121B、抗VEGFR2-AF hAb、歐洲紫杉醇、抗VEGFR2-AF hAb加上歐洲紫杉醇、或IMC-1121B加上歐洲紫杉醇投予帶有PC-3異種移植的NOD/SCID小鼠(第6A圖)。在第38天，以聯合抗VEGFR2-AF hAb加上歐洲紫杉醇治療的小鼠之腫瘤生長減少達到90%，以聯合IMC-1121B加上歐洲紫杉醇治療的小鼠之腫瘤生長減少達到82%，以歐洲紫杉醇治療的小鼠之腫瘤生長減少達到70%，以抗VEGFR2-AF hAb治療的小鼠之腫瘤生長減少達到52%，且以IMC-1121B治療的小鼠之腫瘤生長減少達到45%(第6B圖)。利用體重作為小鼠健康狀態的替代指標(第6C圖)。相較於NHIgG組，抗VEGFR2-AF hAb組和IMC-1121B組於治療期間在體重上無顯著改變。單獨以歐洲紫杉醇治療引起明顯的體重下降(約20%)。利用歐洲紫杉醇聯合其他抗體治療的小鼠與單獨以歐洲紫杉醇治療的小鼠體重下降量相似，此顯示抗VEGFR2-AF hAb和IMC-1121B並不會增強歐洲紫杉醇引發的毒性。
測定腫瘤重量並發現其與腫瘤體積一致(第6D圖和第6E圖)。我們利用抗CD31抗體(偵測腫瘤血管)和TUNEL試驗(辨識凋亡細胞)進一步檢視每一組別的腫瘤組織。我們發現抗VEGFR2-AF hAb在減少腫瘤血管密度和增加癌細胞細胞凋亡方面優於IMC-1121B(第11A圖和第11B圖)。這些結果顯示抗 VEGFR2-AF hAb於減少腫瘤生長方面較IMC-1121B更有效，且抗VEGFR2-AF hAb可顯著地增強歐洲紫杉醇於小鼠中治療人類前列腺腫瘤的效用。
抗VEGFR2-AF hAb可延長帶有HL-60白血病異種移植小鼠的存活
VEGF-A/VEGFR2路徑不只在固體瘤中，也在液體瘤中具有重要的功能。先前研究提供IMC-1121B抑制HL-60白血病細胞生長和於小鼠模型中延長存活的證據。為比較IMC-1121B和抗VEGFR2-AF hAb之抗白血病效果，我們於NSG小鼠發展出HL-60白血病異種移植模型。小鼠接受5×106 HL-60細胞的靜脈注射，並於3天後以IMC-1121B、抗VEGFR2-AF、NHIgG或PBS治療。如第7圖所示，所有以PBS或NHIgG治療的小鼠於36天內死亡；然而，以針對VEGFR2之抗體治療的帶有白血病的小鼠於存活時間上展現了明顯的延長。相較於以IMC-1121B治療者(存活期最長達56天；中位存活期=43天)，以抗VEGFR2-AF hAb治療的小鼠存活較久(存活期最長達70天；中位存活期=53天)。在組別之間未觀察到體重有顯著改變(第7B圖)。
所有小鼠的死後組織病理學檢查顯示，在每一組別小鼠的肝臟、脾臟、心臟或腎臟並未發現明顯的病理變化。相較於正常的卵巢，帶有白血病之小鼠的卵巢有腫脹現象(第7C圖)。H&E染色顯示卵巢已經被轉移性白血病細胞所浸潤(第12A圖和第12B圖)。抗VEGFR2-AF hAb治療組的平均卵巢體積顯著地小於IMC-1121B治療組(第7D圖)。
此外，在九隻以抗VEGFR2-AF hAb治療的小鼠中發現一隻具有白血病浸潤的淋巴結，然而，在九隻以IMC-1121B治療的小鼠中有五隻呈現具有白血病浸潤的淋巴結(第7E圖)。
抗VEGFR2-AF hAb所介導以靶向位於腫瘤內皮細胞上的VEGFR2不僅可阻斷VEGF-A誘導的訊息，也可引發抗體依賴型細胞介導的細胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity(ADCC))或補體依賴性細胞毒性作用(complement-dependent cytotoxicity(CDC))，以直接毒殺目標細胞，其可增強現行的抗血管新生治療。
因為腫瘤細胞也表現VEGFR2，故抗VEGFR2-AF hAb可能能夠在腫瘤血管和惡性細胞二者發揮雙重靶向和抑制效果。雙重靶向能力可能在癌症治療上具有協同作用。我們製造抗VEGFR2-AF全人類抗體，其對VEGFR2展現優異的結合，拮抗此受體的活性。與IMC-1121B相似，抗VEGFR2-AF hAb可特異性地結合人類VEGFR2，而非小鼠VEGFR2。相較於IMC-1121B，抗VEGFR2-AF hAb在生物體外和生物體內呈現更高的抗腫瘤功效，其乃透過阻斷VEGF-A/VEGFR2軸介導的訊息。我們首先證明在前列腺癌治療中抗VEGFR2抗體可增強歐洲紫杉醇的治療功效。此發現顯示，抗VEGFR2-AF hAb透過同時和直接抑制血管新生和表現VEGFR2的腫瘤細胞，有潛力作為用於癌症治療的治療性抗體。
總之，相較於FDA核准的抗VEGFR2人類抗體IMC-1121B(雷莫蘆單抗)，抗VEGFR2-AF hAb具有顯著優異的活性，且可在生物體外抑制VEGF-A介導的毛細血管結構形成。我們觀察於人類前列腺癌細胞株(PC-3)和白 血病細胞株(HL-60)中的VEGFR2表現，並證實VEGFR2表現和人類前列腺癌的惡性和轉移性有關。在PC-3衍生的異種移植小鼠模型中，以抗VEGFR2-AF hAb治療(單一藥物療法或與歐洲紫杉醇聯合)可抑制腫瘤生長和血管新生，其較以IMC-1121B治療更有效率。在具有HL-60衍生之白血病的小鼠中，抗VEGFR2-AF hAb在延長存活和減少白血病細胞轉移至卵巢和淋巴結方面較IMC-1121B展現更顯著的功效。
上述本發明例示性實施例的描述僅作為說明和描述之目的而加以呈現，而非意圖去窮舉或限制本發明至所公開的確切型式。根據上述教示，許多修飾和變化是可能的。在此說明書中所引用和討論的所有文獻於此透過引用併入本文整體且至相同程度，其猶如每一文獻是透過引用而分別地併入。
所有說明書中所揭示之發明技術特點可以任意方式組合。說明書中揭示之每一技術特點可以提供相同、等同或相似目的之其他方式替換。因此，除非另有特別說明，文中所有揭示之特點均只是等同或相似特點之一般系列之實例。
由上述可知，熟習此技藝者能輕易地了解本發明之必要特徵，在不脫離其精神與範圍之下能就本發明做許多改變與調整以應用於不同用途與條件。
<110> 中央研究院
<120> 用於抗血管新生和標靶癌症治療的抗VEGFR2人類抗體
<130> 10011-051PCT
<150> 62147344
<151> 2015-04-14
<160> 80
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC8 VH CDR1
<400> 1
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC8 VH CDR2
<400> 2
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC8 VH CDR3
<400> 3
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC8 VL CDR1
<400> 4
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC8 VL CDR3
<400> 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC12VH CDR1
<400> 6
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC12VH CDR2
<400> 7
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC12 VH CDR3
<400> 8
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC12 VL CDR1
<400> 9
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC12 VL CDR3
<400> 10
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC28 VH CDR1
<400> 11
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC28 VH CDR2
<400> 12
<210> 13
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC28 VH CDR3
<400> 13
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC28 VL CDR1
<400> 14
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC28 VL CDR3
<400> 15
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC29 VH CDR1
<400> 16
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC29 VH CDR2
<400> 17
<210> 18
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC29 VH CDR3
<400> 18
<210> 19
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC29 VL CDR1
<400> 19
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC29 VL CDR3
<400> 20
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC45 VH CDR1
<400> 21
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC45 VH CDR2
<400> 22
<210> 23
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC45 VH CDR3
<400> 23
<210> 24
