CN113747924B - 抗体-药物偶联物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包含半乳糖触发部分和环丙基苯并吲哚(CBI)的新型化合物，以及使用其制备的抗体‑药物偶联物。

Description

抗体-药物偶联物及其用途
技术领域
本发明涉及一种包含半乳糖触发部分和环丙基苯并吲哚(CBI)的新的化合物，以及使用其制备的抗体-药物偶联物。
背景技术
近年来，已经研究了使用抗体诊断或治疗各种疾病的方法。特别是，由于抗体的靶向特异性，已经开发了使用抗体的各种治疗方法，并且正在开发包括抗体的各种类型的药物，例如抗体-药物偶联物(ADC)。因此，增加抗体或抗体-药物偶联物的体内稳定性并使其治疗效果最大化的方法正在不断研究。
其中，与天然抗体相比，ADC一般具有较低的体内稳定性，但开发ADC是为了通过与药物结合以改善是天然抗体的传统上治疗效果低下的缺点。具有特定药效的药物，如与靶向特异性抗体结合的细胞毒素，已经以各种方式开发，并且能够通过将药物与癌细胞特异性抗体结合来诱导癌细胞死亡的抗体-药物偶联物已经商业化。
含有DNA小沟烷化剂作为药物中的载荷的ADC的临床试验正在进行中。此类药物的例子包括吡咯并苯二氮(PBD)二聚体和基于环丙基苯并吲哚(CBI)的倍癌霉素(duocarmycin)衍生物。特别是，已知CBI对各种类型的癌症具有细胞毒性，并且已报道CBI二聚体也具有高细胞毒性(Tietze等人,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2010,49,7336-7339)。
在将ADC递送至靶癌细胞之前，接头可能会意外地从ADC上剪切，而药物可能会从此提前释放，这会造成全身毒性的风险。如果药物为高细胞毒性的，则风险可能更大。为了防止这种现象，当溶酶体中剪切的衍生物用作药物时，该衍生物作为触发物(前药官能团)，因此在释放活性细胞毒性药物之前，除了该接头外，还应当剪切触发物，从而能够降低风险。
已经认为氨基甲酸酯基或磷酸酯基可以作为触发物连接至CBI。当氨基甲酸酯基用作触发物的时候，它可以在溶酶体和/或细胞质中被羧酸酯酶剪切。当磷酸酯基用作触发物的时候，磷酸酯基可以在溶酶体和/或细胞质中被磷酸酶剪切。然而，这些传统的触发物仍然具有安全问题。
在此技术背景下，由于大量努力开发了一种能够有效表现出药物活性以及由于比常规触发物更高的靶向特异性毒性而表现出改善的安全性的触发部分，本发明人发现了含有半乳糖作为触发物的前药能够用于ADC，并在此基础上完成了本发明。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种由下式(I)或(II)表示的化合物(其为与触发部分结合的CBI二聚体化合物)或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
[式I]
[式II]
本发明的另一个目的是提供一种由式(III)表示的抗体-药物偶联物，其中，抗体与由式(II)表示的化合物(其为与触发部分结合的CBI二聚体化合物)结合。
[式III]
本发明的另一个目的是提供一种用于预防或治疗增殖性疾病的组合物，其包含所述抗体-药物偶联物。
根据本发明的一方面，上述和其它目的可以通过提供由下式(I)表示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物来实现：
[式I]
其中，R1为D-半乳糖β-吡喃糖或D-半乳糖α-吡喃糖；
R2为Cl或Br；并且
R3为单键、-O-或-NH-。
根据本发明的另一方面，提供了由下式(II)表示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
[式II]
其中，R1为D-半乳糖β-吡喃糖或D-半乳糖α-吡喃糖；
R2为Cl或Br；
R3为单键、-O-或-NH-；
W为间隔基；并且
L1为接头。
根据本发明的另一方面，提供了一种包含由下式(III)表示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的抗体-药物偶联物：
[式III]
其中
R1为D-半乳糖β-吡喃糖或D-半乳糖α-吡喃糖；
R2为Cl或Br；
R3为单键、-O-或-NH-；
W为间隔基；
L2为接头；并且
Ab为抗体或其抗原结合片段。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于预防或治疗增殖性疾病的药物组合物，其包含所述偶联物。
附图说明
图1为说明前药CBI二聚体转化为活化形式的方法的示意图。
图2示出各种肿瘤细胞系中β-半乳糖苷酶的表达的检测结果。
图3示出根据本发明的前药CBI二聚体对游离药物的功效的检测结果。
图4示出使用SE-HPLC确认根据本发明的抗体-药物偶联物的纯度的结果。
图5示出使用SE-HPLC确认根据本发明的抗体-药物偶联物的纯度的结果。
图6示出使用LC/MS分析根据本发明的抗体-药物偶联物的DAR的结果。
图7示出使用LC/MS分析根据本发明的抗体-药物偶联物的DAR的结果。
图8示出使用H929细胞系确认根据本发明的抗体-药物偶联物的体外细胞毒性的结果。
图9示出使用Mino和Jeko-1细胞系中的每一种确认根据本发明的抗体-药物偶联物的体外细胞毒性的结果。
图10示出使用NCI-N87和HCC1954细胞系中的每一种确认根据本发明的抗体-药物偶联物的体外细胞毒性的结果。
图11示出使用OVCAR-3细胞系确认根据本发明的抗体-药物偶联物的体外细胞毒性的结果。
图12示出使用Jeko-1模型确认根据本发明的抗体-药物偶联物的体内细胞毒性的结果。
图13示出使用多发性骨髓瘤模型异种移植确认根据本发明的抗体-药物偶联物的体内细胞毒性的结果。
图14示出使用AML模型异种移植确认根据本发明的抗体-药物偶联物的体内细胞毒性的结果。
图15示出施用了ADC的动物体重的变化。
图16示出施用了ADC的动物血白细胞水平的变化。
图17示出通过血液生化参数(如ALT(丙氨酸氨基转移酶)、AST(天冬氨酸氨基转移酶)和血尿素氮(BUN))的分析确定检测到的ADC的毒性的结果。
图18示出单剂量大鼠毒性试验中体重的变化。
图19示出通过血液学检查检测到的血白细胞水平的变化。
图20示出基于对SD大鼠施用单剂量之后观察到的体重的变化与血液学的和血液生化的变化确定的毒性表达和恢复的存在。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术的和科学的术语均具有与本发明所属领域的技术人员所理解的含义相同的含义。通常，本文使用的命名法是本领域公知的并且通常使用。
在一方面，本发明涉及一种由下式(I)表示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
其中
R1为D-半乳糖β-吡喃糖或D-半乳糖α-吡喃糖；
R2为Cl或Br；并且
R3为单键、-O-或-NH-。
在另一方面，本发明涉及一种由下式(II)表示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
其中，R1为D-半乳糖β-吡喃糖或D-半乳糖α-吡喃糖；
R2为Cl或Br；
R3为单键、-O-或-NH-；
W为间隔基；并且
L1为接头。
根据本发明的另一方面，提供了一种包含由下式(III)表示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的抗体-药物偶联物：
其中
R1为D-半乳糖β-吡喃糖或D-半乳糖α-吡喃糖；
R2为Cl或Br；
R3为单键、-O-或-NH-；
W为间隔基；
L2为接头；并且
Ab为抗体或其抗原结合片段。
式(I)、(II)和(III)的化合物为先前所未知的新的化合物，式(I)的化合物可以用作药物-系链组合(drug-tether combination)，用于制备抗体-药物复合物与接头-药物复合物；式(II)的化合物可以用作接头-药物复合物，用于制备抗体-药物偶联物；而式(III)的化合物可以用作抗体-药物偶联物或其前药，但本发明可以不限于此。
根据式(I)、(II)或(III)，R1表示前药的触发物，并且如图1所示，通过细胞中的酶去除该触发物以激活CBI二聚体，其为一种细胞毒性药物。触发物R1为D-半乳糖β-吡喃糖或D-半乳糖α-吡喃糖。
如本文所使用的，术语“前药”是指这样的化合物：在特定的体内生理条件下通过酶促氧化、还原和/或水解，通过触发物R1，可以将无活性的CBI二聚体转化为有活性的CBI二聚体，其表现出活性，例如细胞毒性。
本发明人发现，当磷酸酯基被包含作为触发物时，细胞毒性功效极好，但可能诱发严重的肾毒性，其可能伴随不可逆的肾损害。此外，认为含有作为触发物的磷酸酯基的ADC在血清中不稳定，但不限于这样的理论。
然而，本发明发现R1包括作为触发物的D-半乳糖β-吡喃糖或D-半乳糖α-吡喃糖，其为半乳糖的异构体，因此能够保持所需的靶向特异性的细胞毒性，并且能够解决不希望的体内毒性的问题。
当使用半乳糖作为触发物时，能够激活半乳糖的酶可以在靶细胞中高表达，靶细胞例如具有增殖性疾病的细胞，特别是癌细胞。
在一个实施方式中，R1为D-半乳糖β-吡喃糖或D-半乳糖α-吡喃糖，并且在这种情况下，该酶可以为半乳糖苷酶，特别是β-半乳糖苷酶。β-半乳糖苷酶为一种溶酶体酶并且在大多数癌细胞中高水平表达，表明β-半乳糖苷酶被认为是一种肿瘤选择性活化酶(图2)。
在一个实施例中，式(II)或(III)中的以下部分能够将CBI二聚体彼此连接以增强药理效应，并且表示用于将式(II)中的间隔基W和接头L1或将式(III)中的间隔基W和接头L2稳定地结合至药物的系链。
在该系链中，R3为单键、O-或-NH-。
具体地，根据本发明的偶联物可以包括由下式表示的化合物：
在式(II)和(III)中，接头L与间隔基W结合，并且当抗体被结合以将药物递送至靶标时，间隔基用于保持抗体和药物之间的足够距离。任选地，可以提供亲水性部分以提高溶解度。在一些实施例中，术语“接头”也可以称为包括间隔基。
在一个实施例中，该间隔基W为-R4-A-R5-、-R4-A-、-(CH2CH2R6)x-、-(CH2)r(R7(CH2)p)q-、-((CH2)pR7)q-、-(CH2)r(R7(CH2)p)qR8-、-((CH2)pR7)q(CH2)r-、-R8((CH2)pR7)q-或-(CH2)r(R7(CH2)p)qR8CH2-，
其中，R4和R5各自独立地为-(CH2)r(V(CH2)x)p(CH2)q，A为直接键或肽键，并且V为单键、O或S，
R6为-O-、C1-C8亚烷基、-NR9-或-C(O)NR2-，
R7和R8各自独立地为单键、-O-、-NR10-、-C(O)NR11-、-NR12C(O)-或C3-C20杂芳基，
R9至R12各自独立地为氢、C1-C6烷基、(C1-C6烷基)C6-C20芳基或(C1-C6烷基)C3-C20杂芳基，
X为1至5的整数，r为0至10的整数，p为0至10的整数，并且q为0至20的整数，并且
W中的1至10个氢原子可以任选地被羟基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、氨基、ONH2或羰基(oxo)取代。
在一个实施例中，式(II)或式(III)中的W可以包括以下：
(1)-R4-A-R5-或-R4-A-，其中，R4和R5各自独立地为-(CH2)r(V(CH2)x)p(CH2)q，A为直接键或肽键，并且V为单键、O或S，
x为1至5的整数，具体为1、2、3、4或5，
r为0至10的整数，具体为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，
p为0至10的整数，具体为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，或具体为0至7的整数，或0至5的整数，
q为0至20的整数，具体为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，或具体为0至10的整数，0至7的整数，或0至5的整数；和
(2)由-(CH2CH2R6)x-表示的化合物，由-((CH2)pR7)q(CH2)r-表示的化合物，或由-(CH2)r(R7(CH2)p)qR8CH2-表示的化合物。
在这种情况下，R6为-O-、C1-C8亚烷基、-NR9-或-C(O)NR13-；
R7和R8各自独立地为单键、-O-、-NR10-、-C(O)NR11-、-NR12C(O)-或C3-C20杂芳基，具体为C3-C15杂芳基，更具体为C3-C12杂芳基，
R9至R13各自独立地为氢、C1-C6烷基、(C1-C6烷基)C6-C20芳基，具体为(C1-C6烷基)C3-C15芳基，更具体为(C1-C6烷基)C3-C12芳基，或(C1-C6烷基)C3-C20杂芳基，具体为(C1-C6烷基)C3-C15杂芳基，更具体为(C1-C6烷基)C3-C12杂芳基。
x为1至5的整数，具体为1、2、3、4或5，
r为0至10的整数，具体为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，或更具体为0至7的整数，或0至5的整数，
p为0至10的整数，具体为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，或更具体为0至7的整数，或0至5的整数，
q为0至20的整数，具体为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，或更具体为0至10的整数，0至7的整数，或0至5的整数。
式(II)中的接头L1或式(III)中的接头L2使抗体与药物稳定结合，并且当抗体-药物偶联物在体内循环后到达靶细胞时，它使该抗体-药物偶联物进入细胞，通过抗体与药物的解离使得药物容易从中释放，并且提供对靶癌细胞的药效。
式(II)中的接头L1为羟基、醛基、ONH2、NH2或含有1至3个选自N、O和S的杂原子的4至7元或5至7元杂芳基，其中，杂芳基可以被1至5个独立地选自羟基、醛基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、氨基、ONH2和羰基的取代基取代。
式(III)中的L2为-CH2NH-、-ON＝C(CH3)-、-ON＝，或含有1至3个选自N、O和S的杂原子的4至7元或5至7元杂环，其中，杂环可以被1至5个独立地选自羟基、醛基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、氨基、ONH2和羰基的取代基取代。
具体地，接头L1或L2可以包括NH2、-OH、-ONH2(羟胺)、-NH2醛(甲酰基)、-CO2H、-SH、2-甲酰基吡啶、磺酰胺、(杂)环辛炔、叠氮(-N3)或马来酰亚胺。
在一些情况下，式(II)中的接头L1或式(III)中的接头L2可以包括由下式(IV)表示的化合物：
其中，a为0或1，
R13选自C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C3-C24芳基、C3-C24杂芳基、C3-C24烷基芳基、C3-C24烷基杂芳基、C3-C24芳基烷基和C3-C24杂芳基烷基，其中，杂芳基含有选自O、S和NR14的杂原子，其中，R14为氢或C1-C4烷基。
具体地，式(II)中的接头L1可以具有由下式(I-a)或(I-b)表示的结构：
其中，Q2为环辛炔基或杂环辛炔基，其中，环辛炔基或杂环辛炔基任选地各自独立地与选自C3-C12环烷基、C3-C12芳基和C3-C12杂芳基的1或2个环稠合，并且任选地被羟基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、氨基、ONH2或羰基取代，
R13选自C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C3-C24芳基、C3-C24杂芳基、C3-C24烷基芳基、C3-C24烷基杂芳基、C3-C24芳基烷基和C3-C24杂芳基烷基，其中，杂芳基含有选自O、S和NR14的杂原子，其中，R14为氢或C1-C4烷基，
Sp1、Sp2、Sp3和Sp4为间隔基部分并且各自独立地选自：单键，或直链或支链的C1-C200亚烷基、C2-C200亚烯基、C2-C200亚炔基、C3-C200亚环烷基、C5-C200亚环烯基、C8-C200亚环炔基、C7-C200烷基亚芳基、C7-C200芳基亚烷基、C8-C200芳基亚烯基和C9-C200芳基亚炔基，其中，亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被选自O、S和NR14的杂原子取代或含有选自O、S和NR14的杂原子，
Z1和Z2各自独立地选自O、C(O)和N(R13)，
a各自独立地为0或1，
b各自独立地为0或1，
c为0或1，
d为0或1，
e为0或1，
f为0至150的整数，
g为0或1，并且
i为0或1。例如，Q2可以选自以下各式：
其中，U为O或NR15，其中，R15为氢、直链或支链的C1-C12烷基、C4-C12芳基或C4-C12杂芳基，并且更具体地，R15为氢或C1-C4烷基。
具体地，式(III)中的接头L2可以具有由下式(II-a)或(II-b)表示的结构：
其中，Q2为与三唑稠合的环辛烯基或与三唑稠合的杂环辛烯基，其中，环辛烯基或杂环辛烯基任选地还与各自独立地选自C3-C12环烷基、C3-C12芳基和C3-C12杂芳基的1或2个环稠合，并且任选地被羟基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、氨基、ONH2或羰基取代，其中，Q2通过包含在三唑中的氮原子与Ab连接；
Sp1、Sp2、Sp3和Sp4为间隔基部分并且各自独立地选自：单键，或直链或支链的C1-C200亚烷基、C2-C200亚烯基、C2-C200亚炔基、C3-C200亚环烷基、C5-C200亚环烯基、C8-C200亚环炔基、C7-C200烷基亚芳基、C7-C200芳基亚烷基、C8-C200芳基亚烯基和C9-C200芳基亚炔基，其中，亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被选自O、S和NR14的杂原子取代或含有选自O、S和NR14的杂原子；
Z1和Z2各自独立地选自O、C(O)和N(R13)；
a各自独立地为0或1；
b各自独立地为0或1；
c为0或1；
d为0或1；
e为0或1；
f为0至150的整数；
g为0或1；并且
i为0或1。
例如，Q2为与三唑稠合的环辛烯基，其中，环辛烯基还与C3-C6环烷基和/或C3-C6芳基稠合。
例如，为间隔基部分的Sp1、Sp2、Sp3和Sp4各自独立地选自：单键，或直链或支链的C1-C20亚烷基、C2-C20亚烯基、C2-C20亚炔基、C3-C20亚环烷基、C5-C20亚环烯基、C8-C20亚环炔基、C7-C20烷基亚芳基、C7-C20芳基亚烷基、C8-C20芳基亚烯基和C9-C20芳基亚炔基，其中，亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被选自O、S和NR14的1至5个杂原子取代或含有选自O、S和NR14的1至5个杂原子。
如本文所使用的，术语“烷基”是指通过从脂肪族或脂环族、饱和或不饱和(不饱和的、完全不饱和的)烃化合物的碳原子上去除氢原子而获得的一价部分，并且饱和烷基例如包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基等，饱和直链烷基例如包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基(戊基)、正己基、正庚基等，并且饱和支链烷基例如包括异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、新戊基等。
如本文所使用的，术语“亚烯基”是指具有任意长度并具有至少一个不饱和位点的碳原子的直链或支链一价烃基，即碳-碳双键，并且烯基可以任选地独立地被一个或多个下述取代基取代并且可以包括具有“顺式”和“反式”取向的基团。
如本文所使用的，术语“环烷基”是指通过从环烃化合物的脂环族的环原子上去除氢原子而获得的一价部分。环烷基的例子包括：饱和单环烃化合物，如环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷、环庚烷、甲基环丙烷、二甲基环丙烷、甲基环丁烷、二甲基环丁烷、甲基环戊烷、二甲基环戊烷和甲基环己烷；以及
不饱和单环烃化合物，如环丙烯、环丁烯、环戊烯、环己烯、甲基环丙烯、二甲基环丙烯、甲基环丁烯、二甲基环丁烯、甲基环戊烯、二甲基环戊烯和甲基环己烯。
如本文所使用的，术语“杂环基”是指通过从杂环化合物的环原子上去除氢原子而获得的一价部分。
本文所使用的前缀(例如，C1-12、C3-8等)是指环原子数或环原子数的范围，而不管该前缀后面的物质是属于碳原子还是杂原子。例如，本文所使用的术语“C3-6杂环基”是指具有3至6个环原子的杂环基。
单环杂环基的例子包括但不限于衍生自以下的那些：
N1：氮杂环丙烷、氮杂环丁烷、吡咯烷、吡咯啉、2H-或3H-吡咯、哌啶、二氢吡啶、四氢吡啶和氮杂
N2：咪唑烷、吡唑烷、咪唑啉、吡唑啉和哌嗪；
O1：环氧乙烷、氧杂环丁烷、氧杂环戊烷、呋喃(oxol)、氧杂环己烷、二氢吡喃、吡喃和氧杂环庚三烯；
