TWI631958B - 抗tmcc3免疫共軛物及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供抗TMCC3免疫共軛物。本發明亦提供在治療或偵測TMCC3陽性癌症中使用該等免疫共軛物之方法。

Description

抗TMCC3免疫共軛物及其用途

本發明係關於抗TMCC3免疫共軛物及其使用方法。

抗體-藥物共軛物(ADC)為增加效能及治療窗的新穎抗體修飾方法中之一者。ADC由抗體經由特異性連接子與生物活性細胞毒素酬載所組成且經設計為用於治療癌症患者之標靶療法。抗體藥物共軛物為生物共軛物與免疫共軛物之實例。

近年來，對新穎目標及不同類型之單株抗體的研究已吸引了大量關注。用於選擇ADC之適合抗體的標準與用於選擇適合裸抗體之標準並不完全相同。對於選擇ADC之抗體而言，內化能力要比抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)重要。在本文中，吾人選擇TMCC3及其單株抗體作為吾人之目標及ADC之抗體。

大多數癌症死亡係由於復發性或轉移性疾病而發生，而並非由原發腫瘤之影響而發生。腫瘤可視為由致瘤癌細胞所引發之異常器官，其經由積聚突變而獲得無限增殖之能力。自作為異常器官的腫瘤的此視角看，可應用正常幹細胞生物學之原理來較好地理解腫瘤如何產生及播散。諸多觀測結果顯示正常幹細胞與致瘤細胞之間的類比為合適的。正常幹細胞及致瘤細胞兩者均具有廣泛增殖潛力且能夠產生新(正常或異常)組織。致瘤細胞可視為癌症幹細胞(cancer stem cells； CSC)，其經歷異常且調節不佳的器官形成(類似於正常幹細胞所經歷者)過程。腫瘤及正常組織兩者均由細胞之異質組合組成，具有不同表型特徵及不同增殖潛力。

癌症幹細胞咸信為一部分具有幹細胞樣特性之腫瘤細胞，其引發且維持贅生性純系。此等細胞能夠自我更新，且亦產生祖細胞，該等祖細胞產生表型多樣癌細胞但具有較低致瘤潛力。相比於並非癌症幹細胞之腫瘤細胞，此幹細胞樣細胞之亞群對於腫瘤形成應具有高效率。

癌症幹細胞之存在對於癌症療法具有深遠影響。目前，腫瘤中之所有表型多樣癌細胞均得到處理，儘管其具有無限增殖潛力且可獲得轉移能力。然而，多年來，已公認可在從未顯現轉移性疾病的患者中遠離原發腫瘤之部位處偵測到少量播散性癌細胞。一種可能性在於大部分癌細胞缺乏形成新腫瘤之能力，因此僅稀少的癌症幹細胞的播散可導致轉移性疾病。因此，療法之目標必須為鑑別且殺死此癌症幹細胞群。

現有療法很大程度上係針對大量腫瘤細胞群而研發，因為該等療法可藉由其縮小腫瘤塊之能力來鑑別。然而，由於癌症中之大部分細胞具有有限的增殖潛力，縮小腫瘤之能力主要反映殺死此等細胞之能力。針對癌症幹細胞之特異性療法可引起較為持久的反應且會治癒轉移性腫瘤。

已證明癌症幹細胞(CSC)存在於各種人類癌症，諸如黑色素瘤、神經管胚細胞瘤、結腸腫瘤、肝腫瘤、肺腫瘤、前列腺腫瘤、乳腺腫瘤及卵巢瘤中。此等CSC具有自我更新、分化能力，且顯示對化學治療劑與輻射具有抗性，其可能為臨床減輕之數年後腫瘤復發之原因(Hong SP,Wen J,Bang S等人；「CD44-positive cells are responsible for gemcitabine resistance in pancreatic cancer cells」；Int J Cancer；2009；1 25：2323-2331,Wilson TR,Johnston PG,Longley DB；「Anti-apoptotic mechanisms of drug resistance in cancer」；Curr Cancer Drug Targets；2009；9(3)：307-319及Rycaj K1,Tang DG等人；「Cancer stem cells and radioresistance」；Int J Radiat Biol；2014 Aug；90(8)：615-21.)。

US 2014/0363372 A1鑑別出跨膜及捲曲螺旋域家族3(TMCC3)。TMCC3屬於TEX28家族且預測為整合膜蛋白。TMCC3對細胞存活、增殖、癌轉移以及自我更新及乳腺癌幹細胞之維持為至關重要的，且TMCC3之較高表現與各種癌症中之不良臨床結果相關。TMCC3在侵襲性乳癌細胞株及BCSC中分別比在較不具侵襲性之乳癌細胞株及非BCSC中表現要高。此外，在小鼠中，TMCC3表現在遠距離淋巴結癌轉移中比在人類乳癌異種移植之原發腫瘤中要高。TMCC3之沉默導致G1期之留滯及凋亡細胞之增加，以及造成乳腺球群細胞形成及ALDH活性之降低，其為癌症幹細胞之重要特徵。Pu Xia及Xiao-Yan Xu(「PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in cancer stem cells：from basic research to clinical application」；Am J Cancer Res.；2015；5(5)：1602-1609)提出IGF-1R/PI3K/Akt/mTOR路徑對於BCSC存活及維持至關重要。US 2014/0363372 A1揭示TMCC3對乳癌細胞存活、自我更新及癌轉移為至關重要的。因此，TMCC3之抑制提供靶向幹細胞之治療性策略。此外，TMCC3可藉由使用抗TMCC3抗體分選之FACS充當BCSC富集之生物標記物，且亦可充當經歷分化之hES細胞之標記物。

此項技術中仍需要可用於靶向TMCC3來治療及診斷TMCC3相關病狀(諸如癌症)之安全且有效的藥劑。本發明實現彼需要且提供其他益處。

本發明之一個態樣提供一種包含本文所述之抗體及治療劑或標記之免疫共軛物。

本發明之另一態樣提供一種包含本文所述之免疫共軛物及醫藥學上可接受之載劑的組合物。

本發明之另一態樣提供一種用於治療或預防與TMCC3相關之癌症的方法。

本發明之另一態樣提供一種用於偵測生物樣本中TMCC3之存在的方法。

本發明之另一態樣提供一種用於偵測個體中TMCC3陽性癌症之方法。

本發明之另一態樣提供一種包含本文所述之免疫共軛物或組合物的套組。

本文提及之所有公開案、專利申請案、專利及其他參考案均以全文引用的方式併入本文中。

本文中所揭示的本發明之優點及特徵將根據以下描述、附圖及申請專利範圍變得顯而易見。此外，應理解，本文所述之各種實施例之特徵並不相互排斥且可以各種組合及排列存在。

圖1展示藉由使用4%至12%非還原性及還原性SDS-PAGE凝膠之後進行庫馬斯亮藍染色(Coomassie brilliant blue staining)來分析由實例1至實例6獲得的ADC樣本之結果。

