CN105828840A - 1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚二聚体抗体-药物缀合物化合物及使用和治疗方法 - Google Patents

1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚二聚体抗体-药物缀合物化合物及使用和治疗方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供包含经由接头与1?(氯甲基)?2,3?二氢?1H?苯并[e]吲哚(CBI)二聚体药物部分缀合的抗体的抗体?药物缀合物及使用所述抗体?药物缀合物的方法。

Description

1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚二聚体抗体-药物缀 合物化合物及使用和治疗方法
相关申请的交叉引用
所提交的本申请要求2013年12月16日提交的美国临时申请61/916,388和2014年3月24日提交的美国临时申请61/969,499及2014年6月16日提交的国际申请PCT/US2014/042560的优先权的权益，通过引用的方式将其全部内容并入本文。
技术领域
本发明大体涉及与1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚(CBI)二聚体药物部分缀合以形成具有治疗性或诊断性应用的抗体-药物缀合物的抗体。所述抗体可用游离半胱氨酸氨基酸工程化，所述游离半胱氨酸氨基酸的反应性用于与CBI二聚体药物-接头中间体缀合。本发明还涉及使用所述CBI二聚体抗体-药物缀合物化合物在体外、原位和体内诊断或治疗哺乳动物细胞或相关病理学病症的方法。
背景技术
抗体药物缀合物(ADC)是靶向化学治疗分子，组合抗体和细胞毒性药物二者的特性，即通过将有效的细胞毒性药物靶向表达抗原的肿瘤细胞，内在化，并释放药物，由此增强它们的抗肿瘤活性(Carter,P.and Senter,P.(2008)The Cancer Jour.14(3):154-169)。针对给定靶抗原的成功ADC开发取决于抗体选择、接头设计和稳定性、细胞毒性药物效力及药物和接头缀合至抗体的方式的优化(Polakis,P.(2005)Current Opinion inPharmacology 5:382-387)。
5-氨基-1-(氯甲基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚(氨基CBI)类DNA小沟烷基化剂是有效的细胞毒素(Atwell等(1999)J.Med.Chem.,42:3400)，并且已在许多涉及为癌症疗法的前药中被用作效应子单元。它们已包括抗体缀合物(Jeffrey等(2005)J.Med.Chem.,48:1344)、基于氨基甲酸硝基苄基酯的用于基因疗法的前药(Hay等(2003)J.Med.Chem.46:2456)和作为缺氧活化前药的相应的硝基-CBI衍生物(Tercel等(2011)Angew.Chem.,Int.Ed.,50:2606-2609)。CBI与吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂(PBD)药效团已通过烷基链连接在一起(Tercel等(2003)J.Med.Chem 46:2132-2151)。PBD二聚体(其中两个吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂单元被亚烷基或亚烷基-亚芳基束缚)是与DNA小沟中胍反应的非常有效的股间交联剂(Rahman等(2009)Jour.Amer.Chem.Soc.131(38):13756-13766；Thurston等(1994)Chem.Rev.,94:433-465；Bose等(1992)J.Am.Chem.Soc.114:4939-4941；Gregson等(2004)Jour.Med.Chem.47(5):1161-1174；US7511032；US7528126；US7557099；US7049311；US7067511；US7265105)且具有对抗革兰氏阳性菌(Doyle等(2009)Jour.Antimicrob.Chemo.65(5):949-959；Hadjivassileva等(2005)Jour.Antimicrob.Chemo.56(3):513-518)、人类B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞(Pepper等(2004)Cancer Res.64(18):6750-6755)和实体肿瘤(Hochhauser等(2009)Clin.Cancer Res.15(6):2140-2147；Alley等(2004)64(18):6700-6706；Hartley等(2004)Cancer Res.64(18):6693-6699)的活性。二聚体形式的PBD已与抗体连接形成ADC(US2009/304710；US2010/047257；US2009/036431；WO2011/130598,WO2011/130616；US2013/0028919)。
发明内容
本发明包括通过接头共价连接以形成具有治疗性或诊断性应用的抗体-药物缀合物(ADC)化合物的1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚(CBI)二聚体药物部分。
本发明的一个方面是具有下式的抗体-药物缀合物化合物：
Ab-(L-D)p
其中：
Ab是抗体；
L是具有下式的接头：
-Str-(Pep)m-(Sp)n-
其中Str是与抗体共价连接的延伸单元(stretcher unit)；Pep是具有2至12个氨基酸残基的任选肽单元，Sp是与二聚体药物部分共价连接的任选间隔基单元，且m和n独立地选自0和1；
p是1至8的整数；
D是具有下式的二聚体药物部分：
其中
R1选自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb或与L的键；
R2选自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb或与L的键；
Ra和Rb独立地选自H和任选取代有一个或多个F的C1-C6烷基，
或Ra和Rb形成五元或六元杂环基；
T是选自以下的束缚基团(tether group)：C3-C12亚烷基、Y、(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)、(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)、(C2-C6亚烯基)-Y-(C2-C6亚烯基)和(C2-C6亚炔基)-Y-(C2-C6亚炔基)；
其中Y独立地选自O、S、NR1、芳基和杂芳基；
其中亚烷基、亚烯基、芳基和杂芳基独立地且任选地取代有F、OH、O(C1-C6烷基)、NH2、NHCH3、N(CH3)2、OP(O)3H2和C1-C6烷基，其中烷基任选地取代有一个或多个F；
或亚烷基、亚烯基、芳基和杂芳基独立地且任选地取代有与L的键；
D’是选自以下的药物部分：
其中波浪线表示与T连接的位点；
X1和X2独立地选自O和NR3，其中R3选自H和任选地取代有一个或多个F的C1-C6烷基；
R4为H、CO2R或与L的键，其中R为C1-C6烷基或苄基；且
R5为H或C1-C6烷基。
本发明的一个方面是所述抗体-药物缀合物化合物与药学上可接受的载体、助流剂、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
本发明的一个方面是治疗癌症的方法，其包括向患者给药治疗有效量的所述抗体-药物缀合物化合物。
本发明的一个方面是治疗癌症的试剂盒，其包含：
a)药物组合物；和
b)使用说明。
本发明的一个方面是接头-药物中间体，其选自：
X-L-D
其中：
X为反应性官能团，其选自马来酰亚胺、巯基、氨基、溴化物、溴乙酰氨基、碘乙酰氨基、对甲苯磺酸酯、碘化物、羟基、羧基、吡啶基二硫化物和N-羟基琥珀酰亚胺；
L是具有下式的接头：
-Str-(Pep)m-(Sp)n-
其中Str是与X共价连接的延伸单元；Pep是具有2至12个氨基酸残基的任选肽单元，Sp是与二聚体药物部分共价连接的任选间隔基单元，且m和n独立地选自0和1；
D是具有下式的二聚体药物部分：
其中
R1选自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb或与L的键；
R2选自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb或与L的键；
Ra和Rb独立地选自H和任选取代有一个或多个F的C1-C6烷基，或Ra和Rb形成五元或六元杂环基；
T是选自以下的束缚基团：C3-C12亚烷基、Y、(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)、(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)、(C2-C6亚烯基)-Y-(C2-C6亚烯基)和(C2-C6亚炔基)-Y-(C2-C6亚炔基)；
其中Y独立地选自O、S、NR1、芳基和杂芳基；
其中亚烷基、亚烯基、芳基和杂芳基独立地且任选地取代有F、OH、O(C1-C6烷基)、NH2、NHCH3、N(CH3)2、OP(O)3H2和C1-C6烷基，其中烷基任选地取代有一个或多个F；
或亚烷基、亚烯基、芳基和杂芳基独立地且任选地取代有与L的键；
D’是选自以下的药物部分：
其中波浪线表示与T连接的位点；
X1和X2独立地选自O和NR3，其中R3选自H和任选地取代有一个或多个F的C1-C6烷基；
R4为H、CO2R或与L的键，其中R为C1-C6烷基或苄基；且
R5为H或C1-C6烷基。
本发明的一个方面是通过使抗体与接头-药物中间体缀合制备抗体-药物缀合物的方法。
本发明的一个方面是CBI二聚体药物部分化合物，其具有下式：
其中
R1选自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb；
R2选自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb；
Ra和Rb独立地选自H和任选取代有一个或多个F的C1-C6烷基，
或Ra和Rb形成五元或六元杂环基；
T是选自以下的束缚基团：C3-C12亚烷基、Y、(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)、(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)、(C2-C6亚烯
基)-Y-(C2-C6亚烯基)和(C2-C6亚炔基)-Y-(C2-C6亚炔基)；
其中Y独立地选自O、S、NR1、芳基和杂芳基；
其中亚烷基、亚烯基、芳基和杂芳基独立地且任选地取代有F、OH、O(C1-C6烷基)、NH2、NHCH3、N(CH3)2、OP(O)3H2和C1-C6烷基，其中烷基任选地取代有一个或多个F；
或亚烷基、亚烯基、芳基和杂芳基独立地且任选地取代有与L的键；
D’是选自以下的药物部分：
其中波浪线表示与T连接的位点；
X1和X2独立地选自O和NR3，其中R3选自H和任选地取代有一个或多个F的C1-C6烷基；
R4为H、CO2R，其中R为C1-C6烷基或苄基；且
R5为H或C1-C6烷基。
附图说明
图1示出由(S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯51a合成2-(2-溴-N-甲基乙酰氨基)乙基(甲基)氨基甲酸(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯51。
图2示出由(R)-1-(氯甲基)-5-(二苯基亚甲基氨基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯53a合成N-((R)-1-(氯甲基)-3-(5-((R)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺53。
图3示出由(S)-5-(5-(苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酸57c合成1-((S)-5-氨基-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)戊烷-1,5-二酮53j。
图4示出由(R)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯53k合成非天然对映异构体1-((R)-5-氨基-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-((R)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)戊烷-1,5-二酮53p。
图5示出由(S)-(2-氨基-4-羟基-5-甲氧基苯基)(2-(羟基甲基)吡咯烷-1-基)甲酮54a合成N-(4-(((S)-1-(氯甲基)-3-(6-((S)-7-甲氧基-5-氧代-2,3,5,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基氧基)己酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基氧基)甲基)苯基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺54。
图6示出由(S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯51a合成N-((S)-1-((S)-1-(4-(((S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基氧基)甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺55。
图7示出由(S)-8-(6-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-硝基苄基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-6-氧代己基氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-甲酸叔丁酯54g合成(S)-8-(6-((S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-6-氧代己基氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-甲酸叔丁酯56d。
图8示出由(S)-8-(6-((S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-6-氧代己基氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-甲酸叔丁酯56d合成N-((S)-1-((S)-1-(4-(((S)-1-(氯甲基)-3-(6-((S)-7-甲氧基-5-氧代-2,3,5,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基氧基)己酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基氧基)甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺56。
图9示出由(S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯51a合成(S)-5-(1-(氯甲基)-5-(二叔丁氧基磷酰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酸57d。
图10示出由6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸合成2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰氨基)乙基(甲基)氨基甲酸(S)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯57i。
图11示出由2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰氨基)乙基(甲基)氨基甲酸(S)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯57i合成2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰氨基)乙基(甲基)氨基甲酸(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦酰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯57。
图12示出由(S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯51a合成4-甲基哌嗪-1-甲酸(S)-3-(5-((S)-5-(4-氨基苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯58e。
图13示出由4-甲基哌嗪-1-甲酸(S)-3-(5-((S)-5-(4-氨基苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯58e合成4-甲基哌嗪-1-甲酸(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯58。
图14示出由(S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯55e合成磷酸二氢(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯59。
图15示出由(S)-5-氨基-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯61a合成(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦酰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基氨基甲酸2-(吡啶-2-基二硫基)乙基酯61。
图16示出由51a合成(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦酰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基氨基甲酸2-(吡啶-2-基二硫基)丙基酯62。
图17示出由(S)-6-(5-(叔丁氧基羰基氨基)-4-(2-(羟基甲基)吡咯烷-1-羰基)-2-甲氧基苯氧基)己酸2,2,2-三氯乙基酯54c合成4-甲基哌嗪-1-甲酸(S)-3-(6-(4-((S)-2-(乙酰氧基甲基)吡咯烷-1-羰基)-5-氨基-2-甲氧基苯氧基)己酰基)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯65d。
图18示出由(S)-2-(烯丙基氧基羰基氨基)-6-(叔丁氧基羰基氨基)己酸65e合成苄醇赖氨酸65g。
图19示出由4-甲基哌嗪-1-甲酸(S)-3-(6-(4-((S)-2-(乙酰氧基甲基)吡咯烷-1-羰基)-5-氨基-2-甲氧基苯氧基)己酰基)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯65d合成(S)-8-(6-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-甲基哌嗪-1-羰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-6-氧代己基氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-6-(叔丁氧基羰基氨基)己酰氨基)苄基酯65k。
图20示出由65k合成(S)-8-(6-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-甲基哌嗪-1-羰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-6-氧代己基氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-甲酸4-((S)-6-氨基-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)己酰氨基)苄基酯65，其为二三氟乙酸盐。
图21示出由自51a制备的(S)-5-(苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯57a合成磷酸二叔丁酯·(S)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯66d。
图22示出由(2E,2’E)-3,3’-(2-硝基-1,4-亚苯基)二丙烯酸叔丁酯66e合成N-(3-(2,5-二((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-膦酰基氧基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-3-氧代丙-1-烯基)苯基氨基)-3-氧代丙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺66。
图23示出由(2E,2’E)-3,3’-(2-(3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)丙酰氨基)-1,4-亚苯基)二丙烯酸叔丁酯66g合成N-(3-(2,5-二((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-3-氧代丙-1-烯基)苯基氨基)-3-氧代丙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺67。
图24示出由66d、67c、67d合成磷酸二氢(S)-1-(氯甲基)-3-((E)-3-(4-((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-3-氧代丙-1-烯基)-2-(3-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)丙酰氨基)苯基)丙烯酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯68。
图25在3天SK-BR-3体外细胞活力对Thio hu抗CD22 HC A121C-MC-vc-PAB-(CBI二聚体)101和Thio hu抗Her2 HC A121C-MC-vc-PAB-(CBI二聚体)102的浓度(μg/ml)的图中示出抗体-药物缀合物的效力。
图26在3天SK-BR-3体外细胞活力对Thio Hu抗Her2 4D5 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI-PBD)103和Thio Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI-PBD)104的浓度(μg/ml)的图中示出抗体-药物缀合物的效力。
图27在3天SK-BR-3体外细胞活力对Thio Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI二聚体)116和Thio Hu抗Her2 4D5 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI二聚体)117的浓度(μg/ml)的图中示出抗体-药物缀合物的效力。
图28在3天EOL-1体外细胞活力对Thio Hu抗CD33 15G15.33 HC A118C-MC-MMED-(磷酸CBI二聚体)125的浓度(μg/ml)的图中示出抗体-药物缀合物的效力。
图29在3天EOL-1体外细胞活力对Thio Hu抗MUC16 3A5 HC A118C-MC-ED-(二磷酸CBI二聚体DVB)126和Thio Hu抗CD33 15G15.33 HC A118C-MC-ED-(二磷酸CBI二聚体DVB)127的浓度(μg/ml)的图中示出抗体-药物缀合物的效力。
图30在3天EOL-1体外细胞活力对Thio Hu抗CD33 15G15.33 HC A118C-MC-ED-(二磷酸CBI二聚体DVB)127、Thio Hu抗CD33 15G15.33 HC A118C-MC-ED-(磷酸CBI二聚体DVB)129和Thio Hu抗MUC16 3A5 HC A118C-MC-ED-(磷酸CBI二聚体DVB)130的浓度(μg/ml)的图中示出抗体-药物缀合物的效力。
图31在植入到CRL nu/nu小鼠的乳腺脂肪垫中的MMTV-HER2Fo5转基因乳腺肿瘤的体内拟合肿瘤体积在单一静脉内给予以下物质后随时间变化的图中示出抗体-药物缀合物的效力：(1)媒介物：组氨酸缓冲液#8:20mM组氨酸乙酸盐,pH 5.5,240mM蔗糖,0.02％PS20；(2)Thio Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C-MC-MMED-(磷酸CBI二聚体)110；(3)Thio Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI二聚体MePip)108；(4)Thio Hu抗CD22 10F4v3 HCA118C-MC-vc-PAB-(磷酸CBI二聚体)111；(5)Thio Hu抗Her2 4D5 HC A118C-MC-MMED-(磷酸CBI二聚体)109；(6)Thio Hu抗Her2 4D5 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI二聚体MePip)107；(7)Thio Hu抗Her2 4D5 HC A118C-MC-vc-PAB-(磷酸CBI二聚体)112。以10mg/kg给予ADC。
图32在植入到CRL nu/nu小鼠的乳腺脂肪垫中的MMTV-HER2 Fo5转基因乳腺肿瘤的体内拟合肿瘤体积在单一静脉内给予以下物质后随时间变化的图中示出抗体-药物缀合物的效力：(1)媒介物：组氨酸缓冲液#8:20mM组氨酸乙酸盐,pH 5.5,240mM蔗糖,0.02％PS20；(2)Thio Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C-DSE-(磷酸CBI二聚体)120,10mg/kg；(3)Thio Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C-DSE-(磷酸CBI二聚体)122,10mg/kg；(4)Thio Hu抗CD22 10F4v3HC A118C-MC-vc-PAB-(N10,PBD-CBI MePip)124,10mg/kg；(5)Thio Hu抗Her2 4D5HCA118C-DSE-(磷酸CBI二聚体)119,3mg/kg；(6)Thio Hu抗Her2 4D5 HC A118C-DSE-(磷酸CBI二聚体)119,10mg/kg；(7)Thio Hu抗Her2 4D5 HC A118C-DSP-(磷酸CBI二聚体)121,3mg/kg；(8)Thio Hu抗Her2 4D5 HC A118C-DSP-(磷酸CBI二聚体)121,10mg/kg；(9)ThioHu抗Her2 4D5 HC A118C-MC-vc-PAB-(N10,PBD-CBI MePip)123,3mg/kg；(10)Thio Hu抗Her2 4D5 HC A118C-MC-vc-PAB-(N10,PBD-CBI MePip)123,10mg/kg。
图33在植入到C.B-17SCID小鼠中的OVCAR3X2.1人卵巢肿瘤的体内拟合肿瘤体积在单一静脉内给予以下物质后随时间变化的图中示出抗体-药物缀合物的效力：(1)媒介物：组氨酸缓冲液#8:20mM组氨酸乙酸盐,pH 5.5,240mM蔗糖,0.02％PS 20；(2)Thio Hu抗CD33 15G15.33 HC A118C-MC-ED-(二磷酸CBI二聚体DVB)127,3mg/kg；(3)Thio Hu抗MUC163A5 HC A118C-MC-ED-(二磷酸CBI二聚体DVB)126,3mg/kg；(4)Thio Hu抗MUC16 3A5HCA118C-MC-ED-(二磷酸CBI二聚体DVB)126,1mg/kg。
图34在植入到C.B-17 SCID小鼠中的HL-60人急性骨髓性白血病的体内拟合肿瘤体积在以20μg/m2单一静脉内给予以下物质后随时间变化的图中示出抗体-药物缀合物的效力：(1)媒介物：组氨酸缓冲液#8:20mM组氨酸乙酸盐,pH 5.5,240mM蔗糖,0.02％PS 20；(2)Thio Hu抗CD33 15G15.33 HC A118C-MC-MMED-(磷酸CBI二聚体)125；(3)Thio Hu抗CD33 15G15.33 HC A118C-MC-ED-(二磷酸CBI二聚体DVB)127；(4)Thio Hu抗MUC16 3A5 HCA118C-MC-MMED-(磷酸CBI二聚体)128；(5)Thio Hu抗MUC16 3A5 HC A118C-MC-ED-(二磷酸CBI二聚体DVB)126。
图35a示出ADC138在带有HL-60人急性骨髓性白血病肿瘤的SCID小鼠中的效力。与媒介物组相比，ADC138显示出对肿瘤生长的剂量依赖性抑制。非靶向对照ADC135对肿瘤生长没有影响。
图35b示出ADC139在带有HL-60人急性骨髓性白血病肿瘤的SCID小鼠中的效力。与媒介物组相比，ADC139显示出对肿瘤生长的明确抑制。非靶向对照ADC136在1mg/kg时对肿瘤生长具有适度影响；然而，ADC139在匹配剂量时是显著更有效的，这引起完全的肿瘤消退。
图36示出ADC134在带有Igrov-1人卵巢肿瘤的SCID-米色小鼠中的效力。与媒介物组相比，ADC134显示出对肿瘤生长的剂量依赖性抑制。非靶向对照ADC137对肿瘤生长没有影响。
图37示出N-(3-(2,5-二((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-甲基哌嗪-1-羰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-3-氧代丙-1-烯基)苯基氨基)-3-氧代丙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺的合成(化合物编号69,表4)。
图38示出2,5-二((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦酰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-3-氧代丙-1-烯基)苯基氨基甲酸2-(吡啶-2-基二硫基)丙基酯的合成(表4,化合物编号72，图38)。
图39示出磷酸二氢[(1S)-1-(氯甲基)-3-[(E)-3-[4-[(E)-3-[(1S)-1-(氯甲基)-5-膦酰基氧基-1,2-二氢苯并[e]吲哚-3-基]-3-氧代-丙-1-烯基]-2-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基]苯基]丙-2-烯酰基]-1,2-二氢苯并[e]吲哚-5-基]酯的合成(化合物编号78,表4,图39)。
图40示出磷酸二氢[(1S)-1-(氯甲基)-3-[(E)-3-[4-[(E)-3-[(1S)-1-(氯甲基)-5-膦酰基氧基-1,2-二氢苯并[e]吲哚-3-基]-3-氧代-丙-1-烯基]-2-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]苯基]丙-2-烯酰基]-1,2-二氢苯并[e]吲哚-5-基]酯的合成(化合物编号79,表4,图40)。
图41示出N-[1-(氯甲基)-3-[5-[1-(氯甲基)-5-羟基-1,2-二氢苯并[e]吲哚-3-基]-5-氧代-戊酰基]-1,2-二氢苯并[e]吲哚-5-基]氨基甲酸2-(2-吡啶基二硫基)丙基酯的合成(化合物编号80,表4,图41)。
图42-43示出3-[6-[1-(氯甲基)-5-(4-甲基哌嗪-1-羰基)氧基-1,2-二氢苯并[e]吲哚-3-基]-6-氧代-己氧基]-6-羟基-2-甲氧基-11-氧代-6a,7,8,9-四氢-6H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-甲酸2-(2-吡啶基二硫基)丙基酯、3-[6-[1-(氯甲基)-5-膦酰基氧基-1,2-二氢苯并[e]吲哚-3-基]-6-氧代-己氧基]-6-羟基-2-甲氧基-11-氧代-6a,7,8,9-四氢-6H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-甲酸2-(2-吡啶基二硫基)丙基酯和3-[6-[1-(氯甲基)-5-羟基-1,2-二氢苯并[e]吲哚-3-基]-6-氧代-己氧基]-6-羟基-2-甲氧基-11-氧代-6a,7,8,9-四氢-6H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-甲酸2-(2-吡啶基二硫基)丙基酯的合成(化合物编号81-83,表4,图42-43)。
图44示出(1S)-1-(氯甲基)-3-((2E)-3-{4-((1E)-3-{(1S)-1-(氯甲基)-5-[(6-甲基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基)氧基]-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基}-3-氧代-1-丙烯基)-2-[(3-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}丙酰基)氨基]苯基}-2-丙烯酰基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-5-基β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯的合成(化合物编号84,表4,图44)。
图45示出(S)-(1-甲基-1H-吡咯-2,5-二基)二(((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)甲酮)的合成(化合物编号15,表1,图45)。
图46示出N-(2,5-二((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-3-氧代丙-1-烯基)苯基)乙酰胺的合成(化合物编号16,表1,图46)。
图47示出(S,2E,2’E)-3,3’-(2-甲氧基-1,4-亚苯基)二(1-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)丙-2-烯-1-酮)的合成(化合物编号17,表1,图47)。
图48示出(S,2E,2’E)-3,3’-(1-甲基-1H-吡咯-2,5-二基)二(1-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)丙-2-烯-1-酮)的合成(化合物编号18,表1,图48)。
图49示出(S)-3,3’-(2-甲氧基-1,4-亚苯基)二(1-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)丙-2-炔-1-酮)的合成(化合物19,表1,图49)。
具体实施方式
详细内容参照本发明的某些实施方案，其实施例在附带的结构和通式中例示。尽管结合例示的实施方案描述了本发明，但是应当理解的是，它们并非意欲将本发明限定至那些实施方案。相反，本发明意欲覆盖所有的备选、改进和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。
本领域技术人员应当认识到可用于实施本发明的与本文所述的那些相似或等同的许多方法和物质。本发明决不限于所述的方法和物质。
除非另做陈述，否则本文所用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的相同的含义并且与如下文献中所述一致：Singleton等(1994)Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology,2nd Ed.,J.Wiley&Sons,New York,NY；和Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001)Immonobiology,5th Ed.,GarlandPublishing,New York。
定义
除非另做陈述，否则本文所用的下列术语和短语具有如下含义：
当本文中使用商品名时，申请人意欲独立地包括商品名产品制剂、仿制药和商品名产品的活性药物成分。
本文的术语“抗体”以其最广泛的含义使用并且具体覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性(Miller等(2003)Jour.of Immunology 170:4854-4861)。抗体可为鼠、人、人源化、嵌合的抗体或来源于其它物种。抗体为由能够识别和结合特异性抗原的免疫系统产生的蛋白质(Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001)Immuno Biology,5thEd.,Garland Publishing,New York)。靶抗原一般具有由多种抗体的CDR识别的大量结合位点，也称作表位。特异性结合不同表位的各抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可具有一种以上相应的抗体。抗体包括全-长免疫球蛋白分子或全-长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合感性却靶标的抗原或其部分的分子，这类靶标包括但不限于癌细胞或产生与自身免疫性疾病相关的自身免疫性抗体的细胞。本文披露的免疫球蛋白可具有免疫球蛋白分子的任意类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。免疫球蛋白可来源于任意的物种。然而，在一个方面中，免疫球蛋白来源于人、鼠或兔。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分，一般为其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括：Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；微抗体(minibody)(Olafsen等(2004)Protein Eng.Design&Sel.17(4):315-323)；Fab表达文库制备的片段；抗独特型(抗Id)抗体；CDR(互补决定区)；和免疫特异性结合癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的上述任意的表位-结合片段；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
本文使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群中获得的抗体，即除可能少量存在的可能天然发生的突变之外，包含该群体的各抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异的靶向单个抗原位点的抗体。此外，与包括靶向不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，每种单克隆抗体只靶向抗原上的单一决定簇。除其特异性外，单克隆抗体的优点还在于它们可以不被其它抗体污染的方式合成。修饰语“单克隆”表示获自基本上同质的抗体群的抗体特性，并非解释为需要由任何特定方法生产抗体。例如，可通过首先由Kohler等(1975)Nature,256:495描述的杂交瘤方法制备用于本发明的单克隆抗体或可通过重组DNA方法制备(例如参见:US4816567；US5807715)。例如，还可使用Clackson等(1991)Nature,352:624-628；Marks等(1991)J.Mol.Biol.,222:581-597所述的技术从噬菌体抗体文库分离单克隆抗体。
本文的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类型或亚型的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类型或亚型的抗体中的相应序列相同或同源，本文还包括这类抗体的片段，只要它们展示期望的生物学活性(US4816567；和Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855)。本文感兴趣的嵌合抗体包括“灵长化(primatized)”抗体，其包含来源于非人的灵长类(例如旧域猴(Old World Monkey)、猿(Ape)等)的可变区抗原-结合序列和人恒定区序列。
本文的“完整抗体”为包含VL和VH结构域及轻链恒定域(CL)和重链恒定域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定域可为天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。完整抗体可具有一种或多种“效应子功能”，是指归因于抗体的Fc恒定区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括C1q结合；补体依赖的细胞毒性；Fc受体结合；抗体-依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)；胞吞作用；和细胞表面受体，诸如B细胞受体和BCR的减量调节。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226，或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可存在或不存在。除非本文中另有规定，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，又称作EU索引，如记载于Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。通常，可变域的FR由4个FR域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列在VH(或VL)中通常以如下顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
根据其重链恒定域的氨基酸序列的不同，可将完整抗体指定为不同“类别”。存在5种主要类别的完整免疫球蛋白抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且可将其中的几种进一步分成“亚类”(亚型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同抗体类别的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是众所周知的。Ig型包括铰链-修饰型或无铰链型(Roux等(1998)J.Immunol.161:4083-4090；Lund等(2000)Eur.J.Biochem.267:7246-7256；US2005/0048572；US2004/0229310)。
“人抗体”是指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”是指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,NIHPublication 91-3242,Bethesda MD(1991),vols.1-3中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组III。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经经历人源化的抗体。
本文中使用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上定义的环(“高变环”)的每个区域。通常，天然的4链抗体包含6个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者是最高序列变异性的和/或牵涉抗原识别。示例性高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基24-34、L2的50-56、L3的89-97、H1的31-35B、H2的50-65和H3的95-102(Kabat等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。除了VH中的CDR1外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在称作缩短的CDR或a-CDR的CDR区域内。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34、L2的50-55、L3的89-96、H1的31-35B、H2的50-58和H3的95-102(参见Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另有指示，可变域中的HVR残基和其它残基(例如FR残基)在本文中依照Kabat等，见上文编号。
术语“可变区”或“可变域”是指抗体重链或轻链中牵涉抗体结合抗原的结构域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL)通常具有类似的结构，其中每个结构域包括四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见例如Kindt等.Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可分别使用结合特定抗原的抗体的VH或VL结构域筛选互补VL或VH结构域的文库分离结合该抗原的抗体。参见例如Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等,Nature 352:624-628(1991)。
本文使用的术语“载体”是指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及并入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
“游离半胱氨酸氨基酸”是指已经工程化到亲代抗体中的带有巯基官能团(-SH)的并且未配对作为分子内或分子间二硫键桥的半胱氨酸残基。
“接头”、“接头单元”或“连接物”意指包含使抗体共价连接至药物部分的原子链的化学部分。在各个实施方案中，接头为二价基，指定为L。
当说明取代基数目时，术语“一个或多个”是指从一个取代基至最多可能取代基数目的范围，即由取代基替代一个氢直至替代全部氢。术语“取代基”表示在母体分子上替代氢原子的原子或原子团。术语“经取代的”表示指定基团带有一个或多个取代基。当任何基团可带有多个取代基且提供各种可能取代基时，该取代基是独立选择的且无需相同。术语“未经取代的”意指指定基团不带有取代基。术语“任选取代的”意指指定基团是未经取代的或被一个或多个独立选自可能的取代基的取代基取代。当说明取代基数目时，术语“一个或多个”意指从一个取代基至最多可能取代基数目，即由取代基替代一个直至替代全部氢。
本文使用的术语“烷基”是指具有1-12个碳原子(C1-C12)任意长度的饱和直链或支链单价烃基，其中所述烷基可任选地独立取代有一个或多个下文所述的取代基。在另一实施方案中，烷基具有1-8个碳原子(C1-C8)或具有1-6碳原子(C1-C6)。烷基的实例包括但不限于甲基(Me，-CH3)、乙基(Et，-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr，正丙基，-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr，异丙基，-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu，正丁基，-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu，异丁基，-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu，仲丁基，-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu，叔丁基，-C(CH3)3)、1-戊基(正戊基，-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3、1-庚基、1-辛基等。
本文使用的术语“亚烷基”是指具有1-12个碳原子(C1-C12)任意长度的饱和直链或支链二价烃基，其中所述亚烷基可任选地独立取代有一个或多个下文所述的取代基。在另一实施方案中，亚烷基具有1-8碳原子(C1-C8)或具有1-6碳原子(C1-C6)。亚烷基的实例包括但不限于亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基(-CH2CH2CH2-)等。
术语“烯基”是指具有2-8个碳原子(C2-C8)任意长度且具有至少一个不饱和位点(即碳-碳sp2双键)的直链或支链单价烃基，其中所述烯基可任选地独立取代有一个或多个本文所述的取代基并包括具有“顺式”和“反式”取向或者“E”和“Z”取向的基团。实例包括但不限于乙烯基(-CH＝CH2)、烯丙基(-CH2CH＝CH2)等。
术语“亚烯基”是指具有2-8个碳原子(C2-C8)任意长度且具有至少一个不饱和位点(即碳-碳sp2双键)的直链或支链二价烃基，其中所述亚烯基可任选地独立取代有一个或多个本文所述的取代基并包括具有“顺式”和“反式”取向或者“E”和“Z”取向的基团。实例包括但不限于亚乙烯基(-CH＝CH-)、亚烯丙基(-CH2CH＝CH-)等。
术语“炔基”是指具有2-8个碳原子(C2-C8)任意长度且具有至少一个不饱和位点(即碳-碳sp三键)的直链或支链单价烃基，其中所述炔基可任选地独立取代有一个或多个本文所述的取代基。实例包括但不限于乙炔基(-C≡CH)、丙炔基(炔丙基、-CH2C≡CH)等。
术语“亚炔基”是指具有2-8个碳原子(C2-C8)任意长度且具有至少一个不饱和位点(即碳-碳sp三键)的直链或支链二价烃基，其中所述亚炔基可任选地独立取代有一个或多个本文所述的取代基。实例包括但不限于亚乙炔基(-C≡C-)、亚丙炔基(亚炔丙基，-CH2C≡C-)等。
术语“碳环”、“碳环基”、“碳环”和“环烷基”是指具有3至12个碳原子(C3-C12)作为单环或7至12个碳原子作为二环的单价非芳族饱和或部分不饱和的环。具有7至12个原子的二环碳环可排列为例如二环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统，具有9或10个环原子的二环碳环可排列为二环[5,6]或[6,6]系统或排列为桥接系统诸如二环[2.2.1]庚烷、二环[2.2.2]辛烷和二环[3.2.2]壬烷。螺部分也包括在该定义的范围内。单环碳环的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环己二烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、环十一烷基、环十二烷基等。碳环基任选地独立取代有一个或多个本文所述的取代基。
“芳基”意指通过从母体芳族环系中的单个碳原子除去一个氢原子得到的具有6-20个碳原子(C6-C20)的单价芳族烃基。一些芳基表在示例性结构中示为“Ar”。芳基包括含有与饱和、部分不饱和的环或芳族碳环稠合的芳族环的二环基团。典型的芳基包括但不限于由苯(苯基)、经取代的苯、萘、蒽、联苯、茚基、茚满基、1,2-二氢萘、1,2,3,4-四氢萘基等得到的基团。芳基任选地独立取代有一个或多个本文所述的取代基。
“亚芳基”意指通过从母体芳族环系中的两个碳原子除去两个氢原子得到的具有6-20个碳原子(C6-C20)的二价芳族烃基。一些亚芳基在示例性结构中表示为“Ar”。亚芳基包括含有与饱和、部分不饱和的环或芳族碳环稠合的芳族环的二环基团。典型的亚芳基包括但不限于由苯(亚苯基)、经取代的苯、萘基、蒽基、亚联苯基、亚茚基、亚茚满基、1,2-二氢萘基、1,2,3,4-四氢萘基等得到的基团。亚芳基任选地独立取代有一个或多个本文所述的取代基。
术语“杂环”、“杂环基”和“杂环”在本文中可互换使用且是指具有3至约20个环原子的饱和或部分不饱和(即在环中具有一个或多个双键和/或叁键)的碳环基团，其中至少一个环原子为选自氮、氧、磷和硫的杂原子，其余环原子为C，其中一个或多个环原子任选地独立取代有一个或多个下文所述的取代基。杂环可为具有3至7个环成员(2至6个碳原子及1至4个选自N、O、P和S的杂原子)的单环或具有7至10个环成员(4至9个碳原子及1至6个选自N、O、P和S的杂原子)的二环例如二环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统。杂环述于Paquette、Leo A.；“Principles of Modern Heterocyclic Chemistry”(W.A.Benjamin,New York,1968)(特别是第1、3、4、6、7和9章)；“The Chemistry of Heterocyclic Compounds,Aseries of Monographs”(John Wiley&Sons,New York,1950 to present)(特别是第13、14、16、19和28卷)；及J.Am.Chem.Soc.(1960)82:5566中。“杂环基”还包括其中杂环基团与饱和、部分不饱和的环或芳族碳环或杂环稠合的基团。杂环的实例包括但不限于吗啉-4-基、哌啶-1-基、哌嗪基、哌嗪-4-基-2-酮、哌嗪-4-基-3-酮、吡咯烷-1-基、硫吗啉-4-基、S-二氧代硫吗啉-4-基、氮杂环辛烷-1-基、氮杂环丁烷-1-基、八氢吡啶并[1,2-a]吡嗪-2-基、[1,4]二氮杂环庚烷-1-基、吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢噻喃基、哌啶子基、吗啉代、硫吗啉代、硫杂氧杂环己基、哌嗪基、高哌嗪基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、高哌啶基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、氧氮杂基、二氮杂基、硫氮杂基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、二氢吲哚基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二噁烷基、1,3-二氧杂环戊烷基、吡唑啉基、二硫杂环己基、二硫杂环戊烷基、二氢吡喃基、二氢噻吩基、二氢呋喃基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮杂二环[3.1.0]己基、3-氮杂二环[4.1.0]庚基、氮杂二环[2.2.2]己基、3H-吲哚基、喹嗪基和N-吡啶基脲。螺部分也包括在此定义的范围内。其中2个环原子被氧代(＝O)部分取代的杂环基的实例为氧代嘧啶基和1,1-二氧代-硫吗啉基。本文的杂环基团任选地独立取代有一个或多个本文所述的取代基。
术语“杂芳基”是指5、6或7元环的单价芳族基团且包括5-20个环原子的稠环系(其中至少一个环是芳族的)，其含有一个或多个独立选自氮、氧和硫的杂原子。杂芳基的实例为吡啶基(包括例如2-羟基吡啶基)、咪唑基、咪唑并吡啶基、1-甲基-1H-苯并[d]咪唑、[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶、嘧啶基(包括例如4-羟基嘧啶基)、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁二唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、四氢异喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、吲嗪基、酞嗪基、哒嗪基、三嗪基、异吲哚基、蝶啶基、嘌呤基、噁二唑基、噻二唑基、噻二唑基、呋咱基、苯并呋咱基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、二氮杂萘基和呋喃并吡啶基。本文的杂芳基任选地独立取代有本文所述的一个或多个取代基。
杂环或杂芳基在适当连接时可为碳键接的(碳联的)或氮键接的(氮联的)。通过举例而非限制，碳键接的杂环或杂芳基在以下位置进行连接：吡啶的2、3、4、5或6位；哒嗪的3、4、5或6位；嘧啶的2、4、5或6位；吡嗪的2、3、5或6位；呋喃、四氢呋喃、噻吩、吡咯或四氢吡咯的2、3、4或5位；噁唑、咪唑或噻唑的2、4或5位；异噁唑、吡唑或异噻唑的3、4或5位；氮杂环丙烷的2或3位；氮杂环丁烷的2、3或4位；喹啉的2、3、4、5、6、7或8位；或异喹啉的1、3、4、5、6、7或8位。
通过举例而非限制，氮键接的杂环或杂芳基在以下位置进行连接：氮杂环丙烷、氮杂环丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、二氢吲哚、1H-吲唑的1位；异吲哚或二氢异吲哚的2位；吗啉的4位；和咔唑或β-咔啉的9位。
术语“手性”是指具有镜像配偶体不可重叠性质的分子，而术语“非手性”是指可与其镜像配偶体重叠的分子。
术语“立体异构体”是指具有相同化学组成但原子或基团的取向在空间上的排列不同的化合物。
“非对映异构体”是指具有两个或更多手性中心并且其分子不互为镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理性质，例如熔点、沸点、光谱性质和反应性。非对映异构体的混合物可通过高分辨分析操作诸如电泳和色谱来分离。
“对映异构体”是指互为不可重叠镜像的化合物的两种立体异构体。
本文使用的立体化学定义和常规用语通常遵循S.P.Parker,Ed.,McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company,New York；及Eliel,E.and Wilen,S.,Stereochemistry of Organic Compounds(1994)John Wiley&Sons,Inc.,New York。许多有机化合物以光学活性形式存在，即它们具有旋转平面偏振光的平面的能力。在描述有光学活性的化合物时，使用前缀D和L或者R和S来表示分子关于其一个或多个手性中心的绝对构型。前缀d和l或者(+)和(-)用于指定由化合物引起的平面偏振光旋转的符号，其中(-)或l意指化合物是左旋的。前缀为(+)或d的化合物是右旋的。对于给定的化学结构而言，除了互为镜像外，这些立体异构体是相同的。具体的立体异构体也可称为对映异构体，此类异构体的混合物通常称作对映异构题混合物。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋体，当化学反应或方法中没有立体选择性或立体特异性时可出现这种情况。术语“外消旋混合物”和“外消旋体”是指两种对映异构物种的等摩尔混合物，其没有光学活性。
本文使用的短语“药学上可接受盐”是指抗体-药物缀合物(ADC)的药学上可接受的有机盐或无机盐。示例性的盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、丹宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和扑酸盐(即1,1’-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。药学上可接受的盐可能牵涉包含另一种分子，诸如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其它抗衡离子。抗衡离子可为任何稳定母体化合物上电荷的有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐可在其结构中具有一种以上带电荷原子。其中多种带电荷原子作为药学上可接受盐的组成部分的情况可具有多种抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可具有一种或多种带电荷原子和/或一种或多种抗衡离子。
本文中使用了下列缩写，它们具有如下定义：BME为β-巯基乙醇，Boc为N-(叔丁氧基羰基)，cit为瓜氨酸(2-氨基-5-脲基戊酸)，DCC为1,3-二环己基碳二亚胺，DCM为二氯甲烷，DEA为二乙胺，DEAD为偶氮二羧酸二乙酯，DEPC为氰基膦酸二乙酯，DIAD为偶氮二羧酸二异丙酯，DIEA为N,N-二异丙基乙胺，DMA为二甲基乙酰胺，DMAP为4-二甲基氨基吡啶，DME为乙二醇二甲醚(或1,2-二甲氧基乙烷)，DMF为N,N-二甲基甲酰胺，DMSO为二甲基亚砜，DTT为二硫苏糖醇，EDCI为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，EEDQ为2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉，ES-MS为电喷雾质谱，EtOAc为乙酸乙酯，Fmoc为N-(9-芴基甲氧基羰基)，gly为甘氨酸，HATU为O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐，HOBt为1-羟基苯并三唑，HPLC为高压液相色谱，ile为异亮氨酸，lys为赖氨酸，MeCN(CH3CN)为乙腈，MeOH为甲醇，Mtr为4-茴香基二苯甲基(或4-甲氧基三苯甲基)，NHS为N-羟基琥珀酰亚胺，PBS为磷酸盐缓冲盐水(pH 7)，PEG为聚乙二醇或乙二醇单元(-OCH2CH2-)，Ph为苯基，Pnp为对硝基苯基，MC为6-马来酰亚氨基己酰基，phe为L-苯丙氨酸，PyBrop为溴三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐，SEC为尺寸排阻色谱，Su为琥珀酰亚胺，TFA为三氟乙酸，TLC为薄层色谱，UV为紫外线，且val为缬氨酸。
半胱氨酸工程化的抗体
本发明化合物包括含有半胱氨酸工程化的抗体的抗体-药物缀合物，其中野生型或亲代抗体中的一个或多个氨基酸被半胱氨酸替代。由此可以工程化任何形式的抗体，即使其突变。例如，可将亲代Fab抗体片段工程化形成半胱氨酸工程化的Fab，在本文中称作“ThioFab”。类似地，可将亲代单克隆抗体工程化形成“ThioMab”。应当注意的是，单一位点突变在ThioFab中产生单一工程化的半胱氨酸残基，而单一位点突变在ThioMab中产生两个工程化的半胱氨酸残基，这是因IgG抗体的二聚化特性所致。评价被半胱氨酸(Cys)残基替代的(“工程化的”)突变体的新引入的工程化的半胱氨酸巯基反应性。巯基反应值为0至1.0范围内的相对数值范围并且可对任意半胱氨酸工程化的抗体进行测定。本发明半胱氨酸工程化的抗体的巯基反应值的范围为0.6至1.0；0.7至1.0；或0.8至1.0。
半胱氨酸氨基酸可在抗体的反应位点进行工程化且不形成链内或分子间二硫键(Junutula等,2008b Nature Biotech.,26(8):925-932；Dornan等(2009)Blood 114(13):2721-2729；US7521541；US7723485；WO2009/052249,Shen等(2012)Nature Biotech.,30(2):184-191；Junutula等(2008)Jour of Immun.Methods 332:41-52)。工程化的半胱氨酸巯基可与具有巯基反应性的接头试剂或本发明的接头-药物中间体、亲电基团诸如马来酰亚胺或α-卤代酰胺反应以形成具有半胱氨酸工程化的抗体(ThioMab)和药物(D)部分的ADC。药物部分的位置由此可为设计好的、受控的和已知的。由于工程化的半胱氨酸巯基通常以高产率与巯基反应性接头试剂或接头-药物中间体反应，所以载药量是可以控制的。在重链或轻链上单个位点通过取代引入半胱氨酸氨基酸对抗体进行工程化给出了对称抗体上的两个新的半胱氨酸。可实现接近2的载药量和接近同质化的缀合产品ADC。
本发明半胱氨酸工程化的抗体优选保持其野生型亲代抗体对应物的抗原结合能力。因此，半胱氨酸工程化的抗体能够结合抗原，优选特异性结合抗原。这类抗原包括例如肿瘤相关抗原(TAA)、细胞表面受体蛋白和其它细胞表面分子、跨膜蛋白、信号传导蛋白、细胞存活调节因子、细胞增殖调节因子、与组织发育或分化相关(例如已知或怀疑在功能上相关)的分子、淋巴因子、细胞因子、涉及细胞周期调节的分子、涉及血管发生的分子和与血管发生相关(例如已知或怀疑在功能上相关)的分子。肿瘤相关抗原可为分化簇因子(即CD蛋白)。能够结合半胱氨酸工程化的抗体的抗原可为上述类型之一的亚组中的成员，其中所述类型中另一亚组包含具有不同特性的其它分子/抗原(就感兴趣的抗原而言)。
通过链内二硫化物基团的还原和再氧化用接头-药物中间体缀合制备半胱氨酸工程化的抗体(实施例19)。
可用于治疗癌症的抗体-药物缀合物中的半胱氨酸工程化的抗体包括但不限于针对细胞表面受体和肿瘤相关抗原(TAA)的抗体。肿瘤相关抗原为本领域中公知的，并且可制备它们以便用于使用本领域公知的方法和信息生产抗体。在发现用于癌症诊断和疗法的有效细胞靶标的尝试中，研究人员寻求鉴定与一种或多种正常非癌细胞相比在一种或多种特定类型的癌细胞表面上特异性表达的跨膜多肽或肿瘤相关多肽。与非癌细胞相比，通常这类肿瘤相关多肽更大量地在癌细胞表面上表达。对这类肿瘤相关细胞表面抗原多肽的鉴定已经使得能够特异性靶向癌细胞，通过基于抗体的疗法对其进行破坏。
肿瘤相关抗原TAA的实例包括但不限于下述TAA(1)-(51)。为方便起见，均为本领域公知的有关这些抗原的信息如下所列，并且按照National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)的核酸和蛋白质序列鉴定规定，包括名称、可选择的名称、Genbank登记号和主要参考文献。相当于TAA(1)-(51)的核酸和蛋白质序列可在公共数据库诸如GenBank中获得。由抗体靶向的肿瘤相关抗原包括所有氨基酸序列变体和同工型，它们与引述的参考文献中鉴定的序列相比具有至少约70％，80％，85％，90％或95％序列同一性或表现出基本上与具有引述参考文献中发现的序列的TAA相同的生物特性或特征。例如，具有变体序列的TAA通常能够特异性结合文献中所示相应序列TAA特异性结合的抗体。通过引用的方式特别将本文特别引述的参考文献中的序列和公开内容并入。
肿瘤相关抗原：
(1)BMPR1B(骨形态发生受体-IB型,Genbank登记号NM_001203)
ten Dijke,P.等Science 264(5155):101-104(1994),Oncogene 14(11):1377-1382(1997))；WO2004063362(权利要求2)；WO2003042661(权利要求12)；US2003134790-A1(第38-39页)；WO2002102235(权利要求13；第296页)；WO2003055443(第91-92页)；WO200299122(实施例2；第528-530页)；WO2003029421(权利要求6)；WO2003024392(权利要求2；图112)；WO200298358(权利要求1；第183页)；WO200254940(第100-101页)；WO200259377(第349-350页)；WO200230268(权利要求27；第376页)；WO200148204(实施例；图4)
NP_001194骨形态发生蛋白受体,IB型/pid＝NP_001194.1-
交叉引用：MIM:603248；NP_001194.1；AY065994
(2)E16(LAT1,SLC7A5,Genbank登记号NM_003486)
Biochem.Biophys.Res.Commun.255(2),283-288(1999),Nature 395(6699):288-291(1998),Gaugitsch,H.W.等(1992)J.Biol.Chem.267(16):11267-11273)；WO2004048938(实施例2)；WO2004032842(实施例IV)；WO2003042661(权利要求12)；WO2003016475(权利要求1)；WO200278524(实施例2)；WO200299074(权利要求19；第127-129页)；WO200286443(权利要求27；第222、393页)；WO2003003906(权利要求10；第293页)；WO200264798(权利要求33；第93-95页)；WO200014228(权利要求5；第133-136页)；US2003224454(图3)；WO2003025138(权利要求12；第150页)；
NP_003477溶质载体家族7(阳离子氨基酸转运蛋白,y+系统),成员5/pid＝NP_003477.3-智人
交叉引用：MIM:600182；NP_003477.3；NM_015923；NM_003486_1
(3)STEAP1(前列腺六跨膜上皮抗原,Genbank登记号NM_012449)
Cancer Res.61(15),5857-5860(2001),Hubert,R.S.等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(25):14523-14528)；WO2004065577(权利要求6)；WO2004027049(图1L)；EP1394274(实施例11)；WO2004016225(权利要求2)；WO2003042661(权利要求12)；US2003157089(实施例5)；US2003185830(实施例5)；US2003064397(图2)；WO200289747(实施例5；第618-619页)；WO2003022995(实施例9；图13A,实施例53；第173页，实施例2；图2A)；
NP_036581前列腺六跨膜上皮抗原
交叉引用：MIM:604415；NP_036581.1；NM_012449_1
(4)0772P(CA125,MUC16,Genbank登记号AF361486)
J.Biol.Chem.276(29):27371-27375(2001))；WO2004045553(权利要求14)；WO200292836(权利要求6；图12)；WO200283866(权利要求15；第116-121页)；US2003124140(实施例16)；交叉引用：GI:34501467；AAK74120.3；AF361486_1
(5)MPF(MPF,MSLN,SMR,巨核细胞强化因子,间皮素,Genbank登记号NM_005823)Yamaguchi,N.等Biol.Chem.269(2),805-808(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(20):11531-11536(1999),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93(1):136-140(1996),J.Biol.Chem.270(37):21984-21990(1995))；WO2003101283(权利要求14)；(WO2002102235(权利要求13；第287-288页)；WO2002101075(权利要求4；第308-309页)；WO200271928(第320-321页)；WO9410312(第52-57页)；交叉引用：MIM:601051；NP_005814.2；NM_005823_1
(6)Napi2b(NAPI-2B,NAPI-3B,NPTIIb,SLC34A2,溶质载体家族34(磷酸钠),成员2,II型钠依赖性磷酸转运蛋白3b，Genbank登记号NM_006424)
J.Biol.Chem.277(22):19665-19672(2002)；Genomics 62(2):281-284(1999)；Feild,J.A.等(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.258(3):578-582)；WO2004022778(权利要求2)；EP1394274(实施例11)；WO2002102235(权利要求13；第326页)；EP875569(权利要求1；第17-19页)；WO200157188(权利要求20；第329页)；WO2004032842(实施例IV)；WO200175177(权利要求24；第139-140页)；
交叉引用：MIM:604217；NP_006415.1；NM_006424_1
(7)Sema 5b(FLJ10372,KIAA1445,Mm.42015,SEMA5B,SEMAG,脑信号蛋白(semaphorin)5b Hlog,sema结构域,七血小板反应蛋白重复(seven thrombospondinrepeats)(1型和类1型),跨膜结构域(TM)和短胞质域,(脑信号蛋白)5B,Genbank登记号AB040878)
Nagase T.等(2000)DNA Res.7(2):143-150)；WO2004000997(权利要求1)；WO2003003984(权利要求1)；WO200206339(权利要求1；第50页)；WO200188133(权利要求1；第41-43,48-58页)；WO2003054152(权利要求20)；WO2003101400(权利要求11)；
登记号：Q9P283；EMBL；AB040878；BAA95969.1.Genew；HGNC:10737；
(8)PSCA hlg(2700050C12Rik,C530008O16Rik,RIKEN cDNA 2700050C12,RIKENcDNA 2700050C12基因,Genbank登记号AY358628)；Ross等(2002)Cancer Res.62:2546-2553；US2003129192(权利要求2)；US2004044180(权利要求12)；US2004044179(权利要求11)；US2003096961(权利要求11)；US2003232056(实施例5)；WO2003105758(权利要求12)；US2003206918(实施例5)；EP1347046(权利要求1)；WO2003025148(权利要求20)；
交叉引用：GI:37182378；AAQ88991.1；AY358628_1
(9)ETBR(内皮缩血管肽B型受体,Genbank登记号AY275463)；
Nakamuta M.等Biochem.Biophys.Res.Commun.177,34-39,1991；Ogawa Y.等Biochem.Biophys.Res.Commun.178,248-255,1991；Arai H.等Jpn.Circ.J.56,1303-1307,1992；Arai H.等J.Biol.Chem.268,3463-3470,1993；Sakamoto A.,Yanagisawa M.等Biochem.Biophys.Res.Commun.178,656-663,1991；Elshourbagy N.A.等J.Biol.Chem.268,3873-3879,1993；Haendler B.等J.Cardiovasc.Pharmacol.20,s1-S4,1992；Tsutsumi M.等Gene 228,43-49,1999；Strausberg R.L.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99,16899-16903,2002；Bourgeois C.等J.Clin.Endocrinol.Metab.82,3116-3123,1997；Okamoto Y.等Biol.Chem.272,21589-21596,1997；Verheij J.B.等Am.J.Med.Genet.108,223-225,2002；Hofstra R.M.W.等Eur.J.Hum.Genet.5,180-185,1997；Puffenberger E.G.等Cell 79,1257-1266,1994；Attie T.等,Hum.Mol.Genet.4,2407-2409,1995；Auricchio A.等Hum.Mol.Genet.5:351-354,1996；Amiel J.等Hum.Mol.Genet.5,355-357,1996；Hofstra R.M.W.等Nat.Genet.12,445-447,1996；Svensson P.J.等Hum.Genet.103,145-148,1998；Fuchs S.等Mol.Med.7,115-124,2001；Pingault V.等(2002)Hum.Genet.111,198-206；WO2004045516(权利要求1)；WO2004048938(实施例2)；WO2004040000(权利要求151)；WO2003087768(权利要求1)；WO2003016475(权利要求1)；WO2003016475(权利要求1)；WO200261087(图1)；WO2003016494(图6)；WO2003025138(权利要求12；第144页)；WO200198351(权利要求1；第124-125页)；EP522868(权利要求8；图2)；WO200177172(权利要求1；第297-299页)；US2003109676；US6518404(图3)；US5773223(权利要求1a；Col 31-34)；WO2004001004；
(10)MSG783(RNF124,推定蛋白FLJ20315,Genbank登记号NM_017763)；
WO2003104275(权利要求1)；WO2004046342(实施例2)；WO2003042661(权利要求12)；WO2003083074(权利要求14；第61页)；WO2003018621(权利要求1)；WO2003024392(权利要求2；图93)；WO200166689(实施例6)；
交叉引用：LocusID:54894；NP_060233.2；NM_017763_1
(11)STEAP2(HGNC_8639,IPCA-1,PCANAP1,STAMP1,STEAP2,STMP,前列腺癌相关基因1,前列腺癌相关蛋白1,前列腺六跨膜上皮抗原2,六跨膜前列腺蛋白,Genbank登记号AF455138)
Lab.Invest.82(11):1573-1582(2002))；WO2003087306；US2003064397(权利要求1；图1)；WO200272596(权利要求13；第54-55页)；WO200172962(权利要求1；图4B)；WO2003104270(权利要求11)；WO2003104270(权利要求16)；US2004005598(权利要求22)；WO2003042661(权利要求12)；US2003060612(权利要求12；图10)；WO200226822(权利要求23；图2)；WO200216429(权利要求12；图10)；
交叉引用：GI:22655488；AAN04080.1；AF455138_1
(12)TrpM4(BR22450,FLJ20041,TRPM4,TRPM4B,瞬时型受体电位阳离子通道,亚家族M,成员4,Genbank登记号NM_017636)
Xu,X.Z.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(19):10692-10697(2001)；Cell109(3):397-407(2002)；J.Biol.Chem.278(33):30813-30820(2003))；US2003143557(权利要求4)；WO200040614(权利要求14；第100-103页)；WO200210382(权利要求1；图9A)；WO2003042661(权利要求12)；WO200230268(权利要求27；第391页)；US2003219806(权利要求4)；WO200162794(权利要求14；图1A-D)；
交叉引用：MIM:606936；NP_060106.2；NM_017636_1
(13)CRIPTO(CR,CR1,CRGF,CRIPTO,TDGF1,畸胎瘤衍生的生长因子,Genbank登记号NP_003203或NM_003212)
Ciccodicola,A.等EMBO J.8(7):1987-1991(1989)；Am.J.Hum.Genet.49(3):555-565(1991))；US2003224411(权利要求1)；WO2003083041(实施例1)；WO2003034984(权利要求12)；WO200288170(权利要求2；第52-53页)；WO2003024392(权利要求2；图58)；WO200216413(权利要求1；第94-95,105页)；WO200222808(权利要求2；图1)；US5854399(实施例2；Col 17-18)；US5792616(图2)；
交叉引用：MIM:187395；NP_003203.1；NM_003212_1
(14)CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/EB病毒受体)或Hs.73792,Genbank登记号M26004)
Fujisaku等(1989)J.Biol.Chem.264(4):2118-2125)；Weis J.J.等J.Exp.Med.167,1047-1066,1988；Moore M.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84,9194-9198,1987；Barel M.等Mol.Immunol.35,1025-1031,1998；Weis J.J.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83,5639-5643,1986；Sinha S.K.等(1993)J.Immunol.150,5311-5320；WO2004045520(实施例4)；US2004005538(实施例1)；WO2003062401(权利要求9)；WO2004045520(实施例4)；WO9102536(图9.1-9.9)；WO2004020595(权利要求1)；
登记号：P20023；Q13866；Q14212；EMBL；M26004；AAA35786.1.
