JP4404381B2 - Ｐｓｃａ：前立腺幹細胞抗原 - Google Patents

Description

本明細書を通じ、括弧内の様々な文献を参照とした。これらの文献の内容は、その全体が本明細書に参照として組み入れられている。
発明の背景
前立腺癌は、米国において現在最も一般的な癌種であり、この集団における、癌に関連した第二の死因である。前立腺癌が進行した病期において、これは主に骨に転移し、そこで骨芽細胞病変を形成する。抗アンドロゲン療法による初期治療の後に転移した前立腺癌のほとんどは、ホルモン治療抵抗性となり致命的である。現在の診断および治療の様式は、特異性の欠如、およびどの患者が転移性疾患を発生するリスクがあるかが予測不可能であることによって、限定されたものとなっている。
ほとんどの前立腺癌は、尿道から離れた、前立腺辺縁部に初発する。この部位の腫瘍はいかなる症状も生じないため、その結果前立腺癌の初期段階にある男性のほとんどは、顕著な進行が生じるまで本疾患の臨床症状は呈しないであろう。前立腺移行部への腫瘍の進行は、尿道閉塞に繋がり、従って本疾患の最初の症状を生じる。しかしながらこれらの臨床症状は、良性前立腺肥大症(BPH)に良く見られる悪性でない状態とは見分けがつかない。
前立腺癌の診断および治療における基本的問題点のひとつは、病期初期の局在化した腫瘍を正確に検出することのできるマーカーが存在しないことである。多くのマーカーが同定され、かつPSAなどのいくつかは、広範に臨床使用されているにもかかわらず、理想的な前立腺腫瘍マーカーは依然特定されていない。同様の問題点は、どの癌が緩徐発育性(indolent)であるか、およびどれが侵襲性(aggressive)であるかまたは侵襲性になるかを決定するための効果的な予後判定マーカーが存在しないことである。例えばPSAは、緩徐発育性癌および侵襲性癌を正確に区別することができない。更に、抗体指示療法(antibody-directed therapy)、免疫療法および遺伝子治療のような治療法のための理想的な前立腺特異性の標的として利用することができるマーカーも、非常に必要とされている。現在、手術または放射線療法の後に再発性疾患が発症した患者の20〜40%、もしくは診断時に転移性疾患を有する患者について、有効な治療法が無い。抗ホルモン療法は、これらの患者を緩和することはできるが、大部分は、治療不能なアンドロゲン依存型疾患の発症へと必ず進行する(Lalaniら、Cancer Metastasis Rev.、16:29-66(1997))。
前立腺癌の早期検出および診断は、現在、直腸指診(DRE)、前立腺特異抗原(PSA)の測定、経直腸超音波断層法(TRUS)および経直腸針生検(TRNB)に頼っている。現時点で、DREと組合せた血清PSAの測定が、前立腺癌の検出および診断に使用される先導的方法である。両方共、本疾患のより良好な診断マーカーを発見するための集中的研究を刺激する大きな限界を有している。
PSAは、今日前立腺癌のスクリーニング、診断および経過観察のための腫瘍マーカーとして最も広範に使用されている。特に、いくつかの血清PSAを検出するイムノアッセイが、広く臨床使用されている。最近になって、血清中のPSA mRNAの逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)アッセイが開発された。しかしながら、PSAは、BPHおよび前立腺炎患者の大きな割合において(25〜86％)(Gaoら、Prostate、31:264-281(1997))、更には他の悪性でない疾患の患者および健常な男性の一部において、上昇したPSAレベルが検出されるので、疾患に特異的なマーカーではなく、この要因が本マーカーの診断特異性を著しく制限している。例えば、血清PSAの4〜10ng/mlの上昇がBPHにおいて認められ、かつより高い値が、前立腺炎、特に急性前立腺炎において認められる。BPHは、男性において非常によく見られる状態である。更にこの状況を混乱させるのは、血清PSAの上昇がDREによる疾患の徴候が無くとも認められ、その逆もあるという事実である。更に、PSAは、前立腺に特異的でないことが現在わかっている（Gaoら、前記、参照)。
PSAをベースにした検出の特異性を改善するために設計された様々な方法、例えば、PSA密度の測定および遊離PSAに対する複合PSAの比の測定などが説明されている。しかしながら、これらの方法のいずれもが、悪性前立腺疾患から良性のものを再現性をもって識別することができない。更に、PSA診断は感度が57〜79%であり(Cupp & Osterling、Mayo Clin Proc、68:297-306(1993))、従って本疾患を有する男性のかなり大きな集団について前立腺癌を誤って確定する。
前立腺特異性膜抗原(PSMA)は、最近公表された前立腺癌の細胞表面マーカーであり、診断および治療のためのマーカーとしての使用を評価する様々な研究の主題となっている。PSMAの発現は前立腺組織に主として限定されているが、検出可能レベルのPSMA mRNAが、脳、唾液腺、小腸および直腸細胞の癌腫において見つけられている(Israeliら、Cancer Res.、53:227-230(1993))。PSMAタンパク質は、ほとんどの原発性および転移性前立腺癌において高度に発現されるが、ほとんどの正常な上皮内新生腫瘍標本においても発現される(Gaoら、前記)。再発性前立腺癌を造影するためのインジウム-111で標識した抗PSMAモノクローナル抗体を使用する予備的結果は、いくつかの可能性を示している(Sodeeら、Clin Nuc Med、21:759-766(1996))。PSMAが有用な治療の標的であるかどうか証明することは、決定されるべきまま残されている。しかしPSMAは、機能的アンドロゲン受容体の存在を必要とするホルモン依存型抗原である。全ての前立腺癌細胞がアンドロゲン受容体を発現するわけではないので、治療の標的としてのPSMAの利用性は、本質的に制限されたものである。
前立腺癌の臨床的病期判定は、今日泌尿器科医が直面している別の基本的問題点である。現在、臨床的病期判定は、腫瘍が依然として前立腺被膜の境界内に留まっている(局所に限られた)か、もしくはそれを超えて広がっているか(局所的に進行した)を決定するための直腸診と、血清PSAの測定および経直腸的超音波補助生検との組合せに頼っている。しかしながら、DREによる臨床の病期判定は主観に左右されるために、よく腫瘍の局所的広がりを過少評価または過大評価し、しばしばその位置を誤って判定し、かつ腫瘍の体積と広がりとあまり関連しない(Lee,C.T and Osterling,J.E.、Cancer of the Prostate:diagnosis and Staging、Urologic Onclology、W.B.Saunders Company、Philadelphia,pp357-377(1997))。血清PSAレベルは、更に病期判定の目的で利用することもできるが、PSA単独では、前立腺腫瘍を信頼性をもって病期を判定することはできない。本疾患の進行を予想する、信頼できる方法はない。従って、前立腺癌の管理において、より信頼でき、かつ情報の多い病期判定および予後判定の方法の必要性がある。
発明の概要
本発明は、高度の前立腺上皮内新生腫瘍(PIN)、アンドロゲン依存型およびアンドロゲン非依存型前立腺腫瘍を含む、前立腺癌の全ての病期を通じて広範に過剰発現する、前立腺幹細胞抗原(PSCA)と称される、新規の前立腺に特異的な細胞表面抗原を提供する。このPSCA遺伝子は、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー型細胞表面抗原であるThy-1/Ly-6ファミリーの一員である幹細胞抗原-2(SCA-2)と30％の相同性を示し、アミノ末端シグナル配列、カルボキシ末端GPIアンカー配列、および複数のN-グリコシル化部位を伴う123アミノ酸のタンパク質をコードしている。PSCA mRNAの発現は、健常男性の組織において前立腺特異的であり、かつアンドロゲン依存型及びアンドロゲン非依存型の両方の前立腺癌異種移植片において、高度にアップレギュレーションされる。インサイチューmRNA分析は、PSCAの発現を、前立腺の予想される幹細胞コンパートメントである基底細胞上皮に局在化している。フローサイトメトリー分析は、PSCAは主として細胞表面に発現され、かつGPI結合によってつなぎとめられていることを明らかにしている。蛍光インサイチューハイブリダイゼーション分析は、PSCA遺伝子を、前立腺癌の80％以上における対立遺伝子獲得(allelic gain)領域である染色体8q24.2に局在化している。
PSCAは、それが細胞表面に位置すること、前立腺に特異的に発現すること、および前立腺癌細胞において大きくアップレギュレーションされて発現することから、最善の治療の標的となり得る。これに関連して本発明は、前立腺癌細胞を破壊する治療で使用することができるPSCAに結合することが可能な抗体を提供する。これに加えて、PSCAタンパク質およびPSCAをコードする核酸分子を、免疫的に媒介された前立腺腫瘍の破壊を促進するための様々な免疫療法において使用することができる。
PSCAは、更に悪性前立腺癌、正常な前立腺および悪性でない新生腫瘍を区別するために使用が可能な、理想的な前立腺癌マーカーを代表することができる。例えば、PSCAは、良性前立腺肥大症(BPH)に比べ前立腺癌において非常に高レベルで発現される。これに比べて、広範に使用されている前立腺癌マーカーであるPSAは、正常な前立腺およびBPHの両方において高レベルで発現されるが、前立腺癌においては低レベルで発現され、PSAの発現は、BPHまたは正常な腺から悪性前立腺癌を区別する点では無効である。PSCAの発現は、本質的にPSA発現の逆であるので、PSCA発現の分析は、悪性でない状態から前立腺癌を区別するために使用することができる。
ヒトおよびマウスのPSCAをコードする遺伝子は両方とも単離されており、かつそれらのコード配列は解明され、本明細書において提供されている。更にヒトおよびマウスの両方のPSCAのアミノ酸配列も提供されている。本発明は、更に核酸を基にした免疫学的アッセイを含む、前立腺癌の検出、経過観察および予後判定のための様々な診断用アッセイを提供している。PSCAに特異的なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、並びに免疫療法および他の前立腺癌の治療法も提供されている。本発明のこれらおよび他の局面について、更に以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ヒトPSCA(ATCC寄託番号209612)をコードするcDNAのヌクレオチド配列(Ａ)(配列番号：１)および翻訳されたアミノ酸(配列Ｂ)(配列番号：２)である。
図２は、マウスのPSCA相同体（配列番号：４）をコードするcDNAのヌクレオチド配列（配列番号：３）である。
図３は、ヒトPSCA(配列番号：２)、マウスPSCA(配列番号：６)およびヒト幹細胞抗原-2（hSCA-2）（配列番号：５）のアミノ酸配列を並べたものである。斜線の領域は、保存されたアミノ酸を強調している。保存されたシステインは、太字で示した。PSCA中の4個の予想されたN-グリコシル化部位は、アスタリクスで示した。このタンパク質の最初および最後の下線を付けたアミノ酸は各々、N-末端の疎水性シグナル配列およびC-末端のGPI-アンカー配列を表わしている。
図4は、ヒトPSCAの疎水性のプロットである。
図5は、ヒトPSCAのChou-Fasman分析である。
図6は、様々な前立腺癌細胞株および異種移植片におけるPSCA発現のRT-PCR分析である。
図7は、正常および癌性の組織におけるPSCA mRNAの制限された発現である。A：正常ヒト組織におけるPSCA発現のRT-PCR分析は、前立腺、胎盤および扁桃腺において高い発現を示している。示された組織由来の逆転写された第一のcDNA鎖(Clontech,Palo Alto,CA)1ngを、PSCA遺伝子に特異的なプライマーで増幅した。データは、30サイクルの増幅を示している。B：PSCA発現のRT-PCR分析は、前立腺癌異種移植片および正常組織において高レベルを示している。示された組織由来の逆転写cDNA5ngは、PSCA遺伝子に特異的なプライマーで増幅した。β−アクチン遺伝子に特異的なプライマーによる増幅は、様々な試料のcDNA第一鎖が正常であることを示している。データは、25サイクルの増幅を示している。AD、アンドロゲン依存型；AI、アンドロゲン非依存型；IT、脛骨内異種移植片；C.L.、細胞株。
図8は、ヒトPSCA、マウスのPSCAおよびヒトThy-l/Ly-6遺伝子構造の概略図である。
図9は、PSCA発現のノーザンブロット分析である。A：正常な前立腺およびLAPC-4アンドロゲン依存型(AD)および非依存型(AI)の前立腺癌異種移植片由来のRNA全体は、PSCAまたはPSAに特異的なプローブを用いて分析した。同等のRNAの負荷およびRNAの完全性を、18Sおよび28S RNAのエチジウム染色により個別に示した。B：ヒトの複数の組織のPSCAノーザンブロット分析。フィルターは、Clontech(Palo Alto,CA)から入手し、各列はポリA RNAを2μg含有する。
図10は、前立腺癌異種移植片および腫瘍細胞株におけるPSCA、PSMA、およびPSAの発現のノーザンブロットでの比較である。PSCAおよびPSMAは高レベルの前立腺癌に特異的な遺伝子発現を示した。示された組織由来の総RNA 10μgを、アガロース／ホルムアルデヒドゲル上でサイズ分画してニトロセルロースに転写し、かつ³²Pで標識したプローブと順次ハイブリダイゼーションし、PSCA、PSMA、およびPSAのcDNA断片を示した。4時間および72時間後の膜のオートラジオグラフィー暴露を示し、かつ臭化エチジウムゲルは、試料が等量負荷されたことを示している。BPH、良性前立腺肥大症；AD、アンドロゲン依存型；AI、アンドロゲン非依存型；IT、脛骨内異種移植片；C.L.、細胞株。
図11は、正常および悪性前立腺標本上のヒトPSCAのアンチセンスリボプローブによるインサイチューハイブリダイゼーションである。A：PSCAは、基底細胞上皮内の基底細胞サブセットによって発現される(黒色矢印)が、前立腺管の内壁(lining)の最終分化した分泌細胞によっては発現されない(×400倍)。B：倍率×40で、PSCAは、高度の前立腺上皮内新生腫瘍(PIN)(黒色矢印)および侵襲性前立腺癌腺(黄色矢印)によって強力に発現されるが、正常な上皮においては検出されない(緑色矢印)。C：高度の癌腫におけるPSCAの強力な発現(×200倍)。
図12は、PSCAの生化学的分析である。A：PSCAは、「材料および方法」に示したように、PSCA構築物で一過性にトランスフェクションした293T細胞から免疫沈降し、その後N-グリコシダーゼFまたはO-グリコシダーゼのいずれかにより消化した。B：PSCAは、トランスフェクションした293T細胞から、更にこれらの細胞の馴化培地(conditioned media)から免疫沈降した。15％ポリアクリルアミドゲル上で、細胞に結合したPSCAは、分泌されたPSCAよりも大きく移動した。C：親和性精製したポリクローナル抗PSCA抗体を用いる、模擬(mock)トランスフェクションした293T細胞、PSCAトランスフェクションした293T細胞およびLAPC-4前立腺癌異種移植片細胞のFACS分析である。細胞は、表面の発現のみを検出するために透過させ(permeabilize)なかった。y軸は、相対的細胞数を表わし、x軸は対数スケールでの蛍光染色強度を表わしている。
図13は、ビオチン標識したPSCAプローブの、フィトヘムアグルチニン(phytohemagglutinin)で刺激した末梢血リンパ球由来のヒト中期細胞への、インサイチューハイブリダイゼーションである。第8相同染色体を矢印で示し；特異的標識が8q24.2に認められた。挿入図は、8q24.2に(矢印の先)に特異的標識を示す2個の第8相同染色体の部分的核型を示している。画像は、冷却した電荷結合素子(CCD)カメラを装着したZeiss Axiopot顕微鏡を用いて得た。DAPIで染色された染色体およびハイブリダイゼーションシグナルの個別の画像は、画像解析ソフト(NU200およびImage 1.57)を用いて合体した。
図14は、抗−PSCAモノクローナル抗体1G8(緑)および3E6(赤)、マウスの抗-PSCAポリクローナル血清(青)、または対照の第二抗体(黒)を用いる、前立腺癌異種移植片(LAPC-9)、前立腺癌細胞株(LAPC-4)および正常な前立腺上皮細胞(PREC)上の、細胞表面PSCA発現のフローサイトメトリー分析である。詳細は実施例5を参照のこと。
図15は、抗-PSCAモノクローナル抗体1G8および3E6のエピトープマッピングである。詳細は実施例5を参照のこと。
発明の詳細な説明
本発明は、前立腺幹細胞抗原(以後「PSCA」と称す)に関する。PSCAは、前立腺細胞においてほとんど独占的に発現され、かつアンドロゲン依存型およびアンドロゲン非依存型の両方の前立腺癌によって過剰発現される、新規のグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー型細胞表面抗原である。前立腺癌におけるPSCAの発現は、病期の進行に相関し得る。
PSCA mRNAは、正常な前立腺の基底細胞サブセットによっても発現される。この基底細胞上皮は、最終分化した分泌細胞の前駆細胞を含むと考えられている(Bonkhoffら、Prostate、24:114-118(1994))。サイトケラチンマーカーを用いた最近の研究は、この基底細胞上皮が、少なくとも2種類の個別の細胞の亜集団、一方はサイトケラチン5および14を発現し、他方はサイトケラチン5、8および18を発現するものを含むことを示唆している(BonkhoffおよびRemberger、Prostate、28:98-106(1996))。PSCAは基底細胞サブセットによってのみ発現されるという知見は、PSCAがこれら2種の基底細胞系の一方のマーカーであり得ることを示唆している。
PSCAの生物学的機能は不明である。Ly-6遺伝子ファミリーは、シグナル伝達および細胞−細胞接着を含む、多様な細胞機能に関っている。SCA-2によるシグナル伝達は、未成熟な胸腺細胞のアポトーシスを防ぐことが実証されている(Nodaら、J.Exp.Med.、183:2355-2360(1996))。Thy-1は、T細胞の活性化に関与し、かつsrc様のチロシンキナーゼを介してシグナルを伝達する(Thomasら、J.Biol.Chem.、267:12317-12322(1992))。Ly-6遺伝子は、腫瘍発生およびホモ型(homotypic)細胞接着の両方に関っている(BamezaiおよびRock、Proc.Natl.Acad.Sci USA、92:4294-4298(1992);Katzら、Int.J.Cancer、59:684-691(1994);Brakenhoffら、J.Cell Biol、129:1677-1689(1995))。基底細胞におけるPSCAの制限された発現およびそのSca-2に対する相同性を基に、我々は、PSCAは自己再生(抗アポトーシス)および／または増殖のような、幹細胞／前駆細胞の機能において役割を果たすことができると仮定した。
PSCAは、マウスおよびヒトにおいて高度に保存されている。前立腺に主として限られている保存された遺伝子が同定されたことは、PSCAが正常な前立腺の発達において重要な役割を果たすという仮説を裏付けるものである。
この様々な局面において、以下に詳細に説明するように、本発明は、PSCAのタンパク質、抗体、核酸分子、組換えDNA分子、形質転換された宿主細胞、生成法、アッセイ、免疫療法、トランスジェニック動物、免疫学的および核酸を基にしたアッセイならびに組成物を提供する。
PSCAタンパク質
本発明のひとつの局面は、様々なPSCAタンパク質およびそれらのペプチド断片を提供する。本明細書で使用されたように、PSCAは、図1Bおよび3に示されたヒトPSCAのアミノ酸配列、並びに図3に示されたマウスのPSCA相同体のアミノ酸配列、もしくは他の哺乳類のPSCA相同体のアミノ酸配列を有するタンパク質に加え、PSCA活性を有するこれらのタンパク質の対立遺伝子変異体および保存的に置換された突然変異体を意味する。本発明のPSCAタンパク質は、ここに記されたような特異的に同定されかつ特徴付けられた変異体に加え、対立遺伝子変異体、保存的に置換された変異体、並びに以下に概説された方法に従い不当な実験を行うことなく単離／生成し、かつ特徴付けることができるような相同体を含む。簡略化のために、全てのPSCAタンパク質は、PSCAタンパク質、本発明のタンパク質、またはPSCAを集合的に意味する。
「PSCA」という用語は、図1Bおよび3に示された、天然に生じたヒトPSCAの対立遺伝子変異体、アイソフォームおよび前駆体、並びに図3に示されたマウスPSCAを全て含む。一般に、例えばヒトPSCAの天然に生じた対立遺伝子変異体は、図1Bおよび3に提示されたPSCAアミノ酸配列と顕著な相同性を共有している(例えば70〜90％)。対立遺伝子変異体は、僅かに異なるアミノ酸配列により、GPI結合タンパク質として前立腺細胞の表面に発現するか、もしくは分泌されるかする。典型的には、PSCAタンパク質の対立遺伝子変異体は、ここに記されたPSCA配列に由来する保存的アミノ酸の置換を含むか、もしくは例えばここに記されたマウスPSCAの相同体のようなPSCA相同体の対応する位置のアミノ酸の置換を含むであろう。
PSCA対立遺伝子変異体の一つのクラスは、図1Bおよび3に記されたPSCAアミノ酸配列の少なくとも一つの小領域に、高度な相同性を共有するタンパク質であるが、更に非保存的置換、端の切断(truncation)、挿入およびフレームシフトのような、該配列からの決定的変更を含むであろう。このような対立遺伝子は、PSCAの突然変異対立遺伝子と称され、典型的には同じ生物学的機能を発揮することのないタンパク質を表わしている。
