KR20150132864A - 항체 약물 접합체(adc) 정제 - Google Patents

항체 약물 접합체(adc) 정제 Download PDF

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마빈 로버트 리아나
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Abstract

본 발명은 특정한 약물 대 항체 비(DAR)를 갖는 항체 약물 접합체(ADC)를 갖는 조성물을 수득하는 방법을 제공한다. 6 이상의 약물 부하된 종들을 갖는 ADC를 갖는 ADC 혼합물의 정제 방법이 본 발명에 포함되며, 상기 방법은 상기 혼합물을 소수성 수지와 접촉시켜 6 이상의 약물 부하된 종들을 15% 미만으로 포함하는 조성물을 수득함에 의한 것이다. 본 발명은 또한, 존재하는 ADC의 70% 이상이 4 이하의 약물 부하된 종들을 갖고, ADC가 항-EGFR 항체 및 오리스타틴을 포함하는, 조성물을 제공한다.

Description

항체 약물 접합체(ADC) 정제{ANTIBODY DRUG CONJUGATE(ADC) PURIFICATION}
관련 출원
본 출원은 2013년 3월 15일자로 출원된 미국 가출원 제61/792,834호의 이익을 주장한다. 상기 언급된 우선권 서류의 내용은 이에 의해 이의 전문이 인용에 의해 포함된다.
항체 약물 접합체(ADC)는 최근에 뛰어난 임상 효과가 밝혀진 급성장하는 강력한 항암제 부류이다. ADC는 안정한 링커(linker)를 통해 항체에 부착된 세포독성제로 구성된다. 추정상, 세포 표면에서의 항원 결합, 세포내 섭취(endocytosis), 리소좀에의 트래픽킹(trafficking), ADC 변성, 적재 부하물(payload)의 방출, 세포 프로세싱(예를 들어, 유사분열)의 중단 및 아폽토시스를 포함하는 일련의 사건들에 의해, ADC는 세포-표면 단백질의 과발현을 갖는 암세포를 파괴할 수 있다. ADC는 단일클론 항체의 항원-유도 표적화 특성과 세포독성제의 강력한 항-종양 효과를 겸비한다. 예를 들어, 2011년에 ADCETRIS®(항-CD30 항체-MMAE ADC)가 불응성 호지킨 림프종 및 전신 역형성 림프종 치료용으로 규제 승인을 획득하였다.
고도의 약물 부하된 ADC의 유해 효과가 연구에 의해 입증되었다(문헌[Liu et al. (2010) Analy. Chem. 82:5219]). 더 높은 접합 수준의 이들 유해 효과는 응집물 형성의 경향이 증가함을 포함한다(문헌[King et al. (2002) J Med. Chem. 45:4336; Hollander et al. (2008) Bioconjugate Chem 19:358; Burke et al. (2009) Bioconjugate Chem 20:1242; 및 Zhao et al. (2011) J Med. Chem. 54:3606]).
다양한 방법들을 사용하여 ADC의 약물 부하를 조절하는 것이 시도되어 왔으며, 상기 방법들은 (i) 항체에 대해 약물-링커 중간체 또는 링커 시약의 몰 과량을 제한하는 것, (ii) 접합 반응 시간 또는 온도를 제한하는 것, 및 (iii) 시스테인 티올 변형을 위한 부분적 또는 제한적 환원 조건을 포함한다. 항체 상의 부착 지점의 수를 제한하는 환원 방법을 사용하여 항체 하나당 더 적은 수의 약물을 갖는 ADC를 달성하였지만(문헌[Alley et al. (2004) Proc Amer Assoc Cancer Res 45:Abst 627]), 최적의 약물 부하된 종들(species)을 제공할 수 있는 방법 및 조성물에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
발명의 개요
본 발명은 상이한 약물 부하물들을 갖는 항체 약물 접합체(ADC)의 효과적인 분리 방법 및 이러한 방법을 사용하여 수득되는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 더 높은 약물 부하 종들의 ADC가 제거된 조성물을 제공한다.
본 발명은, 하나의 양태에서, 항체 약물 접합체(ADC)를 포함하는 조성물을 수득하는 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 4 이하의 약물 부하된 종들 및 6 이상의 약물 부하된 종들을 포함하는 ADC 혼합물을 소수성 수지와 접촉시키는 단계(여기서, ADC 혼합물과 접촉되는 소수성 수지의 양은 6 이상의 약물 부하된 종들의 수지에의 결합을 허용하기에 충분하지만 4 이하의 약물 부하된 종들의 유의한 결합은 허용하지 않는다); 및 상기 소수성 수지를 상기 ADC 혼합물로부터 제거하여, ADC를 포함하는 조성물을 수득하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 조성물은 6 이상의 약물 부하된 종들을 15% 미만으로 포함하고, 상기 ADC는 오리스타틴에 접합된 항체를 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 조성물은 6 이상의 약물 부하된 종들을 10% 미만으로 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 조성물은 6 이상의 약물 부하된 종들을 5% 이하로 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 방법은 ADC 혼합물 중 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 3 내지 12배인 소수성 수지 중량을 사용함을 포함한다. 하나의 양태에서, 소수성 수지 중량은 ADC 혼합물 중 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 4 내지 8배이다. 추가의 양태에서, 소수성 수지 중량은 ADC 혼합물 중 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 5 내지 10배이다.
추가의 또 다른 양태에서, 소수성 수지 중량은 ADC 혼합물 중 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 6 내지 12배이고, 상기 ADC 혼합물은 0 내지 1N NaCl 또는 이의 등가 이온 강도를 포함한다. 추가의 양태에서, 소수성 수지 중량은 ADC 혼합물 중 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 3 내지 6배이고, 상기 ADC 혼합물은 1 내지 2N NaCl 또는 이의 등가 이온 강도를 포함한다. 추가의 또 다른 양태에서, 소수성 수지 중량은 ADC 혼합물 중 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 3 내지 7배이고, 오리스타틴은 모노메틸오리스타틴 E(MMAE)이다. 추가의 양태에서, 소수성 수지 중량은 ADC 혼합물 중 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 5 내지 10배이고, 오리스타틴은 모노메틸오리스타틴 F(MMAF)이다. 추가의 양태에서, 소수성 수지 중량은 ADC 혼합물 중 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 3 내지 7배이고, 오리스타틴은 모노메틸오리스타틴 E(MMAE)이다.
본 발명은 추가로, 4.5 이하의 평균 약물-대-항체 비(DAR: Drug-to-Antibody Ratio)를 갖는 ADC를 포함하고, 원치 않는 ADC를 15% 미만으로 포함하는 조성물의 제조 방법을 제공하고, 상기 방법은 ADC 혼합물을 소수성 수지와 접촉시키는 단계(여기서, ADC 혼합물과 접촉되는 소수성 수지의 양은 원치 않는 ADC의 결합을 허용하기에 충분하다); 및 상기 소수성 수지를 상기 ADC 혼합물로부터 제거하여, 4.5 이하의 평균 DAR을 갖고, 원치 않는 ADC를 15% 미만으로 포함하는 조성물을 생성하는 단계를 포함하고, 상기 ADC는 오리스타틴에 접합된 항체를 포함한다. 하나의 양태에서, 4 이하의 평균 DAR을 갖는 조성물은 원치 않는 ADC를 10% 미만으로 포함한다. 하나의 양태에서, 원치 않는 ADC들은 6 및 8의 약물 부하된 종들이다. 추가의 양태에서, 원치 않는 ADC들은 8의 약물 부하된 종들이다.
하나의 양태에서, ADC 혼합물에 첨가되는 소수성 수지의 양은 ADC 혼합물 중 원치 않는 ADC의 중량의 3 내지 12배인 수지 중량이다.
추가의 양태에서, ADC 혼합물에 첨가되는 소수성 수지의 양은 ADC 혼합물 중 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 4 내지 8배인 수지 중량이다. 추가의 또 다른 양태에서, ADC 혼합물에 첨가되는 소수성 수지의 양은 ADC 혼합물 중 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 5 내지 7배인 수지 중량이다. 추가의 양태에서, 소수성 수지 중량은 ADC 혼합물 중 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 6 내지 12배이고, ADC 혼합물은 0 내지 1N NaCl 또는 이의 등가 이온 강도를 포함한다. 하나의 양태에서, 소수성 수지 중량은 ADC 혼합물 중 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 3 내지 6배이고, ADC 혼합물은 1 내지 2N NaCl 또는 이의 등가 이온 강도를 포함한다. 또 다른 양태에서, 소수성 수지 중량은 ADC 혼합물 중 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 3 내지 7배이고, 오리스타틴은 모노메틸오리스타틴 E(MMAE)이다. 추가의 또 다른 양태에서, 소수성 수지 중량은 ADC 혼합물 중 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 5 내지 10배이고, 오리스타틴은 모노메틸오리스타틴 F(MMAF)이다. 다른 추가의 양태에서, 소수성 수지 중량은 ADC 혼합물 중 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 3 내지 7배이고, 오리스타틴은 모노메틸오리스타틴 E(MMAE)이다. 하나의 양태에서, 소수성 수지 중량은 ADC 혼합물 중 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 5 내지 10배이고, 오리스타틴은 모노메틸오리스타틴 F(MMAF)이다.
하나의 양태에서, 본 발명의 방법은 4.5 이하의 평균 DAR을 갖는 ADC를 포함하는 조성물을 수득하는 데 사용된다. 하나의 양태에서, 본 발명의 방법은 4 이하의 평균 DAR을 갖는 ADC를 포함하는 조성물을 수득하는 데 사용된다. 하나의 양태에서, 본 발명의 방법은 3.5 이하의 평균 DAR을 갖는 ADC를 포함하는 조성물을 수득하는 데 사용된다. 하나의 양태에서, 본 발명의 방법은 3 이하의 평균 DAR을 갖는 ADC를 포함하는 조성물을 수득하는 데 사용된다. 하나의 양태에서, 조성물은 2.5 이하의 평균 DAR을 갖는다.
하나의 양태에서, 본 발명의 방법은 ADC 혼합물에 소수성 수지를 첨가하여 수지 혼합물을 형성함을 특징으로 하고, 여기서, 상기 수지 혼합물은 상기 ADC 혼합물의 이온 강도와 같거나 그보다 더 높은 이온 강도를 갖는다.
본 발명의 추가의 양태에서, ADC 혼합물은 한외여과/정용여과 공정 후에 수득되었다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 소수성 수지는 부틸 소수성 수지이다.
본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명의 방법은 뱃치식(batch) 공정 또는, 대안적으로, 순환식 공정 또는 유동 관통식(flow through) 공정이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법들을 사용하여 수득되는 조성물을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, ADC를 포함하는 조성물을 특징으로 하고, 상기 ADC의 70%는 4 이하의 약물 부하된 종들을 갖고, 상기 ADC는 항-EGFR 항체(예를 들어, 항체 1) 및 오리스타틴(예를 들어, MMAE 또는 MMAF)을 포함한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 조성물은 ADC를 포함하고, 존재하는 ADC의 75%가 4 이하의 약물 부하된 종들을 갖는다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 조성물은 ADC를 포함하고, 존재하는 ADC의 80%가 4 이하의 약물 부하된 종들을 갖는다. 본 발명의 하나의 양태에서, 조성물은 ADC를 포함하고, 존재하는 ADC의 85%가 4 이하의 약물 부하된 종들을 갖는다. 본 발명의 추가의 양태에서, 조성물은 ADC를 포함하고, 존재하는 ADC의 90%가 4 이하의 약물 부하된 종들을 갖는다. 하나의 양태에서, 조성물은 ADC를 포함하고, 존재하는 ADC의 95%가 4 이하의 약물 부하된 종들을 갖는다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 ADC를 포함하고, 상기 ADC의 70% 이상이 4 내지 1, 3 내지 1, 또는, 대안적으로, 2 내지 1의 약물 부하된 종들을 갖는다.
본 발명은 또한, 4.5 이하의 평균 DAR을 갖는 ADC를 포함하는 조성물을 특징으로 하고, 상기 ADC는 항-EGFR 항체(예를 들어, 항체 1) 및 오리스타틴(예를 들어, MMAE 또는 MMAF)을 포함한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 조성물은 4 이하의 평균 DAR을 갖는 ADC들을 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 조성물은 4 이하의 평균 DAR을 갖는 ADC들을 포함한다. 본 발명의 추가의 또 다른 양태에서, 조성물은 3.5 이하의 평균 DAR을 갖는 ADC들을 포함한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 조성물은 3 이하의 평균 DAR을 갖는 ADC들을 포함한다. 본 발명의 추가의 또 다른 양태에서, 조성물은 2.5 이하의 평균 DAR을 갖는 ADC들을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 4.5 내지 0.001, 4 내지 0.001, 3.5 내지 0.001, 3 내지 0.001, 또는, 대안적으로, 2.5 내지 0.001의 평균 DAR을 갖는 항-EGFR ADC들(예를 들어, MMAE 또는 MMAF에 접합된 항체 1)를 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 항-상피세포 성장 인자 수용체(EGFR) 항체를 포함하는 ADC를 포함한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항-EGFR 항체는, 각각 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1), CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 항-EGFR 항체는 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 항-EGFR ADC는 서열 번호 6의 아미노산 서열에 제시된 경쇄 가변 영역에 기재된 CDR들(즉, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3), 및 서열 번호 1의 아미노산 서열에 기재된 CDR들(즉, 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 모노메틸오리스타틴 E(MMAE) 또는 모노메틸오리스타틴 F(MMAF)인 오리스타틴을 특징으로 한다.
하나의 양태에서, MMAE는 발린-시트룰린(vc) 링커를 통해 항체에 접합된다(vc-MMAE). 또 다른 양태에서, MMAF는 말레이미도카프로일 링커를 통해 항체에 접합된다(mc-MMAF).
하나의 양태에서, 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물이다.
또한 본원에 기재된 조성물을 대상체에게 투여하여 암을 치료함을 포함하는, 대상체에서의 암 치료 방법도 포함된다. 하나의 양태에서, 암은 편평상피 종양(폐, 두경부, 자궁 등의 편평상피 종양을 포함함), 교아종, 신경교종, 비-소세포 폐암, 폐암, 결장암, 두경부암, 유방암, 편평상피 세포 종양, 항문암, 피부암 및 외음부암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 양태에서, 본 발명의 조성물은 다형 교아종을 치료하는 데 사용된다.
하나의 양태에서, 본 발명의 조성물은 EGFR의 과발현을 갖는 고형 종양을 치료하는 데 사용된다. 하나의 양태에서, 본 발명의 조성물은 EGFR의 과발현 가능성이 있는 진행된 고형 종양을 갖는 대상체를 치료하는 데 사용된다.
하나의 양태에서, 본 발명의 조성물은 정맥내로 투여된다.
도 1은 실시예에 기재된 공정의 개요를 제공하며, 항체 1의 환원, 항체 1의 vcMMAE에의 접합, 및 HIC 수지에 의한 뱃치식 정제를 사용하는 ADC의 정제를 포함한다.
도 2는 HIC 수지 뱃치식 정제 전 및 후의 항체 1 ADC 용액의 HIC HPLC 분석을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 2.7, 4 및 5.5의 평균 DAR을 갖는 ADC 혼합물의 정제를 위한 실시예 6에 기재된 공정의 개요를 제공한다.
상세한 설명
I. 정의
본 발명을 더 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해, 특정 용어를 우선 정의한다. 또한, 파라미터의 수치 또는 수치 범위가 언급되는 모든 경우, 언급된 수치들의 중간 수치 및 범위도 본 발명의 일부인 것으로 의도됨을 주지해야 한다.
용어 "항체-약물-접합체(antibody-drug-conjugate)" 또는 "ADC"는, 임의로 치료제 또는 세포독성제일 수 있는 하나 이상의 화학적 약물(들)(본원에서 약제(들)라고도 지칭함)에 화학적으로 연결된 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 나타낸다. 바람직한 양태에서, ADC는 항체, 세포독성 또는 치료 약물, 및 약물의 항체에의 부착 또는 접합을 가능하게 하는 링커를 포함한다. ADC는 전형적으로, 2, 4, 6 또는 8의 약물 부하된 종들을 포함하여, 항체에 접합된 1 내지 8개의 약물들을 임의의 위치에 갖는다. ADC에 포함될 수 있는 약물의 비제한적인 예시는 유사분열 억제제, 항종양 항생제, 면역조절제, 유전자 치료요법용 벡터, 알킬화제, 항혈관형성제, 항대사제, 붕소-함유 약제, 화학적 보호제, 호르몬, 항호르몬제, 코르티코스테로이드, 광활성 치료제, 올리고뉴클레오티드, 방사성핵종 약제, 토포아이소머라제 억제제, 티로신 키나제 억제제 및 방사선증감제이다.
본원에서 상호교환되어 사용되는 용어 "항-상피세포 성장 인자 항체 약물 접합체" 또는 "항-EGFR 항체 약물 접합체" 및 "항-EGFR ADC"는 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 ADC를 나타내며, 이에 의해 항체가 하나 이상의 화학적 약제(들)에 접합된다. 하나의 양태에서, 항-EGFR 항체 약물 접합체는 오리스타틴, 예를 들어, MMAE 또는 MMAF에 접합된 항체 1이다. 항체 1의 경쇄 및 중쇄에 상응하는 아미노산 서열이 서열 번호 1 내지 10에 제공된다.
본원에서 사용된 용어 "오리스타틴"은 항유사분열제의 하나의 부류를 나타낸다. 오리스타틴 유도체도 용어 "오리스타틴"의 정의 내에 포함된다. 오리스타틴의 예에는 오리스타틴 E(AE), 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE), 모노메틸 오리스타틴 F(MMAF) 및 돌라스타틴의 합성 유사체가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "약물-대-항체 비" 또는 "DAR"은 ADC의 항체에 부착된 약물, 예를 들어, 오리스타틴의 개수를 나타낸다. ADC의 DAR은 1 내지 8 범위일 수 있지만, 항체의 연결 지점의 개수에 따라, 이보다 더 높은 부하, 예를 들어, 10도 가능하다. 용어 DAR은 개별 항체 상에 부하된 약물의 개수를 언급할 때 사용될 수 있거나, 또는, 대안적으로, 소정 그룹의 ADC의 평균 또는 중간 DAR을 언급할 때 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "원치 않는 ADC 종들"은 상이한 약물 부하를 갖는 ADC 종들로부터 분리될 임의의 약물 부하된 종들을 나타낸다. 하나의 양태에서, 용어 원치 않는 ADC 종들은 6 이상의 약물 부하된 종들, 즉, 6의 DAR, 7의 DAR, 8의 DAR, 및 8 초과의 DAR(즉, 6, 7, 8, 또는 8 초과의 약물 부하된 종들)을 포함하여, 6 이상의 DAR을 갖는 ADC를 나타낼 수 있다. 별개 양태에서, 용어 원치 않는 ADC 종들은 8 이상의 약물 부하된 종들, 즉, 8의 DAR, 및 8 초과의 DAR(즉, 8, 또는 8 초과의 약물 부하된 종들)을 포함하여, 8 이상의 DAR을 갖는 ADC를 나타낼 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "ADC 혼합물"은 불균일한 DAR 분포의 ADC들을 함유하는 조성물을 나타낸다. 하나의 양태에서, ADC 혼합물은 1 내지 8, 예를 들어, 2, 4, 6 및 8의 DAR 분포(즉, 2, 4, 6 및 8의 약물 부하된 종들)를 갖는 ADC들을 함유한다. 명백하게는, 분해 생성물들이 생성될 수 있어, 1, 3, 5 및 7의 DAR도 혼합물 중에 포함될 수 있다. 또한, 혼합물 내의 ADC들은 8을 초과하는 DAR을 가질 수도 있다. ADC 혼합물은 쇄간(interchain) 이황화물 환원에 이어지는 접합에 기인한다. 하나의 양태에서, ADC 혼합물은 4 이하의 DAR(즉, 4 이하의 약물 부하된 종들)을 갖는 ADC 및 6 이상의 DAR(즉, 6 이상의 약물 부하된 종들)을 갖는 ADC 둘 모두를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "소수성 수지" 또는 "소수성 상호작용 수지"는 분자 혼합물의 정제 목적으로 사용되는 소수성 리간드로 이루어진 매질을 나타내며, 혼합물내 분자 상의 소수성 표면 모이어티의 존재가 매질과의 상호작용을 촉진시켜, 상호작용하는 분자가 매질에 적어도 일시적으로 결합되도록 한다. 하나의 양태에서, 소수성 수지는, 고체 지지체(예를 들어, 아가로스, 실리카 등)에 결합된, 알킬 모이어티를 포함하는 수지, 예를 들어, 4 내지 8개의 직쇄 또는 분지쇄 탄소 원의 알칸 라디칼 그룹, 예를 들어, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸 또는 옥틸 그룹을 포함하는 수지인 C4-C8 알킬 소수성 수지이다. 소수성 알킬 수지의 예에는 소수성 부틸 수지 또는 소수성 헥실 수지가 포함된다. 하나의 양태에서, 소수성 수지는 아릴 모이어티를 포함하는 수지, 예를 들어, 소수성 페닐 수지이다. 하나의 양태에서, 소수성 수지는 알케닐 모이어티를 포함한다. 하나의 양태에서, 소수성 수지는 에테르 모이어티를 포함한다. 추가의 또 다른 양태에서, 소수성 수지는 페닐 모이어티를 포함한다. 소수성 모이어티(예를 들어, 알킬, 아릴 등)는 불활성 물질(예를 들어, 실리카, 아가로스 및/또는 다른 폴리사카라이드 중합체)에 연결될 수 있다. 하나의 양태에서, 수지는 메타크릴레이트 수지이다.
용어 "이온 강도"는 광범위하게는 용액 내의 이온 농도, 즉 용액의 전도도의 척도를 나타낸다. 용액의 이온 강도를 조절하는 데 사용될 수 있는 염의 예에는 브롬화나트륨, 염화나트륨, 시트르산나트륨, 요오드화나트륨, 인산나트륨, 황산나트륨, 브롬화칼륨, 염화칼륨, 시트르산칼륨, 요오드화칼륨, 인산칼륨, 황산칼륨, 염화세슘, 염화리튬, 또는 다른 암모니아염(예를 들어, NH4Cl, (NH4)2SO4), 탄산염(NaHCO3), 시트르산염(NaH2(C3H5O(COO)3), Na2H(C3H5O(COO)3), Na3H(C3H5O(COO)3)), 인산염(예를 들어, KH2PO4, K2HPO4, K3PO4), 질산염(KNO3) 또는 이들 성분들의 임의의 혼합물이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 음이온 및 양이온 둘 모두는 침전 또는 다른 원치 않는 부작용 없이 충분한 이온 강도를 제공하기만 한다면, 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이 가변적일 수 있다는 것을 당해 기술분야의 숙련가는 알고 있다.
용어 "항-EGFR 항체"는 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체를 나타내도록 의도된다. 관심 항원, 즉 EGFR에 "결합하는" 항체는 충분한 친화도로 해당 항원에 결합할 수 있는 항체여서, 항체는 항원 발현 세포를 표적화하는 데 유용하다. 항체 1은 항-EGFR 항체의 일례이다.