(15)CD79b(CD79B,CD79β,IGb(免疫球蛋白相关β),B29,Genbank登记号NM_000626或11038674)
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(7):4126-4131；Blood(2002)100(9):3068-3076；Muller等(1992)Eur.J.Immunol.22(6):1621-1625)；WO2004016225(权利要求2，图140)；WO2003087768,US2004101874(权利要求1，第102页)；WO2003062401(权利要求9)；WO200278524(实施例2)；US2002150573(权利要求5，第15页)；US5644033；WO2003048202(权利要求1，第306和309页)；WO99/558658,US6534482(权利要求13，图17A/B)；WO200055351(权利要求11，第1145-1146页)；
交叉引用：MIM:147245；NP_000617.1；NM_000626_1
(16)FcRH2(IFGP4,IRTA4,SPAP1A(含有SH2结构域的磷酸酶锚定蛋白1a),SPAP1B,SPAP1C,Genbank登记号NM_030764,AY358130)
Genome Res.13(10):2265-2270(2003)；Immunogenetics 54(2):87-95(2002)；Blood 99(8):2662-2669(2002)；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(17):9772-9777(2001)；Xu,M.J.等(2001)Biochem.Biophys.Res.Commun.280(3):768-775；WO2004016225(权利要求2)；WO2003077836；WO200138490(权利要求5；图18D-1-18D-2)；WO2003097803(权利要求12)；WO2003089624(权利要求25)；
交叉引用：MIM:606509；NP_110391.2；NM_030764_1
(17)HER2(ErbB2,Genbank登记号M11730)
Coussens L.等Science(1985)230(4730):1132-1139)；Yamamoto T.等Nature319,230-234,1986；Semba K.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82,6497-6501,1985；SwierczJ.M.等J.Cell Biol.165,869-880,2004；Kuhns J.J.等J.Biol.Chem.274,36422-36427,1999；Cho H.-S.等Nature 421,756-760,2003；Ehsani A.等(1993)Genomics 15,426-429；WO2004048938(实施例2)；WO2004027049(图1I)；WO2004009622；WO2003081210；WO2003089904(权利要求9)；WO2003016475(权利要求1)；US2003118592；WO2003008537(权利要求1)；WO2003055439(权利要求29；图1A-B)；WO2003025228(权利要求37；图5C)；WO200222636(实施例13；第95-107页)；WO200212341(权利要求68；图7)；WO200213847(第71-74页)；WO200214503(第114-117页)；WO200153463(权利要求2；第41-46页)；WO200141787(第15页)；WO200044899(权利要求52；图7)；WO200020579(权利要求3；图2)；US5869445(权利要求3；Col 31-38)；WO9630514(权利要求2；第56-61页)；EP1439393(权利要求7)；WO2004043361(权利要求7)；WO2004022709；WO200100244(实施例3；图4)；
登记号：P04626；EMBL；M11767；AAA35808.1.EMBL；M11761；AAA35808.1.
(18)NCA(CEACAM6,Genbank登记号M18728)；
Barnett T.等Genomics 3,59-66,1988；Tawaragi Y.等Biochem.Biophys.Res.Commun.150,89-96,1988；Strausberg R.L.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:16899-16903,2002；WO2004063709；EP1439393(权利要求7)；WO2004044178(实施例4)；WO2004031238；WO2003042661(权利要求12)；WO200278524(实施例2)；WO200286443(权利要求27；第427页)；WO200260317(权利要求2)；
登记号：P40199；Q14920；EMBL；M29541；AAA59915.1.EMBL；M18728；
(19)MDP(DPEP1,Genbank登记号BC017023)
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26):16899-16903(2002))；WO2003016475(权利要求1)；WO200264798(权利要求33；第85-87页)；JP05003790(图6-8)；WO9946284(图9)；
交叉引用：MIM:179780；AAH17023.1；BC017023_1
(20)IL20Rα(IL20Ra,ZCYTOR7,Genbank登记号AF184971)；
Clark H.F.等Genome Res.13,2265-2270,2003；Mungall A.J.等Nature 425,805-811,2003；Blumberg H.等Cell 104,9-19,2001；Dumoutier L.等J.Immunol.167,3545-3549,2001；Parrish-Novak J.等J.Biol.Chem.277,47517-47523,2002；Pletnev S.等(2003)Biochemistry 42:12617-12624；Sheikh F.等(2004)J.Immunol.172,2006-2010；EP1394274(实施例11)；US2004005320(实施例5)；WO2003029262(第74-75页)；WO2003002717(权利要求2；第63页)；WO200222153(第45-47页)；US2002042366(第20-21页)；WO200146261(第57-59页)；WO200146232(第63-65页)；WO9837193(权利要求1；第55-59页)；
登记号：Q9UHF4；Q6UWA9；Q96SH8；EMBL；AF184971；AAF01320.1.
(21)Brevican(BCAN,BEHAB,Genbank登记号AF229053)
Gary S.C.等Gene 256,139-147,2000；Clark H.F.等Genome Res.13,2265-2270,2003；Strausberg R.L.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99,16899-16903,2002；US2003186372(权利要求11)；US2003186373(权利要求11)；US2003119131(权利要求1；图52)；US2003119122(权利要求1；图52)；US2003119126(权利要求1)；US2003119121(权利要求1；图52)；US2003119129(权利要求1)；US2003119130(权利要求1)；US2003119128(权利要求1；图52)；US2003119125(权利要求1)；WO2003016475(权利要求1)；WO200202634(权利要求1)；
(22)EphB2R(DRT,ERK,Hek5,EPHT3,Tyro5,Genbank登记号NM_004442)
Chan,J.and Watt,V.M.,Oncogene 6(6),1057-1061(1991)；Oncogene10(5):897-905(1995)；Annu.Rev.Neurosci.21:309-345(1998)；Int.Rev.Cytol.196:177-244(2000))；WO2003042661(权利要求12)；WO200053216(权利要求1；第41页)；WO2004065576(权利要求1)；WO2004020583(权利要求9)；WO2003004529(第128-132页)；WO200053216(权利要求1；第42页)；
交叉引用：MIM:600997；NP_004433.2；NM_004442_1
(23)ASLG659(B7h,Genbank登记号AX092328)
US20040101899(权利要求2)；WO2003104399(权利要求11)；WO2004000221(图3)；US2003165504(权利要求1)；US2003124140(实施例2)；US2003065143(图60)；WO2002102235(权利要求13；第299页)；US2003091580(实施例2)；WO200210187(权利要求6；图10)；WO200194641(权利要求12；图7b)；WO200202624(权利要求13；图1A-1B)；US2002034749(权利要求54；第45-46页)；WO200206317(实施例2；第320-321页,权利要求34；第321-322页)；WO200271928(第468-469页)；WO200202587(实施例1；图1)；WO200140269(实施例3；第190-192页)；WO200036107(实施例2；第205-207页)；WO2004053079(权利要求12)；WO2003004989(权利要求1)；WO200271928(第233-234,452-453页)；WO0116318；
(24)PSCA(前列腺干细胞抗原前体,Genbank登记号AJ297436)
Reiter R.E.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95,1735-1740,1998；Gu Z.等Oncogene 19,1288-1296,2000；Biochem.Biophys.Res.Commun.(2000)275(3):783-788；WO2004022709；EP1394274(实施例11)；US2004018553(权利要求17)；WO2003008537(权利要求1)；WO200281646(权利要求1；第164页)；WO2003003906(权利要求10；第288页)；WO200140309(实施例1；图17)；US2001055751(实施例1；图1b)；WO200032752(权利要求18；图1)；WO9851805(权利要求17；第97页)；WO9851824(权利要求10；第94页)；WO9840403(权利要求2；图1B)；
登记号：O43653；EMBL；AF043498；AAC39607.1.
(25)GEDA(Genbank登记号AY260763)；
AAP14954脂肪瘤HMGIC融合-配偶体类蛋白/pid＝AAP14954.1-智人物种：智人(人类)
WO2003054152(权利要求20)；WO2003000842(权利要求1)；WO2003023013(实施例3,权利要求20)；US2003194704(权利要求45)；
交叉引用：GI:30102449；AAP14954.1；AY260763_1
(26)BAFF-R(B细胞活化因子受体,BLyS受体3,BR3,Genbank登记号AF116456)；BAFF受体/pid＝NP_443177.1-智人
Thompson,J.S.等Science 293(5537),2108-2111(2001)；WO2004058309；WO2004011611；WO2003045422(实施例；第32-33页)；WO2003014294(权利要求35；图6B)；WO2003035846(权利要求70；第615-616页)；WO200294852(Col 136-137)；WO200238766(权利要求3；第133页)；WO200224909(实施例3；图3)；
交叉引用：MIM:606269；NP_443177.1；NM_052945_1；AF132600
(27)CD22(B细胞受体CD22-B同工型,BL-CAM,Lyb-8,Lyb8,SIGLEC-2,FLJ22814,Genbank登记号AK026467)；
Wilson等(1991)J.Exp.Med.173:137-146；WO2003072036(权利要求1；图1)；
交叉引用：MIM:107266；NP_001762.1；NM_001771_1
(28)CD79a(CD79A,CD79α,免疫球蛋白相关α(一种与Igβ(CD79B)共价相互作用并且在表面上与Ig M分子形成复合物且转导涉及B细胞分化的信号的B细胞特异性蛋白),pI:4.84,MW:25028TM:2[P]Gene Chromosome:19q13.2,Genbank登记号NP_001774.10)
WO2003088808,US20030228319；WO2003062401(权利要求9)；US2002150573(权利要求4，第13-14页)；WO9958658(权利要求13，图16)；WO9207574(图1)；US5644033；Ha等(1992)J.Immunol.148(5):1526-1531；Mueller等(1992)Eur.J.Biochem.22:1621-1625；Hashimoto等(1994)Immunogenetics 40(4):287-295；Preud’homme等(1992)Clin.Exp.Immunol.90(1):141-146；Yu等(1992)J.Immunol.148(2)633-637；Sakaguchi等(1988)EMBO J.7(11):3457-3464；
(29)CXCR5(伯基特淋巴瘤受体1(一种由CXCL13趋化因子活化且在淋巴细胞迁移和体液防御中起作用且在HIV-2感染中起作用且可能在AIDS、淋巴瘤、黑素瘤和白血病的发展中起作用的G蛋白偶联受体),372aa,pI:8.54MW:41959TM:7[P]Gene Chromosome:11q23.3,Genbank登记号NP_001707.1)
WO2004040000；WO2004015426；US2003105292(实施例2)；US6555339(实施例2)；WO200261087(图1)；WO200157188(权利要求20，第269页)；WO200172830(第12-13页)；WO200022129(实施例1，第152-153页,实施例2，第254-256页)；WO9928468(权利要求1，第38页)；US5440021(实施例2,col 49-52)；WO9428931(第56-58页)；WO9217497(权利要求7，图5)；Dobner等(1992)Eur.J.Immunol.22:2795-2799；Barella等(1995)Biochem.J.309:773-779；
(30)HLA-DOB(MHC II类分子的β亚基(Ia抗原)(其与肽结合并且将其递呈给CD4+T淋巴细胞),273aa,pI:6.56MW:30820TM:1[P]Gene Chromosome:6p21.3,Genbank登记号NP_002111.1)
Tonnelle等(1985)EMBO J.4(11):2839-2847；Jonsson等(1989)Immunogenetics29(6):411-413；Beck等(1992)J.Mol.Biol.228:433-441；Strausberg等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA 99:16899-16903；Servenius等(1987)J.Biol.Chem.262:8759-8766；Beck等(1996)J.Mol.Biol.255:1-13；Naruse等(2002)Tissue Antigens 59:512-519；WO9958658(权利要求13，图15)；US6153408(Col 35-38)；US5976551(col 168-170)；US6011146(col 145-146)；Kasahara等(1989)Immunogenetics 30(1):66-68；Larhammar等(1985)J.Biol.Chem.260(26):14111-14119；
(31)P2X5(嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5(一种由胞外ATP门控的可能涉及突触传递和神经发生且其缺陷可促成特发性逼尿肌不稳定性病理生理学的离子通道),422aa),pI:7.63,MW:47206TM:1[P]Gene Chromosome:17p13.3,Genbank登记号NP_002552.2)
Le等(1997)FEBS Lett.418(1-2):195-199；WO2004047749；WO2003072035(权利要求10)；Touchman等(2000)Genome Res.10:165-173；WO200222660(权利要求20)；WO2003093444(权利要求1)；WO2003087768(权利要求1)；WO2003029277(第82页)；
(32)CD72(B细胞分化抗原CD72,Lyb-2)蛋白质完整序列maeaity...tafrfpd(1..359；359aa),pI:8.66,MW:40225TM:1[P]Gene Chromosome:9p13.3,Genbank登记号NP_001773.1)
WO2004042346(权利要求65)；WO2003026493(第51-52,57-58页)；WO200075655(第105-106页)；Von Hoegen等(1990)J.Immunol.144(12):4870-4877；Strausberg等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA 99:16899-16903；
(33)LY64(淋巴细胞抗原64(RP105),调节B细胞活化和凋亡且其功能缺失与患有系统性红斑狼疮的患者的疾病活动增加有关的富含亮氨酸重复(LRR)家族的I型膜蛋白,661aa,pI:6.20,MW:74147TM:1[P]Gene Chromosome:5q12,Genbank登记号NP_005573.1)
US2002193567；WO9707198(权利要求11，第39-42页)；Miura等(1996)Genomics 38(3):299-304；Miura等(1998)Blood 92:2815-2822；WO2003083047；WO9744452(权利要求8，第57-61页)；WO200012130(第24-26页)；
(34)FcRH1(Fc受体样蛋白1,可能在B淋巴细胞分化中起作用的含有C2型Ig样结构域和ITAM结构域的免疫球蛋白Fc结构域的推定受体,429aa,pI:5.28,MW:46925TM:1[P]Gene Chromosome:1q21-1q22,Genbank登记号NP_443170.1)
WO2003077836；WO200138490(权利要求6，图18E-1-18-E-2)；Davis等(2001)Proc.Natl.Acad.Sci USA 98(17):9772-9777；WO2003089624(权利要求8)；EP1347046(权利要求1)；WO2003089624(权利要求7)；
(35)IRTA2(免疫球蛋白超家族受体易位相关,在B细胞发育和淋巴瘤的生成中具有可能的作用的推定的免疫受体；由于易位所导致的基因失调在某些B细胞恶性肿瘤中发生；977aa,pI:6.88MW:106468TM:1[P]Gene Chromosome:1q21,Genbank登记号Human:AF343662,AF343663,AF343664,AF343665,AF369794,AF397453,AK090423,AK090475,AL834187,AY358085；Mouse:AK089756,AY158090,AY506558；NP_112571.1
WO2003024392(权利要求2，图97)；Nakayama等(2000)Biochem.Biophys.Res.Commun.277(1):124-127；WO2003077836；WO200138490(权利要求3，图18B-1-18B-2)；
(36)TENB2(TMEFF2,tomoregulin,TPEF,HPP1,TR,与EGF/调蛋白家族生长因子和卵泡抑素有关的推定的跨膜蛋白聚糖,374aa,NCBI登记号AAD55776,AAF91397,AAG49451,NCBI RefSeq:NP_057276；NCBI Gene:23671；OMIM:605734；SwissProt Q9UIK5；Genbank登记号AF179274；AY358907,CAF85723,CQ782436
WO2004074320(SEQ ID NO 810)；JP2004113151(SEQ ID NOS 2,4,8)；WO2003042661(SEQ ID NO 580)；WO2003009814(SEQ ID NO 411)；EP1295944(第69-70页)；WO200230268(第329页)；WO200190304(SEQ ID NO 2706)；US2004249130；US2004022727；WO2004063355；US2004197325；US2003232350；US2004005563；US2003124579；Horie等(2000)Genomics67:146-152；Uchida等(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.266:593-602；Liang等(2000)Cancer Res.60:4907-12；Glynne-Jones等(2001)Int JCancer.Oct15；94(2):178-84；
(37)PMEL17(银同系物；SILV；D12S53E；PMEL17；(SI)；(SIL)；ME20；gp100)BC001414；BT007202；M32295；M77348；NM_006928；McGlinchey,R.P.等(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106(33),13731-13736；Kummer,M.P.等(2009)J.Biol.Chem.284(4),2296-2306；
(38)TMEFF1(具有EGF样和两个卵泡抑素样结构域的跨膜蛋白1；Tomoregulin-1；H7365；C9orf2；C9ORF2；U19878；X83961)NM_080655；NM_003692；Harms,P.W.(2003)GenesDev.17(21),2624-2629；Gery,S.等(2003)Oncogene 22(18):2723-2727；
(39)GDNF-Ra1(GDNF家族受体α1；GFRA1；GDNFR；GDNFRA；RETL1；TRNR1；RET1L；GDNFR-alpha1；GFR-ALPHA-1；U95847；BC014962；NM_145793)NM_005264；Kim,M.H.等(2009)Mol.Cell.Biol.29(8),2264-2277；Treanor,J.J.等(1996)Nature 382(6586):80-83；
(40)Ly6E(淋巴细胞抗原6复合物，基因座E；Ly67,RIG-E,SCA-2,TSA-1)NP_002337.1；NM_002346.2；de Nooij-van Dalen,A.G.等(2003)Int.J.Cancer 103(6),768-774；Zammit,D.J.等(2002)Mol.Cell.Biol.22(3):946-952；
(41)TMEM46(shisa同系物2(Xenopus laevis)；SHISA2)NP_001007539.1；NM_001007538.1；Furushima,K.等(2007)Dev.Biol.306(2),480-492；Clark,H.F.等(2003)Genome Res.13(10):2265-2270；
(42)Ly6G6D(淋巴细胞抗原6复合物，基因座G6D；Ly6-D,MEGT1)NP_067079.2；NM_021246.2；Mallya,M.等(2002)Genomics80(1):113-123；Ribas,G.等(1999)J.Immunol.163(1):278-287；
(43)LGR5(含有富含亮氨酸的重复的G蛋白偶联受体5；GPR49,GPR67)NP_003658.1；NM_003667.2；Salanti,G.等(2009)Am.J.Epidemiol.170(5):537-545；Yamamoto,Y.等(2003)Hepatology 37(3):528-533；
(44)RET(ret原癌基因；MEN2A；HSCR1；MEN2B；MTC1；(PTC)；CDHF12；Hs.168114；RET51；RET-ELE1)NP_066124.1；NM_020975.4；Tsukamoto,H.等(2009)Cancer Sci.100(10):1895-1901；Narita,N.等(2009)Oncogene 28(34):3058-3068；
(45)LY6K(淋巴细胞抗原6复合物，基因座K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)NP_059997.3；NM_017527.3；Ishikawa,N.等(2007)Cancer Res.67(24):11601-11611；deNooij-van Dalen,A.G.等(2003)Int.J.Cancer103(6):768-774；
(46)GPR19(G蛋白偶联受体19；Mm.4787)NP_006134.1；NM_006143.2；Montpetit,A.and Sinnett,D.(1999)Hum.Genet.105(1-2):162-164；O’Dowd,B.F.等(1996)FEBSLett.394(3):325-329；
(47)GPR54(KISS1受体；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)NP_115940.2；NM_032551.4；Navenot,J.M.等(2009)Mol.Pharmacol.75(6):1300-1306；Hata,K.等(2009)Anticancer Res.29(2):617-623；
(48)ASPHD1(含有天冬氨酸β-羟化酶结构域的1；LOC253982)NP_859069.2；NM_181718.3；Gerhard,D.S.等(2004)Genome Res.14(10B):2121-2127；
(49)Tyrosinase(TYR；OCAIA；OCA1A；酪氨酸酶；SHEP3)NP_000363.1；NM_000372.4；Bishop,D.T.等(2009)Nat.Genet.41(8):920-925；Nan,H.等(2009)Int.J.Cancer 125(4):909-917；
(50)TMEM118(环指蛋白，跨膜2；RNFT2；FLJ14627)NP_001103373.1；NM_001109903.1；Clark,H.F.等(2003)Genome Res.13(10):2265-2270；Scherer,S.E.等(2006)Nature 440(7082):346-351；
(51)GPR172A(G蛋白偶联受体172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)NP_078807.1；NM_024531.3；Ericsson,T.A.等(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(11):6759-6764；Takeda,S.等(2002)FEBS Lett.520(1-3):97-101。
亲代抗体还可为包含白蛋白结合肽(ABP)序列的融合蛋白(Dennis等(2002)“Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics OfProteins”J Biol Chem.277:35035-35043；WO01/45746)。本发明的抗体包括具有下列文献中教导的ABP序列的融合蛋白：(i)Dennis等(2002)J Biol Chem.277:35035-35043，表III和IV,第35038页；(ii)US20040001827，第[0076]段；和(iii)WO01/45746，第12-13页，并且将所有这些文献通过引用的方式并入本文。
为了通过诱变来制备半胱氨酸工程化抗体，可通过本领域公知的多种方法制备编码起始多肽的氨基酸序列变体的DNA。这些方法包括但不限于通过位点定向(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变和对编码所述多肽的较早制备的DNA的盒式诱变制备。还可通过限制片段操作或通过使用合成寡核苷酸的重叠延伸PCR构建重组抗体的变体。诱变引物编码一种或多种半胱氨酸密码子替代物。标准诱变技术可用于产生编码此类突变的半胱氨酸工程化抗体的DNA。一般指导原则可在下列文献中找到：Sambrook等Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989；和Ausubel等Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishingand Wiley-Interscience,New York,N.Y.,1993。
可使用重组方法和组合物生产抗体，例如如US4816567中所述。在一个实施方案中，分离的核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在进一步的实施方案，提供包含此类核酸的一种或多种载体(例如表达载体)。在进一步的实施方案中，提供包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如已经用其改造)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)包含核酸的第一载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列，及包含核酸的第二载体，所述核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞例如中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，所述方法包括在适于抗体表达的条件下培养上文提供的包含编码抗体的核酸的宿主细胞及任选地从该宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
对于重组生产，将编码抗体的核酸，例如如上文所述，分离并插入用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达的一种或多种载体中。此类核酸可容易地分离并使用常规操作测序(例如通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链基因的寡核苷酸探针)。用于克隆或表达编码抗体的载体的合适的宿主细胞包括本文所述的原核细胞或真核细胞。例如，可在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于细菌中抗体片段和多肽的表达，参见例如US5648237、US5789199和US5840523(还参见Charlton,Methods inMolecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ,2003),pp.245-254,描述了大肠杆菌中抗体片段的表达)。在表达之后，可将抗体以可溶性级分形式从细菌细胞糊中分离并可进一步纯化。除了原核生物，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是抗体编码载体的合适克隆或表达宿主，包括真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经被“人源化”，从而生产具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004),和Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。对于糖基化抗体的表达的合适的宿主细胞也可来源于多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定了许多可与昆虫细胞一起使用杆状病毒株，特别是用于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞转染。植物细胞培养物也可用作宿主，诸如US5959177、US6040498、US6420548、US7125978和US6417429中所述的那些(描述用于在转基因植物中删除抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。其它有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是用SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系；人胚肾系(如例如Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977)中所述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；鼠支持细胞(如例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；Buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中华仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如Y0、NS0和Sp2/0。对于某些适于抗体生产的哺乳动物宿主细胞系，参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。
位点-定向诱变是一种制备替代变体即突变蛋白的方法(Carter(1985)等NucleicAcids Res.13:4431-4443；Ho等(1989)Gene(Amst.)77:51-59；和Kunkel等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488)。通过首先使编码所需突变的寡核苷酸与此类起始DNA的单链杂交来改变起始DNA。在杂交后，将DNA聚合酶用于使用杂交的寡核苷酸作为引物并且使用起始DNA的单链作为模板合成完整的第二链。因此，将编码所需突变的寡核苷酸掺入所得双链DNA。位点-定向诱变可在表达质粒中表达欲进行诱变的蛋白质的基因中进行，并且可对所得质粒测序以证实引入了所需的半胱氨酸替代突变(Liu等(1998)J.Biol.Chem.273:20252-20260)。位点-定向诱变方案和方式是广泛可得的，例如Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene,La Jolla,CA)。
PCR诱变还适于制备起始多肽的氨基酸序列变体。参见Higuchi,(1990)in PCRProtocols,pp.177-183,Academic Press；Ito等(1991)Gene 102:67-70；Bernhard等(1994)Bioconjugate Chem.,5:126-132；和Vallette等(1989)Nuc.Acids Res.,17:723-733。简言之，当将少量模板DNA用作PCR中的起始物时，在序列方面稍不同于模板DNA中相应区的引物可用于产生相对大量的特异性DNA片段，这些片段仅在引物不同于模板的位置上不同于模板序列。
用于制备变体的另一种方法即盒式诱变基于Wells等(1985)Gene,34:315-323所述的技术。起始物质为包含欲突变的起始多肽DNA的质粒(或其它载体)。鉴定欲突变的起始DNA中的一个或多个密码子。在一个或多个鉴定的突变位点的每侧上必须存在独特的限制性内切核酸酶位点。如果不存在此类限制位点，则可使用上述寡核苷酸介导的诱变方法产生它们，以将其引入起始多肽DNA的适当位置上。在这些位点上切割质粒DNA以使其线性化。使用标准操作合成编码在限制位点之间但含有所需突变的DNA序列的双链寡核苷酸，其中分别合成寡核苷酸的两条链然后使用标准技术彼此杂交。这种双链寡核苷酸称作盒。将这种盒设计成具有与线性化质粒末端相容的5’和3’末端，使得它可以直接与质粒接合。这种质粒目前含有突变的DNA序列。可通过DNA测序证实含有编码的半胱氨酸替代物的突变DNA。
还通过寡核苷酸定向诱变，使用经基于PCR的诱变的双链质粒DNA作为模板产生单突变(Sambrook和Russel,(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rdedition；Zoller等(1983)Methods Enzymol.100:468-500；Zoller,M.J.和Smith,M.(1982)Nucl.Acids Res.10:6487-6500)。
在某些实施方案中，可将一个或多个氨基酸修饰引入到本文中提供的抗体的Fc区，由此生成Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，其包含在一个或多个氨基酸位置的氨基酸修饰(例如取代)。
在某些实施方案中，本发明设想了具有一些但不是全部效应子功能的抗体变体，这使得它成为用于施用的理想候选物，其中体内抗体的半衰期是重要的但某些效应子功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的减少/耗尽。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定以确认抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。
CBI二聚体药物部分
本发明的抗体-药物缀合物化合物包含CBI二聚体药物部分D。CBI二聚体药物部分可由两个CBI药物单元或一个CBI药物单元和一个PBD药物单元构成。
所述CBI二聚体药物部分D具有下式：
其中
R1选自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb；
R2选自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb；
Ra和Rb独立地选自H和任选取代有一个或多个F的C1-C6烷基，
或Ra和Rb形成五元或六元杂环基；
T是选自以下的束缚基团：C3-C12亚烷基、Y、(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)、(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)、(C2-C6亚烯基)-Y-(C2-C6亚烯基)和(C2-C6亚炔基)-Y-(C2-C6亚炔基)；
其中Y独立地选自O、S、NR1、芳基和杂芳基；
其中亚烷基、亚烯基、芳基和杂芳基独立地且任选地取代有F、OH、O(C1-C6烷基)、NH2、NHCH3、N(CH3)2、OP(O)3H2和C1-C6烷基，其中烷基任选地取代有一个或多个F；
或亚烷基、亚烯基、芳基和杂芳基独立地且任选地取代有与L的键；
D’是选自以下的药物部分：
其中波浪线表示与T连接的位点；
X1和X2独立地选自O和NR3，其中R3选自H和任选地取代有一个或多个F的C1-C6烷基；
R4为H、CO2R，其中R为C1-C6烷基或苄基；且
R5为H或C1-C6烷基。
在某些实施方案中，Y为苯基、吡啶基、1-甲基-1H-苯并[d]咪唑或[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶。
CBI二聚体药物部分D化合物包括表1中可用于制备表3的接头-CBI药物中间体的那些化合物。
表1 CBI二聚体药物部分化合物
可用于制备CBI二聚体药物部分D化合物的束缚试剂包括表2中的那些试剂。
表2 束缚试剂
接头
本发明的抗体-药物缀合物(ADC)化合物包含具有下式的接头：
-Str-(Pep)m-(Sp)n-
其中Str是与抗体共价连接的延伸单元；Pep是具有2至12个氨基酸残基的任选肽单元，Sp是与二聚体药物部分共价连接的任选间隔基单元，且m和n独立地选自0和1。
在一个示例性实施方案中，Str具有1,3-二取代的吡咯烷-2,5-二酮(琥珀酰亚胺)式：
其中R6选自C1-C10亚烷基、C3-C8碳环基、O-(C1-C8烷基)、亚芳基、C1-C10亚烷基-亚芳基、亚芳基-C1-C10亚烷基、C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)、(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基、C3-C8杂环基、C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)、(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基、C1-C10亚烷基-C(O)N(R8)-C2-C6亚烷基-N(R8)、N(R8)-(C2-C6亚烷基)和(CH2CH2O)r-CH2；其中R8为H或C1-C6烷基，且r为1至10的整数。
Str延伸单元的1,3-二取代的吡咯烷-2,5-二酮实施方案可由抗体的半胱氨酸巯基与接头-药物中间体(诸如表4中的那些)的马来酰亚胺基团缀合形成。
在另一个示例性实施方案中，Str具有下式：
其中R7选自C1-C10亚烷基、C1-C10亚烷基-O、N(R8)-(C2-C6亚烷基)-N(R8)、N(R8)-(C2-C6亚烷基)和(CH2CH2O)r-CH2；其中R8为H或C1-C6烷基，且r为1至10的整数。
在另一个示例性实施方案中，Str具有下式：
其中R9选自C1-C10亚烷基、C1-C10亚烷基-O、(C2-C6亚烷基)-N(R8)和(CH2CH2O)r-CH2；其中R8为H或C1-C6烷基，且r为1至10的整数。
在另一个示例性实施方案中，L形成与抗体的半胱氨酸氨基酸的二硫键，且R9为C2-C6亚烷基-O，其中亚烷基任选地取代有F、OH、O(C1-C6烷基)、NH2、NHCH3、N(CH3)2、OP(O)3H2和C1-C6烷基，其中烷基任选地取代有一个或多个F。
接头试剂和接头-药物中间体可具有2至12个或更多个氨基酸残基的肽单元。
在一个示例性实施方案中，m为1且Pep包含2至12个独立地选自甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、缬氨酸和瓜氨酸的氨基酸残基。
在一个示例性实施方案中，Pep为缬氨酸-瓜氨酸。
肽-接头试剂如所述制备(WO2012113847；US7659241；US7498298；US2009/0111756；US2009/0018086；US6214345；Dubowchik等(2002)Bioconjugate Chem.13(4):855-869)。
在一个示例性实施方案中，Sp包含对氨基苄基或对氨基苄基氧基羰基。
表3显示了可用于制备表4的接头-CBI药物中间体的示例性接头试剂。
表3 肽-接头试剂
可用于ADC的接头-药物中间体
可用于与抗体缀合以制备抗体-药物缀合物的接头-药物中间体具有下式：
X-L-D
其中：
X为反应性官能团，其选自马来酰亚胺、巯基、氨基、溴化物、溴乙酰氨基、碘乙酰氨基、对甲苯磺酸酯、碘化物、羟基、羧基、吡啶基二硫化物和N-羟基琥珀酰亚胺；
L是具有下式的接头：
-Str-(Pep)m-(Sp)n-
其中Str为与反应性官能团X共价连接的延伸单元；Pep是具有2至12个氨基酸残基的任选肽单元，Sp是与二聚体药物部分共价连接的任选间隔基单元，且m和n独立地选自0和1；
D是具有下式的二聚体药物部分：
其中
R1选自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb或与L的键；
R2选自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb或与L的键；
Ra和Rb独立地选自H和任选取代有一个或多个F的C1-C6烷基，或Ra和Rb形成五元或六元杂环基；
T是选自以下的束缚基团：C3-C12亚烷基、Y、(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)、(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)、(C2-C6亚烯基)-Y-(C2-C6亚烯基)和(C2-C6亚炔基)-Y-(C2-C6亚炔基)；
其中Y独立地选自O、S、NR1、芳基和杂芳基；
其中亚烷基、亚烯基、芳基和杂芳基独立地且任选地取代有F、OH、O(C1-C6烷基)、NH2、NHCH3、N(CH3)2、OP(O)3H2和C1-C6烷基，其中烷基任选地取代有一个或多个F；
或亚烷基、亚烯基、芳基和杂芳基独立地且任选地取代有与L的键；
D’是选自以下的药物部分：
其中波浪线表示与T连接的位点；
X1和X2独立地选自O和NR3，其中R3选自H和任选地取代有一个或多个F的C1-C6烷基；
R4为H、CO2R或与L的键，其中R为C1-C6烷基或苄基；且
R5为H或C1-C6烷基。
通过使CBI二聚体药物部分与接头试剂偶联制备表4的接头-药物中间体，如实施例1-18和图1-24所示例。
表4 接头-CBI药物中间体
抗体-药物缀合物(ADC)
本发明的抗体-药物缀合物(ADC)化合物包含与有效CBI二聚体药物部分连接的对肿瘤相关抗原特异性的抗体且包括具有治疗活性的对多种过度增殖性病症(包括癌症)有效的那些。药物部分的生物学活性由与抗体的缀合来调节。本发明的ADC选择性递送有效剂量的CBI二聚体药物或毒素至肿瘤细胞或位点，由此可实现较高的选择性即较低的有效剂量同时增加治疗指数(“治疗窗”)。在一个示例性实施方案中，ADC化合物包含与CBI二聚体药物部分缀合即通过接头与CBI二聚体药物部分共价连接的半胱氨酸工程化抗体。
本发明的抗体-药物缀合物化合物具有下式：
Ab-(L-D)p
其中：
Ab是抗体；
L是具有下式的接头：
-Str-(Pep)m-(Sp)n-
其中Str是与抗体共价连接的延伸单元；Pep是具有2至12个氨基酸残基的任选肽单元，Sp是与二聚体药物部分共价连接的任选间隔基单元，且m和n独立地选自0和1；
p是1至8的整数；
D是具有下式的二聚体药物部分：
其中
R1选自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb或与L的键；
R2选自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb或与L的键；
Ra和Rb独立地选自H和任选取代有一个或多个F的C1-C6烷基，
或Ra和Rb形成五元或六元杂环基；
T是选自以下的束缚基团：C3-C12亚烷基、Y、(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)、(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)、(C2-C6亚烯基)-Y-(C2-C6亚烯基)和(C2-C6亚炔基)-Y-(C2-C6亚炔基)；
其中Y独立地选自O、S、NR1、芳基和杂芳基；
其中亚烷基、亚烯基、芳基和杂芳基独立地且任选地取代有F、OH、O(C1-C6烷基)、NH2、NHCH3、N(CH3)2、OP(O)3H2和C1-C6烷基，其中烷基任选地取代有一个或多个F；
或亚烷基、亚烯基、芳基和杂芳基独立地且任选地取代有与L的键；
D’是选自以下的药物部分：
其中波浪线表示与T连接的位点；
X1和X2独立地选自O和NR3，其中R3选自H和任选地取代有一个或多个F的C1-C6烷基；
R4为H、CO2R，其中R为C1-C6烷基或苄基；且
R5为H。
在一个实施方案中，Ra和Rb形成选自N-甲基哌嗪基、吗啉基、哌啶基和吡咯烷基的五元或六元杂环基。
在一个实施方案中，所述药物部分可经由蛋白酶可裂解的通过组织蛋白酶B(一种在大部分哺乳动物细胞类型中发现的溶酶体蛋白酶)可裂解的肽接头与抗体连接(US6214345；Dubowchik等(2002)Bioconj.Chem.13:855-869)。尽管本发明不受任何具体作用机制的限制或限定，ADC可作为前药起作用，其中药物是无活性的直至接头裂解。ADC能够在肿瘤细胞位置特异性浓缩活性药物，其中疾病可通过常规化学疗法欠佳地治疗。在其它实施方案中，药物部分经由非肽的非蛋白酶可裂解的接头与抗体连接，其可包括诸如二硫化物或琥珀酰亚氨基的官能基。
可经由反应性接头部分与抗体分子缀合的药物部分的数目可受通过本文所述方法引入的游离半胱氨酸残基的数目限制。因此，示例性ADC包括具有1、2、3或4个工程化半胱氨酸氨基酸的抗体(Lyon,R.等(2012)Methods in Enzym.502:123-138)。
在一个实施方案中，所述抗体-药物缀合物化合物具有下式：
其中AA1和AA2独立地选自氨基酸侧链。所述氨基酸侧链独立地选自H、-CH3、-CH2(C6H5)、-CH2CH2CH2CH2NH2、-CH2CH2CH2NHC(NH)NH2、-CHCH(CH3)CH3和-CH2CH2CH2NHC(O)NH2。
在一个实施方案中，所述抗体-药物缀合物化合物具有下式：
在一个实施方案中，所述抗体-药物缀合物化合物具有下式：
在一个实施方案中，所述抗体-药物缀合物化合物具有下式：
在一个实施方案中，所述抗体-药物缀合物化合物具有下式：
在一个实施方案中，所述抗体-药物缀合物化合物具有下式：
在一个实施方案中，所述抗体-药物缀合物化合物具有下式：
在一个实施方案中，所述抗体-药物缀合物化合物具有下式：
在一个实施方案中，所述抗体-药物缀合物化合物具有下式：
其中R7独立地选自H和C1-C12烷基。
在一个实施方案中，p为1、2、3或4。
在一个实施方案中，p为2。
在一个实施方案中，D为选自表1中所列化合物或其衍生物的部分。
在一个实施方案中，L-D为选自表4中所列化合物或其衍生物的部分。
在一个实施方案中，本发明涉及选自表5中所列分子的缀合物。
ADC的载药量
载药量为每个抗体CBI药物部分的平均数量。载药量的范围可为每个抗体(Ab)1至8个药物(D)，即其中1、2、3、4、5、6、7和8个药物部分共价连接到抗体上。ADC的组合物包括与一系列(1至8个)药物缀合的抗体的集合。在由缀合反应制备ADC中每个抗体的药物的平均数量可通过常规手段例如质谱、ELISA测定、电泳和HPLC来表征。也可确定以p为单位的ADC的定量分布。通过ELISA，可确定ADC的具体制备中p的平均值(Hamblett等(2004)Clin.Cancer Res.10:7063-7070；Sanderson等(2005)Clin.Cancer Res.11:843-852)。然而，p(药物)值的分布不能通过抗体-抗原结合和ELISA的检测限识别。另外，检测抗体-药物缀合物的ELISA测定不能确定药物部分连接到抗体的位置，诸如重链或轻链片段或特定氨基酸残基。在一些实例中，从ADC与其它药物载荷中分离、纯化并表征同质ADC(其中p是一定值)可通过诸如反相HPLC或电泳实现。
对于一些抗体-药物缀合物，p可受抗体上连接位点的数目限制。例如，抗体可只具有一个或若干个半胱氨酸巯基或者可只具有一个或若干个足够的反应性巯基(可经其连接接头)。较高的载药量，例如p>5，可引起聚集、不溶解、毒性或某些抗体-药物缀合物的细胞通透性的丧失。
通常，缀合反应期间少于理论最大量的药物部分缀合至抗体。抗体可包含例如许多不与接头-药物中间体(X-L-D)或接头试剂反应的赖氨酸残基。只有反应性最强的赖氨酸基团可与胺反应性接头试剂反应。另外，只有最强反应性半胱氨酸巯基可与巯基反应性接头试剂或接头-药物中间体反应。通常，抗体不包含许多(如果有的话)可连接至药物部分的游离和反应性半胱氨酸巯基。化合物的抗体中的大部分半胱氨酸巯基残基以二硫键形式存在且必须在部分或完全还原性条件下用还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)或TCEP还原。ADC的载量(药物/抗体比例“DAR”)可以若干种不同的方式来控制，包括：(i)限制接头-药物中间体或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制缀合反应时间或温度，和(iii)部分或限制用于半胱氨酸巯基修饰的还原条件。
当多于一个抗体的亲核或亲电基团与接头-药物中间体或接头试剂反应且接着与CBI二聚体药物部分试剂反应时，所得产物是ADC化合物与连接至抗体的药物部分的分布(例如1、2、3等)的混合物。液相色谱方法诸如聚合反相(PLRP)和疏水性相互作用(HIC)可基于载药量值在混合物中分离化合物。可分离出具有单一载药量值(p)的ADC的制剂，然而，这些单一载量值ADC可能仍然是非均质混合物，因为药物部分可经由接头连接在抗体上的不同位点。因此，本发明的抗体-药物缀合物组合物包括抗体-药物缀合物化合物的混合物，其中所述抗体具有一个或多个药物部分且其中所述药物部分可在不同的氨基酸残基处连接至所述抗体。
制备抗体-药物缀合物的方法
按照实施例20由接头-药物中间体51-68制备本发明的示例性抗体-药物缀合物(ADC)化合物101-139并如表4所示。
表5 抗体-药物缀合物(ADC)
*DAR＝药物/抗体比例平均值
**A118C(EU编号)＝A121C(顺序编号)＝A114C(Kabat编号)
抗NaPi2b抗体
根据US8,535,675，表5中ADC的抗NaPi2b抗体包含三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)和三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)：
表5中ADC的抗NaPi2b抗体包含SEQ ID NO:81中所示的轻链可变区(VL)和SEQ IDNO:82中所示的重链可变区(VH)。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSETLVHSSGNTYLEWYQQKPGKAPKLLIYRVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFQGSFNPLTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:81)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSDFAMSWVRQAPGKGLEWVATIGRVAFHTYYPDSMKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHRGFDVGHFDFWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:82)