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC45 VL CDR1
<400> 24
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC45 VL CDR3
<400> 25
<210> 26
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC8 VH FR1
<400> 26
<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC8 VH FR2
<400> 27
<210> 28
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC8 VH FR3
<400> 28
<210> 29
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC8 VH FR4
<400> 29
<210> 30
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC8 VL FR1
<400> 30
<210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC8 VL FR2
<400> 31
<210> 32
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC8 VL FR3
<400> 32
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC8 VL FR4
<400> 33
<210> 34
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC12 VH FR1
<400> 34
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC12 VH FR2
<400> 35
<210> 36
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC12 VH FR3
<400> 36
<210> 37
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC12 VH FR4
<400> 37
<210> 38
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC12 VL FR1
<400> 38
<210> 39
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC12 VL FR2
<400> 39
<210> 40
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC12 VL FR3
<400> 40
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC12 VL FR4
<400> 41
<210> 42
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC28 VH FR1
<400> 42
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC28 VH FR2
<400> 43
<210> 44
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC28 VH FR3
<400> 44
<210> 45
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC28 VH FR4
<400> 45
<210> 46
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC28 VL FR1
<400> 46
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC28 VL FR2
<400> 47
<210> 48
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC28 VL FR3
<400> 48
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC28 VL FR4
<400> 49
<210> 50
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC29 VH FR1
<400> 50
<210> 51
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC29 VH FR2
<400> 51
<210> 52
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC29 VH FR3
<400> 52
<210> 53
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC29 VH FR4
<400> 53
<210> 54
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC29 VL FR1
<400> 54
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC29 VL FR2
<400> 55
<210> 56
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC29 VL FR3
<400> 56
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC29 VL FR4
<400> 57
<210> 58
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC45 VH FR1
<400> 58
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC45 VH FR2
<400> 59
<210> 60
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC45 VH FR3
<400> 60
<210> 61
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC45 VH FR4
<400> 61
<210> 62
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC45 VL FR1
<400> 62
<210> 63
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC45 VL FR2
<400> 63
<210> 64
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC45 VL FR3
<400> 64
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC45 VL FR4
<400> 65
<210> 66
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 66
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 67
<210> 68
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 68
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 69
<210> 70
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗VEGFR2 shRNA序列
<400> 70
<210> 71
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGFR2-F引子
<400> 71
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGFR2-R引子
<400> 72
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2S12AF可變輕鏈CDR3
<400> 73
<210> 74
<211> 1356
<212> PRT
<213> 智人
<400> 74
<210> 75
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 75
<210> 76
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2S12或R2S12-AF的VH區域
<400> 76
<210> 77
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2S12的VL區域
<400> 77
<210> 78
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2S12AF的VL區域
<400> 78
<210> 79
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 79
<210> 80
<211> 1340
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 80

