TW202411251A - 粘附分子-4結合劑 - Google Patents

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馬內爾 克萊姆
史蒂芬妮 香提克斯
班哲明 羅絲
勞倫 古提爾
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法商天賜製藥公司
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本發明係關於結合至粘附分子-4 (Nectin-4)多肽之抗體及抗體片段。本發明亦關於包含該等抗體或抗體片段之抗體-藥物結合物，且關於製造該等結合物之方法、醫藥組合物及使用其診斷、治療或預防疾病，例如以表現粘附分子-4之腫瘤細胞為特徵之癌症的方法。

Description

粘附分子-4結合劑
本發明係關於結合至粘附分子-4多肽之抗體及其片段。本發明亦關於產生此類化合物之細胞、製造此類化合物之方法、結合物及製造結合物之方法、包含該等結合物之醫藥組合物、使用此類化合物診斷、治療或預防疾病，例如以表現粘附分子-4 (Nectin-4)之腫瘤細胞為特徵之癌症的方法。
粘附分子-4為粘附分子蛋白質家族之表面分子，其在各種生物過程中起重要作用，諸如上皮細胞、內皮細胞、免疫細胞及神經元細胞在發育及成人壽命期間之極性、增殖、分化及遷移。粘附分子-4最初係由Lopez集團於2001年自人類氣管中選殖(參見Reymond等人(2001) J. Biol. Chem. 276(46):43205-15)。粘附分子為脊髓灰質炎、單純疱疹及麻疹病毒之主要受體且進一步涉及人類中之若干病理學過程。粘附分子-4在若干種腫瘤中以顯著較高水平表現，且其尤其過度表現於包括三陰性乳癌(triple negative breast cancer；TNBC) (參見M-Rabet等人Ann Oncol. 2017年4月1日;28(4):769-776)之乳癌、胰臟癌及尿道上皮癌中。另外，粘附分子-4亦表現於非小細胞肺癌、卵巢癌、頭頸部鱗狀細胞癌及食道癌腫瘤樣本中。Challita-Eid等人(2016) Cancer Res. 76(10): 3003-3013報導，膀胱(60%)及乳房(53%)腫瘤組織中藉由免疫組織化學進行之染色為中度至強度(H評分≥100)。Zeindler等人2019 Front. Med. 6:200報導，在148例TNBC個案中，86 (58%)例存在高度表現之粘附分子-4。在患有此等癌症之患者的血清中，可溶性形式之粘附分子-4的偵測與不良預後相關。血清粘附分子-4之含量在轉移性進展期間增加，且在治療之後減少。此等結果表明粘附分子-4可為用於治療癌症之可靠目標。
因此，先前技術中已描述若干種抗粘附分子-4抗體。特定言之，恩弗妥單抗維多汀(Enfortumab Vedotin) (ASG-22ME)為靶向粘附分子-4之抗體-藥物結合物(ADC)且當前處於用於治療罹患實性瘤之患者的臨床研究中。上述Challita-Eid等人(2016)基於抗體AGS-22開發與高效微管破壞劑MMAE結合之抗粘附分子-4抗體。研究產生ADC候選藥物恩弗妥單抗維多汀(參見美國專利案第8,637,642號及PCT公開案第WO2012/047724號，Agensys Inc.)，其在治療患有局部晚期或轉移性尿道上皮癌之患者中產生有前景之結果，該等患者先前已在新佐劑/佐劑、局部晚期或轉移性情形下接受含鉑化學療法及PD-1/PD-L1檢查點抑制劑。若干其他集團亦已提出結合至各種毒性劑之抗粘附分子-4藥劑。PCT專利申請案WO2018/158398 (INSERM)報導若干種抗粘附分子-4抗體且提出與一系列細胞毒性劑之潛在偶聯。類似地，美國專利第8,637,642號(Agensys Inc.)亦提供抗粘附分子-4抗體且提出與一系列細胞毒性劑之潛在偶聯。此外，Bicycle Therapeutics已報導抗粘附分子-4靶向劑之開發，該靶向劑包含經由可裂解連接子纈胺酸-瓜胺酸(val-cit)與細胞毒性奧瑞他汀(auristatin) (MMAE)有效負載結合之粘附分子-4結合蛋白。迄今為止，已報導為當與化學治療劑結合時具有活性之所有抗粘附分子-4抗體已靶向粘附分子-4之Ig樣V型域，因此咸信Ig樣V型域會提供最強之抗粘附分子-4 ADC內化作用。
恩弗妥單抗維多汀(抗粘附分子-4 ADC)結合至粘附分子-4之Ig樣V型域，該Ig樣V型域與高度內化之抗粘附分子-4抗體締合。在EV-201之2期研究(2019)中，恩弗妥單抗維多汀在UC中展示令人印象深刻之治療反應，其中客觀反應率(ORR)為44%且完全反應率(CR)為12%，約一半患者中止治療。大部分中止歸因於如藉由RECIST (48%)或臨床症狀(5%)所評估之進行性疾病。另外，18%之中止患者經歷不良事件，尤其神經病變。因此，靶向粘附分子-4之ADC具有侷限性，且此項技術中需要改良對罹患UC及其他癌症之患者的益處。
本文提供重鏈可變(VH)及輕鏈可變(VL)域，其用於粘附分子-4結合蛋白。本發明之一個目標為提供一種抗粘附分子-4抗體或抗體片段，其包含：與包含SEQ ID NO: 37、39、41、43、45、47、49、51、53、55或57之胺基酸序列的重鏈具有至少約80%序列一致性(例如至少約85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性，或100%一致性)之重鏈可變區，及與包含SEQ ID NO: 59、61、63或65之胺基酸序列的輕鏈具有至少約80%序列一致性(例如至少約85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性，或100%一致性)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，提供一種抗粘附分子-4抗體或抗體片段，其包含：與包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列的重鏈具有至少約80%序列一致性(例如至少約85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性，或100%一致性)之重鏈可變區，及與SEQ ID NO: 70之胺基酸序列具有至少約80%序列一致性(例如至少約85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性，或100%一致性)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，提供一種抗粘附分子-4抗體或抗體片段，其包含：包含CDR1、CDR2及CDR3之重鏈可變區(VH)，該等CDR1、CDR2及CDR3分別具有SEQ ID NO: 21、22及23之胺基酸序列及來自人類IGHV1-46*01基因之構架FR1、FR2及FR3胺基酸序列(及進一步視情況具有來自人類IGHJ4*01基因之構架FR4胺基酸序列)；及輕鏈可變區(VL) CDR1、CDR2及CDR3，其分別具有SEQ ID NO: 24、25及26之胺基酸序列及來自人類IGKV2-28*01基因之構架FR1、FR2及FR3胺基酸序列(及進一步視情況具有來自人類IGKJ4*01基因之構架FR4胺基酸序列)。來自特定人類IGHV、IGHJ、IGKV及IGKJ基因之構架序列可包含如本文進一步描述之一或多個胺基酸取代。
在一個實施例中，提供一種抗粘附分子-4抗體或抗體片段，其包含在選自28、38、40、48、69、71、73、78之Kabat位置處包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個或八個胺基酸取代之重鏈可變區。視情況地，在位置28處之蘇胺酸殘基經異白胺酸殘基取代。視情況地，在位置38處之精胺酸殘基經離胺酸殘基取代。視情況地，在位置40處之丙胺酸殘基經精胺酸殘基取代。視情況地，在位置48處之甲硫胺酸殘基經異白胺酸殘基取代。視情況地，在位置69處之甲硫胺酸殘基經白胺酸殘基取代。視情況地，在位置71處之精胺酸殘基經白胺酸殘基取代。視情況地，在位置73處之蘇胺酸殘基經離胺酸殘基取代。視情況地，在位置78處之纈胺酸殘基經蘇胺酸殘基取代。
在一個實施例中，提供一種抗粘附分子-4抗體或抗體片段，其包含在選自2、8、11、64之kabat位置處包含一個、兩個、三個或四個胺基酸取代之輕鏈可變區。視情況地，在位置2處之異白胺酸殘基經纈胺酸殘基取代。視情況地，在位置8處之脯胺酸殘基經丙胺酸殘基取代。視情況地，在位置11處之白胺酸殘基經天冬醯胺取代。視情況地，在位置64處之甘胺酸殘基經絲胺酸殘基取代。
在一個實施例中，提供一種抗粘附分子-4抗體，其包含：與包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列的重鏈具有至少約80%序列一致性(例如至少約70%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性，或100%一致性)之重鏈，及與包含SEQ ID NO: 78之胺基酸序列的輕鏈具有至少約80%序列一致性(例如至少約70%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性，或100%一致性)之輕鏈。
在一個實施例中，提供一種抗粘附分子-4抗體或抗體片段，其包含：與包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的重鏈具有至少約80%序列一致性(例如至少約85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性，或100%一致性)之重鏈可變區，及與SEQ ID NO: 65之胺基酸序列具有至少約80%序列一致性(例如至少約85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性，或100%一致性)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，提供一種粘附分子-4結合蛋白，其包含本發明之抗體或抗體片段及進一步視情況存在之額外抗原結合域。
在任何實施例中，抗體或抗體片段可視情況表徵為單株、人類化及/或呈分離形式。
在一個實施例中，抗粘附分子-4抗體或抗體片段結合粘附分子-4多肽之VC1橋接域。
在任何態樣中，本發明之抗體或抗體片段係用於製備抗體藥物結合物(ADC)。在任何態樣中，本發明之抗體係用於(例如用於以下之方法中)：減少表現粘附分子-4之腫瘤細胞之間的細胞-細胞貼附、抑制粘附分子-4:粘附分子-1相互作用、抑制粘附分子-4:粘附分子-4相互作用、減少表現粘附分子-4之腫瘤細胞的生長及/或減少表現粘附分子-4之腫瘤細胞的團簇形成。
根據本發明中之一者，提供一種抗體藥物結合物，其包含結合至細胞毒性劑之抗粘附分子-4抗體或抗體片段，視情況其中細胞毒性劑係經由連接子結合至抗體或抗體片段，且視情況此外其中連接子或連接子-毒素包含式III至XIV中之任一者。
在一個實施例中，抗體藥物結合物(ADC)包含連接至至少一種細胞毒性藥物部分之抗粘附分子-4抗體或抗體片段，其中抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO: 69之胺基酸序列具有至少約80%序列一致性(例如至少約85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性，或100%一致性)之重鏈可變區，及與SEQ ID NO: 70之胺基酸序列具有至少約80%序列一致性(例如至少約85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性，或100%一致性)之輕鏈可變區。
在一個實施例中，抗體藥物結合物(ADC)包含(a)結合至粘附分子-4多肽之至少一種抗原結合域，該抗原結合域包含(i)與SEQ ID NO: 37、39、41、43、45、47、49、51、53、55或57之胺基酸序列具有至少80%序列一致性(例如至少約85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性，或100%一致性)之重鏈可變區及(ii)與SEQ ID NO: 59、61、63或65之胺基酸序列具有至少約80%序列一致性(例如至少約85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性，或100%一致性)之輕鏈可變區；及(b)至少一種細胞毒性藥物部分。
在一較佳實施例中，抗體藥物結合物(ADC)包含(a)一種粘附分子-4人類化抗體，其包含(i)與SEQ ID NO: 47之胺基酸序列具有至少80%序列一致性(例如至少約85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性，或100%一致性)之重鏈可變區及(ii)與SEQ ID NO: 65之胺基酸序列具有至少約80%序列一致性(例如至少約85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性，或100%一致性)之輕鏈可變區。
在一些態樣中，結合人類粘附分子-4多肽之抗體(例如全長抗體、抗體片段)能夠減少表現粘附分子-4之腫瘤細胞之間的細胞-細胞貼附，及/或減少表現粘附分子-4之腫瘤細胞的生長及/或團簇形成(如例如使用3維或非貼附型腫瘤細胞培養物；腫瘤球狀體分析法所評估)，以用於製備抗體藥物結合物。
在一些態樣中，抗體(例如全長抗體、抗體片段)能夠抑制粘附分子-4:粘附分子-1相互作用及/或粘附分子-4:粘附分子-4相互作用(例如，抗體能夠減少在第一細胞上之粘附分子-4與在第二細胞上之粘附分子-1及/或粘附分子-4的相互作用，視情況其中細胞為腫瘤細胞)。
在本文之任何態樣中，在結合至腫瘤細胞表面上之粘附分子-4後，抗粘附分子-4抗體或抗體片段，或包含此類抗體或片段之抗體-藥物結合物能夠進行胞內內化。
在一些態樣中，提供製備抗體藥物結合物之方法，其包含使抗粘附分子-4抗體或抗體片段(例如根據本發明之抗體或抗體片段)與細胞毒性劑(例如根據本發明之連接子或連接子-毒素)結合。
在一些態樣中，抗體藥物結合物之製備包含使抗體與細胞毒性劑(例如經由連接子部分、進一步包含胞內可裂解部分之連接子部分)結合之步驟。
在一個態樣中，抗粘附分子-4抗體或抗體片段係經由胞內可裂解(例如蛋白酶可裂解)寡肽(例如二肽、三肽、四肽或五肽)結合至細胞毒性劑。在一個態樣中，抗粘附分子-4抗體或抗體片段係經由胞內可裂解(例如蛋白酶可裂解)二肽、三肽、四肽或五肽及自消除間隔子結合至細胞毒性劑(例如，喜樹鹼衍生物)。在一個態樣中，抗粘附分子-4抗體或抗體片段係經由胞內可裂解(例如蛋白酶可裂解)四肽或五肽及自或非自消除間隔子結合至細胞毒性劑(例如，喜樹鹼衍生物)。
在一個態樣中，細胞毒性劑為高效化學治療劑，視情況為選自由以下組成之群的細胞毒性劑：紫杉烷、蒽環黴素、喜樹鹼、埃博黴素(epothilones)、絲裂黴素、康普瑞汀(combretastatins)、長春花生物鹼、氮芥、類美登素(maytansinoids)、倍癌黴素(duocarmycins)、特吡萊辛(tubulysins)、海兔毒素(dolastatins)及奧瑞他汀、烯二炔類(例如卡奇黴素(calicheamicins)、埃斯波黴素(esperamicins)、獅子島黴素(shishijimicins)及那門黴素(namenamicins))、吡咯并苯并二氮呯類(例如吡咯并苯并二氮呯二聚體及吲哚啉并-吡咯并苯并二氮呯二聚體)、毒傘毒素(amatoxins)及伸乙亞胺。在一個實施例中，細胞毒性劑為DNA損傷劑，包括例如DNA嵌入劑，例如將自身插入至細胞之DNA結構中且結合至DNA，從而造成DNA損傷之藥劑(例如道諾黴素(daunorubicin))。化合物包括拓樸異構酶抑制劑、阻斷拓樸異構酶(拓樸異構酶I及II)之作用的化合物。此類化合物係用於廣泛範圍之實性瘤及血液學惡性病，尤其淋巴瘤。拓樸異構酶I抑制劑包括喜樹鹼，例如伊立替康(irinotecan) (經批准以用於治療結腸癌)、拓朴替康(topotecan) (經批准以用於治療卵巢癌及肺癌)、喜樹鹼、片螺素D (lamellarin D)、茚并異喹啉、茵米替康(indimitecan)。其他喜樹鹼包括司拉替康(silatecan)、可司替康(cositecan)、依沙替康(exatecan)、勒托替康(lurtotecan)、吉馬替康(gimatecan)、貝洛替康(belotecan)及盧比替康(rubitecan)。拓樸異構酶II抑制劑包括例如依託泊苷(etoposide) (VP-16)、替尼泊苷(teniposide)、多柔比星(doxorubicin)、道諾黴素、米托蒽醌(mitoxantrone)、安吖啶(amsacrine)、玫瑰樹鹼(ellipticines)、金精三羧酸及HU-331 (一種由大麻二酚合成之喹諾酮)。
視情況地，抗體或抗體片段經式III至XIV中之任一者的連接子-毒素官能化(例如結合至、共價鍵結至連接子-毒素)。
在一個態樣中，細胞毒性劑為喜樹鹼類似物，例如依沙替康、Dxd或SN-38分子。
在一個態樣中，本發明提供本發明之粘附分子-4結合抗體或抗體片段，其結合(例如共價鍵結)至喜樹鹼，例如喜樹鹼類似物、依沙替康或依沙替康衍生物、Dxd分子或SN-38分子。
在本文之任何實施例中，結合(例如共價鍵結)至喜樹鹼類似物(例如依沙替康或SN-38分子)的本發明之粘附分子-4結合抗體或抗體片段可表徵為包含特異性結合至人類粘附分子-4多肽之抗體，該人類粘附分子-4多肽具有一或多個胺基酸殘基(例如半胱胺酸、離胺酸、麩醯胺酸殘基、非天然胺基酸殘基)，該一或多個胺基酸殘基經由連接子經包含化合物1或2之結構的分子官能化。在本文之任何實施例中，粘附分子-4抗體或抗體片段可表徵為經具有式III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII或XIV之結構的連接子-喜樹鹼分子或經化合物3至16中之任一者官能化。
在一個實施例中，結合至喜樹鹼衍生物之粘附分子-4抗體或抗體片段為結合至依沙替康分子(例如具有化合物1 (1a或1b)之結構的分子)之粘附分子-4抗體或抗體片段。在任何實施例中，包含連接子之可裂解連接子或免疫結合物或ADC可表徵為例如在連接子發生酶裂解後，釋放依沙替康分子，例如具有化合物1 (1a或1b)之結構的分子。在一個實施例中，結合至喜樹鹼衍生物之人類化粘附分子-4抗體或抗體片段為結合至SN-38分子(例如具有化合物2之結構的分子)之粘附分子-4抗體或抗體片段。在一個實施例中，粘附分子-4抗體或抗體片段可表徵為包含特異性結合至人類粘附分子-4多肽之抗體，該人類粘附分子-4多肽具有一或多個胺基酸殘基(例如半胱胺酸、離胺酸、麩醯胺酸或非天然胺基酸殘基)，該一或多個胺基酸殘基經由連接子(例如在有或無額外間隔子(例如本文中所描述之間隔子(Y'))之情況下的可裂解連接子分子)經具有以下結構之分子官能化： 化合物1a 或 化合物1b 或 化合物2。
在一個實施例中，結合至細胞毒性劑之粘附分子-4抗體或抗體片段可指定為由式(I)表示之免疫結合物： Ab-X-Z                           式(I) 其中， Ab為特異性結合至人類粘附分子-4多肽之抗體或抗體片段(例如本發明之任何抗體或抗體片段，視情況抗體結合人類粘附分子-4之VC1橋接域及/或呈現相較於與野生型人類粘附分子-4多肽之結合，與突變人類粘附分子-4多肽之結合減少，該突變人類粘附分子-4多肽包含在殘基K197及/或S199處之胺基酸取代(參考SEQ ID NO: 1))； X為連接Ab與Z之連接子分子(例如共價鍵結至Ab及Z中之各者)，其中X包含例如在生理條件下、視情況在胞內條件下為可裂解之部分，該部分視情況為蛋白酶可裂解之二肽、三肽、四肽或五肽，視情況其中X進一步包含安置於可裂解部分與Z之間的自消除或非自消除間隔子系統(Y')，視情況其中X進一步包含安置於Ab與可裂解部分之間的間隔子(Y)；及 Z為細胞毒性劑，視情況其中Z為喜樹鹼類似物，視情況其中Z為依沙替康，視情況其中Z為依沙替康，且連接子之裂解引起具有化合物1 (依沙替康)之結構的化合物之釋放。
在一個實施例中，結合至細胞毒性劑之粘附分子-4抗體或抗體片段可指定為由式(I)表示之免疫結合物： Ab-X-Z                           式(I) 其中， Ab為特異性結合至人類粘附分子-4多肽的根據本發明之抗體或抗體片段； X為連接Ab與Z之連接子分子(例如共價鍵結至Ab及Z中之各者)，其中X包含纈胺酸-瓜胺酸、纈胺酸-丙胺酸或苯丙胺酸-離胺酸二肽，其中X進一步包含安置於可裂解部分與Z之間的自消除或非自消除間隔子系統(Y')，且其中X進一步包含安置於Ab與可裂解部分之間的間隔子(Y)；及 Z為細胞毒性劑，視情況為喜樹鹼類似物，視情況為依沙替康分子或SN-38分子。
在一個實施例中，提供一種向腫瘤遞送或靶向細胞毒性劑(視情況為喜樹鹼類似物)之方法、一種在腫瘤中(例如在患有癌症之受試者中)釋放細胞毒性劑(視情況為喜樹鹼類似物、Dxd、依沙替康)之方法或一種使腫瘤或癌症對細胞毒性劑(視情況為喜樹鹼類似物)敏感之方法，該方法包含向患有癌症之受試者投與由式(I)表示之免疫結合物： Ab-X-Z                           式(I) 其中， Ab為特異性結合至人類粘附分子-4多肽之抗體或抗體片段； X為連接Ab與Z之連接子分子(例如共價鍵結至Ab及Z中之各者)，其中X包含例如在生理條件下、視情況在胞內條件下為可裂解之部分，該部分視情況為蛋白酶可裂解之二肽、三肽、四肽或五肽，視情況其中X進一步包含安置於可裂解部分與Z之間的自消除或非自消除間隔子系統(Y')，視情況其中X進一步包含安置於Ab與可裂解部分之間的間隔子(Y)；及 Z為細胞毒性劑，視情況為喜樹鹼類似物，視情況為依沙替康分子或SN-38分子，視情況其中Z為依沙替康且其中連接子之裂解引起具有化合物1 (依沙替康)之結構的化合物之釋放。
在一個實施例中，結合至細胞毒性劑(視情況為喜樹鹼類似物)之抗體或抗體片段可指定為由式(II)表示之免疫結合物： Ab-(X-(Z) n) m式(II) 其中， Ab為特異性結合至人類粘附分子-4多肽的根據本發明之抗體或抗體片段； X為連接Ab與Z之連接子分子，其中X包含例如在生理條件下、視情況在胞內條件下為可裂解之部分，該部分視情況為蛋白酶可裂解之二肽、三肽、四肽或五肽，視情況其中X進一步包含安置於可裂解部分與Z之間的自消除或非自消除間隔子系統(Y')，視情況其中X進一步包含安置於Ab與可裂解部分之間的間隔子(Y)； Z為細胞毒性劑，視情況為喜樹鹼類似物，視情況Z為包含依沙替康分子或SN-38分子(例如具有化合物1或2之結構的分子)的分子； n為1；及 m為4至8，或視情況m為選自4、5、6、7或8中之整數。
在一個實施例中，結合至細胞毒性劑(視情況為喜樹鹼類似物)之粘附分子-4抗體或抗體片段可表徵為由式(II)表示之免疫結合物之組合物： Ab-(X-(Z) n) m式(II) 其中， Ab為特異性結合至人類粘附分子-4多肽的根據本發明之抗體或抗體片段； X為連接Ab與Z之分子，其中X包含例如在生理條件下、視情況在胞內條件下為可裂解之部分，該部分視情況為蛋白酶可裂解之二肽、三肽、四肽或五肽，視情況其中X進一步包含安置於可裂解部分與Z之間的自消除或非自消除間隔子系統(Y')，視情況其中X進一步包含安置於Ab與可裂解部分之間的間隔子(Y)； Z為細胞毒性劑，視情況為喜樹鹼類似物，視情況Z為包含依沙替康分子或SN-38分子之分子。 其中n為1，且組合物中至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%之免疫結合物具有在2與4之間、在4與8之間、視情況在6與8之間的m (X-Z部分之數目)。視情況地，組合物中至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%之免疫結合物具有為或至少為4、6、7或8之m。
在式I或II中，(X-Z)部分可視情況表徵為具有式III至XI中之任一者或化合物3至12中之任一者的結構。
在式I或II中，分子X或間隔子Y可視情況指定為包含反應性基團(R)，或反應性基團(R)與抗原結合蛋白(例如抗體)之胺基酸或與連接至抗體或抗體片段之胺基酸之互補反應性基團(R')之反應的殘基。
在本文之任何實施例中，依沙替康分子可指定為經由在依沙替康之位置1處之胺結合至連接子(X) (當依沙替康分子為連接子之部分時，NH置換在位置1處之NH 2)。在一個實施例中，依沙替康係結合至連接子(X)，例如結合至X之對-胺基苯甲氧基羰基(PAB)自消除間隔子部分之羰基。在本文之任何實施例中，SN-38分子可指定為經由在位置9處之OH結合至連接子(X) (當化合物2中所示之SN-38分子為連接子之部分時，O置換在位置9處之OH)。
在一個實施例中，結合至依沙替康之粘附分子-4結合劑可表徵為包含特異性結合至人類粘附分子-4多肽之抗體，該人類粘附分子-4多肽具有一或多個胺基酸殘基(例如半胱胺酸殘基、麩醯胺酸殘基)，該一或多個胺基酸殘基經由間隔子(Y)經包含以下結構之連接子-依沙替康分子官能化： 。
在一個實施例中，結合至依沙替康之人類化粘附分子-4抗體或抗體片段可表徵為包含特異性結合至人類粘附分子-4多肽之抗體，該人類粘附分子-4多肽具有一或多個胺基酸殘基(例如半胱胺酸殘基、麩醯胺酸殘基)，該一或多個胺基酸殘基經由間隔子(Y)經包含以下結構之連接子-依沙替康官能化： 。
在一個實施例中，結合至依沙替康之人類化粘附分子-4抗體或抗體片段可表徵為包含特異性結合至人類粘附分子-4多肽之抗體，該人類粘附分子-4多肽具有一或多個胺基酸殘基(例如半胱胺酸殘基、麩醯胺酸殘基)，該一或多個胺基酸殘基經由間隔子(Y)經包含以下結構之連接子-依沙替康分子官能化： 。
在一個實施例中，結合至依沙替康之人類化粘附分子-4抗體或抗體片段可表徵為包含特異性結合至人類粘附分子-4多肽之抗體，該人類粘附分子-4多肽具有一或多個胺基酸殘基(例如半胱胺酸殘基、麩醯胺酸殘基)，該一或多個胺基酸殘基經由間隔子(Y)經包含以下結構之連接子-依沙替康分子官能化： 。
間隔子(Y)可指定為經取代或未經取代之烷基或雜烷基鏈或包含經取代或未經取代之烷基或雜烷基鏈，視情況其中Y具有2至100個原子、2至40個原子、視情況2至30、2至20、4至40、4至30或4至20個原子之鏈長，視情況其中一或多個原子可為除碳以外之原子，例如氧、硫、氮或其他原子，視情況其中鏈之任何碳經烷氧基、羥基、烷基羰氧基、烷基-S-、硫醇、烷基-C(O)S-、胺、烷胺、醯胺或烷基醯胺取代。舉例而言，Y可包含一或多個環氧乙烷單體，視情況Y包含聚環氧乙烷部分，視情況Y包含結構-(CH 2CH 2O) x- ，其中x為1至24，視情況為1至12，視情況為1至8，視情況為1至6。
在一些態樣中，提供一種具有以下結構之連接子-依沙替康分子： 。
在某些實施例中，提供一種結合人類粘附分子-4多肽之免疫結合物，其中免疫結合物係由下式中之任一者表示： 其中n為1至15、5至15、5至23 (例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23)；且 其中Ab為特異性結合人類粘附分子-4多肽之抗體或其抗體片段，視情況其中抗體或抗體片段包含與選自由SEQ ID NO: 19、47、69或77組成之群的胺基酸序列至少60%、視情況至少70%、視情況80%或視情況90%一致之胺基酸序列；及與選自由SEQ ID NO: 20、65、70或78組成之群的胺基酸序列至少60%、視情況至少70%、視情況80%或視情況90%一致之胺基酸序列。S可指定為抗體(Ab)之半胱胺酸殘基之原子。
在一個實施例中，提供一種結合人類粘附分子-4多肽之免疫結合物，其中免疫結合物係由下式表示： 其中Ab為特異性結合人類粘附分子-4多肽之抗體或其抗體片段。在一個實施例中，n為15且免疫結合物係藉由在6與8之間的DAR表徵，視情況其中DAR為6，視情況其中DAR為8；且其中S為抗體(Ab)之半胱胺酸殘基之原子。在一個實施例中，Ab包含：包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)；及包含SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)，視情況其中抗體或抗體片段包含有包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列的重鏈；及包含SEQ ID NO: 78之胺基酸序列的輕鏈。
在一個態樣中，與現有抗粘附分子-4 ADC療法(例如結合至奧瑞他汀之抗粘附分子-4抗體或抗體片段；恩弗妥單抗維多汀)相比，治療展示改良之功效及/或改良之(較低)耐藥性。在一個態樣中，提供一種在有需要之個體中治療及/或預防癌症及/或殺傷腫瘤細胞之方法，其中治療包含以每月1至2次(例如每兩週一次，每三週一次或每四週一次)之頻率投與結合至喜樹鹼衍生物(例如依沙替康或SN-38分子)之粘附分子-4結合劑2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次。
亦提供一種使用視情況與細胞毒性藥物部分結合之抗體、其片段治療或預防有需要之個體中之疾病(例如癌症)的方法。在一個實施例中，視情況與細胞毒性藥物部分結合之抗體或片段係以足以殺傷表現粘附分子-4之腫瘤細胞的量及頻率向患有癌症之個體投與。在一個實施例中，該個體具有表現粘附分子-4之腫瘤，視情況其中腫瘤為表現HER-2之腫瘤或HER2-陰性腫瘤，例如尿道上皮癌、頭頸部鱗狀細胞癌或食道癌。在一個實施例中，癌症或腫瘤為晚期復發性或轉移性癌症，視情況為晚期復發性或轉移性尿道上皮癌。在一個實施例中，癌症或腫瘤為三陰性乳癌(TNBC)。
在一個態樣中，本文中之治療方法可用於患有表現粘附分子-4之癌症(與腫瘤細胞上之粘附分子-4之表現量無關)的個體中。
在一個態樣中，本文中之治療方法可有利地用於腫瘤細胞表現P-醣蛋白(Pgp)之個體中。
在一個態樣中，本發明之治療方法可有利地用於先前已接受用化學治療劑(例如藉由P-醣蛋白(Pgp)輸送之化學治療劑)、鉑劑(例如奧沙利鉑(oxaliplatin)、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、萘達鉑(nedaplatin)、菲鉑(Phenanthriplatin)、吡鉑(picoplatin)、賽特鉑(satraplatin))、紫杉烷(例如紫杉醇(Paclitaxel) (Taxol™)及多西他賽(docetaxel) (Taxotere™))進行之治療的個體中。
由本發明之抗粘附分子-4抗體(例如，尤其在與喜樹鹼衍生物結合時)所提供之增加之抗腫瘤效能及更大治療窗為患有具有抗性之腫瘤的個體提供經改善之治療結果的可能性，該等個體在用包含抗HER2藥劑(例如曲妥珠單抗(trastuzumab)；包含曲妥珠單抗之ADC)之組合物或用包含另一抗粘附分子-4藥劑(例如包含恩弗妥單抗(enfortumab)之ADC；恩弗妥單抗維多汀)之組合物治療後無反應或已惡化經改良之治療窗提供與其他藥劑，尤其化學治療劑及/或抗HER2藥劑組合治療之可能性。
在一個態樣中，本文中之治療方法可有利地用於腫瘤或癌症具有抗性之個體中，該個體在用包含抗HER2抗體(例如曲妥珠單抗；包含曲妥珠單抗之ADC)之組合物或包含另一抗粘附分子-4藥劑(例如包含恩弗妥單抗之ADC；恩弗妥單抗維多汀)之組合物治療後無反應或已惡化。
在本文中之實施例之一個態樣中，個體先前已接受用放射線療法、手術、化學療法進行之治療及/或用生物劑進行之療法。
在本文中之實施例之一個態樣中，個體先前已接受用抗粘附分子-4藥劑進行之治療，該抗粘附分子-4藥劑視情況為包含除拓樸異構酶抑制劑以外之細胞毒性部分的抗粘附分子-4藥劑，例如恩弗妥單抗維多汀。
在本文中之實施例之一個態樣中，提供在有需要之個體中治療癌症、殺傷腫瘤細胞及/或將細胞毒性劑遞送至腫瘤之方法，其包含向先前已接受用結合至奧瑞他汀之粘附分子-4結合劑(視情況為恩弗妥單抗維多汀)治療之個體投與治療有效量之結合人類粘附分子-4多肽之免疫結合物，其中免疫結合物係由下式中之任一者表示： 其中n為5至23，視情況n為7至15，視情況n為15，且其中Ab為特異性結合人類粘附分子-4多肽之抗體或其抗體片段。視情況地，免疫結合物係藉由在6與8之間的DAR表徵，視情況其中DAR為6，視情況其中DAR為8。
在一個態樣中，本發明提供可用於以低劑量或低於習知抗粘附分子-4 ADC所使用之劑量，例如低於3 mg/kg體重、低於1.25 mg/kg體重、低於1 mg/kg體重、低於125 mg均一劑量來介導個體中之抗腫瘤作用之治療方法。
在一個態樣中，本發明之治療方法可用於患有現有神經病變、糖尿病或高血糖症、心機能不全、眼部病變之個體中。
在一個態樣中，本發明之治療方法可用於患有表現粘附分子-4之癌症的個體中，該癌症係以腫瘤細胞之粘附分子-4多肽表現(例如腫瘤細胞膜中之粘附分子-4多肽表現)量低或中度為特徵。
在本文中之任何實施例中，結合至細胞毒性劑之抗粘附分子-4抗體與另一細胞毒性劑(例如化學治療劑、藉由P-醣蛋白(Pgp，人類MDR1基因之產物)輸送之化學治療劑、鉑劑、紫杉烷)組合使用，其中另一細胞毒性劑與結合至細胞毒性劑之抗粘附分子-4抗體分開投與。
在本發明之另一態樣中，提供醫藥組合物及套組，其包含視情況與細胞毒性藥物部分結合之抗粘附分子-4抗體或抗體片段，以及通常一或多種額外成分，該一或多種額外成分可為促進組合物(例如各種載劑)之調配、遞送、穩定性或其他特徵的活性成分或非活性成分。
此等態樣更充分地描述於本文中所提供之實施方式中，且額外態樣、特徵及優點將自本文中所提供之實施方式而顯而易見。
相關申請案之交互參照
本申請案主張2022年5月25日申請之美國臨時申請案第63/345,453號之權利，該案以全文引用之方式併入本文中；包括任何圖式。 序列表 之 參照
本申請案係與電子格式之序列表一起提交。序列表係以2023年5月22日創建之名為「Nectin-4-3 PCT」之文件形式提供，其大小為97 KB。電子格式之序列表中之資訊以全文引用之方式併入本文中。
定義如本說明書中所使用，「一(a)」或「一(an)」可意謂一或多個。如申請專利範圍中所使用，當與字組「包含」結合使用時，字組「一(a)」或「一(an)」可意謂一個或多於一個。如本文中所使用之「另一」可意謂至少第二個或更多個。
當使用「包含」時，此可視情況由「基本上由……組成」或由「由……組成」置換。
「粘附分子-4」及「粘附分子-4多肽」係指由粘附分子4 (NECTIN4)基因(參見Uniprot登錄號Q96NY8)或由此類基因製備之cDNA編碼的蛋白質或多肽。術語粘附分子-4多肽涵蓋任何天然存在之同功型、對偶基因或變異體(例如，與SEQ ID NO: 1或與其至少100、200、300、400或500個胺基酸殘基之連續序列95%、98%或99%一致之粘附分子-4多肽)。包括31個胺基酸信號肽之典型人類粘附分子-4 (同功型1)之510個胺基酸殘基序列展示如下： 。
SEQ ID NO: 1對應於UniProt KB識別碼Q96NY8-1，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
本發明之某些態樣提供結合至人類粘附分子-4之抗粘附分子-4抗體或其同源物，包括(但不限於)哺乳動物粘附分子-4蛋白質及來自其他物種(例如非人類靈長類動物，長尾獼猴(macaca fascicularis))之粘附分子-4異種同源物。
術語「HER2」(亦稱為HER2/neu及ErbB-2)表示「人類表皮生長因子受體2」。其包括HER2之變異體及同功型。
術語「免疫結合物」及「抗體結合物」可互換地使用且係指抗原結合劑，例如抗體結合多肽或與另一分子(例如，喜樹鹼衍生物、依沙替康分子、SN-38分子)結合之抗體。當免疫結合物包含結合至治療劑(例如細胞毒性劑或抗癌劑)之抗原結合劑時，免疫結合物亦可稱為「抗體藥物結合物」或「ADC」。細胞毒性劑之實例包括喜樹鹼、紫杉烷、蒽環黴素、喜樹鹼、埃博黴素、絲裂黴素、康普瑞汀、長春花生物鹼、氮芥、類美登素、卡奇黴素、倍癌黴素、特吡萊辛、海兔毒素及奧瑞他汀、烯二炔類、吡咯并苯并二氮呯類及伸乙亞胺。
如本文所使用，「治療(treatment)」及「治療(treating)」及其類似表述一般意謂獲得所需藥理學及生理作用。該作用就預防或部分預防疾病、其症狀或病況而言可為預防性的，及/或就部分或完全治癒疾病、由該疾病引起之病況、症狀或副作用而言可為治療性的。如本文中所使用之術語「治療(treatment)」涵蓋哺乳動物(尤其人類)中之疾病之任何治療，且包括：(a)預防受試者中之疾病發生，該受試者可能易患該疾病但尚未診斷為患有該疾病，諸如預防性早期無征狀干預；(b)抑制該疾病，例如遏制其發展；或緩解該疾病，例如在已確診患有該疾病之受試者中(例如)引起該疾病及/或其症狀或病況消退，諸如改善或修復損傷。視情況地，治療可引起(例如可表徵為一種引起以下之方法)腫瘤負荷降低、病變尺寸及/或數目減小、癌症惡化減少或延遲(例如無惡化存活期增加)、癌症轉移之延遲或預防及/或存活期增加。視情況地，治療可例如根據標準準則(視情況為RECIST準則)在受試者中引起或提供(例如可表徵為一種引起或提供以下之方法)穩定疾病、部分反應或完全反應。
每當參考粘附分子-4結合劑(例如抗體或抗體片段、免疫結合物)提及「癌症之治療」或其類似者時，此可包括： (a)一種治療癌症之方法，該方法包含以下步驟：(對於至少一種治療)以允許治療癌症之劑量(治療有效量)，視情況以如本文中所指定之劑量(量)向需要此類治療之個體、哺乳動物(尤其人類)投與粘附分子-4結合劑； (b)用於治療癌症之粘附分子-4結合劑之使用； (c)用於治療癌症(尤其人類中之癌症)之粘附分子-4結合劑； (d)用於製造用以治療癌症之醫藥製劑的粘附分子-4結合劑之使用； (e)一種使用用於製造用以治療癌症之醫藥製劑的粘附分子-4結合劑之方法，其包含摻合粘附分子-4結合劑與醫藥學上可接受之載劑； (f)包含有效劑量之適合於治療癌症之粘附分子-4結合劑的醫藥製劑； (g)根據在本申請案所申請之國家中允許申請專利之標的物，(a)、(b)、(c)、(d)、(e)及(f)之任何組合。
如本文中所使用之術語「活檢」定義為出於檢查目的而移除組織，以便建立診斷。活檢類型之實例包括藉由應用抽吸，諸如經由連接至注射器之針；藉由儀器移除組織片段；藉由經由內視鏡用適當儀器移除；藉由手術切除，諸如整個病變；及其類似方式。
