ES2740907T3 - Enlazador de sulfamida, conjugados de los mismos y métodos de preparación - Google Patents

Enlazador de sulfamida, conjugados de los mismos y métodos de preparación Download PDF

Info

Publication number
ES2740907T3
ES2740907T3 ES15813594T ES15813594T ES2740907T3 ES 2740907 T3 ES2740907 T3 ES 2740907T3 ES 15813594 T ES15813594 T ES 15813594T ES 15813594 T ES15813594 T ES 15813594T ES 2740907 T3 ES2740907 T3 ES 2740907T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
groups
group
hetero
linker
alkyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES15813594T
Other languages
English (en)
Inventor
Jorge Merijn Mathieu Verkade
Maria Antonia Wijdeven
De Sande Petrus Josephus Jacobus Maria Van
Berkel Sander Sebastiaan Van
Delft Floris Louis Van
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Synaffix BV
Original Assignee
Synaffix BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Synaffix BV filed Critical Synaffix BV
Application granted granted Critical
Publication of ES2740907T3 publication Critical patent/ES2740907T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Procedimiento para la preparación de un bioconjugado, comprendiendo el procedimiento la etapa de conjugar una glicoproteína (B) con un enlazador-conjugado, haciendo reaccionar un grupo reactivo Q1 del enlazador-conjugado con un grupo funcional F1 de la glicoproteína (B), en donde el enlazador-conjugado es un compuesto que comprende un extremo alfa y un extremo omega, comprendiendo el compuesto en el extremo alfa un grupo reactivo Q1 capaz de reaccionar con un grupo funcional F1 presente en la glicoproteína (B) y en el extremo omega una molécula diana (D) seleccionada a partir del grupo que consiste en un fármaco, un profármaco, un agente de diagnóstico, una proteína, un péptido, un polipéptido, un marcador peptídico, un aminoácido, un glicano, un lípido, una vitamina, un esteroide, un nucleótido, un nucleósido, un polinucleótido, un ARN, un ADN, una molécula informadora, un polímero, una superficie sólida, un hidrogel, una nanopartícula, una micropartícula y una biomolécula, en donde Q1 es un grupo reactivo seleccionado a partir del grupo que consiste en grupos N-maleimidilo opcionalmente sustituidos, grupos Nalquilamido halogenados, grupos éster activados, grupos tiol, grupos alquinilo, grupos (hetero)cicloalquinilo, grupos tetrazinilo, grupos azido, grupos fosfina, grupos 1,1-bis(sulfonilmetil)-metilcarbonilo, grupos 1,2-quinona o grupos triazina, comprendiendo el compuesto adicionalmente un grupo según la fórmula (1) o una sal del mismo:**Fórmula** en donde: a es 0 o 1; y R1 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos cicloalquilo C3 - C24, grupos (hetero)arilo C2 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C3 - C24, los grupos alquilo C1 - C24, grupos cicloalquilo C3 - C24, grupos (hetero)arilo C2 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C3 - C24 opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir de O, S y NR3 en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo C1 - C4, o R1 es una segunda molécula diana D, en donde la segunda molécula diana está conectada opcionalmente con N a través de un resto espaciador; y en donde el grupo según la fórmula (1), o la sal del mismo, está situado entre dicho extremo alfa y dicho extremo omega del compuesto.

Description

DESCRIPCIÓN
Enlazador de sulfamida, conjugados de los mismos y métodos de preparación
Campo técnico de la invención
La presente invención se encuentra en el campo de la bioconjugación. La invención se refiere a enlazadores de sulfamida y a conjugados de los mismos, y a métodos para su preparación. Más particularmente, la invención se refiere a enlazadores que comprenden un grupo acilsulfamida y/o un grupo carbamoil sulfamida y a conjugados que comprenden dichos enlazadores. La invención se refiere además a un procedimiento para la preparación de bioconjugados que comprenden un enlazador, comprendiendo el enlazador un grupo acilsulfamida y/o un grupo carbamoil sulfamida.
Antecedentes de la invención
La bioconjugación es el procedimiento de unir dos o más moléculas, de las cuales al menos una es una biomolécula. La(s) biomolécula(s) también se puede denominar "biomolécula(s) de interés", la(s) otra(s) molécula(s) también se puede denominar "molécula diana" o "molécula de interés". Normalmente, la biomolécula de interés (BOI) consistirá en una proteína (o péptido), un glicano, un ácido nucleico (u oligonucleótido), un lípido, una hormona o un fármaco natural (o fragmentos o combinaciones de los mismos). La otra molécula de interés (MOI) también puede ser una biomolécula, lo que conduce a la formación de homodímeros o heterodímeros (u oligómeros superiores), o la otra molécula puede poseer características específicas que se imparten sobre la biomolécula de interés mediante el proceso de conjugación. Por ejemplo, la modulación de una estructura y función proteica mediante una modificación covalente con una sonda química para la detección y/o el aislamiento, ha evolucionado como una herramienta poderosa en la investigación basada en el proteoma y las aplicaciones biomédicas. El etiquetado de proteínas mediante afinidad o fluorescencia es clave para estudiar el tráfico de proteínas en su hábitat natural. Las vacunas basadas en conjugados proteína-carbohidrato han ganado importancia en la lucha contra el VIH, el cáncer, la malaria y las bacterias patógenas, mientras que los carbohidratos inmovilizados sobre micromatrices son fundamentales para la dilucidación del glicoma. Los oligonucleótidos sintéticos (ONs) de ADN y ARN requieren la introducción de una funcionalidad adecuada para aplicaciones diagnósticas y terapéuticas, como la tecnología de micromatrices, terapias antisentido y de silenciamiento de genes, nanotecnología y diversas aplicaciones de ciencias de los materiales. Por ejemplo, la fijación de un ligando que penetra en una célula es la estrategia más comúnmente aplicada para abordar la baja tasa de internalización de los ONs encontrados durante la terapéutica basada en oligonucleótidos (antisentido, siARN). De manera similar, la preparación de micromatrices basadas en oligonucleótidos requiere la inmovilización selectiva de los ONs sobre una superficie sólida adecuada, p. ej., vidrio.
Existen numerosos ejemplos de reacciones químicas adecuadas para unir covalentemente dos (o más) estructuras moleculares. Sin embargo, el etiquetado de biomoléculas plantea grandes restricciones en las condiciones de reacción que se pueden aplicar (disolvente, concentración, temperatura), mientras que el deseo de un etiquetado quimioselectivo limita la elección de grupos reactivos. Por razones obvias, los sistemas biológicos generalmente se desarrollan mejor en un entorno acuoso, lo que significa que los reactivos para la bioconjugación deben ser adecuados para una aplicación en sistemas acuosos. En general, se pueden reconocer dos conceptos estratégicos en el campo de la tecnología de la bioconjugación: (a) la conjugación basada en un grupo funcional ya presente en la biomolécula de interés, tal como por ejemplo un tiol, una amina, un alcohol o una unidad de hidroxifenol, o (b) un procedimiento de dos etapas que implica modificar uno (o varios) grupos reactivos únicos en una BOI antes del proceso de conjugación real.
El primer enfoque implica normalmente una cadena lateral de aminoácidos reactivos en una proteína (p. ej., cisteína, lisina, serina y tirosina) o un grupo funcional en un glicano (p. ej., amina, aldehído) o un ácido nucleico (p. ej., una funcionalidad de purina o pirimidina o alcohol). Como se resume, entre otras cosas, en G.T. Hermanson, "Bioconjugate Techniques", Elsevier, 3a ed. 2013, un gran número de grupos funcionales reactivos han quedado disponibles a lo largo de los años para el direccionamiento quimioselectivo de uno de esos grupos funcionales, tales como maleimida, haloacetamida, éster activado, carbonato activado, sulfonil haluro, derivado de tiol activado, alqueno, alquino, alenamida y más, en donde cada uno de los cuales requiere sus propias condiciones específicas para la conjugación (pH, concentración, estequiometría, luz, etc.). De manera más prominente, la conjugación de cisteína-maleimida destaca en la conjugación de proteínas debido a su tasa de reacción elevada y su quimioselectividad. Sin embargo, cuando no hay cisteína disponible para la conjugación, como ocurre en muchas proteínas y ciertamente en otras biomoléculas, a menudo se requieren otros métodos, en donde cada uno de los cuales es víctima de sus propias limitaciones.
Una solución elegante y ampliamente aplicable para la bioconjugación implica el enfoque de dos etapas. Aunque la conjugación en dos etapas es más laboriosa a través de una funcionalidad modificada, generalmente conduce a una mayor selectividad (especificidad del sitio) que la conjugación con una funcionalidad natural. Además de eso, se puede lograr una estabilidad total mediante una selección adecuada de la estructura artificial, lo que puede ser un inconveniente importante en la conjugación de una etapa sobre una funcionalidad natural, en particular para la conjugación de cisteína-maleimida. Ejemplos típicos de un grupo funcional que se puede impartir sobre la BOI incluyen alquino (sometido a tensiones), alqueno (sometido a tensiones), norborneno, tetrazina, azida, fosfina, óxido de nitrilo, nitrona, nitrilo imina, compuesto diazo, compuesto de carbonilo, (O-alquil)hidroxilamina e hidrazina, que pueden lograrse mediante un enfoque químico o de biología molecular. Se sabe que cada uno de los grupos funcionales anteriores tiene al menos otro componente de la reacción, que en muchos casos implica una reactividad mutua completa. Por ejemplo, las ciclooctinas reaccionan selectiva y exclusivamente con dipolos 1,3, los alquenos sometidos a tensiones con tetrazinas y las fosfinas con azidas, lo que conduce a enlaces covalentes completamente estables. Sin embargo, algunos de los grupos funcionales anteriores tienen la desventaja de ser altamente lipófilos, lo que puede comprometer la eficacia de la conjugación, en particular en combinación con una molécula lipófila de interés (véase más abajo).
La unidad de enlace final entre la biomolécula y la otra molécula de interés también debe ser con preferencia totalmente compatible con un entorno acuoso en términos de solubilidad, estabilidad y biocompatibilidad. Por ejemplo, un enlazador altamente lipófilo puede conducir a una agregación (durante o después de la conjugación), lo que puede aumentar significativamente los tiempos de reacción y/o reducir los rendimientos de la conjugación, en particular cuando la MOI también es de naturaleza hidrófoba. De manera similar, una combinación de un enlazador altamente lipófilo-MOI puede conducir a una unión inespecífica a superficies o parches hidrófobos específicos sobre la misma u otra biomolécula. Si el enlazador es susceptible de una hidrólisis acuosa u otras reacciones de escisión inducidas por el agua, los componentes que comprenden el bioconjugado original se separan por difusión. Por ejemplo, ciertos restos éster no son adecuados debido a la saponificación, mientras que los compuestos de phidroxicarbonilo o Y-dicarbonilo podrían conducir a una reacción retro-aldol o retro-Michael, respectivamente. Finalmente, el enlazador debe ser inerte frente a las funcionalidades presentes en el bioconjugado o cualquier otra funcionalidad que pueda encontrarse durante la aplicación del bioconjugado, lo que excluye, entre otros, el uso de enlazadores que presentan, por ejemplo, un resto cetona o aldehído (puede conducir a la formación de iminas), un compuesto carbonilo a,p-insaturado (adición de Michael), tioésteres u otros ésteres activados (formación de enlaces amida).
Los compuestos preparados a base de oligómeros lineales de etilenglicol, los llamados enlazadores PEG (polietilenglicol), gozan hoy en día de una popularidad particular en los procedimientos de conjugación biomolecular. Los enlazadores de PEG son altamente solubles en agua, no tóxicos, no antigénicos y conducen a una agregación despreciable o nula. Por esta razón, una gran variedad de enlazadores de PEG lineales, bifuncionales están disponibles comercialmente a partir de varias fuentes, los cuales se pueden modificar selectivamente en cualquier extremo con una (bio)molécula de interés. Los enlazadores de PEG son el producto de un proceso de polimerización de óxido de etileno y, por lo tanto, se obtienen normalmente como mezclas estocásticas de longitud de cadena, que se pueden convertir parcialmente en estructuras artificiales de PEG con una distribución del peso promedio centrada alrededor de 1,2, 4 kDa o más (hasta 60 kDa). Los PEGs homogéneos y discretos (dPEGs) también se conocen con pesos moleculares de hasta 4 kDa y las versiones ramificadas de los mismos llegan hasta los 15 kDa. Curiosamente, la propia unidad de PEG imparte características particulares a una biomolécula. En particular, la PEGilación de una proteína puede conducir a una residencia prolongada in vivo, una degradación reducida por enzimas metabólicas y una reducción o eliminación de la inmunogenicidad proteica. Varias proteínas PEGiladas han sido aprobadas por la FDA y están actualmente en el mercado.
Debido a su alta polaridad, los enlazadores de PEG son perfectamente adecuados para la bioconjugación de restos pequeños y/o solubles en agua en condiciones acuosas. Sin embargo, en el caso de una conjugación de moléculas de interés, hidrófobas, no solubles en agua, la polaridad de una unidad de PEG puede ser insuficiente para compensar la hidrofobicidad, lo que lleva a tasas de reacción significativamente reducidas, rendimientos más bajos y problemas de agregación inducida. En tal caso, pueden requerirse enlazadores de PEG largos y/o cantidades significativas de codisolventes orgánicos para solubilizar los reactivos. Por ejemplo, en el campo de los conjugados de anticuerpo-fármaco, la fijación controlada de un número distinto de cargas útiles tóxicas a un anticuerpo monoclonal es esencial, con una carga útil seleccionada normalmente a partir del grupo de las auristatinas E o F, maitansinoides, duocarmicinas, caliqueamicinas o pirrolobenzodiazepinas (PBDs), con muchas otras en marcha. Con la excepción de la auristatina F, todas las cargas útiles tóxicas son de poco solubles en agua a nada solubles, lo que requiere codisolventes orgánicos para lograr una conjugación exitosa, tal como un 25% de dimetilacetamida (DMA) o un 50% de propilenglicol (PG). En el caso de cargas útiles hidrófobas, a pesar del uso de los codisolventes mencionados anteriormente, pueden requerirse estequiometrías elevadas de los reactivos durante la conjugación, mientras que la eficacia y el rendimiento pueden estar significativamente comprometidos debido a la agregación (en el procedimiento o después del aislamiento del producto), como se describe, por ejemplo, en Senter et al. en Nat. Biotechn. 2014, 24, 1256-1263. El uso de espaciadores largos de PEG (12 unidades o más) puede mejorar parcialmente la solubilidad y/o la eficacia de la conjugación, pero se ha mostrado que los espaciadores largos de PEG pueden conducir a un aclaramiento in vivo más rápido y, por lo tanto, influir negativamente en el perfil farmacocinético del ADC.
Partiendo de lo anterior, queda claro que existe una demanda de espaciadores polares, cortos que permitan la conjugación rápida y eficiente de restos hidrófobos. Está claro que esto último se refiere incluso a un nivel más alto en las reacciones de conjugación en las que se emplea un resto reactivo hidrófobo, tal como por ejemplo, alquinos, alquenos sometidos a tensiones y fosfinas (véase más arriba).
Los enlazadores son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en el documento WO 2008/070291. En WO 2008/070291 se describe un enlazador para el acoplamiento de agentes de direccionamiento con componentes de anclaje. El enlazador contiene regiones hidrófilas representadas por polietilenglicol (PEG) y una extensión que carece de centros quirales que se acopla a un agente de direccionamiento.
El documento WO 01/88535, describe un sistema enlazador de superficies para la bioconjugación, en particular un sistema enlazador que tiene un nuevo grupo espaciador hidrófilo. Los átomos o grupos hidrófilos para uso en el sistema enlazador se seleccionan a partir del grupo que consiste en O, NH, C=O (grupo ceto), O-C=O (grupo éster) y CR3R4, en donde R3 y R4 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en H, OH, alcoxi Ci -C4 y aciloxi C1 - C4.
El documento WO 2014/100762, describe compuestos con un enlazador autoinmolativo hidrófilo, que se puede escindir en condiciones apropiadas e incorpora un grupo hidrófilo para proporcionar una mejor solubilidad al compuesto. Los compuestos comprenden un resto de fármaco, un resto de direccionamiento capaz de dirigirse a una población celular seleccionada y un enlazador que contiene una unidad acilo, una unidad espaciadora opcional para proporcionar una distancia entre el resto de fármaco y el resto de direccionamiento, un enlazador peptídico que se puede escindir en condiciones apropiadas, un enlazador autoinmolativo hidrófilo y un segundo espaciador autoinmolativo opcional o un enlazador de autoeliminación de ciclación. El enlazador autoinmolativo hidrófilo es, p. ej., un grupo benciloxicarbonilo.
Xiuru Li et al., Angewandte Chemie, edición internacional 2014, 53, 7179-7182, describen la preparación de conjugados anticuerpo-fármaco mediante una cicloadición de azida-alquino favorecida por la tensión.
Compendio de la invención
La invención se refiere a un compuesto (también denominado un enlazador-conjugado) que comprende un extremo alfa y un extremo omega, en donde el compuesto comprende en el extremo alfa un grupo reactivo Q1 capaz de reaccionar con un grupo funcional F1 presente en una biomolécula y en el extremo omega una molécula diana (D) seleccionada a partir del grupo que consiste en un fármaco, un profármaco, un agente de diagnóstico, una proteína, un péptido, un polipéptido, un marcador peptídico, un aminoácido, un glicano, un lípido, una vitamina, un esteroide, un nucleótido, un nucleósido, un polinucleótido, un ARN, un ADN, una molécula informadora, un polímero, una superficie sólida, un hidrogel, una nanopartícula, una micropartícula y una biomolécula, en donde el compuesto comprende adicionalmente un grupo de acuerdo con la fórmula (1) o una sal del mismo:
Figure imgf000004_0001
en donde:
a es 0 o 1 ; y
R1 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos cicloalquilo C3 - C24, grupos (hetero)arilo C2 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C3 - C24, los grupos alquilo C1 - C24, grupos cicloalquilo C3 - C24, grupos (hetero)arilo C2 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C3 - C24 opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir de O, S y NR3 en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo C1 - C4 , o R1 es una molécula diana D seleccionada a partir del grupo que consiste en un fármaco, un profármaco, un agente de diagnóstico, una proteína, un péptido, un polipéptido, un marcador peptídico, un aminoácido, un glicano, un lípido, una vitamina, un esteroide, un nucleótido, un nucleósido, un polinucleótido, un ARN, un ADN, una molécula informadora, un polímero, una superficie sólida, un hidrogel, una nanopartícula, una micropartícula y una biomolécula, en donde la molécula diana está conectada opcionalmente con N a través de un resto espaciador;
y Q1 se selecciona a partir del grupo que consiste en un grupo N-maleimidilo opcionalmente sustituido, un grupo (hetero)cicloalquinilo y un grupo biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo].
Más en particular, la invención se refiere a un enlazador-conjugado de acuerdo con la fórmula (4a) o (4b), o una de sus sales:
Figure imgf000005_0001
en donde:
a es independientemente 0 o 1;
b es independientemente 0 o 1;
c es 0 o 1;
d es 0 o 1;
e es 0 o 1;
f es un número entero en el intervalo de 1 a 150;
g es 0 o 1;
i es 0 o 1;
D es una molécula diana seleccionada a partir del grupo que consiste en un fármaco, un profármaco, un agente de diagnóstico, una proteína, un péptido, un polipéptido, un marcador peptídico, un aminoácido, un glicano, un lípido, una vitamina, un esteroide, un nucleótido, un nucleósido, un polinucleótido, un ARN, un ADN, una molécula informadora, un polímero, una superficie sólida, un hidrogel, una nanopartícula, una micropartícula y una biomolécula;
Q1 se selecciona a partir del grupo que consiste en un grupo N-maleimidilo opcionalmente sustituido, un grupo (hetero)cicloalquinilo y un grupo biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo];
Sp1 es un resto espaciador;
Sp2 es un resto espaciador;
Sp3 es un resto espaciador;
Sp4 es un resto espaciador;
Z1 es un grupo de conexión que conecta Q1 o Sp3 con Sp2, O o C(O) o N(R1);
Z2 es un grupo de conexión que conecta D o Sp4 con Sp1, N(R1), O o C(O); y
R1 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos cicloalquilo C3 - C24, grupos (hetero)arilo C2 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C3 - C24, los grupos alquilo C1 - C24, grupos cicloalquilo C3 - C24, grupos (hetero)arilo C2 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C3 - C24 opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir de O, S y NR3 en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo C1 - C4; o
R1 es D, -[(Sp1)b-(Z2)e-(Sp4)i-D] o -[(Sp2)c-(Z1)d-(Sp3)g-Q1], en donde Sp1, Sp2 , Sp3 , Sp4, Z1, Z2, D, Q1, b, c, d, e, g e i son como se han definido anteriormente.
La invención también se refiere a un procedimiento para la preparación de un bioconjugado, en donde el procedimiento comprende la etapa de conjugar una glicoproteína (B) con un enlazador-conjugado, haciendo reaccionar un grupo reactivo Q1 de un enlazador-conjugado con un grupo funcional F1 de una glicoproteína, en donde el enlazador-conjugado es un compuesto que comprende un extremo alfa y un extremo omega, en donde el compuesto comprende en el extremo alfa un grupo reactivo Q1 capaz de reaccionar con un grupo funcional F1 presente en la glicoproteína y en el extremo omega una molécula diana (D) seleccionada a partir del grupo que consiste en un fármaco, un profármaco, un agente de diagnóstico, una proteína, un péptido, un polipéptido, un marcador peptídico, un aminoácido, un glicano, un lípido, una vitamina, un esteroide, un nucleótido, un nucleósido, un polinucleótido, un ARN, un ADN, una molécula informadora, un polímero, una superficie sólida, un hidrogel, una nanopartícula, una micropartícula y una biomolécula, en donde Q1 es un grupo reactivo seleccionado a partir del grupo que consiste en grupos N-maleimidilo opcionalmente sustituidos, grupos N-alquilamido halogenados, grupos éster activados, grupos tiol, grupos alquinilo, grupos (hetero)cicloalquinilo, grupos tetrazinilo, grupos azido, grupos fosfina, grupos 1,1-bis(sulfonilmetil)-metilcarbonilo, grupos 1,2-quinona o grupos triazina, comprendiendo además el compuesto un grupo de acuerdo con la fórmula (1) o una sal del mismo:
Figure imgf000006_0001
en donde a y R1 son como se han definido anteriormente, y en donde el grupo de acuerdo con la fórmula (1), o su sal, está situado entre dicho extremo alfa y dicho extremo omega del compuesto.
Más en particular, la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un bioconjugado, comprendiendo el procedimiento la etapa de hacer reaccionar un grupo reactivo Q1 de un enlazador-conjugado de acuerdo con la fórmula (4a) o (4b) como se ha definido anteriormente, con un grupo funcional F1 de una glicoproteína. En una realización preferida, la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un bioconjugado a través de una cicloadición, tal como una cicloadición (4+2) (por ejemplo, una reacción de Diels-Alder) o una cicloadición (3+2) (por ejemplo, una cicloadición 1,3-dipolar), preferiblemente la cicloadición 1,3-dipolar, más preferiblemente la cicloadición de alquino-azida, y lo más preferiblemente cuando Q1 es o comprende un grupo alquino, tal como un grupo cicloalquino, y F1 es un grupo azido. En una realización preferida adicional, la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un bioconjugado, en donde la molécula diana es hidrófoba (es decir, débilmente soluble en agua), lo más preferiblemente cuando la molécula diana tiene una solubilidad en agua de a lo sumo 0,1% (p/p) en agua (20°C y 100 kPa). En una realización especialmente preferida, la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un bioconjugado a través de una cicloadición, preferiblemente una cicloadición 1,3-dipolar, más preferiblemente la cicloadición de alquino-azida, y lo más preferiblemente cuando Q1 es o comprende un grupo alquino y F1 es un grupo azido, y en donde la molécula diana es hidrófoba, más preferiblemente en donde la molécula diana tiene una solubilidad en agua de, como máximo, el 0,1% (p/p) en agua (20°C y 100 kPa).
La invención se refiere además a un bioconjugado obtenible mediante el procedimiento de acuerdo con la invención.
Descripción de las figuras
La Figura 1 describe el concepto general de conjugación de biomoléculas: una biomolécula de interés (BOI) que contiene uno o varios grupos funcionales F1 se incuba con (un exceso de) una molécula diana D (también conocida como molécula de interés o MOI) fijada covalentemente a un grupo reactivo Q1 a través de un enlazador específico. En el procedimiento de bioconjugación, tiene lugar una reacción química entre F1 y Q1, formando de este modo un bioconjugado que comprende una conexión covalente entre la BOI y la MOI. La BOI puede ser, por ejemplo, un péptido/proteína, un glicano o un ácido nucleico.
La Figura 2 muestra varias estructuras de derivados de azúcares UDP de galactosamina, que pueden modificarse, p. ej., con un grupo 3-mercaptopropionilo (11a), un grupo azidoacetilo (11b) o un grupo azidodifluoroacetilo (11c).
La Figura 3 muestra esquemáticamente cómo cualquiera de los azúcares UDP 11a-c se puede fijar a una glicoproteína que comprende un resto GlcNAc 12 (p. ej., un anticuerpo monoclonal cuyo glicano está recortado por una endoglicosidasa) bajo la acción de un mutante de la galactosiltransferasa o una GalNAc-transferasa, generando de este modo un enlace 1-4 p-glicosídico entre un derivado de GalNAc y GlcNAc (compuestos 13a-c, respectivamente).
La Figura 4 muestra cómo un anticuerpo 13a-c modificado puede someterse a un procedimiento de bioconjugación mediante una adición nucleófila a maleimida (como para 13a, lo que conduce al conjugado de tioéter 14) o después de una cicloadición favorecida por la tensión con un reactivo de ciclooctino (como para 13b o 13c, lo que conduce a los triazoles 15 o 16, respectivamente).
La Figura 5 muestra las estructuras de varios compuestos en los que un grupo reactivo Q1 con N-maleimidilo está conectado con un grupo pireno (D) a través de una unidad enlazadora.
La Figura 6 muestra las estructuras de varios compuestos en donde un grupo reactivo Q1 de biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo] (también conocido como grupo BCN) está conectado con bencilamina (D) a través de una unidad enlazadora.
La Figura 7 muestra las estructuras de varios compuestos en donde un grupo reactivo Q1 de biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo] (también conocido como un grupo BCN) o un grupo reactivo de dibenzoazociclooctina Q1 (también conocido como grupo DIBAC o grupo DBCO) está conectado con pireno a través de una unidad enlazadora.
La Figura 8 muestra las estructuras de varios compuestos en donde un grupo reactivo Q1 de biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo] (también conocido como grupo BCN) está conectado con maitansina a través de una unidad enlazadora.
La Figura 9 muestra las estructuras de varios compuestos en donde un grupo reactivo Q1 de biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo] (también conocido como grupo BCN) está conectado con una estructura artificial Val-Cit-PABA-duocarmicina a través de una unidad enlazadora.
La Figura 10 muestra las estructuras de varios compuestos de acuerdo con la invención, en donde un grupo reactivo Q1 de biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo] (también denominado grupo BCN) se conjuga con Val-Cit-PABA-Ahx-maitansina a través de una unidad enlazadora.
La Figura 11 muestra los tiempos de retención de la HPLC de los compuestos 19-23 y 30-38 con 0,1% de TFA o en tampón con pH 7,4.
La Figura 12a muestra la eficacia de la conjugación de los derivados de BCN-pireno conjugados a través de un enlazador de sulfamida (compuesto 26) o un enlazador PEG corto (compuestos 24 o 25) con trastuzumab-N3 (compuesto 13b).
La Figura 12b muestra la eficacia de la conjugación de los derivados de DIBAC-pireno conjugados a través de un enlazador de sulfamida (compuesto 29) o un enlazador PEG corto (compuestos 27 o 28) con trastuzumab-N3 (compuesto 13b).
La Figura 13a muestra la eficacia de la conjugación de los derivados de BCN-maitansina conjugados a través de un enlazador de sulfamida (compuesto 33) o un enlazador PEG corto (compuestos 30-32) con trastuzumab-N3 (compuesto 13b).
La Figura 13b muestra la eficacia de conjugación de los derivados de BCN-maitansina conjugados a través de un enlazador de sulfamida (compuesto 33) o un enlazador PEG corto (compuestos 30-32, con e
Figure imgf000007_0001
uesto 30 solapándose con 33) con trastuzumab-F2-GalNAz (compuesto 13c).
La Figura 14a muestra la eficacia de la conjugación de los derivados de BCN-duocarmicina conjugados a través de un enlazador de sulfamida (compuesto 35) o un enlazador PEG corto (compuesto 34) con trastuzumab-N3 (compuesto 13b).
La Figura 14b muestra la eficacia de la conjugación de los derivados de la BCN-duocarmicina conjugados a través de un enlazador de sulfamida (compuesto 35) o un enlazador PEG corto (compuesto 34) con trastuzumab-F2-GalNAz (compuesto 13c).
La Figura 15 muestra el esquema sintético general para convertir un alcohol (40) en un derivado de carbamoil sulfamida (42) mediante un tratamiento consecutivo con isocianato de clorosulfonilo (CSI) y una amina. La carbamoil sulfamida 42 puede convertirse en una acilsulfamida (44) si el alcohol de partida es ferc-butanol, después de la desprotección del ferc-butilo con ácido para proporcionar una sulfamida 43, que se puede acilar para proporcionar 44.
La Figura 16 muestra la síntesis de varios enlazadores-conjugados en donde Q1 es un grupo N-maleimidilo y D es un pireno. El compuesto 18 está de acuerdo con la invención, mientras que el compuesto 17 es un ejemplo comparativo.
La Figura 17 muestra la síntesis de varios enlazadores-conjugados, en donde Q1 es un grupo biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo] (también denominado grupo BCN) y D es un grupo bencilo.
La Figura 18 muestra la síntesis de un enlazador-conjugado que es portador de dos grupos sulfamida en el enlazador, en donde Q1 es un grupo biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo] (también denominado grupo BCN) y D es un grupo bencilo.
La Figura 19 muestra la síntesis de varios enlazadores-conjugados, en donde Q1 es un grupo biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo] (también denominado grupo BCN) y D es un grupo pireno.
La Figura 20 muestra la síntesis de varios enlazadores-conjugados en donde Q1 es un grupo heterocicloalquinilo (DIBAC) y D es un grupo pireno.
La Figura 21 muestra la síntesis de un enlazador-conjugado que comprende dos moléculas diana D, en donde Q1 es un grupo bicido[6.1.0]non-4-in-9-ilo] (también denominado grupo BCN) y D es una citotoxina (maitansina).
La Figura 22 muestra un conjunto representativo de grupos funcionales (F1) en una biomolécula, presentes naturalmente o introducidos mediante manipulación, que después de la reacción con el grupo reactivo Q1 conducen a una conexión con el grupo Z3 El grupo de conexión Z3 también puede ser el resultado de una reacción entre F2 y Q2 El grupo funcional F1 también puede introducirse artificialmente (manipulación) en una biomolécula en cualquier posición elegida.
La Figura 23 muestra el grado de agregación de los bioconjugados 36-38 de acuerdo con la invención.
La Figura 24 muestra el progreso de la agregación durante un período de 2 semanas para un bioconjugado de acuerdo con la invención con un enlazador de sulfamida (36 conjugado con 13a) frente a un bioconjugado comparativo con un enlazador PEG (30 conjugado con 13a), así como trastuzumab.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
El verbo "comprender" y sus conjugaciones, tal y como se usan en esta descripción y en las reivindicaciones, se usa en su sentido no limitativo para indicar que se incluyen los elementos que siguen a la palabra, pero que no se excluyen los elementos que no se mencionan específicamente.
Además, la referencia a un elemento por el artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que esté presente más de un elemento, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos. El artículo indefinido "un" o "una" generalmente significa "al menos uno-una".
Los compuestos descritos en esta descripción y en las reivindicaciones pueden comprender uno o varios centros asimétricos, y pueden existir diferentes diastereómeros y/o enantiómeros de los compuestos. La descripción de cualquier compuesto en esta descripción y en las reivindicaciones se entiende que incluye todos los diastereómeros, y mezclas de los mismos, a menos que se indique lo contrario. Además, la descripción de cualquier compuesto en esta descripción y en las reivindicaciones se entiende que incluye tanto los enantiómeros individuales, como cualquier mezcla, racémica o de otro tipo, de los enantiómeros, a menos que se indique lo contrario. Cuando la estructura de un compuesto se representa como un enantiómero específico, debe entenderse que la invención de la presente solicitud no está limitada a ese enantiómero específico.
Los compuestos pueden presentarse en diferentes formas tautómeras. Los compuestos de acuerdo con la invención se entiende que incluyen todas las formas tautómeras, a menos que se indique lo contrario. Cuando la estructura de un compuesto se representa como un tautómero específico, debe entenderse que la invención de la presente solicitud no se limita a ese tautómero específico.
Los compuestos descritos en esta descripción y en las reivindicaciones pueden existir además como diastereoisómeros exo y endo. A menos que se indique lo contrario, la descripción de cualquier compuesto en la descripción y en las reivindicaciones se entiende que incluye tanto el diastereoisómero exo individual como el endo individual de un compuesto, así como mezclas de los mismos. Cuando la estructura de un compuesto se describe como un diastereómero exo o endo específico, debe entenderse que la invención de la presente solicitud no se limita a ese diastereómero endo o exo específico.
Además, los compuestos descritos en esta descripción y en las reivindicaciones pueden existir como isómeros cis y trans. A menos que se indique lo contrario, la descripción de cualquier compuesto en la descripción y en las reivindicaciones se entiende que incluye tanto el isómero cis individual como el trans individual de un compuesto, así como mezclas de los mismos. A modo de ejemplo, cuando la estructura de un compuesto se describe como un isómero cis, ha de entenderse que el isómero trans correspondiente o mezclas del isómero cis y trans no están excluidas de la invención de la presente solicitud. Cuando la estructura de un compuesto se describe como un isómeros cis o trans específico, debe entenderse que la invención de la presente solicitud no se limita a ese isómero cis o trans específico.
Los grupos alquilo no sustituidos tienen la fórmula general CnH2n+1 y pueden ser lineales o ramificados. Opcionalmente, los grupos alquilo están sustituidos con uno o varios sustituyentes especificados más detalladamente en esta memoria. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen metilo, etilo, propilo, 2-propilo, t-butilo, 1-hexilo, 1-dodecilo, etc.
Un grupo cicloalquilo es un grupo alquilo cíclico. Los grupos cicloalquilo no sustituidos comprenden al menos tres átomos de carbono y tienen la fórmula general CnH2n-1. Opcionalmente, los grupos cicloalquilo están sustituidos con uno o varios sustituyentes especificados de forma adicional en esta memoria. Ejemplos de grupos cicloalquilo incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo.
Un grupo alquenilo comprende uno o varios dobles enlaces carbono-carbono, y puede ser lineal o ramificado. Los grupos alquenilo no sustituidos que comprenden un doble enlace C - C tienen la fórmula general CnH2n-1. Los grupos alquenilo no sustituidos que comprenden dos dobles enlaces C - C tienen la fórmula general CnH2n-3. Un grupo alquenilo puede comprender un doble enlace terminal carbono-carbono y/o un doble enlace interno carbonocarbono. Un grupo alquenilo terminal es un grupo alquenilo en el que un doble enlace carbono-carbono está situado en una posición terminal de una cadena de carbono. Un grupo alquenilo también puede comprender dos o más dobles enlaces carbono-carbono. Ejemplos de un grupo alquenilo incluyen etenilo, propenilo, isopropenilo, t-butenilo, 1,3-butadienilo, 1,3-pentadienilo, etc. A menos que se indique lo contrario, un grupo alquenilo puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente como se define a continuación. A menos que se indique lo contrario, un grupo alquenilo puede estar interrumpido opcionalmente por uno o varios heteroátomos seleccionados independientemente a partir del grupo que consiste en O, N y S.
Un grupo alquinilo comprende uno o varios triples enlaces carbono-carbono, y puede ser lineal o ramificado. Los grupos alquinilo no sustituidos que comprenden un triple enlace C - C tienen la fórmula general CnH2n-3. Un grupo alquinilo puede comprender un triple enlace carbono-carbono terminal y/o un triple enlace carbono-carbono interno. Un grupo alquinilo terminal es un grupo alquinilo en el que un triple enlace carbono-carbono está situado en una posición terminal de una cadena de carbono. Un grupo alquinilo también puede comprender dos o más triples enlaces carbono-carbono. A menos que se indique lo contrario, un grupo alquinilo puede estar opcionalmente sustituido con uno o varios sustituyentes, seleccionados independientemente, como se define a continuación. Ejemplos de un grupo alquinilo incluyen etinilo, propinilo, isopropinilo, t-butinilo, etc. A menos que se indique lo contrario, un grupo alquinilo puede estar interrumpido opcionalmente por uno o varios heteroátomos seleccionados independientemente a partir del grupo que consiste en O, N y S.
Un grupo arilo comprende de seis a doce átomos de carbono y puede incluir estructuras monocíclicas y bicíclicas. Opcionalmente, el grupo arilo puede estar sustituido con uno o varios sustituyentes especificados más detalladamente en esta memoria. Ejemplos de grupos arilo son fenilo y naftilo.
Los grupos arilalquilo y los grupos alquilarilo comprenden al menos siete átomos de carbono y pueden incluir estructuras monocíclicas y bicíclicas. Opcionalmente, los grupos arilalquilo y alquilarilo pueden estar sustituidos con uno o varios sustituyentes especificados adicionalmente en esta memoria. Un grupo arilalquilo es, por ejemplo, bencilo. Un grupo alquilarilo es, por ejemplo, 4-f-butilfenilo.
Los grupos heteroarilo comprenden al menos dos átomos de carbono (es decir, al menos C2) y uno o varios heteroátomos N, O, P o S. Un grupo heteroarilo puede tener una estructura monocíclica o bicíclica. Opcionalmente, el grupo heteroarilo puede estar sustituido con uno o varios sustituyentes especificados más detalladamente en esta memoria. Ejemplos de grupos heteroarilo adecuados incluyen piridinilo, quinolinilo, pirimidinilo, pirazinilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, pirrolilo, furanilo, triazolilo, benzofuranilo, indolilo, purinilo, benzoxazolilo, tienilo, fosfolilo y oxazolilo.
Los grupos heteroarilalquilo y los grupos alquilheteroarilo comprenden al menos tres átomos de carbono (es decir, al menos C3) y puede incluir estructuras monocíclicas y bicíclicas. Opcionalmente, los grupos heteroarilo pueden estar sustituidos con uno o varios sustituyentes especificados adicionalmente en esta memoria.
Cuando un grupo arilo se indica como un grupo (hetero)arilo, la indicación se entiende que incluye un grupo arilo y un grupo heteroarilo. De manera similar, un grupo alquil(hetero)arilo se entiende que incluye un grupo alquilarilo y un grupo alquilheteroarilo, y (hetero)arilalquilo se entiende que incluye un grupo arilalquilo y un grupo heteroarilalquilo. Por lo tanto, un grupo (hetero)arilo C2 - C24 debe interpretarse como que incluye un grupo heteroarilo C2 - C24 y un grupo arilo C6 - C24. Del mismo modo, un grupo alquil(hetero)arilo C3 - C24 se entiende que incluye un grupo alquilarilo C7 - C24 y un grupo alquilheteroarilo C3 - C24, y un (hetero)arilalquilo C3 - C24 se entiende que incluye un grupo arilalquilo C7 - C24 y un grupo heteroarilalquilo C3 - C24.
Un grupo cicloalquinilo es un grupo alquinilo cíclico. Un grupo cicloalquinilo no sustituido que comprende un triple enlace tiene la fórmula general CnH2n-5. Opcionalmente, un grupo cicloalquinilo está sustituido con uno o varios sustituyentes especificados más detalladamente en esta memoria. Un ejemplo de un grupo cicloalquinilo es ciclooctinilo.
Un grupo heterocicloalquinilo es un grupo cicloalquinilo interrumpido por heteroátomos seleccionados a partir del grupo de oxígeno, nitrógeno y azufre. Opcionalmente, un grupo heterocicloalquinilo está sustituido con uno o varios sustituyentes especificados más detalladamente en esta memoria. Un ejemplo de un grupo heterocicloalquinilo es azaciclooctinilo.
Un grupo (hetero)arilo comprende un grupo arilo y un grupo heteroarilo. Un grupo alquil(hetero)arilo comprende un grupo alquilarilo y un grupo alquilheteroarilo. Un grupo (hetero)arilalquilo comprende un grupo arilalquilo y un grupo heteroarilalquilo. Un grupo (hetero)alquinilo comprende un grupo alquinilo y un grupo heteroalquinilo. Un grupo (hetero)cicloalquinilo comprende un grupo cicloalquinilo y un grupo heterocicloalquinilo.
Un compuesto (hetero)cicloalquino se define en esta memoria como un compuesto que comprende un grupo (hetero)cicloalquinilo.
Varios de los compuestos descritos en esta descripción y en las reivindicaciones pueden describirse como compuestos (hetero)cicloalquinos fusionados, es decir, compuestos (hetero)cicloalquinos en los que una segunda estructura de anillo está fusionada, es decir, anulada, con el grupo (hetero)cidoalquinilo. Por ejemplo, en un compuesto (hetero)ciclooctino fusionado, un cicloalquilo (por ejemplo, un ciclopropilo) o un areno (por ejemplo, benceno) puede estar anulado con el grupo (hetero)ciclooctinilo. El triple enlace del grupo (hetero)ciclooctinilo en un compuesto (hetero)ciclooctino fusionado puede estar localizado en cualquiera de las tres ubicaciones posibles, es decir, en la posición 2, 3 o 4 del resto ciclooctino (numeración según la "Nomenclatura de la IUPAC de Química Orgánica", Norma A31.2). La descripción de cualquier compuesto (hetero)ciclooctino fusionado en esta descripción y en las reivindicaciones se entiende que incluye los tres regioisómeros individuales del resto ciclooctino.
