ES2221982T3 - Antigeno de celulas madre de la prostata (psca). - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un nuevo antígeno de la superficie celular específico para la próstata, designado como antígeno de célula madre prostática (PSCA), que es ampliamente sobreexpresado a través de todas las etapas del cáncer de próstata, incluyendo la neoplasia intraepitelial prostática de alto grado (PIN), los tumores prostáticos e dependientes de los andrógenos.

Description

Antígeno de células madre de la próstata (PSCA).

A lo largo de esta solicitud, varias publicaciones están referenciadas entre paréntesis. Las exposiciones de estas publicaciones se incorporan así en su integridad a la presente memoria como referencia.

Antecedentes de la invención

El cáncer de próstata es actualmente el tipo de cáncer más frecuente en los norteamericanos y la segunda causa principal de cáncer relacionada con la muerte en esta población. En sus etapas avanzadas, el cáncer de próstata se metastasiza preferentemente en el hueso, en el que forma lesiones osteoblásticas. Después del tratamiento inicial con la terapia de ablación de andrógenos, los cánceres de próstata más metastásicos se vuelven resistentes a la hormona y letales. El diagnóstico actual y las modalidades terapéuticas están limitadas por una falta de especificidad y una incapacidad para predecir qué pacientes presentan riesgo de desarrollar la enfermedad metastásica.

La mayoría de los cánceres de próstata tienen lugar en la zona periférica de la glándula de la próstata, lejos de la uretra. Los tumores en esta zona pueden no producir ningún síntoma, como resultado, la mayoría de los hombres con cáncer de próstata en etapa inicial no presentarán síntomas clínicos de la enfermedad hasta que haya tenido lugar una evolución significativa. La evolución del tumor en la zona de transición de la próstata puede conducir a la obstrucción de la uretra, produciendo de este modo los primeros síntomas de la enfermedad. Sin embargo, estos síntomas clínicos son indistinguibles de la enfermedad común no maligna de la hiperplasia benigna prostática (BPH).

Uno de los problemas fundamentales en el diagnóstico y tratamiento del cáncer de próstata es la falta de un marcador que pueda detectar de forma exacta en la etapa inicial, los tumores localizados. Aunque se ha identificado numerosos marcadores y algunos, como PSA, están en uso clínico extendido, el marcador ideal del tumor de próstata todavía se ha de caracterizar. Un problema similar es la falta de un marcador de pronóstico eficaz para determinar qué cánceres son inactivos y cuáles son o serán agresivos. PSA, por ejemplo, no puede discriminar exactamente entre los cánceres inactivos y los agresivos. Además, existe también una gran necesidad de marcadores que puedan servir como dianas específicas de la próstata ideales para procedimientos terapéuticos tal como la terapia dirigida por anticuerpos, la inmunoterapia y la terapia génica. Actualmente, no existe ningún tratamiento eficaz para el 20 al 40% de pacientes que desarrolla la enfermedad recurrente después de la cirugía o de la terapia de irradiación o para aquellos pacientes que presentan la enfermedad metastásica en el momento del diagnóstico. Aunque la terapia de ablación con hormonas puede paliar a estos pacientes, la mayoría inevitablemente evoluciona para desarrollar la enfermedad incurable independiente del andrógeno (Lalani et al., 1997, Cancer Metastasis Rev. 16: 29-66).

La detección y el diagnóstico precoz del cáncer de próstata actualmente se basa en los exámenes rectales digitales (DRE), las mediciones del antígeno específico de la próstata (PSA), la ultrasonografía transrectal (TRUS) y la biopsia por punción transrectal (TRNB). Actualmente, la medición de PSA en el suero en combinación con DRE representan la herramienta principal utilizada para detectar y diagnosticar el cáncer de próstata. Ambas tienen limitaciones principales que han hecho acopio de intensa investigación en la búsqueda de mejores marcadores de diagnóstico de esta enfermedad.

El PSA es el marcador tumoral más ampliamente utilizado para identificar, diagnosticar, y controlar actualmente el cáncer de próstata. En particular, varios inmunoanálisis para la detección de PSA en el suero están extendidos en utilización clínica. Hace poco, se ha desarrollado un ensayo de reacción en cadena de polimerasa con transcriptasa inversa (RP-PCR) para el ARNm de PSA en el suero. Sin embargo, PSA no es un marcador específico de la enfermedad, ya que en un gran porcentaje de pacientes con BPH y prostatitis (25 al 86%) son detectables elevadas concentraciones de PSA (Gao et al., 1997, Prostate 31:264-281), así como en otros trastornos no malignos en algunos hombres normales, un factor que limita de forma significativa la especificidad del diagnóstico de este marcador. Por ejemplo, aumentos en el PSA del suero de entre 4 a 10 ng/ml se observan en BPH y aún valores mayores se observan en prostatitis, particularmente prostatitis aguda. BPH es una enfermedad extremadamente corriente en los hombres. Además para confundir la situación está el hecho de que las elevaciones de PSA en el suero se pueden observar sin ningún indicio de la enfermedad procedente de DRE y viceversa. Además, se ha reconocido actualmente que PSA no es específico de la próstata (Gao et al., supra, para estudio).

Se han descrito varios procedimientos diseñados para mejorar la especificidad de la detección basados en PSA, tales como la medición de la densidad de PSA y la relación de PSA libre frente a acomplejado. Sin embargo, ninguna de estas metodologías ha sido capaz de distinguir de forma reproducible la enfermedad de la próstata benigna de la maligna. Además, los diagnósticos de PSA tienen sensibilidades de entre 57 a 79% (Cupp & Osterling, 1993, Mayo Clin. Proc. 68:297-306), y por lo tanto se echa en falta la identificación del cáncer de próstata en una población significativa de hombres con la enfermedad.

El antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) es un marcador de la superficie celular del cáncer de próstata descrito recientemente que ha sido objeto de varios estudios que evalúan su utilización como marcador para diagnóstico y terapéutico. La expresión de PSMA está muy restringida a los tejidos de la próstata, pero se han observado concentraciones detectables de ARNm de PSMA en el cerebro, glándula salival, intestino delgado y carcinona de las células renales (Israeli et al., Cancer Res. 53:227-230). La proteína del PSMA está muy expresada en la mayoría de los cánceres de próstata primarios y metastásicos, pero está también expresada en la mayoría de las muestras de neoplasia intraepitelial normales (Gao et al., supra). Los resultados preliminares que utilizan un anticuerpo monoclonal anti-PSMA, marcado con Indio-111 para detectar por imagen el cáncer de próstata recurrente presentan algunas esperanzas (Sodee et al., 1996. Clin. Nuc. Med. 21:759-766). Queda por determinar si PSMA demostrará ser una diana terapéutica útil. Sin embargo, PSMA es un antígeno dependiente de la hormona que requiere la presencia del receptor del andrógeno operativo. Ya que no todas las células del cáncer de próstata expresan el receptor del andrógeno, la utilidad de PSMA como diana terapéutica puede estar inherentemente limitada.

La estadificación clínica del cáncer de próstata es otro problema fundamental que enfrenta a los urólogos hoy en día. Actualmente, la estadificación clínica se basa en el examen rectal para determinar si el tumor permanece dentro de los límites de la cápsula prostática (localmente confinado) o se extiende más allá de ella (localmente avanzado), en combinación con las determinaciones de PSA en el suero y las biopsias guiadas por ultrasonidos transrectales. Sin embargo, debido a la subjetividad implicada la estadificación clínica por DRE infraestima regularmente o sobreestima la extensión local del tumor, frecuentemente equivoca su posición y se correlaciona mal con el volumen y el alcance del tumor (Lee, C.T. y Osterling, J.E. Cancer of the Prostate: Diagnosis and Staging. En: Urologic Oncology, W. B. Saunders Company, Philadelphia, págs 357-377 (1997)). Las concentraciones de PSA en el suero se utilizan también con fines de estadificación, pero el PSA sólo no ha sido capaz de estadificar de forma fiable los tumores de próstata. Ninguna técnica ha demostrado ser fiable para predecir la evolución de la enfermedad. Por lo tanto, existe una necesidad de una estadificación fiable e informativa y de procedimientos de pronóstico en el tratamiento del cáncer de próstata.

Sumario de la invención

La invención proporciona un nuevo antígeno de superficie celular específico de la próstata, denominado antígeno de las células madre de la próstata (PSCA), que se sobreexpresa ampliamente en todas las etapas del cáncer de próstata, incluyendo la neoplasia intraepitelial prostática en alto grado (PIN) y los tumores de próstata dependientes del andrógenos e independientes del andrógeno. El gen del PSCA presenta homología del 30% con el antígeno-2 de la célula madre (SCA-2), un miembro de la familia Thy-1/Ly-6 de los antígenos de la superficie celular anclados en glicosilfosfatidilinositol (GPI) y codifica una proteína de 123 aminoácidos con una secuencia con señal amino-terminal, una secuencia con anclaje a GPI carboxi-terminal y múltiples zonas de N-glucosilación. La expresión del ARNm del PSCA es específica de la próstata en los tejidos del hombre normal y está muy regulada por incremento tanto en los xenotrasplantes de cáncer de próstata dependientes del andrógeno como en los independientes del andrógeno. El análisis de ARNm in situ localiza la expresión de PSCA en el epitelio celular basal, compartimento de la supuesta célula madre de la próstata. El análisis citométrico de flujo demuestra que el PSCA se expresa predominantemente en la superficie de la célula y está anclado por un enlace a GPI. El análisis de hibridación fluorescente in situ localiza el gen de PSCA en el cromosoma 8q24.2, una zona de ganancia alélica en más del 80% de los cánceres de próstata.

El PSCA puede ser una diana terapéutica óptima en vista de su posición en la superficie de la célula, de la expresión específica de la próstata y de la expresión muy regulada por incremento en la expresión de las células cancerosas de próstata. A este respecto, la invención proporciona anticuerpos capaces de unirse a PSCA que se pueden utilizar terapeúticamente para destruir las células cancerosas de próstata. Además, las proteínas de PSCA y las moléculas de ácido nucleico que codifican el PSCA pueden utilizarse en varios procedimientos inmunoterapéuticos para favorecer la destrucción inmuno-mediada de los tumores de próstata.

El PSCA puede representar además un marcador ideal del cáncer de próstata que se puede utilizar para discriminar entre los cánceres malignos de próstata, las próstatas normales y las neoplasias no malignas. PSCA se expresa, por ejemplo, a concentraciones muy altas en el cáncer de próstata en relación con la hiperplasia prostática benigna (BPH). En cambio, el marcador PSA del cáncer de próstata ampliamente utilizado se expresa a altas concentraciones tanto en la próstata normal como en BPH, pero a concentraciones inferiores en el cáncer de próstata, haciendo inútil la expresión de PSA para distinguir el cáncer de próstata maligno de la BPH o de las glándulas normales. Debido a que la expresión del PSCA es esencialmente la inversa de la expresión del PSA, se puede emplear el análisis de la expresión del PSCA para distinguir el cáncer de próstata de las condiciones no malignas.

Se han aislado los genes que codifican tanto el PSCA humano como murino, aclarado sus secuencias de codificación y se proporcionan en la presente memoria. Asimismo se proporcionan las secuencias de aminoácidos del pSCA tanto humano como murino. La invención proporciona además varios análisis de diagnóstico para la detección, control y pronóstico del cáncer de próstata, incluyendo los análisis basados en ácidos nucleicos e inmunológicos. Se han proporcionado también anticuerpos monoclonales y policlonales específicos de PSCA e inmunoterapéuticos y otros procedimientos terapéuticos del tratamiento del cáncer de próstata. Estos y otros aspectos se describen además más adelante.

Breve descripción de las figuras

Fig.1. Nucleótido (A) y secuencias traducidas de aminoácidos (B) de un ADNc que codifica al PSCA humano (denominación ATCC 209612).

Fig.2. Secuencia de nucleótidos de un ADNc que codifica el homólogo del PSCA murino.

Fig.3. Alineación de secuencias de aminoácido del PSCA humano, PSCA murino y del antígeno-2 de las células madre humanas (hSCA-2). Las zonas sombreadas destacan los aminoácidos conservados. Las cisteínas conservadas están indicadas en negrita. Cuatro puntos de N-glucosilación previstos en PSCA se indican con asteriscos. Los aminoácidos subrayados en el comienzo y final de la proteína representan secuencias con señal hidrófoba N-terminal y secuencias con anclaje a GPI en el terminal C, respectivamente.

Fig. 4. Representación de la hidrofobia del PSCA humano.

Fig. 5. Análisis de Chou-Fassman del PSCA humano.

Fig. 6. Análisis RT-PCR de la expresión de PSCA en varias líneas celulares de cáncer de próstata y xenotrasplantes.

Fig. 7. Expresión restringida del ARNm del PSCA en tejidos normales y cancerosos. A: análisis RT-PCR de la expresión del PSCA en tejidos humanos normales demostrando la elevada expresión en la próstata, placenta y amígdalas. 1 ng de la primera cadena de ADNc transcrita a la inversa (Clontech, Palo Alto, CA) de los tejidos indicados se amplificó con cebadores específicos del gen de PSCA. Los datos mostrados son de 30 ciclos de amplificación. B: análisis RT-PCR de la expresión del PSCA que demuestra alta concentración en los xenotrasplantes de cáncer de próstata y en tejido normal. 5 ng de ADNc transcrito a la inversa de los tejidos indicados se amplificó con cebadores específicos del gen del PSCA. La amplificación con cebadores específicos del gen de \beta-actina demuestra la normalización de la primera cadena de ADNc de varias muestras. Los datos mostrados proceden de 25 ciclos de amplificación. AD, dependiente del andrógeno; AI, independiente del andrógeno; IT, xenotrasplante intratibial; C.L., línea celular.

Fig. 8. Representación esquemática del PSCA humano, PSCA murino y de las estructuras del gen Thy-1/Ly-6 humano.

Fig. 9. Análisis de transferencia de Northern de la expresión de PSCA. A: ARN total de próstata normal y xenotrasplantes de cáncer de próstata dependientes del andrógeno (AD) LAPC-4 e independientes (AI) se analizaron utilizando sondas específicas de PSCA o PSA. Cantidad de ARN equivalente e integridad de ARN se demostraron por separado por coloración con etidio para ARN 18S y 28S. B: Análisis de transferencia de Northern del tejido múltiple humano de PSCA. El filtro se adquirió en Clontech (Palo Alto, CA) y contiene 2ng de poliA ARN en cada banda.

Fig. 10. Comparación por transferencia de Northern de la expresión del PSCA, PSMA y PSA en xenotrasplantes de cáncer de próstata y líneas celulares tumorales. PSCA y PSMA demuestran un nivel alto de la expresión del gel específico del cáncer de próstata. 10 \mug de ARN total procedente de los tejidos indicados se fraccionó en un gel de agarosa/formaldehído, se transfirió a nitrocelulosa y se hibridó sucesivamente con sondas marcadas con ^{32}P que representan fragmentos de ADNc de PSCA, PSMA y PSA. Se muestran exposiciones autorradiográficas de la membrana y de gel de bromuro de etidio a las 4 horas y a las 72 horas demostrando la carga equivalente de las muestras. BPH, hiperplasia benigna de próstata, AD, dependiente del andrógeno; AI, independiente del andrógeno; IT, xenotrasplante intratibial; C.L., línea celular.

Fig. 11. Hibridación in situ con ribosonda de cadena complementaria para PSCA humano en muestras de próstata normales y malignas. A: PSCA se expresa mediante un subconjunto de células basales dentro del epitelio celular basal (flechas negras) pero no mediante las células secretoras diferenciadas terminalmente que revisten los conductos prostáticos (ampliación 400\times). B: PSCA se expresa de forma acusada mediante una neoplasia intraepitelial prostática (PIN) en alto grado (flecha) y mediante las glándulas del cáncer de próstata invasivo (flechas), pero no es detectable en el epitelio normal (flecha) a una ampliación de 40\times. C: Expresión marcada de PSCA en el caso de un carcinoma de alto grado (ampliación 200\times).

