CN118103071A - Herv-k抗体治疗剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供治疗性人源化抗HERV‑K抗体、CAR、融合物,包含针对CD3和CD8的双特异性T细胞衔接器(BiTE)、DNA编码BiTE的(DBiTE)或抗体‑药物缀合物(ADC)的组合。本发明还涉及用于免疫治疗方法的肽、蛋白、核酸和细胞。特别地,本发明涉及与MHC分子结合的癌症肽或肽自身免疫疗法,可作为抗体或结合其它分子的靶标的免疫疗法。
Description
技术领域
本发明大致涉及癌症抗原。
背景技术
人内源逆转录病毒(HERVs)人内源逆转录病毒,在基因组中有许多拷贝,大约8%的人基因组具有逆转录病毒来源。参考Lander et al.Nature.409,860-921(2001).逆转录病毒通常会由于累计的基因突变而失去感染性。除了在特定的病理情况(如,癌症)下,这些基因在正常成人组织中在多数情况下是沉默的或不表达的。
最具生物活性的HERV是HERV-K家族成员。HERV-K具有能表达具有复制能力的逆转录病毒所需的所有元件的完整序列,但能在正常细胞中保持沉默。参考Larsson,Kato,&Cohen,当前主题的微生物学和免疫学杂志,148,115-132(1989)及Ono,Yasunaga,Miyata,
&Ushikubo,病毒学杂志,60,589-598(1986).发明人和其他人已经报导了,有些时候,例如在肿瘤中,HERV-K的表达被激活,并且其膜蛋白可以在几种不同类型的肿瘤中以比正常组织中高得多的水平检测到。参见国际专利公开WO 2010/138803(得克萨斯大学体系董事会)、Wang-Johanning et al.,癌症研究杂志,77,Abstract nr LB-221(2017)、Johanning et al.,人内源性逆转录病毒-K的表达与基底样乳腺癌症表型密切相关.科学报告杂志,7,41960(2017)及Li et al.,临床癌症研究杂志(2017)。这种关联说明了HERV-K可以是很好的肿瘤相关抗原和癌症免疫治疗的理想靶点。HERV-K在肿瘤中表达而不存在于正常组织中,这使得脱靶效应得以最小化。
开发癌症治疗剂的一个重要考虑因素是肿瘤相关抗原的表达谱。HERV-K在癌症组织和细胞系中是具有转录活性的。发明人鉴定了肿瘤细胞系和患者肿瘤中的HERV蛋白与序列。发明人观察到在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌中和其他实体瘤中HERV特别是HERV-K序列的表达。他们也发现了HERV-K env转录本在乳腺癌中的表达与基底乳腺癌,一种侵袭性高的亚型,高度相关(Johanning et al.,人内源性逆转录病毒-K的表达与基底样乳腺癌症表型密切相关.科学报告杂志,7,41960(2017))。
多种诊断产品可作为伴随诊断供患者选择。一种策略靶向仅存在于癌细胞而非正常组织上的内源病毒抗原。发明人团队发现HERV-K RNA(env或gag)和抗HERV-K抗体出现在癌症患者的循环中。
加深对乳腺癌肿瘤微环境的了解对于设计合理有效的治疗方法非常重要。限制针对实体瘤的成功治疗的一个问题是缺少在肿瘤细胞中高表达而在正常细胞中不表达的肿瘤抗原。在发明人之前的工作中,他们表明HERV-K env蛋白通常在乳腺癌细胞表面表达。参考Wang-Johanning et al.,国家癌症研究所杂志,104,189-210(2012).上皮间质转化(EMT)在一些肿瘤中降低CD4或CD8 T细胞的浸润(Chae et al.,科学报道杂志,8,2918(2018).)。HERV-K表达被证明可诱导EMT,导致细胞运动性增加,这两者都有利于肿瘤散播。参考See Lemaitre et al.,PLoS病原体杂志,13,e1006451(2017)。HERV-K的过度表达会导致癌症产生并促进癌症进展提供了强力证据。
发明内容
发明人发现血浆和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中检查点分子水平与HERV-K抗体滴度高度相关,特别是侵袭性乳腺癌患者,例如,患有浸润性导管癌(IDC)和浸润性乳腺癌(IMC)的患者中。乳腺癌中肿瘤浸润淋巴细胞的表型和功能特征与HERV-K状态相关,而且检查点抑制和HERV-K抗体治疗相结合可以产生更好的杀伤功效。
在第一个实施方案中,本发明提供了治疗性人源化抗HERV-K抗体。本发明也提供了融合的治疗性人源化HERV-K抗体,针对CD3和CD8双特异性T细胞衔接器(BiTE),一个DNA编码的BiTE(DBiTE),或者一个抗体-药物缀合物(ADC)。过表达HERV-K的癌细胞可以是本发明的抗HERV-K人源化抗体和抗体-药物缀合物的良好靶标和良好模型,因为每个细胞可以结合更多抗体。
在第二个实施方案中,本发明提供由细菌产生的人源化抗体克隆(HUM1)。本发明也提供了由哺乳动物细胞产生的人源化抗体(hu6H5)。这些抗体都能结合从来自重组HERV-K Env表面融合蛋白(KSU)和MDA-MB-231乳腺癌细胞的裂解物产生的抗原。将哺乳动物细胞产生的hu6H5与我们的其他形式的抗HERV-K抗体进行比较。hu6H5与HERV-K抗原的结合亲和力类似于鼠抗体(m6H5)、嵌合抗体(cAb)或人源化抗体(HUM1)。hu6H5抗体诱导癌症细胞发生凋亡,抑制癌细胞增殖,并杀伤表达HERV-K抗原的癌细胞。在小鼠MDA-MB-231异种移植物中证明hu6H5抗体减少肿瘤存活力,并能显著减少癌细胞向肺和淋巴结的转移。与未接受抗体治疗的对照小鼠相比,用这些人源化抗体治疗的携带人类乳腺癌肿瘤的小鼠的存活时间更长。
在第三个实施方案中,本发明提供从乳腺癌患者生成的HERV-K env基因,其作为能诱导癌细胞增殖、肿瘤生长和向肺和淋巴结转移的原癌基因。表达HERV-K的细胞显示出包括半胱天冬酶3、半胱天冬酶9、pRB、SIRT-1和CIDEA在内的与肿瘤抑制相关的基因的表达减少。表达HERV-K的细胞显示出包括Ras、p-ERK、P-P-38和β连环蛋白在内的与肿瘤形成相关的基因的表达增加。
在第四个实施方案中,本发明提供针对T细胞CD3或CD8和肿瘤相关抗原HERV-K的BiTEs。发明人生产此类BiTE,其包含靶向CD3或CD8的抗体和靶向HERV-K的抗体(VL-VH6H5scFv---VH-VLhuCD3或CD8+c-myc+FLAG)或(VL-VH hu6H5scFv---VH-VLhuCD3或huCD8+c-myc+FLAG)。FLAG标签是被抗体识别的肽(DYKDDDDK)(SEQ ID NO:38),和Myc标签是被抗体识别的短肽(EQKLISEEDL)(SEQ ID NO:39)。
在第五个实施方案中,本发明提供表达慢病毒CAR表达载体的T细胞,该表达载体携带人源化或全人HERV-K scFv。如附图1所示,这些T细胞可有效裂解并杀死多种癌症的肿瘤细胞。慢病毒载体表达的人源化K-CARs是泛癌种CAR-Ts。
在第六个实施方案中,本发明提供人源化单链可变片段(scFv)抗体。该抗体能结合从重组HERV-K Env表面融合蛋白(KSU)和来自MDA-MB-231乳腺癌细胞的裂解物产生的抗原。可将由该人源化scFv产生的CAR克隆入慢病毒载体。该重组载体可与疗法组合使用,这些疗法包括但不限于K-CAR T细胞加检查点抑制剂、促炎细胞因子如白介素IL-12和IL-18、溶瘤病毒和激酶抑制剂。激酶抑制剂包括但不限于p-RSK和p-ERK。
在第七个实施方案中,本发明提供在许多情况下与血浆肿瘤标志物CK的染色重叠的HERV-K染色。HERV-K可以是CTC标志物以及HERV-K抗体疗法的靶标。
在第八个实施方案中,本发明提供作为干细胞标志物的HERV-K。靶向HERV-K可通过减慢或阻止癌症干细胞的生长来阻断肿瘤进展。用循环治疗性抗体或其他疗法靶向HERV-K也可以杀伤CTCs并阻止这些循环细胞转移到远端位点。
在第九个实施方案中,本发明提供用药剂增强HERV-K过表达促使癌细胞增加靶标的产生使癌细胞对靶向疗法更敏感以包括靶向免疫疗法,所述药剂通过先天性免疫应答(如Poly I:C处理)或LTR低甲基化(如通过5-Aza)诱导HERV-K表达。
在第十个实施方案中,本发明改良了在SCID/beige小鼠中的体内富集技术(IVE:增强约20倍),这允许快速扩增和B细胞激活。该改良技术可产生许多抗原特异性浆母细胞。对于携带具有更高抗体滴度的癌症的供体,该改良技术使用用人源化小鼠(HM)或人肿瘤小鼠(HTM)代替标准的SCID/beige小鼠的方案。对于没有癌症和没有记忆B细胞的正常供体,该改良技术使用经过修改的方案:用细胞因子混合物(cytokine cocktail)在第1、7和14天处理小鼠,并在第14和21天用抗原加强小鼠。从小鼠收集血清并通过ELISA测试结合亲和力。在检测到抗体滴度增加后,采集、分析脾脏并用其制备杂交瘤。在使用体内富集方案的小鼠中检测到更高的抗体滴度。
在第十一个实施方案中,本发明提供确定不仅产生抗体还能结合抗原并杀伤癌细胞的细胞的方法。该方法可有效刺激并扩增CD40-B细胞以高纯度(>90%)至大数并诱导其抗体的分泌。
在第十二个实施方案中,本发明提供处理的B细胞的后孵育方法。洗涤盖玻片并用荧光抗人IgG抗体标记,再使用微雕刻技术阅读以揭示对应于单个B细胞分泌的抗原特异性抗体的离散点。
在第十三个实施方案中,本发明提供平台的开发以确定微孔板中每个细胞的结合动力学和细胞与细胞相互作用。
在第十四个实施方案中,本发明引人注目地提供显著增强乳腺癌患者的血浆中的六种循环免疫检查点蛋白的表达。本发明还提供患者在手术后6个月或18个月相比于手术前免疫检查点蛋白水平的显著降低。可溶免疫检查点蛋白分子水平与肿瘤中HERV-K表达诱导的HERV-K抗体滴度发生正相关。HERV-K抗体滴度可影响乳腺癌中免疫检查点蛋白水平。因此,HERV-K的表达可控制乳腺癌患者的免疫应答。
在另一方面,这些发现共同表明HERV-K的免疫抑制结构域(ISD)是癌细胞上尚未被识别的免疫检查点,类似于PD-L1免疫检查点。在第十五个实施方案中,本发明提供通过HERV-K的免疫检查点阻断ISD,包括但不限于靶向HERV-K的ISD的单克隆抗体和药物。是癌症免疫调节剂疗法,其允许T细胞继续工作并释放针对癌症的免疫应答并增强现有应答,以促进消除癌细胞。
在第十六个实施方案中,本发明提供靶向HERV-K的人源化和全人(hTab)抗体。这些抗体增强检查点阻断性抗体的治疗功效。有效的组合癌症疗法包括但不限于以下的组合:
(a)HERV-K人源化或hTAb(1.5mg/kg)、(b)K-CAR、(c)K-BiATE、(d)HERV-K shRNA或CRISPR/Cas9基因组编辑技术以敲低HERV-K基因表达、(e)或预防性或治疗性HERV-K疫苗,该疫苗包括全长和截短的HERV-K Env蛋白和HERV-K Env肽。有效的组合癌症疗法包括与包括但不限于以下因素组合的全长和截短的HERV-KEnv蛋白和HERV-K Env肽:(a)抗ICP抗体,(b)癌症化疗,(c)5-氮杂胞苷、5-氮杂-2’-脱氧胞苷或其他表观遗传调节剂,如DNA甲基转移酶抑制剂(DNMTi)和组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi),(d)EMT抑制剂,(e)细胞迁移或侵袭的抑制剂、(f)诱导S或G2期细胞周期阻滞、(g)PI3K/AKT/mTOR或MAPK/ERK信号传导途径的抑制剂,或(f)信号转导至HIF1α。
在第十七个实施方案中,本发明提供靶向HERV-K的人源化抗体,其可用于递送药物进入癌细胞和肿瘤的抗体-药物缀合物。
在第十八个实施方案中,本发明提供可用于肿瘤成像的靶向HERV-K的抗体。
在第十九个实施方案中,本发明提供使用hu6H5 scFv的新CAR。
在第二十个实施方案中,本发明提供使用hu6H5 scFv的新BITE,其包括CD3BiTEs和CD8BiTEs。
附图说明
图1显示了携带人源化或全人HERV-K scFv的慢病毒CAR表达载体(具有psPAX2和pMD2g的pWPT-GFP载体)。
图2显示了用于比较嵌合6H5、HUM1(由细菌产生)和新hu6H5(由哺乳动物细胞产生的新人源化抗HERV-K抗体)与HERV-K env靶标的结合的ELISA。1000表1:1000稀释;2000表1:2000稀释;4000表1:4000稀释;8000表1:8000稀释。
图3显示了用于确定对用hu6H5处理的细胞的增殖抑制的MTS测定。在用6H5抗体(人或小鼠)处理的细胞中观察到细胞增殖显着减少。相较与不表达较高HERV-K水平的231C细胞,表达较高水平HERV-K的231K细胞中的抑制更为显着。231K细胞是通过逆转录病毒载体用HERV-K全长病毒包膜基因蛋白稳定转导的MDA-MB-231人乳腺癌细胞,并与对照非转导细胞(231C)进行比较,评估细胞增殖、细胞杀伤和细胞凋亡。
图4显示了在存在MDA-MB-231luc细胞的情况下,CD3BiTE介导的IFNγ从正常供体外周血单个核细胞(PBMCs)分泌。每个孔中接种5x10-3个细胞/孔在96孔板中。来自ND#230341(阳性对照)和四个正常供体的PBMCs被用作效应细胞。效应细胞/肿瘤细胞的比例为10/1。使用了140μg/ml的CD3BiTE。在板设置后72小时,收集上清液进行IFNγ测定。
图5是一组柱状图。图5A显示了用PBMC加0ng/ml K3Bi或PBMC加100ng/ml K3Bi处理的效应细胞,通过LDH释放测定证明了癌细胞的明显杀伤作用。图5B显示了在用=PBMC加100ng/ml K3Bi处理的三种乳腺癌细胞系的上清液中,IFNγ分泌显著增加。使用未处理细胞、仅PBMC或仅BiTE作为对照。
图6是一组线图,显示了靶向HERV-K的双特异性T细胞诱导剂(BiTE)的疗效。NOD/SCID/IL-2Rγnull(NSG)小鼠在第0天接种MDA-MB-231HERV-K阳性乳腺癌细胞,并在指定的日期用外周血单个核细胞或BiTE进行剂量给药。通过使用卡钳测量肿瘤体积来计算整个实验中的肿瘤体积。
具体实施方式
本发明的实用性
本说明书提供了生成人源化抗HERV-K抗体的方法。hu6H5的抗肿瘤效果在体外和体内得到了证明。
本发明提供用于治疗患有癌症的患者的方法。在第二十实施方案中,本发明提供治疗癌症的方法,其包括施用治疗性人源化抗HERV-K抗体或其由CAR、BiTE或抗体-药物缀合物组成的融合物,并任选地与一种或多种免疫检查点阻断剂组合。这些治疗剂中的每一种都单独靶向免疫系统。在第二十一个实施方案中,本发明的方法抑制转移。在第二十二个实施方案中,本发明的方法减少肿瘤尺寸。在第二十三个实施方案中,本发明的方法抑制肿瘤细胞的生长。在第二十四个实施方案中,本发明的方法检测癌症和癌症转移。
