CN107430125A - 通过抑制tmcc3以抑制癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

一种针对跨膜卷曲螺旋结构域蛋白3(TMCC3)的抗体或其结合片段，包括说明书所述的CDR序列。一种治疗癌症的方法，包括向有需要的个体给予针对跨膜卷曲螺旋结构域蛋白3(TMCC3)的抗体。该抗体结合至TMCC3螺旋间结构域(intercoil domain)里的表位。一种诊断或评估癌症病症的方法，包括评估样品中跨膜卷曲螺旋结构域蛋白3(TMCC3)的表达水平或活性，其中相较于标准品，该TMCC3的表达水平或活性的增加是表示在该样品中有癌症干细胞的存在。

Description

通过抑制TMCC3以抑制癌症的方法
技术领域
本发明关于癌症治疗领域。具体地，本申请关于癌细胞的生物标识(biosignature)，用于癌症的早期检测、预后判断，和预测癌症对治疗的反应。更具体地，本发明关于利用癌症干细胞生物标志物(跨膜卷曲螺旋结构域家族3(transmembrane-coiledcoil domain family 3，TMCC3))来诊断和治疗癌症的方法。
现有技术
大多数的癌症死亡是由于癌症的复发或是转移性疾病，而并非来自原发肿瘤的影响。肿瘤可以被视为异常器官，起因于通过累积突变而获得无限增殖能力的致瘤性癌细胞。在视肿瘤为异常器官的观点下，可应用正常干细胞的生物学原理来更好地了解肿瘤如何发生和扩散。许多观察显示正常干细胞与致瘤性细胞之间的模拟是适当的。正常干细胞与致瘤性细胞两者都有广泛的增殖潜力和产生新的(正常或异常)组织的能力。致瘤性细胞可被认为是癌症干细胞(CSC)，其进行异常的和调控不良的器官形成过程(类似正常干细胞所做)。肿瘤和正常组织均由细胞的异源组合而组成，具有不同的表型特色和不同的增殖潜力。
癌症干细胞被认为是一小部分具有类似干细胞功能的癌细胞，可启动和维持肿瘤复制。这些细胞具有自我更新的能力，但也形成前驱细胞，用以产生表型多样化但致瘤可能性较低的癌细胞。该种干细胞样细胞(stem-like cell)的亚群比起非癌症干细胞的肿瘤细胞在肿瘤生成上具有高效率。
癌症干细胞(CSC)已在多种癌症中被鉴定，包括黑色素瘤、髓母细胞瘤、结肠瘤、肝肿瘤、肺肿瘤、前列癌瘤、乳腺肿瘤，和卵巢瘤。尽管CSC并不一定来自正常的干细胞，但CSC仍经常以正常干细胞内所发现的标志物被分离出来。例如，CD133标志物已用于辨识正常成熟的造血干细胞和神经干细胞。现在CD133已成功地被用来富集来自黑色素瘤、髓母细胞瘤、结肠瘤，和前列腺瘤的CSC。
癌症干细胞的存在对于癌症治疗具有深刻的意义。目前在肿瘤里的所有表型多样性癌细胞均被视为具有无限制的增殖潜力且可获得转移能力。然而多年来，人们已经了解到在从未显现转移性疾病的病患中，只有少量的扩散癌细胞可以在离原发肿瘤的远处被检测到。一种可能性是由于大部分的癌细胞缺乏形成新肿瘤的能力，以至于只有稀少的癌症干细胞的扩散可导致转移性疾病。因此，治疗的目标必须是辨认并杀死该癌症干细胞群。
现有的治疗方法主要开发用于对抗大量群体的肿瘤细胞，因为这些疗法是以其缩小肿瘤块的能力来识别的。然而，因为在癌症里大部分细胞的增殖潜力是有限的，因此缩小肿瘤的能力主要反映出杀死这些细胞的能力。更专一性地对抗癌症干细胞的治疗方法可能造成对转移性肿瘤更持久的反应和疗效。
已在多种人癌症之中证实癌症干细胞(CSC)的存在。这些CSC拥有自我更新、分化的能力并显现出对化疗药剂和放射线的抗性，其可能为肿瘤在临床缓解数年后复发的原因(2，3)。
近期的证据指出在肿瘤内的细胞为异源的，且呈现不同的发展阶段(Clarke等2006.Cancer Res.66:9339-9344)。在某些类型的癌症中，已辨识出一群称作癌症干细胞的细胞，其中癌症干细胞是定义为一种具有自我更新能力且可产生异源谱系癌细胞以构成肿瘤的细胞。从实验上来看，这类的细胞具有产生持续生长之肿瘤的能力(Clarke等2006.Cancer Res.66:9339-9344)。癌症干细胞可源于正常干细胞，但也可源于因为一系列细胞内突变事件而获得自我更新能力的细胞。人们对于癌症干细胞在某些某些类型的癌症中所扮演的角色具有相当大的兴趣。被发现与癌症干细胞的存在有关联的癌症类型包括乳腺癌(Al-Hajj等2003.PNAS 100:3983-3988)、胰腺癌(Hermann等2007.Cell Stem Cell 1:313-323)、脑癌(Singh等2004.Nature 432:396-401)，和睪丸癌(Houldsworth等2006.J.Clin.Oncol.24:5512-5518；Clark A.T.2007.Stem Cell Rev.3:49-59)。
为了设计对抗癌症的疗法，最好是寻找不存在正常细胞中的癌症或癌症干细胞的分子标靶。虽然许多化学治疗药物和标靶治疗药剂已改善了癌症的治愈率，然而因为抗药性的发展所导致的复发性疾病仍是一大挑战。因此，鉴定用于癌症的早期检测、预后和预测治疗反应的生物标识将会是很重要的一件事。到目前为止，并没有可靠且被证实有效的生物标志物可特定用于癌症的早期检测。
人们高度期望可以用特定的标志物来辨识这些癌症干细胞，然后利用这些标志物来开发癌症干细胞的专一性疗法。本发明解决了这个问题。
发明内容
本发明基于新发现：相较于低侵袭性细胞系和非乳腺癌干细胞而言，TMCC3在侵袭性乳腺癌细胞系和乳腺癌干细胞(BCSC)中有较多的表达。
有越来越多的证据显示癌症干细胞易有转移的倾向，且相对地对化疗和放射线有抗性。因此，重要的是要了解乳腺癌干细胞(BCSC)的分子特征，其可能会开发出用于CSC针对疗法的新标靶。
通过磷酸化蛋白质粒学分析BCSC和非BCSC，我们辨别了跨膜卷曲螺旋结构域家族3(TMCC3)的表达差异。TMCC3属于TEX28家族，且被预测为是一种嵌入性膜蛋白(integralmembrane protein)。TMCC3的功能仍未知。
TMCC3对于细胞的存活、增殖、转移、以及自我更新和维持乳腺癌干细胞而言是不可或缺的，且TMCC3的高度表达与多种癌症的不良临床结果有关联。
我们发现比起在低侵袭性乳腺癌细胞系和非BCSC中，TMCC3分别在侵袭性乳腺癌细胞系和BCSC中有更高度的表达。此外，在人乳腺癌异种移植小鼠中，TMCC3在远程淋巴结转移比在原发肿瘤中有更高的表达水平。静默TMCC3可使得细胞周期滞留在G1期而提高细胞凋亡，并伴随着减少的乳腺球细胞(mammosphere)形成和ALDH活性，而这些都是在癌症干细胞中很重要的特征。在我们先前的研究中，IGF-1R/PI3K/Akt/mTOR通路显示对于BCSC的存活和维持是重要的。为了探究TMCC3在此通路中可能的参与，我们发现一旦减弱TMCC3的基因表达，则在BCSC中Akt的磷酸化便消失。这些发现暗示着TMCC3对于乳腺癌细胞的存活、自我更新和转移是不可或缺的。因此，抑制TMCC3可能提供一个针对干细胞的新治疗策略。
TMCC3可当作生物标志物，通过荧光活化细胞分选技术(FACS)利用抗TMCC3抗体来富集BCSC。TMCC3也可当作分化中hES细胞的标志物。
针对TMCC3产生的单抗有助于BCSC的表型特征描述、TMCC3的分子分析，和可作为CSC标靶试剂。因此，TMCC3提供了一个以癌症干细胞为标靶的新治疗策略。这些努力提供了对于乳腺癌及其他癌症和CSC的分子生物学一个新的理解，且加速了以癌症干细胞为标靶的治疗策略的设计。
在本发明的一个实施方式中，提供一种针对跨膜卷曲螺旋结构域蛋白3(TMCC3)的抗体或其结合片段，其中该抗体包含选自SEQ ID NO:20至SEQ ID NO:143的CDRH1序列、选自SEQ ID NO:144至SEQ ID NO:267的CDRH2序列、选自SEQ ID NO:268至SEQ ID NO:391的CDRH3序列、选自SEQ ID NO:392至SEQ ID NO:515的CDRL1序列、一选自SEQ ID NO:516至SEQ ID NO:639的CDRL2序列，和选自SEQ ID NO:640至SEQ ID NO:763的CDRL3序列。
在本发明的一些实施方式中，提供如权利要求1所述的抗体或其结合片段，其中该CDRH1序列是SEQ ID NO:102，该CDRH2序列是SEQ ID NO:226，该CDRH3序列是SEQ ID NO:350，该CDRL1序列是SEQ ID NO:474，该CDRL2序列是SEQ ID NO:598，和该CDRL3序列是SEQID NO:722。
本发明的一些实施方式涉及治疗癌症的方法。在本发明的实施方式中，提供治疗癌症的方法，包括：向有需要的对象给予前述抗体中任一项所述的针对跨膜卷曲螺旋结构域蛋白3(TMCC3)的抗体或其结合片段。
本发明的一些实施方式涉及诊断或评估癌症病症的方法。在本发明的实施方式中，提供诊断或评估癌症病症的方法，包括：评估样品中的跨膜卷曲螺旋结构域蛋白3(TMCC3)的表达水平或活性，其中该TMCC3的表达水平或活性相较于标准品为增加时，表示在该样品中存在癌症干细胞。
根据本发明的实施方式，诊断或评估癌症病症的方法使用前述抗体中任一项所述的抗体或其结合片段。
根据前述实施方式中任一所述，其中癌症选自乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌，和肝癌。在本发明的实施方式中，癌症为乳腺癌。
本发明的一些实施方式涉及定位或成像癌症干细胞的方法。根据本发明的实施方式所述的方法使用前述抗体中任一项所述的抗体或其结合片段。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分且被包括来进一步证明本公开中的某些方面；本发明可通过参考一个或多个这些附图并结合本文中所示的特定实施方式的详细叙述而更好地被理解。
