JP6542383B2 - 抗血管新生及び標的がん療法のための抗vegfr2ヒト抗体 - Google Patents
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Description
一態様において、本発明は、ヒト血管内皮成長因子受容体2(VEGFR2;配列番号: 74)のドメイン1又はドメイン3内に位置するエピトープに特異的な結合親和性を有する単離した抗体又はその抗原結合性断片に関するものであり、VEGFR2のドメイン3内のエピトープは、配列番号: 74のアミノ酸残基250から270の間に位置する。
上記VHは、VH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3を含み、
上記VLは、VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3を含み、
(i)
上記VH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3は、それぞれ、配列番号: 1、配列番号: 2及び配列番号: 3のアミノ酸配列を含み、
上記VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3は、それぞれ、配列番号: 4、Ala Ala Ser及び配列番号: 5のアミノ酸配列を含む、
又は
(ii)
上記VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3は、それぞれ、配列番号: 6、配列番号: 7及び配列番号: 8のアミノ酸配列を含み、
上記VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3は、それぞれ、配列番号: 9、Asp Ala Ser及び配列番号: 10又は73のアミノ酸配列を含む、
又は
(iii)
上記VH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3は、それぞれ、配列番号: 11、配列番号: 12及び配列番号: 13のアミノ酸配列を含み、
上記VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3は、それぞれ、配列番号: 14、Asp Ala Ser及び配列番号: 15のアミノ酸配列を含む、
又は
(iv)
上記VH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3は、それぞれ、配列番号: 16、配列番号: 17及び配列番号: 18のアミノ酸配列を含み、
上記VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3は、それぞれ、配列番号: 19、Gly Ala Ser及び配列番号: 20のアミノ酸配列を含む、
又は
(v)
上記VH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3は、それぞれ、配列番号: 21、配列番号: 22及び配列番号: 23のアミノ酸配列を含み、
上記VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3は、それぞれ、配列番号: 24、Asp Ala Ser及び配列番号: 25のアミノ酸配列を含む。
治療上有効量の本発明の単離した抗体又はその抗原結合性断片及び医薬的に許容可能なキャリアを含む組成物を、それを必要とする対象に投与し、腫瘍成長、腫瘍血管新生を阻害及び/又はがん細胞に対する細胞毒性を誘導させる必要がある対象にそれらを阻害及び/又はそれを誘導させるステップを有する方法に関する。
(i) 本発明の抗体又はその抗原結合性断片を生体試料と混合するステップと、
(ii)上記抗体又はその抗原結合性断片と上記生体試料における上記腫瘍血管内皮細胞又はがん細胞での上記VEGFR2とを相互作用させて複合体を形成させるステップと、
(iii) 上記複合体における上記腫瘍血管内皮細胞又はがん細胞でのVEGFR2の存在を検出するステップと、
を有する方法に関する。
以下で、本発明の様々な実施形態の詳細について説明する。図面を参照する。同じ数は、図の全体にわたって同じ要素を指す。本願明細書の記述で、及び添付の特許請求の範囲の全体にわたって用いられている通り、「a」、「an」及び「the」の意味は、別途文脈で明確に示していない限り、複数の意味を含む。また、本願明細書の記述で、及び添付の特許請求の範囲の全体にわたって用いられている通り、「in」の意味は、別途文脈で明確に示していない限り、「in」及び「on」の意味を含む。加えて、この明細書において使用するいくつかの用語は、以下でより詳しく規定している。