在一些实施方案中，本发明提供包含至少一种、两种、三种、四种、五种或六种选自以下HVR的抗NaPi2b抗体：(a)含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQ IDNO:79的氨基酸序列的HVR-H2；(c)含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的HVR-H3；(d)含有SEQID NO:75的氨基酸序列的HVR-L1；(e)含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供包含至少一种、至少两种或全部三种选自以下的VH HVR序列的抗NaPi2b抗体：(a)含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，所述抗体包含含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，所述抗体包含含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的HVR-H3和含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-L3。在进一步的实施方案中，所述抗体包含含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的HVR-H3、含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-L3和含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的HVR-H2。在进一步的实施方案中，所述抗体包含(a)含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一方面，本发明提供包含至少一种、至少两种或全部三种选自以下的VL HVR序列的抗体：(a)含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的HVR-L1；(b)含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，所述抗体包含(a)含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的HVR-L1；(b)含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一方面，本发明的抗体包含：(a)包含至少一种、至少两种或全部三种选自以下的VH HVR序列的VH结构域：(i)含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)含有SEQID NO:79的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:80的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)包含至少一种、至少两种或全部三种选自以下的VL HVR序列的VL结构域：(i)含有SEQID NO:75的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一方面，本发明提供一种抗体，其包含：(a)含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的HVR-H2；(c)含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的HVR-H3；(d)含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的HVR-L1；(e)含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-L3。
在任一项上述实施方案中，抗NaPi2b抗体为人源化的。在一个实施方案中，抗NaPi2b抗体包含上述实施方案中任一项的HVR且进一步包含人受体框架例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在某些实施方案中，所述人受体框架为人VLκI共有(VLKI)框架和/或VH框架VH1。在某些实施方案中，所述人受体框架为包含任一种以下突变的人VLκI共有(VLKI)框架和/或VH框架VH1。
在另一方面，抗NaPi2b抗体包含与SEQ ID NO:82的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，相对于参照序列，与SEQ ID NO:82的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含所述序列的抗NaPi2b抗体保持结合NaPi2b的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:82中总计1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:82中总计1至5个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR以外的区域(即在FR)。任选地，所述抗NaPi2b抗体包含SEQ IDNO:82的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。在具体的实施方案中，所述VH包含一种、两种或三种选自以下的HVR：(a)含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HVR-H1，(b)含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一方面，本申请提供抗NaPi2b抗体，其中所述抗包含与SEQ ID NO:81的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，相对于参照序列，与SEQ ID NO:81的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗NaPi2b抗体保持结合NaPi2b的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:81中总计1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:81中总计1至5个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR以外的区域(即在FR)。任选地，所述抗NaPi2b抗体包含SEQ ID NO:81的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在具体的实施方案中，所述VL包含选自以下的一种、两种或三种HVR：(a)含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的HVR-L1；(b)含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一方面，本申请提供抗NaPi2b抗体，其中所述抗体包含任一项上文提供的实施方案中的VH和任一项上文提供的实施方案中的VL。
在一个实施方案中，所述抗体包含分别为SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:81的VH和VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。
在另一方面，本文提供结合与本文提供的抗NaPi2b抗体相同的表位的抗体。例如，在某些实施方案中，本申请提供结合与抗NaPi2b抗体相同的表位的抗体，其包含SEQ IDNO:82的VH序列和SEQ ID NO:81的VL序列。
在本发明的另一方面，上述实施方案中任一项的抗NaPi2b抗体为单克隆抗体，其包括人抗体。在一个实施方案中，抗NaPi2b抗体为抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双功能抗体或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，上述抗体为基本上全长的抗体，例如本文所定义的IgG1抗体、IgG2a抗体或其它抗体类型或同工型。
在另一方面，上述实施方案中任一项的抗NaPi2b抗体可单独或组合掺入任一种下文所述的特征。
抗CD22抗体
根据US8226945，表5中ADC的抗CD22抗体包含三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)和三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)：
抗MUC16抗体
根据US7989595，表5中ADC的抗MUC16抗体包含三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)和三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)：
表5中ADC的抗MUC16抗体包含SEQ ID NO:13的可变重链序列和SEQ ID NO:14的可变轻链序列。
E V Q L V E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G Y S I T N D Y A WN W V R Q A P G K G L E W V G Y I S Y S G Y T T Y N P S L K S R F T I S R D TS K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A R W T S G L D Y W G Q G T L V TV S S(SEQ ID NO:13)
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C K A S D L I H N W L A WY Q Q K P G K A P K L L I Y G A T S L E T G V P S R F S G S G S G T D F T L TI S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y W T T P F T F G Q G T K V E I K R(SEQ IDNO:14)
在一个实施方案中，本发明的ADC的抗MUC16抗体为半胱氨酸工程化的ThioMab，其包含位于选自SEQ ID NO:15-32的轻链序列或选自SEQ ID NO:33-46的重链序列中的一个或多个游离半胱氨酸残基：
在一个实施方案中，所述抗MUC16半胱氨酸工程化的ThioMab为包含SEQ ID NO:47的重链序列的人源化抗体。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITNDYAWNWVRQAPGKGLEWVGYISYSGYTTYNPSLKSRFTISRDTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWTSGLDYWGQGTLVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO:47)
在一个实施方案中，所述抗MUC16半胱氨酸工程化的ThioMab为包含SEQ ID NO:48的轻链序列的人源化抗体。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASDLIHNWLAWYQQKPGKAPKLLIYGATSLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYWTTPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO:48)
在一个实施方案中，所述抗MUC16半胱氨酸工程化的ThioMab为包含SEQ ID NO:49的重链序列的嵌合抗体。
DVQLQESGPGLVNPSQSLSLTCTVTGYSITNDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYINYSGYTTYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLHLNSVTTEDTATYYCARWDGGLTYWGQGTLVTVSACSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO:49)
在一个实施方案中，所述抗MUC16半胱氨酸工程化的ThioMab为包含SEQ ID NO:50的轻链序列的嵌合抗体。
DIQMTQSSSFLSVSLGGRVTITCKASDLIHNWLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGVPS
RFSGSGSGNDYTLSIASLQTEDAATYYCQQYWTTPFTFGSGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO:50)
抗HER2抗体
在某些实施方案中，表5的ADC包含抗HER2抗体。在本发明的一个实施方案中，本发明的ADC的抗HER2抗体包括人源化抗HER2抗体例如huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8，如US5821337的表3所述。所述抗体含有具有结合HER2的鼠抗体的互补决定区(4D5)的人框架区。人源化抗体huMAb4D5-8还被称作曲妥珠单抗，其以商品名市售。在本发明的另一个实施方案中，本发明的ADC的抗HER2抗体包括人源化抗HER2抗体例如人源化2C4，如US7862817所述。示例性人源化2C4抗体为帕妥珠单抗，其以商品名市售。
用于制备表5的ADC的半胱氨酸工程化的Thiomab抗体具有在重量的118-丙氨酸位点(EU编号方式)引入的半胱氨酸残基。该位点通过顺序编号方式编号为121或通过Kabat编号方式编号为114。
抗CD33抗体
表5中ADC的抗CD33抗体15G15.33包含三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)和三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)
表5中ADC的抗CD33抗体15G15.33包含SEQ ID NO:57的轻链可变区和/或SEQ IDNO:58的重链可变区。
EIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGVNSVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPWTFGQGTKVEIK
(SEQ ID NO:57)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGIFSNHAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAFMELSSLRSEDTAVYYCAREWADVFDIWGQGTMVTVSS
(SEQ ID NO:58)
抗CD33抗体9C3和其它实施方案
9C3VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKLEIK
9C3VH
EVQLVESGGALIQPGGSLRLSCVASGFTISGNYMSWVRQAPGKGLEWVSLIYSGDSTYYADSVKGRFNISRDISKNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCVRDGYYVSDMVVWGKGTTVTVSS
(SEQ ID NO:66)
9C3.2VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO:67)
9C3.2VH
EVQLVESGGALIQPGGSLRLSCVASGFTISGNYMSWVRQAPGKGLEWVSLIYSGDSTYYADSVKGRFTISRDISKNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCVRDGYYVSDMVVWGKGTTVTVSS
(SEQ ID NO:68)
9C3.3VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO:69)
9C3.3VH
EVQLVESGGALIQPGGSLRLSCVASGFTISGNYMSWVRQAPGKGLEWVSLIYSGDSTYYADSVKGRFSISRDISKNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCVRDGYYVSDMVVWGKGTTVTVSS
(SEQ ID NO:70)
9C3.4VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO:71)
9C3.4VH
EVQLVESGGALIQPGGSLRLSCVASGFTISGNYMSWVRQAPGKGLEWVSLIYSGDSTYYADSVKGRFAISRDISKNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCVRDGYYVSDMVVWGKGTTVTVSS
(SEQ ID NO:72)
在一些实施方案中，本发明提供包含至少一种、两种、三种、四种、五种或六种选自以下的HVR的抗CD33抗体：(a)含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQ IDNO:63的氨基酸序列的HVR-H2；(c)含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-H3；(d)含有SEQID NO:59的氨基酸序列的HVR-L1；(e)含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供包含至少一种、至少两种或全部三种选自以下的VH HVR序列的抗体：(a)含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，所述抗体包含含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，所述抗体包含含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-H3和含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-L3。在进一步的实施方案中，所述抗体包含含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-H3、含有SEQID NO:61的氨基酸序列的HVR-L3和含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HVR-H2。在进一步的实施方案中，所述抗体包含：(a)含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQ IDNO:63的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一方面，本发明提供包含至少一种、至少两种或全部三种选自以下的VL HVR序列的抗体：(a)含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的HVR-L1；(b)含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，所述抗体包含(a)含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的HVR-L1；(b)含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一方面，本发明的抗体包含：(a)包含至少一种、至少两种或全部三种选自以下的VH HVR序列的VH结构域：(i)含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)含有SEQID NO:63的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)包含至少一种、至少两种或全部三种选自以下的VL HVR序列的VL结构域：(i)含有SEQID NO:59的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一方面，本发明提供包含以下部分的抗体：(a)含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HVR-H2；(c)含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-H3；(d)含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的HVR-L1；(e)含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-L3。
在任一项上述实施方案中，抗CD33抗体为人源化。在一个实施方案中，抗CD33抗体包含任一项上述实施方案中的HVR且进一步包含人受体框架例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在某些实施方案中，所述人受体框架为人VLκI共有(VLKI)框架和/或VH框架VH1。在某些实施方案中，所述人受体框架为人VLκI共有(VLKI)框架和/或VH框架VH1，其包含任一种下列突变。
在另一方面，抗CD33抗体包含与SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70和/或SEQ ID NO:72的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，相对于参照序列，与SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70和/或SEQ ID NO:72的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含所述序列的抗CD33抗体保持结合CD33的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70和/或SEQ ID NO:72中总计1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQID NO:70和/或SEQ ID NO:72中总计1至5个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR以外的区域(即在FR)。任选地，所述抗CD33抗体包含SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70和/或SEQ ID NO:72的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。在具体的实施方案中，所述VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-H1，(b)含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一方面，本发明提供抗CD33抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:65、SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:69和/或SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，相对于参照序列，与SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69和/或SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含所述序列的抗CD33抗体保持结合CD33的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69和/或SEQ IDNO:71中总计1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69和/或SEQ ID NO:71中总计1至5个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR以外的区域(即在FR)。任选地，所述抗CD33抗体包含SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69和/或SEQ ID NO:71的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在具体的实施方案中，所述VL包含选自以下的一种、两种或三种HVR：(a)含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的HVR-L1；(b)含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一方面，本发明提供抗CD33抗体，其中所述抗体包含上文提供的任一项实施方案中的VH和上文提供的任一项实施方案中的VL。
在一个实施方案中，所述抗体包含分别为SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:65的VH和VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体包含分别为SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:67的VH和VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体包含分别为SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:69的VH和VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，所述抗体包含分别为SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:71的VH和VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。
在再一方面，本发明提供结合与本文提供的抗CD33抗体相同的表位的抗体。例如，在某些实施方案中，本发明提供结合与抗CD33抗体相同的表位的抗体，其包含分别为SEQID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70和/或SEQ ID NO:72的VH序列及分别为SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69和/或SEQ ID NO:71的VL序列。
在本发明的再一方面，任一项上述实施方案的抗CD33抗体为单克隆抗体，包括人抗体。在一个实施方案中，抗CD33抗体为抗体片段例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双功能抗体或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，所述抗体为基本上全长的抗体，例如本文所定义的IgG1抗体、IgG2a抗体或其它抗体类型或同工型。
在再一方面，任一项上述实施方案的抗CD33抗体可单独或组合掺入任一种下文所述的特征。
体外细胞抗增殖测定
通常，如下测量抗体-药物缀合物(ADC)的细胞毒性或细胞抑制活性：使具有受体蛋白(例如HER2)的哺乳动物细胞在细胞培养基中暴露于ADC的抗体；将细胞培养约6小时至约5天的时间；和测量细胞活力。基于细胞的体外测定用于测量活力(增殖)、细胞毒性和本发明ADC对细胞凋亡的诱导(半胱天冬酶活化)。
通过细胞增殖测定测量抗体-药物缀合物的体外效力(实施例21)。所述ADC在抑制肿瘤细胞增殖中显示出令人惊讶和预料不到的效力。ADC的效力与细胞的靶抗原表达相关。图25-30的数据表明所测试的缀合物能够在体外结合细胞表面上表达的特定抗原并引起这些细胞的死亡。
Luminescent Cell Viability Assay为市售的(Promega Corp.,Madison,WI)基于鞘翅目(Coleoptera)萤光素酶的重组表达的同质测定方法(美国专利US5583024；US5674713；US5700670)。该细胞增殖测定基于对存在的ATP(代谢活性细胞的指示物)进行定量确定培养物中存活细胞的数量(Crouch等(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88；US6602677)。在96孔板中进行Assay，这使得它易于进行自动化高通量筛选(HTS)(Cree等(1995)AntiCancer Drugs 6:398-404)。同质测定操作包括将单一试剂(Reagent)直接添加至在补充有血清的培养基中培养的细胞中。无需进行细胞洗涤、除去培养基和多次吸移的步骤。系统可在添加试剂并且混合后10分钟内检测384孔格中低至15个细胞/孔。可用ADC连续处理细胞，或可处理它们并且与ADC分离。通常，暂短(即3小时)处理的细胞表现出与连续处理的细胞相同的效力作用。
同质“添加-混合-测量”方式导致细胞裂解并且产生与存在的ATP量成比例的发光信号。ATP的量与培养物中存在的细胞数量成正比。Assay产生由萤光素酶反应产生的“辉光型”发光信号，其具有一般大于5小时的半衰期，这取决于所用的细胞类型和培养基。以相对发光单位(RLU)反映存活细胞。底物甲虫萤光素被重组萤火虫萤光素酶氧化脱羧同时ATP转化成AMP并且产生光子。
基于细胞的体外测定用于测量活力(增殖)、细胞毒性和本发明ADC对细胞凋亡的诱导(半胱天冬酶活化)。通常，如下测量抗体-药物缀合物(ADC)的细胞毒性或细胞抑制活性：使表达抗原(诸如HER2或MUC16多肽)的哺乳动物细胞在细胞培养基中暴露于ADC；将细胞培养约6小时至约5天的时间；和测量细胞活力。用于抗MUC16ADC的细胞增殖测定的哺乳动物细胞包括：(1)表达MUC16多肽的细胞系OVCAR-3；(2)工程化以在其细胞表面上稳定表达MUC16多肽的一部分的PC3衍生的细胞系(PC3/MUC16)；(3)不表达MUC16多肽的亲代PC3细胞系；和(4)不表达MUC16多肽但携带用于驱使外源性MUC16表达的载体的PC3细胞系(PC3/neo)。
图25在3天SK-BR-3体外细胞活力对Thio hu抗CD22 HC A121C-MC-vc-PAB-(CBI二聚体)101和Thio hu抗Her2 HC A121C-MC-vc-PAB-(CBI二聚体)102的浓度(μg/ml)的图中示出抗体-药物缀合物的效力。Her2抗原在SK-BR-3细胞中高度表达。抗Her2 ADC 102显示出线性的非剂量响应的杀细胞活性，而对照非靶向抗CD22 ADC 101几乎不显示出活性。
图26在3天SK-BR-3体外细胞活力对Thio Hu抗Her2 4D5 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI-PBD)103和Thio Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI-PBD)104的浓度(μg/ml)的图中示出抗体-药物缀合物的效力。抗Her2 ADC 103显示出线性的非剂量响应的杀细胞活性，而对照非靶向抗CD22 ADC 104几乎不显示出活性。
图27在3天SK-BR-3体外细胞活力对Thio Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI二聚体)116和Thio Hu抗Her2 4D5 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI二聚体)117的浓度(μg/ml)的图中示出抗体-药物缀合物的效力。抗Her2 ADC 117显示出线性的非剂量响应的杀细胞活性，而对照非靶向抗CD22 ADC 116几乎不显示出活性。
图28在3天EOL-1体外细胞活力对Thio Hu抗CD33 15G15.33 HC A118C-MC-MMED-(磷酸CBI二聚体)125的浓度(μg/ml)的图中示出抗体-药物缀合物的效力，其显示出适度的剂量响应的杀细胞活性。
图29在3天EOL-1体外细胞活力对Thio Hu抗MUC16 3A5 HC A118C-MC-ED-(二磷酸CBI二聚体DVB)126和Thio Hu抗CD33 15G15.33 HC A118C-MC-ED-(二磷酸CBI二聚体DVB)127的浓度(μg/ml)的图中示出抗体-药物缀合物的效力。抗CD33 ADC 127显示出强效的剂量响应的杀细胞活性，而对照非靶向抗CD22 ADC 126几乎不显示出活性。
图30在3天EOL-1体外细胞活力对Thio Hu抗CD33 15G15.33 HC A118C-MC-ED-(二磷酸CBI二聚体DVB)127、Thio Hu抗CD33 15G15.33 HC A118C-MC-ED-(磷酸CBI二聚体DVB)129和Thio Hu抗MUC16 3A5 HC A118C-MC-ED-(磷酸CBI二聚体DVB)130的浓度(μg/ml)的图中示出抗体-药物缀合物的效力。抗CD33 ADC 127和129显示出强效的剂量响应的杀细胞活性，而对照非靶向抗CD22 ADC 130几乎不显示出活性。
体内效力
可通过小鼠中的肿瘤异种移植物研究测量本发明的抗体-药物缀合物(ADC)的体内效力(实施例22)。以对小鼠中肿瘤生长的抑制测量抗体-药物缀合物(ADC)的体内效力(实施例21)。所述ADC在抑制肿瘤生长中显示出令人惊讶和预料不到的效力。ADC的效力与肿瘤细胞的靶抗原表达相关。
通过在啮齿动物中植入癌细胞的同种异体移植物或异种移植物并用ADC处理肿瘤体内测量抗体-药物缀合物的效力。预期结果是可变的，这取决于细胞系、使ADC与存在于癌细胞上的受体结合的抗体的特异性、给药方案及其它因素。使用表达中水平至高水平的肿瘤相关抗原(诸如Her2、MUC16和CD33)的转基因外植小鼠模型测量ADC的体内效力。用ADC处理受试者一次并监测3-6周以测量肿瘤倍增时间、对数细胞杀死和肿瘤缩小。进行后续的剂量-响应和多剂量实验。
例如，可通过高度表达HER2的转基因外植小鼠模型测量本发明的抗HER2ADC的体内效力(Phillips等(2008)Cancer Res.68:9280-90)。由对疗法不响应或响应弱的Fo5mmtv转基因小鼠繁殖同种异体移植物。将受试者用一定剂量水平(mg/kg)的ADC和安慰剂缓冲液对照(媒介物)处理一次并监测两周或更长时间以测量肿瘤倍增时间、对数细胞杀死和肿瘤缩小。
图31在植入到CRL nu/nu小鼠的乳腺脂肪垫中的MMTV-HER2Fo5转基因乳腺肿瘤的体内拟合肿瘤体积在单一静脉内给予以下物质后随时间变化的图中示出抗体-药物缀合物的效力：(1)媒介物：组氨酸缓冲液#8:20mM组氨酸乙酸盐,pH 5.5,240mM蔗糖,0.02％PS20；(2)Thio Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C-MC-MMED-(磷酸CBI二聚体)110；(3)Thio Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI二聚体MePip)108；(4)Thio Hu抗CD22 10F4v3 HCA118C-MC-vc-PAB-(磷酸CBI二聚体)111；(5)Thio Hu抗Her2 4D5 HC A118C-MC-MMED-(磷酸CBI二聚体)109；(6)Thio Hu抗Her2 4D5 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI二聚体MePip)107；(7)Thio Hu抗Her2 4D5 HC A118C-MC-vc-PAB-(磷酸CBI二聚体)112。以10mg/kg给予ADC。
图32在植入到CRL nu/nu小鼠的乳腺脂肪垫中的MMTV-HER2Fo5转基因乳腺肿瘤的体内拟合肿瘤体积在单一静脉内给予以下物质后随时间变化的图中示出抗体-药物缀合物的效力：(1)媒介物：组氨酸缓冲液#8:20mM组氨酸乙酸盐,pH 5.5,240mM蔗糖,0.02％PS20；(2)Thio Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C-DSE-(磷酸CBI二聚体)120,10mg/kg；(3)Thio Hu抗CD22 10F4v3 HC A118C-DSE-(磷酸CBI二聚体)122,10mg/kg；(4)Thio Hu抗CD22 10F4v3HC A118C-MC-vc-PAB-(N10,PBD-CBI MePip)124,10mg/kg；(5)Thio Hu抗Her2 4D5 HCA118C-DSE-(磷酸CBI二聚体)119,3mg/kg；(6)Thio Hu抗Her2 4D5 HC A118C-DSE-(磷酸CBI二聚体)119,10mg/kg；(7)Thio Hu抗Her2 4D5 HC A118C-DSP-(磷酸CBI二聚体)121,3mg/kg；(8)Thio Hu抗Her2 4D5 HC A118C-DSP-(磷酸CBI二聚体)121,10mg/kg；(9)ThioHu抗Her2 4D5 HC A118C-MC-vc-PAB-(N10,PBD-CBI MePip)123,3mg/kg；(10)Thio Hu抗Her2 4D5 HC A118C-MC-vc-PAB-(N10,PBD-CBI MePip)123,10mg/kg。
图33在植入到C.B-17 SCID小鼠中的OVCAR3X2.1人卵巢肿瘤的体内拟合肿瘤体积在单一静脉内给予以下物质后随时间变化的图中示出抗体-药物缀合物的效力：(1)媒介物：组氨酸缓冲液#8:20mM组氨酸乙酸盐,pH 5.5,240mM蔗糖,0.02％PS 20；(2)Thio Hu抗CD33 15G15.33 HC A118C-MC-ED-(二磷酸CBI二聚体DVB)127,3mg/kg；(3)Thio Hu抗MUC163A5 HC A118C-MC-ED-(二磷酸CBI二聚体DVB)126,3mg/kg；(4)Thio Hu 抗MUC16 3A5 HCA118C-MC-ED-(二磷酸CBI二聚体DVB)126,1mg/kg。
ADC 126的抗MUC16抗体，包括3A5和11D10变体，已述于WO2007/001851；US7989595；US8449883中，通过引用的方式将其内容并入本文。所述3A5单克隆抗体结合具有通过OVCAR-3Scatchard分析的433pM亲和力的MUC16多肽的多个位点(Chen等(2007)Cancer Res.67(10):4924-4932)。
图34在植入到C.B-17SCID小鼠中的HL-60人急性骨髓性白血病的体内拟合肿瘤体积在以20μg/m2单一静脉内给予以下物质后随时间变化的图中示出抗体-药物缀合物的效力：(1)媒介物：组氨酸缓冲液#8:20mM组氨酸乙酸盐,pH 5.5,240mM蔗糖,0.02％PS 20；(2)Thio Hu抗CD33 15G15.33 HC A118C-MC-MMED-(磷酸CBI二聚体)125；(3)Thio Hu抗CD3315G15.33 HC A118C-MC-ED-(二磷酸CBI二聚体DVB)127；(4)Thio Hu抗MUC16 3A5 HCA118C-MC-MMED-(磷酸CBI二聚体)128；(5)Thio Hu抗MUC16 3A5 HC A118C-MC-ED-(二磷酸CBI二聚体DVB)126。
抗体-药物缀合物的给药
可通过适于所治疗的疾病的任意途径给药本发明的抗体-药物缀合物(ADC)。一般通过肠胃外途径给药ADC，即输注、皮下、肌内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外。
药物制剂
本发明的治疗性抗体-药物缀合物(ADC)的药物制剂通常用药学上可接受的肠胃外媒介物且以单位剂量可注射形式制备供肠胃外给药，即推注、静脉内注射、肿瘤内注射。任选将具有所需纯度的抗体-药物缀合物(ADC)与药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂或稳定剂混合(Remington’s Pharmaceutical Sciences(1980)16th edition,Osol,A.Ed.)成冻干剂型或水溶液形式。
抗体-药物缀合物治疗
预期本发明的抗体-药物缀合物(ADC)可用于治疗各种疾病或病症，例如特征在于肿瘤抗原的过表达的疾病或病症。示例性疾病或过度增殖性病症包括良性或恶性实体肿瘤和血液学病症诸如白血病和淋巴样恶性肿瘤。其它疾病包括神经元、神经胶质、星形胶质细胞、下丘脑、腺体、巨噬细胞、上皮细胞、基质、囊胚腔、炎性、血管发生和免疫性病症，包括自身免疫性病症。
通常，所治疗的疾病或病症为过度增殖性疾病诸如癌症。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)；肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌；腹膜癌；肝细胞癌；胃部癌症或胃癌，包括胃肠癌；胰腺癌；成胶质细胞瘤；宫颈癌；卵巢癌；肝癌；膀胱癌；肝瘤；乳腺癌；结肠癌；直肠癌；结直肠癌；子宫内膜癌或子宫癌；唾液腺癌；肾部癌症或肾癌；前列腺癌；外阴癌；甲状腺癌；肝部癌瘤；肛门癌；阴茎癌；及头颈癌。
其中ADC化合物可用于治疗的自身免疫性疾病包括风湿病(诸如类风湿性关节炎；斯耶格仑综合征；硬皮病；狼疮，诸如系统性红斑狼疮(SLE)和狼疮性肾炎；多肌炎/皮肌炎；冷球蛋白血症；抗磷脂抗体综合征；和牛皮癣性关节炎)、骨关节炎、自身免疫性胃肠病和肝病(诸如炎性肠病(例如溃疡性结肠炎和克罗恩病)、自身免疫性胃炎和恶性贫血、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎和乳糜泻)、血管炎(诸如ANCA相关血管炎，包括变应性肉芽肿性血管炎、韦格纳肉芽肿和多动脉炎)、自身免疫性神经病(诸如多发性硬化、斜视眼肌阵挛综合征、重症肌无力、眼脑脊髓病、帕金森病、阿尔茨海默病和自身免疫性多神经病)、肾脏疾病(诸如肾小球肾炎、古德帕斯彻综合征和贝格尔病)、自身免疫性皮肤病(诸如银屑病、荨麻疹、荨麻疹、寻常天疱疮、大疱性类天疱疮和皮肤红斑狼疮)、血液病(诸如血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、输血后紫癜和自身免疫性溶血性贫血)、动脉粥样硬化、眼色素层炎、自身免疫性听觉疾病(诸如内耳疾病和听力丧失)、贝切特病、雷诺综合征、器官移植和自身免疫性内分泌病(诸如糖尿病相关性自身免疫性疾病，诸如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、阿狄森病和自身免疫性甲状腺疾病(例如格雷夫斯病和甲状腺炎))。更优选的此类疾病包括例如类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、ANCA相关血管炎、狼疮、多发性硬化、斯耶格仑综合征、格雷夫斯病、IDDM、恶性贫血、甲状腺炎和肾小球肾炎。
为了预防或治疗疾病，ADC的适当剂量取决于如上述定义的所治疗的疾病类型、疾病的严重程度和时程、给药所述分子是为了预防还是为了治疗目的、先前的治疗、患者的临床病史和对抗体的响应及主治医师的判定。将所述分子适当对患者给药一次或在一系列治疗过程中给药。取决于疾病类型和严重程度，对患者给药的分子的初始候选剂量约为1μg/kg至15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)，例如无论是通过一次或多次分开的给药，还是通过连续输注。典型的每日剂量范围可为约1μg/kg至100mg/kg或更大，这取决于上述因素。对患者给药的ADC的示例性剂量范围为约0.1至约10mg/kg患者体重。
制品
在本发明的另一个实施方案中，提供含有用于治疗上述病症的物质的制品或“试剂盒”。所述制品包含容器和在容器上或与其相连的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、泡罩包装等。容器可由各种材料诸如玻璃或塑料形成。容器容纳有效治疗疾病的抗体-药物缀合物(ADC)组合物并且可具有无菌存取口(例如容器可为静脉用溶液袋或具有可刺入皮下注射针头的塞的小瓶)。组合物中至少一种活性剂为ADC。标签或包装说明书表示组合物用于治疗选择的疾病诸如癌症。可选择地或另外地，所述制品可进一步含有第二(或第三)容器，该容器包含药学上可接受的缓冲液诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。它可进一步包括从商业和使用者角度而言需要的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
实施例
实施例1 2-(2-溴-N-甲基乙酰氨基)乙基(甲基)氨基甲酸(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯51
遵循L.F.Tietze,J.M.von Hof,M.Müller,B.Krewer,I.Schuberth,Angew.Chem.Int.Ed.(2010)49:7336-7339的操作，将(S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯51a用HCl进行脱保护并用戊二酰氯进行酰化(图1)。代替制备型HPLC，真空除去反应溶剂并用甲醇研磨所得残余物，得到1,5-二((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)戊烷-1,5-二酮51b，其为灰白色固体(产率51％)。Rf＝0.50(乙酸乙酯/石油醚＝2:1)。NMR和MS数据与所报道的值相同。[α]D 26＝-46.3°(c＝0.41,DMA)。
向在冰浴中冷却的51b(650mg,1.15mmol)在DMA(5mL)中的溶液中加入DIPEA(0.40mL,2.31mmol)和氯甲酸4-硝基苯基酯(302mg,1.50mmol)。将混合物温热至室温并搅拌过夜后，加入甲基(2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(652mg,3.00mmol)。将混合物在室温搅拌7h，然后在乙酸乙酯与冷的稀NaHCO3水溶液之间再次分配。用乙酸乙酯萃取水相三次。先后用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，以Na2SO4干燥并经硅藻土过滤。除去溶剂并通过先后使用乙酸乙酯与石油醚的梯度混合物(v/v 1:1至4:1)和仅乙酸乙酯作为洗脱剂的柱色谱进一步纯化残余物，得到甲基(2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸Boc(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯51c，其为灰白色固体(359mg,40％)；mp 157℃(dec.)。[α]D 26＝-45.4°(c＝1.08,乙酸乙酯)。1H NMR(DMSO)(旋转异构体的混合物)δ10.35(s,1H),8.25(s,1H),8.08(d,J＝8.2Hz,1H),8.02(s,1H),7.87-7.77(m,2H),7.58(t,J＝7.6Hz,1H),7.50-7.42(m,2H),7.31(t,J＝7.9Hz,1H),4.42(t,J＝9.7Hz,1H),4.36-4.31(m,2H),4.25(d,J＝10.3Hz,1H),4.19-4.13(m,2H),4.05(dd,J＝2.9,11.0Hz,1H),3.98(dd,J＝2.6,10.9Hz,1H),3.92(dd,J＝7.2,10.9Hz,1H),3.79(dd,J＝8.5,10.2Hz,1H),3.69(br s,1H),3.52-3.42(m,3H),3.21-2.79(m,6H,2NMe),2.75-2.67(m,2H),2.64-2.58(m,2H),2.00-1.93(m,2H),1.44-1.35(m,9H,But)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 777.2801(M+H)。C41H47Cl2N4O7需要777.2816。
还从相同的色谱分离得到二Boc保护的51d和未经保护的回收起始物质51b，其为白色固体(15mg,2％)。得到51d(429mg,37％)，其为灰白色固体。[α]D 26＝-32.0°(c＝1.00,乙酸乙酯)。1H NMR(DMSO)(旋转异构体的混合物)δ8.25(s,2H),7.95(d,J＝8.4Hz,2H),7.87-7.76(m,2H),7.58(t,J＝7.6Hz,2H),7.44(t,J＝7.6Hz,2H),4.41(t,J＝9.8Hz,2H),4.32(br s,2H),4.24(d,J＝10.6Hz,2H),4.06-4.03(m,2H),3.98(dd,J＝7.3,10.8Hz,2H),3.69(br s,2H),3.52-3.43(m,6H),3.21-2.79(m,12H,4NMe),2.75-2.69(m,2H),2.66-2.58(m,2H),1.99-1.95(m,2H),1.44-1.35(m,18H,2But)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 1013.3991(M+Na)。C51H64Cl2N6NaO10需要1013.3991。
向在冰浴中冷却的51c(200mg,0.26mmol)在DCM(3mL)中的溶液中滴加三氟乙酸即TFA(1.5mL)。将反应混合物温热至室温并搅拌2h。除去所有挥发性组分，得到粗甲基(2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯的三氟乙酸盐51e，其为灰白色固体且直接使用。1H NMR(DMSO)(旋转异构体的混合物)δ10.36(s,1H),8.64(br s,1H),8.48(br s,1H),8.35(s,1H),8.08(d,J＝8.1Hz,1H),8.01(s,1H),7.97(d,J＝8.4Hz,1H),7.94-7.88(m,1H),7.78(d,J＝8.4Hz,1H),7.61-7.57(m,2H),7.51-7.45(m,2H),7.34-7.30(m,1H),4.43(t,J＝9.8Hz,1H),4.36-4.31(m,2H),4.26(d,J＝10.4Hz,1H),4.18-4.14(m,2H),4.06(dd,J＝2.9,11.0Hz,1H),4.00(dd,J＝2.7,10.8Hz,1H),3.94(dd,J＝7.5,11.0Hz,1H),3.89-3.84(m,1H),3.79(dd,J＝8.1,10.8Hz,1H),3.63(t,J＝5.7Hz,1H),3.33-3.30(m,6H,2NMe),2.78-2.55(m,6H),2.00-1.94(m,2H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z677.2306(M+H)。C36H39Cl2N4O5需要677.2292。
在-5℃向51e在THF(4mL)中的溶液加入一滴DIPEA，接着慢慢加入溴乙酰溴(34μL,0.39mmol)，然后加入剩余的DIPEA(448μL,总计2.57mmol)。将反应混合物温热至室温并搅拌1h。通过先后旋转蒸发仪和高真空泵除去所有挥发性组分。用乙酸乙酯搅拌所得残余物并滤除不溶性固体，然后将滤液负载在色谱柱上。将乙酸乙酯与石油醚的梯度混合物用作洗脱剂，得到2-(2-溴-N-甲基乙酰氨基)乙基(甲基)氨基甲酸(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯51，其为灰白色固体(80mg,39％)；mp 167-170℃。[α]D 26＝-64.0°(c＝0.25,乙酸乙酯)。1H NMR(DMSO)(旋转异构体的混合物)δ10.39(s,1H),8.25-8.20(m,1H),8.08(d,J＝8.3Hz,1H),8.01(s,1H),7.96(d,J＝8.3Hz,1H),7.89(d,J＝7.4Hz,0.34H),7.82(d,J＝7.4Hz,0.66H),7.78(d,J＝8.4Hz,1H),7.58(t,J＝7.6Hz,1H),7.51-7.45(m,2H),7.31(t,J＝7.6Hz,1H),4.42(t,J＝9.6Hz,1H),4.36-4.31(m,1H),4.24(d,J＝10.7Hz,1H),4.18-4.09(m,3H包含CH2Br),4.07-4.03(dd,J＝2.8,10.9Hz,1H),4.00-3.97(dd,J＝2.6,10.8Hz,1H),3.96-3.91(m,1H),3.82-3.75(m,1H),3.70-3.68(m,1H),3.58-3.43(m,3H),3.26-2.89(m,6H,2NMe),2.78-2.67(m,2H),2.65-2.55(m,2H),1.99-1.92(m,2H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 819.1316(M+Na)。C38H38BrCl2N4O6需要819.1322。
实施例2 (11S,11aS)-8-(6-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-6-氧代己基氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-甲酸叔丁酯52
遵循实施例6的实验操作，制备接头-药物中间体52(图7和8)。HPLC:96.7％纯；mp210℃(dec.)；1H NMR[(CD3)2SO]δ10.03(s,可与D2O交换,1H),8.23-8.11(m,2H),8.09(d,J＝7.3Hz,可与D2O交换,1H),7.85(d,J＝8.5Hz,1H),7.80(d,J＝8.3Hz,可与D2O交换,1H),7.66(d,J＝8.6Hz,2H),7.59-7.44(m,3H),7.38(br t,J＝7.6Hz,1H),7.04(s,1H),6.99(s,2H),6.69(s,1H),6.38(br s,可与D2O交换,1H),5.99(t,J＝5.5Hz,可与D2O交换,1H),5.49-5.34(m,3H,在D2O后减少为1H,其为d,J＝9.5Hz),5.20(s,2H),4.44-4.30(m,2H),4.26-4.13(m,3H),4.10-3.91(m,3H),3.88-3.76(m,1H),3.79(s,3H),3.53-3.44(m,1H),3.41-3.20(m,被水峰部分遮盖,4H),3.09-2.88(m,2H),2.66-2.42(m,被DMSO峰部分遮盖,2H),2.25-1.24(m,21H),1.31(s,9H),1.24-1.11(m,2H),0.86(d,J＝6.8Hz,3H),0.82(d,J＝6.7Hz,3H)。(C55H71ClN8O11·H2O)分析计算值：C,61.53；H,6.85；N,10.44。实测值：C,61.39；H,7.11；N,10.15。
实施例3 N-((R)-1-(氯甲基)-3-(5-((R)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺53
在室温(r.t.)将乙酸(50mL)加至(R)-1-(氯甲基)-5-(二苯基亚甲基氨基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯53a(1.00g,2.01mmol)在THF-H2O(150mL/75mL)中的搅拌的溶液中并将混合物搅拌过夜(图2)。19.5h后，真空除去THF，用EtOAc稀释混合物，将各层很好地振荡，然后分离。用饱和NaHCO3水溶液(4×)洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并真空除去溶剂。通过使用己烷:EtOAc 100:0至90:10的硅胶柱色谱纯化，得到(R)-5-氨基-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯53b(382mg,57％)，其为橙色凝胶样固体。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)8.01(d,J＝8.4Hz,1H),7.64(d,J＝8.0Hz,1H),7.42-7.38(m,1H),7.37(br s,1H),7.22-7.18(m,1H),5.91(s,2H),4.08-3.91(m,4H),3.66(dd,J＝10.6,8.2Hz,1H),1.53(s,9H)。
