BR112019027448B1 - Imunoconjugado compreendendo um anticorpo conjugado a uma porção de fármaco citotóxica, composição farmacêutica e uso dos mesmos - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a imunoconjugados compreendendo um anticorpo anti- ROR1 ou um fragmento de fragmento de antígeno e uma porção de fármaco. Estes imunoconjugados são úteis no tratamento de cânceres de expressão de ROR1.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade dos Pedidos de Patente U.S. 62/524.382, 62/524.386 e 62/524.388, todos dos quais foram depositados em 23 de Junho de 2017. As descrições destes pedidos prioritários são incorporadas por referência aqui em sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e é incorporada por referência em sua totalidade. A cópia de ASCII, criada em 21 de Junho de 2018, é denominada 024651_WO002_SL.txt e tem 58.100 bytes de tamanho.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] O câncer é a segunda principal causa de morte humana, próximo à doença arterial coronariana. Os receptores de tirosinas quinases (RTKs) desempenham um papel fundamental na transformação oncogênica, crescimento e metástases. Os RTKs regulam a diferenciação, proliferação, migração, angiogênese e sobrevivência celular. O receptor órfão 1 tipo receptor de tirosina quinase (ROR1) é uma proteína de membrana tipo I evolutivamente conservada que pertence à subfamília ROR e tem domínios extracelulares que contêm domínios similares à imunoglobulina (Ig), Frizzled, e Kringle. Camundongos deficientes em ROR1 exibem uma variedade de defeitos fenotípicos nos sistemas esquelético e urogenital, bem como retardo de crescimento pós-natal. O ROR1 é expresso durante a embriogênese e por uma variedade de cânceres diferentes, porém, não pelos tecidos normais pós-parto, e pode ser considerado um antígeno de superfície oncoembrionário. Os dados funcionais sugerem que o ROR1 pode funcionar na sinalização WNT não canônica para promover a sobrevivência de células malignas.

[004] A expressão e ativação de ROR1 parecem estar correlacionadas com características de agressividade tumoral em modelos de leucemia linfocítica crônica (CLL), câncer de mama, câncer de pulmão, câncer gástrico e melanoma (Li et al., PLoS One 5(7):e11859 (2010); Gentile et al., Cancer Res. 71(8):3132-41 (2011); Zhang et al., PLoS One 7(3):e31127 (2012); Yamaguchi et al., Cancer Cell. 21(3):348-61 (2012); Daneshmanesh et al., Leucemia 26(6):1348- 55 (2012); Daneshmanesh et al., Leuk Lymphoma 54(4): 843-50 (2013); O'Connell et al., Cancer Discov. 3(12):1378-93 (2013); Hojjat- Farsangi et al., PLoS One 8(4): e61167 (2013); Hojjat-Farsangi et al., PLoS One 8(10): e78339 (2013); Ida et al., Cancer Sci. 107(2):155-61 (2016); e Janovska et al., Clin Cancer Res. 22(2):459-69 (2016)). Níveis elevados de expressão de ROR1 em pacientes e linhagens celulares estão associados a genes envolvidos na transição epitelial- mesenquimal (EMT) (Cui et al., Cancer Res. 73(12):3649-60 (2013)). Em pacientes com CLL, altos níveis de expressão de ROR1 estão associados a menor sobrevida livre de tratamento e sobrevida global (OS) (Cui et al., Blood 128(25):2931-2940 (2016)). Similarmente, em pacientes com câncer de ovário, a alta expressão de ROR1 está associada a maus resultados clínicos (Zhang et al., Sci Rep. 4:5811 (2014)).

[005] Tendo em vista o papel do ROR1 no câncer, há necessidade de terapias novas e melhoradas que tenham como alvo células cancerígenas positivas para ROR1.

SUMARIO DA INVENÇÃO

[006] É aqui fornecido um imunoconjugado tendo a fórmula de Ab-((L)m- (D))n, em que: Ab é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao receptor órfão 1 tipo receptor de tirosina quinase (ROR1); L é um ligante, e m é 0 ou 1; D é uma porção de fármaco citotóxica; e n é um número inteiro de 1 a 10.

[007] A porção de fármaco citotóxica pode ser selecionada do grupo que consiste em, por exemplo, um agente antitubulina, um agente alquilante de DNA, um agente de reticulação de DNA, um agente intercalante de DNA e um inibidor de RNA polimerase II. Em algumas modalidades, a porção de fármaco citotóxica é selecionada do grupo que consiste em monometil auristatina E (MMAE), azonafida, α-amanitina, duocarmicina TM, pirrolobenzodiazepina (PBD), PNU- 159682 e sais, ésteres e análogos farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

[008] O ligante no imunoconjugado pode compreender uma porção clivável. Pode ser clivado dentro de uma célula alvo. Alternativamente, o ligante não é clivável. O ligante pode ser ramificado ou não ramificado. Em algumas modalidades, o ligante compreende uma ou mais porções selecionadas de valina-citrulina (VC), valina-alanina (VA), para-aminobenziloxicarbonila (PAB), polietileno glicol (PEG), ácido diaminopropiônico (DPR), Phe-C4, C2- Gly3, C6 alquila, dimetiletilamina (DMEA) e etileno diamina (EDA). Em certas modalidades, o ligante é covalentemente ligado ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno em um grupo succinimida, carbonila ou cicloocteno ou triazol do ligante.

[009] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento no imunoconjugado é ligado covalentemente ao ligante por reação com uma porção selecionada a partir do grupo que consiste em 6-malei- midocaproíla (MC)-VC-PAB; 6-MC-C6; 6-MC-PEG4-VC-PAB-DMEA; 6- MC-PEG4-VA; 6-MC-DPR-VC-PAB; 6-MC-Phe-C4-VC-PAB; 6-MC- Phe-C4-VC-PAB-DMEA; 6-MC-C2-Gly3-EDA; dibenzilciclooctino (DBCO)-(PEG2-VC-PAB)2; DBCO-PEG4-VC-PAB-DMEA; e N- succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato-VC-PAB. Quando aqui usado, VC representa um dipeptídeo valina-citrulina; VA representa um dipeptídeo valina-alanina, PEG representa polietileno glicol; PAB representa para-amino-benziloxicarbonila; DMEA representa dimetiletilamina; Phe representa um grupo benzila; e EDA representa etileno diamina.

[0010] Também é aqui fornecido um imunoconjugado tendo a fórmula de Ab-((L)m-(D))n, em que: Ab é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao receptor órfão 1 tipo receptor de tirosina quinase (ROR1); L é um ligante clivável e m é 0 ou 1; D é uma auristatina (por exemplo, MMAE); e n é um número inteiro de 1 a 10.

[0011] Em um imunoconjugado da presente descrição, o ligante pode compreender, por exemplo, um heterociclo ou carbonila covalentemente ligado ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, um grupo espaçador covalentemente ligado ao heterociclo ou carbonila e um éster, tioéster, amida, carbonato, tiocarbonato ou carbamato covalentemente ligado à porção de fármaco citotóxica. Em algumas modalidades, o grupo espaçador compreende um grupo aminoácido, um poliaminoácido ou amino benzílico ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o ligante em um imunoconjugado da presente descrição forma uma ligação covalente com um resíduo de cisteína ou lisina no anticorpo ou fragmento.

[0012] O componente Ab (anticorpo ou fragmento do mesmo) de um imunoconjugado da presente descrição pode se ligar ao mesmo epítopo de ROR1 que um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácido de cadeia pesada e de cadeia leve de SEQ ID NOs: 3 e 4, respectivamente. O anticorpo ou fragmento pode compreender a região determinante da complementaridade da cadeia pesada (CDR) 1-3 (HCDR1-3) em SEQ ID NO: 3 e a CDR1-3 de cadeia leve (LCDR1- 3) em SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 7-9 e a cadeia leve do anticorpo compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 10-12. O anticorpo ou fragmento pode ser humanizado. O anticorpo ou fragmento pode ter uma ou mais das seguintes propriedades: a) facilita a internalização de ROR1 em uma célula humana; b) liga-se ao ROR1 humano com uma KD inferior a 100 nM (por exemplo, inferior a 50, 40, 30, 20 ou 10 nM); e c) inibe o crescimento de células cancerígenas humanas ROR1+ in vitro com uma EC50 de 500 nM ou menos (por exemplo, 400 nM ou menos, 300 nM ou menos, 200 nM ou menos, 200 nM ou menos ou 100 nM ou menos).

[0013] Em algumas modalidades, o domínio variável de cadeia pesada (VH) e o domínio variável da cadeia leve (VL) do anticorpo no imunoconjugado compreendem as sequências de aminoácido de: a) SEQ ID NOs: 5 e 6, respectivamente; b) SEQ ID NOs: 5 e 50, respectivamente, c) SEQ ID NOs: 48 e 6, respectivamente; ou d) SEQ ID NOs: 48 e 50, respectivamente. O anticorpo pode compreender uma região constante de IgG1 humana e opcionalmente também uma região constante de cadeia leve K humana. Em outras modalidades, a cadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo compreendem as sequências de aminoácido de: a) SEQ ID NOs: 3 e 4, respectivamente; b) SEQ ID NOs: 3 e 49, respectivamente; c) SEQ ID NOs: 47 e 4, respectivamente; ou d) SEQ ID NOs: 47 e 49, respectivamente.

[0014] Em algumas modalidades, o componente Ab do imunoconjugado é um Fab, F(ab)2 ou scFv, por exemplo, um Fab, F(ab)2 ou scFv.

[0015] Modalidades específicas da presente descrição incluem um imunoconjugado compreendendo um anticorpo conjugado a uma porção de fármaco citotóxica, em que o VH e VL do anticorpo compreendem as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 5 e 6, respectivamente. Exemplos de um tal imunoconjugado são mostrados nas Tabelas 2 e 3 abaixo e incluem Conjuntos de Anticorpo-Fármaco (ADC)-A, E, H, I, J, K, L, M, N, O, P, Q e R Em outras modalidades, a cadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo compreendem as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 3 e 4, respectivamente.

[0016] No imunoconjugado da presente descrição, o número da porção do fármaco por anticorpo ou fragmento, ou a relação da porção de fármaco citotóxica para o anticorpo ou fragmento (DAR), pode ser de 1 para 10, por exemplo, 1 para 7, 1 para 6, 1 para 5, 2 para 7, 2 para 6 ou 2 para 5.

[0017] Também são aqui fornecidas composições farmacêuticas compreendendo um imunoconjugado da presente descrição e um excipiente farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas podem ainda compreender um agente terapêutico adicional selecionado a partir do grupo que consiste em um inibidor de tirosina quinase de Bruton (BTK), um inibidor de linfoma de células B 2 (Bcl-2), um inibidor do alvo da rapamicina de mamífero (mTOR) e um inibidor da fosfoinositídeo 3-quinase (PI3K). Por exemplo, o agente terapêutico adicional é selecionado dentre ibrutinibe, acalabrutinibe, venetoclax, everolimo, sapanisertibe e idelalisibe.

[0018] Também é aqui fornecida uma terapia ou método para o tratamento de câncer em um paciente em necessidade do mesmo, compreendendo a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um imunoconjugado da presente invenção. O câncer pode ser homogêneo ou heterogêneo para a expressão de ROR1 e pode ser, por exemplo, uma leucemia, um linfoma ou um tumor sólido. Em algumas modalidades, o câncer é leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia de células T (TCL), linfoma de células de revestimento (MCL), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma de Burkitt, mieloma múltiplo (MM), linfoma de zona marginal (MZL), linfoma linfocítico pequeno (SLL) ou um linfoma não Hodgkin (NHL) que passou pela transformação de Richter. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), carcinoma hepatocelular, câncer de pâncreas, osteossarcoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de ovário, câncer de mama ou câncer de mama triplo negativo (TNBC).

[0019] O método de terapia ou tratamento da presente descrição pode compreender ainda a administração ao paciente de um agente terapêutico anticâncer adicional, que pode ser, por exemplo, um inibidor de tirosina quinase de Bruton (BTK), um inibidor de linfoma de células B 2 (Bcl-2), um inibidor do alvo da rapamicina de mamífero (mTOR) e um inibidor da fosfoinositídeo 3-quinase (PI3K). Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é selecionado a partir de ibrutinibe, acalabrutinibe, venetoclax, everolimo, sapanisertibe e idelalisibe.

[0020] Em certas modalidades do presente método de terapia ou tratamento, o câncer é CLL, MCL ou um NHL que passou pela transformação de Richter.

[0021] Também são aqui fornecidos imunoconjugados e composições farmacêuticas aqui descritas para uso no tratamento de câncer nos métodos de terapia ou tratamento aqui descritos. Por exemplo, é aqui fornecido um imunoconjugado tendo a fórmula de Ab- ((L)m-(D))n para uso no tratamento de câncer em um paciente em necessidade dos mesmo, em que: Ab é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao receptor órfão 1 tipo receptor de tirosina quinase (ROR1); L é um ligante e m é 0 ou 1; D é uma porção de fármaco citotóxica; e n é um número inteiro de 1 a 10. Modalidades exemplares do imunoconjugado e do tratamento são descritas acima e serão descritas mais adiante.

[0022] Fornecido aqui também é o uso de um imunoconjugado aqui para a fabricação de um medicamento para uso no tratamento de câncer em um paciente em necessidade do mesmo. Por exemplo, aqui fornecido é o uso de um imunoconjugado tendo a fórmula de Ab- ((L)m-(D))n para a fabricação de um medicamento no tratamento de câncer em um paciente em necessidade do mesmo, em que: Ab é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao receptor órfão 1 tipo receptor de tirosina quinase (ROR1); L é um ligante e m é 0 ou 1; D é uma porção de fármaco citotóxica; e n é um número inteiro de 1 a 10. Modalidades exemplares do imunoconjugado e do tratamento são descritas acima e serão descritas mais adiante.

[0023] A presente descrição também fornece um método para fabricar um imunoconjugado, compreendendo: fornecer um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao receptor órfão 1 tipo receptor de tirosina quinase humana (ROR1); conjugando ao anticorpo uma porção de fármaco citotóxica selecionada do grupo que consiste em um agente antitubulina, um agente alquilante de DNA, um agente de reticulação de DNA, um agente intercalante de DNA e um inibidor de RNA polimerase II; em que a cadeia pesada do anticorpo compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 7-9 e a cadeia leve do anticorpo compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 10-12. Modalidades exemplares do imunoconjugado são descritas acima e serão descritas mais adiante.

[0024] Também são aqui fornecidos artigos de fabricantes, como kits, compreendendo um imunoconjugado da presente descrição.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0025] A FIG. 1 é um diagrama esquemático que ilustra um exemplo não limitante de um imunoconjugado da presente descrição.

[0026] As FIGS. 2A e 2B são gráficos ilustrando a ligação de várias concentrações de Ab1 e ADC-A a células positivas para ROR1 Jeko-1 (2A) e MDA-MB-231 (2B). Os valores de EC50 para Ab1 e ADC- A são mostrados abaixo de cada gráfico. A similaridade entre os valores de EC50 para Ab1 e ADC-A não conjugado demonstra que a conjugação do fármaco teve um impacto mínimo na ligação de Ab1 às células alvo.

[0027] As FIGS. 3A e 3B são gráficos ilustrando a ligação de Ab1, 4A5, ADC-A e ADC-T (3A) e Ab1, ADC-A, D10 e ADC-S (3B) a células Jeko-1. Os valores de EC50 para os anticorpos e imunoconjugados são mostrados abaixo de cada gráfico. A similaridade entre os valores de EC50 de anticorpos não conjugados e as construções de ADC correspondentes demonstra que a conjugação do fármaco teve um impacto mínimo na ligação dos anticorpos às células alvo. A diferença nos valores de EC50 entre Ab1/ADC-A e D10/ADC-S reflete a maior afinidade de Ab1 para ROR1 em comparação a D10.

[0028] As FIGS. 4A e 4B são gráficos ilustrando a internalização de Ab1, ADC-A e ADC-B em células Jeko-1 (4A) e a internalização de Ab1 e ADC-A em células MDA-MB-231 (4B). A adição de ligante e carga útil a Ab1 não afetou negativamente sua ligação ou internalização, como demonstrado com ADC-A e AB.

[0029] A FIG. 5 é um gráfico ilustrando a taxa de internalização de Ab1 nas células MDA-MB-231. O gráfico mostra uma taxa inicialmente rápida e, em seguida, uma taxa mais lenta de depuração do receptor de superfície celular.

[0030] A FIG. 6 é um gráfico ilustrando a expressão da superfície celular de ROR1 durante a internalização de Ab1 em células Jeko-1. Enquanto Ab1 é rapidamente internalizado, a quantificação de ROR1 de superfície celular_mostra uma pequena diminuição nos primeiros 10 minutos, com medições subsequentes indicando a restauração da expressão da superfície de ROR1 para níveis iniciais ou ligeiramente mais altos.

[0031] As FIGS. 7A-C são gráficos ilustrando a expressão de superfície celular de ROR1 durante a internalização de Ab1 em células Jeko-1 (7A), células MDA-MB-468 (7B) e células MDA-MB-231 (7C).

[0032] As FIGS. 8A-8I são plotagens de IC50 representativas mostrando a ligação a ROR1 por imunoconjugados da presente descrição, bem como MMAE não conjugado, nas linhagens celulares de câncer TMD-8 (8A), HBL-1 (8B), DOHH2 (8C), MDA-MB-468 (8D), Bt549 (8E), TOV112D (8F), JHOM1 (8G), SKOvr3 (8H) e Mino (8I).

[0033] A FIG. 9 é um gráfico ilustrando a inibição da proliferação celular por 3, 10 ou 30 μg/mL de ADC-A em células Jeko-1, com ou sem pré-tratamento com 100 μg/mL de Ab1. A ADC-A inibiu a proliferação celular de uma maneira dependente de dose. A pré- incubação das células com Ab1 reduziu esta atividade, demonstrando que a atividade inibidora do ADC-A na proliferação celular foi mediada pela ligação de ADC-A ao ROR1.

[0034] A FIG. 10 é um gráfico ilustrando a inibição dependente de dose da carga tumoral de células leucêmicas em um modelo de camundongo com leucemia linfocítica crônica TCL1-ROR1 após tratamento com veículo, 10 mg/kg de Ab1 ou 1 mg/kg, 2 mg/kg ou 5 mg/kg de ADC-A.

[0035] A FIG. 11 é um gráfico ilustrando a inibição do crescimento tumoral em um modelo de xenoenxerto de MCL após tratamento com veículo, 5 mg/kg de ADC-A ou ADC-Q por via intravenosa (IV) a cada quatro dias (Q4D), 10 mg/kg de Ab1 IV uma vez por semana (QW) ou 20 mg/kg de ibrutinibe per os (PO) todos os dias (QD). O tratamento com ADC-A causou a regressão tumoral.

[0036] A FIG. 12 é um par de gráficos mostrando a expressão de ROR1 (painel esquerdo) e inibição do crescimento tumoral em um modelo de xenoenxerto DLBCL-GCB após tratamento com controle, 10 mg/kg de QW Ab1, 50 mg/kg de venetoclax QD, Ab1 + venetoclax ou 5 mg/kg de ADC-A QW (painel direito). O tratamento com ADC-A resultou em regressão completa do tumor em todos os animais tratados. Ab1 sozinho, venetoclax sozinho e uma combinação de Ab1 e venetoclax foram ineficazes.

[0037] A FIG. 13 é um conjunto de gráficos mostrando a expressão de ROR1 (painel esquerdo) e inibição do crescimento tumoral após tratamento com veículo, 2,5 ou 5 mg/kg de ADC-A ou 10 mg/kg de Ab1 (painel direito), em um modelo de camundongo de xenoenxerto de transformação de Richter resistente à quimioterapia. Embora apenas 20 - 30% das células intratumorais sejam positivas para ROR1, regressões tumorais completas e prolongadas foram observadas com 5 mg/kg de ADC-A.

[0038] A FIG. 14 é um gráfico ilustrando a inibição do crescimento tumoral no tratamento com veículo, 1 ou 5 mg/kg de ADC-A IV QW, 1 ou 5 mg/kg de ADC-B IV QW ou 10 mg/kg de Ab1 IV QW em um modelo de camundongo de xenoenxerto de coxim gorduroso mamário com câncer de mama triplo negativo (TNBC) MDA-MB- 231.

[0039] A FIG. 15 é um gráfico ilustrando a inibição do crescimento tumoral após tratamento com veículo, 1 ou 5 mg/kg de ADC-A IV Q4D ou 10 mg/kg de Ab1 IV QW em um modelo de camundongo de xenoenxerto de TNBC humano BR5011. Embora apenas 58% das células intratumorais tenham sido positivas para ROR1, regressões completas e prolongadas foram observadas com 5 mg/kg de ADC-A, onde a regressão tumoral foi mantida por pelo menos 28 dias após a última dose.

[0040] A FIG. 16 é um gráfico ilustrando a inibição do crescimento tumoral após o tratamento com veículo, 1 ou 5 mg/kg de ADC-A IV Q4D ou 10 mg/kg de Ab1 IV QW em um modelo de xenografo de TNBC humano BR5015 (baixa expressão de ROR1). A regressão tumoral foi observada, embora apenas 58% das células intratumorais fossem positivas para ROR1.

[0041] A FIG. 17 é um gráfico ilustrando a inibição do crescimento tumoral em um modelo de camundongo de xenoenxerto de linfoma de células de revestimento humano Jeko-1. Os camundongos foram tratados com veículo; 1 mg/kg de ADC-N, ADC-P ou ADC-R; ou 5 mg/kg de ADC-A, ADC-L, ADC-M, ADC-S ou ADC-T. Veículo e construções de ADC foram administradas IV Q4D. Regressão tumoral significativa foi observada em animais tratados com ADC-A, ADC-L, ADC-M e ADC-S, enquanto a inibição do crescimento tumoral foi observada em animais tratados com ADC-N, ADC-P, ADC-R e ADC- T.

[0042] As FIGS.18A e 18B são gráficos ilustrando o índice de combinação de tratamento com inibidores de ADC-A e BTK ibrutinibe (18A) ou ACP-196/acalabrutinibe (18B) em várias linhagens celulares. O ADC-A apresentou um efeito sinérgico igualmente com ibrutinibe e ACP-196/acalabrutinibona na inibição da proliferação celular.

[0043] As FIGS. 19A e 19B são gráficos ilustrando a inibição da proliferação de células Jeko-1 após tratamento com ADC-A, ibrutinibe ("Ib") ou uma combinação de ADC-A e ibrutinibe (19A); ou ADC-A, ACP-196/acalabrutinibe ("ACP196" ou "196") ou uma combinação de ADC-A e ACP-196/acalabrutinibe (19B).

[0044] As FIGS. 20A-C são gráficos ilustrando o índice de combinação de tratamento com ADC-A e inibidor de Bcl-2 ABT- 199/venetoclax ("ABT199") em várias linhagens celulares (20A), ou de ADC-A com inibidor de Bcl-2 Bcl-2i-1 ou Bcl-2i-2 em células Jeko-1 (20B) ou células Mino (20C). O ADC-A exibiu um efeito sinérgico com o ABT-199 na inibição igualmente da proliferação de células MCL e DLBCL. O ADC-A também exibiu um efeito sinérgico com outros inibidores de Bcl-2 (Bcl-2i-1 e Bcl-2i-2) sobre a inibição da proliferação de células Jeko-1, e exibiu um efeito aditivo com ambos os inibidores na inibição da proliferação de células Mino.

[0045] A FIG. 21 é um gráfico ilustrando a inibição da proliferação de células Jeko-1 após o tratamento com ADC-A, ABT-199 ou uma combinação de ADC-A e ABT-199.

[0046] A FIG. 22 é um gráfico ilustrando o índice de combinação do tratamento com ADC-A e inibidor de mTOR1/2 INK128/sapanisertibe ("INK128") em várias linhagens celulares. O ADC-A exibiu um efeito sinérgico com o INK128 sobre a inibição igualmente da proliferação de células MCL e DLBCL.

[0047] A FIG. 23 é um gráfico ilustrando a inibição da proliferação de células Jeko-1 após tratamento com ADC-A, INK128 ou uma combinação de ADC-A e INK128.

