JP2024501121A - 癌の処置 - Google Patents

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Abstract

本発明は、腫瘍の化学療法剤に対する感受性の向上における使用のため、およびネクチン－４発現腫瘍細胞によって特徴付けられる癌の処置における使用のための、化学療法剤にコンジュゲートした、ネクチン－４ポリペプチドに結合することができる抗原結合タンパク質に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１１月２５日に出願された米国仮出願第６３／１１８，１９８号および２０２１年８月５日に出願された米国仮出願第６３／２２９，５８号の利益を主張するものであり、これらは、あらゆる図面を含め、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は電子形式の配列表と共に出願されている。配列表は、２０２１年１１月２４日に作成された「Ｎｅｃｔｉｎ－４－２ ＰＣＴ＿ＳＴ２５」という名前の６７ＫＢのサイズのファイルとして提供される。配列表の電子形式での情報は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明は、ネクチン－４発現腫瘍細胞によって特徴付けられる癌の処置における使用のための、腫瘍の化学療法剤に対する感受性の向上における使用のための、化学療法剤にコンジュゲートした、ネクチン－４ポリペプチドに結合することができる抗原結合タンパク質を提供する。
２０１６年、米国において、約１６，０００例の死亡と共に７０，０００例を超える膀胱癌の新規診断があったと推定された。尿路上皮癌は、膀胱、尿管、および腎盂の癌腫を包含し、これらはそれぞれ５０：３：１の比率において生じる。尿路上皮の癌は多病巣性のプロセスである。上部尿路の癌を有する患者は、生涯のある時点において膀胱の癌を発症する可能性が３０％～５０％ある。膀胱癌は、膀胱における細胞が異常にまたは制御不能に成長し始める場合に生じる。最も一般的な種類の膀胱癌は尿路上皮癌腫（ＵＣ）と呼ばれる。ＵＣでは、膀胱の内膜（尿路上皮）において異常な成長が起こる。この疾患は、進行すると伝播する場合がある。この疾患は、膀胱周辺の領域または身体の他の部位に伝播する可能性がある（転移）。これは進行性尿路上皮癌腫と呼ばれる。
尿路上皮癌腫（ＵＣ）は、多様な異なる細胞表面抗原の発現の増加によって特徴付けられ、したがって、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の使用を伴う治療としての特異的標的化のための機会を提供する。表面抗原のうち、ＴＲＯＰ－２（ヒト栄養膜細胞表面抗原）、ＳＬＩＴＲＫファミリータンパク質（例えばＳＬＩＴＲＫ６）、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ２、ＴＦ－Ａｇ（トムセン－フリードリッヒ抗原）、ＦＧＦ１Ｖ、Ｆｎ１４（ＦＧＦ誘導性１４）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、およびＰＶＲＬ４としても公知のネクチン－４（ポリオウイルス受容体関連タンパク質４を含むいくつかの抗原は、ＡＤＣの開発に利用可能であることが示されている。
ネクチン－４は、２００１年にＬｏｐｅｚのグループによってヒト気管から初めて閉鎖された（Reymond et al. (2001) J. Biol. Chem. 276(46):43205-15を参照されたい）。ネクチン－４遺伝子のコピー数増加は、発癌において高頻度の事象であること、さらに上皮間葉転換、浸潤および転移を促進し得ることが報告されている。ネクチン－４タンパク質発現は、健康な組織では限定的であるが、いくつかの腫瘍では有意により高いレベルにおいて発現し、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を含む乳癌（M-Rabet et al. Ann Oncol. 2017 Apr 1;28(4):769-776を参照されたい）、膵癌およびＵＣでは特に過剰発現する。しかしながら、ネクチン－４は、非小細胞肺癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮癌腫および食道癌腫瘍検体においても発現する。Challita-Eid et al. (2016) Cancer Res. 76(10): 3003-3013は、膀胱（６０％）および乳房（５３％）腫瘍組織における、免疫組織化学の中等度から強い染色（Ｈスコア≧１００）を報告した。Zeindler et al. 2019 Front. Med. 6:200は、ネクチン－４の高発現が１４８のＴＮＢＣ症例のうち８６（５８％）に存在したと報告した。
前出のChallita-Eid et al. (2016)は、抗体ＡＧＳ－２２に基づく、高度に強力な微小管破壊剤ＭＭＡＥにコンジュゲートした抗ネクチン－４抗体を開発した。この研究はＡＤＣ薬候補であるエンホルツマブベドチン（米国特許第８，６３７，６４２号およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０１２／０４７７２４号、Ａｇｅｎｓｙｓ Ｉｎｃ．を参照されたい）を生じ、これは、ネオアジュバント／アジュバント、局所進行、または転移設定におけるプラチナ含有化学療法およびＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１チェックポイント阻害薬を過去に受けたことがある、局所進行性または転移性尿路上皮癌を有する患者の処置におけるヒト臨床試験において有望な結果をもたらした。いくつかの他のグループもまた、様々な毒性剤に結合した抗ネクチン－４薬剤を提案している。ＰＣＴ特許出願第ＷＯ２０１８／１５８３９８号（ＩＮＳＥＲＭ）は、いくつかの抗ネクチン－４抗体を報告し、多様な細胞毒性剤への潜在的なカップリングを提案している。同様に、米国特許第８，６３７，６４２号（Ａｇｅｎｓｙｓ Ｉｎｃ．）もまた、抗ネクチン－４抗体を提供し、多様な細胞毒性剤への潜在的なカップリングを提案している。さらに、Ｂｉｃｙｃｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓは、切断可能なバリン－シトルリン（ｖａｌ－ｃｉｔ）リンカーを介して細胞毒性のアウリスタチン（ＭＭＡＥ）ペイロードにコンジュゲートしたネクチン－４結合タンパク質で構成された抗ネクチン－４標的剤の開発を報告している。今日まで、化学療法剤にコンジュゲートした場合に活性であると報告されている全ての抗ネクチン－４抗体はネクチン－４のＩｇ様Ｖ型ドメインを標的としており、それゆえ、Ｉｇ様Ｖ型ドメインは抗ネクチン－４ ＡＤＣの最も強力な内在化を実現すると考えられている。
エンホルツマブベドチン（抗ネクチン－４ ＡＤＣ）は、抗ネクチン－４抗体の高度な内在化と関連するネクチン－４のＩｇ様Ｖ型ドメインに結合する。エンホルツマブベドチンは、ＥＶ－２０１第２相研究（２０１９）において、４４％のＯＲＲ（客観的奏効率）および１２％のＣＲ（完全奏効率）を伴う、ＵＣにおける印象的な治療反応を示したが、約半数の患者が処置を中止した。中止の大半は、ＲＥＣＩＳＴによって評価された進行性疾患（４８％）または臨床症状（５％）によるものであった。また、中止した１８％の患者は有害事象、特に神経障害を経験した。したがって、ネクチン－４標的ＡＤＣには限界があり、ＵＣおよび他の癌に罹患した患者に対する利益の改善の必要性が当技術分野に存在する。
ＵＣでは、個体は一般に、癌が身体の遠隔部位に伝播していない場合、または癌が伝播している場合のいずれにおいても、初めにシスプラチンベースのレジメン（放射線照射を伴うかまたは伴わない）を用いて処置される。一般に、カンプトテシン化合物は、ＵＣの処置では使用されない。de Jonge et al., 2004 Invest New Drugs 22: 329-333は、進行性または転移性尿路上皮腫瘍を有する患者においてカンプトテシン類似体（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ ａｎａｌｏｇｕｅ）ＲＦＳ２０００を研究した。De Jonge et al. 2004は、ＲＦＳ２０００は過去に化学療法に失敗した進行性／転移性尿路上皮腫瘍を有する患者において有意な活性を発揮せず、この研究の結果はＲＦＳ２０００のさらなる検討を促すものではないと結論付けた。多数のカンプトテシン類似体が過去数十年にわたって作製されており、それらの中にはエキサテカンも含まれる。Abou-Alfa et al., 2006 Journal of Clinical Oncology 24(27): 4441-4447は、３４９名の患者の第３相試験において、膵癌の処置におけるエキサテカンを評価し、ゲムシタビンに追加されたエキサテカンは有効性においてゲムシタビン単独ほどは優れていないことを見出した。
ピロロベンゾジアゼピンおよびアウリスタチン類などの多くの高度に強力な細胞毒性剤が抗体へのコンジュゲーションのために開発されているが、処置に使用される用量において、これらの薬剤を組み込むＡＤＣは、薬剤の毒性のために依然として重篤な副作用を引き起こす。カンプトテシン類などの他の細胞毒性剤は、より低毒性であるが、それ自体では抗腫瘍活性が限定的でもある。細胞毒性剤の抗腫瘍活性は抗ネクチン－４抗体へのコンジュゲーションによって増強し得るが、本明細書において実証されるように、エンホルツマブ（ＡＳＧ－２２）などのゴールドスタンダードの抗ネクチン－４抗体にコンジュゲートした場合、カンプトテシン類似体ベースのＡＤＣには、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）において試験した場合に依然として限界がある。本発明者らは、本明細書において、細胞毒性剤のネクチン－４陽性腫瘍へのデリバリーの改善に関する方法を提供する。特に、本出願は、細胞毒性剤を、Ｉｇ様ＶおよびＩｇ様Ｃ２型１ドメインを架橋するネクチン－４のドメインまたは領域と結合する抗体にコンジュゲートすることによって、強力な抗腫瘍効果が得られることを示す。本明細書ではＶＣ１架橋ドメイン、ＶＣ１決定基またはＶＣ１エピトープとも称される、Ｉｇ様ＶおよびＩｇ様Ｃ２型１ドメインを架橋するドメインは、細胞間相互作用と関連する。ＶＣ１架橋ドメインアミノ酸置換（Ｋ１９７Ｔ／Ｓ１９９Ａ二重置換を含む突然変異体によって例示されるような、残基Ｋ１９７および／またはＳ１９９における）を有するネクチン－４突然変異体に対して、野生型または非突然変異型ネクチン－４と比較して低減した結合を示すＡＤＣを用いたこのドメインの標的化は、抗腫瘍活性において、高い細胞内内在化能を有するゴールドスタンダードの抗Ｉｇ様Ｖ型ドメインＡＤＣと比較して３倍高い効力をもたらした。細胞間相互作用は、第１の細胞のネクチン－４と第２の細胞のネクチン－１および／またはネクチン－４との相互作用（ネクチン－４：ネクチン－１またはネクチン－４：ネクチン－４相互作用）によって媒介することが可能である。
さらに、本出願は、ＶＣ架橋ドメインと結合する抗体を、リンカーの切断時にエキサテカンを放出する、細胞内で切断可能なリンカーにより機能化（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅ）することによって、高Ｐｇｐ発現を有する腫瘍によって特徴付けられる癌において特に強力な抗腫瘍効果が得られることを示す。抗ネクチン－４－エキサテカンＡＤＣは、カンプトテシン類似体であるＤｘｄを代わりに放出する同じ抗体に抵抗性のＭＤＲの高い腫瘍モデルにおいて効果的な抗腫瘍効果をもたらす。
一部の態様において、癌を処置するためおよび／または抗癌薬耐性を抑制するための方法において使用される、ヒトネクチン－４ポリペプチドと特異的に結合し、腫瘍を細胞毒性剤に対して感作することができる抗体（例えば全長抗体、抗体断片）（または例えばそのような抗体を含むタンパク質）が提供される。ヒトネクチン－４ポリペプチドと結合する抗体は、細胞毒性剤（例えば、化学療法剤）と組み合わせて使用（投与）されてもよい。
本開示の目的の１つは、癌を感作する組成物および抗癌剤（例えば細胞毒性剤、化学療法剤）を含む抗癌組成物であって、癌を感作する組成物がネクチン－４ポリペプチドのＶＣ１架橋ドメインと結合する抗体（例えば全長抗体、抗体断片）を含む、抗癌組成物を提供することである。
一部の態様において、抗体薬物コンジュゲートの調製における使用のための、ヒトネクチン－４ポリペプチドと結合し、腫瘍を細胞毒性剤に対して感作することができる抗体（例えば全長抗体、抗体断片）が提供される。
一部の態様において、細胞毒性剤を、ネクチン－４のＶＣ１架橋ドメインと結合する抗体（例えば全長抗体、抗体断片）にコンジュゲートすることによって改善された、細胞毒性剤（例えばカンプトテシン、エキサテカン）を腫瘍（例えば固形腫瘍内の腫瘍細胞）にデリバリーする方法が提供される。
イムノコンジュゲートまたはＡＤＣに関する本明細書の任意の実施形態において、細胞毒性剤は、細胞内で切断可能な部分（例えばオリゴペプチド、ジ、トリまたはテトラペプチド）および適宜、自己脱離（ｓｅｌｆ－ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ）スペーサーを含むリンカーを介して抗体にコンジュゲートまたは結合していてもよい。任意の実施形態において、細胞毒性剤は、細胞内で切断可能な部分および適宜、自己脱離スペーサーを含むリンカーを介して抗体にコンジュゲートまたは結合しており、その結果、例えば腫瘍または腫瘍細胞において、切断可能な部分の切断時に細胞毒性剤（例えばカンプトテシン類似体、エキサテカン、化合物１、２または１３の構造を有する化合物）が放出される。
細胞毒性剤のデリバリーの改善および／または化学療法剤もしくは細胞毒性剤に対する感作は、ＡＤＣの腫瘍浸潤の改善をもたらす、ネクチン－４発現腫瘍細胞のクラスター形成および／または足場非依存性増殖の抗体媒介性阻害の結果であり得る。
本発明の一態様では、癌の処置に使用されてもよい感作物質－細胞毒性薬コンジュゲートであって、（ａ）ヒトネクチン－４のＶＣ１架橋ドメインに結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインであって、（ｉ）抗体５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂもしくは６Ａ７のＫａｂａｔ重鎖ＣＤＲ１、２および３とヒトフレームワーク領域［例えば本明細書に開示されるヒトＶ遺伝子（ＩＧＨＶ）群由来］とを有するアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに／または（ｉｉ）抗体５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂもしくは６Ａ７のＫａｂａｔ軽鎖ＣＤＲ１、２および３とヒトフレームワーク領域［例えば本明細書に開示されるヒトＶ遺伝子（ＩＧＫＶ）群由来］とを有するアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含んでもよい、抗原結合ドメインと、（ｂ）少なくとも１つの細胞毒性薬部分とを含む、感作物質－細胞毒性薬コンジュゲートが提供される。ポリペプチド（ｉ）および（ｉｉ）は、互いに会合して（例えば共有結合および／または非共有結合によって）、ネクチン－４に結合する抗原結合ドメインを形成すると規定することができる。
一態様において、本開示の抗体を組み込むＡＤＣは、効力の増強を実現し、したがって、特に抵抗性の疾患を有する患者に対する、より低いネクチン－４発現（例えば高発現未満）または異種ネクチン－４発現（例えば尿路上皮癌）を有する疾患の処置に特に有利である。一部の実施形態において、このことは、処置前の腫瘍におけるネクチン－４発現のレベルの評価にもその検出にも依存しないか、またはその評価も検出も伴わない処置を可能にする。
一態様において、本開示の抗体を組み込むＡＤＣは、ＡＤＣの腫瘍浸潤の増強を実現し、これにより、抗腫瘍活性を改善すること、必要とされるＡＤＣの量を低減すること、および／または細胞毒性剤に関連する毒性を低下させることができる。ゴールドスタンダードの内在化抗ネクチン－４抗体（例えばＩｇ Ｖ型ドメイン抗体）と比較して改善されたこの治療濃度域の結果として、本開示のＡＤＣは、従来のＡＤＣが好適ではない（例えば毒性のために）、他の処置に抵抗性の疾患を有する患者の処置に、および／またはそれ自体の毒性を媒介する単剤としての追加の治療剤（例えば、単独のもしくはＡＤＣに組み込まれる化学療法剤）と組み合わせた使用に有利である。
一部の態様において、ネクチン－４と特異的に結合する抗体（例えば全長抗体、抗体断片）であって、ヒトネクチン－４のＶＣ１架橋ドメインに結合する抗体が提供される。
一部の態様において、ネクチン－４と特異的に結合する抗体（例えば全長抗体、抗体断片）であって、残基Ｋ１９７および／またはＳ１９９（配列番号１に準拠）にアミノ酸置換を含む突然変異型ヒトネクチン－４ポリペプチドに対して、野生型ヒトネクチン－４ポリペプチドへの結合と比較して低下した結合を示す抗体が提供される。
一部の態様において、抗体５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７の重鎖および軽鎖ＣＤＲを含む抗体（例えば全長抗体、抗体断片）が提供される。
任意の態様において、本開示の抗体は、抗体薬物コンジュゲートの調製における使用のためのものである。任意の態様において、本開示の抗体は、ネクチン－４発現腫瘍細胞間の細胞－細胞接着を減少させること、ネクチン－４：ネクチン－１相互作用を阻害すること、ネクチン－４：ネクチン－４相互作用を阻害すること、ネクチン－４発現腫瘍細胞の成長を抑制すること、および／またはネクチン－４発現腫瘍細胞のクラスター形成を抑制することにおける使用のため（例えば、これらを行う方法における使用のため）のものである。
一部の態様において、抗体薬物コンジュゲートの調製における使用のための、ヒトネクチン－４ポリペプチドと結合し、ネクチン－４発現腫瘍細胞間の細胞－細胞接着を減少させること、ならびに／またはネクチン－４発現腫瘍細胞の成長および／もしくはクラスター形成を抑制すること（例えば、３次元もしくは非接着腫瘍細胞培養；腫瘍スフェロイドアッセイを使用して評価される）ができる抗体（例えば全長抗体、抗体断片）が提供される。
一部の態様において、ネクチン－４：ネクチン－１相互作用および／またはネクチン－４：ネクチン－４相互作用を阻害することができる抗体（例えば全長抗体、抗体断片）が提供される（例えば、抗体は、第１の細胞のネクチン－４と第２の細胞のネクチン－１および／またはネクチン－４との相互作用を抑制することができ、ここで、細胞は腫瘍細胞であってもよい）。
一部の態様において、抗体薬物コンジュゲートの調製は、抗体を細胞毒性剤に（例えばリンカー部分、細胞内で切断可能な部分をさらに含むリンカー部分を介して）コンジュゲートする工程を含む。
一部の態様において、本開示の抗ネクチン－４抗体を細胞毒性剤にコンジュゲートすることを含む抗体薬物コンジュゲートを調製する方法が提供される。
また、細胞毒性剤にコンジュゲートした抗ネクチン－４抗体を含む抗体薬物コンジュゲートも提供される。
また、細胞毒性剤にコンジュゲートした抗ネクチン－４抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを投与することを含む、癌を処置する方法も提供される。
本開示の抗ネクチン－４抗体（例えば、特にカンプトテシン誘導体にコンジュゲートした場合の）によって提供される増加した抗腫瘍効力およびより大きい治療濃度域は、抗ＨＥＲ２剤（例えばトラスツズマブ、トラスツズマブを含むＡＤＣ）を含む組成物を用いる処置に抵抗性を有するか、その処置に応答性ではないか、またはその処置の後に進行した腫瘍を有する個体における処置転帰の改善の可能性をもたらす。改善した治療濃度域は、他の薬剤、特に化学療法剤および／または抗ＨＥＲ２剤との併用処置の可能性をもたらす。
一部の態様において、化学療法剤であってもよい細胞毒性剤にコンジュゲートしたネクチン－４結合剤、およびネクチン－４発現癌、例えばＵＣ、乳癌（例えばＴＮＢＣ）、非小細胞肺癌、膵癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮癌腫または食道癌の処置におけるその使用が提供され、ここで、結合剤は、ヒトネクチン－４ポリペプチドと結合し、腫瘍または腫瘍細胞、特に転移性癌を細胞毒性剤に対して感作することができる抗体である。
一部の態様において、化学療法剤であってもよい細胞毒性剤にコンジュゲートしたネクチン－４結合剤、およびネクチン－４発現癌、例えばＵＣ、乳癌（例えばＴＮＢＣ）、非小細胞肺癌、膵癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮癌腫または食道癌の処置におけるその使用が提供され、ここで、結合剤は、ヒトネクチン－４のＶＣ１架橋ドメイン；例えば、Ｉｇ様Ｃ２型１ドメインとＩｇ様Ｖ型ドメインとを架橋するアミノ酸のストレッチ、すなわち、Ｉｇ様Ｃ２型１ドメインとＩｇ様Ｖ型ドメインとを架橋するアミノ酸内に少なくとも部分的に位置するエピトープに結合する抗体である。
ネクチン－４のＶＣ１架橋ドメインに結合するという特色は、適宜、（ａ）ヒトネクチン－４ポリペプチドＩｇ様Ｖ型ドメインおよび（ｂ）ヒトネクチン－４ポリペプチドＩｇ様Ｃ２型１ドメインに（例えば少なくとも部分的に）結合する能力として特徴付けることができる。別の態様において、ネクチン－４のＶＣ１架橋ドメインに結合するという特色は、適宜、Ｉｇ様Ｖ型ドメインが欠失しているネクチン－４ポリペプチド（例えばＩｇ様Ｃ２型１ドメインおよびＩｇ様Ｃ２型２ドメインを含むが、Ｉｇ様Ｖ型ドメインを欠いているネクチン－４ポリペプチド；配列番号３２のポリペプチド）への部分的結合を保持することとして特徴付けることができ、ここで、抗体は、Ｉｇ様Ｖ型ドメインが欠失したネクチン－４タンパク質への結合を、野生型ネクチン－４タンパク質への結合と比較して低下したレベルにおいて保持してもよく）、さらに、抗ネクチン－４抗体は、Ｉｇ様Ｖ型ドメインおよびＩｇ様Ｃ２型１ドメインを欠いているネクチン－４ポリペプチド、例えば、配列番号３３のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合しなくてもよい。別の態様において、ネクチン－４のＶＣ１架橋ドメインに結合するという特色は、適宜、残基Ａ７２、Ｇ７３、Ｓ１９５、Ｋ１９７、Ｓ１９９、Ｌ１５０、Ｓ１５２、Ｑ２３４およびＩ２３６（配列番号１に準拠）に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む突然変異型ネクチン－４ポリペプチドに対して、適宜、残基Ｋ１９７、Ｓ１９９および／またはＱ２３４に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む突然変異型ネクチン－４ポリペプチドに対して、野生型ヒトネクチン－４ポリペプチドへの結合と比較して低下した結合、適宜、残基Ｋ１９７および／またはＳ１９９に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む突然変異型ネクチン－４ポリペプチドに対して、野生型ヒトネクチン－４ポリペプチドへの結合と比較して低下した結合を示すこととして特徴付けることができる。結合は、ネクチン－４ポリペプチドを発現するように作製された細胞を使用してフローサイトメトリーによって評価し、蛍光強度レベル（例えばＭＦＩ）が決定されてもよい。
一実施形態において、抗体５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７の機能保存変異体であるネクチン－４結合抗体または抗体断片が提供される。一実施形態において、ネクチン－４結合抗体は、（ｉ）配列番号６、２４、４２もしくは５０を含む群から選択される配列によって定義されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン（適宜、各重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域によって置換されている）、および／または（ｉｉ）配列番号７、２５、４３もしくは５１を含む群から選択される配列によって定義されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン（適宜、各軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域によって置換されている）を含む。
一実施形態において、（ｉ）配列番号８、９および１０（Ｋａｂａｔ Ｈ－ＣＤＲ１、２および３）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに（ｉｉ）配列番号１１、１２および１３（Ｋａｂａｔ Ｌ－ＣＤＲ１、２および３）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むネクチン－４結合抗体または抗体断片が提供される。
一実施形態において、（ｉ）配列番号１４、１５および１６（Ｈ－ＣＤＲ１、２および３）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに（ｉｉ）配列番号１７、１８および１３（Ｌ－ＣＤＲ１、２および３）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むネクチン－４結合抗体または抗体断片が提供される。
一実施形態において、（ｉ）配列番号１９、２０および２１（Ｈ－ＣＤＲ１、２および３）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに（ｉｉ）配列番号２２、１８および２３（Ｌ－ＣＤＲ１、２および３）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むネクチン－４結合抗体または抗体断片が提供される。
一実施形態において、（ｉ）配列番号４４、４５および４６（Ｈ－ＣＤＲ１、２および３）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに（ｉｉ）配列番号４７、４８および４９（Ｌ－ＣＤＲ１、２および３）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むネクチン－４結合抗体または抗体断片が提供される。
一実施形態において、（ｉ）配列番号５２、５３および５４（Ｈ－ＣＤＲ１、２および３）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに（ｉｉ）配列番号５５、５６および５７（Ｌ－ＣＤＲ１、２および３）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むネクチン－４結合抗体または抗体断片が提供される。
本明細書の任意の実施形態において、抗ネクチン－４抗体もしくは抗体断片、またはそのような抗体もしくは断片を含む抗体－薬物コンジュゲートは、腫瘍細胞の表面のネクチン－４に結合すると、細胞内内在化を受けることができる。
本明細書の任意の実施形態において、抗ネクチン－４抗体は細胞毒性剤にコンジュゲートされる。本明細書の任意の実施形態において、細胞毒性剤にコンジュゲートした抗ネクチン－４抗体は、さらなる細胞毒性剤［例えば化学療法剤、Ｐ－糖タンパク質（Ｐｇｐ、ヒトＭＤＲ１遺伝子の産物）によって輸送される化学療法剤、プラチナ剤、タキサン］と組み合わせて使用され、ここで、さらなる細胞毒性剤は、細胞毒性剤にコンジュゲートした抗ネクチン－４抗体と別個に投与される。
一態様において、癌の処置および／または腫瘍細胞の殺滅を、それを必要とする個体において行う方法であって、ヒトネクチン－４ポリペプチドに特異的に結合する治療有効量の本開示の抗体を前記個体に投与することを含み、抗体が、リンカーを介してカンプトテシン類似体であってもよい細胞毒性剤にコンジュゲートされていてもよい、方法が提供される。
一態様において、本発明は、ネクチン－４発現癌を有する個体に、腫瘍細胞におけるネクチン－４発現のレベルにかかわらず使用することができる処置の方法を提供する。
一態様において、本発明は、有利には腫瘍細胞がＰ－糖タンパク質（Ｐｇｐ）を発現する個体において使用することができる処置の方法を提供する。
一態様において、本発明は、有利には、化学療法剤［例えばＰ－糖タンパク質（Ｐｇｐ）によって輸送される化学療法剤、プラチナ剤（例えば、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、フェナントリプラチン（Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｉｐｌａｔｉｎ）、ピコプラチン、サトラプラチン）、タキサン［例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標））およびドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標））］を用いた前処置を受けたことがある個体において使用することができる処置の方法を提供する。
一態様において、本発明は、有利には、腫瘍または癌が抵抗性を有するか、抗ＨＥＲ２抗体（例えばトラスツズマブ、トラスツズマブの重および軽可変領域、ＣＤＲまたはポリペプチド鎖を含むＡＤＣ）を含む組成物を用いる処置に応答性ではないか、またはその処置の後に進行した個体において使用することができる処置の方法を提供する。
一態様において、本発明は、低用量または従来の抗ネクチン－４ ＡＤＣに用いられる用量よりも低い用量、例えば３ｍｇ／ｋｇ体重未満、１．２５ｍｇ／ｋｇ体重未満、１ｍｇ／ｋｇ体重未満、１２５ｍｇ未満の固定用量において個体における抗腫瘍効果を媒介するために使用することができる処置の方法を提供する。
一態様において、本発明は、既存の神経障害、糖尿病または高血糖症、心不全、眼病態を有する個体において使用することができる処置の方法を提供する。
一態様において、本発明は、ネクチン－４ポリペプチドの低または中レベルの腫瘍細胞発現（例えば腫瘍細胞膜におけるネクチン－４ポリペプチドの発現）によって特徴付けられるネクチン－４発現癌を有する個体において使用することができる処置の方法を提供する。
一態様において、抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、細胞内で切断可能な（例えば、プロテアーゼ切断可能な）オリゴペプチド（例えばジ、トリ、テトラまたはペンタペプチド）を介して細胞毒性剤にコンジュゲートされる。一態様において、抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、細胞内で切断可能な（例えばプロテアーゼ切断可能な）ジ、トリ、テトラまたはペンタペプチドおよび自己脱離スペーサーを介して細胞毒性剤（例えばカンプトテシン誘導体）にコンジュゲートされる。一態様において、抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、細胞内で切断可能な（例えば、プロテアーゼ切断可能な）テトラまたはペンタペプチドおよび自己または非自己脱離スペーサーを介して細胞毒性剤（例えばカンプトテシン誘導体）にコンジュゲートされる。
一態様において、細胞毒性剤は、タキサン類、アントラサイクリン類、カンプトテシン類、エポチロン類、マイトマイシン類（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎｓ）、コンブレタスタチン類、ビンカアルカロイド類、ナイトロジェンマスタード類、メイタンシノイド類、デュオカルマイシン類、ツブリシン類、ドラスタチン類およびアウリスタチン類、エンジイン類（例えば、カリケアマイシン類（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎｓ）、エスペラマイシン類、シシジマイシン類およびナメナマイシン類）、ピロロベンゾジアゼピン類（例えばピロロベンゾジアゼピン二量体およびインドリノ－ピロロベンゾジアゼピン二量体）、アマトキシン類、ならびにエチレンイミン類からなる群から選択される細胞毒性剤であってもよい、高度に強力な化学療法剤である。一実施形態において、細胞毒性剤は、例えばＤＮＡインターカレート剤、例えば自らを細胞のＤＮＡ構造に挿入し、ＤＮＡに結合して、それによりＤＮＡ損傷を引き起こす薬剤（例えばダウノルビシン）を含むＤＮＡ損傷剤である。化合物は、トポイソメラーゼ阻害薬、すなわち、トポイソメラーゼ（トポイソメラーゼＩおよびＩＩ）の作用を阻止する化学化合物を含む。そのような化合物は、種々の固形腫瘍および血液学的悪性腫瘍、特にリンパ腫のために使用される。トポイソメラーゼＩ阻害薬としては、カンプトテシン類、例えばイリノテカン（結腸癌の処置に関して承認されている）、トポテカン（卵巣癌および肺癌の処置に関して承認されている）、カンプトテシン、ラメラリンＤ、インデノイソキノリン、インジミテカン（ｉｎｄｉｍｉｔｅｃａｎ）が挙げられる。さらなるカンプトテシン類（ｃａｍｔｏｐｔｈｅｃｉｎｓ）としては、シラテカン、コシテカン、エキサテカン、ルルトテカン、ギマテカン、ベロテカン、およびルビテカンが挙げられる。トポイソメラーゼＩＩ阻害薬としては、例えばエトポシド（ＶＰ－１６）、テニポシド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、エリプチシン類、アウリントリカルボン酸、およびカンナビジオールから合成されたキノロンであるＨＵ－３３１が挙げられる。
抗体は、式Ｉ～ＸＩのいずれか１つのリンカー－毒素により機能化されてもよい。
一態様において、細胞毒性剤はカンプトテシン類似体、例えば、エキサテカン、ＤｘｄまたはＳＮ－３８分子である。
一態様において、本発明は、カンプトテシン、例えばカンプトテシン類似体、エキサテカンもしくはエキサテカン誘導体、Ｄｘｄ分子またはＳＮ－３８分子にコンジュゲートした（例えば共有結合した）本開示のネクチン－４結合抗体または抗体断片を提供する。
本明細書の任意の実施形態において、カンプトテシン類似体、例えばエキサテカンまたはＳＮ－３８分子にコンジュゲートした（例えば共有結合した）本開示のネクチン－４結合抗体または抗体断片は、１つまたは複数のアミノ酸残基（例えばシステイン、リジン、グルタミン残基、非天然アミノ酸残基）が、リンカーを介して化合物１もしくは２の構造を含む分子により機能化されたか、または式ＩもしくはＩＩのリンカー－カンプトテシン分子により機能化された、ヒトネクチン－４ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含むと特徴付けることができる。本明細書の任意の実施形態において、ネクチン－４抗体または抗体断片は、式ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、ＸもしくはＸＩの構造を有するリンカー－カンプトテシン分子、または化合物３～１２のいずれかにより機能化されていると特徴付けることができる。
一実施形態において、カンプトテシン誘導体にコンジュゲートしたネクチン－４抗体または抗体断片は、エキサテカン分子、例えば化合物１（１ａまたは１ｂ）の構造を有する分子にコンジュゲートしたネクチン－４抗体または抗体断片である。任意の実施形態において、切断可能なリンカー、またはリンカーを含むイムノコンジュゲートもしくはＡＤＣは、例えばリンカーの酵素的切断時に、エキサテカン分子、例えば化合物１（１ａまたは１ｂ）の構造を有する分子を放出すると特徴付けることができる。一実施形態において、カンプトテシン誘導体にコンジュゲートしたネクチン－４抗体または抗体断片は、ＳＮ－３８分子、例えば、化合物２の構造を有する分子にコンジュゲートしたネクチン－４抗体または抗体断片である。一実施形態において、ネクチン－４抗体または抗体断片は、１つまたは複数のアミノ酸残基（例えばシステイン、リジン、グルタミンまたは非天然アミノ酸残基）が、リンカー（例えば、追加のスペーサー、例えば本明細書に記載されるスペーサー（Ｙ’）を有するかまたは有しない切断可能なリンカー分子）を介して、構造：
または
または
を有する分子により機能化された、ヒトネクチン－４ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含むと特徴付けることができる。
一実施形態において、細胞毒性剤にコンジュゲートしたネクチン－４抗体または抗体断片は、式（Ｉ）：
Ａｂ－Ｘ－Ｚ 式（Ｉ）
［式中、
Ａｂは、ヒトネクチン－４ポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体断片［例えば、ヒトネクチン－４のＶＣ１架橋ドメインと結合する；ならびに／または残基Ｋ１９７および／もしくはＳ１９９（配列番号１に準拠）にアミノ酸置換を含む突然変異型ヒトネクチン－４ポリペプチドに対して、野生型ヒトネクチン－４ポリペプチドへの結合と比較して低減した結合を示す抗体または抗体断片］であり、
ＸはＡｂとＺとを接続する（例えば、ＡｂおよびＺのそれぞれに共有結合する）リンカー分子であり、Ｘは、例えば細胞内条件下であってもよい生理的条件下において切断可能である部分、適宜、プロテアーゼ切断可能なジ、トリ、テトラまたはペンタペプチドを含み、Ｘは、切断可能な部分とＺとの間に位置する自己脱離または非自己脱離スペーサー系（Ｙ’）をさらに含んでもよく、Ｘは、Ａｂと切断可能な部分との間に位置するスペーサー（Ｙ）をさらに含んでもよく、
Ｚは細胞毒性剤であり、Ｚはカンプトテシン類似体であってもよく、Ｚはエキサテカンであってもよく、Ｚはエキサテカンであって、リンカーの切断が化合物１の構造を有する化合物（エキサテカン）の放出をもたらしてもよい］
によって表されるイムノコンジュゲートであると規定することができる。
一実施形態において、細胞毒性剤にコンジュゲートしたネクチン－４抗体または抗体断片は、式（Ｉ）：
Ａｂ－Ｘ－Ｚ 式（Ｉ）
［式中、
Ａｂは、ヒトネクチン－４ポリペプチドに特異的に結合する本開示の抗体または抗体断片であり、
ＸはＡｂとＺとを接続する（例えば、ＡｂおよびＺのそれぞれに共有結合する）リンカー分子であり、Ｘはバリン－シトルリン、バリン－アラニンまたはフェニルアラニン－リジンジペプチドを含み、Ｘは、切断可能な部分とＺとの間に位置する自己脱離または非自己脱離スペーサー系（Ｙ’）をさらに含み、Ｘは、Ａｂと切断可能な部分との間に位置するスペーサー（Ｙ）をさらに含み、
Ｚは細胞毒性剤、適宜カンプトテシン類似体、適宜エキサテカン分子またはＳＮ－３８分子である］
によって表されるイムノコンジュゲートであると規定することができる。
一実施形態において、細胞毒性剤（カンプトテシン類似体であってもよい）を腫瘍にデリバリーもしくはターゲティングする方法、腫瘍において（例えば癌を有する対象において）細胞毒性剤（カンプトテシン類似体、Ｄｘｄ、エキサテカンであってもよい）を放出する方法、また腫瘍もしくは癌を細胞毒性剤（カンプトテシン類似体であってもよい）に対して感作する方法が提供され、ここで、方法は、式（Ｉ）：
Ａｂ－Ｘ－Ｚ 式（Ｉ）
［式中、
Ａｂは、ヒトネクチン－４ポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体断片であり、
ＸはＡｂとＺとを接続する（例えば、ＡｂおよびＺのそれぞれに共有結合する）リンカー分子であり、Ｘは、例えば細胞内条件下であってもよい生理的条件下において切断可能である部分、適宜、プロテアーゼ切断可能なジ、トリ、テトラまたはペンタペプチドを含み、Ｘは、切断可能な部分とＺとの間に位置する自己脱離または非自己脱離スペーサー系（Ｙ’）をさらに含んでもよく、Ｘは、Ａｂと切断可能な部分との間に位置するスペーサー（Ｙ）をさらに含んでもよく、
Ｚは細胞毒性剤、適宜カンプトテシン類似体、適宜エキサテカン分子またはＳＮ－３８分子であり、Ｚはエキサテカンであってもよく、リンカーの切断は化合物１の構造を有する化合物（エキサテカン）の放出をもたらす］
によって表されるイムノコンジュゲートを、癌を有する対象に投与することを含む。
一実施形態において、細胞毒性剤（カンプトテシン類似体であってもよい）にコンジュゲートした抗体または抗体断片は、式（ＩＩ）：
Ａｂ－（Ｘ－（Ｚ）ｎ）ｍ 式（ＩＩ）
［式中、
Ａｂは、ヒトネクチン－４ポリペプチドに特異的に結合する本開示の抗体または抗体断片であり、
ＸはＡｂとＺとを接続するリンカー分子であり、Ｘは、例えば細胞内条件下であってもよい生理的条件下において切断可能である部分、適宜、プロテアーゼ切断可能なジ、トリ、テトラまたはペンタペプチドを含み、Ｘは、切断可能な部分とＺとの間に位置する自己脱離または非自己脱離スペーサー系（Ｙ’）をさらに含んでもよく、Ｘは、Ａｂと切断可能な部分との間に位置するスペーサー（Ｙ）をさらに含んでもよく、
Ｚは細胞毒性剤、適宜カンプトテシン類似体であり、Ｚはエキサテカン分子またはＳＮ－３８分子、例えば、化合物１または２の構造を有する分子を含む分子であってもよく、
ｎは１であり、
ｍは４～８であるか、またはｍは４、５、６、７もしくは８のうちから選択される整数であってもよい］
によって表されるイムノコンジュゲートであると規定することができる。
一実施形態において、細胞毒性剤（カンプトテシン類似体であってもよい）にコンジュゲートしたネクチン－４抗体または抗体断片は、式（ＩＩ）：
Ａｂ－（Ｘ－（Ｚ）ｎ）ｍ 式（ＩＩ）
［式中、
Ａｂは、ヒトネクチン－４ポリペプチドに特異的に結合する本開示の抗体または抗体断片であり、
ＸはＡｂとＺとを接続する分子であり、Ｘは、例えば細胞内条件下であってもよい生理的条件下において切断可能である部分、適宜、プロテアーゼ切断可能なジ、トリ、テトラまたはペンタペプチドを含み、Ｘは、切断可能な部分とＺとの間に位置する自己脱離または非自己脱離スペーサー系（Ｙ’）をさらに含んでもよく、Ｘは、Ａｂと切断可能な部分との間に位置するスペーサー（Ｙ）をさらに含んでもよく、
Ｚは細胞毒性剤、適宜カンプトテシン類似体であり、Ｚはエキサテカン分子またはＳＮ－３８分子を含む分子であってもよく、
ｎは１であり、組成物における少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％のイムノコンジュゲートは、２～４の間、４～８の間、適宜６～８の間であるｍ（Ｘ－Ｚ部分の数）を有する。組成物における少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％のイムノコンジュゲートは、４、６、７もしくは８であるか、または少なくとも４、６、７もしくは８であるｍを有してもよい］
によって表されるイムノコンジュゲートの組成物として特徴付けることができる。
式ＩまたはＩＩにおいて、（Ｘ－Ｚ）部分は、適宜、式ＩＩＩ～ＸＩのいずれかまたは化合物３～１２のいずれかの構造を有すると特徴付けることができる。
式ＩまたはＩＩにおいて、分子ＸまたはスペーサーＹは、適宜、反応基（Ｒ）、あるいは反応基（Ｒ）と抗原結合タンパク質（例えば、抗体）のアミノ酸または抗体もしくは抗体断片のアミノ酸に結合している相補的反応基（Ｒ’）との反応の残基を含むと規定することができる。
本明細書の任意の実施形態において、エキサテカン分子は、エキサテカンの１位のアミンを介してリンカー（Ｘ）に結合していると規定することができる（エキサテカン分子がリンカーの一部となる場合、１位のＮＨ２はＮＨに置き換えられる）。一実施形態において、エキサテカンは、リンカー（Ｘ）に、例えばＸのｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）自己脱離スペーサー部分のカルボニルに結合する。本明細書の任意の実施形態において、ＳＮ－３８分子は、９位のＯＨを介してリンカー（Ｘ）に結合していると規定することができる（化合物２に示すＳＮ－３８分子がリンカーの一部となる場合、９位のＯＨはＯに置き換えられる）。
一実施形態において、エキサテカンにコンジュゲートしたネクチン－４結合剤は、１つまたは複数のアミノ酸残基（例えばシステイン残基、グルタミン残基）が、スペーサー（Ｙ）を介して、以下の構造：
を含むリンカー－エキサテカン分子により機能化された、ヒトネクチン－４ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含むと特徴付けることができる。
一実施形態において、エキサテカンにコンジュゲートしたネクチン－４抗体または抗体断片は、１つまたは複数のアミノ酸残基（例えばシステイン残基、グルタミン残基）が、スペーサー（Ｙ）を介して、以下の構造：
を含むリンカー－エキサテカンにより機能化された、ヒトネクチン－４ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含むと特徴付けることができる。
一実施形態において、エキサテカンにコンジュゲートしたネクチン－４抗体または抗体断片は、１つまたは複数のアミノ酸残基（例えばシステイン残基、グルタミン残基）が、スペーサー（Ｙ）を介して、以下の構造：
を含むリンカー－エキサテカン分子により機能化された、ヒトネクチン－４ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含むと特徴付けることができる。
一実施形態において、エキサテカンにコンジュゲートしたネクチン－４抗体または抗体断片は、１つまたは複数のアミノ酸残基（例えばシステイン残基、グルタミン残基）が、スペーサー（Ｙ）を介して、以下の構造：
を含むリンカー－エキサテカン分子により機能化された、ヒトネクチン－４ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含むと特徴付けることができる。
スペーサー（Ｙ）は、置換または非置換アルキルまたはヘテロアルキル鎖であるかまたはそれを含むと規定することができ、Ｙは２～４０個の原子、適宜２～３０、２～２０、４～４０、４～３０または４～２０個の原子の鎖長を有してもよく、適宜、１個または複数の原子は、炭素以外のもの、例えば酸素、硫黄、窒素、または他の原子であってもよく、適宜、鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル－Ｓ－、チオール、アルキル－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミドにより置換されている。例えば、Ｙは１つまたは複数のエチレンオキシドモノマーを含んでもよく、Ｙはポリエチレンオキシド部分を含んでもよく、Ｙは構造－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ－（ここで、ｘは１～１２、適宜１～８、適宜１～６である）を含んでもよい。
一態様において、本発明は、既存の抗ネクチン－４ ＡＤＣ療法（例えばアウリスタチンにコンジュゲートした抗ネクチン－４抗体または抗体断片；エンホルツマブベドチン（ｅｎｆｏｒｔｕｍａｂ ｖｅｒｄｏｔｉｎ））と比較して改善した有効性および／または改善した（より低い）薬剤耐性を示す処置を提供する。一態様において、癌の処置および／もしくは予防、ならびに／または腫瘍細胞の殺滅を、それを必要とする個体において行う方法であって、処置が、１か月当たり１～２回（例えば２週間ごとに１回、３週間ごとに１回または４週間ごとに１回）の頻度での、カンプトテシン誘導体（例えばエキサテカンまたはＳＮ－３８分子）にコンジュゲートしたネクチン－４結合剤の２、３、４、５、６、７、８、９または１０回以上の投与を含む、方法が提供される。
一態様において、本発明は、癌の処置および／もしくは予防、ならびに／または腫瘍細胞の殺滅を、それを必要とする個体において行う方法であって、カンプトテシン分子にコンジュゲートしたネクチン－４結合抗体または抗体断片（例えば、１つまたは複数のカンプトテシン部分にコンジュゲートした抗ネクチン－４抗体または抗体断片）を用いて前記個体を処置することを含み、カンプトテシンがエキサテカン、ＤｘｄまたはＳＮ－３８であってもよい、方法を提供する。一実施形態において、前記個体はネクチン－４発現腫瘍を有し、腫瘍は、ＨＥＲ２発現腫瘍またはＨＥＲ２陰性腫瘍、例えば尿路上皮癌、乳癌、非小細胞肺癌、膵癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮癌腫または食道癌であってもよい。一実施形態において、前記個体はＰｇｐ発現腫瘍を有する。一実施形態において、癌または腫瘍は進行性再発性または転移性癌、適宜、進行性再発性または転移性尿路上皮癌である。一実施形態において、癌または腫瘍はトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）である。
一態様において、本発明は、癌の処置、腫瘍細胞の殺滅および／または細胞毒性剤の腫瘍へのデリバリーを、それを必要とする個体において行う方法であって、切断可能なリンカーを介して化合物１のエキサテカンにコンジュゲートした抗ネクチン－４抗体を含む治療有効量の抗体－薬物コンジュゲートを前記個体に投与することを含み、リンカーの切断が化合物１の構造を有する化合物（エキサテカン）の放出をもたらしてもよく、切断可能なリンカーが切断可能なオリゴペプチド（例えばジ、トリまたはテトラペプチド、ｖａｌ－ｃｉｔ、ｖａｌ－ｐｈｅ、ｖａｌ－ａｌａ）および自壊性スペーサー（例えばＰＡＢ）を含んでもよく、前記個体が、Ｐｇｐによる輸送が可能である細胞毒性剤にリンカー（例えばリンカーは、切断時に細胞毒性剤を放出する細胞内で（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｌｔｙ）切断可能なリンカーである）を介してコンジュゲートした結合剤（適宜ネクチン－４結合剤）を用いた処置の後に再燃および／または進行した癌を有する、方法を提供する。任意の実施形態において、Ｐｇｐによる輸送が可能である細胞毒性剤は、エキサテカン以外のカンプトテシン類似体であり、Ｐｇｐによる輸送が可能である細胞毒性剤は、５環性カンプトテシン類似体、６環性カンプトテシン、デルクステカンまたはＤｘｄであってもよく、リンカーの切断は、エキサテカン以外のカンプトテシン類似体（例えば、化合物１３の構造を有するＤｘｄ）の放出をもたらしてもよい。一実施形態において、Ｐｇｐによる輸送が可能である細胞毒性剤にリンカーを介してコンジュゲートした結合剤は、リンカーを介して化合物１３の構造を有する化合物（Ｄｘｄ、デルクステカン）にコンジュゲートした、ネクチン－４と結合する抗体を含み、リンカーは切断可能なグリシン含有オリゴペプチドリンカー、例えばグリシンおよびフェニルアラニン含有オリゴペプチドリンカー、ＧＧＦＧリンカーを含んでもよい。一実施形態において、切断可能なリンカーを介して化合物１のエキサテカンにコンジュゲートした抗ネクチン－４抗体は、ヒトネクチン－４ポリペプチドのＶＣ１架橋ドメインに結合する抗体、例えば本開示の抗体を含む。
本明細書の任意の実施形態の一態様では、個体は、放射線療法、外科的処置、化学療法、および／または生物学的薬剤を用いる処置による前処置を受けたことがある。
本開示のイムノコンジュゲートの組成物もまた提供される。本開示のイムノコンジュゲートと、活性成分または組成物の製剤化、デリバリー、安定性、もしくは他の特徴を促進する不活性成分（例えば、様々な担体）であり得る典型的には１つまたは複数の追加の成分とを含む、薬学的に許容される組成物およびキットもまた提供される。抗ネクチン－４抗体および抗体断片、およびそれらを含むイムノコンジュゲートまたはＡＤＣをスクリーニング、試験および作製する方法、ならびにそれらの方法における使用のためのツールおよび試薬もまた提供される。
これらの態様は、本明細書において提供される本発明の説明により十分に記載されており、追加の態様、特色、および利点は、本明細書において提供される本発明の説明から明らかとなるだろう。
図１は、ＦＡＣＳによって決定された、ＳＵＭ１９０ヒト乳癌腫瘍細胞の表面におけるＨＥＲ２およびネクチン－４ポリペプチドの発現レベルを示す（ＭＦＩ：蛍光強度の平均）。ＳＵＭ１９０腫瘍細胞は、ＨＥＲ２を低～中レベル（蛍光単位中央値１７７７）において、およびネクチン－４をより低いレベル（９９１の蛍光単位中央値）において発現した。 図２は、ＦＡＣＳによって決定された、ＳＵＭ１８５ヒト乳癌腫瘍細胞の表面におけるＨＥＲ２およびネクチン－４ポリペプチドの発現レベルを示す（ＭＦＩ：蛍光強度の平均）。ＳＵＭ１８５細胞は、ＨＥＲ２を中～高レベル（蛍光単位中央値２８８０）において、およびネクチン－４をより高いレベル（４３２６の蛍光単位中央値）において発現した。 図３の右手側のパネルは、ＨＥＲ－２およびネクチン－４発現ＳＵＭ１８５およびＳＵＭ１９０腫瘍細胞の死を引き起こすことにおけるＮ４ ＡＤＣ１（抗ネクチン－４）の有効性を示す。左手側の２つのパネルは、同じそれぞれの細胞におけるＨＥＲ２ ＡＤＣ１（抗Ｈｅｒ２）の有効性を示す。Ｎ４ ＡＤＣ１は、ＳＵＭ１９０細胞においてＨＥＲ２ ＡＤＣ１と比較して２０倍の効力の増加を有し、より低いネクチン－４表面発現によって特徴付けられるＳＵＭ１８５細胞（ＳＵＭ１８５における表面ネクチン－４はＳＵＭ１９０の約４分の１）においてもより高い比較効力を有した。 図４Ａは、ネクチン－４を発現するように作製された細胞を使用してフローサイトメトリーによって評価した、抗ネクチン－４抗体の全（野生型）ネクチン－４タンパク質への結合に関するＭＦＩを示す。ｍＡｂ６（５Ｅ７）および７（１０Ｂ１２）は、他の抗体よりも低いプラトーを示す。図４Ｂは、フローサイトメトリーによって評価した、抗ネクチン－４抗体の、Ｉｇ様Ｃ２型１およびＩｇ様Ｃ２型２ドメインを有し、Ｉｇ様Ｖドメインを欠いている改変ネクチン－４（Ｃ１Ｃ２コンストラクト）を発現するように作製された細胞への結合に関するＭＦＩを示す。左手側のパネルは、ｍＡｂ６（５Ｅ７）および７（１０Ｂ１２）がＣ１Ｃ２コンストラクトへの結合を保持していることを示す。右手側のパネル。右手側のパネルは、ｍＡｂ６および７のＭＦＩが、Ｃ１Ｃ２コンストラクトに完全に結合するｍＡｂ２と比較して減少していることを示す。 同上。 図５は、ネクチン－４のドメイン構造を示す。ＡＤＣとして使用される抗体エンホルツマブおよびＮ４１はＩｇ様Ｖ型ドメインに結合する。本明細書において得られる抗体１～５は、Ｉｇ様Ｃ２型１ドメイン（Ｃ１ドメイン）および／またはＩｇ様Ｃ２型２ドメイン（Ｃ２ドメイン）には結合するが、Ｉｇ様Ｖ型ドメインには結合しない。抗体６（５Ｅ７）および７（１０Ｂ１２）、ならびに本明細書において得られる抗体６ＣＢ１１および６Ａ７は、Ｉｇ様Ｖ型ドメイン（Ｖドメイン）とＩｇ様Ｃ２型１ドメイン（Ｃ１ドメイン）の両方に結合する。 図６は、フローサイトメトリーによって評価した、異なる抗体１～７およびアイソタイプ対照（ＩＣ）のＳＵＭ１８５細胞に対する結合プロファイルを示す。この実験から、Ｃ１および／またはＣ２ドメイン特異的抗体（ｍＡｂ１～５）は、概して、エンホルツマブに匹敵する結合プロファイルを有すると考えられるが、抗体６および７（ｍＡｂ６および７）は異なるプロファイルを有する。 図７Ａは、抗体１～７のそれぞれのＳＵＭ１９０細胞に対する内在化を、抗ネクチン－４抗体濃度に対する発光（細胞生存性を示す）として、エンホルツマブと比較して示す。図７Ｂは、エンホルツマブと比較したｍＡｂ６に関する、ＳＵＭ１８５細胞における発光（細胞生存性を示す）を示す。ｍＡｂ６（５Ｅ７）は、ＳＵＭ１８５細胞への内在化を誘導することに関してエンホルツマブよりも効率的であった。 同上。 図８Ａは、カンプトテシン類似体Ｄｘｄと（実施例７に示すＧＧＦＧ－Ｄｘｄリンカーを介して）またはエキサテカンと［実施例７に示す（ＰＥＧ（８Ｕ）－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ－エキサテカン）リンカーを介して］コンジュゲートしたｍＡｂ６（５Ｅ７）抗体によるヒト乳癌細胞の殺滅を、アイソタイプ対照抗体（ＩＣ）と共に［これらは全て等しい薬物抗体比（ＤＡＲ＝８）である］、Ｖドメインに結合するＥｎｈｅｒｔｕ（商標）［トラスツズマブデルクステカン（抗ＨＥＲ２）］と比較して示す。図８Ｂは、図８Ａと同じカンプトテシン類似体含有リンカーとコンジュゲートしたｍａｂ６（５Ｅ７）によるヒト乳癌細胞の殺滅を、カンプトテシン類似体とコンジュゲートした免疫対照、すなわち同じＤＡＲにおいてカンプトテシン類似体含有リンカーにコンジュゲートしたｍＡｂ３、およびＥｎｈｅｒｔｕ（商標）と共に示す。図８Ｃは、ＨＥＲ－２およびネクチン－４発現ＳＵＭ１８５、ＳＵＭ１９０、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＴＮＢＣ）ヒト腫瘍細胞ならびにＭＣ３８（結腸癌）およびＢ１６Ｆ１０（黒色腫）マウス腫瘍細胞の死を引き起こすことにおける「５Ｅ７－エキサテカン」［実施例７に示すエキサテカンリンカー（ＰＥＧ（８Ｕ）－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ－エキサテカン）にコンジュゲートした５Ｅ７］の有効性と、５Ｅ７－エキサテカンが細胞死を引き起こすことができるＥＣ５０値とを示す。 同上。 同上。 図９は、ヒト乳癌のマウスモデルにおける、カンプトテシンＡＤＣとしてのｍＡｂ６（５Ｅ７）抗体の３ｍｇ／ｋｇの単回用量での有効性を、同じ用量のエンホルツマブ、Ｎ４１およびアイソタイプ対照抗体（ＩＣ）との比較において示す。各抗体は、等しい薬物抗体比（ＤＡＲ＝８）において、同じカンプトテシン類似体（Ｄｘｄ）およびテトラペプチド含有リンカー（ＧＧＦＧ）とコンジュゲートしていた。５Ｅ７のみが腫瘍成長を効果的に制御することができた。 図１０は、ネクチン－４を比較的高いレベルにおいて発現するＳＵＭ１８５ヒト乳癌細胞のｍＡｂ６（５Ｅ７）抗体による殺滅を、Ｐａｄｃｅｖ（商標）（エンホルツマブベドチン）（ＤＡＲ＝４においてアウリスタチン化合物ＭＭＡＥにコンジュゲートしたエンホルツマブ）およびＥｎｈｅｒｔｕ（商標）と比較して示す。この設定は、抗ＨＥＲ２耐性のモデルとして使用されている。 図１１Ａおよび１１Ｂは、フローサイトメトリーによって判定された、抗ネクチン－４抗体の、ラットおよびカニクイザルネクチン４発現ＣＨＯ細胞株それぞれに対する結合を示す。エンホルツマブならびにｍＡｂ６および７はラットネクチン－４に結合するが、ｍＡｂ１～５は結合しない。 同上。 図１２Ａおよび１２Ｂは、置換のシェーディングを有するヒトネクチン－４タンパク質の構造を示し、突然変異体７（１２Ａ）および７ｂｉｓ（１２Ｂ）において置換されているＣ１ドメイン残基に対応する白色の領域が示される。 同上。 図１３Ａおよび１３Ｂは、置換のシェーディングを有するヒトネクチン－４タンパク質の構造のいくつかの図を示し、突然変異体１、２、３、４、５、６、７、８および９において置換されている残基に対応する白色の領域が示される。 同上。 図１４Ａは、抗体５Ｅ７と比較した６Ｃ１１Ｂに関する、ＳＵＭ１９０細胞における発光（細胞生存性を示す）を示す。図１４Ｂは、抗体５Ｅ７と比較した６Ａ７に関する、ＳＵＭ１９０細胞における発光（細胞生存性を示す）を示す。６Ｃ１１Ｂと６Ａ７の両方は、それぞれ、ＳＵＭ１９０細胞への内在化を誘導することに関して５Ｅ７と同程度に効率的であった。 同上。 図１５Ａ、１５Ｂおよび１５ｃは、ＡＤＣを用いて処置されたマウスにおける腫瘍成長の経時的な（腫瘍移植後日数）展開を示す。図１５Ａおよび１５Ｂは、同じＤＡＲにおいて同じリンカー－ペイロードにコンジュゲートした異なる抗体のｉ．ｖ．による３ｍｇ／ｋｇ体重の用量での処置を示す。図１５Ｃは、リンカーの切断時にＤｘｄまたはエキサテカンのいずれかを放出するように設計されたリンカーにコンジュゲートした抗体５Ｅ７を用いたｉ．ｖ．による１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量での処置を示す。 同上。 同上。 図１６Ａは、Ｐａｄｃｅｖ（商標）（エンホルツマブベドチン）、Ｄｘｄにコンジュゲートした抗体５Ｅ７またはエキサテカンにコンジュゲートした５Ｅ７を用いて処理した細胞の発光（細胞生存性を示す）を示す。細胞は、ＭＤＲ１ ｐ－糖タンパク質を内在的に発現し、ネクチン－４を発現するように操作されたＭＣ－３８細胞である。ペイロードとしてのエキサテカンを有するＡＤＣは、この薬剤耐性の設定において細胞生存性を低減するほど高度に強力であった。図１６Ｂは、Ｐｇｐ阻害薬シクロスポリンの存在下または非存在下において、Ｐａｄｃｅｖ（商標）（エンホルツマブベドチン）、Ｄｘｄにコンジュゲートした抗体５Ｅ７またはエキサテカンにコンジュゲートした５Ｅ７を用いて処理したＭＣ３８細胞の、１５０ｎＭ ＡＤＣにおける、対照抗体に対して正規化した腫瘍成長（曲線下面積）を示し、Ｐａｄｃｅｖ（商標）およびＤｘｄにコンジュゲートした抗体５Ｅ７の抗腫瘍活性がＰｇｐによって負の影響を受けることを示唆する。 同上。 図１７Ａおよび１７Ｂは、ＭＤＲ１ ｐ－糖タンパク質発現腫瘍のモデルにおける、エンホルツマブベドチン、デルクステカンにコンジュゲートした抗体６Ａ７またはエキサテカンにコンジュゲートした６Ａ７を１回注射して（図１７Ａ）または３回の毎週の注射において（図１７Ｂ）処置したマウスにおける腫瘍成長の経時的な展開を示す。エキサテカンにコンジュゲートした抗体６Ａ７は、この薬剤耐性のモデルにおいて腫瘍体積の有意な減少を誘導することができた。 同上。