O2：二氧戊环、二氧六环和二氧杂环庚烷；
O3：三氧杂环己烷；
N1O1：四氢恶唑、二氢恶唑、四氢异恶唑、二氢异恶唑、吗啉、四氢恶嗪、二氢恶嗪和恶嗪；
S1：环硫乙烷、环硫丙烷、四氢噻吩、硫杂环己烷和硫杂环庚烷；
N1S1：二氢噻唑、四氢噻唑和硫代吗啉；
N2O1：恶二嗪；
O1S1：氧杂硫醇和氧硫杂环己烷；以及
N1O1S1：恶噻嗪。
如本文所使用的，术语“芳基”是指通过从具有环原子的芳香族化合物的芳环原子上去除氢原子而获得的一价部分。“C6-C20芳基”是指具有6至20个环原子的部分，其通过从芳香族化合物的芳环原子上去除氢原子而获得，并且前缀(C6-C20)是指环原子数或环原子数的范围，而不管该式是关于碳原子还是杂原子，并且表示该式可以包括一个碳原子或至少一个杂原子。
如本文所使用的，术语“杂芳基”是指含有一个或多个杂原子的芳基，并且可以例如包括：吡啶、嘧啶、苯并噻吩、呋喃基、二氧杂环戊烷基、吡咯基、恶唑基、吡啶基、哒嗪基或嘧啶基，具体为具有衍生自苯并呋喃、异苯并呋喃、吲哚、异吲哚、吲哚嗪、二氢吲哚、异吲哚啉酮、嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)、苯并咪唑、吲唑、苯并恶唑、苯并异恶唑、苯并二恶唑、苯并呋喃、苯并三唑、苯并硫呋喃、苯并噻唑或苯并噻二唑的两个稠环的C9，具有衍生自色烯、异色烯、色满、异色满、苯并二氧六环、喹啉、异喹啉、喹嗪、苯并恶嗪、苯并二嗪、吡啶并吡啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、酞嗪、萘啶或蝶啶的两个稠环的C10，具有衍生自苯二氮的两个稠环的C11，具有衍生自咔唑、二苯并呋喃、二苯并噻吩、咔啉、呸啶或吡啶并吲哚的三个稠环的C13，以及具有衍生自吖啶、氧杂蒽、硫杂蒽、二苯并对二恶英(oxanthrene)、吩恶噻、吩嗪、吩恶嗪、吩噻嗪、噻蒽、菲啶、菲咯啉或吩嗪的三个稠环的C14。
如本文所使用的，术语“烷氧基”是指-OR[其中R为烷基]，并且其例子包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基等。
如本文所使用的，术语“亚烷基”是指含有双键的烃化合物，并且可以表示具有1至20个碳原子、1至16个碳原子、1至12个碳原子、1至8个碳原子或1至4个碳原子的亚烷基。亚烷基可以是直链、支链或环状的亚烷基，并且可以任选地被一个或多个取代基取代。
如本文所使用的，术语“药学上可接受的盐”可以是药学上可接受的游离酸形成的酸加成盐，并且游离酸可以是有机酸或无机酸。
有机酸包括但不限于柠檬酸、乙酸、乳酸、酒石酸、马来酸、富马酸、甲酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、苯甲酸、葡萄糖酸、甲磺酸、乙醇酸、琥珀酸、4-甲苯磺酸、谷氨酸和天冬氨酸。此外，无机酸包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸。
例如，当化合物为阴离子或具有可变成阴离子的官能团(例如，-COOH可转化为-COO-)时，它可以与合适的阳离子形成盐。合适的无机阳离子的例子包括但不限于碱金属离子(如Na+和K+)、碱土金属阳离子(如Ca2+和Mg2+)和其它阳离子(如Al3+)。合适的有机阳离子的例子包括但不限于铵离子(即，NH4+)和取代的铵离子(例如，NH3R+、NH2R2 +、NHR3 +、NR4 +)。
一些合适的取代铵离子的例子包括衍生自以下的那些：乙胺、二乙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、葡甲胺和氨丁三醇，以及氨基酸，如赖氨酸和精氨酸。季铵离子的典型例子为N(CH3)4+。
当化合物为阳离子或具有可变成阳离子的官能团(例如，-NH2可转化为-NH3+)时，它可以与合适的阴离子形成盐。合适的无机阴离子的例子包括但不限于衍生自以下无机酸的那些：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸和亚磷酸。
合适的有机阴离子的例子包括但不限于衍生自以下有机酸的那些：2-乙酰氧基苯甲酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、樟脑磺酸、肉桂酸、柠檬酸、乙二胺四乙酸、乙二磺酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、谷氨酸、乙醇酸、羟基马来酸、羟基萘羧酸、羟乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、甲基磺酸、己二烯二酸、油酸、草酸、棕榈酸、氨基磺酸、泛酸、苯乙酸、苯磺酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、对氨基苯磺酸、酒石酸、甲苯磺酸、戊酸等。合适的聚合有机阴离子的例子包括但不限于衍生自以下聚合酸的那些：鞣酸、羧甲基纤维素等。
如本文所使用的，术语“溶剂化物”是指根据本发明的化合物与溶剂分子之间的分子复合物，并且例如，溶剂化物包括但不限于与水、异丙醇、乙醇、甲醇、二甲亚砜、乙酸乙酯、乙酸、乙醇胺或其混合溶剂组合的根据本发明的化合物。
任选地，可以进一步包括氨基酸或肽，如二肽。具体地，可以包括二肽，如Val-Cit、Phe-Cit、Phe-Lys、Val-Lys、Val-Glu、Val-Asp、Val-Ser或Val-Gly。优选Val-Cit二肽接头。当包括单个氨基酸时，例如，可以包括Cit、Glu、Lys或Ser。包括此类氨基酸或肽的接头可被组织蛋白酶B剪切。
具体地，式(II)的化合物可以由下式表示：
/>
/>
根据本发明的式(II)的化合物可以是具有与抗体结合以形成抗体-药物偶联物的接头部分的接头-药物复合物。在一个实施例中，该接头可以包括间隔基。
根据本发明的式(II)的化合物的接头可以具有用于结合药物的马来酰亚胺、醛、氨氧基、2-PCA或环辛炔基，但不限于此。
例如，当根据本发明的式(II)的化合物的接头包括马来酰亚胺基团时，接头可以通过引入抗体的半胱氨酸氨基酸与抗体连接以形成根据本发明的抗体-药物偶联物。例如，半胱氨酸氨基酸可以被工程化并可用于药物偶联，但可以通过THIOMABTM抗体结合，THIOMABTM抗体为在不阻碍抗体折叠且不改变抗原结合或效应子功能的位置被半胱氨酸取代的抗体。它可以通过工程化的半胱氨酸硫醇基与细胞毒性药物偶联，从而能够获得具有统一化学计量(例如，在具有单个工程化的半胱氨酸的抗体中，每个抗体含有多达2种药物)的THIOMABTM抗体-药物偶联物(TDC)。
除了THIOMABTM抗体之外，含有半胱氨酸氨基酸的任何抗体都能够通过以下Michael反应结合至具有马来酰亚胺接头的式(II)的化合物以生成抗体-药物偶联物。
例如，工程化的半胱氨酸可以存在于用于药物连接的不同位置，如在抗体的轻链-Fab、重链-Fab或重链-Fc内的特定氨基酸位置。
重链中的半胱氨酸取代例如选自由根据Kabat编号的Y33C、G162C、V184C、I195C、S420C、Y432C、Q434C、R19C、E46C、T57C、Y59C、A60C、M100cC、W103C、G162C、I195C、S420C、H425C和N430C组成的组。轻链中的半胱氨酸取代例如选自由根据Kabat编号的Y55C、G64C、T85C、T180C、N430C、T31C、S52C、G64C、R66C、A193C和N430C组成的组，或可以任选地选自由LC-I106C、LC-R108C、LC-R142C和LC-K149C组成的组。
例如，当根据本发明的式(II)的化合物的接头包括醛基时，该接头可以通过以下抗体蛋白质的N端或赖氨酸氨基酸的NH2与该接头中的醛之间的还原性烷基化与抗体结合，以生成根据本发明的抗体-药物偶联物。
例如，当根据本发明的式(II)的化合物的接头包括氨氧基时，该接头可以通过以下抗体氨基酸中的酮基与该接头中的氨氧基之间的肟连接与抗体结合，以生成根据本发明的抗体-药物偶联物。
例如，当根据本发明的式(II)的化合物的接头包括2-吡啶甲醛(2-PCA)时，该接头可以通过以下抗体氨基酸中的NH2与该接头的2-PCA之间的N端咪唑烷酮形成与抗体结合，以生成根据本发明的抗体-药物偶联物。
例如，当根据本发明的式(II)的化合物的接头含有环辛炔基时，接头被修饰为具有叠氮基(-N3)，以生成根据本发明的抗体-药物偶联物。该接头可以通过以下抗体中叠氮基与该接头中的环辛炔基之间的点击反应与抗体结合。
上述接头的类型和通过将每个接头与抗体偶联形成抗体-药物偶联物的特异性反应是本领域已知的，并且本领域技术人员无需过度努力即可容易地实施。除了上述接头之外，本领域已知的并且本领域技术人员可以使用的各种接头可以用于生成本发明的抗体-药物偶联物，并且本领域技术人员也容易想到与这种接头结合的抗体-药物偶联物的结构。
本文使用的抗体识别由靶细胞(例如癌细胞)天然表达或过表达的抗原，并且能够作为靶向剂以高度特异性将药物部分递送至癌细胞。当抗体与抗原结合时，抗原-偶联物形成复合物、被内化并最终进入溶酶体，并且药物部分与抗体之间的接头被剪切以释放药物部分，从而提供细胞毒性效应。
例如，抗体可以结合以下抗原，但不限于此：
(1)BMPR1B(骨形态发生蛋白受体-IB型，GenBank登录号NM_001203)；
(2)E16(LAT1，SLC7A5，GenBank登录号NM_003486)；
(3)STEAP1(前列腺1的六跨膜上皮抗原，GenBank登录号NM_012449)；
(4)0772P(CA125，MUC16，GenBank登录号AF361486)；
(5)MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核细胞增强因子、间皮素，GenBank登录号NM_005823)；
(6)Napi3b(NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶质载体家族34(磷酸钠)成员2、II型钠依赖性磷酸盐转运蛋白3b，GenBank登录号NM_006424)；
(7)Sema 5b(FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、臂板蛋白(semaphorin)5b Hlog、sema结构域、7个血小板反应蛋白重复序列(1型和1假型)、跨膜结构域(TM)和一个短细胞质结构域，(Semaphorin)5B，GenBank登录号AB040878)；
(8)PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKEN cDNA 2700050C12、RIKENcDNA 2700050C12基因，GenBank登录号AY358628)；
(9)ETBR(内皮素B型受体，GenBank登录号AY275463)；
(10)MSG783(RNF124，假设蛋白FLJ20315，GenBank登录号NM_017763)；
(11)STEAP2(HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前列腺癌相关基因1、前列腺癌相关蛋白1、前列腺6-跨膜上皮抗原2、6-跨膜前列腺蛋白，GenBank登录号AF455138)；
(12)TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬时受体电位阳离子通道，亚家族M成员4，GenBank登录号NM_017636)；
(13)CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎癌衍生生长因子，GenBank登录号NP_003203或NM_003212)；
(14)CD21(CR2(补体受体2)、C3DR(C3d/Epstein Barr病毒受体)或Hs.73792GenBank登录号M26004)；
(15)CD79b(CD79B、CD79β、IGb(免疫球蛋白相关蛋白β)、B29，GenBank登录号NM_000626)；
(16)FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(含SH2结构域的磷酸酶锚定蛋白1a)、SPAP1B、SPAP1C，GenBank登录号NM_030764)；
(17)HER2(GenBank登录号M11730)；
(18)选自EGFR、HER3和HER4的ErbB受体；
(19)NCA(GenBank登录号M18728)；
(20)MDP(GenBank登录号BC017023)；
(21)IL20Rα(GenBank登录号AF184971)；
(22)短蛋白聚糖(GenBank登录号AF229053)；
(23)EphB2R(GenBank登录号NM_004442)；
(24)ASLG659(GenBank登录号AX092328)；
(25)PSCA(GenBank登录号AJ297436)；
(26)GEDA(GenBank登录号AY260763)；
(27)BAFF-R(B细胞激活因子受体，BLyS受体3，BR3，NP_443177.1)；
(28)CD22(B细胞受体CD22-B同种型，NP-001762.1)；
(29)CD79a(CD79A、CD79α、免疫球蛋白相关蛋白α，它们为与Igβ(CD79B)共价相互作用的B细胞特异性蛋白，在表面上与IgM形成复合物，并传输参与B细胞分化的信号，GenBank登录号NP_001774.1)；
(30)CXCR5(为一种由CXCL13趋化因子激活的G蛋白偶联受体的伯基特(Burkitt)淋巴瘤受体1，被认为作用于淋巴细胞迁移和体液防御，参与HIV-2感染，并且与AIDS、淋巴瘤、骨髓瘤和白血病的发作有关，GenBank登录号NP_001707.1)；
(31)HLA-DOB(MHC II类分子(Ia抗原)的β亚基，其与肽结合并递送给CD4+T淋巴细胞，GenBank登录号NP_002111.1)；
(32)P2X5(为由细胞外ATP门控的离子通道的嘌呤受体P2X配体门控的离子通道5，可以参与突触传递和神经形成，其缺乏可以导致特发性逼尿肌不稳定的病理生理学。GenBank登录号NP_002552.2)；
(33)CD72(B细胞分化抗原CD72、Lyb-2，GenBank登录号NP_001773.1)；
(34)LY64(为富含亮氨酸重复序列(LRR)家族的I型膜蛋白质的淋巴细胞抗原64(RP105)，调节B细胞的活化和凋亡，并且其功能丧失与系统性红斑狼疮患者的增加的疾病活动度有关，GenBank登录号NP_005573.1)；
(35)FcRH1(为包含C2型Ig样和ITAM结构域的免疫球蛋白Fc结构域的推定受体的Fc受体同源蛋白1，可以参与B淋巴细胞分化，GenBank登录号NP_443170.1)；
(36)IRTA2(免疫球蛋白超家族受体易位相关蛋白2，其为一种推定免疫受体，该受体可以作用于B细胞发生和淋巴瘤发生，并且易位导致的基因失调控发生在几种B细胞恶性肿瘤中，GenBank登录号NP_112571.1)；以及
(37)TENB2(与生长因子的EGF/调蛋白家族和卵泡抑素相关的推定跨膜蛋白多糖，GenBank登录号AF179274)；
(38)MAGE-C1/CT7(睾丸癌中过表达的蛋白质)；
(39)雄激素受体、PTEN、人激肽释放酶相关的肽酶3(前列腺癌中过表达的蛋白质)；
(40)CD20；
(41)CD30；
(42)CD33；
(43)CD52；
(44)EpCam；
(45)CEA；
(46)gpA33；
(47)黏蛋白；
(48)TAG-72；
(49)碳酸酐酶IX；
(50)PSMA；
(51)叶酸受体(其是由FOLR基因表达的蛋白质的家族，对叶酸具有高亲和力，并且将5-甲基四氢叶酸转运至细胞内)；
(52)神经节苷脂(GD2、GD3、GM2)；
(53)糖水合物Lewis-Y；
(54)VEGF；
(55)VEGFR；
(56)aVb3；
(57)a5b1；
(58)ERB3；
(59)c-MET；
(60)EphA3；
(61)TRAIL-R1和TRAIL-R2；
(62)RANKL；
(63)FAP；
(64)腱生蛋白；
(65)ROR1；
(66)BCMA；或
(67)CLL1。
例如，抗体可以选自由抗BCMA抗体、抗ROR1抗体、抗Her2抗体、抗NaPi2b抗体和抗CLL1抗体组成的组，但不限于此。在一个具体的例子中，以下抗体被用作用于ADC构建的抗BCMA抗体和抗ROR1抗体。
[表1]
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曲妥珠单抗的已知序列用于抗Her2抗体，10H1抗体的已知序列(10H1 VL:SEQ IDNO:17，10H1 VH:SEQ ID NO:18)用于抗NaPi2b抗体，并且6E7(N54A)抗体的已知序列(6E7(N54A)VL:SEQ ID NO:18，6E7(N54A)VH:SEQ ID NO:19)用于抗CLL1抗体。
如本文所使用的，术语“抗体”是指与特定抗原特异性结合的多肽或蛋白质。抗体不仅包括与抗原特异性结合的完全抗体，还包括抗体的抗原结合片段。
术语“完全抗体”是指具有两条全长轻链和两条全长重链的结构，其中，每条轻链通过二硫键与相应的重链连接。重链恒定区具有伽马(γ)、谬(μ)、阿尔法(α)、德尔塔(δ)和伊普西龙(ε)类型，并且被细分为伽马1(γ1)、伽马2(γ2)、伽马3(γ3)、伽马4(γ4)、阿尔法1(α1)和阿尔法2(α2)。轻链恒定区具有卡帕(κ)和兰布达(λ)类型。
抗体的抗原结合片段或抗体片段为具有抗原结合能力的片段，且包括Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv等。在抗体片段中，Fab是指包括重链和轻链各自的可变区、轻链的恒定区和重链的第一恒定结构域(CH1)的结构，其中每个都具有一个抗原结合位点。Fab'与Fab的不同之处在于它进一步包括铰链区，该铰链区在重链的CH1结构域的C端包括至少一个半胱氨酸残基。F(ab')2通过Fab'的铰链区中的半胱氨酸残基之间的二硫键产生。Fv为仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段。双链Fv为这样的片段，其中，重链的可变区和轻链的可变区通过非共价键连接；而单链Fv(scFv)为这样的片段，其中，重链的可变区和轻链的可变区通常经由其间的肽接头通过共价键连接，或直接在C端连接，形成二聚体状结构，如双链Fv。此类抗体片段可以使用蛋白酶获得(例如，Fab可以通过用木瓜蛋白酶限制性剪切完全抗体得到，而F(ab')2片段可以通过用胃蛋白酶剪切完全抗体得到)，也可使用基因重组技术制备。
重链恒定区可以选自伽马(γ)、谬(μ)、阿尔法(α)、德尔塔(δ)和伊普西龙(ε)同种型。例如，恒定区可以是γ1(IgG1)、γ3(IgG3)或γ4(IgG4)。轻链恒定区可以是κ或λ。
如本文所使用的，术语“重链”包括全长重链及其片段，该全长重链包括含有具有足以将特异性赋予抗原的可变区序列的氨基酸序列的可变结构域(VH)、三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。如本文所使用的，术语“轻链”包括全长轻链及其片段，该全长轻链包括含有具有足以将特异性赋予抗原的可变区序列的氨基酸序列的可变结构域(VL)、恒定结构域(CL)。
本发明的抗体包括但不限于单克隆抗体、人源抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFV)、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键Fv(sdFV)、此类抗体的表位结合片段等。
如本文所使用的，术语“单克隆抗体”是指从基本同质的抗体群体中获得的相同抗体，即构成该群体的每个抗体，排除可以以微不足道的量存在的可能天然发生的突变。单克隆抗体为高度特异性的，并且因此针对单个抗原位点进行诱导。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆的)抗体制剂不同，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。
术语“表位”是指抗体能够特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常包括一组化学活性的表面分子，如氨基酸或糖侧链，并且通常不仅具有特定的三维结构特征，而且具有特定的电荷特征。三维表位与非三维表位的区别在于，在变性溶剂的存在下，与前者的结合被破坏，而与后者的结合未被破坏。
“人源化”形式的非人类(例如鼠)抗体为一种嵌合抗体，其含有源自非人类免疫球蛋白的最少序列。在大多数情况下，人源化抗体为一种人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区的残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人类物种(供体抗体)的高变区的残基代替，非人类物种如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物。
如本文所使用的，术语“人源抗体”是指源自人类免疫球蛋白的分子，其中包括互补决定区和结构区的构成抗体的所有氨基酸序列均由人类免疫球蛋白组成。
