ES2339726T3 - Gen expresado en el cancer de protata. - Google Patents
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Abstract
Un polinucleótido aislado que se selecciona del grupo constituido por (a) un polinucleótido que tiene la secuencia que se muestra en la Fig. 1A, en la que T también puede ser U; (b) un polinucleótido que tiene la secuencia que se muestra en la Fig. 1, desde el resto nucleotídico número 236 hasta el resto nucleotídico número 1466, en la que T también puede ser U; (c) un polinucleótido que codifica un polipéptido 22P4F11 cuya secuencia es codificada por el ADN contenido en el plásmido que se ha depositado en la American Type Culture Collection con el n.º de registro 98985; y (d) un polinucleótido que codifica la proteína 22P4F11 que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Fig. 1A.
Description
Gen expresado en el cáncer de próstata.
La invención descrita en el presente documento
se refiere a un gen novedoso, denominado 22P4F11, y a procedimientos
de diagnóstico útiles en el tratamiento de los cánceres de próstata
que expresan 22P4F11.
El cáncer es la segunda causa principal de
muerte en los seres humanos después de la arteriopatía coronaria.
En todo el mundo, millones de personas mueren de cáncer todos los
años. Solamente en los Estados Unidos, el cáncer provoca la muerte
de bastante más de medio millón de personas anualmente, y se
diagnostican en torno a 1,4 millones de casos nuevos al año. Aunque
las muertes por cardiopatía han estado reduciéndose
significativamente, las producidas por el cáncer generalmente están
aumentando. En la primera parte del siglo próximo, se prevé que el
cáncer se convertirá en la principal causa de muerte.
En todo el mundo, varios cánceres destacan como
principales causas de muerte. En particular, los carcinomas de
pulmón, próstata, mama, colon, páncreas y ovario representan las
causas principales de la muerte por cáncer. Estos y virtualmente
todos los otros carcinomas comparten una característica letal común.
Con muy pocas excepciones, la enfermedad metastásica producida por
un carcinoma es mortal. Además, incluso para los pacientes de cáncer
que inicialmente sobreviven a sus cánceres primarios, la
experiencia habitual ha demostrado que sus vidas se ven alteradas
radicalmente. Muchos pacientes de cáncer experimentan una fuerte
ansiedad provocada por la conciencia de la potencial recidiva o del
fallo del tratamiento. Muchos pacientes de cáncer experimentan
debilidad física después del tratamiento. Muchos pacientes de
cáncer experimentan una recidiva.
Generalmente, el problema fundamental en el
tratamiento de los cánceres más mortales es la falta de terapias
sistémicas eficaces y no tóxicas. La medicina molecular promete
redefinir la forma de tratar estos cánceres. Es incuestionable que
se está realizando un intensivo esfuerzo a nivel mundial dirigido al
desarrollo de nuevas estrategias moleculares para el diagnóstico y
el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, existe un gran interés en
identificar genes y proteínas realmente específicos de tumor que
podrían usarse como marcadores de diagnóstico y pronóstico y/o como
dianas o agentes terapéuticos. Los esfuerzos de investigación en
estas áreas son prometedores, y la creciente disponibilidad de
tecnologías moleculares útiles ha acelerado la adquisición de
conocimientos significativos sobre el cáncer. Sin embargo, el
avance es lento y generalmente irregular.
Como se describe más adelante, el tratamiento
del cáncer de próstata es un buen ejemplo de lo limitado del
progreso clínico real en que se ha traducido la biología molecular.
Con pocas excepciones, la situación es más o menos igual para los
otros carcinomas principales mencionados anteriormente.
En todo el mundo, el cáncer de próstata es el
cuarto cáncer de mayor prevalencia entre los hombres. En el norte
de América y en el norte de Europa es con mucho el cáncer más
habitual entre los hombres y es la segunda causa de muerte por
cáncer entre los hombres. Solo en los Estados Unidos, más de 40.000
hombres mueren anualmente por esta enfermedad - solo por detrás del
cáncer de pulmón. A pesar de la magnitud de las cifras, todavía no
existe ningún tratamiento eficaz para el cáncer de próstata
metastásico. La prostatectomía quirúrgica, la radioterapia, la
terapia de ablación hormonal y la quimioterapia siguen siendo las
principales modalidades de tratamiento. Desafortunadamente, estos
tratamientos son ineficaces para muchos y a menudo están asociados
a consecuencias indeseables.
En términos de diagnóstico, la falta de un
marcador del tumor de próstata que pueda detectar certeramente los
tumores localizados en estadio temprano, sigue siendo una limitación
significativa en el tratamiento de esta enfermedad. Aunque el
ensayo de PSA en suero ha sido una herramienta muy útil, su
especificidad y utilidad general muestra carencias en varios
respectos importantes.
La mayor parte de los cánceres de próstata
inicialmente se producen en la zona periférica de la glándula
prostática, lejos de la uretra. Los tumores en esta zona pueden no
producir síntomas y, por lo tanto, la mayoría de los hombres con
cáncer de próstata en estadio temprano no presentarán síntomas
clínicos de la enfermedad hasta que se ha producido una progresión
significativa. La progresión del tumor a la zona de transición de la
próstata puede provocar obstrucción uretral, produciendo así los
primeros síntomas de la enfermedad. Sin embargo, estos síntomas
clínicos no pueden distinguirse de la afección no maligna habitual
de hiperplasia prostática benigna (BPH). La temprana detección y
diagnóstico del cáncer de próstata actualmente se basa en los
exámenes rectales digitales (DRE), mediciones del antígeno
específico de próstata (PSA), ultrasonografía transrectal (TRUS), y
biopsia transrectal con agujas (TRNB). Actualmente, la medición de
PSA en suero combinada con los DRE representan la herramienta
principal que se emplea para detectar y diagnosticar el cáncer de
próstata. Ambas presentan grandes limitaciones que han espoleado
una intensa investigación para encontrar mejores marcadores
diagnósticos de esta enfermedad.
De forma similar, no existen marcadores
disponibles que puedan predecir la aparición de la etapa metastásica
habitualmente mortal del cáncer de próstata. El diagnóstico de la
etapa metastásica actualmente se consigue mediante linfadenectomía
quirúrgica o laparoscópica, barridos con radionúclidos de todo el
cuerpo, radiografía del esqueleto y/o análisis de biopsias de
lesiones óseas. Claramente, los procedimientos de diagnóstico por
imagen mejores y otros procedimientos de diagnóstico menos invasivos
son prometedores en cuanto a facilitar las dificultades que esos
procedimientos suponen para un paciente, a la vez que mejoran la
precisión de diagnóstico y abren el abanico de las opciones
terapéuticas. Un problema similar es la falta de un marcador de
pronóstico eficaz para determinar qué cánceres son inactivos y
cuales son o serán agresivos. El PSA, por ejemplo, no puede
discriminar con exactitud entre los cánceres inactivos y los
agresivos. Hasta que haya marcadores del tumor de próstata con
capacidad para identificar de forma fiable la enfermedad en estadio
temprano, para predecir la susceptibilidad a la metástasis, y para
obtener imágenes precisas de los tumores, el tratamiento del cáncer
de próstata continuará siendo muy difícil.