保存的アミノ酸置換は、タンパク質の立体配置または機能のいずれかを変更することなく、タンパク質において頻繁に行われ得る。このような変更は、イソロイシン(I)、バリン(V)、ロイシン(L)の、これらの疎水性アミノ酸以外のいずれかへの置換；アスパラギン酸(D)の、グルタミン酸(E)への置換、およびその逆；グルタミン(Q)の、アスパラギン(N)への置換、またはその逆；並びにセリン(S)の、トレオニン(T)への置換、またはその逆の置換を含む。他の置換も、特定のアミノ酸の環境およびタンパク質の3次元構造におけるその役割に応じて、保存的とみなすことができる。例えばグリシン(G)およびアラニン(A)は、頻繁に相互交換でき、アラニン(A)およびバリン(V)も同様である。比較的疎水性のメチオニン(M)は、頻繁にロイシンおよびイソロイシンと、稀にバリンと相互交換される。リシン(K)およびアルギニン(R)は、これらアミノ酸残基の著しい特徴は電荷であり、かつこれらの2種のアミノ酸残基のpKの差が顕著ではない位置において、頻繁に相互交換することができる。更に他の変更も、特定の環境において「保存的」とみなすことができる。
ヒトPSCAのアミノ酸配列は、図1Bおよび3に提示している。ヒトPSCAは、123アミノ酸の単一のサブユニットからなり、かつアミノ末端シグナル配列、カルボキシ末端GPIアンカー配列、および複数のN-グリコシル化部位を含む。PSCAは、造血発生(hamatopoietic development)の初期相をマークする細胞表面タンパク質のグループである、Thy-1/Ly-6遺伝子ファミリーの一員である幹細胞抗原-2(SCA-2)と、30％の相同性を示す。マウスPSCAのアミノ酸配列は、図3に示す。マウスPSCAは、ヒトPSCAとおよそ70％の相同性および類似の構成を有する、123アミノ酸の単一のサブユニットタンパク質である。
PSCAタンパク質は、様々な形で具体化することができるが、単離された形が好ましい。ここで使用されるように、PSCAタンパク質を、通常は該タンパク質に結合している細胞構成体から取り除くために、物理的、機械的または化学的方法が用いられた場合、タンパク質が単離される。当業者は、単離されたPSCAタンパク質を得るために、標準的精製法を容易に使用することができる。精製されたPSCAタンパク質分子は、PSCAを抗体または他のリガンドに結合させる他のタンパク質または分子を実質的に含まない。単離および精製の性質および程度は、意図する用途に応じて決まる。PSCAタンパク質の態様は、精製されたPSCAタンパク質、および機能的可溶性PSCAタンパク質を含む。機能的可溶性PSCAタンパク質のひとつの例は、図1Bに示されたアミノ酸配列もしくはそれらの断片である。ひとつの例において、このような機能的可溶性PSCAタンパク質またはそれらの断片は、抗体または他のリガンドに結合する能力を保持している。
本発明は更に、図1Bおよび3に示したヒトおよびマウスのPSCAアミノ酸配列の生物学的に活性な断片を含むペプチドを提供する。本発明のペプチドは、PSCAの特性、例えばPSCAに連結したエピトープに特異的に結合する抗体の発生を誘発する能力などを示す。このようなPSCAタンパク質のペプチド断片は、標準的ペプチド合成技術および本明細書に記されたヒトまたはマウスのPSCAタンパク質のアミノ酸配列を用いて生成することができる。あるいは、PSCAタンパク質の断片をコードしている核酸分子を生成するために、組換え法を使用することができる。これに関して、本明細書に記されたPSCAをコードしている核酸分子は、所定のPSCA断片を生成する手段を提供する。以下に記したように、PSCAペプチド断片は、特に、ドメイン特異性の抗体の生成；PSCAまたはPSCAドメインに結合する物質の同定；PSCAまたはPSCAドメインに結合する細胞因子の同定；および、ヒトPSCAの相同体または他の対立遺伝子型の単離において有用である。特に興味深い構造を有するPSCAペプチドは、当該技術分野において周知の様々な分析技術を用いて予想および／または同定することができ、この分析は例えばChou-Fasman、Garnier-Robson、Kyte-Doolittle、Eisenberg、Karplus-SchultzまたはJameson-Wolf分析、もしくは免疫原性を基にしたものを含む。例として、ヒトPSCAの疎水性およびChou-Fasmanプロットを、各々、図4および5に示した。このような残基を含む断片は、特にサブユニットに特異的な抗-PSCA抗体の生成、またはPSCAに結合する細胞因子の同定において有用である。
本発明のPSCAタンパク質は、様々な目的に有用であり、これは更に以下に詳細に示すように、前立腺癌の診断および／または予後判定のマーカーとして、ならびに様々な治療様式の標的としてのそれらの使用を含むが、これらに限定されるものではない。PSCAタンパク質は、更にPSCAに結合するリガンドおよび他の物質を同定しかつ単離するために使用することができる。正常な前立腺において、PSCAは、基底細胞サブセットにおいて独占的に発現され、このことは、PSCAが、基底上皮内の特異的な細胞系のマーカーとして使用することができることを示唆している。これに加えて、本出願人の結果は、基底細胞のこのセットが、新生腫瘍の形質転換の標的となることを示唆している。従って例えば形質転換に寄与しうる分子因子を排除または調節するように設計された治療戦略は、PSCA細胞表面タンパク質を介して、この細胞集団に対して特異的に指向することができる。
PSCA抗体
本発明は更に、PSCAに結合する抗体を提供する。最も好ましい抗体は、PSCAに選択的に結合し、かつ非-PSCAタンパク質には結合しない(もしくは弱く結合する)ものであろう。特に意図された抗-PSCA抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、更にはこれらの抗体の抗原結合ドメインおよび／または1個以上の相補性決定領域を含む断片である。
一態様において、PSCA抗体は、PSCAタンパク質の細胞外ドメインに特異的に結合する。別の態様において、PSCA抗体は、他のPSCAタンパク質または前駆体に特異的に結合する。当業者に理解されるように、抗体が指向するPSCAタンパク質の領域またはエピトープは、意図された用途によって変更することができる。例えば、生存可能な前立腺癌細胞上の膜結合PSCAの検出のためのイムノアッセイにおいて使用することが意図された抗体は、膜に結合したPSCA上の利用可能なエピトープに対し指向されなければならない。このような抗体の例は、下記実施例において説明される。別のエピトープを認識する抗体は、傷害を受けたかもしくは死にかけている細胞内のPSCAの同定、分泌されたPSCAタンパク質またはそれらの断片の検出に有用である。本発明は更に、特異的にPSCAタンパク質を認識する抗体断片を包含している。本明細書において使用した抗体断片は、その標的に結合する免疫グロブリン分子の可変部の少なくとも一部、すなわち抗原結合領域と定義される。免疫グロブリンの定常部の一部も含むことができる。
PSCAの前立腺特異性、PSCAのアンドロゲン依存型およびアンドロゲン非依存型前立腺癌細胞の両方における過剰発現、ならびにPSCAの細胞表面の位置は、スクリーニング、診断、予後判定および経過観察のアッセイならびに造影法のための優れたマーカー特性を示している。これに加えて、これらの特性は、PSCAが、標的化された抗体療法、免疫療法および遺伝子治療のような治療法の優れた標的と成り得ることを示している。
本発明のPSCA抗体は、前立腺癌の管理における診断アッセイ、造影法、および治療法において特に有用である。本発明は、PSCAタンパク質の検出および前立腺癌の診断に有用な様々な免疫学的アッセイを提供する。このようなアッセイは、一般にPSCAタンパク質を認識しかつ結合することが可能な1種またはそれ以上のPSCA抗体を含み、かつ当該技術分野で周知の様々な免疫学的アッセイのフォーマットを含み、これらは様々な種類のラジオイムノアッセイ、固相エンザイムイムノアッセイ(ELISA)、蛍光エンザイムイムノアッセイ(ELIFA)などを含むが、これらに限定されるものではない。これに加えて、前立腺癌の検出が可能な免疫造影法も、本発明によって提供され、これは、標識したPSCA抗体を用いるラジオシンチレーション造影法を含むが、これに限定されるものではない。このようなアッセイは、前立腺癌の検出、経過観察、および予後判定において臨床的に有用である。
一態様において、PSCA抗体およびそれらの断片は、前立腺癌、PIN、またはPSCAタンパク質を発現している基底上皮細胞の存在の検出のために使用される。血清、前立腺および他の組織の生検標本、骨などの他の組織、尿などを含む様々な生物学的検体中のこのようなPSCA+細胞の存在は、PSCA抗体によって検出することができる。これに加えてPSCA抗体は、インジウム-111(または他の同位元素)複合抗体によるイムノシンチグラフィーのような、様々な造影法において使用することができる。例えば、In-111が複合した抗-PSMA抗体を用いる、最近明らかにされたものに類似した、ある造影プロトコールは、再発性および転移性前立腺癌腫の検出に使用することができる(Sodeeら、Clin Nuc Med、21:759-766(1997))。例えばPSMAのような前立腺癌の他のマーカーと比較して、PSCAは、アンドロゲン受容体が陰性の前立腺癌細胞の標的化において特に有用である。PSCA抗体は、治療においてPSCA機能を阻害するためにも使用することができる。
PSCA抗体は、更にPSCAタンパク質およびペプチドの精製、ならびにPSCA相同体および関連した分子の単離の方法において使用することができる。例えば一態様において、PSCAタンパク質の精製法は、固形マトリックスに結合したPSCA抗体を、PSCAを含有する溶菌液または他の溶液と共に、PSCA抗体がPSCAに結合することができるような条件下でインキュベーションすること；この固形マトリックスを洗浄し、不純物を除去すること；ならびに、組合せられた抗体からPSCAを溶離することを含む。
これに加えて、PSCA抗体は、PSCA陽性細胞を、細胞選別技術および精製技術を用いて単離するために使用することができる。前立腺腫瘍細胞上に存在するPSCAは、ヒト前立腺癌細胞を他の細胞から区別し、かつ単離するために使用することができる。特にPSCA抗体は、抗体を基にした細胞選別技術または親和性精製技術を用いて、異種移植片腫瘍細胞、培養細胞などから前立腺癌細胞を単離するために使用することができる。本発明のPSCA抗体の別の使用は、PSCAタンパク質を模倣する、抗イディオタイプ抗体の生成を含む。
組織培養液中、または動物モデル(例えばSCIDまたは他の免疫欠損マウス)の異種移植片腫瘍として、増殖することができる比較的純粋なヒト前立腺癌細胞を大量に生成する能力は、多くの利点を提供し、これには例えば、比較的均質な前立腺癌細胞集団の増殖または他の表現型の特徴において、様々な導入遺伝子または治療用化合物の候補を評価できるようにすることを含む。これに加えて、本発明のこの性質は、さらに様々な分子操作に十分な量のヒト前立腺癌に特異的な核酸が非常に豊富な調製物の単離も可能にする。例えばこのような大量の核酸調製物は、前立腺癌の疾病の進行に生物学的に関連している稀な遺伝子の同定を助けるであろう。
本発明のこの局面の、別の価値のある用途は、局所的に進行した、もしくは転移した疾患を有する個々の患者からクローン化された、生存可能な前立腺腫瘍細胞の比較的純粋な調製物を分析し、かつ実験できる能力である。この方法において、例えば個々の患者の前立腺癌細胞は、限定的な生検標本から増やすことができ、その後様々な生存可能な混入細胞によって乱されることなく、診断的および予後判定的な遺伝子の存在、タンパク質、染色体異常、遺伝子発現プロフィール、もしくは他の関連した遺伝子型および表現型の特徴を試験することができる。これに加えて、このような細胞は、動物モデルにおける新生腫瘍の侵襲性(aggressiveness)および転移可能性を評価することができる。同様に、患者に特異的な前立腺癌ワクチンおよび細胞免疫療法を、このような細胞調製物から作製することができる。
抗体を調製する様々な方法が、当該技術分野において周知である。例えば、抗体は、単離されたまたは免疫複合体の形で、PSCAタンパク質、ペプチドまたは断片を用いて、適当な哺乳類宿主を免疫化することによって調製することができる(Harlow、Antibodies、Cold Spring Harbor Press、NY(1989))。更にPSCA GST融合タンパク質のような、PSCAの融合タンパク質も使用することができる。PSCAを発現または過剰発現している細胞も、免疫化に使用することができる。同様に、PSCAを発現するように遺伝子操作したどのような細胞も使用可能である。この戦略は、内因性PSCAの認識能が増強されたモノクローナル抗体の生成をもたらすことができる。
本明細書に示されたPSCAのアミノ酸配列は、抗体生成のためのPSCAタンパク質の特異的領域を選別するために使用することができる。例えば、PSCAアミノ酸配列の疎水性および親水性の分析を用いて、PSCA構造の親水性領域を同定することができる。免疫原性構造を示すPSCAタンパク質の領域、更には他の領域およびドメインは、Chou-Fasman、Garnier-Robson、Kyte-Doolittle、Eisenberg、Karplus-SchultzまたはJameson-Wolf分析などの当該技術分野において公知の様々な他の方法を用いて、容易に同定することができる。これらの残基を含む断片は、抗-PSCA抗体の特異的なクラスの生成に特に適している。特に有用な断片は、TARIRAVGLLTVISK(配列番号：７)およびVDDSQDYYVGKK(配列番号：８)であるが、これらに限定されるものではない。下記実施例2に示したように、ウサギのポリクローナル抗体を前者の断片に対して生成し、合成ペプチドとして調製し、かつPSCA-グルタチオンSトランスフェラーゼ融合タンパク質を用いて、親和性精製した。この抗体によるPSCAの認識は、PSCAおよびGST-PSCA融合タンパク質によりトランスフェクションされた293T細胞抽出物を免疫ブロットおよび免疫沈降することにより立証された。この抗体は更に、蛍光活性化細胞選別法(FACS)を用いて、PSCAでトランスフェクションされた293T細胞およびLAPC-4細胞におけるPSCAの細胞表面の発現を同定した。
免疫原として使用するためのタンパク質の調製の方法、およびBSA、KLHまたは他のキャリヤタンパク質のようなキャリヤとタンパク質との免疫原性複合体の調製の方法は、当該技術分野において周知である。いくつかの状況において、例えばカルボジイミド試薬を用いた直接の複合化を使用することができ；別の場合は、Pierce Chemical Co.,Rockford,IL.より提供されるような連結剤が有効である。PSCA免疫原の投与は、当該技術分野において一般に理解されているように、適当なアジュバントを用いて、適当な期間にわたって注入することによって通常行われる。免疫化スケジュール期間中は、抗体の力価を測定して、抗体形成が適当であることを決定することができる。
この方法で生成されたポリクローナル抗血清は、いくつかの用途については満足できるものであるが、薬学的組成物には、モノクローナル抗体調製物が好ましい。所望のモノクローナル抗体を分泌する、不死化された細胞株は、一般に公知であるように、リンパ球または脾細胞の不死化に作用するコラー(Kohler)およびミルスタイン(Milstein)の標準的方法または変法を用いて調製することができる。所望の抗体を分泌する、不死化された細胞株は、抗原がPSCAタンパク質またはPSCA断片であるようなイムノアッセイにより選別される。所望の抗体を分泌する、適当な不死化された細胞培養物の選別が確定された場合に、この細胞をインビトロで培養するか、もしくは腹水中で生成させるかのいずれかを行うことができる。
その後所望のモノクローナル抗体は、培養液上清から、または腹水上清から回収される。この免疫学的に意味のある部分を含むモノクローナルまたはポリクローナル抗血清の断片は、アンタゴニストとして、更には完全な抗体として使用することができる。F(ab’)₂断片のFab、Fab’のような免疫学的に反応性の断片の使用が、これらの断片は一般に免疫グロブリン全体よりも免疫原性が低いので、しばしば好ましく、特に治療において好ましい。
細胞表面PSCAに結合することが可能な2種のモノクローナル抗体(MAb)の生成は、実施例5に示した。これらのMAbのエピトープマッピングは、これらがPSCAタンパク質上の異なるエピトープを認識しており、一方はカルボキシ末端領域内のエピトープを認識し、他方はアミノ末端領域内のエピトープを認識することを示している。このようなPSCA抗体は、それらのエピトープ結合特性が異なるならば、サンドイッチ型ELISAにおける使用に特に良く適している。
前述の抗体または断片は、更に組換え手段による現在の技術を用いても製造することができる。所望のPSCAタンパク質領域に特異的に結合する領域も、複数の種を起源とするキメラまたはCDR移植された抗体の現状において作製することができる。
本発明の抗体またはその断片は、検出可能なマーカーにより標識するか、もしくは細胞傷害剤のような第二の分子と複合させ、かつPSCA陽性細胞に対するこの第二の分子の標的化に使用することができる(Vitetta,E.S.ら、1993、「経験による免疫毒治療」(Immunotoxin therapy in DeVita.)Jr..V.T.ら編、「癌：腫瘍学の原理および実際」(Cancer:Principles and Practice of Oncology)、第4版、J.B.Lippincott Co..Phiiadelphia,2624-2636)。細胞傷害剤の例は、リシン(ricin)、ドキソルビシン(doxorubicin)、ダウノルビシン(daunorubicin)、タクソール(taxol)、臭化エチジウム、マイトマイシン(mitomycin)、エトプシド(etoposide)、テノプシド(tenoposide)、ビンクリスチン(vincristine)、ビンブラスチン(vinblastine)、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン(dihydroxy anthracin dione)、アクチノマイシンD、ジフテリア毒、シュードモナスエンドトキシン(PE)A、PE40、アブリン(abrin)および糖質コルチコイドならびに他の化学療法用薬剤に加え、放射性同位元素を含むが、これらに限定されるものではない。適当な検出可能なマーカーは、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素を含むが、これらに限定されるものではない。
PSCA抗体は、前立腺癌を治療するために全身に使用することができる。リシンのような毒物と複合したPSCA抗体に加え、複合されていない抗体が、PSCAを産生する前立腺癌細胞を天然に標的とした治療用薬剤として有用である。抗体に治療用薬剤を複合させる技術は周知である(例えばArnonら、「癌治療における薬物の免疫標的化のためのモノクローナル抗体」(Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy)、モノクローナル抗体および癌治療(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy)所収、Reisfeldら編、pp243-56(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstromら、「薬物送達のための抗体」(Antibodies For Drug Delivery)、調節された薬物送達(Controlled Drug Delivery)所収、第2版、Robinsonら編、pp 623-53(Marcel Dekker,Inc.,1987)；Thorpe、「癌治療における細胞傷害性薬物の抗体キャリヤ：レヴュー」(Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review)、モノクローナル抗体’84：生物学的および臨床的応用(Monoclonal Antibodies’84:Biological And Clinical Application)所収、Pincheraら編、pp475-506(1985)；およびThorpeら、「抗体−毒素複合体の調製および細胞傷害性」(The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates)、Immunol.Rev.、62:119-58、1982)。治療用薬剤としてのPSCA抗体の使用は、更に下記の「前立腺癌の免疫療法」において説明している。
PSCAをコードする核酸分子
本発明の別の局面は、PSCAタンパク質およびそれらの断片をコードしている様々な核酸分子を、好ましくは単離された形状で提供しているが、これらはDNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、および関連した分子、PSCAをコードする配列またはそれらの一部に相補的な核酸分子、ならびにPSCA遺伝子またはPSCAをコードしている核酸にハイブリダイゼーションしたものを含んでいる。特に好ましい核酸分子は、本明細書において明らかにされたヒトまたはマウスのDNA配列と実質的に同等または相補的な核酸配列を有するであろう。特に意図するものとして、天然の起源に由来するかまたは合成されたかに関わらず、ゲノムDNA、cDNA、リボザイムおよびアンチセンス分子、更には異なるバックボーンに基づくか、または異なる塩基を含む核酸である。例えば、アンチセンス分子は、RNA類、もしくはペプチド核酸(PNA)または塩基対に依存した方法でDNAまたはRNAに特異的に結合するホスホロチオエート(phosphorothioate)誘導体のような非核酸分子を含むその他の分子でもよい。当業者は、本明細書に記されたPSCA配列を用いることによって、これらの種類の核酸分子を容易に得ることができる。簡便化のため、PSCAをコードしている核酸分子を、ここではPSCAコード核酸分子、PSCA遺伝子、またはPSCA配列と称する。