はじめに
本発明者らは、本明細書において、細胞毒性剤のネクチン－４陽性腫瘍へのデリバリーの改善に関する方法を提供する。特に、本発明はとりわけ、細胞間相互作用と関連する、Ｉｇ様ＶおよびＩｇ様Ｃ２型１ドメインを架橋するネクチン－４の領域における部位に結合するある特定の抗体が、抗腫瘍活性において、ゴールドスタンダードの抗Ｉｇ様Ｖ型ドメインＡＤＣと比較して３倍高い効力をもたらすという観察から生じる。細胞間相互作用は、第１の細胞のネクチン－４と第２の細胞のネクチン－１および／またはネクチン－４との相互作用（ネクチン－４：ネクチン－１またはネクチン－４：ネクチン－４相互作用）によって媒介され得る。トポイソメラーゼＩ阻害薬（カンプトテシン類似体Ｄｘｄおよびエキサテカン）を有するＡＤＣとして調製された場合、ネクチン－４の上述の部位に結合した抗体は、Ｉｇ様ＶおよびＩｇ様Ｃ２型１ドメインを架橋するネクチン－４の異なる場所に結合するゴールドスタンダードの抗体エンホルツマブまたは比較抗体と比較した場合、インビボにおいてより大きい抗腫瘍活性を示した。
一般に、腫瘍を細胞毒性剤に対して感作する能力のために（もしくは感作する方法において）および／または抗癌薬耐性を抑制する能力のために（もしくは抑制する方法において）適宜用いることができる抗体および断片。したがって、本開示の抗体および断片は、細胞毒性剤（例えば、化学療法剤）と組み合わせて使用（投与）することができ、ここで、細胞毒性剤は、別個に投与される非コンジュゲート剤として、または抗ネクチン－４抗体と同じ医薬製剤において、または細胞毒性剤が抗ネクチン－４抗体にコンジュゲートしたイムノコンジュゲートとして投与される。
本開示の目的の１つは、Ｓ１９５、Ｋ１９７およびＳ１９９（配列番号１に準拠）からなる群から選択される１、２または３つの残基（ｒｅｓｉｄｅ）を含むネクチン－４のエピトープに結合する抗体（例えば全長抗体、抗体断片）である。
本開示の目的の１つは、Ｓ１９５、Ｋ１９７およびＳ１９９（配列番号１に準拠）からなる群から選択される１つまたは複数（または全て）の残基に突然変異を含む突然変異型ネクチン－４ポリペプチドに対して低下した結合を有する抗体（例えば全長抗体、抗体断片）であり、突然変異型ネクチン－４ポリペプチドは突然変異Ｓ１９５Ａ、Ｋ１９７ＴおよびＳ１９９Ａを有してもよい。
本開示の目的の１つは、Ｓ１９５、Ｋ１９７およびＳ１９９（配列番号１に準拠）からなる群から選択される１つまたは複数（または全て）の残基に突然変異を含む突然変異型ネクチン－４ポリペプチドに対して低下した結合を有する抗体（例えば全長抗体、抗体断片）であり、突然変異型ネクチン－４ポリペプチドは、抗体薬物コンジュゲートの調製における使用のために、突然変異Ｓ１９５Ａ、Ｋ１９７ＴおよびＳ１９９Ａを有してもよい。
本開示の目的の１つは、Ｓ１９５、Ｋ１９７およびＳ１９９（配列番号１に準拠）からなる群から選択される１つまたは複数（または全て）の残基に突然変異を含むヒトネクチン－４ポリペプチドである。突然変異型ヒトネクチン－４ポリペプチドは、全長ネクチン－４ポリペプチドあるいはその断片、例えば細胞外ドメイン断片、ＶＣドメイン断片、ＶおよびＣ１ドメインを含む断片、または配列番号１のネクチン－４ポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、５０．１００もしくは２００の連続するアミノ酸残基を含む断片であり得る。突然変異型ネクチン－４ポリペプチドは、残基Ｋ１９７およびＳ１９９に突然変異（例えばＫ１９７ＴおよびＳ１９９Ａ）を含んでもよく、突然変異型ネクチン－４ポリペプチドは、残基Ｓ１９５、Ｋ１９７およびＳ１９９に突然変異（例えば、Ｓ１９５Ａ、Ｋ１９７ＴおよびＳ１９９Ａ）を含んでもよく、突然変異型ネクチン－４ポリペプチドは、残基Ａ７２、Ｇ７３、Ｋ１９７およびＳ１９９に突然変異（例えばＡ７２Ｐ／Ｇ７３Ｎ／Ｋ１９７Ｔ／Ｓ１９９Ａ）を含んでもよい。また、そのようなポリペプチドを例えば細胞表面に発現する（発現するように作製された）組換え宿主細胞も提供される。突然変異型ポリペプチドおよび／または宿主細胞は、抗体および／または抗体薬物コンジュゲートの作製、試験、調製またはスクリーニングの方法において使用することができる。
突然変異型ネクチン－４ポリペプチドに対する結合の低下は、突然変異を有しないネクチン－４ポリペプチド、例えば配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドなどの野生型ネクチン－４ポリペプチドへの結合と比較したものであり得る。
本開示の目的の１つは、抗体５Ｅ７、１０Ｂ１２または６Ａ７の機能保存変異体であるネクチン－４結合抗体または抗体断片である。本開示の目的の１つは、ネクチン－４のエピトープへの結合に関して抗体５Ｅ７、１０Ｂ１２または６Ａ７と競合するネクチン－４結合抗体または抗体断片である。本開示の目的の１つは、抗体５Ｅ７、１０Ｂ１２または６Ａ７と同じネクチン－４の部位またはエピトープと結合するネクチン－４結合抗体または抗体断片である。本開示の目的の１つは、抗体５Ｅ７、１０Ｂ１２または６Ａ７の重鎖および軽鎖ＣＤＲを含む抗体または抗体断片である。本開示の目的の１つは、ネクチン－４と結合し、抗体５Ｅ７、１０Ｂ１２または６Ａ７の重鎖および軽鎖ＣＤＲに対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有する重鎖および軽鎖ＣＤＲを含む抗体または抗体断片である。
本開示の目的の１つは、ＡＤＣを作製する方法である。ＡＤＣを調製する場合、細胞毒性剤（例えばトポイソメラーゼ阻害薬またはカンプトテシン類似体）をネクチン－４の上述の部位と結合する抗体に連結させることが有利であり得る。目的の１つにおいて、ＡＤＣを作製するための方法であって、細胞毒性剤（Ｚ）を、Ｓ１９５、Ｋ１９７およびＳ１９９からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基を含むネクチン－４のエピトープに結合する、ならびに／または突然変異Ｓ１９５Ａ、Ｋ１９７ＴおよびＳ１９９Ａ）を有する突然変異型ネクチン－４ポリペプチドに対して低下した結合を有する抗ネクチン－４抗体にコンジュゲートすることを含む方法が提供される。方法は、抗体薬物コンジュゲートが形成されるような好適な条件下において前記抗ネクチン－４抗体を細胞毒性剤（Ｚ）と接触および／または反応させること、ならびに抗体薬物コンジュゲートを単離することを含んでもよく、さらに、抗ネクチン－４抗体は、抗体（Ａｂ）と細胞毒性剤（Ｚ）とを接続するリンカー（Ｘ）を介して細胞毒性剤にコンジュゲートされてもよく、さらに、細胞毒性剤（Ｚ）は、トポイソメラーゼＩ阻害薬、カンプトテシン、適宜５環性カンプトテシン類似体、適宜６環性カンプトテシン類似体、適宜エキサテカン、ＳＮ－３８またはＤｘｄであってもよい。
本開示の目的の１つは、細胞毒性剤にコンジュゲートした本明細書に記載されるネクチン－４結合抗体または抗体断片を含むＡＤＣであり、さらに、細胞毒性剤はトポイソメラーゼＩ阻害薬、適宜カンプトテシン類似体であってもよい。トポイソメラーゼＩ阻害薬（カンプトテシン類似体Ｄｘｄおよびエキサテカン）を有するＡＤＣとして調製された場合、ネクチン－４の上述の部位に結合した抗体は、ネクチン－４とＰ－糖タンパク質の両方を発現する癌細胞株、特にＨＣＴ１１６、Ａ３７５、ＭＣ３８、Ａ５４９、ＨＴ２９およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株を殺滅する能力において高度に強力であった。したがって、他の薬物（例えばアウリスタチン、ＭＭＡＥ）に抵抗性であるネクチン－４発現癌の処置に有利である、癌多剤耐性において有効性を有するそのようなＡＤＣが使用可能である。本開示の目的の１つは、癌、適宜、尿路上皮癌、適宜、進行性再発性もしくは転移性尿路上皮癌、乳癌、ＴＮＢＣ、非小細胞肺癌、膵癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮癌腫または食道癌を処置するための、本開示のイムノコンジュゲートの使用である。本開示の目的の１つは、個体における癌を処置するための本開示のイムノコンジュゲートの使用であり、前記個体は、アウリスタチンまたはＰｇｐによる輸送が可能である細胞毒性剤にコンジュゲートしたネクチン－４結合剤を用いた処置の後に再燃および／または進行しており、アウリスタチンにコンジュゲートしたネクチン－４結合剤はエンホルツマブベドチンであってもよい。本開示の目的の１つは、個体における癌を処置するための本開示のイムノコンジュゲートの使用であり、前記個体は、ＨＥＲ２に結合する抗体、適宜、細胞毒性剤にコンジュゲートした、ＨＥＲ２に結合する抗体、適宜、カンプトテシン類似体にコンジュゲートした、ＨＥＲ２と結合する薬剤を用いた処置の後に再燃および／または進行しており、抗体は、トラスツズマブのＣＤＲおよび／または可変領域を含んでもよい。一態様において、個体は、免疫組織化学によって決定されてもよい腫瘍細胞における低または中ネクチン－４発現によって特徴付けられるネクチン－４発現癌を有する。一態様において、個体はネクチン－４およびＨＥＲ２発現癌を有する。一態様において、個体は、表面に低または中レベルのＨＥＲ２タンパク質を発現する腫瘍細胞によって特徴付けられる癌を有する。一態様において、個体は、表面に高レベルのＨＥＲ２タンパク質を発現する腫瘍細胞によって特徴付けられる癌を有する。一態様において、個体は、尿路上皮癌、適宜、進行性再発性もしくは転移性尿路上皮癌、乳癌、ＴＮＢＣ、非小細胞肺癌、膵癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮癌腫または食道癌を有する。一態様において、個体は、化学療法剤、適宜、Ｐ－糖タンパク質（Ｐｇｐ）によって輸送される化学療法剤、プラチナ剤またはタキサンを用いた前処置を受けたことがある、および／またはその前処置の後に進行した癌を有する。
定義
本明細書において使用される場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つまたは複数を意味する場合がある。特許請求の範囲において使用される場合において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語と共に使用される場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という単語は、１つまたは２つ以上を意味する場合がある。本明細書において使用される場合、「別の」は、少なくとも第２のもの、またはそれ以降のものを意味する場合がある。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、これは、適宜、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」と置き換えることができる。
「ネクチン－４」および「ネクチン－４ポリペプチド」とは、ＮＥＣＴＩＮ４遺伝子（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ９６ＮＹ８を参照されたい）によって、またはそのような遺伝子から調製されたｃＤＮＡによってコードされているタンパク質またはポリペプチドを指す。任意の天然に存在するアイソフォーム、アレルまたは変異体がネクチン－４ポリペプチドという用語に包含される（例えば、配列番号１に対して、またはその少なくとも１００、２００、３００、４００もしくは５００のアミノ酸残基の連続する配列に対して９５％、９８％または９９％同一のネクチン－４ポリペプチド）。３１アミノ酸シグナルペプチドを含む標準ヒトネクチン－４（アイソフォーム１）の５１０アミノ酸残基配列は、以下の通りに示される：
MPLSLGAEMW GPEAWLLLLL LLASFTGRCP AGELETSDVV TVVLGQDAKL
PCFYRGDSGE QVGQVAWARV DAGEGAQELA LLHSKYGLHV SPAYEGRVEQ
PPPPRNPLDG SVLLRNAVQA DEGEYECRVS TFPAGSFQAR LRLRVLVPPL
PSLNPGPALE EGQGLTLAAS CTAEGSPAPS VTWDTEVKGT TSSRSFKHSR
SAAVTSEFHL VPSRSMNGQP LTCVVSHPGL LQDQRITHIL HVSFLAEASV
RGLEDQNLWH IGREGAMLKC LSEGQPPPSY NWTRLDGPLP SGVRVDGDTL
GFPPLTTEHS GIYVCHVSNE FSSRDSQVTV DVLDPQEDSG KQVDLVSASV
VVVGVIAALL FCLLVVVVVL MSRYHRRKAQ QMTQKYEEEL TLTRENSIRR
LHSHHTDPRS QPEESVGLRA EGHPDSLKDN SSCSVMSEEP EGRSYSTLTT
VREIETQTEL LSPGSGRAEE EEDQDEGIKQ AMNHFVQENG TLRAKPTGNG
IYINGRGHLV（配列番号１）
配列番号１はＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ識別子Ｑ９６ＮＹ８－１に対応し、その開示は参照によって本明細書に組み込まれる。
本開示のある特定の態様は、ヒトネクチン－４、またはその相同体、例えば限定されないが、他の種、例えば非ヒト霊長類、カニクイザル（ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）由来の哺乳動物ネクチン－４タンパク質およびネクチン－４オルソログに結合する抗ネクチン－４抗体を提供する。
「ＨＥＲ２」（ＨＥＲ２／ｎｅｕおよびＥｒｂＢ－２としても公知）という用語は、「ヒト上皮成長因子受容体２」を表す。この用語にはＨＥＲ２の変異体およびアイソフォームが含まれる。
「イムノコンジュゲート」および「抗体コンジュゲート」という用語は、交換可能に使用され、抗原結合剤、例えば、ポリペプチドと結合している抗体、または別の分子（例えば、カンプトテシン誘導体、エキサテカン分子、ＳＮ－３８分子）にコンジュゲートしている抗体を指す。イムノコンジュゲートが治療剤、例えば、細胞毒性剤または抗癌剤にコンジュゲートしている抗原結合剤を含む場合、イムノコンジュゲートは「抗体薬物コンジュゲート」または「ＡＤＣ」と称すこともできる。細胞毒性剤の例としては、カンプトテシン類、タキサン類、アントラサイクリン類、カンプトテシン類、エポチロン類、マイトマイシン類、コンブレタスタチン類、ビンカアルカロイド類、ナイトロジェンマスタード類、メイタンシノイド類、カリケアミシン類（ｃａｌｉｃｈｅａｍｙｃｉｎｓ）、デュオカルマイシン類、ツブリシン類、ドラスタチン類およびアウリスタチン類、エンジイン類、ピロロベンゾジアゼピン類、ならびにエチレンイミン類が挙げられる。
本明細書において使用される場合、「処置」および「処置すること」などは、全般に、所望の薬理学的および生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾患、その症状もしくは状態を予防もしくは部分的に予防するという点において予防的であり得る、および／または疾患、疾患に起因する状態、症状もしくは有害作用の部分的もしくは完全な治療という点において治療的であり得る。「処置」という用語は、本明細書において使用される場合、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のあらゆる処置を包含し、（ａ）疾患の素因を有し得るが依然として疾患を有すると診断されていない対象において、疾患の発生を予防すること、例えば予防的早期無症候性介入（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ｅａｒｌｙ ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）、（ｂ）疾患を阻害すること、例えば、その発症を阻止すること、あるいは疾患を緩和すること、例えば、疾患を有すると診断された対象などにおいて、疾患および／またはその症状もしくは状態の退行、例えば損傷の改善または治療を引き起こすことを含む。適宜、処置は、腫瘍負荷の減少、病変のサイズおよび／もしくは数の減少、癌の進行の減少もしくは遅延（例えば、無憎悪生存期間の増加）、癌転移の遅延もしくは予防、ならびに／または生存の増加を引き起こしてもよい（例えばそれを引き起こす方法として特徴付けられてもよい）。適宜、処置は、例えばＲＥＣＩＳＴ基準であってもよい標準的な基準に従って、対象において安定疾患、部分奏効または完全奏効を引き起こすかまたはもたらしてもよい（例えばそれを引き起こすかまたはもたらす方法として特徴付けられてもよい）。
「癌の処置」などがネクチン－４結合剤（例えば抗体または抗体断片）に関連して言及される場合は常に、
（ａ）癌の処置の方法であって、ネクチン－４結合剤を、癌の処置を可能にする用量（治療有効量）、適宜、本明細書において規定される用量（量）において、そのような処置を必要とする個体、哺乳動物、とりわけヒトに投与する工程（少なくとも１つの処置のため）を含む方法、
（ｂ）癌の処置のためのネクチン－４結合剤の使用、
（ｃ）癌の処置（とりわけヒトにおける）における使用のためのネクチン－４結合剤、
（ｄ）癌の処置のための医薬調製物の製造のためのネクチン－４結合剤の使用、
（ｅ）癌の処置のための医薬調製物の製造のためにネクチン－４結合剤を使用する方法であって、ネクチン－４結合剤を薬学的に許容される担体と混和することを含む方法、
（ｆ）癌の処置に適切な有効用量のネクチン－４結合剤を含む医薬調製物、
（ｇ）本願が出願される国における特許取得が可能な主題に応じた、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）の任意の組合せ
が含まれる。
「生検」という用語は、本明細書において使用される場合、診断を確立するためなどの検査を目的とした組織の除去として定義される。生検の種類の例としては、例えばシリンジに取り付けられた針による吸引の適用；器具による組織の断片の除去；内視鏡を介した適切な器具を用いる除去；例えば全病変の外科的切除などが挙げられる。
「抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を指す。重鎖における定常ドメインの種類に応じて、抗体は５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのうちの１つに割り当てられる。これらのうちのいくつかは、サブクラスまたはアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などにさらに分けられる。例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）とを有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識を担う約１００～１１０アミノ酸以上の可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、「アルファ」、「デルタ」、「イプシロン」、「ガンマ」および「ミュー」と称される。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および３次元配置は周知である。ＩｇＧは、生理学的状況において最も一般的な抗体であり、実験室環境において最も容易に作製されるため、本明細書において用いられる抗体の例示的なクラスである。抗体はモノクローナル抗体であってもよい。抗体の特定の例は、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、またはそれ以外のヒトに好適な抗体である。「抗体」にはまた、本明細書に記載される抗体のいずれかの任意の断片または誘導体が含まれる。
抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基は、超可変領域と称されることもある。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」もしくは「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基［例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、および８９～９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、および９５～１０２（Ｈ３）；Kabat et al. 1991］、ならびに／または「超可変ループ」由来のアミノ酸残基［例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、および９１～９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、および９６～１０１（Ｈ３）；Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917］、または抗原結合を担う必須アミノ酸を決定するための類似したシステムを含む。典型的には、この領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、前出のKabat et al.に記載されている方法によって実施される。本明細書における「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔにおける可変ドメイン残基番号付け」および「Ｋａｂａｔによる」などの語句は、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに対するこの番号付けシステムを指す。Ｋａｂａｔ番号付けシステムを使用する場合、ペプチドの実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮またはそれへの挿入に対応する、より少ないまたは追加のアミノ酸を含有していてもよい。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）、および重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含んでいてもよい。残基のＫａｂａｔ番号付けは、所与の抗体について、「標準」Ｋａｂａｔ番号付け配列を有する抗体の配列の相同性の領域におけるアラインメントによって決定することができる。
「に特異的に結合する」という用語は、タンパク質の組換え形態、そこにおけるエピトープ、または単離された標的細胞の表面に存在する天然タンパク質のいずれかを使用して評価される場合に、抗体が、好ましくは競合結合アッセイにおいて、結合相手、例えばネクチン－４に結合することができることを意味する。競合結合アッセイおよび特異的結合を判定するための他の方法は当技術分野において周知である。例えば、結合は、放射性標識、質量分析などの物理的方法、または例えば細胞蛍光分析（例えばＦＡＣＳｃａｎ）を使用して検出される直接もしくは間接蛍光標識を介して検出することができる。対照、すなわち非特異的薬剤を用いた場合に見られる量を超える結合は、薬剤が標的に結合することを示す。
抗体が特定のモノクローナル抗体「と競合する」と表現される場合、これは、組換え分子（例えば、ネクチン－４）または表面発現分子（例えば、ネクチン－４）のいずれかを使用する結合アッセイにおいて、抗体がモノクローナル抗体と競合することを意味する。例えば、結合アッセイにおいて、試験抗体が、配列番号６または２４のいずれかの重鎖可変領域と配列番号７または２５のそれぞれの軽鎖可変領域とを有する抗体の、ネクチン－４ポリペプチドまたはネクチン－４発現細胞への結合を低下させる場合、試験抗体は、それぞれそのような抗体と「競合する」と表現される。
「内在化」という用語は、「細胞内内在化」と交換可能に使用され、分子を細胞の細胞外表面から細胞の細胞内表面へ移動させるプロセスと関連する分子的、生化学的および細胞的事象を指す。分子の細胞内内在化を担うプロセスは周知であり、とりわけ、細胞外分子（例えばホルモン、抗体、および有機小分子）；膜関連分子（例えば細胞表面受容体）；および細胞外分子に結合した膜関連分子の複合体（例えば、膜貫通受容体に結合したリガンドまたは膜関連分子に結合した抗体）の内在化を伴い得る。したがって、「内在化を誘導および／または増加すること」は、細胞内内在化が開始される、ならびに／または細胞内内在化の速度および／もしくは程度が増加する事象を含む。
「親和性」という用語は、本明細書において使用される場合、抗体のエピトープへの結合の強度を意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ－Ａｇ］として定義される解離定数Ｋｄによって示され、ここで、［Ａｂ－Ａｇ］は抗体－抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は非結合抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は非結合抗原のモル濃度である。親和性定数Ｋａは、１／Ｋｄによって定義される。モノクローナル抗体の親和性を決定するための方法は、Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)、Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)、およびMuller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)に見出すことができ、これらの参考文献は全体が参照によって本明細書に組み込まれる。モノクローナル抗体の親和性を決定するための当技術分野において周知の標準的な方法の１つは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング（例えばＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置を用いた分析による）の使用である。
本明細書の文脈において、「決定基」とは、ポリペプチドにおける相互作用または結合の部位を示す。
「エピトープ」という用語は、抗原決定基を指し、抗体が結合する抗原の場所または領域である。タンパク質エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基、および特異的抗原結合抗体またはペプチドによって効果的にブロックされるアミノ酸残基、すなわち、抗体の「フットプリント」内のアミノ酸残基を含み得る。エピトープは、例えば抗体または受容体と結び付くことができる、複合体抗原分子における最も単純な形態または最も小さい構造部分である。エピトープは線状エピトープであっても立体構造／構造エピトープであってもよい。「線状エピトープ」という用語は、アミノ酸の線状配列において連続しているアミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される（一次構造）。「立体構造または構造エピトープ」という用語は、全てが連続しているわけではなく、したがって分子のフォールディングによって互いに近接している、アミノ酸の線状配列の分離した部分を表すアミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される（二次、三次および／または四次構造）。立体構造エピトープは３次元構造に依存する。したがって、「立体構造」という用語は、多くの場合「構造」と交換可能に使用される。
「薬剤」という用語は、本明細書において、化学化合物、化学化合物の混合物、生体高分子、または生物学的材料から作製される抽出物を表すために使用される。「治療剤」という用語は、生物活性を有する薬剤を指す。
「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ部分」、および「Ｆｃ領域」という用語は、例えばヒトγ（ガンマ）重鎖の約アミノ酸（ａａ）２３０～約ａａ４５０もしくは他の種類の抗体重鎖（例えば、ヒト抗体のα、δ、εおよびμ）におけるその対応配列に由来する抗体重鎖のＣ末端断片、またはその天然に存在するアロタイプを指す。別段の規定がない限り、免疫グロブリンについて一般的に認められているＫａｂａｔアミノ酸番号付けが本開示の全体にわたって使用される（Kabat et al. (1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, 5th ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MDを参照されたい）。
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基とは、本明細書において使用される場合、抗体可変ドメインの、ＣＤＲとして定義される領域を除いた領域を意味する。各抗体可変ドメインフレームワークは、ＣＤＲによって分離されている連続する領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）にさらに細分することができる。
「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」という用語は、天然状態において見出されるような物質に通常伴う構成成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を指す。純度および均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技法を使用して決定される。調製物に存在する主要な種であるタンパク質は実質的に精製されている。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。
「組換え」という用語は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関連して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入、または天然核酸もしくはタンパク質の変更によって改変されていること、あるいは細胞がそのように改変された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）形態においては見出されない遺伝子を発現するか、または他の場合では異常に発現するか、過小発現するかもしくは全く発現しない天然遺伝子を発現する。
本明細書の文脈において、ポリペプチドまたはエピトープと「結合」する抗体という用語は、特異性および／または親和性により前記決定基と結合する抗体を示す。
「同一性」または「同一」という用語は、２つ以上のポリペプチドの配列間の関係において使用される場合、２つ以上のアミノ酸残基の文字列間の一致の数によって決定される、ポリペプチド間の配列関連性の程度を指す。「同一性」は、特定の数理モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって処理される、ギャップアライメント（存在する場合）を伴う２つ以上の配列のうちのより小さいものとの間の完全な一致のパーセントを測定する。関連するポリペプチドの同一性は、公知の方法によって容易に算出することができる。そのような方法としては、これらに限定されないが、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988、Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993、Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994、Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987、Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991、およびCarillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)に記載されているものが挙げられる。
同一性を決定するための方法は、試験される配列間における最大の一致を示すように設計される。同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するためのコンピュータプログラム法としては、ＧＡＰ（Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984)；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）を含むＧＣＧプログラムパッケージ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410(1990)）が挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、米国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）および他の供給元（BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894、Altschul et al.、前出）から公開されている。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用することができる。
本明細書において使用される場合、「アルキル」とは、完全に飽和した（二重結合も三重結合も含まない）炭化水素基を含む直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指す。アルキル基は、例えば、１～２０個の炭素原子を有し得る（本明細書において表される場合は常に、「１～２０」などの数値範囲は所与の範囲における各整数を指し、例えば、「１～２０個の炭素原子」は、アルキル基が、１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子などから最大２０個までの炭素原子からなり得ることを意味するが、本定義は、数値範囲が指定されていない「アルキル」という用語の出現も包含する）。化合物のアルキル基は、「Ｃ１～Ｃ４アルキル」または同様の名称として示すことができる。単に例として、「Ｃ１～Ｃ４アルキル」は、１～４個の炭素原子がアルキル鎖に存在すること、すなわち、アルキル鎖が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、およびｔ－ブチルから選択されることを示す。典型的なアルキル基としては、決してこれらに限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第三級ブチル、ペンチルおよびヘキシルが挙げられる。アルキル基は、置換されていてもされていなくてもよい。
本明細書において使用される場合、「ヘテロアルキル」という用語は、１個または複数のヘテロ原子、すなわち、１個または複数の炭素原子の代わりに炭素以外の元素（酸素、硫黄、窒素、リンを含むがこれらに限定されない）を含有する直鎖または分岐鎖のアルキル基を指す。
ある基が「置換」されていると記載される場合は常に、その基は、示された置換基のうちの１つまたは複数により置換されている。置換基が示されていない場合は、示された「置換」されている基が、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、（ヘテロアリシクリル）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、シアノ、ハロゲン、チオカルボニル、カルバミル、チオカルバミル、アミド、スルホンアミド、スルホンアミド、カルボキシ、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、ニトロ、シリル、スルフェニル、スルフィニル、スルホニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、トリハロメタンスルホニル、トリハロメタンスルホンアミド、アミノ、一置換アミノ基および二置換アミノ基、ならびにそれらの保護された誘導体から個々にかつ独立的に選択される１つまたは複数の基により置換されている場合があることを意味する。
置換基の数が規定されていない場合（例えばハロアルキル）、１つまたは複数の置換基が存在し得る。例えば「ハロアルキル」は、１つまたは複数の同じかまたは異なるハロゲンを含み得る。別の例として、「Ｃ１～Ｃ３アルコキシフェニル」は、１、２または３個の原子を含有する１つまたは複数の同じかまたは異なるアルコキシ基を含み得る。
特定の番号を有する「化合物」または「式」（例えば「化合物１」、「化合物２」、「式Ｉ」または「式ＩＩ」）への言及は、文脈上別段の指示が明確にない限り、特定の番号を有する化合物または式に由来する全ての化合物を示す。例えば、化合物１は化合物１ａおよび１ｂへの言及を含む。
ネクチン－４結合抗体および抗体断片
超可変領域、重鎖および軽鎖ＣＤＲ、重鎖および軽鎖可変領域、ならびにそれらを含む抗体、例えば、全長抗体または抗体断片は、細胞、例えば、腫瘍細胞の表面に発現しているヒトネクチン－４と結合し得る。一実施形態において、抗体によるネクチン－４結合は、単一の抗原結合ドメインまたは２つの同一の抗原結合ドメインによって媒介され、ここで、各抗原結合ドメインは、ＶＨおよびＶＬドメイン対または単一可変ドメイン（例えばｓｄＡｂ）を含んでもよい。
ネクチン－４発現腫瘍細胞の排除のための療法において、イムノコンジュゲートまたは非コンジュゲート（「裸の」）抗体（例えば別個に投与される細胞毒性剤と組み合わせてもよい）のいずれかとして使用される場合、ネクチン－４結合抗体（例えば全長抗体、抗体断片）またはそのような抗体を含むタンパク質、コンジュゲートもしくは複合体は、例えば、ネクチン－４発現細胞の細胞クラスター形成を評価することによって（例えば、３次元細胞培養系において、腫瘍スフェロイド形成もしくは成長を評価することによって）および／またはネクチン－４発現細胞の足場非依存性増殖を評価することによって判定して、ネクチン－４によって媒介される細胞－細胞相互作用を有利に阻害し得る。ネクチン－４発現腫瘍細胞の排除のための療法において、細胞毒性剤を有するイムノコンジュゲートまたは別個に投与される細胞毒性剤と組み合わされる非コンジュゲート（「裸の」）抗体のいずれかとして使用される場合、ネクチン－４結合抗体は、有利には、腫瘍を細胞毒性剤に対して感作することができ得る、例えば抗体は、細胞毒性剤の、腫瘍細胞の増殖を阻害するかもしくは死を引き起こす能力、例えばクラスター（例えばスフェロイド）の腫瘍細胞の増殖を阻害するかもしくは死を引き起こす能力、または腫瘍細胞クラスター（例えばスフェロイド）の形成もしくは成長を阻害する能力を増強し得る。ネクチン－４発現腫瘍細胞の排除のための療法において、イムノコンジュゲートとして使用される場合、抗ネクチン－４イムノコンジュゲートは、本明細書に開示される細胞毒性分子にコンジュゲートしている場合、有利には、ネクチン－４発現腫瘍細胞の死を引き起こすことができる。
Ｐｇｐを発現する腫瘍細胞は、ある特定の細胞毒性剤に対して低下した感受性を有し得る。抗体および細胞毒性剤（細胞毒性剤が抗体にコンジュゲートしているか否かにかかわらず）は、適宜、Ｐｇｐを発現する細胞（例えば腫瘍細胞）を使用して試験することができる。
腫瘍スフェロイドは、部分的にはその構造によって付与される保護のために、さらにはより遅い増殖速度のために、一般に化学療法に対する感受性がより低く、結果的に抗体またはイムノコンジュゲートの抗腫瘍効果を評価するのに有用であり得る。抗体またはイムノコンジュゲートは、スフェロイド形成を濃度依存的に阻害する能力、または癌細胞のスフェロイド形成を妨げる能力について試験することができる。抗体またはイムノコンジュゲートは、例えば、リアルタイムデジタル写真術を使用して、異なる癌細胞株においてスフェロイド形成を変更する能力について試験することができる。
抗体またはイムノコンジュゲートは、例えば、癌細胞を単一細胞として維持する（かまたはその維持を向上させる）ことができると特徴付けることができ、それによって、細胞は細胞毒性剤（例えば化学療法）に対してより感受性となり得る。化学療法に対する感受性を向上させる癌細胞の単一細胞としての維持の促進は、抗体またはイムノコンジュゲートの存在下において、異なる化学療法剤（例えば、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎｅ）、シスプラチン、パクリタキセル、カンプトテシンまたはカンプトテシンアナログ（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ ａｎａｌｏｇ））を異なる濃度において別個にまたは組み合わせて添加することによって、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において試験することができ、さらにＩｇ様ＶドメインまたはＩｇ様Ｃ２型１もしくは２ドメインに単独で結合する抗体またはイムノコンジュゲートと比較してもよい。化学療法に対する感受性を向上させる癌細胞の単一細胞としての維持はまた、例えば、異なる毒素を有する、ネクチン－４の異なるドメインを標的とする異なるイムノコンジュゲートを添加することによって、インビトロにおいて試験することができ、ここで、抗体がネクチン－４のＶＣ１ドメインに結合する化学療法もしくはＡＤＣのＩＣ５０は低くなるか、または抗体がネクチン－４のＶＣ１ドメインと結合するＡＤＣの、腫瘍成長を制御するために使用される用量は低くなる。化学療法に対する感受性は、細胞生存性、細胞増殖性または細胞毒性として評価することができ、例えば発光によるＣＴＧ、Ｉｎｃｕｃｙｔｅまたはカスパーゼ３／７またはアネキシンＶを使用したコンフルエンスなどの異なる読み出しを使用してモニタリングすることができる。一実施形態において、抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、野生型ヒトネクチン－４ポリペプチド、例えば配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに配列番号３２のアミノ酸配列を有する改変ヒトネクチン－４ポリペプチド（Ｉｇ様Ｃ２型１および２ドメインを含有するがＩｇ様Ｖ型ドメインを欠いているネクチン－４タンパク質に結合する。抗体は、Ｉｇ様Ｖ型ドメインを欠いているポリペプチドへの部分的結合を保持してもよく、抗体は、Ｉｇ様Ｖ型ドメインを欠いているネクチン－４タンパク質への結合を、野生型ネクチン－４タンパク質への結合と比較して低下したレベルにおいて保持してもよく、例えば低下したレベルは、野生型ネクチン－４への結合の５～５０％、適宜５～３０％、適宜５～２５％、適宜５～１５％の間である。さらに、抗ネクチン－４抗体は、Ｉｇ様Ｖ型ドメインとＩｇ様Ｃ２型１ドメインの両方を欠いているネクチン－４ポリペプチド、例えば、配列番号３３のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合しなくてもよい。結合は、ネクチン－４ポリペプチドを発現するように作製された細胞を使用してフローサイトメトリーによって評価し、蛍光強度レベル（例えばＭＦＩ）が決定されてもよい。
一実施形態において、抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、ヒトネクチン１タンパク質、ヒトネクチン２タンパク質、ヒトネクチン３タンパク質およびヒトＰＶＲタンパク質のいずれにも結合しない。それぞれのネクチンまたはＰＶＲタンパク質は、細胞の表面に発現するものとして規定することができる。
一実施形態において、抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、
配列番号１のアミノ酸配列を有するネクチン－４ポリペプチド、および
配列番号３２のアミノ酸配列を有するネクチン－４ポリペプチド（配列番号１への結合と比較して低下したレベル、適宜５～５０％の間のレベルであってもよい）
と結合し、抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、
配列番号３７のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
配列番号３８のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
配列番号３９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
配列番号４０のアミノ酸配列を有するポリペプチド
のいずれとも結合しない。
さらに、抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、配列番号３３のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合しなくてもよい。
さらに、抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、ラットネクチン－４ポリペプチド（例えば配列番号３５のアミノ酸配列）と結合してもよい。
一実施形態において、抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、ネクチン－４のＶＣ１架橋ドメイン、エピトープまたは決定基に結合する。
一実施形態において、抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、Ａ７２、Ｇ７３、Ｓ１９５、Ｋ１９７、Ｓ１９９、Ｌ１５０、Ｓ１５２、Ｑ２３４およびＩ２３６（配列番号１に準拠）からなる群から選択される１、２、３、４または５つ以上の残基においてヒトネクチン－４に結合する。一実施形態において、抗ネクチン－４抗原結合タンパク質または抗体は、Ｋ１９７、Ｓ１９９およびＱ２３４からなる群から選択される１、２または３つの残基、適宜、残基Ｋ１９７および／またはＳ１９９においてヒトネクチン－４に結合する。一実施形態において、抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、ヒトネクチン－４の残基Ｋ１９７に結合する。一実施形態において、抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、ヒトネクチン－４の残基Ｓ１９９に結合する。一実施形態において、抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、ヒトネクチン－４の残基Ｑ２３４に結合する。結合は、例えば、前記残基が異なる残基によって置換されている突然変異型ネクチン－４ポリペプチド（例えば細胞の表面に発現している）への結合の低減または喪失を抗体または抗体断片が有しているか否かを評価することによって判定することができる。
一実施形態において、抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、Ｉｇ様Ｖ型ドメインとＩｇ様Ｃ２型１ドメインの両方、例えばＩｇ様Ｖ型ドメイン上の決定基またはエピトープとＩｇ様Ｃ２型１ドメイン上の決定基またはエピトープとに結合することができる。
一実施形態において、抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、Ｉｇ様Ｃ２型１ドメインを含むがＩｇ様Ｖ型ドメインを欠いている改変ネクチン－４ポリペプチド、例えば配列番号３のアミノ酸配列の全部または一部を欠いているネクチン－４ポリペプチドへの少なくとも部分的な結合を保持する。部分的結合は、結合を保持するが、配列番号１の残基のアミノ酸配列を有する野生型ヒトネクチン－４ポリペプチドへの結合と比較して低下したレベル（例えばフローサイトメトリーによって評価される）において保持することとして特徴付けることができる。ネクチン－４ポリペプチドは、細胞（例えば、ポリペプチドを発現するように作製された宿主細胞）の表面に発現するものとして規定することができる。
抗体は、当技術分野において公知の様々な技法によって製造することができる。典型的には、抗体は、ネクチン－４ポリペプチド、好ましくはヒトネクチン－４ポリペプチドを含む免疫原を用いた非ヒト動物、好ましくはマウスの免疫化によって製造される。ネクチン－４ポリペプチドは、ヒトネクチン－４ポリペプチドの全長配列、またはその断片もしくは誘導体、典型的には免疫原性断片、すなわち、ネクチン－４ポリペプチドを発現する細胞の表面に露出するエピトープ、例えば５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂもしくは６Ａ７抗体によって認識されるエピトープを含むポリペプチドの一部分を含み得る。ネクチン－４ポリペプチドは、ＶＣ１架橋ドメインまたはその断片もしくは部分配列を含むかまたはそれからなると規定することができる。そのような断片は、典型的には、成熟ポリペプチド配列の少なくとも約７つの連続的なアミノ酸、より一層好ましくはその少なくとも約１０の連続的なアミノ酸を含有する。断片は、典型的には、受容体の細胞外ドメインに本質的に由来する。一実施形態において、免疫原は、脂質膜、典型的には細胞の表面における野生型ヒトネクチン－４ポリペプチドを含む。具体的な実施形態において、免疫原は、処理または溶解されていてもよい無傷細胞、特に無傷ヒト細胞を含む。別の好ましい実施形態において、ポリペプチドは組換えネクチン－４ポリペプチドである。具体的な実施形態において、免疫原は無傷ネクチン－４発現細胞を含む。
抗原を用いて非ヒト哺乳動物を免疫化する工程は、マウスにおける抗体の産生を刺激するための、当技術分野において周知の任意の方式において実行することができる（例えば、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれるE. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)を参照されたい）。
抗体は、例えば（その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれるWard et al. Nature, 341 (1989) p. 544）に開示されているような、免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリーの選択によっても製造することができる。
ネクチン－４への結合に関してモノクローナル抗体５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７と競合する１つまたは複数の抗体の同定は、抗体の競合が評価可能な様々な免疫学的スクリーニングアッセイのいずれか１つを使用して容易に決定することができる。多くのそのようなアッセイは慣例的に実施され、当技術分野において周知である（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，６６０，８２７号を参照されたい）。
例えば、検査される試験抗体が、異なる供給源動物から得られるか、またはさらには異なるＩｇアイソタイプのものである場合、対照（例えば、５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７）と試験抗体とを混和し（または予め吸着させ）、ネクチン－４ポリペプチドを含有する試料に適用する単純競合アッセイが用いられてもよい。ウェスタンブロッティング、および表面プラズモン共鳴（例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標））分析の使用に基づくプロトコルは、そのような競合研究における使用に好適である。
ある特定の実施形態において、ネクチン－４抗原試料に適用する前に、対照抗体（例えば、５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７）を様々な量の試験抗体と（例えば、約１：１０または約１：１００）、一定の期間予め混合する。他の実施形態において、対照と様々な量の試験抗体とは、ネクチン－４抗原試料への曝露中に簡素に混和することができる。結合抗体と遊離抗体とを（例えば、非結合抗体を排除する分離または洗浄技法を使用することによって）、５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７と試験抗体とを（例えば、種特異的もしくはアイソタイプ特異的二次抗体を使用することによって、または検出可能な標識を用いて５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂもしくは６Ａ７を特異的に標識することによって）識別することができる限り、試験抗体が５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７の抗原への結合を低下させるか否かを判定することができる。完全に無関係な抗体の非存在下における（標識）対照抗体の結合は、高い対照値として機能し得る。低い対照値は、標識（５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７）抗体を全く同じ種類（５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７）の非標識抗体と共にインキュベートすることによって得ることができ、ここで、競合が生じ、標識抗体の結合を低下させ得る。試験抗体は、例えば、５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７：試験抗体の約１：１０～約１：１００の間の任意の比において、５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７のネクチン－４抗原への結合を少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、またはより好ましくは少なくとも約８０％もしくは９０％（例えば、約６５～１００％）低下させ得る。そのような試験抗体は、５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７のネクチン－４抗原への結合を少なくとも約９０％（例えば、約９５％）低下させてもよい。
