DE69824287T2

DE69824287T2 - Prostata stammzell-antigen (psca)

Info

Publication number: DE69824287T2
Application number: DE69824287T
Authority: DE
Inventors: Robert Reiter; N. Owen WITTE
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1997-03-10
Filing date: 1998-03-10
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2018-03-11
Also published as: ES2221982T3; AU739407B2; EP1514876B1; DE69824287D1; EP1514876A3; NZ337413A; EP1514876A2; US6267960B1; CA2281877A1; EP0981541A1; WO1998040403A1; EP2343085B1; EP2343085A3; AU6548198A; EP0981541B1; EP2343085A2; EP0981541A4; JP2010029209A; JP4404381B2; JP2002511740A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Prostatakrebs ist gegenwärtig die häufigste Krebsart bei amerikanischen Männer und die zweithäufigste Todesursache bei durch Krebs verursachtem Tod in dieser Population. In fortgeschrittenen Stadien bildet Prostatakrebs Metastasen, vorzugsweise in den Knochen, wo es zur Bildung osteoblastischer Läsionen kommt. Nach einer anfänglichen Behandlung mit Androgen-Ablationstherapie werden die meisten Prostata-Krebsleiden unempfänglich für Hormone und letal. Gegenwärtige diagnostische und therapeutische Vorgehensweisen sind aufgrund eines Mangels an Spezifität und der fehlenden Fähigkeit zur Voraussage, welche Patienten ein Risiko zur Entwicklung einer metastasierenden Krankheit tragen, beschränkt.
Die meisten Prostata-Krebsleiden treten anfänglich in der peripheren Zone der Prostatadrüse auf, von der Urethra entfernt. Tumoren in diesem Bereich können keine Symptome erzeugen und daher werden die meisten Männer mit Prostatakrebs im Frühstadium keine klinischen Symptome der Krankheit aufweisen, bis die Krankheit signifikant fortgeschritten ist. Das Fortschreiten des Tumors in die Übergangszone der Prostata kann zu einer Obstruktion der Urethra führen, wodurch es zu den ersten Krankheitssymptomen kommt. Diese klinischen Symptome lassen sich jedoch nicht von der gewöhnlich nicht-malignen Krankheit der benignen prostatischen Hyperplasie (BPH) unterscheiden.
Eines der grundlegenden Probleme bei der Diagnose und der Behandlung von Prostata-Krebsleiden liegt im Mangel an Markern, die lokalisierte Tumoren im Frühstadium genau nachweisen können. Obwohl einige Marker identifiziert wurden und einige, wie PSA, in der klinischen Anwendung weitverbreitet sind, muss der ideale Marker für Prostatakrebs erst noch identifiziert werden. Ein ähnliches Problem ist das Fehlen eines wirksamen prognostischen Markers zur Bestimmung, welche Krebsarten indolent sind und welche aggressiv sind bzw. aggressiv werden. PSA z. B., kann zwischen indolenten und aggressiven Krebsarten nicht genau unterscheiden. Zusätzlich besteht auch ein großer Bedarf an Markern, die als ideale, prostataspezifische Targets für therapeutische Verfahren dienen können, wie Antikörper-gerichtete Therapie, Immuntherapie und Gentherapie. Gegenwärtig gibt es keine wirksame Behandlung für die 20–40% an Patienten, bei denen nach einem chirurgischen Eingriff oder nach Bestrahlung die Krankheit wieder auftritt oder für jene Patienten, die zum Zeitpunkt der Diagnose metastasierende Krankheit aufweisen. Obwohl eine Hormon- Ablationstherapie bei solchen Patienten zu einer Linderung führen kann, schreiten die meisten jedoch unvermeidbar mit der Entwicklung einer unheilbaren, Androgen-unabhängigen Erkrankung fort (Lalani et al., 1997, Cancer Metastasis Rev. 16: 29–66).
Der frühe Nachweis und die Diagnose von Prostatakrebs beruht gegenwärtig auf digitalen rektalen Untersuchungen (DRE), Messungen des prostataspezifischen Antigens (PSA), transrektaler Ultrasonographie (TRUS) und transrektaler Nadelbiopsie (TRNB). Gegenwärtig stellt die Messung von PSA im Serum in Kombination mit DRE das führende Werkzeug dar, Prostatakrebs nachzuweisen und zu diagnostizieren. Beide Ansätze haben jedoch große Beschränkungen, die intensive Forschungsarbeiten angeregt haben, um bessere diagnostische Marker der Krankheit zu finden.
PSA ist heutzutage der am meisten benützte Tumormarker für das Screening, die Diagnose und die Überwachung von Prostatakrebs. Insbesondere sind einige Immunassays zum Nachweis von PSA im Serum in der klinischen Anwendung weitverbreitet. Kürzlich wurde eine reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) für PSA mRNA in Serum entwickelt. PSA ist jedoch kein krankheitsspezifischer Marker, da erhöhte PSA-Spiegel in einem großen Prozentsatz von Patienten nachweisbar ist, die BPH und Prostatitis aufweisen (25–86%) (Gao et al., 1997, Prostate 31: 264–281), als auch in anderen nichtmalignen Erkrankungen und bei einigen gesunden Männern. Dieser Faktor beschränkt die diagnostische Spezifität dieses Markers signifikant. Eine Erhöhung der Serumkonzentration von PSA zwischen 4–10 ng/ml wird z. B. bei BPH beobachtet, und sogar höhere Werte werden bei Prostatitis, insbesondere bei akuter Prostatitis beobachtet. BPH ist eine extrem häufige Erkrankung bei Männern. Die Tatsache, dass Erhöhungen der PSA-Konzentration auch ohne Anzeichen einer Erkrankung aus DRE-Analyse und umgekehrt beobachtet werden, macht die Situation noch verwirrender. Weiterhin ist es nun anerkannt, dass PSA nicht für die Prostata spezifisch ist (Gao et al., supra, zur Übersicht).
Verschiedene Verfahren, die entwickelt wurden, um die Spezifität des auf PSA basierenden Nachweises zu verbessern, wurden beschrieben, wie die Messung der PSA-Dichte und das Verhältnis von freiem zu komplexiertem PSA. Keine dieser methodischen Herangehensweisen war jedoch in der Lage, benigne von maligner Prostata-Erkrankung reproduzierbar zu unterscheiden. Zusätzlich haben PSA-Diagnostika Empfindlichkeiten zwischen 57–79% (Cupp & Osterling, 1993, Mayo Clin Proc 68: 297–306) und übersehen somit die Identifizierung von Prostatakrebs in einer signifikanten Population von Männern mit der Erkrankung.
Prostata-spezifisches Membranantigen (PSMA) ist ein kürzlich beschriebener Zelloberflächenmarker von Prostatakrebs, der das Objekt verschiedener Untersuchungen war, in denen seine Anwendung als diagnostischer und therapeutischer Marker untersucht wurde. Die Expression von PSMA ist hauptsächlich auf Prostatagewebe beschränkt, aber nachweisbare Spiegel von PSMA mRNA wurden in Gehirn, Speicheldrüse, Dünndarm und Nierenzellkarzinom nachgewiesen (Israeli et al., 1993, Cancer Res. 53: 227–230). Das PSMA Protein wird in den meisten primären und metastasierenden Prostata-Krebsleiden hoch exprimiert, wird aber auch in den meisten normalen intraepithelialen Neoplasie-Proben exprimiert (Gao et al., supra). Vorläufige Ergebnisse mit einem Indium-111 markierten, anti-PSMA monoklonalen Antikörper zur Abbildung von wiederkehrenden Prostata-Krebsleiden sind vielversprechend (Sodee et al., 1996, Clin. Nuc. Med. 21: 759–766). Ob PSMA sich als nützliches therapeutisches Agens herausstellen wird, muss noch geklärt werden. PSMA ist jedoch ein hormon-abhängiges Antigen, dass die Anwesenheit eines funktionalen Androgenrezeptors erfordert. Da nicht alle Prostata-Krebszellen den Androgenrezeptor exprimieren, kann die Verwendbarkeit von PSMA als therapeutisches Target inhärent beschränkt sein.
Die klinische Einteilung von Prostatakrebs ist ein weiteres grundlegendes Problem, dem Urologen heutzutage gegenüberstehen. Gegenwärtig beruht die klinische Einteilung auf der rektalen Untersuchung zur Bestimmung, ob der Tumor innerhalb der Grenzen der Prostatakapsel (lokal begrenzt) bleibt oder über diese hinausreicht (lokal fortgeschritten), in Kombination mit Bestimmung des Serum-PSA und transrektalen ultraschall-gesteuerten Biopsien. Aufgrund der vorhandenen Subjektivität über- oder unterschätzt die klinische Einteilung mit DRE-Analyse häufig die lokale Ausbreitung des Tumors, beurteilt häufig die Lage falsch, und korreliert nur wenig mit dem Volumen und dem Ausmaß des Tumors (Lee, C. T. und Osterling, J. E. Cancer of the Prostat: Diagnosis and Staging. In: Urologic Oncology, W. B. Saunders Company, Philadelphia, S. 357–377 (1997). Serum-Konzentrationen von PSA werden auch zum Zwecke der Einteilung verwendet, aber PSA alleine war nicht in der Lage, Prostatakrebs zuverlässig einzuteilen. Keine Technik hat sich als zuverlässig erwiesen, das Fortschreiten der Krankheit vorauszusagen. Somit besteht ein Bedarf nach einem zuverlässigeren und informativeren Einteilungs- und Prognoseverfahren beim Management von Prostatakrebs.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt ein neues, für die Prostata spezifisches Zelloberflächen-Antigen bereit, dass als Prostata Stammzell-Antigen (PSCA) bezeichnet wird, das in allen Stadien des Prostatakrebs überexprimiert wird, einschließlich hochgradiger prostatischer intraepithelialer Neoplasie (PIN), Androgen-abhängiger und Androgen-unabhängiger Tumoren der Prostata. Das PSCA-Gen zeigt 30% Homologie zu dem Stammzell-Antigen-2 (SCA-2), einem Mitglied der Thy-1/Ly-6 Familie von Glykosylphosphatidyl-Inositol (GPI)-verankerten Zelloberflächen-Antigenen, und kodiert für ein Protein mit 123 Aminosäuren mit einer aminoterminalen Signalsequenz, einer carboxyterminalen GPI-verankernden Sequenz und zahlreichen N-Glykosylierungsstellen. Die Expression von PSCA mRNA ist in normalen männlichen Geweben prostata-spezifisch und ist sowohl in Androgen-abhängigen als auch in Androgen-unabhängigen Prostatakrebs-Xenotransplantaten hochreguliert. Eine in situ Analyse von mRNA lokalisiert die Expression von PSCA im basalen Zellepithel, dem vermutlichen Stammzellkompartiment der Prostata. Flußzytometrische Analysen zeigen, dass PSCA hauptsächlich auf der Zelloberfläche exprimiert wird und durch eine GPI-Verknüpfung verankert ist. Eine Analyse mit in situ Fluoreszenz-Hybridisierung lokalisiert das PSCA-Gen auf das Chromosom 8q24.2, eine Region, die in mehr als 80% der Prostata-Krebsleiden einen Zuwachs an Allelen verzeichnet.
PSCA kann angesichts seiner Lokalisation auf der Zelloberfläche, der Prostata-spezifischen Expression und der stark hochregulierten Expression in Prostata-Krebszellen ein optimales therapeutisches Target sein. In dieser Hinsicht stellt die Erfindung Antikörper bereit, die an PSCA binden können und therapeutisch dazu verwendet werden können, Prostata-Krebszellen zu zerstören. Zusätzlich können PSCA-Proteine und für PSCA kodierende Nukleinsäuremoleküle in verschiedenen immuntherapeutischen Verfahren dazu verwendet werden, eine Immun-vermittelte Zerstörung von Prostatatumoren zu fördern.
PSCA kann auch einen idealen Marker für Prostatakrebs darstellen, der dazu verwendet werden kann, zwischen malignen Prostatakrebs, normalen Prostatadrüsen und nicht-malignen Neoplasien zu unterscheiden. So wird PSCA zum Beispiel in sehr hohen Konzentration in Prostata-Krebsleiden im Vergleich zu benigner prostatischer Hyperplasie (BPH) exprimiert. Im Gegensatz dazu wird der oft verwendete Marker für Prostatakrebs, PSA, in hohen Konzentrationen sowohl in der normalen Prostata als auch bei BPH exprimiert, aber in niedrigeren Konzentrationen bei Prostatakrebs, wodurch die Expression von PSA für die Unterscheidung von malignem Prostatakrebs von BPH oder normalen Drüsen nutzlos ist. Da die Expression von PSCA im wesentlichen umgekehrt zur PSA-Expression ist, kann die Analyse der PSCA-Expression dazu verwendet werden, Prostatakrebs von nicht-malignen Zuständen zu unterscheiden.
Die Gene, die sowohl für menschliches als auch für murines PSCA kodieren, wurden isoliert und ihre kodierenden Sequenzen aufgeklärt und hier bereitgestellt. Es werden ebenfalls Aminosäureseqüenzen sowohl von menschlichem als auch von murinem PSCA bereitgestellt. Die Erfindung stellt weiter verschiedene diagnostische Tests zum Nachweis, zur Überwachung und zur Prognose von Prostatakrebs bereit, einschließlich auf Nukleinsäure basierende Tests und immunologische Tests. Für PSCA spezifische monoklonale und polyklonale Antikörper und immuntherapeutische und andere therapeutische Verfahren zur Behandlung von Prostatakrebs werden auch bereitgestellt. Diese und andere Aspekte der Erfindung werden nachstehend beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. Nukleotid (A)- und translatierte Aminosäuresequenzen (B) einer cDNA, die für menschliches PSCA kodiert (ATCC Hinterlegungsnummer 209612).
2. Nukleotidsequenz einer cDNA, die für murines PSCA Homolog kodiert.
3. Alignment der Aminosäuresequenzen von menschlichem PSCA, murinem PSCA und menschlichem Stammzellantigen-2 (hSCA-2). Schattierte Bereiche heben konservierte Aminosäuren hervor. Konservierte Cysteine werden in Fettbuchstaben dargestellt. Vier vorhergesagte N-Glykosylierungsstellen in PSCA sind durch Sternchen angezeigt. Die unterstrichenen Aminosäuren am Anfang und am Ende des Proteins stellen N-terminale hydrophobe Signalsequenzen bzw. C-terminale GPI-Ankersequenzen dar.
4. Hydrophobizitätsplot von menschlichem PSCA.
5. Chou-Fassman Analyse von menschlichem PSCA.
6. RT-PCR Analyse der PSCA-Expression in verschiedenen Prostatakrebs-Zelllinien und Xenotransplantaten.
7. Restringierte Expression von PSCA mRNA in normalen und kanzerösen Geweben. A: RT-PCR Analyse von PSCA-Expression in normalen menschlichen Geweben, die die hohe Expression in Prostata, Plazenta und Tonsillen zeigt. 1 ng revers-transkribierter Erst-Strang cDNA (Clontech, Palo Alto, CA) aus den gezeigten Geweben wurde mit PSCA-genspezifischen Primern amplifiziert. Die gezeigten Daten stammen von 30 Amplifikationszyklen. B: RT-PCR Analyse von PSCA Expression, die eine hohe Konzentration in Prostatakrebs-Xenotransplantaten und normalem Gewebe zeigt. 5 ng reverstranskribierter cDNA aus den genannten Geweben wurde mit für PSCA spezifischen Genprimern amplifiziert. Die Amplifikation von für β-Actin spezifischen Primern zeigt die Normalisierung der Erst-Strang cDNA der verschiedenen Proben. Die gezeigten Ergebnisse stammen aus 25 Amplifikationszyklen. AD, Androgen-abhängig; AI, Androgen-unabhängig; IT, intratibiales Xenotransplantat; CL, Zelllinie.
8. Schematische Darstellung der Strukturen von menschlichem PSCA, murinem PSCA und menschlichem Thy-1/Ly-6 Gen.
9. Northern Blot Analyse der PSCA Expression. A: Gesamt RNA aus normaler Prostata und aus LAPC-4 Androgen-abhängigen (AD) und unabhängigen (AI) Prostatakrebs-Xenotransplantaten wurden mit für PSCA oder für PSA spezifischen Sonden analysiert. Äquivalente Beladung mit RNA und die Unversehrtheit der RNA wurden getrennt durch Ethidiumfärbung der 18S und der 28S RNA gezeigt. B: Northern Blot Analyse von PSCA aus multiplen menschlichen Geweben. Der Filter stammte von Clontech (Palo Alto, CA) und enthält in jeder Spur 2 ng polyA RNA.
10. Northern Blot Vergleich der Expression von PSCA, PSMA und PSA in Prostatakrebs-Xenotransplantaten und Tumor-Zelllinien. PSCA und PSMA zeigen hohe Konzentrationen von Prostatakrebs-spezifischer Genexpression. 10 μg Gesamt-RNA aus den genannten Geweben wurden auf einem Agarose/Formaldehydgel nach Größe fraktioniert, auf Nitrocellulose transferiert und nacheinander mit ³²P-markierten Sonden, die PSCA-, PSMA- und PSA-cDNA Fragmente darstellen, hybridisiert. Es werden 4 Stunden und 72 Stunden Autoradiographie-Expositionen der Membran gezeigt und das Ethidiumbromid-Gel zeigt die äquivalente Beladung mit Proben. BPH, benigne prostatische Hyperplasie; AD, Androgen-abhängig; AI, Androgen-unabhängig; IT, intratibiales Xenotransplantat; CL, Zelllinie.
11. In situ Hybridisierung mit Antisense-Ribosonde für menschliches PSCA auf normalen und malignen Prostata-Proben. A: PSCA wird von einer Untergruppe von basalen Zellen innerhalb des basalen Zellepithels exprimiert (schwarze Pfeile), aber nicht durch die terminal differenzierten sekretorischen Zellen, die die Prostatagänge auskleiden (400 × Vergrößerung). B: PSCA wird durch eine hochgradige prostatische intraepitheliale Neoplasie (PIN) (Pfeil) und durch invasive Prostatakrebs-Drüsen (Pfeile) stark exprimiert, ist aber in normalem Epithel (Pfeil) bei einer 40 × Vergrößerung nicht nachweisbar. C: starke Expression von PSCA in einem Fall von hochgradigem Karzinom (Vergrößerung 200 ×).