[0048] A FIG. 24 é um gráfico ilustrando o índice de combinação de tratamento com ADC-A e inibidor de PI3K CAL-101/idelalisibe ("CAL101") em várias linhagens celulares. O ADC-A exibiu um efeito sinérgico com o CAL101 sobre a inibição da proliferação de células MCL e DLBCL.

[0049] As FIGS. 25A e 25B são gráficos ilustrando a inibição da proliferação celular após o tratamento com ADC-A, inibidor de PI3K CAL-101/idelalisibe ("CAL101" ou "101") ou uma combinação de ADC- A e CAL101, em linhagem celular de DLBCL-ABC TMD-8 (25A) ou na linha celular de DLBCL-GCB DOHH2 (25B).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0050] A presente invenção fornece imunoconjugados da fórmula Ab-((L)m-(D))n, em que Ab é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à proteína de ROR1; L é um ligante; D é uma porção de fármaco que tem atividade terapêutica no câncer; m é 0 ou 1; e n é um número inteiro de 1 a 10. Na fórmula, o traço "-" denota uma ligação covalente ou não covalente. O anticorpo ou fragmento inclui, porém, não está limitado a um anticorpo ou fragmento de anticorpo que compete com o anticorpo D10 ou Ab1 pela ligação ao ROR1 humano ou se liga ao mesmo epítopo que D10 ou Ab1. A porção de fármaco inclui, porém, não está limitada a outro anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno, um polipeptídeo, um composto de molécula pequena, uma molécula de ácido nucleico, tal como uma molécula de RNA interferente pequena ou uma molécula antissenso. Os imunoconjugados da presente invenção podem ser utilizados para tratar uma variedade de cânceres, tais como cânceres positivos para ROR1.

1. Imunoconjugados

[0051] Um "conjugado anticorpo-fármaco" ou "ADC" ou "imunoconjugado" refere-se a uma molécula de anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que é covalente ou não covalentemente, com ou sem um ligante, a uma ou mais molécula(s) biologicamente ativa(s). Os presentes imunoconjugados compreendem anticorpos ou fragmentos dos mesmos que são específicos para ROR1 humano e podem, portanto, servir como excelentes porções de direcionamento para liberar as cargas úteis conjugadas a células positivas para ROR1. Em algumas modalidades, um imunoconjugado de ROR1 fornecido aqui tem uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de cerca de 1 μM, 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2 nM, 1 nM, 0,5 nM, 0,1 nM, 0,05 nM, 0,01 nM ou 0,001 nM ou menos (por exemplo, 10-8 M ou menos, de 10-8 M a 10-13 M ou de 10-9 M a 10-13 M) para ROR1 humano. A KD pode ser medida por qualquer ensaio adequado, tais como ensaios de ressonância de plasmon de superfície (por exemplo, usando um BIACORE®-2000 ou um BIACORE®-3000). Em certas modalidades, a KD de um imunoconjugado da invenção é menor que a KD para o anticorpo D10. Em certas modalidades, a KD de um imunoconjugado da invenção para ROR1 humano é inferior a cerca de 50, 40, 30, 20 ou 10 nM (por exemplo, 40 nM). Em algumas modalidades, um imunoconjugado de ROR1 fornecido aqui inibe o crescimento de células cancerígenas humanas de ROR1+ in vitro com uma EC50 de cerca de 500, 400, 350, 300 ou 250 nM ou menos (por exemplo, 300 nM ou menos). Quando aqui usado, diz-se que um anticorpo se liga especificamente a um antígeno quando se liga ao antígeno com uma KD de 100 nM ou menos, tal como menos de 10 nM ou menos (por exemplo, 1-5 nM), como determinado por, por exemplo, ressonância de plasmon de superfície ou Bio-Layer Interferometry.

[0052] Em certas modalidades, o imunoconjugado aqui fornecido é internalizado por uma célula positiva para ROR1 principalmente através da via do lisossoma/endossoma. Em modalidades particulares, a internalização é independente do nível de expressão de ROR1 sobre a superfície da célula.

[0053] Modalidades do anticorpo ou fragmento do mesmo, o ligante e a porção de fármaco utilizados nos imunoconjugados são descritos em mais detalhes abaixo.

1.1 Tipos e Estruturas de Anticorpos

[0054] O termo "anticorpo" é usado aqui no sentido mais amplo e inclui anticorpos policlonais e monoclonais, tais como anticorpos intatos e seus fragmentos funcionais (ligação ao antígeno). O termo abrange formas de imunoglobulinas geneticamente modificadas e/ou modificadas de outra maneira, tais como intracorpos, pepticorpos, anticorpos quiméricos, anticorpos totalmente humanos, anticorpos humanizados e anticorpos heteroconjugados, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos), diacorpos, triacorpos e tetracorpos, di-scFv em tandem e tri-scFv em tandem. A menos que de outra maneira indicado, o termo abrange anticorpos intatos ou de tamanho natural, incluindo anticorpos de qualquer classe ou subclasse (por exemplo, IgG e suas subclasses, tais como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4; IgM; IgE; IgA; e IgD), bem como fragmentos de anticorpos.

[0055] Um anticorpo pode incluir uma cadeia pesada (ou uma sequência de polipeptídeo dela derivada) e uma cadeia leve (ou uma sequência de polipeptídeo dela derivada). O termo "região variável" ou "domínio variável" refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvida na ligação do anticorpo a um antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente têm estruturas similares, com cada domínio compreendendo quatro regiões de estrutura conservadas e três regiões determinantes da complementaridade. Um único domínio de VH ou VL pode às vezes ser suficiente para conferir toda ou a maioria da especificidade de ligação ao antígeno de um anticorpo. Além disso, os anticorpos que se ligam a um antígeno específico podem ser isolados usando um domínio de VH ou VL de um anticorpo que se liga ao antígeno para rastrear uma biblioteca de domínios de VL ou VH complementares, respectivamente. Veja, por exemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).

[0056] Os termos "região determinante da complementaridade" e "CDR", que são sinônimos de "região hipervariável" ou "HVR", referem-se a subregiões dentro dos domínios variáveis do anticorpo, que conferem a especificidade e/ou afinidade do anticorpo para seu antígeno. Em geral, existem três CDRs em cada domínio variável de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e três CDRs em cada domínio variável da cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3). "Regiões da estrutura" ("FRs") refere-se às porções não CDR dos domínios variáveis. Em geral, existem quatro FRs em cada domínio variável de cadeia pesada de tamanho natural e quatro FRs em cada domínio variável de cadeia leve de tamanho natural. Os limites precisos da sequência de aminoácido de uma determinada CDR ou FR podem ser facilmente determinados usando qualquer um de vários esquemas conhecidos, incluindo aqueles descritos por Kabat et al., 5th Ed., Public health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) (esquema de numeração "Kabat"); Al-Lazikani et al., JMB 273, 927-948 (1997) (esquema de numeração "Chothia"); MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996) (esquema de numeração "contact"); Lefranc et al., Dev Comp Immunol. 27(1):55-77 (2003) (esquema de numeração "IMGT"); e Honegger and Pluckthun, J. Mol Biol, 309(3):657-70 (2001) (esquema de numeração "Aho").

[0057] Os limites de uma determinada CDR ou FR podem variar dependendo do esquema usado para identificação. Por exemplo, o esquema Kabat é baseado em alinhamentos de sequência, enquanto o esquema Chothia é baseado em informações estruturais. A numeração para ambos os esquemas de Kabat e Chothia é baseada nos comprimentos de sequência da região de anticorpo mais comuns, com inserções modificadas por letras de inserção, por exemplo, "30a". Os dois esquemas colocam certas inserções e deleções ("indels") em posições diferentes, resultando na numeração diferencial. O esquema de contato é baseado na análise de estruturas cristalinas complexas e é similar em muitos respeitos ao esquema de numeração Chothia. A menos que de outra maneira indicado, as CDRs dos anticorpos aqui referidos podem ser identificadas de acordo com quaisquer dos métodos de Kabat, Chothia, IMGT e contact.

[0058] Um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo de tamanho natural pode ser usado na produção de um imunoconjugado da presente invenção. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, porém, não estão limitados a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; fragmentos de IgG recombinante (rIgG); diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv ou sFv); anticorpos de domínio único (por exemplo, sdAb, sdFv, nanocorpos); e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Em certas modalidades, os fragmentos são fragmentos de anticorpo de cadeia única compreendendo uma região de cadeia pesada variável e/ou uma região de cadeia leve variável, tais como scFvs.

1.2 Anticorpos de ROR1 Exemplares

[0059] Um imunoconjugado da invenção compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao ROR1, por exemplo, ROR1 humano. O anticorpo ou fragmento se liga a uma porção extracelular da proteína de ROR1, tal como um epítopo em um ou mais dos domínios do tipo imunoglobulina (Ig), Frizzled e Kringle da proteína de ROR1. Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao ROR1 se liga a uma sequência de aminoácido de ROR1 mostrada em SEQ ID NO: 1 ou 2 (não incluindo a cisteína terminal, que é adicionada para conveniência da conjugação) e pode ser internalizada por uma célula de ROR1+; exemplos de um tal anticorpo são os anticorpos de murino D10 e 99961. Veja, Pats. U.S. 9.217.040 e 9.758.591, as descrições das quais são incorporadas por referência aqui em sua totalidade. Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento compete com D10 ou 99961 pela ligação ao ROR1 humano. As sequências de aminoácido de anticorpos anti-ROR1 exemplares utilizados nos imunoconjugados da invenção são mostradas na Tabela 1 abaixo, onde Ab1-Ab4 são variantes humanizadas do anticorpo 99961. Tabela 1 SEQ ID NOs de Anticorpos Anti-ROR1 Exemplares

[0060] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo no imunoconjugado liga-se especificamente ao ROR1 humano, e suas cadeias pesada e leve, respectivamente, compreendem: a) as sequências de aminoácido de CDR1-3 (HCDR1-3) de cadeia pesada em SEQ ID NO: 3 e as sequências de aminoácido de CDR1-3 (LCDR1-3) de cadeia leve em SEQ ID NO: 4; b) HCDR1-3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID NO: 7-9, respectivamente, e LCDR1-3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 10-12, respectivamente; c) as sequências de aminoácido de HCDR1-3 em SEQ ID NO: 13-15 e as sequências de aminoácido de LCDR1-3 em SEQ ID NOs: 16-18; d) HCDR1-3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID NO: 27-29, respectivamente, e LCDR1-3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 30-32, respectivamente; e) HCDR1-3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID NO: 37-39, respectivamente, e LCDR1-3 compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 40-42, respectivamente; f) HCDR1-3 compreendendo os resíduos 26-33, 51-58 e 97105 de SEQ ID NO: 5, respectivamente, e LCDR1-3 compreendendo os resíduos 27-32, 50-52 e 89-97 de SEQ ID NO: 6, respectivamente; g) HCDR1-3 compreendendo os resíduos 26-32, 52-57 e 99-105 de SEQ ID NO: 5, respectivamente, e LCDR1-3 compreendendo os resíduos 24-34, 50-56 e 89-97 de SEQ ID NO: 6, respectivamente; h) HCDR1-3 compreendendo os resíduos 31-35, 50-66 e 99-105 de SEQ ID NO: 5, respectivamente, e LCDR1-3 compreendendo os resíduos 24-34, 50-56 e 89-97 de SEQ ID NO: 6, respectivamente; i) HCDR1-3 compreendendo os resíduos 26-32, 52-57 e 99105 de SEQ ID NO: 5, respectivamente, e LCDR1-3 compreendendo os resíduos 27-32, 50-52 e 89-97 de SEQ ID NO: 6, respectivamente; ou j) HCDR1-3 compreendendo os resíduos 31-35, 52-57 e 99105 de SEQ ID NO: 5, respectivamente, e LCDR1-3 compreendendo os resíduos 27-32, 50-52 e 89-97 de SEQ ID NO: 6, respectivamente.

[0061] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento é humanizado ou quimérico com regiões constantes humanas. Em outras modalidades, o anticorpo ou fragmento pode compreender uma região constante de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana e opcionalmente uma região constante K humana.

[0062] Em certas modalidades, o imunoconjugado da invenção compreende um anticorpo anti-ROR1, ou um fragmento de ligação ao antígeno, em que o anticorpo compreende: a) um domínio ou região de cadeia pesada variável (VH) compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% (por exemplo, pelo menos 90%) idêntica à de SEQ ID NO: 5 e um domínio ou região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% (por exemplo, pelo menos 90%) idêntica à de SEQ ID NO: 6; b) um VH e um VL compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 5 e 6, respectivamente; c) uma cadeia pesada (HC) compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98% ou 99% (por exemplo, pelo menos 90%) idêntica à de SEQ ID NO: 3 e uma cadeia leve (LC) compreendendo uma sequência de aminoácido 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% (por exemplo, pelo menos 90%) idêntica à de SEQ ID NO: 4; ou d) uma HC e uma LC compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 3 e 4, respectivamente.

[0063] Em certas modalidades, o VH e VL do anticorpo compreendem respectivamente as sequências de aminoácido de: a) SEQ ID NOs: 5 e 50; b) SEQ ID NOs: 48 e 6; ou c) SEQ ID NOs: 48 e 50.

[0064] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento compreende uma região constante de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana e, opcionalmente, uma região constante K humana.

[0065] Em certas modalidades, a HC e LC do anticorpo compreendem respectivamente as sequências de aminoácido de: a) SEQ ID NOs: 3 e 49; b) SEQ ID NOs: 47 e 4; ou c) SEQ ID NOs: 47 e 49.

[0066] Em certas modalidades, o imunoconjugado da invenção compreende um anticorpo ou fragmento do mesmo derivado de um anticorpo de murino com as sequências de aminoácido VH e VL de (i) SEQ ID NOs: 25 e 26, respectivamente; (ii) SEQ ID NOs: 35 e 36, respectivamente; ou (iii) SEQ ID NOs: 45 e 46, respectivamente. Os anticorpos derivados destas sequências podem ser, por exemplo, anticorpos que foram humanizados ou unidos a uma região Fc humana (por exemplo, quimérica). Por exemplo, o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno no imunoconjugado compreende: a) um VH compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à de SEQ ID NO: 45 e um VL compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à de SEQ ID NO: 46; b) um VH compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 45 e um VL compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 46; c) um VH contendo uma sequência de aminoácido pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à de SEQ ID NO: 25 e um VL compreendendo uma sequência de aminoácido pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à de SEQ ID NO: 26; ou d) um VH compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 25 e um VL compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 26.

[0067] Sequências de codificação exemplares para os anticorpos acima mencionados são mostradas na Tabela 12 abaixo. Por exemplo, o anticorpo no imunoconjugado pode compreender: a) um VH codificado por (i) nucleotídeos 73-420 de SEQ ID NO: 21, ou (ii) SEQ ID NO: 23; e um VL codificado pela SEQ ID NO: 22 ou 24; b) um VH codificado pela SEQ ID NO: 52 e um VL codificado pela SEQ ID NO: 54; c) um VH codificado pela SEQ ID NO: 33 e um VL codificado pela SEQ ID NO: 34; d) uma HC codificada pelos nucleotídeos 73-1,410 de SEQ ID NO: 19 e uma LC codificada pelos nucleotídeos 73-714 de SEQ ID NO: 20; ou e) uma HC codificada pela SEQ ID NO: 51 e uma LC codificada pelos nucleotídeos SEQ ID NO: 53.

[0068] Em certas modalidades, o imunoconjugado da invenção compreende um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo anti-ROR1, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende a sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 64-68. Em certas modalidades, o fragmento de ligação ao antígeno compreende as sequências de aminoácido de VH e VL de: a) SEQ ID NOs: 5 e 6; b) SEQ ID NOs: 5 e 50; c) SEQ ID NOs: 48 e 6; d) SEQ ID NOs: 48 e 50; e) SEQ ID NOs: 45 e 46; ou f) SEQ ID NOs: 25 e 26, em que a sequência de aminoácido de VH está opcionalmente ligada à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 62 e/ou a sequência de aminoácido de VL está opcionalmente ligada à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 63.

1.3 Comparação de Sequência de Anticorpo

[0069] Identidade de sequência percentual (%) em relação a uma sequência de polipeptídeo de referência refere-se à porcentagem de resíduos de aminoácido em uma sequência candidata que são idênticas aos resíduos de aminoácido na sequência de referência, após alinhar as sequências e introduzir intervalos, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade de sequência. O alinhamento para fins de determinação da porcentagem de identidade de sequência de aminoácido pode ser alcançado de várias maneiras que são conhecidas; por exemplo, usando o software de computador disponível publicamente, tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Para os fins aqui, no entanto, os valores% de identidade de sequência de aminoácido são gerados usando o programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2. O programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2 foi criado pela Genentech, Inc., e o código fonte foi arquivado com documentação do usuário no U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, onde está registrado sob U.S. Copyright Registration No. TXU510087. O programa ALIGN-2 está disponível publicamente na Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código-fonte. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, incluindo UNIXV4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação de sequência são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.

[0070] Nas situações onde o ALIGN-2 é usado para comparação da sequência de aminoácido, o% de identidade de sequência de aminoácido de uma dada sequência de aminoácido A a uma dada sequência de aminoácido B é calculado da seguinte forma: 100 vezes a fração X/Y, onde X é o número de resíduos de aminoácido registrados como pareamentos idênticos pelo programa de alinhamento de sequência ALIGN-2 neste alinhamento de programa de A e B, e onde Y é o número total de resíduos de aminoácido em B. Será apreciado que onde o comprimento da sequência de aminoácido A não for igual ao comprimento da sequência de aminoácido B, o% de identidade de sequência de aminoácido de A a B não será igual ao% de identidade de sequência de aminoácido de B a A. A menos que especificamente declarado de outra maneira, todos os% dos valores de identidade de sequência de aminoácido usados aqui são obtidos como descrito no parágrafo imediatamente anterior usando o programa de computador ALIGN-2.

[0071] Em algumas modalidades, variantes de sequência de aminoácido dos anticorpos aqui fornecidos são contempladas. Uma variante tipicamente difere de um polipeptídeo aqui descrito especificamente em uma ou mais substituições, deleções, adições e/ou inserções. Tais variantes podem ser de ocorrência natural ou podem ser geradas sinteticamente, por exemplo, modificando uma ou mais das sequências de polipeptídeo acima da invenção e avaliando uma ou mais atividades biológicas do polipeptídeo como descrito aqui e/ou usando qualquer uma de várias técnicas conhecidas. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. As variantes da sequência de aminoácido de um anticorpo podem ser preparadas introduzindo as modificações apropriadas na sequência de nucleotídeo que codifica o anticorpo ou por síntese de peptídeo. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções de e/ou inserções em e/ou substituições de resíduos nas sequências de aminoácido do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas, por exemplo, ligação ao antígeno.

[0072] Quando aqui utilizado, o termo "substancialmente idêntico" refere-se a duas ou mais sequências tendo uma porcentagem de unidades sequenciais (por exemplo, resíduos de aminoácido) que são as mesmas quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima em uma janela de comparação, ou em uma região designada como medido usando algoritmos de comparação. A título de exemplo, duas ou mais sequências podem ser "substancialmente idênticas" se as unidades sequenciais forem cerca de 60% idênticas, cerca de 65% idênticas, cerca de 70% idênticas, cerca de 75% idênticas, cerca de 75% idênticas, cerca de 80% idênticas, cerca de 85% idênticas, cerca de 90% idênticas, cerca de 95% idênticas, cerca de 96% idênticas, cerca de 97% idênticas, cerca de 98% idênticas ou cerca de 99% idênticas em uma região especificada. Tais porcentagens descrevem a "porcentagem de identidade" entre duas sequências.

1.4 Produção e Modificação de Anticorpos de ROR1

[0073] Os anticorpos anti-ROR1 para uso nos imunoconjugados da presente invenção podem ser produzidos imunizando um animal com ROR1 humano ou um fragmento de proteína de ROR1 humana. Os anticorpos que se ligam ao fragmento de imunização com alta afinidade (por exemplo, com uma KD na faixa nM ou inferior) podem ser rastreados usando métodos de rotina, tal como ELISA.

[0074] Se o anticorpo é um anticorpo não humano, ele pode ser humanizado. Um anticorpo "humanizado" é um anticorpo no qual todos ou substancialmente todos os resíduos de aminoácido de CDR são derivados de um anticorpo não humano (por exemplo, camundongo ou rato) e todos ou substancialmente todos os resíduos de aminoácido de FR são derivados de FRs humanas. Um anticorpo humanizado pode opcionalmente incluir pelo menos uma porção de uma região constante derivada de um anticorpo humano. Uma "forma humanizada" de um anticorpo não humano refere-se a uma variante do anticorpo não humano que foi submetido à humanização, tipicamente para reduzir a imunogenicidade para seres humanos, enquanto mantendo a especificidade e a afinidade de ligação ao antígeno do anticorpo não humano parental. Em algumas modalidades, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos pelos resíduos correspondentes do anticorpo não humano cognato para restaurar ou melhorar a especificidade e/ou afinidade de ligação ao antígeno do anticorpo resultante.

[0075] Os anticorpos ou fragmentos de ROR1 podem ser fabricados de forma recombinante em células hospedeiras de mamíferos contendo sequências de codificação para os anticorpos ou fragmentos de ROR1, em que as sequências de codificação estão operacionalmente ligadas a elementos reguladores da transcrição adequados para expressão nas células hospedeiras. As sequências de codificação podem ser introduzidas nas células hospedeiras em um ou mais vetores. As células hospedeiras de mamíferos úteis incluem, inter alia, células de ovário de hamster Chinês (CHO), células NS0, células SP2, células HEK-293T, células 293 Freestyle (Invitrogen), células NIH-3T3, células HeLa, células de rim de hamster bebê (BHK), células de rim de macaco verde Africano (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2) e células A549. As linhagens celulares podem ser selecionadas com base em seus níveis de expressão. Outras linhagens celulares que podem ser usadas incluem linhagens celulares de insetos, tais como células Sf9 ou Sf21, e linhagens celulares de levedura.

[0076] Em algumas modalidades, um anticorpo ROR1 origem pode ser modificado introduzindo uma ou mais substituições de aminoácido para melhorar a ligação ao antígeno do anticorpo, para diminuir a imunogenicidade (por exemplo, desimunizar; veja, por exemplo, Jones et al., Methods Mol Biol. 525:405-23 (2009)) e/ou para melhorar a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC).

[0077] Em algumas modalidades, substituições, inserções ou deleções podem ser feitas dentro de uma ou mais CDRs, em que as mutações não reduzem substancialmente a ligação do anticorpo ao seu antígeno. Por exemplo, substituições conservativas que não reduzem substancialmente a afinidade de ligação, podem ser feitas.

[0078] Alterações (por exemplo, substituições) podem ser feitas em CDRs para melhorar a afinidade do anticorpo. Os resíduos de CDR envolvidos na ligação ao antígeno podem ser identificados usando, por exemplo, mutagênese de varredura de alanina ou modelagem por computador. A HCDR3 e a LCDR3, em particular, geralmente são direcionadas. Uma estrutura cristalina de um complexo antígeno- anticorpo também pode ser usada para identificar pontos de contato entre o anticorpo e seu antígeno. Tais resíduos de contato e seus resíduos vizinhos podem ser direcionados para mutações. As variantes podem ser rastreadas para determinar se elas obtêm as propriedades desejadas. A maturação por afinidade in vitro (por exemplo, usando PCR propensa a erros, rearranjo de cadeia, randomização de CDRs ou mutagênese direcionada a oligonucleotídeo) também pode ser usada para melhorar a afinidade de anticorpos (veja, por exemplo, Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37 (2001)).

[0079] As inserções e deleções de sequência de aminoácido feitas em um anticorpo ou fragmento de anticorpo incluem fusões de terminal amino e/ou carboxila variando no comprimento de um ou alguns resíduos a polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções e deleções intra sequência de resíduos de aminoácido únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionila N-terminal. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão do terminal N ou C do anticorpo a uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida sérica do anticorpo. Exemplos de variantes de inserção intra sequência das moléculas de anticorpo incluem uma inserção de 3 aminoácidos na cadeia leve. Exemplos de deleções terminais incluem um anticorpo com uma deleção de 7 ou menos aminoácidos em uma extremidade da cadeia leve e a remoção da lisina C-terminal na cadeia pesada.