定义
为了方便,下面列出说明书、实施例和随附权利要求中使用的一些术语和短语的含义。除非另有说明或上下文中暗示,这些术语和短语具有以下含义。这些定义是为了帮助描述特定的实施方案,而不意欲限制要求保护的发明。除非另有定义,否则所有技术和科学术语具有与分子生物学领域的普通技术人员普遍理解相同的含义。对于本领域术语的含义与本说明书中提供的定义之间的任何明显差异,应以本说明书中提供的含义为准。
“5-Aza”具有生物技术领域公认的5-氮杂胞苷的含义。
“6H5”具有本实验室中开发的鼠抗HERV-K单克隆抗体的生物技术领域公认的含义。
“约”具有生物技术领域公认的含义,并且根据使用该术语的上下文而变化。如果在给出其使用上下文的情况下,分子生物学领域的普通技术人员不清楚该术语的用法,则“约”将表示高达该值的正负10%。
“抗体-药物缀合物(ADC)”具有生物技术领域公认的通过将小分子抗癌药物或另一治疗剂用永久或不稳定的接头附接至抗体制备的高效生物药物的含义。该抗体靶向仅在靶细胞上发现的特定抗原。
“B7家族”具有生物技术领域公认的未定义受体的抑制性配体的含义。B7家族涵盖B7-H3和B7-H4,两者均在肿瘤细胞和肿瘤浸润细胞中上调。可分别在GenBank注册号Q5ZPR3和AAZ17406下找到完整的hB7-H3和hB7-H4序列。
“BiTE”有生物技术领域公认的双特异性T细胞衔接器的含义。BiTE表示具有来自两个抗体的两个连接的scFvs的重组双特异性蛋白,一个抗体靶向T细胞上的细胞表面分子(例如,CD3ε)而另一个抗体靶向恶性细胞表面的抗原。这两个scFv通过短柔性接头连接。术语“编码BiTE的DNA(DBiTE)”包含可在体内表达的任何编码BiTE的DNA质粒。
“癌症抗原”或“肿瘤抗原”具有以下术语的生物技术领域公认的含义:(i)肿瘤特异性抗原,(ii)肿瘤相关抗原,(iii)表达肿瘤特异性抗原的细胞,(iv)表达肿瘤相关抗原的细胞,(v)肿瘤上的胚胎抗原,(vi)自体肿瘤细胞,(vii)肿瘤特异性膜抗原,(viii)肿瘤相关膜抗原,(ix)生长因子受体,(x)生长因子配体,和(xi)与癌症相关的任何类型的抗原或抗原呈递细胞或材料。
“联合疗法”具有生物技术领域公认的含义,包括在会提供组合的有益效果的方案中以顺序方式施用每种药剂或疗法,并以基本上同时的方式共同施用这些剂或疗法,如以具有固定比例的这些活性剂的单个胶囊或以用于每种药剂的多个单独的胶囊施用。联合疗法还包含组合,该组合中单独的成分可以在不同的时间和/或通过不同的途径施用,但是这些成分以组合发挥作用以通过联合疗法的每种剂或肿瘤治疗方法的共同作用或药代动力学和药效学效应提供有益效果。
“CTL”有生物技术领域公认的溶细胞性T细胞或细胞毒性T细胞的含义。
“细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)”有生物技术领域公认的含义,其为T细胞表面分子并是免疫球蛋白超家族中的一员。该蛋白通过与CD80和CD86结合下调免疫系统。术语“CTLA-4”包含人CTLA-4(hCTLA-4)、hCTLA-4的变体、异构体和物种同系物和与hCTLA-4具有至少一个共同表位的类似物。可在GenBank注册号P16410下找到完整的hCTLA-4序列。
“DCIS”有在生物技术领域公认为导管内癌原位病变的含义。
“衍生自”指定的多核苷酸或蛋白有生物技术领域公认的多肽的起源的含义。优选的,衍生自特定序列的多肽或氨基酸序列具有与该特定序列或其部分基本相同的氨基酸序列,其中该部分由至少10-20个氨基酸组成,优选至少20-30个氨基酸,更优选至少30-50个氨基酸,或分子生物学领域普通技术人员可以以其他方式将该多肽或氨基酸序列识别为起源于该特定序列。衍生自另一肽的多肽相对于起始多肽可具有一个或多个突变,例如,一个或多个氨基酸残基被另一氨基酸残基取代,或具有一个或多个氨基酸残基插入或缺失。多肽可包含不是天然存在的氨基酸序列。此类变体与起始分子的序列同一性或相似性必须低于100%。在一些实施方案中,通过核苷酸序列编码该肽。本发明的核苷酸序列在一些应用中是有用的,包括克隆、基因疗法、蛋白表达和纯化、引入突变、在有需要的宿主中的DNA疫苗接种、用于例如被动免疫的抗体生成、PCR、引物和探针生成等。
“效应细胞”有生物技术领域公认的涉及免疫应答的效应阶段的免疫细胞的含义,效应阶段与免疫应答的认知和激活阶段相反。示例性免疫细胞包含骨髓或淋巴来源的细胞,例如淋巴细胞(如B细胞和T细胞,包括溶细胞性T细胞(CTL))、杀伤细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、多形核细胞,如中性粒细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。一些效应细胞表达特定Fc受体(FcRs)并执行特定免疫功能。
“Env”有生物技术领域公认的病毒包膜蛋白的含义。“Env”有生物技术领域公认的病毒包膜RNA的含有。
“表位”有生物技术领域公认的能特异性结合抗体的蛋白决定簇的含义。表位通常由表面分子如氨基酸或糖侧链组成并通常有特定三维结构特征和特定电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于因变性溶剂的存在下,与前者的结合会消失而与后者的不会。表位可包含直接涉及结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫优势组分)和其他氨基酸残基,其不直接涉及结合,如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基(该氨基酸残基在特异性抗原结合肽的足迹内)。
“FACS”有生物技术领域公认的荧光激活的细胞分选的含义。
“Framework region”有生物技术领域公认的为抗体的可变区域(Fab)的一个分部的含义。抗体的可变区域由七个氨基酸区域组成,其中四个是框架区域,另外三个是超变区域。
“HERV”有生物技术领域公认的人内源性逆转录病毒的含义,“HERV-K”有生物技术领域公认的内源逆转录病毒的HERV-K家族的含义。“人内源逆转录病毒(HERV)”是逆转录病毒,其以整合到所有正常细胞的基因组中的前病毒DNA的形式存在,并通过孟德尔遗传模式传播。“HERV-X”,其中“X”是英文字母,具有生物技术领域公认的HERV的其他家族的生物技术领域公认的含义。
“HERV-K”有生物技术领域公认的内源性逆转录病毒的HERV-K家族的含义。HERV-K在许多肿瘤类型中表达,包括但不限于黑色素瘤(Wang-Johanning et al.(2003),乳腺癌(Wang-Johanning et al.(2003),卵巢癌和畸胎癌。此外,感染的细胞,包括那些被HIV感染的细胞,也表达HERV-K。这提供了一个具有吸引力的机会,一种靶向HERV-K的CAR设计可用于治疗多种癌症和感染。
“HM”有生物技术领域公认的人源化小鼠的含义。
“HTM”有生物技术领域公认的人肿瘤小鼠的含义。
hTAb has the biotechnological art-recognized meaning of a fully humantumor antibody.
“人内源逆转录病毒-K”、“HERV-K”、“HERV”、“人内源性逆转录病毒”、“内源性逆转录病毒”和“ERV”包含内源性逆转录病毒的任何变体、异构体和物种同系物,该内源性逆转录病毒由细胞天然表达或在转染内源性逆转录病毒基因的细胞中表达。
“ICP”有生物技术领域公认的免疫检查点的含义。
“IDC”有生物技术领域公认的浸润性导管癌的含义。
“IHC”有生物技术领域公认的免疫组化的含义。
“ILC”具有生物技术领域公认的浸润性小叶癌的含义。
“免疫细胞”是一种造血细胞并在免疫应答中发挥作用。免疫细胞包含淋巴细胞(例如,B细胞和T细胞)、天然杀伤细胞和髓系细胞(例如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞)。
“免疫检查点阻断剂”具有生物技术领域公认的完全或部分减少、已知、干扰或调节一种或多种检查点蛋白的分子的含义。在一些实施方案中,该免疫检查点阻断剂阻止与免疫检查点相关的抑制信号。在一些实施方案中,该免疫检查点阻断剂是破坏与免疫检查点相关的抑制信号传导的抗体或其片段。在一些实施方案中,该免疫检查点阻断剂是破坏抑制信号传导的小分子。在一些实施方案中,该免疫检查点阻断剂是阻止检查点阻断蛋白之间相互作用的抗体、其片段、或抗体模拟物,例如阻止PD-1和PD-L1之间相互作用抗体或其片段。在一些实施方案中,该免疫检查点阻断剂是阻止CTLA-4和CD80或CD86之间相互作用的抗体或其片段。在一些实施方案中,该免疫检查点阻断剂是阻止LAG3及其配体之间或TIM-3及其配体之间相互作用的抗体或其片段。该检查点阻断剂也可以分子的可溶形式存在,例如,可溶的PD-L1或PD-L1融合物。
“免疫检查点”有生物技术领域公认的调节T细胞受体识别抗原的幅度和质量的共刺激和抑制信号的含义。在一些实施方案中,免疫检查点是抑制信号。在一些实施例中,抑制信号是PD-1和PD-L1之间的相互作用。在一些实施例中,抑制性信号是CTLA-4和CD80或CD86之间的相互作用,以替代CD28的结合。在一些实施例中,抑制信号是LAG3和MHC-II分子之间的相互作用。在一些实施例中,抑制信号是TIM3和galectin 9之间的相互作用。
“体内”有生物技术领域公认的发生在活生物体内过程的含义。如本文所用的术语哺乳动物或受试者或患者包含人和非人,包含但不限于人、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、啮齿动物、牛科动物、马科动物和猪。
“抑制生长”(例如,指细胞,如肿瘤细胞)有生物技术领域公认的含义,包含相比于未接触HERV-K特异性治疗剂的相同细胞的生长,接触HERV-K特异性治疗剂的细胞的生长任何可测量的降低,例如抑制细胞培养的生长至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%或100%。此类细胞生长的降低可以通过抗HERV-K剂单独或组合发挥的多种机制(例如凋亡)发生。
“ISD”具有生物技术领域公认的免疫抑制结构域的含义。
“K-CAR”或“HERV-KenvCAR”有生物技术领域公认的HERV-K包膜基因(表面或跨膜)嵌合抗原受体(CAR)基因构建体的含义。术语HERV-KenvCAR-T细胞或K-CAR-T细胞有生物技术领域公认的转导K-CAR或HERV-KenvCAR慢病毒或睡美人表达系统的T细胞的含义。“KD”具有生物技术领域公认的敲低的含义,其方式通常为shRNA。
“KSU”具有生物技术领域公认的HERV-K包膜表面融合蛋白的含义。
“KTM”具有生物技术领域公认的HERV-KEnv跨膜蛋白的含义。
“连接的”、“融合的”或“融合”互换使用。这些术语指通过任何方式(包括化学缀合或重组方式)将两个以上的元件或组分或结构域连接在一起。本领域已知化学缀合(例如,使用异种双功能交联剂)的方法。
“接头”或“接头结构域”有生物技术领域公认的在线性序列中连接两个或多个结构域(例如靶向HERV-K的人源化抗体和靶向T细胞蛋白的抗体)的序列的含义。适于用于本文公开的方法的构建体可使用一种或多种接头结构域,如多肽接头。
“淋巴激活基因-3(LAG3)”是通过与MHC II类分子结合与淋巴细胞活性的抑制相关的抑制性受体。该受体增强Treg细胞的功能并抑制CD8+效应T细胞功能。如本文所用,术语“LAG3”包含人LAG3(hLAG3)、hLAG3的变体、异构体和物种同系物和与hLAG3具有至少一个共同表位的类似物。可在GenBank注册号P18627下找到完整的hLAG3序列。
“乳腺球”有生物技术领域公认的在非贴壁非分化条件下培养乳房或乳腺细胞形成的离散的细胞簇的含义。
MDA-MB-231 pLVXC或231-C指的是转导了pLVXC的MDA-MB-231细胞。
MDA-MB-231 pLVXK或231-K指的是转导了pLVXK的MDA-MB-231细胞。
“核酸”有生物技术领域公认的单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物的含义。除非另有限制,涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸,这些类似物具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另有指示,特定核酸序列也隐含地包涵其保守修饰的变体(例如,简并密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。具体的,可通过生成序列来实现简并密码子取代,该序列中用混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代序列中一个或多个选定的(或全部)密码子的第三位。参见Batzeret al.,Nucleic Acid Res.,19,5081(1991);Ohtsuka et al.,Biol.Chem.,260,2605-2608(1985);and Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes,8,91-98(1994).。对于精氨酸和亮氨酸,第二个碱基的修饰也可以是保守的。术语核酸可与基因、cDNA和基因编码的mRNA互换。
“PBMC”具有生物技术领域公认的外周血单个核细胞的含义。
“PDX”具有生物技术领域公认的患者衍生异种移植物的含义。PDX通常通过移植人肿瘤细胞或肿瘤组织进入人癌症的免疫缺陷小鼠模型产生。