ヒトPSCAの、一つの対立遺伝子型をコードするcDNAのヌクレオチド配列を図1Aに示した。マウスPSCA相同体(「マウスPSCA」)をコードするcDNAのヌクレオチド配列を図2に示した。ヒトおよびマウスのPSCAゲノムクローンも、実施例4に記したように単離した。ヒトおよびマウスのゲノムクローンは共に、PSCA遺伝子の翻訳領域および3’側非翻訳領域をコードしている3個のエクソンを含んでいる。5’側非翻訳領域をコードしている第4のエクソンは、Ly-6およびThy-1遺伝子ファミリーの別の一員に対するPSCAの相同性を基にして存在が推定される(図8)。
ヒトのPSCA遺伝子を、染色体8q24.2についてマッピングした。ヒト幹細胞抗原2(RIG-E)、更には別の最近同定されたヒトLy-6相同体(E48)もこの領域に局在し、このことは、関連した遺伝子の巨大なファミリーがこの座に存在することを示唆している(Brakenhoffら、(1995)、前記；Maoら、Proc.Natl.Acad Sci.USA、93:5910-5914(1996))。興味深いことに、染色体8qは、進行しかつ再発した前立腺癌の大半において、対立遺伝子の獲得および増幅の領域であることが報告されている(Cherら、Genes Chrom Cancer、11:153-162(1994))。c-mycは、染色体8q24でPSCAに隣接して局在しており、かつc-mycの過剰なコピー(対立遺伝子の獲得または増幅のいずれかを通じて)が、原発性前立腺腫瘍の68％および転移性の96％において認められた(Jenkinsら、Cancer Res.、57:524-531(1997))。
本発明のPSCAをコードする核酸分子の態様は、本発明の核酸分子またはそれらの特異的部分の特異的増幅ができるプライマー、および本発明の核酸分子またはその一部に選択的または特異的にハイブリダイゼーションするプローブを含む。これらの核酸のプローブは、検出可能なマーカーで標識することができる。検出可能なマーカーの例は、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素を含むが、これらに限定されるものではない。このような標識されたプローブは、PSCAタンパク質を発現している細胞を診断する手段としてPSCAタンパク質の存在を診断するために使用することができる。DNAおよびRNAのプローブを作成する技術は周知である。
本明細書において使用されているように、核酸分子とは、核酸分子が、混合したPSCA以外のポリペプチドをコードしている核酸分子から実質的に区別されている場合の、「単離された」ものを意味する。当業者は、単離されたPSCAをコードする核酸分子を得るための核酸の単離法を容易に用いることができる。
本発明は、更に、本発明のPSCAをコードする核酸分子の断片を提供する。本明細書において使用したPSCAをコードする核酸分子の断片とは、全体のPSCAをコードする配列の小部分を意味する。この断片の大きさは、その意図された用途に応じて決まる。例えば、断片が、活性ドメイン、エフェクター結合部位またはGPI結合ドメインのような、PSCAタンパク質の活性部分をコードするために選択される場合、この断片は、PSCAタンパク質の機能領域(複数)をコードするのに十分な大きさが必要であろう。この断片が、核酸プローブまたはPCRプライマーとして使用される場合、この断片の長さは、プロービング／プライミングの際に、比較的少数の偽陽性を得るように選択される。選択的ハイブリダイゼーションプローブまたはPCRプライマーとして特に有用であるヒトPSCAの断片は、技術上公知の方法を用いて、全PSCA配列から容易に同定することができる。RT-PCR分析のために有用なPCRプライマーのひとつのセットは、5’プライマー-TGCTTGCCCTGTTGATGGCAG-(配列番号：９)および3’プライマー-CCAGAGCAGCAGGCCGAGTGCA-(配列番号：１０)である。
PSCAをコードする核酸分子の断片の別の種類は、PSCA遺伝子のゲノムクローンにおいて認められた、PSCAをコードする領域の上流および下流に認められた発現制御配列である。特に、前立腺に特異的な発現制御エレメントは、PSCA遺伝子のゲノムクローンにおいて認められたPSCAコード領域の5’側として同定することができる。このような発現制御配列は、前立腺に特異的な様式で遺伝子発現するための発現ベクターの開発において有用である。当業者は、ゲノムPSCA配列およびPSCA遺伝子において認められた発現制御エレメントを単離しかつ同定するために、ここに記したPSCA cDNA配列を容易に使用することができる。
他のPSCAコード核酸分子の単離法
ここに記された、PSCAをコードする核酸分子は、PSCA相同体、あるいはスライスされた(sliced)アイソフォーム、対立遺伝子変異体、PSCAタンパク質の突然変異、更にはそれらのコード配列および遺伝子配列の突然変異体として単離することができる。最も好ましいPSCA相同体の起源は、哺乳類生物である。
例えば、ここに記したPSCAをコードする配列は、合成することができ、かつヒート以外の生物由来のタンパク質であるPSCAファミリーの一員をコードしているDNA、ここで記したヒトPSCAタンパク質の対立遺伝子変異体、およびPSCA遺伝子を含むゲノム配列を調べるためのプローブとして使用することができる。およそ18〜20個のヌクレオチドを含むオリゴマー(約6〜7個のアミノ酸の範囲(stretch)をコードしている)を調製し、かつストリンジェントな条件下、もしくは偽陽性の不都合なレベルを除去するのに十分なストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションを行うための、ゲノムDNAまたはcDNAのライブラリーの選別に使用する。具体的な態様において、ヒトPSCAをコードしているcDNAは、本明細書の実施例3に記したように、マウスのPSCA相同体をコードする完全長のcDNAを単離するために使用することができる。このマウスのクローンは、ヒトPSCAと70％のアミノ酸が同じタンパク質をコードしている。
これに加えて、ヒトPSCAタンパク質のアミノ酸配列は、細胞から調製した発現ライブラリーをスクリーニングするための抗体プローブの作製のために使用することができる。典型的には、精製したタンパク質(下記)またはモノクローナル抗体で免疫化したウサギなどの哺乳類のポリクローナル抗血清を用いて、標的生物から調製した発現ライブラリーをプロービングし、PSCA相同体の適当なコード配列を得ることができる。このクローン化したcDNA配列は、融合タンパク質として発現されるか、それ自身の制御配列を用いて直接発現されるか、もしくは該酵素の発現に使用される特定の宿主に適した制御配列を用いる発現カセットの構築によって発現され得る。PSCA遺伝子を含むゲノムクローンは、当該技術分野において周知の分子クローニング法を用いて得ることができる。一態様において、PSCA遺伝子のエクソン1〜4を含むほぼ14kbのヒトゲノムクローンを、ヒトPSCA cDNAプローブによるラムダファージライブラリーをスクリーニングすることによって得たが、これはより詳細には、本明細書の実施例4に記した。別の態様において、マウスのPSCA遺伝子を含むおよそ10kbのゲノムクローンを、マウスのPSCA cDNAによるマウスBAC(人工の細菌染色体)ライブラリーのスクリーニングによって得た(同じく実施例4に記した)。
更に、オリグヌクレオチドプライマー対は、PSCAコード核酸分子またはその断片を選択的に増幅／クローニングするため、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に使用するために調製することができる。このようなPCRプライマーを用いるPCRの変性／アニーリング／伸長サイクルは、当該技術分野においては周知であり、他のPSCAコード核酸分子の単離における使用も容易に受け入れることができる。特にプローブまたはプライマーとしての使用に適したヒトPSCA遺伝子の領域は、容易に確定することができる。
ヒト以外のPSCA相同体、天然に生じたPSCAの対立遺伝子変異体およびゲノムPSCA配列は、本明細書に記したヒトPSCA配列と高度の相同性を共有するであろう。一般にこのような核酸分子は、ストリンジェントな条件下でヒトPSCA配列にハイブリダイゼーションすることができる。このような配列は、典型的にはヒトPSCA配列と、少なくとも70％の相同性、好ましくは少なくとも80％の、最も好ましくは少なくとも90％の相同性を有する。「ストリンジェントな条件」とは、(1)洗浄のために、低いイオン強度および高温、例えば50ECの0.015M NaCl／0.015M酒石酸(titrate)ナトリウム／0.1% SDSを用いるか、または(2)ハイブリダイゼーション中に、ホルムアミドのような変性剤、例えば42ECで、50％(v/v)ホルムアミドを0.1％ウシ血清アルブミン／0.1％フィコール／0.1％ポリビニルピロリドン／50mMリン酸ナトリウムバッファー(pH6.5)、750mM NaCl、75mMクエン酸ナトリウムと共に用いる。別の例は、50％ホルムアミド、5×SSC(0.75M NaCl、0.075Mクエン酸ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1％ピロリン酸ナトリウム、5×Denhardt’s液、超音波処理したサケ精液のDNA(50Tg/ml)、0.1% SDS、および10%硫酸デキストランを42ECで用い、洗浄は、42ECで、0.2×SSCおよび0.1％SDS中で行う。当業者は、明確かつ検出可能なハイブリダイゼーションシグナルを得るために適当なストリンジェントな条件を容易に決定しかつ変更することができる。
PSCAコード核酸を含む組換えDNA分子
更に、本明細書に記したPSCAをコードする配列を含む組換えDNA分子(rDNA)またはその断片も提供する。ここで使用したrDNA分子は、インビトロで分子操作を受けたDNA分子である。rDNA分子の生成法は、当該技術分野において周知であり、これについては例えばSambrookらの「分子クローニング」(Molecular Cloning(1989))を参照のこと。本発明の好ましいrDNA分子において、PSCAタンパク質またはPSCAの断片をコードしているPSCAコードDNA配列は、1個またはそれ以上の発現制御配列および／またはベクター配列に、操作できるように連結している。このrDNA分子は、PSCAタンパク質全体をコードすることができるか、もしくは、PSCAタンパク質の断片をコードすることができるかのいずれかである。
PSCAのコード配列が、操作できるように連結したベクターおよび／または発現制御配列の選択は、当該技術分野において周知のように、例えばタンパク質発現、および形質転換される宿主細胞のような、所望の機能特性に直接左右される。本発明において意図されたベクターは、rDNA分子に含まれたPSCAをコードする配列の複製または宿主染色体への挿入、および好ましくは発現をも指示することが少なくとも可能である。
操作できるように連結したタンパク質をコードする配列の発現を調節するために使用される発現制御エレメントは、当該技術分野において公知であり、かつ誘導プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、エンハンサー、転写ターミネーターおよび他の調節エレメントを含むが、これらに限定されるものではない。好ましくは、宿主細胞の培地中の栄養素に対して反応性であるような容易に制御される誘導プロモーターが使用される。
一態様において、PSCAコード核酸分子を含むベクターは、原核細胞レプリコン、すなわち直接自律的複製し、かつそれにより形質転換された細菌宿主細胞のような原核宿主細胞において、組換えDNA分子を染色体内で維持する能力を有するDNA配列を含む。このようなレプリコンは、当該技術分野において周知である。これに加えて、原核細胞レプリコンを含むベクターは、更にその発現が薬剤耐性のような検出可能なマーカーを授けるような遺伝子を含むこともできる。典型的な細菌の薬剤耐性遺伝子は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を授けるものである。
原核細胞レプリコンを含むベクターは、更にE.coliのような細菌宿主細胞におけるPSCAをコードする配列の発現(転写および翻訳)を指示することが可能な原核性またはウイルス性のプロモーターを含むことができる。プロモーターは、RNAポリメラーゼの結合および転写の発生を可能にするDNA配列による発現制御エレメントである。細菌宿主と共存できるプロモーター配列は、典型的には、本発明のDNAセグメントの挿入に便利な切断部位を含むプラスミドベクターにおいて提供される。当業者に周知の様々なウイルスベクター、例えば多くの周知のレトロウイルスベクターなども使用することができる。
真核細胞と共存できる発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞と共存できるものも、PSCAをコードする配列を含む変異体rDNA分子に使用することができる。真核細胞発現ベクターは、当該技術分野において周知であり、いくつかの業者から購入することができる。典型的には、所望のDNAセグメントの挿入に便利な切断部位を含むようなベクターが提供される。このようなベクターの典型は、PSVLおよびpKSV-10(Pharmacia)、pBPV-1/pML2d(International Biotechnologies Inc.)、pTDT1(ATCC、#31255)、ここに記したベクターpCDM8、および同様の真核細胞の発現ベクターである。
本発明のrDNA分子の構築に使用される真核細胞の発現ベクターは、更に真核細胞において効果的な選択マーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーを含むことができる。好ましい薬剤耐性マーカーは、その発現がネオマイシン耐性を生じるような遺伝子、すなわちネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neo)遺伝子である。Southernらの論文(J.Mol Anal Genet、1:327-341(1982))。あるいは、この選択マーカーは、個別のプラスミド上に存在することができ、かつこれら2種のベクターは、宿主細胞の同時トランスフェクションによって導入され、かつ該選択マーカーに適した薬剤の存在下での培養によって選択される。
本発明の実施に係るこのベクターは、前述のcDNA分子をコードしているプラスミド、コスミドまたはファージベクターであることができる。更に、本発明は、適当な真核宿主細胞へトランスフェクションされたプラスミド、コスミドまたはファージベクターを含む宿主−ベクターシステムを提供する。適当な真核宿主細胞の例は、酵母細胞、植物細胞または、例えば哺乳類細胞などの動物細胞を含む。適当な細胞の例は、LnCaP、LAPC-4、および他の前立腺癌細胞株を含む。この宿主−ベクターシステムは、PSCAタンパク質の産生に有用である。あるいは、この宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であることができる。
形質転換された宿主細胞
本発明は更に、PSCAタンパク質またはその断片をコードしている核酸分子で形質転換された宿主細胞も提供する。この宿主細胞は、原核または真核細胞のいずれかであることができる。PSCAタンパク質の発現に有用な真核細胞は、細胞株が細胞培養法と共存でき、かつ発現ベクターの増殖およびPSCA遺伝子の発現と共存しさえすれば、限定されない。好ましい真核宿主細胞は、酵母、昆虫および哺乳類細胞を含み、好ましくは脊椎動物細胞、例えばマウス、ラット、サルまたはヒトの繊維芽細胞株からのものなどであるが、これらに限定されるものではない。LnCaPおよびLAPC-4細胞株のような前立腺癌細胞株も使用することができる。いずれかの原核宿主細胞を、PSCAコードrDNA分子を発現するために使用することができる。好ましい原核宿主は、E.coliである。
本発明のrDNA分子による適当な宿主細胞の形質転換は、典型的には使用したベクターの種類および用いた宿主システムによって左右される周知の方法で達成される。原核宿主細胞の形質転換に関しては、電気穿孔法および塩処理法が典型的には使用されるが、これについてはCohenらの論文(Proc Acad Sci USA(1972)、69:2110；およびManiatisら「分子クローニング、ラボマニュアル」(Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor.NY(1982))を参照のこと。脊椎動物細胞のrDNAを含むベクターによる形質転換に関しては、電気穿孔法、陽イオン脂質または塩処理法が典型的には使用されるが、これについては、例えばGrahamらの論文(Virol、52:456(1973))；Wiglerらの論文(Proc Natl Acad Sci USA、76:1373-76(1979))を参照のこと。
うまく形質転換された細胞、すなわち本発明のrDNA分子を含む細胞は、周知の技術により同定することができる。例えば本発明のrDNAの導入によって生じた細胞は、クローン化し、単一のコロニーを形成することができる。これらのコロニー由来の細胞は、収集、溶菌し、かつそれらのDNA内容物をrDNAの存在について、Southern(J.MoI Biol、98:503(1975))またはBerentら(Biotech、3:208(1985))が記した方法、または免疫学的方法によりアッセイされた細胞から産生されたタンパク質を用いて試験した。
PSCAタンパク質生成の組換え法
本発明は更に、本明細書において記されたPSCAコード核酸分子のひとつを用いてPSCAタンパク質を産生する方法を提供する。一般的用語において、組換えPSCAタンパク質の産生は、典型的には以下の工程を含む。
第一に、図1Aに示された核酸分子のような、PSCAタンパク質またはその断片をコードしている核酸分子を得る。このPSCAコード核酸分子を次に、好ましくは前述の適当な制御配列で操作可能に結合し、PSCAをコードする配列を含む発現ユニットを生成する。この発現ユニットを用いて適当な宿主細胞を形質転換し、かつこの形質転換された宿主を、PSCAタンパク質が生成できるような条件下で培養する。このPSCAタンパク質は、任意に培地または該細胞から単離、回収され、かつこのタンパク質の精製は、一部の不純物が容認できるような場合には必要でない。
前述の各工程は、様々な方法で行うことができる。たとえば、所望のコード配列は、ゲノム断片から得、かつ適当な宿主において直接使用することができる。様々な宿主において操作可能な発現ベクターの構築は、レプリコンおよび制御配列の適当な組合せを用いて達成される。この制御配列、発現ベクターおよび形質転換法は、前述の遺伝子を発現するために使用される宿主細胞の種類によって左右され、これについては先に詳述している。これらのベクターに挿入するために切断可能な遺伝子を提供するために、適当な制限部位を、一般に利用可能でない場合は、このコード配列の末端に追加することができる。当業者は、PSCAタンパク質生成のためのPSCAをコードする配列とと共に使用する、当該技術分野において公知のいずれかの宿主／発現システムを容易に受け入れることができる。
PSCAリガンドおよび他の結合剤の同定のためのアッセイ
本発明の別の局面は、PSCAリガンドおよび他の結合剤、ならびにPSCAに結合する細胞成分を同定するために使用することができるアッセイおよび方法に関する。詳細に述べると、PSCAリガンドおよび他の結合剤、ならびにPSCAに結合する細胞成分は、PSCAリガンドまたは他の結合剤または成分がPSCAに結合する能力、および／またはPSCA活性を阻害／刺激する能力によって同定することができる。PSCAタンパク質を用いるPSCA活性(例えば結合)のアッセイは、高効率のスクリーニング法における使用に適している。
一態様において、このアッセイは、被験物質または細胞抽出物とPSCAの混合を含む。この物質または抽出成分とPSCAとが結合できるような条件下で混合した後、この混合物を分析して、該物質／成分がPSCAと結合するかどうかを決定する。結合剤／成分は、PSCAに結合することができるものとして同定される。代わりにもしくは連続して、PSCA活性を、PSCA活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定する手段として直接評価することができる。
あるいは、PSCAタンパク質に結合する標的を、酵母のツーハイブリッドシステムを用いて、もしくは結合−捕獲アッセイを用いて同定することができる。酵母のツーハイブリッドシステムにおいて、融合タンパク質をコードしている発現ユニットを、2個のサブユニットの転写因子の一方のサブユニットで作製し、そしてPSCAタンパク質が、酵母細胞に導入されかつ発現される。この細胞は更に修飾され、(1)マーカーの発現に、発現のための2個のサブユニットの転写因子を必要とするような検出可能なマーカーをコードしている発現ユニット、および(2)転写因子の第二のサブユニットおよびDNAのクローン化されたセグメントで作製された、融合タンパク質をコードする発現ユニットを含む。このDNAのクローン化されたセグメントがPSCAタンパク質に結合するタンパク質をコードしている場合は、発現により、PSCAおよびコードされたタンパク質の相互作用が生じる。こうして結合の近傍に転写因子の2個のサブユニットがもたらされ、転写因子の再構築ができるようにする。これは、検出可能なマーカーの発現をもたらす。酵母のツーハイブリッドシステムは、PSCAの細胞結合パートナーのためのセグメントをコードしているcDNAライブラリーのスクリーニングにおいて特に有用である。