[0080] Em algumas modalidades, os anticorpos de ROR1 são alterados para aumentar ou diminuir sua glicosilação (por exemplo, alterando a sequência de aminoácido de modo que um ou mais sítios de glicosilação sejam criados ou removidos). Um carboidrato ligado a uma região Fc de um anticorpo pode ser alterado. Anticorpos nativos de células de mamíferos tipicamente compreendem um oligossacarídeo biantenário, ramificado ligado por uma ligação N a Asn297 do domínio CH2 da região Fc (veja, por exemplo, Wright et al., TIBTECH 15:26-32 (1997)). Asn297 refere-se ao resíduo de asparagina localizado em torno da posição 297 na região Fc (numeração EU de resíduos da região Fc; veja, por exemplo, Edelman et al. PNAS 63(1):78-85 (1969)). No entanto, Asn297 também pode estar localizado a cerca de ± 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, isto é, entre as posições 294 e 300, devido a pequenas variações de sequência nos anticorpos. O oligossacarídeo pode ser qualquer um dos vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetil glicosamina (GlcNAc), galactose, ácido siálico ou fucose ligada a um GlcNAc na haste da estrutura de oligossacarídeo biantenário. Modificações do oligossacarídeo em um anticorpo podem ser feitas, por exemplo, para criar variantes de anticorpo com certas propriedades melhoradas. As variantes de glicosilação de anticorpo podem ter uma função de ADCC e/ou CDC melhorada.

[0081] Em algumas modalidades, as variantes de anticorpo são fornecidas tendo uma estrutura de carboidrato que não tem ou tem um nível reduzido de fucose ligada (direta ou indiretamente) a uma região Fc. Por exemplo, a quantidade de fucose em um tal anticorpo pode ser de 1% a 80%, de 1% a 65%, de 5% a 65% ou de 20% a 40%. A quantidade de fucose é determinada calculando a quantidade média de fucose dentro da cadeia de açúcar em Asn297, em relação à soma de todas as glicoestruturas ligadas a Asn297 (veja, por exemplo, Publicação de Patente PCT WO 2008/077546). Tais variantes de fucosilação podem ter uma função melhorada de ADCC (veja, por exemplo, Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); e Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614 (2004)). As linhagens celulares (por exemplo, linhagens celulares nocaute) podem ser usadas para produzir anticorpos desfucosilados, por exemplo, células de CHO Lec13 deficientes em fucosilação de proteína e células de CHO nocaute de gene alfa-1,6-fucosiltransferase (FUT8) (veja, por exemplo, Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614 (2004); e Kanda et al., Biotechnol. Bioeng. 94(4):680-688 (2006)). Outras variantes de glicosilação de anticorpo, como descrito em, por exemplo, Patente U.S. 6.602.684) também podem ser produzidas para os anticorpos de ROR1 ou fragmentos de anticorpo para uso nos presentes imunoconjugados.

[0082] Em algumas modalidades, uma ou mais modificações de aminoácido podem ser introduzidas na região Fc de um anticorpo ROR1 para gerar um anticorpo ROR1 com uma região Fc variante que confere novas propriedades ao anticorpo. Uma região Fc variante pode compreender uma sequência de região Fc humana (por exemplo, uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) compreendendo uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais posições de aminoácido. Por exemplo, um anticorpo ROR1 com uma região Fc variante pode possuir algumas, porém, não todas as funções efetoras, o que o torna um candidato desejável para aplicações nas quais a meia-vida do anticorpo in vivo é importante, mas algumas funções efetoras (tal como complemento e ADCC) são desnecessárias ou deletérias. Ensaios de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser conduzidos para confirmar a redução/depleção das atividades de CDC e/ou ADCC. Por exemplo, os ensaios de ligação ao receptor Fc (FcR) podem ser conduzidos para garantir que o anticorpo não possui ligação a FcyR (portanto, provavelmente sem atividade de ADCC), porém, mantém a capacidade de ligação a FcRn. Exemplos não limitantes de ensaios in vitro para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse são descritos nas Patentes U.S. 5.500.362 e 5.821.337. Alternativamente, métodos de ensaios não radioativos podem ser usados (por exemplo, ensaios de citotoxicidade não radioativos ACTI™ e CytoTox 96®). As células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMCs), monócitos, macrófagos e células exterminadoras naturais (NK).

[0083] Os anticorpos podem ter meias-vidas aumentadas e ligação melhorada ao receptor Fc neonatal (FcRn) (veja, por exemplo, Publicação de Patente U.S. 2005/0014934). Tais anticorpos podem compreender uma região Fc com uma ou mais substituições nela que melhoram a ligação da região Fc a FcRn e incluem aqueles com substituições em um ou mais resíduos da região Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 e 434 de acordo com o sistema de numeração EU (veja, por exemplo, Patente U.S. 7.371.826). Outros exemplos de variantes da região Fc também são contemplados (veja, por exemplo, Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); Pats. U.S. 5.648.260 e 5.624.821; e Publicação PCT WO 94/29351).

[0084] Em algumas modalidades, pode ser desejável criar anticorpos modificados com cisteína, por exemplo, "tioMAbs", nos quais um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos por resíduos de cisteína. Em algumas modalidades, os resíduos substituídos ocorrem em sítios acessíveis do anticorpo. Os grupos tiol reativos podem ser posicionados em sítios para conjugação com outras porções, tais como porções de fármaco ou porções de fármaco ligante, para criar um imunoconjugado. Qualquer um ou mais dos seguintes resíduos pode ser substituído por cisteína: V205 (numeração Kabat) da cadeia leve; A118 (numeração EU) da cadeia pesada; e S400 (numeração EU) da região Fc da cadeia pesada.

[0085] Um anticorpo aqui fornecido pode ser também modificado para incluir porções não proteicas. As porções adequadas para a derivação do anticorpo incluem, porém, não estão limitadas a polímeros solúveis em água. O termo "polímero", quando aqui utilizado, refere-se a uma molécula composta por subunidades repetidas; tais moléculas incluem, porém, não estão limitadas a polipeptídeos, polinucleotídeos ou polissacarídeos ou polialquileno glicois. Exemplos não limitativos de polímeros solúveis em água são polietileno glicol (PEG), copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anidrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros randomizados) e dextrano ou poli(N-vinil pirrolidona)-polietileno glicol, homopolímeros de polipropileno glicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, poliois polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico e suas misturas. O propionaldeído de polietileno glicol pode ter vantagens na fabricação devido à sua estabilidade na água. O polímero pode ter qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros ligados ao anticorpo pode variar e, se dois ou mais polímeros estiverem ligados, eles podem ser a mesma molécula ou diferentes.

1.5 Porções de Fármacos Citotóxicas

[0086] Um imunoconjugado da invenção compreende um anticorpo anti-ROR1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conjugado a um ou mais agentes citotóxicos, tais como agentes quimioterapêuticos, agentes inibidores de crescimento, toxinas (por exemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimaticamente ativas de bactérias, fungos, planta, ou origem animal ou seus fragmentos) ou isótopos radioativos. O(s) agente(s) citotóxico(s) pode(m) ser conjugado(s) ao anticorpo ou fragmento anti-ROR1 por um ligante covalentemente ligado a um resíduo de aminoácido do anticorpo. Muitos fármacos que podem servir como uma porção citotóxica em um imunoconjugado são independentemente tóxicos demais para serem utilizados no tratamento do câncer e, portanto, são mais eficazes quando direcionados especificamente para a célula cancerosa por um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

[0087] O termo "porção de fármaco citotóxica" ou "agente citotóxico" refere-se a um composto que pode causar danos, distúrbios ou morte a uma célula. Exemplos de porções de fármacos citotóxicas que podem ser usadas como parte de um imunoconjugado de ROR1 incluem, porém, não estão limitados a: NCA1, auristatina, auristatina E, agentes de ligação a sulcos menores de DNA, agentes alquilantes de sulcos menores de DNA, enedina, lexitropsina, duocarmicina, taxano, puromicina dolastatina, maitansinoide, vinca alcaloide, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB, taxoides (por exemplo, paclitaxel e derivados de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE® (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.), bem como docetaxel e derivados de docetaxel), CC1065, SN-38, topotecana, morfolino-doxorrubicina, rizoxina, cianomorfolino-doxorrubicina, dolastatina-10, equinomicina, combretatstatina, caliqueamicina, maitansina, DM-1, netropsina, podofilotoxina (por exemplo, etoposídeo e teniposídeo), bacatina e seus derivados, agentes antitubulina, criptofisina, combretastatina, vincristina, sulfato de vincristina, vimblastina, vindesina, vinorelbina, VP-16, camptotecina, epotilona A, epotilona B, nocodazol, colchicinas, colcimida, estramustina, cemadotina, discodermolida, eleuterobina, mecloretamina, ciclofosfamida, melfalana, carmustina, lomustina, semustina, estreptozocina, clorozotocina, mostarda de uracila, clormetina, clorambucila, pipobromano, trietilenomelamina, trietilenotiofosforamina, bussulfano, dacarbazina, temozolomida, itarabina, citosina arabinosídeo, fluorouracila, 5-fluorouracila (5-FU), floxuridina, 6-tioguanina, 6-mercaptopurina, pentostatina, metotrexato, 10-propargil-5,8-dideazafolato, ácido 5,8-dideazatetra-hidrofólico, leucovorina, fosfato de fludarabina, pentostatina, gencitabina, Ara-C, desoxicoformicina, mitomicinas, tais como mitomicina-C, L-as- paraginase, azatioprina, brequinar, antibióticos (por exemplo, antraciclina, gentamicina, cefalotina, vancomicina, telavancina, daptomicina, azitromicina, eritromicina, rocitromicina, furazolidona, amoxicilina, ampicilina, carbenicilina, flucloxacilina, meticilina, penicilina, ciprofloxacino, moxifloxacino, ofloxacino, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina, estreptomicina, rifabutina, etambutol e rifaximina), antibióticos de enediina (por exemplo, caliqueamicina, caliqueamicina gama-1I e caliqueamicina omegaI1 e dinemicina, incluindo dinemicina A), fármacos antivirais (por exemplo, abacavir, aciclovir, ampligênio, cidofovir, delavirdina, didanosina, efavirenz, entecavir, fosfonete, ganciclovir, ibacitabina, imunovir, idoxuridina, inosina, lopinavir, metisazona, nexavir, nevirapina, oseltamivir, penciclovir, estavudina, trifluridina, truvada, valaciclovir e zanamivir), cloridrato de daunorrubicina, daunoricina, cerubidina, idarrubicina, doxorrubicina, epirrubicina e derivados de morfolino, bisciclopeptídeos de fenoxizona (por exemplo, dactinomicina), glicopeptídeos básicos (por exemplo, bleomicina), glicosídeos de antraquinona (por exemplo, plicamicina e mitramicina), antracenodionas (por exemplo, mitoxantrona), azirinopirrolo indoledionas (por exemplo, mitomicina), imunossupressores macrocíclicos (por exemplo, ciclosporina, FK-506, tacrolimus, prograf e rapamicina), navelbeno, CPT-11, anastrazol, letrazol, capecitabina, reloxafina, droloxafina, alocolchicina, Halicondrina B, colchicina e derivados de colchicina, rizoxina, tiocolchicina, tritil cisterina, sulfato de vimblastina, hidroxiureia, N-metil-hidrazina, epidofilotoxina, procarbazina, mitoxantrona, leucovorina e tegafur. "Taxanos" incluem paclitaxel, bem como qualquer derivado de taxano ativo ou profármaco. Agentes quimioterapêuticos tais como erlotinibe (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), bortezomibe (VELCADE®, Millenium Pharm.), fulvestrante (FASLODEX®, AstraZeneca), sunitinibe (Sutent®, Pfizer), letrozol (FEMARA®, Novartis), mesilato de imatinibe (GLEEVEC®, Novartis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), oxaliplatina (Eloxatin®, Sanofi), leucovorina, lapatinibe (TYKERB®, GSK572016, GlaxoSmithKline), lonafarnibe (SCH 33336), sorafenibe (BAY43-9006, Bayer Labs.) e gefitinibe (IRESSA®, AstraZeneca), AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), agentes alquilantes tais como tiotepa e ciclosfosfamida (CYTOXAN®); alquil sulfonatos tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; antineoplásico antifolato, tal como pemetrexede (ALIMTA® Eli Lilly); aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiopofosforamida e trimetilomelamina; acetogeninas (tais como bulatacina e bulatacinona); uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecana); briostatina; calistatina; CC1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (tais como criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo seus análogos sintéticos KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictiina; espongistatina; mostardas de nitrogênio, tais como clorambucila, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalana, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida e mostarda de uracila; nitrosoureias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimnustina; bisfosfonatos, tal como clodronato; uma esperamicina; bem como cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos antibióticos relacionados com cromoproteína enediina, aclacinomisinas, actinomicina, antramicina, azasserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (ADRIAMYCIN®) (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino- doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, idarrubicina, marcelomicina, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabólitos tais como metotrexato e 5-FU; análogos de ácido fólico, tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógeno tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracila; ansacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucido; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidainina; maitansinoides tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamete; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etil- hidrazida; procarbazina; complexo de polissacarídeo PSK® (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxano; rizoxina; sizofurano; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2'- triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosídeo ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por exemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), formulação de nanopartícula, albumina, livre de Cremophor ABRAXANE™, de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.) e doxetaxel TAXOTERE® (Rhone- Poulenc Rorer, Antony, France); clorambucila; gencitabina GEMZAR®; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vimblastina; platina; etoposídeo (VP-16); mitoxantrona; vinorelbina NAVELBINE®; novantrona; teniposídeo; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tal como ácido retinoico; e sais, ésteres, ácidos, profármacos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos precedentes.

[0088] Em algumas modalidades, um agente citotóxico adequado para uso no imunoconjugado de ROR1 é a) um agente antitubulina (por exemplo, auristatina ou dolastatina, tal como auristatina E, monometil auristatina E (MMAE) ou monometil auristatina F (MMAF), dimetilvalina-valina-dolaisoleuina- dolaproína-fenilalanina-p-fenilenodiamina (AFP), ácido 5-benzoilvalé- rico-éster de auristatina E (AEVB), AEB, um maitansinoide, ansamitocina, mertansina/entansina (DM1) ou ravtansina/soravtansina (DM4)), b) um agente alquilante de DNA ou um agente alquilante de sulco menor de DNA (por exemplo, duocarmicina), c) um agente de reticulação de DNA (por exemplo, pirrolobenzodiazepina (PBD)), d) um agente intercalante de DNA (por exemplo, PNU- 159682), e) um agente de ligação a sulco menor de DNA (por exemplo, CC-1065), ou f) um inibidor de RNA polimerase II (por exemplo, amanitina, tal como α-amanitina).

[0089] Quando aqui utilizado, o termo "agente intercalante" refere- se a uma química que pode ser inserida no espaço intramolecular de uma molécula ou no espaço intermolecular entre moléculas. A título de exemplo, um agente intercalante de DNA pode ser uma molécula que se insere nas bases empilhadas da dupla hélice do DNA.

[0090] Em algumas modalidades, o agente citotóxico usado no imunoconjugado de ROR1 é selecionado do grupo que consiste em uma enediina, uma lexitropsina, uma duocarmicina, um taxano, uma puromicina, uma podofilotoxina, um derivado de bacatina, uma criptofisina, uma combrestatina, uma dolastatina, um maitansinoide, um vinca alcaloide, paclitaxel, docetaxel, ansamitocina, CC-1065, SN- 38, topotecano, morfolino-doxorrubicina, rizoxina, cianomorfolino- doxorrubicina, dolastatina-10, equinomicina, combretatstatina, caliqueamicina, vincristina, vimblastina, vindesina, vinorelbina, VP-16, camptotecina, epotilona A, epotilona B, nocodazol, colchicinas, colcimida, estramustina, cemadotina, discodermolida maitansina, eleuterobina e netropsina.

[0091] Em algumas modalidades, a porção de fármaco citotóxica no imunoconjugado é um profármaco. O termo "profármaco" ou "profármaco farmaceuticamente aceitável", quando aqui utilizado, refere-se a um agente que é convertido no fármaco origem in vivo ou in vitro e é relativamente não tóxico. Ou seja, o imunoconjugado pode ser administrado a um indivíduo sem causar efeitos biológicos indesejáveis ou interagir de maneira deletéria com qualquer um dos componentes da composição em que está contido. Os profármacos são geralmente precursores de fármaco que, após administração a um indivíduo e subsequente absorção, são convertidos em uma espécie ativa ou mais ativa por meio de algum processo, tal como a conversão por uma via metabólica. Alguns profármacos têm um grupo químico presente no profármaco que o torna menos ativo e/ou confere solubilidade ou alguma outra propriedade ao fármaco. Uma vez que o grupo químico foi clivado e/ou modificado do profármaco, o fármaco ativo é gerado. Os profármacos podem ser convertidos em fármaco ativo dentro do corpo através de reações enzimáticas ou não enzimáticas. Os profármacos podem fornecer propriedades físicoquímicas melhoradas sobre seus fármacos origem tais como melhor solubilidade, características de liberação realçadas (por exemplo, direcionando uma célula, tecido, órgão ou ligante específico) e valor terapêutico melhorado do fármaco. Os benefícios de tais profármacos podem incluir, porém, não estão limitados a: (i) facilidade de administração em comparação com o fármaco origem; (ii) o profármaco pode estar biodisponível por administração oral onde o de origem não estiver; e (iii) o profármaco pode ter solubilidade melhorada em composições farmacêuticas em comparação com o fármaco origem. Um profármaco inclui um derivado farmacologicamente inativo ou menos ativo de um fármaco. Os profármacos podem ser projetados para modular a quantidade de um fármaco ou molécula biologicamente ativa que atinge um sítio de ação desejado através da manipulação das propriedades de um fármaco, tais como propriedades fisicoquímicas, biofarmacêuticas ou farmacocinéticas.

[0092] Em algumas modalidades, o número médio da porção de fármaco para o anticorpo no imunoconjugado (isto é, relação de fármaco para anticorpo ou DAR) é 1; ou pelo menos 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Métodos exemplares para medir o DAR são descritos nos exemplos abaixo.

1.6 Ligantes

[0093] Em certas modalidades de um imunoconjugado da invenção, o anticorpo pode ser conjugado diretamente ao agente citotóxico, ou pode ser conjugado através de um ligante. Os ligantes adequados incluem, por exemplo, ligantes cliváveis e não cliváveis. Em algumas modalidades, o ligante é um ligante clivável. Um ligante clivável refere-se a um ligante que compreende uma porção clivável e é tipicamente suscetível à clivagem sob condições intracelulares. Os ligantes cliváveis adequados incluem, por exemplo, ligantes peptídicos cliváveis por uma protease intracelular (tal como uma protease lisossômica ou uma protease endossômica) e ligantes cliváveis por ácidos. Em modalidades exemplares, o ligante pode ser um dipeptídeo, tal como um ligante de valina-citrulina (val-cit ou VC) ou um de fenilalanina-lisina (phe-lys). O ligante também pode ser um tripipeptídeo ou um polipeptídeo tendo quatro ou mais resíduos de aminoácido. Outros ligantes adequados incluem ligantes hidrolisáveis a um pH inferior a 5,5, tal como um ligante de hidrazona. Os ligantes cliváveis adequados adicionais incluem ligantes de dissulfeto. Em algumas modalidades, o ligante é um ligante não polimérico. Em alguns casos, o ligante é um ligante não peptídico ou um ligante que não contém um resíduo de aminoácido.

[0094] Em algumas modalidades, o ligante inclui um grupo C1-C6 alquila (por exemplo, um grupo C5, C4, C3, C2 ou C1 alquila). Quando aqui utilizado, o termo "alquila" refere-se a um radical de cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificado consistindo apenas em átomos de carbono e hidrogênio, que não contém insaturação. C1-Cx inclui C1-C2, C1-C3,..., Ci-Cx, em que x é um número inteiro. Ci-Cx refere-se ao número de átomos de carbono no grupo designado. Em algumas modalidades, uma alquila compreende um a oito átomos de carbono (C1-8 alquila). Em algumas modalidades, uma alquila compreende dois a seis átomos de carbono (C2-6 alquila).

[0095] Quando aqui utilizado, um ligante anterior à reação química para ligar os componentes Ab (anticorpo ou fragmento) e D (carga útil) do imunoconjugado também é chamado de um "precursor do ligante". Ficará evidente para a pessoa versada na técnica de ADC se uma determinada entidade química descrita aqui é um precursor do ligante com base em suas capacidades reativas, ou um componente do ligante no produto de imunoconjugado final.

[0096] Em algumas modalidades, a ligação entre os componentes Ab e D do imunoconjugado pode ser formada através da reação dos componentes com um ligante homobifuncional. Ligantes homobifuncionais exemplares incluem, porém, não estão limitados a reagente de Lomant ditiobis (succinimidilpropionato) DSP, 3‘3‘- ditiobis(propionato de sulfossuccinimidil) (DTSSP), suberato de dissuccinimidila (DSS), bis(sulfossuccinimidil)suberato (BS), tartarato de dissuccinimidilsucinato) (DST), tartarato de dissulfossuccinimidila (sulfo DST), etileno glicobis(succinimidilsuccinato) (EGS), glutarato de dissuccinimidila (DSG), carbonato de N,N’-dissuccinimidila (DSC), dimetil adipimidato (DMA), dimetil pimelimidato (DMP), dimetil suberimidato (DMS), dimetil-3,3-ditiobispropionimidato (DTBP), 1,4-di- 3-(2-piridilditio)propionamido) butano (DPDPB), bismaleimido-hexano (BMH), composto contendo haleto de arila (DFDNB), tais como, por exemplo, 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno ou 1,3-difluoro-4,6- dinitrobenzeno, 4,4-difluoro-3,3-dinitrofenilsulfona (DFDNPS), bis-[β- (4-azidossalicilamido)etil]dissulfeto (BASED), formaldeído, glutaraldeído, éter diglicidílico de 1,4-butanodiol, di-hidrazida de ácido adípico, carbo-hidrazida, o-toluidina, 3,3‘-dimetilbenzidina, benzidina, ácido α,α‘-p-diaminodifenila, ácido diiodo-p-xileno sulfônico, N,N‘- etileno-bis(iodoacetamida) e N,N‘-hexametileno-bis(iodoacetamida).