Fig. 12. Análisis bioquímico de PSCA. A: Se inmunoprecipitó el PSCA en células 293T transfectadas transitoriamente con un constructo de PSCA y a continuación se digerieron con N-glucosidasa F u O-glicosidasa, tal como se describe en Materiales y Procedimientos. B: Se inmunoprecipitó el PSCA en células transfectadas 293T, así como procedentes del medio acondicionado de estas células. El PSCA asociado a las células migra más que el PSCA segregado en un gel de poliacrilamida al 15%. C: análisis FACS de células 293T pseudotransfectadas, células 293T transfectadas con PSCA y células de xenotrasplante de cáncer de próstata LAPC-4 utilizando un anticuerpo anti-PSCA policlonal purificado por afinidad. Las células no se permeabilizaron con el fin de detectar solamente la expresión superficial. El eje y representa el número de relativo de células y el eje x representa la intensidad de coloración fluorescente a escala logarítmica.

Fig. 13. Hibridación in situ de sondas de PSCA marcadas con biotina para células humanas de linfocitos de la sangre periférica en metafase estimuladas con fitohemoaglutinina. Los homólogos del cromosoma 8 están identificados con flechas; se observó marcaje específico en 8q24.2. El detalle presenta cariotipos parciales de dos cromosomas 8 análogos que ilustran el marcaje específico en 8q24.2 (puntas de flechas). Las imágenes se consiguieron utilizando un microscopio Zeiss Axiophot acoplado a una cámara con dispositivo acoplado de carga enfriada (CCD). Se combinaron las imágenes independientes de los cromosomas coloreados con DAPI y la señal de hibridación utilizando los programas informáticos de análisis de imagen (NU200 e Image 1.57).

Fig. 14. Análisis citométrico de flujo de la expresión de PSCA en la superficie celular en xenotrasplantes de cáncer de próstata (LAPC-9), línea celular de cáncer de próstata (LAPC-4) y células epiteliales normales de próstata (PREC) utilizando anticuerpos monoclonales anti-PSCA 1G8 y 3E6, suero policlonal anti-PSCA de ratón o anticuerpo secundario de referencia. Véase el Ejemplo 5 para detalles.

Fig. 15. Cartografía del epítopo de anticuerpos anti-PSCA monoclonales 1G8 y 3E6. Véase el Ejemplo 5 para detalles.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere al antígeno de las células madre de la próstata (en lo sucesivo "PSCA"). PSCA es un nuevo antígeno de la superficie celular anclado a glicosilfosfatidilinositol (GPI) que se expresa casi exclusivamente en las células de la próstata y que sobreexpresan tanto las células del cáncer de próstata dependiente del andrógeno como las independientes del andrógeno. La expresión de PSCA en el cáncer de próstata se puede correlacionar con el grado en aumento.

ARNm de PSCA se expresa también mediante un subconjunto de células basales en la próstata normal. El epitelio celular basal se cree que contiene las células precursoras de las células secretoras diferenciadas en el terminal (Bonkhoff et al., 1994, Prostate 24: 114-118). Estudios recientes utilizando marcadores de citoqueratina sugieren que el epitelio celular basal contiene al menos dos subpoblaciones celulares distintas, una que expresa las citoqueratinas 5 y 14 y la otra las citoqueratinas 5, 8 y 18 (Bonkhoff y Remberger, 1996, Prostate 28:98-106). El descubrimiento de que PSCA es expresado solamente por un subconjunto de células basales sugiere que PSCA puede ser un marcador para uno de estos dos linajes de células basales.

La función biológica de PSCA es desconocida. La familia del gen Ly-6 está implicada en funciones celulares diversas, incluyendo la transducción de la señal y la adhesión célula a célula. La señalización mediante SCA-2 se ha demostrado que impide la apoptosis en los timocitos inmaduros (Noda et al., 1996, J. Exp. Med. 183: 2355-2360). Thy-1 está implicado en la activación de los linfocitos T y transmite señales a través de las tirosina-cinasas del tipo src (Thomas et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 12317-12322). Los genes Ly-6 han estado implicados tanto en la formación del tumor como en la adhesión de la célula homotípica (Bamezai y Rock, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4294-4298; Katz et al., 1994, Int. J. Cancer 59: 684-691; Brakenhoff et al., 1995, J. Cell Biol. 129: 1677-1689). Basándose en su expresión limitada en las células basales y en su homología con Sca-2, se supone que PSCA puede desempeñar un papel en las funciones de las células madre-precursoras tales como de autorrenovación (anti-apoptosis) y/o de proliferación.

PSCA se conserva en gran medida en ratones y seres humanos. La identificación de un gen conservado que está predominantemente restringido a la próstata apoya la hipótesis de que PSCA puede desempeñar un papel importante en el desarrollo normal de la próstata.

En varios aspectos, descritos con detalle más adelante, la presente invención proporciona proteínas de PSCA, anticuerpos, moléculas de ácido nucleico, moléculas de ADN recombinante, células huésped transformadas, procedimientos de generación, análisis, procedimientos inmunoterapéuticos, animales transgénicos, análisis inmunológicos y basados en ácidos nucleicos y composiciones.

Proteínas de PSCA

Un aspecto de la invención proporciona varias proteínas de PSCA y fragmentos de péptidos de las mismas. Tal como se utiliza en la presente memoria, PSCA se refiere a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del PSCA humano proporcionada en las Figuras 1B y 3, la secuencia de aminoácidos del homólogo murino de PSCA proporcionado en la Fig. 3 o la secuencia de aminoácidos de otros homólogos de mamíferos de PSCA, así como variantes alélicas y mutantes de sustitución conservadora de estas proteínas que tienen actividad de PSCA. Las proteínas de PSCA de la invención incluyen las variantes identificadas y caracterizadas específicamente descritas en la presente memoria, así como variantes alélicas, variantes y homólogos de sustitución conservadora que se pueden aislar para generar y caracterizar sin experimentación indebida siguiendo los procedimientos bosquejados más adelante. Por comodidad, todas las proteínas de PSCA se denominarán en conjunto proteínas de PSCA, proteínas de la invención o PSCA.

El término "PSCA" incluye todas las variantes alélicas naturales, isoformas y precursoras del PSCA humano proporcionadas en las Figs 1B y 3 y del PSCA murino proporcionadas en la Fig. 3. En general, por ejemplo, las variantes alélicas naturales del PSCA humano compartirán homología significativa (p. ej., 70 a 90%) para la secuencia de aminoácidos de PSCA proporcionada en las Figs. 1B y 3. Las variantes alélicas, aunque poseyendo una secuencia de aminoácidos ligeramente diferente, se pueden expresar en la superficie de las células de la próstata como una proteína unida a GPI o se pueden segregar. Típicamente, las variantes alélicas de la proteína PSCA contendrán sustituciones conservadoras de aminoácidos de la secuencia de PSCA descrita en la presente memoria o contendrán una sustitución de un aminoácido en una posición correspondiente en un homólogo de PSCA tal como, por ejemplo, el homólogo de PSCA murino descrito en la presente memoria.

Una clase de variantes alélicas de PSCA serán las proteínas que comparten un alto grado de homología con al menos una pequeña zona de las secuencias de aminoácidos de PSCA presentadas en las Figs. 1B y 3, pero contendrán además una forma de partida radical en la secuencia, tal como una sustitución, truncamiento, inserción o cambio de marco no conservador. Dichos alelos se denominan alelos mutantes de PSCA y representan proteínas que típicamente no realizan las mismas funciones biológicas.

Se pueden realizar frecuentemente sustituciones conservadoras de aminoácidos en una proteína sin alterar la conformación o la función de la proteína. Dichos cambios incluyen la sustitución de cualquier isoleucina (I), valina (V) y leucina (L) para cualquier otro de estos aminoácidos hidrófobos; ácido aspártico (D) por ácido glutámico (E) y viceversa; glutamina (Q) por asparagina (N) y viceversa; y serina (S) por treonina (T) y viceversa. Otras sustituciones se pueden considerar también conservadoras, dependiendo del medio del aminoácido particular y su papel en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, glicina (G) y alanina (A) pueden ser intercambiables con frecuencia, como puede alanina (A) y valina (V). Metionina (M) que es relativamente hidrófoba, puede intercambiarse frecuentemente con leucina e isoleucina y a veces con valina. Lisina (K) y arginina (R) son intercambiables frecuentemente en posiciones en las que la característica significativa del resto de aminoácidos es su carga y los pK diferenciadores de estos dos restos de aminoácidos no son significativos. Se pueden considerar todavía otros cambios "conservadores" en determinados medios.

La secuencia de aminoácidos de la proteína de PSCA humana se proporciona en las Figs 1B y 3. El PSCA humano se compone de una sola subunidad de 123 amino-ácidos y contiene una secuencia con señal amino-terminal, una secuencia carboxi-terminal que se ancla a GPI y a zonas de N-glucosilación múltiples. PSCA presenta 30% de homología con el antígeno-2 de la célula madre (SCA-2), miembro de la familia de genes Thy-1/Ly-6, un grupo de proteínas de la superficie celular que marca las fases preliminares del desarrollo hematopoyético. En la Fig. 3 se presenta la secuencia de aminoácidos de un homólogo murino de PSCA. El PSCA murino es una proteína con una sola subunidad de 123 aminoácidos que tienen aproximadamente el 70% de homología con el PSCA humano y una organización estructural similar.

Las proteínas de PSCA pueden estar incorporadas de muchas formas, preferentemente en forma aislada. Tal como se utiliza en la presente memoria se dice que una proteína está aislada cuando se emplean procedimientos físicos, mecánicos o químicos para separar la proteína de PSCA de los constituyentes generales que están asociados normalmente a la proteína. El experto en la materia puede emplear fácilmente procedimientos de purificación estándar para obtener una proteína de PSCA aislada. Una molécula de proteína de PSCA purificada estará sustancialmente libre de otras proteínas o moléculas que alteran la unión de PSCA al anticuerpo o a otro ligando. La naturaleza y grado de aislamiento y purificación dependerá de la utilización deseada. Las formas de realización de la proteína de PSCA incluyen una proteína de PSCA purificada y una proteína de PSCA funcional, soluble. Un ejemplo de proteína de PSCA funcional soluble presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1B o un fragmento de la misma. En una forma, dichas proteínas de PSCA funcionales, solubles o los fragmentos de las mismas conservan la capacidad de unirse al anticuerpo o a otro ligando.

La invención también proporciona péptidos que comprenden fragmentos biológicamente activos de las secuencias de aminoácidos del PSCA humano y murino mostrados en las Figs. 1B y 3. Los péptidos de la invención presentan propiedades de PSCA, tales como la capacidad para producir la generación de anticuerpos que se unen específicamente a un epítopo asociado con PSCA. Dichos fragmentos del péptido de las proteínas del PSCA se pueden generar utilizando la tecnología estándar de síntesis de péptidos y las secuencias de aminoácidos de las proteínas de PSCA humano o murino expuestas en la presente memoria. Por otra parte, se pueden utilizar procedimientos recombinantes para generar moléculas de ácido nucleico que codifican un fragmento de la proteína del PSCA. A este respecto, las moléculas de ácido nucleico que codifican los PSCA descritos en la presente memoria proporcionan medios para generar fragmentos definidos de PSCA. Como se expone más adelante, los fragmentos de péptidos de PSCA son particularmente útiles en: la generación de anticuerpos específicos de dominio; la identificación de agentes que se unen a PSCA o a un dominio de PSCA; la identificación de factores celulares que se unen a PSCA o a un dominio de PSCA; y el aislamiento de homólogos o de otras formas alélicas de PSCA humano. Los péptidos de PSCA que contienen estructuras que interesan de una forma particular se pueden prever y/o identificar utilizando varias técnicas analíticas bien conocidas en la materia, que incluyen, por ejemplo, los procedimientos de Chou-Fasman. Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o análisis de Jameson-Wolf, o basados en la inmunogenicidad. Como ejemplos, en las Figs. 4 y 5, respectivamente se proporcionan la hidrofobia y las representaciones de Chou-Fasman del PSCA humano. Los fragmentos que contienen dichos residuos son particularmente útiles para generar anticuerpos anti-PSCA específicos de la subunidad o en la identificación de factores celulares que se unen a PSCA.

Las proteínas PSCA de la invención pueden ser útiles para una variedad de fines, incluyendo pero sin limitarse a su utilización como diagnóstico y/o marcadores de pronóstico del cáncer de próstata como dianas para varias modalidades terapéuticas, además de las descritas más adelante. Las proteínas de PSCA se pueden utilizar también para identificar y aislar ligandos y otros agentes que se unen al PSCA. En la próstata normal, PSCA se expresa exclusivamente en un subconjunto de células basales, lo que sugiere que PSCA se puede utilizar como marcador para un linaje celular específico dentro del epitelio basal. Además, los resultados de los solicitantes sugieren que este conjunto de células basales representa la diana de la transformación neoplásica. Por consiguiente por ejemplo, las estrategias terapéuticas diseñadas para eliminar o modular los factores moleculares responsables de la transformación se pueden dirigir específicamente a esta población de células a través de la proteína de la superficie celular de PSCA.

Anticuerpos de PSCA

La invención proporciona además anticuerpos que se unen a PSCA. Los anticuerpos más preferidos se unirán selectivamente a PSCA y no se unirán (o se unirán débilmente) a proteínas que no sean de PSCA. Los anticuerpos anti-PSCA que se contemplan particularmente incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales así como fragmentos que contienen el dominio que se une al antígeno y/o uno o más zonas que determinan el complemento de estos anticuerpos.

En una forma de realización, los anticuerpos de PSCA se unen específicamente al dominio extracelular de una proteína de PSCA. En otras formas de realización, los anticuerpos de PSCA se unen de forma específica a otros dominios de una proteína o de un precursor de PSCA. Como entienden los expertos en la técnica, las zonas o epítopos de una proteína de PSCA a la que se dirige un anticuerpo pueden variar según la aplicación pretendida. Por ejemplo, los anticuerpos destinados a su utilización en un inmunoanálisis para la detección de un PSCA unido a la membrana en células viables cancerosas de próstata deberían estar dirigidos a un epítopo accesible en el PSCA unido a la membrana. Ejemplos de dichos anticuerpos se describen en los Ejemplos que siguen. Los anticuerpos que reconocen otros epítopos pueden ser útiles para la identificación de PSCA dentro de las células dañadas o moribundas, para la detección de proteínas de PSCA segregadas o fragmentos de las mismas. La invención abarca también fragmentos de anticuerpos que reconocen de forma específica una proteína de PSCA. Tal como se utiliza en la presente memoria, un fragmento de anticuerpo se define al menos como una parte de una zona variable de una molécula de inmunoglobulina que se une a su diana, es decir la zona de unión al antígeno. Puede estar incluida alguna zona constante de la inmunoglobulina.

La especificidad para la próstata de PSCA, su sobreexpresión tanto en las células cancerosas de próstata dependientes del andrógeno como en las independientes del andrógeno y la posición de la superficie celular de PSCA representan características de un excelente marcador para la identificación, diagnóstico, pronóstico y análisis de seguimiento y procedimientos de detección por imagen. Además, estas características indican que PSCA puede ser una diana excelente para los procedimientos terapéuticos tales como la terapia de anticuerpos dirigida, la inmunoterapia y la terapia génica.

Los anticuerpos de PSCA de la invención pueden ser particularmente útiles en los análisis de diagnóstico, las metodologías de detección por la imagen y los procedimientos terapéuticos en el tratamiento del cáncer de próstata. La invención proporciona varios análisis inmunológicos útiles para la detección de proteínas de PSCA y para el diagnóstico del cáncer de próstata. Dichos análisis comprenden en general uno o más anticuerpos de PSCA capaces de reconocer y de unirse a una proteína de PSCA e incluyen varios formatos de análisis inmunológico bien conocidos en la técnica, incluyendo pero no limitados a varios tipos de radioinmunoanálisis, análisis inmunosorbente con enzima ligado (ELISA), análisis inmunofluorescente con enzima ligado (ELIFA) y similares. Además, los procedimientos inmunológicos de detección por la imagen capaces de detectar el cáncer de próstata se proporcionan también por la invención, incluyendo, pero limitados a los procedimientos de detección por imagen radiocentelleográficos utilizando anticuerpos de PSCA marcados. Dichos análisis deben ser clínicamente útiles para la detección, control y pronóstico del cáncer de próstata.