この明細書において使用する用語は、本発明の文脈の中で、及び、それぞれの用語が使われている特定の文脈において、一般的な従来技術での通常の意味を有する。本発明を記述するために用いるある種の用語は、明細書の以下に、又は他の箇所に記述して、本発明の記述に関して実践者に追加のガイダンスを提供する。便宜上、ある種の用語は、強調することができ、例えばイタリック及び/又は引用符を使用することができる。強調表示の使用は、用語の範囲及び意味に影響を及ぼすものではない。それが強調されようとも、用語の範囲及び意味は、同じ文脈において、同じである。同じことを複数の方法で述べることができることはいうまでもない。その結果、他の言葉及び同義語は、任意の1又は複数の用語として用いてもよく、用語が本願明細書に詳しく述べられているか記載されているかにかかわらず特別な意味は有さない。ある種の用語の同義語が提供される。1又は複数の同義語の記述は、他の同義語の使用を排除しない。本明細書中に記載されている任意の用語の例を含む例の使用は、例示的なものに過ぎず、決して本発明又は例示される用語の範囲及び意味を限定するものではない。同様に、本発明は、この明細書において与えられている様々な実施形態に限定されない。
HED =動物への投与量(mg/kg)×(動物体重(kg)/ヒト体重(kg))0.33
QQLDDIPIT(R2S12AF可変軽鎖CDR3;配列番号: 73)
VGFR2(ヒト血管内皮生長因子受容体2;配列番号: 74);GLMTKK(配列番号: 75)
ファージ提示scFvライブラリーからのVEGFR2に結合するファージの分離
我々の研究室が以前確立した複雑度(complexity)が6X1010のヒトナイーブファージ提示scFvライブラリーを選択のために用いた。scFvライブラリーは、タンパク質G DYNABEADS(登録商標)(Invitrogen)を用いて非特異的結合を取り除いて、VEGFR2-Fc組換えタンパク質(R&D Systems)固定DYNABEADS(登録商標)と共にインキュベートした。0.1%のTWEENTM20を含むPBS(PBST0.1)を用いた洗浄の後、VEGFR2-Fcに結合したファージを、大腸菌TG1細胞に感染させることによって回収した。ファージ力価の測定の後、次のバイオパニングを行った。
様々な濃度の抗VEGFR2 scFvを、3nMヒトVEGF-A(Peprotech)を混合して、1mg/mlのVEGFR2-Fcでコートされた96ウェルプレートに加え、1%のBSAで前もってブロッキングした。RTで1時間インキュベーションしてPBSTで洗浄した後、結合したVEGF分子を、抗VEGF mAb(GeneTex)及びHRP標識ヤギ抗マウスIgGを使用して検出した。反応は、OPD及びH2O2の混合物によって進行させ、3N HClによって停止させた。吸光度を、490nmでマイクロプレートリーダーを使用して決定した。
ヒト肺がん外科的試料を、国立台湾大学病院の病理部から得た。凍結切片スライドをPBSによって洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定した。PBSでの洗浄の後、スライドを、正常ウマ血清(Vector)でブロッキングして、scFvと共にインキュベートした。PBSTでの洗浄の後、ラビット抗Eタグ抗体(Bethyl Laboratories)及びマウス抗ヒトCD31 mAb(BD)の混合物を加えて、スライドを1時間インキュベートした。カバーグラスを、FITC標識抗マウスIgG、ローダミン標識ヤギ抗ラビットIgG及びDAPIで1時間染色し、倒立型蛍光顕微鏡(Zeiss、Axiovert 200M)を使用して捕捉した。
MATRIGEL(登録商標)(BD Biosciences)を一晩4℃で解凍し、10μlのMATRIGEL(登録商標)を予め冷却しておいたμ-スライド血管新生(Ibidi)の各ウェルに加え、スライドを37℃で15分間インキュベートした。飢餓状態のHUVEC(4X104細胞)を、40ng/mlのVEGF-A及び抗VEGFR2抗体有り無しの0.2%血清含有EBM-2に加えた。24時間のインキュベーション後、内皮細胞チューブ形成をOLYMPUS倒立型顕微鏡及びデジタルカメラ(OLYMPUS、DP-12)で評価した。チューブの長さ及び分枝点は、ImageJソフトウェアによって量的に評価した。抗体による阻害パーセントは、競合物質のないVEGF-A処理ウェルでのパーセントとして表している。