重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而剩余的链包括与源自另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源的“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，以及表现出所需的生物活性的此类抗体的片段。
如本文所使用的，术语“抗体可变结构域”是指抗体分子的轻链区和重链区，包括互补决定区(CDR；即CDR1、CDR2和CDR3)和框架区(FR)的氨基酸序列。VH是指重链的可变结构域。VL是指轻链的可变结构域。
术语“互补决定区”(CDR，即CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变结构域的氨基酸残基，其为抗原结合所必需的。每个可变结构域通常具有三个CDR区，其确定为CDR1、CDR2和CDR3。
术语“框架区”(FR)是指CDR残基以外的可变结构域残基。每个可变结构域通常具有四个FR，其确定为FR1、FR2、FR3和FR4。
本发明的抗体或抗原结合片段可以包括本文提及的抗体的序列以及其生物学等效物。例如，可以对抗体的氨基酸序列进行另外的改变，以进一步提高该抗体的结合亲和力和/或其它生物学属性。例如，此类改变包括该抗体的氨基酸序列残基的缺失、插入和/或替换。此类氨基酸改变基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，如其疏水性、亲水性、电荷和大小。通过分析氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型可以看出，精氨酸、赖氨酸和组氨酸都是带正电荷的残基，并且丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸具有相似的大小，并且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有相似的形状。因此，基于这些考虑，精氨酸、赖氨酸和组氨酸被认为是生物功能的等效物，丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸被认为是生物功能的等效物，并且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸被认为是生物功能的等效物。
考虑到具有生物等效活性的变异，根据本发明的抗体或编码其的核苷酸分子被解释为包括与以序列号所示的序列具有基本同一性的序列。术语“基本同一性”是指当将本发明的序列与任何其它序列进行比对以尽可能与其对应并使用本领域常用的算法分析比对的序列的时候，序列具有至少90％的同源性，最优选至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。用于序列比较的比对方法为本领域公知的。NCBI基本局部序列比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)可通过NCBI访问，并且可以与互联网上的诸如BLASTP、BLASTM、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX的序列分析程序结合使用。BLAST可在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/获得。使用该程序比较序列同源性的方法可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html上找到。
基于此，根据本发明的抗体或其抗原结合片段能够与本文公开的序列或其全部具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的同源性。同源性可以通过本领域已知的方法通过序列比较和/或比对来确定。例如，根据本发明的核酸或蛋白质的序列同源性百分比可以使用序列比较算法(即BLAST或BLAST 2.0)、手动比对或目测来确定。
在一些情况下，通过分离编码根据本发明的抗体或其抗原结合片段的核酸，能够通过重组产生抗体或其抗原结合片段。核酸被分离并插入到可复制的载体中，然后进一步克隆(DNA的扩增)或进一步表达。基于此，在另一方面，本发明涉及包括该核酸的载体。
术语“核酸”旨在包括DNA(gDNA和cDNA)与RNA分子，以及核苷酸(其为核酸的基本构成单元)包括天然衍生的核苷酸及其类似物，其中糖或碱基部分被修饰。编码本发明的重链可变区和轻链可变区的核酸的序列可以改变。此类改变包括核苷酸的添加、缺失或非保守或保守替换。
使用常规程序(例如，使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的DNA的寡核苷酸探针)可以容易地分离或合成编码抗体的DNA。可以获得多种载体。载体组分一般包括但不限于以下组分中的一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
如本文所使用的，术语“载体”是指用于在宿主细胞中表达靶基因的工具，并且包括质粒载体、粘粒载体和病毒载体，如噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体。载体中编码抗体的核酸与启动子可操作地连接。
术语“可操作地连接”是指一个核酸表达调控序列(例如，一系列启动子、信号序列或转录调节因子的结合位点)和另一个核酸序列之间的功能性连接，并且使得调控序列能够调控其它核酸序列的转录和/或翻译。
当原核细胞用作宿主时，它通常包括能够进行转录的有效启动子(如tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、lpp启动子、pLλ启动子、pRλ启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子或T7启动子)、用于起始翻译的核糖体结合位点和转录/翻译终止序列。此外，例如，当真核细胞用作宿主时，它包括源自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人血红蛋白启动子或人肌肉肌酸启动子)，或源自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、HSV tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV LTR启动子、莫洛尼病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)启动子或劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子)，并且通常具有聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。
任选地，载体可以与另一序列融合以促进由此表达的抗体的纯化。例如，与其融合的序列可以包括谷胱甘肽S-转移酶(Pharmacia，USA)、麦芽糖结合蛋白(NEB，USA)、FLAG(IBI，USA)、6×His(六聚组氨酸；Qiagen，USA)等。
载体包括本领域常用的抗生素抗性基因作为选择性标记，并且其例子包括对氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素和四环素产生抗性的基因。
在另一方面，本发明涉及用上述载体转化的细胞。用于产生本发明的抗体的细胞可以是原核细胞、酵母或更高等的真核细胞，但不限于此。
可以使用原核宿主细胞(如大肠杆菌(Escherichia coli))、芽孢杆菌属(Bacillus)的菌株(如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis))、链霉菌(Streptomyces spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)(例如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)和葡萄球菌(Staphylococcus spp.)(例如肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus))。
对动物细胞的兴趣最大，有用的宿主细胞系的例子包括但不限于COS-7、BHK、CHO、CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL 3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC 5、FS4、3T3、RIN、A549、PC12、K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20S和HT1080。
细胞可以在各种培养基中培养。任何可商购的培养基都可以用作培养基而没有限制。本领域技术人员所已知的所有其他必需补充剂可以以合适的浓度包括在内。培养条件，如温度和pH，是通常用于选择用于表达的宿主细胞的那些，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。
例如，抗体或其抗原结合片段的回收可以通过离心或超滤来进行以从所得产物中去除杂质并使用例如亲和色谱法纯化所得产物。可以使用其它额外的纯化技术，如阴离子或阳离子交换层析法、疏水作用色谱法和羟基磷灰石色谱法。
在另一方面，本发明涉及一种用于预防或治疗增殖性疾病(例如，肿瘤或癌症)的组合物，或涉及一种含有抗体-药物偶联物作为活性成分的药物组合物。
在另一方面，本发明涉及一种用于预防或治疗增殖性疾病(例如，肿瘤或癌症)的药物组合物，含有：(a)药学有效量的抗体-药物偶联物和(b)药学上可接受的载体。在另一方面，本发明涉及一种预防或治疗肿瘤的方法，包括将根据本发明的抗体-药物偶联物施用于患有增殖性疾病(例如肿瘤或癌症)的患者。在另一方面，本发明涉及该抗体-药物偶联物用于预防或治疗增殖性疾病(例如肿瘤或癌症)的用途。
关于此类肿瘤或癌症，能够被治疗的肿瘤或癌症的非限制性例子包括但不限于肾癌、胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、结肠癌、间皮瘤、胃癌、肺癌、前列腺癌、腺癌、肝癌、乳腺癌等。该肿瘤或癌症可以包括难治性或复发性癌症。
该药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体，并且该药学上可接受的载体可以包括常用于制备药物的那些，例如，选自由乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等组成的组中的一种或多种，但不限于此。该药物组合物还可以进一步包含选自由稀释剂、赋形剂、润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂组成的组中的一种或多种。
该药物组合物可以口服或肠胃外给药。肠胃外给药可以是静脉注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、内皮给药、局部给药、鼻内给药、肺部给药、直肠给药等。在口服给药时，蛋白质或肽被消化，因此口服组合物应当用活性药物包衣或配制以防止其在胃中降解。此外，可以使用能够将活性物质递送至靶细胞的任何装置来施用该药物组合物。
根据本发明的药物组合物的有效剂量可以根据因素而变化，该因素如配制方法、给药方法，以及患者的年龄、体重、性别、病理情况、饮食、给药时间、给药间隔、给药途径、排泄率和反应性。例如，该药物组合物的日剂量可以在0.001mg/kg至1,000mg/kg、0.01mg/kg至100mg/kg、0.1mg/kg至50mg/kg或0.1mg/kg至20mg/kg的范围内，但不限于此。制剂可以制备为含有该药物组合物的日剂量的单位剂量形式，或者制剂的日剂量可以分为多剂量或可以整合到多剂量容器中。
该药物组合物可以配制成油或水介质中的溶液、混悬液或乳液的形式，或者可以配制成浸膏剂、粉剂、栓剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂的形式。该组合物可以进一步含有用于配制的分散剂或稳定剂。
实施例
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，对本领域技术人员来说显而易见的是，提供这些实施例仅用于说明本发明，并且不应当被解释为限制本发明的范围。
制备实施例：药物合成
在以下制备实施例中，使用Bruker Avance在400MHz记录所有1H NMR谱。
使用以ESI(+)电离模式运行的Shimadzu LCMS2011四极杆质谱仪(柱：Shim-packXR-ODS(3.0*30mm，2.2m))测量LCMS。流速：0.8mL/min，采集时间：3min或1.5min，波长：UV220，炉温：50℃。
制备型HPLC在以下条件下进行：柱：Fuji C18(300×25)、YMC(250×20)；波长：220nm；流动相：CH3CN(0.05％NH3H2O或0.225％FA)；B水(0.1％NH3·H2O或0.225％FA)；流速：30mL/min；进样量：3mL；运行时间：20分钟；平衡：3分钟
制备实施例1：PD001的合成
1)化合物1的制备
将化合物1A(700mg，1.65mmol)和10％干燥的Pd/C(140mg)在MeOH(7mL)和EtOAc(7mL)中的混合物在真空中脱气并用H2净化多次。将混合物在H2(气球，15psi)中于20℃搅拌4小时。TLC显示形成了一个具有更大极性的新斑点。将混合物通过硅藻土过滤，并且将滤液浓缩并干燥，生成化合物1(549mg，收率99.6％)，其为白色固体。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.56(9H，s)，3.43(1H，t，J＝10.4Hz)，3.85-4.01(2H，m)，4.07-4.16(1H，m)，4.19-4.30(1H，m)，6.24(1H，brs)，7.34(1H，t，J＝7.6Hz)，7.50(1H，t，J＝7.6Hz)，7.59-7.80(2H，m)，8.17(1H，d，J＝8.0Hz)。
2)化合物5-2的制备
在20℃将4A MS(2g)加入到无水DCM(10mL)中化合物1(300mg，0.899mmol)的搅拌溶液中。接着，将混合物在20℃搅拌30分钟。添加化合物5-1(576mg，1.17mmol)之后，将所得混合物冷却至-10℃并向其中滴加在DCM(5mL)中的BF3·Et2O(64mg，0.45mmol)。然后，将混合物于-10℃搅拌1小时。然后将混合物于0℃加热2小时。TLC显示仍有微量起始物料残留，并且形成了一个具有大极性的新的主斑点。滤掉混合物，并将滤液用NaHCO3饱和水溶液(20mL)淬灭。分离混合的有机层。将剩余的水相用DCM(15mL*2)萃取。合并的有机层用Na2SO4干燥，浓缩并干燥。将残余物与批次2混合并使用PE：EtOAc/5：1作为洗脱剂在硅胶柱中进行纯化。
在20℃将4A MS(1.5g)进一步加入到DCM(10mL)中化合物1(249mg，0.746mmol)的搅拌溶液中。接着，将混合物在20℃搅拌30分钟。添加化合物5-1(478mg，0.970mmol)之后，将混合物冷却至-10℃并向其中滴加在DCM(5mL)中的BF3·Et2O(53mg，0.373mmol)。然后，将混合物于-10℃搅拌1小时。然后将混合物于0℃加热2小时。TLC显示仍有微量起始物料残留，并且形成了一个具有大极性的新的主斑点。滤掉混合物，并将滤液用NaHCO3饱和水溶液(20mL)淬灭。分离有机层。将剩余的水相用DCM(15mL*2)萃取。合并的有机层用Na2SO4干燥，浓缩并干燥。将残余物与批次1混合并使用PE：EtOAc/5：1作为洗脱剂在硅胶柱中进行纯化，生成化合物5-2(1.19g，粗品)，其为白色固体。回收35mg化合物1的起始物料，其为白色固体。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.61(9H，s，重叠水信号)，2.02(3H，s)，2.06(3H，s，重叠EtOAc信号)，2.11(3H，s)，2.24(3H，s)，3.45(1H，t，J＝10.8Hz)，3.91-4.05(2H，m)，4.10-4.19(1H，m，重叠EtOAc信号)，4.20-4.43(4H，m)，5.20(1H，dd，J＝10.4，3.6Hz)，5.37(1H，d，J＝8.0Hz)，5.53(1H，d，J＝3.2Hz)，5.72(1H，dd，J＝10.4，7.6Hz)，7.34-7.40(1H，m)，7.49-7.57(1H，m)，7.66(1H，d，J＝8.0Hz)，7.68(1H，brs)，8.13(1H，d，J＝8.0Hz)。
3)化合物5-3的制备
在0℃将BF3·Et2O(890mg，6.27mmol)滴加到无水DCM(15mL)中化合物5-2(1.19g，粗品)的搅拌溶液中。接着，使混合物升温至20℃并搅拌2小时。TLC显示反应完全。将混合物用NaHCO3饱和水溶液(15mL)淬灭。分离有机层。将剩余的水相用DCM(15mL*2)萃取。合并的有机层用Na2SO4干燥，浓缩并进一步干燥。使用PE：EtOAc/2：1至1：1作为洗脱剂将残余物在硅胶柱中进行纯化，得到脱Boc中间体(782mg，两步收率84％)，其为白色固体。回收28mg的化合物5-2。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.06(3H，s)，2.07(3H，s，重叠EtOAc信号)，2.11(3H，s)，2.24(3H，s)，3.52(1H，t，J＝10.8Hz)，3.77-3.87(2H，m)，3.88-3.94(1H，m)，3.96-4.05(1H，m)，4.12-4.25(3H，m，重叠EtOAc信号)，4.31(1H，dd，J＝10.8，6.8Hz)，5.11-5.20(2H，m)，5.52(1H，dd，J＝3.2，0.8Hz)，5.70(1H，dd，J＝10.4，8.0Hz)，6.66(1H，s)，7.20-7.20(1H，m，重叠CDCl3信号)，7.45-7.52(1H，m)，7.60(1H，dd，J＝8.4，1.2Hz)，8.00(1H，d，J＝8.0Hz)。
在20℃将EDCI(219mg，1.14mmol)加入到无水DMF(6mL)中脱Boc中间体(643mg，1.14mmol)和化合物1-7(190mg，0.380mmol)的混合物中。然后，将混合物在20℃搅拌16小时。TLC显示起始物料仍然存在并且观察到了所需产物。在减压下去除溶剂。将混合物用水(15mL)淬灭并用EtOAc(15mL*3)萃取。用水(20mL)洗涤合并的有机层，经Na2SO4浓缩并干燥。使用PE：EtOAc/2：1至1：2作为洗脱剂将残余物在硅胶柱中进行纯化，得到化合物5-3(448mg，收率：74％)，其为黄色固体。此外，回收163mg的脱Boc中间体(LCMS：纯度75％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.01-2.20(18H，m，重叠EtOAc信号)，2.23(6H，s)，3.43-3.57(2H，m)，3.69-3.82(2H，m)，3.95-4.05(2H，m)，4.06-4.10(1H，m，重叠EtOAc信号)，4.19-4.65(15H，m)，5.12-5.27(2H，m)，5.32-5.44(2H，m，重叠CH2Cl2信号)，5.50-5.62(2H，m)，5.70-5.82(2H，m)，6.92-7.13(2H，m)，7.19-7.39(7H，m，重叠CDCl3信号)，7.40-7.50(2H，m)，7.51-7.64(4H，m)，7.65-7.76(5H，m)，7.84(1H，d，J＝15.2Hz)，8.13-8.27(3H，m)，8.47(2H，d，J＝18.4Hz)。
4)化合物5-4的制备
将化合物5-3(250mg，0.157mmol)和哌啶(134mg，1.57mmol)在无水DCM(4mL)中的溶液于20℃搅拌16小时。TLC显示反应进行到完全。在减压下去除溶剂。使用DCM：MeOH/50：1至25：1作为洗脱剂将杂质在硅胶柱中进行纯化，得到化合物5-4(176mg，收率：82％)，其为黄色固体。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.01-2.24(24H，m)，3.35-3.59(4H，m)，3.99-4.62(16H，m)，5.20-5.30(2H，m)，5.37-5.47(2H，m)，5.56(2H，d，J＝1.2Hz)，5.75(2H，dd，J＝8.0，2.0Hz)，6.94(1H，d，J＝15.6Hz)，7.10-7.20(2H，m)，7.26-7.34(1H，m，重叠CDCl3信号)，7.36-7.74(7H，m)，7.80(1H，d，J＝15.2Hz)，8.05-8.20(3H，m)，8.44(2H，d，J＝7.6Hz)。
5)化合物5-5的制备