용어 "항체"는 광범위하게는, 일반적으로 4개의 폴리펩티드 쇄, 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄로 구성되는 면역글로불린(Ig) 분자, 또는 Ig 분자의 필수적인 표적 결합 특징을 보유하는 임의의 기능적 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 이들의 유도체를 나타낸다.
전장 항체에서, 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH라 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL이라 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(CDR)이라 불리는 과가변 영역들로 추가로 세분될 수 있으며, 상기 과가변 영역들 사이에 프레임워크(framework) 영역(FR)이라 불리는 더 보존적인 영역들이 배치된다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 이들은 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 다음의 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 면역글로불린 분자는 임의의 타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY) 및 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류의 것일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 항체의 "항원-결합부"(또는 간단히 "항체 부위")는 항원(예를 들어, hIL-13)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 하나 이상의 항체 단편을 나타낸다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편들에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 항체의 양태는 또한 이중특이적, 이원 특이적 또는 다중-특이적 포맷일 수 있어; 2개 이상의 상이한 항원들에 특이적으로 결합할 수 있다. 항체의 "항원-결합부"라는 용어에 포함되는 결합 단편들의 예에는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지(hinge) 영역에서 다이설파이드 브릿지(bridge)에 의해 연결된 2개의 Fab 단편들을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) 단일 가변 도메인을 포함하는 dAb 단편(문헌[Ward et al., (1989) Nature 341:544-546], 인용에 의해 본원에 포함되는 윈터(Winter) 등의 PCT 공보 WO 제90/05144 A1호); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)이 포함된다. 추가로, Fv 단편의 2개의 도메인 VL 및 VH가 별개 유전자에 의해 암호화되기는 하지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여 합성 링커에 의해 결합될 수 있으며, 상기 합성 링커는 VL 영역과 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄(단일 쇄 Fv(scFv)로서 공지됨; 예를 들어, 문헌[Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조)로서 제조되도록 할 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체도 항체의 "항원-결합부"라는 용어에 포함되는 것으로 의도된다. 다른 형태의 단일 쇄 항체, 예를 들어, 다이아바디(diabody)가 또한 포함된다. 다이아바디는, VH 도메인과 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 발현되지만, 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이에 쌍을 이루도록 하기에는 매우 짧은 링커를 사용함으로써 도메인들이 또 다른 쇄의 상보성 도메인들과 쌍을 이루게 하여 2개의 항원 결합 지점을 생성하는 2가의 이중특이적 항체이다(예를 들면, 문헌[Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123] 참조). 이러한 항체 결합 부위는 당해 기술분야에 공지되어 있다(문헌[Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp])(ISBN 3-540-41354-5).
본원에서 사용된 바와 같이, "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체들을 실질적으로 함유하지 않는 항체를 나타내도록 의도된다(예를 들어, EGFR에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 EGFR이 아닌 항원을 특이적으로 결합하는 항체를 실질적으로 함유하지 않는다). 그러나, EGFR에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원들, 예를 들어, 다른 종으로부터의 EGFR 분자들에 대해 교차-반응성을 가질 수 있다. 또한, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학 물질들을 실질적으로 함유하지 않을 수 있다.
용어 "사람화된 항체"는, 사람이 아닌 종(예를 들어, 마우스)으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열들을 포함하지만, VH 및/또는 VL 서열의 적어도 일부가 더 "사람에 유사"하도록, 즉 사람 생식세포 가변 서열들에 더 유사하도록 변화된 항체를 나타낸다. 특정 양태에서, 용어 "사람화된 항체"는, 관심 항원에 특이적으로 결합하고, 실질적으로 사람 항체의 아미노산 서열을 갖는 프래임워크(FR) 영역을 포함하며, 실질적으로 사람이 아닌 항체의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는, 항체 또는 항체 변이체, 유도체 또는 단편을 나타낸다. CDR의 맥락에서 본원에 사용된 용어 "실질적으로"는 사람이 아닌 항체 CDR의 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR을 나타낸다. 하나의 양태에서, 하나의 타입의 사람화된 항체는, 사람이 아닌 VH 및 VL 서열에 사람 CDR 서열을 도입하여, 상응하는 비사람 CDR 서열을 대체시킨 CDR-이식 항체이다.
본원에서 사용된 용어 "CDR"은 항체 가변 서열 내의 상보성 결정 영역을 나타낸다. 각각의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내에는 3개의 CDR이 존재하며, 이들은 각각의 가변 영역에 대해 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 표시된다. 본원에서 사용된 용어 "CDR 세트"는 항원에 결합할 수 있는 단일 가변 영역 내에 존재하는 3개의 CDR들의 그룹을 나타낸다. 이들 CDR들의 정확한 경계가 상이한 시스템들에 따라 각각 다르게 정의되었다. 카밧(Kabat)에 의해 기재된 시스템(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) 및 (1991)])은 모든 항체 가변 영역에 적용될 수 있는 명백한 잔기 번호매김 시스템을 제공할 뿐만 아니라, 3개의 CDR을 정의하는 정밀한 잔기 경계도 제공한다. 이들 CDR을 카밧 CDR이라 지칭할 수 있다. 초티아(Chothia) 및 공동 연구자들(문헌[Chothia &Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) 및 Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989)])은 카밧 CDR 내의 특정한 하위-부위들이 아미노산 서열 수준에서 높은 다양성을 가짐에도 불구하고 거의 동일한 펩티드 골격 입체구조를 채택한다는 것을 발견하였다. 이들 하위-부위들을 L1, L2 및 L3 또는 H1, H2 및 H3으로 표시하였으며, 여기서, "L" 및 "H"는 각각 경쇄 및 중쇄 영역을 표시한다. 이들 영역을 초티아 CDR이라 지칭할 수 있고, 이들은 카밧 CDR와 중첩되는 경계를 갖는다. 카밧 CDR과 중첩되는 CDR을 정의하는 다른 경계가 패들란(Padlan)(문헌[FASEB J. 9:133-139 (1995)]) 및 맥칼럼(MacCallum)(문헌[J Mol Biol 262(5):732-45 (1996)])에 의해 기재되었다. 또 다른 CDR 경계 정의들은 엄격하게는 상기 시스템들 중 하나를 따르지 않을 수 있지만 그럼에도 카밧 CDR과 중첩될 것이며, 그렇더라도 이들은 특정 잔기들 또는 잔기들의 그룹들 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 크게 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견을 감안하여 단축될 수 있거나 연장될 수 있다. 본원에서 사용되는 방법은 이들 시스템들 중 어느 것에 따라 정의되는 CDR을 사용할 수 있지만, 바람직한 양태는 카밧 또는 초티아 정의된 CDR을 사용한다.
용어 "장애"는 본 발명의 제형을 사용하는 치료로부터 효과를 얻게 되는 임의의 병태, 예를 들어, 제형 중의 항-EGFR 항체를 사용하는 치료를 필요로 하는 장애를 나타낸다. 이는, 대상체가 문제의 장애에 잘 걸리게 하는 병리학적 상태들을 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다.
용어 "암"은 전형적으로는 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 나타내거나 묘사하는 것을 의미한다. 암의 예에는 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병 또는 악성 림프종이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 암의 더욱 특정한 예에는 교아종, 비-소세포 폐암, 폐암, 결장암, 두경부암, 유방암, 편평상피 세포 종양, 항문암, 피부암 및 외음부암이 포함된다. 하나의 양태에서, 본 발명의 조성물은 EGFR 유전자 증폭을 함유하는 종양(들)을 갖는 환자에게 투여되며, 상기 EGFR 유전자 증폭에 의해 종양은 절단된 형태의 EGFR de2-7을 발현한다. 하나의 양태에서, ADC-1을 포함하는 본 발명의 제형은 결장직장암, 두경부암(하인두암, 구인두암, 식도암, 후두암 및 구강암을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아님), 비-소세포 폐암, 췌장암, 위암 및 유방암의 치료를 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 암의 더욱 특정한 예에는 편평상피 종양(폐, 두경부, 자궁 등의 편평상피 종양을 포함함), 교아종, 신경교종, 비-소세포 폐암, 폐암, 결장암, 두경부암, 유방암, 편평상피 세포 종양, 항문암, 피부암 및 외음부암이 포함된다. 본 발명의 하나의 양태에서, 조성물은 고형 종양, 예를 들어, 상피세포 성장 인자 수용체(EGFR) 과발현 가능성이 있는 고형 종양, 또는 다형 교아종을 갖는 대상체를 치료하는 데 사용된다.
본원에서 사용된 용어 "투여되는"은 치료(예를 들어, EGFR-관련 장애의 치료) 목적을 달성하기 위한 물질(예를 들어, 항-EGFR 항체 약물 접합체)의 전달을 나타내도록 의도된다. 투여 방식은 비경구, 경장 및 국소일 수 있다. 비경구 투여는 보통 주사에 의한 것이며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 피막내, 안와내, 심내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입을 비제한적으로 포함한다.
본원에서 사용된 용어 항체의 "치료학적 유효량" 또는 "유효량"은 항체가 치료에 효과가 있는 장애의 증상을 예방하거나 치료하거나 완화시키는 데 효과적인 양을 나타낸다.
용어 "치료"는 치료적 처치 및 예방 또는 방지 조치 둘 모두를 나타낸다. 치료를 필요로 하는 환자는 장애에 이미 걸린 환자 뿐만 아니라, 장애를 예방하여야 하는 환자도 포함한다.
본 발명의 다양한 양상이 아래의 항목들에서 더욱 상세히 설명된다.
II. 항체 약물 접합체 및 이의 조성물의 정제 방법
본 발명은 항체 약물 접합체(ADC)의 정제 방법을 제공하고, ADC의 원치 않는 종들, 예를 들어, 6 이상의 약물 부하된 종들을 ADC 혼합물로부터 제거하기 위한 효과적인 수단을 제공한다. 본 발명의 방법이 임의의 약물 부하된 종들을 분리하는 데 사용될 수 있기는 하지만, 바람직한 양태에서, 본원에 기재된 방법은 최적의 약물 대 항체 비(DAR), 예를 들어, 4 이하의 DAR을 갖는 ADC로부터 고도의 약물 부하된 ADC를 분리하는 데 사용된다. 특정 양태에서, 본 발명의 방법은 전통적인 컬럼 크로마토그래피에 비해 개선된 회수를 포함하여 많은 장점을 제공할 수 있으며, 따라서 분별 및 후속의 분획 풀링(pooling)이 필요하지 않을 수 있다. 본 명세서 전반에 걸쳐 기재된 방법 및 조성물은 항-EGFR 항체-오리스타틴 ADC, 특히, 특정 양태에서, 말레이미도카프로일 링커를 통해 MMAF(mc-MMAF)에 결합되거나 말레이미도카프로일 발린-시트룰린 링커를 통해 MMAE(vc-MMAE)에 결합된 항체 1을 포함하는 항-EGFR ADC를 정제하는 데 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명의 방법은 일반적으로, 소수성 수지를 ADC 혼합물에 첨가하여, 원치 않는 ADC, 즉, 더 고도로 약물 부하된 ADC가 수지에 결합되고 혼합물로부터 선택적으로 제거될 수 있도록 하는 단계를 포함한다. 특정 양태에서, ADC의 분리는 ADC 혼합물(예를 들어, 4 이하의 약물 부하된 종들의 ADC 및 6 이상의 약물 부하된 종들의 ADC를 포함하는 혼합물)을 소수성 수지와 접촉시킴으로써 달성될 수 있으며, 여기서, 수지의 양은 ADC 혼합물로부터 제거될 약물 부하된 종들의 결합을 허용하기에 충분하다. 수지와 ADC 혼합물을 함께 혼합하여, 제거될 ADC 종들(예를 들어, 6 이상의 약물 부하된 종들)이 수지에 결합하고 ADC 혼합물 중의 다른 ADC 종들로부터 분리될 수 있도록 한다. 당해 방법에서 사용되는 수지의 양은 제거될 종들과 수지 사이의 중량비에 기초하며, 사용되는 수지의 양은 원하는 약물 부하된 종들의 유의한 결합을 허용하지 않는다. 따라서, 본 발명은 ADC 혼합물의 평균 DAR을, 예를 들어, 5.5로부터 4 미만으로 감소시키는 방법을 제공한다. 또한, 본원에 기재된 정제 방법을 사용하여 임의의 원하는 범위의 약물 부하된 종들, 예를 들어, 4 이하의 약물 부하된 종들, 3 이하의 약물 부하된 종들, 2 이하의 약물 부하된 종들, 1 이하의 약물 부하된 종들을 갖는 ADC를 단리할 수 있다.
본 발명은, 특정 종들의 분자(들)가 당해 종들과 소수성 수지 사이의 소수성 상호작용에 기초하여 표면에 결합하는 정제 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 방법은 소수성 수지와 ADC 혼합물의 상호혼합에 의존하는 정제 공정에 관한 것으로, 상기 혼합물에 첨가되는 수지의 양은 결합될 종들(예를 들어, 6 이상의 DAR을 갖는 ADC)을 결정한다.
발현 시스템(예를 들어, 포유동물 발현 시스템)으로부터의 항체의 제조 및 정제 후, 항체를 환원시키고 접합 반응을 통해 약물에 결합시킨다. 수득되는 ADC 혼합물은 종종 소정 범위의 DAR, 예를 들어, 1 내지 8의 DAR을 갖는 ADC를 함유한다. 하나의 양태에서, ADC 혼합물은 4 이하의 약물 부하된 종들 및 6 이상의 약물 부하된 종들을 포함한다. 본 발명의 방법에 따르면, 이에 제한되는 것은 아니지만 뱃치식 공정과 같은 공정을 사용하여 4 이하의 약물 부하된 종들을 갖는 ADC를 선별하고 이를 더 높은 약물 부하를 갖는 ADC(예를 들어, 6 이상의 약물 부하된 종들을 갖는 ADC)로부터 분리하여 ADC 혼합물을 정제할 수 있다. 명백하게는, 본원에 기재된 정제 방법을 사용하여 임의의 원하는 범위의 DAR, 예를 들어, 4 이하의 DAR, 3 이하의 DAR, 2 이하의 DAR을 갖는 ADC를 단리할 수 있다.
따라서, 하나의 양태에서, 4 이하의 약물 부하된 종들 및 6 이상의 약물 부하된 종들을 포함하는 ADC 혼합물을 소수성 수지와 접촉시켜 수지 혼합물을 형성하고(여기서, ADC 혼합물과 접촉되는 소수성 수지의 양은 6 이상의 약물 부하된 종들의 수지에의 결합을 허용하기에 충분하지만 4 이하의 약물 부하된 종들의 유의한 결합은 허용하지 않는다); 상기 소수성 수지를 상기 ADC 혼합물로부터 제거하여, ADC를 포함하는 조성물을 수득하고, 여기서, 상기 조성물은 6 이상의 약물 부하된 종들을 15% 미만으로 포함하고, 상기 ADC는 오리스타틴에 접합된 항체를 포함한다. 별개 양태에서, 본 발명의 방법은 4 이하의 약물 부하된 종들 및 6 이상의 약물 부하된 종들을 포함하는 ADC 혼합물을 소수성 수지와 접촉시켜 수지 혼합물을 형성하고(여기서, ADC 혼합물과 접촉되는 소수성 수지의 양은 6 이상의 약물 부하된 종들의 수지에의 결합을 허용하기에 충분하지만 4 이하의 약물 부하된 종들의 유의한 결합은 허용하지 않는다); 상기 소수성 수지를 상기 ADC 혼합물로부터 제거하여, ADC를 포함하는 조성물을 수득하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서, 상기 조성물은 6 이상의 약물 부하된 종들을 15% 미만으로 포함하고, 상기 ADC는 오리스타틴에 접합된 항체를 포함하며, 상기 소수성 수지 중량은 ADC 혼합물 중의 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 3 내지 12배이다.
본 발명의 방법은 낮은 DAR ADC와 높은 DAR ADC의 효과적인 분리 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 당해 방법은 뱃치식 정제 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 뱃치식 정제 공정은 일반적으로, 용기 내에서 ADC 혼합물을 소수성 수지에 첨가하고, 혼합하고, 후속적으로 상청액으로부터 수지를 분리하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 뱃치식 정제의 맥락에서, 소수성 수지를 원하는 평형 완충액 중에서 제조하거나 상기 완충액에 평형화시킬 수 있다. 이렇게 하여 소수성 수지의 슬러리를 수득할 수 있다. 이어서 ADC 혼합물을 상기 슬러리와 접촉시켜, 소수성 수지에 의해 분리될 ADC(들)의 특정 종들을 흡착시킬 수 있다. 이어서 소수성 수지 물질에 결합하지 않은 원하는 ADC를 포함하는 용액을, 예를 들어, 여과에 의해 또는 슬러리의 침적 및 상청액 제거에 의해 슬러리로부터 분리할 수 있다. 수득된 슬러리를 하나 이상의 세척 단계에 적용할 수 있다. 결합된 ADC를 용리시키기 위해, 염 농도를 감소시킬 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명에 사용되는 공정은 50g 이하의 소수성 수지를 포함한다.
따라서, 본 발명의 하나의 양태에서, 뱃치식 방법을 사용하여 4 이하의 약물 부하된 종들 및 6 이상의 약물 부하된 종들을 포함하는 ADC 혼합물을 소수성 수지와 접촉시켜 수지 혼합물을 형성하고(여기서, ADC 혼합물과 접촉되는 소수성 수지의 양은 6 이상의 약물 부하된 종들의 수지에의 결합을 허용하기에 충분하지만 4 이하의 약물 부하된 종들의 유의한 결합은 허용하지 않는다); 상기 소수성 수지를 상기 ADC 혼합물로부터 제거하여, ADC를 포함하는 조성물을 수득하고, 여기서, 상기 조성물은 6 이상의 약물 부하된 종들을 15% 미만으로 포함하고, 상기 ADC는 오리스타틴에 접합된 항체를 포함한다. 별개 양태에서, 뱃치식 방법을 사용하여 4 이하의 약물 부하된 종들 및 6 이상의 약물 부하된 종들을 포함하는 ADC 혼합물을 소수성 수지와 접촉시켜 수지 혼합물을 형성하고(여기서, ADC 혼합물과 접촉되는 소수성 수지의 양은 6 이상의 약물 부하된 종들의 수지에의 결합을 허용하기에 충분하지만 4 이하의 약물 부하된 종들의 유의한 결합은 허용하지 않는다); 상기 소수성 수지를 상기 ADC 혼합물로부터 제거하여, ADC를 포함하는 조성물을 수득하고, 여기서, 상기 조성물은 6 이상의 약물 부하된 종들을 15% 미만으로 포함하고, 상기 ADC는 오리스타틴에 접합된 항체를 포함하며, 상기 소수성 수지 중량은 ADC 혼합물 중의 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 3 내지 12배이다.
대안적으로, 별개 양태에서, 본 발명은 순환식 공정을 사용하여 수행될 수 있는데, 상기 공정에 의하면, 수지를 용기에 패킹시키고, 분리될 ADC(들)의 특정 종들이 제거될 때까지 ADC 혼합물을 소수성 수지 층 위에 통과시킨다. 이어서 (원하는 ADC 종들을 함유하는) 상청액을 용기로부터 펌핑하고, 수지 층을 세척 단계에 적용할 수 있다.
순환식 공정을 사용하여 4 이하의 약물 부하된 종들 및 6 이상의 약물 부하된 종들을 포함하는 ADC 혼합물을 소수성 수지와 접촉시켜 수지 혼합물을 형성하고(여기서, ADC 혼합물과 접촉되는 소수성 수지의 양은 6 이상의 약물 부하된 종들의 수지에의 결합을 허용하기에 충분하지만 4 이하의 약물 부하된 종들의 유의한 결합은 허용하지 않는다); 상기 소수성 수지를 상기 ADC 혼합물로부터 제거하여, ADC를 포함하는 조성물을 수득하고, 여기서, 상기 조성물은 6 이상의 약물 부하된 종들을 15% 미만으로 포함하고, 상기 ADC는 오리스타틴에 접합된 항체를 포함한다. 별개 양태에서, 순환식 공정을 사용하여 4 이하의 약물 부하된 종들 및 6 이상의 약물 부하된 종들을 포함하는 ADC 혼합물을 소수성 수지와 접촉시켜 수지 혼합물을 형성하고(여기서, ADC 혼합물과 접촉되는 소수성 수지의 양은 6 이상의 약물 부하된 종들의 수지에의 결합을 허용하기에 충분하지만 4 이하의 약물 부하된 종들의 유의한 결합은 허용하지 않는다); 상기 소수성 수지를 상기 ADC 혼합물로부터 제거하여, ADC를 포함하는 조성물을 수득하고, 여기서, 상기 조성물은 6 이상의 약물 부하된 종들을 15% 미만으로 포함하고, 상기 ADC는 오리스타틴에 접합된 항체를 포함하며, 상기 소수성 수지 중량은 ADC 혼합물 중의 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 3 내지 12배이다.
대안적으로, 본 발명의 별개 양태에서, 정제 방법은 유동 관통식 공정을 사용하여 수행될 수 있는데, 상기 공정에 의하면, 수지를 용기, 예를 들어, 컬럼에 패킹시키고, 상기 패킹된 수지 위에 ADC 혼합물을 통과시켜, 원하는 ADC 종들은 수지에 실질적으로 결합하지 않고 수지를 관통하여 유동하고, 원치 않는 ADC 종들은 수지에 결합되도록 한다. 유동 관통식 공정은 단일 통과 방식으로(관심 ADC 종들이 용기내 수지의 단일 통과의 결과로 수득됨) 또는 다중-통과 방식(multi-pass mode)으로(관심 ADC 종들이 용기내 수지의 다중 통과의 결과로 수득됨) 수행될 수 있다. 유동 관통식 공정은, 선택된 수지 중량은 원치 않는 ADC 군집에 결합하고, 원하는 ADC(예를 들어, DAR 2 내지 4)는 수지 상에서 유동하여 1회 또는 복수회 통과 후 유동 관통물 내에서 수집되도록 수행된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 유동 관통식 공정을 사용하여 4 이하의 약물 부하된 종들 및 6 이상의 약물 부하된 종들을 포함하는 ADC 혼합물을 소수성 수지와 접촉시킬 수 있고(여기서, ADC 혼합물과 접촉되는 소수성 수지의 양은 6 이상의 약물 부하된 종들의 수지에의 결합을 허용하기에 충분하지만 4 이하의 약물 부하된 종들의 유의한 결합은 허용하지 않음), 상기 4 이하의 약물 부하된 종들은 수지를 통과하고 1회 또는 복수회 통과 후 후속적으로 수집되어, 원하는 ADC들(예를 들어, DAR 2 내지 4)을 포함하는 조성물을 수득하고, 여기서, 상기 조성물은 6 이상의 약물 부하된 종들을 15% 미만으로 포함하고, 상기 ADC는 오리스타틴에 접합된 항체를 포함한다. 별개 양태에서, 유동 관통식 공정을 사용하여 4 이하의 약물 부하된 종들 및 6 이상의 약물 부하된 종들을 포함하는 ADC 혼합물을 소수성 수지에 통과시킴으로써 ADC 혼합물을 수지와 접촉시키고(여기서, ADC 혼합물과 접촉되는 소수성 수지의 양은 6 이상의 약물 부하된 종들의 수지에의 결합을 허용하기에 충분하지만 4 이하의 약물 부하된 종들의 유의한 결합은 허용하지 않음), 상기 4 이하의 약물 부하된 종들은 수지를 통과하고 후속적으로 수집되어, ADC를 포함하는 조성물을 수득하고, 여기서, 상기 조성물은 6 이상의 약물 부하된 종들을 15% 미만으로 포함하고, 상기 ADC는 오리스타틴에 접합된 항체를 포함하며, 상기 소수성 수지 중량은 ADC 혼합물 중의 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 3 내지 12배이다.