12. Biochemische Analyse von PSCA. A: PSCA wurde aus 293T Zellen, die transient mit einem PSCA Konstrukt transfiziert wurden, immunpräzipitiert und dann entweder mit N-Glykosidase F oder O-Glykosidase, wie in Material & Methoden beschrieben, verdaut. B: PSCA wurde aus transfizierten 293T-Zellen immunpräzipitiert, als auch aus dem konditioniertem Medium dieser Zellen: Zell-assoziiertes PSCA wandert höher als sekretiertes PSCA auf einem 15% Polyacrylamidgel. C: FACS Analyse von zum Schein transfizierten 293T-Zellen, mit PSCA transfizierten 293T-Zellen und Zellen eines LAPC-4 Prostatakrebs-Xenotransplantats mit einem affinitätsgereinigtem, polyklonalen anti-PSCA-Antikörper. Zellen wurden nicht permeabilisiert, um nur die Oberflächenexpression nachzuweisen. Die Y-Achse stellt die relative Zellzahl und die X-Achse stellt die Intensität der Fluoreszenz-Färbung auf einer logarithmischen Skala dar.
13. In situ Hybridisierung von mit Biotin markierten PSCA-Sonden menschlicher Metaphase Zellen aus mit Phytohämagglutinin stimulierten peripheren Blut-Lymphozyten. Die Homologen des Chromosoms 8 sind mit Pfeilen markiert; spezifische Markierung wurde bei 8q24.2 nachgewiesen. Der Einsatz zeigt partielle Karyotypen von zwei Chromosom 8-Homologen und veranschaulicht die spezifische Markierung bei 8q24.2 (Pfeilköpfe). Die Bilder wurden mit einem Zeiss Axiophot Mikroskop erhalten, das an eine gekühlte CCD-Kamera angeschlossen war. Getrennte Bilder von DAPI-gefärbten Chromosomen und das Hybridisierungssignal wurden mit Bildverarbeitungssoftware (NU200 und Image 1.57) überlagert.
14. Flußzytometrieanalyse der Zelloberflächenexpression von PSCA auf einem Prostatakrebs-Xenotransplantat (LAPC-9), einer Prostatakrebs-Zelllinie (LAPC-4) und normalen Prostata-Epithelzellen (PREC) mit anti-PSCA monoklonalen Antikörpern 1G8 und 3E6, Maus Anti-PSCA polyklonalem Serum oder sekundärem Kontroll-Antikörper. Siehe Beispiel 5 für Details.
15. Epitop-Kartierung von anti-PSCA monoklonalen Antikörpern 1G8 und 3E6. Siehe Beispiel 5 für Details.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Prostata Stammzell-Antigen (im nachfolgenden als „PSCA" bezeichnet). PSCA ist ein neues, über Glycosylphosphatidylinositol (GPI) verankertes Zelloberflächenantigen, welches fast ausschließlich auf Prostatazellen exprimiert wird und welches sowohl von Androgen-abhängigen als auch von Androgen-unabhängigen Prostatakrebs Zellen überexprimiert wird. Die Expression von PSCA in Prostatakrebs kann mit fortschreitendem Grad korrelieren.
PSCA mRNA wird auch durch eine Teilmenge von basalen Zellen in der normalen Prostata exprimiert. Man nimmt an, dass das basale Zellepithel die Vorläuferzellen für die terminal differenzierten sekretorischen Zellen enthält (Bonkhoff et al., 1994, Prostate 24: 114–118). Neuere Untersuchungen mit Cytokeratin-Markern legen nahe, dass das basale Zellepithel wenigstens zwei unterschiedliche zelluläre Subpopulationen enthält, wobei die eine die Cytokeratine 5 und 14 und die andere die Cytokeratine 5, 8 und 18 exprimiert (Bonkhoff und Remberger, 1996, Prostate 28: 98–106). Die Erkenntnis, dass PSCA nur in einer Teilmenge von basalen Zellen exprimiert wird, legt nahe, dass PSCA ein Marker für eine dieser zwei basalen Zelllinien sein könnte.
Die biologische Funktion von PSCA ist unbekannt. Die Ly-6 Genfamilie ist an diversen zellulären Funktionen beteiligt, einschließlich Signaltransduktion und Zell-Zell Adhäsion. Es wurde gezeigt, dass Signalübertragung durch SCA-2 in unreifen Thymozyten Apoptose verhindert (Noda et al., 1996, J. Exp. Med. 183: 2355–2360). Thy-1 ist an der Aktivierung von T-Zellen beteiligt und überträgt Signale durch src-artige Tyrosinkinasen (Thomas et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 12317–12322). Ly-6 Gene wurden sowohl bei der Tumorentstehung als auch bei der homotypischen Zelladhäsion impliziert (Bamezai und Rock, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci USA 92: 4294–4298; Katz et al., 1994, Int. J. Cancer 59: 684–691; Brakenhoff et al., 1995, J. Cell. Biol. 129: 1677–1689). Basierend auf der restringierten Expression in basalen Zellen und seiner Homologie mit Sca-2 nehmen wir an, das PSCA eine Rolle bei Stammzell/Vorläuferzellfunktionen spielen könnte, wie Selbsterneuerung (anti-Apoptose) und/oder Proliferation.
PSCA ist bei Mäusen und Menschen hoch konserviert. Die Identifizierung eines konservierten Gens, dass hauptsächlich auf die Prostata beschränkt ist, unterstützt die Hypothese, dass PSCA eine wichtige Rolle bei der normalen Entwicklung der Prostata spielen könnte.
In ihren verschieden Aspekten, die nachstehend ausführlich beschrieben werden, stellt die vorliegende Erfindung PSCA-Proteine, Antikörper, Nukleinsäuremoleküle, rekombinante DNA-Moleküle, transformierte Wirtszellen, Erzeugungsverfahren, Assays, immuntherapeutische Verfahren, transgene Tiere, immunologische und auf Nukleinsäure basierende Assays und Zusammensetzungen bereit.
PSCA-PROTEINE
Ein Aspekt der Erfindung stellt verschiedene PSCA-Proteine und Peptidfragmente davon bereit. Wie hier gebräuchlich bezieht sich PSCA auf ein Protein, dass die Aminosäuresequenz von menschlichem PSCA wie in 1B und 3 bereitgestellt, die Aminosäuresequenz des murinen PSCA-Homolog wie in 3 oder die Aminosäuresequenz anderer Säuger-PSCA Homologen besitzt, als auch von allelischen Varianten und konservative Substitutionsmutanten dieser Proteine, die PSCA Aktivität aufweisen. Die erfindungsgemäßen PSCA-Proteine umfassen die hier beschriebenen spezifisch identifizierten und charakterisierten Varianten, als auch allelische Varianten, konservative Substitutionsvarianten und Homologe, die ohne unzumutbaren experimentellen Aufwand gemäß den nachstehend ausgeführten Verfahren isoliert/erzeugt und charakterisiert werden können. Aus Gründen der Einfachheit werden allen PSCA-Protein allgemein als PSCA-Proteine, erfindungsgemäße Proteine oder PSCA bezeichnet.
Der Begriff „PSCA" umfasst alle natürlich auftretenden allelischen Varianten, Isoformen und Vorläufer des menschlichen PSCA wie in den 1B und 3 und murinem PSCA wie in 3 bereitgestellt. Im allgemeinen weisen natürlich auftretende allelische Varianten des menschlichen PSCA signifikante Homologie (z. B. 70–90%) zur in 1B und 3 dargestellten PSCA Aminosäuresequenz auf. Allelische Varianten können, obwohl sie eine leicht unterschiedliche Aminosäuresequenz aufweisen, auf der Oberfläche von Prostatazellen als ein GPI-gekoppeltes Protein exprimiert oder sekretiert werden. Typischerweise enthalten allelische Varianten des PSCA-Proteins konservative Aminosäuresubstitutionen in der hier beschriebenen PSCA-Sequenz oder enthalten eine Substitution einer Aminosäure aus einer entsprechenden Position in einem PSCA Homolog, wie z. B. aus dem hier beschriebenen murinem PSCA Homolog.
Eine Klasse von PSCA allelischen Varianten sind Proteine, die einen hohen Grad von Homologie mit wenigstens einem kleinen Bereich der in den 1B und 3 gezeigten PSCA Aminosäuresequenzen aufweisen, werden aber auch einen radikalen Unterschied zur Sequenz aufweisen, wie eine nicht-konservative Substitution, Verkürzung, Insertion oder Leserahmenverschiebung. Solche Allele werden als mutierte PSCA Allele bezeichnet und stellen Proteine dar, die typischerweise nicht die gleichen biologischen Funktionen ausführen.
Konservative Aminosäure-Substitutionen können häufig in einem Protein durchgeführt werden ohne entweder die Konformation oder die Funktion des Proteins zu verändern. Solche Veränderungen beinhalten den Austausch von Isoleucin (I), Valin (V) und Leucin (L) gegen eine andere dieser Hydrophoben Aminosäuren; Asparaginsäure (D) für Glutaminsäure (E) und umgekehrt; Glutamin (Q) für Asparagin (N) und umgekehrt); und Serin (S) für Threonin (T) und umgekehrt. Andere Substitutionen können ebenfalls als konservativ bezeichnet werden, in Abhängigkeit von der Umgebung der speziellen Aminosäure und ihrer Rolle in der dreidimensionalen Struktur des Proteins. So können z. B. Glycine (G) und Alanin (A) häufig gegeneinander austauschbar sein, genauso wie Alanin (A) und Valin (V). Methionin (M), die relativ hydrophob ist, kann häufig mit Leucin und Isoleucin und manchmal mit Valin ausgetauscht werden. Lysin (K) und Arginin (R) sind häufig an Stellen gegeneinander austauschbar, in denen die signifikante Eigenschaft der Aminosäure ihre Ladung ist und die unterschiedlichen pK's dieser beiden Aminosäurereste nicht signifikant sind. In bestimmten Umgebungen können auch noch andere Veränderungen als „konservativ" betrachtet werden.
Die Aminosäuresequenz des menschlichen PSCA-Protein ist in den 1B und 3 dargestellt. Menschliches PSCA umfasst eine einzelne Untereinheit von 123 Aminosäuren und enthält eine aminoterminale Signalsequenz, eine carboxyterminale GPI-Ankersequenz und zahlreiche N-Glykosylierungsstellen. PSCA zeigt 30% Homologie zum Stammzellantigen-2 (SCA-2), einem Mitglied der Thy-1/Ly-6 Genfamilie, einer Gruppe von Zelloberflächenproteinen die die frühesten Phasen der hämatopoietischen Entwicklung markieren. Die Aminosäuresequenz eines murinen PSCA Homologen ist in 3 gezeigt. Murines PSCA ist ein Protein bestehend aus einer einzelnen Untereinheit von 123 Aminosäuren mit etwa 70% Homologie zu menschlichem PSCA und ähnlicher struktureller Organisation.
PSCA-Proteine können in vielen Formen verkörpert sein, vorzugsweise in isolierter Form. Wie hier verwendet gilt ein Protein dann als isoliert wenn physikalische, mechanische oder chemische Verfahren dazu verwendet werden, das PSCA-Protein von zellulären Bestandteilen zu trennen die normalerweise mit dem Protein assoziiert sind. Ein geübter Fachmann kann leicht Standard-Aufreinigungsverfahren verwenden, um ein isoliertes PSCA-Protein zu erhalten. Ein aufgereinigtes PSCA-Proteinmolekül wird im wesentlichen frei von anderen Molekülen oder Proteinen sein, die die Bindung von PSCA an einen Antikörper oder einen Liganden stören. Die Art und das Ausmaß der Isolierung und Aufreinigung hängen von der beabsichtigten Verwendung ab. Ausführungsformen eines PSCA-Proteins beinhalten ein aufgereinigtes PSCA-Protein und ein funktionelles, lösliches PSCA-Protein. Ein Beispiel eines funktionellen löslichen PSCA-Proteins hat die in 1B gezeigte Aminosäuresequenz oder eines Fragments davon. In einer Form behält solch ein funktionelles, lösliches PSCA-Protein oder Fragmente davon die Fähigkeit bei, Antikörper oder einen anderen Liganden zu binden.
Die Erfindung stellt auch Peptide zur Verfügung, die biologisch aktive Fragmente der menschlichen und murinen PSCA Aminosäuresequenzen aus 1B und 3 darstellen. Die erfindungsgemäßen Peptide weisen Eigenschaften von PSCA auf, wie die Fähigkeit zur Erzeugung von Antikörpern, die spezifisch an ein Epitop binden, das mit PSCA assoziiert ist. Solche Peptidfragmente der PSCA-Proteine können mit Standardverfahren zur Peptidsynthese und mit den hier offenbarten menschlichen und murinen Aminosäuresequenzen hergestellt werden. Alternativ dazu können rekombinante Verfahren dazu verwendet werden, Nukleinsäuremoleküle zu erzeugen, die für ein Fragment des PSCA-Proteins kodieren. In dieser Hinsicht können die hier beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, die für PSCA kodieren, Mittel zur Erzeugung von definierten PSCA-Fragmenten darstellen. Wie nachstehend diskutiert sind Peptidfragmente von PSCA besonders nützlich für: Erzeugung domänenspezifischer Antikörper; Identifizierung von Agenzien, die an PSCA oder eine PSCA Domäne binden; Identifizierung von zellulären Faktoren die an PSCA oder eine PSCA Domäne binden; und Isolieren von Homologen oder anderen allelischen Formen menschlicher PSCA. PSCA Peptide, die insbesondere wichtige Strukturen enthalten, können mit bekannten Verfahren vorhergesagt und/oder identifiziert werden, wie z. B. das Verfahren von Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz oder Jameson Wolf-Analyse, oder auf Basis der Immunogenität. Als Beispiele werden Hydrophobizitäts und Chou-Fasman Plots menschlichem PSCA in den 4 bzw. 5 gezeigt. Fragmente, die solche Reste enthalten, sind zum Erzeugen von Teilmengen-spezifischen anti-PSCA-Antikörpern oder zur Identifizierung von zellulären Faktoren, die an PSCA binden, besonders nützlich.
Die erfindungsgemäßen PSCA-Proteine können für eine Vielzahl von Zwecken nützlich sein, einschließlich in nicht-beschränkender Weise die Verwendung als diagnostische und/oder prognostische Marker für Prostatakrebs und als Targets für verschiedene therapeutische Modalitäten, wie nachstehend beschrieben. PSCA-Proteine können dazu verwendet werden, Liganden und andere Agenzien zu identifizieren und zu isolieren, die an PSCA binden. In der normalen Prostata wird PSCA exklusiv von einer Teilmenge von basalen Zellen exprimiert, was nahe legt, dass PSCA als Marker für eine spezifische Zelllinie innerhalb des basalen Epithels verwendet werden kann. Zusätzlich legen die Ergebnisse des Anmelders nahe, dass diese Gruppe von basalen Zellen das Ziel der neoplastischen Transformation darstellt. Daher können therapeutische Strategien, die dazu gedacht sind, die molekularen Faktoren, die für die Transformation verantwortlich sind, zu eliminieren oder zu modulieren, über PSCA Zelloberflächenproteine direkt auf diese Population gerichtet werden.
PSCA-ANTIKÖRPER
Die Erfindung stellt weiterhin Antikörper bereit, die an PSCA binden. Die bevorzugtesten Antikörper werden selektiv an PSCA und nicht (oder schwach) an nicht-PSCA-Proteine binden. Anti-PSCA-Antikörper, die besonders bevorzugt sind umfassen monoklonale als auch polyklonale Antikörper als auch Fragmente, die die antigenbindende Domäne und/oder eine oder mehrere komplementaritätsbestimmende Bereiche dieser Antikörper umfassen.
In einer Ausführungsform binden die PSCA-Antikörper spezifisch an die extrazelluläre Domäne des PSCA-Protein. In anderen Ausführungsformen binden die PSCA-Antikörper spezifisch an andere Domänen des PSCA-Proteins oder des Vorläufers. Dem Fachmann ist es bekannt, dass die Bereiche oder Epitope eines PSCA-Proteins, an die ein Antikörper bindet, sich mit der beabsichtigten Anwendung ändern kann. So sollten z. B. Antikörper, die zur Verwendung in einem Immunassay zum Nachweis von membrangebundenem PSCA auf lebenden Prostatakrebs Zellen auf ein Epitop gerichtet sein, das auf membrangebundenem PSCA zugänglich ist. Beispiele für solche Antikörper sind in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Antikörper die andere Epitope erkennen können nützlich zur Erkennung von PSCA innerhalb von beschädigten oder absterbenden Zellen sein, zum Nachweis von sekretierten PSCA-Proteinen oder Fragmenten davon. Die Erfindung umfasst auch Antikörperfragmente, die spezifisch ein PSCA-Protein erkennen. Wie hier verwendet ist ein Antikörperfragment durch wenigstens einen Teil der variablen Region des Immunglobulinmoleküls definiert, das an sein Target bindet, d. h., die Antigen-bindende Region. Ein Teil der konstanten Region des Immunglobulins kann ebenfalls umfasst sein.
Die Prostataspezifität von PSCA, seine Überexpression sowohl in Androgen-abhängigen als auch in Androgen-unabhängigen Prostatakrebs Zellen und die Lokalisation auf der Zelloberfläche von PSCA stellen Eigenschaften eines exzellenten Markers für das Screening, die Diagnose, Prognose und nachfolgende Assays und bildgebende Verfahren dar. Zusätzlich zeigen diese Charakteristika dass PCSA ein exzellentes Ziel für therapeutische Verfahren wie gerichtete Antikörpertherapie, Immuntherapie und Gentherapie sein kann.
Erfindungsgemäße Antikörper können besonders nützlich sein in diagnostischen Tests, bildgebenden Verfahren und therapeutischen Verfahren bei der Behandlung von Prostatakrebs. Die Erfindung stellt verschiedene immunologische Assays bereit, die für den Nachweis von PSCA-Proteinen und für die Diagnose von Prostatakrebs nützlich sind. Solche Assays umfassen im allgemeinen einen oder mehrere PSCA-Antikörper, die ein PSCA-Protein erkennen und binden können, und umfassen verschiedene Formate immunologischer Assays, die gut bekannt sind, einschließlich in nicht-beschränkender Weise verschiedene Arten von Radioimmunassays, Enzym-gekoppelte Immunabsorbens-Assays (ELISA), enzymgekoppelte Immunfluoreszenzassays (ELIFA) und ähnliche. Zusätzlich werden ebenfalls immunologische bildgebende Verfahren durch die Erfindung bereitgestellt, die Prostatakrebs nachweisen können, einschließlich in nicht beschränkender Weise radioszintigraphische bildgebende Verfahren unter Verwendung von markierten PSCA-Antikörpern. Solche Assays können klinisch nützlich sein zum Nachweis, zur Überwachung und zur Prognose von Prostatakrebs.