競合は、例えばフローサイトメトリー試験によっても評価することができる。そのような試験において、所与のネクチン－４ポリペプチドを有する細胞は、初めに例えば５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７と共に、次いで蛍光色素またはビオチンを用いて標識された試験抗体と共にインキュベートされ得る。飽和量の５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７とのプレインキュベーションをした場合に得られた結合が、５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７とのプレインキュベーションをしていない抗体によって得られた結合の約８０％、好ましくは約５０％、約４０％以下（例えば、約３０％、２０％または１０％）である場合（蛍光の平均によって測定される）、抗体は５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７と競合すると表現される。あるいは、飽和量の試験抗体と共にプレインキュベートした細胞に対する、標識５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７抗体（蛍光色素またはビオチンによる）を用いて得られた結合が、試験抗体とのプレインキュベーションをしていない場合に得られた結合の約８０％、好ましくは約５０％、約４０％以下（例えば、約３０％、２０％または１０％）である場合、抗体は５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７と競合すると表現される。
試験抗体を予め吸着させ、飽和濃度においてネクチン－４抗原が固定化されている表面に適用する単純競合アッセイもまた用いることができる。単純競合アッセイにおける表面は、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ（商標）チップ（または表面プラズモン共鳴分析に好適な他の媒体）である。ここにおいて、対照抗体（例えば、５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７）をネクチン－４飽和濃度の表面と接触させ、ネクチン－４および対照抗体の表面結合を測定する。対照抗体のこの結合を、試験抗体の非存在下における対照抗体のネクチン－４含有表面への結合と比較する。試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下での対照抗体によるネクチン－４含有表面の結合の有意な低下は、試験抗体が対照抗体と実質的に同じネクチン－４の領域を認識し、その結果、試験抗体が対照抗体と「交差反応」することを示す。試験抗体は、例えば、対照（例えば５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７）抗体のネクチン－４抗原への結合を少なくとも約３０％以上、好ましくは約４０％低下させ得る。そのような試験抗体は、対照抗体（例えば、５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７）のネクチン－４抗原への結合を少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％以上）低下させてもよい。対照および試験抗体の順序は逆でもよい、すなわち、対照抗体を初めに表面に結合させ、その後、試験抗体を競合アッセイにおいて表面と接触させてもよいことは理解されるだろう。第２の抗体について見られる結合の低減（抗体が交差反応していると仮定する）がより大きくなることが予期されるため、好ましくは、ネクチン－４抗原に対してより高い親和性を有する抗体を初めに表面に結合させる。そのようなアッセイのさらなる例は、例えば、その開示が参照によって本明細書に組み込まれるSaunal (1995) J. Immunol. Methods 183: 33-41に提供されている。
抗体は、ネクチン－４陽性腫瘍細胞によって特徴付けられる癌を有する単数または複数の個体、すなわち、抗ネクチン－４抗体を使用する本明細書に記載される方法のうちの１つを用いる処置の候補である個体由来のネクチン－４発現腫瘍細胞に結合し得る。したがって、細胞のネクチン－４を特異的に認識する抗体が得られたら、それは、適宜、ネクチン－４陽性細胞（例えば、癌細胞）に結合する能力について試験されてもよい。それは、適宜、表面に高レベルのネクチン－４ポリペプチドを発現する腫瘍細胞、および／または表面に低レベルのネクチン－４ポリペプチドを発現する腫瘍細胞に結合する能力について試験されてもよい。特に、本抗体のうちの１つを用いて患者を処置する前に、療法が患者に有益となる可能性を最大化するために、適宜、抗体の、例えば血液試料または腫瘍生検において患者から取得した悪性細胞と結合する能力を試験してもよい。
一実施形態において、抗体は、ネクチン－４発現細胞、例えば、悪性細胞に結合する能力を試験するイムノアッセイにおいて検証される。例えば、血液試料または腫瘍生検が実施され、腫瘍細胞が採取される。次いで、所与の抗体の細胞に結合する能力が、当業者に周知の標準的な方法を使用して評価される。抗体の細胞への結合を評価するために、抗体は直接または間接的に標識されてもよい。間接的に標識される場合、二次標識抗体が典型的には添加される。
抗体がエピトープ領域内に結合するか否かの判定は、当業者に公知の手段において実行することができる。そのようなマッピング／特性評価法の一例として、抗ネクチン－４抗体に対するエピトープ領域は、ネクチン－４タンパク質における露出したアミン／カルボキシルの化学改変を使用するエピトープ「フットプリンティング」によって決定することができる。そのようなフットプリンティング技法の具体例の１つは、受容体およびリガンドタンパク質アミドプロトンの水素／重水素交換、結合、および逆交換が行われ、タンパク質結合に関与する骨格アミド基は逆交換から保護され、したがって重水素化されたままとなるＨＸＭＳ（質量分析によって検出される水素－重水素交換）の使用である。この段階において、関連領域は、消化性タンパク質分解、ファストマイクロボア（ｆａｓｔ ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ）高速液体クロマトグラフィー分離、および／またはエレクトロスプレーイオン化質量分析によって同定することができる。例えば、Ehring H, Analytical Biochemistry, Vol. 267 (2) pp. 252-259 (1999)、Engen, J. R. and Smith, D. L. (2001) Anal. Chem. 73, 256fA-265Aを参照されたい。好適なエピトープ同定技法の別の例は、遊離抗原および抗体などの抗原結合ペプチドと複合体を形成した抗原の２次元ＮＭＲスペクトルにおけるシグナルの位置が典型的には比較される核磁気共鳴エピトープマッピング（ＮＭＲ）である。抗原は、典型的には、１５Ｎを用いて選択的に同位体標識され、その結果、抗原に対応するシグナルのみがＮＭＲスペクトルにおいて見られ、抗原結合ペプチド由来のシグナルはＮＭＲスペクトルにおいて見られない。抗原結合ペプチドとの相互作用に関与するアミノ酸を起源とする抗原シグナルは、典型的には、複合体のスペクトルの位置を遊離抗原のスペクトルと比較してシフトさせ、結合に関与するアミノ酸はそのように同定することができる。例えば、Ernst Schering Res Found Workshop. 2004; (44): 149-67、Huang et al., Journal of Molecular Biology, Vol. 281 (1) pp. 61-67 (1998)、およびSaito and Patterson, Methods, 1996 Jun; 9 (3): 516-24を参照されたい。
エピトープマッピング／特性評価は、質量分析法を使用して実施することもできる。例えば、Downard, J Mass Spectrom. 2000 Apr ;35 (4): 493-503およびKiselar and Downard, Anal Chem. 1999 May 1;71 (9): 1792-1801を参照されたい。プロテアーゼ消化技法もまた、エピトープマッピングおよび同定の文脈において有用であり得る。抗原決定基関連領域／配列は、例えば、ネクチン－４に対して約１：５０の比においてトリプシンを使用することまたはｐＨ７～８における一晩の消化によるプロテアーゼ消化と、それに続くペプチド同定のための質量分析（ＭＳ）による分析とによって決定することができる。その後、抗ネクチン－４結合剤によってトリプシン切断から保護されたペプチドは、トリプシン消化に供された試料と、抗体と共にインキュベートした後で例えばトリプシンによる消化に供された試料との比較によって同定することができる（それによって結合剤に対するフットプリントを明らかにする）。他の酵素、例えばキモトリプシン、ペプシンなどは、さらにまたは代替的に、同様のエピトープ特性評価法において使用することができる。さらに、酵素消化は、潜在的な抗原決定基配列が、表面露出していない、したがって、免疫原性／抗原性の点で関連していない可能性が最も高いネクチン－４ポリペプチドの領域内に存在するか否かを分析するための迅速な方法を提供することができる。
部位特異的突然変異導入は、結合エピトープの解明に有用な別の技法である。例えば、「アラニンスキャニング」において、タンパク質セグメント内の各残基は、アラニン残基に置き換えられ、結合親和性についての結果が測定される。突然変異が結合親和性の有意な低下を引き起こす場合、その突然変異は結合に関与している可能性が最も高い。構造エピトープに特異的なモノクローナル抗体（すなわち、フォールディングされていないタンパク質と結合しない抗体）は、アラニン置換がタンパク質の全体的な折り畳みに影響を与えないことを立証するために使用することができる。例えば、Clackson and Wells, Science 1995; 267: 383-386、およびWells, Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 1-6を参照されたい。
電子顕微鏡法もまた、エピトープ「フットプリンティング」のために使用することができる。例えば、Wang et al., Nature 1992; 355: 275-278は、クライオ電子顕微鏡法、３次元画像再構築、およびＸ線結晶構造解析の協調的適用を使用して、天然ササゲモザイクウイルスのカプシド表面におけるＦａｂ断片の物理的フットプリントを決定した。
エピトープ評価のための「標識不含」アッセイの他の形態としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））および反射型干渉分光法（ＲｉｆＳ）が挙げられる。例えば、Faegerstam et al., Journal Of Molecular Recognition 1990; 3:208-14、Nice et al., J. Chromatogr. 1993; 646:159-168、Leipert et al., Angew. Chem. Int. Ed. 1998; 37: 3308-3311、Kroeger et al., Biosensors and Bioelectronics 2002; 17:937-944を参照されたい。
ある抗体と同じかまたは実質的に同じエピトープと結合する抗体が本明細書に記載される例示的な競合アッセイのうちの１つまたは複数において同定可能であることもまた留意されるべきである。
脊椎動物もしくは細胞における抗体の免疫化および産生において、または候補抗体もしくは抗体配列のライブラリーの作製において、特許請求される抗体を単離するために特定の選択工程が実施され得る。この点において、具体的な実施形態では、そのような抗体を製造する方法であって、（ａ）ネクチン－４ポリペプチドを含む免疫原を用いて非ヒト哺乳動物を免疫化するかまたは抗体もしくは抗体配列のライブラリーを調製すること、および（ｂ）前記免疫化動物から、または抗体もしくは配列の前記ライブラリーから抗体を調製すること、および（ｃ）ネクチン－４と結合することができる抗体を工程（ｂ）から選択すること、適宜、ネクチン－４のＶＣ１架橋ドメインに結合することができる抗体を工程（ｂ）から選択することを含む方法が提供される。適宜、ネクチン－４のＶＣ１架橋ドメインに結合することができる抗体を工程（ｂ）から選択することは、本明細書に記載されるもの（例えば、エピトープマッピング／特性評価法、抗体がネクチン－４突然変異体に対して低下した結合を有するか否かを試験すること、抗体がＩｇ様Ｖドメインを欠くように改変されたネクチン－４タンパク質に結合するか否かを試験することなどを含むがこれらに限定されない任意の好適な方法によって実行することができる。
一態様において、抗体は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニングによって（例えばＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置を用いた分析によって）決定される、ヒトネクチン－４に関して１×１０－８Ｍ以下、適宜１×１０－９Ｍ未満の平均解離定数（ＫＤ）を有し得る。より詳細な例示的な態様において、ネクチン－４に対して約１×１０－８Ｍ～約１×１０－１０Ｍ、または約１×１０－９Ｍ～約１×１０－１１ＭのＫＤを有する抗ネクチン－４抗体が提供される。
一実施形態において、ネクチン－４と結合する本開示の抗体は、例えばネクチン－４発現細胞の細胞クラスター形成および／または足場非依存性増殖を評価することによって判定して、ネクチン－４によって媒介される細胞－細胞相互作用を阻害することができる。例えば、ネクチン－４発現腫瘍細胞をネクチン－４と結合する抗体と接触させて、抗体がネクチン－４発現腫瘍細胞間の細胞－細胞接着を減少するか否かを評価すること、ならびに／またはネクチン－４発現腫瘍細胞の成長および／もしくはクラスター形成を抑制することができる（例えば、３次元もしくは非接着腫瘍細胞培養；腫瘍スフェロイドアッセイを使用して評価される）。
一実施形態において、ネクチン－４と結合する本開示の抗体は、ネクチン－４発現腫瘍細胞によるスフェロイド形成を評価することによって判定して、ネクチン－４によって媒介される細胞－細胞相互作用を阻害することができる。抗体がスフェロイド形成を阻害することができるか否かを判定することは、例えば、ネクチン－４発現腫瘍細胞をネクチン－４と結合する抗体の存在下で３次元または非接着腫瘍細胞培養において（例えば腫瘍スフェロイドアッセイにおいて）培養すること、および抗体がスフェロイド形成を阻害するか否かを評価することを含み得る。
一実施形態において、イムノコンジュゲート（例えば抗体薬物コンジュゲート）の調製もしくは製造における使用のための、または癌の処置における使用（例えば化学療法剤との組合せ、もしくはＡＤＣとして）のための抗体を同定または選択するための方法であって、ネクチン－４と結合する抗体をネクチン－４発現腫瘍細胞（例えば３次元または非接着腫瘍細胞培養における；腫瘍スフェロイドアッセイにおける）と接触させること、ならびに抗体がネクチン－４発現腫瘍細胞］のクラスター形成（例えばスフェロイド形成）および／または足場非依存性増殖を阻害するか否かを評価することを含む方法が提供される。方法は、抗体がネクチン－４発現腫瘍細胞のクラスター形成および／または足場非依存性増殖を阻害することができるという判定に基づいて、癌の処置における使用のための抗体を選択することを含んでもよい。
一実施形態において、イムノコンジュゲート（例えば抗体薬物コンジュゲート）の調製もしくは製造における使用のための、または癌の処置における使用（例えば化学療法剤との組合せ、もしくはＡＤＣとして）のための抗体を同定または選択するための方法であって、ネクチン－４と結合する抗体をネクチン－４発現腫瘍細胞（例えば、３次元または非接着腫瘍細胞培養；腫瘍スフェロイドアッセイにおける細胞）と接触させること、および抗体がネクチン－４発現腫瘍細胞によるスフェロイド形成を阻害するか否かを評価することを含む方法が提供される。方法は、抗体がネクチン－４発現腫瘍細胞によるスフェロイド形成を阻害することができるという判定に基づいて、癌の処置における使用のための抗体を選択することを含んでもよい。
上記方法のいずれにおいても、腫瘍細胞はＰｇｐ（ＭＤＲ１）を発現してもよい。
上記方法のいずれにおいても、方法は、腫瘍または腫瘍細胞成長の阻害の評価の前または後のいずれかにおいて、抗体を、好ましくはリンカー部分を介して細胞毒性剤（例えば、カンプトテシン類似体）にコンジュゲートする工程をさらに含んでもよい。本明細書のイムノコンジュゲートはそれによって製造されてもよい。
一実施形態において、イムノコンジュゲート（例えば抗体薬物コンジュゲート）の調製もしくは製造における使用のための、または癌（例えばネクチン－４陽性癌）の処置における使用のための抗体を選択することは、表面にネクチン－４ポリペプチドを発現する細胞（例えば腫瘍細胞）をネクチン－４と結合する抗体薬物コンジュゲートと接触させること、および抗体薬物コンジュゲートの細胞の死を引き起こす能力（例えば効力、ＩＣ５０）を評価することを含み得る。一実施形態において、選択される抗体は、細胞の死を引き起こすことに関して、抗体エンホルツマブのＶＨおよびＶＬを有する抗体薬物コンジュゲートと比較して、より強力（例えばより低いＩＣ５０）である（それぞれのＡＤＣが同じリンカー－細胞毒性薬および薬物：抗体比を有する場合）。抗体薬物コンジュゲートは、カンプトテシン類似体にコンジュゲートしたネクチン－４と結合する抗体を含んでもよい。
一実施形態において、本明細書の方法における使用に好適な抗体を選択および／または同定するために使用することができる方法が提供される。方法はまた、抗体薬物コンジュゲートの製造プロセス中の、抗体薬物コンジュゲートの品質または活性を試験および／またはモニタリングするための「バイオアッセイ」として有利に使用することができる。一例において、方法は、例えば、（ｉ）ネクチン－４発現腫瘍細胞のクラスター形成および／または足場非依存性増殖を阻害する抗体を用意する工程であって、抗体が細胞毒性剤にコンジュゲートされている、工程、ならびに（ｉｉ）表面にネクチン－４ポリペプチドを発現する細胞を工程（ｉ）の抗体薬物コンジュゲートと接触させ、抗体薬物コンジュゲートの細胞の死を引き起こす能力（例えば効力、ＩＣ５０）を評価する工程を含み得る。抗体薬物コンジュゲートが、適宜所定の有効性または効力（例えば、標準品の抗体薬物コンジュゲート組成物と比較される、すなわち所定のＩＣ５０値と比較される）を伴って、細胞の死を引き起こすことができると判定された場合、その抗体薬物コンジュゲートは選択されてもよい（例えば、製造におけるさらなる加工のため、バイアルまたはシリンジなどの容器に充填するため、癌の処置における使用のためなど）。
活性アッセイにおける結合（例えば細胞の死を引き起こす能力）に関する「ＩＣ５０」（またはＥＣ５０）とは、目的の活性に関する最大の応答または効果の５０％を生じる抗ネクチン－４抗体の阻害または有効濃度を指す。
本明細書におけるアッセイは、ＶＣ１架橋ドメインと結合する抗体に特に有用であり得る。例えば、一実施形態において、ネクチン－４結合抗体またはそのようなネクチン－４結合抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを作製、同定または試験する方法であって、残基Ｋ１９７および／またはＳ１９９に突然変異を含む突然変異型ネクチン－４ポリペプチドに対して、抗体と野生型ネクチン－４ポリペプチドとの間の結合と比較して低下した結合を示す抗体または抗体薬物コンジュゲート（またはその製造バッチ由来の試料）を、表面にネクチン－４、適宜、野生型ネクチン－４ポリペプチドを発現する細胞と接触させること、ならびに抗体または抗体薬物コンジュゲートの、細胞内内在化を受ける、抗体－ネクチン－４複合体の細胞内内在化を誘導する、および／または細胞の死を引き起こす能力を評価することを含む方法が提供される。
一部の実施形態において、ネクチン－４のＶＣ１架橋ドメインと結合する抗体を試験する方法であって、（ｉ）細胞毒性剤の存在下において、抗体を表面にネクチン－４を発現する細胞（細胞はＰｇｐを発現してもよい）と接触させることであって、抗体が細胞毒性剤にコンジュゲートされていてもよい、接触させること、および（ｉｉ）抗体またはコンジュゲート抗体の細胞の死を引き起こす能力を評価すること、適宜、細胞毒性剤の存在下における抗体またはコンジュゲート抗体が、細胞毒性剤単独の存在下において観察された細胞死と比較して細胞死を増加させるか否かを評価することを含む方法が提供される。一実施形態において、細胞はＰｇｐを発現し、細胞毒性剤はカンプトテシン類似体、適宜エキサテカンである。
一部の実施形態において、細胞毒性剤（例えばカンプトテシン類似体、エキサテカン）にコンジュゲートした、ネクチン－４のＶＣ１架橋ドメインと結合する抗体を含むＡＤＣを試験する方法であって、（ｉ）細胞毒性剤の存在下において、ＡＤＣを表面にネクチン－４を発現する細胞（細胞はＰｇｐを発現してもよい）と接触させること、および（ｉｉ）ＡＤＣの細胞の死を引き起こす能力を、適宜、参照ＡＤＣと比較して、適宜、細胞毒性剤単独の存在下において観察された細胞死と比較して評価することを含む方法が提供される。
任意の実施形態の一態様において、本方法に従って調製される抗体はモノクローナル抗体である。別の態様において、抗体を製造するために使用される非ヒト動物は哺乳動物、例えばげっ歯類、ウシ、ブタ、家禽、ウマ、ウサギ、ヤギ、またはヒツジである。本発明の抗体は、適宜、例えば全体または一部としてそれぞれの重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは抗原結合領域を含む、抗体５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂもしくは６Ａ７のいずれか以外の抗体、またはその誘導体であると規定することができる。
ネクチン－４ポリペプチドに存在するエピトープと結合する抗体をコードするＤＮＡは、ハイブリドーマから単離され、発現ベクターに入れられ、次いで、発現ベクターは、そのままであれば免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成が得られる。本明細書の他の箇所に記載されるように、そのようなＤＮＡ配列は、多数の目的のいずれかのために、例えば、抗体をヒト化するために、断片もしくは誘導体を製造するために、または例えば、抗原結合部位における抗体の配列を改変して、抗体の結合特異性を最適化するために改変することができる。一実施形態において、抗体の軽鎖および／または重鎖をコードする単離された核酸配列、ならびにそのような核酸を（例えばゲノムに）含む組換え宿主細胞が提供される。
一態様において、抗ネクチン－４抗体は、抗体５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７の重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を有する抗体の機能保存変異体である抗体である。「機能保存変異体」とは、ポリペプチドの全体的な立体構造および機能を変更せずに、タンパク質（例えば、抗体または抗体断片）における所与のアミノ酸残基が変化している変異体であり、変化としては、アミノ酸の、類似した特性（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香族性など）を有するものへの置換えを含むがこれに限定されない。保存されていると示されるもの以外のアミノ酸はタンパク質において異なっていてもよく、そのため、類似した機能の任意の２つのタンパク質間のタンパク質またはアミノ酸配列類似性パーセントは変動してもよく、例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくクラスター法などによるアラインメントスキームに従って決定して、７０％～９９％であってもよい。「機能保存変異体」にはまた、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定して、少なくとも６０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、より一層好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、比較される天然、参照または親タンパク質と同じかまたは実質的に類似した特性または機能を有するポリペプチドも含まれる。
抗体は、例えば細胞表面における、Ｉｇ様Ｖドメインを欠いている膜アンカーネクチン－４ポリペプチドとしてのネクチン－４ポリペプチドのＶＣ１架橋ドメインへの結合に基づいて評価および／または選択することができる。一態様において、抗体は、例えば細胞表面に発現するタンパク質に存在する、ネクチン－４ポリペプチドのＩｇ様Ｖドメインに存在する抗原決定基およびＣ２型１ドメインに存在する抗原決定基（ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）と結合する。一実施形態において、決定基は、Ｉｇ様Ｖドメインに完全には存在せず、Ｉｇ様Ｃ２型１ドメインに完全には存在しない。一実施形態において、抗体は、野生型膜結合ネクチン－４ポリペプチドと比較した、Ｉｇ様Ｖドメインを欠いている膜アンカーネクチン－４ポリペプチド（すなわち配列番号３２に示すアミノ酸配列を有するネクチン－４ポリペプチド）に対する結合の部分的低下を有する。
一態様において、抗ネクチン－４抗体（例えば細胞毒性剤を有するイムノコンジュゲートにおける使用に好適な抗体）を試験および／または製造する方法であって、
（ａ）ネクチン－４タンパク質と結合する複数の抗体を用意すること、
（ｂ）抗体がネクチン－４のＶＣ１架橋ドメインに対する抗体に結合するか否かを評価すること、および
（ｃ）適宜、ネクチン－４のＶＣ１架橋ドメインに対する抗体に結合する抗体を（例えば、工程（ｂ）において評価したものから）選択すること
を含む方法が提供される。適宜、工程（ｂ）は、抗体が、Ｉｇ様Ｖドメインを欠いている膜アンカーネクチン－４ポリペプチドに対する結合の部分的低下を有するか否か、ならびに／あるいは抗体が、１つもしくは複数のアミノ酸置換を（例えば、残基Ａ７２、Ｇ７３、Ｓ１９５、Ｋ１９７、Ｓ１９９、Ｌ１５０、Ｓ１５２、Ｑ２３４およびＩ２３６に）含む突然変異型ネクチン－４ポリペプチド、適宜、１つもしくは複数のアミノ酸置換を残基Ｋ１９７、Ｓ１９９および／もしくはＱ２３４に含む突然変異型ネクチン－４ポリペプチド；適宜、置換Ｓ１９５Ａ／Ｋ１９７Ｔ／Ｓ１９９Ａを含む突然変異型ネクチン－４ポリペプチド、適宜、置換Ａ７２Ｐ／Ｇ７３Ｎ／Ｋ１９７Ｔ／Ｓ１９９Ａを含む突然変異型ネクチン－４ポリペプチド、または適宜、置換Ｌ１５０Ｓ／Ｓ１５２Ａ／Ｑ２３４Ｒ／Ｉ２３６Ｓを含む突然変異型ネクチン－４ポリペプチドに対して低下した結合を有するか否かを評価する工程を含んでもよい。
一態様において、抗ネクチン－４抗体（例えばカンプトテシン類似体であってもよい細胞毒性剤を有するイムノコンジュゲートにおける使用に好適な抗体）を試験および／または製造する方法であって、
（ａ）ネクチン－４タンパク質と結合する複数の抗体を用意すること、
（ｂ）抗体がネクチン－４発現腫瘍細胞のクラスター形成および／または足場非依存性増殖の阻害を引き起こすか否かを評価すること、ならびに
（ｃ）適宜、ネクチン－４発現腫瘍細胞のクラスター形成および／または足場非依存性増殖の阻害を引き起こす抗体を（例えば、工程（ｂ）において評価したものから）選択すること
を含む方法が提供される。適宜、工程（ｂ）は、抗体が結合するか否かを評価する工程、および／またはネクチン－４のＶＣ１架橋ドメインに対する抗体に結合する抗体を選択する工程をさらに含んでもよい。
一態様において、抗ネクチン－４抗体（例えばカンプトテシン類似体であってもよい細胞毒性剤を有するイムノコンジュゲートにおける使用に好適な抗体）を試験および／または製造する方法であって、
（ａ）ネクチン－４タンパク質と結合する複数の抗体を用意すること、
（ｂ）抗体が、ネクチン－４発現腫瘍細胞間の細胞－細胞接着を減少させることができるか否か、および／またはネクチン－４発現腫瘍細胞の成長および／もしくはクラスター形成を抑制すること（例えば、３次元もしくは非接着腫瘍細胞培養；腫瘍スフェロイドアッセイを使用して評価される）ができるか否かを評価すること、ならびに
（ｃ）適宜、ネクチン－４発現腫瘍細胞間の細胞－細胞接着を減少させることができる、および／またはネクチン－４発現腫瘍細胞の成長および／もしくはクラスター形成を抑制することができる抗体を（例えば、工程（ｂ）において評価したものから）選択すること
を含む方法が提供される。適宜、工程（ｂ）は、抗体が結合するか否かを評価する工程、および／またはネクチン－４のＶＣ１架橋ドメインに対する抗体に結合する抗体を選択する工程をさらに含んでもよい。
一態様において、抗ネクチン－４抗体（例えばカンプトテシン類似体であってもよい細胞毒性剤を有するイムノコンジュゲートにおける使用に好適な抗体）を試験および／または製造する方法であって、
（ａ）ネクチン－４タンパク質と結合する複数の抗体を用意すること、
（ｂ）抗体が、例えばネクチン－４発現細胞の細胞クラスター形成および／または足場非依存性増殖を評価することによって判定して、ネクチン－４によって媒介される細胞－細胞相互作用を阻害することができるか否かを評価すること、ならびに
（ｃ）適宜、ネクチン－４によって媒介される細胞－細胞相互作用を阻害することができる抗体を（例えば、工程（ｂ）において評価したものから）選択すること
を含む方法が提供される。
一態様において、抗ネクチン－４抗体（例えばカンプトテシン類似体であってもよい細胞毒性剤を有するイムノコンジュゲートにおける使用に好適な抗体）を試験および／または製造する方法であって、
（ａ）ネクチン－４タンパク質と結合する１つまたは複数の抗体を用意すること、
（ｂ）抗体が、腫瘍（例えば転移性癌、ネクチン－４発現腫瘍）を細胞毒性剤（例えば本明細書に開示される薬剤（Ｚ）、カンプトテシン類似体）に対して感作することができるか否かを評価すること、および
（ｃ）適宜、腫瘍を細胞毒性剤（例えば本明細書に開示される薬剤（Ｚ）、カンプトテシン類似体）に対して感作することができる抗体を（例えば、工程（ｂ）から）選択すること
を含む方法が提供される。適宜、工程（ｂ）は、細胞毒性剤の存在下において、各抗体をＰｇｐ発現腫瘍細胞であってもよい腫瘍細胞（例えば３次元腫瘍細胞培養における、腫瘍スフェロイドアッセイにおける）と接触させること、および抗体が、細胞毒性剤の腫瘍細胞の死を引き起こす能力を、抗体の非存在下における細胞毒性剤と比較して増強するか否かを判定することをさらに含んでもよい。適宜、工程（ｂ）は、抗体が結合するか否かを評価する工程、および／またはネクチン－４のＶＣ１架橋ドメインに対する抗体に結合する抗体を選択する工程をさらに含んでもよい。
一態様において、ＡＤＣ（例えばトポイソメラーゼＩ阻害薬、カンプトテシン類似体、エキサテカンにコンジュゲートした、ＶＣ１架橋ドメインと結合する抗ネクチン－４抗体を含むＡＤＣ）を試験および／または製造する方法であって、
（ａ）トポイソメラーゼＩ阻害薬、適宜カンプトテシン類似体、適宜エキサテカン）にコンジュゲートした、ＶＣ１架橋ドメインと結合する抗ネクチン－４抗体を含むＡＤＣを用意すること、
（ｂ）ＡＤＣをＰｇｐ発現腫瘍細胞と接触させ、抗体がＰｇｐ発現腫瘍細胞の死を引き起こすことができるか否かを評価すること（例えば細胞死を引き起こす効力、ＩＣ５０を決定することを含む）、および
（ｃ）適宜、Ｐｇｐ発現腫瘍細胞の死を引き起こすことができる場合、そのＡＤＣを選択すること
を含む方法が提供される。適宜、工程（ｂ）は、ＡＤＣがＰｇｐ発現腫瘍細胞の死を引き起こすことができるか否かを、トポイソメラーゼＩ阻害薬単独（抗体の非存在下）と比較して判定することを含んでもよい。適宜、工程（ｃ）は、トポイソメラーゼＩ阻害薬単独（抗体の非存在下）と比較したＰｇｐ発現腫瘍細胞の死の増加を引き起こすことができる場合、そのＡＤＣを選択することを含んでもよい。
一態様において、イムノコンジュゲートを選択もしくは試験するか、または抗ネクチン－４イムノコンジュゲートにおける使用のための（例えば抗ネクチン－４抗体と組み合わせた使用のための、抗ネクチン－４抗体へのコンジュゲーションによるイムノコンジュゲートにおける使用のための）トポイソメラーゼ阻害剤の適切性を試験する方法であって、
（ａ）抗ネクチン－４抗体を用意することであって、抗体がネクチン－４のＶＣ１架橋ドメインに結合してもよい、用意すること、
（ｂ）トポイソメラーゼ阻害剤（例えば工程ｃにおいて別個に評価される１つまたは複数の薬剤）を用意し、薬剤を（ａ）の抗体にコンジュゲートすること（例えば複数が評価される場合は、各薬剤を別個にコンジュゲートすること）、
（ｃ）工程（ｂ）のトポイソメラーゼ阻害薬コンジュゲート抗体がＰｇｐ発現腫瘍細胞の死を引き起こすことができるか否かを評価すること、および
適宜、細胞死を引き起こす能力がトポイソメラーゼ阻害薬コンジュゲート抗体によって、適宜、参照または比較トポイソメラーゼ阻害薬コンジュゲート抗体を含むイムノコンジュゲートと比較して向上する場合、イムノコンジュゲートまたはイムノコンジュゲートにおける使用のためのトポイソメラーゼ阻害薬を選択すること
を含む方法が提供される。比較または参照は、異なるトポイソメラーゼ阻害薬および／または異なる抗ネクチン－４抗体を含むことができる。
一態様において、ネクチン－４のＶＣ１架橋ドメインに結合する抗ネクチン－４抗体と共に使用するための（例えば抗ネクチン－４抗体と組み合わせた使用のための、抗ネクチン－４抗体へのコンジュゲーションによるイムノコンジュゲートにおける使用のための）化学療法剤または細胞毒性剤を選択するかまたはその適切性を試験する方法であって、
（ａ）ネクチン－４のＶＣ１架橋ドメインに結合する抗ネクチン－４抗体を用意すること、
（ｂ）細胞毒性剤または化学療法剤（例えば工程ｃにおいて別個に評価される１つまたは複数の薬剤）を用意すること、
（ｃ）抗体が、腫瘍（例えばＰｇｐ発現腫瘍、転移性癌由来の腫瘍、ネクチン－４発現腫瘍）を薬剤に対して感作することができるか否かを評価すること、および
（ｄ）適宜、抗腫瘍活性が抗体によって向上する薬剤（例えば抗ネクチン－４抗体と組み合わせた使用のための、抗ネクチン－４抗体へのコンジュゲーションによるイムノコンジュゲートにおける使用のための）を選択すること
を含む方法が提供される。適宜、工程（ｃ）は、薬剤の存在下において、抗体を腫瘍細胞（例えばＰｇｐ発現細胞、腫瘍スフェロイドアッセイにおける、３次元腫瘍細胞培養における細胞）と接触させること、および抗体が、細胞毒性剤の腫瘍細胞の死を引き起こす能力を、抗体の非存在下における細胞毒性剤と比較して増強するか否かを判定することをさらに含んでもよい。適宜、工程（ａ）は、抗体が結合するか否かを評価する工程、および／またはネクチン－４のＶＣ１架橋ドメインに対する抗体に結合する抗体を選択する工程をさらに含んでもよい。
抗体を製造する上記方法のいずれかにおいて、方法は、抗体のヒトネクチン－４ポリペプチドに対する結合親和性を評価する工程、例えばＳＰＲ一価結合親和性アッセイにおいて決定される１：１結合フィットおよび／または解離速度もしくはオフレート（ｏｆｆ ｒａｔｅ）［ｋｄ（１／ｓ）］を評価する工程をさらに含んでもよい。
試験、選択および／または製造された抗体は、次いで、さらなる評価のために、ある量のさらなる加工、製造のために、細胞毒性剤へのコンジュゲーションのために、容器またはバイアルへの製剤化または充填のために、癌の処置における使用のために使用することができる。一態様において、方法によって製造された抗体またはコンジュゲートされた抗体薬物が提供される。
一例において、抗体のスクリーニングまたは試験は、抗体を特徴付けるおよび／または抗体の選択を方向付けるために、突然変異型ネクチン－４ポリペプチドの使用を含み得る。例えば、ネクチン－４と結合する抗体を製造または試験する方法は、
（ａ）ネクチン－４ポリペプチドと結合する複数の抗体を用意する工程、
（ｂ）前記抗体のそれぞれを、Ａ７２、Ｇ７３、Ｓ１９５、Ｋ１９７、Ｓ１９９、Ｌ１５０、Ｓ１５２、Ｑ２３４およびＩ２３６からなる群から選択される１、２、３、４もしくは５つ以上の残基、または適宜、残基Ｋ１９７および／もしくはＳ１９９、または適宜、Ｋ１９７、Ｓ１９９およびＱ２３４（配列番号１に準拠）からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基に突然変異を含む突然変異型ネクチン－４ポリペプチドと接触させ、抗体と突然変異型ネクチン－４ポリペプチドとの間の結合を、抗体と配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ネクチン－４ポリペプチドとの間の結合と比較して評価する工程、ならびに
（ｃ）適宜、突然変異型ネクチン－４ポリペプチドに対して、抗体と配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ネクチン－４ポリペプチドとの間の結合と比較して低下した結合を有する抗体を選択する工程（例えばさらなる評価のために、細胞毒性剤へのコンジュゲーションのために、ある量のさらなる加工、製造のために、処置における使用のために）
を含み得る。突然変異型ネクチン－４ポリペプチドは、置換Ｓ１９５Ａ／Ｋ１９７Ｔ／Ｓ１９９Ａ、置換Ａ７２Ｐ／Ｇ７３Ｎ／Ｋ１９７Ｔ／Ｓ１９９Ａ、および／または置換Ｌ１５０Ｓ／Ｓ１５２Ａ／Ｑ２３４Ｒ／Ｉ２３６Ｓを含んでもよい。
有利には、抗体は適宜、本明細書に記載される抗体のいずれかと同じネクチン－４ポリペプチドの表面の領域またはエピトープへの結合に基づいて同定および選択することができる。一態様において、抗体は、抗体５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７のいずれかと実質的に同じエピトープと結合する。一実施形態において、抗体は、抗体５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７によって結合されるエピトープと少なくとも部分的に重複するかまたはそのエピトープにおける少なくとも１つの残基を含むネクチン－４のエピトープに結合する。抗体によって結合される残基は、ネクチン－４ポリペプチドの表面、例えば、細胞の表面に発現するネクチン－４ポリペプチドに存在すると規定することができる。
抗ネクチン－４抗体の、ネクチン－４の特定の部位への結合は、抗ネクチン－４抗体の、ネクチン－４突然変異体をトランスフェクトした細胞への結合を測定することによって、抗ネクチン－４抗体の野生型ネクチン－４ポリペプチド（例えば、配列番号１）と結合する能力と比較して評価することができる。本開示は、ＶＣドメインに結合する抗体を含む抗体の結合部位の特性評価を可能にする突然変異型ネクチン－４ポリペプチドを提供する。一実施形態において、表２の突然変異体において示される突然変異を含む突然変異型ネクチン－４ポリペプチド、そのような突然変異体をコードする核酸、および前述のものを発現する組換え宿主細胞が提供される。一実施形態において、Ａ７２、Ｇ７３、Ｓ１９５、Ｋ１９７、Ｓ１９９、Ｌ１５０、Ｓ１５２、Ｑ２３４およびＩ２３６からなる群から選択される１、２、３、４もしくは５つ以上の残基、または適宜、残基Ｋ１９７および／もしくはＳ１９９、または適宜、Ｋ１９７、Ｓ１９９およびＱ２３４（配列番号１に準拠）からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基に突然変異を含む突然変異型ネクチン－４ポリペプチド、そのような突然変異体をコードする核酸、ならびに前述のものを発現する組換え宿主細胞が提供される。抗ネクチン－４抗体と突然変異型ネクチン－４ポリペプチド（例えば、表２の突然変異体）との間の結合の低下は、結合親和性の低下（例えば、特定の突然変異体を発現する細胞のＦＡＣＳ試験などの公知の方法によって、もしくは突然変異型ポリペプチドへの結合のＢｉａｃｏｒｅ試験によって測定される）および／または抗ネクチン－４抗体の総結合能の低下（例えば、ポリペプチド濃度に対する抗ネクチン－４抗体濃度のプロットにおけるＢｍａｘの減少によって証明される）が存在することを意味する。結合の有意な低下は、突然変異した残基が、抗ネクチン－４抗体への結合に直接関与するか、または抗ネクチン－４抗体がネクチン－４に結合する場合において結合タンパク質に非常に近接していることを示す。
一部の実施形態において、結合の有意な低下は、抗ネクチン－４抗体と突然変異型ネクチン－４ポリペプチドとの間の結合親和性および／または結合能が、抗体と野生型ネクチン－４ポリペプチドとの間の結合と比較して４０％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超または９５％超低下することを意味する。ある特定の実施形態において、結合は検出限界未満に低下する。一部の実施形態において、結合の有意な低下は、抗ネクチン－４抗体の突然変異型ネクチン－４ポリペプチドへの結合が、抗ネクチン－４抗体と野生型ネクチン－４ポリペプチドとの間において観察された結合の５０％未満（例えば、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％または１０％未満）である場合に証明される。
一部の実施形態において、抗体５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７によって結合されるアミノ酸残基を含むセグメントにおける残基が異なるアミノ酸により置換されている突然変異型ネクチン－４ポリペプチド（例えば表２の突然変異体）に対して、そのような置換を含まない野生型ネクチン－４ポリペプチド（例えば配列番号１のポリペプチド）への結合と比較して有意に低い結合を呈する抗ネクチン－４抗体が提供される。
一態様において、抗ネクチン－４抗体は、ネクチン－４のＶＣ１架橋ドメイン上またはその内部に位置するエピトープと結合する。一態様において、抗ネクチン－４抗体は、ネクチン－４のＶＣ１架橋ドメイン上のエピトープへの結合に関して抗体５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７と競合する。
一態様において、抗ネクチン－４抗体は、配列番号１に準拠した、Ｋ１９７（例えばＫ１９７Ｔ置換）、Ｓ１９９（例えばＳ１９９Ａ置換）およびＱ２３４（例えばＱ２３４Ｒ置換）からなる群から選択される１、２または３つの残基に突然変異を有するネクチン－４ポリペプチドに対して低下した結合、適宜、結合の喪失を有する。
一実施形態において、抗体は、Ｓ１９５、Ｋ１９７およびＳ１９９（配列番号１に準拠）からなる群から選択される１つまたは複数（または全て）の残基に突然変異を含む突然変異型ネクチン－４ポリペプチドに対して低下した結合をさらに有し、突然変異型ネクチン－４ポリペプチドは、突然変異Ｓ１９５Ａ、Ｋ１９７ＴおよびＳ１９９Ａを有してもよい。
一実施形態において、抗体は、Ａ７２、Ｇ７３、Ｋ１９７およびＳ１９９（配列番号１に準拠）からなる群から選択される１つまたは複数（または全て）の残基に突然変異を含む突然変異型ネクチン－４ポリペプチドに対して低下した結合をさらに有し、突然変異型ネクチン－４ポリペプチドは、突然変異Ａ７２Ｐ、Ｇ７３Ｎ、Ｋ１９７ＴおよびＳ１９９Ａを有してもよい。
一実施形態において、抗体は、Ｌ１５０、Ｓ１５２、Ｑ２３４およびＩ２３６（配列番号１に準拠）からなる群から選択される１つまたは複数（または全て）の残基に突然変異を含む突然変異型ネクチン－４ポリペプチドに対して低下した結合をさらに有し、突然変異型ネクチン－４ポリペプチドは、突然変異Ｌ１５０Ｓ、Ｓ１５２Ａ、Ｑ２３４ＲおよびＩ２３６Ｓを有してもよい。
一実施形態において、抗体は、Ａ７２、Ｇ７３、Ｓ１９５、Ｋ１９７、Ｓ１９９、Ｌ１５０、Ｓ１５２、Ｑ２３４およびＩ２３６（配列番号１に準拠）からなる群から選択される１つまたは複数（または全て）の残基に突然変異を含む突然変異型ネクチン－４ポリペプチドに対して低下した結合をさらに有し、突然変異型ネクチン－４ポリペプチドは、突然変異Ａ７２Ｐ、Ｇ７３Ｎ、Ｓ１９５Ａ、Ｋ１９７Ｔ、Ｓ１９９Ａ、Ｌ１５０Ｓ、Ｓ１５２Ａ、Ｑ２３４ＲおよびＩ２３６Ｓを有してもよい。
それぞれの場合において、結合の低減または喪失は、抗体と配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ネクチン－４ポリペプチドとの間の結合に対するものであると規定することができる。
一態様において、抗ネクチン－４抗体は、Ａ７２、Ｇ７３、Ｓ１９５、Ｋ１９７、Ｓ１９９、Ｌ１５０、Ｓ１５２、Ｑ２３４およびＩ２３６からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば、１、２、３、４もしくは５つの残基）、または適宜Ｋ１９７、Ｓ１９９およびＱ２３４（配列番号１に準拠）からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基を含むネクチン－４のエピトープと結合する。
一態様において、抗ネクチン－４抗体は、Ｓ１９５、Ｋ１９７およびＳ１９９（配列番号１に準拠）からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば、１、２または３つの残基）を含むネクチン－４のエピトープと結合する。
一態様において、抗ネクチン－４抗体は、Ａ７２、Ｇ７３、Ｋ１９７およびＳ１９９からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば、１、２、３または４つの残基）を含むネクチン－４のエピトープと結合する。
一態様において、抗ネクチン－４抗体は、Ｌ１５０、Ｓ１５２、Ｑ２３４およびＩ２３６からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば、１、２、３または４つの残基）を含むネクチン－４のエピトープと結合する。
一態様において、抗ネクチン－４抗体は、ネクチン－４のＶＣ１架橋ドメイン上またはその内部に位置するエピトープと結合する。一態様において、抗ネクチン－４抗体は、ヒトネクチン－４タンパク質のＶＣ１架橋ドメイン上のエピトープへの結合に関して抗体５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７と競合する。
一実施形態において、本開示の抗体のＶＨ領域は、ＩＧＨＶ１－１８、ＩＧＨＶ１－２、ＩＧＨＶ１－２４、ＩＧＨＶ１－３、ＩＧＨＶ１－４５、ＩＧＨＶ１－４６、ＩＧＨＶ１－５８、ＩＧＨＶ１－６９、ＩＧＨＶ１－８、ＩＧＨＶ２－２６、ＩＧＨＶ２－５、ＩＧＨＶ２－７０、ＩＧＨＶ２－７０Ｄ、ＩＧＨＶ３－１１、ＩＧＨＶ３－１３、ＩＧＨＶ３－１５、ＩＧＨＶ３－２０、ＩＧＨＶ３－２１、ＩＧＨＶ３－２３、ＩＧＨＶ３－２３Ｄ、ＩＧＨＶ３－３０、ＩＧＨＶ３－３０－３、ＩＧＨＶ３－３０－５、ＩＧＨＶ３－３３、ＩＧＨＶ３－４３、ＩＧＨＶ３－４３Ｄ、ＩＧＨＶ３－４８、ＩＧＨＶ３－４９、ＩＧＨＶ３－５４、ＩＧＨＶ３－６４、ＩＧＨＶ３－６４Ｄ、ＩＧＨＶ３－６６、ＩＧＨＶ３－７、ＩＧＨＶ３－７２、ＩＧＨＶ３－７３、ＩＧＨＶ３－７４、ＩＧＨＶ３－９、ＩＧＨＶ３－ＮＬ１、ＩＧＨＶ４－２８、ＩＧＨＶ４－３０－１、ＩＧＨＶ４－３０－２、ＩＧＨＶ４－３０－４、ＩＧＨＶ４－３１、ＩＧＨＶ４－３４、ＩＧＨＶ４－３８－２、ＩＧＨＶ ４－３９、ＩＧＨＶ４－４、ＩＧＨＶ４－５９、ＩＧＨＶ４－６１、ＩＧＨＶ５－１０－１、ＩＧＨＶ５－５１、ＩＧＨＶ６－１、およびＩＧＨＶ７－４－１からなる群から選択されるヒトＶ遺伝子群の遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本開示の抗体のＶＨ領域は、前記遺伝子由来のアミノ酸配列（例えばＫａｂａｔ番号付けに従った、例えばＣＤＲおよび／またはヒトフレームワーク領域）を含むＶＨを含んでもよい。
一実施形態において、本開示の抗体のＶＬ領域は、ＩＧＫＶ１－１２、ＩＧＫＶ１－１３、ＩＧＫＶ１－１６、ＩＧＫＶ１－２７、ＩＧＫＶ１－３３、ＩＧＫＶ１－３９、ＩＧＫＶ１－５、ＩＧＫＶ１－６、ＩＧＫＶ１－８、ＩＧＫＶ１－９、ＩＧＫＶ１－ＮＬ１、ＩＧＫＶ１Ｄ－１２、ＩＧＫＶ１Ｄ－１３、ＩＧＫＶ１Ｄ－１６、ＩＧＫＶ１Ｄ－１７、ＩＧＫＶ１Ｄ－３３、ＩＧＫＶ１Ｄ－３９、ＩＧＫＶ１Ｄ４３、ＩＧＫＶ１Ｄ８、ＩＧＫＶ２－２４、ＩＧＫＶ２－２８、ＩＧＫＶ２－２９、ＩＧＫＶ２－３０、ＩＧＫＶ２－４０、ＩＧＫＶ２Ｄ－２６、ＩＧＫＶ２Ｄ－２８、ＩＧＫＶ２Ｄ－２９、ＩＧＫＶ２Ｄ－３０、ＩＧＫＶ２Ｄ－４０、ＩＧＫＶ３－１１、ＩＧＫＶ３－１５、ＩＧＫＶ３－２０、ＩＧＫＶ３Ｄ－１１、ＩＧＫＶ３Ｄ－１５、ＩＧＫＶ３Ｄ－２０、ＩＧＫＶ３Ｄ－７、ＩＧＫＶ４－１、ＩＧＫＶ５－２、ＩＧＫＶ６－２１およびＩＧＫＶ６Ｄ－２１からなる群から選択されるヒトＶ遺伝子群の遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本開示の抗体のＶＬ領域は、前記遺伝子由来のアミノ酸配列（例えばＫａｂａｔ番号付けに従った、例えばＣＤＲおよび／またはヒトフレームワーク領域）を含むＶＬを含んでもよい。
本開示の例示的な抗ネクチン－４ ＶＨおよびＶＬ対は抗体５Ｅ７のものであり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列は以下に記載され（配列番号６）、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は以下に記載される（配列番号７）。具体的な実施形態において、モノクローナル抗体５Ｅ７と本質的に同じエピトープまたは決定基と結合する抗体が提供され、この抗体は、抗体５Ｅ７の超可変領域を含んでもよい。本明細書の任意の実施形態において、抗体５Ｅ７は、そのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列によって特徴付けることができる。一実施形態において、モノクローナル抗体は、５Ｅ７のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２部分を含む。５Ｅ７の重鎖可変領域を含む抗体または抗体断片もまた提供される。一実施形態では、抗体または抗体断片は、５Ｅ７の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。５Ｅ７の可変軽鎖可変領域または５Ｅ７の軽鎖可変領域の１、２もしくは３つのＣＤＲをさらに含む抗体または抗体断片もまた提供される。ＨＣＤＲ１、２、３およびＬＣＤＲ１、２、３配列は、適宜、全てが（またはそれぞれが独立して）、Ｋａｂａｔ番号付けシステムのもの、Ｃｈｏｔｉａ番号付けシステムのもの、ＩＭＧＴ番号付けのもの、または任意の他の好適な番号付けシステムであると規定することができる。適宜、前記軽鎖または重鎖ＣＤＲのいずれか１つまたは複数は、１、２、３、４または５つ以上のアミノ酸改変（例えば置換、挿入または欠失）を含有してもよい。
一態様において、抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、配列番号６のＶＨドメインに対して少なくとも約６０％、７０％または８０％の配列同一性、適宜、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＶＨドメインを含む。別の態様において、抗ネクチン－４抗体は、配列番号７のＶＬドメインに対して少なくとも約６０％、７０％または８０％の配列同一性、適宜、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＶＬドメインを含む。
ＶＨおよびＶＬは、ヒトアクセプターフレームワークを含んでもよい（例えば、組み込むように改変されてもよい）。一実施形態において、本開示の抗ネクチン－４抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けに従う）を含む。一実施形態において、本開示の抗ネクチン－４抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けに従う）を含む。一実施形態において、本開示の抗ネクチン－４抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
５Ｅ７ ＶＨ：
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYIFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIDPSDSYTNYNQKFKGKATLTLDKSSSTTYMQLSSLTSEDSAVYYCVRGYGNYGDYWGQGTTLTVSS（配列番号６）
５Ｅ７ ＶＬ：
DVVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPWTFGGGTKLEIK（配列番号７）
５Ｅ７ ＣＤＲ：
Ｋａｂａｔ： ＣＤＲ－Ｈ１ SYWMH（配列番号８）
ＣＤＲ－Ｈ２ EIDPSDSYTNYNQKFKG（配列番号９）
ＣＤＲ－Ｈ３ GYGNYGDY（配列番号１０）
ＣＤＲ－Ｌ１ RSSKSLLHSNGITYLY（配列番号１１）
ＣＤＲ－Ｌ２ QMSNLAS（配列番号１２）
ＣＤＲ－Ｌ３ AQNLELPWT（配列番号１３）
ＩＭＧＴ： ＣＤＲ－Ｈ１ GYIFTSYW（配列番号１４）
ＣＤＲ－Ｈ２ IDPSDSYT（配列番号１５）
ＣＤＲ－Ｈ３ VRGYGNYGDY（配列番号１６）
ＣＤＲ－Ｌ１ KSLLHSNGITY（配列番号１７）
ＣＤＲ－Ｌ２ QMS（配列番号１８）
ＣＤＲ－Ｌ３ AQNLELPWT（配列番号１３）
Ｃｈｏｔｈｉａ： ＣＤＲ－Ｈ１ GYIFTSY（配列番号１９）
ＣＤＲ－Ｈ２ PSDS（配列番号２０）
ＣＤＲ－Ｈ３ YGNYGD（配列番号２１）
ＣＤＲ－Ｌ１ SKSLLHSNGITY（配列番号２２）
ＣＤＲ－Ｌ２ QMS（配列番号１８）
ＣＤＲ－Ｌ３ NLELPW（配列番号２３）
一実施形態において、抗ネクチン－４抗体は、例えば、配列番号８～１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１１～１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る。抗ネクチン－４抗体は、例えば、アミノ酸配列：ＳＹＷＭＨ（配列番号８）もしくはその少なくとも４つの連続するアミノ酸の配列を含み、適宜、これらのアミノ酸のうちの１つもしくは複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＨＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＥＩＤＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号９）もしくはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０の連続するアミノ酸の配列を含み、適宜、これらのアミノ酸のうちの１つもしくは複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＨＣＤＲ２；アミノ酸配列：ＧＹＧＮＹＧＤＹ（配列番号１０）もしくはその少なくとも４、５もしくは６つの連続するアミノ酸の配列を含み、適宜、これらのアミノ酸のうちの１つもしくは複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＨＣＤＲ３；アミノ酸配列：ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹ（配列番号１１）もしくはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０の連続するアミノ酸の配列を含み、適宜、これらのアミノ酸のうちの１つもしくは複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＬＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＱＭＳＮＬＡＳ（配列番号１２）、もしくはその少なくとも４、５もしくは６つの連続するアミノ酸の配列を含み、適宜、これらのアミノ酸のうちの１つもしくは複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＬＣＤＲ２領域；および／またはアミノ酸配列：ＡＱＮＬＥＬＰＷＴ（配列番号１３）もしくはその少なくとも４、５、６、７もしくは８つの連続するアミノ酸の配列を含み、適宜、これらのアミノ酸のうちの１つもしくは複数が欠失していても異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＬＣＤＲ３領域を含み得る。ＣＤＲ位置はＫａｂａｔ番号付けに従っていてもよい。
本開示の別の例示的な抗ネクチン－４ ＶＨおよびＶＬ対は抗体１０Ｂ１２のものであり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列は以下に記載され（配列番号２４）、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は以下に記載される（配列番号２５）。具体的な実施形態において、モノクローナル抗体１０Ｂ１２と本質的に同じエピトープまたは決定基と結合する抗体が提供され、この抗体は、抗体１０Ｂ１２の超可変領域を含んでもよい。本明細書の任意の実施形態において、抗体１０Ｂ１２は、そのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列によって特徴付けることができる。一実施形態において、モノクローナル抗体は、１０Ｂ１２のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２部分を含む。１０Ｂ１２の重鎖可変領域を含む抗体または抗体断片もまた提供される。一実施形態では、抗体または抗体断片は、１０Ｂ１２の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。１０Ｂ１２の可変軽鎖可変領域または１０Ｂ１２の軽鎖可変領域の１、２もしくは３つのＣＤＲをさらに含む抗体または抗体断片もまた提供される。ＨＣＤＲ１、２、３およびＬＣＤＲ１、２、３配列は、適宜、全てが（またはそれぞれが独立して）、Ｋａｂａｔ番号付けシステムのもの、Ｃｈｏｔｉａ番号付けシステムのもの［例えば抗体はＣＤＲ－Ｈ１アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＹ（配列番号２６）を有する］、ＩＭＧＴ番号付けのもの［例えば抗体はＣＤＲ－Ｈ１アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＹＷ（配列番号２７）を有する］、または任意の他の好適な番号付けシステムであると規定することができる。適宜、前記軽鎖または重鎖ＣＤＲのいずれか１つまたは複数は、１、２、３、４または５つ以上のアミノ酸改変（例えば置換、挿入または欠失）を含有してもよい。