A menos que se indique lo contrario, los grupos alquilo, grupos cicloalquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos (hetero)arilo, grupos (hetero)arilalquilo, grupos alquil(hetero)arilo, grupos alquileno, grupos alquenileno, grupos alquinileno, grupos cicloalquileno, grupos cicloalquenileno, grupos cicloalquinileno, grupos (hetero)arileno, grupos alquil(hetero)arileno, grupos (hetero)arilalquileno, grupos (hetero)arilalquenileno, grupos (hetero)arilalquileno, grupos alquenilo, grupos alcoxi, grupos alqueniloxi, grupos (hetero)ariloxi, grupos alquiniloxi y los grupos cicloalquiloxi pueden estar sustituidos con uno o varios sustituyentes seleccionados independientemente a partir del grupo que consiste en grupos alquilo C1 - C12, grupos alquenilo C2 - C12, grupos alquinilo C2 - C12, grupos cicloalquilo
C3 - C12, grupos cicloalquenilo C5 - C12, grupos cicloalquinilo C8 - C12, grupos alcoxi C1 - C12, grup C12, grupos alquiniloxi C2 - C12, grupos cicloalquiloxi C3 - C12, halógenos, grupos amino, grupos oxo y sililo, en donde los grupos sililo pueden estar representados por la fórmula (R20)3Si-, en donde R20 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en grupos alquilo C1 - C12, grupos alquenilo C2 - C12, grupos alquinilo C2 - C12, grupos cicloalquilo C3 - C12, grupos alcoxi C1 - C12, grupos alqueniloxi C2 - C12, grupos alquiniloxi
C2 - C12 y grupos cicloalquiloxi C3 - C12, en donde los grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos cicloalquilo, grupos alcoxi, grupos alqueniloxi, grupos alquiniloxi y grupos cicloalquiloxi están opcionalmente sustituidos, en donde los grupos alquilo, los grupos alcoxi, los grupos cicloalquilo y los grupos cicloalcoxi están opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir del grupo que consiste en O, N y
S.
El término general "azúcar" se usa en esta memoria para indicar un monosacárido, por ejemplo glucosa (Glc), galactosa (Gal), manosa (Man) y fucosa (Fuc). La expresión "derivado de azúcar" se usa en esta memoria para indicar un derivado de un azúcar monosacárido, es decir, un azúcar monosacárido que comprende sustituyentes y/o grupos funcionales. Ejemplos de un derivado de azúcar incluyen amino azúcares y ácidos de azúcar, por ejemplo, glucosamina (GlcNH2), galactosamina (GalNH2), N-acetilglucosamina (GlcNAc), N-acetilgalactosamina (GalNAc), ácido siálico (Sia), que también se conoce como ácido N-acetilneuramínico (NeuNAc), y ácido N-acetilmurámico (MurNAc), ácido glucurónico (GlcA) y ácido idurónico (IdoA).
El término "nucleótido" se usa en esta memoria en su significado científico normal. El término "nucleótido" se refiere a una molécula que está compuesta por una nucleobase, un azúcar de cinco carbonos (ya sea ribosa o 2-desoxirribosa) y uno, dos o tres grupos fosfato. Sin el grupo fosfato, la nucleobase y el azúcar forman un nucleósido.
Por lo tanto, un nucleótido también se puede llamar un monofosfato de nucleósido, un difosfato de nucleósido o un trifosfato de nucleósido. La nucleobase puede ser adenina, guanina, citosina, uracilo o timina. Los ejemplos de un nucleótido incluyen difosfato de uridina (UDP), difosfato de guanosina (GDP), difosfato de timidina (TDP), difosfato de citidina (CDP) y monofosfato de citidina (CMP).
El término "proteína" se usa esta memoria en su significado científico normal. En esta memoria, los polipéptidos que comprenden aproximadamente 10 o más aminoácidos se consideran proteínas. Una proteína puede comprender aminoácidos naturales, pero también no naturales.
El término "glicoproteína" se usa esta memoria en su significado científico normal y se refiere a una proteína que comprende una o varias cadenas de monosacáridos u oligosacáridos ("glicanos") unidas covalentemente a la proteína. Un glicano puede estar fijado a un grupo hidroxilo en la proteína (glicano unido a O), p. ej., al grupo hidroxilo de serina, treonina, tirosina, hidroxilisina o hidroxiprolina, o a una función amida en la proteína (N-glicoproteína), p. ej., asparagina o arginina, o a un carbono en la proteína (glicoproteína C), por ej., triptófano. Una glicoproteína puede comprender más de un glicano, puede comprender una combinación de uno o varios monosacáridos y uno o varios glicanos de oligosacáridos, y puede comprender una combinación de glicanos unidos a N, unidos a O y unidos a C. Se estima que más del 50% de todas las proteínas tienen alguna forma de glicosilación y, por lo tanto, se califican como glicoproteínas. Ejemplos de glicoproteínas incluyen PSMA (antígeno de membrana específico de la próstata), CAL (lipasa de candida antartica), gp41, gp120, EPO (eritropoyetina), proteína anticongelante y anticuerpos.
El término "glicano" se usa esta memoria en su significado científico normal y se refiere a una cadena de monosacáridos u oligosacáridos que está unida a una proteína. El término glicano, por lo tanto, se refiere a la parte de carbohidrato de una glicoproteína. El glicano se fija a una proteína a través del carbono C-1 de un azúcar, que puede no tener una sustitución adicional (monosacárido) o puede estar sustituido adicionalmente en uno o varios de sus grupos hidroxilo (oligosacárido). Un glicano natural comprende normalmente de 1 a aproximadamente 10 restos sacáridos. Sin embargo, cuando una cadena de sacáridos más larga está unida a una proteína, dicha cadena de sacáridos también se considera en esta memoria un glicano. Un glicano de una glicoproteína puede ser un monosacárido. Normalmente, un glicano monosacárido de una glicoproteína consiste en una única Nacetilglucosamina (GIcNAc), glucosa (Glc), mañosa (Man) o fucosa (Fuc) aislada, fijada covalentemente a la proteína. Un glicano también puede ser un oligosacárido. Una cadena de oligosacáridos de una glicoproteína puede ser lineal o ramificada. En un oligosacárido, el azúcar que se fija directamente a la proteína, se denomina azúcar central. En un oligosacárido, un azúcar que no está fijado directamente a la proteína y que se fija a al menos otros dos azúcares, se denomina un azúcar interno. En un oligosacárido, un azúcar que no está fijado directamente a la proteína sino a otro azúcar, es decir, que no es portador de más sustituyentes de azúcar en uno o varios de sus otros grupos hidroxilo, se denomina el azúcar terminal. Para evitar dudas, pueden existir múltiples azúcares terminales en un oligosacárido de una glicoproteína, pero solo un azúcar central. Un glicano puede ser un glicano unido a O, un glicano unido a N o un glicano unido a C. En un glicano unido a O, un glicano monosacárido u oligosacárido está unido a un átomo de O en un aminoácido de la proteína, normalmente a través de un grupo hidroxilo de serina (Ser) o treonina (Thr). En un glicano unido a N, un glicano monosacárido u oligosacárido está unido a la proteína a través de un átomo de N en un aminoácido de la proteína, normalmente a través de un nitrógeno de la amida en la cadena lateral de asparagina (Asn) o arginina (Arg). En un glicano unido a C, un glicano monosacárido u oligosacárido está unido a un átomo de C en un aminoácido de la proteína, normalmente a un átomo de C de triptófano (Trp).
El término "anticuerpo" se usa en esta memoria en su significado científico normal. Un anticuerpo es una proteína generada por el sistema inmunitario que es capaz de reconocer y de unirse a un antígeno específico. Un anticuerpo es un ejemplo de una glicoproteína. El término anticuerpo en esta memoria se usa en su sentido más amplio e incluye específicamente anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, dímeros, multímeros, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), fragmentos de anticuerpos y anticuerpos de cadena simple y doble. El término "anticuerpo" en esta memoria también se entiende que incluye anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno del cáncer. El término "anticuerpo" se entiende que incluye anticuerpos completos, pero también fragmentos de un anticuerpo, por ejemplo un fragmento Fab de anticuerpo, F(ab')2, un fragmento Fv o un fragmento Fc de un anticuerpo escindido, un fragmento scFv-Fc, un minicuerpo, un diacuerpo o un scFv. Además, el término incluye anticuerpos modificados genéticamente y derivados de un anticuerpo. Los anticuerpos, los fragmentos de anticuerpos y los anticuerpos modificados genéticamente pueden obtenerse mediante métodos que se conocen en la técnica. Entre los ejemplos típicos de anticuerpos se incluyen, entre otros, abciximab, rituximab, basiliximab, palivizumab, infliximab, trastuzumab, alemtuzumab, adalimumab, tositumomab-1131, cetuximab, ibrituximab tiuxetan, omalizumab, bevacizumab, natalizumab, ranibizumab, panitumumab, eculizumab, certolizumab pegol, golimumab, canakinumab, catumaxomab, ustekinumab, tocilizumab, ofatumumab, denosumab, belimumab, ipilimumab y brentuximab.
Un enlazador se define en esta memoria como un resto que conecta dos o más elementos de un compuesto. Por ejemplo, en un bioconjugado, una biomolécula y una molécula diana están conectadas covalentemente entre sí a través de un enlazador; en un enlazador-conjugado un grupo reactivo Q1 está conectado covalentemente con una molécula diana a través de un enlazador; en un enlazador-estructura artificial un grupo reactivo Q1 está covalentemente conectado con un grupo reactivo Q2 a través de un enlazador. Un enlazador puede comprender uno o varios restos espaciadores.
Un resto espaciador se define en esta memoria como un resto que espacia (es decir, proporciona una distancia entre ellos) y une covalentemente dos (o más) partes de un enlazador. El enlazador puede formar parte, por ejemplo, de un enlazador-estructura artificial, un enlazador-conjugado o un bioconjugado, como se define a continuación.
Un enlazador-estructura artificial se define en esta memoria como un compuesto en el que un grupo reactivo Q1 está covalentemente conectado con un grupo reactivo Q2 a través de un enlazador. Un enlazador-estructura artificial comprende un grupo reactivo Q1 capaz de reaccionar con un grupo reactivo presente en una biomolécula y un grupo reactivo Q2 capaz de reaccionar con un grupo reactivo presente en una molécula diana. Q1 y Q2 pueden ser iguales o diferentes. Un enlazador-estructura artificial también puede comprender más de un grupo reactivo Q1 y/o más de un grupo reactivo Q2. Un enlazador-estructura artificial también se puede indicar como Q1-Sp-Q2, en donde Q1 es un grupo reactivo capaz de reaccionar con un grupo reactivo F1 presente en una biomolécula, Q2 es un grupo reactivo capaz de reaccionar con un grupo reactivo F2 presente en una molécula diana y Sp es un resto espaciador. Cuando un enlazador-estructura artificial comprende más de un grupo reactivo Q1 y/o más de un grupo reactivo Q2 , el enlazador-estructura artificial se puede indicar como (Q1)y-Sp-(Q2)z , en donde y es un número entero en el intervalo de 1 a 10 y z es un número entero en el intervalo de 1 a 10. Preferiblemente, y es 1, 2, 3 o 4, más preferiblemente y es 1 o 2 y lo más preferiblemente, y es 1. Preferiblemente, z es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, más preferiblemente z es 1, 2, 3 o 4, aún más preferiblemente z es 1, 2 o 3, incluso aún más preferiblemente z es 1 o 2 y lo más preferiblemente z es 1. Más preferiblemente, y es 1 o 2, preferiblemente 1, y z es 1, 2, 3 o 4, pero aún más preferiblemente y es 1 o 2, preferiblemente 1, y z es 1, 2 o 3, pero aún más preferiblemente y es 1 o 2, preferiblemente 1, y z es 1 o 2, y lo más preferiblemente y es 1 y z es 1.
Un enlazador-conjugado se define en esta memoria como un compuesto en el que una molécula diana está conectada covalentemente con un grupo reactivo Q1, a través de un enlazador. Se puede obtener un enlazadorconjugado mediante una reacción de un grupo reactivo Q2 presente en un enlazador-estructura artificial con un grupo reactivo presente en una molécula diana. Un enlazador-conjugado comprende un grupo reactivo Q1 que es capaz de reaccionar con un grupo reactivo presente en una biomolécula. Un enlazador-conjugado puede comprender uno o varios restos espaciadores. Un enlazador-conjugado puede comprender más de un grupo reactivo Q1 y/o más de una molécula diana.
Un bioconjugado se define en esta memoria como un compuesto en el que una biomolécula está conectada covalentemente con una molécula diana a través de un enlazador. Un bioconjugado comprende una o varias biomoléculas y/o una o varias moléculas diana. El enlazador puede comprender uno o varios restos espaciadores. Cuando un compuesto en esta memoria se denomina un compuesto que comprende un extremo alfa y un extremo omega, dicho compuesto comprende dos (o más) extremos, en donde el primer extremo se denomina el extremo alfa y el segundo extremo se denomina el extremo omega. Dicho compuesto puede comprender más de dos extremos, es decir, un tercer extremo, un cuarto extremo, etc., pueden estar presentes en el compuesto.
Una biomolécula se define en esta memoria como cualquier molécula que se puede aislar a partir de la naturaleza o cualquier molécula compuesta por elementos fundamentales moleculares más pequeños que son los constituyentes de estructuras macromoleculares obtenidas a partir de la naturaleza, en particular ácidos nucleicos, proteínas, glicanos y lípidos. Ejemplos de una biomolécula incluyen una enzima, una proteína (no catalítica), un polipéptido, un péptido, un aminoácido, un oligonucleótido, un monosacárido, un oligosacárido, un polisacárido, un glicano, un lípido y una hormona.
Una molécula diana, también denominada molécula de interés (MOI), se define en esta memoria como una estructura molecular que posee una propiedad deseada que se imparte en la biomolécula después de la conjugación.
La expresión "sal del mismo" significa un compuesto formado cuando un protón ácido, normalmente un protón de un ácido, se reemplaza por un catión, tal como un catión metálico o un catión orgánico, y similares. Cuando es aplicable, la sal es una sal farmacéuticamente aceptable, aunque esto no es necesario para las sales que no están destinadas a la administración a un paciente. Por ejemplo, en una sal de un compuesto, el compuesto puede estar protonado por un ácido inorgánico u orgánico para formar un catión, en donde la base conjugada del ácido inorgánico u orgánico es el componente aniónico de la sal.
La expresión sal "farmacéuticamente aceptada" significa una sal que es aceptable para la administración a un paciente, tal como un mamífero (sales con contraiones que son aceptablemente seguras en mamíferos para un régimen de dosificación dado). Esas sales se pueden obtener a partir de bases inorgánicas u orgánicas farmacéuticamente aceptables y a partir de ácidos inorgánicos u orgánicos farmacéuticamente aceptables. "Sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales farmacéuticamente aceptables de un compuesto, cuyas sales se obtienen a partir de una variedad de contraiones orgánicos e inorgánicos conocidos en la técnica y que incluyen, por ejemplo, sodio, potasio, calcio, magnesio, amonio, tetraalquilamonio, etc., y cuando la molécula contiene una funcionalidad básica, sales de ácidos orgánicos o inorgánicos, como clorhidrato, bromhidrato, formiato, tartrato, besilato, mesilato, acetato, maleato, oxalato, etc.
Enlazador-conjugado
En esta memoria, se describe un enlazador de sulfamida y conjugados de dicho enlazador de sulfamida. La expresión "enlazador de sulfamida" se refiere a un enlazador que comprende un grupo sulfamida, más particularmente un grupo acilsulfamida [-C(O)-N(H)-S(O)2-N(R1)-] y/o un grupo carbamoil sulfamida [-O-C(O)-N(H)-S(O)2-N(R1)-].
La presente invención se refiere al uso de un enlazador de sulfamida de acuerdo con la invención en un procedimiento para la preparación de un bioconjugado. La invención se refiere además a un procedimiento para la preparación de un bioconjugado y a un bioconjugado obtenible por dicho procedimiento. Dicho procedimiento para la preparación de un bioconjugado se describe con más detalle a continuación.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto que comprende un extremo alfa y un extremo omega, comprendiendo el compuesto en el extremo alfa un grupo reactivo Q1 capaz de reaccionar con un grupo funcional F1 presente en una glicoproteína y en el extremo omega una molécula diana D seleccionada a partir del grupo que consiste en un fármaco, un profármaco, un agente de diagnóstico, una proteína, un péptido, un polipéptido, un marcador peptídico, un aminoácido, un glicano, un lípido, una vitamina, un esteroide, un nucleótido, un nucleósido, un polinucleótido, un ARN, un ADN, una molécula informadora, un polímero, una superficie sólida, un hidrogel, una nanopartícula, una micropartícula y una biomolécula, comprendiendo el compuesto además un grupo de acuerdo con la fórmula (1) o una sal del mismo:
Figure imgf000013_0001
en donde:
a es 0 o 1 ; y
R1 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo Ci - C24, grupos cicloalquilo C3 - C24, grupos (hetero)arilo C2 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C3 alquilo Ci - C24, grupos cicloalquilo C3 - C24, grupos (hetero)arilo C2 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C3 - C24 opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir de O, S y NR3, en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo C1 - C4, o R1 es una molécula diana D, en donde la molécula diana está conectada opcionalmente con N a través de un resto espaciador;
y Q1 se selecciona a partir del grupo que consiste en un grupo N-maleimidilo opcionalmente sustituido, un grupo (hetero)cicloalquinilo y un grupo biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo].
Dicho compuesto también se conoce como un enlazador-conjugado. Un enlazador-conjugado se define en esta memoria como un compuesto en el que una molécula diana está conectada covalentemente con un grupo reactivo
Q1, a través de un enlazador. El compuesto comprende un extremo alfa y un extremo omega, en otras palabras, el compuesto comprende un primer extremo y un segundo extremo. El primer extremo del compuesto también puede denominarse un extremo alfa, y el segundo extremo también puede denominarse un extremo omega del compuesto.
Las expresiones "extremo alfa" y "extremo omega" son conocidas por los expertos en la materia. La invención también se refiere por tanto a un compuesto que comprende un primer extremo y un segundo extremo, comprendiendo el compuesto en el primer extremo un grupo reactivo Q1 capaz de reaccionar con un grupo funcional
F1 presente en una glicoproteína y en el segundo extremo una molécula diana D, comprendiendo el compuesto además un grupo de acuerdo con la fórmula (1) o una de sus sales, en donde el grupo de acuerdo con la fórmula
(1), o la sal del mismo, está situado entre dicho primer extremo y dicho segundo extremo del compuesto, y en donde el grupo de acuerdo con la fórmula (1) es como se ha definido anteriormente.
En el compuesto de acuerdo con la invención, el grupo de acuerdo con la fórmula (1), o la sal del mismo, está situado entre dicho extremo alfa y dicho extremo omega del compuesto. El grupo reactivo Q1 se une covalentemente al extremo alfa del compuesto, y la molécula diana D se une covalentemente a un extremo omega del compuesto.
El compuesto de acuerdo con la invención también puede denominarse un enlazador-conjugado. En el enlazadorconjugado de acuerdo con la invención, una molécula diana D está fijada covalentemente a un grupo reactivo Q1 a través de un enlazador, y dicho enlazador comprende un grupo de acuerdo con la fórmula (1), o una sal del mismo, como se ha definido anteriormente.
Cuando el enlazador-conjugado de acuerdo con la invención comprende una sal del grupo de acuerdo con la fórmula (1), la sal es preferiblemente una sal farmacéuticamente aceptable.
El enlazador-conjugado de acuerdo con la invención puede comprender más de una molécula diana D. Por consiguiente, el enlazador-conjugado puede comprender de este modo más de un extremo omega, p. ej., un segundo extremo omega (tercero, cuarto, quinto, etc.), el segundo extremo omega (tercero, cuarto, quinto, etc.) puede estar fijado covalentemente a una molécula diana. De manera similar, el enlazador-conjugado puede comprender más de un grupo reactivo Q1, es decir, el enlazador-conjugado puede comprender más de un extremo alfa. Cuando está presente más de un grupo reactivo Q1, los grupos Q1 pueden ser iguales o diferentes, y cuando más de una molécula diana D está presente, las moléculas diana D pueden ser iguales o diferentes.
Por lo tanto, el enlazador-conjugado de acuerdo con la invención también se puede indicar como (Q1)y-Sp-(D)z, en donde y es un número entero en el intervalo de 1 a 10 y z es un número entero en el intervalo de 1 a 1 0.
La invención también se refiere por ello a un compuesto de acuerdo con la fórmula:
(Q1)y-Sp-(D)z ,
en donde:
y es un número entero en el intervalo de 1 a 1 0 ;
z es un número entero en el intervalo de 1 a 10;
Q1 se selecciona a partir del grupo que consiste en un grupo N-maleimidilo opcionalmente sustituido, un grupo (hetero)cidoalquinilo y un grupo biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo];
D es una molécula diana seleccionada a partir del grupo que consiste en un fármaco, un profármaco, un agente de diagnóstico, una proteína, un péptido, un polipéptido, un marcador peptídico, un aminoácido, un glicano, un lípido, una vitamina, un esteroide, un nucleótido, un nucleósido, un polinucleótido, un ARN, un ADN, una molécula informadora, un polímero, una superficie sólida, un hidrogel, una nanopartícula, una micropartícula y una biomolécula;
Sp es un resto espaciador, en donde un resto espaciador se define como un resto que separa (es decir, proporciona una cierta distancia entre) y une covalentemente el grupo reactivo Q1 y una molécula diana D; y
en donde dicho resto espaciador comprende un grupo de acuerdo con la Fórmula (1) o una de sus sales, en donde el grupo de acuerdo con la Fórmula (1) es como se ha definido anteriormente.
Preferiblemente, y es 1,2, 3 o 4, más preferiblemente y es 1 o 2 y lo más preferiblemente, y es 1. Preferiblemente, z es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, más preferiblemente z es 1, 2, 3 o 4, incluso más preferiblemente z es 1, 2 o 3, aún más preferiblemente z es 1 o 2 y lo más preferiblemente z es 1. Más preferiblemente, y es 1 o 2, preferiblemente 1, y z es 1,2, 3 o 4, pero aún más preferiblemente y es 1 o 2, preferiblemente 1, y z es 1, 2 o 3, y aún más preferiblemente y es 1 o 2, preferiblemente 1, y z es 1 o 2, y lo más preferiblemente y es 1 y z es 1. En una realización preferida, el enlazador-conjugado está de acuerdo con la fórmula Q1-Sp-(D)4, Q1-Sp-(D)3, Q1-Sp-(D)2 o Q1-Sp-D.
El enlazador-conjugado de acuerdo con la invención comprende un grupo de acuerdo con la fórmula (1) tal como se ha definido anteriormente, o una sal del mismo. En una realización preferida, el enlazador-conjugado de acuerdo con la invención comprende un grupo de acuerdo con la fórmula (1) en donde a es 0, o una sal del mismo. En esa realización, el compuesto comprende por tanto un grupo de acuerdo con la fórmula (2) o una sal del mismo:
Figure imgf000014_0001
en donde R1 es como se ha definido anteriormente.
En otra realización preferida, el enlazador-conjugado de acuerdo con la invención comprende un grupo de acuerdo con la fórmula (1) en donde a es 1, o una sal del mismo. En esa realización, el enlazador-conjugado comprende por tanto un grupo de acuerdo con la fórmula (3) o una sal del mismo:
Figure imgf000014_0002
3
en donde R1 es como se ha definido anteriormente.
En los grupos de acuerdo con la fórmula (1), (2) y (3), R1 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos cicloalquilo C3 - C24, grupos (hetero)arilo C2 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C3 - C24, los grupos alquilo C1 - C24, grupos cicloalquilo C3 - C24, grupos (hetero)arilo C2 -C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C3 - C24 opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir de O, S y NR3, en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo C1 - C4, o R1 es una molécula diana D, en donde la molécula diana está conectada opcionalmente con N a través de un resto espaciador; En una realización preferida, R1 es hidrógeno o un grupo alquilo C1 - C20, más preferiblemente R1 es hidrógeno o un grupo alquilo C1 - C16, incluso más preferiblemente R1 es hidrógeno o un grupo alquilo C1 - C10, en donde el grupo alquilo está opcionalmente sustituido y opcionalmente interrumpido por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir de O, S y NR3, preferiblemente O, en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo Ci - C4. En una realización preferida, R1 es hidrogeno. En otra realización preferida, R1 es un grupo alquilo C1 - C20, más preferiblemente un grupo alquilo C1 - C16, incluso más preferiblemente un grupo alquilo C1 - C10, en donde el grupo alquilo está opcionalmente interrumpido por uno o varios átomos de O, y en donde el grupo alquilo está opcionalmente sustituido con un grupo -OH, preferiblemente un grupo -OH terminal. En esa realización, se prefiere además que R1 sea una cadena de (poli)etilenglicol que comprende un grupo terminal -OH. En otra realización preferida, R1 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, metilo, etilo, npropilo, i-propilo, n-butilo, s-butilo y t-butilo, más preferiblemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo e i-propilo, e incluso más preferiblemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, metilo y etilo. Sin embargo, aún más preferiblemente R1 es hidrógeno o metilo, y lo más preferiblemente R1 es hidrogeno
En otra realización preferida, R1 es una molécula diana D. Opcionalmente, la molécula diana D está conectada con N a través de uno o varios restos espaciadores. El resto espaciador, si está presente, se define como un resto que separa, es decir, proporciona una cierta distancia entre, y une covalentemente la molécula diana D y N. La molécula diana D y sus realizaciones preferidas se describen con más detalle a continuación.
Cuando el enlazador-conjugado de acuerdo con la invención comprende dos o más moléculas diana D, las moléculas diana D pueden diferir entre sí.
La molécula diana se selecciona a partir del grupo que consiste en un fármaco, un profármaco, un agente de diagnóstico, una proteína, un péptido, un polipéptido, un marcador peptídico, un aminoácido, un glicano, un lípido, una vitamina, un esteroide, un nucleótido, un nucleósido, un polinucleótido, un ARN, un ADN, una molécula informadora, un polímero, una superficie sólida, un hidrogel, una nanopartícula, una micropartícula y una biomolécula.
Los inventores han encontrado que el uso de un enlazador de sulfamida de acuerdo con la invención mejora la solubilidad del enlazador-conjugado, lo que a su vez mejora significativamente la eficacia de la conjugación. Al emplear enlazadores convencionales, una conjugación eficaz se ve obstaculizada frecuentemente por la relativamente baja solubilidad del enlazador-conjugado en medios acuosos, especialmente cuando se usa una molécula diana relativamente hidrófoba o insoluble en agua. En una realización particularmente preferida, la molécula diana en su forma no conjugada es hidrófoba, normalmente tiene una solubilidad en agua de a lo sumo un 1% (p/p), preferiblemente a lo sumo un 0,1% (p/p), lo más preferiblemente a lo sumo un 0,01% (p/p), determinada a 20°C y 100 kPa. Incluso tales moléculas diana insolubles en agua se someten de forma eficaz a una conjugación cuando se funcionalizan con un enlazador de sulfamida de acuerdo con la invención. En la presente memoria, la "forma no conjugada" se refiere a la molécula diana que no está funcionalizada o conjugada con el enlazador de acuerdo con la invención. Tales formas no conjugadas de moléculas diana son conocidas por los expertos.
La expresión "sustancia activa" en esta memoria se refiere a una sustancia farmacológica y/o biológica, es decir, una sustancia que es biológica y/o farmacéuticamente activa. En el contexto de la invención, las sustancias activas se seleccionan a partir de un fármaco, un profármaco, un agente de diagnóstico, una proteína, un péptido, un polipéptido, un marcador peptídico, un aminoácido, un glicano, un lípido, una vitamina, un esteroide, un nucleótido, un nucleósido, un polinucleótido, un ARN o un ADN. Los ejemplos de marcadores peptídicos incluyen péptidos que penetran en las células, como la lactoferrina humana o la poliarginina. Un ejemplo de un glicano es la oligomanosa. Un ejemplo de un aminoácido es lisina.
Cuando la molécula diana es una sustancia activa, la sustancia activa se selecciona preferiblemente a partir del grupo que consiste en fármacos y profármacos. Más preferiblemente, la sustancia activa se selecciona a partir del grupo que consiste en compuestos farmacéuticamente activos, en particular compuestos de peso molecular bajo a medio (por ejemplo, de aproximadamente 200 a aproximadamente 2500 Da, preferiblemente de aproximadamente 300 a aproximadamente 1750 Da). En una realización preferida adicional, la sustancia activa se selecciona a partir del grupo que consiste en citotoxinas, agentes antivíricos, agentes antibacterianos, péptidos y oligonucleótidos. Los ejemplos de citotoxinas incluyen colchicina, alcaloides de la vinca, antraciclinas, camptotecinas, doxorrubicina, daunorrubicina, taxanos, calicheamicinas, tubulisinas, irinotecanos, un inhibidor peptídico, amanitina, deBouganina, duocarmicinas, maitansinas, auristatinas o pirrolobenzodiazepinas (PBDs). Debido a su escasa solubilidad en el agua, las sustancias activas preferidas incluyen alcaloides de la vinca, antraciclinas, camptotecinas, taxanos, tubulisinas, amanitina, duocarmicinas, maitansinas, auristatinas y pirrolobenzodiazepinas, en particular alcaloides de la vinca, antraciclinas, camptotecinas, taxanos, tubulisinas, amanitina y auristatinas.
La expresión "molécula informadora" en esta memoria se refiere a una molécula cuya presencia se detecta fácilmente, por ejemplo, un agente de diagnóstico, un colorante, un fluoróforo, un marcador de isótopos radiactivos, un agente de contraste, un agente de formación de imágenes por resonancia magnética o un marcador de masa. Los expertos en la técnica conocen una amplia variedad de fluoróforos, también denominados sondas fluorescentes. Varios fluoróforos se describen con más detalle, p. ej., en G.T. Hermanson, "Bioconjugate Techniques", Elsevier, 3a ed. 2013, capítulo 10: "Fluorescent probes", p. 395 - 463. Los ejemplos de un fluoróforo incluyen todos los tipos de Alexa Fluor (por ejemplo, Alexa Fluor 555), colorantes de cianina (por ejemplo, Cy3 o Cy5) y derivados de colorantes de cianina, derivados de cumarina, fluoresceína y derivados de fluoresceína, rodamina y derivados de rodamina, derivados de dipirrometeno de boro, derivados de pireno, derivados de naftalimida, derivados de ficobiliproteína (por ejemplo, aloficocianina), cromomicina, quelatos de lantánidos y nanocristales de punto cuántico. Debido a su escasa solubilidad en agua, los fluoróforos preferidos incluyen colorantes de cianina, derivados de cumarina, fluoresceína y sus derivados, derivados de pireno, derivados de naftalimida, cromomicina, quelatos de lantánido y nanocristales de punto cuántico, en particular derivados de cumarina, fluorescencia, derivados de pirina y cromomicina.
Los ejemplos de un marcador de isótopos radioactivos incluyen 99mTc, 111In, 114mIn, 115In,18F, 14C, 64Cu, 131I, 125I, 123I, 212Bi, 88Y, 90Y, 67Cu, 186Rh, 188Rh, 66Ga, 67Ga y 10B, que está conectado opcionalmente a través de un resto quelante tal como, por ejemplo, DTPA (anhídrido dietilentriaminopentaacético), DOTA (ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N"N,,,-tetraacético), NOTA (ácido 1,4,7-triazaciclononano N,N,N"-triacético), TETA (ácido 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano-N,N,N"N ,,,-tetraacético), DTTA (ácido Ní-(p-isotiocianatobencil)-dietilentriamina-Ní,N2,N3,N3-tetraacético), deferoxamina o DFA (N '-[5-[[4-[[5-(acetilhidroxiamino)pentil]amino]-1,4-dioxobutil]hidroxiamino]pentil]-N-(5-aminopentil)-N-hidroxibutanodiamida) o HYNIC (hidrazino-nicotinamida). Las técnicas de marcado isotópico son conocidas por los expertos en la técnica, y se describen con más detalle, p. ej., G G.T. Hermanson, "Bioconjugate Techniques", Elsevier, 3a ed. 2013, capítulo 12: "Isotopic labelling techniques", p. 507 - 534.
Los polímeros adecuados para uso como una molécula diana D en el compuesto de acuerdo con la invención y conocido por un experto en la técnica y varios ejemplos se describen con más detalle, p. ej., en G.T. Hermanson, "Bioconjugate Techniques", Elsevier, 3a ed. 2013, capítulo 18: "PEGylation and synthetic polymer modificaron", p.
787 - 838. Cuando la molécula diana D es un polímero, la molécula diana D se selecciona preferiblemente de manera independiente a partir del grupo que consiste en un poli(etilenglicol) (PEG), un poli(óxido de etileno) (PEO), un polipropilenglicol (PPG), un poli(óxido de propileno) (PPO), un 1,x-diaminoalcano polímero (en donde x es el número de átomos de carbono en el alcano, y preferiblemente x es un número entero en el intervalo de 2 a 200, preferiblemente de 2 a 10), una (poli)etilenglicol diamina (por ejemplo, 1,8-diamino-3,6-dioxaoctano y equivalentes que comprenden cadenas de etilenglicol más largas), un polisacárido (por ejemplo, dextrano), un poli(aminoácido) (por ejemplo, una poli(L-lisina)) y un poli(alcohol vinílico). Debido a su escasa solubilidad en agua, los polímeros preferidos incluyen un polímero de 1,x-diaminoalcano y poli(alcohol vinílico).
Las superficies sólidas adecuadas para uso como una molécula diana D son conocidas por los expertos en la técnica. Una superficie sólida es, por ejemplo, una superficie funcional (por ejemplo, una superficie de un nanomaterial, un nanotubo de carbono, un fulereno o una cápsida de virus), una superficie de metal (por ejemplo, una superficie de titanio, oro, plata, cobre, níquel, estaño, rodio o zinc), una superficie de aleación metálica (en donde la aleación es de, por ejemplo, aluminio, bismuto, cromo, cobalto, cobre, galio, oro, indio, hierro, plomo, magnesio, mercurio, níquel, potasio, plutonio, rodio, escandio, plata, sodio, titanio, estaño, uranio, cinc y/o circonio), una superficie de polímero (en donde el polímero es, por ejemplo, poliestireno, poli(cloruro de vinilo), polietileno, polipropileno, poli(dimetilsiloxano) o polimetilmetacrilato, poliacrilamida), una superficie de vidrio, una superficie de silicona, una superficie de soporte de cromatografía (en donde el soporte de cromatografía es, por ejemplo, un soporte de sílice, un soporte de agarosa, un soporte de celulosa o un soporte de alúmina), etc. Cuando la molécula diana D es una superficie sólida, se prefiere que D se seleccione independientemente a partir del grupo que consiste en una superficie funcional o una superficie de polímero.
Los hidrogeles son conocidos por los expertos en la técnica. Los hidrogeles son redes hinchadas por el agua, formadas por enlaces cruzados entre los constituyentes poliméricos. Véase, por ejemplo, A. S. Hoffman, Adv. Drug Delivery Rev. 2012, 64, 18. Cuando la molécula diana es un hidrogel, se prefiere que el hidrogel esté compuesto por polietilenglicol (PEG) como base polimérica.
Las micropartículas y nanopartículas adecuadas para uso como una molécula diana D son conocidas por los expertos en la técnica. Se describe una variedad de micropartículas y nanopartículas adecuadas, p. ej., en G.T. Hermanson, "Bioconjugate Techniques", Elsevier, 3a ed. 2013, capítulo 14: "Microparticles and nanoparticles", p. 549 - 587. Las micropartículas o nanopartículas pueden tener cualquier forma, por ejemplo, esferas, varillas, tubos, cubos, triángulos y conos. Preferiblemente, las micropartículas o nanopartículas tienen forma esférica. La composición química de las micropartículas y nanopartículas puede variar. Cuando la molécula diana D es una micro o una nanopartícula, la micropartícula o nanopartícula es, por ejemplo, una micropartícula o nanopartícula polimérica, una micropartícula o nanopartícula de sílice o una micropartícula o nanopartícula de oro. Cuando la partícula es una micropartícula o nanopartícula polimérica, el polímero es preferiblemente poliestireno o un copolímero de estireno (por ejemplo, un copolímero de estireno y divinilbenceno, butadieno, acrilato y/o viniltolueno), poli(metacrilato de metilo) (PMMA), poliviniltolueno, poli(metacrilato de hidroxietilo) (pHEMA) o poli(dimetacrilato de etilenglicol/metacrilato de 2-hidroxietilo) [poli(EDGMA/HEMA)]. Opcionalmente, la superficie de las micropartículas o nanopartículas se modifica, por ejemplo, con detergentes, mediante polimerización por injerto de polímeros secundarios o por fijación covalente de otro polímero o de restos espaciadores, etc.
La molécula diana D también puede ser una biomolécula. Las biomoléculas, y sus realizaciones preferidas, se describen con más detalle a continuación. Cuando la molécula diana D es una biomolécula, se prefiere que la biomolécula se seleccione a partir del grupo que consiste en proteínas (que incluyen glicoproteínas y anticuerpos), polipéptidos, péptidos, glicanos, lípidos, ácidos nucleicos, oligonucleótidos, polisacáridos, oligosacáridos, enzimas, hormonas, aminoácidos y monosacáridos.
El enlazador-conjugado de acuerdo con la invención comprende un grupo reactivo Q1 que es capaz de reaccionar con un grupo funcional F1 presente en una glicoproteína. Los expertos en la técnica conocen los grupos funcionales y pueden definirse como cualquier entidad molecular que imparte una propiedad específica sobre la molécula que la alberga. Por ejemplo, un grupo funcional en una glicoproteína puede constituir un grupo amino, un grupo tiol, un ácido carboxílico, un grupo alcohol, un grupo carbonilo, un grupo fosfato o un grupo aromático. El grupo funcional en la glicoproteína puede estar presente de forma natural o puede estar colocado en la glicoproteína mediante una técnica específica, por ejemplo, una técnica (bio)química o una técnica genética. El grupo funcional que se coloca en la glicoproteína puede ser un grupo funcional que está presente en la naturaleza de forma natural, o puede ser un grupo funcional que se prepara por síntesis química, por ejemplo, una azida, un alquino terminal o un resto fosfina. En esta memoria, la expresión "grupo reactivo" puede referirse a un cierto grupo que comprende un grupo funcional, pero también a un grupo funcional en sí mismo. Por ejemplo, un grupo ciclooctinilo es un grupo reactivo que comprende un grupo funcional, a saber, un triple enlace C - C. De manera similar, un grupo N-maleimidilo es un grupo reactivo, que comprende un doble enlace C - C como grupo funcional. Sin embargo, un grupo funcional, por ejemplo un grupo funcional azido, un grupo funcional tiol o un grupo funcional amino, también se pueden denominar en esta memoria un grupo reactivo.
El enlazador-conjugado puede comprender más de un grupo reactivo Q1. Cuando el enlazador-conjugado comprende dos o más grupos reactivos Q1, los grupos reactivos Q1 pueden diferir unos de otros Preferiblemente, el enlazador-conjugado comprende un grupo reactivo Q1.
El grupo reactivo Q1 que está presente en el enlazador-conjugado, es capaz de reaccionar con un grupo funcional F1 que está presente en una glicoproteína. En otras palabras, el grupo reactivo Q1 tiene que ser complementario a un grupo funcional F1 presente en una glicoproteína. En esta memoria, un grupo reactivo se dice que es "complementario" a un grupo funcional, cuando dicho grupo reactivo reacciona selectivamente con dicho grupo funcional, opcionalmente en presencia de otros grupos funcionales. Los grupos reactivos y funcionales complementarios son conocidos por los expertos en la técnica, y se describen con más detalle a continuación.
En el enlazador-conjugado de acuerdo con la invención, el grupo reactivo Q1 se selecciona a partir del grupo que consiste en grupos N-maleimidilo opcionalmente sustituidos, grupos (hetero)cicloalquinilo y grupos biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo]. En el procedimiento para la preparación de un bioconjugado de acuerdo con la invención, Q1 es un grupo reactivo seleccionado a partir del grupo que consiste en grupos N-maleimidilo opcionalmente sustituidos, grupos N-alquilamido halogenados, grupos éster activados, grupos tiol, grupos alquinilo, grupos (hetero)cicloalquinilo, grupos tetrazinilo, grupos azido, grupos fosfina, grupos 1,1-bis(sulfonilmetil)-metilcarbonilo, grupos 1,2-quinona o grupos triazina
En una realización preferida, Q1 es un grupo N-maleimidilo. Cuando Q1 es un grupo N-maleimidilo, Q1 está preferiblemente sin sustituir. Por lo tanto, Q1 está preferiblemente de acuerdo con la fórmula (9a), como se muestra más abajo.
En otra realización preferida, Q1 es un grupo N-alquilamido halogenado. Cuando Q1 es un grupo N-alquilamido halogenado, se prefiere que Q1 esté de acuerdo con la fórmula (9b), como se muestra a continuación, en donde k es un número entero en el intervalo de 1 a 10 y R4 se selecciona a partir del grupo que consiste en - Cl, -Br e -I. Preferiblemente k es 1, 2, 3 o 4, más preferiblemente k es 1 o 2 y lo más preferiblemente k es 1. Preferiblemente, R4 es -I o -Br. Más preferiblemente, k es 1 o 2 y R4 es -I o -Br, y lo más preferiblemente k es 1 y R4 es -I o -Br.
