CN107531789B - 用于抗血管新生和标靶癌症治疗的抗vegfr2人类抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其对位于人类血管内皮生长因子受体2(VEGFR2；SEQ ID NO:74)的结构域1或结构域3内的表位具有特异性结合亲和力。VEGFR2的结构域3内的表位位于SEQ ID NO:74的第250个氨基酸残基和第270个氨基酸残基之间。本发明还公开了此抗体或其抗原结合片段用于制造在有此需要的个体中用以抑制肿瘤生长、肿瘤血管新生和/或诱导癌细胞的细胞毒性的药物的用途。另外，本发明还公开了一种检测生物样品中位于肿瘤血管内皮细胞或癌细胞上的VEGFR2存在的方法。

Description

用于抗血管新生和标靶癌症治疗的抗VEGFR2人类抗体
技术领域
本发明一般涉及具有抗癌活性的抗体，并且更具体地涉及抗VEGFR2 抗体。
背景技术
血管新生很少发生于成年人的健康组织中。相较于肿瘤相关的内皮细胞，血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)很少表达，且于正常的内皮细胞中以低量表达。于肿瘤血管的VEGFR2表达量较正常血管中高出3至5倍。于癌症患者活体组织检查的免疫组织化学染色进一步证实，相较于邻近肿瘤区域的正常组织的血管内皮，于肿瘤血管中的VEGFR2表达量显著地上升。值得注意的是，高转移性肿瘤血管的VEGFR2表达量高于低转移性肿瘤血管。
起初显示VEGFR2表达被限制于肿瘤组织的血管中。然而，最近的研究提供证据显示VEGFR2也出现于恶性肿瘤细胞中。发现乳癌患者血液中循环的肿瘤内皮细胞表达VEGFR2，因此，此种表达与肿瘤的转移和预后有关。所以，将阻断VEGFR2介导的讯息传递以附随地抑制肿瘤内皮和恶性细胞视为是研发抗癌治疗剂的优良策略。
临床研究结果指出针对VEGFR2的全人类治疗性抗体具有安全性和良好的耐受性。希望通过阻断肿瘤血管新生以作为癌症的新兴治疗方法。因此，发展具有增强治疗功效的新颖的抗VEGFR2人类抗体将有利于癌症患者。
发明内容
在本发明的一个方面是关于一种分离的抗体或其抗原结合片段，其针对于位于人类血管内皮生长因子受体2(VEGFR2；SEQ ID NO:74)的结构域1 或结构域3内的表位具有特异性结合亲和力，其中位于VEGFR2的结构域3 内的表位位于SEQ ID NO:74的第250个氨基酸残基和第270个氨基酸残基之间。
在本发明的一个实施例中，此表位包含NWEYPS的氨基酸序列(SEQ ID NO:66)。此表位不包含GID、KH或GLMTK的氨基酸序列(SEQ ID NO:75)。
在本发明的其他实施例中，本发明抗体或其抗原结合片段对肿瘤血管内皮细胞展现特异性结合亲和力。
本发明抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，此VH包含VH CDR1、VH CDR2以及VH CDR3，且此VL包含VL CDR1、 VL CDR2以及VL CDR3，
(i)其中：
此VH CDR1、VH CDR2以及VH CDR3分别包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2以及SEQ IDNO:3的氨基酸序列；且此VL CDR1、VL CDR2以及VL CDR3分别包含SEQ ID NO:4、Ala Ala Ser以及SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
或(ii)其中：
此VH CDR1、VH CDR2以及VH CDR3分别包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7以及SEQ IDNO:8的氨基酸序列；且此VL CDR1、VL CDR2以及VL CDR3分别包含SEQ ID NO:9、Asp Ala Ser以及SEQ ID NO:10或73的氨基酸序列；
或(iii)其中：
此VH CDR1、VH CDR2以及VH CDR3分别包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12以及SEQID NO:13的氨基酸序列；且此VL CDR1、VL CDR2以及 VL CDR3分别包含SEQ ID NO:14、AspAla Ser以及SEQ ID NO:15的氨基酸序列；
或(iv)其中：
此VH CDR1、VH CDR2以及VH CDR3分别包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17以及SEQID NO:18的氨基酸序列；且此VL CDR1、VL CDR2以及 VL CDR3分别包含SEQ ID NO:19、GlyAla Ser以及SEQ ID NO:20的氨基酸序列；
或(v)其中：
此VH CDR1、VH CDR2以及VH CDR3分别包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22以及SEQID NO:23的氨基酸序列；且此VL CDR1、VL CDR2以及 VL CDR3分别包含SEQ ID NO:24、AspAla Ser以及SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
在本发明的其他实施例中，此VH CDR1、VH CDR2以及VH CDR3分别包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7以及SEQ ID NO:8的氨基酸序列；且此 VL CDR1、VL CDR2以及VL CDR3分别包含SEQ ID NO:9、Asp Ala Ser以及SEQ ID NO:10或73的氨基酸序列。
在本发明的其他实施例中，此抗体或其抗原结合片段包含：(a)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的重链可变区(VH)；以及(b)包含SEQ ID NO:77或 78的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在本发明的其他实施例中，此抗体或其抗原结合片段为单链可变片段、 Fab片段或Fv片段。
在本发明的其他实施例中，此抗体或其抗原结合片段为全人类抗体。
在本发明的其他实施例中，此抗体或其抗原结合片段以可检测的化合物或酶标记。
在本发明的另一个方面是关于一种组合物，其包含治疗上有效剂量的本发明抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体或载剂。
在本发明的一个实施例中，此组合物进一步包含化学治疗剂。在本发明的一个实施例中，此化学治疗剂为欧洲紫杉醇(docetaxel)。
此外，在本发明另一个方面是关于本发明抗体或其抗原结合片段或组合物用于制造在有此需要的个体中用以抑制肿瘤生长、肿瘤血管新生和/或诱导癌细胞的细胞毒性的药物的用途。
在本发明的一个实施例中，肿瘤和/或癌细胞表达VEGFR2。此抗体或其抗原结合片段的用途可进一步包含额外的化学治疗剂(例如，欧洲紫杉醇) 的使用，以用于制造在有此需要的个体中用以抑制肿瘤生长、肿瘤血管新生和/或诱导癌细胞的细胞毒性的药物。
此外，本发明关于一种用于在有此需要的个体中抑制肿瘤生长、肿瘤血管新生和/或诱导癌细胞的细胞毒性的本发明抗体或其抗原结合片段或组合物。
本发明也关于一种用以抑制肿瘤生长、肿瘤血管新生和/或诱导癌细胞的细胞毒性的方法，包含：
对有此需要的个体施用组合物，此组合物包含治疗上有效剂量的本发明分离的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载剂，并借此在有此需要的个体中抑制肿瘤生长、肿瘤血管新生和/或诱导癌细胞的细胞毒性。
本发明的方法可进一步包含对有此需要的个体施用组合物，此组合物包含治疗上有效剂量的化学治疗剂(例如，欧洲紫杉醇)。在本发明的一个实施例中，此化学治疗剂同时给药有此需要的个体。
在本发明的一个实施例中，此肿瘤或癌症是选自由胰脏癌、乳癌、肺癌、白血病、前列腺癌和卵巢癌所组成群组中的至少一种。
还有，在本发明的另一个方面是关于一种检测生物样品中位于肿瘤血管内皮细胞或癌细胞上的VEGFR2存在的方法，包含：
(i)混合本发明抗体或其抗原结合片段与该生物样品；
(ii)允许该抗体或其抗原结合片段与该生物样品中位于该肿瘤血管内皮细胞或癌细胞上的该VEGFR2交互作用并形成复合物；以及
(iii)检测位于该复合物中的位于该肿瘤血管内皮细胞或癌细胞上的该 VEGFR2的存在。
在本发明的一个实施例中，生物样品是来自患者的组织样品。
在本发明的其他实施例中，利用免疫分析法检测位于复合物中的位于肿瘤血管内皮细胞或癌细胞上的VEGFR2的存在。
虽然在此的变化和修饰可能在未脱离本发明新颖概念的精神和范围下受到影响，但是从以下较佳实施例的描述结合下列附图可明显看出这些或其他范畴。
附图说明了本发明的一个或多个实施例，且与书面描述一同用于解释本发明的原理。尽可能地，整个附图中使用的相同标号用以指代一个实施例中相同或相似的组件。
附图说明
第1A-1E图显示了针对VEGFR2的噬菌体呈现scFvs的筛选与鉴定结果。第1A图显示了针对VEGFR2-Fc重组蛋白的噬菌体呈现筛选(phage display biopanning)。在四轮筛选后，其噬菌体回收率超过第一轮，增加了 3,455倍。cfu为菌落形成单位(colony-formingunits)。第1B图显示了以 1×109cfu噬菌体效价通过ELISA来比较VEGFR2-Fc蛋白对经筛选噬菌体克隆的结合。第1C图显示了以1×1010cfu的噬菌体效价通过流式细胞仪于 HUVECs上评估噬菌体克隆的细胞VEGFR2结合亲和力。第1D图显示了纯化可溶性抗VEGFR2 scFvs，并利用考马斯蓝染色通过SDS-PAGE进行分析。第1E图显示了针对人类肿瘤血管的免疫荧光染色。利用抗VEGFR2 scFvs 探测肺癌患者手术样品的冷冻切片，之后利用抗E tag抗体和罗丹明结合的二级抗体染色。利用抗人类CD31抗体染色血管内皮细胞，再与FITC结合的二级抗体培养。利用DAPI染细胞核；Con-scFv为对照组scFv。
第2A-2F图显示了抗VEGFR2 scFv可于HUVECs中抑制VEGF-A结合和VEGFR2的活化。第2A图显示了利用ELISA进行抗VEGFR2 scFv与 VEGF-A的竞争能力分析。将在缺乏竞争者情况下的VEGF-A结合固定化 VEGFR2的量视为100％。第2B图显示了利用蛋白质印迹法检测以VEGF-A 和scFv竞争者处理下于HUVECs中磷酸化VEGFR2(Pho.VEGFR2)的表达。基于荧光强度定量磷酸化VEGFR2，并以总VEGFR2进行标准化。第2C至 2F图显示了R2S12的表位定位(Epitope mapping)。第2C图显示了人类(由 SEQ ID NO:74的第221个氨基酸至第320个氨基酸)和小鼠(由SEQ ID NO: 80的第223个氨基酸至第322个氨基酸)的VEGFR2结构域3(VEGFR2-D3) 的序列比对。两个物种之间不同的残基以框线表示。涉及突变体M1和M2 的残基以底线表示。实心圆形和空心圆形分别用来指出与1121B和6.64抗体接触的人类VEGFR2-D3残基。第2D图显示了VEGFR2-D3骨干的图形；将负责R2S12结合的NWEYPS(SEQ ID NO:66)残基(M1)显著标示。第2E 图显示了VEGFR2-D3表面的模型。NWEYPS(SEQ ID NO:66)残基(即M1 区域)以黑线划定表示。第2F图显示位于VEGFR2-D3表面上与1121B和 6.64接触的残基。也指出1121B的接触残基，其位于M1区域。(N为氨基端；C为羧基端)。
第3A-3D图显示了抗VEGFR2 hAb的亲和力成熟作用，以及抗 VEGFR2-AF hAb活性的分析。第3A图显示了R2S12(SEQ ID NO:10)和 R2S12AF(SEQ ID NO:73)的CDR3的轻链可变结构域(VL-CDR3)的氨基酸。 R2S12和R2S12AF之间不同的残基以框线表示。第3B图显示了抗VEGFR2 和抗VEGFR2-AF hAb的动力学常数，使用纯化的IgG和BIACORE T100TM进行测定。利用BIACORE T100TM评估软件计算Kd数值。第3C图显示了竞争性ELISA，其利用人类抗体检视VEGF-A结合VEGFR2的剂量依赖性抑制。在缺乏竞争者情况下，将4nM VEGF-A对固定化VEGFR2的结合视为 100％数值。以误差杠(Error bar)代表标准偏差(SD)；n＝4。第3D图显示了利用流式细胞仪分析抗VEGFR2抗体对HUVEC的结合亲和力。抗体浓度为 0.1μg/ml。
第4A-4B图显示了抗VEGFR2-AF hAb于HUVECs中可抑制VEGFR2 信号通路并阻断毛细血管结构形成。第4A图显示了利用
Figure BDA0001428312000000051
涂覆的μ-Slides进行毛细血管结构形成试验。将HUVECs(每个孔洞4×104细胞) 以0.2％胎牛血清(FBS)培养，并以40ng/mlVEGF-A，或40ng/ml VEGF-A 连同NHIgG、IMC-1121B或抗VEGFR2-AF抗体，于37℃下处理5小时。在相位差显微镜下可观察到细管状的结构，且利用ImageJ软件定量测定相对的出芽长度(sprout length)(下图)和分支点(branching points)(上图)。由三次独立试验获得所有数据。第4B图显示了以50ng VEGF-A或100nM抗 VEGFR2-AF或IMC-1121B于37℃下处理HUVECs 10分钟。由经处理的 HUVECs制备总蛋白质，并利用蛋白质印迹法进行检测。将α-微管蛋白 (α-tubulin)作为内部对照组。
第5A-5F图显示了人类前列腺癌细胞中VEGFR2活性的特征。第5A 图显示了利用定量RT-PCR于指定细胞株中的VEGFR2表达分析。以293T 细胞作为阴性对照组。以GAPDH表达量对VEGFR2的表达量进行标准化。第5B图显示了将以VEGF-A处理的PC-3细胞用于细胞群落形成(colony formation)、MTT和侵犯试验测定。在每一组别中n＝6。第5C图显示了以VEGFR2靶向短发夹RNA(VEGFR2-targeted shRNA(shVEGFR2))处理PC-3 细胞，并利用定量RT-PCR分析VEGFR2表达。以荧光素酶的shRNA(shLuc) 作为阴性对照组。第5D图显示了进行MTT、细胞群落形成和转移盘侵犯分析(Transwell invasion)试验以分析经VEGF-A处理的shVEGFR2-PC-3细胞。第5E图显示了于良性、原发性肿瘤和转移性前列腺肿瘤的相对VEGFR2表达比较的箱型图，利用公共微矩阵数据库所测定。第5F图显示了利用抗 VEGFR2抗体(55B11,Cell Signaling)的人类前列腺癌组织数组(PRC481, Pantomics)的免疫组织化学染色，以分析人类正常或肿瘤前列腺组织中 VEGFR2蛋白的表达。
