ES2320606T3 - Psca:antigeno de celula madre prostatica y sus utilizaciones. - Google Patents

Abstract

Hibridoma denominado ATCC nº HB-12612 que produce un anticuerpo monoclonal.

Description

PSCA: antígeno de célula madre prostática y sus utilizaciones.

Antecedentes de la invención

En la actualidad, el cáncer prostático es el tipo más común de cáncer en la población estadounidense masculina y la segunda causa de muerte relacionada con el cáncer en esta población. En sus etapas avanzadas, el cáncer prostático se extiende preferentemente al hueso, en el que forma lesiones osteoblásticas. Tras el tratamiento inicial con terapia de ablación de andrógenos, la mayoría de cánceres de próstata metastásicos se vuelven refractarios a las hormonas y letales. Las modalidades diagnósticas y terapéuticas actuales se encuentran limitadas por la falta de especificidad y la incapacidad de predecir qué pacientes presentan riesgo de desarrollar una enfermedad metastásica.

La mayoría de cánceres de próstata inicialmente se produce en la zona periférica de la glándula prostática, lejos de la uretra. Los tumores dentro de esta zona pueden no producir ningún síntoma y, en consecuencia, la mayoría de hombres con cáncer prostático de estadio temprano no presentan síntomas clínicos de la enfermedad hasta que se ha dado una progresión significativa. La progresión del tumor hasta la zona de transición de la próstata puede conducir a la obstrucción uretral, causando de esta manera los primeros síntomas de la enfermedad. Sin embargo, estos síntomas clínicos no pueden distinguirse de la condición no maligna común de la hiperplasia prostática benigna (BPH).

Uno de los problemas fundamentales en el diagnóstico y tratamiento del cáncer prostático es la falta de un marcador que pueda detectar con exactitud los tumores localizados de estadio temprano. Aunque se han identificado varios marcadores y algunos, por ejemplo PSA, se utilizan ampliamente en el contexto clínico, el marcador ideal del tumor prostático todavía no ha sido caracterizado. Un problema análogo es la falta de un marcador prognóstico efectivo para determinar qué cánceres son indolentes y cuáles son o serán agresivos. PSA, por ejemplo, no consigue discriminar con exactitud los cánceres indolentes de los agresivos. Además, también existe una gran necesidad de marcadores que puedan servir como dianas para los procedimientos terapéuticos, tales como la terapia dirigida por anticuerpos, la inmunoterapia y la terapia génica.

En la actualidad no existe ningún tratamiento efectivo para el 20% a 40% de pacientes que desarrolla una enfermedad recurrente tras la cirugía o la terapia de radiación, o para aquellos pacientes que presentan enfermedad metastásica en el momento del diagnóstico. Aunque la terapia de ablación hormonal puede aliviar a estos pacientes, la mayoría inevitablemente progresa hasta la enfermedad incurable independiente de andrógenos (Lalani et al., Cancer Metastasis Rev. 16:29-66, 1997).

La detección y diagnóstico precoces del cáncer prostático se basa actualmente en los exámenes rectales digitales (DRE), en mediciones de antígeno específico prostático (PSA), en la ultrasonografía transrectal (TRUS) y en la biopsia con aguja transrectal (TRNB). En la actualidad, la medición del PSA sérico en combinación con el DRE representa la herramienta principal utilizada para detectar y diagnosticar el cáncer prostático. Ambas presentan limitaciones importantes que han alimentado la investigación intensiva para encontrar mejores marcadores diagnósticos de esta enfermedad.

Actualmente, el PSA es el marcador tumoral más ampliamente utilizado para el cribado, diagnóstico y seguimiento del cáncer prostático. En particular, varios inmunoensayos para la detección del PSA sérico se utilizan ampliamente en el contexto clínico. Recientemente se ha desarrollado una reacción en cadena de la transcriptasa inversa-polimerasa (RT-PCR) para el ARNm de PSA sérico. Sin embargo, PSA no es un marcador específico de la enfermedad, debido a que los niveles elevados de PSA son detectables en un gran porcentaje de los pacientes con BPH y con prostatitis (25% a 86%) (Gao et al., Prostate 31:264-281, 1997), así como en otros trastornos no malignos y en algunos hombres normales, un factor que limita significativamente la especificidad diagnóstica de este marcador. Por ejemplo, se observan elevaciones del PSA sérico de entre 4 y 10 ng/ml en la BPH, y se observan valores incluso más altos en la prostatitis, particularmente en la prostatitis aguda. La BPH es una condición extremadamente común en hombres. Es un elemento de confusión adicional que puedan observarse elevaciones del PSA sérico sin ninguna indicación de la enfermedad según la DRE, y viceversa. Además, ahora se admite que el PSA no es específico de la próstata (Gao et al., supra, para una revisión).

Se han descrito diversos procedimientos diseñados para mejorar la especificidad de la detección basada en PSA, tal como medir la densidad de PSA y la proporción entre PSA libre y PSA acomplejado. Sin embargo, ninguna de estas metodologías han sido capaz de distinguir entre la enfermedad prostática benigna y la maligna. Además, los diagnósticos de PSA presentan sensibilidades de entre 57% y 79% (Cupp y Osterling, Mayo Clin. Proc. 68:297-306, 1993) y de esta manera no consiguen identificar el cáncer prostático en una población significativa de hombres que sí presentan la enfermedad.

El antígeno membranal específico prostático (PSMA) del cáncer prostático es un marcador de superficie celular descrito recientemente que ha sido objeto de diversos estudios que han evaluado su uso como marcador diagnóstico y terapéutico. La expresión de PSMA se restringe en gran parte a los tejidos prostáticos, aunque se han observado niveles detectables de ARNm de PSMA en cerebro, glándula salivar, intestino delgado y carcinoma de células renales (Israeli et al., Cancer Res. 53:227-230, 1993). La proteína PSMA presentan niveles elevados de expresión en la mayoría de los cánceres de próstata primarios y metastásicos, aunque también se expresa en la mayoría de especímenes de neoplasia intraepitelial normal (Gao et al., supra). Los resultados preliminares con un anticuerpo monoclonal (mAb) anti-PSAM marcado con indio-111 para producir imágenes del cáncer prostático recurrente resultan prometedores (Sodee et al., Clin. Nuc. Med. 21:759-766, 1996). Todavía no se ha determinado si PSMA demostrará ser una diana terapéutica útil. Sin embargo, PSMA es un antígeno dependiente de hormonas que requiere la presencia de receptor de andrógeno funcional. Debido a que la mayoría de células de cáncer prostático expresan el receptor de andrógeno, la utilidad del PSMA como diana terapéutica podría encontrarse inherentemente limitada.