“同一性百分比”,在两个或多个核酸或多肽序列的上下文中,指两个或多个序列或子序列在为了获得最大对应性进行比较和比对时具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基,使用下述序列比较算法之一(例如BLASTP和BLASTN或技术人员可用的其他算法)或通过目视检查测量。取决于应用,同一性百分比可以存在于被比较的序列的区域中,例如,在功能结构域中,或存在于被比较的两个序列的全长中。为了序列对比,通常一个序列作为参考序列,其与测试序列进行比较。当使用序列比较算法时,将测试和参考序列输入计算机,指定子序列坐标,指定序列算法程序参数。序列比较算法之后基于制定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。可以进行用于比较的序列的最佳比对,例如,通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.,2,482(1981)的局部同源性算法,通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.,48,443(1970)的同源比对算法,通过Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,85,2444(1988)的相似性搜索方法,通过这些算法的计算机化实现(GAP,BESHERV-KIT,FASTA,and HERV-KASTA in the Wisconsin GeneticsSoftwarePackage,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI,USA),或通过目视检查。适合确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一个实例是BLAST算法,Altschulet al.,J.Mol.Biol.215,403-410(1990)中描述了该算法。用于进行BLAST分析的软件可通过生物技术信息网站国家中心公开获取。“药学上可接受的”通常表示在合理的医学判断范围内适用于与人类和动物的组织、器官和/或体液接触的那些化合物、材料、组合物和/或剂型,没有过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症,与合理的收益/风险比相称。
pLVXC有生物技术领域公认的控制表达载体的含义。
pLVXK有生物技术领域公认的HERV-K表达载体的含义。
“多肽接头”有生物技术领域公认的在多肽链的线性氨基酸序列中连接两个或多个结构域的肽或多肽序列(例如,合成的肽或多肽序列)的含义。此类多肽接头可为多肽分子提供柔性。该多肽接头可用于连接(例如,基因融合)一个或多个Fc结构域和/或药物。
“程序性死亡配体-1(PD-L1)”是PD-1的两个表面糖蛋白配体之一(另一个是PD-L2),其在与PD-1结合后下调T细胞激活和细胞因子分泌。如本文所用,术语PD-L1包含人PD-L1(hPD-L1)、hPD-L1的变体、异构体和物种同系物和与hPD-L1具有至少一个共同表位的类似物。可在GenBank注册号Q9NZQ7下找到完整的hPD-L1序列。
“程序性死亡-1(PD-1)”受体具有生物技术领域公认的术语CD28家族的免疫抑制体的含义。PD-1主要在体内之前激活的T细胞上表达,并与两种配体,PD-L1和PD-L2结合。如本文所用,术语“PD-1”包含人PD-1(hPD-1)、hPD-1的变体、异构体和物种同系物和与hPD-1具有至少一个共同表位的类似物。可在GenBank注册号AAC51773下找到完整的hPD-1序列。
“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)有生物技术领域公认的引入表达载体的细胞的含义。此类术语不仅指特定种类的细胞,也指此类细胞的后代。由于突变或环境影响,后代可能发生某些修饰,此类后代实际上可能与亲代细胞不同,但仍包含在宿主细胞的范围内。重组宿主细胞包含,例如转染瘤,如CHO细胞、HEK293细胞、NS/0细胞和淋巴细胞。“scFv”具有生物技术领域公认的单链可变片段的含义。
“SU”有生物技术领域公认的HERV-K表面蛋白的含义。
“足够的量”或“足以……的量”表示足以期望的效果的量,例如足以减少肿瘤大小的量。关于由两种或多种单独组分产生的效应的“协同作用”或“协同效应”具有生物技术领域公认的现象的含义,该现象中这些组分产生的总效应在组合使用时每个组件单独作用的个体效应的总和。
“T细胞”有生物技术领域公认的CD4+T细胞或CD8+T细胞的含义。术语T细胞包含TH1细胞、TH2细胞和TH17细胞。
“T细胞膜蛋白-3(TIM3)”是涉及通过抑制TH1细胞应答抑制淋巴细胞活性的抑制性受体。TIM3的配体是半乳糖凝集素9,其在各种类型的癌症中上调。如本文所用,术语“TIM3”包含人TIM3(hTIM3)、hTIM3的变体、异构体和物种同系物和与hTIM3具有至少一个共同表位的类似物。可在GenBank注册号Q8TDQo下找到完整的hTIM3序列。
“治疗有效量”是有效改善疾病的症状的量。治疗有效量可以是“预防性治疗有效量”,因为预防可以认为是治疗。
“TM”具有生物技术领域公认的HERV-K跨膜蛋白的含义。
“TNBC”具有生物技术领域公认的三阴性乳腺癌的含义。
“转基因非人动物”具有生物技术领域公认的非人动物的含义,其基因组包含一个或多个人重链和/或轻链转基因或转染色体(整合的或非整合的进入动物的天然基因组DNA中)并且可以完全表达人抗体。转基因小鼠可以具有人轻链转基因和人重链转基因或人重链转染色体,使该小鼠在用HERV-K抗原和/或表达HERV-K的细胞免疫时产生人抗HERV-K抗体。人重链转基因可整合到小鼠的染色体DNA中,如转基因小鼠的情况,例如HUMab小鼠,或人重链转基因可以在染色体外维持,如WO02/43478中描述的转染色体KM小鼠的情况。此类转基因和转染色体小鼠(在本文中共同指转基因小)通过进行V-D-J重组和同种型转换,可产生针对给定抗原的多种同种型人mAb(如IgG、IgA、IgM、IgD或IgE)。通过引入编码特定抗体的基因,例如通过将基因与在动物乳汁中表达的基因可操作地连接,也可使用转基因非人动物产生针对特定抗原的抗体。
“治疗”表示出于缓解、改善、阻止或根除(治愈)疾病状态的症状的目的,施用有效量的本发明的治疗活性化合物。
“载体”具有生物技术领域公认的能运输与其连接的另一核酸的核酸分子的含义。一种类型的载体是质粒,其具有生物技术领域公认的可以将额外的DNA片段连接至其中的环状双链DNA环的含义。另一类型的载体是病毒载体,其中额外的DNA片段可连接至病毒基因组中。一些载体能够在它们被引入其中的宿主细胞中自主复制(例如有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(如非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后可整合入宿主细胞的基因组中,从而与宿主基因组一起复制。一些载体可以调节与其有效连接的基因的表达。本文中称此类载体为重组表达载体(或简称为表达载体)。用于重组DNA技术的表达载体常常为质粒形式。在本说明书中,术语质粒和载体可互换使用,因为质粒是最常用的载体形式。然而,本发明意欲包含此类表达载体的其他形式,如病毒载体(如复制缺陷的逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒),其发挥相同的功能。
除非另有定义,本申请中使用的科学技术术语应按照具有普通生物医学技能的人所普遍理解的含义解释。本发明不限于此处描述的特定方法、方案、试剂等,并且可以变化。
本文所描述的内容不涉及克隆人的过程、修改人类生殖系基因身份的方法、将人类胚胎用于工业或商业目的的用途,以及修改动物基因身份的程序,可能会给动物带来痛苦,而对人或动物没有实质性医疗效益,以及由此类过程产生的动物。
癌症治疗型抗体
癌症治疗型抗体,例如(trastuzumab),(bevacizumab),(cetuximab)等的研发,在全球范围内挽救了数以万计的生命。特别的,使用曲妥珠单抗治疗HER-2阳性转移乳腺或卵巢癌显著改变了患者的治疗结果。抗体疗法提供了相对于小分子药物的不同优势,即:(i)确定的作用机理;(ii)更高的特异性和更少的脱靶效应;和(iii)可预测的安全性和毒理学。随着抗HER2和抗EGFR单克隆抗体的广泛研究证明,仅有少数几种抗体,尽管有成千上万种抗体被鉴定为具有与其分子靶标高亲和力结合的能力,但只有少数几种具备临床有效的癌细胞杀伤所需的性质。治疗性抗体的功效主要来自它们引发强效肿瘤细胞毒性的能力,可以通过直接诱导靶细胞凋亡,也可以通过效应细胞介导的功能,如抗体依赖的细胞介导细胞毒作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒作用(CDC)。
分离的抗体的主要方法是:(i)体外筛选来自免疫动物的文库或使用噬菌体或微生物展示的合成文库的43-45,和(ii)在B细胞永生化或克隆后分离的抗体46-48。这些方法存在以下一个或两个缺点,严重限制了可分离的独特抗体的数量:(i)需要进行广泛的筛选以分离即使是少量的高亲和力抗体和(ii)这些抗体注射入人体后产生的免疫应答。因此,无论用于筛选/分离治疗性单克隆抗体(mAb)的方法如何,从发现到临床的转化率是低效且费力的。加速治疗性mAb获得批准的一项进展是通过互补决定区(CDR)接枝技术生成人源化抗体。在CDR接枝中,将非人抗体CDR序列移植入人框架序列以维持靶向特异性。
人源化抗体和抗体-药物缀合物(ADC)药物组合物
因为每个细胞可结合更多抗体,过表达HERV-K的癌症细胞可以是本发明的抗HERV-K人源化抗体和抗体-药物缀合物的特别好的靶标。因此,在二十五实施方案中,将用本发明的抗HERV-K人源化抗体或抗体-药物缀合物治疗的癌症患者是以下患者,例如在其肿瘤细胞中诊断出有HERV-K过表达的乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌或结直肠癌患者。
在纯化抗HERV-K人源化抗体或抗体-药物缀合物后,可以使用公知的药物载体或赋形剂将它们配制成药物组合物。
药物组合物可以根据常规技术(如Remington:The Science and PracticeofPharmacy,19th Edition,Gennaro,Ed.(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1995)中公开的那些)与药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其他已知的佐剂和赋形剂一起配制。
药学上可接受的载体或稀释剂以及其他已知的佐剂和赋形剂应适于本发明的人源化抗体或抗体-药物缀合物以及所选的使用模式。药物组合物的载体和其他组分的适用性是基于对本发明所选化合物或药物组合物与抗原结合的所需生物学特性没有显著负面影响(例如,小于实质性影响(10%或更少的相对抑制,5%或更少的相对抑制等))。
本发明的药物组合物还可包含稀释剂、填充剂、盐、缓冲液、去污剂(例如,非离子去污剂,如Tween-20或Tween-80)、稳定剂(例如,糖或无蛋白氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、增溶剂和/或适合包含在药物组合物中的其他材料。
本发明的药物组合物中人源化抗体或抗体-药物缀合物的实际剂量水平可以变化以获得对于特定患者、组合物和施用方式有效实现所需治疗应答而不会对患者产生毒性的人源化抗体或抗体-药物缀合物的量。所选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素,包括所用的本发明特定组合物的活性、施用途径、施用时间、所用特定化合物的排泄率、治疗持续时间、其他药物、化合物和/或与所用特定组合物组合使用的材料、接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、整体健康和既往病史,以及医学领域公知的类似因素。
该药物组合物可以任何合适的途径和模式施用。施用本发明的人源化抗体或抗体-药物缀合物的合适途径是本领域公知的并且可以由分子生物学领域的普通技术人员选择。
在第二十六个实施方案中,本发明的药物组合物是胃肠外施用的。
如本文所用的短语胃肠外施用和胃肠外给药表示肠内和局部施用以外的施用模式,常常通过注射,并包含表皮、静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、肌腱内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、脊柱内、颅内、胸腔内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
在第二十七个实施方案中,药物组合物通过静脉内或皮下注射或输注来施用。
药学上可接受的载体包含任何和所有合适的溶剂、分散介质、涂料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂、抗氧化剂和延缓吸收剂等与本发明的人源化抗体或抗体-药物缀合物生理相容的试剂。
可用于本发明的药物组合物的合适的水性和非水性的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇、右旋糖、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油,如橄榄油、玉米油、花生油、棉籽油和芝麻油、羧甲基纤维素胶体溶液、黄芪胶和可注射的有机酯,如油酸乙酯,和/或各种缓冲剂。其他载体在制药领域是公知的。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。本领域公知此类媒介和试剂用于药物活性物质的用途。除非任何常规介质或试剂与本发明的抗HERV-K人源化抗体或抗体-药物缀合物不相容,否则考虑其在本发明的药物组合物中的用途。
可以通过例如,使用涂层材料(如卵磷脂)来维持分散体所需的粒径和使用表面活性剂来维持适当的流动性。
本发明的药物组合物还可包含药学上可接受的抗氧化剂,例如(1)水溶性抗氧化剂,如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等;(2)油溶性抗氧化剂,如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等;和(3)金属螯合剂,如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
本发明的药物组合物还可包含等渗剂,如组合物中的糖、多元醇,如甘露醇、山梨糖醇、甘油或氯化钠。