본 발명의 하나의 양태에서, 유동 관통식 공정 후 수지를 하나 이상의 세척액으로 세척하여, (세척 여액 중에서 발견되는) 원하는 DAR 범위를 갖는 ADC를 추가로 회수한다.　 예를 들어, 감소하는 전도도를 갖는 다수의 세척액을 사용하여 관심 DAR을 갖는 ADC를 추가로 회수할 수 있다. 관심 DAR을 갖는 ADC의 개선된 회수를 위해 수지의 세척으로부터 수득되는 용리 물질을 유동 관통식 공정으로부터 생긴 여액과 후속적으로 합칠 수 있다.
본 발명의 정제 방법은 소수성 수지를 사용하여 ADC의 높은 약물 부하된 종들과 낮은 약물 부하된 종들을 분리하는 것에 기초한다. 소수성 수지는 ADC의 소수성 성질과 상호작용하는 소수성 그룹들을 포함한다. ADC 상의 소수성 그룹들이 소수성 수지 내의 소수성 그룹들과 상호작용한다. 단백질의 소수성이 클수록 상기 단백질은 소수성 수지와 더 강하게 상호작용할 것이다.
소수성 수지는 보통 기본 매트릭스(예를 들어, 가교결합된 아가로스 또는 합성 공중합체 물질)를 포함하고, 상기 매트릭스에 소수성 리간드(예를 들어, 알킬 또는 아릴 그룹)가 결합한다. 다수의 소수성 수지가 시판된다. 이의 예에는 저치환 또는 고치환 Pheny Sepharose™ 6 Fast Flow(스웨덴 소재 Pharmacia LKB Biotechnology, AB); Pheny Sepharose™ High Performance(스웨덴 소재 Pharmacia LKB Biotechnology, AB); Octyl Sepharose™ High Performance(스웨덴 소재 Pharmacia LKB Biotechnology, AB); Fractogel™ EMD Propyl 또는 Fractogel™ EMD Phenyl 컬럼(독일 소재 이. 머크(E. Merck)); Macro-Prep™ Methyl 또는 Macro-Prep™. t-Butyl Supports(미국 캘리포니아주 소재 바이오-래드(Bio-Rad)); WP HI-Propyl (C3)™(미국 뉴저지주 소재 제이. 티. 베이커(J. T. Baker)); 및 Toyopearl™ 에테르, 헥실, 페닐 또는 부틸(미국 펜실베니아주 소재 토소하스(TosoHaas))이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 하나의 양태에서, 소수성 수지는 부틸 소수성 수지이다. 또 다른 양태에서, 소수성 수지는 페닐 소수성 수지이다. 또 다른 양태에서, 소수성 수지는 헥실 소수성 수지, 옥틸 소수성 수지, 또는 데실 소수성 수지이다. 하나의 양태에서, 소수성 수지는 n-부틸 리간드를 갖는 메타크릴 중합체(예를 들어, TOYOPEARL® Butyl-600M)이다.
본 발명의 방법은 소수성 수지를 특정한 양으로 사용하여 특정한 DAR을 갖는 ADC에 선택적으로 결합하도록 할 수 있다는 사실을 발견한 데에 적어도 부분적으로 기초한다. 수지와 주어진 DAR을 갖는 ADC 사이의 결합은 ADC 혼합물로부터 제거될 ADC의 중량에 대한 수지의 중량에 의존한다. ADC 혼합물에 접촉하는 수지 부하량(건조 중량 기준으로 산출됨)을 ADC 혼합물 중 특정 약물 부하된 종들에 대해 변화시킴으로써, 수지는, 예를 들어, 8 이상의 DAR을 갖는 ADC, 6 내지 8의 DAR을 갖는 ADC, 5 내지 8의 DAR을 갖는 ADC 등을 선택적으로 결합하게 될 것이다. 따라서, 소수성 수지의 선택성은 수지의 중량과, 수지에 의해 제거될 ADC 종들의 중량의 비에 의존한다. 하나의 양태에서, ADC 혼합물과 접촉되는 소수성 수지 중량은 ADC 혼합물 중 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 3 내지 12배이다. 하나의 양태에서, ADC 혼합물과 접촉되는 소수성 수지 중량은 ADC 혼합물 중 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 4 내지 8배이다. 하나의 양태에서, ADC 혼합물과 접촉되는 소수성 수지 중량은 ADC 혼합물 중 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 5 내지 10배이다. 또 다른 양태에서, ADC 혼합물과 접촉되는 소수성 수지 중량은 ADC 혼합물 중 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 5 내지 7배이다. 또 다른 양태에서, ADC 혼합물과 접촉되는 소수성 수지 중량은 ADC 혼합물 중 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 5 내지 6배이다. 예를 들어, 하기 실시예에서 표 5에 기재된 바와 같이, 약 5 내지 10 중량의 수지(건조)를 사용하여 6 및 8 부하된 약물 종들을 감소시켜(3.2㎎의 수지/0.54㎎의 6/8 부하된 종들 = 약 6), (6 미만의 DAR을 갖는 ADC가 풍부한) 풍부 조성물을 수득하였다. 또 다른 예에서, 하기 표 7에 기재된 바와 같이, 6 및 8의 약물 부하된 종들의 중량의 대략 8 내지 12배의 수지 중량이 ADC 혼합물로부터 이들 종들을 감소시키는 데 효과적인 것으로 입증되었다. 추가의 예에서, 하기 표 7에 기재된 바와 같이, 6 및 8의 약물 부하된 종들의 중량의 대략 4배의 수지 중량이 ADC 혼합물로부터 이들 종들을 유의하게 감소시키는 데 효과적인 것으로 입증되었다.
ADC에 대한 수지의 선택성은, 특정한 원하는 DAR 분포, 예를 들어, 6 내지 8의 DAR 분포를 갖는 ADC의 선택적 결합을 가져오는 적절한 부하 수지:ADC 중량 비를 제공하는 것으로 본원에서 확인된 비와 함께, 수지 혼합물의 이온 강도에 의해 영향을 받을 수 있다. 일반적으로, 수지 혼합물의 이온 강도가 감소하면 소수성 수지가 덜 흡착성이 될 것이며, 반면 수지 혼합물의 이온 강도가 증가하면 흡착성이 더 높은 수지가 제공될 것이다. ADC의 소수성 수지에의 흡착은 높은 염 농도에 의해 유리한 효과를 얻지만, 실제 농도는 선택된 특정 소수성 수지 및 ADC의 성질에 따라 광범위하게 달라질 수 있다. 일반적으로, Na, K 또는 NH4 설페이트는 소수성 수지 내의 리간드-단백질 상호작용을 효과적으로 증진시킨다. 다음의 상관관계에 의해 주어진 바와 같이 상호작용의 강도에 영향을 주는 염을 제형화할 수 있다: (NH4)2SO4>Na2SO4>NaCl>NH4Cl>NaBr>NaSCN. 일반적으로, 약 0.75 내지 약 2M 황산암모늄 또는 약 1 내지 4M NaCl의 염 농도가 유용하다. 하나의 양태에서, 수지 혼합물은 0 내지 2N NaCl의 이온 강도를 갖는다. ADC 혼합물의 이온 강도는 소수성 수지를 첨가하기 전에, 소수성 수지를 첨가함과 동시에, 또는 소수성 수지를 첨가한 후에 조절될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 방법은 ADC 혼합물 중 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 6 내지 12배인 소수성 수지 중량을 사용하고, 상기 ADC 혼합물은 0 내지 1N NaCl의 이온 강도 또는 이의 등가 이온 강도를 갖는다. 별개 양태에서, 본 발명의 분리 방법은 ADC 혼합물 중 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 3 내지 6배인 소수성 수지 중량을 사용하여 수행되고, 상기 ADC 혼합물은 1 내지 2N NaCl 또는 이의 등가 이온 강도를 포함한다. 당해 방법은 또한 ADC 혼합물 중 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 3 내지 7배인 소수성 수지 중량을 사용하여 수행될 수 있고, 여기서, 오리스타틴은 모노메틸오리스타틴 E(MMAE)이다. 6 이상의 약물 부하된 종들의 추가의 분리 방법은 ADC 혼합물을 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 5 내지 10배 중량의 소수성 수지와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서, 오리스타틴은 모노메틸오리스타틴 F(MMAF)이다.
본원에 기재된 방법을 수행하기 전에 또는 본원에 기재된 방법을 수행한 후에 추가의 정제 또는 공정 단계들을 수행할 수 있다. 예를 들어, 하나의 양태에서, ADC 혼합물은 한외여과/정용여과 공정 후 수득된다. 또 다른 양태에서, ADC의 정제된 조성물을 한외여과/정용여과에 적용한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 방법은 ADC 혼합물을 소수성 수지와 접촉시키는 단계(여기서, ADC 혼합물과 접촉되는 소수성 수지의 양은 6 이상의 약물 부하된 종들의 수지에의 결합을 허용하기에 충분하지만 4 이하의 약물 부하된 종들의 유의한 결합은 허용하지 않는다); 및 상기 소수성 수지를 상기 ADC 혼합물로부터 제거하는 단계를 포함한다. 소수성 수지는 더 높은 약물 부하된 종들, 예를 들어, 6 이상의 약물 부하된 종들을 결합하지만, 더 낮은 약물 부하된 종들, 예를 들어, 4 이하의 약물 부하된 종들은 주로 상청액 중에 잔류한다. ADC 혼합물과 접촉되고 4 이하의 약물 부하된 종들의 유의한 결합은 허용하지 않는 소수성 수지의 양은, 하나의 양태에서, 4 이하의 약물 부하된 종들의 35% 이하를 결합하는 수지의 양이다. 특정 양태에서, 4 이하의 약물 부하된 종들의 유의한 결합은 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하로서 정의된다. 다른 양태에서, 약물 부하된 종들의 유의한 결합은 30% 내지 1%, 25% 내지 1%, 20% 내지 1%, 15% 내지 1%, 10% 내지 1%, 또는 5% 내지 1%로서 정의된다.
하나의 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여, 원치 않는 ADC 종들, 예를 들어, 6 이상의 약물 부하된 종들을 낮은 수준으로 갖는 조성물을 수득할 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 조성물은 6 이상의 약물 부하된 종들을 15% 이하로 갖는다. 하나의 양태에서, 본 발명의 조성물은 6 이상의 약물 부하된 종들을 14% 이하로 갖는다. 하나의 양태에서, 본 발명의 조성물은 6 이상의 약물 부하된 종들을 13% 이하로 갖는다. 하나의 양태에서, 본 발명의 조성물은 6 이상의 약물 부하된 종들을 12% 이하로 갖는다. 하나의 양태에서, 본 발명의 조성물은 6 이상의 약물 부하된 종들을 11% 이하로 갖는다. 하나의 양태에서, 본 발명의 조성물은 6 이상의 약물 부하된 종들을 10% 이하로 갖는다. 하나의 양태에서, 본 발명의 조성물은 6 이상의 약물 부하된 종들을 9% 이하로 갖는다. 하나의 양태에서, 본 발명의 조성물은 6 이상의 약물 부하된 종들을 8% 이하로 갖는다. 하나의 양태에서, 본 발명의 조성물은 6 이상의 약물 부하된 종들을 7% 이하로 갖는다. 하나의 양태에서, 본 발명의 조성물은 6 이상의 약물 부하된 종들을 6% 이하로 갖는다. 하나의 양태에서, 본 발명의 조성물은 6 이상의 약물 부하된 종들을 5% 이하로 갖는다. 하나의 양태에서, 본 발명의 조성물은 6 이상의 약물 부하된 종들을 4% 이하로 갖는다. 추가의 양태에서, 당해 조성물은 6 이상의 약물 부하된 종들을 15% 내지 1%로, 6 이상의 약물 부하된 종들을 10% 내지 1%로, 6 이상의 약물 부하된 종들을 5% 내지 1%로, 6 이상의 약물 부하된 종들을 10% 내지 0.5%로, 또는 6 이상의 약물 부하된 종들을 5% 내지 0.5%로 갖는다.
하나의 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여, 4의 평균 DAR을 갖는 ADC를 포함하는 조성물을 제조할 수 있다. 이러한 조성물은 종 흡수 공정에서 ADC 혼합물을 소정량의 소수성 수지와 접촉시켜 수지 혼합물을 형성하고(여기서, 상기 ADC 혼합물은 4 이하의 약물 부하된 종들 및 6 이상의 약물 부하된 종들을 포함하고, 소수성 수지의 양은 ADC 혼합물 중 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 5 내지 10배이다), 상기 수지 혼합물로부터의 상청액을 수득하여, 4 이하의 평균 DAR을 갖는 ADC를 포함하는 조성물을 제조함으로써 수득될 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 조성물은 3.5 이하의 평균 DAR을 갖는 ADC들을 포함한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 당해 조성물은 3 이하의 평균 DAR을 갖는 ADC들을 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 조성물은 2 내지 4의 평균 DAR을 갖는 ADC들을 포함한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 당해 조성물은 2.4 내지 3.6의 평균 DAR을 갖는 ADC들을 포함한다. 하나의 양태에서, 당해 조성물은 4 이하의 평균 DAR, 또는, 대안적으로, 3.5 이하의 평균 DAR, 3 이하의 평균 DAR, 또는 2.5 이하의 평균 DAR을 갖는 ADC들을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여, 4 이하의 평균 약물-대-항체 비(DAR)를 갖는 ADC를 포함하고, 원치 않는 ADC를 15% 미만으로 포함하는 조성물을 제조할 수 있다. 당해 방법은 ADC 혼합물을 소수성 수지와 접촉시키는 단계(여기서, ADC 혼합물과 접촉되는 소수성 수지의 양은 원치 않는 ADC의 결합을 허용하기에 충분하다); 및 상기 소수성 수지를 상기 ADC 혼합물로부터 제거하여, 4 이하의 평균 DAR을 갖고, 원치 않는 ADC를 15% 미만으로 포함하는 조성물을 생성하는 단계를 포함한다. 하나의 양태에서, 원치 않는 ADC는 6 및 8의 약물 부하된 종들이다. 하나의 양태에서, ADC 혼합물에 첨가되는 소수성 수지의 양은 ADC 혼합물 중의 원치 않는 ADC의 중량의 5 내지 10배인 수지 중량이다. 또 다른 양태에서, ADC 혼합물에 첨가되는 소수성 수지의 양은 ADC 혼합물 중의 원치 않는 ADC의 중량의 5 내지 7배인 수지 중량이다. 하나의 양태에서, ADC 혼합물에 첨가되는 소수성 수지의 양은 ADC 혼합물 중의 원치 않는 ADC의 중량의 3 내지 12배인 수지 중량이다.
ADC의 DAR은 당해 기술분야에 공지된 통상적인 방법에 따라 측정될 수 있으며, 상기 방법에는 ADC의 UV/VIS 분광 분석 및 분석적 HIC 및 HPLC, 예를 들어, HPLC-MS가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
III. 항체 약물 접합체
본원에 기재된 조성물 및 방법은, 오리스타틴에 접합된, EGFR에 특이적으로 결합하는 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 항체 약물 접합체(ADC)들에 적어도 부분적으로 기반한다.
특히, 본 발명은 종양형성성, 과증식성 또는 비정상적 세포 내에서 발견되는 EGFR 에피토프를 인식하는 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 항-EGFR 항체 약물 접합체를 포함하는 방법 및 조성물에 관한 것으로, 상기 에피토프는 정상 또는 야생형 세포에서는 검출되지 않는다. 바람직하게는, 항체 또는 이의 항원-결합 부는 과발현의 부재하에, 그리고 정상적인 EGFR 해독 후 변형의 존재하에, 정상 또는 야생형 EGFR 에피토프를 함유하는 정상 또는 야생형 세포에는 결합하지 않거나 상기 세포를 인식하지 않는다.
본 발명의 조성물 및 방법에 따라 사용하기에 적합한 항-EGFR 항체는 전형적으로 단일클론성이며, 예를 들어, 키메릭 항체(예를 들어, 사람 불변 영역 및 마우스 가변 영역을 가짐), 사람화된 항체 또는 사람 항체; 단일 쇄 항체 등을 포함할 수 있다. 면역글로불린 분자는 임의의 타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류의 면역글로불린 분자일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항-EGFR 항체 약물 접합체에 사용되는 항-EGFR 항체는 항체 1일 수 있다. 항체 1의 서열 및 특성은 아래에 기재된다(또한 WO 제2011/041319호 및 US 제20110076232호(예를 들어, 도 55의 항체 서열 참조)를 참조하기 바라며, 상기 출원문헌들은 이에 의해 이의 전문이 인용에 의해 포함됨). 항체 1은 모든 상피세포 기원 암의 50%에 존재하는 상피세포 성장 인자 수용체(EGFR)의 과발현된 형태를 표적으로 한다.
본 발명의 특정 양태에서, 본 발명의 항-EGFR 항체 약물 접합체에 사용되는 항-EGFR 항체는 증폭된 야생형 EGFR 및 de2-7 EGFR을 인식한다. 본 발명의 항-EGFR 항체는 de2-7 EGFR 및 증폭된 EGFR을 인식하지만, de2-7 EGFR의 특징인 독특한 연접 펩티드 또는 정상의 야생형 EGFR은 인식하지 않는다는 점에서 유용한 특이성을 나타낸다. 항체 1에 대한 서열이 아래에 제공된다.
상기에 기재된 바와 같이, 항체 1은 사람화된 항-EGFR 항체이다. 항체 1의 중쇄 가변(VH) 및 불변(CH) 영역이 아래에 각각 서열 번호 1 및 5로서 기재된다. VH 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(각각 서열 번호 2, 3 및 4)이 밑줄로 표시된다.
중쇄 가변 영역 아미노산 서열(서열 번호 1)(CDR이 밑줄 그어져 있음):
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSISSDFAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGNTR
CDR1(서열 번호 2) CDR2(서열 번호 3)
YQPSLKSRITISRDTSKNQFFLKLNSVTAADTATYYCVTAGRGFPYWGQGTLVTVSS
CDR3(서열 번호 4)
중쇄 불변 영역 아미노산 서열(서열 번호 5):
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
항체 1의 경쇄 가변(VL) 및 불변(CL) 영역이 아래에 각각 서열 번호 6 및 10으로서 기재된다. VL 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(각각 서열 번호 7, 8 및 9)이 밑줄로 표시된다.
경쇄 가변 영역 아미노산 서열(서열 번호 6)(CDR이 밑줄 그어져 있음):
DIQMTQSPSSMSVSVGDRVTITCHSSQDINSNIGWLQQKPGKSFKGLIYHGTNLDDGVPS
CDR1(서열 번호 7) CDR2(서열 번호 8)
RFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCVQYAQFPWTFGGGTKLEIKR
CDR3(서열 번호 9)
경쇄 불변 영역 아미노산 서열(서열 번호 10):
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
따라서, 하나의 양태에서, (본원에 기재된 ADC에 사용되는) 항-EGFR 항체는 각각 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1), CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 서열 번호 6의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 영역, 서열 번호 1의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는 (오리스타틴에 접합된) 항-EGFR 항체를 포함하는 ADC를 포함하는 제형을 제공한다.
하나의 양태에서, (본원에 기재된 ADC에 사용되는) 항-EGFR 항체는 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물에 사용되는 ADC는 항-EGFR 항체, 예를 들어, 항체 1, 및 오리스타틴을 포함한다. 하나의 양태에서, 오리스타틴은 모노메틸오리스타틴 E(MMAE), 예를 들어, vc-MMAE이다. 하나의 양태에서, 오리스타틴은 모노메틸오리스타틴 F(MMAF), 예를 들어, mc-MMAF이다.
대안적으로, 다른 오리스타틴-기반 ADC가 본 발명의 방법에 따라 제조될 수 있다. 오리스타틴-ADC의 제조에 사용될 수 있는 항체의 예에는 키메릭 항체, 사람 항체, 및 사람화된 항체가 포함된다.
항-EGFR 항체 약물 접합체들을 포함하는 ADC의 제조에 사용될 수 있는 항-EGFR 항체를 포함하는 항체는 당해 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 단일클론 항체는, 예를 들어, 하이브리도마, 재조합 및 파지 디스플레이 기술 또는 이의 조합의 사용을 포함하는 매우 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 기술은, 예를 들어, 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed., 1988); 및 Hammerling, et al., In Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp. 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]에 일반적으로 논의되어 있다. 항-CD70 항체 제조에 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 예에는, 예를 들어, 문헌[Brinkman et al., 1995, J Immunol Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J Immunol Methods 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur J Immunol 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280; PCT 출원 제PCT/GB91/01 134호; PCT 공보 WO 제90/02809호; WO 제91/10737호; WO 제92/01047호; WO 제92/18619호; WO 제93/11236호; WO 제95/15982호; WO 제95/20401호; 및 미국 특허 제5,698,426호; 제5,223,409호; 제5,403,484호; 제5,580,717호; 제5,427,908호; 제5,750,753호; 제5,821,047호; 제5,571,698호; 제5,427,908호; 제5,516,637호; 제5,780,225호; 제5,658,727호; 제5,733,743호 및 제5,969,108호(상기 문헌들의 기재 내용은 인용에 의해 본원에 포함됨)]에 개시된 것들이 포함된다.
본 발명의 재조합 항체를 발현시키기 위한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO 세포)(예를 들어, 문헌[Kaufman and Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 DHFR 선택 마커와 함께 사용되는, 문헌[Urlaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 dhfr-CHO 세포를 포함함) 및 DG44 또는 DUXB11 세포(문헌[Urlaub et al. (1986) Som. Cell Molec. Genet. 12:555; Haynes et al. (1983) Nuc. Acid. Res. 11:687-706; Lau et al. (1984) Mol. Cell. Biol. 4:1469-1475]), NS0 골수종 세포, 원숭이 신장 세포주(예를 들어, CVI 및 COS, 예를 들어, COS 7 세포), SP2 세포, 사람 배아 신장(HEK) 세포, 예를 들어, HEK-293 세포, 차이니즈 햄스터 섬유아세포(예를 들어, R1610), 사람 경부 암종 세포(예를 들어, HELA), 뮤린 섬유아세포(예를 들어, BALBc/3T3), 뮤린 골수종 세포(P3x63-Ag3.653; NS0; SP2/O), 햄스터 신장 세포주(예를 들어, HAK), 뮤린 L 세포(예를 들어, L-929), 사람 림프구(예를 들어, RAJI), 사람 신장 세포(예를 들어, 293 및 293T)를 포함한다. 숙주 세포주는 전형적으로 (예를 들어, 미국 켄터키주 렉싱턴 소재의 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences); 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가(Promega); 미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재의 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)로부터) 시판되거나 또는 미국 미생물 보존 센터(ATCC, 미국 버지니아주 머내서스 소재)로부터 구입가능하다.