El PSA es el marcador tumoral de mayor uso para
detectar, diagnosticar y controlar el cáncer de próstata
actualmente. En particular, hay diversos inmunoensayos para la
detección del PSA en suero que se usan profusamente en clínica.
Recientemente, se ha desarrollado un ensayo de reacción en cadena de
la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR)
para el ARNm de PSA en suero. Sin embargo, el PSA no es un marcador
específico de la enfermedad, ya que pueden detectarse niveles
elevados de PSA en un gran porcentaje de los pacientes con BPH y con
prostatitis (25-86%) (Gao et al., 1997,
próstata 31: 264-281), así como en otros trastornos
no malignos y en algunos hombres normales, un factor que limita
significativamente la especificidad de diagnóstico de este marcador.
Por ejemplo, se observan aumentos en el PSA sérico de entre 4 a 10
ng/ml en la BPH, e incluso se observan valores mayores en la
prostatitis, en particular en la prostatitis aguda. La BPH es una
afección muy habitual entre los hombres. Otra cosa que hace la
situación confusa es el hecho de que las elevaciones en PSA sérico
pueden observarse sin ninguna indicación de enfermedad según el
DRE, y viceversa. Además, actualmente se reconoce que el PSA no es
específico de la próstata (Gao et al., referencia anterior,
para una revisión).
Se han descrito diversos procedimientos
destinados a mejorar la especificidad de la detección basada en el
PSA, como por ejemplo medir la densidad de PSA y el cociente entre
PSA libre y complejo. Sin embargo, ninguna de estas metodologías ha
sido capaz de distinguir de forma reproducible la enfermedad de
próstata benigna de la maligna. Además, los diagnósticos basados en
el PSA tienen sensibilidades de entre 57-79% (Cupp
& Osterling, 1993, Mayo Clin Proc 68:297-306),
y por lo tanto no consiguen identificar el cáncer de próstata en una
población significativa de hombres con la enfermedad.
Existen algunos marcadores conocidos que se
expresan de forma predominante en la próstata, como por ejemplo el
antígeno de membrana específico prostático (PSM), una hidrolasa que
es idéntica en un 85% a la neuropeptidasa de rata (Carter et
al., 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 749; Bzdega et
al., 1997, J. Neurochem. 69: 2270). Sin embargo, la expresión
de PSM en el intestino delgado y el cerebro (Israeli et al.,
1994, Cancer Res. 54: 1807), así como su potencial papel en el
catabolismo de los neuropéptidos en el cerebro, suscita el problema
de una potencial neurotoxicidad con las terapias contra PSM. Los
resultados preliminares usando un anticuerpo monoclonal contra PSM
marcado con indio 111 para obtener imágenes de cáncer de próstata
recidivante son prometedores (Sodee et al., 1996, Clin Nuc
Med 21: 759-766). Los marcadores del cáncer de
próstata identificados más recientemente incluyen
PCTA-1 (Su et al., 1996, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 93: 7252) y el antígeno de células germinales prostáticas
(PSCA) (Reiter et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:
1735). La PCTA1, una galectina novedosa, se segrega en grandes
cantidades al medio de las células que la expresan y puede resultar
prometedor como marcador sérico de diagnóstico para el cáncer de
próstata (Su et al., 1996). El PSCA, una molécula de la
superficie celular ligada a GPI, clonada a partir del ADNc de
LAPC-4, es única porque se expresa principalmente en
las células basales del tejido prostático normal y en el epitelio
del cáncer (Reiter et al., 1998). Las vacunas contra el
cáncer de próstata también se están explorando activamente con una
variedad de antígenos, que incluyen PSM y PSA.
El n.º de registro de la base de datos EMBL
AA145922 describe un EST. El n.º de registro de la base de datos
Genbank
A1808141 también describe un EST.
La presente invención se refiere a un gen
novedoso expresado en células de cáncer de próstata, denominado
22P4F11. El análisis de la expresión del ARNm de 22P4F11 en la
próstata normal, en xenoinjertos de tumor de próstata y en una
variedad de tejidos normales indica que la expresión de este gen es
específica de los testículos en los tejidos normales. El gen
22P4F11 también se expresa en los tumores de xenoinjertos de cáncer
de próstata, en algunos casos en niveles elevados. Se proporciona
un ADNc de longitud completa que codifica 22P4F11. El tránscrito de
22P4F11 puede representar un marcador útil para el diagnóstico y/o
una diana terapéutica para el cáncer de próstata.
La invención proporciona polinucleótidos
correspondientes o complementarios a todo o parte de los genes,
ARNm, y/o secuencias codificantes de 22P4F11, preferentemente en
forma aislada, que incluye los polinucleótidos que codifican las
proteínas 22P4F11 y sus fragmentos, ADN, ARN, moléculas híbridas de
ADN/ARN y moléculas relacionadas, polinucleótidos u
oligonucleótidos complementarios a los genes 22P4F11 o secuencias de
ARNm o partes de las mismas, y polinucleótidos u oligonucleótidos
que se hibridan a los genes, los ARNm de 22P4F11 o a los
polinucleótidos que codifican 22P4F11. También se proporcionan
medios para aislar los ADNc y los genes que codifican 22P4F11. La
invención además proporciona procedimientos para detectar la
presencia de los polinucleótidos 22P4F11 en diversas muestras
biológicas, así como procedimientos para identificar las células que
expresan 22P4F11.
Fig. 1A. Secuencias de nucleótidos y aminoácidos
deducidos de un ADNc de longitud completa que codifica el gen
22P4F11. La secuencia de consenso Kozak y la metionina inicial se
indican en negrita, y una secuencia de señal mitocondrial putativa
está incluida en un recuadro.
Fig. 1B. Secuencias de nucleótidos y de
aminoácidos del ORF del ADNc de 22P4F11 aislado en SSH.
Fig. 2. Análisis por RT-PCR de
la expresión génica de 22P4F11 en xenoinjertos de cáncer de
próstata, próstata normal y otros tejidos y líneas celulares que
muestran expresión en xenoinjertos de cáncer de próstata y próstata
normal a niveles aproximadamente iguales (Panel A); y que muestra
que la expresión en tejidos normales es más elevada en la próstata,
testículos, pulmón e hígado (Paneles B y C).
Fig. 3. Análisis por transferencia Northern de
la expresión génica de 22P4F11 en una variedad de tejidos humanos
normales y de diversos xenoinjertos de cáncer de próstata, que
muestra la expresión específica en los testículos en tejidos
normales y en algunos de los tejidos de cáncer de próstata.