In einer Ausführungsform werden PSCA-Antikörper oder Fragmente davon zum Nachweis des Vorliegens von Prostatakrebs, PIN oder basalen epithelialen Zellen, die ein PSCA-Protein exprimieren, verwendet. Die Anwesenheit solcher PSCA+-Zellen in verschiedenen biologischen Proben, einschließlich Serum, Prostata und anderen Gewebeproben, anderen Geweben wie Knochen, Urin, etc, kann mit PSCA-Antikörpern nachgewiesen werden. Zusätzlich können PSCA-Antikörper in verschiedenen bildgebenden Verfahren wie Immunszintigraphie mit Indium 111 (oder anderen Isotop-konjugierten) Antikörpern verwendet werden. So kann z. B. ein bildgebendes Protokoll, das ähnlich zu dem kürzlich beschriebenen Protokoll ist, in dem ein In-111 konjugierter anti-PSMA-Antikörper dazu verwendet werden kann; wiederkehrende und metastasierende Prostata-Krebsleiden nachzuweisen (Sodee et al., 1997, Clin. Nuc. Med. 21: 759–766). Im Verhältnis zu anderen Markern von Prostatakrebs, wie PSMA z. B. kann PSCA besonders nützlich sein zur Ausrichtung auf für Androgenrezeptor negativen Prostatakrebs-Zellen. PSCA-Antikörper können auch dazu verwendet werden, die Funktion von PSCA therapeutisch zu hemmen.
PSCA-Antikörper können ebenfalls in Verfahren verwendet werden zur Aufreinigung von PSCA-Proteinen und Peptiden und zur Isolierung von PSCA Homologen und verwandten Molekülen. So umfasst in einer Ausführungsform ein Verfahren zur Aufreinigung eines PSCA-Proteins das Inkubieren eines PSCA-Antikörpers, der an eine feste Matrix gekoppelt wurde, mit einem Lysat oder einer anderen Lösung, die PSCA enthält unter Bedingungen, bei denen der PSCA-Antikörper an PSCA binden kann; das Waschen der festen Matrix zur Entfernung von Verunreinigungen und die Elution des PSCA vom gekoppelten Antikörper.
Zusätzlich können PSCA-Antikörper dazu verwendet werden, für PSCA positive Zellen mit Zellsortierungstechniken und Aufreinigungstechniken zu isolieren. Die Anwesenheit von PSCA auf Prostatatumorzellen kann dazu verwendet werden, menschliche Prostatakrebszellen von anderen Zellen zu unterscheiden und diese zu isolieren. Insbesondere können PSCA-Antikörper dazu verwendet werden, Prostatakrebs-Zellen aus Xenotransplantat-Tumorgewebe zu isolieren, aus Zellen in Kultur, etc., mit Antikörper-basierender Zellsortierung oder Affinitäts-Aufreinigungstechniken. Andere Verwendungen der erfindungsgemäßen PSCA-Antikörper umfassen die Erzeugung von anti-idiotypischen Antikörpern die das PSCA-Protein nachahmen.
Die Fähigkeit, große Mengen von relativ reinen menschlichen Prostatakrebs Zellen zu erzeugen die in Gewebekultur oder als Xenotransplantat-Tumoren in Tiermodellen (z. B. SCID oder immundefiziente Mäuse) kultiviert werden können stellt viele Vorteile bereit, einschließlich z. B. der Möglichkeit, die Auswirkungen verschiedener Transgene oder Kandidaten-Therapeutika auf das Wachstum oder andere Phänotypische Charakteristika einer relativ homogenen Population von Prostatakrebs Zellen zu beurteilen. Zusätzlich ermöglicht diese Eigenschaft der Erfindung ebenfalls die Isolierung hoch angereicherter Präparationen von menschlichen für Prostatakrebs spezifischen Nukleinsäuren in Mengen, die ausreichend sind für verschiedene molekulare Manipulationen. So können z. B. große Mengen solcher Nukleinsäurepräparationen zur Identifikation seltener Gene beitragen, die eine biologische Relevanz für das Fortschreiten von Prostatakrebs haben.
Eine weitere wertvolle Anwendung dieses Aspektes der Erfindung ist die Fähigkeit, relativ reine Präparationen von lebenden Tumorzellen aus einzelnen Patienten mit lokal fortgeschrittener oder metastasierender Krankheit zu analysieren und damit zu experimentieren. Auf diese Weise können z. B. die Prostatakrebs Zellen eines einzelnen Patienten aus einem begrenzten Biopsieprobe vermehrt und dann auf die Anwesenheit von diagnostischen und prognostischen Genen, Proteinen, chromosomalen Aberrationen, Genexpressionsprofilen oder anderen relevanten genotypischen und phänotypischen Charakteristika getestet werden, ohne die potentielle verwirrende Variable kontaminierender Zellen. Zusätzlich können solche Zellen hinsichtlich neoplastischer Aggressivität und metastatischem Potential in Tiermodellen ausgewertet werden. In ähnlicher Weise können aus solchen Zellpräparationen Patienten-spezifische Prostatakrebs-Vakzine und zelluläre Immuntherapeutika erzeugt werden.
Verschiedene Verfahren zur Herstellung von Antikörpern sind bekannt. So können Antikörper z. B. durch Immunisierung eines geeigneten Säugerwirts mit einem PSCA-Protein, Peptid oder Fragment in isolierter oder immunkonjugierter Form hergestellt werden (Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Zusätzlich können auch PSCA Fusionsproteine verwendet werden, wie ein PSCA-GST Fusionsprotein. Zellen, die PSCA exprimieren oder überexprimieren können ebenfalls für solche Immunisierungen verwendet werden. In ähnlicher Weise kann auch eine Zelle, die so verändert ist, dass sie PSCA exprimiert, verwendet werden. Diese Strategie kann zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern führen, die erhöhte Kapazität zur Erkennung von endogenem PSCA haben.
Die hier vorgestellte Aminosäuresequenz von PSCA kann dazu verwendet werden, spezifische Regionen des PSCA-Proteins zur Erzeugung von Antikörper auszuwählen. So können z. B. Analysen der Hydrophobizität und Hydrophilizität der PSCA Aminosäuresequenz dazu verwendet werden, hydrophile Bereiche in der PSCA Struktur zu identifizieren. Bereiche des PSCA-Proteins, die eine immunogene Struktur zeigen, als auch andere Bereiche und Domänen, können leicht mit anderen bekannten Verfahren identifiziert werden, wie Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz oder Jameson-Wolf Analyse. Fragmente, die diese Reste enthalten, eignen sich besonders zur Erzeugung spezifischer Klassen von anti-PSCA-Antikörpern. Besonders nützliche Fragmente umfassen in nicht beschränkender Weise die Sequenzen TARIRAVGLLTVISK und VDDSQDYYVGKK. Wie im nachstehenden Beispiel 2 beschrieben, wurde ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen das erste Fragment erzeugt, als ein synthetisches Peptid präpariert, und mit einem PSCA Glutathion-S-Transferase Fusionsprotein affinitätsgereinigt. Die Erkennung von PSCA durch diesen Antikörper wurde durch Immunblot und Immunpräzipitationsanalysen von Extrakten aus 293T-Zellenetabliert, die mit PSCA und einem GST-PSCA Fusionsprotein transfiziert waren. Dieser Antikörper identifizierte auch die Zelloberflächenexpression von PSCA in PSCA transfizierten 293T und LAPC-4 Zellen mit Fluoreszenz aktivierter Zellsortierung (FACS):
Verfahren zur Präparation eines Proteins zur Verwendung als Immunogen und zur Präparation von immunogenen Konjugaten eines Proteins mit einem Träger wie BSA, KLH oder anderen Trägerproteinen sind bekannt. In einigen Umständen kann die direkte Konjugation mit z. B. Carbodiimid Reagenzien verwendet werden; in anderem Fällen können Kopplungsreagenzien, die von Pierce Chemical Co, Rockford IL erhältlich sind, wirksam sein. Die Verabreichung eines PSCA Immunogens wird im allgemeinen durch Injektion über einen geeigneten Zeitraum und mit einem geeigneten Adjuvans erfolgen, wie dem Fachmann allgemein bekannt ist. Während des Immunisierungsschema können Antikörpertiter bestimmt werden, um die angemessene Bildung der Antikörper zu verfolgen.
Während die auf diesem Wege erzeugten polyklonalen Antikörper für manche Anwendungen zufriedenstellend sein können, werden für einige pharmazeutische Zusammensetzungen monoklonale Antikörper bevorzugt. Immortalisierte Zelllinien, die einen gewünschten monoklonalen Antikörper sekretieren können anhand des Standardverfahrens von Milstein und Köhler oder Modifikationen davon erzeugt werden, die die Immortalisierung von Lymphozyten oder Milzzellen bewirken, wie man allgemein weiß. Die immortalisierten Zelllinien, die die gewünschten Antikörper sekretieren, werden durch Immunassays gescreent, in denen das Antigen das PSCA-Protein oder PSCA Fragment ist. Sobald die geeignete immortalisierte Zellkultur, die den erwünschten Antikörper sekretiert, identifiziert ist, können die Zellen entweder in vitro oder durch Produktion in Aszitesflüssigkeit kultiviert werden.
Die gewünschten Monoklonalen Antikörper werden dann aus dem Kulturüberstand oder aus dem Aszitesüberstand gewonnen. Fragment oder monoklonalen oder polyklonalen Antisera, die den immunologisch wichtigen Teil entgalten, können als Antagonisten verwendet werden, ebenso wie die intakten Antikörper. Die Verwendung immunologisch reaktiver Fragmente, wie der Fab, Fab' oder F(ab')₂ Fragmente wird häufig bevorzugt, besonders in einem therapeutischen Zusammenhang, da diese Fragmente im allgemeinen weniger immunogen sind als das ganze Immunoglobulin.
Die Erzeugung von zwei monoklonalen Antikörper (MAbs), die an Zelloberflächen-PSCA binden können, wird in Beispiel 5 beschrieben. Epitopkartierung dieser MAbs zeigt, dass sie unterschiedliche Epitope auf dem PSCA-Protein effektiv erkennen, wobei ein Antikörper ein Epitop innerhalb des carboxyterminalen Bereichs und der andere Antikörper ein Epitop im aminoterminalen Bereich erkennt. Solche PSCA-Antikörper eignen sich besonders gut zur Verwendung in Sandwich-Format ELISAs, aufgrund ihrer sich unterscheidenden Epitop-Bindecharakteristika.
Die Antikörper oder Fragmente können auch durch aktuelle Technologie durch rekombinante Verfahren erzeugt werden. Bereiche, die spezifische an gewünschte Bereiche von PSCA Protein binden können auch im Zusammenhang von chimären oder CDR-„grafted" Antikörper mit Multispezies-Ursprung erzeugt werden.
Der erfindungsgemäße Antikörper oder das Fragment davon kann mit einem nachweisbaren Marker markiert oder an ein zweites Molekül gekoppelt sein, wie ein cytotoxisches Agens, und kann zur Ausrichtung des zweiten Moleküls auf eine PSCA-positive Zelle verwendet werden (Vitetta et al., 1993, Immunotoxin Therapy, in DeVita, Jr. V. T. et al., Hsrg. Cancer: Principles and Practice of Oncology, 4. Ausgabe, J. B. Lippincott Co., Philadelphia, 2624–2636). Beispiele cytotoxischer Agenzien beinhalten in nicht beschränkender Weise Rizin, Doxorubizin, Daunorubizin, Taxol, Ethidiumbromid, Mitomyzin, Etoposid, Tenoposid, Vincristin, Vinblastin, Cholchizin, Dihydroxy Anthrazin Dion, Actinomycin D, Diphterie Toxin, Pseudomonas Exotoxin (PE) A, PE40, Rizin, Abrin und Glucocorticoid und andere Chemotherapeutika, als auch Radioisotope. Geeignete nachweisbare Marker umfassen in nicht-beschränkender Weise ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, eine biolumineszierende Verbindung, eine chemilumineszierende Verbindung, einen Metall Chelator oder ein Enzym.
PSCA-Antikörper können dazu verwendet werden, Krebs systemisch zu behandeln. PSCA-Antikörper, die an toxische Agenzien, wie Ricin gekoppelt sind, als auch unkonjugierte Antikörper können nützliche therapeutische Agenzien sein, die natürlicherweise auf PSCA-tragende Prostatakrebs-Zellen gerichtet sind. Techniken zur Konjugation von therapeutischen Agenzien an Antikörper sind bekannt (vgl. z. B. Arnon et al., „Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al., (Hrgs.) Seiten 243–56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., „Antibodies for Drug Delivery" in Controlled Drug Delivery (2. Ausgabe), Robinson et al. (HRSG.) Seiten 623–53 (Marcel Dekker Inc 1987); Thorpe, „Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review" in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et al. (Hrsg.) Seiten 475–506 (1985) und Thorpe et al., "The Preparation and cytotoxic Properties of Antibody-Toxin-Conjugates", Immunol. Rev. 62: 119–58 (1982)). Die Verwendung von PSCA-Antikörpern als therapeutische Agenzien wird nachstehend im Abschnitte "Prostatakrebs Immuntherapie" weiter beschrieben.
FÜR PSCA KODIERENDE NUKLEINSÄUREMOLEKÜLE
Ein anderer Aspekt der Erfindung stellt verschiedene Nukleinsäure-Moleküle bereit, die für PSCA-Proteine und Fragmente davon kodieren, vorzugsweise in isolierter Form, einschließlich DNA, RNA, DNA/RNA Hybriden und verwandten Molekülen, Nukleinsäure-Molekülen, die komplementär zur für PSCA kodierenden Sequenz oder zu einem Teil davon sind, und jene, die an das PSCA-Gen oder an für PSCA kodierende Nukleinsäuren hybridisieren. Insbesonders bevorzugte Nukleinsäure-Moleküle haben eine Nukleotidsequenz, die zu den hier beschriebenen menschlichen oder murinen DNA-Sequenzen im wesentlichen identisch oder komplementär sind. Besonders bevorzugt sind genomische DNA, cDNAs, Ribozyme und Antisense-Moleküle, ebenso wie Nukleinsäuren, die auf einem anderen Gerüst basieren oder alternative Basen beinhalten, die entweder aus natürlichen Quellen abgeleitet sein können oder synthetisiert sind. So können z. B. Antisense-Moleküle RNAs oder andere Moleküle sein, einschließlich Peptidnukleinsäuren (PNAs) oder nicht-Nukleinsäure-Molekülen wie Phosphorothioat-Derivate, die in einer Basenpaar-abhängigen Weise spezifisch an DNA oder RNA binden. Ein Fachmann kann diese Klassen von Nukleinsäuremolekülen unter Verwendung der hier beschriebenen PSCA Sequenzen leicht erhalten. Für PSCA kodierende Nukleinsäuremoleküle werden hier als für PSCA kodierende Nukleinsäuremoleküle, PSCA-Gene oder als PSCA-Sequenzen bezeichnet.
Die Nukleotidsequenz einer cDNA, die eine Allelform des menschlichen PSCA kodiert, ist in 1A gezeigt. Die Nukleotidsequenz einer cDNA, die für ein murines PSCA Homolog („murines PSCA") kodiert, ist in 2 gezeigt. Wie in Beispiel 4 beschrieben, wurden auch genomische Klone von menschlichem und murinem PSCA isoliert. Sowohl die menschlichen als auch die murinen genomischen Klone enthalten drei Exons, die die translatierten und 3' untranslatierten Bereiche des PSCA-Gens kodieren. Man nimmt an, dass ein viertes Exon existier, dass für eine 5'-untranslatierte Region kodiert, basierend auf der Homologie von PSCA zu anderen Mitglieder der Ly-6 und Thy-1 Genfamilien (8).
Das menschliche PSCA-Gen ist auf Chromosom 8q24.2 kartiert. Das menschliche Stammzellantigen 2 (RIG-E) als auch ein weiteres kürzlich identifiziertes menschliches Ly-6 Homolog (E48) sind ebenfalls in dieser Region lokalisiert., was nahe legt, dass an diesem Lokus eine große Familie von verwandten Genen existiert (Brakenhoff et al., 1995, supra; Mao et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci USA 93: 5910–5914). Interessanterweise wurde berichtet, dass Chromosom 8Q eine Region des Allelgewinns und der Amplifikation in einer Vielzahl von fortgeschrittenen und wiederkehrenden Prostata-Krebsleiden ist (Cher et al., 1994, Genes Chrom. Cancer 11: 153–162). C-myc ko-lokalisiert nahe bei PSCA am Chromosom 8q24 und zusätzliche Kopien von c-myc (entweder durch Allelgewinn oder Amplifikation) wurden in 68% der primären Prostatatumoren und 96% der Metastasen gefunden (Jenkins et al., 1997, Cancer Res. 57: 524–531).
Ausführungsformen der für PSCA kodierenden Nukleinsäuren der Erfindung umfassen Primer, die die Amplifikation spezifischer erfindungsgemäßer Nukleinsäuremoleküle ermöglichen oder von irgendwelchen spezifischen Teilen davon, und Sonden, die selektiv oder spezifisch an erfindungsgemäße Nukleinsäuren oder an irgendwelche Teile davon hybridisieren. Die Nukleinsäuresonden können mit einem nachweisbaren Marker markiert sein. Beispiele für nachweisbare Marker umfassen in nicht-beschränkender Weise ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, eine biolumineszierende Verbindung, eine chemilumineszierende Verbindung, einen Metall Chelator oder ein Enzym. Solche markierten Sonden können dazu verwendet werden, die Anwesenheit eines PSCA-Proteins nachzuweisen als Mittel zu Diagnose einer Zelle, die ein PSCA-Protein exprimiert. Technologien zur Erzeugung von DNA und RNA Sonden sind bekannt.
Ein Nukleinsäuremolekül wird dann als „isoliert" bezeichnet, wenn das Nukleinsäuremolekül im wesentlichen von allen kontaminierenden Nukleinsäuremolekülen abgetrennt ist, die für andere Polypeptide als PSCA kodieren. Um ein isoliertes, für PSCA kodierendes Nukleinsäuremolekül zu erhalten, kann ein Fachmann leicht Nukleinsäure-Isolierungsverfahren verwenden.