Claims (11)

  1. 一種分離的抗體或其抗原結合片段，其包含一重鏈可變區(VH)和一輕鏈可變區(VL)，該VH包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，且該VL包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中，該VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3分別包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8的胺基酸序列；且該VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO：9、Asp Ala Ser及SEQ ID NO：10或73的胺基酸序列。
  2. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3分別包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8的胺基酸序列；且該VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO：9、Asp Ala Ser及SEQ ID NO：10的胺基酸序列。
  3. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中：該VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3分別包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8的胺基酸序列；且該VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO：9、Asp Ala Ser及SEQ ID NO：73的胺基酸序列。
  4. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)一重鏈可變區(VH)，包含SEQ ID NO：76胺基酸序列；以及(b)一輕鏈可變區(VL)，包含SEQ ID NO：77或78胺基酸序列。
  5. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其為一單鏈可變片段、一Fab片段或一Fv片段。
  6. 如請求項1至5中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為一全人類抗體。
  7. 一種組成物，包含一治療上有效劑量之如請求項1至6中任一項之抗體或其抗原結合片段以及一藥學上可接受的載體或載劑。
  8. 如請求項7之組成物，進一步包含一治療上有效劑量之化學治療劑。
  9. 一種如請求項1至6中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項7或8之組成物用於製造在一有此需要的個體中用以抑制腫瘤生長、腫瘤血管新生和/或誘導癌細胞之細胞毒性的一藥物的用途。
  10. 如請求項9之用途，其中該腫瘤或癌症係選自由胰臟癌、乳癌、肺癌、白血病、前列腺癌和卵巢癌所組成群組中的至少一種。
  11. 一種偵測一生物樣品中位在腫瘤血管內皮細胞或癌細胞上VEGFR2存在的方法，包含：(i)混合如請求項1至6中任一項之該抗體或其抗原結合片段與該生物樣品；(ii)允許該抗體或其抗原結合片段與該生物樣品中位在該腫瘤血管內皮細胞或癌細胞上之該VEGFR2交互作用並形成一複合物；以及(iii)偵測位於該複合物中之位在該腫瘤血管內皮細胞或癌細胞上之該VEGFR2的存在。
TW105111564A 2015-04-14 2016-04-13 用於對抗血管新生及腫瘤標靶治療之對抗第二型血管內皮生長受體之人類抗體 TWI621629B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562147344P 2015-04-14 2015-04-14
US62/147,344 2015-04-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201712033A TW201712033A (zh) 2017-04-01
TWI621629B true TWI621629B (zh) 2018-04-21

Family

ID=57126972

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW105111564A TWI621629B (zh) 2015-04-14 2016-04-13 用於對抗血管新生及腫瘤標靶治療之對抗第二型血管內皮生長受體之人類抗體

Country Status (15)

