JP2020037571A - Ｔｍｃｃ３の阻害による、癌を抑制するための方法 - Google Patents

Abstract

【課題】乳癌など癌を治療するための方法、癌の状態を診断又は評価する方法、サンプルにおける癌幹細胞の存在を示す方法の提供。【解決手段】特定のＣＤＲ配列を含む、膜貫通コイルドコイル・ドメイン・タンパク質３（ＴＭＣＣ３）に対する抗体、又はその結合フラグメント。【選択図】図７

Description

本発明は、癌治療の分野に関する。具体的には、本出願は、癌に関する治療的応答の早期検出、予知および予測のための癌細胞のバイオシグネチャに関する。より具体的には、本発明は、癌幹細胞バイオマーカーである膜貫通−コイルドコイル・ドメインファミリー３（ＴＭＣＣ３）を介して癌を診断および治療するための方法に関する。

癌死の大部分は、原発性腫瘍の影響によるよりむしろ、再発性または転移性疾患の結果として生じる。腫瘍は、蓄積した突然変異による無限の増殖に関する能力を獲得した腫瘍化癌細胞により開始される、異常な臓器としてみることができる。異常な臓器としての腫瘍のこの観点では、正常な幹細胞生物学の原理を用いて、腫瘍がどのように発達して広まるのかをより良く理解することができる。多くの観察は、正常な幹細胞と腫瘍化細胞との間の類似性が妥当であることを示唆する。正常な幹細胞および腫瘍化細胞の両方とも、広範囲の増殖能および新しい（正常または異常な）組織を引き起こす能力を有する。腫瘍化細胞は、正常な幹細胞が行うものと類似する器官形成の、異常で調節が不十分なプロセスを受ける癌幹細胞（ＣＳＣ）として考えることができる。腫瘍および正常な組織の両方とも、異なる表現型特徴および異なる増殖能を有する細胞の異種の組み合わせからなる。

癌幹細胞は、幹細胞様の特性を有する腫瘍細胞の小画分であり、腫瘍性クローンを開始および維持すると考えられている。これらの細胞は自己再生する能力を有するが、表現型的に多様な癌細胞を生じさせるが腫瘍形成能がより低い前駆細胞も引き起こす。この幹様細胞の亜集団は、癌幹細胞でない腫瘍細胞と比較して腫瘍形成が非常に効率的であるはずである。

癌幹細胞（ＣＳＣ）は、メラノーマ、髄芽腫、結腸、肝臓、肺、前立腺、乳房および卵巣の腫瘍を含む多種多様の癌において現在同定されている。ＣＳＣは、常に正常な幹細胞から生じるわけではないが、それらは度々、正常な幹細胞において見られるマーカーを用いて分離されている。例えば、マーカーＣＤ１３３を用いて、正常な成体の造血性および神経系の幹細胞が同定されている。現在では、ＣＤ１３３をうまく用いて、メラノーマ、髄芽腫、結腸および前立腺の腫瘍からＣＳＣが濃縮されている。

癌幹細胞の存在は、癌治療のための奥深い意味合いがある。現在では、腫瘍における全ての表現型的に多様な癌細胞は、まるでそれらが無制限の増殖能を有し、転移する能力を獲得することができるかのように治療される。しかしながら、長年の間、少数の播種性癌細胞が、転移性疾患が決して現れない患者において、原発性腫瘍から離れた部位で検出され得ることが認識されている。１つの可能性としては、ほとんどの癌細胞は新しい腫瘍を形成する能力がないので、希少な癌幹細胞の播種のみが転移性疾患を導き得るということである。それ故に、治療のゴールは、この癌幹細胞集団を同定して殺すことである必要がある。

治療は腫瘍量を縮小するそれらの能力により同定されるので、既存の治療は、主に、腫瘍細胞の混合集団に対して開発されている。しかしながら、癌におけるほとんどの細胞は増殖能が制限されているので、腫瘍を縮小する能力は、主に、これらの細胞を殺す能力を反映する。癌幹細胞に対してより特異的に向けられる治療は、より持続的な反応および転移腫瘍の治癒をもたらし得る。

癌幹細胞（ＣＳＣ）の存在は、様々なヒトの癌において示されている。これらのＣＳＣは、自己再生、分化に関する能力を保有し、化学療法剤および放射線に対する抵抗性を見せ、臨床的寛解の何年も後に腫瘍再発の原因となり得る（２、３）。

最近の証拠は、腫瘍内の細胞が異種であって異なる発達段階を表わすことを示す（Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６：９３３９−９３４４）。特定のタイプの癌では、癌幹細胞と呼ばれる細胞の集団が同定されていて、癌幹細胞は、自己再生する能力、および、腫瘍を含む癌細胞の異種系統を生じさせる能力を有する細胞として同定される。実験的に、そのような細胞は、連続的に増殖する腫瘍を産生する能力を有するものである（Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６：９３３９−９３４４）。癌幹細胞は、正常な幹細胞から生じ得るが、細胞内での一連の変異原性の事象に潜在的に起因して自己再生する能力を獲得する細胞からも生じ得る。特定のタイプの癌における癌幹細胞の役割について、かなりの興味が存在する。癌幹細胞の存在と関連している癌のタイプは、乳癌（Ａｌ−Ｈａｊｊ ｅｔ ａｌ．２００３．ＰＮＡＳ １００：３９８３−３９８８）、膵癌（Ｈｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １：３１３−３２３）、脳腫瘍（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．２００４．Ｎａｔｕｒｅ ４３２：３９６−４０１）、および精巣癌（Ｈｏｕｌｄｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２４：５５１２−５５１８；Ｃｌａｒｋ Ａ．Ｔ．２００７．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ．３：４９−５９を含む。

癌に対する治療をデザインするためには、正常な細胞に存在しない、癌または癌幹細胞の分子標的を探すことが望ましい。多くの化学療法薬および標的治療薬が癌の治癒率を改善しているが、薬剤耐性の発達のせいで、再発性疾患は挑戦が残っている。したがって、癌に関する治療的応答の早期検出、予知および予測のためのバイオシグネチャを同定することが重要である。これまでに、癌の早期検出に特異的な、信頼性があり確証されたバイオマーカーは存在しない。

特異的なマーカーを用いてこれらの癌幹細胞を同定し、それから、これらのマーカーを使用して癌幹細胞に特異的な治療法を開発することができることが非常に望ましい。本発明は、この問題を対処する。

本発明は、浸潤性の低い株および非−ＢＣＳＣと比較して、浸潤性の乳癌細胞株および乳癌幹細胞（ＢＣＳＣ）において、ＴＭＣＣ３のより高い発現が生じるという新規の知見に基づく。

癌幹細胞は転移する傾向があり、そして、化学療法および放射線に対して相対的に抵抗性であるということを示す証拠が増えている。したがって、ＣＳＣに向けた治療のための新規の標的の開発に導き得る乳癌幹細胞（ＢＣＳＣ）の分子特徴を理解することが重要である。

ＢＣＳＣおよび非−ＢＣＳＣのホスホプロテオミクス分析を通して、我々は、膜貫通およびコイルドコイル・ドメインファミリー３（ＴＭＣＣ３）の示差的発現を同定した。ＴＭＣＣ３はＴＥＸ２８ファミリーに属し、内在性膜タンパクであると予測される。ＴＭＣＣ３の機能は未知である。

ＴＭＣＣ３は、細胞の生存、増殖、転移、ならびに、乳癌幹細胞の維持および自己再生に必須であり、様々な癌において、ＴＭＣＣ３の発現がより高いことは、不十分な臨床転帰と相関する。

我々は、浸潤性の乳癌細胞株およびＢＣＳＣにおいて、それぞれ、非浸潤性の乳癌細胞株および非−ＢＣＳＣよりも高いＴＭＣＣ３の発現を見いだした。加えて、ＴＭＣＣ３発現は、マウスでのヒト乳癌異種移植の原発性腫瘍よりも、離れたリンパ節転移で高かった。ＴＭＣＣ３のサイレンシングは、ＡＬＤＨ活性およびマンモスフェア形成の低減とともに、アポトーシス細胞の増大に伴いＧ１期の停止をもたらし、それらは癌幹細胞の重要な特性である。我々の以前の研究では、ＩＧＦ−１Ｒ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲパスウェイは、ＢＣＳＣの生存および維持に重要であることが示された。このパスフェイにおけるＴＭＣＣ３のあり得る関与を調べるために、我々は、ＴＭＣＣ３のノックダウンにより、ＢＣＳＣにおいてＡｋｔリン酸化が喪失することを見いだした。これらの知見は、乳癌細胞の生存、自己再生および転移にＴＭＣＣ３が必須であることを示唆する。したがって、ＴＭＣＣ３の阻害は、幹細胞を標的とした新規の治療戦略を提供し得る。

ＴＭＣＣ３は、抗−ＴＭＣＣ３抗体を用いたＦＡＣＳソーティングによるＢＣＳＣ濃縮に関するバイオマーカーとして機能することができる。また、分化を受けているｈＥＳ細胞に関するマーカーとしても機能し得る。

ＴＭＣＣ３に対して産生されるモノクローナル抗体は、ＣＳＣ−標的剤として、ＢＣＳＣの表現型の特性化、ＴＭＣＣ３の分子分析を促進することができる。したがって、ＴＭＣＣ３は、癌幹細胞を標的化するための新規の治療戦略を提供する。そのような試みは、乳癌および他の癌の分子生物学およびＣＳＣに対する新たな見識を提供し、癌幹細胞を標的とする治療戦略の設計を促進する。

本発明の実施態様によれば、膜貫通コイルドコイル・ドメイン・タンパク質３（ＴＭＣＣ３）に対する抗体、またはその結合フラグメントは、配列番号２０〜１４３から選択されるＣＤＲＨ１配列、配列番号１４４〜２６７から選択されるＣＤＲＨ２配列、配列番号２６８〜３９１から選択されるＣＤＲＨ３配列、配列番号３９２〜５１５から選択されるＣＤＲＬ１配列、配列番号５１６〜６３９から選択されるＣＤＲＬ２配列、および配列番号６４０〜７６３から選択されるＣＤＲＬ３配列を含んでよい。

本発明の一部の実施態様によれば、請求項１に記載の抗体、またはその結合フラグメントは、ＣＤＲＨ１配列は配列番号１０２）であり、ＣＤＲＨ２配列は配列番号２２６）であり、ＣＤＲＨ３配列は配列番号３５０）であり、ＣＤＲＬ１配列は配列番号４７４）であり、ＣＤＲＬ２配列は配列番号５９８）であり、ＣＤＲＬ３配列は配列番号７２２である。

本発明の一部の実施態様は、癌を治療するための方法に関する。本発明の実施態様によれば、癌を治療するための方法は、それを必要とする対象に、膜貫通コイルドコイル・ドメイン・タンパク質３（ＴＭＣＣ３）に対する抗体、またはその結合フラグメントを投与するステップを含み、ここで、当該抗体は任意の上述の抗体である。

本発明の一部の実施態様は、癌の状態を診断または評価するための方法に関する。本発明の実施態様によれば、癌の状態を診断または評価する方法は、サンプルにおける膜貫通コイルドコイル・ドメイン・タンパク質３（ＴＭＣＣ３）の発現または活性のレベルを評価するステップを含み、ここで、標準と比較したＴＭＣＣ３の発現または活性のレベルの増大は、サンプルにおける癌幹細胞の存在を示す。

上述の方法によれば、癌を診断または評価するための方法は、抗体またはその結合フラグメントを使用し、ここで抗体は、任意の上述の抗体である。

任意の上述の実施態様によれば、癌は、乳癌、前立腺癌、膵癌、肺癌、および肝癌からなる群より選択される。本発明の一部の実施態様によれば、癌は乳癌である。

本発明の一部の実施態様は、癌幹細胞を位置特定または撮像する方法に関する。本発明の実施態様に係る方法は、抗体またはその結合フラグメントを使用し、ここで抗体は、任意の上述の抗体である。

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の特定の態様をさらに説明するように含まれ、その発明は、本明細書に示される特定の実施態様の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つまたは複数を参照することにより、より良く理解することができる。

浸潤性乳癌細胞株、胸部ＣＳＣおよび転移細胞における、ＴＭＣＣ３のより高い発現を示す。図１：ＡＳ−Ｂ１４５、Ｈ１８４Ｂ、Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫＢＲ３、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−１５７細胞株における、ＴＭＣＣ３タンパク質発現。図１Ｂ：ＢＣＳＣおよび非−ＢＣＳＣにおける、ＴＭＣＣ３のタンパク質レベル。図１Ｃ：乳腺脂肪体内で増殖した腫瘍におけるＴＭＣＣ３^＋細胞（図１Ｃ−原発性腫瘍）、および、６．９％は腫瘍細胞を含む同側性リンパ節におけるもの（図１Ｃ−同側性ＬＮ）。図１Ｄ、肺病変、腫瘍を有する同側性リンパ節、および、乳腺脂肪体内で増殖した原発性腫瘍における、ＴＭＣＣ３のＩＨＣ染色。