[0097] Em algumas modalidades, a ligação entre os componentes Ab e D do imunoconjugado pode ser formada através da reação dos componentes com um ligante heterobifuncional. Ligantes heterobifuncionais exemplares incluem, porém, não estão limitados a reticuladores reativos à amina e de sulfidrila, tais como N-succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (sPDP), N-succinimidil 3-(2- piridilditio)propionato de cadeia longa (LC-sPDP), N-succinimidil 3-(2- piridilditio)propionato de cadeia longa solúvel em água (sulfo-LC- sPDP), succinimidiloxicarbonil-α-metil-α-(2-piridilditio)tolueno (sMPT), sulfosuccinimidil-6-[α-metil-α-(2-piridilditio)toluamido]hexanoato (sulfo- LC-sMPT), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato (SMCC), sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1- carboxilato (sulfo-sMCC), éster m-maleimidobenzoil-N- hidroxissuccinimida (MBs), éster m-maleimidobenzoil-N- hidroxissulfossuccinimida (sulfo-MBs), N-succinimidil(4- iodoacetil)aminobenzoato (sIAB), sulfossuccinimidil(4-iodoacetil) aminobenzoato (sulfo-sIAB), succinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato (sMPB), sulfosuccinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato (sulfo-sMPB), éster N-(y-maleimidobutirilóxi)succinimida (GMBs), éster de N-(y-ma- leimidobutirilóxi)sulfosuccinimida (sulfo-GMBs), succinimidil 6-((io- doacetil)amino)hexanoato (sIAX), succinimidil 6-[6-(((iodoacetil) amino)hexanoil)amino]hexanoato (sIAXX), succinimidil 4-(((iodoacetil) amino)metil)ciclo-hexano-1-carboxilato (sIAC), succinimidil 6-((((4-io- doacetil)amino)metil)ciclo-hexano-1-carbonil)amino)hexanoato (sIACX), p-nitrofenil iodoacetato (NPIA), reticuladores reativos à carbonila e reativos à sulfidrila, tais como hidrazida de ácido 4-(4-N-maleimi- dofenil)butírico (MPBH), 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxil- hidrazida-8 (M2C2H), 3-(2-piridilditio)propionil hidrazida (PDPH), reticuladores reativos à amina e fotorreativos, tais como ácido N-hidro- xissuccinimidil-4-azidosalicílico (NHs-AsA), ácido N-hidroxissulfossuc- cinimidil-4-azidosalicílico (sulfo-NHs-AsA), sulfosuccinimidil-(4- azidossalicilamido)hexanoato (sulfo-NHs-LC-AsA), sulfosuccinimidil-2- (p-azidossalicilamido)etil-1,3‘-ditiopropionato (sAsD), N-hidroxissuc- cinimidil-4-azidobenzoato (HsAB), N-hidroxissulfossuccinimidil-4- azidobenzoato (sulfo-HsAB), N-succinimidil-6-(4‘-azido-2‘-nitrofenila- mino)hexanoato (sANPAH), sulfosuccinimidil-6-(4-azido-2-nitrofenila- mino) hexanoato (sulfo-sANPAH), N-5-azido-2-nitrobenzoiloxis- succinimida (ANB-NOs), sulfossuccinimidil-2-(m-azido-o-nitrobenza- mido)-etil-1,3-ditiopropionato (sAND), N-succinimidil-4(4-azidofenil) 1,3-ditiopropionato (sADP), N-sulfossuccinimidil(4-azidofenil)-1,3‘-ditio- propionato (sulfo-sADP), sulfossuccinimidil 4-(p-azidofenil)butirato (sulfo-sAPB), sulfossuccinimidil 2-(7-azido-4-metilcumarin-3- acetamida) etil-1,3‘-ditiopropionato (sAED), sulfossuccinimidil 7-azido- 4-metilcumarin-3-acetato (sulfo-AMCA), p-nitrofenil diazopiruvato (pNPDP), p-nitrofenil-2-diazo-3,3,3-trifluoropropionato (PNP-DTP), reticuladores reativos à sulfidrila e fotorreativos, tais como 1-(p- Azidossalicilamido)-4-(iodoacetamido)butano (AsIB), N-[4-(p- azidossalicilamido)butil]-3-(2-piridilditio)propionamida (APDP), benzofenona-4-iodoacetamida, reticuladores fotorreativos e reativos à benzofenona-4-maleimida carbonila tais como p-azidobenzoil hidrazida (ABH), reticuladores reativos ao carboxilato e fotorreativos tais como 4-(p-azidossalicilamido)butilamina (AsBA) e reticuladores fotorreativos e reativos à arginina, tal como p-azidofenil glioxal (APG).

[0098] Em algumas modalidades, a ligação entre os componentes Ab e D do imunoconjugado pode ser formada através da reação dos componentes com um ligante tendo um grupo funcional reativo que pode compreender, por exemplo, um grupo nucleofílico que é reativo a um grupo eletrofílico presente em uma porção de ligação. Grupos eletrofílicos exemplares incluem grupos carbonila, tais como aldeídos, cetonas, ácidos carboxílicos, ésteres, amidas, enonas, haletos de acila e anidridos ácidos. Em modalidades particulares, o grupo funcional reativo é um aldeído. Grupos nucleofílicos exemplares incluem hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiossemicarbazona, carboxilato de hidrazina e aril-hidrazida.

[0099] Em algumas modalidades, a conjugação do ligante/carga útil ao anticorpo ou fragmento pode ser formada através da reação com um grupo maleimida (que também pode ser referido como um espaçador de maleimida). Em certas modalidades, o grupo maleimida é maleimidocaproíla (mc); assim, o ligante/carga útil é conjugado ao anticorpo ou fragmento através da reação entre um resíduo no anticorpo ou fragmento e o grupo mc no precursor do ligante. Em algumas modalidades, o grupo maleimida compreende um grupo maleimidometila, tal como succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo- hexano-1-carboxilato (SMCC) ou sulfossuccinimidil-4-(N- maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC), como descrito aqui.

[00100] Em algumas modalidades, o grupo maleimida é uma maleimida autoestabilizante. Em algumas modalidades, a maleimida autoestabilizante utiliza ácido diaminopropiônico (DPR) para incorporar um grupo amino básico adjacente à maleimida para fornecer catálise intramolecular da hidrólise do anel de tiossuccinimida, diminuindo assim a capacidade da maleimida de sofrer uma reação de eliminação através de uma reação retro-Michael. Em algumas modalidades, a maleimida autoestabilizante é um grupo maleimida descrito em Lyon et al., Nat. Biotechnol. 32(10):1059-1062 (2014). Em certas modalidades, o precursor do ligante compreende uma maleimida autoestabilizante. Em certas modalidades, o precursor do ligante é uma maleimida autoestabilizante.

[00101] Em algumas modalidades, o ligante pode incluir uma porção de peptídeo. Em algumas modalidades, a porção de peptídeo compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais resíduos de aminoácido. Em algumas modalidades, a porção de peptídeo é clivável (por exemplo, enzimaticamente ou quimicamente). Em algumas modalidades, a porção de peptídeo é não clivável. Em algumas modalidades, a porção de peptídeo compreende Val-Cit (valina- citrulina), Gly-Gly-Phe-Gly (SEQ ID NO: 55), Phe-Lys, Val-Lys, Gly- Phe-Lys, Phe-Phe-Lys, Ala-Lys, Val-Arg, Phe-Cit, Phe-Arg, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 56), ou Gly- Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 57). Em certas modalidades, o ligante compreende Val-Cit (VC). Em certas modalidades, o ligante é Val-Cit (VC).

[00102] Em algumas modalidades, o ligante pode incluir um ácido benzoico ou grupo benzilóxi, ou um derivado do mesmo. Por exemplo, o ligante pode comprometer o ácido para-amino-benzoico (PABA). Em algumas modalidades, o ligante inclui um grupo para-amino- benziloxicarbonila (PAB). Em algumas modalidades, o ligante compreende ácido gama-amino-butírico (GABA).

[00103] Em algumas modalidades, a ligação entre os componentes Ab e D do imunoconjugado pode ser formada através da reação dos componentes com um ligante compreendendo um grupo maleimida, uma porção de peptídeo e/ou um ácido benzoico (por exemplo, PABA) ou grupo benziloxicarbonila, em qualquer combinação. Em certas modalidades, o grupo maleimida é maleimidocaproíla (mc). Em certas modalidades, o grupo peptídeo é Val-Cit (VC). Em certas modalidades, o ligante compreende um grupo Val-Cit-PABA. Em certas modalidades, a conjugação do ligante ao anticorpo ou fragmento pode ser formada a partir de um grupo mc-Val-Cit-PABA. Em certas modalidades, a conjugação do ligante ao anticorpo ou fragmento pode ser formada a partir de um grupo mc-Val-Cit. Em certas modalidades, a ligação entre o anticorpo ou fragmento e a porção de fármaco pode ser formada a partir de um grupo mc-Val-Cit-PAB.

[00104] Em algumas modalidades, o ligante é um ligante autoimolativo ou um ligante de autoeliminação (por exemplo, um ligante de autoeliminação de ciclização). Em algumas modalidades, o ligante pode ser um ligante descrito na Pat. U.S. 9.089.614 ou Publicação PCT WO 2015/038426.

[00105] Em algumas modalidades, o ligante é um ligante do tipo dendrítico. Em certas modalidades, o ligante do tipo dendrítico compreende uma porção de ligante multifuncional ramificada. O ligante dendrítico pode ter duas ou mais ramificações. Em certas modalidades, o ligante do tipo dendrítico é usado para aumentar a razão molar da porção de fármaco ao anticorpo ou fragmento. Em certas modalidades, o ligante do tipo dendrítico compreende dendrímeros de PAMAM.

[00106] Em algumas modalidades, o ligante é um ligante sem rastreamento ou um ligante que após a clivagem não deixa para trás uma porção de ligante (por exemplo, um átomo ou um grupo ligante). Exemplos de ligantes sem rastreamento incluem, porém, não estão limitados a ligantes de germânio, ligantes de silício, ligantes de enxofre, ligantes de selênio, ligantes de nitrogênio, ligantes de fósforo, ligantes de boro, ligantes de cromo e ligantes de fenil-hidrazida. Em algumas modalidades, o ligante é um ligante de aril-triazeno sem rastreamento, como descrito em Hejesen et al., Org Biomol Chem 11(15):2493-2497 (2013). Em algumas modalidades, o ligante é um ligante sem rastreamento descrito em Blaney et al., Chem. Rev. 102:2607-2024 (2002). Em algumas modalidades, um ligante é um ligante sem rastreamento, como descrito na Patente U.S. 6.821.783.

[00107] Em algumas modalidades, o ligante compreende um grupo funcional que exerce impedimento estérico no sítio de ligação entre o ligante e uma porção conjugadora (por exemplo, qualquer um dentre ADC-A, B, C, E, F e H-T aqui descritos). Em algumas modalidades, o impedimento estérico é um impedimento estérico em torno de uma ligação de dissulfeto. Um ligante exemplar que exibe impedimento estérico pode ser, por exemplo, um ligante heterobifuncional (por exemplo, como aqui descrito). Em algumas modalidades, um ligante que exibe impedimento estérico compreende SMCC e SPDB.

[00108] Em algumas modalidades, o ligante é um ligante clivável por ácido. Em algumas modalidades, o ligante clivável por ácido compreende uma ligação de hidrazona, que é suscetível à clivagem hidrolítica. Em algumas modalidades, o ligante clivável por ácido compreende um ligante de ácido tiomaleâmico. Em algumas modalidades, o ligante clivável por ácido é um ligante de ácido tiomaleâmico como descrito em Castaneda et al., Chem. Comum. 49:8187-8189 (2013).

[00109] Em algumas modalidades, o ligante é um ligante descrito em qualquer uma das Patentes U.S. 6.884.869, 7.498.298, 8.288.352, 8.609.105 e 8.697.688; qualquer uma das Publicações de Patente U.S. 2014/0127239, 2013/028919, 2014/286970, 2013/0309256, 2015/037360; e 2014/0294851; ou qualquer uma das Publicações PCT WO 2015/057699, WO 2014/080251, WO 2014/197854, WO 2014/145090 e WO 2014/177042.

[00110] Os ligantes adequados para uso nos imunoconjugados da invenção podem incluir, por exemplo, ligantes que são cliváveis intracelularmente com alta estabilidade extracelular. Em certas modalidades, o ligante compreende um grupo funcional que permite a ligação do ligante a qualquer um dos anticorpos ou fragmentos aqui descritos (por exemplo, um derivado de maleimida). Em certas modalidades, o ligante (ou precursor) compreende 6- maleimidocaproíla (MC), maleimidopropanoíla (MP), valina-citrulina (VC), alanina-fenilalanina (AP), p-aminobenziloxicarbonila (PAB), N- succinimidil 4-(2)-piridiltio) pentanoato (SPP), N-succinimidil 4-(N- maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato (SMCC), N-succinimidil (4- iodo-acetil) aminobenzoato (SIAB), 6-maleimidocaproil-valina-citrulina (MC-VC), 6-maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonila (MC-VC-PAB), N-succinimidil-1-carboxilato-valina-citrulina-p- aminobenziloxicarbonila (SC-VC-PAB), 6-maleimidocaproil-polietileno glicol-valina-citrulina (MC-PEG4-VC), 6-maleimidocaproil-polietileno glicol-valina-alanina (MC-PEG4-VA) ou MC-PEG8-VC-PAB. Em algumas modalidades, o ligante antes da reação de conjugação (também conhecido como precursor de ligante) é 6-maleimidocaproil- valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonila (MC-VC-PAB) ou N- succinimidil-1-carboxilato-valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonila (SC-VC-PAB). Em algumas modalidades, o ligante é um ligante de 6- maleimidocaproíla (MC). Em algumas modalidades, o ligante é um ligante de maleimidopropanoíla (MP). Em algumas modalidades, o ligante é um ligante de valina-citrulina (VC). Em algumas modalidades, o ligante é um ligante de alanina-fenilalanina (AP). Em algumas modalidades, o ligante é um ligante p-aminobenziloxicarbonila (PAB). Em algumas modalidades, o ligante é um ligante de N-succinimidil 4- (2-piridiltio)pentanoato (SPP). Em algumas modalidades, o ligante é um ligante de N-succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1- carboxilato (SMCC). Em algumas modalidades, o ligante é um ligante de N-succinimidil (4-iodo-acetil)aminobenzoato (SIAB). Em algumas modalidades, o ligante é um ligante de 6-maleimidocaproil-valina- citrulina (MC-VC). Em algumas modalidades, o ligante é um ligante de 6-maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonila (MC-VC- PAB). Em algumas modalidades, o ligante é um ligante de N- succinimidil-1-carboxilato-valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonila (SC-VC-PAB). Em algumas modalidades, o ligante compreende ainda um espaçador entre o ligante e a porção citotóxica. Em algumas modalidades, o espaçador é um heteroátomo. Em algumas modalidades, o espaçador é uma cadeia de alquila. Em algumas modalidades, o espaçador é uma cadeia de alquila compreendendo um ou mais heteroátomos. Em algumas modalidades, o espaçador é um grupo carbonila. Em algumas modalidades, o ligante é um ligante homobifuncional ou um ligante heterobifuncional.

[00111] Em algumas modalidades, os ligantes aqui descritos podem ser ligados aos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno aqui descritos em um resíduo de aminoácido de ocorrência natural, tal como uma lisina ou uma cisteína reduzida. Em algumas modalidades, os ligantes podem ser ligados a um aminoácido não natural (por exemplo, azidofenilalanina, p-acetilfenilalanina ou p- azidometilfenilalanina) por meio de uma reação "click" de alcina/azida, condensações de carbonila, adições do tipo Michael, e substituições de Mizoroki-Heck. Sítios de ligante adicionais podem ser adicionados geneticamente e podem compreender um motivo de polipeptídeo que permite a adição enzimática do ligante. Tais motivos de polipeptídeo podem compreender, por exemplo, um marcador de glutamina (por exemplo, LLQGA (SEQ ID NO: 58)), um marcador de aldeído (por exemplo, CxPxR, onde x é qualquer aminoácido), um motivo de sortase (por exemplo, LPxTG (SEQ ID NO: 59, onde x é qualquer aminoácido), NPQTN (SEQ ID NO: 60)) ou um marcador de BirA (por exemplo, GFEIDKVWYDLDA (SEQ ID NO: 61)). A ligação de ligantes a um marcador de glutamina pode ser alcançada usando uma transglutaminase bacteriana. A ligação dos ligantes a um marcador de aldeído é obtida usando a enzima geradora de formilglicina (FGE), que oxida o resíduo de cisteína da sequência de consenso, criando um aldeído; este aldeído pode ser reagido com um grupo amino-óxi em um ligante para formar uma oxima estável. A ligação de ligantes a um motivo de sortase pode ser obtida usando uma transpeptidase bacteriana que reconhece uma sequência LPxTG C-terminal (SEQ ID NO: 59) ou sequência NPQTN (SEQ ID NO: 60), cliva a ligação de TG ou TN, e facilita - através de um intermediário de enzima tioacila- treonina - o ataque nucleofílico da proteína alfa-amina de entrada na treonina. O resíduo atacante pode ser um dímero ou trímero de glicina de um ligante ou adicionado a um ligante. A ligação de ligantes a um motivo de sortase ou a um marcador de BirA pode ser obtida usando uma ligase de biotina. Em certas modalidades, o ligante não está ligado a um resíduo de lisina. Em certas modalidades, o ligante é unido apenas a um resíduo de cisteína. Em certas modalidades, o resíduo de cisteína foi modificado no anticorpo através da conversão de um ou mais resíduos não cisteína na cadeia leve e/ou cadeia pesada em uma cisteína. Em certos dispositivos, a conversão de cisteína não interfere na ligação ao antígeno. Em certas modalidades, a selenocisteína é incorporada no anticorpo por modificação genética. Veja, por exemplo, Sochaj et al., Biotechnology Advances 33:775-784 (2015).

[00112] Em algumas modalidades, o ligante é conjugado ao anticorpo ou fragmento anti-ROR1 por um processo de ligação química. Em algumas modalidades, o ligante é conjugado ao anticorpo ou fragmento anti-ROR1 por uma ligação nativa. Em algumas modalidades, a conjugação é como descrito em Dawson et al., Science 266:776-779 (1994); Dawson et al., J. Am. Chem. Soc. 119:4325-4329 (1997); Hackeng et al., PNAS 96:10068-10073 (1999); ou Wu et al., Angew. Chem. Int. Ed. 45:4116-4125 (2006). Em algumas modalidades, a conjugação é como descrito na Patente U.S. 8.936.910. Em algumas modalidades, o ligante é conjugado ao anticorpo ou fragmento anti-ROR1, especificamente no sítio ou não especificamente através da química de ligação nativa.

[00113] Em algumas modalidades, o ligante é conjugado ao anticorpo anti-ROR1 ou fragmento de ligação ao antígeno por um método direcionado ao sítio utilizando uma tecnologia de acoplamento "sem rastreamento" (Philochem). Em algumas modalidades, a tecnologia de acoplamento "sem rastreamento" utiliza um grupo 1,2- aminotiol N-terminal na porção de ligação que é, então, conjugada com o anticorpo ou seu fragmento contendo um grupo aldeído. Veja, por exemplo, Casi et al., JACS 134(13):5887-5892 (2012). Em algumas modalidades, o ligante é conjugado ao anticorpo ou fragmento anti-ROR1 por um método direcionado ao sítio utilizando um aminoácido não natural incorporado na porção de ligação. Em algumas modalidades, o aminoácido não natural compreende p- acetilfenilalanina (pAcPhe). Em algumas modalidades, o grupo ceto de pAcPhe é seletivamente acoplado a uma porção de conjugação derivada de alcóxi-amina para formar uma ligação de oxima. Veja, por exemplo, Axup et al., PNAS 109(40): 16101-16106 (2012).

[00114] Em algumas modalidades, o ligante é conjugado ao anticorpo anti-ROR1 ou fragmento de ligação ao antígeno por um sis conjugado ao anticorpo anti-ROR1 por um método direcionado ao sítio, utilizando um processo catalisado por enzima. Em algumas modalidades, o método direcionado ao sítio utiliza a tecnologia SMARTag™ (Redwood). Em algumas modalidades, a tecnologia SMARTag™ compreende a geração de um resíduo de formilglicina (FGly) a partir de cisteína pela enzima geradora de formilglicina (FGE) através de um processo de oxidação sob a presença de um marcador de aldeído e a subsequente conjugação de FGly a uma molécula de aminoácido funcionalizada por alquil-hidrazina através da ligação de hidrazino-Pictet-Spengler (HIPS). Veja, por exemplo, Wu et al., PNAS 106(9):3000-3005 (2009) e Agarwal et al., PNAS 110(1):46-51 (2013)).

[00115] Em algumas modalidades, o processo catalisado por enzima compreende transglutaminase microbiana (mTG). Em certas modalidades, o ligante é conjugado ao anticorpo ou fragmento anti- ROR1 utilizando um processo catalisado por transglutaminase microbiana. Em algumas modalidades, o mTG catalisa a formação de uma ligação covalente entre a cadeia lateral de amida de uma glutamina dentro da sequência de reconhecimento e uma amina primária de uma molécula de aminoácido funcionalizada. Em algumas modalidades, o mTG é produzido a partir de Streptomyces mobarensis. Veja, por exemplo, Strop et al., Chemistry and Biology 20(2):161-167 (2013). Em algumas modalidades, o ligante é conjugado ao anticorpo anti-ROR1 por uma reação química baseada em carboidrato. Na estratégia da conjugação baseada em carboidrato, a primeira etapa é geralmente introduzir novas funcionalidades bio- ortogonais para facilitar a conjugação do anticorpo a um fármaco. Estratégias que podem ser usadas para introduzir funcionalidades bio- ortogonais na porção de carboidrato para bioconjugação (glico- conjugação) incluem, porém, não estão limitadas, à oxidação química de glicanos; modificação enzimática e quimioenzimática de glicanos; e engenharia metabólica da porção de carboidrato. As abordagens químicas podem usar periodato de sódio (NaIO4) para oxidar grupos cis-glicol de, por exemplo, galactose ou ácido siálico para gerar aldeídos, que, em seguida, podem ser acoplados a moléculas funcionalizadas por hidrazida ou amina primária para criar hidrazonas marcadas com ácido ou com grupos amino-óxi para formar as oximas. Abordagens enzimáticas e quimioenzimáticas tratam o resíduo de açúcar com neuraminidase (Neu) e galactose oxidase (Gal Oxi) para funcionalidades de formiato aldeído. O tratamento contínuo do anticorpo com β1,4-galactosiltransferase (Gal T)/α2,6-sialiltransferase (Sial T) pode produzir anticorpos homogeneamente sialilados. Os anticorpos resultantes podem, então, ser oxidados seletivamente para as funcionalidades de aldeído correspondentes e, se derivados de ácido siálico forem utilizados, estes anticorpos podem ser usados como alças bio-ortogonais seletivas. Similarmente, o anticorpo pode ser tratado com β-galactosidase (Gal) e um Gal T mutante para mediar a ligação de azida ou ceto-galactoses bio-ortogonais para gerar padrões homogêneos de G2 glicano que possuem funcionalidades não naturais. Outro método produz derivados de tio-fucose não canônicos que podem ser incorporados no glicano de anticorpos, alimentando as células com o açúcar bio-ortogonal, gerando anticorpos expressos que exibem funcionalidades tiol.

[00116] Os ligantes podem ser conjugados com os anticorpos anti- ROR1 e fragmentos de ligação ao antígeno da presente descrição de várias maneiras. Geralmente, um ligante e uma porção citotóxica são sintetizados e conjugados antes da ligação a um anticorpo. Um método de ligação de um conjugado ligante-fármaco a um anticorpo envolve a redução de dissulfetos expostos a solvente com ditiotreitol (DTT) ou tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), seguido pela modificação dos tiois resultantes com porções de ligante-fármaco contendo maleimida (por exemplo, 6-maleimidocaproil-valina-citrulina-p- aminobenziloxicarbonila (MC-VC-PAB)). Um anticorpo nativo contém 4 ligações dissulfeto de intercadeia e 12 ligações dissulfeto de intracadeia, bem como cisteínas não emparelhadas. Assim, os anticorpos modificados desta maneira podem compreender mais de um uma porção ligante-fármaco por anticorpo. Em certas modalidades, os imunoconjugados aqui descritos compreendem pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, 9 ou 10 porções de ligante/fármaco. Em certas modalidades, os imunoconjugados aqui descritos compreendem 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2, porções de ligante/fármaco, ou 1 porção de ligante/fármaco. Nos casos em que o ligante é ramificado e pode cada um se conectar a várias porções de fármaco, a relação da porção de fármaco para o anticorpo será maior do que o uso de um ligante não ramificado.

[00117] Em algumas modalidades, o ligante é da fórmula: em que X é C2-8 alquila; Y é -(CH2CH2O)qCH2CH2-; W é uma unidade de aminoácido; Z é n é 0 ou 1; p é 0 ou 1; q é um número inteiro de 0 a 12; u é um número inteiro de 0 a 5; e v é 0 ou 1; em que ** indica o ponto de ligação à porção de fármaco (D); e * indica o ponto de ligação ao anticorpo ou fragmento (Ab).