Country Link
US (1) US10196447B2 (zh)
EP (1) EP3283528B1 (zh)
JP (1) JP6542383B2 (zh)
KR (1) KR20170135904A (zh)
CN (1) CN107531789B (zh)
AU (1) AU2016249991B2 (zh)
BR (1) BR112017022205A2 (zh)
CA (1) CA2981883C (zh)
ES (1) ES2882276T3 (zh)
MX (1) MX2017013177A (zh)
NZ (1) NZ735720A (zh)
PT (1) PT3283528T (zh)
SG (1) SG11201707949XA (zh)
TW (1) TWI621629B (zh)
WO (1) WO2016168159A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6959912B2 (ja) 2015-09-23 2021-11-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｖｅｇｆ抗体の最適化変異体
CN106674349B (zh) * 2017-03-07 2018-03-13 北京东方百泰生物科技有限公司 一种改进的抗vegfr‑2单克隆抗体
GB201710836D0 (en) * 2017-07-05 2017-08-16 Ucl Business Plc ROR1 Car T-Cells
CN114341170B (zh) * 2019-07-19 2023-09-01 神州细胞工程有限公司 一种人源化抗vegfr2抗体及其应用
KR20230039943A (ko) * 2021-09-15 2023-03-22 주식회사 파멥신 항-vegfr2(kdr) 개량 항체 및 이의 용도

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014055998A1 (en) * 2012-10-05 2014-04-10 Kadmon Corporation, Llc Human anti-vegfr-2/kdr antibodies

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6811779B2 (en) * 1994-02-10 2004-11-02 Imclone Systems Incorporated Methods for reducing tumor growth with VEGF receptor antibody combined with radiation and chemotherapy
WO2002020008A1 (en) 2000-09-06 2002-03-14 The Scripps Research Institute Inhibitors of nadh:ubiquinone oxidoreductase
US7320793B2 (en) * 2001-01-19 2008-01-22 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
KR100883430B1 (ko) * 2007-06-13 2009-02-12 한국생명공학연구원 혈관내피성장인자 수용체를 중화하는 인간 단클론항체 및그 용도
CN102083861B (zh) * 2007-08-13 2016-04-13 瓦斯基因治疗公司 使用结合EphB4的人源化抗体的癌症治疗
KR20140019284A (ko) * 2010-09-03 2014-02-14 아카데미아 시니카 항-C-Met 항체 및 이의 이용 방법들

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014055998A1 (en) * 2012-10-05 2014-04-10 Kadmon Corporation, Llc Human anti-vegfr-2/kdr antibodies

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Franklin MC et al," The structural basis for the function of two anti-VEGF receptor 2 antibodies.", Structure. 2011 Aug 10;19(8):1097-107.
Franklin MC et al," The structural basis for the function of two anti-VEGF receptor 2 antibodies.", Structure. 2011 Aug 10;19(8):1097-107. Witte L et al,"Monoclonal antibodies targeting the VEGF receptor-2 (Flk1/KDR) as an anti-angiogenic therapeutic strategy.", Cancer Metastasis Rev. 1998 Jun;17(2):155-61. *
Witte L et al,"Monoclonal antibodies targeting the VEGF receptor-2 (Flk1/KDR) as an anti-angiogenic therapeutic strategy.", Cancer Metastasis Rev. 1998 Jun;17(2):155-61.

Also Published As

Publication number Publication date
EP3283528A1 (en) 2018-02-21
BR112017022205A2 (pt) 2018-08-28
AU2016249991B2 (en) 2021-03-25
AU2016249991A1 (en) 2017-10-12
US10196447B2 (en) 2019-02-05
CA2981883A1 (en) 2016-10-20
CN107531789A (zh) 2018-01-02
TW201712033A (zh) 2017-04-01
ES2882276T3 (es) 2021-12-01
EP3283528A4 (en) 2019-03-06
WO2016168159A1 (en) 2016-10-20
CN107531789B (zh) 2021-08-10
MX2017013177A (es) 2018-01-30
JP6542383B2 (ja) 2019-07-10
CA2981883C (en) 2019-10-22
EP3283528B1 (en) 2021-07-21
SG11201707949XA (en) 2017-10-30
US20180127504A1 (en) 2018-05-10
PT3283528T (pt) 2021-08-11
KR20170135904A (ko) 2017-12-08
JP2018512434A (ja) 2018-05-17
NZ735720A (en) 2024-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230110249A1 (en) Antibodies and vaccines for use in treating ror1 cancers and inhibiting metastasis
JP6163502B2 (ja) 抗上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）抗体及びその使用方法
TWI621629B (zh) 用於對抗血管新生及腫瘤標靶治療之對抗第二型血管內皮生長受體之人類抗體
AU2019226270A1 (en) Methods and compositions for prognosis, diagnosis and treatment of ADAM8-expressing cancer
US20190127454A1 (en) Inhibition of scube2, a novel vegfr2 co-receptor, suppresses tumor angiogenesis
JP2020037571A (ja) Ｔｍｃｃ３の阻害による、癌を抑制するための方法
Ahn et al. Anti-cancer activity of novel TM4SF5-targeting antibodies through TM4SF5 neutralization and immune cell-mediated cytotoxicity
KR101906558B1 (ko) Tspan8에 특이적인 신규 항체 및 이의 용도
KR20230156936A (ko) 그렘린1 길항제를 사용하여 질환을 치료하는 방법
CN109476759B (zh) Prl3抗体