圖2展示實例8之生物素化分析結果。

圖3展示實例9之結合親和力測試結果。

圖4展示實例10之細胞毒性分析結果。

圖5展示實例11在不同溫度及時段下之內化分析結果。

除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之一般技術者通常所理解相同之含義。雖然類似或等效於本文所述之方法及材料的任何方法及材料可用於本發明之實現或測試中，但現對較佳方法及材料加以描述。本文中所具體提及的所有公開案及專利以引用的方式併入本文中用於所有目的，包括描述及揭示公開案中所報導、可結合本發明使用的化學物質、細胞株、載體、動物、儀器、統計學分析及方法。本說明書中所引用的所有參考文獻均視為此項技術中之技能水準之指示。

應注意，如本文所用，且在隨附申請專利範圍中，除非上下文另外清楚地規定，否則單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個指示物。同樣，在本文中，術語「一(a/an)」、「一或多個」及「至少一個」可互換使用。亦應注意，術語「包含」、「包括」及「具有」可互換使用。

通常，本文中範圍表述為自「約」一個特定值及/或至「約」另一特定值。當表述此類範圍時，一實施例包括自一個特定值及/或至另一特定值之範圍。類似地，當值表述為近似值(藉由使用詞語「約」)時，將理解特定值形成另一實施例。將進一步理解，範圍中之每一者之端點相對於及獨立於另一端點均為有意義的。如本文所用，術語「約」係指±20%、±15%、±10%、±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2%、±1%、±0.5%或±0.25%。

當提及調配物組分時，所用術語，例如「藥劑」意欲不僅涵蓋 特定分子實體，且亦涵蓋其醫藥學上可接受之類似物，其包括(但不限於)鹽、酯、醯胺、前藥、共軛物、活性代謝物及其他此類衍生物、類似物及相關化合物。

如本文所用，術語「治療(treating及treatment)」係指向罹患不良病狀、病症或疾病之有臨床症狀的個體投與藥劑或調配物，以便實現症狀嚴重程度及/或頻率降低、消除症狀及/或其潛在病因及/或有助於損傷好轉或修復。術語「預防(preventing及prevention)」係指向易罹患特定不良病狀、病症或疾病之無臨床症狀的個體投與藥劑或組合物，且因此係關於預防症狀出現及/或其潛在病因。如熟習此項技術者所理解，預防(prevention/preventing)不必達成病狀之絕對(完全)阻斷或避免。確切而言，預防可達成待預防之疾病或病狀之實質上(例如，超過約50%)減輕或避免。除非本文中另外明確或藉由暗示指明，否則若在未提及可能的預防的情況下使用術語「治療」，則意欲亦涵蓋預防。

術語「醫藥學上可接受」意謂材料並非生物學或其他方面不合需要的，例如該材料可併入本發明之調配物中而不會引起任何不合需要的生物效應或以有害方式與劑型調配物之其他組分中之任一者相互作用。然而，當術語「醫藥學上可接受」用以指醫藥賦形劑時，其暗示該賦形劑已滿足毒理學及製造測試所要求之標準及/或其包括在由美國食品藥物管理局(the U.S.Food and Drug Administration)準備的非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)上。如下文進一步詳細解釋，如「藥理學上活性」衍生物或類似物中之「藥理學上活性」(或簡言之「活性」)係指衍生物或類似物具有與親本藥劑相同之藥理學活性類型。

活性劑之「有效」量或「治療有效」量意指無毒性但足以提供有益效應的該藥劑之量。活性劑之「有效」量會視個體間之年齡及一般狀況、特定活性劑及其類似物而變化。除非另外指明，否則如本文所用，術語「治療有效」量意欲涵蓋除有效治療不良病狀之量以外，亦涵蓋有效預防不良病狀及/或改善不良病狀之量。

如本文所用，個體係指人類及非人類靈長類動物(例如大猩猩、獼猴、狨猴)、家畜動物(例如羊、牛、馬、驢及豬)、伴侶動物(例如狗、貓)、實驗室測試動物(例如小鼠、兔、大鼠、天竺鼠、倉鼠)、豢養野生動物(例如狐狸、鹿)及任何其他可受益於本發明藥劑之生物體。對可受益於目前描述之藥劑的動物類型不存在限制。個體，不論其是否為人類或非人類生物體，可稱為患者、個體、動物、宿主或接受者。患者可為尋求現有治療方案之治療、監測、調整或調節等之個體。「癌症患者」可指已診斷患有癌症，目前正遵照治療方案或處於例如移除腫瘤之手術後的復發之風險下的個體。在一些實施例中，癌症患者已診斷患有癌症且為療法之候選者。癌症患者可包括尚未接受治療、目前正接受治療、已作手術之個體及已中斷治療之個體。

「癌症」、「腫瘤」、「轉型」及其類似術語包括癌變前細胞、贅生性細胞、轉型細胞及癌細胞，且可指實體腫瘤或非實體癌症(參見例如，Edge等人AJCC Cancer Staging Manual(第7版2009)；Cibas及Ducatman Cytology：Diagnostic principles and clinical correlates(第3版2009))。癌症包括良性贅瘤及惡性贅瘤(異常生長)兩者。「轉型」係指自發性或誘發性表型變化，例如，細胞不朽化、形態變化、細胞生長異常、降低之接觸抑制及固著及/或惡性疾病(參見，Freshney,Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique(第3版1994))。 儘管轉型可由經轉型病毒之感染及新基因組DNA之併入或外源DNA之攝入引起，其亦可以自發方式或在暴露於誘癌物之後產生。

術語「癌症」可指癌瘤、肉瘤、腺癌、淋巴瘤、白血病、實體及淋巴癌症等。不同類型的癌症之實例包括(但不限於)肺癌(例如，非小細胞肺癌或NSCLC)、卵巢癌、前列腺癌、結腸直腸癌、肝癌(亦即，肝癌瘤)、腎癌(亦即，腎細胞癌)、膀胱癌、乳癌、甲狀腺癌、胸膜癌、胰臟癌、子宮癌、子宮頸癌、睪丸癌、肛門癌、胰臟癌、膽管癌、腸胃類癌、食道癌、膽囊癌、闌尾癌、小腸癌、胃癌(stomach cancer/gastric cancer)、中樞神經系統之癌症、皮膚癌、絨膜癌、頭頸癌、血癌、骨原性肉瘤、纖維肉瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤、黑素瘤、B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、小細胞淋巴瘤、大細胞淋巴瘤、單核細胞性白血病、骨髓性白血病、急性淋巴球性白血病、急性髓細胞性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)及多發性骨髓瘤。在一些實施例中，本發明之免疫共軛物及方法適用於治療與TMCC3相關之癌症(例如，黑色素瘤、神經管胚細胞瘤、結腸癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、乳癌及卵巢癌)。

免疫共軛

本發明揭示一種包含抗TMCC3抗體或其結合片段及治療劑或標記之免疫共軛物。在本發明之一些實施例中，免疫共軛物具有式Ab-(L-D)m，其中：Ab為TMCC3抗體或其結合片段；L為連接子；D為藥物負載(例如，治療劑或標記)；且m為1至8之整數，較佳為2至7，更佳為3至6，且甚至更佳為4至5。