[00118] Em algumas modalidades, p é 0. Em algumas modalidades, p é 1. Em algumas modalidades, p é 1 e X é -(CH2)2-. Em algumas modalidades, p é 1 e X é -(CH2)3-. Em algumas modalidades, p é 1 e X é -(CH2)4-. Em algumas modalidades, p é 1 e X é -(CH2)5-. Em algumas modalidades, p é 1 e X é -(CH2)6-. Em algumas modalidades, q é um número inteiro de 1 a 12. Em algumas modalidades, q é um número inteiro de 4 a 12. Em algumas modalidades, q é um número inteiro de 4 a 8. Em algumas modalidades, q é 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12. Em algumas modalidades, W é uma unidade de aminoácido que compreende resíduos de aminoácido de ocorrência natural, bem como aminoácidos menores e análogos de aminoácido de ocorrência não natural. Em algumas modalidades, W é selecionado dentre alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano, prolina, lisina protegida ou não com acetila ou formila, arginina, arginina protegida ou não com grupos tosila ou nitro, histidina, ornitina, ornitina protegida com acetila ou formila, e citrulina. Em algumas modalidades, u é 1, 2, 3, 4 ou 5. Em algumas modalidades, u é 0. Em algumas modalidades, v é 0. Em algumas modalidades, v é 1.

[00119] Em algumas modalidades, o ligante é da fórmula: em que X é C2-8 alquila; Y é -(CH2CH2O)qCH2CH2-; W é uma unidade de aminoácido; Z é n é 0 ou 1; p é 0 ou 1; q é um número inteiro de 0 a 12; u é um número inteiro de 0 a 5; e v é 0 ou 1; em que ** indica o ponto de ligação à porção de fármaco (D); e * indica o ponto de ligação ao anticorpo ou fragmento (Ab).

[00120] Em algumas modalidades, n é 0. Em algumas modalidades, n é 1. Em algumas modalidades, X é -(CH2)2-. Em algumas modalidades, X é -(CH2)3-. Em algumas modalidades, X é -(CH2)4-. Em algumas modalidades, X é -(CH2)5-. Em algumas modalidades, X é - (CH2)6-. Em algumas modalidades, W é uma unidade de aminoácido compreendendo resíduos de aminoácido de ocorrência natural, bem como aminoácidos menores e análogos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente. Em algumas modalidades, W é selecionado dentre alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano, prolina, lisina protegida ou não com acetila ou formila, arginina, arginina protegida ou não com grupos tosila ou nitro, histidina, ornitina, ornitina protegida com acetila ou formila, e citrulina. Em algumas modalidades, w é 1, 2, 3, 4 ou 5. Em algumas modalidades, w é 0. Em algumas modalidades, v é 0. Em algumas modalidades, v é 1.

[00121] Em algumas modalidades, o imunoconjugado opcionalmente compreende ainda uma porção endossomolítica. Em alguns casos, a porção endossomolítica é um componente de liberação do compartimento celular, tal como um composto capaz de liberar-se de quaisquer dos compartimentos celulares conhecidos na técnica, tal como endossoma, lisossoma, retículo endoplasmático (ER), aparelho de Golgi, microtúbulo, peroxissomo ou outros corpos vesiculares com a célula. Em alguns casos, a porção endossomolítica compreende um polipeptídeo endossomolítico, um polímero endossomolítico, um lipídeo endossomolítico ou uma molécula pequena endossomolítica. Em alguns casos, a porção endossomolítica compreende um polipeptídeo endossomolítico. Em outros casos, a porção endossomolítica compreende um polímero endossomolítico. Em algumas modalidades, um polímero endossomolítico aqui descrito é um polímero endossomolítico responsivo ao pH. Um polímero responsivo ao pH compreende um polímero que aumenta de tamanho (incha) ou entra em colapso, dependendo do pH do ambiente. O ácido poliacrílico e a quitosana são exemplos de polímeros responsivos ao pH. Em algumas modalidades, uma porção endossomolítica aqui descrita é um polímero disruptivo à membrana. Em alguns casos, o polímero disruptivo à membrana compreende um polímero catiônico, um polímero neutro ou hidrofóbico ou um polímero aniônico. Em algumas modalidades, o polímero disruptivo à membrana é um polímero hidrofílico. Em algumas modalidades, p(ácidos alquilacrílicos) incluem ácido polipropilacrílico) (poliPAA), ácido polimetacrílico (PMAA), ácido polietilacrílico) (PEAA) e ácido polipropilacrílico (PPAA). Em algumas modalidades, um p(ácido alquilacrílico) aqui descrito pode ser um p(ácido alquilacrílico) descrito em Jones et al., Biochemistry Journal 372:65-75 (2003). Em algumas modalidades, um polímero disruptivo à membrana responsivo ao pH compreende p(ácido butil acrilato-co-metacrílico). Veja, por exemplo, Bulmus, et al., Journal of Controlled Release 93:105-120 (2003); e Yessine et al., Biochimica et Biophysica Acta 1613:28-38 (2003). Em algumas modalidades, um polímero disruptivo à membrana responsivo ao pH compreende p(anidrido estireno-alt-maleico). Veja, por exemplo, Henry et al., Biomacromolecules 7:2407-2414 (2006). Em algumas modalidades, um polímero disruptivo à membrana responsivo ao pH compreende um polímero de acrilato de piridildissulfeto (PDSA), tal como polímero poli(MAA-co-PDSA), poli(EAA-co-PDSA), poli(PAA-co-PDSA), poli(MAA-co-BA-co-PDSA), poli(EAA-co-BA-co-PDSA) ou poli(PAA-co- BA-co-PDSA). Veja, por exemplo, El-Sayed et al., Journal of Controlled Release 104:417-427 (2005); ou Flanary et al., Bioconjugate Chem. 20:241-248 (2009). Em algumas modalidades, a porção endossomolítica é um lipídeo (por exemplo, um lipídeo fusogênico). Em algumas modalidades, uma molécula de Fórmula (I): A-X-B-Y-C é ainda conjugada com um lipídeo endossomolítico (por exemplo, lipídeo fusogênico). Lipídeos fusogênicos exemplares incluem 1,2-dileoil-sn-3- fosfoetanolamina (DOPE), fosfatidiletanolamina (POPE), palmitoiloloilfosfatidilcolina (POPC), (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta- 6,9,28,31-tetraen-19-ol (Di-Lin), N-metil(2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12- dienil)-1,3-dioxolan-4-il)metanamina (DLin-k-DMA) e N-metil-2-(2,2- di((9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dienil)-1,3-dioxolan-4-il)etanamina (XTC). Moléculas pequenas exemplares adequadas como porções endossomolíticas incluem, porém, não estão limitadas a quinina, cloroquina, hidroxicloroquinas, amodiaquinas (carnoquinas), amopiroquinas, primaquinas, mefloquinas, nivaquinas, halofantrinas, quinona iminas ou qualquer combinação dos mesmos.

[00122] O termo "ligação", quando aqui utilizado, refere-se a uma ligação ou porção química formada a partir de uma reação química entre o grupo funcional de uma entidade molecular e outra entidade molecular. Tais ligações podem incluir, porém, não estão limitadas a ligações covalentes e não covalentes, enquanto tais porções químicas podem incluir, porém, não estão limitadas a ésteres, carbonatos, carbamatos, ésteres de fosfato de iminas, hidrazonas, acetais, ortoésteres, ligações peptídicas, e ligações oligonucleotídicas. A ligação hidroliticamente estável significa que a ligação é substancialmente estável na água e não reage com a água em valores úteis de pH, incluindo, porém, não limitados a condições fisiológicas, por um período prolongado de tempo, talvez até indefinidamente. Ligação hidroliticamente instável ou degradável significa que a ligação é degradável em água ou em soluções aquosas, incluindo, por exemplo, sangue. Ligação enzimaticamente instável ou degradável significa que a ligação pode ser degradada por uma ou mais enzimas. Apenas a título de exemplo, o PEG e os polímeros relacionados podem incluir ligações degradáveis na cadeia principal do polímero ou no grupo ligante entre a cadeia principal do polímero e um ou mais dos grupos funcionais terminais da molécula do polímero. Tais ligações degradáveis incluem, porém, não estão limitadas a ligações de éster formadas pela reação de ácidos carboxílicos de PEG ou ácidos carboxílicos de PEG ativados com grupos álcool em um agente biologicamente ativo, em que tais grupos éster geralmente hidrolisam sob condições fisiológicas para liberar o agente biologicamente ativo. Outras ligações hidroliticamente degradáveis incluem, porém, não estão limitadas a, ligações carbonato; ligações imina resultaram da reação de uma amina e um aldeído; ligações éster de fosfato formadas pela reação de um álcool com um grupo fosfato; ligações hidrazona que são produto da reação de uma hidrazida e um aldeído; ligações acetal que são o produto da reação de um aldeído e um álcool; ligações ortoéster que são o produto da reação de um formiato e de um álcool; ligações peptídicas formadas por um grupo amina, incluindo, porém, não limitadas em uma extremidade de um polímero tal como PEG, e um grupo carboxila de um peptídeo; e ligações oligonucleotídicas formadas por um grupo fosforamidita, incluindo, porém, não limitado, na extremidade de um polímero, e um grupo 5’ hidroxila de um oligonucleotídeo.

1.7 Imunoconjugados de ROR1 Exemplares

[00123] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo e D é uma porção de fármaco. Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo e D é monometil auristatina E (MMAE). Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo. Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo e D é mertansina (também chamado DM1).

[00124] Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo.

[00125] Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo e D é uma porção de fármaco. Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo e D é mertansina. Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo.

[00126] Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo e D é uma porção de fármaco. Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo e D é uma pirrolobenzodiazepina dimérica (PBD). Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo.

[00127] Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo e D é uma porção de fármaco. Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo e D é mertansina. Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo.

[00128] Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo e D é uma porção de fármaco. Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo e D é MMAE. Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo. Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo e D é mertansina. Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo.

[00129] Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo e D é uma porção de fármaco. Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo e D é uma duocarmicina. Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo.

[00130] Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo e D é uma porção de fármaco. Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo e D é uma amanitina, tal como α-amanitina. Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo.

[00131] Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo e D é uma porção de fármaco. Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo e D é PNU159682. Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo.

[00132] Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo e D é uma porção de fármaco. Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo e D é PBD. Em algumas modalidades, o ADC tem a estrutura: em que Ab é um anticorpo.

[00133] Imunoconjugados exemplares da presente invenção são mostrados na tabela abaixo: Tabela 2 Imunoconjugados Exemplares # Carga útil do ligante ramificado. * Conjugação específica de sítio usando transglutaminase microbiana.

[00134] Na tabela acima, as abreviações são usadas como segue: química da maleimida (MAL); maleimidocaproíla (mc); química da succinimida (SC); succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1- carboxilato (SMCC); dibenzilciclo-octina (DBCO); ácido diaminopropiônico (DPR); benzila (Phe), polietileno glicol (PEG); valina-citrulina (VC); valina-alanina (VA); para-amino benziloxicarbonila (porção autoimolativa) (PAB); dimetiletilamina (DMEA); etileno diamina (EDA); monometil auristatina E (MMAE); N2'- Desacetil-N2'-(3-mercaptol-oxopropil) maitansina (DM1); e pirrolobenzodiazepina (PBD), [1,2]Diazepino[3,4-e]indol. Para ADC-Q e ADC-R, a conjugação específica de sítio da carga útil pode ser feita usando transglutaminase microbiana.

[00135] As estruturas químicas dos imunoconjugados na Tabela 2 são mostradas na tabela abaixo: Tabela 3 Estruturas Químicas de Imunoconjugados Exemplares

2. Síntese de Imunoconjugados

[00136] Em algumas modalidades, os imunoconjugados aqui descritos são preparados como mostrado nos Esquemas 1 e 2. O MMAE é preparado em 12 etapas a partir da L-isoleucina, como descrito no Esquema 1. Como mostrado no Esquema 2, o MMAE preparado no Esquema 1 é acoplado ao 4-nitrofenil carbonato de um ligante de valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonila (VC-PAB) protegido por FMOC. A desproteção do grupo FMOC fornece a construção VC-PAB-ligante MMAE-MMAE. Esquema 1 Legenda das figuras: - Cbz-L-Valina Esquema 2

[00137] Métodos de síntese exemplares para os ADCs mostrados na Tabela 3 são ilustrados no Exemplo 1 abaixo. Em ADC-A, C, H a P, S e T, o anticorpo é covalentemente ligado à fração ligante/carga útil via resíduos de cisteína. Em ADC-B, E e F, o anticorpo é covalentemente ligado à porção ligante/carga útil (ou à carga útil para B) via resíduos de lisina. Em ADC-Q e R, o anticorpo é covalentemente ligado ao ligante/carga útil via resíduos de glutamina. 3. Terapia por imunoconjugadosOs imunoconjugados aqui descritos são úteis para o tratamento de uma variedade de cânceres. Foi demonstrado que o ROR1 se expressa em muitos tipos de tumores, incluindo linfomas e tumores sólidos. Altas proporções de cânceres humanos expressam ROR1. Por exemplo, Zhang et al. mostraram que 54% de câncer de ovário, 57% de câncer de cólon, 77% de câncer de pulmão, 90% de linfomas, 89% de câncer de pele, 83% de câncer de pâncreas, 73% de câncer de testículo, 43% de câncer de bexiga, 96% de câncer de útero e 90% de câncer de próstata e 83% dos cânceres suprarrenais que eles examinaram apresentaram coloração de moderada a forte com o anticorpo anti-ROR1 4A5 (Zhang et al., Am J Pathol.181 (6): 1903-10 (2012)). Daneshmanesh et al. similarmente encontrada expressão quase universal de ROR1 na LLC e leucemia de células pilosas (HCL) e graus variáveis de expressão em outros cânceres linfoides, como linfoma de células de revestimento (MCL), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL)/linfoma de zona marginal (MZL), linfoma folicular (FL), leucemia mieloide crônica (LMC), linfoma mieloide agudo (LMA) e mieloma (Daneshmanesh et al., Leuk Lymphoma 54 (4): 843-50 (2013)). Nossos próprios estudos mostraram da mesma forma que proporções substanciais de pacientes com câncer hepatocelular (CHC) ou câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) são positivas para ROR1. Este amplo padrão de expressão tumoral de ROR1 torna os imunoconjugados da presente invenção úteis no tratamento de muitos cânceres hematológicos e tumores sólidos, como os mencionados acima. Além disso, foi demonstrado que a expressão de ROR1 aumenta em cânceres agressivos e se correlaciona com mau prognóstico; assim, os imunoconjugados da presente invenção são particularmente adequados para tratar cânceres agressivos ou avançados. Em algumas modalidades, os imunoconjugados da invenção levam a regressão parcial ou completa do tumor. Em modalidades particulares, a regressão parcial ou completa do tumor pode ser mantida além da dose final do tratamento com imunoconjugado.

[00139] Os imunoconjugados de ROR1 da invenção, como aqueles fabricados com um anticorpo que se liga a um epítopo de ROR1 apresentado em SEQ ID NO: 1 ou 2 (por exemplo, Ab1, Ab2, Ab3 ou Ab4), são eficazes no tratamento de cânceres tais como tumores sólidos que são heterogêneos na expressão de ROR1. Tumores com menos de 20% de suas células que expressam ROR1 podem ser tratados efetivamente pelos imunoconjugados de ROR1; por exemplo, os tumores podem ter 20% ou mais, 30% ou mais, 40% ou mais, 50% ou mais, 60% ou mais ou 70% ou mais de suas células que expressam ROR1. Sem desejar estar vinculado à teoria, é considerado que os imunoconjugados de ROR1 da invenção possam causar morte celular em células tumorais negativas para ROR1 através do efeito de toxicidade observada (ou seja, a carga útil liberada de uma célula tumoral morta causa citotoxicidade em uma célula tumoral vizinha) ou melhorando a imunidade antitumoral do sistema imunológico, ou ambos.

[00140] "Tratar", "tratando" e "tratamento" se referem a um método para aliviar ou revogar um distúrbio biológico e/ou pelo menos um de seus sintomas associados. Quando aqui usado, "aliviar" uma doença, distúrbio ou condição significa reduzir a gravidade e/ou frequência de ocorrência dos sintomas da doença, distúrbio ou condição. Além disso, as referências aqui ao "tratamento" incluem referências ao tratamento curativo, paliativo e profilático. O tratamento do câncer abrange a inibição do crescimento do câncer (incluindo causar regressão parcial ou completa do câncer), inibição da progressão ou metástase do câncer, prevenção da recorrência do câncer ou doença residual e/ou prolongamento da sobrevivência do paciente.

[00141] Em algumas modalidades, o câncer tratável pelos imunoconjugados aqui descritos é um câncer que expressa ROR1. O câncer que expressa ROR1 pode ser determinado por qualquer método adequado para determinar a expressão de genes ou proteínas, por exemplo, por histologia, citometria de fluxo, RT-PCR ou RNA-Seq. As células cancerígenas usadas para a determinação podem ser obtidas por biópsia tumoral ou por coleta de células tumorais circulantes. Em certas modalidades, se um ensaio baseado em anticorpo, como citometria de fluxo ou imuno-histoquímica, é usado, os cânceres que expressam ROR1 são quaisquer cânceres com células que mostram reatividade ao anticorpo anti-ROR1 maior que a de um anticorpo de controle de isótipo. Em certas modalidades, se um ensaio baseado em RNA é usado, os cânceres que expressam ROR1 são aqueles que mostram um nível elevado de RNA de ROR1 em comparação com uma célula de controle negativo ou câncer que não expressa ROR1.

[00142] Em certas modalidades, os anticorpos e imunoconjugados são para uso no tratamento de doenças malignas hematológicas. Em certa modalidade os anticorpos e imunoconjugados são para uso no tratamento de tumores sólidos. O câncer a ser tratado pode ser selecionado dentre, por exemplo, linfoma, pequeno linfoma linfocítico, linfoma de zona marginal, linfoma de células B de células marginais, linfoma de Burkitt, linfoma de células de revestimento, linfoma difuso de células B grandes, um linfoma não Hodgkin que sofreu Transformação de Richter, leucemia linfocítica crônica, leucemia de células T, osteossarcoma, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer de mama, câncer epitelial de células escamosas, melanoma, mieloma, mieloma múltiplo, câncer de estômago, câncer de cérebro, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pâncreas, câncer de colo do útero, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer de testículo, câncer de tireoide e câncer de cabeça e pescoço. Em certas modalidades, o câncer a ser tratado pode ser um câncer refratário a outras terapêuticas (por exemplo, câncer de mama triplo negativo).

[00143] Em certas modalidades, os métodos para tratamento de câncer aqui descritos compreendem tratamento com um imunoconjugado da invenção e tratamento com um agente terapêutico adicional ou molécula biologicamente ativa. Exemplos de moléculas biologicamente ativas incluem, mas não estão limitados a peptídeos, proteínas, enzimas, fármacos de pequenas moléculas, pró-fármacos, carboidratos, agentes de imagem, lipídeos, nucleosídeos, radionuclídeos, oligonucleotídeos, toxinas, células, antibióticos, fungicidas, agentes antivirais, agentes anti-inflamatórios, agentes antitumorais, agentes cardiovasculares, agentes anti-ansiedade, hormônios, fatores de crescimento, agentes esteroides, toxinas derivadas de bactérias e similares. Outros exemplos de moléculas biologicamente ativas são aquelas listadas acima, sob o título "Porções de fármacos citotóxicas".

[00144] Em certas modalidades, o imunoconjugado e o agente terapêutico adicional ou molécula biologicamente ativa são administrados ao mesmo tempo, por exemplo, na mesma formulação. Em certas modalidades, eles são administrados separadamente, nos mesmos ou diferentes esquemas de dosagem. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um inibidor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), um inibidor da tirosina quinase de Bruton (BTK), um inibidor do alvo da rapamicina de mamíferos (mTOR), um inibidor da fosfoinositídeo 3-quinase (PI3K), um inibidor da sinalização de Janus quinase/transdutores de sinal e ativadores da transcrição (Jak/STAT), um inibidor do linfoma 2 de células B (Bcl-2), um inibidor da tirosina quinase do baço (SYK), um inibidor de microtúbulos, um receptor do fator de crescimento epitelial (EGFR) ), um inibidor de poli ADP ribose polimerase (PARP), um inibidor de linfoma quinase anaplásico (ALK), um inibidor de reparo de DNA, um reticulador de DNA, um reticulador de DNA, um análogo de nucleosídeo ou um agente imunomodulador.

[00145] Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é a) um anticorpo como rituximabe (anti-CD20) ou bevacizumabe (anti-VEGF); b) um inibidor de tirosina quinase de Bruton, como acalabrutinibe ou ibrutinibe; c) um inibidor de mTOR, como sapanisertibe, everolimo ou BEZ235; d) um inibidor de PI3K como idelalisibe ou buparlisibe; e) um inibidor de sinalização de Jak/STAT tal como ruxolitinibe; f) um inibidor de Bcl-2 como ABT-199/venetoclax, Bcl-2i-1 ou Bcl-2i-2; g) um inibidor de SYK tal como fostamatinibe; h) um inibidor de microtúbulos como paclitaxel ou vincristina; i) um inibidor de EGFR como o erlotinibe; j) um inibidor de PARP como o olaparibe; k) um inibidor de ALK tal como crizotinibe; l) um inibidor de reparo de DNA tal como carboplatina; m) um reticulador de DNA como oxaliplatina/cisplatina; n) um análogo de nucleosídeo como a gencitabina; ou o) um fármaco imunomodulador (IMiD), como lenalidomida ou pomalidomida.

[00146] Em uma modalidade específica, o agente terapêutico adicional é o venetoclax.

[00147] Em certas modalidades, um imunoconjugado da invenção e um agente terapêutico adicional ou molécula biologicamente ativa são usados em combinação para tratar CLL, MCL ou um linfoma não- Hodgkin que passou pela transformação de Richter. Em modalidades particulares, o agente terapêutico adicional ou molécula biologicamente ativa é, por exemplo, ibrutinibe, acalabrutinibe, venetoclax, Bcl-2i-1, Bcl-2i-2, everolimo, sapanisertibe ou idelalisibe.

[00148] Exemplos adicionais do agente terapêutico adicional são pacritinibe, buparlisibe, BEZ235, ruxolitinibe, fostamatinibe, rituximabe, lenalidomida, pomalidomida, paclitaxel, vincristina, erlotinibe, crizotinibe, carboplatina, oxaliplatina, cisplatina, cisplatina e cisplatina.

[00149] Em certas modalidades, um imunoconjugado da invenção é usado em combinação com um modulador de ponto de verificação imune que aprimora o sistema imunológico do paciente. Por exemplo, o conjugado é usado com um inibidor do ponto de verificação imune, como um anticorpo ou derivado de anticorpo, um oligonucleotídeo antissenso, um pequeno RNA interferente, um aptâmero ou um peptídeo que tem como alvo o ligante de morte programada 1 (PD-L1, também conhecido como B7-H1, CD274), morte programada 1 (PD-1), CTLA-4, PD-L2 (B7-DC, CD273), LAG3, TIM3, 2B4, A2aR, B7H1, B 7H3, B7H4, BTLA, CD2, CD27, CD28, CD30, CD40, CD70, CD80, CD86, CD137, CD160, CD226, CD276, DR3, GAL9, GITR, HAVCR2, HVEM, IDO1, IDO2, ICOS (estimulador de células T indutível)), KIR, LAIR1, LIGHT, MARCO (receptor de macrófagos com estrutura colágena), PS (fosfatidilserina), OX-40, SLAM, TIGHT, VISTA, VTCN1 ou qualquer combinação dos mesmos.

[00150] Entende-se que os imunoconjugados da invenção podem ser utilizados em um método de tratamento como aqui descrito, podem ser usados em um tratamento como aqui descrito e/ou podem ser usados na fabricação de um medicamento para um tratamento como aqui descrito. A invenção também fornece kits e artigos de fabricação compreendendo os imunoconjugados da invenção, como aqui descrito.