图1A至1D显示TMCC3在侵袭性乳腺癌细胞系、乳腺癌干细胞，和转移细胞中有较高的表达。图1：在AS-B145、H184B、T47D、MDA-MB-231、SKBR3、MCF-7和MDA-MB-157细胞系中的TMCC3蛋白表达。图1B：在BCSC和非BCSC中的TMCC3蛋白量。图1C：生长于乳腺脂肪垫之肿瘤的TMCC3+细胞(图1C─原发肿瘤)和6.9％于含肿瘤细胞之同侧淋巴结(图1C─同侧LN)。图1D：TMCC3在肺病变、有肿瘤的同侧淋巴结，和生长于乳腺脂肪垫的原发肿瘤中的IHC染色。
图2A至2C显示TMCC3在多种癌组织中有较高的表达，且高表达水平与不良的临床结果相关。图2A：Kaplan-Meier的分析显示较高TMCC3表达水平的乳腺癌病患有较低的存活率(p值<0.05)。图2B：比较在癌部位与正常组织中的TMCC3之mRNA量，包括子宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、神经胶质质母细胞瘤、皮肤癌、肝癌，和甲状腺乳头状癌。图2C：在乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌和卵巢癌中，较高的TMCC3表达水平均与不良的病患结果相关。
图3A至3D显示在BCSC中，TMCC3有助于乳腺球细胞的形成和ALDH+细胞群，且可作为富集BCSC群的标志物。图3A：分别在MDA-MB-231和AS-B145中的乳腺球细胞形成细胞和单层培养物(贴附性细胞)的TMCC3蛋白量。图3B：在shRNA-TMCC3转染细胞中与shRNA转染细胞对照组中的乳腺球细胞数目(p值<0.001)。图3C：在TMCC3静默细胞中与对照组细胞中的ALDH活性。图3D：在CD44+TMCC3+H2kd-细胞中与CD44+TMCC3-H2kd-细胞中的乳腺球细胞数目。
图4A至4D显示在BCSC中，TMCC3对于调控细胞增殖和自我更新的Akt和ERK1/2通路而言是至关重要的。图4A：比较Aktser473与Akt在shRNA-TMCC3转染后的细胞与非目标shRNA转染细胞中的相对倍数。图4B：非目标shRNA转染细胞于shRNA-TMCC3转染后48小时和72小时的ERK1thr202与ERK1，和ERK2tyr204与ERK2的相对倍数。图4C：磷酸化Akt与Akt，和磷酸化ERK1/2分别在TMCC3-A和TMCC3-C转染细胞中的相对倍数。图4D：生长率在TMCC3-A和TMCC3-C转染细胞中比在对照载体转染细胞中更高。图4E显示TMCC3-A和TMCC3-C转染细胞比对照载体转染细胞呈现较高的细胞密度。
图5A至5B显示在AS-B634细胞中的跨孔迁移分析试验(trans-well migrationassay)的结果。图5A显示比起非目标慢病毒(lentiviral)对照细胞而言，在TMCC3静默细胞中细胞的迁移数量是下降的。图5B显示磷酸化FAK tyr397的相对倍数和磷酸化Srctyr416的相对倍数。
图6A至6B显示TMCC3在人胚胎干细胞(hESC或hES)和胚体(hEB)的表达水平。图6A显示TMCC3在16天自然生成的人胚体中比在人胚胎干细胞中有较高的表达水平。图6B显示TMCC3阳性细胞分布在hEB的外层，但以Tra-1-60标志物的未分化细胞则大多局限在自然生成的hEB内部。
图7显示推测的TMCC3二级结构，其含有一个胞外结构域，该胞外结构域包含横跨螺旋间结构域的两个螺旋结构域。该两个跨膜结构域和一短胞质结构域位于靠近该分子的C端。图上也显示TMCC胞外结构域的各种片段和该螺旋间结构域。这些片段是构建用于噬菌体淘洗和结合分析试验。为了便于纯化和检测这些片段，在这些片段的C端加上免疫球蛋白的恒定片段和/或组氨酸标签(例如：10His卷标)作为卷标。因为这些片段代表胞外结构域不同的缺失，因此它们也可用于本发明抗体的表位的作图，如下面所述。
图8显示两个示例性载体构建，其用于产生两个TMCC3的片段。其中一个载体是用于产生全长胞外结构域(也即TMCC3ΔTM-Fc)，而另一个则是用于产生螺旋间(螺旋间)片段(也即TMCC3-螺旋间-Fc)。
图9显示流程图，用嗜菌体展示法来筛选可结合至TMCC3或其片段的抗体(例如：Fv可变区片段)。如图9所示，例如，该步骤可能包含用已被想要的抗原(例如TMCC3或其片段)挑战过的小鼠来建立cDNA库。该数据库可构建用于产生Fab片段或单炼可变区片段(scFv)。该含有潜在Fab或scFv克隆的嗜菌体库会在细菌内成长，然后通过辅助病毒释放。该释放出来的嗜菌体接着被允许与抗原片段(例如图7中所示之TMCC片段)结合。无论是磁珠或者是ELISA板都可用来分离与抗原片段结合的嗜菌体。该淘洗过程可重复数次以富集阳性嗜菌体克隆。最后，在确认过后，来自阳性嗜菌体克隆的序列信息便可用于表达Fab或scFv。
图10显示来自第二回淘洗的结果，是各种结合至TMCC3螺旋间-Fc片段之嗜菌体克隆。图中也显示这些克隆与背景对照组肽VEGFR2-Fc(VEGF第二型受体片段，显示为R2-Fc)的结合。如同此表中所示，有几个克隆(例如：3B-12)与背景对照组肽有显著的结合，这可能是起因于与Fc部分结合的关系，Fc部分在TMCC3螺旋间-Fc与VEGFR2-Fc片段中均为常见。因此，这些克隆并不会被选来用于进一步的研究。
图11显示数个全长嵌合型抗体的ELISA结合分析试验结果，该抗体含有来自嗜菌体筛选的可变区和免疫球蛋白的恒定区。该结合分析试验是利用TMCC3螺旋间-Fc-10His当作结合目标，并显示出大部分的嵌合型抗体具有良好的结合亲和力(解离常数在10-10M范围内)，除了3B-5克隆。例如，4-84克隆的解离常数为1.13x10-10M(也即0.113nM)，其已足够用于治疗上的应用。
图12A和12B显示利用BIAcore(生物分子交互作用分析系统)分析的结合动力学的结果。该结合是以TMCC螺旋间-Fc-10His与38-8或38-45克隆结合来进行。该动力学曲线显示在使用分析物浓度为50nM、25nM、12.5nM、6.25nM，和3.125nM时的结合。图12A的结果是在机器设定为pH 5.5下最大反应为900反应单元之下进行的，而那些显示于图12B的结果则在机器设定为在ph5.5最大反应为200反应单元之下进行。根据结合与解离动力学(在加入分析物后或在洗涤后的曲线之增加率或减少率)，动力学常数(结合率(Ka)与解离率(Kd))和平衡常数(也即结合常数KD)可利用任何合适的动力学分析程序来计算。这些参数显示于图12A和12B。
图13显示根据BIAcore分析试验(表面等离子体共振)的各种克隆之动力学常数和结合常数的总结，其相似于图12A和图12B中所示。
图14显示本发明的各种抗体克隆的表位作图结果。如上所述，构建各种TMCC3螺旋间片段。这些片段代表螺旋间结构域中不同位置的缺失。因此，根据与不同TMCC3螺旋间片段的不同结合，可推导出与抗体结合的特定表位。例如，从此表可得知3B-22克隆与全长的螺旋间结构域(Tic1-128)、螺旋间结构域前30个氨基酸的片段(Tic1-30)，和含螺旋间结构域前67个氨基酸的片段(Tic1-67)结合良好。基于这些结果，可以判定3B-22克隆的结合表位是位于该螺旋间结构域中的前30个氨基酸内。同样的，3B-66和4-84克隆与全长的Tic1-128和Tic1-67结合良好，但与Tic1-30则不佳。这些结果指出它们的结合表位是位于氨基酸30和67之间。
图15显示各种抗体结合至TMCC3表达细胞(也即AS-B634(p15))的能力。如图所示，大部分的克隆与该细胞结合良好，尤其是克隆4-84、3B-22，和3B-8。
图16显示各种抗体结合至另一个TMCC3表达细胞(MDA MB231)的能力。再一次，大部分的克隆与该细胞系结合地非常好，尤其是克隆4-84、3B-22、3B-45、3B-8、3B-5，和3B-66与该细胞系结合的非常好。
图17显示抗TMCC3螺旋接头抗体(3B-45克隆)与来自一病患(BC0145)的人BSCS细胞之结合结果，利用荧光细胞分选法进行分析试验。在上排，该细胞以一阴性对照抗体(同族抗体)进行处理，而下排则是将该细胞以抗TMCC3抗体(3B-45)进行处理。如上排所示，该细胞含有约57.8％的CD44+细胞，而下排显示有41.9％为只有CD44+，而有17.4％为CD44+和TMCC3+。此外，约有8.4％的细胞为CD44-但为TMCC3+。
图18显示直方图，其概括了各种抗体与三种不同乳腺癌细胞系(AS-B634、MDAMB231，和T47D)的结合。如直方图所示，3B-22与AS-B634的结合特别地强，而4-84与T47D的结合也是如此。
图19显示各种抗体与前列腺癌细胞系(PC3)的结合。如这些FACS数据所示，3B-22和4-84的结合是非常强的，然而大部份的抗体也与该前列腺癌细胞系结合。
图20显示各种抗体与胰腺癌细胞系(AsPC1、MIA-Paca2，和PL45)的结合。如图所示，大部分的抗体与这些胰腺癌细胞系有显著的结合，然而3B-22的结合特别地强。
图21显示各种抗体与肝癌细胞系(HepG2、Hep3B、H22T/VGH，和H59T/VGH)的结合。如图所示，3B-22和4-84的结合是非常强的，而大部分的抗体也会与该测试的肝癌细胞系结合。
图22显示各种抗体与肺癌细胞系(H460和A549)的结合。如图所示，3B-22和4-84的结合是非常强的，而大部分的抗体也会与该测试的肺癌细胞系结合。
图23显示各种抗体与乳腺癌异种移植肿瘤(BC0244)的结合。如图所示，比起对照组的人IgG而言，大部分的本发明抗体会与乳腺癌异种移植强烈地结合。
图24显示3B-45抗体与乳腺癌异种移植肿瘤(BC0145)的结合，显现该抗体与干细胞样癌细胞(例如CD44+抗原呈现细胞)结合的能力。
图25显示3B-22、3B-45，和4-84抗体与胰腺癌异种移植瘤(PC038)的结合，显现这些抗体与该癌细胞的亚群(推测为干细胞样细胞)结合的能力。
图26显示本发明的抗体于乳腺癌细胞系(MDA MB231)中诱导补体依赖性细胞毒性(CDC,complement dependent cytotoxicity)的能力。如图所示，抗体4-84对于诱导CDC特别有效，可导致目标细胞的大量裂解。