将53b(380mg,1.14mmol)、6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸(361mg,1.71mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI.HCl,765mg,3.99mmol)和对甲苯磺酸(TsOH,49mg,0.285mmol)在无水DMA(10mL)中的混合物在室温在氮气下搅拌过夜。17h后，真空除去溶剂。通过先后使用DCM:己烷75:25至100:0和DCM:MeOH 99:1至97:3的硅胶柱色谱纯化粗产物并将含产物的级分蒸发至干。然后将所得物质溶于EtOAc中并用H2O(2×)洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并除去溶剂，得到(R)-1-(氯甲基)-5-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯53c(282mg,47％)，其为黄色固体。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)9.86(s,1H),8.24(br s,1H),7.99(d,J＝8.4Hz,1H),7.88(d,J＝8.3Hz,1H),7.55-7.51(m,1H),7.43-7.39(m,1H),7.01(s,2H),4.21-4.11(m,2H),4.08-4.00(m,2H),3.87(dd,J＝10.9,6.9Hz,1H),3.42(t,J＝7.0Hz,2H),2.45(t,J＝7.1Hz,2H),1.69-1.62(m,2H),1.56-1.54(m,2H),1.54(s,9H),1.35-1.28(m,2H)。
在0℃向53c(66mg,0.125mmol)在DCM(4mL)中的溶液中加入三氟乙酸(3.9mL)和H2O(0.1mL)。将混合物在0℃搅拌1h 20min，然后加入冰和H2O。在0℃用饱和NaHCO3水溶液碱化混合物至pH 8。分离有机层和水层，用H2O(1×)洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并真空除去溶剂，得到(R)-N-(1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺53d(50mg,94％)，其为黄色固体且不经纯化即用于下一步骤。1HNMRδ(400MHz,DMSO-d6)9.70(s,1H),7.87(d,J＝8.5Hz,1H),7.64(d,J＝8.2Hz,1H),7.39(ddd,J＝8.1,6.9,1.0Hz,1H),7.21-7.15(m,2H),7.01(s,2H),5.92(s,1H),4.02-3.96(m,1H),3.85(dd,J＝10.8,3.5Hz,1H),3.69(t,J＝9.3Hz,1H),3.63-3.55(m,2H),3.42(t,J＝7.0Hz,2H),2.42(t,J＝7.1Hz,2H),1.64(td,J＝15.2,7.6Hz,2H),1.55(td,J＝14.5,7.2Hz,2H),1.35-1.26(m,2H)。
将53d(50mg,0.117mmol)、(R)-5-(1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酸53e(56mg,0.161mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐即EDCI.HCl(58mg,0.303mmol)和TsOH(8mg,0.0465mmol)在无水DMA(2mL)中的混合物在室温在氮气下搅拌过夜。19h后，用H2O稀释混合物且固体从溶液中析出。用EtOAc(1×)、DCM(1×)、DCM:MeOH95:5(1×)萃取含水悬浮液并干燥(Na2SO4)合并的有机物且真空除去溶剂。通过使用DCM:MeOH 100:0至94:6的硅胶柱色谱纯化粗产物，得到N-((S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺53(15mg,17％,HPLC纯度:82.3％)，其为黄色固体。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)10.35(s,1H),9.88(s,1H),8.58(s,1H),8.08(d,J＝8.2Hz,1H),8.02(s,1H),7.96(d,J＝8.3Hz,1H),7.92(d,J＝8.4Hz,1H),7.78(d,J＝8.3Hz,1H),7.55(t,J＝7.4Hz,1H),7.51-7.47(m,1H),7.46-7.42(m,1H),7.33-7.30(m,1H),7.01(s,2H),4.42-4.28(m,3H),4.25-4.13(m,3H),4.01(ddd,J＝19.6,10.9,2.6Hz,2H),3.90(dd,J＝10.9,7.5Hz,1H),3.79(dd,J＝10.8,8.1Hz,1H),3.43(t,J＝6.7Hz,2H),2.77-2.57(m,4H),2.46-2.43(m,2H),2.01-1.96(m,2H),1.70-1.62(m,2H),1.60-1.53(m,2H),1.36-1.28(m,2H)。HRMS m/z 777.2186[(M+Na)+C41H40Cl2N4NaO6计算值777.2217]。
实施例3a 1-((S)-5-氨基-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)戊烷-1,5-二酮53j
在-20℃在氮气下将10％Pd/C(1.5g)加至(S)-5-(5-(苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酸57c(2.00g,4.57mmol)在THF-25％NH4HCO2水溶液(60mL/23mL)中的搅拌的溶液(图3)。将反应混合物在-15至-10℃搅拌3.5小时。然后将反应混合物在-20℃保持过夜。17.5h后，将混合物温热至-10℃并在-10至-5℃搅拌5h。然后将混合物温热至0℃并在该温度搅拌30min，然后用甲醇稀释，经硅藻土过滤，用MeOH(3×)洗涤硅藻土塞并真空浓缩溶剂直至固体从溶液中析出。然后将其用H2O(150mL)和己烷(150mL)稀释并在室温搅拌同时用浓HCl酸化至pH 1。将混合物再搅拌30min，然后经由过滤收集固体并用H2O和己烷洗涤且干燥，得到(S)-5-(1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酸53h(1.43g,90％)，其为米色固体。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)12.07(br s,1H),10.35(s,1H),8.08(d,J＝8.0Hz,1H),7.98(s,1H),7.77(d,J＝8.3Hz,1H),7.50-7.46(m,1H),7.33-7.29(m,1H),4.30(t,J＝10.4Hz,1H),4.14-4.12(m,2H),3.98(dd,J＝10.9,2.8Hz,1H),3.78(dd,J＝10.8,7.8Hz,1H),2.63-2.45(m,2H),2.35(t,J＝7.4Hz,2H),1.89-1.78(m,2H)。
在室温将氯化氢气体(HCl)鼓泡通过(S)-1-(氯甲基)-5-(二苯基亚甲基氨基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯53f(425mg,0.855mmol)在无水二噁烷(12mL)中的溶液(经分子筛)(图3)。固体从溶液中析出并在15min后真空除去溶剂。未经纯化将粗固体(S)-1-(氯甲基)-N-(二苯基亚甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-胺53g用于下一步骤。在室温在氮气下将无水DMA(10mL)加至53g、(S)-5-(1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酸53h(327mg,0.941mmol)、EDCI.HCl(573mg,2.99mmol)和(埃)分子筛的混合物中。2天又19.5h后，真空除去溶剂。通过使用DCM:MeOH 100:0至90:10的硅胶柱色谱纯化粗品，接着先后使用己烷:DCM 100:0至50:50至0:100和DCM:MeOH 99:1至98:2再色谱纯化物质，得到1-((S)-1-(氯甲基)-5-(二苯基亚甲基氨基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)戊烷-1,5-二酮53i(193mg,由53f历经2步31％)。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)10.35(s,1H),8.08(d,J＝8.1Hz,1H),8.00(s,1H),7.84(t,J＝9.0Hz,2H),7.79-7.74(m,3H),7.62-7.57(m,2H),7.54-7.46(m,4H),7.40-7.36(m,1H),7.33-7.29(m,1H),7.27-7.22(m,3H),7.09-7.08(m,2H),4.34-4.26(m,2H),4.22-4.12(m,4H),4.01-3.97(m,2H),3.83-3.76(m,2H),2.69-2.50(m,4H),1.93-1.86(m,2H)。HRMS m/z 726.2264[(M+H)+C44H38Cl2N3O3计算值726.2285]。
在室温将乙酸(HOAc,8mL)加至53i(190mg,0.261mmol)在THF-H2O(24mL/12mL)中的搅拌的溶液中并将混合物搅拌过夜。19h后，用H2O稀释混合物并析出固体。真空除去THF并用DIPEA处理含水悬浮液直至中性。经由过滤收集固体，用H2O洗涤并干燥。将固体溶于DMF(1.5mL)中并用MeOH稀释，使得固体析出。倾出溶剂并向固体中加入己烷:DCM90:10，振荡悬浮液并倾出溶剂。先后使用己烷:EtOAc 90:10和单独己烷重复该过程。然后将固体溶于DMF/THF中，吸收到硅胶上并使用DCM:MeOH 100:0至90:10洗脱产物。通过制备型HPLC(柱：Synergi-MAX RP 4μ,21.20×250mm；流速：13mL/min；流动相：溶剂A:H2O/TFA pH 2.5,溶剂B:MeCN/H2O 90:10；方法：等度,溶剂A:溶剂B 20:80,15min；波长：254nm,330nm)进一步纯化该物质，得到1-((S)-5-氨基-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)戊烷-1,5-二酮53j,30mg,22％,HPLC纯度:87.9％)，其为白色固体。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)10.36(s,1H),8.08(d,J＝8.1Hz,1H),8.04-8.02(m,2H),7.79-7.77(m,2H),7.69(d,J＝8.3Hz,1H),7.51-7.47(m,1H),7.42(t,J＝7.5Hz,1H),7.34-7.30(m,1H),7.23(t,J＝7.6Hz,1H),5.91(s,2H),4.36-4.26(m,2H),4.19-4.13(m,3H),4.08-4.04(m,1H),4.01-3.93(m,2H),3.79(dd,J＝10.7,8.2Hz,1H),3.70(dd,J＝10.5,8.9Hz,1H),2.75-2.66(m,2H),2.63-2.54(m,2H),2.00-1.93(m,2H)。HRMS m/z 584.1456[(M+Na)+C31H29Cl2N3NaO3计算值584.1478]。[α]D 28＝-37.6°(c＝0.559,DMSO)。
实施例3b 1-((R)-5-氨基-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-((R)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)戊烷-1,5-二酮53p
在0℃将三乙胺(Et3N,0.54mL,3.89mmol)和三氟甲磺酸酐(0.60mL,3.60mmol)加至(R)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯53k(1.00g,3.00mmol)在DCM(100mL)中的搅拌的溶液中(图4)。将反应混合物在0℃搅拌20min，然后用H2O稀释，将两层分开并用DCM(1×)萃取水层。干燥(Na2SO4)合并的有机层并真空除去溶剂。通过使用己烷:EtOAc 100:0至96:4的硅胶柱色谱纯化，得到(R)-1-(氯甲基)-5-(三氟甲基磺酰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯53l(1.30g,93％)，其为橙色泡沫状固体。1H NMRδ(400MHz,CDCl3)8.30(br s,1H),8.03(d,J＝8.5Hz,1H),7.76(d,J＝8.4Hz,1H),7.62-7.58(m,1H),7.53-7.49(m,1H),4.32(br s,1H),4.20-4.15(m,1H),4.09-4.03(m,1H),3.92(dd,J＝11.2,2.8Hz,1H),3.54-3.49(m,1H),1.61(s,9H)。
在氮气下将53l(1.30g,2.79mmol)在无水THF(60mL,脱气的)中的溶液加至Cs2CO3(1.27g,3.91mmol)、BINAP(209mg,0.336mmol)和Pd(OAc)2(63mg,0.281mmol)的混合物中。然后在氮气下加入二苯甲酮亚胺(0.56mL,3.34mmol)并将混合物回流过夜。20h后，将反应温度降至60-65℃并将反应混合物在该温度在氮气下搅拌1天。加入另外的THF(10mL)并将混合物在相同温度再搅拌1天，然后向混合物中再次加入更多THF(25mL)。再过1天后，加入另一份Pd(OAc)2(19mg,0.0846mmol)、BINAP(52mg,0.0835mmol)和THF(30mL)并将混合物在70℃在氮气下加热过夜。再过28h后，再次加入另一份Pd(OAc)2(31mg,0.138mmol)、BINAP(104mg,0.167mmol)并继续反应22h。然后将反应混合物冷却至室温，用DCM稀释，经硅藻土过滤，用DCM洗涤硅藻土塞直至洗涤液再无颜色并真空蒸发滤液。通过使用己烷:DCM 100:0至50:50的硅胶柱色谱纯化，得到(R)-1-(氯甲基)-5-(二苯基亚甲基氨基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯53a(1.19g,85％)，其为黄色泡沫状固体。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)7.85(d,J＝8.3Hz,1H),7.80(d,J＝8.4Hz,1H),7.75(d,J＝7.2Hz,2H),7.61-7.57(m,1H),7.54-7.49(m,3H),7.37-7.33(m,1H),7.30-7.23(m,3H),7.06(d,J＝6.8Hz,2H),4.13-4.02(m,2H),4.00-3.94(m,2H),3.77(dd,J＝10.9,7.5Hz,1H),1.46(s,9H),1H未观察到。[α]D 27＝+101°(c＝1.04,DCM)。
在室温将氯化氢气体(HCl(g))鼓泡通过53a(300mg,0.604mmol)在无水二噁烷(10mL)中的溶液(以分子筛)。10min后，固体已从溶液中析出并在20min后真空除去溶剂。粗固体(R)-1-(氯甲基)-N-(二苯基亚甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-胺53m未经纯化即用于下一步骤。
在-10℃在氮气下将钯/碳即10％Pd/C(690mg)加至(R)-5-(5-(苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酸53n(1.38g,3.15mmol)在THF-25％NH4HCO2水溶液(40mL/16mL)中的搅拌的溶液中。将混合物在-10至-5℃搅拌3h。然后将反应混合物在-20℃保持过夜。在-20℃保持15h后，用MeOH稀释混合物，经硅藻土过滤，用MeOH洗涤硅藻土塞并真空浓缩溶剂直至固体从溶液中析出。然后用H2O(130mL)和己烷(100mL)稀释悬浮液并在室温搅拌同时用浓HCl酸化至pH 1。将混合物搅拌30min，沉降并倾出己烷。加入另外的己烷(120mL)并将混合物再搅拌30min，再次倾出己烷，然后经由过滤收集固体并用H2O和己烷洗涤且干燥，得到(R)-5-(1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酸53e(925mg,84％)，其为米色固体。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)12.06(br s,1H),10.35(s,1H),8.08(d,J＝8.0Hz,1H),7.98(s,1H),7.77(d,J＝8.3Hz,1H),7.50-7.46(m,1H),7.33-7.29(m,1H),4.30(t,J＝10.5Hz,1H),4.14-4.12(m,2H),3.98(dd,J＝10.9,2.8Hz,1H),3.78(dd,J＝10.8,7.9Hz,1H),2.63-2.45(m,2H),2.35(t,J＝7.4Hz,2H),1.89-1.78(m,2H)。
在室温在氮气下将无水DMA(8mL)加至来自前述反应的53m、53e(241mg,0.693mmol)、EDCI.HCl(404mg,2.11mmol)和分子筛的混合物中。将反应混合物搅拌过夜。19.5h后，用H2O稀释混合物并过滤所得悬浮液。用EtOAc(3×)萃取含水滤液并将滤出的固体溶于EtOAc/MeOH中且与EtOAc萃取物合并。将合并的有机溶液吸收在硅胶上并先后使用己烷:DCM50:50至0:100和DCM:MeOH 99.5:0.5至97:3洗脱产物，得到1-((R)-1-(氯甲基)-5-(二苯基亚甲基氨基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-((R)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)戊烷-1,5-二酮53o(155mg,由53a历经2步35％)，其为暗黄色固体。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)10.35(s,1H),8.08(d,J＝8.0Hz,1H),8.00(s,1H),7.85(t,J＝8.9Hz,2H),7.79-7.74(m,3H),7.62-7.57(m,2H),7.54-7.46(m,4H),7.40-7.36(m,1H),7.33-7.29(m,1H),7.27-7.22(m,3H),7.09-7.08(m,2H),4.34-4.27(m,2H),4.22-4.11(m,4H),4.02-3.97(m,2H),3.83-3.76(m,2H),2.69-2.51(m,4H),1.93-1.85(m,2H),NMR图谱匹配53i的图谱。HRMS m/z 748.2077[(M+Na)+计算值C44H37Cl2N3NaO3 748.2104]。
在室温将乙酸(HOAc,4mL)加至53o(80mg,0.110mmol)在THF-H2O(12mL/6mL)中的搅拌的溶液中并将混合物搅拌过夜。18h后，用H2O稀释混合物并析出固体。真空除去THF并用DIPEA处理含水悬浮液直至pH 8，导致更多固体析出。经由过滤收集固体，干燥并通过使用DCM:MeOH 100:0至97:3的硅胶柱色谱纯化，得到1-((R)-5-氨基-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-((R)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)戊烷-1,5-二酮53p(20mg,32％)，其为黄褐色固体。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)10.36(s,1H),8.08(d,J＝8.2Hz,1H),8.04-8.02(m,2H),7.79-7.77(m,2H),7.69(d,J＝8.3Hz,1H),7.51-7.47(m,1H),7.42(t,J＝7.5Hz,1H),7.34-7.30(m,1H),7.23(t,J＝7.6Hz,1H),5.91(s,2H),4.36-4.26(m,2H),4.19-4.13(m,3H),4.08-4.04(m,1H),4.01-3.93(m,2H),3.79(dd,J＝10.7,8.3Hz,1H),3.71(dd,J＝10.5,8.9Hz,1H),2.75-2.66(m,2H),2.63-2.53(m,2H),2.00-1.93(m,2H),NMR图谱匹配53j的图谱。
实施例4 N-(4-(((S)-1-(氯甲基)-3-(6-((S)-7-甲氧基-5-氧代-2,3,5,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基氧基)己酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基氧基)甲基)苯基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺54
将(S)-(2-氨基-4-羟基-5-甲氧基苯基)(2-(羟基甲基)吡咯烷-1-基)甲酮54a(7.6g,28.6mmol)(通过Tercel等(2003)J.Med.Chem 46:2132-2151的操作制备)和一缩二碳酸二叔丁酯(12.48g,57.2mmol)在无水THF(140mL)中的混合物在氮气气氛中回流搅拌18h。将反应混合物冷却至室温并加入2N NaOH(57.2mL,114mmol)和MeOH(70mL)。将混合物在室温搅拌6h。在35-40℃(浴温度)减压除去挥发物。加入冰水(250mL)并在0℃调节pH至8-9。将混合物与石油醚-乙酸乙酯(20:1)(2×400mL)在室温搅拌15min。分出有机层并弃去。用DCM(4×300mL)萃取水层并干燥(MgSO4)合并的萃取物且减压蒸发，得到(S)-5-羟基-2-(2-(羟基甲基)吡咯烷-1-羰基)-4-甲氧基苯基氨基甲酸叔丁酯54b，其为粉白色固体(9.36g,89％)；mp 154-156℃；1H NMR[(CD3)2SO]δ9.51(s,1H),8.90(s,1H),7.27(s,1H),6.91(s,1H),4.73(t,J＝5.8Hz,1H),4.16-4.02(m,1H),3.73(s,3H),3.64-3.34(m,4H),1.99-1.60(m,4H),1.43(s,9H)。(C18H26N2O6)分析计算值：C,59.00；H,7.15；N,7.65。实测值：C,58.94；H,7.31；N,7.39。
向54b(2.88g,7.87mmol)和6-溴己酸2,2,2-三氯乙基酯(3.86g,11.8mmol)(通过Tercel等(2003)J.Med.Chem 46:2132-2151中的操作制备)在无水DMA(7mL)中的溶液中加入无水K2CO3(2.61g,18.9mmol)。将所得混合物在室温搅拌68h。将其倾入冰-水(600mL)中并将产物萃取至乙酸乙酯(600mL)中。先后用冷的(0℃)2N Na2CO3水溶液(2×400mL)和水(400mL)洗涤萃取物，然后干燥(MgSO4)。蒸发溶剂，得到棕色油状物，通过SiO2柱色谱(DCM-乙酸乙酯＝2:1)将其纯化，得到纯的(S)-6-(5-(叔丁氧基羰基氨基)-4-(2-(羟基甲基)吡咯烷-1-羰基)-2-甲氧基苯氧基)己酸2,2,2-三氯乙基酯54c(3.62g,76％)，其为淡黄泡沫状物；mp 36-39℃；1H NMR[(CD3)2SO]δ9.90(s,1H),7.33(s,1H),6.93(s,1H),4.89(s,2H),4.74(t,J＝5.8Hz,1H),4.17-4.02(m,1H),3.94(t,J＝6.4Hz,2H),3.73(s,3H),3.63-3.26(m,4H),2.55-2.46(m,2H,被DMSO峰部分遮盖),2.00-1.55(m,8H),1.53-1.36(m,11H)。(C26H37N2O8)分析计算值：C,51.03；H,6.09；N,4.58。实测值：C,51.33；H,6.21；N,4.35。
在室温历时15min向54c(3.62g,5.92mmol)在无水DCM(12mL)中的溶液中按份加入戴斯-马丁(Dess-Martin)高碘剂(DMP,1,1,1-三乙酰氧基-1,1-二氢-1,2-苯碘酰-3(1H)-酮,CAS登记号87413-09-0)(3.27g,7.70mmol)。将混合物在室温搅拌45min。将其用DCM(800mL)稀释并先后用10％Na2S2O3(100mL)、冷的(0℃)NaHCO3溶液(400mL)和水(300mL)洗涤，然后干燥(MgSO4)。蒸发溶剂，得到琥珀色固体，通过SiO2柱色谱(石油醚-乙酸乙酯＝3:4)将其纯化，得到(S)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-8-(6-氧代-6-(2,2,2-三氯乙氧基)己基氧基)-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-甲酸叔丁酯54d(2.61g,72％)，其为粘性泡沫状物；1H NMR[(CD3)2SO]δ7.03(s,1H),6.67(s,1H),6.38(s,1H),5.41(s,1H),4.89(s,2H),4.06-3.87(m,2H),3.79(s,3H),3.52-3.43(m,1H),3.42-3.28(m,1H,被水峰部分遮盖),3.27-3.20(m,1H),2.08-1.82(m,5H),1.81-1.71(m,2H),1.71-1.61(m,2H),1.53-1.40(m,3H),1.31(s,9H)。HRMS(ESI)m/z C26H35Cl3N2NaO8计算值：631.1351，实测值：631.1361[MNa+]。
在氮气下向54d(1.80g,2.95mmol)在丙酮-水(3:2)(100mL)中的搅拌的溶液中加入Zn(7.72g,118mmol)和NH4Cl(6.32g,118mmol)。将混合物在搅拌28h。倾出上清液并用NaHCO3水溶液(3×100mL)洗涤Zn残余物。合并洗涤液和上清液并与DCM(300mL且然后2×100mL)搅拌。分出DCM层并弃去。在0℃用浓HCl酸化水层至pH<1。将产物萃取至DCM(400mL；2×200mL)中，将其干燥(MgSO4)并蒸发，得到(S)-8-(5-过氧羟基己-5-烯基氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-甲酸叔丁酯54e(1.34g,95％)，其为无色泡沫状物；mp 65-67℃；1H NMR[(CD3)2SO]δ11.99(br s,1H),7.04(s,1H),6.67(s,1H),6.37(br s,1H),5.41(d,J＝9.4Hz,1H),4.06-3.87(m,2H),3.79(s,3H),3.53-3.19(m,3H,被水峰部分遮盖),2.22(t,J＝7.2Hz,2H),2.09-1.81(m,4H),1.80-1.67(m,2H),1.62-1.49(m,2H),1.49-1.37(m,2H),1.31(s,9H)。(C24H34N2O8·1/4H2O)分析计算值：C,59.68；H,7.20；N,5.80。实测值：C,59.37；H,7.20；N,5.62。
将54e(1.16g,2.42mmol)、(S)-1-(氯甲基)-5-(4-硝基苄基氧基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚54f(893mg,2.42mmol)、EDCI.HCl(1.39g,7.26mmol)和无水TsOH(83mg,0.48mmol)在DMA(7mL)中的混合物在室温在氮气气氛下搅拌4h。加入水(120mL)并将混合物在室温搅拌15min。滤出析出的固体，先后用水(4×40mL)、0.01％NH4OH(4×40mL)和石油醚(4×40mL)洗涤，然后干燥，得到N-Boc-(S)-8-(6-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-硝基苄基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-6-氧代己基氧基)-11-羟基-7-甲氧基-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-5(10H)-酮54g(1.71g,85％)，其为淡黄色固体；mp130-133℃；1H NMR[(CD3)2SO]δ8.30(d,J＝8.8Hz,2H),8.23(d,J＝8.1Hz,1H),8.18(s,1H),7.92-7.82(m,3H),7.57(td,J＝8.2,1.1Hz,1H),7.43(t,J＝8.0Hz,1H),7.03(s,1H),6.69(s,1H),6.39(br s,1H),5.51-5.35(m,3H),4.36(t,J＝9.5Hz,1H),4.28-4.15(m,2H),4.10-3.90(m,3H),3.85(dd,J＝11.1,7.8Hz,1H),3.79(s,3H),3.52-3.42(m,1H),3.42-3.20(m,2H,被水峰部分遮盖),2.68-2.50(m,2H,被DMSO峰部分遮盖),2.11-1.95(m,1H),1.95-1.75(m,5H),1.75-1.61(m,2H),1.59-1.45(m,2H),1.31(s,9H)。(C44H49ClN4O10)分析计算值：C,63.72；H,5.96；N,6.76。实测值：C,63.33；H,5.97；N,6.92。
在氮气下向54g(1.70g,2.05mmol)在THF(90mL)、丙酮(70mL)和水(40mL)的混合物中的搅拌的溶液中加入Zn(2.68g,41.0mmol)和NH4Cl(4.39g,82.0mmol)。将混合物在室温搅拌45min，然后经硅藻土过滤，用THF洗涤若干次。在室温减压浓缩滤液至大约60mL。加入0.01％NH4OH溶液(400mL)并将混合物在室温搅拌15min。收集固体并先后用0.01％NH4OH(3×100mL)、水(3×100mL)和石油醚(3×100mL)洗涤。将固体干燥，得到54g的苯氨基衍生物(1.16g,100％)，将其用6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸(253mg,1.20mmol)、EDCI.HCl(576mg,3.00mmol)和无水TsOH(34.4mg,0.20mmol)在无水DMA(2mL)中的溶液处理。将混合物在室温在氮气下搅拌17h。加入NaHCO3溶液(50mL)并将混合物在室温搅拌30min。收集固体，用水洗涤，干燥并通过硅胶柱色谱(DCM-乙酸乙酯＝1:1)纯化，得到纯的(S)-8-(6-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)苄基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-6-氧代己基氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-甲酸叔丁酯54h(194mg,33％)，其为黄色固体，mp 128-132℃；1H NMR[(CD3)2SO]δ9.91(s,1H),8.20-8.11(m,2H),7.84(d,J＝8.3Hz,1H),7.62(d,J＝8.5Hz,2H),7.54(br t,J＝8.1Hz,1H),7.47(d,J＝8.5Hz,2H),7.38(br t,J＝8.0Hz,1H),7.04(s,1H),7.00(s,2H),6.69(s,1H),6.38(brs,1H),5.45-5.37(m,1H),5.20(s,2H),4.36(t,J＝10.2Hz,1H),4.26-4.13(m,2H),4.10-3.92(m,3H),3.88-3.79(m,1H),3.79(s,3H),3.52-3.30(m,4H),3.24(br t,J＝8.9Hz,1H),2.66-2.50(m,2H,被DMSO峰部分遮盖),2.28(t,J＝7.3Hz,2H),2.08-1.95(m,1H),1.95-1.76(m,5H),1.76-1.64(m,2H),1.64-1.20(m,8H),1.31(s,9H)。(C54H62ClN5O11)分析计算值：C,65.35；H,6.30；N,7.06。实测值：C,65.08；H,6.39；N,6.67。
向在-10至-11℃在氮气气氛下搅拌的N-(4-(((S)-1-(氯甲基)-3-(6-((S)-7-甲氧基-5-氧代-2,3,5,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基氧基)己酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基氧基)甲基)苯基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺54h(204mg,0.21mmol)在DCM(15mL)中的溶液中滴加(历时30min)含2.5％水的TFA(15mL)。加入后，将混合物在该温度再搅拌4h。在0℃将混合物倾入冰、DCM与饱和NaHCO3溶液的混合物中，得到pH 7-8。将混合物在室温搅拌15min。分出DCM层并用更多NaHCO3水溶液和水洗涤，然后干燥(MgSO4)。在25℃(浴温度)蒸发溶剂，得到黄色固体(172mg,94％物质回收)。通过制备型HPLC(Synergi-Max RP柱)(用30％甲酸铵缓冲液pH＝3.5；70％含水(10％)乙腈洗脱；流速：13mL/min)纯化该粗产物，得到54(30mg,16％),HPLC:98.8％纯；mp 190℃(dec.)；[α]20 D+320°(c0.100,DCM)；1H NMR[CDCl3]δ8.29(d,J＝8.3Hz,1H),8.18(s,1H),7.69-7.63(m,2H),7.61-7.44(m,6H),7.37(br t,J＝7.3Hz,2H),6.82(s,1H),6.66(s,2H),5.24(s,2H),4.34-4.19(m,2H),4.19-4.00(m,3H),3.99-3.92(m,1H),3.89(s,3H),3.86-3.78(m,1H),3.76-3.70(m,1H),3.63-3.49(m,3H),3.42(t,J＝10.8Hz,1H),2.68-2.47(m,2H),2.40-2.27(m,3H),2.12-1.92(m,5H),1.92-1.82(m,2H),1.82-1.71(m,2H),1.71-1.54(m,4H,被水峰部分遮盖),1.43-1.32(m,2H)。HRMS(ESI)m/zC49H52ClN5NaO8计算值：896.3397，实测值：896.3375[MNa+]。
实施例5 N-((S)-1-((S)-1-(4-(((S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基氧基)甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺55
在室温将碳酸钾即K2CO3(2.50g,18.1mmol)加至(S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯51a(2.01g,6.02mmol)和1-(溴甲基)-4-硝基苯(5.20g,24.1mmol)在DMF(12mL)中的混合物中(图6)。将反应混合物在室温搅拌2h，然后用EtOAc和H2O稀释并分出各层。用H2O(3×)、盐水(1×)洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并真空除去溶剂。通过两次使用己烷:EtOAc 100:0至96:4的硅胶柱色谱纯化，得到(S)-1-(氯甲基)-5-(4-硝基苄基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯55a(2.17g,77％)，其为明黄色固体。1HNMRδ(400MHz,CDCl3)8.31-8.27(m,3H),7.85(br s,1H),7.72(d,J＝8.4Hz,2H),7.67(d,J＝8.3Hz,1H),7.54(ddd,J＝8.2,6.8,1.2Hz,1H),7.38(ddd,J＝8.2,6.8,1.1Hz,1H),4.28-4.25(m,1H),4.16-4.10(m,1H),4.02-3.92(m,2H),3.45(t,J＝10.6Hz,1H),1.60(s,9H)。HRMS m/z 491.1338[(M+Na)+C25H25ClN2NaO5计算值491.1344]。
还原方法A：将55a(1.53g,3.26mmol)溶于THF-丙酮(75mL/60mL)中。55a已溶解后，加入H2O(30mL)。加入NH4Cl(10.5g,196mmol)和Zn粉(6.40g,97.9mmol)并将所得混合物在室温在氮气下搅拌1h。然后经由硅藻土过滤反应混合物，用DCM洗涤硅藻土塞并用H2O(1×)洗涤合并的滤液，干燥(Na2SO4)并真空除去溶剂，得到化合物55b，其为橙色固体。粗产物未经纯化即用于下一步骤。
还原方法B：将铝汞齐加至55a在THF-MeOH-H2O(150mL/50mL/20mL)中的溶液中。15min后，用DCM稀释反应混合物，经硅藻土过滤并用DCM洗涤硅藻土塞。用H2O洗涤有机物，干燥(Na2SO4)并真空除去溶剂，得到(S)-5-(4-氨基苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯55b，其为橙色固体。产物未经纯化即用于下一步骤。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)8.06(d,J＝8.6Hz,1H),7.80(d,J＝8.3Hz,1H),7.53-7.49(m,1H),7.34-7.30(m,1H),7.19(d,J＝8.2Hz,2H),6.60(d,J＝8.4Hz,2H),5.16(s,2H),5.04(d,J＝1.3Hz,2H),4.18-4.05(m,3H),4.00-3.97(m,1H),3.81(dd,J＝10.9,6.9Hz,1H),1.56(s,9H),1H未观察到。
将(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-5-脲基戊酸(Fmoc-L-瓜氨酸,3.26g,8.20mmol)和2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ,CAS登记号16357-59-8,3.12g,12.6mmol)在DMA(15mL)中的混合物在室温在氮气下搅拌20min。然后加入55b(2.77g,6.31mmol)在DMA(15mL)中的溶液，用氮气冲洗所得混合物并搅拌过夜。16h后，将反应混合物倾倒在冰上并用H2O稀释。滤出所得析出物，用H2O洗涤，溶于DCM/MeOH中，干燥(Na2SO4)并真空除去溶剂。通过研磨纯化粗产物，其中用己烷:EtOAc 94:6析出产物，倾出溶剂并先后使用己烷:EtOAc 90:10和己烷:EtOAc 95:5重复该操作。然后使用DCM:MeOH 100:0至95:5在硅胶柱上纯化该物质，得到(S)-5-(4-((S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯55c(4.23g,由55a历经2步79％,HPLC纯度:95.3％)，其为黄色固体。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)10.12(s,1H),8.12(d,J＝8.4Hz,1H),7.89(d,J＝7.5Hz,2H),7.82(d,J＝8.3Hz,1H),7.77-7.74(m,2H),7.70-7.67(m,3H),7.55-7.49(m,3H),7.42(t,J＝7.4Hz,2H),7.37-7.31(m,3H),6.00(t,J＝5.7Hz,1H),5.43(s,2H),5.22(s,2H),4.29-4.27(m,2H),4.24-4.05(m,6H),4.01-3.98(m,1H),3.82(dd,J＝10.9,7.0Hz,1H),3.09-2.92(m,2H),1.74-1.35(m,4H),1.55(s,9H)。HRMS m/z 840.3101[(M+Na)+C46H48ClN5NaO7计算值840.3134]。
在室温将哌啶(1.5mL,10％v/v)加至55c(4.18g,5.11mmol)在DMF(15mL)中的搅拌的溶液中。将反应混合物搅拌1h。用己烷:EtOAc 90:10(100mL)稀释所得悬浮液并搅拌10min。形成两层并倾出上层。真空除去保持在下层中的溶剂。通过使用DCM:MeOH 100:0至85:15的硅胶柱色谱纯化，得到(S)-5-(4-((S)-2-氨基-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯55d(2.97g,97％,HPLC纯度:99.1％)，其为黄色粉末。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)9.93(br s,1H),8.12(d,J＝8.3Hz,1H),7.82(d,J＝8.3Hz,1H),7.70(d,J＝8.6Hz,2H),7.55-7.48(m,3H),7.37-7.33(m,1H),5.94(t,J＝5.7Hz,1H),5.37(s,2H),5.22(s,2H),4.19-4.05(m,4H),4.01-3.98(m,1H),3.82(dd,J＝10.9,7.0Hz,1H),3.04-2.91(m,2H),1.71-1.36(m,4H),1.55(s,9H),3H未观察到。HRMS m/z 596.2627[(M+H)+C31H39ClN5O5计算值596.2634]。
在室温在氮气下将(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-甲基丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(Fmoc-Val-OSu,3.19g,7.31mmol)和55d(2.91g,4.87mmol)在DMA(15mL)中的混合物搅拌过夜。20h后，加入己烷:EtOAc80:20(150mL)并将悬浮液搅拌30min。然后倾出溶剂，留下固体。使用己烷:EtOAc 75:25重复该操作若干次。然后将固体悬浮于DCM:MeOH 75:25中并超声处理悬浮液。用己烷(200mL)稀释悬浮液并滤出固体且用己烷:EtOAc 65:35洗涤并干燥，得到(S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯55e(3.79g,85％,HPLC纯度:92.4％)，其为橙色粉末。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)10.12(s,1H),8.14-8.12(m,2H),7.89(d,J＝7.5Hz,2H),7.82(d,J＝8.4Hz,1H),7.75(t,J＝7.6Hz,2H),7.66(d,J＝8.5Hz,2H),7.55-7.48(m,3H),7.45-7.30(m,6H),5.98(t,J＝5.7Hz,1H),5.41(s,2H),5.22(s,2H),4.45(dd,J＝13.6,7.7Hz,1H),4.36-4.04(m,6H),4.02-3.90(m,2H),3.82(dd,J＝10.8,6.9Hz,1H),3.08-2.91(m,2H),2.05-1.96(m,1H),1.76-1.34(m,4H),1.55(s,9H),0.89(d,J＝6.8Hz,3H),0.86(d,J＝6.8Hz,3H)。HRMS m/z939.3808[(M+Na)+C51H57ClN6NaO8 939.3819]。
Boc除去方法A：在0℃将TFA(9.5mL)按份加入55e(685mg,0.747mmol)在DCM(19mL)中的悬浮液中。将反应混合物在0℃搅拌1h 45min。然后在0℃向混合物中按份加入NH3水溶液(0.25％,100mL)，接着加入浓NH3水溶液直至pH 9-10。然后加入己烷:EtOAc 90:10并将混合物在0℃搅拌40min，将悬浮液超声处理并经由过滤收集析出物，用H2O、H2O:MeOH 80:20、己烷:EtOAc 60:40、己烷:Et2O 50:50、己烷洗涤并干燥，得到(S)-1-((S)-1-(4-(((S)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基氧基)甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯55f，其为棕色固体(364mg,60％)。
Boc除去方法B：在0℃将BF3.Et2O(0.07mL,0.552mmol)加至55e(0.106g,0.116mmol)在DCM(40mL)中的悬浮液中。1h 50min后，在室温真空浓缩悬浮液直至仅剩余少量DCM。加入少量MeOH直至析出物溶解，然后用H2O稀释溶液。固体析出并倾出H2O。加入己烷:EtOAc 90:10(20mL)并超声处理悬浮液，然后经由过滤收集固体。用H2O和己烷洗涤固体并干燥，得到(S)-1-((S)-1-(4-(((S)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基氧基)甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯55f(66mg,70％)，其为棕色固体。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)10.10(s,1H),8.12(d,J＝7.6Hz,1H),8.00(d,J＝8.3Hz,1H),7.89(d,J＝7.4Hz,2H),7.74(t,J＝7.7Hz,2H),7.64(d,J＝8.5Hz,2H),7.58(d,J＝8.3Hz,1H),7.46-7.37(m,5H),7.34-7.30(m,2H),7.13-7.09(m,1H),6.55(s,1H),5.97(t,J＝5.7Hz,1H),5.41(s,2H),5.17(s,2H),4.43(dd,J＝13.0,7.5Hz,1H),4.34-4.21(m,3H),3.95-3.90(m,2H),3.83(dd,J＝10.7,3.4Hz,1H),3.70-3.66(m,1H),3.61-3.51(m,2H),3.08-2.90(m,2H),2.04-1.96(m,1H),1.76-1.33(m,4H),0.89(d,J＝6.8Hz,3H),0.86(d,J＝6.8Hz,3H),2H未观察到。HRMS m/z 839.3266[(M+Na)+C46H49ClN6NaO6计算值839.3294]。
将55f(485mg,0.593mmol)、53h(206mg,0.593mmol)、EDCI.HCl(293mg,1.48mmol)和TsOH(26mg,0.151mmol)在DMA(10mL)中的混合物用氮气冲洗并在室温搅拌过夜。19.5h后，用H2O稀释反应混合物并经由过滤收集所得固体，用H2O和己烷:EtOAc 50:50洗涤。使用DCM:MeOH 100:0至90:10在硅胶塞上进行过滤柱色谱，得到(S)-1-((S)-1-(4-(((S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基氧基)甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯55g(391mg)，其按粗品形式用于下一步骤。HRMS m/z 1144.4169[(M-H)+C64H64Cl2N7O9计算值1144.4148]。
在室温将哌啶(0.39mL,3.95mmol)加至55g(910mg,0.793mmol)在
DMF(6mL)中的悬浮液中。10min后，真空浓缩该混合物。通过使用DCM:MeOH 95:5至85:15的硅胶柱色谱纯化，接着通过制备型HPLC(柱：Synergi-MAX RP 4μ,21.20×250mm；流速：12mL/min；流动相：溶剂A:H2O/TFA pH 2.47,溶剂B:MeCN/H2O 90:10；方法：梯度,溶剂A:溶剂B 60:40至22:78至60:40,24min；波长：254nm,330nm)进一步纯化，得到(S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)-N-(4-(((S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基氧基)甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺三氟乙酸盐55h(75mg,9％)，其为霜状固体。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)10.35(s,1H),10.24(s,1H),8.69(d,J＝7.7Hz,1H),8.20(s,1H),8.15(d,J＝8.4Hz,1H),8.09-8.02(m,4H),7.86(d,J＝8.4Hz,1H),7.78(d,J＝8.4Hz,1H),7.65(d,J＝8.5Hz,2H),7.57-7.47(m,3H),7.40-7.37(m,1H),7.34-7.30(m,1H),6.04(t,J＝5.8Hz,1H),5.48(brs,2H),5.22(s,2H),4.57-4.51(m,1H),4.40-4.33(m,2H),4.25-4.14(m,4H),4.03-3.98(m,2H),3.85(dd,J＝10.7,7.6Hz,1H),3.79(dd,J＝10.3,8.6Hz,1H),3.66(t,J＝5.2Hz,2H),3.09-2.97(m,2H),2.75-2.57(m,4H),2.11-2.06(m,1H),2.01-1.96(m,2H),1.78-1.70(m,1H),1.68-1.58(m,1H),1.53-1.40(m,2H),0.95(d,J＝6.8Hz,3H),0.94(d,J＝6.8Hz,3H)。HRMS m/z 924.3672[(M+H)+C49H56Cl2N7O7计算值924.3613]。
将二异丙基乙基胺即DIPEA(10mg,0.0774mmol)在DMF(3mL)中溶液加至55h(74mg,0.0712mmol)和6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(33mg,0.107mmol)中并将所得混合物在室温在氮气下搅拌。5.5h后，加入另一份DIPEA(0.9mg,0.00693mmol)和6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(4.4mg,0.0143mmol)。再过1h后，加入另一份6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(8mg,0.0259mmol)并将混合物在-20℃保持过夜。15h后，将混合物温热至室温并加入另一份6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(4.4mg,0.0143mmol)。再过1h后，加入另一份6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(7.5mg,0.0243mmol)。1h后，先后加入己烷:EtOAc 95:5(25mL)和DCM(5mL)并将混合物搅拌20min。经该时段，固体从溶液中析出。使混合物沉降，然后倾出溶剂。然后加入己烷:DCM 95:5，搅拌悬浮液，沉降并倾出溶剂且将固体干燥。通过制备型HPLC(柱：Synergi-MAX RP 4μ,21.20×250mm；流速：13mL/min；流动相：溶剂A:H2O/TFA pH 2.47,溶剂B:MeCN/H2O 90:10；方法：等度,溶剂A:溶剂B 35:65,35min；波长：254nm,330nm)纯化，得到N-((S)-1-((S)-1-(4-(((S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基氧基)甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺55(13.7mg,17％,HPLC纯度:92.5％)，其为淡黄色粉末。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)10.35(s,1H),10.02(s,1H),8.19(s,1H),8.15(d,J＝8.3Hz,1H),8.08(d,J＝8.1Hz,2H),8.02(s,1H),7.86(s,1H),7.81-7.77(m,2H),7.66(d,J＝8.5Hz,2H),7.57-7.53(m,1H),7.50-7.47(m,3H),7.40-7.36(m,1H),7.33-7.30(m,1H),6.99(s,2H),5.97(t,J＝5.5Hz,1H),5.40(br s,2H),5.21(s,2H),4.42-4.32(m,3H),4.22-4.14(m,4H),4.03-3.98(m,2H),3.87-3.77(m,2H),3.34(t,J＝7.0Hz,2H),3.07-3.05(m,2H),2.76-2.59(m,4H),2.22-2.08(m,2H),2.02-1.92(m,3H),1.74-1.57(m,2H),1.51-1.33(m,6H),1.23-1.14(m,3H),0.85(d,J＝6.7Hz,3H),0.82(d,J＝6.8Hz,3H)。HRMS m/z1115.4170[(M-H)+C59H65Cl2N8O10计算值1115.4206]。
实施例6 N-((S)-1-((S)-1-(4-(((S)-1-(氯甲基)-3-(6-((S)-7-甲氧基-5-氧代-2,3,5,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基氧基)己酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基氧基)甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺56