前述のアッセイにおいて使用することができるPSCAタンパク質は、単離されたPSCAタンパク質、PSCAタンパク質の断片、PSCAタンパク質を発現するように変更された細胞、またはPSCAタンパク質を発現するように変更された細胞画分を含むが、これらに限定されるものではない。更に、PSCAタンパク質は、PSCAタンパク質全体またはPSCAタンパク質の所定の断片であることができる。PSCAタンパク質が、例えば分子量または活性のシフトによって、物質の結合についてアッセイされる限りは、本アッセイを使用することができることは、当業者には明らかであろう。
物質／細胞成分がPSCAタンパク質に結合するかどうかを同定するために使用される方法は、使用されるPSCAタンパク質の性質を第一に基本としている。例えば、ゲルシフトアッセイを、物質がPSCAまたはその断片に結合するかどうかを決定するために使用することができる。あるいは、免疫検出およびバイオチップ法は、PSCAタンパク質への使用に採用することができる。当業者は、特定の物質がPSCAタンパク質に結合するかどうかを決定するために、多くの技術上公知の技術を容易に用いることができる。
物質および細胞成分は、更に細胞を用いないアッセイシステムまたは細胞アッセイシステムを用いて、PSCAタンパク質の活性を調節する能力について試験することができる。PSCAタンパク質の活性がより明確になるので、同定された活性を基にした機能アッセイを用いることができる。
本明細書において使用されるように、物質がPSCA活性を減少する場合に、物質は、PSCA活性に拮抗すると称する。この好ましいアンタゴニストは、選択的にPSCAを拮抗し、他の細胞タンパク質には影響を及ぼさない。更に好ましいアンタゴニストは、PSCA活性を50％以上まで、より好ましくは90％以上まで減少し、最も好ましくは全てのPSCA活性を失わせるであろう。
本明細書において使用されるように、物質がPSCA活性を増加する場合に、物質はPSCA活性に作動すると称される。好ましいアゴニストは、PSCAを選択的に作動し、他の細胞タンパク質には影響を及ぼさない。更に好ましいアゴニストは、PSCA活性を50％以上まで、より好ましくは90％以上まで増加し、最も好ましくはPSCA活性を2倍にする。
前述の方法でアッセイされた物質は、無作為に選択されるか、もしくは理論的に選択または設計される。本明細書において使用されるように、物質がPSCAタンパク質の特異的配列を考慮せず無作為に選択される場合は、物質は無作為に選択されたと称す。無作為に選択された物質の例は、化学ライブラリーまたはペプチドコンビナトリアルライブラリーの使用、もしくは生物または植物抽出物の両方の増殖である。
本明細書において使用されるように、物質が標的部位の配列および／または物質の作用と関連したその立体配置を考慮する、無作為でない基準を基に選択される場合は、物質は理論的に選択または設計されると称する。物質は、PSCAタンパク質を製造するペプチド配列を用いて理論的に選択されるか、もしくは理論的に設計されることができる。例えば、理論的に選択されたペプチド物質は、そのアミノ酸配列がPSCAタンパク質の断片と同じであるペプチドであることができる。
本発明の方法で試験した物質は、例えば、ペプチド、小さい分子およびビタミン誘導体に加え、炭水化物であることができる。当業者は、本スクリーニング法において使用される物質の構造的性質に関して制限が無いことを容易に認めることができる。本発明の物質の一つのクラスは、そのアミノ酸配列がPSCAタンパク質のアミノ酸配列を基に選択されたペプチド剤である。小さいペプチド剤も、PSCAタンパク質アッセンブリの競合的阻害剤として利用することができる。
ペプチド剤は、当該技術分野において公知の標準的固相(または液相)ペプチド合成法を用いて調製することができる。加えてこれらのペプチドをコードしているDNAは、市販のオリゴヌクレオチド合成装置を用いて合成し、かつ標準的組換え体生成システムを用いる組換えにより生成することができる。固相ペプチド合成を用いる生成は、遺伝子をコードしていないアミノ酸が含まれる場合は、必須である。
本発明の物質の別の種類は、PSCAタンパク質の重要な位置と免疫反応する抗体である。前述のように、抗体は、抗原領域として、抗体によって標的化されることが意図されたPSCAタンパク質の一部を含むペプチドによる、適当な哺乳類対象の免疫化によって得られる。重要な領域は、図4および5に示されたドメインを含むことができる。このような物質は、第二の生成阻害剤を同定するための競合的結合試験において使用することができる。
本発明の方法で試験された細胞抽出物は、例えば細胞または組織の水性抽出物、細胞または組織の有機溶媒抽出物、もしくは部分的に精製された細胞画分であることができる。当業者は、本発明のスクリーニング法において細胞抽出物の原料に関する制限がないことは容易に認めることができる。
PSCAタンパク質に結合する物質、例えばPSCA抗体は、PSCA活性の調節、適当な哺乳類細胞に対する抗癌剤の標的化、またはPSCAとの相互作用を阻害する物質の同定に使用することができる。PSCAを発現している細胞は、PSCAに結合する物質を用いることによって、標的化または同定することができる。
いかにPSCA結合剤が使用されるかは、そのPSCA結合剤の性質によって決まる。例えばPSCA結合剤は、以下に使用することができる：PSCA発現細胞への、ジフテリヤ毒、コレラ毒、リシンまたはシュードモナス外毒素などの複合した毒素の送達；PSCA活性の調節；PSCA発現細胞の直接の殺傷；または、競合的結合剤を同定するための選別である。例えば、PSCA阻害剤はPSCA発現細胞の増殖を直接阻害することができる一方で、PSCA結合剤は診断剤として使用することができる。
前立腺癌の免疫療法
本発明は、抗体療法、インビボワクチン、およびエクスビボ免疫療法を含む、前立腺癌の免疫療法を提供する。ひとつの方法において、本発明は、前立腺癌を治療するために全身的に使用することができるPSCA抗体を提供する。例えば複合していないPSCA抗体を患者に導入し、その結果該抗体が、前立腺癌細胞上のPSCAに結合し、相補的に仲介された細胞崩壊、抗体に依存した細胞傷害、PSCAの生理的機能の変更、および／またはリガンド結合またはシグナル伝達経路の阻害を含むメカニズムにより、細胞、および腫瘍の破壊を仲介することができる。リシンのような毒物と複合したPSCA抗体も、PSCAを生じる前立腺腫瘍細胞に直接該毒物を送達し、これにより腫瘍を破壊するので、治療に使用することができる。
PSCA抗体を用いる前立腺癌の免疫療法は、他の種類の癌に関して使用されて成功している様々な方法から生じた技術に従うことができるが、これは結腸癌(Arlenら、Crit Rev Immunol、18:133-138(1998))、多発性骨髄腫(Ozakiら、Blood、90:3179-3186(1997)；Tsunenariら、Blood、90:2437-2444(1997))、胃癌(Kasprzykら、Cancer Res、52:2771-2776(1992))、B細胞性リンパ腫(Funakoshiら、J Immunther Emphasis Tumor Immunol、19:93-101(1992))、白血病(Zhongら、Leuk Res、20:581-589(1996))、結腸直腸癌(Mounら、Cancer Res、54:6160^-6166(1994))；Veldersら、Cancer Res、55:4398-4403(1995))、および乳癌(Shepardら、J.Clin Immunol、11:117-127(1991))を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明は更に、PSCAタンパク質またはそれらの断片を含有するように処方されたワクチンを提供する。抗癌剤療法において使用するための体液性免疫および細胞媒介性免疫を生じるためのワクチン中の腫瘍抗原の使用は、当該技術分野において周知であり、かつヒトPSMAおよび齧歯類PAP免疫原を用い、前立腺癌において使用されている(Hodgeら、Int J Cancer、63:231-237(1995)；Fongら、J.Immunol.、159:3113-3117(1997))。このような方法は、PSCAタンパク質またはその断片、もしくはPSCAコード核酸分子およびPSCA免疫原を発現し、かつ適当に存在することが可能な組換えベクターを用いることによって、容易に実践することができる。
例えば、ウイルス遺伝子送達システムを、PSCAコード核酸分子を送達するために使用することができる。本発明のこの局面において使用することができる様々なウイルス遺伝子送達システムは、ワクシニア、鶏痘、カナリア痘、アデノウイルス、インフルエンザ、ポリオウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、シンドビスウイルを含むが、これらに限定されるものではない(Restifo、Curr.Opin.Immunol.、8:658-663(1996))。非ウイルス送達システムも、患者に導入された(例えば筋肉内)PSCAタンパク質またはその断片をコードしている裸のDNAを用いて、抗腫瘍反応を惹起するために使用することができる。一態様において、完全長のヒトPSCA cDNAを用いることができる。別の態様において、特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)エピトープをコードしているPSCA核酸分子を用いることができる。CTLエピトープは、特定のHLA対立遺伝子に任意に結合することが可能なPSCAタンパク質内のペプチドを同定するための特定のアルゴリズム(例えばEpimer,Brown University)を用いて決定することができる。
様々なエクスビボ戦略を使用することもできる。ある方法は、患者の免疫システムにPSCA抗原を提示するために樹状細胞を使用することに関連している。樹状細胞は、MHCクラスIおよびII、B7副刺激分子、ならびにIL-12を発現し、その結果高度に特異化された抗原提示細胞である。前立腺癌において、前立腺に特異的な膜抗原(PSMA)ペプチドによってパルスされた(pulsed)自家(autologous)樹状細胞が、前立腺癌患者の免疫システムを刺激する、第I相臨床試験において用いられている(Tjoaら、Prostate、28:65-69(1996)；Murphyら、Prostate、29:371-380(1996))。樹状細胞は、MHCクラスIおよびII分子に関連して、T細胞にPSCAペプチドを提示すために使用することができる。一態様において、自家樹状細胞は、MHC分子に結合することが可能なPSCAペプチドに加えられる。別の態様において、樹状細胞は、完全なPSCAタンパク質に加えられる。しかし別の態様は、当該技術分野において公知の様々な道具を提供するベクター類、例えばアデノウイルス(Arthurら、Cancer Gene Ther.、4:17-25(1997))、レトロウイルス(Hendersonら、Cancer Res.、56:3763-3770(1996))、レンチウイルス、アデノ関連ウイルス、DNAトランスフェクション(Ribasら、Cancer Res.、57:2865-2869(1997))、および腫瘍由来のRNAトランスフェクション(Ashleyら、J.Exp.Med、186:1177-1182(1997))などを用い、樹状細胞においてPSCA遺伝子が過剰発現するように遺伝子操作することに関っている。
抗イディオタイプの抗PSCA抗体も、PSCAタンパク質を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するワクチンとして抗癌療法に使用することができる。更に詳細に述べると、抗イディオタイプの抗体の生成は、当該技術分野において周知であり、かつPSCAタンパク質上のエピトープを模倣した抗イディオタイプの抗PSCA抗体を生成するために容易に受け入れることができる(例えば、Wagnerら、Hybridoma、16:33-44(1997)；Foonら、J.Clin Invest、96:334-342(1995)；Herlynら、Cancer Immunol Immunother、43:65-76(1996)を参照のこと)。このような抗イディオタイプの抗体は、腫瘍抗原に対して示された他の抗イディオタイプ抗体により現在実施されている抗イディオタイプ療法において使用することができる。
遺伝的免疫化法は、予防または治療のための、PSCAを発現している癌細胞に対する体液性および細胞性免疫応答を形成するために使用することができる。本明細書に記したPSCAコードDNA分子を使用して、PSCAタンパク質／免疫原をコードしているDNA、および適当な調節配列を含む構築物を、患者の筋肉または皮膚に直接注射し、その結果筋肉または皮膚細胞は、該構築物を吸収し、かつコードされたPSCAタンパク質／免疫原を発現する。このPSCAタンパク質／免疫原は、細胞表面タンパク質として発現されるか、もしくは分泌される。PSCAタンパク質／免疫原の発現は、前立腺癌に対する、予防または治療のための体液性および細胞性免疫の形成を生じる。当該技術分野において公知である様々な予防および治療のための遺伝子的免疫化法を使用することができる(例えばインターネット上のアドレスwww.genweb.comにおいて公表された情報および参考文献参照)。
PSCAタンパク質およびPSCA遺伝子およびRNAの同定法
本発明は、PSCAタンパク質またはPSCA遺伝子を発現している細胞、組織または器官を同定する方法を提供している。このような方法は、インビボまたはインビトロにおいてPSCAタンパク質を発現している細胞または器官の有無を診断するために使用することができる。本発明の方法は、前立腺の病的状態を媒介する細胞の存在を決定する際に特に有用である。特に、PSCAタンパク質の存在は、PSCAタンパク質、またはPSCAタンパク質をコードしている核酸が発現されているかどうかを決定することによって確定することができる。PSCAタンパク質の発現は、PSCAタンパク質または遺伝子を発現している細胞、組織または器官の有無を診断する手段として使用することができる。
様々な免疫学的および分子遺伝学的技術を使用して、PSCAタンパク質が特定の細胞または検体中において発現／生成されたかどうかを決定することができる。一般に、核酸分子を含む抽出物またはタンパク質を含む抽出物が調製される。その後これらの抽出物は、PSCAタンパク質、またはPSCAコード核酸分子が、該細胞中で生成されたかどうかを決定するためにアッセイされる。
当該技術分野において周知の様々なポリヌクレオチドをベースにした検出法を、PSCA-コード核酸分子の検出のため、および生物検体中のPSCA発現細胞の検出のために使用することができる。例えば、RT-PCR法を、PSCA mRNAまたはその断片を選択的に増幅するために使用することができ、かつこのような方法は、下記実施例1において示したようなPSCAを発現している細胞の同定に使用することができる。特定の態様において、RT-PCRは、微小転移性の前立腺癌細胞または循環血中の前立腺癌細胞の検出に使用することができる。例えば枝分かれ(branched)DNA法のような様々な他の増幅の種類の検出法、および様々な周知のDNAまたはRNAプローブを用いるハイブリダイゼーションアッセイを、PSCA-コードポリヌクレオチドまたはPSCA発現細胞を検出するために用いることができる。
タンパク質検出の様々な方法が、当該技術分野において周知であり、かつPSCAタンパク質またはPSCA発現細胞の検出のために使用することができる。タンパク質を基にした診断試験を実施するために、常法を用いて、適当なタンパク質検体を採取しかつ調製する。タンパク質検体は、例えば検体のSDSとの煮沸などによって簡単に調製することができる。次に抽出されたタンパク質を分析し、公知の方法を用いて、PSCAが存在するかどうかを決定する。例えばタンパク質の特異的サイズのまたは荷電の変種が存在するならば、電界における移動度を用いて同定することができる。あるいは、検出を目的として抗体を用いることができる。当業者は、検体がPSCAタンパク質を含むかどうかを決定するための公知のタンパク質分析法を容易に適合させることができるであろう。
あるいは、PSCA発現は、更にPSCA遺伝子の発現レベルを低下する物質を同定する方法において使用することができる。例えば、PSCAタンパク質を発現している細胞または組織を、被験物質と接触させ、PSCA発現に対する該物質の作用を決定する。PSCA発現を活性化する物質は、PSCA活性のアゴニストとして使用することができる一方で、PSCA発現を低下する物質は、PSCA活性のアンタゴニストとして使用することができる。
PSCAプロモーターおよび他の発現調節エレメント
本発明は更に、発現ベクターおよびトランスジェニック動物の作製において使用することができる形状の、新たに同定されたPSCA遺伝子の5’側に認められる発現制御配列を提供する。特に、PSCA遺伝子のATG開始コドンの5’側であることを容易に確定することができるPSCAプロモーターのような、PSCA発現制御エレメントは、操作できるように連結したタンパク質をコードしているDNA配列の発現の指示に使用することができる。PSCA発現は、前立腺細胞に限定されるので、この発現制御エレメントは、組織特異的な形式で導入された導入遺伝子の発現を指示する際に特に有用である。当業者は、当該技術分野において公知の方法を用いるベクターの発現において、PSCA遺伝子プロモーターおよび他の調節エレメントを、容易に使用することができる。
トランスジェニック動物の作製
本発明の別の局面は、PSCA核酸を有する、ヒト以外のトランスジェニック哺乳類を提供する。例えば、ある用途において、標準的ノックアウト法を用いてPSCA相同体を不活性化するか、もしくはこのような動物が生存可能でない場合は、誘導可能なPSCA相同体のアンチセンス分子を用いて、PSCA相同体の活性／発現を調節するかして、PSCAを欠損したヒト以外の動物を作製することができる。あるいは、動物は、ヒトPSCAコード核酸分子もしくはPSCAタンパク質の発現を指示するアンチセンスPSCA発現ユニットまたは組織に特異的形式のアンチセンス分子を含むように、変更することができる。このような使用において、ヒト以外の哺乳類、例えばマウスまたはラットのPSCA相同体遺伝子の発現は、不活性化または活性化によって変更されるか、および／またはヒトPSCA遺伝子によって置きかえられたものが作製される。これは、標的化された組換えのような、様々な技術上公知の方法を用いて達成される。一旦作製されると、このPSCA相同体欠損動物、組織特異的方法でPSCA(ヒトまたは相同体)を発現する動物、またはアンチセンス分子を発現する動物を使用して、(1)PSCAタンパク質によって媒介された生物学的および病因学的過程を同定し、(2)PSCAタンパク質と相互作用するタンパク質および他の遺伝子を同定し、(3)PSCAタンパク質欠損を克服するために、外来的に供給することができる物質を同定し、かつ(4)活性を増減するPSCA遺伝子の突然変異体の同定のための適当な選別として利用することができる。
例えば、組織特異的方法でPSCAをコードしているヒトミニジーンを発現しているトランスジェニックマウスを作製し、かつ通常はPSCAタンパク質を含有しない組織および細胞内での該タンパク質の過剰発現の作用を試験することが可能である。この戦略は、他の遺伝子、すなわちbcl-2を用いて成功している(Veisら、Cell、75:229(1993))。このような方法は、容易にPSCAタンパク質／遺伝子に適用することができ、かつ特異的組織におけるPSCAタンパク質の利益または不利益の可能性の問題に対処するために使用することができる。
組成物
本発明は、本発明のPSCA核酸分子、またはPSCAタンパク質をコードしているもしくはそれらの断片をコードしている発現ベクター、および任意に、適当な担体を含有する薬学的組成物を提供している。本発明は更に、PSCAタンパク質を認識しかつ結合する抗体またはそれらの断片を含有する薬学的組成物を提供する。一態様において、抗体またはそれらの断片は、治療薬または細胞毒に複合されるか、もしくは結合される。
薬学的組成物に適した担体は、本発明の核酸または他の分子と組合せた場合にその分子の活性を保持し、かつ対象の免疫システムと反応しないようないずれかの物質を含む。例えば、リン酸緩衝された生理食塩水、水、油／水エマルションのようなエマルション、および様々な種類の湿潤剤などの標準的医薬用担体のいずれかを含むが、これらに限定されるものではない。他の担体は、更に滅菌液、コート錠およびカプセル剤を含む錠剤を含むことができる。このような担体の典型は、デンプン、ミルク、糖、ある種のクレイ、ゼラチン、ステアリン酸またはそれらの塩、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム、タルク、植物油脂または油、アラビアゴム、グリコールなどの賦形剤、もしくは他の賦形剤を含む。このような担体は更に、香味剤および着色剤、または他の添加剤を含む。このような担体を含む組成物は、周知の常法に従い製剤される。このような組成物は更に、例えばリポソームのような様々な脂質組成物の中に加え、高分子ミクロスフェアのような様々な高分子組成物の中などに調製することができる。
本発明は更に、PSCA核酸分子、本発明の核酸分子またはその一部と特異的にハイブリダイゼーションするプローブ、もしくはPSCA抗体またはその断片を含む診断用組成物を提供する。この核酸分子、プローブもしくは抗体またはその断片は、検出可能なマーカーにより標識することができる。検出可能なマーカーの例は、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤、または酵素を含むが、これらに限定されるものではない。更に、本発明は、RT-PCRのようなポリメラーゼ連鎖反応を用いて、PSCAをコードする配列を増幅することが可能な、PSCAに特異的なプライマー対を含有する診断用組成物を提供する。
実施例
実施例1：前立腺特異的な新規の細胞表面抗原(PSCA)の同定および分子の特徴づけ
材料および方法
LAPC-4異種移植片：LAPC-4異種移植片は、Kleinらの論文(Nature Med.、3:402-408(1997))に記されたように作製した。
