CN107106701B - 磺酰胺接头、其缀合物及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含α‑端和ω‑端的化合物，所述化合物在α‑端包含反应性基团Q1并且在ω‑端包含靶分子，所述Q1能够与在生物分子上存在的官能团F1反应，所述化合物还包含式(1)的基团或其盐；所述化合物也可称为接头‑缀合物。本发明还涉及用于制备生物缀合物的方法，所述方法包括使本发明的接头‑缀合物的反应性基团Q1与生物分子的官能团F1反应的步骤。本发明还涉及通过本发明的方法可获得的生物缀合物。在一个优选的实施方案中，本发明涉及通过环加成制备生物缀合物的方法，所述环加成为例如(4+2)‑环加成(例如狄尔斯‑阿尔德反应)或(3+2)‑环加成(例如1,3‑偶极环加成)。
Figure DDA0001312943900000011

Description

磺酰胺接头、其缀合物及制备方法
技术领域
本发明涉及生物缀合领域。本发明涉及磺酰胺接头及其缀合物，并且涉及它们的制备方法。更具体地，本发明涉及包含酰基磺酰胺基和/或氨基甲酰基磺酰胺基的接头，以及涉及包含所述接头的缀合物。本发明还涉及制备包含接头的生物缀合物的方法，所述接头包含酰基磺酰胺基和/或氨基甲酰基磺酰胺基。
背景技术
生物缀合是连接两个或更多个分子的方法，其中至少一个为生物分子。所述生物分子也可称为“目的生物分子”，其他分子也可称为“靶分子”或“目的分子”。通常目的生物分子(BOI)将由蛋白质(或肽)、聚糖、核酸(或寡核苷酸)、脂类、激素或天然药物(或其片段或组合)组成。其他目的分子(MOI)也可为生物分子，从而形成同源或异源二聚体(或更高级低聚体)，或其他分子可具有通过缀合过程而赋予至目的生物分子的特定特征。例如，通过使用用于检测和/或分离的化学探针的共价修饰来对蛋白质结构和功能进行调节已经发展为基于蛋白质组的研究和生物医药应用中的有力工具。对蛋白质的荧光标记或亲和标记是研究蛋白质在其原生境(habitat)中运输的关键。基于蛋白质-碳水化合物缀合物的疫苗在对抗HIV、癌症、疟疾和病原菌方面得以凸显，而固定于微阵列上的碳水化合物有助于阐明糖组。合成的DNA和RNA寡核苷酸(ON)需要引入用于诊断和治疗应用的适合的官能团，所述应用例如微阵列技术、反义和基因沉默疗法、纳米技术和多种材料科学应用。例如，连接穿透细胞的配体是处理在基于寡核苷酸的疗法(反义、siRNA)过程中所遇到的低ON内在化率的最常用的策略。类似地，基于寡核苷酸的微阵列的制备需要将ON选择性地固定在合适的固体表面(例如玻璃)上。
存在大量的适合于共价连接两个(或更多个)分子结构的化学反应的实例。然而，生物分子的标记使可应用的反应条件(溶剂、浓度、温度)受到高度限制，而所需要的化学选择性标记限制了反应性基团的选择。显然，生物系统通常是在水性环境中反应状态(flourish)最佳，这意指用于生物缀合的试剂应当适用于在水性系统中的应用。一般而言，两种策略概念可在生物缀合技术领域中得到认可：(a)基于已存在于目的生物分子中的官能团的缀合，所述官能团例如硫醇、胺、醇或羟基苯酚单元；或(b)两阶段方法，其涉及在实际缀合过程之前，将一个(或多个)独特的反应性基团工程化地插入BOI中。
第一种方法通常涉及蛋白质中的反应性氨基酸侧链(例如半胱氨酸、赖氨酸、丝氨酸和酪氨酸)，或聚糖中的官能团(例如胺、醛)或核酸中的官能团(例如嘌呤或嘧啶官能团或醇)。如尤其是在G.T.Hermanson，“Bioconjugate Techniques”，Elsevier，第3版.2013(以引用的方式纳入)中所总结的，近年来，大量的反应性官能团可用于化学选择性靶向这些官能团(例如马来酰亚胺、卤代乙酰胺、活化酯、活化碳酸酯、磺酰卤、活化硫醇衍生物、烯烃、炔烃、丙二烯酰胺(allenamide)等)中的一种，其中每一种均要求其自身的特定的缀合条件(pH、浓度、化学剂量、光等)。最显著的是，半胱氨酸-马来酰亚胺缀合由于其高的反应速率和化学选择性而突显出以用于蛋白质缀合。然而，当无半胱氨酸可用于缀合时，如在许多蛋白质中，当然还在其他生物分子中，则通常需要其他方法，每种方法都具有其自身的缺点。
用于生物缀合的完善且广泛适用的解决方案涉及两阶段方法。尽管更加费力，但是与在天然官能团上的缀合相比，经工程化官能团的两阶段缀合通常产生更高的选择性(位点特异性)。此外，通过适当选择构建体可实现完全的稳定性，这可能是在天然功能团上的一阶段缀合的重要缺点，尤其是对于半胱氨酸-马来酰亚胺缀合而言。可添加到BOI上的官能团的典型实例包括(有张力的)炔烃、(有张力的)烯烃、降冰片烯、四嗪、叠氮化物、膦、氧化腈、硝酮、腈亚胺、重氮化合物、羰基化合物、(O-烷基)羟胺和肼，这可以通过化学或分子生物学方法实现。已知上述每个官能团都具有至少一种反应配偶体(partner)，在许多情况下涉及完全相互反应性。例如，环辛炔选择性地且专一性地与1，3-偶极子、有张力的烯烃与四嗪、以及膦与叠氮化物的反应，产生完全稳定的共价键。然而，上述的一些官能团具有高亲脂性的缺点，这可能会使缀合效率受损，尤其是在与亲脂性目的分子组合时(参见下文)。
就溶解性、稳定性和生物相容性而言，生物分子和其他目的分子之间的最终连接单元还应优先与水性环境完全相容。例如，高度亲脂性接头可能导致聚集(在缀合期间或缀合之后)，这可显著增加反应时间和/或降低缀合产率，尤其是在MOI也具有疏水性性质时。类似地，高度亲脂性接头-MOI组合可能导致与相同或其他生物分子的表面或特定疏水片(patch)的非特异性结合。如果所述接头对水解或其他水诱导的裂解反应敏感，则所述包含最初生物缀合物的组分通过扩散而分离。例如，当β-羟基羰基或γ-二羰基化合物可分别导致逆羟醛(retro-aldol)反应或逆迈克尔(retro-Michael)反应时，某些酯部分由于皂化而不适合。最终，所述接头对于生物缀合物中存在的官能团或在应用生物缀合物期间可能遇到的任何其他官能团应为惰性的，这就尤其排除了使用以例如酮或醛部分(可导致亚胺形成)、α，β-不饱和羰基化合物(迈克尔加成)、硫酯或其他活性酯(酰胺键形成)为特征的接头。
目前在生物分子缀合过程中，由乙二醇线性低聚体构成的化合物(所谓的PEG(聚乙二醇)接头)特别受欢迎。PEG接头是高度水溶性、无毒性、非抗原性的，并且导致可忽略的聚集或无聚集。为此，许多种类的线性、双官能的PEG接头可从不同来源市售得到，其可使用目的(生物)分子在任意一端进行选择性修饰。PEG接头为环氧乙烷的聚合过程的产物，因此通常以链长度的随机混合物而获得，其可被部分地分解为平均重量分布集中为约1、2、4kDa或更多(最高达60kDa)的PEG构建体。还已知具有最高达4kDa的分子量的均一、离散的PEG(dPEG)，其支化形式最高达15kDa。有趣的是，所述PEG单元自身赋予生物分子以特定的特征。具体地，蛋白质PEG化可导致在体内的停留时间延长、减少代谢酶的降解以及降低或消除蛋白质免疫原性。若干种PEG化蛋白已获FDA批准，目前在市场上销售。
由于其高的极性，PEG接头完全适用于小的和/或水溶性的部分在水性条件下的生物缀合。然而，在疏水的、非水溶性的目的分子的缀合的情况下，PEG单元的极性可能不足以抵消疏水性，从而导致反应速率显著降低、产率下降并且引起了聚集问题。在这种情况下，可能需要相对长的PEG接头和/或大量的有机共溶剂以溶解试剂。例如，在抗体-药物缀合物领域，将不同数量的有毒的有效载荷可控地连接至单克隆抗体是关键，其中有效载荷通常选自耳抑素(auristatin)E或F、美登木素生物碱(maytansinoid)、多卡米星(duocarmycin)，加利车霉素(calicheamicin)或吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)，还有很多其他的正在进行中。除了耳抑素F以外，所有的有毒的有效载荷的非水溶性差，这就需要有机共溶剂来实现成功的缀合，例如25％二甲基乙酰胺(DMA)或50％丙二醇(PG)。在疏水性有效载荷的情况下，尽管使用了上述共溶剂，但是在缀合期间可能需要大的化学计量的试剂，同时由于聚集(在处理中或在产物分离之后)，效率和产率可能会显著降低，如例如Senter等在Nat.Biotechn.2014，24，1256-1263(以引用的方式纳入)中所记载的。使用长的PEG间隔物(12个单元或更多)可部分提高溶解性和/或缀合效率，但是已表明长的PEG间隔物可能导致更快速的体内清除，因此对ADC的药代动力学特性产生负面影响。
由上述可知，需要短的极性间隔物，其能够快速、有效地缀合疏水性部分。显然，后者甚至属于更高水平的缀合反应，在该反应中应用了疏水反应性部分，例如有张力的炔烃、烯烃、和膦(参见上文)。
接头是本领域已知的，并且公开于例如WO 2008/070291(以引用的方式纳入)中。WO 2008/070291公开了用于将靶向试剂偶联到锚定组分的接头。所述接头包含以聚乙二醇(PEG)为代表的亲水性区域和缺少手性中心的延伸部分，所述延伸部分与靶向试剂偶联。
WO 01/88535——以引用方式纳入——公开了一种用于生物缀合的表面的接头体系，尤其是具有新的亲水性间隔基团的接头体系。用于接头体系中的亲水性原子或基团选自O、NH、C＝O(酮基)、O-C＝O(酯基)和CR3R4，其中R3和R4独立地选自H、OH、C1-C4烷氧基和C1-C4酰氧基。
WO 2014/100762——以引用方式纳入——记载了含有亲水性自我牺牲型接头的化合物，所述接头可在适当条件下裂解，并掺入亲水性基团以提供具有更好溶解性的化合物。所述化合物包含药物部分、能够靶向所选的细胞群的靶向部分，以及包含酰基单元的接头、用于提供所述药物部分和靶向部分之间距离的任选的间隔单元、可在适当条件下裂解的肽接头、亲水性自我牺牲型接头、以及任选的第二自我牺牲型间隔物或环化自我牺牲型接头。亲水性自我牺牲型接头为例如苄氧基羰基。
发明内容
本发明涉及包含α-端和ω-端的化合物(也称为接头-缀合物)，所述化合物在α-端包含反应性基团Q1并且在ω-端包含靶分子，所述Q1能够与生物分子上存在的官能团F1反应，所述化合物还包含式(1)的基团或其盐：
Figure BDA0001312943880000051
其中：
a为0或1；以及
R1选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，所述C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基，或R1为靶分子D，其中所述靶分子任选地经由间隔部分与N连接；
并且其中式(1)的基团或其盐位于化合物的所述α-端和所述ω-端之间。
更具体地，本发明涉及式(4a)或(4b)的接头-缀合物，或其盐
Figure BDA0001312943880000052
Figure BDA0001312943880000061
其中：
a独立地为0或1；
b独立地为0或1；
c为0或1；
d为0或1；
e为0或1；
f为1至150范围内的整数；
g为0或1；
i为0或1；
D为靶分子；
Q1为能够与生物分子上存在的官能团F1反应的反应性基团；
Sp1为间隔部分；
Sp2为间隔部分；
Sp3为间隔部分；
Sp4为间隔部分；
Z1为连接基团，其将Q1或Sp3与Sp2、O或C(O)或N(R1)连接；
Z2为连接基团，其将D或Sp4与Sp1、N(R1)、O或C(O)连接；以及
R1选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，所述C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基；或
R1为D、-[(Sp1)b-(Z2)e-(Sp4)i-D]或-[(Sp2)c-(Z1)d-(Sp3)g-Q1]，其中Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、Z1、Z2、D、Q1、b、c、d、e、g和i如上所定义。
本发明还涉及制备生物缀合物的方法，所述方法包括使接头-缀合物的反应性基团Q1与生物分子的官能团F1反应的步骤，其中所述接头-缀合物为包含α-端和ω-端的化合物，所述化合物在α-端包含反应性基团Q1并且在ω-端包含靶分子，所述Q1能够与生物分子上存在的官能团F1反应，所述化合物还包含式(1)的基团或其盐：
Figure BDA0001312943880000071
其中a和R1如上所定义，并且其中式(1)的基团或其盐位于化合物的所述α-端和所述ω-端之间。
更具体地，本发明还涉及制备生物缀合物的方法，所述方法包括使如上所定义的式(4a)或(4b)的接头-缀合物的反应性基团Q1与生物分子的官能团F1反应的步骤。在一个优选的实施方案中，本发明涉及通过环加成制备生物缀合物的方法，所述环加成例如(4+2)-环加成(例如狄尔斯-阿尔德反应)或(3+2)-环加成(例如1，3-偶极环加成)，优选1，3-偶极环加成，更优选炔烃-叠氮化物环加成，并且最优选其中Q1为或包含炔基(例如环炔基)且F1为叠氮基。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及制备生物缀合物的方法，其中所述靶分子是疏水性的(即微溶于水)，最优选其中所述靶分子在水中(20℃且100kPa)的水溶性至多为0.1％(w/w)。在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及通过环加成制备生物缀合物的方法，所述环加成优选1，3-偶极环加成，更优选炔烃-叠氮化物环加成，并且最优选其中Q1为或包含炔基且F1为叠氮基，以及其中所述靶分子是疏水性的，最优选其中所述靶分子在水中(20℃且100kPa)的水溶性至多为0.1％(w/w)。
本发明还涉及通过本发明方法可获得的生物缀合物。
附图说明
图1描述了生物分子缀合的一般概念：将包含一个或多个官能团F1的目的生物分子(BOI)与(过量的)经特定的接头共价连接至反应性基团Q1的靶分子D(也称为目的分子或MOI)孵育。在生物缀合过程中，发生F1和Q1的化学反应，由此形成了包含在BOI和MOI之间的共价连接的生物缀合物。所述BOI可例如为肽/蛋白质、聚糖或核酸。
图2示出了半乳糖胺的UDP糖的衍生物的几种结构，其可以是例如用3-巯基丙酰基(11a)、叠氮基乙酰基(11b)或叠氮基二氟乙酰基(11c)修饰的。
图3示意性地示出了在半乳糖基转移酶突变体或GalNAc-转移酶的作用下，如何将UDP-糖11a-c中的任一个连接至包含GlcNAc部分12的糖蛋白(例如，单克隆抗体，其中聚糖被内切核苷酸修剪)上，由此在GalNAc衍生物和GlcNAc之间产生β-糖苷1-4键(分别为化合物13a-c)。
图4示出了经修饰的抗体13a-c如何可通过与马来酰亚胺的亲核加成(对于13a，生成硫醚缀合物14)或通过使用环辛炔试剂的张力促进的环加成(对于13b或13c，分别生成三唑15或16)来进行生物缀合过程。
图5示出了几种化合物的结构，其中通过接头单元将N-马来酰亚胺基反应性基团Q1连接到芘基(D)。
图6示出了几种化合物的结构，其中通过接头单元将二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]反应性基团Q1(也称为BCN基团)连接到苄胺(D)上。
图7示出了几种化合物的结构，其中通过接头单元将二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]反应性基团Q1(也称为BCN基团)或二苯并氮杂环辛炔(dibenzoazocyclooctyne)连接到芘。
图8示出了几种化合物的结构，其中通过接头单元将二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]反应性基团Q1(也称为BCN基团)连接到美登素(maytansin)。
图9示出了几种化合物的结构，其中通过接头单元将二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]反应性基团Q1(也称为BCN基团)连接到Val-Cit-PABA-多卡米星构建体。
图10示出了本发明的几种化合物的结构，其中通过接头单元将二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]反应性基团Q1(也称为BCN基团)缀合到Val-Cit-PABA-Ahx-美登素。
图11示出了使用0.1％TFA或在缓冲液pH7.4下，化合物19-23和30-38的HPLC保留时间。
图12a示出了通过磺酰胺接头缀合的BCN-芘衍生物(化合物26)或通过短的PEG接头缀合的BCN-芘衍生物(化合物24或25)与曲妥珠抗体-N3(化合物13b)的缀合效率。
图12b示出了通过磺酰胺接头缀合的DIBAC-芘衍生物(化合物29)或通过短的PEG接头缀合的DIBAC-芘衍生物(化合物27或28)与曲妥珠抗体-N3(化合物13b)的缀合效率。
图13a示出了通过磺酰胺接头缀合的BCN-美登素衍生物(化合物33)或通过短的PEG接头缀合的BCN-美登素衍生物(化合物30-32)与曲妥珠抗体-N3(化合物13b)的缀合效率。
图13b示出了通过磺酰胺接头缀合的BCN-美登素衍生物(化合物33)或通过短的PEG接头缀合的BCN-美登素衍生物(化合物30-32，其中化合物30与33重叠)与曲妥珠抗体-F2-GalNAz(化合物13c)的缀合效率。
图14a示出了通过磺酰胺接头缀合的BCN-多卡米星衍生物(化合物35)或通过短的PEG接头缀合的BCN-多卡米星衍生物(化合物34)与曲妥珠抗体-N3(化合物13b)的缀合效率。
图14b示出了通过磺酰胺接头缀合的BCN-多卡米星衍生物(化合物35)或通过短的PEG接头缀合的BCN-多卡米星衍生物(化合物34)与曲妥珠抗体-F2-GalNAz(化合物13c)的缀合效率。
图15示出了通过连续用氯磺酰异氰酸酯(CSI)和胺进行处理将醇(40)转化为氨基甲酰基磺酰胺衍生物(42)的一般合成方案。可将氨基甲酰基磺酰胺42转化为酰基磺酰胺(44)，如果起始的醇为叔丁醇，则在用酸除去叔丁基保护后得到磺酰胺43，其可被酰基化得到44。
图16示出了其中Q1为N-马来酰亚胺基且D为芘的几种接头-缀合物的合成。化合物18为本发明的化合物，而化合物17为比较实施例。
图17示出了几种接头-缀合物的合成，其中Q1为二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基](也称为BCN基团)且D为苄基。
图18示出了带有接头中的两个磺酰胺基的接头-缀合物的合成，其中Q1为二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基](也称为BCN基团)且D为苄基。
图19示出了几种接头-缀合物的合成，其中Q1为二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基](也称为BCN基团)且D为芘基。
图20示出了几种接头-缀合物的合成，其中Q1为杂环炔基(DIBAC)且D为芘基。
图21示出了包含两个靶分子D的接头-缀合物的合成，其中Q1为二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基](也称为BCN基团)且D为细胞毒素(美登素)。
图22示出了生物分子中天然存在的或通过工程化引入的一组代表性官能团(F1)，其在与反应性基团Q1反应后产生连接基团Z3。连接基团Z3也可以是F2和Q2之间反应的结果。也可将官能团F1人工引入(工程化)到生物分子中的任何所选择的位置上。
图23示出了本发明的生物缀合物36-38的聚集程度。
图24示出了在2周的期间内，本发明的具有磺酰胺接头的生物缀合物(与13a缀合的36)与具有PEG接头的比较生物缀合物(与13a缀合的30)，以及曲妥珠单抗的聚集进度。
具体实施方式
定义
本说明书和权利要求书中所用的动词“包含”及其结合形式以其非限制性含义使用，以意指包括该词之后的项，但并不排除未指定提及的项。
此外，除非上下文明确要求有且只有一个元素，否则用不定冠词“一”或“一个(种)”提及元素时不排除存在多于一个所述元素的可能性。因此，所述不定冠词“一”或“一个(种)”通常意指“至少一个(种)”。
本说明书和权利要求书中公开的化合物可包含一个或多个不对称中心，并且可存在所述化合物的不同的非对映异构体和/或对映异构体。除非另有说明，对本说明书和权利要求书中的任何化合物的描述意指包括所有的非对映异构体及其混合物。此外，除非另有说明，对本说明书和权利要求书中的任何化合物的描述意指包括单独的对映异构体，以及对映异构体的任意混合物、外消旋体或其他形式。当一种化合物的结构被描述为具体的对映异构体时，应理解，本申请的发明不限于所述具体的对映异构体。
所述化合物可以不同的互变异构体形式存在。除非另有说明，本发明的化合物意指包括所有的互变异构体形式。当化合物的结构被描述为具体的互变异构体时，应理解，本申请的发明不限于所述具体的互变异构体。
本说明书和权利要求书中公开的化合物还可以外型(exo)和内型(endo)非对映异构体存在。除非另有说明，对本说明书和权利要求书中的任何化合物的描述意指包括化合物的单独的外型和单独的内型非对映异构体，及其混合物。当化合物的结构被描述为具体的内型或外型非对映异构体时，应理解，本申请的发明不限于所述具体的内型或外型非对映异构体。
此外，本说明书和权利要求书中公开的化合物还可以顺式(cis)和反式(trans)异构体存在。除非另有说明，对本说明书和权利要求书中的任何化合物的描述意指包括化合物的单独的顺式异构体和单独的反式异构体，及其混合物。例如，当化合物的结构被描述为顺式异构体时，应理解，相应的反式异构体或顺式和反式异构体的混合物未被排除在本申请的发明之外。当化合物的结构被描述为具体的顺式或反式异构体时，应理解，本申请的发明不限于该具体的顺式或反式异构体。
未取代的烷基具有通式CnH2n+1并且可以是直链或支链的。任选地，所述烷基被本文中进一步指定的一个或多个取代基取代。烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、2-丙基、叔丁基、1-己基、1-十二烷基等。
环烷基为环状烷基。未取代的环烷基包含至少3个碳原子，并且具有通式CnH2n-1。任选地，所述环烷基被本文中进一步指定的一个或多个取代基取代。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
烯基包含一个或多个碳-碳双键，并且可以是直链或支链的。未取代的包含一个C-C双键的烯基具有通式CnH2n-1。未取代的包含两个C-C双键的烯基具有通式CnH2n-3。烯基可包含末端C-C双键和/或内部C-C双键。末端烯基为其中C-C双键定位于碳链的末端位置的烯基。烯基还可包含两个或更多个C-C双键。烯基的实例包括乙烯基、丙烯基、异丙烯基、叔丁烯基、1，3-丁二烯基、1，3-戊二烯基等。除非另有说明，烯基可任选地被一个或多个独立地选择的如下所定义的取代基取代。除非另有说明，烯基可任选地被选自O、N和S中的一个或多个杂原子间隔。
炔基包含一个或多个碳-碳三键，并且可以是直链或支链的。未取代的包含一个C-C三键的炔基具有通式CnH2n-3。炔基可包含末端C-C三键和/或内部C-C三键。末端炔基为其中C-C三键位于碳链的末端位置的炔基。炔基还可包含两个或更多个C-C三键。除非另有说明，炔基可任选地被一个或多个独立地选择的如下所定义的取代基取代。炔基的实例包括乙炔基、丙炔基、异丙炔基、叔丁炔基等。除非另有说明，炔基可任选地被选自O、N和S中的一个或多个杂原子间隔。
芳基包含6至12个碳原子，并且可包括单环或双环结构。任选地，所述芳基可被本文中进一步指定的一个或多个取代基取代。芳基的实例为苯基和萘基。
芳基烷基和烷基芳基包含至少7个碳原子，并且可包括单环和双环结构。任选地，所述芳基烷基和烷基芳基可被本文中进一步指定的一个或多个取代基取代。芳基烷基为例如苄基。烷基芳基为例如4-叔丁基苯基。
杂芳基包含至少两个碳原子(即至少C2)以及一个或多个杂原子N、O、P或S。杂芳基可具有单环或双环结构。任选地，所述杂芳基可被本文中进一步指定的一个或多个取代基取代。合适的杂芳基的实例包括吡啶基、喹啉基、嘧啶基、呲嗪基、呲唑基、咪唑基、噻唑基、呲咯基、呋喃基、三唑基、苯并呋喃基、吲哚基、嘌呤基、苯并噁唑基、噻吩基、磷杂环戊二烯基(phospholyl)和噁唑基。
杂芳基烷基和烷基杂芳基包含至少3个碳原子(即至少C3)，并且可包括单环和双环结构。任选地，所述杂芳基可被本文中进一步指定的一个或多个取代基取代。
在芳基表示为(杂)芳基的情况下，该表示法意指包括芳基和杂芳基。类似地，烷基(杂)芳基意指包括烷基芳基和烷基杂芳基，(杂)芳基烷基意指包括芳基烷基和杂芳基烷基。因此，C2-C24(杂)芳基应理解为包括C2-C24杂芳基和C6-C24芳基。类似地，C3-C24烷基(杂)芳基意指包括C7-C24烷基芳基和C3-C24烷基杂芳基，C3-C24(杂)芳基烷基意指包括C7-C24芳基烷基和C3-C24杂芳基烷基。
环炔基为环状炔基。未取代的包含一个三键的环炔基具有通式CnH2n-5。任选地，环炔基被本文中进一步指定的一个或多个取代基取代。环炔基的实例包括环辛炔基。
杂环炔基为被选自氧、氮和硫的杂原子间隔的环炔基。任选地，杂环炔基被本文中进一步指定的一个或多个取代基取代。杂环炔基的实例为氮杂环辛炔基。
(杂)芳基包含芳基和杂芳基。烷基(杂)芳基包含烷基芳基和烷基杂芳基。(杂)芳基烷基包含芳基烷基和杂芳基烷基。(杂)炔基包含炔基和杂炔基。(杂)环炔基包含环炔基和杂环炔基。
(杂)环炔烃化合物在本文被定义为包含(杂)环炔基的化合物。
本说明书和权利要求书中所公开的几种化合物可被描述为稠合的(杂)环炔烃化合物，即其中第二环结构被稠合(即被增环)至所述(杂)环炔基的(杂)环炔烃化合物。例如在稠合的(杂)环辛炔化合物中，可将环烷基(例如环丙基)或芳烃(例如苯)增环至(杂)环辛炔基上。稠合的(杂)环辛炔化合物中的(杂)环辛炔基的三键可位于三个可能的位置——即所述环辛炔部分的第2、3或4位(依据“IUPAC有机化学命名法”，A31.2条进行编号)——中的任一个。本说明书和权利要求书中对于任何稠合的(杂)环辛炔化合物的描述意指包括所述环辛炔部分的所有三个单独的位置异构体。
除非另有说明，烷基、环烷基、烯基、炔基、(杂)芳基、(杂)芳基烷基、烷基(杂)芳基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、(杂)亚芳基、烷基(杂)亚芳基、(杂)芳基亚烷基、(杂)芳基亚烯基、(杂)芳基亚炔基、烯基、烷氧基、烯氧基、(杂)芳氧基、炔氧基和环烷氧基可被一个或多个独立地选自如下的取代基取代：C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C3-C12环烷基、C5-C12环烯基、C8-C12环炔基、C1--C12烷氧基、C2-C12烯氧基、C2-C12炔氧基、C3-C12环烷氧基、卤素、氨基、氧代和甲硅烷基，其中所述甲硅烷基可表示为式(R20)3Si-，其中R20独立地选自C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C3-C12环烷基、C1--C12烷氧基、C2-C12烯氧基、C2-C12炔氧基和C3-C12环烷氧基，其中所烷基、烯基、炔基、环烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和环烷氧基任选地被取代，所述烷基、烷氧基、环烷基和环烷氧基任选地被选自O、N和S中的一个或多个杂原子间隔。
本文使用的一般性术语“糖”指单糖，例如葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)和岩藻糖(Fuc)。本文使用的术语“糖衍生物”指单糖的衍生物，即包含取代基和/或官能团的单糖。糖衍生物的实例包括氨基糖和糖酸，例如葡糖胺(GlcNH2)、半乳糖胺(GalNH2)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、也称为N-乙酰神经氨酸(NeuNAc)的唾液酸(Sia)、以及N-乙酰胞壁酸(MurNAc)、葡糖醛酸(GlcA)和艾杜糖醛酸(IdoA)。
术语“核苷酸”在本文中以其通常的科学含义使用。术语“核苷酸”是指由核碱基、五碳糖(核糖或2-脱氧核糖)以及一个、二个或三个磷酸基团组成的分子。不含磷酸基团时，核碱基与糖构成核苷。因此，核苷酸也被称为核苷单磷酸、核苷二磷酸或核苷三磷酸。所述核碱基可为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶。核苷酸的实例包括尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)、胸苷二磷酸(TDP)、胞苷二磷酸(CDP)和胞苷单磷酸(CMP)。
术语“蛋白质”在本文中以其通常的科学含义使用。在本文中，包含约10个或更多个氨基酸的多肽被认为是蛋白质。蛋白质可包含天然的和非天然的氨基酸。
术语“糖蛋白”在本文中以其通常的科学含义使用，并且是指包含一个或多个共价键合至蛋白质的单糖或寡糖链(“聚糖”)的蛋白质。聚糖可连接至蛋白质的羟基上(P-连接的聚糖)，例如连接至丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、羟赖氨酸或羟脯氨酸的羟基上；或连接至蛋白质的酰胺官能团上(N-糖蛋白)，例如天冬酰胺或精氨酸；或连接至蛋白质的碳上(C-糖蛋白)，例如色氨酸。糖蛋白可包含多于一个聚糖，可包含一个或多个单糖和一个或多个寡糖聚糖的组合，并且可包含N-连接、O-连接和C-连接的聚糖的组合。据估计，所有蛋白质中超过50％的蛋白质具有一些糖基化的形式，因此被鉴定为糖蛋白。糖蛋白的实例包括PSMA(前列腺特异性膜抗原)、CAL(南极念珠菌脂肪酶(candida antartica lipase))、gp41、gp120、EPO(促红细胞生成素)、抗冻蛋白和抗体。
术语“聚糖”在本文中以其通常的科学含义使用，并且是指连接至蛋白质的单糖或寡糖链。因此，术语聚糖是指糖蛋白的糖类部分。所述聚糖通过一个糖的C-1碳连接至蛋白质，所述聚糖可以不含其他取代(单糖)或可在其一个或多个羟基处被进一步取代(寡糖)。天然存在的聚糖通常包含1至约10个糖部分。然而，当更长的糖链连接至蛋白质时，所述糖链在本文中也被认为是聚糖。糖蛋白中的聚糖可为单糖。通常，糖蛋白的单糖聚糖由共价连接到蛋白质的单个N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)或岩藻糖(Fuc)组成。聚糖也可为寡糖。糖蛋白的寡糖链可以是直链的或支链的。在寡糖中，直接连接至蛋白质的糖称为核心糖。在寡糖中，未直接连接至蛋白质且连接至至少两个其他糖的糖称为内糖。在寡糖中，未直接连接至蛋白质但连接至单个其他糖——即在其一个或多个其他羟基上没有携带其他糖取代基——的糖称为末端糖。为避免疑义，在糖蛋白的寡糖中可存在多个末端糖，但仅有一个核心糖。聚糖可为O-连接的聚糖、N-连接的聚糖或C-连接的聚糖。在O-连接的聚糖中，通常经由丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)的羟基将单糖或寡糖聚糖键合至蛋白质的氨基酸中的O原子上。在N-连接的聚糖中，经由蛋白质的氨基酸中的N原子(通常经由天冬酰胺(Asn)或精氨酸(Arg)侧链上的酰胺氮)将单糖或寡糖聚糖键合至蛋白质。在C-连接的聚糖中，将单糖或寡糖聚糖键合至蛋白质的氨基酸中的C原子上，通常键合至色氨酸(Trp)的C原子上。