一態様において、抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、配列番号２４のＶＨドメインに対して少なくとも約６０％、７０％または８０％の配列同一性、適宜、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＶＨドメインを含む。別の態様において、抗ネクチン－４抗体は、配列番号２５のＶＬドメインに対して少なくとも約６０％、７０％または８０％の配列同一性、適宜、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＶＬドメインを含む。
ＶＨおよびＶＬは、ヒトアクセプターフレームワークを含んでもよい（例えば、組み込むように改変されてもよい）。一実施形態において、本開示の抗ネクチン－４抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けに従う）を含む。一実施形態において、本開示の抗ネクチン－４抗体は、配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けに従う）を含む。一実施形態において、本開示の抗ネクチン－４抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
１０Ｂ１２ ＶＨ：
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIDPSDSYTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCVRGYGNYGDYWGQGTTLTVSS（配列番号２４）
１０Ｂ１２ ＶＬ：
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPWTFGGGTKLEIK（配列番号２５）
本開示の別の例示的な抗ネクチン－４ ＶＨおよびＶＬ対は抗体６Ｃ１１Ｂのものであり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列は以下に記載され（配列番号４２）、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は以下に記載される（配列番号４３）。具体的な実施形態において、モノクローナル抗体６Ｃ１１Ｂと本質的に同じエピトープまたは決定基と結合する抗体が提供され、この抗体は、抗体６Ｃ１１Ｂの超可変領域を含んでもよい。本明細書の任意の実施形態において、抗体６Ｃ１１Ｂは、そのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列によって特徴付けることができる。一実施形態において、モノクローナル抗体は、６Ｃ１１ＢのＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２部分を含む。６Ｃ１１Ｂの重鎖可変領域を含む抗体または抗体断片もまた提供される。一実施形態では、抗体または抗体断片は、６Ｃ１１Ｂの重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。６Ｃ１１Ｂの可変軽鎖可変領域または６Ｃ１１Ｂの軽鎖可変領域の１、２もしくは３つのＣＤＲをさらに含む抗体または抗体断片もまた提供される。ＨＣＤＲ１、２、３およびＬＣＤＲ１、２、３配列は、適宜、全てが（またはそれぞれが独立して）、Ｋａｂａｔ番号付けシステムのもの、Ｃｈｏｔｉａ番号付けシステムのもの、ＩＭＧＴ番号付けのもの、または任意の他の好適な番号付けシステムであると規定することができる。適宜、前記軽鎖または重鎖ＣＤＲのいずれか１つまたは複数は、１、２、３、４または５つ以上のアミノ酸改変（例えば置換、挿入または欠失）を含有してもよい。
一態様において、抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、配列番号４２のＶＨドメインに対して少なくとも約６０％、７０％または８０％の配列同一性、適宜、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＶＨドメインを含む。別の態様において、抗ネクチン－４抗体は、配列番号４３のＶＬドメインに対して少なくとも約６０％、７０％または８０％の配列同一性、適宜、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＶＬドメインを含む。
ＶＨおよびＶＬは、ヒトアクセプターフレームワークを含んでもよい（例えば、組み込むように改変されてもよい）。一実施形態において、本開示の抗ネクチン－４抗体は、配列番号４２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けに従う）を含む。一実施形態において、本開示の抗ネクチン－４抗体は、配列番号４３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けに従う）を含む。一実施形態において、本開示の抗ネクチン－４抗体は、配列番号４２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号４３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
６Ｃ１１Ｂ ＶＨ：
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYTIHWVKQNHGKSLEWIGRINPKNGDIIHNQNFMGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVCYCARSGYGSSYGFAYWGQGTLVTVSA
（配列番号４２）
６Ｃ１１Ｂ ＶＬ：
DIVMTQSPTSLVVSLGQRATISCRASQSVTTPRYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQHSWEIPYTFGGGTKLEIK（配列番号４３）
６Ｃ１１Ｂ ＣＤＲ：
Ｋａｂａｔ： ＣＤＲ－Ｈ１ EYTIH（配列番号４４）
ＣＤＲ－Ｈ２ RINPKNGDIIHNQNFMG（配列番号４５）
ＣＤＲ－Ｈ３ SGYGSSYGFAY（配列番号４６）
ＣＤＲ－Ｌ１ RASQSVTTPRYSYMH（配列番号４７）
ＣＤＲ－Ｌ２ YASNLES（配列番号４８）
ＣＤＲ－Ｌ３ QHSWEIPYT（配列番号４９）
抗ネクチン－４抗体は、例えば、アミノ酸配列：ＥＹＴＩＨ（配列番号４４）もしくはその少なくとも４つの連続するアミノ酸の配列を含み、適宜、これらのアミノ酸のうちの１つもしくは複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＨＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＲＩＮＰＫＮＧＤＩＩＨＮＱＮＦＭＧ（配列番号４５）もしくはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０の連続するアミノ酸の配列を含み、適宜、これらのアミノ酸のうちの１つもしくは複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＨＣＤＲ２；アミノ酸配列：ＳＧＹＧＳＳＹＧＦＡＹ（配列番号４６）もしくはその少なくとも４、５もしくは６つの連続するアミノ酸の配列を含み、適宜、これらのアミノ酸のうちの１つもしくは複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＨＣＤＲ３；アミノ酸配列：ＲＡＳＱＳＶＴＴＰＲＹＳＹＭＨ（配列番号４７）もしくはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０の連続するアミノ酸の配列を含み、適宜、これらのアミノ酸のうちの１つもしくは複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＬＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＹＡＳＮＬＥＳ（配列番号４８）、もしくはその少なくとも４、５もしくは６つの連続するアミノ酸の配列を含み、適宜、これらのアミノ酸のうちの１つもしくは複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＬＣＤＲ２領域；および／またはアミノ酸配列：ＱＨＳＷＥＩＰＹＴ（配列番号４９）もしくはその少なくとも４、５、６、７もしくは８つの連続するアミノ酸の配列を含み、適宜、これらのアミノ酸のうちの１つもしくは複数が欠失していても異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＬＣＤＲ３領域を含み得る。ＣＤＲ位置はＫａｂａｔ番号付けに従っていてもよい。
本開示の別の例示的な抗ネクチン－４ ＶＨおよびＶＬ対は抗体６Ａ７のものであり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列は以下に記載され（配列番号５０）、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は以下に記載される（配列番号５１）。具体的な実施形態において、モノクローナル抗体６Ａ７と本質的に同じエピトープまたは決定基と結合する抗体が提供され、この抗体は、抗体６Ａ７の超可変領域を含んでもよい。本明細書の任意の実施形態において、抗体６Ａ７は、そのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列によって特徴付けることができる。一実施形態において、モノクローナル抗体は、６Ａ７のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２部分を含む。６Ａ７の重鎖可変領域を含む抗体または抗体断片もまた提供される。一実施形態では、抗体または抗体断片は、６Ａ７の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。６Ａ７の可変軽鎖可変領域または６Ａ７の軽鎖可変領域の１、２もしくは３つのＣＤＲをさらに含む抗体または抗体断片もまた提供される。ＨＣＤＲ１、２、３およびＬＣＤＲ１、２、３配列は、適宜、全てが（またはそれぞれが独立して）、Ｋａｂａｔ番号付けシステムのもの、Ｃｈｏｔｉａ番号付けシステムのもの、ＩＭＧＴ番号付けのもの、または任意の他の好適な番号付けシステムであると規定することができる。適宜、前記軽鎖または重鎖ＣＤＲのいずれか１つまたは複数は、１、２、３、４または５つ以上のアミノ酸改変（例えば置換、挿入または欠失）を含有してもよい。
一態様において、抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、配列番号５０のＶＨドメインに対して少なくとも約６０％、７０％または８０％の配列同一性、適宜、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＶＨドメインを含む。別の態様において、抗ネクチン－４抗体は、配列番号５１のＶＬドメインに対して少なくとも約６０％、７０％または８０％の配列同一性、適宜、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＶＬドメインを含む。
ＶＨおよびＶＬは、ヒトアクセプターフレームワークを含んでもよい（例えば、組み込むように改変されている）。一実施形態において、本開示の抗ネクチン－４抗体は、配列番号５０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けに従う）を含む。一実施形態において、本開示の抗ネクチン－４抗体は、配列番号５１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けに従う）を含む。一実施形態において、本開示の抗ネクチン－４抗体は、配列番号５０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号５１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
６Ａ７ ＶＨ：
QVQLKESGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGHGLEWVGEIDPSDSYTNYNQKFKGKATLTIDKSSSTVYMQLSSLTSEDSAVYYCARSGNYDAMDYWGQGTSVTVSA
（配列番号５０）
６Ａ７ ＶＬ：
DIVMTQAAFSSAVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPHFLIYQMSNLASGVPDRFTSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPWTFGGGTKLEIK（配列番号５１）
６Ａ７ ＣＤＲ：
Ｋａｂａｔ： ＣＤＲ－Ｈ１ SYWMH（配列番号５２）
ＣＤＲ－Ｈ２ EIDPSDSYTNYNQKFKG（配列番号５３）
ＣＤＲ－Ｈ３ SGNYDAMDY（配列番号５４）
ＣＤＲ－Ｌ１ RSSKSLLHSNGITYLY（配列番号５５）
ＣＤＲ－Ｌ２ QMSNLAS（配列番号５６）
ＣＤＲ－Ｌ３ AQNLELPWT（配列番号５７）
抗ネクチン－４抗体は、例えば、アミノ酸配列：ＳＹＷＭＨ（配列番号５２）もしくはその少なくとも４つの連続するアミノ酸の配列を含み、適宜、これらのアミノ酸のうちの１つもしくは複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＨＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＥＩＤＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号５３）もしくはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０の連続するアミノ酸の配列を含み、適宜、これらのアミノ酸のうちの１つもしくは複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＨＣＤＲ２；アミノ酸配列：ＳＧＮＹＤＡＭＤＹ（配列番号５４）もしくはその少なくとも４、５もしくは６つの連続するアミノ酸の配列を含み、適宜、これらのアミノ酸のうちの１つもしくは複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＨＣＤＲ３；アミノ酸配列：ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹ（配列番号５５）もしくはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０の連続するアミノ酸の配列を含み、適宜、これらのアミノ酸のうちの１つもしくは複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＬＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＱＭＳＮＬＡＳ（配列番号５６）、もしくはその少なくとも４、５もしくは６つの連続するアミノ酸の配列を含み、適宜、これらのアミノ酸のうちの１つもしくは複数が異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＬＣＤＲ２領域；および／またはアミノ酸配列：ＡＱＮＬＥＬＰＷＴ（配列番号５７）もしくはその少なくとも４、５、６、７もしくは８つの連続するアミノ酸の配列を含み、適宜、これらのアミノ酸のうちの１つもしくは複数が欠失していても異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、ＬＣＤＲ３領域を含み得る。ＣＤＲ位置はＫａｂａｔ番号付けに従っていてもよい。
任意の態様において、抗体または抗体断片（例えば１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂ、６Ａ７または５Ｅ７）の規定の可変領域、ＦＲおよび／またはＣＤＲ配列は、１つまたは複数の配列改変、例えば、置換（１、２、３、４、５、６、７、８つ以上の配列改変）を含んでもよい。一実施形態において、置換は保存的改変である。
抗体の断片および誘導体（別段の記述または文脈上の明確な矛盾がない限り、本出願において使用される「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語に包含される）は、当技術分野において公知の技法によって製造することができる。「断片」は、無傷抗体の一部、概して抗原結合部位または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；連続するアミノ酸残基の１つの途切れていない配列からなる一次構造を有するポリペプチドである任意の抗体断片（本明細書では「一本鎖抗体断片」または「一本鎖ポリペプチド」と称される）、例えば、限定されないが（１）一本鎖Ｆｖ分子、（２）１つのみの軽鎖可変ドメイン、または軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有するその断片を含有し、関連する重鎖分子を含有しない一本鎖ポリペプチド、および（３）１つのみの重鎖可変領域、または重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有するその断片を含有し、関連する軽鎖分子を含有しない一本鎖ポリペプチド；ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。とりわけ、ナノボディ、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体または「ｄＡｂ」が挙げられる。
抗ネクチン－４抗体または抗体断片（例えば可変領域および／もしくはＣＤＲ）は、適宜、多重特異性（例えば、二重特異性）抗体またはタンパク質として具体化されてもよい。例えば、多重特異性タンパク質は、本明細書の任意の実施形態の抗体の超可変領域（例えば、ＶＨおよびＶＬ）、ならびに異なる抗体、例えばネクチン－４以外の目的の抗原に結合する抗体）の超可変領域（例えば、ＶＨおよびＶＬ）を含んでもよい。
細胞によって発現される本開示の抗体または抗体断片、およびそのような抗体または抗体断片を使用する癌の処置の方法もまた包含される。例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞が構築され得る。ＣＡＲは、典型的には、Ｔ細胞抗原受容体複合体ゼータ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインと融合した細胞外一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含み、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などのエフェクター細胞において発現した場合に、モノクローナル抗体の特異性に基づいて抗原認識を変更する能力を有するように操作される。一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメイン（ＴＭ）と、ネクチン－４特異的細胞外ドメイン（例えば、本開示の抗体もしくは抗体断片または本開示の抗体の可変重鎖および軽鎖領域に由来するかまたはそれを含むドメイン）とを含むネクチン－４特異的キメラ免疫受容体を細胞表面膜に発現する、および有する遺伝子操作された免疫細胞が提供される。また、ネクチン－４特異的キメラ免疫受容体、受容体をコードするＤＮＡコンストラクト、および発現に適した配向のコンストラクトを含有するプラスミド発現ベクターも提供される。
一実施形態において、抗体はヒト化される。抗体の「ヒト化」形態は、マウス免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくは抗体の他の抗原結合部分配列）である。大半の部分において、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ここで、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基は、元の抗体（ドナー抗体）の所望の特異性、親和性、および能力を維持しながら、元の抗体のＣＤＲ由来の残基と置き換えられている。
一部の場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基と置き換えられてもよい。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含むことができる。これらの改変は、抗体性能をさらに改良および最適化するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域が元の抗体のものに対応し、全てまたは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことができる。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分を最適に含む。さらなる詳細に関しては、それらの開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Jones et al., Nature, 321, pp. 522 (1986)、Reichmann et al, Nature, 332, pp. 323 (1988)、Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2, pp. 593 (1992)、Verhoeyen et Science, 239, pp. 1534、および米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい。
ヒト化抗体の作製に使用される軽鎖と重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下するのに非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」方法では、抗体の可変ドメインの配列は、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。次いで、マウスの配列に最も近いヒト配列がヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として認められる（Sims et al., J. Immunol. 151, pp. 2296 (1993)、Chothia and Lesk, J. Mol. 196, 1987, pp. 901）。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定の亜群の全てのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークが、いくつかの異なるヒト化抗体のために使用することができる（Carter et al., PNAS 89, pp. 4285 (1992)、Presta et al., J. Immunol., 151, p. 2623 (1993)）。
抗体がネクチン－４に対する高親和性および他の好都合な生物学的特性を保持している状態でヒト化されることがさらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法では、ヒト化抗体は、親配列、ならびに親およびヒト化配列の３次元モデルを使用した様々な概念上のヒト化産物の解析のプロセスによって調製される。３次元免疫グロブリンモデルは、一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された免疫グロブリン候補配列のあり得る３次元構造を例示および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の検証は、免疫グロブリン候補配列の機能化における、残基の考えられる役割の解析、すなわち、免疫グロブリン候補の抗原と結合する能力に影響を与える残基の解析を可能にする。この点において、ＦＲ残基は、標的抗原に対する向上した親和性などの所望の抗体特徴が達成されるように、コンセンサスおよび移入配列から選択および組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は抗原結合に影響を与えることに直接および最も実質的に関与する。一例において、ヒト化抗体鎖のＦＲは、非ヒトドナー（例えば、５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７抗体）の可変領域と少なくとも約６０％の全体的な配列同一性、好ましくは少なくとも約７０％または８０％の全体的な配列同一性を有するヒト可変領域に由来する。ヒト化重鎖および／または軽鎖可変領域は、非ヒトドナー（例えば、５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７抗体）のそれぞれの重鎖および／または軽鎖可変領域と少なくとも約６０％、７０％または８０％の全体的な配列同一性を共有してもよい。「ヒト化」モノクローナル抗体を作製する別の方法は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）を免疫化のために使用されるマウスとして使用することである。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅとは、免疫グロブリン遺伝子が機能性ヒト免疫グロブリン遺伝子と置き換えられているマウス宿主である。したがって、このマウスによって、またはこのマウスのＢ細胞から作製されたハイブリドーマにおいて産生される抗体はすでにヒト化されている。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，１６２，９６３号に記載されている。ヒト抗体はまた、様々な他の技法に従って、例えばヒト抗体レパートリーを発現するように操作された他のトランスジェニック動物を免疫化のために使用することによって（Jakobovitz et al., Nature 362 (1993) 255）、またはファージディスプレイ法を使用した抗体レパートリーの選択によって製造されてもよい。そのような技法は当業者に公知であり、本出願に開示されているモノクローナル抗体から実行することができる。
有利には、本開示の抗体は、抗体コンジュゲートを調製するための方法において使用することができる。一実施形態において、抗体コンジュゲートを調製するための方法は、細胞毒性剤（Ｚ）を本開示の抗ネクチン－４抗体または抗体断片にコンジュゲートすることを含む。一実施形態において、細胞毒性剤（Ｚ）は、リンカー（Ｘ）を介して抗体または断片にコンジュゲートしていると規定することができる。Ｘは抗体または断片（Ａｂ）と細胞毒性剤（Ｚ）とを接続するリンカーであり、例えば、コンジュゲートしている場合、ＸはＡｂおよびＺの一方または両方への共有連結に続くリンカーの残基である。
本明細書の実施形態において、抗体－薬物コンジュゲートを調製するための方法は、本開示の抗ネクチン－４抗体または抗体断片（Ａｂ）を細胞毒性剤（Ｚ）と接触および／または反応させる工程を含む。接触は、本開示のある態様の抗体薬物コンジュゲートが形成されるかまたは得られるような好適な条件下において実行することができる。Ｚは、例えば細胞毒性剤（Ｚ）とリンカー（Ｘ）またはリンカー（Ｘ）の部分とを含む化合物に含まれてもよく、したがって、この工程は、本開示の抗ネクチン－４抗体または抗体断片を細胞毒性剤（Ｚ）とリンカー（Ｘ）またはリンカー（Ｘ）の部分とを含む化合物と接触させることを含む。方法は、適宜、形成された抗体薬物コンジュゲートを単離または回収する工程、および適宜、医薬としての使用のために組成物をさらに加工する工程、適宜、ヒト対象への投与のために前記抗体を（例えば、薬学的賦形剤と共に）製剤化する工程を規定することができる。
ＡＤＣを作製する方法は、抗体または抗体断片を２、３、４、５、６、７または８分子の細胞毒性剤にコンジュゲートすることを含んでもよい。得られる組成物は、２～４の間、４～６の間、６～８の間のＤＡＲによって特徴付けられてもよい。方法は、抗体を４分子の細胞毒性剤にコンジュゲートすることを含んでもよい。方法は、ＤＡＲを評価すること、およびＤＡＲが所定の仕様（例えば本明細書に開示されるＤＡＲまたはＤＡＲ範囲、すなわち約２、４、６、または８などのＤＡＲ）に対応する場合、医薬としての使用のために組成物をさらに加工すること、適宜、ヒト対象への投与のために前記抗体を（例えば、薬学的賦形剤と共に）製剤化することをさらに含んでもよい。
一部の実施形態において、リンカー（Ｘ）－（Ｚ）要素は、（Ｘ）および（Ｚ）を含む化合物を（Ａｂ）と接触（および反応）させることによって抗体薬物コンジュゲートを形成する前に調製および単離される。
一部の実施形態において、方法は、
（ａ）リンカー（Ｘ）またはリンカー（Ｘ）の部分を（Ａｂ）と接触および／または反応させて、Ａｂ－Ｘコンジュゲートを形成すること、ならびに
（ｂ）工程（ａ）のＡｂ－Ｘを細胞毒性剤（Ｚ）、またはリンカー（Ｘ）の第２の部分と（Ｚ）とを含む化合物と接触および／または反応させることによって抗体薬物コンジュゲートを形成すること
を含む。
例えば、Ｘは、例えば細胞内条件下であってもよい生理的条件下において切断可能である部分を含む分子を表し得る。一実施形態において、Ｘは、（ｉ）スペーサー（Ｙ）、（ｉｉ）切断可能な部分、および（ｉｉｉ）任意選択の自己脱離または非自己脱離スペーサー系（Ｙ’）を含む分子を表す。切断可能な部分は、例えばオリゴペプチド（例えばジ、トリ、テトラまたはペンタペプチド）であり得る。スペーサーＹはＡｂと切断可能な部分との間に位置し得、スペーサー系（Ｙ’）は切断可能な部分とＺとの間に位置し得る。
一部の実施形態において、リンカーＸまたはスペーサーＹは、適宜、抗体のアミノ酸または抗体のアミノ酸に結合している相補的反応基（Ｒ’）と（例えば脱保護後であってもよい好適な条件下において）反応することができる反応基（Ｒ）を含むと規定することができる。Ｒは、抗体上の遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリルまたはカルボキシル基と反応性の基であってもよい。例えば、Ｒは、抗体上のチオール基（スルフヒドリル基とも称される）と反応性である以下の構造：
を有するマレイミド－Ｎ－イル基であり得る。
一部の実施形態において、リンカーＸまたはスペーサーＹは、適宜、反応基Ｒと抗体のアミノ酸または抗体のアミノ酸に結合している相補的反応基（Ｒ’）との反応の残基を含むと規定することができる。Ｒは、抗体上の遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリルまたはカルボキシル基と反応性の基と前記遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリルまたはカルボキシル基との反応の残基であってもよい。
任意の実施形態において、抗ネクチン－４抗体または抗体断片を化合物（例えばリンカーおよび／または細胞毒性剤）と接触および／または反応させる工程の前に、方法は、抗ネクチン－４抗体または抗体断片を調製、選択または用意する工程を含む。一実施形態において、この工程は、抗ネクチン－４抗体または抗体断片を調製、選択または用意すること、および抗体または抗体断片が本開示の抗ネクチン－４抗体または抗体断片の特色を有するか否かを判定または試験することを含む。
例えば、抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、ネクチン－４のＶＣ１架橋ドメインに結合する能力について試験することができる。ネクチン－４のＶＣ１架橋ドメインに結合すると判定された抗体または抗体断片を、次いで、化合物（例えばリンカー（Ｘ）および／または細胞毒性剤（Ｚ））と接触および／または反応させる。例えば、抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、突然変異型ネクチン－４ポリペプチド（例えば残基Ｑ２３４、Ｋ１９７および／またはＳ１９９に置換を含む突然変異型ネクチン－４ポリペプチド）に結合する能力について試験することができる。突然変異型ネクチン－４ポリペプチドへの結合の低減または喪失（例えば野生型ネクチン－４ポリペプチドへの結合と比較して）を有すると判定された抗体または抗体断片を、次いで、化合物（例えばリンカー（Ｘ）および／または細胞毒性剤（Ｚ））と接触および／または反応させる。
別の例において、抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、ネクチン－４発現腫瘍細胞（例えば接着腫瘍細胞）間の細胞－細胞接着を減少させる能力について、および／またはネクチン－４発現腫瘍細胞（例えば３次元細胞培養における、腫瘍スフェロイド形成アッセイにおける）の成長を抑制する能力について試験することができる。ネクチン－４発現腫瘍細胞間の細胞－細胞接着を減少させる能力を有すると判定された、および／またはネクチン－４発現腫瘍細胞（例えば接着腫瘍細胞）の成長を抑制する能力について判定された抗体または抗体断片を、次いで、化合物（例えばリンカー（Ｘ）および／または細胞毒性剤（Ｚ））と接触および／または反応させる。
別の例において、抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、腫瘍を細胞毒性剤（例えば細胞毒性剤Ｚ、またはＺと同じ薬物クラスの細胞毒性剤、例えばカンプトテシン薬剤）に対して感作する能力について試験することができる。腫瘍を細胞毒性剤に対して感作する能力を有すると判定された抗体または抗体断片を、次いで、化合物（例えばリンカー（Ｘ）および／または細胞毒性剤（Ｚ））と接触および／または反応させる。
適宜、方法は、抗体を化合物（例えばリンカー（Ｘ）および／または細胞毒性剤（Ｚ））と接触させる前に、任意の２つ以上の抗体試験工程を含むことができる。
本明細書にさらに記載されるように、細胞毒性剤を抗体にコンジュゲートするための一部の周知の方法は、初めに抗体がリンカーまたはリンカーの一部を用いて改変され、細胞毒性剤が抗体－リンカー組成物にコンジュゲートする反応がそれに続く複数の反応工程を伴う。
一実施形態において、抗体コンジュゲートを調製するための方法であって、
（ｉ）抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを用いて形質転換した宿主細胞を培養すること；先行する工程において得られた培養から目的の抗体を採取および精製することによって抗ネクチン－４抗体を得ること、
（ｉｉ）抗ネクチン－４抗体または抗体断片を、（ａ）抗体のアミノ酸（例えば、アミノ酸の側鎖もしくはグリカン、またはアミノ酸もしくはアミノ酸のグリカンに結合した基）と反応することができる第１の反応基、および（ｂ）第２の反応基（Ｒ’）を含む化合物（Ｌ）と接触させて、化合物（Ｌ）により機能化された１つまたは複数のアミノ酸を含む改変抗体を得ること、ならびに
（ｉｉｉ）工程（ｉ）の改変抗体を、（ａ）反応基（Ｒ’）に相補的な反応基（Ｒ）、（ｂ）細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるアミノ酸単位（例えばジ、トリ、テトラまたはペンタペプチド）、（ｃ）適宜、非自己脱離または自己脱離スペーサー（Ｙ’）、および（ｄ）細胞毒性剤（Ｚ）を含む化合物と反応させること
を含む方法が提供される。工程（ｉｉ）の化合物は、Ｒとアミノ酸単位との間に配置されたスペーサー（Ｙ）をさらに含んでもよい。
適宜、抗ネクチン－４抗体を得る工程は、抗原の注射により動物を免疫化し、血液を採取し、その抗体価をアッセイして、脾臓をいつ切除するかを決定することによって抗体産生細胞を調製する工程；骨髄腫細胞を調製する工程；抗体産生細胞を骨髄腫と融合する工程；所望の抗体を産生するハイブリドーマの群をスクリーニングする工程；ハイブリドーマを単一細胞クローンに分割する工程（クローニング）；大量のモノクローナル抗体を産生するためにハイブリドーマを培養するかもしくはハイブリドーマを移植した動物を飼育する工程；ならびに／またはそのように産生されたモノクローナル抗体を生物活性および結合特異性について検査するか、もしくはそれを標識試薬としての特性についてアッセイする工程などをさらに含むことができる。
適宜、抗ネクチン－４抗体を得る工程は、細胞ライブラリーを調製する工程をさらに含むことができる。
一実施形態において、ＲおよびＲ’はクリック反応または環化付加を起こすことができ、ここで、Ｒはアルキン部分を含むかもしくはアルキン部分であり、Ｒ’はアジド部分を含むかもしくはアジド部分であってもよいか、またはＲ’はアルキン部分を含むかもしくはアルキン部分であり、Ｒはアジド部分を含むかもしくはアジド部分であり、工程（ｉｉ）の反応は１，３－双極子環化付加である。
一実施形態において、工程（ｉ）の反応は触媒の存在下において実行され、触媒は酵素（例えば、トランスグルタミナーゼ）であってもよい。
一実施形態において、抗ネクチン－４抗体または抗体断片を化合物（Ｌ）と接触させる前に、工程（ｉ）は、抗ネクチン－４抗体または抗体断片を改変する工程を含む。例えば、抗体または抗体断片は、それを、抗体グリコシル化（例えば、Ｋａｂａｔ残基Ｎ２９７における）を改変することができる酵素と反応または接触させることによって改変することができる。一例において、改変は、コアＮ－アセチルグルコサミン置換基を含む抗体を得るために、エンドグリコシダーゼの存在下における、コアＮ－アセチルグルコサミンを有する抗体グリカンの脱グリコシル化を含み、ここで、前記コアＮ－アセチルグルコサミンおよび前記コアＮ－アセチルグルコサミン置換基はフコシル化されていてもよい。エンドグリコシダーゼの例としては、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＥ、Ｅｎｄｏ１８Ａ、ＥｎｄｏＦ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＤ、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＴおよびＥｎｄｏＳＨならびに／またはそれらの組合せが挙げられる。
抗原結合タンパク質（例えば抗体）分子および細胞毒性剤（例えばカンプトテシン誘導体分子）は、リンカーによって接続される。そのような実施形態において、イムノコンジュゲートは、例えば式（ＩＩ）：
Ａｂ－（Ｘ－（Ｚ）ｎ）ｍ 式（ＩＩ）
［式中、
Ａｂは抗ネクチン４抗体または抗体断片）であり、
ＸはＡｂとＺとを接続するリンカー、例えば、ＡｂおよびＺの一方または両方への共有連結に続くリンカーの残基であり、
Ｚは細胞毒性剤、例えばカンプトテシン類似体であり、Ｚは化合物１または２（エキサテカンまたはＳＮ－３８分子）の構造を含んでもよく、
ｎは１または２であり、
ｎが１である場合、ｍは１～８であるか、またはｍは１～８もしくは１～６のうちから選択される整数であってもよく、ｍは１～４のうちから選択される整数であってもよく、ｍは２もしくは４であってもよく；ｍは２、３、４、５、６、７または８であってもよく；ｎが２である場合、ｍは１～４であるか、またはｍは１～４もしくは１～３のうちから選択される整数であってもよく、ｍは１～４のうちから選択される整数であってもよく、ｍは２もしくは４であってもよく；ｍは１、２、４または４であってもよい］
によって表すことができる。適宜、「ｎ」は分岐度または重合度を表すと規定することができる。「ｎ」および「ｍ」は、複数の抗体を含む組成物における平均を表すと規定することができる。
一実施形態において、Ｘは、例えば細胞内条件下であってもよい生理的条件下において切断可能である部分を含む分子を表す。一実施形態において、Ｘは、（ｉ）スペーサー（Ｙ）、（ｉｉ）切断可能な部分および（ｉｉｉ）任意選択の自己脱離または非自己脱離スペーサー系（Ｙ’）を含む分子を表す。スペーサーＹはＡｂと切断可能な部分との間に位置し得、スペーサー系（Ｙ’）は切断可能な部分とＺとの間に位置し得る。分子ＸまたはスペーサーＹは、適宜、反応基（Ｒ）、または反応基Ｒと抗体のアミノ酸もしくは抗体のアミノ酸に結合している相補的反応基（Ｒ’）との反応の残基を含むと規定することができる。
変数ｍは、イムノコンジュゲートにおける抗体分子１つ当たりの－Ｘ－（Ｚ）ｎ部分の数を表す。複数の抗ネクチン－４ ＡＤＣを含む組成物において、抗体分子１つ当たりの－Ｘ－Ｚ部分の数である数値「ｍ」は変動し得る。したがって、本明細書における式の複数のイムノコンジュゲートを含む例示的な組成物において、ｍはＡｂ１つ当たりの－Ｘ－（Ｚ）ｎ部分の数の平均であり、その場合、ｍは平均薬物負荷または薬物：抗体比（ＤＡＲ）と称すこともできる。平均薬物負荷またはＤＡＲは有利には、Ａｂ１つ当たり１～約８の（－Ｘ－（Ｚ）ｎ）部分の範囲であり得る。部分Ｘに結合しているＺ部分の数である「ｎ」は、例えば１または２であり得る。典型的には、ｎは１である。一部の実施形態において、ｎは１であり、ｍは平均薬物負荷を表し、ｍは２～８の間である。一部の実施形態において、ｎは１であり、ｍは平均薬物負荷を表し、ｍは２～６の間である。一部の実施形態において、ｎは１であり、ｍは平均薬物負荷を表し、ｍは４～８の間である。一部の実施形態において、ｎは１であり、ｍは平均薬物負荷を表し、ｍは６～８の間、適宜、約６、７または８である。一部の実施形態において、ｎは１であり、ｍは平均薬物負荷を表し、ｍは４～６の間、適宜、約４、５または６である。
Ａｂ１つ当たりの（－Ｘ－Ｚ）部分の数は、質量分析法、ＥＬＩＳＡアッセイ、およびＨＰＬＣなどの従来の手段によって特徴付けることができる。ｍに関するイムノコンジュゲートの定量分布もまた決定することができる。一部の場合において、他の薬物負荷を有するイムノコンジュゲートから識別される、ｍがある特定の値である均一なイムノコンジュゲートの分離、精製、および特性評価は、逆相ＨＰＬＣまたは電気泳動などの手段によって達成することができる。
一実施形態において、本開示の処置方法において使用される抗ネクチン－４組成物は、式（Ｉ）：
Ａｂ－（Ｘ－（Ｚ）ｎ）ｍ 式（ＩＩ）
［式中、
Ａｂは抗ネクチン－４抗原結合タンパク質（例えば抗体または抗体断片）であり、
ＸはＡｂとＺとを接続する分子、例えば、ＡｂおよびＺの一方または両方への共有連結に続くリンカーの残基であり、
Ｚは細胞毒性剤、適宜トポイソメラーゼ阻害薬、適宜カンプトテシン類似体、適宜エキサテカンまたはＳＮ－３８分子、例えば、化合物１または２の構造を有する分子を含むカンプトテシン類似体であり、
ｎは１または２であり、
抗体試料におけるイムノコンジュゲートの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％は、２または４、少なくとも２、２～４の間、少なくとも４、４～６の間または４～８の間であるｍ（Ｘ－Ｚ部分の数）を有し、ここで、ｎが１であって、抗体試料におけるイムノコンジュゲートの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％が、２または４、少なくとも２、２～４の間、少なくとも４、４～６の間または４～８の間であるｍ（Ｘ－Ｚ部分の数）を有してもよい］
によって表される複数のイムノコンジュゲートを含むと特徴付けられる。
一実施形態において、本開示の処置方法において使用される抗ネクチン－４組成物は、式（Ｉ）：
Ａｂ－（Ｘ－（Ｚ）ｎ）ｍ 式（ＩＩ）
［式中、
Ａｂは抗ネクチン－４抗原結合タンパク質（例えば抗体または抗体断片）であり、
ＸはＡｂとＺとを接続する分子、例えば、ＡｂおよびＺの一方または両方への共有連結に続くリンカーの残基であり、
ＺはエキサテカンまたはＳＮ－３８分子、例えば、化合物１または２の構造を含む分子を含むカンプトテシン類似体であり、
ｎは１であり、
抗体試料におけるイムノコンジュゲートの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％は、６、少なくとも６、６～８の間、または８であるｍ（Ｘ－Ｚ部分の数）を有する］
によって表される複数のイムノコンジュゲートを含むと特徴付けられる。
細胞毒性剤を含むリンカーを抗体または抗原結合タンパク質に、特定のアミノ酸残基に対して非特異的にまたは特異的に共有連結するために、様々な方法が使用可能であることが理解されるだろう。リンカー（Ｘ）は、リンカーの切断が細胞毒性剤（例えば化合物１、化合物２、化合物１３など）を細胞内環境に放出するように、例えば、実施例に示すように細胞内条件下であってもよい生理的条件下において切断可能である部分を含むことができる。リンカーは、抗体分子上の化学反応基、例えば、遊離アミノ、イミノ、ヒドロキシル、チオールまたはカルボキシル基（例えば、ＮもしくはＣ末端、１つもしくは複数のリジン残基のイプシロンアミノ基、１つもしくは複数のグルタミン酸もしくはアスパラギン酸残基の遊離カルボン酸基、または１つもしくは複数のシステイニル残基のスルフヒドリル基）、炭水化物、あるいは概して抗体に導入されたかまたは操作されて組み込まれた任意の反応基に結合することができる。リンカーが結合する部位は、抗体分子のアミノ酸配列における天然残基であっても、例えばＤＮＡ組換え技術によって（例えば、システインもしくはプロテアーゼ切断部位をアミノ酸配列に導入することによって、すなわち非天然アミノ酸残基を導入することによって）、またはタンパク質生化学（例えば、アミノ酸結合グリカンの酵素改変である糖鎖改変による還元、ｐＨ調整もしくはタンパク質分解）によって抗体分子に導入されてもよい。
一部の実施形態において、リンカー（Ｘ）は、フェニルアラニン、グリシン、バリン、リジン、シトルリン、セリン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸から選択されるアミノ酸を含むペプチド残基を含み、リンカー（Ｘ）はテトラペプチド残基を含んでもよい。
ある特定の実施形態において、リンカー（Ｘ）の前駆体である中間体を適切な条件下において細胞毒性剤（Ｚ）と反応させる。ある特定の実施形態において、細胞毒性剤および／または中間体上の反応基が使用される。一部の実施形態において、細胞毒性剤と中間体との反応の生成物、または誘導体化細胞毒性剤を、その後、適切な条件下において抗体分子と反応させる。他の実施形態において、初めにリンカー（Ｘ）の前駆体を適切な条件下において抗体分子と反応させて、リンカー（Ｘ）の前駆体に結合した抗体を得て、その後、抗体を、細胞毒性剤（Ｚ）を含む分子と反応させる。
一部の実施形態において、リンカー（Ｘ）は、細胞内環境（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ（ｃａｖｅｏｌｅａ）内）に存在する切断物質によって切断可能である。リンカーは、例えば、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含むがこれらに限定されない細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカーまたはアミノ酸単位を含むことができる。一部の実施形態において、ペプチジルリンカー部分は、少なくとも２アミノ酸長または少なくとも３アミノ酸長である。切断物質としては、カテプシンＢおよびＤならびにプラスミンを挙げることができ、これらは全て、ジペプチド薬誘導体を加水分解して、標的細胞の内部において活性な薬物の放出をもたらすことが公知である。細胞に存在する酵素によって切断可能であるペプチジルリンカーが最も典型的である。具体的な実施形態において、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチジルリンカーは、Ｖａｌ－ＣｉｔリンカーまたはＰｈｅ－Ｌｙｓリンカーである（例えば、ドキソルビシンとバリン－シトルリンリンカーとの合成を記載している米国特許第６，２１４，３４５号を参照されたい）。バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）要素は、以下に示す構造：
を有することができる。
別の具体的な実施形態において、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチジルリンカーは、バリン－アラニン（Ｖａｌ－Ａｌａ）リンカーである。ｖａｌ－ａｌａ要素は、以下に示す構造：
を有することができる。
別の具体的な実施形態において、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチジルリンカーは、グリシン含有オリゴペプチドリンカー、例えばグリシンおよびフェニルアラニン含有オリゴペプチドリンカー、適宜ＧＧＦ、ＤＧＧＦ、（Ｄ－）Ｄ－ＧＧＦ、ＥＧＧＦ、ＳＧＧＦ、ＫＧＧＦ、ＤＧＧＦＧ、ＤＤＧＧＦＧ、ＫＤＧＧＦＧ、ＧＧＦＧＧＧＦ ＧＧＦＧ、ＧＧＦＧＧまたはＧＧＦＧＧＧリンカーであり（例えば、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，８３５，８０７号を参照されたい）、ここで、「（Ｄ－）ＤはＤ－アスパラギン酸を表す。
一部の実施形態において、リンカーは、抗体のネクチン－４と結合する能力および／またはネクチン－４によって媒介される細胞－細胞相互作用を阻害する能力との干渉を回避するために抗体をＺから遠ざけるスペーサーまたはストレッチャーとして作用するように機能し得る。リンカーは、スペーサー単位（Ｙ）および／またはスペーサーもしくはスペーサー系（Ｙ’）を含んでもよい。したがって、スペーサーＹはＡｂと切断可能な部分との間に位置し得る。スペーサー系（Ｙ’）は切断可能な部分とＺとの間に位置し得る。分子ＸまたはスペーサーＹは、適宜、反応基（Ｒ）、または反応基Ｒと抗体のアミノ酸もしくは抗体のアミノ酸に結合している相補的反応基（Ｒ’）との反応の残基を含むと規定することができる。スペーサーＹは、例えば、抗体のアミノ酸、例えば、抗体の硫黄原子、第一級もしくは第二級アミノ基または炭水化物基との結合を（例えばその反応基Ｒを介して）形成する分子であり得、このスペーサーまたはストレッチャー（Ｙ）は、抗体を細胞毒性剤（Ｚ）またはＺに連結する自己脱離および／もしくは非自己脱離スペーサー（Ｙ’）をさらに有してもよい切断可能なアミノ酸単位（例えばペプチジルリンカー、切断可能なジ、トリ、テトラもしくはペンタペプチドに連結させる。したがって、スペーサー（Ｙ）が一方の末端においてアミノ酸単位（例えば切断可能なジ、トリ、テトラまたはペンタペプチド）に連結する場合、切断可能なアミノ酸単位は、Ｚに直接連結することができるか、またはアミノ酸単位とＺとを連結する非自己脱離もしくは自己脱離スペーサーなどのさらなるスペーサー（Ｙ’）を含むことができる。
スペーサー（Ｙ）は、適宜、置換または非置換アルキルまたはヘテロアルキル鎖であるかまたはそれを含むと規定することができ、Ｙは２～１００個の原子、適宜２～４０、２～３０、２～２０、４～４０、４～３０または４～２０個の原子の鎖長を有してもよく、適宜、１個または複数の原子は、炭素以外のもの、例えば酸素、硫黄、窒素、または他の原子であってもよく、適宜、鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル－Ｓ－、チオール、アルキル－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミドにより置換されている。
スペーサー（Ｙ）は、適宜、安定性増強部分を含むと規定することができる。例えば、スペーサーＹは、リンカー設計において直交ポリ－エチレングリコール（ＰＥＧ）部分またはポリサルコシン（ポリ－Ｎ－メチルグリシンもしくはＰＳＡＲ）部分を含むことができる（例えば、それらの開示が参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２０１９／０８１４５５号、国際公開第２０１５／０５７６９９号および国際公開第２０１６／０５９３７７号を参照されたい）。
一部の具体的な実施形態において、スペーサー（Ｙ）は１つまたは複数のエチレンオキシドモノマーを含んでもよく、Ｙはポリエチレンオキシド部分を含んでもよく、Ｙは１～２４、適宜１～１２、適宜１～８、適宜１～６つの間のポリエチレンオキシド部分を含んでもよく、Ｙは構造－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ－［ここで、ｘは１～１２、適宜１～８、適宜１～６である］を含んでもよい。
好適な安定性増強部分の一例、スペーサー鎖Ｙは、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０５７６９９号または同第ＷＯ２０１９／０８１４５５号に開示されている安定性増強部分を含むことができる。例えば、スペーサー鎖Ｙは、直交コネクタ部分および安定性増強部分を含むことができる。安定性増強部分はＰＥＧホモポリマー、または概して、直交コネクタ部分に結合した任意の単一分子量ホモポリマー（例えばＰＥＧもしくはポリサルコシンホモポリマー）であり得る。ホモポリマーは、例えば１～４、１～６、１～８、１～１０、１～１２、少なくとも６、８もしくは１０、または６～１２、６～２４、６～７２単位のＰＥＧまたは他のモノマーを有し得る。直交コネクタという用語は、分枝リンカー単位構成成分を指し、これは、リンカー部分（例えばスペーサーＹの鎖）をホモポリマー単位に接続し、リンカー［例えば切断可能なオリゴペプチド（Ｐｅｐ）およびスペーサーＹ’］を介して細胞毒性剤（Ｚ）に接続し、結果として、ホモポリマー単位は細胞毒性剤に対して平行な配置（直列配置ではない）となる（ホモポリマーはＰｅｐ－Ｙ’－Ｚ部分と平行となる）。直交コネクタ部分は、例えば、グルタミン酸、リジンおよびグリシンから選択されてもよい１つまたは複数の天然または非天然アミノ酸であり得る。アミノ酸直交コネクタ部分は、直交コネクタ部分アミノ酸残基が、一方のアミノ酸のα－カルボキシル基と他方のアミノ酸のα－アミノ基とのペプチド結合を介して、ペプチジルリンカー［例えば式ＶまたはＶＩにおける（Ｐｅｐ）］のアミノ酸残基に接続されるように、スペーサー鎖Ｙの末端に配置されてもよい。Ｙは、例えば、直交コネクタ部分と式Ｄ：
［式中、Ｒ１とＲ２とは異なり、
Ｒ１およびＲ２のうちの一方はＨまたは不活性基であり、Ｒ１およびＲ２のうちの他方は機能化反応基であり、前記基は、不活性基が非反応性であるような反応条件において、直交コネクタ部分の結合可能な基への共有結合に対して反応性であり、同一であるかまたは異なっているＺ１およびＺ２は任意選択のスペーサーであり、ｎは１以上であり、ｋは２以上である］
の部分との反応の結果を含み得る。
別の例において、スペーサーＹは、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７／００７２０６８Ａ１号に開示されている基、例えば式（Ｅ）：
［式中、
ａは０または１であり、
Ｒ１は、水素、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ３～Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から選択され、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ３～Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基は、Ｏ、ＳおよびＮＲ３から選択される１個または複数のヘテロ原子によって適宜置換および適宜中断されており、Ｒ３は、水素およびＣ１～Ｃ４アルキル基からなる群から独立的に選択される］の基またはその塩を含み、式Ｅの基またはその塩は、スペーサー鎖Ｙの前記第１の末端と第２の末端との間に位置する。
この態様では、スペーサーＹは、－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－を含み得る。
適宜、そのようなスペーサーＹは、以下の構造：－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－［ここで、ｎは１～６、好ましくは２～４の整数である］をさらに含むことができる。そのような構造としては、例えば、－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＮＨ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－が挙げられる。