本发明的药物组合物还可含有一种或多种所选施用途径的佐剂,如可延长该药物组合物的保质期或有效性的防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、防腐剂或缓冲剂。本发明的抗HERV-K人源化抗体或抗体-药物缀合物可与避免化合物快速释放的载体制备,如控释制剂,包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统。此类载体可包含明胶、单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、生物可降解的,生物相容性聚合物,如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸,单独或与蜡一起,或分子生物学领域公知的其他材料。分子生物学领域技术人员通常知晓制备此类制剂的方法。参见例如,缓释和控释药物递送系统J.R.Robinson,ed.(Marcel Dekker,Inc.,New York,1978)。
在第二十八个实施方案中,可配制本发明的抗HERV-K人源化抗体或抗体-药物缀合物以确保在体内适当分布。用于胃肠外施用的药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。本领域公知此类介质和试剂用于药物活性物质的用途。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容,否则考虑其在本发明的药物组合物中的用途。补充活性化合物也可掺入该组合物。
用于注射的药物组合物通常必须在制造和储存条件下保持无菌和稳定。该组合物可以制成溶液、微乳液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是含水或非水溶剂或分散介质,例如水、乙醇、聚醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适当混合物、橄榄油等植物油和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。可以通过使用表面活性剂和保持所需的分散粒子大小来维持适当的流动性,例如,通过涂层如卵磷脂来保持适当的流动性。通常,最好包括等渗剂,例如糖类、多元醇(如甘油、甘露醇、山梨醇)或氯化钠。延长注射组合物的吸收时间可以通过在组合物中加入延迟吸收的剂,例如单硬脂酸盐和明胶来实现。可通过将所需量的抗HERV-K人源化抗体或抗体-药物缀合物与适量的溶剂以及一个或多个成分(例如上述列举的成分)组合在一起,然后进行灭菌微滤来制备无菌注射溶液。通常,分散体是通过将抗HERV-K人源化抗体或抗体-药物缀合物溶解于含有基本分散介质和所需其他成分的无菌载体中制备的,例如上述列举的成分。用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂的例子,包括真空干燥和冷冻干燥(冻干)的方法,从先前经无菌过滤的溶液中产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。
无菌注射溶液可以通过在适当的溶剂中按所需量加入抗HERV-K人源化抗体或抗体-药物缀合物,以及上述列举的一个或多个成分,根据需要进行制备,然后进行灭菌微滤来制备。通常,分散体是通过将抗HERV-K人源化抗体或抗体-药物缀合物溶解于含有基本分散介质和上述列举的所需其他成分的无菌载体中制备的。用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂的例子包括真空干燥和冷冻干燥(冻干)的方法,从先前经无菌过滤的溶液中产生抗HERV-K人源化抗体或抗体-药物缀合物的粉末,以及任何额外所需的成分。
本发明的药物组合物可包含本发明的抗HERV-K人源化抗体或抗体-药物缀合物或本发明的抗HERV-K人源化抗体或抗体-药物缀合物的组合。
抗HERV-K人源化抗体或抗体-药物缀合物的有效剂量和给药方案取决于所治疗的疾病或病症并可由分子生物学领域的技术人员确定。本发明的化合物的治疗有效量的示例性非限制范围是约0.1-100mg/kg。本发明的抗HERV-K人源化抗体或抗体-药物缀合物的治疗有效量的示例性非限制范围是约0.02-30mg/kg,特别是本文公开的抗体011、098、114或111。关于治疗有效量的进一步指导可由Hendrikx等人提供,肿瘤学中单克隆抗体的固定剂量,Oncologist,22(10),1212–1221(October 2017)和Lu et al.,治疗性抗体用于治疗疾病的发展.Journal of Biomedical Science,v27,文章编号1(January 2,2020)。
在医学领域具有普通技术的医师可简单确定并规定所述药物组合物的有效量。例如,医师可以开始以低于实现所需治疗效果的水平开始药物组合物中使用的抗HERV-K人源化抗体或抗体-药物缀合物的剂量,并逐渐增加剂量直到实现所需效果。本发明的组合物的合适的每日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。这种有效剂量通常取决于上述因素。施用可以是静脉内的、肌内的、腹膜内的或皮下的,并且例如在靶位点附近施用。如果需要,药物组合物的有效每日剂量可以在一天中以合适的间隔作为2、3、4、5、6或更多分剂量来分别施用,任选地以单位剂量形式。虽然本发明的抗HERV-K人源化抗体或抗体-药物缀合物可单独施用,优选以上述药物组合物施用该抗HERV-K人源化抗体或抗体-药物缀合物。
在第二十九个实施方案中,可以约10至1500mg/m2,如30至1500mg/m2,或约50至1000mg/m2,或如10至500mg/m2,或如100至300mg/m2的每周一次的剂量通过输注施用抗HERV-K人源化抗体或抗体-药物缀合物。可重复这种施用,例如1次至8次,如3次至5次。可通过在2小时至24小时,如2小时至12小时的时间段连续输注进行该施用。
在第三十个实施方案中,可以约如30至1500mg/m2,或如50至1000mg/m2,或10至300mg/m2的每三周一次的剂量通过输注施用抗HERV-K人源化抗体或抗体-药物缀合物。可重复这种施用,例如1次至8次,如3次至5次。可通过在2小时至24小时,如2小时至12小时的时间段连续输注施用。
在第三十一个实施方案中,可通过在延长的时间段(如超过24小时)缓慢连续输注施用抗HERV-K人源化抗体或抗体-药物缀合物以减少毒副作用。
在第三十二个实施方案中,可以约50mg至2000mg的每周剂量施用抗HERV-K人源化抗体或抗体-药物缀合物达最高至16次。可通过在2小时至24小时,如2小时至12小时的时间段连续输注进行该施用。这种方案可重复一次或多次,例如在6个月或12个月后。可通过测量施用后本发明的抗HERV-K人源化抗体或抗体-药物缀合物在血液中的量,例如通过取出生物样品并使用靶向本发明的抗HERV-K人源化抗体或抗体-药物缀合物的抗原结合域的抗独特型抗体来确定或调节剂量。关于剂量的进一步指导可由Hendrikx等人提供,肿瘤学中单克隆抗体的固定剂量.Oncologist,22(10),1212–1221(October 2017)和Lu et al.,治疗性抗体用于治疗疾病的发展.Journal of Biomedical Science,v27,文章编号1(January 2,2020)。
在第三十三个实施方案中,抗HERV-K人源化抗体或抗体-药物缀合物可以通过维持疗法来施用,例如,每周一次持续6个或更多个月的时段。
在第三十四个实施方案中,抗体-药物缀合物可以通过一个方案进行给药,该方案包括先给予本发明的抗体-药物缀合物的一次输注,然后再给予本发明的抗HERV-K抗体的一次输注,例如抗体6H5hum。
双特异性T细胞衔接器(BiTE)
在第三十五个实施方案中,本文提供治疗有需要的受试者的HERV-K阳性癌症的方法,包括向受试者施用治疗有效量的包括两个抗原结合域(一个对CD3或CD8特异性结合且一个对HERV-K特异性结合)的双特异性抗体。
在第三十六个实施方案中,本发明涉及双特异性抗体,其包含结合HERV-K的第一单链人可变区串联结合T细胞激活配体CD3或CD8的第二单链人可变区。第一和第二单链人可变区按氨基到羧基的顺序,其中在每个所述片段之间插入有连接子序列,并且其中间隔多肽连接第一和第二单链可变区。
在第三十七个实施方案中,施用是静脉内的或腹膜内的。
在第三十八个实施方案中,双特异性结合分子在所述施用步骤中不与T细胞结合。
在第三十九个实施方案中,该方法进一步包括向受试者施用T细胞。在特定实施方案中,T细胞与跟所述双特异性结合分子相同的分子结合。
在第四十个实施方案中,本文提供药物组合物,其包含治疗有效量的双特异性结合分子、药学上可接受的载体和T细胞。在第四十一个实施方案中,T细胞与跟所述双特异性结合分子相同的分子结合。在第四十二个实施方案中,T细胞与双特异性结合分子的结合是非公价的。在第四十三个实施方案中,结合向受试者输注用于治疗HERV-K阳性癌症的T细胞来进行施用。在第四十四个实施方案中,在用T细胞输注治疗病人后进行施用。在第四十五个实施方案中,T细胞相对于被施用的受试者是自体的。在第四十六个实施方案中,T细胞相对于被施用的受试者是同种异体的。在第四十七个实施方案中,T细胞是人T细胞。
在第四十八个实施方案中,受试者是人。
在第四十九个实施方案中,该双特异性结合分子在药物组合物中,药物组合物进一步包含药学上可接受的载体。
在双特异性结合分子的第五十个实施方案中,该双特异性结合分子不以其可溶形式或细胞结合形式与Fc受体结合。在该双特异性分子的一些实施方案中,突变重链以摧毁N-连接的糖基化位点。在双特异性结合分子的第五十一个实施方案中,重链有一个氨基酸取代,用一个不作为糖基化位点的氨基酸取代作为N-连接糖基化位点的天冬酰胺。在双特异性结合分子的第五十二个实施方案中,突变重链以摧毁C1q结合位点。在双特异性结合分子的第五十三个实施方案中,该双特异性结合分子不激活补体。
在双特异性结合分子的第五十四个实施例中,HERV-K阳性的癌症可以是乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌或任何其他表达HERV-K的肿瘤组织。在第五十五个实施例中,HERV-K阳性的癌症可以是原发性肿瘤或转移性肿瘤,例如脑、骨或肺转移。
DNA编码的双特异性T细胞衔接器(DBiTE)
特异性抗体治疗,包括mAb和双特异性T细胞衔接器(BiTEs),是用于癌症免疫治疗的重要工具。BiTEs是有潜力改造癌症治疗免疫格局的一类人造双特异性单克隆抗体。BiTEs针对宿主的免疫系统,更具体的是T细胞针对癌症细胞的细胞毒活性。BiTEs有两个结合结构域。一个结构域结合靶向肿瘤(如表达HERV-K的细胞)同时另一个结构域通过直接结合至T细胞上的分子衔接免疫系统。该双结合活性直接在肿瘤处驱动T细胞激活,从而产生杀伤功能肿瘤破坏。DBiTEs享有双特异性单克隆抗体的许多优势。两者均由编码两个抗体片段的工程DNA序列组成。患者自己的细胞变成生产被递送的DBiTEs序列编码的功能性BiTEs的工厂。递送BiTEs并允许一次给药DBiTEs的组合作为一种多管齐下的方法来治疗耐药性癌症。BiTEs样分子的合成DNA设计包括在优化的合成质粒DNA盒中对它们工程化并编码。然后将DBiTEs局部注射到肌肉中,肌肉细胞将一串指令转化为蛋白以便在体内直接释放直接进入血流的分子以寻找并摧毁肿瘤。参见Perales-Puchalt等人,JCIInsight,4(8),e126086(April 18,2019)。在临床前研究中,DBiTE相比于传统BiTE表现出独特的发挥,克服一些与生产相关的技术挑战。进一步信息,还参见PCT专利公开WO2016/054153(TheWistar Institute of Anatomy andBiology)和WO2018/041827(Psioxus TherapeuticsLimited)。
HERV-K CAR-T治疗
研发了对靶向抗原特异性的CAR的许多制剂。参见例如,国际专利公开WO2014/186469(Board of Regents,the University of Texas System)。本说明书提供了产生用于治疗目的具有体内长寿潜能的嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞的方法,例如,表现出最小残留疾病(MRD)的白血病患者。总的来说,该方法描述了可溶性分子(如细胞因子)如何融合到细胞表面以增强治疗潜能。该方法的核心依赖于用白细胞介素15(IL-15)的人类细胞因子突变蛋白共同修饰CAR T细胞,此后称为mIL15。mIL15融合蛋白由密码子优化的通过柔性丝氨酸-甘氨酸接头与全长IL15受体alpha融合的IL-15cDNA序列组成。该IL-15突变蛋白被设计为这种融合物以:(i)限制mIL15表达至CAR+T细胞的表面以限制细胞因子在体内环境中非靶标的扩散,从而潜在提高了其安全性,因为外源可溶性细胞因子给药导致毒性;和(ii)在IL-15Ra的背景下呈现IL-15以模拟生理相关和定性信号以及IL15/IL15Ra复合物的稳定和再循环,以获得更长的细胞因子半衰期。表达mIL15的T细胞能继续支持细胞因子信号,这对它们的输注后生存是关键的。通过非病毒睡美人系统(Sleeping Beauty System)基因修饰生成mIL15+CAR+T细胞,并随后在临床可用的平台体外扩增产生在输注于有高、低或没有肿瘤负载的鼠模型有增强的持久性的T细胞输注产品。另外,该mIL15 CAR+T细胞还表明在高和低肿瘤负载模型中均改善的抗肿瘤功效。使用hu6H5 scFv以产生慢病毒载体中的K-CAR。
联合疗法
使用本说明书的治疗可以无需修饰地使用,这依赖于抗体或片段与HERV-K+癌症细胞的表面抗原的原位结合以刺激对该癌症细胞的免疫攻击。上述方法可以使用结合有细胞毒性剂的抗体或结合片段来进行。该细胞毒性抗体或抗体结合片段与肿瘤的结合抑制其生长或杀伤该细胞。
HERV-K env蛋白特异性抗体可用于与其他表达的HERV抗原。这对于其中表达几种不同HERV的疾病的免疫疗法和抗体治疗可能有用。例如,前列腺癌中的HERV-E,卵巢癌中的ERV3、HERV-E和HERV-K和其他癌症中的ERV3、HERV-H和HERV-W。
常见γ链受体家族(γC)中的细胞因子是T细胞的重要共刺激分子,对淋巴功能、存活和增殖至关重要。IL-15具有过继治疗所需的几个属性。IL-15是支持长寿记忆细胞毒性T细胞存活、通过减轻肿瘤驻留细胞的功能抑制促进已建立的肿瘤的根除,并抑制激活诱导的细胞死亡(AICD)的稳态细胞因子。IL-15是组织限制性的,只有在病理条件下,才能在血清或全身的任何水平上观察到它。与分泌到周围环境中的其他γC细胞因子不同,IL-15在IL-15受体(IL-15Ra)的背景下由生产细胞转呈递至T细胞。该细胞因子向T细胞和其他响应细胞的独特递送机制:(i)是高度靶向并本地化的,(ii)增加IL-15的稳定性和半衰期,和(iii)产生与可溶IL-15实现的信号传导定性不同的信号传导。