En una forma de realización, se utilizan los anticuerpos de PSCA y los fragmentos de los mismos para detectar la presencia de un cáncer de próstata, PIN, o la célula epitelial basal que expresa una proteína de PSCA. La presencia de dicho PSCA + células dentro de varias muestras biológicas, incluyendo el suero, la próstata y otras muestras de biopsia de tejido, otros tejidos tales como hueso, orina, etc., pueden ser detectados con anticuerpos de PSCA. Además, se pueden utilizar anticuerpos de PSCA en varias metodologías de detección por imagen, tales como la inmunocentelleografía con anticuerpo conjugado con indio-111 (u otro isótopo). Por ejemplo, se puede utilizar un protocolo de detección por imagen similar a uno descrito recientemente que utiliza un anticuerpo anti-PSMA conjugado con In-111, para detectar carcinomas de próstata recurrentes y metastásicos (Sodee et al., 1997, Clin. Nuc. Med. 21:759-766). En relación con otros marcadores de cáncer de próstata, tal como PSMA por ejemplo, PSCA puede ser particularmente útil para direccionar las células cancerosas de próstata negativas para el receptor del andrógeno. Se pueden utilizar asimismo anticuerpos de PSCA utilizados terapéuticamente para inhibir la función de PSCA.

Se pueden utilizar también anticuerpos de PSCA en los procedimientos de purificación de proteínas de PSCA y péptidos y para aislar homólogos de PSCA y moléculas relacionadas. Por ejemplo, en una forma de realización, el procedimiento de purificación de una proteína de PSCA comprende incubar un anticuerpo de PSCA, que se ha acoplado a una matriz sólida, con un lisado u otra solución que contiene PSCA en condiciones que permitan al anticuerpo de PSCA unirse a PSCA; lavando la matriz sólida para eliminar las impurezas y eluyendo el PSCA procedente del anticuerpo acoplado.

Además, se pueden utilizar anticuerpos de PSCA para aislar células positivas a PSCA utilizando técnicas de selección y purificación celulares. La presencia de PSCA en las células tumorales de la próstata se puede utilizar para distinguir y aislar células del cáncer de próstata humano de otras células. En particular, se pueden utilizar anticuerpos de PSCA para aislar células cancerosas de próstata del tejido tumoral del xenotrasplante, a partir de células en cultivo, etc., utilizando técnicas de selección de células o de purificación por afinidad basadas en el anticuerpo. Otras utilizaciones de los anticuerpos de PSCA de la invención incluyen la generación de anticuerpos anti-idiotípicos que simulan la proteína de PSCA.

La capacidad para generar grandes cantidades de células cancerosas de próstata humanas relativamente puras que se puedan cultivar en cultivos de tejido o como tumores de xenotrasplante en modelos animales (p. ej. SCID u otros ratones inmunodeficientes) proporciona muchas ventajas, incluyendo, por ejemplo, permitir la evaluación de varios compuestos transgénicos o terapéuticos experimentales en el cultivo u otras característica fenotípicas de una población relativamente homogénea de células cancerosas de próstata. Además, esta característica de la invención permite también el aislamiento de preparaciones muy enriquecidas en ácidos nucleicos específicos del cáncer de próstata humano en cantidades suficientes para varias manipulaciones moleculares. Por ejemplo, grandes cantidades de dichas preparaciones de ácido nucleico ayudarán a la identificación de genes con importancia biológica en la evolución de la enfermedad del cáncer de próstata.

Otra aplicación valiosa de este aspecto de la invención es la capacidad para analizar y experimentar con preparaciones relativamente puras de células viables de tumor de próstata clonadas de pacientes individuales con la enfermedad localmente avanzada o metastásica. De esta manera, por ejemplo, las células cancerosas de próstata de cada paciente se pueden propagar a partir de una muestra de biopsia limitada y a continuación analizar la presencia de genes de diagnóstico y pronóstico, proteínas, aberraciones cromosómicas, perfiles de expresión génica u otras características importantes genotípicas y fenotípicas, sin la variable potencialmente confusa de las células contaminantes. Además, se puede evaluar la agresividad neoplásica y el potencial metastásico en dichas células en modelos animales. Igualmente, se pueden crear vacunas contra el cáncer de próstata específicas para el paciente y productos inmunoterapéuticos celulares a partir de dichas preparaciones celulares.

Varios procedimientos para la preparación de anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo se pueden preparar anticuerpos inmunizando un huésped mamífero adecuado utilizando una proteína, péptido o fragmento de PSCA, en forma aislada o inmunoconjugada (Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Además, también se pueden utilizar las proteínas de fusión de PSCA, tal como una proteína de fusión con GST de PSCA. Las células que expresan o sobreexpresan PSCA pueden utilizarse también para inmunizaciones. Igualmente, se puede utilizar cualquier célula modificada genéticamente para expresar PSCA. Esta estrategia puede dar como resultado la producción de anticuerpos monoclonales con aumento de las capacidades para reconocer el PSCA endógeno.

La secuencia de aminoácidos de PSCA presentada en la presente memoria se puede utilizar para seleccionar zonas específicas de la proteína de PSCA para generar anticuerpos. Por ejemplo, se pueden utilizar los análisis de hidrofobia e hidrofilia de la secuencia de aminoácidos de PSCA para identificar zonas hidrófilas por la estructura de PSCA. Las zonas de la proteína de PSCA que presentan una estructura inmunógena, así como otras zonas y dominios, se pueden identificar fácilmente utilizando otros varios procedimientos conocidos en la técnica, tales como los análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf. Los fragmentos que contienen estos residuos son particularmente aconsejables para generar clases específicas de anticuerpos anti-PSCA. Los fragmentos particularmente útiles incluyen, pero no se limitan a las secuencias TARIRAVGLLTVISK y VDDSQDYYVGKK. Como se describe en el Ejemplo 2, más adelante, se generó un anticuerpo policlonal de ratón contra el fragmento anterior, preparado como péptido sintético y se purificó por afinidad utilizando una proteína de fusión PSCA-glutation S transferasa. El reconocimiento de PSCA por este anticuerpo se comprobó por análisis de inmunotransferencia y de inmunoprecipitación de los extractos de las células 293T transfectadas con PSCA y una proteína de fusión de GST-PSCA. Este anticuerpo también identificó la expresión de la superficie celular de PSCA en células 293T transfectadas con PSCA y células LAPC-4 utilizando selección celular activada por fluorescencia (FACS).

Los procedimientos para preparar una proteína para su utilización como inmunógeno y para preparar conjugados inmunogénicos de una proteína con un portador tal como BSA, KLH u otras proteínas portadoras son bien conocidos en la técnica. En algunas circunstancias, se puede utilizar la conjugación directa utilizando, por ejemplo, reactivos de carbodiimida; en otros casos los reactivos para la unión tales como los suministrados por Pierce Chemical Co., Rockford, IL, pueden ser eficaces. La administración de un inmunógeno de PSCA se realiza generalmente por inyección durante un periodo de tiempo adecuado y con la utilización de un adyuvante adecuado, como se entiende generalmente en la técnica. Durante el programa de inmunización, se puede considerar que los valores de los anticuerpos determinan la adecuación de la formación del anticuerpo.

Aunque el antisuero policlonal producido de esta forma puede ser satisfactorio para algunas aplicaciones, se prefieren las composiciones farmacéuticas y las preparaciones de anticuerpo monoclonal. Se pueden preparar líneas celulares inmortalizadas que segregan un anticuerpo monoclonal deseado utilizando el procedimiento estándar de Kohler y Milstein o modificaciones que efectúan la inmortalización de linfocitos o de esplenocitos, como es conocido generalmente. Las líneas celulares inmortalizadas que segregan los anticuerpos deseados se identifican por inmunoanálisis en el que el antígeno es la proteína de PSCA o un fragmento de PSCA. Cuando se identifica el cultivo celular inmortalizado apropiado que segrega el anticuerpo deseado, las células se pueden cultivar ya sea in vitro o por producción en fluido de ascitis.

Los anticuerpos monoclonales deseados se recuperan a continuación del sobrenadante del cultivo o del sobrenadante de ascitis. Los fragmentos de los antisueros monoclonales o policlonales que contienen la parte inmunológicamente significativa se pueden utilizar como antagonistas, así como los anticuerpos intactos. La utilización de fragmentos inmunológicamente reactivos, tales como los fragmentos Fab, Fab', de F(ab')_{2} es con frecuencia preferible, especialmente en un contexto terapéutico, ya que estos fragmentos son generalmente menos inmunógenos que la inmunoglobulina completa.

La generación de dos anticuerpos monoclonales (Mab) capaces de unirse a PSCA de la superficie celular se describe en el Ejemplo 5. La cartografía del epítopo de estos Mab indica que reconocen diferentes epítopos en la proteína de PSCA, uno reconoce un epítopo dentro de la zona carboxi-terminal y el otro reconoce un epítopo dentro de la zona amino-terminal. Dichos anticuerpos de PSCA pueden ser particularmente bien aconsejables para su utilización en un ELISA con formato en sandwich, dadas sus características de unión al epítopo diferentes.

Los anticuerpos o fragmentos se pueden producir también, utilizando tecnología habitual, por medios recombinantes. Las zonas que se unen específicamente a las zonas deseadas de la proteína de PSCA también se pueden producir en el contexto de los anticuerpos híbridos o injertados con CDR de origen de especies múltiples.

El anticuerpo o el fragmento del mismo de la invención puede estar marcado con un marcador detectable o conjugado con una segunda molécula, tal como un agente citotóxico, y ser utilizado para direccionar la segunda molécula a una célula positiva a PSCA (Vitetta, E.S. et al., 1993, Immunotoxin therapy, en DeVita Jr., V.T. et al ., eds. Cancer: Principles and Practice of Oncology, 4ª ed. J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 2624-2636). Ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, pero sin limitarse a ricino, doxorrubicina, daunorrubicina, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxiantracindiona, actinomicina D, toxina de la difteria, exotoxina A de Pseudomonas (PE), PE40, ricino, abrina y glucocorticoide y otros agentes quimioterapéuticos, así como radioisótopos. Los marcadores detectables adecuados incluyen, pero no se limitan a, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante metálico o un enzima.

Se pueden utilizar anticuerpos de PSCA de forma generalizada para tratar el cáncer de próstata. Los anticuerpos de PSCA conjugados con agente tóxicos, tales como ricino, así como los anticuerpos no conjugados pueden ser agentes terapéuticos útiles direccionados de forma natural a células cancerosas de próstata que llevan PSCA. Las técnicas para conjugar los agentes terapéuticos a los anticuerpos son bien conocidas (véase, p. ej. Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al., (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss. Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2ª Ed.). Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987): Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies'84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985): y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)). La utilización de anticuerpos de PSCA como agentes terapéuticos se describe además en el subapartado "PROSTATE CANCER IMMUNOTHERAPY" más adelante.

Moléculas de ácido nucleico que codifican PSCA

Otro aspecto de la invención proporciona varias moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de PSCA y fragmentos de las mismas, preferentemente en forma aislada incluyendo ADN, ARN, híbrido de ADN/ARN y las moléculas relacionadas, moléculas de ácido nucleico complementarias con la secuencia de codificación de PSCA o una parte de la misma y las que se hibridan con el gen de PSCA o con los ácidos nucleicos que codifican PSCA. Las moléculas de ácido nucleico particularmente preferidas tendrán una secuencia de nucleótido sustancialmente idéntica o complementaria con las secuencias de ADN humano o murino expuestas en la presente memoria. Se contemplan de forma específica el ADN genómico, el ADNc, los ribozimas y las moléculas con cadena complementaria, así como los ácidos nucleicos basados en un eje central alternativo o que incluyen bases alternativas, ya procedan de fuentes naturales o sintéticas. Por ejemplo, las moléculas de la cadena complementaria pueden ser moléculas de ARN o de otras, incluyendo los ácidos nucleicos de péptido (APN) o las moléculas de ácido no nucleico, tales como las derivadas de fosforotioato, que se unen específicamente a ADN o ARN en una base de manera dependiente del par. Un experto en la materia puede conseguir fácilmente estas clases de moléculas de ácido nucleico utilizando las secuencias de PSCA descritas en la presente memoria. Por comodidad, las moléculas de ácido nucleico que codifican PSCA se denominarán en la presente memoria moléculas de ácido nucleico que codifican PSCA, genes de PSCA o secuencias de PSCA.

En la Fig. 1A se proporciona la secuencia de nucleótido de un ADNc que codifica una forma alélica del PSCA humano. En la Fig. 2 se proporciona la secuencia de nucleótidos de un ADNc que codifica un homólogo del PSCA murino ("PSCA murino"). También se han aislado los clones genómicos de PSCA humano y murino, como se describe en el Ejemplo 4. Tanto los clones genómicos humano como murino contienen tres exones que codifican las zonas traducidas y 3' no traducidas del gen de PSCA. Se supone que existe un cuarto exón que codifica una zona no traducida 5' basándose en la homología de PSCA con otros elementos de las familias de genes Ly-6 y Thy-1 (Fig. 8).

El gen de PSCA humano se cartografía en el cromosoma 8q24.2. El antígeno 2 de las células madre humanas (RIG-E), así como otro homólogo de Ly-6 humano identificado recientemente, se ha localizado también en esta zona, sugiriendo que puede existir una gran familia de genes relacionados en este locus (Brakenhoff et al., 1995, supra: Mao et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5910-5914). De forma fascinante, se ha descrito que el cromosoma 8q es una zona de ganancia alélica y amplificación en una mayoría de cánceres de próstata avanzados y recurrentes (Cher et al., 1994, Genes Chrom. Cancer 11: 153-162). c-myc se localiza próximo a PSCA en el cromosoma 8q24 y se han observado extracopias de c-myc (ya sea mediante ganancia alélica o amplificación) se ha descubierto en el 68% de los tumores de próstata primarios y en el 96% de metástasis (Jenkins et al., 1997, Cancer Res. 57: 524-531).

Las formas de realización de las moléculas de ácido nucleico que codifican PSCA de la invención incluyen cebadores, que permiten la amplificación específica de las moléculas de ácido nucleico de la invención o de algunas partes específicas de las mismas y sondas que hibridan selectiva o específicamente a las moléculas de ácido nucleico de la invención o a cualquiera de sus partes. Las sondas de ácido nucleico se pueden marcar con un marcador detectable. Ejemplos de marcador detectable incluyen, pero no se limitan a radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante metálico o un enzima. Dichas sondas marcadas se pueden utilizar para diagnosticar la presencia de una proteína de PSCA como medio para diagnosticar las células que expresan una proteína de PSCA. Las tecnologías para generar sondas de ADN y ARN son bien conocidas.

Tal como se utiliza en la presente memoria, una molécula de ácido nucleico se dice que está "aislada" cuando la molécula de ácido nucleico está sustancialmente separada de las moléculas de ácido nucleico contaminantes que codifican otros polipéptidos distintos de PSCA. Un experto en la materia puede emplear fácilmente procedimientos de aislamiento de ácido nucleico para obtener una molécula de ácido nucleico que codifica el PSCA aislado.