4. Composições Farmacêuticas

[00151] Em algumas modalidades, o imunoconjugado da invenção pode ser apreendido em uma composição farmacêutica compreendendo ainda um ou mais excipientes, veículos e diluentes farmaceuticamente aceitáveis. Por exemplo, os anticorpos e imunoconjugados da invenção podem ser administrados suspensos em uma solução estéril (por exemplo, uma solução compreendendo NaCl a 0,9%). Em certas modalidades, a solução compreende ainda um ou mais dos seguintes: tampões (por exemplo, acetato, citrato, histidina, succinato, fosfato, bicarbonato e tampões de hidroximetilaminometano (Tris)); tensoativos (por exemplo, polissorbato 80 (Tween 80), polissorbato 20 (Tween 20) e poloxâmero 188); polióis/dissacarídeo/polissacarídeos (por exemplo, glicose, dextrose, manose, manitol, sorbitol, sacarose, trealose e dextrano 40); aminoácidos (por exemplo, glicina e arginina); antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico e metionina); e/ou agentes quelantes (por exemplo, EDTA e EGTA). Qualquer combinação desses excipientes também é considerada. Em certas modalidades, os imunoconjugados da invenção são transportados/armazenados liofilizados e reconstituídos antes da administração. Em certas modalidades, formulações de anticorpo liofilizado ou imunoconjugado compreendem um agente de volume, como manitol, sorbitol, sacarose, trealose e/ou dextrano 40. A formulação liofilizada pode estar contida em um frasco, como um frasco de vidro. Os imunoconjugados, quando formulados, reconstituídos ou não, podem ser tamponados a um certo pH, por exemplo, menor que 7,0 (como um pH entre 4,5 e 6,5, entre 4,5 e 6,0, entre 4,5 e 5,5, entre 4,5 e 5,5, ou entre 5,0 e 6,0).

[00152] Os imunoconjugados da invenção, como aqui utilizados, abrangem sais ou ésteres farmaceuticamente aceitáveis dos conjugados. Os sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser formados quando um próton ácido presente nos polipeptídeos é substituído por um íon metálico, a título de exemplo um íon de metal alcalino, um íon alcalino terroso ou um íon de alumínio; ou coordena com uma base orgânica. Além disso, as formas de sal dos imunoconjugados podem ser preparadas utilizando sais dos materiais de partida ou intermediários. Os imunoconjugados aqui descritos podem ser preparados como sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis (que são um tipo de sal farmaceuticamente aceitável) fazendo reagir a forma de base livre dos polipeptídeos aqui descritos com um ácido inorgânico ou orgânico farmaceuticamente aceitável. Alternativamente, os imunoconjugados aqui descritos podem ser preparados como sais de adição de base farmaceuticamente aceitáveis (que são um tipo de sal farmaceuticamente aceitável) fazendo reagir a forma de ácido livre de aminoácidos em polipeptídeos aqui descritos com uma base inorgânica ou orgânica farmaceuticamente aceitável.

[00153] Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a: (1) sais de adição de ácido, formados com ácidos inorgânicos, como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e similares; ou formado com ácidos orgânicos, como ácido acético, ácido propiônico, ácido hexanoico, ácido ciclopentanopropiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido lático, ácido malônico, ácido succínico, ácido málico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, benzoico ácido, ácido 3- (4-hidroxibenzoil)benzoico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido 1,2-etanodissulfônico, ácido 2-hidroxietanossulfônico, ácido benzenossulfônico, ácido 2- naftalenossulfônico, ácido 4-metilbiciclo-[2.2.2]oct-2-eno-1-carboxílico, ácido glico-heptônico, ácido 4,4‘-metilenobis-(3-hidróxi-2-eno-1- carboxílico), ácido 3-fenilpropiônico, ácido trimetilacético, ácido butilacético terciário, ácido lauril sulfúrico, ácido glicônico, ácido glutâmico, ácido hidroxinaftoico, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido mucônico e similares; e (2) sais formados quando um próton ácido presente no composto parental é substituído por um íon metálico, por exemplo, um íon de metal alcalino, um íon alcalino terroso ou um íon de alumínio; ou coordena com uma base orgânica. As bases orgânicas aceitáveis incluem etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamina e similares. Bases inorgânicas aceitáveis incluem hidróxido de alumínio, hidróxido de cálcio, hidróxido de potássio, carbonato de sódio, hidróxido de sódio e similares. Os contraíons correspondentes dos sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser analisados e identificados usando vários métodos, incluindo, entre outros, cromatografia de permuta iônica, cromatografia iônica, eletroforese capilar, plasma acoplado indutivamente, espectroscopia de absorção atômica, espectrometria de massa ou qualquer combinação dos mesmos.

[00154] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica da invenção inclui formulações multiparticuladas. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica inclui formulações de nanopartículas. Em algumas modalidades, as nanopartículas compreendem cMAP, ciclodextrina e/ou lipídeos. Em alguns casos, as nanopartículas compreendem nanopartículas lipídicas sólidas, nanopartículas poliméricas, nanopartículas autoemulsificantes, lipossomas, microemulsões e/ou soluções micelares. Nanopartículas exemplares adicionais incluem, mas não estão limitadas a nanopartículas paramagnéticas, nanopartículas superparamagnéticas, nanopartículas de metal, materiais similares a fulereno, nanotubos inorgânicos, dendrímeros (como quelatos metálicos covalentemente ligados), nanofibras, nanohorns, nano-onions, nanorods, nanoropes e/ou pontos quânticos. Em algumas modalidades, uma nanopartícula é uma nanopartícula de metal, por exemplo, uma nanopartícula de escândio, titânio, vanádio, cromo, manganês, ferro, cobalto, níquel, cobre, zinco, ítrio, zircônio, nióbio, molibdênio, rutênio, ródio, paládio, prata, cádmio, háfnio, tântalo, tungstênio, rênio, ósmio, irídio, platina, ouro, gadolínio, alumínio, gálio, índio, estanho, tálio, chumbo, bismuto, magnésio, cálcio, estrôncio, bário, lítio, sódio, potássio, boro, silício, fósforo, germânio, arsênico, antimônio e combinações, ligas ou óxidos dos mesmos.

[00155] Qualquer método para administrar imunoconjugados aceitos na técnica pode ser usado. As composições farmacêuticas da invenção são tipicamente adequadas para administração parentérica. Quando aqui usado, "administração parenteral" de uma composição farmacêutica inclui qualquer via de administração caracterizada por violação física de um tecido de um indivíduo e administração da composição farmacêutica através da ruptura no tecido, resultando geralmente na administração direta no sangue fluxo, no músculo ou em um órgão interno. A administração parentérica inclui assim, mas não está limitada a administração de uma composição farmacêutica por injeção da composição, por aplicação da composição através de uma incisão cirúrgica, por aplicação da composição através de uma ferida não cirúrgica que penetra nos tecidos e similares. Em particular, a administração parentérica é considerada para incluir, mas não está limitada a injeção ou infusões subcutâneas, intraperitoneais, intramusculares, intraesternais, intravenosas, intra-arterial, intratecal, intraventricular, intrauretral, intracraniana, intratumoral e intrassinovial; técnicas de infusão dialítica renal. A perfusão regional também é considerada. Modalidades particulares incluem as vias intravenosa e subcutânea.

5. Artigos de fabricação e kits

[00156] A presente invenção também fornece artigos de fabricação, por exemplo, kits, compreendendo um recipiente (por exemplo, um recipiente de uso único ou multiuso) contendo uma composição farmacêutica do presente imunoconjugado), opcionalmente uma molécula biologicamente ativa adicional (por exemplo, outro agente terapêutico) e instruções de uso. O imunoconjugado e a molécula biologicamente ativa adicional podem ser embalados separadamente em embalagens adequadas, como um frasco ou ampola feita de vidro ou plástico não reativo. Em certas modalidades, o frasco ou ampola contém pó liofilizado compreendendo o imunoconjugado ou agente terapêutico adicional ou molécula biologicamente ativa. Em certas modalidades, o frasco ou ampola contém um estoque concentrado (por exemplo, 2x, 5x, 10x ou mais) do imunoconjugado ou molécula biologicamente ativa. Em certas modalidades, os artigos de fabricação, como kits, incluem um dispositivo médico para administrar o imunoconjugado e/ou molécula biologicamente ativa (por exemplo, uma seringa e uma agulha); e/ou um diluente apropriado (por exemplo, água estéril e solução salina normal). A presente invenção também inclui métodos para a fabricação dos referidos artigos.

6. Certas Modalidades

[00157] Certas modalidades da invenção são ainda ilustrativas abaixo. 1. Um imunoconjugado da fórmula: Ab-((L)m-(D))n ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: i. Ab é um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga à proteína de ROR1; ii. L é um ligante; iii. D é uma fração de fármaco selecionada de um agente antitubulina, um agente alquilante de DNA, um agente de reticulação de DNA, um agente intercalante de DNA e um inibidor de RNA polimerase II; iv. m é 0 ou 1; e v. n é um número inteiro de 1 a 10. 2. Um imunoconjugado da fórmula: Ab-((L)m-(D))n ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: i. Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno ao qual se liga a proteína de ROR1; ii. L é um ligante clivável; iii. D é uma fração de fármaco selecionada de um agente antitubulina, um agente alquilante de DNA, um agente de reticulação de DNA, um agente intercalante de DNA e um inibidor de RNA polimerase II; iv. m é 0 ou 1; e v. n é um número inteiro de 1 a 10 3. Um imunoconjugado da fórmula: Ab-((L)m-(D))n ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: i. Ab é um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga à proteína de ROR1; ii. L é um ligante, em que o ligante não está ligado a um resíduo de aminoácido lisina; iii. D é uma fração de fármaco selecionada de um agente antitubulina, um agente alquilante de DNA, um agente de reticulação de DNA, um agente intercalante de DNA e um inibidor de RNA polimerase II; iv. m é 0 ou 1; e v. n é um número inteiro de 1 a 10. 4. O imunoconjugado como definido em qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que D é um agente antitubulina. 5. O imunoconjugado da modalidade 4, em que o agente antitubulina compreende uma auristatina, uma dolastatina ou um análogo da mesma. 6. O imunoconjugado da modalidade 5, em que a auristatina ou dolastatina compreende auristatina E, monometil auristatina E (MMAE) ou monometil auristatina F (MMAF), dimetilvalina-valina-dolaisoleuina-dolaproina-fenilalanina-p- fenilenodiamina (AFP), ácido 5-benzoilvalérico-éster de auristatina E (AEVB) ou (AEB). 7. O imunoconjugado da modalidade 6, em que a auristatina compreende monometil auristatina E (MMAE). 8. O imunoconjugado da modalidade 4, em que o agente antitubulina compreende uma maitansina, maitansinoide ou análogo do mesmo. 9. O imunoconjugado da modalidade 8, em que o maitansinoide compreende ansamitocina, mertansina/entansina (DM1) ou ravtansina/soravtansina (DM4). 10. O imunoconjugado da modalidade 9, em que o maitansinoide compreende mertansina/entansina (DM1). 11. O imunoconjugado da modalidade 9, em que o maitansinoide compreende a gravitansina/soravtansina (DM4). 12. O imunoconjugado da modalidade 1, em que D é um agente alquilante de DNA. 13. O imunoconjugado da modalidade 12, em que o agente alquilante de DNA compreende duocarmicina. 14. O imunoconjugado da modalidade 1, em que D é um agente de reticulação de DNA. 15. O imunoconjugado da modalidade 14, em que o agente de reticulação de DNA compreende pirrolobenzodiazepina (PBD). 16. O imunoconjugado da modalidade 1, em que D é um agente intercalante de DNA. 17. O imunoconjugado da modalidade 16, em que o agente intercalante de DNA compreende PNU-159682. 18. O imunoconjugado da modalidade 1, em que D é um inibidor de RNA polimerase II. 19. O imunoconjugado da modalidade 18, em que o inibidor de RNA polimerase II compreende α-amanitina. 20. O imunoconjugado da modalidade 1, em que D é duas porções diferentes de fármaco covalentemente ligadas. 21. O imunoconjugado da modalidade 20, em que D é qualquer dois ou mais de um agente alquilante de DNA, um agente de reticulação de DNA, um agente intercalante de DNA, um inibidor de RNA polimerase II ou um agente antitubulina covalentemente ligado um ao outro. 22. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1 a 21, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende um anticorpo quimérico, humanizado, desimunizado ou anticorpo humano ou seu fragmento de ligação ao antígeno. 23. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1 a 22, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende um Fab, F(ab)2 ou scFv. 24. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1 a 23, em que o imunoconjugado compreende ainda um segundo anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, em que o segundo anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga especificamente a um epítopo distinto do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno. 25. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1 a 24, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende: a. uma sequência de aminoácidos de CDR1 (HCDR1) da cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 7, uma sequência de aminoácidos de CDR2 (HCDR2) da cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 8, uma sequência de aminoácidos de CDR3 (HCDR3) da cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 9, uma sequência de aminoácidos de CDR1 da cadeia leve (LCDR1) apresentada na SEQ ID NO: 10, uma sequência de aminoácidos de CDR2 (LCDR2) da cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 11 e uma sequência de aminoácidos de CDR3 de cadeia leve (LCDR3) apresentada na SEQ ID NO: 12; b. uma sequência de HCDR1aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 27, uma sequência de aminoácidos de HCDR2 apresentada na SEQ ID NO: 28, uma sequência de aminoácidos de HCDR3 apresentada na SEQ ID NO: 29, uma sequência de aminoácidos de LCDR1 apresentada na SEQ ID NO: 30, uma sequência de aminoácidos de LCDR2 apresentada na SEQ ID NO: 31 e uma sequência de aminoácidos de LCDR3 apresentada na SEQ ID NO: 32; ou c. uma sequência de aminoácidos de HCDR1 apresentada na SEQ ID NO: 37, uma sequência de aminoácidos HCDR2 apresentada na SEQ ID NO: 38, uma sequência de aminoácidos de HCDR3 apresentada na SEQ ID NO: 39, uma sequência de aminoácidos LCDR1 apresentada na SEQ ID NO: 40, uma sequência de aminoácidos de LCDR2 apresentada na SEQ ID NO: 41 e uma sequência de aminoácidos de LCDR3 apresentada na SEQ ID NO: 42. 26. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1 a 24, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende: uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica à estabelecida na SEQ ID NO: 6 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntico ao apresentado na SEQ ID NO: 5. 27. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1 a 26, em que o anticorpo se liga a ROR1 com uma KD inferior a cerca de 40 nM. 28. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1 a 26, em que o anticorpo se liga a ROR1 com uma KD inferior a cerca de 1 nM. 29. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1 a 26, em que o anticorpo se liga a ROR1 com uma afinidade superior a cerca de 10 vezes a do anticorpo D10, em que o anticorpo D10 compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia leve de imunoglobulina estabelecida na SEQ ID NO: 25 e uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada de imunoglobulina estabelecida na SEQ ID NO: 26. 30. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1 a 26, em que o anticorpo se liga a ROR1 com uma afinidade maior que cerca de 50 vezes a do anticorpo D10, em que o anticorpo D10 compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia leve de imunoglobulina estabelecida na SEQ ID NO: 25 e uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada de imunoglobulina estabelecida na SEQ ID NO: 26. 31. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1 a 30, em que L é selecionado a partir de um ligante clivável, um ligante não clivável, um ligante hidrofílico, um ligante recarregado e um ligante à base de ácido dicarboxílico. 32. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1 a 31, em que L é selecionado dentre 6-maleimidocaproíla (MC), maleimidopropanoíla (MP), valina-citrulina (VC), alanina-fenilalanina (AP), p-aminobenziloxicarbonila (PAB), N-succinimidil 4-(2-piridiltio) pentanoato (SPP), N-succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1- carboxilato (SMCC), N-succinimidil (4-iodo-acetil)aminobenzoato (SIAB), 6-maleimidocaproil-valina-citrulina (MC-VC), 6- maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonila (MC-VC- PAB) e N-succinimidil-1-carboxilato-valina-citrulina-p- aminobenziloxicarbonila (SC-VC) -VC-PAB). 33. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1 a 31, em que L é 6-maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenzilo- xicarbonila (MC-VC-PAB). 34. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1 a 31, em que L é N-succinimidil-1-carboxilato-valina-citrulina-p- aminobenziloxicarbonila (SC-VC-PAB). 35. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1 a 31, em que L é 6-maleimidocaproil-valina-citrulina (MC-VC). 36. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1 a 31, em que L é N-succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1- carboxilato (SMCC). 37. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1 a 31, em que L é um ligante da fórmula: em que X é C2-8 alquila; Y é -(CH2CH2O)qCH2CH2-; W é uma unidade de aminoácido; Z é o ; n é 0 ou 1; p é 0 ou 1; q é um número inteiro de 0 a 12; u é um número inteiro de 0 a 5; e v é 0 ou 1; em que ** indica o ponto de ligação a D; e * indica o ponto de ligação a Ab. 38. O imunoconjugado da modalidade 37, em que X é - (CH2)2-. 39. O imunoconjugado da modalidade 37, em que X é - (CH2)3-. 40. O imunoconjugado da modalidade 37, em que X é - (CH2)4-. 41. O imunoconjugado da modalidade 37, em que X é - (CH2)5-. 42. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 37 a 41, em que p é 0. 43. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 37 a 41, em que p é 1. 44. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 37 a 43, em que q é um número inteiro de 4 a 8. 45. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 37 a 43, em que q é 4. 46. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 37 a 43, em que q é 8. 47. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 37 a 46, em que n é 0. 48. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 37 a 46, em que n é 1. 49. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 37 a 48, em que v é 0. 50. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 37 a 48, em que v é 1. 51. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 37 a 50, em que u é um número inteiro de 2 a 4. 52. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 37 a 51, em que W é selecionado a partir de alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano, prolina, lisina protegida ou não com acetila ou formila, arginina, arginina protegida ou não com grupos tosila ou nitro, histidina, ornitina, ornitina protegida com acetil ou formila e citrulina. 53. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 37 a 52, em que u é 0. 54. O imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1 a 53, compreendendo ainda um espaçador entre L e D. 55. O imunoconjugado, de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 54, em que o imunoconjugado compreende ainda pelo menos uma fração ligante-fármaco adicional da fórmula -(((L)m- (D))n)x em que: L é um ligante; D é uma fração de fármaco selecionada a partir de um agente antitubulina, um agente alquilante de DNA, um agente de reticulação de DNA, um agente intercalante de DNA ou um inibidor de RNA polimerase II; m é 0 ou 1; n é um número inteiro de 1 a 10; ex é um número inteiro de 1 a 10. 56. Uma composição farmacêutica compreendendo o imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1 a 55 e um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável. 57. A composição farmacêutica da modalidade 56, em que a composição farmacêutica é formulada para administração intravenosa. 58. A composição farmacêutica da modalidade 56, em que a composição farmacêutica é formulada para administração subcutânea. 59. Um método de tratamento de câncer, em que compreende a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo de uma dose terapêutica do imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1 a 55 ou da composição farmacêutica de qualquer uma das modalidades 56 a 58. 60. Uso do imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1 a 55 ou da composição farmacêutica de qualquer uma das modalidades 56 a 58 para o tratamento de câncer. 61. O método da modalidade 59 ou o uso da modalidade 60, em que o câncer expressa ROR1. 62. O método ou uso da modalidade 61, em que o câncer é selecionado a partir de linfoma, leucemia linfocítica crônica, linfoma linfocítico pequeno, linfoma de células B de células marginais, linfoma de Burkett, carcinoma de células renais, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de células escamosas epiteliais, melanoma, mieloma, câncer de estômago, câncer cerebral, câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer cervical, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer testicular, câncer de tireoide e câncer de cabeça e pescoço 63. Método de tratamento de um indivíduo com câncer, o método compreendendo administrar ao indivíduo: a. o imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1 a 55; e b. um agente terapêutico adicional. 64. O método da modalidade 63, em que o agente terapêutico adicional compreende acalabrutinibe, idelalisibe, sapanisertibe, pacritinibe, ABT-199, buparlisibe, everolimo, BEZ235, ruxolitinibe, fostamatinibe, rituximabe, lenalidomida, paclitaxel, vincristina, ibrutinibe, erlotinibe, crizotinibe, carboplatina, oxaliplatina/cisplatina, bevacizumabe ou gencitibina. 65. O método da modalidade 63 ou 64, em que o câncer expressa ROR1. 66. O método da modalidade 65, em que o câncer compreende linfoma, leucemia linfocítica crônica, linfoma linfocítico pequeno, linfoma de células B de células marginais, linfoma de Burkett, carcinoma de células renais, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer de mama, câncer epitelial de células escamosas, melanoma, mieloma, câncer de estômago, câncer de cérebro, câncer de pulmão, câncer de pâncreas, câncer de colo de útero, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer de testículo, câncer de tireoide e câncer de cabeça e pescoço. 67. O método de qualquer uma das modalidades 63 a 66, em que o imunoconjugado e o agente terapêutico adicional são administrados separadamente ao indivíduo com câncer. 68. Uma composição farmacêutica compreendendo o imunoconjugado como descrito em qualquer uma das modalidades 1 a 55 e o agente terapêutico adicional como descrito na modalidade 64. 69. A composição farmacêutica da modalidade 68, para uso em um método de qualquer uma das modalidades 63 a 67. 70. Um kit compreendendo o imunoconjugado como descrito em qualquer uma das modalidades 1 a 55 e o agente terapêutico adicional como descrito na modalidade 64, em que o referido imunoconjugado e agente terapêutico adicional estão em embalagens adequadas. 71. O kit da modalidade 70, para uso em um método de qualquer uma das modalidades 63 a 67.

[00158] A menos que o contexto exija de outra forma, em toda a especificação e reivindicações, a palavra "compreender" e suas variações, como "compreende" e "compreendendo", devem ser interpretadas em um sentido aberto e inclusivo, ou seja, como "Incluindo, mas não limitado a". Quando aqui usado e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o(a)" incluem os referentes plurais, a menos que o conteúdo indique claramente o contrário. Também deve ser observado que o termo "ou" é geralmente usado em seu sentido, incluindo "e/ou", a menos que o conteúdo indique claramente o contrário. Quando aqui usado, o termo "cerca de" refere-se a um intervalo numérico de 10%, 5% ou 1%, mais ou menos, de um valor numérico declarado no contexto do uso específico. Além disso, os títulos aqui fornecidos são apenas para conveniência e não interpretam o escopo ou o significado das modalidades reivindicadas.

[00159] Todas as publicações e patentes mencionadas aqui são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, com o objetivo de descrever e divulgar, por exemplo, as construções e metodologias descritas nas publicações, que podem ser usadas em conexão com as invenções atualmente descritas. As publicações aqui discutidas são fornecidas apenas para sua divulgação antes da data de apresentação do presente pedido. Nada neste documento deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores da presente invenção não têm o direito de anteceder essa divulgação em virtude da invenção anterior ou por qualquer outro motivo.

[00160] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que é comumente entendido por alguém de experiência ordinária na técnica a que pertencem as invenções aqui descritas. Quaisquer métodos, dispositivos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos podem ser utilizados na prática ou no teste das invenções aqui descritas.

EXEMPLOS

[00161] Os exemplos a seguir ilustram modalidades representativas da presente invenção e não pretendem limitar de forma alguma.

Exemplo 1: Síntese de imunoconjugados exemplares 1. Conjugação de cisteínas de Ab1 em ADC-A, C e H a P

[00162] A conjugação de Ab1 com MC-VC-PAB-MMAE (ADC-A) foi realizada em várias escalas (2 mg, 30 mg e 350 mg) com resultados similares. Para a menor escala, 2 mg de Ab1 (10 mg/mL em PBS, pH 6,5) foram tratados com 2,50 equivalentes (eq) de tris(2- carboxietil)fosfina (TCEP, 5 mM) em solução tampão de conjugação em banho de água a 37 °C por 2 horas. O tampão de PBS continha Na2HPO4 15,75 mM, NaH2PO4 34,25 mM, EDTA 2 mM e NaCl 50 mM, a pH 6,5. Subsequentemente, a reação foi resfriada a 4 °C. Em seguida, foram adicionados 7 eq de MC-VC-PAB-MMAE em N,N- dimetilacetamida (DMA) e a mistura foi deixada a 4 °C por mais 1 hora. O tampão foi trocado com histidina 20 mM, pH 5,5 (tampão de MMAE) usando uma coluna de dessalinização por rotação (40 kD, 0,5 mL). O número de moléculas de fármacos MMAE ligadas por molécula de anticorpo (DAR) foi determinado usando HIC-HPLC, SEC-HPLC, RP- HPLC e UV/Vis e está resumido na Tabela 4. Resultados consistentes foram obtidos em todas as escalas, com DAR variando de 3,89 a 5,09, em média, dependendo da metodologia utilizada. Tabela 4 Caracterização do ADC-A * D0: anticorpo não conjugado.

