CN105209076A - 抗体药物偶联物(adc)纯化 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于获得含有具有指定药物-抗体比率(DAR)的抗体药物偶联物(ADC)的组合物的方法。本发明包括用于通过将含有具有6或更高的载药种类的ADC的ADC混合物与疏水性树脂接触来纯化ADC混合物的方法，从而获得包含少于15％的6或更高的载药种类的组合物。本发明还提供一种组合物，其中存在的70％或更多的ADC具有4或更低的载药种类，其中ADC包含抗-EGFR抗体和阿里他汀。

Description

抗体药物偶联物(ADC)纯化
相关申请
本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请No.61/792,834的利益。前述优先权文件的内容在此通过引入全文并入。
背景技术
抗体药物偶联物(ADC)是一类新出现的有效抗癌剂，其最近显示出显著的临床益处。ADC由通过稳定的接头与抗体连接的细胞毒性剂组成。据推定，ADC可以通过一系列事件(包括细胞表面处的抗原结合、胞吞、运输到溶酶体、ADC降解、有效负载的释放、细胞加工(例如，有丝分裂)的中断和细胞凋亡)破坏具有细胞表面蛋白的过表达的癌细胞。ADC将单克隆抗体的抗原驱动的靶向特性与细胞毒性剂的强力抗肿瘤作用结合。例如，在2011年，管理机构批准(一种抗-CD30抗体-MMAEADC)用于治疗难治性霍奇金淋巴瘤和系统性间变性淋巴瘤。
研究证明了高药物负载的ADC的有害效应(Liu等(2010)Analy.Chem.82:5219)。较高水平偶联的这些有害效应包括更高的聚集体形成倾向(King等(2002)JMed.Chem.45:4336；Hollander等(2008)BioconjugateChem19:358；Burke等(2009)BioconjugateChem20:1242和Zhao等(2011)JMed.Chem.54:3606)。
ADC的药物载量的控制已经使用各种方法进行尝试，包括：(i)限制药物-接头中间体或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制偶联反应时间或温度，和(iii)部分或限制半胱氨酸巯基修饰的还原性条件。尽管限制抗体上的连接位点数的还原方法已用于获得具有每分子的较少药物的ADC(Alley等(2004)ProcAmerAssocCancerRes45:Abst627)，但仍然存在着对于可以提供最佳载药种类的方法和组合物的需要。
发明内容
本发明提供用于分离具有不同药物载量的抗体药物偶联物(ADC)的有效方法以及使用这类方法获得的组合物。本发明也提供其中较高载药种类的ADC被除去的组合物。
在一个实施方案中，本发明特征在于获得包含抗体药物偶联物(ADC)的组合物的方法，所述方法包括将包含4或更低的载药种类和6或更高的载药种类的ADC混合物与疏水性树脂接触，其中与ADC混合物接触的疏水性树脂的量足以允许6或更高的载药种类与树脂结合但不允许4或更低的载药种类的显著结合；和从ADC混合物移除疏水性树脂，以使得获得包含ADC的组合物，其中该组合物包含少于15％的6或更高的载药种类，且其中ADC包含与阿里他汀偶联的抗体。在一个实施方案中，该组合物包含少于10％的6或更高的载药种类。在另一个实施方案中，该组合物包含5％或更低的6或更高的载药种类。
在一个实施方案中，本发明的方法包括使用3-12倍于ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的疏水性树脂重量。在一个实施方案中，疏水性树脂重量是ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的4-8倍。在进一步的实施方案中，疏水性树脂重量是ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的5-10倍。
在再另一个实施方案中，疏水性树脂重量是ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的6-12倍，且其中ADC混合物包含0-1N的NaCl或其等同离子强度。在进一步的实施方案中，疏水性树脂重量是ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的3-6倍，且其中ADC混合物包含1-2N的NaCl或其等同离子强度。在再另一个实施方案中，疏水性树脂重量是ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的3-7倍，且其中阿里他汀是单甲基阿里他汀E(MMAE)。在进一步的实施方案中，疏水性树脂重量是ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的5-10倍，且其中阿里他汀是单甲基阿里他汀F(MMAF)。在进一步的实施方案中，疏水性树脂重量是ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的3-7倍，且其中阿里他汀是单甲基阿里他汀E(MMAE)。
本发明进一步提供产生包含平均药物-抗体比率(DAR)为4.5或更低的ADC和包含少于15％的不希望的ADC的组合物的方法，所述方法包括将ADC混合物与疏水性树脂接触，其中与ADC混合物接触的疏水性树脂的量足以允许不希望的ADC结合；和从所述ADC混合物移除所述疏水性树脂，使得产生具有4.5或更低的平均DAR并包含少于15％的不希望的ADC的组合物，其中所述ADC包含与阿里他汀偶联的抗体。在一个实施方案中，具有4或更低的平均DAR的组合物包含少于10％的不希望的ADC。在一个实施方案中，不希望的ADC是6和8的载药种类。在进一步的实施方案中，不希望的ADC是8的载药种类。
在一个实施方案中，添加到ADC混合物的疏水性树脂的量是作为ADC混合物中不希望的ADC的重量的3-12倍的树脂重量。
在进一步的实施方案中，添加到ADC混合物的疏水性树脂的量是作为ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的4-8倍的树脂重量。在再另一个实施方案中，添加到ADC混合物的疏水性树脂的量是作为ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的5-7倍的树脂重量。在进一步的实施方案中，疏水性树脂的重量是ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的6-12倍，且其中ADC混合物包含0-1N的NaCl或其等同离子强度。在一个实施方案中，疏水性树脂的重量是ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的3-6倍，且ADC混合物包含1-2N的NaCl或其等同离子强度。在另一个实施方案中，疏水性树脂的重量是ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的3-7倍，且其中阿里他汀是单甲基阿里他汀E(MMAE)。还在另一个实施方案中，疏水性树脂的重量是ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的5-10倍，且其中阿里他汀是单甲基阿里他汀F(MMAF)。在再进一步的实施方案中，疏水性树脂的重量是ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的3-7倍，且其中阿里他汀是单甲基阿里他汀E(MMAE)。在一个实施方案中，疏水性树脂的重量是ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的5-10倍，且其中阿里他汀是单甲基阿里他汀F(MMAF)。
在一个实施方案中，本发明的方法用于获得包含平均DAR为4.5或更低的ADC的组合物。在一个实施方案中，本发明的方法用于获得包含平均DAR为4或更低的ADC的组合物。在一个实施方案中，本发明的方法用于获得包含平均DAR为3.5或更低的ADC的组合物。在一个实施方案中，本发明的方法用于获得包含平均DAR为3或更低的ADC的组合物。在一个实施方案中，组合物具有2.5或更低的平均DAR。
在一个实施方案中，本发明的方法特征在于向ADC混合物添加疏水性树脂以形成树脂混合物，其中树脂混合物具有等于或高于ADC混合物的离子强度。
在本发明的进一步实施方案中，ADC混合物在超滤/透析处理后获得。
在本发明的一个实施方案中，本发明的方法中使用的疏水性树脂是丁基疏水性树脂。
在本发明的一个实施方案中，本发明的方法是分批处理、循环处理或流过(flowthrough)处理。
在一个实施方案中，本发明特征在于使用本文描述的方法获得的组合物。
本发明进一步特征在于包含ADC的组合物，其中70％的ADC具有4或更低的载药种类，且其中ADC包含抗-EGFR抗体(例如，抗体1)和阿里他汀(例如，MMAE或MMAF)。在本发明的一个实施方案中，组合物中存在的75％的ADC具有4或更低的载药种类。在本发明的另一个实施方案中，组合物中存在的80％的ADC具有4或更低的载药种类。在本发明的一个实施方案中，组合物中存在的85％的ADC具有4或更低的载药种类。在本发明的进一步的实施方案中，组合物包含90％具有4或更低的载药种类的ADC。在一个实施方案中，本发明的组合物中存在的95％的ADC具有4或更低的载药种类。在另一个实施方案中，本发明的组合物包含ADC，其中70％或更多的ADC具有4-1、3-1或者可选地2-1的载药种类。
本发明进一步特征在于包含平均DAR为4.5或更低的ADC的组合物，其中ADC包含抗-EGFR抗体(例如，抗体1)和阿里他汀(例如，MMAE或MMAF)。在本发明的一个实施方案中，组合物包含平均DAR为4或更低的ADC。在本发明的另一个实施方案中，组合物包含平均DAR为4或更低的ADC。在本发明的再另一个实施方案中，组合物包含平均DAR为3.5或更低的ADC。在本发明的一个实施方案中，组合物包含平均DAR为3或更低的ADC。在本发明的再另一个实施方案中，组合物包含平均DAR为2.5或更低的ADC。在另一个实施方案中，本发明的组合物包含平均DAR为4.5-0.001、4-0.001、3.5-0.001、3-0.001或者可选地2.5-0.001的抗-EGFRADC(例如，与MMAE或MMAF偶联的抗体1)。
在一个实施方案中，本发明的方法和组合物包括包含抗表皮生长因子受体(EGFR)抗体的ADC。在本发明的一个实施方案中，抗-EGFR抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含分别含有SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9所示的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3结构域，且所述重链可变区包含分别含有SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在本发明的另一个实施方案中，抗-EGFR抗体包含含有SEQIDNO:6所示的氨基酸序列的轻链可变区和含有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的重链可变区。
在本发明的另一个实施方案中，抗-EGFRADC包含SEQIDNO:6的氨基酸序列所示的轻链可变区中描述的CDR(即，轻链CDR1、CDR2和CDR3)和SEQIDNO:1的氨基酸序列中描述的CDR(即，重链CDR1、CDR2和CDR3)。
在进一步的实施方案中，本发明的方法和组合物特征在于为单甲基阿里他汀E(MMAE)或单甲基阿里他汀F(MMAF)的阿里他汀。
在一个实施方案中，MMAE通过缬氨酸-瓜氨酸(vc)接头与抗体偶联(vc-MMAE)。在另一个实施方案中，MMAF通过马来酰亚胺基己酰基(mc)接头与抗体偶联(mc-MMAF)。
在一个实施方案中，本发明的组合物是药物组合物。
本发明还包括治疗受试者的癌症的方法，包括向受试者施用本文所述的组合物以治疗癌症。在一个实施方案中，癌症选自鳞状肿瘤(包括肺、头颈、宫颈等的鳞状肿瘤)、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、非小细胞肺癌、肺癌、结肠癌、头颈癌、乳腺癌、鳞状细胞肿瘤、肛门癌、皮肤癌和外阴癌。
在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗多形性胶质母细胞瘤。
在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗具有EGFR过表达的实体肿瘤。在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗患有可能过表达EGFR的晚期实体肿瘤的受试者。
在一个实施方案中，本发明的组合物静脉内施用。
附图说明
图1提供实施例中描述的方法的概述，包括抗体1的还原、抗体1与vcMMAE的偶联和使用HIC树脂的批纯化的ADC纯化。
图2图示描绘了在HIC树脂批纯化之前和之后抗体1ADC溶液的HICHPLC分析。
图3提供实施例6中描述的用于纯化平均DAR为2.7、4和5.5的ADC混合物的方法的概述。
具体实施方式
I.定义
为了使本发明可以更容易地理解，首先定义一些术语。此外，应当注意，当任何时候提及参数的值或数值范围时，在所述值中间的值和范围也意欲是本发明的部分。
术语“抗体-药物偶联物”或“ADC”是指与一个或多个化学药物(本文中也称为药剂)(其可以任选地是治疗剂或细胞毒性剂)化学连接的结合蛋白如抗体或其抗原结合片段。在优选的实施方案中，ADC包括抗体、细胞毒性或治疗药物和使得药物能够与抗体连接或偶联的接头。ADC通常具有与抗体偶联的1-8个之间任意个数的药物，包括2、4、6或8的载药种类。可以包括在ADC中的药物的非限制性实例是有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、免疫调节剂、基因治疗的载体、烷化剂、抗血管生成剂、抗代谢物、含硼试剂、化疗保护剂、激素、抗激素剂、皮质类固醇、光活性治疗剂、寡核苷酸、放射性核素试剂、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和放射致敏剂。
本文中可互换使用的术语“抗表皮生长因子抗体药物偶联物”、“抗-EGFR抗体药物偶联物”或“抗-EGFRADC”是指包含与EGFR特异性结合的抗体的ADC，从而抗体与一个或多个化学药剂偶联。在一个实施方案中，抗-EGFR抗体药物偶联物是与阿里他汀(例如，MMAE或MMAF)偶联的抗体1。对应于抗体1的轻链和重链的氨基酸序列提供在SEQIDNO:1-10中。
如本文所用的，术语“阿里他汀”是指一个抗有丝分裂剂家族。阿里他汀衍生物也包括于术语“阿里他汀”的定义之内。阿里他汀的实例包括但不限于，阿里他汀E(AE)、单甲基阿里他汀E(MMAE)、单甲基阿里他汀F(MMAF)和多拉司他汀的合成类似物。
术语“药物-抗体比率”或“DAR”是指与ADC的抗体连接的药物(例如，阿里他汀)的数目。ADC的DAR可以是1-8的范围，虽然更高的载量(例如，10)也是可能的，这取决于抗体上连接位点的数目。术语DAR可以用于指加载到单个抗体上的药物的数目，或者可选地可以用于指一组ADC的平均或中数DAR。
如本文所用的，术语“不希望的ADC种类”是指与具有不同药物载量的ADC种类分离的任何载药种类。在一个实施方案中，术语不希望的ADC种类可以指6或更高的载药种类，即具有6或更高的DAR的ADC，包括DAR6、DAR7、DAR8和大于8的DAR(即，6、7、8或高于8的载药种类)。在单独的实施方案中，术语不希望的ADC种类可以指8或更大的载药种类，即具有8或更高的DAR的ADC，包括DAR8和大于8的DAR(即，8或高于8的载药种类)。
如本文所用的，术语“ADC混合物”是指包含ADC的多相DAR分布的组合物。在一个实施方案中，ADC混合物包含DAR分布为1-8，例如2、4、6和8(即，2、4、6和8的载药种类)的ADC。值得注意的是，降解产物可能使得1、3、5和7的DAR也可以包含于混合物中。此外，混合物中的ADC也可以具有超过8的DAR。ADC混合物由链间二硫键还原然后偶联获得。在一个实施方案中，ADC混合物包含具有4或更低的DAR(即，4或更低的载药种类)的ADC和具有6或更高的DAR(即，6或更高的载药种类)的ADC。
如本文所用的，术语“疏水性树脂”或“疏水相互作用树脂”是指由用于纯化分子混合物的目的的疏水性配体组成的介质，其中混合物内的分子上疏水性表面部分的存在有助于与介质的相互作用，使得相互作用的分子至少暂时结合于介质。在一个实施方案中，疏水性树脂是包含烷基部分的树脂，例如C4-C8烷基疏水性树脂，其是包含与固体载体(例如，琼脂糖、硅石等)偶联的直链或支链的四到八个碳成员的烷烃基团如丁基、戊基、己基、庚基或辛基的树脂。疏水性烷基树脂的实例包括疏水性丁基树脂或疏水性己基树脂。在一个实施方案中，疏水性树脂是包含芳基部分的树脂，例如疏水性苯基树脂。在一个实施方案中，疏水性树脂包含烯基部分。在一个实施方案中，疏水性树脂包含醚部分。在再另一个实施方案中，疏水性树脂包含苯基部分。疏水性部分(例如，烷基、芳基等)可以连接于惰性物质(例如，硅石、琼脂糖和/或其它多糖聚合物)。在一个实施方案中，树脂是甲基丙烯酸树脂。
术语“离子强度”广义地指溶液中离子浓度的量度，即溶液的电导率。可以用于调节溶液的离子强度的示例性盐包括，但不限于溴化钠、氯化钠、柠檬酸钠、碘化钠、磷酸钠、硫酸钠、溴化钾、氯化钾、柠檬酸钾、碘化钾、磷酸钾、硫酸钾、氯化铯、氯化锂，或者氨(例如，NH4Cl、(NH4)2SO4)、碳酸(NaHCO3)、柠檬酸(NaH2(C3H5O(COO)3)、Na2H(C3H5O(COO)3)、Na3H(C3H5O(COO)3)、磷酸(例如，KH2PO4、K2HPO4、K3PO4)、硝酸(KNO3)或这些组分的任何混合物的其它盐。本领域技术人员理解，阴离子和阳离子两者可以如本领域技术人员已知的进行变化，只要提供充分的离子强度而无沉淀或其它不希望的副作用。
术语“抗EGFR抗体”意指与EGFR特异性结合的抗体。与目标抗原(即，EGFR)“结合”的抗体是能够以足够的亲和性与该抗原结合的抗体，从而使该抗体可用于靶向表达该抗原的细胞。抗体1是抗-EGFR抗体的实例。
术语“抗体”广义地是指通常由四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)组成的免疫球蛋白(Ig)分子，或保留Ig分子的必要靶标结合特征的其任何功能性片段、突变体、变体或衍生物。