항체를 암호화하는 재조합 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포 내로 도입할 때, 숙주 세포 내 항체의 발현 또는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 내로의 항체의 분비가 가능하도록 충분한 시간의 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체를 생성한다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
항체 재조합 발현을 위한 예시적 시스템에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄 둘 모두를 암호화하는 재조합 발현 벡터를 인산칼슘-매개성 형질감염에 의해 dhfr-CHO 세포 내로 도입한다. 재조합 발현 벡터 내에서, 항체 중쇄 및 경쇄 cDNA가 CMV 인헨서/AdMLP 프로모터 조절 요소들에 각각 작동적으로 연결되어 높은 수준의 cDNA 전사를 추진한다. 재조합 발현 벡터는 또한 DHFR을 암호화하는 cDNA를 가지며, 이는 메토트렉세이트 선택/증폭을 사용하여, 벡터로 형질감염된 CHO 세포의 선택을 가능하게 한다. 선택된 형질전환체 숙주 세포를 배양하여 항체 중쇄 및 경쇄의 발현을 가능하게 하고, 온전한 항체를 배양 배지로부터 회수한다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질전환체를 선택하고, 숙주 세포를 배양하고 항체를 배양 배지로부터 회수한다. 또한 추가로, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포를 항체가 합성될 때까지 적합한 배양 배지 내에서 배양함으로써 항체를 합성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 항체를 배양 배지로부터 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
바람직한 양태에서, 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 부는 (하나 이상의) 오리스타틴에 접합된다. 오리스타틴은 미세관 동역학 특성, GTP 가수분해, 및/또는 핵 및 세포 분열을 방해하고 항암 및/또는 항진균 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 오리스타틴은, 일반적으로 미세관 동역학 특성 및 GTP 가수분해를 방해하고 이에 의해 세포 분열을 억제함으로써 항암 활성을 갖는 것으로 밝혀진 돌라스타틴 유사체의 그룹을 나타낸다. 예를 들어, (인용에 의해 본원에 포함되는 미국 특허 제5,635,483호에 기재된) 오리스타틴 E는 튜불린 상에서 항암 약물 빈크리스틴과 동일 부위에 결합함으로써 튜불린 중합을 억제하는 화합물인 해양 천연 생성물 돌라스타틴 10의 합성 유사체이다(문헌[G. R. Pettit, Prog. Chem. Org. Nat. Prod, 70: 1-79 (1997)]). 돌라스타틴 10, 오리스타틴 PE 및 오리스타틴 E는 4개의 아미노산을 갖는 직쇄 펩티드이며, 상기 아미노산들 중 3개의 아미노산은 돌라스타틴 부류 화합물들에 있어 독특한 것이다. 오리스타틴 하위부류 유사분열 억제제의 예시적 양태에는 모노메틸 오리스타틴 D(MMAD 또는 오리스타틴 D 유도체), 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE 또는 오리스타틴 E 유도체), 모노메틸 오리스타틴 F(MMAF 또는 오리스타틴 F 유도체), 오리스타틴 F 페닐렌디아민(AFP), 오리스타틴 EB(AEB), 오리스타틴 EFP(AEFP) 및 5-벤조일발레르산-AE 에스테르(AEVB)가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 오리스타틴 유도체의 합성 및 구조는 미국 특허 출원 공보 제2003-0083263호, 제2005-0238649호 및 제2005-0009751호; 국제 특허 공보 WO 제04/010957호, 국제 특허 공보 WO 제02/088172호, 및 미국 특허 제6,323,315호; 제6,239,104호; 제6,034,065호; 제5,780,588호; 제5,665,860호; 제5,663,149호; 제5,635,483호; 제5,599,902호; 제5,554,725호; 제5,530,097호; 제5,521,284호; 제5,504,191호; 제5,410,024호; 제5,138,036호; 제5,076,973호; 제4,986,988호; 제4,978,744호; 제4,879,278호; 제4,816,444호; 및 제4,486,414호에 기재되어 있으며, 상기 문헌들 각각은 인용에 의해 본원에 포함된다.
하나의 양태에서, 본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 MMAF(모노메틸오리스타틴 F)에 접합된다. 모노메틸 오리스타틴 F(MMAF)는 튜불린의 중합을 차단함으로써 세포 분열을 억제한다. 이는 하전된 C-말단 페닐알라닌 잔기를 가지며, 상기 잔기는 이의 하전되지 않은 대응 MMAE와 비교하여 이의 세포독성 활성을 약화시킨다. 이의 극도의 독성으로 인해, 이는 약물 자체로서 사용될 수 없지만, 이를 암세포로 직접 유도하는 단일클론 항체(mAb)에 연결될 수 있다. 하나의 양태에서, 항-EGFR 항체에 대한 링커는 세포외 유체 내에서는 안정하지만, 일단 접합체가 종양 세포로 진입하면 카텝신에 의해 개열되고, 이에 따라 항-유사분열 메커니즘을 활성화시킨다. 하나의 양태에서, 항체 1은 비개열형 말레이미도카프로일(mc) 연결기를 사용하여 MMAF에 접합된다. MMAF의 구조가 도 1에 제공된다.
하나의 양태에서, 본 발명의 항-EGFR 항체는 적어도 하나의 MMAE(모노-메틸 오리스타틴 E)에 접합된다. 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE, 베도틴)는 튜불린의 중합을 차단함으로써 세포 분열을 억제한다. 이의 극도의 독성으로 인해, 이것 또한 약물 자체로서 사용될 수 없다. 최근의 암 치료요법 개발에 있어서, 암세포내 특정 마커 발현을 인식하고 MMAE를 암세포로 유도하는 단일클론 항체(mAb)에 이를 연결시킨다. 하나의 양태에서, MMAE를 항-EGFR 항체에 연결시키는 링커는 세포외 유체(즉, 배지 또는 세포의 외부 환경) 내에서는 안정하지만, 일단 ADC가 특이적 암세포 항원에 결합하고 암세포로 진입하면 카텝신에 의해 개열되고, 이에 따라 독성 MMAE를 방출하고 강력한 항-유사분열 메커니즘을 활성화시킨다. MMAE의 구조가 도 1에 제공된다.
치료제를 단백질에, 그리고 특히 항체에 접합시키는 기술은 익히 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Dekker, Inc., 2nd ed. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985); 및 Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58] 및 예를 들어, 공보 WO 89/12624호 참조).
하나의 양태에서, 항-EGFR-ADC는 세포독성제와 항체 사이에 링커 영역을 포함한다. 예를 들어, 이러한 링커, 스페이서 및/또는 스트레처(stretcher) 화합물에는 다음의 것들이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다: 아미노 벤조산 스페이서(예를 들어, 그리고 비제한적으로, 미국 특허 제7,091,186호 및 제7,553,816호를 참조하기 바라며, 상기 특허문헌 각각은 이에 의해 이의 전문이 인용에 의해 포함됨); 말레이미도카프로일; p-아미노벤질카바모일(PAB); 리소좀 효소-개열형 링커(예를 들어, 그리고 비제한적으로, 미국 특허 제6,214,345호를 참조하기 바라며, 상기 특허문헌은 이에 의해 이의 전문이 인용에 의해 포함됨); 말레이미도카프로일-폴리에틸렌 20 글리콜(MC(PEG)6-OH); N-메틸-발린 시트룰린; N-석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC)(예를 들어, 그리고 비제한적으로, 문헌[Yoshitake et al. (1979) Eur. J. Biochem., 101, 395-399]을 참조하기 바라며, 상기 문헌은 이에 의해 이의 전문이 인용에 의해 포함됨); N-석신이미딜 4-(2-피리딜디티오) 부타노에이트(SPDB)(예를 들어, 그리고 비제한적으로, 미국 특허 제4,563,304호를 참조하기 바라며, 상기 특허문헌은 이에 의해 이의 전문이 인용 25에 의해 포함됨); N-석신이미딜 4-(2-피리딜티오)펜타노에이트(SPP); 발린-시트룰린; 및 다른 링커, 스페이서 및/또는 스트레처 화합물(예를 들어, 그리고 비제한적으로, 미국 특허 제7,090,843호, 제7,223,837호 및 제7,659,241호 및 미국 특허 공보 제2004/0018194호, 제2004/0121940호, 제2006/0116422호, 제2007/0258987호, 제2008/0213289호, 제2008/0241128호, 제2008/0311136호, 제2008/0317747호 및 제2009/0010945호를 참조하기 바라며, 상기 특허문헌 각각은 이에 의해 이의 전문이 인용에 의해 포함됨). 일반적으로 말하면, 상기에 기술된 약제 뿐만 아니라 다른 약제들을 본 발명의 특정 결합 구성원, 특히 이의 항체 및 단편에 부착하고/하거나 접합하는 기술은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 문헌[Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", In Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe et al., "The Preparation and Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)]을 참조하기 바라며, 상기 문헌들 각각은 이에 의해 이의 전문이 인용에 의해 포함된다.
많은 상이한 반응들이 약물의 항체에의 공유결합 부착에 사용될 수 있다. 이는 종종 리신의 아민 그룹, 글루탐산 및 아스파르트산의 유리 카복실산 그룹, 시스테인의 설프하이드릴 그룹 및 방향족 아미노산의 각종 모이어티를 포함하여 항체 분자의 아미노산 잔기의 반응에 의해 달성된다. 가장 흔히 사용되는 비특정의 공유결합 부착 방법 중 하나는 화합물의 카복시(또는 아미노) 그룹을 항체의 아미노(또는 카복시) 그룹에 연결하기 위한 카보디이미드 반응이다. 추가로, 디알데하이드 또는 이미도에스테르와 같은 2관능성 성분을 사용하여 화합물의 아미노 그룹을 항체 분자의 아미노 그룹에 연결시켰다. 또한 쉬프(Schiff) 염기 반응도 약물의 항체 부착에 이용가능하다. 이 방법은 글리콜 또는 하이드록시 그룹을 함유하는 약물의 페리오데이트 산화를 수반하며, 이에 따라 알데하이드가 형성되고, 상기 알데하이드가 이어서 항체 분자와 반응한다. 부착은 항체 분자의 아미노 그룹에 의한 시프 염기의 형성을 통해 일어난다. 이소티오시아네이트가 또한 약물의 항체에의 공유결합 부착을 위한 커플링제로서 사용될 수 있다. 다른 기술들이 당해 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 본 발명의 범위 내에서 있다. 이러한 기술들의 비제한적인 예는, 예를 들어, 미국 특허 제5,665,358호; 제5,643,573호; 및 제5,556,623호에 기재되어 있고, 상기 특허문헌들은 이의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다.
특정 양태에서, 링커의 전구체인 중간체가 적합한 조건하에서 약물과 반응한다. 특정 양태에서, 반응성 그룹들이 약물 및/또는 중간체 상에서 사용된다. 약물과 중간체 사이의 반응 생성물 또는 유도체화된 약물이 후속적으로 적합한 조건하에서 항-EGFR 항체와 반응한다.
접합 방법의 다른 예가 미국 특허 제7,837,980호(시애틀 제네틱스(Seattle Genetics)), 문헌[Carter and Senter (2008) Cancer J, 14(3):154], 뿐만 아니라 미국 출원 공보 제2004-0157782 A1호 및 제2005-0238649호 및 국제 특허 출원 제PCT/US04/038392호에 기재되어 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 부는, MMAF인 오리스타틴에 접합된다. 하나의 양태에서, 항-EGFR ADC는 항체 1-mc-MMAF이다. 항체 1-mc-MMAF는 모노메틸 오리스타틴 F(MMAF)의 하나 이상의 분자에 공유 결합된 (상기에 그리고 서열 번호 1 내지 10에 기재된) 항체 1을 포함한다(구조에 대해 도 1 참조). 항체 1-mc-MMAF를 생성하기 위해, 항체 1의 쇄간 다이설파이드 결합을 설프하이드릴 그룹으로 환원시킨다. 이어서 MMAF를 이들 설프하이드릴 그룹을 통해 항체에 커플링시킨다. 항체 1-mc-MMAF를 비개열형 링커, 즉 도 1에 나타낸 바와 같은 비개열형 말레이미도카프로일(mc) 연결기를 사용하여 생성한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 부는, MMAE인 오리스타틴에 접합된다. 하나의 양태에서, 항-EGFR ADC는 항체 1-vc-MMAE를 포함한다. 항체 1-vc-MMAE는 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE)의 하나 이상의 분자에 공유 결합된 (상기에 그리고 서열 번호 1 내지 10에 기재된) 항체 1을 포함한다(구조에 대해 도 1 참조). 항체 1-vc-MMAE를 생성하기 위해, 항체 1의 쇄간 다이설파이드 결합을 설프하이드릴 그룹으로 환원시킨다. 이어서 vcMMAE를 이들 설프하이드릴 그룹을 통해 항체에 커플링시킨다. 항체 1-vc-MMAE를 도 1에 나타낸 바와 같은 발린 시트룰린 링커(vc)를 사용하여 생성하여, 항체 1-vc-MMAE를 형성한다.
IV. 조성물 용도
본 발명의 방법에 따르면, 원하는 평균 DAR을 갖는 항-EGFR ADC를 포함하는 조성물이 항-EGFR 항체를 사용하는 치료를 필요로 하는 장애를 갖는(또는 상기 장애를 가질 위험이 있는) 대상체에게 투여된다. 항-EGFR ADC를 포함하는 제형은 항-EGFR 항체를 사용하는 치료를 필요로 하는 장애의 예방 또는 치료에서 단독으로 또는 다른 조성물과 조합되어 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "EGFR 활성이 유해 효과를 미치는 장애"는 장애를 앓고 있는 대상체에서 EGFR의 존재가 해당 장애의 병태생리의 원인 또는 해당 장애의 악화에 기여하는 요인인 것으로 밝혀졌거나 의심되는 질환 및 다른 장애를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, EGFR 활성이 유해 효과를 미치는 장애는 EGFR 활성의 억제가 장애의 증상 및/또는 진행을 완화시킬 것으로 기대되는 장애이다. 이러한 장애는, 예를 들어, 장애를 앓고 있는 대상체로부터의 생물학적 시료 내에 존재하는 EGFR의 활성의 증가 또는 EGFR의 양의 증가(예를 들어, 조직 시료 내의, 대상체의 혈청, 혈장, 관절 낭액 등 내의 EGFR의 농도 증가)에 의해 입증될 수 있으며, 이는, 예를 들어, 항-EGFR 항체를 사용하여 검출될 수 있다.
따라서, 예를 들어, 2 내지 4의 평균 DAR을 갖는 본 발명의 ADC 조성물은 암을 치료하는 데 사용될 수 있다. 치료될 수 있는 암의 예에는 교아종, 비-소세포 폐암, 편평상피 비-소세포 폐암(NSCLC), 폐암, 결장암, 두경부암, 유방암, 편평상피 세포 종양, 항문암, 피부암 및 외음부암이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 원하는 평균 DAR을 갖는 ADC 조성물은 또한 상피세포 성장 인자 수용체(EGFR) 과발현 가능성이 있는 고형 종양 또는 다형 교아종을 갖는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다.
하나의 양태에서, 예를 들어, 2 내지 4의 평균 DAR을 갖는 본 발명의 정제된 ADC 조성물은 결장직장암, 두경부암(하인두암, 구인두암, 식도암, 후두암 및 구강암을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아님), 비-소세포 폐암, 편평상피 비-소세포 폐암(NSCLC), 췌장암, 위암, 고형 종양, 상피세포 성장 인자 수용체(EGFR) 과발현 가능성이 있는 고형 종양, 다형 교아종 및 유방암을 치료하는 데 사용된다. 이러한 암의 더욱 특정한 예에는 편평상피 종양(폐, 두경부, 자궁 등의 편평상피 종양을 포함함), 교아종, 신경교종, 폐암, 결장암, 두경부암, 유방암, 편평상피 세포 종양, 항문암, 피부암 및 외음부암이 포함된다.
항-EGFR ADC를 포함하는 조성물의 독특한 특이성은 종래 기술에 공지된 EGFR 항체에서 볼 수 있는 정상 조직 흡수와 관련된 문제점을 갖지 않으면서, 많은 종양형성성 세포 타입 및 종양 타입, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, 교아종, 비-소세포 폐암, 폐암, 결장암, 두경부암, 유방암, 편평상피 세포 종양, 항문암, 피부암, 상피세포 성장 인자 수용체(EGFR) 과발현 가능성이 있는 고형 종양, 다형 교아종 및 외음부암을 식별하거나, 확인하거나, 표적화하고 치료하거나, 감소시키거나 제거하기 위한 진단 및 치료 용도를 제공한다. 따라서, EGFR을 (예를 들어, 돌연변이 또는 변이 EGFR의 증폭 또는 발현에 의해) 과발현하는 세포, 및 특정 양태에서, 해독 후 변형 이상을 나타내는 세포를 본 발명의 항체(들) 또는 이의 단편들을 사용하여 인식하거나, 단리하거나, 확인하거나, 표적화하고 치료하거나 또는 제거할 수 있다. 본 발명의 조성물은 EGFR 양성 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 종양내 EGFR 발현의 검출 방법이 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, EGFR pharmDx™ Kit(다코(Dako))를 들 수 있다. 반면, "EGFR 음성 종양"은 면역조직 화학 기술에 의해 측정 시 종양 시료 내에서 배경 위에 EGFR 멤브레인 염색의 부재를 갖는 종양으로서 정의된다.
본 발명의 하나의 양상에서는, 본원에 기재된 조성물들 중 어느 것의 항-EGFR ADC의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하는 대상체의 치료 방법이 제공되며, 상기 대상체는 당해 조성물 중의 항-EGFR 항체를 사용하는 치료를 필요로 하는 장애(예를 들어, 종양, 암성 상태, 전암성 상태, 및 과증식성 세포 성장과 관련이 있거나 이로부터 기인하는 임의의 병태)를 갖는다.
따라서, 항-EGFR ADC를 포함하는 조성물은 EGFR 종양 또는 종양형성성 세포의 성질을 구체적으로 카테고리화할 수 있으며, 이는 EGFR 과발현, 특히 증폭 및/또는 EGFR 돌연변이, 특히 de2-7 EGFR이 존재하는 종양 또는 세포를 염색하거나 다른 방법으로 인식함에 의한 것이다.
따라서, 본 발명의 추가의 양상에서는, 항체 1을 포함하는 항-EGFR ADC를 포함하는 본 발명의 조성물의 투여를 포함하는, 종양, 암성 상태, 전암성 상태, 및 과증식성 세포 성장과 관련이 있거나 이로부터 기인하는 임의의 병태의 치료 방법이 제공된다.
다양한 전달 시스템이 공지되어 있으며, 본 발명의 항-EGFR ADC 조성물의 투여에 사용될 수 있다. 도입 방법에는 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비내, 경막외 및 경구 경로가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. ADC는, 예를 들어, 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내막(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해에 의해 투여될 수 있고, 화학치료제와 같은 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적 또는 국소적일 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 제형은 정맥내로 대상체에게 전달된다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 제형은 피하로 대상체에게 전달된다. 하나의 양태에서, 대상체는 혼자서 제형을 투여(자가-투여)한다.
제형 중의 항-EGFR 항체를 사용하는 치료를 필요로 하는 장애, 예를 들어, 암의 치료 또는 예방에 효과적인 ADC의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, 임의로 시험관내 검정을 사용하여 최적 투여량 범위의 식별에 도움을 줄 수 있다. 제형에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로 및 면역학적 장애 또는 EGFR-발현 암의 병기에 의존할 것이며, 주치의의 판단 및 각각의 환자의 환경에 따라 정해질 수 있다. 하나의 양태에서, 제형의 치료학적 유효량이 투여된다. 본원에서 사용된 용어 항체의 "치료학적 유효량" 또는 "유효량"은 항체가 치료에 유효한 장애의 증상을 예방하거나 치료하거나 완화시키는 데 효과적인 양을 나타낸다. 제형의 치료학적 유효량의 일례는 유해한 EGFR 활성을 억제하기에 또는 EGFR 활성이 유해 효과를 미치는 장애를 치료하기에 충분한 양이다.
소정 용량의 항-EGFR ADC가, 예를 들어, 매일, 주 1회(매주), 주 2회, 주 3회, 주 4회, 주 5회, 격주로, 3주에 한 번, 매월, 4주에 한 번, 2주 투여/1주 쉬기로 또는 그렇지 않으면 필요에 따라 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른, 그리고 본 발명에 따라 사용하기 위한, 약제학적 조성물은 활성 성분(ADC) 외에도 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충액, 안정제 또는 당해 기술분야에 익히 공지된 다른 물질들을 포함할 수 있다. 이러한 물질들은 비독성이어야 하고, 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로에 의존할 수 있으며, 상기 투여 경로는 경구일 수 있거나, 주사, 예를 들어, 정맥내 주사에 의한 것일 수 있다. 하나의 양태에서, 약제학적 조성물은 ADC(예를 들어, MMAE 또는 MMAF에 접합된 항체 1과 같은 항-EGFR 항체) 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 　본원에서 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 적합한 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예에는 물, 염수, 인산염 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 뿐만 아니라 이들의 조합물 중 하나 이상이 포함된다. 다수의 경우, 등장화제, 예를 들어, 당류, 폴리알코올, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다.
특정 양태에서, 항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 대상체에게 공동-투여될 수 있다. 용어 "공동-투여되는"은 2가지 이상의 상이한 약제학적 성분 또는 치료제(예를 들어, 방사선 치료제)를 동일한 약제학적 조성물 또는 개별 약제학적 조성물들 중에서 조합하여 대상체에게 투여하는 것을 의미한다. 따라서, 공동-투여는 2가지 이상의 약제학적 성분을 포함하는 단일 약제학적 조성물을 동시에 투여하거나 또는 2가지 이상의 상이한 조성물들을 동일하거나 상이한 시간에 동일 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제의 예에는 방사선제, 알킬화제, 혈관형성 억제제, 항체, 항대사제, 항유사분열제, 항증식제, 항바이러스제, 오로라 키나제 억제제, 아폽토시스 촉진제(예를 들어, Bcl-xL, Bcl-w 및 Bfl-1) 억제제, 사멸 수용체 통로 활성제, Bcr-Abl 키나제 억제제, BiTE(이중-특이적 T 세포 연관체) 항체, 항체 약물 접합체, 생물학적 반응 개질제, 사이클린-의존성 키나제 억제제, 세포 주기 억제제, 사이클로옥시게나제-2 억제제, DVD(이중 가변 도메인 항체), 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체(ErbB2) 수용체 억제제, 성장 인자 억제제, 열 충격 단백질(HSP)-90 억제제, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제, 호르몬 치료요법제, 면역제, 아폽토시스 단백질 억제제(IAP)의 억제제, 삽입성(intercalating) 항생제, 키나제 억제제, 키네신 억제제, Jak2 억제제, 라파마이신 억제제의 포유동물 표적, 마이크로 RNA, 미토겐-활성화 세포외 신호-조절 키나제 억제제, 다가 결합 단백질, 비-스테로이드 항-염증 약물(NSAID), 폴리 ADP(아데노신 디포스페이트)-리보스 폴리머라제(PARP) 억제제, 백금 화학치료제, 폴로-유사 키나제(Plk) 억제제, 포스포이노시타이드-3 키나제(브로모도메인) 억제제, 프로테아솜 억제제, 퓨린 유사체, 피리미딘 유사체, 수용체 티로신 키나제 억제제, 에티노이드/델토이드 식물 알칼로이드, 소형 억제성 리보핵산(siRNA), 토포아이소머라제 억제제, 테모졸로미드, 유비퀴틴 리가제 억제제 등, 및 이들 약제들 중 하나 이상의 조합물이 포함된다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 T-세포와 암세포를 동시에 결합함으로써 T-세포가 암세포를 공격하도록 유도하는 이중-특이적 항체인 BiTE 항체를 포함한다. T-세포는 이어서 표적 암세포를 공격한다. BiTE 항체의 예에는 아데카투무맙(Micromet MT201), 블리나투모맙(Micromet MT103) 등이 포함된다. 이론에 결부시키지 않고, T-세포가 표적 암세포의 아폽토시스를 도출하는 메커니즘 중 하나는 퍼포린 및 그랜자임 B를 포함하는 세포융해성 과립 성분들의 세포외 유출(exocytosis)에 의한 것이다. 이와 관련하여, Bcl-2는 퍼포린 및 그랜자임 B 둘 모두에 의한 아폽토시스의 도입을 약화시키는 것으로 밝혀졌다. 이들 데이터는, Bcl-2의 억제가 암세포 표적화 시 T-세포에 의해 도출되는 세포독성 효과를 향상시킬 수 있다는 것을 시사한다(문헌[V.R. Sutton, D.L. Vaux and J.A. Trapani, J. of Immunology 1997, 158 (12), 5783]).