La identificación del estadio clínico del cáncer prostático es otro problema fundamental para los urólogos hoy en día. En la actualidad la identificación del estadio clínico se basa en el examen rectal para determinar si el tumor sigue dentro de los límites de la cápsula prostática (se encuentra confinado localmente) o se extiende más allá de la misma (estadio avanzado localmente), en combinación con determinaciones de PSA sérico y biopsias transrectales guiadas por ultrasonidos. Sin embargo, debido a la subjetividad que implica, la identificación del estadio clínico mediante DRE regularmente infraestima o sobreestima la extensión local del tumor, con frecuencia juzga erróneamente su localización y se correlaciona pobremente con el volumen y extensión del tumor (Lee, C.T. y Osterling, J.E., Cancer of the Prostate: Diagnosis and Staging, en: Urologic Oncology, W.B. Saunders Company, Philadelphia, páginas 357 a 377, 1997). También se utilizan los niveles séricos de PSA con el fin de identificar el estadio, aunque el PSA por sí solo no ha sido capaz de identificar fiablemente el estadio de los tumores prostáticos. Ninguna técnica ha demostrado ser fiable para predecir la progresión de la enfermedad. De esta manera, existe una necesidad de procedimientos más fiables e informativos para identificar el estadio y prognósticos en el control del cáncer prostático.

Sumario de la invención

El antígeno de células madre prostáticas (PSCA) es un nuevo antígeno de superficie celular prostático que se encuentra ampliamente sobreexpresado en todos los estadios del cáncer prostático, incluyendo la neoplasia intraepitelial prostática (PIN) de grado alto y los tumores prostáticos dependientes e independientes de andrógenos. El gen PSCA muestra una homología de 30% con el antígeno 2 de las células madre (SCA-2), un miembro de la familia Thi-1/Ly-6 de antígenos de superficie celular anclados por glucosilfosfatidilinositol (GPI), y codifica una proteína de 123 aminoácidos con una secuencia de señal aminoterminal, una secuencia de anclaje GPI carboxi-terminal y múltiples sitios de N-glucosilación. La expresión de ARNm de PSCA se encuentra altamente regulada positivamente en los xenoinjertos de cáncer prostático dependientes e independientes de andrógenos. El análisis del ARNm in situ localiza la expresión de PSCA en el epitelio de células basales, el compartimiento putativo de las células madre prostáticas. El análisis de citometría de flujo demuestra que PSCA se expresa predominantemente sobre la superficie celular y que se encuentra anclado por un enlace GPI. El análisis de hibridación in situ fluorescente localiza el gen PSCA en el cromosoma 8q24.2, una región de ganancia alélica en más de 80% de los cánceres prostáticos.

PSCA puede ser una diana terapéutica óptima en vista de su localización en la superficie celular y la expresión fuertemente regulada en sentido positivo en determinados tipos de cáncer, tales como las células de cáncer prostático. A este respecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma denominado ATCC nº HB-12612, capaz de unirse a PSCA que puede utilizarse terapéuticamente para destruir dichas células de cáncer prostático.

El PSCA podría representar asimismo un marcador ideal del cáncer prostático que podría utilizarse para discriminar entre los cánceres de próstata malignos, las glándulas prostáticas normales y las neoplasias no malignas. Por ejemplo, PSCA se expresa a niveles muy elevados en el cáncer prostático comparado con la hiperplasia prostática benigna (BPH). Por el contrario, el ampliamente utilizado marcador PSA del cáncer prostático se expresa a niveles elevados tanto en la próstata normal como en la BPH, aunque a niveles más bajos en el cáncer prostático, provocando que la expresión de PSA resulte inútil para distinguir entre el cáncer prostático maligno y la BPH o las glándulas normales. Debido a que la expresión de PSCA esencialmente es la inversa de la expresión de PSA, el análisis de la expresión de PSCA puede utilizarse para distinguir el cáncer prostático de las condiciones no malignas.

Asimismo, la invención proporciona diversos ensayos inmunológicos para la detección, seguimiento y prognosis del cáncer prostático. También se proporcionan anticuerpos monoclonales y policlonales específicos de PSCA e inmunoterapéutica y otros procedimientos terapéuticos de tratamiento del cáncer prostático. Éste y otros aspectos de la invención se describen en más detalle posteriormente.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1. Secuencias de nucleótidos (A) y traducidas de aminoácidos (B) de un ADNc codificante de PSCA humano (ATCC denominación nº 209612).

Fig. 2. Secuencia de nucleótidos de un ADNc codificante de un homólogo murino de PSCA.

Fig. 3. Alineación de las secuencias de aminoácidos de PSCA humano, PSCA murino y antígeno 2 de células madre humanas (hSCA-2). Las regiones sombreadas señalan los aminoácidos conservados. Las cisteínas conservadas se indican en negrita. Se indican con asteriscos cuatro sitios de N-glucosilación predecidos en PSCA. Los aminoácidos subrayados al inicio y final de la proteína representan las secuencias de señal hidrofóbicas N-terminales y las secuencias C-terminales de anclaje GPI, respectivamente.

Fig. 4. Gráfico de hidrofobicidad del PSCA humano.

Fig. 5. Análisis de Chou-Fassman del PSCA humano.

Fig. 6. Transferencia western que muestra que el anticuerpo monoclonal 1G8 se une a LAPC9 (control PSCA-positivo) y a un carcinoma de células transicionales (carcinoma de vejiga) denominado "Bladder" (Rob).

Fig. 7. Expresión restringida de ARNm de PSCA en tejidos normales y cancerosos. A: análisis de RT-PCR de la expresión de PSCA en tejidos humanos normales que demuestra un nivel elevado de expresión en próstata, placenta y amígdalas. Se amplificó 1 ng de primera cadena de ADNc transcrito inversamente (Clontech, Palo Alto, CA) procedente de los tejidos indicados, con cebadores específicos del gen PSCA. Los datos mostrados son de 30 ciclos de amplificación. B: análisis de RT-PCR de la expresión de PSCA, que demuestra un nivel elevado en xenoinjertos de cáncer prostático y en tejido normal. Utilizando cebadores específicos del gen PSCA se amplificaron 5 ng de ADNc transcrito inversamente procedente de los tejidos indicados. La amplificación con cebadores específicos del gen \beta-actina demuestra la normalización de la primera cadena de ADNc de las diversas muestras. Los datos mostrados son de 25 ciclos de amplificación. AD, dependiente de andrógenos; AI, independiente de andrógenos; IT, xenoinjerto intratibial; C.L., línea celular.