第6A-6E图显示了于PC-3小鼠异种移植模型中抗VEGFR2-AF hAb的治疗功效分析。第6A图显示了治疗时程表。第6B图显示了每一组别小鼠的肿瘤生长概况。第6C图显示了每一组别的体重。第6D图显示了在治疗期间结束时由每一只小鼠解剖取得的实质肿块(tumormass)。第6E图显示了在治疗期间结束时所测得的肿瘤重量。所有数据以每组别九只小鼠的平均值表示；以误差杠代表标准误差(SE)；*代表P＜0.05。
第7A-7E图显示了抗VEGFR2-AF hAb于HL60小鼠异种移植模型中较 IMC-1121B展现出更高的抗肿瘤活性。第7A图显示了每一组别小鼠的 Kaplan-Meier存活分析。基于对数等级检定(Log-rank test)，相较于 IMC-1121B组，在抗VEGFR2-AF hAb组中显著地延长了存活(P＝0.0284)。第7B图显示了每一组别小鼠的体重。第7C图显示了在死亡后由每只小鼠解剖取得的卵巢。将来自无白血病的NSG小鼠的卵巢作为正常对照组。第 7D图显示了以IMC-1121B或抗VEGFR2-AF处理的小鼠的卵巢体积。第7E 图显示了带有白血病肿瘤小鼠的淋巴结(LN)变化的型态分析。由指定组别小鼠解剖取得已转移至淋巴结的白血病细胞(在每一组别中n＝9)。
第8图显示了VEGFR2表达载体的构建。表达人类VEGFR2结构域的删除或取代突变种的构建示意图。在VEGFR2细胞外区域有七个类免疫球蛋白结构域，将其标记为I至VII。TM代表跨膜结构域。
第9A-9B图显示了利用噬菌体呈现合成scFv库筛选和鉴定针对 VEGFR2的scFvs的结果。第9A图显示了R2S12的亲和力成熟作用。将噬菌体呈现的R2S12-VL-CDR3突变的scFv库与固定在蛋白质G
Figure BDA0001428312000000071
上的0.1μg VEGFR2-Fc于4℃下培养1小时。随后，以含有 1％TWEENTM20的PBS清洗磁珠四次。在四轮筛选后，其噬菌体回收率超过第一轮，增加了929倍。第9B图显示了指定浓度R2S12和R2S12-AF scFv 对VEGFR2-Fc蛋白的结合活性的比较。其利用ELISA分析的。以误差杠代表标准误差。
第10A-10C图显示了抗VEGFR2-AF hAb于PC-3细胞中可拮抗 VEGF-A介导的细胞活性。第10A图显示了进行转移盘分析以检测作为指定处理的PC-3细胞的侵犯能力。上图为具侵犯性细胞的吉姆萨染色(Giemsa staining)。100倍放大；在每一组别中n＝3；比例尺为150μm。第10B图显示了将总数为1×103PC-3细胞种于六孔培养盘中，并以有或无100ng/mlVEGF-A和10μg/ml的NHIgG、IMC-1121B或抗VEGFR2-AF抗体处理。将培养盘培养7天以允许细胞群落形成。利用结晶紫染色显现细胞群落。在洗去结晶紫溶液后计算在每一孔洞中细胞群落的相对数目。在每一组别中 n＝3。第10C图显示了伤口愈合试验。将PC-3细胞置于含有2％FBS的RPMI 培养基中培养，并分别在呈现或缺乏10μg/ml NHIgG、IMC-1121B或抗VEGFR2-AF状况下，利用100ng/ml VEGF-A处理以进行刺激。在0、16 和36小时培养后拍摄照片。比例尺为150μm。在每一组别中n＝3。以误差杠代表标准误差。
第11A-11B图显示了在药物处理后于肿瘤组织中的血管内皮细胞和凋亡细胞的研究。在治疗期间结束时由每一组别的小鼠制备冷冻肿瘤切片。第 11A图显示了利用抗CD31抗体对切片进行染色，以显现肿瘤血管。利用 ImageJ软件定量测定CD31阳性内皮细胞。第11B图显示了利用TUNEL试验分析在冷冻肿瘤切片中的凋亡细胞。利用ImageJ软件定量凋亡细胞。利用DAPI对切片进行染色，以表示所有细胞。n＝5；比例尺为100μm；200 倍放大；以误差杠代表标准误差；**代表P＜0.01；***代表P＜0.001。
第12A-12B图显示了在抗体治疗后于人类白血病异种移植小鼠卵巢的组织病理学表型。在以生理食盐水、NHIgG、IMC-1121B或抗VEGFR2-AF hAb治疗后，由带有HL-60肿瘤的小鼠收集卵巢。将组织切片并以苏木精和伊红(H&E)染色，以显现具有白血病细胞的浸润。在抗VEGFR2-AF治疗的组别显现较少的血管，并保留了一些初级卵母细胞。在每一组别中n＝9。第12A图显示200倍放大的卵巢。比例尺为500μm。第12B图的比例尺为 150μm。
具体实施方式
现在要详细描述本发明的各种实施例。请参照附图，相同的标号在整个观点中表示相同的组件。如同在本文描述和在随后整个申请专利范围中所使用的，除非上下文另有明确说明，否则“一”、“一个”和“该”的含义包含复数引用。此外，如同在本文描述和在随后整个申请专利范围中所使用的，除非上下文另有明确说明，否则“在…里”的含义包含“在…里”和“在…上”。另外，以下更具体地定义本说明书中使用的一些术语。
定义
在本说明书中使用的术语通常在本领域中、在本发明上下文中以及在使用每一个术语的特定上下文中，具有其通常的含义。在以下或是在本说明书中的其他地方讨论用以描述本发明的某些术语，以提供关于本发明描述的对实施者的额外指导。为了方便起见，可利用例如斜体字和/或引号，以强调某些术语。强调的使用对术语的范围和含义并无影响。无论受到强调与否，在相同情况下，术语的范围和含义是相同的。应该理解的是，可以一种以上的方式说明相同的东西。因此，可对任一个或一个以上在此讨论的术语使用替代语言和同义词，无论是否在此阐述或讨论术语，而无赋予术语任何特殊意义。提供了某些术语的同义词。一个或多个同义词的列举并不排除其他同义词的使用。在本说明书中任一处实施例的使用(包含在此讨论的任何术语的范例)仅为说明性的，且绝非用以限制本发明或任何例示的术语的范围和含义。同样地，本发明并不限定于在本说明书中给出的各种实施例。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有如同本发明所属领域中具有通常知识者普遍理解的相同含义。若有冲突状况，以本文件(包含定义)为准。
术语“治疗”是指对有此需要的个体(此个体具有癌症或具有此疾病的症状或倾向)施用化合物的有效剂量，对此疾病、其症状或其倾向具有治愈、减轻、缓解、补救、改善或预防的目的。保健专家可基于来自任何合适诊断方法的结果识别此个体。
“有效剂量”是指对接受治疗的个体给予治疗效果所需活性化合物的量。如同由本领域技术人员所认可的，根据给药途径、赋形剂使用，以及与其他治疗处置共同使用的可能性，有效剂量会有所不同。
术语“化学治疗剂”是指已知在癌症治疗中使用的药剂。
由美国卫生福利部食品药物管理局出版的“Guidance for Industry andReviewers Estimating the Safe Starting Dose in Clinical Trials forTherapeutics in Adult Healthy Volunteers”公开了可由以下公式计算获得“治疗上有效剂量”：人体等效剂量(HED)＝动物剂量(mg/kg)×(动物体重(kg)/人体重(kg))0.33。
雷莫芦单抗(Ramucirumab)(即IMC-1121B)的商品名为
Figure BDA0001428312000000091
人类血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的结构域1是从第45个氨基酸至第110个氨基酸，而结构域3是从第224个氨基酸至第320个氨基酸。
序列标识符(Sequence identifiers)：
QQLDDIPIT(R2S12AF可变轻链CDR3；SEQ ID NO:73)；VGFR2(人类血管内皮生长因子受体2；SEQ ID NO:74)；GLMTKK(SEQ ID NO:75)；
R2S12和R2S12-AF的VH区域相同(SEQ ID NO:76)：
QVNLRESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFGSYTMNWVRQAPGKGLEWV ASITSGSSYIFYTDSVKGRFTISRDNSRSSLFLQMNSLRAEDTAIYYCARGS ASAFDIWGQGTMVTVSS；
R2S12的VL区域(SEQ ID NO:77)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASDDIINYLNWYQQKPGEAPKLLIYD ASILETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDILPLTFGGGT KLEIK；
R2S12AF的VL区域(SEQ ID NO:78)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASDDIINYLNWYQQKPGEAPKLLI YDASILETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQLDDIPITFGG GTKLEIK；
以上R2S12VL和R2S12AF VL之间不同的氨基酸残基画有下划线。
人类IgG1恒定区(SEQ ID NO:79)；小鼠VEGFR2氨基酸序列(SEQ ID NO:80)。
缩写：互补决定区域(CDRs)；Fab(片段，抗原结合区域)；Fv区域(可变结构域)。
实施例
以下依照本发明实施例所给出的例示性仪器、装置、方法和其相关结果并非意图限制本发明的范围。注意，为了方便阅读可于实施例中使用标题或副标题，绝不应该将其用以限制本发明的范围。此外，在此提出或公开某些理论；然而，只要是依照本发明可实施本发明而无需考虑任何特定理论或作用方案时，无论理论对错与否，决不应该用以限制本发明的范围。
材料与方法
由噬菌体呈现scFv库中分离结合VEGFR2的噬菌体
将本实验室先前建立的人类自然噬菌体呈现scFv库(复杂性为6×1010) 用于筛选。将scFv库扣除与蛋白质
Figure BDA0001428312000000101
(Invitrogen)的非特异性结合，随后将其与VEGFR2-Fc重组蛋白(R&D Systems)固定化的
Figure BDA0001428312000000102
培养。在利用含有0.1％TWEENTM20的PBS(PBST0.1)清洗后，通过感染大肠杆菌TG1细胞回收结合VEGFR2-Fc的噬菌体。在测定噬菌体效价后，进行下一轮的筛选。
竞争性VEGF结合试验
将各种浓度的抗VEGFR2 scFvs与3nM人类VEGF-A(Peprotech)混合且加入以1μg/ml VEGFR2-Fc涂覆的96孔培养盘中，并以1％BSA进行预先阻断。在室温下培养1小时后，利用PBST清洗，使用抗VEGF单株抗体 (GeneTex)和HRP标记的山羊抗小鼠IgG检测结合的VEGF分子。利用邻苯二胺(OPD)和H2O2混合液进行显色，随后利用3N盐酸终止反应。利用酶标仪测定波长490nm处的吸光度。
利用抗VEGFR2 scFvs对人类肿瘤血管染色
由台湾大学附设医院病理部获得人类肺癌手术样品。以PBS清洗冷冻切片，并利用三聚甲醛固定。在以PBS清洗后，利用正常马血清(Vector)对切片进行阻断，并将其与scFv培养。在以PBST清洗后，加入兔抗E tag抗体(Bethyl Laboratories)和小鼠抗人类CD31单株抗体(BD)的混合液，并将切片培养1小时。利用FITC标记的抗小鼠IgG、罗丹明标记的山羊抗兔IgG 和DAPI对切片染色1小时后，以倒立式荧光显微镜(Zeiss,Axiovert 200M) 拍摄影像。
管柱形成(tube formation)试验
将
Figure BDA0001428312000000103
(BD Biosciences)于4℃下过夜解冻，并将10μl
Figure BDA0001428312000000104
加入预冷的μ-Slide Angiogenesis(Ibidi)的每一孔洞中；然后，将培养盘于37℃培养15分钟。将血清饥饿(Starved)的HUVECs(4×104细胞) 加入具有或缺乏40ng/ml VEGF-A和抗VEGFR2抗体的含有0.2％血清的 EBM-2培养基中。在培养24小时之后，利用OLYMPUS倒立式显微镜和数字相机(OLYMPUS,DP-12)评估内皮细胞管柱形成。利用ImageJ软件定量评估管腔长度(tubular lengths)和分支点。将抗体抑制百分比表示为相对于无竞争者状况下的VEGF-A处理组的百分比。
临床数据集分析
由位于国家生物技术讯息中心(NCBI)网站上的基因表达数据数据库 (GeneExpression Omnibus)下载原始微矩阵数据。对原始数据进行标准化。将GEO profileGDS2545/1954_at/KDR用于转移性前列腺癌分析。
抗VEGFR2人类抗体的构筑和表达
利用AgeI和NheI切位，将R2S12、R2S12-AF和IMC-1121B的VH区域(Lu et al.,(2003)“Tailoring in vitro selection for a picomolar affinity human antibodydirected against vascular endothelial growth factor receptor 2 for enhancedneutralizing activity”J Biol Chem 278,43496-43507)分别地克隆进入经修饰的表达载体pcDNA5-FRT-Gamma1中，此载体具有信号肽和人类 IgG1恒定区。此外，利用AgeI和EcoRV切位，将R2S12、R2S12-AF和 IMC-1121B的VL区域分别地克隆进入经修饰的表达载体p-Kappa-HuGs中。将含有重链和轻链基因的质粒组合成双顺反子载体(bicistronicvector)，以产生单一载体系统。将此载体转染进入FLPINTM-CHO细胞(Invitrogen)。在2-3周后，利用潮霉素B(hygromycin B)筛选转染的细胞，以建立稳定的克隆；将这些克隆于SFM4CHO培养基(Thermo Scientific)中培养以产生人类抗体。在2周培养之后，将稳定克隆的培养基收集、离心，并以0.45μm膜过滤。然后将上清液进行蛋白质G柱层析(GEhealthcare)以纯化抗VEGFR2人类 IgG。在用PBS对洗提液进行透析后，利用Bradford试剂(Thermo Scientific) 和分光光度计评估抗体浓度。
抗VEGFR2人类IgG的亲和力成熟作用
如先前所述执行亲和力成熟作用。简单来说，我们构筑了包含R2S12 的VH和VL基因谱型(gene repertoire)的合成噬菌体呈现scFv库，其具有于 VL-CDR3的七个氨基酸残基处引入的随机突变。利用这个合成库对于 VEGFR2-Fc固定化的
Figure BDA0001428312000000111
进行筛选。在生物体外进行四至五轮严格的筛选后，利用ELISA筛选并鉴定出阳性克隆。通过与各自的亲本克隆(parental clone)比较，以鉴定出较好的VEGFR2结合克隆。