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 siRNA를 포함한다. siRNA는 내생성 RNA 염기 또는 화학적으로 개질된 뉴클레오티드를 갖는 분자이다. 개질은 세포 활성을 무효화시키지 않고, 오히려 증가된 안정성 및/또는 증가된 세포 효력을 부여한다. 화학 개질체의 예에는 포스포로티오에이트 그룹, 2'-데옥시뉴클레오티드, 2'-OCH3-함유 리보뉴클레오티드, 2'-F-리보뉴클레오티드, 2'-메톡시에틸 리보뉴클레오티드, 이들의 조합 등이 포함된다. siRNA는 다양한 길이(예를 들어, 10 내지 200bps) 및 구조(예를 들어, 헤어핀, 단일/이중 가닥, 벌지(bulge), 닉(nick)/갭(gap), 미스매치)를 가질 수 있고, 세포 내에서 활성 유전자 사일런싱을 제공하도록 처리된다. 이중-가닥 siRNA(dsRNA)는 각각의 가닥 상에 동일 개수의 뉴클레오티드를 가질 수 있거나(평활 말단) 또는 비대칭 말단(돌출부)을 가질 수 있다. 1 내지 2개의 뉴클레오티드의 돌출부는 주어진 가닥의 5'- 및/또는 3'-말단 상에 존재할 수 있을 뿐만 아니라, 센스 및/또는 안티센스 가닥 상에 존재할 수도 있다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 DVD 및 다른 다가 결합 단백질을 포함한다. 다가 결합 단백질은 2개 이상의 항원 결합 자리를 포함하는 결합 단백질이다. 다가 결합 단백질은 3개 이상의 항원 결합 자리를 갖도록 조작되며, 일반적으로는 천연 항체가 아니다. 용어 "다중특이적 결합 단백질"은 2개 이상의 관련되거나 관련되지 않은 표적들을 결합할 수 있는 결합 단백질을 의미한다. 이중 가변 도메인(DVD) 결합 단백질은 2개 이상의 항원 결합 자리를 포함하는 4가 또는 다가 결합 단백질이다. 이러한 DVD는 단일특이적(즉, 하나의 항원에 결합할 수 있음) 또는 다중특이적(즉, 2개 이상의 항원에 결합할 수 있음)일 수 있다. 2개의 중쇄 DVD 폴리펩티드 및 2개의 경쇄 DVD 폴리펩티드를 포함하는 DVD 결합 단백질을 DVD Ig라 지칭한다. DVD Ig의 각각의 절반은 중쇄 DVD 폴리펩티드, 경쇄 DVD 폴리펩티드 및 2개의 항원 결합 자리를 포함한다. 각각의 결합 자리는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 항원 결합 자리 하나당 총 6개의 CDR이 항원 결합에 수반된다. 다중특이적 DVD는 DLL4 및 VEGF, 또는 C-met 및 EGFR 또는 ErbB3 및 EGFR을 결합하는 DVD 결합 단백질을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 알킬화제를 포함한다. 알킬화제에는 알트레타민, AMD-473, AP-5280, 아파지퀴온, 벤다무스틴, 브로스탈리신, 부설판, 카보퀴온, 카무스틴(BCNU), 클로람부실, CLORETAZINE®(라로무스틴, VNP 40101M), 사이클로포스파미드, 데카바진, 에스트라무스틴, 포테무스틴, 글루포스파미드, 이포스파미드, KW-2170, 로무스틴(CCNU), 마포스파미드, 멜팔란, 미토브로니톨, 미톨락톨, 니무스틴, 질소 머스터드 N-옥사이드, 라니무스틴, 테모졸로미드, 티오테파, TREANDA®(벤다무스틴), 트레오설판, 로포스파미드 등이 포함된다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 혈관형성 억제제를 포함한다. 혈관형성 억제제에는 내피-특이적 수용체 티로신 키나제(Tie-2) 억제제, 상피세포 성장 인자 수용체(EGFR) 억제제, 인슐린 성장 인자-2 수용체(IGFR-2) 억제제, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2) 억제제, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9(MMP-9) 억제제, 혈소판-유래 성장 인자 수용체(PDGFR) 억제제, 트롬보스폰딘 유사체, 혈관 내피 성장 인자 수용체 티로신 키나제(VEGFR) 억제제 등이 포함된다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 항대사제를 포함한다. 항대사제에는 ALIMTA®(페메트렉시드 이나트륨, LY231514, MTA), 5-아자시티딘, XELODA®(카페시타빈), 카르모푸르, LEUSTAT®(클라드리빈), 클로파라빈, 사이타라빈, 사이타라빈 옥포스페이트, 사이토신 아라비노시드, 데시타빈, 데페록사민, 독시플루리딘, 에플로르니틴, EICAR(5-에티닐-1-β-D-리보푸라노실이미다졸-4-카복스아미드), 에노시타빈, 에티닐사이티딘, 플루다라빈, 5-플루오로우라실 단독 또는 류코보린과의 조합물, GEMZAR®(겜시타빈), 하이드록시우레아, ALKERAN®(멜팔란), 머캅토퓨린, 6-머캅토퓨린 리보시드, 메토트렉세이트, 마이코페놀산, 넬라라빈, 놀라트렉세드, 옥포스페이트, 펠리트렉솔, 펜토스타틴, 랄티트렉세드, 리바비린, 트리아핀, 트리메트렉세이트, S-1, 티아조푸린, 테가푸르, TS-1, 비다라빈, UFT 등이 포함된다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 항바이러스제를 포함한다. 항바이러스제에는 리토나비르, 하이드록시클로로퀸 등이 포함된다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 오로라 키나제 억제제를 포함한다. 오로라 키나제 억제제에는 ABT-348, AZD-1152, MLN-8054, VX-680, 오로라 A-특이적 키나제 억제제, 오로라 B-특이적 키나제 억제제 및 pan-오로라 키나제 억제제 등이 포함된다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 Bcl-2 단백질 억제제를 포함한다. Bcl-2 단백질 억제제에는 AT-101((-)고시폴), GENASENSE®(G3139 또는 오블리메르센(Bcl-2-표적화 안티센스 올리고뉴클레오티드)), IPI-194, IPI-565, N-(4-(4-((4'-클로로(1,1'-바이페닐)-2-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(디메틸아미노)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)-3-니트로벤젠설폰아미드)(ABT-737), N-(4-(4-((2-(4-클로로페닐)-5,5-디메틸-1-사이클로헥스-1-엔-1-일)메틸)피페라진-1-일)벤조일)-4-(((1R)-3-(모르폴린-4-일)-1-((페닐설파닐)메틸)프로필)아미노)-3-((트리플루오로메틸)설포닐)벤젠설폰아미드(ABT-263), GX-070(오바토클락스), ABT-199 등이 포함된다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 Bcr-Abl 키나제 억제제, 예를 들어, DASATINIB®(BMS-354825), GLEEVEC®(이마티닙) 등을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 CDK 억제제를 포함한다. CDK 억제제에는 AZD-5438, BMI-1040, BMS-032, BMS-387, CVT-2584, 플라보피리돌, GPC-286199, MCS-5A, PD0332991, PHA-690509, 셀리시클립(CYC-202, R-로스코비틴), ZK-304709 등이 포함된다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 COX-2 억제제를 포함한다. COX-2 억제제에는 ABT-963, ARCOXIA®(에토리콕시브), BEXTRA®(발데콕시브), BMS347070, CELEBREX®(셀레콕시브), COX-189(루미라콕시브), CT-3, DERAMAXX®(데라콕시브), JTE-522, 4-메틸-2-(3,4-디메틸페닐)-1-(4-설파모일페닐-1H-피롤), MK-663(에토리콕시브), NS-398, 파레콕시브, RS-57067, SC-58125, SD-8381, SVT-2016, S-2474, T-614, VIOXX®(로페콕시브) 등이 포함된다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 다른 EGFR 억제제를 포함한다. EGFR 억제제에는 EGFR 항체, ABX-EGF, 항-EGFR 면역리포솜, EGF-백신, EMD-7200, ERBITUX®(세툭시맙), HR3, IgA　항체, IRESSA®(게피티닙), TARCEVA®(에를로티닙 또는 OSI-774), TP-38, EGFR 융합 단백질, TYKERB®(라파티닙) 등이 포함된다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 HER2 억제제를 포함한다. ErbB2 수용체 억제제에는 CP-724-714, CI-1033(카네르티닙), HERCEPTIN®(트라스투주맙), TYKERB®(라파티닙), OMNITARG®(2C4, 페투주맙), TAK-165, GW-572016(이오나파르닙), GW-282974, EKB-569, PI-166, dHER2(HER2 백신), APC-8024(HER-2 백신), 항-HER/2neu 이중특이적 항체, B7.her2IgG3, AS HER2 3관능성 이중특이적 항체, mAB AR-209, mAB 2B-1 등이 포함된다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 히스톤 데아세틸라제 억제제, 예를 들어, 뎁시펩티드, LAQ-824, MS-275, 트라폭신, 수베로일아닐리드 하이드록삼산(SAHA), TSA, 발프로산 등을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 HSP-90 억제제를 포함하고, HSP-90 억제제에는 17-AAG-nab, 17-AAG, CNF-101, CNF-1010, CNF-2024, 17-DMAG, 겔다나마이신, IPI-504, KOS-953, MYCOGRAB®(HSP-90에 대한 사람 재조합 항체), NCS-683664, PU24FCl, PU-3, 라디시콜, SNX-2112, STA-9090 VER49009 등이 포함된다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 아폽토시스 단백질 억제제의 억제제, 예를 들어, HGS1029, GDC-0145, GDC-0152, LCL-161, LBW-242 등을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 다른 ADC, 예를 들어, 항-CD22-MC-MMAF, 항-CD22-MC-MMAE, 항-CD22-MCC-DM1, CR-011-vcMMAE, PSMA-ADC, MEDI-547, SGN-19Am SGN-35, SGN-75 ADC 등을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 TRAIL과 같은 사멸 수용체 통로의 활성제, TRAIL 또는 사멸 수용체(예를 들어, DR4 및 DR5)를 표적화하는 항체 또는 다른 약제, 예를 들어, 아포맙, 코나투무맙, ETR2-ST01, GDC0145, (렉사투무맙), HGS-1029, LBY-135, PRO-1762 및 트라스투주맙을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 키네신 억제제, 예를 들어, AZD4877, ARRY-520과 같은 Eg5 억제제; GSK923295A와 같은 CENPE 억제제 등을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 JAK-2 억제제, 예를 들어, CEP-701(레사우르티닙), XL019 및 INCB018424 등을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 MEK 억제제, 예를 들어, ARRY-142886, ARRY-438162 PD-325901, PD-98059 등을 포함한다.
항-EGFR ADC(또는 항-EGFR ADC를 포함하는 제형)는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 mTOR 억제제, 예를 들어, AP-23573, CCI-779, 에베롤리무스, RAD-001, 라파마이신, 템시롤리무스, ATP-경쟁적 TORC1/TORC2 억제제를 포함하고, 이는 PI-103, PP242, PP30, Torin 1 등을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 비-스테로이드 항-염증 약물(NSAID), 예를 들어, AMIGESIC®(살살레이트), DOLOBID®(디플루니살), MOTRIN®(이부프로펜), ORUDIS®(케토프로펜), RELAFEN®(나부메톤), FELDENE®(피록시캄), 이부프로펜 크림, ALEVE®(나프록센) 및 NAPROSYN®(나프록센), VOLTAREN®(디클로페낙), INDOCIN®(인도메타신), CLINORIL®(설린닥), TOLECTIN®(톨메틴), LODINE®(에토돌락), TORADOL®(케토롤락), DAYPRO®(옥사프로진) 등을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 PDGFR 억제제, 예를 들어, C-451, CP-673, CP-868596 등을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 백금 화학치료제, 예를 들어, 시스플라틴, ELOXATIN®(옥살리플라틴) 엡타플라틴, 로바플라틴, 네다플라틴, PARAPLATIN®(카보플라틴), 사트라플라틴, 피코플라틴 등을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 폴로-유사 키나제 억제제, 예를 들어, BI-2536 등을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 포스포이노시타이드-3 키나제(PI3K) 억제제, 예를 들어, 보르트만닌, LY294002, XL-147, CAL-120, ONC-21, AEZS-127, ETP-45658, PX-866, GDC-0941, BGT226, BEZ235, XL765 등을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 트롬보스폰딘 유사체, 예를 들어, ABT-510(트롬보스폰딘 모사물), ABT-567, ABT-898(트롬보스폰딘-1 모사 펩티드), TSP-1 등을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 VEGFR 억제제, 예를 들어, AVASTIN®(베바시주맙), ABT-869, AEE-788, ANGIOZYME™(혈관형성을 억제하는 리보자임(리보자임 파마슈티칼스(Ribozyme Pharmaceuticals)(미국 콜로라도주 볼더 소재) 및 키론(Chiron)(미국 캘리포니아주 에머리빌 소재)), 악시티닙(AG-13736), AZD-2171, CP-547,632, IM-862, MACUGEN(페갑타밉), NEXAVAR®(소라페닙, BAY43-9006), 파조파닙(GW-786034), 바탈라닙(PTK-787, ZK-222584), SUTENT®(수니티닙, SU-11248), VEGF trap, ZACTIMA™(반데타닙, ZD-6474), GA101, 오파투무맙, ABT-806(mAb-806), ErbB3 특이적 항체, BSG2 특이적 항체, DLL4 특이적 항체 및 C-met 특이적 항체 등을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 항생제, 예를 들어, 삽입성 항생제 아클라루비신, 악티노마이신 D, 암루비신, 안나마이신, 아드리아마이신, BLENOXANE®(블레오마이신), 다우노루비신, CAELYX® 또는 MYOCET®(리포솜 독소루비신), 엘사미트루신, 에피르부신, 글라르부신, ZAVEDOS®(이다루비신), 미토마이신 C, 네모루비신, 네오카르지노스타틴, 페플로마이신, 피라루비신, 레베카마이신, 스티말라머, 스트렙토조신, VALSTAR®(발루비신), 지노스타틴 등을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 토포아이소머라제 억제제, 예를 들어, 아클라루비신, 9-아미노캄프토테신, 아모나피드, 암사크린, 베카테카린, 벨로테칸, BN-80915, CAMPTOSAR®(이리노테칸 하이드로클로라이드), 캄프토테신, CARDIOXANE®(덱스라족신), 디플로모테칸, 에도테카린, ELLENCE® 또는 PHARMORUBICIN®(에피루비신), 에토포시드, 엑사테칸, 10-하이드록시캄프토테신, 지마테칸, 루르토테칸, 미톡산트론, 오라테신, 피라르부신, 픽산트론, 루비테칸, 소부족산, SN-38, 타플루포시드, 토포테칸 등을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 치료 항체, 예를 들어, AVASTIN®(베바시주맙), CD40-특이적 항체, chTNT-1/B, 데노수맙, ERBITUX®(세툭시맙), HUMAX-CD4®(자놀리무맙), IGF1R-특이적 항체, 린투주맙, PANOREX®(에드레콜로맙), RENCAREX®(WX　G250), RITUXAN®(리툭시맙), 티실리무맙, 트라스투지맙, CD20 항체 타입 I 및 II 등을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 호르몬 치료요법제, 예를 들어, ARIMIDEX®(아나스트로졸), AROMASIN®(엑세메스탄), 아르족시펜, CASODEX®(비칼루타미드), CETROTIDE®(세트로렐릭스), 데가렐릭스, 데슬로렐린, DESOPAN®(트릴로스탄), 덱사메타손, DROGENIL®(플루타미드), EVISTA®(랄록시펜), AFEMA™(파드로졸), FARESTON®(토레미펜), FASLODEX®(풀베스트란트), FEMARA®(레트로졸), 포르메스탄, 글루코코르티코이드, HECTOROL®(독세르칼시페롤), RENAGEL®(세벨라머 카보네이트), 라소폭시펜, 류프롤리드 아세테이트, MEGACE®(메게스테롤), MIFEPREX®(미페프리스톤), NILANDRON™(닐루타미드), NOLVADEX®(타목시펜 시트레이트), PLENAXIS™(아바렐릭스), 프레드니손, PROPECIA®(피나스테리드), 릴로스탄, SUPREFACT®(부세렐린), TRELSTAR®(황체화 호르몬 방출 호르몬(LHRH)), VANTAS®(히스트렐린 이식제), VETORYL®(트릴로스탄 또는 모드라스탄), ZOLADEX®(포스렐린, 고세렐린) 등을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 델토이드 및 레티노이드, 예를 들어, 세오칼시톨(EB1089, CB1093), 렉사칼시트롤(KH1060), 펜레티니드, PANRETIN®(알리레티노인), ATRAGEN®(리포솜 트레티노인), TARGRETIN®(벡사로텐), LGD-1550 등을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 PARP 억제제, 예를 들어, ABT-888(벨리파립), 올라파립, KU-59436, AZD-2281, AG-014699, BSI-201, BGP-15, INO-1001, ONO-2231 등을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 식물 알칼로이드, 예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 비노렐빈 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 프로테아솜 억제제, 예를 들어, VELCADE®(보르테조밉), MG132, NPI-0052, PR-171 등을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 면역제를 포함한다. 면역제의 예에는 인터페론 및 다른 면역-증진제가 포함된다. 인터페론에는 인터페론 알파, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 인터페론 베타, 인터페론 감마-1a, ACTIMMUNE®(인터페론 감마-1b) 또는 인터페론 감마-n1, 이들의 조합물 등이 포함된다. 다른 약제에는 ALFAFERONE®(IFN-α), BAM-002(산화된 글루타티온), BEROMUN®(타소네르민), BEXXAR®(토시투모맙), CAMPATH®(알렘투주맙), CTLA4(세포독성 림프구 항원 4), 데카르바진, 데닐류킨, 에프라투주맙, GRANOCYTE®(레노그라스팀), 렌티난, 백혈구 알파 인터페론, 이미퀴모드, MDX-010(항-CTLA-4), 흑색종 백신, 미투모맙, 몰그라모스팀, MYLOTARG™(겜투주맙 오조가미신), NEUPOGEN®(필그라스팀), OncoVAC-CL, OVAREX®(오레고보맙), 펨투모맙(Y-muHMFG1), PROVENGE®(시푸류셀-T), 사그라모스팀, 시조필란, 테셀류킨, THERACYS®(바실루스 칼메트-게링(Bacillus Calmette-Guerin)), 우베니멕스, VIRULIZIN®(면역치료제, 로루스 파마슈티칼스(Lorus Pharmaceuticals)), Z-100(마루야마 특이적 물질(SSM: Specific Substance of Maruyama)), WF-10(테트라클로로데카옥사이드(TCDO)), PROLEUKIN®(알데스류킨), ZADAXIN®(티말파신), ZENAPAX®(다클리주맙), ZEVALIN®(90Y-이브리투모맙 티욱세탄) 등이 포함된다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 생물학적 반응 개질제, 예를 들어, 조직 세포의 생존, 성장 또는 분화와 같은 생물학적 반응 또는 살아있는 유기체의 방어 기전을 개질시켜 이들이 항-종양 활성을 갖도록 하는 약제를 포함하며, 이에는 크레스틴, 렌티난, 시조피란, 피시바닐 PF-3512676(CpG-8954), 우베니멕스 등이 포함된다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 피리미딘 유사체, 예를 들어, 사이타라빈(ara C 또는 아라비노시드 C), 사이토신 아라비노시드, 독시플루리딘, FLUDARA®(플루다라빈), 5-FU(5-플루오로우라실), 플록수리딘, GEMZAR®(겜시타빈), TOMUDEX®(라티트렉세드), TROXATYL™(트리아세틸우리딘 트록사시타빈) 등을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 퓨린 유사체, 예를 들어, LANVIS®(티오구아닌) 및 PURI-NETHOL®(머캅토퓨린)을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 항유사분열제, 예를 들어, 바타불린, 에포틸론 D(KOS-862), N-(2-((4-하이드록시페닐)아미노)피리딘-3-일)-4-메톡시벤젠설폰아미드, 익사베필론(BMS 247550), 파클리탁셀, TAXOTERE®(도세탁셀), PNU100940(109881), 파투필론, XRP-9881(라로탁셀), 빈플루닌, ZK-EPO(합성 에포틸론) 등을 포함한다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 유비퀴틴 리가제 억제제, 예를 들어, 뉴트린과 같은 MDM2 억제제, MLN4924와 같은 NEDD8 억제제 등을 포함한다.
본 발명의 화합물은 또한 방사선 치료요법의 효능을 향상시키는 방사선증감제로서 사용될 수 있다. 방사선 치료요법의 예에는 외부 빔 방사선 치료요법, 원격 치료요법, 근접 치료요법, 및 밀봉, 비밀봉 선원 방사선 치료요법(unsealed source radiotherapy) 등이 포함된다.