药物组合物
本说明书还涉及药物组合物,其包含特异性结合至HERV-K env蛋白的疗法和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。这种药物组合物可以任何合适的形式施用,包括胃肠外、局部、口服或局部(如气雾剂或透皮)或其任何组合。合适的方案还包括通过静脉推注进行初始给药,然后以一个或多个间隔重复给药。
通过将具有所需纯度的含有肽配体的化合物与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences,第18版,1990)混合来制备用于储存的本公开化合物的药物组合物,以冻干制剂或水溶液的剂型。可接受的载体、赋形剂或稳定剂以对接受者无毒的剂量和浓度使用。
本文的组合物还可包含超过一种活性化合物,优选不会对彼此产生不利影响的具有互补活性的那些活性化合物,其用于所治疗的特定适应症。或者此外,组合物可包含细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂和/或心脏保护剂。此类分子以对预期目的有效的量适当地组合存在。通过以下实施例进一步说明本发明,以下实施例不意欲以任何方式限制本发明的范围或内容。
实施例1
商业上生产的和发明人实验室生产的人源化抗体
发明人合成并纯化了针对HERV-K肿瘤抗原的人源化抗体。HERV-K包膜表面基因肿瘤抗原(KSU)源自人类患者的癌细胞,而不是GenBank中的序列,后者是来自正常人的HERV-K基因序列。发明人证明,这些来自癌症患者的HERV-K序列包含与正常HERV-K序列不同的变体。发明人的人源化抗体专门针对在人类癌细胞中发现的HERV-K靶点。这种特异性区别了人类癌细胞中发现的HERV-K靶点与正常个体或患有非癌症疾病的患者组织中存在的HERV-K靶点。这种特异性也将发明人的人源化抗体与HERV-K肿瘤抗原的其他抗体区分开来。这些人源化抗体针对的是HERV-K包膜基因的全长表面蛋白,而不是基因的肽段或小片段。全长包膜表面蛋白仅在从癌症患者获得的癌细胞中表达。
针对HERV-K包膜表面融合蛋白的小鼠抗体的单链可变区(scFv)序列被提交给了一个合同研究机构(CRO)来生产人源化抗体。该CRO无法生成发明人设计HERV-K的人源化抗体的轻链,这表明生产包括重链和轻链的HER-K拮抗剂人源化抗体是意想不到的。
第二家合同研究机构产生了一个嵌合抗体,但该抗体无法通过ELISA、SPR或Westernblot检测法与HERV-K包膜表面融合蛋白结合,即使通过ELISA或Western blot检测法可以轻松检测到嵌合抗体和发明人的非人源化小鼠抗体的结合。这个结果也表明了生产包括重链和轻链的活性HER-K拮抗剂人源化抗体是意料不到的。
发明人随后生成了三种人源化抗体。只有其中一种人源化抗体(HUM1,在细菌细胞中表达)结合HERV-K抗原。表达的HUM2或HUM3蛋白与重组SU蛋白结合能力不强,特别是不能很好地与从乳腺癌细胞(MDA-MB-231)产生的SU蛋白结合。
随后,发明人生产了另一种人源化抗体,即hu6H5。hu6H5在哺乳动物细胞中表达,并确定了其抗肿瘤效果。HUM1和hu6H5抗体均与全长KSU抗原结合。
本文表格1中显示了HUM1、HUM2和HUM3的VH之间的区别,表格2中显示了VL之间的区别。HUM1、HUM2和HUM3都是从同一细菌表达载体生成的。它们的VH和VL都具有相同的CDRs。hu6H5是基于HUM1序列生成的哺乳动物表达载体。HUM1、HUM2和HUM3都与重组KSU蛋白结合。只有HUM1与从癌细胞中分离的蛋白结合。
这个实施例意想不到的显示了,抗体与从癌细胞中分离的蛋白结合的医学上有用的功能属性并不是由VH和VL的CDRs结构所产生的属性。
实施例2
对比hu6H5序列与其他人源化抗HERV-K抗体的序列,以及与其他靶向肿瘤抗原的抗体的序列
一种针对肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的靶向HERV-K抗体,称为GN-mAb-Env_K01,与具有SLDKHKHKKLQSFYP核心序列的HERV-K包膜线性肽结合。参考美国专利号10,723,787。hu6H5抗体与较长的全长HERV-K包膜SU结构域结合,而不是线性肽。
与GN-mAb-Env_K01相比,发明人的人源化抗体特异性针对来自癌细胞靶点的HERV-K ENV蛋白。hu6H5序列与GN-mAb-Env_K01人源化抗体的相似性很小。它们的同一性为VH为60%,VL为55%。
BLAST搜索显示,其他靶向癌症相关抗原的抗体与hu6H5的同源性很小(6-15个肽)。其中包括与靶向HER2阳性乳腺癌的抗ErbB2抗体(基于抗ErbB2 Fab2C4的晶体结构)的VH的82%同一性,以及与抗DREG-55(抗DREG-55(L选择素)免疫球蛋白轻链可变区)的VL的88%同一性。抗DREG-55的靶标L选择素在癌症中介导适应性和先天性免疫。
发明人还确定了他们的人源化抗HERV-K抗体中CDRs边界附近的人类遗传序列。这些序列包括VRQAPGKGLEW(SEQ ID NO:4)和LQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO:47)。
实施例3
抗HERV-K人源化抗体与HERV-K SU蛋白的结合亲和力,以及抗体的内吞作用发明人通过ELISA实验确定,HUM1人源化抗体对HERV-K包膜表面融合蛋白的亲和力与其m6H5抗体在抗体浓度高于0.00625μg/ml时一样有效,并且比大多数发明人的其他小鼠单克隆抗体更有效。参见图2。发明人的嵌合人源化抗HERV-K抗体通过免疫印迹实验显示结合了两种HERV-K包膜表面蛋白,ERVK6和HERV-K包膜表面融合蛋白,以及他们的m6H5单克隆抗体。
为了确定人源化和小鼠抗体的内吞作用,细胞被孵育在37℃下不同时间间隔(0、5、30和45分钟)与HUM1或m6H5一起。在每个时间点,细胞被固定。一半的细胞被渗透化处理,另一半未被渗透化处理。使用抗人IgG 488或抗小鼠IgG 488检测未被渗透化处理的细胞表面上剩余的与HERV-K env蛋白结合的抗体的百分比。观察到HERV-K阳性细胞表面表达的减少。在渗透化处理的细胞中确定了内吞速率。每个时间点的内吞百分比方程为100-(%在时间0的标签)。
结果表明,在处理过HUM1或小鼠m6H5单克隆抗体的细胞中,内吞的HERV-K阳性细胞表达增加,但HUM1从细胞表面消失比6H5更快,表明发明人的人源化抗体比它们的小鼠抗体更快地被吞噬。这种快速的内吞支持了HUM1具有比m6H5更快地传递荷载的独特能力。
实施例4
癌细胞杀伤和细胞凋亡
将HERV-K转导到231K细胞中导致这些细胞中HERV-K的表达增加。流式细胞术结果显示,人源化(HUM1)和小鼠(6H5)抗HERV-K抗体结合到MDA-MB-231细胞,并且发明人的治疗性单克隆抗体在表达更高水平的HERV-K的细胞中更强烈地诱导凋亡。然后,评估了m6H5处理的BXPC 3胰腺癌细胞中早期凋亡和晚期凋亡的诱导模式并测定了m6H5。人源化和小鼠单克隆抗体的诱导模式相似。然而,与m6H5处理相比,hu6H5处理导致早期和晚期凋亡的增加,表明人源化单克隆抗体治疗优于小鼠单克隆抗体治疗。这些研究数据表明,在乳腺癌细胞中增加的HERV-K抗原水平的存在使发明人的人源化抗HERV-K抗体能够通过诱导早期和晚期凋亡来更有效地靶向并杀死这些细胞。
实施例5
乳腺癌细胞信号通路RNA表达的模式,包括有或没有HERV-K蛋白过表达的诱导在MDA-MB-231乳腺癌细胞(231K)中HERV-K过表达对细胞信号通路基因的RNA表达的影响,通过RNA测序(RNA-Seq)进行评估,并与231C非转染细胞中的表达进行比较。发明人证明,在诱导HERV-K表达的细胞中,PI3K-Akt和TNF信号通路强烈上调(增加了5倍以上)。此外,与231C细胞相比,MAPK、mTOR、NF-κB、Ras以及Ras相关蛋白Rap-1在231K细胞中呈现出超过3倍的上调。
一个免疫缺陷小鼠的治疗组(KC)接种了231K细胞,与接种了231C细胞的免疫缺陷小鼠的对照组(C)进行比较。这个体内实验大体上反映了体外实验的结果,显示了KC小鼠肿瘤中PI3K-Akt、TNF、MAPK、mTOR和NF-κB的主要上调,并且Ras和Rap-1在KC小鼠的肿瘤中也有适度上调。
实施例6
对乳腺癌细胞信号通路蛋白在人源化和小鼠单克隆抗体治疗中的表达模式进行研究,包括有和没有HERV-K蛋白过表达情况
在实施例4中所述,采用了逆转录病毒载体将HERV-K引入到MDA-MB-231人类乳腺癌细胞中。用于HERV-K和信号转导途径表达的流式细胞仪分析的一次和二次抗体及其稀释情况为:
m6H5:1:200;小鼠抗:1:1,000
Ras:1:200;大鼠抗:1:1,000
p-ERK:1:200;小鼠抗;1:1,000
SIRT-1:1:200;兔抗:1:1,000
CIDEA:1:200;小鼠抗:1:1,000
p-Rb:1:200;兔抗;1:1,000
PE标记的半胱天冬酶3:1:200
一抗孵育:4℃下1小时
二抗孵育:4℃下30分钟
发明人观察到,在用hu6H5处理的231K细胞中,HERV-K、Ras、p-ERK和SIRT-1的表达减少,而hu6H5的抑制作用远远大于小鼠m6H5对这些通路的影响。已被记载的SIRT-1表达对p53介导的凋亡的积极影响,以及其对p53诱导的细胞衰老的负调节作用,导致了这样的发现,SIRT1活性的抑制导致p53乙酰化和转录活性升高,进而增强凋亡并抑制细胞生长和增殖。这种在HERV-K抗体治疗后观察到的SIRT-1表达变化此前尚未被报道过。因此,hu6H5诱导的SIRT-1表达抑制对癌症治疗有益,而且进一步证实了发明人以前的发现,降低HERV-K表达对p53信号通路有显著影响。同样地,用hu6H5处理的231K细胞中,凋亡促进基因半胱天冬酶3和肿瘤抑制基因Rb的表达增加大于231C细胞,进一步支持了发明人的人源化抗体刺激促进肿瘤细胞死亡途径的有效性。
实施例7
使用抗-GST单抗和BiTE结合到靶细胞来确定CD3或CD8 BiTE重组蛋白的百分比使用抗-GST抗体标签的流式细胞术,确定含有连接到抗CD3或抗CD8抗体的抗-HERV-K scFv的外周血单核细胞的百分比。CD3 BiTEs的百分比范围为54.1%至58.5%。CD8 BiTEs的百分比范围为48.8%至55.2%。
CD3BiTE/CD8BiTE与其相应靶标的结合通过ELISA进行评估。孔板被涂覆了CD3ε或CD8蛋白(1μg/ml),然后加入递增浓度的BiTE。接着加入鼠抗-GST抗体,随后是羊抗鼠IgG-HRP(或同种型),最后使用ABTS进行染色。ELISA结果表明,CD3BiTE与CD3ε结合,但CD3BiTE也与CD8蛋白发生交叉反应。CD8BiTE与CD8蛋白结合,但不与CD3ε发生交叉反应。
实施例8
Effect of BiTE treatment on killing of cancer cells无论是CD3还是CD8BiTEs的细胞杀伤效果都非常强大。在体外实验中,CD3和CD8 BiTE的处理都导致人乳腺癌(MDA-MB-231、MCF7)、胰腺癌(BxPC3)和小鼠卵巢癌(ID8)细胞的细胞杀伤增加。值得注意的是,在LDH测定中,当MDA-MB-231细胞被CD3或CD8 BiTEs处理时,均值荧光强度从125增加到近3500,其他细胞株也观察到了类似但相对不明显的细胞杀伤增加。对MDA-MB-231细胞进行直接显微观察,发现在HERV-K CD3 BiTE的浓度为0、0.03、0.3、30和300ng/ml的情况下,BiTEs的剂量和时间对MDA-MB-231细胞的杀伤产生了剂量-反应和时间-效应,更高的BiTEs浓度和更长的处理时间导致细胞死亡增加。然而,当癌细胞仅被BiTEs处理时,没有添加外周血单核细胞或T细胞时,细胞死亡并未增加。在T细胞存在的情况下,细胞杀伤的显著增加,表面了我们HERV-K靶向BiTE的体外疗效。
实施例9
人源化单链可变片段(scFv)抗体的设计
抗体编号方案和CDR定义:抗体编号服备器是KabatMan数据库的一部分,并用于根据增强的Chothia方案对本发明研究实施例的所有抗体序列进行编号。在人源化研究实施例中,发明人将增强的Chothia编号与抗体序列的完整CDR定义相结合以在以下位置定义抗体轻链和重链的CDR:H-CDR1 30-35、H-CDR2 47-58、H-CDR3 93-101、L-CDR1 30-36、L-CDR246-55、L-CDR3 89-96。
人模板的选择:为生成人源化scFv基因,将小鼠VH和VL的6个互补决定区(CDRs)接枝在选定的显示出最高氨基酸序列同一性的人框架(FR)上以人源化给定抗体。使用人免疫球蛋白种系序列用于小鼠FWJ抗体克隆的选定的人FR(图1)。使用V-quest服务器
(http://www.imgt.org/IMGT_vquest)和Ig-BLAST服务器
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast)独立鉴定在人和鼠FWJ的VH和VL间的框架区示出最高氨基酸序列相似性的人免疫球蛋白种系序列。基于保守种系选择重链VHIII和轻链KI。共有人FR是在选定的种系基因中设计的,用于接枝FWJ的CDR残基。用人类残基取代与共有人FR不同的鼠VH和VL的FR中的氨基酸序列,同时保留称为Vernier区残基和链堆积残基的位置处的小鼠残基。
表1
HUM1,HUM2和MuVH的重链可变区(VHs)
"*"这意味着在该列中的残基或核苷酸在对齐中的所有序列中都是相同的
":"意味着观察到保守性替代
"."这意味着观察到半保守性替代,如具有相似形状的氨基酸。
表2
HUM2,HUM3和MuVL的轻链可变区(VLs)对比