術語「抗TMCC3抗體」及「與TMCC3結合之抗體」係指能夠以 足夠親和力結合TMCC3的抗體，使得抗體適用作靶向TMCC3之診斷劑及/或治療劑。在某些實施例中，與TMCC3結合之抗體的解離常數(Kd)為至少約100nM、至少約10nM、至少約5nM、至少約4nM、至少約3nM、至少約2nM、至少約1nM、至少約0.1nM或至少約0.01nM(例如約10^-8M或小於10^-8M，例如約10^-8M至約10^-12M，例如約10^-9M至約10^-11M)。Kd可由以下等式計算：

其中：X為配位體(TMCC3抗原)之濃度。

Y為特異性結合。

Bmax為結合位點之最大數目，其以與Y軸相同之單位表示(通常為每分鐘之放射性計數、每個細胞之位點數或每毫克組織之受體的fmol)。

Kd為平衡解離常數，以與X軸(濃度)相同之單位表示。當抗體藥物共軛物之濃度等於Kd時，在平衡時佔據一半結合位點。

在某些實施例中，抗TMCC3抗體與來自不同物種的TMCC3當中的保守TMCC3抗原決定基結合。在一些實施例中，抗體可為多株抗體、單株抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體及人類或人類化抗體。在一些實施例中，抗體為結合TMCC3之抗體片段。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂；雙功能抗體；線抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。

術語「內化率」表示在特定培育時間之後在特定培育溫度下內化於細胞中的免疫共軛物之量。內化率可由以下等式計算： 內化率=(在用細胞培育免疫共軛物Y分鐘之後在X℃下免疫共軛物與細胞表面的結合百分比)/(在X℃下且在0分鐘之培育時間下免疫共軛物與細胞表面的結合百分比)*100%。

根據本發明，在37℃之培育溫度及60分鐘之培育時間下，免疫共軛物之內化率為至少約50%(例如約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約100%)。

TMCC3蛋白具有與SEQ ID NO：1之序列70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。

TMCC3中適用的免疫原性序列之實例包括(但不限於)SEQ ID NO：2。

TMCC3基因cDNA具有與SEQ ID NO：3之序列70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列。

在本發明之一些實施例中，抗TMCC3抗體或其結合片段包含CDRH1，其包含胺基酸序列GFNIKDYYMH(SEQ ID NO：4)；CDRH2，其包含胺基酸序列WIDPENGDTEYAPKFDG(SEQ ID NO：5)；及CDRH3，其包含胺基酸序列NFDY(SEQ ID NO：6)；及/或CDRL1，其包含胺基酸序列SASSSVSYMY(SEQ ID NO：7)； CDRL2，其包含胺基酸序列DTSNLAS(SEQ ID NO：8)；及CDRL3，其包含胺基酸序列QQYSGYPLT(SEQ ID NO：9)。在本發明之一些實施例中，抗TMCC3抗體或其結合片段包含重鏈可變區(V_H)，其包含與 (SEQ ID NO：10)80%、81%、82%、 83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及/或輕鏈可變區(V_L)，其包含與 (SEQ ID NO：11)80%、81%、82%、83%、84%、 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在本發明之一些實施例中，抗TMCC3抗體或其結合片段包含重鏈可變區(V_H)，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及/或輕鏈可變區(V_L)，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列。

可以本領域中之技術內的各種方式，例如，使用公開可用的電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體來達成序列一致性之百分比。

對於製備適合的本發明抗體及根據本發明之用途，例如重組抗體、單株抗體或多株抗體而言，可使用此項技術中已知的諸多技術(參見例如，Kohler及Milstein,Nature 256：495-497(1975)；Kozbor等人,Immunology Today 4：72(1983)；Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy中之第77至96頁,Alan R.Liss,Inc.(1985)；Coligan,Current Protocols in Immunology(1991)；Harlow及Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(1988)；及Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(第2版1986))。

編碼相關抗體之重鏈及輕鏈的基因可選殖自細胞，例如，編碼單株抗體之基因可選殖自融合瘤且可用於產生重組單株抗體。編碼單株抗體之重鏈及輕鏈的基因庫亦可由融合瘤或漿細胞製得。重鏈及輕鏈基因產物之隨機組合會產生具有不同抗原特異性之大抗體庫(參見例如，Kuby,Immunology(第3版增刊1997))。

用於產生單鏈抗體或重組抗體之技術(美國專利第4,946,778號、美國專利第4,816,567號)可適用於產生本發明之抗體及多肽。此外，可使用轉殖基因小鼠或其他生物體(諸如其他哺乳動物)來表現人類化或人類抗體(參見例如，美國專利第5,545,807號；第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；第5,661,016號；Marks等人,Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等人,Nature 368：856-859(1994)；Morrison,Nature 368：812-13(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnology 14：845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology 14：826(1996)；及Lonberg及Huszar,Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995))。

或者，可使用噬菌體呈現技術鑑別特異性結合於所選抗原之抗體及異聚Fab片段(參見例如，McCafferty等人,Nature 348：552-554(1990)；Marks等人,Biotechnology 10：779-783(1992))。抗體亦可製成為雙特異性的，亦即，能夠識別兩種不同抗原(參見例如，WO 93/08829；Traunecker等人,EMBO J.10：3655-3659(1991)；及Suresh 等人,Methods in Enzymology 121：210(1986))。抗體亦可為異共軛物，例如，兩種共價連接之抗體或免疫毒素(參見例如，美國專利第4,676,980號；WO 91/00360；WO 92/200373；及EP 03089)。

可使用多種表現系統，包括原核表現系統及真核表現系統來產生抗體。在一些實施例中，表現系統為哺乳動物細胞(諸如融合瘤)或CHO細胞表現系統。諸多此類系統廣泛係購自商業供應商。在其中抗體包含V_H及V_L區之實施例中，例如在雙順反子表現單元中或在不同啟動子的控制下，V_H及V_L區可使用單一載體表現。在其他實施例中，V_H及V_L區可使用單獨載體表現。如本文所述之V_H及V_L區可視情況包含N端處之甲硫胺酸。

本發明之抗體亦可以各種格式產生，包括以Fab、Fab'、F(ab')₂、scFv或dAB形式。可藉由各種方法獲得抗體片段，該等方法包括用酶，諸如胃蛋白酶(產生(Fab')₂片段)或番木瓜蛋白酶(產生Fab片段)消化完整抗體；或從頭合成。抗體片段亦可使用重組DNA方法合成。在一些實施例中，抗TMCC3抗體包含特異性結合TMCC3之F(ab')₂片段。本發明之抗體亦可包括人類恆定區，例如，人類化或人類抗體。參見例如，Fundamental Immunology(Paul編，第4版1999)；Bird等人,Science 242：423(1988)；及Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879(1988)。