结合动力学的测定
在BIACORE T100TM(GE healthcare)中利用表面电浆共振(Surface PlasmonResonance)测定抗VEGFR2抗体的亲和力和动力学。将VEGFR2-Fc 蛋白耦联至位于BIACORE流通池(flow cell)中的EDC和NHS活化的CM5 感应芯片上，然后依照说明书利用乙醇胺进行阻断。利用浓度范围介于0.1 至100nM的抗体，在连续流动(30μl/min)下监测结合和解离阶段，时间为5 分钟。利用再生缓冲液(0.2M NaCl,10mM甘氨酸,pH 2.7)的注入进行芯片再生。为测定结合常数，利用BIAevaluation软件(GE healthcare)，将感应图 (sensorgrams)以对样品1:1交互作用的模式进行全局拟合。
动物模型
根据符合法律和政策的“ 中央研究院” 动物实验管理小组的指导方针进行涉及动物和其护理的作法。由实验动物中心(中国 台湾)购得非肥胖型糖尿病与重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠。通过皮下注射2×106PC-3细胞进入六周龄雄性小鼠的背侧部以发展人类前列腺癌异种移植肿瘤模型。每天监测动物的整体健康状况，并且每周测定体重两次。利用游标卡尺测量肿瘤大小，并依照长度×宽度2×0.52计算。将具有符合尺寸的肿瘤(50mm3)的小鼠随机分配到不同治疗组(n＝9)，并且以正常人类IgG(NHIgG；JacksonImmunoResearch)、IMC-1121B、抗VEGFR2-AF抗体，或等体积的PBS通过尾静脉进行静脉注射。以20mg/kg的抗体剂量每周注射两次，为期四周。为了进行联合治疗，以5mg/kg剂量的欧洲紫杉醇(ScinoPharm)每周静脉注射一次，为期三周。在试验结束时，将肿瘤组织和内脏器官取出并固定以供组织学分析。
为了进行全身性白血病移植试验，由“ 中央研究院” 细胞与个体生物学研究所的动物中心获得NOD/SCID/IL2Rγ-/-(NSG)小鼠。通过尾静脉将5×106 HL-60细胞静脉注射进入六周龄雌性小鼠中。每天监测动物的整体健康状况，并且每周测定体重两次。在肿瘤接种后3天，随机选择小鼠(n＝9)以20mg/kg NHIgG、IMC-1121B、抗VEGFR2-AF抗体，或等体积的PBS静脉注射，其频率为每周两次。每天观察小鼠的毒性反应，并记录存活时间。在试验终点，将每只小鼠的内脏器官取出并固定，以进一步供组织学检查。
细胞培养
由LONZA购得HUVEC(人类脐静脉血管内皮细胞)。由美国菌种保存中心
Figure BDA0001428312000000121
获得HL-60(人类前骨髓性白血病)、PC-3(人类前列腺癌)、 EA.hy926(人类脐静脉内皮细胞株)和293T(人类胚胎肾脏细胞)细胞株。由 WiCell购得hESC-H9(人类胚干细胞)细胞株，而由Invitrogen获得 FLP-INTM-CHO细胞株。将HUVECs培养于内皮细胞生长培养基(EBM-2,LONZA)中。将HL-60和PC-3细胞培养于RPMI 1640培养基(GIBCOTM)中。将EA.hy926和293T细胞培养于DMEM(GIBCOTM)中。将FLP-INTM-CHO 细胞维持在Ham’s F12培养基中。如前所述培养hESC-H9细胞株。于37℃、湿度固定、空气成分含5％二氧化碳的培养箱中，将所有细胞株维持在具有 10％FBS(GIBCOTM)和100μg/ml青霉素/链霉素(P/S；GIBCOTM)的条件培养基中。
利用ELISA筛选抗VEGFR2噬菌体克隆
利用ELISA筛选进一步检视所选择的噬菌体。利用配制于0.1M碳酸氢钠中的1μg/ml的VEGFR2-Fc、Met-Fc(R&D)或BSA(Sigma)蛋白涂覆96 孔培养盘，并于4℃过夜培养。在室温下以配制于PBS中的1％BSA(w/v) 进行阻断2小时之后，将70个随机选择的噬菌体克隆以1:2的比例稀释于 1％BSA中以加入培养盘内，并于室温下培养1小时。之后用PBST清洗，利用以1∶2000比例稀释的辣根过氧化酶(HRP)结合的小鼠抗M13噬菌体抗体(GE)与培养盘培养1小时。在以PBST清洗后，利用过氧化酶底物邻苯二胺(OPD；Sigma)加上H2O2显色15分钟，随后加入3N盐酸终止显色反应。利用酶标仪(SpectraMax,Molecular Devices)测定波长490nm处的吸光度。分离阳性克隆的质粒DNA，并利用pCANTAB5定序用引物组进行定序。
质粒构筑
由Thermo Scientifics购得编码全长VEGFR2序列(NM_002253.2)的人类 cDNA克隆，并作为以下构筑的PCR模板。如下(也可参照第8图)，构筑具有信号肽、跨膜结构域和截断的细胞质结构域的不同长度的VEGFR2细胞外区域：VEGFR2(1-7)为VEGFR2的全长细胞外区域，包含从残基Met1至 Leu813的结构域1-7；VEGFR2(2-7)包含从残基Ala111至Leu813的结构域2-7； VEGFR2(3-7)包含从残基Ser208至Leu813的结构域3-7；VEGFR2(4-7)包含从残基Phe321至Leu813的结构域4-7；VEGFR2(del2-3)，其中通过接合编码结构域1(Met1至Glu140)和结构域4-7(Phe321至Leu813)的两个片段以删除 VEGFR2的结构域2和3；VEGFR2(del3)，其中通过接合编码结构域1-2(Met1至Arg222)和结构域4-7(Phe321至Leu813)的两个片段以删除VEGFR2的结构域3；VEGFR2(M1)为包含VEGFR2的全长细胞外区域(Met1至Leu813)的所有七个结构域的突变构筑，其中以小鼠同源物的261TWHSPP266取代位于结构域3的259NWEYPS264；以及VEGFR2(M2)为包含VEGFR2的全长细胞外区域(Met1至Leu813)的所有七个结构域的突变构筑，其中以小鼠同源物的281PFPGTVA287取代位于结构域3的279TQSGSEM285。
可溶性scFv的表达和纯化
利用抗VEGFR2 scFv噬菌体克隆PC-8、12、28、29或45感染大肠杆菌菌株HB2151，并制备细菌的细胞间质层萃取物(periplasmic extracts)。依照说明书利用蛋白质L琼脂糖柱(Thermo Scientific)纯化细胞间质层萃取物中的可溶性scFv。以PBS使纯化的scFvs完全地透析，并利用还原性 SDS-PAGE随后以考马斯蓝染色进行分析。
增殖试验
将总数为1×104HUVECs种在96孔培养盘上并过夜培养。然后将细胞置于无血清EBM-2培养基中过夜培养使其饥饿。接着，将8μg/ml经选择的scFv与配制于低血清EBM-2(0.2％)培养基中的40ng/ml VEGF一同加入孔洞中，培养48小时。依照说明书利用MTT试剂(Invitrogen)评估细胞增殖。
流式细胞仪分析
将约1×104HUVEC与经选择的抗VEGFR2噬菌体克隆置于FACS缓冲液(含有1％FBS的PBS)中于4℃下培养1小时。在用FACS缓冲液清洗细胞后，首先将细胞与小鼠抗M13噬菌体抗体于4℃下培养1小时，然后和 R-藻红素(phycoerythrin)结合的山羊抗小鼠IgG(Jackson Immuno Research)于 4℃下培养30分钟。利用FACSCantoII(BD)进行流式细胞仪分析，并利用 FACS Diva软件(BD)测定发射荧光强度，以定量比较结合亲和力。
慢病毒介导的短发夹RNA(shRNA)敲减
慢病毒载体pLKO_TRCN0000199129，其编码shRNA序列， ccggcgctgacatgtacggtctat gctcgagca tag accgta cat gtcagcgttttttg(SEQ ID NO: 70)，并针对人类VEGFR2，此慢病毒载体是由干扰性核糖核酸核心设施(研究院，中国 台湾)所提供。利用编码针对萤火虫荧光素酶(luciferase)的shRNA的 pLKO_TRCN0000072249载体作为阴性对照组。为了产生病毒，利用
Figure BDA0001428312000000141
2000(Invitrogen)，将pLKO载体、外膜质粒pMD.G和包裹质粒pCMV-ΔR8.91以10:1:9的比例共转染进入293T细胞。在转染后 18小时，以外加10％FBS和1％BSA的新鲜DMEM取代培养基。在培养 24和48小时后收集含有病毒颗粒的上清液。
在慢病毒转导(lentivirus transduction)后一天，将PC-3细胞以1×106细胞的密度种于60毫米培养皿中。将具有8μg/ml凝聚胺(polybrene) (Sigma-Aldrich)的含有病毒的培养基加入PC-3细胞并培养24小时。接着，利用于含有2μg/ml嘌霉素(puromycin)的生长培养基培养3天以筛选转导的细胞。
免疫组织化学染色
如前所述进行免疫组织化学染色。简单来说，利用Trilogy缓冲液(Cell Marque)将切片脱蜡和复水，并同时进行抗原修复。接着，通过置于含有3％ H2O2的甲醇中培养30分钟以阻断内生性过氧化酶活性。在用PBS清洗后，将切片与1％BSA培养30分钟以阻断非特异性结合。然后，将切片于室温下与抗VEGFR2抗体(55B11,Cell Signaling)培养1小时。在以PBST0.1清洗后，依据说明书以polymer-based Super Sensitive IHC detection system(Biogenex,San Ramon)处理切片。利用显色受质盐酸二氨基联苯胺 (diaminobenzidinehydrochloride(DAB))(0.02％)进行显色以检测辣根过氧化酶活性。将切片利用苏木精(Sigma-Aldrich)稍微地复染色，以Permount (Fisher Scientific)封片，并以光学显微镜检视。
蛋白质印迹法分析
如前所述，利用标准方法进行蛋白质印迹法。由Cell Signaling Technology购得一级抗体，并使用1,000倍稀释供蛋白质检测；使用的抗体如下：抗VEGFR2(克隆55B11)、抗phospho-VEGFR2(Tyr1175；克隆19A10)、抗FAK、抗phospho-FAK(Tyr397；克隆D20B1)、抗p42/44MAPK、抗 phospho-p42/44MAPK(Thr202/Tyr204；克隆D13.14.4E)、抗Akt和抗phospho-Akt(Ser473)。
冷冻组织切片的免疫荧光试验
关于肿瘤血管的研究，将样品固定于冷冻包埋剂(OCT)内。将冷冻块切成50μm切片，并用1％三聚甲醛固定冷冻肿瘤组织切片，利用0.1％ TRITONTM-X 100增加通透性，用正常马血清(Vector)进行阻断，且之后与1∶100稀释的一级抗体(大鼠抗小鼠CD31(PECAM-1)；BD Bioscience)于室温下培养1小时。接着，将组织切片与Alexa 549结合的山羊抗大鼠抗体 (Invitrogen)于室温下培养1小时。利用DAPI对细胞核染色，且之后利用荧光封片溶液进行封片。利用Zeiss Axiovert 200M显微镜获得免疫荧光影像。在低功率放大下，利用ImageJ软件，通过像素面积计算，并以DAPI染色进行标准化，以定量CD31内皮细胞的阳性区域。
末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP切口末端标记技术(TUNEL)
在与TUNEL反应混合液(Roche Diagnostics)于37℃培养1小时之前，用1％三聚甲醛固定冷冻肿瘤组织切片，并利用0.1％TRITONTM-X 100增加通透性。在用PBS清洗三次后，将切片与FITC-抗DIG抗体(1∶2000)和DAPI (1∶500)培养。以封片溶液对切片进行封片，并将切片于荧光显微镜下显像。由三个人独立地检视切片。利用ImageJ软件，通过像素面积计算，并以DAPI 染色进行标准化，以定量具有TUNEL阳性细胞的区域。
苏木精和伊红(H&E)染色
从小鼠中切下肿瘤和指定的器官，并置于4％三聚甲醛中过夜固定。依照标准程序进行样品的固定和处理。将样品包埋在石蜡中并切成50μm的切片。将经复水的石蜡包埋组织切片以Mayer’s苏木精染色液(Wako)染色5分钟，并以水清洗1-2分钟。然后将切片以伊红溶液(Wako)染色10分钟。利用类流式固态组织细胞仪(Tissue Gnostics microscopes)显现组织。
定量反转录聚合酶连锁反应
利用TrizolRNA分离试剂(Invitrogen)进行总RNA萃取。接着，依照说明书利用oligo(dT)引物(Fermentas)和Super Script III反转录酶(Invitrogen)合成cDNA。通过PCR以放大VEGFR2 cDNA所使用的正向引物和反向引物如以下所示：VEGFR2-F：gaacatttgggaaatctcttgc(SEQE ID NO:71)； VEGFR2-R：cggaagaacaatgtagtctttgc(SEQID NO:72)。利用LightCycler480 系统(Roche Applied Science)进行定量PCR。以相同样品中GAPDH转录量对 VEGFR2转录量进行标准化。针对每一样品相应地计算此比值。以三重复进行此反应。
结果
结合VEGFR2的噬菌体呈现scFv的鉴定
利用噬菌体呈现人类自然scFv库去分离可结合VEGFR2重组蛋白的噬菌体。在四轮亲和力筛选后，结合噬菌体的效价增加高达3,455倍(第1A图)。通过ELISA筛选和DNA定序，鉴定出五个不同的噬菌体克隆(R2PC8、 R2PC12、R2PC28、R2PC29、R2PC45；表1)，其可与VEGFR2-Fc(而非 c-Met-Fc对照组蛋白)高度结合(第1B图)。然后，利用人类脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)进行FACS试验，证实所有五个克隆均具有能力去结合位于细胞表面上的VEGFR2，五个克隆中以R2PC12展现最高的反应性(第1C图)。
表1显示抗VEGFR2 scFvs的VH和VL结构域的氨基酸序列。
表1
Figure BDA0001428312000000161
Figure BDA0001428312000000171
Figure BDA0001428312000000172
Figure BDA0001428312000000181
接着，由五个VEGFR2结合的噬菌体克隆制造可溶性scFv蛋白，其命名为R2S8、R2S12、R2S28、R2S29和R2S45(第1D图)。利用免疫荧光染色试验，研究抗VEGFR2 scFvs对人类肺癌手术样品中肿瘤血管内皮细胞的结合能力。观察到抗VEGFR2 scFvs的荧光信号明显与内皮细胞标记CD31 位置重合(第1E图)，显示出这些scFvs可特异性地识别肿瘤血管。
抗VEGFR2 scFvs拮抗VEGF-A/VEGFR2交互作用和VEGF-A诱导的 VEGFR2磷酸化