RDAノーザン分析およびRT-PCR：アンドロゲン依存型および非依存型LAPC-4腫瘍の表象(representational)差異の分析を、先に示されたように行った(Braunら、Mol.Cell.Biol.、15:4623-4630(1995))。全RNAを、登録商標Ultraspec RNA単離システム(Biotecx,Houston,TX)を製造業者の指示に従って用いて単離した。ノーザン分析用フィルターを、そのコード配列に相当する660bp RDA断片およびPSCAまたはPSAの〜400bp断片の3’側非翻訳配列の一部でプロービングした。ヒトの複数の組織ブロットを、クロンテック(Clontech)から入手し、かつ指定されたようにプロービングした。逆転写(RT)-PCR分析のために、第一のcDNA鎖を、GeneAmp RNA PCRコアキット(Perkin Elmer-Roche,New Jersey)を用いて、全RNAから合成した。ヒトPSCA転写物のRT-PCRのために、プライマー5’-tgcttgccctgttgatggcag-(配列番号：９)および3’プライマー-ccagagcagcaggccgagtgca−(配列番号：１０)を用いて、〜320bp断片を増幅した。温度サイクルは、95℃で30秒、60℃で30秒、および72℃で1分を25〜25サイクル行い、引き続き72℃で10分間伸長反応した。GAPDH(Clontech)用のプライマーを、対照として使用した。マウスPSCAについて使用したプライマーは、5’プライマー-ttctcctgctggccacctac-(配列番号：１１)および3’プライマー-gcagctcatcccttcacaat-(配列番号：１２)であった。
PSCA mRNAのインサイチューハイブリダイゼーションアッセイ：mRNAのインサイチューハイブリダイゼーションのために、完全長のPSCA遺伝子を含む組換えプラスミドpCR II(1μg、Invitrogen、San Dieg、CA)を、線状化し、センスおよびアンチセンスのジゴキシゲニン標識したリボプローブを作製した。インサイチューハイブリダイゼーションを、先に記された(Magi-Galluzziら、Lab.Invest、76:37-43(1997))ように、自動化された装置(Ventana Gen II、Ventana Medical Systems)で行った。前立腺標本を、〜130の標本へと拡張されている、先に記したデータベースから入手した(Magi-Galluzziら、前記)。2名の病理医が、盲検化された状態でスライドを読み、かつスコア化した。スコア0〜3を、陽性細胞の割合に従って割りつけ(0＝0％；1＝＜25％；2＝25〜50％；3＝＞50％)、かつ染色の強度を割りつけた(0＝0；1＝1+；2＝2+；3＝3+)。これら2種のスコアを乗じ、総合スコア0〜9を得た。
結果
ヒトPSCA cDNA：表象的差異分析(RDA)、PCRを基にした差引きハイブリダイゼーション法を用いて、ヒト前立腺癌異種移植片(LAPC-4)のホルモン依存型およびホルモン非依存型変異体の遺伝子発現の差を比較し、かつアンドロゲン非依存型LAPC-4亜株においてアップレギュレーションされたcDNAを単離した。複数の遺伝子をクローニング、配列決定し、かつ異なる発現についてチェックした。正常な前立腺と比べて、異種移植片腫瘍中に非常に過剰発現していることがわかった一つの660bp断片(クローン#15)を同定した。このクローンの発現と、正常な前立腺および異種移植片腫瘍中のPSAのそれを比較すると、クローン#15が相対的に癌特異性であることが示唆された(図9)。
配列分析は、クローン#15がこれらのデータベースとは完全には一致しないが、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー型細胞表面抗原のThy-1/Ly-6スーパーファミリーの一員である幹細胞抗原2とは30％のヌクレオチド相同性を共有することを明らかにした。クローン#15は、SCA-2(RIG-Eとも称される)と30％一致する123アミノ酸のタンパク質をコードし、かつLy-6/Thy-1遺伝子ファミリーの特性である多くの高度に保存されたシステイン残基を含んでいる(図3)。GPIアンカー型タンパク質のファミリーとのその相同性と同じく、クローン#15は、アミノ末端の疎水性シグナル配列およびGPI結合のための切断／結合部位と定義された小さいアミノ酸群が先行する疎水性アミノ酸のカルボキシ末端の範囲の両方を含んでいる(UndenfriendおよびKodukula、Ann.Rev.Biochem.、64:563-591(1995))。これは更に4個の推定N-グリコシル化部位を含む。クローン#15は、幹細胞抗原-2との強力な相同性を持つので、前立腺幹細胞抗原(PSCA)と改名した。その後5’および3’PCR RACE分析を、LAP-4アンドロゲン非依存型異種移植片から得られたcDNAを用いて行い、かつ完全長のcDNAヌクレオチド配列(コード領域および非翻訳領域を含む)を得た。ヒトPSCAをコードしている完全長のcDNAのヌクレオチド配列は、図1Aに示し、かつ翻訳されたアミノ酸配列は、図1Bおよび3に示した。
PSCA発現は前立腺に特異的である：正常なヒト組織におけるPSCA mRNAの分布を、ノーザンブロット分析により調べた。図9Bに示したように、この結果は、PSCAが前立腺において優先的に発現され、胎盤において、より低レベルの発現が存在することを実証した。長期暴露後、腎臓および小腸において、少量のmRNAが検出され、かつこれは前立腺組織において認められるレベルのおよそ1/100であった。正常なヒト組織におけるPSCA発現の逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)分析も、PSCA発現が限定されたものであることを実証した。正常組織のパネルについて、高レベルのPSCA mRNAの発現が、前立腺において検出され、胎盤および扁桃腺において有意な発現が検出された(図7A)。様々な前立腺癌異種移植片、前立腺癌細胞株および他の細胞株、ならびに正常な前立腺におけるPSCA mRNA発現のRT-PCR分析は、正常な前立腺、LAPC-4およびLAPC-9前立腺癌異種移植片、および卵巣癌細胞株A431に対し限定された高レベルの発現を示した(図7B)。
正常な前立腺の主なPSCA転写物は、〜1kbである(図9B)。マウスPSCAの発現を、マウスの脾臓、肝臓、肺、前立腺、腎臓および精巣のRT-PCRにより分析した。ヒトPSCAと同様に、マウスPSCAは前立腺において主に発現した。発現は、腎臓においても検出されたが、そのレベルは、ヒト組織中の胎盤において認められたものと類似していた。これらのデータは、PSCA発現が、主に前立腺に特異的なものであることを示している。
前立腺癌細胞株および異種移植片におけるPSCA、PSMAおよびPSAの発現を、ノーザンブロット分析により比較した。図10に示された結果は、PSCAおよびPSMAの両方共が高レベルに前立腺癌に特異的に発現する一方で、PSAの発現は前立腺癌に特異的でないことを実証している。
正常な前立腺の基底細胞サブセットによりPSCAは発現する：正常な前立腺は、2種の主要な上皮細胞集団−−分泌性内腔細胞および下側の基底細胞を含む。インサイチューハイブリダイゼーションを、正常な前立腺の複数の切片について、PSCAに特異的なアンチセンスリボプローブを用いて行い、その発現の場所を定めた。図11に示したように、PSCAは、正常な基底細胞サブセット内のみに発現されている。ストローマ、分泌細胞または浸潤しているリンパ球においては、ほとんど染色が認められなかった。センスPSCAリボプローブとのハイブリダイゼーションは、バックグラウンド染色を示さなかった。GAPDHに対するアンチセンスプローブとのハイブリダイゼーションは、全ての種類の細胞においてRNAが完全であることを確認した。基底細胞は、最終的に分化された分泌細胞の予想される前駆細胞を表わしているので、これらの結果は、PSCAが前立腺に特異的な幹／前駆細胞のマーカーとなり得ることを示唆している(Bonkhoffら、Prostate、24:114-118(1994))。更に基底細胞はアンドロゲン非依存型であるので、PSCAと基底細胞との結合は、PSCAがアンドロゲン非依存型前立腺癌の進行において役割を果たす可能性を生じる。
PSCAは前立腺癌細胞において過剰発現する：正常な前立腺およびLAPC-4異種移植片におけるPSCA発現を比較する最初の分析は、PSCAが、前立腺癌において過剰発現したことを示した。図9に示したノーザンブロット分析によって実証されたように、LAPC-4前立腺癌腫瘍は、強力にPSCAを発現する；しかしながら、正常な前立腺においては検出可能な発現はほとんど無い。これとは対照的に、PSAの発現は、正常な前立腺において明らかに検出することができ、このレベルは、LAPC-4腫瘍において認められるものの2〜3倍である。従って、前立腺癌におけるPSCAの発現は、PSAについて認められるものとは逆であるように思われる。PSAは、悪性の前立腺組織よりも正常組織においてより強力に発現されるが、PSCAは、前立腺癌においてより高度に発現される。
前立腺に特異的なPSCA発現を確認するために、126個のパラフィン包埋された前立腺癌標本を、PSCA発現のためのmRNAインサイチューハイブリダイゼーションにより分析した。標本は、1例を除き全て、前立腺全摘除術または経尿道的前立腺切除術によって摘出された原発性腫瘍から得た。バックグラウンド染色を制御するために、全ての標本を、センスおよびアンチセンス構築物でプロービングした。スライドは、「材料および方法」に記したように複合スコアに割りつけ、スコア6〜9は、強力な発現を示し、スコア4は、中等度の発現を意味した。癌の102/126(81%)が、PSCAについて濃く染色される一方で、別の9/126(7%)が、中等度の染色を示した(図11Bおよび11C)。標本の82%(97/118)において、高グレードの前立腺上皮内新生腫瘍、侵襲性前立腺癌の予想される前駆病変が、PSCAについて濃く染色された(図3B)(Yangら、Am.J.Path.、150:693-703(1997))。正常な腺は、悪性の腺よりも一貫して薄く染まった(図11B)。手術前に抗ホルモン療法を受けた患者から、9標本を得た。これらの残留性のおそらくアンドロゲン非依存型癌の9標本中7標本(78%)について、PSCAが過剰発現し、その割合は、未治療の癌において認められるものと類似していた。このようにPSCA mRNAを発現した標本の割合が大きいので、PSCA発現と、腫瘍の段階および等級などの病理的特徴の間の統計的相関関係については調べなかった。これらの結果は、PSCA mRNAの過剰発現が、アンドロゲン依存型および非依存型前立腺癌の共通の特徴であることを示唆している。
PSCAはアンドロゲン受容体陰性前立腺癌細胞株において発現した：最初にPSCAを、差引きハイブリダイゼーションを行ってクローン化したが、ノーザンブロット分析は、アンドロゲン依存型およびアンドロゲン非依存型の両方のLAPC-4異種移植片腫瘍において強力なPSCA発現を実証した(図9)。更に、PSCA発現は、LAPC-4細胞株および異種移植片、LAPC-9異種移植片、およびLnCaP細胞株(全てアンドロゲン依存型)、更にはAI LAPC-4異種移植片亜株、LAPC-3異種移植片、PC-3およびDU-145細胞株、AI LnCaP亜株、およびMatLyLu細胞株(全てアンドロゲン非依存型)を含む、試験した全ての前立腺癌の異種移植片および細胞株において検出された。
アンドロゲン非依存型、アンドロゲン受容体陰性前立腺癌細胞株PC3およびDU145におけるPSCA発現も、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応分析により検出された。これらのデータは、PSCAが、機能的アンドロゲン受容体が存在しない状態でも発現できることを示唆している。
実施例2：PSCAの生化学的特徴
材料および方法
ポリクローナル抗体および免疫沈降法：ウサギのポリクローナル抗血清を、合成ペプチド-TARIRAVGLLTVISK-(配列番号：７)に対して作製し、そしてPSCA-グルタチオンSトランスフェラーゼ融合タンパク質を用いて親和性精製した。293T細胞は、PSCA、CD59．E25を含有するpCDNA II(Invitrogen,San Diego,CA)発現ベクターで、またはベクター単独で、リン酸カルシウム沈殿法により、一過性にトランスフェクションした。先に記されたように(HarlowおよびLane、「抗体：ラボマニュアル」Antibodies：A Laboratory Manual.(Cold Spring Harbor Press)(1988))、免疫沈降を行った。簡単に述べると、細胞をトランス35S標識物(ICN、Irvine,CA)500μCiで、6時間標識した。細胞溶菌液および馴化培地を、精製したウサギの抗PSCA抗体1μgおよびタンパク質AセファロースCL-4B(Pharmacia Biotech,Sweden)20μlと共に、2時間インキュベーションした。脱グリコシル化のために、免疫沈降物を、1u N-グリコシダーゼF(Boehringer Mannheim)または0.1uネウラミダーゼ(Sigma,St.Louis,MO)と共に、37℃で一晩、その後2.5mU O-グリコシダーゼ(Boehringer Mannheim)で1時間処理した。
フローサイトメトリー：PSCA細胞表面発現のフローサイトメトリー分析のために、単一の細胞懸濁液を、2μg/mlの精製した抗PSCA抗体および500倍希釈した蛍光イソチオシアネート(FITC)で標識した抗ウサギIgG(Jackson Laboratories,West Grove,PA)により染色した。データを、FACScan(Becton Dickinson)により得、かつLYSIS IIソフトウェアを用いて解析した。対照の検体は、二次的抗体単独で染色した。グリコシルホスファチジルイノシトール結合は、2×10⁶細胞を、0.5ユニットのホスファチジルイノシトールに特異的なホスホリパーゼC(PI-PLC、Boeliringer Mannheim)により、37℃で90分間消化することによって分析した。細胞は消化の前後に、FACSスキャンニングまたはイムノブロットのいずれかにより分析した。
結果
PSCAは細胞表面上に発現されたGPIアンカー型糖タンパク質である：推定されたPSCAアミノ酸配列から、PSCAは非常にグリコシル化され、かつGPIメカニズムにより細胞表面につなぎとめられていると推定された。これらの推定を検証するために、我々は独自のPSCAペプチドに対して生じた、親和性精製したポリクローナル抗体を作製した(「方法および材料」を参照のこと)。このペプチドは、グリコシル化部位を含まず、かつCD59(別のGPIアンカー型PSCA相同体)の三次元構造の比較を基に、成熟タンパク質の露出された部分にあると予想された(Kieferら、Biochem、33:4471-4482(1994))。親和性精製した抗体がPSCAを認識することは、PSCAおよびGST-PSCA融合タンパク質によってトランスフェクションされた293T細胞の抽出物のイムノブロットおよび免疫沈降分析により実証された。このポリクローナル抗体は、PSCA-トランスフェクションした細胞では主に24kdのバンドを免疫沈降するが、模擬トランスフェクションした細胞では沈降しなかった(図12A)。3本の小さいバンドも存在し、最小は〜10kdであった。これらのバンドがPSCAのグリコシル化された形を表わしているかどうかを決定するために、N-および0-に特異的なグリコシダーゼにより免疫沈降処理した。N-グリコシダーゼFは、PSCAを脱グリコシル化したが、O-グリコシダーゼは、作用を有さなかった(図12A)。一部のGPIアンカー型タンパク質は、膜結合型および分泌型の両方を有することは公知である(FritzおよびLowe、J.Physiol.、270:G176-G183(1996))。図12Bは、一部のPSCAが、293Tを過剰発現しているシステムにおいて分泌されていることを示している。PSCAの分泌型は、細胞表面結合型よりも、小さい分子量を示すように移動し、これはおそらくGPI共有結合が存在しないことを反映しているのであろう。この結果は、293T細胞株の高レベルの発現を反映し、かつ前立腺癌およびインビボにおいて確認されることが求められている。
蛍光表示式細胞分取器(FACS)分析を用いて、該細胞表面に対するPSCA発現の位置を明らかにした。透過しない模擬トランスフェクションした239T細胞、PSCAを発現している293T細胞、およびLAPC-4細胞は、親和性精製した抗体および第二抗体単独で染色した。図12Cは、PSCAトランスフェクションした293TおよびLAPC-4細胞においては、PSCAが細胞表面に発現したが、模擬トランスフェクションした細胞では発現しなかったことを示している。この細胞表面の発現がGPI共有結合によって媒介されていることを確認するために、細胞を、GPIに特異的なホスホリパーゼC(PLC)で処理した。PLCによる細胞表面からのPSCAの遊離が、蛍光強度において1桁対数以上の減少が示された。消化後馴化培地におけるPSCAの回収も、イムノブロット法により確認した。GPIアンカー型タンパク質のホスホリパーゼCの消化に対する特異性は、GPI結合した抗原CD59または非GPI結合膜貫通タンパク質E25aでトランスフェクションした293T細胞について、同じ実験を行って確認した(Deleersnijderら、J.Biol.Chem、271:19475-19482(1996))。PLC消化は、PSCAと同じ程度までCD59の細胞表面の発現を低下したが、E25に対する作用は有さなかった。これらの結果は、PSCAが、グリコシル化されたGPIアンカー型細胞表面タンパク質であるという予想を裏付けるものである。
実施例3：マウスのPSCA相同体のcDNAの単離
可能性のある、トランスジェニック実験およびノックアウト実験用の相同体を同定するために、ヒトPSCA cDNAを用いて、マウスのESTデータベースを検索した。ひとつのESTは、胎児マウスから得、他方は新生児腎から得たが、これらはヌクレオチドおよびアミノ酸の両方のレベルについて、ヒトcDNAと70％同等であった。マウスクローンおよびヒトPSCAの間の相同性は、ヒトPSCAおよびそのGPIアンカー型相同体の間の分岐進化領域を含んでおり、このことは、これらのクローンがおそらくPSCAのマウス相同体によってもたらされたことを示している。これらのESTとRACE-PCRを用いる5’伸長部を並べると、コード配列全体が提供される(図2)。
実施例4：ヒトおよびマウスのPSCA遺伝子の単離
材料および方法
ゲノムクローニング：ヒトPSCA遺伝子を含むラムダファージクローンを、ヒトPSCA cDNAプローブによる、ヒトゲノムライブラリー(Stratagene)のスクリーニングにより得た(Sambrookら、Molecular Cloning(Cold Spring Harbor)(1989))。マウスのPSCA遺伝子を含むBAC(人工の細菌染色体)クローンを、マウスのPSCA cDNAプローブによる、マウスのBACライブラリー(Genome Systems,St.Louis.,MO)のスクリーニングにより得た。14kbのヒトのNot I断片および10kbのマウスのEcoRI断片を、pBluescript(Stratagene)にサブクローニングし、配列決定し、かつ制限地図を作製した。
蛍光インサイチューハイブリダイゼーションによる染色体マッピング：蛍光インサイチュー染色体分析(FISH)を、前述のように、重複しているヒトラムダファージクローンを用いて行った(Rowleyら、1990、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、87:9358-9362)。
結果
PSCA遺伝子の構造：ヒトおよびマウスのゲノムクローン、各々およそ14kbおよび10kbを得、制限地図を作製した。ヒトおよびマウスのPSCAおよびLy-6/Thy-lの概略を、図8に示した。ヒトおよびマウスのゲノムクローンは両方共、PSCA遺伝子の翻訳領域および3’側非翻訳領域をコードしている3個のエクソンを含んでいる。5’側非翻訳領域をコードしている第4のエクソンは、Ly-6およびThy-l遺伝子ファミリーの他の一員に対するPSCAの相同性を発揮していると推定される(図8)。
染色体8q24.2に対するヒトPSCA遺伝子マッピング：LAPC-4ゲノムDNAのサザンブロット分析は、PSCAが単一のコピー遺伝子によってコードされていることを明らかにした。別のLy-6遺伝子ファミリーの一員は4個のエクソンを有し、第一のエクソンは、5’側非翻訳領域をコードし、残りの3個のエクソンは、翻訳領域および3’側非翻訳領域をコードしている。推定される5’側の第一のエクソン以外は全てを含むヒトおよびマウスのPSCAのゲノムクローンを、ラムダファージライブラリーのスクリーニングにより得た。マウスおよびヒトのPSCAクローンは、同様のゲノム構成(organization)を有していた。ヒトクローンを用いて、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション分析により、PSCAの位置を明らかにした。重複しているヒトPSCAラムダファージクローンの同時ハイブリダイゼーションは、第8染色体のみに特異的な標識を生じた(図13)。検出されたシグナルの97％は、染色体8q24に局在し、その中の87％は、染色体8q24.2に特異的であった。これらの結果は、PSCAが第8染色体、バンドq24.2に局在していることを示している。
実施例5：PSCAの異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体の生成
材料および方法
GST-PSCA融合タンパク質免疫原を用いて、標準的モノクローナル抗体生成法により、マウスにおいて抗体を作製した。簡単に述べると、図1Bに示したヒトPSCAアミノ酸配列の18から98のアミノ酸に相当するPSCAをコードする配列を、下記プライマー対を用いて、PCR増幅した：