La invención proporciona además fragmentos de moléculas de ácido nucleico que codifican al PSCA de la presente invención. Tal como se utiliza en la presente memoria, un fragmento de una molécula de ácido nucleico que codifica al PSCA se refiere a una pequeña parte de la secuencia que codifica al PSCA completo. El tamaño del fragmento se determinará por su uso pretendido. Por ejemplo, si el fragmento se selecciona con el fin de codificar una parte activa de la proteína de PSCA, tales como un dominio activo, el punto de unión al efector o el dominio de unión a GPI, entonces el fragmento necesitará ser bastante grande para codificar la(s) zona(s) funcional(es) de la proteína de PSCA. Si el fragmento se ha de utilizar como sonda de ácido nucleico o cebador en PCR, entonces se selecciona la longitud del fragmento con el fin de obtener un número relativamente pequeño de falsos positivos durante el sondado/cebado. Los fragmentos de PSCA humano que son particularmente útiles como sondas de hibridación selectiva o cebadores en PCR se pueden identificar fácilmente en la secuencia de PSCA completa utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Un conjunto de cebadores de PCR que son útiles para el análisis por RT-PCR comprenden 5'-TGCTTGCCCTGTTGATGGCAG- y 3'-CCAGAGCAGCAGGCCGAGTGCA -.

Otra clase de fragmentos de moléculas de ácido nucleico que codifica PSCA son la secuencia de expresión de control corriente arriba y corriente abajo de la zona de codificación del PSCA hallada en los clones genómicos del gen de PSCA. Específicamente, los elementos del control de expresión específicos de la próstata se pueden identificar como 5' para la zona de codificación de PSCA hallada en los clones genómicos del gen de PSCA. Dichas secuencias de control de expresión son útiles en la generación de los vectores de expresión para expresar genes de un modo específico de la próstata. Un experto en la materia puede utilizar fácilmente la secuencia de ADNc del PSCA descrita en la presente memoria para aislar e identificar secuencias del PSCA genómico y los elementos para control de la expresión hallados en el gen de PSCA.

Procedimientos para aislar otras moléculas de ácido nucleico que codifican PSCA

Las moléculas de ácido nucleico que codifican PSCA descritas en la presente memoria permiten el aislamiento de homólogos de PSCA, como alternativa isoformas en secciones, variantes alélicas y formas mutantes de la proteína de PSCA, así como sus secuencias de codificación y del gen. La fuente más preferida de homólogos de PSCA son los organismos de mamíferos.

Por ejemplo, se puede sintetizar una parte de la secuencia que codifica PSCA descrita en la presente memoria y utilizar como una sonda para recuperar ADN que codifica a un elemento de la familia PSCA de proteínas a partir de otros organismos distintos al ser humano, variantes alélicas de la proteína del PSCA humana descritas en la presente memoria y la secuencia genómica que contiene el gen de PSCA. Se preparan oligómeros que contienen aproximadamente de 18 a 20 nucleótidos (que codifican aproximadamente un tramo de 6 a 7 aminoácidos) y se utilizan para identificar bibliotecas genómicas de ADN o de ADNc para obtener hibridación en condiciones restrictivas o condiciones de restricción suficiente para eliminar un nivel indebido de falsos positivos. En una forma de realización determinada, se utilizó ADNc que codifica PSCA humano para aislar un ADNc completo que codifica el homólogo de PSCA murino, tal como se describe en el Ejemplo 3 en la presente memoria. El clon murino codifica una proteína con 70% de identidad de aminoácidos en PSCA humano.

Además, se puede utilizar la secuencia de aminoácidos de la proteína de PSCA humano para generar sondas de anticuerpos para cribar bibliotecas de expresión preparadas a partir de las células. Típicamente, se puede utilizar antisuero policlonal procedente de mamíferos tales como conejos inmunizados con la proteína purificada (como se describe más adelante) o anticuerpos monoclonales para sondar una biblioteca de expresión, preparada a partir de un organismo diana, para obtener una secuencia de codificación apropiada para un homólogo de PSCA. La secuencia de ADNc clonada se puede expresar como proteína de fusión, expresada directamente utilizando sus propias secuencias de referencia o expresada construyendo una casete de expresión utilizando secuencias de referencia apropiadas al huésped particular utilizado para la expresión del enzima.

Los clones genómicos que contienen genes de PSCA se pueden obtener utilizando procedimientos de clonación molecular bien conocidos en la técnica. En una forma de realización, se obtuvo un clon genómico humano de aproximadamente 14 kb que contiene 1 a 4 exones del gen de PSCA, cribando una biblioteca del fago lambda con una sonda ADNc de PSCA, descrita de forma más completa en el Ejemplo 4 de la presente memoria. En otra forma de realización, se obtuvo un clon genómico de aproximadamente 10 kb que contiene el gen de PSCA murino cribando una biblioteca de BAC murino (cromosoma artificial bacteriano) con un ADNc de PSCA murino (también descrito en el Ejemplo 4).

Además, se pueden preparar pares de cebadores de oligonucleótido para utilizar en una reacción en cadena de polimerasa (PCR) para amplificar/clonar selectivamente una molécula de ácido nucleico que codifica al PSCA o un fragmento de la misma. Un ciclo para desnaturalizar/hibridar/ampliar por PCR para utilizar dichos cebadores de PCR es bien conocido en la técnica y se puede adaptar fácilmente para utilizar en aislar otras moléculas de ácido nucleico que codifiquen a PSCA. Se pueden identificar fácilmente zonas del gen de PSCA humano que son particularmente muy aconsejables para su utilización como sonda o como cebadores.

Homólogos no humanos de PSCA, variantes alélicas naturales de PSCA y secuencias de PSCA genómicas compartirán un alto grado de homología con las secuencias de PSCA humano descritas en la presente memoria. En general, dichas moléculas de ácido nucleico se hibridarán con la secuencia de PSCA humano en condiciones restrictivas. Dichas secuencias contendrán de forma típica, por lo menos, 70% de homología, preferentemente al menos 80%, más preferentemente al menos 90% de homología con la secuencia de PSCA humano. "Condiciones restrictivas" son aquellas que (1) emplean fuerza iónica baja y alta temperatura para el lavado, por ejemplo, NaCl 0,015M/citrato de sodio 0,0015M/SDS al 0,1% a 50 EC., o (2) emplean durante la hibridación un agente de desnaturalización tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (vol/vol) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón de fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 EC. Otro ejemplo consiste en la utilización de formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón tratado con ultrasonidos (50 Tg/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42 EC., con lavados a 42 EC, en 0,2 x SSC y SDS al 0,1%. Un experto en la materia puede determinar fácilmente y variar las condiciones de restricción de forma apropiada para obtener una señal de hibridación clara y detectable.

Moléculas de ADN recombinante que contienen ácidos nucleicos que codifican PSCA

También se proporcionan moléculas de ADN recombinante (ADNr) que contienen secuencias que codifican PSCA como se describe en la presente memoria, o un fragmento de las mismas. Tal como se utiliza en la presente memoria, una molécula de ADNr es una molécula de ADN que se ha sometido a una manipulación molecular in vitro. Los procedimientos para generar moléculas de ADNr son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, véase Sambrook et al., Molecular Cloning (1989). En las moléculas de ADNr preferidas de la presente invención, una secuencia de ADN que codifica PSCA que codifica una proteína de PSCA o un fragmento de PSCA, está unida operativamente a una o más secuencias de control de expresión y/o secuencias del vector. La molécula de ADNr puede codificar la proteína de PSCA completa o puede codificar un fragmento de la proteína de PSCA.

La selección del vector y/o de las secuencias de control de expresión a la que la secuencia que codifica el PSCA se une operativamente depende directamente, como es bien conocido en la técnica, de las propiedades funcionales deseadas, p. ej. la expresión de la proteína y la célula huésped que se ha de transformar. Un vector contemplado en la presente invención es al menos capaz de dirigir la replicación o inserción en el cromosoma del huésped y preferentemente también la expresión de la secuencia de codificación del PSCA incluida en la molécula de ADNr.

Los elementos del control de expresión que se utilizan para regular la expresión de una secuencia que codifica una proteína unida operativamente son conocidos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a activadores inducibles, activadores constitutivos, señales de secreción, potenciadores, terminadores de transcripción y otros elementos reguladores. Preferentemente, se utiliza un activador inducible que se controla fácilmente, tal como el que es responsable de un nutriente en el medio de las células huésped.

En una forma de realización, el vector que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica PSCA incluirá un replicón procariótico, es decir, una secuencia de ADN que tiene capacidad para dirigir la replicación autónoma y el mantenimiento de la molécula de ADN recombinante en el interior del cromosoma en una célula huésped procariótica, tal como una célula huésped bacteriana, transformada con ésta. Dichos replicones son bien conocidos en la técnica. Además, los vectores que incluyen un replicón procariótico pueden también incluir un gen cuya expresión confiere un marcador detectable, como por ejemplo una resistencia al fármaco. Los genes bacterianos típicos con resistencia al fármaco son aquellos que confieren resistencia a la ampicilina o a la tetraciclina.

Los vectores que incluyen un replicón procariótico pueden además incluir un activador procariótico o vírico capaz de dirigir la expresión (transcripción y traducción) de la secuencia que codifica PSCA en una célula huésped bacteriana, como por ejemplo E. coli. Un activador es un elemento de control de expresión formado por una secuencia de ADN que permite que tenga lugar la unión de ARN polimerasa y la transcripción. Las secuencias de activador compatibles con los huéspedes bacterianos están provistas típicamente en los vectores de plásmido que contienen zonas de restricción convenientes para la inserción de un segmento de ADN de la presente invención. Se pueden también utilizar varios vectores víricos bien conocidos por los expertos en la técnica, tal como, por ejemplo, numerosos vectores retrovíricos bien conocidos.

Se pueden utilizar también vectores de expresión compatibles con las células eucarióticas, preferentemente los compatibles con las células de vertebrados, para las moléculas de ADNr variantes que contienen una secuencia que codifica PSCA. Los vectores de expresión de las células eucarióticas son bien conocidos en la técnica y están disponibles en diversos proveedores comerciales. Típicamente, dichos vectores se proporcionan conteniendo zonas de restricción convenientes para la inserción del segmento de ADN deseado. Dichos vectores típicos son PSVL y pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1/pML2d (International Biotechnologies, Inc.), pTDTI (ATCC, nº 31255), el vector pCDM8 descrito en la presente memoria y los vectores de expresión eucariótica similares.

Los vectores de expresión celular eucariótica utilizados para construir las moléculas de ADNr de la presente invención pueden incluir además un marcador seleccionable que es eficaz en una célula eucariótica, preferentemente un marcador de selección con resistencia al fármaco. Un marcador con resistencia al fármaco preferido es el gen cuya expresión produce resistencia a la neomicina, es decir, el (neo) gen de neomicin fosfotransferasa. Southern et al., J. Mol. Anal. Genet. (1982) 1:327-341. Por otra parte, el marcador seleccionable puede estar presente en un plásmido independiente y los dos vectores se introducen por cotransfección de la célula huésped y se seleccionan para cultivar en presencia del fármaco apropiado para el marcador seleccionable.

Según la práctica de la invención, el vector puede ser un plásmido, cósmido o vector de fago que codifica la molécula de ADNc expuesta anteriormente. Además, la invención proporciona un sistema de huésped-vector que comprende el plásmido, cósmido o vector de fago transfectado en una célula huésped eucariótica adecuada. Ejemplos de células huésped eucarióticas adecuadas incluyen una célula de levadura, una célula vegetal, una célula animal, como por ejemplo una célula de mamífero. Ejemplos de células adecuadas incluyen el LnCaP, LAPC-4 y otras líneas celulares de cáncer de próstata. El sistema huésped-vector es útil para la producción de una proteína de PSCA. Por otra parte, la célula huésped puede ser procariótica, como por ejemplo, una célula bacteriana.

Células huésped transformadas

La invención proporciona además células huésped transformadas con una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de PSCA o un fragmento de la misma. La célula huésped puede ser procariótica o eucariótica. Las células eucarióticas útiles para la expresión de una proteína de PSCA no están limitadas, con tal que la línea celular sea compatible con los procedimientos de cultivo celular y compatible con la propagación del vector de expresión y con la expresión de un gen de PSCA. Las células huésped eucarióticas preferidas incluyen, pero no están limitadas a, células de levadura, de insecto y de mamífero, preferentemente células de vertebrados tales como las de una línea celular fibroblástica de ratón, rata, mono o humana. También se pueden utilizar las líneas celulares de cáncer de próstata, tales como las líneas celulares LnCaP y LAPC-4. Se puede utilizar cualquier huésped procariótico para expresar una molécula de ADNr que codifique a PSCA. El huésped procariótico preferido es E. coli.

La transformación de células huésped apropiadas con la molécula de ADNr de la presente invención se realiza por procedimientos bien conocidos que dependen típicamente del tipo de vector utilizado y del sistema de huésped empleado. Con respecto a la transformación de células huésped procarióticas, se emplean de manera típica los métodos de electroporación y de tratamiento con sales, véase, por ejemplo, Cohen et al., Proc. Acad. Sci. USA (1972) 69:2110; y Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982). Con respecto a la transformación de las células de vertebrado con vectores que contienen ADNr, se puede emplear típicamente la electroporación, tratamiento con lípidos catiónicos o con sales, véase, por ejemplo, Graham et al., Virol. (1973) 52:456: Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76:1373-76.

Las células transformadas con éxito, es decir, células que contienen una molécula de ADNr de la presente invención, se pueden identificar mediante técnicas bien conocidas. Por ejemplo, las células resultantes de la introducción de un ADNr de la presente invención se pueden clonar para producir colonias aisladas. Las células de estas colonias se pueden recoger, lisar y examinar la presencia del ADNr en su contenido en ADN utilizando un procedimiento tal como el descrito por Southern, J. Mol. Biol.. (1975) 98:503, o Berent et al., Biotech (1985) 3:208 o las proteínas producidas a partir de la célula ensayada mediante un procedimiento inmunológico.

Procedimientos recombinantes de generación de proteínas de PSCA

La invención proporciona además procedimientos para producir una proteína de PSCA utilizando una de las moléculas de ácido nucleico que codifica PSCA descritas en la presente memoria. En términos generales, la producción de una proteína de PSCA recombinante implica típicamente las siguientes etapas.

En primer lugar, se obtiene una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de PSCA o un fragmento de la misma, tal como la molécula de ácido nucleico representada en la Fig. 1A. La molécula de ácido nucleico que codifica PSCA se coloca a continuación preferentemente en un enlace operable con secuencias de control adecuadas, como se describió anteriormente, para generar una unidad de expresión que contiene la secuencia de codificación de PSCA. La unidad de expresión se utiliza para transformar un huésped adecuado y el huésped transformado se cultiva en condiciones que permitan la producción de la proteína de PSCA. Opcionalmente la proteína de PSCA se aisla del medio o de las células: la recuperación y purificación de la proteína puede no ser necesaria en algunos casos en los que se pueden tolerar algunas impurezas.

Cada una de las etapas anteriores se puede realizar de varias formas. Por ejemplo, las secuencias de codificación deseadas se pueden obtener a partir de fragmentos genómicos y utilizar directamente en un huésped apropiado. La construcción de vectores de expresión que son operables en varios huéspedes se realiza utilizando una combinación apropiada de replicones y de secuencias de control. Las secuencias de control, los vectores de expresión y los procedimientos de transformación dependen del tipo de célula huésped utilizada para expresar el gen y se expusieron con detalle al principio. Las zonas de restricción adecuadas pueden, si no están disponibles normalmente, añadirse a los extremos de la secuencia de codificación con el fin de proporcionar un gen escindible para insertar en estos vectores. Un experto en la materia puede adaptar fácilmente cualquier sistema de huésped/expresión conocido en la técnica para utilizar con las secuencias de codificación de PSCA para producir una proteína de PSCA.

Análisis para identificar ligandos de PSCA y otros agentes de unión

Otro aspecto de la invención se refiere a los análisis y procedimientos que se pueden utilizar para identificar ligandos de PSCA y otros agentes y constituyentes celulares que se unen a PSCA. De forma específica, se pueden identificar los ligandos de PSCA y otros agentes y constituyentes celulares que se unen a PSCA por la capacidad del ligando de PSCA o de otro agente o constituyente para unirse a PSCA y/o la capacidad para inhibir/estimular la actividad de PSCA. Los análisis de actividad de PSCA (p. ej. unión) utilizando una proteína de PSCA son adecuados para su utilización en los procedimientos de cribado de alto rendimiento.