在全长抗体中，每条重链由重链可变区(在此缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在此缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其穿插于更保守的区域(称为框架区(FR))。各VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)和类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类。
如本文所用的，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”)是指保持抗体与抗原(例如hIL-13)特异性结合的能力的一个或多个抗体片段。已经表明抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执行。此类抗体实施方式也可以是双特异性、双重特异性或多特异性形式；其特异性地与两个或更多个不同抗原结合。术语抗体的“抗原结合部分”涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)包含单个可变域的dAb片段(Ward等,(1989)Nature341:544-546,Winter等,PCT公开WO90/05144A1，在此通过引用并入本文)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头将它们接合，使它们能够形成为其中VL和VH区配对以形成单价分子的单个蛋白链(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等(1988)Science242:423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。术语抗体的“抗原结合部分”也意欲包含此类单链抗体。还包含单链抗体的其他形式，例如双体。双体是二价的双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单一多肽链上表达，但使用过短的接头而使得在同一链上的两个结构域之间不能配对，因此迫使结构域与另一链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点(参见，例如Holliger,P.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448；Poljak,R.J.等(1994)Structure2:1121-1123)。此类抗体结合部分是本领域已知的(Kontermann和Dubel编辑,AntibodyEngineering(2001)Springer-Verlag.NewYork.790pp.(ISBN3-540-41354-5)。
如本文所用的，“分离的抗体”意指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合EGFR的分离的抗体基本上不含特异性结合EGFR之外的抗原的抗体)。然而，特异性结合EGFR的分离的抗体可以对其他抗原例如来自其他物种的EGFR分子具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
术语“人源化抗体”是指包含来自非人物种(例如小鼠)的重链和轻链可变区序列，但其中至少一部分VH和/或VL序列已经被改变成更加“类人”(即与人种系可变序列更相似)的抗体。在具体的实施方案中，术语“人源化抗体”是指特异性结合目标抗原和包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的框架(FR)区且包含具有基本上非人抗体的氨基酸序列的CDR的抗体或者抗体变体、衍生物或片段。如本文所用的，在CDR的情况下，术语“基本上”是指与非人抗体CDR的氨基酸序列具有至少80％、优选至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的CDR。在一个实施方案中，人源化抗体的一种类型是CDR移植抗体，其中将人CDR序列引入非人VH和VL序列中以替换对应的非人CDR序列。
如本文中所用的，术语“CDR”是指在抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链的各个可变区中有三个CDR，其对于各个可变区命名为CDR1、CDR2和CDR3。如本文中所用的，术语“CDR组”是指存在于能够结合抗原的单个可变区内的三个CDR的组。这些CDR的精确边界根据不同系统有不同定义。由Kabat描述的系统(Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1987)和(1991))不仅提供了可适用于抗体的任何可变区的明确的残基编号系统，还提供了限定三个CDR的精确残基边界。这些CDR可以称为KabatCDR。Chothia和他的同事(Chothia等,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)和Chothia等,Nature342:877-883(1989))发现KabatCDR内的某些子部分采取几乎相同的肽骨架构象，尽管其在氨基酸序列水平上具有很大的多样性。这些子部分被命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别是指轻链和重链区域。这些区域可以称为ChothiaCDR，其具有与KabatCDR重叠的边界。Padlan(FASEBJ.9:133-139(1995))和MacCallum(JMolBiol262(5):732-45(1996))描述了限定与KabatCDR重叠的CDR的其他边界。还有其他的CDR边界定义可能没有严格遵循以上系统之一，但仍将与KabatCDR重叠，尽管它们可能根据特定的残基或残基组或甚至整个CDR不显著影响抗原结合的预测或实验发现而被缩短或延长。在此所用的方法可以使用根据这些系统中任一个定义的CDR，尽管优选的实施方式使用Kabat或Chothia定义的CDR。
术语“病症”是指从本发明制剂的治疗受益的任何状况，例如需要用制剂中的抗EGFR抗体治疗的病症。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使受试者易感所讨论的疾病的那些病理状况。
术语“癌症”意指或描述哺乳动物中通常特征是不受调节的细胞生长的生理状况。癌症的实例包括，但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体的实例包括胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、肺癌、结肠癌、头颈癌、乳腺癌、鳞状细胞癌、肛门癌、皮肤癌和外阴癌。在一个实施方案中，向患有包含EGFR基因扩增的肿瘤的患者施用本发明的组合物，从而肿瘤表达截短形式的EGFRde2-7。在一个实施方案中，可以向受试者施用包含ADC1的本发明制剂用于治疗结肠直肠癌、头颈癌(包括，但不限于下咽癌、口咽癌、食管癌、喉癌和口腔癌)、非小细胞肺癌、胰腺癌、胃癌和乳腺癌。此类癌症的更具体的实例包括鳞状肿瘤(包括肺、头颈、宫颈等的鳞状肿瘤)、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、非小细胞肺癌、肺癌、结肠癌、头颈癌、乳腺癌、鳞状细胞癌、肛门癌、皮肤癌和外阴癌。在本发明的一个实施方案中，组合物用于治疗患有实体肿瘤(例如，可能过表达表皮生长因子受体(EGFR)的实体肿瘤)或多形性胶质母细胞瘤的受试者。
如本文中所用的，术语“施用”意指递送物质(例如，抗EGFR抗体药物偶联物)以达到治疗目的(例如，治疗EGFR相关的疾病)。施用方式可以是胃肠外、经肠和局部。胃肠外施用通常是通过注射，且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。
如本文中所用的，术语抗体的“治疗有效量”或“有效量”是指有效地预防或治疗或缓解其中抗体对于其治疗有效的疾病的症状的量。
术语“治疗”是指治疗性治疗和预防或防止性措施。需要治疗的那些患者包括已经患有疾病的那些以及待预防疾病的那些。
本发明的各个方面在以下小节中更详细地描述。
II.用于纯化抗体药物偶联物的方法及其组合物
本发明提供用于纯化抗体药物偶联物(ADC)的方法，并提供用于从ADC混合物除去不希望的ADC种类，例如6或更高的载药种类，的有效手段。尽管本发明的方法可以用于分离任何载药种类，但在优选的实施方案中，本文描述的方法用于将具有高药物载量的ADC与具有最佳药物-抗体比率(DAR)(例如，4或更低的DAR)的ADC分离。在某些实施方案中，本发明的方法可以提供优于传统柱色谱的多种优势，包括改善的回收率，因为分馏和随后的级分合并可能不是必需的。应当理解全文中描述的方法和组合物可以用于纯化抗-EGFR抗体-阿里他汀ADC，特别地在特定实施方案中，抗-EGFRADC包含通过马来酰亚胺基己胺基接头与MMAF偶联的(mc-MMAF)或通过缬氨酸-瓜氨酸接头与MMAE偶联的(vc-MMAE)的抗体1。
本发明的方法一般包括添加疏水性树脂到ADC混合物中以使得不希望的ADC(即，较高药物载量的ADC)结合树脂和可以选择性地从混合物除去。在某些实施方案中，ADC的分离可以通过使ADC混合物(例如，包含4或更低的ADC载药种类和6或更高的ADC载药种类的混合物)与疏水性树脂接触来实现，其中树脂的量足以允许待从ADC混合物除去的载药种类的结合。树脂和ADC混合物混合在一起，使得被除去的ADC种类(例如，6或更高的载药种类)结合于树脂并可以与ADC混合物中的其它ADC种类分离。用于该方法中的树脂量是基于待除去的种类与树脂之间的重量比，其中所使用的树脂量不允许希望的载药种类的显著结合。因此，本发明提供用于将ADC混合物的平均DAR从例如5.5降低到小于4的方法。此外，本文中描述的纯化方法可以用于分离具有任何所需范围的载药种类的ADC，例如4或更低的载药种类、3或更低的载药种类、2或更低的载药种类、1或更低的载药种类。
本发明提供纯化方法，从而特定分子种类基于该种类和疏水性树脂之间的疏水相互作用与表面结合。在一个实施方案中，本发明的方法是指依赖于疏水性树脂与ADC混合物的互混的纯化过程，其中添加到混合物中的树脂的量决定哪些种类(例如具有6或更高的DAR的ADC)将结合。
在抗体从表达系统(例如，哺乳动物表达系统)产生和纯化后，抗体被还原并通过偶联反应与药物偶联。所得的ADC混合物通常包含具有一定范围的DAR(例如，1-8)的ADC。在一个实施方案中，ADC混合物包含4或更低的载药种类和6或更高的载药种类。根据本发明的方法，ADC混合物可以使用例如但不限于分批处理的方法纯化，使得选择具有4或更低的载药种类的ADC并与具有较高药物载量的ADC(例如，具有6或更高的载药种类的ADC)分离。值得注意的是，本文描述的纯化方法可以用于分离具有任何所需范围的DAR(例如，4或更低的DAR、3或更低的DAR、2或更低的DAR)的ADC。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括使包含4或更低的载药种类和6或更高的载药种类的ADC混合物与疏水性树脂接触以形成树脂混合物，其中与ADC混合物接触的疏水性树脂的量足以允许6或更高的载药种类与树脂结合但不允许4或更低的载药种类的显著结合；和从ADC混合物除去疏水性树脂，使得获得包含ADC的组合物，其中组合物包含少于15％的6或更高的载药种类，且其中ADC包含与阿里他汀偶联的抗体。在单独的实施方案中，本发明的方法包括使包含4或更低的载药种类和6或更高的载药种类的ADC混合物与疏水性树脂接触以形成树脂混合物，其中与ADC混合物接触的疏水性树脂的量足以允许6或更高的载药种类与树脂结合但不允许4或更低的载药种类的显著结合；和从ADC混合物除去疏水性树脂，使得获得包含ADC的组合物，其中组合物包含少于15％的6或更高的载药种类，且其中ADC包含与阿里他汀偶联的抗体，其中疏水性树脂的重量是ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的3-12倍。
本发明的方法提供分离低和高DAR的ADC的有效方法。在一个实施方案中，该方法可以使用批纯化方法进行。批纯化处理一般包括将ADC混合物添加到容器中的疏水性树脂，混合和随后将树脂从上清液分离。例如，在批纯化的情况中，疏水性树脂可以在所需的平衡缓冲液中制备或相对于所需的平衡缓冲液进行平衡。因此可以获得疏水性树脂的浆料。ADC混合物然后可以与浆料接触以吸附待通过疏水性树脂分离的特定种类的ADC。包含不与疏水性树脂材料结合的所需ADC的溶液然后可以例如通过过滤或通过允许浆料沉降和除去上清液而与浆料分离。所得的浆料可以进行一个或多个洗涤步骤。为了洗脱结合的ADC，盐浓度可以降低。在一个实施方案中，本发明中使用的方法包括不超过50g的疏水性树脂。
因此，在本发明的一个实施方案中，分批方法可以用于使包含4或更低的载药种类和6或更高的载药种类的ADC混合物与疏水性树脂接触以形成树脂混合物，其中与ADC混合物接触的疏水性树脂的量足以允许6或更高的载药种类与树脂结合但不允许4或更低的载药种类的显著结合；和从ADC混合物除去疏水性树脂，使得获得包含ADC的组合物，其中组合物包含少于15％的6或更高的载药种类，且其中ADC包含与阿里他汀偶联的抗体。在单独的实施方案中，分批方法用于使包含4或更低的载药种类和6或更高的载药种类的ADC混合物与疏水性树脂接触以形成树脂混合物，其中与ADC混合物接触的疏水性树脂的量足以允许6或更高的载药种类与树脂结合但不允许4或更低的载药种类的显著结合；和从ADC混合物除去疏水性树脂，使得获得包含ADC的组合物，其中组合物包含少于15％的6或更高的载药种类，且其中ADC包含与阿里他汀偶联的抗体，其中疏水性树脂的重量是ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的3-12倍。
或者，在单独的实施方案中，本发明可以使用循环处理进行，从而树脂填塞在容器中且ADC混合物经过疏水性树脂床直到待分离的特定种类的ADC被除去。上清液(含有所需的ADC种类)然后从容器泵送且树脂床可以进行洗涤步骤。
循环处理可以用于使包含4或更低的载药种类和6或更高的载药种类的ADC混合物与疏水性树脂接触以形成树脂混合物，其中与ADC混合物接触的疏水性树脂的量足以允许6或更高的载药种类与树脂结合但不允许4或更低的载药种类的显著结合；和从ADC混合物除去疏水性树脂，使得获得包含ADC的组合物，其中组合物包含少于15％的6或更高的载药种类，且其中ADC包含与阿里他汀偶联的抗体。在单独的实施方案中，循环处理用于使包含4或更低的载药种类和6或更高的载药种类的ADC混合物与疏水性树脂接触以形成树脂混合物，其中与ADC混合物接触的疏水性树脂的量足以允许6或更高的载药种类与树脂结合但不允许4或更低的载药种类的显著结合；和从ADC混合物除去疏水性树脂，使得获得包含ADC的组合物，其中组合物包含少于15％的6或更高的载药种类，且其中ADC包含与阿里他汀偶联的抗体，其中疏水性树脂的重量是ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的3-12倍。
或者，在本发明的单独实施方案中，纯化方法可以用流过处理进行，从而树脂填塞在容器(例如，柱)中，且ADC混合物经过填塞的树脂以使得所需的ADC种类基本上不与树脂结合而流过树脂，且不希望的ADC种类结合于树脂。流过处理可以以单轮模式(其中目标ADC种类由于单次通过容器的树脂而获得)进行或以多轮模式(其中目标ADC种类由于多次通过容器的树脂而获得)进行。进行流过处理以使得所选择的树脂重量结合不希望的ADC群体，而所需的ADC(例如，DAR2-4)流过树脂并在一次或多次通过后收集在流通液中。
在本发明的一个实施方案中，流过处理可以用于使包含4或更低的载药种类和6或更高的载药种类的ADC混合物与疏水性树脂接触，其中与ADC混合物接触的疏水性树脂的量足以允许6或更高的载药种类与树脂结合但不允许4或更低的载药种类的显著结合，其中4或更低的载药种类经过树脂并随后在一次或多次通过后收集，使得获得包含所需ADC(例如，DAR2-4)的组合物，其中组合物包含少于15％的6或更高的载药种类，且其中ADC包含与阿里他汀偶联的抗体。在单独的实施方案中，流过处理用于通过使包含4或更低的载药种类和6或更高的载药种类的ADC混合物经过疏水性树脂而使ADC混合物与树脂接触，其中与ADC混合物接触的疏水性树脂的量足以允许6或更高的载药种类与树脂结合但不允许4或更低的载药种类的显著结合，其中4或更低的载药种类经过树脂并随后收集，使得获得包含ADC的组合物，其中组合物包含少于15％的6或更高的载药种类，且其中ADC包含与阿里他汀偶联的抗体，其中疏水性树脂重量的量是ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的3-12倍。
在本发明的一个实施方案中，树脂在流过处理后用一次或多次洗涤进行洗涤以进一步回收具有所需DAR范围的ADC(在洗涤滤液中发现)。例如，具有降低的电导率的多个洗液可以用于进一步回收具有目标DAR的ADC。从树脂的洗涤获得的洗脱材料可以随后与从流过处理获得的滤液组合以获得具有目标DAR的ADC的更高回收率。
本发明的纯化方法是基于使用疏水性树脂来分离高载药种类的ADC与低载药种类的ADC。疏水性树脂包含与ADC的疏水性质相互作用的疏水基团。ADC上的疏水基团与疏水性树脂内的疏水基团相互作用。蛋白质疏水性越高，其与疏水性树脂的相互作用越强。
疏水性树脂通常包含疏水性配体(例如烷基或芳基)与其偶联的基本基质(例如交联的琼脂糖或合成的共聚物材料)。很多疏水性树脂可商购获得。实例包括但不限于具有低或高取代的PhenylSepharoseTM6FastFlow(PharmaciaLKBBiotechnology,AB,Sweden)、PhenylSepharoseTMHighPerformance(PharmaciaLKBBiotechnology,AB,Sweden)、OctylSepharoseTMHighPerformance(PharmaciaLKBBiotechnology,AB,Sweden)、FractogelTMEMD丙基或FractogelTMEMD苯基柱(E.Merck,Germany)、Macro-PrepTM甲基或Macro-PrepTM叔丁基支持物(Bio-Rad,California)、WPHI-丙基(C3)TM(J.T.Baker,NewJersey)和ToyopearlTM醚、己基、苯基或丁基(TosoHaas,PA)。在一个实施方案中，疏水性树脂是丁基疏水性树脂。在另一个实施方案中，疏水性树脂是苯基疏水性树脂。在另一个实施方案中，疏水性树脂是己基疏水性树脂、辛基疏水性树脂或癸基疏水性树脂。在一个实施方案中，疏水性树脂是具有正丁基配体的甲基丙烯酸聚合物(例如，Butyl-600M)。