Fig. 8. Representación esquemática del PSCA humano, del PSCA murino y de las estructuras del gen Thy-1/Ly-6 humano.

Fig. 9. Análisis de transferencia northern de la expresión de ARN de PSCA. A: se analizó el ARN total de próstata normal y de xenoinjertos de cáncer prostático LAPC-4 dependiente (AD) e independiente (AI) de andrógenos utilizando sondas específicas de PSCA o de PSA. Se demostraron separadamente carga equivalente de ARN e integridad del mismo mediante tinción de etidio para los ARN 18S y 28S. B: análisis de transferencia northern de múltiples tejidos humanos del ARN de PSCA. El filtro se obtuvo de Clontech (Palo Alto, CA) y contenía 2 \mug de ARN poliA en cada carril.

Fig. 10. Comparación de la transferencia northern de la expresión de ARN de PSCA, PSMA y PSA en xenoinjertos de cáncer prostático y en líneas celulares tumorales. PSCA y PSMA demostraron un nivel elevado de expresión génica específica del cáncer prostático. Se fraccionaron por tamaños en un gel de agarosa/formaldehído 10 \mug de ARN total de los tejidos indicados, se transfirieron a nitrocelulosa y se hibridaron secuencialmente con sondas marcadas con ^{32}P, representando los fragmentos de ADNc de PSCA, PSMA y PSA. Se muestran las exposiciones autorradiográficas de 4 horas y de 72 horas de la membrana y el gel de bromuro de etidio que demuestra la carga equivalente de las muestras. BPH, hiperplasia prostática benigna; AD, dependiente de andrógenos; AI, independiente de andrógenos; IT, xenoinjerto intratibial; C.L., línea celular.

Fig. 11. Hibridación in situ con ribosonda antisentido para ARN de PSCA humano en especímenes de próstata normales y malignos. A: un subconjunto de células basales dentro del epitelio de células basales (flechas negras) expresa ARN de PSCA, pero no por las células secretorias terminalmente diferenciadas que revisten los conductos prostáticos (magnificación: 400X). B: se expresa fuertemente en una neoplasia intraepitelial prostática (PIN) (flecha negra) de grado alto ARN de PSCA, y en glándulas prostáticas con cáncer invasivo (flechas amarillas), aunque no resulta detectable en epitelio normal (flecha verde) a una magnificación de 40X. C: expresión fuerte de ARN de PSCA en un caso de carcinoma de grado alto (magnificación: 200X).

Fig. 12. análisis bioquímica de la proteína PSCA. A: se inmunoprecipitó la proteína PSCA a partir de células 293T transfectadas transitoriamente con un constructo de PSCA y después se digirió con N-glucosidasa F o con O-glucosidasa, tal como se describe en Materiales y Métodos. B: se inmunoprecipitó proteína PSCA a partir de células 293T transfectadas, así como de medio condicionado de dichas células. PSCA asociado a células migra más alto que PSCA secretado o desprendido en un gel de poliacrilamida al 15%. C: análisis de FACS de células 293T falsamente transfectadas, células 293T transfectadas por PSCA y células de xenoinjerto de cáncer prostático LAPC-4 utilizando un anticuerpo anti-PSCA policlonal purificado por afinidad. Las células no se permeabilizaron con el fin de detectar únicamente la expresión en superficie. El eje y representa el número celular relativo y el eje x representa la intensidad de tinción fluorescente en una escala logarítmica.

Fig. 13. Hibridación in situ de sondas de PSCA marcadas con biotina a células metafásicas humanas de linfocitos de sangre periférica estimuladas por fitohemaglutinina. Se identificaron los homólogos del cromosoma 8 con flechas, se observó marcaje específico en 8q24.2. Las fotografías insertas muestran cariotipos parciales de dos homólogos de cromosoma 8 que ilustran el marcaje específico en 8q24.2 (cabezas de flecha). Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio Zeiss Axiophot acoplado a una cámara dispositivo de carga acoplada (CCD) enfriada. Se unieron imágenes separadas de cromosomas teñidos con DAPI y la señal de hibridación utilizando software de análisis de imágenes (NU200 e Imge 1.57).

Fig. 14. Análisis de citometría de flujo de la expresión de proteína PSCA en superficie celular en xenoinjerto de cáncer prostático (LAPC-9), línea celular de cáncer prostático (LAPC-4) y células de epitelio prostático normal (PreC) utilizando anticuerpos monoclonales anti-PSCA 1G8 (verde) y 3E6 (rojo), suero policlonal anti-PSCA de ratón o anticuerpo secundario de control (negro). Véase el Ejemplo 5 para más detalles.

Fig. 15 (a). Mapa de epítopos para cada uno de los siete anticuerpos dados a conocer. (b) Mapado de epítopos de los anticuerpos monoclonales anti-PSCA llevado a cabo mediante análisis de transferencia western de proteínas de fusión GST-PSCA.

Fig. 16. Diagrama esquemático que muestra que PSCA es una proteína anclada por GPI.

Fig. 17. Fotografía que muestra un análisis FISH de PSCA y del número de copia génica de c-myc en el cáncer prostático.

Fig. 18. Fotografía que muestra que los anticuerpos 1G8 marcados con FITC se unen fuertemente a proteína PSCA en células LNCAP transfectadas por PSCA.

Fig. 19. Fotografía que muestra que los anticuerpos 1G8 marcados con FITC se unen débilmente a las células PreC.

Fig. 20. Fotografía que muestra la hibridación in situ de ARN de PSCA en células basales prostáticas normales.

Fig. 21. Inmunotinción de PSCA en cánceres prostáticos primarios. Se tiñeron con mAbs anti-PSCA secciones representativas incluidas en parafina procedentes de cuatro pacientes. El espécimen procedente del paciente 1 mostraba sobreexpresión de la proteína PSCA en un tumor de grado 4 de Gleason (flecha) y un nivel indetectable de expresión de PSCA en glándulas normales contiguas (cabeza de flecha) con mAb 1G8 PSCA. El cáncer teñido positivamente circundaba completamente las glándulas normales. El espécimen procedente del paciente 2 mostraba tinción heterogénea en un cáncer de grado 3 + 3/4 de Gleason. Las glándulas de patrón 3 de Gleason (cabeza de flecha) se tiñeron débilmente en comparación con las glándulas de patrón 3/4 de Gleason (flecha), de apariencia más cribiforme. El espécimen procedente del paciente 3 mostraba un nivel fuerte de expresión de PSCA en un tumor de grado 5 de Gleason (flecha) pobremente diferenciado con mAb 1G8. El paciente 4 era un espécimen de biopsia que no mostraba tinción de PSCA en la mayor parte de un tumor pobremente diferenciado (cabeza de flecha) y tinción extremadamente débil en un foco
cribiforme identificado en el espécimen. La metástasis ósea correspondiente del paciente 4 se muestra en la figura 28.