この増幅されたPSCA配列を、pGEX-2T(Pharmacia)にクローン化し、E.coliの形質転換に使用し、かつ融合タンパク質を単離した。
細胞表面PSCA発現のフローサイトメトリー分析を、LAPC-9マウスの前立腺癌異種移植片細胞、前立腺癌細胞株LAPC-4、または正常な前立腺上皮細胞(Clonetics)において、MAb 3E6および1G8、および実施例2のマウスのポリクローナル血清を用いて行った。MAb 1G8、3E6またはマウスのポリクローナル血清のいずれかを10倍希釈して染色し、その後FITC標識したヤギの抗マウス第二抗体を100倍希釈した後、1試料につき25,000細胞を分析した。バックグラウンドの蛍光(対照)を、第二抗体のみの試料について測定した。
抗PSCAモノクローナル抗体のエピトープマッピングを、GST-PSCA融合タンパク質のウェスタンブロット分析により行った。簡単に述べると、1μgのGST-PSCA融合タンパク質(アミノ酸18〜98)またはGST-PSCAアミノ末端領域タンパク質(N-末端、アミノ酸2〜50)、GST-PSCA中間領域タンパク質(GST-中間、アミノ酸46〜109)、またはGST-カルボキシ末端領域タンパク質(GST-C末端、アミノ酸85〜123)を、12% SDS-PAGEゲル上で分離し、かつニトロセルロース膜に転写した。この膜を、1G8または3E6モノクローナル抗体ハイブリドーマのいずれかの濃縮した組織培養液上清の250倍希釈物によりプローブし、その後ペルオキシダーゼで標識した第二抗体でプローブし、かつ化学発光を増強し視覚化した。
結果：
4種のハイブリドーマクローンを選択し、組織培養液上清を、ELISA、FACS、ウェスタンブロット、および免疫沈降法により評価した。これらの分析は、2種のクローンが一貫してPSCAを認識する、3E6および1G8と称されるMAbを産生することを示した。MAb 3E6および1G8ならびに実施例2のポリクローナル抗体を用いるフローサイトメトリーによる癌性および正常な前立腺上皮細胞上のPSCA発現の細胞表面発現の分析を、図14に示した。
PSCA MAb 3E6および1G8は、GST-PSCA融合タンパク質のウェスタンブロット分析によりエピトープマッピングした。その結果を図15に示したが、これはこれらのMAbが、PSCA上の異なるエピトープを認識することを示している。MAb 3E6は、該タンパク質のカルボキシ末端領域のエピトープを認識するのに対して、MAb 1G8は、アミノ末端領域のエピトープを認識する(図15)。
実施例6
このデータは、抗PSCAモノクローナル抗体エピトープマッピングを提供する。
モノクローナル抗体1G8、2H5、3C5、および4A10は、PSCAタンパク質のアミノ末端領域に存在するエピトープを認識し、かつモノクローナル抗体3E6は、該タンパク質のカルボキシ末端領域のエピトープを認識する。PSCAタンパク質のアミノ末端領域(N末端、アミノ酸2〜50)、中間領域(中間、アミノ酸46〜109)、またはカルボキシ末端領域(C末端、アミノ酸85〜123)のいずれかをコードしているGST-PSCA融合タンパク質をELISAにおいて用いて、5種の抗PSCAモノクローナル抗体によって認識されたエピトープを同定した。マイクロタイタープレートのウェル中を被覆した示した融合タンパク質10ngを、ハイブリドーマ1G8または3E6の濃縮した組織培養液上清の250倍希釈物、もしくはハイブリドーマ2H5、3C5または4A10の濃縮した組織培養液上清の10倍希釈物のいずれかと共に、インキュベーションした。これらのモノクローナル抗体の結合は、ペルオキシダーゼで標識した第二抗体の4000倍希釈物とインキュベーションし、かつ3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン塩基(tetoramethylbenzidine base)で呈色して検出した。前述のウェルの光学密度を波長450nmで測定した。1G8および3E6抗体のデータは、3回測定の平均±SDで示し、ならびに2H5、3C5および4A10のデータは、2回測定の平均±範囲で示した。これらのモノクローナル抗体の様々な融合タンパク質に対する最強の結合を、太字で示した。結果を表1に示す。