在0℃，将NaOMe(8.0mg，0.15mmol)的MeOH(0.5mL)溶液滴加到化合物5-4(100mg，0.073mmol)在MeOH(2mL)和DCM(2mL)中的溶液中。然后，将混合物在0℃搅拌2小时。粗LCMS显示观察到了所需产物MS。将混合物用AcOH(9.0mg，0.15mmol)淬灭。接着，将混合物浓缩并在25℃干燥，得到粗化合物5-5(79mg)，其为黄色固体。接着，79mg粗化合物5-5直接用于下一步。
6)PD001的制备
将化合物5-5(79mg，粗品)、化合物1-3(24mg，0.076mmol)和DIEA(20mg，0.15mmol)在DMF(2mL)中的混合物在20℃搅拌16小时。粗LCMS显示观察到了所需产物MS。通过制备型HPLC(0.05％NH3·H2O)纯化溶剂。在减压下去除大部分MeCN。将剩余的水相冻干，得到纯的PD001(20mg，两步收率：22％)，其为黄色固体。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.15-1.27(2H，m)，1.42-1.60(4H，m)，2.13(2H，t，J＝7.6Hz)，3.48-3.74(10H，m)，3.75-3.88(4H，m)，3.89-4.08(4H，m)，4.24-4.40(4H，m)，4.48-4.74(8H，m)，4.92-5.05(4H，m)，5.38(2H，d，J＝5.6Hz)，6.96(2H，s)，7.29-7.45(4H，m)，7.48(1H，d，J＝8.0Hz)，7.52-7.63(2H，m)，7.66(1H，s)，7.90(1H，d，J＝15.6Hz)，7.86-8.01(4H，m)，8.20-8.25(1H，m)，8.33(2H，dd，J＝8.4，4.8Hz)，8.38-8.48(2H，m)。
7)化合物1-2的制备
将呋喃-2，5-二酮(374mg，3.81mmol)加入到在AcOH(5mL)中6-氨基己酸(500mg,3.81mmol)的溶液中。将混合物于25℃在N2下搅拌2小时。接着，将混合物于110℃在N2下搅拌16小时。TLC显示形成了另一个斑点。真空浓缩反应混合物。向残余物中加水(10mL)，所得溶液用EtOAc(20mL*3)萃取，并且将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，然后真空浓缩。使用石油醚：乙酸乙酯/1：1至1：2将残余物通过硅胶色谱纯化，生成化合物1-2(525mg，收率：65％)，其为白色固体。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.11-1.29(2H，m)，1.40-1.57(4H，m)，2.18(2H，t，J＝7.2Hz)，3.36-3.41(2H，m，与水信号重叠)，6.93-7.07(2H，s)，12.00(1H，brs)。
8)化合物1-3的制备
将化合物1-2(525mg，2.49mmol)、1-羟基-2，5-吡咯烷二酮(300mg，2.61mmol)和DIC(336mg，2.66mmol)在DCM(5mL)中的溶液于25℃在N2下搅拌16小时。TLC显示形成了另一个斑点。向反应混合物中添加水(10mL)，并且所得的溶液用EtOAc萃取(15mL*4)。将合并的有机相用无水Na2SO4干燥，过滤，然后真空浓缩。使用石油醚：乙酸乙酯/2：1至1：1至1：2作为洗脱剂将残余物通过硅胶色谱纯化，生成不纯的化合物1-3(643mg)，其为白色固体。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.32-1.45(2H，m)，1.61-1.65(2H，m)，1.73-1.81(2H，m)，2.59(2H，t，J＝7.2Hz)，2.82(4H，s)，3.52(2H，t，J＝7.2Hz)，6.68(2H，m)。
9)化合物1-5的制备
将5-溴-2-碘-苯酚(1.0g，3.35mmol)、丙烯酸叔丁酯(1.50g，11.7mmol)、Pd(OAc)2(15mg，0.67mmol)、三(邻甲基苯基)膦化合物(79mg，0.26mmol)与Et3N(1.02g，10.0mmol)在DMF(10mL)中的溶液于110℃在N2下搅拌16小时。TLC显示形成了所需产物。将反应混合物在60mL水中淬灭，并且所得的溶液用EtOAc萃取(40mL*4)。用水(100mL)洗涤合并的有机层，用无水Na2SO4干燥，过滤，然后真空浓缩。使用石油醚：乙酸乙酯/24：1至20：1至6：1作为洗脱剂将残余物在CombiFlash装置中纯化，生成化合物1-5(963mg，收率：83％)，其为黄色固体。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.48(18H，s)，6.41(1H，d，J＝15.6Hz)，6.56(1H，d，J＝16.0Hz)，7.07(1H，s)，7.19(1H，d，J＝8.0Hz)，7.45(1H，d，J＝15.6Hz)，7.63(1H，d，J＝8.0Hz)，7.75(1H，d，J＝16.4Hz)，10.42(1H，brs)。
10)化合物1-6的制备
将化合物1-5(2.00g，5.77mmol)和化合物1-5A(2.45g，8.66mmol)在THF(20mL)中的溶液于0℃在N2下搅拌30分钟。当透明溶液转化为白色乳液时，在0℃向混合物中加入Ph3P(2.57g，9.81mmol)并在N2下搅拌10分钟。接着，在0℃将DIAD(1.75g，8.66mmol)滴加到混合物中(白色乳液转化为橙色澄清溶液)。然后，使所得的溶液在N2下升温至25℃持续1小时。TLC显示形成了所需产物。将1N的HCl水溶液(60mL)加入反应混合物中，并且所得溶液用EtOAc萃取(50mL*3)。合并的有机层用盐水(80mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，然后真空浓缩。使用石油醚，然后使用石油醚：乙酸乙酯/7：1作为洗脱剂将残余物在CombiFlash装置中纯化，生成不纯的化合物1-6(3.67g)，其为无色油。
11)化合物1-7的制备
将TFA(19.3g，169mmol)加入至化合物1-6(3.67g，不纯)在DCM(80mL)中的溶液中。将混合物在25℃搅拌16小时而不进行监测。真空浓缩反应混合物。将残余物用甲基叔丁基醚(60mL)研制，然后过滤。将滤饼用甲基叔丁基醚洗涤(20mL*3)。将滤饼真空干燥得到化合物1-7(2.12g，2步收率：74％)，其为白色固体。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.43-3.46(2H，m)，4.13-4.27(3H，m)，4.31-4.43(2H，m)，6.59(1H，d，J＝16.2Hz)，6.69(1H，d，J＝16.2Hz)，7.29-7.35(3H，m)，7.36-7.48(3H，m)，7.55-7.65(2H，m)，7.66-7.77(3H，m)，7.80-7.92(3H，m)，12.40(2H，brs)。
制备实施例2：PD005的合成
1)化合物5-5的制备
在0℃，将NaOMe(4.0mg，0.073mmol)的MeOH(0.1mL)溶液滴加到化合物5-4(50mg，0.036mmol)在MeOH(1mL)和DCM(1mL)中的溶液中。接着，将混合物在0℃搅拌3.5小时。粗LC-MS显示在保留时间0.828(MS计算：1031；发现MS：1034[M+3H]+)处的产物的纯度为93％。将混合物用AcOH(4.6mg)淬灭。然后，将混合物在25℃浓缩至干，生成粗化合物5-5(41mg)，其为黄色固体。41mg的粗化合物5-5直接用于下一步。
2)PD005的制备
将化合物5-5(41mg，粗品)、化合物5-6(11mg，粗品)和DIPEA(10mg，0.079mmol)在DMF(1mL)中的混合物在15℃搅拌16小时。粗LC-MS显示在保留时间0.845(MS计算：1143；发现MS：1149[M+6H]+)处的产物的纯度为89％。将反应混合物通过制备型HPLC(0.225％FA)纯化。在减压下去除大部分MeCN。将剩余的水相冻干，生成粗PD005(11mg)，其为黄色固体。此外，HNMR显示观察到了微量的醛信号质子。
3)化合物5-5A的制备
将HOBt(9.5mg，0.070mmol)、EDCI(13mg，0.070mmol)和DIEA(9.1mg，0.070mmol)加入到化合物5-6b(8.4mg，0.064mmol)的DCM(2mL)溶液中。接着，将混合物在15℃搅拌10分钟。将化合物5-4(80mg，0.058mmol)加入到反应混合物中。将制备的混合物在15℃搅拌2小时。TLC显示起始原料被完全消耗。形成了一个新斑点。将混合物用水(10mL)淬灭并用DCM萃取(6mL*3)。将合并的有机层用Na2SO4干燥并浓缩至干。使用EtOAc作为洗脱剂将残留物在硅胶柱中进行纯化，得到化合物5-5A(81mg，收率：94％)，其为黄色固体。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.58-1.75(4H，m)，1.95-2.05(12H，m)，2.06-2.16(12H，m)，2.24-2.31(2H，m)，2.40-2.49(2H，m)，3.42-3.55(3H，m)，3.69-3.79(2H，m)，3.92-4.05(2H，m)，4.10-4.38(9H，m，重叠EtOAc信号)，4.42-4.64(4H，m)，5.12-5.26(2H，m)，5.30-5.42(2H，m)，5.50-5.60(2H，m)，5.67-5.77(2H，m)，6.91-7.06(2H，m)，7.13-7.22(2H，m，重叠CDCl3信号)，7.35-7.48(3H，m)，7.50-7.60(2H，m)，7.65-7.76(3H，m)，7.77-7.84(1H，m)，8.09-8.19(2H，m)，8.20-8.30(1H，m)，8.37-8.50(2H，m)，9.71(1H，s)。
4)PD005的制备
在0℃将NaOMe(1.8mg，0.034mmol)的MeOH(0.1mL)溶液滴加到化合物5-5A(25mg，0.017mmol)在MeOH(0.5mL)和DCM(0.5mL)中的搅拌溶液中。然后，将混合物在0℃搅拌2小时。粗LC-MS显示在保留时间0.834(MS计算：1143；发现MS：1144[M+H]+)处的产物的纯度为98％。接着，将混合物用水(5mL)淬灭并于15℃减压去除溶剂。通过过滤收集产生的黄色沉淀。将滤饼用水(10mL)稀释并冻干，得到粗PD005(11mg)，其为黄色固体。约6mg粗品用于HNMR分析，并提供了5mg粗品。
1H NMR(400MHz，DMSO)δ1.19-1.60(4H，m)，2.05-2.22(2H，m)，2.35-2.45(2H，m，重叠DMSO信号)，3.45-4.76(30H，m)，4.90-5.05(4H，m)，5.35-5.53(2H，m)，7.18-8.05(13H，m)，8.15-8.50(4H，m，)，9.61(0.5H，m)。
在0℃将NaOMe(4.1mg，0.076mmol)的MeOH(0.2mL)溶液滴加到化合物5-5A(56mg，0.038mmol)在MeOH(1mL)和DCM(1mL)中的搅拌溶液中。接着，将混合物在0℃搅拌2小时。粗LCMS显示形成了所需的产物M。粗LC-MS显示在保留时间0.857(MS计算：1143；发现MS：1169[M+Na]+)处的产物的纯度为98％。
接着，将混合物用水(10mL)淬灭并于15℃减压去除溶剂。通过过滤收集产生的黄色沉淀。将滤饼用水(10mL)稀释并冻干，得到粗PD005(27mg)，其为黄色固体。
1H NMR(400MHz，DMSO)δ1.19-1.60(4H，m)，2.05-2.21(2H，m)，2.35-2.45(2H，m，重叠DMSO信号)，3.45-4.76(30H，m)，4.90-5.05(4H，m)，5.35-5.51(2H，m)，7.21-8.01(13H，m)，8.15-8.50(4H，m，)，9.61(0.4H，m)。
5)化合物5-6b的制备
将6-氧代己酸乙酯(546mg，3.45mmol)、TsOH(15mg，0.08mmol)和H2O(1.2mL)的溶液于90℃在N2下搅拌16小时。TLC显示形成了另一个斑点。将反应混合物在水(10mL)中淬灭，并且所得的溶液用EtOAc萃取(15mL*4)。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，然后真空浓缩。使用石油醚：乙酸乙酯/1：1至2：3作为洗脱剂将残余物在硅胶柱中进行纯化，得到化合物5-6b(383mg，收率：85％)，其为无色油。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.49-1.53(4H，m)，2.22(2H，t，J＝6.8Hz)，2.44(2H，t，J＝7.2Hz)，9.66(1H，s)，12.01(1H，brs)。
6)化合物5-6的制备
在N2下将DIC(397mg，3.15mmol)加入到化合物5-6b(383mg，2.94mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(356mg，3.09mmol)的DCM(4mL)溶液中。将混合物在25℃搅拌3小时。TLC显示形成了另一个极性较低的斑点。过滤反应混合物，滤液用水(10mL)淬灭，并分离有机层。然后，用DCM萃取水相(10mL*3)。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，并真空浓缩。使用石油醚：乙酸乙酯/3：2至2：3作为洗脱剂将残余物在硅胶柱中进行纯化，得到不纯的化合物5-6(204mg)，其为白色固体。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.76-1.78(4H，m)，2.49-2.51(2H，m)，2.64(2H，t，J＝6.8Hz)，2.84(4H，s)，9.77(1H，s)。
制备实施例3：PD006的合成
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1)化合物6-4的制备
将化合物6-3(349mg，0.635mmol)和化合物6-2(220mg，0.635mmol)和K2CO3(105mg，0.762mmol)在DMF(3mL)中的混合物加热至60℃并搅拌16小时。粗LC-MS显示在保留时间1.088(MS计算：723.4；发现MS：746.3[M+Na]+)处的产物的纯度为59％。在减压下去除大部分溶剂。将混合物用水(20mL)淬灭并用EtOAc(15mL*3)萃取。合并的有机层用水(20mL*2)洗涤，用Na2SO4干燥，浓缩，并进一步干燥，得到化合物6-4(0.45g，收率98％)，其为棕色油。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.51-1.56(18H，m)，3.39(2H，t，J＝4.8Hz)，3.61-3.68(24H，m)，3.69-3.72(2H，m)，3.92(2H，t，J＝4.8Hz)，4.21(2H，t，J＝4.8Hz)，6.37(1H，d，J＝16.0Hz)，6.50(1H，d，J＝16.0Hz)，7.02(1H，s)，7.10(1H，d，J＝8.0Hz)，7.47-7.55(2H，m)，7.86(1H，d，J＝16.0Hz)。
化合物6-2的合成过程与上述PD001的实施例中的相同。
2)化合物6-5的制备
在10℃将PPh3(196mg，0.746mmol)加入到化合物6-4(450mg，0.622mmol)的THF(4mL)溶液中，并将混合物在1℃搅拌1小时。然后，向混合物中加入H2O(1mL)，并且将所得混合物在10℃搅拌16小时。粗LC-MS显示在保留时间0.967(MS计算：697.4；发现MS：698.4[M+H]+)处的产物的纯度为21％。在减压下去除溶剂。使用EtOAc，DCM：MeOH/5：1，然后MeOH：NH3·H2O/100：1作为洗脱剂将残余物进行纯化，得到化合物6-5(285mg，收率66％)，其为棕色油。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.52-1.64(18H，m，重叠水信号)，2.88(2H，t，J＝5.2Hz)，3.63(2H，t，J＝5.2Hz)，3.62-3.75(22H，m)，3.76-3.80(2H，m)，3.94(2H，t，J＝5.2Hz)，4.24(2H，t，J＝5.2Hz)，6.39(1H，d，J＝16.0Hz)，6.52(1H，d，J＝16.4Hz)，7.04(1H，s)，7.12(1H，d，J＝8.4Hz)，7.49-7.57(2H，m)，7.89(1H，d，J＝16.4Hz)。
没有观察到两个活性质子。
3)化合物6-11的制备
在10℃将Fmoc-Cl(96mg，0.37mmol)和NaHCO3(31mg，0.37mmol)加入到化合物6-5(235mg，0.337mmol)在THF(1mL)和H2O(1mL)中的溶液中。然后，将混合物在10℃搅拌2小时。粗LC-MS显示在保留时间1.155(MS计算：919.5；发现MS：942.5[M+Na]+)处的产物的纯度为84％。将混合物用水(5mL)淬灭并用EtOAc萃取(15mL*3)。将混合的有机层用Na2SO4干燥，浓缩，并进一步干燥，得到粗化合物6-11(325mg)，其为无色油，含有FmocCl。
4)化合物6-12的制备
将化合物6-11(325mg，粗品)和DCM(3mL)在TFA(2mL)中的混合物在10℃搅拌16小时。粗LC-MS显示在保留时间0.890(MS计算：807.4；发现MS：830.3[M+Na]+)处的产物的纯度为87％。在减压下去除溶剂。将残余物用EtOAc(5mL)研制，得到化合物6-12(191mg，两步收率：70％)，其为白色固体。
1H NMR(400MHz，DMSO)δ3.10-3.17(2H，m)，3.30-3.43(2H，m，重叠水信号)，3.45-3.58(24H，m)，3.59-3.64(2H，m)，3.78-3.84(2H，m)，4.18-4.32(5H，m)，4.42(2H，d，J＝7.2Hz)，5.46(1H，brs)，6.65(2H，dd，J＝16.0，14.4Hz)，7.27-7.36(4H，m)，7.38-7.46(3H，m)，7.57(1H，d，J＝16.0Hz)，7.66-7.74(3H，m)，7.81(1H，d，J＝16.4Hz)，7.89(2H，d，J＝7.6Hz)，12.4(2H，brs)。
5)化合物6-13的制备
将化合物6-12(90mg，0.11mmol)、化合物6-9(188mg，0.334mmol)和EDCI(64mg，0.33mmol)在DMF(2mL)中的混合物在10℃搅拌16小时。TLC显示形成了所需产物。在大大降低的压力下去除溶剂。使用PE：EtOAc/2：1，然后使用EtOAc：MeOH/50：1作为洗脱剂将残余物在CombiFlash装置中纯化，得到化合物13(96mg，收率45％)，其为黄色固体。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.04-2.09(12H，m，重叠EtOAc信号)，2.16(6H，d，J＝10.4Hz)，2.24(6H，s)，3.35-3.43(2H，m)，3.47-3.84(30H，m)，3.98-4.09(4H，m)，4.11-4.62(15H，m，重叠EtOAc信号)，5.17-5.27(2H，m)，5.34-5.43(2H，m)，5.46-5.62(3H，m)，5.69-5.80(2H，m)，6.97(1H，d，J＝14.8Hz)，7.17(1H，s)，7.25-7.36(4H，m，重叠CDCl3信号)，7.37-7.50(4H，m)，7.53-7.66(5H，m)，7.69-7.80(4H，m)，7.83(1H，d，J＝15.2Hz)，8.00(1H，d，J＝15.2Hz，重叠DMF信号)，8.17(2H，dd，J＝8.4，2.0Hz)，8.46(2H，d，J＝12.0Hz)。
化合物6-9的制备过程与上述PD001的实施例中的相同。
6)化合物6-14的制备
将哌啶(86mg，1.0mmol，0.1mL)和化合物6-13(96mg，0.051mmol)在DCM(1mL)中的溶液中于10℃搅拌3小时。TLC显示起始物料被完全消耗并且形成了一个新的主点。减压去除溶剂。使用DCM：MeOH/100：1至9：1作为洗脱剂将残余物在CombiFlash装置中纯化，得到化合物6-14(75mg，收率：78％)，其为黄色固体。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.03-2.09(12H，m，重叠EtOAc信号)，2.17(6H，d，J＝10.4Hz)，2.24(6H，s)，3.11-3.18(2H，m)，3.48-3.87(30H，m)，3.97-4.70(18H，m，重叠EtOAc信号)，5.16-5.26(2H，m)，5.36-5.46(2H，m)，5.51-5.63(2H，m)，5.68-5.79(2H，m)，7.13(1H，d，J＝15.2Hz)，7.24-7.37(3H，m，重叠CDCl3信号)，7.40-7.49(2H，m)，7.53-7.65(3H，m)，7.73(2H，d，J＝8.0Hz)，7.83(1H，d，J＝15.2Hz)，8.02(1H，d，J＝15.2Hz)，8.16(2H，d，J＝8.4Hz)，8.46(2H，d，J＝8.4Hz)。