Fig. 22. Fotografía de una muestra de hueso que muestra metástasis óseas de cáncer prostático según se determinó mediante anticuerpo monoclonal 1G8 biotinilado ligado a estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante.

Fig. 23. Fotografía de una muestra de hueso que muestra metástasis óseas de cáncer prostático según se determinó con un anticuerpo monoclonal 1G8 biotinilado ligado a estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante.

Fig. 24. Fotografía de una muestra de hueso que muestra metástasis óseas según se determinó con un anticuerpo monoclonal 3E6 biotinilado ligado a estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante.

Fig. 25. Transferencia northern que muestra un nivel incrementado de ARN de PSCA en carcinoma LAPC9 y de células transicionales de un carcinoma avanzado de vejiga.

Fig. 26. Fotografía de un tejido con cáncer prostático de estadio temprano según se determinó con anticuerpo monoclonal 3E6 biotinilado ligado a estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante.

Fig. 27. Fotografía de una muestra de hueso que muestra metástasis óseas de cáncer prostático según se determinó con anticuerpo monoclonal 3E6 teñido con hematoxilina.

Fig. 28. Inmunotinción de PSCA en metástasis óseas de cáncer prostático. El panel superior muestra la tinción de hematoxilina-eosina (izquierda) y de PSCA (derecha) de una lesión ósea procedente del paciente 5. Se identificó un único foco sospechoso de cáncer (flecha) en la sección H y E, y se confirmó mediante tinción intensa con mAb 1G8 anti-PSCA (flecha). El panel inferior muestra la tinción H y E (izquierda) y PSCA de una lesión ósea procedente del paciente 4. La lesión primaria del paciente 4 se ilustra en la figura 21. Las lesiones tanto H y E como PSCA muestran una implicación ósea difusa del cáncer prostático (flechas). Nuevamente la inmunotinción de PSCA en las metástasis óseas era uniforme e intensa.

Fig. 29. Fotografía de un tejido con cáncer prostático de estadio temprano según se determinó con anticuerpo monoclonal 1G8 biotinilado ligado a estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante.

Fig. 30. Fotografía que muestra que 1G8 se une a células LAPC9 según se determinó mediante tinción de hematoxilina.

Fig. 31. Fotografía que muestra que 1G8 se une a células LnCaP transfectadas por PSCA.

Fig. 32. Fotografía que muestra que 1G8 no se une a células LnCaP (no transfectadas con PSCA).

Fig. 33. Reconocimiento con citometría de flujo de PSCA sobre la superficie celular de células no permeabilizadas de cáncer prostático humano LAPC-9 utilizando los mAbs 1G8, 2H9, 3E6, 3C5 y 4A10. Se comparó la tinción con un anticuerpo de control de isotipo no relevante.

Fig. 34. Fotografía que muestra células 293T transfectadas transitoriamente con PSCA e inmunotransferido con anticuerpos monoclonales PSCA. Los anticuerpos monoclonales 2H9 y 3E6 se unen a PSCA desglucosilado pero no se unen a PSCA glucosilado en células 293T. En contraste, los anticuerpos monoclonales 1G8, 3C5 y 4A10 reconocen PSCA desglucosilado.

Fig. 35. Análisis de inmunofluorescencia que demuestra la expresión en superficie celular de PSCA en células no permeabilizadas de cáncer prostático. Se transfectaron establemente células LNCaP con PSCA teñido con los mAbs 1G8, 3E6, 3C5 y 4A10. Entre los controles negativos se incluían anticuerpo de isotipo irrelevante y células LNCaP transfectadas con vector de control, la totalidad de los cuales no mostraron tinción incluso tras exposiciones prolongadas.

Fig. 36. Fotografía que muestra que el anticuerpo monoclonal 2H9 se une a células LAPC9.

Fig. 37. Fotografía que muestra la reactividad inmunológico de los mAbs anti-PSCA. (A) Inmunoprecipitación de PSCA de células 293T transfectadas transitoriamente con PSCA utilizando los mAbs 1G8, 2H9, 3C5, 3E6 y 4A10. El control era un mAb de IgG murino irrelevante. (B) Análisis de inmunotransferencia de células 293T transfectadas transitoriamente con PSCA utilizando cinco mAbs anti-PSCA. Los mAbs 1G8, 3C5 y 4A10 reconocen formas moleculares equivalentes de PSCA, mientras que los mAbs 2H9 y 3E6 reconocen sólo débilmente las formas desglucosiladas de PSCA en las células 293T-PSCA en este ensayo.

Fig. 38. Tinción inmunohistoquímica de próstata normal con mAbs anti-PSCA. Entre los ejemplos mostrados se incluyen una glándula normal teñida con un anticuerpo de isotipo irrelevante como control negativo (flecha), PSCA mAb 3E6 y mAb 1G8. PSCA mAb 3E6 tiñe preferentemente células basales (flecha) en comparación con las células secretorias (cabeza de flecha), mientras que mAb 1G8 tiñe las células tanto basales (flecha) como secretorias (cabeza de flecha) igualmente. Asimismo, se muestra la tinción fuerte de una glándula monocapa atrófica procedente de un espécimen de próstata normal teñido con PSCA mAb 2H9.

Fig. 39. Expresión de proteína PSCA en tejidos normales. (A) El panel a muestra la tinción de epitelio transicional de vejiga con mAb 1G8. El panel b muestra la tinción de células neuroendocrinas colónicas con mAb 1G8. La tinción doble con cromogranina confirmó que las células positivas eran de origen neuroendocrino (no mostrado). El panel c muestra la tinción de conductos y túbulos recolectores (flecha) con mAb 3E6. El panel d muestra la tinción de trofoblastos placentarios con mAb 3E6. (B) Análisis de transferencia northern de la expresión de ARNm de PSCA. Se analizó el ARN total de próstata, riñón y vejiga normales, y del xenoinjerto de cáncer prostático LAPC-9 utilizando una sonda específica de PSCA (panel superior). Se sondeó la misma membrana con actina para controlar las diferencias de carga (panel inferior).