モノクローナル抗体1G8、2H5、3C5および4A10は、PSCAタンパク質のアミノ末端領域に存在するエピトープを認識し、かつモノクローナル抗体3E6は、該タンパク質のカルボキシ末端に存在するエピトープを認識する。PSCAタンパク質のアミノ末端領域(N末端、アミノ酸2〜50)、中間領域(中間、アミノ酸46〜109)、またはカルボキシ末端領域(C末端、アミノ酸85〜123)のいずれかをコードしているGST-PSCA融合タンパク質をELISAにおいて用いて、5種の抗PSCAモノクローナル抗体によって認識されたエピトープを同定した。マイクロタイタープレートのウェル中を被覆した指示した融合タンパク質10ngを、ハイブリドーマ1G8または3E6の濃縮した組織培養液上清の250倍希釈物、もしくはハイブリドーマ2H5、3C5または4A10の濃縮した組織培養液上清の10倍希釈物のいずれかと共に、インキュベーションした。これらのモノクローナル抗体の結合は、ペルオキシダーゼで標識した第二抗体の4000倍希釈物とインキュベーションし、かつ3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン塩基で呈色して検出した。前述のウェルの光学密度を波長450nmで測定した。1G8および3E6抗体のデータは、3回測定の平均±SDで示し、ならびに2H5、3C5および4A10のデータは、2回測定の平均±範囲で示した。これらのモノクローナル抗体の様々な融合タンパク質に対する最強の結合を、太字で示した。結果を表2に示す。