R2S12、R2S12-AF及びIMC-1121BのVH領域は、AgeI及びNheIサイトを使用して、シグナルペプチド及びヒトIgG1定常領域を有する改変型発現ベクターpcDNA5-FRT-Gamma1に別々にクローニングした。加えて、R2S12、R2S12-AF及びIMC-1121BのVL領域は、AgeI及びEcoRVサイトを使用して、改変型発現ベクターp-カッパ-HuGsに別々にクローニングした。重鎖遺伝子含有プラスミドと軽鎖遺伝子含有プラスミドをバイシストロン性ベクターと組み合わせて、単一のベクターシステムを作成した。プラスミドを、FLPINTM-CHO細胞(Invitrogen)にトランスフェクションした。2-3週間後に、トランスフェクト細胞を、ヒグロマイシンBを使用して選別し、安定クローンを確立した。これらのクローンをSFM4CHO培地(Thermo Scientific)で培養して、ヒト抗体を生産した。2週間のインキュベーションの後、安定クローンの培養培地を集めて、遠心分離し、0.45μm膜でろ過した。そして、抗VEGFR2ヒトIgGの精製のためのタンパク質Gカラムクロマトグラフィー(GE healthcare)に上清をかけた。PBSを用いて溶出液を透析した後、抗体量を、ブラッドフォード試薬(Thermo Scientific)及び分光測光を使用して評価した。
親和性成熟は、前述したように実行した。簡潔に言えば、VL-CDR3の7つのアミノ酸残基に導入されたランダム変異を用いて、R2S12のVH及びVL遺伝子レパートリーから成る合成ファージ提示scFvライブラリーを構成した。この合成ライブラリーを用いて、VEGFR2-Fc固定DYNABEADS(登録商標)についてバイオパニングを行った。4から5回のストリンジェントなインビトロバイオパニングの後、陽性クローンをスクリーニングして、ELISAによって同定した。優れたVEGFR2-結合クローンを、それぞれの親クローンとの比較によって同定した。
抗VEGFR2抗体の親和性及びカイネティクスを、BIACORE T100TM (GE healthcare)にて表面プラズモン共鳴で測定した。VEGFR2-Fcタンパク質を、製造業者の指示に従ってBIACOREフローセルのEDC及びNHS活性CM5センサーチップに結合し、エタノールアミンによってブロッキングした。結合及び解離フェーズを、0.1から100nMにわたる抗体濃度を使用して、30μl/分の連続フロー下で5分間モニターした。再生は、再生バッファー(0.2MのNaCl、10mMのグリシン、pH 2.7)の注入によって行った。結合定数を決定するために、センサーグラムを、BIAevaluationソフトウェア(GE healthcare)を使用してサンプル1:1相互作用モデルにグローバルに設定した。
動物及びそれらのケアに関する手順は、国家的及び国際的な法律及び方針に従いAcademia Sinica Institutional Animal Care及びUtilization委員会のガイドラインに沿って行った。非肥満性糖尿病性重症複合型免疫不全(NOD/SCID)マウスを国立研究所動物センター(台湾)から購入した。ヒト前立腺がん異種移植片腫瘍モデルは、6週齢雄マウスの背中側脇腹に2X106個のPC-3細胞を皮下に注入することによって開発した。動物は、一般的な健康状態について毎日モニターし、体重は、週2回測定した。腫瘍サイズは、ノギスによって測定し、長さX幅2 X 0.52として算出した。サイズがマッチした腫瘍(50のmm3)をもつマウスを、種々の治療グループ(n=9)に無作為に分けて、正常ヒトIgG(NHIgG; Jackson ImmunoResearch)、IMC-1121B、抗-VEGFR2-AF抗体又は等価な量のPBSを、尾静脈を通じて静脈内に注射した。20mg/kgの抗体用量を4週間で週に2回注射した。また、併用療法のために、ドセタキセル(ScinoPharm Taiwan)を3週間で週に1回、5mg/kgの用量で静脈内に投与した。実験終了後、腫瘍組織及び内臓器官を組織学的分析のために取り出して固定した。