En una forma de realización, el análisis comprende mezclar PSCA con un agente de prueba o un extracto celular. Después del mezclado en condiciones que permitan la asociación de PSCA con el agente o componente del extracto, se analiza la mezcla para determinar si el agente/componente está unido a PSCA. Los agentes/componentes de unión se identifican como capaces de unirse a PSCA. Por otra parte o sucesivamente, la actividad de PSCA se puede evaluar directamente como un medio para identificar agonistas y antagonistas de la actividad de PSCA.

Por otra parte, se pueden identificar las dianas que se unen a una proteína de PSCA utilizando un sistema de levadura de dos híbridos o utilizando un análisis de captura por unión. En el sistema de levadura con dos híbridos, una unidad de expresión que codifica una proteína de fusión construida de una subunidad de un factor de transcripción de dos subunidades y la proteína de PSCA se introduce y se expresa en una célula de levadura. La célula se modifica además para contener (1) una unidad de expresión que codifica un marcador detectable cuya expresión requiere el factor de transcripción de dos subunidades para la expresión y (2) una unidad de expresión que codifica una proteína de fusión construida de la segunda subunidad del factor de transcripción y de un segmento clonado de ADN. Si el segmento clonado de ADN codifica una proteína que se une a la proteína de PSCA, la expresión produce la interacción del PSCA y la proteína codificada. Ésta lleva las dos subunidades del factor de transcripción a la proximidad de la unión, permitiendo la reconstrucción del factor de transcripción. Esto produce la expresión del marcador detectable. El sistema de levadura de dos híbridos es particularmente útil en el cribado de una biblioteca de ADNc que codifica los segmentos para los compañeros de unión celular de PSCA.

Las proteínas de PSCA que se pueden utilizar en los análisis anteriores incluyen, pero no se limitan a, una proteína de PSCA aislada, un fragmento de una proteína de PSCA, una célula que se ha alterado para expresar una proteína de PSCA o una fracción de una célula que se ha alterado para expresar una proteína de PSCA. Además, la proteína de PSCA puede ser la proteína de PSCA completa o un fragmento definido de la proteína de PSCA. Es evidente para un experto en la técnica que con tal que se pueda analizar la unión del agente en la proteína de PSCA, p. ej. mediante un cambio en el peso molecular o en la actividad, se puede utilizar el presente análisis.

El procedimiento utilizado para identificar si un agente/componente celular se une a una proteína de PSCA estará basado principalmente en la naturaleza de la proteína de PSCA utilizada. Por ejemplo, se puede utilizar un análisis de retardo del gen para determinar si un agente se une a PSCA o a un fragmento del mismo. Por otra parte, se pueden adoptar las tecnologías de inmunodetección y biochip para su utilización con la proteína del PSCA. Un experto en la materia puede emplear fácilmente numerosas técnicas conocidas en la materia para determinar si un determinado agente se une a una proteína de PSCA.

Se puede analizar además la capacidad para modular la actividad de una proteína de PSCA en agentes y componentes celulares utilizando un sistema de análisis exento de células o un sistema de análisis celular. A medida que las actividades de la proteína de PSCA están más definidas, se puede emplear análisis funcional basado en la actividad identificada.

Tal como se utiliza en la presente memoria, se dice que un agente antagoniza la actividad de PSCA cuando el agente reduce la actividad de PSCA. El agonista preferido antagonizará selectivamente a PSCA, sin afectar ninguna otra proteína celular. Además, el antagonista preferido reducirá la actividad de PSCA más del 50%, más preferentemente más del 90%, aún más preferentemente eliminando toda la actividad de PSCA.

Tal como se utiliza en la presente memoria, se dice que un agente agoniza la actividad de PSCA cuando el agente aumenta la actividad de PSCA. El agonista preferido agonizará selectivamente PSCA, sin afectar ninguna otra de las proteínas celulares. Además, el antagonista preferido incrementará la actividad de PSCA en más del 50%, más preferentemente en más del 90%, aún más preferentemente más del doble de la actividad de PSCA.

Los agentes que se analizan en el procedimiento anterior se pueden seleccionar al azar o seleccionar o diseñar de forma racional. Tal como se utiliza en la presente memoria, se dice que un agente se selecciona al azar cuando el agente se selecciona al azar sin considerar las secuencias específicas de la proteína de PSCA. Un ejemplo de agentes seleccionados al azar es la utilización de una biblioteca química o de una biblioteca combinatoria de péptidos o de un caldo de cultivo de un extracto de organismo o de plantas.

Tal como se utiliza en la presente memoria, se dice que un agente se selecciona o se diseña de forma racional cuando el agente se selecciona en una base no aleatoria que tiene en cuenta la secuencia de la zona diana y/o su conformación en conexión con la acción del agente. Se pueden seleccionar agentes de forma racional o diseñar de forma racional utilizando las secuencias del péptido que construyen la proteína de PSCA. Por ejemplo, un agente de péptido seleccionado de forma racional puede ser un péptido cuya secuencia de aminoácidos sea idéntica a un fragmento de una proteína de PSCA.

Los agentes probados en los procedimientos de la presente invención pueden ser, por ejemplo péptidos, pequeñas moléculas y derivados de vitaminas, así como carbohidratos. Un experto en la materia puede reconocer fácilmente que no existen límites a la naturaleza estructural de los agentes utilizados en el presente procedimiento de identificación. Una clase de agentes de la presente invención son los agentes de péptidos cuyas secuencias de aminoácidos se seleccionan basándose en la secuencia de aminoácidos de la proteína de PSCA. Pequeños agentes de péptidos pueden servir como inhibidores competitivos del conjunto de proteínas del PSCA.

Los agentes de péptidos se pueden preparar utilizando métodos de síntesis de péptido en fase sólida estándar (o fase de solución), como es conocido en la técnica. Además, el ADN que codifica estos péptidos se puede sintetizar utilizando instrumentación de síntesis de oligonucleótidos disponible en el comercio y producir de forma recombinante utilizando sistemas estándar de producción recombinante. La producción utilizando la síntesis de péptidos en fase sólida se necesita si se han de incluir los aminoácidos que no codificados por genes.

Otra clase de agentes de la presente invención son los anticuerpos inmunorreactivos con posiciones críticas de la proteína de PSCA. Como se describió anteriormente, los anticuerpos se obtienen por inmunización de mamíferos con péptidos, que contienen como zonas antigénicas, aquellas partes de la proteína de PSCA destinadas a ser dirigidas por los anticuerpos. Las zonas críticas pueden incluir los dominios identificados en las Figuras 4 y 5. Dichos agentes se pueden utilizar en estudios de unión competitiva para identificar agentes inhibidores de la segunda generación.

Los extractos celulares probados en los procedimientos de la presente invención pueden ser, por ejemplo, extractos acuosos de células o tejidos, extractos orgánicos de células o tejidos o fracciones celulares parcialmente purificadas. Un experto en la materia puede reconocer fácilmente que no existen límites a la procedencia del extracto celular utilizado en el procedimiento de identificación de la presente invención.

Se pueden utilizar agentes que se unen a una proteína de PSCA, tal como un anticuerpo de PSCA, para modular la actividad de PSCA, para dirigir los agentes anticancerosos a las células de mamífero apropiadas o para identificar agentes que bloquean la interacción con PSCA. Las células que expresan a PSCA pueden ser dirigidas o identificadas utilizando un agente que se une a PSCA.

Cómo serán utilizados los agentes que se unen a PSCA depende de la naturaleza del agente de unión a PSCA. Por ejemplo, se puede utilizar un agente de unión a PSCA para: administrar toxinas conjugadas, tal como una toxina de difteria, toxina de cólera, ricino o exotoxina de pseudomonas, a una célula que expresa a PSCA; modular la actividad de PSCA; destruir directamente las células que expresan a PSCA; o en tamices para identificar los agentes de unión competitivos. Por ejemplo, un agente inhibidor de PSCA se puede utilizar para inhibir directamente el crecimiento de las células que expresan a PSCA mientras se puede utilizar un agente de unión a PSCA como agente de diagnóstico.

Inmunoterapia del cáncer de próstata

La invención proporciona varios procedimientos inmunoterapéuticos para tratar el cáncer de próstata, incluyendo la terapia con anticuerpos, vacunas in vivo, y propuestas de inmunoterapia ex vivo. En una propuesta, la invención proporciona anticuerpos de PSCA que se pueden utilizar de forma generalizada para tratar el cáncer de próstata. Por ejemplo, se pueden introducir anticuerpos de PSCA no conjugados en un paciente de modo que el anticuerpo se una al PSCA en las células del cáncer de próstata y medie la destrucción de las células, y el tumor, por mecanismos que pueden incluir la citolisis mediada por el complemento, la citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos, alterando la función fisiológica del PSCA y/o la inhibición de unión al ligando o las vías de transducción de señales. Se pueden utilizar también terapéuticamente los anticuerpos de PSCA conjugados con agentes tóxicos tales como el ricino para administrar el agente tóxico directamente a las células del tumor de próstata que llevan PSCA y de este modo destruir el tumor.

La inmunoterapia del cáncer de próstata utilizando anticuerpos de PSCA puede seguir las instrucciones generadas en varias propuestas que han sido empleados con éxito con respecto a otros tipos de cáncer, incluyendo pero sin limitarse el cáncer de colon (Arlen et al., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18:133-138), mieloma múltiple (Ozaki et al., 1997, Blood 90:3179-3186: Tsunenari et al., 1997, Blood 90: 2437-2444), cáncer gástrico (Kasprzyk et al., 1992, Cancer Res. 52: 2771-2776), linfoma de linfocitos B (Funakoshi et al., 1996, J. Immunther. Emphasis Tumor Immunol. 19: 93-101), leucemia (Zhong et al., 1996, Leuk. Res. 20: 581-589), cáncer colorectal (Moun et al.,1994, Cancer Res. 54: 6160-6166); (Velders et al, 1995, Cancer Res. 55: 4398-4403), y cáncer de mama (Shepard et al., 1991, J. Clin. Immunol. 11: 117-127).

La invención proporciona además vacunas formuladas para contener una proteína de PSCA o un fragmento de la misma. La utilización de un antígeno tumoral en una vacuna para generar inmunidad humoral y mediada por células para su utilización en la terapia del cáncer es bien conocida en la técnica y se ha empleado en el cáncer de próstata utilizando PSMA humano e inmunógenos PAP de roedores (Hodge et al., 1995, Int. J. Cancer 63: 231-237, Fong et al., 1997, J. Immunol. 159: 3113-3117). Dichos procedimientos se pueden poner en práctica fácilmente empleando una proteína de PSCA, o un fragmento de la misma o una molécula de ácido nucleico que codifica PSCA y vectores recombinantes capaces de expresar y presentar de forma apropiada el inmunógeno de PSCA.

Los sistemas de administración génica víricos se pueden utilizar, por ejemplo, para administrar una molécula de ácido nucleico que codifica PSCA. Varios sistemas de administración génica vírica que se pueden utilizar en la práctica de este aspecto de la invención incluyen, pero no se limitan a, vacunas, viruela aviar, viruela de canarios, adenovirus, virus de la gripe, poliovirus, virus adenoasociados, lentivirus y virus sindbus (Restifo, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8: 658-663). Se pueden emplear también sistemas de administración no víricos utilizando ADN desnudo que codifica una proteína de PSCA o un fragmento de la misma introducido en el paciente (p. ej., por vía intramuscular) para producir una respuesta antitumoral. En una forma de realización, se puede emplear ADNc de PSCA humano completo. En otra forma de realización, se pueden emplear moléculas de ácido nucleico de PSCA que codifican los epítopos específicos del linfocito T citotóxico (CTL). Se puede determinar los epítopos de CTL utilizando algoritmos específicos (p. ej. Epimer, Universidad Brown) para identificar péptidos en una proteína de PSCA que son capaces de unirse óptimamente a alelos de HLA especificados.

Se pueden emplear también varias estrategias ex vivo. Un planteamiento implica la utilización de células dendríticas para presentar el antígeno de PSCA al sistema inmunitario del paciente. Las células dendríticas expresan un coestimulador B7 de MHC de clase I y II e IL-12, y por lo tanto son células muy especializadas que presentan al antígeno. En el cáncer de próstata, las células dendríticas autólogas pulsadas con péptido del antígeno de la membrana específico de la próstata (PSMA) se están utilizando en una prueba clínica en fase I para estimular los sistemas inmunitarios de los pacientes de cáncer de próstata (Tjoa et al., 1996, Prostate 28: 65-69; Murphy et al., 1996, Prostate 29: 371-380). Las células dendríticas se pueden utilizar para presentar los péptidos de PSCA a los linfocitos T en el contexto de las moléculas MHC de clase I y II. En una forma de realización, las células dendríticas autólogas se pulsan con péptidos de PSCA capaces de unirse a moléculas de MHC. En otra forma de realización, las células dendríticas se pulsan con la proteína de PSCA completa. Todavía otra forma de realización implica modificar genéticamente la sobreexpresión del gen de PSCA en las células dendríticas utilizando varios vectores implantadores conocidos en la técnica, como por ejemplo adenovirus (Arthur et al., 1997, Cancer Gene Ther. 4: 17-25), retrovirus (Henderson et al., 1996, Cancer Res. 56: 3763-3770), lentivirus, adenovirus asociado. La transfección de ADN (Ribas et al., 1997, Cancer Res. 57: 2865-2869), y la transfección de ARN derivado del tumor (Ashley et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 1177-1182).

Se pueden emplear también anticuerpos anti-PSCA anti-idiotípicos en una terapia anticancerosa como vacuna para producir una respuesta inmunitaria a las células que expresan una proteína de PSCA. Específicamente, la generación de anticuerpos anti-idiotípicos es bien conocida en la técnica y se puede adaptar fácilmente para generar anticuerpos anti-PSCA anti-idiotípicos que simulen un epítopo en una proteína de PSCA (véase, por ejemplo, Wagner et al., 1997, Hybridoma 16: 33-40; Foon et al., 1995, J. Clin. Invest. 96: 334-342; Herlyn et al., 1996, Cancer Immunol. Immunother. 43: 65-76). Dicho anticuerpo anti-idiotípico se puede utilizar en una terapia anti-idiotípica, como se pone en práctica actualmente, con otros anticuerpos anti-idiotípicos dirigidos contra antígenos tumorales.

Se pueden emplear procedimientos de inmunización genética para generar respuestas inmunitarias profilácticas o humorales y celulares terapéuticas dirigidas contra células de cáncer que expresan a PSCA. Utilizando las moléculas de ADN que codifican PSCA descritas en la presente memoria, las construcciones que comprenden el ADN que codifica una proteína/inmunógeno de PSCA y las secuencias reguladoras apropiadas se pueden inyectar directamente en el músculo o en la piel de un paciente, de modo que las células del músculo o de la piel absorban la construcción y expresen la proteína/inmunógeno del PSCA codificado. La proteína/inmunógeno del PSCA se puede expresar como proteína de la superficie celular o se puede segregar. La expresión de la proteína/inmunógeno de PSCA produce la generación de inmunidad profiláctica o humoral terapéutica y celular contra el cáncer de próstata. Se pueden utilizar varias técnicas profilácticas y de inmunización genética terapéutica conocidas en la técnica (para estudios, véase la información y referencias publicadas en las direcciones de internet www.genweb.com).

Procedimientos para identificar proteínas de PSCA y genes de PSCA y ARN

La invención proporciona procedimientos para identificar células, tejidos u organismos que expresen una proteína de PSCA o un gen de PSCA. Dichos procedimientos se pueden utilizar para diagnosticar la presencia de células o un organismo que exprese una proteína de PSCA in vivo o in vitro. Los procedimientos de la presente invención son particularmente útiles para determinar la presencia de células que medien los estados patológicos de la próstata. Específicamente, se puede identificar la presencia de una proteína de PSCA determinando si está expresada una proteína de PSCA o un ácido nucleico que codifica una proteína de PSCA. La expresión de una proteína de PSCA se puede utilizar como medio para diagnosticar la presencia de células, tejidos o de un organismo que exprese una proteína o un gen de PSCA.