如本文中所使用，術語「抗體」係指多株抗體及單株抗體。視重鏈中之恆定域之類型而定，將抗體分配至以下五個主要類別中之一者：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。將此等中之若干者進一步分成子類或同型，諸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其類似物。例示性免疫球蛋白(抗體)結構單元包含四聚體。各四聚體包含兩對相同之多肽鏈，各對具有一個「輕」鏈(約25 kDa)及一個「重」鏈(約50至70 kDa)。各鏈之N端界定具有約100至110個或更多個主要負責抗原識別之胺基酸的可變區。術語可變輕鏈(V L)及可變重鏈(V H)分別指此等輕及重鏈。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為「α」、「δ」、「ε」、「γ」及「μ」。不同類別之免疫球蛋白的次單元結構及三維組態為熟知的。IgG為本文中所使用之抗體之例示性類別，因為其為生理情況下最常見之抗體且因為其最易於在實驗室環境中製備。視情況地，抗體為單株抗體。抗體之特定實例為人類化、嵌合、人類或者其他人類適合之抗體。「抗體」亦包括本文中所描述之抗體中之任一者的任何片段或衍生物。
負責抗原結合之抗體之胺基酸殘基亦可稱為高變區。高變區一般包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基(例如，輕鏈可變域中之殘基24至34 (L1)、50至56 (L2)及89至97 (L3)，及重鏈可變域中之31至35 (H1)、50至65 (H2)及95至102 (H3)；Kabat等人1991)及/或來自「高變環」之此等殘基(例如，輕鏈可變域中之殘基26至32 (L1)、50至52 (L2)及91至96 (L3)，及重鏈可變域中之26至32 (H1)、53至55 (H2)及96至101 (H3)；Chothia及Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196:901-917)，或用於測定負責抗原結合之基本胺基酸的類似系統。通常，此區域中之胺基酸殘基之編號係藉由Kabat等人之前述文獻中所描述之方法來進行。本文中諸如「Kabat位置」、「如Kabat中之可變域殘基編號」及「根據Kabat」之片語係指用於重鏈可變域或輕鏈可變域之此編號系統。使用Kabat編號系統，肽之實際線性胺基酸序列可含有較少或額外之胺基酸，其對應於可變域之FR或CDR之縮短或其中之插入。舉例而言，重鏈可變域可包括在CDR H2之殘基52之後的單一胺基酸插入物(根據Kabat之殘基52a)及在重鏈FR殘基82之後的插入殘基(例如根據Kabat之殘基82a、82b及82c等)。對於給定抗體，可藉由將抗體序列之同源區與「標準」Kabat編號序列比對來確定殘基之Kabat編號。
術語「特異性結合至」意謂抗體較佳可在競爭性結合分析法中與結合搭配物(例如粘附分子-4)結合，如使用重組形式之蛋白質、其中之抗原決定基或存在於經分離之靶細胞表面上之天然蛋白質所評估。競爭性結合分析法及其他用於測定特異性結合之方法為此項技術中熟知的。舉例而言，結合可經由放射性標記、物理方法(諸如質譜法)或使用例如細胞螢光分析法(例如FACScan)偵測之直接或間接螢光標記來偵測。高於對照、非特異性藥劑所觀測到之量的結合指示藥劑結合至標靶。
當據稱抗體與特定單株抗體競爭時，其意謂抗體在使用重組分子(例如粘附分子-4)或表面表現分子(例如粘附分子-4)之結合分析法中與單株抗體競爭。舉例而言，若測試抗體在結合分析法中降低具有SEQ ID NO: 19中之任一者之重鏈可變區及SEQ ID NO: 20之各別輕鏈可變區的抗體與粘附分子-4多肽或表現粘附分子-4之細胞的結合，則據稱抗體分別與此類抗體「競爭」。
術語「內化」可與「胞內內化」互換地使用，其係指與將分子自胞外細胞表面易位至胞內細胞表面之過程相關的分子、生物化學及細胞事件。負責分子之胞內內化的過程為熟知的，且可涉及尤其以下之內化：胞外分子(諸如激素、抗體及有機小分子)；膜相關分子(諸如細胞表面受體)；及結合至胞外分子之膜相關分子之複合物(例如結合至跨膜受體之配位體或結合至膜相關分子之抗體)。因此，「誘導及/或增加內化」包含其中啟動胞內內化及/或增加胞內內化之速率及/或程度的事件。
如本文中所使用，術語「親和力」意謂抗體與抗原決定基結合之強度。藉由解離常數Kd給出抗體之親和力，Kd定義為[Ab]×[Ag]/[Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]為抗體-抗原複合物之莫耳濃度，[Ab]為未結合抗體之莫耳濃度，且[Ag]為未結合抗原之莫耳濃度。親和力常數K a係由1/Kd定義。用於測定單株抗體之親和力之方法可見於Harlow等人, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)、Coligan等人, 編, Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)及Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)，該等文獻以全文引用之方式併入本文中。此項技術中熟知用於測定單株抗體之親和力的一種標準方法為使用表面電漿子共振(SPR)篩選(諸如藉由使用BIAcore™ SPR分析裝置進行分析)。
在本文之上下文內，「決定子」代表多肽上之相互作用或結合之部位。
術語「抗原決定基」係指抗原決定子且為與抗體結合之抗原上的面積或區域。蛋白抗原決定基可包含直接涉及結合之胺基酸殘基以及由特定抗原結合抗體或肽實際上阻斷之胺基酸殘基，亦即在抗體之「佔據面積(footprint)」內的胺基酸殘基。其為可與例如抗體或受體組合之複合抗原分子上之最簡單形式或最小結構面積。抗原決定基可為線性或組態/結構性的。術語「線性抗原決定基」定義為由在線性胺基酸序列(一級結構)上為連續之胺基酸殘基構成之抗原決定基。術語「組態或結構性抗原決定基」定義為由不全部連續之胺基酸殘基構成之抗原決定基，且因此該等胺基酸殘基表示藉由分子摺疊而接近彼此的線性胺基酸序列之分離部分(二級、三級及/或四級結構)。組態抗原決定基依賴於3維結構。因此，術語「組態」通常可與「結構性」互換地使用。
術語「藥劑」在本文中用以指代化合物、化合物之混合物、生物大分子或由生物材料製成之提取物。術語「治療劑」係指具有生物活性之藥劑。
術語「Fc域」、「Fc部分」及「Fc區」係指抗體重鏈之C端片段，例如人類(γ)重鏈之約胺基酸(aa) 230至約aa 450或其在其他類型之抗體重鏈中之對應序列(例如人類抗體之α、δ、ε及μ)或其天然存在之異型。除非另外說明，否則在整個本發明中使用免疫球蛋白之通常接受之Kabat胺基酸編號(參見Kabat等人(1991) Sequences of Protein of Immunological Interest,第5版, United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD)。
如本文中所使用，「構架」或「FR」殘基意謂排除定義為CDR之此等區域之抗體可變域的區域。各抗體可變域構架可進一步細分成藉由CDR分隔開之連續區域(FR1、FR2、FR3及FR4)。
術語「經分離」、「經純化」或「生物學上純的」係指物質實質上或基本上不含如天然狀態下所發現的通常伴隨其之組分。通常使用諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相層析之分析型化學技術測定純度及均質性。實質上純化作為存在於製劑中之主要物種的蛋白質。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換地使用以指胺基酸殘基之聚合物。該等術語適用於胺基酸聚合物，其中一或多個胺基酸殘基為對應天然存在之胺基酸的人造化學模擬物，以及適用於天然存在之胺基酸聚合物及非天然存在之胺基酸聚合物。
當參考例如細胞或核酸、蛋白質或載體使用時，術語「重組」指示該細胞、核酸、蛋白質或載體已藉由引入異源核酸或蛋白質或改變天然核酸或蛋白質而經修飾，或指示該細胞衍生自經如此修飾之細胞。因此，舉例而言，重組細胞表現未在天然(非重組)形式之細胞內發現之基因或表現以其他方式異常表現、不完全表現或完全不表現之天然基因。
在本文之上下文內，術語「結合」多肽或抗原決定基之抗體表示以特異性及/或親和力結合該決定子之抗體。
當用於兩種或更多種多肽之序列之間的關係中時，術語「一致性」或「一致」係指多肽之間的序列相關性程度(藉由兩種或更多個胺基酸殘基之串之間的匹配數目所測定)。「一致性」量測具有由特定數學模型或電腦程式(亦即「演算法」)定址之間隙比對的兩個或更多個序列中之較小者之間的一致匹配百分比。相關多肽之一致性可藉由已知方法容易地計算。此類方法包括(但不限於)描述於以下文獻中之方法：Computational Molecular Biology, Lesk, A. M.編, Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W編, Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, 第1部分, Griffin, A. M.及Griffin, H. G.編, Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及Devereux, J.編, M. Stockton Press, New York, 1991；及Carillo等人, SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)。
用於測定一致性之方法經設計以在所測試序列之間產生最大匹配。測定一致性之方法描述於可為公眾獲得之電腦程式中。用於測定兩個序列之間的一致性之電腦程式方法包括GCG程式包，包括GAP (Devereux等人, Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984)；Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)、BLASTP、BLASTN及FASTA (Altschul等人, J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990))。BLASTX程式可公開地購自美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information；NCBI)及其他來源(BLAST手冊、Altschul等人NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894；Altschul等人, 同上)。亦可使用熟知之史密斯沃特曼演算法(Smith Waterman algorithm)以測定一致性。
如本文中所使用，「烷基」係指包含完全飽和(無雙鍵或參鍵)烴基之直鏈或分支鏈烴鏈。烷基可具有例如1至20個碳原子(每當在本文中出現時，諸如「1至20」之數值範圍係指給定範圍中之各整數；例如「1至20個碳原子」意謂烷基可由1個碳原子、2個碳原子、3個碳原子等、至多並包括20個碳原子組成，但本定義亦涵蓋其中不指定數值範圍之術語「烷基」之出現)。化合物中之烷基可命名為「C 1-C 4烷基」或類似名稱。僅作為實例，「C 1-C 4烷基」指示烷基鏈中存在一至四個碳原子，亦即烷基鏈係選自甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、二級丁基及三級丁基。典型烷基包括(但不限於)甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、三級丁基、戊基及己基。烷基可經取代或未經取代。
如本文中所使用，術語「雜烷基」係指含有一或多個雜原子之直鏈或分支鏈烷基，亦即除碳(包括(但不限於)氧、硫、氮、磷)以外之元素替代一或多個碳原子。
每當將基團描述為「經取代」時，該基團經所指示之取代基中之一或多者取代。若未指示取代基，則其意謂指示之「經取代」基團可經個別且獨立地選自以下之一或多個基團取代：烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、雜烷基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基、羥基、烷氧基、芳氧基、醯基、巰基、烷硫基、芳硫基、氰基、鹵素、硫羰基、胺甲醯基、硫胺甲醯基、醯胺基、磺醯胺基、磺醯胺基、羧基、異氰醯基、硫氰基、異硫氰基、硝基、矽烷基次磺醯基、亞碸基、磺醯基、鹵烷基、鹵烷氧基、三鹵甲烷磺醯基、三鹵甲烷磺醯胺基、胺基、經單取代之胺基及經二取代之胺基及其受保護之衍生物。
在取代基之數目未指定(例如鹵烷基)時，可存在一或多個取代基。舉例而言，「鹵烷基」可包括相同或不同鹵素中之一或多者。作為另一實例，「C 1-C 3烷氧基苯基」可包括含有一個、兩個或三個原子之相同或不同烷氧基中之一或多者。
除非上下文另外明確指示，否則提及具有特定編號之「化合物」或「式」(例如「化合物1」、「化合物2」、「式I」或「式II」)表示所有衍生自具有特定編號之化合物或式的化合物。舉例而言，化合物1包括提及化合物1a及1b。
產生抗體及抗體片段高變區、重鏈及輕鏈CDR、重鏈及輕鏈可變區以及蛋白質(例如，包含其之全長抗體或抗體片段、多特異性抗原結合蛋白、嵌合抗原受體)將結合表現於細胞(例如腫瘤細胞)表面上之人類粘附分子-4。在一個實施例中，抗體之粘附分子-4結合係由單一抗原結合域或由兩個相同抗原結合域介導，視情況其中各抗原結合域包含VH及VL域對。在一些實施例中，提供單一VH或VL可變域；此類域可例如併入至分別表現及產生之多肽中，且接著可經組合以形成粘附分子-4結合域。
當作為免疫結合物或作為非結合(「裸」)抗體(例如視情況與分別投與之細胞毒性劑組合)用於消除表現粘附分子-4之腫瘤細胞的療法中時，粘附分子-4結合抗體(例如全長抗體、抗體片段)或包含此類抗體之蛋白質、結合物或複合物可有利地抑制由粘附分子-4介導之細胞-細胞相互作用，例如藉由評估細胞團簇形成(例如在3維細胞培養系統中，藉由評估腫瘤球狀體形成或生長)及/或表現粘附分子-4之細胞的錨定非依賴性生長所測定。當作為具有細胞毒性劑之免疫結合物或作為與分別投與之細胞毒性劑組合之非結合(「裸」)抗體用於消除表現粘附分子-4之腫瘤細胞的療法中時，粘附分子-4結合抗體可有利地能夠使腫瘤對細胞毒性劑敏感，例如抗體可增強細胞毒性劑抑制增殖或引起腫瘤細胞死亡之能力，例如抑制增殖或引起團簇中(例如球狀體中)之腫瘤細胞死亡，或抑制腫瘤細胞團簇(例如球狀體)之形成或生長。當作為免疫結合物用於消除表現粘附分子-4之腫瘤細胞的療法中時，抗粘附分子-4免疫結合物在與如本文中所揭示之細胞毒性分子結合時可有利地能夠引起表現粘附分子-4之腫瘤細胞死亡。
表現Pgp之腫瘤細胞可對某些細胞毒性劑具有降低之敏感性。可視情況使用表現Pgp之細胞(例如腫瘤細胞)測試抗體及細胞毒性劑(無論細胞毒性劑是否與抗體結合)。
腫瘤球狀體一般對化學療法較不敏感，部分歸因於其結構所得到之保護，且亦歸因於其較慢增殖速率，且因此可適用於評估抗體或免疫結合物之抗腫瘤作用。可以濃度依賴性方式測試抗體或免疫結合物抑制球狀體形成，或破壞癌細胞球狀體形成之能力。可例如使用即時數位攝影測試抗體或免疫結合物改變不同癌細胞株中之球狀體形成之能力。
抗體或免疫結合物可例如表徵為能夠將癌細胞維持(或增強維持)為單細胞，由此可使細胞對細胞毒性劑(例如化學療法)更敏感。可藉由單獨添加不同化學治療劑(例如多柔比星、順鉑、紫杉醇、喜樹鹼或喜樹鹼類似物)或在存在抗體或免疫結合物之情況下以不同濃度組合，視情況進一步與僅結合至Ig樣V域或Ig樣C2 1或2型域之抗體或免疫結合物比較來活體外測試促進癌細胞維持為單細胞以提高對化學療法之敏感性。亦可例如藉由添加以不同毒素靶向粘附分子-4之不同域的不同免疫結合物來活體外測試將癌細胞維持為單細胞以增加對化學療法之敏感性，其中化學療法或ADC之IC50將較低，其中抗體結合至粘附分子-4之VC1域，或對於ADC而言，用於控制腫瘤生長之劑量將較低，其中抗體結合粘附分子-4之VC1域。對化學療法之敏感性可評估為細胞存活力、細胞增殖或細胞毒性，例如使用不同讀出進行監測，諸如藉由發光進行CTG、使用Incucyte或凋亡蛋白酶3/7或膜聯蛋白V進行匯合。在一個實施例中，抗粘附分子-4抗體或抗體片段結合至野生型人類粘附分子-4多肽，例如具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的多肽，以及結合至具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的經修飾之人類粘附分子-4多肽(含有Ig樣C2 1及2型域但缺少Ig樣V型域之粘附分子-4蛋白質)。視情況地，抗體保持部分結合至缺少Ig樣V型域之多肽，視情況其中與結合至野生型粘附分子-4蛋白質相比，抗體以降低之水平保持與缺少Ig樣V型域之粘附分子-4蛋白質的結合，例如其中與野生型粘附分子-4之結合的降低之水平在5%至50%、視情況在5%至30%、視情況在5%至25%、視情況在5%至15%之間。此外視情況地，抗粘附分子-4抗體不結合缺少Ig樣V型及Ig樣C2 1型域兩者之粘附分子-4多肽，例如具有SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的多肽。視情況地，使用經製備以表現粘附分子-4多肽之細胞藉由流式細胞分析技術來評估結合且測定螢光強度水平(例如MFI)。
在一個實施例中，抗粘附分子-4抗體或抗體片段未結合至人類粘附分子1蛋白質、人類粘附分子2蛋白質、人類粘附分子3蛋白質及人類PVR蛋白質中之任一者。各別粘附分子或PVR蛋白質可指定為表現於細胞之表面處。
在一個實施例中，抗粘附分子-4抗體或抗體片段結合： 具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的粘附分子-4多肽及 具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的粘附分子-4多肽(相較於與SEQ ID NO: 1之結合，視情況處於降低之水平下，視情況水平在5%至50%之間)，其中抗粘附分子-4抗體或抗體片段不結合以下中之任一者： 具有SEQ ID NO: 13之胺基酸序列的多肽， 具有SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的多肽， 具有SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的多肽，及 具有SEQ ID NO: 18之胺基酸序列的多肽。
此外視情況地，抗粘附分子-4抗體或抗體片段不結合具有SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的多肽。
此外視情況地，抗粘附分子-4抗體或抗體片段結合大鼠粘附分子-4多肽(例如SEQ ID NO: 13之胺基酸序列)。
在一個實施例中，抗粘附分子-4抗體或抗體片段結合至粘附分子-4之VC1橋接域、抗原決定基或決定子。
在一個實施例中，抗粘附分子-4抗體或抗體片段在1、2、3、4或5或更多個選自由A72、G73、S195、K197、S199、L150、S152、Q234及I236 (參考SEQ ID NO: 1)組成之群的殘基處結合至人類粘附分子-4。在一個實施例中，抗粘附分子-4抗原結合蛋白或抗體在1、2或3個選自由K197、S199及Q234 (視情況為殘基K197及/或S199)組成之群的殘基處結合至人類粘附分子-4。在一個實施例中，抗粘附分子-4抗體或抗體片段結合至人類粘附分子-4之殘基K197。在一個實施例中，抗粘附分子-4抗體或抗體片段結合至人類粘附分子-4之殘基S199。在一個實施例中，抗粘附分子-4抗體或抗體片段結合至人類粘附分子-4之殘基Q234。結合可例如藉由評估抗體或抗體片段與其中該殘基經不同殘基取代之突變體粘附分子-4多肽(例如，如在細胞表面處所表現)之結合是否減少或損失來測定。
在一個實施例中，抗粘附分子-4抗體或抗體片段能夠結合至Ig樣V型域及Ig樣C2 1型域兩者，例如結合至Ig樣V型域上之決定子或抗原決定基及Ig樣C2 1型域上之決定子或抗原決定基。
在一個實施例中，抗粘附分子-4抗體或抗體片段保持至少部分結合至包含Ig樣C2 1型域但缺少Ig樣V型域之經修飾粘附分子-4多肽，例如缺少SEQ ID NO: 3之胺基酸序列之全部或部分的粘附分子-4多肽。部分結合可表徵為保持結合，但與結合至具有SEQ ID NO: 1之殘基之胺基酸序列的野生型人類粘附分子-4多肽相比處於降低之水平下(例如，如藉由流式細胞分析技術所評估)。粘附分子-4多肽可指定為表現於細胞(例如，製備以表現多肽之宿主細胞)之表面處。
抗體可藉由此項技術中已知之各種技術產生。通常，其係藉由用包含粘附分子-4多肽(較佳為人類粘附分子-4多肽)之免疫原對非人類動物(較佳為小鼠)進行免疫接種而產生。粘附分子-4多肽可包含人類粘附分子-4多肽之全長序列或其片段或衍生物，通常為免疫原性片段，亦即多肽之一部分包含暴露於表現粘附分子-4多肽之細胞的表面上之抗原決定基，例如由5E7抗體識別之抗原決定基。粘附分子-4多肽可指定為包含VC1橋接域或其片段或子序列或由其組成。此類片段通常含有成熟多肽序列之至少約7個連續胺基酸，甚至更佳其至少約10個連續胺基酸。片段通常基本上衍生自受體之細胞外域。在一個實施例中，免疫原在脂質膜中(通常在細胞之表面處)包含野生型人類粘附分子-4多肽。在一特定實施例中，免疫原包含視情況經處理或溶解之完整細胞，尤其完整人類細胞。在另一較佳實施例中，多肽為重組粘附分子-4多肽。在一特定實施例中，免疫原包含完整之表現粘附分子-4之細胞。
用抗原使非人類哺乳動物免疫接種之步驟可以此項技術中熟知之用於刺激小鼠中之抗體產生的任何方式進行(參見例如E. Harlow及D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)，其全部揭示內容以引用之方式併入本文中)。
抗體亦可藉由選擇免疫球蛋白之組合庫來產生，如例如在(Ward等人Nature, 341 (1989)第544頁，其全部揭示內容以引用之方式併入本文中)中所揭示。
本文提供經修飾之人類受體構架序列，其中可併入抗體CDR，從而使得所得抗粘附分子-4可變區在表現粘附分子-4之細胞中具有高效之結合及內化。抗體具有在人類中具有低免疫原性或降低之免疫原性的優點，例如在向人類投與後，具有較低之產生針對非所需抗粘附分子-4抗體之免疫反應的能力或可能性。本發明之此類抗體之實例包括抗體，其包含與L0、L1、L2或L3 VL域組合之H0、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9或H10 VH域。本發明之抗體之實例包括抗體，其包含抗體H0+L0、H1+L0、H2+L0、H3+L0、H3+L1、H3+L2、H3+L3、H4+L1、H4+L2、H4+L3、H5+L1、H5+L2、H5+L3、H6+L1、H6+L2、H6+L3、H7+L1、H7+L2、H7+L3、H8+L1、H9+L1及H10+L1中之任一者之VH及VL域對。
在一個態樣中，結合人類粘附分子-4多肽之抗體或抗體片段包含人類來源(例如衍生自人類胺基酸序列)之VH及VL構架(例如FR1、FR2、FR3及FR4)。在一個態樣中，抗體或抗體片段包含：包含如SEQ ID NO: 21中所闡述之胺基酸序列SYWMH的HCDR1 (重鏈CDR1)；包含如SEQ ID NO: 22中所闡述之胺基酸序列EIDPSDSYTNYNQKFKG的HCDR2 (重鏈CDR2)；包含如SEQ ID NO: 23中所闡述之胺基酸序列GYGNYGDY的HCDR3 (重鏈CDR3)；包含如SEQ ID NO: 24中所闡述之胺基酸序列RSSKSLLHSNGITYLY的LCDR1；包含如SEQ ID NO: 25中所闡述之胺基酸序列QMSNLAS的LCDR2；包含如SEQ ID NO: 26中所闡述之胺基酸序列AQNLELPWT的LCDR3。
在一個實施例中，抗體包含衍生自人類子群IGHV1-46 (視情況連同IGHJ4，較佳為IGHJ4*01)之重鏈構架，視情況IGHV1-46為IGHV1-46*01。在一個實施例中，抗體包含衍生自人類子群IGKV2-28 (視情況連同IGKJ，較佳為IGKJ4*01)之輕鏈構架，視情況IGKV2-28為IGKV2-28*01。
抗體可進一步包含人類重鏈及/或輕鏈構架中之一個、兩個、三個、四個、五個或超過五個胺基酸取代，以例如增強抗體之親和力、穩定性或其他特性。
視情況地，在任何實施例中，抗體可指定為除鼠類親本抗體以外的抗體，例如具有SEQ ID NO: 19及20之各別VH及VL的鼠類親本抗體。
視情況地，人類構架包含一或多個突變，例如引入存在於非人類哺乳動物(例如小鼠)中之特定位置處之殘基的回復突變。視情況地，抗體之重鏈可變區之人類構架在選自28、38、40、48、69、71、73或78之kabat位置處包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個或八個突變。
在本文中之任何實施例之一個態樣中，在Kabat重鏈位置28處之蘇胺酸殘基經蘇胺酸殘基取代。
在本文中之任何實施例之一個態樣中，在Kabat重鏈位置38處之精胺酸殘基經離胺酸殘基取代。
在本文中之任何實施例之一個態樣中，在Kabat重鏈位置40處之丙胺酸殘基經精胺酸殘基取代。
在本文中之任何實施例之一個態樣中，在Kabat重鏈位置48處之甲硫胺酸殘基經異白胺酸殘基取代。
在本文中之任何實施例之一個態樣中，在Kabat重鏈位置69處之甲硫胺酸殘基經白胺酸殘基取代。
在本文中之任何實施例之一個態樣中，在Kabat重鏈位置71處之精胺酸殘基經白胺酸殘基取代。
在本文中之任何實施例之一個態樣中，在Kabat重鏈位置73處之蘇胺酸殘基經離胺酸殘基取代。
在本文中之任何實施例之一個態樣中，在Kabat重鏈位置78處之纈胺酸殘基經蘇胺酸殘基取代。
視情況地，抗體之輕鏈可變區之人類構架在選自2、8、11或64之kabat位置處包含一個、兩個、三個或四個突變。
在本文中之任何實施例之一個態樣中，在kabat輕鏈位置2處之異白胺酸殘基經纈胺酸殘基取代。
在本文中之任何實施例之一個態樣中，在Kabat輕鏈位置8處之脯胺酸殘基經丙胺酸殘基取代。
在本文中之任何實施例之一個態樣中，在Kabat輕鏈位置11處之白胺酸殘基經天冬醯胺取代。
在本文中之任何實施例之一個態樣中，在Kabat輕鏈位置64處之甘胺酸殘基經絲胺酸殘基取代。
使用Kabat編號系統描述本文中之VH及VL域中之位置(Kabat等人(1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, 第5版, United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD)。
在一個態樣中，經分離之抗粘附分子-4人類化單株抗體或其片段包含與SEQ ID NO: 37、39、41、43、45、47、49、51、53、55或57中之任一者之胺基酸序列具有至少約80%序列一致性(例如至少約85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性，或100%一致性)之重鏈可變區，及與SEQ ID NO: 59、61、63或65中之任一者之胺基酸序列具有至少約80%序列一致性(例如至少約85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性，或100%一致性)之輕鏈可變區。
在一個態樣中，經分離之抗粘附分子-4人類化單株抗體或其片段包含與SEQ ID NO: 47 (H5)之胺基酸序列具有至少約80%序列一致性(例如至少約85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性，或100%一致性)的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 65 (L3)之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一個實施例中，提供一種抗粘附分子-4抗體，其包含：與包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列的重鏈具有至少約80%序列一致性(例如至少約85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性，或100%一致性)的重鏈；及與包含SEQ ID NO: 78之胺基酸序列的輕鏈具有至少約80%序列一致性(例如至少約85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性，或100%一致性)的輕鏈。
可製備編碼抗體之DNA且將其置放於適合之表現載體中以轉染至適合之宿主中。隨後，宿主係用於重組產生抗體或其變異體，諸如該單株抗體之人類化形式、抗體之活性片段、包含抗體之抗原識別部分的嵌合抗體或包含可偵測部分之形式。
編碼本發明之單株抗體的DNA可使用習知程序(例如，藉由使用能夠特異性結合於編碼鼠類抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)容易地分離及定序。在一個態樣中，提供一種核酸，其編碼本文中之任何實施例之抗粘附分子-4抗體或抗體片段的重鏈或輕鏈。DNA一經分離，則可置放於表現載體中，隨後將該等表現載體轉染至不另外產生免疫球蛋白之宿主細胞(諸如結腸桿菌(E. coli)細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中，以在重組宿主細胞中達成單株抗體之合成。此類DNA序列可出於許多目的中之任一者而經修飾，例如用於使抗體人類化、產生片段或衍生物，或用於例如在抗原結合部位中修飾抗體序列以使抗體之結合特異性最佳化。在一個實施例中，提供一種編碼抗體之輕鏈及/或重鏈的經分離之核酸序列，以及一種包含(例如在其基因體中)此類核酸之重組宿主細胞。編碼抗體之DNA之細菌中的重組表現為此項技術中所熟知的(參見例如，Skerra等人, Curr. Opinion in Immunol., 5, 第256頁(1993)；及Pluckthun, Immunol. 130, 第151頁(1992))。
可藉由此項技術中已知的技術產生抗體之片段及衍生物(如本申請案中所使用，除非另行說明或與上下文明顯矛盾，否則其由術語「抗體(antibody)」或「抗體(antibodies)」涵蓋)。「片段」包含完整抗體之一部分，通常為抗原結合部位或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、Fab'-SH、F (ab') 2及Fv片段；雙功能抗體；任何抗體片段，其為具有由連續胺基酸殘基之一個不間斷序列組成之一級結構的多肽(在本文中稱為「單鏈抗體片段」或「單鏈多肽」)；及由抗體片段形成之多特異性(例如雙特異性)抗體。舉例而言，多特異性蛋白質可包含本文實施例中之任一者之抗體的高變區(例如VH及VL)及不同抗體(例如結合至除粘附分子-4以外之相關抗原的抗體)之高變區(例如VH及VL)。
通常，本文中所提供之抗粘附分子-4抗體對粘附分子-4多肽(例如，如在本文實例中產生之粘附分子-4多肽)之親和力在約10 4至約10 11M -1(例如約10 7至約10 10M -1)範圍內。舉例而言，在一特定態樣中，本發明提供相對於粘附分子-4具有小於1×10 -7M之平均解離常數(K D)的抗粘附分子-4抗體，藉由例如表面電漿子共振(SPR)篩選(諸如藉由使用BIAcore™ SPR分析裝置進行分析)所測定。在一更特定例示性態樣中，本發明提供相對於粘附分子-4具有約1×10 -7M至約1×10 -10M之K D的抗粘附分子-4抗體。
抗體可例如藉由不超過約(亦即親和力更好) 200、150、100、80、70、60、40、30或25奈莫耳之平均KD表徵。可例如藉由將以重組方式產生之人類粘附分子-4蛋白質固定於薄片表面上，隨後施用在溶液中測試之抗體來測定KD。在一個實施例中，方法進一步包含步驟(d)，自(b)選擇能夠與對照抗體競爭結合至粘附分子-4之抗體。
抗粘附分子-4抗體可具有或可不具有與Fcγ受體之實質性結合。在一個實施例中，抗粘附分子-4抗體包含人類IgG1同型之Fc域，其保持與人類Fcγ受體之結合。在一個實施例中，抗粘附分子-4抗體包含人類IgG1同型之Fc域，其經修飾(例如藉由引入取代)以增加與人類Fcγ受體(例如CD16A)之結合。在另一實施例中，抗粘附分子-4抗體可經製備以使得其不具有與人類Fcγ受體(例如CD16A、CD16B、CD32A、CD32B及/或CD64中之任一或多者)之實質性結合。此類抗體可包含已知缺少與Fcγ受體之結合或具有與Fcγ受體之低結合的各種重鏈之恆定區。或者，不包含恆定區(或包含恆定區之部分)之抗體片段(諸如F(ab')2片段)可用於避免Fc受體結合。可根據此項技術中已知之方法評估Fc受體結合，此項技術中已知之方法包括例如在BIACORE分析法中測試抗體與Fc受體蛋白之結合。此外，通常可使用其中Fc部分經修飾(例如藉由引入1、2、3、4、5或更多個胺基酸取代)以最小化或消除與Fc受體之結合的任何抗體IgG同型(參見例如WO 03/101485，其揭示內容以引用之方式併入本文中)。評估Fc受體結合之此類分析法為此項技術中所熟知的，且描述於例如WO 03/101485中。緘默Fc lgG1抗體之實例為在lgG1 Fc胺基酸序列中包含L234A及L235A突變之LALA突變體。Fc緘默突變之另一實例為在殘基D265處或在D265及P329處之突變，例如，如在lgG1抗體中作為DAPA (D265A、P329A)突變(US 6,737,056)所使用。另一緘默lgG1抗體包含在殘基N297處之突變(例如N297A、N297S突變)，其產生去醣基化/非醣基化抗體。其他緘默突變包括：在殘基L234及G237 (L234A/G237A)處之取代；在殘基S228、L235及R409 (S228P/L235E/R409K,T,M,L)處之取代；在殘基H268、V309、A330及A331 (H268Q/V309L/A330S/A331S)處之取代；在殘基C220、C226、C229及P238 (C220S/C226S/C229S/P238S)處之取代；在殘基C226、C229、E233、L234及L235 (C226S/C229S/E233P/L234V/L235A)處之取代；在殘基K322、L235及L235 (K322A/L234A/L235A)處之取代；在殘基L234、L235及P331 (L234F/L235E/P331S)處之取代；在殘基234、235及297處之取代；在殘基E318、K320及K322 (L235E/E318A/K320A/K322A)處之取代；在殘基(V234A、G237A、P238S)處之取代；在殘基243及264處之取代；在殘基297及299處之取代；使得由EU編號系統定義之殘基233、234、235、237及238包含選自PAAAP、PAAAS及SAAAS之序列的取代(參見WO2011/066501)。在一個實施例中，抗體在重鏈恆定區中在選自由以下組成之群的殘基中之任一者、兩者、三者、四者、五者或多於五者處具有取代：220、226、229、233、234、235、236、237、238、243、264、268、297、298、299、309、310、318、320、322、327、330、331及409 (在重鏈恆定區中之殘基的編號係根據Kabat根據EU編號)。
在此處所使用之速記表示法中，格式為：野生型殘基：多肽中之位置：突變型殘基，其中殘基位置係根據Kabat根據EU編號指示。
在一特定實施例中，提供一種與單株抗體5E7結合基本上相同之抗原決定基或決定子的抗體；視情況地，抗體包含抗體5E7之高變區。在本文之實施例中之任一者中，抗體5E7之特徵可為胺基酸序列及/或編碼其之核酸序列。在一個實施例中，單株抗體包含5E7之Fab或F(ab') 2部分。亦提供一種包含5E7之重鏈可變區之抗體或抗體片段。根據一個實施例，抗體或抗體片段包含5E7之重鏈可變區之三個CDR。亦提供一種抗體或抗體片段，其進一步包含5E7之可變輕鏈可變區或5E7之輕鏈可變區之CDR中之一者、兩者或三者。HCDR1、2、3及LCDR1、2、3序列可視情況指定為所有(或各自獨立地)為Kabat編號系統之此等序列、Chotia編號系統之此等序列、IMGT編號或任何其他適合之編號系統之此等序列。視情況地，該等輕鏈或重鏈CDR中之任一或多者可含有一個、兩個、三個、四個或五個或更多個胺基酸修飾(例如取代、插入或缺失)。
在一個態樣中，抗粘附分子-4抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO: 19之VH域具有至少約60%、70%或80%序列一致性，視情況至少約85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性的VH域。在另一態樣中，抗粘附分子-4抗體包含與SEQ ID NO: 20之VL域具有至少約60%、70%或80%序列一致性，視情況至少約85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性的V L域。
VH及VL包含(例如經修飾以併入)人類受體構架。在一個實施例中，抗粘附分子-4抗體包含具有SEQ ID NO: 19之胺基酸序列的重鏈可變區之VH CDR1、CDR2及/或CDR3 (例如根據Kabat編號)。在一個實施例中，抗粘附分子-4抗體包含具有SEQ ID NO: 20之胺基酸序列的輕鏈可變區之VL CDR1、CDR2及/或CDR3 (例如根據Kabat編號)。在一個實施例中，抗粘附分子-4抗體包含：VH，其包含具有SEQ ID NO: 19之胺基酸序列的重鏈可變區之Kabat CDR1、CDR2及/或CDR3；及VL，其包含具有SEQ ID NO: 20之胺基酸序列的輕鏈可變區之Kabat CDR1、CDR2及/或CDR3。 5E7 VH： 5E7 VL： 5E7 CDR： Kabat：  CDR-H1        SYWMH (SEQ ID NO: 21) CDR-H2        EIDPSDSYTNYNQKFKG (SEQ ID NO: 22) CDR-H3        GYGNYGDY (SEQ ID NO: 23) CDR-L1        RSSKSLLHSNGITYLY (SEQ ID NO: 24) CDR-L2        QMSNLAS (SEQ ID NO: 25) CDR-L3        AQNLELPWT (SEQ ID NO: 26) IMGT： CDR-H1        GYIFTSYW (SEQ ID NO: 27) CDR-H2        IDPSDSYT (SEQ ID NO: 28) CDR-H3        VRGYGNYGDY (SEQ ID NO: 29) CDR-L1        KSLLHSNGITY (SEQ ID NO: 30) CDR-L2        QMS (SEQ ID NO: 31) CDR-L3        AQNLELPWT (SEQ ID NO: 26) Chothia：    CDR-H1        GYIFTSY (SEQ ID NO: 32) CDR-H2        PSDS (SEQ ID NO: 33) CDR-H3        YGNYGD (SEQ ID NO: 34) CDR-L1        SKSLLHSNGITY (SEQ ID NO: 35) CDR-L2        QMS (SEQ ID NO: 31) CDR-L3        NLELPW (SEQ ID NO: 36)