图27显示本发明的抗体在乳腺癌细胞系(MDA MB231)中诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的能力。使用新鲜制备的人外周血单核细胞(PBMC)作为作用细胞，而MDAMB231则用作目标细胞。在本实验中，该作用细胞与目标细胞之比率为16.5。所示结果代表三个独立实验(三位健康的捐赠者)。该结果显示抗体3B-22与4-84很有可能可以用于目标癌症细胞的ADCC裂解。
图28显示抗TMCC3螺旋间结构域抗体可富集干细胞样癌细胞。在此实验中是使用乳腺癌细胞系BC0145。如图所示，该抗TMCC3抗体显著地富集干细胞样癌细胞的细胞群。
图29显示本发明各种抗体的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2，和CDRL3序列。图中也显示那些在TMCC3上的结合位置，在螺旋间区域或是在第一螺旋处。
发明详述
本发明的实施方式有关基于TMCC3的癌症诊断和治疗方法。跨膜卷曲螺旋结构域蛋白3(TMCC3)属于TEX28家族，且被预测为是一种嵌入性膜蛋白。TMCC3的功能仍未知。通过乳腺癌干细胞(BCSC)和非BCSC的磷酸化蛋白质粒学分析透露，在BCSC里的磷酸化TMCC3比在非BCSC里的多。人TMCC3基因位于染色体12上，TMCC3蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)显示于表1中。
表1：人TMCC3蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)
在TMCC3内有用的免疫性序列的示例包括但不限于：VNKPKYGSDDECSSGTSGSADSNGNQSFGAGGASTLDSQGKLAVI(SEQ ID NO:2)。
TMCC3基因cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)显示于下面的表2中：
表2：人TMCC3蛋白的cDNA序列(SEQ ID NO:3)
在以下的叙述中参考了附图，该附图构成本说明书的一部份。在这些图中，特定的具体实施方式以图解显示。这些实施方式经详细叙述以使本领域技术人员能实现本发明，且应理解在不悖离本发明范围的情况下可能利用其他实施方式或进行修改。
应注意到，除非于上下文中清楚指出，否则于本文中和所附的权利要求中所使用的单数型“一”、“一个”和“所述”包括复数涵义。
一活性试剂之“有效”量或是“治疗有效”量意指无毒但足够提供有益效果的试剂量。“有效”的活性试剂量依个体的年龄和全身状况、特定的活性试剂或试剂等而在受试者之间各不相同。
如文中所使用的术语“抗原”定义为任何可引起免疫反应的物质。如文中所使用的术语“免疫原”是指抗原或能够诱导抗体产生之物质，例如DNA疫苗。如文中所使用的术语“免疫原性”是指免疫原、抗原、或疫苗激发免疫反应的能力。
如文中所使用的“V区”是指抗体可变区，包含框架1、CDR1、框架2、CDR2，和框架3的片段，包括CDR3和框架4，这些片段在B细胞分化时会加到V片段上作为V区基因重链和轻链重组的结果。
如文中所使用的“互补决定区(CDR)”是指在各链中的三个高度可变区，其在轻链可变区和重链可变区所建立的四个“框架”区中穿插。该CDR主要负责结合至抗原的表位。各链的CDR通常是指CDR1、CDR2，和CDR3，从N末端开始按照顺序编号，且也通常通过该特定CDR所在的链来辨认。因此，VH CDR3(或CDRH3)是在重链可变区的CDR3，而VL CDR1(或CDRL1)是在轻链可变区的CDR1。
CDR和框架区的氨基酸序列可利用各种本领域中熟知的定义来确认，例如：Kabat、Chothia、国际免疫遗传学数据库(international ImMunoGeneTics database，IMGT)，和AbM(参照例如Johnson等,同上；Chothia和Lesk,(1987)J.Mol.Biol.196,901-917；Chothia等(1989)Nature 342,877-883；Chothia等(1992)J.Mol.Biol.227,799-817；Al-Lazikani等,J.Mol.Biol.1997,273(4))。
“嵌合型抗体”是一种抗体分子，其中(a)该恒定区或其部分被转变、替换、或交换，因而该抗原结合位置(可变区、CDR、或其部分)连结至不同或转变的类别、效应子功能，和/或种类的恒定区，或连结至可赋予嵌合型抗体新的特性的截然不同的分子(例如：酶、毒素、激素、生长因子、药物等)；或(b)该可变区或其部分被转变、替换、或与有不同的或改变的抗原特异性的可变区交换(例如：来自不同种类的CDR和/或框架区)。
抗体结合至抗原的“表位”。表位是在抗原上的一个特定的抗体结合交互作用位置，且可包括一些氨基酸或是一些氨基酸的部分，例如5个或6个，或更多个，例如20或更多个氨基酸，或这些氨基酸的部分。在某些情况下，该表位包括非蛋白构件，例如来自碳水化合物、核酸、或脂质。在某些情况下，该表位是三维部分。
该医药组合物优选地包含至少一种医药上可接受的载体。在这类的医药组合物中，本文所述的组合物形成了“活性化合物”，也称为“活性试剂”。如本文中所使用的术语“医药上可接受的载体”包括可与药物施用相容的溶剂、分散介质、涂料、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。补充用的活性化合物也可加入该组合物。医药组合物会被配制成可兼容于其预定施药途径。施药途径的示例包括非口服(例如静脉注射、皮内注射、皮下注射)、口服(例如吸入)、经皮(局部)、经黏膜，和经直肠给药。
如本文中所使用的对象是指人和非人的灵长类(例如大猩猩、猕猴、狨猴)、家畜动物(例如羊、牛、马、驴，和猪)、伴侣动物(例如狗、猫)、实验动物(例如小鼠、兔子、大鼠、天竺鼠、仓鼠)、圈养的野生动物(例如狐狸、鹿)，和任何可以受益于本发明试剂的其他生物。(癌症病患)可指一个被诊断出癌症、正在遵循治疗疗程、或具有复发风险(例如肿瘤摘除手术之后)的个体。
在治疗癌症的叙述中，需要治疗的对象可以是指有癌症或癌前状态、曾有过癌症且有复发的风险、疑似患有癌症、正在接受癌症标准治疗(例如放射线疗法或是化学治疗)等的个体。
术语“癌症”可以是指上皮癌、肉瘤、腺癌、淋巴瘤、白血病、实体瘤，和淋巴癌等。不同类型的癌症示例包括但不限于肺癌(例如：非小细胞肺癌或是NSCLC)、卵巢癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肝癌(即肝细胞癌)、肾癌(即肾细胞癌)、膀胱癌、乳腺癌、甲状腺癌、胸膜癌、胰腺癌、子宫癌、子宫颈癌、睪丸癌、肛门癌、胆管癌、胃肠道癌、食道癌、胆囊癌、阑尾癌、小肠癌、胃癌、中枢神经系统的癌症、皮肤癌、绒毛膜癌；头颈癌、血癌、骨原性肉瘤、纤维肉瘤、神经胚细胞瘤、神经胶质瘤、黑色素瘤、B细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin'slymphoma)、柏基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、小细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、单核球白血病、骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)，和多发性骨髓瘤。在一些实施方式中，本发明之组合物和方法可用于治疗癌症。
癌症干细胞(CSC)是发现于肿瘤或血癌中的细胞，其可产生构成大部分癌症的细胞。该CSC也可自我更新，类似正常(非癌症)干细胞。CSC因此可通过迁移至个体中的非肿瘤组织并开始形成“新”肿瘤以介导癌转移。CSC在任何给定的癌症中占有非常小的比例，其取决于该癌症被检测到的阶段。例如：在AML细胞样品中的CSC平均频率被认为约是1:10,000。造血CSC可被识别为CD34+，类似于正常的造血干细胞(HSC)。其他与CSC相关联的标志物包括ALDH(乳腺癌)、CD44(乳腺癌)、CD133(神经胶质癌)，和Notch(例如骨髓瘤和神经胚细胞瘤)。
如本文中所定义，该活性化合物的治疗有效量(即有效剂量)的范围可能从约0.001至100g/kg体重，或其他对于技术人员而言无须过度实验便显而易见且理解的范围。本领域技术人员将理解某些因素可影响有效地治疗对象所需的剂量和时间点，包括但不限于疾病或紊乱的严重程度、先前的治疗、对象的一般健康状态或年龄、及其他存在的疾病。
如本文中所使用的术语“特异性结合”是指结合对(例如抗体和抗原)之间的交互作用。在各种示例中，特异性结合可以通过约10-6摩尔/升、约10-7摩尔/升、或约10-8摩尔/升、或更少的亲和力常数来具体实现。
在各种乳腺癌细胞系中TMCC3的表达差异
为了研究TMCC3在乳腺癌中的角色，我们测定了TMCC3在数个人乳腺癌细胞系(MCF-7、SKBR3、T47D、MDA-MB-157、MDA-MB-231和AS-B145细胞)中的蛋白量。该蛋白量标准化至H184B(人乳腺上皮细胞系)，并以相对倍数变化呈现。
如图1A所示，TMCC3的蛋白表达水平在AS-B145细胞系内最高，是H184B的3.9倍。接着是T47D和MDA-MB-231细胞，相对倍数分别是1.5倍和1.8倍。在较不具侵略性的SKBR3、MCF-7和MDA-MB-157乳腺癌细胞系内注意到较低的TMCC3表达，相对倍数分别是1.1、1.1，和1.0倍。因此，侵略性较强的细胞系，例如MDA-MB-231和AS-B145，比侵略性较弱的乳腺癌细胞系具有更高的TMCC3蛋白表达水平。
BCSC比非BCSC表达更高的TMCC3蛋白水平