将(S)-8-(6-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-硝基苄基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-6-氧代己基氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-甲酸叔丁酯54g(829mg,1.00mmol)还原(Zn/NH4Cl)成相应的苯胺(通过上文针对合成54h所报道的方法)并溶于无水DMA(3mL)中。向该溶液中加入通过在室温将(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-5-脲基戊酸(Fmoc-L-瓜氨酸,1.19g,3.00mmol)和2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉EEDQ(0.99g,4.00mmol)在无水DMA(4mL)中搅拌40min而形成的混合物。将最终的反应混合物在室温在氮气气氛下搅拌19h。将混合物倾入水中并在室温搅拌5h。收集固体，用水洗涤若干次，干燥并通过硅胶柱色谱(0-5％DCM-MeOH梯度)纯化，得到(S)-8-(6-((S)-5-(4-((S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-6-氧代己基氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-甲酸叔丁酯56a(0.91g,77％)，其为纯的米色固体；mp 172℃；1H NMR[(CD3)2SO]δ10.10(s,1H),8.22-8.11(m,2H),7.94-7.62(m,8H),7.59-7.46(m,3H),7.46-7.27(m,5H),7.04(s,1H),6.69(s,1H),6.39(br s,1H),5.99(t,J＝5.6Hz,1H),5.51-5.32(m,3H),5.22(s,2H),4.42-3.90(m,10H),3.88-3.75(m,1H),3.79(s,3H),3.53-3.18(m,3H),3.15-2.87(m,2H),2.66-2.44(m,2H,被DMSO峰部分遮盖),2.11-1.20(m,14H),1.31(s,9H)。(C65H72ClN7O12·1/2H2O)分析计算值：C,65.73；H,6.20；N,8.26。实测值：C,65.64；H,6.19；N,8.27。
在0℃在氮气气氛下向N-Fmoc 56a(0.91g,0.77mmol)在无水DMA(9mL)中的搅拌的溶液中加入哌啶在DMA中的溶液(1.0mmol/mL溶液)(3.85mL,3.85mmol)。加入后，将混合物在该温度再搅拌2h，然后倾入乙酸乙酯-石油醚的混合物(1:10)(150mL)中并在0℃搅拌30min。从不溶性物质中倾出溶剂并弃去。在室温用更多乙酸乙酯-石油醚(1:3)(2×150mL)重复洗涤步骤。收集固体，用乙酸乙酯-石油醚(1:3)洗涤并干燥，得到(S)-8-(6-((S)-5-(4-((S)-2-氨基-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-6-氧代己基氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-甲酸叔丁酯56b，其为无色固体(0.73g,99％)；mp 223℃(dec.)；1H NMR[(CD3)2SO]δ10.60-9.30(br s,3H),8.24-8.12(m,2H),7.84(d,J＝8.2Hz,1H),7.70(d,J＝8.5Hz,2H),7.54(br t,J＝7.5Hz,1H),7.50(d,J＝8.5Hz,2H),7.39(br t,J＝7.6Hz,1H),7.04(s,1H),6.69(s,1H),6.39(br s,1H),5.93(t,J＝5.7Hz,1H),5.47-5.28(m,3H),5.21(s,2H),4.36(t,J＝10.8Hz,1H),4.28-4.13(m,2H),4.10-3.92(m,3H),3.90-3.77(m,1H),3.79(s,3H),3.54-3.20(m,3H,被水峰部分遮盖),3.06-2.89(m,2H),2.70-2.49(m,3H,被DMSO峰部分遮盖),2.10-1.25(m,14H),1.31(s,9H)。(C50H62ClN7O10·3/4H2O)分析计算值：C,61.91；H,6.60；N,10.11。实测值：C,62.05；H,6.96；N,10.08。
将胺56b(0.73g,0.763mmol)和(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-甲基丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(Fmoc-Val-Osu,0.50g,1.15mmol)在无水DMA(7mL)中的混合物在室温在氮气气氛下搅拌18h。加入乙酸乙酯-石油醚(1:2)(100mL)并将混合物在室温搅拌30min。从不溶性物质中倾出溶剂并用更多乙酸乙酯-石油醚(1:1)(2×100mL)重复洗涤步骤。将无色固体洗涤，得到(S)-8-(6-((S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-6-氧代己基氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-甲酸叔丁酯56c(0.89g,91％)；mp 191℃(dec.)；1H NMR[(CD3)2SO]δ10.11(s,1H),8.22-8.08(m,3H),7.92-7.81(m,3H),7.74(t,J＝7.4Hz,2H),7.65(d,J＝8.4Hz,2H),7.54(br t,J＝7.2Hz,1H),7.48(d,J＝8.4Hz,2H),7.46-7.35(m,4H),7.32(br t,J＝7.4Hz,2H),7.04(s,1H),6.69(s,1H),6.39(br s,1H),5.97(br s,1H),5.47-5.34(m,3H),5.21(s,2H),4.53-4.13(m,7H),4.10-3.75(m,5H),3.79(s,3H),3.53-3.20(m,3H,被水峰部分遮盖),3.10-2.87(m,2H),2.69-2.45(m,2H,被DMSO峰部分遮盖),2.10-1.25(m,15H),1.31(s,9H),0.88(d,J＝6.8Hz,3H),0.85(d,J＝6.7Hz,3H)。(C70H81ClN8O13·3/4H2O)分析计算值：C,65.10；H,6.44；N,8.68。实测值：C,64.85；H,6.48；N,8.67。
在0℃在氮气气氛下向N-Fmoc化合物56c(0.89g,0.70mmol)在无水DMA(6mL)的搅拌的溶液中加入哌啶在DMA中的溶液(1.0mmol/mL溶液)(3.48mL,3.48mmol)。加入后，将混合物在该温度再搅拌1.5h。加入乙酸乙酯-石油醚的混合物(1:2)(90mL)并将混合物在0℃搅拌10min。从不溶性物质中倾出溶剂层并弃去。在室温用更多乙酸乙酯-石油醚(1:2)(2×90mL)重复洗涤步骤。干燥留下的无色固体，得到(S)-8-(6-((S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-6-氧代己基氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-甲酸叔丁酯56d(0.68g,93％)；mp225℃(dec.)；1H NMR[(CD3)2SO]δ10.16(s,可与D2O交换,1H),8.23-8.07(m,3H,D2O后减少为2H),7.84(d,J＝8.2Hz,1H),7.65(d,J＝8.5Hz,2H),7.59-7.45(m,3H),7.37(br t,J＝7.5Hz,1H),7.04(s,1H),6.69(s,1H),6.38(br s,可与D2O交换,1H),5.96(t,J＝5.8Hz,可与D2O交换,1H),5.45-5.30(m,3H,D2O后减少为1H,其为d,J＝9.6Hz),5.21(s,2H),4.41(br s,D2O后变成dd,J＝8.4,5.4Hz,1H),4.36(br t,J＝10.7Hz,1H),4.26-4.13(m,2H),4.10-3.91(m,3H),3.88-3.76(m,1H),3.79(s,3H),3.53-3.43(m,1H),3.41-3.20(m,2H),3.09-2.88(m,3H),2.70-2.50(m,2H,被DMSO峰部分遮盖),2.10-1.20(m,15H),1.31(s,9H),0.88(d,J＝6.9Hz,3H),0.79(d,J＝6.8Hz,3H),2H未观察到。(C55H71ClN8O11·H2O)分析计算值：C,61.53；H,6.85；N,10.44。实测值：C,61.39；H,7.11；N,10.15。
将胺56d(0.68g,0.64mmol)和6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(马来酰亚氨基-Osu,0.50g,1.61mmol)在无水DMA(6mL)中的混合物在0℃在氮气气氛下搅拌1h。加入乙酸乙酯-石油醚的混合物(1:2)(90mL)并将混合物在0℃搅拌15min。从不溶性物质中倾出溶剂层并弃去。在室温先后用更多乙酸乙酯-石油醚(1:1)(90mL)和纯乙酸乙酯(50mL)重复洗涤步骤。将留下的米色固体干燥，得到(S)-8-(6-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-6-氧代己基氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-甲酸叔丁酯52(0.72g,90％)；HPLC:96.7％纯；mp 210℃(dec.)；1H NMR[(CD3)2SO]δ10.03(s,可与D2O交换,1H),8.23-8.11(m,2H),8.09(d,J＝7.3Hz,可与D2O交换,1H),7.85(d,J＝8.5Hz,1H),7.80(d,J＝8.3Hz,可与D2O交换,1H),7.66(d,J＝8.6Hz,2H),7.59-7.44(m,3H),7.38(br t,J＝7.6Hz,1H),7.04(s,1H),6.99(s,2H),6.69(s,1H),6.38(br s,可与D2O交换,1H),5.99(t,J＝5.5Hz,可与D2O交换,1H),5.49-5.34(m,3H,D2O后减少为1H,其为d,J＝9.5Hz),5.20(s,2H),4.44-4.30(m,2H),4.26-4.13(m,3H),4.10-3.91(m,3H),3.88-3.76(m,1H),3.79(s,3H),3.53-3.44(m,1H),3.41-3.20(m,被水峰部分遮盖,4H),3.09-2.88(m,2H),2.66-2.42(m,被DMSO峰部分遮盖,2H),2.25-1.24(m,21H),1.31(s,9H),1.24-1.11(m,2H),0.86(d,J＝6.8Hz,3H),0.82(d,J＝6.7Hz,3H)。(C55H71ClN8O11·H2O)分析计算值：C,61.53；H,6.85；N,10.44。实测值：C,61.39；H,7.11；N,10.15。
在-10至-12℃(浴温度)历时10min向N-tBoc衍生物52(125mg,0.10mmol)在DCM(10mL)中的搅拌的溶液中滴加2.5％水在TFA(10mL)中的溶液。加入后，将混合物在该温度再搅拌3h。加入冷的(-25℃)乙酸乙酯-石油醚(1:10)(300mL)，接着在-10℃(浴温度)慢慢加入饱和NaHCO3水溶液，得到pH 6-7。除去有机层并用更多乙酸乙酯-石油醚(1:1)(300mL)重复洗涤步骤。收集固体，先后用水和乙酸乙酯洗涤若干次并干燥，得到粗产物，其为淡黄色固体(102mg)。通过制备型HPLC[Genentech]纯化该固体，得到N-((S)-1-((S)-1-(4-(((S)-1-(氯甲基)-3-(6-((S)-7-甲氧基-5-氧代-2,3,5,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基氧基)己酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基氧基)甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺56(4.1mg,3.6％)；HRMS(ESI)m/z C60H72ClN9NaO11计算值：1152.4932，实测值：1152.4906[MNa+]。C60H73ClN9O11计算值：1130.5113，实测值：1130.5077[MH+]。
实施例7 2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰氨基)乙基(甲基)氨基甲酸(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦酰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯57
在室温向(S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯51a(2.00g,5.99mmol)在DMF(5mL)中的溶液中加入苄基溴(7.13mL,59.90mmol)、碘化钾KI(50mg,0.30mmol)和碳酸钾K2CO3(4.14g,30.00mmol)。参见图9。将混合物搅拌2h，然后用乙酸乙酯稀释。滤出析出物。将滤液在乙酸乙酯与水之间再次分配。用乙酸乙酯萃取水相三次。用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，以无水Na2SO4干燥并经硅藻土过滤。通过旋转蒸发仪除去溶剂并泵除过量的苄基溴。通过使用乙酸乙酯和石油醚的混合物(v/v 1:10)作为洗脱剂的柱色谱纯化所得残余物，得到(S)-5-(苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯57a，其为白色固体(1.97g,78％)；mp 186-188℃。1H NMR(CDCl3)δ8.29(d,J＝8.3Hz,1H),7.86(br s,1H),7.65(d,J＝8.29Hz,1H),7.55-7.49(m,3H),7.45-7.41(m,2H),7.38-7.31(m,2H),5.26(s,2H),4.26(br s,1H),4.13(t,J＝10.8Hz,1H),4.00-3.92(m,2H),3.44(t,J＝10.5Hz,1H),1.61(s,9H)ppm。LRMS(APCI)实测值m/z 424.8(M+H)。C25H27ClNO3需要424.2。(Boger D.,Ishizakilb T.,Kitos P.and Suntornwat O.,(1990)J.Org.Chem.,55,5823-5832)。
用乙酸乙酯和石油醚的混合物(v/v 1:1)进一步洗脱，得到图9所示的环丙基产物，其为黄色油状物(345mg,19％)(Lajiness J.and Boger D.,(2011)J.Org.Chem.,76,583-587)。
向在冰浴中冷却的57a(1.60g,3.77mmol)在DCM(15mL)中的溶液中加入4N HCl/二噁烷(40mL)。将混合物温热至室温并搅拌3h。泵除全部挥发性组分，得到(S)-5-(苄基氧基)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚57b，其为盐酸盐。将盐溶于THF(15mL)中并在冰浴中冷却下来。加入戊二酸酐(646mg,5.66mmol)、DMAP(46mg,0.38mmol)和吡啶(5mL)并将所得混合物在室温搅拌4h。泵除全部挥发性组分后，将残余物溶于稀NaHCO3水溶液中并用乙酸乙酯洗涤3次。使用1N HCl将水相酸化至pH 2并用乙酸乙酯萃取3次。用水和盐水洗涤合并的乙酸乙酯萃取物，以无水Na2SO4干燥并经用MeOH和乙酸乙酯的混合物(v/v 1:10)洗涤的硅胶垫过滤。除去溶剂，得到(S)-5-(5-(苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酸57c，其为灰白色固体(978mg,59％)。
在-10℃向57c(978mg,2.23mmol)在THF(20mL)中的溶液中先后加入25％甲酸铵水溶液(20mL)和Pd-C催化剂(10％,湿的,500mg)并将混合物在-10℃搅拌7h。加入更多Pd-C催化剂(500mg)并将混合物在相同温度搅拌过夜。经硅藻土滤出催化剂并用THF洗涤硅藻土。从滤液中泵除THF并用乙酸乙酯萃取剩余水溶液3次。用水和盐水洗涤合并的萃取物，经无水Na2SO4干燥并过滤。除去溶剂，得到(S)-5-(1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酸53h，其为灰白色固体(487mg,63％)；1H NMR(DMSO)δ12.08(br s,1H),10.35(br s,1H),8.08(d,J＝8.0Hz,1H),7.98(s,1H),7.77(d,J＝8.3Hz,1H),7.50-7.46(m,1H),7.33-7.29(m,1H),4.30(t,J＝10.5Hz,1H),4.14-4.12(m,2H),3.98(dd,J＝2.8,10.9Hz,1H),3.78(dd,J＝7.8,10.8Hz,1H),2.63-2.54(m,2H),2.34(t,J＝7.4Hz,2H),1.99-1.83(m,2H)ppm。LRMS(APCI)实测值m/z 348.6(M+H)。C18H19ClNO4需要348.1。
向53h(500mg,1.44mmol)在THF(15mL)中的溶液中先后加入四唑(3％在乙腈中的溶液,51mL,17.25mmol)和二叔丁基-N,N-二异丙基亚磷酰胺(5.73mL,17.25mmol)。将混合物在室温搅拌过夜，然后在冰浴中冷却并滴加H2O2(30％水溶液,3.53mL,34.5mmol)。将所得混合物温热至室温并搅拌5h。伴随在冰浴中冷却通过加入10％亚硫酸钠水溶液淬灭反应混合物。通过旋转蒸发仪除去有机挥发物，得到含悬浮油状物的水相。加入石油醚并将混合物搅拌半小时。经由过滤收集形成的析出物，用水和石油醚洗涤并真空干燥，得到(S)-5-(1-(氯甲基)-5-(二叔丁氧基磷酰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酸57d(660mg,85％)，其为灰白色泡沫状物；1H NMR(DMSO)δ12.07(br s,1H),8.56(s,1H),8.04(d,J＝8.2Hz,1H),7.93(d,J＝8.4Hz,1H),7.60-7.56(m,1H),7.50-7.46(m,1H),4.38(t,J＝9.8Hz,1H),4.32-4.26(m,1H),4.20-4.18(m,1H),4.02(dd,J＝2.9,11.0Hz,1H),3.90(dd,J＝7.1,11.0Hz,1H),2.67-2.53(m,2H),2.34(t,J＝7.4Hz,2H),1.87-1.78(m,2H),1.481和1.476(2×s,18H)ppm。31P NMR(DMSO)δ-15.46ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 562.1719(M+Na)。C26H35ClNNaO7P需要562.1732。
向在冰浴中冷却的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸(1.00g,4.73mmol)在DCM(20mL)中的悬浮液中先后滴加一滴DMF和草酰氯(2.03mL,23.67mmol)。参见图10。将混合物温热至室温并搅拌过夜，得到暗棕色溶液。先后通过旋转蒸发仪和高真空泵除去所有挥发性组分。将所得残余物溶于DCM(5mL)中并先后通过旋转蒸发仪和高真空泵除去溶剂。将上述溶解和除去操作再重复一次，得到粗6-马来酰亚氨基己酰氯，其为暗棕色油状物。向在冰浴中冷却的甲基(2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(891mg,4.73mmol)在DCM(5mL)中的溶液中滴加上文制备的6-马来酰亚氨基己酰氯在DCM(20mL)中的溶液。将所得混合物温热至室温并搅拌过夜。除去DCM并将残余物溶于乙酸乙酯中。用NaHCO3水溶液、冷的5％柠檬酸水溶液和盐水洗涤该溶液，然后以无水Na2SO4干燥并经用乙酸乙酯洗涤的硅胶垫过滤。除去溶剂，得到2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰氨基)乙基(甲基)氨基甲酸叔丁酯57e，其为棕色油状物(1.33g,74％)；1H NMR(DMSO)(旋转异构体的混合物)δ7.006和7.005(2×s,1H),3.39-3.36(m,4H),3.29-3.25(m,2H),2.92-2.75(m,6H,2NMe),2.21(t,J＝7.38Hz,2H),1.50-1.44(m,4H),1.37(s,9H),1.24-1.16(m,2H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 382.2338(M+H)。C19H32N3O5需要382.2336。
向在冰浴中冷却的57e(274mg,0.72mmol)在DCM(5mL)中的溶液中滴加TFA(5mL)。将混合物在相同温度搅拌2h，然后先后通过旋转蒸发仪和高真空泵除去全部挥发性组分。按原样使用所得残余物6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基-N-(2-(甲基氨基)乙基)己酰胺三氟乙酸盐57f。
在室温将51a(200mg,0.60mmol)溶于DCM(5mL)中并先后加入DIPEA(0.3mL,1.72mmol)和氯甲酸4-硝基苯基酯(145mg,0.72mmol)，形成(S)-1-(氯甲基)-5-((4-硝基苯氧基)羰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯57g。将混合物搅拌5h后，加入粗57f在DCM(5mL)和DIPEA(0.7mL,4.02mmol)中的溶液，得到明黄色溶液，将其搅拌过夜。除去全部挥发性组分。将残余物溶于乙酸乙酯中并用5％氨水和盐水洗涤。通过先后使用乙酸乙酯、DCM与石油醚的混合物(v/v/v 1:2:1)和乙酸乙酯与DCM的混合物(v/v1:2)作为洗脱剂的柱色谱进一步纯化获得的粗物质，得到(S)-1-(氯甲基)-5-((2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰氨基)乙基)(甲基)氨甲酰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯57h(223mg,58％)，其为灰白色固体；mp 53-56℃。1H NMR(CDCl3)(旋转异构体的混合物)δ8.04(br s,1H),7.86-7.78(m,1H),7.72-7.68(m,1H),7.53-7.48(m,1H),7.40-7.34(m,1H),6.67(s,2H),4.25(br s,1H),4.46-4.10(m,1H),4.06-3.98(m,1H),3.92-3.72(表观d,J＝11.2Hz,1H),3.72-3.42(m,7H),3.28,3.10,3.09,2.99(4×s,6H,2NMe),2.38-2.21(m,2H),1.67-1.54(m,4H),1.57(s,9H),1.33-1.25(m,2H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 641.2728(M+H)。C33H42ClN4O7需要641.2737。
向在冰浴中冷却的57h(110mg,0.17mmol)在DCM(2mL)中的溶液中滴加TFA(2mL)。将混合物在相同温度搅拌2h，然后除去全部挥发性组分。将所得残余物在乙酸乙酯和冷的稀NaHCO3水溶液之间再次分配。用乙酸乙酯萃取水相三次。先后用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，以无水Na2SO4干燥并经硅藻土过滤。除去溶剂，得到2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰氨基)乙基(甲基)氨基甲酸(S)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯57i，其为黄色固体(86mg,92％)且未经进一步纯化按原样使用；1HNMR(CDCl3)(旋转异构体的混合物)δ7.76(d,J＝8.4Hz,1H),7.63-7.59(m,1H),7.48-7.41(m,1H),7.25-7.20(m,1H),6.79(s,1H),6.68(s,2H),4.01-3.94(m,1H),3.88-3.78(m,3H),3.74-3.68(m,2H),3.62-3.47(m,5H),3.28,3.10,3.06,3.00(4×s,6H,2NMe),2.38-2.21(m,2H),1.69-1.50(m,4H),1.33-1.25(m,2H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 541.2217(M+H)。C28H34ClN4O5需要541.2212。
向在冰浴中冷却的57i(83mg,0.15mmol)在DMA(3mL)中的溶液中先后加入(S)-5-(1-(氯甲基)-5-(二叔丁氧基磷酰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酸57d(99mg,0.18mmol)和EDCI盐酸盐(88mg,0.46mmol)及对甲苯磺酸(2.6mg,0.015mmol)。参见图11。将混合物温热至室温并搅拌过夜。将混合物在乙酸乙酯和冷的稀NaHCO3水溶液之间再次分配。用乙酸乙酯萃取水相三次。先后用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，以无水Na2SO4干燥并经硅藻土过滤。除去溶剂并用石油醚研磨所得残余物。将获得的固体从DCM和异丙醇中再次析出，得到2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰氨基)乙基(甲基)氨基甲酸(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-(二叔丁氧基磷酰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯57j，其为黄色固体(116mg,71％)；mp 81℃(dec.)。1H NMR(CDCl3)(旋转异构体的混合物)δ8.63(s,1H),8.36(s,1H),8.23(d,J＝8.5Hz,1H),7.89-7.82(m,1H),7.72-7.67(m,2H),7.54-7.50(m,2H),7.43-7.39(m,2H),6.66(s,2H),4.34-4.25(m,4H),4.10-4.05(m,2H),3.98-3.93(m,2H),3.72-3.69(m,2H),3.50-3.46(m,5H),3.28,3.10,3.09,2.99(4×s,6H,2NMe),2.79-2.73(m,2H),2.70-2.62(m,2H),2.38-2.32(m,1H),2.27-2.20(m,3H),1.67-1.54(m,3H),1.56(s,9H),1.55(s,9H),1.33-1.25(m,4H)ppm。31P NMR(CDCl3)δ-15.71ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 1084.3755(M+Na)。C54H66Cl2N5NaO11P需要1084.3766。
向在冰浴中冷却的57j(55mg,0.052mmol)在DCM(1mL)中的溶液中滴加TFA(1mL)。将混合物在相同温度搅拌1.5h，然后除去全部挥发性组分。将所得残余物从DCM和乙酸乙酯中再次析出，得到2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰氨基)乙基(甲基)氨基甲酸(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦酰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯57，其为灰色固体(33mg,67％,HPLC纯度:89％)；mp 191-194℃(dec.)。1H NMR(DMSO)(旋转异构体的混合物)δ8.49(s,1H),8.23-8.21(m,1H),8.10(d,J＝8.4Hz,1H),7.95-7.76(m,3H),7.59-7.53(m,2H),7.45-7.39(m,2H),6.97,6.96,6.94,6.90(4×s,总计2H,马来酰亚氨基),4.34-4.21(m,4H),4.06-4.01(m,2H),3.95-3.85(m,2H),3.71-3.61(m,2H),3.54-3.30(m,5H),3.23,3.18,3.04,3.00,2.97,2.95,2.89,2.85(8×s,总计6H,2NMe),2.37-2.28(m,2H),2.19(d,J＝7.4Hz,1H),2.00-1.95(m,2H),1.50-1.40(m,5H),1.25-1.15(m,5H)ppm。31P NMR(DMSO)δ-5.79ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 972.2488(M+Na)。C46H50Cl2N5NaO11P需要972.2514。
实施例8 4-甲基哌嗪-1-甲酸(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯58
将(S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯51a(3.338g,10mmol)、4-甲基哌嗪-1-羰基氯盐酸盐(5.98g,30mmol)、Et3N(3.5g,35mmol)和DMAP(1.34g,11mmol)在CH2Cl2(80mL)中的混合物在室温搅拌2天。参见图12。用水洗涤混合物并真空除去溶剂且干燥，以定量产率得到(S)-1-(氯甲基)-5-(4-甲基哌嗪-1-羰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯58a(Boger D.L.等,Synthesis,(1999),1505-1509)：mp98℃；1H NMR(CDCl3)δ8.11(br,1H),7.84(d,J＝8.4Hz,1H),7.70(d,J＝8.4Hz,1H),7.50(ddd,J＝8.2,6.9,1.1Hz,1H),7.37(ddd,J＝8.1,6.9,1.0Hz,1H),4.34-4.20(m,1H),4.17-4.10(m,1H),4.01-3.98(m,1H),3.94(dd,J＝9.6,2.4Hz,1H),3.87-3.80(br,2H),3.68-3.60(br,2H),3.47(t,J＝10.8Hz,1H),2.57-2.48(m,4H),2.83(s,3H),1.58(s,9H)；MS(APCI+)m/z 461.2MH+。C24H30ClN3O4分析计算值：C,62.7；H,6.6；N,9.1。实测值：C,62.5；H,6.8；N,9.2％。
在0℃将58a(2.30g,5mmol)在CH2Cl2(50mL)中的溶液用过量三氟乙酸(TFA)处理4h并用冷的NH3水溶液中和该混合物。用己烷稀释，导致固体析出，其经由过滤收集，用水和己烷洗涤并干燥，得到4-甲基哌嗪-1-甲酸(S)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯58b(1.60g,89％)：mp144-147℃；1H NMR(CDCl3)δ7.69(d,J＝8.4Hz,1H),7.63(d,J＝8.4Hz,1H),7.45(ddd,J＝8.3,6.9,1.2Hz,1H),7.25(ddd,J＝8.4,6.8,1.2Hz,1H),6.82(s,1H),5.30(s,1H),4.17-4.05(m,2H),4.03-3.96(m,2H),3.89-3.77(m,4H),3.54(t,J＝10.9Hz,1H),3.20-2.90(m,4H),2.76(s,3H)。C19H22ClN3O2分析计算值：C,63.4；H,6.2；N,11.7。实测值：C,63.2；H,6.2；N,11.5％。
用HCl(4M在二噁烷中的溶液,10mL)处理55a(4.689g,10mmol)在二噁烷(30mL)中的溶液并将混合物在室温搅拌过夜。加入氢氧化铵，除去溶剂，得到(S)-1-(氯甲基)-5-(4-硝基苄基氧基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚54f，将其与戊二酸酐(3.4g,30mmol)在CH2Cl2(50mL)中的溶液混合。冷却至0℃后，加入Et3N(5.05g,50mmol)并将混合物慢慢温热且在室温搅拌过夜。加入稀HCl，得到固体，其经由过滤收集，用水和CH2Cl2洗涤并干燥，得到(S)-5-(1-(氯甲基)-5-(4-硝基苄基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酸58c(2.95g,61％)：1H NMR(DMSO-d6)δ12.07(br s,1H),8.30(br d,J＝8.8Hz,2H),8.24(d,J＝8.1Hz,1H),8.17(s,1H),7.89-7.85(m,3H),7.57(ddd,J＝8.2,6.9,1.1Hz,1H),7.43(ddd,J＝8.1,7.1,1.0Hz,1H),5.46(s,2H),4.34(t,J＝9.7Hz,1H),4.25-4.13(m,2H),4.01(dd,J＝11.0,2.8Hz,1H),3.85(dd,J＝10.9,7.4Hz,1H),2.66-2.57(m,1H),2.55-2.46(m,1H),2.35(t,J＝7.3Hz,2H),1.87-1.79(m,2H)。
将58b(1.33g,3.7mmol)和58c(1.63g,3.38mmol)在DMA(25mL)与1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI.HCl,3.26g,17.0mmol)中的混合物在室温搅拌过夜。用NaHCO3水溶液稀释混合物并相继用水和甲醇洗涤所得析出物并干燥。在硅胶上进行色谱纯化(先后用EtOAc/MeOH 9:1和EtOAc/MeOH 4:1洗脱)，得到4-甲基哌嗪-1-甲酸(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-硝基苄基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯58d(0.98g,35％)：1H NMR(CDCl3)δ8.35(s,1H),8.33-8.27(m,3H),8.17(s,1H),7.85(d,J＝8.3Hz,1H),7.73-7.68(m,4H),7.58-7.49(m,2H),7.45-7.38(m,2H),5.33(q,J＝13.0Hz,2H),4.39-4.27(m,4H),4.14-4.06(m,2H),4.01-3.95(m,2H),3.83-3.77(m,2H),3.64-3.59(m,2H),3.48(dt,J＝10.5,7.3Hz,2H),2.85-2.65(m,4H),2.55-2.47(m,4H),2.38(s,3H),2.28-2.21(m,2H)。
在0℃用铝汞齐(2g)处理58d(0.41g,5mmol)在THF(35mL)、MeOH(15mL)和水(5mL)的混合物中的悬浮液并历时3h将所得混合物温热至室温。用MeOH稀释后，经硅藻土过滤混合物并将滤液蒸发至干，得到4-甲基哌嗪-1-甲酸(S)-3-(5-((S)-5-(4-氨基苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯58e(0.31g,78％)，其直接用于下一步骤：1H NMR(CDCl3)δ8.37(s,1H),8.26(d,J＝8.2Hz,1H),8.18(s,1H),7.86(d,J＝8.3Hz,1H),7.67(d,J＝8.3Hz,1H),7.60(d,J＝8.3Hz,1H),7.49-7.43(m,2H),7.39(br t,J＝7.6Hz,1H),7.34-7.26(m,3H),6.68(d,J＝8.3Hz,2H),5.10(q,J＝10.9Hz,2H),4.32-4.15(m,4H),4.07-3.97(m,2H),3.94-3.90(m,2H),3.86-3.79(m,2H),3.66-3.60(m,2H),3.50-3.40(m,2H),2.77-2.58(m,4H),2.56-2.48(m,4H),2.27(s,3H),2.22-2.14(m,2H)。
将2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ,0.58g,2.3mmol)和(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-5-脲基戊酸(Fmoc-L-瓜氨酸,0.69g,1.7mmol)的混合物在无水DMA(10mL)中在氮气下搅拌10min直至固体溶解。参见图13。加入粗58e(0.31g,0.39mmol)并继续搅拌过夜。用EtOAc稀释混合物并加入水以使产物析出，其经由过滤收集并用沸腾的MeOH研磨，得到粗4-甲基哌嗪-1-甲酸(S)-3-(5-((S)-5-(4-((S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯58f(0.62g,>100％)，在室温将其用哌啶(50mg,0.59mmol)在无水DMF(20mL)中的溶液处理30min。用EtOAc、己烷和水稀释，得到析出物，其经由过滤收集并用己烷和水洗涤，得到粗4-甲基哌嗪-1-甲酸(S)-3-(5-((S)-5-(4-((S)-2-氨基-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯58g(0.33g,HPLC纯度89％,85％)，将其用1.5当量Fmoc-Val-OSu(N-α-Fmoc-L-缬氨酸N-羟基琥珀酰亚胺酯,0.23g,0.53mmol)在无水DMA(10mL)中的溶液处理。用EtOAc和水稀释，得到固体，其经由过滤收集并干燥，得到粗4-甲基哌嗪-1-甲酸(S)-3-(5-((S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯58h(0.38g,85％)：1H NMR(DMSO-d6)δ10.11(s,1H),8.24-8.11(m,3H),7.96(d,J＝8.4Hz,1H),7.90-7.80(m,4H),7.74(t,J＝7.4Hz,2H),7.65(d,J＝8.4Hz,2H),7.61-7.53(m,2H),7.50-7.36(m,6H),7.32(t,J＝7.5Hz,2H),5.97(t,J＝5.4Hz,1H),5.40(s,2H),5.20(s,2H),4.44-4.19(m,9H),4.08-3.81(m,5H),3.74-3.70(br,2H),3.50-3.42(br,2H),3.07-2.89(m,2H),2.77-2.55(m,4H),2.52-2.36(m,4H),2.25(s,3H),2.03-1.94(m,3H),1.76-1.53(m,2H),1.49-1.30(m,2H),0.87(dd,J＝11.2,6.8Hz,6H)。
使粗58h(0.38g,0.3mmol)与哌啶在DMA中的溶液在室温反应1h并用EtOAc和水稀释混合物，得到固体，将其收集并干燥，得到4-甲基哌嗪-1-甲酸(S)-3-(5-((S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯58i(0.23g,HPLC纯度73％,83％)：1HNMR(CDCl3)δ9.34(br,1H),8.35(br s,1H),8.28(d,J＝8.1Hz,1H),8.14(s,1H),8.02(s,1H),7.86(d,J＝8.2Hz,1H),7.75(d,J＝7.5Hz,1H),7.70(d,J＝7.6Hz,1H),7.65-7.60(m,2H),7.54-7.47(m,2H),7.46-7.33(m,4H),7.29(td,J＝7.4,1.3Hz,1H),5.20(br s,2H),5.17-5.09(m,1H),4.82-4.73(m,1H),4.59-4.50(m,1H),4.33-4.15(m.3H),4.07-4.01(m,1H),3.98-3.90(m,2H),3.86-3.76(m,3H),3.65-3.57(m,2H),3.55-3.39(m,3H),3.25(br s,1H),2.81-2.60(m,3H),2.59-2.41(m,6H),2.37(s,3H),2.27-2.16(m,3H),1.55-1.48(m,2H),0.98(d,J＝6.7Hz,3H),0.83(d,J＝6.6Hz,3H)。
将粗58i(0.105g,0.1mmol)和6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(62mg,0.2mmol)在无水DMF(10mL)中的混合物在室温搅拌过夜并用乙酸乙酯和水稀释混合物，得到固体，将其收集并干燥，得到粗物质(70mg,HPLC纯度71％)，将其通过制备型HPLC纯化，得到4-甲基哌嗪-1-甲酸(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯58。MS m/z 1243.4[(M+H)+C65H76Cl2N10O11计算值1243.5]。
实施例9 磷酸二氢(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯59
向(S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯55e(1.00g,1.09mmol)在DMF(10mL)中的溶液中加入哌啶(1.08mL,10.90mmol)。参见图14。将混合物在室温搅拌2h，然后泵除全部挥发性组分。用乙醚研磨所得残余物，得到(S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯59a，其为白色固体(700mg,92％)。1H NMR(DMSO)δ10.17(s,1H),8.17(d,J＝8.0Hz,1H),8.12(d,J＝8.4Hz,1H),7.82(d,J＝8.4Hz,1H),7.66(d,J＝8.6Hz,2H),7.55-7.49(m,3H),7.37-7.33(m,1H),5.98(t,J＝5.7Hz,1H),5.41(s,2H),5.22(s,2H),4.51-4.48(m,1H),4.19-3.98(m,4H),3.84-3.80(m,1H),3.08-2.90(m,3H),1.99-1.91(m,2H),1.75-1.65(m,2H),1.55(s,9H),1.49-1.33(m,2H),0.89(d,J＝6.8Hz,3H),0.80(d,J＝6.8Hz,3H)ppm。
将59a(688mg,0.99mmol)、6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(SuOMC,320mg,1.04mmol)和DIPEA(190μL,1.09mmol)在DMSO(10mL)中的混合物在室温搅拌过夜。泵除全部挥发性组分。用乙酸乙酯研磨所得残余物，得到(S)-1-(氯甲基)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯59b，其为灰白色固体(832mg,95％)。1H NMR(DMSO)δ10.03(s,1H),8.13-8.08(m,2H),7.83-7.79(m,2H),7.66(d,J＝8.4Hz,2H),7.55-7.48(m,3H),7.35(t,J＝7.5Hz,1H),6.99(s,2H),5.97(t,J＝5.4Hz,1H),5.41(s,2H),5.21(s,2H),4.43-4.38(m,1H),4.22-3.98(m,4H),3.84-3.80(m,1H),3.38-3.33(m,3H),3.08-2.90(m,2H),2.24-2.06(m,2H),2.01-1.91(m,1H),1.74-1.14(m,10H),1.55(s,9H),0.86(d,J＝6.8Hz,3H),0.83(d,J＝6.7Hz,3H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 910.3897(M+Na)。C46H58ClN7NaO9需要910.3877。
向在冰浴中冷却的59b(100mg,0.11mmol)在DCM(2mL)中的悬浮液中加入TFA(2mL)。将混合物在冰浴中搅拌3h。泵除全部挥发性组分。将所得残余物溶于THF中并在乙酸乙酯与冷的5％氨水之间再次分配。用乙酸乙酯萃取水相三次。用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，以无水Na2SO4干燥，经硅藻土过滤并除去溶剂，得到N-((S)-1-((S)-1-(4-(((S)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基氧基)甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺59c，其为绿棕色固体(80mg,90％)且直接使用。1H NMR(DMSO)δ10.02(s,1H),8.09-8.07(m,1H),7.99(d,J＝8.3Hz,1H),7.80(d,J＝8.5Hz,1H),7.65(d,J＝8.3Hz,2H),7.56(d,J＝8.3Hz,1H),7.45(d,J＝8.4Hz,2H),7.38(t,J＝7.1Hz,1H),7.09(t,J＝7.4Hz,1H),6.99(s,2H),5.97(br s,1H),5.41(s,2H),5.16(s,2H),4.46-4.35(m,1H),4.21-4.17(m,1H),3.96-3.87(m,1H),3.84-3.80(m,1H),3.70-3.65(m,1H),3.60-3.49(m,1H),3.38-3.33(m,3H),3.06-2.92(m,2H),2.22-2.08(m,2H),2.02-1.92(m,1H),1.75-1.14(m,10H),0.86(d,J＝6.7Hz,3H),0.82(d,J＝6.7Hz,3H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 810.3332(M+Na)。C41H50ClN7NaO7需要810.3352。
在室温向59c(75mg,0.095mmol)和(S)-5-(1-(氯甲基)-5-(二叔丁氧基磷酰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酸57d(62mg,0.11mmol)在DMA(3mL)中的溶液中先后加入EDCI盐酸盐(40mg,0.21mmol)和对甲苯磺酸(1.6mg,0.0095mmol)。将混合物搅拌5h后，再加入EDCI盐酸盐(35mg,0.18mmol)并将混合物搅拌过夜。泵除全部挥发性组分。将所得残余物溶于THF中并在乙酸乙酯与冷的稀NaHCO3水溶液之间再次分配。用乙酸乙酯萃取水相三次。用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，以无水Na2SO4干燥，经硅藻土过滤并除去溶剂，得到磷酸二叔丁酯·(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯59d，其为棕色固体(104mg,83％)且直接使用。1H NMR(DMSO)δ10.03(s,1H),8.60(s,1H),8.19-7.38(m,14H),6.87(s,2H),5.97(br s,1H),5.40(s,2H),5.20(br s,2H),4.45-3.82(m,10H),3.38-3.33(m,3H),3.07-2.90(m,2H),2.75-2.50(m,2H),2.20-2.08(m,4H),2.02-1.92(m,2H),1.75-1.10(m,12H),1.48(s,18H),0.86-0.82(m,6H)ppm。31P NMR(DMSO)δ-15.46ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 1331.5071(M+Na)。C67H83Cl2N8NaO13P需要1331.5086。
向在冰浴中冷却的59d(95mg,0.073mmol)在DCM(2mL)中的悬浮液中加入TFA(1mL)。将混合物在冰浴中搅拌1.5h。泵除全部挥发性组分。用乙酸乙酯研磨所得残余物，得到蓝灰色固体(77mg,90％)，通过制备型HPLC(柱：Synergi-Max RP 4μ,250×21.20mm；流动相：A/B＝30:70(A:H2O-TFA pH 2.56,B:90％乙腈/水)；流速13mL/min)将其进一步纯化，得到磷酸二氢(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯59，其为灰白色固体(5mg,HPLC纯度97％)。1H NMR(DMSO)δ10.04(s,1H),8.49(s,1H),8.19-8.09(m,4H),7.87-7.81(m,2H),7.66(d,J＝8.5Hz,2H),7.56-7.48(m,4H),7.40-7.36(m,2H),6.98(s,2H),6.01(br s,1H),5.43(br s,2H),5.22(s,2H),4.42-3.34(m,2H),4.25-4.12(m,4H),4.03-3.98(m,2H),3.88-3.81(m,2H),3.38-3.33(m,3H),3.10-2.90(m,2H),2.75-2.55(m,4H),2.20-2.08(m,2H),2.00-1.92(m,2H),1.75-1.10(m,12H),0.88-0.81(m,6H)ppm。31PNMR(DMSO)δ-5.60ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 1219.3794(M+Na)。C59H67Cl2N8NaO13P需要1219.3834。
实施例10 N-((S)-1-((S)-1-(4-(((S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基氧基)甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺60
对磷酸二氢(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯59进行酶脱磷酸化，得到60。
实施例11 (S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦酰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基氨基甲酸2-(吡啶-2-基二硫基)乙基酯61
在室温将三光气(136mg,0.458mmol)在无水DCM(10mL)中的溶液加至(S)-5-氨基-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯61a(150mg,0.451mmol)和DMAP(386mg,3.16mmol)在无水DCM(30mL)中的混合物中。参见图15。45min后，加入2-(吡啶-2-基二硫基)乙醇(Chem.Eur.J.(2006)12:3655-3671)(350mg,1.87mmol)在无水DCM(10mL)中的溶液并将反应混合物搅拌过夜。20h后，用MeOH(30mL)稀释混合物并真空除去溶剂。通过先后使用己烷:DCM 100:0至0:100和DCM:EtOAc 100:0至95:5的硅胶柱色谱纯化，得到化合物61b和起始物质2-(吡啶-2-基二硫基)乙醇的混合物(389mg)。该混合物用于下一步骤。在0℃将TBDMSCl(262mg,1.74mmol)在DMF(1.5mL)中的溶液加至产物61b、2-(吡啶-2-基二硫基)乙醇和咪唑(118mg,1.74mmol)在DMF(4mL)中的搅拌的混合物中。将混合物温热至室温，搅拌45min，然后用EtOAc和H2O稀释。分出两层并用H2O(3×)洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并真空除去溶剂。通过先后使用己烷:DCM 50:50至0:100和DCM:EtOAc 98:2至94:6的硅胶柱色谱纯化，得到(S)-1-(氯甲基)-5-((2-(吡啶-2-基二硫基)乙氧基)羰基氨基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯61b(190mg,由61a历经两步77％)，其为淡黄色泡沫状固体。1H NMRδ(400MHz,CDCl3)8.49(br s,1H),8.48-8.47(m,1H),7.84(d,J＝8.4Hz,1H),7.71(t,J＝7.0Hz,2H),7.63(t,J＝7.3Hz,1H),7.54-7.50(m,1H),7.40(ddd,J＝8.2,6.8,1.1Hz,1H),7.09(ddd,J＝7.3,4.9,1.0Hz,1H),6.93(br s,1H),4.48(t,J＝6.3Hz,2H),4.31-4.27(m,1H),4.15-4.10(m,1H),4.04-3.98(m,1H),3.91(dd,J＝11.1,2.4Hz,1H),3.45(t,J＝10.7Hz,1H),3.13(t,J＝6.3Hz,2H),1.60(s,9H)。
在0℃将TFA(4.8mL)慢慢加至61b(180mg,0.330mmol)在DCM(9.5mL)中的溶液中并将混合物在该温度搅拌1h。然后用DCM和H2O稀释反应混合物并用饱和NaHCO3水溶液中和直至pH 7-8。分出两层并用H2O(1×)洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并真空除去溶剂，得到(S)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基氨基甲酸2-(吡啶-2-基二硫基)乙基酯61c(113mg,77％)，其为黄色固体且未经纯化即用于下一步骤。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)9.52(s,1H),8.48-8.46(m,1H),7.88(d,J＝8.4Hz,1H),7.83-7.78(m,2H),7.64(d,J＝8.2Hz,1H),7.39(ddd,J＝8.1,6.9,1.0Hz,1H),7.25(ddd,J＝6.5,4.8,2.2Hz,1H),7.14(ddd,J＝8.2,6.8,1.0Hz,1H),7.09(s,1H),5.94(br s,1H),4.33(t,J＝6.2Hz,2H),4.02-3.96(m,1H),3.85(dd,J＝10.8,3.5Hz,1H),3.70(t,J＝9.3Hz,1H),3.63-3.55(m,2H),3.18(t,J＝6.1Hz,2H)。
在室温在氮气下将(S)-5-(1-(氯甲基)-5-(二叔丁氧基磷酰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酸57d(135mg,0.250mmol)在DMA(6mL)中的溶液加至61c(110mg,0.247mmol)和EDCI.HCl(116mg,0.605mmol)的混合物中并将混合物搅拌过夜。18.5h后，加入另外的57d(40mg,0.0741mmol)在DMA(0.5mL)中的溶液和固体EDCI.HCl(28.4mg,0.148mmol)并将混合物在室温在氮气下搅拌。再过6h后，加入另一份57d(7mg,0.0130mmol)在DMA(0.5mL)中的溶液和固体EDCI.HCl(24mg,0.125mmol)并将混合物再搅拌2天又16.5h。然后用H2O稀释混合物并析出固体。经由过滤收集固体，用H2O、饱和NaHCO3水溶液、H2O和己烷洗涤。将固体溶于EtOAc中，用饱和NaHCO3水溶液(3×)和H2O(1×)洗涤该溶液，然后干燥(Na2SO4)并真空除去溶剂。然后将固体再溶于DCM中并再用饱和NaHCO3水溶液(3×)洗涤，干燥(Na2SO4)并真空除去溶剂。然后用己烷:EtOAc 95:5至90:10研磨固体，得到(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-(二叔丁氧基磷酰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基氨基甲酸2-(吡啶-2-基二硫基)乙基酯61d(117mg,HPLC纯度:86.1％)，其为米色固体且未经纯化即用于下一步骤。HRMS m/z989.2289[(M+Na)+C47H53Cl2N4NaO8PS2计算值989.2312]。