様々な癌組織におけるＴＭＣＣ３のより高い発現を示し、高い発現は、不十分な臨床転帰と相関する。図２Ａ：カプラン・マイヤー分析は、ＴＭＣＣ３の発現がより高い乳癌患者は生存率がより低いことを示す（ｐ値＜０．０５）。図２Ｂ：子宮頸癌、前立腺癌、膵癌、肺癌、膠芽腫、皮膚癌、肝癌および甲状腺乳頭部癌腫における、正常な組織と比較した、癌部分でのＴＭＣＣ３のｍＲＮＡレベル。図２Ｃ：乳癌だけでなく、結腸直腸癌、肺癌および卵巣癌においても、ＴＭＣＣ３のより高い発現は、不十分な患者の成果と相関する。 ＴＭＣＣ３が、ＢＣＳＣにおけるＡＬＤＨ^＋集団およびマンモスフェア形成に寄与し、ＢＣＳＣ集団の濃縮に関するマーカーとなり得ることを示す。図３Ａ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＡＳ−Ｂ１４５における、それぞれマンモスフェア形成細胞および単層培養（接着細胞）内のＴＭＣＣ３のタンパク質レベル。図３Ｂ：ｓｈＲＮＡ−ＴＭＣＣ３をトランスフェクトした細胞およびコントロールのｓｈＲＮＡをトランスフェクトした細胞における、スフェア数（ｐ値＜０．００１）。図３Ｃ：ＴＭＣＣ３−サイレンスおよびコントロール細胞における、ＡＬＤＨ活性。図３Ｄ：ＣＤ４４^＋ＴＭＣＣ３^＋Ｈ２ｋｄ⁻細胞およびＣＤ４４^＋ＴＭＣＣ３⁻Ｈ２ｋｄ⁻細胞における、マンモスフェアの数。 ＢＣＳＣにおける細胞増殖および自己再生を調節するためのＡｋｔおよびＥＲＫ１／２シグナル伝達に、ＴＭＣＣ３が極めて重要であることを示す。図４Ａ：非−標的化ｓｈＲＮＡをトランスフェクトした細胞と比較した、ｓｈＲＮＡ−ＴＭＣＣ３トランスフェクション後のＡｋｔに対するＡｋｔ^{ｓｅｒ４７３}の相対倍率。図４Ｂ：ｓｈＲＮＡ−ＴＭＣＣ３トランスフェクション後４８時間および７２時間における、非−標的化ｓｈＲＮＡをトランスフェクトした細胞の、ＥＲＫ１に対するＥＲＫ１^{ｔｈｒ２０２}およびＥＲＫ２に対するＥＲＫ２^{ｔｙｒ２０４}の相対倍率。図４Ｃ：ＴＭＣＣ３−ＡおよびＴＭＣＣ３−Ｃをトランスフェクトした細胞における、Ａｋｔに対する蛍光体−Ａｋｔ、および、蛍光体−ＥＲＫ１／２のそれぞれの相対倍率。図４Ｄ：増殖速度は、コントロールベクターをトランスフェクトした細胞と比較して、ＴＭＣＣ３−ＡおよびＴＭＣＣ３−Ｃをトランスフェクトした細胞でより高い。図４Ｅは、ＴＭＣＣ３−ＡおよびＴＭＣＣ３−Ｃをトランスフェクトした細胞が、コントロールベクターをトランスフェクトした細胞のものよりも高い細胞密度を見せることを示す。 ＡＳ−Ｂ６３４細胞で行なった、トランスウェル遊走分析の結果を示す。図５Ａは、遊走細胞の数が、非−標的化レンチウイルスコントロール細胞と比較して、ＴＭＣＣ３−サイレンス細胞において低減したことを示す。図５Ｂは、リン酸化ＦＡＫ^{ｔｙｒ３９７}の相対倍率およびリン酸化Ｓｒｃ^{ｔｙｒ４１６}の相対倍率を示す。 ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣまたはｈＥＳ）および胚様体（ｈＥＢ）における、ＴＭＣＣ３の発現を示す。図６Ａは、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）よりも、１６日のアウトグロウス（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）ヒト胚様体（ｈＥＢ）において、ＴＭＣＣ３の発現がより高いことを示す。図６Ｂは、ＴＭＣＣ３陽性細胞はｈＥＢの外層に分布したが、Ｔｒａ−１−６０によりマークされた未分化細胞は、主に、アウトグロウス（ｏｕｔ−ｇｒｏｗｔｈ）ｈＥＢの内側部分に留まることを示す。 コイル間領域をまたがる２つのコイル領域を含む細胞外ドメインを含む、ＴＭＣＣ３の推定二次構造を示す。２つの膜貫通ドメインおよび短い細胞質ドメインは、分子のＣ末端の近くに位置する。ＴＭＣＣ細胞外ドメインおよびコイル間ドメインの様々なフラグメントも示す。これらのフラグメントは、ファージパニングおよび結合アッセイのために構築される。これらのフラグメントの精製および検出を促進するために、これらのフラグメントは、それらのＣ末端に、免疫グロブリン定常フラグメントおよび／またはヒスチジンタグ（例えば、１０Ｈｉｓタグ）でタグ付けられる。これらのフラグメントは細胞外ドメインの異なる欠失を表わすので、それらは、以下に記載のように本発明の抗体のエピトープのマップに用いることもできる。 ２つのＴＭＣＣ３フラグメントの生産のための２つの例示的なベクター構築物を示す。一方のベクターは細胞外ドメイン全長（すなわち、ＴＭＣＣ３_ΔＴＭ−Ｆｃ）の生産のためのものであり、もう一方はコイル間フラグメント（すなわち、ＴＭＣＣ３−コイル間−Ｆｃ）の生産のためのものである。 ファージディスプレイを用いてＴＭＣＣ３またはそのフラグメントに結合する抗体（例えば、Ｆｖ可変フラグメント）をスクリーニングするフローチャートを示す。図９に示すように、例えば、そのプロセスは、所望の抗原（例えば、ＴＭＣＣ３またはそのフラグメント）でチャレンジされたマウス由来のｃＤＮＡライブラリーをまず構築するステップを含んでよい。ライブラリーは、Ｆａｂフラグメントまたは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の生産のために構築され得る。潜在的なＦａｂまたはｓｃＦｖクローンを含むファージライブラリーは、細菌内で増殖され、それから、ヘルパーウイルスにより放出される。放出されたファージは、それから、抗原フラグメント（例えば、図７に示すＴＭＣＣフラグメント）に結合することが可能である。磁気ビーズまたはＥＬＩＳＡプレートのいずれかを用いて、抗原フラグメントに結合するファージを分離し得る。パニングのプロセスを数回繰り返して、陽性ファージクローンを濃縮し得る。最後に、確認後、陽性ファージクローン由来の配列情報を用いてＦａｂまたはｓｃＦｖを発現し得る。 ２回目のパニング由来のＴＭＣＣ３コイル間−Ｆｃフラグメントに結合する、様々なファージクローンの結果を示す。また、バックグラウンドコントロールペプチドであるＶＥＧＦＲ２−Ｆｃ（Ｒ２−Ｆｃとして示されるＶＥＧＦレセプター２型フラグメント）に対するこれらのクローンの結合も示す。この表に示されるように、いくつかのクローン（例えば、３Ｂ−１２）は、バックグラウンドコントロールペプチドに対する有意な結合を示し、それは、両方のタンパク質フラグメントに共通のＦｃ部分に対する結合に起因し得る。したがって、これらのクローンは、さらなる研究の候補でない。 ファージスクリーニングによる可変領域および免疫グロブリンの定常領域を含む、いくつかのキメラ抗体全長のＥＬＩＳＡ結合アッセイの結果を示す。ＴＭＣＣ３コイル間−Ｆｃ−１０Ｈｉｓを結合標的として用いて行なわれた結合アッセイは、３Ｂ−５クローンを除いて、ほとんどのキメラ抗体が、良好な結合アフィニティ（１０^−１０Ｍの範囲内の解離定数）を有することを示した。例えば、クローン４−８４は、解離定数１．１３×１０^−１０Ｍ（すなわち、０．１１３ｎＭ）を有し、それは治療的適用に十分である。 ＢＩＡｃｏｒｅを用いた結合カイネティクスの結果を示す。結合は、ＴＭＣＣコイル間−Ｆｃ−１０Ｈｉｓを用いて行ない、クローン３８−８または３８−４５と結合させた。カイネティクス曲線は、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、および３．１２５ｎＭの被分析物濃度を用いた結合を示す。図１２Ａでの結果は、ｐＨ５．５で９００反応単位の最大反応に設定した機械を用いて行ない、一方で、図１２Ｂに示されるものは、２００ＲＵおよびｐＨ５．５の最大反応に設定した機械を用いて行なった。結合および解離のカイネティクス（被分析物の添加後または洗浄後の曲線における増加および減少の速度）に基づき、カイネティクス定数（会合速度（ｋ_ａ）および解離速度（ｋ_ｄ））および平衡定数（すなわち、結合定数、Ｋ_Ｄ）は、任意の適切なカイネティクス分析プログラムを用いて計算され得る。これらのパラメーターを図１２Ａおよび図１２Ｂに示す。 図１２Ａおよび図１２Ｂに示すものと同様に、ＢＩＡｃｏｒｅ解析（表面プラズモン共鳴）に基づく、様々なクローンに関するカイネティクス定数および結合定数の要約を示す。 本発明の様々な抗体クローンのエピトープマッピングの結果を示す。上述のとおり、様々なＴＭＣＣ３コイル間フラグメントを構築した。これらのフラグメントは、コイル間ドメイン内の異なる位置に欠失を表わす。したがって、異なるＴＭＣＣ３コイル間フラグメントに対する異なる結合に基づいて、抗体と結合する特定のエピトープを推定することができる。例えば、この表から、クローン３Ｂ−２２は、コイル間ドメイン全長（Ｔｉｃ１−１２８）、コイル間ドメインの最初の３０アミノ酸を有するフラグメント（Ｔｉｃ１−３０）、および、コイル間ドメインの最初の６７アミノ酸を含むフラグメント（Ｔｉｃ１−６７）に良好に結合する。これらの結果に基づき、３Ｂ−２２クローンに関する結合エピトープは、コイル間ドメインの最初の３０アミノ酸内に位置すると結論付けることができる。同様に、クローン３Ｂ−６６および４−８４は、全長（Ｔｉｃ１−１２８）およびＴｉｃ１−６７に良好に結合するが、Ｔｉｃ１−３０には結合しない。これらの結果は、それらの結合エピトープは、アミノ酸３０と６７との間に位置することを示す。 様々な抗体の、ＴＭＣＣ３発現細胞（すなわち、ＡＳ−Ｂ６３４（ｐ１５））に対して結合する能力を示す。示されるように、ほとんどのクローンが、細胞に対して良好に結合する（具体的には、クローン４−８４、３Ｂ−２２、および３Ｂ−８）。 様々な抗体の、別のＴＭＣＣ発現細胞（ＭＤＡ ＭＢ２３１）に対して結合する能力を示す。繰り返しになるが、ほとんどのクローンが、この細胞株に対して非常に良好に結合する。具体的には、クローン４−８４、３Ｂ−２２、３Ｂ−４５、３Ｂ−８、３Ｂ−５、および３Ｂ−６６は、この細胞株に対して非常に良好に結合する。 蛍光細胞ソーティングにより分析した、患者由来のヒトＢＳＣＳ細胞（ＢＣ０１４５）に対する、抗−ＴＭＣＣ３コイルドリンカー抗体（クローン３Ｂ−４５）の結合の結果を示す。上のパネルでは、細胞を、ネガティブコントロール抗体であるＩｓｏ−抗体により処理し、下のパネルでは、細胞を抗−ＴＭＣＣ３抗体（３Ｂ−４５）により処理した。上のパネルに示されるように、細胞は約５７．８％のＣＤ４４＋細胞を含み、一方で、下のパネルは、ＣＤ４４＋のみであるものが４１．９％であり、ＣＤ４４＋およびＴＭＣＣ３＋の両方であるものが１７．４％であることを示す。加えて、ＴＭＣＣ３＋であるがＣＤ４４−であるものは細胞の約８．４％である。 ３つの異なる乳癌細胞株（ＡＳ−Ｂ６３４、ＭＤＡ ＭＢ２３１、およびＴ４７Ｄ）に対する、様々な抗体の結合を要約する棒グラフを示す。この棒グラフに示されるように、ＡＳ−Ｂ６３４に対する３Ｂ−２２の結合が特に強く、Ｔ４７Ｄに対する４−８４の結合も同様である。 前立腺癌細胞株（ＰＣ３）に対する、様々な抗体の結合を示す。これらのＦＡＣＳデータに示されるように、３Ｂ−２２および４−８４の結合が非常に強く、一方で、ほとんどの抗体が、この前立腺癌細胞株に対して結合する。 膵癌細胞株（ＡｓＰＣ１、ＭＩＡ−Ｐａｃａ２、およびＰＬ４５）に対する、様々な抗体の結合を示す。示されるように、ほとんどの抗体が、これらの膵癌細胞株に対して有意な結合を有し、一方で、３Ｂ−２２の結合が特に強い。 肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈ２２Ｔ／ＶＧＨ、およびＨ５９Ｔ／ＶＧＨ）に対する、様々な抗体の結合を示す。示されるように、３Ｂ−２２および４−８４の結合が非常に強く、一方で、ほとんどの抗体が、試験の（ｔｅｓｔ）肝癌細胞株に対して結合する。 肺癌細胞株（Ｈ４６０およびＡ５４９）に対する、様々な抗体の結合を示す。示されるように、３Ｂ−２２および４−８４の結合が非常に強く、一方で、ほとんどの抗体が試験の肝癌細胞株に対して結合する。 乳癌異種移植腫瘍（ＢＣ０２４４）に対する、様々な抗体の結合を示す。示されるように、コントロールのヒトＩｇＧと比較して、本発明のほとんどの抗体は、乳癌異種移植に対して強く結合する。 乳癌異種移植腫瘍（ＢＣ０１４５）に対する、３Ｂ−４５抗体の結合を示し、抗体が幹細胞様の癌細胞（例えば、ＣＤ４４＋抗原提示細胞）と結合する能力を示す。 膵癌異種移植腫瘍（ＰＣ０３８）に対する、３Ｂ−２２、３Ｂ−４５、および４−８４抗体の結合を示し、これらの抗体が、癌細胞の亜集団（おそらく幹細胞様の細胞）と結合する能力を示す。 本発明の抗体が、乳癌細胞株（ＭＤＡ ＭＢ２３１）においてＣＤＣ（補体依存性細胞毒性）を誘導する能力を示す。示されるように、抗体４−８４は、ＣＤＣの誘導に特に効果的であり、標的細胞の実質的な溶解をもたらす。 本発明の抗体が、乳癌細胞株（ＭＤＡ ＭＢ２３１）においてＡＤＣＣ（抗体依存−細胞媒介細胞毒性）を誘導する能力を示す。調製されたばかりのヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）をエフェクター細胞として用い、ＭＤＡ ＭＢ２３１を標的細胞として用いた。標的細胞に対するエフェクターの比は、本実験では１６．５である。示される結果は、３回の独立実験（３人の健康なドナー）の代表である。結果は、抗体３Ｂ−２２および４−８４が、標的癌細胞のＡＤＣＣ溶解に有望であることを示す。 抗−ＴＭＣＣ３コイル間ドメイン抗体が、幹細胞様の癌細胞を濃縮することができることを示す。この実験では、乳癌細胞株ＢＣ０１４５を用いた。示されるように、抗−ＴＭＣＣ３Ａｂは、幹細胞様の癌細胞集団を有意に濃縮した。 本発明の様々な抗体の、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列を示す。コイル間領域または第一のコイルのいずれかにおけるＴＭＣＣ３上のそれらの結合部位も示す。