Fig. 40. Reconocimiento del gen de PSCA de ratón. (A) El panel a es un dibujo esquemático que muestra una estrategia para crear un vector de reconocimiento de PSCA. (B) El panel b es una fotografía de un análisis de transferencia southern de ADN genómico utilizando una sonda 3' que muestra la recuperación de células ES de tipo salvaje (+/+) y heterocigóticas (+/-).

Fig. 41. El panel superior es un dibujo esquemático de una estrategia para generar modelos de ratón transgénico del cáncer prostático. El panel inferior es una lista de modelos de ratón transgénico existentes del cáncer prostático.

Fig. 42. Dibujo esquemático que muestra constructos de gen informador para el ensayo de transfección.

Fig. 43. Gráfico de columnas que muestra la expresión predominante en un tejido (células de próstata y de vejiga) de la región reguladora corriente arriba de 9kb de PSCA humano que presenta actividad incrementada de expresión génica.

Fig. 44. Gráficos de columnas que identifican los elementos de expresión predominantes en la próstata dentro de las regiones corriente arriba de PSCA que presentan actividad incrementada de expresión génica, es decir las regiones PSCA de 9kb, de 6 kb, de 3 kb y de 1 kb.

Fig. 45. Dibujo esquemático que muestra el diseño de vectores transgénicos que contienen una región corriente arriba de PSCA humano de 9kb o de 6 kb operablemente ligada a un marcador detectable.

Fig. 46. Fotografías que muestran que la región corriente arriba de PSCA de 9 kb controla la expresión de gen informador en próstata, vejiga y piel in vivo.

Fig. 47. Fotografías de análisis de transferencia northern de múltiples tejidos que muestra los patrones de expresión específicos de tejido de ARN de PSCA humano y murino.

Descripción detallada de la invención

PSCA es un antígeno de superficie celular anclado por glucosilfosfatidilinositol (GPI) que se expresa en células normales, tales como células prostáticas, urotelio, conductos renales recolectores, células neuroendocrinas colónicas, placenta, vejiga normal y células epiteliales transicionales de uretra (fig. 16). PSCA, además de en células normales, también se sobreexpresa en células de cáncer prostático tanto dependientes como independientes de andrógenos (figs. 9 a 11), metástasis de cáncer prostático a hueso (figs. 20 a 24 y 26 a 32) y carcinomas de vejiga (figs. 6 y 25). La expresión de PSCA en el cáncer, por ejemplo el cáncer prostático, aparentemente se correlaciona con un grado creciente. Además, la sobreexpresión de PSCA (es decir, una expresión más alta que la encontrada en células normales) en pacientes que sufren cáncer, por ejemplo cáncer prostático, aparentemente es indicativa de mal prognóstico.

Un subconjunto de células basales en la próstata normal también expresa el ARNm de PSCA. Se cree que el epitelio de células basales contiene las células progenitoras para las células secretorias terminalmente diferenciadas (Bonkhoff et al., Prostate 24:114-118, 1994). Recientes estudios con marcadores de citoqueratina sugieren que el epitelio de células basales contiene por lo menos dos subpoblaciones celulares diferentes, una que expresa las citoqueratinas 5 y 14, y la otra, las citoqueratinas 5, 8 y 18 (Bonkhoff y Remberger, Prostate 28:98-106, 1996). El resultado de que PSCA se expresa sólo en un subconjunto de células basales sugiere que PSCA podría ser un marcador para una de estos dos linajes de células basales.

Se desconoce cuál es la función biológica de PSCA. La familia del gen Ly-6 está implicada en diversas funciones celulares, incluyendo la transducción de señales y la adhesión célula a célula. Se ha demostrado que la señalización a través de SCA-2 evita la apóptosis en timocitos inmaduros (Noda et al., J. Exp. Med. 183:2355-2360, 1996). Thy-1 se encuentra implicado en la activación de las células T y transmite señales a través de las tirosina quinasas de tipo sr (Thomas et al., J. Biol. Chem. 267:12317-12322, 1992). Los genes Ly-6 se han implicado tanto en la tumorigénesis como en la adhesión celular homotípica (Bamezai y Rock, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4294-4298, 1995; Katz et al., Int. J. Cancer 59:684-691, 1994; Brakenhoff et al., J. Cell Biol. 129:1677-1689, 1995). Basándose en la expresión restringida de dichos genes en las células basales y en la homología de los mismos respecto a Sca-2, los presentes inventores plantearon la hipótesis de que PSCA podría desempeñar un papel clave en las funciones de las células madre/progenitoras, tales como la autorenovación (antiapóptosis) y/o la proliferación.

PSCA se encuentra altamente conservado en ratones y seres humanos. La identificación de un gen conservado que se encuentra predominantemente restringido a la próstata apoya la hipótesis de que PSCA podría desempeñar un papel importante en el desarrollo de la próstata normal.

En sus diversos aspectos, tal como se describe en detalle posteriormente, la presente invención proporciona proteínas PSCA, anticuerpos, moléculas de ácidos nucleicos, moléculas de ADN recombinante, células huésped transformadas, procedimientos de generación, ensayos, procedimientos inmunoterapéuticos, animales transgénicos, ensayos inmunológicos y basados en ácidos nucleicos y composiciones.

Proteínas PSCA

Tal como se utiliza en la presente memoria, PSCA se refiere a una proteína que presenta la secuencia de aminoácidos de PSCA humano, tal como se proporciona en las figs. 1B y 3, la secuencia de aminoácidos del homólogo murino de PSCA tal como se proporciona en la fig. 3, o la secuencia de aminoácidos de otros homólogos de mamífero de PSCA, así como variantes alélicas y mutantes por sustitución conservativa de estas proteínas que presentan actividad de PSCA. Las proteínas PSCA incluyen las variantes específicamente identificadas y caracterizadas indicadas en la presente memoria, así como las variantes alélicas, variantes y homólogos de sustitución conservativa que pueden aislarse/generarse y caracterizarse sin experimentación indebida siguiendo los procedimientos descritos de manera general posteriormente. Por conveniencia todas las proteínas PSCA se denominan colectivamente proteínas PSCA o PSCA.