항-EGFR ADC는 암 치료를 위한 하나 이상의 약제의 치료학적 유효량과 함께 공동-투여될 수 있으며, 상기 약제는 화학치료제, 예를 들어, ABRAXANE™(ABI-007), ABT-100(파르네실 트랜스퍼라제 억제제), ADVEXIN®(Ad5CMV-p53 백신), ALTOCOR® 또는 MEVACOR®(로바스타틴), AMPLIGEN®(폴리 I:폴리 C12U, 합성 RNA), APTOSYN®(엑시술린드), AREDIA®(파미드론산), 아르글라빈, L-아스파르기나제, 아타메스탄(1-메틸-3,17-디온-안드로스타-1,4-디엔), AVAGE®(타자로텐), AVE-8062(콤브레아스타틴 유도체) BEC2(미투모맙), 카켁틴 또는 카켁신(종양 괴사 인자), 칸박신(백신), CEAVAC®(암 백신), CELEUK®(셀모류킨), CEPLENE®(히스타민 디하이드로클로라이드), CERVARIX®(사람 유두종 바이러스 백신), CHOP®(C: CYTOXAN®(사이클로포스파미드); H: ADRIAMYCIN®(하이드록시독소루비신); O:　빈크리스틴(ONCOVIN®; P: 프레드니손), CYPAT™(사이프로테론 아세테이트), 콤브레스타틴 A4P, DAB(389)EGF(His-Ala 링커를 통해 사람 상피세포 성장 인자에 융합된 디프테리아 독소의 촉매 및 전좌 도메인) 또는 TransMID-107R™(디프테리아 독소), 다카르바진, 닥티노마이신, 5,6-디메틸크산테논-4-아세트산(DMXAA), 에닐우라실, EVIZON™(스쿠알라민 락테이트), DIMERICINE®(T4N5 리포솜 로션), 디스코더몰리드, DX-8951f(엑사테칸 메실레이트), 엔자스타우린, EPO906(에피틸론 B), GARDASIL®(4가 사람 유두종 바이러스(타입 6, 11, 16, 18) 재조합 백신), GASTRIMMUNE®, GENASENSE®, GMK(강글리오시드 접합체 백신), GVAX®(전립선암 백신), 할로푸기논, 히스테렐린, 하이드록시카바미드, 이반드론산, IGN-101, IL-13-PE38, IL-13-PE38QQR(신트레데킨 베수도톡스), IL-13-슈도모나스 균체외 독소, 인터페론-α, 인터페론-γ, JUNOVAN™ 또는 MEPACT™(미파무르티드), 로나파르닙, 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트, 밀테포신(헥사데실포스포콜린), NEOVASTAT®(AE-941), NEUTREXIN®(트리메트렉세이트 글루코로네이트), NIPENT®(펜토스타틴), ONCONASE®(리보뉴클레아제 효소), ONCOPHAGE®(흑색종 백신 치료제), ONCOVAX®(IL-2 백신), ORATHECIN™(루비테칸), OSIDEM®(항체-기반 세포 약물), OVAREX® MAb(뮤린 단일클론 항체), 파클리탁셀, PANDIMEX™(20(S)프로토파낙사디올(aPPD) 및 20(S)프로토파낙사트리올(aPPT)을 포함하는 인삼으로부터의 아글리콘 사포닌), 파니투무맙, PANVAC®-VF(연구 중인 암 백신), 페가스파가제, PEG 인터페론 A, 페녹소디올, 프로카바진, 레비마스타트, REMOVAB®(카투막소맙), REVLIMID®(레날리도미드), RSR13(에파프록시랄), SOMATULINE® LA(란레오티드), SORIATANE®(아시트레틴), 스타우로스포린(스트렙토마이세스 스타우로스포레스(Streptomyces staurospores), 탈라보스타트(PT100), TARGRETIN®(벡사로텐), TAXOPREXIN®(DHA-파클리탁셀), TELCYTA®(칸포스파미드, TLK286), 테밀리펜, TEMODAR®(테모졸로미드), 테스밀리펜, 탈리도미드, THERATOPE®(STn-KLH), 티미타크(2-아미노-3,4-디하이드로-6-메틸-4-옥소-5-(4-피리딜티오)퀴나졸린 디하이드로클로라이드), TNFERADE™(아데노벡터: 종양 괴사 인자-α를 위한 유전자를 함유하는 DNA 운반체), TRACLEER® 또는 ZAVESCA®(보센탄), 트레티노인(레틴-A), 테트란드린, TRISENOX®(삼산화비소), VIRULIZIN®, 우크라인(애기똥풀(greater celandine) 식물 유래 알칼로이드의 유도체), 비탁신(항-알파v베타3 항체), XCYTRIN®(모텍사핀 가돌리늄), XINLAY™(아트라센탄), XYOTAX™(파클리탁셀 폴리글루멕스), YONDELIS®(트라벡테딘), ZD-6126, ZINECARD®(덱스라족산), ZOMETA®(졸렌드론산), 조루비신 등을 포함한다.
하나의 양태에서, 항-EGFR-ADC를 포함하는 제형은 교아종을 갖는 대상체에게 방사선 및/또는 TEMODAR®(테모졸로미드)와 조합되어 정맥내 투여된다.
또한, 하나의 양태에서, 본 발명의 조성물은 (a) 동결건조된 형태인 항-EGFR ADC를 함유하는 용기 및 (b) 주사용의 약제학적으로 허용되는 희석액(예를 들어, 멸균수)을 함유하는 제2의 용기를 포함하는 약제학적 키트로서 제공될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 희석액은 동결건조된 ADC의 재구성 또는 희석에 사용될 수 있다. 약제학적 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 공고문이 임의로 이러한 용기(들)와 관련될 수 있으며, 상기 공고문은 사람 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매의 정부 기관에 의한 승인을 반영한다.
본 발명을 하기 실시예에서 추가로 설명하며, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 의도가 아니다.
실시예
실시예 1: 오리스타틴 vc-MMAE의 항-EGFR 항체 1에의 접합
하기 실시예는 항체 약물 접합체(ADC)를 형성하기 위한 항체의 오리스타틴에의 접합, 구체적으로는 MMAE의 항-EGFR 항체 1에의 접합에 대해 설명한다. 항체에 대해 vc-MMAE 분자의 감소된 약물 부하를 갖는 항체 1 ADC의 생성은 mAb의 부분적 환원에 이어 Val-Cit-MMAE(vcMMAE)와의 반응을 수반하여 접합을 완결하였으며, 이는 아래에 상세히 기재된 바와 같다.
항체의 다이설파이드 환원
항체 1의 환원은 TCEP(트리카복시에틸 포스핀)을 사용하여 달성하였다. 재조합 단일클론 항체 1은 형질감염된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주에 의해 제조되고, 애보트 바이오리서치 센터(Abbott Bioresearch Center: 미국 매사추세츠주 우스터 소재)에서 정제되었다. 항체 정제 후, 항체 용액(148㎎/㎖, 6㎖)을 50㎖ 폴리프로필렌 원심분리 관 내에 충전시켰다. 이어서 상기 항체 용액을 PBSE 완충액(360㎖; 125mM K2HPO4, 150mM NaCl; 6.3mM EDTA, pH 7.7)을 첨가하여 41㎖의 총 부피로 희석하였다. 단백질 함량은 A280에 의해 측정 시 21.6㎎/㎖였다. 19㎖의 항체 용액을 410.6㎎의 총량에 대해 반응기 내에 충전시켰다. 상기 항체 용액을 37℃로 승온시켰다. 이어서 항체 1(20㎎/㎖)을 상기 항체 용액에 TCEP(시그마 알드리치 파인 케미컬(Sigma Aldrich Fine Chemical: 미국 미주리주 세인트루이스 소재))를 첨가함으로써 부분적으로 환원시켰다. 구체적으로는, 9.67mM TCEP 용액(0.592㎖, 2.05당량)을 상기 항체 용액에 첨가하였다(TCEP:mAb의 몰 당량은 2.05였음). TCEP 첨가 후, 상기 항체 용액을 37℃에서 1시간 동안 항온배양하였다. 이어서 상기 환원 반응물을 20℃로 냉각시켰다. 당해 공정은 항체 1의 다이설파이드 결합의 환원을 초래하였다.
MMAE 및 항체 1의 접합
다음은 항체 환원 후 MMAE가 예시적 항체 1에 접합되는 프로세스에 대해 설명한다.
항체 1의 티올을 Val-Cit-MMAE(vc-MMAE)에 접합시키기 위해, Val-Cit(파라-아미노벤질카바메이트-모노메틸오리스타틴 E; 미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마 알드리치 파인 케미컬)를 vc-MMAE:환원 시스테인(Cys) 최종 몰 비 1.15로 항체 용액에 첨가하였다. 접합 반응은 10%(v/v) DMSO(디메틸설폭사이드; 미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마 알드리치 파인 케미컬)의 존재하에 수행하고, 20℃에서 45분 동안 진행되도록 하였다.
접합 반응 후, 과량의 유리 N(아세틸)-시스테인(미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마 알드리치 파인 케미컬)(vcMMAE 충전량 대비 2.3당량)을 첨가하여 미반응 vc-MMAE를 켄칭시켜 N(아세틸)-Cys-vc-MMAE를 생성하였다. N(아세틸)-Cys 켄칭 반응은 20℃에서 대략 30분 동안 진행되도록 하였다. 이어서 상기 켄칭된 반응 혼합물(조 용액이라고도 부름)을 하기 실시예 2에 기재된 바와 같이 정제하였다.
대안적으로, 다음의 프로토콜이 또한 더 작은 규모의 반응에 사용되었다. 접합은 10mM vcMMAE DMSO 용액(1.32㎖, 4.72당량)을 충전시켜 수행되었다. DMSO(0.86㎖)를 충전시켰다. 이어서 상기 반응 혼합물을 주위 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 과량의 약물 링커를 50mM N-(아세틸) 시스테인(0.53㎖)을 첨가하여 켄칭시켰다. 이어서 상기 혼합물을 약 15분 동안 교반하였다. 이어서 상기 반응 혼합물을 냉장고에 저장하였다.
반응 혼합물의 해석적 분석
반응 혼합물의 해석적 분석을 수행하였다. 상청액 시료의 분석은 TSKgel Butyl-NPR 컬럼(4.6㎜ ID × 3.5㎝, 2.5㎛; 일본 소재의 토소 바이오사이언스 엘엘씨(Tosoh Bioscience LLC))을 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피-고성능 액체 크로마토그래피(HIC-HPLC)에 의해 성취되었다.
단백질 함량의 UV 분석은 386.4㎎의 단백질을 나타냈다. HIC 트레이스 분석은 항체 1-vcMMAE에 대한 평균 약물 대 항체 비(DAR)가 3.85인 것을 나타냈고, 이는 하기 표 1에 기재된 바와 같다. 평균 DAR은 PA%(PA%는 A280에서의 피크하에 측정된 면적에 의해 결정되는 피크 면적 퍼센트임)와 필수 약물 부하를 곱한 2, 4, 6 및 8 ADC 곱을 합하고 100으로 나누어 결정되었고, 예를 들어, [(6.3 PA% × 0) + (24.8 PA% × 2) + (34.8 × 4) + (20.9 × 6) + (8.8 × 8)] / 100 = 3.85였다.
Figure pct00001
표 1에 기재된 바와 같이, 접합 반응은 소정 범위의 약물 부하, 즉 2 내지 8의 DAR을 갖는 ADC 종들의 혼합물을 초래하였다. 표 1에 기재된 바와 같이 적은 비율의 ADC들은 약물 부하를 갖지 않았다.
실시예 2: 소수성 수지를 사용하는 항체 약물 접합체(ADC)의 뱃치식 정제
하기 실시예는 ADC(항체 1-vc-MMAE)의 뱃치식 정제에 대해 설명하며, 그 결과로 생긴 정제된 조성물은 2.8의 평균 DAR을 가졌다. 다음의 정제 공정은 더 고도로 부하된 ADC들, 즉 6 및 8의 약물 부하된 종들을 선택적으로 제거하여, 더 낮은 약물 부하된 종들, 즉 2 내지 4의 DAR들을 포함하는 정제된 분포를 초래하였다. 당해 정제 공정은, 조 항체 용액(또는 혼합물) 내로 적정되어 다양한 접합도의 ADC들을 선택적으로 제거할 수 있는 소량의 소수성 수지를 사용하였다.
당해 정제 공정은 부분적 쇄간 다이설파이드 환원 및 후속의 vc-MMAE 또는 mc-MMAF에 의한 알킬화로부터 기인하는 오리스타틴 E 접합물 및 오리스타틴 F 접합물 둘 모두의 분포를 선택적으로 조절하는 실질적인, 크기조정 가능한 공정을 제공한다. 아래에 설명된 정제 방법은 뱃치 모드에서 또는 순환 모드에서 밀리그램 내지 수 그램 규모로 86% 수율의 정제된 분포를 제공하는 것으로 입증되었다. 항체 환원, 접합, 및 정제 공정의 개요가 도 1에 기재된다.
재료 및 방법
본원에 기재된 완충액은 다음과 같이 제조되었다:
완충액 A(50mM K2HPO4 완충액 pH 7 완충액/2M NaCl)는 K2HPO4(0.87g)(K2HPO4; 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)) 및 NaCl(11.7g)(NaCl; 이엠디(EMD))를 충전시키고, WIFI를 사용하여 대략 90㎖로 희석함으로써 제조되었다. 상기 수득된 용액을 1.0N HCl을 사용하여 7.0의 최종 pH로 처리하고, 100㎖의 총 부피로 추가로 희석하였다.
완충액 A'(50mM K2HPO4/4M NaCl)는 NaCl(2.92g)을 플라스크 내에 충전시킨 다음, 이동 상 A를 충전시켜 25㎖의 최종 부피를 달성함으로써 제조되었다.
완충액 B(50mM K2HPO4 완충액 pH 7 완충액)는 K2HPO4(0.87g) 및 NaCl(11.7g)을 충전시키고, WIFI(주사용수; 깁코(Gibco))를 사용하여 대략 90㎖로 희석함으로써 제조되었다. 상기 수득된 용액을 1.0N HCl(1.0N HCl; 제이티 베이커(JT Baker))을 사용하여 7.0의 최종 pH로 처리하고, 100㎖의 총 부피로 추가로 희석하였다.
예비-처리된 부틸-HIC(Bu-HIC) 수지는 간단히 ToyoPearl Butyl-600M 수지 슬러리(ToyoPearl Bu-HIC 수지(600M); 토소 바이오사이언스)의 벌크 용기를 혼합하고, 조대한 폴리프로필렌 필터 내로 쏟아 부음(1g)으로써 제조되었다. 상기 슬러리를 여과하고 완충액 A(3×2㎖)로 세정하였다. 여과된 질소를 상기 습윤 케익에 10분 동안 또는 조대한 깔대기 바닥에서 액적이 관찰되지 않을 때까지 통과시킴으로써 상기 습윤 케익을 건조시켰다. 습윤 케익 상에 존재하는 물의 양을 빼서 건조 중량 기준을 산출하였다. 수분의 양은 칼 피셔 분석(Karl Fisher analysis)에 의해 측정되었다(전형적으로는 55%의 물을 함유함).
ADC DAR 2 내지 4를 위한 조건을 결정하기 위한 적정 스크리닝 연구
6 내지 8의 DAR을 갖는 ADC들을 제거하기 위한 조건을 결정하기 위해 고체 상 적정 연구를 수행하였다. 상청액 시료의 분석은 TSKgel Butyl-NPR 컬럼(4.6㎜ ID × 3.5㎝, 2.5㎛; 일본 소재의 토소 바이오사이언스 엘엘씨)을 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피-고성능 액체 크로마토그래피(HIC-HPLC)에 의해 성취되었다. 당해 방법은 100% 완충액 A[25mM 인산나트륨, 1.5M(NH4)2SO4, pH 7.0]로부터 100% 완충액 B[75% v/v 25mmol/ℓ 인산나트륨(pH 7.0), 25% v/v 이소프로판올]로의 12분 내 선형 구배로 이루어졌다. 유속은 0.8㎖/분으로 설정되고, 주입은 30㎕이며, 온도는 30℃로 설정되었고, 검출은 280㎚에서 수행하였다.
HIC-HPLC 분석을 위한 시료 제조
시료는 반응 혼합물 슬러리를 5㎛ 시린지 필터를 통해 여과 제거함으로써 제조되었다. 여액을 완충액 A(30㎕/주입)를 사용하여 5배로 희석하였다.
8가지 조건(검정-Bu-0, Bu-1, Bu-2, Bu-4, Bu-8, Bu-16, Bu-32, 및 스케일 업(scale up))을 시험하였고, 이때 각각에서 수지의 양을 변화시켰다. 검정-Bu-0은 100㎕의 조 항체 1-vcMMAE 반응 용액(실시예 1)(18㎎/㎖)을 바이알 내에 충전시킴으로써 수행되었다. 완충액 A'(100㎕)를 첨가한 다음, 100㎕의 완충액 B를 첨가하였다. 이어서 상기 용액을 최저 셋팅(오비탈 믹서(orbital mixer)) 상에서 진탕하였다. 상청액의 시료를 20분에 채취하였다. 상청액을 샘플링하고 HIC-HPLC에 따라 측정하였다. 구체적으로는, 시료 제조는 30㎕의 상청액을 제거하고 이를 120㎕의 완충액 A를 사용하여 희석하고 내용물을 HIC-HPLC에 의해 측정함으로써 수행되었다. 분포의 개요에 대해 표 5를 참조하기 바란다.
검정-Bu-1 내지 Bu-32는 모두, 소수성 상호작용 수지를 전혀 함유하지 않고 대조물인 검정-Bu-0의 변형이었다. 검정-Bu-1은 완충액 B 첨가 전에 0.8㎎의 프리컨디셔닝된 n-Bu HIC 600M 수지를 용액에 첨가한 것을 제외하고는 검정-Bu-0과 동일하였다. 검정-Bu-2는 완충액 B 첨가 전에 1.6㎎의 프리컨디셔닝된 n-Bu HIC 600M 수지를 첨가한 것을 제외하고는 검정-Bu-0과 동일하였다. 검정-Bu-4는 완충액 B 첨가 전에 3.2㎎의 프리컨디셔닝된 n-Bu HIC 600M 수지를 첨가한 것을 제외하고는 검정-Bu-0과 동일하였다. 검정-Bu-8은 완충액 B 첨가 전에 6.4㎎의 프리컨디셔닝된 n-Bu HIC 600M 수지를 첨가한 것을 제외하고는 검정-Bu-0과 동일하였다. 검정-Bu-16은 완충액 B 첨가 전에 12.8㎎의 프리컨디셔닝된 n-Bu HIC 600M 수지를 첨가한 것을 제외하고는 검정-Bu-0과 동일하였다. 검정-Bu-32는 완충액 B 첨가 전에 25.6㎎의 프리컨디셔닝된 n-Bu HIC 600M 수지를 첨가한 것을 제외하고는 검정-Bu-0과 동일하였다. 이들 실험들 각각에 대해, 최종 NaCl 농도는 1.3M NaCl이었다. 8가지 조건으로부터의 결과가 하기 표 2 내지 5에 요약된다.
표 2는 다양한 ADC 종들(예를 들어, 항체 단독/비접합(% mAb), 2의 DAR을 갖는 ADC(% 2 부하), 4의 DAR을 갖는 ADC(% 4 부하) 등)의 분포의 개요를 제공한다. 표 2에 기재된 부하물 대 단백질 비는 산출된 항체 단백질 중량에 대한 수지의 건조 중량을 나타낸다. ADC 중량은 280㎚에서의 UV 흡수에 의해 측정된 바와 같은 총 단백질 함량을 약물 부하된 종들의 피크 면적(%)과 곱함으로써 산출된다. 표 2에 기재된 바와 같이, 수지 부하물:단백질 비는 특정 DAR들을 갖는 ADC(%)에 영향을 미친다. 예를 들어, 1.8의 수지 부하물 대 총 단백질 비(또는 6 내지 8 부하물에 대해 5.9 중량의 수지; 표 2의 "검정-Bu-4" 가로열 참조)는 HIC-HPLC에 의해 측정된 바와 같이, 94% 순도의 2 또는 4 약물-부하된 종들(각각 47%)을 초래하고, 6 또는 8의 DAR을 갖는 ADC의 수준은 검출되지 않았다. 표 3은 표 2에 기재된 각각의 실험을 위해 첨가된 Bu-HIC 수지의 양을 기재하고, 반면 표 4는 스크린 내에 존재하는 약물 부하된 종들의 순 중량의 산출을 기재한다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
상기 분석적 HIC 결과는 특정 약물 부하된 종들(예를 들어, 6 내지 8의 DAR을 갖는 ADC)의 존재를 감소시키기에 충분한 선택성을 나타냈다. 표 2 및 5로부터의 데이터는, 약 1.3M NaCl 농도의 최종 이온 강도 또는 이의 등가 이온 강도의 존재하에, 8-부하된 종들의 감소는 주로 0.5(구체적으로는 0.44중량%) 중량의 수지 충전을 사용함으로써 달성될 수 있고; 6/8 부하된 종들의 감소는 약 2 중량의 소수성 수지를 조 접합 반응 혼합물에 첨가함으로써 달성될 수 있다는 것을 시사한다. 4-8 약물 부하된 종들은 주로 약 3.5 중량의 수지(총 단백질 대비(표 5의 "검정-Bu-8" 가로열 참조))를 사용함으로써 제거될 수 있고, 2-8 부하된 종들은 총 단백질 대비 약 7 중량의 수지(표 5의 "검정-Bu-16" 가로열 참조)를 사용함으로써 제거될 수 있다. 이들 데이터는 또한, 건조 중량 기준으로 4 중량 부하 또는 2 중량 부하(총 단백질 대비)는 2 또는 4의 약물 부하된 종들의 최소한의 소모를 가지면서 고도의 약물 부하 제거에서 선택적이었음을 시사한다.
감소될 종들에 대한 수지 부하의 중량 비를 산출하고 표 5에 요약하였다.
분석적 HIC 연구 결과의 개요가 표 5에 제공된다.
Figure pct00005
요지
요약하면, 실시예 1로부터 수득된 반응 혼합물을 완충액 A'(4N NaCl, 0.05M pH 7 K2HPO4 인산염 완충액, 1㎖/㎖ 접합 반응 혼합물)로 희석하였다. 상기 희석된 반응 혼합물을 산출량의 예비-처리된 Bu-HIC 수지로 처리하고, 조대한 폴리프로필렌 필터를 통해 여과하고, 완충액 B(0.05M pH 7 K2HPO4 인산염 완충액, 1㎖/㎖ 접합 반응 혼합물)로 추가로 희석하였다. 수지의 산출량은, 표 5에 나타난 바와 같이, 조 혼합물로부터 제거될 약물 부하된 종들에 의존한다. 예를 들어, 6 및 8의 약물 부하된 종들의 중량의 대략 5 내지 10배의 수지 중량이 이들 종들을 조 혼합물로부터 제거하는 데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 수지/희석된 반응 혼합물을 적정 시간 동안 교반하고, 분석적 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 특정 약물 접합체 생성물의 감소에 대해 모니터링하였다.
실시예 3: 뱃치식 소수성 상호작용 ADC 정제의 스케일 업
적정 스크린으로부터 확인된 고도의 DAR ADC의 제거를 위한 최적 조건을 더 큰 규모의 정제를 위해 스케일 업하였다.
먼저 항체를 환원시키기 위해, 항체 1을 함유하는 용액(151㎎/㎖, 50㎖, 7.52g)을 500㎖ 플라스크에 첨가하였다. 상기 용액을 pH 6, 15mM 히스티딘 완충액(30㎖) 및 PBSE 완충액(360㎖; 125mM K2HPO4, 150mM NaCl; 6.3mM EDTA, pH 7.7)을 혼합하여 제조한 용액을 첨가함으로써 395㎖의 총 부피로 희석하였다. 상기 수득된 항체 용액을 37℃로 승온시켰다. 이어서 10.98mM TCEP 용액(12.1㎖, 2.05당량)을 상기 용액에 첨가하고 30분 동안 교반하였다. 이어서 상기 항체 용액을 20분에 걸쳐 주위 온도로 냉각시켰다.