En otro aspecto, Q1 es un grupo sulfoniloxi N-alquilamido. Cuando Q1 es un grupo sulfoniloxi N-alquilamido, se prefiere que Q1 esté de acuerdo con la fórmula (9b), como se muestra a continuación, en donde k es un número entero en el intervalo de 1a 10 y R4 se selecciona a partir del grupo que consiste en -O-mesilo, -O-fenilsulfonilo y -O-tosilo. Preferiblemente k es 1, 2, 3 o 4, más preferiblemente k es 1 o 2, aún más preferiblemente k es 1. Lo más preferiblemente, k es 1 y R4 se selecciona a partir del grupo que consiste en -O-mesilo, -O-fenilsulfonilo y -O-tosilo. En otra realización preferida, Q1 es un grupo éster activado. Los grupos éster activados son conocidos por los expertos en la técnica. Un grupo éster activado se define en esta memoria como un grupo éster que comprende un grupo saliente bueno, en donde el grupo éster carbonilo está unido a dicho grupo saliente bueno. Los grupos salientes buenos son conocidos por los expertos en la técnica. Además, se prefiere que el éster activado esté de acuerdo con la fórmula (9c), como se muestra a continuación, en donde R5 se selecciona a partir del grupo que consiste en -N-succinimidilo (NHS), -N-sulfo-succinimidilo (sulfo-NHS), -(4-nitrofenilo), -pentafluorofenilo o -tetrafluorofenilo (TFP).
En otro aspecto, Q1 es un grupo carbonato. Cuando Q1 es un grupo carbonato, se prefiere que el grupo carbonato sea un grupo carbonato activado. Los grupos carbonato activados son conocidos por los expertos en la técnica. Un grupo carbonato activado se define en esta memoria como un grupo carbonato que comprende un grupo saliente bueno, en donde el grupo carbonilo del carbonato está unido a dicho grupo saliente bueno. Además, se prefiere que el grupo carbonato esté de acuerdo con la fórmula (9d), como se muestra a continuación, en donde R7 se selecciona a partir del grupo que consiste en -N-succinimidilo, -N-sulfo-succinimidilo, -(4-nitrofenilo), -pentafluorofenilo o -tetrafluorofenilo.
En otro aspecto, Q1 es un grupo sulfonil haluro de acuerdo con la fórmula (9e) como se muestra a continuación, en donde X se selecciona a partir del grupo que consiste en F, Cl, Br e I. Preferiblemente X es Cl o Br, más preferiblemente Cl.
En otra realización preferida, Q1 es un grupo tiol (9f), o un derivado o un precursor de un grupo tiol. Un grupo tiol también puede denominarse un grupo mercapto. Cuando Q1 es un derivado o un precursor de un grupo tiol, el derivado de tiol está preferiblemente de acuerdo con la fórmula (9g), (9h) o (9zb) como se muestra a continuación, en donde R8 es un grupo alquilo C1 - C12 opcionalmente sustituido o un grupo (hetero)arilo C2 - C12, V es O o S y R16 es un grupo alquilo C1 - C12 opcionalmente sustituido. Más preferiblemente R8 es un grupo alquilo C1 - C6 opcionalmente sustituido o un grupo (hetero)arilo C2 - C6, e incluso más preferiblemente R8 es metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, s-butilo, t-butilo o fenilo. Aún más preferiblemente, R8 es metilo o fenilo, lo más preferiblemente metilo. Más preferiblemente R16 es un grupo alquilo C1 - C6 opcionalmente sustituido, e incluso más preferiblemente R16 es metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, s-butilo o t-butilo, más preferiblemente metilo. Cuando Q1 es un derivado de tiol de acuerdo con la fórmula (9g) o (9zb), y Q1 reacciona con un grupo reactivo F1 en una glicoproteína, dicho derivado de tiol se convierte en un grupo tiol durante el procedimiento. Cuando Q1 está de acuerdo con la fórmula (9h), Q1 es -SC(O)OR8 o -SC(S)OR8, preferiblemente SC(O)OR8, en donde R8, y realizaciones preferidas del mismo, es como se ha definido anteriormente.
En otro aspecto, Q1 es un grupo alquenilo, en donde el grupo alquenilo es lineal o ramificado, y en donde el grupo alquenilo está opcionalmente sustituido. El grupo alquenilo puede ser un grupo alquenilo terminal o interno. El grupo alquenilo puede comprender más de un doble enlace C - C, y si es así, comprende preferiblemente dos enlaces dobles C - C. Cuando el grupo alquenilo es un grupo dienilo, se prefiere además que los dos enlaces dobles C - C estén separados por un enlace simple C - C (es decir, se prefiere que el grupo dienilo sea un grupo dienilo conjugado). Preferiblemente dicho grupo alquenilo es un grupo alquenilo C2 - C24, más preferiblemente un grupo alquenilo C2 - C12, e incluso más preferiblemente un grupo alquenilo C2 - C6. Además, se prefiere que el grupo alquenilo sea un grupo alquenilo terminal. Más preferiblemente, el grupo alquenilo está de acuerdo con la fórmula (9i) como se muestra a continuación, en donde l es un número entero en el intervalo de 0 a 10, preferiblemente en el intervalo de 0 a 6, y p es un número entero en el intervalo de 0 a 10, preferiblemente de 0 a 6. Más preferiblemente, l es 0, 1, 2, 3 o 4, más preferiblemente l es 0, 1 o 2 y lo más preferiblemente les 0 o 1. Más preferiblemente, p es 0, 1, 2, 3 o 4, más preferiblemente p es 0, 1 o 2 y lo más preferiblemente p es 0 o 1. Se prefiere particularmente que p sea 0 y l sea 0 o 1, o que p sea 1 y l sea 0 o 1.
En otra realización preferida, Q1 es un grupo alquinilo, en donde el grupo alquinilo es lineal o ramificado, y en donde el grupo alquinilo está opcionalmente sustituido. El grupo alquinilo puede ser un grupo alquinilo terminal o interno. Preferiblemente, dicho grupo alquinilo es un grupo alquinilo C2 - C24, más preferiblemente un grupo alquinilo C2 - C12, e incluso más preferiblemente un grupo alquinilo C2 - C6. Además, se prefiere que el grupo alquinilo sea un grupo alquinilo terminal. Más preferiblemente, el grupo alquinilo está de acuerdo con la fórmula (9j) como se muestra a continuación, en donde l es un número entero en el intervalo de 0 a 10, preferiblemente en el intervalo de 0 a 6. Más preferiblemente, les 0, 1, 2, 3 o 4, más preferiblemente les 0, 1 o 2 y lo más preferiblemente les 0 o 1.
En otro aspecto, Q1 es un grupo cicloalquenilo. El grupo cicloalquenilo está opcionalmente sustituido. Preferiblemente dicho grupo cicloalquenilo es un grupo cicloalquenilo C3 - C24, más preferiblemente un grupo cicloalquenilo C3 - C12, e incluso más preferiblemente un grupo cicloalquenilo C3 - C8. En una realización preferida, el grupo cicloalquenilo es un grupo frans-cicloalquenilo, más preferiblemente un grupo frans-ciclooctenilo (también denominado grupo TCO) y lo más preferiblemente un grupo frans-ciclooctenilo de acuerdo con la fórmula (9zi) o (9zj) como se muestra más abajo. En otra realización preferida, el grupo cicloalquenilo es un grupo ciclopropenilo, en donde el grupo ciclopropenilo está opcionalmente sustituido. En otra realización preferida, el grupo cicloalquenilo es un grupo norbornenilo, un grupo oxanorbornenilo, un grupo norbornadienilo o un grupo oxanorbornadienilo, en donde el grupo norbornenilo, el grupo oxanorbornenilo, el grupo norbornadienilo o un grupo oxanorbornadienilo está opcionalmente sustituido. En una realización preferida adicional, el grupo cicloalquenilo está de acuerdo con la fórmula (9k), (9l), (9m) o (9zc) como se muestra a continuación, en donde T es CH2 u O, R9 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, un grupo alquilo C1 - C12 lineal o ramificado o un grupo (hetero)arilo C4 - C12, y R19 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno e hidrocarburos fluorados. Preferiblemente, R9 es independientemente hidrógeno o un grupo alquilo C1 - C6, más preferiblemente R9 es independientemente hidrógeno o un grupo alquilo C1 - C4, incluso más preferiblemente R9 es independientemente hidrógeno o metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, s-butilo o t-butilo. Sin embargo, aún más preferiblemente R9 es independientemente hidrógeno o metilo. En una realización preferida adicional, R19 se selecciona a partir del grupo de hidrógeno y - CF3, -C2F5, -C3F7 y - C4F9, más preferiblemente hidrógeno y - CF3. En una realización preferida adicional, el grupo cicloalquenilo está de acuerdo con la fórmula (9k), en donde un R9 es hidrógeno y el otro R9 es un grupo metilo. En otra realización preferida adicional, el grupo cicloalquenilo está de acuerdo con la fórmula (9l), en donde ambos R9 son hidrogeno. En esas realizaciones, se prefiere adicionalmente que l sea 0 o 1. En otra realización preferida adicional, el grupo cicloalquenilo es un grupo norbornenilo (T es CH2) o un grupo oxanorbornenilo (T es O) de acuerdo con la fórmula (9m), o un grupo norbornadienilo (T es CH2) o un grupo oxanorbornadienilo (T es O) de acuerdo con la fórmula (9zc), en donde R9 es hidrógeno y R19 es hidrógeno o - CF3, preferiblemente - CF3.
En otra realización preferida, Q1 es un grupo (hetero)cicloalquinilo. El grupo (hetero)cicloalquinilo está opcionalmente sustituido. Preferiblemente, el grupo (hetero)cicloalquinilo es un grupo (hetero)ciclooctinilo, es decir, un grupo heterociclooctilino o un grupo ciclooctinilo, en donde el grupo (hetero)cidooctinilo está opcionalmente sustituido. En una realización preferida adicional, el grupo (hetero)ciclooctinilo está de acuerdo con la fórmula (9n), también denominado grupo DIBO, (9o), también denominado grupo DIBAC o (9p), también denominado grupo BARAC, o (9zk), también denominado grupo COMBO, todos ellos como se muestra a continuación, en donde U es O o NR9 , y las realizaciones preferidas de R9 son como se han definido anteriormente. Los anillos aromáticos en (9n) están opcionalmente O-sulfonilados en una o varias posiciones, mientras que los anillos de (9o) y (9p) se pueden halogenar en una o varias posiciones.
En una realización especialmente preferida, el átomo de nitrógeno fijado a R1 en el compuesto (4b) es el átomo de nitrógeno en el anillo del grupo heterocicloalquino tal como el átomo de nitrógeno en (9o). En otras palabras, c, d y g son 0 en el compuesto (4b) y R1 y Q1, junto con el átomo de nitrógeno al que están fijados, forman un grupo heterocicloalquino, preferiblemente un grupo heterociclooctino, lo más preferiblemente el grupo heterociclooctino de acuerdo con la fórmula (9o) o (9p). En esta memoria, el resto carbonilo de (9o) se reemplaza por el grupo sulfonilo del grupo de acuerdo con la fórmula (1). Alternativamente, el átomo de nitrógeno al que está fijado R1 es el mismo átomo que el átomo designado como U en la fórmula (9n). En otras palabras, cuando Q1 está de acuerdo con la fórmula (9n), U puede ser el átomo de nitrógeno derecho del grupo de acuerdo con la fórmula (1), o U = NR9 y R9 es el resto del grupo de acuerdo con la fórmula (1) y R1 es el resto ciclooctino.
En otra realización preferida, Q1 es un grupo biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo], opcionalmente sustituido, también denominado grupo bCn . Preferiblemente, el grupo biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo] está de acuerdo con la fórmula (9q) como se muestra más abajo.
En otra realización preferida, Q1 es un grupo (hetero)dieno conjugado capaz de reaccionar en una reacción de Diels-Alder seleccionado a partir de grupos tetrazinilo opcionalmente sustituidos, grupos 1,2-quinona opcionalmente sustituidos y grupos triazina opcionalmente sustituidos. Más preferiblemente, dicho grupo tetrazinilo está de acuerdo con la fórmula (9r), como se muestra a continuación, en donde R9 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, un grupo alquilo C1 - C12 lineal o ramificado o un grupo (hetero)arilo C4 - C12. Preferiblemente, R9 es hidrógeno, un grupo alquilo C1 - C6 o un grupo (hetero)arilo C4 - C10, más preferiblemente R9 es hidrógeno, un grupo alquilo C1 - C4 o un grupo (hetero)arilo C4 - C6. Incluso más preferiblemente R9 es hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, s-butilo, t-butilo o piridilo. Sin embargo, aún más preferiblemente, R9 es hidrógeno, metilo o piridilo. Más preferiblemente, dicho grupo 1,2-quinona está de acuerdo con la fórmula (9zl) o (9zm). Dicho grupo triazina puede ser cualquier regioisómero. Más preferiblemente, dicho grupo triazina es un grupo 1,2,3-triazina o un grupo 1,2,4-triazina, que se puede fijar a través de cualquier posición posible, como se indica en la fórmula (9zn). La 1,2,3-triazina es la más preferida como grupo triazina.
En otra realización preferida, Q1 es un grupo azido de acuerdo con la fórmula (9s) como se muestra más abajo. En otra realización preferida, Q1 es un grupo triarilfosfina, opcionalmente sustituido, que es adecuado para realizar una reacción de ligación de Staudinger. Preferiblemente, el grupo fosfina está de acuerdo con la fórmula (9t) como se muestra a continuación, en donde R10 es hidrógeno o un grupo (tio)éster. Cuando R10 es un grupo (tio)éster, se prefiere que R10 sea -C(O)-V-R11, en donde V es O o S y R11 es un grupo alquilo C1 - C12. Preferiblemente, R11 es un grupo alquilo C1 - C6 , más preferiblemente un grupo alquilo C1 - C4. Lo más preferiblemente, R11 es un grupo metilo. En otro aspecto, Q1 es un grupo de óxido de nitrilo de acuerdo con la fórmula (9u) como se muestra más abajo. En otro aspecto, Q1 es un grupo nitrona. Preferiblemente, el grupo nitrona está de acuerdo con la fórmula (9v) como se muestra a continuación, en donde R12 se selecciona a partir del grupo que consiste en grupos alquilo C1 - C12 lineales o ramificados y grupos arilo C6 - C12. Preferiblemente, R12 es un grupo alquilo C1 - C6, más preferiblemente R12 es un grupo alquilo C1 - C4. Incluso más preferiblemente R12 es metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, s-butilo o t-butilo. Sin embargo, aún más preferiblemente R12 es metilo.
En otro aspecto, Q1 es un grupo nitrilo imina. Preferiblemente, el grupo nitrilo imina está de acuerdo con la fórmula (9w) o (9zd) como se muestra a continuación, en donde R13 se selecciona a partir del grupo que consiste en grupos alquilo C1 - C12 lineales o ramificados y grupos arilo C6 - C12. Preferiblemente, R13 es un grupo alquilo C1 - C6, más preferiblemente R13 es un grupo alquilo C1 - C4. Incluso más preferiblemente R13 es metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, s-butilo o t-butilo. Sin embargo, aún más preferiblemente R13 es metilo.
En otro aspecto, Q1 es un grupo diazo. Preferiblemente, el grupo diazo está de acuerdo con la fórmula (9x) como se muestra a continuación, en donde R14 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno o un derivado carbonilo. Más preferiblemente, R14 es hidrogeno.
En otro aspecto, Q1 es un grupo cetona. Más preferiblemente, el grupo cetona está de acuerdo con la fórmula (9y) como se muestra a continuación, en donde R15 se selecciona a partir del grupo que consiste en grupos alquilo C1 -C12 lineales o ramificados y grupos arilo C6 - C12. Preferiblemente, R15 es un grupo alquilo C1 - C6, más preferiblemente R15 es un grupo alquilo C1 - C4. Incluso más preferiblemente R15 es metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, s-butilo o t-butilo. Sin embargo, aún más preferiblemente R15 es metilo.
En otro aspecto, Q1 es un grupo (O-alquil)hidroxilamino. Más preferiblemente, el grupo (O-alquil)hidroxilamino está de acuerdo con la fórmula (9z) como se muestra más abajo.
En otro aspecto, Q1 es un grupo hidrazina. Preferiblemente, el grupo hidrazina está de acuerdo con la fórmula (9za) como se muestra más abajo.
En otro aspecto, Q1 es un grupo N-maleimidilo halogenado o un grupo N-maleimidilo sulfonilado. Cuando Q1 es un grupo N-maleimidilo halogenado o sulfonilado, Q1 está preferiblemente de acuerdo con la fórmula (9ze) como se muestra a continuación, en donde R6 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno F, Cl, Br, I y -S(O)2R18, en donde R18 se selecciona a partir del grupo que consiste en grupos alquilo C1 - C12 opcionalmente sustituidos y grupos (hetero)arilo C4 - C12, y con la condición de que al menos un R6 no es hidrógeno. Cuando R6 es halógeno (es decir, cuando R6 es F, Cl, Br o I), se prefiere que R6 sea Br. Cuando R6 es -S(O)2R18, se prefiere que R18 sea un grupo alquilo C1 - C6 o un grupo (hetero)arilo C4 - C6, preferiblemente un grupo fenilo.
En otro aspecto, Q1 es un grupo carbonil haluro de acuerdo con la fórmula (9zf) como se muestra a continuación, en donde X se selecciona a partir del grupo que consiste en F, Cl, Br e I. Preferiblemente, X es Cl o Br, y más preferiblemente, X es Cl.
En otro aspecto, Q1 es un grupo alenamida de acuerdo con la fórmula (9zg).
En otra realización preferida, Q1 es un grupo 1,1-bis(sulfonilmetil)metilcarbonilo de acuerdo con la fórmula (9zh), o un derivado por eliminación del mismo, en donde R18 se selecciona a partir del grupo que consiste en grupos alquilo C1 - C12 opcionalmente sustituidos y grupos (hetero)arilo C4 - C12. Más preferiblemente, R18 es un grupo alquilo C1 -C6 opcionalmente sustituido o un grupo (hetero)arilo C4 - C6, y lo más preferiblemente un grupo fenilo.
Figure imgf000021_0001
en donde k, l, X, T, U, V, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18 y R19 son como se han definido anteriormente.
En una realización preferida del procedimiento de conjugación de acuerdo con la invención tal y como se describe a continuación, la conjugación se realiza a través de una cicloadición, tal como una reacción de Diels-Alder o una cicloadición 1,3-dipolar, preferiblemente la cicloadición 1,3-dipolar. De acuerdo con esta realización, el grupo reactivo Q1 (así como F1 en la glicoproteína) se selecciona a partir de grupos reactivos en una reacción de cicloadición. En esta memoria, los grupos reactivos Q1 y F1 son complementarios, es decir, son capaces de reaccionar entre sí en una reacción de cicloadición.
Para una reacción de Diels-Alder, uno entre F1 y Q1 es un dieno y el otro entre F1 y Q1 es un dienófilo. Según lo apreciado por una persona experta, el término "dieno" en el contexto de la reacción de Diels-Alder se refiere a 1,3-(hetero)dienos, e incluye dienos conjugados (R2C=CR-CR=CR2), iminas (por ejemplo, R2C=CR-N=CR2 o R2C=CR-CR=NR, R2C=N-N=c R2) y carbonilos (por ejemplo, R2C=CR-Cr=O u O=CR-CR=O). Las reacciones de hetero-Diels-Alder con dienos que contienen N y O son conocidas en la técnica. Cualquier dieno conocido en la técnica por ser adecuado para las reacciones de Diels-Alder, se puede usar como grupo reactivo Q1 o F1. Los dienos preferidos incluyen tetrazinas como se han descrito anteriormente, 1,2-quinonas como se han descrito anteriormente y triazinas como se han descrito anteriormente. Aunque cualquier dienófilo conocido en la técnica por ser adecuado para las reacciones de Diels-Alder se puede emplear como grupo reactivo Q1 o F1, el dienófilo es preferiblemente un grupo alqueno o alquino tal y como se ha descrito anteriormente, lo más preferiblemente un grupo alquino. Para la conjugación a través de una reacción de Diels-Alder, se prefiere que F1 sea el dieno y Q1 sea el dienófilo. En esta memoria, cuando Q1 es un dieno, F1 es un dienófilo y cuando Q1 es un dienófilo, F1 es un dieno. Lo más preferiblemente, Q1 es un dienófilo, preferentemente Q1 es o comprende un grupo alquinilo, y F1 es un dieno, preferiblemente un grupo tetrazina, 1,2-quinona o triazina.
Para una cicloadición 1,3-dipolar, uno entre F1 y Q1 es un dipolo 1,3 y el otro entre F1 y Q1 es un dipolarófilo. Cualquier dipolo 1,3 conocido en la técnica que sea adecuado para cicloadiciones 1,3-dipolares puede usarse como grupo reactivo Q1 o F1. Los dipolos 1,3 preferidos incluyen grupos azido, grupos nitrona, grupos óxido de nitrilo, grupos nitrilo imina y grupos diazo. Aunque cualquier dipolarófilo conocido en la técnica que sea adecuado para cicloadiciones 1,3-dipolares puede usarse como grupo reactivo Q1 o F1, el dipolarófilo es preferiblemente un grupo alqueno o alquino, lo más preferiblemente un grupo alquino. Para la conjugación a través de una cicloadición 1,3-dipolar, se prefiere que F1 sea el dipolo 1,3 y Q1 el dipolarófilo. En esta memoria, cuando Q1 es un dipolo 1,3, F1 es un dipolarófilo y cuando Q1 es un dipolarofilo, F1 es un dipolo 1,3. Lo más preferiblemente, Q1 es un dipolarófilo, preferentemente Q1 es o comprende un grupo alquinilo, y F1 es un dipolo 1,3, preferiblemente un grupo azido.
Por tanto, en una realización preferida, Q1 se selecciona a partir de dipolarófilos y dienófilos. Preferiblemente, Q1 es un grupo alqueno o alquino. En una realización especialmente preferida, Q1 comprende un grupo alquino, preferiblemente seleccionado a partir del grupo alquinilo como se ha descrito anteriormente, el grupo cicloalquenilo como se ha descrito anteriormente, el grupo (hetero)cicloalquinilo como se ha descrito anteriormente y un grupo biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo], más preferiblemente Q1 se selecciona a partir de las fórmulas (9j), (9n), (9o), (9p), (9q) y (9zk), como se ha definido anteriormente y se muestra a continuación, se selecciona más preferiblemente a partir de las fórmulas (9n), (9o), (9p), (9q) y (9zk). Lo más preferiblemente, Q1 es un grupo biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo], preferiblemente de fórmula (9q). Se sabe que esos grupos son altamente efectivos en la conjugación con glicoproteínas funcionalizadas con azida como se describe en esta memoria, y cuando el enlazador de sulfamida de acuerdo con la invención se emplea en tales enlazadores-conjugados y bioconjugados, cualquier agregación se reduce al mínimo de manera beneficiosa. El enlazador de sulfamida de acuerdo con la invención proporciona una reducción significativa de la agregación, especialmente para tales grupos reactivos hidrófobos de Q1, y para los bioconjugados conjugados.
Como se ha descrito anteriormente, en el compuesto de acuerdo con la invención, Q1 es capaz de reaccionar con un grupo reactivo F1 que está presente en una glicoproteína. Los grupos reactivos F1 complementarios para el grupo reactivo Q1 son conocidos por los expertos en la materia, y se describen con más detalle a continuación. Algunos ejemplos representativos de una reacción entre F1 y Q1 y sus productos correspondientes se muestran en la Figura 22.
Como se ha descrito anteriormente, la molécula diana D y el grupo reactivo Q1 están fijados covalentemente al enlazador con el enlazador-conjugado de acuerdo con la invención. La fijación covalente de una molécula diana D con el enlazador puede tener lugar, por ejemplo, a través de la reacción de un grupo funcional F2 presente en la molécula diana con un grupo reactivo Q2 presente en el enlazador. Las reacciones orgánicas adecuadas para la fijación de una molécula diana D a un enlazador son conocidas por los expertos en la técnica, al igual que los grupos funcionales F2 que son complementarios a un grupo reactivo Q2. En consecuencia, D puede estar fijada al enlazador a través de un grupo de conexión Z.
La expresión "grupo de conexión" en esta memoria se refiere al elemento estructural que conecta una parte de un compuesto y otra parte del mismo compuesto. Como entenderá el experto en la materia, la naturaleza de un grupo de conexión depende del tipo de reacción orgánica con la que se ha obtenido la conexión entre las partes de dicho compuesto. A modo de ejemplo, cuando el grupo carboxilo de R-C(O)-OH reacciona con el grupo amino de H2N-R' para formar R-C(O)-N(H)-R', R está conectado con R' a través del grupo de conexión Z, y Z puede estar representado por el grupo -C(O)-N(H)-.
El grupo reactivo Q1 se puede fijar al enlazador de manera similar. En consecuencia, Q1 se puede fijar al resto espaciador a través de un grupo de conexión Z.
Se conocen numerosas reacciones en la técnica para la fijación de una molécula diana a un enlazador, y para la fijación de un grupo reactivo Q1 a un enlazador. En consecuencia, una amplia variedad de grupos de conexión Z puede estar presente en el enlazador-conjugado de acuerdo con la invención.
Por tanto, la invención también se refiere a un compuesto de acuerdo con la fórmula:
(Q1)y-(Zw )-Sp-(Zx)-(D)z ,
en donde:
y es un número entero en el intervalo de 1 a 10;
z es un número entero en el intervalo de 1 a 10;
Q1 se selecciona a partir del grupo que consiste en un grupo N-maleimidilo opcionalmente sustituido, un grupo (hetero)cicloalquinilo y un grupo biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo];
D es una molécula diana seleccionada a partir del grupo que consiste en un fármaco, un profármaco, un agente de diagnóstico, una proteína, un péptido, un polipéptido, un marcador peptídico, un aminoácido, un glicano, un lípido, una vitamina, un esteroide, un nucleótido, un nucleósido, un polinucleótido, un ARN, un ADN, una molécula informadora, un polímero, una superficie sólida, un hidrogel, una nanopartícula, una micropartícula y una biomolécula;
Sp es un resto espaciador, en donde un resto espaciador se define como un resto que separa (es decir, proporciona una cierta distancia entre) y se une covalentemente al grupo reactivo Q1 y a la molécula diana D;
Zw es un grupo de conexión que conecta el grupo reactivo Q1 con dicho resto espaciador;
Zx es un grupo de conexión que conecta la molécula diana D con dicho resto espaciador; y en donde dicho resto espaciador comprende un grupo de acuerdo con la Fórmula (1) o una de sus sales, en donde el grupo de acuerdo con la Fórmula (1) es como se ha definido anteriormente.
En una realización preferida, a en el grupo de acuerdo con la fórmula (1) es 0. En otra realización preferida, a en el grupo de acuerdo con la fórmula (1) es 1.
Las realizaciones preferidas para y y z son como se han definido anteriormente para (Q1)y-Sp-(D)z . Además, se prefiere que el compuesto esté de acuerdo con la fórmula Q1-(Zw )-Sp-(Zx)-(D)4, Q1-(Zw )-Sp-(Zx)-(D)3, Q1-(Zw )-Sp-(Zx)-(D)2 o Q1-(Zw )-Sp-(Zx)-D, más preferiblemente Q1-(Zw )-Sp-(Zx)-(D)2 o Q1-(Zw )-Sp-(Zx)-D y lo más preferiblemente Q1-(Zw )-Sp-(Zx)-D, en donde Zw y Zx son como se han definido anteriormente.
Preferiblemente, Zw y Zx se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en -O-, -S-, -NR2-, -N=N-, -C(O)-, -C(O)-NR2-, -O-C(O)-, -O-C(O)-O-, -O-C(O)-NR2, -NR2-C(O)-, -NR2-C(O)-O-, -NR2-C(O)-NR2-, -S-C(O)-, -S-C(O)-O-, -S-C(O)-NR2-, -S(O)-, -S(O)2-, -O-S(O)2-, -O-S(O)2-O-, -O-S(O)2-NR2-, -O-S(O)-, -O-S(O)-O-, -O-S(O)-NR2-, -O-NR2-C(O)-, -O-NR2-C(O)-O-, -O-NR2-C(O)-NR2-, -NR2-O-C(O)-, -NR2-O-C(O)-O-, -NR2-O-C(O)-NR2-, -O-NR2-C(S)-, -O-NR2-C(S)-O-, -O-NR2-C(S)-NR2-, -NR2-O-C(S)-, -NR2-O-C(S)-O-, -NR2-O-C(S)-NR2-, -O-C(S)-, -O-C(S)-O-, -O-C(S)-NR2-, -NR2-C(S)-, -NR2-C(S)-O-, -NR2-C(S)-NR2-, -S-S(O)2-, -S-S(O)2-O-, -S-S(O)2-NR2-, -NR2-O-S(O)-, -NR2-O-S(O)-O-, -NR2-O-S(O)-NR2-, -NR2-O-S(O)2-, -NR2-O-S(O)2-O-, -NR2-O-S(O)2-NR2-, -O-NR2-S(O)-, -O-NR2-S(O)-O-, -O-NR2-S(O)-NR2-, -O-NR2-S(O)2-O-, -O-NR2-S(O)2-NR2-, -O-NR2-S(O)2-, -O-P(O)(R2)2-, -S-P(O)(R2)2-, -NR2-P(O)(R2)2- y combinaciones de dos o más de los mismos, en donde R2 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos alquenilo C2 - C24, grupos alquinilo C2 -C24 y grupos cicloalquilo C3 - C24, en donde los grupos alquilo, los grupos alquenilo, los grupos alquinilo y los grupos cicloalquilo están opcionalmente sustituidos.
Realizaciones preferidas para D y Q1 son como se han definido anteriormente.
Más particularmente, la presente invención se refiere a un compuesto de acuerdo con la fórmula (4a) o (4b), o una de sus sales:
Figure imgf000024_0001
en donde:
a es independientemente 0 o 1;
b es independientemente 0 o 1;
c es 0 o 1;
d es 0 o 1;
e es 0 o 1;
f es un número entero en el intervalo de 1a 150;
g es 0 o 1;
i es 0 o 1;
D es una molécula diana seleccionada a partir del grupo que consiste en un fármaco, un profármaco, un agente de diagnóstico, una proteína, un péptido, un polipéptido, un marcador peptídico, un aminoácido, un glicano, un lípido, una vitamina, un esteroide, un nucleótido, un nucleósido, un polinucleótido, un ARN, un ADN, una molécula informadora, un polímero, una superficie sólida, un hidrogel, una nanopartícula, una micropartícula y una biomolécula;
Q1 se selecciona a partir del grupo que consiste en un grupo N-maleimidilo opcionalmente sustituido, un grupo (hetero)cicloalquinilo y un grupo biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo];
Sp1 es un resto espaciador;
Sp2 es un resto espaciador;
Sp3 es un resto espaciador;
Sp4 es un resto espaciador;
Z1 es un grupo de conexión que conecta Q1 o Sp3 con Sp2, O o C(O) o N(R1);
Z2 es un grupo de conexión que conecta D o Sp4 con Sp1, N(R1), O o C(O); y
R1 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos cicloalquilo C3 - C24, grupos (hetero)arilo Ci - C24, grupos alquil(hetero)arilo Ci - C24 y grupos (hetero)arilalquilo Ci - C24, los grupos alquilo C1 - C24, grupos cicloalquilo C3 - C24, grupos (hetero)arilo C2 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C3 - C24 opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir de O, S y NR3 en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo C1 - C4; o
R1 es D, -[(Sp1)b-(Z2)e-(Sp4)i-D] o -[(Sp2)c-(Z1)d-(Sp3)g-Q1], en donde Sp1, Sp2 , Sp3 , Sp4 , Z1, Z2, D, Q1, b, c, d, e, g e i son como se han definido anteriormente.
El compuesto de acuerdo con la fórmula (4a) o (4b), o una de sus sales, también puede denominarse un enlazadorconjugado.
En una realización preferida, a es 1 en el compuesto de acuerdo con la fórmula (4a) o (4b). En otra realización preferida, a es 0 en el compuesto de acuerdo con la fórmula (4a) o (4b).
Tal y como se ha definido anteriormente, Z1 es un grupo de conexión que conecta Q1 o Sp3 con Sp2, O o C(O) o N(R1), y Z2 es un grupo de conexión que conecta D o Sp4 con Sp1, N(R1), O o C(O). Como se ha descrito con más detalle anteriormente, la expresión "grupo de conexión" se refiere a un elemento estructural que conecta una parte de un compuesto y otra parte del mismo compuesto.
En un compuesto de acuerdo con la fórmula (4a), el grupo de conexión Z1, cuando está presente (es decir, cuando d es 1), conecta Q1 (opcionalmente a través de un resto espaciador Sp3) con el átomo de O o con el grupo C(O) del compuesto de acuerdo con la fórmula (4a), opcionalmente a través de un resto espaciador Sp2. Más particularmente, cuando Z1 está presente (es decir, d es 1), y cuando Sp3 y Sp2 están ausentes (es decir, g es 0 y c es 0), Z1 conecta Q1 con el átomo de O (a es 1) o con el grupo C(O) (a es 0) del enlazador-conjugado de acuerdo con la fórmula (4a). Cuando Z1 está presente (es decir, cuando d es 1), Sp3 está presente (es decir, g es 1) y Sp2 está ausente (es decir, c es 0), Z1 conecta el resto espaciador Sp3 con el átomo de O (a es 1) o con el grupo C(O) (a es 0) del enlazadorconjugado de acuerdo con la fórmula (4a). Cuando Z1 está presente (es decir, d es 1), y cuando Sp3 y Sp2 están presentes (es decir, g es 1 y c es 1), Z1 conecta el resto espaciador Sp3 con el resto espaciador Sp2 del enlazadorconjugado de acuerdo con la fórmula (4a). Cuando Z1 está presente (es decir, cuando d es 1), Sp3 está ausente (es decir, g es 0) y Sp2 está presente (es decir, c es 1), Z1 conecta Q1 con el resto espaciador Sp2 del enlazadorconjugado de acuerdo con la fórmula (4a).
En un compuesto de acuerdo con la fórmula (4b), el grupo de conexión Z1, cuando está presente (es decir, cuando d es 1), conecta Q1 (opcionalmente a través de un resto espaciador Sp3) con el átomo de N del grupo N(R1) en el enlazador-conjugado de acuerdo con la fórmula (4b), opcionalmente a través de un resto espaciador Sp2. Más particularmente, cuando Z1 está presente (es decir, d es 1), y cuando Sp3 y Sp2 están ausentes (es decir, g es 0 y c es 0), Z1 conecta Q1 con el átomo de N del grupo N(R1) del enlazador-conjugado de acuerdo con la fórmula (4b). Cuando Z1 está presente (es decir, cuando d es 1), Sp3 está presente (es decir, g es 1) y Sp2 está ausente (es decir, c es 0), Z1 conecta el resto espaciador Sp3 con el átomo de N del grupo N(R1) del enlazador-conjugado de acuerdo con la fórmula (4b). Cuando Z1 está presente (es decir, d es 1), y cuando Sp3 y Sp2 están presentes (es decir, g es 1 y c es 1), Z1 conecta el resto espaciador Sp3 con el resto espaciador Sp2 del enlazador-conjugado de acuerdo con la fórmula (4b). Cuando Z1 está presente (es decir, cuando d es 1), Sp3 está ausente (es decir, g es 0) y Sp2 está presente (es decir, c es 1), Z1 conecta Q1 con el resto espaciador Sp2 del enlazador-conjugado de acuerdo con la fórmula (4b).
En el compuesto de acuerdo con la fórmula (4a), cuando c, d y g son todos 0, entonces Q1 está fijado directamente al átomo de O (cuando a es 1) o al grupo C(O) (cuando a es 0) del enlazador-conjugado de acuerdo con la fórmula (4a).
En el compuesto de acuerdo con la fórmula (4b), cuando c, d y g son todos 0, entonces Q1 está fijado directamente al átomo de N del grupo N(R1) del enlazador-conjugado de acuerdo con la fórmula (4b).
En un compuesto de acuerdo con la fórmula (4a), el grupo de conexión Z2, cuando está presente (es decir, cuando e es 1), conecta D (opcionalmente a través de un resto espaciador Sp4) con el átomo de N del grupo N(R1) en el enlazador-conjugado de acuerdo con la fórmula (4a), opcionalmente a través de un resto espaciador Sp1. Más particularmente, cuando Z2 está presente (es decir, e es 1), y cuando Sp1 y Sp4 están ausentes (es decir, b es 0 e i es 0), Z2 conecta D con el átomo de N del grupo N(R1) del enlazador-conjugado de acuerdo con la fórmula (4a). Cuando Z2 está presente (es decir, cuando e es 1), Sp4 está presente (es decir, i es 1) y Sp1 está ausente (es decir, b es 0), Z2 conecta el resto espaciador Sp4 con el átomo de N del grupo N(R1) del enlazador-conjugado de acuerdo con la fórmula (4a). Cuando Z2 está presente (es decir, e es 1), y cuando Sp1 y Sp4 están presentes (es decir, b es 1 e i es 1), Z2 conecta el resto espaciador Sp1 con el resto espaciador Sp4 del enlazador-conjugado de acuerdo con la fórmula (4a). Cuando Z2 está presente (es decir, cuando e es 1), Sp4 está ausente (es decir, i es 0) y Sp1 está presente (es decir, b es 1), Z2 conecta D con el resto espaciador Sp1 del enlazador-conjugado de acuerdo con la fórmula (4a).
En el compuesto de acuerdo con la fórmula (4a), cuando b, e e i son todos 0, entonces D se fija directamente al átomo de N del grupo N(R1) del enlazador-conjugado de acuerdo con la fórmula (4a).
En el compuesto de acuerdo con la fórmula (4b), cuando b, e e i son todos 0, entonces D se fija directamente al átomo de O (cuando a es 1) o al grupo C(O) (cuando a es 0) del enlazador-conjugado de acuerdo con la fórmula (4b).
Como entenderá el experto en la materia, la naturaleza de un grupo de conexión depende del tipo de reacción orgánica con la que se ha obtenido la conexión entre las partes específicas de dicho compuesto. Se dispone de una gran cantidad de reacciones orgánicas para conectar un grupo reactivo Q1 con un resto espaciador, y para conectar una molécula diana con un resto espaciador. En consecuencia, existe una gran variedad de grupos de conexión Z1 y Z2.
En una realización preferida del enlazador-conjugado de acuerdo con la fórmula (4a) y (4b), Z1 y Z2 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en -O-, -S-, -S-S-, -NR2-, -N=N-, -C(O)-, -C(O)-NR2-, -O-C(O)-, -O-C(O)-O-, -O-C(O)-NR2 , -NR2-C(O)-, -NR2-C(O)-O-, -NR2-C(O)-NR2-, -S-C(O)-, -S-C(O)-O-, -S-C(O)-NR2-, -S(O)-, -S(O)2-, -O-S(O)2-, -O-S(O)2-O-, -O-S(O)2-NR2-, -O-S(O)-, -O-S(O)-O-, -O-S(O)-NR2-, -O-NR2-C(O)-, -O-NR2-C(O)-O-, -O-NR2-C(O)-NR2-, -NR2-O-C(O)-, -NR2-O-C(O)-O-, -NR2-O-C(O)-NR2-, -O-NR2-C(S)-, -O-NR2-C(S)-O-, -O-NR2-C(S)-NR2-, -NR2-O-C(S)-, -NR2-O-C(S)-O-, -NR2-O-C(S)-NR2-, -O-C(S)-, -O-C(S)-O-, -O-C(S)-NR2-, -NR2-C(S)-, -NR2-C(S)-O-, -NR2-C(S)-NR2-, -S-S(O)2-, -S-S(O)2-O-, -S-S(O)2-NR2-, -NR2-O-S(O)-, -NR2-O-S(O)-O-, -NR2-O-S(O)-NR2-, -NR2-O-S(O)2-, -NR2-O-S(O)2-O-, -NR2-O-S(O)2-NR2-, -O-NR2-S(O)-, -O-NR2-S(O)-O-, -O-NR2-S(O)-NR2-, -O-NR2-S(O)2-O-, -O-NR2-S(O)2-NR2-, -O-NR2-S(O)2-, -O-P(O)(R2)2-, -S-P(O)(R2)2-, -NR2-P(O)(R2)2- y combinaciones de dos o más de los mismos, en donde R2 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos alquenilo C2 - C24, grupos alquinilo C2 - C24 y grupos cicloalquilo C3 - C24, los grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo y grupos cicloalquilo están opcionalmente sustituidos.
Como se ha descrito anteriormente, en el compuesto de acuerdo con la fórmula (4a) o (4b), Sp1, Sp2, Sp3 y Sp4 son restos espaciadores. Sp1, Sp2, Sp3 y Sp4 pueden estar, independientemente, ausentes o presentes (b, c, g e i son, independientemente, 0 o 1). Sp1, si está presente, puede ser diferente de Sp2 si está presente, de Sp3 y/o de Sp4, si está presente.
Los restos espaciadores son conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos de restos espaciadores adecuados incluyen diaminas de polietilenglicol (por ejemplo, 1,8-diamino-3,6-dioxaoctano o equivalentes que comprenden cadenas de etilenglicol más largas), cadenas de polietilenglicol o cadenas de poli(óxido de etileno), cadenas de polipropilenglicol o cadenas de poli(óxido de propileno) y 1,x-diaminoalcanos, en donde x es el número de átomos de carbono en el alcano.