アミノ酸単位（例えば切断可能なジ、トリ、テトラまたはペンタペプチド）とＺとの間に配置されているスペーサーまたはスペーサー系（Ｙ’）は自己脱離スペーサーであっても非自己脱離スペーサーであってもよい。スペーサーＹ’は、例えば置換または非置換アルキルまたはヘテロアルキル鎖を含んでもよく、Ｙは２～３０個の原子、適宜２～２０、４～２０、２～１０または４～２０個の原子の鎖長を有してもよく、適宜、１個または複数の原子は、炭素以外のもの、例えば酸素、硫黄、窒素、または他の原子であってもよく、適宜、鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル－Ｓ－、チオール、アルキル－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミドにより置換されている。一実施形態において、Ｙ’はｐ－アミノベンジルオキシカルボニル基を含む。一実施形態において、Ｙ’は、非自己脱離スペーサーであり、－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－［ここで、ｎは０～５の整数である］の構造を含み、前記構造は－Ｏ－または単結合によって切断可能な部分に接続している。例えば、Ｙ’は、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、ＨＯ－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－または－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－基であり得るかまたはそれを含み得る。
「自己脱離」スペーサー単位は、別個の加水分解工程を伴わずに薬物部分の放出を可能にする。自己脱離スペーサーが使用される場合、アミノ酸単位の切断または形質転換の後に、スペーサーのアミノ酸単位に連結した側がブロックされなくなり、１つまたは複数の部分Ｚの最終的な放出をもたらす。自己脱離型（ｓｅｌｆ－ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）スペーサー系は、例えば、それらの開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第０２／０８３１８０号および国際公開第２００４／０４３４９３号に記載されているもの、ならびに当業者に公知の他の自己脱離型スペーサーであり得る。ある特定の実施形態において、リンカーのスペーサー単位はｐ－アミノベンジル単位を含む。そのような実施形態の１つにおいて、ｐ－アミノベンジルアルコールはアミド結合を介してアミノ酸単位に結合しており、ベンジルアルコールと細胞毒性剤との間にカルバメート、メチルカルバメート、またはカーボネートが生じる。一実施形態において、スペーサー単位は、例えば構造：
を有するｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）である。
自己脱離スペーサー単位の例としては、これらに限定されないが、ｐ－アミノベンジルアルコールに電子的に類似している芳香族化合物（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２５６０３０Ａ１号を参照されたい）、例えば２－アミノイミダゾール－５－メタノール（ｍｅｔｈａｎｏｉ）誘導体（Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237）およびオルトまたはパラ－アミノベンジルアセタールがさらに挙げられる。使用することができるスペーサーは、置換および非置換４－アミノ酪酸アミド（Rodrigues et al.. Chemistry Biology, 1995, 2, 223）および２－アミノフェニルプロピオン酸アミド（Amsberry, et al., J. Org. Chem., 1990, 55. 5867）などのアミド結合加水分解時に環化を受けてもよい。グリシンのａ位において置換されているアミン含有薬の脱離（Kingsbury, et al., J. Med. Chem., 1984, 27, 1447）もまた自己脱離スペーサーの例である。ｐ－アミノベンジル自己脱離スペーサー（例えばＰＡＢ）は、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－ＡｌａまたはＶａｌ－Ｃｉｔ切断可能ジペプチド単位と一緒に使用することに特に適している（ＰＡＢはジペプチドとカンプトテシン誘導体（Ｚ）との間に配置される。
「非自己脱離」スペーサー単位は、スペーサー単位の一部または全部が抗体－目的の部分コンジュゲートの酵素的（例えば、タンパク質）切断後も部分Ｚに結合したままであるものである。Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙアミノ酸単位とエキサテカン分子との間のスペーサーとしての使用に適合した非自己脱離スペーサー単位の例としては、これらに限定されないが、－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、ＨＯ－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－および－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－（例えば、ＧＧＦＧ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－エキサテカン単位を形成する）が挙げられる。ＧＧＦＧアミノ酸単位とエキサテカンとの間におけるそのようなスペーサーの使用は、化合物１３の構造を有する分子の放出をもたらす。非自己脱離スペーサー単位の他の例としては、これらに限定されないが、グリシンスペーサー単位およびグリシン－グリシンスペーサー単位が挙げられる。配列特異的酵素的切断に感受性のペプチドスペーサーの他の公知の組合せが同様に使用可能である。例えば、グリシン－グリシンスペーサー単位を含有する抗体－目的の部分コンジュゲートの腫瘍細胞関連プロテアーゼによる酵素的切断は、グリシン－グリシン－薬物部分の、抗体－目的の部分コンジュゲートの残りの部分からの放出をもたらし得る。そのような実施形態の１つにおいて、グリシン－グリシン－薬物部分は、次いで、腫瘍細胞において別個の加水分解工程に供され、それによりグリシン－グリシンスペーサー単位を薬物部分から切断する。
例示的なリンカー－細胞毒性薬部分（Ｘ－Ｚ）は、以下の式ＩＩＩおよびＩＶに示す構造のいずれかを含むことができる。
スペーサー（Ｙ）および（Ｙ’）は、適宜、直鎖または分岐鎖Ｃ１～Ｃ２０アルキレン基、Ｃ２～Ｃ２０アルケニレン基、Ｃ２～Ｃ２０アルキニレン基、Ｃ３～Ｃ２０シクロアルキレン基、Ｃ５～Ｃ２０シクロアルケニレン基、Ｃ８～Ｃ２０シクロアルキニレン基、Ｃ７～Ｃ２０アルキルアリーレン基、Ｃ７～Ｃ２０アリールアルキレン基、Ｃ８～Ｃ２０アリールアルケニレン基およびＣ９～Ｃ２０アリールアルキニレン基からなる群から独立的に選択されていると規定することができ、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基は、Ｏ、ＳおよびＮＲ１の基から選択される１個または複数のヘテロ原子によって適宜置換および適宜中断されており、Ｒ１は、水素、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ２～Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２～Ｃ２４アルキニル基およびＣ３～Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立的に選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は適宜置換されている。
スペーサー（Ｙ）および（Ｙ’）は、適宜、Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－、－Ｃ１～Ｃ１０ヘテロアルキレン－、－Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ－、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ８アルキル）－、－アリーレン－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－アリーレン－、－アリーレン－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－（Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ）－、－（Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ）－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－、－Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－（Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ）－、－（Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ）－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ１～Ｃ１０ヘテロアルキレン－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ８アルキル）－Ｃ（＝Ｏ）－、－アリーレン－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－アリーレン－Ｃ（＝Ｏ）－、－アリーレン－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－（Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ）－Ｃ（＝Ｏ）－、－（Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ）－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－（Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ）－Ｃ（＝Ｏ）－、－（Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ）－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－ＮＨ－、－Ｃ１～Ｃ１０ヘテロアルキレン－ＮＨ－、－Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ－ＮＨ－、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ８アルキル）－ＮＨ－、－アリーレン－ＮＨ－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－アリーレン－ＮＨ－、－アリーレン－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－ＮＨ－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－（Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ）－ＮＨ－、－（Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ）－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－ＮＨ－、－Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ－ＮＨ－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－（Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ）－ＮＨ－、－（Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ）－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－ＮＨ－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｓ－、－Ｃ１～Ｃ１０ヘテロアルキレン－Ｓ－、－Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ－Ｓ－、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ８アルキル）－）－Ｓ－、－アリーレン－Ｓ－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－アリーレン－Ｓ－、－アリーレン－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｓ－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－（Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ）－Ｓ－、－（Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ）－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｓ－、－Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ－Ｓ－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－（Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ）－Ｓ－、－（Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ）－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｓ－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ８アルキル）－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－アリーレン－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－アリーレン－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－アリーレン－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－（Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ）－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－（Ｃ３～Ｃ８カルボシクロ）－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－（Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ）－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－（Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ）－Ｃ１～Ｃ１０アルキレン－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－であるかまたはそれを含むと規定することができ、それぞれの場合において、－Ｘ、－Ｒ’、－Ｏ、－ＯＲ’、＝Ｏ、－ＳＲ’、－Ｓ－、－ＮＲ’２、－ＮＲ’３ ＋、＝ＮＲ’、－ＣＸ３、－ＣＮ、－ＯＣＮ、－ＳＣＮ、－Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、－ＮＣＳ、－ＮＯ、－ＮＯ２、＝Ｎ２、－Ｎ３、－ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’２、－ＳＯ３ －、－ＳＯ３Ｈ、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’、－ＯＳ（＝Ｏ）２ＯＲ’、－Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’、－Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、－ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ’）２、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ’）２、－ＰＯ３、－ＰＯ３Ｈ２、－Ｃ（＝Ｏ）Ｘ、－Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、－ＣＯ２Ｒ’、－ＣＯ２、－Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’２、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’２、およびＣ（＝ＮＲ’）ＮＲ’２から選択される置換基のうちの１つまたは複数により適宜置換されており、各Ｘは独立的にハロゲン、すなわち－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、または－Ｉであり、各Ｒ’は独立的に－Ｈ、－Ｃ１～Ｃ２０アルキル、－Ｃ６～Ｃ２０アリール、または－Ｃ３～Ｃ１４複素環である。
一実施形態において、スペーサー（Ｙ）は、適宜、例えば鎖の一方の末端に、抗体上の遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリルもしくはカルボキシル基、または炭水化物と反応性である反応基（Ｒ）を含むと規定することができる。一部の態様において、スペーサーＹはＲ基－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－（ＣＨ２）ｎ ３－Ｃ（＝Ｏ）［ここで、ｎ３は２～８の整数である］を含み、－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）は以下の式Ｆ：
によって表される構造を有する。上記構造の３位は抗体への接続位置であり得る。３位での抗体への結合は、チオエーテル形成を伴う結合によって特徴付けられる。
一実施形態において、スペーサー（Ｙ）は、適宜、例えば鎖の一方の末端に、抗体のアミノ酸に（例えば、遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリルもしくはカルボキシル基、または炭水化物を介して）結合している相補的反応基（Ｒ’）と反応性である反応基（Ｒ）、あるいは、抗ネクチン－４抗体へのコンジュゲーション後は、反応基（Ｒ）と抗体上の遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリルもしくはカルボキシル基または抗体のアミノ酸に結合している相補的反応基（Ｒ’）との反応の残基を含むと規定することができる。ＲとＲ’とによる反応基対の例としては、双直交反応、好ましくは環化付加、例えば、アジドとシクロオクチンとの間（銅不含クリックケミストリー）、ニトロンとシクロオクチンとの間などでのディールス・アルダー反応または１，３－双極子環化付加、アルデヒドおよびケトンからのオキシム／ヒドラゾン形成、ならびにテトラジンライゲーションが可能な多様な基が挙げられる（それらの開示が参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／０９２９８３号または米国特許出願公開第２０１７／００７２０６８Ａ１号もまた参照されたい）。例えば、ＲがアルキンでＲ’がアジドであっても、ＲがアジドでＲ’がアルキンであってもよい。したがって、結果として得られるリンカーおよび機能化抗体、またはそのＹ要素は、任意の実施形態においてＲとＲ’との反応から生じた基（ＲＲ’）を含んでもよく、例えばＲＲ’は、アルキンとアジドとの反応から生じたトリアゾールであってもそれを含んでもよい。
一実施形態において、反応基ＲおよびＲ’は、「クリック」反応を一緒に起こすことができる相補的な試薬（すなわち、クリックケミストリー試薬または反応基）である。例えば１，３－双極子官能性化合物は、好ましくは付加触媒（例えば、Ｃｕ（Ｉ））の実質的な非存在下において、複素環式化合物を形成する環化反応においてアルキンと反応することができる。少なくとも１つの１，３－双極子基が結合している（３個の原子に非局在化している４個の電子を含有する３原子パイ電子系を有する）様々な化合物が、本明細書に開示されるアルキンと反応させるために使用することができる。例示的な１，３－双極子基としては、これらに限定されないが、アジド、ニトリルオキシド、ニトロン、アゾキシ基、およびアシルジアゾ基が挙げられる。
例としては、ｏ－ホスフェン芳香族エステル（ｏ－ｐｈｏｓｐｈｅｎｅａｒｏｍａｔｉｃ ｅｓｔｅｒ）、アジド、フルミネート、アルキン（任意の歪みシクロアルキンを含む）、シアン化物、アントラセン、１，２，４，５－テトラジン、またはノルボルネン（もしくは他の歪みシクロアルケン）が挙げられる。
一実施形態において、Ｒは末端アルキンまたはアジドを有する部分であり、そのような部分は、例えば、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，７６３，７３６号に記載されている。末端アルキンとアジドとの間のクリック反応の触媒としての銅（および他の金属塩）の使用に好適な反応条件は、米国特許第７，７６３，７３６号において提供されている。
一実施形態において、Ｒは置換または非置換シクロアルキンである。特定の化合物を含むシクロアルキンは、例えば、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，８０７，６１９号に記載されている。
一部の実施形態において、シクロアルキンは、式Ａ：
［式中、
Ｒ１は、カルボニル、アルキルエステル、アリールエステル、置換アリールエステル、アルデヒド、アミド、アリールアミド、アルキルハロゲン化物、チオエステル、スルホニルエステル、アルキルケトン、アリールケトン、置換アリールケトン、およびハロスルホニルから選択され、
Ｒ１は、シクロオクチン基における、三重結合によって結合している２つの炭素以外の任意の位置に存在し得る］
の化合物であり得る。
一部の実施形態において、改変されたシクロアルキンは式Ａのシクロアルキンであり、ここで、シクロオクチン環における三重結合によって結合している２つの炭素原子以外の炭素原子のうちの１つまたは複数は、１つまたは複数の電子求引基、例えば、ハロ（ブロモ、クロロ、フルオロ、ヨード）、ニトロ基、シアノ基、スルホン基、またはスルホン酸基により置換されている。したがって、例えば、一部の実施形態において、主題の改変されたシクロアルキンは、式Ｂ：
［式中、
Ｒ２およびＲ３のそれぞれは、独立的に、（ａ）Ｈ、（ｂ）ハロゲン原子（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、ヨード）、（ｃ）－Ｗ－（ＣＨ２）ｎ－Ｚ［ここで、ｎは１～４の整数である（例えば、ｎ＝１、２、３、もしくは４であり）、Ｗは、存在する場合、Ｏ、Ｎ、もしくはＳであり、Ｚはニトロ、シアノ、スルホン酸、もしくはハロゲンである］、（ｄ）－（ＣＨ２）ｎ－Ｗ－（ＣＨ２）ｍ－Ｒ４［ここで、ｎおよびｍはそれぞれ独立的に１もしくは２であり、ＷはＯ、Ｎ、Ｓ、もしくはスルホニルであり、ＷがＯ、Ｎ、もしくはＳである場合、Ｒ４はニトロ、シアノ、もしくはハロゲンであり、Ｗがスルホニルである場合、Ｒ４はＨである］、または（ｅ）－ＣＨ２）ｎ－Ｒ４［ここで、ｎは１～４の整数であり（例えば、ｎ＝１、２、３、もしくは４）、Ｒ４はニトロ、シアノ、スルホン酸、もしくはハロゲンである］であり、
Ｒ１は、カルボニル、アルキルエステル、アリールエステル、置換アリールエステル、アルデヒド、アミド、アリールアミド、アルキルハロゲン化物、チオエステル、スルホニルエステル、アルキルケトン、アリールケトン、置換アリールケトンおよびハロスルホニルから選択される。Ｒ１は、シクロオクチン基における、三重結合によって連結している２つの炭素以外の任意の位置に存在し得る］
のシクロアルキンである。
一実施形態において、Ｒは置換または非置換複素環式歪みアルキンである。特定の化合物を含むシクロアルキンは、例えば、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第８，１３３，５１５号に記載されている。一実施形態において、アルキンは、式Ｃ：
［式中、
各Ｒ１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、ナイトレート、ナイトライト、サルフェート、およびＣ１～Ｃ１０アルキルまたはヘテロアルキルからなる群から独立的に選択され、
各Ｒ２は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、ナイトレート、ナイトライト、サルフェート、およびＣ１～Ｃ１０有機基からなる群から独立的に選択され、Ｘは、Ｎ－Ｒ３Ｒ４、ＮＨ－Ｒ４、ＣＨ－Ｎ－ＯＲ４、Ｃ－Ｎ－ＮＲ３Ｒ４、ＣＨＯＲ４、またはＣＨＮＨＲ４を表し、各Ｒ３は水素または有機基を表し、Ｒ４はリンカーの連結部分Ｃを表す］のアルキンである。一実施形態において、ＲまたはＲ’は、以下のＤＢＣＯ（ジベンゾシクロオクチル（ｄｉｂｅｎｚｙｃｙｃｌｏｏｃｔｙｌ））基である。
アルキン、例えば、本明細書において上に記載したアルキンは、好ましくは付加触媒（例えば、Ｃｕ（Ｉ））の実質的な非存在下において、複素環式化合物を形成する環化反応において少なくとも１つの１，３－双極子官能性化合物と反応させることができる。少なくとも１つの１，３－双極子基が結合している（３個の原子に非局在化している４個の電子を含有する３原子パイ電子系を有する）多種多様な化合物が、本明細書に開示されるアルキンと反応させるために使用することができる。例示的な１，３－双極子基としては、これらに限定されないが、アジド、ニトリルオキシド、ニトロン、アゾキシ基、およびアシルジアゾ基が挙げられる。
本明細書の式において、Ｙ’は、適宜存在しなくてもよく、またはスペーサー、適宜、例えばｐ－アミノベンジル単位を含む自己脱離スペーサーもしくは非自己脱離スペーサーであってもよい。Ｙ’は、置換または非置換アルキルまたはヘテロアルキル鎖であってもそれを含んでもよく、Ｙ’は２～４０個の原子、適宜２～３０、２～２０、４～４０、４～３０または４～２０個の原子の鎖長を有してもよく、適宜、１個または複数の原子は、炭素以外のもの、例えば酸素、硫黄、窒素、または他の原子であってもよく、適宜、鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル－Ｓ－、チオール、アルキル－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミドにより置換されている。
抗ネクチン－４抗体にコンジュゲートし得る例示的なリンカー－細胞毒性剤分子（例えば式Ｉ～ＸＩのＸ－Ｚ部分）は、適宜、式Ｖ：
（Ｒ）－（Ｙ）－（Ｐｅｐ）－（Ｙ’）－（Ｚ） 式（Ｖ）
［式中、
Ｒは、抗体上の遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリルもしくはカルボキシル基と反応性であるか、または抗体のアミノ酸に結合している相補的反応基（Ｒ’）と反応性の基であるか、あるいは、抗ネクチン－４結合タンパク質へのコンジュゲーション後は、Ｒは、反応基（Ｒ）と抗体上の遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリルもしくはカルボキシル基または抗体のアミノ酸に結合している相補的反応基（Ｒ’）との反応の残基であり、
Ｙは、存在しなくてもよいか、またはスペーサーであり、
Ｐｅｐは、細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカー、例えばバリン－シトルリン、バリン－アラニンまたはフェニルアラニン－リジンジペプチドであるかまたはそれを含み、
Ｙ’は、存在しなくてもよいか、またはスペーサー、適宜、自己脱離スペーサーまたは非自己脱離スペーサーであり、
Ｚは細胞毒性剤、適宜カンプトテシン類似体、適宜エキサテカン、ＤｘｄまたはＳＮ－３８分子である］
によって表すことができる。
結果として得られる本発明のネクチン－４結合イムノコンジュゲートは、例えば式（ＶＩ）：
Ａｂ－（Ｙ）－（Ｐｅｐ）－（Ｙ’）－（Ｚ）
式（ＶＩ）
［式中、
Ａｂは抗ネクチン－４抗体であり、
Ｙは、存在しなくてもスペーサーであってもよい。式ＶＩは、（Ａｂ）と（Ｙ）との間に、反応基（例えばマレイミド、第一級アミン）と抗ネクチン－４抗原結合タンパク質（Ａｂ）のアミノ酸の側鎖または炭水化物との反応の残基を含んでもよい。あるいは、反応基（例えばマレイミド、第一級アミン）と抗ネクチン－４抗原結合タンパク質（Ａｂ）のアミノ酸の側鎖との反応の残基は、Ｙに含まれていると規定することができ、
Ｐｅｐは、細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるアミノ酸単位（例えばペプチジルリンカー）であるかまたはそれを含み［例えば、（Ｐｅｐ）はプロテアーゼ切断可能なジ、トリ、テトラまたはペンタペプチド、例えばバリン－シトルリン、バリン－アラニンまたはフェニルアラニン－リジン単位であり］、
Ｙ’は、存在しなくてもよいか、またはスペーサー、適宜、自己脱離スペーサーまたは非自己脱離スペーサーであり、
Ｚは細胞毒性剤、適宜カンプトテシン誘導体、適宜エキサテカン、ＤｘｄまたはＳＮ－３８分子である］
によって表すことができる。
適宜、式は、［例えば（Ａｂ）とＹ（またはＹが存在しない場合は（ＰｅｐもしくはＸ））の末端との間に］反応基（Ｒ）と抗体上の遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリルもしくはカルボキシル基または抗体のアミノ酸に結合している相補的反応基（Ｒ’）との反応の残基（ＲＲ’）を含むかまたはそれを含むと規定することができる。
一例において、（ＲＲ’）が反応基（Ｒ）と抗体に結合している相補的反応基（Ｒ’）（例えばＲ’は抗体のアミノ酸の側鎖またはグリカンに結合している）との反応の残基である場合、本発明のネクチン－４結合イムノコンジュゲートは、例えば式（ＶＩｂｉｓ）：
Ａｂ－（ＲＲ’）－（Ｙ）－（Ｐｅｐ）－（Ｙ’）－（Ｚ） 式（ＶＩｂｉｓ）
［式中、Ａｂ、Ｙ、Ｐｅｐ、Ｙ’およびＺは式ＶＩにおいて定義された通りであり、ＲＲ’は双直交反応、好ましくは環化付加、例えばディールス・アルダー反応または１，３－双極子環化付加の結果である］によって表すことができる。一実施形態において、ＲＲ’は：
［式中、Ｘ８はＯまたはＮＨであり、Ｘ９は、Ｈ、メチルおよびピリジルから選択され、構造（ＲＲ’ｃ）および（ＲＲ’ｄ）において、
結合は単結合または二重結合のいずれかを表す］
からなる群から選択される構造を有する。
任意の実施形態において、エキサテカン分子（または他の６環性カンプトテシン）は、エキサテカンの１位のアミンを介してＹ’［またはＹ’が存在しない場合は（Ｐｅｐ）］に結合していると規定することができる。
任意の実施形態において、ＳＮ－３８分子（または他の５環性カンプトテシン）は、ＳＮ－３８の９位のアミンを介してＹ’［またはＹ’が存在しない場合は（Ｐｅｐ）］に結合していると規定することができる。
（Ｚ）部分とも称される細胞毒性剤としては、例えば、抗新生物剤などの細胞毒性剤が挙げられる。細胞毒性剤の例は当技術分野において公知である。例えば、Ｚはアルキル化剤（ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、好ましくはＤＮＡアルキル化剤であり得る。アルキル化薬剤（ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）とは、生理的条件下（例えばｐＨ７．４、３７Ｃ、水溶液）において水素原子をアルキル基に置き換えることができる化合物である。アルキル化反応は、典型的には、Ｎ、ＯおよびＳヘテロ原子求核剤と求電子アルキル化剤との置換反応に関して記載されるが、マイケル付加反応もまた重要である。アルキル化剤の例としては、ナイトロジェンおよびサルファマスタード類、エチレンイミン類、メタノスルホネート類、ＣＣ－１０６５およびデュオカルマイシン類、ニトロソウレア類、プラチナ含有剤、ＤＮＡのトポイソメラーゼＩＩ媒介部位依存アルキル化をもたらす薬剤（例えばプソロスペルミンおよび関連するビスフラノキサントン類（ｂｉｓｆｕｒａｎｏｘａｎｔｈｏｎｅｓ））、エクテイナシジンおよび他のまたは関連するＤＮＡ副溝アルキル化薬剤が挙げられる。
一実施形態において、Ｚは、キレート化金属、例えば２～８（端点を含む）の配位数を有する正二価または正三価金属のキレートである。そのような金属の具体例としては、テクネチウム（Ｔｃ）、レニウム（Ｒｅ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、鉛（Ｐｂ）、ビスマス（Ｂｉ）、インジウム（Ｉｎ）、ガリウム（Ｇａ）、イットリウム（Ｙ）、テルビウム（Ｔｂ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、およびスカンジウム（Ｓｃ）が挙げられる。概して、金属は好ましくは放射性核種である。具体的な放射性核種としては、９９ｍＴｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５８Ｃｏ、６０Ｃｏ、６７Ｃｕ、１９５Ａｕ、１９９Ａｕ、１１０Ａｇ、２０３Ｐｂ、２０６Ｂｉ、２０７Ｂｉ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８８Ｙ、９０Ｙ、１６０Ｔｂ、１５３Ｇｄおよび４７Ｓｃが挙げられる。キレート化金属は、例えば、任意の好適な多座キレート剤、例えば非環状または環状ポリアミン、ポリエーテル（例えばクラウンエーテルおよびその誘導体）；ポリアミド；ポルフィリン；ならびに炭素環式誘導体を用いてキレート化された上記種類の金属のうちの１つであり得る。
抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、例えば、ネクチン－４腫瘍細胞を検出するための診断法においても使用することができる。そのような実施形態において、抗体または抗体断片は、例えば診断において有用な、検出可能な物質などのエフェクター分子にコンジュゲートすることができる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、陽電子放出金属（陽電子放射断層撮影における使用のための）、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。診断法としての使用のための抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンの概略については米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。好適な酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族としては、ストレプトアビジン、アビジンおよびビオチンが挙げられ、好適な蛍光物質としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルおよびフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｂｒｉｎ）が挙げられ、好適な発光物質としてはルミノールが挙げられ、好適な生物発光物質としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびイクオリンが挙げられ、好適な放射性核種としては１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎおよび９９Ｔｃが挙げられる。
一実施形態において、細胞毒性剤（Ｚ）は、ＤＮＡ副溝結合および／またはアルキル化剤、例えば、ピロロベンゾジアゼピン、デュオカルマイシン、またはその誘導体である。
さらなる実施形態において、細胞毒性剤は、タキサン類、アントラサイクリン類、カンプトテシン類、エポチロン類、マイトマイシン類、コンブレタスタチン類、ビンカアルカロイド類、ナイトロジェンマスタード類、メイタンシノイド類、カリケアミシン類、デュオカルマイシン類、ツブリシン類、ドラスタチン類およびアウリスタチン類、エンジイン類、アマトキシン類、ピロロベンゾジアゼピン類、エチレンイミン類、放射性同位元素、治療タンパク質およびペプチド、ならびにそれらの毒素または断片からなる群から選択される。
さらなる実施形態において、細胞毒性剤は、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、４－（ビス（２－クロロエチル）アミノ）フェノール、４－（ビス（２－フルオロエチル）アミノ）フェノール（４－（ｂｉｓ（２－ｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌ）ａｍｍｏ）ｐｈｅｎｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－クロロエチル）－ｐ－フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ－ビス（２－フルオロ－エチル）－ｐ－フェニレンジアミン、カルムスチン、ロムスチン、トレオスルファン、ダカルバジン、シスプラチン、カルボプラチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、テニポシド、トポテカン、イリノテカン（ｉｎｉｒｏｔｅｃａｎ）、９－アミノカンプトテシン、９－ニトロカンプトテシン、１０－ヒドロキシカンプトテシン、ルルトテカン、カンプトテシン、クリスナトール、ミトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、ミトマイシンＡ、メトトレキセート、トリメトレキセート、ミコフェノール酸、トリアゾフリン、リバビリン、ヒドロキシ尿素、デフェロキサミン、５－フルオロウラシル、フロクスウリジン、ドキシフルリジン、ラルチトレキセド、シタラビン、シトシンアラビノシド、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チオグアニン、ラロキシフェン、メゲストロール、ゴセレリン、酢酸ロイプロリド、フルタミド、ビカルタミド、ベルトポルフィン（ｖｅｒｔｏｐｏｒｆｉｎ）、フタロシアニン、光増感剤Ｐｃ４、デメトキシヒポクレリンＡ、インターフェロン－アルファ、インターフェロン－ガンマ、腫瘍壊死因子、ロバスタチン、スタウロスポリン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシンＡ２、ブレオマイシンＢ２、ペプロマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、Ｎ－（５，５－ジアセトキシペンチル）ドキソルビシン、モルホリノドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、ミトキサントロン、タプシガルギン、Ｎ８－アセチルスペルミジン、タリソマイシン、エスペラマイシン、酪酸、レチノイン酸、１，８－ジヒドロキシビシクロ［７．３．１］トリデカ－４－エン－２，６－ジイン－１３－オン、アングイジン、ポドフィロトキシン、コンブレタスタチンＡ－４、パンクラチスタチン、ツブリシンＡ、ツブリシンＤ、カルミノマイシン、ストレプトニグリン、酢酸エリプトミウム、メイタンシン、メイタンシノール、カリケアミシン、メルタンシン（ＤＭ１）、Ｎ－アセチル－γ１ Ｉ－カリケアミシン、カリケアミシン－γ１ Ｉ、カリケアミシン－α２ Ｉ、カリケアミシン－α３ Ｉ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＡ、ＣＣ－１０６５、ＣＢＩ－ＴＭＩ、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＢ２、センタナマイシン、ドラスタチン、アウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、α－アマニチン、β－アマニチン、γ－アマニチン、ε－アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン、およびアマヌリン酸、ならびにそれらの誘導体から選択される。
例示的なアウリスタチンの実施形態は、以下の式（ａ１）および（ａ２）：
［式中、（ａ１）および（ａ２）の波線は、リンカー（例えばリンカーＸ、または部分Ｙ、ＰｅｐもしくはＹ’）への共有結合部位を示し、各位置において独立的に：
Ｒ２は、ＨおよびＣ１～Ｃ８アルキルから選択され、
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８アルキル、Ｃ１～Ｃ８炭素環、アリール、Ｃ１～Ｃ８アルキル－アリール、Ｃ１～Ｃ８アルキル－（Ｃ３～Ｃ８炭素環）、Ｃ３～Ｃ８複素環およびＣ１～Ｃ８アルキル－（Ｃ３～Ｃ８複素環）から選択され、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８アルキル、Ｃ３～Ｃ８炭素環、アリール、Ｃ１～Ｃ８アルキル－アリール、Ｃ１～Ｃ８アルキル－（Ｃ３～Ｃ８炭素環）、Ｃ３～Ｃ８複素環およびＣ１～Ｃ８アルキル－（Ｃ３～Ｃ８複素環）から選択され、
Ｒ５はＨおよびメチルから選択されるか、
またはＲ４およびＲ５は一緒に炭素環式環を形成し、式－（ＣＲａＲｂ）ｎを有し、ＲａおよびＲｂは、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８アルキルおよびＣ３～Ｃ８炭素環から独立的に選択され、ｎは２、３、４、５および６から選択され、
Ｒ６はＨおよびＣ１～Ｃ８アルキルから選択され、
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８アルキル、Ｃ３～Ｃ８炭素環、アリール、Ｃ１～Ｃ８アルキル－アリール、Ｃ１～Ｃ８アルキル－（Ｃ３～Ｃ８炭素環）、Ｃ３～Ｃ８複素環およびＣ１～Ｃ８アルキル－（Ｃ３～Ｃ８複素環）から選択され、
各Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１～Ｃ８アルキル、Ｃ３～Ｃ８炭素環およびＯ－（Ｃ１～Ｃ８アルキル）から独立的に選択され、
Ｒ９はＨおよびＣ１～Ｃ８アルキルから選択され、
Ｒ１０はアリールまたはＣ３～Ｃ８複素環から選択され、
ＺはＯ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ１２であり、Ｒ１２はＣ１～Ｃ８アルキルであり、
Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１～Ｃ２０アルキル、アリール、Ｃ３～Ｃ８複素環、－（Ｒ１３Ｏ）ｍ－Ｒ１４、または－（Ｒ１３Ｏ）ｍ－ＣＨ（Ｒ１５）２から選択され、ｍは１～１０００の範囲の整数であり、
Ｒ１３はＣ２～Ｃ８アルキルであり、
Ｒ１４はＨまたはＣ１～Ｃ８アルキルであり、
Ｒ１５の各出現は、独立的にＨ、ＣＯＯＨ、－（ＣＨ２）ｎ－Ｎ（Ｒ１６）２、－（ＣＨ２）ｎ－ＳＯ３－Ｃ１～Ｃ８アルキルであり、
Ｒ１６の各出現は、独立的にＨ、Ｃ１～Ｃ８アルキル、または－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＨであり、
Ｒ１８は、－Ｃ（Ｒ８）２－Ｃ（Ｒ８）２－アリール、－Ｃ（Ｒ８）２－Ｃ（Ｒ８）２－（Ｃ３～Ｃ８複素環）、および－Ｃ（Ｒ８）２－Ｃ（Ｒ８）２－（Ｃ３～Ｃ８炭素環）から選択され、
ｎは０～６の範囲の整数である］
のいずれかの構造を含むＮ末端連結モノメチルアウリスタチン薬物部分を含む。
一実施形態において、Ｒ３、Ｒ４およびＲ７は、独立的にイソプロピルまたはｓｅｃ－ブチルであり、Ｒ５は－Ｈまたはメチルである。例示的な実施形態において、Ｒ３およびＲ４はそれぞれイソプロピルであり、Ｒ５は－Ｈであり、Ｒ７はｓｅｃ－ブチルである。
さらに別の実施形態において、Ｒ２およびＲ６はそれぞれメチルであり、Ｒ９は－Ｈである。
さらに別の実施形態において、Ｒ８の各出現は－ＯＣＨ３である。
例示的な実施形態において、Ｒ３およびＲ４はそれぞれイソプロピルであり、Ｒ２およびＲ６はそれぞれメチルであり、Ｒ５は－Ｈであり、Ｒ７はｓｅｃ－ブチルであり、Ｒ８の各出現は－ＯＣＨ３であり、Ｒ９は－Ｈである。
一実施形態において、Ｚは－Ｏ－または－ＮＨ－である。
一実施形態において、Ｒ１０はアリールである。
例示的な実施形態において、Ｒ１０は－フェニルである。
例示的な実施形態において、Ｚが－０－である場合、Ｒ１１は－Ｈ、メチルまたはｔ－ブチルである。
一実施形態において、Ｚが－ＮＨである場合、Ｒ１１は－ＣＨ（Ｒ１５）２であり、ここで、Ｒ１５は－（ＣＨ２）ｎ－Ｎ（Ｒ１６）２であり、Ｒ１６は－Ｃ１～Ｃ８アルキルまたは－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＨである。
別の実施形態において、Ｚが－ＮＨである場合、Ｒ１１は－ＣＨ（Ｒ１５）２であり、ここで、Ｒ１５は－（ＣＨ２）ｎ－ＳＯ３Ｈである。
式（ａ１）の１つの例示的なアウリスタチンの実施形態はＭＭＡＥ：
［式中、波線はリンカーへの共有結合を示す］である。
式（ａ２）のある例示的なアウリスタチンの実施形態はＭＭＡＦ：
［式中、波線は抗体－薬物コンジュゲートのリンカー（Ｌ）への共有結合を示す］である（米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号およびDoronina et al. (2006) Bioconjugate Cfiem. 17: 1 14-124を参照されたい）。
他の例示的なＺの実施形態は、ペンタペプチドアウリスタチン薬物部分のＣ末端にフェニルアラニンカルボキシ改変を有するモノメチルバリン化合物（国際公開第２００７／００８８４８号）、およびペンタペプチドアウリスタチン薬物部分のＣ末端にフェニルアラニン側鎖改変を有するモノメチルバリン化合物（国際公開第２００７／００８６０３号）を含む。
他の薬物部分としては、以下のＭＭＡＦ誘導体：
［式中、波線はリンカーへの共有結合を示す］が挙げられる。
（Ｚ）部分としてのＭＭＡＦと一緒になった、第一級アミンを含むスペーサー（Ｙ）、（Ｐｅｐ）部分としてのバリン－シトルリン、（Ｙ’）部分としてのＰＡＢを含むリンカーの一例を以下に示す。
一実施形態において、Ｚ部分はＤＮＡ副溝結合剤であり、Ｚはピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）を含んでもよい。一実施形態において、Ｚはピロロベンゾジアゼピンモノマーである。一実施形態において、Ｚは２つのピロロベンゾジアゼピン単位を含むピロロベンゾジアゼピン二量体である。一実施形態において、Ｚは３つのピロロベンゾジアゼピン単位を含むピロロベンゾジアゼピン三量体である。一実施形態において、Ｚは４つ以上のピロロベンゾジアゼピン単位を含むピロロベンゾジアゼピン多量体である。ＰＢＤの構造、ならびにそれを生成する式および方法は、例えば、それぞれの開示が参照によって本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１３／１７７４８１号、同第ＷＯ２０１１／１３０６１６号、同第ＷＯ２００４／０４３８８０号、同第ＷＯ２００５／０８５２５１号、同第ＷＯ２０１２／１１２６８７号および同第ＷＯ２０１１／０２３８８３号に記載されている。
ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピンは、グアニン残基に共有結合する配列選択的副溝結合ＤＮＡ相互作用剤のファミリーである。ＰＢＤのＣ１１ａ位における（Ｓ）－キラリティーは、ＤＮＡ副溝に完全に適合する適切な３次元形状をＰＢＤにもたらすことが報告されている。ＰＢＤは種々の効果および作用機構を有し得る。ＰＢＤはＤＮＡの架橋を引き起こさないＤＮＡ結合剤もしくはＤＮＡアルキル化薬（ａｌｋｙｌａｔｏｒ）であり得るか、またはＰＢＤはＤＮＡ架橋剤であり得る。
ピロロベンゾジアゼピン単位またはモノマーは、以下の一般的な構造：
［式中、ＰＢＤは、芳香族Ａ環とピロロＣ環の両方において、置換基の数、種類および位置が異なっていてもよく、Ｃ環の飽和度が変動してもよい。Ｂ環において、ＤＮＡのアルキル化を担う求電子中心であるＮ１０～Ｃ１１位に、イミン（Ｎ＝Ｃ）、カルビノールアミン（ＮＨ－ＣＨ（ＯＨ））、またはカルビノールアミンメチルエーテル（ＮＨ－ＣＨ（ＯＭｅ））のいずれかが存在する］
を有し得る。
ＰＢＤの生物活性は、２つのＰＢＤモノマーまたは単位を、典型的にはＣ８／Ｃ８’－ヒドロキシル官能基によって、可動性アルキレンリンカーを介して１つに結合することにより高めることができる。
本明細書の任意の実施形態の一態様において、ピロロベンゾジアゼピンモノマーまたは単位はピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピンである。本明細書の任意の実施形態の一態様において、ピロロベンゾジアゼピン二量体はＣ８／Ｃ８’連結ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン二量体である。
ＰＢＤは任意の好適な位置によりリンカーに結合することができる。例えば、ＰＢＤは、以下に示すＰＢＤ単位における任意の位置を介してリンカーに接続することができる。
一実施形態において、ＰＢＤ二量体は、化合物内の他の置換基または官能基への例示的な結合点が矢印によって示される以下の一般式：
［式中、
Ｒ１２およびＲ１２’ならびに／もしくはＲ２およびＲ２’はそれぞれ一緒に二重結合＝ＣＨ２もしくは＝ＣＨ－ＣＨ３を形成するか、または
Ｒ２’およびＲ１２’は存在せず、Ｒ２およびＲ１２は、
（ｉｉａ）Ｃ１～５飽和脂肪族アルキル、
（ｉｉｂ）Ｃ３～６飽和シクロアルキル、
（ｉｉｃ）Ｒ１２基における炭素原子の総数が５以下である場合、
［式中、Ｒ２１、Ｒ２２およびＲ２３のそれぞれは、Ｈ、Ｃ１～３飽和アルキル、Ｃ２～３アルケニル、Ｃ２～３アルキニルおよびシクロプロピルから独立的に選択される］、
（ｉｉｄ）
［式中、Ｒ２５ａおよびＲ２５ｂのうちの一方はＨであり、他方は、
ハロ、メチル、メトキシから選択される基によって適宜置換されているフェニル；ピリジル；およびチオフェニルから選択される］、ならびに
（ｉｉｅ）
［式中、Ｒ２４は、Ｈ；Ｃ１～３飽和アルキル；Ｃ２～３アルケニル；Ｃ２～３アルキニル；シクロプロピル；ハロ、メチル、メトキシから選択される基によって適宜置換されているフェニル；ピリジル；およびチオフェニルから選択される］
から独立的に選択され、
Ｒ６およびＲ９は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ニトロ、Ｍｅ３Ｓｎおよびハロから独立的に選択され、ここで、ＲおよびＲ’は、適宜置換されているＣ１～１２アルキル、Ｃ３～２０ヘテロシクリルおよびＣ５～２０アリール基から独立的に選択され、
Ｒ７は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＨＲＲ’、ニトロ、Ｍｅ３Ｓｎおよびハロから選択され、
（ａ）Ｒ１０はＨであり、Ｒ１１はＯＨ、ＯＲＡであり、ここで、ＲＡはアルキルであるか、
（ｂ）Ｒ１０およびＲ１１は、それらが結合している窒素原子と炭素原子との間に窒素－炭素二重結合を形成するか、または
（ｃ）Ｒ１０はＨであり、Ｒ１１はＳＯｚＭであり、ここで、ｚは２もしくは３であり、Ｍは薬学的に許容される一価カチオンである
のいずれかであり、
Ｒ”はＣ３～１２アルキレン基であり、その鎖は、１個または複数のヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ、ＮＲＮ２（ここで、ＲＮ２はＨもしくはＣ１～４アルキルである）、および／または芳香族環、例えば、ベンゼンもしくはピリジンによって中断されていてもよく、
ＹおよびＹ’は、Ｏ、Ｓ、またはＮＨから選択され、
Ｒ６’、Ｒ７’、Ｒ９’は、それぞれＲ６、Ｒ７およびＲ９と同じ基から選択され、Ｒ１０’およびＲ１１’はＲ１０およびＲ１１と同じであり、ここで、Ｒ１１およびＲ１１がＳＯｚＭである場合、Ｍは薬学的に許容される二価カチオンを表し得る］
の構造を含む。
別の例において、ＰＢＤ二量体は、以下の一般式：
［式中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ６’、Ｒ７’、Ｒ９’、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１０’およびＲ１１’は上で定義された通りであり、「Ｋ」環は置換または非置換芳香族または非芳香族環、適宜６員環、適宜フェニルである］
の構造を含む。
一実施形態において、細胞毒性剤（Ｚ）はカンプトテシンである、例えば、細胞毒性剤（Ｚ）はカンプトテシンまたはカンプトテシンアナログの構造を有するかまたは含む。カンプトテシンは周知であり、様々な置換を有するコア環系を共有する種々のカンプトテシン類似体が存在するが、好ましくは、以下の基本的なカンプトテシン構造の環Ａおよび／またはＢに改変または置換を有する。
トポテカン、イリノテカン、エキサテカン、ＤＸｄ、９－アミノカンプトテシン、９－ニトロカンプトテシン、１０－ヒドロキシカンプトテシン、ルルトテカン、カンプトテシン、ギマテカン、ベロテカン、およびルビテカンを含む多くのカンプトテシン類似体が報告されている。さらなるカンプトテシン類似体は、それらの開示が参照によって本明細書に組み込まれる、Li et al., ACS Med. Chem. Lett. 2019, 10, 10, 1386-1392、Jpn. J. Cancer Res. 86: 776-782、およびTakiguchi et al. 1997 Jpn. J. Cancer Res. 88: 760-769に開示されている。トポテカン、イリノテカン、ベロテカン、およびＤＸｄ（トラスツズマブデルクステカンの一部として）の４つの類似体はＦＤＡによって承認されている。一実施形態において、カンプトテシン類似体は５環性化合物である（例えば、カンプトテシンはＦ環を欠いている）。一実施形態において、カンプトテシン類似体は、例えばＦ環を含む６環性化合物である。
基本的なカンプトテシン構造、ＳＮ－３８分子（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン；イリノテカンの活性代謝産物）、およびLi et al., ACS Med. Chem. Lett. 2019, 10, 10, 1386-139に開示されているカンプトテシン類似体などの一部の例は、５つの環（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ環）を有し、例えばＢ環上の置換基を介してリンカー（例えばスペーサーＹもしくはＹ’、またはリンカーＸ）に結合することができる。
ＳＮ－３８：
Li et al., ACS Med. Chem. Lett. 2019, 10, 10, 1386-139の化合物：
カンプトテシン類似体は６環性化合物（さらにＦ環）であってもよく、ここで、化合物はそのようなＦ環上の置換基を介してリンカーに結合する。そのような６環性化合物の例としては、これらに限定されないが、ＤＸｄ（ＣＡＳ番号：１５９９４４０－３３－１）およびエキサテカンが挙げられる。
したがって、カンプトテシン類似体としては、エキサテカン、ＳＮ－３８、およびそのような部分を含む任意の多様な分子が挙げられ、例えば、エキサテカンは非置換であっても１位のアミンにおいて置換されていてもよく、例えば、置換基は、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、ＨＯ－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－基、またはその開示が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，８３５，８０７号に示されている他の基であるかまたはそれを含む。
一実施形態において、本開示の抗体は、ネクチン－４発現腫瘍細胞の存在下のインビボまたはインビトロにおいて、（例えば切断可能な部分の酵素的切断とそれに続くスペーサーＹ’の自己脱離とにより）化合物１の構造を有するエキサテカン分子を放出する。
カンプトテシン誘導体または類似体であるエキサテカンは、それらの開示が参照によって本明細書に組み込まれる、Mitsui et al. 1995 Jpn. J. Cancer Res. 86: 776-782およびTakiguchi et al. 1997 Jpn. J. Cancer Res. 88: 760-769に記載されている。エキサテカンの構造を化合物１ａとして以下に示す。
エキサテカンは、１位のアミノ基の窒素原子を介してリンカーにカップリングすることができ、それゆえ、エキサテカン部分は、リンカーに結合するかまたはリンカー－エキサテカン分子（（Ｘ－Ｚ）分子）中に存在する場合、例えば抗体にコンジュゲートする場合、エキサテカンは化合物１ｂの構造を有し得る。