Die Erfindung stellt weiterhin Fragmente der für PSCA kodierenden erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle bereit. Ein Fragment eines für PSCA kodierenden Nukleinsäuremoleküls bezieht sich auf einen kleinen Teil der vollständigen für PSCA kodierenden Sequenz- Die Größe des Fragments wird durch die beabsichtigte Verwendung bestimmt. Wenn das Fragment z. B. so ausgewählt wird, dass es einen aktiven Teil des PSCA-Proteins kodiert, wie eine aktive Domäne, eine Effektorbindestelle oder GPI Bindedomäne, dann muss das Fragment groß genug sein, um die funktionellen Bereiche des PSCA-Proteins zu kodieren. Wenn das Fragment als Nukleinsäuresonde oder als Primer für die PCR verwendet werden soll, dann wird die Fragmentlänge so gewählt, um während er Hybridisierung/während des Priming möglichst wenige falsch-positive zu erhalten. Fragmente von menschlichem PSCA, die als selektive Hybridisierungssonden oder PCR Primer besonders nützlich sind können durch bekannte Verfahren leicht aus der gesamten PSCA-Sequenz identifiziert werden. Ein Primer-Set, das für die RT-PCR Analyse nützlich ist, umfasst 5'-TGCTTGCCCTGTTGATGGCAG- und 3'-CCAGAGCAGCAGGCCGAGTGCA-.
Eine andere Klasse von Fragmenten der für PSCA kodierenden Nukleinsäuren sind die Expressionskontrollsequenzen, die man stromaufwärts und stromabwärts der Region findet, die in genomischen Klonen des PSCA-Gen für PSCA kodieren. Spezifisch können prostata-spezifische Expressionskontrollelement als in 5'-Richtung von der für PSCA kodierenden Region identifiziert werden, in genomischen Klonen des PSCA-Gens. Solche Expressionskontrollsequenzen sind nützlich zur Erzeugung von Expressionsvektoren zur Expression von Genen in einer Prostata-Spezifischen Weise. Ein Fachmann kann leicht die hier beschriebene PSCA cDNA Sequenz dazu verwenden, genomische PSCA-Sequenzen und die im PSCA-Gen gefundenen Expressionskontrollsequenzen zu isolieren und zu identifizieren.
VERFAHREN ZUR ISOLIERUNG ANDERER FÜR PSCA KODIERENDER NUKLEINSÄUREMOLEKÜLE
Die hier beschriebenen, für PSCA kodierenden Nukleinsäuremoleküle ermöglichen die Isolierung von PSCA Homologen, Alternativ gespleissten Isoformen, allelischen Varianten, und mutanter Formen des PSCA-Proteins als auch ihrer kodierenden und Gensequenzen. Die bevorzugteste Quelle für PSCA Homologe sind Säugerorganismen.
So kann z. B. ein Teil der hier beschriebenen, für PSCA kodierenden Sequenz synthetisiert und als Sonde verwendet werden, DNA zu gewinnen, die für ein Mitglied der PSCA-Proteinfamilie kodiert aus anderen Organismen als Menschen, oder allelische Varianten der hier beschriebenen PSCA-Proteine, und genomische Sequenz, die das PSCA-Gen enthält. Oligomere, die etwa 18–20 Nukleotide enthalten (und einen Bereich von etwa 6–7 Aminosäuren kodieren) Werden hergestellt und dazu verwendet, genomische DNA oder cDNA Banken zu screenen, um Hybridisierung unter stringenten Bedingungen zu erreichen oder Bedingungen ausreichender Stringenz um ein unangemessenes Maß an falsch positiven zu eliminieren. In einer bestimmten Ausführungsform wurde cDNA, die für menschliches PSCA kodiert dazu verwendet, eine Gesamtlängen cDNA zu isolieren, die ein murines PSCA Homolog wie hier in Beispiel 3 beschrieben kodiert. Der murine Klon kodiert für ein Protein mit 70% Aminosäureidentität zu menschlichem PSCA.
Zusätzlich kann die Aminosäuresequenz des menschlichen PSCA-Proteins zur Erzeugung von Antikörpersonden zum Screening von Expressionsbibliotheken, die aus Zellen präpariert wurden, verwendet werden. Typischerweise kann polyklonales Antiserum aus Säugern, wie z. B. Kaninchen, die mit dem aufgereinigten Protein (wie nachstehend beschrieben) immunisiert wurden oder monoklonale Antikörper dazu verwendet werden, eine Expressionsbibliothek zu screenen, die aus einem Zielorganismus präpariert wurde, um die geeignete kodierende Sequenz für ein PSCA Homolog zu erhalten. Die klonierte cDNA-Sequenz kann als ein Fusionsprotein exprimiert werden, entweder direkt exprimiert unter Verwendung ihrer eigenen Kontrollsequenzen oder exprimiert durch Konstruktion einer Expressionskassette mit Expressionskontrollsequenzen, die für den jeweiligen Wirt geeignet sind, der zur Expression des Enzyms verwendet wird.
Genomische Klone, die PSCA-Gene enthalten, können mit bekannten molekularbiologischen Verfahren erhalten werden. IN einer Ausführungsform wurde ein menschlicher genomischer Klon von etwa 14 kb, der die Exone 1–4 des PSCA-Gens enthält durch Screening einer Lambda Phagen Bibliothek mit einer menschlichen PSCA cDNA Sonder erhalten, wie in Beispiel 4 ausführlicher beschrieben wird. In einer anderen Ausführungsform wurde ein genomischer Klon von etwa 10 kb, der das murine PSCA-Gen enthält durch Screening einer murinen BAC (künstliches Bakterienchromosom) Bibliothek mit einer murinen PSCA cDNA erhalten (ebenfalls in Beispiel 4 beschrieben).
Zusätzlich können Paare von Oligonukleotidprimern für die Anwendung in der Polymerasekettenreaktion (PCR) zur selektiven Amplifikation/Klonierung eines für PSCA kodierenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Fragments davon hergestellt werden. Ein PCR Denaturierungs/Anlagerungs/Verlängerungs-Zyklus zur Verwendung solcher PCR-Primer ist bekannt und kann leicht zur Verwendung bei der Isolierung anderer, für PSCA kodierender Nukleinsäuremoleküle angepasst werden. Bereiche des menschlichen PSCA-Gens, die besonders gut zur Verwendung als Sonde oder als Primer geeignet sind, können leicht identifiziert werden.
Nicht-menschliche Homologe von PSCA, natürlich auftretende allelische Varianten von PSCA und genomische PSCA-Sequenzen werden mit den hier beschriebenen PSCA-Sequenzen ein hohes Maß an Homologie aufweisen. Im allgemeinen werden solche Nukleinsäuren an die menschliche PSCA-Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Solche Sequenzen besitzen typischerweise wenigstens 70% Homologie, bevorzugt wenigstens 80% Homologie und insbesondere bevorzugt wenigstens 90% Homologie zur menschlichen PSCA-Sequenz. „Stringente Bedingungen" sind Bedingungen, die (1) eine niedrige Ionenstärke und eine hohe Temperatur zum Waschen verwenden, z. B. 0,015 M NaCl(0.0015 M Natriumtitrat/0,1% SDS bei 50 Ec, oder (2) verwenden während der Hybridisierung ein denaturierendes Agens wie Formamid, z. B. 50% (vol/vol) Formamid mit 0.1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42 EC. Ein anderes Beispiel ist die Verwendung von 50% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0.075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), –0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt's Lösung, sonifizierte Lachssperma-DNA (50 Tg/ml), 0.1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42 EC; mit Waschschritten bei 42 EC in 0,2 SSC und 0,1% SDS. Der Fachmann kann die geeigneten Stringenzbedingungen zum Erhalt eines klaren und nachweisbaren Hybridisierungssignals leicht bestimmen und variieren.
REKOMBINANTE DNA-MOLEKÜLE DIE NUKLEINSÄUREN ENTHALTEN, DIE FÜR PSCA KODIEREN
Es werden auch rekombinante DNA Moleküle (rDNAs) bereitgestellt, die die hier beschriebenen, für PSCA kodierenden Sequenzen oder Fragmente davon enthalten. Ein rDNA Molekül ist ein DNA Molekül, dass in vitro einer molekularen Manipulation unterzogen wurde. Verfahren zur Erzeugung von rDNA sind im Stand der Technik bekannt, z. B. aus Sambrook et al., Molecular Cloning (1989). In der bevorzugten erfindungsgemäßen rDNA Molekülen ist eine für PSCA kodierende DNA-Sequenz, die für ein PSCA-Protein oder ein PSCA-Fragment kodiert funktionell an einer oder mehrere Expressionskontrollsequenzen und/oder Vektorsequenzen gekoppelt. Das rDNA Molekül kann entweder für das gesamte PSCA-Protein oder für ein Fragment des PSCA-Proteins kodieren.
Die Wahl des Vektors und/oder der Expressionskontrollsequenzen, an die die für PSCA kodierende Sequenz funktionell gekoppelt ist, hängt, wie der Fachmann weiß, direkt von den erwünschten Fähigkeiten ab, z. B. Proteinexpression und die zu transformierende Wirtszelle. Ein von der gegenwärtigen Erfindung in Betracht gezogener Vektor kann zumindest die Replikation oder Insertion in das Wirtsgenom steuern und vorzugsweise auch die Expression der im rDNA Molekül enthaltenen, für PSCA kodierenden Sequenz.
Expressionskontrollelemente, die zur Regulation der Expression einer funktionell gekoppelten proteinkodierenden Sequenz verwendet werden, sind bekannt und umfassen in nicht-beschränkender Weise induzierbare Promotoren, Konstitutive Promotoren, Sekretionssignale, Enhancer, Transkriptionsterminatoren und andere regulatorische Elemente. Vorzugsweise wird ein induzierbarer Promoter verwendet, der leicht kontrolliert werden kann, der z. B. auf einen Nährstoff im Wirtszellmedium reagiert.
In einer Ausführungsform enthält der Vektor, der eine für PSCA kodierende Nukleinsäure enthält ein prokaryotisches Replikon, d. h. eine DNA Sequenz mit der Fähigkeit zur Steuerung der autonomen Replikation und Aufrechterhaltung des rekombinanten DNA Moleküls intrachromosomal in einer prokaryotischen Wirtszelle, wie in einer bakteriellen Wirtszelle, die damit transformiert ist. Solche Replikons sind im Stand der Technik gut bekannt. Zusätzlich können Vektoren, die ein prokaryotisches Replikon enthalten auch ein gen umfassen, dessen Expression einen nachweisbaren Marker wie eine Arzneistoffresistenz verleiht. Typische Arzneistoffresistenzgene sind solche Gene, die Resistenz gegen Ampicillin oder Tetrazyklin verleihen.
Vektoren, die ein prokaryotisches Replikon beinhalten können weiter einen prokaryotischen oder viralen Promoter enthalten, der die Expression (Transkription und Translation) der für PSCA kodierenden Sequenz in einer bakteriellen Wirtszelle, wie E. coli, steuern kann. Ein Promoter ist ein Expressionskontrollelement, das durch DNA gebildet wird und das die Bindung von RNA Polymerase und Transkription ermöglicht. Promotersequenzen, die mit bakteriellen Wirten kompatibel sind, werden typischerweise in Plasmidvektoren bereitgestellt, die nützliche Restriktionsschnittstellen für die Insertion eines erfindungsgemäßen DNA Segmentes enthalten. Für den Fachmann gut bekannte verschiedene virale Vektoren können ebenfalls verwendet werden, wie z. B. eine Anzahl gut bekannter retroviraler Vektoren.
Expressionsvektoren, die mit eukaryotischen Zellen, insbesondere mit Vertebratenzellen kompatibel sind, können auch dazu verwendet werden, rDNA Moleküle zu variieren, die eine für PSCA kodierende Sequenz enthalten. Eukaryotische zelluläre Expressionsvektoren sind im stand der Technik bekannt und können von verschiedenen Herstellern bezogen werden. Typischerweise werden solche Vektoren bereitgestellt, indem sie nützliche Restriktionsschnittstellen für die Insertion des gewünschten DNA Segmentes enthalten. Typische solche Vektoren sind PSVL und pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1/pML2d (International Biotechnologies, Inc.) pTDT1 (ATCC, #31255), der hier beschriebene Vektor pCDM8 und ähnliche eukaryotische Expressionsvektoren.
Eukaryotische zelluläre Expressionsvektoren, die dazu verwendet werden, die erfindungsgemäßen rDNA Moleküle zu erzeugen, können weiterhin einen selektierbaren Marker beinhalten, der in einer eukaryotischen Zelle wirksam ist vorzugsweise einen Arzneistoffresistenz-Selektionsmarker. Ein bevorzugter Arzneistoffresistenzmarker ist das Gen dessen Expression zu Neomycinresistenz führt, d. h. das Neomycin Phosphotransferase (neo) Gen, Southern et al., J. Mol. Anal. Genet. (1982) 1: 327–341. Alternativ kann der selektierbare Marker auf einem separaten Plasmid vorhanden sein, und die beiden Vektoren werden durch Kotransfektion der Wirtszelle eingebracht, und durch Kultivierung in Anwesenheit der für den selektierbaren Marker geeigneten Arzneistoffes selektiert.
Erfindungsgemäß kann der Vektor ein Plasmid, Kosmid oder Phagenvektor sein, der für das wie vorstehend diskutierte cDNA Molekül kodiert. Zusätzlich stellt die Erfindung ein Wirts-Vektorsystem zur Verfügung, das den Plasmid-, Kosmid- oder Phagenvektor umfasst, der in eine geeignete Wirtszelle transfiziert ist. Beispiele geeigneter eukaryotischer Wirtszellen umfassen eine Hefezelle, eine Pflanzenzelle, oder eine tierische Zelle, wie eine Säugerzelle. Beispiel geeigneter Zellen umfassen die LnCaP, LAPC-4 und andere Prostatakrebs Zelllinien. Das Wirts-Vektorsystem ist nützlich für die Produktion eines PSCA-Proteins. Alternativ kann die Wirtszelle prokaryotisch sein, wie eine Bakterienzelle.
TRANSFORMIERTE WIRTSZELLEN
Die Erfindung stellt weiterhin Wirtszellen bereit, die mit einem Nukleinsäuremolekül transformiert sind, dass ein PSCA-Protein oder ein Fragment davon kodiert. Die Wirtszelle kann entweder eu- oder prokaryotisch sein. Eukaryotische Zellen, die zur Expression eines PSCA-Proteins geeignet sind, sind nicht beschränkt, so lange die Zelle kompatibel ist mit Zellkulturverfahren und kompatibel ist mit der Vermehrung des Expressionsvektors und der Expression des PSCA-Gens. Bevorzugte Eukaryotische Wirtszellen umfassen in nicht beschränkender Weise Hefe, Insekten und Säugerzellen, vorzugsweise Vertebratenzellen, die von einer Maus, Ratte, Affe oder menschlichen Fibroblastenlinie abstammen. Prostatakrebs-Zelllinien, wie die Zelllinien LnCaP und LAPC-4 können ebenfalls verwendet werden. Jeder prokaryotische Wirt kann dazu verwendet werden, ein für PSCA kodierendes rDNA Molekül zu exprimieren. Der bevorzugte prokaryotische Wirt ist E. coli.
Die Transformation von geeigneten Zellwirten mit einem erfindungsgemäßen rDNA Molekül wird durch bekannte Verfahren durchgeführt, die typischerweise von dem verwendeten Vektor und Wirtssystem abhängen. Im Hinblick auf die Transformation von prokaryotischen Wirtszellen, werden typischerweise Elektroporation und Salzbehandlungsverfahren verwendet, siehe z. B. Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1972) 69_2110; und Maniatis et al., Molecular Cloning.: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982). Hinsichtlich der Transformation von Vertebratenzellen mit Vektoren, die rDNAs enthalten, werden Elektroporation, kationischer Lipid- oder Salzbehandlungsverfahren typischerweise verwendet, siehe z. B. Graham et al., Virol. (1973) 52: 456; Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1979) 76: 1373–76.
Erfolgreich transformierte Zellen, d. h. Zellen, die ein erfindungsgemäßes rDNA Molekül enthalten, können anhand bekannter Verfahren identifiziert werden. So können z. B. Zellen, die aus der Einbringung einer erfindungsgemäßen rDNA resultieren, kloniert werden, um Einzelkolonien zu erzeugen. Zellen dieser Kolonien können geerntet werden, lysiert und ihr DNA Gehalt hinsichtlich der Anwesenheit von rDNA untersucht werden durch ein Verfahren wie z. B. von Southern beschrieben, J. Mol. Biol. (1975) 98: 503; oder Berent et al., Biotech (1985) 3: 208 oder die von der Zelle erzeugten Proteine können mit einer immunologischen Methode getestet werden.
REKOMBINANTE VERFAHREN ZUR ERZEUGUNG VON PSCA-PROTEINEN
Die Erfindung stellt weiterhin Verfahren bereit zur Erzeugung eines PSCA-Proteins unter Verwendung eines der hier beschriebenen für PSCA kodierenden Nukleinsäuremoleküls. Im allgemeinen beinhaltet die Erzeugung eines rekombinanten PSCA-Proteins typischerweise die folgenden Schritte.
Zuerst wird ein Nukleinsäuremolekül erhalten, dass ein PSCA-Protein oder ein Fragment davon kodiert, wie das in 1A dargestellte Nukleinsäuremolekül. Die für PSCA kodierende Nukleinsäure wird dann vorzugsweise in eine funktionelle Anordnung mit geeigneten Kontrollsequenzen gebracht, wie vorstehend beschrieben, zur Erzeugung einer Expressionseinheit, die die für PSCA kodierende Sequenz enthält. Die Expressionseinheit wird dazu verwendet, einen geeigneten Wirt zu transformieren und der transformierte Wirt wird unter Bedingungen kultiviert, die die Produktion eines PSCA-Proteins ermöglichen. Optional wird das PSCA-Protein aus dem Medium oder aus den Zellen isoliert, die Gewinnung und Aufreinigung kann in einigen Fällen, in denen Verunreinigungen toleriert werden können, nicht notwendig sein.