本发明的方法至少部分地基于疏水性树脂可以以特定的量使用以选择性结合具有特定DAR的ADC的发现。树脂和具有给定DAR的ADC之间的结合取决于相对于待从ADC混合物除去的ADC的重量的树脂重量。通过相对于ADC混合物中特定载药种类重量改变与ADC混合物接触的树脂加载量的量(基于干重计算)，树脂选择性地结合具有例如8或更高的DAR的ADC、具有6-8的DAR的ADC、具有5-8的DAR的ADC等。因此，疏水性树脂的选择性取决于树脂与待通过树脂除去的ADC种类的重量的重量比。在一个实施方案中，与ADC混合物接触的疏水性树脂的重量是ADC混合物中6或更高的载药种类重量的3-12倍。在一个实施方案中，与ADC混合物接触的疏水性树脂的重量是ADC混合物中6或更高的载药种类重量的4-8倍。在一个实施方案中，与ADC混合物接触的疏水性树脂的重量是ADC混合物中6或更高的载药种类重量的5-10倍。在另一个实施方案中，与ADC混合物接触的疏水性树脂的重量是ADC混合物中6或更高的载药种类重量的5-7倍。在另一个实施方案中，与ADC混合物接触的疏水性树脂的重量是ADC混合物中6或更高的载药种类重量的5-6倍。例如，如以下实施例的表5中描述的，约5-10倍重量的树脂(干重)用于减少6和8的载药种类(3.2mg树脂/0.54mg6/8的载药种类＝大约6)，得到富集的组合物(富集具有低于6的DAR的ADC)。在另一实例中，如以下表7中描述的，大约8-12倍于6和8的载药种类的重量的树脂重量证明有效地从ADC混合物减少那些种类。在进一步的实例中，如以下表7中描述的，大约4倍于6和8的载药种类的重量的树脂重量证明有效地从ADC混合物显著减少那些种类。
树脂对于ADC的选择性可以受到与本文中确定为提供适宜的树脂加载量:ADC重量比率(其导致具有所需的特定DAR分布例如6-8的DAR分布的ADC的选择性结合)的比率相结合的树脂混合物离子强度的影响。一般地，通过降低树脂混合物的离子强度，疏水性树脂只有较低吸附性，而树脂混合物的离子强度的提高提供更高吸附性的树脂。ADC吸附于疏水性树脂通过高盐浓度来促进，但实际的浓度可以根据ADC和所选择的特定疏水性树脂的特性在宽范围内变化。一般地，Na、K或NH4硫酸盐有效地促进疏水性树脂中的配体-蛋白质相互作用。盐可以进行配制，其如以下关系确定的影响相互作用的强度：(NH4)2SO4>Na2SO4>NaCl>NH4Cl>NaBr>NaSCN。一般地，约0.75和约2M硫酸铵之间或约1和4MNaCl之间的盐浓度是有用的。在一个实施方案中，树脂混合物的离子强度为0-2NNaCl。ADC混合物的离子强度可以在添加疏水性树脂之前、同时或之后进行调节。
在一个实施方案中，本发明的方法使用6-12倍于ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的疏水性树脂重量，其中ADC混合物具有0-1NNaCl的离子强度或其等同离子强度。在单独的实施方案中，本发明的分离方法使用3-6倍于ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的疏水性树脂重量进行，且其中ADC混合物包含1-2NNaCl或其等同离子强度。该方法也可以使用3-7倍于ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的疏水性树脂重量进行，且其中阿里他汀是单甲基阿里他汀E(MMAE)。用于分离6或更高的载药种类的其它方法包括ADC混合物与5-10倍于6或更高的载药种类的重量的疏水性树脂重量接触，其中阿里他汀是单甲基阿里他汀F(MMAF)。
另外的纯化或处理步骤可以在本文描述的方法之前或之后进行。例如，在一个实施方案中，ADC混合物在超滤/透析处理之后获得。在另一个实施方案中，纯化的ADC组合物进行超滤/透析。
在一个实施方案中，本发明的方法包括使ADC混合物与疏水性树脂接触，其中与疏水性树脂接触的疏水性树脂的量足以允许6或更高的载药种类与树脂结合但不允许4或更低的载药种类的显著结合，和从ADC混合物除去疏水性树脂。疏水性树脂结合较高载药种类，例如6或更高的载药种类，而较低载药种类，例如4或更低的载药种类，大部分保留在上清液中。与ADC混合物接触且不允许4或更低的载药种类的显著结合的疏水性树脂的量在一个实施方案中是结合35％或更少的4或更低的载药种类的树脂量。在某些实施方案中，4或更低的载药种类的显著结合定义为30％或更少、25％或更少、20％或更少、15％或更少、10％或更少或者5％或更少。在其它实施方案中，载药种类的显著结合定义为30％-1％、25％-1％、20％-1％、15％-1％、10％-1％或5％-1％。
在一个实施方案中，本发明的方法可以用于获得具有低水平的不希望的ADC种类例如6或更高的载药种类的组合物。在一个实施方案中，本发明的组合物具有15％或更少的6或更高的载药种类。在一个实施方案中，本发明的组合物具有14％或更少的6或更高的载药种类。在一个实施方案中，本发明的组合物具有13％或更少的6或更高的载药种类。在一个实施方案中，本发明的组合物具有12％或更少的6或更高的载药种类。在一个实施方案中，本发明的组合物具有11％或更少的6或更高的载药种类。在一个实施方案中，本发明的组合物具有10％或更少的6或更高的载药种类。在一个实施方案中，本发明的组合物具有9％或更少的6或更高的载药种类。在一个实施方案中，本发明的组合物具有8％或更少的6或更高的载药种类。在一个实施方案中，本发明的组合物具有7％或更少的6或更高的载药种类。在一个实施方案中，本发明的组合物具有6％或更少的6或更高的载药种类。在一个实施方案中，本发明的组合物具有5％或更少的6或更高的载药种类。在一个实施方案中，本发明的组合物具有4％或更少的6或更高的载药种类。在进一步的实施方案中，组合物具有15％-1％的6或更高的载药种类、10％-1％的6或更高的载药种类、5％-1％的6或更高的载药种类、10％-0.5％的6或更高的载药种类或5％-0.5％的6或更高的载药种类。
在一个实施方案中，本发明的方法可以用于产生包含平均DAR为4的ADC的组合物。这种组合物可以通过在种类吸附过程中使ADC混合物与一定量的疏水性树脂接触以形成树脂混合物而获得，其中ADC混合物包含4或更低的载药种类和6或更高的载药种类，且其中疏水性树脂的量是ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的5-10倍，和从树脂混合物获得上清液，使得产生包含平均DAR为4或更低的ADC的组合物。在一个实施方案中，本发明的组合物包含平均DAR为3.5或更低的ADC。在本发明的一个实施方案中，组合物包含平均DAR为3或更低的ADC。在一个实施方案中，本发明的组合物包含平均DAR为2-4的ADC。在本发明的一个实施方案中，组合物包含平均DAR为2.4-3.6的ADC。在一个实施方案中，组合物包含ADC并具有4或更低的平均DAR，或者可选地3.5或更低的平均DAR、3或更低的平均DAR或者2.5或更低的平均DAR。
在一个实施方案中，本发明的方法可以用于产生包含平均药物-抗体比率(DAR)为4或更低的ADC且包含少于15％的不希望的ADC的组合物。该方法包括使ADC混合物与疏水性树脂接触，其中与ADC混合物接触的疏水性树脂的量足以允许不希望的ADC的结合；和从ADC混合物除去疏水性树脂，使得产生具有4或更低的平均DAR和包含少于15％的不希望的ADC的组合物。在一个实施方案中，不希望的ADC是6和8的载药种类。在一个实施方案中，添加到ADC混合物中的疏水性树脂的量是作为ADC混合物中不希望的ADC的重量5-10倍的树脂重量。在另一个实施方案中，添加到ADC混合物中的疏水性树脂的量是作为ADC混合物中不希望的ADC的重量5-7倍的树脂重量。在一个实施方案中，添加到ADC混合物中的疏水性树脂的量是作为ADC混合物中不希望的ADC的重量3-12倍的树脂重量。
ADC的DAR可以按照本领域中已知的通用方法测量，其包括，但不限于ADC的UV/VIS光谱分析及分析型HIC和HPLC，例如HPLC-MS。
III.抗体药物偶联物
本文描述的组合物和方法至少部分地基于包含特异性结合于与阿里他汀偶联的EGFR的抗-EGFR抗体或其抗原结合部分的抗体药物偶联物(ADC)。
特别地，本发明涉及包含含有识别在致肿瘤的、过度增殖的或异常的细胞中发现的EGFR表位的抗体或其抗原结合部分的抗-EGFR抗体药物偶联物的组合物和方法，其中该表位在正常或野生型细胞中不能检测到。优选地，抗体或其抗原结合部分在不存在过表达和存在正常EGFR翻译后修饰的情况下不结合或识别含有正常或野生型EGFR表位的正常或野生型细胞。
根据本发明的组合物和方法适合使用的抗-EGFR抗体通常是单克隆的，且可以包括例如嵌合(例如，具有人恒定区和小鼠可变区)、人源化或人抗体；单链抗体等。免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类。例如，用于本发明的抗EGFR抗体药物偶联物中的抗EGFR抗体可以是抗体1。抗体1的序列和特性如下所述(也参见其全文通过引用在此并入本文的WO2011/041319和US20110076232(参见，例如图55的抗体序列))。抗体1靶向于在50％的所有表皮起源癌症中存在的表皮生长因子受体(EGFR)的过表达形式。
在本发明的具体的实施方案中，用于本发明的抗EGFR抗体药物偶联物中的抗EGFR抗体识别扩增的野生型EGFR和de2-7EGFR。本发明的抗EGFR抗体显示有用的特异性，因为它识别de2-7EGFR和扩增的EGFR，但不识别正常的、野生型EGFR或de2-7EGFR特征性的独特接合肽。以下提供抗体1的序列。
如上所述，抗体1是人源化的抗-EGFR抗体。抗体1的重链可变区(VH)和恒定区(CH)以下分别显示为SEQIDNO:1和5。VH区CDR1、CDR2和CDR3(分别为SEQIDNO:2、3和4)以下划线表示。
重链可变区氨基酸序列(SEQIDNO:1)(CDR加下划线)：
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSISSDFAWNWIRQPPGKGLCDR1(SEQIDNO:2)
EWMGYISYSGNTRYQPSLKSRITISRDTSKNQFFLKLNSVTAADTACDR2(SEQIDNO:3)
TYYCVTAGRGFPYWGQGTLVTVSSCDR3(SEQIDNO:4)
重链恒定区氨基酸序列(SEQIDNO:5)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
抗体1的轻链可变区(VL)和恒定区(CL)以下分别显示为SEQIDNO:6和10。VL区CDR1、CDR2和CDR3(分别为SEQIDNO:7、8和9)以下划线表示。
轻链可变区氨基酸序列(SEQIDNO:6)(CDR加下划线)：
DIQMTQSPSSMSVSVGDRVTITCHSSQDINSNIGWLQQKPGKSFKGCDR1(SEQIDNO:7)
LIYHGTNLDDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCVQYACDR2(SEQIDNO:8)CDR3
QFPWTFGGGTKLEIKR(SEQIDNO:9)
轻链恒定区氨基酸序列(SEQIDNO:10)：
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
因此，在一个实施方案中，抗-EGFR抗体(用于本文描述的ADC中)包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含含有分别如SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9所示氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3结构域，且重链可变区包含含有分别如SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一个实施方案中，本发明提供包含含有抗EGFR抗体(与阿里他汀偶联)的ADC的制剂，所述抗EGFR抗体具有包含SEQIDNO：6的氨基酸序列中描述的CDR的轻链可变区，和包含SEQIDNO：1的氨基酸序列中描述的CDR的重链可变区。
在一个实施方案中，抗-EGFR抗体(用于本文描述的ADC中)包含含有SEQIDNO：6所示氨基酸序列的轻链可变区和含有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的重链可变区。
在优选的实施方案中，用于本发明的方法和组合物中的ADC包含抗-EGFR抗体(例如，抗体1)和阿里他汀。在一个实施方案中，阿里他汀是单甲基阿里他汀E(MMAE)，例如vc-MMAE。在一个实施方案中，阿里他汀是单甲基阿里他汀F(MMAF)，例如mc-MMAF。
或者，其它基于阿里他汀的ADC可以按照本发明的方法制备，可以用于制备阿里他汀-ADC的抗体的实例包括嵌合抗体、人抗体和人源化抗体。
可以用于制备ADC(包括抗-EGFR抗体药物偶联物)的抗体(包括抗-EGFR抗体)可以通过本领域中已知的任何合适方法产生。例如，可以使用多种多样的技术制备单克隆抗体，包括例如使用杂交瘤技术、重组技术和噬菌体展示技术或其组合。例如，Harlow等,Antibodies:ALaboratoryManual,(ColdSpringHarborLaboratoryPress,2nded.,1988)和Hammerling等,InMonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas,pp.563-681(Elsevier,N.Y.,1981)中总体地讨论了杂交瘤技术。可以用来制备抗CD70抗体的噬菌体展示方法的实例包括例如在Brinkman等,1995,JImmunolMethods182:41-50；Ames等,1995,JImmunolMethods184:177-186；Kettleborough等,1994,EurJImmunol24:952-958；Persic等,1997,Gene187:9-18；Burton等,1994,AdvancesinImmunology57:191-280；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT公开WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；及美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108(其公开通过引用在此并入本文)中描述的那些。
用于表达本发明的重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括在Urlaub和Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220中描述的dhfr-CHO细胞,其与例如描述于Kaufman和Sharp(1982)J.Mol.Biol.159:601-621中的DHFR选择标记一起使用)和DG44或DUXB11细胞(Urlaub等(1986)Som.CellMolec.Genet.12:555；Haynes等(1983)Nuc.Acid.Res.11:687-706；Lau等(1984)Mol.Cell.Biol.4:1469-1475)、NS0骨髓瘤细胞、猴肾细胞系(例如，CVI和COS,例如COS7细胞)、SP2细胞、人胚肾(HEK)细胞,例如HEK-293细胞、中国仓鼠成纤维细胞(例如，R1610)、人宫颈癌细胞(例如，HELA)、鼠成纤维细胞(例如，BALBc/3T3)、鼠骨髓瘤细胞(P3x63-Ag3.653；NS0；SP2/O)、仓鼠肾细胞系(例如，HAK)、鼠L细胞(例如，L-929)、人淋巴细胞(例如，RAJI)、人肾细胞(例如，293和293T)。宿主细胞系通常可商购获得(例如，从BDBiosciences,Lexington,Ky.；Promega,Madison,Wis.；LifeTechnologies,Gaithersburg,Md.)或从AmericanTypeCultureCollection(ATCC,Manassas,Va.)获得。
当将编码抗体的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足够允许在宿主细胞中表达抗体或允许抗体分泌至宿主细胞在其中生长的培养基中的时间产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基回收抗体。
在用于抗体重组表达的示例性系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链两者的重组表达载体引入dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体中，抗体重链和轻链cDNA各自可操作地与CMV增强子/AdMLP启动子调控元件连接以驱动cDNA的高水平转录。重组表达载体还携带编码DHFR的cDNA，其允许使用氨甲喋呤选择/扩增来选择已经用载体转染的CHO细胞。培养选择的转化体宿主细胞以允许抗体重链和轻链的表达，并从培养基回收完整的抗体。使用标准分子生物学技术来制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞和从培养基回收抗体。还进一步地，本发明提供通过在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞直到抗体合成来合成抗体的方法。该方法可进一步包括从培养基分离抗体。