本発明の実施態様は、ＴＭＣＣ３に基づく、癌の診断および治療の方法に関する。膜貫通およびコイルドコイル・ドメインタンパク質３（ＴＭＣＣ３）は、ＴＥＸ２８ファミリーに属し、内在性膜タンパクであると予測される。ＴＭＣＣ３の機能は未知である。乳癌幹細胞（ＢＣＳＣ）および非−ＢＣＳＣの、我々のホスホプロテオミクス分析は、ＢＣＳＣにおいて、非−ＢＣＳＣよりも多くのリン酸化ＴＭＣＣ３が存在することを明らかにした。ヒトＴＭＣＣ３遺伝子は染色体１２に位置し、ＴＭＣＣ３タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を表１に示す。

ＴＭＣＣ３内の有用な免疫原性配列の例は、限定されないが：ＶＮＫＰＫＹＧＳＤＤＥＣＳＳＧＴＳＧＳＡＤＳＮＧＮＱＳＦＧＡＧＧＡＳＴＬＤＳＱＧＫＬＡＶＩ（配列番号２）を含む。

ＴＭＣＣ３遺伝子ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３）を、以下の表２に示す：

以下の説明では、その一部を形成する付随の図面に対して参照がなされる。これらの図面では、特定の実施態様が例示として示される。これらの実施態様は、当業者が本発明を実施することができるように詳細に説明され、他の実施態様が利用され得ること、および、本発明の範囲を逸脱せずに変更がなされ得ることが理解されよう。

本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別段の指示をしない限り、複数形の言及を含むことが理解されよう。

「効果的な」量または「治療的に効果的な」量の活性剤は、有益な効果を与えるのに十分であるが非毒性の量の薬剤を意味する。「効果的」である活性剤の量は、個々の年齢および全身状態、特定の活性剤（単数または複数）などに応じて、対象ごとに異なる。

本明細書において用いられる用語「抗原」は、免疫応答を誘発することが可能な任意の物質として定義される。本明細書において用いられる用語「免疫原」は、抗体の生産を誘導することが可能な抗原または物質、例えばＤＮＡワクチンを指す。本明細書において用いられる用語「免疫原性」は、免疫原、抗原、またはワクチンが免疫応答を刺激する能力を指す。

本明細書において用いられる「Ｖ−領域」は、フレームワーク１、ＣＤＲ１、フレームワーク２、ＣＤＲ２、および、フレームワーク３のセグメントを含む抗体可変領域ドメインを指し、ＣＤＲ３およびフレームワーク４（これらのセグメントは、Ｂ細胞分化の間の、重鎖および軽鎖Ｖ−領域遺伝子の再配列の帰結として、Ｖ−セグメントに付加される）を含む。

本明細書において用いられる「相補性決定領域領域（ＣＤＲ）」は、軽鎖および重鎖の可変領域により確立される４つの「フレームワーク」領域に割り込む、各鎖における３つの超可変領域を指す。ＣＤＲは、主に、抗原のエピトープに対する結合の要因となる。各鎖のＣＤＲは、典型的に、Ｎ末端から始まって連続して番号が付けられ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれ、そしてまた、典型的に、特定のＣＤＲが位置する鎖によっても特定される。したがって、Ｖ_ＨＣＤＲ３（またはＣＤＲＨ３）は、重鎖の可変ドメインにおけるＣＤＲ３であり、一方で、Ｖ_ＬＣＤＲ１（またはＣＤＲＬ１）は、軽鎖の可変ドメインにおけるＣＤＲ１である。

ＣＤＲおよびフレームワーク領域のアミノ酸配列は、当分野における様々な公知の定義、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｃｈｏｔｈｉａ，ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＭＧＴ）、およびＡｂＭを用いて決定することができる（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｃｈｏｔｈｉａ ＆Ｌｅｓｋ，（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２，８７７−８８３；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７，７９９−８１７；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７，２７３（４）を参照）。

「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域、ＣＤＲ、またはその一部）が、異なるまたは変更されたクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域、または、新たな特性をキメラ抗体に与える完全に異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬剤など）に連結されるように、定常領域またはその一部が、変更、置換または交換され；または、（ｂ）可変領域またはその一部が、異なるまたは変更された抗原特異性を有する可変領域（例えば、異なる種由来のＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域）と、変更、置換または交換された、抗体分子である。

抗体は、抗原上の「エピトープ」に結合する。エピトープは、抗原上の特異的な抗体結合相互作用部位であり、数個のアミノ酸、または数個のアミノ酸の一部、例えば、５または６個、またはそれよりも多く、例えば、２０個またはそれよりも多いアミノ酸、またはこれらのアミノ酸の一部を含むことができる。ある場合には、エピトープは、例えば、炭水化物、核酸、または脂質由来の、非−タンパク質成分を含む。ある場合には、エピトープは三次元部分である。

医薬組成物は、好ましくは、少なくとも１つの薬学的に許容できる担体を含む。そのような医薬組成物において、本明細書に開示される組成物は、「活性の化合物」（「活性剤」とも呼ばれる）を形成する。本明細書において用いられる用語「薬学的に許容できる担体」は、製剤投与と適合する、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。また、補助活性化合物も組成物中に取り込むことができる。医薬組成物は、その意図する投与経路と適合するように処方される。投与経路の例は、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（吸入など）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与を含む。

本明細書において用いられる対象は、ヒトおよび非−ヒト霊長類（例えば、ゴリラ（ｇｕｅｒｉｌｌａ）、マカク、マーモセット）、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、およびブタ）、コンパニオン動物（例えば、イヌ、ネコ）、実験試験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕獲野生動物（例えば、キツネ、シカ）、および、本開示の薬剤により恩恵を受けることのできる任意の他の生物を指す。「癌患者」は、癌と診断されたことのある個体、治療的レジメンを現在フォローしている個体、または再発のリスクがある個体（例えば腫瘍を取り除く外科的処置後）を指し得る。

癌の治療の文脈において、治療を必要とする対象は、癌または前癌状態である個体、癌があったことがある、および再発のリスクがある個体、癌がある疑いがある個体、放射線療法または化学療法のような癌のための標準的な治療を受けている個体を指すことができる。

用語「癌」は、癌腫、肉腫、腺癌、リンパ腫、白血病、固形癌およびリンパ系癌などを指すことができる。異なるタイプの癌の例は、限定されないが、肺癌（例えば、非小細胞肺癌またはＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肝臓癌（すなわち、肝細胞癌）、腎癌（すなわち、腎細胞癌）、膀胱癌、乳癌、甲状腺癌、胸膜癌、膵癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、肛門癌、膵癌、胆管癌、消化管カルチノイド腫瘍、食道癌、胆嚢癌、虫垂癌、小腸癌、胃（胃）癌、中枢神経系の癌、皮膚癌、絨毛癌；頭頸部癌、血液癌、骨肉腫、線維肉腫、神経芽細胞腫、グリオーマ、メラノーマ、Ｂ細胞リンパ腫、非−ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小細胞リンパ腫、大細胞リンパ腫、単球性白血病、骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、および多発性骨髄腫を含む。一部の実施態様では、本発明の組成物および方法は、癌の治療に有用である。

癌幹細胞（ＣＳＣ）は、癌の大部分を構成する細胞を引き起こすことのできる腫瘍または血液癌に見られる細胞である。ＣＳＣは、正常な（癌でない）幹細胞と同様に、自己再生することもできる。したがって、ＣＳＣは、個体内において非−腫瘍組織へ遊走し、「新たな」腫瘍をスタートすることにより転移を仲介することができる。ＣＳＣは、癌が検出されたステージに応じて、非常に小さな割合の任意の所定の癌を構成する。例えば、ＡＭＬ細胞のサンプルにおけるＣＳＣの平均頻度は、約１：１０，０００であると考えられる。造血性ＣＳＣは、正常な造血幹細胞（ＨＳＣ）と同様に、ＣＤ３４＋として特定することができる。他のＣＳＣと関係があるマーカーは、ＡＬＤＨ（乳癌）、ＣＤ４４（乳癌）、ＣＤ１３３（グリア癌）、およびＮｏｔｃｈ（例えば、骨髄腫および神経芽細胞腫）を含む。

本明細書において定義されるように、治療的に有効量の活性化合物（すなわち、効果的な用量）は、約０．００１〜１００ｇ／ｋｇ体重の範囲、または、過度の実験なく技術者により明らかであって理解される他の範囲であってよい。熟練した技術者は、特定の因子が、対象を効果的に治療するために必要な用量およびタイミングに影響を与え得ることを認識している（制限されないが、疾患または障害の重症度、従前の治療、対象の健康全般または年齢、および存在する他の疾患を含む）。

本明細書において用いられる用語「特異的に結合」は、結合ペア間（例えば、抗体と抗原）の相互作用を指す。様々な場合において、特異的に結合することは、約１０^−６モル／リットル、約１０^−７モル／リットル、または約１０^−８モル／リットル、またはそれ未満の親和定数により具体化することができる。

様々な乳癌細胞株間のＴＭＣＣ３の示差的発現
乳癌におけるＴＭＣＣ３の役割を研究するために、我々は、いくつかのヒト乳癌細胞株（ＭＣＦ−７、ＳＫＢＲ３、Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＡＳ−Ｂ１４５細胞）における、ＴＭＣＣ３のタンパク質レベルを決定した。タンパク質量をＨ１８４Ｂ（ヒト乳腺上皮細胞株）に対して標準化し、相対的な倍率変化として表した。

図１Ａに示すように、ＴＭＣＣ３タンパク質発現は、ＡＳ−Ｂ１４５細胞株において最も高く、Ｈ１８４Ｂの３．９倍だった。これにＴ４７ＤおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が続き、それぞれ、１．５倍および１．８倍の相対倍率であった。より低いレベルのＴＭＣＣ３が、侵襲性がより低い乳癌細胞株（ＳＫＢＲ３、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−１５７）において見られ、それぞれ、相対倍率は１．１倍、１．１倍および１．０倍であった。したがって、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＡＳ−Ｂ１４５のような、浸潤性がより高い細胞株は、浸潤性がより低い乳癌細胞株よりも、タンパク質レベルで高いＴＭＣＣ３の発現を有する。

ＢＣＳＣは、非−ＢＣＳＣよりも高いレベルのＴＭＣＣ３タンパク質を発現する
次に、我々は、ＢＣＳＣにおいてＴＭＣＣ３タンパク質レベルを決定した。マウス異種移植腫瘍ＢＣ０１４５から、ＣＤ２４⁻ＣＤ４４^＋Ｈ２ｋ^ｄ−（ＢＣＳＣ）およびＣＤ２４⁻ＣＤ４４⁻Ｈ２ｋ^ｄ−細胞（非−ＢＣＳＣ）をソーティングし、ＢＣ０２４４およびＢＣ０６３４腫瘍から、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）高活性（ＢＣＳＣ）およびＡＬＤＨ低活性（非−ＢＣＳＣ）細胞をソーティングした。図１Ｂに示すように、ＴＭＣＣ３のタンパク質レベルは、ＢＣ０１４５、ＢＣ０２４４およびＢＣ０６３４腫瘍に関して、それぞれ２６．４倍、２１．０倍および８．９倍、非−ＢＣＳＣよりもＢＣＳＣにおいて高かった。このことは、ＢＣ０１４５異種移植腫瘍に関する我々のマイクロアレイ分析で、非−ＢＣＳＣよりもＢＣＳＣにおいてＴＭＣＣ３ ｍＲＮＡのレベルが高いことと一致する。これらの知見は、ＴＭＣＣ３が、腫瘍の浸潤だけでなく、乳癌幹細胞の維持にも寄与し得ることを示唆する。