术语“抗体”在本文中以其通常的科学含义使用。抗体是通过免疫系统产生的能够识别和结合特定抗原的蛋白质。抗体是糖蛋白的一个实例。在本文中，术语抗体以其最宽泛的含义使用，并具体包括单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、以及双链抗体和单链抗体。在本文中，术语“抗体”也意指包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和特异性结合癌症抗原的抗体。术语“抗体”意指包括全抗体、以及抗体片段(例如来自经裂解的抗体的抗体Fab片段、F(ab’)2、Fv片段或Fc片段；scFv-Fc片段；小抗体；双抗体或scFv)。此外，所述术语包括遗传工程化抗体和抗体衍生物。抗体、抗体片段和遗传工程化抗体可通过本领域已知的方法获得。抗体的典型实例尤其包括，阿昔单抗(abciximab)、利妥昔单抗(rituximab)、巴利昔单抗(basiliximab)、帕利珠单抗(palivizumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、阿仑珠单抗(alemtuzumab)、阿达木单抗(adalimumab)、托西莫单抗I131(tositumomab-I131)、西妥昔单抗(cetuximab)、替伊莫单抗(ibrituximab tiuxetan)、奥马珠单抗(omalizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、依库珠单抗(eculizumab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、戈利木单抗(golimumab)、卡那单抗(canakinumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、乌司奴单抗(ustekinumab)、托珠单抗(tocilizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、地舒单抗(denosumab)、贝利木单抗(belimumab)、伊匹木单抗(ipilimumab)和布妥昔单抗(brentuximab)。
接头在本文中被定义为连接化合物的两个或更多个元素的部分。例如在生物缀合物中，生物分子和靶分子经由接头彼此共价连接；在接头-缀合物中，反应性基团Q1经由接头与靶分子共价连接；在接头-构建体中，反应性基团Q1经由接头与反应性基团Q2共价连接。接头可包含一个或多个间隔部分。
间隔部分在本文中被定义为使接头的两部分(或更多部分)间隔开(即提供它们之间的距离)并且共价连接在一起的部分。所述接头可为例如，如下所定义的接头-构建体、接头-缀合物或生物缀合物的部分。
接头-构建体在本文中被定义为其中反应性基团Q1经由接头与反应性基团Q2共价连接的化合物。接头-构建体包含能够与生物分子上存在的反应性基团反应的反应性基团Q1，以及能够与靶分子上存在的反应性基团反应的反应性基团Q2。Q1和Q2可以是相同或不同的。接头-构建体也可包含超过一个的反应性基团Q1和/或超过一个的反应性基团Q2。接头-构建体也可表示为Q1-Sp-Q2，其中Q1为能够与生物分子上存在的反应性基团F1反应的反应性基团，Q2为能够与靶分子上存在的反应性基团F2反应的反应性基团，并且Sp为间隔部分。当接头-构建体包含超过一个的反应性基团Q1和/或超过一个的反应性基团Q2时，所述接头-构建体可表示为(Q1)y-Sp-(Q2)z，其中y为1至10范围内的整数，且z为1至10范围内的整数。优选地，y为1、2、3或4，更优选地，y为1或2，最优选地，y为1。优选地，z为1、2、3、4、5或6，更优选地，z为1、2、3或4，甚至更优选地z为1、2或3，甚至更优选地，z为1或2，并且最优选地，z为1。更优选地，y为1或2，优选1，且z为1、2、3或4；甚至更优选地，y为1或2，优选1，且z为1、2或3；甚至更优选地，y为1或2，优选1，且z为1或2；并且最优选地，y为1且z为1。
接头-缀合物在本文中被定义为其中靶分子经由接头与反应性基团Q1共价连接的化合物。接头-缀合物可通过使接头-构建体上存在的反应性基团Q2与靶分子上存在的反应性基团反应而获得。接头-缀合物包含能够与生物分子上存在的反应性基团反应的反应性基团Q1。接头-缀合物可包含一个或多个间隔部分。接头-缀合物可包含超过一个的反应性基团Q1和/或超过一个的靶分子。
生物缀合物在本文中被定义为其中生物分子经由接头与靶分子共价连接的化合物。生物缀合物包含一个或多个生物分子和/或一个或多个靶分子。所述接头可包含一个或多个间隔部分。
当化合物在本文中被定义为包含α端和ω端的化合物时，则所述化合物包含两个(或更多个)末端，第一末端被称为α端，且第二末端被称为ω端。所述化合物可包含超过两个的末端，即化合物中可存在第三、第四末端等。
生物分子在本文中被定义为可自自然界分离的任何分子，或由较小分子构建模块组成的任何分子，所述较小分子构建模块为衍生自自然界的大分子结构的构件，特别是核酸、蛋白质、聚糖和脂类。生物分子的实例包括酶、(非催化的)蛋白质、多肽、肽、氨基酸、寡核苷酸、单糖、寡糖、多糖、聚糖、脂质和激素。
靶分子，也被称为目的分子(MOI)，在本文中被定义为具有所需特性的分子结构，所需特性在缀合时赋予至生物分子。
术语“其盐”意指当酸性质子(通常为酸的质子)通常被阳离子(例如金属阳离子或有机阳离子等)替换而形成的化合物。如果适用，所述盐是药学上可接受的盐，尽管这不是并不旨在用于给药至患者的盐所必需的。例如，在化合物的盐中，所述化合物可被无机酸或有机酸质子化以形成阳离子，同时所述无机酸或有机酸的共轭碱作为盐的阴离子组分。
术语“药学上可接受的”盐意指对于给药至患者(例如哺乳动物)是可接受的的盐(对于给定的剂量方案，其为包含具有可接受的哺乳动物安全性的抗衡离子的盐)。这种盐可衍生自药学上可接受的无机碱或有机碱，以及衍生自药学上可接受的无机酸或有机酸。“药学上可接受的盐”是指化合物的药学上可接受的盐，所述盐衍生自本领域已知的多种有机和无机抗衡离子，并且包括例如钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等，并且当分子包含碱性官能团时，所述盐为有机酸或无机酸的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、甲酸盐、酒石酸盐、苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。
接头-缀合物
在本文中，公开了磺酰胺接头和所述磺酰胺接头的缀合物。术语“磺酰胺接头”是指包含磺酰胺基(更具体地为酰基磺酰胺基[-C(O)-N(H)-S(P)2-N(R1)-]和/或氨基甲酰基磺酰胺基[-O-C(O)-N(H)-S(O)2-N(R1)-])的接头。
本发明涉及本发明的磺酰胺接头在制备生物缀合物的方法中的用途。本发明还涉及制备生物缀合物的方法，并且涉及通过所述方法可获得的生物缀合物。下面将更详细地描述所述制备生物缀合物的方法。
在第一方面，本发明涉及包含α端和ω端的化合物，所述化合物在α端包含能够与生物分子上存在的官能团F1反应的反应性基团Q1以及在ω端包含靶分子D，所述化合物还包含式(1)的基团或其盐；
Figure BDA0001312943880000181
其中：
a为0或1；以及
R1选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，所述C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基，或R1为靶分子D，其中所述靶分子任选地经由间隔部分与N连接；
以及其中式(1)的基团或其盐位于化合物的所述α-端和所述ω-端之间。
所述化合物也被称为接头-缀合物。接头-缀合物在本文中被定义为其中靶分子经由接头与反应性基团Q1共价连接的化合物。所述化合物包含α端和ω端，换言之，所述化合物包含第一末端和第二末端。化合物的第一末端也可称为α端，第二末端也可称为化合物的ω端。术语“α端”和“ω端”是本领域技术人员已知的。因此，本发明也涉及包含第一末端和第二末端的化合物，所述化合物在第一末端包含能够与生物分子上存在的官能团F1反应的反应性基团Q1以及在第二末端包含靶分子D，所述化合物还包含式(1)的基团或其盐，其中式(1)的基团或其盐位于化合物的所述第一末端和所述第二末端之间，并且其中式(1)的基团如上所定义。
在本发明的化合物中，式(1)的基团或其盐位于化合物的所述α-端和所述ω-端之间。反应性基团Q1共价键合至化合物的α-端，靶分子D共价键合至化合物的ω-端。
本发明化合物也可称为接头-缀合物。在本发明的接头-缀合物中，靶分子D经由接头与反应性基团Q1共价连接，并且所述接头包含如上所定义的式(1)的基团或其盐。
当本发明的接头-缀合物包含式(1)的基团的盐时，所述盐优选为药学上可接受的盐。
本发明的接头-缀合物可包含超过一个的靶分子D。因此，所述接头-缀合物包含超过一个的ω-端，例如第二(第三、第四、第五等)ω-端，所述第二(第三、第四、第五等)ω-端可与靶分子共价连接。类似地，所述接头-缀合物可包含超过一个的反应性基团Q1，即所述接头-缀合物可包含超过一个的α-端。当存在超过一个的反应性基团Q1时，所述基团Q1可为相同或不同的，当存在超过一个的靶分子D时，所述靶分子D可为相同或不同的。
因此，本发明接头-缀合物也可表示为(Q1)y-Sp-(D)z，其中y为1至10范围内的整数，并且z为1至10范围内的整数。
因此，本发明也涉及下式的化合物：
(Q1)y-Sp-(D)z，
其中：
y为1至10范围内的整数；
z为1至10范围内的整数；
Q1为能够与生物分子上存在的官能团F1反应的反应性基团；
D为靶分子；
Sp为间隔部分，其中间隔部分被定义为使反应性基团Q1和靶分子D间隔(即在它们之间提供一定的距离)且使它们共价连接的部分；以及
其中所述间隔部分包含式(1)的基团或其盐，其中式(1)的基团如上所定义。
优选地，y为1、2、3或4，更优选y为1或2，最优选y为1。优选地，z为1、2、3、4、5或6，更优选z为1、2、3或4，甚至更优选z为1、2或3，甚至更优选z为1或2，并且最优选z为1。更优选地，y为1或2，优选1，且z为1、2、3或4；甚至更优选y为1或2，优选1，且z为1、2或3；甚至更优选y为1或2，优选1，且z为1或2；并且最优选y为1且z为1。在一个优选的实施方案中，所述接头-缀合物为式Q1-Sp-(D)4、Q1-Sp-(D)3、Q1-Sp-(D)2或Q1-Sp-D。
本发明的接头-缀合物包含如上定义的式(1)的基团或其盐。在一个优选实施方案中，本发明的接头-缀合物包含其中a为0的式(1)的基团或其盐。因此，在该实施方案中，所述化合物包含式(2)的基团或其盐：
Figure BDA0001312943880000201
其中R1如上所定义。
在另一个优选的实施方案中，本发明的接头-缀合物包含其中a为1的式(1)的基团或其盐。因此，在该实施方案中，所述化合物包含式(3)的基团或其盐：
Figure BDA0001312943880000202
其中R1如上所定义。
在式(1)、(2)和(3)的基团中，R1选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，所述C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基，或R1为靶分子D，其中靶分子任选地经由间隔部分与N连接；
在一个优选的实施方案中，R1为氢或C1-C20烷基，更优选R1为氢或C1-C16烷基，甚至更优选R1为氢或C1-C10烷基，其中所述烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中——优选O——的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基。在一个优选的实施方案中，R1为氢。在另一个优选的实施方案中，R1为C1-C20烷基，更优选C1-C16烷基，甚至更优选C1-C10烷基，其中所述烷基任选地被一个或多个O原子间隔，并且其中所述烷基任选地被-OH基团(优选末端-OH基团)取代。在该实施方案中，还优选R1为包含末端-OH基团的(聚)乙二醇链。在另一个优选的实施方案中，R1选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基和叔丁基，更优选地选自氢、甲基、乙基、正丙基和异丙基，并且甚至更优选地选自氢、甲基和乙基。甚至更优选R1为氢或甲基，并且最优选R1为氢。
在另一个优选的实施方案中，R1为靶分子D。任选地，所述靶分子D经由一个或多个间隔部分与N连接。所述间隔部分，如果存在，被定义为使靶分子D和N间隔开(即在它们之间提供一定的距离)并且使它们共价连接的部分。下面将更详细地描述所述靶分子D及其优选实施方案。
当本发明的接头-缀合物包含两个或更多个靶分子D时，所述靶分子D可彼此不同。
在本发明的接头-缀合物的优选实施方案中，所述靶分子选自活性物质、报告分子、聚合物、固体表面、水凝胶、纳米颗粒、微颗粒和生物分子。
本发明人发现使用本发明的磺酰胺接头改善所述接头-缀合物的溶解性，进而显著改善缀合的功效。使用常规接头，有效的缀合通常被接头-缀合物在水性介质中相对低的溶解性所阻碍，尤其是在使用相对不溶于水的或疏水性靶分子时。在一个特别优选的实施方案中，非缀合形式的靶分子为疏水性的，如在20℃和100kPa下测定的，其水溶性通常为至多1％(w/w)，优选至多0.1％(w/w)，最优选至多0.01％(w/w)。即使是这种不溶于水的靶分子在用本发明的磺酰胺接头官能化时，其也能有效地进行缀合。在本文中，“非缀合形式”是指未用本发明的接头官能化或未与其缀合的靶分子。这种非缀合形式的靶分子为本领域技术人员已知的。
在本文中，术语“活性物质”是指药理学或生物学物质，即具有生物学和/或药学活性的物质，例如药物、前药、诊断剂、蛋白质、肽、多肽、肽标签、氨基酸、聚糖、脂类、维生素、类固醇、核苷酸、核苷、多核苷酸、RNA或DNA。肽标签的实例包括细胞渗透性肽，如人乳铁蛋白或聚精氨酸。聚糖的实例为低聚甘露糖。氨基酸的实例为赖氨酸。
当靶分子为活性物质时，所述活性物质优选选自药物和前药。更优选地，所述活性物质选自药学活性化合物，尤其是低分子量至中等分子量的化合物(例如约2000至约2500Da，优选约300至约1750Da)。在其他优选的实施方案中，所述活性物质选自细胞毒素、抗病毒剂、抗菌剂、肽和寡核苷酸。细胞毒素的实例包括秋水仙素(colchicine)、长春花生物碱(vinca alkaloids)、蒽环类抗生素(anthracyclines)、喜树碱(camptothecins)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、紫杉烷类(taxanes)、刺孢霉素(calicheamycins)、微管溶素(tubulysins)、伊立替康(irinotecans)、抑制肽、鹅膏蕈碱(amanitin)、deBouganin、多卡米星(duocarminsins)、美登素(maytansines)、阿里他汀(auristatins)或吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)。考虑到其差的水溶性，优选的活性物质包括长春花生物碱、蒽环类抗生素、喜树碱、紫杉烷类、微管溶素、鹅膏蕈碱、多卡米星、美登素、阿里他汀和吡咯并苯并二氮杂卓，尤其是长春花生物碱、蒽环类抗生素、喜树碱、紫杉烷类、微管溶素、鹅膏蕈碱、美登素和阿里他汀。
术语“报告分子”在本文中是指容易检测其存在的分子，例如诊断剂、染料、荧光团、放射性同位素标记、造影剂、磁共振成像剂或质量标记。
各种荧光团——也称为荧光探针——是本领域技术人员已知的。在例如G.T.Hermanson，“Bioconjugate Techniques”，Elsevier，第3版2013，第10章：“Fluorescent probes”，第395-463页(以引用的方式纳入)中，更详细记载了几种荧光团。荧光团的实例包括Alexa Fluor(例如Alexa Fluor 555)、花青染料(例如Cy3或Cy5)和花青染料衍生物、香豆素衍生物、荧光素和荧光素衍生物、罗丹明和罗丹明衍生物、硼二吡咯亚甲基衍生物、芘衍生物、萘酰亚胺衍生物、藻胆蛋白衍生物(例如别藻蓝蛋白)、色霉素、镧系元素螯合物和量子点纳米晶体的所有种类。考虑到其差的水溶性，优选的荧光团包括花青染料、香豆素衍生物、荧光素及其衍生物、芘衍生物、萘酰亚胺衍生物、色霉素、镧系螯合物和量子点纳米晶体，尤其是香豆素衍生物、荧光素、芘衍生物和色霉素。
放射性同位素标记的实例包括99mTc、111In、114mIn、115In、18F、14C、64Cu、131I、125I、123I、212Bi、88Y、90Y、67Cu、186Rh、188Rh、66Ga、67Ga和10B，其任选地通过螯合部分连接，所述螯合部分例如DTPA(二亚乙基三胺五乙酸酐)、DOTA(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸)、NOTA(1，4，7-三氮杂环壬烷N，N，N″-三乙酸)、TETA(1，4，8，11-四氮杂环十四烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸)、DTTA(N1-(对-异硫氰酸根合苄基)-二亚乙基三胺-N1，N2，N3，N3-四乙酸)、去铁胺或DFA(N′-[5-[[4-[[5-(乙酰基羟基氨基)戊基]氨基]-1，4-二氧代丁基]羟基氨基]戊基]-N-(5-氨基戊基)-N-羟基丁二酰胺)或HYNIC(肼基烟酰胺)。同位素标记技术为本领域技术人员已知的，并且在G.T.Hermanson，“Bioconjugate Techniques”，Elsevier，第3版.2013，第18章：“PEGylation and syntheticpolymer modification”，第787-838页(以引用的方式纳入)中更详细地记载。
适合用作本发明化合物中靶分子D的聚合物为本领域技术人员已知的，并且在例如G.T.Hermanson，“Bioconjugate Techniques”，Elsevier，第3版.2013，第18章：“PEGylation and synthetic polymet modification”，第787-838页(以引用的方式纳入)中更详细地记载了几个实例。当靶分子D是聚合物时，优选靶分子D独立地选自聚(乙二醇)(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚丙二醇(PPG)、聚环氧丙烷(PPO)、1，x-二氨基烷烃聚合物(其中x为烷烃中的碳原子数，优选x为2至200、优选2至10范围内的整数)、(聚)乙二醇二胺(例如1，8-二氨基-3，6-二氧杂辛烷以及包含更长乙二醇链的等同物)、多糖(例如葡聚糖)、聚(氨基酸)(例如聚(L-赖氨酸))和聚(乙烯醇)。考虑到其差的水溶性，优选的聚合物包括1，x-二氨基烷烃聚合物和聚(乙烯醇)。
适合用作靶分子D的固体表面为本领域技术人员已知的。固体表面为例如功能性表面(例如，纳米材料、碳纳米管、富勒烯或病毒壳体的表面)、金属表面(例如，钛、金、银、铜、镍、锡、铑或锌表面)、金属合金表面(其中合金来自例如铝、铋、铬、钴、铜、镓、金、铟、铁、铅、镁、汞、镍、钾、钚、铑、钪、银、钠、钛、锡、铀、锌和/或锆)、聚合物表面(其中聚合物为例如聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚(二甲基硅氧烷)或聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺)、玻璃表面、硅氧烷表面、色谱载体表面(其中色谱载体为例如二氧化硅载体、琼脂糖载体、纤维素载体或氧化铝载体)等。当靶分子D为固体表面时，优选D独立地选自功能性表面或聚合物表面。
水凝胶为本领域技术人员已知的。水凝胶为由聚合物成分之间交联而形成的水溶胀网络。参见例如A.S.Hoffman，Adv.Drug Delivery Rev.2012，64，18(以引用的方式纳入)。当所述靶分子为水凝胶时，优选水凝胶由作为聚合物基底的聚(乙二醇)(PEG)组成。
适合用作靶分子D的微颗粒和纳米颗粒为本领域技术人员已知的。在例如G.T.Hermanson，“Bioconjugate Techniques”，Elsevier，第3版.2013，第14章：“Microparticles and nanoparticles”，第549-587页(以引用的方式纳入)中记载了多种合适的微颗粒和纳米颗粒。所述微米或纳米颗粒可为任意形状，例如球体、杆、管、立方体、三角形和椎体。优选地，所述微颗粒或纳米颗粒为球形。所述微颗粒和纳米颗粒的化学组成可以改变。当靶分子D为微颗粒或纳米颗粒时，所述微颗粒或纳米颗粒为例如聚合微颗粒或聚合纳米颗粒、二氧化硅微颗粒或二氧化硅纳米颗粒、或金微颗粒或金纳米颗粒。当所述颗粒为聚合微颗粒或聚合纳米颗粒时，聚合物优选为聚苯乙烯或苯乙烯共聚物(例如苯乙烯和二乙烯基苯、丁二烯、丙烯酸酯和/或乙烯基甲苯的共聚物)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯基甲苯、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(pHEMA)或聚(乙二醇二甲基丙烯酸酯/甲基丙烯酸2-羟乙酯)[聚(EDGMA/HEMA)]。任选地，微颗粒或纳米颗粒的表面例如使用洗涤剂，通过次级聚合物的接枝聚合或通过另一种聚合物或间隔部分的共价连接等，进行改性。
靶分子D也可为生物分子。下面将更详细地描述生物分子及其优选实施方案。当靶分子D为生物分子时，优选生物分子选自蛋白质(包括糖蛋白和抗体)、多肽、肽、聚糖、脂类、核酸、寡核苷酸、多糖、寡糖、酶、激素、氨基酸和单糖。
本发明的接头-缀合物包含能够与生物分子上存在的官能团F1反应的反应性基团Q1。官能团为本领域技术人员已知的，并且可被定义为能够向含有其的分子赋予特定性质的任何分子实体。例如，生物分子中的官能团可以构成氨基、硫醇基、羧酸、醇基、羰基、磷酸基团或芳族基团。生物分子中的官能团可以是天然存在的或通过特定技术(例如(生物)化学或遗传技术)被放置于生物分子中。被放置于生物分子中的官能团可以是自然界中天然存在的官能团，或者可以是通过化学合成制备的官能团，例如叠氮化物、末端炔或膦部分。在本文中，术语“反应性基团”可以指包括官能团的某一基团，也可以指官能团本身。例如，环辛炔基为包含官能团(即C-C三键)的反应性基团。类似地，N-马来酰亚胺基为包含C-C双键作为官能团的反应性基团。然而，官能团(例如叠氮基官能团、硫醇官能团或氨基官能团)在本文中也可称为反应性基团。
所述接头-缀合物可包含超过一个的反应性基团Q1。当所述接头-缀合物包含两个或更多个反应性基团Q1时，反应性基团Q1可彼此不同。优选地，所述接头-缀合物可包含一个反应性基团Q1。
存在于接头-缀合物中的反应性基团Q1能够与在生物分子中存在的官能团F1反应。换言之，反应性基团Q1需要与在生物分子中存在的官能团F1互补。在本文中，任选在其他官能团的存在下，当反应性基团选择性地与官能团反应时，将所述反应性基团表示为与所述官能团“互补”。互补的反应性基团和官能团为本领域技术人员已知的，并在下文中更详细地描述。
在一个优选的实施方案中，反应性基团Q1选自：任选取代的N-马来酰亚胺基、卤代N-烷基酰氨基、磺酰基氧基N-烷基酰氨基、酯基、碳酸酯基、磺酰卤基、硫醇基或其衍生物、烯基、炔基、(杂)环炔基、二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团、环烯基、四嗪基、叠氮基、膦基、氧化腈基、硝酮基、腈亚胺基、重氮基、酮基、(O-烷基)羟氨基、肼基、卤代N-马来酰亚胺基、1，1-双(磺酰基甲基)-甲基羰基或其消除衍生物、碳酰卤(carbonyl halide)基、丙二烯酰胺基、1，2-醌基或三嗪基。
在一个优选的实施方案中，Q1为N-马来酰亚胺基。在Q1为N-马来酰亚胺基时，Q1优选为未取代的。因此，Q1优选为式(9a)，如下所示。
在另一个优选的实施方案中，Q1为卤代N-烷基酰氨基。当Q1为卤代N-烷基酰氨基时，优选Q1为式(9b)，如下所示，其中k为1至10范围内的整数，且R4选自-Cl、-Br和-I。优选k为1、2、3或4，更优选k为1或2且最优选k为1。优选地，R4为-I或-Br。更优选k为1或2且R4为-I或-Br，最优选k为1且R4为-I或Br。
在另一个优选的实施方案中，Q1为磺酰基氧基N-烷基酰氨基。当Q1为磺酰基氧基N-烷基酰氨基时，优选Q1为式(9b)，如下所示，其中k为1至10范围内的整数，且R4选自-O-甲磺酰基、-O-苯磺酰基和-O-甲苯磺酰基。优选k为1、2、3或4，更优选k为1或2，甚至更优选k为1。最优选k为1且R4选自-O-甲磺酰基、-O-苯磺酰基和-O-甲苯磺酰基。
在另一个优选的实施方案中，Q1为酯基。当Q1为酯基时，优选酯基为活化的酯基。活化的酯基为本领域技术人员已知的。活化的酯基在本文中被定义为包含良好的离去基团的酯基，其中酯羰基与所述良好的离去基团键合。良好的离去基团为本领域技术人员已知的。进一步优选，所述活化的酯基为式(9c)，如下所示，其中R5选自-N-琥珀酰亚胺基(NHS)、-N-磺基-琥珀酰亚胺基(磺基-NHS)、-(4-硝基苯基)、-五氟苯基或-四氟苯基(TFP)。
在另一个优选的实施方案中，Q1为碳酸酯基。当Q1为碳酸酯基时，优选碳酸酯基为活化的碳酸酯基。活化的碳酸酯基为本领域技术人员已知的。活化的碳酸酯基在本文中被定义为包含良好的离去基团的碳酸酯基，其中碳酸酯羰基与所述良好的离去基团键合。进一步优选，所述碳酸酯基为式(9d)，如下所示，其中R7选自-N-琥珀酰亚胺基、-N-磺基-琥珀酰亚胺基、-(4-硝基苯基)、-五氟苯基或-四氟苯基。
在另一个优选的实施方案中，Q1为如下所示的式(9e)的磺酰卤基，其中X选自F、Cl、Br和I。优选X为Cl或Br，更优选Cl。
在另一个优选的实施方案中，Q1为硫醇基(9f)、或硫醇基的衍生物或前体。硫醇基也可称为巯基。当Q1为硫醇基的衍生物或前体时，硫醇衍生物优选为如下所示的式(9g)、(9h)或(9zb)，其中R8为任选取代的C1-C12烷基或C2-C12(杂)芳基，V为O或S且R16为任选取代的C1-C12烷基。更优选R8为任选取代的C1-C6烷基或C2-C6(杂)芳基，并且甚至更优选R8为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基或苯基。甚至更优选地，R8为甲基或苯基，最优选甲基。更优选R16为任选取代的C1-C6烷基，甚至更优选R16为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基，最优选甲基。当Q1为式(9g)或(9zb)的硫醇衍生物，并且Q1与生物分子上的反应性基团F1反应时，在该过程中所述硫醇衍生物被转化成硫醇基团。当Q1为式(9h)时，Q1为-SC(O)OR8或-SC(S)OR8，优选SC(O)OR8，其中R8及其优选实施方案如上所定义。
在另一个优选的实施方案中，Q1为烯基，其中所述烯基是直链或支链的，并且其中烯基任选地被取代。烯基可为末端或内部烯基。所述烯基可包含超过一个的C-C双键，如果如此，优选包含两个C-C双键。当烯基为二烯基时，进一步优选由一个C-C单键分隔的两个C-C双键(即优选二烯基为共轭二烯基)。优选地，所述烯基为C2-C24烯基，更优选C2-C12烯基，甚至更优选C2-C6烯基。进一步优选，烯基为末端烯基。更优选地，所述烯基为如下所示的式(9i)，其中l为0至10范围内的整数，优选在0至6范围内的整数，且p为0至10范围内的整数，优选0至6。更优选地，l为0、1、2、3或4，更优选l为0、1或2并且最优选l为0或1。更优选地，p为0、1、2、3或4，更优选p为0、1或2并且最优选p为0或1。尤其优选，p为0且l为0或1，或p为1且l为0或1。
在另一个优选的实施方案中，Q1为炔基，其中所述炔基是直链或支链的，并且其中炔基任选地被取代。炔基可为末端或内部烯基。优选地，所述炔基为C2-C24炔基，更优选C2-C12炔基，甚至更优选C2-C6炔基。进一步优选，炔基为末端炔基。更优选地，所述炔基为如下所示的式(9j)，其中l为0至10范围内的整数，优选在0至6范围内的整数。更优选地，l为0、1、2、3或4，更优选l为0、1或2并且最优选l为0或1。
在另一个优选的实施方案中，Q1为环烯基。所述环烯基任选地被取代。优选，所述环烯基为C3-C24环烯基，更优选C3-C12环烯基，并且甚至更优选C3-C8环烯基。在一个优选的实施方案中，所述环烯基为反式-环烯基，更优选反式-环辛烯基(也称为TCO基)，并且最优选如下所示的式(9zi)或(9zi)的反式-环辛烯基。在另一个优选的实施方案中，所述环烯基为环丙烯基，其中所述环丙烯基任选地被取代。在另一个优选的实施方案中，所述环烯基为降冰片烯基、氧杂降冰片烯基、降冰片二烯基或氧杂降冰片二烯基，其中所述降冰片烯基、氧杂降冰片烯基、降冰片二烯基或氧杂降冰片二烯基任选地被取代。在其他优选的实施方案中，所述环烯基为如下所示的式(9k)、(9l)、(9m)或(9zc)，其中T为CH2或O，R9独立地选自氢、直链或支链C1-C12烷基或C4-C12(杂)芳基，且R19选自氢和氟代烃。优选地，R9独立地为氢或C1-C6烷基，更优选R9独立地为氢或C1-C4烷基。甚至更优选，R9独立地为氢或甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基。甚至更优选，R9独立地为氢或甲基。在其他优选的实施方案中，R19选自氢和-CF3、-C2F5、-C3F7和-C4F9，，更优选氢和-CF3。在其他优选的实施方案中，所述环烯基为式(9k)，其中一个R9为氢且另一个R9为甲基。在另一个优选的实施方案中，所述环烯基为式(9l)，其中两个R9都为氢。在这些实施方案中，进一步优选l为0或1。在另一个优选的实施方案中，所述环烯基为式(9m)的降冰片烯基(T为CH2)或氧杂降冰片烯基(T为O)，或式(9zc)的降冰片二烯基(T为CH2)或氧杂降冰片二烯基(T为O)，其中R9为氢且R19为氢或-CF3，优选-CF3。
在另一个优选的实施方案中，Q1为(杂)环炔基。所述(杂)环炔基任选地被取代。优选地，所述(杂)环炔基为(杂)环辛炔基，即杂环辛炔基或环辛炔基，其中所述(杂)环辛炔基任选地被取代。在其他优选的实施方案中，所述(杂)环辛炔基为式(9n)，也称为DIBO基团，或为式(9o)，也称为DIBAC基团，或为式(9p)，也称为BARAC基团，或为式(9zk)，也称为COMBO基团，所有基团均如下所示，其中U为O或NR9，并且R9的优选实施方案如上所定义。(9n)中的芳族环任选地在一个或多个位置处被O-磺酰化，而(9o)和(9p)的环可在一个或多个位置处被卤代。
在一个特别优选的实施方案中，化合物(4b)中与R1连接的氮原子为杂环炔基的环中的氮原子(例如9o中的氮原子)。换言之，化合物(4b)中c、d和g为0，R1和Q1与它们所连接的氮原子一起形成杂环炔基，优选杂环辛炔基，最优选式(9o)或(9p)的杂环辛炔基。此处，(9o)的羰基部分被式(1)的基团的磺酰基替换。或者，与R1连接的氮原子和式(9n)中被指定为U的原子是同一原子。换言之，当Q1为式(9n)时，U可为式(1)的基团的右侧氮原子，或U＝NR9且R9为式(1)的基团的剩余部分，以及R1为环辛炔部分。