在一個實施例中，抗粘附分子-4抗體可例如包含：包含SEQ ID NO: 37、39、41、43、45、47、49、51、53、55或57之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 59、61、63或65之胺基酸序列的輕鏈可變區。抗粘附分子-4抗體可例如包含：包含胺基酸序列：SYWMH (SEQ ID NO: 21)或其至少4個連續胺基酸之序列的HCDR1，視情況其中此等胺基酸中之一或多者可經不同胺基酸取代；包含胺基酸序列：EIDPSDSYTNYNQKFKG (SEQ ID NO: 22)或其至少4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個連續胺基酸之序列的HCDR2，視情況其中此等胺基酸中之一或多者可經不同胺基酸取代；包含胺基酸序列：GYGNYGDY (SEQ ID NO: 23)或其至少4個、5個或6個連續胺基酸之序列的HCDR3，視情況其中此等胺基酸中之一或多者可經不同胺基酸取代；包含胺基酸序列：RSSKSLLHSNGITYLY (SEQ ID NO: 24)或其至少4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個連續胺基酸之序列的LCDR1，視情況其中此等胺基酸中之一或多者可經不同胺基酸取代；包含胺基酸序列：QMSNLAS (SEQ ID NO:25)或其至少4個、5個或6個連續胺基酸之序列的LCDR2區，視情況其中此等胺基酸中之一或多者可經不同胺基酸取代；及/或包含胺基酸序列：AQNLELPWT (SEQ ID NO: 26)或其至少4個、5個、6個、7個或8個連續胺基酸之序列的LCDR3區，視情況其中此等胺基酸中之一或多者可缺失或經不同胺基酸取代。CDR位置可根據Kabat編號。
有利地，本發明之抗體可用於製備抗體-結合物之方法中。在一個實施例中，用於製備抗體-結合物之方法包含使細胞毒性劑(Z)與本發明之抗粘附分子-4抗體或抗體片段結合。在一個實施例中，細胞毒性劑(Z)可指定為經由連接子(X)結合至抗體或片段。X為連接抗體或片段(Ab)與細胞毒性劑(Z)之連接子，例如在結合後，X為在共價鍵聯至Ab及Z中之一或兩者後的連接子之殘基。
在本文中之實施例中，用於製備抗體-藥物結合物之方法包含使本發明之抗粘附分子-4抗體或抗體片段(Ab)與細胞毒性劑(Z)接觸及/或反應之步驟。接觸可在適合條件下進行以便形成或獲得本發明之一態樣之抗體藥物結合物。Z可例如包含於包含細胞毒性劑(Z)及連接子(X)或連接子(X)之部分的化合物中，從而使得步驟包含使本發明之抗粘附分子-4抗體或抗體片段與包含細胞毒性劑(Z)及連接子(X)或連接子(X)之部分的化合物接觸。方法可視情況指定以下步驟：分離或復原所形成之抗體藥物結合物，且視情況進一步處理適用作藥劑之組合物，視情況調配用於向人類受試者投與之該抗體(例如用醫藥賦形劑)。
視情況地，一種製備ADC之方法包含使抗體或抗體片段與2、3、4、5、6、7或8個細胞毒性劑分子結合。視情況地，所獲得之組合物係藉由在2與4之間、在4與6之間、在6與8之間的DAR表徵。在一個實施例中，方法包含使抗體與4個細胞毒性劑分子結合。在一個實施例中，方法包含使抗體與8個細胞毒性劑分子結合。視情況地，方法進一步包含評估DAR，且若DAR對應於預定說明(例如，如本文中所揭示之DAR或DAR範圍，約2、4、6或8等之DAR)，則進一步處理適用作藥劑之組合物，視情況調配用於向人類受試者投與之該抗體(例如用醫藥賦形劑)。
在一些實施例中，在使包含(X)及(Z)之化合物與(Ab)接觸(及反應)之前製備及分離連接子(X) - (Z)元件，由此形成抗體藥物結合物。
在一些實施例中，方法包含： (a)使連接子(X)或連接子(X)之一部分與(Ab)接觸及/或反應以形成Ab-X結合物，及 (b)使步驟(a)之Ab-X與細胞毒性劑(Z)或包含連接子(X)之另一部分及(Z)的化合物接觸及/或反應，由此形成抗體藥物結合物。
X可例如表示分子，該分子包含可例如在生理條件下、視情況在胞內條件下裂解之部分。在一個實施例中，X表示包含以下之分子：(i)間隔子(Y)、(ii)可裂解部分及(iii)視情況存在之自消除或非自消除間隔子系統(Y')。可裂解部分可例如為寡肽(例如二肽、三肽、四肽或五肽)。間隔子Y可安置於Ab與可裂解部分之間，且間隔子系統(Y')可安置於可裂解部分與Z之間。
在一些實施例中，連接子X或間隔子Y可視情況指定為包含反應性基團(R)，該基團能夠與抗體之胺基酸或與連接至抗體之胺基酸的互補反應性基團(R')反應(例如在適合之條件下，視情況在脫除保護基之後)。視情況地，R為與抗體上之游離胺基、羥基、硫氫基或羧基具有反應性之基團。舉例而言，R可為具有以下結構之順丁烯二醯亞胺-N-基，其與抗體上之硫醇基(亦稱為硫氫基)具有反應性： 。
在一些實施例中，連接子X或間隔子Y可視情況指定為包含反應性基團R與抗體之胺基酸或與連接至抗體之胺基酸的互補反應性基團(R')之反應的殘基。視情況地，R為與抗體上之游離胺基、羥基、硫氫基或羧基具有反應性之基團與該游離胺基、羥基、硫氫基或羧基之反應的殘基。
在任何實施例中，在使抗粘附分子-4抗體或抗體片段與化合物(例如連接子及/或細胞毒性劑)接觸及/或反應的步驟之前，方法包含製備、選擇或提供抗粘附分子-4抗體或抗體片段之步驟。在一個實施例中，步驟包含製備、選擇或提供抗粘附分子-4抗體或抗體片段及測定或測試抗體或抗體片段是否具有本發明之抗粘附分子-4抗體或抗體片段的特徵。
舉例而言，可測試抗粘附分子-4抗體或抗體片段結合至粘附分子-4之VC1橋接域的能力。隨後，使經測定結合至粘附分子-4之VC1橋接域的抗體或抗體片段與化合物(例如連接子(X)及/或細胞毒性劑(Z))接觸及/或反應。舉例而言，可測試抗粘附分子-4抗體或抗體片段結合至突變粘附分子-4多肽(例如包含在殘基K197及/或S199處之取代的突變粘附分子-4多肽)的能力。隨後，使經測定降低或喪失與突變體粘附分子-4多肽之結合(例如與野生型粘附分子-4多肽之結合相比)的抗體或抗體片段與化合物(例如連接子(X)及/或細胞毒性劑(Z))接觸及/或反應。
在另一實例中，可測試抗粘附分子-4抗體或抗體片段降低表現粘附分子-4之腫瘤細胞(例如貼附腫瘤細胞)之間的細胞-細胞貼附的能力及/或減少表現粘附分子-4之腫瘤細胞(例如在3維細胞培養中，在腫瘤球狀體形成分析法中)之生長的能力。隨後，使經測定具有降低表現粘附分子-4之腫瘤細胞之間的細胞-細胞貼附之能力及/或減少表現粘附分子-4之腫瘤細胞(例如貼附腫瘤細胞)生長之能力的抗體或抗體片段與化合物(例如連接子(X)及/或細胞毒性劑(Z))接觸及/或反應。
在另一實例中，可測試抗粘附分子-4抗體或抗體片段使腫瘤對細胞毒性劑(例如細胞毒性劑Z或與Z為相同類別之藥物的細胞毒性劑，例如喜樹鹼藥劑)敏感之能力。隨後，使經測定具有使腫瘤對細胞毒性劑敏感之能力的抗體或抗體片段與化合物(例如連接子(X)及/或細胞毒性劑(Z))接觸及/或反應。
視情況地，在使抗體與化合物(例如連接子(X)及/或細胞毒性劑(Z))接觸之前，方法可包含抗體測試步驟中之任兩者或更多者。
如本文進一步所描述，用於使細胞毒性劑結合至抗體之一些熟知方法涉及多個反應步驟，其中抗體首先經連接子或連接子之部分修飾，隨後進行其中使細胞毒性劑與抗體-連接子組合物結合之反應。
在一個實施例中，提供一種用於製備抗體-結合物之方法，其包含： (i)藉由培養宿主細胞來獲得抗粘附分子-4抗體，該宿主細胞經含有編碼抗體之聚核苷酸的表現載體轉型；收集並純化來自前述步驟中所獲得之培養物的相關抗體； (ii)使抗粘附分子-4抗體或抗體片段與化合物(L)接觸，該化合物包含(a)能夠與抗體之胺基酸(例如胺基酸之側鏈或聚糖，或連接至胺基酸或胺基酸之聚糖的基團)反應的第一反應性基團及(b)第二反應性基團(R')，以獲得包含經化合物(L)官能化之一或多個胺基酸的經修飾之抗體；及 (iii) 使步驟(i)之經修飾之抗體與化合物反應，該化合物包含(a)與反應性基團(R')互補之反應性基團(R)、(b)由胞內肽酶或蛋白酶裂解之胺基酸單元(例如二肽、三肽、四肽或五肽)、(c)視情況存在之非自消除或自消除間隔子(Y')及(d)細胞毒性劑(Z)。視情況地，步驟(ii)之化合物進一步包含置放於R與胺基酸單元之間的間隔子(Y)。
視情況地，獲得抗粘附分子-4抗體之步驟可進一步包含以下步驟：藉由注射抗原使動物免疫接種來製備產生抗體之細胞、收集血液、分析其抗體力價以測定何時切除脾臟；製備骨髓瘤細胞；融合具有骨髓瘤之產生抗體之細胞；篩選一組產生所需抗體之融合瘤；將融合瘤分成單細胞殖株(選殖)；培養融合瘤或飼養植入有融合瘤之動物以用於產生大量單株抗體；及/或檢查由此產生之單株抗體的生物活性及結合特異性，或分析該單株抗體作為標記試劑之特性；及其類似步驟。
視情況地，獲得抗粘附分子-4抗體之步驟可進一步包含製備細胞庫之步驟。
在一個實施例中，R及R'能夠進行點擊反應或環加成，視情況其中R包含或為炔烴部分且R'包含或為迭氮化物部分，或其中R'包含或為炔烴部分且R包含或為迭氮化物部分，且其中步驟(ii)之反應為1,3-偶極環加成。
在一個實施例中，步驟(i)之反應在存在催化劑之情況下進行，視情況催化劑為酶(例如麩醯胺酸轉胺酶)。
在一個實施例中，在使抗粘附分子-4抗體或抗體片段與化合物(L)接觸之前，步驟(i)包含修飾抗粘附分子-4抗體或抗體片段之步驟。舉例而言，抗體或抗體片段可藉由使其與能夠修飾抗體醣基化之酶(例如在Kabat殘基N297處)反應或接觸來修飾。在一個實例中，修飾包含在存在內切糖苷酶之情況下，具有核心N-乙醯基葡糖胺之抗體聚糖之去醣基化，以便獲得包含核心N-乙醯基葡糖胺取代基之抗體，其中該核心N-乙醯基葡糖胺及該核心N-乙醯基葡糖胺取代基視情況經岩藻醣基化。內切糖苷酶之實例包括EndoS、EndoA、EndoE、Endo18A、EndoF、EndoM、EndoD、EndoH、EndoT及EndoSH及/或其組合。
抗原結合蛋白(例如抗體)分子及細胞毒性劑(例如喜樹鹼衍生物分子)係藉助於連接子連接。在此類實施例中，免疫結合物可例如由式(II)表示： Ab-(X-(Z) n) m式(II) 其中， Ab為抗粘附分子4抗體或抗體片段； X為連接Ab與Z之連接子，例如在共價鍵聯至Ab及Z中之一或兩者後的連接子之殘基； Z為細胞毒性劑，例如喜樹鹼類似物，視情況Z包含化合物1或2 (依沙替康或SN-38分子)之結構； n為1或2；及 當n為1時，m係來自1至8之中，或視情況m為選自1至8或1至6中之整數，視情況m為選自1至4中之整數，視情況m為2或4；視情況地，m為2、3、4、5、6、7或8；且當n為2時，m係來自1至4之中，或視情況m為選自1至4或1至3中之整數，視情況m為選自1至4中之整數，視情況m為2或4；視情況地，m為1、2、4或4。視情況地，可指定「n」以表示分支度或聚合度。可指定「n」及「m」以表示包含複數個抗體之組合物中的平均值。
在一個實施例中，X表示包含可例如在生理條件下、視情況在胞內條件下裂解之部分的分子。在一個實施例中，X表示包含以下之分子：(i)間隔子(Y)、(ii)可裂解部分及(iii)視情況存在之自消除或非自消除間隔子系統(Y')。間隔子Y可安置於Ab與可裂解部分之間，且間隔子系統(Y')可安置於可裂解部分與Z之間。分子X或間隔子Y可視情況指定為包含反應性基團(R)，或反應性基團R與抗體之胺基酸或與連接至抗體之胺基酸的互補反應性基團(R')的反應之殘基。
變數m表示免疫結合物中每抗體分子之-X-(Z) n部分之數目。在包含複數個抗粘附分子-4 ADC之組合物中，每抗體分子之-X-Z部分之數目的數值「m」可變化。因此，在包含複數個本文之式之免疫結合物的例示性組合物中，m為每Ab之-X-(Z) n部分之平均數目，在此情況下m亦可稱為平均藥物負載或藥物:抗體比率(DAR)。平均藥物負載或DAR可有利地在每Ab 1至約8個(-X-(Z) n)部分之範圍內。連接至部分X之Z部分的數目「n」可例如為1或2。通常，n為1。在一些實施例中，n為1，且m表示平均藥物負載，m在2與8之間。在一些實施例中，n為1，且m表示平均藥物負載，m在2與6之間。在一些實施例中，n為1，且m表示平均藥物負載，m在4與8之間。在一些實施例中，n為1，且m表示平均藥物負載，m在6與8之間，視情況為約6、7或8。在一些實施例中，n為1，且m表示平均藥物負載，m在4與6之間，視情況為約4、5或6。
每Ab之(-X-Z)部分之數目可藉由諸如質譜法、ELISA分析法及HPLC之習知方式來表徵。亦可測定就m而言的免疫結合物之定量分佈。在一些情況下，與具有其他藥物負載之免疫結合物不同，在m為特定值之情況下均質免疫結合物之分離、純化及表徵可藉由諸如逆相HPLC或電泳之方式來達成。
在一個實施例中，用於本發明之治療方法中之抗粘附分子-4組合物的特徵為包含複數個由式(I)表示之免疫結合物： Ab-(X-(Z) n) m式(II) 其中， Ab為抗粘附分子-4抗原結合蛋白(例如抗體或抗體片段)； X為連接Ab與Z之分子，例如在共價鍵聯至Ab及Z中之一或兩者後的連接子之殘基； Z為細胞毒性劑，視情況為拓樸異構酶抑制劑，視情況為喜樹鹼類似物，視情況為包含依沙替康或SN-38分子(例如具有化合物1或2之結構的分子)之喜樹鹼類似物； n為1或2；及 其中抗體樣品中至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%之免疫結合物具有為2或4、至少為2、在2與4之間、至少為4、在4與6之間或在4與8之間的m (X-Z部分之數目)，視情況其中n為1且抗體樣品中至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%之免疫結合物具有為2或4、至少為2、在2與4之間、至少為4、在4與6之間或在4與8之間的m (X-Z部分之數目)。
在一個實施例中，用於本發明之治療方法中之抗粘附分子-4組合物的特徵為包含複數個由式(I)表示之免疫結合物： Ab-(X-(Z) n) m式(II) 其中， Ab為抗粘附分子-4抗原結合蛋白(例如抗體或抗體片段)； X為連接Ab與Z之分子，例如在共價鍵聯至Ab及Z中之一或兩者後的連接子之殘基； Z為包含依沙替康或SN-38分子(例如包含化合物1或2之結構的分子)之喜樹鹼類似物； n為1；及 其中抗體樣品中至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%之免疫結合物具有為6、至少為6、在6與8之間或為8之m (X-Z部分之數目)。
應瞭解，可使用各種方法將包含細胞毒性劑之連接子共價連接至抗體或抗原結合蛋白，非特異性或特異性地連接至特定胺基酸殘基。連接子(X)可包含例如可在生理條件下，視情況在如實例中所示之胞內條件下裂解之部分，從而使得連接子之裂解在胞內環境中釋放細胞毒性劑(例如化合物1、化合物2、化合物13等)。連接子可鍵結至抗體分子上之化學反應性基團，例如鍵結至游離胺基、亞胺基、羥基、硫醇基或羧基(例如鍵結至N端或C端，鍵結至一或多個離胺酸殘基之ε胺基、一或多個麩胺酸或天冬胺酸殘基之游離羧酸基，或鍵結至一或多個半胱胺醯基殘基之硫氫基)、鍵結至碳水化合物，或通常鍵結至引入或工程改造至抗體中之任何反應性基團。連接子結合之部位可為抗體分子之胺基酸序列中之天然殘基或其可例如藉由DNA重組技術(例如藉由引入胺基酸序列中之半胱胺酸或蛋白酶裂解部位，藉由引入非天然胺基酸殘基)或藉由蛋白質生物化學(例如還原、pH值調節或蛋白分解，藉由糖基工程改造、胺基酸結合聚糖之酶修飾)引入至抗體分子中。
在一些實施例中，連接子(X)包含含有選自苯丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、丙胺酸、離胺酸、瓜胺酸、絲胺酸、麩胺酸及天冬胺酸之胺基酸的肽殘基，視情況連接子(X)包含二肽、三肽或四肽殘基。
在某些實施例中，中間產物(其為連接子(X)之前驅物)與細胞毒性劑(Z)在適當條件下反應。在某些實施例中，在細胞毒性劑及/或中間產物上使用反應性基團。在一些實施例中，細胞毒性劑與中間產物之間的反應之產物，或衍生之細胞毒性劑隨後在適當條件下與抗體分子反應。在其他實施例中，連接子(X)之前驅物首先在適當條件下與抗體分子反應，以便產生結合至連接子(X)之前驅物的抗體，且隨後使抗體與包含細胞毒性劑(Z)之分子反應。
在一些實施例中，連接子(X)可藉由胞內環境中(例如溶酶體或胞內體或胞膜窖內)存在之裂解劑來裂解。連接子可包含例如由胞內肽酶或蛋白酶裂解之肽基連接子或胺基酸單元，該蛋白酶包括(但不限於)溶酶體或胞內體蛋白酶。在一些實施例中，肽基連接子部分為至少兩個胺基酸長或至少三個胺基酸長。裂解劑可包括組織蛋白酶B及D以及纖維蛋白溶酶，已知其皆可使二肽藥物衍生物發生水解，從而使活性藥物釋放於靶細胞內部。最典型之肽基連接子為可由存在於細胞中之酶裂解的肽基連接子。在一特定實施例中，可由胞內蛋白酶裂解之肽基連接子為Val-Cit連接子或Phe-Lys連接子(參見例如，美國專利6,214,345，其描述用纈胺酸-瓜胺酸連接子合成多柔比星)。纈胺酸-瓜胺酸(Val-Cit)元件可具有下文所示之結構： 。
在另一特定實施例中，可藉由胞內蛋白酶裂解之肽基連接子為纈胺酸-丙胺酸(Val-Ala)連接子。val-ala元件可具有下文所示之結構： 。
在另一特定實施例中，可藉由胞內蛋白酶裂解之肽基連接子為含有甘胺酸之寡肽連接子，例如含有甘胺酸及含有苯丙胺酸之寡肽連接子，視情況為GGF、DGGF、(D-)D-GGF、EGGF、SGGF、KGGF、DGGFG (SEQ ID NO: 71)、DDGGFG (SEQ ID NO: 72)、KDGGFG (SEQ ID NO: 73)、GGFGGGF (SEQ ID NO: 74)、GGFG、GGFGG (SEQ ID NO: 75)或GGFGGG (SEQ ID NO: 76)連接子(參見例如，美國專利第6,835,807號，其揭示內容以引用之方式併入本文中)，其中「(D-)D」表示D-天冬胺酸。
在一些實施例中，連接子可用以充當間隔子或延伸子來將抗體與Z分開，以避免干擾抗體結合粘附分子-4及/或抑制由粘附分子-4介導之細胞-細胞相互作用之能力。連接子可包含間隔子單元(Y)及/或間隔子或間隔子系統(Y')。因此，間隔子Y可安置於Ab與可裂解部分之間。間隔子系統(Y')可安置於可裂解部分與Z之間。分子X或間隔子Y可視情況指定為包含反應性基團(R)，或反應性基團R與抗體之胺基酸或與連接至抗體之胺基酸的互補反應性基團(R')的反應之殘基。間隔子Y可例如為與抗體之胺基酸形成鍵(例如經由其反應性基團R)的分子，例如抗體之硫原子、一級或二級胺基或碳水化合物基團，且此間隔子或延伸子(Y)將抗體連接至細胞毒性劑(Z)或連接至可裂解胺基酸單元(例如肽基連接子、可裂解二肽、三肽、四肽或五肽)，視情況進一步具有繼而連接至Z之自消除及/或非自消除間隔子(Y')。因此，當間隔子(Y)在一端連接至胺基酸單元(例如可裂解二肽、三肽、四肽或五肽)時，可裂解胺基酸單元繼而可直接連接至Z或可包含另一間隔子(Y')，諸如連接胺基酸單元與Z之非自消除或自消除間隔子。
間隔子(Y)可視情況指定為經取代或未經取代之烷基或雜烷基鏈或包含經取代或未經取代之烷基或雜烷基鏈，視情況其中Y具有2至100個原子、視情況2至40、2至30、2至20、4至40、4至30或4至20個原子之鏈長，視情況其中一或多個原子可為除碳以外之原子，例如氧、硫、氮或其他原子，視情況其中鏈之任何碳經烷氧基、羥基、烷基羰氧基、烷基-S-、硫醇、烷基-C(O)S-、胺、烷胺、醯胺或烷基醯胺取代。
間隔子(Y)可視情況指定為包含穩定性增強部分。舉例而言，間隔子Y可在連接子設計中正交聚-乙二醇(PEG)部分或聚肌胺酸(聚-N-甲基甘胺酸或PSAR)部分(參見例如，WO2019/081455、WO2015/057699及WO2016/059377，其揭示內容以引用之方式併入本文中)。
在一些特定實施例中，間隔子(Y)可包含一或多個環氧乙烷單體，視情況Y包含聚環氧乙烷部分，視情況Y包含在1與24、視情況1與12、視情況1與8、視情況6與24個之間的聚環氧乙烷部分，視情況Y包含結構- (CH 2CH 2O) x-，其中x為1至24、視情況為1至12、視情況為1至6、視情況為6至24。
適合之穩定性增強部分之實例(間隔子鏈Y)可包含PCT公開案第WO2015/057699號或第WO2019/081455號中所揭示之穩定性增強部分。舉例而言，間隔子鏈Y可包含正交連接體部分及穩定性增強部分。穩定性增強部分可為PEG均聚物，或通常與正交連接體部分結合之任何單一分子量均聚物(例如PEG或聚肌胺酸均聚物)。均聚物可具有例如1至4、1至6、1至7、1至8、1至10、1至12、至少6、8或10，或6至12、6至24、6至72或不超過6、7或8個PEG或其他單體之單元。術語正交連接體係指分支鏈連接子單元組分，其將連接子部分(例如間隔子Y之鏈)連接至均聚物單元且經由連接子(例如可裂解寡肽(Pep)及間隔子Y')連接至細胞毒性劑(Z)，以使得均聚物單元相對於細胞毒性劑呈平行組態(相對於串聯組態) (均聚物平行於Pep-Y'-Z部分)。正交連接體部分可例如為視情況選自麩胺酸、離胺酸及甘胺酸之一或多種天然或非天然胺基酸。視情況地，胺基酸正交連接部分係置放於間隔子鏈Y之末端，以使得正交連接體部分胺基酸殘基經由一個胺基酸之α-羧基與另一胺基酸之α-胺基之間的肽鍵連接至肽基連接子(例如式V或VI中之(Pep))之胺基酸殘基。Y可例如包含正交連接體部分與式D之部分之反應的結果： 式D 其中R 1與R 2不同，且 R 1及R 2中之一者為H或惰性基團，R 1及R 2中之另一者為經官能化之反應性基團，該基團對共價結合至正交連接體部分之可結合基團具有反應性，在此類反應條件中，惰性基團不具反應性，Z 1及Z 2(相同或不同)為視情況存在之間隔子，且n為1或更大且k為2或更大。
視情況地，正交連接體衍生自麩胺酸。
在另一實例中，間隔子Y包含美國專利公開案第US2017/0072068A1號(其揭示內容以引用之方式併入本文中)中所揭示之基團，例如根據式(E)之基團或其鹽： 式E 其中 a為0或1；且 R 1係選自由以下組成之群：氫、C 1-C 24烷基、C 3-C 24環烷基、C2-C24 (雜)芳基、C3-C24烷基(雜)芳基及C 3-C 24(雜)芳基烷基，該等C 1-C 24烷基、C 3-C 24環烷基、C 2-C 24(雜)芳基、C 3-C 24烷基(雜)芳基及C 3-C 24(雜)芳基烷基視情況經選自O、S及NR 3之一或多個雜原子取代且視情況間雜有選自O、S及NR 3之一或多個雜原子，其中R 3係獨立地選自由氫及C 1-C 4烷基組成之群；且其中根據式E之基團或其鹽定位於間隔子鏈Y之該第一端與第二端之間。
根據此態樣，間隔子Y可包含-(丁二醯亞胺-3-基-N)—CH2CH2—C(═O)—、-(丁二醯亞胺-3-基-N)—CH2CH2CH2—C(═O)—、-(丁二醯亞胺-3-基-N)—CH2CH2CH2CH2—C(═O)—、-(丁二醯亞胺-3-基-N)—CH2CH2CH2CH2CH2—C(═O)—。
視情況地，此類間隔子Y可進一步包含以下結構：—NH—(CH2CH2—O)n -CH 2CH 2 —C(═O)—，其中n為1至6、較佳2至4之整數。此類結構包括例如—NH—CH 2CH 2—O—CH 2CH 2—C(═O)—、—NH—CH 2CH 2—O—CH 2CH 2—O—CH 2CH 2—C(═O)—、—NH—CH 2CH 2—O—CH 2CH 2—O—CH 2CH 2—O—CH 2CH 2—C(═O)—、—NH—CH 2CH 2—O—CH 2CH 2—O—CH 2CH 2—O—CH 2CH 2—O—CH 2CH 2—C(═O)—、—NH—CH 2CH 2—O—CH 2CH 2—O—CH 2CH 2—O—CH 2CH 2—O—CH 2CH 2—O—CH 2CH 2—C(═O)—、—NH—CH 2CH 2—O—CH 2CH 2—O—CH 2CH 2—O—CH 2CH 2—O—CH 2CH 2—O—CH 2CH 2—O—CH 2CH 2—O—CH 2CH 2—C(═O)—。
置放於胺基酸單元(例如可裂解二肽、三肽、四肽或五肽)與Z之間的間隔子或間隔子系統(Y')可為自消除或非自消除的。間隔子Y'可例如包含經取代或未經取代之烷基或雜烷基鏈，視情況其中Y具有2至30個原子、視情況2至20、4至20、2至10或4至20個原子之鏈長，視情況其中一或多個原子可為除碳以外之原子，例如氧、硫、氮或其他原子，視情況其中鏈之任何碳經烷氧基、羥基、烷基羰氧基、烷基-S-、硫醇、烷基-C(O)S-、胺、烷胺、醯胺或烷基醯胺取代。在一個實施例中，Y'包含對-胺基苯甲氧基羰基。在一個實施例中，Y'為非自消除間隔子且包含-(CH2)n-C(═O)—之結構，其中n為0至5之整數，該結構藉由-O-或單鍵連接至可裂解部分。舉例而言，Y'可為或可包含-C(=O)-、-O-C(=O)-、-O-CH2-C(=O)-、-O-CH2CH2-C(=O)-、-O-CH2CH2CH2-C(=O)-、-O-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、-O-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、HO-O-CH2-C(=O)-、-CH2-C(=O)-、-CH2CH2-C(=O)-、-CH2CH2CH2-C(=O)-、-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-、-CH2-O-CH2-C(=O)-或-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-基團。
「自消除」間隔子單元允許在無獨立水解步驟之情況下釋放藥物部分。當使用自消除間隔子時，在胺基酸單元裂解或轉型之後，連接至胺基酸單元之間隔子側變成未封端的，此引起一或多個部分Z之最終釋放。自消除間隔子系統可例如為WO02/083180及WO2004/043493 (其揭示內容以全文引用之方式併入本文中)中所描述之自消除間隔子系統，以及熟習此項技術者已知之其他自消除間隔子。在某些實施例中，連接子之間隔子單元包含對-胺基苯甲基單元。在一個此類實施例中，對-胺基苯甲醇係經由醯胺鍵連接至胺基酸單元，且在苯甲醇與細胞毒性劑之間生成胺基甲酸酯、甲基胺基甲酸酯或碳酸酯。在一個實施例中，間隔子單元為例如具有以下結構之對-胺基苯甲氧基羰基(PAB)： 。
自消除間隔子單元之實例進一步包括(但不限於)在電子學上類似於對-胺基苯甲醇(參見例如US 2005/0256030 Al)之芳族化合物，諸如2-胺基咪唑-5-甲醇衍生物(Hay等人(1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237)及鄰-胺基苯甲基乙醛或對-胺基苯甲基乙醛。可使用在醯胺鍵水解後經歷環化之間隔子，諸如經取代及未經取代之4-胺基丁酸醯胺(Rodrigues等人Chemistry Biology, 1995, 2, 223)及2-胺基苯基丙酸醯胺(Amsberry等人, J. Org. Chem., 1990, 55. 5867)。在甘胺酸之a位置處經取代之含胺藥物之消除(Kingsbury等人, J. Med. Chem.,1984, 27, 1447)亦為自消除間隔子之實例。對-胺基苯甲基自消除間隔子(例如PAB)尤其適用於與Phe-Lys、Val-Ala或Val-Cit可裂解二肽單元一起使用(PAB係置放於二肽與喜樹鹼衍生物(Z)之間)。
「非自消除」間隔子單元為其中間隔子單元之部分或全部在抗體-部分-相關結合物之酶(例如蛋白水解)裂解後保持結合至部分Z之間隔子單元。適合用作Gly-Gly-Phe-Gly胺基酸單元與依沙替康分子之間的間隔子之非自消除間隔子單元之實例包括(但不限於)，包括-O-CH 2-C(=O)-、HO-O-CH 2-C(=O)-、-CH 2CH 2-C(=O)-、-CH 2CH 2CH 2-C(=O)-、-CH 2-O-CH 2-C(=O)-及-CH 2CH 2-O-CH 2-C(=O)- (例如以形成GGFG-CH 2CH 2-O-CH 2-C(=O)-依沙替康單元)。在GGFG胺基酸單元與依沙替康之間使用此類間隔子引起具有化合物13之結構之分子的釋放。非自消除間隔子單元之其他實例包括(但不限於)甘胺酸間隔子單元及甘胺酸-甘胺酸間隔子單元。可以類似方式使用對序列特異性酶裂解敏感之肽間隔子的其他已知組合。舉例而言，藉由腫瘤細胞相關蛋白酶進行之含有甘胺酸-甘胺酸間隔子單元之抗體-部分-相關結合物的酶裂解將引起甘胺酸-甘胺酸-藥物部分自抗體-部分-相關結合物之其餘部分釋放。在一個此類實施例中，甘胺酸-甘胺酸-藥物部分隨後在腫瘤細胞中經歷獨立水解步驟，因此自藥物部分裂解甘胺酸-甘胺酸間隔子單元。
例示性連接子-細胞毒性藥物部分(X-Z)可包含以下式III及IV中所示之結構中之任一者。 式IIIa 式IIIb 式IIIc 式IVa 式IVb 式IVc。
間隔子(Y)及(Y')可視情況指定為係獨立地選自由以下組成之群：直鏈或分支鏈C 1-C 20伸烷基、C 2-C 20伸烯基、C 2-C 20伸炔基、C 3-C 20環伸烷基、C 5-C 20環伸烯基、C 8-C 20環伸炔基、C 7-C 20烷基伸芳基、C 7-C 20芳基伸烷基、C 8-C 20芳基伸烯基及C 9-C 20芳基伸炔基，該等伸烷基、伸烯基、伸炔基、環伸烷基、環伸烯基、環伸炔基、烷基伸芳基、芳基伸烷基、芳基伸烯基及芳基伸炔基視情況經選自O、S及NR 1之群的一或多個雜原子取代且視情況間雜有選自O、S及NR 1之群的一或多個雜原子，其中R 1係獨立地選自由氫、C 1-C 24烷基、C 2-C 24烯基、C 2-C 24炔基及C 3-C 24環烷基組成之群，該等烷基、烯基、炔基及環烷基視情況經取代。
間隔子(Y)及(Y')可視情況指定為以下基團或包含以下基團：C 1-C 10伸烷基-、-C 1-C 10伸雜烷基-、-C 3-C 8碳環-、-O-(C 1-C 8烷基)-、-伸芳基-、-C 1-C 10伸烷基-伸芳基-、-伸芳基-C 1-C 10伸烷基-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8碳環)-、-(C 3-C 8碳環)-C 1-C 10伸烷基-、-C 3-C 8雜環-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8雜環)-、-(C 3-C 8雜環)-C 1-C 10伸烷基-、-C 1-C 10伸烷基-C(=O)-、-C 1-C 10伸雜烷基-C(=O)-、-C 3-C 8碳環-C(=O)-、-O-(C 1-C 8烷基)-C(=O)-、-伸芳基-C(=O)-、-C 1-C 10伸烷基-伸芳基-C(=O)-、-伸芳基-C 1-C 10伸烷基-C(=O)-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8碳環)-C(=O)-、-(C 3-C 8碳環)-C 1-C 10伸烷基-C(=O)-、-C 3-C 8雜環-C(=O)-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8雜環)-C(=O)-、-(C 3-C 8雜環)-C 1-C 10伸烷基-C(=O)-、-C 1-C 10伸烷基-NH-、-C 1-C 10伸雜烷基-NH-、-C 3-C 8碳環-NH-、-O-(C 1-C 8烷基)-NH-、-伸芳基-NH-、-C 1-C 10伸烷基-伸芳基-NH-、-伸芳基-C 1-C 10伸烷基-NH-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8碳環)-NH-、-(C 3-C 8碳環)-C 1-C 10伸烷基-NH-、-C 3-C 8雜環-NH-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8雜環)-NH-、-(C 3-C 8雜環)-C 1-C 10伸烷基-NH-、-C 1-C 10伸烷基-S-、-C 1-C 10伸雜烷基-S-、-C 3-C 8碳環-S-、-O-(C 1-C 8烷基)-)-S-、-伸芳基-S-、-C 1-C 10伸烷基-伸芳基-S-、-伸芳基-C 1-C 10伸烷基-S-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8碳環)-S-、-(C 3-C 8碳環)-C 1-C 10伸烷基-S-、-C 3-C 8雜環-S-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8雜環)-S-、-(C 3-C 8雜環)-C 1-C 10伸烷基-S-、-C 1-C 10伸烷基-O-C(=O)-、-C 3-C 8碳環-O-C(=O)-、-O-(C 1-C 8烷基)-O-C(=O)-、-伸芳基-O-C(=O)-、-C 1-C 10伸烷基-伸芳基-O-C(=O)-、-伸芳基-C 1-C 10伸烷基-O-C(=O)-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8碳環)-O-C(=O)-、-(C 3-C 8碳環)-C 1-C 10伸烷基-O-C(=O)-、-C 3-C 8雜環-O-C(=O)-、-C 1-C 10伸烷基-(C 3-C 8雜環)-O-C(=O)-、-(C 3-C 8雜環)-C 1-C 10伸烷基-O-C(=O)-，其在各情況下視情況經選自以下之取代基中之一或多者取代：-X、-R'、-O、-OR'、=O、-SR'、-S -、-NR' 2、-NR' 3 +、=NR'、-CX 3、-CN、-OCN、-SCN、-N=C=O、-NCS、-NO、-NO 2、=N 2、-N 3、-NR'C(=O)R'、-C(=O)R'、-C(=O)NR' 2、-SO 3 -、-SO 3H、-S(=O) 2R'、-OS(=O) 2OR'、-S(=O) 2NR'、-S(=O)R'、-OP(=O)(OR') 2、-P(=O)(OR') 2、-PO 3、-PO 3H 2、-C(=O)X、-C(=S)R'、-CO 2R'、-CO 2、-C(=S)OR'、C(=O)SR'、C(=S)SR'、C(=O)NR' 2、C(=S)NR' 2及C(=NR')NR' 2，其中各X獨立地為鹵素：-F、-Cl、-Br或-I；且各R'獨立地為-H、-C 1-C 20烷基、-C 6-C 20芳基或-C 3-C 14雜環。
在一個實施例中，間隔子(Y)可視情況指定為例如在鏈之一端包含與抗體上之游離胺基、羥基、硫氫基或羧基或碳水化合物具有反應性之反應性基團(R)。在一些態樣中，間隔子Y包含R基團-(丁二醯亞胺-3-基-N)-(CH 2) n 3-C(=O)，其中n 3為2至8之整數，且-(丁二醯亞胺-3-基-N)具有由下文之式F所表示之結構： 式F。
以上結構之位置3可為與抗體之連接位置。在位置3處與抗體之鍵結係藉由形成與硫醚之鍵結表徵。
在一個實施例中，間隔子(Y)可視情況指定為例如在鏈之一端包含：與連接至抗體之胺基酸(例如，經由游離胺基、羥基、硫氫基或羧基或碳水化合物)之互補反應性基團(R')具有反應性的反應性基團(R)；或在與抗粘附分子-4抗體結合後，反應性基團(R)與抗體上之游離胺基、羥基、硫氫基或羧基或與連接至抗體之胺基酸的互補反應性基團(R')之反應的殘基。反應性基團對R及R'之實例包括能夠進行雙正交反應之一系列基團，該雙正交反應較佳為環加成，例如狄爾斯-阿爾德反應(Diels-Alder reaction)或1,3-偶極子環加成(例如在迭氮化物與環辛炔之間(不含銅之點擊化學)、在硝酮與環辛炔之間)、由醛及酮形成肟/腙及四𠯤接合(亦參見WO2013/092983或US2017/0072068A1，其揭示內容以引用之方式併入本文中)。舉例而言，R可為炔烴且R'可為迭氮化物，或R可為迭氮化物且R'為炔烴。因此，在任何實施例中，所得連接子及經官能化之抗體或其Y元件可包含由R與R'之反應產生之基團(RR')，例如RR'可為或包含由炔烴與迭氮化物之反應產生之三唑。
在一個實施例中，反應性基團R及R'為能夠進行「點擊」反應之互補試劑(亦即點擊化學試劑或反應性基團)。舉例而言，1,3-偶極官能化合物可在環化反應中與炔烴反應以形成雜環化合物，較佳在實質上不存在添加催化劑(例如Cu(I))之情況下進行。具有至少一個連接於其上之1,3-偶極基團(具有三原子pi電子系統，其含有在三個原子上離域之4個電子)的各種化合物可用於與本文中所揭示之炔烴反應。例示性1,3-偶極基團包括(但不限於)迭氮化物、腈氧化物、硝酮、氧偶氮基及醯基重氮基。
實例包括鄰-磷烯芳族酯、迭氮化物、雷酸鹽、炔烴(包括任何應變環炔烴)、氰化物、蒽(anthracene)、1,2,4,5-四𠯤或降莰烯(norbornene) (或其他應變環烯烴)。
在一個實施例中，R為具有末端炔烴或迭氮化物之部分；此類部分描述於例如美國專利第7,763,736號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。將銅(及其他金屬鹽)用作末端炔烴與迭氮化物之間的點擊反應之催化劑的適合反應條件提供於美國專利第7,763,736號中。
在一個實施例中，R為經取代或未經取代之環炔烴。包括特定化合物之環炔烴描述於例如美國專利第7,807,619號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，環炔烴可為式A化合物： 式A 其中： R 1係選自羰基、烷基酯、芳基酯、經取代之芳基酯、醛、醯胺、芳基醯胺、烷基鹵化物、硫酯、磺醯基酯、烷基酮、芳基酮、經取代之芳基酮及鹵磺醯基； R 1可位於環辛炔基上除了由參鍵接合之兩個碳以外的任何位置處。