接着，我们测定TMCC3在BCSC里的蛋白表达水平。将CD24-CD44+H2kd-(BCSC)和CD24-CD44-H2kd-细胞(非BCSC)从小鼠异种移植肿瘤BC0145筛选出来，并将醛去氢酶(ALDH)活性高的细胞(BCSC)和ALDH活性低的细胞(非BCSC)从BC0244和BC0634肿瘤筛选出来。如图1B所示，在BC0145、BC0244，和BC0634肿瘤中，TMCC3在BCSC里的蛋白量比在非BCSC里分别高出26.4、21.0，和8.9倍。此与BC0145异种移植肿瘤的微阵列分析结果中TMCC3在BCSC的mRNA表达水平比非在BCSC里较高是一致的。这些发现意味着TMCC3可能不仅有助于肿瘤侵略，而且也有助于乳腺癌干细胞的维持。
在乳腺癌及其他癌症中较高的TMCC3表达水平与不良预后相关联
我们初步的数据显示TMCC3在侵略性乳腺癌细胞系和BCSC中有较高的表达水平。为了探讨我们的发现之临床相关性，我们利用一微阵列数据库来评估TMCC3表达与乳腺癌病患结果之间的关联性。在此微阵列数据库中，作者将一系列295个原发性乳腺癌病患分类为具有与不良预后相关的基因表达标志或是具有与良好预后相关的基因表达标志(van deVijver,等,“A gene-expression signature as a predictor of survival in breastcancer.”N Engl J Med,347:1999-2009,2002)。如图2A中所示，Kaplan-Meier分析显示有较高TMCC3表达的乳腺癌病患具有较低的存活率(p值＝0.045)。
我们进一步利用在线DNA微阵列数据库(可在ONCOMINE网站获取)来预测TMCC3在多种癌症中的致癌角色。如图2B中所示，在子宫颈癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、神经胶质质母细胞瘤、皮肤癌、肝癌，和乳突性甲状腺瘤中，癌区的TMCC3之mRNA表达水平比在正常组织中多。我们也利用PrognoScan网站来预测TMCC3在癌症进程中的参与程度，而该预测结果显示在乳腺癌以及结肠直肠癌、肺癌，和卵巢癌中，较高的TMCC3表达与不良的病患结果相关(图2C)。这些发现意味着TMCC3在癌症进程中可能扮演着关键的角色。
转移的癌细胞中比原发肿瘤表达更高水平的TMCC3
为了阐述TMCC3在乳腺癌转移中的角色，我们进一步于人原发乳腺癌异种移植小鼠里检验乳腺癌转移病灶中TMCC3的表达。在注射BC0145或BC1079肿瘤于NSG小鼠的乳腺脂肪垫两个月后，观察到在同侧的淋巴结有乳腺癌转移病灶。收集带有BC0145小鼠的淋巴结和原发性肿瘤部分组织并以抗CD44和抗TMCC3抗体进行染色。如图1C中所示，生长于乳腺脂肪垫的肿瘤里有20.0％的CD44+、TMCC3+细胞(图1C─原发肿瘤)，而有28.1％在含有肿瘤细胞的同侧淋巴结(图1C─同侧LN)。在带有BC0179异种移植的小鼠中观察到至肺和淋巴结的转移。如图1D中所示，TMCC3在肺病灶的IHC染色最为强烈，其次为具有肿瘤的同侧淋巴结，接着为生长于乳腺脂肪垫的原发肿瘤。这些发现意味着TMCC3可能有助于细胞的侵略和转移。
TMCC3有助于BCSC中的乳腺球细胞形成和ALDH活性
乳腺球细胞形成和高ALDH活性是BCSC的特征。我们发现TMCC3在乳腺球细胞成形细胞里的蛋白表达水平比在单层培养(贴附性细胞)里的多，在MDA-MB-231和AS-B145中分别为1.6和4.4倍(图3A)。我们进一步检测在各个1000TMCC3静默(sh-T3)或对照的shRNA(sh-Con)转染的BCSC细胞系(AS-B145和AS-B634)里癌症干细胞球体形成的数量。如图3B中所示，在shRNA-TMCC3转染细胞中乳腺球细胞的数量比在对照的shRNA转染细胞中来得少(p值<0.001)。我们也测定在TMCC3静默细胞和对照细胞中ALDH的活性，并发现ALDH+细胞从在对照细胞中存在21.2％降至在TMCC3敲减细胞中存在16.6％(图3C)。这些观察指出TMCC3在维持BCSC特性上扮演着重要的角色。
通过分选TMCC3+细胞来富集BCSC群
为了测试利用TMCC3作为富集BCSC细胞群的标志物的可能性，以FACS分选法利用抗TMCC3抗体从BC0145异种移植肿瘤中分选出CD44+TMCC3+H2kd-和CD44+TMCC3-H2kd-细胞群，接着利用乳腺球细胞形成分析试验来检测它们自我更新的能力。结果显示CD44+TMCC3+H2kd-细胞比CD44+TMCC3-H2kd-细胞有显著更高的乳腺球细胞形成能力。乳腺球细胞的大小和数目在CD44+TMCC3+H2kd-细胞中都比在CD44+TMCC3-H2kd-细胞中来的大(图3D)。此结果表示TMCC3可用作富集BCSC的新生物标志物，并可作为未来药物设计的治疗标靶。
TMCC3对于在BCSC里用以调节细胞增殖和自我更新的Akt和ERK1/2信号传导是不可或缺的
日益增加的证据显示PI3K/Akt/mTOR和MEK/ERK信号传导通路的活化对于癌症干细胞的存活和自我更新是重要的。近来，我们已验证IGF-1R/PI3K/Akt/mTOR通路对于BCSC的维持是重要的。先前我们发现在BCSC中有较多的磷酸化TMCC3(丝氨酸216)。为了确定TMCC3与Akt/mTOR信号传导间可能存在的联系，我们在TMCC3静默的AS-B145中测定了Akt和mTOR的磷酸化作用。如图4A中所示，在shRNA-TMCC3转染后48小时和72小时，Aktser473对于Akt的相对倍数比起非靶标shRNA转染细胞而言分别下降至0.2倍和0.1倍。mTOR的磷酸化作用在TMCC3敲减细胞中也下降。在转染后48和72小时的磷酸化mTOR相对倍数分别为0.8和0.7倍。这些结果显示TMCC3对于Akt的活化是很重要的，且也有助于mTOR的活化。我们进一步检测在TMCC3静默的AS-B145中ERK1/2的磷酸化作用。如图4B所示，在shRNA-TMCC3转染后48和72小时，ERK1thr202对于ERK1，和ERK2tyr204对于ERK2的相对倍数比起非靶标shRNA转染细胞而言分别降至0.3和0.25倍，和0.5和0.9倍。这些结果显示TMCC3可能为Akt/mTOR和ERK1/2通路的上游调控子，且在BCSC的增殖和维持中扮演关键的角色。
此外，我们建立了过度表达TMCC3的293T细胞克隆(TMCC3-A和TMCC3-C)，并利用空载体(CD511B-1，携带有GFP)作为对照组。图4E显示TMCC3-A和TMCC3-C转染细胞比起对照载体转染细胞展现较高的细胞密度。为了量化TMCC3过度表达的影响，我们利用阿尔玛蓝(氧化还原指示剂，会对代谢活动产生色度变化和荧光信号的反应)来测定细胞增殖。如图4D中所示，比起对照载体转染细胞而言，TMCC3-A和TMCC3-C转染细胞的生长速率较高。此外，在转染后48小时收集该转染细胞以做Western印迹分析。如图4C中所示，在TMCC3-A和TMCC3-C转染细胞中，磷酸化Akt对于Akt的相对倍数分别增加至4.7和1.8倍，而磷酸化ERK1/2则分别增加至1.8/1.8和3.5/2.2倍。这些发现进一步支持TMCC3在细胞增殖中通过活化Akt和ERK1/2信号转导而具有关键作用。
TMCC3通过FAK/Src通路有助于细胞迁移和转移
在我们的研究中，我们发现比起生长于乳腺脂肪垫的原发肿瘤而言，TMCC3在转移至淋巴结和肺的癌细胞中有较高的表达水平(图1C至1D)。为了破解TMCC3在细胞迁移和侵略的角色，以AS-B634细胞进行跨孔细胞迁移分析试验。如图5A中所示，相较于非靶标慢病毒对照组细胞，在TMCC3静默细胞中迁移细胞的数量是下降的。
据报导，上皮细胞间质转化(EMT)对于肿瘤起始细胞的转移是很重要的。然而在TMCC3静默后我们并未发现EMT标志物(包括E钙黏蛋白、N钙黏蛋白和波形蛋白(vimentin))的表达水平有任何不同(数据未显示)。FAK是一种细胞质酪氨酸激酶，在胞内信号传导中被识别为关键介导物，其被整合素诱导来调控细胞的存活、迁移，和侵略。先前的研究已显示在乳腺癌中，通过Src-FAK的信号传导通路，整合素β5有助于致瘤性，且在FAK靶标小鼠的原发肿瘤中，FAK的耗损会缩小癌症干细胞/先驱细胞库并减弱它们的自我更新和迁移。因此我们检测TMCC3依赖型细胞迁移是否与FAK/Src的磷酸化相关。确实，我们发现在TMCC3静默的BCSC中FAK磷酸化下降。在三种不同的shRNA-TMCC3克隆中磷酸化FAK tyr397的相对倍数为0.5、0.6，和0.2倍(图5B)。在TMCC3敲减细胞中，Src磷酸化也下降。磷酸化Srctyr416的相对倍数分别为0.7、0.6，和0.7倍(图5B)。这些结果指出在BCSC中TMCC3依赖型细胞的迁移与FAK/Src的信号传导息息相关。
下面为该三种shRNA-TMCC3克隆的序列：
表3：shRNA的TMCC3序列
hEB比hESC表达更高的TMCC3蛋白水平
同时测定TMCC3在人胚胎干细胞(hESC)和胚胎体(hEB)中的表达。我们发现TMCC3在16天过度生长的hEB中的表达水平比在hESC中高(图6A)。这个现象在Hes5和H9衍生胚体中也可观察到。再者，TMCC3阳性细胞分布在hEB的外层，但以Tra-1-60标志物的未分化细胞则大多局限在过度生长的hEB内部，如图6B所示，且在hEB中TMCC3与Tra-1-60并无共定位现象。这意味着TMCC3可能在hEB内标志物更加分化的细胞。
TMCC3相关的紊乱
与TMCC3相关的紊乱包括与TMCC3表达水平上升相关的癌症，如下所述。本发明的抗体可以用于诊断和监控这些紊乱，也可用于标靶治疗，例如：给予对表达TMCC3的癌症细胞具有特异性的化疗(或细胞毒性)药剂。在一些情况下，该标靶治疗可包含将TMCC3表达细胞与如本文中所述的抗体接触。
TMCC3与癌症细胞和癌症干细胞相关联，且结合TMCC3(例如：与一TMCC3特异性抗体、或一与细胞毒性药剂连结的TMCC3特异性抗体)可有效地抑制癌细胞的生长。本发明之TMCC3特异性抗体也可用于诊断或定位TMCC3表达癌症，任选接着利用TMCC3特异性抗体进行标靶治疗(例如：同样的抗体、或具有不同结合特征的不同的TMCC3特异性抗体)。