本発明の範囲は、ここに記した態様によって限定されるものではなく、これらは、本発明の個々の局面のひとつの例証を意図するものであり、機能的に同等なものはいずれも、本発明の範囲に含まれる。ここに記したものに加えて、本発明のモデルおよび方法の様々な変更が、当業者には前述の説明および内容により明らかであり、かつこれらも同様に本発明の範囲に含まれる。このような変更または他の態様を、本発明の範囲および精神を逸脱しない限りにおいて、実行することができる。
配列表

Claims (8)

1. 抗体と検体を接触させる段階、および該検体中のPSCAタンパク質と該抗体との結合を検出する段階を含む、前立腺がん組織中のPSCAタンパク質の存在のインビトロの検出法であって、該抗体は、ＰＳＣＡタンパク質に結合し、該ＰＳＣＡタンパク質は、以下のアミノ酸配列
   

   

   を有する、
   検出法。
2. 請求項１に記載の方法であって、前記検出段階が、以下：
   a．前記前立腺検体を、該検体中のPSCAタンパク質と複合体を形成可能な抗体に接触させる段階；および
   b．何らかの複合体がそれにより形成されたかどうかを決定する段階、
   を包含する、方法。
3. 前立腺がん組織検体中のPSCAタンパク質をコードしている第一の核酸の存在を検出するためのインビトロの方法であって、該方法は、PSCAタンパク質をコードしている第二の核酸と該検体を接触させる段階、および該第一の核酸の該第二の核酸に対する結合を検出する段階、を包含し、該結合が該検体中のPSCAタンパク質をコードしている第一の核酸の指標と成る、方法であって、該ＰＳＣＡタンパク質をコードする核酸は、以下の核酸配列：
   

   

   を含む、方法。
4. 前記第一の核酸がRNAである、請求項３に記載の方法。
5. 前記抗体が、検出可能なシグナルを直接または間接的に生じるよう、放射性標識、酵素、発色団および蛍光体からなる群より選択される化合物で標識されている、請求項１記載の方法。
6. 前記第二の核酸が、検出可能なシグナルを直接または間接的に生じるよう、放射性標識、酵素、発色団および蛍光体からなる群より選択される化合物で標識されている、請求項３記載の方法。
7. 前立腺がん組織検体中のPSCAタンパク質をコードしているRNAまたはDNA核酸の存在を検出するためのインビトロの方法であって、該方法は、該PSCAタンパク質をコードしている該RNAまたはDNA核酸に特異的にハイブリダイズする核酸プローブと該検体と接触させる段階、および該プローブの該PSCAタンパク質をコードしている該RNAまたはDNA核酸分子対する結合を検出する段階、を包含し、該結合が該検体中のPSCAタンパク質をコードしている該RNAまたはDNA核酸の指標と成る、方法であって、該ＰＳＣＡタンパク質をコードする核酸は、以下の核酸配列：
   

   

   を含む、方法。
8. 前立腺がん組織検体中のPSCAタンパク質をコードしているRNAまたはDNA核酸の存在を検出するためのインビトロの方法であって、該方法は、該PSCAタンパク質をコードしている該RNAまたはDNA核酸をRT-PCRまたはPCRよって増幅する段階、およびその結果増幅された核酸を検出する段階、を包含する方法であって、該ＰＳＣＡタンパク質をコードする核酸は、以下の核酸配列：
   

   

   を含む、方法。

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