7)化合物6-15的制备
在10℃将K2CO3(14mg，0.10mmol)加入到化合物6-14(87mg，0.052mmol)在MeOH(2mL)和DCM(1mL)中的溶液中。然后，将混合物在10℃搅拌1小时。粗LC-MS显示在保留时间0.836(MS计算：1339.5；发现MS：1340.9[M+H]+)处的产物的纯度为90％。TLC显示起始物料被完全消耗。将混合物用AcOH(10mg)淬灭。将混合物浓缩至干，生成粗化合物6-15(74mg)，其为黄色固体，直接用于下一步。
8)PD006的制备
将化合物6-15(74mg，粗品)、化合物6-6(16mg，0.061mmol)和DIEA(8.6mg，0.066mmol)在DMF(1mL)中的混合物在10℃搅拌5小时。粗LC-MS显示在保留时间0.842(MS计算：1490.5；发现MS：1493.5[M+2H]+)处的产物的纯度为94％。减压去除溶剂。通过制备型HPLC(0.225％FA)纯化残余物。将剩余水溶液冻干，得到PD006(8mg)和7mg杂质。将不纯的PD006通过制备型HPLC(0.225％FA)进一步纯化。将剩余水溶液冻干，得到PD006(4mg)，其为黄色固体。得到总计12mg PD006，两步的收率为16％。
1H NMR(400MHz，DMSO)δ2.24-2.37(2H，m，重叠DMSO信号)，3.08-3.21(2H，m)，3.24-4.10(46H，m，重叠水信号)，4.26-4.77(12H，m)，4.88-5.02(4H，m)，5.34-5.47(2H，m)，6.99(1.1H，s)，7.30-7.64(8H，m)，7.74(1H，d，J＝15.2Hz)，7.83-7.94(4H，m)，7.98-8.04(1H，m)，8.29-8.46(4H，m)。
9)化合物6-3B的制备
在0℃将TsCl(14.7g，77.2mmol)加入到四甘醇(30.0g，154mmol)、EtN(11.7g，116mmol)和DMAP(944mg，7.72mmol)在DCM(300mL)中的混合物中。将反应混合物在10℃搅拌16小时。TLC显示两个新斑点，并且显示起始物料被完全消耗。用水(100mL)淬灭反应混合物并分离有机层。然后，剩余的混合物用DCM萃取(100mL*4)。合并的有机层用盐水(400mL)洗涤。有机层用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。使用EtOAc，然后使用DCM：MeOH/20：1作为洗脱剂将残余物在硅胶柱上进行纯化，得到无色油状化合物6-3B(9.33g)和无色油状化合物6-3B(7.16g)。然后，使用DCM：MeOH/50：1至20:1作为洗脱剂将7.16g的不纯油在CombiFlash装置中纯化，得到无色油状化合物6-3B(4.89g)。因此，得到总计14.2g化合物6-3B，并且收率为26％。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.45(3H，s)，2.48-2.62(1H，brs)，3.58-3.71(14H，m)，4.17(2H，t，J＝4.8Hz)，7.34(2H，d，J＝8.0Hz)，7.80(2H，dd，J＝6.4Hz，1.6Hz)。
情况2：
在15℃将TsCl(9.82g，51.5mmol)、KI(855mg，5.15mmol)和Ag2O(14.3g，61.8mmol)的混合物加入到四甘醇(10.0g，51.5mmol)的DCM(300mL)溶液中。将反应混合物在15℃搅拌16小时。TLC显示了另一个具有更大极性的斑点，并且显示起始物料被完全消耗。将反应混合物通过硅藻土过滤，并且真空浓缩滤液。使用石油醚：乙酸乙酯/1：1与MeOH作为洗脱剂将残余物在CombiFlash装置中纯化，得到化合物6-3B(11.8g，收率：66％)，其为无色油。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.32-2.44(1H，brs)，2.45(3H，s)，3.60-3.71(14H，m)，4.17(2H，t，J＝4.4Hz)，7.33(2H，d，J＝8.0Hz)，7.80(2H，d，J＝8.0Hz)。
10)化合物6-3C的制备
将NaN3(465mg，7.15mmol)加入到化合物6-3B(1.66g，4.76mmol)的DMF(20mL)溶液中。将反应混合物在60℃搅拌16小时。TLC显示了另一个极性较低的斑点，并且显示起始物料被完全消耗。将反应混合物用水(50mL)淬灭，并且所得的溶液用EtOAc萃取(50mL*4)。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，并真空浓缩。使用DCM：MeOH/40：1至30：1作为洗脱剂将残余物在硅胶柱中进行纯化，得到淡黄色油状不纯的化合物6-3C(800mg)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.46-2.72(1H，brs)，3.34-3.45(2H，m)，3.59-3.64(2H，m)，3.66-3.71(10H，m)，3.71-3.75(2H，m)。
11)化合物6-3D的制备
在0℃将EtN(517mg，5.11mmol)和TsCl(974mg，5.11mmol)加入到化合物6-3C(800mg，不纯)的DCM(16mL)溶液中，然后使其升温至15℃持续16小时。TLC显示了另一个低极性的斑点。将混合物用水(20mL)淬灭，并分离有机层。然后，剩余的混合物用DCM萃取(15mL*3)。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，并真空浓缩。使用石油醚：乙酸乙酯/2：1至1：1作为洗脱剂将残余物在硅胶柱中进行纯化，得到化合物6-3D(1.01g，两步收率：57％)，其为无色油。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.47(3H，s)，3.35-3.46(2H，m)，3.62-3.72(12H，m)，4.18(2H，t，J＝4.8Hz)，7.36(2H，d，J＝8.0Hz)，7.82(2H，d，J＝8.4Hz)。
12)化合物6-3E的制备
将化合物6-3A(3.41g，17.6mmol)的THF(3mL)溶液于0℃在N2下滴加到NaH(780mg，在19.5mmol矿物油中的纯度为60％)在THF(33mL)中的悬浮液中。将反应在10℃搅拌1.5小时。然后，将化合物6-3D(3.28g不纯)的THF(3mL)溶液滴加到回流的醇钠溶液中。然后，将混合物回流(70℃)16小时。TLC显示形成了新斑点。反应混合物冷却至室温后，真空去除THF。残余物用水(30mL)淬灭，并且所得的溶液用混合溶剂(DCM：MeOH/10：1)萃取(50mL*5)。将混合的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，并真空浓缩，得到粗化合物6-3E(3.47g，粗品)，直接用于下一步。
13)化合物6-3的制备
将Et3N(1.12g，11.1mmol)加入化合物6-3E(3.03g，粗品)的DCM(30mL)溶液中，并且将TsCl(2.12g，11.1mmol)在0℃加入到混合物中。将反应混合物升温至10℃并搅拌16小时。TLC显示形成了另一个新的斑点。将反应混合物用水(40mL)淬灭并分离有机层。然后，剩余的水相用DCM萃取(30mL*5)。然后，将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，并真空浓缩。使用石油醚：乙酸乙酯(EtOAc)/3：1作为洗脱剂将残余物在硅胶柱中进行纯化，得到不纯的化合物6-3(1.82g)。使用石油醚：乙酸乙酯/2：1，然后使用EtOAc作为洗脱剂将不纯的固体用CombiFlash装置纯化，得到化合物6-3(1.26g，两步收率：26％)，其为黄色油。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.47(3H，s)，3.40-3.53(2H，m)，3.54-3.83(28H，m)，4.14-4.24(2H，m)，7.36(2H，d，J＝8.4Hz)，7.81(2H，d，J＝8.0Hz)。
14)化合物6-6的制备
将EDCI(1.21g，6.33mmol)加入到3-马来酰亚胺丙酸(1.00g，5.91mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(714mg，6.21mmol)在DCM(10mL)中的溶液中，并且将所得混合物于15℃在N2存在下搅拌16小时。TLC显示形成了另一个具有较低极性的斑点。用水(15mL)淬灭反应并分离有机层。然后，将剩余的水相用DCM萃取(20mL*3)。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，并真空浓缩。使用石油醚：乙酸乙酯/1：2作为洗脱剂将残余物在硅胶柱中进行纯化，得到化合物6-6(1.18g，收率：75％)，其为白色固体。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.84(4H，s)，3.04(2H，t，J＝14.0Hz)，3.95(2H，t，J＝7.2Hz)，6.76(2H，s)。
制备实施例4：PD008的合成
1)化合物8-1的制备
将(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)6-氧代己酸酯(16mg，0.072mmol)、DIPEA(15mg，0.12mmol)和化合物6-14(100mg，0.0596mmol)在DCM(1mL)中的混合物在10℃搅拌16小时。TLC显示形成了具有较低极性的新斑点。将混合物用水(8mL)淬灭并用DCM萃取(8mL*3)。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥并浓缩至干。使用EtOAc：MeOH/10：1作为洗脱剂将残余物通过制备型TLC纯化，得到化合物8-1(59mg，收率：55％)，其为黄色固体。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.55-1.76(4H，m，重叠水信号)，2.03-2.10(12H，m)，2.13-2.27(14H，m)，2.45-2.50(2H，m)，3.42-3.48(2H，m)，3.49-3.85(30H，m)，3.99-4.63(16H，m)，5.22(2H，dd，J＝10.4，3.2Hz)，5.40(2H，dd，J＝7.2，2.0Hz)，5.57(2H，d，J＝2.8Hz)，5.70-5.79(2H，m)，6.41(1H，brs)，6.98(1H，d，J＝15.2Hz)，7.18(1H，s)，7.26-7.36(2H，m，重叠CDCl3信号)，7.41-7.48(2H，m)，7.54-7.65(3H，m)，7.70-7.78(2H，m)，7.84(1H，d，J＝15.2Hz)，8.01(1H，d，J＝15.6Hz)，8.14-8.20(2H，m)，8.46(2H，d，J＝11.6Hz)，9.77(1H，t，J＝1.6Hz)。
(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)6-氧代己酸酯与化合物6-14的合成与PD006的制备实施例中的相同。
2)化合物PD008的制备
将化合物8-1(59mg，0.033mmol)和K2CO3(9.1mg，0.065mmol)在MeOH(1mL)和DCM(0.5mL)中的混合物在15℃搅拌1小时。粗LC-MS显示在保留时间0.796(MS计算：1451.5；发现MS：1455.1[M+3H]+)处的产物的纯度为99.9％。将混合物用AcOH(4mg)淬灭。所得混合物通过制备型HPLC(0.225％FA)纯化。在减压下去除大部分MeCN。将剩余的混合物冻干，得到PD008(16mg，收率：33％)，其为黄色固体。
1H NMR(400MHz，DMSO)δ1.36-1.56(4H，m)，1.95-2.12(2H，m)，2.33-2.44(2H，m，重叠DMSO-d6信号)，3.08-3.22(2H，m，重叠水信号)，3.24-4.11(44H，m，重叠水信号)，4.24-4.74(12H，m)，4.86-5.04(4H，m)，5.24-5.57(2H，m)，7.27-7.64(8H，m)，7.68-7.94(6H，m)，8.28-8.49(4H，m)，9.64(0.6H，s)。
制备实施例5：PD009的合成
1)化合物2的制备
在N2下，将三(邻甲苯基)-膦(433mg，1.42mmol)和乙酸钯(80mg，0.36mmol)加入到2,5-二溴苯(5.00g，17.8mmol)和丙烯酸叔丁酯(6.84g，53.4mmol)的溶液中。将混合物在100℃搅拌16小时。TLC显示化合物1未被完全消耗。接着，向反应混合物中加入丙烯酸叔丁酯(4.00g)、三(邻甲苯基)-膦(224mg)和乙酸钯(80mg)。然后，将混合物在100℃搅拌20小时。TLC显示形成了另一个具有更大极性的斑点。真空浓缩反应混合物，向残余物中加入EtOAc(50mL)，过滤混合物，并真空浓缩滤液。使用PE：EtOAc/50：1作为洗脱剂将残余物在CombiFlash装置中纯化，得到化合物2(5.72g，收率：85％)，其为黄色固体。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.54(18H，s)，6.34(1H，d，J＝15.6Hz)，6.48(1H，d，J＝16.0Hz)，7.56(1H，d，J＝16.0Hz)，7.65(1H，d，J＝8.0Hz)，7.72(2H，dd，J＝8.0Hz，1.6Hz)，7.98(1H，d，J＝16.0Hz)，8.12(1H，d，J＝1.6Hz)。
2)化合物3的制备
将Zn(9.73g，149mmol)加入到在冰浴中冷却的化合物2(6.98g，18.6mmol)的丙酮(70mL)溶液中，然后向其中加入NH4Cl(3.98g，74.4mmol)的H2O(35mL)溶液。将混合物在5℃搅拌4小时。TLC显示形成了另一个具有更大极性的斑点，并且起始物料被完全消耗。将EtOAc(50mL*4)加入到反应混合物中，并收集作为最上层存在的澄清溶液。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，并真空浓缩。使用PE：EtOAc/16：1作为洗脱剂将残余物在CombiFlash装置中纯化，得到化合物3(5.22g，收率：81％)，其为黄色固体。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.54(18H，s，重叠水信号)，3.99(2H，brs)，6.26-6.38(2H，m)，6.81(1H，s)，6.93(1H，d，J＝9.6Hz)，7.37(1H，d，J＝8.4Hz)，7.46(1H，d，J＝16.0Hz)，7.68(1H，d，J＝16.0Hz)。
3)化合物6的制备
将化合物3(300mg，0.484mmol)、TsOH(8mg，0.05mmol)、化合物9-5(251mg，0.726mmol)和EDCI(464mg，2.42mmol)在DMA(6mL)中的混合物在10℃搅拌16小时。TLC显示形成了另一个具有更大极性的斑点。真空去除DMA。将残余溶液在水(10mL)中淬灭，并且将所得溶液用EtOAc：MeOH＝3：1萃取(30mL*6)。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，并真空浓缩。使用EtOAc，然后使用EtOAc：MeOH/10：1作为洗脱剂将残余物在硅胶柱中进行纯化，得到化合物6(319mg，收率：69％)，其为黄色油。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.52(18H，s)，2.71(2H，t，J＝5.6Hz)，3.44-3.67(26H，m)，3.71-3.75(2H，m)，3.82-3.89(2H，m)，4.16-4.24(1H，m)，4.38-4.40(2H，m)，5.45(1H，brs)，6.33-6.45(2H，m)，7.26-7.32(3H，m，重叠CDCl3信号)，7.39(2H，t，J＝7.6Hz)，7.51-7.61(4H，m)，7.69-7.76(3H，m)，8.00(1H，s)，8.76(1H，brs)。
4)化合物7的制备
将TFA(1.09g，9.52mmol)加入到化合物6(319mg，0.337mmol)的DCM(3mL)溶液中。将混合物在10℃搅拌16小时。粗LC-MS显示在保留时间0.801(MS计算：834.3；发现MS：835.0[M+H]+)处的产物的纯度为95％。真空浓缩反应混合物。将残余物用EtOAc(10mL)研制并过滤。将滤饼用EtOAc(5mL)洗涤，得到化合物7(244mg，收率：86％)，其为白色固体。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ2.51-2.68(2H，m，重叠DMSO-d6信号)，3.09-3.17(2H，m)，3.44-3.58(26H，m，重叠水信号)，3.62-3.79(2H，m)，4.16-4.21(1H，m)，4.22-4.42(2H，m)，6.48-6.61(2H，m)，7.28-7.34(3H，m)，7.36-7.49(2H，m)，7.54-7.58(2H，m)，7.66-7.72(4H，m)，7.84-7.90(3H，m)，9.88(1H，brs)，12.48(2H，brs)。
5)化合物8的制备
在10℃将EDCI(168mg，0.877mmol)加入到化合物7(244mg，0.292mmol)和化合物6-9(494mg，0.877mmol)在DMF(4mL)中的溶液中。接着，将混合物在10℃搅拌16小时。TLC显示形成了另一个具有更大极性的斑点。真空去除DMF并将残余物用水(10mL)淬灭。将所得溶液用EtOAc：MeOH(20：1)萃取(15mL*6)。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，并真空浓缩。使用PE：EtOAc/1：1至0：1，然后使用EtOAc：MeOH/20：1作为洗脱剂将残余物在硅胶柱中进行纯化，得到化合物8(469mg，收率：83％)，其为黄色固体。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.97-2.04(12H，m，重叠水信号)，2.11-2.14(6H，m)，2.15-2.23(6H，m)，2.71-2.82(2H，m)，3.39-3.62(26H，m)，3.67-3.73(2H，m)，3.75-3.83(2H，m)，3.92-4.06(4H，m)，4.11-4.57(15H，m)(重叠EtOAc信号)，5.22(2H，d，J＝7.6Hz)，5.35-5.40(2H，m)，5.50-5.56(3H，m)，5.74(2H，t，J＝8.0Hz)，6.95-7.03(2H，m)，7.27-7.36(2H，m，重叠CDCl3信号)，7.37-7.46(5H，m)，7.54-7.61(4H，m)，7.71-7.76(5H，m)，7.84(1H，d，J＝15.6Hz)，7.98-8.04(1H，m)，8.17(3H，d，J＝8.0Hz)，8.43(2H，d，J＝8.0Hz)，8.95(1H，brs)。
化合物6-9的合成与PD005的制备实施例中的相同。
6)化合物9的制备
在10℃将哌啶(0.3mL)加入到化合物8(197mg，0.102mmol)的DCM(3mL)溶液中。将混合物在10℃搅拌1.5小时。TLC显示形成了另一个具有更大极性的斑点。真空浓缩反应混合物，并且将残余物用水(10mL)淬灭。将所得溶液用DCM萃取(15mL*4)。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，并真空浓缩。使用EtOAc，然后使用DCM：MeOH/50：1至10：1作为洗脱剂将残余物在硅胶柱中进行纯化，得到化合物9(96mg，收率：55％)，其为黄色固体。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.03-2.10(12H，m，重叠水信号)，2.11-2.18(6H，m)，2.19-2.28(6H，m)，2.95-3.06(2H，m)，3.16-3.16(2H，m)，3.48-3.76(28H，m)，3.76-3.82(2H，m)，3.84-3.90(2H，m)，3.91-4.06(4H，m)，4.13-4.39(8H，m)，4.46-4.63(4H，m)，5.23(2H，d，J＝10.8Hz)，5.40(2H，d，J＝8.0Hz)，5.52-5.61(2H，m)，5.68-5.80(2H，m)，6.98(2H，t，J＝15.6Hz)，7.38-7.49(3H，m)，7.56(2H，t，J＝7.2Hz)，7.67-7.89(4H，m)，7.83(2H，d，J＝15.2Hz)，7.93-8.04(2H，m)，8.12-8.20(2H，m)，8.34-8.51(2H，m)，10.04(1H，brs)。