在0℃将TFA(1mL)滴至61d在DCM(2mL)中的搅拌的溶液中并将混合物在该温度搅拌70min。然后在25℃真空除去溶剂。将所得黑色残余物溶于DCM中并用EtOAc稀释该溶液。真空除去DCM，得到在EtOAc中的悬浮液。经由过滤收集固体，用EtOAc和己烷研磨并干燥，得到绿色固体。通过制备型HPLC(柱：Synergi-MAX RP 4μ,21.20×250mm；流速：12mL/min；流动相：溶剂A:H2O/TFA pH 2.6,溶剂B:MeCN/H2O 90:10；方法：梯度,溶剂A:溶剂B 60:40至2:98,35min；波长：254nm,330nm)进一步纯化该固体，得到61(16mg,由61c历经两步8％,HPLC纯度:97.2％)。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)9.69(s,1H),8.57-8.46(m,3H),8.09(d,J＝8.3Hz,1H),8.01(d,J＝8.5Hz,1H),7.91(dd,J＝8.3,2.4Hz,2H),7.82(d,J＝3.3Hz,2H),7.59-7.52(m,2H),7.47-7.40(m,2H),7.27-7.23(m,1H),4.42-4.22(m,8H),4.06-4.01(m,2H),3.90(td,J＝11.2,7.4Hz,2H),3.19(t,J＝6.0Hz,2H),2.77-2.59(m,4H),2.01-1.94(m,2H)。2个质子未观察到。31P NMRδ(400MHz,DMSO-d6)-6.01。HRMS m/z877.1053[(M+Na)+C39H37Cl2N4NaO8PS2计算值877.1060]。[α]D 24＝-42.3°(c＝0.213,DMSO)。
实施例12 (S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦酰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基氨基甲酸2-(吡啶-2-基二硫基)丙基酯62
在0℃将三乙胺即Et3N(0.92mL,6.62mmol)和三氟甲磺酸酐(1.03mL,6.11mmol)加至51a(1.70g,5.09mmol)在DCM(160mL)中的搅拌的溶液中。参见图16。将反应混合物在0℃搅拌20min，然后用H2O稀释，将两层分开并用DCM(1×)萃取水层。干燥(Na2SO4)合并的有机层并真空除去溶剂。通过使用己烷:EtOAc 100:0至95:5的硅胶柱色谱纯化，得到(S)-1-(氯甲基)-5-(三氟甲基磺酰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯62a(2.20g,93％)，其为米色泡沫状固体。1H NMRδ(400MHz,CDCl3)8.30(br s,1H),8.03(d,J＝8.5Hz,1H),7.76(d,J＝8.4Hz,1H),7.62-7.59(m,1H),7.53-7.49(m,1H),4.32(br s,1H),4.21-4.15(m,1H),4.09-4.03(m,1H),3.92(dd,J＝11.2,2.8Hz,1H),3.54-3.49(m,1H),1.61(s,9H)。
在密封管中在氮气下将62a(2.15g,4.61mmol)在无水THF(60mL)中的溶液加至Cs2CO3(2.10g,6.44mmol)、BINAP(430mg,0.690mmol)和Pd(OAc)2(155mg,0.690mmol)的混合物中。然后将二苯甲酮亚胺(1.0mL,5.98mmol)加至反应混合物中并使氮气鼓泡经过混合物10min。将密封管在60-65℃加热4天。然后将反应混合物冷却至室温，用DCM稀释，经硅藻土过滤，用DCM洗涤硅藻土塞直至洗涤液不再有颜色且真空蒸发滤液。通过使用己烷:DCM100:0至50:50的硅胶柱色谱纯化残余物，得到(S)-1-(氯甲基)-5-(二苯基亚甲基氨基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯53f(2.09g,91％)，其为黄色泡沫状固体。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)7.85(d,J＝8.4Hz,1H),7.80(d,J＝8.4Hz,1H),7.75(d,J＝7.3Hz,2H),7.61-7.57(m,1H),7.54-7.49(m,3H),7.37-7.33(m,1H),7.30-7.23(m,3H),7.06(d,J＝6.7Hz,2H),4.14-4.02(m,2H),3.99-3.94(m,2H),3.77(dd,J＝10.8,7.4Hz,1H),1.46(s,9H),1H未观察到。HRMS m/z 497.1984[(M+H)+C31H30ClN2O2计算值497.1990]。[α]D 28＝-101.5°(c＝0.995,DCM)。
在室温将冰乙酸即HOAc(65mL)加至53f(1.30g,2.62mmol)在THF和H2O(195mL/98mL)中的搅拌的溶液中并将混合物搅拌过夜。18h后，在不加热超过30℃的情况下真空浓缩反应混合物以除去大部分THF。然后用EtOAc(200mL)稀释该混合物，分出有机层，用饱和NaHCO3水溶液洗涤(4×,直至洗涤液为pH 8)，干燥(Na2SO4)并真空除去溶剂。通过使用己烷:EtOAc100:0至90:10的硅胶柱色谱纯化残余物，得到(S)-5-氨基-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯61a(503mg,58％)。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)8.01(d,J＝8.4Hz,1H),7.64(d,J＝8.0Hz,1H),7.40(ddd,J＝8.1,6.8,0.9Hz,1H),7.36(br s,1H),7.20(ddd,J＝8.1,6.8,1.1Hz,1H),5.91(s,2H),4.11-3.91(m,4H),3.66(dd,J＝10.6,8.2Hz,1H),1.53(s,9H)。
在0℃将2-巯基丙酸(3.02g,28.5mmol)在无水THF(10mL)中的溶液滴至LiAlH4(1.29g,34.0mmol)在无水THF(40mL)中的搅拌的混悬液中。将反应混合物温热至室温并搅拌3h。然后将混合物冷却至0℃并用H2O(5mL)和5％NaOH水溶液(3mL)淬灭。将混合物在0℃搅拌20min，经硅藻土过滤，用Et2O(3×)洗涤硅藻土塞，干燥(Na2SO4)合并的有机物，过滤并除去溶剂，得到2-巯基丙-1-醇(944mg)，其未经纯化即用于下一步骤。在室温将1,2-二(吡啶-2-基)二硫烷(Bioorg.Med.Chem.Lett.(2011)21:4985-4988.)(470mg,5.10mmol)在MeOH(7mL)中的溶液加至2-巯基丙-1-醇在MeOH(4mL)中的溶液中并将混合物搅拌过夜。17.5h后，真空除去溶剂。通过先后使用己烷:DCM50:50至0:100和DCM:EtOAc 99:1至75:25的氧化铝(中性)柱色谱纯化，得到2-(吡啶-2-基二硫基)丙-1-醇(528mg,由2-巯基丙酸历经两步18％)，其为黄色油状物。1H NMRδ(400MHz,CDCl3)8.50(ddd,J＝5.0,1.8,0.9Hz,1H),7.57(ddd,J＝8.0,7.4,1.8Hz,1H),7.39(td,J＝8.1,1.0Hz,1H),7.15(ddd,J＝7.4,5.0,1.1Hz,1H),5.93(dd,J＝8.8,5.8Hz,1H),3.68(ddd,J＝12.5,8.8,3.8Hz,1H),3.40(ddd,J＝12.4,7.8,5.8Hz,1H),3.14-3.06(m,1H),1.31(d,J＝6.9Hz,3H)。
在室温将三光气(127mg,0.428mmol)在无水DCM(10mL)中的溶液慢慢加至61a(250mg,0.751mmol)和DMAP(551mg,4.51mmol)在无水DCM(40mL)中的混合物中。立即析出黄色固体。30min后，加入2-(吡啶-2-基二硫基)丙-1-醇(420mg,2.09mmol)在无水DCM(6mL)中的溶液并溶解析出物。将反应混合物搅拌过夜。18h后，加入1M NaOH(30mL)并搅拌该混合物。然后将两层分开并干燥有机层(Na2SO4)，用MeOH(15mL)稀释并吸收在硅胶上。先后使用己烷:DCM 100:0至50:50至0:100和DCM:EtOAc 99:1至92:8洗脱产物。然后再在先后使用己烷:DCM 100:0至50:50至0:100和DCM:EtOAc 98:2至95:5的硅胶色谱上纯化该物质。由此得到62b和2-(吡啶-2-基二硫基)丙-1-醇的混合物(385mg)。将该混合物用于下一步骤。在0℃将TBDMSCl(81mg,0.535mmol)在DMF(1mL)中的溶液加至62b和2-(吡啶-2-基二硫基)丙-1-醇及咪唑(36mg,0.535mmol)在DMF(2mL)中的搅拌的混合物中。将混合物温热至室温，搅拌50min，然后用EtOAc和H2O稀释。将混合物充分搅拌，将两层分开并用H2O(3×)洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并真空除去溶剂。通过先后使用己烷:DCM 50:50至0:100和DCM:EtOAc 95:5的硅胶柱色谱纯化，得到(1S)-1-(氯甲基)-5-((2-(吡啶-2-基二硫基)丙氧基)羰基氨基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯62b(295mg,由化合物61a历经两步70％)，其为淡黄色泡沫状固体。1H NMRδ(400MHz,CDCl3)8.49(br s,1H),8.46(ddd,J＝4.8,1.7,0.8Hz,1H),7.86(d,J＝8.4Hz,1H),7.75-7.73(m,2H),7.64-7.60(m,1H),7.54(ddd,J＝8.1,6.9,1.0Hz,1H),7.42(ddd,J＝8.2,6.8,1.1Hz,1H),7.08(ddd,J＝7.4,4.9,0.8Hz,1H),6.97(brs,1H),4.37-4.28(m,3H),4.17-4.11(m,1H),4.05-3.99(m,1H),3.92(dd,J＝11.1,2.5Hz,1H),3.47(t,J＝10.7Hz,1H),3.38-3.30(m,1H),1.62(s,9H),1.41(d,J＝6.9Hz,3H)。HRMSm/z582.1265[(M+Na)+C27H30ClN3NaO4S2计算值582.1258]。
在0℃将TFA(7mL)慢慢加至62b(285mg,509mmol)在DCM(14mL)中的溶液并将混合物在该温度搅拌1h。然后用DCM和H2O稀释反应混合物并用饱和NaHCO3水溶液中和直至pH 7。将两层分开并用H2O(1×)洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并真空除去溶剂，得到(S)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基氨基甲酸2-(吡啶-2-基二硫基)丙基酯62c(220mg,94％)，其为黄色固体且未经纯化即用于下一步骤。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)9.52(s,1H),8.45(ddd,J＝4.8,1.7,0.8Hz,1H),7.88(d,J＝8.5Hz,1H),7.85-7.83(m,1H),7.79-7.75(m,1H),7.64(d,J＝8.2Hz,1H),7.39(ddd,J＝8.1,6.8,1.0Hz,1H),7.23(ddd,J＝7.3,4.8,1.0Hz,1H),7.15(ddd,J＝8.1,6.8,1.0Hz,1H),7.08(s,1H),5.93(br s,1H),4.24-4.13(m,2H),4.02-3.96(m,1H),3.85(dd,J＝10.8,3.5Hz,1H),3.70(t,J＝9.3Hz,1H),3.63-3.55(m,2H),3.43-3.36(m,1H),1.34(d,J＝6.9Hz,3H)。
在室温将(S)-5-(1-(氯甲基)-5-(二叔丁氧基磷酰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酸57d(365mg,0.676mmol)在DMA(10mL)中的溶液加至62c(215mg,0.467mmol)和EDCI.HCl(268mg,1.40mmol)的混合物中。加入TsOH(16mg,0.0929mmol)并将混合物在氮气下搅拌过夜(且经分子筛)。27.5h后，用EtOAc和H2O稀释混合物，充分振荡并将两层分开。用饱和NaHCO3水溶液(3×)、盐水(1×)洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并真空除去溶剂。将所得残余物溶于DCM中并用己烷稀释直至固体从溶液中析出。真空除去溶剂并用己烷:EtOAc 95:5研磨固体，得到(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-(二叔丁氧基磷酰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基氨基甲酸2-(吡啶-2-基二硫基)丙基酯62d(372mg)，其为黄褐色固体且未经进一步纯化即用于下一步骤。HRMS m/z1003.2445[(M+Na)+C48H55Cl2N4NaO8PS2计算值1003.2468]。
在0℃将TFA(3.5mL)慢慢加至62d(如上制备)在DCM(7mL)中的搅拌的溶液中。将混合物在该温度搅拌1h。然后在25℃真空除去溶剂。将所得暗绿色残余物溶于DCM中并用EtOAc稀释溶液，使得固体从溶液中析出。在30℃真空除去溶剂并将残余物再次溶于DCM中并用EtOAc稀释。真空除去DCM，得到在EtOAc中的悬浮液。经由过滤收集固体，然后用EtOAc和己烷洗涤固体并干燥，得到绿色固体。通过制备型HPLC(柱：Synergi-MAX RP 4μ,21.20×250mm；流速：12mL/min；流动相：溶剂A:H2O/甲酸铵缓冲液pH 3.5,溶剂B:MeCN/H2O 90:10；方法：梯度,溶剂A:溶剂B 25:75至0:100,历时19min)纯化该固体，得到(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦酰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基氨基甲酸2-(吡啶-2-基二硫基)丙基酯62(78mg,由62c历经两步19％,HPLC纯度:87.4％)，其为霜状粉末。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)9.69(s,1H),8.56(s,1H),8.48(s,1H),8.44(d,J＝4.5Hz,1H),8.15(d,J＝8.3Hz,1H),8.00(d,J＝8.5Hz,1H),7.90(d,J＝8.4Hz,1H),7.85-7.76(m,3H),7.55-7.48(m,2H),7.44-7.40(m,1H),7.36-7.32(m,1H),7.24-7.21(m,1H),4.41-4.14(m,8H),4.05-3.99(m,2H),3.91(dd,J＝10.8,7.2Hz,1H),3.85-3.81(m,1H),3.37-3.28(m,1H),2.74-2.57(m,4H),1.98-1.95(m,2H),1.34(d,J＝6.7Hz,3H),2个质子未观察到。31P NMRδ(400MHz,DMSO-d6)-5.09。HRMS m/z 891.1221[(M+Na)+C40H39Cl2N4NaO8PS2计算值891.1216]。
实施例13 2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰氨基)乙基(甲基)氨基甲酸(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯63
对2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己酰氨基)乙基(甲基)氨基甲酸(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦酰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯57进行酶脱磷酸化，得到63。
实施例14 (S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基氨基甲酸2-(吡啶-2-基二硫基)乙基酯64
对(S)-1-(氯甲基)-3-(5-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦酰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-5-氧代戊酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基氨基甲酸2-(吡啶-2-基二硫基)乙基酯61进行酶脱磷酸化，得到64。
实施例15 (11aS)-8-(6-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-甲基哌嗪-1-羰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-6-氧代己基氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-甲酸4-((S)-6-氨基-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)己酰氨基)苄基酯65
在室温向(S)-6-(5-(叔丁氧基羰基氨基)-4-(2-(羟基甲基)吡咯烷-1-羰基)-2-甲氧基苯氧基)己酸2,2,2-三氯乙基酯54c(1.66g,2.71mmol)在无水DCM(10mL)的搅拌的溶液中加入乙酸酐(1.29mL,13.6mmol)和三乙胺(2.27mL,16.3mmol)。参见图17。将反应混合物再搅拌4h。加入无水MeOH(1.5mL)并将混合物搅拌30min。加入乙酸乙酯(200mL)并分出乙酸乙酯层，然后用水洗涤若干次。干燥(MgSO4)乙酸乙酯溶液并蒸发，得到(S)-6-(4-(2-(乙酰氧基甲基)吡咯烷-1-羰基)-5-(叔丁氧基羰基氨基)-2-甲氧基苯氧基)己酸2,2,2-三氯乙基酯65a(1.8g,100％)，其为淡黄色胶状物；1H NMR[(CD3)2SO]δ8.82(br s,1H),7.27(s,1H),6.86(s,1H),4.89(s,2H),4.39-4.20(m,3H),3.93(t,J＝6.4Hz,2H),3.74(s,3H),3.50-3.33(m,2H),2.10-1.94(m,4H),1.92-1.61(m,7H),1.53-1.42(m,2H),1.43(s,9H),2H被DMSO峰遮盖。HRMS(ESI)m/z C28H39Cl3N2NaO9计算值：675.1613，实测值：675.1603[MNa+]。C28H40Cl3N2O9计算值：653.1794，实测值：653.1778[MH+]。
在氮气下向65a(1.76g,2.69mmol)在丙酮(30mL)、水(20mL)和THF(12mL)的混合物中的搅拌的溶液中加入Zn(7.06g,108mmol)和NH4Cl(11.6g,216mmol)。将混合物在室温搅拌23h。加入乙酸乙酯(100mL)并将混合物搅拌15min。倾出有机层。用更多乙酸乙酯(2×100mL)重复萃取。用水(2×100mL)洗涤合并的有机溶液，干燥(MgSO4)，经硅藻土过滤并蒸发，得到(S)-6-(4-(2-(乙酰氧基甲基)吡咯烷-1-羰基)-5-(叔丁氧基羰基氨基)-2-甲氧基苯氧基)己酸65b(1.36g,96％)，其为粘性无色泡沫状物；1H NMR[(CD3)2SO]δ11.49(非常宽的单峰,1H),8.83(s,1H),7.27(s,1H),6.86(br s,1H),4.39-4.02(m,3H),3.93(t,J＝6.4Hz,2H),3.74(s,3H),3.51-3.33(m,2H,被水峰部分遮盖),2.21(t,J＝7.1Hz,2H),2.11-1.93(m,4H),1.90-1.66(m,5H),1.62-1.50(m,2H),1.50-1.35(m,2H),1.43(s,9H)。(C26H38N2O9.)分析计算值：C,59.76；H,7.33；N,5.36。实测值：C,59.66；H,7.49；N,5.29。
在0℃在氮气气氛下向65b(0.87g,2.41mmol)和4-甲基哌嗪-1-甲酸(S)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯58b(1.26g,2.41mmol)在无水DMA(5mL)中的搅拌的溶液中先后加入4M HCl/对二噁烷(1.21mL,4.82mmol)和EDCI.HCl(1.39g,7.23mmol)及无水TsOH(83mg,0.48mmol)。将反应混合物在0℃在氮气下搅拌21小时，然后在乙酸乙酯(500mL)与水(500mL)之间分配。分出乙酸乙酯层并用更多乙酸乙酯(200mL)进一步萃取水层。相继用水(200mL)、饱和NaHCO3溶液(2×200mL)和水(200mL)洗涤合并的乙酸乙酯萃取物。干燥乙酸乙酯层并蒸发，得到4-甲基哌嗪-1-甲酸(S)-3-(6-(4-((S)-2-(乙酰氧基甲基)吡咯烷-1-羰基)-5-(叔丁氧基羰基氨基)-2-甲氧基苯氧基)己酰基)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯65c(1.66g,80％)，其为米色固体泡沫状物；mp 84-87℃；1HNMR[(CD3)2SO]δ8.84(br s,1H),8.21(s,1H),7.95(d,J＝8.3Hz,1H),7.81(d,J＝8.3Hz,1H),7.58(br t,J＝7.7,1H),7.46(br t,J＝8.1Hz,1H),7.29(s,1H),6.86(s,1H),4.40(t,J＝10.0Hz,1H),4.36-3.86(m,10H),3.83-3.74(m,1H),3.73(s,3H),3.54-3.36(m,4H),2.67-2.34(m,6H,被DMSO峰部分遮盖),2.26(s,3H),2.02(br s,3H),1.93-1.62(m,8H),1.60-1.47(m,2H),1.42(s,9H)。(C45H58ClN5O10·1 1/2H2O)分析计算值：C,60.63；H,6.90；N,7.86。实测值：C,60.39；H,6.66；N,8.08。
在0℃在氮气气氛下向65c(2.17g,2.51mmol)在DCM(20mL)中的搅拌的溶液中加入TFA(20mL)。加入后，将混合物在该温度再搅拌2.5h。将混合物倾入冷的(0℃)NaHCO3(50g)、水(700mL)和DCM(500mL)的混合物中并搅拌15min(pH约8)。分出DCM层并用更多NaHCO3水溶液(200mL)和水(200mL)洗涤，然后干燥(MgSO4)。蒸发溶剂，得到4-甲基哌嗪-1-甲酸(S)-3-(6-(4-((S)-2-(乙酰氧基甲基)吡咯烷-1-羰基)-5-氨基-2-甲氧基苯氧基)己酰基)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯65d，其为淡棕色固体泡沫状物(1.76g,92％)；mp62℃；1H NMR[(CD3)2SO]δ8.21(s,1H),7.95(d,J＝8.3Hz,1H),7.81(d,J＝8.3Hz,1H),7.57(br t,J＝7.6Hz,1H),7.46(br t,J＝7.2Hz,1H),6.67(s,1H),6.37(s,1H),5.09(s,2H),4.41(t,J＝9.7Hz,1H),4.36-4.20(m,3H),4.17-4.00(m,3H),3.97-3.86(m,3H),3.81-3.70(m,2H),3.63(s,3H),3.54-3.32(m,5H),2.66-2.34(m,6H,被DMSO峰部分遮盖),2.26(s,3H),2.08-1.96(m,1H),2.10(s,3H),1.93-1.63(m,7H),1.57-1.45(m,2H)。(C40H50ClN5O8·1/2H2O)分析计算值：C,62.13；H,6.65；N,9.06。实测值：C,62.12；H,6.76；N,8.77。
将(S)-2-(烯丙基氧基羰基氨基)-6-(叔丁氧基羰基氨基)己酸65e(3.30g,10.0mmol)和EEDQ(3.71g,15.0mmol)在无水DMA(10mL)中的混合物在室温在氮气下搅拌15min。参见图18。向该预形成的混合物中加入4-((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)苯胺(由相应的对硝基苄醇和TBDMSCl在DMF中制备；接着使用Zn/NH4Cl还原)(2.37g,10.0mmol)在无水DMA(3mL)中的溶液。将最终的反应混合物在室温在氮气气氛下再搅拌23h。将混合物在乙酸乙酯(500mL)与水(500mL)之间分配。分出乙酸乙酯层并相继用饱和NaHCO3(2×300mL)和水(300mL)洗涤，然后干燥(MgSO4)。蒸发溶剂，得到橙色油状物，通过硅胶柱色谱(10-35％石油醚-乙酸乙酯梯度)将其纯化，得到经TBDMS保护的赖氨酸65f(4.87g,89％)，其为粘性米色固体泡沫状物；1H NMR[(CD3)2SO]δ9.97(s,1H),7.55(d,J＝8.50Hz,2H),7.44(d,J＝7.8Hz,1H),7.21(d,J＝8.5Hz,2H),6.75(t,J＝5.3Hz,1H),5.99-5.82(m,1H),5.28(br d,J＝17.2Hz,1H),5.17(br d,J＝10.5Hz,1H),4.64(s,2H),4.46(d,J＝5.2Hz,2H),4.12-4.02(m,1H),2.93-2.83(m,2H),1.70-1.52(m,2H),1.46-1.20(m,4H),1.35(s,9H),0.89(s,9H),0.06(s,6H)。HRMS(ESI)m/z C28H47N3NaO6Si计算值：572.3126，实测值：572.3136[MNa+]。
在室温向65f(4.81g,8.75mmol)在THF(30mL)中的搅拌的溶液中加入1M四丁基氟化铵在THF中的溶液(17.5mL,17.5mmol)。加入后，将混合物在该温度再搅拌2.5h。加入NH4Cl水溶液(300mL)并将产物萃取至乙酸乙酯(500mL)中。用水(2×100mL)洗涤乙酸乙酯并干燥(MgSO4)。蒸发溶剂，得到苄醇赖氨酸65g(3.81g,100％)，其为米色固体；mp 101-103℃；1H NMR[(CD3)2SO]δ9.94(s,1H),7.52(d,J＝8.4Hz,2H),7.44(d,J＝7.8Hz,1H),7.23(d,J＝8.4Hz,2H),6.76(t,J＝5.4Hz,1H),5.97-5.84(m,1H),5.29(br d,J＝17.2Hz,1H),5.17(br d,J＝10.4Hz,1H),5.08(t,J＝5.7Hz,1H),4.47(d,J＝5.3Hz,2H),4.43(d,J＝5.7Hz,2H),4.13-4.03(m,1H),2.96-2.82(m,2H),1.72-1.52(m,2H),1.46-1.20(m,4H),1.36(s,9H)。HRMS(ESI)m/z C22H33N3NaO6计算值：458.2262，实测值：458.2272[MNa+]；C22H33N3KO6计算值：474.2001，实测值：474.1998[MK+]。
在室温在氮气下向65d(764mg,1.00mmol)和DMAP(367mg,3.00mmol)在无水DCM(15mL)中的搅拌的溶液中加入双光气在无水DCM中的溶液(0.05mmol/mL,12mL,0.60mmol)并将混合物再搅拌20min。参见图19。向该混合物中加入65g(3.97g,9.13mmol)在无水DCM(80mL)中的溶液。将最终反应混合物在室温在氮气气氛下再搅拌48h。将混合物在乙酸乙酯(500mL)与水(300mL)之间分配。分出乙酸乙酯层并用乙酸乙酯(2×200mL)进一步萃取水层。用更多水(2×200mL)洗涤合并的乙酸乙酯溶液并干燥(MgSO4)。在30℃(浴温度)蒸发溶剂，得到橙色油状物，通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯-MeOH＝10:1)将其纯化，得到4-甲基哌嗪-1-甲酸(S)-3-(6-(4-((S)-2-(乙酰氧基甲基)吡咯烷-1-羰基)-5-((4-((S)-2-(烯丙基氧基羰基氨基)-6-(叔丁氧基羰基氨基)己酰氨基)苄基氧基)羰基氨基)-2-甲氧基苯氧基)己酰基)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯65h(1.04g,85％)，其为淡橙色固体；mp 90-93℃；1H NMR[(CD3)2SO]δ10.04(s,1H),9.10(br s,1H),8.21(s,1H),7.95(d,J＝8.3Hz,1H),7.81(d,J＝8.3Hz,1H),7.63-7.53(m,3H),7.51-7.42(m,2H),7.32(d,J＝8.5Hz,2H),7.21(br s,1H),6.85(br s,1H),6.79-6.72(m,1H),5.97-5.83(m,1H),5.29(brd,J＝17.2Hz,1H),5.17(br d,J＝10.4Hz,1H),5.08-4.96(m,2H),4.52-4.37(m,3H),4.37-3.85(m,10H),3.83-3.66(m,2H),3.74(s,3H),3.54-3.41(m,2H),3.41-3.23(m,2H,被水峰部分遮盖),2.95-2.83(m,2H),2.66-2.34(m,6H,被DMSO峰部分遮盖),2.25(s,3H),2.07-1.92(m,4H),1.87-1.45(m,11H),1.45-1.20(m,4H),1.35(s,9H)。HRMS(ESI)m/zC63H82ClN8O15计算值：1225.5583，实测值：1225.5557[MH+]；C63H81ClN8NaO15计算值：1247.5402，实测值：1247.5401[MNa+]；C63H81ClKN8O15计算值：1263.5142，实测值：1263.5141[MK+]。
将65h(1.01g,0.824mmol)和K2CO3(1.14g,8.24mmol)在DCM(20mL)和MeOH(10mL)中的混合物在室温搅拌1小时又40min。用DCM(200mL)稀释混合物并与冰-水(200mL)搅拌10min。分出DCM层并用DCM(2×100mL)进一步萃取水层。用更多水(200mL)洗涤合并的DCM溶液并干燥(MgSO4)。在25℃(浴温度)蒸发溶剂，得到4-甲基哌嗪-1-甲酸(S)-3-(6-(5-((4-((S)-2-(烯丙基氧基羰基氨基)-6-(叔丁氧基羰基氨基)己酰氨基)苄基氧基)羰基氨基)-4-((S)-2-(羟基甲基)吡咯烷-1-羰基)-2-甲氧基苯氧基)己酰基)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯65i(0.94g,96％)，其为米色固体；mp104-107℃；1H NMR[(CD3)2SO]δ10.04(s,1H),9.17(br s,1H),8.21(s,1H),7.95(d,J＝8.4Hz,1H),7.80(d,J＝8.3Hz,1H),7.63-7.53(m,3H),7.51-7.42(m,2H),7.38-7.21(m,3H),6.93(s,1H),5.32(t,J＝5.4Hz,1H),5.98-5.83(m,1H),5.30(br d,J＝17.2Hz,1H),5.17(br d,J＝11.7Hz,1H),5.03(s,2H),4.73(t,J＝5.7Hz,1H),4.52-4.36(m,3H),4.36-4.17(m,2H),4.17-3.85(m,6H),3.83-3.66(m,2H),3.73(s,3H),3.61-3.40(m,4H),3.40-3.20(m,2H,被水峰部分遮盖),2.94-2.83(m,2H),2.67-2.34(m,6H,被DMSO峰部分遮盖),2.25(s,3H),1.96-1.45(m,12H),1.45-1.20(m,4H),1.35(s,9H)。HRMS(ESI)m/z C61H80ClN8O14计算值：1183.5477，实测值：1183.5445[MH+]；C61H79ClN8NaO14计算值：1205.5296，实测值：1205.5256[MNa+]；C61H79ClKN8O14计算值：1221.5036，实测值：1221.5026[MK+]。
在0℃向65i(0.92g,0.78mmol)在无水DCM(20mL)中的搅拌的溶液中按份加入戴斯-马丁高碘剂(DMP,1,1,1-三乙酰氧基-1,1-二氢-1,2-苯碘酰-3(1H)-酮,CAS登记号87413-09-0,492mg,1.16mmol)(历时8min)。加入完成后，将反应混合物在0℃再搅拌2h，然后在室温搅拌45h。用DCM(100mL)稀释混合物并与10％Na2S2O3(100mL)在室温搅拌10min。将所得混合物在DCM(400mL)与饱和NaHCO3溶液(400mL)之间分配。分出DCM层并用DCM(2×100mL)进一步萃取水层。用饱和NaHCO3溶液(200mL)和水(200mL)进一步洗涤合并的DCM溶液，然后干燥(MgSO4)。在25℃(浴温度)蒸发溶剂，得到淡棕色固体，通过SiO2柱色谱(DCM-乙酸乙酯-MeOH＝15:15:1,梯度至15:15:3)纯化，得到(S)-8-(6-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-甲基哌嗪-1-羰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-6-氧代己基氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-甲酸4-((S)-2-(烯丙基氧基羰基氨基)-6-(叔丁氧基羰基氨基)己酰氨基)苄基酯65j(0.64g,70％)，其为淡黄色固体；mp 137℃(dec.)；1H NMR[(CD3)2SO]δ10.02(s,1H),8.21(s,1H),7.95(d,J＝8.4Hz,1H),7.80(d,J＝8.3Hz,1H),7.65-7.38(m,5H),7.18(d,J＝7.0Hz,2H),7.03(s,1H),6.82-6.63(m,2H),6.49(分辨率差的d,J＝4.7Hz,可与D2O交换,1H),5.96-5.82(m,1H),5.46(分辨率差的dd,J＝9.8,4.7Hz,D2O后变成d,J＝10.1Hz,1H),5.27(br d,J＝17.1Hz,1H),5.21-5.10(m,2H),4.81(br d,J＝12.3Hz,1H),4.51-4.17(m,5H),4.13-3.84(m,4H),3.84-3.67(m,2H),3.77(s,3H),3.55-3.20(m,6H,被水峰部分遮盖),2.66-2.30(m,6H,被DMSO峰部分遮盖),2.26(s,3H),2.10-1.20(m,16H),1.35(s,9H)。HRMS(ESI)m/z C61H78ClN8O14计算值：1181.5321，实测值：1181.5286[MH+]；C61H77ClN8NaO14计算值：1203.5140，实测值：1203.5130[MNa+]；C61H77ClKN8O14计算值：1219.4879，实测值：1219.4861[MK+]。
在0℃在氮气气氛下向65j(623mg,0.53mmol)在无水DCM(15mL)中的搅拌的溶液中先后加入吡咯烷(0.86mL,10.5mmol)和Pd(Ph3P)4(30mg,9.8％Pd)。加入后，将反应混合物在室温再搅拌5h。用石油醚(100mL)稀释混合物并在室温搅拌30min。从不溶性物质中倾出溶剂并用DCM-石油醚(1:10)(100mL)重复洗涤步骤。将留下的粘性固体溶于DCM(200mL)中并用水(3×100mL)洗涤，然后干燥(MgSO4)并经过短的SiO2柱以除去基线物质。使用DCM-MeOH梯度(2％至5％)洗脱所需要的化合物。在25℃(浴温度)蒸发溶剂，得到淡黄色固体泡沫状物(472mg,82％)，将其直接用于下一步骤。在室温在氮气气氛下用Fmoc-val-Osu(N-α-Fmoc-L-缬氨酸N-羟基琥珀酰亚胺酯,550mg,1.26mmol)在无水DMA(8mL)中的溶液处理该粗胺并将混合物搅拌5h。加入乙酸乙酯-石油醚(1:10,100mL)并将混合物在室温搅拌20min。从不溶性物质中倾出溶剂并用更多乙酸乙酯-石油醚(1:10,2×50mL)重复洗涤步骤。干燥留下的粘性固体并通过SiO2柱色谱(DCM-乙酸乙酯-MeOH＝20:10:3)纯化，得到(S)-8-(6-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-甲基哌嗪-1-羰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-6-氧代己基氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-6-(叔丁氧基羰基氨基)己酰氨基)苄基酯65k(246mg,47％)，其为无色固体；mp 143℃(dec.)；1H NMR[(CD3)2SO]δ10.03(s,可与D2O交换,1H),8.21(s,1H),8.05(br d,J＝7.5Hz,可与D2O交换,1H),7.95(d,J＝8.5Hz,1H),7.87(d,J＝7.4Hz,2H),7.81(d,J＝8.3Hz,1H),7.72(t,J＝7.0Hz,2H),7.62-7.25(m,10H,D2O后减少为9H),7.18(分辨率差的d,J＝5.8Hz,2H),7.04(s,1H),6.70(br s,2H,D2O后减少为1H),6.50(br s,可与D2O交换,1H),5.53-5.40(m,D2O后变成d,J＝9.9Hz,1H),5.15(br d,J＝12.4Hz,1H),4.82(br d,J＝12.3Hz,1H),4.46-4.16(m,7H),4.07-3.85(m,4H),3.83-3.67(m,2H),3.76(s,3H),3.56-3.23(m,5H,被水峰部分遮盖),2.93-2.79(m,2H),2.64-2.32(m,6H,被DMSO峰部分遮盖),2.25(s,3H),2.09-1.20(m,17H),1.35(s,9H),0.87(d,J＝7.0Hz,3H),0.83(d,J＝6.8Hz,3H)。HRMS(ESI)m/zC77H93ClN9O15计算值：1418.6474，实测值：1418.6420[MH+]；C77H92ClN9NaO15计算值：1440.6294，实测值：1440.6231[MNa+]；C77H92ClKN9O15计算值：1456.6033，实测值：1456.6021[MK+]。
在0℃在氮气气氛下向65k(224mg,0.158mmol)在无水DMA(2mL)中的搅拌的溶液中加入哌啶在N,N-二甲基乙酰胺中的溶液(DMA,1.0mmol/mL,1.58mL,1.58mmol)。参见图20。加入后，将混合物在该温度再搅拌1h又45min。加入乙酸乙酯-石油醚的混合物(1:5,50mL)并将混合物在0℃搅拌20min。从不溶性物质中倾出溶剂层并弃去。在室温用更多乙酸乙酯-石油醚(1:5,2×30mL)重复洗涤步骤。干燥留下的淡黄色固体，得到(S)-8-(6-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-甲基哌嗪-1-羰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-6-氧代己基氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-甲酸4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)-6-(叔丁氧基羰基氨基)己酰氨基)苄基酯65l(173mg,99％)；mp 74℃(dec.)；1H NMR[(CD3)2SO]δ10.09(s,可与D2O交换,1H),8.21(s,1H),8.08(br s,可与D2O交换,1H),7.96(d,J＝8.4Hz,1H),7.81(d,J＝8.2Hz,1H),7.66-7.42(m,4H),7.19(分辨率差的d,J＝7.5Hz,2H),7.04(s,1H),6.71(br s,2H,D2O后减少为1H),6.49(br s,可与D2O交换,1H),5.52-5.40(m,D2O后变成d,J＝10.6Hz,1H),5.16(brd,J＝12.1Hz,1H),4.81(br d,J＝11.7Hz,1H),4.49-4.18(m,4H),4.10-3.85(m,3H),3.85-3.67(m,2H),3.77(s,3H),3.59-3.22(m,5H,被水峰部分遮盖),3.03-2.97(m,D2O后变成d,J＝4.8Hz,1H),2.91-2.81(m,2H),2.71-2.33(m,7H,被DMSO峰部分遮盖),2.25(s,3H),2.11-1.20(m,17H),1.34(s,9H),0.86(d,J＝6.5Hz,3H),0.76(d,J＝6.7Hz,3H),2H未观察到。HRMS(ESI)m/z C62H83ClN9O13计算值：1196.5793，实测值：1196.5804[MH+]；C62H82ClN9NaO13计算值：1218.5613，实测值：1218.5612[MNa+]；C62H82ClKN9O13计算值：1234.5352，实测值：1234.5359[MK+]。
将65l(173mg,0.158mmol)和6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(马来酰亚氨基-Osu,122mg,0.395mmol)在无水DMA(2mL)中的混合物在0℃在氮气气氛下搅拌1h 45min。加入乙酸乙酯-石油醚的混合物(1:5,50mL)并将所得混合物在0℃搅拌15min。从不溶性物质中倾出溶剂层并弃去。在室温用更多乙酸乙酯-石油醚(1:5,2×30mL)重复洗涤步骤。干燥留下的固体并通过硅胶柱色谱(DCM:乙酸乙酯:MeOH＝20:10:3)纯化，得到(S)-8-(6-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-甲基哌嗪-1-羰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-6-氧代己基氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-甲酸4-((S)-6-(叔丁氧基羰基氨基)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)己酰氨基)苄基酯65m(152mg,69％)，其为淡黄色固体；HPLC:90.6％纯；mp 120℃；1H NMR[(CD3)2SO]δ9.95(s,可与D2O交换,1H),8.21(s,1H),8.01(d,J＝7.4Hz,可与D2O交换,1H),7.95(d,J＝8.4Hz,1H),7.85-7.73(m,2H,D2O交换后减少为1H),7.63-7.50(m,3H),7.46(t,J＝7.7Hz,1H),7.17(分辨率差的d,J＝8.4Hz,2H),7.04(s,1H),6.98(s,2H),6.81-6.66(m,2H,D2O交换后减少为1H),6.49(分辨率差的d,J＝5.3Hz,可与D2O交换,1H),5.51-5.41(m,D2O后变成d,J＝9.9Hz,1H),5.15(d,J＝12.6Hz,1H),4.81(br d,J＝11.3Hz,1H),4.41(t,J＝9.7Hz,1H),4.37-4.27(m,2H),4.27-4.13(m,2H),4.10-3.85(m,3H),3.85-3.63(m,2H),3.77(s,3H),3.60-3.21(m,8H,被水峰部分遮盖,1H),2.92-2.81(m,2H),2.67-2.33(m,6H,被DMSO峰部分遮盖),2.26(s,3H),2.23-1.11(m,25H),1.30(s,9H),0.84(d,J＝6.8Hz,3H),0.81(d,J＝6.7Hz,3H)。HRMS(ESI)m/z C72H94ClN10O16计算值：1389.6532，实测值：1389.6478[MH+]；C72H94ClN10NaO16计算值：706.3212，实测值：706.3244[MH+Na+]；C72H93ClN10Na2O16计算值：717.3122，实测值：717.3121[MNa+Na+]。
在0℃(浴温度)在氮气下向65m(32.2mg,0.023mmol)在DCM(0.4mL)中的搅拌的溶液中先后加入TFA(0.8mL)和2％水在TFA(0.8mL)中的溶液。加入后，将混合物在该温度再搅拌8h。加入乙酸乙酯-石油醚(1:5,25mL)并将混合物在0℃搅拌15min。收集析出的固体，用乙酸乙酯-石油醚(1:5,2×30ml)洗涤并干燥，得到粗产物(30mg)，通过制备型HPLC[SynergiMaxRP柱；水-TFA(pH＝2.56；95％至55％)/10％H2O于CH3CN中(5％至45％)；流速：12mL/min]将其纯化，得到(S)-8-(6-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-甲基哌嗪-1-羰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-6-氧代己基氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-甲酸4-((S)-6-氨基-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)己酰氨基)苄基酯65，其为二三氟乙酸盐(22.2mg,64％)，其为玻璃状固体；HPLC:97.1％纯；mp 114℃；[α]D+43.6°(c 0.275,MeOH)；1H NMR[(CD3)2SO]δ9.97(s,1H),9.90(br s,1H),8.73(br s,2H),8.27(s,1H),8.09(d,J＝7.6Hz,1H),8.04-7.93(m,2H),7.89(d,J＝8.4Hz,1H),7.82(d,J＝7.9Hz,1H),7.74-7.50(m,5H),7.46(br t,J＝7.6Hz,1H),7.22(m,2H),7.04(s,1H),7.00(s,2H),6.75(s,1H),6.51(br s,1H),5.52-5.40(m,1H),5.18-5.04(m,1H),4.94-4.82(m,1H),4.48-3.70(m,14H),3.43-3.20(m,4H,被水峰部分遮盖),3.17-3.05(m,3H),2.89(s,3H),2.82-2.70(m,2H),2.66-2.48(m,2H,被DMSO峰部分遮盖),2.25-1.08(m,25H),0.91-0.77(m,6H),2H未观察到。HRMS(ESI)m/z C67H86ClN10O14计算值：1289.6008，实测值：1289.5975[MH+]；C67H85ClN10NaO14计算值：1311.5827，实测值：1311.5772[MNa+]；C67H85ClN10Na2O14计算值：667.2860，实测值：667.2874[MNa+Na+]；C67H86ClN10NaO14计算值：656.2950，实测值：656.2963[MH+Na+]；C67H87ClN10O14计算值：645.3040，实测值：645.3052[MH+H+]。
实施例16 N-(3-(2,5-二((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-膦酰基氧基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-3-氧代丙-1-烯基)苯基氨基)-3-氧代丙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺66
向在冰浴中冷却的(S)-5-(苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯57a(在实施例7中由51a制备)(1.595g,3.76mmol)在DCM(15mL)中的溶液中加入4NHCl/二噁烷(40mL)。参见图21。将混合物温热至室温并搅拌2h。泵除全部挥发性组分。将所得残余物在乙酸乙酯与冷的5％氨水之间再次分配。用乙酸乙酯萃取水相三次。先后用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，以无水Na2SO4干燥并经硅藻土过滤。除去溶剂，得到(S)-5-(苄基氧基)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚57b，其为棕色胶状物且直接使用；1H NMR(DMSO)δ8.04(d,J＝8.2Hz,1H),7.61(d,J＝8.3Hz,1H),7.53(d,J＝7.2Hz,2H),7.45-7.34(m,4H),7.14(t,J＝7.3Hz,1H),6.60(s,1H),5.24(s,2H),3.96-3.92(m,1H),3.84(dd,J＝3.4,10.7Hz,1H),3.70(t,J＝9.3Hz,1H),3.60(dd,J＝2.4,10.0Hz,1H),3.55(t,J＝10.3Hz,1H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z324.1150(M+H)。C20H19ClNO需要324.1150。
在冰浴中冷却中间体57b并先后加入吡啶(15mL)和三氟乙酸酐(3.14mL,22.57mmol)。将所得混合物搅拌10min并加入冰。将混合物在乙酸乙酯与水之间再次分配。用乙酸乙酯萃取水相三次。先后用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，以无水Na2SO4干燥并经硅藻土过滤。除去溶剂并通过使用乙酸乙酯和石油醚的混合物(v/v 1:10)作为洗脱剂的柱色谱纯化所得残余物，得到(S)-1-(5-(苄基氧基)-1-(氯甲基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-2,2,2-三氟乙酮66a，其为白色固体(1.11g,70％)；mp 167-170℃。1H NMR(CDCl3)δ8.37(d,J＝8.3Hz,1H),8.05(s,1H),7.72(d,J＝8.2Hz,1H),7.61-7.54(m,3H),7.49-7.42(m,3H),7.39-7.35(m,1H),5.30(AB q,J＝11.7,15.7Hz,2H),4.63-4.59(m,1H),4.43-4.38(m,1H),4.15-4.09(m,1H),3.97-3.93(m,1H),3.49(dd,J＝9.9,11.3Hz,1H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 442.0799(M+Na)。C22H17ClF3NNaO2需要442.0795。
在-10℃向66a(1.10g,2.62mmol)在THF(20mL)中的溶液中先后加入25％甲酸铵水溶液(20mL)和Pd-C催化剂(10％,湿的,550mg)并将混合物搅拌2h，然后再加入Pd-C催化剂(550mg)。将所得混合物在-10℃搅拌过夜并经硅藻土滤出催化剂。从滤液中除去THF并将残余物在乙酸乙酯与水之间再次分配。用乙酸乙酯萃取水相三次。先后用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，以无水Na2SO4干燥并经硅藻土过滤。除去溶剂并通过使用乙酸乙酯和石油醚的混合物(v/v 1:5)作为洗脱剂的柱色谱纯化所得残余物，得到(S)-1-(1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-2,2,2-三氟乙酮66b，其为灰白色固体(758mg,88％)；mp209-212℃。1H NMR(CDCl3)δ8.33(d,J＝8.2Hz,1H),8.10(s,1H),7.85(s,1H),7.64(d,J＝8.2Hz,1H),7.60-7.56(m,1H),7.51-7.47(m,1H),4.60-4.56(m,1H),4.41-4.36(m,1H),4.00-3.95(m,1H),3.93-3.90(m,1H),3.44(dd,J＝9.8,11.3Hz,1H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 352.0331(M+Na)。C15H11ClF3NNaO2需要352.0323。
向66b(250mg,0.76mmol)在THF(15mL)中的溶液中先后加入四唑(3％于乙腈中,13.5mL,4.55mmol)和二叔丁基-N,N-二异丙基亚磷酰胺(1.51mL,4.55mmol)。将混合物在室温搅拌过夜，然后在冰浴中冷却并滴加H2O2(30％水溶液,0.78mL,7.58mmol)。将所得混合物温热至室温并搅拌5h。通过加入10％亚硫酸钠水溶液伴随在冰浴中冷却淬灭反应混合物。通过旋转蒸发仪除去有机挥发物。将所得混合物在乙酸乙酯与水之间再次分配。用乙酸乙酯萃取水相三次。先后用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，以无水Na2SO4干燥并经硅藻土过滤。除去溶剂并通过使用乙酸乙酯与石油醚的梯度混合物(v/v1:6至1:3)作为洗脱剂的(USSilica)柱色谱纯化所得残余物，得到磷酸二叔丁酯·(S)-1-(氯甲基)-3-(2,2,2-三氟乙酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯66c，其为无色油状物(367mg,93％)；1H NMR(DMSO)δ8.44(d,J＝1.0Hz,1H),8.11(d,J＝8.1Hz,1H),8.06(d,J＝8.2Hz,1H),7.69-7.65(m,1H),7.63-7.59(m,1H),4.61-4.56(m,1H),4.46-4.41(m,1H),4.15-4.12(m,1H),4.06-4.00(m,1H),1.50(s,9H),1.48(s,9H)ppm。31P NMR(DMSO)δ-15.54ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 544.1236(M+Na)。C23H28ClF3NNaO5P需要544.1238。