A no ser que se defina de otro modo, todos los
términos de la técnica, la notación y otra terminología científica
que se usa en el presente documento se pretende que tengan los
significados que habitualmente entienden los expertos en la técnica
a la que pertenece esta invención. En algunos casos, los términos
con significados que se entienden habitualmente se definen en el
presente documento para mayor claridad y/o para tener una
referencia accesible, y la inclusión de dichas definiciones en el
presente documento no debería interpretarse necesariamente como que
representa una diferencia sustancial con respecto a lo que
generalmente se entiende en la técnica. Las técnicas y
procedimientos que se describen o a las que se hace referencia en el
presente documento generalmente se entienden bien y se emplean
habitualmente usando metodología convencional por los expertos en
la técnica, como por ejemplo, las metodologías de clonación
molecular ampliamente utilizados que se describen en Sambrook et
al., Molecular Cloning: A Laboradory Manual 2ª edición (1989)
Cold Spring Harbor Laboradory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Según
sea apropiado, los procedimientos que suponen el uso de kits y
reactivos comercialmente disponibles generalmente se realizan de
acuerdo con los protocolos y/o parámetros definidos por el
fabricante, a no ser que se indique lo
contrario.
contrario.
Tal como se usan en el presente documento, los
términos "cáncer de próstata avanzado", "cáncer de próstata
localmente avanzado,", "enfermedad avanzada" y "enfermedad
localmente avanzada" quieren decir cánceres de próstata que se
han extendido hasta la cápsula prostática y se pretende que incluyan
la enfermedad en estadio C según el sistema de la American
Urological Association (AUA), enfermedad en estadio C1 - C2 según el
sistema Whitmore-Jewett, y enfermedad T3 - T4 y N+
según el sistema TNM (tumor, nódulo, metástasis). En general, la
cirugía no está recomendada en pacientes con enfermedad localmente
avanzada, y estos pacientes presentan desenlaces sustancialmente
menos favorables que los pacientes con cáncer de próstata
clínicamente localizado (confinado a un órgano). La enfermedad
localmente avanzada se identifica clínicamente por signos palpables
de endurecimiento del borde lateral de la próstata, o por asimetría
o endurecimiento por encima de la base de la próstata. El cáncer de
próstata localmente avanzado actualmente se diagnostica
anatomopatológicamente tras la prostatectomía radical si el tumor
invade o penetra en la cápsula prostática, se extiende hasta el
margen quirúrgico o invade las vesículas seminales. Tal como se
usan en el presente documento, los términos "cáncer de próstata
metastásico" y "enfermedad metastásica" quieren decir
cánceres de próstata que se han extendido a los nódulos linfáticos
regionales o a áreas distantes y se pretende que incluyan enfermedad
en estadio D según el sistema AUA y estadio T xNxM+ según el
sistema TNM; Al igual que en el caso del cáncer de próstata
localmente avanzado, generalmente la cirugía no está recomendada
para los pacientes con enfermedad metastásica, y la modalidad de
tratamiento preferente es la terapia hormonal (ablación de
andrógenos). Los pacientes con cáncer de próstata metastásico
finalmente desarrollan un estado resistente a los andrógenos en los
12 a 18 meses desde el inicio del tratamiento y aproximadamente la
mitad de estos pacientes mueren en los 6 meses siguientes. La zona
más habitual para la metástasis del cáncer de próstata es el hueso.
Las metástasis óseas del cáncer de próstata, en el equilibrio,
característicamente osteoblásticas en lugar de osteolíticas (es
decir, provocan la formación neta de hueso). Las metástasis óseas
se encuentran con mayor frecuencia en la columna vertebral, y
después en el fémur, la pelvis, la caja torácica, cerebro y húmero.
Otras zonas habituales para la metástasis incluyen los nódulos
linfáticos, pulmón, hígado y cerebro. El cáncer de próstata
metastásico habitualmente se diagnostica mediante linfadenectomía
abierta o laparoscópica, barridos con radionúclidos de todo el
cuerpo, radiografía del esqueleto y/o biopsias de lesiones
óseas.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "polinucleótido" quiere decir una forma polimérica de
nucleótidos de al menos 10 bases o pares de bases de longitud, o
bien ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de
cualquiera de los dos tipos de nucleótidos, y se pretende que
incluya formas monocatenarias y bicatenarias de ADN.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "polipéptido" quiere decir un polímero de al menos 10
aminoácidos. En toda la memoria descriptiva, se usan las
denominaciones estándar de tres letras o de una única letra para
los aminoácidos.
Tal como se usan en el presente documento, los
términos "hibridar", "hibridación", "se hibrida" y
similares, que se usan en el contexto de polinucleótidos, se
pretende que se refiera a condiciones de hibridación convencionales,
preferentemente como por ejemplo hibridación en 50% de
formamida/6XSSC/0,1% de SDS/100 \mug/ml de ADNmc, en las que las
temperaturas para la hibridación están por encima de 37 grados C y
las temperaturas de lavado en 0,1XSSC/0,1% de SDS son superiores a
55 grados C, y lo más preferentemente a condiciones de hibridación
rigurosas.
En el contexto de comparaciones de secuencias de
aminoácidos, el término "identidad" se usa para expresar el
porcentaje de restos de aminoácidos en la misma posición relativa
que son iguales. También en este contexto, el término
"homología" se usa para expresar el porcentaje de restos
aminoacídicos en las mismas posiciones relativas que son o bien
idénticas o son similares, usando los criterios de aminoácido
conservados del análisis BLAST, tal como se entiende generalmente
en la técnica. A continuación se proporcionan detalles adicionales
sobre las sustituciones de aminoácidos que se consideran
conservadoras según dichos criterios.
En las subsecciones siguientes se proporcionan
definiciones adicionales.
Como se describe adicionalmente en los Ejemplos
siguientes, los genes y proteínas de 22P4F11 han sido caracterizados
usando numerosas estrategias de análisis. Por ejemplo, se
realizaron análisis de codificación de los nucleótidos y de
secuencias de aminoácidos para identificar las moléculas
potencialmente relacionadas y tres isoformas diferentes de 22P4F11,
así como dominios estructurales reconocibles, características
topológicas y otros elementos dentro de las estructuras de ARNm y
proteínas de 22P4F11. También se realizaron análisis por
RT-PCR y transferencia Northern de la expresión del
ARNm de 22P4F11.