Jeder der vorhergehenden Schritte kann auf eine Vielzahl von Arten durchgeführt werden. So können z. B. die gewünschten kodierenden Sequenzen aus genomischen Fragmenten erhalten und direkt in einem geeigneten Wirt verwendet werden. Die Konstruktion von Expressionsvektoren, die in einer Vielzahl von Wirten funktionsfähig ist, wird mit einer geeigneten Kombination von Replikons und Kontrollsequenzen erreicht. Die Kontrollsequenzen, Expressionsvektoren und Transformationsverfahren hängen von dem Zelltyp ab, der zur Expression des Gens verwendet wird und wurden vorstehend genauer diskutiert. Geeignete Restriktionsstellen können, wenn sie nicht schon normal erhältlich sind, an den Enden der kodierenden Sequenz hinzugefügt werden, damit ein ausschneidbares Gen zur Insertion in die Vektoren bereitgestellt wird. Ein Fachmann kann jedes bekannte Wirts/Expressionssystem zur Verwendung mit den für PSCA kodierenden Sequenzen zur Erzeugung eines PSCA-Proteins leicht anpassen.
ASSAYS ZUR IDENTIFIZIERUNG VON PSCA LIGANDEN UND ANDEREN BINDEAGENZIEN
Ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf Assays und Verfahren die dazu verwendet werden können, PSCA Liganden und andere Agenzien und zelluläre Bestandteile zu identifizieren, die an PSCA binden. Spezifisch können PSCA Liganden und andere Agenzien und zelluläre Bestandteile, die an PSCA binden durch die Fähigkeit des PSCA Liganden oder anderer Agenzien oder zellulärer Bestandteile identifiziert werden, an PSCA zu binden und/oder die Fähigkeit, PSCA Aktivität zu hemmen/zu stimulieren. Assays für PSCA Aktivität (z. B. Bindung) unter Verwendung eines PSCA-Proteins eignen sich für die Verwendung in Screening-Verfahren mit hohem Durchsatz.
In einer Ausführungsform umfasst der Assay das Mischen von PSCA mit einem Test-Agens oder einem zellulären Extrakt. Nach dem Vermischen unter Bedingungen, die die Assoziation von PSCA mit dem Agens oder dem Bestandteil des Extraktes gestatten, wird das Gemisch analysiert um zu bestimmen, ob das Agens/der Bestandteil an PSCA gebunden ist. Bindende Agenzien/Bestandteile werden identifiziert durch die Fähigkeit, an PSCA zu binden. Alternativ oder nachfolgend kann die PSCA Aktivität direkt als Mittel zur Identifizierung von Agonisten und Antagonisten der PSCA Aktivität identifiziert werden.
Alternativ können Targets, die an ein PSCA-Protein binden, mit einem Hefe Two-Hybrid System oder einem Bindungs-Capture Assay identifiziert werden. Im Hefe Two-Hybrid System wird eine Expressionseinheit, die für ein Fusionsprotein kodiert, dass aus einer Untereinheit eines Transkriptionsfaktors mit zwei Untereinheiten und dem PSCA-Protein besteht, in eine Hefezelle eingebracht und in dieser exprimiert. Die Zelle wird weiter modifiziert um (1) eine Expressionseinheit zu enthalten, die für einen nachweisbaren Marker kodiert, dessen Expression den Transkriptionsfaktor aus zwei Untereinheiten zur Expression benötigt und (2) eine Expressionseinheit, die für ein Fusionsprotein kodiert, bestehend aus der zweiten Untereinheit des Transkriptionsfaktor und einem klonierten Segment DNA. Wenn das klonierte Segment der DNA für ein Protein kodiert, dass an das PSCA-Protein bindet, dann führt die Expression zur Wechselwirkung von PSCA und dem kodierten Protein. Somit werden die beiden Untereinheiten des Transkriptionsfaktors in Bindenähe gebracht, wodurch der Transkriptionsfaktor rekonstituiert wird. Dies führt zur Expression des nachweisbaren Markers. Das Hefe Two-Hybrid System eignet sich besonders zum Screening einer Bibliothek von cDNA kodierende Segmenten auf zelluläre Bindepartner für PSCA.
PSCA-Proteine, die in den vorstehenden Assays verwendet werden können umfassen in nicht beschränkender Weise ein isoliertes PSCA-Protein, ein Fragment eines PSCA-Proteins, eine Zelle, die so verändert wurde, dass sie ein PSCA-Protein exprimiert, oder eine Zellfraktion die so verändert wurde, dass sie ein PSCA-Protein exprimiert. Weiterhin kann das PSCA-Protein dass gesamte PSCA-Protein oder ein definiertes Fragment des PSCA-Protein sein. Ein Fachmann weiß, dass solange das PSCA-Protein durch eine Veränderung des Molekulargewichts oder der Aktivität für Agens Bindung getestet werden kann, der gegenwärtige Assay verwendet werden kann.
Das Verfahren, dass dazu verwendet wird, ob ein Agens/zellulärer Bestandteil an ein PSCA-Protein bindet, wird im wesentlichen auf der Art des verwendeten PSCA-Proteins basieren. So kann z. B. ein Gel-Retardierungs-Assay dazu verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Agens and PSCA oder ein Fragment davon bindet. Alternativ können Immunnachweis- und Biochip-Technolgie für die Verwendung mit dem PSCA-Protein angepasst werden. Ein geübter Fachmann kann zahlreiche aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren zur Bestimmung verwenden, ob ein bestimmtes Agens an ein PSCA-Protein bindet.
Agenzien und zelluläre Bestandteile können weiter hinsichtlich der Fähigkeit getestet werden, die Aktivität eines PSCA-Proteins mit einem zellfreien Assay-System oder einem zellulären Assay-System zu modulieren. Da die Aktivitäten des PSCA-Proteins immer definierter werden, können funktionelle Assays, die auf der identifizierten Aktivität beruhen, verwendet werden.
Wie hier verwendet wirkt ein Agens dann als Antagonist der PSCA Aktivität, wenn das Agens die Aktivität des PSCA vermindert. Der bevorzugte Antagonist antagonisiert PSCA selektiv und beeinträchtigt andere Proteine nicht. Weiterhin wird der bevorzugte Antagonist die PSCA Aktivität um mehr als 50%, bevorzugt um mehr als 90% reduzieren und insbesondere bevorzugt die PSCA Aktivität vollständig aufheben.
Wie hier verwendet wirkt ein Agens dann als Agonist, wenn das Agens die PSCA Aktivität erhöht. Der bevorzugte Agonist wird selektiv agonistisch auf PSCA wirken und beeinträchtigt andere Proteine nicht. Der bevorzugte Agonist erhöht die PSCA Aktivität um mehr als 50%, bevorzugt um mehr als 90% und verdoppelt insbesondere bevorzugt die PSCA Aktivität.
Agenzien, die in dem vorstehend genannten Verfahren getestet werden, sind zufällig ausgewählt oder speziell ausgewählt oder entworfen. Ein Agens ist dann zufällig ausgewählt, wenn das Agens ohne in Betrachtnahme der spezifischen Sequenzen des PSCA-Proteins ausgewählt wurde. Ein Beispiel für zufällig ausgewählte Agenzien ist die Verwendung einer chemischen Bibliothek oder einer kombinatorischen Peptidbibliothek, oder einer Wachstumsbrühe eines Organismus oder ein Pflanzenextrakt.
Agenzien sind speziell ausgewählt oder entworfen wenn das Agens auf einer nicht zufälligen Basis ausgewählt wurde, die die Sequenz der Zielstelle und/oder seine Konformation in Zusammenhang mit der Wirkung des Agens in Betracht zieht. Agenzien können gewählt ausgewählt oder entworfen werden durch Verwendung von Peptidsequenzen, aus denen das PSCA-Protein besteht. So kann z. B. ein speziell ausgewähltes Peptidagens ein Peptid sein, dessen Aminosäuresequenz zu einem Fragment des PSCA-Proteins identisch ist.
Die in den erfindungsgemäßen Verfahren getesteten Agenzien können, als beispiele, Peptide, kleine Moleküle und Vitaminderivate, als auch Kohlenhydrate sein. Ein Fachmann kann leicht erkennen, dass es hinsichtlich der Struktur der in dem erfindungsgemäßen Screening-Verfahren verwendeten Agenzien keine Beschränkung gibt. Eine Klasse von erfindungsgemäßen Agenzien sind Peptidagenzien, deren Aminosäuresequenzen basierend auf der Aminosäuresequenz des PSCA-Proteins ausgewählt ist. Kleine Peptidagenzien können als kompetitive Inhibitoren des PSCA-Protein Zusammenbaus wirken.
Peptidagenzien können mit standardmäßigen feste Phase (oder flüssige Phase) Peptidsyntheseverfahren hergestellt werden, wie es im Stand der Technik bekannt ist. Zusätzlich kann die DNA, die für diese Peptide kodiert, mit käuflich erhältlichen Geräten zur Oligonukleotidsynthese synthetisiert werden und rekombinant mit gewöhnlichen rekombinanten Produktionssystemen erzeugt werden. Die Produktion durch feste Phase Peptidsynthese wird bevorzugt, wenn nicht von einem Gen kodierte Aminosäuren umfasst werden sollen.
Eine andere Klasse von erfindungsgemäßen Agenzien sind Antikörper, die mit kritischen Positionen des PSCA-Proteins immunreaktiv sind. Wie vorstehend beschrieben werden Antikörper durch Immunisierung geeigneter Säuger-Testpersonen mit Peptiden erhalten, die als antigene Bereiche jene Teile des PSCA-Proteins enthalten, die vom Antikörper erkannt werden sollen. Kritische Bereiche können die in den 4 und 5 identifizierten Bereiche umfassen. Solche Agenzien können in kompetitiven Bindestudien dazu verwendet werden, inhibitorische Agenzien der zweiten Generation zu identifizieren.
Die in den erfindungsgemäßen Verfahren untersuchten zellulären Extrakte können als Beispiel wässrige Extrakte von Zellen oder Geweben, organische Extrakte von Zellen oder Geweben oder teilweise aufgereinigte zelluläre Fraktionen sein. Ein geübter Fachmann kann leicht erkennen, dass es keine Beschränkung hinsichtlich der Quelle des zellulären Extraktes gibt, der im erfindungsgemäßen Screening-Verfahren verwendet wird.
Agenzien, die an ein PSCA-Protein, wie einen PSCA-Antikörper binden, können dazu verwendet werden, die Aktivität von PSCA zu modulieren, um Antikrebs-Agenzien auf geeignete Säugerzellen auszurichten, oder um Agenzien zu identifizieren, die die Wechselwirkung mit PSCA blockieren. Zellen, die PSCA exprimieren können durch ein Agens, das an PSCA bindet, angesteuert oder identifiziert werden.
Die Art der Anwendung der PSCA bindenden Agenzien hängt von der Art des PSCA-bindenden Agens ab. Ein an PSCA bindendes Agens kann z. B. verwendet werden um: konjugierte Toxine, wie ein Diphterie-Toxin, Cholera-Toxin, Ricin oder Pseudomonas Exotoxin an eine PSCA-exprimierende Zelle zu transportieren; um PSCA Aktivität zu modulieren, um PSCA-exprimierende Zellen direkt abzutöten, oder in Screens, um kompetitive Bindeagenzien zu identifizieren. So kann z. B. ein PSCA inhibitorisches Agens dazu verwendet werden, das Wachstum von PSCA exprimierenden Zellen direkt zu hemmen, während ein PSCA bindendes Agens als diagnostisches Agens verwendet werden kann.
PROSTATAKREBS-IMMUNTHERAPIE
Die Erfindung stellt verschiedene immuntherapeutische Verfahren zur Behandlung von Prostatakrebs, einschließlich Antikörpertherapie, in vivo Vakzinen und ex vivo Immuntherapie-Ansätzen bereit. In einem Ansatz stellt die Erfindung PSCA-Antikörper bereit, die systemisch zur Therapie von Prostatakrebs verwendet werden können. So kann z. B. ein unkonjugierter PSCA-Antikörper in einen Patienten so eingebracht werden, dass der Antikörper an PSCA auf Prostatakrebs Zellen bindet und die Zerstörung von Zellen und des Tumors vermittelt, durch Mechanismen, die komplement-vermittelte Cytolyse, Antikörper-abhängige zelluläre Cytotoxizität, Veränderung der physiologischen Funktion von PSCA und/oder die Hemmung der Liganden Bindung oder von Signaltransduktionswegen umfassen. PSCA-Antikörper, die an toxische Agenzien wie Rizin gekoppelt sind, können ebenfalls therapeutisch verwendet werden, um das toxische Agens direkt zu PSCA-tragenden Prostatatumor-Zellen zu transportieren und um somit den Tumor zu zerstören.
Prostatakrebs-Immuntherapie mit PSCA-Antikörper kann den Lehren aus verschiedenen Ansätzen folgen, die im Hinblick auf andere Krebsarten erfolgreich verwendet wurden, einschließlich in nicht beschränkender Weise Darmkrebs (Arlen et al. 1988 Crit. Rev. Immunol. 18: 133–138), multiples Myelom (Ozaki et al., 1977, Blood 90: 3179–3186; Tsunenari et al., 1997, Blood 90: 2437–2444), Magenkrebs (Kasprzyk et al., 1992, Cancer Res. 52: 2771–2776), B-Zell-Lymphom (Funakoshi et al., 1996, J. Immunther Emphasis Tumor Immunol. 19: 93–101), Leukämie (Zhong et al., 1996, Leuk. Res. 20: 531–589), Kolorektalkrebs (Moun et al., 1994, Cancer Res. 54: 6160–6166); Velders et al., 1995, Cancer Res. 55: 4398–4403) und Brustkrebs (Shepard et al., 1991, J. Clin. Immunol. 11: 117–127).
Die Erfindung stellt weiterhin Vakzine bereit, die so formuliert sind, dass sie ein PSCA-Protein oder Fragment davon enthalten. Die Verwendung eines Tumorantigens in einem Vakzin zur Erzeugung humoraler und zell-vermittelter Immunität zur Verwendung bei der Anti-Krebs Therapie ist bekannt und wurde mit menschlichen PSMA und Nager-PAP Immunogen bei Prostatakrebs verwendet (Hodge et al., 1995, Int. J. Cancer 63: 231–237; Fong et al., 1997, J. Immunol. 159: 3113–3117). Solche Verfahren können leicht ausgeführt werden mit einem PSCA-Protein, einem Fragment davon, oder mit einem für PSCA kodierenden Nukleinsäuremolekül und rekombinanten Vektoren, die das PSCA Immunogen exprimieren und geeignet präsentieren können.
Es können z. B. virale Systeme zum Gentransport dazu verwendet werden, ein für PSCA kodierendes Nukleinsäuremolekül zu transportieren. Verschiedene Systeme zum Gentransport, die in der Ausübung dieses Aspektes der Erfindung verwendet werden können umfassen in nicht-beschränkender Weise Vaccinia, Fowlpox, Kanarypox, Adenovirus, Influenza, Poliovirus, Adeno-assoziiertes Virus, Lentivirus und Sindbis Virus (Restifo, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8: 658–663). Nicht-virale Transportsysteme können ebenfalls verwendet werden unter Verwendung nackter DNA, die für ein PSCA-Protein oder ein Fragment davon kodiert, die in den Patienten (z. B. intramuskulär) eingebracht wird, um eine Anti-Tumor Antwort zu erzeugen. In einer Ausführungsform kann die Gesamtlängen menschlicher PSCA cDNA verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform können PSCA Nukleinsäuremoleküle, die für spezifische cytotoxische T-Lymphozyten (CTL) Epitope kodieren, verwendet werden. CTL Epitope können anhand spezifischer Algorithmen (z. B. Epimer, Brown Universität) zur Identifizierung von Peptiden innerhalb eines PSCA-Proteins verwendet werden, die optimal an spezifische HLA Allele binden können.
Verschiedene ex vivo Strategien können ebenfalls verwendet werden. Ein Ansatz beinhaltet die Verwendung von dendritischen Zellen zur Präsentation von PSCA Antigen an das Immunsystem des Patienten. Dendritische Zellen exprimieren MHC Klasse I und II, B7 Ko-Stimulator und IL-12 und sind somit hochspezialisierte antigenpräsentierende Zellen. Bei Prostatakrebs werden autologe dendritische Zellen, die mit Peptiden des prostata-spezifischen Membranantigen (PSMA) beladen sind, in einer Phase I klinischen Untersuchung dazu verwendet, das Immunsystem eines Prostatakrebs Patienten zu stimulieren (Tjoa et al., 1996, Prostate 28: 65–69; Murphy et al., 1996, Prostate 29: 371–380). Dendritische Zellen können dazu verwendet werden, PSCA-Peptide an T-Zellen im Kontext von MHC Klasse I und Klasse II Molekülen zu präsentieren. In einer Ausführungsform werden autologe dendritische Zellen mit PSCA-Peptiden beladen, die an MHC-Moleküle binden können. In einer anderen Ausführungsform werden dendritische Zellen mit dem Vollständigen PSCA-Protein beladen. In einer weiteren Ausführungsform ist die Überexpression des PSCA-Gens in dendritischen Zellen umfasst unter Verwendung verschiedener implementierender bekannter Vektoren, wie Adenovirus (Arthur et al., 1997, Cancer Gene Ther. 4: 17–25), Retrovirus (Henderson et al. 1996, Cancer Res. 56: 3763–3770), Lentivirus, Adeno-assoziiertes Virus, DNA Transfektion (Ribas et al., 1997, Cancer Res. 57: 2865–2869) und tumor-abgeleitete RNA-Transfektion (Ashley et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 1177–1182).
Anti-idiotypische Anti-PSCA-Antikörper können auch in der Anti-Krebstherapie als Vakzin zur Induktion einer Immunantwort gegen Zellen verwendet werden, die ein PSCA-Protein exprimieren. Spezifisch ist die Erzeugung von anti-idiotypischen Antikörper gut bekannt und kann leicht adaptiert werden, um anti-idiotypische anti-PSCA-Antikörper zu erzeugen, die ein Epitop auf einem PSCA-Protein nachahmen (siehe z. B. Wagner et al., 1997, Hybridoma 16: 33–40: Foon et al., 1995, J. Clin. Invest 96: 334–342, Herlyn et al., 1996 Cancer Immunol Immunother 43: 65–76). Solch ein anti-idiotypischer Antikörper kann in einer wie gegenwärtig durchgeführten Therapie mit anderen anti-idiotypischen Antikörper, die gegen ein Tumorantigen gerichtet sind, verwendet werden.