在另一个优选的实施方案中，Q1为任选取代的二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团，也称为BCN基团。优选地，所述二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团为如下所示的式(9q)。
在另一个优选的实施方案中，Q1为能够在狄尔斯-阿尔德反应中反应的共轭(杂)二烯基。优选的(杂)二烯基包括任选取代的四嗪基、任选取代的1，2-醌基和任选取代的三嗪基。更优选地，所述四嗪基为式(9r)，如下所示，其中R9选自氢、直链或支链的C1-C12烷基或C4-C12(杂)芳基。优选地，R9为氢、C1-C6烷基或C4-C10(杂)芳基，更优选R9为氢、C1-C4烷基或C4-C6(杂)芳基。甚至更优选地，R9为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基或吡啶基。甚至更优选地，R9为氢、甲基或吡啶基。更优选地，所述1，2-醌基为式(9zl)或(9zm)。所述三嗪基可为任意位置异构体。更优选地，所述三嗪基为1，2，3-三嗪基或1，2，4-三嗪基，其可经任何可能的位点连接，如式(9zn)中所示。作为三嗪基，所述1，2，3-三嗪是最优选的。
在另一个优选的实施方案中，Q1为如下所示的式(9s)的叠氮基。
在另一个优选的实施方案中，Q1为适合于进行施陶丁格连接反应(Staudingerligation reaction)的任选取代的三芳基膦基。优选地，所述膦基为如下所示的式(9t)，其中R10为氢或(硫)酯基。当R10为(硫)酯基时，优选R10为-C(O)-V-R11，其中V为O或S且R11为C1-C12烷基。优选地，R11为C1-C6烷基，更优选C1-C4烷基。最优选地，R11为甲基。
在另一个优选的实施方案中，Q1为如下所示的式(9u)的氧化腈基。
在另一个优选的实施方案中，Q1为硝酮基。优选地，所述硝酮基为如下所示的式(9v)，其中R12选自直链或支链的C1-C12烷基和C6-C12芳基。优选地，R12为C1-C6烷基，更优选R12为C1-C4烷基。甚至更优选地，R12为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基。甚至更优选地，R12为甲基。
在另一个优选的实施方案中，Q1为腈亚胺基。优选地，所述腈亚胺基为如下所示的式(9w)或(9zd)，其中R13选自直链或支链的C1-C12烷基和C6-C12芳基。优选地，R13为C1-C6烷基，更优选R13为C1-C4烷基。甚至更优选地，R13为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基。甚至更优选R13为甲基。
在另一个优选的实施方案中，Q1为重氮基。优选地，所述重氮基为如下所示的式(9x)，其中R14选自氢或羰基衍生物。更优选地，R14为氢。
在另一个优选的实施方案中，Q1为酮基。更优选地，所述酮基为如下所示的式(9y)，其中R15选自直链或支链的C1-C12烷基和C6-C12芳基。优选地，R15为C1-C6烷基，更优选R15为C1-C4烷基。甚至更优选R15为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基。甚至更优选R15为甲基。
在另一个优选的实施方案中，Q1为(O-烷基)羟氨基。更优选地，所述(O-烷基)羟氨基为如下所示的式(9z)。
在另一个优选的实施方案中，Q1为肼基。优选地，所述肼基为如下所示的式(9za)。
在另一个优选的实施方案中，Q1为卤代N-马来酰亚胺基或磺酰化N-马来酰亚胺基。当Q1为卤代或磺酰化N-马来酰亚胺基时，Q1优选为如下所示的式(9ze)，其中R6独立地选自氢、F、Cl、Br、I和-S(O)2R18，其中R18选自任选取代的C1-C12烷基和C4-C12(杂)芳基，条件是至少一个R6不为氢。当R6为卤素时(即当R6为F、Cl、Br或I时)，优选R6为Br。当R6为-S(O)2R18时，优选R18为C1-C6烷基或C4-C6(杂)芳基，优选苯基。
在另一个优选的实施方案中，Q1为如下所示的式(9zf)的碳酰卤，其中X选自F、Cl、Br和I。优选地，X为Cl或Br，并且最优选地，X为Cl。
在另一个优选的实施方案中，Q1为式(9zg)的丙二烯酰胺基。
在另一个优选的实施方案中，Q1为式(9zh)的1，1-双(磺酰基甲基)甲基羰基，或其消除衍生物，其中R18选自任选取代的C1-C12烷基和C4-C12(杂)芳基。更优选地，R18为任选取代的C1-C6烷基或C4-C6(杂)芳基，并且最优选苯基。
Figure BDA0001312943880000301
Figure BDA0001312943880000311
Figure BDA0001312943880000321
其中k、l、X、T、U、V、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18和R19如上所定义。
在如下文所述的本发明的缀合方法的优选实施方案中，缀合通过环加成实现，所述环加成如狄尔斯-阿尔德反应或1，3-偶极环加成，优选1，3-偶极环加成。根据该实施方案，反应性基团Q1(以及生物分子上的F1)选自在环加成反应中具有反应性的基团。此处，反应性基团Q1和F1为互补的，即在环加成反应中它们能够相互反应。
对于狄尔斯-阿尔德反应，F1和Q1中的一个为二烯，且F1和Q1中的另一个为亲二烯体。正如本领域技术人员所理解的，在狄尔斯-阿尔德反应的上下文下，术语“二烯”是指1，3-(杂)二烯，并且包括共轭二烯(R2C＝CR-CR＝CR2)、亚胺(例如R2C＝CR-N＝CR2或R2C＝CR-CR＝NR、R2C＝N-N＝CR2)和羰基(例如R2C＝CR-CR＝O或O＝CR-CR＝O)。使用含N-二烯和含O-二烯的杂-狄尔斯-阿尔德反应在本领域中是已知的。本领域中已知的适用于狄尔斯-阿尔德反应的任何二烯均可用作反应性基团Q1或F1。优选的二烯包括如上所述的四嗪，如上所述的1，2-醌和如上所述的三嗪。尽管本领域中已知的适用于狄尔斯-阿尔德反应的任何亲二烯体均可用作反应性基团Q1或F1，但是所述亲二烯体优选为如上所述的烯烃或炔烃基团，最优选炔烃基团。对于通过狄尔斯-阿尔德反应的缀合，优选F1为二烯且Q1为亲二烯体。此处，当Q1为二烯时，F1为亲二烯体；当Q1为亲二烯体时，F1为二烯。最优选地，Q1为亲二烯体，优选Q1为或包含炔基，且F1为二烯，优选四嗪、1，2-醌或三嗪基团。
对于1，3-偶极环加成，F1和Q1中的一个为1，3-偶极体，且F1和Q1中的另一个为亲偶极体。本领域中已知的适用于1，3-偶极环加成的任何1，3-偶极体均可用作反应性基团Q1或F1。优选的1，3-偶极体包括叠氮基、硝酮基、氧化腈基、腈亚胺基和重氮基。尽管本领域中已知的适用于1，3-偶极环加成的任何亲偶极体均可用作反应性基团Q1或F1，但是所述亲偶极体优选为烯烃或炔烃基团，最优选炔烃基团。对于通过1，3-偶极环加成的缀合，优选F1为1，3-偶极体且Q1为亲偶极体。此处，当Q1为1，3-偶极体时，F1为亲偶极体；当Q1为亲偶极体时，F1为1，3-偶极体。最优选地，Q1为亲偶极体，优选Q1为或包含炔基，且F1为1，3-偶极体，优选叠氮基。
因此，在一个优选的实施方案中，Q1选自亲偶极体和亲二烯体。优选地，Q1为烯基或炔基。在一个特别优选的实施方案中，Q1包含炔基，优选选自如上所述的炔基、如上所述的环烯基、如上所述的(杂)环炔基，以及二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团，更优选Q1选自如上所定义的以及下文描述的(9j)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)和(9zk)，更优选选自(9n)、(9o)、(9p)、(9q)和(9zk)。最优选地，Q1为二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团，优选式(9q)的基团。已知这些基团在与本文所述的叠氮官能化的生物分子的缀合中是高效的，并且当本发明的磺酰胺接头用于这种接头-缀合物和生物缀合物中时，任何聚集均被有利地减小至最低。尤其是对于这种疏水反应性基团Q1，以及对于所述经缀合的生物缀合物，本发明的磺酰胺接头使得聚集显著降低。
如上文所述，在本发明的化合物中，Q1能够与生物分子上存在的反应性基团F1反应。反应性基团Q1的互补反应性基团F1为本领域技术人员已知的，并且在下文中进行更详细的描述。F1和Q1之间的反应及其相应产物的一些代表性实例示于附图22中。
如上所述，在本发明的接头-缀合物中，靶分子D和反应性基团Q1共价连接到接头上。靶分子D与接头的共价连接可通过例如在所述靶分子上存在的官能团F2与在所述接头上存在的反应性基团Q2的反应来发生。用于连接靶分子D与接头的合适的有机反应为本领域技术人员已知的，与反应性基团Q2互补的官能团F2也是。因此，D可通过连接基团Z与接头连接。
术语“连接基团”在本文中是指将化合物的一部分与同一化合物的另一部分连接的结构元素。正如本领域技术人员所理解的，连接基团的性质取决于获得所述化合物的部分之间的连接所采用的有机反应的类型。例如，当R-C(O)-OH的羧基与H2N-R’的氨基反应以形成R-C(O)-N(H)-R’时，R通过连接基团Z与R’连接，并且Z可由基团-C(O)-N(H)-表示。
反应性基团Q1可以类似的方式与接头连接。因此，Q1可通过连接基团Z与间隔部分连接。
在本领域中已知有大量的反应用于靶分子与接头的连接，以及用于反应性基团Q1与接头的连接。因此，多种连接基团Z均可存在于本发明的接头-缀合物中。
因此，本发明还涉及下式的化合物：
(Q1)y-(Zw)-Sp-(Zx)-(D)z，
其中：
y为1至10范围内的整数；
z为1至10范围内的整数；
Q1为能够与生物分子上存在的官能团F1反应的反应性基团；
D为靶分子；
Sp为间隔部分，其中间隔部分被定义为使反应性基团Q1和靶分子D间隔(即在它们之间提供一定的距离)且使它们共价连接的部分；
Zw为使反应性基团Q1连接到所述间隔部分的连接基团；
Zx为使靶分子D连接到所述间隔部分的连接基团；以及
其中所述间隔部分包含式(1)的基团或其盐，其中式(1)的基团为如上所定义。
在一个优选的实施方案中，式(1)的基团中a为0。在另一个优选的实施方案中，式(1)的基团中a为1。
y和z的优选实施方案为如上述(Q1)y-Sp-(D)z中所定义。进一步优选，所述化合物为式Q1-(Zw)-Sp-(Zx)-(D)4、Q1-(Zw)-Sp-(Zx)-(D)3、Q1-(Zw)-Sp-(Zx)-(D)2或Q1-(Zw)-Sp-(Zx)-D，更优选Q1-(Zw)-Sp-(Zx)-(D)2或Q1-(Zw)-Sp-(Zx)-D且最优选Q1-(Zw)-Sp-(Zx)-D，其中Zw和Zx为如上所定义。
优选地，Zw和Zx独立地选自-O-、-S-、-NR2-、-N＝N-、-C(O)-、-C(O)-NR2-、-O-C(O)-、-O-C(O)-O-、-O-C(O)-NR2、-NR2-C(O)-、-NR2-C(O)-O-、-NR2-C(O)-NR2-、-S-C(O)-、-S-C(O)-O-、-S-C(O)-NR2-、-S(O)-、-S(O)2-、-O-S(O)2-、-O-S(O)2-O-、-O-S(O)2-NR2-、-O-S(O)-、-O-S(O)-O-、-O-S(O)-NR2-、-O-NR2-C(O)-、-O-NR2-C(O)-O-、-O-NR2-C(O)-NR2-、-NR2-O-C(O)-、-NR2-O-C(O)-O-、-NR2-O-C(O)-NR2-、-O-NR2-C(S)-、-O-NR2-C(S)-O-、-O-NR2-C(S)-NR2-、-NR2-O-C(S)-、-NR2-O-C(S)-O-、-NR2-O-C(S)-NR2-、-O-C(S)-、-O-C(S)-O-、-O-C(S)-NR2-、-NR2-C(S)-、-NR2-C(S)-O-、-NR2-C(S)-NR2-、-S-S(O)2-、-S-S(O)2-O-、-S-S(O)2-NR2-、-NR2-O-S(O)-、-NR2-O-S(O)-O-、-NR2-O-S(O)-NR2-、-NR2-O-S(O)2-、-NR2-O-S(O)2-O-、-NR2-O-S(O)2-NR2-、-O-NR2-S(O)-、-O-NR2-S(O)-O-、-O-NR2-S(O)-NR2-、-O-NR2-S(O)2-O-、-O-NR2-S(O)2-NR2-、-O-NR2-S(O)2-、-O-P(O)(R2)2-、-S-P(O)(R2)2-、-NR2-P(O)(R2)2-，及其两种或更多种的组合，其中R2独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基被任选地取代。
D和Q1的优选实施方案如上所定义。
更具体地，本发明涉及式(4a)或(4b)的化合物，或其盐：
Figure BDA0001312943880000351
其中：
a独立地为0或1；
b独立地为0或1；
c为0或1；
d为0或1；
e为0或1；
f为1至150范围内的整数；
g为0或1；
i为0或1；
D为靶分子；
Q1为能够与生物分子上存在的官能团F1反应的反应性基团；
Sp1为间隔部分；
Sp2为间隔部分；
Sp3为间隔部分；
Sp4为间隔部分；
Z1为连接基团，其将Q1或Sp3与Sp2、O或C(O)或N(R1)连接；
Z2为连接基团，其将D或Sp4与Sp1、N(R1)、O或C(O)连接；以及
R1选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C1-C24(杂)芳基、C1-C24烷基(杂)芳基和C1-C24(杂)芳基烷基，所述C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基；或
R1为D、-[(Sp1)b-(Z2)e-(Sp4)i-D]或-[(Sp2)c-(Z1)d-(Sp3)g-Q1]，其中Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、Z1、Z2、D、Q1、b、c、d、e、g和i如上所定义。
式(4a)或(4b)的化合物或其盐也可称为接头-缀合物。
在一个优选的实施方案中，式(4a)或(4b)的化合物中a为1。在另一个优选的实施方案中，式(4a)或(4b)的化合物中a为0。
如上所述，Z1为将Q1或Sp3与Sp2、O或C(O)或N(R1)连接的连接基团，以及Z2为将D或Sp4与Sp1、N(R1)、O或C(O)连接的连接基团。如上文更详细描述的，术语“连接基团”是指将化合物的一部分与同一化合物的另一部分连接的结构元素。
在式(4a)的化合物中，连接基团Z1——当存在(即当d为1)时——将式(4a)的化合物的Q1(任选地通过间隔部分Sp3)与O-原子或C(O)基团(任选地通过间隔部分Sp2)连接。更具体地，当Z1存在(即d为1)时，并且当Sp3和Sp2不存在(即g为0且c为0)时，Z1将式(4a)的接头-缀合物的Q1与O原子(a为1)或C(O)基团(a为0)连接。当Z1存在(即当d为1)、Sp3存在(即g为1)且Sp2不存在(即c为0)时，Z1将式(4a)的接头-缀合物的间隔部分Sp3与O原子(a为1)或C(O)基团(a为0)连接。当Z1存在(即d为1)时，并且当Sp3和Sp2存在(即g为1且c为1)时，Z1将式(4a)的接头-缀合物的间隔部分Sp3与间隔部分Sp2连接。当Z1存在(即当d为1)、Sp3不存在(即g为0)且Sp2存在(即c为1)时，Z1将式(4a)的接头-缀合物的Q1与间隔部分Sp2连接。
在式(4b)的化合物中，连接基团Z1——当存在(即当d为1)时——将式(4b)的接头-缀合物中的Q1(任选地通过间隔部分Sp3)与N(R1)基团的N原子(任选地通过间隔部分Sp2)连接。更具体地，当Z1存在(即当d为1)时，并且当Sp3和Sp2不存在(即g为0且c为0)时，Z1将式(4b)的接头-缀合物的Q1与N(R1)基团的N原子连接。当Z1存在(即当d为1)、Sp3存在(即g为1)且Sp2不存在(即c为0)时，Z1将式(4b)的接头-缀合物的间隔部分Sp3与N(R1)基团的N原子连接。当Z1存在(即当d为1)时，并且当Sp3和Sp2存在(即g为1且c为1)时，Z1将式(4b)的接头-缀合物的间隔部分Sp3与间隔部分Sp2连接。当Z1存在(即当d为1)、Sp3不存在(即g为0)且Sp2存在(即c为1)时，Z1将式(4b)的接头-缀合物的Q1与间隔部分Sp2连接。
在式(4a)的化合物中，当c、d和g都为0时，则式(4a)的接头-缀合物中的Q1与O原子(当a为1时)或与C(O)基团(当a为0时)直接连接。
在式(4b)的化合物中，当c、d和g都为0时，则式(4b)的接头-缀合物中的Q1与N(R1)基团的N原子直接连接。
在式(4a)的化合物中，连接基团Z2——当存在(即当e为1)时——将式(4a)的接头-缀合物的D(任选地通过间隔部分Sp4)与N(R1)基团的N原子(任选地通过间隔部分Sp1)连接。更具体地，当Z2存在(即e为1)时，并且当Sp1和Sp4不存在(即b为0且i为0)时，Z2将式(4a)的接头-缀合物的D与N(R1)基团的N原子连接。当Z2存在(即当e为1)、Sp4存在(即i为1)且Sp1不存在(即b为0)时，Z2将式(4a)的接头-缀合物的间隔部分Sp4与N(R1)基团的N原子连接。当Z2存在(即当e为1)时，并且当Sp1和Sp4存在(即b为1且i为1)时，Z2将式(4a)的接头-缀合物的间隔部分Sp1与间隔部分Sp4连接。当Z2存在(即当e为1)、Sp4不存在(即i为0)且Sp1存在(即b为1)时，Z2将式(4a)的接头-缀合物的D与间隔部分Sp1连接。
在式(4a)的化合物中，当b、e和i都为0时，则式(4a)的接头-缀合物中的D与N(R1)基团的N原子直接连接。
在式(4b)的化合物中，当b、e和i都为0时，则式(4b)的接头-缀合物中的D与O原子(当a为1时)或与C(O)基团(当a为0时)直接连接。
正如本领域技术人员所理解的，连接基团的性质取决于获得所述化合物的特定部分之间的连接所采用的有机反应的类型。大量的有机反应可用于将反应性基团Q1与间隔部分连接，以及用于将靶分子与间隔部分连接。因此，存在多种连接基团Z1和Z2。
在(4a)和(4b)的接头-缀合物的一个优选的实施方案中，Z1和Z2独立地选自-O-、-S-、-S-S-、-NR2-、-N＝N-、-C(O)-、-C(O)-NR2-、-O-C(O)-、-O-C(O)-O-、-O-C(O)-NR2、-NR2-C(O)-、-NR2-C(O)-O-、-NR2-C(O)-NR2-、-S-C(O)-、-S-C(O)-O-、-S-C(O)-NR2-、-S(O)-、-S(O)2-、-O-S(O)2-、-O-S(O)2-O-、-O-S(O)2-NR2-、-O-S(O)-、-O-S(O)-O-、-O-S(O)-NR2-、-O-NR2-C(O)-、-O-NR2-C(O)-O-、-O-NR2-C(O)-NR2-、-NR2-O-C(O)-、-NR2-O-C(O)-O-、-NR2-O-C(O)-NR2-、-O-NR2-C(S)-、-O-NR2-C(S)-O-、-O-NR2-C(S)-NR2-、-NR2-O-C(S)-、-NR2-O-C(S)-O-、-NR2-O-C(S)-NR2-、-O-C(S)-、-O-C(S)-O-、-O-C(S)-NR2-、-NR2-C(S)-、-NR2-C(S)-O-、-NR2-C(S)-NR2-、-S-S(O)2-、-S-S(O)2-O-、-S-S(O)2-NR2-、-NR2-O-S(O)-、-NR2-O-S(O)-O-、-NR2-O-S(O)-NR2-、-NR2-O-S(O)2-、-NR2-O-S(O)2-O-、-NR2-O-S(O)2-NR2-、-O-NR2-S(O)-、-O-NR2-S(O)-O-、-O-NR2-S(O)-NR2-、-O-NR2-S(O)2-O-、-O-NR2-S(O)2-NR2-、-O-NR2-S(O)2-、-O-P(O)(R2)2-、-S-P(O)(R2)2-、-NR2-P(O)(R2)2-，及其两种或更多种的组合，其中R2独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
如上所述，在式(4a)或(4b)的化合物中，Sp1、Sp2、Sp3和Sp4为间隔部分。Sp1、Sp2、Sp3和Sp4可独立地存在或不存在(b、c、g和i独立地为0或1)。Sp1(如果存在)，可不同于Sp2(如果存在)，可不同于Sp3和/或Sp4(如果存在)。
间隔部分为本领域技术人员已知的。合适的间隔部分的实例包括(聚)乙二醇二胺(例如，1，8-二氨基-3，6-二氧杂辛烷或包含更长的乙二醇链的等同物)，聚乙二醇链或聚环氧乙烷链，聚丙二醇链或聚环氧丙烷链，以及1，x-二氨基烷烃(其中x为烷烃中碳原子的数目)。
另一类合适的间隔部分包括可裂解的间隔部分，或可裂解的接头。所述可裂解的接头是在本领域中众所周知的。例如，Shabat et al.，Soft Matter2012，6，1073——以引用方式纳入本文—－公开了包含在生物学引发(例如酶裂解或氧化事件)时释放自我牺牲型部分的可裂解接头。一些合适的可裂解接头的实例为在还原时裂解的二硫化物接头，在蛋白酶(例如组织蛋白酶、血纤维蛋白溶酶或金属蛋白酶)的特异性识别下裂解的肽接头，或在糖苷酶(例如葡萄糖醛酸苷酶)特异性识别下裂解的基于糖苷的接头，或在贫氧、缺氧区域中被还原的硝基芳族化合物。此处，合适的可裂解的间隔部分也包括包含特定的、可裂解的氨基酸序列的间隔部分。实例包括例如包含Val-Cit(缬氨酸-瓜氨酸)部分的间隔部分。由于其有限的水溶性，包含可裂解接头(例如Val-Cit接头，尤其是Val-Cit-PABC)的生物缀合物在很大程度上发生聚集。对于这种生物缀合物，纳入本发明的磺酰胺接头是特别有益的。此外，与包含可裂解接头的接头缀合物的缀合反应受到所述接头-缀合物的有限的水溶性阻碍。因此，包含可裂解接头(例如Val-Cit接头，尤其是Val-Cit-PABC)以及本发明的磺酰胺接头的接头-缀合物优于包含这种可裂解接头但缺少这种缀合至生物分子的磺酰胺接头的接头-缀合物。
因此，在式(4a)和(4b)的接头-缀合物的一个优选实施方案中，间隔部分Sp1、Sp2、Sp3和/或Sp4——如果存在——包含氨基酸序列。包含氨基酸序列的间隔部分为本领域技术人员已知的，并且也可被称为肽接头。实例包括包含Val-Cit部分(例如Val-Cit-PABC、Val-Cit-PAB、Fmoc-Val-Cit-PAB等)的间隔部分。优选地，将Val-Cit-PABC部分用于所述接头-缀合物中。
在式(4a)和(4b)的接头-缀合物的一个优选实施方案中，间隔部分Sp1、Sp2、Sp3和Sp4——如果存在——独立地选自直链或支链的C1-C200亚烷基、C2-C200亚烯基、C2-C200亚炔基、C3-C200亚环烷基、C5-C200亚环烯基、C8-C200亚环炔基、C7-C200烷基亚芳基、C7-C200芳基亚烷基、C8-C200芳基亚烯基和C9-C200芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。当所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被上述定义的一个或多个杂原子间隔时，优选所述基团被一个或多个O原子，和/或被一个或多个S-S基团间隔。
更优选地，间隔部分Sp1、Sp2、Sp3和Sp4——如果存在——独立地选自直链或支链的C1-C100亚烷基、C2-C100亚烯基、C2-C100亚炔基、C3-C100亚环烷基、C5-C100亚环烯基、C8-C100亚环炔基、C7-C100烷基亚芳基、C7-C100芳基亚烷基、C8-C100芳基亚烯基和C9-C100芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
甚至更优选地，间隔部分Sp1、Sp2、Sp3和Sp4——如果存在——独立地选自直链或支链的C1-C50亚烷基、C2-C50亚烯基、C2-C50亚炔基、C3-C50亚环烷基、C5-C50亚环烯基、C8-C50亚环炔基、C7-C50烷基亚芳基、C7-C50芳基亚烷基、C8-C50芳基亚烯基和C9-C50芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
甚至更优选地，间隔部分Sp1、Sp2、Sp3和Sp4——如果存在——独立地选自直链或支链的C1-C20亚烷基、C2-C20亚烯基、C2-C20亚炔基、C3-C20亚环烷基、C5-C20亚环烯基、C8-C20亚环炔基、C7-C20烷基亚芳基、C7-C20芳基亚烷基、C8-C20芳基亚烯基和C9-C20芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
在这些优选实施方案中，进一步优选所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基未被取代并且任选地被选自O、S和NR3中－－优选O－－的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基，优选氢或甲基。
最优选地，间隔部分Sp1、Sp2、Sp3和Sp4——如果存在——独立地选自直链或支链的C1-C20亚烷基，所述亚烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。在该实施方案中，进一步优选所述亚烷基未被取代并且任选地被选自O、S和NR3中——优选O和/或S-S－—的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基，优选氢或甲基。
因此，优选的间隔部分Sp1、Sp2、Sp3和Sp4包括-(CH2)n-、-(CH2CH2)n-、-(CH2CH2O)n-、-(OCH2CH2)n-、-(CH2CH2O)nCH2CH2-、-CH2CH2(OCH2CH2)n-、-(CH2CH2CH2O)n-、-(OCH2CH2CH2)n-、-(CH2CH2CH2O)nCH2CH2CH2-和-CH2CH2CH2(OCH2CH2CH2)n-，其中n为1至50范围内的整数，优选在1至40范围内，更优选在1至30范围内，甚至更优选在1至20范围内，并且甚至更优选在1至15范围内。更优选地，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选1、2、3、4、5、6、7或8，甚至更优选1、2、3、4、5或6，甚至更优选1、2、3或4。
由于Sp1、Sp2、Sp3和Sp4独立地选择，因此Sp1(如果存在)，可不同于Sp2(如果存在)，可不同于Sp3和/或Sp4(如果存在)。
上文更详细地描述了反应性基团Q1。在式(4a)和(4b)的接头-缀合物中，优选反应性基团Q1选自：任选取代的N-马来酰亚胺基、卤代N-烷基酰氨基、磺酰基氧基N-烷基酰氨基、酯基、碳酸酯基、磺酰卤基、硫醇基或其衍生物、烯基、炔基、(杂)环炔基、二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团、环烯基、四嗪基、叠氮基、膦基、氧化腈基、硝酮基、腈亚胺基、重氮基、酮基、(O-烷基)羟氨基、肼基、卤代N-马来酰亚胺基、碳酰卤基、丙二烯酰胺基和1，1-双(磺酰基甲基)-甲基羰基或其消除衍生物。在其他优选的实施方案中，Q1为式(9a)、(9b)、(9c)、(9d)、(9e)、(9f)、(9g)、(9h)、(9i)、9j)、(9k)、(9l)、(9m)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9r)、(9s)、(9t)、(9u)、(9v)、(9w)、(9x)、(9y)、(9z)、(9za)、(9zb)、(9zc)、(9zd)、(9ze)、(9zf)、(9zg)、(9zh)、(9zi)、(9zj)、(9zk)、(9zl)、(9zm)或(9zn)，其中(9a)、(9b)、(9c)、(9d)、(9e)、(9f)、(9g)、(9h)、(9i)、(9j)、(9k)、(9l)、(9m)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9r)、(9s)、(9t)、(9u)、(9v)、(9w)、(9x)、(9y)、(9z)、(9za)、(9zb)、(9zc)、(9zd)、(9ze)、(9zf)、(9zg)、(9zh)、(9zi)、(9zj)、(9zk)、(9zl)、(9zm)、(9zn)及其优选实施方案如上所定义。在一个优选的实施方案中，Q1为式(9a)、(9b)、(9c)、(9f)、(9j)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9s)、(9t)、(9zh)、(9r)、(9zl)、(9zm)或(9zn)。在一个甚至更优选的实施方案中，Q1为式(9a)、(9n)、(9o)、(9q)、(9p)、(9t)、(9zh)或(9s)，并且在一个特别优选的实施方案中，Q1为式(9a)、(9q)、(9n)、(9o)、(9p)、(9t)或(9zh)及其优选实施方案，如上所定义。
在式(4a)和(4b)的接头-缀合物中，靶分子D和靶分子D的优选实施方案如上所定义。在式(4a)和(4b)的接头-缀合物的一个优选实施方案中，D选自活性物质、报告分子、聚合物、固体表面、水凝胶、纳米颗粒、微颗粒和生物分子。活性物质、报告分子、聚合物、水凝胶、固体表面、纳米颗粒和微颗粒以及生物分子，及其优选实施方案已在上文更详细描述。
如上所述，R1选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，所述C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基，或R1为D、-[(Sp1)b-(Z2)e-(Sp4)i-D]或-[(Sp2)c-(Z1)d-(Sp3)g-Q1]，其中Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、Z1、Z2、D、Q1、b、c、d、e、g和i如上所定义。
在一个优选的实施方案中，R1为氢或C1-C20烷基，更优选R1为氢或C1-C16烷基，甚至更优选R1为氢或C1-C10烷基，其中所述烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中——优选O——的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基。在其他优选的实施方案中，R1为氢。在另一个优选的实施方案中，R1为C1-C20烷基，更优选C1-C16烷基，甚至更优选C1-C10烷基，其中所述烷基任选地被一个或多个O原子间隔，并且其中所述烷基任选地被-OH基——优选末端-OH基——取代。在该实施方案中，进一步优选R1为包含末端-OH基的聚乙二醇链。在另一个优选的实施方案中，R1为C1-C12烷基，更优选C1-C6烷基，甚至更优选C1-C4烷基，并且甚至更优选R1选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基和叔丁基。