人類化或靈長類化非人類抗體之方法亦為此項技術中已知。一般而言，人類化抗體具有一或多個自非人類來源引入至其中的胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常稱為輸入殘基，其通常取自輸入可變域。人類化基本上可遵照Winter及同事的方法(參見例如，Jones等人,Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332：323-327 (1988)；Verhoeyen等人,Science 239：1534-1536(1988)及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992))來進行，其係藉由用嚙齒動物CDR序列取代人類抗體之相應序列。此類人類化抗體為嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中實質上小於一個完整人類可變域已經非人類物種之相應序列取代。實際上，人類化抗體通常為一些CDR殘基及可能一些FR殘基經來自嚙齒動物抗體中之類似位點的殘基取代之人類抗體。

當產生及/或製成且選擇本發明之TMCC3抗體時，其可與醫藥學上活性或診斷性部分或生物相容性修飾因子連接、融合、共軛(例如共價或非共價)或以其他方式與其結合。

在一些實施例中，治療劑為細胞生長抑制劑或細胞毒性劑或具有相應放射性同位素之同位素螯合劑。細胞生長抑制劑或細胞毒性劑之實例包括(但不限於)抗代謝物(例如，氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5-FUdR)、甲胺喋呤、甲醯四氫葉酸(leucovorin)、羥基尿素(hydroxyurea)、硫鳥嘌呤(6-TG)、巰基嘌呤(6-MP)、阿糖胞苷、噴司他汀(pentostatin)、氟達拉賓磷酸鹽(fludarabine phosphate)、克拉屈濱(cladribine；2-CDA)、天冬醯胺酶、吉西他濱(gemcitabine)、卡培他濱(capecitibine)、硫唑嘌呤、胞嘧啶甲胺喋呤、三甲氧苄二氨嘧啶(trimethoprim)、乙胺嘧啶或培美曲塞(pemetrexed))；烷基化劑(例如，美法侖(melphalan)、氯芥苯丁酸、白消安(busulfan)、噻替派(thiotepa)、異環磷醯胺(ifosfamide)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine)、鏈脲菌素(streptozocin)、達卡巴嗪(dacarbazine)、絲裂黴素C、環磷醯胺(cyclophosphamide)、氮芥(mechlorethamine)、烏拉莫司汀(uramustine)、二溴甘露醇、四硝酸 酯、丙卡巴肼、六甲蜜胺(altretamine)、米托唑胺(mitozolomide)或替莫唑胺(temozolomide))；類烷基化劑(例如，順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、奈達鉑(nedaplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、賽特鉑(satraplatin)或特瑞鉑(triplatin))；DNA小溝烷基化劑(例如諸如CC-1065之倍癌黴素及其任何類似物或衍生物；吡咯并苯并二氮卓(pyrrolobenzodiazapene)或其任何類似物或衍生物)；蒽環黴素(例如，道諾黴素、小紅莓、表柔比星(epirubicin)、艾達黴素或伐柔比星(valrubicin))；抗生素(例如，放線菌素D(dactinomycin)、博萊黴素(bleomycin)、光神黴素(mithramycin)、安麯黴素(anthramycin)、鏈佐黴素、短桿菌素D、絲裂黴素(例如絲裂黴素C)、卡奇黴素；抗有絲分裂劑(包括例如，類美登素(maytansinoid)(諸如DM1、DM3及DM4)、奧瑞他汀(auristatin)(包括例如，單甲基奧瑞他汀E(MMAE)及單甲基奧瑞他汀F(MMAF))、海兔毒素(dolastatin)、隱藻素(cryptophycin)、長春花生物鹼(例如，長春新鹼、長春鹼、長春地辛、長春瑞濱)、紫杉烷(例如，太平洋紫杉醇、多西他賽(docetaxel)或新穎紫杉烷)、特吡萊辛(tubulysin)及秋水仙鹼(colchicine))；拓撲異構酶抑制劑(例如，伊立替康(irinotecan)、拓朴替康(topotecan)、喜樹鹼(camptothecin)、依託泊苷(etoposide)、替尼泊甙(teniposide)、安吖啶(amsacrine)或米托蒽醌(mitoxantrone))；HDAC抑制劑(例如，伏立諾他(vorinostat)、羅米地辛(romidepsin)、西達本胺(chidamide)、帕比司他(panobinostat)或貝林諾他(belinostat))；蛋白酶體抑制劑(例如，肽基酸)；以及放射性同位素，諸如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²或²¹³、P³²及Lu之放射性同位素(包括Lu¹⁷⁷)。同位素螯合劑之實例包括(但不限於)乙二胺四乙酸(EDTA)、二伸乙基三胺 -N,N,N',N",N"-五乙酸(DTPA)、1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N',N",N"'-四乙酸(DOTA)、1,4,7,10-肆(2-羥丙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷(THP)、三伸乙基四胺-N,N,N',N",N"',N"'-六乙酸(TTHA)、1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N',N",N"'-肆(亞甲基膦酸酯)(DOTP)及巰基乙醯基三甘胺酸(MAG3)。

在一些實施例中，當免疫共軛物用於偵測時，其可包含標記。標記包括(但不限於)直接偵測之標記或部分(諸如螢光、發色、電子緻密、化學發光及放射性標記)，以及例如經由酶反應或分子相互作用間接偵測之部分(諸如酶或配位體)。例示性標記包括(但不限於)放射性同位素P³²、C¹⁴、I¹²⁵、H³及I¹³¹；螢光團，諸如稀土螯合物或螢光素及其衍生物、若丹明(rhodamine)及其衍生物、丹醯基、傘酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶；螢光素；2,3-二氫酞嗪二酮；辣根過氧化酶(HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸酯去氫酶；雜環氧化酶，諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與採用過氧化氫氧化染料前驅體之酶(諸如HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶)偶合；生物素/抗生物素蛋白；自旋標記；噬菌體標記；穩定自由基及其類似標記。在另一實施例中，標記為正電子發射體。正電子發射體包括(但不限於)Ga⁶⁸、F¹⁸、Cu⁶⁴、Y⁸⁶、Br⁷⁶、Zr⁸⁹及I¹²⁴。

本發明之免疫共軛物之例示性實施例包含TMCC3抗體或其片段(Ab)、藥物負載(D)及使Ab附接於D之連接子(L)。「連接子」(L)可為雙功能或多功能部分，其可將一或多個藥物負載(D)與抗體(Ab)連接以形成抗體-藥物共軛物(ADC)。在一些實施例中，抗體經由一或多個胺基酸殘基，諸如離胺酸及/或半胱胺酸附接於連接子(L)。舉例而 言，連接子具有能夠與抗體上存在之游離半胱胺酸反應形成共價鍵的官能基。此類反應性官能基之非限制性實例包括順丁烯二醯亞胺、鹵乙醯胺、α-鹵乙醯基、活化酯(諸如丁二醯亞胺酯、4-硝基苯酯、五氟苯酯、四氟苯酯)、酸酐、酸氯化物、磺醯氯、異氰酸酯及異硫氰酸酯。

在一些實施例中，連接子具有能夠與抗體上存在之親電子基團反應的官能基。此類親電子基團之實例包括(但不限於)醛及酮羰基。在一些實施例中，連接子之反應性官能基之雜原子可與抗體上之親電子基團反應且形成與抗體單元連結之共價鍵。此類反應性官能基之非限制性實例包括(但不限於)醯肼、肟、胺基、肼、硫縮胺基脲(thiosemicarbazone)、肼羧酸酯及芳基醯肼。