Otra clase de restos espaciadores adecuados comprende restos espaciadores escindibles o enlazadores escindibles. Los enlazadores escindibles son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo Shabat et al., Soft Matter 2012, 6, 1073, describe enlazadores escindibles que comprenden restos autoinmolativos que se liberan después de un desencadenante biológico, p. ej., una escisión enzimática o un evento de oxidación. Algunos ejemplos de enlazadores escindibles adecuados son los enlazadores de disulfuro que se escinden después de una reducción, los enlazadores peptídicos que se escinden después de un reconocimiento específico por una proteasa, p. ej., catepsina, plasmina o metaloproteasas, o enlazadores basados en glicósidos que se escinden después de un reconocimiento específico por una glicosidasa, p. ej., glucoronidasa, o nitroaromáticos que se reducen en áreas hipóxicas pobres en oxígeno. En esta memoria, los restos espaciadores escindibles adecuados también incluyen restos espaciadores que comprenden una secuencia de aminoácidos específica, escindible. Los ejemplos incluyen, por ejemplo, restos espaciadores que comprenden un resto Val-Cit (valina-citrulina). Los bioconjugados que contienen un enlazador escindible, como el enlazador Val-Cit, en particular el Val-Cit-PABC, experimentan una agregación considerable debido a su limitada solubilidad en agua. Para tales bioconjugados, la incorporación del enlazador de sulfamida de acuerdo con la invención es particularmente beneficiosa. Además, las reacciones de conjugación con un enlazador-conjugado que comprende un enlazador escindible se ven obstaculizadas por la limitada solubilidad en agua del enlazador-conjugado. Por lo tanto, los enlazadores-conjugados que comprenden un enlazador escindible, como el enlazador Val-Cit, en particular Val-Cit-PABC, y el enlazador de sulfamida de acuerdo con la invención, superan a los enlazadores-conjugados que comprenden un enlazador escindible de ese tipo pero que carecen de ese enlazador de sulfamida en la conjugación con biomoléculas.
Por lo tanto, en una realización preferida de los enlazadores-conjugados de acuerdo con la fórmula (4a) y (4b), los restos espaciadores Sp1, Sp2, Sp3 y/o Sp4, si están presentes, comprenden una secuencia de aminoácidos. Los restos espaciadores que comprenden una secuencia de aminoácidos son conocidos en la técnica, y también pueden denominarse enlazadores peptídicos. Los ejemplos incluyen restos espaciadores que comprenden un resto Val-Cit, p. ej., Val-Cit-PABC, Val-Cit-PAB, Fmoc-Val-Cit-PAB, etc. Preferiblemente, se emplea un resto Val-Cit-PABC en el enlazador-conjugado.
En una realización preferida de los enlazadores-conjugados de acuerdo con la fórmula (4a) y (4b), los restos espaciadores Sp1, Sp2, Sp3 y Sp4, si están presentes, se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en grupos alquileno C1 - C200 lineales o ramificados, grupos alquenileno C2 - C200, grupos alquinileno C2 -C200, grupos cicloalquileno C3 - C200, grupos cicloalquenileno C5 - C200, grupos cicloalquinileno Ce - C200, grupos alquilarileno C7 - C200, grupos arilalquileno C7 - C200, grupos arilalquenileno Ce - C200 y grupos arilalquinileno Cg -C200, en donde los grupos alquileno, los grupos alquenileno, los grupos alquinileno, los grupos cicloalquileno, los grupos cicloalquenileno, los grupos cicloalquinileno, los grupos alquilarileno, los grupos arilalquileno, los grupos arilalquenileno y los grupos arilalquinileno están opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir del grupo de O, S y NR3 , en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos alquenilo C2 - C24, grupos alquinilo C2 -C24 y grupos cicloalquilo C3 - C24, en donde los grupos alquilo, los grupos alquenilo, los grupos alquinilo y los grupos cicloalquilo están opcionalmente sustituidos. Cuando los grupos alquileno, los grupos alquenileno, los grupos alquinileno, los grupos cicloalquileno, los grupos cicloalquenileno, los grupos cicloalquinileno, los grupos alquilarileno, los grupos arilalquileno, los grupos arilalquenileno y los grupos arilalquinileno están interrumpidos por uno o varios heteroátomos como se ha definido anteriormente, se prefiere que dichos grupos estén interrumpidos por uno o varios átomos de O, y/o por uno o varios grupos S-S.
Más preferiblemente, los restos espaciadores Sp1, Sp2, Sp3 y Sp4, si están presentes, se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en grupos alquileno C1 - C100 lineales o ramificados, grupos alquenileno C2 - C100, grupos alquinileno C2 - C100, grupos cicloalquileno C3 - C100, grupos cicloalquenileno C5 -C100, grupos cicloalquinileno C8 - C100, grupos alquilarileno C7 - C100, grupos arilalquileno C7 - C100, grupos arilalquenileno C8 - C100 y grupos arilalquinileno C9 - C100, en donde los grupos alquileno, los grupos alquenileno, los grupos alquinileno, los grupos cicloalquileno, los grupos cicloalquenileno, los grupos cicloalquinileno, los grupos alquilarileno, los grupos arilalquileno, los grupos arilalquenileno y los grupos arilalquinileno están opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir del grupo de O, S y NR3 , en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo Ci
- C24, grupos alquenilo C2 - C24, grupos alquinilo C2 - C24 y grupos cicloalquilo C3 - C24, en donde los grupos alquilo, los grupos alquenilo, los grupos alquinilo y los grupos cicloalquilo están opcionalmente sustituidos.
Aún más preferentemente, los restos espaciadores Sp1, Sp2 , Sp3 y Sp4, si están presentes, se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en grupos alquileno C1 - C50 lineales o ramificados, grupos alquenileno C2 - C50, grupos alquinileno C2 - C50, grupos cicloalquileno C3 - C50, grupos cicloalquenileno C5 - C50, grupos cicloalquinileno C8 - C50, grupos alquilarileno C7 - C50, grupos arilalquileno C7 - C50, grupos arilalquenileno C8
- C50 y grupos arilalquinileno C9 - C50, en donde los grupos alquileno, los grupos alquenileno, los grupos alquinileno, los grupos cicloalquileno, los grupos cicloalquenileno, los grupos cicloalquinileno, los grupos alquilarileno, los grupos arilalquileno, los grupos arilalquenileno y los grupos arilalquinileno están opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir del grupo de O, S y NR3 , en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo Ci - C24, grupos alquenilo C2 - C24, grupos alquinilo C2 - C24 y grupos cicloalquilo C3 - C24, en donde los grupos alquenilo, los grupos alquinilo y los grupos cicloalquilo están opcionalmente sustituidos.
Aún más preferiblemente, los restos espaciadores Sp1, Sp2 , Sp3 y Sp4, si están presentes, se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en grupos alquileno C1 - C20 lineales o ramificados, grupos alquenileno C2 - C20, grupos alquinileno C2 - C20, grupos cicloalquileno C3 - C20, grupos cicloalquenileno C5 - C20, grupos cicloalquinileno C8 - C20, grupos alquilarileno C7 - C20, grupos arilalquileno C7 - C20, grupos arilalquenileno C8
- C20 y grupos arilalquinileno C9 - C20, en donde los grupos alquileno, los grupos alquenileno, los grupos alquinileno, los grupos cicloalquileno, los grupos cicloalquenileno, los grupos cicloalquinileno, los grupos alquilarileno, los grupos arilalquileno, los grupos arilalquenileno y los grupos arilalquinileno están opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir del grupo de O, S y NR3 , en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo Ci - C24, grupos alquenilo C2 - C24, grupos alquinilo C2 - C24 y grupos cicloalquilo C3 - C24, en donde los grupos alquenilo, los grupos alquinilo y los grupos cicloalquilo están opcionalmente sustituidos.
En esas realizaciones preferidas, se prefiere adicionalmente que los grupos alquileno, los grupos alquenileno, los grupos alquinileno, los grupos cicloalquileno, los grupos cicloalquenileno, los grupos cicloalquinileno, los grupos alquileno, los grupos arilalquileno, los grupos arilalquenileno y los grupos arilalquinileno estén opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir del grupo de O, S y NR3 , preferiblemente O, en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo C1 - C4, preferiblemente hidrógeno o metilo.
Lo más preferiblemente, los restos espaciadores Sp1, Sp2, Sp3 y Sp4, si están presentes, se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en grupos alquileno C1 - C20 lineales o ramificados, en donde los grupos alquileno están opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir del grupo de O, S y NR3, en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos alquenilo C2 - C24, grupos alquinilo C2 - C24 y grupos cicloalquilo C3 - C24, en donde los grupos alquilo, los grupos alquenilo, los grupos alquinilo y los grupos cicloalquilo están opcionalmente sustituidos. En esa realización, se prefiere además que los grupos alquileno no estén sustituidos y estén opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir del grupo de
O, S y NR3, preferiblemente O y/o S-S, en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo Ci - C4 preferiblemente hidrógeno o metilo.
Los restos espaciadores preferidos Sp1, Sp2, Sp3 y Sp4 incluyen por tanto, -(CH2)n-, -(CH2CH2)n-, -(CH2CH2OV, -(OCH2CH2)n-, -(CH2CH2O)nCH2CH2-, -CH2CH2(OCH2CH2)n-, -(CH2CH2CH2OV, -(OCH2CH2CH2V, -(CH2CH2CH2O)nCH2CH2CH2- y - CH2CH2CH2(OCH2CH2CH2)n-, en donde n es un número entero en el intervalo de 1 a 50, preferiblemente en el intervalo de 1 a 40, más preferiblemente en el intervalo de 1 a 30, aún más preferiblemente en el intervalo de 1 a 20 e incluso más preferiblemente en el intervalo de 1 a 15. Más preferiblemente n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, incluso más preferiblemente 1,2, 3, 4, 5 o 6, y todavía más preferiblemente 1,2, 3 o 4.
Puesto que Sp1, Sp2, Sp3 y Sp4 se seleccionan independientemente, Sp1, si está presente, puede ser diferente de Sp2, si está presente, de Sp3 y/o de Sp4, si está presente.
Los grupos reactivos Q1 se han descrito con más detalle anteriormente. En el enlazador-conjugado de acuerdo con la fórmula (4a) y (4b), se prefiere que el grupo reactivo Q1 se seleccione a partir del grupo que consiste en grupos N maleimidilo opcionalmente sustituidos, grupos N-alquilamido halogenados, grupos sulfoniloxi N-alquilamido, grupos éster, grupos carbonato, grupos sulfonil haluro, grupos tiol o derivados de los mismos, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos (hetero)cicloalquinilo, grupos biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo], grupos cicloalquenilo, grupos tetrazinilo, grupos azido, grupos fosfina, grupos óxido de nitrilo, grupos nitrona, grupos nitrinilo imina, grupos diazo, grupos cetona, grupos (O-alquil)hidroxilamino, grupos hidrazina, grupos N-maleimidilo halogenados, grupos carbonil haluro, grupos alenamida y grupos 1,1-bis(sulfonilmetil)metilcarbonilo o derivados por eliminación de los mismos. En una realización preferida adicional, Q1 está de acuerdo con la fórmula (9a), (9b), (9c), (9d), (9e), (9f), (9g), (9h), (9i), (9j),
(9k), (9l), (9m), (9n), (9o), (9p), (9q), (9r), (9s), (9t), (9u), (9v), (9w), (9x), (9y), (9z), (9za), (9zb), (9zc), (9zd), (9ze),
(9zf), (9zg), (9zh), (9zi), (9zj), (9zk), (9zl), (9zm) o (9zn), en donde (9a), (9b), (9c), (9d), (9e), (9f), (9g), (9h), (9i),
(9j), (9k), (9l), (9m), (9n), (9o), (9p), (9q), (9r), (9s), (9t), (9u), (9v), (9w), (9x), (9y), (9z), (9za), (9zb), (9zc), (9zd),
(9ze), (9zf), (9zg), (9zh), (9zi), (9zj), (9zk), (9zl), (9zm), (9zn) y sus realizaciones preferidas, son como se han definido anteriormente. En una realización preferida, Q1 está de acuerdo con la fórmula (9a), (9b), (9c), (9f), (9j),
(9n), (9o), (9p), (9q), (9s), (9t), (9zh), (9r), (9zl), (9zm) o (9zn). En una realización aún más preferida, Q1 está de acuerdo con la fórmula (9a), (9n), (9o), (9q), (9p), (9t), (9zh) o (9s), y en una realización particularmente preferida,
Q1 está de acuerdo con la fórmula (9a), (9q), (9n), (9o), (9p), (9t) o (9zh), y realizaciones preferidas de las mismas, como se ha definido anteriormente.
La molécula diana D y realizaciones preferidas para la molécula diana D en el enlazador-conjugado de acuerdo con la fórmula (4a) y (4b) son como se han definido anteriormente. D se selecciona a partir del grupo que consiste en un fármaco, un profármaco, un agente de diagnóstico, una proteína, un péptido, un polipéptido, un marcador peptídico, un aminoácido, un glicano, un lípido, una vitamina, un esteroide, un nucleótido un nucleósido, un polinucleótido, un
ARN, un ADN, una molécula informadora, un polímero, una superficie sólida, un hidrogel, una nanopartícula, una micropartícula y una biomolécula. Las sustancias activas, moléculas informadoras, polímeros, hidrogeles, superficies sólidas, nanopartículas y micropartículas y biomoléculas, y sus realizaciones preferidas, se han descrito con más detalle anteriormente.
Tal y como se ha descrito anteriormente, R1 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos cicloalquilo C3 - C24, grupos (hetero)arilo C2 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C3 - C24, los grupos alquilo C1 - C24, grupos cicloalquilo C3 - C24, grupos (hetero)arilo C2 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C3 - C24 opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir de O, S y NR3 en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo C1 - C4 , o R1 es D, -[(Sp1)b-(Z2)e-(Sp4)i-D] o -[(Sp2)c-(Z1)d-(Sp3)g-Q1], en donde Sp1, Sp2, Sp3 , Sp4, Z1, Z2 , D, Q1, b, c, d, e, g e i son como se han definido anteriormente.
En una realización preferida, R1 es hidrógeno o un grupo alquilo C1 - C20, más preferiblemente R1 es hidrógeno o un grupo alquilo C1 - C16, incluso más preferiblemente R1 es hidrógeno o un grupo alquilo C1 - C10, en donde el grupo alquilo está opcionalmente sustituido y opcionalmente interrumpido por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir de O, S y NR3 , preferiblemente O, en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo C1 - C4. En una realización preferida adicional, R1 es hidrogeno. En otra realización preferida, R1 es un grupo alquilo C1 - C20, más preferiblemente un grupo alquilo C1 - C16, incluso más preferiblemente un grupo alquilo C1 - C10, en donde el grupo alquilo está opcionalmente interrumpido por uno o varios átomos de O, y en donde el grupo alquilo está opcionalmente sustituido con un grupo -OH, preferiblemente un grupo -OH terminal. En esa realización, se prefiere además que R1 sea una cadena de polietilenglicol que comprende un grupo terminal -OH. En otra realización adicional preferida, R1 es un grupo alquilo C1 - C12, preferiblemente un grupo alquilo C1 - C6, incluso más preferiblemente un grupo alquilo C1 - C4, y aún más preferiblemente, R1 se selecciona a partir del grupo que consiste en metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, s-butilo y t-butilo.
En otra realización preferida, R1 es una molécula diana D, -[(Sp1)b-(Z2)e-(Sp4)i-D] o -[(Sp2)c-(Z1)d-(Sp3)g-Q1], en donde
Sp1, Sp2, Sp3 , Sp4, Z1, Z2 , D, Q1, b, c, d, e, g e i son como se han definido anteriormente. Cuando R1 es D o -[(Sp1)b-(Z2)e-(Sp4)i-D], se prefiere además que el enlazador-conjugado esté de acuerdo con la fórmula (4a). En esa realización, el enlazador-conjugado (4a) comprende dos moléculas diana D, que pueden ser iguales o diferentes.
Cuando R1 es -[(Sp1)b-(Z2)e-(Sp4)i-D], Sp1, b, Z2, e, Sp4 , i y D en -[(Sp1)b-(Z2)e-(Sp4)i-D] pueden ser iguales o diferentes a Sp1, b, Z2, e, Sp4, i y D en el otro -[(Sp1)b-(Z2)e-(Sp4)i-D] que está fijado al átomo de N de N(R1). En una realización preferida, ambos grupos -[(Sp1)b-(Z2)e-(Sp4)i-D] en el átomo de N de N(R1) son iguales.
Cuando R1 es -[(Sp2)c-(Z1)d-(Sp3)g-Q1], se prefiere además que el enlazador-conjugado esté de acuerdo con la fórmula (4b). En esa realización, el enlazador-conjugado (4b) comprende dos moléculas diana Q1, que pueden ser iguales o diferentes. Cuando R1 es -[(Sp2)c-(Z1)d-(Sp3)g-Q1], Sp2 , c, Z1, d, Sp3 , g y D en -[(Sp1)b-(Z2)e-(Sp4)i-D] pueden ser iguales o diferentes a Sp1, b, Z2 , e, Sp4, i y Q1 en el otro -[(Sp2)c-(Z1)d-(Sp3)g-Q1] que está fijado al átomo de N de N(R1). En una realización preferida, ambos grupos -[(Sp2)c-(Z1)d-(Sp3)g-Q1] en el átomo de N de N(R1) son iguales.
En los enlazadores conjugados de acuerdo con la fórmula (4a) y (4b), f es un número entero en el intervalo de 1 a
150. El enlazador-conjugado puede comprender por tanto más de un grupo de acuerdo con la fórmula (1), en donde el grupo de acuerdo con la fórmula (1) es como se ha definido anteriormente. Cuando más de un grupo de acuerdo con la fórmula (1) está presente, es decir, cuando f es 2 o más, entonces a, b, Sp1 y R1 se seleccionan independientemente. En otras palabras, cuando f es 2 o más, cada a es independientemente 0 o 1, cada b es independientemente 0 o 1, cada Sp1 puede ser igual o diferente y cada R1 puede ser igual o diferente. En una realización preferida, f es un número entero en el intervalo de 1 a 100, preferiblemente en el intervalo de 1 a 50, más preferiblemente en el intervalo de 1 a 25, e incluso más preferiblemente en el intervalo de 1 a 15. Más preferiblemente, f es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, incluso más preferiblemente f es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, pero aún más preferiblemente f es 1,2, 3, 4, 5 o 6, aunque aún más preferiblemente f es 1,2, 3 o 4, y lo más preferiblemente f es 1 en esa realización. En otra realización preferida, f es un número entero en el intervalo de 2 a 150, preferiblemente en el intervalo de 2 a 100, más preferiblemente en el intervalo de 2 a 50, más preferiblemente en el intervalo de 2 a 25, e incluso más preferiblemente en el intervalo de 2 a 15. Más preferiblemente, f es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, aún más preferiblemente f es 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, aún más preferiblemente, f es 2, 3, 4, 5 o 6, pero aún más preferiblemente f es 2, 3 o 4, y lo más preferiblemente f es 2 en esa realización.
Como se ha descrito anteriormente, en una realización preferida, a es 0 en el compuesto de acuerdo con la fórmula (4a) o (4b). Por lo tanto, la invención también se refiere a un compuesto de acuerdo con la fórmula (6a) o (6b), o una de sus sales:
Figure imgf000029_0001
en donde a, b, c, d, e, f, g, i, D, Q1, Sp1, Sp2, Sp3, Sp4, Z1, Z2 y R1, y sus realizaciones preferidas, son como se han definido anteriormente para (4a) y (4b).
Como se ha descrito anteriormente, en otra realización preferida, a es 1 en el compuesto de acuerdo con la fórmula (4a) o (4b). Por lo tanto, la invención también se refiere a un compuesto de acuerdo con la fórmula (7a) o (7b), o una de sus sales:
Figure imgf000029_0002
en donde a, b, c, d, e, f, g, i, D, Q1, Sp1, Sp2, Sp3, Sp4, Z1, Z2 y R1, y sus realizaciones preferidas, son como se han definido anteriormente para (4a) y (4b).
Cuando Sp4 está ausente en el enlazador-conjugado de acuerdo con la fórmula (4a), es decir, cuando i es 0, la molécula diana D está unida a Z2 (cuando e es 1), a Sp1 (cuando e es 0 y b es 1) o a N(R1) (cuando e es 0 y b es 0). Cuando Sp4 está ausente en el enlazador-conjugado de acuerdo con la fórmula (4b), es decir, cuando i es 0, la molécula diana D está unida a Z2 (cuando e es 1), a Sp1 (cuando e es 0 y b es 1), al átomo de O (cuando a es 1 y b y e son 0) o al grupo C(O) (cuando a es 0 y b y e son 0). Por lo tanto, la invención también se refiere a un enlazadorconjugado de acuerdo con la fórmula (4c) o (4d), o una de sus sales:
Figure imgf000030_0001
en donde:
a, b, c, d, e, f, g, D, Q1, Sp1, Sp2, Sp3, Z1, Z2 y R1, y sus realizaciones preferidas, son como se han definido anteriormente para (4a) y (4b).
En una realización preferida, en el enlazador-conjugado de acuerdo con la fórmula (4c) o (4d), a es 0. En otra realización preferida, en el enlazador-conjugado de acuerdo con la fórmula (4c) o (4d), a es 1.
En una realización específica del enlazador-conjugado de acuerdo con la invención, particularmente un enlazadorconjugado de acuerdo con la fórmula (4a), (4b), (4c), (4d), (6a), (6b), (7a) o (7b), Sp1, Sp2 Sp3 y Sp4, si están presentes, se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en grupos alquileno C1 - C20 lineales o ramificados, en donde los grupos alquileno están opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir del grupo que consiste en O, S y NR3, en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y grupo alquilo C1 - C4, y Q1 está de acuerdo con la fórmula (9a), (9b), (9c), (9d), (9e), (9f), (9g), (9h), (9i), (9j), (9k), (9l), (9m), (9n), (9o), (9v), (9w), (9x), (9y), (9z), (9za), (9zb), (9zc), (9zd), (9ze), (9zf), (9zg) (9zh), (9zi), (9zj), (9zk), (9zl), (9zm) o (9zn), en donde (9a), (9b), (9c), (9d), (9e), (9f), (9g), (9h), (9i), (9j), (9k), (9l), (9m), (9n), (9o), (9p), (9q), (9r), (9s), (9t),
(9u), (9v), (9w), (9x), (9y), (9z), (9za), (9zb), (9zc), (9zd), (9ze), (9zf), (9zg), (9zh), (9zi), (9zj), (9zk), (9zl), (9zm),
(9zn) y sus realizaciones preferidas, son como se han definido anteriormente. En una realización preferida, Q1 está de acuerdo con la fórmula (9a), (9b), (9c), (9f), (9j), (9n), (9o), (9p), (9q), (9s) (9t), (9zh), (9r), (9zl), (9zm) o (9zn).
En una realización aún más preferida, Q1 está de acuerdo con la fórmula (9a), (9n), (9o), (9p), (9q), (9t), (9s), y en una realización particularmente preferida, Q1 está de acuerdo con la fórmula (9a), (9q), (9n), (9p), (9t),
(9zh) o (9o), y realizaciones preferidas de las mismas, como se han definido anteriormente.
Un enlazador se define en esta memoria como un resto que conecta dos o más elementos de un compuesto.
En consecuencia, en el enlazador-conjugado de acuerdo con la fórmula (4a), (4b), (4c), (4d), (6a), (6b), (7a) o (7b) tal y como se han definido anteriormente, el enlazador tal y como se ha definido anteriormente se puede representarse por la fórmula (8a) y (8b), respectivamente:
Figure imgf000031_0001
Como entenderá el experto en la materia, las realizaciones preferidas de los restos espaciadores (8a) y (8b) pueden depender, por ejemplo, de la naturaleza de los grupos reactivos Q1 y D en el enlazador-conjugado, del método sintético para preparar el enlazador-conjugado (por ejemplo, la naturaleza del grupo funcional complementario F2 en una molécula diana), de la naturaleza de un bioconjugado que se prepara utilizando el enlazador-conjugado (por ejemplo, la naturaleza del grupo funcional complementario F1 en la glicoproteína).
Cuando Q1 es, por ejemplo, un grupo ciclooctinilo de acuerdo con la fórmula (9n), (9o), (9p), (9q) o (9zk) como se han definido anteriormente, entonces preferiblemente Sp3 está presente (g es 1).
Cuando, por ejemplo, el enlazador-conjugado se ha preparado mediante la reacción de un grupo reactivo Q2 que es un grupo ciclooctinilo de acuerdo con la fórmula (9n), (9o), (9p), (9q) o (9zk), con un grupo funcional azido F2, entonces preferiblemente Sp4 está presente (i es 1).
Además, se prefiere que al menos uno de Sp1, Sp2, Sp3 y Sp4 esté presente, es decir, al menos uno de b, c, g, e i no sea 0. En otra realización preferida, al menos uno de Sp1 y Sp4 y al menos uno de Sp2 y Sp3 están presentes.
Cuando f es 2 o más, se prefiere que Sp1 esté presente (b es 1).
Estas realizaciones preferidas del resto enlazador (8a) y (8b) también se conservan para el resto enlazador en los bioconjugados de acuerdo con la invención como se describe con más detalle a continuación.
Las realizaciones preferidas de Sp1, Sp2, Sp3 y Sp4 son como se han definido anteriormente.
Enlazador-estructura artificial
Un enlazador-estructura artificial se define en esta memoria como un compuesto en el que un grupo reactivo Q1 está conectado covalentemente con un grupo reactivo Q2 a través de un enlazador. Un enlazador-estructura artificial comprende un grupo reactivo Q1 capaz de reaccionar con un grupo reactivo F1 presente en una glicoproteína, y un grupo reactivo Q2 capaz de reaccionar con un grupo reactivo F2 presente en una molécula diana. Q1 y Q2 pueden ser iguales o diferentes. Un enlazador-estructura artificial puede comprender más de un grupo reactivo Q1 y/o más de un grupo reactivo Q2. Cuando está presente más de un grupo reactivo Q1, los grupos Q1 pueden ser iguales o diferentes, y cuando está presente más de un grupo reactivo Q2, los grupos Q2 pueden ser iguales o diferentes. En esta memoria también se describe un compuesto, más particularmente un enlazador-estructura artificial, en donde dicho compuesto comprende un extremo alfa y un extremo omega, comprendiendo el compuesto en el extremo alfa un grupo funcional Q1 capaz de reaccionar con un grupo funcional F1 presente en una biomolécula y en el extremo omega un grupo funcional Q2 capaz de reaccionar con un grupo funcional F2 presente en una molécula diana, en donde el compuesto comprende adicionalmente un grupo de acuerdo con la fórmula (1), o una de sus sales, en donde dicho grupo de acuerdo con la fórmula (1) es como se ha definido anteriormente, y en donde el grupo de acuerdo con la fórmula (1), o una de sus sales, está situado entre dicho extremo alfa y dicho extremo omega del compuesto.
El grupo reactivo Q1 está unido covalentemente con el extremo alfa del compuesto y el grupo reactivo Q2 está unido covalentemente con un extremo omega del compuesto.
Este compuesto también se puede denominar un enlazador-estructura artificial. En el enlazador-estructura artificial, un grupo reactivo Q2 está conectado covalentemente con un grupo reactivo Q1 a través de un enlazador, y dicho enlazador comprende un grupo de acuerdo con la fórmula (1), o una sal del mismo, como se ha definido anteriormente. Cuando el enlazador-estructura artificial comprende una sal del grupo de acuerdo con la fórmula (1), la sal es preferiblemente una sal farmacéuticamente aceptable.
El enlazador-estructura artificial puede comprender más de un grupo reactivo Q2. En consecuencia, el enlazador puede comprender, por ejemplo, un tercer extremo (cuarto, quinto, etc.), que puede denominarse un extremo psi, chi, phi, etc., en donde el tercer extremo (cuarto, quinto, etc.) comprende un grupo reactivo Q2. De manera similar, el enlazador-conjugado puede comprender más de un grupo reactivo Q1.
Por lo tanto, el enlazador-estructura artificial también se puede denominar (Q1)y-Sp-(Q2)z, en donde y es un número entero en el intervalo de 1 a 10 y z es un número entero en el intervalo de 1 a 10.
También se describe en esta memoria un enlazador-estructura artificial de acuerdo con la fórmula:
(Q1)y-Sp-(Q2)z ,
en donde:
y es un número entero en el intervalo de 1 a 10;
z es un número entero en el intervalo de 1 a 10;
Q1 es un grupo reactivo capaz de reaccionar con un grupo funcional F1 presente en una biomolécula;
Q2 es un grupo reactivo capaz de reaccionar con un grupo funcional F2 presente en una molécula diana;
Sp es un resto espaciador, en donde un resto espaciador se define como un resto que separa (es decir, proporciona una cierta distancia entre) y une covalentemente un grupo reactivo Q1 y un grupo reactivo Q2; y
en donde dicho resto espaciador comprende un grupo de acuerdo con la Fórmula (1) o una de sus sales, en donde el grupo de acuerdo con la Fórmula (1) es como se ha definido anteriormente.
Preferiblemente, y es 1,2, 3 o 4, más preferiblemente y es 1 o 2 y lo más preferiblemente, y es 1. Preferiblemente, z es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, más preferiblemente z es 1, 2, 3 o 4, incluso más preferiblemente z es 1, 2 o 3, aún más preferiblemente z es 1 o 2 y lo más preferiblemente z es 1. Más preferiblemente, y es 1 o 2, preferiblemente 1, y z es 1,2, 3 o 4, pero aún más preferiblemente y es 1 o 2, preferiblemente 1, y z es 1, 2 o 3, y aún más preferiblemente y es 1 o 2, preferiblemente 1, y z es 1 o 2, y lo más preferiblemente y es 1 y z es 1. En una realización preferida, el enlazador-estructura artificial está de acuerdo con la fórmula Q1-Sp-(Q2)4, Q1-Sp-(Q2)3, Q1-Sp-(Q2)2 o Q1-Sp-Q2. El enlazador-estructura artificial comprende un grupo de acuerdo con la fórmula (1) tal y como se ha definido anteriormente, o una sal del mismo. En una realización preferida, el enlazador-estructura artificial comprende un grupo de acuerdo con la fórmula (1) en donde a es 0, o una sal del mismo. En esa realización, el enlazadorestructura artificial comprende de este modo un grupo de acuerdo con la fórmula (2) o una sal del mismo:
Figure imgf000032_0001
en donde R1 es como se ha definido anteriormente.
En otra realización preferida, el enlazador-estructura artificial comprende un grupo de acuerdo con la fórmula (1) en donde a es 1, o una sal del mismo. En esta realización, el enlazador-estructura artificial comprende de este modo un grupo de acuerdo con la fórmula (3) o una sal del mismo:
Figure imgf000032_0002
3
en donde R1 es como se ha definido anteriormente.
En el enlazador-estructura artificial, R1 y las realizaciones preferidas de R1 son como se han definido anteriormente. Además, el grupo reactivo Q1 y el resto espaciador Sp, así como sus realizaciones preferidas, son como se han definido anteriormente para el enlazador-conjugado de acuerdo con la invención.
Más en particular, el enlazador-estructura artificial es un compuesto de acuerdo con la fórmula:
(Q1)y-(Zw)-Sp-(Zx)-(Q2)z ,
en donde:
y es un número entero en el intervalo de 1 a 10;
z es un número entero en el intervalo de 1 a 1 0 ;
Q1 es un grupo reactivo capaz de reaccionar con un grupo funcional F1 presente en una biomolécula;
Q2 es un grupo reactivo capaz de reaccionar con un grupo funcional F2 presente en una biomolécula;
Sp es un resto espaciador, en donde un resto espaciador se define como un resto que separa (es decir, proporciona una cierta distancia entre) y une covalentemente los grupos reactivos Q1 y Q2;
Zw es un grupo de conexión que conecta el grupo reactivo Q1 con dicho resto espaciador;
Zx es un grupo de conexión que conecta el grupo reactivo Q2 con dicho resto espaciador; y
en donde dicho resto espaciador comprende un grupo de acuerdo con la Fórmula (1) o una de sus sales, en donde el grupo de acuerdo con la Fórmula (1) es como se ha definido anteriormente.
En una realización preferida, a en el grupo de acuerdo con la fórmula (1) es 0. En otra realización preferida, a en el grupo de acuerdo con la fórmula (1) es 1.
Realizaciones preferidas para y y z son las definidas anteriormente para (Q1)y-Sp-(Q2)z. Además, se prefiere que el compuesto esté de acuerdo con la fórmula Q1-(Zw)-Sp-(Zx)-(Q2)4, Q1-(Zw)-Sp-(Zx)-(Q2)a, Q1-(Zw)-Sp-(Zx)-(Q2)2 o Q1-(Zw)-Sp-(Zx)-Q2, más preferiblemente Q1-(Zw)-Sp-(Zx)-(Q2)2 o Q1-(Zw)-Sp-(Zx)-Q2 y lo más preferiblemente Q1-(Zw)-Sp-(Zx)-Q2, en donde Zw y Zx son como se han definido anteriormente.
En el compuesto enlazador, Zw y Zx se seleccionan preferiblemente de forma independiente a partir del grupo que consiste en -O-, -S-, -NR2-, -N=N-, -C(O)-, -C(O)-NR2-, -O-C(O)-, -O-C(O)-O-, -O-C(O)-NR2, -NR2-C(O)-, -NR2-C(O)-O-, -NR2-C(O)-NR2-, -S-C(O)-, -S-C(O)-O-, -S-C(O)-NR2-, -S(O)-, -S(O)2-, -O-S(O)2-, -O-S(O)2-O-, -O-S(O)2-NR2-, -O-S(O)-, -O-S(O)-O-, -O-S(O)-NR2-, -O-NR2-C(O)-, -O-NR2-C(O)-O-, -O-NR2-C(O)-NR2-, -NR2-O-C(O)-, -NR2-O-C(O)-O-, -NR2-O-C(O)-NR2-, -O-NR2-C(S)-, -O-NR2-C(S)-O-, -O-NR2-C(S)-NR2-, -NR2-O-C(S)-, -NR2-O-C(S)-O-, -NR2-O-C(S)-NR2-, -O-C(S)-, -O-C(S)-O-, -O-C(S)-NR2-, -NR2-C(S)-, -NR2-C(S)-O-, -NR2-C(S)-NR2-, -S-S(O)2-, -S-S(O)2-O-, -S-S(O)2-NR2-, -NR2-O-S(O)-, -NR2-O-S(O)-O-, -NR2-O-S(O)-NR2-, -NR2-O-S(O)2-, -NR2-O-S(O)2-O-, -NR2-O-S(O)2-NR2-, -O-NR2-S(O)-, -O-NR2-S(O)-O-, -O-NR2-S(O)-NR2-, -O-NR2-S(O)2-O-, -O-NR2-S(O)2-NR2-, -O-NR2-S(O)2-, -O-P(O)(R2)2-, -S-P(O)(R2)2-, -NR2-P(O)(R2)2- y combinaciones de dos o más de los mismos, en donde R2 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos alquenilo C2 - C24, grupos alquinilo C2 - C24 y grupos cicloalquilo C3 - C24, en donde los grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo y grupos cicloalquilo, están opcionalmente sustituidos.
Las realizaciones preferidas para Q1 son como se han definido anteriormente.
En el enlazador-estructura artificial, Q2 es un grupo reactivo capaz de reaccionar con un grupo funcional F2 presente en una molécula diana. Grupos reactivos Q2 capaces de reaccionar con un grupo funcional F2 de ese tipo son conocidos por un experto en la materia. En una realización preferida, Q2 es un grupo reactivo seleccionado a partir del grupo que consiste en grupos N-maleimidilo opcionalmente sustituidos, grupos N-alquilamido halogenados, grupos sulfoniloxi N-alquilamido, grupos éster, grupos carbonato, grupos sulfonil haluro, grupos tiol o derivados de los mismos, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos (hetero)cicloalquinilo, grupos biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo], grupos cicloalquenilo, grupos tetrazinilo, grupos azido, grupos fosfina, grupos óxido de nitrilo, grupos nitrona, grupos nitrilo imina, grupos diazo, grupos cetona, grupos (O-alquil)hidroxilamino, grupos hidrazina, grupos N-maleimidilo halogenados, grupos 1 ,1 -bis(sulfonilmetil)metilcarbonilo o derivados por eliminación de los mismos, grupos carbonil haluro y grupos alenamida, -[C(R17)2C(R17)2O]q-R17, en donde q está en el intervalo de 1 a 200, -CN, -NCV, -VCN, -VR17, -N(R17)2, -+N(R17)3, -C(V)N(R17)2, -C(R17)2VR17, -C(V)R17, -C(V)VR17, -S(O)R17, -S(O)2R17, -S(O)OR17, -S(O)2OR17, -S(O)N(R17)2, -S(O)2N(R17)2, -OS(O)R17, -OS(O)2R17, -OS(O)OR17, -OS(O)2OR17, -P(O)(R17)(OR17), -P(O)(OR17)2, -OP(O)(OR17)2 , -Si(R17)3, -VC(V)R17, -VC(V)VR17, -VC(V)N(R17)2, -N(R17)C(V)R17, -N(R17)C(V)VR17 y -N(R17)C(V)N(R17)2, en donde V es O o S y en donde R17 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 -C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24.
En una realización preferida adicional, Q2 está de acuerdo con la fórmula (9a), (9b), (9c), (9d), (9e), (9f), (9g), (9h),
(9i), (9j), (9k), (9l), (9m), (9n), (9o), (9p), (9q), (9r), (9s), (9t), (9u), (9v), (9w), (9x), (9y), (9z), (9za), (9zb), (9zc),
(9zd), (9ze), (9zf), (9zg), (9zh), (9zi), (9zj), (9zk), (9zl), (9zm) o (9zn), en donde (9a), (9b), (9c), (9d), (9e), (9f), (9g),
(9h), (9i), (9j), (9k), 9l), (9m), (9n), (9o), (9p), (9q), (9r), (9s), (9t), (9u), (9v), (9w), (9x), (9y), (9zd), (9ze), (9zf), (9zg), (9zh), (9zi), (9zj), (9zk), (9zl), (9zm), (9zn) y sus realizaciones preferidas, son tal y como se han definido anteriormente. En esa realización se prefiere además que Q2 esté de acuerdo con la fórmula (9a), (9b),
(9c), (9f), (9j), (9n), (9o), (9p), (9q), (9s), (9t), (9zh), (9r), (9zl), (9zm) o (9zn), más preferiblemente de acuerdo con la fórmula (9a), (9n), (9o), (9p), (9q), (9t), (9zh) o (9s), y aún más preferiblemente que Q2 esté de acuerdo con la fórmula (9a), (9p), (9q), (9n), (9t), (9zh) o (9o), y realizaciones preferidas de las mismas, como se han definido anteriormente. Lo más preferiblemente, Q2 está de acuerdo con la fórmula (9a), (9p), (9q), (9n), (9t), (9zh) o (9o), y realizaciones preferidas de las mismas, como se han definido anteriormente.
En otra realización preferida adicional, Q2 se selecciona a partir del grupo que consiste en -[C(R17)2C(R17)2O]q- R17, en donde q está en el intervalo de 1 a 200, -CN, -NCV, -VCN, -VR17, -N(R17)2 , -+N(R17)3 , -C(V)N(R17)2, -C(R17)2VR17, -C(V)R17, -C(V)VR17, -S(O)R17, -S(O)2R17, -S(O)OR17, -S(O)2OR17, -S(O)N(R17)2 , -S(O)2N(R17)2 , -OS(O)R17, -OS(O)2R17, -OS(O)OR17, -OS(O)2OR17, -P(O)(R17)(OR17), -P(O)(OR17)2, -OP(O)(OR17)2, -Si(R17)3 , -VC(V)R17, -VC(V)VR17, -VC(V)N(R17)2, -N(R17)C(V)R17, -N(R17)C(V)VR17 y -N(R17)C(V)N(R17)2 , en donde V y R17 son como se han definido anteriormente. En esa realización se prefiere además que Q2 se seleccione a partir del grupo que consiste en -OR17, -SR17, -N(R17)2 , --+N(R17)3 , -C(O)N(R17)2 , -C(R17)2OR17, -C(O)R17, -C(O)OR17, -S(O)R17, -S(O)2R17, -S(O)OR17, -S(O)2OR17, -S(O)N(R17)2 , -S(O)2N(R17)2, -OS(O)R17, -OS(O)2R17, -OS(O)OR17, -OS(O)2OR17, -P(O)(R17)(OR17), -P(O)(OR17)2, -OP(O)(OR17)2, -Si(R17)3, -OC(O)R17, -OC(O)OR17, -OC(O)N(R17)2 , -N(R17)C(O)R17, -n (r17)C(O)OR17 y -N(R17)C(O)N(R17)2 , en donde R17 es como se ha definido anteriormente.
En una realización específica del enlazador-estructura artificial, Q1 está de acuerdo con la fórmula (9a), (9b), (9c), (9d), (9e), (9f), (9g), (9h), (9i), (9j), (9k), (9l), (9m), (9n), (9o), (9p), (9q), (9r), (9s), (9t), (9u), (9v), (9w), (9x), (9y), (9z), (9za), (9zb), (9zc), (9zd), (9ze), (9zf), (9zg), (9zh), (9zi), (9zj), (9zk), (9zl), (9zm) o (9zn), en donde (9a), (9b), (9c), (9d), (9e), (9f), (9g), (9h), (9i), (9j), (9k), (9l), (9m), (9n), (9o), (9p), (9q), (9r), (9s), (9t), (9u), (9v), (9w), (9x), (9y), (9z), (9za), (9zb), (9zc), (9zd), (9ze), (9zf), (9zg), (9zh), (9zi), (9zj), (9zk), (9zl), (9zm), (9zn) y sus realizaciones preferidas, son como se han definido anteriormente; y el resto espaciador Sp se selecciona a partir del grupo que consiste en grupos alquileno C1 - C20 lineales o ramificados, en donde los grupos alquileno están opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir del grupo que consiste en O, S y Nr3 , en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo C1 - C4 ; en donde el resto espaciador Sp está interrumpido por uno o varios grupos de acuerdo con la fórmula (1) o una sal de la misma; y en donde (1) es como se ha definido anteriormente.