Se ha aislado un ADNc de longitud completa que
codifica el gen 22P4F11. Las secuencias de nucleótidos y de
aminoácidos deducidos de este ADNc se muestran en la Fig. 1A. La
secuencia de nucleótidos del fragmento de ADNc aislado inicialmente
que corresponde e identifica el gen 22P4F11 se proporciona en la
Fig. 1B. Esta secuencia no muestra homología con ninguno de los
genes conocidos ni con EST-s, y contiene un marco de
lectura abierto que codifica 69 aminoácidos (Fig. 1B). El análisis
de la expresión por RT-PCR muestra que 22P4F11 se
expresa en xenoinjertos de cáncer de próstata con LAPC dependientes
de andrógenos e independientes de andrógenos y en la próstata
normal a niveles aproximadamente iguales (Fig. 2). En los tejidos
normales, la expresión del gen 22P4F11 parece estar algo
restringida, observándose los mayores niveles de expresión en los
tejidos de la próstata, los testículos, pulmón e hígado (Fig 2). El
análisis por transferencia Northern usando una sonda de ADNc de
22P4F11 de longitud completa, sin embargo, muestra expresión
específica de testículos en tejidos normales así como expresión en
xenoinjertos del cáncer de próstata, pero no muestra expresión en la
próstata normal (Fig. 3).
Un aspecto de la invención proporciona
polinucleótidos que corresponde o complementarios a todo o parte de
un gen, ARNm, y/o secuencia codificante de 22P4F11, preferentemente
en forma aislada, que incluyen polinucleótidos que codifican una
proteína 22P4F11 y sus fragmentos, ADN, ARN, híbrido de ADN/ARN y
moléculas relacionadas, polinucleótidos u oligonucleótidos
complementarios a un gen o secuencia de ARNm de 22P4F11 o una parte
de la misma y polinucleótidos u oligonucleótidos que se hibridan a
un gen 22P4F11, ARNm, o a un polinucleótido que codifica 22P4F11
(denominados de forma colectiva "polinucleótidos 22P4F11"). Tal
como se usa en el presente documento, el gen 22P4F11 se pretende
que incluya los genes 22P4F11 específicamente descritos en el
presente documento y los genes que corresponden a otras proteínas
22P4F11 y variantes estructuralmente similares de los anteriores.
Dichas otras variantes de 22P4F11 generalmente tendrán secuencias
codificantes que son altamente homólogas a la secuencia codificante
de 22P4F11 y que preferentemente compartirán al menos
aproximadamente 50% de identidad entre los aminoácidos y al menos
aproximadamente 60% de homología entre los aminoácidos (usando los
criterios BLAST), más preferentemente que comparten una homología
del 70% o mayor (usando los criterios BLAST). Una realización de un
polinucleótido 22P4F11 tiene la secuencia que se muestra en la Fig.
1A.
Un polinucleótido 22P4F11 puede comprender un
polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos de 22P4F11
humano tal como se muestra en la Fig. 1A, en la que T también puede
ser U; un polinucleótido que codifica todo o parte de la proteína
22P4F11; una secuencia complementaria a la anterior; o un fragmento
polinucleotídico de cualquiera de los anteriores. Otra realización
comprende un polinucleótido que tiene la secuencia que se muestra
en la Fig. 1, desde el resto nucleotídico número 236 hasta resto
nucleotídico número 1466, en la que T también puede ser U. Otra
realización comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido
22P4F11 cuya secuencia es codificada por el ADNc contenido en el
plásmido que se ha depositado en la American Type Culture
Collection con el n.º de registro 98985. Otra realización comprende
un polinucleótido que es capaz de hibridarse en condiciones de
hibridación rigurosas al ADNc de 22P4F11 humano que se muestra en la
Fig. 1A o a un fragmento polinucleotídico del mismo, distinto de
las secuencias de polinucleótidos representadas con el n.º de
registro en la base de datos EMBL AA 145922 y n.º de registro de la
base de datos Genbank A1808141.
De forma específica se contemplan las moléculas
de ADN, ADNc, ribozimas, y antisentido, así como las moléculas de
ácido nucleico basadas en un esqueleto alternativo o que incluyen
bases alternativas, independientemente de si se derivan de fuentes
naturales o de si son sintéticas. Por ejemplo, las moléculas
antisentido pueden ser ARN u otras moléculas, que incluyen ácidos
peptidonucleicos (PNA) o moléculas distintas de ácido nucleico como
por ejemplo derivados de fosforotioato, que específicamente se unen
a ADN o ARN de forma dependiente de las bases. Un experto puede
obtener fácilmente estas clases de moléculas de ácido nucleico
usando los polinucleótidos 22P4F11 y secuencias de polinucleótidos
descritas en el presente documento.
Otras realizaciones específicas de este aspecto
de la invención incluyen cebadores y pares de cebadores, que
permiten la amplificación específica de los polinucleótidos de la
invención o de cualquier parte específica de las mismas, y sondas
que selectivamente o específicamente se hibridan a moléculas de
ácido nucleico de la invención o a cualquier parte de las mismas.
Las sondas pueden estar marcadas con un marcador detectable, como
por ejemplo, un radioisótopo, compuesto fluorescente, compuesto
bioluminescente, un compuesto quimioluminescente, quelante metálico
o enzima. Dichas sondas y cebadores pueden usarse para detectar la
presencia de un polinucleótido 22P4F11 en una muestra y como medio
para detectar una célula que expresa una proteína 22P4F11. Los
ejemplos de dichas sondas incluyen polipéptidos que comprenden todo
o parte de las secuencias de ADNc 22P4F11 humanas que se muestran
en las Fig. 1A y 1B. En los Ejemplos siguientes también se describen
ejemplos de pares de cebadores capaces de amplificar
específicamente los ARN de 22P4F11. Como entenderá el experto,
pueden prepararse muchísimos cebadores y sondas diferentes
basándose en las secuencias que se proporcionan en en el presente
documento y usarse eficazmente para amplificar y/o detectar un ARNm
de 22P4F11.
Tal como se usa en el presente documento, se
dice que un polinucleótido está "aislado" cuando está
sustancialmente separado de polinucleótidos contaminantes que
corresponden o son complementarios a genes distintos del gen
22P4F11 o que codifican polipéptidos distintos del producto del gen
22P4F11 o sus fragmentos. Un experto fácilmente puede emplear
procedimientos de aislamiento de ácido nucleico para obtener un
polinucleótido 22P4F11 aislado.
Los polinucleótidos 22P4F11 de la invención son
útiles para una variedad de fines, que incluyen, pero sin
limitación su uso como sondas y cebadores para la amplificación y/o
detección de los gen(es) 22P4F11, ARNm o sus fragmentos; y
su uso como reactivos para el diagnóstico y/o pronóstico del cáncer
de próstata.
Las secuencias de ADNc de 22P4F11 que se
describen en el presente documento permiten aislar otros
polinucleótidos que codifican los producto(s) de los
gen(es) 22P4F11, así como aislar los polinucleótidos que
codifican homólogos los producto(s) de los gen(es)
22P4F11, isoformas con ayustes alternativos, variantes alélicas y
formas mutantes del producto del gen 22P4F11. Son notorios los
diversos procedimientos de clonación molecular que pueden emplearse
para aislar los ADNc de longitud completa que codifican un gen
22P4F11 (Véase, por ejemplo, Sambrook, J. et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2^{a} edición., Cold Spring Harbor
Press, Nueva York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology.