能夠用於偶合抗體分子與治療劑或標記的連接子之實例包括(但不限於)順丁烯二醯亞胺基己醯基(mc)；順丁烯二醯亞胺基己醯基-對胺基苯甲基胺基甲酸酯；順丁烯二醯亞胺基己醯基-肽-胺基苯甲基胺基甲酸酯連接子，例如，順丁烯二醯亞胺基己醯基-L-苯丙胺酸-L-離胺酸-對胺基苯甲基胺基甲酸酯及順丁烯二醯亞胺基己醯基-L-纈胺酸-L-瓜胺酸-對胺基苯甲基胺基甲酸酯(vc)；3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二醯亞胺酯(亦稱為4-(2-吡啶基二硫基)戊酸N-丁二醯亞胺酯或SPP)；4-丁二醯亞胺基-氧基羰基-2-甲基-2-(2-吡啶基二硫基)-甲苯(SMPT)；3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二醯亞胺酯(SPDP)；4-(2-吡啶基二硫基)丁酸N-丁二醯亞胺酯(SPDB)；2-亞胺基硫雜環戊烷；S-乙醯基丁二酸酐；胺基甲酸二硫化苯甲酯；碳酸酯；腙連接子；N-(a-順丁烯二醯亞胺基乙醯氧基)丁二醯亞胺酯；N-[4-(對疊氮基柳基胺基)丁基]-3'-(2'-吡啶基二硫基)丙醯胺(AMAS)；N-[b-順丁烯二醯亞胺基丙氧基]丁二醯亞胺酯(BMPS)；[N-e-順丁烯二醯亞胺基己醯氧基] 丁二醯亞胺酯(EMCS)；N-[g-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基]丁二醯亞胺酯(GMBS)；丁二醯亞胺基-4-[N-順丁烯二醯亞胺基甲基]環己烷-1-羧基-[6-醯胺基己酸酯](LC-SMCC)；6-(3-[2-吡啶基二硫基]-丙醯胺基)己酸丁二醯亞胺酯(LC-SPDP)；間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基丁二醯亞胺酯(MBS)；N-丁二醯亞胺基[4-碘乙醯基]胺基苯甲酸酯(SIAB)；4-[N-順丁烯二醯亞胺基甲基]環己烷-1-甲酸丁二醯亞胺酯(SMCC)；N-丁二醯亞胺基3-[2-吡啶基二硫基]-丙醯胺基(SPDP)；[N-e-順丁烯二醯亞胺基己醯氧基]磺基丁二醯亞胺酯(磺基-EMCS)；N-[g-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基]磺基丁二醯亞胺酯(磺基-GMBS)；4-磺基丁二醯亞胺基-6-[甲基-a-(2-吡啶基二硫基)甲苯醯胺基]己酸酯)(磺基-LC-SMPT)；6-(3'-[2-吡啶基二硫基]-丙醯胺基)己酸磺基丁二醯亞胺酯(磺基-LC-SPDP)；間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基磺基丁二醯亞胺酯(磺基-MBS)；N-磺基丁二醯亞胺基[4-碘乙醯基]胺基苯甲酸酯(磺基-SIAB)；4-[N-順丁烯二醯亞胺基甲基]環己烷-1-甲酸磺基丁二醯亞胺酯(磺基-SMCC)；4-[對順丁烯二醯亞胺基苯基]丁酸磺基丁二醯亞胺酯(磺基-SMPB)；乙二醇-雙(丁二酸N-羥基丁二醯亞胺酯)(EGS)；酒石酸二丁二醯亞胺酯(DST)；1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)；二伸乙基三胺-五乙酸(DTPA)；及硫脲連接子。

組合物

在另一態樣中，本發明之特徵在於組合物，例如醫藥組合物。組合物可包括治療作用量之如本文所述之免疫共軛物及醫藥學上可接受之載劑。

醫藥學上可接受之載劑在所用劑量及濃度下一般對接受者無毒，且其包括(但不限於)緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機 酸；抗氧化劑，其包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨；苯紮氯銨；苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。

組合物可呈各種形式。此等形式包括例如液體、半固體及固體劑型，諸如液體溶液(例如可注射及可輸注溶液)、分散液或懸浮液、脂質體及栓劑。較佳形式視預期之投藥模式及治療應用而定。一些典型組合物呈可注射或可輸注溶液形式，其意欲用於非經腸投藥(例如，靜脈內、皮下、腹膜內、肌肉內)。在一些實施例中，組合物藉由靜脈內輸注或注射投與。在其他實施例中，組合物藉由肌肉內或皮下注射投與。

治療有效量之免疫共軛物可根據諸如個體之疾病病況、年齡、性別及體重，及抗體分子或免疫共軛物在個體中引起所需反應之能力的因素而變化。治療有效量亦為免疫共軛物之治療有益效應超過其任何毒性或有害效應的量。相對於未經治療之個體，「治療有效劑量」較佳抑制所治療個體中至少約20%、至少約40%、至少約60%，且在一些實施例中，為至少約80%之可量測之參數(例如，腫瘤負荷及/或 腫瘤生長速率)。可在可預測在人類腫瘤中之功效的動物模型系統中評估免疫共軛物抑制可量測之參數(例如癌症)之能力。或者，可藉由熟習此項技術者已知的分析，藉由檢驗化合物活體外之抑制能力來評估組合物之此特性。

在本發明之一些實施例中，組合物進一步包含第二治療劑。當以組合形式使用時，免疫共軛物及第二治療劑以治療有效量加以提供。在某些實施例中，第二治療劑為DNA損傷劑，包括(例如)拓撲異構酶I抑制劑、拓撲異構酶II抑制劑、烷基化劑、類烷基化劑、蒽環黴素、DNA嵌入劑、DNA小溝烷基化劑及抗代謝物。

治療方法

在另一態樣中，本發明提供一種用於治療TMCC3陽性癌症之方法。在一個實施例中，該方法包含向患有此類TMCC3陽性癌症之個體投與有效量之免疫共軛物。在一個此類實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種例如如上所述之第二治療劑。

在另一態樣中，提供一種用作藥物之免疫共軛物。在其他態樣中，提供一種用於治療方法中之免疫共軛物。在某些實施例中，提供一種用於治療TMCC3陽性癌症之免疫共軛物。在某些實施例中，本發明提供一種用於治療患有TMCC3陽性癌症之個體的方法中的免疫共軛物，該方法包含向個體投與有效量的如本文所述之免疫共軛物。在一個此類實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種例如如上所述之第二治療劑。

在另一態樣中，本發明提供免疫共軛物在製造或製備藥物中之用途。在一個實施例中，該藥物用於治療TMCC3陽性癌症。在另一實施例中，該藥物用於治療TMCC3陽性癌症之方法中，該方法包含 向患有TMCC3陽性癌症之個體投與有效量之藥物。在一個此類實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種例如如上所述之第二治療劑。