7)化合物10的制备
将K2CO3(19mg，0.14mmol)加入到化合物9(120mg，0.0704mmol)在DCM(1mL)和MeOH(2mL)中的溶液中。将混合物在10℃搅拌30分钟。粗LC-MS显示出新的峰，并且显示化合物9被完全消耗(MS计算：1702.5)(化合物10的MS超过1500，因此不能检测到)。将CH3COOH(19mg)加入到反应混合物中。将混合物在10℃搅拌5分钟并真空浓缩，得到化合物10(92mg，粗品)，其为黄色固体。
8)PD009的制备
在10℃将化合物6-6(28mg，0.11mmol)加入到化合物10(92mg，粗品)和DIEA(14mg，0.11mmol)在DMF(1mL)中的溶液中。将混合物在10℃搅拌16小时。粗LC-MS显示出新的峰，并且显示化合物10被完全消耗(MS计算：1366.5)(PD009的MS超过1500，并且不能检测到)。将所得混合物通过制备型HPLC(0.225％FA)纯化。在减压下去除大部分MeCN。将剩余的混合物冻干，得到PD009(40mg，两步收率：37％)，其为黄色固体。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ2.32(2H，t，J＝7.2Hz)，2.64-2.74(2H，m)3.09-3.18(2H，m)，3.46-3.71(33H，m，重叠水信号)，3.73-4.12(12H，m)，4.23-4.70(11H，m)4.91-5.00(4H，m)，5.34-5.44(2H，m)，6.99(1.4H，s)，7.27(2H，d，J＝15.2Hz)，7.43(2H，t，J＝8.0Hz)，7.57(2H，t，J＝7.6Hz)，7.66-7.81(2H，m)，7.84-7.91(4H，m)，7.98-8.10(2H，m)，8.32-8.41(4H，m)，10.00(1H，brs)。
化合物6-6的合成与PD006的制备实施例中的相同。
9)化合物9-2’的制备
批次1
于0℃并在N2下，将三甘醇(2.41g，16.1mmol)的THF(5mL)溶液滴加到NaH(536mg，60％，在13.4mmol矿物油中)的THF(20mL)悬浮液中。将反应在5℃搅拌1.5小时。接着，将化合物6-3D(2.00g，5.36mmol)的THF(5mL)溶液滴加到回流的醇钠溶液中。接着，将混合物在N2下回流(70℃)16小时。TLC显示了另一个新位置，并且显示化合物6-3D被完全消耗。将反应混合物与批次2混合。
批次2
于0℃并在N2下，将三甘醇(2.41g，16.1mmol)的THF(5mL)溶液滴加到NaH(536mg，60％，在13.4mmol矿物油中)的THF(20mL)悬浮液中。将反应在5℃搅拌1.5小时。接着，将化合物6-3D(2.00g,5.36mmol)的THF(5mL)溶液滴加到回流的醇钠溶液中。接着，将混合物在N2下回流(70℃)16小时。TLC显示了另一个新位置，并且显示化合物6-3D被完全消耗。将反应混合物与批次1一起用水(50mL)淬灭。分离有机层，然后用DCM：MeOH(10：1)萃取剩余的混合物(50mL*4)。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，并真空浓缩。使用DCM：MeOH/100：1至50：1作为洗脱剂将残余物在硅胶柱中进行纯化，得到化合物9-2’(3.03g，二批收率：80％)，其为粉红色油。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.41(2H，t，J＝5.2Hz)，3.62-3.76(26H,m)。
化合物6-3D的合成与PD006的制备实施例中的相同。
10)化合物9-3的制备
在0℃将NaH(4.0mg，0.093mmol，60％，在矿物油中)加入到化合物9-2'(328mg，0.933mmol)的THF(5mL)溶液中，并且将混合物在0℃搅拌1小时。接着，向混合物中加入丙烯酸叔丁酯(239mg，1.87mmol)。将反应混合物在5℃搅拌16小时。TLC显示了另一个具有低极性的斑点。剩余了微量的化合物9-2'。将反应用水(10mL)淬灭，所得溶液用DCM：MeOH(10：1)萃取(15mL*4)。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，并真空浓缩。使用PE：EtOAc/1：1至1：4作为洗脱剂将残余物在硅胶柱中进行纯化，得到化合物9-3(322mg，收率：72％)，其为无色油。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.45(9H，s)，2.50(2H，t，J＝6.8Hz)，3.39(2H，t，J＝5.2Hz)，3.62-3.72(28H，m)。
11)化合物9-3’的制备
在N2下将PPh3(896mg，3.42mmol)加入到化合物9-3(1.49g，3.11mmol)的THF(10mL)溶液中。将混合物在10℃搅拌1小时，然后向混合物中加入H2O(5mL)。接着，将混合物于10℃在N2下搅拌16小时。粗LC-MS显示在保留时间0.742(MS计算：453.2；发现MS：454.2[M+H]+)处的产物的纯度为3％。真空去除THF。将剩余溶液用水(10mL)淬灭，所得溶液用EtOAc：PE(3：1)萃取(30mL*2)。真空浓缩剩余的水层，制得化合物9-3'(1.52g，粗品)(含有水)，其为无色油。
12)化合物9-4’的制备
将Fmoc-Cl(897mg，3.47mmol)和NaHCO3(291mg，3.47mmol)加入到化合物9-3'(1.52g)(粗品，水)在THF(10mL)和H2O(10mL)中的溶液中。将混合物在10℃搅拌16小时后，TLC显示了另一个极性较小的斑点。真空去除THF并用水(20mL)淬灭剩余溶液。所得溶液用EtOAc萃取(40mL*5)。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，并真空浓缩。使用PE：EtOAc/1：1至0：1作为洗脱剂将残余物在硅胶柱中进行纯化，得到化合物9-4'(1.25g，两步收率：59％)，其为无色油。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.46(9H，s)，2.51(2H，t，J＝6.8Hz)，3.39-3.43(2H，m)，3.62-3.73(28H，m)，4.22-4.26(1H，m)，4.42(2H，d，J＝7.2Hz)，5.45(1H，brs)，7.31-7.35(2H，m)，7.38-7.47(2H，m)，7.62(2H，d，J＝7.2Hz)，7.78(2H，d，J＝7.2Hz)。
13)化合物9-5的制备
将TFA(5.95g，52.2mmol)加入到化合物9-4’(1.25g，1.85mmol)的DCM(12mL)溶液中。将混合物在10℃搅拌16小时。粗LC-MS显示在保留时间0.816(MS计算：619.3；发现MS：642.0[M+Na]+)处的产物的纯度为95％。真空浓缩反应混合物，得到化合物9-5(1.17g，收率：100％)，其为无色油。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ2.43(2H，t，J＝6.4Hz)，3.13(2H，dd，J＝11.6Hz，5.6Hz)，3.40(2H，t，J＝6.0Hz)，3.48-3.49(24H，m)，3.59(2H，t，J＝6.4Hz)，4.19-4.23(1H，m)，4.29(2H，d，J＝6.4Hz)，7.29-7.39(3H，m)，7.42(2H，t，J＝7.6Hz)，7.69(2H，d，J＝7.2Hz)，7.89(2H，d，J＝7.2Hz)。没有观察到活性质子。
制备实施例6：PD010的合成
1)化合物10的制备
将化合物9(120mg，0.0704mmol)、(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)6-氧代己酸酯(24mg，0.11mmol)和DIEA(18mg，0.14mmol)在DCM(2mL)中的混合物在10℃搅拌16小时。TLC显示了一个具有较低极性的主斑点。反应混合物通过制备型TLC(20：1的EtOAc：MeOH作为洗脱剂)进行纯化，得到化合物10(72mg，收率：56％)，其为黄色固体。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.57-1.76(4H，m)，2.01-2.10(12H，m)，2.11-2.30(14H，m)，2.41-2.50(2H，m)，2.77-2.88(2H，m)，3.36-3.76(28H，m)，3.78-3.86(2H，m)，3.90-4.07(4H，m)，4.12-4.39(8H，m)，4.45-4.63(4H，m)，5.23(2H，d，J＝10.0Hz)，5.35-5.45(2H，m)，5.56(2H，s)，5.74(2H，d，J＝9.2Hz)，6.42(1H，brs)，6.93-7.07(2H，m)，7.40-7.50(3H，m)，7.52-7.63(2H，m)，7.69-7.78(3H，m)，7.85(1H，d，J＝15.6Hz)，8.02(1H，d，J＝14.8Hz)，8.13-8.21(3H，m)，8.43(2H，d，J＝7.2Hz)，9.10(1H，brs)，9.75(1H，s)。
(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)6-氧代己酸酯的合成与PD006的制备实施例中的相同。化合物9的合成与PD009的制备实施例中的相同。
2)PD010的制备
将化合物10(72mg，0.040mmol)和K2CO3(11mg，0.079mmol)在DCM(1mL)和MeOH(2mL)中的混合物在10℃搅拌1小时。粗LC-MS显示在保留时间0.831(MS计算：1478.5；发现MS：1481.1[M+3H]+)处的产物的纯度为91％。将反应混合物用AcOH(12mg)淬灭。所得混合物通过制备型HPLC(0.225％FA)纯化。在减压下去除大部分MeCN。将剩余的混合物冻干，得到PD010(24mg，收率：41％)，其为黄色固体。将该批次(24mg)与批次es8455-193-p1(2mg)混合。然后，获得总计26mg PD010。
1H NMR(400MHz，DMSO)δ1.30-1.54(4H，m)，1.95-2.10(2H，m)，2.63-2.78(2H，m，重叠DMSO信号)，3.08-3.24(2H，m，重叠水信号)，3.25-4.11(46H，m)，4.26-4.42(2H，m)，4.45-4.77(8H，m)，4.81-5.10(4H，m)，5.29-5.54(2H，brs)，7.18-7.33(2H，m)，7.36-7.49(2H，m)，7.51-7.62(2H，m)，7.64-7.96(7H，m)，8.04-8.14(1H，m)，8.26-8.47(4H，m)，9.64(1H，s)，10.00(1H，s)。
制备实施例7：PD011的合成
1)化合物11-2的制备
将化合物11-1(1.30g，1.94mmol)、化合物3(672mg，1.94mmol)和K2CO3(322mg，2.33mmol)在DMF(6mL)中的混合物在60℃搅拌16小时。TLC显示化合物11-1的起始物料仍然存在。观察到一个新斑点。将混合物用水(50mL)淬灭并用DCM萃取(20mL*3)。将合并的有机层用水(50mL)洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩至干。将残留物用含有EtOAc：PE/1：1与EtOAc的CombiFlash洗脱剂纯化，得到粗化合物11-2(710mg，含有DMF)，其为无色油。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.55(18H，d，J＝4.0Hz)，3.56-3.73(22H，m)，3.75-3.80(2H，m)，3.86-3.90(2H，m)，3.92-3.96(2H，m)，4.21-4.26(2H，m)，4.37-4.42(2H，m)，6.30(1H，d，J＝16.0Hz)，6.52(1H，d，J＝16.0Hz)，7.04(1H，s)，7.12(1H，d，J＝8.4Hz)，7.48-7.57(2H，m)，7.75-7.79(2H，m)，7.84-7.91(3H，m)。
化合物11-1的合成与PD001的实施例中的相同。
2)化合物11-3的制备
将NH3和化合物11-2(738mg，粗品)在MeOH(7M，10mL)中的溶液在15℃搅拌16小时。形成白色沉淀，然后过滤。将滤液浓缩并干燥，得到化合物11-3(582mg)，其为无色油。
1H NMR(400MHz，DMSO)δ1.48(18H，d，J＝4.4Hz)，3.46-3.54(22H，m)，3.55-3.66(6H，m)，3.79-3.85(2H，m)，4.24-4.29(2H，m)，4.37-4.42(2H，m)，5.98(2H，brs)，6.60-6.71(2H，m)，7.28(1H，d，J＝7.6Hz)，7.45(1H，s)，7.53(1H，d，J＝16.0Hz)，7.73(1H，t，J＝8.0Hz)，7.81(1H，d，J＝18.4Hz)。
3)化合物11-4的制备
将化合物11-3(580mg，0.812mmol)、Fmoc-Cl(231mg，0.894mmol)和NaHCO3(75mg，0.89mmol)在H2O(5mL)和THF(5mL)中的混合物在15℃搅拌2小时。粗LC-MS显示在保留时间1.003(MS计算：935.5；发现MS：958.5[M+Na]+)处的产物的纯度为43％。将混合物用EtOAc萃取(6mL*4)。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，浓缩，并进一步干燥。使用PE：EtOAc/1：1，EtOAc，然后使用EtOAc：MeOH/10：1作为洗脱剂将残余物在硅胶柱中进行纯化，得到化合物11-4(558mg，收率：73％)，其为无色油。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.55(18H，d，J＝4.8Hz)，3.61-3.79(26H，m)，3.90-3.96(2H，m)，4.01-4.06(2H，m)，4.19-4.30(3H，m)，4.50(2H，d，J＝6.8Hz)，6.38(1H，d，J＝16.0Hz)，6.52(1H，d，J＝16.0Hz)，7.03(1H，s)，7.12(1H，d，J＝7.6Hz)，7.31-7.36(2H，m)，7.42(1H，t，J＝7.6Hz)，7.48-7.57(2H，m)，7.62(1H，d，J＝7.6Hz)，7.78(1H，d，J＝7.2Hz)，7.88(1H，d，J＝16.0Hz)，8.27(1H，brs)。
4)化合物11-5的制备
将化合物11-4(558mg，0.596mmol)和TFA(3.08g，27.0mmol，2mL)在DCM(5mL)中的溶液在15℃搅拌16小时。粗LC-MS显示在保留时间0.827(MS计算：823.3；发现MS：846.3[M+Na]+)处的产物的纯度为85％。减压去除溶剂。将残余物用PE：EtOAc/1：1(10mL)研制，得到化合物11-5(433mg，收率：88％)，其为白色固体。
1H NMR(400MHz，DMSO)δ3.41-3.87(30H，m，重叠水信号)，4.21-4.32(3H，m)，4.40(2H，d，J＝6.8Hz)，6.59-6.72(2H，m)，7.26-7.37(3H，m)，7.38-7.47(3H，m)，7.58(1H，d，J＝16.0Hz)，7.65-7.75(3H，m)，7.80(1H，d，J＝16.4Hz)，7.89(2H，d，J＝7.6Hz)，10.46(1H，brs)，12.43(2H，brs)。
5)化合物11-6的制备
在15℃将EDCI(168mg，0.874mmol)加入到化合物11-5(240mg，0.291mmol)和化合物6-9(493mg，粗品)在DMF(3mL)中的混合物中。接着，将混合物在15℃搅拌16小时。TLC显示了一个主黄色斑点。在减压下去除大部分DMF。使用EtOAc，然后使用EtOAc：MeOH/25：1作为洗脱剂将残余物在硅胶柱中进行纯化，得到产物(541mg)，其为黄色固体。约165mg粗产物用于下一步(脱Fmoc反应)，但未获得阳性结果。然后，将残余物(375mg)溶解在EtOAc(40mL)中并用水洗涤(40mL*3)。分离有机层，用Na2SO4干燥，并浓缩至干，得到纯的化合物11-6(340mg)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.00-2.11(12H，m，重叠EtOAc信号)，2.17(6H，d，J＝11.2Hz)，2.24(6H，s)，3.45-3.84(28H，m)，3.97-4.40(19H，m，重叠EtOAc信号)，4.42-4.63(5H，m)，5.18-5.26(2H，m)，5.36-5.44(2H，m)，5.52-5.60(2H，m)，5.70-5.80(2H，m)，6.97(1H，d，J＝15.2Hz)，7.17(1H，s)，7.25-7.37(4H，m，重叠CDCl3信号)，7.38-7.49(4H，m)，7.53-7.64(5H，m)，7.69-7.79(4H，m)，7.83(1H，d，J＝15.2Hz)，8.00(1H，d，J＝15.6Hz)，8.14-8.20(2H，m)，8.34(1H，brs)，8.46(1H，d，J＝11.6Hz)。
6)化合物11-7的制备
将化合物11-6(280mg，0.146mmol)和哌啶(172mg，2.03mmol，0.2mL)在THF(2mL)中的溶液在15℃搅拌1小时。TLC显示观察到了一个新斑点。起始物料被完全消耗。减压去除溶剂。使用EtOAc：MeOH/10：1作为洗脱剂，将残留物通过制备型TLC纯化，得到化合物11-7(116mg，收率：47％)，其为黄色固体。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.06(12H，d，J＝4.4Hz)，2.17(6H，d，J＝10.4Hz)，2.24(6H，s)，3.47-3.85(30H，m)，3.97-4.63(18H，m)，5.17-5.27(2H，m)，5.35-5.44(2H，m)，5.52-5.62(2H，m)，5.70-5.80(2H，m)，6.98(1H，d，J＝15.2Hz)，7.18(1H，s)，7.26-7.37(2H，m，重叠CDCl3信号)，7.40-7.49(2H，m)，7.52-7.65(3H，m)，7.73(2H，d，J＝7.6Hz)，7.84(1H，d，J＝15.2Hz)，8.00(1H，d，J＝15.2Hz)，8.13-8.21(2H，m)，8.45(2H，d，J＝11.6Hz)。
7)PD011的制备
将化合物11-7(116mg，0.068mmol)和K2CO3(19mg，0.146mmol)在MeOH(1mL)和THF(1mL)中的混合物在15℃搅拌1小时。粗LC-MS显示在保留时间0.772(MS计算：1355.5；发现MS：1357.2[M+2]+)处的产物的纯度为86％。将混合物用AcOH(50mg)淬灭。将混合物通过制备型HPLC(0.225％FA)纯化。减压去除大部分MeCN，将剩余水溶液冻干，得到PD011(45mg，收率：48％)，其为黄色固体。
1H NMR(400MHz，DMSO)δ3.18-4.10(48H，m，重叠水信号)，4.27-4.72(12H，m)，4.87-5.02(2H，m)，5.39(2H，brs)，7.30-7.64(8H，m)，7.74(1H，d，J＝15.2Hz)，7.81-7.97(4H，m)，8.28-8.49(4H，m)。
8)化合物2的制备
在15℃将TosCl(2.57g，13.5mmol)加入到八乙二醇(5.00g，13.5mmol)和Et3N(1.37g，13.5mmol)在DCM(50mL)中的溶液中。接着，将混合物在15℃搅拌16小时。TLC显示起始物料被消耗并且形成了两个新斑点。用水(50mL)淬灭混合物并分离有机层。剩余的水相用DCM萃取(30mL*2)。将混合的有机层用Na2SO4干燥，浓缩，并进一步干燥。使用EtOAc，然后使用EtOAc：MeOH/9：1作为洗脱剂将残余物在CombiFlash装置中纯化，得到化合物2(3.59g，收率：51％)，其为无色油。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.59-3.76(30H，m)，4.18(2H，t，J＝4.8Hz)，7.36(2H，d，J＝8.0Hz)，7.82(2H，d，J＝8.4Hz)。
9)化合物3的制备