Se puede utilizar una variedad de técnicas inmunológicas y genéticas moleculares para determinar si una proteína de PSCA se expresa/produce en una determinada célula o muestra. En general, se prepara un extracto que contiene moléculas de ácido nucleico o un extracto que contiene proteínas. Se analiza a continuación el extracto para determinar si se produce en la célula una proteína de PSCA o una molécula de ácido nucleico que codifica PSCA.

Se pueden emplear varios procedimientos de detección basados en polinucleótidos bien conocidos en la técnica para la detección de moléculas de ácido nucleico que codifican PSCA y para la detección de células que expresan a PSCA en una muestra biológica. Se pueden utilizar, por ejemplo, procedimientos de RT-PCR para ampliar selectivamente un ARNm de PSCA o un fragmento del mismo y se pueden utilizar dichos procedimientos para identificar células que expresen a PSCA, tal como se describe en el Ejemplo 1 más adelante. En una determinada forma de realización, se utiliza RT-PCR para detectar células cancerosas de próstata micrometastásicas o células cancerosas de próstata circulantes. Se pueden también utilizar otros varios procedimientos de detección del tipo de amplificación, tales como, por ejemplo, procedimientos de ADN ramificado y varios análisis de hibridación bien conocidos que utilizan sondas de ADN o de ARN, para la detección de polinucleótidos que codifican PSCA o de células que expresan PSCA.

Varios procedimientos para la detección de proteínas son bien conocidos en la técnica y se pueden emplear para la detección de proteína de PSCA y de células que expresan a PSCA. Para realizar una prueba de diagnóstico basada en proteínas, se obtiene una muestra de proteína adecuada y se prepara utilizando técnicas convencionales. Se pueden preparar muestras de proteína, por ejemplo, simplemente hirviendo una muestra con SDS. La proteína extraída se puede analizar a continuación para determinar la presencia de una proteína de PSCA utilizando procedimientos conocidos. Por ejemplo, se puede identificar la presencia de variantes con dimensiones específicas o con carga de una proteína utilizando la movilidad en un campo eléctrico. Por otra parte, se pueden utilizar anticuerpos con fines de detección. Un experto en la materia puede adaptar fácilmente procedimientos analíticos de proteínas conocidos para determinar si una muestra contiene una proteína de PSCA.

Por otra parte, la expresión de PSCA se puede también utilizar en procedimientos para identificar agentes que disminuyan el nivel de expresión del gen de PSCA. Por ejemplo, se pueden poner en contacto células o tejidos que expresen una proteína de PSCA con un agente de la prueba para determinar los efectos del agente sobre la expresión de PSCA. Se pueden utilizar agentes que activen la expresión de PSCA como agonistas de actividad de PSCA mientras que los agentes que disminuyen la expresión de PSCA se pueden utilizar como agonistas de actividad de PSCA.

Activador de PSCA y otros elementos reguladores de expresión

La invención proporciona además las secuencias de control de expresión halladas 5' del gen de PSCA recién identificado de forma que se pueden utilizar para generar vectores de expresión y animales transgénicos. Específicamente, los elementos de control de expresión de PSCA, tal como el activador de PSCA que se puede identificar fácilmente como 5' a partir del codón de inicio de ATG en el gen de PSCA, se puede utilizar para dirigir la expresión de una proteína unida de forma operativa que codifica la secuencia de ADN. Como la expresión de PSCA está confinada en las células de la próstata, los elementos de control de expresión son particularmente útiles para dirigir la expresión de un transgén introducido en un tejido de manera específica. Un experto en la materia puede utilizar fácilmente el activador del gen de PSCA y otros elementos reguladores en los vectores de expresión utilizando procedimientos conocidos en la técnica.

Generación de animales transgénicos

Otro aspecto de la invención proporciona mamíferos transgénicos no humanos que comprenden ácidos nucleicos de PSCA. Por ejemplo, en una aplicación, se pueden generar animales carentes de PSCA no humanos utilizando procedimientos estándar obsoletos para inactivar un homólogos de PSCA o, si dichos animales son no viables, se pueden utilizar moléculas de cadena complementaria homólogas de PSCA inducible para regular la actividad/expresión del homólogo de PSCA. Por otra parte, se puede alterar un animal de modo que contenga una molécula de ácido nucleico que codifica un PSCA humano o una unidad de expresión de PSCA de cadena complementaria que dirija la expresión de la proteína de PSCA o la molécula de cadena complementaria en un tejido de manera específica. En tales utilizaciones, se genera un mamífero no humano, por ejemplo un ratón o una rata, en el que se altera la expresión del gen homólogo de PSCA por inactivación o activación y/o se sustituye por un gen de PSCA humano. Esto se puede realizar utilizando una variedad de procedimientos conocidos en la técnica, como por ejemplo la recombinación dirigida. Una vez generado, el animal deficiente homólogo de PSCA, el animal que expresa PSCA (humano o homólogo) en un tejido de manera específica o un animal que expresa una molécula de cadena complementaria se puede utilizar (1) identificar los procesos biológicos y patológicos mediados por la proteína de PSCA, (2) identificar proteínas y otros genes que interactúen con las proteínas de PSCA, (3) identificar agentes que se puedan suministrar de forma exógena para superar una deficiencia de la proteína de PSCA y (4) servir como pantalla apropiada para identificar mutaciones en el gen de PSCA que aumenten o disminuyan la actividad.

Por ejemplo, es posible generar ratones transgénicos que expresen el PSCA que codifica el minigén humano en un tejido de manera específica y probar el efecto de sobreexpresión de la proteína en tejidos y células que normalmente no contienen la proteína de PSCA. Esta estrategia se ha utilizado con éxito para otros genes, a saber bc1-2 (Veis et al., Cell 1993 75:229). Dicho planteamiento se puede aplicar fácilmente a la proteína/gen de PSCA y se puede utilizar para dirigir la emisión de un efecto benéfico o perjudicial potencial de las proteínas de PSCA en un tejido específico.

Composiciones

La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico de PSCA de la invención o un vector de expresión que codifica una proteína de PSCA o que codifica un fragmento de la misma y, opcionalmente, un vehículo adecuado. La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo que reconoce y se une a una proteína de PSCA. En una forma de realización, el anticuerpo o su fragmento se conjuga o se une a un fármaco terapéutico o a un agente citotóxico.

Los excipientes adecuados para composiciones farmacéuticas incluyen cualquier material que cuando se combina con el ácido nucleico u otra molécula de la invención conserva la actividad de la molécula y no es reactivo con los sistemas inmunitarios del paciente. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a cualquier vehículo farmacéutico habitual como por ejemplo una solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones tales como la emulsión de aceite en agua y varios tipos de agentes humectantes. Otros vehículos pueden incluir asimismo soluciones esterilizadas, comprimidos, incluyendo comprimidos recubiertos y cápsulas. Típicamente dichos vehículos contienen excipientes tales como almidón, leche, azúcar, determinados tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico o sus sales, estearato de magnesio o de calcio, talco, grasas vegetales o aceites, gomas, glicoles u otros excipientes conocidos. Dichos vehículos pueden incluir además esencias y aditivos para el color u otros ingredientes. Las composiciones que comprenden dichos vehículos se formulan por los procedimientos convencionales bien conocidos. Dichas composiciones se pueden formular también en varias composiciones de lípidos, tales como, por ejemplo, liposomas, así como en varias composiciones poliméricas, tales como microesferas de polímero.

La invención proporciona también una composición para el diagnóstico que comprende una molécula de ácido nucleico de PSCA, una sonda que se hibrida de forma específica a una molécula de ácido nucleico de la invención o cualquier parte de la misma, o un anticuerpo de PSCA o un fragmento del mismo. La molécula de ácido nucleico, la sonda o el anticuerpo, o un fragmento de los mismos se puede marcar con un marcador detectable. Ejemplos de marcador detectable incluyen, pero no se limitan a, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante metálico o un enzima. Además, la invención proporciona una composición para diagnóstico que comprende un par cebador específico de PSCA capaz de amplificar secuencias que codifican PSCA utilizando metodologías de reacción en cadena de polimerasa tal como RT-PCR.

Ejemplos Ejemplo 1 Identificación y caracterización molecular de un nuevo antígeno de la superficie celular específico de la próstata (PSCA) Materiales y procedimientos

Xenotrasplantes LAPC-4: Se generaron xenotrasplantes LAPC-4, tal como se describe en Klein et al., 1997, Nature Med. 3: 402-408

RDA, análisis de Northern y RT-PCR: El análisis representativo de diferencia de los tumores LAPC-4 dependientes e independientes del andrógeno se realizó como se describió anteriormente (Braun et al., 1995, Mol. Cell. Biol. 15: 4623-4630). Se aisló ARN total utilizando sistemas de aislamiento de ARN Ultraspec^{R} (Biotex, Houston, TX), según cxlas instrucciones del fabricante. Se probaron filtros de Northern con un fragmento de ADN de 660 bp correspondiente a la secuencia de codificación y una parte de la secuencia 3' sin traducir de PSCA o un fragmento de \sim400 bp de PSCA. Se adquirió transferencia de tejido múltiple humano en Clontech y se probó tal como se especifica. Para el análisis (RT)-PCR de transcriptasa inversa, se sintetizó en primer lugar ADNc de cadena a partir de ARN total utilizando el kit del núcleo de PCR de ARN de GeneAmp (Perkin Elmer-Roche, Nueva Jersey). Para RT-PCR de las transcripciones de PSCA humano, se utilizaron cebadores 5'-tgcttgccctgttgatggcag- y 3'-ccagagcagcaggccgagtgca- para amplificar un fragmento de \sim320 bp. La ciclación térmica se realizó en ciclos 25-25 de 95º durante 30 seg., 60º durante 30 seg. y 72º durante 1 min, seguido de extensión a 72º durante 10 min. Se utilizaron cebadores de GAPDH (Clontech) como referencias. Para PSCA de ratón, los cebadores utilizados fueron 5'-ttctcctgctggccacctac- y 3'-gcagctcatcccttcacaat-.

Ensayo de hibridación in situ para ARNm de PSCA: Para la hibridación in situ de ARNm, se linealizó plásmido pCR II recombinante (1 \mug, Invitrogen, San Diego, CA), conteniendo el PSCA completo para generar ribosondas marcadas con digoxigenina de las cadenas transcrita y complementaria. La hibridación in situ se realizó en un instrumento automático (Ventana Gen II, Ventana Medical Systems) como se describió anteriormente (Magi-Galluzzi et al., 1997, Lab. Invest. 76: 37-43). Se obtuvieron muestras de próstata de una base de datos descrita anteriormente que se habían extendido a \sim130 muestras (Magi-Galluzzi et al., supra). Las secciones fueron leidas y puntuadas por dos patólogos a ciegas. Las puntuaciones de 0 a 3 se asignaron según el porcentaje de células positivas (0=0%; 1=<25%; 2=25-50%; 3=>50%) y la intensidad de la coloración (0=0; 1=1+; 2=2+; 3=3+). Las dos puntuaciones se multiplicaron para dar una puntuación global de 0 a 9.

Resultados

ADNc de PSCA humano: Se utilizó análisis representativo de diferencias (RDA), técnica de hibridación sustractiva basada en PCR, para comparar la expresión del gen entre variantes dependientes de la hormona e independientes de la hormona de un xenotrasplante de cáncer de próstata humano (LAPC-4) y para aislar los ADNc regulados por incremento en la sublinea LAPC-4 independiente del andrógeno. Se clonaron genes múltiples, se secuenciaron y se comprobó la expresión diferencial. Se identificó un fragmento de 660 bp (clon nº 15) que se observó que estaba muy sobreexpresado en los tumores del xenotrasplante cuando se comparó con la próstata normal. La comparación de la expresión de este clon con la del PSCA en la próstata normal y los tumores del xenotrasplante sugirieron que el clon nº15 era relativamente específico del cáncer (Fig. 9).

Los análisis de la secuencia pusieron de manifiesto que el clon nº 15 no tenía un par exacto en la base de datos, pero compartía 30% de homología de nucleótico con el antígeno 2 de la célula madre, un miembro de la superfamilia Thy-1/Ly-6 de los antígenos de la superficie celular anclados con glucosilfosfatidilinositol (GPI). El clon nº15 codifica una proteína de 123 aminoácidos que es idéntica en el 30% a PSCA-2, (también denominada RIG-E) y contiene numerosos restos de cisteína muy conservados característicos de la familia del gen Ly-6/Thy-1 (Fig. 3). Coherente con su homología con una familia de proteínas ancladas por GPI, el clon nº15 contiene tanto una secuencia con señal hidrófoba aminoterminal y un tramo carboxi-terminal de aminoácidos hidrófobos precedido por un grupo de pequeños aminoácidos que definen una zona de escisión/unión para el enlace de GPI (Udenfriend y Kodukula, 1995, Ann. Rev. Biochem. 64: 563-591). También contiene cuatro puntos de N-glucosilación previstos. Debido a su acusada homología con el antígeno-2 de la célula madre, el clon nº15 se redenominó antígeno de la célula madre de la próstata (PSCA). Se realizó a continuación el análisis RACE por PCR 5' y 3' utilizando ADNc obtenido del xenotrasplante independiente del antígeno LAPC-4 y se obtuvo la secuencia de nucleótidos de ADNc completo (incluyendo la codificación y las zonas no traducidas). La secuencia del nucleótido del PSCA humano que codifica a ADNc completo se presenta en la Fig. 1A y la secuencia de aminoácidos traducida se presenta en la Fig. 1B y en la Fig. 3.

La expresión de PSCA es específica de la próstata: Se examinó la distribución del ARNm del PSCA en los tejidos humanos normales por análisis de transferencia de Northern. Los resultados, mostrados en la Fig. 9B, demuestran que PSCA se expresa de forma predominante en la próstata, con un nivel inferior de expresión presente en la placenta. Pequeñas cantidades de ARNm se pueden detectar en el riñón y en el intestino delgado después de exposición prolongada y aproximadamente a 1/100º del nivel observado en el tejido de la próstata. El análisis de la reacción en cadena de polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) de la expresión de PSCA en tejidos normales humanos demuestran también que la expresión de PSCA está limitada. En un panel de tejidos normales, se detectó alto nivel de expresión de ARNm de PSCA en la próstata, con expresión significativa detectada en la placenta y en las amígdalas (Fig. 7A). El análisis por RT-PCR de la expresión de ARNm de PSCA en una variedad de líneas celulares de cáncer de próstata en xenotrasplantes de cáncer de próstata y otras líneas celulares y la próstata normal mostraron alto nivel de expresión limitada a la próstata normal, xenotrasplantes de cáncer de próstata LAPC-4 y LAPC-9 y la línea celular A431 de cáncer de ovarios (Fig. 7B).

La principal transcripción de PSCA en la próstata normal es \sim1kb (Fig. 9B). Se analizó la expresión de PSCA de ratón por RT-PCR en el bazo, hígado, pulmón, próstata, riñón y testículos del ratón. Como el PSCA humano, el PSCA murino se expresa de forma predominante en la próstata. La expresión se puede detectar también en el riñón en un nivel similar al observado para la placenta en los tejidos humanos. Estos datos indican que la expresión de PSCA es muy específica de la próstata.

La expresión de PSCA, PSMA y PSA en las líneas celulares del cáncer de próstata y en xenotrasplantes se comparó mediante análisis de transferencia de Northern. Los resultados mostrados en la Fig. 10 demuestran alto nivel de expresión específica del cáncer de próstata tanto de PSCA como de PSMA, mientras que la expresión de PSCA no es específica del cáncer de próstata.