術語「癌症」可指癌瘤、肉瘤、腺癌、淋巴瘤、白血病、實體及淋巴癌症等。不同類型的癌症之實例包括(但不限於)肺癌(例如，非小細胞肺癌或NSCLC)、卵巢癌、前列腺癌、結腸直腸癌、肝癌(亦即，肝癌瘤)、腎癌(亦即，腎細胞癌)、膀胱癌、乳癌、甲狀腺癌、胸膜癌、胰臟癌、子宮癌、子宮頸癌、睪丸癌、肛門癌、胰臟癌、膽管癌、腸胃類癌、食道癌、膽囊癌、闌尾癌、小腸癌、胃癌(stomach cancer/gastric cancer)、中樞神經系統之癌症、皮膚癌、絨膜癌、頭頸癌、血癌、骨原性肉瘤、纖維肉瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤、黑素瘤、B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、小細胞淋巴瘤、大細胞淋巴瘤、單核細胞性白血病、骨髓性白血病、急性淋巴球性白血病、急性髓細胞性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)及多發性骨髓瘤。

上文所提及之此類組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或大於兩種治療劑包括在同一或單獨調配物中)及單獨投與，在此情況下，本發明之免疫共軛物之投與可在投與第二治療劑之前、同時及/或之後進行。本發明之免疫共軛物亦可與放射療法及/或手術組合使用。

診斷學及偵測方法

在一些實施例中，本發明所提供的包含標記之免疫共軛物適用於偵測生物樣本中TMCC3之存在。如本文所用，術語「偵測」涵蓋定量或定性偵測。「生物樣本」包含例如細胞或組織(例如活組織檢查物，包括癌或潛伏地癌淋巴組織，諸如淋巴細胞、淋巴母細胞、單核 細胞、骨髓單核細胞及其混合物)。

在另一態樣中，提供一種用於診斷或偵測方法中的包含標記之免疫共軛物。在另一態樣中，提供一種偵測生物樣本中TMCC3之存在的方法。在某些實施例中，該方法包含在容許免疫共軛物與TMCC3結合之條件下使生物樣本與如本文所述的包含標記之免疫共軛物接觸，且偵測在免疫共軛物與生物樣本中之TMCC3之間是否形成複合物。此類方法可為活體外或活體內方法。

套組/製品

在本發明之另一態樣中，提供一種含有適用於治療、預防及/或診斷上述病症之物質的套組/製品。套組/製品包含容器及容器上或與容器相關聯的說明書或藥品說明書。適合之容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由多種材料(諸如玻璃或塑膠)形成。容器裝有單獨或與有效治療、預防及/或診斷病症之另一組合物組合之組合物，且可具有無菌接取口(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之免疫共軛物。說明書或藥品說明書指示該組合物用於治療所選病狀。此外，套組/製品可包含(a)其中含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明之免疫共軛物；及(b)其中含有組合物之第二容器，其中該組合物包含另一細胞毒性劑或其他治療劑。本發明之此實施例中之套組/製品可進一步包含指示組合物可用於治療特定病狀之藥品說明書。或者或另外，套組/製品可進一步包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝劑，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液。其可進一步包括就商業及使用者觀點而言所需之其他物質，包括 其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。

實例

呈現以下實例以說明本發明之某些實施例，但不應理解為限制本發明之範疇。除非另有指示，否則，在500MHz下獲得各1H NMR資料。除非另外規定，否則本文中所用之縮寫如下：Bu：丁基；Bn：苯甲基；BOC：第三丁氧基羰基；BOP：苯并三唑-1-基氧基三/二甲胺基-六氟磷酸鏻；DCC：二環己基碳化二亞胺；DMF：N,N-二甲基甲醯胺；DMAP：4-二甲胺基吡啶；EDC：1-(3-二甲胺基丙基)3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽；EtOAc：乙酸乙酯；Eq.：當量；HOBt：羥基苯并三唑；LAH：氫化鋰鋁；MeOH：甲醇；MHz：兆赫茲；MS(ES)：質譜分光光度計-電子噴霧；NMP：N-甲基吡咯啶酮；Ph：苯基；Pr：丙基；TEA：三乙胺；THF：四氫呋喃； TLC：薄層層析法；及Tetrakis：肆(三苯基膦)鈀。

實例1. TMCC3抗體之製備 抗TMCC3 4-84穩定庫：

藉由將抗TMCC3 4-84抗體表現載體化學轉染或電穿孔至HEK293細胞中製備抗TMCC3 4-84抗體，且隨後藉由使用管柱層析純化所獲得之抗體。

實例2. TMCC3抗體-生物素共軛物之製備

向抗TMCC-3單株抗體(4-84)之溶液(430μL(2.7mg/mL)，於含有50mM磷酸鉀、50mM氯化鈉、2mM EDTA且pH 6.5之緩衝液中)中緩慢添加3.8μL Osu-Biotin(20mM於DMSO中)。在氬氣及室溫下攪拌反應混合物2小時、4小時及16小時。對抗體製備物進行去鹽且藉由使用Amicon Ultra-15離心過濾裝置以30kDa NMWL在pH 7.4 PBS緩衝液中進行濃縮，得到TMCC-3-生物素ADC 2-1。

向抗TMCC-3單株抗體(4-84)之溶液(180μL(5.0mg/mL)，於pH 7.4之PBS緩衝液中)中緩慢添加TCEP(5.0當量)。在37℃下攪拌反應混合物1.0小時。將生物素-順丁烯二醯亞胺(12當量)添加至混合物中。隨後在氬氣及室溫下攪拌混合物20小時。對抗體製備物進行去鹽且藉由使用Amicon Ultra-15離心過濾裝置以30kDa NMWL在pH 7.4 PBS緩衝液中進行濃縮，得到TMCC-3-生物素ADC 2-2。

實例3. TMCC3抗體-SMCC-DM1共軛物之製備

向抗TMCC-3單株抗體(4-84)之溶液(500μL(2.9mg/mL)，於含有50mM磷酸鉀、50mM氯化鈉、2mM EDTA且pH 6.5之緩衝液中)中緩慢添加58μL SMCC-DM1(5mM於DMSO中)。在氬氣及37℃下攪拌反應混合物20小時。對抗體製備物進行去鹽且藉由使用Amicon Ultra-15離心過濾裝置以30kDa NMWL在pH 7.4 PBS緩衝液中進行濃縮，得到TMCC-3-SMCC-DM1 ADC 3。

實例4. TMCC3抗體-MMAE共軛物之製備

向抗TMCC-3單株抗體(4-84)之溶液(400μL(5.0mg/mL)於含有50mM磷酸鉀、50mM氯化鈉、2mM EDTA且pH 6.5之緩衝液中)中緩慢 添加40μL Osu-MMAE(5mM於DMSO中)。在氬氣及37℃下攪拌反應混合物20小時。對抗體製備物進行去鹽且藉由使用Amicon Ultra-15離心過濾裝置以30kDa NMWL在pH 7.4 PBS緩衝液中進行濃縮，得到TMCC-3-MMAE ADC 4。