如表2中以黄色背景突出显示的,鼠和人的CDRs完全相同,但VL序列的其余部分存在主要差异,这可能部分解释了HUM2和HUM3无法结合到人类癌细胞HERV-K包膜蛋白的原因。scFV的构建和针对人KV和231抗原的生物学活性的测试。扩增并合成FWJ_1和FWJ_2抗体基因的可变重链和轻链的克隆。编码scFV的基因是具有标准20氨基酸接头(Gly4Ser)3GGGAR(SEQ ID NO:14)的VH-接头-VL。用BssHII和NheI限制酶消化扩增基因并将其插入含有用于控制周质蛋白表达的pelB启动子(Novagen,Madison,WI,USA)和用于通过金属亲和层析纯化的C端6x组氨酸tag的基于pET的载体(PAB-myc)并转化到DH5α菌株中。转化的克隆在含有氨苄青霉素肉汤的LB中扩增过夜。制备质粒DNA并送去DNA测序。将正确序列的scFv质粒转化到T7 Shuffle菌株中,并将转化的细菌用于周质区室中的可溶性蛋白质生产。
FWJ_1和FWJ_2_scFv基因和翻译的蛋白质:序列表描绘了FWJ_1和FWJ_2_scFv的重链和轻链以及接头臂。在FWJ_1和FWJ_2_scFv基因的工程化中,两个表位标签被工程化至C端上:(1)促进所编码的scFV通过镍亲和层析纯化的6His标签;和(2)促进所表达的scFV快速免疫化学识别的myc标签。
在细菌宿主中诱导ScFv蛋白:将FWJ_1和FWJ_2scFv克隆转化到T7 shuffle菌株中。T7shuffle细胞在1.4L 2xYT加氨苄青霉素培养基中生长直到对数期(OD600=0.5),用0.3mM的IPTG诱导,并允许在30℃再生长16h。诱导后,通过4℃下以8000g离心15min收获细菌,并沉淀物在-20℃中储存至少2小时。将冷冻的沉淀物短暂解冻并悬浮在40ml裂解缓冲液中(PBS中的1mg/ml溶菌酶加不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)。裂解混合物在冰上孵育1小时,然后加入10mM MgCL2和1μg/ml DNaseI,并在25℃孵育该混合物20min。终的裂解混合物以12000g的速度离心20分钟,并收集上清液。将该上清液称为用于镍柱亲和层析的周质提取物。
使用FWJ_1和FWJ_2_scFv蛋白的蛋白质印迹分析:在点印分析中,裂解液中的Ag和HERV-K表面融合蛋白被用作抗原靶标。将作为非还原条件的2-5ugAg蛋白和作为阴性对照的1ug纯化蛋白加载到硝酸纤维素膜上。在室温下使用磷酸盐缓冲溶液中的3%脱脂乳封闭膜3小时。之后,将膜与FWJ_1和FWJ_2scFv蛋白的周质提取物在4℃孵育过夜。用含0.05%吐温20缓冲液(PBST)的磷酸钠缓冲盐水洗涤膜3次。洗涤后的膜在室温下与抗c-Myc鼠源IgG孵育一个小时,以识别scFv上的c-Myc标签,并鉴定scFv结合的抗原位置。在用PBST洗涤后,用稀释的(1:3000v/v)羊源抗鼠IgG(H+L)HRP缀合物在磷酸盐缓冲溶液室温孵育膜一小时,并用TMB底物混合物可视化特异性免疫反应条带。
发明人鉴定抗-HERV-K mAb 6H5重链CDR(H-CDR1 30-35、H-CDR2 47-58、H-CDR393-101),和轻链CDR(L-CDR1 30-36、L-CDR2 46-55和L-CDR3 89-96)并将它们接枝到选定的示出最高氨基酸序列同一性的人框架(FRs)上以优化给定抗体的人源性。V-quest(http://www.imgt.org/IMGT_vquest)和Ig-BLAST服务器(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast)独立鉴定在人和鼠VH和VL间的框架区示出最高氨基酸序列相似性的人免疫球蛋白种系序列。用人类残基取代与共有人FR不同的鼠VH和VL的FR中的氨基酸序列,同时保留称为Vernier区残基和链堆积残基的位置处的小鼠残基。候选人源化抗体基因的VH和VL链克隆被扩增和合成。编码单链抗体的基因,其中包括一个标准的20个氨基酸连接肽(Gly4Ser)3GGGAR(SEQ ID NO:14)的VH-连接-VL,被插入到一个含有pelB启动子的pET基于载体中,用于控制周质膜蛋白的表达(Novagen,Madison,WI,USA),同时在C-末端包含一个6x组脯氨酸标签,用于金属亲和色谱纯化,还包含一个myc标签,以便快速免疫化学识别表达的单链抗体。正确的scFv质粒序列用于在周质膜区域生产可溶性蛋白。选择了两个hu6H5克隆(FWJ1和FWJ2),并确定其与抗原的结合亲和力。这两个克隆都结合了重组HERV-K Env表面融合蛋白(KSU)产生的抗原和MDA-MB-231乳腺癌细胞的裂解物。
将具有人IgG1的HuVH或HuVL克隆到pcDNA 3.4载体中以产生VH-CH(人IgG1)或VL-CL(人κ)。将质粒瞬时转染到Expi293细胞中用于哺乳动物表达。H链与L链质粒的比例为2∶3。使用蛋白印迹确定表达,并在还原条件下检测到预测的49/23kDa的MW(H链/L链)。蛋白印迹法用于在还原条件下的SDS-PAGE凝胶中检测人源化抗HERV-K抗体的VH链和VL链。检测到VH链的分子质量为49KDa,VL链的分子质量为23KDa。
进一步使用大小排除色谱(SEC)按大小和/或分子量进行蛋白质表达的分离。检测到只有两个峰,第2峰的浓度大于总结合峰1和峰2的大小的99%。人源化的6H5抗体(纯度>95%),内毒素水平<1EU/mg,用于确定体外和体内的抗肿瘤效果。
使用ELISA测定来比较hu6H5相对于m6H5的抗原结合敏感性和特异性。未检测到这两个参数之间存在显著差异。如图2所示,这两个参数之间没有显著差异。
使用凋亡试验比较了hu6H5和m6H5在杀死癌细胞方面的效果。分别使用1或10μg/ml的抗体处理MDA-MB-231乳腺癌细胞4小时和24小时。凋亡试验用于确定小鼠和人源化抗HERV-K抗体对癌细胞的细胞毒性。包括MDA-MB-231-pLVXK(231K)(一种转导了pLVX载体表达HERV-K env蛋白的乳腺癌细胞系)或MDA-MB-231-pLVXC(231C)(相同的乳腺癌细胞系转导了pLVX空载体)的癌细胞用1或10μg/ml的m6H5或hu6H5处理4小时或16小时。使用AnnexinV和7AAD确定凋亡细胞的百分比。
将未用抗体处理或用mIgG或人IgG处理的细胞用作对照。结果示出hu6H5在杀伤这些乳腺癌细胞上有与m6H5相似的效果。为了进一步评价细胞杀伤的功效,用多种抗体(10μg/ml)处理MDA-MB-231细胞十六个小时。使用共染色的活/死细胞活力检测试剂鉴定活细胞和可能的死细胞,结果显示,hu6H5在杀死乳腺癌细胞方面与m6H5具有类似的有效性。使用活/死细胞活力检测试剂评估抗HERV-K抗体处理后的细胞死亡诱导。MDA-MB-231细胞在24孔板中过夜培养。细胞用不同抗体(10μg/ml)处理并在37℃的细胞培养箱中孵育十六小时。然后添加Calcein Am(4μl/10ml培养基)和Eth-D1(20μl/10ml培养基),每孔200μl,并在室温下孵育三十分钟。EthD-1穿透有膜损伤的细胞并结合核酸,在死细胞中产生红色荧光。使用共染色的活/死细胞活力检测试剂鉴定活细胞(绿色;Calcein Am)和可能的死细胞(红色;EthD-1)。人源IgG或小鼠IgG用作对照。在用对照人源或小鼠IgG处理后未观察到红色荧光细胞。然而,在用人源或小鼠6H5抗HERV-K抗体处理后,观察到了红色荧光细胞。
MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)测定可以用来确认hu6H5可以抑制癌细胞生长。如附图3所示。
ADCC被用来确定乳腺癌细胞杀伤的机制,我们的结果验证了,效应细胞介导的分泌细胞毒性分子,溶解被抗体包被的靶细胞。ADCC被用来确定抗体诱导细胞杀伤的机制。在处理过hu6H5的细胞中观察到比处理过m6H5的细胞更多的癌细胞ADCC裂解,且外周血单核细胞的百分比增加。
流式细胞术被用来确定hu6H5是否可以下调p-ERK、Ras和SIRT-1的表达。231C或231K细胞被用10μg/ml的hu6H5处理十六小时。在perm和non-perm条件下,这两种细胞的HERV-K、SIRT-1、p-ERK和Ras的表达。结果表明,在用hu6H5处理的231K或231C中,HERV-K、p-ERK、Ras和SIRT-1的表达被下调。小鼠接种了231K或231C细胞(皮下注射2百万个细胞)。然后小鼠用hu6H5抗体治疗(n=3;每周两次,4mg/kg)。肿瘤生长被监测并每周测量三次,并确定小鼠的存活情况。与另一组用对照抗体治疗的小鼠相比,用hu6H5治疗的小鼠存活时间更长(n=4)。观察到接种了231K细胞的小鼠的存活时间比接种了231C细胞的小鼠短,这表明乳腺癌细胞中HERV-K的过表达缩短了与肿瘤相关的存活时间。
pLVXK是一个HERV-K表达载体,MDA-MB-231pLVXK是转染了pLVXK的MDA-MB-231细胞。同理,pLVXC是控制表达载体,MDA-MB-231pLVXC是转染了pLVXC的MDA-MB-231细胞。NSG雌性小鼠(8周龄)被接种了MDA-MB-231pLVXC(231-C;皮下,2百万细胞)对比MDA-MB-231pLVXK(231-K;皮下,2百万细胞)。在第6天,小鼠接受hu6H5治疗(每周两次,腹腔内注射,4mg/kg,持续3周)。每隔一天监测和测量肿瘤生长。对于接受抗体治疗的231-C和231-K细胞的小鼠,观察到较高的存活率。从每只小鼠收集了肿瘤和肺组织。在一些携带231-K细胞的小鼠中检测到较大的淋巴结,在携带231-C细胞的小鼠中则没有检测到。苏木精和伊红(H&E染色)进一步用于评估肿瘤组织和其他器官(肺和淋巴结)的形态学特征。通过H&E染色测量肿瘤区域,病理学家量化了肿瘤活力和坏死情况。人源化抗体治疗导致肿瘤体积减小、肿瘤灶和数量减少、浸润性边界减少以及有丝分裂活动减少。在携带231-C细胞的小鼠或用抗体处理的231-K细胞中观察到较低百分比的肿瘤活力。相对于对照组,用hu6H5处理的231C或231K细胞显示出降低的肿瘤变异性。使用抗Ki67和抗HERV-KmAb。与对照组相比(60%),用hu6H5治疗的小鼠显示出降低的肿瘤活力(20%)。抗体治疗组的外观更为一致,核形态更少见多形性,核小而核仁更小,肿瘤浸润性淋巴细胞数量显著增加。
从携带231-K细胞的小鼠的肺组织中还发现了转移性肿瘤细胞,但在携带231-C细胞的小鼠中没有。在接种了231K细胞的小鼠中观察到了肺和淋巴结的转移性肿瘤。只有接种了231K细胞的小鼠才观察到了肺或淋巴结的转移。在接种了231K细胞并用hu6H5治疗的小鼠的肺中检测到了降低的肿瘤活力和增加的肿瘤坏死。在接种了231K细胞的小鼠中可见明显肿大的淋巴结,但在接种了231C细胞的小鼠中没有。在接种了231K细胞并用hu6H5治疗的小鼠的淋巴结中检测到了降低的肿瘤活力和增加的肿瘤坏死(KAB)(B18;40%)相比于未添加抗体的231K细胞(KCON)(B26>95%)。这些结果表明HERV-K表达是肿瘤发展的诱因,尤其是对于转移到远端器官部位的转移。我们的人源化抗HERV-K抗体可以降低肿瘤活力,增加肿瘤坏死,并减少对肺和淋巴结的转移。与未接受抗体治疗的相比,在接种了231-K并接受抗体治疗的小鼠的肺中观察到了降低的肿瘤活力。只有接种了231K细胞的小鼠中检测到了转移性淋巴结。在接种了231-K细胞的小鼠的淋巴结中检测到了超过95%的肿瘤活力,相比未接受抗体治疗的小鼠,在接受抗体治疗的小鼠中观察到了降低的肿瘤活力百分比。在未接受抗体治疗的情况下,携带231K或231C肿瘤细胞的小鼠中观察到了腹水。
实施例10
双特异性T细胞衔接器(BiTE)靶向HERV-K的功效
产生了针对T细胞CD3或CD8和肿瘤相关抗原HERV-K的BiTE,包括靶向CD3或CD8和HERV-K的抗体。这种BiTE已被证明能够表达载有HERV-K表位的主要组织相容性类(MHC)分子的MDA-MB-231乳腺癌细胞的干扰素-γ(IFNγ)细胞毒活性,经BiTE处理后IFNγ表达增加了20-30倍。如附图4所示。
BiTE是一种重组蛋白,构建为将T细胞重定向至肿瘤细胞的单链抗体构建体,并且不需要通过抗原呈递细胞扩增内源性T细胞。BiTE分子可以直接施用于患者,并且BiTE介导的T细胞激活不依赖于MHC I类分子的存在,CAR也是如此。鉴于靶向HERV-K Env作为肿瘤相关抗原(TAA)的成功,以及几乎所有乳腺癌细胞系都表达Kenv蛋白,发明人假设Kenv和CD3特异性的BiTE(K3Bi)如K-CAR一样有效治疗转移性疾病。发明人已设计并合成有Kenv和CD3双重特异性的K3Bi。如此,T细胞能够靶向HERV-K+肿瘤细胞。发明人已经生成、纯化并验证了K3Bi和一个CD8BiTE(K8Bi)。这是通过使用也用于CAR构建中的mAb 6H5和用于其他BiTE的针对人CD3的抗体OKT3来完成的,该抗体被人源化并连接了一个柔性接头,以及两个C端表位标签(MYC和FLAG),用于纯化和染色。在发明人的实验室中生成从OKT8杂交瘤细胞获得的CD8单链抗体(scFv)并用于生产K8Bi(VL-VH6H5接头VH-VLCD8-MYC和FLAG)。将K3Bi和K8Bi克隆到pLJM1-EGFP Lenti或pGEX-6P-1载体中用于重组蛋白表达。通过几种免疫测定确定K3Bi或K8Bi结合T细胞和HERV-K+乳腺癌细胞系的能力。发明人发现随着BiTE浓度的增加,与BiTE结合的靶细胞数量增加。
发明者还检查了K3Bi诱导T细胞激活、增殖、细胞因子产生和靶肿瘤细胞溶解的能力。来自健康对照者的大量外周血单个核细胞(每孔50000个)与K3Bi(0、1、10、100和1000ng/ml)和肿瘤细胞(每孔5000个)共培养,以实现细胞效应细胞:靶细胞比例为10:1,如Zhang et al.,Cancer Immunol.Immunother.,63,121-132(2014)中所述。一个结果如附图5所示。相比于没有K3Bi的PBMC+MCF-7,PBMC+MCF-7+K3Bi展示出增加的肿瘤细胞杀伤,如附图5A所示。如本发明人之前所做的,用LDH释放测定检测细胞活力和细胞毒性。参考Zhou etal.,Oncoimmunology,4,e1047582(2015)。在用K3Bi处理的MDA-MB-231、MDA-MB-468和MCF-7细胞中,通过ELISA测定观察到增强的IFNγ的产生,如附图5B所示。未处理细胞、仅PBMC组或仅BiTE组作为对照,并且在这些对照组中未观察到IFNγ的产生。治疗携带HERV-K阳性MDA-MB-231乳腺癌细胞的免疫缺陷NSG小鼠,使用PBMC和CD3 HERV-KBiTE加IL-2或CD8HERV-K BiTE加PBMC加IL-2,导致肿瘤生长明显减少。如附图6所示。此外,231K细胞经过hu6H5与人免疫球蛋白G(huIgG)对照抗体的处理。活/死细胞检测试剂盒(Calcein AM,7-AAD)显示,与对照组huIgG相比,231K细胞在接受hu6H5处理后表现出增强的杀伤效果。