向在冰浴中冷却的66c(239mg,0.46mmol)在MeOH(2mL)中的溶液中加入CsCO3(298mg,0.92mmol)和几滴水。将混合物在冰浴中搅拌1h，然后在乙酸乙酯与水之间再次分配。用乙酸乙酯萃取水相三次。用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，以无水Na2SO4干燥，经硅藻土过滤并除去溶剂。将所得残余物溶于乙酸乙酯中并经(USSilica)柱色谱垫过滤，得到磷酸二叔丁酯·(S)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯66d，其为灰白色胶状物(183mg,94％)且未经进一步纯化即直接使用；1H NMR(DMSO)δ8.08(d,J＝8.4Hz,1H),7.58(d,J＝8.3Hz,1H),7.46-7.42(m,1H),7.25-7.21(m,1H),7.13(d,J＝0.8Hz,1H),4.00-3.93(m,1H),3.87-3.78(m,2H),3.54-3.42(m,2H),1.50(s,9H),1.49(s,9H)ppm。31P NMR(DMSO)δ-15.58ppm。HRMS(ESI)实测值m/z426.1587(M+H)。C21H30ClNO4P需要426.1595。
将2,5-二溴硝基苯(5.0g,17.8mmol)和丙烯酸叔丁酯(7.75mL,53.40mmol)溶于三乙胺(50mL)中。参见图22。通过使氮气鼓泡经过该溶液冲洗烧瓶，然后在氮气气流下加入三对甲苯基膦(433mg,1.42mmol)和乙酸钯(80mg,0.36mmol)。将混合物在氮气下搅拌回流过夜。泵除三乙胺。将所得残余物溶于乙酸乙酯中并经硅胶垫过滤。浓缩滤液并装载于色谱柱上。使用乙酸乙酯与石油醚的混合物(1:10)作为洗脱剂，得到(2E,2’E)-3,3’-(2-硝基-1,4-亚苯基)二丙烯酸叔丁酯66e，其为白色固体(5.85g,88％)；mp 123-124℃。1H NMR(CDCl3)δ8.14(d,J＝1.7Hz,1H),7.99(d,J＝15.8Hz,1H),7.74(dd,J＝1.7,8.2Hz,1H),7.66(d,J＝8.1Hz,1H),7.58(d,J＝16.0Hz,1H),6.50(d,J＝16.0Hz,1H),6.36(d,J＝15.8Hz,1H),1.58(s,9H),1.56(s,9H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 398.1574(M+Na)。C20H25NNaO6需要398.1574。
向在冰浴中冷却的66e(5.85g,15.58mmol)在丙酮(40mL)中的溶液中先后加入锌粉(8.15g,125.0mmol)和NH4Cl(3.33g,62.30mmol)在水(20mL)中的溶液。将混合物在室温搅拌1h。加入更多锌粉和(4.00g)和更多NH4Cl(1.7g)在水(10mL)中的溶液。1h后，加入乙酸乙酯(100mL)并经由倾出收集上层清液。再重复洗涤和倾出步骤两次。先后用水和盐水洗涤合并的有机溶液，以无水Na2SO4干燥并经硅胶垫过滤。除去溶剂，得到(2E,2’E)-3,3’-(2-氨基-1,4-亚苯基)二丙烯酸叔丁酯66f，其为黄色胶状物(5.46g,100％)；mp 73-75℃。1H NMR(CDCl3)δ7.68(d,J＝15.8Hz,1H),7.46(d,J＝16.0Hz,1H),7.37(d,J＝8.1Hz,1H),6.92(dd,J＝1.5,8.1Hz,1H),6.81(d,J＝1.4Hz,1H),6.33(d,J＝16.0Hz,1H),6.31(d,J＝15.8Hz,1H),3.99(br s,2H),1.53(s,9H),1.51(s,9H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 368.1830(M+Na)。C20H27NNaO4需要368.1832。
将66f(2.73g,7.90mmol)、3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)丙酸(Fmoc-β-丙氨酸,3.69g,11.85mmol)、EDCI盐酸盐(7.58g,39.50mmol)和对甲苯磺酸(136mg,0.79mmol)在DMA(25mL)中的混合物在室温搅拌过夜。将混合物在乙酸乙酯与水之间再次分配。用乙酸乙酯萃取水相三次。先后用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，以无水Na2SO4干燥并经硅藻土过滤。除去溶剂，得到(2E,2’E)-3,3’-(2-(3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)丙酰氨基)-1,4-亚苯基)二丙烯酸叔丁酯66g，其为白色固体(4.89g,97％)；mp 102-105℃。1H NMR(CDCl3)δ7.87(s,1H),7.70-7.66(m,2H),7.62-7.52(m,4H),7.44(br s,1H),7.38-7.34(m,3H),7.29-7.25(m,2H),6.41(d,J＝16.0Hz,1H),6.34(d,J＝15.7Hz,1H),4.42(br s,2H),4.19(t,J＝6.4Hz,1H),3.59(br s,2H),2.67(br s,2H),1.53(s,9H),1.51(s,9H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 661.2878(M+Na)。C38H42N2NaO7需要661.2884。
向在冰浴中冷却的66g(530mg,0.83mmol)在DCM(4mL)中的溶液中加入TFA(1mL,12.98mmol)。将混合物温热至室温并搅拌过夜，得到白色悬浮液。加入乙酸乙酯以析出更多固体，经由过滤收集该固体并用乙酸乙酯和石油醚洗涤，得到(2E,2’E)-3,3’-(2-(3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)丙酰氨基)-1,4-亚苯基)二丙烯酸66h，其为白色固体(404mg,92％)。mp 282℃(dec.)。1H NMR(DMSO)δ12.46(br s,1H),9.92(s,1H),7.89-7.84(m,3H),7.74-7.68(m,4H),7.58-7.54(m,2H),7.44-7.38(m,3H),7.31-7.28(m,2H),6.54(dd,J＝3.2,16.0Hz,2H),4.30(d,J＝6.5Hz,2H),4.22(t,J＝6.8Hz,1H),3.30(br s,2H),2.83-2.79(m,2H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 549.1643(M+Na)。C30H26N2NaO7需要549.1632。
将66d(178mg,粗的,约0.42mmol)、66h(55mg,0.10mmol)、EDCI盐酸盐(160mg,0.84mmol)和对甲苯磺酸(1.8mg,0.01mmol)在DMA(2mL)中的混合物在室温搅拌过夜。将混合物在乙酸乙酯与冷的稀NaHCO3水溶液之间再次分配。用乙酸乙酯萃取水相三次。先后用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，以无水Na2SO4干燥并经硅藻土过滤。除去溶剂并通过使用MeOH和乙酸乙酯的梯度混合物(v/v 0.25-5％)的(USSilica)柱色谱进一步纯化残余物，得到3-(2,5-二((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-(二叔丁氧基磷酰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-3-氧代丙-1-烯基)苯基氨基)-3-氧代丙基氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯66i，其为黄色固体(62mg,44％)；1H NMR(DMSO)δ10.04(s,1H),8.67(s,2H),8.11-8.05(m,3H),7.97(d,J＝8.2Hz,2H),7.88-7.82(m,4H),7.78(d,J＝8.4Hz,1H),7.73-7.67(m,3H),7.63-7.58(m,2H),7.53-7.47(m,3H),7.38(t,J＝7.4Hz,2H),7.30-7.24(m,4H),4.60-4.50(m,4H),4.42-4.35(m,2H),4.30(d,J＝6.7Hz,2H),4.22(t,J＝6.6Hz,1H),4.06-3.93(m,4H),3.40-3.33(m,2H),2.63-2.59(m,2H),1.50(2×s,18H),1.47(2×s,18H)ppm。31PNMR(DMSO)δ-15.45ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 1341.4677(M+H)。C72H81Cl2N4O13P2需要1341.4647。
向66i(60mg,0.045mmol)在DMF(1mL)中的溶液中加入哌啶(44μL,0.45mmol)。将混合物在室温搅拌3h，然后泵除全部挥发性组分。用乙醚和石油醚的混合物(v/v 1:1)研磨所得残余物，得到游离胺66j，其为白色固体(44mg,96％)。1H NMR(DMSO)δ8.68(s,2H),8.11-8.05(m,3H),7.98(d,J＝8.4Hz,2H),7.91-7.86(m,2H),7.78-7.85(m,1H),7.70(d,J＝15.3Hz,1H),7.63-7.58(m,2H),7.51(t,J＝7.9Hz,2H),7.26(d,J＝15.3Hz,2H),4.66-4.52(m,4H),4.44-4.35(m,2H),4.07-3.95(m,4H),2.95(t,J＝6.5Hz,2H),2.56-2.50(m,2H),1.50-1.49(m,36H)ppm。31P NMR(DMSO)δ-15.42,15.45ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 1119.3981(M+H)。C57H71Cl2N4O11P2需要1119.3966。
将66j(40mg,0.036mmol)、6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(SuOMC,12mg,0.037mmol)和DIPEA(6.8μL,0.039mmol)在DMSO(1mL)中的混合物在室温搅拌过夜，然后泵除全部挥发性组分。用乙醚研磨所得残余物，得到二(二叔丁基磷酸酯)·N-(3-(2,5-二((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-3-氧代丙-1-烯基)苯基氨基)-3-氧代丙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺66k，其为黄色固体(32mg,67％)。1H NMR(DMSO)δ10.02(s,1H),8.67(s,2H),8.11-8.05(m,3H),7.98-7.92(m,3H),7.85-7.75(m,2H),7.70(d,J＝15.3Hz,1H),7.63-7.58(m,2H),7.51(t,J＝7.9Hz,2H),7.26(dd,J＝4.4,15.4Hz,2H),6.96(s,2H),4.66-4.52(m,4H),4.44-4.35(m,2H),4.07-3.95(m,4H),3.45-3.30(m,4H),2.52-2.50(m,2H),2.08(t,J＝7.2Hz,2H),1.50-1.40(m,40H),1.33-1.25(m,2H)ppm。31P NMR(DMSO)δ-15.42,15.45ppm。HRMS(ESI)实测值m/z1334.4515(M+Na)。C67H81Cl2N5NaO14P2需要1334.4525。
向在冰浴中冷却的66k(30mg,0.02mmol)在DCM(1mL)中的溶液中加入TFA(1mL,12.98mmol)。将混合物温热至室温并搅拌3h。泵除全部挥发性组分并用乙酸乙酯研磨所得残余物，得到N-(3-(2,5-二((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-膦酰基氧基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-3-氧代丙-1-烯基)苯基氨基)-3-氧代丙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺66，其为黄色固体(20mg,80％,HPLC纯度95％)；1H NMR(DMSO)δ10.01(s,1H),8.59(s,2H),8.16-8.08(m,3H),7.97-7.90(m,3H),7.88-7.73(m,2H),7.69(d,J＝14.5Hz,1H),7.61-7.55(m,2H),7.46(t,J＝7.3Hz,2H),7.29-7.24(d,J＝14.0Hz,2H),6.97(s,2H),4.62-4.52(m,3H),4.40-4.30(m,3H),4.05-3.90(m,4H),3.43-3.37(m,2H),3.24-3.18(m,2H),2.61-2.55(m,2H),2.08(br s,2H),1.54-1.44(m,4H),1.27-1.15(m,2H)ppm。31P NMR(DMSO)δ-5.81ppm。HRMS(ESI-)实测值m/z1086.2067(M-H)。C51H48Cl2N5O14P2需要1086.2056。
实施例17 N-(3-(2,5-二((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-3-氧代丙-1-烯基)苯基氨基)-3-氧代丙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺67
向(2E,2’E)-3,3’-(2-(3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)丙酰氨基)-1,4-亚苯基)二丙烯酸叔丁酯66g(4.89g,7.66mmol)在DCM(30mL)中的溶液中加入哌啶(4.5mL,45.50mmol)。参见图23。将混合物在室温搅拌5h，然后通过旋转蒸发仪除去全部挥发性组分。先后使用乙酸乙酯作为洗脱剂及TEA、MeOH与乙酸乙酯的混合物(v/v 1:10:100)进行柱色谱，得到(2E,2’E)-3,3’-(2-(3-氨基丙酰氨基)-1,4-亚苯基)二丙烯酸叔丁酯67a，其为白色固体(2.33g,73％)。mp 62-63℃。1H NMR(CDCl3)δ11.04(s,1H),8.32(d,J＝1.4Hz,1H),7.91(d,J＝15.7Hz,1H),7.55(d,J＝16.1Hz,1H),7.54(d,J＝8.0Hz,1H),7.24(dd,J＝1.5,8.2Hz,1H),6.42(d,J＝16.0Hz,1H),6.34(d,J＝15.7Hz,1H),3.18(d,J＝5.6Hz,2H),2.52(t,J＝5.6Hz,2H),1.53(s,18H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 417.2394(M+H)。C23H33N2O5需要417.2384。
将67a(1.00g,2.40mmol)、6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(SuOMC,740mg,2.40mmol)和DIPEA(460μL,2.64mmol)在DMF(10mL)中的混合物在室温搅拌过夜。泵除全部挥发性组分。通过先后使用乙酸乙酯和石油醚的混合物(v/v 2:1)作为洗脱剂及单独乙酸乙酯的柱色谱纯化所得残余物，得到(2E,2’E)-3,3’-(2-(3-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)丙酰氨基)-1,4-亚苯基)二丙烯酸叔丁酯67b，其为白色固体(1.00g,68％)。mp 69-72℃。1H NMR(CDCl3)δ7.95(s,1H),7.73(s,1H),7.65(d,J＝15.9Hz,1H),7.61(d,J＝8.2Hz,1H),7.53(d,J＝16.0Hz,1H),7.37(d,J＝8.2Hz,1H),6.69(br s,1H),6.64(s,2H),6.39(d,J＝16.0Hz,1H),6.38(d,J＝15.8Hz,1H),3.68-3.63(m,2H),3.43(d,J＝7.0Hz,2H),2.69(d,J＝5.5Hz,2H),2.21(t,J＝7.3Hz,2H),1.67-1.50(m,4H),1.53(s,9H),1.52(s,9H),1.31-1.24(m,2H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 632.2931(M+Na)。C33H43N3NaO8需要632.2942。
向在冰浴中冷却的67b(500mg,0.82mmol)在DCM(4mL)中的溶液中滴加TFA(2mL)。将混合物温热至室温并搅拌4h。泵除全部挥发性组分，用乙酸乙酯研磨所得残余物，得到(2E,2’E)-3,3’-(2-(3-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)丙酰氨基)-1,4-亚苯基)二丙烯酸67c，其为白色固体(380mg,93％)。mp 257-261℃。1H NMR(DMSO)δ12.47(s,2H),9.90(s,1H),7.89-7.83(m,2H),7.71-7.67(m,2H),7.57-7.53(m,2H),6.99(s,2H),6.53(d,J＝15.9Hz,2H),3.36-3.30(m,4H),2.54-2.50(m,2H),2.06(t,J＝7.3Hz,2H),1.52-1.42(m,4H),1.22-1.17(m,2H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z520.1683(M+Na)。C25H27N3NaO8需要520.1690。
向在冰浴中冷却的(S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯51a(298mg,0.89mmol)在DCM(5mL)中的溶液中加入4N HCl/二噁烷(10mL)。将混合物温热至室温并搅拌3h。泵除全部挥发性组分，得到(S)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-醇67d，其为盐酸盐，向其中加入67c(185mg,0.37mmol)、EDCI盐酸盐(428mg,2.23mmol)、对甲苯磺酸(6mg,0.037mmol)和DMA(5mL)。将混合物在室温搅拌6h后，加入更多EDCI盐酸盐(285mg,1.49mmol)和甲苯磺酸(6mg,0.037mmol)。将混合物搅拌过夜，然后在乙酸乙酯与水之间再次分配。用乙酸乙酯萃取水相三次。先后用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，以无水Na2SO4干燥并经硅藻土过滤。除去溶剂并通过使用MeOH和乙酸乙酯的梯度混合物(v/v 1-15％)作为洗脱剂的柱色谱进一步纯化所得残余物，得到67，其为黄色固体(160mg,46％,HPLC纯度96％)；mp230-234℃(dec)。1H NMR(DMSO)δ10.43(s,1H),10.40(s,1H),10.00(s,1H),8.14-8.08(m,5H),7.95(br s,1H),7.83-7.75(m,5H),7.68(d,J＝15.2Hz,1H),7.52(t,J＝7.4Hz,2H),7.35(t,J＝7.6Hz,2H),7.28-7.23(dd,J＝5.2,15.2Hz,2H),6.95(s,2H),4.58-4.45(m,4H),4.29-4.20(m,2H),4.04-3.97(m,2H),3.88-3.80(m,2H),3.43-3.37(m,2H),3.23(d,J＝6.9Hz,2H),2.60-2.56(m,2H),2.09(d,J＝7.1Hz,2H),1.50-1.40(m,2H),1.40-1.30(m,2H),1.24-1.14(m,2H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 950.2672(M+Na)。C51H47Cl2N5NaO8需要950.2694。
实施例18 磷酸二氢(S)-1-(氯甲基)-3-((E)-3-(4-((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-3-氧代丙-1-烯基)-2-(3-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)丙酰氨基)苯基)丙烯酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯68
向在冰浴中冷却的磷酸二叔丁酯·(S)-1-(氯甲基)-3-(2,2,2-三氟乙酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯66c(125mg,0.24mmol)在MeOH(1mL)中的溶液中加入CsCO3(298mg,0.92mmol)和几滴水。将混合物在冰浴中搅拌1h，然后在乙酸乙酯与水之间再次分配。用乙酸乙酯萃取水相三次。用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，以无水Na2SO4干燥，经硅藻土过滤并除去溶剂。将所得残余物溶于乙酸乙酯中并经(USSilica)垫过滤。除去溶剂，得到磷酸二叔丁酯·(S)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯66d，其为灰白色泡沫状物且未经进一步纯化即直接使用。
向在冰浴中冷却的(S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-甲酸叔丁酯51a(80mg,0.24mmol)在DCM(2mL)中的溶液中加入4N HCl/二噁烷(4mL)。将混合物温热至室温并搅拌2h。泵除全部挥发性组分并直接使用(S)-1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-醇67d。
向在盐-冰浴(-10℃)中冷却的66d和67d(各自如上制备)在DMA(2mL)中的溶液中先后加入(2E,2’E)-3,3’-(2-(3-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)丙酰氨基)-1,4-亚苯基)二丙烯酸67c(119mg,0.24mmol)及EDCI盐酸盐(276mg,1.44mmol)和对甲苯磺酸(4mg,0.024mmol).将混合物温热至室温，搅拌过夜，然后倾倒在冰上。经由过滤收集所得析出物，用水洗涤并真空干燥。通过使用MeOH和DCM的梯度混合物(v/v 2-10％)的(USSilica)色谱柱进行纯化，得到黄色固体(50mg)，其经LC-MS鉴定为磷酸二叔丁酯·((S)-1-(氯甲基)-3-((E)-3-(4-((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-3-氧代丙-1-烯-1-基)-2-(3-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)丙酰氨基)苯基)丙烯酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基)酯68a和磷酸二叔丁酯·((S)-1-(氯甲基)-3-((E)-3-(4-((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-3-氧代丙-1-烯-1-基)-3-(3-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)丙酰氨基)苯基)丙烯酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基)酯68b(经HPLC确定分别为20％和23％)、67(经HPLC确定为44％)和66(经HPLC确定为8％)的混合物。通过制备型HPLC(柱：RP 4μ,250×21.20mm；流动相：A/B＝25％至0％(A:甲酸铵pH3.45,B:90％乙腈/水)；流速12mL/min；梯度方法；波长：254nm,325nm)进一步纯化该混合物，得到68a和68b的混合物，其为黄色固体(18mg,8％)。HRMS(ESI)实测值m/z 1142.3577(M+Na)。C59H64Cl2N5NaO11P需要1142.3609。
向在冰浴中冷却的68a和68b(17mg,0.015mmol)在DCM(0.5mL)中的溶液中滴加TFA(0.5mL)。将混合物温热至室温并搅拌3h。泵除全部挥发性组分。用乙酸乙酯研磨所得残余物，得到磷酸二氢(S)-1-(氯甲基)-3-((E)-3-(4-((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-3-氧代丙-1-烯基)-2-(3-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)丙酰氨基)苯基)丙烯酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯68和磷酸酯区域异构体磷酸二氢(S)-1-(氯甲基)-3-((E)-3-(4-((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-3-氧代丙-1-烯基)-3-(3-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)丙酰氨基)苯基)丙烯酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯68c的混合物，其为橙色固体(11mg,72％,HPLC纯度:95％,异构体的比例1:1)。1H NMR(DMSO)δ10.45(s,1H),10.01(s,1H),8.58(s,1H),8.15-7.23(m,17H),6.95(s,2H),4.60-3.80(m,10H),3.43-3.37(m,2H),3.27-3.18(m,2H),2.60-2.50(m,2H),2.10-2.00(m,2H),1.55-1.35(m,4H),1.20-1.10(m,2H)ppm。
31P NMR(DMSO)δ-5.81ppm。HRMS(ESI-)实测值m/z 1006.2394(M-H)。C51H47Cl2N5O11P需要1006.2392。
实施例23 N-(3-(2,5-二((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-甲基哌嗪-1-羰基氧 基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-3-氧代丙-1-烯基)苯基氨基)-3-氧代丙基)-6-(2,5-二 氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(化合物编号69,表4,图37)
向192mg(0.53mmol)1(通过上述操作新制备)在DMA(2mL)中的溶液中加入2(100mg,0.20mmol)、EDCI盐酸盐(231mg,1.21mmol)和甲苯磺酸(3.5mg,0.020mmol)。将混合物搅拌过夜，然后倾入氨水和冰的混合物中。经由过滤收集所得析出物，用水洗涤，干燥并通过硅胶柱色谱纯化。使用MeOH和DCM的梯度混合物(v/v 1-15％)作为洗脱剂，得到N-(3-(2,5-二((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-(4-甲基哌嗪-1-羰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)-3-氧代丙-1-烯基)苯基氨基)-3-氧代丙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺，其为黄色固体(30mg,13％,HPLC纯度96％)。mp 268℃(dec)。1H NMR(CDCl3)δ8.60(s,1H),8.46(s,1H),8.42(s,1H),7.87-7.84(m,3H),7.75-7.60(m,5H),7.40-7.33(m,5H),7.22(br s,1H),6.77(t,J＝15.3Hz,2H),6.56(s,2H),4.46-4.40(m,2H),4.30-4.25(m,2H),4.11-4.00(m,2H),3.95-3.90(m,7H),3.68(表观s,6H),3.53-3.46(m,3H),3.38(t,J＝7.0Hz,2H),2.73(表观s,2H),2.59-2.55(m,8H),2.42(s,6H),2.28(t,J＝7.0Hz,2H),1.56-1.49(m,2H),1.31-1.23(m,2H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 1180.4416(M+H)。
C63H68Cl2N9O10需要1180.4416。
实施例24 2,5-二((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦酰基氧基)-1H-苯并[e]吲哚-3 (2H)-基)-3-氧代丙-1-烯基)苯基氨基甲酸2-(吡啶-2-基二硫基)丙基酯(表4,化合物编号72,图38)
向207mg(0.49mmol)1(通过上述操作新制备)中加入2(70mg,0.15mmol)、EDCI盐酸盐(233mg,1.22mmol)、甲磺酸(3mg,0.015mmol)和DMA(0.5mL)。将混合物搅拌过夜后，真空除去大部分DMA并将残余物在乙酸乙酯与水之间再次分配。用乙酸乙酯萃取水相三次。先后用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，以无水Na2SO4干燥并经硅藻土垫过滤。除去溶剂并将所得残余物溶于最小量DCM中并通过加入庚烷进行析出，得到粗产物(156mg)，通过制备型HPLC(柱：Synergi-Max RP 4μ,250×21.20mm；流动相：A/B＝10％至1％(A:甲酸铵pH 3.45,B:90％乙腈/水)；流速12mL/min；梯度方法；波长：254nm,325nm)将其进一步纯化，得到3(78mg,40％)，其为黄色固体。1H NMR(DMSO)δ9.67(s,1H),8.67(s,2H),8.43(d,J＝4.5Hz,1H),8.11-8.06(m,3H),7.97(表观d,J＝8.5Hz,2H),7.92(d,J＝15.3Hz,1H),7.84-7.76(m,3H),7.70(d,J＝15.3Hz,2H),7.61(t,J＝7.6Hz,2H),7.51(t,J＝7.7Hz,2H),7.28(d,J＝15.3Hz,1H),7.27(d,J＝15.3Hz,1H),7.23-7.19(m,1H),4.62-4.53(m,4H),4.43-4.37(m,2H),4.23-4.13(m,2H),4.05-3.95(m,4H),3.42-3.37(m,1H),1.51(s,9H),1.50(s,9H),1.49(s,9H),1.48(s,9H),1.34(d,J＝6.5Hz,3H)ppm。31P NMR(DMSO)δ-15.46(s)和-15.48(s)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 1297.3471(M+Na)。C63H74Cl2N4NaO12P2S2需要1297.3489。
向在冰浴中冷却的3(60mg,0.047mmol)在DCM(2mL)中的溶液中加入TFA(1mL,6.49mmol)。将混合物温热至室温并搅拌3h。泵除全部挥发性组分并用乙酸乙酯研磨所得残余物，得到4，其为黄色固体(49mg,99％,HPLC纯度100％)；1H NMR(DMSO)δ9.65(s,1H),8.59(s,2H),8.46-8.44(m,1H),8.15-8.08(m,3H),7.96-7.90(m,3H),7.82-7.70(m,3H),7.70(d,J＝15.6Hz,1H),7.59(t,J＝6.8Hz,2H),7.48(t,J＝7.5Hz,2H),7.31-7.22(m,3H),5.75(s,1H),4.64-4.53(m,4H),4.40-4.33(m,3H),4.25-4.15(m,3H),4.06-3.93(m,3H),1.35-1.32(m,3H)ppm。31P NMR(DMSO)δ-5.95(s)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z1073.0949(M+Na)。C47H42Cl2N4NaO12P2S2需要1073.0985。
实施例25 磷酸二氢[(1S)-1-(氯甲基)-3-[(E)-3-[4-[(E)-3-[(1S)-1-(氯甲 基)-5-膦酰基氧基-1,2-二氢苯并[e]吲哚-3-基]-3-氧代-丙-1-烯基]-2-[2-[2-(2,5-二 氧代吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基]苯基]丙-2-烯酰基]-1,2-二氢苯并[e]吲哚-5-基]酯(化合物编号78,表4,图39)
中间体3
向76mg(0.18mmol)1(通过上述操作新制备)中加入2(18mg,0.045mmol)、EDCI盐酸盐(69mg,0.36mmol)、甲磺酸(0.8mg,0.005mmol)和DMA(0.25mL)。将混合物搅拌过夜后，真空除去大部分DMA并将残余物在乙酸乙酯与水之间再次分配。用乙酸乙酯萃取水相三次。先后用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，以无水Na2SO4干燥并经硅藻土垫过滤。除去溶剂并将所得残余物溶于最小量DCM中且通过加入庚烷进行析出，得到粗产物(54mg)，通过制备型HPLC(柱：Synergi-Max RP 4μ,250×21.20mm；流动相：A/B＝20％至1％(A:甲酸铵pH 3.45,B:90％乙腈/水)；流速12mL/min；梯度方法；波长：254nm,325nm)将其进一步纯化，得到3(17mg,30％)，其为黄色固体。1H NMR(CDCl3)δ8.72(br s,2H),8.23(d,J＝8.4Hz,2H),7.96(d,J＝15.2Hz,1H),7.83(d,J＝15.3Hz,1H),7.71(d,J＝8.2Hz,2H),7.54-7.50(m,3H),7.42-7.39(m,2H),7.26-7.12(m,3H),6.95-6.88(m,1H),6.67(s,2H),4.57-4.52(m,2H),4.47-4.38(m,2H),4.28-4.24(m,2H),4.16-4.09(m,2H),4.00-3.94(m,4H),3.78(表观s,4H),3.55-.348(m,2H),1.57(s,36H)ppm。31P NMR(CDCl3)δ-15.64(s)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 1238.3862(M+Na)。C62H73Cl2N3NaO14P2需要1238.3837。
向在冰浴中冷却的3(16mg,0.013mmol)在DCM(1mL)中的溶液中加入TFA(0.5mL,3.24mmol)。将混合物温热至室温并搅拌3h。泵除全部挥发性组分并用乙酸乙酯研磨所得残余物，得到化合物78，其为黄色固体(13mg,100％,HPLC纯度100％)。1H NMR(DMSO)δ8.60(s,2H),8.12(d,J＝8.4Hz,2H),7.95-7.87(m,4H),7.72(d,J＝15.1Hz,1H),7.61-7.57(m,2H),7.53-7.45(m,4H),
7.38-7.32(m,2H),6.97(s,2H),4.60-4.48(m,4H),4.30-4.28(m,4H),4.08-3.88(m,6H),3.68-3.58(m,4H)。31P NMR(DMSO)δ-5.94(s)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z1014.1301(M+Na)。C46H41Cl2N3NaO14P2需要1014.1333。
实施例26 磷酸二氢[(1S)-1-(氯甲基)-3-[(E)-3-[4-[(E)-3-[(1S)-1-(氯甲 基)-5-膦酰基氧基-1,2-二氢苯并[e]吲哚-3-基]-3-氧代-丙-1-烯基]-2-[2-(2,5-二氧代 吡咯-1-基)乙氧基]苯基]丙-2-烯酰基]-1,2-二氢苯并[e]吲哚-5-基]酯(化合物编号79, 表4,图40)
中间体3
向52mg(0.12mmol)1(通过上述操作新制备)中加入2(11mg,0.031mmol)、EDCI盐酸盐(35mg,0.18mmol)、甲磺酸(0.5mg,0.003mmol)和DMA(0.25mL)。将混合物搅拌过夜后，真空除去大部分DMA并将残余物在乙酸乙酯与水之间再次分配。用乙酸乙酯萃取水相三次。先后用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，以无水Na2SO4干燥并经硅藻土垫过滤。除去溶剂并将所得残余物溶于最小量DCM中且通过加入庚烷进行析出，得到粗产物(71mg)，通过制备型HPLC(柱：Synergi-Max RP 4μ,250×21.20mm；流动相：A/B＝20％至1％(A:甲酸铵pH 3.45,B:90％乙腈/水)；流速12mL/min；梯度方法；波长：254nm,300nm)将其进一步纯化，得到3(15mg,42％)，其为黄色固体。1H NMR(CDCl3)δ8.71(br s,2H),8.25(d,J＝8.4Hz,2H),7.95(d,J＝15.5Hz,1H),7.83(d,J＝15.3Hz,1H),7.72(d,J＝8.2Hz,2H),7.60-7.52(m,3H),7.46-7.40(m,2H),7.28-7.20(m,2H),7.13-6.99(m,2H),6.78(s,2H),4.64-4.60(m,2H),4.51-4.45(m,2H),4.38-4.32(m,2H),4.15-4.05(m,4H),4.00-3.95(m,2H),3.57-3.49(m,2H),1.58(s,36H)ppm。31P NMR(CDCl3)δ-15.67(s)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 1194.3606(M+Na)。C60H69Cl2N3NaO13P2需要1194.3575。
化合物编号79
向在冰浴中冷却的3(13mg,0.011mmol)在DCM(0.5mL)中的溶液中加入TFA(0.2mL,1.30mmol)。将混合物温热至室温并搅拌0.5h。加入乙醚，得到析出物，将其滤出并用乙酸乙酯洗涤，得到4(化合物编号79)，其为黄色固体(8.4mg,80％,HPLC纯度90％)。1H NMR(DMSO)δ8.59(s,2H),8.13(d,J＝8.3Hz,2H),7.97-7.82(m,4H),7.71(d,J＝15.1Hz,1H),7.60-7.52(m,3H),7.49-7.44(m,3H),7.35-7.24(m,2H),7.08(s,2H),4.65-4.50(m,4H),4.40-4.30(m,4H),4.05-3.90(m,6H)。31P NMR(DMSO)δ-5.81(s)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z970.1036(M+Na)。C44H37Cl2N3NaO13P2需要970.1071。
实施例27 N-[1-(氯甲基)-3-[5-[1-(氯甲基)-5-羟基-1,2-二氢苯并[e]吲哚-3- 基]-5-氧代-戊酰基]-1,2-二氢苯并[e]吲哚-5-基]氨基甲酸2-(2-吡啶基二硫基)丙基酯(化合物编号80,表4,图41)
将62c(31.0mg,0.0674mmol,通过上述操作新制备)、53h(23.0mg,0.0674mmol,通过上述操作新制备)、EDCI.HCl(38.7mg,0.202mmol)和TsOH(2.3mg,0.0135mmol)在无水DMA(2mL)中的混合物在室温在氮气下搅拌过夜。18h后，用EtOAc和H2O稀释反应混合物并充分混合。将两层分开并用H2O(3×)洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并真空除去溶剂。通过使用DCM:MeOH 100:0至98:2的硅胶柱色谱纯化粗产物，接着用二异丙基醚研磨，得到化合物1(化合物编号80,26.0mg,49％,HPLC纯度:95.2％)，其为霜状固体。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)10.36(s,1H),9.69(s,1H),8.56(s,1H),8.44(d,J＝4.3Hz,1H),8.08(d,J＝8.0Hz,1H),8.02-8.00(m,2H),7.92(d,J＝8.3Hz,1H),7.85-7.77(m,3H),7.57-7.53(m,1H),7.51-7.47(m,1H),7.45-7.41(m,1H),7.34-7.30(m,1H),7.24-7.21(m,1H),4.42-4.29(m,3H),4.25-4.13(m,5H),4.05-3.97(m,2H),3.91(dd,J＝11,7.2Hz,1H),3.79(dd,J＝11,8.3Hz,1H),3.43-3.36(m,1H),2.77-2.56(m,4H),2.01-1.93(m,2H),1.34(d,J＝6.7Hz,3H)。HRMS m/z811.1542[(M+Na)+C40H38Cl2N4NaO5S2计算值811.1553]。
实施例28 3-[6-[1-(氯甲基)-5-(4-甲基哌嗪-1-羰基)氧基-1,2-二氢苯并[e]吲 哚-3-基]-6-氧代-己氧基]-6-羟基-2-甲氧基-11-氧代-6a,7,8,9-四氢-6H-吡咯并[2,1- c][1,4]苯并二氮杂 -5-甲酸2-(2-吡啶基二硫基)丙基酯、3-[6-[1-(氯甲基)-5-膦酰基 氧基-1,2-二氢苯并[e]吲哚-3-基]-6-氧代-己氧基]-6-羟基-2-甲氧基-11-氧代-6a,7,8, 9-四氢-6H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂 -5-甲酸2-(2-吡啶基二硫基)丙基酯和3- [6-[1-(氯甲基)-5-羟基-1,2-二氢苯并[e]吲哚-3-基]-6-氧代-己氧基]-6-羟基-2-甲氧 基-11-氧代-6a,7,8,9-四氢-6H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂 -5-甲酸2-(2-吡啶基 二硫基)丙基酯(化合物编号81-83,表4,图42-43)
将1(1.40g,4.00mmol,遵循文献操作制备:J.Med.Chem.2003,46,2132-2151)、2(1.31g,5.22mmol,遵循文献操作制备:WO2004065491A1)和K2CO3(829mg,6.00mmol)在无水DMA(15mL)中的混合物在室温搅拌43h。然后用EtOAc和H2O稀释混合物，充分混合并将两层分开。用H2O(3×)、盐水(1×)洗涤有机层并干燥(Na2SO4)且真空除去溶剂。通过使用EtOAc:Hex50:50至67:33至100:0的硅胶柱色谱纯化粗产物，得到化合物3(1.74g,84％)，其为黄色油状物。1H NMRδ(400MHz,CDCl3)8.77(br s,1H),7.79(s,1H),6.82(s,1H),6.02-5.92(m,1H),5.36(dq,J＝17.2,1.5Hz,1H),5.26(dq,J＝10.4,1.2Hz,1H),4.69-4.60(m,2H),4.47-4.39(m,1H),4.28(br s,1H),4.09-4.05(m,2H),3.83(s,3H),3.90-3.80(m,1H),3.74-3.70(m,1H),3.65-3.59(m,1H),3.54-3.47(m,1H),2.25(t,J＝7.4Hz,2H),2.20-2.15(m,1H),1.93-1.84(m,3H),1.81-1.72(m,1H),1.70-1.63(m,3H),1.53-1.47(m,2H),1.44(s,9H)。HRMS m/z543.2666[(M+Na)+C27H40N2NaO8计算值543.2677]。
在室温将Et3N(1.32mL,9.47mmol)加至3(821mg,1.58mmol)在无水DCM(6mL)中的溶液中。然后加入乙酸酐(0.75mL,7.93mmol)并将混合物在室温搅拌4.5h。将反应混合物冷却至0℃并加入无水MeOH(1mL)且将混合物在0℃搅拌15min。然后加入EtOAc(120mL)并用H2O(2×)、盐水(1×)洗涤混合物，干燥(Na2SO4)并真空除去溶剂，得到化合物4(891mg,定量的)，其未经纯化即用于下一步骤。1H NMRδ(400MHz,CDCl3)8.88(br s,1H),7.82(s,1H),6.81(s,1H),6.01-5.91(m,1H),5.36(dq,J＝17.2,1.5Hz,1H),5.25(dq,J＝10.4,1.3Hz,1H),4.65-4.62(m,2H),4.61-4.54(m,1H),4.32-4.22(m,2H),4.09-4.06(m,2H),3.83(s,3H),3.55-3.47(m,2H),2.26-2.23(m,2H),2.18-2.12(m,1H),2.07(s,3H),1.97-1.77(m,5H),1.70-1.63(m,2H),1.54-1.47(m,2H),1.44(s,9H)。HRMS m/z 585.2774[(M+Na)+C29H42N2NaO9计算值585.2783]。
在室温将吡咯烷(1.6mL,19.2mmol)加至4(1.06g,1.88mmol)在无水DCM(20mL)中的溶液中。然后加入Pd(PPh3)4(109mg,0.0943mmol)并将反应混合物在室温搅拌40min。用0.25M HCl溶液(2×75mL)洗涤反应混合物，干燥(Na2SO4)并真空除去溶剂。通过使用EtOAc:Hex 50:50至100:0的硅胶柱色谱纯化粗产物，得到化合物5(726mg,81％)，其为黄色油状物。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)6.67(s,1H),6.35(s,1H),5.08(s,2H),4.35-4.30(m,1H),4.13-4.06(m,2H),3.87(t,J＝6.4Hz,2H),3.63(s,3H),3.50-3.44(m,1H),3.42-3.35(m,1H),2.21(t,J＝7.2Hz,2H),2.07-2.00(m,1H),2.01(s,3H),1.89-1.82(m,1H),1.77-1.67(m,4H),1.59-1.51(m,2H),1.44-1.36(m,2H),1.39(s,9H)。HRMS m/z 501.2573[(M+Na)+C25H38N2NaO7计算值501.2571]。
在室温在氮气下将双光气(0.22mL,1.82mmol)加至5(726mg,1.52mmol)和DMAP(557mg,4.56mmol)在无水DCM(25mL)中的混合物中。30min后，加入6(2.60g,12.9mmol；通过上述操作新制备,无编号先前归属于醇)在无水DCM(25mL)中的溶液并将混合物在室温搅拌过夜。18h后，用H2O(1×)洗涤反应混合物，干燥(Na2SO4)并真空除去溶剂。通过使用DCM:EtOAc 100:0至95:5至94:6的硅胶柱色谱纯化粗产物直至过量6洗脱，然后使用EtOAc:Hex70:30，得到化合物7(920mg,86％)，其为淡黄色油状物。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)9.16(br s,1H),8.45-8.43(m,1H),7.83-7.78(m,2H),7.25-7.21(m,1H),7.15(d,J＝2.8Hz,1H),6.87(s,1H),4.29(br s,1H),4.17-3.99(m,4H),3.92(t,J＝6.4Hz,2H),3.75(s,3H),3.42-3.30(m,3H),2.20(t,J＝7.2Hz,2H),2.06-1.95(m,4H),1.83(br s,1H),1.77-1.68(m,4H),1.58-1.49(m,2H),1.43-1.36(m,2H),1.39(s,9H),1.29(d,J＝6.8Hz,3H)。HRMS m/z 706.2832[(M+H)+C34H48N3O9S2计算值706.2826]。
将7(949mg,1.34mmol)和K2CO3(1.85g,13.4mmol)在DCM-MeOH(34mL/17mL)中的混合物在室温搅拌45min。用DCM稀释混合物，倾入冰水(200mL)中，充分混合并将两层分开。用DCM(1×)萃取水层，干燥(Na2SO4)合并的有机层并真空除去溶剂。通过使用DCM:EtOAc 100:0至50:50的硅胶柱色谱纯化粗产物，得到化合物8(808mg,91％)，其为淡黄色油状物。1HNMRδ(400MHz,DMSO-d6)9.20(br s,1H),8.44(d,J＝4.7Hz,1H),7.81-7.80(m,2H),7.25-7.20(m,2H),6.94(s,1H),4.75(t,J＝5.6Hz,1H),4.17-3.99(m,3H),3.92(t,J＝6.4Hz,2H),3.74(s,3H),3.60-3.46(m,2H),3.37-3.20(m,3H),2.20(t,J＝7.2Hz,2H),1.93-1.76(m,3H),1.75-1.68(m,3H),1.58-1.51(m,2H),1.44-1.36(m,2H),1.39(s,9H),1.29(d,J＝6.9Hz,3H)。HRMS m/z 664.2721[(M+H)+C32H46N3O8S2计算值664.2724]。
在室温将(二乙酰氧基碘)苯(259mg,0.804mmol)加至8(349mg,0.526mmol)和TEMPO(82.2mg,0.526mmol)在无水DCM(10mL)中的混合物中并将反应混合物搅拌过夜。24h后，用DCM和饱和Na2S2O3水溶液稀释混合物并充分混合。将两层分开并用饱和Na2S2O3水溶液(1×)、饱和NaHCO3水溶液(1×)洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并真空除去溶剂。通过使用EtOAc:Hex70:30至100:0的硅胶柱色谱纯化粗产物，得到化合物9(248mg,71％)，其为白色泡沫状物。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)8.45-8.43(m,1H),7.79-7.69(m,1H),7.51-7.48(m,1H),7.24-7.20(m,1H),7.10(s,1H),6.96和6.91(2s,1H),6.55(t,J＝5.9Hz,1H),5.46(dd,J＝8.9,6.1Hz,1H),4.31-4.21(m,1H),4.02-3.84(m,3H),3.80和3.79(2s,3H),3.52-3.46(m,1H),3.40-3.18(m,3H),2.19-2.13(m,2H),2.09-2.00(m,1H),1.96-1.85(m,3H),1.70-1.67(m,2H),1.56-1.45(m,2H),1.40-1.34(m,2H),1.38和1.37(2s,9H),1.15-1.10(m,3H)。HRMS m/z662.2592[(M+H)+C32H44N3O8S2计算值662.2564]。
将9(254mg,0.384mmol)和4M HCl/二噁烷(11mL)的混合物在室温搅拌1h 15min。在25-30℃真空除去溶剂，得到化合物10(162mg,70％)，其未经纯化即用于下一步骤。
将10(161mg,0.266mmol)、58b(195mg,0.542mmol,通过上述操作新制备)、EDCI.HCl(253mg,1.32mmol)和TsOH(19.5mg,0.113mmol)在无水DMA(5mL)中的混合物在室温在氮气下搅拌过夜。23h后，用EtOAc和饱和NaHCO3水溶液稀释反应混合物并充分混合。将两层分开并用EtOAc(1×)萃取水层。用H2O(1×)、盐水(1×)洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)并真空除去溶剂。通过使用DCM:MeOH 100:0至93:7的硅胶柱色谱纯化粗产物并使用DCM:MeOH 99:1至94:6再次以柱色谱纯化物质，得到11(化合物编号81,118mg,47％,HPLC纯度:98.0％)，其为淡黄色泡沫状物。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)8.43-8.41(m,1H),8.22(s,1H),7.96(d,J＝8.4Hz,1H),7.83(d,J＝8.4Hz,1H),7.73-7.66(m,1H),7.61-7.56(m,1H),7.51-7.45(m,2H),7.22-7.17(m,1H),7.10(s,1H),6.97和6.92(2s,1H),6.56(t,J＝6.0Hz,1H),5.46(dd,J＝9.1,6.2Hz,1H),4.42-4.20(m,4H),4.05-3.76(m,7H),3.80和3.79(2s,3H),3.52-3.47(m,1H),3.38-3.11(m,4H),2.09-1.99(m,1H),1.94-1.88(m,3H),1.77-1.74(m,2H),1.65-1.62(m,2H),1.48-1.42(m,2H),1.35-1.23(m,1H),1.15-1.10(m,3H),9H被DMSO部分遮盖。HRMS m/z 969.3070[(M+Na)+C47H55ClN6NaO9S2计算值969.3053]。
将10(162mg,0.267mmol)、66d(178mg,0.418mmol,通过上述操作新制备)、EDCI.HCl(184mg,0.960mmol)和TsOH(11mg,0.0639mmol)在无水DMA(5mL)中的混合物在室温在氮气下搅拌过夜。18.5h后，用EtOAc和H2O稀释反应混合物并充分混合。将两层分开并用饱和NaHCO3水溶液(1×)、H2O(1×)、盐水(1×)洗涤有机层，干燥(Na2SO4)并真空除去溶剂。通过使用EtOAc:MeOH 100:0至95:5的硅胶柱色谱纯化粗产物，得到黄色残余物。通过制备型HPLC(柱：Synergi-MAX RP 4μ,21.20×250mm；流速：12mL/min；流动相：溶剂A:H2O/甲酸铵缓冲液pH 3.45,溶剂B:MeCN/H2O 90:10；方法：梯度,溶剂A:溶剂B 90:10至10:90至0:100,历时30min)纯化该残余物，得到化合物12(89.3mg,33％,HPLC纯度:99.5％)，其为白色泡沫状物。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)8.56(s,1H),8.43-8.41(m,1H),8.04(d,J＝8.2Hz,1H),7.92(d,J＝8.4Hz,1H),7.73-7.67(m,1H),7.60-7.56(m,1H),7.51-7.45(m,2H),7.22-7.17(m,1H),7.10(s,1H),6.98和6.92(2s,1H),6.55(t,J＝5.6Hz,1H),5.47-5.44(m,1H),4.40-4.36(m,1H),4.30-4.19(m,3H),4.04-3.86(m,4H),3.86-3.75(m,1H),3.80和3.79(2s,3H),3.52-3.46(m,1H),3.38-3.22(m,3H),3.21-3.15(m,1H),2.09-1.99(m,1H),1.94-1.85(m,3H),1.78-1.74(m,2H),1.69-1.60(m,2H),1.55-1.40(m,2H),1.47和1.47(2s,18H),1.28-1.23(m,1H),1.15-1.10(m,3H)。HRMS m/z 1035.3162[(M+Na)+C49H62ClN4NaO11PS2计算值1035.3175]。