實例5. TMCC3抗體-4-異硫氰基-苯基-DTPA共軛物之製備

向抗TMCC-3單株抗體(4-84)之溶液(400μL(5.0mg/mL)於含有50mM磷酸鉀、50mM氯化鈉、2mM EDTA且pH 6.5之緩衝液中)中添加40μL 4-異硫氰基-苯基-DTPA(5mM於DMSO中)。在氬氣下在37℃下攪拌反應混合物20小時。對抗體製備物進行去鹽且藉由使用Amicon Ultra-15離心過濾裝置以30kDa NMWL在pH 7.4 PBS緩衝液中進行濃縮，得到TMCC-3-硫脲-4-苯基-DTPA ADC 5。

實例6. TMCC3抗體-N-苯基己二醯胺-DPTA共軛物之製備

向抗TMCC-3單株抗體(4-84)之溶液(400μL(5.0mg/mL)於含有50mM磷酸鉀、50mM氯化鈉、2mM EDTA且pH 6.5之緩衝液中)中緩慢添加40μL 6-OSu-N-苯基己醯胺-DPTA(5mM於DMSO中)。在氬氣及37℃下攪拌反應混合物20小時。對抗體製備物進行去鹽且藉由使用 Amicon Ultra-15離心過濾裝置以30kDa NMWL在pH 7.4 PBS緩衝液中進行濃縮，得到TMCC-3-N-苯基己醯胺-DPTA ADC 6。

實例7. 非還原性及還原性SDS-PAGE

藉由使用4%至12%非還原性及還原性SDS-PAGE凝膠之後再進行庫馬斯亮藍染色來分析由實例1至實例6獲得之ADC樣本。結果展示於圖1中。

實例8. 生物素化分析

將濃度為1μg/ml之100μL IgG之塗佈緩衝液添加至培養盤之各孔中且塗佈於其上。密封培養盤且在4℃下培育隔夜。抽吸各孔且用300微升/孔之PBST(0.05% Tween 20)洗滌3次。藉由添加300微升/孔之PBS-5%脫脂牛奶封閉各孔且在37℃下培育1小時。抽吸各孔且用300微升/孔之PBST(0.05% Tween 20)洗滌3次。將100μL用PBS稀釋的100ng ADC樣本添加至各孔中且隨後在37℃下培育培養盤1小時。抽吸各孔且用300微升/孔之PBST(0.05% Tween 20)洗滌3次。將100微升/孔之抗生蛋白鏈菌素(1：10000)添加至各孔中且隨後在37℃下培育培養盤1小時。抽吸各孔且用300微升/孔之PBST(0.05% Tween 20)洗滌3次。將100微升/孔之TMB添加至各孔中且隨後在37℃下培育培養盤10分鐘。藉由添加100μL 1N HCl停止顯色。且在450nm至650nm之吸光度下藉由使用ELISA讀取器量測培養盤。

生物素化資料展示於圖2中。強生物素化訊號表示生物素成功地經由離胺酸共軛及半胱胺酸共軛附接至抗TMCC-3 mAb(4-84)。

實例9. 結合親和力

將濃度為1μg/ml之100μL Her2之塗佈緩衝液添加至培養盤之各孔中且塗佈於其上。密封培養盤且在4℃下培育隔夜。抽吸各孔且用 300微升/孔之PBST(0.05% Tween 20)洗滌3次。藉由添加300微升/孔之PBS-5%脫脂牛奶封閉各孔且在37℃下培育1小時。抽吸各孔且用300微升/孔之PBST(0.05% Tween 20)洗滌3次。將100μL用PBS-1% BSA稀釋的100ng ADC樣本添加至各孔中且隨後在37℃下培育培養盤1小時。抽吸各孔且用300微升/孔之PBST(0.05% Tween 20)洗滌3次。將100μL抗人類κ輕鏈(1：10000)添加至各孔中且在37℃下培育培養盤1小時。抽吸各孔且用300微升/孔之PBST(0.05% Tween 20)洗滌3次。將100微升/孔之TMB添加至各孔中且在37℃下培育培養盤10分鐘。藉由添加100μL 1N HCl停止顯色。且在450nm至650nm之吸光度下藉由使用ELISA讀取器量測培養盤。資料展示於圖3中。

圖3之結合親和力結果顯示，與裸抗TMCC-3 mAb(4-84)相比，實例1至實例6中經與離胺酸(2-1、3、4、5、6)及經與半胱胺酸(2-2)共軛之ADC之結合親和力並未降低。

實例10. 細胞毒性分析

以胰蛋白酶處理pHA59T細胞，且隨後搜集並再懸浮於含有10%FBS之DMEM中。以每孔2,000個細胞之密度將細胞添加至三個96孔培養盤之各孔中。隨後培育培養盤隔夜。將0.78μg/ml、1.56μg/ml、3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml及100μg/ml之濃度(最終濃度)的抗TMCC3 4-84蛋白及TMCC-3-SMCC-DM1 ADC 3分別添加至培養盤之不同孔中且隨後培育培養盤96小時。將WST-1添加至培養盤之各孔中之後，再培育培養盤1小時。監測450nm下之吸光度且將參照波長設定在650nm下。藉由與對照組之相對細胞存活率百分比進行比較來計算各組中之相對細胞存活率百分比，其結果顯示在圖4中。

細胞毒性結果顯示，裸mAb 4-84不具有細胞毒性作用，但TMCC-3-SMCC-DM1 ADC 3對pHA59T癌細胞株具有強細胞毒性作用，因此其為潛在之抗癌劑。

實例11. 內化分析

以胰蛋白酶處理pHA59T細胞，且隨後搜集並再懸浮於FAC緩衝液中。對照組：將2Ab抗人類IgG PE(1：200)添加至pHA59T細胞中。在4℃下培育細胞持續0分鐘、5分鐘、15分鐘及30分鐘之時間間隔，且隨後藉由2mL FACS緩衝液加以洗滌。捨棄上清液。測試組：將pHA59T細胞與5μg/ml TMCC-3-SMCC-DM1 ADC 3一起預培育於冰上之FAC緩衝液中60分鐘，用FAC緩衝液洗滌3次，且隨後在37℃下培育持續0分鐘、5分鐘、15分鐘及30分鐘之時間間隔。藉由流式細胞測量術分析細胞且結果展示於圖5A及圖5B中。

如圖5中所示，在4℃及不同時段下的對照組之內化並未發生實質上變化，但在37℃下，對於15分鐘而言，細胞表面抗原與TMCC-3-SMCC-DM1 ADC 3之結合由100%降至約39%，且對於30分鐘而言，其結合降至約26%。此表明，TMCC-3-SMCC-DM1 ADC 3可經由內化進入pHA59T細胞。

<110> 財團法人生物技術開發中心

<120> 抗TMCC3免疫共軛物及其用途

<130> 196370

<140> TW 105135619

<141> 2016-11-2

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 477

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 45

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 5867

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 家鼠

<400> 4

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 家鼠

<400> 5

<210> 6

<211> 4

<212> PRT

<213> 家鼠

<400> 6

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 家鼠

<400> 7

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 家鼠

<400> 8

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 家鼠

<400> 9

<210> 10

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> 合成

<400> 10

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> 合成

<400> 11

Claims (15)