实施例11
CAR-A和CAR-B慢病毒载体转导的正常供体PBMC染色结果
来自正常供体的外周血单个核细胞(PBMCs)经两个CAR-T慢病毒载体构建转导,分别为K-CAR-A(CAR-A)或K-CAR B(CAR-B)。使用pWPT-GFP、psPAX2和pMD2g。
VH-VLhu6H5-CD8-CD28-4-1BB-CD3zeta。通过替代睡美人转导过程,即慢病毒转导,生成HERV-Kenv CAR-T细胞的方案如下:
1.解冻PBMC(2×107)并通过塑料吸附消减单核细胞(37℃孵育1小时,5%CO2)。
2.在补充有10%FBS、100U/mL盘尼西林、100μg/mL链霉素的RPMI1640(完全培养基)中培养消减单核细胞的PBMC。用抗CD3/CD28珠以珠:细胞为3:1的比例用40IU/mL的IL-2刺激T细胞24h。
3.用CAR-A或CAR-B转导激活的T细胞(CD19 CAR作为对照)。
4.转导后24小时,在含有300IU/mL IL-2和γ-辐照(100Gy)的MDA-MB-231-Kenv(Kenv是HERV-K的包膜蛋白)aAPC的完全培养基中以aAPC/T细胞为2:1的比例培养T细胞以刺激CAR-T细胞增殖。使用γ-辐照过的K562-CD19作为对照aAPC。
5.在第5天去除抗CD3/CD28珠。每两到三天用含有IL-2的新鲜培养基补充CAR-T细胞。
6.当增殖示出从对数期降低时使用CAR-T细胞进行进一步的实验。
CAR-A或CAR-B转导细胞与γ辐照(100Gy)的MDA MB 231抗原呈递细胞共培养。其他每一天都加入可溶IL-2细胞因子(50U/ml)。在第14天收获用于染色的细胞。首先在4℃下用1:1000稀释的BV450活和死染料对它们染色20分钟。在20min后,洗涤细胞并根据制造者的推荐用K10-AF 488蛋白(1μg/ml)、CD4 Amcyan、CD3 Pe cy7和山羊抗人IgG Fc AF 594抗体在4℃染色30min并用PBS洗涤。细胞用4%PFA固定15-30分钟,并在于流式细胞仪中分析前洗涤。样品呈GFP阳性,因其是用GFP+CAR-A/CAR-B转染的。
CD4+细胞的百分比是通过对那些BV450阴性且相应颜色阳性的人群进行选通来确定的。CD4-(称为CD8+细胞)的百分比是通过选择那些BV450阴性且CD4 Amcyan颜色阴性的人群来确定的。结果显示,与未经操作的T细胞相比,经CAR-A/CAR-B转导的CD4+PBMC的被K10标记的AF488蛋白染色百分比更高。这表明经CAR-A或CAR-B转导的T细胞被HERV-K10蛋白染色。
表达携带人源化或全人HERV-K scFv的慢病毒CAR表达载体的T细胞将有效地裂并杀死来自几种癌症的肿瘤细胞。慢病毒载体表达的人源化的K-CAR是泛癌种CAR-T。
实施例12
HERV-K特异性人源化嵌合抗原受体(K-CAR)疗法
发明人产生了人源化单链可变片段(scFv)抗体(实施例1),它能够与从重组HERV-K Env表面融合蛋白(KSU)(实施例3)和MDA-MB-231乳腺癌细胞裂解物产生的抗原结合。从这种人源化scFv产生的CAR被克隆到慢病毒载体中,并与疗法联合使用,该疗法包括但不限于K-CAR T细胞加检查点抑制剂、促炎细胞因子,如白细胞介素(IL)-12和IL-18、溶瘤病毒和激酶抑制剂(包括但不限于p-RSK、p-ERK)。
实施例13
从非常罕见的展示出强靶向特异性和高灵敏度的B细胞鉴定人治疗性抗体(hTAb)
从人适应性免疫系统生成全人治疗性抗体:为了直接利用乳腺癌患者的B细胞作为高亲和力抗体的来源,发明人进行了间接ELISA或免疫印迹实验,使用HERV-KEnv重组融合蛋白,用于检测来自几位乳腺癌患者的抗HERV-K Env特异性反应。选择具有较高抗HERV-K抗体滴度的患者进行单个B细胞分析。来自乳腺癌患者的PBMCs经多克隆激活:(1)使用照射的3T3-CD40L成纤维细胞激活两周。这种方法可以有效刺激和扩增CD40-B细胞至高纯度的大量细胞(>90%),并诱导其抗体的分泌;和(2)使用重组人IL-21、IL-2、可溶性CD40配体和抗-APO1进行体外培养四天。这种第二种方法可以在最短的培养时间内使最高百分比的B细胞分泌。IL-21促进抗体分泌细胞的分化。体外IL-2刺激可以诱导人浆细胞的分化,其需要T细胞的帮助达到诱导阈值。sCD40L与B细胞表面的CD40结合,以模拟T细胞介导的激活。由于激活还会诱导细胞死亡,因此使用抗-APO1来挽救B细胞免受Fas诱导的凋亡。检测到的细胞毒性B细胞很少。
研发平台以确定微孔板中每个细胞的结合动力学和细胞与细胞相互作用。微雕刻过程的详细信息,该过程能够在一段时间内筛选和监测B细胞相互作用,以实现单细胞克隆产生抗体的B细胞。聚二甲基硅氧烷(PDMS)中的纳米井阵列被制备出来,并且来自患者乳腺肿瘤组织的球状体产生的细胞在发明人的实验室中被用作确定乳腺癌细胞杀伤效果的靶标。来自同一供体的B细胞和球状体细胞(1:1比例)被加载到一个纳米井阵列中(每个孔一个细胞),然后通过重力使细胞沉降。在同一孔中显示了一个死亡的肿瘤细胞(红色)和一个B细胞。通过在玻璃盖片的相同位置检测到由该B细胞产生的抗HERV-K抗体。然后使用CellCelector进行RT-PCR挑选单个B细胞。我们的结果表明,HERV-K特异性记忆B细胞表现出抗HERV-K抗体表达以及对其自体乳腺细胞球的细胞毒性。
使用体内富集(IVE)适应的治疗性抗体发现:这个平台将能够分离出不仅能结合靶癌细胞还能杀死该细胞的抗体。该平台还将允许使用没有记忆B细胞的正常供体代替乳腺癌患者供体来生成hTAbs。由于能够产生用于治疗的治疗性抗体的B细胞即使在离体富集后也极为罕见,因此发明人开发了以下平台来鉴定非常罕见的hTAbs:
在第1天免疫野生型Balb/c小鼠(雌性,6周龄)的组(N=10/组)并在第3周和第5周加强。ELISPOT用于检测来自免疫小鼠(用HERV-K跨膜(TM)蛋白(小鼠M1至M4)或磷酸盐缓冲液(M5至M6)免疫)的CD8+T细胞的IFN分泌。ELISA分析用于检测免疫小鼠血清中的抗HERV-KIgG滴度。无论CpG或CDN的状态如何,与HERV-KEnv表面融合蛋白治疗的小鼠中检测到的抗体滴度更高。在接种了HERV-K表面融合蛋白的人类肿瘤小鼠模型MDA-MB-231(HTM1)或MDA-MB-468(HTM2)和接种了抗人IgGmAb的人源化小鼠(HM1和HM2)中,通过ELISA检测到抗HERV-K抗体滴度。
实施例13.1.在SCID/beige小鼠中采用体内富集技术(IVE:约20倍增强),允许快速扩增和B细胞激活,目标是产生大量抗原特异性浆母细胞。该平台将在最短8天的时间内从B细胞产生全人抗体。作为原理证明,发明人开发了一种体内富集技术,在从与MFP-2伴侣细胞融合第8天的脾细胞生成的杂交瘤细胞中产生全人抗寨卡病毒抗体的IVE技术。
最近,通过静脉内注射CD34+细胞(1-2x105/小鼠)用于生成HM并用HERV-K SU或PD-L1重组融合蛋白免疫,成功生成了人源化小鼠(HM)和人肿瘤小鼠(HTM)。
发明人还在乳腺脂肪垫中共同植入CD34+造血干细胞和5x104-3x106个三阴性乳腺癌患者源异种移植瘤(TNBC PDX细胞,或MDA-MB-231或MDA-MB-468TNBC细胞)以生成人类肿瘤小鼠。在接种TNBC PDX细胞后四周,以及在接种MDA-MB-231人类肿瘤小鼠模型后七周,分别定量了获得的huCD45+细胞中CD33、CD3和CD19+细胞的百分比,在共同植入CD34+造血干细胞的情况下。在接种CD34细胞后更长时间后,小鼠中hCD19+或hCD45+细胞的百分比较高。与抗原接触与肿瘤中HERV-K的表达相关联,并且检测到较高的抗体滴度(HTM2:40天vs HTM1:30天)。这一结果表明,接种乳腺癌细胞的小鼠可以产生抗HERV-K抗体。
这一结果促使利用人源化小鼠或人类肿瘤小鼠产生完全的人源化抗体,特别是利用从未接触过抗原的正常供体。缺乏T细胞、B细胞和NK细胞活性的NSG小鼠是建立人源化小鼠的理想候选者。利用免疫荧光染色,使用抗HERV-K mAb 6H5检测从人类肿瘤小鼠获得的MDA-MB-231肿瘤中HERV-K的表达。F-actin是对照。在肿瘤组织中也检测到huCD3+细胞。
通过ELISA检测了接种MDA-MB-231(HTM1)或MDA-MB-468(HTM2)的人类肿瘤小鼠模型以及HM1和HM2免疫的HERV-K SU Env蛋白后用抗人IgGmAb检测到的抗HERV-K抗体滴度。后来开发了人类CD45+细胞移植率较早期结果更高的小鼠,且没有显著毒性。
体内富集方案1.对于具有更高抗体滴度的癌症的供体,发明人使用人源化小鼠而不是标准的SCID/beige小鼠。来自乳腺癌患者的PBMCs(50x106)通过IL-21、IL-2、可溶性CD40配体和抗-APO1的多克隆激活,并与抗原(HERV-K或PD-L1;100μg)预混。使用EasySepTM人B细胞富集试剂盒(StemcellTechnologies)通过阴性选择从上述PBMCs中分离B细胞,并与在第0天用布司他芬(Fisher:30mg/kg腹腔内注射)处理的CD34细胞一起注入小鼠体内。小鼠接受细胞因子混合物的处理(第1、4和7天),并在第2天接受抗原的增强。该方案可以相对快速地完成(8天)。
体内富集方案2.对于未患癌症且没有记忆B细胞的正常供体,发明人使用经过修改的方案1:用细胞因子混合物(第1、7和14天)处理小鼠,并在第14和21天用抗原加强。从小鼠收集血清并通过ELISA测试结合亲和力。在检测到抗体滴度增加后,收获、分析脾脏并用于制备杂交瘤。使用体内富集方案2的小鼠在第2周检测到更高的抗体滴度。
实施例13.2.此后,收获一半脾脏用于流式细胞术分析、显微雕刻和其他分析。B细胞表面和细胞内标志物及CFSE标记的流式细胞术分析(Invitrogen CellTrace CFSE试剂盒)使用以下方法进行:与FITC、PE、PECy5、PECy7、Alexa 700或别藻蓝蛋白缀合的小鼠IgG1k的抗CD19 PECy5、抗CD27别藻蓝蛋白、抗CD38 PECy7、抗IgG FITC或抗IgM PE同种型对照(均来自BD Bioscience)。使用负磁免疫亲和珠分离(MiltenyiBiotec)从脾脏中分离总CD19+B细胞,并在存在重组人B细胞激活因子(BAFF;75ng/ml;GenScript)、IL-2(20IU/ml)、IL-10(50ng/ml)和IL-15(10ng/ml)(均来自BD Biosciences)的情况下,用CpG2006(10ng/ml;Oligos,Inc.)刺激细胞72小时。使用我们的多孔显微雕刻平台(多达400,000个孔),以其自体肿瘤细胞或HERV-K+TNBC细胞作为靶细胞,确定直接来自方案1或2的肿瘤杀伤B细胞。确定不仅产生抗体还能结合抗原并杀伤癌症细胞的细胞。
实施例13.3.发明人随后开发了人杂交瘤细胞以确保抗体的长期可用性。为了开发全人杂交瘤,使用MFP-2细胞作为伴侣,使用ClonaCellTM-HY(StemcellTechnologiesInc.,)按照它们的方案与剩余的一半脾脏一起生成杂交瘤。使用聚乙二醇(PEG)融合人淋巴细胞与MFP-2细胞,并使用该试剂盒中基于甲基纤维素的半固体培养基克隆和选择杂交瘤细胞。将选择后长出的克隆移入96孔板中,并通过ELISA筛选对HERV-K Env蛋白的反应性。使用来自Thermo Fisher Scientific的人IgG抗体同种型分析试剂盒确定阳性克隆的同种型。然后使克隆适应无血清培养基条件并扩增。收获杂交瘤上清液,并取决于人抗体的同种型使用Hi-Trap蛋白A或蛋白G柱纯化抗体。已知蛋白A柱与同种型IgG1、IgG2和IgG4抗体具有高亲和力,并且与同种型IgM抗体具有可变结合,而已知蛋白G柱与同种型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体具有高结合力,但不结合IgM抗体。
EXAMPLE 13.4.发明人在体外评估了从上述方案获得的候选B细胞的抗肿瘤功效,包括对细胞生长、增殖和凋亡的影响,正如发明人在常规实验室中所做的那样。还完成了评估hTAb在免疫缺陷小鼠模型中功效的体内研究以评估功效,使用乳腺癌细胞系和原发性肿瘤细胞,并与匹配的无关对照乳腺细胞进行比较。
实施例14
联合疗法
发明人的乳腺癌数据来自强烈支持涉及HERV-K的联合治疗方法的潜力。因此,靶向HERV-K的人源化和全人抗体将增强检查点阻断抗体的治疗功效。有效的组合癌症疗法包括但不限于以下的组合:(a)HERV-K hTAb(1.5mg/kg)、(b)K-CAT、(c)K-BiTE、(d)HERV-KshRNA或CRISPR/Cas9基因组编辑技术以敲低HERV-K基因表达、(e)或预防性或治疗性HERV-K疫苗,包括全长和截短的HERV-K Env蛋白和HERV-K Env肽,和(a)抗ICP抗体、(b)癌症化疗、(c)5-氮杂胞苷、5-氮杂-2’-脱氧胞苷或其他表观遗传调节剂,如DNA甲基转移酶抑制剂(DNMTi)和组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)、(d)EMT抑制剂,(e)细胞迁移或侵袭抑制剂,(f)诱导S或G2期细胞周期停滞,(g)PI3K/AKT/mTOR或MAPK/ERK信号传导途径的抑制剂,或(h)信号转导至HIF1α。
发明人使用结合HERV-K和免疫检查点检测方法评估了乳腺癌患者的基线免疫状态与HERV-K状态之间的关系。利用Luminex检测方法在包括DCIS和侵袭性乳腺癌在内的乳腺癌患者以及正常供体中确定了可溶性免疫检查点蛋白的表达。发明者比较了DCIS、侵袭性乳腺癌(aBC)和正常女性供体中六种ICP的表达。一个显着的发现是乳腺癌患者血浆中六种循环ICP的表达显著增强。另一个发现是患者在术后六个月或十八个月与术前(时间点1)相比,免疫检查点蛋白水平明显下降。观察到可溶性ICP分子水平与肿瘤中HERV-K表达诱导的HERV-K抗体滴度之间存在正相关。这一结果表明,HERV-K抗体滴度应影响乳腺癌中的ICP水平。因此,HERV-K的表达可以控制乳腺癌患者的免疫反应。
实施例15
抗CD3和CD8 BiTE序列数据
表3
抗CD8重链对齐
表4
抗CD8轻链对齐
IgG结构域的顺序:
VL-VH6H5---VH-VLhuCD3 or CD8+c-myc标签+FLAG or VL-VHhu6H5---VH-VLhuCD3 or huCD8+c-myc标签+FLAG.