일단 환원되면, 10mM vcMMAE DMSO 용액(28.8㎖, 4.72당량)을 상기 항체 용액에 첨가함으로써 항체 1을 vcMMAE에 접합시켰다. 다음으로 DMSO(21.2㎖)를 첨가하고, 이때 상기 용액을 주위 온도에서 45분 동안 교반하였다. 과량의 약물 링커를 50mM N-아세틸 시스테인(9.7㎖)을 첨가하여 켄칭시켰다. 상기 용액을 약 15분 동안 교반하였다. 항체 1의 vcMMAE에의 접합 후 UV 단백질 농도는 7.4g의 단백질인 것으로 측정되었고, HIC 분석은 4.1의 DAR(6-8 약물 부하된 종들을 합쳐 약 25 PA%(또는 1.85g))을 나타냈다.
이어서 상기 조 반응 혼합물을 동일 부피의 4N NaCl/0.05M pH 7 K2HPO4 완충액으로 희석하였다. 이어서 30.7g의 예비-세척된 Bu HIC 습윤 수지(KF = 56중량% 물; 건조 중량 기준으로 총 17.2g의 수지; 총 단백질 대비 2.3 중량의 수지; 6-8 부하된 종들 대비 9.3 중량의 수지)를 첨가한 다음, 50mM KH2PO4 pH7 완충액(460㎖)을 첨가하였다. 상기 항체 수지 용액을 실온에서 3시간 동안 부드럽게 교반하였다. 대안적으로, 상기 용액을 냉장고에서 12시간 동안 저장하고, 후속적으로 추가로 2.5시간 동안 교반하였다.
이어서 수지를 조대한 폴리프로필렌 필터를 통해 여과 제거하였다. 투명한 여액을 새로운 용기에 부었다. 1469g의 중량(밀도 = 1.06g/㎖)이 측정되었다. 정제된 ADC 용액의 해석적 분석은 상기 용액이 3.7㎎/㎖의 UV 단백질 함량 또는 5.07g의 총 단백질(전체 수율 67%)을 갖는다는 것을 나타냈다. HIC 트레이스 분석은 2.8의 DAR을 나타냈다.
정제 전 및 후 항체 용액들의 HIC-HPLC의 중첩을 나타내는 그래프가 도 2에 제공된다. 도 2에서 2개의 늦은 용리 피크는 6 내지 8의 DAR을 갖는 ADC들을 나타낸다(체류 시간: 각각 8.6분 및 9.6분). 이들 피크들은 정제 후 소실되며, 이는 0, 2 및 4 DAR ADC 종들은 영향을 받지 않는다는 것과, 당해 정제 공정은 높은(예를 들어, 6 내지 8) DAR ADC 종들만을 제거한다는 점에서 선택적이라는 것을 입증한다.
UF/DF (농축 및 최종 완충액 교환)
정제 후, 정제된 ADC 용액을 한외여과/정용여과(UF/DF) 및 최종 완충액 교환에 적용하였다. 여액을 UF/DF 저장기에 첨가하고, 상기 용액을 약 50㎎/㎖로 농축시키고, Pall Centramate Omega 30K LV1 파트 OS030C12P1 일련 번호 31061058R 상에서 약 25psi의 막 투과 압력 및 80 내지 100㎖/분의 연동 펌프 속력으로 1400g을 제거하였다(대략 1시간 농축). 약 50㎎/㎖로 농축 후, 10 DV의 15mM pH 6.0 히스티딘 완충액을 실행하였다. UF/DF 시스템을 배수시키고, 후속적으로 15mM pH 6.0 히스티딘 완충액(2×20㎖)으로 플러싱하였다. 농도는 (127g 용액) 40.1㎎/㎖에서 측정되었다. 15mM 히스티딘 pH 6.0 완충액을 사용하여 35.1㎎/㎖(141g BDS)의 농도로 희석하였다. BDS를 0.45마이크론 시린지 필터를 통해 여과한 다음, 0.2마이크론 멸균 여과를 수행하였다. 여액을 12개의 바이알에 각각 100㎎ 그리고 Falcon 관(3×35㎖)에 충전시켰다.
상기 UF/DF 공정은 뱃치식 정제 공정 전 또는 후에 사용될 수 있다.
별개 실험에서, 2g의 예비-처리된 Toyopearl Butyl-600M HIC 수지(일본 소재의 토소 바이오사이언스)/1g의 mAb를 혼합하고, 0.05M pH 7 K2HPO4 인산염 완충액으로 추가로 희석하고, 주위 온도에서 6시간 동안 교반하였다. 상기 슬러리를 조대한 폴리프로필렌 필터를 통해 여과하고, 완충액 A로 세척하였다(2 습윤 케익 층 용적). 상기 수득된 여액 및 세정액을 합하고, 정용여과에 의해 0.015M pH 6 히스티딘 완충액으로 완충액-교환하여, 정제된 항체 1-Val-Cit-MMAE를 수득하였고, 이를 항체 1-vcMMAEp라 지칭하였다. 당해 실시예에서, 전체 수율은 67%의 항체 1-vcMMAEp였다. 조 반응 혼합물 중 0 내지 4의 약물 부하된 종들의 양을 기준으로 하여, 정제 수율은 87%였다.
실시예 4: 항-EGFR 항체 1/mc-MMAF ADC의 제조
하기 실시예는 항-EGFR 항체 1 mc-MMAF ADC의 제조에 대해 설명한다.
항-EGFR 항체 1의 환원
항체 정제 후, 항체 용액(151㎎/㎖, 86㎖)을 1ℓ 플라스크에 충전시켰다. 이어서 상기 항체 용액을 PBSE 완충액(600㎖; 125mM K2HPO4, 150mM NaCl; 6.3mM EDTA, pH 7.7) 및 15mM 히스티딘 완충액(43㎖, pH 6)을 첨가하여 729㎖의 총 부피로 희석하였다. 단백질 함량은 UV 분광법(A280)에 의해 측정시 20.0㎎/㎖였다. 상기 항체 1 함유 용액을 37℃로 가열하였다. 이어서 9.67mM TCEP 용액(0.592㎖, 2.05당량)을 30분 동안 교반하에 항체 1의 용액에 첨가하였다. 상기 반응물을 후속적으로 20분에 걸쳐 주위 온도로 냉각시켰다.
mcMMAF의 항-EGFR 항체 1에의 접합
항-EGFR 항체 1를 후속적으로 말레이미도카프로일-MMAF(항체 1-mcMMAF)에 접합시켰다. 10mM mcMMAF/DMSO(38㎖, 4.72당량)를 충전시켰다. DMSO(18.6㎖)를 충전시켰다. 주위 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 100mM N-아세틸 시스테인(7.6㎖)을 첨가하고 15분 동안 교반함으로써 과량의 mc-MMAF를 켄칭시켰다. 상기 켄칭된 반응물을 냉장고에 넣었다.
조 항체 1-mcMMAF 반응 혼합물의 분석
반응 혼합물을 분석하여 단백질 농도를 측정하였다. UV 분광법(A280)은 17.7㎎/㎖의 단백질 농도를 나타냈다. 수득된 HIC 트레이스의 분석은 3.93의 DAR을 나타냈다(표 6). 평균 DAR은 PA%와 필수 약물 부하를 곱한 2, 4, 6 및 8 ADC 곱을 합하고 100으로 나누어 결정되었고, 예를 들어, [(5.72 PA% × 0) + (27.27 PA% × 2) + (41.08 × 4) + (16.79 × 6) + (9.13 × 8)] / 100 = 3.93이었다.
Figure pct00006
표 6에 기재된 바와 같이, 접합 반응은 소정 범위의 약물 부하, 즉 2 내지 8의 DAR을 갖는 ADC 종들의 혼합물을 초래하였다. 표 6에 기재된 바와 같이 적은 비율의 ADC들은 약물 부하를 갖지 않았다.
UF/DF (농축 및 최종 완충액 교환)
정제된 ADC 용액을 한외여과/정용여과(UF/DF) 및 최종 완충액 교환에 적용하였다. 접선 유동 여과를 Millipore Biomax Pellicon 3 88㎠ 멤브레인 상에서 수행하였다. 시료를 20psi(TMP) 및 40㎖/분의 교차유동에서 100㎎/㎖로 농축시켰다. 단백질을 후속적으로 15mM 히스티딘 완충액(pH 6)을 사용하여 60㎎/㎖의 농도로 희석시켰으며, 이는 대략 20psi(TMP)에서 40㎖/분의 속도로 10 DV를 수행함에 의한 것이다. 상기 수득된 용액을 0.45㎛ Millipak 20 필터(밀리포어(Millipore))를 통해 여과하였다. 단백질 농도는 UV 분광법(A280)을 통해 59.7㎎/㎖인 것으로 측정되었다. UF/DF 정제된 벌크 mc-MMAF 항체 1 용액의 58.6㎖ 시료를 후속적으로 15mM 히스티딘 완충액(pH 6.0)을 사용하여 100㎖의 최종 부피로 희석하였다. UV 분광법에 의해 측정된 농도는 35.7㎎/㎖였다. 이어서 상기 단백질 용액을 0.2㎛ Millipak 20 필터(밀리포어)를 통해 멸균 125㎖ PETG 병 내로 여과하였다. 상기 정제된 mc-MMAF 항체 1 용액을 동결시키고 -80℃ 초저온 동결기(cryofreezer)에서 저장하였다.
실시예 5: 소수성 수지를 사용하는 mc-MMAF ADC의 뱃치식 정제
실시예 4로부터의 정제된 항체 1-mc-MMAF를 수지 처리 정제 스크린에 적용하였다. 상기 스크린은 총 수지 충전량(0.5, 1, 2 및 3 중량; 정제된 항체 1-mc-MMAF는 9.5㎎/㎖ 내지 34㎎/㎖에서 가변적임), NaCl 농도(0N, 0.65N, 1.3N) 및 체류 시간(0.5시간, 4시간 및 20시간)을 변화시킴으로써 수행되었다. 표 7은 다양한 ADC 종들의 분포의 개요를 수지 충전량, NaCl 농도 및 체류 시간의 함수로서 제공한다. DAR 값은 상기에 기재된 바와 같은 HIC 트레이스 분석에 의해 측정되었다. 산출된 수율은 UV 분광법에 의해 측정되고, 표 8에 요약된다.
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
요약하면, 표 7 및 8에 기재된 수지 적정 스크린은 수지 부하, NaCl 농도 및 체류 시간이 실시예 4로부터의 UF/DF 정제된 항체 1-mc-MMAF ADC로부터 수득되는 정제 공정(DAR, 단백질 농도)에 미치는 영향을 결정하기 위해 수행되었다. 표 7에 나타낸 수지의 산출량은 조 분포물로부터 제거될 약물 부하된 종들에 의존한다. 실시예 4로부터의 항체 1-mcMMAF를 사용하는 일련의 반응 조건을 아래에 기재된 바와 같이 시험하였다(표 7 및 8에 나타냄). 완충액 A는 다음의 것들을 함유한다: 4.35g K2HPO4; 58.5g NaCl; 495㎖ 물(WFI); 5㎖ 1N HCl을 사용해 pH를 7.0으로 조절함.
반응 1: 0N NaCl; 수지 함유하지 않음:
1) 항체 1-mcMMAF(1.00㎖, 35㎎)를 4㎖ 바이알에 충전시킨다.
2) 0㎎ Bu-HIC 수지를 충전시킨다.
3) 진탕한다.
4) 0.5, 4 및 20시간에 상청액 시료를 추출한다(시린지 필터를 통해 50㎕를 제거하고, 당해 상청액 시료 20㎕를 2N NaCl/0.05M K2HPO4 pH 7 완충액(완충액 A)을 사용해 희석하여 1/50x를 수득한다).
5) UV 단백질 농도에 대해 분석하고, HIC 분석을 수행한다.
반응 2: 0N NaCl; 0.5 중량 수지:
1) 항체 1-mcMMAF(1.00㎖, 35㎎)를 4㎖ 바이알에 충전시킨다.
2) 17.5㎎ Bu-HIC 수지를 충전시킨다.
3) 진탕한다.
4) 0.5, 4 및 20시간에 상청액 시료를 추출한다(시린지 필터를 통해 50㎕를 제거하고, 당해 상청액 시료 20㎕를 2N NaCl/0.05M K2HPO4 pH 7 완충액(완충액 A)을 사용해 희석하여 1/50x를 수득한다).
5) UV 단백질 농도에 대해 분석하고, HIC 분석을 수행한다.
반응 3: 0N NaCl; 1 중량 수지:
1) 항체 1-mcMMAF(1.00㎖, 35㎎)를 4㎖ 바이알에 충전시킨다.
2) 350㎎ Bu-HIC 수지를 충전시킨다.
3) 진탕한다.
4) 0.5, 4 및 20시간에 상청액 시료를 추출한다(시린지 필터를 통해 50㎕를 제거하고, 당해 상청액 시료 20㎕를 2N NaCl/0.05M K2HPO4 pH 7 완충액(완충액 A)을 사용해 희석하여 1/50x를 수득한다).
5) UV 단백질 농도에 대해 분석하고, HIC 분석을 수행한다.
반응 4: 0N NaCl; 2 중량 수지:
1) 항체 1-mcMMAF(1.00㎖, 35㎎)를 4㎖ 바이알에 충전시킨다.
2) 70㎎ Bu-HIC 수지를 충전시킨다.
3) 진탕한다.
4) 0.5, 4 및 20시간에 상청액 시료를 추출한다(시린지 필터를 통해 50㎕를 제거하고, 당해 상청액 시료 20㎕를 2N NaCl/0.05M K2HPO4 pH 7 완충액(완충액 A)을 사용해 희석하여 1/50x를 수득한다).
5) UV 단백질 농도에 대해 분석하고, HIC 분석을 수행한다.
반응 5: 0N NaCl; 3 중량 수지:
1) 항체 1-mcMMAF(1.00㎖, 35㎎)를 4㎖ 바이알에 충전시킨다.
2) 105㎎ Bu-HIC 수지를 충전시킨다.
3) 진탕한다.
4) 0.5, 4 및 20시간에 상청액 시료를 추출한다(시린지 필터를 통해 50㎕를 제거하고, 당해 상청액 시료 20㎕를 2N NaCl/0.05M K2HPO4 pH 7 완충액(완충액 A)을 사용해 희석하여 1/50x를 수득한다).
5) UV 단백질 농도에 대해 분석하고, HIC 분석을 수행한다.
반응 6: 0.65N NaCl; 수지를 함유하지 않음:
1) 항체 1-mcMMAF(1.00㎖, 35㎎)를 4㎖ 바이알에 충전시킨다.
2) 0.195㎖의 4N NaCl/0.05M K2HPO4 pH 7 완충액(완충액 A')을 충전시킨다.
3) 0㎎ Bu-HIC 수지를 충전시킨다.
4) 진탕한다.
5) 0.5, 4 및 20시간에 상청액 시료를 추출한다(시린지 필터를 통해 50㎕를 제거하고, 당해 상청액 시료 20㎕를 2N NaCl/0.05M K2HPO4 pH 7 완충액(완충액 A)을 사용해 희석하여 1/50X를 수득한다).
6) UV 단백질 농도에 대해 분석하고, HIC 분석을 수행한다.
반응 7: 0.65N NaCl; 0.5 중량 수지:
1) 항체 1-mcMMAF(1.00㎖, 35㎎)를 4㎖ 바이알에 충전시킨다.
2) 0.195㎖의 4N NaCl/0.05M K2HPO4 pH 7 완충액(완충액 A')을 충전시킨다.
3) 17.5㎎ Bu-HIC 수지를 충전시킨다.
4) 진탕한다.
5) 0.5, 4 및 20시간에 상청액 시료를 추출한다(시린지 필터를 통해 50㎕를 제거하고, 당해 상청액 시료 20㎕를 2N NaCl/0.05M K2HPO4 pH 7 완충액(완충액 A)을 사용해 희석하여 1/50X를 수득한다).
6) UV 단백질 농도에 대해 분석하고, HIC 분석을 수행한다.
반응 8: 0.65N NaCl; 1 중량 수지:
1) 항체 1-mcMMAF(1.00㎖, 35㎎)를 4㎖ 바이알에 충전시킨다.
2) 0.195㎖의 4N NaCl/0.05M K2HPO4 pH 7 완충액(완충액 A')을 충전시킨다.
3) 35㎎ Bu-HIC 수지를 충전시킨다.
4) 진탕한다.
5) 0.5, 4 및 20시간에 상청액 시료를 추출한다(시린지 필터를 통해 50㎕를 제거하고, 당해 상청액 시료 20㎕를 2N NaCl/0.05M K2HPO4 pH 7 완충액(완충액 A)을 사용해 희석하여 1/50X를 수득한다).
6) UV 단백질 농도에 대해 분석하고, HIC 분석을 수행한다.
반응 9: 0.65N NaCl; 2 중량 수지:
1) 항체 1-mcMMAF(1.00㎖, 35㎎)를 4㎖ 바이알에 충전시킨다.
2) 0.195㎖의 4N NaCl/0.05M K2HPO4 pH 7 완충액(완충액 A')을 충전시킨다.
3) 70㎎ Bu-HIC 수지를 충전시킨다.
4) 진탕한다.
5) 0.5, 4 및 20시간에 상청액 시료를 추출한다(시린지 필터를 통해 50㎕를 제거하고, 당해 상청액 시료 20㎕를 2N NaCl/0.05M K2HPO4 pH 7 완충액(완충액 A)을 사용해 희석하여 1/50X를 수득한다).
6) UV 단백질 농도에 대해 분석하고, HIC 분석을 수행한다.
반응 10: 0.65N NaCl; 3 중량 수지:
1) 항체 1-mcMMAF(1.00㎖, 35㎎)를 4㎖ 바이알에 충전시킨다.
2) 0.195㎖의 4N NaCl/0.05M K2HPO4 pH 7 완충액(완충액 A')을 충전시킨다.
3) 105㎎ Bu-HIC 수지를 충전시킨다.
4) 진탕한다.
5) 0.5, 4 및 20시간에 상청액 시료를 추출한다(시린지 필터를 통해 50㎕를 제거하고, 당해 상청액 시료 20㎕를 2N NaCl/0.05M K2HPO4 pH 7 완충액(완충액 A)을 사용해 희석하여 1/50X를 수득한다).
6) UV 단백질 농도에 대해 분석하고, HIC 분석을 수행한다.
반응 11: 1.3N NaCl; 수지를 함유하지 않음:
1) 항체 1-mcMMAF(1.00㎖, 35㎎)를 4㎖ 바이알에 충전시킨다.
2) 0.48㎖의 4N NaCl/0.05M K2HPO4 pH 7 완충액(완충액 A')을 충전시킨다.
3) 0㎎ Bu-HIC 수지를 충전시킨다.
4) 진탕한다.
5) 0.5, 4 및 20시간에 상청액 시료를 추출한다(시린지 필터를 통해 50㎕를 제거하고, 당해 상청액 시료 20㎕를 2N NaCl/0.05M K2HPO4 pH 7 완충액(완충액 A)을 사용해 희석하여 1/50X를 수득한다).
6) UV 단백질 농도에 대해 분석하고, HIC 분석을 수행한다.
반응 12: 1.3N NaCl; 0.5 중량 수지:
1) 항체 1-mcMMAF(1.00㎖, 35㎎)를 4㎖ 바이알에 충전시킨다.
2) 0.48㎖의 4N NaCl/0.05M K2HPO4 pH 7 완충액(완충액 A')을 충전시킨다.
3) 17.5㎎ Bu-HIC 수지를 충전시킨다.
4) 진탕한다.
5) 0.5, 4 및 20시간에 상청액 시료를 추출한다(시린지 필터를 통해 50㎕를 제거하고, 당해 상청액 시료 20㎕를 2N NaCl/0.05M K2HPO4 pH 7 완충액(완충액 A)을 사용해 희석하여 1/50X를 수득한다).
6) UV 단백질 농도에 대해 분석하고, HIC 분석을 수행한다.
반응 13: 1.3N NaCl; 1 중량 수지:
1) 항체 1-mcMMAF(1.00㎖, 35㎎)를 4㎖ 바이알에 충전시킨다.
2) 0.48㎖의 4N NaCl/0.05M K2HPO4 pH 7 완충액(완충액 A')을 충전시킨다.
3) 35㎎ Bu-HIC 수지를 충전시킨다.
4) 진탕한다.
5) 0.5, 4 및 20시간에 상청액 시료를 추출한다(시린지 필터를 통해 50㎕를 제거하고, 당해 상청액 시료 20㎕를 2N NaCl/0.05M K2HPO4 pH 7 완충액(완충액 A)을 사용해 희석하여 1/50X를 수득한다).
6) UV 단백질 농도에 대해 분석하고, HIC 분석을 수행한다.
반응 14: 1.3N NaCl; 2 중량 수지:
1) 항체 1-mcMMAF(1.00㎖, 35㎎)를 4㎖ 바이알에 충전시킨다.
2) 0.48㎖의 4N NaCl/0.05M K2HPO4 pH 7 완충액(완충액 A')을 충전시킨다.
3) 70㎎ Bu-HIC 수지를 충전시킨다.
4) 진탕한다.
5) 0.5, 4 및 20시간에 상청액 시료를 추출한다(시린지 필터를 통해 50㎕를 제거하고, 당해 상청액 시료 20㎕를 2N NaCl/0.05M K2HPO4 pH 7 완충액(완충액 A)을 사용해 희석하여 1/50X를 수득한다).
6) UV 단백질 농도에 대해 분석하고, HIC 분석을 수행한다.
반응 15: 1.3N NaCl; 3 중량 수지:
1) 항체 1-mcMMAF(1.00㎖, 35㎎)를 4㎖ 바이알에 충전시킨다.
2) 0.48㎖의 4N NaCl/0.05M K2HPO4 pH 7 완충액(완충액 A')을 충전시킨다.
3) 105㎎ Bu-HIC 수지를 충전시킨다.
4) 진탕한다.
5) 0.5, 4 및 20시간에 상청액 시료를 추출한다(시린지 필터를 통해 50㎕를 제거하고, 당해 상청액 시료 20㎕를 2N NaCl/0.05M K2HPO4 pH 7 완충액(완충액 A)을 사용해 희석하여 1/50X를 수득한다).
6) UV 단백질 농도에 대해 분석하고, HIC 분석을 수행한다.
수지 제조 및 산출:
수지의 칼 피셔(KF) 적정:
부틸 = 72중량% 물(28% 역가). 수지의 모든 충전은 건조 중량 기준에 기초한다는 것을 주지해야 한다.
건조 중량 수지 충전의 시료 산출: 35㎎ 수지 충전/0.28 건조 중량 역가 = 125㎎의 습윤 수지 충전.
일반적으로, 수지의 역가는 100% - 칼 피셔 분석으로부터의 물 w/w%에 의해 산출되었다.