En una realización preferida, dicho resto espaciador Sp está interrumpido por uno o varios grupos de acuerdo con la fórmula (2), o una sal de la misma, en donde (2) es como se ha definido anteriormente. En otra realización preferida, dicho resto espaciador Sp está interrumpido por uno o varios grupos de acuerdo con la fórmula (3), o una sal de la misma, en donde (3) es como se ha definido anteriormente.
En una realización preferida adicional, Q1 está de acuerdo con la fórmula (9a), (9b), (9c), (9f), (9j), (9n), (9o), (9p), (9q), (9s), (9t), (9zh), (9zk), (9r), (9zl), (9zm) o (9zn). En una realización aún más preferida, Q1 está de acuerdo con la fórmula (9a), (9n), (9o), (9p), (9q), (9t), (9zh) o (9s), y en una realización particularmente preferida, Q1 está de acuerdo con la fórmula (9a), (9p), (9q), (9n), (9t), (9zh), (9zk) o (9o), y realizaciones preferidas de las mismas, como se han definido anteriormente. Más preferiblemente, Q1 está de acuerdo con la fórmula (9a), (9p), (9q), (9n), (9t), (9zh) o (9o), y realizaciones preferidas de las mismas, como se han definido anteriormente.
Procedimiento para la preparación de un enlazador-conjugado
En esta memoria se describe también un procedimiento para la preparación de un enlazador-conjugado de acuerdo con la invención. En particular, el procedimiento para la preparación de un enlazador-conjugado de acuerdo con la invención, comprende la etapa de hacer reaccionar un grupo funcional Q2 de un enlazador-estructura artificial con un grupo funcional F2 de una molécula diana, en donde dicho enlazador-estructura artificial es un compuesto que comprende un extremo alfa y un extremo omega, comprendiendo el compuesto en el extremo alfa un grupo funcional Q1 capaz de reaccionar con un grupo funcional F1 presente en una biomolécula, y en el extremo omega un grupo funcional Q2 capaz de reaccionar con un grupo funcional F2 presente en dicha molécula diana, en donde el compuesto comprende además un grupo de acuerdo con la fórmula (1), o una de sus sales, en donde dicho grupo de acuerdo con la fórmula (1) es como se ha definido anteriormente, y en donde el grupo de acuerdo con la fórmula (1), o la sal del mismo, está situado entre dicho extremo alfa y dicho extremo omega del compuesto.
El enlazador-estructura artificial y sus realizaciones preferidas, incluyendo las realizaciones preferidas de Q1, Q2 y la molécula diana D, se han descrito con detalle anteriormente.
En una realización preferida del procedimiento para la preparación de un enlazador-conjugado, el enlazadorestructura artificial está de acuerdo con (Q1)y-Sp-(Q2)z tal y como se ha definido anteriormente. En una realización preferida adicional del procedimiento para la preparación de un enlazador-conjugado, el enlazador-estructura artificial está de acuerdo con (Q1)y-(Zw)-Sp-(Zx)-(Q2)z tal y como se ha definido anteriormente.
La invención se refiere además al uso de un enlazador de sulfamida-estructura artificial de acuerdo con la invención en un procedimiento de bioconjugación. El enlazador-estructura artificial de acuerdo con la invención, y las realizaciones preferidas, se han descrito con detalle anteriormente. La invención se refiere particularmente al uso de un enlazador-estructura artificial de acuerdo con la fórmula (Q1)y-Sp-(Q2)z en un procedimiento de bioconjugación, y al uso de un enlazador-estructura artificial de acuerdo con la fórmula (Q1)y-(Zw)-Sp-(Zx)-(Q2)z en un procedimiento de bioconjugación.
La invención también se refiere al uso de un enlazador-conjugado de acuerdo con la invención en un procedimiento de bioconjugación. El enlazador-conjugado de acuerdo con la invención, y las realizaciones preferidas, se han descrito con detalle anteriormente. La invención se refiere particularmente al uso de un enlazador-conjugado de acuerdo con la fórmula (4a), (4b), (4c), (4d), (6a), (6b), (7a) o (7b) en un procedimiento de bioconjugación.
Bioconjugado
Un bioconjugado se define en esta memoria como un compuesto en el que una biomolécula está conectada covalentemente con una molécula diana a través de un enlazador. Un bioconjugado comprende una o varias biomoléculas y/o una o varias moléculas diana. El enlazador puede comprender uno o varios restos espaciadores. El bioconjugado de acuerdo con la invención se prepara convenientemente mediante el procedimiento para la preparación de un bioconjugado de acuerdo con la invención, en el que el enlazador-conjugado que comprende el grupo reactivo Q1 se conjuga con una biomolécula que comprende el grupo reactivo F1. En esa reacción de conjugación, los grupos reactivos Q1 y F1 reaccionan entre sí para formar un resto enlazador, el cual une el enlazador-conjugado con la biomolécula. Todas las realizaciones preferidas descritas en esta memoria para el enlazador-conjugado y la biomolécula, se aplican por tanto igualmente al bioconjugado de acuerdo con la invención, a excepción de todos los mencionados para Q1 y F1, en donde el bioconjugado de acuerdo con la invención contiene el producto de reacción de Q1 y F1 como se ha definido en esta memoria.
La invención también se refiere a un compuesto, en donde el compuesto comprende un extremo alfa y un extremo omega, comprendiendo el compuesto en el extremo alfa una biomolécula y en el extremo omega una molécula diana, en donde el compuesto comprende además un grupo de acuerdo con la fórmula (1) o una sal del mismo:
Figure imgf000035_0001
en donde:
a es 0 o 1 ; y
R1 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos cicloalquilo C3 -C24, grupos (hetero)arilo C2 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C3 - C24, en donde los grupos alquilo C1 - C24, grupos cicloalquilo C3 - C24, grupos (hetero)arilo C2 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C3 - C24 están opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir de O, S y NR3 en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo C1 - C4 ; o
R1 es una molécula diana D, en donde la molécula diana está conectada opcionalmente con N a través de un resto espaciador;
y en donde el grupo de acuerdo con la fórmula (1), o la sal del mismo, está situado entre dicho extremo alfa y dicho extremo omega.
En una realización preferida, el compuesto comprende además un resto que puede obtenerse mediante una reacción de cicloadición, preferiblemente una reacción de cicloadición 1,3-dipolar, lo más preferiblemente un anillo de 1,2,3-triazol, que se localiza entre dicho extremo alfa y dicho grupo de acuerdo con la fórmula (1). En esta memoria, el compuesto comprende por tanto, cuando se visualiza desde el extremo alfa hasta el extremo omega, una biomolécula, un resto que puede obtenerse mediante una reacción de cicloadición, un grupo de acuerdo con la fórmula (1) y una molécula diana.
En una realización preferida adicional, la molécula diana es hidrófoba como se ha definido en esta memoria anteriormente.
Este compuesto de acuerdo con la invención también puede denominarse bioconjugado. Cuando el bioconjugado de acuerdo con la invención comprende una sal del grupo de acuerdo con la fórmula (1), la sal es preferiblemente una sal farmacéuticamente aceptable.
La biomolécula se fija covalentemente al extremo alfa, y la molécula diana se fija covalentemente al extremo omega del bioconjugado de acuerdo con la invención.
El bioconjugado de acuerdo con la invención puede comprender más de una molécula diana. De manera similar, el bioconjugado puede comprender más de una biomolécula. La biomolécula B y la molécula diana D, y sus realizaciones preferidas, se han descrito con más detalle anteriormente. Las realizaciones preferidas para D en el bioconjugado de acuerdo con la invención se corresponden con realizaciones preferidas de D en el enlazadorconjugado de acuerdo con la invención como se han descrito con más detalle anteriormente. Las realizaciones preferidas para el enlazador (8a) o (8b) en el bioconjugado de acuerdo con la invención se corresponden con realizaciones preferidas del enlazador en el enlazador-conjugado de acuerdo con la invención, como se han descrito con más detalle anteriormente.
En el bioconjugado de acuerdo con la invención, la biomolécula B es una glicoproteína (incluyendo los anticuerpos). Más preferiblemente, la biomolécula B es un anticuerpo.
El bioconjugado de acuerdo con la invención también puede definirse como un bioconjugado en el que una biomolécula se conjuga con una molécula diana a través de un resto espaciador, en donde el resto espaciador comprende un grupo de acuerdo con la fórmula (1), o una de sus sales, en donde el grupo de acuerdo con la fórmula (1) es como se ha definido anteriormente.
El bioconjugado de acuerdo con la invención también se puede denominar (B)y-Sp-(D)z, en donde y es un número entero en el intervalo de 1 a 10 y z es un número entero en el intervalo de 1 a 1 0.
Por lo tanto, la invención también se refiere a un bioconjugado de acuerdo con la fórmula:
(B)y-Sp-(D)z,
en donde:
y es un número entero en el intervalo de 1 a 1 0 ;
z es un número entero en el intervalo de 1 a 1 0 ;
B es una biomolécula;
D es una molécula diana;
Sp es un resto espaciador, en donde un resto espaciador se define como un resto que separa (es decir, proporciona una cierta distancia entre) y une covalentemente una biomolécula B y una molécula diana D; y
en donde dicho resto espaciador comprende un grupo de acuerdo con la fórmula (1) o una de sus sales, en donde el grupo de acuerdo con la fórmula (1) es como se ha definido anteriormente.
En una realización preferida, dicho resto espaciador comprende además un resto que puede obtenerse mediante una reacción de cicloadición, preferiblemente una reacción de cicloadición 1,3-dipolar, lo más preferiblemente un anillo de 1,2,3-triazol, que se localiza entre B y dicho grupo de acuerdo con la fórmula (1).
Preferiblemente, y es 1,2, 3 o 4, más preferiblemente y es 1 o 2 y lo más preferiblemente, y es 1. Preferiblemente, z es 1, 2, 3, 4, 5 o 6 , más preferiblemente z es 1, 2, 3 o 4, incluso más preferiblemente z es 1,2 o 3, aún más preferiblemente z es 1 o 2 y lo más preferiblemente z es 1. Más preferiblemente, y es 1 o 2, preferiblemente 1, y z es 1,2, 3 o 4, pero aún más preferiblemente y es 1 o 2, preferiblemente 1, y z es 1 ,2o 3, y aún más preferiblemente y es 1 o 2, preferiblemente 1, y z es 1 o 2, y lo más preferiblemente y es 1 y z es 1. En una realización preferida, el bioconjugado está de acuerdo con la fórmula B-Sp-(D)4 , B-Sp-(D)3 , B-Sp-(D)2 o B-Sp-D.
Como se ha descrito anteriormente, el bioconjugado de acuerdo con la invención comprende un grupo de acuerdo con la fórmula (1) como se ha definido anteriormente, o una sal del mismo. En una realización preferida, el bioconjugado comprende un grupo de acuerdo con la fórmula (1) en donde a es 0, o una sal del mismo. En esa realización, el bioconjugado comprende por tanto un grupo de acuerdo con la fórmula (2) o una sal del mismo, en donde (2) es como se ha definido anteriormente.
En otra realización preferida, el bioconjugado comprende un grupo de acuerdo con la fórmula (1) en donde a es 1, o una sal del mismo. En esa realización, el bioconjugado comprende por tanto un grupo de acuerdo con la fórmula (3) o una sal del mismo, en donde (3) es como se ha definido anteriormente.
En el bioconjugado de acuerdo con la invención, R1, el resto espaciador Sp, así como realizaciones preferidas de R1 y Sp, son como se han definido anteriormente para el enlazador-conjugado de acuerdo con la invención.
En una realización preferida, el bioconjugado está de acuerdo con la fórmula (5a) o (5b), o una de sus sales:
Figure imgf000037_0001
en donde a, b, c, d, e, f, g, h, i, D, Sp1, Sp2, Sp3, Sp4, Z1, Z2, Z3 y R1, y sus realizaciones preferidas, son como se han definido anteriormente para el enlazador-conjugado (4a) y (4b); y
h es 0 o 1 ;
Z3 es un grupo de conexión que conecta B con Sp3, Z1, Sp2, O o C(O); y
B es una biomolécula.
Preferiblemente, h es 1.
Las realizaciones preferidas de la biomolécula B son como se han definido anteriormente.
Cuando el bioconjugado de acuerdo con la invención es una sal de (5a) o (5b), la sal es preferiblemente una sal farmacéuticamente aceptable.
Z3 es un grupo de conexión. Como se ha descrito anteriormente, la expresión "grupo de conexión" en esta memoria se refiere al elemento estructural que conecta una parte de un compuesto y otra parte del mismo compuesto. Normalmente, un bioconjugado se prepara a través de una reacción de un grupo reactivo Q1 presente en un enlazador-conjugado con un grupo funcional F1 presente en una biomolécula. Como entenderá el experto en la materia, la naturaleza del grupo de conexión Z3 depende del tipo de reacción orgánica que se haya utilizado para establecer la conexión entre una biomolécula y un enlazador-conjugado. En otras palabras, la naturaleza de Z3 depende de la naturaleza del grupo reactivo Q1 del enlazador-conjugado y de la naturaleza del grupo funcional F1 en la biomolécula. Dado que hay un gran número de reacciones químicas diferentes disponibles para establecer la conexión entre una biomolécula y un enlazador-conjugado, en consecuencia, hay una gran cantidad de posibilidades para Z3.
Varios ejemplos de combinaciones adecuadas de F1 y Q1, y del grupo de conexión Z3 que estará presente en un bioconjugado cuando un enlazador-conjugado que comprende Q1 se conjuga con una biomolécula que comprende un grupo funcional F1 complementario, se muestran en la Figura 22.
Cuando F1 es por ejemplo un grupo tiol, los grupos complementarios Q1 incluyen grupos N-maleimidilo y grupos alquenilo, y los grupos de conexión Z3 correspondientes son como se muestran en la Figura 2 2. Cuando F1 es un grupo tiol, los grupos complementarios Q1 también incluyen grupos de alenamida.
Cuando F1 es, por ejemplo, un grupo amino, los grupos complementarios Q1 incluyen grupos cetona, grupos éster activados y grupos azido, y los grupos de conexión Z3 correspondientes son como se muestra en la Figura 22. Cuando F1 es, por ejemplo, un grupo cetona, los grupos complementarios Q1 incluyen grupos (O-alquil)hidroxilamino y grupos hidrazina, y los grupos de conexión Z3 correspondientes son como se muestra en la Figura 22.
Cuando F1 es, por ejemplo, un grupo alquinilo, los grupos complementarios Q1 Incluyen grupos azido, y el grupo de conexión Z3 correspondiente es como se muestra en la Figura 22.
Cuando F1 es, por ejemplo, un grupo azido, los grupos complementarios Q1 incluyen grupos alquinilo, y el grupo de conexión Z3 correspondiente es como se muestra en la Figura 22.
Cuando F1 es, por ejemplo, un grupo ciclopropenilo, un grupo trans-cicloocteno o un grupo ciclooctino, los grupos complementarios Q1 incluyen grupos tetrazinilo y el grupo de conexión Z3 correspondiente es como se muestra en la Figura 22. En estos casos particulares, Z3 es solo una estructura intermedia y expulsará N2, generando de este modo una dihidropiridazina (a partir de la reacción con alqueno) o piridazina (a partir de la reacción con alquino). Las combinaciones adicionales adecuadas de F1 y Q1y la naturaleza del grupo de conexión resultante Z3 son conocidas por los expertos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en G.T. Hermanson, "Bioconjugate Techniques", Elsevier, 3a ed. 2013 (ISBN:978-0-12-382239-0), en particular en el Capítulo 3, páginas 229-258. Una lista de los grupos reactivos complementarios adecuados para procesos de bioconjugación, se describe en la Tabla 3.1, páginas 230-232 del capítulo 3 de G.T. Hermanson, "Bioconjugate Techniques", Elsevier, 3 a ed. 2013 (ISBN:978-0-12-382239-0).
En el bioconjugado de acuerdo con (5a) y (5b), es preferible que al menos uno de Z3, Sp3, Z1 y Sp2 esté presente, es decir, al menos uno de h, g, d y c no sea 0. También se prefiere que al menos uno de Sp1, Z2 y Sp4 esté presente, es decir, que al menos uno de b, e e i no sea 0. Más preferiblemente, al menos uno de Z3, Sp3, Z1 y Sp2 está presente y al menos uno de Sp1, Z2 y Sp4 está presente, es decir, se prefiere que al menos uno de b, e e i no sea 0 y al menos uno de h, g, d y c no sea 0.
Procedimiento para la preparación de un bioconjugado.
La presente invención también se refiere a un procedimiento para la preparación de un bioconjugado, en donde el procedimiento comprende la etapa de hacer reaccionar un grupo reactivo Q1 de un enlazador-conjugado con un grupo funcional F1 de una glicoproteína. Las realizaciones preferidas del enlazador-conjugado se han descrito con más detalle anteriormente.
La Figura 1 muestra el concepto general de conjugación de biomoléculas: una biomolécula de interés (BOI) que comprende uno o varios grupos funcionales F1 se incuba con (un exceso de) una molécula diana D (también conocida como molécula de interés o MOI) fijada covalentemente a un grupo reactivo Q1 a través de un enlazador específico. En el procedimiento de bioconjugación, tiene lugar una reacción química entre F1 y Q1, formándose de este modo un bioconjugado que comprende un enlace covalente entre la BOI y la MOI. En el procedimiento de acuerdo con la invención, el enlazador es un enlazador de sulfamida.
La presente invención se refiere de este modo a un procedimiento para la preparación de un bioconjugado, comprendiendo el procedimiento la etapa de hacer reaccionar un grupo reactivo Q1 de un enlazador-conjugado con un grupo funcional F1 de una glicoproteína, en donde el enlazador-conjugado es un compuesto que comprende un extremo alfa y un extremo omega, comprendiendo el compuesto en el extremo alfa un grupo reactivo Q1 capaz de reaccionar con un grupo funcional F1 presente en la glicoproteína y en el extremo omega, una molécula diana seleccionada a partir del grupo que consiste en un fármaco, un profármaco, un agente de diagnóstico, una proteína, un péptido, un polipéptido, un marcador peptídico, un aminoácido, un glicano, un lípido, una vitamina, un esteroide, un nucleótido, un nucleósido, un polinucleótido, un ARN, un ADN, una molécula informadora, un polímero, una superficie sólida, un hidrogel, una nanopartícula, una micropartícula y una biomolécula, en donde Q1 es un grupo reactivo seleccionado a partir del grupo que consiste en grupos N-maleimidilo opcionalmente sustituidos, grupos N-alquilamido halogenados, grupos éster activados, grupos tiol, grupos alquinilo, grupos (hetero)cicloalquinilo, grupos tetrazinilo, grupos azido, grupos fosfina, grupos 1 ,1 -bis(sulfonilmetil)-metilcarbonilo, grupos 1 ,2 -quinona o grupos triazina, en donde el compuesto comprende además un grupo de acuerdo con la fórmula (1) o una sal del mismo:
Figure imgf000038_0001
en donde:
a es 0 o 1 ; y
R1 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos cicloalquilo C3 -C24, grupos (hetero)arilo C2 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C3 - C24, en donde los grupos alquilo C1 - C24, grupos cicloalquilo C3 - C24, grupos (hetero)arilo C2 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C3 - C24 están opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir de O, S y NR3 en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo C1 - C4 , o R1 es una molécula diana D, en donde la molécula diana está conectada opcionalmente con N a través de un resto espaciador;
y en donde el grupo de acuerdo con la fórmula (1), o la sal del mismo, está situado entre dicho extremo alfa y dicho extremo omega del enlazador-conjugado.
En una realización preferida, la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un bioconjugado a través de una cicloadición, tal como una cicloadición (4+2) (por ejemplo, una reacción de Diels-Alder) o una cicloadición (3+2) (por ejemplo, una cicloadición 1,3-dipolar). Preferiblemente, la conjugación es la reacción de Diels-Alder o la cicloadición 1,3-dipolar. La reacción preferida de Diels-Alder es la cicloadición de Diels-Alder con demanda inversa de electrones. En otra realización preferida, se usa la cicloadición 1,3-dipolar, más preferiblemente la cicloadición de alquino-azida, y lo más preferiblemente cuando Q1 es o comprende un grupo alquino y F1 es un grupo azido. Las cicloadiciones, tales como las reacciones de Diels-Alder y las cicloadiciones 1,3-dipolares, son conocidas en la técnica, y los expertos en la materia saben cómo realizarlas. En una realización preferida adicional, la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un bioconjugado, en donde la molécula diana es hidrófoba (es decir, débilmente soluble en agua), más preferiblemente en donde la molécula diana tiene una solubilidad en agua de a lo sumo 0 ,1 % (p/p) en agua (2 0 °C y 1 00 kPa). En una realización especialmente preferida, la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un bioconjugado a través de una cicloadición, preferiblemente una cicloadición 1,3-dipolar, más preferiblemente la cicloadición de alquino-azida, y lo más preferiblemente cuando Q1 es o comprende un grupo alquino y F1 es un grupo azido, y en donde la molécula diana es hidrófoba, lo más preferiblemente cuando la molécula diana tiene una solubilidad en agua de, como máximo, el 0,1% (p/p) en agua (20°C y 100 kPa).
En el procedimiento de acuerdo con la invención, Q1 reacciona con F1, formando una conexión covalente entre la biomolécula y el resto enlazador. Los grupos reactivos complementarios Q1 y los grupos funcionales F1 se han descrito con más detalle anteriormente y a continuación.
En una realización preferida del procedimiento de acuerdo con la invención, a es 0 en el grupo de acuerdo con la fórmula (1). En esa realización, el enlazador-conjugado comprende de este modo un grupo de acuerdo con la fórmula (2), como se ha definido anteriormente. En otra realización preferida del procedimiento de acuerdo con la invención, a es 1 en el grupo de acuerdo con la fórmula (1). En esa realización, el enlazador-conjugado comprende de este modo un grupo de acuerdo con la fórmula (3), como se ha definido anteriormente.
Las biomoléculas se han descrito con más detalle anteriormente. En el procedimiento de acuerdo con la invención, la biomolécula se selecciona a partir del grupo que consiste en glicoproteínas, incluyendo los anticuerpos.
Las moléculas diana se han descrito con más detalle anteriormente. En el procedimiento de acuerdo con la invención, la molécula diana se selecciona a partir del grupo que consiste en una sustancia activa seleccionada a partir de un fármaco, un profármaco, un agente de diagnóstico, una proteína, un péptido, un polipéptido, un marcador peptídico, un aminoácido, un glicano, un lípido, una vitamina, un esteroide, un nucleótido, un nucleósido, un polinucleótido, ARN y ADN, una molécula informadora, un polímero, una superficie sólida, un hidrogel, una nanopartícula, una micropartícula y una biomolécula. Las sustancias activas, las moléculas informadoras, los polímeros, las superficies sólidas, los hidrogeles, las nanopartículas y las micropartículas se han descrito con detalle anteriormente, al igual que sus realizaciones preferidas. Debido a la solubilidad en agua significativamente mejorada del enlazador-conjugado cuando se emplea el enlazador de sulfamida de acuerdo con la invención, una realización preferida del procedimiento para la preparación de un bioconjugado, emplea una molécula diana hidrófoba. La molécula diana hidrófoba en su forma no conjugada normalmente tiene una solubilidad en agua de a lo sumo 1 % (p/p), preferiblemente a lo sumo 0,1% (p/p), lo más preferiblemente a lo sumo 0,01% (p/p), determinada a 20°C y 100 kPa.
En el procedimiento de acuerdo con la invención, el grupo reactivo Q1 se selecciona a partir del grupo que consiste en grupos N-maleimidilo sustituidos opcionalmente, grupos N-alquilamido halogenados, grupos éster activados, grupos tiol, grupos alquinilo, grupos (hetero)cicloalquinilo, grupos tetrazinilo, grupos azido, grupos fosfina, grupos 1 ,1 -bis(sulfonilmetil)-metilcarbonilo, grupos 1 ,2 -quinona o grupos triazina.
En una realización preferida adicional, Q1 está de acuerdo con la fórmula (9a), (9b), (9c), (9f), (9g), (9h), (9j), (9n), (9o), (9p), (9q), (9r), (9s), (9t), (9zb), (9zh), (9zl), (9zm) o (9zn), en donde (9a), (9b), (9c), (9f), (9g), (9h), (9j), (9n), (9o), (9p), (9q), (9r), (9s), (9t), (9zb), (9zh), (9zk), (9zl), (9zm), (9zn) y realizaciones preferidas de las mismas, como se han definido anteriormente para el enlazador-conjugado de acuerdo con la invención. Más preferiblemente, Q1 está de acuerdo con la fórmula (9a), (9n), (9o), (9p), (9q), (9t), (9zh) o (9s), y lo más preferiblemente, Q1 está de acuerdo con la fórmula (9a), (9p), (9q), (9n), (9t), (9zh) o (9o), y realizaciones preferidas de las mismas, como se han definido anteriormente.
En una realización especialmente preferida, Q1 comprende un grupo alquino, preferiblemente seleccionado a partir del grupo alquinilo tal y como se ha descrito anteriormente, el grupo cicloalquenilo tal y como se ha descrito anteriormente, el grupo (hetero)cicloalquinilo tal y como se ha descrito anteriormente y un grupo biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo], más preferiblemente Q1 se selecciona a partir de las fórmulas (9j), (9n), (9o), (9p), (9q) y (9zk), tal y como se han definido anteriormente. Más preferiblemente, Q1 es un grupo biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo], preferiblemente de fórmula (9q).
En una realización preferida adicional del procedimiento de acuerdo con la invención, el enlazador-conjugado está de acuerdo con la fórmula (4a) o (4b), o una sal de las mismas:
Figure imgf000039_0001
Figure imgf000040_0001
en donde:
a es independientemente 0 o 1 ;
b es independientemente 0 o 1 ;
c es 0 o 1;
d es 0 o 1 ;
e es 0 o 1 ;
f es un número entero en el intervalo de 1a 150;
g es 0 o 1 ;
i es 0 o 1 ;
D es una molécula diana;
Q1 es un grupo reactivo capaz de reaccionar con un grupo funcional F1 presente en una biomolécula;
Sp1 es un resto espaciador;
Sp2 es un resto espaciador;
Sp3 es un resto espaciador;
Sp4 es un resto espaciador;
Z1 es un grupo de conexión que conecta Q1 o Sp3 con Sp2, O o C(O) o N(R1);
Z2 es un grupo de conexión que conecta D o Sp4 con Sp1, N(R1), O o C(O); y
R1 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo Ci - C24, grupos cicloalquilo C3 - C24,
grupos (hetero)arilo C2 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C3 -grupos alquilo C1 - C24, grupos cicloalquilo C3 - C24, grupos (hetero)arilo C2 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 - C24 y
grupos (hetero)arilalquilo C3 - C24 están opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios
heteroátomos seleccionados a partir de O, S y NR3 en donde R3 se selecciona independientemente a partir del
grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo C1 - C4 , o
R1 es D, -[(SpV(Z 2M S p > D ] o -[(Sp2)c-(Z1)d-(Sp3)g-Q1], en donde Sp1, Sp2 , Sp3, Sp4, Z1, Z2, D, Q1, b, c, d, e, g e i
son como se han definido anteriormente.
Sp1, Sp2 , Sp3 y Sp4 son, independientemente, restos espaciadores, en otras palabras, Sp1, Sp2, Sp3 y Sp4 pueden
diferir unos de otros Sp1, Sp2 , Sp3 y Sp4 pueden estar presentes o ausentes (b, c, g e i son, independientemente, 0 o
1). Sin embargo, se prefiere que al menos uno de Sp1, Sp2, Sp3 y Sp4 esté presente, es decir, se prefiere que al
menos uno de b, c, g e i no sea 0.
Si está presente, preferiblemente Sp1, Sp2 , Sp3 y Sp4 se seleccionan independientemente a partir del grupo que
consiste en grupos alquileno C1 - C20o lineales o ramificados, grupos alquenileno C2 - C20o, grupos alquinileno C2 -C2oo, grupos cicloalquileno C3 - C200, grupos cicloalquenileno C5 - C200, grupos cicloalquinileno C8 - C200, grupos
alquilarileno C7 - C200, grupos arilalquileno C7 - C200, grupos arilalquenileno C8 - C200 y grupos arilalquinileno C9 -C200, en donde los grupos alquileno, los grupos alquenileno, los grupos alquinileno, los grupos cicloalquileno, los
grupos cicloalquenileno, los grupos cicloalquinileno, los grupos alquilarileno, los grupos arilalquileno, los grupos
arilalquenileno y los grupos arilalquinileno están opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o
varios heteroátomos seleccionados a partir del grupo de O, S y NR3 , en donde R3 se selecciona independientemente
a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos alquenilo C2 - C24, grupos alquinilo C2 -C24 y grupos cicloalquilo C3 - C24, en donde los grupos alquilo, los grupos alquenilo, los grupos alquinilo y los grupos
cicloalquilo están opcionalmente sustituidos. Cuando los grupos alquileno, los grupos alquenileno, los grupos alquinileno, los grupos cicloalquileno, los grupos cicloalquenileno, los grupos cicloalquinileno, los grupos alquilarileno, los grupos arilalquileno, los grupos arilalquenileno y los grupos arilalquinileno están interrumpidos por uno o varios heteroátomos como se ha definido anteriormente, se prefiere que dichos grupos estén interrumpidos por uno o varios átomos de O, y/o por uno o varios grupos S-S.
Más preferiblemente, los restos espaciadores Sp1, Sp2, Sp3 y Sp4, si están presentes, se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en grupos alquileno C1 - C100 lineales o ramificados, grupos alquenileno C2 - C100, grupos alquinileno C2 - C100, grupos cicloalquileno C3 - C100, grupos cicloalquenileno C5 - C100, grupos cicloalquinileno C8 - C100, grupos alquilarileno C7 - C100, grupos arilalquileno C7 - C100, grupos arilalquenileno
C8 - C100 y grupos arilalquinileno Cg - C100, en donde los grupos alquileno, los grupos alquenileno, los grupos alquinileno, los grupos cicloalquileno, los grupos cicloalquenileno, los grupos cicloalquinileno, los grupos alquilarileno, los grupos arilalquileno, los grupos arilalquenileno y los grupos arilalquinileno están opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir del grupo de O, S y
NR3, en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo Ci
- C24, grupos alquenilo C2 - C24, grupos alquinilo C2 - C24 y grupos cicloalquilo C3 - C24, en donde los grupos alquilo, los grupos alquenilo, los grupos alquinilo y los grupos cicloalquilo están opcionalmente sustituidos.
Aún más preferentemente, los restos espaciadores Sp1, Sp2, Sp3 y Sp4, si están presentes, se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en grupos alquileno C1 - C50 lineales o ramificados, grupos alquenileno C2 - C50, grupos alquinileno C2 - C50, grupos cicloalquileno C3 - C50, grupos cicloalquenileno C5 - C50, grupos cicloalquinileno C8 - C50, grupos alquilarileno C7 - C50, grupos arilalquileno C7 - C50, grupos arilalquenileno C8
- C50 y grupos arilalquinileno Cg - C50, en donde los grupos alquileno, los grupos alquenileno, los grupos alquinileno, los grupos cicloalquileno, los grupos cicloalquenileno, los grupos cicloalquinileno, los grupos alquilarileno, los grupos arilalquileno, los grupos arilalquenileno y los grupos arilalquinileno están opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir del grupo de O, S y NR3, en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo Ci - C24, grupos alquenilo C2 - C24, grupos alquinilo C2 - C24 y grupos cicloalquilo C3 - C24, en donde los alquenilo, los grupos alquinilo y los grupos cicloalquilo están opcionalmente sustituidos.
Aún más preferiblemente, los restos espaciadores Sp1, Sp2, Sp3 y Sp4, si están presentes, se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en grupos alquileno C1 - C20 lineales o ramificados, grupos alquenileno C2 - C20, grupos alquinileno C2 - C20, grupos cicloalquileno C3 - C20, grupos cicloalquenileno C5 - C20, grupos cicloalquinileno C8 - C20, grupos alquilarileno C7 - C20, grupos arilalquileno C7 - C20, grupos arilalquenileno C8
- C20 y grupos arilalquinileno Cg - C20, en donde los grupos alquileno, los grupos alquenileno, los grupos alquinileno, los grupos cicloalquileno, los grupos cicloalquenileno, los grupos cicloalquinileno, los grupos alquilarileno, los grupos arilalquileno, los grupos arilalquenileno y los grupos arilalquinileno están opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir del grupo de O, S y NR3, en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo Ci - C24, grupos alquenilo C2 - C24, grupos alquinilo C2 - C24 y grupos cicloalquilo C3 - C24, en donde los alquenilo, los grupos alquinilo y los grupos cicloalquilo están opcionalmente sustituidos.
En esas realizaciones preferidas, se prefiere adicionalmente que los grupos alquileno, los grupos alquenileno, los grupos alquinileno, los grupos cicloalquileno, los grupos cicloalquenileno, los grupos cicloalquinileno, los grupos alquileno, los grupos arilalquileno, los grupos arilalquenileno y los grupos arilalquinileno estén opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir del grupo de O, S y
NR3, preferiblemente O, en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo C1 - C4, preferiblemente hidrógeno o metilo.
Lo más preferiblemente, los restos espaciadores Sp1, Sp2, Sp3 y Sp4, si están presentes, se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en grupos alquileno C1 - C20 lineales o ramificados, en donde los grupos alquileno están opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir del grupo de O, S y NR3, en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo Ci - C24, grupos alquenilo C2 - C24, grupos alquinilo C2 - C24 y grupos cicloalquilo C3 - C24, en donde los grupos alquilo, los grupos alquenilo, los grupos alquinilo y los grupos cicloalquilo están opcionalmente sustituidos. En esa realización, se prefiere además que los grupos alquileno no estén sustituidos y estén opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir del grupo de
O, S y NR3, preferiblemente O y/o S-S, en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo Ci - C4, preferiblemente hidrógeno o metilo.
Los restos espaciadores particularmente preferidos Spi , Sp2, Sp3 y Sp4 incluyen -(CH2V, -(CH2CH2)n-, -(CH2CH2O)n-, -(OCH2CH2)n-, -(CH2CH2O)nCH2CH2-, -CH2CH2(OCH2CH2)n-, -(CH2CH2CH2O)n-, -(OCH2CH2CH2)n-, -(CH2CH2CH2O)nCH2CH2CH2- y - CH2CH2CH2(OCH2CH2CH2)n-, en donde n es un número entero en el intervalo de i a 50, preferiblemente en el intervalo de i a 40, más preferiblemente en el intervalo de i a 30, aún más preferiblemente en el intervalo de i a 20 e incluso más preferiblemente en el intervalo de i a i5. Más preferiblemente n es i, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 o i0, más preferiblemente i, 2, 3, 4, 5, 6 , 7 u 8 , incluso más preferiblemente i, 2, 3, 4, 5 o 6 , y todavía más preferiblemente i, 2, 3 o 4.
4 i
En otra realización preferida del procedimiento de acuerdo con la invención, en los enlazadores-conjugados de acuerdo con la fórmula (4a) y (4b), los restos espaciadores Sp1, Sp2 , Sp3 y/o Sp4, si están presentes, comprenden una secuencia de aminoácidos. Los restos espaciadores que comprenden una secuencia de aminoácidos son conocidos en la técnica, y también pueden denominarse enlazadores peptídicos. Los ejemplos incluyen restos espaciadores que comprenden un resto Val-Cit, p. ej., val-cit-PABC, val-cit-PAB, Fmoc-val-cit-PAB, etc.
Como se ha descrito anteriormente, Z1 y Z2 son grupos de conexión. En una realización preferida del procedimiento de acuerdo con la invención, Z1 y Z2 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en -O-, -S-, -NR2-, -N=N-, -C(O)-, -C(O)NR2-, -O-C(O)-, -O-C(O)-O-, -O-C(O)-NR2, -NR2-C(O)-, -NR2-C(O)-O-, -NR2-C(O)-NR2-, -S-C(O)-, -S-C(O)-O-, -S-C(O)-NR2-, -S(O)-, -S(O)2-, -O-S(O)2-, -O-S(O)2-O-, -O-S(O)2-NR2-, -O-S(O)-, -O-S(O)-O-, -O-S(O)-NR2-, -O-NR2-C(O)-, -O-NR2-C(O)-O-, -O-NR2-C(O)-NR2-, -NR2-O-C(O)-, -NR2-O-C(O)-O-, -NR2-O-C(O)-NR2-, -O-NR2-C(S)-, -O-NR2-C(S)-O-, -O-NR2-C(S)-NR2-, -NR2-O-C(S)-, -NR2-O-C(S)-O-, -NR2-O-C(S)-NR2-, -O-C(S)-, -O-C(S)-O-, -O-C(S)-NR2-, -NR2-C(S)-, -NR2-C(S)-O-, -NR2-C(S)-NR2-, -S-S(O)2-, -S-S(O)2-O-, -S-S(O)2-NR2-, -NR2-O-S(O)-, -NR2-O-S(O)-O-, -NR2-O-S(O)-NR2-, -NR2-O-S(O)2-, -NR2-O-S(O)2-O-, -NR2-O-S(O)2-NR2-, -O-NR2-S(O)-, -O-NR2-S(O)-O-, -O-NR2-S(O)-NR2-, -O-NR2-S(O)2-O-, -O-NR2-S(O)2-NR2-, -O-NR2-S(O)2-, -O-P(O)(R2)2-, -S-p (O)(R2)2-, -NR2-P(O)(R2)2- y combinaciones de dos o más de los mismos, en donde R2 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos alquenilo C2 - C24, grupos alquinilo C2 - C24 y grupos cicloalquilo C3 - C24, en donde los grupos alquilo, los grupos alquenilo, los grupos alquinilo y los grupos cicloalquilo están opcionalmente sustituidos.
En un procedimiento particularmente preferido de acuerdo con la invención, Sp1, Sp2, Sp3 y Sp4, si están presentes, se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en grupos alquileno C1 - C20 lineales o ramificados, estando los grupos alquileno opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir del grupo que consiste en O, S y NR3 , en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo C1 - C4, y en donde Q1 está de acuerdo con la fórmula (9a), (9p), (9q), (9n), (9t) o (9o):
Figure imgf000042_0001
en donde:
R10 es hidrógeno o un grupo (tio)éster.
Como se ha descrito anteriormente, en el procedimiento para la preparación de un bioconjugado, un grupo reactivo Q1 que está presente en un enlazador-conjugado reacciona con un grupo funcional F1 que está presente en una glicoproteína. En el procedimiento de acuerdo con la invención, más de un grupo funcional puede estar presente en la glicoproteína. Cuando dos o más grupos funcionales están presentes, dichos grupos pueden ser iguales o diferentes. De manera similar, más de un grupo reactivo puede estar presente en el enlazador-conjugado. Cuando dos o más grupos reactivos están presentes, dichos grupos pueden ser iguales o diferentes. En una realización preferida del procedimiento de acuerdo con la invención, el enlazador-conjugado comprende un grupo reactivo Q1 y una o varias moléculas dianas D que pueden ser iguales o diferentes. El enlazador-conjugado comprende, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 , preferiblemente 1, 2, 3 o 4, más preferiblemente 1,2 o 3, incluso más preferiblemente 1 o 2 moléculas diana D. En una realización particularmente preferida, el enlazador-conjugado comprende 1 molécula diana D. En otra realización particularmente preferida, el enlazador-conjugado comprende 2 moléculas dianas D, que pueden ser iguales o diferentes. En otra realización preferida, la glicoproteína comprende dos o más grupos funcionales F, que pueden ser iguales o diferentes, y dos o más grupos funcionales reaccionan con un grupo reactivo complementario Q de un enlazador-conjugado. Por ejemplo, una glicoproteína que comprende dos grupos funcionales F, es decir, F1 y F2, puede reaccionar con dos enlazadores-conjugados que comprenden un grupo funcional Q1, que pueden ser iguales o diferentes, para formar un bioconjugado.
Ejemplos de un grupo funcional F1 en una glicoproteína comprenden un grupo amino, un grupo tiol, un ácido carboxílico, un grupo alcohol, un grupo carbonilo, un grupo fosfato o un grupo aromático. El grupo funcional en la glicoproteína puede estar presente de forma natural o se puede situar en la glicoproteína mediante una técnica específica, por ejemplo, una técnica (bio)química o genética. El grupo funcional que se sitúa en la glicoproteína puede ser un grupo funcional que está presente en la naturaleza de forma natural, o puede ser un grupo funcional que se prepara por síntesis química, por ejemplo una azida, un alquino terminal, un resto ciclopropeno o un resto fosfina. Debido al modo preferido de conjugación mediante cicloadición, se prefiere que F1 sea un grupo capaz de reaccionar en una cicloadición, tal como un dieno, un dienófilo, un dipolo 1,3 o un dipolarófilo, preferiblemente F1 se selecciona a partir de un dipolo 1,3 (normalmente un grupo azido, un grupo nitrona, un grupo óxido de nitrilo, un grupo nitrilo imina o un grupo diazo) o un dipolarófilo (normalmente un grupo alquenilo o alquinilo). En esta memoria, F1 es un dipolo 1,3 cuando Q1 es un dipolarófilo y F1 es un dipolarófilo cuando Q1 es un dipolo 1,3, o F1 es un dieno cuando Q1 es un dienófilo y F1 es un dienófilo cuando Q1 es un dieno. Lo más preferiblemente, F1 es un dipolo 1,3, preferiblemente F1 es o comprende un grupo azido.