在另一个优选的实施方案中，R1为靶分子D、-[(Sp1)b-(Z2)e-(Sp4)i-D]或-[(Sp2)c-(Z1)d-(Sp3)g-Q1]，其中Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、Z1、Z2、D、Q1、b、c、d、e、g和i如上所定义。当R1为D或-[(Sp1)b-(Z2)e-(Sp4)i-D]时，进一步优选所述接头-缀合物为式(4a)。在该实施方案中，接头-缀合物(4a)包含两个靶分子D，其可为相同或不同的。当R1为-[(Sp1)b-(Z2)e-(Sp4)i-D]时，在-[(Sp1)b-(Z2)e-(Sp4)i-D]中的Sp1、b、Z2、e、Sp4、i和D可与N(R1)的N原子连接的另一个-[(Sp1)b-(Z2)e-(Sp4)i-D]中的Sp1、b、Z2、e、Sp4、i和D相同或不同。在一个优选的实施方案中，在N(R1)的N原子上的两个-[(Sp1)b-(Z2)e-(Sp4)i-D]是相同的。
当R1为-[(Sp2)c-(Z1)d-(Sp3)g-Q1]时，进一步优选所述接头-缀合物为式(4b)。在该实施方案中，接头-缀合物(4b)包含两个靶分子Q1，其可为相同或不同的。当R1为-[(Sp2)c-(Z1)d-(Sp3)g-Q1]时，在-[(Sp1)b-(Z2)e-(Sp4)i-D]中的Sp2、c、Z1、d、Sp3、g和D可与N(R1)的N原子连接的另一个-[(Sp2)c-(Z1)d-(Sp3)g-Q1]中的Sp1、b、Z2、e、Sp4、i和Q1相同或不同。在一个优选的实施方案中，在N(R1)的N原子上的两个-[(Sp2)c-(Z1)d-(Sp3)g-Q1]是相同的。
在式(4a)和(4b)的接头-缀合物中，f为1至150范围内的整数。因此，所述接头-缀合物可包含超过一个的式(1)的基团，所述式(1)的基团如上所定义。当存在超过一个的式(1)的基团时，即当f为2或更大时，则a、b、Sp1和R1独立地选择。换言之，当f为2或更大时，每个a独立地为0或1，每个b独立地为0或1，每个Sp1可为相同或不同的，并且每个R1可为相同或不同的。在一个优选的实施方案中，f为1至100范围内的整数，优选在1至50范围内，更优选在1至25范围内，并且甚至更优选在1至15范围内。在该实施方案中，更优选地，f为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，甚至更优选f为1、2、3、4、5、6、7或8，甚至更优选f为1、2、3、4、5或6，甚至更优选f为1、2、3或4，并且最优选f为1。在另一个优选的实施方案中，f为2至150范围内的整数，优选在2至100范围内，更优选在2至50范围内，更优选在2至25范围内，并且甚至更优选在2至15范围内。在该实施方案中，更优选地，f为2、3、4、5、6、7、8、9或10，甚至更优选f为2、3、4、5、6、7或8，甚至更优选f为2、3、4、5或6，甚至更优选f为2、3或4，并且最优选f为2。
如上所述，在一个优选的实施方案中，式(4a)或(4b)的化合物中a为0。因此，本发明也涉及式(6a)或(6b)的化合物，或其盐：
Figure BDA0001312943880000441
其中a、b、c、d、e、f、g、i、D、Q1、Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、Z1、Z2和R1，及其优选实施方案，如上文(4a)和(4b)中所定义。
如上所述，在另一个优选的实施方案中，式(4a)或(4b)的化合物中a为1。因此，本发明也涉及式(7a)或(7b)的化合物，或其盐：
Figure BDA0001312943880000451
其中a、b、c、d、e、f、g、i、D、Q1、Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、Z1、Z2和R1，及其优选实施方案，如上文(4a)和(4b)中所定义。
当在式(4a)的接头-缀合物中Sp4不存在时(即当i为0时)，靶分子D与Z2连接(当e为1时)、与Sp1连接(当e为0且b为1时)或与N(R1)连接(当e为0且b为0时)。当在式(4b)的接头-缀合物中Sp4不存在时(即当i为0时)，靶分子D与Z2连接(当e为1时)、与Sp1连接(当e为0且b为1时)或与O原子连接(当a为1且b和e为0时)或与C(O)基连接(当a为0且b和e为0时)。因此，本发明也涉及式(4c)或(4d)的接头-缀合物，或其盐：
Figure BDA0001312943880000452
其中：
a、b、c、d、e、f、g、D、Q1、Sp1、Sp2、Sp3、Z1、Z2和R1，及其优选实施方案，如上文(4a)和(4b)中所定义。
在一个优选的实施方案中，式(4c)或(4d)的接头-缀合物中a为0。在另一个优选的实施方案中，式(4c)或(4d)的接头-缀合物中a为1。
在本发明的接头-缀合物的一个具体实施方案中，尤其是在(4a)、(4b)、(4c)、(4d)、(6a)、(6b)、(7a)或(7b)的接头-缀合物中，Sp1、Sp2、Sp3和Sp4——如果存在——独立地选自直链或支链的C1-C20亚烷基，所述亚烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基，并且Q1为式(9a)、(9b)、(9c)、(9d)、(9e)、(9f)、(9g)、(9h)、(9i)、(9j)、(9k)、(9l)、(9m)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9r)、(9s)、(9t)、(9u)、(9v)、(9w)、(9x)、(9y)、(9z)、(9za)、(9zb)、(9zc)、(9zd)、(9ze)、(9zf)、(9zg)(9zh)、(9zi)、(9zj)、(9zk)、(9zl)、(9zm)或(9zn)，其中(9a)、(9b)、(9c)、(9d)、(9e)、(9f)、(9g)、(9h)、(9i)、(9j)、(9k)、(9l)、(9m)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9r)、(9s)、(9t)、(9u)、(9v)、(9w)、(9x)、(9y)、(9z)、(9za)、(9zb)、(9zc)、(9zd)、(9ze)、(9zf)、(9zg)、(9zh)、(9zi)、(9zj)、(9zk)、(9zl)、(9zm)、(9zn)及其优选实施方案如上所定义。在一个优选的实施方案中，Q1为式(9a)、(9b)、(9c)、(9f)、(9j)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9s)(9t)、(9zh)、(9r)、(9zl)、(9zm)或(9zn)。在甚至进一步优选的实施方案中，Q1为式(9a)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9t)、(9zh)或(9s)，并且在一个特别优选的实施方案中，Q1为式(9a)、(9q)、(9n)、(9p)、(9t)、(9zh)或(9o)及其优选实施方案，如上所定义。
接头在本文中被定义为使化合物的两个或更多个元素连接的部分。
因此，在如上所定义的式(4a)、(4b)、(4c)、(4d)、(6a)、(6b)、(7a)或(7b)的接头-缀合物中，如上所定义的接头可分别由式(8a)和(8b)表示：
Figure BDA0001312943880000461
Figure BDA0001312943880000471
正如本领域技术人员所理解的，间隔部分(8a)和(8b)的优选实施方案可取决于例如所述接头-缀合中反应性基团Q1和D的性质、制备所述接头-缀合物的合成方法(例如在靶分子上互补官能团F2的性质)、使用所述接头-缀合物制备的生物缀合物的性质(例如在生物分子上互补官能团F1的性质)。
当Q1为例如如上所定义的式(9n)、(9o)、(9p)、(9q)或(9zk)的环辛炔基时，则优选Sp3存在(g为1)。
当例如接头-缀合物通过反应性基团Q2——式(9n)、(9o)、(9p)、(9q)或(9zk)的环辛炔基——与叠氮基官能团F2反应来制备时，优选Sp4存在(i为1)。
此外，优选Sp1、Sp2、Sp3和Sp4中的至少一个是存在的，即b、c、g和i中的至少一个不为0。在另一个优选的实施方案中，Sp1和Sp4中的至少一个以及Sp2和Sp3中的至少一个是存在的。
当f为2或更大时，优选Sp1存在(b为1)。
接头部分(8a)和(8b)的这些优选实施方案也适用于以下更详细描述的本发明的生物缀合物中的接头部分。
Sp1、Sp2、Sp3和Sp4的优选实施方案如上所定义。
接头-构建体
接头-构建体在本文中被定义为其中反应性基团Q1经由接头与反应性基团Q2共价连接的化合物。接头-构建体包含能够与生物分子上存在的反应性基团F1反应的反应性基团Q1，以及能够与靶分子上存在的反应性基团F2反应的反应性基团Q2。Q1和Q2可相同或不同。接头-构建体可包含超过一个的反应性基团Q1和/或超过一个的反应性基团Q2。当存在超过一个的反应性基团Q1时，所述基团Q1可相同或不同，并且当存在超过一个的反应性基团Q2时，所述基团Q2可相同或不同。
本发明还涉及一种化合物，更具体地涉及一种接头-构建体，所述化合物包含α端和ω端，所述化合物在α端包含能够与生物分子上存在的官能团F1反应的官能团Q1，以及在ω端包含能够与靶分子上存在的官能团F2反应的官能团Q2，所述化合物还包含式(1)的基团或其盐，其中所述式(1)的基团如上所定义，并且其中式(1)的基团或其盐位于化合物的所述α-端和所述ω-端之间。
反应性基团Q1共价键合至化合物的α-端，并且反应性基团Q2共价键合至化合物的ω-端。
本发明的该化合物也可称为接头-构建体。在本发明的接头-构建体中，反应性基团Q2经由接头与反应性基团Q1共价连接，并且所述接头包含如上所定义的式(1)的基团或其盐。当本发明的接头-构建体包含式(1)的基团的盐时，所述盐优选为药学上可接受的盐。
本发明的接头-构建体可包含超过一个的反应性基团Q2。因此，所述接头可包含例如第三(第四、第五等)末端，其可被称为psi、chi、phi等末端，所述第三(第四、第五等)末端包含反应性基团Q2。类似地，所述接头-缀合物可包含超过一个的反应性基团Q1。
因此，本发明接头-缀合物也可表示为(Q1)y-Sp-(Q2)z，其中y为1至10范围内的整数，并且z为1至10范围内的整数。
因此，本发明也涉及下式的接头-构建体：
(Q1)y-Sp-(Q2)z，
其中：
y为1至10范围内的整数；
z为1至10范围内的整数；
Q1为能够与生物分子上存在的官能团F1反应的反应性基团；
Q2为能够与靶分子上存在的官能团F2反应的反应性基团；
Sp为间隔部分，其中间隔部分被定义为使反应性基团Q1和反应性基团Q2间隔(即在它们之间提供一定的距离)且使它们共价连接的部分；以及
其中所述间隔部分包含式(1)的基团或其盐，其中式(1)的基团如上所定义。
优选地，y为1、2、3或4，更优选y为1或2，并且最优选y为1。优选地，z为1、2、3、4、5或6，更优选z为1、2、3或4，甚至更优选z为1、2或3，甚至更优选z为1或2，并且最优选z为1。更优选地，y为1或2，优选1，且z为1、2、3或4；甚至更优选y为1或2，优选1，且z为1、2或3；甚至更优选y为1或2，优选1，且z为1或2；并且最优选y为1且z为1。在一个优选的实施方案中，所述接头-构建体为式Q1-Sp-(Q2)4、Q1-Sp-(Q2)3、Q1-Sp-(Q2)2或Q1-Sp-Q2。
本发明的接头-构建体包含如上定义的式(1)的基团或其盐。在一个优选的实施方案中，本发明的接头-构建体包含其中a为0的式(1)的基团或其盐。因此，在该实施方案中，所述接头-构建体包含式(2)的基团或其盐：
Figure BDA0001312943880000491
其中R1如上所定义。
在另一个优选的实施方案中，本发明的接头-构建体包含其中a为1的式(1)的基团或其盐。因此，在该实施方案中，所述接头-构建体包含式(3)的基团或其盐：
Figure BDA0001312943880000492
其中R1如上所定义。
在本发明的接头-构建体中，R1以及R1的优选实施方案如上所定义。此外，反应性基团Q1和间隔部分Sp，以及它们的实施方案，如上述对于本发明的接头-缀合物中所定义的。
更具体地，本发明涉及下式的化合物：
(Q1)y-(Zw)-Sp-(Zx)-(Q2)z，
其中：
y为1至10范围内的整数；
z为1至10范围内的整数；
Q1为能够与生物分子上存在的官能团F1反应的反应性基团；
Q2为能够与生物分子上存在的官能团F2反应的反应性基团；
Sp为间隔部分，其中间隔部分被定义为使反应性基团Q1和Q2间隔(即在它们之间提供一定的距离)且使它们共价连接的部分；
Zw为将反应性基团Q1与所述间隔部分连接的连接基团；
Zx为将反应性基团Q2与所述间隔部分连接的连接基团；以及
其中所述间隔部分包含式(1)的基团或其盐，其中式(1)的基团如上所定义。
在一个优选的实施方案中，式(1)的基团中的a为0。在另一个优选的实施方案中，式(1)的基团中的a为1。
y和z的优选实施方案如上述(Q1)y-Sp-(Q2)z中所定义的。进一步优选所述化合物为式Q1-(Zw)-Sp-(Zx)-(Q2)4、Q1-(Zw)-Sp-(Zx)-(Q2)3、Q1-(Zw)-Sp-(Zx)-(Q2)2或Q1-(Zw)-Sp-(Zx)-Q2，更优选Q1-(Zw)-Sp-(Zx)-(Q2)2或Q1-(Zw)-Sp-(Zx)-Q2，并且最优选Q1-(Zw)-Sp-(Zx)-Q2，其中Zw和Zx如上所定义。
在本发明的接头化合物中，Zw和Zx优选独立地选自-O-、-S-、-NR2-、-N＝N-、-C(O)-、-C(O)-NR2-、-O-C(O)-、-O-C(O)-O-、-O-C(O)-NR2、-NR2-C(O)-、-NR2-C(O)-O-、-NR2-C(O)-NR2-、-S-C(O)-、-S-C(O)-O-、-S-C(O)-NR2-、-S(O)-、-S(O)2-、-O-S(O)2-、-O-S(O)2-O-、-O-S(O)2-NR2-、-O-S(O)-、-O-S(O)-O-、-O-S(O)-NR2-、-O-NR2-C(O)-、-O-NR2-C(O)-O-、-O-NR2-C(O)-NR2-、-NR2-O-C(O)-、-NR2-O-C(O)-O-、-NR2-O-C(O)-NR2-、-O-NR2-C(S)-、-O-NR2-C(S)-O-、-O-NR2-C(S)-NR2-、-NR2-O-C(S)-、-NR2-O-C(S)-O-、-NR2-O-C(S)-NR2-、-O-C(S)-、-O-C(S)-O-、-O-C(S)-NR2-、-NR2-C(S)-、-NR2-C(S)-O-、-NR2-C(S)-NR2-、-S-S(O)2-、-S-S(O)2-O-、-S-S(O)2-NR2-、-NR2-O-S(O)-、-NR2-O-S(O)-O-、-NR2-O-S(O)-NR2-、-NR2-O-S(O)2-、-NR2-O-S(O)2-O-、-NR2-O-S(O)2-NR2-、-O-NR2-S(O)-、-O-NR2-S(O)-O-、-O-NR2-S(O)-NR2-、-O-NR2-S(O)2-O-、-O-NR2-S(O)2-NR2-、-O-NR2-S(O)2-、-O-P(O)(R2)2-、-S-P(O)(R2)2-、-NR2-P(O)(R2)2-，及其两种或更多种的组合，其中R2独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
Q1的优选实施方案如上所定义。
在本发明的接头-构建体中，Q2为能够与靶分子上存在的官能团F2反应的反应性基团。能够与此类官能团F2反应的反应性基团Q2为本领域技术人员已知的。在一个优选的实施方案中，Q2为选自以下的反应性基团：任选取代的N-马来酰亚胺基、卤代N-烷基酰氨基、磺酰基氧基N-烷基酰氨基、酯基、碳酸酯基、磺酰卤基、硫醇基或其衍生物、烯基、炔基、(杂)环炔基、二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团、环烯基、四嗪基、叠氮基、膦基、氧化腈基、硝酮基、腈亚胺基、重氮基、酮基、(O-烷基)羟氨基、肼基、卤代N-马来酰亚胺基、1，1-双(磺酰基甲基)甲基羰基或其消除衍生物、碳酰卤基和丙二烯酰胺基、-[C(R17)2C(R17)2O]q-R17(其中q在1至200范围内)、-CN、-NCV、-VCN、-VR17、-N(R17)2、-+N(R17)3、-C(V)N(R17)2、-C(R17)2VR17、-C(V)R17、-C(V)VR17、-S(O)R17、-S(O)2R17、-S(O)OR17、-S(O)2OR17、-S(O)N(R17)2、-S(O)2N(R17)2、-OS(O)R17、-OS(O)2R17、-OS(O)OR17、-OS(O)2OR17、-P(O)(R17)(OR17)、-P(O)(OR17)2、-OP(O)(OR17)2、-Si(R17)3、-VC(V)R17、-VC(V)VR17、-VC(V)N(R17)2、-N(R17)C(V)R17、-N(R17)C(V)VR17和-N(R17)C(V)N(R17)2，其中V为O或S，并且其中R17独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基。
在其他优选的实施方案中，Q2为式(9a)、(9b)、(9c)、(9d)、(9e)、(9f)、(9g)、(9h)、(9i)、(9j)、(9k)、(9l)、(9m)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9r)、(9s)、(9t)、(9u)、(9v)、(9w)、(9x)、(9y)、(9z)、(9za)、(9zb)、(9zc)、(9zd)、(9ze)、(9zf)、(9zg)、(9zh)、(9zi)、(9zj)、(9zk)、(9zl)、(9zm)或(9zn)，其中(9a)、(9b)、(9c)、(9d)、(9e)、(9f)、(9g)、(9h)、(9i)、(9j)、(9k)、(9l)、(9m)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9r)、(9s)、(9t)、(9u)、(9v)、(9w)、(9x)、(9y)、(9z)、(9za)、(9zb)、(9zc)、(9zd)、(9ze)、(9zf)、(9zg)、(9zh)、(9zi)、(9zj)、(9zk)、(9zl)、(9zm)、(9zn)及其优选的实施方案如上所定义。在该实施方案中，进一步优选Q2为式(9a)、(9b)、(9c)、(9f)、(9j)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9s)、(9t)、(9zh)、(9r)、(9zl)、(9zm)或(9zn)，更优选式(9a)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9t)、(9zh)或(9s)，并且甚至更优选Q2为式(9a)、(9p)、(9q)、(9n)、(9t)、(9zh)或(9o)，及其优选实施方案，如上所定义。最优选地，Q2为式(9a)、(9p)、(9q)、(9n)、(9t)、(9zh)或(9o)，及其优选实施方案，如上所定义。
在另一个其他优选的实施方案中，Q2选自-[C(R17)2C(R17)2O]q-R17，其中q在1至200范围内，-CN、-NCV、-VCN、-VR17、-N(R17)2、-+N(R17)3、-C(V)N(R17)2、-C(R17)2VR17、-C(V)R17、-C(V)VR17、-S(O)R17、-S(O)2R17、-S(O)OR17、-S(O)2OR17、-S(O)N(R17)2、-S(O)2N(R17)2、-OS(O)R17、-OS(O)2R17、-OS(O)OR17、-OS(O)2OR17、-P(O)(R17)(OR17)、-P(O)(OR17)2、-OP(O)(OR17)2、-Si(R17)3、-VC(V)R17、-VC(V)VR17、-VC(V)N(R17)2、-N(R17)C(V)R17、-N(R17)C(V)VR17和-N(R17)C(V)N(R17)2，其中V和R17如上所定义。在该实施方案中，进一步优选Q2选自-OR17、SR17、-N(R17)2、-+N(R17)3、-C(O)N(R17)2、-C(R17)2OR17、-C(O)R17、-C(O)OR17、-S(O)R17、-S(O)2R17、-S(O)OR17、-S(O)2OR17、-S(O)N(R17)2、-S(O)2N(R17)2、-OS(O)R17、-OS(O)2R17、-OS(O)OR17、-OS(O)2OR17、-P(O)(R17)(OR17)、-P(O)(OR17)2、-OP(O)(OR17)2、-Si(R17)3、-OC(O)R17、-OC(O)OR17、-OC(O)N(R17)2、-N(R17)C(O)R17、-N(R17)C(O)OR17和-N(R17)C(O)N(R17)2，其中R17如上所定义。
在本发明的接头-构建体的一个具体实施方案中，Q1为式(9a)、(9b)、(9c)、(9d)、(9e)、(9f)、(9g)、(9h)、(9i)、(9j)、(9k)、(9l)、(9m)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9r)、(9s)、(9t)、(9u)、(9v)、(9w)、(9x)、(9y)、(9z)、(9za)、(9zb)、(9zc)、(9zd)、(9ze)、(9zf)、(9zg)、(9zh)、(9zi)、(9zj)、(9zk)、(9zl)、(9zm)或(9zn)，其中(9a)、(9b)、(9c)、(9d)、(9e)、(9f)、(9g)、(9h)、(9i)、(9j)、(9k)、(9l)、(9m)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9r)、(9s)、(9t)、(9u)、(9V)、(9w)、(9x)、(9y)、(9z)、(9za)、(9zb)、(9zc)、(9zd)、(9ze)、(9zf)、(9zg)、(9zh)、(9zi)、(9zj)、(9zk)、(9zl)、(9zm)、(9zn)及其优选实施方案，如上所定义；以及间隔部分Sp选自直链或支链的C1-C20亚烷基，所述亚烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基；其中所述间隔部分Sp被一个或多个式(1)的基团或其盐间隔；并且其中(1)如上所定义。
在一个优选的实施方案中，所述间隔部分Sp被一个或多个式(2)的基团或其盐间隔，其中(2)如上所定义。在另一个优选的实施方案中，所述间隔部分Sp被一个或多个式(3)的基团或其盐间隔，其中(3)如上所定义。
在其他优选的实施方案中，Q1为式(9a)、(9b)、(9c)、(9f)、(9j)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9s)、(9t)、(9zh)、(9zk)、(9r)、(9zl)、(9zm)或(9zn)。在一个更进一步优选的实施方案中，Q1为式(9a)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9t)、(9zh)或(9s)，并且在一个特别优选的实施方案中，Q1为式(9a)、(9p)、(9q)、(9n)、(9t)、(9zh)、(9zk)或(9o)，及其优选实施方案，如上所定义。最优选Q1为式(9a)、(9p)、(9q)、(9n)、(9t)、(9zh)或(9o)，及其优选实施方案，如上所定义。
接头-缀合物的制备方法
本发明还涉及本发明的接头-缀合物的制备方法。具体地，本发明涉及本发明的接头-缀合物的制备方法，所述方法包括使接头-构建体的官能团Q2与靶分子的官能团F2反应的步骤，其中所述接头-构建体为包含α-端和ω-端的化合物，所述化合物在α-端包含官能团Q1并且在ω-端包含官能团Q2，所述Q1能够与生物分子上存在的官能团F1反应，并且所述Q2能够与所述靶分子上存在的官能团F2反应，所述化合物还包含式(1)的基团或其盐，其中所述式(1)的基团如上所定义，并且其中式(1)的基团或其盐位于化合物的所述α-端和所述ω-端之间。
包括Q1、Q2和靶分子D的优选实施方案的所述接头-构建体及其优选实施方案在上文中详细描述。
在接头-构建体的制备方法的一个优选实施方案中，所述接头-构建体为如上所定义的(Q1)y-Sp-(Q2)z。在接头-构建体的制备方法的其他优选实施方案中，所述接头-构建体为如上所定义的(Q1)y-(Zw)-Sp-(Zx)-(Q2)z。
本发明还涉及本发明的磺酰胺接头-构建体在生物缀合过程中的用途。本发明的接头-构建体及其优选实施方案在上文中已详细描述。本发明尤其涉及式(Q1)y-Sp-(Q2)z的接头-构建体在生物缀合过程中的用途，并且涉及式(Q1)y-(Zw)-Sp-(Zx)-(Q2)z的接头-构建体在生物缀合过程中的用途。
本发明还涉及本发明的接头-缀合物在生物缀合过程中的用途。本发明的接头-缀合物及其优选实施方案在上文中详细描述。本发明尤其涉及式(4a)、(4b)、(4c)、(4d)、(6a)、(6b)、(7a)或(7b)的接头-缀合物在生物缀合过程中的用途。
生物缀合物
生物缀合物在本文中被定义为其中生物分子经由接头与靶分子共价连接的化合物。生物缀合物包含一个或多个生物分子和/或一个或多个靶分子。所述接头可包含一个或多个间隔部分。本发明的生物缀合物通过用于本发明生物缀合物的制备方法来方便地制备，其中将包含反应性基团Q1的接头-缀合物缀合到包含反应性基团F1的生物分子。在该缀合反应中，反应性基团Q1和F1相互反应以形成接头部分，其将所述接头缀合物和生物分子连接。因此，本文所述的接头-缀合物和生物分子的所有优选实施方案均等同地适用于本发明的生物缀合物，除了所有所述的Q1和F1以外，其中本发明的生物缀合物含有如上所定义的Q1和F1的反应产物。
本发明还涉及一种化合物，所述化合物包含α-端和ω-端，所述化合物在α-端包含生物分子并且在ω-端包含靶分子，所述化合物还包含式(1)的基团或其盐：
Figure BDA0001312943880000541
其中：
a为0或1；以及
R1选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，所述C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基，或
R1为靶分子D，其中所述靶分子任选地通过间隔部分与N连接；
以及其中式(1)的基团或其盐位于化合物的所述α-端和所述ω-端之间。
在一个优选的实施方案中，所述化合物还包含通过环加成反应(优选1，3-偶极环加成反应，最优选1，2，3-三唑环)可获得的部分，该部分位于所述α-端和所述式(1)的基团之间。因此，在当从α-端至ω-端进行观察时，本文所述化合物包含生物分子、通过环加成反应可获得的部分、式(1)的基团以及靶分子。
在其他优选的实施方案中，所述靶分子为如上所定义的疏水性的。
本发明的该化合物也可称为生物缀合物。当本发明的生物缀合物包含式(1)的基团的盐时，所述盐优选为药学上可接受的盐。
生物分子共价连接到本发明的生物缀合物的α-端，并且靶分子共价连接到本发明的生物缀合物的ω-端。
本发明的缀合物可包含超过一个的靶分子。类似地，生物缀合物可包含超过一个的生物分子。生物分子B和靶分子D，及其优选的实施方案，已在上文更详细描述。如上文中更详细描述的，本发明的生物缀合物中D的优选实施方案对应于本发明的接头-构建体中D的优选实施方案。如上文中更详细描述的，本发明的生物缀合物中接头(8a)或(8b)的优选实施方案对应于本发明的接头-缀合物中接头的优选实施方案。
在本发明的生物缀合物中，生物分子B优选选自蛋白质(包括糖蛋白和抗体)、多肽、肽、聚糖、脂类、核酸、寡核苷酸、多糖、寡糖、酶、激素、氨基酸和单糖。更优选地，生物分子B选自蛋白质(包括糖蛋白和抗体)、多肽、肽、聚糖、核酸、寡核苷酸、多糖、寡糖和酶。最优选地，生物分子B选自蛋白质(包括糖蛋白和抗体)、多肽、肽和聚糖。
本发明的生物缀合物也可定义为其中生物分子经由间隔部分与靶分子缀合的生物缀合物，其中所述间隔部分包含式(1)的基团或其盐，其中式(1)的基团如上所定义。
本发明的生物缀合物也可表示为(B)y-Sp-(D)z，其中y为1至10范围内的整数，并且z为1至10范围内的整数。
因此，本发明也涉及下式的生物缀合物：
(B)v-Sp-(D)z，
其中：
y为1至10范围内的整数；
z为1至10范围内的整数；
B为生物分子；
D为靶分子；
Sp为间隔部分，其中间隔部分被定义为使生物分子B和靶分子D间隔(即在它们之间提供一定的距离)且使它们共价连接的部分；以及
其中所述间隔部分包含式(1)的基团或其盐，其中式(1)的基团如上所定义。
在一个优选的实施方案中，所述间隔部分还包含通过环加成反应(优选1，3-偶极环加成反应，最优选1，2，3-三唑环)可获得的部分，该部分位于B和所述式(1)的基团之间。
优选地，y为1、2、3或4，更优选y为1或2，最优选y为1。优选地，z为1、2、3、4、5或6，更优选z为1、2、3或4，甚至更优选z为1、2或3，甚至更优选z为1或2，并且最优选z为1。更优选地，y为1或2，优选1，且z为1、2、3或4；甚至更优选y为1或2，优选1，且z为1、2或3；甚至更优选y为1或2，优选1，且z为1或2；并且最优选y为1且z为1。在一个优选的实施方案中，所述生物缀合物为式B-Sp-(D)4、B-Sp-(D)3、B-Sp-(D)2或B-Sp-D。
如上所述，本发明的生物缀合物包含如上所定义的式(1)的基团或其盐。在一个优选的实施方案中，生物缀合物包含其中a为0的式(1)的基团或其盐。因此，在该实施方案中，所述生物缀合物包含式(2)的基团或其盐，其中(2)如上所定义。
在另一个优选的实施方案中，所述生物缀合物包含其中a为1的式(1)的基团或其盐。因此，在该实施方案中，所述生物缀合物包含式(3)的基团或其盐，其中(3)如上所定义。
在本发明的生物缀合物中，R1、间隔部分Sp、以及R1和Sp的优选实施方案如上文对于本发明的接头-缀合物中所定义。
在一个优选的实施方案中，所述生物缀合物为式(5a)或(5b)，或其盐：
Figure BDA0001312943880000561
Figure BDA0001312943880000571
其中a、b、c、d、e、f、g、h、i、D、Sp1、Sp2、Sp3、Z1、Z2、Z3和R1，及其优选实施方案如上文(4a)和(4b)的接头-缀合物中所定义；以及
h为0或1；
Z3为连接基团，其将B与Sp3、Z1、Sp2、O或C(O)连接；
B为生物分子。
优选地，h为1。
生物分子B的优选实施方案如上所定义。
当本发明的生物缀合物为(5a)或(5b)的盐时，所述盐优选为药学上可接受的盐。
Z3为连接基团。如上所述，本文中的术语“连接基团”是指将化合物的一部分与同一化合物的另一部分连接的结构元素。通常，生物缀合物通过在接头-缀合物中存在的反应性基团Q1与在生物分子中存在的官能团F1的反应来制备。正如本领域技术人员所理解的，连接基团Z3的性质取决于为建立生物分子和接头-缀合物之间的连接而使用的有机反应的类型。换言之，Z3的性质取决于所述接头-缀合物的反应性基团Q1的性质，以及所述生物分子中的官能团F1的性质。由于存在大量的不同的化学反应可用于建立生物分子与接头-缀合物之间的连接，因此，Z3存在许多的可能性。