Genetische Immunisierungsverfahren können verwendet werden, um prophylaktische oder therapeutische humorale und zelluläre Immunantworten gegen Krebszellen, die PSCA exprimieren, zu erzeugen. Unter Verwendung der hier beschriebenen für PSCA kodierenden DNA Moleküle, können Konstrukte, die DNA umfassen, die für ein PSCA-Protein/Immunogen kodieren und geeigneten regulatorischen Sequenzen direkt in einem Muskel oder Haut eines Individuums injiziert werden, so dass die Muskelzellen oder die Haut das Konstrukt aufnehmen und das kodierte PSCA-Protein/Immunogen exprimieren. Das PSCA-Protein/Immunogen kann als Zelloberflächenprotein exprimiert oder sekretiert werden. Die Expression des PSCA-Proteins/Immunogens führt zur Erzeugung von prophylaktischer oder therapeutischer humoraler und zellulärer Immunität gegen Prostatakrebs. Verschiedene prophylaktische und therapeutische genetische Immunisierungstechniken, die im Stand der Technik bekannt sind, können verwendet werden (für einen Überblick, siehe die Information und die Referenzen, die auf www.geneb.com veröffentlich sind).
VERFAHREN ZUR IDENTIFIZIERUNG VON PSCA-PROTEINEN UND PSCA-GENEN UND RNA
Die Erfindung stellt Verfahren zur Identifizierung von Zellen, Geweben oder Organismen bereit, die ein PSCA-Protein oder PSCA-Gen exprimieren. Solche Verfahren können dazu verwendet werden um die Anwesenheit von Zellen oder eines Organismus in vivo oder in vitro festzustellen, die ein PSCA-Protein exprimieren. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind insbesondere nützlich zur Bestimmung der Anwesenheit von Zellen, die pathologische Zustände der Prostata vermitteln. Spezifisch kann die Anwesenheit eines PSCA-Proteins identifiziert werden durch die Bestimmung, ob ein PSCA-Protein, eine Nukleinsäure, die für ein PSCA-Protein kodiert, exprimiert wird. Die Expression eines PSCA-Proteins kann als Mittel verwendet werden, um die Anwesenheit von Zellen, Geweben oder eines Organismus festzustellen, der ein PSCA-Protein oder Gen exprimiert.
Eine Vielzahl von immunologischen und molekularen genetischen Techniken kann dazu verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein PSCA-Protein exprimiert/produziert wird in einer bestimmten Zelle oder Probe. Im allgemeinen wird ein Extrakt, der Nukleinsäuremoleküle enthält oder ein Extrakt, der Proteine enthält, zubereitet. Der Extrakt wird dann untersucht, um zu bestimmen, ob ein PSCA-Protein, oder ein für PSCA kodierendes Nukleinsäuremolekül in der Zelle produziert wird.
Verschiedene auf Polynukleotiden basierende Nachweisverfahren sind im Stand der Technik bekannt und können zum Nachweis der für PSCA kodierenden Nukleinsäuremoleküle und zum Nachweis von PSCA exprimierenden Zellen in einer biologischen Probe verwendet werden. So können z. B. RT-PCR Verfahren dazu verwendet werden, eine PSCA mRNA oder ein Fragment davon selektiv zu amplifizieren, und solche Verfahren können dazu verwendet werden, Zellen zu identifizieren, die PSCA exprimieren, wie im nachstehenden Beispiel 1 beschrieben. In einer besonderen Ausführungsform wird RT-PCR dazu verwendet, mikrometastasierende Prostatakrebs Zellen oder zirkulierende Prostatakrebs Zellen nachzuweisen. Verschiedene andere Nachweisverfahren mittels Amplifikation wie z. B. verzweigte DNA Verfahren und verschiene bekannte Hybridisierungsassays mit DNA- oder RNA-Sonden können ebenfalls zum Nachweis von für PSCA kodierenden Polynukleotiden oder von PSCA-exprimierenden Zellen verwendet werden.
Verschiedene Verfahren zum Nachweis von Proteinen sind im Stand der Technik bekannt und können zum Nachweis von PSCA-Proteinen und PSCA exprimierenden Zellen verwendet werden. Zur Durchführung eines diagnostischen Tests, der auf Proteinen basiert wird eine geeignete Proteinprobe erhalten und gemäß herkömmlicher Techniken präpariert. Proteinproben können z. B. durch Kochen einer Probe mit SDS hergestellt werden. Das extrahierte Protein kann dann analysiert werden, um die Anwesenheit eines PSCA-Proteins mit bekannten Verfahren zu bestimmen. Die Anwesenheit von Varianten eines Proteins mit spezifischer Größe oder Ladung kann durch die Mobilität in einem elektrischen Feld nachgewiesen werden. Alternativ können Antikörper für Nachweiszwecke verwendet werden. Ein geübter Fachmann kann Proteinanalyseverfahren leicht abwandeln, um zu bestimmen, ob eine Probe ein PSCA-Protein enthält.
Alternativ kann die PSCA Expression auch in Verfahren verwendet werden, um Agenzien zu identifizieren, die die Expressionshöhe des PSCA-Gens vermindern. So können z. B. Zellen oder Gewebe, die ein PSCA-Protein exprimieren, mit einem Testagens kontaktiert werden, um die Auswirkungen eines Agens auf die PSCA Expression zu bestimmen. Agenzien, die die PSCA Expression aktivieren, können als ein Agonist der PSCA Aktivität verwendet werden, während Agenzien, die die PSCA Expression vermindern, als ein Antagonist der PSCA Aktivität verwendet werden können.
PSCA PROMOTER UND ANDERE EXPRESSIONS-REGULATORISCHE ELEMENTE
Die Erfindung stellt weiterhin die Expressionskontrollsequenzen bereit, die in 5'-Richtung des neu identifizierten PSCA-Gens gefunden wurden, in einer Form, die zur Erzeugung von Expressionsvektoren und transgenen Tieren verwendet werden kann. Spezifisch können die PSCA Expressionskontrollelemente, wie der PSCA Promoter, die leicht als in 5'-Richtung vom ATG Startkodon im PSCA-Gen liegend identifiziert werden können, dazu verwendet werden, die Expression einer funktional gekoppelten, für ein Protein kodierenden DNA Sequenz zu steuern. Da die Expression von PSCA auf Prostatazellen beschränkt ist, sind die Expressionskontrollelemente insbesondere nützlich zur Ausrichtung der Expression eines eingebrachten Transgens in einer gewebespezifischen Weise. Ein geübter Fachmann kann den PSCA-Genpromoter und andere regulatorische Elemente in Expressionsvektoren mit bekannten Verfahren leicht verwenden.
ERZEUGUNG TRANSGENER TIERE
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt transgene nicht-menschliche Säuger bereit, die PSCA Nukleinsäuren umfassen. So können z. B. in einer Anwendung PSCA-defiziente nicht-menschliche Tiere mit Standard-Knock-out Verfahren zur Inaktivierung eines PSCA Homologs oder, wenn solche Tiere nicht lebensfähig sind, können induzierbare PSCA Homologe Antisense Moleküle dazu verwendet werden, die PSCA Homologe Aktivität/Expression zu regulieren. Alternativ kann ein Tier verändert werden, um eine menschliche für PSCA kodierende Nukleinsäure oder eine Antisense-PSCA Expressionseinheit zu enthalten, die die Expression eines PSCA-Proteins oder eines Antisense-Moleküls in einer Gewebespezifischen Weise steuert. In solchen Fällen wird ein nicht-menschlicher Säuger, z. B. eine Maus oder eine Ratte erzeugt, in dem die Expression des PSCA Homologen Gens durch Inaktivierung oder Aktivierung verändert und/oder durch ein menschliches PSCA-Gen ersetzt wurde. Dies kann mit einer Reihe von bekannten Verfahren wie gerichtete Rekombination durchgeführt werden. Einmal erzeugt kann das für PSCA Homolog defiziente Tier, das Tier, das PSCA (Mensch oder Homolog) in einer gewebespezifischen Weise exprimiert, oder ein Tier, das ein Antisensemolekül exprimiert dazu verwendet werden (1) biologische und pathologische Prozesse zu identifizieren, die vom PSCA-Protein vermittelt werden, (2) Proteine und andere Gene zu identifizieren, die mit den PSCA-Proteinen interagieren, (3) Agenzien zu identifizieren, die exogen zugeführt werden können, um eine PSCA-Protein-Defizienz zu behandeln und (4) als ein geeigneter Screen dienen zur Identifizierung von Mutationen innerhalb des PSCA-Gens, die die Aktivität steigern oder verringern.
Es ist z. B. möglich, transgene Mäuse zu erzeugen, die ein menschliches Minigen, das PSCA kodiert, in einer gewebespezifischen Weise zu exprimieren und den Effekt der Überexpression des Proteins in Geweben und Zellen zu testen, die normalerweise das PSCA-Protein nicht enthalten. Diese Strategie wurde für andere Gene erfolgreich verwendet, nämlich bcl-2 (Veis et al., Cell. 1993 75: 229). Solch ein Ansatz kann leicht auf das PSCA-Protein/Gen angewandt werden und kann dazu verwendet werden, den möglichen Nutzen oder den schädigenden Effekt von PSCA-Proteinen in einem spezifischen Gewebe zu bewerten.
ZUSAMMENSETZUNGEN
Die Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die ein erfindungsgemäßes PSCA Nukleinsäuremolekül oder einen Expressionsvektor umfasst, der für ein PSCA-Protein kodiert oder für ein Fragment davon kodiert und optional, einen geeigneten Träger. Die Erfindung stellt zusätzlich eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die einen Antikörper oder ein Fragment davon umfasst, der ein PSCA-Protein erkennt und daran bindet. In einer Ausführungsform ist der Antikörper oder das Fragment davon an einer therapeutischen Arzneistoff oder ein cytotoxisches Agens konjugiert oder gekoppelt.
Geeignete Träger für pharmazeutische Verbindungen umfassen jedes Material, welches in Kombination mit der Nukleinsäure oder einem anderen erfindungsgemäßen Molekül die Aktivität des Moleküls beibehält und nicht mit dem Immunsystem der Testperson reagiert. Beispiele umfassen in nicht-beschränkender Weise einen der Standard-Pharmazeutischen Träger wie eine Phosphat-gepufferte Salinelösung, Wasser, Emulsionen wie eine Öl/Wasser Emulsion und verschiedene Arten von Benetzern. Andere Träger umfassen auch sterile Lösungen, Tabletten, umfassen beschichtete Tabletten und Kapseln. Typischerweise enthalten solche Träger Exzipienten wie Stärke, Milch, Zucker, verschiedene Arten von Ton, Gelatine, Stearinsäure oder Salze davon, Magnesium oder Calciumstearat, Talk, Pflanzenfette oder - öle, Gummis, Glykole oder andere bekannte Exzipienten. Solche Träger können auch Geschmack und Farb-Additive oder andere Bestandteile beinhalten. Zusammensetzungen, die solche Träger enthalten, werden anhand herkömmlicher Verfahren formuliert. Solche Zusammensetzungen können auch mit verschiedenen Lipidzusammensetzungen, wie z. B. Liposomen als auch in verschiedenen polymeren Zusammensetzungen, wie als Polymer Mikrosphären formuliert werden.
Die Erfindung stellt auch eine diagnostische Zusammensetzung bereit, die ein PSCA Nukleinsäuremolekül, eine Sonde, die spezifisch an ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül oder an einen Teil davon hybridisiert oder einen PSCA-Antikörper oder ein Fragment davon umfasst. Das Nukleinsäuremolekül, die Sonde oder der Antikörper oder das Fragment davon können mit einem nachweisbaren Marker markiert sein. Beispiele eines nachweisbaren Markers beinhalten in nicht beschränkender Weise ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, eine chemilumineszierende Verbindung, eine biolumineszierende Verbindung, einen Metallchelator oder ein Enzym. Weiterhin stellt die Erfindung eine diagnostische Zusammensetzung zur Verfügung, die ein für PSCA spezifisches Primerpaar umfasst, das für PSCA kodierende Sequenzen mit Polymerasekettenreaktions-Verfahren, wie RT-PCR, amplifizieren kann.
BEISPIELE
BEISPIEL 1: IDENTIFIZIERUNG UND MOLEKULARE CHARAKTERISIERUNG
EINES NEUEN PROSTATA-SPEZIFISCHEN ZELLOBERFLÄCHENANTIGENS (PSCA)
MATERIAL UND METHODEN
LAPC-4 Xenotransplantate: LAPC-4 Xenotransplantate wurden wie in Klein et al., 1997, Nature med. 3: 402–408 beschrieben erzeugt.
RDA. Northern Analyse und RT-PCR: Repräsentative Analyse der Unterschiede von Androgen-abhängigen und unabhängigen LAPC-4 Tumoren wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Braun et al., 1995, Mol. Cell. Biol. 15: 4623–4630). Gesamt RNA wurde mit den Ultraspec^® RNA Isolierungssystemen (biotecx, Houston, TX) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Northern Filter wurde mit einem 660 bp RDA Fragment hybridisiert, dass der kodierenden Sequenz und einem Teil der 3' untranslatierten Sequenz von PSCA oder einem ~400 bp Fragment von PSA entsprach. Der menschliche multiple Gewebeblot wurde von Clontech erhalten und wie spezifiziert hybridisiert. Für die reverse Transkriptase (RT) PCR-Analyse wurde Erst-Strang cDNA aus Gesamt RNA mit dem GeneAmp RNA PCR core Kit (Perkin Elmer-Roche, New Jersey) synthetisiert. Für eine RT-PCR menschlicher PSCA Transkripte wurden die Primer 5'-tgcttgccctgttgatggcag- und 3'-ccagagcagcaggccgagtgca- zur Amplifikation eines ~320 bp Fragmentes verwendet. Wärmezyklen wurden für 25–25 Zyklen bei 95°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute durchgeführt, gefolgt von einer Verlängerung bei 72°C für 10 Minuten. Primer für GAPDH (Clontech) wurden als Kontrollen verwendet. Für Maus-PSCA waren die verwendeten Primer 5'-ttctcctgctggccacctac- und 3'-gcagctcatcccttcacaat-.
In situ Hybridisierungsassay für PSCA mRNA: Für eine in situ Hybridisierung von mRNA wurde das rekombinante Plasmid pCR II (1 μg, Invitrogen, San Diego, CA), dass das Gesamtlängen PSCA-Gen enthielt, linearisiert, um mit Digoxygenin markierte Sense- und Antisense Ribosonden zu erhalten. Die In situ Hybridisierung wurde auf einem automatisierten Instrument (Ventana Gen IΙ, Ventana Medical Systems) wie zuvor beschrieben durchgeführt (Magi-Galuzzi et al., 1997, Lab. Invest. 76: 37–43). Prostata-Proben wurden aus einer bekannten Datenbank erhalten, die auf ~130 Proben erweitert wurde (Magi-Galluzzi et al., supra). Objektträger wurden eingelesen und von zwei Pathologen blind bewertet. Werte von 0–3 wurden gemäß dem Prozentsatz von positiven Zellen zugeordnet (0 = 0%; 1 =< 25%, 2 = 25–50%; 3 => 50%)) und der Färbungsintensität (0 = 0; 1 = 1+; 2 = 2+; 3 = 3+). Die beiden Werte wurden multipliziert um einen Gesamtwert von 0–9 zu ergeben.
ERGEBNISSE
Menschliche PSCA cDNA: Repräsentative Unterschiedsanalyse (RDA), eine auf PCR basierende subtraktive Hybridisierungstechnik wurde dazu verwendet, Genexpression zwischen hormonabhängigen und hormonunabhängigen Varianten eines menschlichen Prostatakrebs Xenotransplantats (LAPC-4) zu vergleichen und um cDNAs zu isolieren, die in der Androgen-unabhängigen LAPC-4 Sublinie heraufreguliert sind. Multiple Gene wurden kloniert, sequenziert und für differentielle Expression überprüft. Ein 660 bp Fragment (klon #15) wurde identifiziert, der im Vergleich mit normalem Prostatagewebe in Xenotransplantat Tumoren stark überexprimiert war. Vergleich der Expression dieses Klons mit PSA Expression in normalem Gewebe und in Xenotransplantat-Tumoren legte nahe, dass Klon #15 relativ für Krebs spezifisch ist (9).
Sequenzanalyse zeigte, dass Klon #15 keine genaue Übereinstimmung in der Datenbank hat, aber 30% Nukleotidhomologie mit dem Stammzellantigen 2, einem Mitglied der Thy-1/Ly-6 Superfamilie von Glykosylphosphatidylinositol (GPI)-verankerten Zelloberflächenantigene hatte. Klon #15 kodiert für ein Protein mit 123 Aminosäuren, dass zu 30% identisch zu SCA- 2 (auch als RIG-E bezeichnet) ist und eine Anzahl von hochkonservierten Cysteinresten aufweist, die für die Ly-6/Thy-1 Genfamilie (3) typisch sind. Übereinstimmend mit der Homologie zu einer Familie der GPI-verankerten Proteine enthält Klon #15 sowohl eine aminoterminale hydrophobe Signalsequenz und eine carboxyterminale Strecke von hydrophoben Aminosäuren, denen eine kleine Gruppe von kleinen Aminosäuren vorhergeht, die eine Spaltungs/Bindungsstelle für die GPI-Verknüpfung darstellen (Udenfriend und Kodukula, 1995, Ann. Rev. Biochem. 64: 563–591). Es enthält auch vier vorhergesagte N-Glykosylierungsstellen. Aufgrund der starken Homologie zum Stammzellantigen-2 wurde der Klon #15 als Prostata Stammzellantigen (PSCA) umbenannt. 5' und 3' PCR RACE Analyse wurde dann mit cDNA durchgeführt, die aus dem LAPC4 Androgen-unabhängigen Xenotransplantat gewonnen wurde und die Gesamtlängen cDNA Nukleotidsequenz (umfassend die kodierende und untranslatierten Bereiche) wurde erhalten. Die Nukleotidsequenz der Gesamtlängen cDNA, die menschliche PSCA kodiert, wird in 1A gezeigt und die translatierte Aminosäuresequenz wird in den 1B und 3 gezeigt.