乳癌および他の癌でのＴＭＣＣ３のより高い発現は、予後不良と相関する
我々の予備データは、浸潤性乳癌細胞株およびＢＣＳＣにおいて、ＴＭＣＣ３のより高い発現を示した。我々の知見の臨床的関連性を調べるために、我々は、マイクロアレイデータベースを用いて、ＴＭＣＣ３発現と乳癌患者の結果との相関を評価した。このマイクロアレイデータベースでは、作者らは、原発性乳癌腫を有する一連の２９５人の患者を、予後不良または予後良好のいずれかと関連する遺伝子発現シグネチャーを有するとして分類した（ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ， ｅｔ ａｌ．，「Ａ ｇｅｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ａｓ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｏｆ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．」Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３４７：１９９９−２００９，２００２）。図２Ａに示すように、カプラン・マイヤー分析は、ＴＭＣＣ３の発現がより高い乳癌患者は生存率がより低いことを明らかにした（ｐ値＝０．０４５）。

我々はさらに、ＯＮＣＯＭＩＮＥウェブサイトで利用可能なオンラインＤＮＡマイクロアレイデータベースを用いて、様々な癌におけるＴＭＣＣ３の発癌の役割を予測した。図２Ｂに示すように、正常な組織よりも癌の部分で高いＴＭＣＣ３のｍＲＮＡレベルが、子宮頸癌、前立腺癌、膵癌、肺癌、膠芽腫、皮膚癌、肝癌および甲状腺乳頭部癌腫において見られた。また我々は、ＰｒｏｇｎｏＳｃａｎウェブサイトを用いて、癌の進行におけるＴＭＣＣ３の関与を予測した。予測された結果は、乳癌だけでなく、結腸直腸、肺および卵巣癌においても、患者の不十分な結果と相関するＴＭＣＣ３のより高い発現を示す（図２Ｃ）。これらの知見は、ＴＭＣＣ３が、癌の進行において、極めて重要役割を果たし得ることを示唆する。

転移性癌細胞は、原発性腫瘍よりも高いレベルのＴＭＣＣ３を発現する
乳癌の転移におけるＴＭＣＣ３の役割を説明するために、我々はさらに、ヒト原発性乳癌のマウス異種移植において、乳癌の転移病変におけるＴＭＣＣ３の発現を試験した。ＮＳＧマウスの乳腺脂肪体内のＢＣ０１４５またはＢＣ０１７９腫瘍の注入後２ヶ月に、同側性リンパ節において転移病変が観察された。ＢＣ０１４５を保有するマウスのリンパ節および原発性腫瘍部位組織を、抗−ＣＤ４４および抗−ＴＭＣＣ３抗体での染色のために採取した。図１Ｃに示すように、乳腺脂肪体において増殖した腫瘍内に、ＣＤ４４^＋、ＴＭＣＣ３^＋細胞が２０．０％存在し（図１Ｃ−原発性腫瘍）、腫瘍細胞を含む同側性リンパ節内に２８．１％存在する（図１Ｃ−同側性ＬＮ）。ＢＣ０１７９異種移植を保有するマウスでは、肺およびリンパ節への転移が観察された。図１Ｄに示すように、ＴＭＣＣ３のＩＨＣ染色は、肺病変で最も強く、腫瘍を有する同側性リンパ節が後に続き、それから、乳腺脂肪体内で増殖した原発性腫瘍が続いた。これらの知見は、ＴＭＣＣ３が細胞浸潤および転移に寄与し得ることを示唆する。

ＴＭＣＣ３は、ＢＣＳＣにおいて、マンモスフェア形成およびＡＬＤＨ活性に寄与する
マンモスフェア形成および高いＡＬＤＨ活性は、ＢＣＳＣの特徴である。我々は、マンモスフェア形成細胞内のＴＭＣＣ３のタンパク質レベルが、単層培養（接着細胞）内のものよりも、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＡＳ−Ｂ１４５において、それぞれ１．６倍および４．４倍高いことを見いだした（図３Ａ）。我々はさらに、ＴＭＣＣ３−サイレンス（ｓｈ−Ｔ３）またはコントロールｓｈＲＮＡ（ｓｈ−Ｃｏｎ）がトランスフェクトされた１０００のＢＣＳＣ細胞株（ＡＳ−Ｂ１４５およびＡＳ−Ｂ６３４）のそれぞれにおいて、スフェア形成の数を調べた。図３Ｂに示すように、スフェア数は、コントロールのｓｈＲＮＡをトランスフェクトした細胞よりも、ｓｈＲＮＡ−ＴＭＣＣ３をトランスフェクトした細胞において低かった（ｐ値＜０．００１）。また、我々は、ＴＭＣＣ３−サイレンスおよびコントロール細胞において、ＡＬＤＨ活性を決定し、ＡＬＤＨ＋細胞の割合は、コントロール細胞での２１．２％からＴＭＣＣ３ノックダウン細胞での１６．６％に低下することを見いだした（図３Ｃ）。これらの観察は、ＴＭＣＣ３が、ＢＣＳＣの特性維持において重要な役割を果たすことを示す。

ＴＭＣＣ３ ^＋ 細胞のソーティングによる、ＢＣＳＣ集団の濃縮
ＢＣＳＣ集団の濃縮のためのマーカーとしての、ＴＭＣＣ３の使用の可能性を試験するために、ＢＣ０１４５異種移植腫瘍由来のＣＤ４４^＋ＴＭＣＣ３^＋Ｈ２ｋｄ⁻およびＣＤ４４^＋ＴＭＣＣ３⁻Ｈ２ｋｄ⁻細胞集団を、抗−ＴＭＣＣ３抗体でのＦＡＣＳソーティングを用いてソーティングし、それから、それらの自己再生能をマンモスフェア形成アッセイにより試験した。結果は、ＣＤ４４^＋ＴＭＣＣ３^＋Ｈ２ｋｄ⁻細胞が、ＣＤ４４^＋ＴＭＣＣ３⁻Ｈ２ｋｄ⁻細胞よりも有意に高いマンモスフェア形成能を有することを示す。マンモスフェアのサイズだけでなく数も、ＣＤ４４^＋ＴＭＣＣ３⁻Ｈ２ｋｄ⁻細胞よりもＣＤ４４^＋ＴＭＣＣ３^＋Ｈ２ｋｄ⁻細胞において大きい（図３Ｄ）。この結果は、ＴＭＣＣ３が、ＢＣＳＣ濃縮のための新規のバイオマーカーおよび将来的な薬剤設計のための治療的標的として役立ち得ることを示す。

ＴＭＣＣ３は、ＢＣＳＣにおける細胞増殖および自己再生を調節するためのＡｋｔおよびＥＲＫ１／２シグナル伝達に極めて重要である
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲおよびＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路の活性化が、癌幹細胞の生存および自己再生に重要であることを示す証拠が増えている。最近になって；我々は、ＩＧＦ−１Ｒ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路が、ＢＳＣＳ維持に重要であることを示した。以前、我々は、リン酸化ＴＭＣＣ３（セリン２１６）がＢＣＳＣにおいて、より高いことを発見した。Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達に対するＴＭＣＣ３のあり得るリンクを決定するために、我々は、ＴＭＣＣ３−サイレンスＡＳ−Ｂ１４５において、ＡｋｔおよびｍＴＯＲリン酸化を調べた。図４Ａに示すように、Ａｋｔに対するＡｋｔ^{ｓｅｒ４７３}の相対倍率は、非−標的化ｓｈＲＮＡをトランスフェクトした細胞と比較して、ｓｈＲＮＡ−ＴＭＣＣ３のトランスフェクション後４８時間および７２時間で０．２倍および０．１倍まで落ちた。ｍＴＯＲリン酸化も、ＴＭＣＣ３ノックダウン細胞において低下した。リン酸化ｍＴＯＲの相対倍率は、トランスフェクション後４８時間および７２時間で、それぞれ０．８および０．７であった。これらの結果は、ＴＭＣＣ３がＡｋｔ活性化に重要であり、ｍＴＯＲ活性化にも寄与することを示す。我々はさらに、ＴＭＣＣ３−サイレンスＡＳ−Ｂ１４５におけるＥＲＫ１／２リン酸化を調べた。図４Ｂに示すように、ＥＲＫ１に対するＥＲＫ１^{ｔｈｒ２０２}の相対倍率は０．３および０．２５まで落ち、ＥＲＫ２に対するＥＲＫ２^{ｔｙｒ２０４}は、ｓｈＲＮＡ−ＴＭＣＣ３トランスフェクション後４８時間および７２時間で、非−標的化ｓｈＲＮＡをトランスフェクトした細胞の０．５倍および０．９倍まで低下した。これらの結果は、ＴＭＣＣ３が、Ａｋｔ／ｍＴＯＲおよびＥＲＫ１／２経路の上流レギュレーターであり、ＢＣＳＣ増殖および維持において重要な役割を果たすことを示す。

さらに、２９３Ｔ細胞のＴＭＣＣ３過剰発現クローン（ＴＭＣＣ３−ＡおよびＴＭＣＣ３−Ｃ）が確立され、空ベクター（ＣＤ５１１Ｂ−１、ＧＦＰ保有）をコントロールとして用いた。図４Ｅは、ＴＭＣＣ３−ＡおよびＴＭＣＣ３−Ｃをトランスフェクトした細胞が、コントロールベクターをトランスフェクトした細胞よりも高い細胞密度を見せることを示す。ＴＭＣＣ３過剰発現の効果を定量するために、我々は、代謝活性に応答して比色変化および蛍光シグナルを生じる酸化還元指示薬であるアラマーブルーを用いて、細胞増殖を判定した。図４Ｄに示すように、増殖速度は、コントロールベクターをトランスフェクトした細胞と比較して、ＴＭＣＣ３−ＡおよびＴＭＣＣ３−Ｃをトランスフェクトした細胞においてより高い。さらに、トランスフェクトした細胞を、トランスフェクション後４８時間に、ウェスタンブロッティング分析のために採取した。図４Ｃに示すように、Ａｋｔに対する蛍光体−Ａｋｔの相対倍率は、ＴＭＣＣ３−ＡおよびＴＭＣＣ３−Ｃをトランスフェクトした細胞において、それぞれ４．７および１．８まで増大し、蛍光体−ＥＲＫ１／２は、それぞれ１．８／１．８および３．５／２．２まで増大した。これらの知見は、ＡｋｔおよびＥＲＫ１／２シグナル伝達活性化を介した細胞増殖におけるＴＭＣＣ３の極めて重要な役割にさらなる支持を与える。

ＴＭＣＣ３は、ＦＡＫ／Ｓｒｃ経路を介して細胞遊走および転移に寄与する
我々の研究において、我々は、リンパ節および肺へ転移性の癌細胞において、乳腺脂肪体内で増殖した原発性腫瘍よりも高いＴＭＣＣ３発現を見いだした（図１Ｃ−図１Ｄ）。細胞遊走および浸潤におけるＴＭＣＣ３の役割を解明するために、トランスウェル遊走アッセイをＡＳ−Ｂ６３４細胞において行なった。図５Ａに示すように、遊走細胞の数は、非−標的化レンチウイルスのコントロール細胞と比較して、ＴＭＣＣ３−サイレンス細胞において減少した。

上皮間葉転換（ＥＭＴ）は、腫瘍開始細胞（ｔｕｍｏｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）の転移に重要であることが報告されている。しかしながら、我々は、ＴＭＣＣ３サイレンシング（データ示さず）の際に、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリンおよびビメンチンを含むＥＭＴマーカーの発現にいかなる違いも見いださなかった。ＦＡＫは、細胞生存、遊走および浸潤を調節するための、インテグリンにより引き起こされる細胞内シグナル伝達の重要なメディエータ―として同定された細胞質チロシンキナーゼである。以前の研究は、インテグリンβ５が乳癌においてＳｒｃ−ＦＡＫシグナル伝達経路を通して腫瘍原性に寄与し、ＦＡＫのアブレーションが、ＦＡＫ標的化マウスの原発性腫瘍内の癌幹／前駆細胞のプールを減少させ、それらの自己再生および遊走を阻害したことを示している。したがって我々は、ＴＭＣＣ３−依存性細胞遊走がＦＡＫ／Ｓｒｃのリン酸化と相関するかどうか試験した。実際に我々は、ＦＡＫリン酸化がＴＭＣＣ３サイレンスのＢＣＳＣにおいて低減することを見いだした。リン酸化ＦＡＫ^{ｔｙｒ３９７}の相対倍率は、３つの異なるｓｈＲＮＡ−ＴＭＣＣ３クローンにおいて、０．５、０．６および０．２であった（図５Ｂ）。Ｓｒｃリン酸化も、ＴＭＣＣ３ノックダウン細胞において低減した。リン酸化Ｓｒｃ^{ｔｙｒ４１６}の相対倍率は、それぞれ０．７、０．６および０．７であった（図５Ｂ）。これらの結果は、ＴＭＣＣ３依存性細胞遊走が、ＢＣＳＣにおけるＦＡＫ／Ｓｒｃシグナル伝達経路と密接に関連することを示す。