したがって、化合物１ａのエキサテカンが１位のアミンを介してリンカーに結合している場合（そして、例えば、リンカーが抗体に結合している場合）、エキサテカンは１位における、改変されている基である（すなわち、１位のＮＨ２基がＮＨ、または代替的にＯＨもしくはＯ基と置き換えられている）と理解され得ることが理解されるだろう。例えば、エキサテカンは、切断可能なオリゴペプチドを含むリンカーを介して抗体にカップリングすることができる。例としては、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる、ＰＡＢ分子に結合した、米国特許第６，８３５，８０７号に示されているグリシンおよびフェニルアラニン含有ペプチドなどのジ、トリ、テトラおよびペンタペプチド、またはジペプチドであるバリン－シトルリンもしくはバリン－アラニンが挙げられる。活性エキサテカンまたはエキサテカン誘導体を１位のアミノにおいて遊離させることができる様々な好適なリンカー－Ｚ構造は公知である。エキサテカンは、式ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸ、または実施例７の（ＰＥＧ（８Ｕ）－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ－エキサテカン）リンカーに示されるように、１位のアミンに結合しているｐ－アミノベンジルオキシカルボニル基（ＰＡＢ）基を介して、切断時に化合物１ａの構造を有するエキサテカンの遊離をもたらす切断可能なオリゴペプチドに連結することができる。一例において、エキサテカンは、式ＩＩＩおよび化合物１３（Ｄｘｄ）、ならびに実施例７のｇｇｆｇ－Ｄｘｄリンカーに示されるように、１位のアミンに結合している（ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ））基を介して、切断時にエキサテカン含有化合物１３（Ｄｘｄ）の遊離をもたらす切断可能なオリゴペプチドに連結することができる。化合物１のエキサテカンの１位のＮＨまたはＮＨ２における置換基の例としては、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、または－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、ＨＯ－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－および－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－などの基を含む（ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ））が挙げられる。
一実施形態において、置換エキサテカン誘導体（例えば１位において誘導体化されている）は化合物１３の構造を有する。
Ｄｘｄの構造を以下に示す。
Ｄｘｄは、炭素鎖の末端の酸素原子を介してリンカーにカップリングすることができ、それゆえ、Ｄｘｄ部分は、リンカーに結合するかまたはリンカー－Ｄｘｄ分子（（Ｘ－Ｚ）分子）中に存在する場合、例えば抗体にコンジュゲートする場合、炭素鎖末端ＯＨはＯと置き換えられ得る。
一実施形態において、リンカー部分（Ｘ－Ｚ）は、以下の式ＶＩＩに示す構造であるかまたはそれを含み、式中、（Ｙ）は、（例えば、その末端に）反応基（Ｒ）とアミノ酸残基、例えば抗体上の遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリルまたはカルボキシル基（例えば、１つもしくは複数のリジン残基のイプシロンアミノ基、１つもしくは複数のグルタミン酸もしくはアスパラギン酸残基の遊離カルボン酸基、または１つもしくは複数のシステイニル残基のＳ原子）との反応の残基を含むスペーサーである。式ＶＩＩまたは化合物３もしくは４の構造を含むリンカーにより機能化された抗ネクチン－４結合タンパク質は、化合物１ａの構造を有する化合物を（例えばネクチン－４発現腫瘍細胞の存在下における細胞内に）放出するかまたはもたらすことができる。
Ｒ基としてマレイミドを有する例示的なリンカーは、以下の化合物３の構造を有し得る。そのようなリンカーは、鎖間ジスルフィド結合が還元剤、例えばトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩により還元された後、抗体におけるシステイン残基を介して抗体にコンジュゲートすることができる。
結果として得られる抗体－薬物コンジュゲートは、化合物３の構造を有する化合物により機能化された１つまたは複数のシステイン残基を含む抗体を含み得る（ここで、化合物３は、システイン残基のＳ原子を介して結合している）。
別の実施形態において、リンカーは、Ｒ基として第一級アミンを有することができ、トランスグルタミナーゼ酵素の存在下において抗体と反応させる場合、リンカーにより機能化された１つまたは複数の受容体グルタミン残基を含む抗体をもたらすことができる。例えば、リンカー（Ｘ－Ｚ）またはそれにより機能化された抗体は、以下に化合物４として示す構造を有するかまたは含む。
一実施形態において、リンカー部分（Ｘ－Ｚ）は、以下の式ＶＩＩＩに示す構造であるかまたはそれを含み、式中、（Ｙ）は、（例えば、その末端に）反応基（Ｒ）とアミノ酸残基、例えば抗体上の遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリルまたはカルボキシル基（例えば、１つもしくは複数のリジン残基のイプシロンアミノ基、１つもしくは複数のグルタミン酸もしくはアスパラギン酸残基の遊離カルボン酸基、または１つもしくは複数のシステイニル残基のＳ原子）、あるいは例えばグリコシル化アミノ酸残基のグリカン構造（例えば抗体のＫａｂａｔ残基Ｎ２９７に結合している、天然であるか、切断されているかまたは他の方法により改変されているＮ－グリカン）との反応の残基を含むスペーサーである。式ＶＩＩＩまたは化合物５、６もしくは７の構造を含むリンカーにより機能化された抗ネクチン－４結合タンパク質は、化合物Ｉａの構造を有する化合物を（例えばネクチン－４発現腫瘍細胞の存在下における細胞内に）放出するかまたはもたらすことができる。
Ｒ基としてマレイミドを有する例示的なリンカーは、以下の化合物５または６の構造を有し得る。そのようなリンカーは、鎖間ジスルフィド結合が還元剤により還元された後、抗体におけるシステイン残基を介して抗体にコンジュゲートすることができる。
別の実施形態において、リンカーは、Ｒ基として第一級アミンを有することができ、トランスグルタミナーゼ酵素の存在下において抗体と反応させる場合、リンカーにより機能化された１つまたは複数の受容体グルタミン残基を含む抗体をもたらすことができる。例えば、リンカー（Ｘ－Ｚ）またはそれにより機能化された抗体は、以下に化合物７として示す構造を有するかまたは含む。
一実施形態において、リンカー部分（Ｘ－Ｚ）は、以下の式ＩＸに示す構造であるかまたはそれを含み、式中、（Ｙ）は、（例えば、その末端に）反応基（Ｒ）とアミノ酸残基、例えば抗体上の遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリルまたはカルボキシル基（例えば、１つもしくは複数のリジン残基のイプシロンアミノ基、１つもしくは複数のグルタミン酸もしくはアスパラギン酸残基の遊離カルボン酸基、または１つもしくは複数のシステイニル残基のＳ原子）、あるいは例えばグリコシル化アミノ酸残基のグリカン構造（例えば抗体のＫａｂａｔ残基Ｎ２９７に結合している、天然であるか、切断されているかまたは他の方法により改変されているＮ－グリカン）との反応の残基を含むスペーサーである。式ＩＸの構造を含むリンカーにより機能化された抗ネクチン－４結合タンパク質は、化合物Ｉａの構造を有する化合物を（例えばネクチン－４発現腫瘍細胞の存在下における細胞内に）放出することができる。
Ｒ基としてマレイミドを有する例示的なリンカーは、以下の化合物８の構造を有し得る。そのようなリンカーは、鎖間ジスルフィド結合が還元剤により還元された後、抗体におけるシステイン残基を介して抗体にコンジュゲートすることができる。
別の実施形態において、リンカーは、Ｒ基として第一級アミンを有することができ、トランスグルタミナーゼ酵素の存在下において抗体と反応させる場合、リンカーにより機能化された１つまたは複数の受容体グルタミン残基を含む抗体をもたらすことができる。例えば、リンカー（Ｘ－Ｚ）またはそれにより機能化された抗体は、以下に化合物９として示す構造を有するかまたは含む。
一実施形態において、リンカー部分（Ｘ－Ｚ）は、以下の式Ｘに示す構造であるかまたはそれを含み、式中、（Ｙ）は、（例えば、その末端に）反応基（Ｒ）とアミノ酸残基、例えば抗体上の遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリルまたはカルボキシル基（例えば、１つもしくは複数のリジン残基のイプシロンアミノ基、１つもしくは複数のグルタミン酸もしくはアスパラギン酸残基の遊離カルボン酸基、または１つもしくは複数のシステイニル残基のＳ原子）、あるいは例えばグリコシル化アミノ酸残基のグリカン構造（例えば抗体のＫａｂａｔ残基Ｎ２９７に結合している、天然であるか、切断されているかまたは他の方法により改変されているＮ－グリカン）との反応の残基を含むスペーサーである。
Ｒ基としてマレイミドを有する例示的なリンカーは、以下の化合物１０の構造を有し得る。そのようなリンカーは、鎖間ジスルフィド結合が還元剤、例えばトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩により還元された後、抗体におけるシステイン残基を介して抗体にコンジュゲートすることができる。
一実施形態において、リンカー部分（Ｘ－Ｚ）は、以下の式ＸＩに示す構造であるかまたはそれを含み、式中、（Ｙ）は、（例えば、その末端に）反応基（Ｒ）とアミノ酸残基、例えば抗体上の遊離アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリルまたはカルボキシル基（例えば、１つもしくは複数のリジン残基のイプシロンアミノ基、１つもしくは複数のグルタミン酸もしくはアスパラギン酸残基の遊離カルボン酸基、または１つもしくは複数のシステイニル残基のＳ原子）、あるいは例えばグリコシル化アミノ酸残基のグリカン構造（例えば抗体のＫａｂａｔ残基Ｎ２９７に結合している、天然であるか、切断されているかまたは他の方法により改変されているＮ－グリカン）との反応の残基を含むスペーサーである。
Ｒ基としてマレイミドを有する例示的なリンカーは、以下の化合物１１の構造を有し得る。そのようなリンカーは、鎖間ジスルフィド結合が還元剤により還元された後、抗体におけるシステイン残基を介して抗体にコンジュゲートすることができる。
別の実施形態において、リンカーは、Ｒ基として第一級アミンを有することができ、トランスグルタミナーゼ酵素の存在下において抗体と反応させる場合、リンカーにより機能化された１つまたは複数の受容体グルタミン残基を含む抗体をもたらすことができる。例えば、リンカー（Ｘ－Ｚ）またはそれにより機能化された抗体は、以下に化合物１２として示す構造を有するかまたは含む。
式ＸＩまたは化合物１１および１２のオリゴペプチド含有リンカーにより機能化された抗ネクチン－４結合タンパク質は、以下の構造に示すようにＯＨ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）置換基が１位のアミンに存在する置換エキサテカンの放出（例えばネクチン－４発現腫瘍細胞の存在下における細胞内に）をもたらす。
式ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸまたはＸＩの例示的なリンカーは、第一級アミンを有する構造として調製される場合、トランスグルタミン酵素（例えば細菌由来トランスグルタミナーゼ、ＢＴＧ）の存在下において、トランスグルタミナーゼ酵素が抗体の一次構造内、例えば免疫グロブリン定常ドメイン内または定常領域に挿入もしくは付加（例えば、融合）されたＴＧａｓｅ認識タグ内の受容体グルタミン残基へのリンカーのコンジュゲーションを触媒するように、抗体と反応させることができる。抗体へのＢＴＧ媒介コンジュゲーションのための方法およびそのコンジュゲーションにおける使用のためのリンカーは、その開示が参照によって組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／２０２７７３号に記載されている。ＢＴＧによって触媒されるコンジュゲーションは、組成物における平均薬物：抗体比の精密な制御を可能にする。「トランスグルタミナーゼ」という用語は、「ＴＧａｓｅ」または「ＴＧ」と交換可能に使用され、ペプチド結合グルタミンのγ－カルボキサミド基と、リジンのε－アミノ基またはアミノペンチル基などの構造的に関連する第一級アミン、例えばペプチド結合リジンのε－アミノ基との間のアシル転移反応によりタンパク質を架橋して、ε－（γ－グルタミル）リジンイソペプチド結合をもたらすことができる酵素を指す。ＴＧａｓｅとしては、とりわけ、細菌由来トランスグルタミナーゼ（ＢＴＧ）、例えばＥＣ参照番号ＥＣ２．３．２．１３を有する酵素（タンパク質－グルタミン－γ－グルタミルトランスフェラーゼ）が挙げられる。「受容体グルタミン」残基という用語は、抗体のグルタミン残基に言及する場合、ＴＧａｓｅによって認識され、グルタミンとリジンまたはアミノペンチル基などの構造的に関連する第一級アミンとの間の反応を介してＴＧａｓｅによって架橋することができるグルタミン残基を意味する。好ましくは、受容体グルタミン残基は表面露出グルタミン残基である。「ＴＧａｓｅ認識タグ」という用語は、受容体グルタミン残基を含むアミノ酸の配列であって、好適な条件下においてポリペプチド配列に組み込まれる（例えば付加される）場合、ＴＧａｓｅによって認識され、アミノ酸の配列内のアミノ酸側鎖と反応相手との間の反応を介してＴＧａｓｅによる架橋を生じる、アミノ酸の配列を指す。認識タグは、酵素認識タグを含むポリペプチドに天然には存在しないペプチド配列であってもよい。ＴＧａｓｅ認識タグの例としては、アミノ酸配列：ＬＬＱ、ＬＬＱＧ、ＬＳＱＧ、ＧＬＬＱ、ＳＬＬＱＧ、ＧＧＧＱＧＧＬ、ＬＬＱＧＧ、ＬＬＱＧＡ、ＬＬＱＧＧおよびＬＬＱＧＡ、またはＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬまたは１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８もしくは９つ）の配列改変を有する変異体が挙げられる。
それらの開示が参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／０９２９８３号および国際公開第２０２０／１８８０６１号に例示されているように、リンカー－薬物部分（Ｘ－Ｚ）は、抗体におけるグルタミン残基（受容体グルタミン）に２工程プロセスにおいてコンジュゲートすることができ、このプロセスは、第一級アミンと第１の反応基（Ｒ）とを含む部分をＢＴＧの存在下において抗体にコンジュゲートさせる第１の工程と、それに続く、抗体－リンカーコンジュゲートを、（ｉ）第１の反応基と反応性である第２の反応基（Ｒ’）および（ｉｉ）細胞毒性剤（Ｚ）を含む分子と反応させる工程とを含む。ＲとＲ’とによる反応基対の例としては、双直交反応、例えばアジドとシクロオクチンとの間（銅不含クリックケミストリー）、ニトロンとシクロオクチンとの間の１，３－双極子環化付加、アルデヒドおよびケトンからのオキシム／ヒドラゾン形成、ならびにテトラジンライゲーションが可能な多様な基が挙げられる（国際公開第２０１３／０９２９８３号もまた参照されたい）。したがって、結果として得られるリンカーおよび機能化抗体、またはそのＹ要素は、ＲとＲ’との反応から生じたＲＲ’基、例えばトリアゾールを含んでもよい。
抗ネクチン－４イムノコンジュゲートは、１ｍｇ／ｍｌ～５００ｍｇ／ｍｌの濃度において医薬製剤に組み込むことができ、ここで、前記製剤は２．０～１０．０のｐＨを有する。製剤は、緩衝系、保存剤、等張化剤、キレート剤、安定剤および界面活性剤をさらに含んでもよい。一実施形態において、医薬製剤は水性製剤、すなわち水を含む製剤である。そのような製剤は、典型的には溶液または懸濁液である。さらなる実施形態において、医薬製剤は水溶液である。「水性製剤」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む製剤として定義される。同様に、「水溶液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む溶液として定義され、「水性懸濁液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む懸濁液として定義される。
別の実施形態において、医薬製剤は凍結乾燥製剤であり、医師または患者は、使用前に溶媒および／または希釈剤をこれに添加する。
別の実施形態において、医薬製剤は、事前に溶解せずに直ちに使用できる乾燥製剤（例えば凍結乾燥または噴霧乾燥製剤）である。
さらなる態様において、医薬製剤は、そのような抗体の水溶液と緩衝剤とを含み、ここで、抗体は１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度において存在し、前記製剤は約２．０～約１０．０のｐＨを有する。
別の実施形態において、製剤のｐＨは、約２．０～約１０．０、約３．０～約９．０、約４．０～約８．５、約５．０～約８．０、および約５．５～約７．５からなるリストから選択される範囲である。
さらなる実施形態において、緩衝剤は、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびトリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸またはそれらの混合物からなる群から選択される。これらの具体的な緩衝剤のそれぞれは、本発明の代替的な実施形態を構成する。
さらなる実施形態において、製剤は薬学的に許容される保存剤をさらに含む。さらなる実施形態において、製剤は等張剤をさらに含む。さらなる実施形態において、製剤はまたキレート剤を含む。本発明のさらなる実施形態において、製剤は安定剤をさらに含む。さらなる実施形態において、製剤は界面活性剤をさらに含む。説明の便宜のために、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995が参照される。
他の成分が本発明の医薬製剤に存在する可能性がある。そのような追加の成分としては、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、浸透圧調節剤、キレート剤、金属イオン、油性媒体、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチンまたはタンパク質）ならびに双性イオン（例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジンおよびヒスチジンなどのアミノ酸）を挙げることができる。そのような追加の成分は、当然、本発明の医薬製剤の全体的な安定性に悪影響を及ぼすべきではない。
本発明の医薬組成物の投与は、いくつかの投与経路、例えば、静脈内によるものであり得る。好適な抗体製剤はまた、他のすでに開発されている治療用ＡＤＣに関する経験を調査することによって決定することができる。
任意の実施形態において、組成物は、本開示の複数のネクチン－４結合イムノコンジュゲートを含むと特徴付けることができ、ここで、試料における少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％のイムノコンジュゲートは、本明細書に開示されるリンカーにより機能化されている抗体１つ当たり少なくとも４、６または８つのアミノ酸残基を有する。任意の実施形態において、組成物は、本開示の複数のネクチン－４結合イムノコンジュゲートを含むと特徴付けることができ、ここで、試料における少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％のイムノコンジュゲートは、リンカー－カンプトテシン部分、例えば、本明細書における式の（Ｘ－Ｚ）単位または（－（Ｙ）－（Ｐｅｐ）－（Ｙ’）－（Ｚ））単位により機能化されている抗体１つ当たり少なくとも２、４、６または８つのアミノ酸残基を有する。任意の実施形態において、組成物は、本開示の複数のネクチン－４結合イムノコンジュゲートを含むと特徴付けることができ、ここで、試料における少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％のイムノコンジュゲートは、抗体１つ当たりの機能化アミノ酸の数が同じであり、その数は、４、６、または８であってもよい。
悪性腫瘍の診断法、予後症状、および処置
一部の態様において、表面にネクチン－４を発現する腫瘍細胞によって特徴付けられる癌の診断、予後、モニタリングおよび処置に有用な方法ならびに抗体、抗体断片およびイムノコンジュゲートが記載される。治療方法において、処置は本開示の抗体をヒト対象または個体に投与することを含む。一部の実施形態において、細胞毒性剤、特定のカンプトテシン類似体のネクチン－４陽性腫瘍へのデリバリーの改善に関する改善された方法が提供される。細胞毒性剤のデリバリーの改善は、細胞毒性剤および／またはそのような薬剤を含むＡＤＣの腫瘍浸潤の改善をもたらす、ネクチン－４発現腫瘍細胞のクラスター形成および／または足場非依存性増殖の抗体媒介性阻害の結果であり得る。本開示のＡＤＣを用いる処置は、特に抵抗性の疾患を有する患者もしくは他のＡＤＣが好適ではない患者のための、より低いかもしくは異種のネクチン－４発現を有する疾患の処置、および／または単剤として毒性を媒介する追加の治療剤（例えば、化学療法剤）と組み合わせた使用に特に有利である。
一実施形態において、抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、腫瘍を細胞毒性剤または化学療法剤に対して感作するのに有用であり得る。抗ネクチン－４抗体は、癌性細胞の化学耐性を低下させることによって、抗癌剤の癌に対する毒性を、抗癌剤それ自体と比較して強化または増強することにおいて有用であり得る。抗ネクチン－４抗体または抗体断片を含む、癌を感作する組成物は、腫瘍（例えばＰｇｐ発現腫瘍）を抗癌剤に対して感作して、化学耐性を低下させ、抗癌剤の治療効果を改善するのに有用であり得る。
一実施形態において、本開示の抗ネクチン－４抗体または抗体断片は、化学療法剤と組み合わせてヒト個体における腫瘍を処置することにおける使用のためのものであると規定することができ、ここで、抗ネクチン－４抗体、抗体断片および化学療法剤は、別個の投与のために製剤化され、同時または逐次に投与される。例えば、処置は、有効量の（ａ）本開示の抗ネクチン－４抗体または抗体断片、および（ｂ）抗癌剤、適宜、化学療法剤、適宜、Ｐ－糖タンパク質（Ｐｇｐ）による輸送が可能であることが公知の化学療法剤、適宜、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、エトポシド、タキサン、プラチナ化合物または適宜カンプトテシンのそれぞれを個体に投与することを含むことができる。
一実施形態において、抗体または抗体断片は細胞毒性剤、例えば、カンプトテシン、エキサテカンまたはＳＮ－３８分子にコンジュゲートされる。抗体または抗体断片は、典型的には、複数の分子の細胞毒性剤、例えばカンプトテシン類似体、エキサテカンにコンジュゲートすることができる。細胞毒性剤、例えばカンプトテシンまたはエキサテカンは、プロテアーゼ切断可能なオリゴペプチドリンカーを含むリンカーを介して抗体にコンジュゲートすることができる。例示的な医薬組成物は、平均して、抗体分子１つ当たり１～８つの細胞毒性剤（例えばカンプトテシン誘導体、エキサテカン）分子、適宜、抗体分子１つ当たり２～８、４～８、６～８つの細胞毒性剤分子、または例えば抗体分子１つ当たり約２、４、５、６、７もしくは８つの細胞毒性剤分子を含むことができる。抗体または抗体断片がエキサテカンにコンジュゲートする（すなわちリンカーを介して）場合、そのようなイムノコンジュゲートは、Ｐｇｐ発現腫瘍［例えばＰｇｐ（ＭＤＲ１）の発現によって特徴付けられる腫瘍］を処置するのに特に有利である。Ｐｇｐの発現によって特徴付けられる腫瘍には、化学療法剤およびＡＤＣを用いた処置の後の腫瘍が含まれ、例えば、アウリスタチン（ＭＭＡＥ）ペイロードを含むＡＤＣを用いる処置が腫瘍におけるＰｇｐ発現を誘導することが示されている。加えて、天然Ｐｇｐ／ＭＤＲ１発現によって特徴付けられる多様な腫瘍が公知であり、例えば、著しいレベルのＭＤＲ１は、腎癌、副腎皮質癌腫、胆管癌腫、肝癌、直腸癌、結腸癌、脳癌、膵癌、前立腺癌、中皮腫、胃の癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、ＡＭＬ、甲状腺癌、ＤＬＢＣ、食道癌、乳癌、肉腫、精巣（ｔｅｓｔｉｃａｌ）癌、子宮癌、胸腺腫、子宮頸癌、肺癌、膀胱癌（例えば、尿路上皮癌腫）、および頭頸部扁平上皮癌腫によって発現される。
細胞毒性剤にコンジュゲートしたネクチン－４結合剤（例えば抗ネクチン－４抗体または抗体断片）は、有利には、ネクチン－４を（例えば腫瘍細胞膜または細胞表面に）発現する腫瘍細胞によって特徴付けられるネクチン－４発現癌を有する個体を処置するために使用することができる。そのような癌の例は、尿路上皮癌、乳癌（例えばトリプルネガティブ乳癌、ＨＥＲ２陽性乳癌）、非小細胞肺癌、膵癌、卵巣癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸癌（例えば結腸癌）、頭頸部扁平上皮癌腫および食道癌である。
細胞毒性剤にコンジュゲートしたネクチン－４結合剤は、ネクチン－４高発現腫瘍において使用することができる。
細胞毒性剤にコンジュゲートしたネクチン－４結合剤は、異種および／または低ネクチン－４発現腫瘍においても使用することができる。そのような腫瘍において、本開示のイムノコンジュゲートは、適宜ＭＤＲ１媒介耐性の回避および／またはバイスタンダー抗腫瘍効果を介して、有利な有効性をもたらすことができる。
細胞毒性剤にコンジュゲートしたネクチン－４結合剤は、有利には、ネクチン－４発現レベルにかかわらず、個体の腫瘍細胞におけるネクチン－４発現レベルの不均一性にかかわらず、および／または個体が過去にエンホルツマブベドチンを用いて処置されたことがあるか否かにかかわらず、個体を処置するために使用することができる。細胞毒性剤がエキサテカンである場合、細胞毒性剤にコンジュゲートしたネクチン－４結合剤はまた、有利には、腫瘍Ｐｇｐ発現にかかわらず、および／あるいは個体が過去にＰｇｐによる輸送が可能である細胞毒性剤を含むＡＤＣ［例えば、エキサテカン以外のカンプトテシン類似体にコンジュゲートした抗ネクチン－４抗体を含むＡＤＣ、Ｄｘｄに（例えばＧＧＦＧ含有リンカーを介して）コンジュゲートした抗ネクチン－４抗体を含むＡＤＣ、またはアウリスタチン、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、エトポシド、タキサンもしくはプラチナ化合物にコンジュゲートした抗ネクチン－４抗体］を用いて処置されたことがあるか否かにかかわらず、個体を処置するために使用することができる。
一実施形態において、カンプトテシン誘導体分子にコンジュゲートしたネクチン－４結合剤は、有利には、過去にエンホルツマブベドチンを用いて処置されたことがある個体を処置するために使用することができる。そのような個体は、適宜、エンホルツマブベドチン処置の後の異種および／または低ネクチン４発現腫瘍によって特徴付けられる癌を有してもよい。そのような個体は、適宜、エンホルツマブベドチン処置の後のＰｇｐ発現腫瘍によって特徴付けられる癌を有してもよい。個体は、アウリスタチンまたはＭＭＡＥ分子（例えば、エンホルツマブベドチン）にコンジュゲートした抗体を用いた処置にもかかわらず（例えば処置中または処置後に）抵抗性である、応答しなかった、再燃したおよび／または進行した癌を有してもよい。例えば、個体は、局所進行性または転移性尿路上皮癌を有してもよく、過去にアウリスタチンまたはＭＭＡＥ分子（例えば、エンホルツマブベドチン）にコンジュゲートした抗体を用いた処置を受けたことがある。
一実施形態において、リンカーを介してエキサテカンにコンジュゲートしたネクチン－４結合剤を含むイムノコンジュゲートは、有利には、過去にＰｇｐによる輸送が可能である細胞毒性剤にリンカーを介してコンジュゲートしたネクチン－４結合剤を含むイムノコンジュゲートを用いて処置されたことがある個体を処置するために使用される。一実施形態において、リンカーを介してエキサテカンにコンジュゲートしたネクチン－４結合剤を含むイムノコンジュゲートは、有利には、Ｐｇｐによる輸送が可能である細胞毒性剤にリンカーを介してコンジュゲートしたネクチン－４結合剤を含むイムノコンジュゲートを用いた処置の後の異種および／または低ネクチン４発現腫瘍によって特徴付けられる癌を有する個体を処置するために使用される。一実施形態において、リンカーを介してエキサテカンにコンジュゲートしたネクチン－４結合剤を含むイムノコンジュゲートは、有利には、Ｐｇｐによる輸送が可能である細胞毒性剤にリンカーを介してコンジュゲートしたネクチン－４結合剤を用いた処置にもかかわらず（例えば処置中または処置後に）抵抗性である、応答しなかった、再燃したおよび／または進行した癌を有する個体を処置するために使用される。Ｐｇｐによる輸送が可能である細胞毒性剤にリンカーを介してコンジュゲートしたネクチン－４結合剤は、リンカーの切断時にエキサテカン以外のカンプトテシン類似体（例えばＤｘｄまたはデルクステカン）を放出するように、リンカーを介してカンプトテシン類似体にコンジュゲートした抗ネクチン－４抗体を含んでもよい。Ｐｇｐによる輸送が可能である細胞毒性剤にリンカーを介してコンジュゲートしたネクチン－４結合剤は、Ｄｘｄに（例えばＧＧＦＧ含有リンカーを介して）コンジュゲートした抗ネクチン－４抗体を含んでもよい。Ｐｇｐによる輸送が可能である細胞毒性剤にリンカーを介してコンジュゲートしたネクチン－４結合剤は、アウリスタチン、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、エトポシド、タキサンまたはプラチナ化合物）にコンジュゲートした抗ネクチン－４抗体を含んでもよい。Ｐｇｐによる輸送が可能である細胞毒性剤にリンカーを介してコンジュゲートしたネクチン－４結合剤は、ネクチン－４のＩｇＶドメインに結合する抗ネクチン－４抗体を含んでもよい。Ｐｇｐによる輸送が可能である細胞毒性剤にリンカーを介してコンジュゲートしたネクチン－４結合剤は、ネクチン－４のＶＣ１架橋ドメインに結合する抗ネクチン－４抗体を含んでもよい。一実施形態において、リンカーを介してエキサテカンにコンジュゲートしたネクチン－４結合剤を含むイムノコンジュゲートは、切断時にエキサテカンの放出をもたらす、酵素的に切断可能な部分（および適宜、自壊性スペーサー）を有するリンカーを含む。
進行性再発性または転移性尿路上皮癌において、著しい割合の個体は腫瘍細胞に高レベルのネクチン－４を発現し、例えばＨスコアは少なくとも２９０である（ＥＶ－２０１臨床試験コホート１ ネクチン－４発現を参照されたい）。しかしながら、患者のサブセットは２５０未満のＨスコアを有し、一部は２００未満のＨスコアを有する。少数の患者は１５０未満のＨスコアを有し、一部は１００未満のＨスコアを有した。トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）において、６２％の患者は腫瘍細胞に高ネクチン－４発現を有し、３８％は腫瘍細胞に低ネクチン－４発現を有することが報告されている（Rabat et al., 2017 Annals Onc. 28: 769-776）。他の癌種において、ネクチン－４発現のＨスコア中央値は、典型的には、ＵＣにおいて、特に非小細胞肺癌、膵癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮癌腫および食道癌において観察されたものよりも低かった。
一実施形態において、本開示に従って処置される個体は、進行性再発性または転移性癌、適宜、進行性再発性または転移性尿路上皮癌を有する。
一実施形態において、本開示に従って処置される個体は、エストロゲン受容体および／またはプロゲステロン受容体の検査結果が陽性であり、上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）または過剰なＨＥＲ２タンパク質の検査結果が陰性である癌（例えば、乳癌）を有し、癌は、ＨＥＲ２の検査結果が陽性であるが、ＨＥＲ２が低レベルにおいて発現していてもよい。
一実施形態において、本開示に従って処置される個体は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、例えば、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、および過剰なＨＥＲ２タンパク質の検査結果が陰性である乳癌を有する。
一実施形態において、本開示に従って処置される個体は、ＨＥＲ２タンパク質の検査結果が陽性である癌（例えば乳癌）を有し、ここで、癌は過剰なＨＥＲ２タンパク質を発現していてもよく（ＨＥＲ２過剰発現）、癌は低レベルのＨＥＲ２タンパク質を発現していてもよい（過剰なＨＥＲ２発現よりも少ない）。一実施形態において、個体は、ＨＥＲ２ポリペプチドと結合する薬剤（例えば抗体）（例えばトラスツズマブ、ペルツズマブ）と組み合わせた抗ネクチン－４ ＡＤＣを用いて処置され、ここで、ＨＥＲ２と結合する薬剤はＡＤＣであってもよく、ＨＥＲ２と結合する抗体は、細胞毒性剤、適宜アウリスタチン、メイタンシノイド（例えばＤＭ１）またはカンプトテシン類似体（例えば化合物１、２もしくは１３）にコンジュゲートされていてもよく、ＨＥＲ２と結合する抗体は、トラスツズマブエムタンシンまたはトラスツズマブデルクステカン（ＤＳ－８２０１ａ、Ｅｎｈｅｒｔｕ（商標））であってもよい。
一実施形態において、本開示に従って処置される個体は非小細胞肺癌、適宜、肺腺癌腫を有する。
一実施形態において、本開示に従って処置される個体は膵癌を有する。
一実施形態において、本開示に従って処置される個体は卵巣癌を有する。
一実施形態において、本開示に従って処置される個体は頭頸部扁平上皮癌腫を有する。
一実施形態において、本開示に従って処置される個体は食道癌を有する。
一実施形態において、本開示に従って処置される個体は結腸直腸癌を有する。結腸直腸癌（ＣＲＣ）とは、本明細書において使用される場合、結腸癌、直腸癌、および結腸直腸癌（結腸部と直腸部の両方の癌）を指す。
一実施形態において、本開示に従って処置される個体は、ＨＥＲ２タンパク質の検査結果が陽性であるＮＳＣＬＣまたは肺腺癌腫、胃癌、結腸直腸癌腫、膵癌、尿路上皮癌腫または膀胱癌を有し、ここで、癌は過剰なＨＥＲ２タンパク質を発現していてもよく（ＨＥＲ２過剰発現）、癌は低レベルのＨＥＲ２タンパク質を発現していてもよい（過剰なＨＥＲ２発現よりも少ない）。一実施形態において、個体は、ＨＥＲ２ポリペプチドと結合する薬剤（例えば抗体）（例えば、トラスツズマブまたはペルツズマブの重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を含む抗体）と組み合わせた本開示の抗ネクチン－４ ＡＤＣを用いて処置され、ここで、ＨＥＲ２と結合する薬剤はＡＤＣであってもよく、ＨＥＲ２と結合する抗体は、細胞毒性剤、適宜アウリスタチン、メイタンシノイド（例えばＤＭ１）またはカンプトテシン類似体（例えば化合物１、２もしくは１３）にコンジュゲートされていてもよく、Ｈｅｒ２と結合する抗体は、トラスツズマブエムタンシンまたはトラスツズマブデルクステカン（ＤＳ－８２０１ａ）であってもよい。
本明細書に示されるように、切断時に（例えば細胞毒性剤Ｚを含む細胞内で切断可能なリンカーの切断時に）エキサテカンを放出するＡＤＣは、Ｐｇｐによって輸送される細胞毒性剤（エキサテカン以外）、例えばアウリスタチン類またはＤｘｄを切断時に放出するリンカーを有するＡＤＣに抵抗性である腫瘍の処置に特に有利である。したがって、一実施形態において、ＨＥＲ２陽性癌が抗ネクチン－４結合剤（例えば抗ネクチン－４ ＡＤＣ）と抗ＨＥＲ２ ＡＤＣとの組合せを用いて処置される場合、抗ＨＥＲ２ ＡＤＣは、切断時に（例えば細胞毒性剤Ｚを含む細胞内で切断可能なリンカーの切断時に）エキサテカンを放出するように設計することができる。抗ネクチン－４結合剤（例えば抗ネクチン－４ ＡＤＣ）は、切断時に（例えば細胞毒性剤Ｚを含む細胞内（ｉｎｔｒａｌｅｌｌｕｌａｒｌｙ）で切断可能なリンカーの切断時にエキサテカンを放出するように設計することができるか、または任意の他の細胞毒性剤（Ｚ）を放出することができ、ここで、例えばＺは、タキサン、アントラサイクリン、カンプトテシン、エポチロン、マイトマイシン、コンブレタスタチン、ビンカアルカロイド、ナイトロジェンマスタード、メイタンシノイド、デュオカルマイシン、ツブリシン、ドラスタチン、アウリスタチン、エンジイン、ピロロベンゾジアゼピン、アマトキシンもしくはエチレンイミンである。
したがって、一態様において、本開示は、癌（例えば、ＨＥＲ２陽性ネクチン－４陽性癌）の処置における使用のための、ヒトネクチン－４ポリペプチドと結合するイムノコンジュゲートであって、式：
ＡｂＮ４－（ＸＮ４－（ＺＮ４））
［式中、
ＡｂＮ４は、ヒトネクチン－４ポリペプチドに特異的に結合するポリペプチド、ペプチドまたは抗体であり、
ＸＮ４はＡｂＮ４とＺＮ４とを接続する分子であり、ＸＮ４は、例えば細胞内条件下であってもよい生理的条件下において切断可能な部分、適宜、プロテアーゼ切断可能なジ、トリ、テトラまたはペンタペプチドを含み、
ＺＮ４は細胞毒性剤を含む］
によって表され、式：
ＡｂＨＥＲ２－（ＸＨＥＲ２－（ＺＨＥＲ２））
［式中、
ＡｂＨＥＲ２は、ヒトＨＥＲ２ポリペプチドに特異的に結合するポリペプチド、ペプチドまたは抗体であり、ＡｂＨＥＲ２は、トラスツズマブまたはペルツズマブの重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を含んでもよく、
ＸＨＥＲ２はＡｂＨＥＲ２とＺＨＥＲ２とを接続する分子であり、ＸＨＥＲ２は、例えば細胞内条件下であってもよい生理的条件下において切断可能な部分、適宜、プロテアーゼ切断可能なジ、トリ、テトラまたはペンタペプチドを含み、
ＺＨＥＲ２はエキサテカンである］によって表される、ヒトＨＥＲ２ポリペプチドと結合するイムノコンジュゲートと組み合わせた使用のためのものである、ヒトネクチン－４ポリペプチドと結合するイムノコンジュゲートを提供する。ヒトＨＥＲ２ポリペプチドと結合するイムノコンジュゲートは、切断可能な部分の切断時にエキサテカンを放出する。ＺＮ４はエキサテカンであってもよく、ヒトネクチン－４ポリペプチドと結合するイムノコンジュゲートは、切断可能な部分の切断時にエキサテカンを放出してもよい。
また、一態様において、本開示は、癌、例えば、ＨＥＲ２陽性ネクチン－４陽性癌）の処置における使用のための、ヒトＨＥＲ２ポリペプチドと結合するイムノコンジュゲートであって、式：
ＡｂＨＥＲ２－（ＸＨＥＲ２－（ＺＨＥＲ２））
［式中、
ＡｂＨＥＲ２は、ヒトＨＥＲ２ポリペプチドに特異的に結合するポリペプチド、ペプチドまたは抗体であり、ＡｂＨＥＲ２は、トラスツズマブまたはペルツズマブの重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を含んでもよく、
ＸＨＥＲ２はＡｂＨＥＲ２とＺＨＥＲ２とを接続する分子であり、ＸＨＥＲ２は、例えば細胞内条件下であってもよい生理的条件下において切断可能な部分、適宜、プロテアーゼ切断可能なジ、トリ、テトラまたはペンタペプチドを含み、
ＺＨＥＲ２はエキサテカンである］
によって表され、式：
ＡｂＮ４－（ＸＮ４－（ＺＮ４））
［式中、
ＡｂＮ４は、ヒトネクチン－４ポリペプチドに特異的に結合するポリペプチド、ペプチドまたは抗体であり、
ＸＮ４はＡｂＮ４とＺＮ４とを接続する分子であり、ＸＮ４は、例えば細胞内条件下であってもよい生理的条件下において切断可能な部分、適宜、プロテアーゼ切断可能なジ、トリ、テトラまたはペンタペプチドを含み、
ＺＮ４は細胞毒性剤を含む］によって表される、ヒトネクチン－４ポリペプチドと結合するイムノコンジュゲートと組み合わせた使用のためのものである、ヒトＨＥＲ２ポリペプチドと結合するイムノコンジュゲートを提供する。ヒトＨＥＲ２ポリペプチドと結合するイムノコンジュゲートは、切断可能な部分の切断時にエキサテカンを放出する。ＺＮ４はエキサテカンであってもよく、ヒトネクチン－４ポリペプチドと結合するイムノコンジュゲートは、切断可能な部分の切断時にエキサテカンを放出してもよい。
一態様において、本開示の処置方法は、腫瘍組織におけるネクチン－４発現の評価にも検出にも依存しない、ならびに／あるいは前記個体由来の組織試料における、腫瘍細胞のネクチン－４の発現レベルおよび／またはネクチン－４発現腫瘍細胞の頻度もしくは数に依存しない。一態様において、本開示の処置方法は、腫瘍のＰｇｐ（ＭＤＲ１）発現の評価にも検出にも依存しない。
一態様において、本発明は、癌の処置および／または抗腫瘍免疫応答の誘発を、それを必要とする個体において行う方法であって、前記個体が、進行性再発性または転移性尿路上皮癌または乳癌（例えばＴＮＢＣ）を有し、前記方法が、個体がネクチン－４を発現する細胞（例えば腫瘍細胞）を含む腫瘍組織を有するか否かを事前に判定することを必要としない、方法を提供する。
一態様において、本発明は、癌の処置および／または腫瘍細胞の殺滅を、それを必要とする個体において行う方法であって、前記個体が、進行性再発性または転移性尿路上皮癌または乳癌（例えばＴＮＢＣ）を有し、前記方法が、例えば免疫組織化学評価（例えばＨスコアまたは他の適切なＩＨＣスコアリング法）によって定義される高レベルのネクチン－４を発現する細胞（例えば腫瘍細胞）を含む腫瘍組織を個体が有するか否かを事前に判定することを必要としない、方法を提供する。
一態様において、個体における癌を処置するおよび／または腫瘍細胞を殺滅する方法は、腫瘍細胞のネクチン－４発現のレベルを事前に決定することを必要としない。
一態様において、個体における癌、適宜、進行性再発性または転移性尿路上皮癌または乳癌（例えばＴＮＢＣ、ＨＥＲ２陽性癌）を処置する方法は、ネクチン－４発現について、２９０、２５０、２００、１５０または１００以下またはそれ未満のＨスコアによって特徴付けられる癌を有する個体を処置することを含む。
個体における癌を処置または予防することに関する任意の実施形態において、方法は、（ｉ）腫瘍細胞がネクチン－４を発現する個体を同定する工程（例えば免疫組織化学によって決定される）、および（ｉｉ）本開示の有効量の抗ネクチン－４抗体薬物コンジュゲートを個体に投与する工程を含むと規定することができる。
個体における癌を処置または予防することに関する任意の実施形態において、方法は、（ｉ）腫瘍細胞が（ａ）ネクチン－４（例えば免疫組織化学によって決定される）、および（ｂ）ＨＥＲ２（ここで、腫瘍細胞は低レベルのＨＥＲ２を発現していてもよい）（例えば免疫組織化学によって決定される；Ｈｅｒｃｅｐｔｅｓｔ（商標）によって決定される）を発現する個体を同定する工程、ならびに（ｉｉ）本開示の有効量の抗ネクチン－４抗体薬物コンジュゲートを、適宜、Ｈｅｒ２ポリペプチドと結合する薬剤（例えば抗体）（例えばトラスツズマブ、ペルツズマブ）と組み合わせて個体に投与する工程を含むと規定することができ、ここで、Ｈｅｒ２と結合する抗体はＡＤＣであってもよく、Ｈｅｒ２と結合する抗体は、細胞毒性剤、適宜アウリスタチン、メイタンシノイド（例えばＤＭ１）またはカンプトテシン誘導体（例えば化合物１、２もしくは１３）にコンジュゲートされていてもよく、Ｈｅｒ２と結合する抗体は、トラスツズマブエムタンシンまたはトラスツズマブデルクステカン（ＤＳ－８２０１ａ）であってもよい。
個体における癌を処置または予防することに関する任意の実施形態において、方法は、（ｉ）腫瘍細胞が低または中レベルのネクチン－４発現を有する個体を同定する工程（例えば免疫組織化学によって決定される）、および（ｉｉ）本開示の有効量の抗ネクチン－４抗体薬物コンジュゲートを工程（ｉ）において同定された個体に投与する工程を含むと規定することができる。
個体における癌（例えばネクチン－４陽性癌）を処置または予防することに関する任意の実施形態において、方法は、（ｉ）癌が低レベルのネクチン－４発現によって特徴付けられる個体を同定する工程（例えば免疫組織化学によって決定される）、および（ｉｉ）本開示の有効量の抗ネクチン－４抗体薬物コンジュゲートを工程（ｉ）において同定された個体に投与する工程を含むと規定することができる。一実施形態において、個体は、ネクチン－４発現について、１５０または１００以下またはそれ未満のＨスコアによって特徴付けられる癌を有する。
個体における癌（例えばネクチン－４陽性癌）を処置または予防することに関する任意の実施形態において、方法は、（ｉ）癌が中レベルの腫瘍ネクチン－４発現によって特徴付けられる個体を同定する工程（例えば免疫組織化学によって決定される）、および（ｉｉ）本開示の有効量の抗ネクチン－４抗体薬物コンジュゲートを個体に投与する工程を含むと規定することができる。一実施形態において、個体は、ネクチン－４発現について、２９０、２５０、２００、１５０以下またはそれ未満のＨスコアによって特徴付けられる癌を有し、さらに、癌は、ネクチン－４発現について、少なくとも１００のＨスコアによって特徴付けられてもよい。
さらなる実施形態において、個体における癌（例えばネクチン－４陽性癌）を処置または予防するための方法であって、（ｉ）癌が腫瘍ネクチン－４発現について、２９０、２５０、２００、１５０、１２０または１００以下またはそれ未満のＨスコアによって特徴付けられる個体を同定すること、および（ｉｉ）本開示の有効量の抗ネクチン－４抗体薬物コンジュゲートを個体に投与することを含む方法が提供される。適宜、工程（ｉ）は、腫瘍細胞におけるネクチン－４発現を組織化学（例えばＩＨＣ）によって評価する工程を含むと規定されてもよい。
さらなる実施形態において、個体における癌（例えばネクチン－４陽性癌、乳癌）を処置または予防するための方法であって、（ｉ）癌が腫瘍ネクチン－４発現について、２００、１５０、１２０または１００以下またはそれ未満のＱＳスコアによって特徴付けられる個体を同定すること、および（ｉｉ）本開示の有効量の抗ネクチン－４抗体薬物コンジュゲートを個体に投与することを含む方法が提供される。適宜、工程（ｉ）は、腫瘍細胞におけるネクチン－４発現を組織化学（例えばＩＨＣ）によって評価する工程を含むと規定されてもよい。
個体由来、例えば生検由来の生体試料は、取得および評価することができる。試料は、ホルムアルデヒド（例えばホルマリン）固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料として保存されてもよい。脱パラフィン後、スライドに対して、ネクチン－４（および／またはＨＥＲ２）の発現を検出する方法を行うことができる。
腫瘍細胞におけるネクチン－４および／またはＨＥＲ２の発現は、当技術分野において公知の任意の方法によって決定することができる。ある特定の実施形態において、アッセイとしては、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイ、例えば定量的ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、イムノブロッティング（例えばウェスタンブロッティング、ドットブロッティング、またはインセルウェスタンブロッティング）、および他のイムノアッセイが挙げられる。
組織切片のＩＨＣ染色は、試料中のタンパク質の存在を評価または検出する信頼性の高い方法であることが示されている。免疫組織化学技法は、一般に発色法または蛍光法によって細胞の抗原をインサイチュにおいて探索および可視化する抗体を利用する。したがって、各マーカーに特異的な抗体または抗血清、一部の実施形態においてポリクローナル抗血清、および一部の実施形態においてモノクローナル抗体が発現を検出するために使用される。抗体は、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチンなどのハプテン標識、または西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼなどの酵素を用いる抗体自体の直接標識によって検出することができる。あるいは、非標識一次抗体が、一次抗体に特異的な抗血清、ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を含む標識二次抗体と共に使用される。免疫組織化学プロトコルおよびキットは当技術分野において周知であり、市販されている。
一部の実施形態において、ＩＨＣアッセイは、抗体の標的抗原への結合を直接決定する直接的アッセイである。この直接的アッセイは、蛍光タグまたは酵素標識一次抗体などの、さらなる抗体相互作用を伴わずに可視化することができる標識試薬を使用する。一部の実施形態において、ＩＨＣアッセイは間接的アッセイである。典型的な間接的アッセイでは、非コンジュゲート一次抗体が抗原に結合し、次いで標識二次抗体が一次抗体に結合する。二次抗体が酵素標識にコンジュゲートされる場合、発色（ｃｈｒｏｍａｇｅｎｉｃ）基質または蛍光発生基質が添加されて抗原の可視化をもたらす。いくつかの二次抗体は一次抗体の異なるエピトープと反応する場合があるため、シグナル増幅が行われる。免疫組織化学のために使用される一次および／または二次抗体は、典型的には、検出可能な分子を用いて標識される。放射性同位元素、コロイド金粒子、蛍光標識、および酵素－基質標識を含む多数の標識が利用可能である。
強く染色すること、中等度に染色すること、および弱く染色することとは、当業者に周知の記載である。一部の態様において、強く染色すること、中等度に染色すること、および弱く染色することとは、範囲が確立されており、染色の強度がその範囲内にビニングされる、染色の較正されたレベルである。一部の実施形態において、強い染色は、強度範囲の７５パーセンタイルを超える染色であり、中等度の染色は、強度範囲の２５～７５パーセンタイルの染色であり、低い染色は、強度範囲の２５パーセンタイル未満の染色である。一部の態様において、当業者および特定の染色技法に精通している者は、ビンサイズを調整し、染色カテゴリーを定義する。
様々な染色強度（例えば、抗ネクチン－４抗体を用いて染色した場合）を有する対照細胞株（例えば、遠心分離してペレットにし、ホルマリン固定パラフィン包埋し、例えば、組織マイクロアレイとして調製し、例えば、抗ネクチン－４抗体を用いて染色した）は、ＩＨＣ解析の対照として利用することができる。当業者は、陰性の、弱い、中等度の、および高いｃ－ｍｅｔ染色強度を有する他の対照細胞ペレットが、本出願の教示ならびにおよび当技術分野において周知の方法および本明細書に開示される方法を使用して容易に同定され得ることを理解する。
一部の実施形態において、癌または腫瘍は、ネクチン－４陽性である（例えばＩＨＣアッセイを使用してネクチン－４陽性であると決定される）場合、ネクチン－４発現癌腫瘍であると考えられる。
一部の実施形態において、個体の癌または腫瘍は、試料中の腫瘍細胞の５％以上がネクチン－４タンパク質を発現している（例えば、ネクチン－４タンパク質を任意の強度において発現している）場合、ネクチン－４陽性である。一部の実施形態において、個体の癌または腫瘍は、試料中の腫瘍細胞の１０％以上がネクチン－４タンパク質を発現している（例えば、ネクチン－４タンパク質を任意の強度において発現している）場合、ネクチン－４陽性である。一部の実施形態において、個体の癌または腫瘍は、試料中の腫瘍細胞の２０％以上がネクチン－４タンパク質を発現している（例えば、ネクチン－４タンパク質を任意の強度において発現している）場合、ネクチン－４陽性である。一部の実施形態において、個体の癌または腫瘍は、試料中の腫瘍細胞の３０％以上がネクチン－４タンパク質を発現している（例えば、ネクチン－４タンパク質を任意の強度において発現している）場合、ネクチン－４陽性である。一部の実施形態において、個体の癌または腫瘍は、試料中の腫瘍細胞の４０％以上がネクチン－４タンパク質を発現している（例えば、ネクチン－４タンパク質を任意の強度において発現している）場合、ネクチン－４陽性である。一部の実施形態において、個体の癌または腫瘍は、試料中の腫瘍細胞の５０％以上がネクチン－４タンパク質を発現している（例えば、ネクチン－４タンパク質を任意の強度において発現している）場合、ネクチン－４陽性である。一部の実施形態において、個体の癌または腫瘍は、試料中の腫瘍細胞の６０％以上がネクチン－４タンパク質を発現している（例えば、ネクチン－４タンパク質を任意の強度において発現している）場合、ネクチン－４陽性である。一部の実施形態において、個体の癌または腫瘍は、試料中の腫瘍細胞の７０％以上がネクチン－４タンパク質を発現している（例えば、ネクチン－４タンパク質を任意の強度において発現している）場合、ネクチン－４陽性である。一部の実施形態において、個体の癌または腫瘍は、試料中の腫瘍細胞の８０％以上がネクチン－４タンパク質を発現している（例えば、ネクチン－４タンパク質を任意の強度において発現している）場合、ネクチン－４陽性である。一部の実施形態において、個体の癌または腫瘍は、試料中の腫瘍細胞の９０％以上がネクチン－４タンパク質を発現している（例えば、ネクチン－４タンパク質を任意の強度において発現している）場合、ネクチン－４陽性である。
一部の実施形態において、個体の癌または腫瘍は、試料中の腫瘍細胞の５％以上がネクチン－４タンパク質を中等度および／または強い染色強度において発現している場合、ネクチン－４陽性である。一部の実施形態において、個体の癌または腫瘍は、試料中の腫瘍細胞の１０％以上がネクチン－４タンパク質を中等度および／または強い染色強度において発現している場合、ネクチン－４陽性である。一部の実施形態において、個体の癌または腫瘍は、試料中の腫瘍細胞の２０％以上がネクチン－４タンパク質を中等度および／または強い染色強度において発現している場合、ネクチン－４陽性である。一部の実施形態において、個体の癌または腫瘍は、試料中の腫瘍細胞の３０％以上がネクチン－４タンパク質を中等度および／または強い染色強度において発現している場合、ネクチン－４陽性である。一部の実施形態において、個体の癌または腫瘍は、試料中の腫瘍細胞の４０％以上がネクチン－４タンパク質を中等度および／または強い染色強度において発現している場合、ネクチン－４陽性である。一部の実施形態において、個体の癌または腫瘍は、試料中の腫瘍細胞の５０％以上がネクチン－４タンパク質を中等度および／または強い染色強度において発現している場合、ネクチン－４陽性である。一部の実施形態において、個体の癌または腫瘍は、試料中の腫瘍細胞の６０％以上がネクチン－４タンパク質を中等度および／または強い染色強度において発現している場合、ネクチン－４陽性である。一部の実施形態において、個体の癌または腫瘍は、試料中の腫瘍細胞の７０％以上がネクチン－４タンパク質を中等度および／または強い染色強度において発現している場合、ネクチン－４陽性である。一部の実施形態において、個体の癌または腫瘍は、試料中の腫瘍細胞の８０％以上がネクチン－４タンパク質を中等度および／または強い染色強度において発現している場合、ネクチン－４陽性である。一部の実施形態において、個体の癌または腫瘍は、試料中の腫瘍細胞の９０％以上がネクチン－４タンパク質を中等度および／または強い染色強度において発現している場合、ネクチン－４陽性である。
免疫組織化学アッセイを評価して、個体の癌または腫瘍が高ネクチン－４発現によって特徴付けられるか否か（例えば低または中ネクチン－４発現）を判定することは、典型的には、公知のスコアリング法の適用を伴い得る。
低、中および高腫瘍ネクチン－４発現は、米国特許出願公開第２０１３／０００５６７８号に記載されているように、「Ｈスコア」に基づいて決定することができる。Ｈスコアは、式：（３×強染色細胞の百分率）＋（２×中染色細胞の百分率）＋（弱染色細胞の百分率）によって得られ、０～３００の範囲を示す。Ｈスコアは特にＵＣにおいて使用されている。
本明細書における方法のいずれかの一部の実施形態において、低または中ネクチン－４発現（例えば、低または中レベルのネクチン－４発現を有する腫瘍または腫瘍細胞）は、約２５０以下、約２２０以下、約２００以下、約１８０以下、約１６０以下、約１５０以下、約１４０以下、約１３０以下、約１２０以下、約１１０以下または約１００以下のＨスコアに対応する。
本明細書における方法のいずれかの一部の実施形態において、低ネクチン－４発現（例えば、低レベルのネクチン－４発現を有する腫瘍または腫瘍細胞）は、２００以下、約１８０以下、約１６０以下、約１５０以下、約１４０以下、約１３０以下、約１２０以下、約１１０以下または約１００以下のＨスコアに対応する。
本明細書における方法のいずれかの一部の実施形態において、高ネクチン－４発現（例えば高レベルのネクチン－４発現を有する腫瘍または腫瘍細胞）は、約２９０以上のＨスコアに対応する。
別の例において、ネクチン－４染色は、クイックスコア（ＱＳ）によって、以下の式：ＱＳ＝Ｐ（陽性細胞の百分率）×Ｉ（強度）を使用してスコア化することができ、その最大スコアは３００である。ＱＳは、例えば乳癌において使用されている。例えば、ＴＮＢＣにおいて、一部の研究グループは、低ネクチン－４発現群をＱＳ≦１００として定義している。本明細書における方法のいずれかの一部の実施形態において、低または中ネクチン－４発現（例えば、低または中レベルのネクチン－４発現を有する腫瘍または腫瘍細胞）は、約２００以下、約１８０以下、約１６０以下、約１５０以下、約１４０以下、約１３０以下、約１２０以下、約１１０以下または約１００以下のＱＳスコアに対応する。
ＨＥＲ２の腫瘍細胞発現を評価するためのアッセイは当技術分野において周知である。例えば、ＦＤＡによって承認されているＳＰｏＴ－Ｌｉｇｈｔ ＨＥＲ２ ＣＩＳＨなどのアッセイは、ＨＥＲ２過剰発現を検出するために使用することができる。発色インサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）は、ＨＥＲ２遺伝子増幅を検出する。減算プローブ技術発色インサイチュハイブリダイゼーション（Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）とも称されるこの技法は、乳癌細胞が細胞表面にＨＥＲ２受容体タンパク質を過剰発現しているかどうかを確認するために使用される試験である。
別の広く使用されるＨＥＲ２のためのアッセイは、ホルマリン固定パラフィン包埋癌組織におけるＨＥＲ２タンパク質過剰発現を決定するために使用される半定量免疫組織化学アッセイであるＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）（Ｄａｋｏ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．）である。例えば、低レベルのＨＥＲ２を発現している腫瘍は、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）により、＋１～＋２のスコアによって同定することができる。