在一些實施例中，經修飾之環炔烴具有式A，其中除了由參鍵接合之兩個碳原子以外，環辛炔環中之碳原子中之一或多者經一或多個拉電子基(例如鹵基(溴、氯、氟、碘)、硝基、氰基、碸基或磺酸基)取代。因此，例如在一些實施例中，經標的物修飾之環炔烴具有式B： 式B 其中： R 2及R 3中之各者獨立地為：(a) H；(b)鹵素原子(例如，溴、氯、氟、碘)；(c) -W-(CH 2) n-Z (其中：n為1至4之整數(例如，n=1、2、3或4)；W (若存在)為O、N或S；且Z為硝基、氰基、磺酸或鹵素)；(d) -(CH 2) n-W-(CH 2) m-R 4(其中：n及m各自獨立地為1或2；W為O、N、S或磺醯基；若W為O、N或S，則R 4為硝基、氰基或鹵素；且若W為磺醯基，則R 4為H)；或(e) -CH 2) n- R 4(其中：n為1至4之整數(例如，n=1、2、3或4)；且R 4為硝基、氰基、磺酸或鹵素)；及 R 1係選自羰基、烷基酯、芳基酯、經取代之芳基酯、醛、醯胺、芳基醯胺、烷基鹵化物、硫酯、磺醯基酯、烷基酮、芳基酮、經取代之芳基酮及鹵磺醯基。R 1可位於環辛炔基上除了由參鍵連接之兩個碳以外的任何位置處。
在一個實施例中，R為經取代或未經取代之雜環應變炔烴。包括特定化合物之環炔烴描述於例如美國專利第8,133,515號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。在一個實施例中，炔烴具有式C： 式C 其中： 各R 1係獨立地選自由以下組成之群：氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸鹽、亞硝酸鹽、硫酸鹽及C 1-C 10烷基或雜烷基； 各R 2係獨立地選自由以下組成之群：氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸鹽、亞硝酸鹽、硫酸鹽及C 1-C 10有機基；X表示N-R 3R 4、NH-R 4、CH-N-OR 4、C-N-NR 3R 4、CHOR 4或CHNHR 4；且各R 3表示氫或有機基團且R 4表示連接子之鍵聯部分C。在一個實施例中，R或R'為下文之二苯甲基環辛基(dibenzycyclooctyl；DBCO)： DBCO。
炔烴(諸如上文所描述之炔烴)在環化反應中可與至少一種1,3-偶極官能化合物反應以形成雜環化合物，較佳在實質上不存在添加催化劑(例如Cu(I))之情況下進行。具有至少一個連接於其上之1,3-偶極基團(具有三原子pi電子系統，其含有在三個原子上離域之4個電子)的廣泛多種化合物可用於與本文中所揭示之炔烴反應。例示性1,3-偶極基團包括(但不限於)迭氮化物、腈氧化物、硝酮、氧偶氮基及醯基重氮基。
在本文之式中，Y'可視情況為不存在或可為間隔子，視情況為自消除間隔子(例如包含對-胺基苯甲基單元)或非自消除間隔子。視情況地，Y'為經取代或未經取代之烷基或雜烷基鏈或包含經取代或未經取代之烷基或雜烷基鏈，視情況其中Y'具有2至40個原子、視情況2至30、2至20、4至40、4至30或4至20個原子之鏈長，視情況其中一或多個原子可為除碳以外之原子，例如氧、硫、氮或其他原子，視情況其中鏈之任何碳經烷氧基、羥基、烷基羰氧基、烷基-S-、硫醇、烷基-C(O)S-、胺、烷胺、醯胺或烷基醯胺取代。
可與抗粘附分子-4抗體結合之例示性連接子-細胞毒性劑分子(例如式I至式XI之X-Z部分)可視情況由式V表示： (R)-(Y) - (Pep) - (Y') - (Z)                     式(V) 其中， R為與抗體上之游離胺基、羥基、硫氫基或羧基具有反應性，或與連接至抗體之胺基酸之互補反應性基團(R')具有反應性的基團，或在結合至抗粘附分子-4結合蛋白後，R為反應性基團(R)與抗體上之游離胺基、羥基、硫氫基或羧基或與連接至抗體之胺基酸的互補反應性基團(R')之反應的殘基； Y視情況為不存在或為間隔子； Pep為或包含由胞內肽酶或蛋白酶裂解之肽基連接子，例如纈胺酸-瓜胺酸、纈胺酸-丙胺酸或苯丙胺酸-離胺酸二肽； Y'視情況為不存在或為間隔子，視情況為自消除間隔子或非自消除間隔子；及 Z為細胞毒性劑，視情況為喜樹鹼類似物，視情況為依沙替康、Dxd或SN-38分子。
根據本發明之所得粘附分子-4結合免疫結合物可例如由式(VI)表示： Ab - (Y) - (Pep) - (Y') - (Z)                              式(VI) 其中， Ab為抗粘附分子-4抗體； Y視情況為不存在或為間隔子。視情況地，式VI在(Ab)與(Y)之間包含反應性基團(例如順丁烯二醯亞胺、一級胺)與抗粘附分子-4抗原結合蛋白(Ab)之胺基酸的側鏈或碳水化合物之反應的殘基。或者，反應性基團(例如順丁烯二醯亞胺、一級胺)與抗粘附分子-4抗原結合蛋白(Ab)之胺基酸的側鏈之反應的殘基可指定為包含於Y中； Pep為或包含由胞內肽酶或蛋白酶裂解之胺基酸單元(例如肽基連接子) (例如(Pep)為蛋白酶可裂解二肽、三肽、四肽或五肽，例如纈胺酸-瓜胺酸、纈胺酸-丙胺酸或苯丙胺酸-離胺酸單元)； Y'視情況為不存在或為間隔子，視情況為自消除間隔子或非自消除間隔子；及 Z為細胞毒性劑，視情況為喜樹鹼衍生物，視情況為依沙替康、Dxd或SN-38分子。
視情況地，式包含可指定為(例如在(Ab)與Y (或若Y不存在，則為(Pep或X))之末端之間)包含反應性基團(R)與抗體上之游離胺基、羥基、硫氫基或羧基或與連接至抗體之胺基酸的互補反應性基團(R')之反應的殘基(RR')。
在一個實例中，其中(RR')為反應性基團(R)與連接至抗體之互補反應性基團(R')之反應的殘基(例如，R'係連接至抗體之胺基酸的側鏈或聚糖)，根據本發明之粘附分子-4結合免疫結合物可例如由式(VI bis)表示： Ab - (RR') - (Y) - (Pep) - (Y') - (Z)                    式(VI bis) 其中Ab、Y、Pep、Y'及Z係如式VI中所定義，且RR'為雙正交反應之結果，該雙正交反應較佳為環加成，例如狄爾斯-阿爾德反應或1,3-偶極子環加成。在一個實施例中，RR'具有選自由以下組成之群的結構： 其中X 8為O或NH，X 9係選自H、甲基及吡啶基，且在結構(RR' c)及(RR' d)中，且 ----鍵表示單鍵或雙鍵。
在任何實施例中，依沙替康分子(或其他6環喜樹鹼)可指定為經由依沙替康之位置1處的胺鍵結至Y' (或若Y'不存在，則為(Pep))。
在任何實施例中，SN-38分子(或其他5環喜樹鹼)可指定為經由SN-38之位置9處的胺鍵結至Y' (或若Y'不存在，則為(Pep))。
細胞毒性劑(亦稱為(Z)部分)包括(例如)諸如抗腫瘤劑之細胞毒性劑。細胞毒性劑之實例為此項技術中已知的。舉例而言，Z可為烷基化劑，較佳為DNA烷基化劑。烷基化劑為可在生理條件(例如pH 7.4、37℃，水性溶液)下用烷基置換氫原子之化合物。烷基化反應通常藉由N、O及S雜原子親核試劑與親電子烷基化劑之取代反應來描述，儘管邁克爾加成反應(Michael addition reaction)亦至關重要。烷基化劑之實例包括氮芥及硫芥、伸乙亞胺、甲烷磺酸酯、CC-1065及倍癌黴素、亞硝基脲、含鉑試劑、實現拓樸異構酶II介導之DNA部位依賴性烷基化的試劑(例如普梭草素(psorospermin)及相關雙呋喃氧𠮿酮(bisfuranoxanthone))、依特那斯汀(ecteinascidin)及其他或相關DNA小溝烷基化劑。
在一個實施例中，Z為螯合金屬，諸如具有2至8 (包括端點)之配位數的帶兩個或三個正電荷之金屬的螯合物。此類金屬之特定實例包括鎝(Tc)、錸(Re)、鈷(Co)、銅(Cu)、金(Au)、銀(Ag)、鉛(Pb)、鉍(Bi)、銦(In)、鎵(Ga)、釔(Y)、鋱(Tb)、釓(Gd)及鈧(Sc)。一般而言，金屬較佳為放射性核種。特定放射性核種包括99mTc、186Re、188Re、58Co、60Co、67Cu、195Au、199Au、110Ag、203Pb、206Bi、207Bi、111In、67Ga、68Ga、88Y、90Y、160Tb、153Gd及47Sc。螯合金屬可為例如用任何適合之多牙螯合劑螯合之以上類型之金屬中之一者，例如非環狀或環狀多元胺、聚醚(例如冠醚及其衍生物)；聚醯胺；卟啉(porphyrin)；及碳環衍生物。
抗粘附分子-4抗體或抗體片段亦可用於診斷學中，例如以偵測粘附分子-4腫瘤細胞。在此類實施例中，抗體或抗體片段可結合至效應分子，諸如適用於例如診斷中之可偵測物質。可偵測物質之實例包括各種酶、輔基、螢光物質、發光物質、生物發光物質、放射性核素、正電子發射金屬(用於正電子發射斷層攝影中)及非放射性順磁性金屬離子。關於可結合至抗體以用於診斷學之金屬離子，通常參見美國專利第4,741,900號。適合之酶包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；適合之輔基包括鏈黴抗生物素蛋白、抗生物素蛋白及生物素；適合之螢光物質包括傘酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯及藻紅素(phycoerytbrin)；適合之發光物質包括流明諾(luminol)；適合之生物發光物質包括螢光素酶、螢光素及水母發光蛋白(aequorin)；且適合之放射性核素包括125I、131I、111In及99Tc。
在一個實施例中，細胞毒性劑(Z)為DNA小溝結合劑及/或烷基化劑，例如吡咯并苯并二氮呯、倍癌黴素或其衍生物。
在另一實施例中，細胞毒性劑係選自由以下組成之群：紫杉烷、蒽環黴素、喜樹鹼、埃博黴素、絲裂黴素、康普瑞汀、長春花生物鹼、氮芥、類美登素、卡奇黴素、倍癌黴素、特吡萊辛、海兔毒素及奧瑞他汀、烯二炔類、毒傘毒素、吡咯并苯并二氮呯類、伸乙亞胺、放射性同位素、治療性蛋白及肽，以及毒素或其片段。
在另一實施例中，細胞毒性劑係選自環磷醯胺、異環磷醯胺、苯丁酸氮芥、4-(雙(2-氯乙基)胺基)苯酚、4-(雙(2-氟乙基)胺基)苯酚、N,N-雙(2-氯乙基)-對苯二胺、N,N-雙(2-氟-乙基)-對苯二胺、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、曲奧舒凡(treosulfan)、達卡巴嗪(dacarbazine)、順鉑、卡鉑、長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱(vinorelbine)、紫杉醇、多西他賽、依託泊苷、替尼泊苷、拓朴替康、伊立替康(inirotecan)、9-胺基喜樹鹼、9-硝基喜樹鹼、10-羥基喜樹鹼、勒托替康(lurtotecan)、喜樹鹼、克立那托(crisnatol)、絲裂黴素C、絲裂黴素A、甲胺喋呤、三甲曲沙(trimetrexate)、黴酚酸(mycophenolic acid)、噻唑呋林(tiazofurin)、利巴韋林(ribavirin)、羥基尿素、去鐵胺、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、去氧氟尿苷、雷替曲塞(raltitrexed)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、雷洛昔芬(raloxifen)、甲地孕酮(megestrol)、戈舍瑞林(goserelin)、乙酸亮丙立德(leuprolide acetate)、氟他胺、比卡魯胺(bicalutamide)、弗妥珀芬(vertoporfin)、酞青素(phthalocyanine)、光敏劑Pc4、去甲氧基-竹紅菌素(hypocrellin) A、干擾素-α、干擾素-γ、腫瘤壞死因子、洛伐他汀(lovastatin)、星形孢菌素、放線菌素D、博萊黴素(bleomycin) A2、博萊黴素B2、培洛黴素(peplomycin)、道諾黴素、多柔比星、N-(5,5-二乙醯氧基戊基)多柔比星、𠰌啉基多柔比星、艾達黴素(idarubicin)、表阿黴素(epirubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、左柔比星(zorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、毒胡蘿蔔素(thapsigargin)、N 8-乙醯亞精胺、他利黴素(tallysomycin)、艾斯普黴素(esperamycin)、丁酸、視黃酸、l,8-二羥基雙環[7.3.1]十三碳-4-烯-2,6-二炔-13-酮、胺癸叮(anguidine)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、康普瑞汀A-4、盤克斯達汀(pancratistatin)、特吡萊辛A、特吡萊辛D、洋紅黴素(carminomycin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、依利醋銨(elliptmium acetate)、美登素(maytansine)、美登醇(maytansinol)、卡奇黴素(calicheamycin)、美登素(DM1)、N-乙醯基-γ 1 I-卡奇黴素、卡奇黴素-γ 1 I、 卡奇黴素-α 2 I、卡奇黴素-α 3 I、倍癌黴素SA、倍癌黴素A、CC-1065、CBI-TMI、倍癌黴素C2、倍癌黴素B2、森特黴素(centanamycin)、海兔毒素、奧瑞他汀E、單甲基奧瑞他汀E (MMAE)、單甲基奧瑞他汀F (MMAF)、α-瓢菌素、β-瓢菌素、γ-瓢菌素、ε-瓢菌素、鵝膏素(amanin)、鵝膏毒肽醯胺(amaninamide)、鵝膏林(amanullin)，以及鵝膏林酸及其衍生物。
例示性奧瑞他汀實施例包括N端連接之單甲基奧瑞他汀藥物部分，其包含下文之式(a1)及(a2)中之任一者的結構： 式a1 式a2 其中(a1)及(a2)之波浪線指示與連接子(例如連接子X，或部分Y、Pep或Y')之共價連接部位，且獨立地位於各位置處： R 2係選自H及C 1-C 8烷基； R 3係選自H、C 1-C 8烷基、C 1-C 8碳環、芳基、C 1-C 8烷基-芳基、C 1-C 8烷基-(C 3-C 8碳環)、C 3-C 8雜環及C 1-C 8烷基-(C 3-C 8雜環)； R 4係選自H、C 1-C 8烷基、C 3-C 8碳環、芳基、C 1-C 8烷基-芳基、C 1-C 8烷基-(C 3-C 8碳環)、C 3-C 8雜環及C 1-C 8烷基-(C 3-C 8雜環)； R 5係選自H及甲基； 或R 4及R 5共同形成碳環且具有式-(CR aR b) n，其中R a及R b係獨立地選自H、C 1-C 8烷基及C 3-C 8碳環且n係選自2、3、4、5及6； R 6係選自H及C 1-C 8烷基； R 7係選自H、C 1-C 8烷基、C 3-C 8碳環、芳基、C 1-C 8烷基-芳基、C 1-C 8烷基-(C 3-C 8碳環)、C 3-C 8雜環及C 1-C 8烷基-(C 3-C 8雜環)； 各R 8係獨立地選自H、OH、C 1-C 8烷基、C 3-C 8碳環及O-(C 1-C 8烷基)； R 9係選自H及C 1-C 8烷基； R 10係選自芳基或C 3-C 8雜環； Z為O、S、NH或NR 12，其中R 12為C 1-C 8烷基； R 11係選自H、C 1-C 20烷基、芳基、C3-C8雜環、-(R 13O) m-R 14或-(R 13O) m-CH(R 15) 2；m為1至1000範圍內之整數； R 13為C 2-C 8烷基； R 14為H或C 1-C 8烷基； R 15在每次出現時獨立地為H、COOH、-(CH 2) n-N(R 16) 2、-(CH 2) n-SO 3-C 1-C 8烷基； R 16在每次出現時獨立地為H、C 1-C 8烷基或-(CH 2) n-COOH； R 18係選自-C(R 8) 2-C(R 8) 2-芳基、-C(R 8) 2-C(R 8) 2-(C 3-C 8雜環)及-C(R 8) 2-C(R 8) 2-(C 3-C 8碳環)；及 n為0至6範圍內之整數。
在一個實施例中，R 3、R 4及R 7獨立地為異丙基或二級丁基且R 5為-H或甲基。在一例示性實施例中，R 3及R 4各自為異丙基，R 5為-H，且R 7為二級丁基。
在又一實施例中，R 2及R 6各自為甲基，且R 9為-H。
在再一實施例中，R 8在每次出現時為-OCH 3。
在一例示性實施例中，R 3及R 4各自為異丙基，R 2及R 6各自為甲基，R 5為-H，R 7為二級丁基，R 8在每次出現時為-OCH 3，且R 9為-H。
在一個實施例中，Z為-O-或-NH-。
在一個實施例中，R 10為芳基。
在一例示性實施例中，R 10為-苯基。
在一例示性實施例中，當Z為-O-時，R 11為-H、甲基或三級丁基。
在一個實施例中，當Z為-NH時，R 11為-CH(R 15) 2，其中R 15為-(CH 2) n-N(R 16) 2，且R 16為-C 1-C 8烷基或-(CH 2) n-COOH。
在另一實施例中，當Z為-NH時，R 11為-CH(R 15) 2，其中R 15為-(CH 2) n-SO 3H。
式(a1)之一個例示性奧瑞他汀實施例為MMAE，其中波浪線指示與連接子之共價連接： MMAE。
式(a2)之例示性奧瑞他汀實施例為MMAF，其中波浪線指示與抗體-藥物結合物之連接子(L)的共價連接(參見US 2005/0238649及Doronina等人(2006) Bioconjugate Cfiem. 17: 1 14-124)： MMAF。
其他例示性Z實施例包括在五肽奧瑞他汀藥物部分之C端具有苯丙胺酸羧基修飾之單甲基纈胺酸化合物(WO 2007/008848)及在五肽奧瑞他汀藥物部分之C端具有苯丙胺酸側鏈修飾之單甲基纈胺酸化合物(WO 2007/008603)。
其他藥物部分包括以下MMAF衍生物，其中波浪線指示與連接子之共價連接： 。
包含間隔子(Y)之連接子之實例如下所示，該間隔子(Y)包含一級胺、作為(Pep)部分之纈胺酸-瓜胺酸、作為(Y')部分之PAB以及作為(Z)部分之MMAF： 。
在一個實施例中，Z部分為DNA小溝結合劑，視情況Z包含吡咯并苯并二氮呯(PBD)。在一個實施例中，Z為吡咯并苯并二氮呯單體。在一個實施例中，Z為包含兩個吡咯并苯并二氮呯單元之吡咯并苯并二氮呯二聚體。在一個實施例中，Z為包含三個吡咯并苯并二氮呯單元之吡咯并苯并二氮呯三聚體。在一個實施例中，Z為包含超過三個吡咯并苯并二氮呯單元之吡咯并苯并二氮呯多聚體。PBD之結構以及其調配物及製備方法描述於例如PCT公開案第WO 2013/177481號、第WO 2011/130616號、第WO 2004/043880號、第WO 2005/085251號、第WO2012/112687號及第WO 2011/023883號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
吡咯并[2,1- c][1,4]苯并二氮呯為一系列之序列選擇性、小溝結合DNA-相互作用藥劑，其共價連接至鳥嘌呤殘基。已報導，在PBD之C11a位置處的( S)-對掌性為其提供適合之3維形狀以極佳地擬合至DNA小溝中。PBD可具有不同效應及作用模式。PBD可為不引起DNA交聯之DNA結合劑或DNA烷基製劑，或PBD可為DNA交聯劑。
吡咯并苯并二氮呯單元或單體可具有如下通式結構： 其中PBD在芳族A環及吡咯并C環兩者中可具有不同數目、類型及位置之取代基，且在C環之飽和度方面可變化。在B環中，在N 10-C 11位置處存在亞胺(N=C)、甲醇胺(NH-CH(OH))或甲醇胺甲基醚(NH-CH(OMe))，該位置為負責使DNA烷基化之親電子中心。
PBD之生物活性可藉由將兩個PBD單體或單位通常經其C8/C8'-羥基官能基經由可撓性伸烷基連接子連接在一起來增強。
在本文之實施例中之任一者的一個態樣中，吡咯并苯并二氮呯單體或單元為 吡咯并 [ 2 , 1 - c ][ 1 , 4 ] 苯并二氮呯。在本文之實施例中之任一者的一個態樣中，吡咯并苯并二氮呯二聚體為C8/C8'所連接之 吡咯并 [2,1-c][1,4] 苯并二氮呯二聚體。
PBD可經由任何適合之位置連接至連接子。舉例而言，PBD可經由下文所示之PBD單元中的位置中之任一者連接至連接子。
在一個實施例中，PBD二聚體包含下文通式之結構，其中例示性連接點指向化合物內由箭頭指示之其他取代基或官能基： 其中： R 12及R 12 '及/或R 2及R 2 '分別共同形成雙鍵=CH 2或=CH-CH 3；或 R 2 '及R 12 '為不存在且R 2及R 12係獨立地選自： (iia) C 1-5飽和脂族烷基； (iib) C 3-6飽和環烷基； (iic) ， 其中R 21、R 22及R 23中之各者係獨立地選自H、C 1 - 3飽和烷基、C 2 - 3烯基、C 2 - 3炔基及環丙基，其中R 12基團中之碳原子的總數目不超過5； (iid) ， 其中R 25a及R 25b中之一者為H且另一者係選自： 苯基，該苯基視情況經選自鹵基、甲基、甲氧基之基團取代；吡啶基；及苯硫基；及 (iie) ， 其中R 24係選自：H；C 1 - 3飽和烷基；C 2 - 3烯基；C 2 - 3炔基；環丙基；苯基，該苯基視情況經選自鹵基、甲基、甲氧基之基團取代；吡啶基；及苯硫基； R 6及R 9係獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH 2、NHR、NRR'、硝基、Me 3Sn及鹵基；其中R及R'係獨立地選自視情況經取代之C 1 - 12烷基、C 3 - 20雜環基及C 5 - 20芳基； R 7係選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH 2、NHR、NHRR'、硝基、Me 3Sn及鹵基； 抑或： (a) R 10為H，且R 11為OH、OR A，其中R A為烷基； (b) R 10及R 11在其所結合之氮與碳原子之間形成氮-碳雙鍵；或 (c) R 10為H且R 11為SO zM，其中z為2或3且M為醫藥學上可接受之單價陽離子； R"為C 3 - 12伸烷基，其鏈可間雜有一或多個雜原子(例如O、S、NR N2(其中R N2為H或C 1 - 4烷基))及/或芳族環(例如苯或吡啶)； Y及Y'係選自O、S或NH；及 R 6 '、R 7 '、R 9 '係分別選自與R 6、R 7及R 9相同之基團，且R 10 '及R 11 '與R 10及R 11相同，其中若R 11及R 11 '為SO zM，則M可表示醫藥學上可接受之二價陽離子。
在另一實例中，PBD二聚體包含下文通式之結構： 其中R 6、R 7、R 9、R 6 '、R 7 '、R 9 '、R 10、R 11、R 10 '及R 11 '係如上文所定義，且其中「K」環為經取代或未經取代之芳族環或非芳族環，視情況為6員環，視情況為苯基。
在一個實施例中，細胞毒性劑(Z)為喜樹鹼，例如其具有或包含喜樹鹼或喜樹鹼類似物之結構。喜樹鹼為熟知的，以及廣泛範圍之喜樹鹼類似物，其共用具有各種取代之核心環系統，但較佳在以下基本喜樹鹼結構之環A及/或B中具有修飾或取代： 環(A)       (B)     (C)    (D)      (E)。
已報導許多喜樹鹼類似物，包括拓朴替康、伊立替康、依沙替康、DXd、9-胺基喜樹鹼、9-硝基喜樹鹼、10-羥基喜樹鹼、勒托替康、喜樹鹼、吉馬替康、貝洛替康及盧比替康。其他喜樹鹼類似物揭示於Li等人, ACS Med. Chem. Lett. 2019, 10, 10, 1386-1392, Jpn. J. Cancer Res. 86: 776-782及Takiguchi等人1997 Jpn. J. Cancer Res. 88: 760-769中，該等文獻之揭示內容以引用之方式併入本文中。FDA已批准四種類似物：拓朴替康、伊立替康、貝洛替康及DXd (作為曲妥珠單抗德魯替康之部分)。在一個實施例中，喜樹鹼類似物為五環化合物(例如，喜樹鹼缺少F環)。在一個實施例中，喜樹鹼類似物為例如包含F環之六環化合物。
一些實例，諸如基本喜樹鹼結構、SN-38分子(7-乙基-10-羥基喜樹鹼；伊立替康之活性代謝物)及揭示於Li等人, ACS Med. Chem. Lett. 2019, 10, 10, 1386-139中之喜樹鹼類似物具有五個環(A、B、C、D及E環)且可例如經由B環上之取代基連接至連接子(例如間隔子Y或Y'，或連接子X)。 SN-38: 。
Li等人, ACS Med. Chem. Lett. 2019, 10, 10, 1386-139之化合物： 。
視情況地，喜樹鹼類似物為六環化合物(另外之F環)，其中化合物係經由此類F環上之取代基連接至連接子。此類六環化合物之實例包括(但不限於) DXd (CAS號：1599440-33-1)及依沙替康。
因此，喜樹鹼類似物包括依沙替康、SN-38及包含此類部分之一系列分子中之任一者，例如依沙替康可未經取代或可在位置1之胺處經取代，例如其中取代基為或包含-C(=O)-、-O-C(=O)-、-O-CH 2-C(=O)-、HO-O-CH 2-C(=O)-、-CH 2CH 2-C(=O)-、-CH 2CH 2CH 2-C(=O)-、-CH 2-O-CH 2-C(=O)-、-CH 2CH 2-O-CH 2-C(=O)-基團或美國專利第6,835,807號中所示之其他基團，該專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一個實施例中，本發明之抗體在存在表現粘附分子-4之腫瘤細胞的情況下(例如在酶裂解可裂解部分，隨後進行間隔子Y'之自消除後)活體內或活體外釋放具有化合物1之結構的依沙替康分子。
喜樹鹼衍生物或類似物依沙替康描述於Mitsui等人1995 Jpn. J. Cancer Res. 86: 776-782及Takiguchi等人1997 Jpn. J. Cancer Res. 88: 760-769中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。依沙替康之結構展示於下文之化合物1a中： 化合物1a。
依沙替康可經由在位置1處之胺基之氮原子與連接子偶合，從而使得依沙替康部分在與連接子結合或存在於連接子-依沙替康分子((X-Z)分子)內時，例如與抗體結合時，依沙替康將具有化合物1b之結構： 化合物1b。
因此，應理解，在化合物1a之依沙替康經由在位置1處之胺連接至連接子時(及例如在連接子繼而連接至抗體時)，依沙替康應理解為在位置1處之經修飾之基團(亦即在位置1處之NH 2基團經NH置換，或替代地，經OH或O基團置換)。舉例而言，依沙替康可經由包含可裂解寡肽之連接子與抗體偶合。實例包括二肽、三肽、四肽及五肽，諸如美國專利第6,835,807號中所示之含有甘胺酸及苯丙胺酸之肽，或連接至PAB分子之二肽纈胺酸-瓜胺酸或纈胺酸-丙胺酸，或該專利案之揭示內容以引用之方式併入本文中。已知各種適合之連接子-Z結構可在位置1之胺基處釋放活性依沙替康或依沙替康衍生物。依沙替康可經由連接至位置1之胺的對-胺基苯甲氧基羰基(PAB)連接至可裂解寡肽，如式VII、VIII及IX中或實例7之(PEG(8U)-Val-Ala-PAB-依沙替康)連接子中所示，其裂解後引起具有化合物1a之結構的依沙替康釋放。在一個實例中，依沙替康可經由連接至位置1之胺的(CH 2-C(=O) )基團連接至可裂解寡肽，如式III及化合物13 (Dxd)中以及實例7之ggfg-Dxd連接子中所示，其裂解後引起含有依沙替康之化合物13 (Dxd)釋放。在化合物1之依沙替康的位置1之NH或NH 2處之取代基的實例包括-C(=O)-、-O-C(=O)-，或包含(CH 2-C(=O))之基團，諸如-O-CH 2-C(=O)-、HO-O-CH 2-C(=O)-、-CH 2CH 2-C(=O)-、-CH 2CH 2CH 2-C(=O)-、-CH 2-O-CH 2-C(=O)-及-CH 2CH 2-O-CH 2-C(=O)-。
在一個實施例中，經取代之依沙替康衍生物(例如在位置1處衍生)具有化合物13之結構。
Dxd之結構展示如下： 。
Dxd可經由末端處/碳鏈之氧原子與連接子偶合，從而使得Dxd部分在結合至連接子或存在於連接子-Dxd分子((X-Z)分子)內時，例如與抗體結合時，碳鏈-末端OH將由O置換。
在一個實施例中，連接子部分(X-Z)為或包含下文之式VII中所示之結構，其中(Y)為間隔子，其包含(例如在其末端處)反應性基團(R)與胺基酸殘基之反應的殘基，該胺基酸殘基例如抗體上(例如，在一或多個離胺酸殘基之ε胺基、一或多個麩胺酸或天冬胺酸殘基之游離羧酸基上，或至一或多個半胱胺醯基殘基之S原子)之游離胺基、羥基、硫氫基或羧基。經包含式VII之結構的連接子或化合物3或4官能化之抗粘附分子-4結合蛋白將釋放或產生(例如在胞內，在存在表現粘附分子-4之腫瘤細胞的情況下)具有化合物1a之結構的化合物。 式VII
具有順丁烯二醯亞胺作為R基團之例示性連接子可具有下文之化合物3之結構。此類連接子可在用還原劑(例如參(2-羧乙基)膦鹽酸鹽)還原鏈間二硫鍵之後，經由抗體中之半胱胺酸殘基與抗體結合。 化合物3
所得抗體-藥物結合物將包含抗體，該抗體包含經具有化合物3之結構的化合物官能化之一個或複數個半胱胺酸殘基(其中化合物3經由半胱胺酸殘基之S原子結合)。
在另一實施例中，連接子可具有一級胺作為R基團，且當在存在麩醯胺酸轉胺酶之情況下與抗體反應時，可產生包含經連接子官能化之一個或複數個受體麩醯胺酸殘基的抗體。舉例而言，連接子(X-Z)或經其官能化之抗體具有或包含下文展示為化合物4之結構： 化合物4。
在一個實施例中，連接子部分(X-Z)為或包含下文之式VIII中所示之結構，其中(Y)為間隔子，其包含(例如在其末端處)反應性基團(R)與胺基酸殘基之反應的殘基，該胺基酸殘基例如抗體上(例如，在一或多個離胺酸殘基之ε胺基、一或多個麩胺酸或天冬胺酸殘基之游離羧酸基上，或至一或多個半胱胺醯基殘基之S原子)之游離胺基、羥基、硫氫基或羧基，或例如醣基化胺基酸殘基之聚糖結構(例如結合至抗體之Kabat殘基N297之天然、經截短或以其他方式修飾之N-聚糖)。經包含式VIII之結構的連接子或化合物5、6或7官能化之抗粘附分子-4結合蛋白將釋放或產生(例如在胞內，在存在表現粘附分子-4之腫瘤細胞的情況下)具有化合物Ia之結構的化合物。 式VIII
具有順丁烯二醯亞胺作為R基團之例示性連接子可具有下文之化合物5或6之結構。此類連接子可在用還原劑還原鏈間二硫鍵之後，經由抗體中之半胱胺酸殘基與抗體結合。 化合物5 化合物6
在另一實施例中，連接子可具有一級胺作為R基團，且當在存在麩醯胺酸轉胺酶之情況下與抗體反應時，可產生包含經連接子官能化之一個或複數個受體麩醯胺酸殘基的抗體。舉例而言，連接子(X-Z)或經其官能化之抗體具有或包含下文展示為化合物7之結構： 化合物7。
在一個實施例中，連接子部分(X-Z)為或包含下文之式IX中所示之結構，其中(Y)為間隔子，其包含(例如在其末端處)反應性基團(R)與胺基酸殘基之反應的殘基，該胺基酸殘基例如抗體上(例如，在一或多個離胺酸殘基之ε胺基、一或多個麩胺酸或天冬胺酸殘基之游離羧酸基上，或至一或多個半胱胺醯基殘基之S原子)之游離胺基、羥基、硫氫基或羧基，或例如醣基化胺基酸殘基之聚糖結構(例如結合至抗體之Kabat殘基N297之天然、經截短或以其他方式修飾之N-聚糖)。經包含式IX之結構的連接子官能化之抗粘附分子-4結合蛋白將釋放(例如在胞內，在存在表現粘附分子-4之腫瘤細胞的情況下)具有化合物Ia之結構的化合物。 式IX
具有順丁烯二醯亞胺作為R基團之例示性連接子可具有下文之化合物8之結構。此類連接子可在用還原劑還原鏈間二硫鍵之後，經由抗體中之半胱胺酸殘基與抗體結合。 化合物8
在另一實施例中，連接子可具有一級胺作為R基團，且當在存在麩醯胺酸轉胺酶之情況下與抗體反應時，可產生包含經連接子官能化之一個或複數個受體麩醯胺酸殘基的抗體。舉例而言，連接子(X-Z)或經其官能化之抗體具有或包含下文展示為化合物9之結構： 化合物9。
在一個實施例中，連接子部分(X-Z)為或包含下文之式X中所示之結構，其中(Y)為間隔子，其包含(例如在其末端處)反應性基團(R)與胺基酸殘基之反應的殘基，該胺基酸殘基例如抗體上(例如，在一或多個離胺酸殘基之ε胺基、一或多個麩胺酸或天冬胺酸殘基之游離羧酸基上，或至一或多個半胱胺醯基殘基之S原子)之游離胺基、羥基、硫氫基或羧基，或例如醣基化胺基酸殘基之聚糖結構(例如結合至抗體之Kabat殘基N297之天然、經截短或以其他方式修飾之N-聚糖)。 式X
具有順丁烯二醯亞胺作為R基團之例示性連接子可具有下文之化合物10之結構。此類連接子可在用還原劑(例如參(2-羧乙基)膦鹽酸鹽)還原鏈間二硫鍵之後，經由抗體中之半胱胺酸殘基與抗體結合。 化合物10
在一個實施例中，連接子部分(X-Z)為或包含下文之式XI中所示之結構，其中(Y)為間隔子，其包含(例如在其末端處)反應性基團(R)與胺基酸殘基之反應的殘基，該胺基酸殘基例如抗體上(例如，在一或多個離胺酸殘基之ε胺基、一或多個麩胺酸或天冬胺酸殘基之游離羧酸基上，或至一或多個半胱胺醯基殘基之S原子)之游離胺基、羥基、硫氫基或羧基，或例如醣基化胺基酸殘基之聚糖結構(例如結合至抗體之Kabat殘基N297之天然、經截短或以其他方式修飾之N-聚糖)。 式XI
具有順丁烯二醯亞胺作為R基團之例示性連接子可具有下文之化合物11之結構。此類連接子可在用還原劑還原鏈間二硫鍵之後，經由抗體中之半胱胺酸殘基與抗體結合。 化合物11
在一個實施例中，連接子部分(X-Z)為或包含根據下文之式XII之結構，其中(Y)為間隔子，其包含(例如在其末端處)反應性基團(R)與胺基酸殘基之反應的殘基，該胺基酸殘基例如抗體上(例如，在一或多個離胺酸殘基之ε胺基、一或多個麩胺酸或天冬胺酸殘基之游離羧酸基上，或至一或多個半胱胺醯基殘基之S原子)之游離胺基、羥基、硫氫基或羧基，或例如醣基化胺基酸殘基之聚糖結構(例如結合至抗體之Kabat殘基N297之天然、經截短或以其他方式修飾之N-聚糖)。連接子可包含例如1至72、1至16、1至12、1至8、1至7、1至6、6至24、6、8、16、18或24個PEG單元。在下式中，PEG單元之數目n可為例如1至72、5至23、1至15、1至16、1至11、1至12、1至8、1至7、1至6、7、15、17或23。 式XII
在此類實施例中，包含具有順丁烯二醯亞胺作為R基團之連接子部分的免疫結合物或抗體-藥物結合物可具有式XII bis之結構，其中順丁烯二醯亞胺部分在用還原劑還原鏈間二硫鍵之後與抗體(Ab)之胺基酸(亦即半胱胺酸)之硫基(S)結合。 式XII bis
在其中胞內可裂解肽為纈胺酸-瓜胺酸之式XII的變異體中，包含具有順丁烯二醯亞胺作為R基團之連接子部分的免疫結合物或抗體-藥物結合物可具有式XIIter之結構， 式XIIter
具有順丁烯二醯亞胺作為R基團之例示性連接子可具有下文之化合物14a之結構。此類連接子可在用還原劑還原鏈間二硫鍵之後，經由抗體中之半胱胺酸殘基與抗體結合。在此實例中，連接子部分包含8個PEG單元。 化合物14a
根據此實例，包含此類連接子部分之一種免疫結合物或一種抗體-藥物結合物可具有下文之化合物14a bis之結構。 化合物14a bis
具有順丁烯二醯亞胺作為R基團之另一例示性連接子可具有下文之化合物14b之結構。此類連接子可在用還原劑還原鏈間二硫鍵之後，經由抗體中之半胱胺酸殘基與抗體結合。在此實例中，連接子部分包含7個PEG單元。 化合物14b
根據此實例，包含此類連接子部分之一種免疫結合物或一種抗體-藥物結合物可具有下文之化合物14b bis之結構。 化合物14b bis
具有順丁烯二醯亞胺作為R基團之另一例示性連接子可具有下文之化合物14c之結構。此類連接子可在用還原劑還原鏈間二硫鍵之後，經由抗體中之半胱胺酸殘基與抗體結合。在此實例中，連接子部分包含16個PEG單元。 化合物14c
根據此實例，包含此類連接子部分之免疫結合物或抗體-藥物結合物可具有下文之化合物14c bis之結構。 化合物14c bis
在一個實施例中，連接子部分(X-Z)為或包含根據下文之式XIII之結構，其中(Y)為間隔子，其包含(例如在其末端處)反應性基團(R)與胺基酸殘基之反應的殘基，該胺基酸殘基例如抗體上(例如，在一或多個離胺酸殘基之ε胺基、一或多個麩胺酸或天冬胺酸殘基之游離羧酸基上，或至一或多個半胱胺醯基殘基之S原子)之游離胺基、羥基、硫氫基或羧基，或例如醣基化胺基酸殘基之聚糖結構(例如結合至抗體之Kabat殘基N297之天然、經截短或以其他方式修飾之N-聚糖)。連接子可包含例如1至72、1至16、1至12、1至8、1至7、1至6、6至24、8、16、18或24個PEG單元。在下式中，PEG單元之數目n可為例如1至72、5至23、1至15、1至16、1至11、1至12、1至8、1至7、1至6、7、15、17或23。 式XIII
在此類實施例中，包含具有順丁烯二醯亞胺作為R基團之連接子部分的免疫結合物或抗體-藥物結合物可具有以下式XIII bis，其中順丁烯二醯亞胺部分在用還原劑還原鏈間二硫鍵之後與抗體(Ab)之胺基酸(亦即半胱胺酸)之硫基(S)結合。 式XIII bis
具有順丁烯二醯亞胺作為R基團之例示性連接子可具有下文之化合物15a之結構。此類連接子可在用還原劑還原鏈間二硫鍵之後，經由抗體中之半胱胺酸殘基與抗體結合。在此實例中，連接子部分包含8個PEG單元。 化合物15a
根據此實例，包含此類連接子部分之免疫結合物或抗體-藥物結合物可具有下文之化合物15a bis之結構。 化合物15a bis
具有順丁烯二醯亞胺作為R基團之另一例示性連接子可具有下文之化合物15b之結構。此類連接子可在用還原劑還原鏈間二硫鍵之後，經由抗體中之半胱胺酸殘基與抗體結合。在此實例中，連接子部分包含7個PEG單元。 化合物15b
根據此實例，包含此類連接子部分之免疫結合物或抗體-藥物結合物可具有下文之化合物15b bis之結構。 化合物15b bis
在一個實施例中，連接子部分(X-Z)為或包含根據下文之式XIV之結構，其中(Y)為間隔子，其包含(例如在其末端處)反應性基團(R)與胺基酸殘基之反應的殘基，該胺基酸殘基例如抗體上(例如，在一或多個離胺酸殘基之ε胺基、一或多個麩胺酸或天冬胺酸殘基之游離羧酸基上，或至一或多個半胱胺醯基殘基之S原子)之游離胺基、羥基、硫氫基或羧基，或例如醣基化胺基酸殘基之聚糖結構(例如結合至抗體之Kabat殘基N297之天然、經截短或以其他方式修飾之N-聚糖)。在下式中，PSAR單元之數目n可為例如1至72、1至24、1至16、1至10、1至12、1至8、1至6、8、16、18或24。 式XIV
具有順丁烯二醯亞胺作為R基團之例示性連接子可具有下文之化合物16之結構。此類連接子可在用還原劑還原鏈間二硫鍵之後，經由抗體中之半胱胺酸殘基與抗體結合。 化合物16
根據此實例，包含此類連接子部分之免疫結合物或抗體-藥物結合物可具有以下化合物16 bis之結構。 化合物16 bis
在另一實施例中，連接子可具有一級胺作為R基團，且當在存在麩醯胺酸轉胺酶之情況下與抗體反應時，可產生包含經連接子官能化之一個或複數個受體麩醯胺酸殘基的抗體。舉例而言，連接子(X-Z)或經其官能化之抗體具有或包含下文展示為化合物12之結構： 化合物12。
經式XI之含有寡肽之連接子或化合物11及12官能化之抗粘附分子-4結合蛋白引起經取代之依沙替康釋放(例如在胞內，在存在表現粘附分子-4之腫瘤細胞的情況下)，該經取代之依沙替康具有存在於位置1之胺處之OH-CH2-C(=O)取代基，如下文結構中所示： 化合物13 (Dxd)。