利用基于培养盘的竞争结合试验，增加scFvs浓度与VEGF-A竞争结合至固定化的VEGFR2上，以测定抗VEGFR2 scFvs是否可阻断VEGF-A结合至VEGFR2。R2S8和R2S12强烈地抑制VEGF-A和VEGFR2的交互作用，其半数最大抑制浓度(IC50)分别为7.03和3.26nM，而R2S28和R2S29 展现出较弱的竞争能力(第2A图)。接着，要研究scFvs是否可以于HUVECs 中拮抗VEGF-A介导的VEGFR2活化；R2S8和R2S12可显然地抑制由 VEGF-A所造成的VEGFR2的酪胺酸磷酸化，且R2S12展现最强的抑制活性(第2B图)。
抗VEGFR2 scFv的结合表位的鉴定
我们产生一系列VEGFR2删除突变，其由信号肽和跨膜结构域所组成 (第8图)，以定位出负责抗VEGFR2 scFv的结合结构域。这些蛋白质突变体异位地表达于293T细胞中，并利用R2S8、R2S12和R2S28免疫荧光染色加以检视(表2)。发现R2S28结合至表达VEGFR2(1-7)的细胞，而非表达 VEGFR2(2-7)或VEGFR2(4-7)的细胞，显示VEGFR2的结构域1对R2S28 结合是必需的。R2S8和R2S12结合至表达VEGFR2(1-7)和VEGFR2(2-7)的 293T细胞，而非表达缺乏结构域3构筑的细胞，例如VEGFR2(4-7)、 VEGFR2(del2-3)或VEGFR2(del3)，进一步指出其结合表位位于结构域3内。表2显示出抗VEGFR2 scFv的表位图谱分析。
表2
Figure BDA0001428312000000191
*nd，因为此构筑未表达所以未测定结合。
此外，我们发现中和scFvs，R2S8和R2S12，并不会与小鼠VEGFR2 蛋白交叉反应。人类和小鼠VEGFR2间的氨基酸序列比对显示出其于结构域3只有67％一致性，其为VEGFR2细胞外区域的七个结构域中最具变异性的。因此，我们推测位于人类VEGFR2结构域3中的R2S8和R2S12的不同表位并未呈现于小鼠VEGFR2中。比较人类和小鼠的结构域3显示出有30个残基不同，且这些残基聚集为多个群组。为鉴定对R2S8和R2S12 结合具关键性的位于结构域3的氨基酸残基，我们选择了两个主要群组(M1 和M2)进行突变，如以下所示：将人类NWEYPS(SEQ ID NO:66)和 TQSGSEM(SEQ ID NO:67)残基分别用小鼠TWHSPP(SEQ ID NO:68)和PFPGTVA(SEQ ID NO:69)残基取代(第2C图)。免疫荧光染色的结果显示 R2S8和R2S12不会识别表达VEGFR2-M1突变蛋白的293T细胞。相反地，在VEGFR2的M2区域的突变并不影响对R2S8和R2S12的结合(表2)。
由在先报导的晶体结构信息和我们的突变数据，我们建立了VEGFR2 结构域3的分子模型。条带和表面模型显示出NWEYPS(SEQ ID NO:66)残基(M1区域)位于VEGFR2结构域3的-strand和中间表面(第2D图和第2E 图)。中和抗VEGFR2抗体、IMC-1121B和6.64的接触残基和结合表面位于 VEGFR2结构域3(第2C图和第2F图)。我们观察到M1区域靠近IMC-1121B和6.64抗体的结合表位。发现IMC-1121B抗体的两个结合残基，Asn259和Glu261，位于M1区域。因此，我们的结果显示出R2S8和R2S12的结合表位最有可能不同于IMC-1121B和6.64抗体的结合表位。
进行R2S12的亲和力成熟作用以产生具有较高结合活性的抗 VEGFR2-AF人类抗体
具有高亲和力的中和抗体对治疗功效来说是重要的。因为R2S12在受检视的scFvs中具有最强的结合和拮抗活性，所以我们利用基于噬菌体呈现的亲和力成熟作用来进一步增加其结合活性。在四轮的生物体外严格筛选后，鉴别出具有较好结合活性的克隆(R2S12AF)(第9A图至第9B图)。R2S12-AF 的VL-CDR3内的四个残基有别于其亲本克隆R2S12(第3A图)。已显示scFv 型式因为其短的血清半衰期(将近3.5小时)和无法引发人类效应物功能而限制其于临床上的使用。为了克服这些挑战，我们将R2S12和R2S12-AF scFv 的编码序列分子设计进入人类IgG1骨架以分别地产生抗VEGFR2和抗 VEGFR2-AF全人类抗体(hAb)。
我们利用BIACORE T100TM分析两个人类抗体对VEGFR2的亲和力。抗体-抗原动力学参数的测定显示出抗VEGFR2-AF hAb具有sub-nmol/L的亲和力常数(Kd＝0.264nM)，且抗VEGFR2-AF hAb的结合亲和力超过其亲本克隆抗VEGFR2 hAb(Kd＝2.1nM)，有8倍的增加(第3B图)。我们进行固相竞争试验以定量评估通过个别抗体对VEGF-A/VEGFR2结合的阻断。第3C图显示出对抗VEGFR2-AF hAb、抗VEGFR2 hAb和IMC-1121B而言， VEGF-A结合至VEGFR2的IC50数值分别为0.88nM、1.87nM和1.42nM。这些数据表明抗VEGFR2-AF hAb在阻断VEGF/VEGFR2交互作用上优于 IMC-1121B。HUVECs的FACS分析结果进一步证实抗VEGFR2-AF hAb相较于IMC-1121B对细胞表面VEGFR2展现较强的结合(第3D图)。
抗VEGFR2-AF hAb在HUVECs中可抑制VEGFR2介导的信号通路的活化并阻断毛细血管结构形成
为了说明抗VEGFR2-AF hAb的抗血管新生潜力，我们分析了抗 VEGFR2-AF hAb对HUVEC生长、移动和管柱形成的影响。我们利用MTT 和伤口愈合试验分别地发现抗VEGFR2-AF hAb可抑制VEGF-A诱导的 HUVEC增殖和移动。为了研究抗VEGFR2-AF hAb对内皮细胞管柱形成(血管新生中的一个重要步骤)的影响，我们检视在缺乏或具有VEGF-A和抗 VEGFR2-AF hAb的状况下位于
Figure BDA0001428312000000211
层上的HUVECs(第4A图)。利用倒立式照相显微镜(inverted photomicroscope)评估和定量内皮细胞移动和组织成为类毛细血管结构的能力。基于管腔长度和分支点数的测量，我们证实了抗VEGFR2-AF hAb在抑制VEGF-A引发的类毛细血管结构方面较 IMC-1121B更为有效(第4A图)。
为了研究抗VEGFR2-AF hAb的抗血管新生特性的分子机制，我们利用蛋白质印迹法检视信号分子和路径(第4B图)。发现抗VEGFR2-AF hAb可有效地减少VEGFR-2的VEGF-A诱导的磷酸化和其下游讯信号息分子(例如Akt、MAPK和FAK)。特别地，在抗VEGFR2-AF处理的组别中，磷酸化VEGFR2、Akt和MAPK的量低于IMC-1121B处理的组别，然而以任意抗体处理仅略为减少FAK磷酸化(第4B图)。此结果表明抗VEGFR2-AF hAb 可显著地抑制血管内皮细胞血管新生的几个关键步骤，显示出此抗体在生物体内可具有抗血管新生的潜力。
抗VEGFR2-AF hAb在VEGFR2表达的人类前列腺癌细胞中抑制 VEGF-A诱导的细胞功能
我们选择人类前列腺癌细胞株PC-3作为模型以研究抗VEGFR2-AF hAb在抑制肿瘤生长中的治疗功效。我们进行定量反转录聚合酶连锁反应 (qRT-PCR)分析以研究在PC-3细胞中VEGFR2的内生性表达(第5A图)。已知HUVECs、EA.hy926和hESC-H9细胞高度表达VEGFR2mRNA，且因此作为阳性对照组。我们发现VEGFR2 mRNA在PC-3细胞中很容易被检测到，但在阴性对照组293T细胞中几乎检测不到。
为了描述VEGF-A/VEGFR2在PC-3细胞的功能意义的特征，我们分析了用VEGF-A处理后的PC-3细胞活性。发现以VEGF-A处理可增强PC-3 细胞的各种细胞活性，包含增殖、细胞群落形成和侵犯能力(第5B图)。相较于以对照组shRNA(shLuc)感染的PC-3细胞(第5D图)，我们利用慢病毒介导的shRNA(shVEGFR2)建立VEGFR2弱化的PC-3细胞(VEGFR2-knockdown PC-3 cells)，并发现VEGFR2的弱化可减少PC-3细胞的增殖、细胞群落形成和侵犯能力(第5C图)。我们以抗VEGFR2-AF hAb处理PC-3细胞，并证实通过抗VEGFR2-AF hAb可抑制VEGF-A诱导的细胞活性(第10A图至第10C图)。因此，这些数据显示出VEGF/VEGFR2轴对PC-3细胞的群落形成和肿瘤形成能力是重要的。
我们研究在相关微矩阵数据集中的VEGFR2表达模式。我们发现在转移性前列腺肿瘤中相较于在原发性肿瘤中具较高的VEGFR2转录量。我们利用市售抗VEGFR2抗体对人类前列腺癌组织数组进行染色，并显示出在肿瘤细胞中可检测到VEGFR2，且相较于第I级，其在第III级前列腺腺癌 (prostate adenocarcinoma)中的表达量上升(第5F图)。在正常前列腺组织样品中，VEGFR2是呈现于血管内皮细胞中，而非于正常前列腺细胞中。
抗VEGFR2-AF在人类前列腺癌异种移植中的治疗功效
我们利用PC-3异种移植前列腺肿瘤模型来说明抗VEGFR2-AF hAb相对IMC-1121B于生物体内的抗肿瘤活性。欧洲紫杉醇为用于转移性阉割抗性前列腺癌(metastaticcastration-resistant prostate cancer)患者的第一线化学治疗剂。因此，我们也研究联合欧洲紫杉醇和抗VEGFR2-AF hAb或 IMC-1121B的治疗效果。利用IMC-1121B、抗VEGFR2-AFhAb、欧洲紫杉醇、抗VEGFR2-AF hAb加上欧洲紫杉醇、或IMC-1121B加上欧洲紫杉醇给药带有PC-3异种移植的NOD/SCID小鼠(第6A图)。在第38天，用联合抗VEGFR2-AF hAb加上欧洲紫杉醇治疗的小鼠的肿瘤生长减少达到90％，用联合IMC-1121B加上欧洲紫杉醇治疗的小鼠的肿瘤生长减少达到82％，用欧洲紫杉醇治疗的小鼠的肿瘤生长减少达到70％，用抗VEGFR2-AF hAb 治疗的小鼠的肿瘤生长减少达到52％，且用IMC-1121B治疗的小鼠的肿瘤生长减少达到45％(第6B图)。利用体重作为小鼠健康状态的替代指标(第 6C图)。相较于NHIgG组，抗VEGFR2-AF hAb组和IMC-1121B组于治疗期间在体重上无显著改变。单独以欧洲紫杉醇治疗引起明显的体重下降(约 20％)。利用欧洲紫杉醇联合其他抗体治疗的小鼠与单独以欧洲紫杉醇治疗的小鼠体重下降量相似，此显示出抗VEGFR2-AF hAb和IMC-1121B并不会增强欧洲紫杉醇引发的毒性。
测定肿瘤重量并发现其与肿瘤体积一致(第6D图和第6E图)。我们利用抗CD31抗体(检测肿瘤血管)和TUNEL试验(识别凋亡细胞)进一步检视每一组别的肿瘤组织。我们发现抗VEGFR2-AF hAb在减少肿瘤血管密度和增加癌细胞细胞凋亡方面优于IMC-1121B(第11A图和第11B图)。这些结果显示出抗VEGFR2-AF hAb在减少肿瘤生长方面较IMC-1121B更有效，且抗 VEGFR2-AF hAb可显著地增强欧洲紫杉醇在小鼠中治疗人类前列腺肿瘤的效用。
抗VEGFR2-AF hAb可延长带有HL-60白血病异种移植小鼠的存活
VEGF-A/VEGFR2路径不只在固体瘤中，也在液体瘤中具有重要的功能。在先研究提供了IMC-1121B抑制HL-60白血病细胞生长和于小鼠模型中延长存活的证据。为比较IMC-1121B和抗VEGFR2-AF hAb的抗白血病效果，我们在NSG小鼠中发展出HL-60白血病异种移植模型。小鼠接受5×106 HL-60细胞的静脉注射，并于3天后以IMC-1121B、抗VEGFR2-AF、NHIgG 或PBS治疗。如第7图所示，所有用PBS或NHIgG治疗的小鼠于36天内死亡；然而，用针对VEGFR2的抗体治疗的带有白血病的小鼠于存活时间上展现出了明显的延长。相较于用IMC-1121B治疗者(存活期最长达56天；中位存活期＝43天)，用抗VEGFR2-AF hAb治疗的小鼠存活较久(存活期最长达70天；中位存活期＝53天)。在组别之间未观察到体重有显著改变(第 7B图)。
所有小鼠的死后组织病理学检查显示，在每一组别小鼠的肝脏、脾脏、心脏或肾脏并未发现明显的病理变化。相较于正常的卵巢，带有白血病的小鼠的卵巢有肿胀现象(第7C图)。H&E染色显示卵巢已经被转移性白血病细胞所浸润(第12A图和第12B图)。抗VEGFR2-AFhAb治疗组的平均卵巢体积显著地小于IMC-1121B治疗组(第7D图)。
此外，在九只用抗VEGFR2-AF hAb治疗的小鼠中发现一只具有白血病浸润的淋巴结，然而，在九只用IMC-1121B治疗的小鼠中有五只呈现具有白血病浸润的淋巴结(第7E图)。
抗VEGFR2-AF hAb所介导的以靶向位于肿瘤内皮细胞上的VEGFR2 不仅可阻断VEGF-A诱导的信号，也可引发抗体依赖型细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity(ADCC))或补体依赖性细胞毒性作用(complement-dependent cytotoxicity(CDC))，以直接毒杀目标细胞，其可增强现行的抗血管新生治疗。
因为肿瘤细胞也表达VEGFR2，故抗VEGFR2-AF hAb可能能够在肿瘤血管和恶性细胞二者上发挥双重靶向和抑制效果。双重靶向能力可能在癌症治疗上具有协同作用。我们制造抗VEGFR2-AF全人类抗体，其对VEGFR2 展现优异的结合，拮抗此受体的活性。与IMC-1121B相似，抗VEGFR2-AF hAb可特异性地结合人类VEGFR2，而非小鼠VEGFR2。相较于IMC-1121B，抗VEGFR2-AF hAb在生物体外和生物体内呈现更高的抗肿瘤功效，其乃通过阻断VEGF-A/VEGFR2轴介导的讯息。我们首先证明了在前列腺癌治疗中抗VEGFR2抗体可增强欧洲紫杉醇的治疗功效。此发现显示，抗 VEGFR2-AF hAb通过同时和直接抑制血管新生和表达VEGFR2的肿瘤细胞，有潜力作为用于癌症治疗的治疗性抗体。
总之，相较于FDA核准的抗VEGFR2人类抗体IMC-1121B(雷莫芦单抗)，抗VEGFR2-AFhAb具有显著优异的活性，且可在生物体外抑制 VEGF-A介导的毛细血管结构形成。我们观察了在人类前列腺癌细胞株 (PC-3)和白血病细胞株(HL-60)中的VEGFR2表达，并证实VEGFR2表达和人类前列腺癌的恶性和转移性有关。在PC-3衍生的异种移植小鼠模型中，以抗VEGFR2-AF hAb治疗(单一药物疗法或与欧洲紫杉醇联合)可抑制肿瘤生长和血管新生，其较以IMC-1121B治疗更有效率。在具有HL-60衍生的白血病的小鼠中，抗VEGFR2-AF hAb在延长存活和减少白血病细胞转移至卵巢和淋巴结方面较IMC-1121B展现出更显著的功效。
上述本发明例示性实施例的描述仅作为说明和描述的目的而加以呈现，而非意图去穷举或限制本发明至所公开的确切形式。根据上述教导，许多修饰和变化是可能的。在此说明书中所引用和讨论的所有文献在此通过引用并入本文整体且至相同程度，其犹如每一文献是通过引用而分别地并入。
SEQUENCE LISTING
<110> “中央研究院”