在优选的实施方案中，抗EGFR抗体或其抗原结合部分与阿里他汀(一个或多个)偶联。已经表明阿里他汀干扰微管动力学、GTP水解和/或细胞核和细胞分裂，且具有抗癌和/或抗真菌活性。阿里他汀代表一组多拉司他汀类似物，其通常表明通过干扰微管动力学和GTP水解来抑制细胞分裂，从而具有抗癌活性。例如，阿里他汀E(在此通过引用并入本文的美国专利号5,635,483)是海洋天然产物多拉司他汀10(一种通过结合于微管蛋白上与抗癌药物长春新碱相同的位点来抑制微管蛋白聚合的化合物)的合成类似物(G.R.Pettit,Prog.Chem.Org.Nat.Prod,70:1-79(1997))。多拉司他汀10、阿里他汀PE和阿里他汀E是具有四个氨基酸的线性肽，其中三个对于多拉司他汀类化合物是特有的。有丝分裂抑制剂的阿里他汀子类的示例性实施方案包括，但不限于单甲基阿里他汀D(MMAD或阿里他汀D衍生物)、单甲基阿里他汀E(MMAE或阿里他汀E衍生物)、单甲基阿里他汀F(MMAF或阿里他汀F衍生物)、阿里他汀F苯二胺(AFP)、阿里他汀EB(AEB)、阿里他汀EFP(AEFP)和5-苯甲酰戊酸-AE酯(AEVB)。阿里他汀衍生物的合成和结构描述于各自在此通过引用并入本文的美国专利申请公开号2003-0083263、2005-0238649和2005-0009751、国际专利公开号WO04/010957、国际专利公开号WO02/088172及美国专利号6,323,315、6,239,104、6,034,065、5,780,588、5,665,860、5,663,149、5,635,483、5,599,902、5,554,725、5,530,097、5,521,284、5,504,191、5,410,024、5,138,036、5,076,973、4,986,988、4,978,744、4,879,278、4,816,444和4,486,414中。
在一个实施方案中，本发明的抗-EGFR抗体与至少一个MMAF(单甲基阿里他汀F)偶联。单甲基阿里他汀F(MMAF)通过阻断微管蛋白的聚合来抑制细胞分裂。与其不带电的对应物MMAE相比，它具有带电的C末端苯丙氨酸残基，这减弱其细胞毒性活性。因为它的超强毒性，其本身不能用作药物，但可以与将其指引到癌细胞的单克隆抗体(mAb)连接。在一个实施方案中，抗EGFR抗体的接头在细胞外液中是稳定的，但一旦偶联物进入肿瘤细胞中，其被组织蛋白酶切割，从而激活抗有丝分裂机制。在一个实施方案中，抗体1使用不可切割的马来酰亚胺基己酰基(mc)连接与MMAF偶联。图1提供了MMAF的结构。
在一个实施方案中，本发明的抗-EGFR抗体与至少一个MMAE(单甲基阿里他汀E)偶联。单甲基阿里他汀E(MMAE，vedotin)通过阻断微管蛋白的聚合来抑制细胞分裂。由于它的超强毒性，其本身不能用作药物。在最近的癌症治疗发展中，它与识别癌细胞中的特定标志物表达的单克隆抗体(mAb)连接，并将MMAE指引到癌细胞。在一个实施方案中，将MMAE连接至抗EGFR抗体的接头在细胞外液(即，细胞外部的介质或环境)中是稳定的，但一旦ADC与特定癌细胞抗原结合并进入癌细胞中，则其被组织蛋白酶切割，从而释放毒性的MMAE并激活有效的抗有丝分裂机制。图1提供了MMAE的结构。
用于将治疗剂与蛋白质，尤其是与抗体偶联的技术是公知的(参见，例如Arnon等,"MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy,"inMonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy(Reisfeld等eds.,AlanR.Liss,Inc.,1985)；Hellstrom等,"AntibodiesForDrugDelivery,"inControlledDrugDelivery(Robinson等eds.,MarcelDekker,Inc.,2nded.1987)；Thorpe,"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview,"inMonoclonalAntibodies'84:BiologicalAndClinicalApplications(Pinchera等eds.,1985)；"Analysis,Results,andFutureProspectiveoftheTherapeuticUseofRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy,"inMonoclonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapy(Baldwin等eds.,AcademicPress,1985)；和Thorpe等,1982,Immunol.Rev.62:119-58。还参见例如PCT公开WO89/12624)。
在一个实施方案中，抗-EGFR-ADC包含在细胞毒性药物和抗体之间的接头区。例如，此类接头、间隔物和/或延伸剂化合物包括但不限于以下：氨基苯甲酸间隔物(参见，例如且非限制地其全文各自通过引用在此并入本文中的美国专利号7,091,186和7,553,816)、马来酰亚胺基己酰基、p-氨基苄基氨甲酰基(PAB)、溶酶体酶可切割的接头(参见，例如且非限制地其全文通过引用在此并入本文的美国专利号6,214,345)、马来酰亚胺基己酰基-聚乙二醇20(MC(PEG)6-OH)、N-甲基-缬氨酸瓜氨酸、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)(参见，例如但不限于其全文通过引用在此并入本文的Yoshitake等(1979)Eur.J.Biochem.,101,395-399)、4-(2-吡啶二硫代)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDB)(参见，例如但不限于其全文通过引用在此并入本文的美国专利号4,563,304)、4-(2-吡啶硫代)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(SPP)、缬氨酸-瓜氨酸及其他接头、间隔物和/或延伸剂化合物(参见，例如但不限于其全文各自通过引用在此并入本文的美国专利号7,090,843、7,223,837和7,659,241及美国专利公开号2004/0018194、2004/0121940、2006/0116422、2007/0258987、2008/0213289、2008/0241128、2008/0311136、2008/0317747和2009/0010945)。一般来说，用于将上述药剂以及其他药剂连接和/或偶联至本发明的特定结合成员，尤其是抗体及其片段的技术是本领域已知的。参见，例如但不限于其全文各自通过引用在此并入本文的Amon等,"MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy",inMonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy,Reisfeld等(eds.),pp.243-56(AlanR.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等,"AntibodiesForDrugDelivery",inControlledDrugDelivery(2ndEd.),Robinson等(eds.),pp.623-53(MarcelDekker,Inc.1987)；Thorpe,"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview",InMonoclonalAntibodies'84:BiologicalAndClinicalApplications,Pinchera等(eds.),pp.475-506(1985)；"Analysis,Results,AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy",inMonoclonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapy,Baldwin等(eds.),pp.303-16(AcademicPress1985)和Thorpe等,"ThePreparationAndCytotoxicPropertiesOfAntibody-ToxinConjugates",Immunol.Rev.,62:119-58(1982)。
将药物共价连接至抗体的多种不同反应是可用的。这通常通过抗体分子的氨基酸残基(包括赖氨酸的胺基、谷氨酸和天冬氨酸的游离羧基、半胱氨酸的巯基和芳族氨基酸的各种部分)的反应来完成。最常用的非特异性的共价连接方法之一是将化合物的羧基(或氨基)连接至抗体的氨基(或羧基)的碳二亚胺反应。此外，已经使用双官能试剂例如二醛或亚氨酸酯来连接化合物的氨基和抗体分子的氨基。还可用于连接药物与抗体的是希夫碱反应。该方法涉及包含二醇或羟基的药物的高碘酸氧化，从而形成随后与抗体分子反应的醛。连接通过与抗体分子的氨基形成希夫碱而发生。也可以用异硫氰酸酯作为偶联剂以将药物共价连接至抗体。其他技术是本领域技术人员已知的，且也在本发明的范围内。这些技术的非限制性实例描述于，例如其全文通过引用在此并入本文的美国专利号5,665,358、5,643,573和5,556,623中。
在某些实施方案中，中间体(其为接头的前体)与药物在合适条件下反应。在某些实施方案中，使用药物和/或中间体上的反应性基团。随后将药物和中间体之间反应的产物或衍生药物与抗EGFR抗体在合适条件下反应。
偶联方法的其他实例描述于美国专利号7,837,980(SeattleGenetics),Carter和Senter(2008)CancerJ,14(3):154,以及美国公开申请号2004-0157782A1和2005-0238649及国际专利申请号PCT/US04/038392中。
在本发明的一个实施方案中，抗-EGFR抗体或其抗原结合部分与作为MMAF的阿里他汀偶联。在一个实施方案中，抗-EGFRADC是抗体1-mc-MMAF。抗体1-mc-MMAF包含与一个或多个单甲基阿里他汀F(MMAF)分子(结构参见图1)共价连接的抗体1(在以上和在SEQIDNO:1-10中描述的)。为产生抗体1-mc-MMAF，抗体1的链间二硫键被还原成巯基。然后通过这些巯基将MMAF与抗体偶联。如图1所示的，使用不可切割的接头(即，不可切割的马来酰亚胺基己酰基(mc)接头)制备抗体1-mc-MMAF。
在本发明的一个实施方案中，抗-EGFR抗体或其抗原结合部分与作为MMAE的阿里他汀偶联。在一个实施方案中，抗-EGFRADC包括抗体1-vc-MMAE。抗体1-vc-MMAE包含与一个或多个单甲基阿里他汀E(MMAE)分子(结构参见图1)共价连接的抗体1(在以上和在SEQIDNO:1-10中描述的)。为产生抗体1-vc-MMAE，抗体1的链间二硫键被还原成巯基。vcMMAE然后通过这些巯基与抗体偶联。如图1所示，使用缬氨酸瓜氨酸接头(vc)产生抗体1-vc-MMAE，因此形成抗体1-vc-MMAE。
IV.组合物用途
根据本发明的方法，向患有需要用抗EGFR抗体治疗的疾病(或具有患病风险)的受试者施用包含具有所需平均DAR的抗EGFRADC的组合物。在预防或治疗需要用抗EGFR抗体治疗的疾病中，包含抗EGFRADC的制剂可以单独施用或与其他组合物结合施用。
如本文中所用的，术语“其中EGFR活性有害的疾病”意欲包括其中患有疾病的受试者中EGFR的存在已经表明或怀疑造成该疾病的病理生理或者是造成疾病恶化的因素的疾病和其他病症。因此，其中EGFR活性有害的疾病是其中期望抑制EGFR活性来缓解疾病的症状和/或进展的疾病。例如，此类疾病可以由例如可以用例如抗EGFR抗体检测的来自患有该疾病的受试者的生物样品中存在的EGFR活性的提高或EGFR量的增加(例如受试者的组织样品、血清、血浆、滑膜液等中EGFR浓度的增加)来证明。
因此，具有例如2-4的平均DAR的本发明ADC组合物可以用于治疗癌症。可以治疗的癌症的实例包括但不限于胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、结肠癌、头颈癌、乳腺癌、鳞状细胞肿瘤、肛门癌、皮肤癌和外阴癌。具有所需平均DAR的ADC组合物可以用于治疗患有可能过表达表皮生长因子受体(EGFR)的实体肿瘤或多形性胶质母细胞瘤的受试者。
在一个实施方案中，具有例如2-4的平均DAR的本发明的纯化ADC组合物用于治疗结肠直肠癌、头颈癌(包括，但不限于下咽癌、口咽癌、食管癌、喉癌和口腔癌)、非小细胞肺癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、胃癌、实体肿瘤、可能过表达表皮生长因子受体(EGFR)的实体肿瘤、多形性胶质母细胞瘤和乳腺癌。这类癌症的更特别的实例包括鳞状肿瘤(包括肺、头颈、宫颈等的鳞状肿瘤)、胶质母细胞瘤、胶质瘤、肺癌、结肠癌、头颈癌、乳腺癌、鳞状细胞肿瘤、肛门癌、皮肤癌和外阴癌。
包含抗EGFRADC的组合物的独特特异性提供鉴定、表征、靶定和治疗、减少或消除多种致肿瘤细胞类型和肿瘤类型，例如但不限于胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、肺癌、结肠癌、头颈癌、乳腺癌、鳞状细胞肿瘤、肛门癌、皮肤癌、可能过表达表皮生长因子受体(EGFR)的实体肿瘤、多形性胶质母细胞瘤和外阴癌的诊断和治疗用途，而没有与用之前已知的EGFR抗体可观察到的正常组织摄取相关的问题。因此，使用本发明的抗体或其片段可以识别、分离、表征、靶向和治疗或消除过表达EGFR的细胞(例如，通过突变体或变体EGFR的扩增或表达)，且在特定的实施方案中，表现异常的翻译后修饰的那些。本发明的组合物可以用于治疗EGFR阳性肿瘤。检测肿瘤中EGFR表达的方法是本领域已知的，例如EGFRpharmDxTMKit(Dako)。相反，“EGFR阴性肿瘤”定义为如通过免疫组化技术测定的，肿瘤样品中没有高于背景的EGFR膜染色的肿瘤。
在本发明的一个方面中，提供治疗受试者的方法，包括施用治疗有效量的本文所述的任何组合物中的抗EGFRADC，其中所述受试者患有需要用组合物中的抗-EGFR抗体治疗的疾病(例如，肿瘤、癌性状况、癌前状况和与过度增殖的细胞生长相关或由其造成的任何状况)。
因此，包含抗EGFRADC的组合物制剂可以通过染色或另外地识别其中存在EGFR过表达(尤其是扩增)和/或EGFR突变(尤其是de2-7EGFR)的那些肿瘤或细胞来特别地分类EGFR肿瘤或致瘤细胞的性质。
因此，在本发明的进一步的方面中，提供治疗肿瘤、癌性状况、癌前状况和与过度增殖的细胞生长相关或由其造成的任何状况的方法，包括施用包含含有抗体1的抗-EGFRADC的本发明组合物。
各种递送系统是已知的，且可用于施用包含本发明的抗EGFRADC组合物。引入的方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。ADC可以通过例如输注或静脉推注、通过经上皮或粘膜衬层(mucocutaneouslining)(如口腔粘膜、直肠和小肠粘膜等)的吸收来施用，并可以与其它生物活性剂(如化疗剂)一起施用。施用可以是全身的或局部的。在一个实施方案中，本发明的制剂静脉内递送至受试者。在另一个实施方案中，本发明的制剂皮下递送至受试者。在一个实施方案中，受试者给他/她自己施用制剂(自身施用)。
可以通过标准临床技术确定在需要制剂中的抗EGFR抗体治疗的疾病(例如，癌症)的治疗或预防中有效的ADC的量。此外，任选地可以采用体外试验来帮助确定最佳剂量范围。制剂中采用的精确剂量还将取决于施用途径及免疫疾病或表达EGFR的癌症的阶段，且应当根据实施者的判断和各个患者的情况来决定。在一个实施方案中，施用治疗有效量的制剂。如本文中所用的，术语抗体的“治疗有效量”或“有效量”是指在抗体治疗有效的疾病的症状的预防或治疗或缓解中有效的量。治疗有效量的制剂的实例是足够抑制有害的EGFR活性或治疗其中EGFR活性有害的疾病的量。
抗EGFRADC的剂量可以，例如每天、每周一次(每周)、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、两周一次、每三周、每个月、每四周、两周用药/一周停药或另外地按照需要来施用。
因此，根据本发明的和根据本发明使用的药物组合物除活性成分(ADC)外还可以包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员公知的其它材料。这类材料应当是无毒的且不应当干扰活性剂的效能。载体或其它材料的精确特性可以取决于施用途径，其可以是口服或通过注射，例如静脉内。在一个实施方案中，药物组合物包含ADC(例如，与MMAE或MMAF偶联的抗-EGFR抗体如抗体1)和药学上可接受的载体。如本文中所用的，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等，其是生理上相容的。药学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，及其组合。在许多情况中，优选的是组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化钠。