當製備為具有一級胺之結構時，式III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII或XIV之例示性連接子可在存在麩醯胺酸轉胺酶(例如細菌麩醯胺酸轉胺酶(Bacterial Transglutaminase)，BTG)之情況下與抗體反應，從而使得麩醯胺酸轉胺酶催化連接子與在抗體之一級結構內(例如在免疫球蛋白恆定域內或在插入或附加至(例如稠合至)恆定區之TG酶識別標籤內)之受體麩醯胺酸殘基的結合。用於由BTG介導之與抗體之結合中的方法及連接子描述於PCT公開案第WO2014/202773號中，其揭示內容以引用之方式併入。由BTG催化之結合允許精確控制組合物中之平均藥物:抗體比率。可與「TG酶」或「TG」互換使用之術語「麩醯胺酸轉胺酶」係指能夠經由結合肽之麩醯胺酸之γ-甲醯胺基與離胺酸或結構上相關之一級胺(諸如胺基戊基)的ε-胺基(例如結合肽之離胺酸)之間的醯基轉移反應來交聯蛋白質之酶，其產生ε-(γ-麩胺醯基)離胺酸異肽鍵。TG酶尤其包括細菌麩醯胺酸轉胺酶(BTG)，諸如具有EC參考號EC 2.3.2.13之酶(蛋白質-麩醯胺酸-γ-麩胺醯基轉移酶)。當提及抗體之麩醯胺酸殘基時，術語「受體麩醯胺酸」殘基意謂麩醯胺酸殘基，其係由TG酶識別且可藉由TG酶經由麩醯胺酸與離胺酸或結構上相關之一級胺(諸如胺基戊基)之間的反應交聯。受體麩醯胺酸殘基較佳為表面暴露之麩醯胺酸殘基。術語「TG酶識別標籤」係指包含受體麩醯胺酸殘基之胺基酸序列，且當在適合條件下併入至(例如附加至)多肽序列中時，其係由TG酶識別且藉由TG酶經由胺基酸序列內之胺基酸側鏈與反應搭配物之間的反應產生交聯。識別標籤可為非天然存在於包含酶識別標籤之多肽中的肽序列。TG酶識別標籤之實例包括WO2012/059882及WO2014/072482中所揭示之胺基酸序列。
如WO2013/092983及WO2020/188061中所例示，其揭示內容以引用之方式併入本文中，連接子-藥物部分(X-Z)可在兩步法中與抗體中之麩醯胺酸殘基(受體麩醯胺酸)結合，該方法包含第一步驟，其中包含一級胺及第一反應性基團(R)之部分在存在BTG之情況下與抗體結合，隨後進行使抗體-連接子結合物與分子反應之步驟，該分子包含(i)與第一反應性基團具有反應性之第二反應性基團(R')及(ii)細胞毒性劑(Z)。反應性基團對R及R'之實例包括能夠進行雙正交反應之一系列基團，該雙正交反應例如在迭氮化物與環辛炔之間(不含銅之點擊化學)、在硝酮與環辛炔之間的1,3-偶極子環加成、由醛及酮形成肟/腙及四𠯤接合(亦參見WO2013/092983)。因此，所得連接子及經官能化之抗體或其Y元件可包含由R與R'之反應產生之RR'基團，例如三唑。
抗粘附分子-4免疫結合物可以1 mg/ml至500 mg/ml之濃度併入醫藥調配物中，其中該調配物具有2.0至10.0之pH。調配物可進一步包含緩衝液系統、防腐劑、張力劑、螯合劑、穩定劑及界面活性劑。在一個實施例中，醫藥調配物為水性調配物，亦即包含水之調配物。此類調配物通常為溶液或懸浮液。在另一實施例中，醫藥調配物為水性溶液。術語「水性調配物」定義為包含至少50% w/w水之調配物。同樣地，術語「水性溶液」定義為包含至少50% w/w水之溶液，且術語「水性懸浮液」定義為包含至少50% w/w水之懸浮液。
在另一實施例中，醫藥調配物為冷凍乾燥之調配物，醫師或患者在使用之前向其添加溶劑及/或稀釋劑。
在另一實施例中，醫藥調配物為無需任何先前溶解之即用型乾燥調配物(例如冷凍乾燥或噴霧乾燥)。
在另一態樣中，醫藥調配物包含此類抗體之水性溶液及緩衝液，其中抗體係以1 mg/ml或更高之濃度存在，且其中該調配物具有約2.0至約10.0之pH。
在另一實施例中，調配物之pH在選自由以下組成之清單的範圍內：約2.0至約10.0、約3.0至約9.0、約4.0至約8.5、約5.0至約8.0及約5.5至約7.5。
在另一實施例中，緩衝液係選自由以下組成之群：乙酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、甘胺醯甘胺酸、組胺酸、甘胺酸、離胺酸、精胺酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉及tris(羥甲基)-胺基甲烷、二甘胺酸、麥黃酮、蘋果酸、丁二酸鹽、順丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、天冬胺酸或其混合物。此等特定緩衝液中之各者構成本發明之替代性實施例。
在另一實施例中，調配物進一步包含醫藥學上可接受之防腐劑。在另一實施例中，調配物進一步包含等張劑。在另一實施例中，調配物亦包含螯合劑。在本發明之另一實施例中，調配物進一步包含穩定劑。在另一實施例中，調配物進一步包含界面活性劑。為方便起見，參考Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995。
其他成分可存在於本發明之醫藥調配物中為可能的。此類額外成分可包括濕潤劑、乳化劑、抗氧化劑、增積劑、張力調節劑、螯合劑、金屬離子、油性媒劑、蛋白質(例如人類血清白蛋白、明膠或蛋白質)及兩性離子(例如胺基酸，諸如甜菜鹼、牛磺酸、精胺酸、甘胺酸、離胺酸及組胺酸)。當然，此類額外成分不應不利地影響本發明之醫藥調配物之整體穩定性。
根據本發明之醫藥組合物之投與可經由若干種投藥途徑，例如靜脈內投與進行。亦可藉由用其他已開發之治療性ADC檢查經歷來測定適合之抗體調配物。
在任何實施例中，組合物之特徵可為包含複數個本發明之粘附分子-4結合免疫結合物，其中樣品中至少70%、80%、90%、95%、98%或99%之免疫結合物具有每個抗體至少4、6或8個胺基酸殘基，該等胺基酸殘基經本文中所揭示之連接子官能化。在任何實施例中，組合物之特徵可為包含複數個本發明之粘附分子-4結合免疫結合物，其中樣品中至少70%、80%、90%、95%、98%或99%之免疫結合物具有每個抗體至少2、4、6或8個胺基酸殘基，該等胺基酸殘基經連接子-喜樹鹼部分，例如本文之式之(X-Z)單元或(-(Y) - (Pep) - (Y') - (Z))單元官能化。在任何實施例中，組合物之特徵可為包含複數個本發明之粘附分子-4結合免疫結合物，其中樣品中至少70%、80%、90%、95%、98%或99%之免疫結合物具有每個抗體相同數目之經官能化之胺基酸，視情況其中數目為4、6或8。
惡性腫瘤之診斷、預後及治療在一些態樣中，描述適用於診斷、預後、監測及治療癌症之方法以及抗體、抗體片段及免疫結合物，該癌症係以表面上表現粘附分子-4之腫瘤細胞為特徵。在治療方法中，治療包含向人類受試者或個體投與本發明之抗體。在一些實施例中，提供用於改良細胞毒性劑(尤其喜樹鹼類似物)遞送至粘附分子-4陽性腫瘤之改良方法。細胞毒性劑之改良遞送可為抗體介導抑制叢集形成及/或表現粘附分子-4之腫瘤細胞之非錨定依賴性生長的的結果，其使得細胞毒性劑及/或包含此類藥劑之ADC對腫瘤的滲透得到改良。用本發明之ADC進行之治療尤其有利於治療具有較低或異質粘附分子-4表現之疾病、有利於患有尤其耐藥之疾病的患者或其他ADC不適用之患者、及/或有利於與作為單一藥劑介導毒性之其他治療劑(例如化學治療劑)組合使用。
在一個實施例中，抗粘附分子-4抗體或抗體片段可適用於使腫瘤對細胞毒性劑或化學治療劑敏感。與抗癌劑自身相比，抗粘附分子-4抗體可藉由降低癌細胞之化學抗性而適用於增強或促進抗癌劑對癌症之毒性。包含抗粘附分子-4抗體或抗體片段之癌症敏感性組合物可適用於使腫瘤(例如表現Pgp之腫瘤)對抗癌劑敏感，以降低化學抗性並改善抗癌劑之治療作用。
在一個實施例中，本發明之抗粘附分子-4抗體或抗體片段可指定為用於與化學治療劑組合以治療人類個體中之腫瘤，其中抗粘附分子-4抗體、抗體片段及化學治療劑經調配以用於單獨投與且同時或依序投與。舉例而言，治療可包含向個體投與有效量之以下中之各者：(a)本發明之抗粘附分子-4抗體或抗體片段；及(b)抗癌劑，視情況為化學治療劑(視情況為已知能夠藉由P-醣蛋白(Pgp)輸送的化學治療劑)，視情況為蒽環黴素、長春花生物鹼、依託泊苷、紫杉烷、鉑化合物或視情況為喜樹鹼。
在一個實施例中，抗體或抗體片段係與細胞毒性劑(例如喜樹鹼、依沙替康或SN-38分子)結合。抗體或抗體片段通常與複數個細胞毒性劑(例如喜樹鹼類似物、依沙替康)分子結合。細胞毒性劑，例如喜樹鹼或依沙替康，可經由包含蛋白酶可裂解寡肽連接子之連接子(例如式VII至XIV中之任一者的連接子-毒素)與抗體結合。例示性醫藥組合物可包含每個抗體分子平均1至8個細胞毒性劑分子(例如喜樹鹼衍生物、依沙替康、式VII至XIV中之任一者之連接子-毒素)，視情況每個抗體分子2至8、4至8、6至8個細胞毒性劑分子，或例如每個抗體分子約2、4、5、6、7或8個細胞毒性劑分子。當抗體或抗體片段與依沙替康結合(亦即經由連接子，例如式VII至XIV中之任一者之連接子-毒素)時，此類免疫結合物尤其有利於治療表現Pgp之腫瘤(例如以Pgp (MDR1)之表現為特徵之腫瘤)。以Pgp之表現為特徵之腫瘤包括用化學治療劑及ADC治療後的腫瘤，例如已展示用包含奧瑞他汀(MMAE)有效負載之ADC治療誘導腫瘤上之Pgp表現。另外，以天然Pgp/MDR1表現為特徵之一系列腫瘤為已知的，例如腎癌、腎上腺皮質癌、膽管癌、肝癌、直腸癌、結腸癌、腦癌、胰臟癌、前列腺癌、間皮瘤、胃癌、AML、甲狀腺癌、DLBC、食道癌、乳癌、肉瘤、睾丸癌、子宮癌、胸腺瘤、宮頸癌、肺癌、膀胱癌(例如尿道上皮癌)及頭頸部鱗狀細胞癌存在顯著的MDR1表現量。
結合至細胞毒性劑之粘附分子-4結合劑(例如，抗粘附分子-4抗體或抗體片段)可有利地用於治療患有表現粘附分子-4之癌症的個體，該癌症係以(例如在腫瘤細胞膜或細胞表面處)表現粘附分子-4之腫瘤細胞為特徵。此類癌症之實例為尿道上皮癌、乳癌(例如三陰性乳癌；HER2-陽性乳癌))、非小細胞肺癌、胰臟癌、卵巢癌、胃癌、結腸直腸癌(例如結腸癌)、頭頸部鱗狀細胞癌及食道癌。
結合至細胞毒性劑之粘附分子-4結合劑可用於高度表現粘附分子-4之腫瘤中。
結合至細胞毒性劑之粘附分子-4結合劑亦可用於異質及/或低粘附分子-4表現之腫瘤中。在此類腫瘤中，本發明之免疫結合物可視情況經由避免MDR1介導之抗性及/或旁觀者抗腫瘤作用來提供有利功效。
結合至細胞毒性劑之粘附分子-4結合劑可有利地用於治療個體而不考慮粘附分子-4表現量，不考慮個體內之腫瘤細胞上之粘附分子-4表現量的異質性，及/或不考慮個體先前是否已用恩弗妥單抗維多汀治療。在細胞毒性劑為依沙替康時，結合至細胞毒性劑之粘附分子-4結合劑亦可有利地用於治療個體而不考慮腫瘤Pgp表現及/或不考慮個體先前是否已用包含能夠藉由Pgp進行輸送之細胞毒性劑的ADC (例如，包含結合至除依沙替康以外之喜樹鹼類似物之抗粘附分子-4抗體的ADC、包含結合至Dxd (例如經由含有GGFG之連接子)之抗粘附分子-4抗體或結合至奧瑞他汀、蒽環黴素、長春花生物鹼、依託泊苷、紫杉烷或鉑化合物之抗粘附分子-4抗體的ADC)治療。
在一個實施例中，結合至喜樹鹼衍生物分子之粘附分子-4結合劑可有利地用於治療先前已用恩弗妥單抗維多汀治療之個體。此類個體可視情況患有癌症，該癌症係以恩弗妥單抗維多汀治療後的表現異質及/或低粘附分子4之腫瘤為特徵。此類個體可視情況患有癌症，該癌症係以恩弗妥單抗維多汀治療後的表現Pgp之腫瘤為特徵。儘管用結合至奧瑞他汀或MMAE分子之抗體(例如恩弗妥單抗維多汀)治療(例如在該治療期間或之後)，個體可患有具有抗性、尚未有反應、已復發及/或惡化之癌症。舉例而言，個體可患有局部晚期或轉移性尿道上皮癌，且先前已接受用結合至奧瑞他汀或MMAE分子之抗體(例如恩弗妥單抗維多汀)治療。
在一個實施例中，包含經由連接子結合至依沙替康之粘附分子-4結合劑的免疫結合物有利地用於治療先前已用免疫結合物治療之個體，該免疫結合物包含經由連接子結合至能夠藉由Pgp進行輸送之細胞毒性劑的粘附分子-4結合劑。在一個實施例中，包含經由連接子與依沙替康結合之粘附分子-4結合劑的免疫結合物有利地用於治療患有癌症之個體，該癌症係以免疫結合物治療後的表現異質及/或低粘附分子4之腫瘤為特徵，該免疫結合物包含經由連接子與能夠藉由Pgp輸送之細胞毒性劑結合之粘附分子-4結合劑。在一個實施例中，包含經由連接子與依沙替康結合之粘附分子-4結合劑的免疫結合物有利地用於治療患有癌症之個體，儘管用經由連接子與能夠藉由Pgp輸送之細胞毒性劑結合的粘附分子-4結合劑治療(例如在該治療期間或之後)，該癌症仍具有抗性、尚未有反應、已復發及/或惡化。視情況地，經由連接子與能夠藉由Pgp輸送之細胞毒性劑結合的粘附分子-4結合劑包含經由連接子與喜樹鹼類似物結合的抗粘附分子-4抗體，以便在連接子裂解後釋放除依沙替康以外之喜樹鹼類似物(例如Dxd或德魯替康)。視情況地，經由連接子與能夠藉由Pgp輸送之細胞毒性劑結合的粘附分子-4結合劑包含與Dxd結合(例如經由含有GGFG之連接子)之抗粘附分子-4抗體。視情況地，經由連接子與能夠藉由Pgp輸送之細胞毒性劑結合的粘附分子-4結合劑包含與奧瑞他汀、蒽環黴素、長春花生物鹼、依託泊苷、紫杉烷或鉑化合物結合之抗粘附分子-4抗體。視情況地，經由連接子與能夠藉由Pgp輸送之細胞毒性劑結合的粘附分子-4結合劑包含結合至粘附分子-4之IgV域之抗粘附分子-4抗體。視情況地，經由連接子與能夠藉由Pgp輸送之細胞毒性劑結合的粘附分子-4結合劑包含結合至粘附分子-4之VC1橋接域之抗粘附分子-4抗體。在一個實施例中，包含經由連接子與依沙替康結合之粘附分子-4結合劑的免疫結合物包含連接子，其具有在裂解後引起依沙替康釋放之酶可裂解部分(及視情況存在之自分解間隔子)。
在晚期復發性或轉移性尿道上皮癌中，顯著比例之個體將在腫瘤細胞上表現高水平之粘附分子-4，例如H評分為至少290 (參見EV-201臨床試驗第1組粘附分子-4表現)。然而，患者之子集具有低於250之H評分，且一些患者低於200。少數患者具有低於150之H評分，其中一些患者具有低於100之H評分。在三陰性乳癌(TNBC)中，已報導62%之患者在腫瘤細胞上具有高粘附分子-4表現且38%在腫瘤細胞上具有低粘附分子-4表現(Rabat等人, 2017 Annals Onc. 28: 769-776)。在其他癌症類型中，粘附分子-4表現之中值H評分值通常低於UC，尤其非小細胞肺癌、胰臟癌、卵巢癌、頭頸部鱗狀細胞癌及食道癌中所觀測到的值。
在一個實施例中，根據本發明治療之個體患有晚期復發性或轉移性癌症，視情況患有晚期復發性或轉移性尿道上皮癌。
在一個實施例中，根據本發明治療之個體患有癌症(例如乳癌)，該癌症測試為對雌激素受體及/或孕酮受體呈陽性，且測試為對表皮生長因子受體2 (HER2)或過量HER2蛋白質呈陽性，視情況癌症測試為對HER2呈陽性但HER2係以低水平表現。
在一個實施例中，根據本發明治療之個體患有三陰性乳癌(TNBC)，例如測試為對雌激素受體、孕酮受體及過量HER2蛋白質呈陰性之乳癌。
在一個實施例中，根據本發明治療之個體患有測試為對HER2蛋白質呈陽性之癌症(例如乳癌)，視情況其中癌症表現過量HER2蛋白質(HER2過度表現)，視情況癌症表現低水平之HER2蛋白質(低於過量HER2表現)。在一個實施例中，個體用抗粘附分子-4 ADC與結合HER2多肽(例如曲妥珠單抗、帕妥珠單抗(pertuzumab))之藥劑(例如抗體)之組合治療；視情況其中結合HER2之藥劑為ADC；視情況其中結合HER2之抗體係結合至細胞毒性劑，視情況為奧瑞他汀、類美登素(例如DM1)或喜樹鹼類似物(例如化合物1、2或13)組合；視情況其中結合HER2之抗體為曲妥珠單抗恩他新(trastuzumab emtansine)或曲妥珠單抗德魯替康(DS-8201a；Enhertu™)。
在一個實施例中，根據本發明治療之個體患有非小細胞肺癌，視情況患有肺腺癌。
在一個實施例中，根據本發明治療之個體患有胰臟癌。
在一個實施例中，根據本發明治療之個體患有卵巢癌。
在一個實施例中，根據本發明治療之個體患有頭頸部鱗狀細胞癌。
在一個實施例中，根據本發明治療之個體患有食道癌。
在一個實施例中，根據本發明治療之個體患有結腸直腸癌。如本文中所使用之結腸直腸癌(CRC)係指結腸癌、直腸癌及結腸直腸癌(結腸及直腸區域兩者之癌症)。
在一個實施例中，根據本發明治療之個體患有NSCLC或肺腺癌、胃癌、結腸直腸癌、胰臟癌、尿道上皮癌或膀胱癌，其測試為對HER2蛋白質呈陽性，視情況其中癌症表現過量HER2蛋白質(HER2過度表現)，視情況癌症表現低水平之HER2蛋白質(低於過量HER2表現)。在一個實施例中，個體用根據本發明之抗粘附分子-4 ADC與結合HER2多肽(例如包含曲妥珠單抗或帕妥珠單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區的抗體)之藥劑(例如抗體)之組合治療；視情況其中結合HER2之藥劑為ADC；視情況其中結合HER2之抗體係結合至細胞毒性劑，視情況為奧瑞他汀、類美登素(例如DM1)或喜樹鹼類似物(例如化合物1、2或13)；視情況其中結合Her2之抗體為曲妥珠單抗恩他新或曲妥珠單抗德魯替康(DS-8201a)。
如本文中所示，在裂解後(例如在裂解包含細胞毒性劑Z之胞內可裂解連接子後)釋放依沙替康之ADC尤其有利於用連接子治療對ADC具有抗性之腫瘤，該等連接子在裂解後釋放藉由Pgp輸送之細胞毒性劑(除依沙替康以外)，例如奧瑞他汀或Dxd。因此，在一個實施例中，在用抗粘附分子-4結合劑(例如抗粘附分子-4 ADC)與抗HER2 ADC之組合治療HER2陽性癌症時，抗HER2 ADC可經設計以在裂解後(例如在裂解包含細胞毒性劑Z之胞內可裂解連接子後)釋放依沙替康。抗粘附分子-4結合劑(例如抗粘附分子-4 ADC)可經設計以在裂解後(例如在裂解包含細胞毒性劑Z之胞內可裂解連接子後)釋放依沙替康，或可釋放任何其他細胞毒性劑(Z)，例如其中Z為紫杉烷、蒽環黴素、喜樹鹼、埃博黴素、絲裂黴素、康普瑞汀、長春花生物鹼、氮芥、類美登素、倍癌黴素、特吡萊辛、海兔毒素、奧瑞他汀、烯二炔、吡咯并苯并二氮呯、毒傘毒素或伸乙基亞胺。
因此，在一個態樣中，本發明提供一種結合人類粘附分子-4多肽之免疫結合物，其用於治療癌症(例如，HER2陽性粘附分子-4陽性癌症)，其中結合人類粘附分子-4多肽之免疫結合物係由下式表示： Ab N4-(X N4-(Z N4)) 其中， Ab N4為特異性結合至人類粘附分子-4多肽之多肽、肽或抗體； X N4為連接Ab N4與Z N4之分子，其中X N4包含可裂解部分，例如在生理條件下，視情況在胞內條件下，視情況包含蛋白酶可裂解二肽、三肽、四肽或五肽；及 Z N4包含細胞毒性劑； 其中結合人類粘附分子-4多肽之免疫結合物與由下式表示之結合人類HER2多肽的免疫結合物組合使用： Ab HER2-(X HER2-(Z HER2)) 其中， Ab HER2為特異性結合至人類HER2多肽之多肽、肽或抗體，視情況其中Ab HER2包含曲妥珠單抗或帕妥珠單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區； X HER2為連接Ab HER2與Z HER2之分子，其中X HER2包含可裂解部分，例如在生理條件下，視情況在胞內條件下，視情況包含蛋白酶可裂解二肽、三肽、四肽或五肽；及 Z HER2為依沙替康。結合人類HER2多肽之免疫結合物在可裂解部分裂解後釋放依沙替康。視情況地，Z N4為依沙替康，視情況結合人類粘附分子-4多肽之免疫結合物在可裂解部分裂解後釋放依沙替康。
此外，在一個態樣中，本發明提供一種結合人類HER2多肽之免疫結合物，其用於治療癌症(例如，HER2陽性粘附分子-4陽性癌症)，其中結合人類HER2多肽之免疫結合物係由下式表示： Ab HER2-(X HER2-(Z HER2)) 其中， Ab HER2為特異性結合至人類HER2多肽之多肽、肽或抗體，視情況其中Ab HER2包含曲妥珠單抗或帕妥珠單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區； X HER2為連接Ab HER2與Z HER2之分子，其中X HER2包含可裂解部分，例如在生理條件下，視情況在胞內條件下，視情況包含蛋白酶可裂解二肽、三肽、四肽或五肽；及 Z HER2為依沙替康； 其中結合人類HER2多肽之免疫結合物與由下式表示之結合人類粘附分子-4多肽的免疫結合物組合使用： Ab N4-(X N4-(Z N4)) 其中， Ab N4為特異性結合至人類粘附分子-4多肽之多肽、肽或抗體； X N4為連接Ab N4與Z N4之分子，其中X N4包含可裂解部分，例如在生理條件下，視情況在胞內條件下，視情況包含蛋白酶可裂解二肽、三肽、四肽或五肽；及 Z N4包含細胞毒性劑。結合人類HER2多肽之免疫結合物在可裂解部分裂解後釋放依沙替康。視情況地，Z N4為依沙替康，視情況結合人類粘附分子-4多肽之免疫結合物在可裂解部分裂解後釋放依沙替康。
因此，在一個態樣中，本發明提供一種結合人類粘附分子-4多肽之免疫結合物，其用於治療癌症(例如，TROP-2陽性粘附分子-4陽性癌症)，其中結合人類粘附分子-4多肽之免疫結合物係由下式表示： Ab N4-(X N4-(Z N4)) 其中， Ab N4為特異性結合至人類粘附分子-4多肽之多肽、肽或抗體； X N4為連接Ab N4與Z N4之分子，其中X N4包含可裂解部分，例如在生理條件下，視情況在胞內條件下，視情況包含蛋白酶可裂解二肽、三肽、四肽或五肽；及 Z N4包含細胞毒性劑； 其中結合人類粘附分子-4多肽之免疫結合物與由下式表示之結合人類TROP-2多肽的免疫結合物組合使用： Ab TROP-2-(X TROP-2-(Z TROP-2)) 其中， Ab TROP - 2為特異性結合至人類TROP-2多肽之多肽、肽或抗體，視情況其中Ab TROP - 2包含達博妥單抗(datopotamab)或戈沙妥珠單抗(sacituzumab)之重鏈及輕鏈CDR或可變區； X TROP - 2為連接Ab TROP - 2與Z TROP - 2之分子，其中X TROP - 2包含可裂解部分，例如在生理條件下，視情況在胞內條件下，視情況包含蛋白酶可裂解二肽、三肽、四肽或五肽；及 Z TROP - 2為依沙替康。結合人類TROP-2多肽之免疫結合物在可裂解部分裂解後釋放依沙替康。視情況地，Z N4為依沙替康，視情況結合人類粘附分子-4多肽之免疫結合物在可裂解部分裂解後釋放依沙替康。
此外，在一個態樣中，本發明提供一種結合人類TROP-2多肽之免疫結合物，其用於治療癌症(例如，TROP-2陽性粘附分子-4陽性癌症)，其中結合人類TROP-2多肽之免疫結合物係由下式表示： Ab TROP-2-(X TROP-2-(Z TROP-2)) 其中， Ab TROP - 2為特異性結合至人類TROP-2多肽之多肽、肽或抗體，視情況其中Ab TROP - 2包含達博妥單抗或戈沙妥珠單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區； X TROP - 2為連接Ab TROP - 2與Z TROP - 2之分子，其中X TROP - 2包含可裂解部分，例如在生理條件下，視情況在胞內條件下，視情況包含蛋白酶可裂解二肽、三肽、四肽或五肽；及 Z TROP - 2為依沙替康； 其中結合人類TROP-2多肽之免疫結合物與由下式表示之結合人類粘附分子-4多肽的免疫結合物組合使用： Ab N4-(X N4-(Z N4)) 其中， Ab N4為特異性結合至人類粘附分子-4多肽之多肽、肽或抗體； X N4為連接Ab N4與Z N4之分子，其中X N4包含可裂解部分，例如在生理條件下，視情況在胞內條件下，視情況包含蛋白酶可裂解二肽、三肽、四肽或五肽；及 Z N4包含細胞毒性劑。結合人類TROP-2多肽之免疫結合物在可裂解部分裂解後釋放依沙替康。視情況地，Z N4為依沙替康，視情況結合人類粘附分子-4多肽之免疫結合物在可裂解部分裂解後釋放依沙替康。
因此，在一個態樣中，本發明提供一種結合人類粘附分子-4多肽之免疫結合物，其用於治療癌症(例如，B7H3陽性粘附分子-4陽性癌症)，其中結合人類粘附分子-4多肽之免疫結合物係由下式表示： Ab N4-(X N4-(Z N4)) 其中， Ab N4為特異性結合至人類粘附分子-4多肽之多肽、肽或抗體； X N4為連接Ab N4與Z N4之分子，其中X N4包含可裂解部分，例如在生理條件下，視情況在胞內條件下，視情況包含蛋白酶可裂解二肽、三肽、四肽或五肽；及 Z N4包含細胞毒性劑； 其中結合人類粘附分子-4多肽之免疫結合物與由下式表示之結合人類B7H3多肽的免疫結合物組合使用： Ab B7H3-(X B7H3-(Z B7H3)) 其中， Ab B7H3為特異性結合至人類B7H3多肽之多肽、肽或抗體，視情況其中Ab B7H3包含依諾妥珠單抗(enoblituzumab)、伊夫利西單抗(ifinatamab)、米佐妥單抗(mirzotamab)、奧瑞達妥單抗(obrindatamab)、奧伯單抗(omburtamab)或沃布米妥單抗(vobramitamab)之重鏈及輕鏈CDR或可變區； X B7H3為連接Ab B7H3與Z B7H3之分子，其中X B7H3包含可裂解部分，例如在生理條件下，視情況在胞內條件下，視情況包含蛋白酶可裂解二肽、三肽、四肽或五肽；及 Z B7H3為依沙替康。結合人類B7H3多肽之免疫結合物在可裂解部分裂解後釋放依沙替康。視情況地，Z N4為依沙替康，視情況結合人類粘附分子-4多肽之免疫結合物在可裂解部分裂解後釋放依沙替康。
此外，在一個態樣中，本發明提供一種結合人類B7H3多肽之免疫結合物，其用於治療癌症(例如，B7H3陽性粘附分子-4陽性癌症)，其中結合人類B7H3多肽之免疫結合物係由下式表示： Ab B7H3-(X B7H3-(Z B7H3)) 其中， Ab B7H3為特異性結合至人類B7H3多肽之多肽、肽或抗體，視情況其中Ab B7H3包含依諾妥珠單抗、伊夫利西單抗、米佐妥單抗、奧瑞達妥單抗、奧伯單抗或沃布米妥單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區； X B7H3為連接Ab B7H3與Z B7H3之分子，其中X B7H3包含可裂解部分，例如在生理條件下，視情況在胞內條件下，視情況包含蛋白酶可裂解二肽、三肽、四肽或五肽；及 Z B7H3為依沙替康； 其中結合人類B7H3多肽之免疫結合物與由下式表示之結合人類粘附分子-4多肽的免疫結合物組合使用： Ab N4-(X N4-(Z N4)) 其中， Ab N4為特異性結合至人類粘附分子-4多肽之多肽、肽或抗體； X N4為連接Ab N4與Z N4之分子，其中X N4包含可裂解部分，例如在生理條件下，視情況在胞內條件下，視情況包含蛋白酶可裂解二肽、三肽、四肽或五肽；及 Z N4包含細胞毒性劑。結合人類B7H3多肽之免疫結合物在可裂解部分裂解後釋放依沙替康。視情況地，Z N4為依沙替康，視情況結合人類粘附分子-4多肽之免疫結合物在可裂解部分裂解後釋放依沙替康。
在一個態樣中，本發明之治療方法不依賴於對腫瘤組織中之粘附分子-4表現的評估或偵測，及/或不依賴於腫瘤細胞上之粘附分子-4的表現量及/或來自該個體之組織樣品中之表現粘附分子-4之腫瘤細胞的出現率或數目。在一個態樣中，本發明之治療方法不依賴於腫瘤Pgp (MDR1)表現之評估或偵測。
在一個態樣中，本發明提供在有需要之個體中治療癌症及/或引發抗腫瘤免疫反應之方法，其中該個體患有晚期復發性或轉移性尿道上皮癌或乳癌(例如TNBC)，其中該等方法不需要預先確定個體是否具有包含表現粘附分子-4之細胞(例如腫瘤細胞)的腫瘤組織。
在一個態樣中，本發明提供在有需要之個體中治療癌症及/或殺傷腫瘤細胞之方法，其中該個體患有晚期復發性或轉移性尿道上皮癌或乳癌(例如TNBC)，其中該等方法不需要預先確定個體是否具有包含表現高水平之粘附分子-4之細胞(例如腫瘤細胞)的腫瘤組織，例如，如藉由免疫組織化學評估(例如，H評分或其他適合之IHC計分法)所定義。
在一個態樣中，在個體中治療癌症及/或殺傷腫瘤細胞之方法不需要預先確定腫瘤細胞之粘附分子-4表現量。
在一個態樣中，治療個體中之癌症、視情況晚期復發性或轉移性尿道上皮癌或乳癌(例如TNBC、HER2陽性癌症)之方法包含治療患有癌症之個體，該癌症係由不超過或低於290、250、200、150或100之粘附分子-4表現之H評分表徵。
在用於治療或預防個體中之癌症的任何實施例中，方法可指定為包含以下步驟：(i)鑑別腫瘤細胞表現粘附分子-4之個體(例如藉由免疫組織化學所測定)，及(ii)向個體投與有效量之本發明之抗粘附分子-4抗體藥物結合物。
在用於治療或預防個體中之癌症的任何實施例中，方法可指定為包含以下步驟：(i)鑑別腫瘤細胞表現以下之個體：(a)粘附分子-4 (例如藉由免疫組織化學所測定)及(b)HER2，視情況其中腫瘤細胞表現低水平之HER2 (例如藉由免疫組織化學所測定；藉由Herceptest™所測定)及(ii)向個體投與有效量之本發明之抗粘附分子-4抗體藥物結合物，視情況與結合Her2多肽(例如曲妥珠單抗、帕妥株單抗)之藥劑(例如抗體)之組合；視情況其中結合Her2之抗體為ADC；視情況其中結合Her2之抗體係結合至細胞毒性劑，視情況為奧瑞他汀、類美登素(例如DM1)或喜樹鹼衍生物(例如化合物1、2或13)；視情況其中結合Her2之抗體為曲妥珠單抗恩他新或曲妥珠單抗德魯替康(DS-8201a)。
在用於治療或預防個體中之癌症的任何實施例中，方法可指定為包含以下步驟：(i)鑑別腫瘤細胞具有低或中等水平之粘附分子-4表現(例如藉由免疫組織化學所測定)的個體，及(ii)向步驟(i)中所鑑別之個體投與有效量之本發明之抗粘附分子-4抗體藥物結合物。
在用於治療或預防個體中之癌症(例如粘附分子-4陽性癌症)的任何實施例中，方法可指定為包含以下步驟：(i)鑑別癌症之特徵為低水平之粘附分子-4表現(例如藉由免疫組織化學所測定)之個體，及(ii)向步驟(i)中所鑑別之個體投與有效量之本發明之抗粘附分子-4抗體藥物結合物。在一個實施例中，個體患有特徵為粘附分子-4表現之H評分不超過或低於150或100的癌症。
在用於治療或預防個體中之癌症(例如粘附分子-4陽性癌症)的任何實施例中，方法可指定為包含以下步驟：(i)鑑別癌症之特徵為中等水平之腫瘤粘附分子-4表現(例如藉由免疫組織化學所測定)之個體，及(ii)向個體投與有效量之本發明之抗粘附分子-4抗體藥物結合物。在一個實施例中，個體患有特徵為粘附分子-4表現之H評分不超過或低於290、250、200、150的癌症，視情況此外其中癌症之特徵為粘附分子-4表現之H評分為至少100。
在再一實施例中，提供一種治療或預防個體中之癌症(例如粘附分子-4陽性癌症)之方法，其包含：(i)鑑別癌症之特徵為腫瘤粘附分子-4表現之H評分不超過或低於290、250、200、150、120或100之個體，及(ii)向個體投與有效量之本發明之抗粘附分子-4抗體藥物結合物。視情況地，步驟(i)可指定為包含藉由組織化學(例如IHC)評估腫瘤細胞上之粘附分子-4表現的步驟。
在再一實施例中，提供一種治療或預防個體中之癌症(例如粘附分子-4陽性癌症；乳癌)之方法，其包含：(i)鑑別癌症之特徵為腫瘤粘附分子-4表現之QS評分不超過或低於200、150、120或100之個體，及(ii)向個體投與有效量之本發明之抗粘附分子-4抗體藥物結合物。視情況地，步驟(i)可指定為包含藉由組織化學(例如IHC)評估腫瘤細胞上之粘附分子-4表現的步驟。
可獲得並評估來自個體，例如來自切片之生物樣品。視情況地，樣品保存為經甲醛(例如福爾馬林)固定石蠟包埋(FFPE)之樣品。在脫蠟後，載玻片適合於偵測粘附分子-4 (及/或HER2、TROP-2、B7H3)之表現的方法。
腫瘤細胞中之粘附分子-4、TROP-2、B7H3及/或HER2表現可藉由此項技術中已知之任何方法測定。在某些實施例中，分析法包括免疫組織化學(IHC)分析法、螢光活化細胞分選(FACS)分析法(例如定量FACS)、ELISA、免疫墨點法(例如西方墨點法(western blotting)、斑點墨點法或細胞內西方墨點法)及其他免疫分析法。
組織切片之IHC染色已展示為評估或偵測樣品中蛋白質之存在的可靠方法。免疫組織化學技術利用抗體以原位探測及觀測細胞抗原，通常藉由顯色或螢光方法進行。因此，使用對各標記物具有特異性之抗體或抗血清，在一些實施例中為多株抗血清，且在一些實施例中為單株抗體以偵測表現。可藉由例如用放射性標記、螢光標記、半抗原標記(諸如生物素)或酶(諸如辣根過氧化酶或鹼性磷酸酶)直接標記抗體本身來偵測抗體。或者，未經標記之初級抗體與對初級抗體具有特異性的經標記之二級抗體(包含抗血清、多株抗血清或單株抗體)結合使用。免疫組織化學方案及套組在此項技術中為熟知的且可商購。
在一些實施例中，IHC分析法為直接分析法，其中直接測定抗體與標靶抗原之結合。此直接分析法使用標記試劑，諸如螢光標籤或經酶標記之初級抗體，其可目測而無需其他抗體相互作用。在一些實施例中，IHC分析法為間接分析法。在典型之間接分析法中，未結合之初級抗體結合至抗原且隨後經標記之二級抗體結合至初級抗體。當二級抗體結合至酶標記時，添加顯色或螢光受質以提供抗原之觀測。由於若干二級抗體可與初級抗體上之不同抗原決定基反應，因此出現信號放大。用於免疫組織化學之初級及/或二級抗體通常將由可偵測分子標記。許多標記為可獲得的，包括放射性同位素、膠態金粒子、螢光標記及酶受質標記。
強染色、中度染色及弱染色為熟習此項技術者所熟知之描述。在一些態樣中，強染色、中度染色及弱染色為校準之染色水平，其中確立範圍且將染色強度分級於範圍內。在一些實施例中，強染色為超過強度範圍之第75個百分位數之染色，中度染色為自強度範圍之第25個百分位數至第75個百分位數之染色，且低染色為低於強度範圍之第25個百分位數之染色。在一些態樣中，熟習此項技術及熟悉特定染色技術者調節分級尺寸並定義染色類別。
可利用具有各種染色強度(例如當用抗粘附分子-4抗體染色時)之對照細胞株(例如離心成集結粒且經福爾馬林固定及石蠟包埋，且例如製備為組織微陣列，且例如用抗粘附分子-4抗體染色)作為對照以用於IHC分析。一般熟習此項技術者應瞭解，可容易地使用本申請案之教示內容及此項技術中熟知且本文中所揭示之方法來鑑別具有陰性、弱、中度及高c-met染色強度之其他對照細胞集結粒。
在一些實施例中，當癌症或腫瘤為(例如使用IHC分析法測定為)粘附分子-4陽性時，該癌症或腫瘤被視為表現粘附分子-4之癌症腫瘤。在一些實施例中，當樣品中5%或更多之腫瘤細胞表現粘附分子-4蛋白質(例如，在任何強度下表現粘附分子-4蛋白質)時，個體之癌症或腫瘤為粘附分子-4陽性。在一些實施例中，當樣品中10%或更多之腫瘤細胞表現粘附分子-4蛋白質(例如，在任何強度下表現粘附分子-4蛋白質)時，個體之癌症或腫瘤為粘附分子-4陽性。在一些實施例中，當樣品中20%或更多之腫瘤細胞表現粘附分子-4蛋白質(例如，在任何強度下表現粘附分子-4蛋白質)時，個體之癌症或腫瘤為粘附分子-4陽性。在一些實施例中，當樣品中30%或更多之腫瘤細胞表現粘附分子-4蛋白質(例如，在任何強度下表現粘附分子-4蛋白質)時，個體之癌症或腫瘤為粘附分子-4陽性。在一些實施例中，當樣品中40%或更多之腫瘤細胞表現粘附分子-4蛋白質(例如，在任何強度下表現粘附分子-4蛋白質)時，個體之癌症或腫瘤為粘附分子-4陽性。在一些實施例中，當樣品中50%或更多之腫瘤細胞表現粘附分子-4蛋白質(例如，在任何強度下表現粘附分子-4蛋白質)時，個體之癌症或腫瘤為粘附分子-4陽性。在一些實施例中，當樣品中60%或更多之腫瘤細胞表現粘附分子-4蛋白質(例如，在任何強度下表現粘附分子-4蛋白質)時，個體之癌症或腫瘤為粘附分子-4陽性。在一些實施例中，當樣品中70%或更多之腫瘤細胞表現粘附分子-4蛋白質(例如，在任何強度下表現粘附分子-4蛋白質)時，個體之癌症或腫瘤為粘附分子-4陽性。在一些實施例中，當樣品中80%或更多之腫瘤細胞表現粘附分子-4蛋白質(例如，在任何強度下表現粘附分子-4蛋白質)時，個體之癌症或腫瘤為粘附分子-4陽性。在一些實施例中，當樣品中90%或更多之腫瘤細胞表現粘附分子-4蛋白質(例如，在任何強度下表現粘附分子-4蛋白質)時，個體之癌症或腫瘤為粘附分子-4陽性。
在一些實施例中，當樣品中5%或更多之腫瘤細胞表現具有中度及/或強染色強度之粘附分子-4蛋白質時，個體之癌症或腫瘤為粘附分子-4陽性。在一些實施例中，當樣品中10%或更多之腫瘤細胞表現具有中度及/或強染色強度之粘附分子-4蛋白質時，個體之癌症或腫瘤為粘附分子-4陽性。在一些實施例中，當樣品中20%或更多之腫瘤細胞表現具有中度及/或強染色強度之粘附分子-4蛋白質時，個體之癌症或腫瘤為粘附分子-4陽性。在一些實施例中，當樣品中30%或更多之腫瘤細胞表現具有中度及/或強染色強度之粘附分子-4蛋白質時，個體之癌症或腫瘤為粘附分子-4陽性。在一些實施例中，當樣品中40%或更多之腫瘤細胞表現具有中度及/或強染色強度之粘附分子-4蛋白質時，個體之癌症或腫瘤為粘附分子-4陽性。在一些實施例中，當樣品中50%或更多之腫瘤細胞表現具有中度及/或強染色強度之粘附分子-4蛋白質時，個體之癌症或腫瘤為粘附分子-4陽性。在一些實施例中，當樣品中60%或更多之腫瘤細胞表現具有中度及/或強染色強度之粘附分子-4蛋白質時，個體之癌症或腫瘤為粘附分子-4陽性。在一些實施例中，當樣品中70%或更多之腫瘤細胞表現具有中度及/或強染色強度之粘附分子-4蛋白質時，個體之癌症或腫瘤為粘附分子-4陽性。在一些實施例中，當樣品中80%或更多之腫瘤細胞表現具有中度及/或強染色強度之粘附分子-4蛋白質時，個體之癌症或腫瘤為粘附分子-4陽性。在一些實施例中，當樣品中90%或更多之腫瘤細胞表現具有中度及/或強染色強度之粘附分子-4蛋白質時，個體之癌症或腫瘤為粘附分子-4陽性。
評估免疫組織化學分析法以便確定個體之癌症或腫瘤之特徵是否為高粘附分子-4表現(例如低或中等粘附分子-4表現)通常將涉及已知計分法之應用。
低、中等及高腫瘤粘附分子-4表現可基於美國專利公開案第2013/0005678號中所描述之「H評分」而判定。藉由下式獲得H評分：(3×強染色細胞之百分比) + (2×中度染色細胞之百分比) + (弱染色細胞之百分比)，得到0至300之範圍。H評分尤其用於UC中。
在本文之方法中之任一者的一些實施例中，低或中等粘附分子-4表現(例如，具有低或中等水平之粘附分子-4表現之腫瘤或腫瘤細胞)對應於約250或更低、約220或更低、約200或更低、約180或更低、約160或更低、約150或更低、約140或更低、約130或更低、約120或更低、約110或更低或約100或更低之H評分。
在本文之方法中之任一者的一些實施例中，低粘附分子-4表現(例如，具有低水平之粘附分子-4表現之腫瘤或腫瘤細胞)對應於200或更低、約180或更低、約160或更低、約150或更低、約140或更低、約130或更低、約120或更低、約110或更低或約100或更低之H評分。
在本文之方法中之任一者的一些實施例中，高粘附分子-4表現(例如，具有高水平之粘附分子-4表現之腫瘤或腫瘤細胞)對應於約290或更高之H評分。