PSCA se expresa mediante un subconjunto de células basales en la próstata normal: La próstata normal contiene dos poblaciones de células epiteliales principales, las células luminales secretoras y las células basales subyacentes. Se realizaron hibridaciones in situ en secciones múltiples de próstata normal utilizando una ribosonda de cadena complementaria específica para PSCA para localizar su expresión. Como se muestra en la Fig. 11, PSCA se expresa exclusivamente en un subconjunto de células basales normales. Se observa poca a ninguna coloración en el estroma, en las células secretoras o en los linfocitos infiltrantes. La hibridación con ribosondas de PSCA de cadena transcrita demostró la no coloración del fondo. La hibridación con una sonda de cadena complementaria para GAPDH confirmó que el ARN en todos los tipos de células estaba intacto. Debido a que las células basales representan las células supuestas del progenitor para las células secretoras diferenciadas terminalmente, estos resultados sugieren que PSCA puede ser un marcador de la célula madre/progenitora específico de la próstata (Bonkhoff et al., 1994, Prostate 24: 114-118). Además, como las células basales son independientes del andrógeno, la asociación de PSCA con las células basales aumenta la posibilidad de que PSCA pueda jugar un papel en la evolución del cáncer de próstata independiente del andrógeno.

PSCA se sobreexpresa en las células de cáncer de próstata: El análisis inicial comparando la expresión de PSCA en la próstata normal y los tumores del xenotrasplante LAPC-4 sugirieron que PSCA se sobreexpresaba en el cáncer de próstata. Como se demuestra por los análisis de transferencia de Northern mostrados en la Fig. 9, los tumores de cáncer de próstata LAPC-4 expresan de forma marcada a PSCA; sin embargo, no existe casi expresión detectable en la próstata normal. En cambio, la expresión de PSCA se detecta claramente en la próstata normal, a niveles 2 a 3 veces los observados en los tumores LAPC-4. Por lo tanto, la expresión de PSCA en el cáncer de próstata parece ser la inversa de la que se observa con PSCA. Aunque PSCA se expresa de forma más marcada en el tejido normal que en de próstata maligna, PSCA se expresa mucho más en el cáncer de próstata.

Para confirmar la especificidad para la próstata de la expresión de PSCA, se analizó por hibridación de ARNm in situ la expresión de PSCA en muestras de cáncer de próstata embebidas en parafina. Las muestras se obtuvieron de tumores primarios extraídos por prostatectomía radical o transuretraectomía en todos los casos excepto uno. Se sondaron todas las muestras tanto con una construcción de cadena transcrita como de cadena complementaria con el fin de comprobar la coloración del fondo. Se asignaron a las secciones una puntuación compuesta tal como se describe en Materiales y Procedimientos, indicando una puntuación de 6 a 9 expresión marcada y una puntuación de 4 significa expresión moderada. 102/126 (81%) de los cánceres fueron coloreados intensamente por PSCA, mientras otros 9/126 (7%) presentaban coloración moderada (Fig. 11B y 11C). La neoplasia intraepitelial prostática en alto grado, la supuesta lesión del precursor del cáncer de próstata invasivo, se coloreó muy positivo por PSCA en el 82% (97/118) de las muestras (Fig. 3b) (Yang et al., 1997, Am. J. Path.150: 693-703). Las glándulas normales colorearon consecuentemente más débil que las glándulas malignas (Fig. 11B). Se obtuvieron nueve muestras de pacientes tratados antes de la cirugía con terapia de ablación de la hormona. Siete de nueve (78%) de los cánceres independientes del andrógeno supuestamente residuales sobreexpresaron PSCA, un porcentaje similar al observado en los cánceres no tratados. Debido a dicho gran porcentaje de muestras que expresaron ARNm de PSCA, ninguna correlación estadística se podría realizar entre la expresión de PSCA y las características patológicas, tal como una etapa y el grado del tumor. Estos resultados sugieren que la sobreexpresión de ARNm de PSCA es una característica común del cáncer de próstata dependiente e independiente del andrógeno.

PSCA se expresa en las líneas celulares del cáncer de próstata negativas del receptor del andrógeno: Aunque el PSCA se clonó inicialmente utilizando hibridación sustractiva, el análisis de transferencia de Northern, demostró una marcada expresión de PSCA tanto en los tumores de xenotrasplante de LAPC-4 dependientes del andrógeno como independientes del andrógeno (Fig. 9). Además, la expresión de PSCA se detectó en todos los xenotrasplantes de cáncer de próstata y las líneas celulares probadas, incluyendo la línea celular LAPC-4 y el xenotrasplante, el xenotrasplante de LAPC-9 y la línea celular LnCaP (todas dependientes del andrógeno) así como en la sublinea de xenotrasplante AI LAPC-4, el xenotrasplante LAPC-3, las líneas celulares PC-3 y DU-145, la sublinea AI LnCaP y la línea celular MatLyLu (todas independientes del andrógeno).

Se detectó también la expresión del PSCA en las líneas celulares PC3 y DU145 del cáncer de próstata negativo para el receptor andrógeno, independiente del andrógeno mediante el análisis de reacción en cadena de polimerasa con transcriptasa inversa. Estos datos sugieren que se puede expresar PSCA en ausencia del receptor del andrógeno funcional.

Ejemplo 2 Caracterización bioquímica de PSCA Materiales y procedimientos

Anticuerpos policlonales e inmunoprecipitaciones: Se generó antisuero policlonal de conejo frente al péptido sintético -TARIRAVGLLTVISK- y se purificó por afinidad usando una proteína de fusión PSCA-glutatión S transferasa. Las células 293T se transfectaron de forma transitoria con pCADN II (Invitrogen, San Diego, CA) vectores de expresión que contienen PSCA, CD59, E25 o vector solo por precipitación con fosfato de calcio. La inmunoprecipitación se realizó como se describió anteriormente (Harlow y Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Press)). En resumen, las células se marcaron con 500 uCi de marcador trans35S (ICN, Irvine, CA) durante seis horas. Los lisados celulares y el medio acondicionado se incubaron con 1 \mug de anticuerpo anti-PSCA de conejo purificado y 20 \mul de proteína A sefarosa CL-4B (Pharmacia Biotech, Suecia) durante dos horas. Para la desglucosilación, se trataron los inmunoprecipitados toda la noche a 37º con 1\mu de N-glucosidasa F (Boehringer Mannheim) o 0,1 u de neuraminidasa (Sigma, St. Louis, MO) durante 1 hora seguido por toda la noche en 2,5 mU de O-glucosidasa (Boehringer Mannheim).

Citometría de flujo: Para los análisis de citometría de flujo de la expresión de la superficie celular de PSCA, se colorearon las suspensiones celulares individuales con 2 \mug/ml de anticuerpo anti-PSCA purificado y una dilución 1:500 de IgG anti-conejo marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Jackson Laboratories, West Grove, PA). Los datos se adquirieron en una FACScan (Becton Dickinson) y se analizaron utilizando un programa informático LYSIS II. Las muestras de referencia se colorearon con anticuerpo secundario solo. Se analizó el enlace glucosililfosfatidil inositol por digestión de 2 x 10^{6} células con 0,5 unidades de fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol (PI-PLC, Boehringer Mannheim) durante 90 min a 37ºC. Las células se analizaron antes y después de la digestión por ecografía FACS o inmunotransferencia.

Resultados

PSCA es una glucoproteína anclada a GPI expresada en la superficie celular: La secuencia de aminoácidos de PSCA deducida predice que PSCA está muy glucosilado y anclado a la superficie celular a través de un mecanismo GPI. Para probar estas predicciones se produjo un anticuerpo policlonado purificado por afinidad obtenido contra un único péptido de PSCA (véase Materiales y Procedimientos). Este péptido no contiene puntos de glucosilación y se predijo, basándose en la comparación con las tres estructuras dimensionales de CD59 (otro homólogo de PSCA anclado a GPI), para permanecer en una parte expuesta de la proteína madura (Kiefer et al., 1994, Biochem. 33: 4471-4482). El reconocimiento de PSCA por el anticuerpo purificado por afinidad se demostró por análisis de inmunotransferencia e inmunoprecipitación de los extractos de las células 293T transfectadas con PSCA y una proteína de fusión de GST-PSCA. El anticuerpo policlonal inmunoprecipita predominantemente una banda de 24 kd de PSCA transfectado, pero no células transfectadas bien simuladas (Fig. 12A). Tres bandas más pequeñas están también presentes, siendo la más pequeña de \sim10 kd. Se trató el inmunoprecipitado con glucosidasas específicas de N y O para determinar si estas bandas representaban formas glucosiladas de PSCA. N-glucosidasa F desglucosiló PSCA, mientras que O-glucosidasa no tuvo efecto (Fig. 12A). Algunas proteínas ancladas a GPI se conocen porque tienen tanto formas unidas a la membrana como segregadas (Fritz y Lowe, 1996, Am. J. Physiol. 270: G176-G183). La Fig. 12B indica que algo de PSCA se segrega en el sistema que sobreexpresa a 293T. La forma segregada de PSCA migra a un peso molecular inferior al de la forma asociada a la superficie celular, reflejando quizás la ausencia del enlace covalente con GPI. Este resultado puede reflejar el alto nivel de expresión en la línea celular 293T y necesita ser confirmado en las líneas celulares de cáncer de próstata e in vivo.

Se utilizó el análisis para selección de células activadas fluorescentes (FACS) para localizar la expresión de PSCA en la superficie celular. Células 293T transfectadas simuladas no permeabilizadas, células 293T que expresan a PSCA y células LAPC-4 se colorearon con anticuerpo purificado por afinidad o anticuerpo secundario solo. La Fig. 12C muestra la expresión de la superficie celular de PSCA en células 293T transfectadas por PSCA y LAPC-4, pero no en las células transfectadas simuladas. Para confirmar que esta expresión de la superficie celular está mediada por un enlace covalente con GPI, se trataron las células con fosfolipasa C específica para GPI (PLC). La liberación de PSCA de la superficie celular por PLC se indicó por una reducción log mayor de uno en intensidad de fluorescencia. La recuperación de PSCA en el medio acondicionado después de la digestión se confirmó también por inmunotransferencia. La especificidad de la digestión de fosfolipasa C para las proteínas ancladas a GPI se confirmó realizando el mismo experimento en las células 293T transfectadas con el antígeno CD59 unido a GPI o la proteína E25a de transmembrana no unida a GPI (Deleersnijder et al., 1996, J. Biol. Chem 271: 19475-19482). La digestión de PLC redujo la expresión de la superficie celular de CD59 en el mismo grado que PSCA pero no tuvo ningún efecto sobre E25. Estos resultados apoyan la predicción de que PSCA es una proteína de la superficie celular anclada a GPI, glucosilada.

Ejemplo 3 Aislamiento del homólogo de PSCA murino que codifica a ADNc

Se utilizó ADNc de PSCA humano para buscar la base de datos de EST murino con el fin de identificar homólogos para experimentos transgénicos y eliminatorios o parciales. Un EST obtenido a partir de ratón fetal y otro a partir de riñón neonatal fueron 70% idénticos al ADNc humano tanto en el nivel del nucleótido como de los aminoácidos. La homología entre los clones de ratón y el PSCA humano incluía zonas de divergencia entre el PSCA y sus homólogos anclados a GPI, indicando que estos clones probablemente representaban al homólogo de ratón de PSCA. La alineación de estos EST y la extensión 5' utilizando RACE-PCR proporció la secuencia de codificación completa (Fig. 2).

Ejemplo 4 Aislamiento de genes de PSCA humanos y murinos Materiales y procedimientos

Clonación genómica: Se obtuvieron clones del fago lambda que contienen el gen de PSCA humano cribando una biblioteca genómica humana (Stratagene) con una sonda de ADNs de PSCA humano (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor)). Los clones de BAC (cromosoma artificial bacteriano) que contienen el gen de PSCA murino se obtuvieron cribando una biblioteca de BAC murino (Genome Systems, St. Louis, MO) con una sonda de ADNc de PSCA murino. Se subclonaron un fragmento Not I humano de 14 kd y un fragmento Eco RI murino de 10 kb en pBluescript (Stratagene), se secuenciaron y se realizó la cartografía de restricción.

Cromatografía del cromosoma por hibridación de fluorescencia in situ : El análisis cromosómico de fluorescencia in situ (FISH) se realizó como se describió anteriormente utilizando clones de fago lambda humano solapantes (Rowley et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9358-9362).

Resultados

Estructura del gen de PSCA: Se obtuvieron los clones genómicos humanos y murinos de aproximadamente 14 kb y 10 kb respectivamente y se realizó la cartografía de restricción. Una representación esquemática de las estructuras del gen de PSCA y Ly-6/Thy-1 humanos y murinos se muestra en la Fig. 8. Tanto los clones genómicos humanos como murinos contienen tres exones que codifican las zonas traducidas y no traducidas 3' del gen de PSCA. Se supone que existe un cuarto exón que codifica una zona 5' no traducida basándose en la homología de PSCA con otros miembros de las familias de los genes Ly-6 y Thy-1 (Fig. 8).

Mapas génicos de PSCA humano para el cromosoma 8q24.2: El análisis de transferencia Southern del ADN genómico de LAPC-4 puso de manifiesto que PSCA está codificado por una sola copia del gen. Otros miembros de la familia del gen Ly-6 contienen cuatro exones, incluyendo un primer exón que codifica una zona 5' no traducida y tres exones adicionales que codifican las zonas traducidas y no traducidas 3'. Se obtuvieron clones genómicos del PSCA humano o murino que contienen todos menos el supuesto primer exón 5' cribando bibliotecas del fago lambda. Los clones de PSCA de ratón y humano tenían una organización genómica similar. Se utilizó clon humano para localizar PSCA por análisis de hibridación por fluorescencia in situ. La hibridación conjunta de los clones del fago lambda con PSCA humano solapante produjo el marcado específico únicamente del cromosoma 8 (Fig. 13). Noventa y siete por ciento de las señales detectadas se localizaron en el cromosoma 8q24, del que el 87% eran específicas del cromosoma 8q24.2. Estos resultados demuestran que PSCA está localizado en el cromosoma 8, banda q24.2.

Ejemplo 5 Generación de anticuerpos monoclonales que reconocen diferentes epítopos de PSCA Materiales y procedimientos

Se utilizó inmunógeno de proteína de fusión GST-PSCA para producir anticuerpos en ratones utilizando metodología estándar de generación de anticuerpos monoclonales. En resumen, la secuencia de codificación de PSCA correspondiente a los aminoácidos 18 a 98 de la secuencia de aminoácidos de PSCA humano mostrada en la Fig. 1B se amplificó por PCR utilizando el par cebador:

5'-GGGAGAATTCATGGCACTGCCCTGCTGTGCTAC

3'-GGAGAATTCCTAATGGGCCCCGCTGGCGTT

La secuencia de PSCA amplificada se clonó en pGEX-2T (Pharmacia), se utilizó para transformar E. coli y se aisló la proteína de fusión.

Se realizó el análisis citométrico de flujo de la expresión de PSCA de la superficie celular en las células del xenotrasplante de cáncer de próstata de ratón LAPC-9, la línea celular LAPC-4 de cáncer de próstata o las células epiteliales de próstata normales (Clonetics) utilizando Mab 3E6 y 1G8 y el suero policlonal de ratón descrito en el Ejemplo 2. Se analizaron 25.000 células por muestra después de la coloración con una dilución 1 a 10 de Mab 1G8, 3E6 o suero policlonal de ratón, seguido de una dilución 1 a 100 de un anticuerpo secundario anti-ratón de cabra marcado con FITC. Se determinó la fluorescencia de fondo (referencia) por incubación de las muestras solamente con el anticuerpo secundario.