在某些实施方案中，抗EGFRADC可以与一种或多种其他治疗剂共施用于受试者以治疗癌症。术语“共施用”是指通过在同一药物组合物或单独的药物组合物中组合来施用向受试者施用的两种或更多种不同药剂或治疗(例如放射治疗)。因此，共施用包括向同一受试者同时施用包含两种或更多种药剂的单一药物组合物或在相同或不同时间施用两种或更多种不同的组合物。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，其中所述药剂的实例包括，例如辐射、烷化剂、血管生成抑制剂、抗体、抗代谢物、抗有丝分裂剂、抗增殖剂、抗病毒药、极光激酶抑制剂、细胞凋亡促进剂(例如，Bcl-xL、Bcl-w和Bfl-1)的抑制剂、死亡受体途径的激活剂、Bcr-Ab1激酶抑制剂、BiTE(双特异性T细胞衔接剂)抗体、抗体药物偶联物、生物反应调节剂、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、细胞周期抑制剂、环氧合酶-2抑制剂、DVD(双可变域抗体)、白血病病毒癌基因同源物(ErbB2)受体抑制剂、生长因子抑制剂、热休克蛋白(HSP)-90抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、激素疗法、免疫剂、凋亡蛋白抑制剂(IAP)的抑制剂、嵌入抗生素、激酶抑制剂、驱动蛋白抑制剂、Jak2抑制剂、雷帕霉素抑制剂的哺乳动物靶标、微RNA、有丝分裂原激活细胞外信号调节的激酶抑制剂、多价结合蛋白、非类固醇抗炎药(NSAID)、聚ADP(二磷酸腺苷)-核糖聚合酶(PARP)抑制剂、铂化疗剂、polo样激酶(Plk)抑制剂、磷脂酰肌醇-3激酶(溴区结构域)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物、受体酪氨酸激酶抑制剂、etinoid/deltoid植物生物碱、抑制性小核糖核酸(siRNA)、拓扑异构酶抑制剂、替莫唑胺、泛素连接酶抑制剂等，以及与这些试剂中一种或多种的组合。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括BiTE抗体(其为通过同时结合两个细胞指引T细胞攻击癌细胞的双特异性抗体)。然后T细胞攻击靶癌细胞。BiTE抗体的实例包括阿德木单抗(MicrometMT201)、blinatumomab(MicrometMT103)等。不受理论限制，T细胞诱导靶癌细胞凋亡的机制之一是通过溶细胞颗粒成分(其包括穿孔素和颗粒酶B)的胞吐作用。在这方面，已经表明Bcl-2通过穿孔素和颗粒酶B两者减弱凋亡的诱导。这些数据表明，当靶向癌细胞时，Bcl-2的抑制可以增强T细胞诱导的细胞毒性作用(V.R.Sutton,D.L.Vaux和J.A.Trapani,J.ofImmunology1997,158(12),5783)。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括siRNA。siRNA是具有内源RNA碱基或化学修饰的核苷酸的分子。修饰没有消除细胞活性，反而赋予增强的稳定性和/或增强的细胞效力。化学修饰的实例包括硫代磷酸酯基团、2’-脱氧核苷酸、含2’-OCH3的核糖核苷酸、2’-F-核糖核苷酸、2’-甲氧乙基核糖核苷酸、它们的组合等等。siRNA可以具有变化的长度(例如，10-200bp)和结构(例如发夹、单/双链、凸起、缺口/空位、错配)，并在细胞中被加工以提供活性基因的沉默。双链siRNA(dsRNA)在各条链上可以具有相同数量的核苷酸(平端)或可以具有非对称末端(突出端)。1-2个核苷酸的突出端可以在有义和/或反义链上存在，以及可以在给定链的5’-和/或3’-端上存在。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括DVD和其他多价结合蛋白。多价结合蛋白是包含两个或更多个抗原结合位点的结合蛋白。多价结合蛋白被工程化以具有三个或更多个抗原结合位点，且通常不是天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”是指能够结合两个或更多个相关或不相关靶标的结合蛋白。双重可变域(DVD)结合蛋白是包含两个或更多个抗原结合位点的四价或多价结合蛋白。这类DVD可以是单特异性的(即能够结合一种抗原)或多特异性的(即能够结合两种或更多种抗原)。包含两条重链DVD多肽和两条轻链DVD多肽的DVD结合蛋白称为DVDIg。DVDIg的各一半包含重链DVD多肽、轻链DVD多肽和两个抗原结合位点。每个结合位点包含重链可变域和轻链可变域，每个抗原结合位点共有6个CDR参与抗原结合。多特异性DVD包括结合DLL4和VEGF、或者C-met和EGFR或者ErbB3和EGFR的DVD结合蛋白。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括烷化剂。烷化剂包括六甲蜜胺、AMD-473、AP-5280、apaziquone、苯达莫司汀、brostallicin、白消安、卡波醌、卡莫司汀(BCNU)、苯丁酸氮芥、(laromustine,VNP40101M)、环磷酰胺、氮烯咪胺(decarbazine)、雌氮芥、福莫司汀、葡磷酰胺、异环磷酰胺、KW-270、洛莫司汀(CCNU)、马磷酰胺、美法兰、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、尼莫司汀、氮芥N-氧化物、雷莫司汀、替莫唑胺、噻替哌、(苯达莫司汀)、苏消安、rofosfamide等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括血管生成抑制剂。血管生成抑制剂包括内皮特异性受体酪氨酸激酶(Tie-2)抑制剂、表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂、胰岛素生长因子-2受体(IGFR-2)抑制剂、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)抑制剂、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)抑制剂、血小板源生长因子受体(PDGFR)抑制剂、血小板反应蛋白类似物、血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶(VEGFR)抑制剂等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括抗代谢物。抗代谢物包括(培美曲塞二钠、LY231514、MTA)、5-阿扎胞苷、(卡培他滨)、卡莫氟、(克拉屈滨)、氯法拉滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸酯、胞嘧啶阿拉伯糖苷、地西他滨、去铁胺、脱氧氟尿苷、依氟鸟氨酸、EICAR(5-乙炔基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-甲酰胺)、依诺他滨、乙炔基胞苷、氟达拉滨、单独或与亚叶酸组合的5-氟尿嘧啶、(吉西他滨)、羟基脲、(美法仑)、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤核苷、氨甲喋呤、霉酚酸、奈拉滨、诺拉曲塞、ocfosfate、吡利曲索、喷司他丁、雷替曲塞、利巴韦林、triapine、曲美沙特、S-1、噻唑呋林(tiazofurin)、替加氟、TS-1、阿糖腺苷、UFT等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括抗病毒剂。抗病毒剂包括利托那韦、羟氯喹等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括极光激酶抑制剂。极光激酶抑制剂包括ABT-348、AZD-1152、MLN-8054、VX-680、AuroraA特异性激酶抑制剂、AuroraB特异性激酶抑制剂和泛极光激酶抑制剂等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括Bcl-2蛋白抑制剂。Bcl-2蛋白抑制剂包括AT-101((-)棉酚)、(G3139或奥利默森(Bcl-2靶向的反义寡核苷酸))、IPI-194、IPI-565、N-(4-(4-((4'-氯(1,1'-联苯基)-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)-4-(((1R)-3-(二甲基氨基)-1-((苯硫基)甲基)丙基)氨基)-3-硝基苯磺酰胺)(ABT-737)、N-(4-(4-((2-(4-氯苯基)-5,5-二甲基-1-环己-1-烯-1-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)-4-(((1R)-3-(吗啉-4-基)-1-((苯硫基)甲基)丙基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯磺酰胺(ABT-263)、GX-070(奥巴克拉(obatoclax))、ABT-199等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括Bcr-Ab1激酶抑制剂，例如(BMS-354825)、(伊马替尼)等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括CDK抑制剂。CDK抑制剂包括AZD-5438、BMI-1040、BMS-032、BMS-387、CVT-2584、夫拉平度(flavopyridol)、GPC-286199、MCS-5A、PD0332991、PHA-690509、seliciclib(CYC-202,R-roscovitine)、ZK-304709等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括COX-2抑制剂。COX-2抑制剂包括ABT-963、(依托考昔)、(伐地考昔)、BMS347070、(塞来昔布)、COX-189(罗美昔布)、CT-3、(地拉考昔)、JTE-522、4-甲基-2-(3,4-二甲基苯基)-1-(4-氨磺酰苯基-1H-吡咯)、MK-663(依托考昔)、NS-398、帕瑞考昔、RS-57067、SC-58125、SD-8381、SVT-2016、S-2474、T-614、(罗非考昔)等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括其他EGFR抑制剂。EGFR抑制剂包括EGFR抗体、ABX-EGF、抗EGFR免疫脂质体、EGF疫苗、EMD-7200、(西妥昔单抗)、HR3、IgA抗体、(吉非替尼)、(厄洛替尼或OSI-774)、TP-38、EGFR融合蛋白、(拉帕替尼)等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括HER2抑制剂。ErbB2受体抑制剂包括CP-724-714、CI-1033(卡奈替尼)、(曲妥珠单抗)、(拉帕替尼)、(2C4、帕妥珠单抗)、TAK-165、GW-572016(洛那法尼)、GW-282974、EKB-569、PI-166、dHER2(HER2疫苗)、APC-8024(HER-2疫苗)、抗HER/2neu双特异性抗体、B7.her2IgG3、ASHER2三官能双特异性抗体、mABAR-209、mAB2B-1等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂，例如缩酚酸肽、LAQ-824、MS-275、trapoxin、羟肟酸(SAHA)、TSA、丙戊酸等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括HSP-90抑制剂。HSP-90抑制剂包括17-AAG-nab、17-AAG、CNF-101、CNF-1010、CNF-2024、17-DMAG、格尔德霉素、IPI-504、KOS-953、(HSP-90的人重组抗体)、NCS-683664、PU24FCl、PU-3、根赤壳菌素、SNX-2112、STA-9090VER49009等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括凋亡抑制蛋白抑制剂的抑制剂，例如HGS1029、GDC-0145、GDC-0152、LCL-161、LBW-242等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括其他ADC，例如抗CD22-MC-MMAF、抗-CD22-MC-MMAE、抗-CD22-MCC-DM1、CR-011-vcMMAE、PSMA-ADC、MEDI-547、SGN-19AmSGN-35、SGN-75等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括死亡受体通路的激活剂，例如TRAIL、靶向TRAIL或死亡受体(例如，DR4和DR5)的抗体或其他试剂如Apomab、西他土珠单抗、ETR2-ST01、GDC0145、(来沙木单抗)、HGS-1029、LBY-135、PRO-1762和曲妥珠单抗。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括驱动蛋白抑制剂，例如Eg5抑制剂如AZD4877、ARRY-520；CENPE抑制剂如GSK923295A等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括JAK-2抑制剂，例如CEP-701(来他替尼)、XL019和INCB018424等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种试剂共施用以治疗癌症，包括MEK抑制剂，例如ARRY-142886、ARRY-438162PD-325901、PD-98059等。
抗EGFRADC(或包含抗EGFRADC的制剂)可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括mTOR抑制剂，例如AP-23573、CCI-779、依维莫司、RAD-001、雷帕霉素、替西罗莫司、ATP竞争性TORC1/TORC2抑制剂，包括PI-103、PP242、PP30、Torin1等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括非类固醇抗炎药(NSAID)，例如(双水杨酯)、(二氟尼柳)、(布洛芬)、(酮洛芬)、(萘布美酮)、(吡罗昔康)、布洛芬乳膏、(萘普生)和(萘普生)、(双氯芬酸)、(吲哚美辛)、(舒林酸)、(托美汀)、(依托度酸)、(酮洛酸)、(奥沙普嗪)等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括PDGFR抑制剂，例如C-451、CP-673、CP-868596等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括铂化疗剂，例如顺铂、(奥沙利铂)依他铂、洛铂、奈达铂、(卡铂)、沙铂、吡铂等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括polo样激酶抑制剂，例如BI-2536等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)抑制剂，例如渥曼青霉素、LY294002、XL-147、CAL-120、ONC-21、AEZS-127、ETP-45658、PX-866、GDC-0941、BGT226、BEZ235、XL765等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括血小板反应蛋白类似物，例如ABT-510(血小板反应蛋白模拟物)、ABT-567、ABT-898(血小板反应蛋白-1模拟肽)、TSP-1等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括VEGFR抑制剂，例如(贝伐珠单抗)、ABT-869、AEE-788、ANGIOZYMETM(抑制血管生成的核酶(RibozymePharmaceuticals(Boulder,CO.)和Chiron,(Emeryville,CA))、阿西替尼(AG-13736)、AZD-2171、CP-547,632、IM-862、MACUGEN(pegaptamib)、(索拉非尼、BAY43-9006)、帕唑帕尼(GW-786034)、瓦他拉尼(PTK-787、ZK-222584)、(舒尼替尼、SU-11248)、VEGFtrap、ZACTIMATM(凡德他尼、ZD-6474)、GA101、奥法木单抗、ABT-806(mAb-806)、ErbB3特异性抗体、BSG2特异性抗体、DLL4特异性抗体和C-met特异性抗体等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括抗生素，例如嵌入抗生素阿柔比星、放线菌素D、氨柔比星、annamycin、阿霉素、(博来霉素)、道诺霉素、或(多柔比星脂质体)、依沙芦星、表柔比星、glarbuicin、(去甲氧柔红霉素)、丝裂霉素C、奈莫柔比星、新制癌菌素、培洛霉素、吡柔比星、蝴蝶霉素、stimalamer、链脲菌素、(戊柔比星)、净司他丁等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括拓扑异构酶抑制剂，例如阿柔比星、9-氨基喜树碱、氨萘非特、安吖啶、becatecarin、贝洛替康、BN-80915、(盐酸依立替康)、喜树碱、(右旋丙亚胺)、二氟替康、edotecarin、或(表柔比星)、依托泊苷、依沙替康、10-羟基喜树碱、吉马替康、勒托替康、米托蒽醌、orathecin、吡柔比星、匹克生琼、卢比替康、索布佐生、SN-38、tafluposide、托泊替康等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括治疗性抗体，例如(贝伐珠单抗)、CD40特异性抗体、chTNT-1/B、迪诺塞麦、(西妥昔单抗)、(扎木单抗)、IGF1R特异性抗体、林妥珠单抗、(依决洛单抗)、(WXG250)、(利妥昔单抗)、ticilimumab、曲妥珠单抗、I和II型CD20抗体等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括激素疗法，例如(阿那曲唑)、(依西美坦)、阿佐昔芬、(比卡鲁胺)、(西曲瑞克)、地加瑞克、地洛瑞林、(曲洛司坦)、地塞米松、(氟他胺)、(雷洛昔芬)、AFEMATM(法倔唑)、(托瑞米芬)、(氟维司群)、(来曲唑)、福美坦、糖皮质激素类、(度骨化醇)、(碳酸司维拉姆)、拉索昔芬、醋酸亮丙瑞林、(甲地孕酮)、(米非司酮)、NILANDRONTM(尼鲁米特)、(柠檬酸他莫昔芬)、PLENAXISTM(阿巴瑞克)、泼尼松、(非那司提)、rilostane、(布舍瑞林)、(促黄体素释放激素(LHRH))、(组氨瑞林植入物)、(曲洛司坦或modrastane)、(fosrelin、戈舍瑞林)等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括deltoid和维甲酸类，例如西奥骨化醇(EB1089、CB1093)、lexacalcitrol(KH1060)、芬维A胺、(aliretinoin)、(脂质体维A酸)、(贝沙罗汀)、LGD-1550等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括PARP抑制剂，例如ABT-888(维利帕尼)、奥拉帕尼、KU-59436、AZD-2281、AG-014699、BSI-201、BGP-15、INO-1001、ONO-2231等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括植物生物碱，例如但不限于长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括蛋白酶体抑制剂，例如(硼替佐米)、MG132、NPI-0052、PR-171等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括免疫剂。免疫剂的实例包括干扰素和其他免疫增强剂。