<120> 用于抗血管新生和标靶癌症治疗的抗VEGFR2人类抗体
<130> 10011-051PCT
<150> US62147344
<151> 2015-04-14
<160> 80
<170> PatentIn version 3.5
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Ala Arg Gly Ser Ala Ser Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC12 VL CDR1
<400> 9
Asp Asp Ile Ile Asn Tyr
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC12 V L CDR3
<400> 10
Gln Gln Tyr Asp Ile Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 11
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1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 12
Ile Ser Asp Asp Gly Arg Asn Lys
1 5
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC28 VH CDR3
<400> 13
Ala Arg Val Pro Thr Val Trp Arg Gly Gly Val Tyr Asp Ile
1 5 10
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 14
Gln Ser Val Gly Ser Tyr
1 5
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<213> 人工序列
<220>
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<211> 8
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<213> 人工序列
<220>
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1 5
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<213> 人工序列
<220>
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Ile Ile Pro Leu Phe Gly Thr Gly
1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC29 VH CDR3
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Ala Thr Ala Asp Val Asp Tyr Ser Asp Ser Leu Glu Ala Phe Asp Met
1 5 10 15
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<213> 人工序列
<220>
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1 5
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<211> 8
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 20
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
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<211> 8
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<220>
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Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
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<211> 16
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<213> 人工序列
<220>
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Ala Arg Glu Gln Asp Tyr Gly Ser Ser Ser Gly Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10 15
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<211> 6
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<213> 人工序列
<220>
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Gln Arg Ile Ser Ser Tyr
1 5
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<211> 9
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 25
His Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Pro Thr
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<211> 25
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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<211> 17
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 27
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10 15
Ser
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<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC8 VH FR3
<400> 28
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
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<211> 11
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC8 VL FR1
<400> 30
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
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<210> 31
<211> 17
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 31
Leu Asn Trp Tyr Gln His Lys Ser Gly Glu Asp Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
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<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC8 VL FR3
<400> 32
Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 34
Gln Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 35
<211> 17
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<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC12 VH FR2
<400> 35
Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Ser
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<211> 38
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<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC12 VH FR3
<400> 36
Phe Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ser Arg Ser Ser Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
35
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<213> 人工序列
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Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC12 VL FR1
<400> 38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
20 25
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<211> 17
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<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC12 VL FR2
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC12 VL FR3
<400> 40
Ile Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC12 VL FR4
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<211> 25
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser
20 25
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC28 VH FR2
<400> 43
Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala
1 5 10 15
Val
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<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC28 VH FR3
<400> 44
Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 45
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC28 VH FR4
<400> 45
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 46
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC28 VL FR1
<400> 46
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
20 25
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC28 VL FR2
<400> 47
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 48
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC28 VL FR3
<400> 48
Asn Arg Ala Thr Gly Val Ala Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC28 VL FR4
<400> 49
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC29 VH FR1
<400> 50
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Ser Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 51
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC29 VH FR2
<400> 51
Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Gly
<210> 52
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC29 VH FR3
<400> 52
Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu
1 5 10 15
Ser Thr Thr Thr Val Tyr Leu Gln Leu Thr Ser Leu Thr Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Phe Cys
35
<210> 53
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC29 VH FR4