一態様において、処置は、既存の神経障害、糖尿病または高血糖症、心不全、眼病態を有する個体において使用される。そのような状態は、個体を、本開示の抗ネクチン－４抗体薬物コンジュゲートよりも高い毒性または狭い治療濃度域を有するエンホルツマブベドチンなどの抗ネクチン－４ ＡＤＣを用いる処置に対して不適切とし得る。
任意の実施形態において、処置の方法は、適宜、（ａ）個体における癌ステージおよび／または疾患進行を評価する工程、ならびに（ｂ）個体が再発性、転移性および／または進行（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｇ）癌を有する場合、本開示の有効量の抗ネクチン－４抗体薬物コンジュゲートを個体に投与する工程を含んでもよい。
一部の実施形態において、本発明は、尿路上皮癌を有する個体における腫瘍を処置する方法であって、（ａ）個体における癌ステージおよび／または疾患進行を評価すること、ならびに（ｂ）個体が再発性、転移性および／または進行癌を有する場合、本開示の有効量の抗ネクチン－４抗体薬物コンジュゲートを個体に投与することを含む方法を含む。
適宜、本開示の抗ネクチン－４抗体薬物コンジュゲートを用いて処置される個体は、外科的処置および／または治療剤、例えば化学療法剤、抗体、ＡＤＣもしくは放射線療法を用いた処置にもかかわらず（例えば処置中または処置後に）抵抗性であるか、応答しなかったか、または再燃および／もしくは進行した癌［例えば、尿路上皮癌、乳癌（例えばトリプルネガティブ乳癌、ＨＥＲ２陽性癌）、非小細胞肺癌、膵癌、卵巣癌、胃癌、結腸直腸癌、頭頸部扁平上皮癌腫または食道癌］を有してもよい。
本明細書の任意の実施形態において、処置応答は、周知の基準、例えば固形腫瘍における治療効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ、Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ Ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ）、例えばバージョン１．１（Eisenhauer et al.(2009) Eur. J. Cancer 45:228-247を参照されたい）、または免疫関連効果判定基準（ｉｒＲＣ、Ｉｍｍｕｎｅ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｃｒｉｔｅｒｉａ）（Wolchock et al.(2009) Clinical Cancer Research 15:7412-7420を参照されたい）に従って定義および／または評価することができる。
本開示の抗ネクチン－４抗体薬物コンジュゲートを用いて処置される個体は、化学療法剤［例えばＰ－糖タンパク質（Ｐｇｐ）による輸送が可能であることが公知の化学療法剤、例えばアントラサイクリン類（ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキサン類（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンカアルカロイド類（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン）、およびエトポシド類を用いる処置に抵抗性を示すか、その処置に応答性ではないか、またはその処置の後に進行した腫瘍または癌を有してもよい。Ｐｇｐによって認識される化合物は、典型的には、適度に疎水性（オクタノール－水分配係数、ｌｏｇＰ＞１）であると特徴付けられ、多くの場合、生理的条件下において正味正電荷を有する滴定可能なプロトンを含有し、主に芳香族部分を有する「天然物」である。
一部の実施形態において、抗ネクチン－４抗体、抗体断片を含むＡＤＣは、化学療法剤の併用投与の非存在下において使用または投与される。
他の実施形態において、抗ネクチン－４抗体、抗体断片またはそのようなものを含むＡＤＣは、化学療法剤と組み合わせて使用または投与されてもよい。例示的な化学療法剤としては、これらに限定されないが、アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、リポソーム化ドキソルビシン、リポソーム化ダウノルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、サトラプラチン、ストレプトゾシン、テガフール－ウラシル、テモゾロミド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、またはそれらの組合せが挙げられる。一実施形態において、抗ネクチン－４抗体、抗体断片（またはそのようなものを含むＡＤＣ）および化学療法剤は、別個の投与のために製剤化され、同時または逐次に投与される。
適宜、個体は、進行しているか、再燃しているかまたは前療法を伴う前処置に応答性ではない癌を有すると特徴付けることができ、さらに、前療法はエンホルツマブベドチンの投与および／またはＰＤ－１中和剤（例えば、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、ニボルマブ）の投与を含んでもよく、前療法は化学療法剤であってもよい。
適宜、任意の実施形態において、個体は、エンホルツマブベドチンを用いる処置に不適格である、および／またはエンホルツマブベドチンを用いる処置に好適でも適応でもない癌を有すると特徴付けることができる。
カンプトテシン誘導体分子にコンジュゲートした抗ネクチン－４抗体を用いてヒトを処置するための例示的な処置プロトコルは、例えば、本開示の有効量の抗ネクチン－４抗体薬物コンジュゲートを患者に投与することを含み、方法は、少なくとも１用量の、カンプトテシン誘導体分子にコンジュゲートした抗ネクチン－４抗体が０．１～１０ｍｇ／ｋｇ体重、０．１～５ｍｇ／ｋｇ体重、０．１～１ｍｇ／ｋｇ体重、１～１０ｍｇ／ｋｇ体重または１～５ｍｇ／ｋｇ体重の用量において投与される少なくとも１回の投与サイクルを含む。一実施形態において、複数の用量、例えば少なくとも２、３、４、５、６、８、１０用量が投与される。一実施形態において、複数用量の投与は、少なくとも２、３または４週間離される。一実施形態において、投与サイクルは２週間～８週間の間、または少なくとも４、６、８もしくは１６週間である。
一実施形態において、本開示の抗ネクチン－４抗体薬物コンジュゲートはｉ．ｖ．によって投与される。
［実施例１］
Ｈｅｒ２およびネクチン－４を共発現するヒト腫瘍細胞
ＨＥＲ２およびネクチン－４遺伝子発現の研究を、異なる種類の癌における重要なゲノム変化の多次元マップに基づく癌ゲノムアトラス（米国国立癌研究所と米国立ヒトゲノム研究所との共同研究）を使用して実行した。ＨＥＲ２およびネクチン－４発現の有意な相関は、特に膵癌、肺腺癌腫患者、乳癌および膀胱癌患者由来の試料において観察された。観察された最も高い相関は膵癌であり、相関値は、スピアマンにおいて０．７１、ピアソンにおいて０．７８であった。
ＳＵＭ１８５およびＳＵＭ１９０ヒト乳癌腫瘍細胞株（Ｂｉｏｖｉｔ Ｉｎｃ．）におけるＨＥＲ２およびネクチン－４発現をフローサイトメトリーによって決定した。ＳＵＭ１８５は、ＥＲ陰性、ＰＲ陰性かつＨＥＲ２陽性未分化乳癌腫を有する患者の胸水を起源とする。この細胞株はＨｅｒ２を過剰発現する。ＳＵＭ１９０は、ＥＲ陰性、ＰＲ陰性かつＨＥＲ２陽性（増幅）乳癌を有する患者由来の原発性腫瘍を起源とする。腫瘍細胞を、１０μｇ／ｍｌ（４℃）の抗ネクチン－４抗体（Ｆｃガンマ受容体結合が低下した、Ｎ２９７Ｑ突然変異を含有するヒトＩｇＧ１アイソタイプとして改変されたＡＳＧ－２２ＭＥ）または抗Ｈｅｒ２抗体（Ｆｃガンマ受容体結合が低下した、Ｎ２９７Ｑ突然変異を含有するヒトＩｇＧ１アイソタイプとして改変されたトラスツズマブ）、およびアイソタイプ対照を用いて染色し、続いて１：２００の希釈率のＰＥコンジュゲートポリクローナルヤギ抗ヒト抗体を用いて染色した。試料を、Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＨＴＳ）を用いる細胞蛍光分析によって分析した。
代表的な結果を、ＳＵＭ１９０ヒト乳癌腫瘍細胞については図１、ＳＵＭ１８５ヒト乳癌腫瘍細胞については図２に示す。ＭＦＩ：蛍光強度の中央値。ＳＵＭ１９０腫瘍細胞は、ＨＥＲ２を低～中レベル（蛍光単位中央値１７７７）において、およびネクチン－４をより低いレベル（９９１の蛍光単位中央値）において発現した。ＳＵＭ１８５細胞は、ＨＥＲ２を中～高レベル（蛍光単位中央値２８８０）において、およびネクチン－４をより高いレベル（４３２６の蛍光単位中央値）において発現した。

［実施例２］
カンプトテシン誘導体により機能化された抗ネクチン－４ ＡＤＣのＨＥＲ２＋ネクチン４＋ヒト腫瘍細胞に対する有効性
抗ネクチン－４抗体－薬物コンジュゲートを調製し、ＨＥＲ２＋ネクチン４＋ヒト腫瘍細胞に対する有効性についてトラスツズマブ抗体－薬物コンジュゲートと比較した。ヒトＩｇＧ１アイソタイプとして配列番号２８および２９のＶＨおよびＶＬを有する抗ネクチン－４抗体－薬物コンジュゲートを調製した。
Ｎ４１ ＶＨ：
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGSTDYN
AAFISRLSISKDTSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARELIHAMDNWGQGTSVTVSS
（配列番号２８）。
Ｎ４１ ＶＬ：
DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGNSPQLLVFAATNLADGVPS
RFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGTYYCQHFWGTPTFGGGTKLEIK
（配列番号２９）。
トラスツズマブの重鎖および軽鎖（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ）を有する抗ＨＥＲ２抗体－薬物コンジュゲートを調製した。抗ネクチン－４抗体と抗ＨＥＲ２抗体の両方は、それぞれ、鎖間ジスルフィドの部分的還元後、抗体のシステイン残基を介してリンカー－カンプトテシン誘導体に確率的にコンジュゲートした。２～１０モル当量の範囲の還元剤トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を撹拌下（３５０～４００ｒｐｍ、＋３７℃）において２時間、抗体（３ｍｇ／ｍＬ）と共にインキュベートして、ジスルフィドを還元した。リンカー－毒素のコンジュゲーションは、９．２または１２モル当量のモル過剰のリンカー－毒素の添加によって、撹拌ホイール上＋３７℃において一晩インキュベートして実行した。結果として得たＡＤＣは、約８の平均薬物負荷（薬物：抗体比）を有した。さらなる例において、同じ方法を使用して、抗ネクチン－４抗体を、リンカーを含有する第２のカンプトテシン（ＳＮ－３８）にもコンジュゲートした。本実施例において使用したＡＤＣは以下の通りである。
Ｎ４ ＡＤＣ１：構造：
を有するリンカーにコンジュゲートした抗ネクチン－４、
Ｈｅｒ２ ＡＤＣ１：構造：
を有するリンカーにコンジュゲートした抗ＨＥＲ２、
Ｎ４ ＡＤＣ２：構造：
を有するリンカーにコンジュゲートした抗ネクチン－４。
結果として得たＡＤＣを、実施例１のネクチン－４／ＨＥＲ２発現ＳＵＭ１９０、ＭＣＦ－７腫瘍細胞の死を誘導する能力について試験した。簡潔に述べると、細胞は、９６ウェルプレートにプレーティングした（Ｖ＝８０μｌ）。Ｎ４ ＡＤＣ１およびＨＥＲ２ ＡＤＣ１もしくはヒトＩｇＧ１－アイソタイプ対照（ＩＣ）－リンカー－毒素または培地（濃度５倍）を、（５３０ｎＭ～３０ｎＭ）からの１：２の段階希釈において、ならびにＮ４ ＡＤＣ１およびアイソタイプ対照については１：５の段階希釈（７ｎＭ～７×１０－２ｎＭ）において試験した。Ｎ４ ＡＤＣ２およびアイソタイプ対照を、（５３０ｎＭ～５．３ １０－２）からの１：１０の段階希釈において試験した。ＡＤＣの細胞死を引き起こす能力を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３－２装置を使用してコンフルエンスを評価することによって判定し、処置後６日目の生存性を、Ｅｎｓｐｉｒｅ２装置を用いるＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（商標）（ＣＴＧ）アッセイを使用して決定した。各ＡＤＣのＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８による６日目のデータにおける発光細胞生存性を使用して決定した。実験を２回繰り返した。
代表的な結果を図３に示す。図３の右手側の２つのパネルは、Ｎ４ ＡＤＣ１（抗ネクチン－４）が腫瘍細胞の死を引き起こすことに関して効果的であることを示し、Ｎ４ ＡＤＣ１を、正方形を有する実線として示し、アイソタイプ対照を破線として示す。図３の左手側の２つのパネルは、同じそれぞれの細胞におけるＨＥＲ２ ＡＤＣ１（抗ＨＥＲ２）の有効性を示し、ＨＥＲ２ ＡＤＣ１を、点を有する実線として示し、アイソタイプ対照を破線として示す。ＩＣ５０値を以下の表に要約する。Ｎ４ ＡＤＣ１は、はるかに低いネクチン－４表面発現によって特徴付けられるＳＵＭ１８５細胞（ＳＵＭ１８５における表面ネクチン－４はＳＵＭ１９０の約４分の１）においても特に強力であった。カンプトテシン誘導体ＳＮ３８を有するＮ４ ＡＤＣ２（抗ネクチン－４）もまた良好な効力を示した（以下の表のＩＣ５０を参照されたい）。
表：ＡＤＣのＩＣ５０値
結果は、ネクチン－４を発現するＳＵＭ１８５において、抗ネクチン－４ ＡＤＣ（Ｎ４ ＡＤＣ１）が抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ（Ｈｅｒ２ ＡＤＣ１）よりも相当に強力であったことを示し、ネクチン－４ ＡＤＣのＩＣ５０は４０分の１であった。注目すべきことに、ＳＵＭ１８５細胞はネクチン－４を比較的高いレベルにおいて発現し、これらの細胞において、ネクチン－４発現レベルはＨＥＲ２の約２倍であった（実施例１を参照されたい）。しかしながら、興味深いことに、抗ネクチン－４（Ｎ４ ＡＤＣ１）および抗ＨＥＲ２（ＨＥＲ－２ ＡＤＣ１）ＡＤＣを、これよりもはるかに低いレベルのネクチン－４表面発現を有するＳＵＭ１９０細胞において試験した場合、抗ネクチン－４ ＡＤＣ（Ｎ４ ＡＤＣ１）は依然として高度に強力であった。これらのＳＵＭ１９０細胞において、ネクチン－４表面発現はＨＥＲ２の半分に過ぎなかったが、抗ネクチン－４カンプトテシンＡＤＣは依然として、抗ＨＥＲ２ ＡＤＣと少なくとも同程度に強力であったか、または場合によっては抗ＨＥＲ２ ＡＤＣよりも強力であり、抗ネクチン－４ ＡＤＣのＩＣ５０は抗抗Ｈｅｒ２ ＡＤＣの６分の１であった。
したがって、細胞内で切断可能なペプチドリンカーとカンプトテシン誘導体化合物との組合せは、ピロロベンゾジアゼピン類およびアウリスタチン類などの最も広く使用される細胞毒性剤と比較して改善されたオフターゲット毒性を有しない、より低いネクチン－４発現レベルによって特徴付けられるものを含むネクチン－４発現腫瘍細胞を排除するための効果的な手段となり得る。抗ネクチン－４ ＡＤＣはまた、ＨＥＲ２低発現癌および／またはＨＥＲ２中発現癌を含むがこれらに限定されないＨＥＲ２陽性癌を処置する有益な手法も提供し得る。
［実施例３］
抗ＨＥＲ２ ＡＤＣと組み合わせた抗ネクチン－４カンプトテシン誘導体ＡＤＣの有効性
抗ネクチン－４ ＡＤＣ（Ｎ４ ＡＤＣ１）および抗Ｈｅｒ２ ＡＤＣ（Ｈｅｒ２ ＡＤＣ１）を試験して、組み合わせて使用した場合の腫瘍細胞死を引き起こす能力を評価した。
使用した抗ネクチン－４カンプトテシン誘導体ＡＤＣは、実施例２に示したＮ４ ＡＤＣ１であった。抗Ｈｅｒ２ ＡＤＣもまた、実施例２において使用したもの（Ｈｅｒ２ ＡＤＣ１）であった。ＡＤＣの細胞死を引き起こす能力は、実施例２に記載したように、コンフルエンスを評価し、６日目のＳＵＭ１９０細胞の生存性を決定することによって判定した。結果は、抗ネクチン－４ ＡＤＣと抗Ｈｅｒ２ ＡＤＣとの組合せが、ネクチン－４＋Ｈｅｒ２＋腫瘍細胞の死を引き起こすことに関して、単独で使用されたいずれかのＡＤＣと比較して改善された効力（より低いＩＣ５０）を有したことを示した。
［実施例４］
新規抗ネクチン－４抗体のパネルの作製
免疫化
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、Ｃ末端６－Ｈｉｓタグと融合した以下のネクチン－４アミノ酸配列断片を有する組換えヒトネクチン－４タンパク質を用いて免疫化した：
GRCPAGELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARVDAGEGAQELALLHS KYGLHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRL RVLVPPLPSLNPGPALEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTTSSRSFKHSRSAA VTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDQRITHILHVSFLAEASVRGLEDQNLWHIGRE GAMLKCLSEGQPPPSYNWTRLDGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEFSSR DSQVTVDVLDPQEDSGKQVDLVSASVV（配列番号２）
２回目のＩＰ注射（ＩＰ２）後、免疫化マウスの血清を回収して、滴定を実施した。これらの滴定は、各血清の力価の決定、および融合のための最良の応答マウスの選択を可能にした。血清滴定は、表面に全長ヒトネクチン－４を発現するように作製されたＣＨＯ細胞株（以下に記載されるｈｕＮｅｃｔｉｎ４ Ｃｌ．３Ｃ８細胞株）に対して行った。
免疫前血清においてバックグラウンドシグナルは観察されなかった。全ての免疫化マウスは、２回のＩＰ注射後の免疫化に対する応答が弱く、ＥＣ５０は、滴定曲線がプラトー相に達しなかったため、算出不能であった。曲線によると、マウス＃２、＃３および＃４はｈｕＮｅｃｔｉｎ４に対してより高い反応性を呈し、これらを融合プロセスのために使用した。
融合プロセスによって生成されたハイブリドーマをメチルセルロース半固形培地含有１ウェルプレートに播種し、３７℃、１０％ＣＯ２において１１～１３日間インキュベートした。成長コロニーをピッキングし、平底９６ウェルプレートに散布した。５～７日後、ハイブリドーマ上清をフローサイトメトリースクリーニング＃１のために回収した。
フローサイトメトリースクリーニング＃１
ハイブリドーマ上清の１５のプレートを、野生型ヒトネクチン－４発現ＣＨＯ細胞株に対する結合について、フローサイトメトリーによって試験した。簡潔に述べると、ウェルごとに、ＰＢＳ、ＢＳＡ ０．５％、ＥＤＴＡ ５ｍＭの緩衝液中０．２×１０６個のネクチン－４発現細胞を使用した。第１の抗体を、５０μＬの上清において、＋５±３℃にて１時間細胞と共にインキュベートした。対照抗体にはアイソタイプエンホルツマブＴ１－１が含まれた。細胞を染色緩衝液において３回洗浄し、二次抗体を＋５±３℃において３０分間インキュベートして、ハイブリドーマ上清についてはヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ特異的二次抗体、対照抗体についてはヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的－ＰＥ二次抗体を使用して、結合抗ネクチン－４抗体を明らかにした。ＦｏｒｅＣｙｔ（商標）ソフトウェア上でのデータ解析を伴うＨＴＦＣフローサイトメーター（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）の取得。
少なくとも弱い陽性シグナルを含む陽性シグナルを示した全てのハイブリドーマをさらなる特性評価のために選択した。この１回目のスクリーニング試験後のハイブリドーマのランク付けを行うために、それらのプロファイルを結合レベルに応じて＋／－から＋＋＋まで記録した。２回目のフローサイトメトリースクリーニングアッセイのために、３５のクローンを選択し、新しいプレートに移した。
フローサイトメトリースクリーニング＃２
１回目のスクリーニングの結果および選択を検証するために、スクリーニング＃１と同じ方法に基づいて選択した３５のクローンに対して２回目のスクリーニングを実施することが必要であった。合計で１９のクローンは、ヒトネクチン－４発現細胞株に対して陽性であることがフローサイトメトリーによって確認された。より低いＭＦＩを有する４つのクローンもまた保持された。これらのハイブリドーマを２４ウェルプレートにおいて最大１ｍＬに増幅した。上清を回収し、細胞をＲＮＡの保存のためにＲＡ１溶解緩衝液中で凍結した。
要約すると、ほぼ１０００のハイブリドーマ上清の結合特性を、ヒトネクチン－４発現ＣＨＯ細胞株に対してフローサイトメトリーによって評価した。２ラウンドのスクリーニング後、２３のハイブリドーマをさらなる特性評価およびＫｏｆｆ決定のために選択した。
Ｋｏｆｆスクリーニング
Ｋｏｆｆスクリーニングを２３の選択したクローンに対して実施した。この試験は、ハイブリドーマの上清に存在する各抗体の解離速度の決定を可能にする。この試験のために使用したタンパク質は、以下のアミノ酸配列：
GELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARVDAGEGAQELALLHSKYGLHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVLVPPLPSLNPGPALEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTTSSRSFKHSRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDQRITHILHVSFLAEASVRGLEDQNLWHIGREGAMLKCLSEGQPPPSYNWTRLDGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEFSSRDSQVTVDVLDPQEDSGKQVDLVSASHHHHHHLHHILDAQKMVWNHR（配列番号３０）
を有するモノマーｈｕＮｅｃｔｉｎ４－ｈｉｓ－ＢｉｒＡタンパク質であった。
簡潔に述べると、キネティック緩衝液（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｂｕｆｆｅｒ）１Ｘ（ＫＢ１Ｘ）に１０分間、次いでＲＰＭＩ培地に１０分間浸すことによる２００μＬ／ウェルでの平衡化、２００μＬの最終容量の、選択した抗体上清のＫＢ１Ｘへの１／３希釈液、およびＫＢ１Ｘ中１００ｎＭの組換えタンパク質ｈｕＮｅｃｔｉｎ４－ＢｉｒＡタンパク質の希釈液を伴う、ＡＭＣ抗マウスＦｃバイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｃｏｒｐ．）を使用した。工程を以下の表に記載し、ここにおいて、工程ごとに９６ウェルプレートを調製した（２００μＬの各緩衝液）。結果はＦｏｒｔｅｂｉｏデータ解析において取得した。
工程 時間（秒） 緩衝液
１．ベースライン ６０ ＫＢ１Ｘ
２．充填 ３００ 希釈ＳＮ
３．ベースライン ６０ ＫＢ１Ｘ
４．会合 １８０ 希釈タンパク質
５．解離 ３００ ＫＢ１Ｘ
６．再生 ５（×３） グリシン１０Ｍｍ ｐＨ１．８およびＰＢＳ１Ｘ
スクリーニング＃１、＃２の結果、クローニングプロセスのために９つの抗体が選択された。Ｋｏｆｆスクリーニングは、全ての試験されたＡｂが高いＫｏｆｆ（３．７５Ｅ－３～５．８８Ｅ－３ ｓ－１の範囲）を有したことを示し、これらの抗体においては抗体／タンパク質相互作用の解離が速いことを示した。
アンカーネクチン－４ドメイン欠失タンパク質への結合
新規抗体をヒトＩｇＧ１アイソタイプ（以下のさらなる試験において使用）として組換えにより製造し、公知の比較抗体エンホルツマブおよびＮ４と一緒に試験し、ヒトネクチン－４の異なるドメインと結合する能力について評価した。ＦＤＡによって承認されているＡＤＣエンホルツマブベドチンの抗体構成成分であるエンホルツマブ（ＡＳＧ－２２ＭＥ）は、ＡＤＣとして高い内在化能力および強力な抗腫瘍活性を有することが実証されている。抗体Ｎ４１は、ＡＤＣとして高い内在化能力および強力な抗腫瘍活性を有する。エンホルツマブとＮ４１の両方は、膜遠位であるネクチン－４のＩｇ様Ｖ型ドメインに結合すると考えられる。
野生型ｈｕＮｅｃｔｉｎ４タンパク質は、以下の表１に要約される３つの細胞外Ｉｇ様ドメイン（Ｖ、Ｃ１およびＣ２）から構成される。
表１
抗体のネクチン－４ドメインに対する結合の特性評価を、野生型ヒトネクチン－４タンパク質を発現するように作製された細胞、ならびにＩｇ様Ｃ２型１およびＩｇ様Ｃ２型２ドメインを有し、Ｉｇ様Ｖドメインを欠いている改変ネクチン－４（Ｃ１Ｃ２コンストラクト）を発現するように作製された細胞を使用してフローサイトメトリーによって実施した。後者のタンパク質は、フローサイトメトリー細胞選別のためのＶ５タグをさらに有し、細胞を、ネクチン４－Ｃ１Ｃ２－Ｖ５選別細胞として使用した。
野生型ネクチン－４（Ｃｌ．３Ｃ８細胞株）、Ｃ２コンストラクト（Ｉｇ様Ｃ２型２ドメインを含有し、ＶドメインとＣ１ドメインの両方を欠いている）、およびＣ１Ｃ２コンストラクトは、試験抗体がＶドメインまたは異なるＣドメインに結合するか否かについての判定を可能にする。簡潔に述べると、異なるヒトネクチン－４ドメインをコードする核酸配列をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を適切な制限部位において発現ベクターに挿入した。リーダーペプチド、ならびにＣ１Ｃ２およびＣ２についてはアミノ酸配列ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ（配列番号４１）を有するＮ末端Ｖ５タグを付加し、細胞の表面の発現をフローサイトメトリーによって確認した。結果として得た異なるヒトネクチン－４ドメイン断片含有タンパク質のアミノ酸配列を以下に示す（Ｖ５タグには下線を付している）。次いで、ベクターをＣＨＯ細胞株にトランスフェクトして、異なるネクチン－４ドメインタンパク質を細胞表面に発現する安定なクローンを得た。
ｈｕＮｅｃｔｉｎ４ Ｃｌ．３Ｃ８細胞株（野生型ネクチン－４）におけるネクチン－４アミノ酸配列：
GELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARVDAGEGAQELALLHSKYGLHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVLVPPLPSLNPGPALEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTTSSRSFKHSRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDQRITHILHVSFLAEASVRGLEDQNLWHIGREGAMLKCLSEGQPPPSYNWTRLDGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEFSSRDSQVTVDVLDPQEDSGKQVDLVSASVVVVGVIAALLFCLLVVVVVLMSRYHRRKAQQMTQKYEEELTLTRENSIRRLHSHHTDPRSQPEESVGLRAEGHPDSLKDNSSCSVMSEEPEGRSYSTLTTVREIETQTELLSPGSGRAEEEEDQDEGIKQAMNHFVQENGTLRAKPTGNGIYINGRGHLV（配列番号３１）
ｈｕＮｅｃｔｉｎ４－Ｃ１Ｃ２－Ｖ５細胞株（Ｖドメインを欠いている）におけるネクチン－４アミノ酸配列：
PPLPSLNPGPALEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTTSSRSFKHSRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDQRITHILHVSFLAEASVRGLEDQNLWHIGREGAMLKCLSEGQPPPSYNWTRLDGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEFSSRDSQVTVDVLDPQEDSGKQVDLVSASVVVVGVIAALLFCLLVVVVVLMSRYHRRKAQQMTQKYEEELTLTRENSIRRLHSHHTDPRSQPEESVGLRAEGHPDSLKDNSSCSVMSEEPEGRSYSTLTTVREIETQTELLSPGSGRAEEEEDQDEGIKQAMNHFVQENGTLRAKPTGNGIYINGRGHLV（配列番号３２）
ｈｕＮｅｃｔｉｎ４－Ｃ２－Ｖ５細胞株（ＶドメインおよびＣ１ドメインを欠いている）におけるネクチン－４アミノ酸配列：
ASVRGLEDQNLWHIGREGAMLKCLSEGQPPPSYNWTRLDGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEFSSRDSQVTVDVLDPQEDSGKQVDLVSASVVVVGVIAALLFCLLVVVVVLMSRYHRRKAQQMTQKYEEELTLTRENSIRRLHSHHTDPRSQPEESVGLRAEGHPDSLKDNSSCSVMSEEPEGRSYSTLTTVREIETQTELLSPGSGRAEEEEDQDEGIKQAMNHFVQENGTLRAKPTGNGIYINGRGHLV（配列番号３３）
９つの選択した抗体のうちの３つは、全ネクチン－４タンパク質に結合しなかった。この結果は、これらの３つの抗体が試料中において信頼性の高い結果を生じるほど十分には濃縮されなかった（捕捉シグナル＜０．３ｎｍ）ことを示すＫｏｆｆ実験と一致した。結果を、全（野生型）ネクチン－４タンパク質への結合については図４Ａ、Ｃ１Ｃ２コンストラクトへの結合については図４Ｂに示す。残りの６つの選択した抗体については、４つの抗体が全ネクチン－４タンパク質およびＩｇ様Ｖ型ドメインを欠いているＣ１Ｃ２コンストラクトへの完全な結合を保持し、これらがＣ１および／またはＣ２ドメイン内に結合することを示した。比較として、ゴールドスタンダードの内在化抗体Ｎ４１およびエンホルツマブは、全ネクチン－４タンパク質に結合し、Ｃ１Ｃ２コンストラクトへのあらゆる結合を喪失した。したがって、Ｎ４１およびエンホルツマブは、Ｖドメイン内においてネクチン－４に結合する。１０Ｂ１２（ｍＡｂ７とも称される）および５Ｅ７（ｍＡｂ６とも称される）の２つの抗体は、抗Ｉｇ様Ｖドメイン抗体にも抗Ｉｇ様Ｃ２型１および／またはＣ２型２ドメイン抗体にも対応しないプロファイルを示した。１μｇ／ｍＬの濃度において、ｍＡｂ１～５は、１０００００の範囲の蛍光（ＭＦＩ）値を示したが、ｍＡｂ６および７のＭＦＩは５０００～１５０００の間であった。したがって、抗体５Ｅ７および１０Ｂ１２は、Ｃ１Ｃ２コンストラクトへの結合の部分的な喪失を示し、このことは、これらが部分的にはＶドメインにおいて、および部分的にはＩｇ様Ｃ２型１ドメインにおいてネクチン－４と結合することを示唆し、クローニングおよび精製された抗体を用いて繰り返した場合、Ｃ１Ｃ２コンストラクトへの結合の喪失は結合の低減であって完全な喪失ではないことが確認された。ネクチン－４タンパク質の構造解析と、ヒト、カニクイザル、ラットおよびマウスネクチン－４への抗体結合プロファイルとを考慮すると、抗体１０Ｂ１２（ｍＡｂ７）および５Ｅ７（ｍＡｂ６）は、ドメインＣ１とドメインＶとの接合部においてネクチン－４と結合すると考えられる。ネクチン－４のドメインおよび抗体を図５に示す。
Ｈｕ－Ｎｅｃｔｉｎ４ ＩｇＣ１Ｃ２－Ｖ５選別細胞への結合のＥＣ５０値
結論として、３５を超える抗体を取得および特性評価して、この免疫化において得られた抗体は、本質的に全てがＩｇ様Ｃ２型１および／またはＣ２型２ドメインと結合した抗体であった。ＡＤＣにおいて使用される高度に内在化するゴールドスタンダードの抗体と会合するＩｇ様Ｖセットドメインに特異的である抗体は得られなかった。
［実施例５］
フローサイトメトリー滴定アッセイによるネクチン－４への結合の特性評価
実施例４においてエンホルツマブまたはＮ４１と同様の抗Ｉｇ様Ｖセットドメイン抗体が得られなかったという事実にもかかわらず、Ｉｇ様Ｃ２型１および／またはＣ２型２ドメインと結合した抗体は、処分されず、それにもかかわらず、フローサイトメトリー滴定アッセイ、内在化能に関するアッセイ、およびトポイソメラーゼ阻害薬（カンプトテシン（ｃａｍｐｔｈｏｔｈｅｃｉｎ）類似体であるデルクステカン）にコンジュゲートした直接細胞毒性アッセイにおいてさらに特性評価された。
この実験において、抗ネクチン－４ ＡｂのＳＵＭ１８５細胞（比較的高いレベルのネクチン－４を発現する）のネクチン－４に結合する能力をフローサイトメトリーによって評価した。ある濃度範囲の抗体を細胞上においてインキュベートし、結合した抗ネクチン－４抗体を、二次抗体「ヤギ抗ヒトＨ＋Ｌ ＰＥ」の添加によって明らかにした（蛍光は、抗ネクチン－４ Ａｂの細胞への結合に比例した）。簡潔に述べると、ＳＵＭ１８５細胞を、トリプシン（３７℃、５分間）を用いてフラスコから剥離し、次いで培地を用いて１回洗浄した。５００００個の細胞を、２０μｇ／ｍｌからの濃度範囲の試験抗体（８点、希釈倍率４）と共に４℃において３０分間インキュベートした。細胞を、氷冷ＳＢを用いて３回洗浄し、結合した抗ネクチン－４ Ａｂを、１／２００の二次抗体「ヤギ抗ヒトＨ＋Ｌ ＰＥ」（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）の氷上での３０分間の添加によって明らかにした。細胞を、氷冷ＳＢを用いて２回洗浄した。取得はフローサイトメーター上で行った。
結果を図６に示す。結合プロファイルに応じて、抗ネクチン－４ Ａｂの２つの異なる群が存在することが観察された。概して、２つの抗体を除いて、実施例４の新規抗体はエンホルツマブと類似したプロファイルを有し、ＳＵＭ１８５細胞への結合について同様に高いプラトーを示した。除外されたものは、ＳＵＭ１８５細胞への結合についてより低いプラトーによって特徴付けられた異なるプロファイルを有した実施例４の２つの抗体５Ｅ７（ｍＡｂ６）および１０Ｂ１２（ｍＡｂ７）であった。図６は、実施例４の異なる抗体およびアイソタイプ対照（ＩＣ）のＳＵＭ１８５細胞に対する結合プロファイルを示す。この実験から、Ｃ１および／またはＣ２特異的抗体（ｍＡｂ１～５）は、概して、エンホルツマブに匹敵する結合プロファイルを有すると考えられる。
［実施例６］
細胞内内在化
抗ネクチン－４抗体のネクチン－４内在化を誘導する能力を、より低いレベルのネクチン－４を発現するＳＵＭ１９０細胞株およびより高いレベルのネクチン－４を発現するＳＵＭ１８５細胞において評価した。内在化は、抗ネクチン－４抗体がネクチン－４発現細胞を標的とし、それを排除することを可能にするＦａｂ－ＺＡＰヒト内在化キット（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用することによって、ＣＴＧ基質を使用した細胞生存性の測定［ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）］に基づいて、間接的に判定した。Ｆａｂ－ＺＡＰは、ヤギ抗ヒト一価抗体とリボソーム不活性化タンパク質であるサポリンとの化学的コンジュゲートである。使用した抗体は、ヒトＩｇＧの重鎖と軽鎖の両方に対する親和性精製ポリクローナル抗体である。この二次コンジュゲートを使用して、一次抗体の内在化する可能性を評価する。
簡潔に述べると、ある濃度範囲の抗ネクチン－４抗体または対照をＳＵＭ１９０またはＳＵＭ１８５細胞と共にインキュベートした。４℃における４５分のインキュベーション後、非結合抗体を洗浄除去し、Ｆａｂ－ＺＡＰを細胞上に添加した。新たに形成された複合体（抗ネクチン－４抗体＋Ｆａｂ－ＺＡＰ）は細胞に内在化され、細胞において、サポリンは、放出され、タンパク質合成を停止して細胞死をもたらした。抗体の内在化能を細胞生存性によって間接的に判定した、すなわち、細胞殺滅が効率的であるほど抗体の内在化能はより良好であると判定した。
図７Ａは、ＳＵＭ１９０細胞に対する内在化を示し、各抗体およびエンホルツマブについて、抗ネクチン－４抗体濃度に対する発光をグラフにプロットしたことを示す。実施例４の様々な新規抗ネクチン－４抗体が、陰性対照（ＩＣ）と比較して、ネクチン－４の内在化とそれに続く細胞の死とを誘導した。しかしながら、Ｉｇ様Ｖセットドメインに結合せずにＩｇ様Ｃ２型１および／またはＣ２型２ドメインと結合した５つの抗体は全て、内在化の誘導に関してエンホルツマブよりも相当に効力が低く、高度に内在化する抗体はＩｇ－Ｖセットドメインと結合する抗体であることを示唆した。しかしながら、２つの非ＩｇＶ、非Ｃ１Ｃ２抗体（５Ｅ７および１０Ｂ１２）は、内在化を誘導することに関してエンホルツマブと同程度に効率的であった。
図７Ｂは、エンホルツマブと比較したｍＡｂ６のＳＵＭ１８５細胞に対する内在化を示し、各抗体について、抗ネクチン－４抗体濃度に対する発光をグラフにプロットしたことを示す。抗体５Ｅ７（ｍＡｂ６）は、ＳＵＭ１８５細胞への内在化を誘導することに関してエンホルツマブよりも効率的であった。
［実施例７］
ＡＤＣとしての新規抗体の腫瘍細胞株に対するインビトロ細胞毒性
ネクチン－４低／ＳＵＭ１９０乳癌モデル
カンプトテシン類似体（Ｄｘｄまたはエキサテカン）とコンジュゲートした５Ｅ７抗体（ｍＡｂ６）のＳＵＭ１９０細胞を殺滅する能力を評価した。この実験において、５Ｅ７抗体は、等しい薬物抗体比において同じ毒素とコンジュゲートした、抗Ｉｇ様Ｖドメイン抗体エンホルツマブおよびＮ４１、ならびに対照抗体と共に試験した。抗体が、ｇｇｆｇ－Ｄｘｄと称される以下に示す構造：
を有する細胞内で切断可能なテトラペプチドリンカー（ＧＧＦＧ）を含むリンカーを介して、抗体１つ当たり８つの毒素（ＤＡＲ＝８）においてカンプトテシン類似体（Ｄｘｄ）にコンジュゲートした第１のＡＤＣを調製した。
抗体が、ＰＥＧ（８Ｕ）－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ－エキサテカンと称される以下の構造：
を有する切断可能なリンカーを介して、抗体１つ当たり８つの毒素（ＤＡＲ＝８）において別のカンプトテシン類似体（エキサテカン）にコンジュゲートした第２のＡＤＣを調製した。
簡潔に述べると、複数の用量範囲の試験された各Ａｂ（出発点１５０ｎＭ、希釈倍率２において３点、次いで５において５点）を、細胞と共に５日間インキュベートした後、ＣＴＧ基質の添加によって細胞生存性測定を行った。Ａｂ濃度に対する発光をグラフにプロットした。
各ＡＤＣについて、ある濃度範囲のＡＤＣをネクチン－４発現細胞と共にインキュベートした。インキュベーション後、ＣＴＧ基質を１／１の比において添加し、発光シグナルを、プレートリーダー（Ｅｎｓｐｉｒｅ）を用いて読み取った。これは、細胞生存性に比例する、存在するＡＴＰ（代謝活性細胞の指標）を定量することを可能にした。
結果を図８Ａおよび８Ｂに示す。図８Ａは、カンプトテシン類似体Ｄｘｄに（ＧＧＦＧ－Ｄｘｄリンカーを介して）またはエキサテカンに［（ＰＥＧ（８Ｕ）－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ－エキサテカンリンカーを介して］コンジュゲートしたｍＡｂ６（５Ｅ７）抗体によるヒト乳癌細胞の殺滅を、アイソタイプ対照抗体（ＩＣ）と共に［これらは全て等しい薬物抗体比（ＤＡＲ＝８）である］、Ｖドメインに結合するＥｎｈｅｒｔｕ（商標）［トラスツズマブデルクステカン（抗ＨＥＲ２）］と比較して示す。図８Ｂは、同じカンプトテシン類似体含有リンカーとコンジュゲートしたｍａｂ６（５Ｅ７）によるヒト乳癌細胞の殺滅を、カンプトテシン類似体とコンジュゲートした免疫対照、すなわち同じＤＡＲにおいてカンプトテシン類似体含有リンカーにコンジュゲートしたｍＡｂ３、およびＥｎｈｅｒｔｕ（商標）と共に示す。
３つのネクチン－４標的ＡＤＣは、非標的ＡＤＣ（ＩＣ－ＧＧＦＧ－カンプトテシン）よりも効率的に細胞生存性を低下させた。Ｅｎｈｅｒｔｕ（商標）およびいずれかのカンプトテシン類似体含有リンカーによりコンジュゲートした５Ｅ７は、いかなるリンカーを使用した場合であれ、カンプトテシン類似体にコンジュゲートしたｍＡｂ３よりも強力であった。
ＳＵＭ１８５、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＭＣ３８およびＢ１６Ｆ１０細胞株
エキサテカンに［（ＰＥＧ（８Ｕ）－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ－エキサテカンリンカーを介して］コンジュゲートした抗体５Ｅ７を、他の癌細胞株に対する細胞殺滅についてさらに試験した。図８Ｃは、ＨＥＲ－２およびネクチン－４発現ＳＵＭ１８５およびＳＵＭ１９０ならびにＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＴＮＢＣ）ヒト腫瘍細胞、ならびにヒトネクチン－４発現ＭＣ３８（結腸癌）およびＢ１６Ｆ１０（黒色腫）マウス腫瘍細胞の死を引き起こすことができる「５Ｅ７－エキサテカン」［エキサテカンリンカー（ＰＥＧ（８Ｕ）－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ－エキサテカンにコンジュゲートした５Ｅ７］の有効性を示す。細胞生存性のＥＣ５０値を以下に示す。

［実施例８］
抗ＩｇＶＣ１抗体による結合を特性評価するためのフローサイトメトリー滴定アッセイの改変
抗体５Ｅ７によって認識されたネクチン－４受容体の特異的ドメインのために、実施例５のフローサイトメトリー滴定プロトコルを改変した。実施例５において、トリプシンは、抗ＶＣ１ドメイン抗体５Ｅ７のエピトープに影響を及ぼすかまたはそれを破壊するように腫瘍細胞のネクチン－４を切断していると仮定した。この可能性を探索するために、トリプシンを用いた剥離後、腫瘍細胞を一晩成長させて、ネクチン－４の再発現を可能にした。
ＳＵＭ１９０ネクチン－４発現細胞を、トリプシン（３７℃、５分間）を用いてフラスコから剥離し、次いで培地を用いて１回洗浄した。ウェル１つ当たり５０，０００個の細胞を９６ウェル平底プレートに播種し、３７℃のインキュベーターにおいて一晩インキュベートした。用量範囲の抗体を２０μｇ／ｍｌから調製し（３点、希釈倍率２０）、洗浄した細胞上において４℃にて６０分間インキュベートした。細胞を、氷冷ＳＢ（染色緩衝液）を用いて氷上において２回洗浄し、結合した抗ネクチン－４抗体を、１／２００の二次抗体「ヤギ抗ヒトＨ＋Ｌ ＰＥ」（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）の氷上での３０分間の添加によって明らかにした。細胞を、数回ピペッティングすることによって剥離し、９６ウェルＵ底プレートに移し、ＳＢを用いて３回洗浄した。取得はフローサイトメーター上で行った。
［実施例９］
ヒト乳癌のマウスモデル（ネクチン－４低／ＳＵＭ１９０モデル）におけるＡＤＣのインビボ有効性
カンプトテシンＡＤＣとしての５Ｅ７抗体の有効性を、エンホルツマブおよびＮ４１との比較において、ヒト乳癌のマウスモデルにおいて比較した。この実験において、５Ｅ７抗体は、抗体１つ当たり８つの毒素の等しい薬物抗体比（ＤＡＲ＝８）においてｇｇｆｇ－Ｄｘｄリンカーにコンジュゲートした、エンホルツマブおよびＮ４１および対照Ａｂと一緒に試験した。
ＳＵＭ１９０細胞を、ＰＢＳにおいて１／２に希釈した成長因子を含有する１００μｌのマトリゲル中５０万個の用量において、ＣＢ１７－ＳＣＩＤ免疫欠損マウスに皮下移植した。腫瘍が１９５～２５０ｍｍ３の間の体積に達したら、マウスを、３ｍｇ／ｋｇのカンプトテシンＡＤＣの単回注射を用いる静脈内処置のために９匹のマウスからなる複数の群に無作為化した。腫瘍成長を週に２回追跡した。カプラン・マイヤー生存曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ７ソフトウェアを使用することによって以下の基準に従って確立した：腫瘍体積が１５００ｍｍ３に達した場合、マウスを安楽死させ、屠殺の当日（Ｄ）に死亡したものとみなした。腫瘍が壊死の徴候を示した場合、マウスを安楽死させ、同じ日（Ｄ）に死亡したものとみなした（個々の腫瘍成長のグラフにおいて赤い星により示した）。
結果は、１０ｍｇ／ｋｇ用量において、全てのＡＤＣが腫瘍体積の増大を予防することに関して同様に効率的であったことを示した。しかしながら、より低い用量のＡＤＣ（３ｍｇ／ｋｇ）においては、抗体５Ｅ７は腫瘍成長を予防する強力な能力を示したが、Ｎ４１とエンホルツマブの両方は腫瘍成長を制御する能力をもはや示さなかった。３ｍｇ／ｋｇ用量の結果を図９に示す。
［実施例１０］
薬剤耐性の乳癌モデル（ヒト乳癌、ＨＥＲ２／ネクチン－４高／ＳＵＭ１８５モデル）におけるＡＤＣのインビトロ有効性の比較
次に、カンプトテシン類似体とコンジュゲートした５Ｅ７ ＡｂのＳＵＭ１８５細胞を殺滅する能力を、ＰＡＤＣＥＶ（商標）（エンホルツマブベドチン）およびＥＮＨＥＲＴＵ（商標）と比較して評価した。この設定は、抗ＨＥＲ２耐性のモデルとして使用されている。ＳＵＭ１８５細胞はネクチン－４を比較的高いレベルにおいて発現し、これらの細胞において、ネクチン－４発現レベルはＨＥＲ２の約２倍である（実施例１を参照されたい）。この実験において、５Ｅ７抗体は、ＤＡＲ＝８を有するＡＤＣとして、ＰＡＤＣＥＶ（商標）（ＤＡＲ＝４、ＦＤＡによって承認されているＰＡＤＣＥＶ（商標）に対する仕様）および全て等しい薬物抗体比において同じ毒素とコンジュゲートした対照抗体と共に試験した。５Ｅ７は、ｇｇｆｇ－Ｄｘｄリンカーを介してカンプトテシン類似体Ｄｘｄとコンジュゲートした。
簡潔に述べると、複数の用量範囲の試験された各Ａｂ（出発点１５０ｎＭ、希釈倍率２において３点、次いで５において５点）を、細胞上において５日間インキュベートした後、ＣＴＧ基質の添加によって細胞生存性測定を行った。Ａｂ濃度に対する発光をグラフにプロットした。
各ＡＤＣについて、ある濃度範囲のＡＤＣをネクチン－４発現細胞と共にインキュベートした。インキュベーション後、ＣＴＧ基質を１：１の比において添加し、発光シグナルを、プレートリーダー（Ｅｎｓｐｉｒｅ）を用いて読み取り、細胞生存性に比例する、存在するＡＴＰ（代謝活性細胞の指標）の定量を可能にした。
結果を図１０に示す。５Ｅ７－ｇｇｆｇ－ＤｘｄおよびＰＡＤＣＥＶ（商標）は、ＥＮＨＥＲＴＵ（商標）よりも効率的にＳＵＭ１８５を殺滅することができた。それぞれの場合において、ネクチン４標的ＡＤＣは、非標的ＡＤＣ（ＩＣ）カウンターパートよりも効率的に細胞生存性を低下させた。
［実施例１１］
抗ネクチン－４抗体の種交差反応性の特性評価
抗ネクチン－４抗体を、マウス、カニクイザルおよびラットネクチン－４タンパク質（以下の配列には示していないＮ末端Ｖ５タグを含む）をそれぞれ発現するように作製された異なるＣＨＯ細胞株への結合について、フローサイトメトリーによって試験した。
細胞によって発現されたタンパク質の成熟アミノ酸配列は以下の通りであった：
マウスネクチン－４：
ELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDPDEQVGQVAWARVDPNEGIRELALLHSKYGLHVNPAYEDRVEQPPPPRDPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARMRLRVLVPPLPSLNPGPPLEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTQSSRSFTHPRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDRRITHTLQVAFLAEASVRGLEDQNLWQVGREGATLKCLSEGQPPPKYNWTRLDGPLPSGVRVKGDTLGFPPLTTEHSGVYVCHVSNELSSRDSQVTVEVLDPEDPGKQVDLVSASVIIVGVIAALLFCLLVVVVVLMSRYHRRKAQQMTQKYEEELTLTRENSIRRLHSHHSDPRSQPEESVGLRAEGHPDSLKDNSSCSVMSEEPEGRSYSTLTTVREIETQTELLSPGSGRTEEDDDQDEGIKQAMNHFVQENGTLRAKPTGNGIYINGRGHLV（配列番号３４）
ラットネクチン－４：
MPLSLGAEMWGPEAWLLLLFLASFTGRYSAGELETSDLVTVVLGQDAKLPCFYRGDPDEQVGQVAWARVDPNEGTRELALLHSKYGLHVSPAYEDRVEQPPPPRDPLDGSILLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARMRLRVLVPPLPSLNPGPPLEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTQSSRSFKHSRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDQRITHTLQVAFLAEASVRGLEDQNLWHVGREGATLKCLSEGQPPPKYNWTRLDGPLPSGVRVKGDTLGFPPLTTEHSGVYVCHVSNELSSRASQVTVEVLDPEDPGKQVDLVSASVVVVGVIAALLFCLLVVVVVLMSRYHRRKAQQMTQKYEEELTLTRENSIRRLHSHHTDPRSQPEESVGLRAEGHPDSLKDNSSCSVMSEEPEGRSYSTLTTVREIETQTELLSPGSGRTEEEDDQDEGIKQAMNHFVQENGTLRAKPTGNGIYINGRGHLV（配列番号３５）
カニクイザルネクチン－４：
GELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARADAGEGAQELALLHSKYGLHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVLVPPLPSLNPGPALEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTTSSRSFKHSRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDQRITHILHVSFLAEASVRGLEDQNLWHVGREGAMLKCLSEGQPPPSYNWTRLDGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEFSSRDSQVTVDVLDPQEDSGKQVDLVSASVVVVGVIAALLFCLLVVVVVLMSRYHRRKAQQMTQKYEEELTLTRENSIRRLHSHHTDPRSQPEESVGLRAEGHPDSLKDNSSCSVMSEEPEGRSYSTLTTVREIETQTELLSPGSGRTEEEEDQDEGIKQAMNHFVQENGTLRAKPTGNGIYINGRGHLV（配列番号３６）
実施例４の全ての抗ネクチン－４抗体は、ヒトおよびカニクイザルネクチン４タンパク質と結合したが、マウスネクチン４タンパク質への結合を欠いている。５Ｅ７、１０Ｂ１２のみがラットネクチン４発現細胞への結合を示した。図１１Ａおよび１１Ｂは、抗ネクチン－４抗体のラットおよびカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓ）ネクチン－４発現ＣＨＯ細胞株に対する結合を示す。
［実施例１２］
ネクチンファミリー交差反応性の特性評価
抗ネクチン－４抗体を、ヒトネクチン１、ネクチン２、ネクチン３およびＰＶＲタンパク質をそれぞれ発現するように作製された異なるＣＨＯ細胞株への結合について、フローサイトメトリーによって試験した。各細胞株の発現を制御し、それぞれ公知の抗ヒトネクチン１、抗ヒトネクチン２、抗ヒトネクチン３および抗ヒトＰＶＲ抗体を用いて検証した。細胞によって発現されたタンパク質の成熟アミノ酸配列は以下の通りであった：
ネクチン－１：
MGLAGAAGRWWGLALGLTAFFLPGVHSQVVQVNDSMYGFIGTDVVLHCSFANPLPSVKITQVTWQKSTNGSKQNVAIYNPSMGVSVLAPYRERVEFLRPSFTDGTIRLSRLELEDEGVYICEFATFPTGNRESQLNLTVMAKPTNWIEGTQAVLRAKKGQDDKVLVATCTSANGKPPSVVSWETRLKGEAEYQEIRNPNGTVTVISRYRLVPSREAHQQSLACIVNYHMDRFKESLTLNVQYEPEVTIEGFDGNWYLQRMDVKLTCKADANPPATEYHWTTLNGSLPKGVEAQNRTLFFKGPINYSLAGTYICEATNPIGTRSGQVEVNITEFPYTPSPPEHGRRAGPVPTAIIGGVAGSILLVLIVVGGIVVALRRRRHTFKGDYSTKKHVYGNGYSKAGIPQHHPPMAQNLQYPDDSDDEKKAGPLGGSSYEEEEEEEEGGGGGERKVGGPHPKYDEDAKRPYFTVDEAEARQDGYGDRTLGYQYDPEQLDLAENMVSQNDGSFISKKEWYV（配列番号３７）
ネクチン－２：
MARAAALLPSRSPPTPLLWPLLLLLLLETGAQDVRVQVLPEVRGQLGGTVELPCHLLPPVPGLYISLVTWQRPDAPANHQNVAAFHPKMGPSFPSPKPGSERLSFVSAKQSTGQDTEAELQDATLALHGLTVEDEGNYTCEFATFPKGSVRGMTWLRVIAKPKNQAEAQKVTFSQDPTTVALCISKEGRPPARISWLSSLDWEAKETQVSGTLAGTVTVTSRFTLVPSGRADGVTVTCKVEHESFEEPALIPVTLSVRYPPEVSISGYDDNWYLGRTDATLSCDVRSNPEPTGYDWSTTSGTFPTSAVAQGSQLVIHAVDSLFNTTFVCTVTNAVGMGRAEQVIFVRETPNTAGAGATGGIIGGIIAAIIATAVAATGILICRQQRKEQTLQGAEEDEDLEGPPSYKPPTPKAKLEAQEMPSQLFTLGASEHSPLKTPYFDAGASCTEQEMPRYHELPTLEERSGPLHPGATSLGSPIPVPPGPPAVEDVSLDLEDEEGEEEEEYLDKINPIYDALSYSSPSDSYQGKGFVMSRAMYV（配列番号３８）
ネクチン－３：
MARTLRPSPLCPGGGKAQLSSASLLGAGLLLQPPTPPPLLLLLFPLLLFSRLCGALAGPIIVEPHVTAVWGKNVSLKCLIEVNETITQISWEKIHGKSSQTVAVHHPQYGFSVQGEYQGRVLFKNYSLNDATITLHNIGFSDSGKYICKAVTFPLGNAQSSTTVTVLVEPTVSLIKGPDSLIDGGNETVAAICIAATGKPVAHIDWEGDLGEMESTTTSFPNETATIISQYKLFPTRFARGRRITCVVKHPALEKDIRYSFILDIQYAPEVSVTGYDGNWFVGRKGVNLKCNADANPPPFKSVWSRLDGQWPDGLLASDNTLHFVHPLTFNYSGVYICKVTNSLGQRSDQKVIYISDPPTTTTLQPTIQWHPSTADIEDLATEPKKLPFPLSTLATIKDDTIATIIASVVGGALFIVLVSVLAGIFCYRRRRTFRGDYFAKNYIPPSDMQKESQIDVLQQDELDSYPDSVKKENKNPVNNLIRKDYLEEPEKTQWNNVENLNRFERPMDYYEDLKMGMKFVSDEHYDENEDDLVSHVDGSVISRREWYV（配列番号３９）
ＰＶＲ（ネクチン－５）：
DVVVQAPTQVPGFLGDSVTLPCYLQVPNMEVTHVSQLTWARHGESGSMAVFHQTQGPSYSESKRLEFVAARLGAELRNASLRMFGLRVEDEGNYTCLFVTFPQGSRSVDIWLRVLAKPQNTAEVQKVQLTGEPVPMARCVSTGGRPPAQITWHSDLGGMPNTSQVPGFLSGTVTVTSLWILVPSSQVDGKNVTCKVEHESFEKPQLLTVNLTVYYPPEVSISGYDNNWYLGQNEATLTCDARSNPEPTGYNWSTTMGPLPPFAVAQGAQLLIRPVDKPINTTLICNVTNALGARQAELTVQVKEGPPSEHSGISRNAIIFLVLGILVFLILLGIGIYFYWSKCSREVLWHCHLCPSSTEHASASANGHVSYSAVSRENSSSQDPQTEGTR（配列番号４０）
結果は、ヒトネクチンファミリーのメンバーに対する抗ネクチン－４抗体の交差反応性が存在しなかったことを示した。図は、ヒトネクチン１、ヒトネクチン２、ヒトネクチン３およびヒトＰＶＲ発現ＣＨＯ細胞に対する抗ネクチン－４抗体のフローサイトメトリー結果を示す。示した抗体はいずれも各細胞株に結合しない。
［実施例１３］
ＳＰＲによる親和性決定