于0℃在N2存在下，将2-羟基异吲哚啉-1,3-二酮(1.11g，6.82mmol)和PPh3(2.33g，8.87mmol)加入到化合物2(3.58g，6.82mmol)的THF(30mL)溶液中。接着，将混合物在0℃搅拌30分钟。然后，在0℃将DIAD(1.66g,8.19mmol)加入到混合物中。将所得混合物于15℃在N2存在下搅拌16小时。TLC显示了一个新斑点。然后，减压去除溶剂。使用PE：EtOAc/1：1与EtOAc作为洗脱剂将残余物在CombiFlash装置中纯化，得到化合物3(3.91g，收率：86％)，其为无色油。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.47(3H，s)，3.56-3.73(26H，m)，3.86-3.91(2H，m)，4.16-4.20(2H，m)，4.37-4.42(2H，m)，7.36(2H，d，J＝7.6Hz)，7.75-7.88(6H，m)。
制备8：PD012的合成
1)化合物12-1的制备
将DIEA(13mg，0.10mmol)加入到化合物6-14(107mg，0.0638mmol)和化合物12-1a(25mg，粗油)在DMF(2mL)中的溶液中。将混合物在15℃搅拌16小时。TLC显示了另一个具有较低极性的黄斑点。真空去除DMF。将残余物用水(10mL)淬灭。将所得溶液用DCM萃取(15mL*4)。将合并的有机层用水(50mL)洗涤，有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，然后真空浓缩。使用EtOAc：MeOH/10：1作为洗脱剂将残余物通过制备型TLC纯化，得到化合物12-1(81mg，粗油)，其为黄色油。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.94-2.08(12H，m)，2.09-2.24(12H，m)，3.50-3.84(32H，m)，3.98-4.37(13H，m)，4.43-4.62(4H，m)，5.20(2H，d，J＝10.0Hz)，5.38(2H，d，J＝7.2Hz)，5.50-5.57(2H，m)，5.72(2H，t，J＝8.8Hz)，6.96(1H，d，J＝15.2Hz)，7.15(1H，s)，7.27-7.35(2H，m，重叠CDCl3信号)，7.39-7.47(2H，m)，7.51-7.62(4H，m)，7.71(2H，d，J＝8.0Hz)，7.81(1H，d，J＝15.2Hz)，7.94-8.09(2H，m)，8.11-8.20(2H，m)，8.36-8.48(3H，m)，10.07(1H，s)。
化合物6-14的合成与PD006的实施例中的相同。
2)PD012的制备
将K2CO3(12mg，0.090mmol)加入到化合物12-1(81mg，粗品)在DCM(0.2mL)和MeOH(0.4mL)中的溶液中。将混合物在15℃搅拌1小时。粗LC-MS显示在保留时间0.787(MS计算：1474.2；发现MS：1496.2[M+Na]+)处的产物的纯度为99％。真空浓缩反应混合物。将残余物通过制备型HPLC(0.225％FA)纯化。减压去除大部分MeCN，将剩余混合物冻干，得到PD012(31mg，两步收率：33％)，其为黄色固体。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.44-3.68(28H，m)，3.71-4.16(15H，m)，4.26-4.82(15H，m)，4.88-5.07(4H，m)，5.39(2H，brs)，7.25-7.64(8H，m)，7.57(1H，d，J＝5.2Hz)，7.81-8.02(4H，m)，8.07(1H，d，J＝7.6Hz)，8.17-8.36(4H，m)，8.37-8.46(2H，m)，8.81(1H，brs)，10.02(1H，s)。
3)化合物1的制备
在0℃将2,6-吡啶二甲酸(2.00g，12.0mmol)加入到SOCl2(8.83g，74.2mmol)的MeOH(25mL)溶液中。将混合物在70℃搅拌3小时。粗LC-MS显示在保留时间0.752(MS计算：195.1；发现MS：195.9[M+H]+)处的产物的纯度为99％。将反应混合物用NaHCO3饱和水溶液(30mL)淬灭，并且将所得溶液用EtOAc萃取(30mL*6)。合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤，然后真空浓缩，得到化合物1(2.33g，收率：99％)，其为白色固体。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.03(6H，s)，8.03(1H，t，J＝8.0Hz)，8.32(2H，d，J＝7.2Hz)。
4)化合物2的制备
在0℃将NaBH4(1.71g，45.1mmol)分批加入到化合物1(2.33g，11.9mmol)在MeOH(35mL)中的搅拌溶液中，并且将混合物在0℃搅拌1小时。粗LC-MS显示在保留时间0.297(MS计算：167.1；发现MS：167.7[M+H]+)处的产物的纯度为97％。将反应混合物用NaHCO3饱和水溶液(200mL)淬灭，并且将所得溶液用DCM萃取(100mL*6)。合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤，并真空浓缩。使用PE：EtOAc/1：1，然后使用EtOAc作为洗脱剂将残余物在硅胶柱中进行纯化，得到化合物2(832mg，收率：42％)，其为白色固体。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.45(1H，brs)，4.02(3H，s)，4.88(2H，d，J＝4.8Hz)，7.55(1H，d，J＝7.6Hz)，7.87(1H，t，J＝7.6Hz)，8.06(1H，d，J＝7.2Hz)。
5)化合物3的制备
在15℃将MnO2(4.33g，50.0mmol)加入到化合物2(832mg，4.98mmol)的1,2-二氯乙烷(25mL)溶液中，并且将混合物在90℃搅拌2小时。粗LC-MS显示在保留时间0.386(MS计算：165.1；发现MS：165.7[M+H]+)处的产物的纯度为98％。将混合物通过硅藻土过滤并蒸发滤液，得到化合物3(606mg，收率：73％)，其为白色固体。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.10(3H，s)，8.08(1H，t，J＝7.6Hz)，8.18(1H，d，J＝6.8Hz)，8.38(1H，d，J＝7.6Hz)，10.22(1H，s)。
6)化合物4的制备
在0℃将LiOH(132mg，5.50mmol)加入到化合物3(606mg，3.67mmol)在THF(6mL)和H2O(6mL)中的溶液中，并且将混合物在0℃搅拌1小时。TLC显示了另一个具有更大极性的新斑点，并显示起始物料被完全消耗。真空浓缩反应混合物，将剩余溶液用1N的HCl水溶液淬灭。所得溶液用EtOAc：THF＝10：1萃取(20mL*8)，得到不纯的产物(466mg)，其为白色固体。将不纯的产物用TBME：PE＝1：1(10mL)研制并过滤，并且真空干燥滤饼，得到化合物4(444mg，粗油)，其为白色固体。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.09(1H，dd，J＝7.6Hz，1.2Hz)，8.20(1H，t，J＝7.6Hz)，8.29(1H，dd，J＝7.6Hz，1.2Hz)，10.03(1H，s)。(注：没有观察到活性质子)。
7)化合物12-1a的制备
于15℃在N2存在下，将EDCI(136mg，0.708mmol)加入到化合物4(100mg，粗品)和N-羟基琥珀酰亚胺(80mg，0.695mmol)在DMF(1.5mL)中的溶液中，并且将混合物在15℃搅拌4小时。粗LC-MS显示在保留时间1.289(MS计算：248.1；发现MS：248.9[M+H]+)处的产物的纯度为96％。真空去除DMF，并且使用PE：EtOAc/2：3作为洗脱剂将残余物在硅胶柱中进行纯化，得到化合物12-1a(51mg，不纯)，其为白色固体。
制备实施例9：PD013的合成
根据Synaffix的美国专利No.9,636,421中描述的方法制备接头。使用制备的接头以与制备实施例8中相同的方式制备接头-药物复合物。
(PD013)
实施例1.与正常细胞相比，肿瘤细胞系中β-半乳糖苷酶的过表达
通过蛋白质印迹法鉴定肿瘤细胞系中β-半乳糖苷酶的表达。将15个细胞系(每个细胞系1×107)用PBS洗涤，然后离心以得到细胞沉淀。用哺乳动物蛋白质提取试剂(Thermo，78501)裂解细胞，并提取细胞中含有的蛋白质。将200μl的/>哺乳动物蛋白提取试剂加入到细胞沉淀中，移液，并使其反应10分钟。将反应溶液离心并收集上清液。使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce，23225)测量上清液中蛋白质的浓度。将每个细胞系的10ug蛋白提取物进行SDS-PAGE电泳。电泳后，使用iBlot转印系统将蛋白质转印到PVDF膜(Invitrogen，IB401002)。将该膜用4％BSA(PBS)在室温封闭2小时，抗β-半乳糖苷酶抗体(1/10000，abcam，ab128993)处理，并使其在4℃反应15小时。将反应产物用1×PBST(1×PBS+0.05％Tween20)洗涤3次，用抗兔IgG HRP(1/3000，Pierce，65-6120)处理，并使其在室温反应1小时。所得产物用1×PBST洗涤3次并用ECL溶液(GE Healthcare，RPN2232)处理，并检测蛋白质。将已用于鉴定β-半乳糖苷酶表达的膜剥离，以鉴定β-肌动蛋白的表达。将剥离的膜用4％BSA(PBS)在室温封闭2小时，然后使其与抗肌动蛋白抗体(1/1000，Santa Cruz，SC-47778)在4℃反应15小时。将膜用1×PBST(1×PBS+0.05％Tween20)洗涤3次，抗小鼠IgGHRP(1/10000，Pierce，31432)处理，并使其在室温反应1小时。将反应产物用1×PBST洗涤3次并用ECL溶液处理，并检测蛋白质。
蛋白质印迹法的结果显示，β-半乳糖苷酶在15个肿瘤细胞系中均有表达。另外，TCGA(癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas))数据的分析结果显示，与正常组织相比，肿瘤组织中β-半乳糖苷酶的mRNA表达水平较高(图2)。图2示出了肿瘤组织和正常组织中β-半乳糖苷酶基因GLB1的mRNA表达比例，并且表明，与正常组织相比，肿瘤组织中β-半乳糖苷酶被高表达。特别是在子宫癌的情况下，GLB1在肿瘤组织中的表达是在正常组织中的表达的2倍，并且乳腺癌组织也过表达GLB1达到68％以上。这表明在肿瘤细胞中高表达的β-半乳糖苷酶能够用作肿瘤选择性活化酶。
实施例2.接头-药物复合物的功效的评估
评估了制备的含有β-半乳糖苷酶的接头-药物复合物本身的细胞毒性。具体地，将溶解在DMSO中的每种接头-药物复合物在用于细胞培养的培养基中从200nM连续稀释3次至30pM以制备样品，并且用该样品处理各种癌细胞系，最终将细胞暴露于100nM至15pM的接头-药物复合物。将细胞培养6天，使用CCK-8细胞计数试剂盒观察细胞活力并评估细胞毒性。评估结果简单显示于表2，而代表性反应曲线如图3所示。如表2和图3所示，PD003对大多数细胞没有细胞毒性，因此无法确定IC50。另一方面，PD001对多种细胞具有细胞毒性，并且IC50显示于表2中。
这些实验结果表明，癌细胞中存在足够的降解β-半乳糖的β-半乳糖苷酶，因此PD001能够在多种癌细胞中被β-半乳糖苷酶激活，并且能够表现出细胞毒性。PD003无活性的事实间接表明β-葡萄糖部分不能用作β-葡萄糖苷酶的底物。另外，下面给出的示例表明，以ADC形式制备的PD001比单一物质更具细胞毒性，这支持ADC形式对药物递送和激活更有效的观点。
[表2]
无响应
实施例3.抗体与药物结合的抗体-药物偶联物(ADC)的制备
为了制备抗体与药物结合的ADC，将在现有抗体轻链的第149位(根据Kabat编号，这也适用于下文)的赖氨酸(K)突变为半胱氨酸(C)并使其与还原剂(如二硫苏糖醇(DTT))反应，以在抗体轻链K153C上生成硫醇基(K153C T)，并且该抗体通过硫醇基与药物之间产生的二硫键与药物偶联。具体地，通过超滤/渗滤(UF/DF)以5mg/ml或更高的浓度制备抗体，并且向其中加入1M的三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)与pH 8.8、500mM的乙二胺四乙酸(EDTA)以将最终的抗体浓度调节为5mg/ml，并且得到75mM的Tris-HCl和2mM的EDTA。将100mM的二硫苏糖醇(DTT)加入到已制备的抗体中，使得抗体与DTT的摩尔比调节为1：20，并且允许在25℃反应16.5小时，以去除抗体轻链的第149位的半胱氨酸处通过二硫键连接的游离半胱氨酸。此过程称为“脱帽”，然后进行阳离子交换色谱法(CEX)作为分离脱帽抗体的纯化方法。在用SPHP-A缓冲液[10mM琥珀酸盐，pH 5.0]和SPHP-B缓冲液[50mM三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)，pH 7.5，0.5M氯化钠]平衡的HiTrap SPHP柱(GE Healthcare)上洗脱反应产物。通过使用1M的三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl，pH7.5)以重新结合脱帽抗体，在75mM的Tris-HCl(pH7.5)中制备待氧化的抗体；将脱氢抗坏血酸(DHAA)(一种氧化的维生素C)以1：20的抗体与DHAA的比例添加，并于25℃在黑暗中再氧化2小时。然后，为了分离再氧化的抗体，使用阳离子交换色谱(CEX)纯化方法用SPHP-C缓冲液[10mM琥珀酸盐，pH 5.0，0.5M氯化钠]洗脱所得物。通过超滤/渗滤(UF/DF)将纯化的抗体浓缩至5mg/ml或更多。然后，为了产生抗体-药物偶联物，将待反应的抗体在100mM三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl，终浓度：5mg/ml，pH 8.0)中制备，并添加1M三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl，pH 8.0)，使得抗体与药物的摩尔比为1：10，然后允许在25℃反应16.5小时。然后，为了分离抗体-药物偶联物，使用阳离子交换色谱(CEX)纯化方法用SPHP-C缓冲液[10mM琥珀酸盐，pH 5.0，0.5M氯化钠]进行洗脱。然后，使用疏水作用色谱法(HIC)来分离DAR2抗体-药物偶联物。为此，用HIC-A缓冲液[50mM磷酸钾，pH 7.0，1.0M硫酸铵]平衡HiTrap丁基HP柱(GE Healthcare)，并使用HIC-B缓冲液[50mM磷酸钾，pH 7.0，30％异丙醇(2-丙醇)]洗脱。然后，通过超滤/渗滤(UF/DF)将抗体与HA缓冲液[20mM组氨酸，pH5.5，240mM蔗糖]交换以去除异丙醇(2-丙醇)，从而制备最终的抗体-药物偶联物。
表3示出根据本发明的ADC、使用D-葡萄糖β-吡喃糖或葡萄糖醛酸苷作为触发物的ADC以及连接到不同药物的ADC的名称和具体配置。各抗体的VH和VL序列如表1所示。
[表3]
实施例4.ADC的表征
4-1.已制备的ADC的纯度的检测
通过体积排阻-高效液相色谱法(SE-HPLC)测量已制备的ADC的纯度。在Agilent1200系列HPLC仪器上使用Tosoh TSKgel G3000SWxl柱(Tosoh bioscience)比较每个样品的洗脱位置和曲线下面积(AUC)，以确定D20106和D20109的纯度。确认ADC的主峰纯度为97％或更高，并且总方法收率(基于抗体)为20％或更高。这些结果分别显示在图4和图5中。
4-2.已制备的ADC的药物-抗体比的检测
ADC的药物-抗体比(DAR)通过液相色谱-质谱(LC/MS)方法确定。每100μg的1mg/mlADC(在PBS中)抗体添加1个单位的PNGaseF(NEB)，然后在37℃孵育15小时并去除N-聚糖。将Acquity UPLC BEH200 SEC 1.7μm(4.6*150mm)柱安装在LC/MS装置(包括Waters UPLC I-class设备和Waters Synapt G2-S)上，并且使用30％(v/v)乙腈、0.1％(v/v)甲酸和0.05％三氟乙酸(TFA)的流动相进行平衡。将去除了N-聚糖的5μg样品加载到其上并实施LC/MS。从作为LC/MS结果获得的分子量分布计算每种化学物质的相对含量的加权平均值，以确定DAR。这些结果分别显示在图6和图7中。如图6和7所示，D20106和D20109的DAR约为2。这些结果表明，PD006和PD009以预期的DAR数值连接至抗体。
4-3.已制备的ADC的体外靶向特异性细胞毒性的检测
(1)多发性骨髓瘤细胞系中的体外细胞毒性
使用表达BCMA的多发性骨髓瘤细胞系MM NCI-H929检测含有抗BCMA抗体的ADC，即D20103(B58 PD001)、D20106(B58 PD006)和D20109(B58 PD009)的体外细胞毒性。具体地，将50μl的在含有RPMI(ATCC)、10％FBS(Gibco)、0.05mMβ-巯基乙醇和抗生素-抗真菌药(Gibco)的培养基中培养的H929细胞系(ATCC，CRL-9068TM)以20,000个细胞/孔的密度接种在96孔板上，并且每孔接种50μl以相同培养基稀释的ADC。通过连续稀释，ADC的浓度从200nM变为5pM。然后，将细胞在37℃和5％CO2下孵育约6天。孵育后，每孔加入10μl WST-8(Dojindo)，然后进一步孵育。使用SpectraMax酶标仪在450nm波长处测量吸光度。将吸光度和ADC浓度之间的响应曲线进行4PL曲线拟合以计算IC50值(nM)，IC50值是指50％细胞凋亡的浓度。结果显示在图8中。D20103、D20106和D20109均表现出极好的效价，尤其是包括PD009的D20109具有最好的功效。偶联再过滤后得到的PD009的量高于PD006的情况，并且在相同条件下能够生产更多具有高DAR的ADC。就此而言，下表4示出偶联过程中反应后的阳离子交换树脂的纯化的结果。PD009的这种工艺特性是由于其相对高的溶解度，因此认为PD009为更工艺友好的。
[表4]
(2)套细胞淋巴瘤细胞系的体外细胞毒性
使用表达ROR1的人类套细胞淋巴瘤细胞系Mino和Jeko-1检测D20204(C2E3-PD001)(一种含有抗ROR1抗体的ADC)的体外细胞毒性。此处使用的对照组为：(i)C2E3-PD003，其包括相同的抗ROR1抗体C2E3，但包括PD003作为药物，不含D-葡萄糖β-吡喃糖，而含有D-半乳糖β-吡喃糖作为触发物，以及(ii)C2E3-CAAX-MMAE，其包括相同的抗ROR1抗体C2E3，并包括常规药物MMAE。具体地，在含有RPMI(ATCC)、20％FBS(jeko-1)(Gibco)或15％FBS(mino)和抗生素-抗真菌药(Gibco)的培养基中培养的Jeko-1细胞系(ATCC，CRL-3006TM)和Mino细胞系(ATCC，CRL-3000TM)各50μl，以20,000个细胞/孔接种在96孔板上，然后进行确定细胞毒性的测试。随后的实验方法与抗BCMAADC的实验方法相同。
结果显示在表5和图9中。在Mino细胞系中，D20204比对照C2E3-CAAX-MMAE更具细胞毒性，并且含有葡萄糖作为触发物的C2E3-PD003没有细胞毒性。在Jeko-1中，D20204的细胞毒性略低于C2E3-CAAX-MMAE，而PD003根本没有细胞毒性。这表明，与含有葡萄糖作为触发物的ADC相比，含有半乳糖作为触发物的本发明的ADC表现出显著优越的靶向特异性细胞毒性。
[表5]
(3)胃癌细胞系和乳腺癌细胞系中的体外细胞毒性
使用表达Her2的胃癌细胞系(NCI-N87)和乳腺癌细胞系(HCC1954)检测D20001(T-PD001)(一种含有抗Her2抗体的ADC)的体外细胞毒性。此处使用的对照组为D20103(B58-PD001)，其包括与相同药物PD001连接的抗BCMA抗体。具体地，在含有RPMI(ATCC)、10％FBS(Gibco)和抗生素-抗真菌药(Gibco)的培养基中培养的NCI-N87细胞系(ATCC，CRL-5822TM)和HCC1954细胞系(ATCC，CRL-2338TM)各50μl，以10,000个细胞/孔或5,000个细胞/孔接种在96孔板上，然后进行确定靶向特异性细胞毒性的测试。随后的实验方法与抗BCMA ADC的实验方法相同。
结果显示在表6和图10中。表达Her2的NCI-N87和HCC1954细胞系表现出D20001的细胞毒性，但未表现出D20103(一种抗BCMA ADC)的细胞毒性。这表明，根据本发明的ADC具有靶向特异性细胞毒性，其取决于ADC中所含抗体的类型。
[表6]
IC50(nM) D20001 D20103(非结合体) 非结合体/结合体比
NCI-N87 0.0365 16.7 457
HCC1954 0.263 无响应 n.d.