３つのｓｈＲＮＡ−ＴＭＣＣ３クローンの配列は以下のとおりである：

ｈＥＢは、ｈＥＳＣよりも高いレベルのＴＭＣＣ３タンパク質を発現する
また、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および胚様体（ｈＥＢ）におけるＴＭＣＣ３の発現も判定した。我々は、１６日のアウトグロウス（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）ｈＥＢにおいて、ｈＥＳＣよりも高いＴＭＣＣ３の発現を見いだした（図６Ａ）。この現象は、Ｈｅｓ５およびＨ９由来の胚体において見られた。さらに、ＴＭＣＣ３陽性細胞はｈＥＢの外層に分布されたが、Ｔｒａ−１−６０によりマークされた未分化細胞は、主に、アウトグロウス（ｏｕｔ−ｇｒｏｗｔｈ）ｈＥＢの内側部分に留まり（図６Ｂに示される）、ｈＥＢにおいて、ＴＭＣＣ３およびＴｒａ−１−６０の間に共局在はなかった。このことは、ＴＭＣＣ３が、ｈＥＢ内の、より分化した細胞のマークとなり得ることを示唆する。

ＴＭＣＣ３と関係がある障害
ＴＭＣＣ３と関係がある障害は、以下に述べるように、ＴＭＣＣ３発現の上昇と関連する癌を含む。本発明の抗体は、これらの障害の診断およびモニタリング、ならびに標的療法のために、例えば、化学療法（または細胞毒性）剤を、ＴＭＣＣ３を発現している癌細胞に特異的に送達する場合に用いることができる。ある場合には、本明細書に記載のように、標的療法は、ＴＭＣＣ３発現細胞を抗体と接触させるステップを含むことができる。

ＴＭＣＣ３は、癌細胞および癌幹細胞と関連し、（例えば、ＴＭＣＣ３特異抗体、または細胞毒性薬に連結したＴＭＣＣ３特異抗体との）ＴＭＣＣ３の結合は、癌細胞の増殖を効果的に阻害することができる。このＴＭＣＣ３特異抗体は、ＴＭＣＣ３を発現している癌の診断または位置特定に用いることもでき、場合により、ＴＭＣＣ３特異抗体（例えば、同一の抗体、または、異なる結合特性を有する異なるＴＭＣＣ３特異抗体）を用いた標的療法を続ける。

本明細書に記載される結果は、ＴＭＣＣ３が、浸潤性乳癌細胞株およびＢＣＳＣおよび他の癌細胞株において発現されることを初めて示すものである。したがって、ＴＭＣＣ３特異抗体を用いて、乳癌細胞（例えば、診断および／または治療的適用のために）、ならびに、ＴＭＣＣ３発現と関連する他の癌を標的化することができる。正常よりも高いＴＭＣＣ３発現が、子宮頸癌、前立腺癌、膵癌、肺癌、膠芽腫、皮膚癌、肝癌および甲状腺乳頭部癌腫において見られた。また、ＴＭＣＣ３のより高い発現は、乳癌だけでなく、結腸直腸、肺および卵巣癌においても、患者の不十分な結果と相関する。

ＴＭＣＣ３抗体
本発明の適切な抗体の調製のために、および本発明による使用のために（例えば、組み換え、モノクローナル、またはポリクローナル抗体）、当技術分野で知られている多くの技術を用いることができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，ｐｐ．７７−９６ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）；Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）；および、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｄ ｅｄ．１９８６）を参照）。

目的の抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子は、細胞からクローン化することができ、例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマからクローン化して用いて、組み換えモノクローナル抗体を生産することができる。モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子ライブラリーは、ハイブリドーマまたは血漿細胞から作製することもできる。重鎖および軽鎖の遺伝子産物のランダムな組み合わせは、異なる抗原特異性を有する抗体の巨大プールを産生する（例えば、Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（３．ｓｕｐ．ｒｄ ｅｄ．１９９７）を参照）。

単鎖抗体または組み換え抗体の生産のための技術（米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第４，８１６，５６７号）を適用して、本発明のポリペプチドに対する抗体を生産することができる。また、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳類などの他の生物を用いて、ヒト化またはヒト抗体を発現することもできる（例えば、米国特許第５，５４５，８０７；５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，６６１，０１６号、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８２６（１９９６）；および、Ｌｏｎｂｅｒｇ＆Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照）。

あるいは、ファージディスプレイ技術を用いて、選択された抗原に特異的に結合する抗体および異種Ｆａｂフラグメントを同定することができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４（１９９０）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３（１９９２）を参照）。抗体は、二重特異性にすることもでき、すなわち、２つの異なる抗原を認識することができる（例えば、ＷＯ９３／０８８２９，Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５−３６５９（１９９１）；および、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０（１９８６）を参照）。抗体は、ヘテロコンジュゲート、例えば、２つの共有結合した抗体、または免疫毒素であってもよい（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；およびＥＰ０３０８９を参照）。

抗体は、原核生物および真核生物の発現系を含む、任意の数の発現系を用いて生産することができる。一部の実施態様では、発現系は、哺乳類の細胞発現、例えば、ハイブリドーマ、またはＣＨＯ細胞発現系である。多くのそのような系は、市販業者から広く入手可能である。抗体がＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域の両方を含む実施態様では、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、単一のベクターを用いて、例えばジシストロニックな発現系で、または異なるプロモーターの制御下で、発現され得る。他の実施態様では、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、別個のベクターを用いて発現され得る。本明細書に記載のＶ_ＨまたはＶ_Ｌ領域は、場合により、Ｎ−末端にメチオニンを含んでよい。

また、本発明の抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、またはｄＡＢを含む、様々な形式で生産することもできる。抗体フラグメントは、ペプシン（（Ｆａｂ’）_２フラグメントを生産するため）またはパパイン（Ｆａｂフラグメントを生産するため）などの酵素を用いた無傷の抗体の消化；またはデノボ合成を含む、様々な方法により得ることができる。また、抗体フラグメントは、組み換えＤＮＡ方法論を用いて合成することもできる。一部の実施態様では、抗−ＴＭＣＣ３抗体は、ＴＭＣＣ３に特異的に結合するＦ（ａｂ’）_２フラグメントを含む。また、本発明の抗体は、ヒト定常領域（例えば、ヒト化またはヒト抗体）を含んでもよい。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ ｅｄ．，４ｄ ｅｄ．１９９９）；Ｂｉｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３（１９８８）；および、Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９（１９８８）を参照。

また、非−ヒト抗体をヒト化または霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｉｎｇ）する方法も、当技術分野で知られている。一般に、ヒト化抗体は、非−ヒトである供給源からそれに導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非−ヒトアミノ酸残基は、インポート残基と呼ばれることが多く、典型的に、インポート可変ドメインから取られる。ヒト化は、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する配列に置換することにより、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび協力者らの方法に従って行なうことができる（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）および、Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照）。そのようなヒト化抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、ここで、無傷のヒト可変ドメインよりも実質的に少しが、非−ヒト種由来の対応する配列により置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的に、一部のＣＤＲ残基および場合により一部のＦＲ残基が齧歯類抗体内の類似する部位由来の残基により置換された、ヒト抗体である。

ある場合には、抗体または抗体フラグメントは、別の分子（例えば、ポリエチレングリコール（ペグ化）または血清アルブミン）にコンジュゲートして、インビボで延長された半減期を提供することができる。抗体フラグメントのペグ化の例は、Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ １５：４０９，２００４（アブシキシマブについて）；Ｐｅｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７０：１１２６，１９９４（抗−ＣＥＡ抗体について）；Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：７８０，１９９９；および、Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．２０：２２７，２００７）において提供される。抗体または抗体フラグメントは標識することもでき、または、以下に記載の治療薬にコンジュゲートすることもできる。

診断適用
したがって、ＴＭＣＣ３−特異抗体をインビトロおよびインビボ診断分析に用いて、ＴＭＣＣ３−発現細胞（例えば、ＢＣＳＣ、特定の固形腫瘍細胞、および本明細書に示される造血性癌細胞）を検出することができる。例えば、サンプル（例えば、血液サンプルまたは組織バイオプシー）を患者から得て、ＴＭＣＣ３抗体と接触させることができ、そして、抗体結合を検出することにより、患者サンプル中のＴＭＣＣ３発現細胞の存在を判定することができる。抗体結合は、直接（例えば、抗体自体が標識されている場合）または二次抗体などの二次的検出剤を用いて、検出することができる。検出可能な標識は、直接的または間接的（例えばキレート剤またはリンカーを介して）のいずれかで、本発明の抗体と結合することができる。

一部の実施態様では、抗−ＴＭＣＣ３抗体は、ＴＭＣＣ３と関係がある障害を有する、または有する疑いがある個体由来の生物学的サンプルと接触され、サンプル中の細胞に結合する抗体が決定され、ここで、正常よりも高いまたは低い抗体結合は、その個体が、ＴＭＣＣ３と関係がある障害を有することを示す。一部の実施態様では、生物学的サンプルは、血液サンプルまたは血液画分（例えば、血清、血漿、血小板、赤血球、白血球）である。一部の実施態様では、生物学的サンプルは、例えば、分かっている腫瘍の境界線を決めるために、例えば疑わしい腫瘍部位由来または罹患していると分かっている組織由来の、組織サンプル（バイオプシー）である。一部の実施態様では、生物学的サンプルは、炎症部位から得られる。

バイオプシーは典型的に、組織（すなわち、非流体の細胞のタイプ）からサンプルを得るために行なわれる。用いられるバイオプシー技術は、評価される組織のタイプ（例えば、胸部、皮膚、結腸、前立腺、腎臓、肺、膀胱、リンパ節、肝臓、骨髄、気道または肺）に依存する。癌の場合は、技術は、他の因子の中でも、腫瘍のサイズおよびタイプ（例えば、固形、懸濁、または血液）にも依存する。バイオプシー技術は、例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｋａｓｐｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１６ｔｈ ｅｄ．，２００５の第７０章、および第Ｖ部全体を通じて議論されている。

サンプル中の細胞に結合する抗体を検出する任意の方法を、当該診断アッセイに用いることができる。抗体結合を検出する方法は、例えば、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、ＥＬＩＳＡなど、当技術分野でよく知られている。一部の実施態様では、当該方法は、決定するステップの前に、検出のための生物学的サンプルを調製するステップを含む。例えば、細胞の亜集団（例えば、白血球）を、個体由来のサンプルの残りのもの（例えば、他の血液成分）から分離することができ、または、組織中の細胞を、より簡単な検出のために懸濁することができる。

一部の実施態様では、サンプル中のＴＭＣＣ３−発現細胞の割合が決定され、そして、コントロール、例えば、ＴＭＣＣ３と関係がある障害を有することが知られている個体または個体グループ由来のサンプル（ポジティブコントロール）、または、ＴＭＣＣ３と関係がある障害がないことが知られる個体または個体グループ由来のサンプル（正常、非−疾患、またはネガティブコントロール）と比較される。一部の実施態様では、コントロールは、所定の組織に関して実証されたＴＭＣＣ３発現の標準的な範囲である。正常よりも高いまたは低いＴＭＣＣ３発現細胞の割合、または、より高いまたはより低い発現レベルは、その個体が、ＴＭＣＣ３と関係がある障害を有することを示す。

一部の実施態様では、本明細書に記載の標識ＴＭＣＣ３特異抗体は、治療用化合物とさらに結合して、例えば「セラノスティック」組成物を形成することができる。例えば、本明細書に記載の抗−ＴＭＣＣ３抗体は、検出可能な標識および治療薬（例えば、ＴＭＣＣ３を発現している癌細胞またはＣＳＣを殺す細胞傷害剤）の両方に（直接的または間接的に）結合することができる。一部の実施態様では、標識ＴＭＣＣ３特異抗体は、ＴＭＣＣ３を発現している癌細胞の診断および／または位置特定に使用され、そして、ＴＭＣＣ３を発現している癌細胞は、それから、別個の治療用ＴＭＣＣ３特異抗体により標的化される。

治療的適用
ＴＭＣＣ３は、癌細胞および癌幹細胞において異常発現され、そのような状態でのＴＩＭ３−発現細胞は、ＴＭＣＣ３−特異抗体を用いて標的化することができる。

あるいはまた、ＴＭＣＣ３結合を用いて、ＴＭＣＣ３の機能または発現を阻害する医薬品または生物製剤をスクリーニングすることができる。生物製剤および医薬品の両方とも、乳癌または関連する症状の予後、検出および治療のための、化学療法剤を含むことができる。

化学療法（抗癌）剤は、癌の増殖を低減させることが可能な任意の薬剤であってよく、例えば、癌細胞の複製を妨げ、直接的または間接的に癌細胞を殺し、転移を低減させ、腫瘍の血液供給を低減させる。したがって、化学療法剤は、細胞毒性薬を含む。細胞毒性薬は、限定されないが、サポリン、タキサン、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、および白金に基づく薬剤を含む。化学療法剤のクラスは、限定されないが、アルキル化剤、代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサート、植物アルカロイド、例えば、ビンクリスチン、および抗生物質、例えば、ドキソルビシン、ならびに、特定のクラスに分類されない種々雑多な薬剤、例えばヒドロキシ尿素を含む。白金に基づく薬剤は、シスプラチンおよびオキサリプラチンにより例示され、化学療法の主要クラスを表わす。これらの薬剤はＤＮＡに結合して複製を妨げる。タキソールにより例示されるタキサンは、化学療法の別の主要クラスを表わす。これらの化合物は、細胞骨格および紡錘体形成を妨げることにより作用して細胞分裂を阻害し、それにより、急速に分裂する癌細胞の増殖を防ぐ。他の化学療法薬は、ホルモン療法を含む。