En la Figura 2 se muestran varios ejemplos de un grupo funcional que se sitúa en una glicoproteína. La Figura 2 muestra varias estructuras de derivados de azúcares UDP de galactosamina, que pueden modificarse, p. ej., un grupo tiopropionilo (11a), un grupo azidoacetilo (11b) o un grupo azidodifluoroacetilo (1lc).
La Figura 3 muestra esquemáticamente cómo cualquiera de los azúcares UDP 11a-c se puede fijar a una glicoproteína que comprende un resto GlcNAc 12 (p. ej., un anticuerpo monoclonal cuyo glicano está recortado por una endoglicosidasa) bajo la acción de un mutante de galactosiltransferasa o GalNAc-transferasa, generando de este modo un enlace p-glicosídico 1-4 entre un derivado de GalNAc y GlcNAc (compuestos 13a-c, respectivamente). Ejemplos preferidos de grupos F1 funcionales presentes de forma natural incluyen un grupo tiol y un grupo amino. Ejemplos preferidos de un grupo funcional que se prepara por síntesis química para la incorporación en la glicoproteína incluyen un grupo cetona, un grupo alquino terminal, un grupo azida, un grupo ciclo (hetero)alquino, un grupo ciclopropeno o un grupo tetrazina.
Como se ha descrito anteriormente, los grupos reactivos complementarios Q1 y los grupos funcionales F1 son conocidos por los expertos en la técnica, y varias combinaciones adecuadas de Q1 y F1 se han descrito anteriormente y se muestran en la Figura 22. Una lista de grupos complementarios Q1 y F1 se describe en la Tabla 3.1, páginas 230-232 del capítulo 3 de G.T. Hermanson, "Bioconjugate Techniques", Elsevier, 3a ed. 2013 (ISBN:978-0-12-382239-0).
Una realización del procedimiento de acuerdo con la invención se describe en la Figura 4. La Figura 4 muestra cómo un anticuerpo modificado 13a-c puede someterse un procedimiento de bioconjugación mediante una adición nucleofílica con maleimida (como para 13a, lo que conduce al conjugado tioéter 14) o después de una cicloadición favorecida por la tensión con un reactivo de ciclooctino (como para 13b o 13c, que conduce a los triazoles 15 o 16, respectivamente).
La invención se refiere además a un bioconjugado obtenible mediante el procedimiento de acuerdo con la invención para la preparación de un bioconjugado.
Una ventaja del procedimiento de acuerdo con la invención para la preparación de un bioconjugado, y del enlazadorconjugado y del enlazador de sulfamida de acuerdo con la invención es que la eficacia de la conjugación se incrementa en caso de que se use un enlazador de sulfamida en lugar de un espaciador típico de polietilenglicol (PEG). Por ejemplo, como se demuestra en el ejemplo 58, un experimento de competencia que implica la incubación de trastuzumab que contiene una cisteína única libre modificada por ingeniería genética, con una mezcla estequiométrica de maleimida 17 (que comprende un enlazador comparativo) y 18 (que comprende un enlazador de sulfamida de acuerdo con la invención) mostraba que la eficacia de la conjugación de la maleimida que contenía sulfamida 18 es más alta que con 17.
La Figura 5 muestra la estructura de los enlazadores-conjugados 17 y 18, en donde Q1 es un grupo N-maleimidilo y D es un pireno. El compuesto 18 está de acuerdo con la invención, mientras que el compuesto 17 es un ejemplo comparativo. La Figura 16 muestra la síntesis de 17 y 18.
Asimismo, las conjugaciones de 19-35, ilustradas en las Figuras 6-9, con trastuzumab-N3 muestran que un procedimiento de conjugación basado en la cicloadición de azida-ciclooctina es invariablemente más rápido para los enlazadores-conjugados que contienen sulfamida, en comparación con los enlazadores-conjugados tradicionales que contienen PEG, y en la mayoría de los casos es claramente más rápido (véase la Tabla 1 y 2 y las Figuras 12­ 14).
Los conjugados de 20, 21,23, 26, 29, 33 y 35 con trastuzumab-N3 están de acuerdo con la invención, y los conjugados de 19, 22, 24, 25, 27, 28, 30, 31, 32 y 34 son ejemplos comparativos. Además, en varios casos, las conjugaciones con estructuras artificiales basadas en PEG, no consiguen una conversión completa, incluso después de tiempos de incubación prolongados, p. ej., Figura 12a, 12b, 13b y 14a.
Tabla 1
Figure imgf000044_0001
* Basado en el trastuzumab-N3 inicial restante
n.d.=no determinado
Tabla 2
Figure imgf000044_0002
La Figura 12a muestra la eficacia de la conjugación de los derivados de BCN-pireno conjugados a través de un enlazador de sulfamida (compuesto 26) o enlazadores PEG cortos (compuestos 24 o 25) con trastuzumab-N3 (compuesto 13b).
La Figura 12b muestra la eficacia de la conjugación de los derivados de DIBAC-pireno conjugados a través de un enlazador de sulfamida (compuesto 29) o enlazadores PEG cortos (compuestos 27 o 28) con trastuzumab-N3 (compuesto 13b).
La Figura 13a muestra la eficacia de la conjugación de los derivados de BCN-maitansina conjugados a través de un enlazador de sulfamida (compuesto 33) o enlazadores PEG cortos (compuestos 30-32) con trastuzumab-N3 (compuesto 13b).
La Figura 13b muestra la eficacia de la conjugación de los derivados de BCN-maitansina conjugados a través de un enlazador de sulfamida (compuestos 33) o enlazadores PEG cortos (compuestos 30-32, en donde el compuesto 30 se solapa con 33) con trastuzumab-F2-GalNAz (compuesto 13c).
La Figura 14a muestra la eficacia de la conjugación de los derivados de BCN-duocarmicina conjugados a través de un enlazador de sulfamida (compuesto 35) o un enlazador PEG corto (compuesto 34) con trastuzumab-N3 (compuesto 13b).
La Figura 14b muestra la eficacia de la conjugación de los derivados de BCN-duocarmicina conjugados a través de un enlazador de sulfamida (compuesto 35) o un enlazador PEG corto (compuesto 34) con trastuzumab-F2-GalNAz (compuesto 13c).
Una ventaja adicional de un grupo sulfamida, en particular de un grupo acilsulfamida o carbamoilsulfamida, es su polaridad elevada, que imparte un efecto positivo sobre la solubilidad de un enlazador que comprende ese grupo, y sobre la estructura artificial en su conjunto, antes, durante y después de la conjugación. El aumento de la polaridad del espaciador de sulfamida se hace evidente en la Tabla 3 (representada gráficamente en la Figura 11), que resume los tiempos de retención de los compuestos 19-23 y 30-38 en una RP-HPLC. Debido a esa polaridad incrementada, la conjugación con enlazadores-conjugados que contienen el enlazador de sulfamida de acuerdo con la invención, es particularmente adecuada para conjugar compuestos diana hidrófobos con una biomolécula.
La Figura 11 muestra los tiempos de retención de una HPLC de los compuestos 19-23 y 30-38 con 0,1% de TFA o en tampón a pH 7,4.
La Figura 6 muestra las estructuras de varios compuestos, en donde un grupo reactivo Q1 de biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo] (también conocido como grupo BCN) está conectado con bencilamina (D) a través de una unidad enlazadora. Los compuestos 20, 21 y 23 están de acuerdo con la invención, mientras que los compuestos 19 y 22 son ejemplos comparativos. La Figura 17 muestra la síntesis de 19-22 (véanse también los Ejemplos 21-28) y la Figura 18 la síntesis de 23 (véanse también los Ejemplos 29-31).
La Figura 7 muestra las estructuras de varios compuestos, en donde un grupo reactivo Q1 de biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo] (también conocido como un grupo BCN) o un grupo reactivo Q1 de dibenzoazociclooctina (también conocido como grupo DIBAC o grupo DBCO) está conectado con pireno a través de una unidad enlazadora. Los compuestos 26 y 29 están de acuerdo con la invención, mientras que los compuestos 24, 25, 27 y 28 son ejemplos comparativos. La Figura 19 muestra las rutas sintéticas que conducen a los compuestos 24-26, y la Figura 20 muestra las rutas sintéticas que conducen a los compuestos 27-29.
La Figura 8 muestra las estructuras de varios compuestos, en donde un grupo reactivo Q1 de biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo] (también conocido como grupo BCN) está conectado con maitansina a través de una unidad enlazadora. El compuesto 33 está de acuerdo con la invención, mientras que los compuestos 30, 31 y 32 son ejemplos comparativos.
La Figura 9 muestra las estructuras de varios compuestos en donde un grupo reactivo Q1 de biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo] (también conocido como grupo BCN) está conectado con una estructura artificial de Val-Cit-PABA-duocarmicina a través de una unidad enlazadora. El compuesto 35 está de acuerdo con la invención, mientras que el compuesto 34 es un ejemplo comparativo.
La Figura 10 muestra las estructuras de los compuestos 36-38 de acuerdo con la invención, en donde un grupo reactivo Q1 de biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo] (también conocido como grupo BCN) se conjuga con Val-Cit-PABA-Ahxmaitansina a través de un enlazador.
La síntesis de los compuestos 30-35 se describe en los ejemplos 43-49 y las rutas sintéticas para los compuestos 36-38 se representan gráficamente en la Figura 21 y se describen en los ejemplos 50-55.
. .
Figure imgf000046_0001
Ya que los compuestos más polares muestran un tiempo de retención reducido, los valores más bajos para los compuestos 20, 21 y 23 con respecto al compuesto 19 y 22 a pH 7,4 (ningún efecto es visible a un pH bajo), reflejan claramente la polaridad de los espaciadores de sulfamida, en comparación con las estructuras artificiales de enlazadores de amida normales (compuesto 19). El compuesto 22 metilado, aunque también es una sulfamida en sentido estricto, no muestra la polaridad aumentada, debido a la falta de un protón ácido en el nitrógeno acilado. El hecho de que no sea visible una diferencia clara en el tiempo de retención con 0,1% de TFA (cuyo pH no tendrá lugar una desprotonación) también es una indicación de que el protón ácido desempeña un papel clave en la definición de la polaridad. El compuesto 22 de bisulfamida, destaca finalmente que las unidades de sulfamida adicionales en un solo enlazador (es decir, cuando f es 2 o más en los compuestos y el procedimiento de acuerdo con la invención) aumentan aún más la polaridad. La última observación también ha facilitado la conjugación suave de una estructura artificial y BCN que es portadora de dos toxinas lipófilas (maitansinas), como en el compuesto de bisulfamida 38 y 39, con un azido-mAb.
La polaridad elevada de las sulfamidas también tiene un impacto positivo en el caso de que se impartan restos hidrófobos sobre una biomolécula de interés, que se sabe que requiere grandes cantidades de codisolvente orgánico durante la conjugación y/o que induce la agregación del bioconjugado. Los altos niveles de codisolvente (hasta el 50% de DMA, propilenglicol o DMSO) pueden inducir una desnaturalización de la proteína durante el procedimiento de conjugación y/o pueden requerir un equipamiento especial en el procedimiento de preparación. Un ejemplo de la estabilidad del bioconjugado implica el compuesto 38 altamente polar que contiene bisulfamida, el cual una vez conjugado con trastuzumab, mostraba una agregación de cero a despreciable después de un almacenamiento prolongado, lo que de hecho también se aplica a la monosulfamida 37.
Debido a esa tendencia reducida a agregarse, el enlazador de sulfamida de acuerdo con la invención es particularmente beneficioso para emplearlo en la preparación de bioconjugados en los que el producto de reacción de la reacción de conjugación, es decir, la reacción entre los grupos reactivos Q1 y F1, proporciona un resto enlazador que es débilmente soluble en agua. En una realización especialmente preferida, la conjugación se realiza a través de una cicloadición, preferiblemente una cicloadición 1,3-dipolar, más preferiblemente una cicloadición de alquino-azida. Como se muestra en los ejemplos, cualquier agregación en esta memoria se reduce de manera beneficiosa utilizando el enlazador de sulfamida de acuerdo con la invención, lo que mejora enormemente la estabilidad del producto al reducir la tendencia a la agregación. Por lo tanto, el problema de la agregación asociada con los restos de enlazadores hidrófobos en los bioconjugados, se resuelve de manera eficiente utilizando el enlazador de sulfamida de acuerdo con la invención, en el espaciador entre la molécula diana y el grupo reactivo Q1 en el enlazador-conjugado en la formación del bioconjugado.
Una ventaja adicional de un enlazador de sulfamida de acuerdo con la invención, y su uso en procedimientos de bioconjugación, es su facilidad de síntesis y los altos rendimientos. Como se muestra esquemáticamente en la Figura 15, la síntesis de un espaciador de carbamoil sulfamida implica la reacción de un alcohol primario 40 con el reactivo comercialmente disponible CSI (isocianato de clorosulfonilo), lo que conduce a un cloruro de sulfonilo intermedio 41 que, sin tratamiento, reacciona con una amina proporcionando de este modo la carbamoil sulfamida estable 42. El último compuesto se puede convertir fácilmente en una acilsulfamida en el caso de que R1 sea un terc-butilo, el cual después de un tratamiento con ácido proporciona un producto de sulfamida primaria 43. Del mismo modo, en el caso de que R1 = bencilo, una desprotección puede verse afectada con la hidrogenación. La sulfamida primaria 43 se puede acilar convenientemente con ésteres activados con procedimientos comunes para proporcionar la acilsulfamida 44.
La facilidad de la síntesis de los enlazadores de sulfamida de acuerdo con la invención, y su excelente rendimiento en los procedimientos de bioconjugación también se hacen evidentes en la síntesis y la utilidad de los compuestos 23 y 38, ambos estructuras artificiales de bisulfamida que se generan fácilmente mediante la repetición de los eventos resumidos anteriormente, es decir, el tratamiento de un alcohol con CSI, seguido de una reacción con un aminoalcohol, genera a cambio un alcohol que se puede someter nuevamente a la secuencia de eventos, generando de este modo una bisulfamida. Una repetición adicional de la secuencia genera trioligómeros, tetraoligómeros y oligómeros de sulfamida superiores, dependiendo del número de repeticiones.
El hecho de que el enlazador de sulfamida en el conjugado final sea corto, puede tener una ventaja adicional en el sentido de que se sabe que en los espaciadores particularmente largos de PEG (p. ej., PEG24), necesarios para contrarrestar el carácter hidrófobo de una molécula diana, tal como una citotoxina, pueden tener un impacto negativo sobre la farmacocinética del conjugado de proteína final, como se conoce por los conjugados de anticuerpo-fármaco, en particular con una alta carga de fármaco.
Ejemplos
Ejemplo 1. Síntesis de 1-fosfato de a-2-azido-2-desoxi-3,4,6-tri-O-acetil-D-galactosa
El 1-fosfato de a-2-azido-2-desoxi-3,4,6-tri-O-acetil-D-galactosa se preparó a partir de D-galactosamina de acuerdo con los procedimientos descritos para la D-glucosamina en Linhardt et al., J. Org. Chem. 2012, 77, 1449-1456.
1H-RMN (300 MHz, CD3OD): 8 (ppm) 5,69 (dd, J = 7,2, 3,3 Hz, 1H), 5,43-5,42 (m, 1H), 5,35 (dd, J = 11,1, 3,3 Hz, 1H), 4,53 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 4,21-4,13 (m, 1H), 4,07-4,00 (m, 1H), 3,82 (dt, J = 10,8, 2,7 Hz, 1H), 2,12 (s, 3H), 2,00 (s, 3H), 1,99 (s, 3H). LRMS (ESI-) m/z calcd. para C12H17N3O11P (M-H+) = 410,06; encontrada 410,00.
Ejemplo 2. Síntesis de a-UDP-2-azido-2-desoxi-3,4,6-tri-O-acetil-D-galactosa
El 1-fosfato de a-2-azido-2-desoxi-3,4,6-tri-O-acetil-D-galactosa, como se había preparado en el ejemplo 1, se fijó a UMP de acuerdo con Baisch et al. Bioorg. Med. Chem., 1997, 5, 383-391.
Por lo tanto, una solución de sal disódica de D-uridina-5'-monofosfato (1,49 g, 4,05 mmol) en H2O (15 ml) se trató con DOWEX 50Wx8 (forma H+) durante 30 minutos y se filtró. El material filtrado se agitó vigorosamente a temperatura ambiente mientras que se añadía gota a gota tributilamina (0,97 ml, 4,05 mmol). Después de 30 minutos de agitación adicional, la mezcla de reacción se liofilizó y se secó adicionalmente sobre P2O5 a vacío durante 5 h.
La uridina-5'-monofosfato de tributilamonio resultante se disolvió en DMF seca (25 ml) en atmósfera de argón. Se añadió carbonil diimidazol (1,38 g, 8,51 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente (ta) durante 30 min. A continuación, se añadió MeOH seco (180 jl) y se agitó durante 15 minutos para eliminar el exceso de carbonildiimidazol. El MeOH sobrante se eliminó a alto vacío durante 15 min. El compuesto resultante (2,0 g, 4,86 mmol) se disolvió en DMF seca (25 ml) y se añadió gota a gota a la mezcla de reacción. La reacción se dejó agitando a temperatura ambiente durante 2 días antes de una concentración a vacío. El consumo del producto intermedio imidazol-UMP fue controlado por MS. Una cromatografía en columna ultrarrápida en gradiente (7:2:1 ^ 5:2:1 de EtOAc:MeOH:H2O) proporcionó a-UDP-2-azido-2-desoxi-3,4,6-tri-O-acetil-D-galactosa (1,08 g, 1,51 mmol, 37%).
1H-RMN (300 MHz, D2O): 8 (ppm) 7,96 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 5,98-5,94 (m, 2H), 5,81-5,79 (m, 1H), 5,70 (dd, J = 7,1, 3,3 Hz, 1H), 5,49 (dd, J = 15,2, 2,6 Hz, 1H), 5,30 (ddd, J = 18,5, 11,0, 3,2 Hz, 2H), 4,57 (q, J = 6,0 Hz, 2H), 4,35-4,16 (m, 9H), 4,07-3,95 (m, 2H), 2,17 (s, 3H), 2,08 (s, 3H), 2,07 (s, 3H). LRMS (ESI-) m/z calcd. para C21H29N5O19P2 (M-H+) = 716,09; encontrada 716,3.
Ejemplo 3. Síntesis de a-UDP-2-azido-2-desoxi-D-galactosa
La desacetilación de a-UDP-2-azido-2-desoxi-3,4,6-tri-O-acetil-D-galactosa, como se había preparado en el ejemplo 2, se realizó de acuerdo con Kiso et al., Glycoconj. J., 2006, 23, 565.
Por lo tanto, a-UDP-2-azido-2-desoxi-3,4,6-tri-O-acetil-D-galactosa (222 mg, 0,309 mmol) se disolvió en H2O (2,5 mL) y se añadió Et3N (2,5 ml) y MeOH ( 6 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 3 h y luego se concentró al vacío para proporcionar a-UDP-2-azido-2-desoxi-D-galactosa cruda. 1H-RMN (300 MHz, D2O): 8 (ppm) 7,99 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,02-5,98 (m, 2H), 5,73 (dd, J = 7,4, 3,4 Hz, 1H), 4,42-4,37 (m, 2H), 4,30-4,18 (m, 4H), 4,14-4,04 (m, 2H), 3,80-3,70 (m, 2H), 3,65-3,58 (m, 1H). LRMS (ESI') m/z calcd. para C15H23N5O16P2 (M-H+) = 590,05; encontrada 590,20.
Ejemplo 4. Síntesis de a-UDP-D-galactosamina (UDP-GalNH2)
A una solución de a-UDP-2-azido-2-desoxi-D-galactosa, como se había preparado en el ejemplo 3, en una mezcla 1:1 de H2O-MeOH (4 ml), se añadió al catalizador de Lindlar (50 mg). La reacción se agitó bajo una atmósfera de hidrógeno durante 5 h y se filtró sobre celite. El filtro se enjuagó con H2O (10 ml) y el filtrado se concentró al vacío para proporcionar a-UDP-D-galactosamina (UDP-GalNH2) (169 mg, 0,286 mmol, 92% de rendimiento en dos etapas). 1H-RMN (300 MHz, D2O): 8 (ppm) 7,93 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,99-5,90 (m, 2H), 5,76-5,69 (m, 1H), 4,39-4,34 (m, 2H), 4,31-4,17 (m, 5H), 4,05-4,01 (m, 1H), 3,94-3,86 (m, 1H), 3,82-3,70 (m, 3H), 3,30-3,16 (m, 1H). LRMS (ESI-) m/z calcd. para C15H25N3O16P2 (M-H+) = 564,06; encontrada 564,10.
Ejemplo 5. Síntesis de UDP-GalNProSAc
Se disolvió UDP-a-D-galactosamina (44 mg, 0,078 mmol) en NaHCO30,1 M (1 mL). Se añadió éster succinimidílico de ácido 3-AcS-propiónico (38 mg, 0,156 mmol) y DMF (1 ml) y la reacción se agitó durante una noche a ta, seguido de concentración a presión reducida. Una cromatografía ultrarrápida en gradiente (7:2:1 ^ 5:2:1 EtOAc:MeOH:H2O) proporcionó UDP-GalNProSAc ( 6 mg, 0,009 mmol, 11%) contaminación de UDP-GalNAc. LRMS (ESI') calcd. para C20H31N3O1bP2S(M-) 694,08 encontrado 694,1.
1H-RMN (300 MHz, D2O): (ppm) 7,79 (m, 1H), 5,83-5,80 (m, 2H), 5,48-5,45 (m, 1H), 4,28-4,05 (m, 6 H), 3,88-3,85 (m, 2H), 3,63-3,55 (m, 3H), 3,17-3,16 (m, 2H), 2,60-2,55 (m, 2H) 2,50 (s, 3H).
Ejemplo 6. Síntesis de UDP-GalNProSH (11a)
Se disolvió UDP-GalNProSAc (3 mg, 0,005 mmol) en NaOH 1 M desgasificado (1 ml) y se agitó durante 1,5 h seguido de concentración al vacío. El producto se utilizó crudo en los experimentos de glicosilación.
1H-RMN (400 MHz, D2O): 8 (ppm) 7,86 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 5,88-5,86 (m, 2H), 5,48-5,45 (m, 1H), 4,20-4,05 (m, 8 H), 3,95-3,85 (m, 1H), 3,68-3,65 (m, 2H), 2,69-2,67 (m, 2H), 2,60-2,55 (m, 2H).
Ejemplo 7. Síntesis de 2-azido-2,2-difluoroacetato de etilo
A una solución de 2-bromo-2,2-difluoroacetato de etilo (950 mg, 4,68 mmol) en DMSO seco (5 ml) se añadió azida de sodio (365 mg, 5,62 mmol). Después de agitar durante una noche a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se vertió en agua (150 ml). Las capas se separaron, se añadió diclorometano a la capa orgánica y la capa se secó sobre Na2SO4. Después de la filtración, el disolvente se eliminó a presión reducida (300 mbar) a 35°C proporcionando 2-azido-2,2-difluoroacetato de etilo crudo (250 mg, 1,51 mmol, 32%).
1H-RMN (300 MHz, CDCh): 8 (ppm) 4,41 (q, J =7,2 hz, 2H), 1,38 (t, J =6,9 Hz, 3H).
Ejemplo 8. Síntesis de 1-fosfato de a-2-amino-3,4,6-tri-O-acetil-D-galactosa
A una solución de a-2-azido-2-desoxi-3,4,6-tri-O-acetil-D-galactosa-1-fosfato (105 mg, 0,255 mmol), como se había preparado en el ejemplo 1, en MeOH (3 ml), se añadió Pd/C (20 mg). La reacción se agitó bajo una atmósfera de hidrógeno durante 2 h y se filtró sobre celite. El filtro se enjuagó con MeOH (10 ml) y el filtrado se concentró al vacío para proporcionar la amina libre (94 mg, 0,244 mmol, 96%).
1H-RMN (300 MHz, D2O): (ppm) 5,87-5,76 (m, 1H), 5,44 (br, s, 1H), 5,30-5,20 (m, 1H), 4,55 (t, J = 6,3 Hz, 1H), 4,28­ 4,00 (m, 3H), 2,11 (s, 3H), 2,03 (s, 3H), 2,00 (s, 3H). LRMS (ESI-) m/z calcd. para C12H19NO11P (M-H+) = 384,07; encontrada 384,10.
Ejemplo 9. Síntesis de 1-fosfato de a-(2'-azido-2,2'-difluoroacetamido)-3,4,6-tri-O-acetil-D-galactosa
A una solución de 1-fosfato de a-2-amino-3,4,6-tri-O-acetil-D-galactosa (94 mg, 0,244 mmol), como se había preparado en el ejemplo 8 , en DMF seca (3 ml), se añadió 2-azido-2,2-difluoroacetato de etilo (48 mg, 0,293 mmol) y Et3N ( 68 |j L, 0,488 mmol). La reacción se agitó durante 6 h, seguido de concentración al vacío para proporcionar el producto crudo. Una cromatografía en columna ultrarrápida en gradiente (100:0 ^ 50:50 de EtOAc:MeOH) proporcionó 1-fosfato de a-(2'-azido-2',2'-difluoroacetamido)-3,4,6-tri-O-acetil-D-galactosa (63 mg, 0,125 mmol, 51%).
Ejemplo 10. Síntesis de UDP-a-(2'-azido-2,2'-difluoroacetamido)-3,4,6-tri-O-acetil-D-galactosa
El 1-fosfato de a-(2'-azido-2',2'-difluoroacetamido)-3,4,6-tri-O-acetil-D-galactosa como se había preparado en el ejemplo 9, se acopló a UMP de acuerdo con Baisch et al. Bioorg. Medicina. Chem., 1997, 5, 383-391.).
Por lo tanto, una solución de sal disódica de D-uridina-5'-monofosfato (98 mg, 0,266 mmol) en H2O (1 ml) se trató con DOWEX 50Wx8 (forma H+) durante 40 minutos y se filtró. El material filtrado se agitó vigorosamente a ta mientras se añadía gota a gota tributilamina (63 jl, 0,266 mmol). Después de 30 minutos de agitación adicional, la mezcla de reacción se liofilizó y se secó adicionalmente sobre P2O5 al vacío durante 5 h. El uridin-5'-monofosfato de tributilamonio resultante se disolvió en DMF seca (15 ml) bajo una atmósfera de argón. Se añadió carbonil diimidazol (35 mg, 0,219 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a ta durante 30 min. A continuación, se añadió MeOH seco (4,63 jl) y se agitó durante 15 minutos para eliminar el exceso de carbonil diimidazol. El MeOH restante se eliminó a alto vacío (15 min). Posteriormente, se añadió N-metilimidazol.HCl (61 mg, 0,52 mmol) a la mezcla de reacción y el compuesto resultante (63 mg, 0,125 mmol) se disolvió en DMF seca (15 ml) y se añadió gota a gota a la mezcla de reacción. La reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente antes de concentrar la mezcla a presión reducida. El consumo del producto intermedio imidazol-UMP se controló mediante análisis de mS. Una cromatografía en columna ultrarrápida en gradiente (7:2:1 ^ 5:2:1 de EtOAc:MeOH:H2O) proporcionó UDP-a-(2'-azido-2’,2’-difluoroacetamido)-3,4,6-tri-O-acetil-D-galactosa.
1H-RMN (300 MHz, D2O): 5 (ppm) 7,87 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,913-5,85 (m, 2H), 5,67 (dd, J = 6 ,6 , 2,7 Hz, 1H), 5,56­ 5,50 (m, 1H), 5,47-5,43 (m, 1H), 5,31-5,25 (m, 2H), 4,61-4,43 (m, 2H), 4,31-4,05 (m, 5H), 2,16 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 1,94 (s, 3H). LRMS (ESI-) m/z calcd. para C23H29F2N6O20P2 (M-H+) = 809,09; encontrada 809,1.
Ejemplo 11. Síntesis de a-UDP-2-(2'-azido-2,2’-difluoroacetamido)-2-desoxi-D-galactosa (UDP-F2-GalNAz, 11c) La desacetilación de UDP-a-(2'-azido-2’,2’-difluoroacetamido)-3,4,6-tri-O-acetil-D-galactosa se realizó de acuerdo con Kiso et al., Glycoconj. J., 2006, 23, 565.
Para ello, se disolvió UDP-a-(2'-azido-2’,2’-difluoroacetamido)-3,4,6-tri-O-acetil-D-galactosa, como se había preparado en el ejemplo 10, en H2O (1 ml) y trietilamina (1 ml) y se añadió MeOH (2,4 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 2 h y luego se concentró al vacío. Una cromatografía en columna ultrarrápida en gradiente (7:2:1 ^ 5:2:1 de EtOAc:MeOH:H2O) proporcionó a-UDP-2-(2'-azido-2’,2’-difluoroacetamido)-2-desoxi-D-galactosa (11c).
1H-RMN (300 MHz, D2O): 5 (ppm) 7,86 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,91-5,85 (m, 2H), 5,54 (dd, J = 6 ,6 , 3,6 Hz, 1H), 4,31­ 3,95 (m, 9H), 3,74-3,62 (m, 2H). LRMS (ESI-) m/z calcd. para C17H23F2 N6O17P2 (M-H+) = 683,06; encontrada 683,10. Recorte de trastuzumab con endoS para preparar 12
Análisis del espectro de masas de anticuerpos monoclonales
Se incubó una solución de 50 ^g (modificada) de IgG, Tris-HCl 1 M, pH 8,0, EDTA 1 mM y DTT 30 mM en un volumen total de aproximadamente 70 ^L durante 20 minutos a 37°C para reducir los puentes de disulfuro permitiendo analizar tanto la cadena ligera como la pesada. Si estaban presentes, las funcionalidades azidas también se redujeron a aminas en esas condiciones. Las muestras reducidas se lavaron tres veces con milliQ usando una membrana Amicon Ultra-0.5, Ultracel-10 (Millipore) y se concentraron hasta tener IgG 10 ^M (modificada). La IgG reducida se analizó mediante ionización por electropulverización en tiempo de vuelo (ESI-TOF) en un AccuToF de JEOL. Los espectros desconvolutados se obtuvieron utilizando el programa informático Magtran. Ejemplo 12. Preparación de trastuzumab 12 recortado
El recorte del glicano de trastuzumab se realizó con endoS procedente de Streptococcus pyogenes (disponible comercialmente en Genovis, Lund, Suecia). Por lo tanto, trastuzumab (10 mg/ml) se incubó con endoS (40 U/ml) en Tris 25 mM, pH 8,0, durante aproximadamente 16 horas a 37°C. La IgG desglicosilada se concentró y se lavó con MnCl2 10 mM y Tris-HCl 25 mM, pH 8,0, utilizando una membrana Amicon Ultra-0.5, Ultracel-10 (Millipore).
Una muestra se sometió a análisis de MS y, después de la desconvolución de los picos, el espectro de masas mostraba un pico de la cadena ligera y dos picos de la cadena pesada. Los dos picos de la cadena pesada pertenecían a un producto principal (49496 Da, 90% de la cadena pesada total), resultante de un trastuzumab sustituido con GlcNAc(Fuc) central, y un producto secundario (49351 Da, ± 10% de la cadena pesada total), resultante de trastuzumab desglicosilado.
Expresión transitoria de un mutante de trastuzumab y enzimas glicosiltransferasas en CHO
Las proteínas (enzimas y mutante de trastuzumab) se expresaron de forma transitoria en células CHO K1 mediante Evitria (Zurich, Suiza) a una escala de 20-25 ml.
Mutante doble de GalT (Y289L, C342T) identificado mediante SEQ ID NO: 1 RDLRRLPQLVGVHPPLQGSSHGAAAIGQPSGELRLRGVAPPPPLQNSSKPRSRA PSNLDAYSHPGPGPGPGSNLTSAPVPSTTTRSLTACPEESPLLVGPMLIEFNIPVD LKLVEQQNPKVKLGGRYTPMDCISPHKVAIIIPFRNRQEHLKYWLYYLHPILQR QQLDYGIYYINQAGESMFNRAKLLNYGFKEALKDYDYNCFYFSDYDLIPMND HNTYRCFSQPRHISVAMDKFGFSFPYVQFFGGVSAFSKQQFFSINGFPNNYWG WGGEDDDIYNRLAFRGMSVSRPNAVIGKTRMIRHSRDKKNEPNPQRFDRIAHT KETMFSDGFN SET YM VFE V QRYPF YTKITVDIGTPS
CeGalNAcT [30-383] identificado mediante SEQ ID NO: 2
KIPSFYENFTIGSSTFIADVDAMEAVFGNTASTSDDFFDTWNSTFSPISEVNQTS FMEDIRPILFPDNQTLQFCNQTPPHLVGPIRVFLDEPDFKTLEKIYPDTHAGGHG MPKDCVARHRVAIIVPYRDREAHFRIMFHNFHSFFAKQQFDYAIFIVEQVANQ TFNRGKFMNV GYD YASRFYP WQCFIFHD YDFFPEDDRNFYT CPIQPRHM S YAI DKFN YKFP Y S AIF GGIS AFTKDHFKKIN GF SNDF W G WGGEDDDF ATRTSM AGE KVSRYPTQIARYKMIKHSTEATNPVNKCRYKIMGQTKRRWTRDGFSNFKYKF VNFEFKPFYTRAVYDFFEKDCRREFRRDFPT CF
CeGalNAcT(30-383)-His6) identificado mediante SEQ ID NO: 3
KIPSFYENFTIGSSTFIADVDAMEAVFGNTASTSDDFFDTWNSTFSPISEVNQTS FMEDIRPIFFPDN QTFQF CN QTPPHF Y GPIRYFFDEPDFKTFEKIYPDTH AGGHG MPKDCVARHRVAIIVPYRDREAHFRIMFHNFHSFFAKQQFDYAIFIVEQVANQ TFNRGKFMNVGYDVASRFYPWQCFIFHDVDFFPEDDRNFYTCPIQPRHMSVAI DKFN YKFP Y S AIF GGI S AFTKDHFKKIN GF SNDF W G WGGEDDDF ATRTSM AGE KVSRYPTQIARYKMIKHSTEATNPVNKCRYKIMGQTKRRWTRDGFSNFKYKF VNFEFKPFYTRAVVDFFEKDCRREFRRDFPTCFHHHHHH
Trastuzumab (cadena pesada N300C), identificado mediante SEQ ID NO: 4
EVQFVESGGGFVQPGGSFRFSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGFEWVARIYP TNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYFQMNSFRAEDTAVYYCSRWGGDGFY AMDYWGQGTFVTVSSASTKGPSVFPFAPSSKSTSGGTAAFGCFVKDYFPEPVT VSWNSGAFTSGVHTFPAVFQSSGFYSFSSVVTVPSSSFGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFFGGPSVFFFPPKPKDTFMISRTPEVTCVV VDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVV SVFTVFHQD WF NGKEYKCKVSNKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTFPPSREEMTKNQVSFTCF VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVFDSDGSFFFYSKFTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEAFHNHYTQKSFSFSPG
Trastuzumab (cadena ligera), identificado mediante SEQ ID NO: 5
DIQMTQSPS SLS AS V GDRVTIT CRASQD VNT AVAWY QQKPGKAPKLLIY S ASFL YSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
Ejemplo 13-1. Purificación de CeGalNAcT
El protocolo de purificación se basa en el intercambio de cationes en una columna SP (GE Healthcare) seguido de una cromatografía de exclusión por tamaño.
En un experimento de purificación típico, el material sobrenadante producido por CHO que contenía el CeGalNAcT expresado, se dializó frente a tampón Tris 20 mM, pH 7,5. El material sobrenadante (normalmente 25 ml) se filtró a través de un filtro con diámetro de poro de 0,45 ^M y posteriormente se purificó sobre una columna de intercambio catiónico (columna SP, 5 ml, GE Healthcare), que se equilibró con tampón Tris 20 mM, pH 7,5 antes del uso. La purificación se realizó en un sistema de cromatografía AKTA Prime equipado con un recolector de fracciones externo. Las muestras se cargaron desde la bomba A del sistema. Las proteínas no unidas se eluyeron de la columna lavando la columna con 10 volúmenes de columna (VCs) de tampón Tris 20 mM, pH 7,5. La proteína retenida se eluyó con tampón de elución (Tris 20 mM, 1 NaCl, pH 7,5; 10 ml). Las fracciones recogidas se analizaron mediante SDS-PAGE en geles de poliacrilamida (12%) y las fracciones que contenían la proteína diana se combinaron y se concentraron usando filtración por centrifugación hasta un volumen de 0,5 ml. A continuación, la proteína se purificó en una columna preparativa de exclusión por tamaño Superdex, sobre un sistema purificador AKTA (UNICORN v6.3). Esta etapa de purificación condujo a la identificación y la separación de un dímero y una fracción de monómero de proteína diana. Ambas fracciones se analizaron por SDS-PAGe y se almacenaron a -80°C antes de un uso posterior
Ejemplo 13-2. Purificación de CeGalNAcT-Hise
En un experimento de purificación típico, el material sobrenadante de CHO se filtró a través de un filtro con un diámetro de poro de 0,45 pM y se aplicó a una columna de Ni-NTA (GE Healthcare, 5 ml), que se había equilibrado con tampón A (tampón Tris 20 mM, imidazol 20 mM, NaCl 500 mM, pH 7,5) antes del uso. Antes de la filtración, se añadió imidazol al material sobrenadante de CHO hasta una concentración final de 20 mM para minimizar la unión no específica a la columna. La columna se lavó primero con tampón A (50 ml). La proteína retenida se eluyó con tampón B (Tris 20 mM, NaCl 500 mM, imidazol 250 mM, pH 7,5, l0 ml). Las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGe en geles de poliacrilamida (1 2 %), y las fracciones que contenían la proteína diana purificada se combinaron y el tampón se intercambió por Tris 20 mM (pH 7,5) mediante diálisis realizada durante una noche a 4°C. La proteína purificada se almacenó a -80°C antes de un uso posterior. Nota: para la identificación de las especies de CeGalNAcT-His6 monoméricas y diméricas se realizó una purificación mediante SEC adicional (como se ha descrito anteriormente).
Transferencia de 11a-c a 12 para preparar 13a-c
Ejemplo 14. Preparación de trastuzumab(GalNProSH) 2 13a
El trastuzumab desglicosilado (10 mg/ml) se incubó con un derivado de galactosa UDP 11a (1,3 mM) y p(1,4)-Gal-T1(Y289L,C342T) (2 mg/mL) en MnCh 10 mM y Tris-HCl 50 mM, pH 6,0 durante 16 horas a 30°C.
A continuación, el trastuzumab funcionalizado se incubó con agarosa y proteína A (40 pl por mg de IgG) durante 1 hora a ta. La agarosa y proteína A se lavó tres veces con TBS (pH 6,0) y la IgG se eluyó con glicina-HCl 100 mM pH 2,5. La IgG eluida se neutralizó con Tris-HCl 1 M a pH 7,0 y se concentró y se lavó con Tris-HCl 50 mM a pH 6,0 usando una membrana Amicon Ultra-0.5, Ultracel-10 (Millipore) a una concentración de 15-20 mg/ml. Un análisis espectral después de la digestión con Fabricator y el lavado posterior con MilliQ usando una membrana Amicon Ultra-0.5, Ultracel-10 (Millipore) mostraba la formación de dos productos, el producto principal (24387 Da) con el GalNProSH introducido y el secundario (25037 Da) con el GalNProSH introducido UDPGalNProSH como disulfuro. La relación entre los productos es de aproximadamente 60:40.
Glicosiltransferencia de un derivado de UDP-galactosa con Gal-T1(Y289L,C342T), protocolo general
La introducción enzimática de un derivado de UDP-galactosa sobre trastuzumab desglicosilado se efectuó con el mutante doble de p(1,4)-galactosiltransferasa bovina [p(1,4)-Gal-T1(Y289L,C342T)]. El trastuzumab desglicosilado (10 mg/ml) se incubó con el derivado de UDP-galactosa apropiado (0,4 mM) y el mutante doble de Gal-T (1 mg/ml) en MnCl210 mM y Tris-HCl 25 mM, pH 8,0, durante 16 horas a 30°C.
A continuación, el trastuzumab funcionalizado se incubó con agarosa y proteína A (40 pl por mg de IgG) durante 2 horas a 4°C. La agarosa y proteína A se lavó tres veces con PBS y la IgG se eluyó con glicina 100 mM-HCl pH 2,7. La IgG eluida se neutralizó con Tris-HCl 1 M, pH 8,0, y se concentró y se lavó con PBS utilizando una membrana Amicon Ultra-0.5, Ultracel-10 (Millipore) hasta una concentración de 15-20 mg/ml.
Glicosiltransferencia de derivados de UDP-GalNAc con CeGalNAcT (protocolo general)
La introducción enzimática de derivados de GalNAc sobre IgG se efectuó con una CeGalNAc-transferasa. La IgG desglicosilada (preparada como se ha descrito anteriormente, 10 mg/ml) se incubó con un derivado de UDP-GalNAc modificado (por ejemplo, un derivado de azido-azúcar modificado-UDP) (0,4 mM) y CeGalNAc-T (1 mg/ml) en MnCh 10 mM y Tris-HCl 25 mM, pH 8,0, durante 16 horas a 30°C. La IgG funcionalizada (por ejemplo, IgG funcionalizada con azido) se incubó con agarosa y proteína A (40 pl por mg de IgG) durante 2 horas a 4°C. La agarosa y proteína A se lavó tres veces con PBS y la IgG se eluyó con glicina 100 mM-HCl pH 2,7. La IgG eluida se neutralizó con Tris-HCl 1 M, pH 8,0, y se concentró y se lavó con PBS utilizando una membrana Amicon Ultra-0.5, Ultracel-10 (Millipore) hasta una concentración de 15-20 mg/ml.