图22示出了，当包含Q1的接头-缀合物与包含互补官能团F1的生物分子缀合时，F1和Q1的合适的组合的几个实例，以及在生物缀合物中存在的连接基团Z3的几个实例。
当F1为例如硫醇基时，互补基团Q1包括N-马来酰亚胺基和烯基，并且相应的连接基团Z3如图22所示。当F1为硫醇基时，互补基团Q1还包括丙二烯酰胺基。
当F1为例如氨基时，互补基团Q1包括酮基、活化酯基和叠氮基，并且相应的连接基团Z3如图22所示。
当F1为例如酮基时，互补基团Q1包括(O-烷基)羟氨基和肼基，并且相应的连接基团Z3如图22所示。
当F1为例如炔基时，互补基团Q1包括叠氮基，并且相应的连接基团Z3如图22所示。
当F1为例如叠氮基时，互补基团Q1包括炔基，并且相应的连接基团Z3如图22所示。
当F1为例如环丙烯基、反-环辛烯基或环辛炔基时，互补基团Q1包括四嗪基，并且相应的连接基团Z3如图22所示。在这些特定的情况下，Z3仅为中间体结构，并且将排出N2，从而生成二氢哒嗪(来自与烯基的反应)或哒嗪(来自与炔烃的反应)。
F1和Q1的其他合适的组合以及所得连接基团Z3的性质为本领域技术人员已知的，并且例如记载于G.T.Hermanson，“Bioconjugate Techniques”，Elsevier，第3版.2013(ISBN：978-0-12-382239-0)(尤其是第3章、第229-258页)(以引用的方式纳入)中。适用于生物缀合过程的互补的反应性基团的列表公开于G.T.Hermanson，“BioconjugateTechniques”，Elsevier，第3版.2013(ISBN：978-0-12-382239-0)的第3章的第230-232页的表3.1中，并且该表的内容以引用的方式明确纳入本文中。
在(5a)和(5b)的生物缀合物中，优选Z3、Sp3、Z1和Sp2中的至少一个是存在的，即h、g、d和c中至少一个不为0。也优选Sp1、Z2和Sp4中的至少一个是存在的，即b、e和i中至少一个不为0。更优选地，Z3、Sp3、Z1和Sp2中的至少一个是存在的，并且Sp1、Z2和Sp4中的至少一个是存在的，即优选b、e和i中至少一个不为0，并且h、g、d和c中至少一个不为0。
制备生物缀合物的方法
本发明还涉及制备生物缀合物的方法，所述方法包括将本发明的接头-缀合物的反应性基团Q1与生物分子的官能团F1反应的步骤。本发明的接头-缀合物及其优选实施方案已在上文中更详细描述。
图1示出了生物分子缀合的一般概念：将包含一个或多个官能团F1的目的生物分子(BOI)与(过量的)通过特定的接头与反应性基团Q1共价连接的靶分子D(也称为目的分子或MOI)孵育。在生物缀合过程中，发生F1和Q1之间的化学反应，由此形成了包含BOI和MOI之间的共价键的生物缀合物。所述BOI可为例如肽/蛋白质、聚糖或核酸。在本发明的方法中，所述接头为磺酰胺接头。
本发明还涉及制备生物缀合物的方法，所述方法包括使接头-缀合物的反应性基团Q1与生物分子的官能团F1反应的步骤，其中所述接头-缀合物为包含α-端和ω-端的化合物，所述化合物在α-端包含反应性基团Q1并且在ω-端包含靶分子，所述Q1能够与在生物分子上存在的官能团F1反应，所述化合物还包含式(1)的基团或其盐：
Figure BDA0001312943880000591
其中：
a为0或1；以及
R1选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，所述C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基，或R1为靶分子D，其中所述靶分子任选地通过间隔部分与N连接；
以及其中式(1)的基团或其盐位于所述接头缀合物的所述α-端和所述ω-端之间。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及通过环加成制备生物缀合物的方法，所述环加成例如(4+2)-环加成(例如狄尔斯-阿尔德反应)或(3+2)-环加成(例如1，3-偶极环加成)。优选地，所述缀合为狄尔斯-阿尔德反应或1，3-偶极环加成。优选的狄尔斯-阿尔德反应为反电子需求的狄尔斯-阿尔德环加成。在另一个优选的实施方案中，使用1，3-偶极环加成，更优选炔烃-叠氮化合物环加成，并且最优选其中Q1为或包含炔基且F1为叠氮基。环加成(例如狄尔斯-阿尔德反应和1，3-偶极环加成)在本领域中是已知的，并且技术人员知道如何去实施。在其他优选的实施方案中，本发明涉及制备生物缀合物的方法，其中所述靶分子为疏水性的(即微溶于水)，最优选其中所述靶分子在水中的水溶性至多为0.1％(w/w)(20℃且100kPa)。在一个尤其优选的实施方案中，本发明涉及通过环加成制备生物缀合物的方法，所述环加成优选1，3-偶极环加成，更优选炔烃-叠氮化物环加成，并且最优选其中Q1为或包含炔基且F1为叠氮基，以及其中所述靶分子为疏水性的，最优选其中所述靶分子在水中的水溶性至多为0.1％(w/w)(20℃且100kPa)。
在本发明方法中，Q1与F1反应，形成生物分子与接头部分之间的共价连接。互补的反应性基团Q1和官能团F1已在上下文中更详细描述。
在本发明方法的一个优选实施方案中，式(1)的基团中a为0。因此，在该实施方案中，所述接头-缀合物包含式(2)的基团，如上所定义。在本发明方法的另一个优选实施方案中，式(1)的基团中a为1。因此，在该实施方案中，所述接头-缀合物包含式(3)的基团，如上所定义。
生物分子已在上文中更详细描述。优选地，在本发明的方法中，所述生物分子选自蛋白质(包括糖蛋白和抗体)、多肽、肽、聚糖、脂类、核酸、寡核苷酸、多糖、寡糖、酶、激素、氨基酸和单糖。更优选地，生物分子B选自蛋白质(包括糖蛋白和抗体)、多肽、肽、聚糖、核酸、寡核苷酸、多糖、寡糖和酶。最优选地，生物分子B选自蛋白质(包括糖蛋白和抗体)、多肽、肽和聚糖。
靶分子已在上文中更详细描述。在本发明方法的一个优选实施方案中，所述靶分子选自活性物质、报告分子、聚合物、固体表面、水凝胶、纳米颗粒、微颗粒和生物分子。活性物质、报告分子、聚合物、固体表面、水凝胶、纳米颗粒和微颗粒已在上文中详细描述，它们的优选方案也是如此。鉴于当使用本发明的磺酰胺接头时所述接头-缀合物的水溶性显著提高，制备生物缀合物的方法的优选实施方案使用疏水性靶分子。在20℃和100kPa下测定的，以其非缀合形式的疏水性靶分子的水溶性通常为至多1％(w/w)，优选至多0.1％(w/w)，最优选至多0.01％(w/w)。
在本发明的方法中，优选反应性基团Q1选自任选取代的N-马来酰亚胺基、卤代N-烷基酰氨基、磺酰基氧基N-烷基酰氨基、酯基、碳酸酯基、磺酰卤基、硫醇基或其衍生物、烯基、炔基、(杂)环炔基、二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团、环烯基、四嗪基、叠氮基、膦基、氧化腈基、硝酮基、腈亚胺基、重氮基、酮基、(O-烷基)羟氨基、肼基、卤代N-马来酰亚胺基、1，1-双(磺酰基甲基)甲基羰基或其消除衍生物、碳酰卤基和丙二烯酰胺基。
在其他优选的实施方案中，Q1为式(9a)、(9b)、(9c)、(9d)、(9e)、(9f)、(9g)、(9h)、(9i)、(9j)、(9k)、(9l)、(9m)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9r)、(9s)、(9t)、(9u)、(9v)、(9w)、(9x)、(9y)、(9z)、(9za)、(9zb)、(9zc)、(9zd)、(9ze)、(9zf)、(9zg)、(9zh)、(9zi)、(9zj)、(9zk)、(9zl)、(9zm)或(9zn)，其中(9a)、(9b)、(9c)、(9d)、(9e)、(9f)、(9g)、(9h)、(9i)、(9j)、(9k)、(9l)、(9m)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9r)、(9s)、(9t)、(9u)、(9v)、(9w)、(9x)、(9y)、(9z)、(9za)、(9zb)、(9zc)、(9zd)、(9ze)、(9zf)、(9zg)、(9zh)、(9zi)、(9zj)、(9zk)、(9zl)、(9zm)、(9zn)及其优选实施方案如上文对于本发明的接头-缀合物中所定义。更优选地，Q1为式(9a)、(9b)、(9c)、(9f)、(9j)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9s)、(9t)、(9zh)、(9r)、(9zl)、(9zm)或(9zn)。甚至更优选地，Q1为式(9a)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)、(9t)、(9zh)或(9s)，并且最优选地，Q1为式(9a)、(9p)、(9q)、(9n)、(9t)、(9zh)或(9o)，及其优选实施方案，如上所定义。
在一个特别优选的实施方案中，Q1包含炔基，优选选自如上所述的炔基、如上所述的环烯基、如上所述的(杂)环炔基以及二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团，更优选Q1选自如上所定义的(9j)、(9n)、(9o)、(9p)、(9q)和(9zk)。最优选地，Q1为二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团，优选式(9q)的基团。
在本发明方法的其他优选实施方案中，所述接头-缀合物为式(4a)或(4b)，或其盐：
Figure BDA0001312943880000611
Figure BDA0001312943880000621
其中：
a独立地为0或1；
b独立地为0或1；
c为0或1；
d为0或1；
e为0或1；
f为1至150范围内的整数；
g为0或1；
i为0或1；
D为靶分子；
Q1为能够与生物分子上存在的官能团F1反应的反应性基团；
Sp1为间隔部分；
Sp2为间隔部分；
Sp3为间隔部分；
Sp4为间隔部分；
Z1为连接基团，其将Q1或Sp3与Sp2、O或C(O)或N(R1)连接；
Z2为连接基团，其将D或Sp4与Sp1、N(R1)、O或C(O)连接；以及
R1选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，所述C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基；或
R1为D、-[(Sp1)b-(Z2)e-(Sp4)i-D]或-[(Sp2)c-(Z1)d-(Sp3)g-Q1]，其中Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、Z1、Z2、D、Q1、b、c、d、e、g和i如上所定义。
Sp1、Sp2、Sp3和Sp4独立地为间隔部分，换言之，Sp1、Sp2、Sp3和Sp4可彼此不同。Sp1、Sp2、Sp3和Sp4可存在或不存在(b、c、g和i独立地为0或1)。然而，优选Sp1、Sp2、Sp3和Sp4中的至少一个是存在的，即优选b、c、g和i中的至少一个不为0。
如果存在，优选Sp1、Sp2、Sp3和Sp4独立地选自直链或支链的C1-C200亚烷基、C2-C200亚烯基、C2-C200亚炔基、C3-C200亚环烷基、C5-C200亚环烯基、C8-C200亚环炔基、C7-C200烷基亚芳基、C7-C200芳基亚烷基、C8-C200芳基亚烯基和C9-C200芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。当所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被如上所定义的一个或多个杂原子间隔时，优选所述基团被一个或多个O原子，和/或被一个或多个S-S基团间隔。
更优选地，间隔部分Sp1、Sp2、Sp3和Sp4——如果存在——独立地选自直链或支链的C1-C100亚烷基、C2-C100亚烯基、C2-C100亚炔基、C3-C100亚环烷基、C5-C100亚环烯基、C8-C100亚环炔基、C7-C100烷基亚芳基、C7-C100芳基亚烷基、C8-C100芳基亚烯基和C9-C100芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
甚至更优选地，间隔部分Sp1、Sp2、Sp3和Sp4——如果存在——独立地选自直链或支链的C1-C50亚烷基、C2-C50亚烯基、C2-C50亚炔基、C3-C50亚环烷基、C5-C50亚环烯基、C8-C50亚环炔基、C7-C50烷基亚芳基、C7-C50芳基亚烷基、C8-C50芳基亚烯基和C9-C50芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
甚至更优选地，间隔部分Sp1、Sp2、Sp3和Sp4——如果存在—－独立地选自直链或支链的C1-C20亚烷基、C2-C20亚烯基、C2-C20亚炔基、C3-C20亚环烷基、C5-C20亚环烯基、C8-C20亚环炔基、C7-C20烷基亚芳基、C7-C20芳基亚烷基、C8-C20芳基亚烯基和C9-C20芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被取代并且任选地被选自P、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
在这些优选实施方案中，进一步优选所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基未被取代并且任选地被选自O、S和NR3中——优选O——的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基，优选氢或甲基。
最优选地，间隔部分Sp1、Sp2、Sp3和Sp4——如果存在——独立地选自直链或支链的C1-C20亚烷基，所述亚烷基任选地被取代并且任选地被选自P、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。在该实施方案中，进一步优选所述亚烷基未被取代并且任选地被选自O、S和NR3中——优选O和/或S-S——的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基，优选氢或甲基。
特别优选的间隔部分Sp1、Sp2、Sp3和Sp4包括-(CH2)n-、-(CH2CH2)n-、-(CH2CH2O)n-、-(PCH2CH2)n-、-(CH2CH2O)nCH2CH2-、-CH2CH2(OCH2CH2)n-、-(CH2CH2CH2O)n-、-(OCH2CH2CH2)n-、-(CH2CH2CH2O)nCH2CH2CH2-和-CH2CH2CH2(OCH2CH2CH2)n-，其中n为1至50范围内的整数，优选在1至40范围内，更优选在1至30范围内，甚至更优选在1至20范围内，并且甚至更优选在1至15范围内。更优选地，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选1、2、3、4、5、6、7或8，甚至更优选1、2、3、4、5或6，甚至更优选1、2、3或4。
在本发明方法的另一个优选的实施方案中，在式(4a)或(4b)的接头-缀合物中，间隔部分Sp1、Sp2、Sp3和/或Sp4——如果存在——包含氨基酸序列。包含氨基酸序列的间隔部分为本领域技术人员已知的，也可被称为肽接头。实例包括包含Val-Cit部分(例如Val-Cit-PABC、Val-Cit-PAB、Fmoc-Val-Cit-PAB等)的间隔部分。
如上所述，Z1和Z2为连接基团。在本发明方法的一个优选的实施方案中，Z1和Z2独立地选自-O-、-S-、-NR2-、-N＝N-、-C(O)-、-C(O)NR2-、-O-C(O)-、-O-C(O)-O-、-O-C(O)-NR2、-NR2-C(O)-、-NR2-C(O)-O-、-NR2-C(O)-NR2-、-S-C(O)-、-S-C(O)-O-、-S-C(O)-NR2-、-S(O)-、-S(O)2-、-O-S(O)2-、-O-S(O)2-O-、-O-S(O)2-NR2-、-O-S(O)-、-O-S(O)-O-、-O-S(O)-NR2-、-O-NR2-C(O)-、-O-NR2-C(O)-O-、-O-NR2-C(O)-NR2-、-NR2-O-C(O)-、-NR2-O-C(O)-O-、-NR2-O-C(O)-NR2-、-O-NR2-C(S)-、-O-NR2-C(S)-O-、-O-NR2-C(S)-NR2-、-NR2-O-C(S)-、-NR2-O-C(S)-O-、-NR2-O-C(S)-NR2-、-O-C(S)-、-O-C(S)-O-、-O-C(S)-NR2-、-NR2-C(S)-、-NR2-C(S)-O-、-NR2-C(S)-NR2-、-S-S(O)2-、-S-S(O)2-O-、-S-S(O)2-NR2-、-NR2-O-S(O)-、-NR2-O-S(O)-O-、-NR2-O-S(O)-NR2-、-NR2-O-S(O)2-、-NR2-O-S(O)2-O-、-NR2-O-S(O)2-NR2-、-O-NR2-S(O)-、-O-NR2-S(O)-O-、-O-NR2-S(O)-NR2-、-O-NR2-S(O)2-O-、-O-NR2-S(O)2-NR2-、-O-NR2-S(O)2-、-O-P(O)(R2)2-、-S-P(O)(R2)2-、-NR2-P(O)(R2)2-，及其两种或更多种的组合，其中R2独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，Sp1、Sp2、Sp3和Sp4——如果存在－—独立地选自直链或支链的C1-C20亚烷基，所述亚烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基，并且其中Q1为式(9a)、(9p)、(9q)、(9n)、(9t)、(9zh)或(9o)：
Figure BDA0001312943880000661
其中：
R10为氢或(硫)酯基；以及
R18选自任选取代的C1-C12烷基和C4-C12(杂)芳基。
如上所述，在制备生物缀合物的方法中，存在于接头-缀合物中的反应性基团Q1与存在于生物分子中的官能团F1反应。在本发明的方法中，所述生物分子中可存在超过一个的官能团。当存在两个或更多个官能团时，所述基团可为相同或不同的。类似地，所述接头-缀合物中可存在超过一个的反应性基团。当存在两个或更多个反应性基团时，所述基团可为相同或不同的。在本发明方法的一个优选实施方案中，所述接头-缀合物包含一个反应性基团Q1，以及一个或多个可相同或不同的靶分子D。所述接头-缀合物包含例如1、2、3、4、5或6个，优选1、2、3或4个，更优选1、2或3个，甚至更优选1或2个靶分子D。在一个特别优选的实施方案中，所述接头-缀合物包含1个靶分子D。在另一个特别优选的实施方案中，所述接头-缀合物包含2个靶分子D，其可为相同或不同的。在另一个优选的实施方案中，所述生物分子包含两个或更多个官能团F，其可为相同或不同的，以及两个或更多个官能团与接头-缀合物的互补反应性基团Q反应。例如，包含两个官能团F(即F1和F2)的生物分子可与两个包含官能团Q1的接头-缀合物(其可为相同或不同的)反应，以形成生物缀合物。
生物分子中官能团F1的实例包括氨基、硫醇基、羧酸、醇基、羰基、磷酸基或芳族基团。生物分子中的官能团可以是天然存在的或通过特定技术(例如(生物)化学或遗传技术)被放置于生物分子中。被放置于生物分子中的官能团可以是自然界中天然存在的官能团，或者可以是通过化学合成制备的官能团，例如叠氮化物、末端炔、环丙烯部分或膦部分。鉴于通过环加成的缀合的优选模式，优选F1为能够在环加成中反应的基团，例如二烯、亲二烯体、1，3-偶极体或亲偶极体，优选F1选自1，3-偶极体(通常为叠氮基、硝酮基、氧化腈基、腈亚胺基或重氮基)或亲偶极体(通常为烯基或炔基)。此处，当Q1为亲偶极体时，F1为1，3-偶极体；当Q1为1，3-偶极体时，F1为亲偶极体；或当Q1为亲二烯体时，F1为二烯；当Q1为二烯时，F1为亲二烯体。最优选地，F1为1，3-偶极体，优选F1为或包含叠氮基。
图2示出了放置于生物分子中的官能团的几个实例。图2示出了半乳糖胺的UDP糖的衍生物的几种结构，其可以是例如经过巯基丙酰基(11a)、叠氮基乙酰基(11b)或叠氮基二氟乙酰基(11c)修饰的。
图3示意性地示出了在半乳糖基转移酶突变体或GalNAc-转移酶的作用下，如何将任意的UDP-糖11a-c连接到包含GlcNAc部分12的糖蛋白(例如，单克隆抗体，其中聚糖被内切核苷酶修剪)上，由此在GalNAc衍生物和GlcNAc之间产生β-糖苷1-4键(分别为化合物13a-c)。
天然存在的官能团F1的优选实施例包括硫醇基和氨基。通过化学合成制备的用于纳入生物分子的官能团的优选实例包括酮基、末端炔基、叠氮基、环(杂)炔基、环丙烯基、或四嗪基。
如上所述，互补的反应性基团Q1和官能团F1为本领域技术人员已知的，并且Q1和F1的几种合适的组合已在上文描述并示于图22中。互补的基团Q1和F1的列表公开于G.T.Hermanson，“Bioconjugate Techniques”，Elsevier，第3版.2013(ISBN：978-0-12-382239-0)的第3章的第230-232页的表3.1中，并且该表的内容以引用的方式明确纳入本文中。
图4中描述了本发明方法的实施方案。图4示出了经修饰的抗体13a-c如何可通过与马来酰亚胺的亲核加成(对于13a，生成硫醚缀合物14)或在使用环辛炔试剂的张力促进的环加成条件下(对于13b或13c，分别生成三唑15或16)，来进行生物缀合过程。
本发明还涉及通过用于制备生物缀合物的本发明的方法可获得的生物缀合物。
用于制备生物缀合物的本发明的方法以及本发明的接头-缀合物和磺酰胺接头的优点在于，在使用磺酰胺接头替代通常的聚乙二醇(PEG)间隔物的情况下，缀合效率增加。例如，如实施例58所证明的，竞争性实验——包括将含有单一工程化的游离半胱氨酸的曲妥珠单抗与马来酰亚胺17(包含比较接头)和18(包含本发明的磺酰胺接头)的化学计量学混合物进行孵育——证明含有磺酰胺的马来酰亚胺18的缀合效率比17更高。
图5示出了接头-缀合物17和18的结构，其中Q1为N-马来酰亚胺基且D为芘。化合物18为本发明的化合物，而化合物17为比较实施例。图16示出了17和18的合成。
同样，图6-9中所示的19-35与曲妥珠单抗-N3的缀合表明，相对于传统的含PEG的接头缀合物，含磺酰胺的接头缀合物的基于叠氮化物-环辛炔环加成的缀合过程总是更快，并且在大多数情况下显著更快(参见表1和2以及图12-14)。
20、21、23、26、29、33和35与曲妥珠单抗-N3的缀合物为本发明，19、22、24、25、27、28、30、31、32和34的缀合物为比较实施例。此外，在几个实例中，使用基于PEG的构建体的缀合甚至在延长的孵育时间之后也未达到完全转化，例如，图12a、12b、13b和14a。
表1
Figure BDA0001312943880000681
Figure BDA0001312943880000691
＊基于剩余的起始曲妥珠抗体-N3。
n.d.＝未测定。
表2
Figure BDA0001312943880000692
图12a示出了通过磺酰胺接头缀合的BCN-芘衍生物(化合物26)或通过短的PEG接头缀合的BCN-芘衍生物(化合物24或25)与曲妥珠抗体-N3(化合物13b)的缀合效率。
图12b示出了通过磺酰胺接头缀合的DIBAC-芘衍生物(化合物29)或通过短的PEG接头缀合的DIBAC-芘衍生物(化合物27或28)与曲妥珠抗体-N3(化合物13b)的缀合效率。
图13a示出了通过磺酰胺接头缀合的BCN-美登素衍生物(化合物33)或通过短的PEG接头缀合的BCN-美登素衍生物(化合物30-32)与曲妥珠抗体-N3(化合物13b)的缀合效率。
图13b示出了通过磺酰胺接头缀合的BCN-美登素衍生物(化合物33)或通过短的PEG接头缀合的BCN-美登素衍生物(化合物30-32，其中化合物30与33重叠)与曲妥珠抗体-F2-GalNAz(化合物13c)的缀合效率。
图14a示出了通过磺酰胺接头缀合的BCN-多卡米星衍生物(化合物35)或通过短的PEG接头缀合的BCN-多卡米星衍生物(化合物34)与曲妥珠抗体-N3(化合物13b)的缀合效率。
图14b示出了通过磺酰胺接头缀合的BCN-多卡米星衍生物(化合物35)或通过短的PEG接头缀合的BCN-多卡米星衍生物(化合物34)与曲妥珠抗体-F2-GalNAz(化合物13c)的缀合效率。
磺酰胺基(尤其是酰基磺酰胺基或氨基甲酰基磺酰胺基)的另一优点在于其高极性，这在缀合之前、期间和之后对包含这种基团的接头的溶解性以及对作为整体的构建体都将产生积极作用。由表3(图11中用图形示出)可以清楚地看出所述磺酰胺间隔物的极性增加，表3总结了化合物19-23和30-38在RP-HPLC中的保留时间。鉴于这种增加的极性，使用含本发明的磺酰胺接头的接头-缀合物的缀合尤其适合于将疏水性靶分子缀合到生物分子上。
图11示出了使用0.1％TFA或在缓冲液pH 7.4下，化合物19-23和30-38的HPLC保留时间。
图6示出了几种化合物的结构，其中通过接头单元将二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]反应性基团Q1(也称为BCN基团)连接到苄胺(D)上。化合物20、21和23为本发明，而化合物19和22为比较实施例。图17示出了19-22的合成(也参见实施例21-28)以及图18示出了23的合成(也参见实施例29-31)。
图7示出了几种化合物的结构，其中通过接头单元将二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]反应性基团Q1(也称为BCN基团)或二苯并氮杂环辛炔反应性基团Q1(也称为DIBAC基团或DBCO基团)连接到芘上。化合物26和29为本发明，而化合物24、25、27和28为比较实施例。图19示出了得到化合物24-26的合成路线，以及图20示出了得到化合物27-29的合成路线。
图8示出了几种化合物的结构，其中通过接头单元将二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]反应性基团Q1(也称为BCN基团)连接到美登素上。化合物33和29为本发明，而化合物30、31和32为比较实施例。
图9示出了几种化合物的结构，其中通过接头单元将二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]反应性基团Q1(也称为BCN基团)连接到Val-Cit-PABA-多卡米星构建体上。化合物35为本发明，而化合物34为比较实施例。
图10示出了本发明的化合物36-38的结构，其中通过接头将二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]反应性基团Q1(也称为BCN基团)缀合到Val-Cit-PABA-Ahx-美登素上。
实施例43-39中描述了化合物30-35的合成，化合物36-38的合成路线在图21中用图形示出，并且被描述于实施例50-55中。
表3.通过RP-HPLC测量的化合物19-23和30-38的保留时间
Figure BDA0001312943880000711
由于更大极性的化合物显示出缩短的保留时间，因此在pH 7.4(在低pH下无可见的影响)下，相对于化合物19和22，化合物20、21和23的更低的值清楚地反映了与标准的酰胺接头构建体(化合物19)相比的磺酰胺间隔物的极性。甲基化的化合物22，尽管在严格意义上也为磺酰胺，但并未显示出增强的极性，这是由于在酰基化的氮上缺少酸质子。使用0.1％TFA(在该pH下不发生去质子化)可观察到保留时间无明显差异的这一事实，也表明酸质子在定义极性中具有关键作用。双磺酰胺化合物22最终表明在单一的接头中额外的磺酰胺单元(即在本发明的化合物和方法中，f为2或更大时)进一步增强了极性。后一观察结果也有利于带有两个亲脂性毒素(美登素)的BCN-构建体(如在双磺酰胺化合物38和39中)顺利缀合至叠氮基-mAb。
磺酰胺的高极性在将疏水性部分赋予至目的分子的情况下也具有积极影响，已知其在缀合期间需要大量的有机共溶剂和/或降低生物缀合物的聚集。高含量的共溶剂(最高达50％的DMA、聚丙二醇、或DMSO)可在缀合过程中诱导蛋白质变性，和/或在制造过程中可能需要特殊的设备。生物缀合物的稳定性的实例包括含有高度极性的双磺酰胺的化合物38，其一旦与曲妥珠单抗缀合，则在长期储存时显示出零至可忽略的聚集，这实际上也适用于单磺酰胺37。
鉴于这种降低的聚集趋势，本发明的磺酰胺接头特别有利于用于制备这样的生物缀合物——其中缀合反应的反应产物(即反应性基团Q1和F1的反应)提供了微溶于水的连接部分。在一个特别优选的实施方案中，缀合通过环加成，优选1，3-偶极环加成，更优选炔烃-叠氮化物环加成来完成。如实施例中所示，使用本发明的磺酰胺接头有利地降低了本文中的任何聚集，其通过降低聚集的趋势而大大地提高了产物的稳定性。因此，在生物缀合物的形成中，通过在接头-缀合物中的靶分子和反应性基团Q1之间的间隔物中使用本发明的磺酰胺接头，有效地解决了生物缀合物中的疏水性连接部分所伴随的聚集问题。
本发明的磺酰胺接头及其在生物缀合过程中的用途的另一个优点在于其易于合成且产率高。如图15示意性示出的，氨基甲酰基磺酰胺间隔物的合成涉及伯醇40与市售试剂CSI(氯磺酰基异氰酸酯)的反应，得到中间体磺酰氯41，其无需进行后处理而与胺反应从而得到稳定的氨基甲酰基磺酰胺42。在R1为叔丁基时，后一化合物可很容易地被转化成酰基磺酰胺，其在酸处理后得到初级磺酰胺产物43。类似地，在R1＝苄基时，可使用氢化来进行去保护。采用常规步骤，初级磺酰胺43可使用活化酯方便地酰化，以得到酰基磺酰胺44。
在化合物23和38的合成和利用中，还清楚地看出本发明的磺酰胺接头易于合成，以及在生物缀合过程中它们的优异性能，这两种双磺酰胺构建体(化合物23和38)容易地通过重复以上总结的事件生成，即利用CSI处理醇，接着与氨基醇反应生成可再次进行所述顺序事件的醇，从而得到双磺酰胺。进一步重复所述顺序生成三-、四-以及更高的磺酰胺低聚体，这取决于重复的数目。
在已知平衡靶分子(例如细胞毒素)的疏水特性所需要的尤其是长的PEG间隔物(例如PEG24)对于最终的蛋白质缀合物的药代动力学可能具有负面影响(如对于抗体-药物缀合物(尤其是具有高的药物负载的缀合物)所已知的)的意义上，最终缀合物中的磺酰胺接头是短的这一事实可具有额外的优势。
实施例
实施例1.α-2-叠氮基-2-脱氧-3，4，6-三-O-乙酰基-D-半乳糖1-磷酸酯的合成
按照Linhardt et al.，J.Org.Chem.2012，77，1449-1456(以引用的方式被纳入)中所记载的用于D-葡萄糖胺的方法，从D-半乳糖胺制备α-2-叠氮基-2-脱氧-3，4，6-三-O-乙酰基-D-半乳糖1-磷酸酯。
1H-NMR(300MHz，CD3OD)：δ(ppm)5.69(dd，J＝7.2，3.3Hz，1H)，5.43-5.42(m，1H)，5.35(dd，J＝11.1，3.3Hz，1H)，4.53(t，J＝7.2Hz，1H)，4.21-4.13(m，1H)，4.07-4.00(m，1H)，3.82(dt，J＝10.8，2.7Hz，1H)，2.12(s，3H)，2.00(s，3H)，1.99(s，3H).LRMS(ESI-)m/z计算值C12H17N3O11P(M-H+)＝410.06；实测值410.00.