抗体を、野生型ヒトネクチン－４タンパク質に対する結合親和性について、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）法によって試験した。測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において、２５℃にて実施した。センサーグラムを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェアを用いて解析した。約６００ＲＵにおいて固定化されたプロテインＡを有するＣＭＲセンサーチップを使用した。抗ネクチン－４抗体をプロテインＡチップに捕捉した（抗体は、ＨＢＳ－ＥＰ＋１Ｘ緩衝液において１μｇ／ｍｌに希釈し、１２０秒にわたって４０μＬ／分において注入した）。組換えヒトモノマーｈｕＮｅｃｔｉｎ－４－ｈｉｓ－ＢｉｒＡタンパク質を１００ｎＭ～１．５６ｎＭの範囲の異なる濃度において捕捉した抗体に対して注入し（ＨｕＮｅｃｔｉｎ－４－Ｈｉｓ－ＢｉｒＡは、ＨＢＳ－ＥＰ＋１Ｘにおいて１／２希釈に希釈し、１２０秒にわたって４０μｌ／分において注入した）、６００秒間解離させた。ＮａＯｈ １０ｍＭ ２Ｘを３０秒間４０μｌ／分において用いてチップを再生した。センサーグラムセットを、１：１キネティック結合モデルまたは２状態反応モデルを使用して、曲線のプロファイルの関数としてフィッティングした。
結果を以下の表に示す。ＫＤの差は概して、腫瘍細胞を排除する能力における５Ｅ７および１０Ｂ１２抗体の効力の増加に相関しないと考えられる。したがって、結合親和性は抗体のＡＤＣとしての効力の差を説明しない。

［実施例１４］
ＳＰＲによるネクチン－４への結合に関する競合に基づくエピトープマッピング
実施例１３の抗体を、以前に報告された抗体Ｎ４．１（Ｎ４１）、抗体１４Ａ５およびエンホルツマブと一緒に、野生型ヒトネクチン－４タンパク質への結合に関して互いに競合する能力について、Ｎｉ－ＮＴＡ（ＮＴＡ）バイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を使用するＯＣＴＥＴ解析を用いるＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）法によって試験した。簡潔に述べると、キネティック緩衝液１０Ｘにおいて５μｇ／ｍＬに希釈したＨｕｍｓｎネクチン４－Ｈｉｓ－ＢｉｒＡタンパク質をバイオセンサーに捕捉した。第１の抗体を、キネティック緩衝液１０Ｘにおいて１０μｇ／ｍＬに希釈して注入し、続いて、キネティック緩衝液１０Ｘにおいて１０μｇ／ｍＬに希釈した第１の抗体の２回目の注入を行い、シグナルを飽和させた。第２の抗体を、キネティック緩衝液１０Ｘにおいて１０μｇ／ｍＬに希釈して注入した。
結果を以下の表に示す。黒色の四角は、第１の抗体と第２の抗体との間の実質的または直接的な競合（第１の抗体が第２の抗体の結合を妨げる／結合の喪失を引き起こす）を示し、灰色の四角は、潜在的な部分的競合（第１の抗体が第２の抗体の結合の潜在的な低下を引き起こすが喪失は引き起こさない）を示し、白色の四角は、競合がないことを示す。抗体５Ｅ７および１０Ｂ１２は、ネクチン－４への結合に関して互いに競合した。しかしながら、５Ｅ７または１０Ｂ１２と他の抗体のいずれかとの間の競合は、Ｉｇ様Ｖドメインと結合する抗体において観察された結合の潜在的な部分的低下以外は存在しなかった。抗Ｉｇ様Ｃ２型２ドメイン抗体（ｍＡｂ１～５）は、抗Ｉｇ様Ｖドメイン抗体と同様に、ネクチン－４への結合に関して互いに競合した。
［実施例１５］
ネクチン－４点突然変異体を使用した抗体のエピトープマッピング
細胞表面発現ヒトネクチン－４点突然変異体
非ヒトネクチン－４タンパク質の種間差を伴う抗体の種結合プロファイル（ヒト、カニクイザルおよびラットネクチン－４には結合するが、マウスネクチン－４には結合しない）と一緒になった、抗ネクチン－４抗体の全長タンパク質およびＩｇ様Ｖドメイン欠失タンパク質に対する結合プロファイルは、Ｉｇ様ＶドメインとＩｇ様Ｃ２型１ドメイン（「Ｃ１」とも称される）との接合部の残基の同定を可能にした。公開されているネクチン－４ドメインの構造と組み合わせて、表面露出アミノ酸残基におけるネクチン－４突然変異を設計した。ネクチン－４ドメイン構造を、タンパク質構造データバンク参照番号：４ＦＲＷ（ドメインＶおよびＣ１）に基づいてモデル化した。使用したヒトネクチン－４はＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿１１２１７８．２であり、使用したマウスネクチン－４はＮＣＢＩ参照配列：ＡＡＬ７９８３３．１であり、使用したカニクイザルネクチン－４はＮＣＢＩ参照配列：ＸＰ＿００５５４１２７７．１であり、使用したラットネクチン－４はＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１１０２５４６．１であった。次いで、抗ネクチン－４抗体を異なるネクチン－４突然変異体への結合の喪失について試験するためにネクチン－４突然変異体を発現する細胞を使用して、ネクチン－４の同じ部位に結合する抗体を同定した。特に、残基Ｋ１９７Ｔおよび／もしくはＳ１９９ＡにＣ１－Ｖ接合部置換を有する突然変異体、またはドメインＣ１とドメインＶとの接合部にさらなるおよび／もしくは隣接する置換を有する突然変異体７、７ｂｉｓおよび９は、イムノコンジュゲートとしての有利な適用を有する抗体を同定することができる。突然変異体７は置換Ｓ１９５Ａ／Ｋ１９７Ｔ／Ｓ１９９Ａを有した。突然変異体７ｂｉｓは置換Ａ７２Ｐ／Ｇ７３Ｎ／Ｋ１９７Ｔ／Ｓ１９９Ａを有した。突然変異体９は、鍵残基Ｑ２３４置換を含み、置換Ｌ１５０Ｓ／Ｓ１５２Ａ／Ｑ２３４Ｒ／Ｉ２３６Ｓを有した。図１２Ａおよび１２Ｂは、ヒトネクチン－４タンパク質の分子モデルを示し、突然変異体７（１２Ａ）および突然変異体７ｂｉｓ（１２Ｂ）における置換残基の位置を示し、これらの突然変異体は、Ｃ１ドメインに存在し、ネクチン－４タンパク質の対向する面にあるドメインＣ１とＶドメインとの接合部における２つの部位を同定する。図１３Ａおよび１３Ｂは、ヒトネクチン－４タンパク質の分子モデルの異なる図を示し、突然変異体１、２、３、４、５、６、７、８および９における置換残基の位置を示す。
ネクチン－４突然変異体をＰＣＲによって生成した。増幅した配列をアガロースゲルにおいて泳動させ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＰＣＲクリーンアップゲル抽出キットを使用して精製した。次いで、各突然変異体に対して生成した精製ＰＣＲ産物を、ＣｌｏｎＴｅｃｈ ＩｎＦｕｓｉｏｎシステムを用いて発現ベクターにライゲーションした。突然変異配列を含有するベクターをＭｉｎｉｐｒｅｐとして調製し、配列決定した。配列決定後、突然変異配列を含有するベクターを、Ｐｒｏｍｅｇａ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍを使用してＭｉｄｉｐｒｅｐとして調製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において成長させ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用してベクターをトランスフェクトし、ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃にて４８時間インキュベートした後、導入遺伝子発現について試験した。以下の表に示す突然変異体をＨｅｋ－２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。標的アミノ酸突然変異を、野生型ネクチン－４に存在する残基／残基の位置／突然変異型ネクチン－４に存在する残基を記載して以下の表２に示し、ここで、位置参照は、配列番号１に示すリーダーペプチドを有するネクチン－４タンパク質に対するものである。
表２
抗体とネクチン－４突然変異体との間の会合の結果を以下の表に示す。（＋）は、抗体－ネクチン－４会合が生じることを意味する。（－）は、抗体－ネクチン－４会合が生じないことを意味する。突然変異体５に関連する結果は、前記タンパク質の発現の非存在のため、適切なものではない。
表３
したがって、抗体１０Ｂ１２、５Ｅ７および６Ａ７は、突然変異体７および７ｂｉｓにおいて突然変異しているＣ１ドメイン残基（Ｓ１９５Ａ／Ｋ１９７Ｔ／Ｓ１９９ＡおよびＡ７２Ｐ／Ｇ７３Ｎ／Ｋ１９７Ｔ／Ｓ１９９Ａ）を包含するネクチン－４に対する結合部位を有する。抗体６Ｃ１１Ｂは、突然変異体３において突然変異しているＶドメイン残基（Ａ７６Ｓ／Ｑ７７Ｒ／Ｅ７８Ａ／Ｓ９１Ｎ）を包含するネクチン－４に対する結合部位を有する。抗体１Ｂ７Ａは、突然変異体２において突然変異しているＶドメイン残基（Ｖ９０Ｓ／Ｐ９２Ａ／Ａ９３Ｓ／Ｅ９５Ａ／Ｇ９６Ｄ）および突然変異体３において突然変異しているＶドメイン残基（Ａ７６Ｓ／Ｑ７７Ｒ／Ｅ７８Ａ／Ｓ９１Ｎ）を包含するネクチン－４に対する結合部位を有する。
したがって、抗体１０Ｂ１２、５Ｅ７および６Ａ７は、エンホルツマブ、Ｎ４１および１４Ａ５（ネクチン－４のＶドメイン上のエピトープと結合する）と異なるネクチン－４のエピトープと結合する。６Ｃ１１Ｂおよびエンホルツマブはネクチン－４の同じ領域と結合するが、それらのエピトープは異なる。
［実施例１６］
抗ＶＣ１ドメイン抗体のための第２の免疫化および指向スクリーニング
抗体５Ｅ７および１０Ｂ１２と同じかまたは類似した機能特性を有するさらなる抗体を得るために、さらなる免疫化は実施例４の方法を使用していた。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、Ｃ末端６－Ｈｉｓタグと融合した全長野生型ネクチン－４アミノ酸配列を有する組換えヒトネクチン－４タンパク質を用いて免疫化し、続いて、表面に全長ヒトネクチン－４を発現するように作製されたＣＨＯ細胞株に対して各血清の力価を決定して、融合のための最良の応答マウスを選択した。
ハイブリドーマを成長させ、上清を回収して、陽性対照として使用される抗体５Ｅ７および陰性対照としてのアイソタイプ対照と共に上に記載した野生型ネクチン－４発現Ｃｌ．３Ｃ８細胞を使用する、２回の連続スクリーニング（スクリーニング＃１および確認スクリーニング＃２）におけるフローサイトメトリーによるネクチン－４への結合に関するスクリーニングに供した。これらのハイブリドーマを増幅し、上清を回収し、細胞をＲＮＡの保存のために凍結した。
実施例４と同様に、この方法によって、野生型ネクチン－４を発現するＣＨＯ細胞株に対して２つの群の滴定が観察され、第１の群は大多数の抗体がより高いプラトーを有し、第２のプロファイルは５Ｅ７と実質的に同じＩＣ５０を有する１つの抗体によってより低いプラトーが示された。
選択したハイブリドーマを、ヒト、ラット、マウスおよびカニクイザルネクチン－４に対する種交差反応性、ならびに実施例４と同様のネクチン－４ドメイン置換タンパク質への結合を判定することによってさらに特性評価した。新規抗体を、ヒトネクチン－４の異なるドメインと結合する能力について、全ネクチン－４タンパク質を含有する野生型ヒトネクチン－４細胞株およびヒトネクチン４－Ｃ１Ｃ２－Ｖ５選別細胞株を使用してフローサイトメトリーによって評価した。
ネクチン－４発現Ｃｌ．３Ｃ８細胞に対して滴定した抗体のうち（観察されたＩＣ５０値は５Ｅ７に匹敵した）、６つの抗体はＩｇ様Ｖドメインと結合し、全ネクチン－４タンパク質への結合とＣ１Ｃ２コンストラクトへのあらゆる結合の喪失とを示し、７つの抗体は抗Ｉｇ様Ｃ２型１ドメイン結合抗体であり、全ネクチン－４タンパク質への、およびＣ１コンストラクト（Ｃ２型１ドメインのみを有する）とＣ１Ｃ２コンストラクト（Ｃ２型１ドメインおよびＣ２型２ドメインのみを有する）の両方への完全な結合を示した。２つの抗体（クローン６Ｃ１１Ｂおよび６Ａ７）は、野生型ネクチン－４への結合の部分的な喪失を示し、Ｃ１コンストラクトへの結合の喪失と共に、Ｃ１Ｃ２コンストラクトへの結合を保持し、これらが部分的にはＶドメインにおいて、および部分的にはＩｇ様Ｃ２型１ドメインにおいてネクチン－４と結合することを示唆した。
抗ネクチン－４抗体を、マウス、カニクイザルおよびラットネクチン－４タンパク質をそれぞれ発現するように作製された異なるＣＨＯ細胞株への結合について、実施例１１の方法に従ってフローサイトメトリーによって試験した。抗体６Ｃ１１Ｂおよび６Ａ７はラットおよびカニクイザルネクチン－４タンパク質に結合した。抗ネクチン－４抗体を、実施例１２と同様に、ヒトネクチン１、ネクチン２、ネクチン３およびＰＶＲタンパク質をそれぞれ発現するように作製された異なるＣＨＯ細胞株への結合について、フローサイトメトリーによってさらに試験した。抗体６Ｃ１１Ｂおよび６Ａ７は、ヒトネクチン１、ネクチン２、ネクチン３およびＰＶＲタンパク質それぞれのいずれにも結合しなかった。エピトープマッピングを、実施例１４と同様にＳＰＲによって、ネクチン－４への結合に関する競合を評価することによって実行した。抗体６Ａ７は、ヒトネクチン－４への結合に関して５Ｅ７と競合したが、抗体６Ｃ１１Ｂは、ヒトネクチン－４への結合に関して５Ｅ７と競合しなかった。５Ｅ７および６Ａ７は、６Ｃ１１Ｂのエピトープビンと異なるエピトープビンを同定し、これは、抗体が、ネクチン－４タンパク質の異なるかまたは対向する面における、ドメインＣ１とドメインＶとの接合部においてネクチン－４に結合することによって説明され得る。上で論じられたように、図１２は、突然変異体７において置換されている残基のうちの１つまたは複数を伴うネクチン－４の第１の面におけるエピトープビン、および突然変異体９において置換されている残基のうちの１つまたは複数を伴うネクチン－４の第２の面における別のエピトープビンを示す。
抗ネクチン－４抗体のネクチン－４内在化を誘導する能力を、ＳＵＭ１９０細胞株において、実施例６と同様に、Ｆａｂ－ＺＡＰヒト内在化キット（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＣＴＧ基質を使用した細胞生存性の測定［ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）］に基づいて評価した。図１４Ａおよび１４Ｂは、抗体６Ｃ１１Ｂおよび６Ａ７のそれぞれに関する、５Ｅ７と比較した内在化（発光として測定された細胞生存性）をそれぞれ示し、６Ｃ１１Ｂおよび６Ａ７がいずれも腫瘍細胞上のネクチン－４の細胞内内在化を誘導する強力な能力を示すことを示す。
［実施例１７］
抗ネクチン４抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）のインビボ有効性
ヒト乳癌細胞株ＳＵＭ１９０ＰＴ（ＢｉｏＩＶＴ ２８０６８Ａ１－６２８１）を、以下の、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２、ＦＢＳ １ｇ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ、エタノールアミン５ｍＭ、インスリン５μｇ／ｍＬ、ヒドロコルチゾン１μｇ／ｍＬ、アポトランスフェリン５μｇ／ｍＬ、トリヨードチロニン（Ｔ３）６．７ｎｇ／ｍＬ、亜セレン酸ナトリウム８．７ｎｇ／ｍＬを含有する細胞培養培地において培養した。
免疫欠損ＣＢ１７－ＳＣＩＤマウスを７～８週齢において使用した。ヒトＦｃ領域を有する抗ネクチン－４抗体エンホルツマブ、５Ｅ７、６Ａ７、６Ｃ１１Ｂおよび１Ｂ７Ａを製造し、細胞内で切断可能なリンカーｇｇｆｇ－ＤｘｄまたはＰＥＧ（８Ｕ）－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ－エキサテカンを介してペイロードＤｘｄ（デルクステカン）またはエキサテカンにコンジュゲートした。ｇｇｆｇ－Ｄｘｄリンカーは切断時にＤｘｄ（デルクステカン）を放出することができ、ＰＥＧ（８Ｕ）－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ－エキサテカンリンカーは切断時にエキサテカンを放出することができる。
ＳＵＭ１９０細胞を、ＰＢＳにおいて１／２に希釈した成長因子を含有する１００μｌのマトリゲル中５０万個の用量において、ＣＢ１７－ＳＣＩＤ免疫欠損マウスに皮下移植した。実験に応じて腫瘍が１４６．９±６３．２ｍｍ３または２１３．２±７７．５ｍｍ３の体積平均に達した２１日目に、マウスを、実験に応じて８または９匹のマウスからなる複数の群に無作為化し、３または１０ｍｇ／ｋｇ体重のＡＤＣまたは対照としてのＰＢＳの単回注射により静脈内処置した。腫瘍成長を週に２回追跡した。カプラン・マイヤー生存曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ７ソフトウェアを使用することによって以下の基準に従って確立した：腫瘍体積が１５００ｍｍ３に達した場合、マウスを安楽死させ、屠殺の当日（Ｄ）に死亡したものとみなした。腫瘍が高度に壊死性であった場合、マウスを安楽死させ、同じ日（Ｄ）に死亡したものとみなした。
３ｍｇ／ｋｇ用量の結果を図１５Ａおよび１５Ｂに示し、ここから、Ｋ１９７Ｔ／Ｓ１９９Ａ突然変異を有するネクチン－４への結合を喪失することが見出された抗ＩｇＶＣ１ ＡＤＣである５Ｅ７－ｇｇｆｇ－Ｄｘｄおよび６Ａ７－ｇｇｆｇ－Ｄｘｄは、マウスにおける腫瘍成長を制限することにおいて最も高い効率を呈することが分かる。加えて、ＡＤＣ ６Ｃ１１－ｇｇｆｇ－Ｄｘｄおよび１Ｂ７Ａ－ｇｇｆｇ－Ｄｘｄは、腫瘍成長を制御することにおいて、エンホルツマブ－ｇｇｆｇ－ＤｘｄおよびＮ４．１－ｇｇｆｇ－Ｄｘｄよりも幾分効率的であった。
さらに、リンカー切断時にエキサテカンを放出するように設計されたＰＥＧ（８Ｕ）－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ－エキサテカン）とコンジュゲートした５Ｅ７は、１０ｍｇ／ｋｇ用量について図１５Ｃに示すように、マウスにおける腫瘍成長を制御することにおいて、リンカー切断時にＤｘｄを放出するように設計されたｇｇｆｇ－Ｄｘｄとコンジュゲートした５Ｅ７と比較して高い効率性を示した。
［実施例１８］
Ｐｇ－ｐ発現癌モデルにおけるＡＤＣのインビトロ有効性
ＭＤＲ１ Ｐ－糖タンパク質（Ｐｇｐ）を内在的に発現するＭＣ－３８細胞を、ネクチン－４を発現するように操作し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳにおいて培養した。細胞をＡＤＣの存在下において、媒体（ＤＳＭＯ）、またはＰｇｐの阻害薬として作用することが公知であるシクロスポリンＡ（５μＭ、ＤＭＳＯ中ストック溶液）のいずれかを用いて処理した。試験したＡＤＣは以下の通りであった：
（ａ）ＰＡＤＣＥＶ（商標）、
（ｂ）切断時にデルクステカン（Ｄｘｄ）を放出するｇｇｆｇ－Ｄｘｄリンカーを介してＤｘｄにコンジュゲートした抗体５Ｅ７（５Ｅ７－ＧＧＦＧ－ＤｘＤ）、および
（ｃ）切断時にエキサテカンを放出するＰＥＧ（８Ｕ）－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ－エキサテカンリンカーを介してエキサテカンにコンジュゲートした抗体５Ｅ７（５Ｅ７－エキサテカン）。
ＡＤＣおよび同等のアイソタイプ対照ＡＤＣを１５０～２．３ １０－３ｎＭの用量範囲において使用した。細胞との共インキュベーションの５日後、細胞生存性をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（商標）（ＣＴＧ）基質の添加によって測定した。Ａｂ濃度に対する発光をプロットした。
図１６Ａは、Ｐａｄｃｅｖ（商標）（エンホルツマブベドチン）、Ｄｘｄにコンジュゲートした抗体５Ｅ７またはエキサテカンにコンジュゲートした５Ｅ７を用いて処理した細胞の発光（細胞生存性を示す）を示す。ペイロードとしてのエキサテカンを有するＡＤＣ（５Ｅ７－エキサテカン）は、この薬剤耐性の設定において細胞生存性を低減するほど高度に強力であった。図１６Ｂは、Ｐｇｐ阻害薬シクロスポリンの存在下または非存在下において、Ｐａｄｃｅｖ（商標）（エンホルツマブベドチン）、Ｄｘｄにコンジュゲートした抗体５Ｅ７またはエキサテカンにコンジュゲートした５Ｅ７を用いて処理したＭＣ３８細胞の、１５０ｎＭ ＡＤＣにおける、対照抗体に対して正規化した腫瘍成長（曲線下面積）を示す。結果は、Ｐａｄｃｅｖ（商標）およびＤｘｄにコンジュゲートした抗体５Ｅ７の抗腫瘍活性がＰｇｐによって負の影響を受けることを示唆する。
［実施例１９］
Ｐｇ－ｐ発現癌モデルにおけるＡＤＣのインビボ有効性
ＭＤＲ１ Ｐ－糖タンパク質を内在的に発現するＭＣ－３８細胞を、ネクチン－４を発現するように操作し、培養した。実験の１日目に、ＭＣ－３８細胞を、ＰＢＳにおいて１／２に希釈した成長因子を含有する１００μｌのマトリゲル中５０万個の用量において、７～８週齢において使用した免疫欠損ＣＢ１７－ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。この実験において試験したＡＤＣは以下の通りであった：
（ａ）ＰＡＤＣＥＶ（商標）、
（ｂ）切断時にデルクステカン（Ｄｘｄ）を放出するｇｇｆｇ－Ｄｘｄリンカーを介してＤｘｄにコンジュゲートした抗体６Ａ７（６Ａ７－デルクステカン）、および
（ｃ）切断時にエキサテカンを放出するＰＥＧ（８Ｕ）－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ－エキサテカンリンカーを介してエキサテカンにコンジュゲートした抗体６Ａ７（６Ａ７－エキサテカン）。
第１の実験において、単回用量の１０ｍｇ／ｋｇのエンホルツマブベドチン（ＰＡＤＣＥＶ（商標））、またはエキサテカンもしくはデルクステカンにコンジュゲートした抗体６Ａ７を、７日目に各マウスに静脈内注射した。第２の実験において、３用量の１０ｍｇ／ｋｇのエンホルツマブベドチン（ＰＡＤＣＥＶ（商標））またはエキサテカンにコンジュゲートした６Ａ７を、７、１４および２１日目に各マウスに静脈内注射した。マウスにおける腫瘍体積を１回目の注射から追跡した。図１７Ａ（単回用量）および１７Ｂ（３用量）は、１群当たり２例の死亡が発生するまで、腫瘍体積平均を経時的に提示する。図１７Ａはまた、エキサテカンにコンジュゲートした６Ａ７の単回注射（右側のパネルにおける一番右側の曲線）が、エンホルツマブベドチンの単回注射またはデルクステカンにコンジュゲートした６Ａ７の単回注射と比較して有意に大きい腫瘍成長の抑制を誘導することを示す。加えて、図１７Ｂは、エキサテカンにコンジュゲートした６Ａ７の３回の連続した毎週の注射がエンホルツマブベドチンの３回の毎週の注射と比較して大きい抗腫瘍効果を有することを示す。
刊行物、特許出願、および特許を含む、本明細書において引用された全ての参考文献は、本明細書の他の箇所においてなされた特定の文献の別個に提供された任意の組込みにかかわらず、各参考文献が参照によって組み込まれ、その全体が本明細書に記載されることが個別的かつ具体的に指示される場合と同じ程度（法律によって許容される最大の程度）に、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
別段の記述がない限り、本明細書において提供された全ての正確な値は、対応する近似値を代表するものである（例えば、特定の因子または測定に関して提供された全ての例示的な正確な値は、必要に応じて「約」によって修飾される、対応する近似した測定値も提供すると考えることができる）。「約」がある数値に関連して使用される場合、これは、その明記された数値の＋／－１０％に対応する値を含むと規定することができる。
単数または複数の要素に関して「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、または「含有する」などの用語を使用した、本明細書における本発明の任意の態様または実施形態の記載は、別段の記述がない限りまたは文脈上明確に矛盾しない限り、その特定の単数または複数の要素「からなる」、「から本質的になる」、またはそれを「実質的に含む」本発明の類似した態様または実施形態に対する支持を提供することが意図されている（例えば、特定の要素を含むと本明細書に記載される組成物は、別段の記述がない限りまたは文脈上明確に矛盾しない限り、その要素からなる組成物も記載していると理解されるべきである）。
本明細書において提供されたあらゆる例または例示的な語（例えば、「など」）の使用は、本発明をより良好に例示することを意図したものに過ぎず、別途特許請求されない限り、本発明の範囲に対する限定を提起しない。本明細書におけるいかなる語も、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施に不可欠なものとして示していると解釈されるべきではない。

Claims (70)

  1. 抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を作製するための方法であって、前記ＡＤＣが、癌の処置における使用のためのものであってもよく、前記方法が、細胞毒性剤（Ｚ）を抗ネクチン－４抗体にコンジュゲートすることを含み、前記抗ネクチン－４抗体が、ヒトネクチン－４ポリペプチドのＶＣ１架橋ドメインに結合する、方法。
  2. ヒトネクチン－４ポリペプチドのＶＣ１架橋ドメインに結合する抗ネクチン－４抗体を用意すること、抗体薬物コンジュゲートが形成されるような好適な条件下において前記抗ネクチン－４抗体を細胞毒性剤（Ｚ）と接触および／または反応させること、ならびに前記抗体薬物コンジュゲートを単離することを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記抗ネクチン－４抗体が、抗体（Ａｂ）と細胞毒性剤（Ｚ）とを接続するリンカー（Ｘ）を介して細胞毒性剤にコンジュゲートされる、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記細胞毒性剤（Ｚ）が、カンプトテシン、適宜５環性カンプトテシン類似体、適宜６環性カンプトテシン類似体、適宜エキサテカン、ＳＮ－３８またはＤｘｄである、請求項１から３に記載の方法。
  5. 癌の処置、腫瘍細胞の殺滅および／または腫瘍の細胞毒性剤に対する感作を、それを必要とする個体において行う方法であって、ヒトネクチン－４ポリペプチドのＶＣ１架橋ドメインに結合する治療有効量の抗ネクチン－４抗体を細胞毒性剤と組み合わせて前記個体に投与することを含み、前記細胞毒性剤が、同じ日または異なる日に別個に投与されてもよい、方法。
  6. 癌の処置、腫瘍細胞の殺滅および／または細胞毒性剤の腫瘍へのデリバリーを、それを必要とする個体において行う方法であって、リンカーを介して細胞毒性剤（Ｚ）にコンジュゲートした抗ネクチン－４抗体を含む治療有効量の抗体－薬物コンジュゲートを前記個体に投与することを含み、前記抗体が、ヒトネクチン－４ポリペプチドのＶＣ１架橋ドメインに結合する、方法。
  7. 前記抗体が、ネクチン－４のＩｇ様ＶドメインおよびＩｇ様Ｃ１型２ドメインに結合する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記抗体が、ネクチン－４のアミノ酸残基Ｋ１９７および／もしくはＳ１９９（配列番号１に準拠）を含むエピトープに結合する、ならびに／または前記抗体が、残基Ｋ１９７および／もしくはＳ１９９に突然変異を含む突然変異型ネクチン－４ポリペプチドに対して、前記抗体と配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ネクチン－４ポリペプチドとの間の結合と比較して低下した結合を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記抗体が、抗体－ネクチン－４複合体の細胞内内在化を誘導する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記抗体が、配列番号１のネクチン－４ポリペプチドのエピトープへの結合に関して、抗体５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７の重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは重鎖および軽鎖可変領域を含む抗体と競合する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記抗体が、抗体５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７の機能保存変異体である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を有する膜アンカーヒトネクチン－４タンパク質、配列番号３２のアミノ酸配列を有する膜アンカーヒトネクチン－４タンパク質に結合し、さらに、前記抗体が、配列番号３３のアミノ酸配列を有する膜アンカーヒトネクチン－４タンパク質に結合しなくてもよい、および／または、さらに、前記抗体が、配列番号３７～４０のアミノ酸配列を有するネクチンファミリータンパク質のいずれにも結合しなくてもよい、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記抗体が、抗体５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、２および３を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記抗体が、
    （ａ）配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３を含むＶＬ、
    （ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３を含むＶＬ、
    （ｃ）配列番号４２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号４３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３を含むＶＬ、または
    （ｄ）配列番号５０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号５１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３を含むＶＬ
    を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記抗体が、
    （ａ）アミノ酸配列：ＳＹＷＭＨ（配列番号８）を含むＨＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＥＩＤＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号９）を含むＨＣＤＲ２；アミノ酸配列：ＧＹＧＮＹＧＤＹ（配列番号１０）を含むＨＣＤＲ３；アミノ酸配列：ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹ（配列番号１１）を含むＬＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＱＭＳＮＬＡＳ（配列番号１２）を含むＬＣＤＲ２領域；およびアミノ酸配列：ＡＱＮＬＥＬＰＷＴ（配列番号１３）を含むＬＣＤＲ３領域、
    （ｂ）アミノ酸配列：ＥＹＴＩＨ（配列番号４４）を含むＨＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＲＩＮＰＫＮＧＤＩＩＨＮＱＮＦＭＧ（配列番号４５）を含むＨＣＤＲ２；アミノ酸配列：ＳＧＹＧＳＳＹＧＦＡＹ（配列番号４６）を含むＨＣＤＲ３；アミノ酸配列：ＲＡＳＱＳＶＴＴＰＲＹＳＹＭＨ（配列番号４７）を含むＬＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＹＡＳＮＬＥＳ（配列番号４８）を含むＬＣＤＲ２領域；およびアミノ酸配列：ＱＨＳＷＥＩＰＹＴ（配列番号４９）を含むＬＣＤＲ３領域、または
    （ｃ）アミノ酸配列：ＳＹＷＭＨ（配列番号５２）を含むＨＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＥＩＤＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号５３）を含むＨＣＤＲ２；アミノ酸配列：ＳＧＮＹＤＡＭＤＹ（配列番号５４）を含むＨＣＤＲ３；アミノ酸配列：ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹ（配列番号５５）を含むＬＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＱＭＳＮＬＡＳ（配列番号５６）を含むＬＣＤＲ２領域；およびアミノ酸配列：ＡＱＮＬＥＬＰＷＴ（配列番号５７）を含むＬＣＤＲ３領域
    を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記細胞毒性剤（Ｚ）が、カンプトテシン、適宜５環性カンプトテシン類似体、適宜６環性カンプトテシン類似体、適宜エキサテカン、ＳＮ－３８またはＤｘｄである、請求項６から１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記個体が、アウリスタチンにコンジュゲートしたネクチン－４結合剤を用いた処置の後に再燃および／または進行した癌を有し、アウリスタチンにコンジュゲートした前記ネクチン－４結合剤がエンホルツマブベドチンであってもよい、請求項５から１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. （Ｚ）が化合物１の構造を有し、前記個体が、Ｐｇｐによる輸送が可能である細胞毒性剤にコンジュゲートしたネクチン－４結合剤を用いた処置の後に再燃および／または進行した癌を有し、Ｐｇｐによる輸送が可能である前記細胞毒性剤が化合物１３の構造を有してもよい、請求項５から１６のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記個体が、ＨＥＲ２に結合する抗体、適宜、細胞毒性剤にコンジュゲートした、ＨＥＲ２に結合する抗体、適宜、カンプトテシン類似体にコンジュゲートした、ＨＥＲ２と結合する薬剤を用いた処置の後に再燃および／または進行し、前記抗体が、トラスツズマブのＣＤＲおよび／または可変領域を含んでもよい、請求項５から１６のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記個体が、免疫組織化学によって決定されてもよい腫瘍細胞における低または中ネクチン－４発現によって特徴付けられるネクチン－４発現癌を有する、請求項５から１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記個体がネクチン－４およびＨＥＲ２発現癌を有する、請求項５から２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記処置が、ヒトＨＥＲ２ポリペプチドと結合する薬剤と組み合わされ、ヒトＨＥＲ２ポリペプチドと結合する前記薬剤が、式：
    ＡｂＨＥＲ２－（ＸＨＥＲ２－（ＺＨＥＲ２））
    ［式中、
    ＡｂＨＥＲ２は、ヒトＨＥＲ２ポリペプチドに特異的に結合するポリペプチド、ペプチドまたは抗体であり、
    ＸＨＥＲ２はＡｂＨＥＲ２とＺＨＥＲ２とを接続する分子であり、ＸＨＥＲ２は、例えば細胞内条件下であってもよい生理的条件下において切断可能な部分、適宜、プロテアーゼ切断可能なジ、トリ、テトラまたはペンタペプチドを含み、
    ＺＨＥＲ２は、細胞毒性剤、適宜カンプトテシン類似体、適宜５環性カンプトテシン類似体、適宜６環性カンプトテシン類似体、適宜エキサテカン、ＳＮ－３８またはＤｘｄである］
    によって表される、請求項５から２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 癌の処置、腫瘍細胞の殺滅および／または細胞毒性剤の腫瘍へのデリバリーを、それを必要とする個体において行う方法であって、リンカーを介して細胞毒性剤にコンジュゲートした抗ネクチン－４抗体を含む抗体－薬物コンジュゲートを、リンカーを介して細胞毒性剤にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２抗体を含む抗体－薬物コンジュゲートと組み合わせて前記個体に投与することを含み、前記抗ネクチン－４および抗ＨＥＲ２のうちの少なくとも一方が、式：
    Ａｂ－（Ｘ－（Ｚ））
    ［式中、
    Ａｂは、ヒトネクチン－４ポリペプチドまたはヒトＨＥＲ２ポリペプチドそれぞれに特異的に結合するポリペプチド、ペプチドまたは抗体であり、
    ＸはＡｂとＺとを接続する分子であり、Ｘは、例えば細胞内条件下であってもよい生理的条件下において切断可能な部分、適宜、プロテアーゼ切断可能なジ、トリ、テトラまたはペンタペプチドを含み、
    Ｚはエキサテカンである］
    によって表される、方法。
  24. 前記個体が、表面に低または中レベルのＨＥＲ２タンパク質を発現する腫瘍細胞によって特徴付けられる癌を有する、請求項５から２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記個体が、表面に高レベルのＨＥＲ２タンパク質を発現する腫瘍細胞によって特徴付けられる癌を有する、請求項５から２３のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記個体が、尿路上皮癌、適宜、進行性再発性もしくは転移性尿路上皮癌、乳癌、非小細胞肺癌、膵癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮癌腫または食道癌を有する、請求項５から２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記個体が、化学療法剤、適宜、Ｐ－糖タンパク質（Ｐｇｐ）によって輸送される化学療法剤、プラチナ剤またはタキサンを用いた前処置を受けたことがある、請求項５から２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記個体が、免疫組織化学によって決定されてもよい腫瘍細胞における高ネクチン－４発現によって特徴付けられる癌を有する、請求項５から１９または２１から２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記個体がネクチン－４を発現する腫瘍細胞を有するか否かを判定する予備工程を含む、請求項５から２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 腫瘍におけるネクチン－４発現のレベルの評価にもその検出にも依存しない、請求項５から２８のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記抗体－薬物コンジュゲートが、式（Ｉ）：
    Ａｂ－（Ｘ－（Ｚ）） 式（Ｉ）
    ［式中、
    Ａｂは、ヒトネクチン－４ポリペプチドのＶＣ１架橋ドメインに特異的に結合する抗体であり、
    ＸはＡｂとＺとを接続するリンカー分子であり、Ｘは、細胞内条件下であってもよい生理的条件下において切断可能である部分、適宜、プロテアーゼ切断可能なジ、トリ、テトラまたはペンタペプチドを含み、
    Ｚは、細胞毒性剤、適宜カンプトテシン類似体、適宜５環性カンプトテシン類似体、適宜６環性カンプトテシン類似体、適宜エキサテカン、ＳＮ－３８またはＤｘｄを含む］
    によって表されるイムノコンジュゲートである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記プロテアーゼ切断可能なジ、トリ、テトラまたはペンタペプチドが、バリン－シトルリンまたはバリン－アラニンを含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記プロテアーゼ切断可能なジ、トリ、テトラまたはペンタペプチドが、グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシンを含む、請求項３１に記載の方法。
  34. ヒトネクチン－４ポリペプチドと結合するイムノコンジュゲートであって、式（Ｉ）：
    Ａｂ－（Ｘ－（Ｚ）） 式（Ｉ）
    ［式中、
    Ａｂは、ヒトネクチン－４ポリペプチドのＶＣ１架橋ドメインに特異的に結合するポリペプチド、ペプチド、抗体であり、
    ＸはＡｂとＺとを接続する分子であり、Ｘは、例えば細胞内条件下であってもよい生理的条件下において切断可能な部分、適宜、プロテアーゼ切断可能なジ、トリ、テトラまたはペンタペプチドを含み、
    Ｚは、細胞毒性剤、適宜カンプトテシン類似体、適宜５環性カンプトテシン類似体、適宜６環性カンプトテシン類似体、適宜エキサテカン、ＳＮ－３８またはＤｘｄを含む］
    によって表される、イムノコンジュゲート。
  35. 以下の式：
    Ａｂ－（Ｙ）－（Ｘ）－（Ｙ’）－（Ｚ）
    ［式中、
    Ａｂは、ヒトネクチン－４ポリペプチドのＶＣ１架橋ドメインに特異的に結合するポリペプチド、ペプチド、抗体であり、
    Ｙは、存在しなくてもよいか、または置換もしくは非置換アルキルもしくはヘテロアルキル鎖であってもよいスペーサーであり、適宜、１個または複数の原子は、炭素以外のもの、例えば酸素、硫黄、窒素、または他の原子であってもよく、適宜、前記鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル－Ｓ－、チオール、アルキル－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミドにより置換されており、Ｙは、２～１００個の原子の鎖長を有し、さらに、Ｙは、反応基と前記抗体のアミノ酸の側鎖との反応の残基を含んでもよく、
    Ｘは、細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカーであるかまたはそれを含み、
    Ｙ’は、存在しなくてもよいか、または自己脱離スペーサーもしくは非自己脱離スペーサーを含んでもよいスペーサーであり、
    Ｚは、細胞毒性剤、適宜カンプトテシン類似体、適宜５環性カンプトテシン類似体、適宜６環性カンプトテシン類似体、適宜エキサテカン、ＳＮ－３８またはＤｘｄを含む］
    によって表される、請求項３４に記載のイムノコンジュゲート。
  36. 前記プロテアーゼ切断可能なペプチドまたはペプチジルリンカーが、バリン－シトルリンまたはバリン－アラニンを含む、請求項３４または３５に記載のイムノコンジュゲート。
  37. 前記プロテアーゼ切断可能なペプチドまたはペプチジルリンカーが、グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシンを含む、請求項３４または３５に記載のイムノコンジュゲート。
  38. Ｘがｖａｌ－ｃｉｔ、ｖａｌ－ａｌａまたはｖａｌ－ｐｈｅジペプチドを含み、Ｙ’が自己脱離スペーサーであり、Ｙ’がｐ－アミノベンジル単位であってもよい、請求項３４または３５に記載の組成物。
  39. Ｘがｇｌｙ－ｇｌｙ－ｐｈｅ－ｇｌｙペプチドを含み、Ｙ’が非自己脱離スペーサーである、請求項３４または３５に記載の組成物。
  40. 前記抗体が、配列番号１のネクチン－４ポリペプチドのエピトープへの結合に関して、抗体５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７の重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは重鎖および軽鎖可変領域を含む抗体と競合する、請求項３４から３９のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  41. 前記抗体が、抗体５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７の機能保存変異体である、請求項３４から４０のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  42. 前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を有する膜アンカーヒトネクチン－４タンパク質、配列番号３２のアミノ酸配列を有する膜アンカーヒトネクチン－４タンパク質に結合するが、配列番号３７～４０のアミノ酸配列を有するネクチンファミリータンパク質のいずれにも結合しない、請求項３４から４１のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  43. 前記抗体が、抗体５Ｅ７、１０Ｂ１２、６Ｃ１１Ｂまたは６Ａ７の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、２および３を含む、請求項３４から４２のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  44. 前記抗体が、
    （ａ）配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３を含むＶＬ、
    （ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３を含むＶＬ、
    （ｃ）配列番号４２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号４３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３を含むＶＬ、または
    （ｄ）配列番号５０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号５１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３を含むＶＬ
    を含む、請求項３４から４３のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  45. 前記抗体が、
    （ａ）アミノ酸配列：ＳＹＷＭＨ（配列番号８）を含むＨＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＥＩＤＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号９）を含むＨＣＤＲ２；アミノ酸配列：ＧＹＧＮＹＧＤＹ（配列番号１０）を含むＨＣＤＲ３；アミノ酸配列：ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹ（配列番号１１）を含むＬＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＱＭＳＮＬＡＳ（配列番号１２）を含むＬＣＤＲ２領域；およびアミノ酸配列：ＡＱＮＬＥＬＰＷＴ（配列番号１３）を含むＬＣＤＲ３領域、
    （ｂ）アミノ酸配列：ＥＹＴＩＨ（配列番号４４）を含むＨＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＲＩＮＰＫＮＧＤＩＩＨＮＱＮＦＭＧ（配列番号４５）を含むＨＣＤＲ２；アミノ酸配列：ＳＧＹＧＳＳＹＧＦＡＹ（配列番号４６）を含むＨＣＤＲ３；アミノ酸配列：ＲＡＳＱＳＶＴＴＰＲＹＳＹＭＨ（配列番号４７）を含むＬＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＹＡＳＮＬＥＳ（配列番号４８）を含むＬＣＤＲ２領域；およびアミノ酸配列：ＱＨＳＷＥＩＰＹＴ（配列番号４９）を含むＬＣＤＲ３領域、または
    （ｃ）アミノ酸配列：ＳＹＷＭＨ（配列番号５２）を含むＨＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＥＩＤＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号５３）を含むＨＣＤＲ２；アミノ酸配列：ＳＧＮＹＤＡＭＤＹ（配列番号５４）を含むＨＣＤＲ３；アミノ酸配列：ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹ（配列番号５５）を含むＬＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＱＭＳＮＬＡＳ（配列番号５６）を含むＬＣＤＲ２領域；およびアミノ酸配列：ＡＱＮＬＥＬＰＷＴ（配列番号５７）を含むＬＣＤＲ３領域
    を含む、請求項３４から４４のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  46. 試料における少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％のイムノコンジュゲートが、（－（Ｙ）－（Ｘ）－（Ｙ’）－（Ｚ））単位により機能化されている抗体１つ当たり少なくとも２、４、６または８つのアミノ酸残基を有する、請求項３４から４５のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲートの組成物。
  47. ヒトネクチン－４ポリペプチドに結合する抗体であって、ネクチン－４のアミノ酸残基Ｋ１９７および／またはＳ１９９（配列番号１に準拠）を含むエピトープに結合する、抗体。
  48. ヒトネクチン－４ポリペプチドに結合する抗体であって、残基Ｋ１９７および／またはＳ１９９に突然変異を含む突然変異型ネクチン－４ポリペプチドに対して、前記抗体と配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ネクチン－４ポリペプチドとの間の結合と比較して低下した結合を有する抗体。
  49. ヒトネクチン－４ポリペプチドに結合する抗体であって、アミノ酸配列：
    （ａ）SYWMH（配列番号８）；EIDPSDSYTNYNQKFKG（配列番号９）；GYGNYGDY（配列番号１０）；RSSKSLLHSNGITYLY（配列番号１１）；QMSNLAS（配列番号１２）；およびAQNLELPWT（配列番号１３）；
    （ｂ）EYTIH（配列番号４４）；RINPKNGDIIHNQNFMG（配列番号４５）；SGYGSSYGFAY（配列番号４６）；RASQSVTTPRYSYMH（配列番号４７）；YASNLES（配列番号４８）；およびQHSWEIPYT（配列番号４９）；または
    （ｃ）SYWMH（配列番号５２）；EIDPSDSYTNYNQKFKG（配列番号５３）；SGNYDAMDY（配列番号５４）；RSSKSLLHSNGITYLY（配列番号５５）；QMSNLAS（配列番号５６）；およびＡＱＮLELPWT（配列番号５７）
    を含む抗体。
  50. ヒトネクチン－４ポリペプチドに結合する抗体であって、
    （ａ）配列番号６の重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１、２および３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号７の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
    （ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３を含むＶＬ、
    （ｃ）配列番号４２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号４３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３を含むＶＬ、または
    （ｄ）配列番号５０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号５１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３を含むＶＬ
    を含む抗体。
  51. ヒト重鎖および軽鎖フレームワーク領域を含む、請求項４７から５０に記載の抗体。
  52. Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、一本鎖抗体断片、または複数の異なる抗体断片を含む多重特異性抗体から選択される抗体断片である、請求項４７から５１のいずれか一項に記載の抗体。
  53. ネクチン－４のＩｇ様ＶドメインおよびＩｇ様Ｃ１型２ドメインに結合する、請求項４７から５２のいずれか一項に記載の抗体。
  54. 残基Ｋ１９７および／またはＳ１９９に突然変異を含む突然変異型ネクチン－４ポリペプチドに対して、前記抗体と配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ネクチン－４ポリペプチドとの間の結合と比較して低下した結合を有する、請求項４９から５３のいずれか一項に記載の抗体。
  55. インビトロにおいて判定される、ネクチン－４発現腫瘍細胞のクラスター形成および／または足場非依存性増殖の阻害が可能である、請求項４７から５４のいずれか一項に記載の抗体。
  56. 細胞毒性剤に共有結合し、前記細胞毒性剤が、タキサン類、アントラサイクリン類、カンプトテシン類、エポチロン類、マイトマイシン類、コンブレタスタチン類、ビンカアルカロイド類、ナイトロジェンマスタード類、メイタンシノイド類、デュオカルマイシン類、ツブリシン類、ドラスタチン類およびアウリスタチン類、エンジイン類、ピロロベンゾジアゼピン類、アマトキシン類、ならびにエチレンイミン類からなる群から選択されてもよい、請求項４７から５５のいずれか一項に記載の抗体。
  57. 請求項４７から５６のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  58. 請求項４７から５５のいずれか一項に記載の抗体を含み、前記抗体を特異的に認識する標識二次抗体をさらに含んでもよいキット。
  59. 請求項４７から５５のいずれか一項に記載の抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸または核酸のセット。
  60. 請求項４７から５５のいずれか一項に記載の抗体を産生するハイブリドーマまたは組換え宿主細胞。
  61. 抗体と野生型ヒトネクチン－４ポリペプチドとの間の結合に関連する残基Ｋ１９７および／またはＳ１９９に突然変異を含むヒトネクチン－４ポリペプチド。
  62. 請求項６１に記載のポリペプチドを産生する組換え宿主細胞。
  63. 癌の処置、腫瘍細胞の殺滅および／または細胞毒性剤の腫瘍へのデリバリーを、それを必要とする個体において行う方法であって、切断可能なリンカー（および適宜、自己脱離スペーサー）を介して化合物１のエキサテカンにコンジュゲートした抗ネクチン－４抗体を含む治療有効量の抗体－薬物コンジュゲートを前記個体に投与することを含み、前記個体が、Ｐｇｐによる輸送が可能である細胞毒性剤にリンカーを介してコンジュゲートした結合剤（適宜ネクチン－４結合剤またはＨＥＲ２結合剤）を用いた処置の後に再燃および／または進行した癌を有する、方法。
  64. Ｐｇｐによる輸送が可能である前記細胞毒性剤が、エキサテカン以外のカンプトテシン類似体であり、Ｐｇｐによる輸送が可能である前記細胞毒性剤が、５環性カンプトテシン類似体、６環性カンプトテシン、またはＤｘｄであってもよい、請求項６３に記載の方法。
  65. Ｐｇｐによる輸送が可能である細胞毒性剤にリンカーを介してコンジュゲートした前記結合剤が、切断可能なリンカーを介して化合物１３の構造を有する化合物（Ｄｘｄ）にコンジュゲートした、ネクチン－４と結合する抗体を含む、請求項６３に記載の方法。
  66. 切断可能なリンカーを介して化合物１のエキサテカンにコンジュゲートした抗ネクチン－４抗体を含む前記抗体－薬物コンジュゲートが、請求項４７から５６に記載の抗ネクチン－４抗体を含む、請求項６３から６５に記載の方法。
  67. 切断可能なリンカーを介して化合物１のエキサテカンにコンジュゲートした抗ネクチン－４抗体を含む前記抗体－薬物コンジュゲートが、請求項３４から４６に記載のイムノコンジュゲートであり、Ｚがエキサテカンである、請求項６４から６６に記載の方法。
  68. ネクチン－４結合抗体またはそのようなネクチン－４結合抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを作製、同定または試験する方法であって、前記抗体または抗体薬物コンジュゲートを請求項６１に記載のポリペプチドまたは請求項６２に記載の細胞と接触させること、ならびに前記抗体と突然変異型ネクチン－４ポリペプチドとの間の結合を、適宜、前記抗体と残基Ｋ１９７および／またはＳ１９９に突然変異を有しないネクチン－４ポリペプチドとの間の結合と比較して評価することを含む方法。
  69. ネクチン－４結合抗体またはそのようなネクチン－４結合抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを作製、同定または試験する方法であって、残基Ｋ１９７および／またはＳ１９９に突然変異を含む突然変異型ネクチン－４ポリペプチドに対して、抗体と野生型ネクチン－４ポリペプチドとの間の結合と比較して低下した結合を示す抗体または抗体薬物コンジュゲート（またはその製造バッチ由来の試料）を、表面にネクチン－４、適宜、野生型ネクチン－４ポリペプチドを発現する細胞と接触させること、ならびに前記抗体または抗体薬物コンジュゲートの、細胞内内在化を受ける、抗体－ネクチン－４複合体の細胞内内在化を誘導する、および／または細胞の死を引き起こす能力を評価することを含む方法。
  70. ネクチン－４結合のＶＣ１架橋ドメインと結合する抗体を試験する方法であって、（ｉ）細胞毒性剤の存在下において、前記抗体を、表面にネクチン－４を発現する細胞と接触させることであって、前記細胞がＰｇｐを発現してもよく、前記抗体が前記細胞毒性剤にコンジュゲートされていてもよい、接触させること、および（ｉｉ）前記抗体またはコンジュゲート抗体の前記細胞の死を引き起こす能力を評価すること、適宜、細胞毒性剤の存在下における前記抗体またはコンジュゲート抗体が、前記細胞毒性剤単独の存在下において観察された細胞死と比較して細胞死を増加させるか否かを評価することを含む方法。
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