El término "PSCA" incluye todas las variantes alélicas, isoformas y precursores naturales de PSCA humana tal como se proporcionan en las figs. 1B y 3 y el PSCA murino tal como se proporciona en la fig. 3. En general, por ejemplo las variantes alélicas naturales de PSCA humano comparten una homología significativa (por ejemplo 70% a 90%) con la secuencia de aminoácidos de PSCA proporcionada en las figs. 1B y 3. Las variantes alélicas, aunque presenten una secuencia de aminoácidos ligeramente diferente, pueden expresarse sobre la superficie de células prostáticas en forma de proteína ligada por GPI o puede secretarse o desprenderse. Típicamente, las variantes alélicas de la proteína PSCA contiene sustituciones conservativas de aminoácidos respecto a la secuencia de PSCA indicada en la presente memoria, o contiene una sustitución de un aminoácido de una posición correspondiente en un homólogo de PSCA tal como, por ejemplo, el homólogo murino de PSCA indicado en la presente memoria.

Una clase de variantes alélicas de PSCA son proteínas que comparten un grado elevado de homología con por lo menos una región pequeña de las secuencias de aminoácidos de PSCA presentadas en las figs. 1B y 3, aunque también contienen una diferencia radical respecto a la secuencia, tal como una sustitución no conservativa, truncado, inserción o desplazamiento de marco. Estos alelos se denominan alelos mutantes de PSCA y representan proteínas que típicamente no llevan a cabo las mismas funciones biológicas.

Las sustituciones conservativas de aminoácidos frecuentemente pueden realizarse en una proteína sin alterar ni la conformación ni la función de la proteína. Entre estos cambios se incluyen sustituir cualquiera de entre isoleucina (I), valina (V) y leucina (L) por cualquier otro de estos aminoácidos hidrofóbicos; ácido aspártico (D) por ácido glutámico (E) y viceversa; glutamina (Q) por asparagina (N) y viceversa, y serina (S) por treonina (T) y viceversa. Asimismo, pueden considerarse conservativas otras sustituciones, dependiendo del ambiente del aminoácido particular y el papel del mismo en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, glicina (G) y alanina (A) con frecuencia puede ser intercambiable, al igual que alanina (A) y valina (V). La metionina (M), que es relativamente hidrofóbica, con frecuencia puede intercambiarse por leucina e isoleucina, y en ocasiones por valina. La lisina (K) y la arginina (R) con frecuencia son intercambiables en localizaciones en las que la característica significativa del residuo aminoácido es su carga y la diferencia entre las pKs de estos dos residuos aminoácidos no es significativa. Todavía otros cambios pueden considerarse "conservativos" en ambientes particulares.

La secuencia de aminoácidos de la proteína PSCA humana se proporciona en las figs. 1B y 3. El PSCA humano comprende una única subunidad de 123 aminoácidos y contiene una secuencia de señal aminoterminal, una secuencia carboxiterminal de anclaje por GPI y múltiples sitios de N-glucosilación. PSCA muestra una homología de 30% con el antígeno 2 de las células madre (SCA-2), un miembro de la familia de genes Thy-1/Ly-6, un grupo de proteínas de superficie celular que marcan las etapas más tempranas del desarrollo hematopoyético. La secuencia de aminoácidos de un homólogo murino de PSCA se muestra en la fig. 3. El PSCA murino es una proteína de una sola subunidad de 123 aminoácidos que presenta una homología de aproximadamente 70% con el PSCA humano y una organización estructural similar.

Las proteínas PSCA pueden realizarse en muchas formas, preferentemente en forma aislada. Tal como se utiliza en la presente memoria, una proteína se dice que ha sido aislada al utilizar procedimientos físicos, mecánicos o químicos para separar la proteína PSCA de constituyentes celulares que normalmente se encuentran asociados a la proteína. Un experto en la materia puede utilizar fácilmente procedimientos de purificación estándar para obtener una proteína PSCA aislada. Una molécula de proteína PSCA purificada se encontrará sustancialmente libre de otras proteínas o moléculas que alteran la unión de PSCA al antígeno o a otro ligando. La naturaleza y grado de aislamiento y purificación dependerá del uso pretendido. Entre las realizaciones de la proteína PSCA se incluyen una proteína PSCA purificada y una proteína PSCA soluble funcional. Un ejemplo de una proteína PSCA soluble funcional presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la fig. 1B o un fragmento de la misma. En una forma, dichas proteínas PSCA solubles funcionales o fragmentos de las mismas conservan la capacidad de unirse a un anticuerpo o a otro ligando.

Se muestran en las figs. 1B y 3 péptidos que comprenden unos fragmentos biológicamente activos de las secuencias de aminoácidos de PSCA humano y murino. Por ejemplo, un fragmento peptídico que presenta la secuencia de aminoácidos TARIRAVGLLTVISK, un fragmento peptídico que presenta la secuencia de aminoácidos VDDSQDYYVGKK y SLNCVDDSQDYYVGK.

Los péptidos muestran propiedades de PSCA, tales como la capacidad de inducir la generación de anticuerpos que se unen específicamente a un epítopo asociado a PSCA. Estos fragmentos peptídicos de las proteínas PSCA pueden generarse utilizando tecnología de síntesis de péptidos y las secuencias de aminoácidos de las proteínas PSCA humanas o murinas. Alternativamente, pueden utilizarse procedimientos recombinantes para generar moléculas de ácidos nucleicos que codifican un fragmento de la proteína PSCA. A este respecto, las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de PSCA proporciona un medio para generar fragmentos definidos de PSCA.

Tal como se comentará posteriormente, los fragmentos peptídicos de PSCA resultan particularmente útiles en: la generación de anticuerpos específicos de dominio, la identificación de agentes que se unen a PSCA o a un dominio de PSCA; la identificación de factores celulares que se unen a PSCA o a un dominio de PSCA; y el aislamiento de homólogos u otras formas alélicas de PSCA humano. Los péptidos PSCA que contienen estructuras particularmente interesantes pueden predecirse y/o identificarse utilizando diversas técnicas analíticas bien conocidas de la técnica, incluyendo, por ejemplo, los procedimientos de análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf, o basándose en la inmunogenicidad. A título de ejemplos, se proporcionan en las figs. 4 y 5 la hidrofobicidad y los gráficos de Chou-Fasman del PSCA humano, respectivamente. Los fragmentos que contienen dichos residuos resultan particularmente útiles para generar anticuerpos anti-PSCA específicos de subunidad o para identificar factores celulares que se unen a PSCA.