HUVEC(ヒト臍血管内皮細胞)をLONZAから購入した。HL-60(ヒト前骨髄球性白血病)、PC-3(ヒト前立腺がん)、EA.hy926(ヒト臍静脈細胞株)及び293T(ヒト胎児腎臓細胞)の細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC(登録商標))から得た。hESC-H9(ヒト胚性幹細胞)株は、WiCellから購入し、FLP-INTM-CHO細胞は、Invitrogenから得た。HUVECは、内皮成長培地(EBM-2、LONZA)で培養した。HL-60及びPC-3細胞は、RPMI 1640培地(GIBCOTM)で培養した。EA.hy926及び293T細胞は、DMEM(GIBCOTM)で培養した。FLP-INTM-CHO細胞は、ハムF12培地に維持した。hESC-H9株は、前述の通り培養した。全ての細胞株は、37℃、5%のCO2加湿インキュベーターにおいて、10%のウシ胎児血清(FBS; GIBCOTM)及び100μg/mlペニシリン/ストレプトマイシン(P/S; GIBCOTM)補充条件培地に維持した。
選別したファージを、ELISAスクリーニングによって更に検討した。96ウェルプレートを、4℃一晩、0.1Mの重炭酸ナトリウムにおいて1mg/mlのVEGFR2-Fc、Met-Fc(R&D)又はBSA(Sigma)タンパク質でコートした。室温で2時間、1%BSA含有PBS(w/v)でブロッキングの後、ランダムに選別した70個のファージクローンを1%のBSAにて1:2の希釈度でプレートに加えて、室温で1時間インキュベートした。PBSTでの洗浄後、プレートを、1:2000の希釈度のワサビペルオキシダーゼ(HRP)-共役マウス抗M13ファージ抗体(GE)と共に1時間インキュベートした。PBSTでの洗浄の後、比色反応を、ペルオキシダーゼ基質オルトフェニレンジアミン(OPD; Sigma)とH2O2で15分間進め、3N HClの添加によって停止させた。490nmの吸光度をマイクロプレートリーダー(SpectraMax, Molecular Devices)を使用して決定した。ポジティブクローンのプラスミドDNAを、pCANTAB5配列決定プライマーセットを使用して単離し、配列を決定した。
VEGFR2全長配列(NM_002253.2)をエンコードしているヒトcDNAクローンを、Thermo Scientificsから購入し、以下の構築物のPCRテンプレートとして用いた。シグナルペプチドを有するVEGFR2細胞外領域、膜貫通ドメイン及び切り詰めた細胞質ドメインの様々な長さを、以下の通り構成した(また、図8を参照)。VEGFR2(1-7)は、VEGFR2の全長細胞外領域であり、残基Met1からLeu813のドメイン1-7からなる。VEGFR2(2-7)は、残基Ala111からLeu813のドメイン2-7を含む。VEGFR2(3-7)は、残基Ser208からLeu813のドメイン3-7を含む。VEGFR2(4-7)は、残基Phe321からLeu813のドメイン4-7を含む。VEGFR2(del2-3)は、 VEGFR2のドメイン2及び3がドメイン1(Met1からGlu140)及びドメイン4-7(Phe321からLeu813)をエンコードしている2つの断片のライゲーションによって削除されている。VEGFR2(del3)は、 VEGFR2のドメイン3がドメイン1-2(Met1からArg222)及び4-7(Phe321からLeu813)をエンコードしている2つの断片のライゲーションによって削除されている。VEGFR2(M1)は、VEGFR2の全長細胞外領域の7つ全てのドメイン(Met1からLeu813)を含む変異構築物であり、ドメイン3の259NWEYPS264 (配列番号66)は、マウスホモログの261TWHSPP266 (配列番号68)に置換されている。VEGFR2(M2)は、VEGFR2の全長細胞外領域の7つ全てのドメイン(Met1からLeu813)を含む変異構築物であり、ドメイン3の279TQSGSEM285 (配列番号67)は、マウスホモログの281PFPGTVA287 (配列番号69)に置換されている。
大腸菌株HB2151を抗VEGFR2 scFvファージクローンPC-8、12、28、29又は45に感染させ、細菌の細胞膜周辺抽出物を調整した。可溶性scFvを、製造業者の指示に従ってタンパク質Lアガロースカラム(Thermo Scientific)を使用して細胞膜周辺抽出物において精製した。精製されたscFvsを、PBSで完全に透析し、還元SDS-PAGEを行い次にクマシーブルー染色を行って分析した。
合計で1X104個のHUVECを、96ウェルプレートに播種して一晩おいた。そして、細胞を一晩無血清EBM-2において飢餓状態にした。その後、8μg/mlの選別したscFvを、40ng/mlのVEGF含有低血清EBM-2(0.2%)と共にウェルに加え、48時間インキュベートした。細胞増殖は、製造業者の指示に従って、MTT試薬(Invitrogen)を使用して評価した。