(4)卵巢癌细胞系的体外细胞毒性
使用表达NaPi2b的卵巢癌细胞系(OVCAR-3)检测D20002(10H1-PD001)(一种含有抗NaPi2b抗体的ADC)的体外细胞毒性。此处使用的对照组为D20103(B58-PD001)，其中抗BCMA抗体与相同的药物PD001连接。具体地，将50μl的在含有RPMI(ATCC)、20％FBS(Gibco)和抗生素-抗真菌药(Gibco)的培养基中培养的OVCAR-3细胞系(ATCC，HTB-161TM)以5,000个细胞/孔接种至96孔板的每个孔中，然后进行确定体外细胞毒性的测试。随后的实验方法与抗BCMA ADC的实验方法相同。
结果显示在图11中。从图11中可以看出，包含D20002的ADC表现出1.53nM的IC50。含有D20002的ADC具有100或更高的非结合体/结合体(non-binder/binder)比，因此在实体癌细胞系中表现出最好的反应性。另一方面，含有D20103的ADC没有D20103(一种抗BCMA ADC)的细胞毒性。这表明，根据本发明的ADC具有靶向特异性胞毒性，其取决于ADC中所含抗体的类型。
(5)结论
将制备成包括含有D-半乳糖β-吡喃糖作为触发物的药物的本发明的ADC的体外细胞毒性与各种对照ADC的体外细胞毒性进行比较。结果表明，根据本发明的大多数ADC在各种细胞系中具有1nM或更小的IC50，并且通过体外实验确定了其作为有效药物的潜力(表7)。
[表7]
·具有不完全响应的S形响应曲线
·ND:已测试，但未确定
·NA:不可用
4-4.体内靶向特异性细胞毒性的检测
为了确定ADC的体内靶向特异性细胞毒性，测试了在不同癌细胞系的异种移植小鼠模型中的肿瘤抑制功效。具体地，将0.5×107或1×107个癌细胞与基质胶(Matrigel)混合，然后皮下注射到6-8周龄雌性Fox Chase SCID小鼠(CB17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl)或裸小鼠的胁腹中。当平均肿瘤尺寸达到150mm3至200mm3时，将小鼠依次分类为各个实验组。通过ADC组和对照组中每只小鼠的尾静脉施用药物，并且PBS(载体)用作阴性对照。通过使用游标卡尺测量肿瘤的长轴和短轴来确定肿瘤的尺寸，并使用以下等式计算肿瘤体积：
肿瘤体积(mm3)＝(0.5)×(长轴)×(短轴)2
(1)人类套细胞淋巴瘤细胞异种移植小鼠模型中的细胞毒性
在使用表达ROR1的人类套细胞淋巴瘤细胞系Jeko-1的异种移植小鼠模型中检测D20204(C2E3-PD001)的体内细胞毒性。将包括C2E3作为抗体和MMAF作为药物的C2E3-mc-MMAF用作对照组并且以4mg/kg的单次ADC剂量每周3次进行施用。
结果显示在图12中。D20204在体外测试中表现出大于10nM的IC50(图9)，但在体内实验中表现出比与MMAF偶联的ADC显著优越的效果。
(2)人类多发性骨髓瘤细胞异种移植小鼠模型中的细胞毒性
在使用表达BCMA的多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929的异种移植小鼠模型中检测D20106(B58-PD006)和D20109(B58-PD009)的体内细胞毒性。具体地，使用6-7周龄的FoxChase SCID小鼠，并且将1×107个NCl-H929细胞与基质胶(Matrigel)混合并皮下植入每只小鼠的胁腹。当平均肿瘤尺寸达到180mm3至200mm3时向其施用药物。将这两种物质D20106和D20109分别以三种剂量(2.5mpk、1.25mpk、0.625mpk)施用，并且每周测量两次肿瘤尺寸并持续观察3周。
如图13所示，D20106和D20109在多发性骨髓瘤细胞异种移植模型中均表现出极好的细胞毒性。具体地，D20106和D20109有效抑制NCI-H929肿瘤的生长，并且除了以低剂量(0.625mpk)施用D20106的组之外，其它治疗组中的肿瘤消失。
(3)急性骨髓性白血病细胞异种移植小鼠模型中的细胞毒性
在使用表达CLL-1的急性骨髓性淋巴瘤(AML)细胞系EOL-1和HL-60的异种移植小鼠模型中检测D20502(6E7-PD009)的体内细胞毒性。具体地，使用6-7周龄Fox Chase SCID小鼠，将5×106个EOL-1细胞或HL-60细胞与基质胶(Matrigel)混合并皮下植入每只小鼠的胁腹，并且当平均肿瘤尺寸为180mm3至200mm3时向其施用药物。D20502以2mpk的单次剂量施用一次，并且每周测量两次肿瘤尺寸并持续观察3周。
从图14可以看出，在2mpk剂量时，D20502在两种AML异种移植模型中均有效抑制肿瘤生长，并且所有肿瘤在施用后2周消失。
4-5.用于确定最大耐受剂量的单次剂量啮齿动物毒性试验1
进行了单次剂量啮齿动物毒性试验以评估含有PD001或PD006的ADC的毒性并确定最大耐受剂量。具体地，如下表8所示，将7-8周龄的雌性SD大鼠依次分组，使得各组的平均体重相似。将ADC以5mpk至45mpk的剂量施用至其尾静脉，并在第3天、第18天和第35天收集血样用于血液学和血清生化分析。在第34天处死所有其它动物，并对主要器官进行组织病理学分析。第1组，即对照组，施用作为载体的pH 6.0的20mM组氨酸和7％海藻糖。
[表8]
测试物质 剂量 施用次数
第1组(G1) 赋形剂 - 一次
第2组(G2) D20103 5mpk 一次
第3组(G3) D20103 15mpk 一次
第4组(G4) D20103 45mpk 一次
第5组(G5) D20106 5mpk 一次
第6组(G6) D20106 15mpk 一次
第7组(G7) D20106 45mpk 一次
(1)重量变化
使用小动物秤将所有动物在第1天(施用前)和第2、4、8、15、19、22、25、28、31、34和35天称重。测量死亡的和垂死的动物的重量，随后在发现此类死亡的或垂死的动物后立即对其进行尸检。
重量变化的测量结果显示在图15中。如图15所示，在以45mpk的剂量施用的第4组和第7组以外的组中未观察到体重减轻。在以最大剂量施用的第4组和第7组中，所有受试者均在实验结束前死亡。
(2)血液学分析
通过血液学测试评估ADC的毒性。在施用之后，在第3天(第一次采血)、第18天(第二次采血)和第35天(第三次采血)进行静脉采血，并且动物在采血前禁食(但提供水)过夜。将约0.5mL血液注入含有EDTA-2K(一种抗凝血剂)的CBC瓶中后，使用自动血液分析仪测量白细胞水平的变化，并且结果显示在图16中。分析结果显示，在以高剂量施用的第4组和第7组以外的组中未观察到显著的毒性。由于施用的物质引起的毒性，白细胞计数暂时减少，但随着时间的推移逐渐恢复。
(3)血清生化分析
通过分析血液生化参数(如ALT(丙氨酸氨基转移酶)、AST(天冬氨酸氨基转移酶)和血尿素氮(BUN))检测ADC的毒性。在施用之后，在第3天(初次采血)、第18天(第二次采血)和第35天(第三次采血)进行静脉采血。将约1mL血液注入含有凝血活化剂的5mL真空采血管中，使其在室温下凝血15至20分钟，然后离心10分钟。使用血液生化分析仪检测得到的血清。结果显示在图17中。分析的结果是，在以45mpk的剂量施用的第4组和第7组以外的组中未观察到显著的毒性。
(4)病理分析结果
表9显示了尸检时观察到的每个器官的症状。在施用ADC的组，即G2、G3、G4和G7中观察到胸腺的萎缩，但这被认为是由于白细胞减少而不是测试物质的直接效应。在垂死的动物的脾、胃和淋巴结中发现了其它结果，但不伴有组织病理学变化，或是自发性变化，因此认为它们不是ADC毒性引起的症状。
表10示出组织病理学结果。在肾小管中观察到巨核细胞的形成并表现出剂量-反应相关性，这被认为是由于测试物质所致。特别是，这种现象仅在D20103中观察到，而在D20106中未观察到，因此推测用于接头的PEG基涉及降低肾毒性。
[表9]
[表10]
4-6.用于确定最大耐受剂量的单次剂量啮齿动物毒性试验2
实验组如下表11所示进行设置，并对其进行单次剂量啮齿动物毒性试验，以评估含有PD006或PD009的ADC的毒性并确定最大耐受剂量。
[表11]
组 测试物质 剂量
G1 载体
G2 D20106 10mpk，一次
G3 D20106 20mpk，一次
G4 D20106 30mpk，一次
G5 D20109 5mpk，一次
G6 D20109 10mpk，一次
G7 D20109 20mpk，一次
施用、饲养和称重方法与上述4-5中的相同。在施用后第3天、第14天和第35天采血，并使用自动血液分析仪进行血液学检查。试验完成后，进行安乐死、尸检和病理检查。第1组，即对照组，施用作为载体的pH 6.0的20mM组氨酸和7％海藻糖。
试验动物的体重变化显示在图18中。所有实验组在施用后2周内均观察到涉及体重减轻的急性毒性反应，但在除G4和G7之外的其它组中均恢复，G4和G7为用最高剂量施用的组。G4和G7在施用后3周内缓慢恢复。在第36天所有组的体重减轻为处死前禁食导致的变化。
此外，在图19中示出血液学检查时白细胞计数的变化的测量结果。观察到类似于体重变化的模式，并且在以最高剂量施用的组以外的组中，在施用后第14天观察到白细胞毒性的降低，并在施用后第35天(即试验结束日期)恢复。然而，在接受最高剂量的组(即G4和G7组)中，没有白细胞计数恢复的模式。
因此，基于体重和白细胞计数这两个指标，含有PD006的D20106的最大耐受剂量(MTD)设定为20mpk，而含有PD009的D20109的最大耐受剂量设定为10mpk。
4.7.用于与类似物质比较的单次剂量啮齿动物毒性试验
为了证明含有作为触发物的β-半乳糖的载荷在毒性方面优于含有具有与其相似结构的另一种触发物的载荷，合成了具有以下结构且基于CBI和β-葡萄糖醛酸苷的GT70，在此基础上制备了ADC，并比较了毒性。以与实施例2中相同的方式制备ADC，不同之处在于将作为接头-药物的GT70与B58抗体偶联，并命名为“D20111”。
向SD大鼠各施用1次D20109和D20111，连续28天观察体重变化与血液学和血液生化变化，并且根据这些变化确定毒性表达和恢复。单次剂量毒性试验的具体方法如上述实施例4-5所述，实验组的配置见下表12。
[表12]
测试物质 剂量 剂量次数
第1组 载体 单次剂量
第2组 D20109 6.16mpk 单次剂量
第3组 D20109 12.32mpk 单次剂量
第4组 D20111 6.30mpk 单次剂量
第5组 D20111 12.6mpk 单次剂量
在图20中示出试验结果。所有毒理学指标均显示出剂量依赖性反应，并且在高剂量组(第3组和第5组)中比在低剂量组(第2组和第4组)中观察到更多毒性反应。当观察到体重变化时，在相同的剂量水平下，施用D20109的组比施用D20111的组减轻的体重更少，并且在试验结束时恢复了更多的体重(图20)。即使根据作为血液学指标的血白细胞计数来比较毒性，与施用D20111的组相比，施用D20109的组显示出较少的白细胞减少，并且显示出恢复模式(图20)。特别是，在高剂量组D20111中，雄性的血红细胞计数直到实验结束才恢复(图20)。这支持以下结果：β-半乳糖在用作ADC的触发物时，与具有类似结构的其它材料相比具有显著优越的稳定性。
【工业实用性】
根据本发明的连接至含有半乳糖触发物的载荷的ADC具有靶向特异性属性，即只有当半乳糖被在癌细胞或肿瘤细胞中高表达的β-半乳糖苷酶去除时才显示出细胞毒性，从而显著降低药物过早释放的风险以及由此引起的后续全身毒性。此外，发现根据本发明的含有半乳糖触发物的ADC，与具有与其类似结构的另一种触发物的ADC(例如具有作为触发物的葡萄糖或葡萄糖醛酸苷的ADC)相比，表现出优异的药物功效和更低的体内毒性。也就是说，与常规前药相比，毒性较小的、体内高度稳定的、表现出优异功效并且具有更宽的治疗窗口的ADC可以使用根据本发明的利用半乳糖触发物的载荷制备。
虽然已经详细描述了本发明的具体配置，但是本领域技术人员将理解，提供此说明书是为了说明目的而阐述优选实施方式，并且不应被解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求及其等效内容限定。
【序列表自由文本】
附加有电子文件。
序列表
<110> ABL生物公司
<120> 抗体-药物偶联物及其用途
<130> 2353
<160> 20
<170> PatentIn版本3.2
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
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<220>
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Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
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Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 19
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6E7(N54A) VL
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Cys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 20
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6E7(N54A) VH
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
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Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Ala Gly Ala Ala Phe Tyr Ser Gln Asn Phe
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165 170 175
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180 185 190
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210 215 220
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225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
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370 375 380
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Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450

Claims (13)

1.一种由下式(I)表示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
其中，R1为D-半乳糖β-吡喃糖或D-半乳糖α-吡喃糖；
R2为Cl；并且
R3为-O-或-NH-。
2.一种由下式(II)表示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
其中，R1为D-半乳糖β-吡喃糖或D-半乳糖α-吡喃糖；
R2为Cl；
R3为-O-或-NH-；
W为间隔基；并且
L1为接头。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中，W为-R4-A-R5-、-R4-A-、-(CH2CH2R6)x-、-(CH2)r(R7(CH2)p)q-、-((CH2)pR7)q-、-(CH2)r(R7(CH2)p)qR8-、-((CH2)pR7)q(CH2)r-、-R8((CH2)pR7)q-或-(CH2)r(R7(CH2)p)qR8CH2-，
其中，R4和R5各自独立地为-(CH2)r(V(CH2)x)p(CH2)q，其中，A为直接键或肽键；并且V为单键、O或S；并且
R6为-O-、C1-C8亚烷基、-NR9-或-C(O)NR13-；并且
R7和R8各自独立地为单键、-O-、-NR10-、-C(O)NR11-、-NR12C(O)-或C3-C20杂芳基，
其中，R9至R13各自独立地为氢、C1-C6烷基、(C1-C6烷基)C6-C20芳基或(C1-C6烷基)C3-C20杂芳基；
X为1至5的整数；
r为0至10的整数；
p为0至10的整数；并且
q为0至20的整数，
其中，W中的1至10个氢原子任选地被羟基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、氨基、ONH2或羰基取代。
4.根据权利要求2所述的化合物，其中，L1为羟基、醛基、ONH2、NH2或含有1至3个选自N、O和S的杂原子的4至7元杂芳基，或具有由下式(I-a)或(I-b)表示的结构，其中，所述杂芳基能够被1至5个独立地选自羟基、醛基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、氨基、ONH2和羰基的取代基取代：
其中，Q2为环辛炔基或杂环辛炔基，其中，所述环辛炔基或杂环辛炔基任选地与各自独立地选自C3-C12环烷基、C3-C12芳基和C3-C12杂芳基中的1或2个环稠合，并且任选地被羟基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、氨基、ONH2或羰基取代；
R13选自C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C3-C24芳基、C3-C24杂芳基、C3-C24烷基芳基、C3-C24烷基杂芳基、C3-C24芳基烷基和C3-C24杂芳基烷基，其中，所述杂芳基含有选自O、S和NR14的杂原子，其中，R14为氢或C1-C4烷基；
Sp1、Sp2、Sp3和Sp4为间隔基部分并且各自独立地选自：单键，或直链或支链的C1-C200亚烷基、C2-C200亚烯基、C2-C200亚炔基、C3-C200亚环烷基、C5-C200亚环烯基、C8-C200亚环炔基、C7-C200烷基亚芳基、C7-C200芳基亚烷基、C8-C200芳基亚烯基和C9-C200芳基亚炔基，其中，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被选自O、S和NR14的杂原子取代或含有选自O、S和NR14的杂原子；
Z1和Z2各自独立地选自O、C(O)和N(R13)；
a各自独立地为0或1；
b各自独立地为0或1；
c为0或1；
d为0或1；
e为0或1；
f为0至150的整数；
g为0或1；并且
i为0或1。
5.根据权利要求2所述的化合物，包括由下式表示的化合物：
6.根据权利要求2所述的化合物，包括由下式表示的化合物：
7.一种包含由下式(III)表示的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的抗体-药物偶联物：
其中
R1为D-半乳糖β-吡喃糖或D-半乳糖α-吡喃糖；
R2为Cl；
R3为-O-或-NH-；
W为间隔基；
L2为接头；并且
Ab为抗体或其抗原结合片段。
8.根据权利要求7所述的抗体-药物偶联物，其中，W为-R4-A-R5-、-R4-A-、-(CH2CH2R6)x-、-(CH2)r(R7(CH2)p)q-、-((CH2)pR7)q-、-(CH2)r(R7(CH2)p)qR8-、-((CH2)pR7)q(CH2)r-、-R8((CH2)pR7)q-或-(CH2)r(R7(CH2)p)qR8CH2-，
其中，R4和R5各自独立地为-(CH2)r(V(CH2)x)p(CH2)q，其中，A为直接键或肽键；并且V为单键、O或S；并且
R6为-O-、C1-C8亚烷基、-NR9-或-C(O)NR2-；并且
R7和R8各自独立地为单键、-O-、-NR10-、-C(O)NR11-、-NR12C(O)-或C3-C20杂芳基，
其中，R9至R13各自独立地为氢、C1-C6烷基、(C1-C6烷基)C6-C20芳基或(C1-C6烷基)C3-C20杂芳基；
X为1至5的整数；
r为0至10的整数；
p为0至10的整数；并且
q为0至20的整数，
其中，W中的1至10个氢原子任选地被羟基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、氨基、ONH2或羰基取代。
9.根据权利要求7所述的抗体-药物偶联物，其中，L2为-CH2NH-、-ON＝C(CH3)-、-ON＝、-CH＝、CH＝N-或含有1至3个选自N、O和S的杂原子的4至7元杂环，或具有由下式(II-a)或(II-b)表示的结构，其中，所述杂环能够被1至5个独立地选自羟基、醛基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、氨基、ONH2和羰基的取代基取代：
其中，Q2为与三唑稠合的环辛烯基或与三唑稠合的杂环辛烯基，其中，所述环辛烯基或杂环辛烯基任选地还与各自独立地选自C3-C12环烷基、C3-C12芳基和C3-C12杂芳基的1或2个环稠合，任选地被羟基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、氨基、ONH2或羰基取代，其中，Q2通过包含在所述三唑中的氮原子与Ab连接；
Sp1、Sp2、Sp3和Sp4为间隔基部分并且各自独立地选自：单键，或直链或支链的C1-C200亚烷基、C2-C200亚烯基、C2-C200亚炔基、C3-C200亚环烷基、C5-C200亚环烯基、C8-C200亚环炔基、C7-C200烷基亚芳基、C7-C200芳基亚烷基、C8-C200芳基亚烯基和C9-C200芳基亚炔基，其中，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被选自O、S和NR14的杂原子取代或含有选自O、S和NR14的杂原子；
Z1和Z2各自独立地选自O、C(O)和N(R13)；
a各自独立地为0或1；
b各自独立地为0或1；
c为0或1；
d为0或1；
e为0或1；
f为0至150的整数；
g为0或1；并且
i为0或1。
10.根据权利要求7所述的抗体-药物偶联物，其中，由所述式(III)表示的所述化合物包括由下式表示的化合物：
11.根据权利要求7所述的抗体-药物偶联物，其中，所述接头通过引入所述抗体的半胱氨酸、赖氨酸、叠氮基或酮基或者通过抗体蛋白质的N端与所述抗体连接。
12.根据权利要求7所述的抗体-药物偶联物，其中，所述抗体选自由抗BCMA抗体、抗ROR1抗体、抗Her2抗体、抗NaPi2b抗体和抗CLL1抗体组成的组。
13.一种用于预防或治疗增殖性疾病的药物组合物，包含根据权利要求7至12中任一项所述的抗体-药物偶联物。
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