１よりも多い治療薬を、同一の組成物または別個の組成物のいずれかに組み合わせることができる。治療薬（単数または複数）を、特定の個体に適したさらなる治療薬と組み合わせることもできる。癌患者に提供される一般的な治療薬は、痛み、吐き気、貧血、感染、炎症、および、癌患者が一般に経験する他の症状を対処する医薬を含む。

一部の実施態様では、本明細書に開示される方法は、癌の治療または予防に有用であり、例えば癌は、ＴＭＣＣ３発現の増大により特徴付けられる。一部の実施態様では、癌は癌幹細胞を含む。一部の実施態様では、癌は前癌、および／または悪性癌および／または治療抵抗性の癌である。一部の実施態様では、癌は乳癌である。

一実施態様では、ＴＭＣＣ３発現は、制限されないが、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびそれらの遺伝子サイレンシング変異体を含むＲＮＡ干渉誘導（ＲＮＡｉ）分子により、抑制またはサイレンスされる。

さらに提供されるものは、癌、癌の転移挙動を、診断、段階分け、および／または、予知する、インビボ撮像する、および／または、治療的癌治療の有効性をモニタリングするためのキットであり、ＴＭＣＣ３抗原に特異的に結合する結合剤および使用説明書を含む。

本明細書に記載の実施例および実施態様は、例示目的のためのみであること、および、様々な改変または変更が本発明の範囲を逸脱せずに可能であることが理解されよう。

実施例１：ウエスタンブロット分析
細胞を、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤で補充されたＲＩＰＡバッファー中で溶解させ、タンパク質ローディングバッファーと混合後にボイルした。細胞溶解物のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、タンパク質をＰＶＤＦ膜にトランスファーした。膜ブロットを、３％ ＢＳＡ含有ＴＢＳＴバッファーで室温にて１時間ブロックし、それから、４℃にて一晩、ＴＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０および３％ ＢＳＡ含有）中に希釈したそれぞれの一次抗体とともにインキュベートした。続いて、ブロットを洗浄して、ＴＢＳＴ中の適切な二次抗体とともにインキュベートした。抗−ホスホ−ｍＴＯＲ（Ｓｅｒ ２４４８）、ｍＴＯＲ、ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ ４７３）、Ａｋｔ、ｐ−ＦＡＫ（Ｔｙｒ ３９７）、ＦＡＫ、ｐ−ＥＲＫ１／２（ｐ４４／４２）およびＥＲＫ１／２抗体を、細胞シグナル伝達技術から得た。抗−ＧＡＰＤＨ抗体はＧｅｎｅＴｅｘ Ｉｎｃ由来であった。

実施例２：マンモスフェア形成アッセイ
単一の細胞を、超低付着プレート（３５ｍｍ；Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、ウェルあたり１，０００細胞の密度でプレーティングした。細胞を、Ｂ２７（１：５０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦおよび２０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で補充された血清フリーのＤＭＥＭ／Ｆ１２、および１０ｎｇ／ｍＬインスリン（Ｓｉｇｍａ）中で増殖させた。マンモスフェアを７〜１０日間（ｄ）培養した。それから、直径が１００μｍよりも大きいマンモスフェアを計測した。

実施例３：ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（商標）アッセイおよびフローサイトメトリー
レンチウイルスのノックダウン細胞のＡＬＤＨ活性を測定するために、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（商標）アッセイを、製造元（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）のガイドラインに従って行なった。ｓｈ−ＴＭＣＣ３およびｓｈ−コントロールのトランスフェクト細胞を、ＡＬＤＨ基質、Ｂｏｄｉｐｙａｍｉｎｏａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ（ＢＡＡＡ）を含む、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（商標）アッセイバッファーに懸濁して、３７℃で３０分間インキュベートした。ＡＬＤＨ−陽性および−陰性細胞の間を区別するために、細胞画分を、ＡＬＤＨ阻害剤、ジエチルアミノベンズアルデヒド（ＤＥＡＢ）存在下で、同一条件下でインキュベートした。これは、ＡＬＤＨ−陽性細胞において蛍光強度の有意な低下をもたらす。そして、フローサイトメトリー分析での補償のために用いた。

実施例４：トランスウェル遊走アッセイ
１×１０^５細胞を、ウシ胎児血清を含まないＭＥＭ培地中に懸濁し、トランスウェルの上部チャンバーに蒔き、一方で、下部チャンバーはＭＥＭコンプリート培地をロードして栄養勾配を形成し、細胞を引き寄せてトランスウェルを遊走および貫通させた。３７℃で一晩培養後、トランスウェルを洗浄し、クリスタルバイオレットで固定および染色した。挿入膜を乾燥後、フィルターの下側の細胞の数を顕微鏡下で計測した。

実施例５：免疫組織化学アッセイ
腫瘍およびマウス臓器を回収して、４％ホルマリンで固定してパラフィン包理した。５μｍ切片を切断して顕微鏡スライド上にマウントした。抗原回復後、スライドを抗−ＴＭＣＣ３抗体またはウサギＩｇＧ抗体（コントロールとして）で染色し、その後、ビオチン−コンジュゲート二次抗体、それから、ストレプトアビジン−ＨＲＰを続けた。ＰＢＳで洗浄後、スライドをＤＡＢ色素原溶液とともにインキュベートし、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。カバーガラスをマリノール（ｍａｌｉｎｏｌ）とともにマウントし、スライドを光学顕微鏡下で可視化した。

実施例６：細胞ソーティング
マウス異種移植腫瘍を、コラゲナーゼ（１，０００Ｕ／ｍｌ）、ヒアルロニダーゼ（３００Ｕ／ｍｌ）、およびＤＮａｓｅＩ（１００μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃で１時間インキュベーションすることにより、酵素的消化に供した。１００μｍ細胞ストレーナー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通した濾過の後に乳癌細胞を回収し、５％ ＦＢＳで補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁した。細胞を、５％ ＦＢＳおよび抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン）を含むＲＰＭＩ１６４０中に調製し、それから、抗−ＣＤ４４−ＡＰＣ、および抗−マウスＨ２ｋｄコンジュゲートビオチン抗体混合物（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で標識した。ＴＭＣＣ３発現を、ウサギ抗−ＴＭＣＣ３抗体（ＨＰＡ０１４２７２，Ｓｉｇｍａ）の後にヤギ抗−ウサギＩｇＧコンジュゲートＡｌｅｘａ４８８を用いて染色することにより検出した。ＣＤ４４^＋、ＴＭＣＣ３^＋、Ｈ２ｋｄ⁻およびＣＤ４４^＋、ＴＭＣＣ３⁻、Ｈ２ｋｄ⁻細胞集団を、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ細胞ソーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により、それぞれゲートおよびソートした。

実施例７：レンチウイルスのベクター生産および形質導入
ＴＲＣＮ００００１７９８０２（ＣＣＧＧＣＧＡＣＡＡＣＡＴＴＧＣＴＣＡＣＴＴＧＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＣＡＡＧＴＧＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＴＴＧ；配列番号：４）クローン、ＴＲＣＮ００００１８３７５０（ＣＣＧＧＣＧＴＣＡＴＧＡＣＡＴＧＡＡＴＡＣＣＴＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＡＧＧＴＡＴＴＣＡＴＧＴＣＡＴＧＡＣＧＴＴＴＴＴＴＧ；配列番号：５）クローン、ＴＲＣＮ００００１８０４１２（ＣＣＧＧＧＡＴＧＧＧＡＡＴＧＴＴＧＣＧＧＡＧＴＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＡＣＴＣＣＧＣＡＡＣＡＴＴＣＣＣＡＴＣＴＴＴＴＴＴＧ；配列番号：６）、ＴＲＣＮ０００００７２２０５（非−標的化コントロール）、ｐＭＤ．ＧプラスミドおよびｐＣＭＶΔＲ８．９１プラスミドを、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）のＮａｔｉｏｎａｌ ＲＮＡｉ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙから取得した。当業者は、他の商業的供給源由来の同様のプラスミドを代わりに使用し得ることを理解するであろう。レンチウイルスの形質導入のために、１〜５の感染多重度で、レンチウイルス粒子により細胞を感染させた。２４時間の感染後、培養培地を、２μｇ／ｍｌピューロマイシン含有ＭＥＭコンプリート培地でさらに４８時間置換した。それから、レンチウイルスのトランスフェクト細胞をさらなる実験のために回収し、Ｑ−ＰＣＲまたはウェスタンブロッティングアッセイを行なって、ノックダウン効率を確認した。

実施例８：ポリペプチドに対する抗体の生産
ＴＭＣＣ３またはその抗原性フラグメントを含むポリペプチドを、細菌または他の（例えば、酵母、バキュロウイルス）発現系から分離または合成し、ｍ−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイイドエステル（ＭＢＳ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）を用いてウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）にコンジュゲートした。これらのペプチドによる免疫プロトコルは、標準的な方法に従って行なう。はじめに、ウサギの事前出血（ｐｒｅ−ｂｌｅｅｄ）を、免疫化の前に行なう。最初の免疫化は、フロイントの完全アジュバントおよび５００μｇのコンジュゲートペプチドまたは１００μｇの精製ペプチドを含む。後に続く免疫化は全て（前回の注入後４週に行なわれる）、同量のタンパク質を含むフロイントの不完全アジュバントを含む。出血は、免疫化後７〜１０日行なわれる。

抗体の親和性精製のために、対応するＴＭＣＣ３ポリペプチドを、ＭＢＳを用いてＲＳＡにコンジュゲートし、ＣＮＢｒ−活性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に連結させる。抗血清を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中に１０倍希釈し、アフィニティマトリックスで一晩インキュベートする。洗浄後、１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．５）を用いて樹脂から結合した抗体を溶出させる。

実施例９：ＴＭＣＣ３またはその抗原性フラグメントに対する、モノクローナル抗体の生産
非−変性アジュバント（Ｒｉｂｉ，Ｒ７３０，Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｍｏｎｔ．）を、リン酸緩衝生理食塩水中４ｍｌに再水和する。それから、この再水和アジュバント１００μｌを、４００μｌのハンクス緩衝塩類溶液で希釈し、それからこれを、免疫化に使用する細胞ペレットと穏やかに混合する。およそ５００μｇのコンジュゲートペプチドまたは１００μｇの精製ペプチドおよびフロイントのコンプリートを、１週間に１回、Ｂａｌｂ／ｃマウスに足蹠を介して注射する。６週間毎週注射した後、血液一滴をそれぞれの免疫化した動物の尾から採取し、ＴＭＣＣ３ポリペプチドに対する抗体力価またはＴＭＣＣ３を発現している細胞を、ＦＡＣＳ分析を用いて試験する。力価が少なくとも１：２０００に到達したときに、マウスをＣＯ_２チャンバー内で屠殺し、その後に頚椎脱臼させる。リンパ節を、ハイブリドーマ調製のために採取する。最も高い力価を有するマウス由来のリンパ球を、３５％ポリエチレングリコール４０００を用いてマウス骨髄腫株Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と融合させる。融合の後１０日目に、ハイブリドーマ上清を、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）により、ＴＭＣＣ３−特異的なモノクローナル抗体の存在についてスクリーニングする。各ハイブリドーマ由来の馴化培地を、組み合わせたアリコートのＰＣ３、Ｃｏｌｏ−２０５、ＬｎＣａｐ、またはＰａｎｃ−１細胞とともに、３０分間インキュベートする。インキュベーション後、細胞サンプルを洗浄して、０．１ｍｌの希釈剤中に再懸濁し、ヤギ抗−マウスＩｇＧのＦＩＴＣコンジュゲートＦ（ａｂ’）_２フラグメント１μｇ／ｍｌとともに４℃で３０分間インキュベートする。細胞を洗浄し、０．５ｍｌのＦＡＣＳ希釈剤中に再懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎ細胞分析器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）を用いて分析する。ハイブリドーマクローンを、さらなる拡張、クローニング、および、ＴＭＣＣ３ポリペプチドを発現する１つまたは複数の細胞株の表面に対するそれらの結合に基づく特性化（ＦＡＣＳにより評価される）のために選択する。

ファージディスプレイを用いた、ＴＭＣＣ３に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生産
ＴＭＣＣ３タンパク質またはそのフラグメントを抗原として用いてＴＭＣＣに対する抗体を生産することに加えて、我々はまた、ファージディスプレイ法を用いて、ＴＭＣＣ３に対するｍＡｂを生産した。

図７に示すように、ＴＭＣＣ３の細胞外ドメインの予測二次構造は、１つのコイル間ドメインにより連結された２つのコイルドコイルのドメインを含む。第一のコイルドコイル・ドメインはアミノ酸１１２〜１５３に渡り、第二のコイルドコイル・ドメインはアミノ酸２８２〜３９８に渡る。コイル間ドメイン（すなわち、リンカー）は、アミノ酸１５３および２８２の間に位置する。より有用な抗体は、これらの細胞外ドメインに結合する。ファージパニングを促進するために、ＴＭＣＣ３細胞外ドメインまたは細胞外ドメインのフラグメントを含むいくつかのＴＭＣＣ３フラグメントを構築した。これらのタンパク質フラグメントは、これらのペプチドの精製および取扱いを容易にするためにＨｉｓタグまたはＦｃ（抗体定常フラグメント）のいずれかとともに構築される。