分析約1X104個のHUVECを、FACSバッファー(1%のウシ胎児血清を含むPBS)において、選別した抗VEGFR2ファージクローンと共に4℃で1時間インキュベートした。細胞をFACSバッファーで洗浄した後、それらを、まず、マウス抗M13ファージAbと共に4℃で1時間インキュベートし、次に、R-フィコエリトリン共役ヤギ抗マウスIgG(Jackson Immuno Research)と共に4℃で30分間インキュベートした。フローサイトメトリーを、FACSCantoII(BD)を用いて行い、放出蛍光強度をFACS Divaソフトウェア(BD)によって測定し結合親和性を量的に比較した。
shRNA配列(ccggcgctgacatgtacggtc tat gctcgagca tag accgta cat gtcagcgttttttg(配列番号: 70))をエンコードしており、そして、標的ヒトVEGFR2でもあるレンチウイルスベクターpLKO_TRCN0000199129は、国立RNAi Core Facility(Academia Sinica, Taiwan)から得た。ホタルルシフェラーゼに対するshRNAをエンコードしているpLKO_TRCN0000072249ベクターをネガティブコントロールとして用いた。ウイルス生産のために、pLKOベクター、エンベローププラスミドpMD.G及びパッキングプラスミドpCMV-R8.91を、LIPOFECTAMINE(登録商標)2000 (Invitrogen)を使用して293T細胞に、10:1:9の比率で共トランスフェクションした。形質移入の18時間後、培養液を、10%のFBS及び1%のBSAを含む新鮮なDMEMに置換した。ウイルス粒子を含む上清を、24及び48時間のインキュベーションの後に回収した。
免疫組織化学的染色を、前述の通り行った。簡潔に述べると、切片を脱パラフィンして、再水和し、抗原回収を、トリロジーバッファー(Cell Marque)を使用して同時に行った。そして、内因性ペルオキシダーゼ活性を、3%のH2O2含有メタノール中でのインキュベーションによって30分間ブロッキングした。PBSでの洗浄の後、切片を、1%のBSAで30分間インキュベートして、非特異的結合のブロッキングを行った。そして、切片を、抗VEGFR2抗体(55B11、Cell Signaling)と共に室温で1時間インキュベートした。PBST0.1での洗浄の後、切片を、製造業者の指示に従ってポリマー系Super Sensitive IHC検出システム(Biogenex, San Ramon)で処理した。ワサビペルオキシダーゼ活性は、色素基質であるジアミノベンジジン塩酸塩(DAB)(0.02%)を用いた発色によって検出した。スライドを、ヘマトキシリン(Sigma-Aldrich)で軽く対比染色して、Permount(Fisher Scientific)と共にマウントし、光学顕微鏡によって調べた。
ウェスタンブロットは、前述した通り、標準プロトコールを使用して行った。一次抗体は、Cell Signaling Technologyから購入し、タンパク質検出のために1,000倍希釈で用いた。使用した抗体は、以下の通りである:抗VEGFR2(クローン55B11)、抗ホスホVEGFR2(Tyr1175;クローン19A10)、抗FAK、抗ホスホFAK(Tyr397; クローンD20B1)、抗p42/44 MAPK、抗ホスホp42/44 MAPK(Thr202/Tyr204; クローンD13.14.4E)、抗Akt及び抗-ホスホAkt(Ser473)。
腫瘍血管調査のために、サンプルをOCTに固定した。凍結ブロックを50μmの切片に切り分けて、凍結腫瘍組織切片を1%のパラホルムアルデヒドで固定し、0.1%のTRITONTM-X 100で透過処理して、正常ウマ血清(Vector)でブロッキング処理を施し、そして、1:100希釈の一次抗体(ラット抗マウスCD31(PECAM-1);BD Bioscience)と共に室温(RT)で1時間インキュベートした。その後、組織切片を、Alexa 549共役ヤギ抗ラット抗体(Invitrogen)と共に室温で1時間インキュベートした。核を、DAPIで染色し、切片を蛍光マウンティング溶液にマウントした。免疫蛍光画像を、Zeiss Axiovert 200M顕微鏡を使用して取得した。CD31内皮細胞のポジティブ領域を、ピクセル領域計数によって定量化し、ImageJソフトウェアを低倍率下で使用し、DAPI染色について正規化した。