实施例2.α-UDP-2-叠氮基-2-脱氧-3，4，6-三-O-乙酰基-D-半乳糖的合成
按照Baisch et al.Bioorg.Med.Chem.，1997，5，383-391，将如实施例1中制备的α-2-叠氮基-2-脱氧-3，4，6-三-O-乙酰基-D-半乳糖1-磷酸酯与UMP连接。
因此，用DOWEX 50Wx8(H+形式)处理溶于H2O(15mL)的D-尿苷-5′-单磷酸二钠盐(1.49g，4.05mmol)的溶液30分钟并过滤。将滤液在室温下剧烈搅拌的同时逐滴加入三丁胺(0.97mL，4.05mmol)。再次搅拌30分钟后，将反应混合物冻干，真空下经P2O5再次干燥5h。
在氩气气氛中，将所得的三丁铵尿苷-5′-单磷酸盐溶于干燥DMF(25mL)中。加入羰基二咪唑(1.38g，8.51mmol)并在室温下搅拌该反应混合物30min。然后，加入干燥MeOH(180μL)，并且搅拌15min以除去过量的羰基二咪唑。剩余的MeOH在高真空下去除15min。将所得的化合物(2.0g，4.86mmol)溶于干燥DMF(25mL)，并且将其逐滴加入到所述反应混合物中。在真空浓缩之前，使反应物在室温下搅拌2天。咪唑-UMP中间体的消耗通过MS监测。梯度快速柱层析(7∶2∶1→5∶2∶1EtOAc∶MeOH∶H2O)得到α-UDP-2-叠氮基-2-脱氧-3，4，6-三-O-乙酰基-D-半乳糖(1.08g，1.51mmol，37％)。
1H-NMR(300MHz，D2O)：δ(ppm)7.96(d，J＝8.0Hz，1H)，5.98-5.94(m，2H)，5.81-5.79(m，1H)，5.70(dd，J＝7.1，3.3Hz，1H)，5.49(dd，J＝15.2，2.6Hz，1H)，5.30(ddd，J＝18.5，11.0，3.2Hz，2H)，4.57(q，J＝6.0Hz，2H)，4.35-4.16(m，9H)，4.07-3.95(m，2H)，2.17(s，3H)，2.08(s，3H)，2.07(s，3H).LRMS(ESI-)m/z计算值C21H29N5O19P2(M-H+)＝716.09；实测值716.3.
实施例3：α-UDP-2-叠氮基-2-脱氧-D-半乳糖的合成
按照Kiso et al.，Glycoconj.J.，2006，23，565，将如实施例2中制备的α-UDP-2-叠氮基-2-脱氧-3，4，6-三-O-乙酰基-D-半乳糖进行去乙酰化。
因此，将α-UDP-2-叠氮基-2-脱氧-3，4，6-三-O-乙酰基-D-半乳糖(222mg，0.309mmol)溶于H2O(2.5mL)中，加入Et3N(2.5mL)和MePH(6mL)。将该反应混合物搅拌3h，然后真空浓缩以得到α-UDP-2-叠氮基-2-脱氧-D-半乳糖粗品。1H-NMR(300MHz，D2O)：δ(ppm)7.99(d，J＝8.2Hz，1H)，6.02-5.98(m，2H)，5.73(dd，J＝7.4，3.4Hz，1H)，4.42-4.37(m，2H)，4.30-4.18(m，4H)，4.14-4.04(m，2H)，3.80-3.70(m，2H)，3.65-3.58(m，1H).LRMS(ESI-)m/z计算值C15H23N5O16P2(M-H+)＝590.05；实测值590.20.
实施例4.α-UDP-D-半乳糖胺(UDP-GalNH2)的合成
向溶于1∶1 H2O-MeOH混合物(4mL)的如实施例3中制备的α-UDP-2-叠氮基-2-脱氧-D-半乳糖的溶液中加入Lindlar催化剂(50mg)。在氢气气氛中，搅拌该反应5h，然后用硅藻土过滤。用H2O(10mL)冲洗过滤器，真空下浓缩滤液以得到α-UDP-D-半乳糖胺(UDP-GalNH2)(169mg，0.286mmol，两步的产率为92％)。1H-NMR(300MHz，D2O)：δ(ppm)7.93(d，J＝8.1Hz，1H)，5.99-5.90(m，2H)，5.76-5.69(m，1H)，4.39-4.34(m，2H)，4.31-4.17(m，5H)，4.05-4.01(m，1H)，3.94-3.86(m，1H)，3.82-3.70(m，3H)，3.30-3.16(m，1H).LRMS(ESI-)m/z计算值C15H25N3O16P2(M-H+)＝564.06；实测值564.10.
实施例5.UDP-GalNProSAc的合成
将UDP-α-D-半乳糖胺(44mg，0.078mmol)溶于0.1M NaHCO3(1mL)中。加入3-AcS-丙酸琥珀酰亚胺基酯(38mg，0.156mmol)和DMF(1mL)，并将该反应在室温下搅拌过夜，接着在减压下浓缩。梯度快速柱层析(7∶2∶1→5∶2∶1 EtOAc∶MeOH∶H2O)得到UDP-GalNProSAc(6mg，0.009mmol，11％)+UDP-GalNAc杂质。
LRMS(ESI-)计算值C20H31N3O18P2S(M-)694.08实测值694.1.
1H-NMR(300MHz，D2O)：δ(ppm)7.79(m，1H)，5.83-5.80(m，2H)，5.48-5.45(m，1H)，4.28-4.05(m，6H)，3.88-3.85(m，2H)，3.63-3.55(m，3H)，3.17-3.16(m，2H)，2.60-2.55(m，2H)2.50(s，3H).
实施例6.UDP-GalNProSH(11a)的合成
将UDP-GalNProSAc(3mg，0.005mmol)溶于脱气的1M NaOH(1mL)中，搅拌1.5h，接着在真空下浓缩。在糖基化实验中，以粗品形式使用该产物。
1H-NMR(400MHz，D2O)：δ(ppm)7.86(d，J＝8.0Hz，1H)，5.88-5.86(m，2H)，5.48-5.45(m，1H)，4.20-4.05(m，8H)，3.95-3.85(m，1H)，3.68-3.65(m，2H)，2.69-2.67(m，2H)，2.60-2.55(m，2H).
实施例7.2-叠氮基-2，2-二氟乙酸乙酯的合成
向溶于干燥DMSO(5mL)的2-溴-2，2-二氟乙酸乙酯(950mg，4.68mmol)的溶液中加入叠氮化钠(365mg，5.62mmol)。在室温下搅拌过夜后，将反应混合物倒入水(150mL)中。分离各层，将二氯甲烷加入到有机层中，并将该层用Na2SO4干燥。过滤后，于35℃在减压(300mbar)下除去溶剂，得到2-叠氮基-2，2-二氟乙酸乙酯粗品(250mg，1.51mmol，32％)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ(ppm)4.41(q，J＝7.2hz，2H)，1.38(t，J＝6.9Hz，3H).
实施例8.α-2-氨基-3，4，6-三-O-乙酰基-D-半乳糖1-磷酸酯的合成
向溶于MeOH(3mL)的如实施例1中制备的α-2-叠氮基-2-脱氧-3，4，6-三-O-乙酰基-D-半乳糖-1-磷酸酯(105mg，0.255mmol)的溶液中加入Pd/C(20mg)。将该反应在氢气气氛下搅拌2h，并用硅藻土过滤。用MeOH(10mL)冲洗过滤器，将滤液在真空下干燥以得到游离胺(94mg，0.244mmol，96％)。
1H-NMR(300MHz，D2O)：δ(ppm)5.87-5.76(m，1H)，5.44(br.s，1H)，5.30-5.20(m，1H)，4.55(t，J＝6.3Hz，1H)，4.28-4.00(m，3H)，2.11(s，3H)，2.03(s，3H)，2.00(s，3H).LRMS(ESI-)m/z计算值C12H19NO11P(M-H+)＝384.07；实测值384.10.
实施例9.α-(2′-叠氮基-2′，2′-二氟乙酰胺基)-3，4，6-三-O-乙酰基-D-半乳糖1-磷酸酯的合成
向溶于干燥DMF(3mL)的如实施例8中制备的α-2-氨基-3，4，6-三-O-乙酰基-D-半乳糖1-磷酸酯(94mg，0.244)的溶液中加入2-叠氮基-2，2-二氟乙酸乙酯(48mg，0.293mmol)和Et3N(68μL，0.488mmol)。将该反应搅拌6h，接着在真空下浓缩以得到粗产物。梯度快速柱层析(100∶0→50∶50 EtOAc∶MeOH)得到α-(2′-叠氮基-2′，2′-二氟乙酰胺基)-3，4，6-三-O-乙酰基-D-半乳糖1-磷酸酯(63mg，0.125mmol，51％)。
实施例10.UDP-α-(2′-叠氮基-2′，2′-二氟乙酰胺基)-3，4，6-三-O-乙酰基-D-半乳糖的合成
按照Baisch et al.Bioorg.Med.Chem.，1997，5，383-391(以引用的方式纳入)，将如实施例9中所制备的α-(2′-叠氮基-2′，2′-二氟乙酰胺基)-3，4，6-三-O-乙酰基-D-葡萄糖1-磷酸酯与UMP偶联。
因此，用DOWEX 50Wx8(H+形式)处理溶于H2O(1mL)的D-尿苷-5′-单磷酸二钠盐(98mg，0.266mmol)的溶液40分钟，然后过滤。在室温下剧烈搅拌滤液的同时逐滴加入三丁胺(63μL，0.266mmol)。再次搅拌30分钟后，将反应混合物冻干，在真空下用P2O5再次干燥5h。在氩气气氛中，将所得的三丁铵尿苷-5′-单磷酸盐溶于干燥DMF(15mL)中。加入羰基二咪唑(35mg，0.219mmol)并在室温下搅拌该反应混合物30min。然后，加入干燥MeOH(4.63μL)，并且搅拌15min以除去过量的羰基二咪唑。将剩余的MeOH在在高真空下去除(15min)。随后，将N-甲基咪唑.HCl(61mg，0.52mmol)加入到反应混合物中，将所得的化合物(63mg，0.125mmol)溶于干燥DMF(15mL)中并逐滴加入到所述反应混合物中。在减压浓缩混合物之前，将该反应在室温下搅拌过夜。咪唑-UMP中间体的消耗通过MS分析来监测。梯度快速柱层析(7∶2∶1→5∶2∶1 EtOAc∶MeOH∶H2O)得到UDP-α-(2′-叠氮基-2′，2′-二氟乙酰胺基)-3，4，6-三-O-乙酰基-D-半乳糖。
1H-NMR(300MHz，D2O)：δ(ppm)7.87(d，J＝8.1Hz，1H)，5.913-5.85(m，2H)，5.67(dd，J＝6.6，2.7Hz，1H)，5.56-5.50(m，1H)，5.47-5.43(m，1H)，5.31-5.25(m，2H)，4.61-4.43(m，2H)，4.31-4.05(m，5H)，2.16(s，3H)，2.02(s，3H)，1.94(s，3H).
LRMS(ESI-)m/z计算值C23H29F2N6O20P2(M-H+)＝809.09；实测值809.1.
实施例11.α-UDP-2-(2′-叠氮基-2′，2′-二氟乙酰胺基)-2-脱氧-D-半乳糖(UDP-F2-GalNAz，11c)的合成
按照Kiso et al.，Glycoconj.J.，2006，23，565(其以引用方式纳入)，对UDP-α-(2′-叠氮基-2′，2′-二氟乙酰胺基)-3，4，6-三-O-乙酰基-D-半乳糖进行去乙酰化。
因此，将如实施例10中制备的UDP-α-(2′-叠氮基-2′，2′-二氟乙酰胺基)-3，4，6-三-O-乙酰基-D-半乳糖溶于H2O(1mL)中，加入三乙胺(1mL)和MeOH(2.4mL)。将该反应混合物搅拌2h，然后真空浓缩。梯度快速柱层析(7∶2∶1→5∶2∶1 EtOAc∶MeOH∶H2O)得到α-UDP-2-(2′-叠氮基-2′，2′-二氟乙酰胺基)-2-脱氧-D-半乳糖(11c)。
1H-NMR(300MHz，D2O)：δ(ppm)7.86(d，J＝8.1Hz，1H)，5.91-5.85(m，2H)，5.54(dd，J＝6.6，3.6Hz，1H)，4.31-3.95(m，9H)，3.74-3.62(m，2H).LRMS(ESI-)m/z计算值C17H23F2N6O17P2(M-H+)＝683.06；实测值683.10.
用endoS修剪曲妥珠单抗以制备12
单克隆抗体的质谱分析
将在37℃下，将总体积约70μL的50μg(经修饰的)IgG、1M Tris-HCl pH 8.0、1mMEDTA和30mM DTT的溶液孵育20分钟，以还原二硫桥，从而允许分析轻链和重链。如果存在，叠氮官能团在这些条件下也被还原成胺。将经还原的样品使用Amicon Ultra-0.5、Ultracel-10膜(Millipore)，采用milliQ洗涤3次，然后浓缩至10μM(经修饰的)IgG。通过电喷雾离子化飞行时间(ESI-TOF)在JEOL AccuTOF上，对经还原的IgG进行分析。使用Magtran软件获得去卷积谱。
实施例12.经修剪的曲妥珠单抗12的制备
使用来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(商购自Genovis，Lund，Sweden)的endoS进行曲妥珠单抗的聚糖修剪。因此，在37℃下，将曲妥珠单抗(10mg/mL)与endoS(40U/mL)于25mM Tris pH 8.0中孵育约16小时。将去糖基化的IgG浓缩，并使用AmiconUltra-0.5、Ultracel-10膜(Millipore)，用10mM MnCl2和25mM Tris-HCl pH8.0洗涤。
将样品进行MS分析，并且在峰的去卷积之后，质谱示出了一个轻链峰和两个重链峰。重链的两个峰属于一种主产物(49496Da，总重链的90％)(由核心GlcNAc(Fuc)取代的曲妥珠单抗产生)，以及一个次产物(49351Da，总重链的±10％)(由去糖基化的曲妥珠单抗产生)。
曲妥珠单抗突变体和羰基转移酶在CHO中的瞬时表达
在CHO K1细胞中，通过20-25mL规格的Evitria(Zurich，Switzerland)，使蛋白质(酶和曲妥珠单抗突变体)进行瞬时表达。
由SEQ ID NO：1鉴定的GalT双突变体(Y289L，C342T)
RDLRRLPQLVGVHPPLQGSSHGAAAIGQPSGELRLRGVAPPPPLQNSSKPRSRAPSNLDAYSHPGPGPGPGSNLTSAPVPSTTTRSLTACPEESPLLVGPMLIEFNIPVDLKLVEQQNPKVKLGGRYTPMDCISPHKVAIIIPFRNRQEHLKYWLYYLHPILQRQQLDYGIYVINQAGESMFNRAKLLNVGFKEALKDYDYNCFVFSDVDLIPMNDHNTYRCFSQPRHISVAMDKFGFSLPYVQLFGGVSALSKQQFLSINGFPNNYWGWGGEDDDIYNRLAFRGMSVSRPNAVIGKTRMIRHSRDKKNEPNPQRFDRIAHTKETMLSDGLNSLTYMVLEVQRYPLYTKITVDIGTPS
由SEQ ID NO：2鉴定的CeGalNAcT[30-383]
KIPSLYENLTIGSSTLIADVDAMEAVLGNTASTSDDLLDTWNSTFSPISEVNQTSFMEDIRPILFPDNQTLQFCNQTPPHLVGPIRVFLDEPDFKTLEKIYPDTHAGGHGMPKDCVARHRVAIIVPYRDREAHLRIMLHNLHSLLAKQQLDYAIFIVEQVANQTFNRGKLMNVGYDVASRLYPWQCFIFHDVDLLPEDDRNLYTCPIQPRHMSVAIDKFNYKLPYSAIFGGISALTKDHLKKINGFSNDFWGWGGEDDDLATRTSMAGLKVSRYPTQIARYKMIKHSTEATNPVNKCRYKIMGQTKRRWTRDGLSNLKYKLVNLELKPLYTRAVVDLLEKDCRRELRRDFPTCF
由SEQ ID NO：3鉴定的CeGalNAcT(30-383)-His6
KIPSLYENLTIGSSTLIADVDAMEAVLGNTASTSDDLLDTWNSTFSPISEVNQTSFMEDIRPILFPDNQTLQFCNQTPPHLVGPIRVFLDEPDFKTLEKIYPDTHAGGHGMPKDCVARHRVAIIVPYRDREAHLRIMLHNLHSLLAKQQLDYAIFIVEQVANQTFNRGKLMNVGYDVASRLYPWQCFIFHDVDLLPEDDRNLYTCPIQPRHMSVAIDKFNYKLPYSAIFGGISALTKDHLKKINGFSNDFWGWGGEDDDLATRTSMAGLKVSRYPTQIARYKMIKHSTEATNPVNKCRYKIMGQTKRRWTRDGLSNLKYKLVNLELKPLYTRAVVDLLEKDCRRELRRDFPTCFHHHHHH
由SEQ ID NO：4鉴定的曲妥珠单抗(重链N300C)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
由SEQ ID NO：5鉴定的曲妥珠单抗(轻链)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
实施例13-1.CeGalNAcT的纯化
纯化方案基于SP柱(GE Healthcare)上的阳离子交换和随后的尺寸排阻层析。
在常规纯化实验中，用20mM Tris缓冲液，pH 7.5透析含有经表达的CeGalNAcT的产生CHO的上清液。将所述上清液(通常25mL)通过0.45μM-孔直径过滤器过滤，随后经阳离子交换柱(SP column，5mL，GE Healthcare)纯化，所述柱在使用前用20mM Tris缓冲液、pH7.5平衡。纯化在装配有外部级分收集器的AKTA Prime柱层析系统上进行。样品从系统泵A上样。通过用10个柱体积(CV)的20mM Tris缓冲液、pH 7.5洗涤柱子，将未结合的蛋白质从柱子上洗脱。将保留的蛋白质用洗脱缓冲液(20mM Tris，1 NaCl，pH7.5；10mL)进行洗脱。通过SDS-PAGE在聚丙烯酰胺凝胶(12％)上对所收集的级分进行分析，将含有靶蛋白质的级分合并，并且使用旋转过滤浓缩至体积为0.5mL。然后在AKTA纯化系统(UNICORN v6.3)上，将蛋白质在制备型Superdex尺寸排阻柱上纯化。该纯化步骤鉴定并分离了靶蛋白质的二聚体级分和单体级分。将这两种级分通过SDS-PAGE分析，且在进一步使用之前储存于-80℃下。
实施例13-2.CeGalNAcT-His6的纯化
在常规纯化实验中，将CHO上清液通过0.45μM-孔直径过滤器过滤，并且施用于Ni-NTA柱(GE Healthcare，5mL)上，所述柱在使用前用缓冲液A(20mM Tris缓冲液，20mM咪唑，500mM NaCl，pH7.5)平衡。在过滤之前，将咪唑加入到CHO上清液中至终浓度为20mM，以最小化非特异性结合至柱。首先用缓冲液A(50mL)洗涤所述柱。将保留的蛋白质用缓冲液B(20mMTris，500mM NaCl，250mM咪唑，pH 7.5，10mL)洗脱。通过SDS-PAGE在聚丙烯酰胺凝胶(12％)上对级分进行分析，将含有经纯化的靶蛋白的级分合并，通过在4℃下过夜进行的透析将所述缓冲液用20mM Tris(pH 7.5)交换。在进一步使用之前，将经纯化的蛋白质储存于-80℃下。注意：对于单体和二聚体CeGalNAcT-His6种类的鉴定，进行另外的SEC纯化(如上所述)。
11a-c转移至12以制备13a-c
实施例14.曲妥珠单抗(GalNProSH)213a的制备
在30℃下，将去糖基化的曲妥珠单抗(10mg/mL)与UDP-半乳糖衍生物11a(1.3mM)和β(1，4)-Gal-T1(Y289L，C342T)(2mg/mL)于10mM MnCl2和50mM Tris-HCl pH 6.0中孵育16小时。
随后，在室温下将官能化的曲妥珠单抗与蛋白质A琼脂糖(40μL/mg IgG)孵育1小时。用TBS(pH 6.0)洗涤蛋白质A琼脂糖3次，用100mM甘氨酸-HCl pH2.5洗脱IgG。将经洗脱的IgG用1M Tris-HCl pH 7.0中和，浓缩，并使用Amicon Ultra-0.5、Ultracel-10膜(Millipore)，用50mM Tris-HCl pH6.0洗涤至浓度为15-20mg/mL。用Fabricator消化并随后使用Amicon Ultra-0.5、Ultracel-10膜(Millipore)用MiliQ洗涤后的光谱分析表明形成了两种产物，含有引入的GalNProSH的主产物(24387Da)以及含有引入的GalNProSH+UDPGalNProSH作为二硫化物的次产物(25037Da)。产物的比例为约60∶40。
用Gal-T1(Y289L，C342T)进行UDP-半乳糖衍生物的糖基转移，通用方案
使用牛β(1，4)-半乳糖基转移酶[β(1，4)-Gal-T1(Y289L，C342T)]的双突变体进行UDP-半乳糖衍生物至去糖基化的曲妥珠单抗的酶法引入。将去糖基化的曲妥珠单抗(10mg/mL)与适当的UDP-半乳糖衍生物(0.4mM)和Gal-T双突变体(1mg/mL)在30℃下于10mM MnCl2和25mM Tris-HCl pH8.0中孵育16小时。
随后，在4℃下将官能化的曲妥珠单抗与蛋白质A琼脂糖(40μL/mg IgG)孵育2小时。用PBS洗涤蛋白质A琼脂糖3次，并用100mM甘氨酸-HCl pH2.7洗脱IgG。将经洗脱的IgG用1M Tris-HCl pH8.0中和，浓缩，使用Amicon Ultra-0.5、Ultracel-10膜(Millipore)用PBS洗涤至浓度为15-20mg/mL。
用CeGalNAcT进行UDP-GalNAc衍生物的糖基转移(通用方案)
使用CeGalNAc-转移酶进行GalNAc衍生物至IgG的酶法引入。将去糖基化的IgG(如上述制备的，10mg/mL)与经修饰的UDP-GalNAc衍生物(例如叠氮基修饰的糖-UDP衍生物)(0.4mM)和CeGalNAc-T(1mg/mL)在30℃下于10mM MnCl2和25mM Tris-HCl pH 8.0中孵育16小时。在4℃下将官能化的IgG(例如叠氮基官能化的IgG)与蛋白质A琼脂糖(40μL/mg IgG)孵育2小时。用PBS洗涤蛋白质A琼脂糖3次，并用100mM甘氨酸-HCl pH2.7洗脱IgG。将经洗脱的IgG用1M Tris-HCl pH8.0中和，浓缩，使用Amicon Ultra-0.5、Ultracel-10膜(Millipore)用PBS洗涤至浓度为15-20mg/mL。
实施例15.用GalT双突变体制备曲妥珠单抗(GalNAz)213b
使用UDP-N-叠氮基乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAz)和Gal-T双突变体对曲妥珠单抗进行糖基化转移方案。在蛋白质A亲和纯化之后，质量分析表明形成了一个主产物(49713Da，总重链的90％)，其由GalNAz转移到核心GlcNAc(Fuc)取代的曲妥珠单抗而得到，以及一个次产物(49566Da，总重链的±10％)，其由GalNAz转移到核心GlcNAc取代的曲妥珠单抗而得到。
这个是式(13b)的叠氮基修饰的糖蛋白的实例。
实施例16-1.用CeGalNAc-T制备曲妥珠单抗(GalNAz)213b
使用UDP-N-叠氮基乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAz)和CeGalNAc-T对经修剪的曲妥珠单抗进行糖基化转移方案。在蛋白质A亲和纯化之后，将少量的样品用DTT还原，随后进行MS分析，表明形成了一种主产物(49713Da，总重链的90％)，其由GalNAz转移到核心GlcNAc(Fuc)取代的曲妥珠单抗而得到，以及一种次产物(49566Da，总重链的±10％)，其由GalNAz转移到核心GlcNAc取代的曲妥珠单抗而得到。
实施例16-2.用CeGalNAc-T制备曲妥珠单抗(F2-GalNAz)213c
使用UDP-N-叠氮基二氟乙酰基半乳糖胺(UDP-F2-GalNAz，13c)和CeGalNAc-T或CeGalNAcT-His6对经修剪的曲妥珠单抗进行糖基化转移方案。在蛋白质A亲和纯化之后，将少量的样品用DTT还原，随后进行MS分析，表明形成了一种主重链产物(49865Da，约为总重链的90％)，其由F2-GalNAz转移到在样品制备过程中已与DTT反应的核心GlcNAc(Fuc)取代的曲妥珠单抗而得到。
这个是式(13c)的叠氮基修饰的糖蛋白的实例。
17-68的合成
实施例17.1-芘甲酸OSu酯45)的合成
向溶于DCM/DMF(各2mL)的1-芘甲酸(1-pyrenecarboxylic acid)(65mg，0.24mmol)的溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(34mg，0.29mmol)和EDC.HCl(70mg，0.36mmol)。将反应搅拌2h，随后用DCM(10mL)稀释，用柠檬酸水溶液(10％，5mL)和饱和NaHCO3(3x 5mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩得到粗品45。
实施例18.(46)的合成
将化合物45(480mg，1.38mmol)溶于DCM(15mL)中，加入(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基叔丁酯(348mg，1.4mmol)和Et3N(286μL，2.1mmol)。将反应混合物搅拌过夜，并用水(15mL)终止，将有机层用水(1x 15mL)和饱和NaHCO3水溶液(2x 15mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。通过梯度快速柱层析(DCM→DCM∶MeOH 95∶5)纯化得到产物46(460mg，0.97mmol，70％)。
实施例19.(17)的合成
将Boc-保护的芘胺46(460mg，0.97mmol)溶于甲醇(10mL)中，加入乙酰氯(140μL，1.9mmol)，在1h和3h后，加入额外的乙酰氯(2x 140μL，1.9mmol)。搅拌4h后，在减压下浓缩该混合物。随后，将粗产物(100mg，0.24mmol)溶于DCM(3mL)中，加入4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯(50mg，0.17mmol)和Et3N(73μL，0.52mmol)。搅拌过夜后，将溶液用水(3mL)终止，用水(2x 3mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤且浓缩。通过梯度快速柱层析(DCM→DCM∶MeOH 95∶5)纯化得到产物17(69mg，0.13mmol，75％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)8.48(d，1H，J＝9.2Hz)，8.12(d，2H，J＝7.6Hz)，8.04-7.93(m，6H)，6.59(bs，1H)，6.38(s，2H)，5.99(bs，1H)，3.76-3.71(m，4H)，3.62-3.60(m，2H)，3.54-3.52(m，2H)，3.37(t，J＝5.2Hz，2H)，3.23-3.17(m，4H)，1.82(t，J＝6.8Hz，2H)，1.63(q，J＝7.2Hz，2H).