[00163] Outros ligantes e cargas úteis (ADC-C e ADC-H a ADC-P) foram conjugados a Ab1 de maneira similar, e os DARs resultantes estão resumidos na Tabela 5. Tabela 5 DAR médio para construções adicionais de ADC

2. Conjugação de lisinas de Ab1 em ADC-B, E e F

[00164] Ab1 em PBS (pH 6,5) foi combinado com SC-VC-PAB- MMAE (ADC-E) ou SC-VC-PAB-DM1 (ADC-F) em DMA e colocado em uma plataforma rotativa a 10 rpm a 22 °C por 2-4 horas. Para ADC-B, Ab1 em PBS (pH 7,0) foi combinado com SMCC-DM1 e colocado em uma plataforma rotativa a 10 rpm a 22 °C por 2-4 horas. A carga útil que não reagiu foi removida por troca de tampão, usando ultrafiltração Amicon (50 kDa, 0,5 mL). O ADC-B foi trocado em ácido succínico 20 mM (pH 5,0). Os valores de DAR foram determinados usando SEC- HPLC, MS e UV/Vis e estão resumidos na Tabela 6. Quando a carga útil do ligante foi usada em ~ 11 eq, os DARs se aproximaram de 4,0 após 4 horas de incubação. Tabela 6 Caracterização de ADC-B, ADC-E e ADC-F

3. Conjugação específica de sítio de Ab1 em ADC-Q e R

[00165] ADC-Q e ADC-R foram sintetizados usando a tecnologia de conjugação específica do sítio (Dennler et al., Bioconjugate Chemistry, 25 (3): 569-578 (2014) e Publicação de Patente U.S. 2016/0022833). O Ab1 foi primeiro desglicosilado por incubação com 6 U/mg de proteína de N-glicosidase F (PNGase F) durante a noite a 37 °C. O anticorpo desglicosilado foi purificado por cromatografia em Proteína A e formulado para a reação de modificação da transglutaminase bacteriana. Em seguida, 10-40 eq de 11-azido-3,6,9-trioxaundecan-1- amina (azido-PEG3-amina) por glutamina foram adicionados a 1-5 mg/mL de Ab1 em PBS (pH 7,4) e a reação foi iniciada pela adição de 2-6 U/mL de transglutaminase microbiana e incubada durante a noite a 37 °C. Subsequentemente, o excesso de azido-PEG3-amina foi removido por cromatografia em Proteína A. Finalmente, 50-200 μM de carga útil de fármaco contendo dibenzilciclooctina (DBCO) (1,25 a 5 mol equiv. Por grupo azida) foram adicionados a 20 μM de Ab1 ativado por azida e incubados em temperatura ambiente por 0,5-6 horas, formando conjugados de carga útil de Ab1 ligados através de uma porção de triazol. O excesso de carga útil contendo DBCO foi removido. A caracterização dos ADCs sintetizados desta maneira demonstrou DARs de 4,4 para ADC-Q e 2,1 para ADC-R (Tabela 7). Tabela 7 DAR médio para construções adicionais de ADC

Exemplo 2: Ligação de anticorpos e imunoconjugados a células positivas para ROR1

[00166] Foi avaliada a ligação às células tumorais pelos anticorpos Ab1 e 4A5, bem como construções ADC derivadas desses anticorpos (ADC-A e ADC-T). Primeiro, foi testada a ligação de Ab1 a duas linhagens celulares tumorais humanas positivas para ROR1, representando diferentes tipos de câncer. A linhagem celular Jeko-1, do linfoma de células de revestimento, é uma linhagem celular em suspensão, enquanto a linhagem celular MDA-MB-231, do câncer de mama triplo negativo, é uma linhagem celular aderente. As linhagens celulares têm níveis diferentes de expressão de ROR1, com células Jeko-1 exibindo cerca de 13507 cópias da superfície celular e células MDA-MB-231 exibindo cerca de 21015 cópias da superfície celular. As linhagens celulares Jeko-1 (ATCC Cat. No. CRL-3006) e MDA-MB-231 (ATCC Cat. No. CCL-227) foram adquiridas da American Type Culture Collection e mantidas de acordo com as recomendações da ATCC.

[00167] As células Jeko-1 (FIG.2A) ou células MDA-MB-231 (FIG.2B) foram incubadas com 0, 1, 10, 100 ou 1000 ng/mL de Ab1 por 20 minutos em gelo. Após lavagem do anticorpo não ligado, as células foram incubadas com anticorpo IgG anti-humano secundário marcado com ficoceritrina (PE) por mais 20 minutos. A quantidade de fluorescência de PE foi medida usando o analisador BDFACS Verse e o software FlowJo V10. O sinal de PE para a concentração mais alta foi usado como o sinal de ligação máxima para calcular a % de ligação máxima. A EC50 foi calculada usando o GraphPad Prism 7. O ensaio de ligação ao receptor resultou em valores de EC50 de 13,6 ng/mL nas células Jeko-1 e 32,8 ng/mL nas células MDA-MB-231.

[00168] A seguir, a ligação de Ab1 foi comparada ao ADC-A (FIGS. 2A e 2B). A ligação foi comparada nas linhagens celulares Jeko-1 e MDA-MB-231. A ligação de ADC-A a células Jeko-1 (FIG. 2A, quadrados) e células MDA-MB-231 (FIG. 2B, quadrados) foi muito similar à ligação do anticorpo parental não conjugado Ab1 (FIG. 2A, 17 ng/mL vs. 13,6 ng/mL e FIG. 2B, 48,5 ng/mL vs. 32,8 ng/mL). A similaridade entre os valores de EC50 de Ab1 não conjugado e ADC-A demonstra que a conjugação do fármaco teve um impacto mínimo na ligação de Ab1 às células alvo.

[00169] A ligação de Ab1 foi comparada a 4A5, um anticorpo que liga um epítopo no ROR1 distinto do epítopo de Ab1 (FIG. 3A). Ab1 (EC50 = 16,39 ng/mL; FIG. 3A, círculos abertos) ligou as células Jeko-1 com uma afinidade/avidez mais alta do que 4A5 (EC50 = 120,6 ng/mL; FIG. 3A, quadrados abertos). A ligação das construções ADC foi comparada com os anticorpos parentais não conjugados correspondentes (Ab1 versus ADC-A e 4A5 contra ADC-T). O ADC-A se ligou com um EC50 de 21,57 ng/mL, enquanto o ADC-T se ligou com um EC50 de 192,7 ng/mL. A similaridade entre os valores EC50 de anticorpos não conjugados e as construções ADC correspondentes demonstra novamente que a conjugação do fármaco teve um impacto mínimo na ligação dos anticorpos às células alvo.

[00170] Em um experimento diferente, a ligação de Ab1 às células Jeko-1 também foi comparada à ligação de D10, um anticorpo de menor afinidade que se liga ao mesmo epítopo que Ab1 (FIG. 3B). Ab1 (EC50 = 16,5 ng/mL; FIG. 3B, círculos abertos) ligou células Jeko- 1 com uma afinidade/avidez mais alta do que D10 (EC50 = 250 ng/mL; FIG. 3B, triângulos abertos). Além disso, a ligação das construções ADC foi comparada com a dos anticorpos parentais não conjugados correspondentes (Ab1 versus ADC-A e D10 versus ADC-S). ADC-A se ligou com um EC50 de 22,1 ng/mL (FIG. 3B, círculos fechados) enquanto ADC-S se ligou com um EC50 de 150 ng/mL (FIG. 3B, triângulos fechados). A similaridade entre os valores EC50 de anticorpos não conjugados e as construções correspondentes da ADC demonstra novamente que a conjugação do fármaco teve um impacto mínimo na ligação dos anticorpos às células alvo.

[00171] De maneira similar, foi avaliada a ligação de todas as outras construções ADC a células positivas para ROR1. Verificou-se que todas as construções aqui descritas se ligam a células positivas para ROR1.

Exemplo 3: Internalização de anticorpos e imunoconjugados de ROR1

[00172] Vários métodos foram usados para determinar a internalização de anticorpos. Em uma abordagem, a internalização foi medida usando uma metodologia de pulso-perseguição que quantifica o anticorpo não internalizado da superfície celular em 15, 30, 60, 120 e 240 minutos usando citometria de fluxo. As células Jeko-1 foram cultivadas e colhidas antes da confluência, lavadas com PBS frio e ressuspensas a 1x107 em tampão FACS frio (PBS + 2% de FBS - Fisher/Gibco Cat. No. 16140071). Adicionaram-se 1x106 células a tubos ou cavidades de microcentrífuga. A internalização das construções Ab1 e ADC pelas células foi determinada em concentrações saturadas de anticorpos, utilizando 30 μg/mL para células Jeko-1 e 100 μg/mL para células MDA-MB-231. Foram preparadas soluções mãe 10X de construções ADC ou Ab1 (300 μg/mL para uso com células Jeko-1 ou 1 mg/mL para uso com células MDA-MB-231) e 10 μL de controle de amostra ou tampão foram adicionados aos seguintes (adicionando tubos adicionais para cada ponto de tempo): a) Não marcado b) Apenas anticorpo secundário c) mAb negativo de hIgG de controle negativo a 30 μg/mL - tempo 0 d) Construção de Controle Positivo ADC ou Ab1 a 30 μg/mL - tempo 0 e) Construção ADC ou Ab1 - ponto de tempo 1 f) construção ADC ou Ab 1 - ponto de tempo 2, etc.

[00173] As células e o anticorpo foram incubados em gelo por 20 minutos, girados a 300 x g por 4 minutos, lavados duas vezes com 200 μL de tampão FACS e ressuspensos em 100 μL de tampão FACS. As amostras foram incubadas a 37 °C por 15, 30, 60, 120 e 240 minutos, como indicado acima. A internalização foi encerrada transferindo as amostras para gelo. Foi gerado um período de tempo para a internalização do anticorpo para cada artigo teste como descrito acima, após o qual o anticorpo remanescente na superfície da célula foi detectado usando um anticorpo secundário marcado com PE. As células foram centrifugadas a 250 x g, lavadas duas vezes com tampão FACS e ressuspensas em 100 μL de tampão FACS. O anticorpo secundário (IgG-PE humano anti-cabra, específico para Fc- gama - eBiosciences, Cat. No. 12-4998) foi diluído 1 : 2000 (estirpe 10X) em tampão FACS e 10 μL/tubo foram adicionados aos tubos apropriados. As células foram incubadas em gelo por 20 minutos, lavadas duas vezes com tampão FACS e ressuspensas em 100 μL de tampão de correção (paraformaldeído a 4% em PBS). Posteriormente, a análise por FACS foi realizada. A intensidade mediana de fluorescência (MFI) foi quantificada e o grau de internalização do receptor foi determinado usando a quantidade de anticorpo ou ADC presente em cada momento, quando comparado com a quantidade presente no tempo = 0. A linha tracejada representa a coloração de fundo (anticorpo secundário apenas).

[00174] O Ab1 se ligou e foi rapidamente internalizado pelas células Jeko-1 (FIG. 4A) e MDA-MB-231 (FIG. 4B). A internalização de 8090% do anticorpo ligado foi observada em menos de 60 minutos para o MDA-MB-231 ou 120 minutos para o Jeko-1. Notavelmente, a adição de ligante e carga útil a Ab1 não afetou negativamente a ligação ou a internalização, como demonstrado com ADC-A e ADC-B (FIG. 4A, compare ADC-A e ADC-B com Ab1, e FIG. 4B, compare ADC-A com Ab1).

[00175] De maneira similar, as características de internalização de outras construções ADC com diferentes ligantes e cargas úteis foram avaliadas usando células Jeko-1. Todas as construções exibiram cinética de internalização similar em comparação com Ab1, consistente com a observação acima de que os ligantes e as cargas úteis usadas não afetaram as características do anticorpo (dados não mostrados).

[00176] Foram também avaliadas as propriedades de internalização de uma construção ADC (ADC-T) utilizando um anticorpo de ROR1 (4A5) que reconhece um epítopo distinto de Ab1, mas com químicas de ligação e carga útil idênticas às da ADC-A. O ADC-T ligou as células Jeko-1, mas foi internacionalizado em uma taxa mais lenta e em menor extensão do que o ADC-A (dados não mostrados). Estes dados demonstram a importância do anticorpo e seu epítopo na determinação das propriedades de internalização da construção ADC.

[00177] A internalização de Ab1 também foi caracterizada usando métodos convencionais de coloração por imunofluorescência e células MDA-MB-231. Nesta abordagem, Ab1 foi carregado na superfície celular e as células foram posteriormente fixadas e a superfície Ab1 foi quantificada. Além disso, uma segunda amostra de células foi permeabilizada e quantificado Ab1 (superfície e intracelular). Nesse protocolo, o anticorpo primário foi autorizado a incubar sem um anticorpo secundário, eliminando a possibilidade de que o anticorpo secundário pudesse influenciar a internalização. Foi observada coloração na superfície. Após a permeabilização, foi observada uma coloração intracelular pontual clara e distinta de Ab1. Além disso, utilizando um rastreador específico para lisossomas, foi demonstrado que o Ab1 internalizado se colocalizou com a via lisossômica. Este achado é consistente com um modo de internalização de anticorpos que ocorre principalmente pela via do lisossoma/endossoma. Finalmente, a taxa de internalização foi quantificada. Quando as células foram submetidas à exposição contínua a Ab1, a taxa inicial era aproximadamente o dobro da taxa média e a taxa terminal era aproximadamente metade da taxa média (FIG. 5). Isto indica que existe uma fase rápida inicial de limpeza do receptor da superfície celular, seguida por um processo mais lento de ligação e internalização do receptor que é expresso recentemente na superfície da célula. O receptor da superfície celular recém-expresso pode ser reciclado, expresso a partir de estoques intracelulares e/ou recém- sintetizado. A extensão e o caráter da colocalização de Ab1 foram similares ao EGFR, mostrando uma colocalização substancialmente lisossômica após 4 horas.

Exemplo 4: Medição da expressão de ROR1 da superfície celular

[00178] A internalização de anticorpos foi medida usando abordagens de busca por pulso que detectaram anticorpo não internalizado na superfície celular em vários momentos (2, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 120 e 240 minutos). Neste estudo, além de medir o anticorpo não internalizado da superfície celular, a expressão de ROR1 na superfície celular foi quantificada por (1) nova coloração com Ab1 e um anticorpo secundário ou (2) usando um segundo anticorpo anti-ROR1 marcado que reconhece um epítopo distinto de Ab1.

[00179] Para a primeira abordagem, a internalização de Ab1 nas células Jeko-1 foi realizada como descrito no Exemplo 3 (uma amostra foi processada em cada momento para quantificar o anticorpo remanescente na superfície celular). Além disso, uma segunda amostra em cada momento foi rapidamente corada novamente usando níveis saturantes de Ab1 (30 μg/mL), mantendo as células no gelo. Posteriormente, as células foram lavadas e o anticorpo de superfície foi quantificado usando o mesmo anticorpo secundário usado para medições de internalização. Como mostrado anteriormente, Ab1 foi rapidamente internalizado (FIG. 6, quadrados). Por outro lado, enquanto a quantificação do ROR1 da superfície celular mostrou inicialmente uma pequena diminuição nos primeiros 10 minutos, as medições subsequentes indicaram que a expressão da superfície do ROR1 foi restaurada para níveis iniciais ou ligeiramente mais altos (FIG. 6, círculos). Estes dados são consistentes com a reciclagem de ROR1 para a superfície celular dissociada do anticorpo, ou com a rápida regulação positiva de ROR1 através da síntese de novo ou do tráfego de reservas intracelulares. Esta experiência foi repetida utilizando células Jeko-1 (FIG. 7A), MDA-MB-468 (FIG. 7B) e MDA- MB-231 (FIG. 7C), com resultados similares.

[00180] Foi testada uma abordagem alternativa para medir a expressão de ROR1 da superfície celular em conjunto com estudos de internalização de Ab1. Especificamente, a expressão de ROR1 na superfície celular foi quantificada em 0, 0,5, 1, 2 e 4 horas por coloração de células diretamente com um anticorpo anti-ROR1 marcado que se liga a um epítopo distinto do de Ab1. A expressão da superfície de ROR1 em células Jeko-1 tratadas com ADC-A, M, N e P foi avaliada. Consistente com os resultados obtidos usando a abordagem descrita anteriormente, a expressão de ROR1 foi mantida ou ligeiramente aumentada, enquanto as células estavam sendo tratadas com construções ADC baseadas em Ab1 (dados não mostrados).

[00181] Estes dados indicam que Ab1 e seus imunoconjugados podem ser internalizados efetivamente por células positivas para ROR1. Além disso, a expressão persistente de ROR1 na superfície celular demonstra que ROR1 é um excelente alvo para a entrega de agentes citotóxicos a células cancerígenas através de um ADC da presente invenção.

Exemplo 5: Potência dos imunoconjugados in vitro

[00182] Os imunoconjugados ADC-A, B, C, E e F, que tinham diferentes porções citotóxicas e química do ligante, foram analisados para este Exemplo. A ligação de ROR1 por estes conjugados foi testada em cultura de células para definir a potência de várias combinações de ligante-agente citotóxico. Três tipos diferentes de linhagens celulares de câncer foram testados: linhagens celulares de linfoma B TMD-8, HBL-1 e DOHH2; linhagens celulares triplo- negativas de câncer de mama HCC1187, MDA-MB-468, Bt549; e linhagens celulares de câncer de ovário A2008, TOV112D, JHOM1 e SKOvr3.

[00183] As células foram cultivadas em crescimento em fase logarítmica e distribuídas em placas de 96 cavidades. Cada linhagem celular foi semeada com uma densidade celular ligeiramente diferente, variando de 5x103 a 50x104 células/cavidade. As células duplicadas foram incubadas com diluição em série de três vezes de um imunoconjugado específico (10, 3,33, 1,11, 0,37, 0,12, 0,041, 0,014 e 0,0045 μM) por 72 horas a 37 °C e CO2 a 5%. Após o tratamento, as células foram incubadas com um volume igual de reagente CellTiter- Glo® (Promega Inc.) por 15 minutos em temperatura ambiente e a viabilidade foi determinada por um luminômetro. As curvas e os valores de EC50 foram gerados no GraphPad Prism usando um ajuste de regressão não linear de resposta à dose sigmoidal. Os dados destas experiências estão resumidos na Tabela 8. As FIGS. 8A-8I mostram gráficos representativos de IC50 para todos os cinco imunoconjugados testados contra as linhagens celulares indicadas. Tabela 8 Citotoxicidade de imunoconjugados exemplares in vitro * *Dados representados como IC50 em nM. Células vazias: não concluídas.

Exemplo 6: Dados adicionais sobre a potência dos imunoconjugados in vitro

[00184] Este exemplo apresentou dados adicionais sobre a potência dos vários ADCs na indução de morte celular de uma variedade de linhagens celulares de câncer. As células foram cultivadas e distribuídas em placas de 96 cavidades, como descrito no Exemplo 5. As células em duplicata foram incubadas com diluição em série de três vezes de um imunoconjugado específico (660, 220, 73,3, 24,4, 8,14, 2,71, 0,91 e 0,3 nM) por 72 horas a 37 °C e 5% de CO2. Em algumas experiências, as células foram incubadas com um imunoconjugado por 96 horas em vez de 72 horas (valores destacados com "*"). Após o tratamento, a viabilidade celular foi determinada como descrito no Exemplo 5. Os dados dessas experiências estão resumidos nas Tabelas 9.1 a 9.17 abaixo. A expressão de ROR1 na superfície celular foi avaliada por citometria de fluxo quantitativa e a expressão de ROR1 foi caracterizada como MFI> 30 ou MFI <30 (MFI: intensidade fluorescente média). Os dados demonstram que as células cancerígenas sensíveis à carga útil que expressam ROR1 responderam a um número de ADCs testadas nos ensaios de morte celular aqui descrito. Enquanto muitas das células cancerígenas que respondem a ADC expressam altos níveis de ROR1 (MFI > 30), algumas células expressam níveis mais baixos de ROR1 (MFI < 30) também foram sensíveis a determinados ADCs.

[00185] A linhagem celular MEC1, que é derivada da leucemia linfocítica crônica B na transformação prolinocitoide, foi transfectada com um vetor de expressão que codifica ROR1 humano ou um vetor controle, e linhagens celulares estáveis foram criadas usando meios de seleção contendo G418. As células MEC1 transfectadas com ROR1 apresentaram proporções significativamente maiores de células na fase S/G2/M do que as células transfectadas controle 16 horas após serem transferidas do meio isento de soro para o meio de crescimento completo, implicando que a expressão de ROR1 aumentava as proporções relativas de células passando por divisão celular. Consistente com isso, as células ROR1 + MEC1 tiveram um número significativamente maior de células > 48 horas após serem transferidas do meio sem soro do que as culturas comparativamente semeadas de células MEC1 que não expressavam ROR1. Níveis elevados de p-AKT e p-CREB também foram observados em células MEC1 produzidas para expressar ROR1 em relação às células MEC1 transfectadas com vetor de controle. Tabela 9.1 Citotoxicidade do ADC-A in vitro Tabela 9.2 Citotoxidade de ADC-E in vitro Tabela 9.3 Citotoxidad e de ADC-B in vitro Tabela 9.4 Citotoxidade de ADC-C in vitro Tabela 9.5 Citotoxidade de ADC-F in vitro Tabela 9.6 Citotoxidade de ADC-H in vitro Tabela 9.7 Citotoxidade de ADC-I in vitro Tabela 9.8 Citotoxid ade de ADC-J in vitro Tabela 9.9 Citotoxidade de ADC-K in vitro Tabela 9.10 Citotoxidade de ADC-L in vitro Tabela 9.11 Citotoxidade de ADC-M in vitro Tabela 9.12 Citotoxidade de ADC-N in vitro Tabela 9.13 Citotoxidade de ADC-O in vitro Tabela 9.14 Citotoxidade de ADC- P in vitro Tabela 9.15 Citotoxidade de ADC-Q in vitro Tabela 9.16 Citotoxidade de ADC-R in vitro Tabela 9.17 Citotoxidade de ADC-S in vitro

[00186] Os dados nas tabelas demonstram que os ADCs testados são eficazes contra uma variedade de linhagens celulares de câncer com diferentes níveis de expressão de ROR1 e diferentes sensibilidades às várias cargas úteis.

Exemplo 7: Dependência Antigênica de Efeitos Antiproliferativos de ADCs Exemplares

[00187] Os estudos descritos neste exemplo avaliaram a dependência dos ADCs testados em ROR1 por seus efeitos antiproliferativos. As células Jeko-1 foram cultivadas no crescimento da fase logarítmica antes da instalação da experiência. Para experimentos de competição, 5x104 células foram incubadas com 100 μg/mL de Ab1 ou controle de veículo por 2 horas a 37 °C a 5% de CO2. Posteriormente, foram adicionados 3, 10 e 30 μg/mL de ADC-A e as células foram incubadas por 72 horas adicionais a 37 °C e CO2 a 5%. Cada condição foi testada em duplicata. A viabilidade celular foi determinada como descrito no Exemplo 5.

[00188] Os dados mostram que o ADC-A inibiu a proliferação celular de maneira dependente da dose (FIG. 9, barras pretas). A pré- incubação das células com o anticorpo parental não conjugado Ab1 inibiu essa atividade antiproliferativa em todas as concentrações de ADC-A testadas (FIG. 9, barras cinza), demonstrando que a morte celular foi mediada pela ligação de ADC-A ao seu destino, ROR1.

Exemplo 8: Atividades Antitumorais de Imunoconjugados Exemplares in vivo 1. Eficácia do ADC-A em um modelo de camundongo com TCL1 x ROR1 CLL

[00189] Foi demonstrado que o ROR1 interage com o oncogene de leucemia de células T 1 (TCL1) e melhora a leucemogênese em camundongos transgênicos Em-TCL1, e o tratamento com um anticorpo anti-ROR1 pode prejudicar o enxerto de células de leucemia ROR1 x TCL1 (Widhopf et al., PNAS111: 793-798 (2014)). Este estudo avaliou a atividade do ADC-A em comparação com o veículo e o Ab1 não conjugado no modelo de camundongo com TCL1 x ROR1 CLL. No estudo, as células de leucemia ROR1 x TCL1 foram enxertadas em camundongos por injeção na veia da cauda, e os camundongos injetados foram randomizados em cinco grupos, 8 camundongos/grupo. Os grupos foram controle de veículo, 10 mg/kg de Ab1 e 1, 2 e 5 mg/kg de ADC-A. Os camundongos receberam dosagem IV semanalmente para um total de quatro doses. Os resultados deste estudo são mostrados na Tabela 10 abaixo.