在另一實例中，可根據Quick評分(QS)藉由使用下式對粘附分子-4染色進行評分：QS = P (陽性細胞之百分比) × I (強度)，最大評分為300。QS已用於例如乳癌中。舉例而言，在TNBC中，一些研究小組已將低粘附分子-4表現組定義為QS =或＜ 100。在本文之方法中之任一者的一些實施例中，低或中等粘附分子-4表現(例如，具有低或中等水平之粘附分子-4表現之腫瘤或腫瘤細胞)對應於約200或更低、約180或更低、約160或更低、約150或更低、約140或更低、約130或更低、約120或更低、約110或更低或約100或更低之QS評分。
用於評估HER2之腫瘤細胞表現的分析法為此項技術中所熟知。舉例而言，諸如經FDA批准之SPoT-Light HER2 CISH之分析法可用於偵測HER2過度表現。顯色原位雜交(Chromogenic in situ hybridization；CISH)偵測HER2基因擴增。此技術(亦稱為減影探針技術顯色原位雜交(Subtraction Probe Technology Chromogenic In Situ Hybridization))為一種用於觀測乳癌細胞是否在細胞表面處過度表現HER2受體蛋白之測試。
HER2之另一廣泛使用之分析法為HercepTest™ (Dako North America, Inc.)，一種用於測定經福爾馬林固定石蠟包埋之癌症組織中之HER2蛋白質過度表現的半定量免疫組織化學分析法。舉例而言，可經由HercepTest™藉由+1至+2之評分鑑別表現低水平之HER2的腫瘤。
在一個態樣中，治療係用於患有現有神經病變、糖尿病或高血糖症、心機能不全、眼部病變之個體中。此類條件可使得個體不適合於用抗粘附分子-4 ADC治療，諸如與本發明之抗粘附分子-4抗體藥物結合物相比具有較高毒性或較狹窄治療窗之恩弗妥單抗維多汀。
在任何實施例中，治療方法可視情況包含以下步驟：(a)評估個體中之癌症階段及/或疾病惡化；及(b)若個體患有復發性、轉移性及/或惡化之癌症，則向個體投與有效量之本發明之抗粘附分子-4抗體藥物結合物。
在一些實施例中，本發明包括一種治療患有尿道上皮癌之個體中之腫瘤的方法，其包含：(a)評估個體中之癌症階段及/或疾病惡化；及(b)若個體患有復發性、轉移性及/或惡化之癌症，則向個體投與有效量之本發明之抗粘附分子-4抗體藥物結合物。
視情況地，用本發明之抗粘附分子-4抗體藥物結合物治療之個體可患有癌症(例如，尿道上皮癌、乳癌(例如三陰性乳癌；HER2陽性癌症)、非小細胞肺癌、胰臟癌、卵巢癌、胃癌、結腸直腸癌、頭頸部鱗狀細胞癌或食道癌)，儘管用治療劑(例如化學治療劑)、抗體、ADC或放射線療法進行手術及/或治療(例如在該手術及/或治療期間或之後)，該癌症仍具有抗性、尚未有反應或已復發及/或惡化。
在本文之任何實施例中，治療反應可根據熟知準則來定義及/或評估，該準則例如實性瘤反應評估準則(Response Evaluation Criteria In Solid Tumors；RECIST)，諸如1.1版，參見Eisenhauer等人(2009) Eur. J. Cancer 45:228-247，或免疫相關反應準則(Immune-Related Response Criteria；irRC)，參見Wolchock等人(2009) Clinical Cancer Research 15:7412-7420。
視情況地，用本發明之抗粘附分子-4抗體藥物結合物治療之個體患有腫瘤或癌症，該腫瘤或癌症在用化學治療劑(例如已知能夠藉由P-醣蛋白(Pgp)進行輸送之化學治療劑，例如蒽環黴素(多柔比星、道諾黴素)、紫杉烷(紫杉醇、多西他賽)、長春花生物鹼(長春新鹼、長春花鹼、長春地辛)及依讬泊苷)治療後呈現抗性、無反應或已惡化。由Pgp識別之化合物通常表徵為適當疏水性(辛醇與水之分配係數，logP＞1)，常常在生理條件下含有具有淨陽離子電荷之可滴定質子，且主要為具有芳族部分之「天然產物」。
在一些實施例中，在不存在化學治療劑之組合投與的情況下，使用或投與包含抗粘附分子-4抗體、抗體片段之ADC。
在其他實施例中，抗粘附分子-4抗體、抗體片段或包含此類抗粘附分子-4抗體、抗體片段之ADC係視情況與化學治療劑組合使用或投與。例示性化學治療劑包括(但不限於)安吖啶、博萊黴素、白消安(busulfan)、卡培他濱(capecitabine)、卡鉑、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉑、克拉屈濱(cladribine)、氯法拉濱(clofarabine)、克立他酶(crisantaspase)、環磷醯胺、阿糖胞苷、達卡巴嗪、放線菌素d、道諾黴素、多西他賽、多柔比星、表阿黴素、依託泊苷、氟達拉濱、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基尿素、艾達黴素、異環磷醯胺、伊立替康、甲醯四氫葉酸、脂質體多柔比星、脂質體道諾黴素、洛莫司汀、美法侖(melphalan)、巰基嘌呤、美司那(mesna)、甲胺喋呤、絲裂黴素、米托蒽醌、奧沙利鉑、紫杉醇、培美曲塞、噴司他汀(pentostatin)、丙卡巴肼、雷替曲塞、賽特鉑、鏈脲佐菌素、替加氟-尿嘧啶(tegafur-uracil)、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷、噻替派(thiotepa)、硫鳥嘌呤、拓朴替康、曲奧舒凡、長春花鹼、長春新鹼、長春地辛、長春瑞濱或其組合。在一個實施例中，抗粘附分子-4抗體、抗體片段(或包含此類抗粘附分子-4抗體、抗體片段之ADC)及化學治療劑經調配以用於單獨投與且同時或依序投與。
視情況地，個體可表徵為患有已惡化、復發或對用先前療法進行之先前治療無反應之癌症，視情況此外其中先前療法包含投與恩弗妥單抗維多汀及/或投與PD-1中和劑(例如帕博利珠單抗(pembrolizumab)、阿特珠單抗(atezolizumab)、納武單抗(nivolumab))，視情況其中先前療法為化學治療劑。
視情況地，在任何實施例中，個體可表徵為不適合用恩弗妥單抗維多汀進行治療，及/或患有不適合或未經指示用恩弗妥單抗維多汀進行治療之癌症。
用結合至喜樹鹼衍生物分子之抗粘附分子-4抗體治療人類之例示性治療方案包括例如，向患者投與有效量之本發明之抗粘附分子-4抗體藥物結合物，其中方法包含至少一個投與週期，其中至少一個劑量之結合至喜樹鹼衍生分子之抗粘附分子-4抗體係以0.1至10 mg/kg體重、0.1至5 mg/kg體重、0.1至1mg/kg體重、1至10 mg/kg體重或1至5mg/kg體重之劑量進行投與。在一個實施例中，投與複數個劑量，例如至少2、3、4、5、6、8、10個劑量。在一個實施例中，劑量之投與相隔至少2、3或4週。在一個實施例中，投與為每週、每兩週、每三週或每四週。
在一個實施例中，本發明之抗粘附分子-4抗體藥物結合物係以靜脈內形式投與。
實例 實例 1 ： 共同表現 Her2 、 TROP - 2 、 B7H3 及粘附分子 - 4 之人類腫瘤細胞使用基於不同類型癌症中關鍵基因體變化之多維圖譜的癌症基因體圖譜(Cancer Genome Atlas) (國家癌症研究所(National Cancer Institute)與國家人類基因體研究機構(National Human Genome Research Institute)之間的合作)進行HER2及粘附分子-4基因表現之研究。尤其在來自胰臟癌、肺腺癌患者、乳癌及膀胱癌患者之樣品中觀測到HER2及粘附分子-4表現之顯著相關性。所觀測到之最高相關性為胰臟癌，其中相關性值：斯皮爾曼(Spearman)為0.71且皮爾森(Pearson)為0.78。
藉由流式細胞分析技術測定SUM185及SUM190人類乳癌腫瘤細胞株(Biovit Inc.)上之HER2及粘附分子-4表現。SUM185源自患有ER陰性、PR陰性及HER2陽性未分化乳癌之患者的胸膜積水。細胞株過度表現Her2。SUM190源自患有ER陰性、PR陰性及HER2陽性(擴增)乳癌之患者的原發性腫瘤。在10 µg/ml (在4℃)下，用以下各者染色腫瘤細胞：抗粘附分子-4抗體(經修飾為含有N297Q突變之人類IgG1同型的ASG-22ME，該突變具有降低之Fcγ受體結合)、抗TROP-2抗體、抗B7H3抗體或抗Her2抗體(經修飾為含有N297Q突變之人類IgG1同型的曲妥珠單抗，該突變具有降低之Fcγ受體結合)，以及同型對照，隨後使PE以1:200之稀釋度結合多株山羊抗人類抗體。藉由用Canto II (HTS)進行細胞螢光分析來分析樣品。
HER2及粘附分子-4之代表性結果展示於SUM190人類乳癌腫瘤細胞之 圖 1及SUM185人類乳癌腫瘤細胞之 圖 2中。MFI：螢光強度之中值。SUM190腫瘤細胞以低至中等水平(中值螢光單位1777)表現HER2以及以較低水平(中值螢光單位991)表現粘附分子-4。SUM185細胞以中等至高水平(中值螢光單位2880)表現HER2以及以較高水平(中值螢光單位4326)表現粘附分子-4。另外，SUM185細胞以高水平表現TROP-2及B7H3(中值螢光單位分別為17327及11481)。表現資料呈現於下 表 1中。 表 1 ：
   HER2 (MFI) 粘附分子 - 4 (MFI) TROP-2 (MFI) B7H3 (MFI)
SUM185 2880 4326 17327 11481
SUM190 1777 991      
實例 2 ： 抗粘附分子 - 4 喜樹鹼衍生物 ADC 與抗 HER2 ADC 之組合的功效製備抗粘附分子-4抗體-藥物結合物，且比較其與曲妥珠單抗抗體-藥物結合物對HER2+粘附分子4+人類腫瘤細胞之功效。製備具有 SEQ ID NO : 6 及 7(作為人類IgG1同型)之VH及VL的抗粘附分子-4抗體-藥物結合物。 N41 VH： ( SEQ ID NO: 6)。 N41 VL： ( SEQ ID NO: 7)。
製備具有曲妥珠單抗(人類IgG1同型)之重鏈及輕鏈的抗HER2抗體-藥物結合物。抗粘附分子-4抗體及抗HER2抗體兩者在鏈間二硫化物部分地還原之後，經由抗體中之半胱胺酸殘基各自隨機結合至連接子-喜樹鹼衍生物。在攪拌(350至400 rpm，+37℃)下，使一系列2至10莫耳當量之還原劑參(2-羧乙基)膦鹽酸鹽與抗體(3 mg/mL)一起培育2小時以減少二硫化物。藉由添加莫耳過量之9.2或12莫耳當量之連接子-毒素，並在攪拌輪上在+37℃下培育隔夜來進行連接子-毒素之結合。所得ADC具有約8之平均藥物負載(藥物:抗體比率)。在另一實例中，亦使用相同方法將抗粘附分子-4抗體結合至含有喜樹鹼(SN-38)之另一連接子。此實例中所使用之ADC如下。
N4 ADC1：結合至具有以下結構之連接子的抗粘附分子-4：
Her2 ADC1：結合至具有以下結構之連接子的抗HER2：
N4 ADC2：結合至具有以下結構之連接子的抗粘附分子-4： 。
測試所得ADC在組合使用時誘導表現粘附分子-4/HER2之SUM190、實例1之MCF-7腫瘤細胞之死亡的能力。簡言之，將細胞接種於96孔盤中(V=80 µl)。以始於(530 nM至30 nM)之1:2連續稀釋測試N4 ADC1及HER2 ADC1或人類IgG1同型對照(IC)-連接子-毒素或培養基(5倍濃度)，且以1:5之連續稀釋(7 nM至7×10-2 nM)測試N4 ADC1及同型對照。以始於(530 nM至5.3×10-2)之1:10連續稀釋測試N4 ADC2及同型對照。藉由使用Incucyte S3-2設備評估匯合來測定ADC引起細胞死亡之能力；藉由Enspire2設備使用Cell Titer Glo™ (CTG)分析法來測定治療之後的第6天之存活力。藉由GraphPad Prism8使用第6天之發光細胞存活力資料來測定各ADC之IC50值。實驗重複二次。
結果表明，與單獨使用任一ADC相比，抗粘附分子-4 ADC與抗Her2 ADC之組合在引起粘附分子-4+ Her2+腫瘤細胞之死亡上具有改良之效能(IC50較低)。
實例 3 ： 具有人類構架序列之第一組抗人類粘附分子 - 4 抗體之建模及產生鑑別人類VH及VK模板以用於引入抗體5E7之CDR。單獨地分析各VH、VJ、VK及JK構架。隨後，藉由引入至來自人類子組IGHV1-46*01之重鏈構架(FR1、FR2、FR3)以及IGHJ4*01之重鏈構架(FR4)的VH中且引入至來自人類子組IGKV2-28*01之輕鏈構架(FR1、FR2、FR3)以及IGKJ4*01之輕鏈構架(FR4)的VL中來修飾分別具有SEQ ID NO: 19及20之VH及VL胺基酸序列的親本抗體。
使用以下重鏈及輕鏈序列來對親本嵌合抗體Fab (HPLP)進行建模： HP重鏈(可變域帶下劃線)： LP重鏈(可變域帶下劃線)：
使用以下重鏈及輕鏈序列來對人類化抗體Fab H0L0進行建模。 H0重鏈： L0輕鏈：
對於輕鏈及重鏈人類化變異體之設計，疊加5E7 HPLP及H0L0三維模型且逐一仔細檢查所有胺基酸差異。亦評估殘基之間的鏈內及鏈外連接，以便鑑別及避免藉由在給定鏈中引入回復突變而破壞任何重要低能鍵。
自原始CDR接枝開始，鑑別潛在回復突變，隨後觀察人類與小鼠之間的構架差異殘基。
重鏈設計： 為了研究在位置72處之殘基(根據Kabat編號之殘基71)的作用，此殘基經回復突變，由此保存親本抗體中存在之白胺酸。與H0L0抗體中之TRD相比，親本抗體具有序列TLD。此回復突變應與殘基79上之一者偶合以避免空間衝突。
為了研究在位置79處之殘基的作用，此殘基經回復突變，由此保存親本抗體中存在之蘇胺酸。與H0L0抗體中之TVY相比，親本抗體具有序列TTY。在位置79中之蘇胺酸定向於VH域內部且不接觸任何其他殘基。儘管在位置79中之纈胺酸與蘇胺酸充分疊加，但此殘基與R72、M34、C22及I51形成許多鍵。I51之旋轉異構位置係由與V79 (根據Kabat編號之V78)之接觸解釋。若V79將存在，則在殘基72 (R72L；根據kabat編號之殘基71)上引入回復突變將在I51與L72之間引入空間衝突。
為了研究在位置74處之殘基的作用，此殘基經回復突變，由此保存親本抗體中存在之離胺酸。與H0L0抗體中之DTS相比，親本抗體具有序列DKS。在位置74中之離胺酸殘基暴露於分子表面且佔據重要位置，儘管其與潛在結合部位並不接近。
為了研究在位置28處之殘基的作用，此殘基經回復突變，由此保存親本抗體中存在之異白胺酸。與H0L0抗體中之YTF相比，親本抗體具有序列YIF。異白胺酸與在位置28處之蘇胺酸充分疊加。其暴露於分子表面且位於抗體頂部，接近互補位。無法排除此殘基可參與結合。此外，根據IMGT定義，此殘基包括於CDR-H1中。
具有展示於 SEQ ID NO : 39中之胺基酸序列的第一重鏈變異體(H1)具有R71L及V78T取代。具有展示於 SEQ ID NO : 41中之胺基酸序列的第二重鏈變異體(H2)具有R71L、T73K及V78T取代。具有展示於 SEQ ID NO : 43中之胺基酸序列的第三重鏈變異體(H3)具有T28I、R71L、T73K及V78T取代。取代之編號係根據Kabat。
輕鏈設計： 為了研究在位置2處之殘基的作用，此殘基經回復突變，由此保存親本抗體之纈胺酸殘基。與H0L0抗體中之DIV相比，親本抗體具有序列DVV。殘基V2與位於CDR-L1中之殘基K27相互作用，其進一步與位於CDR-L3中之殘基E98相互作用。
為了研究在位置69處之殘基的作用，此殘基經回復突變，由此保存親本抗體之絲胺酸殘基。與H0L0抗體中之SGS相比，親本抗體具有序列SSS。殘基S69定向於VL域內部且與相鄰殘基W40及M56 (位於CDR-L2中)形成許多鍵，而G69 (根據Kabat編號之G64)與M56形成h鍵。所有此等殘基充分疊加。殘基W40為整個內部網路之中心。
為了研究在位置11處之殘基的作用，此殘基經回復突變，由此保存親本抗體之天冬醯胺殘基。與H0L0抗體中之SLP相比，親本抗體具有序列SNP。殘基L11與殘餘物P8相互作用且很可能使P8 β股堅硬化。
為了研究在位置8處之殘基的作用，此殘基經回復突變，由此保存親本抗體之丙胺酸殘基。與H0L0抗體中之SPL相比，親本抗體具有序列SAL。如上文所陳述，殘基P8與殘基L11相互作用且此類相互作用很可能使P8 β股堅硬化。
具有 SEQ ID NO : 61之胺基酸序列的第一輕鏈變異體(L1)具有I2V及G64S取代。具有 SEQ ID NO : 63之胺基酸序列的第二輕鏈變異體(L2)具有I2V、L11N及G64S取代。具有 SEQ ID NO : 65之胺基酸序列的第三輕鏈變異體(L3)具有I2V、P8A、L11N及G64S取代。取代之編號係根據Kabat。
各別重鏈( 表 2中之「H」鏈)及輕鏈( 表 2中之「L」鏈)可變區之胺基酸序列展示於下 表 2中。 表 2
鏈 SEQ ID NO 序列(胺基酸取代為粗體，Kabat CDR帶下劃線)
H1 39 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SYWMHWVRQAPGQGLEWMG EIDPSDSYTNY NQKFKGRVTMT LDTSTST TYMELSSLRSEDTAVYYCAR GYGNYGDYWGQGTLVTVSS
H2 41 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SYWMHWVRQAPGQGLEWMG EIDPSDSYTNY NQKFKGRVTMT LD KSTST TYMELSSLRSEDTAVYYCAR GYGNYGDYWGQGTLVTVSS
H3 43 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGY IFT SYWMHWVRQAPGQGLEWMG EIDPSDSYTNY NQKFKGRVTMT LD KSTST TYMELSSLRSEDTAVYYCAR GYGNYGDYWGQGTLVTVSS
L1 61 D VVMTQSPLSLPVTPGEPASISC RSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIY QMSNLASGVPDRFS SSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC AQNLELPWTFGGGTKVEIK
L2 63 D VVMTQSPLS NPVTPGEPASISC RSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIY QMSNLASGVPDRFS SSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC AQNLELPWTFGGGTKVEIK
L3 65 D VVMTQS ALS NPVTPGEPASISC RSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIY QMSNLASGVPDRFS SSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC AQNLELPWTFGGGTKVEIK   
產生具有下 表 3中所示之重鏈及輕鏈組合的抗體。 表 3
      輕鏈
L0 L1 L2 L3
重鏈 H0 H0L0 H0L1 H0L2 H0L3
H1 H1L0 H1L1 H1L2 H1L3
H2 H2L0 H2L1 H2L2 H2L3
H3 H3L0 H3L1 H3L2 H3L3
實例 4 ： 藉由 SPR 結合至粘附分子 - 4 之表徵 實例 3之 表 3中之抗體經選殖為人類IgG1同型抗體，產生並純化，隨後測試以用於與人類粘附分子-4之結合。藉由SPR分析評估16種人類化變異體之親和力，以及其締合常數及解離常數。表4概述所有經計算之常數(親和力常數KD (nM)、締合常數ka (1/Ms)及解離常數kd (1/s))。
具有完全人類IGKHV-46*01及IGHJ4*01重鏈構架及完全人類IGKV-28*01及IGKJ4*01輕鏈構架之H0L0抗體產生80.2 nM之kD。如 表 4中所示，其他變異體展現比H0L0低之KD。
重鏈H3恢復與親本抗體接近之KD值。因此，引入H3中之回復突變對於人類化抗體之穩定而言為重要的。注意到自H0至H3之解離常數值之刻度。 表 4
抗體 KD (nM) ka (1/Ms) kd (1/s)
5E7 5.9 ± 1.2 4.8E+5 ± 1.0E-5 2.7E-3 ± 0.3E-3
H0L0 80.2 1.7E+5 1.4E-2
H1L0 67.3 1.1E+5 7.2E-3
H2L0 46.4 1.3E+5 6.2E-3
H3L0 35.8 1.1E+5 4.1E-3
H3L1 22.0 ± 0.4 4.0E+5 ± 0.3E+5 8.7E-3 ± 0.4E-3
H3L2 25.9 3.1E+5 8.1E-3
H3L3 27.0 2.6E+5 7.0E-3
實例 5 ： 具有人類構架序列之第二組抗人類粘附分子 - 4 抗體之建模及產生基於實例3中所產生之人類化抗體之SPR資料，設計新抗體。
重鏈設計 為了研究在位置38處之殘基的作用，此殘基經回復突變，由此保存親本抗體之離胺酸殘基。與H0L0抗體中之VRQ相比，親本抗體具有序列VKQ。K38將為具有殘基E46之鹽橋之部分。
為了研究在位置40處之殘基的作用，此殘基經回復突變，由此保存親本抗體之精胺酸殘基。與H0L0抗體中之QAP相比，親本抗體具有序列QRP。殘基R40接觸Q43，該殘基接觸與輕鏈之殘基Q43形成兩個氫鍵的Q39。在具有此類回復突變之情況下，重鏈之殘基Q43佔據發散位置，但維持與Q39之接觸且兩個氫鍵亦維持與L0-Q43之接觸。
為了研究在位置48處之殘基的作用，此殘基經回復突變，由此保存親本抗體之異白胺酸殘基。與H0L0抗體中之WMG相比，親本抗體具有序列WIG。殘基I48與A68、M81及F64 (位於CDR-H2中)相互作用。
為了研究在位置70處之殘基的作用，此殘基經回復突變，由此保存親本抗體之白胺酸殘基。與H0L0抗體中之TMT相比，親本抗體具有序列TLT。殘基L70與殘基M81、I51 (其位於CDR-H2中)、Y60 (位於CDR-H2中)及W36相互作用。殘基M70 (根據Kabat編號之M69)與殘基I51 (位於CDR-H2中)、Y60 (位於CDR-H2中)及W36相互作用。除了殘基I51佔據不同旋轉異構位置以外，所有其他殘基極佳地充分疊加且兩種網路幾乎等效。
具有展示於 SEQ ID NO : 45中之胺基酸序列的第四重鏈變異體(H4)具有R38K取代。具有 SEQ ID NO : 47之胺基酸序列的第五重鏈變異體(H5)具有R38K及A40R取代。具有 SEQ ID NO : 49之胺基酸序列的第六重鏈變異體(H6)具有R38K、A40R及M48I取代。具有 SEQ ID NO : 51之胺基酸序列的第七重鏈變異體(H7)具有R38K、A40R、M48I及M69L取代。此外，第八(H8； SEQ ID NO : 53)、第九(H9； SEQ ID NO : 55)及第十(H10； SEQ ID NO : 57)條鏈經設計具有取代之不同組合。胺基酸殘基之編號係根據Kabat。
各別重鏈( 表 5中之「H」鏈)及輕鏈( 表 5中之「L」鏈)可變區之胺基酸序列展示於下 表 5中。 表 5
鏈 SEQ ID NO 序列(胺基酸取代為粗體，Kabat CDR帶下劃線)
H4 45 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGY IFT SYWMHWV KQAPGQGLEWMG EIDPSDSYTNY NQKFKGRVTMT LD KSTST TYMELSSLRSEDTAVYYCAR GYGNYGDYWGQGTLVTVSS
H5 47 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGY IFT SYWMHWV KQ RPGQGLEWMG EIDPSDSYTNY NQKFKGRVTMT LD KSTST TYMELSSLRSEDTAVYYCAR GYGNYGDYWGQGTLVTVSS
H6 49 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGY IFT SYWMHWV KQ RPGQGLEW IG EIDPSDSYTNY NQKFKGRVTMT LD KSTST TYMELSSLRSEDTAVYYCAR GYGNYGDYWGQGTLVTVSS
H7 51 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGY IFT SYWMHWV KQ RPGQGLEW IG EIDPSDSYTNY NQKFKGRVT LT LD KSTST TYMELSSLRSEDTAVYYCAR GYGNYGDYWGQGTLVTVSS
H8 53 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGY IFTSYWMHWV KQAPGQGLEW IGEIDPSDSYTNY NQKFKGRVTMT LD KSTST TYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGNYGDYWGQGTLVTVSS
產生具有下表6中所示之重鏈及輕鏈組合的抗體。 表 6
      輕鏈
L0 L1 L2 L3
重鏈 H4 H4L0 H4L1 H4L2 H4L3
H5 H5L0 H5L1 H5L2 H5L3
H6 H6L0 H6L1 H6L2 H6L3
H7 H7L0 H7L1 H7L2 H7L3
H8    H8L1      
實例 6 ： 藉由 SPR 結合至粘附分子 - 4 之表徵 ( 第二組 ) 實例 5之 表 6中之抗體經選殖為人類IgG1同型抗體，產生並純化，隨後測試以用於與人類粘附分子-4之結合。藉由SPR分析評估16種人類化變異體之親和力，以及其締合常數及解離常數。表7概述所有經計算之常數(親和力常數KD (nM)、締合常數ka (1/Ms)及解離常數kd (1/s))。
具有完全人類IGKHV-46*01及IGHJ4*01重鏈構架及完全人類IGKV-28*01及IGKJ4*01輕鏈構架之H0L0抗體產生80.2 nM之kD。如 表 7中所示，其他變異體展現比H0L0低之KD。特定言之，變異體H4L1、H5L3及H8L1具有與嵌合親本抗體(其KD為5.9 nM ± 1.2)更接近之KD。 表 7
人類化變異體 KD (nM) ka (1/Ms) kd (1/s)
ch5E7 5.9 ± 1.2 4.8E+5 ± 1.0E-5 2.7E-3 ± 0.3E-3
H0L0 80.2 1.7E+5 1.4E-2
H4L1 19.5 ± 0.8 3.1E+5 ± 0.3E+5 5.9E-3 ± 0.3E-3
H4L2 26.8 2.0E+5 5.4E-3
H4L3 21.6 ± 1.1 2.5E+5 ± 0.3E+5 5.2E-3 ± 0.2E-3
H5L1 24.5 2.3E+5 5.6E-3
H5L2 23.8 2.2E+5 5.3E-3
H5L3 21.5 ± 0.4 2.5E+5 ± 0.1E+5 5.3E-3 ± 0.0E-3
H6L1 32.1 1.9E+5 6.2E-3
H6L2 41.3 1.4E+5 5.8E-3
H6L3 38.6 1.3E+5 5.1E-3
H7L1 29.7 2.0E+5 6.0E-3
H7L2 39.5 1.6E+5 6.3E-3
H7L3 49.0 1.1E+5 5.5E-3
H8L1 19.2 2.5E+5 4.8E-3
實例 7 ： 藉由流式細胞分析技術分析法結合至粘附分子 - 4 之表徵 實例 3之 表 3及 實例 5之 表 6中之人類化抗體經選殖、產生並純化，隨後藉由流式細胞分析技術測試以用於與表現粘附分子-4之細胞的結合。在表現高水平粘附分子-4之SUM190細胞株上測定呈人類IgG1型式之人類化變異體之結合。EC50及表示處於飽和期之MedFi的最大MedFI展示於下 表 8中。
所有具有L0或L1鏈之人類化變異體具有比其他變異體更低之結合能力(更低之平穩期)。相比之下，所有攜帶L2或L3鏈之人類化變異體與親本嵌合5E7抗體(ch5E7)相比具有類似之結合能力。變異體H5L3展現最高MedFi值。 表 8
抗體 EC 50 最大 MedFi
ch5E7 1.10 25213
H0L0 0.542 15507
H1L0 0.64 17251
H2L0 0.45 16704
H3L0 0.88 17596
H3L1 1.79 17208
H3L2 1.19 22887
H3L3 1.45 23814
H4L1 1.49 18399
H4L2 1.44 24352
H4L3 1.60 24840
H5L1 1.43 18263
H5L2 1.14 25276
H5L3 1.29 27095
H6L1 1.15 18263
H6L2 1.30 24779
H6L3 1.01 24840
H7L1 1.27 17816
H7L2 1.30 23404
H7L3 1.23 25026
H8L1 1.63 17251
實例 8 ：胞內內化分析法 實例 3之 表 3中及 實例 5之 表 6中之人類化變異體經選殖、產生並純化，隨後測試其誘導粘附分子-4內化之能力。嵌合親本5E7抗體及同型對照物係用作陰性對照。此分析使用Fab-ZAP人類內化套組分析法進行，使用Cell Titer Glo™ (CTG)分析法用作讀數。對表現不同水平粘附分子-4之兩種細胞株進行實驗。MDA-MB-468具有比SUM190更低之粘附分子-4表現。
SUM190細胞株上之內化分析法 SUM190細胞株上之內化分析法之結果展示於下 表 9中，其呈現內化效率(相對於SUM190細胞株上之嵌合親本抗體內化效率標準化)。實驗重複進行兩次(兩次獨立實驗)。 表 9
抗體 SUM190 上之內化效率 ( 相對於嵌合親本抗體內化潛力標準化 )
嵌合親本5E7 100.0 100.0
H0L0 65.9 35.4
H1L0 83.7 58.6
H2L0 74.2 61.8
H3L0 81.4 69.7
H3L1 82.1 41.0
H3L2 69.8 45.5
H3L3 65.3 59.6
H4L1 73.5 72.6
H4L2 83.6 67.6
H4L3 81.9 61.0
H5L1 71.5 52.4
H5L2 81.3 86.0
H5L3 82.8 74.9
H6L1 71.3 54.5
H6L2 69.7 63.5
H6L3 78.7 92.8
H7L1 128.7 73.1
H7L2 89.6 74.8
H7L3 88.5 61.3
H8L1 131.9 65.2
在SUM190細胞株上進行之實驗中所測定之內化效率展示，人類化變異體H3L0、H4L2、H5L2、H5L3、H6L3及H7L2與親本抗體(5E7)相比誘導75%或更多之內化，因此展現有趣之內化潛力。應注意，H8L1及H7L1變異體比第1次實驗中之嵌合5E7更有效，但此結果在第2次實驗中未確認。
MDA-M-468細胞株上之內化分析法 SUM190細胞株上之內化分析法之結果展示於下 表 10中，其呈現內化效率(相對於MDA-M-468細胞株上之嵌合親本抗體內化效率標準化)。實驗重複進行兩次(兩次獨立實驗)。 表 10
抗體 MDA - MB - 468 上之內化效率 ( 相對於嵌合親本抗體內化效率標準化 )
嵌合親本5E7 100.0 100.0
H0L0 -36.2 -36.2
H1L0 -7.4 -7.4
H2L0 -35.5 -35.5
H3L0 1.2 1.2
H3L1 48.2 48.2
H3L2 13.7 13.7
H3L3 43.8 43.8
H4L1 31.0 31.0
H4L2 64.2 64.2
H4L3 43.8 43.8
H5L1 33.4 33.4
H5L2 39.4 39.4
H5L3 87.8 87.8
H6L1 61.6 61.6
H6L2 58.5 58.5
H6L3 66.3 66.3
H7L1 79.0 79.0
H7L2 58.7 58.7
H7L3 51.8 51.8
H8L1 71.2 71.2
所獲得之結果展示，僅H5L3人類化變異體始終達到超過親本嵌合5E7抗體之功效的75%，而所有其他變異體不太有效且其中許多在實驗之間具有異質結果。
實例 9 ： 作為 ADC 之抗體對腫瘤細胞株之活體外細胞毒性粘附分子-4低/SUM190乳癌模型 吾人評估5E7抗體與喜樹鹼類似物(Dxd或依沙替康)結合以殺傷SUM190細胞之能力。在此實驗中，測試5E7抗體，以及抗Ig樣V域抗體恩弗妥單抗及N41及對照抗體，其以等效藥物與抗體比率與相同毒素結合。製備第一種ADC，其中抗體係以每個抗體8種毒素(DAR=8)經由連接子結合(至半胱胺酸殘基)至喜樹鹼類似物(Dxd)，該連接子包含具有下文所展示之結構的胞內可裂解四肽連接子(GGFG)，稱為ggfg-Dxd：
製備第二種ADC，其中抗體係以每個抗體8種毒素(DAR=8)經由可裂解連接子結合至另一喜樹鹼類似物(依沙替康)，該可裂解連接子具有下文之結構，稱為PEG(8U)-Val-Ala-PAB-依沙替康：
簡言之，在藉由添加CTG受質進行細胞存活力量測之前，與細胞一起培育各測試Ab之劑量範圍(起始點150 nM，稀釋因子2為3分，隨後稀釋因子5為5分)持續5天。在圖式上標繪發光相對於Ab濃度。
對於各ADC，將一定濃度範圍之ADC與表現粘附分子-4之細胞一起培育。在培育之後，以1/1比率添加CTG受質且用盤讀取器(Enspire)讀出發光信號。其允許對與細胞存活力成比例之存在之ATP (代謝活性細胞之指標)進行量化。
結果展示於 圖 3A中。 圖 3A展示與喜樹鹼類似物Dxd (經由GGFG-Dxd連接子)或依沙替康(經由(PEG(8U)-Val-Ala-PAB-依沙替康)連接子)結合之5E7抗體以及同型對照抗體(IC) (所有均在等效藥物與抗體比率(DAR=8)下)對人類乳癌細胞之殺傷，及與V域結合Enhertu™ (曲妥珠單抗德魯替康(抗HER2))相比之殺傷。
所有靶向粘附分子-4之ADC比非靶向ADC (IC-GGFG-喜樹鹼)更有效地降低細胞存活力。
SUM185、MDA-MB-468、MC38及B16F10細胞株 進一步測試與依沙替康結合之抗體5E7 (經由(PEG(8U)-Val-Ala-PAB-依沙替康)連接子)以用於在其他癌細胞株上進行細胞殺傷。 圖 3B展示，「5E7-依沙替康」(結合至依沙替康連接子(PEG(8U)-Val-Ala-PAB-依沙替康)之5E7)能夠引起HER-2及表現粘附分子-4之SUM185及SUM190，以及MDA-MB-468 (TNBC)人類腫瘤細胞及表現人類粘附分子-4之MC38 (結腸癌)及B16F10 (黑色素瘤)鼠類腫瘤細胞之死亡的功效。細胞存活力之EC 50值展示於下 表 11中。 表 11
細胞株 MDA-MB-468 SUM185 SUM190 MC38-huN4 B16F10-huN4
EC 50(nM) 1.5E+05 3E+05 7E+05 2.3E+5 9.8E+5
實例 10 ： ADC 在人類乳癌小鼠模型 ( 粘附分子 - 4 低 / SUM190 模型 ) 中之活體內功效吾人比較作為喜樹鹼ADC之5E7抗體與恩弗妥單抗及N41相比在人類乳癌小鼠模型中之功效。在此實驗中，測試5E7抗體，以及恩弗妥單抗及N41及對照Ab，其以每個抗體8種毒素之等效藥物與抗體比率(DAR=8)與ggfg-Dxd連接子結合。
將SUM190細胞以50萬個細胞之劑量在具有以½稀釋於PBS中之生長因子的100 µl基質膠中皮下移植於CB17-SCID免疫缺陷小鼠中。當腫瘤達到195與250 mm3之間的體積時，將小鼠隨機分為9隻小鼠之小組以用於藉由單次注射3 mg/kg喜樹鹼ADC進行靜脈內治療。一週兩次追蹤腫瘤生長。根據以下準則，藉由使用GraphPad Prism V7軟體確立卡普蘭邁耶(Kaplan Meier)存活曲線：當腫瘤體積達到1500 mm3時，處死小鼠且在處死當天(D)被視為死亡。當腫瘤展示壞死跡象時，處死小鼠且在同一天(D)被視為死亡(在個體腫瘤生長之圖式上用紅色星形指示)。
結果表明，在10 mg/kg劑量下，所有ADC在阻止腫瘤體積增加方面同樣有效。然而，在較低劑量之ADC (3 mg/kg)下，抗體5E7展示強的阻止腫瘤生長之能力，而N41及恩弗妥單抗兩者均不再展示控制腫瘤生長之能力。3 mg/kg劑量之結果展示於 圖 4中。
實例 11 ： ADC 在耐藥性乳癌模型 ( 人類乳癌、 HER2 / 粘附分子 - 4 高 / SUM185 模型 ) 中之活體外功效的比較隨後，吾人評估了與PADCEV™ (恩弗妥單抗維多汀)及ENHERTU™相比，5E7 Ab與喜樹鹼類似物結合以殺傷SUM185細胞之能力。此環境係用作抗HER2抗性模型。SUM185細胞以相對高水平表現粘附分子-4，其中粘附分子-4表現量為此等細胞中之HER2之約兩倍(參見 實例 1)。在此實驗中，測試作為具有DAR=8之ADC的5E7抗體，以及PADCEV™ (DAR=4，經FDA批准之PADCEV™之說明)及對照抗體，所有均以等效藥物與抗體比率與相同毒素結合。5E7係經由ggfg-Dxd連接子與喜樹鹼類似物Dxd結合。
簡言之，在藉由添加CTG受質進行細胞存活力量測之前，在細胞上培育各測試Ab之劑量範圍(起始點150 nM，稀釋因子2為3分，隨後稀釋因子5為5分)持續5天。在圖式上標繪發光相對於Ab濃度。
對於各ADC，將一定濃度範圍之ADC與表現粘附分子-4之細胞一起培育。在培育之後，以1:1比率添加CTG受質且用盤讀取器(Enspire)讀出發光信號，允許對與細胞存活力成比例之存在之ATP (代謝活性細胞之指標)進行定量。
結果展示於 圖 5中。5E7-ggfg-Dxd及PADCEV™能夠比ENHERTU™更有效地殺傷SUM185。在各情況下，靶向粘附分子4之ADC比其非靶向ADC (IC)對應物更有效地降低細胞存活力。
實例 12 ： 抗粘附分子 - 4 抗體之物種交叉反應性之表徵藉由流式細胞分析技術來測試抗粘附分子-4抗體與製備以分別表現小鼠、石蟹獼猴及大鼠粘附分子-4蛋白質(包括下文序列中未展示之N端V5標籤)之不同CHO細胞株的結合。
由細胞表現之蛋白質之成熟胺基酸序列如下： 小鼠粘附分子-4： 大鼠粘附分子-4： 石蟹獼猴粘附分子-4：
抗體5E7結合人類、石蟹獼猴以及大鼠粘附分子4蛋白質，但缺乏與小鼠粘附分子4蛋白質之結合。 圖 6A 及圖 6B展示抗粘附分子-4抗體在表現大鼠及石蟹獼猴粘附分子-4之CHO細胞株上之結合。
實例 13 ： 粘附分子家族交叉反應性之表徵藉由流式細胞分析技術來測試抗粘附分子-4抗體與製備以分別表現人類粘附分子1、粘附分子2、粘附分子3及PVR蛋白質之不同CHO細胞株的結合。藉由已知之抗人類粘附分子1、抗人類粘附分子2、抗人類粘附分子3及抗人類PVR抗體來分別控制及驗證各細胞株之表現。由細胞表現之蛋白質之成熟胺基酸序列如下： 粘附分子-1： 粘附分子-2： 粘附分子-3： PVR (粘附分子-5)：