CD8 BiTE:见SEQ ID NOs:35-36.
CD3 BiTE:见SEQ ID NOs:37-38.
用5种Map免疫小鼠,收集血清并使用多种HERV融合蛋白通过ELISA进行测试。只有HERV-K表面融合蛋白呈阳性。从用5种Map免疫的小鼠生成杂交瘤细胞中选择了一个scFv。对于针对HERV-K的MAPs的scFv(用于抗HERV-K单克隆抗体的序列),见SEQ ID NOs:45-46。
实施例16
可以用于抗体-药物缀合物以递送药物进入癌症细胞和肿瘤的靶向HERV-K的人源化抗体使用抗HERV-K 6H5-rGel抗体-药物缀合物观察到重组白树素(r-Gel)在HERV-K阳性的癌细胞中的传递。
重组白树素(r-Gel)毒素与6H5缀合。使用抗HERV-K 6H5单克隆抗体检测了DOV13卵巢癌细胞中HERV-K的表面和细胞质表达。在处理四小时后,使用抗rGel抗体检测到DOV13细胞中的r-Gel表达。
使用抗r-Gel抗体,在内化一小时后,在OVCAR3、SKBr3、MCF-7和MDA-MB-231细胞中检测到HERV-K env蛋白或r-Gel信号。发明人观察到目标细胞细胞质中HERV-K env蛋白和rGel毒素的共定位。与接受控制IgG治疗的小鼠相比,对接受6H5(p=0.0052)和6H5-r-Gel(p<0.0001)处理的MDA-MB-231细胞接种小鼠的抗肿瘤效果进行了比较。
在MDA-MB-231细胞中,经过裸金纳米粒子或6H5-GNP孵育两小时后,使用透射电子显微镜(TEM)检测到金纳米颗粒(GNP)。从用6H5-GNP或6H5scFV-GNP静脉内注射后24小时的小鼠分离的MDA-MB-231或SKBr3的肿瘤中使用银增强测定检测到GNP。金纳米颗粒在放射频场中产生的热量可杀死靶向肿瘤细胞。
实施例17
小鼠肿瘤结节中抗HERV-K抗体的体内成像
使用Nuance系统进行体内成像,在小鼠静脉注射抗HERV-K-Alexa647缀合物6H5-Alexa647,注射后24小时,小鼠的肿瘤结节中检测到更高密度的6H5。
实施方案的列表
HERV-K抗体治疗的具体组合和方法。本发明的范围应仅由权利要求定义。在生物医学领域具有普通技术水平的人将会在与上下文和本公开的精神一致的情况下以尽可能广泛的方式解释所有权利要求术语。本公开中的详细描述是说明性的而不是限制性的或详尽的。本发明不限于本说明书中描述的特定方法、方案和试剂,并且在实践中可能会有所变化。当说明书或权利要求描述了有序步骤或功能时,其他实施例可能会以不同的顺序或几乎同时执行它们的功能。如生物医学领域的普通技术人员所认识到的,在不脱离本说明书中描述的发明构思的情况下,除已经描述的那些之外的其他等同物和修改是可能的。
本说明书整篇中引用的所有专利和出版物均通过引用并入,以公开和描述与本说明书中描述的技术一起使用的材料和方法。仅提供在本说明书的申请日之前公开的专利和出版物。所有关于专利和出版物的公开和出版日期的陈述均来自发明人的信息和信念。发明人不承认这些文件的内容或日期的正确性。如果本说明书中提供的日期与实际发布日期之间存在差异,则以实际发布日期为准。由于在先发明或其他原因,发明人可能会提前此类公开。如果在先专利或出版物的科学或技术教导与本说明书之间存在差异,则以本说明书和这些权利要求书的教导为准。
当说明书提供数值范围时,该范围上限和下限之间的每个中间值都在数值范围内,除非上下文另有规定。
本说明书中提供的实施方案为:
1.与人内源逆转录病毒-K(HERV-K)结合的分离的抗体,其包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)。人源化抗HERV-K抗体能够减少肿瘤的生长,尤其是减少向肺、淋巴结和其他器官的转移。
2.根据实施方案1的抗体,其包含人源化或人框架区。
3.根据实施方案1的抗体,其中所述抗体是HERV-K拮抗剂。
4.分离的核酸,其包含编码实施方案1的HCVR、LCVR或其组合的核苷酸序列。
5.表达载体,其包含实施方案4的核酸。
6.宿主细胞,其用实施方案5的表达载体转化而得。
7.产生包含HCVR、LCVR或其组合的抗体的方法,所述方法包括:在使得宿主细胞表达包含HCVR、LCVR或其组合的抗体的情况下培养实施方案1的宿主细胞;并分离包含HCVR、LCVR或其组合的抗体。
8.治疗哺乳动物中的癌症的方法,其包括向有此需要的哺乳动物施用有效量的根据实施方案1中的抗体。
9.治疗癌症的方法,其包括向有此需要的个体施用有效量的抗体-药物缀合物,所述抗体-药物缀合物包括包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体,其中:VH区包含CDR1、CDR2和CDR3,并且VL区包含CDR1、CDR2和CDR3,其中所述抗体经由接头与细胞毒性药物、澳瑞他汀或功能性肽类似物或其衍生物缀合。
10.实施方案9的方法,其中所述抗体-药物缀合物与一种或多种额外的治疗剂联合施用。
11.实施方案9的方法,其中一种或多种额外的治疗剂包含化疗剂。
12.实施方案9的方法,其中所述癌症选自黑色素瘤、慢性淋巴细胞白血病、乳腺癌、胰腺癌、头颈癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠直肠癌、睾丸癌、胃癌、肾癌、子宫内膜癌、子宫癌、膀胱癌、前列腺癌、食管癌、肝癌和非小细胞肺癌。
13.为CAR T、CAR NK和BiTE研究开发的人源化抗体。
14.实施方案9的方法,其中所述抗体是全长抗体
15.实施方案9的方法,其中所述抗体是人单克隆IgG1或IgG4抗体。
16.实施方案9的方法,其中所述澳瑞他汀是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)或单甲基澳瑞他汀F(MMAF)。
17.实施方案9的方法,其中所述细胞毒性药物为emtansine(DM1);奥佐米星(calicheamicin);德鲁替康(DXd);戈维替康(SN-38);马福多丁(MMAF);
duocarmazine(duocarmycin);BAT8001(美登素)索星(DM4);或替西林(PBD)。
18.实施方案9的方法,其中所述接头附接至通过抗体的部分还原获得的抗体的巯基残基。
19.实施方案9的方法,其中所述接头-澳瑞他汀是vcMMAF或vcMMAE。
20.早期检测、转移或HERV-K加免疫检查点生物标志物,基本上如本文所述。
21.过表达HERV-K的癌细胞作为本发明的抗HERV-K人源化抗体和抗体-药物缀合物的靶标。
22.从细菌(HUM1和HUM2)或哺乳动物细胞中生成的hu6H5克隆(FWJ1和FWJ2)。
23.针对T细胞CD3或CD8的BiTE,以及针对肿瘤相关抗原HERV-K的人源化单链抗体,包括针对CD3或CD8和HERV-K的抗体。
24.T细胞,其表达携带人源化或全人HERV-KscFv的慢病毒CAR表达载体。
25.人源化单链可变片段(scFv)抗体,其能够与从重组HERV-KEnv表面融合蛋白(KSU)和表达HERV-K Env蛋白的癌细胞裂解物产生的抗原结合。
26.由实施方案28的人源化scFv产生的CAR,其任选地克隆到慢病毒载体中。
27.由实施方案28的人源化scFv产生的克隆入慢病毒载体的CAR,其克隆到慢病毒载体中,用于联合疗法。
28.改进的体内富集方法,用于无记忆B细胞的供体的快速扩增和B细胞激活,其包括以下步骤:在第1、7和14天用细胞因子混合物处理小鼠,和在第14和21天用抗原加强小鼠。
29.细胞,其不仅能产生抗体,抗体还能结合抗原并杀伤癌细胞,并且表达抗原的细胞能被抗体杀死。
30.乳腺癌患者血浆中六种循环免疫检查点蛋白的表达显著增强。
31.用HERV-K免疫检查点抑制剂阻断免疫抑制结构域(ISD)的方法。
32.实施方案31的方法,其中HERV-K的免疫检查点抑制剂选自靶向HERV-K的ISD的单克隆抗体和药物。
33.靶向HERV-K的人源化和全人抗体,其用于增强检查点阻断抗体治疗功效。
34.从用5种多抗原肽(MAPS)免疫的小鼠中产生新抗体的方法,所述所述5种多抗原肽(MAPS)是从癌症患者产生的HERV-K SU蛋白生成的。
35.生产HERV-K CAR A:VH-VLhu6H5-CD8-CD28-4-1BB-CD3zeta的方法。
参考文献
分子生物学领域的普通技术人员在制造和使用本发明时可以使用这些专利、专利申请和科学参考文献作为可预测结果的指导
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Claims (21)
1.一种分离的 HERV-K 拮抗剂抗体,其与人内源性逆转录病毒-K (HERV-K) 包膜蛋白结合,其包含:
(a)人源化或人框架区;
(b)包含CDR序列的重链可变区(HCVR),GYSFTGYY (SEQ ID NO: 52), VNPNSGGT (SEQID NO: 53), 和ARSKGNYFYAMDY (SEQ ID NO: 54);
(c)包含CDR序列的轻链可变区(LCVR), ASESVDSHGTSF (SEQ ID NO: 56), RASN (SEQID NO: 56), 和QQSNEDPPT (SEQ ID NO: 57)
(d)结合全长 HERV-K 包膜 SU 结构域。
2.根据权利要求1所述的抗体,进一步包括从以下组中选取的接近CDR边界的序列:VRQAPGKGLEW (SEQ ID NO: 46)和LQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 47)。
3.根据权利要求1所述的抗体,其中所述抗体是HUM1抗体。
4.根据权利要求1所述的抗体,其中所述抗体是hu6H5抗体。
5.根据权利要求1所述的抗体,其用于减少肿瘤生长。
6.根据权利要求1的抗体,其用于减少肺部、淋巴结或其他器官的转移。
7.一种分离的核酸,其包含编码权利要求1所述的HCVR、LCVR或其组合的核苷酸序列。
8.一种表达载体,其包含权利要求7所述的核酸。
9.一种用权利要求8所述的表达载体转化的宿主细胞。
10.一种治疗哺乳动物中癌症的方法,其包括向有此需要的哺乳动物施用有效量的根据权利要求1所述的抗体。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述抗体经由接头与细胞毒性药物、澳瑞他汀或功能性肽类似物或其衍生物缀合。
12.根据权利要求10所述的方法,其中所述癌症选自黑色素瘤、慢性淋巴细胞白血病、乳腺癌、胰腺癌、头颈癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠直肠癌、睾丸癌、胃癌、肾癌、子宫内膜癌、子宫癌、膀胱癌、前列腺癌、食管癌、肝癌和非小细胞肺癌。
13.一种人源化抗体,其用于CAR T、CAR NK或BiTE测定。
14.一种人源化抗体,其用于CAR T、CAR NK或BiTE测定中,其中所述测定用于开发CART、CAR NK或BiTE。
15.一种结合人CD3 T细胞或CD8 T细胞的分离的抗体,包含:
(a)重链可变区(HCVR),包含CDR序列SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO.25,或SEQ ID NO. 27;和
(b)轻链可变区(LCVR),包含CDR序列SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO.32,或SEQ ID NO. 33。
16.一种BiTE,包含针对CD3或CD8T细胞的抗体;和一种人源化scFv 抗体,针对肿瘤相关抗原HERV-K。
17.一种T细胞表达慢病毒CAR载体,携带人源化或全人源HERV-K scFv。
18.一种人源化单链可变片段(scFv)抗体,其能够结合来自HERV-K Env表面融合蛋白(KSU)和癌细胞裂解HERV-K Env蛋白的抗原。
19.一种CAR,来自权利要求18所述的人源化HERV-K scFv。
20.一种用HERV-K的免疫检查点抑制剂阻断免疫抑制结构域(ISD)的方法。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述HERV-K的免疫检查点抑制剂选自单克隆抗体和靶向HERV-K的ISD药物。
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