Se realizó la cartografía del epítopo de los anticuerpos monoclonales anti-PSCA por análisis de transferencia de Western de las proteínas de fusión GST-PSCA. En resumen, se separaron 1 \mug de proteína de fusión de GST-PSCA (aminoácidos 18 a 98) o una proteína de la zona aminoácido terminal de GST-PSCA (aminoácidos N-terminales 2 a 50), una proteína de la zona media de GST-PSCA (aminoácidos de medio de GST 46 a 109) o una proteína de la zona carboxil terminal de GST (aminoácidos 85 a 123 C-terminal de GST) en un gel al 12% de SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa. Se sondó la membrana con una dilución 1 a 250 de cultivo sobrenadante del tejido concentrado de hibridomas de anticuerpo monoclonal 1G8 o 3E6 y a continuación con un anticuerpo secundario marcado por peroxidasa y se visualizó por aumento de quimioluminiscencia.

Resultados

Se seleccionaron cuatro clones de hibridoma y se evaluaron los sobrenadantes del cultivo de tejido por ELISA, FACS, transferencia Western e inmunoprecipitación. Estos análisis indicaron que dos de los clones producen Mab, se denominaron 3E6 y 1G8, que reconocen consecuentemente a PSCA. En la Fig. 14 se presentan los análisis de expresión de la superficie celular de la expresión de PSCA en células cancerosas y epiteliales de próstata normal por citometría de flujo utilizando Mab 3E6 y 1G8 y el anticuerpo policlonal descrito en el Ejemplo 2.

Los Mab 3E6 y 1G8 de PSCA eran epítopos cartografiados por análisis de transferencia Western de proteínas de fusión de GST-PSCA. Los resultados se presentan en la Fig. 15 e indican que estos Mab reconocen diferentes epítopos en PSCA. MAb 3E6 reconoce un epítopo en la zona carboxi-terminal de la proteína, mientras que Mab 1G8 reconoce un epítopo amino-terminal (Fig. 15).

Ejemplo 6

Estos datos proporcionan la cartografía del epítopo de los anticuerpos monoclonales anti-PSCA.

Los anticuerpos monoclonales 1G8, 2H5, 3C5 y 4A10 reconocen un epítopo que reside en la zona amino-terminal de la proteína de PSCA y el anticuerpo monoclonal 3E6 reconoce un epítopo en la zona carboxil-terminal de la proteína. Las proteínas de fusión de GST-PSCA que codifican la zona amino-terminal de la proteína PSCA (aminoácidos 2 a 50 N-terminales), la zona media (aminoácidos 46 a 109 medios) o la zona carboxil terminal (aminoácidos C-terminales 85 a 123) se utilizaron en un ELISA para identificar el epítopo reconocido por 5 anticuerpos anti-PSCA monoclonales. 10 ng de la proteína de fusión indicada cubiertos en pocillos de una placa de microvaloración se incubaron con una dilución 1:250 de sobrenadantes de cultivo de tejido concentrado de hibridomas 1G8 ó 3E6 o con diluciones 1:10 de sobrenadantes procedentes de los hibridomas 2H5, 3C5 ó 4A10. La unión de los anticuerpos monoclonales se detectó por incubación con una dilución 1:4.000 de anticuerpo secundario marcado con peroxidasa y se reveló con 3,3',5,5'-tetrametilbencidina base. Se determinaron las densidades ópticas de los pocillos a una longitud de onda de 450 nm. Los datos de los anticuerpos 1G8 y 3E6 representan la media \pm SD de las determinaciones por triplicado y los datos para 2H5, 3C5 y 4A10 son las medias \pm el intervalo de las determinaciones por duplicado. La unión más fuerte de los anticuerpos monoclonales a las diversas proteínas de fusión está indicada en negrita. Los resultados están en la Tabla 1.

TABLA 1

	1G8	3E6	2H5	3C5	4A10
N-terminal	1,262\pm0,202	0,147\pm0,014	0,803\pm0,033	2,230\pm0,064	1,859\pm0,071
Medio	0,588\pm0,066	0,124\pm0,007	0,006\pm0,010	0,002\pm0,001	0,009\pm0,002
C-terminal	0,088\pm0,025	>4,00	0,010\pm0,010	0,066\pm0,060	0,006\pm0,003

Los anticuerpos monoclonales 1G8, 2H5, 3C5 y 4A10 reconocen un epítopo que reside en la zona amino-terminal de la proteína de PSCA y el anticuerpo monoclonal 3E6 reconoce un epítopo en la zona carboxil-terminal de la proteína. Las proteínas de fusión de GST-PSCA que codifican la zona amino-terminal de la proteína PSCA (aminoácidos 2 a 50 N-terminales), la zona media (aminoácidos 46 a 109 medios) o la zona carboxil terminal (aminoácidos C-terminales 85 a 123) se utilizaron en un ELISA para identificar el epítopo reconocido por 5 anticuerpos anti-PSCA monoclonales. 10 ng de la proteína de fusión indicada cubiertos en pocillos de una placa de microvaloración se incubaron con una dilución 1:250 de sobrenadantes de cultivo de tejido concentrado de hibridomas 1G8 ó 3E6 o con diluciones 1:10 de sobrenadantes procedentes de los hibridomas 2H5, 3C5 ó 4A10. La unión de los anticuerpos monoclonales se detectó por incubación con una dilución 1:4.000 de anticuerpo secundario marcado con peroxidasa y se reveló con 3,3',5,5'-tetrametilbencidina base. Se determinaron las densidades ópticas de los pocillos a una longitud de onda de 450 nm. Los datos de los anticuerpos 1G8 y 3E6 representan la media \pm SD de las determinaciones por triplicado y los datos para 2H5, 3C5 y 4A10 son las medias \pm el intervalo de las determinaciones por duplicado. La unión más fuerte de los anticuerpos monoclonales a las diversas proteínas de fusión está indicada en negrita. Los resultados se presentan en la Tabla 2.

TABLA 2

	1G8	3E6	2H5	3C5	4A10
N-terminal	1,262\pm0,202	0,147\pm0,014	0,803\pm0,033	2,230\pm0,064	1,859\pm0,071
Medio	0,588\pm0,066	0,124\pm0,007	0,006\pm0,010	0,002\pm0,001	0,009\pm0,002
C-terminal	0,088\pm0,025	>4,00	0,010\pm0,010	0,066\pm0,060	0,006\pm0,003

La presente invención no está limitada en su alcance por las formas de realización expuestas en la presente memoria, que están destinadas a ilustraciones exclusivas de aspectos individuales de la invención, y cualquiera que sea funcionalmente equivalente estará comprendida dentro del alcance de la invención. Diversas modificaciones respecto a los modelos y procedimientos de la invención, además de las descritas en la presente memoria, resultarán evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripción y enseñanzas anteriores y se pretende igualmente que estén comprendidas dentro del alcance de la invención.

Claims (37)

1. Anticuerpo anti-PSCA o un fragmento inmunológicamente activo del mismo que se une al domino extracelular de una proteína del antígeno de las células madre de la próstata (PSCA), en el que la proteína de PSCA tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1B ó 2 o las variantes alélicas de la misma que tienen las propiedades de PSCA.

2. Anticuerpo anti-PSCA o el fragmento inmunológicamente activo según la reivindicación 1, que se une a un fragmento de péptido del antígeno de las células madre de la próstata que tiene la secuencia de aminoácidos TARI
RAVGLLTVISK.

3. Anticuerpo anti-PSCA o el fragmento inmunológicamente activo según la reivindicación 1, que comprende un antígeno que se une al dominio que está dirigido a un fragmento de péptido del antígeno de las células madre de la próstata que tiene la secuencia de aminoácidos VDDSQDYYVGKK.

4. Anticuerpo anti-PSCA o el fragmento inmunológicamente activo según la reivindicación 1, que se une al antígeno natural de las células madre de la próstata o a variantes alélicas del mismo que tienen las propiedades de PSCA expresadas en la superficie de una célula.

5. Anticuerpo anti-PSCA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es un anticuerpo policlonal.

6. Anticuerpo anti-PSCA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es un anticuerpo monoclonal.

7. Anticuerpo anti-PSCA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es un anticuerpo híbrido.

8. Anticuerpo anti-PSCA o el fragmento inmunológicamente activo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que está marcado con el fin de producir directa o indirectamente una señal detectable con un compuesto seleccionado del grupo que consta de un radiomarcador, un enzima, un cromóforo y un fluorescente.

9. Anticuerpo anti-PSCA o el fragmento inmunológicamente activo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su utilización como producto farmacéutico.

10. Fragmento inmunológicamente activo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, 8 y 9, que se selecciona del grupo constituido por los fragmentos F(ab), F(ab') y F(ab')2.

11. Inmunoconjugado que comprende el anticuerpo anti-PSCA o el fragmento inmunológicamente activo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, unido a un agente terapéutico.

12. Inmunoconjugado según la reivindicación 11, en el que el agente terapéutico es un agente citotóxico.

13. Inmunoconjugado según la reivindicación 12, en el que el agente citotóxico se selecciona de un grupo que consta de ricino, doxorrubicina, daunorrubicina, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxiantracindiona, actinomicina D, toxina de la difteria, exotoxina A de Pseudomonas (PE), PE40, abrina, glucocorticoide y radioisótopos.

14. Inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, que está marcado con el fin de producir directa o indirectamente una señal detectable con un compuesto seleccionado del grupo que consta de un radiomarcador, un enzima, un cromóforo y un fluorescente.

15. Inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13, que inhibe el crecimiento de una célula que expresa el antígeno de las células madre de la próstata (PSCA).

16. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-PSCA o el fragmento inmunológicamente activo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o el inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15 y un vehículo adecuado.

17. Composición farmacéutica según la reivindicación 16, en la que el vehículo es una solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsión de aceite en agua agente humectante, solución esterilizada, excipientes, almidón, leche, azúcar, arcilla, gelatina, ácido esteárico, estearato de magnesio, estearato de calcio, talco, grasa vegetal, aceite vegetal, gomas, glicol, esencia o aditivo colorante.

18. Composición farmacéutica según la reivindicación 16, que está formulada como un comprimido, comprimido recubierto, cápsula, liposoma o una microesfera polimérica.

19. Utilización del anticuerpo anti-PSCA o de un fragmento inmunológicamente activo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o del inmunoconjugado según la reivindicación 14 para detectar la presencia del antígeno de las células madre de la próstata en una muestra.

20. Utilización del anticuerpo anti-PSCA o de un fragmento inmunológicamente activo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o del inmunoconjugado según la reivindicación 14, para preparar una composición adecuada para diagnóstico para detectar la presencia del antígeno de las células madre de la próstata en un paciente.

21. Utilización del anticuerpo del antígeno anti-próstata de las células madre (PSCA) o del fragmento inmunológicamente activo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o el inmunoconjugado según la reivindicación 14, para preparar una composición adecuada para diagnóstico destinada a detectar la presencia de la proteína del antígeno de las células madre de la próstata (PSCA) en una muestra.

22. Utilización del anticuerpo del antígeno anti-próstata de las células madre (PSCA) o del fragmento inmunológicamente activo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o del inmunoconjugado de la reivindicación 14, para preparar una composición adecuada para diagnóstico destinada a detectar una célula o tejido canceroso que exprese la proteína de PSCA en un paciente.

23. Utilización del anticuerpo del antígeno anti-próstata de las células madre (PSCA) o del fragmento inmunológicamente activo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o del inmunoconjugado de la reivindicación 14, para preparar una composición adecuada para diagnóstico destinada a detectar el cáncer de próstata en un paciente.

24. Utilización del anticuerpo del antígeno anti-próstata de las células madre (PSCA) o del fragmento inmunológicamente activo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o del inmunoconjugado de la reivindicación 14, para preparar una composición adecuada para diagnóstico destinada a diagnosticar una célula o tejido canceroso que exprese la proteína de PSCA en un paciente.

25. Utilización del anticuerpo del antígeno anti-próstata de las células madre (PSCA) o de un fragmento inmunológicamente activo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o del inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 12, 13 y 15 para preparar una composición farmacéutica adecuada para destruir de forma selectiva una célula que exprese el antígeno de las células madre de la próstata en un paciente.

26. Utilización del anticuerpo anti-PSCA o del fragmento inmunológicamente activo o del inmunoconjugado según la reivindicación 19, en la que detectar la presencia del antígeno de las células madre de la próstata en una muestra que comprende poner en contacto la muestra con el anticuerpo anti-PSCA o con el fragmento inmunológicamente activo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o con el inmunoconjugado de la reivindicación 14, y detectar la unión del anticuerpo o del fragmento inmunológicamente activo o del inmunoconjugado con la proteína de PSCA en la muestra.

27. Utilización del anticuerpo anti-PSCA o de un fragmento inmunológicamente activo o del inmunoconjugado según la reivindicación 26, en la que la detección comprende (a) poner en contacto la muestra con el anticuerpo anti-PSCA o con el fragmento inmunológicamente activo o con el inmunoconjugado que es capaz de formar un complejo con la proteína del antígeno de las células madre de la próstata (PSCA) en la muestra; y (b) determinar si se forma de este modo algún complejo, siendo el complejo indicador de la presencia de la proteína del antígeno de las células madre de la próstata (PSCA) en la muestra.

28. Utilización del anticuerpo anti-PSCA o de un fragmento inmunológicamente activo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o el inmunoconjugado según la reivindicación 14, para preparar una composición farmacéutica adecuada para el seguimiento del curso del cáncer de próstata en un paciente, en la que el seguimiento del curso del cáncer de próstata en el paciente comprende determinar cualitativamente en una primera muestra del paciente la cantidad de una proteína del antígeno de las células madre de la próstata (PSCA) utilizando el anticuerpo anti-PSCA o el fragmento inmunológicamente activo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o el inmunoconjugado según la reivindicación 14 y comparar la cantidad determinada de este modo con la cantidad de proteína de PSCA presente en una segunda muestra del paciente, en la que la primera y segunda muestras se obtienen del pacientes en diferentes puntos de tiempo, siendo indicativa una diferencia de las cantidades de proteína de PSCA en la primera y segunda muestra del curso del cáncer.

29. Anticuerpo anti-PSCA o el fragmento inmunológicamente activo según la reivindicación 4 ó 9 o el inmunoconjugado según la reivindicación 15, en el que la célula es una célula de la próstata, una célula cancerosa de próstata, una célula de placenta, una célula cancerosa de ovario o una célula de amígdalas.

30. Utilización del anticuerpo anti-próstata del antígeno de las células madre (PSCA) o de un fragmento inmunológicamente activo según la reivindicación 25, en la que la célula que expresa al antígeno de las células madre de la próstata es una célula de la próstata, una célula cancerosa de próstata, una célula de placenta, una célula cancerosa de ovario o una célula de amígdalas.

31. Utilización del anticuerpo anti-próstata del antígeno de las células madre (PSCA) o de un fragmento inmunológicamente activo o del inmunoconjugado según la reivindicación 22 ó 24, en la que la célula o tejido canceroso que expresan el antígeno de las células madre de la próstata es una célula cancerosa de próstata o una célula cancerosa de ovario.

32. Utilización del anticuerpo del antígeno anti-próstata de las células madre (PSCA) o de un fragmento inmunológicamente activo o del inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 19, 21, 26, 27 ó 28, en la que la muestra, la primera muestra o la segunda muestra es un tejido, una célula o un fluido biológico.

33. Utilización del anticuerpo anti-próstata del antígeno de las células madre (PSCA) o de un fragmento inmunológicamente activo o del inmunoconjugado según la reivindicación 32, en la que el tejido procede de próstata, de cáncer de próstata, de placenta, de cáncer de ovario o de amígdalas.

34. Utilización del anticuerpo anti-próstata del antígeno de las células madre (PSCA) o de un fragmento inmunológicamente activo o del inmunoconjugado según la reivindicación 32, en la que el fluido biológico es orina o suero sanguíneo.

35. Utilización de una proteína del antígeno de las células madre de la próstata (PSCA) para preparar una vacuna para la terapia del cáncer de próstata.

36. Anticuerpo anti-PSCA anti-idiotípico que se une al anticuerpo anti-PSCA o a un fragmento inmunológicamente activo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o se une a los inmunoconjugados según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15.

37. Utilización de un anticuerpo anti-PSCA anti-idiotípico según la reivindicación 36, para preparar una vacuna adecuada para la terapia del cáncer de próstata.