干扰素包括干扰素α、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素β、干扰素γ-1a、(干扰素γ-1b)或干扰素γ-n1、它们的组合等。其他药剂包括(IFN-α)、BAM-002(氧化谷胱甘肽)、(他索纳明)、(托西莫单抗)、(阿仑单抗)、CTLA4(细胞毒性淋巴细胞抗原4)、氨烯咪胺、地尼白介素、依帕珠单抗、(来格司亭)、蘑菇多糖、白细胞α干扰素、咪喹莫特、MDX-010(抗-CTLA-4)、黑色素瘤疫苗、米妥莫单抗、莫拉司亭、MYLOTARGTM(吉妥珠单抗奥唑米星)、(非格司亭)、OncoVAC-CL、(奥戈伏单抗)、pemtumomab(Y-muHMFG1)、(sipuleucel-T)、沙格司亭、裂裥多糖、替西硫津、(卡介苗)、乌苯美司、(免疫治疗剂、LorusPharmaceuticals)、Z-100(SpecificSubstanceofMaruyama(SSM))、WF-10(十氧化四氯(Tetrachlorodecaoxide)(TCDO))、(阿地白介素)、(胸腺法新)、(达克珠单抗)、(90Y-替伊莫单抗)等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括生物反应调节剂，例如调节活生物体的防御机制或生物反应(如组织细胞的存活、生长或分化)以使它们具有抗肿瘤活性的试剂，包括云芝多糖、蘑菇多糖、西佐糖、溶链菌PF-3512676(CpG-8954)、乌苯美司等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括嘧啶类似物，例如阿糖胞苷(araC或阿拉伯糖苷C)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、脱氧氟尿苷、(氟达拉滨)、5-FU(5-氟尿嘧啶)、氟尿苷、(吉西他滨)、(雷替曲塞)、TROXATYLTM(三乙酰尿苷曲沙他滨)等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括嘌呤类似物，例如(硫鸟嘌呤)和(巯基嘌呤)。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括抗有丝分裂剂，例如batabulin、埃博霉素D(KOS-862)、N-(2-((4-羟苯基)氨基)吡啶-3-基)-4-甲氧基苯磺酰胺、伊沙匹隆(BMS247550)、紫杉醇、(多西他赛)、PNU100940(109881)、帕土匹龙、XRP-9881(拉洛他赛)、长春氟宁、ZK-EPO(合成埃博霉素)等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种试剂共施用以治疗癌症，包括泛素连接酶抑制剂，例如MDM2抑制剂如nutlin、NEDD8抑制剂如MLN4924等。
本发明的化合物还可用作提高放疗效力的放射增敏剂。放疗的实例包括外照射放疗、远距放射疗法、短距离放射治疗和密封、非密封源的放射治疗等。
抗EGFRADC可以与治疗有效量的一种或多种药剂共施用以治疗癌症，包括化疗剂例如ABRAXANETM(ABI-007)、ABT-100(法尼基转移酶抑制剂)、(Ad5CMV-p53疫苗)、或(洛伐他汀)、(聚I:聚C12U，一种合成RNA)、(依昔舒林)、(帕米膦酸)、arglabin、L-天冬酰胺酶、阿他美坦(1-甲基-3,17-二酮-雄甾-1,4-二烯)、(他扎罗汀)、AVE-8062(考布他汀衍生物)BEC2(米妥莫单抗)、恶病质素或cachexin(肿瘤坏死因子)、卡伐辛(疫苗)、(癌症疫苗)、(西莫白介素)、(二盐酸组胺)、(人乳头状瘤病毒疫苗)、(C:(环磷酰胺)；H:(羟基阿霉素)；O:长春新碱()；P:泼尼松)、CYPATTM(醋酸环丙孕酮)、考布他汀A4P、DAB(389)EGF(通过His-Ala接头与人表皮生长因子融合的白喉毒素的催化和易位结构域)或TransMID-107RTM(白喉毒素)、氮烯唑胺、更生霉素、5,6-二甲基呫吨酮-4-醋酸(DMXAA)、恩尿嘧啶、EVIZONTM(角鲨胺乳酸盐)、(T4N5脂质体洗剂)、圆皮海绵内酯、DX-8951f(依沙替康甲磺酸酯)、enzastaurin、EPO906(埃博霉素B),、(四价人乳头状瘤病毒(6、11、16、18型)重组疫苗)、 GMK(神经节苷脂结合疫苗)、(前列腺癌疫苗)、哈洛夫酮、组氨瑞林、羟基脲、伊班膦酸、IGN-101、IL-13-PE38、IL-13-PE38QQR(cintredekinbesudotox)、IL-13-假单胞菌外毒素、干扰素-α、干扰素-γ、JUNOVANTM或MEPACTTM(米伐木肽)、洛那法尼、5,10-亚甲基四氢叶酸、米替福新(十六烷胆碱磷酸)、(AE-941)、(三甲曲沙葡萄糖醛酸)、(喷司他丁)、(核糖核酸酶)、(黑色素瘤疫苗治疗)、(IL-2疫苗)、ORATHECINTM(卢比替康)、(基于抗体的细胞药物)、MAb(鼠单克隆抗体)、紫杉醇、PANDIMEXTM(来自人参的包含20(S)原人参萜二醇(aPPD)和20(S)原人参萜三醇(aPPT)的糖苷皂苷)、帕尼单抗、(研究性癌症疫苗)、培加帕酶、PEG干扰素A、苯妥帝尔(phenoxodiol)、普鲁苄肼、瑞马司他、(卡妥索单抗)、(来那度胺)、RSR13(乙丙昔罗)、LA(兰乐肽)、(阿昔曲丁)、十字孢碱(星形孢子链霉菌)、talabostat(PT100)、(贝沙罗汀)、(DHA-紫杉醇)、(canfosfamide、TLK286)、temilifene、(替莫唑胺)、替米利芬、沙利度胺、(STn-KLH)、thymitaq(2-氨基-3,4-二氢-6-甲基-4-氧代-5-(4-吡啶硫代)喹唑啉酮二盐酸盐)、TNFERADETM(腺病毒载体:包含肿瘤坏死因子-α的基因的DNA载体)、或(波生坦)、维A酸(维-A)、粉防乙碱、(三氧化二砷)、ukrain(来自高等白屈菜植物的生物碱的衍生物)、vitaxin(抗αβ3抗体)、(莫特沙芬钆)、XINLAYTM(阿曲生坦)、XYOTAXTM(聚谷氨酸紫杉醇)、(曲贝替定)、ZD-6126、(右丙亚胺)、(唑来膦酸)、佐柔比星等。
在一个实施方案中，与辐射和/或(替莫唑胺)联合向患有胶质母细胞瘤的受试者静脉内施用包含抗EGF-ADC的制剂。
此外，在一个实施方案中，本发明的组合物可以作为包含以下的药物试剂盒提供：(a)包含冻干形式的抗EGFRADC的容器和(b)包含药学上可接受的注射用稀释剂(如，无菌水)的第二容器。药学上可接受的稀释剂可用于重构或稀释冻干的ADC。任选与这些容器结合的可以是以管理医药或生物制品的生产、使用或销售的政府部门规定的形式的通告，该通告反映管理生产、使用或销售的部门对于向人施用的批准。
本发明进一步在以下实施例中描述，该实施例不意图限制本发明的范围。
实施例
实施例1：阿里他汀vc-MMAE与抗-EGFR抗体1的偶联
以下实施例描述了抗体与阿里他汀的偶联以形成抗体药物偶联物(ADC)，特别是MMAE与抗-EGFR抗体1的偶联。具有降低的每抗体vc-MMAE分子药物载量的抗体1ADC的产生包括mAb的部分还原，之后与Val-Cit-MMAE(vcMMAE)反应以完成偶联，如以下详细描述的。
抗体的二硫键还原
抗体1的还原使用TCEP(三羧酸乙基膦)实现。重组单克隆抗体1通过转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系产生并在AbbottBioresearchCenter(Worcester,MA)纯化。在抗体纯化后，抗体溶液(148mg/mL,6mL)载入50mL聚丙烯离心管中。抗体溶液然后通过添加PBSE缓冲液(360mL；125mMK2HPO4,150mMNaCl；6.3mMEDTA,pH7.7)稀释到41mL的总体积。蛋白质含量是21.6mg/ml，如通过A280测定的。19ml的抗体溶液载入反应器中到总共410.6mg。抗体溶液升温到37℃。然后抗体1(20mg/mL)通过添加TCEP(SigmaAldrichFineChemical(St.Louis,MO))到抗体溶液中部分地还原。具体地，9.67mMTCEP溶液(0.592mL,2.05当量)添加到抗体溶液(TCEP:mAb的摩尔当量为2.05)。在添加TCEP后，抗体溶液在37℃下孵育1小时。然后还原反应冷冻到20℃。这一过程导致抗体1的二硫键还原。
MMAE和抗体1的偶联
以下描述了MMAE与示例性抗体1在抗体还原后偶联的过程。
为偶联抗体1的巯基，Val-Cit-MMAE(vc-MMAE)，Val-Cit(对-氨基苄基氨基甲酸酯-单甲基阿里他汀E；SigmaAldrichFineChemical(St.Louis,MO))添加到抗体溶液中达到1.15的最终vc-MMAE:还原半胱氨酸(Cys)摩尔比。偶联反应在10％v/v的DMSO(二甲亚砜；SigmaAldrichFineChemical(St.Louis,MO))存在下进行，并允许在20℃下继续进行45分钟。
在偶联反应后，添加过量的游离N(乙酰基)-半胱氨酸(SigmaAldrichFineChemical(St.Louis,MO)(2.3当量vs.vcMMAE装料)以淬灭未反应的vc-MMAE而产生N(乙酰基)-Cys-vc-MMAE。N(乙酰基)-Cys淬灭反应允许在20℃下继续进行大约30分钟。淬灭的反应混合物(也称为粗溶液)然后纯化，如以下实施例2中描述的。
或者，以下方案也用于较小规模的反应。偶联通过载入10mMvcMMAEDMSO溶液(1.32mL,4.72当量)进行。载入DMSO(0.86mL)。反应混合物然后在环境温度下搅拌1小时。过量药物接头通过添加50mMN-(乙酰基)半胱氨酸(0.53mL)淬灭。混合物然后搅拌约15分钟。反应混合物然后储存在冰箱中。
反应混合物的分析型分析
进行反应混合物的分析型分析。上清液样品的分析通过疏水相互作用色谱-高效液相(HIC-HPLC)使用TSKgelButyl-NPR柱(4.6mmIDx3.5cm,2.5um；TosohBioscienceLLC,Japan))完成。
蛋白质含量的UV分析显示386.4mg的蛋白质。HIC痕量分析显示抗体1-vcMMAE的平均药物-抗体比率(DAR)是3.85，如以下表1中描述的。平均DAR通过将PA％(PA％是如通过A280峰下测量的面积测定的峰面积百分比)乘以需要的药物载量的2、4、6和8ADC的积相加并除以100确定，例如，[(6.3PA％x0)+(24.8PA％x2)+(34.8x4)+(20.9x6)+(8.8x8)]/100＝3.85。
表1：反应混合物的HIC痕量分析
如表1中所述，偶联反应产生具有药物载量范围(即，2-8的DAR)的ADC种类的混合物。小百分比的ADC没有表1中描述的药物载量。
实施例2：抗体药物偶联物(ADC)使用疏水性树脂的批纯化
以下实施例描述ADC(抗体1-vc-MMAE)的批纯化，其中所得的纯化组合物具有2.8的平均DAR。以下纯化过程选择性地除去较高载量的ADC，即六和八的载药种类，从而产生包含较低等级载药种类(即2-4的DAR)的纯化的分布。纯化过程利用少量的疏水性树脂，其可以滴定到粗抗体溶液(或混合物)中以选择性地除去具有不同偶联水平的ADC。
纯化过程提供实用的、可放大的方法以选择性地调节由部分链间二硫键还原和随后用vc-MMAE和mc-MMAF的烷基化获得的阿里他汀E和阿里他汀F偶联物的分布。以下描述的纯化方法在毫克至多克规模上以分批方式或循环方式证明以86％产率提供纯化的分布。抗体还原、偶联和纯化过程的概述描述于图1中。
材料和方法
本文描述的缓冲液如下制备：
缓冲液A(50mMK2HPO4缓冲剂pH7缓冲液/2MNaCl)通过载入K2HPO4(0.87g)(K2HPO4；FisherScientific)和NaCl(11.7g)(NaCl；EMD)，用WIFI稀释到大约90mL制备。所得的溶液用1.0NHCl处理到最终pH7.0和进一步稀释到100mL的总体积。
缓冲液A’(50mMK2HPO4/4MNaCl)通过载入NaCl(2.92g)到烧瓶中，之后载入流动相A以实现25mL的最终体积而制备。
缓冲液B(50mMK2HPO4缓冲剂pH7缓冲液)通过载入K2HPO4(0.87g)和NaCl(11.7g)，用WIFI(注射用水；Gibco)稀释到大约90mL制备。所得的溶液用1.0NHCl(1.0NHCl；JTBaker)处理到最终pH7.0和进一步稀释到100mL的总体积。
预处理的丁基-HIC(Bu-HIC)树脂通过简短地混合ToyoPearlButyl-600MResin浆(ToyoPearlBu-HICResin(600M)；TosohBioscience)的散装容器制备，倒入(1克)到粗聚丙烯过滤器中。浆料过滤并用缓冲液A(3x2mL)清洗。湿滤饼通过使过滤的氮气经过湿滤饼10分钟或直到不再有液滴在粗漏斗的底部观察到而进行干燥。干重基础通过减去湿滤饼上存在的水量来计算。水分的量通过KarlFisher分析测量(通常包含55％的水)。
滴定筛选研究以确定DAR2-4的ADC的条件
进行固相滴定研究以确定用于除去DAR为6-8的ADC的条件。上清液样品的分析通过疏水相互作用色谱-高效液相(HIC-HPLC)使用TSKgelButyl-NPR柱(4.6mmIDx3.5cm,2.5um；TosohBioscienceLLC,Japan))完成。该方法由12分钟内从100％缓冲液A[25mM磷酸钠，1.5M(NH4)2SO4,pH7.0]至100％缓冲液B[75％v/v25mmol/L磷酸钠(pH7.0)，25％v/v异丙醇]的线性梯度组成。流速设定为0.8mL/min，注射30uL，温度设定为30℃，且检测在280nm下进行。
HIC-HPLC分析的样品制备
样品通过经5um注射器式滤器过滤掉反应混合物浆来制备。滤液用缓冲液A(30uL/注射)5倍稀释。
各自用不同量的树脂测试八种条件(试验-Bu-0、Bu-1、Bu-2、Bu-4、Bu-8、Bu-16、Bu-32和放大)。试验-Bu-0通过载入100uL的粗抗体1-vcMMAE反应溶液(实施例1)(18mg/mL)到小瓶中进行。添加缓冲液A’(100uL)，接着添加100uL缓冲液B。溶液然后在最低设定(行星式混合器)上振摇。上清液的样品在20分钟时获取。上清液采样并按照HIC-HPLC测量。具体地，样品制备通过除去30uL的上清液，用120uL缓冲液A稀释和通过HIC-HPLC测量含量而进行。参见表5对分布的总结。
试验-Bu-1至Bu-32全部是试验-Bu-0的变型，试验-Bu-0不包含任何疏水相互作用树脂并且是对照。试验-Bu-1与试验-Bu-0相同，除了0.8mg的预条件化的n-BuHIC600M树脂在添加缓冲液B之前添加到溶液中。试验-Bu-2与试验-Bu-0相同，除了1.6mg的预条件化的n-BuHIC600M树脂在添加缓冲液B之前添加。试验-Bu-4与试验-Bu-0相同，除了3.2mg的预条件化的n-BuHIC600M树脂在添加缓冲液B之前添加。试验-Bu-8与试验-Bu-0相同，除了6.4mg的预条件化的n-BuHIC600M树脂在添加缓冲液B之前添加。试验-Bu-16与试验-Bu-0相同，除了12.8mg的预条件化的n-BuHIC600M树脂在添加缓冲液B之前添加。试验-Bu-32与试验-Bu-0相同，除了25.6mg的预条件化的n-BuHIC600M树脂在添加缓冲液B之前添加。对于这些试验中的各试验，最终NaCl浓度是1.3MNaCl。八个条件的结果总结在以下表2-5中。
表2提供各种ADC种类(例如，单独抗体/未偶联的(％mAb)、DAR为2的ADC(％2载量)、DAR为4的ADC(％4载量)等)的分布的总结。表2中描述的载量-蛋白质比率表示树脂干重vs.计算的抗体蛋白质重量。ADC重量通过将如在280nm下使用UV吸收测定的总蛋白质含量乘以载药种类的峰面积％计算。如表2中描述的，树脂载量:蛋白质比率影响具有特定DAR的ADC的％。例如，1.8的树脂加载量vs.总蛋白质(或5.9倍重量的树脂相对于6-8载量；参见表2的“试验-Bu-4”行)产生94％纯度的2或4载药种类(各47％)且没有可检测水平的DAR为6或8的ADC，如通过HIC-HPLC测定的。表3描述了对于表2中描述的各试验添加的Bu-HIC树脂的量，而表4描述了筛选中存在的载药种类净重的计算。
表2：通过HIC-HPLC测量的分布的总结
*以>24小时的保留时间测量的，添加有1体积％的IPA。
表3：Bu-HIC树脂的加载量
*(树脂的水含量＝55％)；**基于280nm蛋白质浓度和每小瓶递送的体积。
表4：筛选中存在的载药种类湿重的计算
*奇数种类未包括；**1.8mg总蛋白/小瓶。
以上分析型HIC结果证明减少特定载药种类(例如，DAR为6-8的ADC)的存在的足够选择性。来自表2的5的数据表明在～1.3MNaCl浓度的最终离子强度或其等同离子强度存在下，8-载药种类的减少主要可以通过利用0.5wt(特别地0.44％wt)树脂加载量实现；6/8的载药种类的减少可以通过向粗偶联反应混合物添加约两倍重量的疏水性树脂实现。4-8的载药种类主要可以通过使用～3.5倍重量的树脂(相对于总蛋白(参见表5的“试验-Bu-8”行))除去且2-8的载药种类可以通过使用相对于总蛋白的～7倍重量的树脂(参见表5的“试验-Bu-16”行)除去。这些数据也表明基于干重的4倍重量加载量或2倍重量加载(相对于总蛋白)在除去高药物载量方面是选择性的，具有2或4的载药种类的最小损耗。
计算树脂加载量与待减少的种类的重量比并总结在表5中。
分析型HIC研究结果的总结提供在表5中。
表5：载药种类*vs.树脂加载的总结
*参见表3的载药种类的计算
**下划线的值表示树脂加载量的近似量，其中6/8种类的量小于2％(如表2中所示的)。
总结
总之，实施例1获得的反应混合物用缓冲液A’(4NNaCl,0.05MpH7K2HPO4磷酸盐缓冲液,1mL/mL偶联反应混合物)稀释。稀释的反应混合物用计算量的预处理Bu-HIC树脂处理，通过粗聚丙烯过滤器过滤并用缓冲液B(0.05MpH7K2HPO4磷酸盐缓冲液,1mL/mL偶联反应混合物)稀释。计算量的树脂(如表5中所示)取决于待从粗混合物除去的载药种类。例如，约5-10倍于6和8的载药种类重量的树脂重量证明对于从粗混合物除去这些种类是有效的。树脂/稀释的反应混合物搅拌适当时间并通过分析型疏水相互作用色谱监测指定药物偶联物产物的减少。
实施例3：分批疏水相互作用ADC纯化的放大
从滴定筛选确定的用于除去高DARADC的最佳条件放大到较大规模的纯化。
为了首先还原抗体，包含抗体1(151mg/mL,50mL,7.52g)的溶液添加到500mL烧瓶中。溶液通过添加经混合pH6,15mM组氨酸缓冲液(30mL)和PBSE缓冲液(360mL；125mMK2HPO4,150mMNaCl；6.3mMEDTA,pH7.7)制备的溶液稀释到395mL的总体积。所得的抗体溶液升温到37℃。10.98mMTCEP溶液(12.1mL,2.05当量)然后添加到溶液中，其搅拌30分钟。抗体溶液然后经20分钟冷却到环境温度。