本文中所述的结果首次证实TMCC3表达于侵略性乳腺癌细胞系和BCSC及其他的癌症细胞系中。TMCC3特异性抗体因此可以用来标靶乳腺癌细胞(例如用于诊断和/或治疗应用)及其他与TMCC3表达有关的癌症。在子宫颈癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、神经胶质质母细胞瘤、皮肤癌、肝癌，和乳突性甲状腺瘤中可观察到比正常的TMCC3更高的表达水平。在乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌，和卵巢癌中，较高的TMCC3表达水平也与不良的病患结果相关。
TMCC3抗体
为了制备本发明之合适抗体和为了根据本发明来使用(例如：重组、单克隆、或多克隆抗体)，可使用该领域中许多熟知方法(参见例如：Kohler&Milstein,Nature 256:495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today 4:72(1983)；Cole等，单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)第77-96页,Alan R.Liss公司(1985)；Coligan,Current Protocols in Immunology(1991)；Harlow&Lane,《抗体，实验室手册》(Antibodies,A Laboratory Manual)(1988)；和Goding,单克隆抗体：理论和实践(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice)(第二版.1986))。
编码感兴趣抗体之重链和轻链的基因可以从细胞中复制，例如：编码单抗的基因可以从杂交瘤中复制，且用于产生重组单抗。编码单抗之重链和轻链的基因库可以从杂交瘤或浆细胞中制备。重链和轻链基因产物的随机组合可产生具有不同抗原特异性的大抗体库(参见例如Kuby,Immunology(第三版增刊.1997))。
用来产生单链抗体或重组抗体的技术(美国专利号4,946,778，美国专利号4,816,567)可适用于生产本发明的抗体至多肽。同样地，转基因小鼠或其他生物(例如其他哺乳类)可用于表达人源化或人抗体(参见例如：美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，Marks等，Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology 14:845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology 14:826(1996)；和Lonberg&Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。
或者，嗜菌体展示法技术可用于鉴定专一性结合至所选抗原的抗体和异源Fab片段(参见例如：McCafferty等，Nature 348:552-554(1990)；Marks等，Biotechnology 10:779-783(1992))。抗体也可被制作成具有双特异性，也就是可以辨认两种不同的抗原(参见例如：WO 93/08829，Traunecker等，EMBO J.10:3655-3659(1991)；和Suresh等，Methods inEnzymology 121:210(1986))。抗体也可为异源偶联抗体(例如两个共价结合的抗体)或是免疫毒素(参见例如：美国专利号4,676,980；WO 91/00360；WO 92/200373；和EP 03089)。
可使用任意数量表达系统来生产抗体，包括原核和真核表达系统。在一些实施方式中，该表达系统是哺乳类细胞表达系统，例如杂交瘤、或CHO细胞表达系统。许多此系统可广泛地从商业供货商获得。在抗体包含VH和VL区的实施方式中，该VH和VL区可能利用单一载体来表达，例如：在双顺反子表达单元中，或在不同启动子的控制之下。在其他实施方式中，该VH和VL区可能利用分离的载体来表达。如本文中所述的VH或VL区可任选包含甲硫氨酸于N末端。
本发明的抗体也可制成各种形式，包括Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、或dAB。该抗体片段可通过各种方式获得，包括以酶消化一个完整的抗体，例如胃蛋白酶(以产生(Fab')2片段)、或木瓜酶(以产生Fab片段)；或是重新合成。抗体片段也可利用重组DNA方法来合成。在一些实施方式中，该抗TMCC3抗体包含专一性结合至TMCC3的F(ab')2片段。本发明的抗体也可包括人恒定区，例如人源化或人抗体。参见例如：《基础免疫学》(FundamentalImmunology)(Paul编,第4d版.1999)；Bird等，Science 242:423(1988)；和Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879(1988)。
在本领域也熟知使非人抗体人源化或灵长类化的方法。通常人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常是指导入的残基，而这些导入的残基通常是取自导入可变区。人源化可实质上依据Winter及其同事的方法来进行(参见例如：Jones等，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239:1534-1536(1988)和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992))，以啮齿类动物的CDR或CDR序列取代相对应的人抗体序列。此类的人源化抗体为嵌合型抗体(美国专利号4,816,567)，其中实质上不完整的人可变区已被一来自非人品种的相对应序列取代。实践上，人源化抗体通常为人抗体，只是其中一些CDR残基和可能有一些FR残基被来自啮齿类抗体上相似位置的残基所取代。
在一些情况下，该抗体或抗体片段可共轭结合至另一分子，例如：聚乙二醇(聚乙二醇化)或血清蛋白，以使体内的半衰期延长。抗体片段聚乙二醇化的示例是提供于Knight等，Platelets 15:409,2004(阿昔单抗)；Pedley等，Br.J.Cancer 70:1126,1994(抗CEA抗体)；Chapman等，Nature Biotech.17:780,1999；和Humphrey等，Protein Eng.Des.20:227,2007。如下所述，该抗体或抗体片段也可被标记，或是共轭结合至治疗剂。
诊断应用
TMCC3特异性抗体因此可用于体外和体内的诊断分析试验，以检测TMMC3表达细胞(例如文中所指之BCSC、某些固态肿瘤细胞，和造血癌细胞)。例如，样品(例如血液样品或组织切片)可以从病患中获得并与TMCC3抗体接触，然后在该病患样品中存在的TMCC3表达细胞便可通过检测抗体结合来测定。抗体的结合可以是直接地检测(例如该抗体本身被标记)或是通过利用第二检测剂，像是第二抗体。该可检测标记物可与本发明的抗体直接地或间接地(例如通过螯合剂或连接体)连接。
在一些实施方式中，该抗TMCC3抗体与来自具有或疑似具有TMCC3相关联疾病的个体的生物样品接触，然后测定样品内细胞与抗体的结合，其中比正常的抗体结合高或是低则代表该个体具有与TMCC3相关联的疾病。在一些实施方式中，该生物样品是一血液样品或血液分层(例如血清、血浆、血小板、红血球、白血球)。在一些实施方式中，该生物样品是组织样品(切片)，例如来自可疑肿瘤位置，或是来自已知被侵略的组织，例如：以测定已知肿瘤的范围。在一些实施方式中，该生物样品是从发炎部位所获取。
活组织切片检查法(biopsy)向来用于从组织(即非流体细胞种类)中获取样品。活组织切片检查技术的实施需取决于欲评估的组织型态(例如乳房、皮肤、结肠、前列腺、肾脏、肺、膀胱、淋巴结、肝脏、骨髓、气道或肺)。在癌症的情况下，除了其他因素，该技术也取决于肿瘤的大小和型态(例如固态、悬浮态、或血液)。在例如《哈里森内科学原理》(Harrison's Principles of Internal Medicine),Kasper等编,第16版,2005,第70章和第五部分全文中有讨论活组织切片检查法的技术。
任何检测抗体结合至样本中细胞的方法可用于本发明的诊断分析试验。在本领域中，检测抗体结合的方法本领域熟知，例如：流式细胞仪、荧光显微镜、酶结合免疫吸附分析(ELISA)等。在一些实施方式中，该方法包含在测定步骤前制备该生物样品以用于检测。例如，细胞的亚群(例如白血球)可以从来自个体剩下的样品(例如其它血液成分)中分离出来，或是在组织中的细胞可悬浮以易于检测。
在一些实施方式中，测定该样品中TMCC3表达细胞的百分比并与对照组(例如，来自已知患有TMCC3相关疾病的个体或个体群(正对照组)，或是来自已知并无患有TMCC3相关疾病的个体或个体群(正常对照组、非疾病对照组、或负对照组)比较。在一些实施方式中，该对照组是为一给定组织建立的TMCC3表达标准范围。比正常的TMCC3表达细胞百分比高或是低，或是较高或较低的表达水平，代表该个体具有与TMCC3相关联的疾病。
在一些实施方式中，如本文中所述的被标记物的TMCC3特异性抗体可进一步与治疗性化合物相连，例如形成(治疗诊断)组合物。例如：如本文中所述的抗TMCC3抗体可连接(直接地或间接地)至可检测的标记物和治疗剂，如用来杀死TMCC3表达癌细胞或CSC的细胞毒性剂。在一些实施方式中，被标记的TMCC3特异性抗体可用于诊断和/或定位TMCC3表达癌细胞，且该TMCC3表达癌细胞接着被不同的治疗性TMCC3特异性抗体标定为目标。
治疗应用
TMCC3会在癌细胞和癌症干细胞中异常表达，而在这样的情况下可利用TMCC3特异性抗体来靶向该TIM3表达细胞。