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介dUTPニックエンドラベリング反応混合物(Roche Diagnostics)と共に37℃で1時間インキュベートする前に、凍結腫瘍組織切片を、1%のパラホルムアルデヒドで固定し、0.1%のTRITONTM-X 100で透過処理を施した。PBSで3回洗浄した後、スライドを、FITC-抗-DIG抗体(1:2000)及びDAPI(1:500)と共にインキュベートした。スライドをマウンティング溶液にマウントして蛍光顕微鏡下で視覚化した。3つ独立したスライドを、他と関係なく検討した。TUNELポジティブ細胞を有する領域を、ピクセル領域計数によって定量化し、ImageJソフトウェアを使用してDAPI染色について正規化した。
腫瘍及び明示した臓器をマウスから取り出して、4%のパラホルムアルデヒドにおいて一晩固定した。試料の固定及び処理を標準手順に従って実行した。試料をパラフィンに包埋して、50μm切片に切り分けた。再水和したパラフィン包埋組織切片を、マイヤーヘマトキシリン溶液(Wako)で5分間染色し、水で1-2分間洗浄した。そして、スライドを、エオジン液(Wako)で10分間染色した。組織を、Tissue Gnostics顕微鏡で視覚化した。
全RNA抽出を、TrizolRNA単離試薬(Invitrogen)を使用して実行した。その後、cDNAを製造業者の指示に従ってオリゴ(dT)プライマー(Fermentas)及びSuper Script III逆転写酵素(Invitrogen)を使用して合成した。PCRによるVEGFR2 cDNAを増幅するために用いる順方向及び逆方向プライマーは、以下の通りである:VEGFR2-F:gaacatttgggaaatctcttgc(配列番号: 71);VEGFR2-R:cggaagaacaatgtagtctttgc(配列番号: 72)。定量PCRを、LightCycler480システムを使用して実行した(Roche Applied Science)。VEGFR2の転写産物レベルは、同じサンプル中のGAPDHについて正規化した。比率は、サンプルごとに算出した。反応は、3つ一組で実行した。
VEGFR2に結合するファージ提示scFvの同定
ファージ提示ヒトナイーブscFvライブラリーを用いて、VEGFR2組換え型タンパク質に結合するファージを単離した。4回の親和性選択(バイオパニング)の後、結合したファージの力価は、3,455倍も増加した(図1A)。ELISAスクリーニング及びDNA塩基配列決定を通じて、c-Met-Fcコントロールタンパク質ではなくVEGFR2-Fcによく結合する5つの互いに異なるファージクローン(R2PC8、R2PC12、R2PC28、R2PC29、R2PC45;表1)を同定した(図1B)。次に、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)のFACSアッセイを用いて、5つ全てのクローンが細胞表面上のVEGFR2に結合する能力を有することを確認したところ、5つのクローンのうち、R2PC12が最も大きな反応性を示した(図1C)。表1は、VHのアミノ酸配列及び抗VEGFR2 scFvのVLドメインを示している。
抗VEGFR2 scFvがVEGFR2へのVEGF-Aの結合をブロックすることができるか否かを決定するために、固定化VEGFR2への結合がscFvの濃度増大でVEGF-Aと競合するプレートベース競合結合アッセイを実行した。VEGFR2とのVEGF-Aの相互作用は、R2S8及びR2S12によってそれぞれ7.03及び3.26nMの最大半減阻害濃度(IC50)で強く抑制された一方でR2S28及びR2S29は、比較的弱い競合能力を示した(図2A)。次に、scFvがHUVECにおけるVEGFR2のVEGF-A媒介活性を拮抗することができるか否かを調査した。R2S8及びR2S12は、VEGF-AによるVEGFR2のチロシンリン酸化を明らかに阻害し、R2S12は最も強い阻害活性を示した(図2B)。
抗VEGFR2 scFvの役割を果す結合ドメインをマッピングするために、シグナルペプチド及び膜貫通ドメインをからなる一連のVEGFR2欠失変異体を作成した(図8)。これらのタンパク質変異体を293T細胞において異所的に発現させ、R2S8、R2S12及びR2S28を用いて免疫蛍光染色によって検討した(表2)。R2S28は、VEGFR2(1-7)を発現している細胞に結合したが、VEGFR2(2-7)又はVEGFR2(4-7)を発現している細胞には結合しなかったことから、VEGFR2のドメイン1は、R2S28結合に必要であることが示された。R2S8及びR2S12は、VEGFR2(1-7)及びVEGFR2(2-7)を発現している293T細胞に結合するが、ドメイン3を欠いている構築物(例えば、VEGFR2(4-7)、VEGFR2(del2-3)又はVEGFR2(del3))を発現している細胞に結合しないことから、それらの結合エピトープは、ドメイン3の中に位置していることが更に示された。表2は、抗VEGFR2 scFvのエピトープマッピングを示している。