1. 一種免疫共軛物，其包含TMCC3抗體或其結合片段及治療劑或標記，其中該抗體之解離常數(Kd)為至少約100nM，且其中在37℃之培育溫度及60分鐘之培育時間下，該免疫共軛物之內化率為至少50%，其中該抗TMCC3抗體或其結合片段包含CDRH1，其包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列；CDRH2，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；及CDRH3，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及/或CDRL1，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；CDRL2，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；及CDRL3，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。
2. 如請求項1之免疫共軛物，其中該抗TMCC3抗體或其結合片段包含重鏈可變區(VH)，其包含與SEQ ID NO：10之序列80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及/或輕鏈可變區(VL)，其包含與SEQ ID NO：11之序列80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
3. 如請求項2之免疫共軛物，其中該抗TMCC3抗體或其結合片段包含重鏈可變區(VH)，其包含該SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及/或輕鏈可變區(VL)，其包含該SEQ ID NO：11之胺基酸序列。
4. 如請求項1之免疫共軛物，其中該治療劑係選自抗代謝物、烷基化劑、類烷基化劑、DNA小溝烷基化劑、蒽環黴素(anthracycline)、抗生素、卡奇黴素(calicheamicin)、抗有絲分裂劑、拓撲異構酶抑制劑(topoisomerase inhibitor)、蛋白酶體抑制劑及放射性同位素。
5. 如請求項4之免疫共軛物，其中該治療劑係選自DM1、DM3、DM4、單甲基奧瑞他汀E(MMAE)及單甲基奧瑞他汀F(MMAF)。
6. 如請求項1之免疫共軛物，其中該標記為螢光標記、發色標記、電子緻密標記、化學發光標記、放射性標記、酶標記或正電子發射體。
7. 如請求項1至6中任一項之免疫共軛物，其具有式Ab-(L-D)m，其中：(a)Ab為該TMCC3抗體或其結合片段；(b)L為連接子；(c)D為該治療劑或標記；且(d)m為1至8之整數。
8. 如請求項7之免疫共軛物，其中該連接子係選自順丁烯二醯亞胺基己醯基(mc)、順丁烯二醯亞胺基己醯基-對胺基苯甲基胺基甲酸酯、順丁烯二醯亞胺基己醯基-肽-胺基苯甲基胺基甲酸酯連接子、3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二醯亞胺酯(SPP)、4-丁二醯亞胺基-氧基羰基-2-甲基-2-(2-吡啶基二硫基)-甲苯(SMPT)、3-(2-吡啶基二硫基)丙 酸N-丁二醯亞胺酯(SPDP)、4-(2-吡啶基二硫基)丁酸N-丁二醯亞胺酯(SPDB)、2-亞胺基硫雜環戊烷、S-乙醯基丁二酸酐、胺基甲酸二硫化苯甲酯、碳酸酯、腙連接子、N-(a-順丁烯二醯亞胺基乙醯氧基)丁二醯亞胺酯、N-[4-(對疊氮基柳基胺基)丁基]-3'-(2'-吡啶基二硫基)丙醯胺(AMAS)、N-[b-順丁烯二醯亞胺基丙氧基]丁二醯亞胺酯(BMPS)、[N-e-順丁烯二醯亞胺基己醯氧基]丁二醯亞胺酯(EMCS)、N-[g-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基]丁二醯亞胺酯(GMBS)、丁二醯亞胺基-4-[N-順丁烯二醯亞胺基甲基]環己烷-1-羧基-[6-醯胺基己酸酯](LC-SMCC)、6-(3-[2-吡啶基二硫基]-丙醯胺基)己酸丁二醯亞胺酯(LC-SPDP)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基丁二醯亞胺酯(MBS)、N-丁二醯亞胺基[4-碘乙醯基]胺基苯甲酸酯(SIAB)、4-[N-順丁烯二醯亞胺基甲基]環己烷-1-甲酸丁二醯亞胺酯(SMCC)、N-丁二醯亞胺基3-[2-吡啶基二硫基]-丙醯胺基(SPDP)、[N-e-順丁烯二醯亞胺基己醯氧基]磺基丁二醯亞胺酯(磺基-EMCS)、N-[g-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基]磺基丁二醯亞胺酯(磺基-GMBS)、4-磺基丁二醯亞胺基-6-[甲基-a-(2-吡啶基二硫基)甲苯醯胺基]己酸酯)(磺基-LC-SMPT)、6-(3'-[2-吡啶基二硫基]-丙醯胺基)己酸磺基丁二醯亞胺酯(磺基-LC-SPDP)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基磺基丁二醯亞胺酯(磺基-MBS)、N-磺基丁二醯亞胺基[4-碘乙醯基]胺基苯甲酸酯(磺基-SIAB)、4-[N-順丁烯二醯亞胺基甲基]環己烷-1-甲酸磺基丁二醯亞胺酯(磺基-SMCC)、4-[對順丁烯二醯亞胺基苯基]丁酸磺基丁二醯亞胺酯(磺基-SMPB)、乙二醇-雙(丁二酸N-羥基丁二醯亞胺酯)(EGS)、酒石酸二丁二醯亞胺酯(DST)、1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、二伸乙基三胺-五乙酸(DTPA)及硫脲連接子。
9. 如請求項7之免疫共軛物，其中m在3至6範圍內。
10. 一種組合物，其包含如請求項1至9中任一項之免疫共軛物及醫藥學上可接受之載劑。
11. 一種如請求項1至5及7至9中任一項之免疫共軛物之用途，其係用於製造用於治療癌症之藥物。
12. 如請求項11之用途，其中該藥物係伴隨額外治療劑、放射療法或手術投與。
13. 如請求項11或12之用途，其中該癌症係選自肺癌(例如，非小細胞肺癌或NSCLC)、卵巢癌、前列腺癌、結腸直腸癌、肝癌(亦即，肝癌瘤)、腎癌(亦即，腎細胞癌)、膀胱癌、乳癌、甲狀腺癌、胸膜癌、胰臟癌、子宮癌、子宮頸癌、睪丸癌、肛門癌、胰臟癌、膽管癌、腸胃類癌、食道癌、膽囊癌、闌尾癌、小腸癌、胃癌(stomach cancer/gastric cancer)、中樞神經系統之癌症、皮膚癌、絨膜癌、頭頸癌、血癌、骨原性肉瘤、纖維肉瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤、黑素瘤、B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、小細胞淋巴瘤、大細胞淋巴瘤、單核細胞性白血病、骨髓性白血病、急性淋巴球性白血病、急性髓細胞性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)及多發性骨髓瘤。
14. 一種偵測生物樣本中之TMCC3的活體外方法，該方法包含在容許該免疫共軛物與該TMCC3結合之條件下使該生物樣本與如請求項1至3及6至9中任一項之免疫共軛物接觸，且偵測在該免疫共軛物與該生物樣本中之該TMCC3之間是否形成複合物。
15. 一種套組，其包含如請求項1至9中任一項之免疫共軛物及用於治療、預防及/或診斷癌症之說明書。