或者，TMCC3的结合可用以筛选能抑制TMCC3功能或表达之药物或生物制剂。生物制剂和药物两者均可包含化疗药剂来做乳腺癌或相关病症的预后、检测，和治疗。
化疗(抗癌)药剂可以是任何能减少癌症生长、干扰癌细胞复制、直接或间接杀死癌细胞、减少癌转移、减少肿瘤血液供应等的药剂。因此化疗药剂包括细胞毒性药剂。细胞毒性药剂包括但不限于皂草毒蛋白(saporin)、紫杉烷类、长春花生物碱、蒽环类药物，和铂基药剂。化疗药剂的种类包括但不限于烷化剂、抗代谢药物(如：氨甲喋呤)、植物碱(如：长春新碱)，和抗生素(如：阿霉素)以及各式各样不属于特定种类之药物，如羟基脲。铂基药物(以顺铂和奥沙利铂(oxaliplatin)为例)代表化学疗法的主要种类。这些药物结合至DNA并干扰其复制。紫杉烷类(以泰克索(taxol)为例)代表化学疗法的另一个主要种类。这些化合物采取干扰细胞骨架和纺锤体形成的行动来抑制细胞分裂，从而防止快速分裂的癌细胞生长。其他化疗药物包括荷尔蒙疗法。
多于一种的治疗药剂可以结合在同一个组合物中或是分开在不同组合物里。该治疗药剂也可与其他的治疗药剂结合以适合特定个体。提供给癌症病患的常见治疗药剂包括用来解决疼痛、呕吐、贫血、感染、发炎、及其他癌症病患常经历的症状之药物。
在一些实施方式中，如本文所公开的方法可用于治疗或预防癌症，例如特征为TMCC3表达水平增加的癌症。在一些实施方式中，该癌症包含癌症干细胞。在一些实施方式中，该癌症是前期癌(pre-cancer)，和/或恶性癌和/或疗法抗性癌症。在一些实施方式中，该癌症是乳腺癌。
在一实施方式中，TMCC3的表达可通过RNA干扰诱导(RNAi)分子(包括但不限于siRNA、dsRNA、stRNA、shRNA，及其基因静默变异体)而被抑制或静默。
还提供一种用于癌症、癌症转移行为的诊断、判断期别和/或预后、体内成像和/或监测有疗效之癌症治疗效率之试剂盒，其包含专一性结合至TMCC3抗原的结合剂和使用指南。
应了解的是叙述于本文中的实施例和实施方式仅用于说明之目的，而在不悖离本发明范围的情况下各种修改或变更是可行的。
实施例
实施例1：Western印迹分析
将细胞裂解于添加了磷酸酶和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中，然后在与蛋白质上样缓冲液混合后加热至沸腾。将等分的细胞裂解液进行SDS-PAGE，然后将该蛋白转印至PVDF膜。将该批膜以含3％BSA之TBST缓冲液在室温下阻断一小时，接着与在TBST(含有0.05％吐温20和3％BSA)中稀释的分别的一级抗体在4℃孵育过夜。随后，洗掉转渍，并以合适的二级抗体于TBST中培养。通过细胞信号传导技术(Cell Signaling Technology)获取抗磷酸化-mTOR(Ser 2448)、mTOR、磷酸化-Akt(Ser 473)、Akt、p-FAK(Tyr 397)、FAK、p-ERK1/2(p44/42)和ERK1/2抗体。自GeneTex Inc获取抗GAPDH抗体。
实施例2：乳腺球细胞成形分析试验
将单细胞以每孔1,000个细胞的密度置于超低吸附培养板(35mm；康宁公司(Corning))。使细胞生长于无血清的DMEM/F12(添加有B27(1:50，英杰公司(Invitrogen))、20ng/mL EGF和20ng/mL bFGF(BD生物科学公司)，和10ng/mL胰岛素(西格玛公司(Sigma))。培养该乳腺球细胞7至10天。接着计算直径>100μm的乳腺球细胞数目。
实施例3：ALDEFLUORTM分析试验和流式细胞仪
为了测量慢病毒敲减细胞的ALDH活性，依据厂商(加拿大温哥华的干细胞技术有限公司(Stemcell Technologies,Vancouver,Canada))的使用指南进行ALDEFLUORTM分析试验。使sh-TMCC和sh-对照的转染细胞悬浮于含有ALDH受质(BODIPY氨基乙醛，BAAA)的ALDEFLUORTM缓冲液中，并于37℃培养30分钟。为了分辨ALDH阳性和ALDH阴性细胞，将一部份的细胞以相同的条件培养但加入ALDH抑制剂(二乙基氨基苯甲醛，DEAB)。这会造成ALDH阳性细胞的荧光强度显著降低，并用于做为流式细胞分析的补偿。
实施例4：跨孔迁移分析试验
将1x105个细胞悬浮于无胎牛血清的MEM培养基之中，并种在跨孔(transwell)的上方腔室中，而下方腔室则装载了MEM完全培养基以形成营养梯度来吸引细胞迁移和穿过跨孔。在37℃中培养过夜后，将该跨孔清洗、固定并以结晶紫进行染色。将插入膜(insertmembrane)干燥后，在显微镜底下计算滤膜下方的细胞数量。
实施例5：免疫组织化学分析试验
收集肿瘤和小鼠器官，以4％的福尔马林固定并包埋于石蜡中。切下5μm的切片并固定于显微镜载玻片上。在进行抗原修复后，以抗TMCC3抗体或兔IgG抗体将载玻片染色以作为对照，接着染上生物素共轭二级抗体，然后再染上链霉亲和素-HRP。以PBS清洗后，将该载玻片以DAB呈色溶液培养，并以苏木精复染。将盖玻片以Malinol封固，并使载玻片于光学显微镜下显现。
实施例6：细胞分选
将小鼠异种移植肿瘤于37℃下在含有胶原蛋白酶(1,000U/ml)、玻尿酸酶(300U/ml)，和DNA水解酶I(100μg/ml)的RPMI1640培养基中培养1小时来进行酶消化。在以100-μm的细胞滤网(BD生物科学公司)过滤后收集乳腺癌细胞，并将之悬浮于添加有5％FBS的RPMI1640培养基中。于含有5％FBS和抗生素(盘尼西林/链霉素)的RPMI1640培养基中制备细胞，并以抗CD44-APC和抗小鼠H2kd共轭生物素抗体混合物(BD法敏进公司(BDPharmingen))来标志物。以兔抗TMCC3抗体(HPA014272，西格玛公司)染色，接着再以山羊抗兔IgG共轭Alexa488染色来检测TMCC3的表达。圈选出CD44+、TMCC3+、H2kd-和CD44+、TMCC3-、H2kd-的细胞群，再分别通过FACS Aria II细胞分选仪(BD公司(Becton Dickinson))分选出来。
实施例7：慢病毒载体生产和转导
TRCN0000179802
(CCGGCGACAACATTGCTCACTTGAACTCGAGTTCAAGTGAGCAATGTTGTCGTTTTTTG；SEQ IDNO:4)克隆、TRCN0000183750(CCGGCGTCATGACATGAATACCTTACTCGAGTAAGGTATTCATGTCATGACGTTTTTTG；SEQ ID NO:5)克隆、TRCN0000180412(CCGGGATGGGAATGTTGCGGAGTATCTCGAGATACTCCGCAACATTCCCATCTTTTTTG；SEQ ID NO:6)、TRCN0000072205(非靶标对照组)、pMD.G质粒和pCMVΔR8.91质粒是取自分子生物研究所国立RNAi核心设施(中央研究院，台北，台湾)。本领域技术人员将理解来自其他商业来源的相似质粒可拿来代替使用。关于慢病毒的转导，用慢病毒粒子以1至5的感染复数(multiplicity of infection)来感染细胞。在感染后24小时，将该培养基以含有2μg/ml嘌呤霉素(puromycin)的MEM完全培养基取代并再培养48小时。接着收集被慢病毒转染的细胞以用于进一步的实验，并进行Q-PCR或Western印迹分析试验来确认敲减效率。
实施例8：抗多肽抗体的生成
合成或是从细菌或其他(例如酵母、杆状病毒)表达系统中分离出包含TMCC3或其抗原性片段的多肽，并将之共轭结合至带有m-马来酰亚胺苯甲酸N-羟基丁二酰亚胺酯(m-maleimido benzoic acid N-hydroxysuccinimide ester，MBS)的兔血清白蛋白(RSA)(伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯化学品公司(Pierce，Rockford，Ill))。根据标准方法来进行这些肽的免疫流程。一开始，在免疫前先对兔子进行预先的抽血。第一次免疫包括弗氏完全佐剂和500μg共轭肽或100μg纯化的肽。所有随后的免疫(于前次注射的四个礼拜后进行)包括与蛋白等量的弗氏不完全佐剂。在免疫后七至十天进行抽血。
至于抗体的亲和性纯化，将相对应的TMCC3多肽共轭结合至带有MBS的RSA，并耦合至溴化氰活化的琼脂糖凝胶(瑞典乌普萨拉的法玛西亚公司(Pharmacia，Uppsala，Sweden))。将抗血清于10mM Tris-HCl(pH 7.5)中稀释十倍，并与亲和基质(affinitymatrix)培养过夜。清洗后，以100mM甘氨酸(pH2.5)从树脂中洗脱出结合的抗体。
实施例9：抗TMCC3或其抗原性片段之单抗的生成
将一非变性佐剂(Ribi,R730,Corixa,Hamilton Mont.)于磷酸盐缓冲盐水中再水合至4ml。取100μl该再水合佐剂并接着以400μl的汉克氏平衡盐溶液(Hank's BalancedSalt Solution)稀释，然后将其温和地与用于免疫的细胞沉淀物混合。将大约500μg共轭肽或100μg纯化肽和弗氏完全佐剂从足垫注射入Balb/c小鼠，一周一次。这样的每周注射经过6周后，从每只免疫动物的尾巴采一滴血用于测试抗TMCC3多肽抗体的效价或利用FACS分析测试表达TMCC3的细胞。当该效价达到至少1：2000，便于二氧化碳腔室内处死该小鼠并进行颈椎脱位术。收取淋巴结以用于制备杂交瘤。将来自具有最高效价的小鼠的淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞系X63-Ag8.653利用35％的聚乙二醇4000进行融合。在融合后的第十天，通过荧光活化细胞分选法(FACS)筛检该杂交瘤上清液中TMCC3特异性单抗的存在。将来自各个杂交瘤的条件培养基与PC3、Colo-205、LnCap、或Panc-1细胞结合的等分试样一同培养30分钟。培养过后，清洗该细胞样品，将其重新悬浮于0.1ml的稀释液，并于4℃与1μg/ml的FITC共轭山羊抗小鼠IgG的F(ab')2片段一同培养30分钟。清洗该细胞，将之悬浮于0.5ml的FACS稀释液里并利用FACScan细胞分析仪(加利福尼亚州圣何塞的BD公司)进行分析。根据杂交瘤对一个或多个表达TMCC3多肽的细胞系表面的结合情况(如FACS评定)来选择杂交瘤克隆以用于进一步的放大、复制，和定性。