これらのフラグメントは、タンパク質発現のための任意の適切なベクターへ構築され得る。図８は、ｐＮＣベクターに基づく２つの発現ベクターの２つの例を示す。これらの生産されたフラグメントを用いて、以下に示すようにＴＭＣＣ３ドメインに結合することができるファージをスクリーニングし得る。市販されるベクターへの所望の配列のクローニングは、当業者にとってルーチンプラクティスである。したがって、当業者は、示された２つのベクターは例示のためのみであり、本発明の範囲を限定することを意味しないことを理解するであろう。

ファージディスプレイ法
以下の説明は、ファージディスプレイ法のための１つの例示的な手順を提供する。当業者は、この実施例に提供される様々なパラメーターおよび条件は例示のためのみであり、これらのパラメーターは、本発明の範囲から逸脱せずに変更または最適化され得ることを理解するであろう。

ｓｃＦｖ／Ｆａｂ抗体ライブラリーの構築
本発明の実施態様によれば、抗体は、ファージパニングを用いて生産され得る。図９に示すように、ｃＤＮＡライブラリーは、免疫化マウスから構築され得る。マウスは、例えば、組み換えＴＭＣＣ３またはそのフラグメントにより免疫化され得る。マウスを屠殺して脾臓を取り出して全ＲＮＡを抽出した。それから、ＲＴ−ＰＣＲを用いて抗体フラグメント（例えば、Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｌ、重鎖（Ｆ_ｄ）または軽鎖）を取得した。これらのフラグメントを用いてＦａｂライブラリーを構築し得る。さらに、ＰＣＲを用いてこれらのフラグメントを集めて、ｓｃＦｖに関する抗体ｃＤＮＡフラグメントを生産し、それから、それを用いてｓｃＦｖライブラリーを構築した。一実施例では、Ｆａｂライブラリーは６．６×１０^８の多様性を有し、ｓｃＦｖライブラリーは１．４×１０^９の多様性を有する。

スクリーニングのためのファージ調製
上記（ｓｃＦｖまたはＦａｂ）ライブラリーストックをそれぞれ、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％グルコース（２ＹＴＡＧ）含有２×ＹＴ培地へ接種し、３７℃で振とうしながらＯＤ（６００ｎｍ）が０．５に到達するまで増殖させた。それから、ヘルパーファージを１：２０の比率で添加することにより、この培養物をＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージで感染させた。生じた培養物を３７℃の水浴中で振とうせずに３０分間インキュベートした。

それから、感染細胞を４，０００ｒｐｍで１５分間スピンすることにより回収した。細胞を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌカナマイシン（２ＹＴＡＫ）含有２×ＹＴ中に穏やかに再懸濁し、３０℃で振とうしながら一晩インキュベートした。

一晩培養物を１０，０００ｒｐｍで２０分間スピンして細胞を回収した。ＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％ ＰＥＧ ８０００、２．５Ｍ ＮａＣｌ；１／５容量）を上清に添加した。溶液を混合して、１時間またはそれよりも長く４℃に置いた。それから、１０，０００ｒｐｍで２０分間スピンした。それから、上清を吸引した。

ペレットを４０ｍｌの滅菌水中に再懸濁し、１２，０００ｒｐｍで１０分間スピンして、残存する細菌デブリのほとんどを除去した。１／５容量のＰＥＧ／ＮａＣｌを上清に再度添加した。それをよく混合して、１時間またはそれよりも長く４℃においた。

それを再度１０，０００ｒｐｍで２０分間スピンして、上清を吸引した。それから、ペレットをＰＢＳ中に再懸濁し、１２，０００ｒｐｍで１０分間スピンして残存する細菌デブリのほとんどを除去した。

上記は、ファージの調製に関する一例である。この実施例は例示のためのみであり、保護の範囲を限定することを意図しない。当業者は、様々な改変および変異が可能であることを理解するであろう。ファージは、ＥＬＩＳＡプレートまたはＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を用いてスクリーニングされ得る。

ＥＬＩＳＡプレートを用いた選択
ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、ウェルあたり１μｇ／１００μｌの抗原（例えば、組み換えＴＭＣＣ３フラグメント）でコーティングした。抗原コーティングは、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）または５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．６）中、４℃で一晩行なった。それから、ウェルをＰＢＳで３回リンスし、ウェルあたり３００μｌのＰＢＳ−５％スキムミルク（ＭＰＢＳ）で１．５時間、３７℃でブロッキングした。この後に、ＰＢＳで３回リンスした。

それから、５％ ＭＰＢＳ中、１００μｌの１０^１１〜１０^１２ファージ。溶液を３７℃で９０分間インキュベートし、試験溶液（ｔｅｓｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を捨てて、ＰＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。

各ウェルに１００μｌのＰＢＳを添加した。それを３７℃で６０分間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回、ＰＢＳで１回洗浄した。過剰のＰＢＳをプレートから振り落とし、３７℃で３０分間継続的に回転させながら１００μｌの１００ｍＭトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加することによりファージを溶出させた。迅速な中和のために、トリスバッファー（５０μｌ、１Ｍ、ｐＨ７．４）を溶出した１００μｌのファージに添加した。

１０ｍｌの指数関数的に増殖しているＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＧ１の培養物を取って１５０μｌの溶出したファージへ添加した。また、１００μｌのＴＧ１培養物も免疫プレートに添加した。両方の培養を、振とうせずに３７℃で３０分間インキュベートして感染させた。１０ｍｌおよび１００μｌの感染したＴＧ１細菌をプールして（ｗｅｒｅ ｐｏｌｌｅｄ）、４０００ｒｐｍで１５分間スピンした。ペレット化した細菌を２×ＴＹ中に再懸濁し、大きな２ＹＴＡＧプレートにプレーティングした。細菌を、３０℃で一晩増殖させた。

Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を用いた選択
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を１ｍｌのＰＢＳで３回事前洗浄し、２％ ＭＰＢＳ中に再懸濁した。ファージ（０．３ｍｌ）を０．５ｍｌの２％ ＰＢＳＭおよび上記の洗浄したＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）と混合した。生じた懸濁液を、ローテーター上で３０分間、事前インキュベートした。

Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を除去して、ＴＭＣＣ３フラグメント（ビオチン標識）を添加した。生じた混合物を、ローテーター上で９０分間混合した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を１ｍｌのＰＢＳで３回事前洗浄し、２％ ＰＢＳＭ中に再懸濁した。それからこれをローテーター上で９０分間インキュベートした。

ファージ−ＴＭＣＣ３フラグメント混合物を、ローテーター上でさらに３０分間、平衡されたＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）に添加した。それから、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を、１ｍｌの０．０５％ ＰＢＳＴ、２％ ＰＢＳＭ、およびＰＢＳで洗浄した。それから、結合したファージを１ｍｌの１００ｍＭ ＴＥＡで溶出した。インキュベーションの間、チューブを０．５ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）で調製し、迅速な中和のための、溶出したファージの添加に用意した。

６ｍｌのＴＧ１の指数関数的に増殖している培養物を取って、ＴＥＡ溶出ファージを添加した。また、４ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１培養物もビーズに添加した。３７℃（水浴）で３０分間の両方の培養物は、振とうせずにインキュベートした。

感染したＴＧ１細菌をプールし、４０００ｒｐｍで１５分間スピンした。１ｍｌの２×ＹＴ中でペレット化した細菌を再懸濁し、大きな２ＴＹＡＧプレート上にプレーティングした。細菌は、３０℃で一晩増殖させた。

次のファージ（Ｎｅｘｔ Ｒｏｕｎｄ Ｐｈａｇｅ）の調製
１５％グリセロールを含む５〜６ｍｌの２×ＹＴを、上述のとおり一晩増殖させた細菌プレートに添加し、コロニーをガラススプレーダーでほぐした（ｗｅｒｅ ｌｏｏｓｅｎ）。５０〜１００μｌのかき集めた細菌を、１００ｍｌの２×ＹＴＡＧに添加した。細菌を、３７℃で振とうしながら６００ｎｍでのＯＤが０．５になるまで増殖させた。この培養物１０ｍｌとＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージとを、ヘルパーファージを１：２０の比率で添加することにより感染させた。感染した培養物を、振とうせずに３７℃でインキュベートした。

感染した細胞を４０００ｒｐｍで１５分間スピンして細菌を回収した。ペレットを５０ｍｌの２×ＹＴＡＫ中に穏やかに再懸濁し、培養物を、振とうしながら３０℃で一晩インキュベートした

４０ｍｌの一晩培養物を取って１０，０００ｒｐｍで２０分間スピンして、上清を回収した。１／５容量（８ｍｌ）のＰＥＧ／ＮａＣｌを上清に添加してよく混合し、１時間またはそれよりも長く４℃に置いた。上清を１０，０００ｒｐｍで２０分間スピンし、それから吸引した。ペレットを２ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁し、１２０００ｒｐｍで１０分間スピンして、残存する細菌デブリのほとんどを除去した。

ＥＬＩＳＡによる、ＴＭＣＣ３−陽性ファージのスクリーニング
個々のコロニーをプレートから２００μｌの２×ＹＴＡＧの９６−ウェルプレートにインキュベートし、振とうしながら３７℃で一晩増殖させた。９６−ウェルを、プレートからの５０μｌの接種物をウェルあたり２００μｌの２×ＹＴＡＧを含む第二の９６−ウェルプレートへ移すための移行デバイスとして用い、振とうしながら３７℃で２時間増殖させた。１０^９ｐｆｕ Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを含む５０μｌの２×ＹＴＡＧを、第二のプレートの各ウェルに添加し、３７℃で３０分間静置して（ｓｔａｎｄ）、それから、３７℃で１時間振とうした。

プレートを４０００ｒｐｍで３０分間スピンして、それから、上清を吸引した。ペレットを３００μｌの２×ＹＴＡＫ中に再懸濁して、振とうしながら３０℃で一晩増殖させた。混合物を４０００ｒｐｍで３０分間スピンして、１００μｌの培養上清をファージＥＬＩＳＡにおいて用いた。

ＥＬＩＳＡプレートを、ウェルあたり１μｇ／１００μｌのタンパク質抗原でコーティングした。ウェルをＰＢＳで３回リンスし、ウェルあたり３００μｌの２％ＭＰＢＳで、３７℃にて２時間ブロッキングした。ウェルをＰＢＳで３回リンスした。１００μｌのファージ培養上清を上記に詳述したとおりに添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。試験溶液を捨てて、ＰＢＳＴで３回洗浄した。２％ ＭＰＢＳ中のＨＲＰ−抗−Ｍ１３抗体の適切な希釈物を添加し、３７℃で９０分間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。

反応混合物を、基質溶液（ＴＭＢ）で発現（ｄｅｖｅｌｏｐ）させた。５０μｌの１Ｍ硫酸を添加することにより反応を止めた。色は黄色に変化するはずである。６５０ｎｍおよび４５０ｎｍでのＯＤを読み取った。読み取りは、ＯＤ６５０をＯＤ４５０から引いた。

図１０は、ＥＬＩＳＡプレート法を用いたバイオ−パニングの例示的な結果を示す。この実験では、ＶＥＧＦＲ２−Ｆｃフラグメントをバックグラウンドコントロールとして用いる。バックグラウンドコントロールにも結合するクローン（３Ｂ−１２クローンなど）は、組み換えタンパク質のＦｃ部分に結合すると考えられる。これらのクローンは無視することができる。図１０に示すように、ＴＭＣＣ３コイル間領域に特異的ないくつかのクローンが同定された。

治療薬としての使用のために、抗体は、好ましくは、標的分子に対して良好な親和性を有するべきである。ＴＭＣＣ３に結合する様々な抗体の親和性およびカイネティクスは、任意の適切な器具、例えばＥＬＩＳＡまたはＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ１００での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく分析を用いて評価され得る。

図１１は、ＴＭＣＣ３コイル間−Ｆｃ−１０Ｈｉｓおよび陽性ファージクローン由来のキメラ抗体の間の結合相互作用を示す。結合曲線から、これらのファージクローンの解離定数を計算することができる（図１１の表に示される）。示されるように、ＴＭＣＣ３コイル間−Ｆｃ−１０Ｈｉｓおよびほとんどのキメラ抗体の間の結合はかなり堅く、サブナノモル（約１０^−１０Ｍ）の範囲の解離定数を有する。例えば、抗体４−８４は、１．１３×１０^−１０Ｍの解離定数を有する。

抗体４−８４のＣＤＲ配列は以下のとおりである：ＣＤＲＨ１（ＧＦＮＩＫＤＹＹＭＨ；配列番号１３）、ＣＤＲＨ２（ＷＩＤＰＥＮＧＤＴＥＹＡＰＫＦＤＧ；配列番号１４）、ＣＤＲＨ３（ＮＦＤＹ；配列番号１５）、ＣＤＲＬ１（ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹ；配列番号１６）、ＣＤＲＬ２（ＤＴＳＮＬＡＳ；配列番号１７）、およびＣＤＲＬ３（ＱＱＹＳＧＹＰＬＴ；配列番号１８）。

さらに、様々な他の抗体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列（配列番号：２０〜７６３）を図２９に示す。ＴＭＣＣ３上のそれらの結合部位は、ＴＭＣＣ３のコイル間領域またはＴＭＣＣ３の第一のコイルのいずれかが示されている。ＣＤＲ配列のほとんどが高度の相同性を示す。例えば、ＣＤＲＨ１は、ＧＦＮＩＫＤＴＹＭＨの配列またはこの配列と相同性が高い配列を含み、ＣＤＲＨ２は、ＷＩＤＰＥＮＧＤＴＥＹＡＰＫＦＱＧの配列またはこの配列と相同性が高い配列を含む。