Las proteínas PSCA pueden resultar útiles para una diversidad de fines, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, la utilización de los mismos como marcadores diagnósticos y/o prognósticos del cáncer prostático, la capacidad de inducir la generación de anticuerpos y como dianas para diversas modalidades terapéuticos, tal como se describe adicionalmente después. Las proteínas PSCA también pueden utilizarse para identificar y aislar ligandos y otros agentes que se unen a PSCA. En la próstata normal, PSCA se expresa exclusivamente en un subconjunto de células basales, sugiriendo que PSCA puede utilizarse como marcador para un linaje celular específico dentro del epitelio basal. Además, los resultados del solicitante sugieren que este conjunto de células basales representan la diana de la transformación neoplásica. De acuerdo con lo anterior, por ejemplo, pueden focalizarse específicamente en esta población celular mediante la proteína PSCA de superficie celular, estrategias terapéuticas diseñadas para eliminar o modular los factores moleculares responsables de la transformación.

Anticuerpos de PSCA

Asimismo, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma denominado ATCC nº HB-12.612 y anticuerpos humanizados derivados del mismo que se unen a PSCA. Los anticuerpos más preferentes se unen selectivamente a PSCA y no se unen (o se unen débilmente) a proteínas que no son PSCA. El anticuerpo anti-PSCA que se encuentra particularmente contemplado es un anticuerpo monoclonal, así como los fragmentos del mismo (por ejemplo proteínas recombinantes) que contienen el dominio ligante de antígeno y/o una o más regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo. Este anticuerpo procedente del ratón.

Los anticuerpos de PSCA se unen específicamente al dominio extracelular de una proteína PSCA, por ejemplo sobre la superficie celular de células de cáncer prostático procedentes de lesiones primarias y de metástasis óseas del cáncer prostático. Por ejemplo, los anticuerpos destinados a la utilización en un inmunoensayo para la detección de PSCA unido a membrana sobre células viables de cáncer prostático deben dirigirse a un epítopo accesible sobre el PSCA unido a membrana. Este tipo de anticuerpo se describe en los Ejemplos, posteriormente. La invención comprende asimismo unos fragmentos de anticuerpo que reconocen específicamente una proteína PSCA. Tal como se utiliza en la presente memoria, un fragmento de anticuerpo se define como por lo menos una parte de la región variable de la molécula de inmunoglobulina que se une a su diana, es decir, la región ligante de antígeno. Puede unirse parte de la región constante de la inmunoglobulina.

Por ejemplo, la sobreexpresión de PSCA en células de cáncer prostático tanto dependientes como independientes de andrógenos, y la localización en la superficie celular de PSCA representan características de un marcador excelente para los ensayos de cribado, diagnóstico, prognóstico y seguimiento y para procedimientos de obtención de imágenes. Además, estas características indican que PSCA podría ser una diana excelente para procedimientos terapéuticos tales como la terapia de anticuerpos dirigidos, la inmunoterapia y la terapia génica.

Los anticuerpos de PSCA de la invención pueden resultar particularmente útiles en ensayos diagnósticos, metodologías de obtención de imágenes y procedimientos terapéuticos en el control del cáncer prostático. La invención proporciona diversos ensayos inmunológicos útiles para la detección de proteínas PSCA y para el diagnóstico del cáncer prostático. Estos ensayos generalmente comprenden uno o más anticuerpos de PSCA capaces de reconocer y de unirse a una proteína PSCA, e incluyen diversos formatos de ensayo inmunológico bien conocidos de la técnica, aunque sin limitarse a los diversos tipos de precipitación, aglutinación, fijación del complemento, radioinmunoensayos (RIA), ensayos de inmunosorción ligada a enzima (ELISA), ensayos de inmunofluorescencia ligada a enzima (ELIFA) (H. Liu et al., Cancer Research 58:4055-4060, 1998), análisis inmunohistoquímica y similares. Además, la invención también proporciona procedimientos de obtención de imágenes inmunológicas capaces de detectar el cáncer prostático, incluyendo, aunque sin limitación, procedimientos radioescintigráficos de obtención de imágenes utilizando anticuerpos de PSCA marcados. Estos ensayos pueden resultar clínicamente útiles en la detección, seguimiento y prognóstico del cáncer prostático.

En una forma de realización, los anticuerpos de PSCA y fragmentos de los mismos (por ejemplo Fv, Fab', F(ab')2) se utilizaron para detectar la presencia de un cáncer prostático, carcinoma de vejiga, metástasis óseas del cáncer prostático, PIN o células epiteliales basales que expresan una proteína PSCA. La presencia de dichas células PSCA-positivas (+) dentro de diversas muestras biológicas, incluyendo suero, próstata y otros especímenes de biopsia de tejido, otros tejidos tales como hueso, orina, etc., puede detectarse con anticuerpos de PSCA. Además, los anticuerpos de PSCA pueden utilizarse en diversas metodologías de obtención de imágenes, tales como la inmunoescintigrafía con anticuerpo conjugado con indio-111 (u otro isótopo). Por ejemplo, puede utilizarse un protocolo de formación de imágenes similar al recientemente descrito en el que se utiliza un anticuerpo anti-PSMA conjugado con In-111, para detectar carcinomas prostáticos recurrentes y metastásicos (Sodee et al., Clin. Nuc. Med. 21:759-766, 1997). En relación a otros marcadores del cáncer prostático, tales como PSMA por ejemplo, PSCA puede resultar particularmente útil para reconocer células de cáncer prostático independientes de andrógeno. Los anticuerpos de PSCA pueden utilizarse asimismo terapéuticamente para inhibir la función de PSCA.

Los anticuerpos de PSCA también pueden utilizarse en procedimientos para purificar proteínas y péptidos PSCA y para aislar homólogos de PSCA y moléculas relacionadas. Por ejemplo, un procedimiento para purificar una proteína PSCA comprende incubar un anticuerpo de PSCA, que ha sido acoplado a una matriz sólida, con un lisado u otra solución que contiene PSCA bajo condiciones que permitan que el anticuerpo de PSCA se una a PSCA, lavar la matriz sólida para eliminar las impurezas y eluir el PSCA del anticuerpo acoplado. Además, los anticuerpos de PSCA pueden utilizarse para aislar células positivas para PSCA utilizando técnicas de separación celular y de purificación. La presencia de PSCA sobre las células tumorales prostáticas (solo o en combinación con otros marcadores de superficie celular) puede utilizarse para distinguir y aislar las células de cáncer prostático humano de otras células. En particular, pueden utilizarse anticuerpos de PSCA para aislar células de cáncer prostático de tejido de tumor xenoinjertado, de células en cultivo, etc., utilizando técnicas de separación celular basada en anticuerpos o de purificación por afinidad. Entre otros usos de los anticuerpos de PSCA de la invención se incluyen la generación de anticuerpos antiidiotípicos que imitan la proteína PSCA, por ejemplo un anticuerpo antiidiotípico monoclonal que reaccione con un idiotipo situado sobre el anticuerpo monoclonal de la invención, 1G8.