利用噬菌体展示技术生成抗TMCC3单抗(mAb)
除了使用TMCC3蛋白或其片段作为抗原来产生抗TMCC3抗体之外，我们也利用嗜菌体展示技术来生产抗TMCC3单抗。
如图7所示，该预测的TMCC3胞外结构域二级结构包括两个由一螺旋间结构域连接的卷曲螺旋结构域。该第一卷曲螺旋结构域横跨氨基酸112至153，而该第二卷曲螺旋结构域横跨氨基酸282至398。该螺旋间结构域(即该接头)是位于氨基酸153和282之间。可结合至这些胞外结构域的抗体会更加有用。为了促进嗜菌体淘洗，构建数个TMCC3片段，其包括TMCC3胞外结构域或胞外结构域的片段。将这些蛋白片段与一Fc(抗体恒定区片段)或者一His标签一同构建以促进这些肽的纯化和处理。
这些片段可构建至任何合适的载体里面用于蛋白表达。图8显示两个根据pNC载体的表达载体示例。这些产生的片段可能用于筛选能结合至TMCC3结构域的嗜菌体，如下所述。将想要的序列克隆至商购可得的载体对于本领域技术人员而言是常规做法。因此，本领域技术人员将理解所示的该两个载体仅用于说明而并非用来限制本发明的范围。
嗜菌体展示方法
以下的说明提供该嗜菌体展示方法的一种示例性步骤。本领域技术人员将理解到此实施例中所提供的各种参数和条件仅用于说明且这些参数在不悖离本发明范围的情况下可被修改或优化。
scFv/Fab抗体库的构建
依照本发明之实施例，抗体可利用嗜菌体淘洗来产生。如图9中所示，cDNA库可构建自免疫小鼠。该小鼠可能以例如重组TMCC3或其片段进行免疫。处死该小鼠并移出脾脏以提取全部的RNA。接着使用RT-PCR来获取抗体片段(例如：VH、VL、重链(Fd)或轻链)。这些片段可用来构建Fab库。此外，利用PCR将这些片段组合以产生抗体scFv的cDNA片段，接着将其用于构建scFv库。在示例中，该Fab库具有6.6×108的多样性，且该scFv库具有1.4×109的多样性。
制备筛选用的嗜菌体
将各个上述的(scFv或Fab)数据库储备液接种进含有100μg/ml安比西林和2％葡萄糖的2×YT培养基(2YTAG)里，并且摇晃生长于37℃，直到OD(600nm)达到0.5。此培养物接着以1:20的比例加入M13KO7辅助嗜菌体来感染。将所生成的培养物在37℃水浴中培养30分钟(不摇晃)。
接着，用4,000rpm离心15分钟以收集被感染的细胞。将该细胞和缓地重新悬浮于含有100μg/ml安比西林和2％葡萄糖的2×YT培养基(2YTAG)里并在30℃摇晃培养过夜。
将该过夜的培养物以10,000rpm离心20分钟以收集该细胞。将PEG/NaCl(20％PEG8000，2.5M NaCl；1/5体积)加入至上清液中。混合该溶液并于4℃中放置一小时或更久。接着将其以10,000rpm离心20分钟。然后将上清液吸出。
将沉淀物重新悬浮于40ml的无菌水中并以12,000rpm离心10分钟以除去大部分残留的细菌碎屑。再一次将1/5体积的PEG/NaCl加入该上清液中。将其均匀混合后于4℃中放置一小时或更久。
将其再一次以10,000rpm离心20分钟，吸出上清液。接着将该沉淀物重新悬浮于PBS中并以12,000rpm离心10分钟以除去大部分残留的细菌碎屑。
上述为制备嗜菌体的一个示例。此示例仅用于说明且不意图限制保护范围。本领域技术人员将理解到各种修饰和变更是可能的。该嗜菌体可利用ELISA板或进行筛选。
使用ELISA板进行挑选
在ELISA板(Nunc)的每一板孔中涂布1μg/100μl的抗原(例如重组的TMCC3片段)。该抗原的涂布是在PBS(pH 7.4)或50mM的碳酸氢纳(pH 9.6)中于4℃进行过夜。接着，以PBS冲洗板孔三次，然后每个板孔用300μl含5％脱脂牛奶的PBS(MPBS)在37℃进行阻断1.5小时。随后再以PBS冲洗3次。
接着，将100μl的1011至1012嗜菌体溶于5％的MPBS内。将该溶液在37℃中培养90分钟，然后丢弃该测试溶液并以含0.05％Tween20的PBS(PBST)清洗3次
在每格板孔加入100μl的PBS。将其于37℃中培养60分钟并以PBST清洗3次，以PBS清洗1次。将过量的PBS摇晃出板外，并通过加入100μl 100mM的三乙胺(TEA)并在37℃持续旋转30分钟而洗脱该嗜菌体。将Tris缓冲液(50μl,1M,pH 7.4)加入洗脱的100μl嗜菌体以快速中和。
取10ml的大肠杆菌(Escherichia coli)TG1指数成长培养物并将其加入150μl洗脱的嗜菌体中。在免疫板中也加入100μl的TG1培养物。将两种培养物于37℃无晃动培养30分钟以进行感染。选取10ml培养基和100μl被噬菌体感染的TG1细菌并以4000rpm离心15分钟。将该细菌沉淀物重新悬浮于2×TY并置于大型2YTAG板中。使该细菌于30℃生长过夜。
利用进行挑选
将以1ml的PBS预先冲洗三次并重新悬浮于2％的MPBS中。将嗜菌体(0.3ml)与0.5ml 2％PBSM和上述该冲洗过的混合。将得到的悬浮液于旋转器上预先培养30分钟。
移除该并加入TMCC3片段(具有生物素标志物)。将得到的混合物于旋转器上混合90分钟。将以1ml的PBS预先清洗三次并重新悬浮于2％的PBSM中。接着将其于旋转器上培养90分钟。
于旋转器上将该嗜菌体-TMCC3片段混合物加入至平衡过的再另外培养30分钟。接着将该以1ml 0.05％PBST、2％PBSM，和PBS清洗。接着将该结合的嗜菌体以1ml 100mM TEA洗脱。培养期间，在试管中准备0.5ml 1M的Tris(pH 7.4)以用来加入洗脱的嗜菌体，以进行快速中和。
取6ml的TG1指数成长培养物并加入经TEA洗脱的嗜菌体。4ml的E.coli TG1培养物也加入磁珠内。将两个培养物在37℃(水浴)无晃动培养30分钟。
将被感染的TG1细菌集中并以4000rpm离心15分钟。将细菌沉淀物重新悬浮于1ml的2×YT中并置于大型2TYAG板上。使该细菌于30℃生长过夜
下一轮的嗜菌体制备
将含有15％甘油的5-6ml的2×YT加入如上述之已生长过夜的细菌板里，并将菌落以玻璃涂抹棒松开。将50-100μl刮起的细菌加进100ml的2×YTAG。使该细菌摇晃生长于37℃直至600nm的OD值为0.5。将10ml此具有M13KO7辅助嗜菌体的培养物通过以1:20的比例加入辅助嗜菌体来感染。将被感染的培养物于37℃无摇晃培养。
该感染的细胞以4000rpm离心15分钟以收集该细菌。将沉淀物和缓地重新悬浮于50ml的2×YTAK中，并将该培养物于30℃摇晃培养过夜。
取40ml的该过夜培养物并以10,000rpm离心20分钟以收集上清液。将1/5体积(8ml)的PEG/NaCl加入至上清液中，混合均匀并于4℃放置1小时或更久。将该上清液以10,000rpm离心20分钟，然后吸出。将沉淀物重新悬浮于2ml的PBS中并以12000rpm离心10分钟以移除大部分残留的细菌碎屑。
通过ELISA筛选TMCC3阳性嗜菌体
将板中培养的个别菌落移至200μl 2×YTAG 96孔板，并于37℃摇晃生长过夜。使用一96孔板当作转移装置，将50μl的接种液自该板转移至每格含有200μl2×YTAG的第二96孔板，并于37℃摇晃生长2小时。将具有109pfu M13KO7辅助嗜菌体的50μl 2×YTAG加入该第二板的各个孔，于37℃静置30分钟，接着于37℃摇晃1小时。
将该板以4000rpm离心30分钟，接着将上清液吸出。将沉淀物重新悬浮于300μl的2×YTAK并于30℃摇晃生长过夜。将该混合物以4000rpm离心30分钟，并将100μl的培养物上清液使用于嗜菌体ELISA。
将ELISA板每孔涂上1μg/100μl蛋白抗原。以PBS冲洗板孔3次然后每孔以300μl2％MPBS于37℃阻断2小时。以PBS冲洗板孔3次。如上所详述，将100μl的嗜菌体培养物上清液加入，并于37℃培养90分钟。丢弃该测试溶液并以PBST清洗三次。加入适当稀释于2％MPBS的HRP-抗M13抗体，于37℃培养90分钟，并以PBST清洗三次。
将该反应混合物与底物溶液(TMB)培养。通过加入50μl 1M的硫酸来终止该反应。颜色应转为黄色。读取650nm和450nm的OD值。将OD 450的读值减去OD 650nm的读值。
图10显示利用ELISA板方法进行生物淘洗的示例性结果。在此实验中，使用VEGFR2-Fc片段作为背景对照组。也结合至背景对照组的克隆(如3B-12克隆)很可能会结合至该重组蛋白的Fc部分。这些克隆可被忽略。如图10所示，鉴别出数个对TMCC3螺旋间结构域具有特异性的克隆。
就作为治疗剂的应用而言，抗体优选地应对目标分子具有良好的亲和性。结合至TMCC3的各种抗体之亲和性和动力学可以通过任何适合的仪器来评估，例如ELISA或在BIAcore T100上进行的基于表面等离子体共振(SPR)的分析试验。
图11显示TMCC3螺旋间-Fc-10His与源自该阳性嗜菌体克隆的嵌合型抗体之间结合的交互作用。从该结合曲线，可以计算这些嗜菌体克隆的解离常数(显示于图11的表格)。如所示，TMCC3螺旋间-Fc-10His与大部分的嵌合型抗体之间的结合是非常紧密的，解离常数在亚奈米摩尔(约10-10M)范围内。例如，抗体4-84具有1.13x10-10M的解离常数。
抗体4-84的CDR序列如下：CDRH1(GFNIKDYYMH；SEQ ID NO:13)、CDRH2(WIDPENGDTEYAPKFDG；SEQ ID NO:14)、CDRH3(NFDY；SEQ ID NO:15)、CDRL1(SASSSVSYMY；SEQ ID NO:16)、CDRL2(DTSNLAS；SEQ ID NO:17)，和CDRL3(QQYSGYPLT；SEQ ID NO:18)。