ＢＩＡｃｏｒｅを用いた、親和性測定およびカイネティクス分析
ＴＭＣＣ３コイル間−Ｆｃ−１０Ｈｉｓおよびキメラ抗体の間の結合カイネティクスは、ＢＩＡｃｏｒｅを用いて測定され得て、例えば、関係があるソフトウェアを用いた単一サイクルまたは複数サイクルのカイネティクス（ＭＣＫ）法により分析され得る。以下は、ＢＩＡｃｏｒｅ分析のための１つの例示的なパラメーターおよび条件を説明する。これらのパラメーターおよび条件は、参照のためのみであり、当業者は、本発明の範囲を逸脱せずに変異が可能であることを理解するであろう。

一例として、ＴＭＣＣ３キメラ抗体は、ＣＭ５クリップ上に、５０〜１５０反応単位（ＲＵ）の範囲でＲ_ｍａｘを達成することを可能にする密度で固定化され得る。

この実施例では、カイネティクス分析パラメーターは以下であった：データ回収速度１Ｈｚ；デュアル検出モード；温度：２５℃；濃度単位：ｎＭ；およびバッファーＡ ＨＢＳ−ＥＰ。測定は５レプリケートで行なった。様々な器具セットは以下である。

キャプチャー（Ｃａｐｔｕｒｅ）、流路（ｆｌｏｗ ｐａｔｈ）２−１、チップＣＭ５、再生１を選択。

リガンドキャプチャー（Ｌｉｇａｎｄ Ｃａｐｔｕｒｅ）を選択し、および、パラメーターを以下のように設定する、接触時間：１２秒、流速：１０μＬ／分、安定期：９０秒。（５０〜１５０反応単位（ＲＵ）の範囲内）（ＢＤ２および突然変異体の抗−ＴＭＣＣ３抗体をリガンドとして）。

サンプルを選択し、パラメーターを以下のように設定する、接触時間：３００秒、流速：４０μＬ／分、解離時間：５００秒。

再生を選択し、パラメーターを以下のように設定する、再生溶液：２５ｍＭグリシンｐＨ１．５、接触時間：６０秒、流速：３０μＬ／分、安定期：１２０秒。

ランニングバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ＋）でのＴＭＣＣ３フラグメントの段階希釈。得られた連続濃度は、１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５、０．１５６２５、０および１．２５ｎＭ（繰り返し）である。サンプルをＲａｃｋ Ｐｏｓｉｔｉｏｎｓに従って準備および配置する。

結果を、ＢＩＡｃｏｒｅＴ１００評価ソフトウェアを用いて評価した。ブランクのフローセルからの応答を差し引くことにより、結合応答をバッファー効果に関して補正した。１：１のＬａｎｇｍｕｉｒフィッティングモデルを用いて、ｋ_ａまたはｋ_ｏｎ（会合速度またはｏｎ−速度）およびｋ_ｄまたはｋ_ｏｆｆ（解離速度またはｏｆｆ−速度）を推定した。Ｋ_Ｄ（またはＫ_ｄ）値は、ｋ_ｏｆｆおよびｋ_ｏｎの比から決定され得る（すなわち、Ｋ_ｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）。

図１２Ａは、３Ｂ−８および３Ｂ−４５クローンを用いた２つの例がＴＭＣＣ３コイル間−Ｆｃ−１０Ｈｉｓに結合する、単一サイクルのカイネティクス分析を示し（分析条件：９００ＲＵ、ｐＨ５．５）、図１２Ｂは、わずかに異なる条件下（２００ＲＵ、ｐＨ５．５）での同一の分析を示す。対応するカイネティクスパラメーターは、グラフの下の表に示される。他の抗体も同様の活性を有する。ＳＰＲカイネティクス（ＢＩＡｃｏｒｅ）分析によるこれらのクローンに関する結果を、図１３の表に示す。

ＴＭＣＣ３−特異的キメラｍＡｂのエピトープマッピング
我々は、様々なＴＭＣＣ３フラグメントを用いて、ＴＭＣＣ３特異的キメラｍＡＢと相互作用するエピトープも研究した。図１３に示すように、２つのキメラ抗体、３Ｂ−２２および４−８４は、ＴＭＣＣ３のコイル間フラグメントに対して良好な結合を示す。クローン３Ｂ−２２は、コイル間領域１〜３０ペプチドを含むフラグメントに結合し、このｍＡｂは、コイル間領域内の一続きのアミノ酸１〜３０内に位置するエピトープに結合することを示唆する。一方で、クローン３Ｂ−６６および４−８４は、より長いフラグメント（コイル間１〜６７および１〜１２８フラグメント）に対して良好に結合するが、より短いフラグメント（例えば、コイル間１〜３０フラグメント）には弱く結合するだけであり、それらのエピトープは、コイル間のアミノ酸３０〜６７に位置すると考えられることを示唆する。

癌細胞に対するｍＡｂの結合
本発明の一部の実施態様は、ＴＭＣＣ３に対する抗体を用いた、癌を治療する方法に関する。これらの抗体が癌細胞に結合する能力が研究されている。癌細胞に対する抗体の結合は、免疫組織化学染色（ｓｔａｎｄｉｎｇ）を用いた後に、フローサイトメトリー画像分析で評価される。異なる癌細胞株に対する様々な抗体の結合の結果を図１５〜図１８に示す。

図１５は、様々な抗体による、ＡＳ−Ｂ６３４（ｐ１５）細胞に対する結合の結果を示す。図１６は、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞（三重陰性であり、非常に浸潤性および転移性である細胞）に対する結合の結果を示す。図１７は、患者から得られたヒトＢＣＳＣに対する結合の結果を示す。異なる乳癌細胞（ＡＳ−Ｂ６３４、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、およびＴ４７Ｄ）に結合する様々な抗体の結果を、図１８に棒グラフとして要約する。

図１５〜図１８に示される乳癌細胞に加えて、抗体は、他の癌細胞にも良好に結合する。図１９は、前立腺癌細胞株（ＰＣ３）に対する結合の結果を示す。図２０は、膵癌細胞（例えば、Ａｓ ＰＣ１、ＭＩＡ−ｐａｃａ１、およびＰＬ４５）に対する結合結果を示す。様々な抗体が肝癌細胞（ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈ２２Ｔ／ＶＧＨ、およびＨ５９Ｔ／ＶＧＨ）に結合する能力を図２１に示す。見られるように、クローン３Ｂ−２２および４−８４は、これらの肝癌細胞に対して非常に強く結合する。図２２は、肺癌細胞（Ｈ４６０およびＡ５４９）に対する様々な抗体の結合の結果を示す。これらの結果は、本発明の抗体が、様々な癌細胞に堅く結合することができることを示す。したがって、これらの抗体は、幅広い用途を有する。

癌異種移植に対する抗体の結合
細胞株に加えて、これらの抗体は、異種移植における癌細胞にも良好に結合する。図２３は、本発明の様々な抗体および乳癌異種移植腫瘍（ＢＣ０２４４）の結合を示し、図２４は、別の乳癌異種移植腫瘍（ＢＣ０１４５）での同様の結果を示す。乳癌異種移植に加えて、これらの抗体は、膵臓癌異種移植（図２５；ＰＣ０３８）に対する結合においても効果的である。繰り返しになるが、これらの結果は、本発明の抗体が異なる癌タイプにおいて、幅広い用途を有し得ることを示す。

抗−ＴＭＣＣ３抗体のＣＤＣ（補体依存性細胞毒性）活性
標的細胞に結合する抗体は、細胞殺傷を誘導し得る。このことは本発明の抗体を用いて実際に観察される。図２６に示すように、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１に対する様々な抗−ＴＭＣＣ３抗体の結合は、補体依存性細胞毒性をもたらした。結果として、乳癌細胞は溶解した。これらの結果は、本発明の抗体が癌細胞への結合に効果的であり得て、補体依存性のメカニズムを介して癌細胞の溶解を誘導することを示す。したがって、これらの抗体は、効果的な癌治療薬である。

抗−ＴＭＣＣ３抗体の抗体依存−細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性
ＡＤＣＣは、細胞が仲介する免疫防御のメカニズムであり、それにより、標的細胞上の膜−表面抗原が特異抗体により結合された時点で免疫系のエフェクター細胞は標的細胞を溶解することができる。図２７は、本発明の抗体が、ＡＤＣＣの誘導にも効果的であり、標的癌細胞（例えば、ＭＤＡ ＭＢ２３１）を溶解することを示す。これらの結果は、本発明の抗体が、ＣＤＣおよびＡＤＣＣの両方のメカニズムを介して、標的細胞の溶解を誘導することができることを示す。

幹細胞様の癌細胞（「癌幹細胞」とも呼ばれる）の濃縮
上記のとおり、幹細胞様である癌細胞の亜集団は、より多くのＴＭＣＣ３を発現する。これらの幹細胞様の癌細胞は、より浸潤性であり、癌治療の管理の主な焦点である。これらのより侵襲性の癌細胞を効果的に管理および治療するために、これらの幹細胞様の癌細胞を同定および分離する手段が必要である。

上記の抗体結合の結果は、本発明の抗体が、そのような幹細胞様の癌細胞の同定および分離に有用なツールであることを示す。図２８は、１つのそのような例−ＢＣ０１４５異種移植由来の幹細胞様の癌細胞の濃縮を示す。

これらの抗体が幹細胞様の癌細胞の濃縮に効果的であるという事実は、診断および治療の両方においてそれらが有用であることを示す。診断については、それらを用いて、幹細胞様の癌細胞の存在および量を評価し得る。そのような細胞の存在は、より浸潤性の癌のタイプを示す。治療用途については、これらの抗体を用いて、癌におけるこれらのより浸潤性の集団を、例えば、治療薬、放射性同位体、または細胞毒性薬とコンジュゲートすることにより、または、これらの細胞に単純に結合することによって標的化して、ＣＤＣまたはＡＤＣＣ溶解を誘導し得る。あるいは、これらの抗体を用いて、循環する幹細胞様の癌細胞を除去し得る。これらは、どのようにこれらの抗体を用いて、より侵襲性の癌細胞の亜集団を診断および治療することができるか関する限定された例である。当業者は、これらの抗体の用途はそのように制限されないことを理解するであろう。

本発明は制限された数の実施態様に関して説明しているが、本開示の利益を有する当業者は、他の実施態様を考案することができ、本明細書に開示される本発明の範囲から逸脱しないことを理解するであろう。したがって、本発明の範囲は、添付された特許請求の範囲によってのみ制限されるべきである。

Claims (10)

1. 膜貫通コイルドコイル・ドメイン・タンパク質３（ＴＭＣＣ３）に対する抗体、またはその結合フラグメントであって、
   前記抗体は、配列番号２０〜１４３から選択されるＣＤＲＨ１配列、配列番号１４４〜２６７から選択されるＣＤＲＨ２配列、配列番号２６８〜３９１から選択されるＣＤＲＨ３配列、配列番号３９２〜５１５から選択されるＣＤＲＬ１配列、配列番号５１６〜６３９から選択されるＣＤＲＬ２配列、および配列番号６４０〜７６３から選択されるＣＤＲＬ３配列を含む、
   抗体、またはその結合フラグメント。
2. 請求項１に記載の抗体、またはその結合フラグメントであって、
   前記ＣＤＲＨ１配列は配列番号１０２）であり、
   前記ＣＤＲＨ２配列は配列番号２２６）であり、
   前記ＣＤＲＨ３配列は配列番号３５０）であり、
   前記ＣＤＲＬ１配列は配列番号４７４）であり、
   前記ＣＤＲＬ２配列は配列番号５９８）であり、および、
   前記ＣＤＲＬ３配列は配列番号７２２である、
   抗体、またはその結合フラグメント。
3. 癌を治療するための方法であって、
   それを必要とする対象に、請求項１または２に記載の膜貫通コイルドコイル・ドメイン・タンパク質３（ＴＭＣＣ３）に対する抗体、またはその結合フラグメントを投与するステップを含む、
   方法。
4. 請求項３に記載の方法であって、
   前記癌は、乳癌、前立腺癌、膵癌、肺癌、および肝癌からなる群より選択される、
   方法。
5. 請求項３に記載の方法であって、
   前記癌が乳癌である、
   方法。
6. 癌の状態を診断または評価する方法であって、
   サンプルにおける膜貫通コイルドコイル・ドメイン・タンパク質３（ＴＭＣＣ３）の発現または活性のレベルを評価するステップを含み、
   ここで、標準と比較したＴＭＣＣ３の発現または活性のレベルの増大は、サンプルにおける癌幹細胞の存在を示す、
   方法。
7. 請求項６の方法であって、
   前記評価は、請求項１または２に記載の抗体またはその結合フラグメントを使用する、
   方法。
8. 請求項６に記載の方法であって、
   前記癌幹細胞は、造血性癌、上皮癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、脳癌、結腸癌、骨髄の癌、および／またはリンパの癌の幹細胞である、
   方法。
9. 請求項６に記載の方法であって、
   前記癌幹細胞は、乳癌の幹細胞である、
   方法。
10. 請求項１または２に記載の抗体またはその結合フラグメントを用いて、癌幹細胞を位置特定または撮像する、
    方法。