Ausubel et al., Ed., Wiley and Sons, 1995). Por ejemplo,
convenientemente pueden emplearse metodologías de clonación en
fagos lambda, usando sistemas de clonación disponibles
comercialmente (por ejemplo, Lambda ZAP Express, Stratagene). Los
clones de fagos que contienen los ADNc del gen 22P4F11 pueden
identificarse sondando con un ADNc de 22P4F11o un fragmento del
mismo marcados. Por ejemplo, en una realización, puede sintetizarse
el ADNc de 22P4F11 (Fig. 1A, 1B) o una porción del mismo y usarse
como sonda para recuperar ADNc superpuestos y de longitud completa
que corresponden a un gen 22P4F11. El gen 22P4F11 en sí puede
aislarse cribando adenotecas de ADN genómico, adenotecas de
cromosomas artificiales bacterianos (BAC), adenotecas de cromosomas
artificiales de hongos (YAC), y similares, con sondas o cebadores de
ADN de 22P4F11.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a procedimientos para detectar polinucleótidos 22P4F11, así como a
procedimientos para identificar una célula que exprese 22P4F11.
Más particularmente, la invención proporciona
ensayos para la detección de polinucleótidos 22P4F11 en una muestra
biológica, como por ejemplo suero, hueso, próstata, y otros tejidos,
orina, semen, preparaciones celulares y similares. Los
polinucleótidos 22P4F11 detectables incluyen, por ejemplo, un gen
22P4F11 o sus fragmentos, ARNm de 22P4F11, ARNm de 22P4F11 con
variantes de ayuste alternativas, y moléculas de ADN o ARN
recombinantes que contienen un polinucleótido 22P4F11. Son notorios
en la técnica numerosos procedimientos para amplificar y/o detectar
la presencia de polinucleótidos 22P4F11 y pueden emplearse en la
práctica de este aspecto de la invención.
En una realización, un procedimiento para
detectar un ARNm de 22P4F11 en una muestra biológica comprende
producir ADNc a partir de la muestra mediante transcripción inversa
usando al menos un cebador; amplificar el ADNc así producido usando
polinucleótidos 22P4F11 como cebadores de transcripción y
complementario para amplificar los ADNc de 22P4F11 presentes en el
mismo y detectar la presencia del ADNc de 22P4F11 amplificado.
También se describe un procedimiento de detectar un gen 22P4F11 en
una muestra biológica que comprende primero aislar ADN genómico de
la muestra; amplificar el ADN genómico aislado usando
polinucleótidos 22P4F11 como cebadores de transcripción y
complementario para amplificar el gen 22P4F11 incluido en él; y
detectar la presencia del gen 22P4F11 amplificado. Puede diseñarse
cualquier número combinaciones de sondas transcripción y
complementario a partir de las secuencias de nucleótidos que se
proporcionan para 22P4F11 (Figs. 1-3) y usarse para
este fin.
También se describen procedimientos para
identificar una células que expresa 22P4F11. Por ejemplo, se
describe un ensayo para identificar una célula que expresa un gen
22P4F11 que comprende detectar la presencia de ARNm de 22P4F11 en
la célula. Los procedimientos para la detección de ARNm particulares
en las células son notorios e incluyen, por ejemplo, ensayos de
hibridación usando sondas de ADN complementarias (como por ejemplo
hibridación in situ usando ribosondas de 22P4F11 marcadas,
transferencia Northern y técnicas relacionadas) y diversos ensayos
de amplificación de ácidos nucleicos (como por ejemplo
RT-PCR usando cebadores complementarios específicos
para 22P4F11, y otros procedimientos de detección de tipo
amplificación, como por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y
similares).
La determinación del estado de los patrones de
expresión de 22P4F11 en un individuo puede usarse para diagnosticar
el cáncer de próstata y puede proporcionar información sobre el
pronóstico útil para definir las opciones terapéuticas apropiadas.
De forma similar, el estado de expresión de 22P4F11 puede
proporcionar información útil para predecir la susceptibilidad a un
estado de enfermedad particular, a la progresión y/o a la
agresividad del tumor. La invención proporciona procedimientos y
ensayos para determinar el estado de expresión de 22P4F11 y
diagnosticar los cánceres de próstata que expresan 22P4F11. El
estado de expresión de 22P4F11 en las muestras de un paciente puede
analizarse por medios notorios en la técnica, que incluyen
hibridación in situ y análisis por RT-PCR en
muestras microdiseccionadas capturadas por láser.
En un aspecto, la invención proporciona ensayos
útiles para determinar la presencia de cáncer de próstata en un
individuo, que comprende detectar un aumento significativo en la
expresión de ARNm de 22P4F11 en una muestra o células o tejidos de
prueba con respecto a los niveles de expresión de la célula o tejido
normales correspondientes. La presencia de ARNm de 22P4F11 se
evalúa en muestras de tejido de próstata. La presencia de una
expresión significativa de 22P4F11 en el tejido de próstata puede
ser útil para indicar la emergencia, presencia y/o gravedad de los
cánceres de próstata, dado que el tejido normal correspondiente no
expresa ARNm de 22P4F11 o lo expresa a niveles menores.
Además, la sangre periférica puede ensayarse
convenientemente para determinar la presencia de células de cáncer
de próstata, usando RT-PCR para detectar la
expresión de 22P4F11. La presencia de ARNm de 22P4F11 amplificable
por RT-PCR proporciona una indicación de la
presencia de cáncer de próstata. Actualmente se están evaluando
ensayos de detección por RT-PCR para células
tumorales en sangre periférica para usar en el diagnóstico y
tratamiento de un número de tumores sólidos humanos. En el campo del
cáncer de próstata, estas incluyen ensayos por
RT-PCR para la detección de células que expresan PSA
y PSM (Verkaik et al., 1997, Urol. Res. 25:
373-384; Ghossein et al., 1995, J. Clin.
Oncol. 13: 1195-2000; Heston et al., 1995,
Clin. Chem. 41: 1687-1688). Los ensayos por
RT-PCR son notorios en la técnica.
También se describe un procedimiento para
predecir la susceptibilidad a desarrollar cáncer de próstata en un
individuo. Este procedimiento para predecir la susceptibilidad al
cáncer de próstata comprende detectar el ARNm de 22P4F11 en una
muestra de tejido de próstata, donde su presencia indica la
susceptibilidad al cáncer, donde el grado de expresión de ARNm de
22P4F11 presente es proporcional al grado de susceptibilidad. Por lo
tanto, se examina la presencia de 22P4F11 en tejido de próstata,
donde la presencia de 22P4F11 en la muestra proporciona una
indicación de susceptibilidad al cáncer de próstata (o la emergencia
o existencia de un tumor de próstata).