实施例20-1.马来酰亚胺醇衍生物(47)的合成
向溶于饱和NaHCO3水溶液(16mL)的5-氨基戊-1-醇(100mg，0.97μmol)的冷的(0℃)溶液中，加入N-甲氧基羰基马来酰亚胺(150mg，0.64μmol)。将该混合物搅拌1.5h，并用DCM(2×20mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)并浓缩。得到呈无色油状的产物47(137mg，0.75mmol，75％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)6.69(s，2H)，3.70--3.67(m，1H)，3.67-3.60(m，2H)，3.53(t，J＝7.1Hz，2H)，1.68-1.54(m，4H)，1.42-1.31(m，2H).
实施例20-2.马来酰亚胺-芘衍生物(18)的合成
向溶于DCM(1mL)的醇47(7.7mg，42μmol)的溶液中，加入氯磺酰基异氰酸酯(CSI，3.9μL，5.9mg，42μmol)。在将该溶液搅拌15min后，加入Et3N(18μL，13mg，126μmol)以及1-芘甲胺.HCl(49，11mg，42μmol)和Et3N(18μL，13mg，126μmol)的溶液。80min后，加入饱和的NH4Cl水溶液(20mL)和DCM(20mL)。分离后，将有机相干燥(Na2SO4)并浓缩。在梯度快速柱层析(DCM→2％MeOH于DCM)之后，得到呈淡黄色固体的产物18(7.4mg，14.2μmol，34％)。1HNMR(400MHz，CDCl3/CD3OD)δ(ppm)8.32-8.26(m，1H)，8.20-7.90(m，8H)，6.61(s，2H)，4.90(s，2H)，3.65(t，J＝6.5Hz，2H)，3.30(t，J＝7.2Hz，2H).1.40-1.20(m，4H)，1.08-0.97(m，2H)。
实施例21.BCN-庚酸(52)的合成
向溶于MeCN(5mL)的BCN-OSu衍生物51的溶液中，加入溶于0.1M NaHCO3水溶液(30mL)和MeCN(25mL)的7-氨基庚酸50(145mg，1.0mmol)。将该混合物搅拌4h并部分浓缩。加入饱和的NH4Cl水溶液(30mL)，并且在用DCM(2×30mL)萃取之后，将合并的有机物干燥(Na2SO4)并浓缩。产物52无需进一步纯化而直接用于所述步骤中。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)4.68(bs，1H)，4.14(d，J＝7.9Hz，2H)，3.17(dd，J＝12.8，6.3Hz，2H)，2.35(t，J＝7.5Hz，2H)，2.32-2.09(m，6H)，1.70-1.25(m，11H)，0.94(t，J＝9.7Hz，2H).
实施例22.BCN-庚酸苄基酰胺(19)的合成
向溶于DCM(25mL)的51(291mg，1.00mmol)的混合物中，加入7-氨基庚酸50和Et3N(417μl，303mg，3.00mmol)和DMF(10mL)。在DCM蒸发(40℃)后，将所得的混合物搅拌10min，加入NaHCO3水溶液(0.1M)。在将该反应混合物再搅拌3h后，将其倒入饱和的NH4Cl水溶液(50mL)并用DCM(2×50mL)萃取。将合并的有机相干燥且浓缩。将残留物溶解在DCM(25mL)中，加入N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI.HCl，249mg，1.30mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(150，1.30mmol)，然后搅拌所得的混合物18h。加入水(50mL)后，分离各层并用DCM(2x 25mL)萃取水相。将合并的有机相用盐水(50mL)洗涤、干燥(Na2SO4)并浓缩。柱层析得到呈无色浓稠油状的52的中间体NHS酯衍生物(233mg，0.56mmol，56％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)4.69(s，1H)，4.14(d，J＝8.0Hz，2H)，3.17(dd，J＝13.6，6.9Hz，2H)，2.91-2.77(m，4H)，2.61(t，J＝7.4Hz，2H)，2.37-2.12(m，6H)，1.83-1.69(m，2H)，1.66-1.17(m，9H)，1.01-0.90(m，2H)。随后，向溶于DCM(12mL)的中间体BCN-氨基庚酸NHS酯(49mg，0.12mmol)的溶液中，加入苄胺(19μL，19mg，0.18mmol)和Et3N(50μL，36mg，0.36mmol)。将该混合物搅拌19h，然后加入DCM(10mL)和饱和的NH4Cl水溶液(20mL)。干燥(Na2SO4)并浓缩有机层。在梯度柱层析(25％→50％在庚烷中的EtOAc)后，得到呈白色固体的化合物19(31mg，0.076mmol，63％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)7.38-7.27(m，5H)，5.72(bs，1H)，4.64(bs，1H)，4.45(d，J＝5.6Hz，2H)，4.13(d，J＝8.1Hz，2H)，3.16(dd，J＝12.8，6.3Hz，2H)，2.38-2.13(m，8H)，1.75-1.11(m，11H)，1.00-0.88(m，2H)。
实施例23.N-苄基氨磺酰基氨基甲酸叔丁酯(53)的合成
在N2气氛下，向溶于Et2O(20mL)的叔丁醇的冷却溶液(-78℃)中，加入氯磺酰基异氰酸酯(CSI)，使该混合物达到室温。45min后，将该混合物浓缩，并且将所得的氯磺酰基氨基甲酸叔丁酯用于下一步骤中，无需进一步纯化(视为68％纯度)。因此，向溶于DCM(10mL)的氯磺酰基氨基甲酸叔丁酯粗品(199mg粗品＝135mg，0.63mmol)的溶液中，加入Et3N(263μL，191mg，1.89mmol)和苄胺(82μL，81mg，0.85mmol)。将该混合物搅拌2h，并且加入饱和的NH4Cl.DCM水溶液(10mL)使其终止，分离各层。将有机层干燥(Na2SO4)并浓缩。在梯度柱层析(25％→50％在庚烷中的EtOAc)之后，得到呈白色固体的化合物53(169mg，0.59mmol)。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)7.41-7.29(m，5H)，5.41-5.30(m，1H)，4.30-4.20(m，2H)，1.46(s，9H)。
实施例24.N-苄基磷酰胺(54)的合成
向溶于DCM(10mL)的N-苄基氨磺酰基氨基甲酸叔丁酯53(108mg，0.38)的溶液中，加入三氟乙酸(2mL)。将该反应混合物搅拌1.5h，然后倒入饱和的NaHCO3水溶液(50mL)中。在加入另外的50mL的饱和NaHCO3水溶液后，用DCM(50mL)萃取该含水混合物。将有机层干燥(Na2SO4)并浓缩。得到呈白色固体的产物54(36mg，0.19mmol，50％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)7.41-7.30(m，5H)，4.32(d，J＝6.1Hz，2H).
实施例25.(20)的合成
向溶于DCM(5mL)的52(44mg，0.136mmol)的溶液中，加入EDCI.HCl(39mg，0.204mmol)、DMAP(2.9mg，0.024mmol)和N-苄基磺酰胺54(13mg，0.068mmol)。在室温下将该反应混合物搅拌22h之后，加入EtOAc(20mL)和饱和NH4Cl水溶液(20mL)。分离后，用EtOAc(20mL)萃取水相。将合并的有机相干燥(Na2SO4)并浓缩。梯度柱层析(25％→50％在庚烷中的EtOAc)后，得到标题化合物和N-苄基磺酰胺54的不可分离的混合物形式的产物20(质量比3.2/1)(14.4mg)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)7.38-7.27(m，5H)，5.99(bs，1H)，5.01(t，J＝6.2Hz，1H)，4.20(s，2H)，4.85-4.70(m，2H)，4.13(d，J＝8.12Hz，2H)，3.15(q，J＝6.50，2H)，2.35-2.15(m，6H)，2.09(t，J＝7.4Hz，2H)，1.65-0.75(m，13H).
实施例26.(56)的合成
向溶于DCM(20mL)的51(430mg，1.48mmol)的溶液中，加入溶于DCM(4mL)和Et3N(619μL，449mg，4.44mmol)的5-氨基戊-1-醇55(152mg，1.47mmol)的溶液。在室温下将该混合物搅拌1.5h，此后加入饱和NaHCO3水溶液(40mL)。分离后，将有机层干燥(Na2SO4)并浓缩。将残留物通过梯度柱层析(EtOAc/庚烷1/1→3/1)纯化。得到呈无色粘稠液体的产物56(356mg，1.27mmol，81％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)4.68(s，1H)，4.14(d，J＝8.0Hz，2H)，3.65(dd，J＝11.7，6.3Hz，2H)，3.19(dd，J＝13.2，6.7Hz，2H)，2.35-2.15(m，6H)，1.66-1.30(m，7H)，1.02-0.88(m，2H)。
实施例27.(21)的合成
向溶于DCM(10mL)的56(51mg，0.18mmol)的溶液中，加入氯磺酰基异氰酸酯(16μl，25mg，0.18mmol)。在搅拌该混合物40min后，加入Et3N(75μl，55mg，0.54mmol)和苄胺(19μl，19mg，0.18mmol)。将混合物再搅拌1.5h并且通过加入NH4Cl(饱和)水溶液使其终止。分离后，用DCM(20mL)萃取水层。将合并的有机层干燥(Na2SO4)并浓缩。将残留物通过梯度柱层析(20％→50％在戊烷中的EtOAc)纯化，得到呈无色粘稠油状的产物21(57mg，0.12mmol，67％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)7.41-7.28(m，5H)，5.55(s，1H)，4.75(s，1H)，4.29--4.24(m，2H)，4.20-4.08(m，2H)，3.19(dd，J＝13.4，6.6Hz，2H)，2.37-2.16(m，6H)，1.74-1.31(m，9H)，0.94(t，J＝9.7Hz，2H)。
实施例28.(22)的合成
在惰性气氛下，将21(93mg，0.19mmol)溶于无水THF(10mL)中。加入PPh3(49mg，0.19mmol)和MeOH(50μL，1.23mmol)，并将该混合物冷却到0℃。缓慢滴加溶于无水THF(5mL)的DIAD(37μL，0.19mmol)的溶液，并使混合物达到室温，之后将所述反应搅拌18h，随后浓缩。梯度柱层析(20→50％在庚烷中的EtOAc)得到呈无色粘稠油状的产物22。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)7.39-7.26(m，5H)，5.94-5.84(m，1H)，4.80-4.64(m，1H)，4.19(d，J＝6.4Hz，2H，)，4.13(d，J＝7.4Hz，2H)，4.08(t，J＝6.5Hz，2H)，3.17(q，2H，J＝6.5Hz)，3.12(s，3H)，2.35-2.14(m，6H)，1.80-1.65(m，13H)。
实施例29.(58)的合成
在N2气氛下，向溶于DCM(150mL)的57(1.5g，10mmol)的溶液中，加入CSI(0.87mL，1.4g，10mmol)、Et3N(2.8mL，2.0g，20mmol)和2-(2-氨基乙氧基)乙醇(1.2mL，1.26g，12mmol)。将该混合物搅拌10min，并通过加入NH4Cl(饱和，150mL)水溶液使其终止。分离后，用DCM(150mL)萃取水层。将合并的有机层干燥(Na2SO4)并浓缩。使用柱层析对残留物进行纯化。得到呈淡黄色粘稠油状的产物58(2.06g，5.72mmol，57％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)6.0(bs，1H)，4.28(d，J＝8.2Hz，2H)，3.78-3.73(m，2H)，3.66-3.61(m，2H)，3.61-3.55(m，2H)，3.34(t，J＝4.9Hz，2H)，2.37-2.15(m，6H)，1.64-1.48(m，2H)，1.40(四重峰，J＝8.7Hz，1H)，1.05-0.92(m，2H)。
实施例30.(59)的合成
随后，向58(130mg，0.36mmol)的溶液中，加入CSI(31μL，51mg，0.36mmol)、Et3N(151μL)和2-(2-氨基乙氧基)乙醇(36μL，38mg，0.36mmol)。15min后，加入水(20mL)，在分离后，将水层用1 M HCl水溶液酸化至pH 3，然后用DCM(20mL)萃取。将DCM层干燥并浓缩。在柱层析后，得到呈无色油状的产物59(87mg，0.15mmol，42％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)6.15-5.95(m，2H)，4.40-4.32(m，2H)，4.31(d，J＝8.3Hz，2H)，3.85-3.55(m，10H)，3.45-3.25(m，4H)，2.40-2.15(m，6H)，1.65-1.47(m，2H)，1.40(四重峰，J＝8.7Hz，1H)，1.06-1.92(m，2H)。
实施例31.(23)的合成
随后，向溶于DCM(10mL)的59(63mg，0.11mmol)的溶液中，加入对硝基苯基氯甲酸酯(22mg，0.11mmol)和Et3N(46μL，33mg，0.33mmol)。20h后，将苄胺(22μL，21.6mg，0.20mmol)加入到所述反应混合物中。将混合物再搅拌24h，之后浓缩该混合物，将残留物通过梯度柱层析(第一次柱：0→20％在DCM中的MeOH，第二次柱：0→8％在DCM中的MeOH)纯化。得到呈无色膜状的产物23(18mg，0.026mmol，23％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ(ppm)7.38-7.18(m，5H)，4.31-4.22(m，6H)，4.22-4.16(m，2H)，3.70-3.63(m，4H)，3.63-3.54(m，4H)，3.34(s，1H)，3.24-3.15(m，4H)，2.30-2.10(m，6H)，1.68-1.52(m，2H)，1.42(四重峰，J＝8.7Hz，1H)，1.02-0.90(m，2H)。
实施例32.BCN-dPEG4-C(O)OSu(60a)的合成
随后，向溶于无水DMF(30mL)的氨基-dPEG4-酸(1.23g，4.23mmol)的溶液中，加入51(1.02g，3.85mmol)和三乙胺(1.60mL，11.53mmol)。在室温下将该反应混合物搅拌3h，之后加入EDCI.HCl(0.884g，4.61 mmol)和NHS(88mg，0.77mmol)。在室温下，将所得的溶液搅拌过夜，然后倒入100mL NaHCO3(饱和)和150mL EtOAc中。分离各层，用饱和NaHCO3(90mL)和H2O(75mL)洗涤有机相。将有机相干燥(Na2SO4)、过滤、并真空浓缩。梯度柱层析(MeCN→MeCN∶H2O30∶1)得到呈无色油状的产物60a(800mg，1.48mmol，40％)。
实施例33.BCN-dPEG4-芘(24)的合成
向溶于DCM(10mL)的60a(50mg，0.095mmol)的溶液，加入49(30mg，0.11mmol)和Et3N(17μL，0.12mmol)。在室温下搅拌过夜后，在减压下浓缩该反应混合物。随后通过快速柱层析(DCM→DCM∶MeOH 9∶1)进行纯化，得到产物24(38mg，61％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)8.29-8.26(m，2H)，8.19-8.11(m，4H)，8.06-7.97(m，4H)，7.04(br.s，1H)，5.24(br.s，1H)，5.16(d，2H，J＝4Hz)，4.06(d，2H，J＝4Hz)，3.76(t，2H，J＝5.6Hz)，3.50(m，2H)，3.39-3.22(m，14H)，2.56-2.53(m，2H)，2.27-2.13(m，7H)，1.29-1.25(m，2H)，0.87-0.83(m，2H)。
实施例34.BCN-PEG8-C(O)OSu(60b)的合成
随后，向溶于无水DMF(3mL)的氨基-dPEG8-酸(217mg，0.492mmol)的溶液中，加入51(143mg，0.492mmol)和Et3N(204μL，1.47mmol)。在室温下将该反应混合物搅拌3h，之后加入EDCI.HCl(0.88g，4.61mmol)和NHS(88mg，0.77mmol)。在室温下，将所得的溶液搅拌过夜，然后倒入50mL NaHCO3(饱和)和50mL EtPAc中。分离各层，并用饱和NaHCO3(50mL)和H2O(30mL)洗涤有机相。将有机相干燥(Na2SO4)、过滤、并真空浓缩。梯度柱层析(MeCN→MeCN∶H2O 30∶1)得到呈无色油状的产物60b(212mg，0.30mmol，60％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ(ppm)4.13(d，J＝8.1Hz，2H)，3.84(t，J＝6.3Hz，2H)，3.68-3.59(m，28H)，3.54(t，J＝5.1Hz，2H)，3.36(q，J＝5.4Hz，2H)，2.89(t，J＝6.3Hz，2H)，2.82(s，4H)，2.35-2.15(m，6H)，1.68-1.48(m，2H)，1.44-1.23(m，1H)，1.00-0.86(m，2H).LRMS(ESI+)m/z计算值C34H54N2O14(M+Na+)＝737.8；实测值737.3.
实施例35.BCN-PEG8-芘(25)的合成
向溶于DCM(15mL)的60b(100mg，0.14mmol)的溶液中，加入1-氨基甲基芘.HCl49(50mg，0.19mmol)和Et3N(47μL，0.25mmol)。在搅拌3h后，在减压下浓缩该反应混合物。随后通过快速柱层析(DCM→DCM∶MeOH 95∶5)进行纯化，得到产物25(35mg，30％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)8.30-8.28(m，1H)，8.21-8.13(m，4H)，8.05-7.99(m，4H)，7.22(bs，1H)，5.16(d，2H，J＝5.2Hz)，4.12(d，2H，J＝8.0Hz)，3.76(t，2H，J＝6.0Hz)，3.65-3.49(m，21H)，3.45-3.42(m，2H)，3.36-3.32(m，4H)，2.59-2.54(m，4H)，2.28-2.20(m，4H)，1.59-1.54(m，2H)，1.38-1.25(m，2H)，0.93-0.91(m，2H)。
实施例36.(61)的合成
向溶于DCM(15mL)的57(0.15g，1.0mmol)溶液中，加入CSI(87μL，0.14g，1.0mmol)、Et3N(279μL，202mg，2.0mmol)和溶于DCM(1mL)的H2N-PEG3-OH(251mg，1.3mmol)的溶液。搅拌2.5h后，通过加入NH4Cl(饱和，20mL)溶液终止该反应混合物。分离后，用DCM(20mL)萃取水层。将合并的有机层干燥(Na2SO4)并浓缩。将残留物通过梯度柱层析(溶于DCM的0→10％MeOH)纯化。得到呈无色粘稠油状的产物61(254mg，0.57mmol，57％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)6.81(br.s，1H)，4.26(d，J＝8.2Hz，2H)，3.80-3.70(m，4H)，3.70-3.58(m，10H)，3.36(t，J＝4.7Hz，2H)，2.36-2.16(m，6H)，1.64-1.49(m，2H)，1.40(四重峰，J＝8.7Hz，1H)，1.04-0.92(m，2H)。
实施例37.(62)的合成
向溶于DCM(30mL)的61(242mg，0.54mmol)的溶液中，加入对硝基苯基氯甲酸酯(218mg；1.08mmol)和Et3N(226μL，164mg，1.62mmol)。将该混合物搅拌17h并用水(20mL)终止。分离后，将有机层干燥(Na2SO4)并浓缩。将残留物通过梯度柱层析(EtOAc/戊烷1/1→EtOAc)纯化得到产物62(259mg，0.38mmol)。LRMS(ESI)m/z计算值C33H42N5O16S(M+NH4 +)＝796.23；实测值796.52。
实施例38.BCN-磺酰胺-芘(26)的合成
将化合物62(40mg，0.11mmol)溶于DCM(10mL)中，加入49(34mg，0.13mmol)和Et3N(30μL，0.21mmol)。将该反应混合物搅拌4h，在减压下浓缩，并且在梯度快速柱层析(DCM→DCM∶MeOH 96∶4)上纯化。将含有产物的级分用饱和NaHCO3(3x 100mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩得到26(25mg，36％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)8.29-8.26(m，2H)，8.19-8.11(m，4H)，8.06-7.97(m，4H)，6.87(d，1H，J＝12Hz)，5.78(br.s，2H)，5.12(d，2H，J＝5.6Hz)，4.31-4.26(m，2H)，3.97(d，2H，J＝8.4Hz)，3.69-3.62(m，4H)，3.28(m，2H)，2.18-1.96(m，7H)，1.28(m，1H)，0.79-0.74(m，2H)。
实施例39.DIBAC-PEG4-芘(27)的合成
将化合物45(75mg，0.22mmol)溶于DCM(3mL)中，接着加入氨基-PEG4-甲酸(53mg，0.20mmol)和Et3N(83μL，0.6mmol)。搅拌过夜后，加入另外的45(25mg，0.07mmol)，然后将该反应混合物再搅拌1h。完全转化后(基于TLC分析)，加入N-羟基琥珀酰亚胺(5mg，0.04mmol)和EDC.HCl(70mg，0.36mmol)，在室温下搅拌该反应过夜。向该反应混合物中，加入64(60mg，0.2mmol)和Et3N(50μL，0.36mmol)，1h后，在减压下浓缩该反应混合物。通过梯度快速柱层析(DCM→DCM∶MeOH 9∶1)进行纯化，得到产物27(12mg，8％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)8.61(d，1H，J＝9.2Hz)，8.23-8.21(m，2H)，8.17-8.10(m，4H)，8.07-8.02(m，3H)，7.59(d，1H，J＝7.2Hz)，7.38-7.18(m，7H)，7.06(bs，1H)，6.45(m，1H)，5.00(d，1H，J＝13.6)，3.86-3.79(m，3H)，3.70-3.19(m，14H)，2.42-2.38(m，1H)，2.19-2.15(m，2H)，1.89-1.85(m，1H)。
实施例40.DIBAC-PEG8-芘(28)的合成
将化合物45(24mg，0.07mmol)溶于DCM(1mL)中，接着加入氨基-PEG8-甲酸(27mg，0.06mmol)和Et3N(14μL，0.10mmol)。搅拌2h后，加入另外的45(10mg，0.03mmol)，然后继续搅拌该反应混合物。随后加入NHS(10mg，0.08mmol)和EDC.HCl(17mg，0.09mmol)，搅拌该反应2h。随后，加入64(21mg，0.08mmol)和Et3N(14μL，0.10mmol)，4h后，通过加入水(3mL)使该反应终止。有机层用水(2x 3mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过快速柱层析(DCM→DCM∶MeOH 9∶1)进行纯化，得到产物(8mg，14％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)8.55(d，1H，J＝9.2Hz)，8.19-7.86(m，7H)，7.59(d，1H，J＝6.8Hz)，7.33-7.18(m，8H)，6.99(m，1H)，6.45(m，1H)，5.03(d，1H，J＝14.0)，3.78-3.74(m，3H)，3.65-3.29(m，29H)，2.43-2.37(m，1H)2.25-2.21(m，2H)，1.91-1.84(m，1H)。
实施例41.(65)的合成
将化合物45(50mg，0.14mmol)溶于DCM(3mL)中，接着加入2-氨基乙醇(10μL，0.16mmol)和Et3N(30μL，0.22mmol)。2h后，加入另外的2-氨基乙醇(10μL，0.16mmol)，并在室温下将该反应混合物搅拌过夜。随后，加入水(5mL)，将有机层用水(3x 5mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。通过梯度快速柱层析(DCM→DCM∶MeOH 97∶3)纯化得到产物65(32mg，79％)。LRMS(ESI+)m/z计算值C19H16NO2(M+H+)＝290.12；实测值290.30。
实施例42.DIBAC-磺酰胺-芘(29)的合成
将化合物65(26mg，0.09mmol)溶于DCM(2mL)中，接着加入CSI(8μL，0.09mmol)。5min后，加入Et3N(37μL，0.27mmol)和64(26mg，0.09mmol)，在室温下搅拌该反应2h，之后通过加入NH4Cl水溶液(饱和，5mL)使该反应终止。将有机层用水(3x 5mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。通过梯度快速柱层析(DCM→DCM∶MeOH 95∶5)纯化得到产物29(10mg，17％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)8.49(d，1H，J＝9.2Hz)，8.25-8.18(m，3H)，8.11-7.95(m，5H)，7.38-7.00(m，8H)，6.05(m，1H)，5.96(m，1H)，4.62-4.58(m，1H).4.52-4.47(m，1H)，4.11-4.08(m，1H)，3.81-3.78(m，1H)，3.64-3.60(m，1H)，3.06(d，1H，J＝14Hz)，2.90-2.87(m，2H)，2.17-2.09(m，lH)，1.62-1.56(m，2H)。
实施例43-1.(30)的合成
将溶于1mL DMF的BCN-PEG4-C(O)OSu(60a，7.1mg，0.013mmol)和Et3N(9.1μL，6.6mg，65.5μmol)的溶液加入到H-Ahx-木登素.TFA(10mg，0.011mmol)中。在室温下，将该反应搅拌20h，然后在减压下浓缩。将残留物通过反相(C18)HPLC柱层析(30→90％在H2O(1％AcOH)中的MeCN(1％AcOH))进行纯化。得到呈无色液体的产物30(8.9mg，7.5μmol，68％)。LRMS(ESI+)m/z计算值C60H87ClN5O16(M+-H2O)＝1168.58；实测值1168.87.