PSCA-Expression ist prostata-spezifisch: Die Verteilung von PSCA mRNA in normalen menschlichen Geweben wurde durch Northern Blot Analyse untersucht. Die Ergebnisse, gezeigt in 9B zeigen, dass PSCA vorwiegend in Prostata exprimiert wird, mit einer geringeren Expressionslevel in der Plazenta. Kleine Mengen an mRNA können nach verlängerter Exposition in der Niere und im Dünndarm in einer Konzentration von 1/100 des Prostatagewebes nachgewiesen werden. Eine Analyse mit reverser Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) von PSCA Expression in normalen menschlichen Geweben zeigt auch, dass die PSCA Expression beschränkt ist. In einer Reihe von normalen Geweben, wurde eine hohe Konzentration von PSCA mRNA Expression in der Prostata nachgewiesen, mit einer signifikanten Expression, die in der Plazenta und in den Tonsillen nachgewiesen wurde (7A). RT-PCR Analyse der PSCA mRNA Expression in einer Vielzahl von Prostatakrebs Xenotransplantaten, Prostatakrebs Zelllinien und anderen Zelllinien und normaler Prostata zeigt einen hohen Konzentrationslevel beschränkt auf die normale Prostata, die LAPC-4 und LAPC-9 Prostatakrebs Xenotransplantate, und die ovariale Krebszelllinie A431 (7B).
Das hauptsächliche PSCA Transkript in der normalen Prostata ist ~1 kb (9B) Die PSCA Expression bei der Maus wurde durch RT-PCR Analyse in Milz, Leber, Lunge, Prostata, Niere und Hoden der Maus analysiert. Wie menschliches PSCA wird auch murines PSCA hauptsächlich in der Prostata exprimiert- Die Expression kann auch in der Niere in einer Konzentration nachgewiesen werden, die ähnlich zu Plazenta in menschlichen Geweben ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass die PSCA Expression im wesentlichen Prostata-spezifisch ist.
Die Expression von PSCA, PSMA und PSA in Prostata Krebszelllinien und Xenotransplantaten wurde durch Northern Blot Analyse verglichen. Die in 10 gezeigten Ergebnisse zeigen eine hohe prostatakrebs-spezifische Expression sowohl von PSCA und PSMA, wobei die PSA Expression nicht Prostatakrebs-spezifisch ist.
PSCA wird von einer Teilmenge der basalen Zellen in der normalen Prostata exprimiert: Normale Prostata enthält zwei hauptsächliche epitheliale Zellpopulationen: sekretorische luminale Zellen und darunter liegende basale Zellen. Zur Lokalisierung der Expression von PSCA wurden in situ Hybridisierungen auf multiplen Schnitten normaler Prostata mit einer Antisense Ribosonde durchgeführt, die spezifisch für PSCA ist. Wie in 11 gezeigt, ist PSCA exklusiv in einer Teilmenge von normalen basalen Zellen exprimiert. In dem Stroma, in sekretorischen Zellen oder infiltrierenden Lymphozyten sieht man keine oder eine schwache Färbung. Die Hybridisierung mit Sense PSCA Ribosonden zeigte keine Hintergrundfärbung. Die Hybridisierung mit einer Antisense-Sonde für GAPDH bestätigte, dass die RNA in allen Zelltypen intakt war. Da basale Zellen die möglichen Vorläuferzellen für die terminal differenzierten sekretorischen Zellen darstellen, legen diese Ergebnisse nahe, dass PSCA ein prostata-spezifischer Stamm-/Vorläuferzell-Marker ist (Bonkhoff et al., 1994, Prostate 24: 114–118). Zusätzlich legt die Assoziation von PSCA mit basalen Zellen, da basale Zellen androgen-unabhängig sind die Möglichkeit nahe, dass PSCA eine Rolle bei der androgen-unabhängigen Fortschreiten von Prostatakrebs spielen könnte.
PSCA wird in Prostatakrebs-Zellen überexprimiert: Die anfängliche Analyse, die die Expression von PSCA in normaler Prostata und LAPC-4 Xenotransplantat Tumoren vergleicht legt nahe, dass PSCA in Prostatakrebs überexprimiert war. Wie durch die Northern Blot Analyse aus 9 gezeigt wurde, exprimieren LAPC-4 Prostatakrebs-Tumoren PSCA stark; es gibt jedoch fast keine nachweisbare Expression in normaler Prostata. Im Gegensatz dazu ist die PSA Expression in normaler Prostata deutlich erkennbar, in Konzentrationen, die 2–3 fach so hoch sind wie in LAPC-4 Tumoren. Somit scheint die Expression von PSCA in Prostatakrebs umgekehrt wie die PSA Expression zu sein. Während PSA in normalen stärker als in malignen Prostatageweben exprimiert wird, ist PSCA in Prostatakrebs stärker exprimiert.
Zur Bestätigung der Prostataspezifität der Expression von PSCA wurden 126 in Paraffin eingebettete Prostatakrebs Proben durch mRNA in situ Hybridisierung auf PSCA Expression untersucht. Proben wurden aus Primärtumoren erhalten, die in allen Fällen mit einer Ausnahme durch radikale Prostatektomie oder transurethrale Resektion entfernt wurden. Alle Proben wurden sowohl mit einem Antisense als auch mit einem Sense Konstrukt hybridisiert um die Hintergrundfärbung zu kontrollieren. Den Objektträgern wurden wie unter Material und Methoden beschrieben ein zusammengesetzter Wert zugeordnet, wobei ein Wert von 6–9 starke Expression und ein Wert von 4 mäßige Expression anzeigte. 102/126 (81%) der Krebsleiden färbten sich stark für PSCA, während 9/126 (7%) eine mäßige Färbung zeigten (11B und 11C). Hochgradige intraepitheliale Neoplasie, die mögliche Vorläuferläsion von invasivem Prostatakrebs färbte sich stark positiv für PSCA in 82% (97/118) der Proben (3B) (Yang et al., 1997, Am. J. Pathol. 150: 693–703). Normale Drüsen färbten sich durchgehend schwächer als maligne Drüsen (11B). Neun Proben wurden von Patienten erhalten, die vor dem Eingriff mit Hormonablationstherapie behandelt wurden. 7 von 9 (78%) dieser verbleibenden vermutlich androgen-unabhängigen Krebsleiden überexprimierten PSCA, ein Prozentsatz, der ähnlich zu unbehandelten Krebsleiden ist. Da ein so großer Prozentsatz von Proben PSCA mRNA exprimierte, konnte keine statistische Korrelation zwischen Expression von PSCA und pathologischen Eigenschaften wie Tumorstadium und - grad gemacht werden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die PSCA mRNA Überexpression eine allgemeine Eigenschaft von androgen- abhängigem und -unabhängigem Prostatakrebs ist.
PSCA wird in Androgenrezeptor-negativen Prostatakrebs-Zelllinien exprimiert: Obwohl PSCA ursprünglich mit subtraktiver Hybridisierung kloniert wurde, zeigte Northern Blot Analyse eine starker PSCA Expression sowohl in androgen-abhängigen als auch in androgen-unabhängigen LAPC-4 Xenotransplantat-Tumoren (9). Weiterhin wurde PSCA Expression in allen getesteten Prostatakrebs Xenotransplantaten und Zelllinien entdeckt, einschließlich der LAPC-4 Zelllinie und dem Xenotransplantat, dem LAPC-9 Xenotransplantat und der LnCaP Zelllinie (alle androgen-abhängig) als auch in der AI LAPC-4 Xenotransplantat Sublinie, dem LAPC-3 Xenotransplantat, den PC-3 und DU-145 Zelllinien, der AI LnCaP Sublinie und der MatLyLu Zelllinie (alle Androgen-unabhängig).
PSCA Expression in den androgen-unabhängigen, androgen-rezeptor-negativen Prostatakrebs Zelllinien PC-3 und DU-145 wurde ebenfalls durch reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktionsanatyse entdeckt. Diese Daten legen nahe, dass PSCA in Abwesenheit eines funktionellen Androgenrezeptors exprimiert werden kann.
BEISPIEL 2: BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG VON PSCA
MATERIAL UND METHODEN
Polyklonale Antikörper und Immunpräzipitationen: Polyklonales Antiserum aus Kaninchen wurde gegen das synthetische Peptid – TARIRAVGLLTVISK – erzeugt und mit einem PSCA-Glutathion S-Transferase Fusionsprotein affinitätsgereinigt. 293T-Zellen wurden mit pCDNA II (Invitrogen, San Diego, CA) Expressionsvektoren, die PSCA, CD59, E25 enthielten oder mit Vektor alleine durch Kalziumphosphatpräzipitation transfiziert. Immunpräzipitation wurde wie früher beschrieben durchgeführt (Harlow und Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press)). Zellen wurden mit 500 μCi trans35S Markierung (ICN, Irvine, CA) für sechs Stunden markiert. Zelllysate und konditioniertes Medium wurden mit 1 μg aufgereinigtem Kaninchen anti-PSCA-Antikörper und 20 μl Protein A Sepharose CL-4B (Pharmacia Biotech, Schweden) für 2 Stunden inkubiert. Zur Deglykosylierung wurden die Immunpräzipitate über Nacht bei 37°C mit 1U N-Glykosidase F (Boehringer Mannheim) behandelt oder 0,1 u Neuraminidase (Sigma, St. Louis, MO) für 1 Stunde, gefolgt von über nacht Inkubation in 2,5 mU O-Glykosidase (Boehringer Mannheim).
Flußzytometrie: Für flußzytometrische Analysen der PSCA Zelloberflächenexpression wurden Einzelzellsuspensionen mit 2 μg/ml aufgereinigtem anti-PSCA-Antikörper und mit einer 1 : 500 Verdünnung eines mit Fluorescein Isothiocyanat (FITC) markiertem anti-Kaninchen IgG (Jackson Laboratories, West Grove, PA) gefärbt. Daten wurden auf einem FACScan (Becton Dickinson) gewonnen und mit LYSIS II Software analysiert. Kontrollproben wurden mit sekundärem Antikörper alleine gefärbt. Glykosylphosphatidyl- Inositol-Kopplung wurde durch Verdau von 2 × 10⁶ Zellen mit 0,5 Einheiten von für Phosphatidylinositol spezifischer Phospholipase C (PI-PLC, Boehringer Mannheim) für 90 Minuten bei 37°C analysiert. Zellen wurden nach und vor Verdau entweder durch FACS Scan oder durch Immunblot analysiert.
ERGEBNISSE
PSCA ist ein GPI-verankertes Glykoprotein, das auf der Zelloberfläche exprimiert wird: Die abgeleitete PSCA Aminosäuresequenz sagt voraus, dass PSCA stark glykosyliert und über einen GPI Mechanismus an der Zelloberfläche verankert ist. Um diese Vorhersagen zu testen, stellten wir einen Affinitätsgereinigten, polyklonalen Antikörper her, der gegen ein einzigartiges PSCA Peptid gebildet wurde (siehe Material und Methoden). Dieses Peptid enthält keine Glykosylierungsstellen und es wurde vorhergesagt, basierend auf der dreidimensionalen Struktur von CD59 (ein anderes GPI- verankertes PSCA Homolog), in einer exponierten Position des reifen Proteins zu liegen (Kiefer et al., 1994, Biochem 33: 4471–4482). Die Erkennung von PSCA durch den affinitäts-gereinigten Antikörper wurde durch Immunblot und Immunpräzipitationsanalysen von Extrakten von 293T-Zellengezeigt, die mit PSCA und einem GST-PSCA Fusionsprotein transfiziert waren. Der polyklonale Antikörper immunpräzipitiert hauptsächlich eine 24 kd Bande aus PSCA-transfizierten, aber nicht schein-transfizierten Zellen (12A). Drei kleiner Banden sind ebenfalls anwesend, wobei die kleinste etwa ~10 kd groß ist. Das Inmunpräzipitat wurde mit N- und O-spezifischen Glykosidasen behandelt, um zu bestimmen, ob diese Banden glykosylierte Formen von PSCA darstellen. N-Glykosidase F deglykosylierte PSCA, während O-Glykosidase keinen Effekt hatte (12A). Einige GPI-verankerte Proteine sind dafür bekannt, sowohl membrangebundene als auch sekretierte Formen zu haben (Fritz und Lowe, 1996, Am. J. Physiol. 270_G176–G183). 12B zeigt, dass etwas PSCA im 293T Überexpressionsystem sekretiert wird. Die sekretierte Form von PSCA wandert bei einem niedrigeren Molekulargewicht als die Zelloberflächen-assoziierte Form, was wahrscheinlich das fehlen einer kovalenten GPI-Verknüpfung anzeigt. Dieses Ergebnis kann die hohe Konzentration an Expression in der 293T Zelllinien zeigen und muss durch Prostatakrebs Zelllinien in vivo bestätigt werden.
Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieren (FACS) wurde dazu verwendet, die PSCA Expression auf der Zelloberfläche zu lokalisieren. Nicht permeabilisierte, scheintransfizierte 293T Zellen, 293T Zellen, die PSCA exprimieren und LAPC-4 Zellen wurden mit affinitätsgereinigtem oder sekundären Antikörper alleine gefärbt. 12C zeigt die Zelloberflächenexpression von PSCA in PSCA-transfizierten 293T- und LAPC-4 Zellen, aber nicht in scheintransfizierten Zellen. Zur Bestätigung, dass diese Zelloberflächenexpression durch eine kovalente GPI-Verknüpfung vermittelt wird, wurden die Zellen mit GPI-spezifischer Phospholipase C (PLC) behandelt. Die Freisetzung von PSCA von der Zelloberfläche durch PLC zeigte sich durch eine höhere als eine Verminderung um 1 log in der Fluoreszenzintensität. Rückgewinn von PSCA in dem post-Verdau konditionierten Medium wurde auch durch Immunblotting bestätigt. Die Spezifität von Phospholipase C Verdau für GPI-verankerte Proteine wurde durch Durchführen des gleichen Experimentes auf 293T-Zellen bestätigt, die mit dem GPI- verknüpften Antigen CD59 oder dem nicht mit GPI verknüpften Transmembranprotein E25a transfiziert waren (Dellersnijder et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 19475–19482). PLC Verdau verringerte die Zelloberflächenexpresion von CD59 auf das gleiche Maß wie PSCA hatte aber keinen Effekt auf E25. Diese Ergebnisse unterstützen die Annahme, dass PSCA ein glykosyliertes, GPI-verknüpftes Zelloberflächenprotein ist.
BEISPIEL 3: ISOLIERUNG VON CDNA, DIE FÜR DAS MURINE PSCA HOMOLOG KODIERT
Die menschliche PSCA cDNA wurde dazu verwendet, murine EST Datenbanken abzusuchen, um Homologe für mögliche transgene und knockout-Experimente zu identifizieren. Ein EST aus fötaler Maus und ein anderes aus neonataler Niere waren 70% identisch zur menschlichen cDNA sowohl auf Nukleotid- als auch auf Aminosäureebene. Die Homologie zwischen den Mausklonen und dem menschlichen PSCA umfasste Bereiche von Divergenz zwischen menschlichem PSCA und seinen GPI-verankerten Homologen, was zeigt, dass diese Klone wahrscheinlich das murine Homolog von PSCA darstellen. Alignment dieser ESTs und eine 5' Verlängerung mit RACE-PCR stellte die vollständige kodierende Sequenz bereit (2)
BEISPIEL 4: ISOLIERUNG MENSCHLICHER UND MURINER PSCA-GENE
MATERIAL UND METHODEN
Genomische Klonierung: Lambda Phagen-Klone, die das menschliche PSCA-Gen enthielten wurden durch Screening einer menschlichen genomischen Bibliothek (Stratagene) mit einer menschlichen PSCA cDNA Sonde (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor)) erhalten. BAC (bakterielle artifizielle Chromosomen) Klone, die das murine PSCA-Gen enthielten, wurden durch Screening einer murinen BAC Bibliothek (Genome Systems, St. Louis, MO) mit einer murinen PSCA cDNA Sonde erhalten. Ein 14 kb großes menschliches Not I Fragment und ein 10 kb großes murines Eco RI Fragment wurden in pBluescript (Stratagene) subkloniert, sequenziert und restriktionskartiert.
Chromosomen-Kartierung durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung, Fluoreszenz in situ chromosomale Analyse (FISH) wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt unter Verwendung überlappender menschlicher Lambda Phagen-Klone (Rowley et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci USA 87: 9358–9362).
ERGEBNISSE
Struktur des PSCA-Gen: Menschliche und murine genomische Klone von etwa 14 kb bzw. 10 kb Größe wurden erhalten und restriktionskartiert. Eine schematische Repräsentation der Genstrukturen menschlicher und muriner PSCA und Ly-6/Thy-1 wird in 8 gezeigt. Sowohl die murinen als auch die menschlichen genomischen Klone enthalten drei Exons, die die translatierten und die 3' untranslatierten Bereiche des PSCA-Gens kodieren. Ein viertes Exon, das für einen 5' untranslatierten Bereich kodiert existiert angenommenerweise basierend auf der Homologie von PSCA mit anderen Mitgliedern der Ly-6 und Thy-1 Genfamilien (8).
Menschliches PSCA-Gen liegt auf Chromosom 8q24.2: Eine Southern-Blot Analyse der LAPC-4 genomischen DNA zeigte, dass PSCA von einem Einzelkopie-Gen kodiert wird. Andere Ly-6 Genfamilien-Mitglieder enthalten vier Exons, einschließlich eines ersten Exons, das für einen 5' untranslatierten bereich kodiert und 3 zusätzliche Exons, die für den translatierten und 3' untranslatierte Bereiche kodieren. Genomische Klone von menschlichem und murinem PSCA, die alle außer dem angenommenen 5' ersten Exon enthielten wurden erhalten durch Screening von Lambda Phagenbibliotheken. Murine und menschliche PSCA Klone hatten eine ähnliche genomische Organisation. Der menschliche Klon wurde dazu verwendet, PSCA durch Fluoreszenz in situ Hybridisierungs-Analyse zu lokalisieren. Kohybridisierung von überlappenden menschlichen PSCA Lambda Phagen-Klonen resultierte in der spezifischen Markierung ausschließlich von Chromosom 8 (13). 97% der nachgewiesenen Signale lokalisierten auf Chromosom 8q24, davon waren wiederum 87% spezifisch für Chromosom 8q24.2. Diese Ergebnisse zeigen, dass PSCA auf Chromosom 8, Bande q24.2 lokalisiert ist.
BEISPIEL 5: ERZEUGUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN DIE UNTERSCHIEDLICHE EPITOPE VON PSCA ERKENNEN
MATERIAL UND METHODEN
Ein GST-PSCA Fusionsprotein-Immunogen wurde dazu verwendet, Antikörper in Mäusen herzustellen nach dem Standardverfahren der Erzeugung von monoklonalen Antikörpern. Die für PSCA kodierende Sequenz, die den Aminosäuren 18 bis 98 der menschlichen PSCA Aminosäuresequenz, die in 1B gezeigt ist, entspricht, wurde mit dem folgenden Primerpaar amplifiziert:
Die amplifizierte PSCA-Sequenz wurde in pGEX-2T (Pharmacia) kloniert, dazu verwendet, E. coli zu transformieren und das Fusionsprotein wurde isoliert.