抗-VEGFR2-AF hAbの抗血管新生の潜在性を解明するために、HUVEC成長、遊走及びチューブ形成に対する抗-VEGFR2-AF hAbの影響を分析した。抗-VEGFR2-AF hAbが、MTT及び創傷-治癒アッセイを用いてそれぞれVEGF-A誘導HUVEC増殖及び遊走を抑制したことを明らかにした。内皮細胞チューブ形成(血管新生における重要なステップ)に対する抗-VEGFR2-AF hAbの効果を調査するために、VEGF-A及び抗-VEGFR2-AF hAbの存在及び非存在下でMATRIGEL(登録商標)層上のHUVECを調べた(図4A)。遊走及び毛細血管様構造の形成に関する内皮細胞の能力を、倒立型写真用顕微鏡を使用して評価及び定量化した。チューブ長及び分岐点数の測定値に基づいて、抗-VEGFR2-AF hAbがVEGF-A誘発毛細血管様構造の抑制についてIMC-1121Bよりも有効的であることを確かめた。(図4A)。
ヒト前立腺がん細胞株PC-3をモデルとして選択し腫瘍成長の阻害について抗-VEGFR2-AF hAbの治療の有効性を調べた。定量逆転写-PCR(qRT-PCR)分析を実行してPC-3細胞におけるVEGFR2の内因性発現を調査した(図5A)。HUVEC、EA.hy926及びhESC-H9細胞は、VEGFR2 mRNAの発現が高いことで知られているため、ポジティブコントロールとして使われている。VEGFR2 mRNAはPC-3細胞において容易に検出可能であるが、ネガティブコントロール293Tの細胞においてかろうじて検出可能であることが明らかになった。
抗-VEGFR2-AF hAb対IMC-1121Bのインビボ抗腫瘍活性を明らかにするために、PC-3異種移植片前立腺腫瘍モデルを使用した。ドセタキセルは、転移性去勢療法抵抗性前立腺がんを患っている患者に最初に使用される化学療法剤である。従って、ドセタキセル及び抗-VEGFR2-AF hAb又はIMC-1121Bの併用治療効果を調査した。PC-3異種移植片を有するNOD/SCIDマウスに、IMC-1121B、抗-VEGFR2-AF hAb、ドセタキセル、抗-VEGFR2-AF hAb及びドセタキセル又はIMC-1121B及びドセタキセルを投与した(図6A)。38日目で、腫瘍成長減退は、抗-VEGFR2-AF hAbとドセタキセルとの併用で治療したマウスで90%、IMC-1121Bとドセタキセルとの併用で治療したマウスで82%、ドセタキセルで治療したマウスで70%、抗-VEGFR2-AF hAbで治療したマウスで52%、そして、IMC-1121Bで治療したマウスで45%に達した(図6B)。体重を、マウスの健康状態の代わりの指標として用いた(図6C)。抗-VEGFR2-AF hAb及びIMC-1121Bグループは、NHIgGグループと比較して、治療期間の間、体重に有意な変化を示さなかった。ドセタキセル単独での治療は、体重を著しく減少(約20%)させた。他の抗体と併用してドセタキセルで治療したマウスは、ドセタキセル単独で治療したマウスと同様に体重を失った。これは、抗-VEGFR2-AF hAb及びIMC-1121Bがドセタキセル誘導毒性を高めないことを示している。
VEGF-A/VEGFR2経路は、固形腫瘍だけでなく、液腫瘍(例えば白血病又はリンパ腫)においても重要な機能を有する。以前の調査で、IMC-1121BがHL-60白血病成長を阻害して、マウスモデルの生存期間を延ばす根拠が示された。IMC-1121Bの抗白血病効果と抗-VEGFR2-AF hAbの抗白血病効果とを比較するために、NSGマウスのHL-60白血病異種移植片モデルを開発した。マウスに、5X106個のHL-60細胞を静脈内に注射して、3日後にIMC-1121B、抗-VEGFR2-AF、NHIgG又はPBSで治療した。図7Aに示すように、全てのPBS又はNHIgG処理マウスは、36日以内に死んだ。しかしながら、VEGFR2に対する抗体で治療した白血病マウスは、生存期間が著しく伸びることが示された。抗-VEGFR2-AF hAbで治療したマウスは、IMC-1121Bで治療したマウス(56日;中央値= 43日)よりも長く生存した(70日;中央値= 53日)。体重の有意な変化は、グループ間で観察されなかった(図7B)。