실시예 6: 2.7, 4 및 5.5의 평균 DAR을 갖는 ADC 혼합물의 정제
하기 실시예는 2.7의 평균 DAR 또는 5.5의 더 무겁게 부하된 평균 DAR을 갖는 항체 1-vc-MMAE 또는 항체 1-mc-MMAF를 포함하는 여러 상이한 ADC 혼합물들의 뱃치식 정제에 대해 설명한다. 추가로, 4의 평균 DAR을 갖는 항체 1-vcMMAE를 포함하는 ADC 혼합물도 설명된다. 더욱 구체적으로는, 수지 중량, NaCl 농도가 2가지 상이하게 부하된 ADC들(항체 1-vc-MMAE 및 항체 1-mc-MMAF)의 정제 공정(DAR, 단백질 농도)에 미치는 영향을 결정하기 위해 스크린을 수행하였으며, 이때 정제 공정내 유입물로서의 6 및 8 부하된 종들의 양을 변화시켰다. 일련의 반응 조건을 아래에 기재된 바와 같이 시험하였다.
실시예 6에서 사용된 5개의 조 ADC 혼합물(1 내지 5)을 아래에 기재된 바와 같이 제조하였다. 4개의 조 ADC 혼합물 (1) 항체 1-vcMMAE DAR 2.7(평균), (2) 항체 1-mcMMAF DAR 2.7(평균), (3) 항체 1-vcMMAE DAR 5.5(평균) 및 (4) 항체 1-mcMMAF DAR 5.5(평균)를 실시예 1 및 도 1에 기재된 방법에 따라 제조하고, 여기서 항체 1의 환원을 TCEP(1.3 또는 2.65 몰 당량)를 사용하여 달성하고, 접합을 mc-MMAF 또는 vcMMAE(3 또는 6당량)를 사용하여 달성하여, 항체-1-vcMMAE DAR 2.7(평균) 및 5.5(평균) ADC 혼합물들 및 항체-1-mcMMAF DAR 2.7(평균) 및 5.5(평균) ADC 혼합물들을 제조하였다. 추가로, 5번째 조 ADC 혼합물 (5) 항체 1-vcMMAE DAR 4(평균)를 실시예 1에 따라 제조하였다.
스크리닝 절차를 다음의 프로토콜에 따라 수행하였다. 먼저, (대표적으로 실시예 2의 재료 및 방법 항목에 기재된 바와 같이 제조된) 습윤 Bu-HIC 수지의 각각의 양을 4㎖ 바이알 내에 칭량하였다. 수지의 양은 몇가지 계산에 기초하였다. 먼저, 필요한 건조 수지의 양은 6 및 8 부하된 종들의 질량에 기초하였다. 상기 질량은 조 ADC 출발 물질 용액에 기초하여 다음과 같이 산출되었다:
제거될 종들의 질량:
Σ(6 부하 + 8 부하), ㎎ = 20㎎의 조 ADC(1 내지 5) × (Σ(6 부하 pa% + 8 부하 pa%))/100
예를 들어, 바이알 13의 경우:
Σ(6 부하 + 8 부하), ㎎ = 20㎎의 mAb × (10.7/100) = 2.14㎎ Σ(6 부하 + 8 부하)
다음으로, 6 부하 및 8 부하의 총 질량을 수지의 목표 중량으로 곱하였다. 예를 들어, 바이알 13의 경우:
5 중량의 수지 = 5×2.14㎎ Σ(6 부하 + 8 부하) = 10.7㎎ 건조 수지
7.5 중량의 수지 = 7.5×2.14㎎ Σ(6 부하 + 8 부하) = 16.1㎎ 건조 수지
10 중량의 수지 = 10×2.14㎎ Σ(6 부하 + 8 부하) = 21.4㎎ 건조 수지
마지막으로, 수지를 물, 염화나트륨 및 K2HPO4 함량에 대해 보정하였다. 무기 염 보정은, 수지가 여과에 의해 사전 단리되고 1.95M NaCl/0.05M K2HPO4 용액으로 단리되었기 때문에 수행되었다. (Bu-HIC 수지를 여과하고, 1.95M NaCl/0.05M K2HPO4 용액으로 수회 세척하였다. 수지의 수분 함량은 KF(칼 피셔 수분 적정) 분석에 의해 59.0w/w%에서 결정되었다. 이어서 세척 성분(10.6w/w% NaCl, 0.8w/w% K2HPO4, 88.6% 물)의 w/w% 농도를 사용하여 습윤 수지(51.8g 습윤 수지, 30.6g 물, 3.6g NaCl 및 0.3g K2HPO4) 중 NaCl 및 K2HPO4 중량을 추정하고, 이어서 이를 감산하여 건조 수지의 양(17.3g)을 산출하였다.)
예를 들어, 5 중량의 건조 수지에서 바이알 13의 경우:
10.7㎎ 건조 수지/(0.334㎎ 건조 수지/㎎ 습윤 수지) = 32.0㎎ 습윤 수지
Bu-HIC 수지 첨가 후, 조 ADC 혼합물들(1 내지 5)(1.1 내지 1.2㎖, 20㎎)을 4㎖ 바이알에 충전시켰다. 조 ADC 용액의 부피를 20㎎의 총 단백질을 목표로 조절하였다.
다음으로, 소정 범위의 염화나트륨 용액을 제조하였다. 0.55 내지 0.6㎖(ADC 용액 부피의 대략 ½)의 각각의 몰 농도의 염화나트륨 용액/50mM K2PO4/pH 7을 여러 바이알에 충전시켰다. NaCl 용액들의 초기 농도는 pH 7에서 일정 농도의 50mM K2HPO4에서 0M, 1.95M, 3.9M 및 5.85M이었다. ADC 용액에 첨가된 후, NaCl 농도가 희석으로 인해 0, 0.65, 1.3 및 1.95M NaCl로 감소되었다. 이어서 바이알 내용물(DAR 2.5 또는 5.5의 ADC + 다양한 농도의 염 용액)을 밤새(대략 20시간) 진탕시켰다.
밤새(>20시간) 교반한 후, 상청액 시료를 채취하였다(시린지 필터를 통해 0.6㎖를 제거하고, 상기 상청액 시료 75㎕를 924㎕ 1.95N NaCl/0.05M K2HPO4 pH 7 완충액으로 희석하였다). 후속 HPLC-HIC 분석을 수행하여 단백질 회수율 뿐만 아니라 각각의 부하된 종들의 PA%를 측정하였다. 연구 결과가 하기 표 9 및 10에 기재된다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
요약하면, 실시예 6, 표 9 및 10에 기재된 수지 적정 스크린은 수지 부하 및 NaCl 농도가 2.7 내지 5.5 범위의 DAR(평균)을 갖는 조 항체-1-mcMMAF 및 항체-1-vcMMAE ADC 혼합물들 (1) 내지 (5)로부터 수득되는 정제 공정(DAR, 단백질 농도)에 미치는 영향을 결정하기 위해 수행되었다. 표 9 및 10에 나타낸 수지의 산출량은 조 분포물로부터 제거될 약물 부하된 종들에 의존한다. 예를 들어, 6 및 8 약물 부하된 종들의 중량의 대략 5 내지 10배의 수지 중량은 조 반응 혼합물로부터 이들 종들을 제거하기에 효과적인 것으로 밝혀졌다.
실시예 7: 항체 1-vc-MMAE의 뱃치식 및 유동 관통식 정제
뱃치식 정제 방법
ADC, 즉, 항체 1-vc-MMAE의 조 분포물의 생성을 실시예 1에 기재된 방법에 따라 수행하였다.
이어서 상기 반응 혼합물을 pH 6.8에서 50mM 인산칼륨, 2M NaCl 및 완충액으로 사전 세척된 Bu-HIC 수지로 처리하였다. 상기 수지/반응 혼합물을 후속적으로 교반하고, (위의 실시예에 기재된 방법에 따라) 분석적 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 약물 접합체 생성물의 제거에 대해 모니터링하였다. 항체 1-vc-MMAE의 뱃치식 정제를 설명하는 당해 추가 실험의 결과가 표 11에 기재된다. 표 11에 나타낸 체류 시간은 분석적 HPLC 분석에서 화합물이 용리되는 데 걸리는 시간이다.
Figure pct00016
표 11에 기재된 바와 같이, 항체-1-vc-MMAE의 뱃치식 정제는 초기 반응 혼합물에 비해 더 낮은 평균 DAR을 초래하였다.
유동 관통식 정제 방법
대안적으로, 항체 1-vc-MMAE의 정제를 유동 관통식 정제 방식을 사용하여 수행할 수 있다.
유동 관통식 정제를 일반적으로 다음의 방법에 따라 수행하였다: Tosoh Bioscience Butyl 600 M 수지의 2ℓ 뱃치를 제조하였다. 수지를 2ℓ 소결 깔대기 내로 여과하였다(상기 깔대기는 IPA로 사전 세척되고 건조되었음에 주목한다). 여과된 수지를 pH 6.8에서 2×2ℓ의 50mM 인산칼륨, 2M NaCl 인산염 완충액으로 세척하였다. 수지 역가는 칼 피셔 수분 분석에 의해 27%인 것으로 측정되었다(상기 분석은 73w/w% 물의 존재를 나타냈고; 당해 실시예에서는 수지의 역가 산출에서 소량의 무기 잔류물(NaCl 및 K2HPO4)이 사용되지 않았음에 주목한다).
134.9g의 항체 1로부터 출발하여 실시예 1에 기재된 환원/접합 방법을 사용하였다. 실시예 1에 기재된 프로토콜과 비교하여 하나의 변화는 2.15당량의 TCEP를 사용하였다는 것이다(이는 약간 더 높은 평균 DAR을 초래하였다). 당해 공정은 33.8 pa%를 갖는 6 내지 8 부하된 종들을 초래하였다. 따라서, 45.6g의 6 내지 8 부하된 종들이 조 반응 혼합물 중에 존재하였다.
5배 부하의 소수성 수지를 사용하는 경우, 228.5g 건조 중량의 소수성 수지가 필요하였다(즉, 45.6g의 6 내지 8 부하된 종들 곱하기 5 = 228.5g의 역가 조정된 수지). 27%의 수지 역가(주의: 수지의 역가는 100% - 칼 피셔 분석으로부터의 물 w/w%에 의해 산출된다)에서, 228.5g의 역가 조정된 수지와 동등한 856g 습윤 중량의 수지(즉, 산출: 228.5g 역가 조정 수지/(27g 건조 중량 수지/100g 습윤 수지) = 856g 습윤 수지 필요량)를 4인치×7인치인 스테인레스 강 컬럼 내로 로딩하였다. 이어서 상기 조 반응 혼합물을 멸균 20ℓ 카보이(carboy)로부터 사이즈 35 파메드 튜빙(Pharmed tubing)을 사용하는 연동 펌프 및 압력 센서를 통해 185㎖/분의 속도로 수지 층 위에서 제2의 20ℓ 멸균 카보이 내로 펌핑하였다. 이어서 상기 수집된 여액을 수지 층을 통해 다시 펌핑하여, 최종 여액 중에서 더 낮은 DAR 종들을 함유하는 원하는 ADC 혼합물을 수집하였다. 사용된 유동 관통식 공정은 이중 통과 공정이었다.
이어서 상기 수지 층을 여러 번 세척하여, 높은 DAR 종들(약물 부하물 6 내지 8)은 수지에 결합된 채 남겨 두고, 잔류하는 미결합의 더 낮은 DAR 종들을 세척하였다. 구체적으로는, 먼저, 수지 층을 600㎖의 50mM 인산칼륨, 2M NaCl을 WFI를 사용해 1200㎖로 희석하여 제조된 1200㎖ 1N NaCl(95mS)로 세척하였다. 이어서 상기 수지 층을 450㎖의 50mM 인산칼륨, 2M NaCl을 WFI를 사용해 1200㎖로 희석하여 제조된 1200㎖ 0.75N NaCl(71mS)로 세척하였다. 3차 세척은 300㎖의 50mM 인산칼륨, 2M NaCl을 900㎖ WFI로 희석하여 제조된 1200㎖ 0.5N NaCl(50mS)을 사용하여 수행하였다. 4차 세척은 150㎖의 50mM 인산칼륨, 2M NaCl을 WFI를 사용해 1200㎖로 희석하여 제조된 1200㎖ 0.25N NaCl(26mS)을 사용하여 수행하였다. 수지 세척으로부터의 여액을 대부분 수집하고, 상기 유동 관통식 공정으로부터의 최종 여액과 합하여, 벌크(즉, 최종 여액 + 세척액)를 수득하였다.
명백하게는, 2 내지 4의 DAR을 갖는 정제된 ADC들은 상기에 기재된 초기 다중-통과 절차로부터 최종 여액 중에서 수득되기 때문에, 수지 층의 세척은 선택적이다. 1차 세척은 세척으로부터 약 10% 회수율을 제공하였고, 반면 후속 세척은 약 1 내지 2% 회수율을 초래하였다.
상기 벌크를 접선 유동 여과(TFF)에 의해 농축시켜 대략 1200g의 농축된 ADC 용액을 수득한 다음, pH 6에서 10 다이아볼륨(diavolume)의 15mM 히스티딘 완충액으로 교환하여, 원하는 DAR 0 내지 4 종들의 항체 1-vc-MMAE를 최종 단백질 농도 35㎎/㎖(81g 단리됨, 66% 수율, DAR 0 내지 4에 대해 91% 회수)로 수득하였다. 따라서, 유동 관통식 정제 방법은 DAR 종들의 분리, 즉, 6 내지 8의 고도 부하된 종들을 이보다 더 낮은 DAR 종들로부터 분리하는 데에 성공적이었다(하기 표 12에 더욱 상세히 기재됨).
뱃치식 정제 방식과 유동 관통식 정제 방식의 비교(표 12)를 수행하였다. 둘 모두의 경우, 단백질에 대한 수지의 부하는 항체 1-vc-MMAE의 고도 부하된 DAR 6 내지 8 종들의 질량에 대해 5 중량의 수지였다. (유동 관통식 실험예에서 약간 더 높은 당량의 TCEP가 사용됨으로 인해) 개별 종들의 상대적 양에서 약간의 차이가 존재하기는 하지만, 이들 방법들의 고도 DAR 종들의 제거 효용성은 대등하였다. 표 12에서 "유동 관통식 방법" 열에 나타낸 물질은 유동 관통식 방법으로부터 합해진 여액 및 세척으로부터의 물질을 포함한다(통칭하여 "벌크"라고 지칭함).
Figure pct00017
결론으로서, 뱃치식 정제 방법과 유동 관통식 정제 방법은 둘 다 2 내지 4의 DAR을 갖는 ADC를 농화시키는 데 사용되었다. 이들 정제 방법들은 둘 다 (고도 약물 부하된 종들의 분획과 결합된) 단백질(ADC) 중량 대 사용된 수지 부하물의 비에 의존하였고, ADC 혼합물 중 6 내지 8(6 이상)의 약물 부하된 종들의 중량의 5 내지 6배인 소수성 수지 중량은 6 내지 8의 DAR을 갖는 ADC의 수준의 실질적으로 감소된 수준을 초래하였다. 표 12에 기재된 바와 같이, 이들 공정들은 둘 다 4 이하의 DAR을 갖는 ADC를 95% 이상 포함하는 조성물 또는 6 이상의 약물 부하된 종들을 4% 미만으로 갖는 ADC을 포함하는 조성물을 초래한다.
본원에 기재된 실시예 및 양태는 단지 예시를 목적으로 하며, 이를 감안하여 다양한 변형 또는 변화가 당해 기술분야의 숙련가에게 시사될 것이며, 상기 변형 또는 변화는 첨부된 특허청구범위의 취지 및 범위 내에 포함된다는 것을 이해해야 한다. 본원에서 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 인용에 의해 본원에 포함된다.
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Claims (50)

  1. 항체 약물 접합체(ADC: Antibody Drug Conjugate)를 포함하는 조성물을 수득하는 방법으로서, 상기 방법은
    4 이하의 약물 부하된 종들(drug loaded species) 및 6 이상의 약물 부하된 종들을 포함하는 ADC 혼합물을 소수성 수지와 접촉시키는 단계(여기서, 상기 ADC 혼합물과 접촉되는 상기 소수성 수지의 양은 상기 6 이상의 약물 부하된 종들의 수지에의 결합을 허용하기에 충분하지만 상기 4 이하의 약물 부하된 종들의 유의한 결합은 허용하지 않는다); 및
    상기 소수성 수지를 상기 ADC 혼합물로부터 제거하여, ADC를 포함하는 조성물을 수득하는 단계를 포함하고,
    상기 조성물은 상기 6 이상의 약물 부하된 종들을 15% 미만으로 포함하고,
    상기 ADC는 오리스타틴에 접합된 항체를 포함하는, 항체 약물 접합체(ADC)를 포함하는 조성물을 수득하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 6 이상의 약물 부하된 종들을 10% 미만으로 포함하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 6 이상의 약물 부하된 종들을 5% 이하로 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 수지 중량은 상기 ADC 혼합물 중의 상기 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 3 내지 12배인, 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 수지 중량은 상기 ADC 혼합물 중의 상기 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 4 내지 8배인, 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 수지 중량은 상기 ADC 혼합물 중의 상기 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 5 내지 10배인, 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 수지 중량은 상기 ADC 혼합물 중의 상기 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 6 내지 12배이고, 상기 ADC 혼합물은 0 내지 1N NaCl 또는 이의 등가 이온 강도를 포함하는, 방법.
  8. 제4항에 있어서, 상기 소수성 수지 중량은 상기 ADC 혼합물 중의 상기 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 3 내지 6배이고, 상기 ADC 혼합물은 1 내지 2N NaCl 또는 이의 등가 이온 강도를 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 수지 중량은 상기 ADC 혼합물 중의 상기 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 3 내지 7배이고, 상기 오리스타틴은 모노메틸오리스타틴 E(MMAE)인, 방법.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 수지 중량은 상기 ADC 혼합물 중의 상기 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 5 내지 10배이고, 상기 오리스타틴은 모노메틸오리스타틴 F(MMAF)인, 방법.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 수지 중량은 상기 ADC 혼합물 중의 상기 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 3 내지 7배이고, 상기 오리스타틴은 모노메틸오리스타틴 E(MMAE)인, 방법.
  12. 4.5 이하의 평균 약물-대-항체 비(DAR)를 갖고, 원치 않는 ADC를 15% 미만으로 포함하는 조성물의 제조 방법으로서, 상기 방법은
    ADC 혼합물을 소수성 수지와 접촉시키는 단계(여기서, 상기 ADC 혼합물과 접촉되는 상기 소수성 수지의 양은 상기 원치 않는 ADC의 결합을 허용하기에 충분하다); 및
    상기 소수성 수지를 상기 ADC 혼합물로부터 제거하여, 4.5 이하의 평균 DAR을 갖고, 상기 원치 않는 ADC를 15% 미만으로 포함하는 조성물을 생성하는 단계를 포함하고,
    상기 ADC는 오리스타틴에 접합된 항체를 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 4.5 이하의 평균 DAR을 갖는 상기 조성물은 상기 원치 않는 ADC를 10% 미만으로 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 원치 않는 ADC들은 6 및 8의 약물 부하된 종들인, 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC 혼합물에 첨가되는 소수성 수지의 양은 상기 ADC 혼합물 중의 상기 원치 않는 ADC의 중량의 3 내지 12배인 수지 중량인, 방법.
  16. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC 혼합물에 첨가되는 소수성 수지의 양은, 상기 ADC 혼합물 중의 상기 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 4 내지 8배인 수지 중량인, 방법.
  17. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC 혼합물에 첨가되는 소수성 수지의 양은 상기 ADC 혼합물 중의 상기 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 5 내지 7배인 수지 중량인, 방법.
  18. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 수지 중량은 상기 ADC 혼합물 중의 상기 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 6 내지 12배이고, 상기 ADC 혼합물은 0 내지 1N NaCl 또는 이의 등가 이온 강도를 포함하는, 방법.
  19. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 수지 중량은 상기 ADC 혼합물 중의 상기 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 3 내지 6배이고, 상기 ADC 혼합물은 1 내지 2N NaCl 또는 이의 등가 이온 강도를 포함하는, 방법.
  20. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 수지 중량은 상기 ADC 혼합물 중의 상기 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 3 내지 7배이고, 상기 오리스타틴은 모노메틸오리스타틴 E(MMAE)인, 방법.
  21. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 수지 중량은 상기 ADC 혼합물 중의 상기 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 5 내지 10배이고, 상기 오리스타틴은 모노메틸오리스타틴 F(MMAF)인, 방법.
  22. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 수지 중량은 상기 ADC 혼합물 중의 상기 6 이상의 약물 부하된 종들의 중량의 3 내지 7배이고, 상기 오리스타틴은 모노메틸오리스타틴 E(MMAE)인, 방법.
  23. 제13항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 4 이하의 평균 DAR을 갖는, 방법.
  24. 제13항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 3.5 이하의 평균 DAR을 갖는, 방법.
  25. 제13항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 3 이하의 평균 DAR을 갖는, 방법.
  26. 제13항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 2.5 이하의 평균 DAR을 갖는, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC 혼합물은 한외여과/정용여과 공정 후에 수득되는, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 수지는 부틸 소수성 수지인, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 뱃치식(batch) 공정, 순환식 공정 또는 유동 관통식(flow through) 공정인, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 항-상피세포 성장 인자 수용체(EGFR) 항체를 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 항-EGFR 항체는, 각각 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1), CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 항-EGFR 항체는 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오리스타틴은 모노메틸오리스타틴 E(MMAE) 또는 모노메틸오리스타틴 F(MMAF)인, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 MMAE는 발린-시트룰린(vc) 링커(linker)를 통해 상기 항체에 접합되는, 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 MMAF는 말레이미도카프로일(mc) 링커를 통해 상기 항체에 접합되는, 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 방법을 통해 수득되는 조성물.
  37. 제36항의 조성물을 대상체에게 투여하여 암을 치료함을 포함하는, 대상체에서의 암 치료 방법.
  38. ADC를 포함하는 조성물로서,
    존재하는 ADC의 70%가 4 이하의 약물 부하된 종들을 갖고, 상기 ADC는 항-EGFR 항체 및 오리스타틴을 포함하는, ADC를 포함하는 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 존재하는 ADC의 75%가 4 이하의 약물 부하된 종들을 갖는, 조성물.
  40. 제38항에 있어서, 존재하는 ADC의 80%가 4 이하의 약물 부하된 종들을 갖는, 조성물.
  41. 제38항에 있어서, 존재하는 ADC의 85%가 4 이하의 약물 부하된 종들을 갖는, 조성물.
  42. 제38항에 있어서, 존재하는 ADC의 90%가 4 이하의 약물 부하된 종들을 갖는, 조성물.
  43. 제38항에 있어서, 존재하는 ADC의 95%가 4 이하의 약물 부하된 종들을 갖는, 조성물.
  44. 제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-EGFR 항체는, 각각 서열 번호 7, 서열 번호 8 및 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1), CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 조성물.
  45. 제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-EGFR 항체는 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 조성물.
  46. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오리스타틴은 모노메틸오리스타틴 E(MMAE) 또는 모노메틸오리스타틴 F(MMAF)인, 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 상기 MMAE는 발린-시트룰린(vc) 링커를 통해 상기 항체에 접합되는, 조성물.
  48. 제46항에 있어서, 상기 MMAF는 말레이미도카프로일(mc) 링커를 통해 상기 항체에 접합되는, 조성물.
  49. 제38항 내지 제48항 중 어느 한 항의 조성물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  50. 제49항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하여 암을 치료함을 포함하는, 대상체에서의 암 치료 방법.
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