Ejemplo 15. Preparación de trastuzumab(GalNAz) 2 13b con el mutante doble de GalT
Trastuzumab se sometió al protocolo de una transferencia de glicosilo con UDP-N-azidoacetilgalactosamina (UDP-GalNAz) y el mutante doble de Gal-T. Después de una purificación por afinidad con proteína A, el análisis de masas indicaba la formación de un producto principal (49713 Da, 90% de la cadena pesada total), resultante de la transferencia de GalNAz al trastuzumab central sustituido con GlcNAc(Fuc), y un producto secundario (49566 Da, ± 10% de la cadena pesada total), resultante de la transferencia de GalNAz a un trastuzumab central sustituido con GlcNAc.
Este es un ejemplo de una glicoproteína modificada con azido de acuerdo con la fórmula (13b).
Ejemplo 16-1. Preparación de trastuzumab(GalNAz) 2 13b con CeGalNAc-T
El trastuzumab recortado se sometió al protocolo de transferencia de glicosilo con UDP-N-azidoacetilgalactosamina (UDP-GalNAz) y CeGalNAc-T. Después de la purificación por afinidad con proteína A, una pequeña muestra se redujo con DTT y posteriormente se sometió a un análisis MS que indica la formación de un producto principal (49713 Da, 90% de la cadena pesada total), resultante de la transferencia de GalNAz al trastuzumab central sustituido con GlcNAc(Fuc), y un producto secundario (49566 Da, ± 10% de la cadena pesada total), resultante de la transferencia de GalNAz al trastuzumab central sustituido con GlcNAc.
Ejemplo 16-2. Preparación de trastuzumab(F2-GalNAz) 2 13c con CeGalNAc-T
El trastuzumab recortado se sometió al protocolo de transferencia de glicosilo con UDP-N-azidodifluoroacetilgalactosamina (UDP-F2-GalNAz, 13c) y CeGalNAcT o CeGalNAcT-His6. Después de una purificación por afinidad con proteína A, una pequeña muestra se redujo con DTT y posteriormente se sometió a un análisis MS que indicaba la formación de un producto principal de cadena pesada (49865 Da, aproximadamente el 90% del total de la cadena pesada), resultante de la transferencia de F2-GalNAz a un trastuzumab central sustituido con GlcNAc(Fuc) que había reaccionado con DTT durante la preparación de la muestra.
Este es un ejemplo de una glicoproteína modificada con azido de acuerdo con la fórmula (13c).
Síntesis de 17-68
Ejemplo 17. Síntesis de éster de OSu de ácido 1-pirenocarboxílico (45)
A una solución de ácido 1-pirenocarboxílico (65 mg, 0,24 mmol) en DCM/DMF (2 ml de cada uno) se añadió N-hidroxisuccinimida (34 mg, 0,29 mmol) y EDC.HCl (70 mg, 0,36 mmol). La reacción se agitó durante 2 h y luego se diluyó con DCM (10 ml), se lavó con ácido cítrico acuoso (10%, 5 ml) y se saturó con NaHCO3 (3 x 5 mL), se secó sobre Na2SO4 , se filtró y se concentró al vacío para proporcionar 45 crudo.
Ejemplo 18. Síntesis de (46)
El compuesto 45 (480 mg, 1,38 mmol) se disolvió en DCM (15 ml) y se añadió (2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etil)carbamato de terc-butilo (348 mg, 1,4 mmol y Et3N (286 pL, 2,1 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante una noche y se inactivó con agua (15 ml), la capa orgánica se lavó con agua (1 x 15 ml) y NaHCO3 acuoso saturado (2 x 15 mL), se secó sobre Na2SO4 , se filtró y se concentró al vacío. Una purificación por cromatografía en columna ultrarrápida en gradiente (DCM ^ DCM:MeOH 95:5) proporcionó el producto 46 (460 mg, 0,97 mmol, 70%).
Ejemplo 19. Síntesis de (17)
Amina de pireno protegida con Boc 46 (460 mg, 0,97 mmol) se disolvió en metanol (10 ml) y se añadió cloruro de acetilo (140 pl, 1,9 mmol) y, después de 1 y 3 horas, se añadió cloruro de acetilo adicional (2 x 140 pL, 1,9 mmol). Después de agitar durante 4 h, la mezcla se concentró a presión reducida. A continuación, el producto crudo (100 mg, 0,24 mmol) se disolvió en DCM (3 ml) y se añadió 4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)butanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (50 mg, 0,17 mmol) y Et3N (73 pL, 0,52 mmol). Después de agitar durante una noche, la solución se inactivó con agua (3 ml), se lavó con agua (2 x 3 ml), se secó sobre Na2SO4 , se filtró y se concentró. La purificación por cromatografía en columna ultrarrápida en gradiente (DCM ^ DCM:MeOH 95:5) proporcionó el producto 17 (69 mg, 0,13 mmol, 75%). 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 (ppm) 8,48 (d, 1H, J = 9,2 Hz), 8,12 (d, 2H, J = 7,6 Hz), 8,04-7,93 (m, 6 H), 6,59 (bs, 1H), 6,38 (s, 2H), 5,99 (bs, 1H), 3,76-3,71 (m, 4H), 3,62-3,60 (m, 2H), 3,54-3,52 (m, 2H), 3,37 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 3,23-3,17 (m, 4H), 1,82 (t, J = 6 , 8 Hz, 2H), 1,63 (q, J = 7,2Hz, 2H).
Ejemplo 20-1. Síntesis del derivado de alcohol de maleimida (47)
A una solución enfriada (0°C) de 5-aminopentan-1-ol (100 mg, 0,97 pmol) en NaHCO3 acuoso saturado (16 mL) se añadió N-metoxicarbonilmaleimida (150 mg, 0,64 pmol). La mezcla se agitó durante 1,5 h y se extrajo con DCM (2 x 20 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron (Na2SO4) y se concentraron. El producto 47 Se obtuvo como un aceite incoloro (137 mg, 0,75 mmol, 75%). 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 (ppm) 6,69 (s, 2H), 3,70-3,67 (m, 1H), 3,67­ 3,60 (m, 2H), 3,53 (t, J =7, 1 Hz, 2H), 1,68-1,54 (m, 4H), 1,42-1,31 (m, 2H).
Ejemplo 20-2. Síntesis del derivado de maleimida-pireno (18)
A una solución del alcohol 47 (7,7 mg, 42 pmol) en DCM (1 ml) se añadió isocianato de clorosulfonilo (CSI, 3,9 pl, 5,9 mg, 42 pmol). Después de agitar la solución durante 15 min, se añadió Et3N (18 pL, 13 mg, 126 pmol) y una solución de 1-pirenometilamina.HCl (49, 11 mg, 42 pmol) y Et3N (18 pL, 13 mg, 126 pmol). Después de 80 min, se añadió NH4O acuoso saturado (20 ml) y DCM (20 ml). Después de la separación, la fase orgánica se secó (Na2SO4) y se concentró. Después de una cromatografía en columna ultrarrápida en gradiente (DCM ^ MeOH al 2% en DCM), el producto 18 se obtuvo como un sólido ligeramente amarillo (7,4 mg, 14,2 pmol, 34%). 1H RMN (400 MHz, CDCI3/CD3OD) 8 (ppm) 8,32-8,26 (m, 1H), 8,20-7,90 (m, 8 H), 6,61 (s, 2H), 4,90 (s, 2H), 3,65 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 3,30 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 1,40-1,20 (m, 4H), 1,08-0,97 (m, 2H).
Ejemplo 21. Síntesis de ácido BCN-heptanoico (52)
A una solución de un derivado de BCN-OSu 51 en MeCN (5 ml) se añadió ácido 7-aminoheptanoico 50 (145 mg, 1,0 mmol) en NaHCO3 acuoso 0,1 M (30 mL) y MeCN (25 mL). La mezcla se agitó durante 4 h y se concentró parcialmente. Se añadió NH4Cl acuoso saturado (30 ml) y, después de la extracción con DCM (2 x 30 ml), los extractos orgánicos combinados se secaron (Na2SO4) y se concentraron. El producto 52 se utilizó en la etapa sin una purificación adicional. 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 (ppm) 4,68 (bs, 1H), 4,14 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 3,17 (dd, J = 12,8, 6,3 Hz, 2H), 2,35 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,32-2,09 (m, 6 H), 1,70-1,25 (m, 11H), 0,94 (t, J = 9,7 Hz, 2H).
Ejemplo 22. Síntesis de bencilamida de ácido BCN-heptanoico (19)
A una mezcla de 51 (291 mg, 1,00 mmol) en DCM (25 ml) se añadió ácido 7-aminoheptanoico 50 y Et3N (417 pl, 303 mg, 3,00 mmol) y DMF (10 ml). Después de la evaporación (40°C) de DCM, la mezcla resultante se agitó durante 10 min y se añadió una solución acuosa (0,1 M) de NaHCO3. Después de agitar la mezcla de reacción durante 3 h adicionales, se vertió en NH4Cl acuoso saturado (50 ml) y se extrajo con DCM (2 x 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron (Na2SO4) y se concentraron. El residuo se recogió en DCM (25 ml), se añadió clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida (EDCI.HCl, 249 mg, 1,30 mmol) y se añadió N-hidroxisuccinimida (150, 1,30 mmol) y la mezcla resultante se agitó durante 18 h. Después de la adición de agua (50 ml), las capas se separaron y la fase acuosa se extrajo con DCM (2 x 25 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (50 ml), se secaron (Na2SO4) y se concentraron. Una cromatografía en columna proporcionó el derivado de éster NHS intermedio de 52 como un aceite espeso incoloro (233 mg, 0,56 mmol, 56%). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) 8 (ppm) 4,69 (s, 1H), 4,14 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 3,17 (dd, J = 13,6, 6,9 Hz, 2H), 2,91-2,77 (m, 4H), 2,61 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,37-2,12 (m, 6 H), 1,83-1,69 (m, 2H), 1,66-1,17 (m, 9H), 1,01-0,90 (m, 2H). A continuación, a una solución del éster NHS de ácido BCN-aminoheptanoico intermedio (49 mg, 0,12 mmol) en DCM (12 ml) se añadió bencilamina (19 pL, 19 mg, 0,18 mmol) y Et3N (50 pl, 36 mg, 0,36 mmol). La mezcla se agitó durante 19 h y se añadió DCM (10 ml) y NH4Cl saturado acuoso (20 ml). La capa orgánica se secó (Na2SO4) y se concentró. Después de la cromatografía en columna en gradiente (25% ^ 50% de EtOAc en heptano) se obtuvo el compuesto 19 como un sólido blanco (31 mg, 0,076 mmol, 63%). 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 (ppm) 7,38-7,27 (m, 5H), 5,72 (bs, 1H), 4,64 (bs, 1H), 4,45 (d, J = 5,6 Hz, 2H), 4,13 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 3,16 (dd, J = 12,8, 6,3 Hz, 2H), 2,38-2,13 (m, 8 H), 1,75-1,11 (m, 11H), 1,00-0,88 (m, 2H).
Ejemplo 23. Síntesis de N-bencilsulfamoilcarbamato de terc-butilo (53)
Bajo una atmósfera de N2 , a una solución enfriada (-78°C) de terc-butanol en Et2O (20 ml) se añadió isocianato de clorosulfonilo (CSI) y se dejó que la mezcla alcanzara la ta. Después de 45 minutos, la mezcla se concentró y el clorosulfonilcarbamato de terc-butilo resultante se utilizó en la siguiente etapa sin una purificación adicional (considerado puro en un 6 8 %). Por tanto, a una solución del clorosulfonilcarbamato de terc-butilo crudo (199 mg de crudo = 135 mg, 0,63 mmol) en DCM (10 ml) se añadió Et3N (263 pL, 191 mg, 1,89 mmol) y bencilamina (82 pL, 81 mg, 0,85 mmol). La mezcla se agitó durante 2 h y se inactivó con NH4Cl acuoso saturado. Se añadió DCM (10 ml) y se separaron las capas. La capa orgánica se secó (Na2SO4) y se concentró. Después de la cromatografía en columna en gradiente (25% ^ 50% de EtOAc en heptano), se obtuvo el compuesto 53 como un sólido blanco (169 mg, 0,59 mmol). 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 (ppm) 7,41-7,29 (m, 5H), 5,41-5,30 (m, 1H), 4,30-4,20 (m, 2H), 1,46 (s, 9H).
Ejemplo 24. Síntesis de N-bencilsulfamida (54)
A una solución de N-bencilsulfamoilcarbamato de terc-butilo 53 (108 mg, 0,38) en DCM (10 ml) se añadió ácido trifluoroacético (2 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 1,5 h y se vertió en NaHCO3 acuoso saturado (50 mL). Después de la adición de otros 50 ml de NaHCO3 acuoso saturado, la mezcla acuosa se extrajo con DCM (50 ml). La capa orgánica se secó (Na2SO4) y se concentró. El producto 54 se obtuvo como un sólido blanco (36 mg, 0,19 mmol, 50%). 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 (ppm) 7,41-7,30 (m, 5H), 4,32 (d, J = 6,1 Hz, 2H).
Ejemplo 25. Síntesis de ( 20 )
A una solución de 52 (44 mg, 0,136 mmol) en DCM (5 ml) se añadió EDCI.HCl (39 mg, 0,204 mmol), DMAP (2,9 mg, 0,024 mmol) y N-bencilsulfamida 54 (13 mg, 0,068 mmol). Después de dejar agitar la mezcla de reacción durante 22 h a ta, se añadió EtOAc (20 ml) y NH4O saturado acuoso (20 ml). Después de la separación, la fase acuosa se extrajo con EtOAc (20 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron (Na2SO4) y se concentraron. Después de la cromatografía en columna en gradiente (25% ^ 50% de EtOAc en heptano), el producto 20 se obtuvo como una mezcla inseparable del compuesto del título y N-bencilsulfamida 54 (relación en masa de 3,2/1) (14,4 mg). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) 8 (ppm) 7,38-7,27 (m, 5H), 5,99 (bs, 1H), 5,01 (t, J = 6,2 Hz, 1H), 4,20 (s, 2H), 4,85-4,70 (m, 2H), 4,13 (d, J = 8,12 Hz, 2H), 3,15 (q, J = 6,50, 2H), 2,35-2,15 (m, 6 H), 2,09 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,65-0,75 (m, 13H). Ejemplo 26. Síntesis de (56)
A una solución de 51 (430 mg, 1,48 mmol) en DCM (20 ml) se añadió una solución de 5-aminopentan-1-ol 55 (152 mg, 1,47 mmol) en DCM (4 ml) y Et3N (619 jL, 449 mg, 4,44 mmol). La mezcla se agitó durante 1,5 h a ta, después de lo cual se añadió una solución acuosa saturada de NaHCO3 (40 ml). Después de la separación, la capa orgánica se secó (Na2SO4) y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna en gradiente (EtOAc/heptano 1/1 ^ 3/1). El producto 56 se obtuvo como un líquido pegajoso incoloro (356 mg, 1,27 mmol, 81%). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) 8 (ppm) 4,68 (s, 1H), 4,14 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 3,65 (dd, J = 11,7, 6,3 Hz, 2H), 3,19 (dd, J = 13,2, 6,7 Hz, 2H), 2,35-2,15 (m, 6 H), 1,66-1,30 (m, 7H), 1,02-0,88 (m, 2H).
Ejemplo 27. Síntesis de (21)
A una solución de 56 (51 mg, 0,18 mmol) en DCM (10 ml) se añadió isocianato de clorosulfonilo (16 jl, 25 mg, 0,18 mmol). Después de agitar la mezcla durante 40 min, se añadió Et3N (75 jl, 55 mg, 0,54 mmol) y bencilamina (19 jl, 19 mg, 0,18 mmol). La mezcla se agitó durante 1,5 h más y se detuvo mediante la adición de una solución acuosa de NH4Cl (sat). Después de la separación, la capa acuosa se extrajo con DCM (20 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron (Na2SO4) y se concentraron. El residuo se purificó por cromatografía en columna en gradiente (20% ^ 50% de EtOAc en pentano) y el producto 21 se obtuvo como un aceite espeso incoloro (57 mg, 0,12 mmol, 67%). 1H RMN (400 MHz, CDCla) 8 (ppm) 7,41-7,28 (m, 5H), 5,55 (s, 1H), 4,75 (s, 1H), 4,29-4,24 (m, 2H), 4,20-4,08 (m, 2H), 3,19 (dd, J = 13,4, 6 , 6 Hz, 2H), 2,37-2,16 (m, 6 H), 1,74-1,31 (m, 9H), 0,94 (t, J = 9,7 Hz, 2H). Ejemplo 28. Síntesis de (22)
Bajo una atmósfera inerte, 21 (93 mg, 0,19 mmol) se disolvió en THF anhidro (10 ml). Se añadió PPh3 (49 mg, 0,19 mmol) y MeOH (50 jL, 1,23 mmol) y la mezcla se enfrió a 0°C. Se añadió lentamente una solución de DIAD (37 jl, 0,19 mmol) en THF anhidro (5 ml) y se dejó que la mezcla alcanzara la ta, después de lo cual la reacción se agitó durante 18 h y luego se concentró. Una cromatografía en columna en gradiente (20 ^ 50% de EtOAc en heptano) proporcionó el producto 22 como un aceite espeso incoloro. 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 (ppm) 7,39-7,26 (m, 5H), 5,94-5,84 (m, 1H), 4,80-4,64 (m, 1H), 4,19 (d, J = 6,4 Hz, 2H,), 4,13 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 4,08 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 3,17 (q, 2H, J = 6,5 Hz), 3,12 (s, 3H), 2,35-2,14 (m, 6 H), 1,80-1,65 (m, 13H).
Ejemplo 29. Síntesis de (58)
A una solución de 57 (1,5 g, 10 mmol) en DCM (150 ml), bajo una atmósfera de N2 , se añadió CSI (0,87 ml, 1,4 g, 10 mmol), Et3N (2,8 ml, 2,0 g, 20 mmol) y 2-(2-aminoetoxi)etanol (1,2 ml, 1,26 g, 12 mmol). La mezcla se agitó durante 10 minutos y se inactivó mediante la adición de NH4Cl acuoso (sat., 150 ml). Después de la separación, las capas acuosas se extrajeron con DCM (150 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron (Na2SO4) y se concentraron. El residuo se purificó con cromatografía en columna. El producto 58 se obtuvo como un aceite espeso ligeramente amarillo (2,06 g, 5,72 mmol, 57%). 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 (ppm) 6,0 (bs, 1H), 4,28 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 3,78­ 3,73 (m, 2H), 3,66-3,61 (m, 2H), 3,61-3,55 (m, 2H), 3,34 (t, J = 4,9 Hz, 2H), 2,37-2,15 (m, 6 H), 1,64-1,48 (m, 2H), 1,40 (quinteto, J = 8,7 Hz, 1H), 1,05-0,92 (m, 2H).
Ejemplo 30. Síntesis de (59)
A una solución de 58 (130 mg, 0,36 mmol) se añadió posteriormente CSI (31 jL, 51 mg, 0,36 mmol), Et3N (151 jL ) y 2-(2-aminoetoxi)etanol (36 jL, 38 mg, 0,36 mmol). Después de 15 minutos, se añadió agua (20 ml) y, después de la separación, la capa acuosa se acidificó con HCl ac. 1 M a pH 3 y se extrajo con DCM (20 ml). La capa de DCM se secó y se concentró. Después de una cromatografía en columna, se obtuvo el producto 59 como un aceite incoloro (87 mg, 0,15 mmol, 42%). 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 (ppm) 6,15-5,95 (m, 2H), 4,40-4,32 (m, 2H), 4,31 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 3,85-3,55 (m, 10H), 3,45-3,25 (m, 4H), 2,40-2,15 (m, 6 H), 1,65-1,47 (m, 2H), 1,40 (quinteto, J = 8,7 Hz, 1H), 1,06-1,92 (m, 2H).
Ejemplo 31. Síntesis de (23)
A una solución de 59 (63 mg, 0,11 mmol) en DCM (10 ml) se añadió posteriormente cloroformiato de p-nitrofenilo (22 mg, 0,11 mmol) y Et3N (46 jL, 33 mg, 0,33 mmol). Después de 20 h, se añadió bencilamina (22 jL, 21,6 mg, 0,20 mmol) a la mezcla de reacción. La mezcla se agitó durante 24 h adicionales, en donde después la mezcla se concentró y el residuo se purificó por cromatografía en columna en gradiente (1a col. 0 ^ 20% de MeOH en DCM, 2a col. 0 ^ 8 % de MeOH en DCM). El producto 23 se obtuvo como una película incolora (18 mg, 0,026 mmol, 23%). 1H RMN (400 MHz, CD3OD) (ppm) 7,38-7,18 (m, 5H), 4,31-4,22 (m, 6 H), 4,22-4,16 (m, 2H), 3,70-3,63 (m, 4H), 3,63­ 3,54 (m, 4H), 3,34 (s, 1H), 3,24-3,15 (m, 4H), 2,30-2,10 (m, 6 H), 1,68-1,52 (m, 2H), 1,42 (quinteto, J = 8,7 Hz, 1H), 1,02-0,90 (m, 2H).
Ejemplo 32. Síntesis de BCN-dPEG4-C(O)OSu (60a)
A una solución de ácido amino-dPEG4 (1,23 g, 4,23 mmol) en DMF anhidra (30 ml) se añadió posteriormente 51 (1,02 g, 3,85 mmol) y trietilamina (1,60 ml, 11,53 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente, después de lo cual se añadió EDCI.HCl (0,884 g, 4,61 mmol) y NHS ( 88 mg, 0,77 mmol). La solución resultante se agitó durante una noche a ta y se vertió en 100 ml de NaHCO3 (sat.) y 150 ml de EtOAc. Las capas se separaron y la fase orgánica se lavó con NaHCO3 sat. (90 mL) y H2O (75 ml). La fase orgánica se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró al vacío. Una cromatografía ultrarrápida en gradiente (MeCN ^ MeCN:H2O 30:1) proporcionó el producto 60a como un aceite incoloro (800 mg, 1,48 mmol, 40%).
Ejemplo 33. Síntesis de BCN-dPEG4-pireno (24)
A una solución de 60a (50 mg, 0,095 mmol) en DCM (10 ml) se añadió 49 (30 mg, 0,11 mmol) y Et3N (17 j L, 0,12 mmol). Después de agitar durante una noche a ta, la mezcla de reacción se concentró a presión reducida. La purificación posterior por cromatografía en columna ultrarrápida (DCM ^ DCM:MeOH 9:1) proporcionó el producto 24 (38 mg, 61%). 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 (ppm) 8,29-8,26 (m, 2H), 8,19-8,11 (m, 4H), 8,06-7,97 (m, 4H), 7,04 (br. s, 1H), 5,24 (br. s, 1H), 5,16 (d, 2H, J = 4 Hz), 4,06 (d, 2H, J = 4 Hz), 3,76 (t, 2H, J = 5,6 Hz), 3,50 (m, 2H), 3,39­ 3,22 (m, 14H), 2,56-2,53 (m, 2H), 2,27-2,13 (m, 7H), 1,29-1,25 (m, 2H), 0,87-0,83 (m, 2H).
Ejemplo 34. Síntesis de BCN-PEG8-C(O)OSu (60b)
A una solución de ácido amino-dPEGa (217 mg, 0,492 mmol) en DMF anhidra (3 ml) se añadió posteriormente 51 (143 mg, 0,492 mmol) y Et3N (204 j L, 1,47 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 3 horas a ta, después de lo cual se añadió EDCI.HCl (0,88 g, 4,61 mmol) y NHS ( 88 mg, 0,77 mmol). La solución resultante se agitó durante una noche a ta y se vertió en 50 ml de NaHCO3 (sat.) y 50 ml de EtOAc. Las capas se separaron y la fase orgánica se lavó con NaHCO3 sat. (50 mL) y H2O (30 ml). La fase orgánica se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró al vacío. Una cromatografía ultrarrápida en gradiente (MeCN ^ MeCN:H2O 30:1) proporcionó el producto 60b como un aceite incoloro (212 mg, 0,30 mmol, 60%).
1H RMN (300 MHz, CDCh): 8 (ppm) 4,13 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 3,84 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 3,68-3,59 (m, 28 H), 3,54 (t, J = 5,1 Hz, 2H), 3,36 (q, J = 5,4 Hz, 2H), 2,89 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 2,82 (s, 4H), 2,35-2,15 (m, 6 H), 1,68-1,48 (m, 2H), 1,44-1,23 (m, 1H), 1,00-0,86 (m, 2H). LRMS (ESI+) m/z calcd. para C34H54N2O14 (M+Na+) = 737,8; encontrada 737,3. Ejemplo 35. Síntesis de BCN-PEG8-pireno ( 25 )
A una solución de 60b (100 mg, 0,14 mmol) en DCM (15 ml) se añadió 1-aminometilpireno.HCl 49 (50 mg, 0,19 mmol) y Et3N (47 j L, 0,25 mmol). Después de agitar durante 3 h, la mezcla de reacción se concentró a presión reducida. Una purificación posterior por cromatografía ultrarrápida en columna (DCM ^ DCM:MeOH 95:5) proporcionó el producto 25 (35 mg, 30%). 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 (ppm) 8,30-8,28 (m, 1H), 8,21-8,13 (m, 4H), 8,05-7,99 (m, 4H), 7,22 (bs, 1H), 5,16 (d, 2H, J = 5,2 Hz), 4,12 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 3,76 (t, 2H, J = 6,0 Hz), 3,65-3,49 (m, 21H), 3,45-3,42 (m, 2H), 3,36-3,32 (m, 4H), 2,59-2,54 (m, 4H), 2,28-2,20 (m, 4H), 1,59-1,54 (m, 2H), 1,38-1,25 (m, 2H), 0,93-0,91 (m, 2H).
Ejemplo 36. Síntesis de (61)
A una solución de 57 (0,15 g, 1,0 mmol) en DCM (15 ml) se añadió CSI (87 j L, 0,14 g, 1,0 mmol), Et3N (279 j L, 202 mg, 2,0 mmol) y una solución de H2N-PEG3-OH (251 mg, 1,3 mmol) en DCM (1 ml). Después de agitar durante 2,5 h, la mezcla de reacción se detuvo mediante la adición de una solución de NH4Cl (sat., 20 ml). Después de la separación, la capa acuosa se extrajo con DCM (20 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron (Na2SO4) y se concentraron. El residuo se purificó por cromatografía en columna en gradiente (MeOH 0 ^ 10% en DCM). Producto 61 se obtuvo como un aceite espeso incoloro (254 mg, 0,57 mmol, 57%). 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 (ppm) 6,81 (br, s, 1H), 4,26 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 3,80-3,70 (m, 4H), 3,70-3,58 (m, 10H), 3,36 (t, J = 4,7 Hz, 2H), 2,36-2,16 (m, 6 H), 1,64-1,49 (m, 2H), 1,40 (quinteto, J = 8,7 Hz, 1H), 1,04-0,92 (m, 2H).
Ejemplo 37. Síntesis de ( 62 )
A una solución de 61 (242 mg, 0,54 mmol) en DCM (30 mL) se añadió cloroformiato de p-nitrofenilo (218 mg; 1,08 mmol) y Et3N (226 j L, 164 mg, 1,62 mmol). La mezcla se agitó durante 17 h y se enfrió con agua (20 ml). Después de la separación, la capa orgánica se secó (Na2SO4) y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna en gradiente (EtOAc/pentano 1/1 ^ EtOAc) para proporcionar el producto 62 (259 mg, 0,38 mmol). LRMS (ESI) m/z calcd. para C33H42N5O16S (M+NH4+) = 796,23; encontrada 796,52.
Ejemplo 38. Síntesis de BCN-sulfamida-pireno (26)
El compuesto 62 (40 mg, 0,11 mmol) se disolvió en DCM (10 ml) y se añadió 49 (34 mg, 0,13 mmol) y Et3N (30 j L, 0,21 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 4 h, se concentró a presión reducida y se purificó en cromatografía en columna ultrarrápida en gradiente (DCM ^ DCM:MeOH 96:4). Las fracciones que contenían el producto se lavaron con NaHCO3 sat. (3 x 100 ml), se secaron sobre Na2SO4 , se filtraron y se concentraron al vacío para proporcionar 26 (25 mg, 36%). 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 (ppm) 8,29-8,26 (m, 2H), 8,19-8,11 (m, 4H), 8,06­ 7,97 (m, 4H), 6,87 (d, 1H, J = 12 Hz), 5,78 (br, s, 2H), 5,12 (d, 2H, J = 5,6 Hz), 4,31-4,26 (m, 2H), 3,97 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 3,69-3,62 (m, 4H), 3,28 (m, 2H), 2,18-1,96 (m, 7H), 1,28 (m, 1H), 0,79-0,74 (m, 2H).
Ejemplo 39. Síntesis de DIBAC-PEG4-pireno (27)
El compuesto 45 (75 mg, 0,22 mmol) se disolvió en DCM (3 ml) seguido de la adición de ácido amino-PEG4-carboxílico (53 mg, 0,20 mmol) y Et3N (83 j L, 0,6 mmol). Después de agitar durante una noche, se añadió 45 adicional (25 mg, 0,07 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 1 h adicional. Después de completar la conversión (basada en un análisis de TLC), se añadió N-hidroxisuccinimida (5 mg, 0,04 mmol) y EDC.HCl (70 mg, 0,36 mmol) y la reacción se agitó durante una noche a ta. A la mezcla de reacción se añadió 64 (60 mg, 0,2 mmol) y Et3N (50 |jL, 0,36 mmol) y después de 1 h la mezcla de reacción se concentró a presión reducida. Una purificación por cromatografía en columna ultrarrápida en gradiente (DCM ^ DCM:MeOH 9:1) proporcionó un producto 27 (12 mg, 8 %). 1H RMN (400 MHz, CDCla) 8 (ppm) 8,61 (d, 1H, J = 9,2 Hz), 8,23-8,21 (m, 2H), 8,17-8,10 (m, 4H), 8,07­ 8,02 (m, 3H), 7,59 (d, 1H, J = 7,2 Hz), 7,38-7,18 (m, 7H), 7,06 (bs, 1H), 6,45 (m, 1H), 5,00 (d, 1H, J = 13,6), 3,86­ 3,79 (m, 3H), 3,70-3,19 (m, 14H), 2,42-2,38 (m, 1H), 2,19-2,15 (m, 2H), 1,89-1,85 (m, 1H).
Ejemplo 40. Síntesis de DIBAC-PEG8-pireno (28)
El compuesto 45 (24 mg, 0,07 mmol) se disolvió en DCM (1 mL) seguido por la adición de ácido amino-PEGacarboxílico (27 mg, 0,06 mmol) y Et3N (14 j L, 0,10 mmol). Después de agitar durante 2 h, se añadió 45 adicional (10 mg, 0,03 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante un tiempo. Posteriormente, se añadió NHS (10 mg, 0,08 mmol) y EDC.HCl (17 mg, 0,09 mmol) y la reacción se agitó durante 2 h. A continuación, se añadió 64 (21 mg, 0,08 mmol) y Et3N (14 jl, 0,10 mmol) y después de 4 h, la reacción se detuvo mediante la adición de agua (3 mL). La capa orgánica se lavó con agua (2 x 3 ml), se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró a presión reducida. Una purificación por cromatografía ultrarrápida en columna (DCM ^ DCM:MeOH 93:7) proporcionó el producto ( 8 mg, 14%). 1H RMN (400 MHz, CDCla) 8 (ppm) 8,55 (d, 1H, J = 9,2 Hz), 8,19-7,86 (m, 7H), 7,59 (d, 1H, J = 6 , 8 Hz), 7,33­ 7,18 (m, 8 H), 6,99 (m, 1H), 6,45 (m, 1H), 5,03 (d, 1H, J = 14,0), 3,78-3,74 (m, 3H), 3,65-3,29 (m, 29H), 2,43-2,37 (m, 1H) 2,25-2,21 (m, 2H), 1,91-1,84 (m, 1H).
Ejemplo 41. Síntesis de ( 65 )
El compuesto 45 (50 mg, 0,14 mmol) se disolvió en DCM (3 ml) seguido por la adición de 2-aminoetanol (10 jl, 0,16 mmol) y Et3N (30 j L, 0,22 mmol). Después de 2 h, se añadió 2-aminoetanol adicional (10 jl, 0,16 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante una noche a ta. Posteriormente, se añadió agua (5 ml) y la capa orgánica se lavó con agua (3 x 5 ml), se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró a vacío. La purificación por cromatografía en columna ultrarrápida en gradiente (DCM ^ DCM:MeOH 97:3) proporcionó un producto 65 (32 mg, 79%). LRMS (ESI+) m/z calcd. para C19H16NO2 (M+H+) = 290,12; encontrada 290,30.
Ejemplo 42. Síntesis de DIBAC-sulfamida-pireno (29)
El compuesto 65 (26 mg, 0,09 mmol) se disolvió en DCM (2 ml) seguido de la adición de CSI ( 8 j L, 0,09 mmol). Después de 5 min, se añadió Et3N (37 j L, 0,27 mmol) y 64 (26 mg, 0,09 mmol) y la reacción se agitó durante 2 horas a ta, después de lo cual la reacción se detuvo mediante la adición de NH4Cl acuoso (sat., 5 ml). La capa orgánica se lavó con agua (3 x 5 ml), se secó sobre Na2SO4 , se filtró y se concentró al vacío. Una purificación por cromatografía en columna ultrarrápida en gradiente (DCM ^ DCM:MeOH 95:5) proporcionó el producto 29 (10 mg, 17%). 1H RMN (400 MHz, CDCla) 8 (ppm) 8,49 (d, 1H, J = 9,2 Hz), 8,25-8,18 (m, 3H), 8,11-7,95 (m, 5H), 7,38-7,00 (m, 8 H), 6,05 (m, 1H), 5,96 (m, 1H), 4,62-4,58 (m, 1H), 4,52-4,47 (m, 1H), 4,11-4,08 (m, 1H), 3,81-3,78 (m, 1H), 3,64­ 3,60 (m, 1H), 3,06 (d, 1H, J = 14 Hz), 2,90-2,87 (m, 2H), 2,17-2,09 (m, 1H), 1,62-1,56 (m, 2H).
Ejemplo 43-1. Síntesis de ( 30 )
Una solución de solución de BCN-PEG4-C(O)OSu (60a, 7,1 mg, 0,013 mmol) y Et3N (9,1 jl, 6 , 6 mg, 65,5 jmol) en 1 ml de DMF se añadió a H-Ahx-maitansina.TFA (10 mg, 0,011 mmol). La reacción se agitó durante 20 h a temperatura ambiente y posteriormente se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía HPLC de fase inversa (C18) (30 ^ 90% de MeCN (1% de AcOH) en H2O (1% de AcOH). El producto 30 se obtuvo como un líquido incoloro (8,9 mg, 7,5 jmol, 6 8 %). LRMS (ESI+) m/z calcd. para C60H87ClN5O-i6 (M+-H2O) = 1168,58; encontrada 1168,87.
Ejemplo 43-2. Síntesis de BCN-PEG12-C(O)OSu
A una solución de ácido amino-dPEG12 (43 mg, 0,069 mmol) en DMF anhidro (1 ml) se añadió 51 (22 mg, 0,076 mmol) y trietilamina 24 j L, 0,174 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 5 horas a ta, después de lo cual se añadió EDCI.HCl (27 mg, 0,139 mmol) y NHS ( 8 mg, 0,076 mmol). La solución resultante se agitó durante una noche a ta y se vertió en 10 ml de NaHCO3 sat. y 10 ml de DCM. Las capas se separaron y la fase orgánica se lavó con H2O (2 x 10 ml). Las capas de agua combinadas se extrajeron con DCM (10 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron al vacío. Una cromatografía en columna ultrarrápida en gradiente (MeCN ^ MeCN:H2O 20:1,10:1) proporcionó BCN-PEG-,2-C(O)OSu.
1H RMN (400 MHz, CDCla): 8 (ppm) 4,14 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 3,85 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 3,69-3,60 (m, 44 H), 3,56 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 3,36 (q, J = 5,2 Hz, 2H), 2,91 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 2,84 (s, 4H), 2,36-2,17 (m, 6 H), 1,65-1,51 (m, 2H), 1,44-1,23 (, J = 8,4 Hz, 1H), 1,00-0,88 (m, 2H). LRMS (ESI+) m/z calcd. para C42H70N2O18 (M+H+) = 892,0; encontrada 891,6.
Ejemplo 44. Síntesis de (31)
Una solución de BCN-PEGi2-C(O)OSu (14 mg, 15,7 |jmol) y Et3N (9,1 jl, 6,6 mg, 65,5 jmol) en 1,1 ml de DMF se añadió a H-Ahx-maitansina.TFA (10 mg, 0,011 mmol). Después de 18 h, se añadió 2,2'-(etilendioxi)bis(etilamina) (2,3 jl, 2,3 mg, 16 jmol) y la mezcla se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía HPLC de fase inversa (C18) (30 ^ 90% de MeCN (1% de AcOH) en H2O (1% de AcOH). El producto 31 se obtuvo como una película incolora (6,6 mg, 4,3 jmol, 39%). LRMS (ESI+) m/z calcd. para C75H118ON5O25 (M+-H2O) = 1520,79; encontrada 1520,96.
Ejemplo 45. Síntesis de BCN-PEG24-C(O)OSu
A una solución de ácido amino-dPEG24 (48 mg, 0,042 mmol) en DMF anhidro (1 ml) se añadió 51 (14 mg, 0,048 mmol) y trietilamina (17 jL, 0,125 mmol). La mezcla de reacción se agitó a ta durante una noche, después de lo cual se añadió DCM (10 ml) y ácido cítrico (10% de solución acuosa, 5 ml). La fase acuosa se extrajo con DCM (15 ml) y las capas orgánicas combinadas se secaron (Na2SO4). Después de la filtración, se eliminó el disolvente al vacío. El producto crudo se disolvió de nuevo en DMF anhidra (1 ml) y se añadió EDCI.HCl (17 mg, 0,088 mmol) y NHS (8 mg, 0,070 mmol). La solución resultante se agitó durante una noche a ta, después de lo cual se añadió un equivalente de adición de EDCI.HCL (16 mg) y NHS (7 mg). Después de 6 h, la mezcla de reacción se vertió en 10 ml de NaHCO3 sat. y 15 ml de EtOAc. Las capas se separaron y la fase orgánica se lavó con NaHCO3 sat. (10 mL) y H2O (10 ml). La fase orgánica se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró al vacío. Una cromatografía en columna ultrarrápida en gradiente (MeCN ^ MeCN:H2O 20:1,10:1, 5:1) proporcionó BCN-PEG24-C(O)OSu como un aceite incoloro (32 mg, 0,022 mmol, 54%).
1H RMN (400 MHz, CDCh): 8 (ppm) 4,08 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 3,78 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 3,63-3,54 (m, 92 H), 3,49 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 3,30 (q, J = 5,2 Hz, 2H), 2,84 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 2,78 (s, 4H), 2,29-2,08 (m, 6H), 1,59-1,43 (m, 2H), 1,35-1,23 (m, 1H), 0,93-0,80 (m, 2H). LRMS (ESI+) m/z calcd. para C66H118N2O30 (M+H+) = 1420,66; encontrada 1420,0.
Ejemplo 46. Síntesis de ( 32 )
Una solución de BCN-PEG24-C(O)OSu (25 mg, 17,6 jmol) y Et3N (9,1 jl, 6,6 mg, 65,5 jmol) en 0,78 ml de DMF se añadió a H-Ahx-maitansina.TFA (10 mg, 0,011 mmol).
Después de 18 h, se añadió 2,2'-(etilendioxi)bis(etilamina) (2,3 jl, 2,3 mg, 16 jmol) y la mezcla se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía HpLC de fase inversa (C18) (30 ^ 90% de MeCN (1% de AcOH) en H2O (1% de AcOH). El producto se obtuvo como una película incolora (11,4 mg, 5,5 jmol, 50%). LRMS (ESI+) m/z calcd. para C100H171ClN5O373+ (M+3H+)/3 = 690,05; encontrada 690,05.
Ejemplo 47. Síntesis de ( 33 )
Se añadió una solución de H-Ahx-maitansina.TFA (20 mg, 0,023 mmol) en DMF (2 ml) a una solución de 62 (14 mg, 0,023 mmol) y Et3N (9,5 jl, 6,9 mg, 0,068 mmol) en DMF (2 ml) y la mezcla de reacción resultante se agitó durante 24 h. El compuesto del título 33 se obtuvo con un rendimiento cuantitativo después de una cromatografía en columna de gel de sílice (29 mg, 99%). La prueba de identidad se realizó en el estadio ADC.
Ejemplo 48. Síntesis de (34)
Una solución de 60a (6,6 mg, 0,012 mmol) y Et3N (6,8 jl, 4,9 mg, 48,5 jmol) en 1 ml de DMF se añadió a H-Val-Cit-PABA-duocarmicina (10 mg, 0,0097 mmol). Después de 18 h, se añadió 2,2'-(etilendioxi)bis(etilamina) (1,8 jl, 1,8 mg, 12 jmol) y la mezcla se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía HPLC de fase inversa (C1 8 ) (30 ^ 90% de MeCN (1% de AcOH) en H2O (1% de AcOH). El producto 34 se obtuvo como una película incolora (7,5 mg, 5,1 jmol, 53%). LRMS (ESI+) m/z calcd. para C71Hg4ClN10O21 (M+H+) = 1457,63; encontrada 1456,89.