一旦还原，抗体1通过添加10mMvcMMAEDMSO溶液(28.8mL,4.72当量)到抗体溶液中与vcMMAE偶联。接着添加DMSO(21.2mL)，此时溶液在环境温度下搅拌45分钟。过量药物接头通过添加50mMN-乙酰基半胱氨酸(9.7mL)淬灭。溶液搅拌约15分钟。抗体1与vcMMAE偶联后，UV蛋白质浓度测定为7.4g蛋白质，且HIC分析显示4.1的DAR(约25PA％(或1.85g)的综合的6-8的载药种类)。
粗反应混合物然后用相同体积的4NNaCl/0.05MpH7K2HPO4缓冲液稀释。然后添加30.7g预洗涤BuHIC湿树脂(KF＝56wt％水；基于干重的净17.2g树脂；2.3倍重量树脂vs总蛋白；9.3倍重量树脂vs6-8的载药种类)，接着添加50mMKH2PO4pH7缓冲液(460mL)。抗体树脂溶液在室温下温和搅拌3小时。或者，溶液在冰箱中储存12小时，且随后再搅拌2.5小时。
树脂然后通过粗聚丙烯过滤器过滤掉。澄清滤液倒入新容器中。测定1469g的重量(密度＝1.06g/mL)。纯化的ADC溶液的分析型分析显示溶液具有3.7mg/ml的UV蛋白质含量或5.07g的总蛋白(67％总产率)。HIC痕量分析显示2.8的DAR。
显示抗体溶液在纯化前后HIC-HPLC的重叠的曲线图提供在图2中。图2中的两个较晚洗脱峰表示具有6-8的DAR的ADC(保留时间：分别8.6分钟和9.6分钟)。这些峰在纯化后缺失，表明0、2和4DAR的ADC种类未受影响且这一纯化过程在仅除去高(例如6-8)DAR的ADC种类方面是选择性的。
UF/DF(浓缩和最终的缓冲液交换)
在纯化后，纯化的ADC溶液进行超滤/透析(UF/DF)和最终的缓冲液交换。滤液添加到UF/DF储室，浓缩溶液到～50mg/mL并在PallCentramateOmega30KLV1部件OS030C12P1序列号31061058R上以～25psi的跨膜压力和80-100mL/分钟的蠕动泵速度(大约1小时来浓缩)除去1400g。在浓缩到～50mg/mL后，运行10DV的15mMpH6.0组氨酸缓冲液。排空UF/DF系统并随后用15mMpH6.0组氨酸缓冲液(2x20mL)冲洗。浓度测定为(127g溶液)40.1mg/mL。用15mM组氨酸pH6.0缓冲液稀释到35.1mg/mL(141gBDS)的浓度。BDS通过0.45微米注射器式过滤器过滤，接着进行0.2微米无菌过滤。滤液以每个100mg载入12个小瓶和Falcon管(3x35mL)中。
以上UF/DF处理可以在批纯化过程之前或之后使用。
在单独的试验中，2克的预处理ToyopearlButyl-600MHIC树脂(TosohBioscience,Japan)/1克的mAb进一步用0.05MpH7K2HPO4磷酸盐缓冲液稀释和在环境下搅拌6小时。浆液通过粗聚丙烯过滤器过滤并用缓冲液A洗涤(2个湿滤饼床体积)。所得滤液和洗液合并和通过透析缓冲液交换到0.015MpH6组氨酸缓冲液中以提供称为抗体1-vcMMAEp的纯化的抗体1-Val-Cit-MMAE。在这一实施例中，总产率是67％的抗体1-vcMMAEp。基于粗反应混合物中0-4的载药种类的量，纯化产率是87％。
实施例4：抗-EGFR抗体1/mc-MMAFADC的制备
以下实施例描述抗-EGFR抗体1mc-MMAFADC的制备。
抗-EGFR抗体1的抗原
在抗体纯化后，抗体溶液(151mg/mL,86mL)载入1L烧瓶中。抗体溶液然后通过添加PBSE缓冲液(600mL；125mMK2HPO4,150mMNaCl；6.3mMEDTA,pH7.7)和15mM组氨酸缓冲液(43mL,pH6)稀释到729mL的总体积。蛋白质含量如通过UV光谱学(A280)测定的为20.0mg/ml。包含抗体1的溶液加热到37℃。9.67mMTCEP溶液(0.592mL,2.05当量)然后在搅拌下添加到抗体1的溶液30分钟。反应随后经20分钟冷却到环境温度。
mcMMAF与抗-EGFR抗体1的偶联
抗-EGFR抗体1随后与马来酰亚胺基己酰基-MMAF(抗体1-mcMMAF)偶联。载入10mMmcMMAF/DMSO(38mL,4.72当量)。载入DMSO(18.6mL)。在环境温度下搅拌1小时。过量mc-MMAF通过添加100mMN-乙酰基半胱氨酸(7.6mL)和搅拌15分钟淬灭。淬灭的反应置于冰箱中。
粗抗体1-mcMMAF反应混合物的分析
分析反应混合物以测定蛋白质浓度。UV光谱(A280)显示17.7mg/mL的蛋白质浓度。所得HIC痕量的分析揭示3.93的DAR(表6)。平均DAR通过将PA％乘以需要的药物载量的2、4、6和8ADC的积的相加并除以100确定，例如，[(5.72PA％x0)+(27.27PA％x2)+(41.08x4)+(16.79x6)+(9.13x8)]/100＝3.93。
表6：抗体1-mc-MMAF反应混合物的HIC痕量分析
DAR PA％ 药物载量
0 5.72 0
2 27.27 49.680
4 41.08 139.360
6 16.79 125.520
8 9.13 70.320
平均DAR* 3.93
*药物载量当量的总和/100
如表6中所述，偶联反应产生具有一定范围药物载量(即，2-8的DAR)的ADC种类的混合物。小百分比的ADC不具有如表6中所述的药物载量。
UF/DF(浓缩和最终缓冲液交换)
纯化的ADC溶液进行超滤/透析(UF/DF)和最终缓冲液交换。切向流过滤在MilliporeBiomaxPellicon388cm2膜上进行。样品以20psi(TMP)和40mL/min横向流浓缩到100mg/mL。蛋白质随后通过以40mL/min的速率在大约20psi(TMP)下进行10DV使用15mM组氨酸缓冲液(pH6)稀释到60mg/mL的浓度。所得溶液通过0.45μmMillipak20过滤器(Millipore)过滤。蛋白质浓度通过UV光谱(A280)测定为59.7mg/mL。UF/DF纯化的本体mc-MMAF抗体1溶液的58.6mL样品随后用15mM组氨酸缓冲液(pH6.0)稀释到100mL最终体积。如通过UV光谱测定的浓度为35.7mg/mL。蛋白质溶液然后通过0.2μmMillipak20过滤器(Millipore)过滤到无菌的125mlPETG瓶中。纯化的mc-MMAF抗体1溶液在-80℃低温冷冻器中冷冻和储存。
实施例5：使用疏水性树脂的mc-MMAFADC批纯化
来自实施例4的纯化的抗体1-mc-MMAF进行树脂处理纯化筛选。筛选通过改变总树脂加载量(0.5、1、2和3wt；纯化的抗体1-mc-MMAF从9.5mg/mL变为34mg/mL)、NaCl浓度(0N、0.65N、1.3N)和保留时间(0.5小时、4小时和20小时)进行。表7提供各种ADC种类的分布随树脂加载量、NaCl浓度和保留时间变化的总结。DAR值通过如上所述的HIC痕量的分析测定。计算的产率通过UV光谱测定并总结在表8中。
表7：如通过HIC-HPLC测量的分布的总结
表7中的粗体表示除去的6-载体种类<3PA％(峰面积％)的条件；8-载体种类在这些实验条件下是不可检测的。“T0”是指0分钟的保留时间(即没有树脂的对照实验)；“M30”是指0.5小时的保留时间；“H4”是指4小时的保留时间；“H20”是指20小时的保留时间。
表8：随树脂处理纯化筛选变化的UV抗体1-mc-MMAF浓度结果
总之，进行表7和8中所述的树脂滴定筛选以确定树脂加载量、NaCl浓度和保留时间对从实施例4中UF/DF纯化的抗体1-mc-MMAFADC获得的纯化过程(DAR，蛋白质浓度)的影响。如表7中显示的计算的树脂量取决于待从粗分布除去的载药种类。如下所述测试使用来自实施例4的抗体1-mcMMAF的一系列反应条件(参见表7和8)。缓冲液A包含以下：4.35gK2HPO4；58.5gNaCl；495mL水(WFI)；pH用5mL1NHCl调节到7.0。
反应1：0NNaCl；无树脂：
1)载入抗体1-mcMMAF(1.00mL,35mg)到4mL小瓶中
2)载入0mgBu-HIC树脂
3)振摇
4)在0.5、4和20小时吸取上清液样品(通过注射器式过滤器移除50μL，用2NNaCl/0.05MK2HPO4pH7缓冲液(缓冲液A)稀释20μL的这一上清液样品以提供1/50x)。
5)分析UV蛋白质浓度并进行HIC分析。
反应2：0NNaCl；0.5wt树脂：
1)载入抗体1-mcMMAF(1.00mL,35mg)到4mL小瓶中
2)载入17.5mgBu-HIC树脂
3)振摇
4)在0.5、4和20小时吸取上清液样品(通过注射器式过滤器移除50μL，用2NNaCl/0.05MK2HPO4pH7缓冲液(缓冲液A)稀释20μL的这一上清液样品以提供1/50x)。
5)分析UV蛋白质浓度并进行HIC分析。
反应3：0NNaCl；1wt树脂：
1)载入抗体1-mcMMAF(1.00mL,35mg)到4mL小瓶中
2)载入350mgBu-HIC树脂
3)振摇
4)在0.5、4和20小时吸取上清液样品(通过注射器式过滤器移除50μL，用2NNaCl/0.05MK2HPO4pH7缓冲液(缓冲液A)稀释20μL的这一上清液样品以提供1/50x)。
5)分析UV蛋白质浓度并进行HIC分析。
反应4：0NNaCl；2wt树脂：
1)载入抗体1-mcMMAF(1.00mL,35mg)到4mL小瓶中
2)载入70mgBu-HIC树脂
3)振摇
4)在0.5、4和20小时吸取上清液样品(通过注射器式过滤器移除50μL，用2NNaCl/0.05MK2HPO4pH7缓冲液(缓冲液A)稀释20μL的这一上清液样品以提供1/50x)。
5)分析UV蛋白质浓度并进行HIC分析。
反应5：0NNaCl；3wt树脂：
1)载入抗体1-mcMMAF(1.00mL,35mg)到4mL小瓶中
2)载入105mgBu-HIC树脂
3)振摇
4)在0.5、4和20小时吸取上清液样品(通过注射器式过滤器移除50μL，用2NNaCl/0.05MK2HPO4pH7缓冲液(缓冲液A)稀释20μL的这一上清液样品以提供1/50x)。
5)分析UV蛋白质浓度并进行HIC分析。
反应6：0.65NNaCl；无树脂：
1)载入抗体1-mcMMAF(1.00mL,35mg)到4mL小瓶中
2)载入0.195mL的4NNaCl/0.05MK2HPO4pH7缓冲液(缓冲液A')。
3)载入0mgBu-HIC树脂
4)振摇
5)在0.5、4和20小时吸取上清液样品(通过注射器式过滤器移除50μL，用2NNaCl/0.05MK2HPO4pH7缓冲液(缓冲液A)稀释20μL的这一上清液样品以提供1/50X)。
6)分析UV蛋白质浓度并进行HIC分析。
反应7：0.65NNaCl；0.5wt树脂：
1)载入抗体1-mcMMAF(1.00mL,35mg)到4mL小瓶中
2)载入0.195mL的4NNaCl/0.05MK2HPO4pH7缓冲液(缓冲液A')。
3)载入17.5mgBu-HIC树脂
4)振摇
5)在0.5、4和20小时吸取上清液样品(通过注射器式过滤器移除50μL，用2NNaCl/0.05MK2HPO4pH7缓冲液(缓冲液A)稀释20μL的这一上清液样品以提供1/50X)。
6)分析UV蛋白质浓度并进行HIC分析。
反应8：0.65NNaCl；1wt树脂：
1)载入抗体1-mcMMAF(1.00mL,35mg)到4mL小瓶中
2)载入0.195mL的4NNaCl/0.05MK2HPO4pH7缓冲液(缓冲液A')。
3)载入35mgBu-HIC树脂
4)振摇
5)在0.5、4和20小时吸取上清液样品(通过注射器式过滤器移除50μL，用2NNaCl/0.05MK2HPO4pH7缓冲液(缓冲液A)稀释20μL的这一上清液样品以提供1/50X)。
6)分析UV蛋白质浓度并进行HIC分析。
反应9：0.65NNaCl；2wt树脂：
1)载入抗体1-mcMMAF(1.00mL,35mg)到4mL小瓶中
2)载入0.195mL的4NNaCl/0.05MK2HPO4pH7缓冲液(缓冲液A')。
3)载入70mgBu-HIC树脂
4)振摇
5)在0.5、4和20小时吸取上清液样品(通过注射器式过滤器移除50μL，用2NNaCl/0.05MK2HPO4pH7缓冲液(缓冲液A)稀释20μL的这一上清液样品以提供1/50X)。
6)分析UV蛋白质浓度并进行HIC分析。
反应10：0.65NNaCl；3wt树脂：
1)载入抗体1-mcMMAF(1.00mL,35mg)到4mL小瓶中
2)载入0.195mL的4NNaCl/0.05MK2HPO4pH7缓冲液(缓冲液A')。
3)载入105mgBu-HIC树脂
4)振摇
5)在0.5、4和20小时吸取上清液样品(通过注射器式过滤器移除50μL，用2NNaCl/0.05MK2HPO4pH7缓冲液(缓冲液A)稀释20μL的这一上清液样品以提供1/50X)。
6)分析UV蛋白质浓度并进行HIC分析。
反应11：1.3NNaCl；无树脂：
1)载入抗体1-mcMMAF(1.00mL,35mg)到4mL小瓶中
2)载入0.48mL的4NNaCl/0.05MK2HPO4pH7缓冲液(缓冲液A')。
3)载入0mgBu-HIC树脂
4)振摇
5)在0.5、4和20小时吸取上清液样品(通过注射器式过滤器移除50μL，用2NNaCl/0.05MK2HPO4pH7缓冲液(缓冲液A)稀释20μL的这一上清液样品以提供1/50X)。
6)分析UV蛋白质浓度并进行HIC分析。
反应12：1.3NNaCl；0.5wt树脂：
1)载入抗体1-mcMMAF(1.00mL,35mg)到4mL小瓶中
2)载入0.48mL的4NNaCl/0.05MK2HPO4pH7缓冲液(缓冲液A')。
3)载入17.5mgBu-HIC树脂
4)振摇
5)在0.5、4和20小时吸取上清液样品(通过注射器式过滤器移除50μL，用2NNaCl/0.05MK2HPO4pH7缓冲液(缓冲液A)稀释20μL的这一上清液样品以提供1/50X)。
6)分析UV蛋白质浓度并进行HIC分析。
反应13：1.3NNaCl；1wt树脂：
1)载入抗体1-mcMMAF(1.00mL,35mg)到4mL小瓶中
2)载入0.48mL的4NNaCl/0.05MK2HPO4pH7缓冲液(缓冲液A')。
3)载入35mgBu-HIC树脂
4)振摇
5)在0.5、4和20小时吸取上清液样品(通过注射器式过滤器移除50μL，用2NNaCl/0.05MK2HPO4pH7缓冲液(缓冲液A)稀释20μL的这一上清液样品以提供1/50X)。
6)分析UV蛋白质浓度并进行HIC分析。
反应14：1.3NNaCl；2wt树脂：
1)载入抗体1-mcMMAF(1.00mL,35mg)到4mL小瓶中
2)载入0.48mL的4NNaCl/0.05MK2HPO4pH7缓冲液(缓冲液A')。
3)载入70mgBu-HIC树脂
4)振摇
5)在0.5、4和20小时吸取上清液样品(通过注射器式过滤器移除50μL，用2NNaCl/0.05MK2HPO4pH7缓冲液(缓冲液A)稀释20μL的这一上清液样品以提供1/50X)。
6)分析UV蛋白质浓度并进行HIC分析。
反应15：1.3NNaCl；3wt树脂：
1)载入抗体1-mcMMAF(1.00mL,35mg)到4mL小瓶中
2)载入0.48mL的4NNaCl/0.05MK2HPO4pH7缓冲液(缓冲液A')。
3)载入105mgBu-HIC树脂
4)振摇
5)在0.5、4和20小时吸取上清液样品(通过注射器式过滤器移除50μL，用2NNaCl/0.05MK2HPO4pH7缓冲液(缓冲液A)稀释20μL的这一上清液样品以提供1/50X)。
6)分析UV蛋白质浓度并进行HIC分析。
树脂制备和计算
树脂的KarlFischer(KF)滴定：
丁基＝72wt％水(28％效能)。注意：所有树脂加载量是基于干重。
干重树脂加载量的样品计算：35mg树脂加载量/0.28干重效能＝125mg湿树脂加载量。
一般，树脂的效能通过100％-来自KarlFisher分析的水w/w％计算。
实施例6：具有2.7、4和5.5的平均DAR的ADC混合物的纯化
以下实施例描述包含平均DAR2.7或更高载量平均DAR5.5的抗体1-vc-MMAE或抗体1-mc-MMAF的几种不同ADC混合物的批纯化。另外，也描述了包含平均DAR为4的抗体1-vcMMAE的ADC混合物。更具体地，进行筛选以确定树脂重量、NaCl浓度对具有不同量的6和8的载药种类的两种不同加载的ADC(抗体1-vc-MMAE和抗体1-mc-MMAF)作为纯化过程输入的纯化过程(DAR，蛋白质浓度)的影响。一系列反应条件如下所述进行测试。
实施例6中使用的五种粗ADC混合物(1-5)如下所述制备。四种粗ADC混合物(1)抗体1-vcMMAEDAR2.7(平均)、(2)抗体1-mcMMAFDAR2.7(平均)、(3)抗体1-vcMMAEDAR5.5(平均)和(4)抗体1-mcMMAFDAR5.5(平均)按照实施例1和图1中描述的方法制备，其中抗体1的还原使用TCEP(1.3或2.65摩尔当量)实现且偶联使用mc-MMAF或vcMMAE(3或6当量)任一实现，导致制备抗体-1-vcMMAEDAR2.7(平均)和5.5(平均)ADC混合物及抗体-1-mcMMAFDAR2.7(平均)和5.5(平均)ADC混合物。另外，第五粗ADC混合物(5)抗体1-vcMMAEDAR4(平均)按照实施例1制备。
按照以下方案进行筛选程序。首先，相应量的湿Bu-HIC树脂(在材料和方法节中如实施例2中所述典型地制备)称重到4mL小瓶中。树脂的量是基于少量计算。首先，需要的干树脂的量是基于6和8的载药种类的质量。质量如下基于粗ADC起始材料溶液计算：
待除去种类的质量：
Σ(6载量+8载量d),mg＝20mg粗ADC(1-5)x(Σ(6载量pa％+8载量pa％))/100
例如对于小瓶13：
Σ(6载量+8载量),mg＝20mgmAbx(10.7/100)＝2.14mgΣ(6载量+8载量)
接着，6载量和8载量的总质量乘以树脂的目标重量。例如对于小瓶13：
5倍重量的树脂＝5x2.14mgΣ(6载量+8载量)＝10.7mg干树脂
7.5倍重量的树脂＝7.5x2.14mgΣ(6载量+8载量)＝16.1mg干树脂
10倍重量的树脂＝10x2.14mgΣ(6载量+8载量)＝21.4mg干树脂
最后，树脂对于水、氯化钠和K2HPO4含量进行校正。进行无机盐校正，因为树脂预先通过过滤分离并用1.95MNaCl/0.05MK2HPO4溶液洗涤。(Bu-HIC树脂进行过滤并用1.95MNaCl/0.05MK2HPO4溶液多次洗涤。树脂的水分含量通过KF(KarlFisher水分滴定)分析测定为59.0w/w％。洗液成分的w/w％浓度(10.6w/w％NaCl,0.8w/w％K2HPO4,88.6％水)然后用于估计湿树脂中NaCl和K2HPO4的质量(51.8g湿树脂,30.6g水,3.6gNaCl和0.3gK2HPO4)，其然后被减去以计算干树脂量(17.3g)。)