<400> 53
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 54
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC29 VL FR1
<400> 54
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
20 25
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC29 VL FR2
<400> 55
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 56
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC29 VL FR3
<400> 56
Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC29 VL FR4
<400> 57
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC45 VH FR1
<400> 58
Gln Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC45 VH FR2
<400> 59
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Val
<210> 60
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC45 VH FR3
<400> 60
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 61
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC45 VH FR4
<400> 61
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 62
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC45 VL FR1
<400> 62
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
20 25
<210> 63
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC45 VL FR2
<400> 63
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 64
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC45 VL FR3
<400> 64
Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Gly Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala
20 25 30
Ile Tyr Phe Cys
35
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2PC45 VL FR4
<400> 65
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 66
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 66
Asn Trp Glu Tyr Pro Ser
1 5
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 67
Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met
1 5
<210> 68
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 68
Thr Trp His Ser Pro Pro
1 5
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 69
Pro Phe Pro Gly Thr Val Ala
1 5
<210> 70
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗VEGFR2 shRNA 序列
<400> 70
ccggcgctga catgtacggt ctatgctcga gcatagaccg tacatgtcag cgttttttg 59
<210> 71
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGFR2-F引物
<400> 71
gaacatttgg gaaatctctt gc 22
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGFR2-R引物
<400> 72
cggaagaaca atgtagtctt tgc 23
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2S12AF variable light chain CDR3
<400> 73
Gln Gln Leu Asp Asp Ile Pro Ile Thr
1 5
<210> 74
<211> 1356
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 74
Met Gln Ser Lys Val Leu Leu Ala Val Ala Leu Trp Leu Cys Val Glu
1 5 10 15
Thr Arg Ala Ala Ser Val Gly Leu Pro Ser Val Ser Leu Asp Leu Pro
20 25 30
Arg Leu Ser Ile Gln Lys Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn Thr Thr
35 40 45
Leu Gln Ile Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro
50 55 60
Asn Asn Gln Ser Gly Ser Glu Gln Arg Val Glu Val Thr Glu Cys Ser
65 70 75 80
Asp Gly Leu Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val Ile Gly Asn
85 90 95
Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala Ser
100 105 110
Val Ile Tyr Val Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser
115 120 125
Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys
130 135 140
Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser
145 150 155 160
Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg
165 170 175
Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile
180 185 190
Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser
195 200 205
Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr
210 215 220
Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu
225 230 235 240
Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile
245 250 255
Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu
260 265 270
Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe
275 280 285
Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu
290 295 300
Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr
305 310 315 320
Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met
325 330 335
Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala
340 345 350
Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly
355 360 365
Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr
370 375 380
Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu
385 390 395 400
Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val
405 410 415
Val Tyr Val Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ser Leu Ile Ser Pro Val
420 425 430
Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Thr Thr Gln Thr Leu Thr Cys Thr Val Tyr
435 440 445
Ala Ile Pro Pro Pro His His Ile His Trp Tyr Trp Gln Leu Glu Glu
450 455 460
Glu Cys Ala Asn Glu Pro Ser Gln Ala Val Ser Val Thr Asn Pro Tyr
465 470 475 480
Pro Cys Glu Glu Trp Arg Ser Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys
485 490 495
Ile Glu Val Asn Lys Asn Gln Phe Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys
500 505 510
Thr Val Ser Thr Leu Val Ile Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr
515 520 525
Lys Cys Glu Ala Val Asn Lys Val Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser
530 535 540
Phe His Val Thr Arg Gly Pro Glu Ile Thr Leu Gln Pro Asp Met Gln
545 550 555 560
Pro Thr Glu Gln Glu Ser Val Ser Leu Trp Cys Thr Ala Asp Arg Ser
565 570 575
Thr Phe Glu Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Leu Gly Pro Gln Pro Leu Pro
580 585 590
Ile His Val Gly Glu Leu Pro Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Thr
595 600 605
Leu Trp Lys Leu Asn Ala Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile
610 615 620
Leu Ile Met Glu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr
625 630 635 640
Val Cys Leu Ala Gln Asp Arg Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Val Val
645 650 655
Arg Gln Leu Thr Val Leu Glu Arg Val Ala Pro Thr Ile Thr Gly Asn
660 665 670
Leu Glu Asn Gln Thr Thr Ser Ile Gly Glu Ser Ile Glu Val Ser Cys
675 680 685
Thr Ala Ser Gly Asn Pro Pro Pro Gln Ile Met Trp Phe Lys Asp Asn
690 695 700
Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Lys Asp Gly Asn Arg
705 710 715 720
Asn Leu Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Thr
725 730 735
Cys Gln Ala Cys Ser Val Leu Gly Cys Ala Lys Val Glu Ala Phe Phe
740 745 750
Ile Ile Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu Ile Ile Ile Leu
755 760 765
Val Gly Thr Ala Val Ile Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu Leu Val Ile
770 775 780
Ile Leu Arg Thr Val Lys Arg Ala Asn Gly Gly Glu Leu Lys Thr Gly