实施例43-2.BCN-PEG12-C(O)OSu的合成
向溶于无水DMF(1mL)的氨基-dPEG12-酸(43mg，0.069mmol)的溶液中，加入51(22mg，0.076mmol)和三乙胺(24μL，0.174mmol)。在室温下将该反应混合物搅拌5h，之后加入EDCI.HCl(27mg，0.139mmol)和NHS(8mg，0.076mmol)。将所得的溶液在室温下搅拌过夜，并且倒入10mL饱和NaHCO3和10mL DCM中。分离各层，用H2O(2x 10mL)洗涤有机相。将合并的水层用DCM(10mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)、过滤并真空浓缩。梯度快速柱层析(MeCN→MeCN∶H2O20∶1，10∶1)得到BCN-PEG12-C(O)OSu。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ(ppm)4.14(d，J＝8.0Hz，2H)，3.85(t，J＝6.4Hz，2H)，3.69-3.60(m，44H)，3.56(t，J＝5.2Hz，2H)，3.36(q，J＝5.2Hz，2H)，2.91(t，J＝6.4Hz，2H)，2.84(s，4H)，2.36-2.17(m，6H)，1.65-1.51(m，2H)，1.44-1.23(，J＝8.4Hz，1H)，1.00-0.88(m，2H).LRMS(ESI+)m/z计算值C42H70N2O18(M+H+)＝892.0；实测值891.6.
实施例44.(31)的合成
将溶于1.1mL DMF的BCN-PEG12-C(O)OSu(14mg，15.7μmol)和Et3N(9.1μL，6.6mg，65.5μmol)的溶液加入到H-Ahx-木登素.TFA(10mg，0.011mmol)中。18h后，加入2，2′-(亚乙基二氧基)双(乙胺)(2.3μL，2.3mg，16μmol)，并浓缩该混合物。将残留物通过反相(C18)HPLC柱层析(30→90％在H2O(1％AcPH)中的MeCN(1％AcOH))进行纯化。得到呈无色膜状的产物31(6.6mg，4.3μmol，39％)。LRMS(ESI+)m/z计算值C75H118ClN5O25(M+-H2O)＝1520.79；实测值1520.96。
实施例45.BCN-PEG24-C(O)OSu的合成
向溶于无水DMF(1mL)的氨基-dPEG24-酸(48mg，0.042mmol)的溶液中，加入51(14mg，0.048mmol)和三乙胺(17μL，0.125mmol)。在室温下将反应混合物搅拌过夜，之后加入DCM(10mL)和柠檬酸(10％水溶液，5mL)。将水相用DCM(15mL)萃取，将合并的有机层干燥(Na2SO4)。过滤后，真空去除溶剂。将粗产物重新溶解于无水DMF(1mL)中，加入EDCI.HCl(17mg，0.088mmol)和NHS(8mg，0.070mmol)。在室温下将所得的混合物搅拌过夜，之后加入另外等当量的EDCI.HCL(16mg)和NHS(7mg)。6h后，将该反应混合物倒入10mL饱和NaHCO3和15mL EtOAc中。分离各层，将有机相用饱和NaHCO3(10mL)和H2O(10mL)洗涤。将有机相干燥(Na2SO4)、过滤并真空浓缩。梯度快速柱层析(MeCN→MeCN∶H2O 20∶1，10∶1，5∶1)得到呈无色油状的BCN-PEG24-C(O)OSu(32mg，0.022mmol，54％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ(ppm)4.08(d，J＝8.0Hz，2H)，3.78(t，J＝6.4Hz，2H)，3.63-3.54(m，92H)，3.49(t，J＝5.2Hz，2H)，3.30(q，J＝5.2Hz，2H)，2.84(t，J＝6.4Hz，2H)，2.78(s，4H)，2.29-2.08(m，6H)，1.59-1.43(m，2H)，1.35-1.23(m，1H)，0.93-0.80(m，2H).LRMS(ESI+)m/z计算值C66H118N2O30(M+H+)＝1420.66；实测值1420.0.
实施例46.(32)的合成
将溶于0.78mL DMF的BCN-PEG24-C(O)OSu(25mg，17.6μmol)和Et3N(9.1μL，6.6mg，65.5μmol)的溶液加入到H-Ahx-木登素.TFA(10mg，0.011mmol)中。18h后，加入2，2′-(亚乙基二氧基)双(乙胺)(2.3μL，2.3mg，16μmol)，并浓缩该混合物。将残留物通过反相(C18)HPLC柱层析(30→90％在H2O(1％AcOH)中的MeCN(1％AcOH))进行纯化。得到呈无色膜状的产物(11.4mg，5.5μmol，50％).LRMS(ESI+)m/z计算值C100H171ClN5O37 3+(M+3H+)/3＝690.05；实测值690.05.
实施例47.(33)的合成
将溶于DMF(2mL)的H-Ahx-木登素.TFA(20mg，0.023mmol)的溶液加入到溶于DMF(2mL)的62(14mg，0.023mmol)和Et3N(9.5μL，6.9mg，0.068mmol)的溶液中，将所得的反应混合物搅拌24h。在硅胶柱层析后，得到定量产率的标题化合物33(29mg，+99％)。鉴定的证据在ADC阶段进行。
实施例48.(34)的合成
将溶于1mL DMF的60a(6.6mg，0.012mmol)和Et3N(6.8μL，4.9mg，48.5μmol)的溶液加入到H-Val-Cit-PABA-多卡米星(10mg，0.0097mmol)中。18h后，加入2，2′-(亚乙基二氧基)双(乙胺)(1.8μL，1.8mg，12μmol)，并在减压下浓缩该混合物。将残留物通过反相(C18)HPLC柱层析(30→90％在H2O(1％AcOH)中的MeCN(1％AcOH))进行纯化。得到呈无色膜状的产物34(7.5mg，5.1μmol，53％)。LRMS(ESI+)m/z计算值C71H94ClN10O21(M+H+)＝1457.63；实测值1456.89。
实施例49.(35)的合成
将溶于1mL DMF的62(6.0mg，9.8μmol)和Et3N(6.8μL，4.9mg，48.5μmol)的溶液加入到H-Val-Cit-PABA-多卡米星(10mg，0.0097mmol)中。22h后，加入2，2′-(亚乙基二氧基)双(乙胺)(2.8μL，2.8mg，19μmol)。1h后，在减压下浓缩该反应混合物，并将残留物通过反相(C18)HPLC柱层析(的30→90％在H2O(1％AcOH)中MeCN(1％AcOH))进行纯化。得到呈白色固体的产物35(6.4mg，4.2μmol.44％)。LRMS(ESI+)m/z计算值C69H92ClN12O22S(M+H+)＝1507.59；实测值1508.00。
实施例50.(36)的合成
向溶于DCM(20mL)的58(229mg，0.64mmol)的溶液中，加入对硝基苯基氯甲酸酯(128mg，0.64mmol)和Et3N(268μL，194mg，1.92mmol)。在室温下将该混合物搅拌过夜，随后在减压下浓缩。将残留物通过梯度柱层析(20→70％在庚烷中的EtOAc(1％AcOH))纯化以得到呈白色固体的58的PNP碳酸酯衍生物(206mg，0.39mmol，61％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)8.31-8.26(m，2H)，7.45-7.40(m，2H)，5.56(t，J＝6.0Hz，1H)，4.48-4.40(m，2H)，4.27(d，J＝8.2Hz，2H)，3.81-3.75(m，2H)，3.68(t，J＝5.0Hz，2H)，3.38-3.30(m，2H)，2.36-2.14(m，6H)，1.61-1.45(m，2H)，1.38(quintet，J＝8.7Hz，1H)，1.04-0.94(m，2H)。
随后，向溶于DMF(1mL)的58的PNP衍生物(4.1mg，7.8μmol)和Et3N(3.3μL，2.4mg，23.4μmol)的溶液中，加入溶于DMF(100μL)的H-Val-Cit-PABA-Ahx-美登素(10mg，8.6μmol)的溶液。20h后，加入2，2′-(亚乙基二氧基)双(乙胺)(5.7μL，5.6mg，38μm0l)，并将该混合物在减压下浓缩。将残留物通过反相(C18)HPLC柱层析(30→90％在H2O(1％AcOH)中的MeCN(1％AcOH))纯化，得到36(2.2mg，1.4μmol，18％).LRMS(ESI+)m/z计算值C73H103ClN11O21S(M-18+H+)＝1536.67；实测值1537.08.
实施例51.(66)的合成
向溶于DCM(100mL)的57(500mg，3.33mmol)的搅拌溶液中，加入CSI(290μL，471mg，3.33mmol)。20min后，加入Et3N(1.4mL，1.0g，10mmol)和溶于DMF(5mL)的二乙醇胺.HCl(571mg，4.0mmol)的溶液。另外的45min后，将反应混合物在减压下浓缩，并且将残留物通过梯度柱层析(0→15％在DCM中的MeOH)纯化。得到呈无色粘稠油状的产物66(767mg，2.13mmol，64％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)4.26(d，J＝8.2Hz，2H)，3.87(t，J＝4.9Hz，4H)，3.55(t，J＝4.9Hz，4H)，2.37-2.16(m，6H)，1.65-1.45(m，2H)，1.39(四重峰，J＝8.6Hz，1H)，1.05-0.92(m，2H)
实施例52.(67)的合成
向溶于DCM(20mL)的66(206mg，0.57mmol)的悬浮液中，加入Et3N(318μL，231mg，2.28mmol)和对硝基苯基氯甲酸酯(230mg，1.14mmoL，2当量)。在室温下将该反应混合物搅拌28h，随后浓缩。将残留物通过梯度柱层析(20→75％在庚烷中的EtOAc)纯化，得到呈淡黄色粘稠油状的67(83mg，0.12mmol，21％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)8.31-8.24(m，4H)，7.43-7.34(m，4H)，4.53(t，J＝5.4Hz，2H)，4.22(d，J＝4.2Hz，2H)，3.87(t，J＝5.4Hz，4H)，2.35-2.15(m，6H)，1.55-1.40(m，2H)，1.35(四重峰，J＝8.8Hz，1H)，1.03-0.92(m，2H)。
实施例53.(37)的合成
向溶于DMF(1mL)的67(2.7mg，3.9μmol)和Et3N(2.7μL，2.0mg，19.5μmol)的溶液中，加入溶于DMF(100μL)的H-Val-Cit-PABA-Ahx-美登素(10mg，0.0086mmol)的溶液。使混合物在室温下反应过夜，随后浓缩。加入溶于DMF(1mL)的2，2′-(亚乙基二氧基)双(乙胺)(2.8μL，2.8mg，19μmol)的溶液。浓缩该反应混合物，并将残留物通过反相(C18)HPLC柱层析(30→90％在H2O(1％AcOH)中的MeCN(1％AcOH))纯化得到化合物37(4.8mg，1.7μmol，45％)。LRMS(ESI+)m/z计算值C131H186Cl2N20O38S(M+2H+)/2＝1375.12；实测值1375.51。
实施例54.(68)的合成
向溶于DCM(10mL)的58(47mg，0.13mmol)的搅拌溶液中，加入CSI(11μL，18mg，0.13mmol)。30min后，加入Et3N(91μL，66mg，0.65mmol)和溶于DMF(0.5mL)的二乙醇胺(16mg，0.16mmol)的溶液。30分钟后，加入对硝基苯基氯甲酸酯(52mg，0.26mmol)和Et3N(54μL，39mg，0.39mmol)。另外的4.5h后，浓缩该反应混合物，并将残留物通过梯度柱层析(33→66％EtOAc/庚烷(1％AcOH))纯化得到呈无色油状的68(88mg，0.098mmol，75％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)8.28-8.23(m，4H)，7.42-7.35(m，4H)，4.52(t，J＝5.4Hz，4H)，4.30(d，J＝8.3Hz，2H)，4.27-4.22(m，2H)，3.86(t，J＝5.3Hz，4H)，3.69-3.65(m，2H)，3.64-3.59(m，2H)，3.30-3.22(m，2H)，2.34-2.14(m，6H)，1.62-1.46(m，2H)，1.38(四重峰，J＝8.7Hz，1H)，1.04-0.92(m，2H)。
实施例55.(38)的合成
向溶于DMF(1mL)的68(3.9mg，4.3μmol)和Et3N(3.0μL，2.2mg，21.5μmol)的溶液中，加入溶于DMF(100μL)的H-Val-Cit-PABA-Ahx-美登素(10mg，8.6μmol)的溶液。使该混合物反应并浓缩。将残留物通过反相(C18)HPLC层析(30→90％在H2O(1％AcOH)中的MeCN(1％AcOH))纯化得到产物38(3.9mg，1.32μmol，31％)。LRMS(ESI+)m/z计算值C136H196Cl2N22O43S2(M+2H+)/2＝1480.13；实测1480.35.LRMS(ESI+)m/z计算值C85H119ClN14O31S2(M+2H+)/2＝965.36；实测值965.54。
作为副产物，分离了68的单取代Ahx-美登素衍生物(未示出)。LRMS(ESI+)计算值C85H119ClN14O31S2 2+m/z 965.36；实测值965.54.
实施例56.(39)的合成
向68的单取代Ahx-美登素衍生物(如在实施例55中作为副产物分离的)中加入溶于DMF(1mL)的Et3N(0.7μL，0.5mg，5μmol)的溶液和1.2mg(1.1μmol)H-Val-Cit-PABA-MMAF的溶液。使该混合物反应过夜，然后加入2，2′-(亚乙基二氧基)双(乙胺)(1μL，1.0mg，6.7μmol)。15min后，浓缩该反应混合物。反相(C18)HPLC层析(30→90％在H2O(1％AcOH)中的MeCN(1％AcOH))得到1.0mg所需产物。LRMS(ESI+)m/z计算值C137H206ClN23O41S2(M+2H+)/2＝1464.69；实测值1465.66.
实施例57.HPLC保留时间的确定
将化合物19-38的样品注射进HPLC系统中，所述系统装配有Phenomenex Luna C18(2)5μ，150×4.6mm，
Figure BDA0001312943880000991
柱，并用梯度的10％MeCN(0.1％TFA)/90％水(0.1％TFA)至90％MeCN(0.1％TFA)/10％水(0.1％TFA)、或者梯度的10％MeCN/90％10mM磷酸钾缓冲液pH7.4至90％MeCN/10％10mM磷酸钾缓冲液pH7.4洗脱。所获得的这些化合物的保留时间示于表3。
时间程序：
0-12min：10％MeCN至90％MeCN
12-14min：90％MeCN
14-15min：90％MeCN至10％MeCN
15-17min：10％MeCN
表3：化合物19-23和30-38在RP-HPLC上的保留时间
Figure BDA0001312943880001001
实施例58.17与18竞争性缀合至曲妥珠单抗(N300C)
在室温下，在含有30mM EDTA和1mM TCEP(10当量)的PBS中，孵育曲妥珠单抗(N300C)(100μM)2小时。在用PBS交换缓冲液之后，将部分还原的曲妥珠单抗(N300C)(66.7μM)与1.33mM脱氢抗坏血酸(20当量)孵育。将再氧化的曲妥珠单抗(N300C)(66.7μM)与0.4mM马来酰亚胺17(6当量)和0.4mM马来酰亚胺18(6当量)一起孵育。在室温下孵育1小时后，通过加入5倍摩尔过量的N-乙酰基半胱氨酸终止该反应。将反应产物用FabricatorTM(购自Genovis)消化，并且通过MS-分析(AccuTOF)进行分析。约45％的Fc-片段缀合到马来酰亚胺18(24297Da，预期质量＝24299)，约35％的Fc-片段缀合到马来酰亚胺17(24319Da，预期质量＝24323)。剩余的20％的Fc-片段由多种未缀合的形式组成(从23776至23874Da范围)。
实施例59.19-39缀合至13b或13c
向适当的曲妥珠单抗(叠氮化物)2(8.8μL，0.2mg，22.7mg/ml，溶于Tris缓冲液pH7.510mM)的溶液中，加入Tris缓冲液pH7.510mM(4μL)和底物(2μL，溶于MiliQ的2mM溶液+5％DMA)。在室温下孵育该反应，并在预设定时间点采样(2μL)。将这些样品与DTT(2μL0.2M)孵育，用MiliQ(30μL)稀释，并进行MS分析(AccuTof)以确定缀合效率(参见表1和2)。
实施例60.聚集
研究36、37和38与曲妥珠单抗(F2-GalNAz)2(13c)的缀合物(按照实施例59制备)的聚集趋势。在37℃下，将ADC以1mg/mL的浓度在PBS pH7.4中孵育。在0、1和2周后，使用Superdex200 PC 3.2/30柱(GE Healthcare)分析聚集水平。结果示于图23中。从药物与抗体比例为2(DAR2)的缀合物36至药物与抗体比例为4(DAR4)的缀合物37，聚集依然低于1％，这表明磺酰胺间隔物具有补偿由有效载荷数加倍而赋予的增加的亲脂性的潜力。对于38的双磺酰胺接头，完全没有观察到聚集。这些结果大大改善了通过炔烃-叠氮化合物环加成连接而制备的常规生物缀合物。
实施例61.聚集
在14天的时间段内，监测30和36与曲妥珠单抗(F2-GalNAz)2(13c)的缀合物(按照实施例59制备)，以及曲妥珠单抗自身的聚集趋势。将缀合物在40℃下于pH 5中储存2周，并在第0、2、7、10和14天测定聚集的程度。使用Superdex200 PC 3.2/30柱(GE Healthcare)对聚集的水平进行分析。结果示于图24中。与实施例61比较，胁迫(stress)增加(升高的T，较低pH)的条件导致聚集增加。然而，相比于30与曲妥珠单抗(F2-GalNAz)2(13c)的比较生物缀合物(采用PEG4间隔物)，本发明的缀合物(36与曲妥珠单抗(F2-GalNAz)2(13c)的缀合物)的聚集显著降低。值得注意的是，鉴于缺少稠合到环辛烷和美登素部分的疏水性基团例如1，2，3-三唑部分，曲妥珠单抗自身来显示出任何聚集趋势。

Claims (29)

1.用于制备生物缀合物的方法，所述方法包括使接头-缀合物的反应性基团Q1与糖蛋白(B)的官能团F1反应的步骤，其中所述接头-缀合物为包含α-端和ω-端的化合物，所述化合物在α-端包含反应性基团Q1并且在ω-端包含靶分子(D)，所述Q1能够与糖蛋白(B)上存在的官能团F1反应，所述靶分子(D)选自活性物质、报告分子、聚合物、固体表面、水凝胶、纳米颗粒、微颗粒和生物分子，所述化合物还包含式(1)的基团或其盐：
Figure FDA0002552312400000011
其中：
a为0或1；以及
R1选自氢、C1–C24烷基、C3–C24环烷基、C2–C24(杂)芳基、C3–C24烷基(杂)芳基和C3–C24(杂)芳基烷基，所述C1–C24烷基、C3–C24环烷基、C2–C24(杂)芳基、C3–C24烷基(杂)芳基和C3–C24(杂)芳基烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1–C4烷基，或R1为第二靶分子D，其中所述第二靶分子任选地通过间隔部分与N连接；以及
其中式(1)的基团或其盐位于化合物的所述α-端和所述ω-端之间；
其中Q1为选自以下的反应性基团：任选取代的N-马来酰亚胺基、卤代N-烷基酰氨基、磺酰基氧基N-烷基酰氨基、酯基、碳酸酯基、磺酰卤基、硫醇基或其衍生物、烯基、炔基、(杂)环炔基、二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团、环烯基、四嗪基、叠氮基、膦基、氧化腈基、硝酮基、腈亚胺基、重氮基、酮基、(O-烷基)羟氨基、肼基、卤代N-马来酰亚胺基、1,1-双(磺酰基甲基)甲基羰基或其消除衍生物、碳酰卤基和丙二烯酰胺基、共轭的(杂)二烯基、1,2-醌基和三嗪基。
2.权利要求1的方法，其中，在式(1)的基团中，a为0。
3.权利要求1的方法，其中，在式(1)的基团中，a为1。
4.权利要求1的方法，其中所述靶分子为活性物质、报告分子或聚合物。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述反应涉及反应性基团Q1和官能团F1之间的完全相互反应性。
6.权利要求5的方法，其中所述反应为环加成。
7.权利要求6的方法，其中所述环加成为狄尔斯-阿尔德反应或1,3-偶极环加成。
8.权利要求1的方法，其中Q1为炔基、(杂)环炔基或二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团，并且F1为叠氮基。
9.权利要求1的方法，其中所述接头-缀合物为式(4a)或(4b)，或其盐
Figure FDA0002552312400000021
其中：
a独立地为0或1；
b独立地为0或1；
c为0或1；
d为0或1；
e为0或1；
f为1至150范围内的整数；
g为0或1；
i为0或1；
D为靶分子；
Q1为能够与糖蛋白上存在的官能团F1反应的反应性基团；
Sp1为间隔部分；
Sp2为间隔部分；
Sp3为间隔部分；
Sp4为间隔部分；
Z1为连接基团，其将Q1或Sp3与Sp2、O或C(O)或N(R1)连接；
Z2为连接基团，其将D或Sp4与Sp1、N(R1)、O或C(O)连接；以及
R1选自氢、C1–C24烷基、C3–C24环烷基、C2–C24(杂)芳基、C3–C24烷基(杂)芳基和C3–C24(杂)芳基烷基，所述C1–C24烷基、C3–C24环烷基、C2–C24(杂)芳基、C3–C24烷基(杂)芳基和C3–C24(杂)芳基烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1–C4烷基；或
R1为D、-[(Sp1)b-(Z2)e-(Sp4)i-D]或-[(Sp2)c-(Z1)d-(Sp3)g-Q1]，其中Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、Z1、Z2、D、Q1、b、c、d、e、g和i如上所定义。
10.权利要求9的方法，其中Sp1、Sp2、Sp3和Sp4独立地选自直链或支链的C1-C200亚烷基、C2-C200亚烯基、C2-C200亚炔基、C3-C200亚环烷基、C5-C200亚环烯基、C8-C200亚环炔基、C7-C200烷基亚芳基、C7-C200芳基亚烷基、C8-C200芳基亚烯基和C9-C200芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢、C1–C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
11.权利要求9的方法，其中Z1和Z2独立地选自-O-、-S-、-NR2-、-N＝N-、-C(O)-、-C(O)NR2-、-O-C(O)-、-O-C(O)-O-、-O-C(O)-NR2、-NR2-C(O)-、-NR2-C(O)-O-、-NR2-C(O)-NR2-、-S-C(O)-、-S-C(O)-O-、-S-C(O)-NR2-、-S(O)-、-S(O)2-、-O-S(O)2-、-O-S(O)2-O-、-O-S(O)2-NR2-、-O-S(O)-、-O-S(O)-O-、-O-S(O)-NR2-、-O-NR2-C(O)-、-O-NR2-C(O)-O-、-O-NR2-C(O)-NR2-、-NR2-O-C(O)-、-NR2-O-C(O)-O-、-NR2-O-C(O)-NR2-、-O-NR2-C(S)-、-O-NR2-C(S)-O-、-O-NR2-C(S)-NR2-、-NR2-O-C(S)-、-NR2-O-C(S)-O-、-NR2-O-C(S)-NR2-、-O-C(S)-、-O-C(S)-O-、-O-C(S)-NR2-、-NR2-C(S)-、-NR2-C(S)-O-、-NR2-C(S)-NR2-、-S-S(O)2-、-S-S(O)2-O-、-S-S(O)2-NR2-、-NR2-O-S(O)-、-NR2-O-S(O)-O-、-NR2-O-S(O)-NR2-、-NR2-O-S(O)2-、-NR2-O-S(O)2-O-、-NR2-O-S(O)2-NR2-、-O-NR2-S(O)-、-O-NR2-S(O)-O-、-O-NR2-S(O)-NR2-、-O-NR2-S(O)2-O-、-O-NR2-S(O)2-NR2-、-O-NR2-S(O)2-、-O-P(O)(R2)2-、-S-P(O)(R2)2-、-NR2-P(O)(R2)2-及其两种或更多种的组合，其中R2独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
12.权利要求9的方法，其中Sp1、Sp2、Sp3和Sp4，如果存在，独立地选自直链或支链的C1-C20亚烷基，所述亚烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1–C4烷基，并且其中Q1为反-环辛烯基或式(9a)、(9i)、(9j)、(9k)、(9l)、(9q)、(9n)、(9o)或(9p)的基团：
Figure FDA0002552312400000041
其中p为0至10范围内的整数，l为0至10范围内的整数，U为O或NR9，并且R9为氢、直链或支链的C1-C12烷基或C4-C12(杂)芳基，并且其中(9n)中的芳族环在一个或多个位置处任选地被O-磺酰化，以及(9o)和(9p)的环在一个或多个位置处任选地被卤代。
13.权利要求12的方法，其中所述反-环辛烯基为式(9zi)或(9zj)：
Figure FDA0002552312400000051
14.权利要求1的方法，其中所述糖蛋白为抗体。
15.权利要求14的方法，其中所述抗体特异性结合癌症相关的抗原。
16.权利要求1的方法，其中所述生物缀合物为抗体-药物-缀合物。
17.通过权利要求1-16中任一项的方法可获得的生物缀合物。
18.包含α-端和ω-端的化合物，所述化合物在α-端包含反应性基团Q1并且在ω-端包含靶分子(D)，所述Q1能够与糖蛋白上存在的官能团F1反应，所述靶分子(D)选自活性物质、报告分子、聚合物、固体表面、水凝胶、纳米颗粒、微颗粒和生物分子，所述化合物还包含式(1)的基团或其盐：
Figure FDA0002552312400000052
其中：
a为0或1；
R1选自氢、C1–C24烷基、C3–C24环烷基、C2–C24(杂)芳基、C3–C24烷基(杂)芳基和C3–C24(杂)芳基烷基，所述C1–C24烷基、C3–C24环烷基、C2–C24(杂)芳基、C3–C24烷基(杂)芳基和C3–C24(杂)芳基烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1–C4烷基，或R1为靶分子D，其中所述靶分子任选地通过间隔部分与N连接；以及
Q1选自：任选取代的N-马来酰亚胺基、卤代N-烷基酰氨基、磺酰基氧基N-烷基酰氨基、碳酸酯基、磺酰卤基、硫醇基或其衍生物、包含内部碳-碳三键的炔基、(杂)环炔基、二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团、环烯基、四嗪基、叠氮基、膦基、氧化腈基、硝酮基、腈亚胺基、重氮基、酮基、(O-烷基)羟氨基、肼基、卤代N-马来酰亚胺基、1,1-双(磺酰基甲基)甲基羰基或其消除衍生物、碳酰卤基和丙二烯酰胺基。
19.权利要求18的化合物，其中Q1包含环烯基或环炔基。
20.权利要求19的化合物，其中Q1为任选取代的(杂)环炔基。
21.权利要求19的化合物，其中Q1为二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团。
22.权利要求18的化合物，其中所述化合物为式(4a)或(4b)，或其盐：
Figure FDA0002552312400000061
其中a、b、c、d、e、f、g、i、D、Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、Z1、Z2和R1如权利要求8中所定义。
23.权利要求18的化合物，其中Q1为反-环辛烯基或式(9a)、(9i)、(9j)、(9k)、(9l)、(9q)、(9n)、(9o)或(9t)的基团：
Figure FDA0002552312400000062
Figure FDA0002552312400000071
其中p为0至10范围内的整数，l为0至10范围内的整数，U为O或NR9，并且R9为氢、直链或支链的C1-C12烷基或C4-C12(杂)芳基，并且其中(9n)中的芳族环在一个或多个位置处任选地被O-磺酰化，以及(9o)和(9p)的环在一个或多个位置处任选地被卤代。
24.权利要求23的化合物，其中所述反-环辛烯基为式(9zi)或(9zj)：
Figure FDA0002552312400000072
25.权利要求22的化合物，其中Sp1、Sp2、Sp3和Sp4，如果存在，独立地选自直链或支链的C1-C20亚烷基，所述亚烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1–C4烷基。
26.权利要求25的化合物，其中所述杂原子为O。
27.包含α-端和ω-端的化合物，所述化合物在α-端包含糖蛋白(B)并且在ω-端包含靶分子(D)，所述靶分子(D)选自活性物质、报告分子、聚合物、固体表面、水凝胶、纳米颗粒、微颗粒和生物分子，所述化合物还包含式(1)的基团或其盐：
Figure FDA0002552312400000073
其中：
a为0或1；以及
R1选自氢、C1–C24烷基、C3–C24环烷基、C2–C24(杂)芳基、C3–C24烷基(杂)芳基和C3–C24(杂)芳基烷基，所述C1–C24烷基、C3–C24环烷基、C2–C24(杂)芳基、C3–C24烷基(杂)芳基和C3–C24(杂)芳基烷基任选地被取代并且任选地被选自O、S和NR3中的一个或多个杂原子间隔，其中R3独立地选自氢和C1–C4烷基；或
R1为靶分子D，其中所述靶分子任选地通过间隔部分与N连接。
28.权利要求27的化合物，其中所述糖蛋白为抗体。
29.权利要求27的化合物，其中所述靶分子为活性物质、报告分子或聚合物。
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