結果表明，抗粘附分子-4抗體對人類粘附分子家族之成員不存在交叉反應性。圖展示抗粘附分子-4抗體對表現人類粘附分子1、人類粘附分子2、人類粘附分子3及人類PVR之CHO細胞的流式細胞分析技術結果。抗體未呈現與各細胞株之結合。
實例 14 ： 藉由 SPR 競爭結合至粘附分子 - 4 之抗原決定基定位藉由表面電漿子共振(Surface Plasmon Resonance；SPR)方法，藉由使用Ni-NTA (NTA)生物感測器(Fortebio)之OCTET分析，測試嵌合抗體5E7連同先前報導之抗體N4.1 (N41)、抗體14A5及恩弗妥單抗彼此競爭以結合至野生型人類粘附分子-4蛋白質之能力。簡言之，在生物感測器上捕獲在動力學緩衝液10X中稀釋至5 µg/mL之人類粘附分子4-His-BirA蛋白。注射在動力學緩衝液10X中稀釋至10 µg/mL之第一抗體，隨後第二次注射在動力學緩衝液10X中稀釋至10 µg/mL之第一抗體以便使信號飽和。注射在動力學緩衝液10X中稀釋至10 µg/mL之第二抗體。
結果展示於下 表 12中。黑色方塊指示第1抗體與第2抗體之間的實質性或直接競爭(第1抗體防止/引起第2抗體之結合損失)，具有X之方塊指示潛在部分競爭(第1抗體引起第2抗體之結合潛在地減少而非損失)，白色方塊指示無競爭。抗體5E7彼此競爭結合至粘附分子-4。 表 12
      所注射之第2 mab
      5E7 恩弗妥單抗 N41 14A5 MABT64
所注射之第1 mAb 5E7               
恩弗妥單抗               
N41               
14A5               
MABT64               
實例 15 ： 使用粘附分子 - 4 點突變體之抗體的抗原決定基定位細胞表面表現之人類粘附分子-4點突變體 在全長及Ig樣V域缺失之蛋白質上的抗粘附分子-4抗體之結合概況，以及抗體(結合至人類、石蟹獼猴及大鼠粘附分子-4而非結合至小鼠粘附分子-4)之物種結合概況，以及非人類粘附分子-4蛋白質當中之物種間差異准許鑑別Ig樣V域及Ig樣C2 1型域(亦稱為「C1」)之接合點處的殘基。結合粘附分子-4域之公佈結構，設計在表面暴露之胺基酸殘基處的粘附分子-4突變。基於蛋白質資料庫(Protein Data Bank)參考：4FRW (域V及C1)對粘附分子-4域結構進行建模。所使用之人類粘附分子-4為NCBI參考序列：NP_112178.2，所使用之小鼠粘附分子-4為NCBI參考序列：AAL79833.1，所使用之石蟹獼猴粘附分子-4為NCBI參考序列：XP_005541277.1，所使用之大鼠粘附分子-4為NCBI參考序列：NP_001102546.1。隨後，將表現粘附分子-4突變體之細胞用於測試抗粘附分子-4抗體與不同粘附分子-4突變體之結合的損失，以鑑別結合至粘附分子-4上之相同部位處的抗體。特定言之，在殘基K197T及/或S199A處具有C1-V接合點取代之突變體，或在域C1及V之接合點處具有額外及/或相鄰取代之突變體7、7bis及9可鑑別具有作為免疫結合物之有利應用的抗體。突變體7具有取代S195A/K197T/S199A。突變體7bis具有取代A72P/G73N/K197T/S199A。突變體9包括關鍵殘基Q234取代，且具有取代L150S/S152A/Q234R/I236S。 圖 7A及 圖 7B展示人類粘附分子-4蛋白質之分子模型，指示突變體7 ( 7A)及突變體7bis ( 7B)中之經取代之殘基的位置；此等突變體位於C1域中，其鑑別在粘附分子-4蛋白質之相對面上之域C1及V域之接合點處的兩個部位。 圖 8A及 圖 8B展示人類粘附分子-4蛋白質之分子模型的不同視圖，指示突變體1、2、3、4、5、6、7、8及9中之經取代之殘基的位置。
藉由PCR來產生粘附分子-4突變體。在瓊脂糖凝膠上操作經擴增之序列，且使用Macherey Nagel PCR清除凝膠提取套組(Macherey Nagel PCR Clean-Up Gel Extraction kit)純化。隨後使用ClonTech InFusion系統，將針對各突變體產生之經純化之PCR產物接合至表現載體中。含有突變序列之載體係以小規模純化(Miniprep)形式製備並定序。在定序之後，使用Promega PureYield™質體中等規模純化系統(Plasmid Midiprep System)以中等規模純化(Midiprep)形式製備含有突變序列之載體。在測試轉殖基因表現之前，使HEK293T細胞在DMEM培養基(Invitrogen)中生長，使用Invitrogen之脂染胺(Lipofectamine) 2000用載體轉染且在CO 2培育箱中在37℃下培育48小時。在Hek-293T細胞中轉染突變體，如下表中所示。所靶向之胺基酸突變展示於下 表 13中，列出存在於野生型粘附分子-4中之殘基/殘基之位置/存在於突變體粘附分子-4中之殘基，其中位置參考係相對於具有展示於SEQ ID NO: 1中之前導肽的粘附分子-4蛋白質。 表13
突變體 參考SEQ ID NO: 1之粘附分子-4之胺基酸取代
1 S58P/G59D/Q61A/N106D/P107A
2 V90S/P92A/A93S/E95A/G96D
3 A76S/Q77R/E78A/S91N
4 A72P/G73N/G75S
5 A158P/E160G/S243A/F244S
6 H238A/I239T/H241Q
7 S195A/K197T/S199A
7bis A72P/G73N/K197T/S199A
8 T190A/T191Q/S193A
9 L150S/S152A/Q234R/I236S
抗體與粘附分子-4突變體之間之締合的結果展示於下 表 14中。(+)意謂發生抗體-粘附分子-4締合。(-)意謂未發生抗體-粘附分子-4締合。由於該蛋白質之表現不存在，因而與突變體5相關之結果無關緊要。 表14
   EXPI培養基(陰性對照) 突變體1 突變體2 突變體3 突變體4 突變體5 突變體6 突變體7 突變體7bis 突變體8 突變體9
CHG1-M-1N4-5E7 - + + + + - + - - + +
恩弗妥單抗 - + - - + - + + + + +
N41 - - + + + - + + + + +
14A5.2 - - + + + - + + + + +
因此，抗體5E7在粘附分子-4上具有涵蓋C1域殘基之結合部位，該等C1域殘基在突變體7及7bis (S195A/K197T/S199A及A72P/G73N/K197T/S199A)中突變。因此，抗體5E7結合粘附分子-4上之抗原決定基，該等抗原決定基不同於恩弗妥單抗、N41及14A5 (其結合粘附分子-4之V域上的抗原決定基)。
實例 16 ： 依沙替康 ADC 之活體內功效在以下含有哈姆氏(Ham's) F12、FBS 1g/L、HEPES 10 mM、乙醇胺5 mM、胰島素5 µg/mL、氫皮質酮1 µg/mL、脂蛋白元-運鐵蛋白5 µg/mL、三碘甲狀腺胺酸(T3) 6.7 ng/mL、亞硒酸鈉8.7 ng/mL之細胞培養基中培養人類乳癌細胞株SUM190PT。
使用在7至8週齡之免疫缺陷CB17-SCID小鼠。產生各自具有人類Fc區之抗粘附分子-4抗體恩弗妥單抗、5E7及6A7，且經由胞內可裂解連接子ggfg-Dxd或PEG(8U)-Val-Ala-PAB-依沙替康結合至有效負載Dxd (德魯替康)或依沙替康。抗體6A7與5E7共用大部分CDR，具有類似之粘附分子-4結合親和力且結合粘附分子-4上之相同部位(對於6A7胺基酸序列，參見2021年11月24號申請之PCT/EP2021/082872)。ggfg-Dxd連接子將在裂解後釋放Dxd (德魯替康)且PEG(8U)-Val-Ala-PAB-依沙替康連接子將在裂解後釋放依沙替康。
將SUM190細胞以50萬個細胞之劑量在含有以½稀釋於PBS中之生長因子的100 µl基質膠中皮下移植於CB17-SCID免疫缺陷小鼠中。在第21天，當腫瘤達到146.9 ± 63.2 mm 3或213.2 ± 77.5 mm 3之平均體積(視實驗而定)時，將小鼠隨機分為8或9隻小鼠之小組(視實驗而定)，且用單次注射3或10 mg/kg體重之ADC或PBS (作為對照)進行靜脈內治療。一週兩次追蹤腫瘤生長。根據以下準則，藉由使用GraphPad Prism V7軟體確立卡普蘭邁耶存活曲線：當腫瘤體積達到1500 mm 3時，處死小鼠且在處死當天(D)被視為死亡。當腫瘤高度壞死時，處死小鼠且在同一天(D)被視為死亡。
關於3 mg/kg劑量之結果呈現於 圖 9A 及圖 9B中，其中可看出，發現損失與具有K197T/S199A突變之粘附分子-4之結合的抗IgVC1 ADC 5E7-ggfg-Dxd在限制小鼠中之腫瘤生長方面展現最高效率。此外，與經設計以在連接子裂解後釋放Dxd之ggfg-Dxd結合的5E7相比，與經設計以在連接子裂解後釋放依沙替康之PEG(8U)-Val-Ala-PAB-依沙替康結合的5E7在控制小鼠中之腫瘤生長方面展示較高效率，如 圖 9C中關於10 mg/kg劑量所示。
實例 17 ： ADC 在表現 Pg-p 之癌症模型中之活體外功效內源性地表現MDR1 P-醣蛋白(Pgp)之MC-38細胞經工程改造以表現粘附分子-4且培養於DMEM + 10% FBS中。在存在ADC之情況下，用媒劑(DSMO)或用已知充當Pgp之抑制劑的環孢素A (5 µM，於DMSO中之儲備溶液)治療細胞。所測試之ADC如下： (a) PADCEV™， (b) 經由在裂解後釋放Dxd之ggfg-Dxd連接子結合至德魯替康(Dxd)之抗體5E7 (5E7-GGFG-DxD)，及 (c) 經由在裂解後釋放依沙替康之PEG(8U)-Val-Ala-PAB-依沙替康連接子結合至依沙替康之抗體5E7 (5E7-依沙替康)。
ADC及等效同型對照ADC係以150至2.3×10 -3nM範圍內之劑量使用。在與細胞共同培育五天之後，藉由添加Cell Titer Glo™ (CTG)受質來量測細胞存活力。標繪發光相對於Ab濃度。
圖 10A展示經Padcev™ (恩弗妥單抗維多汀)、結合至Dxd之抗體5E7或結合至依沙替康之5E7治療之細胞的發光(指示細胞存活力)。具有依沙替康之ADC (5E7-依沙替康)作為有效負載在此耐藥性環境下高效地降低細胞存活力。 圖 10B展示在存在或不存在Pgp抑制劑環孢素之情況下，用Padcev™ (恩弗妥單抗維多汀)、結合至Dxd之抗體5E7或結合至依沙替康之5E7在150 nM ADC下治療且相對於對照抗體標準化之MC38細胞的腫瘤生長(曲線下面積)。結果表明，在其中結合至依沙替康之5E7為高度有效之濃度下，Padcev™及結合至Dxd之抗體5E7的抗腫瘤活性受到Pgp之不利影響。
實例 18 ： 支化 PEG - 二肽 - 依沙替康 ADC 之活體內功效抗VC域抗粘附分子-4抗體係經由不同支化PEG連接子結合至依沙替康，且在活體內SUM190腫瘤模型(粘附分子-4低/SUM190乳癌模型)中評估所得ADC。
製備ADC，其中抗VC域抗粘附分子-4 (N4)人類IgG1同型抗體6A7係經由不同連接子以每個抗體8種毒素(DAR=8)結合(在半胱胺酸殘基處)至依沙替康。所測試之連接子-毒素如下： VA - PAB - 依沙替康 - PEG ( 8U ) ： FK-PAB- 依沙替康 -PEG(8U) ： VA-PAB- 依沙替康 -PEG(16U) ： PSAR10- 依沙替康：
將SUM190細胞以50萬個細胞之劑量在具有以½稀釋於PBS中之生長因子的100 µl基質膠中皮下移植於CB17-SCID免疫缺陷小鼠中。當腫瘤達到200與250 mm 3之間的體積時，將小鼠隨機分為10隻小鼠之小組以用於藉由單次注射3 mg/kg ADC進行靜脈內治療。一週兩次追蹤腫瘤生長。根據以下準則，藉由使用GraphPad Prism V7軟體確立卡普蘭邁耶存活曲線：當腫瘤體積達到1500 mm 3時，處死小鼠且在處死當天(D)被視為死亡。當腫瘤展示壞死跡象時，處死小鼠且在同一天(D)被視為死亡(在個體腫瘤生長之圖式上用紅色星形指示)。
結果表明，在3 mg/kg劑量下，所有ADC在阻止腫瘤體積增加方面為有效的。作為游離毒素(未結合至抗粘附分子-4抗體，指示為「IC」)所投與之不同連接子-毒素在阻止腫瘤生長方面不太有效。IC (游離毒素)之結果展示於 圖 11中。ADC之結果展示於 圖 12中。
實例 19 ： 支化 PEG - 二肽 - 依沙替康 ADC 之活體內藥物動力學及功效抗VC域抗粘附分子-4抗體6A7係以(DAR=8)經由VA-PAB-依沙替康-PEG(16U)連接子(下文所示之結構)結合至依沙替康，且在活體內SUM190腫瘤模型(粘附分子-4低/SUM190乳癌模型)中以不同較低劑量評估。此實驗測試至多1 mg/kg體重之不同給藥方案且評估抗腫瘤功效與循環中之ADC濃度的相關性。
將SUM190細胞以50萬個細胞之劑量在具有以½稀釋於PBS中之生長因子的100 µl基質膠中皮下移植於CB17-SCID免疫缺陷小鼠中。當腫瘤達到150與250 mm 3之間的體積時，將小鼠隨機分為20隻小鼠之小組，以用於用PBS (作為對照)或用單次注射0.11 mg/kg、0.33 mg/kg、0.66 mg/kg或1 mg/kg體重(分別為2.2 µg、6.6 µg、13.2 µg及20 µg劑量)之ADC進行靜脈內治療。量測腫瘤生長且在同一天獲得血漿樣品，其中在治療後的5分鐘、5小時(h)、24小時時獲得血漿樣品，且隨後在72小時、第7天獲得血漿樣品並進行腫瘤生長量測兩者，且其後每週進行一次。
結果展示於 圖 13中。圖13之左上圖展示PBS並未阻止腫瘤體積增加。圖13之右上圖展示1 mg/kg劑量之ADC之結果，其表明強抗腫瘤功效。圖13之下圖展示ADC隨時間推移在血漿中之濃度，表明ADC在ADC展示抗腫瘤活性之時段內保持可偵測。
實例 20 ： 支化 PEG - 二肽 - 依沙替康 ADC 之活體內安全性在3 mg/kg體重至30 mg/kg體重範圍內之劑量下進行以DAR-8結合至VA-PAB-依沙替康-PEG(16U)連接子之抗VC域抗粘附分子-4抗體的劑量範圍研究。
在第一次實驗中，在第1天及第22天，藉由靜脈內推注以3、10或30 mg/kg體重在史泊格多利(Sprague Dawley)大鼠中注射ADC。沿研究過程收集血漿樣品(每時間點每劑量水平n=3隻雄性大鼠)，且藉由ELISA量測總抗粘附分子-4抗體(總抗體；TA) (DAR≥0)及ADC (DAR≥1)之濃度，且藉由LC-MS量測游離依沙替康(Exa)。
圖 14A展示3 mg/kg劑量(上圖)及10 mg/kg劑量(下圖)之結果且 圖 14B展示30 mg/kg劑量之結果。對於各分析物，低於定量下限(lower limit of quantification；LLOQ)之濃度值係以LLOQ/2標繪。Y軸表示以ng/mL計之分析物血漿濃度，且X軸表示以天數計之時間。符號及線條展示各組之平均值及標準差。
在第二次實驗中，在第1天及第22天，藉由靜脈內推注以3、10或30 mg/kg體重在毛里求斯石蟹獼猴(Mauritian cynomolgus monkey)中注射ADC。沿研究過程收集血漿樣品(每劑量水平n=1隻雄性猴及1隻雌性猴)，且藉由ELISA量測總抗粘附分子-4抗體(總抗體；TA) (DAR≥0)及ADC (DAR≥1)之濃度，且藉由LC-MS量測游離依沙替康(Exa)。
圖 15A展示3 mg/kg劑量(上圖)及10 mg/kg劑量(下圖)之結果且 圖 15B展示30 mg/kg劑量之結果。對於各分析物，低於定量下限(LLOQ)之濃度值係以LLOQ/2標繪。Y軸表示以ng/mL計之分析物血漿濃度，且X軸表示以天數計之時間。符號及線條展示各組之平均值及標準差。
大鼠與非人類靈長類動物兩者之結果顯示，ADC在所測試之最高劑量(30 mg/kg體重)下為安全且耐受良好的。
本文中所引用之所有參考文獻，包括公開案、專利申請案及專利均以全文引用之方式併入本文中，且引用程度與個別且特定地指示在本文中以引用之方式併入且全文闡述(在法律允許之最大程度上)的各參考文獻相同，不考慮本文中其他地方作出之特定文獻的任何單獨提供之併入。
除非另有說明，否則本文中所提供之所有確切值表示對應近似值(例如，關於特定因素或量測所提供之所有確切例示性值可被視為亦提供對應近似量測值，在適當時藉由「約」修飾)。當「約」與數值結合使用時，此可指定為包括對應於指定數值之+/-10%的值。
除非另外說明或明顯與上下文矛盾，否則本文中參考一或多個要素使用諸如「包含」、「具有」、「包括」或「含有」之術語的本發明之任何態樣或實施例之描述意欲對「由該一或個種特定要素組成」、「基本上由其組成」或「實質上包含其」之本發明之類似態樣或實施例提供支援(例如，除非另有說明或明顯與上下文矛盾，否則本文中描述為包含特定要素之組合物應理解為亦描述由該要素組成之組合物)。
除非另外主張，否則使用本文中所提供之任何及所有實例或例示性語言(例如，「諸如」)僅意欲較佳地闡明本發明而不對本發明之範疇形成限制。本說明書中之語言不應解釋為指示任何未主張之要素對於本發明之實踐而言必不可少。
表 15
SEQ ID NO: 描述 序列
1              具有信號肽之人類粘附分子-4 MPLSLGAEMW GPEAWLLLLL LLASFTGRCP AGELETSDVV TVVLGQDAKL PCFYRGDSGE QVGQVAWARV DAGEGAQELA LLHSKYGLHV SPAYEGRVEQ PPPPRNPLDG SVLLRNAVQA DEGEYECRVS TFPAGSFQAR LRLRVLVPPL PSLNPGPALE EGQGLTLAAS CTAEGSPAPS VTWDTEVKGT TSSRSFKHSR SAAVTSEFHL VPSRSMNGQP LTCVVSHPGL LQDQRITHIL HVSFLAEASV RGLEDQNLWH IGREGAMLKC LSEGQPPPSY NWTRLDGPLP SGVRVDGDTL GFPPLTTEHS GIYVCHVSNE FSSRDSQVTV DVLDPQEDSG KQVDLVSASV V VVGVIAALL FCLLVVVVVL MSRYHRRKAQ QMTQKYEEEL TLTRENSIRR LHSHHTDPRS QPEESVGLRA EGHPDSLKDN SSCSVMSEEP EGRSYSTLTT VREIETQTEL LSPGSGRAEE EEDQDEGIKQ AMNHFVQENG TLRAKPTGNG IYINGRGHLV
2              免疫接種中所使用之人類粘附分子-4 GRCPAGELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARVDAGEGAQELALLHSKYGLHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVLVPPLPSLNPGPALEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTTSSRSFKHSRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDQRITHILHVSFLAEASVRGLEDQNLWHIGREGAMLKCLSEGQPPPSYNWTRLDGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEFSSRDSQVTVDVLDPQEDSGKQVDLVSASVV 
3              V域 GELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARVDAGEGAQELALLHSKYGLHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLR
4              Ig樣C2 1型 PPLPSLNPGPALEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTTSSRSFKHSRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDQRIT
5              Ig樣C2 2型 ASVRGLEDQNLWHIGREGAMLKCLSEGQPPPSYNWTRLDGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEFSSRDSQVTVDVLDPQEDSGKQVDLVSASV
6              N41 VH QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGSTDYNAAFISRLSISKDTSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARELIHAMDNWGQGTSVTVSS
7              N41 VL DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGNSPQLLVFAATNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGTYYCQHFWGTPTFGGGTKLEIK
8              人類粘附分子4-His-BirA GELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARVDAGEGAQELALLHSKYGLHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVLVPPLPSLNPGPALEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTTSSRSFKHSRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDQRITHILHVSFLAEASVRGLEDQNLWHIGREGAMLKCLSEGQPPPSYNWTRLDGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEFSSRDSQVTVDVLDPQEDSGKQVDLVSASHHHHHHLHHILDAQKMVWNHR
9              野生型N4構築體 GELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARVDAGEGAQELALLHSKYGLHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVLVPPLPSLNPGPALEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTTSSRSFKHSRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDQRITHILHVSFLAEASVRGLEDQNLWHIGREGAMLKCLSEGQPPPSYNWTRLDGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEFSSRDSQVTVDVLDPQEDSGKQVDLVSASVVVVGVIAALLFCLLVVVVVLMSRYHRRKAQQMTQKYEEELTLTRENSIRRLHSHHTDPRSQPEESVGLRAEGHPDSLKDNSSCSVMSEEPEGRSYSTLTTVREIETQTELLSPGSGRAEEEEDQDEGIKQAMNHFVQENGTLRAKPTGNGIYINGRGHLV
10           C1C2構築體 PPLPSLNPGPALEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTTSSRSFKHSRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDQRITHILHVSFLAEASVRGLEDQNLWHIGREGAMLKCLSEGQPPPSYNWTRLDGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEFSSRDSQVTVDVLDPQEDSGKQVDLVSASVV VVGVIAALLFCLLVVVVVLMSRYHRRKAQQMTQKYEEELTLTRENSIRRLHSHHTDPRSQPEESVGLRAEGHPDSLKDNSSCSVMSEEPEGRSYSTLTTVREIETQTELLSPGSGRAEEEEDQDEGIKQAMNHFVQENGTLRAKPT GNGIYINGRGHLV
11           C2構築體 ASVRGLEDQNLWHIGREGAMLKCLSEGQPPPSYNWTRLDGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEFSSRDSQVTVDVLDPQEDSGKQVDLVSASVVVVGVIAALLFCLLVVVVVLMSRYHRRKAQQMTQKYEEELTLTRENSIRRLHSHHTDPRSQPEESVGLRAEGHPDSLKDNSSCSVMSEEPEGRSYSTLTTVREIETQTELLSPGSGRAEEEEDQDEGIKQAMNHFVQENGTLRAKPTGNGIYINGRGHLV
12           小鼠粘附分子-4-V5 ELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDPDEQVGQVAWARVDPNEGIRELALLHSKYGLHVNPAYEDRVEQPPPPRDPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARMRLRVLVPPLPSLNPGPPLEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTQSSRSFTHPRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDRRITHTLQVAFLAEASVRGLEDQNLWQVGREGATLKCLSEGQPPPKYNWTRLDGPLPSGVRVKGDTLGFPPLTTEHSGVYVCHVSNELSSRDSQVTVEVLDPEDPGKQVDLVSASVIIVGVIAALLFCLLVVVVVLMSRYHRRKAQQMTQKYEEELTLTRENSIRRLHSHHSDPRSQPEESVGLRAEGHPDSLKDNSSCSVMSEEPEGRSYSTLTTVREIETQTELLSPGSGRTEEDDDQDEGIKQAMNHFVQENGTLRAKPTGNGIYINGRGHLV
13           大鼠粘附分子-4 V5 MPLSLGAEMWGPEAWLLLLFLASFTGRYSAGELETSDLVTVVLGQDAKLPCFYRGDPDEQVGQVAWARVDPNEGTRELALLHSKYGLHVSPAYEDRVEQPPPPRDPLDGSILLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARMRLRVLVPPLPSLNPGPPLEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTQSSRSFKHSRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDQRITHTLQVAFLAEASVRGLEDQNLWHVGREGATLKCLSEGQPPPKYNWTRLDGPLPSGVRVKGDTLGFPPLTTEHSGVYVCHVSNELSSRASQVTVEVLDPEDPGKQVDLVSASVVVVGVIAALLFCLLVVVVVLMSRYHRRKAQQMTQKYEEELTLTRENSIRRLHSHHTDPRSQPEESVGLRAEGHPDSLKDNSSCSVMSEEPEGRSYSTLTTVREIETQTELLSPGSGRTEEEDDQDEGIKQAMNHFVQENGTLRAKPTGNGIYINGRGHLV
14           石蟹獼猴粘附分子-4 V5 GELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARADAGEGAQELALLHSKYGLHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVLVPPLPSLNPGPALEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTTSSRSFKHSRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDQRITHILHVSFLAEASVRGLEDQNLWHVGREGAMLKCLSEGQPPPSYNWTRLDGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEFSSRDSQVTVDVLDPQEDSGKQVDLVSASVVVVGVIAALLFCLLVVVVVLMSRYHRRKAQQMTQKYEEELTLTRENSIRRLHSHHTDPRSQPEESVGLRAEGHPDSLKDNSSCSVMSEEPEGRSYSTLTTVREIETQTELLSPGSGRTEEEEDQDEGIKQAMNHFVQENGTLRAKPTGNGIYINGRGHLV
15           粘附分子-1 MGLAGAAGRWWGLALGLTAFFLPGVHSQVVQVNDSMYGFIGTDVVLHCSFANPLPSVKITQVTWQKSTNGSKQNVAIYNPSMGVSVLAPYRERVEFLRPSFTDGTIRLSRLELEDEGVYICEFATFPTGNRESQLNLTVMAKPTNWIEGTQAVLRAKKGQDDKVLVATCTSANGKPPSVVSWETRLKGEAEYQEIRNPNGTVTVISRYRLVPSREAHQQSLACIVNYHMDRFKESLTLNVQYEPEVTIEGFDGNWYLQRMDVKLTCKADANPPATEYHWTTLNGSLPKGVEAQNRTLFFKGPINYSLAGTYICEATNPIGTRSGQVEVNITEFPYTPSPPEHGRRAGPVPTAIIGGVAGSILLVLIVVGGIVVALRRRRHTFKGDYSTKKHVYGNGYSKAGIPQHHPPMAQNLQYPDDSDDEKKAGPLGGSSYEEEEEEEEGGGGGERKVGGPHPKYDEDAKRPYFTVDEAEARQDGYGDRTLGYQYDPEQLDLAENMVSQNDGSFISKKEWYV
16           粘附分子-2 MARAAALLPSRSPPTPLLWPLLLLLLLETGAQDVRVQVLPEVRGQLGGTVELPCHLLPPVPGLYISLVTWQRPDAPANHQNVAAFHPKMGPSFPSPKPGSERLSFVSAKQSTGQDTEAELQDATLALHGLTVEDEGNYTCEFATFPKGSVRGMTWLRVIAKPKNQAEAQKVTFSQDPTTVALCISKEGRPPARISWLSSLDWEAKETQVSGTLAGTVTVTSRFTLVPSGRADGVTVTCKVEHESFEEPALIPVTLSVRYPPEVSISGYDDNWYLGRTDATLSCDVRSNPEPTGYDWSTTSGTFPTSAVAQGSQLVIHAVDSLFNTTFVCTVTNAVGMGRAEQVIFVRETPNTAGAGATGGIIGGIIAAIIATAVAATGILICRQQRKEQTLQGAEEDEDLEGPPSYKPPTPKAKLEAQEMPSQLFTLGASEHSPLKTPYFDAGASCTEQEMPRYHELPTLEERSGPLHPGATSLGSPIPVPPGPPAVEDVSLDLEDEEGEEEEEYLDKINPIYDALSYSSPSDSYQGKGFVMSRAMYV
17           粘附分子-3 MARTLRPSPLCPGGGKAQLSSASLLGAGLLLQPPTPPPLLLLLFPLLLFSRLCGALAGPIIVEPHVTAVWGKNVSLKCLIEVNETITQISWEKIHGKSSQTVAVHHPQYGFSVQGEYQGRVLFKNYSLNDATITLHNIGFSDSGKYICKAVTFPLGNAQSSTTVTVLVEPTVSLIKGPDSLIDGGNETVAAICIAATGKPVAHIDWEGDLGEMESTTTSFPNETATIISQYKLFPTRFARGRRITCVVKHPALEKDIRYSFILDIQYAPEVSVTGYDGNWFVGRKGVNLKCNADANPPPFKSVWSRLDGQWPDGLLASDNTLHFVHPLTFNYSGVYICKVTNSLGQRSDQKVIYISDPPTTTTLQPTIQWHPSTADIEDLATEPKKLPFPLSTLATIKDDTIATIIASVVGGALFIVLVSVLAGIFCYRRRRTFRGDYFAKNYIPPSDMQKESQIDVLQQDELDSYPDSVKKENKNPVNNLIRKDYLEEPEKTQWNNVENLNRFERPMDYYEDLKMGMKFVSDEHYDENEDDLVSHVDGSVISRREWYV
18           PVR粘附分子-5 DVVVQAPTQVPGFLGDSVTLPCYLQVPNMEVTHVSQLTWARHGESGSMAVFHQTQGPSYSESKRLEFVAARLGAELRNASLRMFGLRVEDEGNYTCLFVTFPQGSRSVDIWLRVLAKPQNTAEVQKVQLTGEPVPMARCVSTGGRPPAQITWHSDLGGMPNTSQVPGFLSGTVTVTSLWILVPSSQVDGKNVTCKVEHESFEKPQLLTVNLTVYYPPEVSISGYDNNWYLGQNEATLTCDARSNPEPTGYNWSTTMGPLPPFAVAQGAQLLIRPVDKPINTTLICNVTNALGARQAELTVQVKEGPPSEHSGISRNAIIFLVLGILVFLILLGIGIYFYWSKCSREVLWHCHLCPSSTEHASASANGHVSYSAVSRENSSSQDPQTEGTR
19           5E7 VH QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYIFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIDPSDSYTNYNQKFKGKATLTLDKSSSTTYMQLSSLTSEDSAVYYCVRGYGNYGDYWGQGTTLTVSSASTKGP
20           5E7 VL DVVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPWTFGGGTKLEIKRTVAAP
21           5E7 CDR-H1 Kabat SYWMH
22           5E7 CDR-H2 Kabat EIDPSDSYTNYNQKFKG
23           5E7 CDR-H3 Kabat GYGNYGDY
24           5E7 CDR-L1 Kabat RSSKSLLHSNGITYLY
25           5E7 CDR-L2 Kabat QMSNLAS
26           5E7 CDR-L3 Kabat AQNLELPWT
27           5E7 CDR-H1 IMGT GYIFTSYW
28           5E7 CDR-H2 IMGT IDPSDSYT
29           5E7 CDR-H3 IMGT VRGYGNYGDY
30           5E7 CDR-L1 IMGT KSLLHSNGITY
31           5E7 CDR-L2 IMGT QMS
32           5E7 CDR-H1 CHotia GYIFTSY
33           5E7 CDR-H2 Chotia PSDS
34           5E7 CDR-H3 Chotia YGNYGD
35           5E7 CDR-L1 Chotia SKSLLHSNGITY
36           5E7 CDR-L3 Chotia NLELPW
37           5E7 H0 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGEIDPSDSYTNYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGNYGDYWGQGTLVTVSS
38           5E7 H0 DNA CAG GTT CAG CTG GTT CAG TCA GGT GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGA GCT AGC GTG AAA GTG TCC TGC AAA GCC TCT GGC TAC ACC TTT ACC TCC TAT TGG ATG CAC TGG GTA CGA CAG GCA CCA GGA CAA GGG CTG GAA TGG ATG GGC GAA ATC GAT CCC TCT GAC AGC TAC ACG AAC TAC AAC CAG AAG TTC AAG GGT AGG GTC ACT ATG ACT CGC GAC ACA TCC ACC AGT ACC GTC TAC ATG GAG CTC TCC AGT TTG CGG TCT GAG GAT ACA GCC GTG TAC TAC TGT GCC AGA GGC TAT GGC AAT TAT GGG GAC TAT TGG GGA CAA GGG ACA CTG GTC ACT GTG AGC TCA
39           5E7 H1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGEIDPSDSYTNYNQKFKGRVTMT LDTSTST TYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGNYGDYWGQGTLVTVSS
40           5E7 H1 DNA CAG GTT CAG CTG GTC CAG AGT GGT GCA GAA GTG AAG AAA CCT GGC GCT TCA GTG AAG GTA TCC TGC AAA GCC TCT GGG TAC ACC TTT ACC TCC TAT TGG ATG CAC TGG GTT CGC CAA GCT CCA GGA CAG GGC TTG GAA TGG ATG GGA GAG ATC GAT CCC TCT GAC TCC TAC ACC AAC TAC AAC CAG AAG TTC AAG GGA AGG GTG ACG ATG ACT CTC GAC ACT AGC ACC AGC ACA ACC TAC ATG GAG CTG AGT TCA CTT CGG TCT GAG GAT ACT GCC GTC TAC TAC TGT GCC AGA GGC TAT GGG AAT TAT GGG GAC TAT TGG GGT CAA GGC ACA CTG GTG ACA GTG TCC AGC
41           5E7 H2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGEIDPSDSYTNYNQKFKGRVTMT LD KSTST TYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGNYGDYWGQGTLVTVSS
42           5E7 H2 DNA CAG GTG CAG CTG GTT CAG TCA GGA GCA GAG GTC AAG AAA CCT GGT GCT TCT GTG AAG GTG TCC TGC AAA GCC AGT GGC TAT ACC TTT ACC AGC TAC TGG ATG CAC TGG GTT CGG CAA GCT CCA GGT CAG GGC TTG GAA TGG ATG GGA GAG ATC GAT CCC TCA GAC TCC TAC ACG AAC TAC AAC CAG AAG TTC AAA GGG AGG GTA ACC ATG ACA CTG GAC AAG TCT ACA TCC ACC ACT TAC ATG GAG CTG AGT TCT CTT CGC TCC GAA GAT ACT GCC GTG TAC TAC TGT GCC AGA GGC TAT GGG AAT TAT GGC GAC TAT TGG GGA CAA GGG ACT CTC GTG ACA GTC AGC AGC
43           5E7 H3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGY IFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGEIDPSDSYTNYNQKFKGRVTMT LD KSTST TYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGNYGDYWGQGTLVTVSS
44           5E7 H3 DNA CAG GTT CAG CTG GTC CAG TCA GGT GCA GAA GTG AAG AAA CCT GGA GCT AGC GTG AAG GTG TCC TGC AAA GCC TCT GGC TAC ATC TTT ACC TCC TAT TGG ATG CAC TGG GTA CGC CAA GCT CCA GGT CAG GGG TTG GAA TGG ATG GGA GAG ATT GAT CCC TCT GAC AGC TAC ACC AAC TAC AAC CAG AAG TTC AAA GGA CGG GTT ACC ATG ACA CTG GAC AAG TCC ACT TCA ACG ACC TAC ATG GAG CTT TCC TCT CTG AGG AGT GAG GAT ACT GCC GTG TAC TAC TGT GCC AGA GGG TAT GGC AAT TAT GGG GAC TAT TGG GGC CAA GGC ACA CTC GTC ACA GTG AGC AGT
45           5E7 H4 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGY IFTSYWMHWV KQAPGQGLEWMGEIDPSDSYTNYNQKFKGRVTMT LD KSTST TYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGNYGDYWGQGTLVTVSS
46           5E7 H4 DNA CAG GTT CAG CTC GTT CAG TCT GGA GCC GAA GTG AAG AAA CCA GGT GCT AGC GTG AAA GTG AGT TGC AAG GCT TCC GGC TAC ATC TTT ACC AGC TAT TGG ATG CAC TGG GTC AAA CAG GCA CCT GGA CAA GGG TTG GAG TGG ATG GGA GAG ATT GAT CCC TCA GAC TCC TAC ACC AAC TAC AAC CAG AAG TTC AAG GGC AGG GTA ACC ATG ACA CTG GAC AAG TCC ACG AGT ACT ACC TAC ATG GAA CTG TCC TCT CTT CGG TCT GAG GAT ACA GCC GTG TAC TAC TGT GCC AGA GGG TAT GGC AAT TAT GGG GAC TAT TGG GGT CAA GGC ACT CTG GTC ACA GTG AGC TCA
47           5E7 H5 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGY IFTSYWMHWV KQ RPGQGLEWMGEIDPSDSYTNYNQKFKGRVTMT LD KSTST TYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGNYGDYWGQGTLVTVSS
48           5E7 H5 DNA CAG GTT CAG CTC GTT CAG TCA GGT GCA GAA GTC AAG AAA CCA GGA GCT AGC GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCT TCT GGG TAC ATC TTT ACC AGC TAC TGG ATG CAC TGG GTG AAA CAG CGC CCT GGT CAA GGA CTG GAA TGG ATG GGC GAG ATT GAT CCC AGT GAC AGC TAC ACC AAC TAC AAC CAG AAG TTC AAA GGC AGG GTG ACC ATG ACA CTG GAC AAG TCC ACT TCA ACC ACG TAC ATG GAG CTC AGT TCC CTT CGG TCT GAG GAT ACA GCC GTC TAC TAT TGT GCC AGA GGG TAT GGC AAT TAT GGG GAC TAT TGG GGA CAA GGC ACA CTG GTC ACA GTG AGC TCA
49           5E7 H6 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGY IFTSYWMHWV KQ RPGQGLEW IGEIDPSDSYTNYNQKFKGRVTMT LD KSTST TYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGNYGDYWGQGTLVTVSS
50           5E7 H6 DNA CAG GTT CAG CTC GTT CAG AGT GGA GCA GAG GTG AAG AAA CCA GGA GCT TCA GTC AAG GTA TCC TGC AAA GCC TCT GGC TAC ATC TTT ACC AGC TAC TGG ATG CAC TGG GTG AAA CAA CGC CCT GGA CAA GGG TTG GAG TGG ATT GGG GAA ATC GAT CCC TCC GAT TCC TAC ACC AAC TAC AAC CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTG ACG ATG ACA CTG GAC AAG TCT ACA TCC ACT ACC TAC ATG GAA CTC AGC TCA CTT CGG AGT GAG GAC ACA GCC GTC TAT TAC TGT GCT AGG GGC TAT GGG AAT TAT GGC GAC TAT TGG GGT CAG GGT ACT CTG GTC ACA GTG AGC TCA
51           5E7 H7 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGY IFTSYWMHWV KQ RPGQGLEW IGEIDPSDSYTNYNQKFKGRVT LT LD KSTST TYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGNYGDYWGQGTLVTVSS
52           5E7 H7 DNA CAG GTT CAG CTC GTT CAG TCA GGC GCT GAA GTC AAG AAA CCC GGA GCA TCC GTG AAG GTG TCC TGT AAG GCC TCT GGG TAC ATC TTT ACG AGC TAC TGG ATG CAC TGG GTG AAA CAG AGG CCT GGT CAA GGG CTT GAG TGG ATT GGA GAG ATC GAT CCA AGC GAC TCA TAC ACC AAC TAC AAC CAG AAG TTC AAA GGT CGC GTT ACA CTG ACT CTG GAC AAG AGT ACC TCC ACC ACC TAC ATG GAA CTG AGT TCT TTG CGG TCT GAG GAT ACA GCC GTG TAT TAC TGC GCT AGA GGG TAT GGC AAT TAT GGC GAC TAT TGG GGA CAA GGC ACA CTG GTC ACA GTG AGC TCA
53           5E7 H8 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGY IFTSYWMHWV KQAPGQGLEW IGEIDPSDSYTNYNQKFKGRVTMT LD KSTST TYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGNYGDYWGQGTLVTVSS
54           5E7 H8 DNA ACA GGC GTG CAT TCG CAG GTT CAG CTG GTA CAG TCA GGT GCC GAA GTG AAG AAA CCT GGT GCA TCC GTC AAA GTG AGC TGC AAA GCC AGT GGG TAC ATC TTT ACC TCC TAT TGG ATG CAC TGG GTT AAG CAG GCT CCA GGA CAA GGG TTG GAG TGG ATT GGC GAA ATC GAT CCC TCA GAC TCC TAC ACG AAC TAC AAC CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTG ACA ATG ACT CTG GAC AAG TCT ACC TCT ACC ACC TAT ATG GAG CTG TCT AGC CTT CGG AGT GAG GAT ACA GCC GTG TAC TAC TGT GCT AGG GGA TAC GGG AAT TAT GGC GAC TAT TGG GGA CAA GGC ACA CTC GTC ACT GTG TCC AGC GCG AGC ACC AAG GGC
55           5E7 H9 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGY IFTSYWMHWV KQAPGQGLEW IGEIDPSDSYTNYNQKFKGRVTMT LD KSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGNYGDYWGQGTLVTVSS
56           5E7 H9 DNA ACA GGC GTG CAT TCG CAG GTT CAG CTG GTT CAG TCT GGC GCT GAA GTC AAG AAA CCT GGA GCC AGT GTC AAG GTG TCA TGC AAA GCT TCC GGG TAC ATC TTT ACG AGC TAT TGG ATG CAC TGG GTG AAA CAG GCA CCA GGA CAA GGG TTG GAG TGG ATT GGT GAG ATC GAT CCC TCA GAC AGC TAC ACC AAC TAC AAC CAG AAG TTC AAG GGT AGG GTA ACC ATG ACA CTG GAC AAG TCC ACA AGC ACC GTG TAC ATG GAA CTC TCC TCT CTT CGG AGT GAG GAT ACT GCC GTG TAC TAC TGT GCC AGA GGC TAT GGC AAT TAT GGG GAC TAT TGG GGA CAA GGC ACT CTG GTC ACA GTG TCC TCT GCG AGC ACC AAG GGC
57           5E7 H10 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGY IFTSYWMHWV KQAPGQGLEW VGEIDPSDSYTNYNQKFKGRVTMT LD KSTST TYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGNYGDYWGQGTLVTVSS
58           5E7 H10 DNA ACA GGC GTG CAT TCG CAG GTA CAG CTG GTT CAG TCA GGT GCT GAG GTG AAG AAG CCA GGT GCA TCC GTG AAG GTC AGC TGC AAA GCC TCT GGG TAC ATC TTT ACC AGC TAT TGG ATG CAC TGG GTG AAA CAG GCT CCT GGA CAA GGA CTG GAA TGG GTT GGG GAG ATT GAC CCC AGT GAC TCC TAT ACC AAC TAC AAC CAG AAG TTC AAA GGG AGG GTC ACG ATG ACT CTC GAC AAG TCA ACC TCC ACA ACC TAC ATG GAA CTG TCC TCT TTG CGG AGT GAG GAT ACA GCC GTG TAC TAC TGT GCC AGA GGC TAT GGC AAT TAT GGC GAT TAC TGG GGA CAA GGC ACT CTT GTC ACA GTG AGC TCT GCG AGC ACC AAG GGC
59           5E7 L0 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPWTFGGGTKVEIK
60           5E7 L0 DNA GAC ATC GTG ATG ACA CAG AGT CCC TTG TCC TTG CCT GTG ACT CCT GGA GAA CCC GCT AGC ATT AGC TGC AGA AGC AGC AAG TCC CTT CTC CAC TCT AAC GGC ATA ACC TAT CTG TAC TGG TAT CTG CAG AAA CCA GGG CAG AGT CCC CAA CTC CTG ATC TAC CAG ATG TCC AAC CTG GCA TCT GGC GTT CCT GAT CGG TTC TCA GGG TCA GGT TCT GGC ACT GAC TTC ACA CTG AAG ATC TCC AGG GTA GAG GCC GAA GAT GTC GGA GTG TAC TAT TGT GCC CAG AAT CTG GAG CTT CCA TGG ACC TTT GGA GGT GGC ACC AAA GTC GAG ATT AAG
61           5E7 L1 D VVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFS SSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPWTFGGGTKVEIK
62           5E7 L1 DNA GAT GTC GTG ATG ACC CAG AGT CCA CTG TCC CTT CCT GTC ACT CCT GGT GAA CCA GCC AGT ATT TCC TGT CGG TCA AGC AAA TCC CTC CTT CAC TCC AAC GGG ATT ACC TAT CTG TAC TGG TAT CTG CAG AAA CCC GGC CAA TCT CCC CAG TTG CTC ATC TAC CAG ATG AGC AAT CTG GCC TCT GGA GTA CCC GAC AGG TTC AGC TCT AGT GGA TCA GGG ACA GAC TTC ACA CTG AAG ATC AGC AGA GTG GAA GCT GAG GAT GTT GGC GTG TAC TAT TGC GCA CAG AAC CTG GAG TTG CCT TGG ACC TTT GGA GGT GGC ACT AAG GTG GAG ATA AAG
63           5E7 L2 D VVMTQSPLS NPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFS SSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPWTFGGGTKVEIK
64           5E7 L2 DNA GAC GTC GTG ATG ACT CAG TCC CCT CTC TCT AAT CCC GTT ACT CCT GGA GAA CCA GCC AGC ATT TCC TGC AGA AGC AGC AAA TCC CTG CTG CAC AGT AAC GGC ATA ACC TAT CTG TAC TGG TAT CTG CAG AAA CCA GGG CAA AGT CCC CAG TTG CTG ATC TAC CAG ATG TCC AAC TTG GCT TCA GGT GTG CCT GAT CGG TTC AGT AGC TCT GGG TCT GGC ACA GAC TTC ACC CTG AAG ATC TCA AGG GTC GAA GCA GAG GAT GTA GGC GTG TAT TAC TGT GCC CAG AAT CTC GAG CTT CCC TGG ACC TTT GGA GGT GGA ACT AAG GTG GAG ATA AAG
65           5E7 L3 D VVMTQS ALS NPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFS SSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPWTFGGGTKVEIK
66           5E7 L3 DNA GAT GTG GTC ATG ACT CAG TCT GCC TTG AGC AAT CCC GTA ACT CCA GGT GAA CCA GCC AGC ATA AGT TGT CGG TCA AGC AAG AGT CTC CTT CAC TCC AAT GGC ATT ACC TAT CTC TAC TGG TAT CTG CAG AAA CCT GGT CAG TCT CCC CAA CTG CTG ATC TAC CAG ATG AGC AAC CTG GCA AGT GGA GTC CCT GAC AGG TTC TCC TCC TCA GGA TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTG AAG ATC TCC AGA GTG GAA GCT GAG GAT GTT GGC GTG TAC TAT TGC GCT CAG AAC CTG GAG TTG CCC TGG ACC TTT GGC GGA GGG ACT AAG GTG GAG ATA AAG
67           5E7 HP FAB QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYIFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIDPSDSYTNYNQKFKGKATLTLDKSSSTTYMQLSSLTSEDSAVYYCVRGYGNYGDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK
68           5E7 LP FAB DVVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
69           5E7 H0 FAB QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGEIDPSDSYTNYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGNYGDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK
70           5E7 L0 FAB DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
71           連接子DGGFG DGGFG
72           連接子DDGGFG DDGGFG
73           連接子KDGGFG KDGGFG
74           連接子GGFGGGF GGFGGGF
75           連接子GGFGG GGFGG
76           連接子GGFGGG GGFGGG
77           全鏈5E7 H5 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYWMHWVKQRPGQGLEWMGEIDPSDSYTNYNQKFKGRVTMTLDKSTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGNYGDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
78           全鏈5E7 L3 DVVMTQSALSNPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
圖1展示藉由FACS所測定，在SUM190人類乳癌腫瘤細胞之表面處的HER2及粘附分子-4多肽之表現量(MFI：螢光強度之平均值)。SUM190腫瘤細胞以低至中等水平(中值螢光單位1777)表現HER2以及以較低水平(中值螢光單位991)表現粘附分子-4。 圖2展示藉由FACS所測定，在SUM185人類乳癌腫瘤細胞之表面處的HER2及粘附分子-4多肽之表現量(MFI：螢光強度之平均值)。SUM185細胞以中等至高水平(中值螢光單位2880)表現HER2以及以較高水平(中值螢光單位4326)表現粘附分子-4。 圖3A展示與喜樹鹼類似物Dxd (經由實例9中所示之GGFG-Dxd連接子)或依沙替康(經由實例9中所示之(PEG(8U)-Val-Ala-PAB-依沙替康)連接子)結合之5E7抗體以及同型對照抗體(IC) (所有均在等效藥物與抗體比率(DAR=8)下)對人類乳癌細胞之殺傷，及與V域結合Enhertu™ (曲妥珠單抗德魯替康(deruxtecan) (抗HER2))相比之殺傷。圖3B展示「5E7-依沙替康」(結合至實例9中所示之依沙替康連接子(PEG(8U)-Val-Ala-PAB-依沙替康)之5E7)如在引起表現HER-2及粘附分子-4之SUM185、SUM190、MDA-MB-468 (TNBC)人類腫瘤細胞以及MC38 (結腸癌)及B16F10 (黑色素瘤)鼠類腫瘤細胞死亡中之功效，以及5E7-依沙替康引起細胞死亡之能力之EC50值。 圖4展示在人類乳癌之小鼠模型中，與相同劑量之恩弗妥單抗、N41及同型對照抗體(IC)相比，在單次劑量之3 mg/kg之5E7抗體下作為喜樹鹼ADC之功效。各抗體係以等效藥物與抗體比率(DAR=8)與相同喜樹鹼類似物(Dxd)及含有四肽之連接子(GGFG)結合。僅5E7能夠有效地控制腫瘤生長。 圖5展示與Padcev™ (恩弗妥單抗維多汀) (以DAR=4結合至奧瑞他汀化合物MMAE之恩弗妥單抗)及Enhertu™相比，在5E7抗體之相對較高水平下表現粘附分子-4的SUM185人類乳癌細胞之殺傷。此環境係用作抗HER2抗性模型。 圖6A及圖6B分別展示藉由流式細胞分析技術(flow cytometry)所測定，抗粘附分子-4抗體5E7在表現大鼠及石蟹獼猴(cynomolgus)粘附分子-4之CHO細胞株上之結合。 圖7A及圖7B展示人類粘附分子-4蛋白質之結構，其中陰影部分為取代；指示對應於突變體7 (7A)及7bis (7B)中所取代之C1域殘基的白色區域。 圖8A及圖8B展示人類粘附分子-4蛋白質之結構的若干視圖，其中陰影部分為取代；指示對應於突變體1、2、3、4、5、6、7、8及9中所取代之殘基的白色區域。 圖9A、圖9B及圖9C展示經ADC治療之小鼠中的腫瘤生長隨時間推移(腫瘤移植後的天數)之演化。圖9A及圖9B展示在相同DAR下結合至相同連接子-有效負載之不同抗粘附分子-4抗體(5E7或6A7)以靜脈內(i.v.)形式在3 mg/kg體重之劑量下進行之治療。圖9C展示在連接子之裂解後，結合至經設計以釋放Dxd或依沙替康之連接子的抗體5E7以靜脈內形式在10 mg/kg體重之劑量下進行之治療。 圖10A展示經Padcev™ (恩弗妥單抗維多汀)、結合至Dxd之抗體5E7或結合至依沙替康之5E7治療之細胞的發光(指示細胞存活力)。細胞為MC-38細胞，其內源性地表現MDR1 p-醣蛋白且經工程改造以表現粘附分子-4。具有依沙替康之ADC作為有效負載在此耐藥性環境下高效地降低細胞存活力。圖10B展示在存在或不存在Pgp抑制劑環孢素(cyclosporine)之情況下，用Padcev™ (恩弗妥單抗維多汀)、結合至Dxd之抗體5E7或結合至依沙替康之5E7在150 nM ADC下治療且相對於對照抗體標準化之MC38細胞的腫瘤生長(曲線下面積)，表明Padcev™及結合至Dxd之抗體5E7之抗腫瘤活性受到Pgp之不利影響。 圖11及圖12展示在3 mg/kg劑量下游離毒素及ADC之小鼠中之活體內評估結果。IC (游離毒素)之結果展示於圖11中。ADC之結果展示於圖12中。 圖13展示隨時間推移，抗粘附分子-4 ADC之小鼠中之活體內抗腫瘤功效及ADC之血漿濃度的結果。左上圖展示PBS並未阻止腫瘤體積增加。右上圖展示1 mg/kg劑量之ADC展示強抗腫瘤功效。下圖展示血漿中之ADC隨時間推移之濃度。 圖14展示大鼠中之ADC之活體內血漿濃度。圖14A展示3 mg/kg劑量(上圖)及10 mg/kg劑量(下圖)且圖14B展示30 mg/kg劑量之結果。 圖15展示非人類靈長類動物中之ADC之活體內血漿濃度。圖15A展示3 mg/kg劑量(上圖)及10 mg/kg劑量(下圖)且圖15B展示30 mg/kg劑量之結果。 表15展示本申請案中所揭示之核酸及胺基酸序列。
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Claims (37)

  1. 一種特異性結合人類粘附分子-4 (Nectin-4)多肽之抗體或其抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含：重鏈可變區(VH)，其包含與選自由SEQ ID NO: 47、49、51、37、39、41、43、45組成之群的胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL)，其包含與選自由SEQ ID NO: 65、63、61、59組成之群的胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列。
  2. 如請求項1之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含：重鏈可變區(VH)，其包含具有SEQ ID NO: 21、22及23中所示之各別胺基酸序列的CDR1、CDR2、CDR3；及輕鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3，其具有SEQ ID NO: 24、25、26中所示之各別胺基酸序列。
  3. 如請求項2之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含：包含來自人類基因IGKHV-46*01之構架FR1、FR2及FR3胺基酸序列的重鏈可變區(VH)，及包含來自人類基因IGKV-28*01之構架FR1、FR2及FR3胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)。
  4. 如請求項3之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含：重鏈可變區(VH)，其進一步包含具有人類基因IGHJ4*01之胺基酸序列的構架FR4；及輕鏈可變區(VL)，其進一步包含具有人類基因IGKJ4*01之胺基酸序列的構架FR4。
  5. 如請求項2至4中任一項之抗體或抗體片段，其中Kabat重鏈位置71處之胺基酸為白胺酸且Kabat重鏈位置78處之胺基酸為蘇胺酸。
  6. 如請求項2至5中任一項之抗體或抗體片段，其中Kabat重鏈位置73處之胺基酸為離胺酸。
  7. 如請求項2至6中任一項之抗體或抗體片段，其中Kabat重鏈位置28處之胺基酸為異白胺酸。
  8. 如請求項2至7中任一項之抗體或抗體片段，其中Kabat重鏈位置38處之胺基酸為離胺酸。
  9. 如請求項2至8中任一項之抗體或抗體片段，其中Kabat重鏈位置40處之胺基酸為精胺酸。
  10. 如請求項2至9中任一項之抗體或抗體片段，其中Kabat輕鏈位置2處之胺基酸為纈胺酸且Kabat輕鏈位置64處之胺基酸為絲胺酸。
  11. 如請求項2至10中任一項之抗體或抗體片段，其中Kabat輕鏈位置11處之胺基酸為天冬醯胺。
  12. 如請求項2至11中任一項之抗體或抗體片段，其中Kabat輕鏈位置8處之胺基酸為丙胺酸。
  13. 如請求項1至12中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含有包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)；及包含SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)。
  14. 如請求項1至13中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段與連接子-有效負載部分(X-Z)結合，其中抗體-連接子-有效負載具有以下結構： 其中n為15。
  15. 一種結合人類粘附分子-4多肽的免疫結合物，該免疫結合物由式(I)表示： Ab - (X - (Z))                        式(I) 其中， Ab為如請求項1至13中任一項之抗體或抗體片段， X為連接Ab與Z之分子，其中X包含可裂解部分，例如在生理條件下，視情況在胞內條件下，視情況包含蛋白酶可裂解二肽、三肽、四肽或五肽； Z包含細胞毒性劑，視情況為喜樹鹼類似物，視情況為五環喜樹鹼類似物，視情況為六環喜樹鹼類似物，視情況為依沙替康(exatecan)、SN-38或Dxd。
  16. 如請求項15之免疫結合物，其中免疫結合物係由下式表示： Ab-(Y) - (X) - (Y') - (Z) 其中， Ab為特異性結合至人類粘附分子-4多肽之VC1橋接域之多肽、肽、抗體； Y視情況為不存在的或為間隔子，視情況為經取代或未經取代之烷基或雜烷基鏈，視情況其中一或多個原子可為除碳以外之原子，例如氧、硫、氮或其他原子，視情況其中該鏈之任何碳經烷氧基、羥基、烷基羰氧基、烷基-S-、硫醇、烷基-C(O)S-、胺、烷胺、醯胺或烷基醯胺取代，其中Y具有2至100個原子之鏈長，視情況此外其中Y包含反應性基團與該抗體之胺基酸側鏈反應的殘基； X為或包含藉由胞內肽酶或蛋白酶裂解之肽基連接子； Y'視情況為不存在的或為間隔子，視情況包含自消除間隔子或非自消除間隔子；及 Z包含細胞毒性劑，視情況為喜樹鹼類似物，視情況為五環喜樹鹼類似物，視情況為六環喜樹鹼類似物，視情況為依沙替康、SN-38或Dxd。
  17. 如請求項15至16中任一項之免疫結合物，其中該蛋白酶可裂解肽或肽基連接子包含纈胺酸-丙胺酸。
  18. 如請求項15至16中任一項之免疫結合物，其中該蛋白酶可裂解肽或肽基連接子包含苯丙胺酸-離胺酸或纈胺酸-瓜胺酸。
  19. 如請求項15至18中任一項之免疫結合物，其中該間隔子(Y)包含正交連接體部分及結合至該正交連接體部分之穩定性增強部分，視情況其中該穩定性增強部分為PEG或PSAR均聚物。
  20. 如請求項19之免疫結合物，其中該PEG或PSAR均聚物包含不超過16個單元之PEG或PSAR，視情況在8與16個單元之間的PEG或PSAR。
  21. 如請求項18至20中任一項之免疫結合物，其中該正交連接體係衍生自麩胺酸。
  22. 如請求項15至21中任一項之免疫結合物，其中該免疫結合物係由下式中之任一者表示： 其中n為5至23；且 其中Ab為特異性結合人類粘附分子-4多肽之抗體或其抗體片段。
  23. 如請求項15至22中任一項之免疫結合物，其中該抗體或抗體片段包含有包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)；及包含SEQ ID NO: 65之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)。
  24. 如請求項15至23中任一項之免疫結合物，其中該抗體或抗體片段包含有包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列的重鏈；及包含SEQ ID NO: 78之胺基酸序列的輕鏈。
  25. 如請求項15至24中任一項之免疫結合物，其中n為15且該免疫結合物係以6與8之間的DAR為特徵，視情況其中該DAR為6，視情況其中該DAR為8。
  26. 一種製備抗體-藥物-結合物(antibody-drug-conjugate；ADC)之方法，該方法包含使細胞毒性劑(Z)與如請求項1至13中任一項之抗粘附分子-4抗體結合，其中連接子(X)使該抗粘附分子-4抗體(Ab)與該細胞毒性劑(Z)連接。
  27. 如請求項26之方法，其中該方法包含提供如請求項1至13中任一項之抗粘附分子-4抗體，使該抗粘附分子-4抗體與細胞毒性劑(Z)在適合條件下接觸及/或反應以便形成抗體藥物結合物，及分離該抗體藥物結合物。
  28. 如請求項26至27中任一項之方法，其中該方法包含提供如請求項1至13中任一項之抗粘附分子-4抗體，使該抗粘附分子-4抗體與具有下式之連接子有效負載部分(X - Z)接觸及/或反應： 。
  29. 一種在有需要之個體中治療癌症、殺傷腫瘤細胞及/或向腫瘤遞送細胞毒性劑之方法，其包含向該個體投與治療有效量之如請求項14至25中任一項之免疫結合物，或根據如請求項26至28中任一項之方法所製備之抗體藥物結合物。
  30. 如請求項29之方法，其中該個體患有表現粘附分子-4之癌症，其特徵為腫瘤細胞上存在低或中度粘附分子-4表現，視情況藉由免疫化學所測定。
  31. 如請求項29至30中任一項之方法，其中該個體患有尿道上皮癌、TNBC、非小細胞肺癌、胰臟癌、卵巢癌、頭頸部鱗狀細胞癌或食道癌。
  32. 如請求項29至31中任一項之方法，其中該個體先前已接受化學治療劑治療，該化學治療劑視情況為藉由P-醣蛋白(Pgp)輸送之化學治療劑、鉑藥劑或紫杉烷。
  33. 如請求項29至32中任一項之方法，其中該個體先前已接受用結合至奧瑞他汀(auristatin)之粘附分子-4結合劑治療，視情況為恩弗妥單抗維多汀(enfortumab vedotin)。
  34. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至13中任一項之抗體、如請求項14至25中任一項之免疫結合物或根據如請求項26至38中任一項之方法所製備之抗體藥物結合物，及醫藥學上可接受之載劑。
  35. 一種核酸或一組核酸，其編碼如請求項1至13中任一項之抗體或抗體片段的重鏈及/或輕鏈。
  36. 一種融合瘤或重組宿主細胞，其產生如請求項1至13中任一項之抗體或抗體片段。
  37. 一種製備如請求項1至13中任一項之抗體或抗體片段之方法，其包含培養如請求項36之細胞及回收該抗體或抗體片段。
TW112119460A 2022-05-25 2023-05-25 粘附分子-4結合劑 TW202411251A (zh)

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