Se describe otro procedimiento para calibrar la
agresividad del tumor de próstata. Este procedimiento para calibrar
la agresividad de un tumor de próstata comprende determinar el nivel
de ARNm de 22P4F11 expresado por las células en una muestra del
tumor de próstata, comparar el nivel así determinado con el nivel de
ARNm de 22P4F11 expresado en un tejido de próstata normal
correspondiente del mismo individuo o una muestra de referencia de
tejido normal, donde el grado de expresión del ARNm de 22P4F11 en la
muestra de tumor relativo a la muestra normal indica el grado de
agresividad.
En el presente documento se describen métodos
para detectar y cuantificar la expresión de ARNm de 22P4F11 y el
uso de tecnologías estándar de detección y cuantificación de ácido
nucleico notorias en la técnica. Los procedimientos estándar para
la detección y cuantificación de ARNm de 22P4F11 incluyen
hibridación in situ usando ribosondas de 22P4F11 marcadas,
transferencia Northern y técnicas relacionadas usando sondas de
polinucleótidos 22P4F11, análisis por RT-PCR usando
cebadores específicos para 22P4F11, y otros procedimientos de
detección de tipo amplificación, como por ejemplo, ADN ramificada,
SISBA, TMA y similares. En una realización específica, puede usarse
RT-PCR semicuantitativa para detectar y cuantificar
la expresión de ARNm de 22P4F11 como se describe en los Ejemplos
siguientes. Puede usarse cualquier número de cebadores capaces de
amplificar 22P4F11 para este fin, que incluyen pero sin limitación
los diversos conjuntos de cebadores descritos específicamente en el
presente documento.
Para usar en las aplicaciones de diagnóstico que
se describen o se sugieren anteriormente, también se describen
kits. Dichos kits pueden comprender un medio portador con
compartimientos para recibir, de forma cerrada uno o más medios de
envase como por ejemplo viales, tubos y similares, comprendiendo
cada medio de envase uno de los distintos elementos a usar en el
procedimiento. Por ejemplo, uno de los medios de envase puede
comprender una sonda que está marcada o puede marcarse para poder
ser detectada. Dicha sonda puede ser un polinucleótido específico
para un gen o mensaje 22P4F11, respectivamente, donde el kit utiliza
hibridación de ácidos nucleicos para detectar el ácido nucleico
diana, el kit también puede tener envases que contengan
nucleótido(s) para la amplificación de la secuencia de
ácidos nucleicos diana y/o un envase que comprende un medio testigo,
como por ejemplo una proteína que se une a biotina, como por
ejemplo avidina o estreptavidina, unido a una molécula testigo,
como por ejemplo un marcador enzimático, fluorescente o un
radioisótopo.
Diversos aspectos de la invención se describen e
ilustran adicionalmente mediante diversos ejemplos cuantitativos,
ninguno de los cuales se pretende que limite el alcance de la
invención.
Los xenoinjertos con LAPC se obtuvieron del Dr.
Charles Sawyers (UCLA) y se generaron como se ha descrito (Klein
et al, 1997, Nature Med. 3: 402-408). Se
desarrollaron xenoinjertos con LAPC-4 dependientes e
independiente de andrógenos LAPC4 AD y AI, respectivamente) y
xenoinjertos con LAPC-9 AD en ratones SCID macho y
se pasaron en forma de pequeños trozos de tejido a machos
receptores. Los xenoinjertos LAPC-4 A1 se derivaron
de tumores LAPC-4 AD. Se castró a los ratones macho
que portaban los tumores LAPC-4 AD y se mantuvieron
durante 2-3 meses. Después de que volvieran a
crecer los tumores con LAPC-4, los tumores se
recogieron y se pasaron a machos castrados o a hembras de ratones
SCID.
Se obtuvieron líneas celulares humanas (por
ejemplo, HeLa) de la ATCC y se mantuvieron en DMEM con suero bovino
fetal al 5%.
Se homogeneizó tejido tumoral y las líneas
celulares en reactivo Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) usando
10 ml/g de tejido o 10 ml/ 10^{8} células para aislar el ARN
total. Se purificó ARN poli A del ARN total usando los kits
Oligotex mRNA Mini y Midi de Qiagen. Se cuantificó el ARNm y el
total mediante análisis espectrofotométrico (D.O. 260/280 nm) y se
analizó mediante electroforesis en gel.
Se usaron los siguientes oligonucleótidos
purificados por HPLC.
DPNCN (cebador para la síntesis de ADNc):
\newpage
Se usó hibridación sustractiva por supresión
(SSH) para identificar ADNc correspondientes a los genes que pueden
estar expresados diferencialmente en el cáncer de próstata. Se
sintetizaron ADNc bicatenarios correspondientes al xenoinjerto con
LAPC-4 A 1 (prueba) y el xenoinjerto con
LAPC-4 AD (director) se sintetizaron a partir de 2
\mug de ARN con poli(A)* aislado de tejido de xenoinjerto,
como que se describe anteriormente, usando el kit de sustracción de
ADN PCR-Select de CLONTECH y 1 ng del
oligonucleótido DPNCDN como cebador. Se realizaron las síntesis de
la primera y la segunda hebras como se describe en el protocolo de
manual del usuario del Kit (CLONTECH n.º de protocolo
PT1117-1, n.º de catálogo K1804-1).
El ADNc resultante se digirió con Dpn II durante 3 h. a 37ºC. El
ADNc digerido se extrajo con fenol/cloroformo (1:1) y se precipitó
con etanol.
El ADNc director (LAPG-4 AD) se
generó combinando en una proporción de 1:1 ADNc de
LAP-4 AD digerido con Dpn II con una mezcla de los
ADNc digeridos derivados de hiperplasia prostática benigna humana
(BPH), las líneas celulares humanas HeLa, 295, A431, Colo205, e
hígado de ratón.
El ADNc de prueba (LAPC-4 A 1)
se generó diluyendo 1 \mul de ADNc de LAPC-4 A1
digerido con Dpn II (400 ng) en 5 \mul de agua. El ADNc diluido
(2 \mul, 160 ng) después se ligó a 2 \mul de Adaptador 1 y
Adaptador 2 (10 \muM), en reacciones de ligado separadas en un
volumen total de 10 \mul a 16ºC toda la noche, usando 400 u de
ADN ligasa de T4 (CLONTECH), el ligado se terminó con 1 \mul de
EDTA 0,2 M y se calentó a 72ºC durante 5 min.