Ejemplo 49. Síntesis de ( 35 )
Una solución de 62 (6,0 mg, 9,8 jmol) y Et3N (6,8 jl, 4,9 mg, 48,5 jmol) en DMF (1 ml) se añadió a H-Val-Cit-PABA-duocarmicina (10 mg, 0,0097 mmol). Después de 22 h, se añadió 2,2'-(etilendioxi)bis(etilamina) (2,8 jl, 2,8 mg, 19 jmol). Después de 1 h, la mezcla de reacción se concentró a presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía HPLC de fase inversa (C18) (30 ^ 90% de MeCN 1% de AcOH) en H2O (1% de AcOH). El producto 35 se obtuvo como un sólido blanco (6,4 mg, 4,2 jmol. 44%). LRMS (ESI+) m/z calcd. para C69H92ClN12O22S (M+H+) = 1507,59; encontrada 1508,00.
Ejemplo 50. Síntesis de ( 36 )
A una solución de 58 (229 mg, 0,64 mmol) en DCM (20 ml) se añadió cloroformiato de p-nitrofenilo (128 mg, 0,64 mmol) y Et3N (268 jL, 194 mg, 1,92 mmol). La mezcla se agitó durante una noche a ta y posteriormente se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna en gradiente (20 ^ 70% de EtOAc en heptano (1% de AcOH) para proporcionar el derivado de carbonato de PNP de 58 como un sólido blanco (206 mg, 0,39 mmol, 61%). 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 (ppm) 8,31-8,26 (m, 2H), 7,45-7,40 (m, 2H), 5,56 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 4,48-4,40 (m, 2H), 4,27 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 3,81-3,75 (m, 2H), 3,68 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 3,38-3,30 (m, 2H), 2,36-2,14 (m, 6H), 1,61-1,45 (m, 2H), 1,38 (quinteto, J = 8,7 Hz, 1H), 1,04-0,94 (m, 2H).
A continuación, a una solución de PNP-derivado de 58 (4,1 mg, 7,8 |jmol) y Et3N (3,3 jL, 2,4 mg, 23,4 |jmol) en DMF (1 ml) se añadió una solución de H-Val-Cit-PABA-Ahx-maitansina (10 mg, 8,6 jmol) en DMF (100 jL). Después de 20 h, se añadió 2,2'-(etilendioxi)bis(etilamina) (5,7 jl, 5,6 mg, 38 jmol) y la mezcla se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía HPLC de fase inversa (C18) (30 ^ 90% de MeCN (1% de AcOH) en H2O (1% de AcOH) para proporcionar 36 (2,2 mg, 1,4 jmol, 18%). LRMS (ESI+) m/z calcd. para C73H103ClNnO21S (M-18+H+) = 1536,67; encontrada 1537,08.
Ejemplo 51. Síntesis de ( 66 )
A una solución agitada de 57 (500 mg, 3,33 mmol) en DCM (100 ml) se añadió CSI (290 jl, 471 mg, 3,33 mmol). Después de 20 min, se añadió posteriormente Et3N (1,4 ml, 1,0 g, 10 mmol) y una solución de dietanolamina.HCl (571 mg, 4,0 mmol) en DMF (5 ml). Después de 45 minutos adicionales, la mezcla de reacción se concentró a presión reducida y el residuo se purificó por cromatografía en columna en gradiente (0 ^ 15% de MeOH en DCM). El producto 6 6 se obtuvo como un aceite espeso incoloro (767 mg, 2,13 mmol, 64%). 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 (ppm) 4,26 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 3,87 (t, J = 4,9 Hz, 4H), 3,55 (t, J = 4,9 Hz, 4H), 2,37-2,16 (m, 6H), 1,65-1,45 (m, 2H), 1,39 (quinteto, J = 8,6 Hz, 1H), 1,05-0,92 (m, 2H).
Ejemplo 52. Síntesis de ( 67 )
A una suspensión de 6 6 (206 mg, 0,57 mmol) en DCM (20 ml) se añadió Et3N (318 jL, 231 mg, 2,28 mmol) y cloroformiato de p-nitrofenilo (230 mg, 1,14 mmol, 2 eq.). La mezcla de reacción se agitó durante 28 h a ta y posteriormente se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gradiente (20 ^ 75% de EtOAc en heptano), proporcionando 67 como un aceite espeso ligeramente amarillo (83 mg, 0,12 mmol, 21%). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) 8 (ppm) 8,31-8,24 (m, 4H), 7,43-7,34 (m, 4H), 4,53 (t, J = 5,4 Hz, 2H), 4,22 (d, J = 4,2 Hz, 2H), 3,87 (t, J = 5,4 Hz, 4H), 2,35-2,15 (m, 6H), 1,55-1,40 (m, 2H), 1,35 (quinteto, J = 8,8 Hz, 1H), 1,03-0,92 (m, 2H). Ejemplo 53. Síntesis de ( 37 )
Una solución de 67 (2,7 mg, 3,9 jmol) y Et3N (2,7 jL, 2,0 mg, 19,5 jmol) en DMF (1 ml) se añadió a una solución de H-Val-Cit-PABA-Ahx-maitansina (10 mg, 0,0086 mmol) en DMF (100 jL). La mezcla se dejó reaccionar durante una noche a ta y posteriormente se concentró. Se añadió una solución de 2,2'-(etilendioxi)bis(etilamina) (2,8 jl, 2,8 mg, 19 jmol) en DMF (1 ml). La mezcla de reacción se concentró y el residuo se purificó por cromatografía HPLC de fase inversa (C18) (30 ^ 90% de MeCN (1% de AcOH) en H2O (1% de AcOH) para proporcionar el compuesto 37 (4,8 mg, 1,7 jmol, 45%). LRMS (ESI+) m/z calcd. para ^ -iH ^C h^cA se S (M+2H+)/2 = 1375,12; encontrada 1375,51.
Ejemplo 54. Síntesis de ( 68 )
A una solución agitada de 58 (47 mg, 0,13 mmol) en DCM (10 ml) se añadió CSI (11 jl, 18 mg, 0,13 mmol). Después de 30 min, se añadió Et3N (91 jl, 66 mg, 0,65 mmol) y una solución de dietanolamina (16 mg, 0,16 mmol) en DMF (0,5 ml). Después de 30 minutos, se añadió cloroformiato de p-nitrofenilo (52 mg, 0,26 mmol) y Et3N (54 jL, 39 mg, 0,39 mmol). Después de 4,5 h adicionales, la mezcla de reacción se concentró y el residuo se purificó por cromatografía en columna en gradiente (33 ^ 66% de EtOAc/heptano (1% de AcOH)) para proporcionar 68 como un aceite incoloro (88 mg, 0,098 mmol, 75%). 1H RMN (400 MHz, CDCh 8 (ppm) 8,28-8,23 (m, 4H), 7,42-7,35 (m, 4H), 4,52 (t, J = 5,4 Hz, 4H), 4,30 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 4,27-4,22 (m, 2H), 3,86 (t, J = 5,3 Hz, 4H), 3,69-3,65 (m, 2H), 3,64­ 3,59 (m, 2H), 3,30-3,22 (m, 2H), 2,34-2,14 (m, 6H), 1,62-1,46 (m, 2H), 1,38 (quinteto, J = 8,7 Hz, 1H), 1,04-0,92 (m, 2H).
Ejemplo 55. Síntesis de ( 38 )
Una solución de 6 8 (3,9 mg, 4,3 jmol) y Et3N (3,0 jl, 2,2 mg, 21,5 jmol) en DMF (1 ml) se añadió a una solución de H-Val-Cit-PABA-Ahx-maitansina (10 mg, 8,6 jmol) en DMF (100 jl). La mezcla se dejó reaccionar durante la noche y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía HPLc de fase inversa (C18) (30 ^ 90% de MeCN (1% AcOH) en H2O (1% de AcOH) para proporcionar el producto 38 (3,9 mg, 1,32 jmol, 31%). LRMS (ESI+) m/z calcd. para C136H-ig6Cl2N22O43S2 (M+2H+)/2 = 1480,13; encontrada 1480,35. LRMS (Es I+) m/z calcd. para C85H119ClN-i4O31S2 (M+2H+)/2 = 965,36; encontrada 965,54.
Como producto secundario, se aisló el derivado de Ahx-maitansina monosustituido de 6 8 (no representado). LRMS (ESI+) calculada para C85H11gClN14O31S22+ m/z 965,36 encontrada 965,54.
Ejemplo 56. Síntesis de (39)
Al derivado de Ahx-maitansina monosustituido de 6 8 , aislado como un producto secundario en el ejemplo 55, se añadió una solución de Et3N (0,7 jL, 0,5 mg, 5 jmol) en DMF (1 mL) y una solución de 1,2 mg (1,1 jmol) de H-Val-Cit-PABA-MMAF. La mezcla se dejó reaccionar durante una noche y se añadió 2,2'-(etilendioxi)bis(etilamina) (1 jl, 1,0 mg, 6,7 |jmol). Después de 15 min, la mezcla de reacción se concentró. Una cromatografía HPLC de fase inversa (C18) (30 ^ 90% de MeCN (1% de AcOH) en H2O (1% de AcOH) proporcionó 1,0 mg del producto deseado. LRMS (ESI+) m/z calcd. para C w ^ c ^ C ^ O ^ (M+2H+)/2 = 1464,69; encontrada 1465,66.
Ejemplo 57. Determinación del tiempo de retención de la HPLC
Muestras de los compuestos 19-38 se inyectaron en un sistema de HPLC equipado con una columna Phenomenex Luna C18(2) 5 j , 150 * 4,6 mm, 100 A y eluyeron con un gradiente de 10% de MeCN (0,1% de TFA)/90% de agua (0,1% de TFA) hasta 90% de MeCN (0,1% de TFA)/10% de agua (0,1% de TFA) o un gradiente de 10% de MeCN/90% de tampón de fosfato de potasio 10 mM, pH 7,4 hasta 90% de MeCN/10% de tampón de fosfato de potasio 10 mM, pH 7,4. Los tiempos de retención obtenidos para estos compuestos se muestran en la Tabla 3. Programa del tiempo:
0-12 min: 10% de MeCN hasta 90% de MeCN
12-14 min: 90% de MeCN
14- 15 min: 90% de MeCN hasta 10% de MeCN
15- 17 min: 10% de MeCN
Tabla 3. Tiempos de retención de los compuestos 19-23 y 30-38 en RP-HPLC.
Figure imgf000059_0001
Ejemplo 58. Conjugación por competencia de 17 frente a 18 con trastuzumab(N300C)
Trastuzumab(N300C) (100 jM ) se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente en PBS con EDTA 30 mM y TCEP 1 mM (10 eq.). El tampón se intercambió a PBS, después de lo cual el trastuzumab(N300C) (66,7 jM ) parcialmente reducido se incubó con ácido deshidroascórbico 1,33 mM (20 eq.). El trastuzumab(N300C) reoxidado (66,7 jM ) se incubó con maleimida 17 0,4 mM ( 6 eq.) y maleimida 18 0,4 mM ( 6 eq.). Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, la reacción se inactivó mediante la adición de un exceso 5 veces molar de N-acetilcisteína. Los productos de la reacción se digirieron con Fabricator® (comprado en Genovis) y se analizaron mediante análisis MS (AccuTOF). Aproximadamente el 45% del fragmento Fc se conjugaba con maleimida 18 (24297 Da, masa esperada = 24299) y aproximadamente el 35% del fragmento Fc se conjugaba con maleimida 17 (24319 Da, masa esperada = 24323). El 20% restante de los fragmentos Fc consiste en varias formas no conjugadas (que oscilan desde 23776 hasta 23874 Da).
Ejemplo 59. Conjugación de 19-39 con 13b o 13c
A una solución del trastuzumab(azida)2 adecuada (8 , 8 jl, 0,2 mg, 22,7 mg/ml en tampón Tris pH 7,5 10 mM) se añadió tampón Tris pH 7,5 10 mM (4 jL ) y el sustrato (2 jL, solución 2 mM en MiliQ 5% de DMA). La reacción se incubó a ta y las muestras (2 j L) se tomaron en puntos de tiempo preestablecidos. Esas muestras se incubaron con DTT (2 j L 0,2 M), se diluyeron con MiliQ (30 j L) y se sometieron a análisis MS (AccuTof) para determinar la eficacia de la conjugación (véase la Tabla 1 y 2).
Ejemplo 60. Agregación
Se investigó la tendencia a la agregación para los conjugados de 36, 37 y 38 con trastuzumab(F2-GalNAz)2 (13c), preparados de acuerdo con el ejemplo 59. Los ADCs se incubaron en PBS pH 7,4 a una concentración de 1 mg/ml a 37°C. El nivel de agregación se analizó utilizando una columna Superdex200 PC 3.2/30 (GE Healthcare) después de 0, 1 y 2 semanas. Los resultados se muestran en la Figura 23. La agregación permaneció por debajo del 1% al pasar de la relación de fármaco a anticuerpo de 2 (DAR2) del conjugado 36 a la relación de fármaco a anticuerpo de 4 (DAR4) del conjugado 37, lo que indicaba el potencial del espaciador de sulfamida para compensar el aumento de la lipofilicidad impartida mediante una duplicación del número de cargas útiles. Para el enlazador de bis-sulfamida de 38, no se observó ninguna agregación. Estos resultados son una mejora notable con respecto a los bioconjugados convencionales preparados por ligación con cicloadición de alquino-azida.
Ejemplo 61. Agregación
La tendencia a la agregación para los conjugados de 30 y 36 con trastuzumab(F2-GalNAz)2 (13c), preparados de acuerdo con el ejemplo 59, y para el propio trastuzumab, se vigiló durante un período de 14 días. Los conjugados se almacenaron durante 2 semanas a 40°C a pH 5, y los días 0, 2, 7, 10 y 14 se determinó el grado de agregación. El nivel de agregación se analizó utilizando una columna Superdex200 PC 3.2/30 (GE Healthcare). Los resultados se muestran en la Figura 24. Las condiciones con un estrés incrementado (mayor T, menor pH) en comparación con el ejemplo 61, conducían a un aumento de la agregación. Sin embargo, la agregación se reducía significativamente en el conjugado de acuerdo con la invención (conjugado de 36 con trastuzumab(F2-GalNAz)2 (13c )), comparado con el bioconjugado comparativo de 30 con trastuzumab(F2-GalNAz)2 (13c), empleando un espaciador PEG4. En particular, el mismo trastuzumab no mostraba ninguna tendencia a la agregación, debido a la ausencia de grupos hidrófobos, tales como un resto 1,2,3-triazol fusionado con un ciclooctano y el resto maitansinoide.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento para la preparación de un bioconjugado, comprendiendo el procedimiento la etapa de conjugar una glicoproteína (B) con un enlazador-conjugado, haciendo reaccionar un grupo reactivo Q1 del enlazador-conjugado con un grupo funcional F1 de la glicoproteína (B), en donde el enlazador-conjugado es un compuesto que comprende un extremo alfa y un extremo omega, comprendiendo el compuesto en el extremo alfa un grupo reactivo Q1 capaz de reaccionar con un grupo funcional F1 presente en la glicoproteína (B) y en el extremo omega una molécula diana (D) seleccionada a partir del grupo que consiste en un fármaco, un profármaco, un agente de diagnóstico, una proteína, un péptido, un polipéptido, un marcador peptídico, un aminoácido, un glicano, un lípido, una vitamina, un esteroide, un nucleótido, un nucleósido, un polinucleótido, un ARN, un ADN, una molécula informadora, un polímero, una superficie sólida, un hidrogel, una nanopartícula, una micropartícula y una biomolécula, en donde Q1 es un grupo reactivo seleccionado a partir del grupo que consiste en grupos N-maleimidilo opcionalmente sustituidos, grupos N-alquilamido halogenados, grupos éster activados, grupos tiol, grupos alquinilo, grupos (hetero)cicloalquinilo, grupos tetrazinilo, grupos azido, grupos fosfina, grupos 1 ,1 -bis(sulfonilmetil)-metilcarbonilo, grupos 1 ,2 -quinona o grupos triazina,
    comprendiendo el compuesto adicionalmente un grupo según la fórmula (1 ) o una sal del mismo:
    Figure imgf000061_0001
    en donde:
    a es 0 o 1 ; y
    R1 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos cicloalquilo C3 -C24, grupos (hetero)arilo C2 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C3 - C24, los grupos alquilo C1 - C24, grupos cicloalquilo C3 - C24, grupos (hetero)arilo C2 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 -C24 y grupos (hetero)arilalquilo C3 - C24 opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir de O, S y NR3 en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo C1 - C4, o R1 es una segunda molécula diana D, en donde la segunda molécula diana está conectada opcionalmente con N a través de un resto espaciador; y en donde el grupo según la fórmula (1 ), o la sal del mismo, está situado entre dicho extremo alfa y dicho extremo omega del compuesto.
    2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la molécula diana es un fármaco, un profármaco, un agente de diagnóstico, una proteína, un péptido, un polipéptido, un marcador peptídico, un aminoácido, un glicano, un lípido, una vitamina, un esteroide, un nucleótido, un nucleósido, un polinucleótido, un ARN, un ADN, una molécula informadora o un polímero.
    3. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que la reacción es una cicloadición, preferiblemente una reacción de Diels-Alder o una cicloadición 1,3-dipolar.
    4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que Q1 es un grupo alquinilo, grupos (hetero)cicloalquinilo o un grupo biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo], y F1 es un grupo azido.
    5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el enlazador-conjugado es según la fórmula (4a) o (4b), o una de sus sales:
    Figure imgf000061_0002
    Figure imgf000062_0001
    en donde:
    a es independientemente 0 o 1 ;
    b es independientemente 0 o 1 ;
    c es 0 o 1;
    d es 0 o 1 ;
    e es 0 o 1 ;
    f es un número entero en el intervalo de 1a 150;
    g es 0 o 1 ;
    i es 0 o 1 ;
    D es una molécula diana;
    Q1 es como se define en la reivindicación 1;
    Sp1 es un resto espaciador;
    Sp2 es un resto espaciador;
    Sp3 es un resto espaciador;
    Sp4 es un resto espaciador;
    Z1 es un grupo de conexión que conecta Q1 o Sp3 con Sp2, O o C(O) o N(R1);
    Z2 es un grupo de conexión que conecta D o Sp4 con Sp1, N(R1), O o C(O); y
    R1 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo Ci - C24, grupos cicloalquilo C3 - C24, grupos (hetero)arilo C2 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C3 - C24, los grupos alquilo C1 - C24, grupos cicloalquilo C3 - C24, grupos (hetero)arilo C2 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C3 - C24 opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir de O, S y NR3 en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo C1 - C4; o
    R1 es D, -[(SpV(Z2)e-(Sp4)i-D] o -[(Sp2)c-(Z1)d-(Sp3)g-Q1], en donde Sp1, Sp2 , Sp3 , Sp4 , Z1, Z2, D, Q1, b, c, d, e, g e i son como se han definido anteriormente.
    6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que Sp1, Sp2 , Sp3 y Sp4 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en grupos alquileno C1 - C20o lineales o ramificados, grupos alquenileno C2 - C20o, grupos alquinileno C2 - C200, grupos cicloalquileno C3 - C200, grupos cicloalquenileno C5 - C200, grupos cicloalquinileno C8 -C200, grupos alquilarileno C7 - C200, grupos arilalquileno C7 - C200, grupos arilalquenileno C8 - C200 y grupos arilalquinileno C9 - C200, en donde los grupos alquileno, los grupos alquenileno, los grupos alquinileno, los grupos cicloalquileno, los grupos cicloalquenileno, los grupos cicloalquinileno, los grupos alquilarileno, los grupos arilalquileno, los grupos arilalquenileno y los grupos arilalquinileno están opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir del grupo de O, S y NR3 , en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos alquenilo C2 - C24, grupos alquinilo C2 - C24 y grupos cicloalquilo C3 - C24, en donde los grupos alquenilo, los grupos alquinilo y los grupos cicloalquilo están opcionalmente sustituidos; y/o
    en donde Z1 y Z2 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en -O-, -S-, -NR2-, -N=N-, -C(O)-, -C(O)NR2-, -O-C(O)-, -O-C(O)-O-, -O-C(O)-NR2 , -NR2-C(O)-, -NR2-C(O)-O-, -NR2-C(O)-NR2-, -S-C(O)-, -S-C(O)-O-, -S-C(O)-NR2-, -S(O)-, -S(O)2-, -O-S(O)2-, -O-S(O)2-O-, -O-S(O)2-NR2-, -O-S(O)-, -O-S(O)-O-, -O-S(O)-NR2-,
    -O-NR2-C(O)-, -O-NR2-C(O)-O-, -O-NR2-C(O)-NR2-, -NR2-O-C(O)-, -NR2-O-C(O)-O-, -NR2-O-C(O)-NR2-, -O-NR2 C(S)-, -O-NR2-C(S)-O-, -O-NR2-C(S)-NR2-, -NR2-O-C(S)-, -NR2-O-C(S)-O-, -NR2-O-C(S)-NR2-, -O-C(S)-, -O-C(S)-O-, -O-C(S)-NR2-, -NR2-C(S)-, -NR2-C(S)-O-, -NR2-C(S)-NR2-, -S-S(O)2-, -S-S(O)2-O-, -S-S(O)2-NR2-, -NR2-O-S(O)-, -NR2-O-S(O)-O-, -NR2-O-S(O)-NR2-, -NR2-O-S(O)2-, -NR2-O-S(O)2-O-, -NR2-O-S(O)2-NR2-, -O-NR2-S(O)-, -O-NR2-S(O)-O-, -O-NR2-S(O)-NR2-, -O-NR2-S(O)2-O-, -O-NR2-S(O)2-NR2-, -O-NR2-S(O)2-, -O-P(O)(R2)2-, -S-P(O)(R2)2-, -NR2-P(O)(R2)2- y combinaciones de dos o más de los mismos, en donde R2 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo Ci - C24, grupos alquenilo C2 - C24, grupos alquinilo C2 -C24 y grupos cicloalquilo C3 - C24, en donde los grupos alquilo, los grupos alquenilo, los grupos alquinilo y los grupos cicloalquilo están opcionalmente sustituidos.
    7. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que Sp1, Sp2, Sp3 y Sp4, si están presentes, se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en grupos alquileno C1 - C20 lineales o ramificados, estando los grupos alquileno opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir del grupo que consiste en O, S y NR3, en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo C1 - C4, y en donde Q1 es un grupo trans-ciclooctenilo o un grupo según la fórmula (9a), (9i), (9j), (9k), (9l), (9q), (9n), (9o) o (9p):
    Figure imgf000063_0001
    en donde p es un número entero en el intervalo de 0 a 10, l es un número entero en el intervalo de 0 a 10, U es O o NR9, y R9 es hidrógeno, un grupo alquilo C1 - C12 lineal o ramificado o un grupo (hetero)arilo C4 - C12, y en donde los anillos aromáticos en (9n) están opcionalmente O-sulfonilados en una o varias posiciones y los anillos de (9o) y (9p) están opcionalmente halogenados en una o varias posiciones, preferiblemente en donde el grupo trans-ciclooctenilo es según la fórmula (9zi) o (9zj):
    Figure imgf000063_0002
    8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la glicoproteína es un anticuerpo, preferiblemente en donde el anticuerpo se une específicamente a un antígeno, lo más preferiblemente un antígeno relacionado con el cáncer.
    9. Procedimiento según la reivindicación 8 , en el que el bioconjugado es un conjugado de anticuerpo-fármaco.
    10. Bioconjugado obtenible mediante el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1- 9.
    11. Compuesto que comprende un extremo alfa y un extremo omega, comprendiendo el compuesto en el extremo alfa un grupo reactivo Q1 capaz de reaccionar con un grupo funcional F1 presente en una glicoproteína y en el extremo omega una molécula diana (D) seleccionada a partir del grupo que consiste en un fármaco, un profármaco, un agente de diagnóstico, una proteína, un péptido, un polipéptido, un marcador peptídico, un aminoácido, un glicano, un lípido, una vitamina, un esteroide, un nucleótido, un nucleósido, un polinucleótido, un ARN, un ADN, una molécula informadora, un polímero, una superficie sólida, un hidrogel, una nanopartícula, una micropartícula y una biomolécula, en donde el compuesto comprende adicionalmente un grupo según la fórmula (1) o una sal del mismo:
    Figure imgf000064_0001
    en donde:
    a es 0 o 1 ;
    R1 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo Ci - C24, grupos cicloalquilo C3 -C24, grupos (hetero)arilo C2 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 - C24 y grupos (hetero grupos alquilo C1 - C24, grupos cicloalquilo C3 - C24, grupos (hetero)arilo C2 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 -C24 y grupos (hetero)arilalquilo C3 - C24 opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir de O, S y NR3 en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo C1 - C4, o R1 es una molécula diana D seleccionada a partir del grupo que consiste en un fármaco, un profármaco, un agente de diagnóstico, una proteína, un péptido, un polipéptido, un marcador peptídico, un aminoácido, un glicano, un lípido, una vitamina, un esteroide, un nucleótido, un nucleósido, un polinucleótido, un ARN, un ADN, una molécula informadora, un polímero, una superficie sólida, un hidrogel, una nanopartícula, una micropartícula y una biomolécula, en donde la molécula diana está conectada opcionalmente con N a través de un resto espaciador; y
    Q1 se selecciona a partir del grupo que consiste en un grupo N-maleimidilo opcionalmente sustituido, un grupo (hetero)cicloalquinilo y un grupo biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo].
    12. Compuesto según la reivindicación 11, en el que Q1 es un grupo (hetero)cicloalquinilo opcionalmente sustituido, lo más preferiblemente un grupo biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilo]; y/o
    en donde Q1 es un grupo según la fórmula (9a), (9q), (9n), (9o) o (9p):
    Figure imgf000064_0002
    en donde U es O o NR9, y R9 es hidrógeno, un grupo alquilo C1 - C12 lineal o ramificado o un grupo (hetero)arilo C4 -C12, y en donde los anillos aromáticos en (9n) están opcionalmente O-sulfonilados en una o varias posiciones y los
    anillos de (9o) y (9p) están opcionalmente halogenados en una o varias posiciones.
    13. Compuesto según la reivindicación 11 o 12, en donde el compuesto está de acuerdo con la fórmula (4a) o (4b), o una sal del mismo:
    Figure imgf000065_0001
    en donde a, b, c, d, e, f, g, i, D, Sp1, Sp2, Sp3, Sp4, Z1, Z2 y R1 son como se han definido en la reivindicación 5, preferiblemente en donde Sp1, Sp2, Sp3 y Sp4, si están presentes, se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en grupos alquileno C1 - C20 lineales o ramificados, estando los grupos alquileno opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir del grupo que consiste en O, S y NR3, preferiblemente O, en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo C1 - C4.
    14. Compuesto que comprende un extremo alfa y un extremo omega, comprendiendo el compuesto en el extremo alfa una glicoproteína (B) y en el extremo omega una molécula diana (D) seleccionada a partir del grupo que consiste en un fármaco, un profármaco, un agente de diagnóstico, una proteína, un péptido, un polipéptido, un marcador peptídico, un aminoácido, un glicano, un lípido, una vitamina, un esteroide, un nucleótido, un nucleósido, un polinucleótido, un ARN, un ADN, una molécula reportera, un polímero, una superficie sólida, un hidrogel, una nanopartícula, una micropartícula y una biomolécula, en donde el compuesto comprende además un grupo según la fórmula (1 ) o una sal del mismo:
    Figure imgf000065_0002
    en donde:
    a es 0 o 1 ; y
    R1 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos cicloalquilo C3 - C24, grupos (hetero)arilo C2 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C3 - C24, los grupos alquilo C1 - C24, grupos cicloalquilo C3 - C24, grupos (hetero)arilo C2 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C3 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C3 - C24 opcionalmente sustituidos y opcionalmente interrumpidos por uno o varios heteroátomos seleccionados a partir de O, S y NR3 en donde R3 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y grupos alquilo C1 - C4 ; o R1 es una molécula diana D seleccionada a partir del grupo que consiste en un fármaco, un profármaco, un agente de diagnóstico, una proteína, un péptido, un polipéptido, un marcador peptídico, un aminoácido, un glicano, un lípido, una vitamina, un esteroide, un nucleótido, un nucleósido, un polinucleótido, un ARN, un ADN, una molécula informadora, un polímero, una superficie sólida, un hidrogel, una nanopartícula, una micropartícula y una biomolécula, en donde la molécula diana está conectada opcionalmente con N a través de un resto espaciador;
    preferiblemente en donde la glicoproteína es un anticuerpo y/o en donde la molécula diana es un fármaco, un profármaco, un agente de diagnóstico, una proteína, un péptido, un polipéptido, un marcador peptídico, un aminoácido, un glicano, un lípido, una vitamina, un esteroide, un nucleótido, un nucleósido, un polinucleótido, un ARN, un ADN, una molécula informadora o un polímero.
ES15813594T 2014-10-03 2015-10-05 Enlazador de sulfamida, conjugados de los mismos y métodos de preparación Active ES2740907T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14187615 2014-10-03
PCT/NL2015/050697 WO2016053107A1 (en) 2014-10-03 2015-10-05 Sulfamide linker, conjugates thereof, and methods of preparation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2740907T3 true ES2740907T3 (es) 2020-02-07

Family

ID=51663050

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES15813594T Active ES2740907T3 (es) 2014-10-03 2015-10-05 Enlazador de sulfamida, conjugados de los mismos y métodos de preparación

Country Status (6)

Country Link
US (3) US9636421B2 (es)
EP (3) EP3733209A1 (es)
JP (1) JP6733993B2 (es)
CN (2) CN112494657A (es)
ES (1) ES2740907T3 (es)
WO (1) WO2016053107A1 (es)

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015157446A1 (en) 2014-04-08 2015-10-15 University Of Georgia Research Foundation Inc. Site-specific antibody-drug glycoconjugates and methods
EP3733209A1 (en) * 2014-10-03 2020-11-04 Synaffix B.V. Sulfamide linker, conjugates thereof, and methods of preparation
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
EP3354726A1 (en) 2015-04-23 2018-08-01 Synaffix B.V. Process for the modification of a glycoprotein using a glycosyltransferase that is or is derived from a beta-(1,4)-n-acetylgalactosaminyltransferase
WO2015151078A2 (en) 2015-06-15 2015-10-08 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd Hydrophilic linkers for conjugation
GB201600290D0 (en) 2016-01-07 2016-02-24 Fujifilm Diosynth Biotechnologies Uk Ltd Process
GB201600287D0 (en) * 2016-01-07 2016-02-24 Fujifilm Diosynth Biotechnologies Uk Ltd Process
US10858641B2 (en) 2016-02-08 2020-12-08 Synaffix B.V. Enzymes for trimming of glycoproteins
WO2017137457A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 Synaffix B.V. Antibody-conjugates with improved therapeutic index for targeting cd30 tumours and method for improving therapeutic index of antibody-conjugates
US10874746B2 (en) 2016-02-08 2020-12-29 Synaffix B.V. Sulfamide linkers for use in bioconjugates
US11338043B2 (en) 2016-02-08 2022-05-24 Synaffix B.V. Antibody-conjugates with improved therapeutic index for targeting HER2 tumours and method for improving therapeutic index of antibody-conjugates
CN109152844B (zh) 2016-02-08 2022-11-22 西纳福克斯股份有限公司 用于治疗的含有磺酰胺接头的生物缀合物
EP3413916A1 (en) 2016-02-08 2018-12-19 Synaffix B.V. Antibody-conjugates with improved therapeutic index for targeting cd30 tumours and method for improving therapeutic index of antibody-conjugates
GB201702031D0 (en) * 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
RS61795B1 (sr) * 2017-02-08 2021-06-30 Adc Therapeutics Sa Konjugati pirolobenzodiazepin antitela
MX2019009427A (es) * 2017-02-08 2019-10-07 Medimmune Ltd Conjugados de pirrolobenzodiazepinas y anticuerpos.
GB201719906D0 (en) * 2017-11-30 2018-01-17 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
JP2020517609A (ja) 2017-04-18 2020-06-18 メディミューン リミテッド ピロロベンゾジアゼピン複合体
BR112019021880A2 (pt) 2017-04-20 2020-06-02 Adc Therapeutics Sa Terapia de combinação com conjugado anticorpo anti-axl-droga
CA3062238A1 (en) 2017-05-11 2018-11-15 Vib Vzw Glycosylation of variable immunoglobulin domains
WO2019034764A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Medimmune Limited CONJUGATES OF PYRROLOBENZODIAZEPINE
WO2019110725A1 (en) 2017-12-06 2019-06-13 Synaffix B.V. Enediyne conjugates
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
SG11202100934PA (en) 2018-08-02 2021-02-25 Dyne Therapeutics Inc Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
US11911484B2 (en) 2018-08-02 2024-02-27 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
CA3108289A1 (en) 2018-08-02 2020-02-06 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11168141B2 (en) 2018-08-02 2021-11-09 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
EP3876998A1 (en) 2018-11-05 2021-09-15 Synaffix B.V. Antibody-conjugates for targeting of tumours expressing trop-2
GB201901608D0 (en) 2019-02-06 2019-03-27 Vib Vzw Vaccine adjuvant conjugates
KR20210127714A (ko) 2019-03-07 2021-10-22 에이비엘바이오 주식회사 항체-약물 접합체 및 이의 용도
JP7210770B2 (ja) 2019-03-29 2023-01-23 メドイミューン・リミテッド 化合物及びその複合体
AU2020263959A1 (en) 2019-04-24 2021-11-25 Heidelberg Pharma Research Gmbh Amatoxin antibody-drug conjugates and uses thereof
MX2022003065A (es) * 2019-09-30 2022-06-09 Beijing Xuanyi Pharmasciences Co Ltd Conjugados de proteína-macromolécula y métodos de uso de estos.
WO2021151984A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Innate Pharma Treatment of cancer
WO2021260232A1 (en) * 2020-06-26 2021-12-30 Synaffix B.V. Methods for the preparation of linker payload constructs
JP2023541637A (ja) 2020-09-15 2023-10-03 シンアフィックス ビー．ブイ． 抗体－エクサテカンコンジュゲート
CN116615256A (zh) 2020-10-16 2023-08-18 乔治亚大学研究基金会 糖缀合物
WO2022079211A1 (en) 2020-10-16 2022-04-21 Adc Therapeutics Sa Glycoconjugates
KR20230112656A (ko) 2020-11-25 2023-07-27 이나뜨 파르마 에스.에이. 암의 치료
MX2023007126A (es) 2020-12-23 2023-09-04 Univ Muenchen Ludwig Maximilians Conjugados anticuerpo-droga mejorados dirigidos contra cd30 y usos de los mismos.
EP4301782A1 (en) 2021-03-05 2024-01-10 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-cd44 antibodies and their uses
CN113234122A (zh) * 2021-05-07 2021-08-10 联宁（苏州）生物制药有限公司 一种用于抗体偶联药物的双臂中间体lnd1037的合成方法
US11771776B2 (en) 2021-07-09 2023-10-03 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
US11633498B2 (en) 2021-07-09 2023-04-25 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
US11672872B2 (en) 2021-07-09 2023-06-13 Dyne Therapeutics, Inc. Anti-transferrin receptor antibody and uses thereof
US11969475B2 (en) 2021-07-09 2024-04-30 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11638761B2 (en) 2021-07-09 2023-05-02 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
WO2023014863A1 (en) 2021-08-05 2023-02-09 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-muc4 antibodies and their uses
WO2023180489A1 (en) 2022-03-23 2023-09-28 Synaffix B.V. Antibody-conjugates for targeting of tumours expressing carcinoembyronic antigen
WO2023180490A1 (en) 2022-03-23 2023-09-28 Synaffix B.V. Antibody-conjugates for targeting of tumours expressing nectin-4
WO2023180484A1 (en) 2022-03-23 2023-09-28 Synaffix B.V. Antibody-conjugates for targeting of tumours expressing ptk7
WO2023180485A1 (en) 2022-03-23 2023-09-28 Synaffix B.V. Antibody-conjugates for targeting of tumours expressing trop-2
US11931421B2 (en) 2022-04-15 2024-03-19 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and formulations for treating myotonic dystrophy
WO2023227660A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Innate Pharma Nectin-4 binding agents
WO2024038065A1 (en) 2022-08-15 2024-02-22 Synaffix B.V. Anthracyclins and conjugates thereof
EP4344707A1 (en) 2022-09-29 2024-04-03 Emergence Therapeutics AG New anti-nectin-4 antibody drug conjugates

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS495988A (es) * 1973-03-22 1974-01-19
US4585862A (en) * 1981-12-11 1986-04-29 Abbott Laboratories Fluorescence polarization immunoassay
EP0199963B1 (en) * 1985-04-01 1991-10-23 Abbott Laboratories Ethosuximide assay tracers, immunogens and antibodies
US5214206A (en) * 1990-11-07 1993-05-25 Warner-Lambert Company Aminosulfonyl urea acat inhibitors
JPH0827147A (ja) * 1994-07-20 1996-01-30 Kureha Chem Ind Co Ltd Ｎ−（置換アミノ）イミド誘導体、その製造方法及び除草剤
DK1132739T3 (da) 2000-05-16 2002-01-28 Biochip Technologies Gmbh Linkersystem til aktivering af overflader til biokonjugation og fremgangsmåder til anvendelse deraf
GB0012718D0 (en) * 2000-05-24 2000-07-19 Angeletti P Ist Richerche Bio Conjugates of aminodrugs
US7737275B2 (en) * 2003-12-03 2010-06-15 Basf Aktiengesellschaft Method for producing 3-phenyl(thio)uracils and 3-phenyldithiouracils
JP5198063B2 (ja) 2004-08-26 2013-05-15 アッパラオ・サティアム 新規バイオ開裂性リンカー
WO2008070291A2 (en) 2006-10-24 2008-06-12 Kereos, Inc. Improved linkers for anchoring targeting ligands
US20110098241A1 (en) * 2008-04-14 2011-04-28 Poniard Pharmaceuticals, Inc. Rapamycin analogs as anti-cancer agents
PT2481725E (pt) * 2009-09-25 2015-05-21 Astellas Pharma Inc Composto de amida substituído
ES2659270T3 (es) * 2012-10-23 2018-03-14 Synaffix B.V. Anticuerpo modificado, conjugado de anticuerpo y proceso de preparación de los mismos
RU2019105549A (ru) 2012-12-21 2019-03-28 Биоэллаенс К. В. Гидрофильные саморазрушающиеся линкеры и их конъюгаты
MX368258B (es) * 2013-03-15 2019-09-25 Zymeworks Inc Compuestos citotoxicos y antimitoticos y metodos de uso de los mismos.
KR102384740B1 (ko) 2013-12-27 2022-04-07 자임워크스 인코포레이티드 약물 접합체를 위한 설폰아마이드-함유 연결 시스템
EP3733209A1 (en) * 2014-10-03 2020-11-04 Synaffix B.V. Sulfamide linker, conjugates thereof, and methods of preparation
US11338043B2 (en) * 2016-02-08 2022-05-24 Synaffix B.V. Antibody-conjugates with improved therapeutic index for targeting HER2 tumours and method for improving therapeutic index of antibody-conjugates
CN109152844B (zh) * 2016-02-08 2022-11-22 西纳福克斯股份有限公司 用于治疗的含有磺酰胺接头的生物缀合物

Also Published As

Publication number Publication date
EP3134128B1 (en) 2019-06-05
US11850286B2 (en) 2023-12-26
US20170072068A1 (en) 2017-03-16
CN107106701A (zh) 2017-08-29
CN112494657A (zh) 2021-03-16
US20170298145A1 (en) 2017-10-19
EP3733209A1 (en) 2020-11-04
JP6733993B2 (ja) 2020-08-05
EP3598983A1 (en) 2020-01-29
US10792369B2 (en) 2020-10-06
JP2017538666A (ja) 2017-12-28
WO2016053107A1 (en) 2016-04-07
CN107106701B (zh) 2020-11-06
EP3134128A1 (en) 2017-03-01
US9636421B2 (en) 2017-05-02
US20210030886A1 (en) 2021-02-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2740907T3 (es) Enlazador de sulfamida, conjugados de los mismos y métodos de preparación
US11957763B2 (en) Sulfamide linkers for use in bioconjugates
JP7488003B2 (ja) 治療において使用するためのスルファミドリンカーを含むバイオコンジュゲート
CN108883191B (zh) 用于靶向cd30肿瘤的具有改善的治疗指数的抗体-缀合物以及用于改善抗体-缀合物的治疗指数的方法
US10266502B2 (en) Process for the cycloaddition of a halogenated 1,3-dipole compound with a (hetero)cycloalkyne
US20230127659A1 (en) Antibody-conjugates with improved therapeutic index for targeting her2 tumours and method for improving therapeutic index of antibody-conjugates
WO2017137457A1 (en) Antibody-conjugates with improved therapeutic index for targeting cd30 tumours and method for improving therapeutic index of antibody-conjugates
WO2010119158A1 (es) Ciclooligosacáridos anfifílicos policatiónicos y su uso como transportadores moleculares
JP2017200902A (ja) Ｈｅｒ２腫瘍を標的化するための改善された治療指数を有する新規な抗体−コンジュゲート及び抗体−コンジュゲートの治療指数を改善するための方法
JP2017197512A (ja) Ｃｄ３０腫瘍を標的化するための改善された治療指数を有する新規な抗体−コンジュゲート及び抗体−コンジュゲートの治療指数を改善するための方法
US20230068165A1 (en) Phosphine-mediated amine-azide coupling in ionic liquid for bioconjugation reactions
Ng Genetically Encoded Fragment-Based Discovery of Inhibitors for Glycan-Binding Proteins
Zhang Biomemitic Glycomacromolecules for Medical Applications
Rauthu Design of selective ligands for conjugate drug targeting to human serum albumin (HSA) through cysteine-34 and β-D-galactopyranoside inhibitors towards galectins