例如对于5倍重量干树脂的小瓶13：
10.7mg干树脂/(0.334mg干树脂/mg湿树脂)＝32.0mg湿树脂
在添加Bu-HIC树脂后，粗ADC混合物(1-5)(1.1-1.2mL,20mg)载入4mL小瓶中。粗ADC溶液的体积调节到目标的20mg总蛋白。
接着，制备一定范围的氯化钠溶液。0.55-0.6mL(大约1/2的ADC溶液体积)的相应摩尔浓度的氯化钠溶液/50mMK2PO4/pH7载入各个小瓶中。NaCl溶液的初始浓度在pH7的50mMK2HPO4恒定浓度下是0M、1.95M、3.9M和5.85M。在添加到ADC溶液后，NaCl浓度由于稀释而降低到0、0.65、1.3和1.95MNaCl。小瓶内容物(DAR2.5或5.5的ADC+各种浓度的盐溶液)然后振摇过夜(大约20hr)。
搅拌过夜(>20小时)后，获取上清液样品(通过注射器式过滤器除去0.6mL，用924μL1.95NNaCl/0.05MK2HPO4pH7缓冲液稀释75μL的这一上清液)。随后进行HPLC-HIC分析以测定各载药种类的PA％以及蛋白质回收率。该研究的结果显示在以下表9和10中。
表9：如通过HIC-HPLC测量的vc-MMAE的分布的总结
1奇数种类未包括
*蛋白质回收率通过HPLC使用UV在280nm下计算。
表10：通过HIC-HPLC测量的mc-MMAF分布的总结
*蛋白质回收率通过HPLC使用UV在280nm下计算。2奇数种类未包括。
总之，进行实施例6、表9和10中描述的树脂滴定筛选以确定树脂加载量和NaCl浓度对从具有2.7-5.5的DAR(平均)范围的粗抗体-1-mcMMAF和抗体-1-vcMMAEADC混合物(1)-(5)获得的纯化过程(DAR，蛋白质浓度)的影响。如表9和10中显示的计算树脂量取决于待从粗分布除去的载药种类。例如，大约5-10倍于6和8的载药种类重量的树脂重量证明对于从粗反应混合物除去这些种类是有效的。
实施例7：抗体1-vc-MMAE的批纯化和流过纯化
批纯化方法
按照实施例1中描述的方法完成ADC(即，抗体1-vc-MMAE)的粗分布的产生。
反应混合物然后用Bu-HIC树脂处理，该树脂预先用50mM磷酸钾,2MNaCl，和pH6.8的缓冲液洗涤。树脂/反应混合物随后搅拌，并通过分析型疏水相互作用色谱监测药物偶联物产物的移除(按照之前实施例中描述的方法)。描述抗体1-vc-MMAE的批纯化的这一另外实施例的结果描述于表11中。表11中所称的保留时间是化合物从分析型HPLC分析洗脱花费的时间。
表11：在纯化前(以下标记为“反应”)和纯化后(以下标记为 “纯化的”)反应混合物的峰面积％结果(PA％)
如表11中所描述的，抗体-1-vc-MMAE的批纯化产生相对于初始反应混合物的较低平均DAR。
流过纯化方法
或者，抗体1-vc-MMAE的纯化可以使用流过纯化方式进行。
流过纯化一般按照以下方法进行：制备两升批量的TosohBioscienceButyl600M树脂。树脂过滤到2L烧结漏斗中(注意漏斗已经预先用IPA洗涤并干燥)。过滤的树脂用2x2L的50mM磷酸钾,2MNaCl磷酸盐缓冲液，pH6.8洗涤。树脂效能通过KarlFisher湿度分析测定为27％(分析显示存在73w/w％的水平；注意在这一实施例中，适度量的无机残留物(NaCl和K2HPO4)不用于计算树脂效能)。
使用实施例1中描述的还原/偶联方法，用134.9g的抗体1开始。相对于实施例1中描述的方案的一个变化是使用2.15当量TCEP(其产生略高的平均DAR)。该过程产生33.8pa％的6-8的载药种类。因此45.6g的6-8的载药种类存在于粗反应混合物中。
使用5x加载量的疏水性树脂，需要228.5g干重疏水性树脂(即，45.6g的6-8的载药种类乘以5＝228.5g的效能调节的树脂)。以27％的树脂效能(注意：树脂效能通过100％-KarlFisher分析得到的水的w/w％计算)，856g湿重树脂等同于228.5克的效能调节的树脂(即，计算：228.5克效能调节的树脂/(27克干重树脂/100克湿树脂))＝需要的856g湿树脂)加载到4英寸x7英寸的不锈钢柱中。粗反应混合物然后使用35号Pharmed管道从树脂床上的无菌的20L酸瓶通过压力传感器和蠕动泵泵送并以185ml/min进入到第二个20L无菌酸瓶中。收集的滤液然后再次经树脂床泵送，收集在最终滤液中包含较低DAR种类的所需ADC混合物。使用的流过处理是双轮过程。
树脂床然后洗涤多次以除去残留的未结合较低DAR的种类而留下与树脂结合的高DAR的种类(药物载量6-8)。具体地，首先，树脂床用通过将600ml的50mM磷酸钾，2MNaCl用WFI稀释到1200ml制备的1200mL1NNaCl(95mS)进行洗涤。树脂床然后用通过将450ml的50mM磷酸钾，2MNaCl用WFI稀释到1200mL制备的1200ml0.75NNaCl(71mS)洗涤。第三洗涤使用通过将300ml的50mM磷酸钾，2MNaCl用900mlWFI稀释制备的1200mL0.5NNaCl(50mS)进行。第四洗涤使用通过将150ml的50mM磷酸钾，2MNaCl用WFI稀释到1200ml制备的1200mL0.25NNaCl(26mS)进行。来自树脂洗涤的滤液大部分收集并与来自上述流过处理的最终滤液合并，从而提供本体(即，最终滤液+洗液)。
值得注意的是，树脂床的洗涤是任选的，因为DAR为2-4的纯化ADC在如上所述的初始多轮过程后在最终滤液中获得。第一洗涤从洗涤提供大约10％的回收率，而随后洗涤产生约1-2％的回收率。
本体通过切向流过滤(TFF)浓缩到大约1200g浓缩的ADC溶液且随后与10透析体积(diavolume)的15mM组氨酸缓冲液，pH6交换以产生35mg/mL最终蛋白质浓度的所需抗体1-vc-MMAE的DAR0-4的种类(分离的81克，66％产率，91％回收率vsDAR0-4)。因此，流过纯化方法成功地分离DAR种类，即6-8的高载药种类，与低DAR的种类(下面在表12中更详细地描述)。
进行批纯化方式与流过纯化方式的比较(表12)。在两种情况中，树脂的加载量vs.蛋白质是5倍树脂重量vs.抗体1-vc-MMAE的DAR6-8的高载药种类质量。虽然存在单个种类相对量的轻微变异(由于流过试验实施例中使用的TCEP的略高当量)，两种方法除去较高DAR种类的效率是相当的。表12中“流过方法”栏中所指的材料包括来自流过方法的合并滤液和来自洗液的材料(统称为“本体”)。
表12.批方法vs流过方法的比较
总之，批纯化和流过纯化方法两者用于富集DAR为2-4的ADC。两种纯化方法均依赖于蛋白质(ADC)的重量(与高载药种类的部分偶联)与所使用树脂的加载量的比率，其中5-6倍于ADC混合物中6-8(6或更高)的载药种类重量的疏水性树脂重量产生实质上降低的DAR为6-8的ADC的水平。如表12中描述的，两种方法产生包含至少95％的DAR为4或更低的ADC的组合物或包含具有低于4％的6或更高的载药种类的ADC的组合物。
应理解本文描述的实施例和实施方案仅用于说明性目的且其各种改进和变化是本领域技术人员可以想到的和包括在所附权利要求的精神和范围内。本文中引用的所有公开、专利和专利申请为所有目的通过引用全文并入本文中。

Claims (50)

1.一种获得包含抗体药物偶联物(ADC)的组合物的方法，所述方法包括：
将包含4或更低的载药种类和6或更高的载药种类的ADC混合物与疏水性树脂接触，其中与所述ADC混合物接触的疏水性树脂的量足以允许所述6或更高的载药种类与所述树脂结合但不允许所述4或更低的载药种类显著结合；和
从所述ADC混合物移除所述疏水性树脂，使得获得所述包含ADC的组合物，
其中所述组合物包含少于15％的6或更高的载药种类，且
其中所述ADC包含与阿里他汀偶联的抗体。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含少于10％的所述6或更高的载药种类。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含5％或更少的所述6或更高的载药种类。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述疏水性树脂的重量是所述ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的3-12倍。
5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述疏水性树脂的重量是所述ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的4-8倍。
6.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述疏水性树脂的重量是所述ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的5-10倍。
7.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述疏水性树脂的重量是所述ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的6-12倍，且其中所述ADC混合物包含0-1N的NaCl或其等同离子强度。
8.如权利要求4所述的方法，其中所述疏水性树脂的重量是所述ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的3-6倍，且其中所述ADC混合物包含1-2N的NaCl或其等同离子强度。
9.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述疏水性树脂的重量是所述ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的3-7倍，且其中所述阿里他汀是单甲基阿里他汀E(MMAE)。
10.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述疏水性树脂的重量是所述ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的5-10倍，且其中所述阿里他汀是单甲基阿里他汀F(MMAF)。
11.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述疏水性树脂的重量是所述ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的3-7倍，且其中所述阿里他汀是单甲基阿里他汀E(MMAE)。
12.一种产生包含具有4.5或更低的平均抗体-药物比率(DAR)的ADC并包含少于15％的不希望的ADC的组合物的方法，所述方法包括：
将ADC混合物与疏水性树脂接触，其中与所述ADC混合物接触的疏水性树脂的量足以允许不希望的ADC结合；和
从所述ADC混合物移除所述疏水性树脂，使得产生具有4.5或更低的平均DAR并包含少于15％的不希望的ADC的组合物，
其中所述ADC包含与阿里他汀偶联的抗体。
13.如权利要求12所述的方法，其中具有4.5或更低的平均DAR的所述组合物包含少于10％的不希望的ADC。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述不希望的ADC是6和8的载药种类。
15.如权利要求12-14中任一项所述的方法，其中添加到所述ADC混合物的疏水性树脂的量是作为所述ADC混合物中不希望的ADC的重量的3-12倍的树脂重量。
16.如权利要求12-14中任一项所述的方法，其中添加到所述ADC混合物的疏水性树脂的量是作为所述ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的4-8倍的树脂重量。
17.如权利要求12-14中任一项所述的方法，其中添加到所述ADC混合物的疏水性树脂的量是作为所述ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的5-7倍的树脂重量。
18.如权利要求12-14中任一项所述的方法，其中所述疏水性树脂的重量是所述ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的6-12倍，且其中所述ADC混合物包含0-1N的NaCl或其等同离子强度。
19.如权利要求12-14中任一项所述的方法，其中所述疏水性树脂的重量是所述ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的3-6倍，且其中所述ADC混合物包含1-2N的NaCl或其等同离子强度。
20.如权利要求12-14中任一项所述的方法，其中所述疏水性树脂的重量是所述ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的3-7倍，且其中所述阿里他汀是单甲基阿里他汀E(MMAE)。
21.如权利要求12-14中任一项所述的方法，其中所述疏水性树脂的重量是所述ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的5-10倍，且其中所述阿里他汀是单甲基阿里他汀F(MMAF)。
22.如权利要求12-14中任一项所述的方法，其中所述疏水性树脂的重量是所述ADC混合物中6或更高的载药种类的重量的3-7倍，且其中所述阿里他汀是单甲基阿里他汀E(MMAE)。
23.如权利要求13-23中任一项所述的方法，其中所述组合物具有4或更低的平均DAR。
24.如权利要求13-23中任一项所述的方法，其中所述组合物具有3.5或更低的平均DAR。
25.如权利要求13-23中任一项所述的方法，其中所述组合物具有3或更低的平均DAR。
26.如权利要求13-23中任一项所述的方法，其中所述组合物具有2.5或更低的平均DAR。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述ADC混合物在超滤/透析处理后获得。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述疏水性树脂是丁基疏水性树脂。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其为分批处理、循环处理或流过处理。
30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述ADC包含抗表皮生长因子受体(EGFR)抗体。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述抗-EGFR抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含分别含有SEQIDNO：7、SEQIDNO：8和SEQIDNO：9所示的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3结构域，且所述重链可变区包含分别含有SEQIDNO：2、SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3结构域。
32.如权利要求30所述的方法，其中所述抗-EGFR抗体包含含有SEQIDNO：6所示的氨基酸序列的轻链可变区和含有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的重链可变区。
33.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述阿里他汀是单甲基阿里他汀E(MMAE)或单甲基阿里他汀F(MMAF)。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述MMAE通过缬氨酸-瓜氨酸(vc)接头与所述抗体偶联。
35.如权利要求33所述的方法，其中所述MMAF通过马来酰亚胺基己酰基(mc)接头与所述抗体偶联。
36.一种通过权利要求1-35任一项的方法获得的组合物。
37.一种治疗受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用权利要求36所述的组合物以治疗癌症。
38.一种包含ADC的组合物，其中存在的70％的ADC具有4或更低的载药种类，且其中所述ADC包含抗-EGFR抗体和阿里他汀。
39.如权利要求38所述的组合物，其中存在的75％的ADC具有4或更低的载药种类。
40.如权利要求38所述的组合物，其中存在的80％的ADC具有4或更低的载药种类。
41.如权利要求38所述的组合物，其中存在的85％的ADC具有4或更低的载药种类。
42.如权利要求38所述的组合物，其中存在的90％的ADC具有4或更低的载药种类。
43.如权利要求38所述的组合物，其中存在的95％的ADC具有4或更低的载药种类。
44.如权利要求38-43中任一项所述的组合物，其中所述抗-EGFR抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含分别含有SEQIDNO：7、SEQIDNO：8和SEQIDNO：9所示的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3结构域，且所述重链可变区包含分别含有SEQIDNO：2、SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3结构域。
45.如权利要求38-43中任一项所述的组合物，其中所述抗-EGFR抗体包含含有SEQIDNO：6所示的氨基酸序列的轻链可变区和含有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的重链可变区。
46.如权利要求38-45中任一项所述的组合物，其中所述阿里他汀是单甲基阿里他汀E(MMAE)或单甲基阿里他汀F(MMAF)。
47.如权利要求46所述的组合物，其中所述MMAE通过缬氨酸-瓜氨酸(vc)接头与所述抗体偶联。
48.如权利要求46所述的组合物，其中所述MMAF通过马来酰亚胺基己酰基(mc)接头与所述抗体偶联。
49.一种药物组合物，包含权利要求38-48任一项所述的组合物和药学上可接受的载体。
50.一种治疗受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用权利要求49所述的药物组合物以治疗癌症。
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