785 790 795 800
Tyr Leu Ser Ile Val Met Asp Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu His
805 810 815
Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp
820 825 830
Arg Leu Lys Leu Gly Lys Pro Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gln Val
835 840 845
Ile Glu Ala Asp Ala Phe Gly Ile Asp Lys Thr Ala Thr Cys Arg Thr
850 855 860
Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg
865 870 875 880
Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly His His Leu
885 890 895
Asn Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu
900 905 910
Met Val Ile Val Glu Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu
915 920 925
Arg Ser Lys Arg Asn Glu Phe Val Pro Tyr Lys Thr Lys Gly Ala Arg
930 935 940
Phe Arg Gln Gly Lys Asp Tyr Val Gly Ala Ile Pro Val Asp Leu Lys
945 950 955 960
Arg Arg Leu Asp Ser Ile Thr Ser Ser Gln Ser Ser Ala Ser Ser Gly
965 970 975
Phe Val Glu Glu Lys Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Ala Pro
980 985 990
Glu Asp Leu Tyr Lys Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu Ile Cys Tyr
995 1000 1005
Ser Phe Gln Val Ala Lys Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys
1010 1015 1020
Cys Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu
1025 1030 1035
Lys Asn Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile
1040 1045 1050
Tyr Lys Asp Pro Asp Tyr Val Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro
1055 1060 1065
Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Thr Ile Phe Asp Arg Val Tyr Thr
1070 1075 1080
Ile Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile
1085 1090 1095
Phe Ser Leu Gly Ala Ser Pro Tyr Pro Gly Val Lys Ile Asp Glu
1100 1105 1110
Glu Phe Cys Arg Arg Leu Lys Glu Gly Thr Arg Met Arg Ala Pro
1115 1120 1125
Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met Tyr Gln Thr Met Leu Asp Cys Trp
1130 1135 1140
His Gly Glu Pro Ser Gln Arg Pro Thr Phe Ser Glu Leu Val Glu
1145 1150 1155
His Leu Gly Asn Leu Leu Gln Ala Asn Ala Gln Gln Asp Gly Lys
1160 1165 1170
Asp Tyr Ile Val Leu Pro Ile Ser Glu Thr Leu Ser Met Glu Glu
1175 1180 1185
Asp Ser Gly Leu Ser Leu Pro Thr Ser Pro Val Ser Cys Met Glu
1190 1195 1200
Glu Glu Glu Val Cys Asp Pro Lys Phe His Tyr Asp Asn Thr Ala
1205 1210 1215
Gly Ile Ser Gln Tyr Leu Gln Asn Ser Lys Arg Lys Ser Arg Pro
1220 1225 1230
Val Ser Val Lys Thr Phe Glu Asp Ile Pro Leu Glu Glu Pro Glu
1235 1240 1245
Val Lys Val Ile Pro Asp Asp Asn Gln Thr Asp Ser Gly Met Val
1250 1255 1260
Leu Ala Ser Glu Glu Leu Lys Thr Leu Glu Asp Arg Thr Lys Leu
1265 1270 1275
Ser Pro Ser Phe Gly Gly Met Val Pro Ser Lys Ser Arg Glu Ser
1280 1285 1290
Val Ala Ser Glu Gly Ser Asn Gln Thr Ser Gly Tyr Gln Ser Gly
1295 1300 1305
Tyr His Ser Asp Asp Thr Asp Thr Thr Val Tyr Ser Ser Glu Glu
1310 1315 1320
Ala Glu Leu Leu Lys Leu Ile Glu Ile Gly Val Gln Thr Gly Ser
1325 1330 1335
Thr Ala Gln Ile Leu Gln Pro Asp Ser Gly Thr Thr Leu Ser Ser
1340 1345 1350
Pro Pro Val
1355
<210> 75
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 75
Gly Leu Met Thr Lys
1 5
<210> 76
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2S12或R2S12-AF的VH区
<400> 76
Gln Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Thr Ser Gly Ser Ser Tyr Ile Phe Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Ser Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Ala Ser Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 77
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2S12的VL区
<400> 77
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp Asp Ile Ile Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ile Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ile Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 78
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2S12AF的VL区
<400> 78
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp Asp Ile Ile Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ile Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asp Asp Ile Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 79
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 79
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 80
<211> 1340
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 80
Met Glu Ser Lys Ala Leu Leu Ala Val Ala Leu Trp Phe Cys Val Glu
1 5 10 15
Thr Arg Ala Ala Ser Val Gly Leu Pro Gly Asp Phe Leu His Pro Pro
20 25 30
Lys Leu Ser Thr Gln Lys Asp Ile Leu Thr Ile Leu Ala Asn Thr Thr
35 40 45
Leu Gln Ile Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro
50 55 60
Asn Ala Gln Arg Asp Ser Glu Glu Arg Val Leu Val Thr Glu Cys Gly
65 70 75 80
Gly Gly Asp Ser Ile Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Arg Val Val
85 90 95
Gly Asn Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Ser Tyr Arg Asp Val Asp Ile
100 105 110
Ala Ser Thr Val Tyr Val Tyr Val Arg Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile
115 120 125
Ala Ser Val Ser Asp Gln His Gly Ile Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys
130 135 140
Asn Lys Thr Val Val Ile Pro Cys Arg Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn
145 150 155 160
Val Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly
165 170 175
Asn Arg Ile Ser Trp Asp Ser Glu Ile Gly Phe Thr Leu Pro Ser Tyr
180 185 190
Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp
195 200 205
Glu Thr Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Val Ile
210 215 220
Leu Ser Pro Pro His Glu Ile Glu Leu Ser Ala Gly Glu Lys Leu Val
225 230 235 240
Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Leu Asp Phe Thr
245 250 255
Trp His Ser Pro Pro Ser Lys Ser His His Lys Lys Ile Val Asn Arg
260 265 270
Asp Val Lys Pro Phe Pro Gly Thr Val Ala Lys Met Phe Leu Ser Thr
275 280 285
Leu Thr Ile Glu Ser Val Thr Lys Ser Asp Gln Gly Glu Tyr Thr Cys
290 295 300
Val Ala Ser Ser Gly Arg Met Ile Lys Arg Asn Arg Thr Phe Val Arg
305 310 315 320
Val His Thr Lys Pro Phe Ile Ala Phe Gly Ser Gly Met Lys Ser Leu
325 330 335
Val Glu Ala Thr Val Gly Ser Gln Val Arg Ile Pro Val Lys Tyr Leu
340 345 350
Ser Tyr Pro Ala Pro Asp Ile Lys Trp Tyr Arg Asn Gly Arg Pro Ile
355 360 365
Glu Ser Asn Tyr Thr Met Ile Val Gly Asp Glu Leu Thr Ile Met Glu
370 375 380
Val Thr Glu Arg Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu Thr Asn Pro
385 390 395 400
Ile Ser Met Glu Lys Gln Ser His Met Val Ser Leu Val Val Asn Val
405 410 415
Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ala Leu Ile Ser Pro Met Asp Ser Tyr
420 425 430
Gln Tyr Gly Thr Met Gln Thr Leu Thr Cys Thr Val Tyr Ala Asn Pro
435 440 445