将12(84.0mg,0.0829mmol)和TFA(1mL)在无水DCM(2mL)中的混合物在室温搅拌40min。然后在25℃真空除去溶剂，得到绿色残余物。将残余物溶于DCM中，用EtOAc稀释溶液并真空除去DCM，得到白色固体且倾出剩余溶剂。重复该操作并用EtOAc研磨所得固且干燥，得到化合物13(化合物编号82,43.8mg,59％,HPLC纯度:93.8％)，其为白色固体。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)8.47(s,1H),8.44-8.42(m,1H),8.08(d,J＝8.3Hz,1H),7.90(d,J＝8.3Hz,1H),7.74-7.68(m,1H),7.58-7.54(m,1H),7.51-7.48(m,1H),7.47-7.43(m,1H),7.22-7.18(m,1H),7.10(s,1H),6.98和6.93(2s,1H),5.46(d,J＝9.5Hz,1H),4.39-4.18(m,4H),4.04-3.95(m,3H),3.90-3.85(m,1H),3.84-3.76(m,1H),3.80和3.80(2s,3H),3.52-3.47(m,1H),3.40-3.27(m,3H),3.21-3.15(m,1H),2.10-2.02(m,1H),1.94-1.88(m,3H),1.78-1.74(m,2H),1.69-1.60(m,2H),1.48-1.42(m,2H),1.35-1.23(m,1H),1.16-1.10(m,3H),3H未观察到。HRMS m/z 923.1938[(M+Na)+C41H46ClN4NaO11PS2计算值923.1923]。
将10(45.0mg,0.0743mmol)、67d(24.3mg,0.0899mmol,通过上述操作新制备)、EDCI.HCl(42.7mg,0.223mmol)和TsOH(3mg,0.0174mmol)在无水DMA(3mL)中的混合物在室温在氮气下搅拌5h。向混合物中加入另一份67d(24.3mg,0.0899mmol)和EDCI.HCl(16.0mg,0.0835mmol)并将反应混合物在室温搅拌过夜。22h后，用EtOAc稀释反应混合物并用H2O(2×)、盐水(1×)洗涤，干燥(Na2SO4)并真空除去溶剂。通过使用EtOAc的硅胶柱色谱纯化粗产物，得到绿色粉末。通过使用EtOAc的硅胶柱色谱第二次纯化该粉末，得到化合物14(化合物编号83,8.3mg,13.5％,HPLC纯度:81.2％)，其为米色固体。1H NMRδ(400MHz,DMSO-d6)10.33(s,1H),8.43-8.42(m,1H),8.07(d,J＝8.1Hz,1H),7.98(s,1H),7.77(d,J＝8.4Hz,1H),7.74-7.67(m,1H),7.50-7.46(m,2H),7.33-7.29(m,1H),7.24-7.18(m,1H),7.10(s,1H),6.98和6.92(2s,1H),6.56(t,J＝6.0Hz,1H),5.47-5.44(m,1H),4.33-4.21(m,2H),4.15-4.13(m,2H),4.05-3.93(m,3H),3.90-3.75(m,2H),3.80和3.79(2s,3H),3.52-3.47(m,1H),3.38-3.13(m,4H),2.10-1.99(m,1H),1.94-1.89(m,3H),1.77-1.74(m,2H),1.66-1.62(m,2H),1.52-1.41(m,2H),1.32-1.24(m,1H),1.15-1.10(m,3H)。HRMS m/z 843.2258[(M+Na)+C41H45ClN4NaO8S2计算值843.2260]。
实施例29 (1S)-1-(氯甲基)-3-((2E)-3-{4-((1E)-3-{(1S)-1-(氯甲基)-5-[(6- 甲基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基)氧基]-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基}-3-氧代-1-丙烯 基)-2-[(3-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}丙酰基)氨基]苯 基}-2-丙烯酰基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-5-基β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯(化合物编号84,表4,图44)
根据文献操作制备三氯乙酰亚胺酯(1)：L.Lázár,E.M.Herczeg,A.Lipták,S.Antus,A.Borbás,Tetrahedron 2012,68,7386-7399；L.Tietze,H.Schuster,K.Schmuck,I.Schuberth,F.Alves,Bioorg.&Med.Chem.2008,16,6312-6318。
将三氯乙酰亚胺酯(1)(360mg,0.75mmol)、苯酚-CBI(2,第一份专利申请中的化合物51a)(200mg,0.60mmol)和活化的分子筛(1g)在无水CH2Cl2(20mL)中的悬浮液在室温搅拌1h。将混合物冷却至-10℃，然后滴加BF3.OEt2(40μl,0.3mmol)。将温度在-10℃至-5℃保持1h，然后将其在0℃搅拌30min。随后在0℃滴加BF3.OEt2(0.24mL,1.8mmol)，使温度升至室温并将其搅拌2h。然后经硅藻土过滤悬浮液并蒸发溶剂，得到粗CBI-Glucuronide(3)，其未经进一步纯化即用于下一步骤。将胺(3)和二酸(4,第一份专利申请中的化合物66h)(126mg,0.24mmol)在无水DMA(4mL)中的溶液冷却至0℃。然后加入pTsOH(17mg,0.096mmol)和EDCI·HCl(276mg,1.44mmol)，使温度升至室温并将其搅拌16h。减压除去溶剂并通过柱色谱[先后(SiO2,CH2Cl2/MeOH 0-2％)和(SiO2,CH2Cl2/MeOH 1-2％)]纯化残余物，得到(1S)-1-(氯甲基)-3-((2E)-3-{4-((1E)-3-{(1S)-1-(氯甲基)-5-[(2,3,4-三-O-乙酰基-6-甲基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基)氧基]-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基}-3-氧代-1-丙烯基)-2-[(3-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丙酰基)氨基]苯基}-2-丙烯酰基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-5-基2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯(5)(127mg,27％)，其为黄色固体。1H NMR(300MHz,[(CD3)2SO])δ10.04(s,1H,NH),8.38(br s,2H),8.11(d,J＝8.1Hz,1H),7.97(d,J＝8.5Hz,2H),7.93(d,J＝8.2Hz,2H),7.83-7.88(m,4H),7.78(d,J＝7.6Hz,1H),7.68-7.72(m,3H),7.59(t,J＝7.5Hz,2H),7.45-7.48(m,3H),7.38(t,J＝7.4Hz,2H),7.25-7.29(m,4H),5.85(d,J＝7.7Hz,1H),5.83(d,J＝7.8Hz,1H),5.62-5.65(m,2H),5.32(t,J＝8.7Hz,2H),5.14(t,J＝9.6Hz,2H),4.78(t,J＝8.2Hz,2H),4.55(m,4H),4.31-4.38(m,4H),4.22(t,J＝6.9Hz,1H),4.01-4.03(m,2H),3.91-3.96(m,2H),3.65(s,3H),3.63(s,3H),3.36-3.38(m,2H),2.59-2.64(m,2H),1.98-2.03(m,18H)；LC-MS(ESI)C82H79Cl2N4O25(M+H)+计算值m/z 1591.4,实测值m/z 1591.4；C82H78Cl2N4O25Na(M+Na)+计算值m/z 1613.4,实测值m/z 1613.4。
将衍生物(5)(110mg,0.07mmol)和哌啶(468μL,0.7mmol)在无水DMF(5mL)中的溶液在室温搅拌30min。在室温减压除去溶剂并用冷Et2O研磨残余物，得到粗(1S)-3-{(2E)-3-[2-[(3-氨基丙酰基)氨基]-4-((1E)-3-{(1S)-1-(氯甲基)-5-[(2,3,4-三-O-乙酰基-6-甲基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基)氧基]-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基}-3-氧代-1-丙烯基)苯基]-2-丙烯酰基}-1-(氯甲基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-5-基2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯(6)(86mg,90％)，其未经进一步纯化即用于下一步骤。1H NMR(300MHz,[(CD3)2SO]δ8.38(br s,2H),8.10(d,J＝8.4Hz,1H),7.98(d,J＝8.4Hz,2H),7.94(d,J＝8.4Hz,2H),7.90(s,1H),7.88(d,J＝15.1Hz,1H),7.76(d,J＝7.6Hz,1H),7.70(d,J＝15.1Hz,1H),7.59(t,J＝7.9Hz,2H),7.47(t,J＝7.9Hz,2H),7.27(dd,J＝3.4,15.3Hz,2H),5.85(d,J＝7.8Hz,1H),5.84(d,J＝7.8Hz,1H),5.63-5.68(m,2H),5.32(dd,J＝7.8,9.6Hz,2H),5.14(dt,J＝1.5,9.6Hz,2H),4.79(d,J＝9.6Hz,2H),4.56-4.60(m,4H),4.29-4.41(m,2H),4.02-4.04(m,2H),3.92-3.97(m,2H),3.67(s,6H),2.93(t,J＝6.4Hz,2H),2.03-2.04(m,18H),2H在DMSO峰下,NH和NH2未观察到。
在0℃向胺(6)(110mg,0.08mmol)在MeOH/CH2Cl2的混合物(1:1)(10mL)中的搅拌的溶液中滴加NaOMe(8.7mg,0.16mmol)在MeOH(1mL)中的溶液并将反应混合物在0℃搅拌2h。然后加入AcOH(8滴)并在室温减压除去溶剂且高真空干燥，得到(1S)-3-{(2E)-3-[2-[(3-氨基丙酰基)氨基]-4-((1E)-3-{(1S)-1-(氯甲基)-5-[(6-甲基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基)氧基]-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基}-3-氧代-1-丙烯基)苯基]-2-丙烯酰基}-1-(氯甲基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-5-基β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯(7)，其为橙色固体且未经进一步纯化即用于下一步骤。向胺(7)和6-马来酰亚氨基己酸N-琥珀酰亚氨基酯(24mg,0.077mmol)在无水DMF(5mL)中的搅拌的溶液中加入DIEA(78μL,0.1mmol)并将混合物在室温搅拌过夜。然后在室温减压除去溶剂并通过柱色谱[先后(SiO2,EtOAc/MeOH 10-20％)和两次(SiO2,EtOAc/MeOH 15％)]纯化残余物，得到(1S)-1-(氯甲基)-3-((2E)-3-{4-((1E)-3-{(1S)-1-(氯甲基)-5-[(6-甲基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基)氧基]-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基}-3-氧代-1-丙烯基)-2-[(3-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}丙酰基)氨基]苯基}-2-丙烯酰基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-5-基β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯8(化合物编号84)(31mg,34％)，其为黄色固体。HPLC纯度95.9％；1H NMR(300MHz,[(CD3)2SO]δ10.01(s,1H),8.32(s,2H),8.31(d,J＝8.6Hz,2H),8.09(d,J＝8.2Hz,1H),7.89-7.95(m,3H),7.84(t,J＝7.6Hz,2H),7.77(d,J＝8.0Hz,1H),7.70(d,J＝15.1Hz,1H),7.58(t,J＝7.9Hz,2H),7.43(t,J＝8.0Hz,2H),7.27(d,J＝15.6Hz,2H),6.96(s,2H),5.67(d,J＝5.3Hz,1H),5.66(d,J＝5.3Hz,1H),5.45(d,J＝5.6Hz,2H),5.35(d,J＝4.6Hz,2H),5.16(d,J＝7.5Hz,2H),4.52-4.62(m,4H),4.33(br s,2H),3.99-4.04(m,4H),3.93(dd,J＝7.4,10.5Hz,2H),3.68(s,3H),3.67(s,3H),3.37-3.48(m,8H),2.57-2.61(m,2H),2.09(t,J＝7.3Hz,2H),1.41-1.54(m,4H),1.14-1.23(m,4H)；HRMS(ESI)C65H67Cl2N5NaO20(M+Na+)计算值m/z1330.3649；实测值m/z 1330.3600。
实施例30 (S)-(1-甲基-1H-吡咯-2,5-二基)二(((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯 并[e]吲哚-3(2H)-基)甲酮)(化合物编号15,表1,图45)
将1(500mg,3.22mmol)和N,N-二甲基甲酰胺二叔丁基缩醛(2,5.24g,25.77mmol)在NMP(10mL)中的混合物加热至100℃并搅拌过夜。减压除去大部分挥发性组分并将所得残余物在乙酸乙酯与水之间再次分配。用乙酸乙酯萃取水相三次。先后用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，以无水Na2SO4干燥并经硅胶垫过滤。除去溶剂并获得3，其为灰白色结晶性固体(331mg,38％)；1H NMR(DMSO)δ12.26(s,1H),6.68(d,J＝2.0Hz,2H),1.51(s,18H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 290.1362(M+Na)。C14H21NNaO4需要290.1363。
将3(50mg,0.18mmol)、K2CO3(52mg,0.37mmol)、MeI(0.12mL,1.87mmol)和四丁基碘化铵(3.5mg,0.0094mmol)在MeCN(1mL)和水(0.01mL)中的混合物在35-40℃加热并搅拌3天。将反应混合物在乙酸乙酯与水之间再次分配。用乙酸乙酯萃取水相三次。先后用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，以无水Na2SO4干燥并经硅胶垫过滤。除去溶剂并获得4，其为灰白色油状物，所述油状物在数小时内变成无色结晶性固体(45mg,86％)；1H NMR(CDCl3)δ6.77(s,2H),4.21(s,3H),1.56(s,18H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z304.1512(M+Na)。C15H23NNaO4需要304.1519。
在室温向4(45mg,0.16mmol)在DCM(1mL)中的溶液中加入TFA(0.5mL,6.49mmol)。将混合物搅拌3h，得到粉色溶液。泵除全部挥发性组分并用石油醚研磨所得残余物，得到5，其为粉色固体(25mg,93％)。1H NMR(DMSO)δ12.81(s,2H),6.80(s,2H),4.15(s,3H)ppm。HRMS(ESI-)实测值m/z168.0306(M-H)。C7H6NO4需要168.0302。
在室温向Boc-CBI-OH(化合物51a,130mg,0.39mmol)在DCM(2mL)中的溶液中加入4N HCl/二噁烷(2mL)。将混合物搅拌2.5h。泵除全部挥发性组分并按原样直接使用所得残余物(6)。
将6(上文制备)、5(22mg,0.13mmol)、EDCI盐酸盐(150mg,0.78mmol)和甲苯磺酸(2.2mg,0.013mmol)在DMA(2mL)中的混合物在室温搅拌过夜。泵除大部分溶剂并将所得残余物在乙酸乙酯与水之间再次分配。用乙酸乙酯萃取水相三次。先后用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，以无水Na2SO4干燥并经硅藻土垫过滤。除去溶剂并通过使用MeOH和DCM的混合物(v/v 2％)作为洗脱剂的硅胶柱色谱纯化所得残余物，得到7(化合物编号15,表1)，其为灰白色固体(60mg,77％)。1H NMR(DMSO)δ10.43(s,2H),8.12(d,J＝8.3Hz,2H),7.83(d,J＝8.3Hz,2H),7.73(br s,2H),7.52(dd,J＝1.0,8.0Hz,2H),7.37(dd,J＝0.4,8.0Hz,2H),6.77(s,2H),4.62-4.57(m,2H),4.31-4.27(m,2H),4.10-4.07(m,2H),4.02-4.00(m,2H),3.88-3.85(m,5H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 622.1255(M+Na)。C33H27Cl2N3NaO4需要622.1271。
实施例31 N-(2,5-二((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)- 基)-3-氧代丙-1-烯基)苯基)乙酰胺(化合物编号16,表1,图46)
在冰浴中向1(66f,500mg,1.45mmol)在THF(5mL)和吡啶(5mL)中的溶液中加入乙酰氯(0.50mL,7.03mmol)。将混合物温热至室温并搅拌过夜。泵除全部挥发性组分并将所得残余物在乙酸乙酯与碳酸氢钠水溶液之间再次分配。用乙酸乙酯萃取水相三次。先后用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，以无水Na2SO4干燥并经硅藻土垫过滤。除去溶剂并通过使用乙酸乙酯和石油醚的混合物(v/v 1:2)作为洗脱剂的硅胶柱色谱纯化所得残余物，得到2，其为灰白色固体(475mg,85％)；1H NMR(CDCl3)δ8.00(s,1H),7.70(d,J＝15.8Hz,1H),7.55-7.51(m,2H),7.31(表观d,J＝8.6Hz,2H),6.40(d,J＝16.0Hz,1H),6.37(d,J＝15.8Hz,1H),2.25(s,3H),1.54(s,9H),1.53(s,9H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 410.1921(M+Na)。C22H29NNaO5需要410.1938。
在室温向2(470mg,1.21mmol)在DCM(5mL)中的溶液中加入TFA(2.5mL,32.40mmol)。将混合物搅拌3h，得到白色悬浮液。加入更多DCM以析出更多固体，经由过滤收集该固体并用乙酸乙酯和石油醚洗涤。获得3，其为白色固体(290mg,87％)。1H NMR(DMSO)δ12.40(br s,2H),9.89(s,1H),7.85(d,J＝8.3Hz,1H),7.70(表观d,J＝16.0Hz,2H),7.57-7.53(m,2H),6.54(d,J＝15.9Hz,1H),6.53(d,J＝16.0Hz,1H),2.09(s,3H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z298.0672(M+Na)。C14H13NNaO5需要298.0686。
在室温向Boc-CBI-OH(化合物51a,291mg,0.87mmol)在DCM(3mL)中的溶液中加入4N HCl/二噁烷(3mL)。将混合物搅拌2.5h。泵除全部挥发性组分并按原样直接使用所得残余物(4)。
将4(上文制备)、3(80mg,0.29mmol)、EDCI盐酸盐(334mg,1.74mmol)和甲苯磺酸(5mg,0.029mmol)在DMA(3mL)中的混合物在室温搅拌过夜。泵除全部挥发性组分并用甲醇研磨所得残余物若干次，得到粗产物(123mg)，将其溶于THF中并通过加入MeOH使其析出，得到5(化合物编号16,表1)，其为黄色固体(96mg,47％,HPLC纯度97％)；1H NMR(DMSO)δ10.43(s,2H),9.97(s,1H),8.12-8.07(m,5H),7.85-7.81(m,4H),7.74(表观d,J＝6.7Hz,1H),7.68(d,J＝15.4Hz,1H),7.73(t,J＝7.4Hz,2H),7.35(t,J＝7.5Hz,2H),7.26(dd,J＝3.2,15.3Hz,2H),4.58-4.46(m,4H),4.28-4.22(m,2H),4.05-3.98(m,2H),3.88-3.82(m,2H),2.15(s,3H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 728.1662(M+Na)。C40H33Cl2N3NaO5需要728.1689。
实施例32 (S,2E,2’E)-3,3’-(2-甲氧基-1,4-亚苯基)二(1-((S)-1-(氯甲基)-5- 羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)丙-2-烯-1-酮)(化合物编号17,表1,图47)
在干冰-MeCN浴中在-30至-40℃在N2下向1(2.50g,13.30mmol)在无水THF(12mL)中的溶液中滴加三氟化硼乙醚合物(BF3·Et2O,4.92mL,39.90mmol)。将混合物在-30℃搅拌10min，滴加tBuONO(2.39mL,19.94mmol)。将混合物温热至室温并搅拌1.5h，得到悬浮液。加入石油醚(50mL)，得到更多析出物。通过倾出除去上清液并用石油醚洗涤留下的固体，得到白色固体。将该固体溶于无水MeCN(20mL)中并在冰浴中冷却。加入KI(11.00g,66.26mmol)和I2(6.00g,23.64mmol)。将反应混合物在室温搅拌4h，然后加入饱和Na2S2O3溶液(50mL)以淬灭反应混合物。用乙酸乙酯萃取混合物3次。先后用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，以无水Na2SO4干燥并经硅藻土垫过滤。除去溶剂并通过使用乙酸乙酯和石油醚的混合物(v/v1:9)作为洗脱剂的硅胶柱色谱纯化所得残余物，得到2，其为灰白色固体(2.83g,71％)；1HNMR(CDCl3)δ7.50(d,J＝8.5Hz,1H),7.16(d,J＝2.2Hz,1H),6.84(dd,J＝2.2,8.5Hz,1H),5.39(s,1H)ppm。
将2(500mg,1.67mmol)、丙烯酸叔丁酯(0.728mL,5.02mmol)、乙酸钯(II)(7.5mg,0.033mmol)和三邻甲苯基膦(41mg,0.13mmol)在重蒸的三乙胺(5mL)中的混合物在N2下回流加热过夜，得到暗灰色悬浮液。泵除全部挥发性组分。将所得残余物溶于乙酸乙酯中并滤出析出物。蒸发滤液并通过使用乙酸乙酯和石油醚的混合物(v/v 1:6)作为洗脱剂的柱色谱纯化所得残余物，得到3(160mg,28％)，其为灰白色固体。1H NMR(DMSO)δ10.43(s,1H),7.75(d,J＝16.4Hz,1H),7.63(d,J＝8.4Hz,1H),7.45(d,J＝16.0Hz,1H),7.18(d,J＝8.0Hz,1H),7.07(d,J＝0.8Hz,1H),6.56(d,J＝16.4Hz,1H),6.41(d,J＝15.6Hz,1H),1.483(s,9H),1.478(s,9H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 369.1687(M+Na)。C20H26NaO5需要369.1672。
向3(160mg,0.46mmol)在DMF(2mL)中的溶液中加入K2CO3(254mg,1.84mmol)和MeI(0.28mL,4.50mmol)。将混合物在室温搅拌过夜并滤出析出物。先后用水和盐水洗涤所得滤液，以无水Na2SO4干燥并经硅藻土垫过滤。除去溶剂并通过使用乙酸乙酯和石油醚的混合物(v/v 1:10)作为洗脱剂的硅胶柱色谱纯化所得残余物，得到4，其为无色油状物(72mg,43％)；1H NMR(CDCl3)δ7.87(d,J＝16.2Hz,1H),7.54(d,J＝15.9Hz,1H),7.49(d,J＝8.0Hz,1H),7.10(dd,J＝1.3,8.0Hz,1H),7.00(d,J＝1.2Hz,1H),6.47(d,J＝16.1Hz,1H),6.38(d,J＝15.9Hz,1H),3.91(s,3H),1.539(s,9H),1.533(s,9H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z383.1838(M+Na)。C21H28NaO5需要383.1829。
在室温向4(70mg,0.19mmol)在DCM(2mL)中的溶液中加入TFA(1mL,12.98mmol)。将混合物搅拌2.5h，得到白色悬浮液。泵除全部挥发性组分并用DCM和乙酸乙酯研磨所得残余物，得到5，其为白色固体(41mg,85％)。1H NMR(DMSO)δ12.41(br s,2H),7.80(d,J＝16.2Hz,1H),7.72(d,J＝8.0Hz,1H),7.58(d,J＝16.0Hz,1H),7.41(d,J＝1.2Hz,1H),7.30(dd,J＝1.0,8.1Hz,1H),6.47(d,J＝16.0Hz,1H),6.38(d,J＝16.1Hz,1H),3.92(s,3H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z271.0573(M+Na)。C13H12NaO5需要271.0577。
在室温向Boc-CBI-OH(化合物51a,161mg,0.48mmol)在DCM(2mL)中的溶液中加入4N HCl/二噁烷(2mL)。将混合物搅拌2.5h。泵除全部挥发性组分并按原样直接使用所得残余物(6)。
将6(上文制备)、5(40mg,0.16mmol)、EDCI盐酸盐(185mg,0.97mmol)和甲苯磺酸(2.8mg,0.016mmol)在DMA(1mL)中的混合物在室温搅拌过夜。泵除全部挥发性组分并用甲醇研磨所得残余物，得到黄色固体，将其溶于THF中并通过加入甲醇使其析出，得到7(化合物编号17,表1)，其为黄色固体(45mg,41％,HPLC纯度98％)；1H NMR(DMSO)δ10.43(s,2H),8.12-8.10(m,4H),8.00-7.95(m,2H),7.85-7.80(m,2H),7.72(d,J＝15.4Hz,1H),7.54-7.50(m,4H),7.37-7.26(m,4H),4.57-4.45(m,4H),4.28-4.22(m,2H),4.00-3.99(m,5H),3.90-3.83(m,2H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 701.1596(M+Na)。C39H32Cl2N2NaO5需要701.1580。
实施例33 (S,2E,2’E)-3,3’-(1-甲基-1H-吡咯-2,5-二基)二(1-((S)-1-(氯甲 基)-5-羟基-1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)丙-2-烯-1-酮)(化合物编号18,表1,图48)
使用文献方法(参见Russ J Org Chem,2007,43,855-860)制备1。
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将1(50mg,0.41mmol)、K2CO3(112mg,0.81mmol)、MeI(0.25mL,4.06mmol)和四丁基碘化铵(7.5mg,0.020mmol)在MeCN(2mL)和水(0.02mL)中的混合物在40℃加热并搅拌3h。减压除去大部分挥发性组分并将所得残余物在乙酸乙酯与水之间再次分配。用乙酸乙酯萃取水相三次。先后用水和盐水洗涤合并的有机萃取物，以无水Na2SO4干燥且经硅胶垫过滤。除去溶剂并获得2，其为白色固体(47mg,84％)；其1H NMR图谱与所报道的图谱相同(参见C.E.Loader,G.H.Barnett和H.J.Anderson,Can.J.Chem.,1982,60,383)。
4
将2(40mg,0.29mmol)和(三苯基亚正膦烷基)乙酸甲酯(3,400mg,1.20mmol)在DCM(3mL)中的混合物搅拌2天，得到黄色溶液。通过使用乙酸乙酯与石油醚的梯度混合物(v/v＝1:5、1:4和1:3)作为洗脱剂的硅胶柱色谱纯化混合物，得到4，其为黄色固体(63mg,87％)；1H NMR(CDCl3)δ7.61(d,J＝15.6Hz,2H),6.70(s,2H),6.26(d,J＝15.6Hz,2H),3.79(s,6H),3.73(s,3H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 272.0898(M+Na)。C13H15NNaO4需要272.0893。
5
将4(60mg,0.24mmol)和KOH(100mg,1.78mmol)在EtOH(2mL)和THF(1mL)中的混合物在70℃搅拌2h。减压蒸发混合物至干。将所得残余物溶于水中并用1N HCl酸化直至pH 5，得到黄色析出物，经由过滤收集所述析出物，然后用水和石油醚洗涤，得到5，其为黄色固体(51mg,96％)；1H NMR(DMSO)δ12.20(s,2H),7.54(d,J＝15.6Hz,2H),6.89(s,2H),6.30(d,J＝15.6Hz,2H),3.70(s,3H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 244.0590(M+Na)。C11H11NNaO4需要244.0580。
7
在室温向Boc-CBI-OH(化合物51a,200mg,0.60mmol)在DCM(2mL)中的溶液中加入4N HCl/二噁烷(10mL)。将混合物搅拌2h。泵除全部挥发性组分并按原样直接使用所得残余物(6,化合物67d)。
将6(上文制备)、5(49mg,0.22mmol)、EDCI盐酸盐(255mg,1.33mmol)和甲苯磺酸(3.8mg,0.022mmol)在DMA(2mL)中的混合物在室温搅拌过夜。除去溶剂并通过使用MeOH与乙酸乙酯的混合物(v/v 3％)的硅胶柱色谱纯化所得残余物且用乙酸乙酯研磨粗产物，得到7，其为橙色固体(60mg,41％,HPLC 100％)；1H NMR(DMSO)δ10.41(s,2H),8.11(d,J＝8.2Hz,4H),7.81(d,J＝8.3Hz,2H),7.70(d,J＝14.9Hz,2H),7.50(t,J＝7.4Hz,2H),7.33(t,J＝7.5Hz,2H),7.12(s,2H),7.01(d,J＝14.9Hz,2H),4.49-4.42(m,4H),4.24-4.19(m,2H),4.01-3.97(m,2H),3.85-3.82(m,5H)ppm。HRMS(ESI-)实测值m/z650.1600(M-H)。C37H30Cl2N3O4需要650.1619。
实施例34 (S)-3,3’-(2-甲氧基-1,4-亚苯基)二(1-((S)-1-(氯甲基)-5-羟基- 1H-苯并[e]吲哚-3(2H)-基)丙-2-炔-1-酮)(化合物19,表1,图49)
2
通过基于US2007/49758所述操作的改进操作合成化合物2。向1(5.50g,25.00mmol)和乙酸银(I)(6.26g,37.5mmol)在DCM(100mL)中的悬浮液中滴加碘(6.98g,27.50mmol)在DCM(150mL)中的溶液。将所得混合物在室温搅拌过夜，然后经硅藻土垫过滤。蒸发滤液并通过使用乙酸乙酯和石油醚的混合物(v/v 1:10)作为洗脱剂的硅胶柱色谱纯化所得残余物，得到2，其为白色固体(966mg,11％)；mp 97-99℃。1H NMR(CDCl3)δ7.342(d,J＝8.3Hz,1H),7.339(d,J＝2.0Hz,1H),7.00(dd,J＝2.0,8.3Hz,1H),5.32(s,1H)ppm。13CNMR(CDCl3,100.6MHz)δ155.70,139.46(CH),131.80(CH),124.44(CH),94.65,85.52ppm。
3
向2(270mg,0.78mmol)在DMF(4mL)中的溶液中加入K2CO3(162mg,1.17mmol)和MeI(0.24mL,3.90mmol)。将混合物在室温搅拌2h。经硅胶垫过滤混合物并蒸发滤液，得到3，其为无色油状物(277mg,99％)；1H NMR(CDCl3)δ7.45(d,J＝8.1Hz,1H),7.09(d,J＝1.8Hz,1H),7.04(dd,J＝1.8,8.1Hz,1H),3.87(s,3H)ppm。
4
将3(274mg,0.76mmol)、丙炔酸叔丁酯(0.314mL,2.28mmol)、碘化亚铜(I)(5.8mg,0.030mmol)、乙酸钯(II)(3.4mg,0.015mmol)和三苯基膦(12mg,0.046mmol)在重蒸的三乙胺(5mL)中的混合物在60℃在N2下加热过夜，得到暗色悬浮液。泵除全部挥发性组分。将所得残余物与DCM搅拌并滤出析出物。蒸发滤液并通过使用DCM与石油醚的混合物(v/v＝1:1)作为洗脱剂的硅胶柱色谱纯化所得残余物，得到4(195mg,72％)，其为灰白色固体。1H NMR(CDCl3)δ7.48(d,J＝7.9Hz,1H),7.13(d,J＝7.9Hz,1H),7.06(s,1H),3.89(s,3H),1.545(s,9H)和1.514(s,9H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 379.1510(M+Na)。C21H24NaO5需要379.1516。
5
在室温向4(100mg,0.28mmol)在DCM(2mL)中的溶液中加入TFA(1mL,12.98mmol)。将混合物搅拌2.5h，得到白色悬浮液。泵除全部挥发性组分并用DCM与石油醚的混合物(v/v＝1:1)研磨所得残余物，得到5，其为白色固体(66mg,96％)。1H NMR(DMSO)δ13.92(br s,2H),7.61(d,J＝7.9Hz,1H),7.37(表观s,1H),7.25(dd,J＝1.1,7.9Hz,1H),3.90(s,3H)ppm。
7
在室温向Boc-CBI-OH(化合物51a,267mg,0.80mmol)在DCM(3mL)中的溶液中加入4N HCl/二噁烷(3mL)。将混合物搅拌2.5h。泵除全部挥发性组分并按原样直接使用所得残余物(6)。
将6(上文制备)、5(65mg,0.27mmol)、EDCI盐酸盐(306mg,1.60mmol)和甲苯磺酸(4.6mg,0.027mmol)在DMA(1mL)中的混合物在室温搅拌过夜。泵除全部挥发性组分并用甲醇研磨所得残余物，得到黄色固体，将其溶于THF中并通过加入甲醇使其析出，得到7，其为黄色固体(140mg,78％,HPLC纯度99％)；1H NMR(DMSO)δ10.52(s,2H),8.12(d,J＝8.4Hz,2H),7.90-7.85(m,4H),7.76(d,J＝7.9Hz,1H),7.56-7.50(m,3H),7.41-7.37(m,3H),4.63-4.49(m,4H),4.29-4.21(m,2H),4.09-4.06(m,2H),4.01(s,3H),3.99-3.94(m,1H),3.91-3.86(m,1H)ppm。HRMS(ESI)实测值m/z 697.1267(M+Na)。C39H28Cl2N2NaO5需要697.1267。
实施例19 通过还原和再氧化制备用于缀合的半胱氨酸工程化抗体
在某些条件下，半胱氨酸工程化抗体可对与本发明的接头-药物中间体(诸如表4中的那些)缀合变得具有反应性，通过用诸如DTT(Cleland试剂,二硫代苏糖醇)或TCEP(三(2-羧基乙基)膦盐酸盐；Getz等(1999)Anal.Biochem.Vol 273:73-80；Soltec Ventures,Beverly,MA)那样的还原剂进行处理。将在CHO细胞中表达的全长半胱氨酸工程化单克隆抗体(ThioMab)(Gomez等(2010)Biotechnology and Bioeng.105(4):748-760；Gomez等(2010)Biotechnol.Prog.26:1438-1445)还原，例如用约50倍过量的DTT在室温过夜以还原可能在新引入的半胱氨酸残基与存在于培养基中的半胱氨酸之间形成的二硫键。
轻链氨基酸依照Kabat(Kabat等,Sequences of proteins of immunologicalinterest,(1991)5th Ed.,USDept of Health and Human Service,National Institutesof Health,Bethesda,MD)编号。重链氨基酸依照EU编号系统(Edelman等(1969)Proc.Natl.Acad.of Sci.63(1):78-85)编号，除了注释为Kabat系统的情况。使用单字母氨基酸缩写。
在CHO细胞中表达的全长半胱氨酸工程化单克隆抗体(ThioMab)携带半胱氨酸加合物(胱氨酸)或在工程化半胱氨酸上谷胱甘肽化，这取决于细胞培养条件。为了释放工程化半胱氨酸的反应性巯基，将ThioMab溶于约pH 8.0的500mM硼酸钠和500mM氯化钠中并用约50-100倍过量的1mM TCEP(盐酸三(2-羧乙基)膦)(Getz等(1999)Anal.Biochem.Vol273:73-80；Soltec Ventures,Beverly,MA)在37℃还原约1-2小时。可选择地，可使用DTT作为还原剂。通过非还原性SDS-PAGE或通过变性反相HPLC PLRP柱色谱监测链间二硫键的形成。将还原后的ThioMab在pH 5的10mM乙酸钠中稀释并装载到HiTrap SP FF柱上并用含有0.3M氯化钠的PBS或含有150mM氯化钠的50mM Tris-Cl,pH 7.5洗脱。
通过进行再氧化使二硫键在亲代Mab中存在的半胱氨酸残基之间重新形成。将洗脱的还原后的ThioMab用15×或2mM脱氢抗坏血酸(dhAA)在pH 7处理3小时或在50mM Tris-Cl,pH 7.5中处理3小时或用2mM硫酸铜(CuSO4)水溶液在室温处理过夜。可使用本领域中已知的其它氧化剂(即氧化试剂)和氧化条件。环境空气氧化也会是有效的。该温和的部分再氧化步骤有效且高保真地形成链内二硫键。通过在Sephadex G25树脂上洗脱来交换缓冲液并用含1mM DTPA的PBS洗脱。自溶液在280nm处的吸光度确定还原后的抗体浓度及通过与DTNB(Aldrich,Milwaukee,WI)反应并测定在412nm处的吸光度来确定巯基浓度，由此检查巯基/抗体值。
在质量范围扩大的TSQ Quantum Triple quadrupoleTM质谱仪(Thermo Electron,San Jose California)上进行液相色谱/质谱分析。在加热至75℃的1000A,微孔柱(50mm×2.1mm,Polymer Laboratories,Shropshire,UK)上对样品进行色谱纯化。使用30-40％B的线性梯度(溶剂A:0.05％TFA/水,溶剂B:0.04％TFA/乙腈)并使用电喷雾源将洗脱液直接电离。通过数据系统收集数据并使用(Novatia,LLC,NewJersey)实施解卷积。在LC/MS分析之前，将抗体或药物缀合物(50微克)用PNGase F(2单位/ml；PROzyme,San Leandro,CA)在37℃处理2小时以除去N-连接的碳水化合物。
将疏水相互作用色谱(HIC)样品注射到Butyl HIC NPR柱(2.5微米粒度,4.6mm×3.5cm)上并以0.8ml/min用0至70％B的线性梯度(A:1.5M硫酸铵/50mM磷酸钾,pH 7,B:50mM磷酸钾,pH 7,20％异丙醇)洗脱。使用配备有多波长检测器和Chemstation软件的Agilent1100系列HPLC系统来解析并定量具有不同药物与抗体比例的抗体种类。
实施例20 接头-药物中间体与抗体的缀合
在实施例19的还原和再氧化操作后，将抗体溶于PBS(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液中并在冰上冷却。将具有巯基反应性官能团(诸如马来酰亚氨基或溴乙酰胺)的过量(约1.5摩尔浓度至20当量)接头-药物中间体(包括但不限于表4中的51-68)溶于DMSO中，在乙腈和水中稀释并添加至在PBS中经冷却的还原后再氧化的抗体。1小时后，添加过量马来酰亚胺以淬灭反应混合物并封闭任何未反应的抗体巯基。装载缀合混合物并经HiTrap SP FF柱洗脱以除去过量药物-接头中间体和其它杂质。通过离心超滤浓缩反应混合物并通过在PBS中经G25树脂洗脱将半胱氨酸工程化抗体药物缀合物纯化且脱盐，在无菌条件下经0.2μm滤器过滤并冷冻以供保存。
通过上述操作，制备表5的半胱氨酸工程化抗体药物缀合物101-133。
实施例21 体外细胞增殖测定
通过采用下述实验方案的细胞增殖测定来测量ADC的效力(CELLTITER GLOTMLuminescent Cell Viability Assay,Promega Corp.Technical Bulletin TB288；Mendoza等(2002)Cancer Res.62:5485-5488)：
1.在壁不透明的96孔板的每个孔中沉积在培养基中含有约104个细胞(SKBR-3、BT474、MCF7或MDA-MB-468)的100μl细胞培养物等分试样。
2.制备含有培养基但不含细胞的对照孔。
3.将ADC添加至实验孔并温育3-5天。
4.将板平衡至室温且保持约30分钟。
5.添加体积与每个孔中存在的细胞培养基的体积相等的CELLTITER GLOTM试剂。
6.在轨道摇床上将内容物混合2分钟以诱导细胞裂解。
7.将板在室温温育10分钟以稳定发光信号。
8.以RLU＝相对发光单位记录发光并在图中报告。
以每组一式多份的发光平均值及标准偏差误差条绘制数据。实验方案是CELLTITER GLOTM Luminescent Cell的改进。
培养基：SK-BR-3在50/50/10％FBS/谷氨酰胺/250μg/mL G-418中生长，OVCAR-3在RPMI/20％FBS/谷氨酰胺中生长。
实施例22 高度表达HER2转基因外植体的小鼠和其它肿瘤模型中的肿瘤生长抑制体内功效
建立肿瘤并在第0天单一治疗前使其生长至体积为150-200mm3(如使用卡尺所测量)。根据下式使用卡尺测量肿瘤体积：V(mm3)＝0.5A×B2，其中A和B分别为长径和短径。在肿瘤体积达到3000mm3或当肿瘤显示即将发生溃疡迹象时处死小鼠。从各实验组(10只小鼠/组)收集的数据表示为平均值±SE。
采用Fo5小鼠乳腺肿瘤模型来评价本发明的抗体-药物缀合物在单剂静脉内注射后的体内功效且如先前所述(Phillips GDL,Li GM,Dugger DL等.Targeting HER2-Positive Breast Cancer with Trastuzumab-DM1,an Antibody-Cytotoxic DrugConjugate.(2008)Cancer Res.68:9280-90)，将其通过引用的方式并入本文。用Fo5模型测试抗Her2ADC，而Fo5模型是一种转基因小鼠模型，其中在乳腺上皮中在鼠乳腺肿瘤病毒启动子的转录调节下过表达人HER2基因(MMTV-HER2)，如图31和32所示。HER2过表达引起乳腺肿瘤的自发形成。通过连续移植肿瘤碎片(约2×2mm尺寸)在FVB小鼠的后续世代中繁殖这些建立者动物(建立者#5[Fo5])之一的乳腺肿瘤。所有研究依照“Guide for the Care andUse of Laboratory Animals”进行。在研究开始时及在移植后14天给9只动物静脉内服用每种抗体-药物缀合物(单剂量)。初始肿瘤尺寸为约200mm3体积。本发明抗体-药物缀合物和对照随时间对肿瘤生长抑制的测量结果示于图31-34中。
如所述(Chen等(2007)Cancer Res 67:4924-4932)那样采用OVCAR-3乳腺脂肪垫移植效力模型，评价单一静脉内剂量后的肿瘤体积并使用从携带腹膜内肿瘤的小鼠切除的肿瘤，然后连续传代至受体小鼠的乳腺脂肪垫中(图33)。
在Igrov-1(人卵巢癌)的小鼠异种移植物模型中研究抗Napi2B抗体-药物缀合物(ADC)的效力。
将雌性C.B-17SCID-米色小鼠(Charles River Laboratories；San Diego,CA)各自在胸椎乳腺脂肪垫区域植入500万个Igrov-1细胞。当异种移植物肿瘤达到100-300mm3的平均肿瘤体积(称为第0天)时，将动物随机分成每组7-10只小鼠并接受ADC的单一静脉内注射。整个研究期间，每周测量1-2次肿瘤和小鼠的体重。当体重减轻大于其起始重量的20％时，立即将小鼠处死。在肿瘤体积达到3000mm3或显示即将发生溃疡迹象前处死所有小鼠。与媒介物组比较，抗Napi2B抗体-药物缀合物(ADC134)显示出对肿瘤生长的剂量依赖性抑制。非靶向对照(ADC137)对肿瘤生长没有影响(图36)。
在HL-60或EOL-1(人急性骨髓性白血病)的小鼠异种移植模型中研究抗CD33抗体-药物缀合物(ADC)的效力。HL-60细胞系得自ATCC(American Type Culture Collection；Manassas,VA)且EOL-1细胞系源自DSMZ(German Collection of Microorganisms和CellCultures；Braunschweig,Germany)。
将雌性C.B-17SCID小鼠(Charles River Laboratories；Hollister,CA)各自在胁腹区域皮下植入500万个HL-60或EOL-1细胞。当异种移植物肿瘤达到100-300mm3的平均肿瘤体积(称为第0天)时，将动物随机分成每组7-10只小鼠并接受ADC的单一静脉内注射。给予ADC前约4小时，对动物腹膜内给予过量(30mg/kg)的抗gD对照抗体以阻断在肿瘤细胞上可能的非特异性抗体结合位点。整个研究期间，每周测量1-2次肿瘤和小鼠的体重。当体重减轻大于其起始重量的20％时，立即将小鼠处死。在肿瘤体积达到3000mm3或显示即将发生溃疡迹象前处死所有小鼠。
尽管已通过例证和实施例的方式相当详细地描述了前述发明以便清楚理解，但是说明书和实施例不应当被解释为限制本发明的范围。将整个说明书中引用的所有专利、专利申请和参考文献通过引用的方式明确并入本文。

Claims (37)

1.具有下式的抗体-药物缀合物化合物：
Ab-(L-D)p
其中：
Ab是抗体；
L是具有下式的接头：
-Str-(Pep)m-(Sp)n-
其中Str是与抗体共价连接的延伸单元；Pep是具有2至12个氨基酸残基的任选肽单元，Sp是与二聚体药物部分共价连接的任选间隔基单元，且m和n独立地选自0和1；
p是1至8的整数；
D是具有下式的二聚体药物部分：
其中
R1选自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb或与L的键；
R2选自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb或与L的键；
Ra和Rb独立地选自H和任选取代有一个或多个F的C1-C6烷基，
或Ra和Rb形成五元或六元杂环基；
T是选自以下的束缚基团：C3-C12亚烷基、Y、(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)、(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)、(C2-C6亚烯基)-Y-(C2-C6亚烯基)和(C2-C6亚炔基)-Y-(C2-C6亚炔基)；
其中Y独立地选自O、S、NR1、芳基和杂芳基；
其中亚烷基、亚烯基、芳基和杂芳基独立地且任选地取代有F、OH、O(C1-C6烷基)、NH2、NHCH3、N(CH3)2、OP(O)3H2和C1-C6烷基，其中烷基任选地取代有一个或多个F；
或亚烷基、亚烯基、芳基和杂芳基独立地且任选地取代有与L的键；
D’是选自以下的药物部分：
其中波浪线表示与T连接的位点；
X1和X2独立地选自O和NR3，其中R3选自H和任选地取代有一个或多个F的C1-C6烷基；
R4为H、CO2R或与L的键，其中R为C1-C6烷基或苄基；且
R5为H或C1-C6烷基；其中所述抗体与Napi2b结合。
2.权利要求1的抗体-药物缀合物化合物，其中Str具有下式：
其中R6选自C1-C10亚烷基、C3-C8碳环基、O-(C1-C8烷基)、亚芳基、C1-C10亚烷基-亚芳基、亚芳基-C1-C10亚烷基、C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)、(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基、C3-C8杂环基、C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)、(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基、C1-C10亚烷基-C(O)N(R8)-C2-C6亚烷基-N(R8)、N(R8)-(C2-C6亚烷基)和(CH2CH2O)r-CH2；其中R8为H或C1-C6烷基，且r为1至10的整数。
3.权利要求2的抗体-药物缀合物化合物，其中R6为(CH2)5。
4.权利要求1的抗体-药物缀合物化合物，其中m为0，且n为0。
5.权利要求1的抗体-药物缀合物化合物，其中m为0，且n为1。
6.权利要求1的抗体-药物缀合物化合物，其中Str具有下式：
其中R7选自C1-C10亚烷基、C1-C10亚烷基-O、N(R8)-(C2-C6亚烷基)-N(R8)、N(R8)-(C2-C6亚烷基)和(CH2CH2O)r-CH2；其中R8为H或C1-C6烷基，且r为1至10的整数。
7.权利要求1的抗体-药物缀合物化合物，其中Str具有下式：
其中R9选自C1-C10亚烷基、C1-C10亚烷基-O、(C2-C6亚烷基)-N(R8)和(CH2CH2O)r-CH2；其中R8为H或C1-C6烷基，且r为1至10的整数。
8.权利要求7的抗体-药物缀合物化合物，其中L与所述抗体的半胱氨酸氨基酸形成二硫键，且R9为C2-C6亚烷基-O，其中亚烷基任选地取代有F、OH、O(C1-C6烷基)、NH2、NHCH3、N(CH3)2、OP(O)3H2和C1-C6烷基，其中烷基任选地取代有一个或多个F。
9.权利要求1的抗体-药物缀合物化合物，其中m为1，且n为1。
10.权利要求1的抗体-药物缀合物化合物，其中m为1，且Pep包含2至12个独立地选自甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、缬氨酸和瓜氨酸的氨基酸残基。
11.权利要求10的抗体-药物缀合物化合物，其中Pep为缬氨酸-瓜氨酸。
12.权利要求1的抗体-药物缀合物化合物，其中n为1，且Sp包含对氨基苄基或对氨基苄基氧基羰基。
13.权利要求9的抗体-药物缀合物化合物，其具有下式：
其中AA1和AA2独立地选自氨基酸侧链；p为1至8的整数。
14.权利要求13的抗体-药物缀合物化合物，其中所述氨基酸侧链独立地选自H、-CH3、-CH2(C6H5)、-CH2CH2CH2CH2NH2、-CH2CH2CH2NHC(NH)NH2、-CHCH(CH3)CH3和-CH2CH2CH2NHC(O)NH2。
15.权利要求14的抗体-药物缀合物化合物，其具有下式：
16.权利要求15的抗体-药物缀合物化合物，其具有下式：
17.权利要求16的抗体-药物缀合物化合物，其具有下式：
18.权利要求9的抗体-药物缀合物化合物，其具有下式：
19.权利要求18的抗体-药物缀合物化合物，其具有下式：
20.权利要求9的抗体-药物缀合物化合物，其具有下式：
21.权利要求20的抗体-药物缀合物化合物，其具有下式：
22.权利要求20的抗体-药物缀合物化合物，其具有下式：
其中R7独立地选自H和C1-C12烷基。
23.权利要求1的抗体-药物缀合物化合物，其中Ra和Rb形成选自N-甲基哌嗪基、吗啉基、哌啶基和吡咯烷基的五元或六元杂环基。
24.权利要求1的抗体-药物缀合物化合物，其中T为C3-C5亚烷基。
25.权利要求24的抗体-药物缀合物化合物，其中T选自(CH2)3、(CH2)4和(CH2)5。
26.权利要求1的抗体-药物缀合物化合物，其中T为(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)，其中Y为取代有与L的键的苯基。
27.权利要求1的抗体-药物缀合物化合物，其中T为(C2-C6亚烯基)-Y-(C2-C6亚烯基)，其中Y为取代有与L的键的苯基。
28.权利要求1的抗体-药物缀合物化合物，其中Y选自苯基、吡啶基、1-甲基-1H-苯并[d]咪唑和[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶。
29.权利要求1的抗体-药物缀合物化合物，其中D’为：
30.权利要求1的抗体-药物缀合物化合物，其中D’为：
31.权利要求1的抗体-药物缀合物化合物，其中D’为：
32.权利要求1的抗体-药物缀合物化合物，其中所述抗体包含3个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)和3个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)，其中：
HVR-L1包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；
HVR-L2包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；
HVR-L3包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；
HVR-H1包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；
HVR-H2包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和
HVR-H3包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。
33.权利要求32的抗体-药物缀合物化合物，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的轻链高变区或含有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的重链可变区。
34.权利要求32的抗体-药物缀合物化合物，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的轻链高变区和含有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的重链可变区。
35.一种药物组合物，其包含权利要求1至44中任一项的抗体-药物缀合物化合物和药学上可接受的载体、助流剂、稀释剂或赋形剂。
36.一种治疗癌症的方法，其包括向患者施用治疗有效量的权利要求35的药物组合物。
37.一种治疗癌症的试剂盒，其包含：
a)权利要求35的药物组合物；和
b)使用说明。
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