2. Eficácia do ADC-A e ADC-Q em um modelo de camundongo com xenoenxerto de MCL

[00190] As células Jeko-1 (MCL) foram enxertadas subcutaneamente em camundongos, e os camundongos enxertados foram randomizados em cinco grupos, 9 camundongos/grupo. Os grupos foram controle de veículo, 10 mg/kg de Ab1, 20 mg/kg de ibrutinibe, 5 mg/kg de ADC-A e 5 mg/kg de ADC-Q. Os ratos foram dosados IV q4d. Os resultados deste estudo são mostrados na Tabela 10 abaixo.

3. Eficácia do ADC-A em um modelo de camundongo DLBCL-GCB PDX

[00191] As células do linfoma difuso de grandes células B do tipo célula B de células germinais (DLBCL-GCB) foram enxertadas subcutaneamente em camundongos, e os camundongos enxertados foram randomizados em cinco grupos, 6 camundongos/grupo. Os grupos foram controle de veículo, 10 mg/kg de Ab1, 50 mg/kg de venetoclax, 10 mg/kg de Ab1 mais 50 mg/kg de venetoclax e 5 mg/kg de ADC-A. Ab1 e ADC-A foram administrados IV, qw e venetoclax foi administrado PO qd. Os resultados deste estudo são mostrados na Tabela 10 abaixo.

4. Eficácia do ADC-A em um modelo de camundongo PDX com síndrome de Richter positivo para ROR1

[00192] Camundongos NSG foram injetados subcutaneamente em ambas as áreas do flanco com células RS9373 (xenoenxerto derivado do paciente ou PDX) em uma suspensão de células em matrigel. Quando foram observados tumores palpáveis (a aproximadamente 50 mm3), os animais foram randomizados em três grupos, 4 camundongos/grupo. Os grupos de tratamento foram controle de veículo, 2,5 mg/kg de ADC-A IV q4d e 5 mg/kg de ADC-A IV q4d. Os camundongos receberam 3 tratamentos totais e os tumores foram colhidos 24 horas após o último tratamento. A inibição média do crescimento tumoral (TGI) foi calculada utilizando a seguinte fórmula: Legenda da Figura: - Tratado (Final) - Tratado (1° Dia) - Controle (Final) - Controle (1° Dia)

[00193] Na maioria dos tipos de tumores, a expressão heterogênea de ROR1 é observada no nível intratumoral. No entanto, a regressão tumoral foi observada nos grupos tratados com ADC-A. No modelo RS101 PDX de linfoma de Richter, 20 a 30% das células foram positivas para ROR1, mas foram observadas regressões completas e prolongadas (FIG. 13). Os resultados deste estudo são mostrados na Tabela 10 abaixo.

5. Eficácia do ADC-A em um modelo de xenoenxerto TNBC humano positivo para ROR1

[00194] Camundongos NCR foram injetados subcutaneamente na almofada de gordura mamária com células MDA-MB-231 (células de câncer de mama triplo negativo humano (TNBC) positivas para ROR1) em uma suspensão de células em matrigel. Quando tumores palpáveis foram observados (a aproximadamente 250 mm3), os animais foram randomizados em três grupos diferentes, 9 camundongos/grupo: controle de veículo, 1 mg/kg de ADC-A IV qw e 5 mg/kg de ADC-A IV qw. Os camundongos receberam 5 tratamentos totais e os tumores foram colhidos 24 h após o último tratamento. A inibição média do crescimento tumoral (TGI) foi calculada utilizando a fórmula acima. Os resultados deste estudo são mostrados na Tabela 10 abaixo.

6. Eficácia do ADC-A em dois modelos TNBC PDX humanos positivos para ROR1

[00195] Dois modelos de PDX exibindo diferentes níveis de expressão de ROR1 foram selecionados para este estudo. A expressão de ROR1 foi baseada no nível de marcação de ROR1 via IHC de um microarranjo de tecido representando núcleos triplicados de modelos TNBC PDX. O nível médio de expressão de ROR1, avaliado por% de células positivas para ROR1, foi de 58% e 38% para as células TNBC humanas BR5011 e BR5015, respectivamente.

[00196] Camundongos nus NOD/SCID foram injetados subcutaneamente com células BR5011 ou BR5015 na almofada de gordura mamária. Quando foram observados tumores palpáveis (volume médio de tumor de aproximadamente 150 mm3 para BR5011 e aproximadamente 250 mm3 para BR5015), os animais foram randomizados em três grupos. Os grupos para o modelo BR5011 PDX foram controle de veículo, 1 mg/kg de ADC-A IV q4d e 5 mg/kg de ADC-A IV q4d. Os grupos para o modelo BR5015 PDX foram controle de veículo, 1 mg/kg de ADC-A IV qw e 5 mg/kg de ADC-A IV qw. O TGI médio foi calculado como descrito acima.

[00197] Foi observada inibição e/ou regressão tumoral nos grupos tratados com ADC-A. Por exemplo, no modelo BR5011 TNBC PDX, que mostrou expressão de ROR1 em 58% das células cancerígenas, foram observadas regressões completas e prolongadas (FIG. 15). Os resultados deste estudo são mostrados na Tabela 10 abaixo.

7. Eficácia de ADC-A, L, M, N, P, R, S e T em um modelo de xenoenxerto de MCL humano Jeko-1

[00198] As células Jeko-1 (MCL) foram enxertadas subcutaneamente em camundongos. Quando o tamanho do tumor atingiu 100 mm3, os camundongos foram randomizados em nove grupos, 9 camundongos/grupo. Os grupos foram controle de veículo; 1 mg/kg de ADC-N, ADC-P ou ADC-R; ou 5 mg/kg de ADC-A, ADC-L, ADC-M, ADC-S ou ADC-T. Os camundongos foram dosados IV q4d. Os resultados intermediários deste estudo são mostrados na Tabela 10 abaixo. Tabela 10 Resultados de Estudos in vivo com Imunoconjugados Exemplares

[00199] Estudos in vivo 1-7 aqui mostram que, apesar da heterogeneidade da expressão de ROR1 em um tumor e níveis variáveis de expressão de ROR1 entre os tipos de câncer, o tratamento com ADC-A resultou em inibição do crescimento do tumor e até em regressão completa e prolongada em uma variedade de cânceres. Por exemplo, no modelo TNBC PDX que mostrou expressão de ROR1 em 58% das células tumorais, foram observadas regressões completas e prolongadas em todos os tumores (FIG. 15). Da mesma forma, no modelo RS101 PDX do linfoma de Richter, 20 a 30% das células eram positivas para ROR1, mas regressões completas e prolongadas foram observadas em todos os tumores (FIG. 13). Esses resultados sugerem que os imunoconjugados anti-ROR1 erradicam o câncer não apenas pela citotoxicidade nas células cancerígenas ligadas, mas também observam a toxicidade nas células cancerígenas vizinhas no microambiente tumoral, ou na regulação positiva do efeito anticâncer do sistema imunológico ou por uma combinação de esses mecanismos. Este achado é significativo porque indica que os imunoconjugados da presente invenção podem ser utilizados para tratar tumores que possuem expressão heterogênea intratumoral de ROR1.

[00200] Os estudos atuais in vivo também mostram que o ADC-A foi eficaz no tratamento de cânceres resistentes a fármacos. Observam- se regressões em xenoenxertos de tumores humanos que eram resistentes ao ibrutinibe (modelo Jeko-1 MCL) ou à imunoquimioterapia com rituximabe-CHOP (modelo de transformação de Richter). Uma vez que o ROR1 é um marcador para cânceres avançados e que a quimioterapia anterior parece aumentar a expressão do ROR1, os nossos resultados demonstram o potencial dos imunoconjugados da presente invenção no tratamento de cânceres avançados ou agressivos.

8. Avaliação adicional in vivo dos ADCs

[00201] A eficácia in vivo dos ADCs, por exemplo, ADC-A, E, F, L, M, N, P, Q e R, pode ser avaliada ainda mais em um modelo de xenoenxerto MCL humano, subcutâneo e positivo para ROR1, usando células Jeko-1. Os animais são administrados IV q4d com veículo, 1 mg/kg de ADC ou 5 mg/kg de ADC. O crescimento do tumor e os pesos corporais são medidos a cada 2-3 dias. A análise farmacocinética dos ADCs da presente invenção pode ser realizada para determinar parâmetros farmacocinéticos padrão, como Cmax e meia-vida de anticorpo.

Exemplo 9: Terapia de Combinação

[00202] Os efeitos da combinação de ADC-A com outros agentes anti-proliferativos foram examinados. Os estudos iniciais concentraram-se nos efeitos do ADC-A combinado com um inibidor de BTK (ibrutinibe, ACP-196/acalabrutinibe), Bcl-2 (ABT-199/venetoclax), mTOR (INK128) ou PI3K (idelalisibe). Estudos adicionais examinaram os efeitos da combinação de ADC-A com dois inibidores adicionais de Bcl-2, denominados linhagens Bcl-2i-1 e Bcl-2i-2. As células foram testadas para ambos os subtipos distintos de DLBCL - célula B do centro germinativo (GCB) e célula B ativada (ABC). A análise do efeito mediano foi usada para determinar sinergismo, antagonismo ou aditividade da inibição da proliferação de várias linhagens celulares tratadas com ADC-A combinadas com os agentes antiproliferativos. O Índice de Combinação (IC) foi determinado pela equação de Chou/Talalay. A IC50 para cada composto foi determinada em um ensaio CellTiter-Glo® de 72 horas. Para ensaios de combinação, os fármacos foram utilizados em proporções equimolares (isto é, na proporção de seus valores de IC50). O software CalcuSyn (da Biosoft) foi utilizado para a análise do efeito da dose. Um índice de combinação menor que 1,1 indica que os tratamentos são sinérgicos; 0,9 - 1,1 indica que os tratamentos são aditivos; e maior que 1,1 indica que os tratamentos são antagônicos.

[00203] O ADC-A exibiu um efeito sinérgico com dois inibidores diferentes da BTK, ibrutinibe (FIG. 18A) e ACP-196/acalabrutinibe (FIG. 18B). O efeito sinérgico foi mais pronunciado com o acalabrutinibe e com as linhagens celulares MCL. Dados representativos para ADC-A combinados com ibrutinibe e acalabrutinibe na linhagem celular MCL Jeko-1 são mostrados nas FIGS.19A e 19B, respectivamente.

[00204] O ADC-A também exibiu um efeito sinérgico com o inibidor de Bcl-2 ABT-199/venetoclax (FIG. 20A). O efeito sinérgico foi pronunciado nas linhagens celulares MCL e DLBCL. A atividade de ADC-A combinada com inibidores adicionais de Bcl-2, Bcl2i-1 e Bcl2i- 2, foi examinada nas células Jeko-1 (FIG. 20B) e Mino (FIG. 20C) (ambas são do tipo MCL). ADC-A exibiu um efeito sinérgico com ambos os inibidores nas células Jeko-1 e um efeito aditivo com ambos os inibidores nas células Mino. Dados representativos para ADC-A combinados com venetoclax em Jeko-1 são mostrados na FIG. 21.

[00205] O ADC-A exibiu um efeito sinérgico com o inibidor de mTOR1/2 INK128/sapanisertibe (FIG. 22). O efeito sinérgico foi observado nas linhagens celulares MCL e DLBCL. Dados representativos para ADC-A combinados com sapanisertibe em Jeko-1 são mostrados na FIG. 23.

[00206] O ADC-A exibiu um efeito sinérgico com o inibidor de PI3K CAL-101/idelalisibe (FIG. 24). O efeito sinérgico foi observado nas linhagens celulares MCL e DLBCL. Dados representativos para ADC-A combinados com idelalisibe demonstrando efeitos sinérgicos em ambos os subtipos de DLBCL são mostrados na FIG. 25A (células TMD, DLBCL-ABC) e FIG. 25B (células DOHH2, DLBCL-GCB).

Exemplo 10: Avaliação Adicional da Terapia de Combinação

[00207] A eficácia in vivo dos ADCs em combinação com um inibidor de Bcl-2 pode ser avaliada em um modelo de xenoenxerto de MCL humano positivo para ROR1, usando células Jeko-1 ou em um modelo de PDX. Tanto o ADC como o inibidor de Bcl-2 são dosados com doses máximas toleradas e subideais, isoladamente e em combinação, como descrito abaixo, em um estudo de dose repetida. O crescimento do tumor e o peso corporal são medidos a cada 2-3 dias. • dosagem MTD de ADC-A e inibidor de Bcl-2 o 5 mg/kg de ADC-A, IV, q4d o 100 mg/kg de venetoclax (ABT-199), semanalmente • dosagem subideal e de combinação de ADC-A e inibidor de Bcl-2 o 1 mg/kg de ADC-A, IV, q4d o 2 mg/kg de ADC-A, IV, q4d o 50 mg/kg de ABT-199, PO, qd O 100 mg/kg de ABT-199, PO, qd o 1 mg/kg de ADC-A, IV, q4d + 50 mg/kg de ABT-199, PO, qd o 2 mg/kg de ADC-A, IV, q4d + 50 mg/kg de ABT-199, PO, qd o 1 mg/kg de ADC-A, IV, q4d + 100 mg/kg de ABT-199, PO, qd o 2 mg/kg de ADC-A, IV, q4d + 100 mg/kg de ABT-199, PO, qd

[00208] A análise farmacocinética é realizada para determinar parâmetros farmacocinéticos padrão, como Cmax e meia-vida de anticorpo.

Exemploll: Estudo Clínico de Fase 2 de Imunoconjugados anti- ROR1-MMAE

[00209] A seguir, é descrito um protocolo para um ensaio clínico prospectivo de Fase 1b/2 de rótulo aberto para terapia com imunoconjugado anti-ROR1-MMAE. Critérios de inclusão: • Estado de desempenho do Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) de 0, 1 ou 2 • Diagnóstico histológico de LLC/SLL ou MCL como documentado em registros médicos • CLL/SLL ou MCL foi tratado anteriormente e recidivou após ou progrediu durante o tratamento anterior • Presença de linfadenopatia radiograficamente mensurável ou malignidade linfoide extranodal (definida como a presença de >1 lesão não irradiada e não biopsiada que mede >2,0 cm na dimensão mais longa [LD] e >1,0 cm na maior dimensão perpendicular [LPD] avaliada por tomografia computadorizada [CT] ou Imageamento por ressonância magnética [MRI]). • Necessidade médica atual de terapia devido a sintomas relacionados à doença, linfadenopatia, organomegalia, envolvimento de órgão extranodal ou doença progressiva. • Conclusão de toda a terapia anterior (incluindo cirurgia, radioterapia, quimioterapia, imunoterapia ou terapia experimental) para o tratamento do câncer 1 semana antes do início da terapia do estudo. • Todos os efeitos tóxicos agudos de qualquer terapia antitumoral anterior foram resolvidos para o Grau 1 antes do início do tratamento em estudo (com exceção da alopecia [Grau 1 ou 2 permitido], ou neurotoxicidade [Grau 1 ou 2 permitido] ou parâmetros laboratoriais selecionados [Grau 1 ou grau 2 permitidos, com exceções, como indicado abaixo]). • Função adequada da medula óssea: o a) Contagem absoluta de neutrófilos (ANC) > 1,0 x 109/L (Grau < 2). b) Contagem de plaquetas > 50 x 109/L (Grau < 2). b) Hemoglobina > 8,0 g/dL (Grau <2) mantida por > 1 semana a partir de qualquer transfusão prévia. • Nota: É permitida neutropenia, trombocitopenia ou anemia de grau > 3 se a anormalidade estiver relacionada ao envolvimento da medula óssea com malignidade hematológica (como documentado pela biópsia/aspirado de medula óssea obtidos desde a última terapia anterior). • Perfil hepático adequado: o Alanina aminotransferase sérica (ALT) < 3 x limite superior do normal (ULN) (Grau < 1). o Aspartato aminotransferase sérica (AST) < 3 x ULN (Grau < 1). o Bilirrubina sérica <1,5 x LSN (Grau < 1). • Função renal adequada: o a) Depuração estimada da creatinina (eClCR) > 45 mL/minuto (com a eClCR a ser calculada pela fórmula de Cockcroft- Gault), ou b) Depuração medida da creatinina > 45 mL/minuto (avaliada com uma coleta de urina de 24 horas). • Perfil de coagulação adequado: o Tempo de protrombina (PT) <1,5 x LSN (Grau <1). o Tempo parcial de tromboplastina ativado (aPTT) <1,5 x LSN (Grau <1). • Sorologia viral negativa: o Anticorpo negativo do vírus da imunodeficiência humana (HIV). o Antígeno de superfície negativo da hepatite B (HBsAg) e anticorpo negativo do núcleo da hepatite B (HBc) ou ácido desoxirribonucléico (DNA) indetectável da hepatite B (HBV) por meio testes quantitativos de reação em cadeia da polimerase (PCR). o Anticorpo negativo para o vírus da hepatite C (HCV) ou ácido ribonucleico negativo (RNA) por PCR quantitativo. • Para indivíduos fêmeas com potencial para engravidar, um teste de gravidez na urina ou soro negativo antes do início da terapia do estudo. • A critério do investigador, a participação no protocolo oferece uma relação benefício-risco aceitável ao considerar o status atual da doença, a condição médica e os possíveis benefícios e riscos de tratamentos alternativos para o câncer do indivíduo. • Disposição e capacidade do indivíduo de cumprir visitas agendadas, plano de administração de fármacos, exames laboratoriais especificados por protocolo, outros procedimentos de estudo (incluindo todas as biópsias/aspirações e estudos radiográficos da medula óssea) e restrições do estudo. Critério de Exclusão: • Transformação histológica conhecida em linfoma agressivo (isto é, transformação de Richter). Nota: A documentação da biópsia da ausência ou presença de transformação não é necessária. • Malignidade conhecida do sistema nervoso central. Nota: A imagem do sistema nervoso central é necessária apenas em indivíduos com suspeita de malignidade do sistema nervoso central. • História de outra malignidade, exceto pelo seguinte: célula basal local adequadamente tratada ou carcinoma espinocelular da pele; carcinoma tratado adequadamente in situ sem evidência de doença; câncer de bexiga não invasivo papilífero tratado adequadamente; outro câncer que esteja em remissão completa por > 2 anos. • Doença cardiovascular significativa (por exemplo, infarto do miocárdio, tromboembolismo arterial, tromboembolismo cerebrovascular) dentro de 3 meses antes do início da terapia do estudo; angina que requer terapia; doença vascular periférica sintomática; insuficiência cardíaca congestiva Classe 3 ou 4 de New York Heart Association; ou hipertensão Grau > 3 não controlada (pressão arterial diastólica > 100 mmHg ou pressão sistólica > 160 mmHg) apesar da terapia anti-hipertensiva. • Triagem significativa de anormalidades no ECG, incluindo arritmia cardíaca instável que requer medicação, fibrilação atrial/flutter, bloqueio de ramo esquerdo, bloqueio atrioventricular (AV) de segundo grau tipo II, bloqueio AV de terceiro grau, bradicardia de grau > 2 ou QT corrigido (QTc)> 450 ms (para homens) ou> 470 ms (para as mulheres). • Doença gastrointestinal (por exemplo, cirurgia de bypass gástrico ou intestinal, insuficiência de enzimas pancreáticas, síndrome de má absorção, doença inflamatória intestinal sintomática, doença diarreica crônica, obstrução intestinal) que podem interferir na absorção do medicamento ou na interpretação dos EAs gastrointestinais. • Risco contínuo de sangramento devido a úlcera péptica ativa; diátese hemorrágica; ou requisito para anticoagulação sistêmica com um medicamento antiplaquetário (por exemplo, aspirina, triflusal, clopidogrel, prasugrel, ticagrelor, ticlopidina, cilostazol, vorapaxar, dipiridamol); ou com heparina, frações de heparina de baixo peso molecular ou heparina (por exemplo, enoxaparina, dalteparina, fondaparinux) ou anticoagulantes orais (por exemplo, apixabano, rivaroxabano, dabigatrano etexilato, varfarina). Nota: É permitido o uso de heparina ou agentes trombolíticos para manutenção local ou depuração de um cateter venoso central. • Evidência de uma infecção bacteriana, fúngica ou viral sistêmica em andamento (incluindo infecções do trato respiratório superior) no início do tratamento em estudo. Nota: Indivíduos com infecções fúngicas localizadas da pele ou unhas não são impedidos de participar. • Em indivíduos com transplante prévio de células progenitoras hematopoiéticas, evidências de doença do enxerto versus hospedeiro em curso (GVHD). • Gravidez ou amamentação. • Grande cirurgia dentro de 4 semanas antes do início da terapia de estudo. • Transplante prévio de órgãos sólidos. • Terapia anti-ROR1 prévia nas 12 semanas precedentes ao início da terapia de estudo. • Terapia imunossupressora em curso, incluindo corticosteroides sistêmicos ou entéricos. Nota: Na triagem, os indivíduos podem estar usando corticosteroides tópicos ou inalados. Durante a terapia em estudo, o uso de corticosteroides como profilaxia para reações à infusão será minimizado. No entanto, os indivíduos podem usar corticosteroides sistêmicos, entéricos, tópicos ou entéricos, como necessário para condições emergentes do tratamento Medidas Primárias de Resultado: • Fase 1b: regime de dosagem recomendado (RDR) [período de tempo: da linha de base às 52 semanas] Avaliação das relações dose-farmacodinâmica e farmacocinética-farmacodinâmica e segurança farmacocinética do cirntuzumabe. • Fase 2: taxa de resposta completa (CR) [Período: da randomização até a interrupção do tratamento de todos os indivíduos do estudo ou 72 semanas após o acúmulo do indivíduo final] Proporção de indivíduos que atingem uma CR de acordo com os critérios de resposta pré-estabelecidos para linfoma (Cheson, J. Clin Oncol. 32 (27): 3059-68 (2014)). Tabela 11 Regimes de Dosagem Exemplares

[00210] A fase de determinação da dose será realizada por comparação de doses paralelas em 1,0, 2,0 e 3,0 mg/kg.

[00211] Embora modalidades preferidas da presente invenção tenham sido mostradas e descritas aqui, será óbvio para aqueles versados na técnica que tais modalidades são fornecidas apenas a título de exemplo. Numerosas variações, alterações e substituições ocorrerão agora para aqueles versados na técnica sem se afastar da invenção. Deve ser entendido que várias alternativas para as modalidades da invenção aqui descritas podem ser usadas na prática da invenção.

[00212] As sequências de aminoácidos e sequências nucleotídicas descritas aqui estão listadas na Tabela 12 abaixo. Tabela 12 Lista de sequências

Claims (6)

1. Imunoconjugado compreendendo um anticorpo conjugado a uma porção de fármaco citotóxica, caracterizado pelo fato de que a VH e VL do anticorpo compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 5 e 6, respectivamente, e o imunoconjugado é ADC-A, apresentando a estrutura em que Ab na estrutura é o anticorpo.

2. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo compreendem as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 3 e 4, respectivamente.

3. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a proporção da porção de fármaco citotóxica para o anticorpo é de 1 para 7.

4. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o imunoconjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um agente terapêutico adicional selecionado do grupo que consiste em um inibidor de tirosina-quinase de Bruton (BTK), um inibidor de linfoma de células B 2 (Bcl-2), um inibidor do alvo de rapamicina em mamíferos (mTOR), e um inibidor da fosfoinositídeo-3 quinase (PI3K).

6. Uso de um imunoconjugado compreendendo um anticorpo conjugado a uma porção de fármaco citotóxica, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de uma composição farmacêutica ou um medicamento para o tratamento de um câncer que expressa ROR1 em um paciente em necessidade do mesmo.