La primera hibridación se realizó añadiendo 1,5
\mul (600 ng) del ADNc director a cada uno de los de dos tubos
que contenían 1,5 \mul (20 ng) de ADNc de prueba ligado al
Adaptador 1 y al Adaptador 2. En un volumen final de 4 \mul, las
muestras se cubrieron con aceite mineral, se desnaturalizaron en un
ciclador térmico MJ Research a 98ºC durante 1,5 minutos y después
se dejó hibridar durante 8 h a 68ºC. Después las dos hibridaciones
se mezclaron con un 1 \mul adicional de ADNc director
desnaturalizado reciente y se dejaron hibridar toda la noche a
68ºC. La segunda hibridación después se diluyó en 200 \mul de
Hepes 20 mM, a pH 8,5, NaCl 50 mM, EDTA 0,2 mM, se calentó a 70ºC
durante 7 min. y se almacenó a -20ºC.
Para amplificar los fragmentos génicos
resultantes de las reacciones de SSH, se realizaron dos
amplificaciones por PCR. En la reacción de PCR primaria, 1 \mul
de la mezcla de hibridación final diluida se añadió a 1 \mul del
cebador 1 de la PCR (10 \muM), 0,5 \mul de mezcla de dNTP (10
\muM), 2,5 \mul de 10 x tampón de reacción (CLONTECH) y 0,5
\mul de 50 x de la mezcla de ADNc polimerasa Advantage (CLONTECH)
en un volumen final de 25 \mul. La PCR 1 se realizó usando las
siguientes condiciones: 75ºC durante 5 min., 94ºC durante 25 s,
después 27 ciclos de 94ºC durante 10 s, 66ºC durante 30 s., 72ºC
durante 1,5 min. Se realizaron cinco reacciones de PCR primarias
distintas para cada experimento. Los productos se agruparon y se
diluyó 1:10 con agua. Para la reacción de PCR secundaria, se añadió
1 \mul de la reacción primaria agrupada y diluida a la misma
mezcla de reacción que se usó para la PCR 1, pero se usaron los
cebadores NP1 y NP2 (10 \muM) en lugar del cebador 1 de PCR. La
PCR 2 se realizó usando 10-12 ciclos de 94ºC durante
10 s, 68ºC durante 30 s, 72ºC durante 1,5 minutos. Los productos de
las PCR se analizaron usando electroforesis en gel de agarosa al
2%.
Los productos de las PCR se insertaron en
pCR2-1 usando el kit de clonación con vectores T/A
(Invitrogen). Las E. coli transformadas se sometieron a
selección con azul/blanco y ampicilina. Se escogieron las colonias
blancas y se dispusieron en placas de 96 pocillos y se cultivaron en
cultivo líquido toda la noche. Para identificar los insertos, se
realizó una amplificación por PCR en 1 ml de cultivo bacteriano
usando las condiciones de la PCR1 y NP1 y NP2 como cebadores. Los
productos de las PCR se analizaron usando electroforesis en gel de
agarosa al 2%.
Los clones bacterianos se almacenaron en
gliceron al 20% en un formato de 96 pocillos. El ADN plasmídico se
preparó, se secuenció y se sometió a búsquedas de homología de
ácidos nucleicos en las bases de datos GenBank, dBest, y
NCI-CGAP.
Se generaron los ADNc de la primera hebra a
partir de 1 \mug de ARNm con cebado por oligo
(dT)12-18 usando el sistema de
preamplificación Superscript de Gibao-BRL. Se usó el
protocolo del fabricante y se incluyó una incubación durante 50 min
a 42ºC con transcriptasa inversa seguida de tratamiento con ARNsa H
a 37ºC durante 20 min. Después de completar la reacción, se aumentó
el volumen a 200 \mul con agua antes de la normalización. Los
ADNc de la primera hebra de 16 tejidos humanos normales diferentes
se obtuvieron de Clontech.
Se realizó una normalización de los ADNc de las
hebras de los cebadores de múltiples tejidos usando los cebadores
5'atatcgccgcgctcgtcgtcgacaa3' y 5'agccacacgcagctcattgtagaagg3' para
amplicar \beta-acción. El ADNc de la primera
hebra (5 \mul) se amplificó en un volumen total de 50 \mul que
contenía los cebadores 0,4 \muM, 0,2 \muM de cada dNTP, 1 X
tampón de PCR (Clontech, Tris-HCl 10 mM, MgCl_{2}
1,5 mM, KCl 50 mM, a pH 8,3) y 1 X ADN polimerasa Klentaq
(Clontech). Se retiraron 5 \mul de la reacción de PCR a los 18,
20, y 22 ciclos y se usaron para electroforesis en gel de agarosa.
La PCR se realizó usando un ciclador término MJ Research con las
siguientes condiciones: la desnaturalización inicial fue a 94ºC
durante 15 s, seguido de a 18, 20, y 22 ciclos de 94ºC durante 15,
65ºC durante 2 min, 72ºC durante 5 s. Se realizó una extensión final
a 72ºC durante 2 min. Después de la electroforesis en gel de
agarosa, se compararon las intensidades de las bandas de
\beta-actina de 283 pb de múltiples tejidos
mediante inspección visual. Se calcularon los factores de dilución
para que los ADNc de la primera hebra produjeran bandas de
\beta-actina de la misma intensidad en todos los
tejidos después de 22 ciclos de PCR. Se necesitaron tres tandas de
normalización para lograr unas intensidades iguales de las bandas
en todos los tejidos después de 22 ciclos de PCR.
Para determinar los niveles de expresión del gen
22P4F11, se analizaron 5 \mul de ADNc normalizado de la primera
hebra por PCR usando 25, 30, y 35 ciclos de amplificación usando los
siguientes pares de cebadores, que se diseñaron con ayuda de (MIT;
para los detalles véase
- 5' - GCC ACA AAC AGA ATG CAA TGA AAG - 3'
- 5' - AAA CTG CCT GTG GTG AAA GTA GA - 3'
Se realizó un análisis semicuantitativo de la
expresión comparando los productos de las PCR con los números de
ciclos que consiguen intensidades de bandas claras.
\vskip1.000000\baselineskip
El experimento por SSH descrito en los
Materiales y Métodos, anteriormente, consiguió aislar numerosos
clones de fragmentos génicos (clones de SSH). Se secuenciaron todos
los clones candidatos y se sometieron a análisis por homología
comparando con todas las secuencias en las principales bases de
datos génicas públicas para proporcionar información sobre la
identidad del gen correspondiente y para ayudar a guiar la decisión
de analizar un gen particular para la expresión diferencial. En
general, los fragmentos génicos que no presentaban homología con
ninguna secuencia conocida de ninguna de las bases de datos en las
que se buscó, y por lo tanto se consideraba que representaban genes
novedosos, así como los fragmentos génicos que mostraban homología
con los marcadores de las secuencias expresadas (EST) secuenciadas
previamente, se sometieron a análisis de expresión diferencial por
RT-PCR y/o análisis por Northern.