Pro Leu His His Ile Gln Trp Tyr Trp Gln Leu Glu Glu Ala Cys Ser
450 455 460
Tyr Arg Pro Gly Gln Thr Ser Pro Tyr Ala Cys Lys Glu Trp Arg His
465 470 475 480
Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys Ile Glu Val Thr Lys Asn Gln
485 490 495
Tyr Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys Thr Val Ser Thr Leu Val Ile
500 505 510
Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr Lys Cys Glu Ala Ile Asn Lys
515 520 525
Ala Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser Phe His Val Ile Arg Gly Pro
530 535 540
Glu Ile Thr Val Gln Pro Ala Ala Gln Pro Thr Glu Gln Glu Ser Val
545 550 555 560
Ser Leu Leu Cys Thr Ala Asp Arg Asn Thr Phe Glu Asn Leu Thr Trp
565 570 575
Tyr Lys Leu Gly Ser Gln Ala Thr Ser Val His Met Gly Glu Ser Leu
580 585 590
Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Ala Leu Trp Lys Leu Asn Gly Thr
595 600 605
Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile Leu Ile Val Ala Phe Gln Asn
610 615 620
Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr Val Cys Ser Ala Gln Asp Lys
625 630 635 640
Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Leu Val Lys Gln Leu Ile Ile Leu Glu
645 650 655
Arg Met Ala Pro Met Ile Thr Gly Asn Leu Glu Asn Gln Thr Thr Thr
660 665 670
Ile Gly Glu Thr Ile Glu Val Thr Cys Pro Ala Ser Gly Asn Pro Thr
675 680 685
Pro His Ile Thr Trp Phe Lys Asp Asn Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser
690 695 700
Gly Ile Val Leu Arg Asp Gly Asn Arg Asn Leu Thr Ile Arg Arg Val
705 710 715 720
Arg Lys Glu Asp Gly Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Cys Asn Val Leu
725 730 735
Gly Cys Ala Arg Ala Glu Thr Leu Phe Ile Ile Glu Gly Ala Gln Glu
740 745 750
Lys Thr Asn Leu Glu Val Ile Ile Leu Val Gly Thr Ala Val Ile Ala
755 760 765
Met Phe Phe Trp Leu Leu Leu Val Ile Val Leu Arg Thr Val Lys Arg
770 775 780
Ala Asn Glu Gly Glu Leu Lys Thr Gly Tyr Leu Ser Ile Val Met Asp
785 790 795 800
Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu Arg Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp
805 810 815
Ala Ser Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp Arg Leu Lys Leu Gly Lys Pro
820 825 830
Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gln Val Ile Glu Ala Asp Ala Phe Gly
835 840 845
Ile Asp Lys Thr Ala Thr Cys Lys Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys
850 855 860
Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys
865 870 875 880
Ile Leu Ile His Ile Gly His His Leu Asn Val Val Asn Leu Leu Gly
885 890 895
Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu Met Val Ile Val Glu Phe Cys
900 905 910
Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu Arg Gly Lys Arg Asn Glu Phe
915 920 925
Val Pro Tyr Lys Ser Lys Gly Ala Arg Phe Arg Gln Gly Lys Asp Tyr
930 935 940
Val Gly Glu Leu Ser Val Asp Leu Lys Arg Arg Leu Asp Ser Ile Thr
945 950 955 960
Ser Ser Gln Ser Ser Ala Ser Ser Gly Phe Val Glu Glu Lys Ser Leu
965 970 975
Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Ala Ser Glu Glu Leu Tyr Lys Asp Phe
980 985 990
Leu Thr Leu Glu His Leu Ile Cys Tyr Ser Phe Gln Val Ala Lys Gly
995 1000 1005
Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys Cys Ile His Arg Asp Leu Ala
1010 1015 1020
Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Lys Asn Val Val Lys Ile Cys
1025 1030 1035
Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asp Pro Asp Tyr Val
1040 1045 1050
Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu
1055 1060 1065
Thr Ile Phe Asp Arg Val Tyr Thr Ile Gln Ser Asp Val Trp Ser
1070 1075 1080
Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Ala Ser Pro
1085 1090 1095
Tyr Pro Gly Val Lys Ile Asp Glu Glu Phe Cys Arg Arg Leu Lys
1100 1105 1110
Glu Gly Thr Arg Met Arg Ala Pro Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met
1115 1120 1125
Tyr Gln Thr Met Leu Asp Cys Trp His Glu Asp Pro Asn Gln Arg
1130 1135 1140
Pro Ser Phe Ser Glu Leu Val Glu His Leu Gly Asn Leu Leu Gln
1145 1150 1155
Ala Asn Ala Gln Gln Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Val Leu Pro Met
1160 1165 1170
Ser Glu Thr Leu Ser Met Glu Glu Asp Ser Gly Leu Ser Leu Pro
1175 1180 1185
Thr Ser Pro Val Ser Cys Met Glu Glu Glu Glu Val Cys Asp Pro
1190 1195 1200
Lys Phe His Tyr Asp Asn Thr Ala Gly Ile Ser His Tyr Leu Gln
1205 1210 1215
Asn Ser Lys Arg Lys Ser Arg Pro Val Ser Val Lys Thr Phe Glu
1220 1225 1230
Asp Ile Pro Leu Glu Glu Pro Glu Val Lys Val Ile Pro Asp Asp
1235 1240 1245
Ser Gln Thr Asp Ser Gly Met Val Leu Ala Ser Glu Glu Leu Lys
1250 1255 1260
Thr Leu Glu Asp Arg Asn Lys Leu Ser Pro Ser Phe Gly Gly Met
1265 1270 1275
Met Pro Ser Lys Ser Arg Glu Ser Val Ala Ser Glu Gly Ser Asn
1280 1285 1290
Gln Thr Ser Gly Tyr Gln Ser Gly Tyr His Ser Asp Asp Thr Asp
1295 1300 1305
Thr Thr Val Tyr Ser Ser Asp Glu Ala Gly Leu Leu Lys Met Val
1310 1315 1320
Asp Ala Ala Val His Ala Asp Ser Gly Thr Thr Leu Arg Ser Pro
1325 1330 1335
Pro Val
1340

Claims (14)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其针对位于序列为SEQ ID NO:74的人类血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的结构域3内的表位具有特异性结合亲和力，其中该位于VEGFR2的结构域3内的表位位于SEQ ID NO:74的第250个氨基酸残基和第270个氨基酸残基之间，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该VH包含VH CDR1、VHCDR2以及VH CDR3，且该VL包含VL CDR1、VL CDR2以及VL CDR3，其中，该VH CDR1、VH CDR2以及VH CDR3分别为SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7以及SEQ ID NO:8的氨基酸序列；且该VL CDR1、VLCDR2以及VL CDR3分别为SEQ ID NO:9、Asp Ala Ser以及SEQ ID NO:10或73的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，该VL CDR3为SEQ ID NO:73的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，该VH包含SEQ ID NO:76氨基酸序列；以及该VL包含SEQ ID NO:77或78氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其为单链可变片段、Fab片段或Fv片段。
5.根据权利要求1、3和4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体为完全的人类抗体。
6.一种组合物，包含治疗上有效剂量的根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体或载剂。
7.根据权利要求6所述的组合物，进一步包含治疗上有效剂量的化学治疗剂。
8.一种根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求7所述的组合物在制备用于在有需要的个体中抑制肿瘤生长、肿瘤血管新生和/或诱导癌细胞的细胞毒性的药物中的用途。
9.一种根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，该药物用于在有需要的个体中抑制肿瘤生长、肿瘤血管新生和/或诱导癌细胞的细胞毒性，其中所述抗体为完全的人类抗体。
10.根据权利要求8或9所述的用途，其中该肿瘤或癌症为选自由胰脏癌、乳癌、肺癌、白血病、前列腺癌和卵巢癌所组成群组中的至少一种。
11.根据权利要求1、3和4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备检测试剂的用途，该检测试剂用于检测生物样品中位于癌细胞上的VEGFR2。
12.根据权利要求2或3所述的抗体或其抗原结合片段在制备检测试剂的用途，该检测试剂用于检测生物样品中位于癌细胞上的VEGFR2。
13.根据权利要求1、3和4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备检测试剂的用途，该检测试剂用于检测生物样品中位于肿瘤血管内皮细胞上的VEGFR2。
14.根据权利要求2或3所述的抗体或其抗原结合片段在制备检测试剂的用途，该检测试剂用于检测生物样品中位于肿瘤血管内皮细胞上的VEGFR2。
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