此外，多种其他抗体的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2，和CDRL3序列(SEQ IDNOs:20-763)显示于图29中。它们在TMCC3上的结合位置有被标示，无论是TMCC3的螺旋间结构域或TMCC3的第一螺旋。大部分的CDR序列显现出高度同源性。例如：CDRH1含有GFNIKDTYMH序列或与此序列高度同源的序列，和CDRH2含有WIDPENGDTEYAPKFQG序列或与此序列高度同源的序列。
利用BIAcore进行亲和性测量和动力学分析
TMCC3螺旋间-Fc-10His与嵌合型抗体的结合动力学可利用BIAcore来测量和分析，例如，通过使用相关的软件以进行单循环或多循环动力学(MCK)方法。以下描述BIAcore分析试验的示例性参数和条件。这些参数和条件仅用于参考，且所属领域技术人员将理解到在不悖离本发明范围内的变动是可能的。
作为示例，TMCC3嵌合型抗体可能被固定于CM5芯片上，密度为可使芯片在50–150反应单元(RU)的范围内达到R最大(Rmax)。
在此实施例中，该动力学分析试验参数如下：数据收集速率1Hz；双重检测模式；温度：25℃；浓度单位：nM；和缓冲液A HBS-EP。该测量以5重复执行。各种仪器设定如下：
选择捕获(Capture)，流动通路2-1，芯片CM5，再生1。
选择配体捕获(Ligand Capture)并设定参数如下：接触时间：12秒，流速：每分钟10μL，稳定期：90秒。(范围为50至150反应单位(RU))(以BD2和突变体的抗VEGF抗体作为配体)。
选择样本(Sample)并设定参数如下：接触时间：300秒，流速：每分钟40μL，解离时间：500秒。
选择再生(Regeneration)并设定参数如下：再生溶液：25mM的甘氨酸(pH1.5)，接触时间：60秒，流速：每分钟30μL，稳定期：120秒。
以电泳缓冲液(HBS-EP+)连续稀释TMCC3片段。所获得的连续浓度为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0和1.25nM(重复)。依据支架位置准备和放置样本。
以BIAcoreT100评估软件评估结果。通过减去来自空白流道的反应来校正缓冲液对该结合反应的影响。利用1：1之朗缪尔拟合模型(Langmuir fitting model)估算ka或kon(结合速率)和kd或koff(解离速率)。KD(或Kd)值可由koff和kon的比率来决定(也即KD＝koff/kon)。
图12A显示使用3B-8和3B-45克隆结合至TMCC3螺旋间-Fc-10His的单循环动力学分析试验的两个示例(分析试验条件：900RU，pH 5.5)，而图12B显示在稍微不同的条件下之相同试验(200RU，pH 5.5)。相对应的动力学参数显示于图下方的表格。其他抗体也具有相似的活性。由SPR动力学(BIAcore)分析所得到的这些克隆的结果是显示于图13的表格中。
TMCC3特异性嵌合型单抗的表位作图
我们也利用各种TMCC3片段来研究与TMCC3特异性嵌合型单抗互相作用的表位。如图13所示，两个嵌合型抗体3B-22和4-84显示与TMCC3的螺旋间片段有良好的结合。与克隆3B-22结合的的片段含有螺旋间结构域的1-30肽，这意味着该单抗是结合至位于螺旋间结构域内氨基酸1-30的伸展(stretch)表位。在另一方面，克隆3B-66和4-84良好地结合至较长的片段(螺旋间1-67和1-128片段)，但仅微弱地结合至较短的片段(例如螺旋间1-30片段)，这意味着它们的表位很可能位于该螺旋间的氨基酸30-67。
单抗与癌细胞的结合
本发明的一些实施方式关于利用抗TMCC3抗体治疗癌症的方法。本发明探究了这些抗体结合至癌细胞的能力。利用免疫组织化学染色法，之后再利用流式细胞成像分析试验来评估抗体与癌细胞的结合。各种抗体与不同癌细胞系之结合结果显示于图15-18中。
图15显示各种抗体结合至AS-B634(p15)细胞的结果。图16显示结合至MDA-MB231细胞(三阴性、高度侵略性，和转移性细胞)的结果。图17显示结合至来自病患的BCSC之结果。各种抗体结合至不同乳腺癌细胞(AS-B634、MDA-MB231，和T47D)的结果是总结于图18的条形图。
除了显示于图15-18的乳腺癌细胞之外，该抗体也与其他癌细胞结合良好。图19显示结合至一前列腺癌细胞系(PC3)的结果。图20显示与胰腺癌细胞(例如：As PC1、MIA-paca1，和PL45)的结合结果。各种抗体与肝癌细胞(HepG2、Hep3B、H22T/VGH，和H59T/VGH)的结合能力显示于图21中。如图所示，3B-22和4-84对这些肝癌细胞而言是非常强的结合剂。图22显示各种抗体与肺癌细胞(H460和A549)的结合结果。这些结果显示本发明的抗体可紧密地结合至各种癌细胞。因此，这些抗体具有广泛的应用。
抗体与癌症异种移植的结合
除了细胞系以外，这些抗体也良好地结合至异种移植的癌细胞。图23显示本发明之各种抗体与乳腺癌异种移植肿瘤(BC0244)的结合，而图24显示与另一个乳腺癌异种移植肿瘤(BC0145)的相似结果。除了乳腺癌异种移植以外，这些抗体也对结合至胰腺癌异种移植(图25；PC038)很有效。再次强调，这些结果显示本发明的抗体可在不同癌症型态中有广泛的应用。
抗TMCC3抗体的补体依赖性细胞毒性活性(CDC)分析
抗体结合至目标细胞可能会导致细胞杀灭。这确实可通过本发明抗体观察到。如图26所示，各种抗TMCC3抗体与乳腺癌细胞系MDA-MB231的结合会诱导补体依赖性细胞毒性活性。因此，该乳腺癌细胞裂解。这些结果指出本发明的抗体可有效结合至癌细胞并通过补体依赖性机制来诱导癌细胞的裂解。因此，这些抗体将会是有效的癌症治疗剂。
抗TMCC3抗体的抗体依赖性细胞毒性活性(ADCC)分析
ADCC是一种细胞介导的免疫防御机制，通过该机制，一旦目标细胞的膜表面抗原被特异性抗体结合，免疫系统的作用细胞便可裂解该目标细胞。图27显示本发明的抗体也能有效地诱导ADCC来裂解目标癌细胞(例如MDA MB231)。这些结果表示本发明的抗体可通过CDC和ADCC机制来诱导目标细胞的裂解。
干细胞样癌细胞(也称作(癌症干细胞))的富集
如上所述，干细胞样的癌细胞亚群会表达更多的TMCC3。这些干细胞样癌细胞更有侵略性，而应成为癌症治疗管理的主要重点。为了有效地管理和治疗这些较具侵略性的癌细胞，人们需要一个辨认并分离这些干细胞样癌细胞的方法。
上面的抗体结合结果指出本发明的抗体将会是鉴别和分离此类干细胞样癌细胞的有效工具。图28显示此类的示例──来自BC0145异种移植的干细胞样癌细胞的富集。
事实是这些抗体可有效地富集干细胞样癌细胞，这代表它们可用于诊断和治疗。在诊断上，它们可能被用来评估干细胞样癌细胞的存在和数量。这类细胞的存在将表示更具侵略性的癌症类型。在治疗应用上，这些抗体可能被用来靶向这些更具侵略性的癌症群体，例如，通过共轭结合至治疗剂、放射性同位素、或细胞毒性剂，或通过仅仅与这些细胞结合来诱导CDC或ADCC细胞裂解。或者，这些抗体可被用来移除循环中的干细胞样癌细胞。这些是如何运用这些抗体来诊断和治疗更具侵略性的癌细胞亚群的有限示例。本领域技术人员将理解到这些抗体的应用并不局限于此。
虽已就有限数量的实施例对本发明进行描述，然而所属领域技术人员根据本发明将理解到在不悖离如本文所公开之本发明范围的情况下可设计出其他实施例。因此，本发明的范围应仅受到所附权利要求的限制。

Claims (10)

1.一种针对跨膜卷曲螺旋结构域蛋白3(TMCC3)的抗体或其结合片段，其中该抗体包含选自SEQ ID NO:20至SEQ ID NO:143的CDRH1序列、选自SEQ ID NO:144至SEQ ID NO:267的CDRH2序列、选自SEQ ID NO:268至SEQ ID NO:391的CDRH3序列、选自SEQ ID NO:392至SEQID NO:515的CDRL1序列、一选自SEQ ID NO:516至SEQ ID NO:639的CDRL2序列，和选自SEQID NO:640至SEQ ID NO:763的CDRL3序列。
2.如权利要求1所述的抗体或其结合片段，其中该CDRH1序列是SEQ ID NO:102，该CDRH2序列是SEQ ID NO:226，该CDRH3序列是SEQ ID NO:350，该CDRL1序列是SEQ ID NO:474，该CDRL2序列是SEQ ID NO:598，和该CDRL3序列是SEQ ID NO:722。
3.一种治疗癌症的方法，包括：向有需要的对象给予如权利要求1或2所述的针对跨膜卷曲螺旋结构域蛋白3(TMCC3)的抗体或其结合片段。
4.如权利要求3所述的方法，其中该癌症选自乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌，和肝癌。
5.如权利要求3所述的方法，其中该癌症为乳腺癌。
6.一种诊断或评估癌症病症的方法，包括：
评估样品中的跨膜卷曲螺旋结构域蛋白3(TMCC3)的表达水平或活性，
其中该TMCC3的表达水平或活性相较于标准品为增加时，表示在该样品中存在癌症干细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其中该评估使用如权利要求1或2所述的抗体或其结合片段。
8.如权利要求6所述的方法，其中该癌症干细胞为造血癌干细胞、上皮癌干细胞、乳腺癌干细胞、卵巢癌干细胞、肺癌干细胞、胰腺癌干细胞、前列腺癌干细胞、脑癌干细胞、结肠癌干细胞、骨髓癌干细胞，和/或淋巴癌干细胞。
9.如权利要求6所述的方法，其中该癌症干细胞为乳腺癌干细胞。
10.一种利用如权利要求1或2所述的抗体或其结合片段来定位或成像癌症干细胞的方法。
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