Uno de los clones de SHH que comprendían
aproximadamente 209 pb, no mostró homología con ningún gen conocido
y se denominó 22P4F11. La secuencia de nucleótidos de este clon de
SHH se muestra en la Fig. 1B. Esta secuencia de ADNc parcial del
gen 22P4F11 codifica un marco de lectura abierto de 69 aminoácidos.
El análisis de expresión diferencial por RT-PCR
mostró la expresión en todos los xenoinjertos de LAPC y en próstata
normal a niveles aproximadamente iguales (Fig. 2, Panel A). Además,
el posterior análisis de la expresión por RT-PCR de
los ADNc de la primera hebra de 16 tejidos normales detectó un alto
nivel de expresión del gen 22P4F11 sólo en próstata, testículos,
pulmón e hígado (Fig. 2, paneles B y C).
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento SSH de 22P4F11 (Ejemplo 1) se usó
para aislar ADNc adicionales que codificaban este gen. En resumen,
se cribó una adenoteca de ADNc de próstata humana normal (Clontech)
con una sonda marcada generada a partir del ADNc de 22P4F11. Uno de
los clones positivos, el clon GTP3E10, tenía 2250 pb de longitud, y
codificaba el marco de lectura abierto completo del gen 22P4F11. El
ADNc de 22P4F11-GTP3E10 codifica una proteína de
387 aminoácidos y contiene una secuencia de señal mitocondrial
prevista. El ADNc de 22P4F11-GTP3E10 se depositó en
forma del plásmido p22P4F11-GTP3E10 en la American
Type Culture Collection (ATCC) el 11 de noviembre de 1998 y se le
ha otorgado el número de registro de la ATCC 98985. Las secuencias
de nucleótidos y de aminoácidos deducidos de este gen 22P4F11
codificado por este ADNc se muestran en la Fig. 1A.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión de ARNm de 22P4F11 en tejidos
humanos normales se realizó mediante transferencia Northern de dos
transferencias de tejidos múltiples obtenidos de Clontech (Palo
Alto, California), que comprendía un total de 16 tejidos humanos
normales diferentes, usando ADNc de 22P4F11-GTP3E10
marcado como sonda. Las muestras de ARN se normalizaron
cuantitativamente con una sonda de \beta-actina.
Los resultados se muestran en las Fig. 3A y B. La expresión sólo se
detectó en los testículos.
Para analizar la expresión de 22P4F11 en tejidos
y líneas celulares de cánceres humanos, también se analizaron los
ARN derivados de xenoinjertos de cáncer de próstata, próstata normal
y una línea celular de cáncer de próstata humanos. Los resultados
se muestran en la Fig. 3C. Se detectó una fuerte expresión en uno de
los xenoinjertos con LAPC-4, y un nivel de
expresión menor en la línea celular de cáncer de próstata LNCaP y en
alguno de los otros xenoinjertos. No se detectaron mensajes en la
próstata normal.
La presente invención no debe estar limitada en
su alcance por las realizaciones que se describen en el presente
documento, que se pretende que sean ilustraciones únicas de aspectos
individuales de la invención, y cualquiera que sea funcionalmente
equivalente está dentro del alcance de la invención. Para los
expertos en la técnica serán obvias diversas modificaciones de los
modelos y procedimientos de la invención, además de los descritos
en el presente documento, a partir de la descripción y enseñanzas
anteriores, e igualmente se pretende que entren dentro del alcance
de la invención.
Claims (8)
1. Un polinucleótido aislado que se selecciona
del grupo constituido por
(a) un polinucleótido que tiene la secuencia que
se muestra en la Fig. 1A, en la que T también puede ser U;
(b) un polinucleótido que tiene la secuencia que
se muestra en la Fig. 1, desde el resto nucleotídico número 236
hasta el resto nucleotídico número 1466, en la que T también puede
ser U;
(c) un polinucleótido que codifica un
polipéptido 22P4F11 cuya secuencia es codificada por el ADN
contenido en el plásmido que se ha depositado en la American Type
Culture Collection con el n.º de registro 98985; y
(d) un polinucleótido que codifica la proteína
22P4F11 que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la
Fig. 1A.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un polinucleótido aislado que selectivamente
se hibrida en condiciones rigurosas a un polinucleótido de acuerdo
con la reivindicación 1, distinto de la secuencia:
3. Un fragmento aislado de un polinucleótido de
acuerdo con la reivindicación 1 que tiene al menos 20 bases
nucleotídicas de longitud.
4. Un polinucleótido aislado que es totalmente
complementario a un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3.
5. Un polinucleótido aislado de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que está marcado con un
marcador detectable.
6. Un ensayo para detectar la presencia de un
polinucleótido 22P4F11 en una muestra biológica, que comprende
(a) poner en contacto la muestra con una sonda
polinucleotídica que se hibrida específicamente al ADNc de 22P4F11
contenido en el plásmido depositado en la American Type Culture
Collection con el n.º de registro 98985, el polinucleótido que se
muestra en la Fig. 1A, o los complementos de los mismos; y
(b) detectar la presencia de un complejo de
hibridación formado por la hibridación de la sonda con el
polinucleótido 22P4F11 en la muestra, indicando la presencia del
complejo de hibridación la presencia del polinucleótido 22P4F11 en
la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Un ensayo para detectar la presencia de ARNm
de 22P4F11 en una muestra biológica, que comprende:
(a) producir ADN a partir de la muestra mediante
transcripción inversa usando al menos un cebador;
(b) amplificar el ADNc así producido usando los
polinucleótidos 22P4F11 como cebadores de transcripción y
complementario para amplificar los ADNc de 22P4F11 contenidos en
ella;
(c) detectar la presencia del ADNc de 22P4F11
amplificado,
en el que los polinucleótidos 22P4F11 que se
usan como sondas de transcripción y complementario son capaces de
amplificar el ADNc de 22P4F11 contenido en el plásmido depositado en
la American Type Culture Collection con el n.º de registro
98985.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Un procedimiento para diagnosticar la
presencia de cáncer de próstata en un individuo que comprende:
(a) obtener una muestra de tejido de prueba del
individuo;
(b) determinar el nivel de ARNm de 22P4F11
expresado en la muestra de prueba;
(c) comparar el nivel así determinado con el
nivel de ARNm de 22P4F11 expresado en una muestra de tejido normal
conocida comparable,
\vskip1.000000\baselineskip
en la que la presencia de una expresión elevada
de ARNm de 22P4F11 en la muestra de prueba con respecto a la
muestra de tejido normal proporciona una indicación de la presencia
de cáncer de próstata, siendo dicho ARNm de 22P4F11 un
polinucleótido que tiene la secuencia que se muestra en la figura
1A, en la que T es U, o es un polinucleótido cuya secuencia es la
del ADNc contenido en el plásmido depositado en la American Type
Culture Collection con el n.º de registro 98985, en la que T es
U.
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