Flußzytometrieanalyse der Zelloberflächenexpression von PSCA wurde mit LAPC-9 Maus Prostatakrebs-Xenotransplantat-Zellen, mit der Prostatakrebs Zelllinie LAPC-4 oder normal Prostata-Epithelzellen (Clonetics) durchgeführt, mit MAbs 3E6 und 1G8 und dem in Beispiel 2 beschriebenen polyklonalen Mausserum. 25000 Zellen pro Probe wurden nach der Färbung mit einer 1 zu 10 Verdünnung von entweder MAb 1G8, 3E6 oder polyklonalem Maus-Serum analysiert, gefolgt von einer 1 : 100 Verdünnung eines mit FITC markierten Ziege Anti-Maus sekundären Antikörper. Hintergrund-Fluoreszenz (Kontrolle) wurde durch Inkubation der Proben mit dem sekundären Antikörper alleine bestimmt.
Die Epitop-Kartierung der anti-PSCA monoklonalen Antikörper wurde durchgeführt durch Western Blot Analyse der GST-PSCA Fusionsproteine. 1 μg der GST-PSCA Fusionsproteine (Aminosäuren 18–98) oder ein Fusionsprotein aus dem GST-PSCA aminoterminalem Bereich (N-terminal, Aminosäuren 2–50), ein GST-PSCA Protein aus dem mittleren Bereich (GST- Mitte, Aminosäuren 46–109), oder ein Protein aus dem GST-carboxyterminalen Bereich (GST-C-terminal, Aminosäuren 85–123) wurden auf einem 12% SDS-PAGE Gel aufgetrennt und auf Nitrozellulose übertragen. Die Membran wurde mit einer 1 : 250 Verdünnung von konzentriertem Gewebekulturüberstand von entweder 1G8 oder 3E6 monoklonalen Antikörper-Hybridomen hybridisiert und dann mit einem Peroxidase-gekoppelten sekundären Antikörper und durch verstärkte Chemilumineszenz sichtbar gemacht.
ERGEBNISSE
4 Hybridom-Klone wurden selektiert und die Gewebekulturüberstände durch ELISA, FACS, Western Blot und Immunpräzipitation ausgewertet. Diese Analysen zeigten, dass zwei der Klone MAbs erzeugen, die als 3E6 und 1G8 bezeichnet werden, die übereinstimmend PSCA erkennen. Die Zelloberflächen-Expressionsanalyse von PSCA-Expression auf kanzerösen und normalen Prostata-Epithelzellen durch Flußzytometrie mit den MAbs 3E6 und 1G8 und dem in Beispiel 2 beschriebenen polyklonalen Antikörper wird in 14 gezeigt.
Die PSCA MAbs 3E6 und 1G8 wurden durch Western Blot Analyse der GST-PSCA Fusionsproteine epitopkartiert. Die Ergebnisse sind in 15 dargestellt und zeigen, dass diese MAbs unterschiedliche Epitope auf PSCA erkennen. MAb 3E6 erkennt ein Epitop im Carboxyterminalen Bereich des Proteins, während MAb 1G8 ein aminoterminales Epitop erkennt (15).
Beispiel 6
Diese Ergebnisse stellen die Epitopkartierung von anti-PSCA monoklonalen Antikörpern bereit.
Monoklonale Antikörper 1G8, 2H5, 3C5 und 4A10 erkennen ein Epitop im aminoterminalen Bereich des PSCA-Proteins und der monoklonale Antikörper 3E6 erkennt ein Epitop im carboxyterminalen Bereich des Proteins. GST-PSCA Fusionsproteine, die entweder den aminoterminalen Bereich des PSCA-Proteins (N-terminal, Aminosäuren 2–50), den mittleren Bereich (Mitte, Aminosäuren 46–109) oder den carboxyterminalen Bereich (C-terminale Aminosäuren 85–123) erkennen wurden in einem ELISA dazu verwendet, das Epitop zu identifizieren, das von den 5 anti-PSCA monoklonalen Antikörpern erkannt wird. 10 ng der genannten Fusionsproteine, mit denen die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte beschichtet wurden, wurden entweder mit einer 1 : 250 Verdünnung von konzentrierten Gewebekulturüberständen von Hybridomen 1G8 oder 3E6 oder mit 1 : 10 Verdünnungen der Überstände der Hybridome 2H5, 3C5 oder 4A10 inkubiert. Die Bindung der monoklonalen Antikörper wurde durch Inkubation mit einer 1 : 4000 Verdünnung eines Peroxidase-markierten sekundären Antikörpers und Entwicklung mit 3,3' 5,5' Tetramethylbenzidin-Base nachgewiesen. Optische Dichten der Vertiefungen wurden bei einer Wellenlänge von 450 nm bestimmt. Die Ergebnisse für die Antikörper 1G8 und 3E6 stellen den Mitelwert ± die Standardabweichung aus Bestimmungen im Dreifachansatz dar und Ergebnisse für 2H5, 3C5 und 4A10 stellen den Mittelwert ± Standardabweichung für Bestimmungen im Doppelansatz dar. Die stärkste Bindung der monoklonalen Antikörper an die verschiedenen Fusionsproteine ist fettgedruckt dargestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
Die monoklonalen Antikörper 1G8, 2H5, 3C5 und 4°10 erkennen ein Epitop, das im aminoterminalen Bereich des PSCA-Proteins liegt und der monoklonalen Antikörper 3E6 erkennt ein Epitop im carboxyterminalen Bereich des Proteins. GST-PSCA Fusionsproteine, die entweder den aminoterminalen Bereich des PSCA-Proteins kodieren (N-terminal, Aminosäuren 2–50), den mittleren Bereich (Mitte, Aminosäuren 46–109) oder den carboxyterminalen Bereich (C-terminale Aminosäuren 85–123) wurden in einem ELISA dazu verwendet, das von den 5 anti-PSCA monoklonalen Antikörpern erkannte Epitop zu identifizieren. 10 ng der genannten Fusionsproteine, mit denen die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte beschichtet wurden, wurden entweder mit einer 1 : 250 Verdünnung von konzentrierten Gewebekulturüberständen von Hybridomen 1G8 oder 3E6 oder mit 1 : 10 Verdünnungen der Überstände der Hybridome 2H5, 3C5 oder 4A10 inkubiert. Die Bindung der monoklonalen Antikörper wurde durch Inkubation mit einer 1 : 4000 Verdünnung eines Peroxidase-markierten sekundären Antikörpers und Entwicklung mit 3,3' 5,5' Tetramethylbenzidin-Base nachgewiesen. Optische Dichten der Vertiefungen wurden bei einer Wellenlänge von 450 nm bestimmt. Die Ergebnisse für die Antikörper 1G8 und 3E6 stellen den Mittelwert ± die Standardabweichung aus Bestimmungen im Dreifachansatz dar und Ergebnisse für 2H5, 3C5 und 4A10 stellen den Mittelwert ± Standardabweichung für Bestimmungen im Doppelansatz dar. Die stärkste Bindung der monoklonalen Antikörper an die verschiedenen Fusionsproteine ist fettgedruckt dargestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2
Die vorliegende Erfindung ist in ihrem Umfang nicht auf die hier beschriebenen Ausführungsformen beschränkt, die als einzelne Veranschaulichungen einzelner Aspekte der Erfindung gedacht sind. Funktionelle Äquivalente davon sind ebenfalls von der Erfindung umfasst. Verschiedene Modifikationen der Modelle und Verfahren der Erfindung, zusätzlich zu den hier beschriebenen, sind für den Fachmann aus der vorhergehenden Beschreibung und Lehre ersichtlich, und gehören ebenfalls zur Erfindung.

Claims

Anti-PSCA-Antikörper oder ein immunologisch aktives Fragment davon, welches an die extrazelluläre Domäne eines Prostata-Stammzell-Antigen-(PSCA)-Proteins bindet, wobei das PSCA-Protein die Aminosäuresequenz hat wie gezeigt in 1B oder 2, oder allelische Varianten davon, die PSCA-Eigenschaften haben.
Anti-PSCA-Antikörper oder das immunologisch aktive Fragment nach Anspruch 1, das an ein Peptidfragment des Prostata-Stammzell-Antigens, das die Aminosäuresequenz TARIRAVGLLTVISK hat, bindet.
Anti-PSCA-Antikörper oder das immunologisch aktive Fragment nach Anspruch 1, umfassend eine Antigen-Bindedomäne, welche gegen ein Peptidfrag ment des Prostata-Stammzell-Antigens, das die Aminosäuresequenz VDDSQDYYVGKK hat, gerichtet ist.
Anti-PSCA-Antikörper oder das immunologisch aktive Fragment nach Anspruch 1, welches an das native Prostata-Stammzell-Antigen oder allelische Varianten davon, die PSCA-Eigenschaften wie auf der Oberfläche einer Zelle exprimiert haben, bindet.
Anti-PSCA-Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4, der ein polyklonaler Antikörper ist.
Anti-PSCA-Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4, der ein monoklonaler Antikörper ist.
Anti-PSCA-Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4, der ein chimärer Antikörper ist.
Anti-PSCA-Antikörper oder das immunologisch aktive Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das so markiert ist, dass es direkt oder indirekt ein detektierbares Signal erzeugt mit einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Radiomarkierung, einem Enzym, einem Chromophor und einer Fluoreszenzverbindung.
Anti-PSCA-Antikörper oder das immunologisch aktive Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Verwendung als ein Arzneimittel.
Immunologisch aktives Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4, 8 und 9, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus F(ab)-, F(ab')- und F(ab')₂-Fragmenten.
Immunkonjugat, umfassend den anti-PSCA-Antikörper oder das immunologisch aktive Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 10, verknüpft an ein therapeutisches Agens.
Immunkonjugat nach Anspruch 11, wobei das therapeutische Agens ein zytotoxisches Agens ist.
Immunkonjugat nach Anspruch 12, wobei das zytotoxische Agens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ricin, Doxorubicin, Daunorubicin, Taxol, Ethidiumbromid, Mitomycin, Etoposid, Tenoposid, Vincristin, Vinblastin, Colchicin, Dihydroxyanthracendion, Actinomycin D, Diphterietoxin, Pseudomonas Exotoxin (PE) A, PE40, Abrin, Glucocorticoid und Radioisotopen.
Immunkonjugat nach einem der Ansprüche 11 bis 13, das so markiert ist, dass es direkt oder indirekt ein detektierbares Signal erzeugt mit einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Radiomarkierung, einem Enzym, einem Chromophor und einer Fluoreszenzverbindung.
Immunkonjugat nach einem der Ansprüche 12 bis 13, welches das Wachstum einer Zelle, die Prostata-Stammzell-Antigen-(PSCA) exprimiert, inhibiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den anti-PSCA-Antikörper oder das immunologisch aktive Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder das Immunkonjugat nach einem der Ansprüche 11 bis 15 und einen geeigneten Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei der Träger eine phosphatgepufferte Salinelösung, Wasser, Öl/Wasser-Emulsion, Benetzungsmittel, sterile Lösung, Arzneistoffträger, Stärke, Milch, Zucker, Ton, Gelatine, Stearinsäure, Magnesiumstearat, Calciumstearat, Talg, vegetarisches Fett, vegetarisches Öl, Gummi, Glycerin, Aroma, oder Farbstoffzusatz ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 16, welche als eine Tablette, beschichtete Tablette, Kapsel, Liposom oder eine polymere Mikrosphere formuliert ist.
Verwendung des anti-PSCA-Antikörpers oder eines immunologisch aktiven Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder dem Immunkonjugat nach Anspruch 14 zur Detektion des Vorliegens von Prostata-Stammzell-Antigen in einer Probe.
Verwendung des anti-PSCA-Antikörpers oder eines immunologisch aktiven Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder dem Immunkonjugat nach Anspruch 14 zur Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung, die geeignet ist zur Detektion des Vorliegens von Prostata-Stammzell-Antigen in einem Subjekt.
Verwendung des anti-Prostata-Stammzell-Antigen-(PSCA)-Antikörpers oder des immunologisch aktiven Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder des Immunkonjugats nach Anspruch 14 zur Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung, die zur Detektion des Vorliegens des Prostata-Stammzell-Antigen-(PSCA)-Proteins in einer Probe geeignet ist.
Verwendung des anti-Prostata-Stammzell-Antigen-(PSCA)-Antikörpers oder des immunologisch aktiven Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder des Immunkonjugats nach Anspruch 14 zur Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung, die zur Detektion einer Krebszelle oder -gewebe, die das PSCA-Protein in einem Subjekt exprimiert, geeignet ist.
Verwendung des anti-Prostata-Stammzell-Antigen-(PSCA)-Antikörpers oder des immunologisch aktiven Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder des Immunkonjugats nach Anspruch 14 zur Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung, die zur Detektion von Prostatakrebs in einem Subjekt geeignet ist.
Verwendung des anti-Prostata-Stammzell-Antigen-(PSCA)-Antikörpers oder des immunologisch aktiven Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder des Immunkonjugats nach Anspruch 14 zur Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung, die zur Diagnose einer Krebszelle oder -gewebe, die das PSCA-Protein in einem Subjekt exprimiert, geeignet ist.
Verwendung des anti-Prostata-Stammzell-Antigen-(PSCA)-Antikörpers oder des immunologisch aktiven Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder des Immunkonjugats nach einem der Ansprüche 12, 13, 15 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die zum selektiven Abtöten einer Zelle, die Prostata-Stammzell-Antigen in einem Subjekt exprimiert, geeignet ist.
Verwendung des anti-PSCA-Antikörpers oder des immunologisch aktiven Fragments oder des Immunkonjugats nach Anspruch 19, wobei die Detektion des Vorliegens des Prostata-Stammzell-Antigens in einer Probe das In-Kontakt-Bringen der Probe mit dem anti-PSCA-Antikörper oder des immunologisch aktiven Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder dem Immunkonjugat nach Anspruch 14 und Nachweis der Bindung des Antikörpers oder des immunologisch aktiven Fragments oder des Immunkonjugats mit dem PSCA-Protein in einer Probe umfasst.
Verwendung des anti-PSCA-Antikörpers oder eines immunlogisch aktiven Fragments oder des Immunkonjugats nach Anspruch 26, wobei die Detektion umfasst (a) In-Kontakt-Bringen der Probe mit dem anti-PSCA-Antikörper oder des immunologisch aktiven Fragments oder dem Immunkonjugat, das zur Bildung eines Komplexes mit dem Prostata-Stammzell-Antigen-(PSCA)-Protein in der Probe fähig ist und (b) Bestimmen, ob sich irgendein Komplex so gebildet hat, wobei der Komplex für das Vorliegen des Prostata-Stammzell-Antigen-(PSCA)-Proteins in der Probe hinweisend ist.
Verwendung des anti-PSCA-Antikörpers oder eines immunologisch aktiven Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder des Immunkonjugats nach Anspruch 14 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die geeignet ist zum Beobachten des Verlaufs von Prostatakrebs in einem Subjekt, wobei das Beobachten des Verlaufs des Prostatakrebses in dem Subjekt die quantitative Bestimmung in einer ersten Probe von dem Subjekt der Menge eines Prostata-Stammzell-Antigen-(PSCA)-Proteins unter Verwendung des anti-PSCA-Antikörpers oder des immunologisch aktiven Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder des Immunkonjugats nach Anspruch 14 und Vergleichen der so bestimmten Menge mit der Menge von PSCA-Protein, das in einer zweiten Probe von dem Subjekt vorliegt, umfasst, wobei die erste und zweite Probe von dem Subjekt zu verschiedenen Zeitpunkten erhalten werden und ein Unterschied bei den Mengen von PSCA-Protein in der ersten und zweiten Probe für den Verlauf des Krebses hinweisend ist.
Anti-PSCA-Antikörper oder das immunologisch aktive Fragment nach Anspruch 4 oder 9 oder das Immunkonjugat nach Anspruch 15, wobei die Zelle eine Prostatazelle, Prostatakrebszelle, Plazentazelle, Eierstockkrebszelle oder eine Mandelzelle ist.
Die Verwendung des Prostata-Stammzell-Antigen-(PSCA)-Antikörpers oder eines immunologisch aktiven Fragments oder des Immunkonjugats nach Anspruch 25, wobei die Zelle, die das Prostata-Stammzell-Antigen exprimiert, eine Prostatazelle, Prostatakrebszelle, Plazentazelle, Eierstockkrebszelle oder eine Mandelzelle ist.
Die Verwendung des Prostata-Stammzell-Antigen-(PSCA)-Antikörpers oder eines immunologisch aktiven Fragments oder des Immunkonjugats nach Anspruch 22 oder 24, wobei die Krebszelle oder -gewebe, die das Prostata-Stammzell-Antigen exprimiert, eine Prostatakrebszelle oder eine Eierstockkrebszelle ist.
Verwendung des Prostata-Stammzell-Antigen-(PSCA)-Antikörpers oder eines immunologisch aktiven Fragments oder des Immunkonjugats nach einem der Ansprüche 19, 21, 26, 27 oder 28, wobei die Probe, die erste Probe oder die zweite Probe ein Gewebe, eine Zelle oder eine biologische Flüssigkeit ist.
Die Verwendung des Prostata-Stammzell-Antigen-(PSCA)-Antikörpers oder eines immunologisch aktiven Fragments oder des Immunkonjugats nach Anspruch 32, wobei das Gewebe aus Prostata, Prostatakrebs, Plazenta, Eierstockkrebs oder Mandel stammt.
Die Verwendung des Prostata-Stammzell-Antigen-(PSCA)-Antikörpers oder eines immunologisch aktiven Fragments oder des Immunkonjugats nach Anspruch 32, wobei die biologische Flüssigkeit Urin oder Blutserum ist.
Verwendung eines Prostata-Stammzell-Antigen-(PSCA)-Proteins zur Herstellung eines Vaccins zur Prostatakrebstherapie.
Anti-idiotypischer anti-PSCA-Antikörper, der an den anti-PSCA-Antikörper oder das immunologisch aktive Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 10 bindet oder an das Immunkonjugat nach einem der Ansprüche 11 bis 15 bindet.
Verwendung des anti-idiotypischen anti-PSCA-Antikörpers nach Anspruch 36 zur Herstellung eines Vaccins, das zur Prostatakrebstherapie geeignet ist.