Claims (14)
- 重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)を含み、
前記VHは、VH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3を含み、
前記VLは、VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3を含み、
前記VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3は、それぞれ、配列番号: 6、配列番号: 7及び配列番号: 8のアミノ酸配列を含み、
前記VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3は、それぞれ、配列番号: 9、Asp Ala Ser及び配列番号: 10又は73のアミノ酸配列を含む、
抗体又はその抗原結合性断片。 - 前記VL CDR3は、配列番号: 73のアミノ酸配列を含む、
請求項1に記載の抗体又はその抗原結合性断片。 - (a)前記VH は、配列番号: 76のアミノ酸配列を含み、
(b)前記VL は、配列番号: 77又は78のアミノ酸配列を含む、
請求項1に記載の抗体又はその抗原結合性断片。 - 前記抗体又はその抗原結合性断片は、単鎖可変断片、Fab断片又はFv断片である、
請求項1に記載の抗体又はその抗原結合性断片。 - 前記抗体は、完全ヒト抗体である、
請求項1、3及び4のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合性断片。 - 治療上有効量の請求項5に記載の抗体又はその抗原結合性断片及び医薬的に許容可能なビヒクル又はキャリアを含む、組成物。
- 治療上有効量の化学療法剤を更に含む、
請求項6に記載の組成物。 - 腫瘍成長、腫瘍血管新生の阻害及び/又はがん細胞に対する細胞毒性の誘導での治療のための医薬を必要とする対象におけるそれらの阻害及び/又はそれの誘導での治療のための医薬の製造における請求項5に記載抗体若しくはその抗原結合性断片又は請求項7に記載の組成物の使用。
- 腫瘍成長、腫瘍血管新生の阻害及び/又はがん細胞に対する細胞毒性の誘導での治療のための医薬を必要とする対象におけるそれらの阻害及び/又はそれの誘導での治療のための医薬の製造における請求項2に記載の抗体又はその抗原結合性断片の使用であって、
前記抗体は、完全ヒト抗体である、使用。 - 前記腫瘍又はがんは、膵臓、胸部、肺、白血病、前立腺及び卵巣がんからなる群より選択される少なくとも1つである、請求項8又は9に記載の使用。
- 生体試料における腫瘍血管内皮細胞又はがん細胞でのVEGFR2の存在を検出する方法であって、
(i)請求項1、3及び4のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合性断片を生体試料と混合するステップと、
(ii)前記抗体又はその抗原結合性断片と前記生体試料における前記腫瘍血管内皮細胞又はがん細胞での前記VEGFR2とを相互作用させて複合体を形成させるステップと、
(iii)前記複合体における前記腫瘍血管内皮細胞又はがん細胞でのVEGFR2の存在を検出するステップと、を有する方法。 - 生体試料における腫瘍血管内皮細胞又はがん細胞でのVEGFR2の存在を検出する方法であって、
(i)請求項2又は3に記載の抗体又はその抗原結合性断片を生体試料と混合するステップと、
(ii)前記抗体又はその抗原結合性断片と前記生体試料における前記腫瘍血管内皮細胞又はがん細胞での前記VEGFR2とを相互作用させて複合体を形成させるステップと、
(iii)前記複合体における前記腫瘍血管内皮細胞又はがん細胞でのVEGFR2の存在を検出するステップと、を有する方法。 - 腫瘍成長、腫瘍血管新生の阻害及び/又はがん細胞に対する細胞毒性の誘導での治療を必要とする対象におけるそれらの阻害及び/又はそれの誘導での治療のために使用される、請求項5に記載の抗体若しくはその抗原結合性断片又は請求項7に記載の組成物。
- 腫瘍成長、腫瘍血管新生の阻害及び/又はがん細胞に対する細胞毒性の誘導での治療を必要とする対象におけるそれらの阻害及び/又はそれの誘導での治療のために使用される、請求項2に記載の抗体又はその抗原結合性断片であって、
前記抗体は、完全ヒト抗体である、抗体又はその抗原結合性断片。
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