La capacidad de generar grandes cantidades relativamente puras de células de cáncer prostático positivo para PSCA humano que pueda cultivarse en cultivo de tejido o en forma de tumores xenoinjertados en modelos animales (por ejemplo SCID u otros ratones inmunodeficientes) proporciona muchas ventajas, incluyendo, por ejemplo, permitir la evaluación de diversos transgenes o de compuestos terapéuticos candidatos sobre el crecimiento u otras características fenotípicas de una población relativamente homogénea de células de cáncer prostático. Además, esta característica de la invención también permite aislar preparaciones altamente enriquecidas de ácidos nucleicos específicos de cáncer prostático positivo para PSCA humano en cantidades suficientes para diversas manipulaciones moleculares. Por ejemplo, una cantidad elevada de dichas preparaciones de ácidos nucleicos ayudará en la identificación de genes raros con relevancia biológica para la progresión de la enfermedad del cáncer prostático.

Otra aplicación valiosa de dicho aspecto de la invención es la capacidad de aislar, analizar y experimentar con preparaciones relativamente puras de células viables de tumor prostático positivo para PSCA clonadas a partir de pacientes individuales con una enfermedad localmente avanzada o metastásica. De esta manera, por ejemplo, pueden expandirse las células de cáncer prostático de un paciente individual a partir de una muestra de biopsia limitada y después someterse a ensayo para la presencia de genes diagnósticos y prognósticos, proteínas, aberraciones cromosómicas, perfiles de expresión génica u otras características genotípicas y fenotípicas relevantes, sin la variable potencialmente de confusión de las células contaminantes. Además, estas células pueden evaluarse para agresividad neoplásica y potencial metastásico en modelos animales. De manera similar, las vacunas de cáncer prostático específicas de paciente y la inmunoterapéutica celular pueden crearse a partir de este tipo de preparaciones celulares.

Son bien conocidos en la técnica diversos procedimientos para la preparación de anticuerpos. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos mediante la inmunización de un huésped mamífero adecuado utilizando una proteína, péptido o fragmento de PSCA, en forma aislada o inmunoconjugada (Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY, 1989). Además, también pueden utilizarse proteínas de fusión de PSCA, tales como la proteína de fusión PSCA GST. Las células que expresan o sobreexpresan PSCA también pueden utilizarse para inmunizaciones. De manera similar, puede utilizarse cualquier célula manipulada para expresar PSCA. Esta estrategia puede resultar en la producción de anticuerpos monoclonales con capacidades mejoradas para reconocer PSCA endógeno. Por ejemplo, utilizando las tecnologías estándares descritas en el Ejemplo 5 y los protocolos estándares de hibridomas (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press), 1988), se produjeron los hibridomas productores del anticuerpo monoclonal denominado 1G8 (ATCC nº HB-12.612). Este anticuerpo fue depositado el 11 de diciembre de 1998 en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852.

Los anticuerpos quiméricos de la invención son moléculas de inmunoglobulina que comprenden una parte humana y una parte no humana. La región ligante de antígeno (región variable) de un anticuerpo quimérico puede derivarse a partir de una fuente no humana (por ejemplo murina) y la región constante del anticuerpo quimérico que proporciona la función biológica efectora a la inmunoglobulina puede derivarse a partir de una fuente humana. El anticuerpo quimérico debe presentar la especificidad de unión de antígeno de la molécula de anticuerpo no humano y la función efectora proporcionada por la molécula de anticuerpo humano.

En general, los procedimientos utilizados para producir anticuerpos quiméricos pueden implicar las etapas siguientes:

a)

identificar y clonar el segmento génico correcto codificante de la parte ligante de antígeno de la molécula de anticuerpo; este segmento génico (conocido como VDJ, regiones variables, diversas y de unión para la cadenas pesadas, o como VJ, regiones variables de unión para las cadenas ligeras, o simplemente como V, región variable) puede encontrarse en forma de ADNc o en forma genómica;

b)

clonar los segmentos génicos codificantes de la región constante o la parte deseada de la misma;

c)

ligar la región variable con la región constante de manera que el anticuerpo quimérico completo se encuentre codificado en una forma que pueda transcribirse o traducirse;

d)

ligar este constructo en un vector que contiene un marcador seleccionable y regiones de control génico, tales como promotores, intensificadores y señales de adición de poli(A);

e)

amplificar dicho constructo en bacterias;

f)

introducir dicho ADN en células eucarióticas (transfección), con frecuencia linfocitos de mamífero;

g)

seleccionar las células que expresan el marcador seleccionable;

h)

cribar para las células que expresan el anticuerpo quimérico deseado, y

k)

someter a ensayo el anticuerpo para la especificidad de unión y funciones efectoras apropiadas.

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Los anticuerpos de varias especificidades de unión de antígeno diferentes han sido manipulados mediante estos protocolos para producir proteínas quiméricas [por ejemplo anti-TNP; Boulianne et al., Nature 312:643, 1984, y antígenos antitumorales: Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066, 1986]. De manera similar, se han conseguido varias funciones efectoras diferentes uniendo secuencias nuevas a aquéllas codificantes de la región ligante de antígeno. Entre algunas de éstas se incluyen enzimas [Neuberger et al., Nature 312:604, 1984], regiones constantes de inmunoglobulina de otra especie, y regiones constantes de otra cadena de inmunoglobulina [Sharon et al., Nature 309:364, 1984; Tan et al., J. Immunol. 135:3565-3567, 1985]. Además, se han descrito procedimientos para modificar moléculas de anticuerpo y para producir moléculas de anticuerpo quimérico utilizando la recombinación homóloga para dirigir una modificación génica (Fell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8507-8511, 1989).

Dichos anticuerpos son capaces de unirse a PSCA, por ejemplo sobre la superficie celular de las células de cáncer prostático, confirmando de esta manera la localización de superficie celular de PSCA. Debido a que estos mAbs reconocen epítopos sobre el exterior de la superficie celular, presentan utilidad para el diagnóstico y terapia del cáncer prostático. Por ejemplo, estos Mabs han sido utilizados para localizar sitios de enfermedad metastásica (Ejemplo 6). Otra posibilidad es que puedan utilizarse (por ejemplo sistémicamente) para dirigirse terapéuticamente a células de cáncer prostático en el caso de que se utilicen solos o conjugados con un isótopo radioactivo u otra toxina.

Los mAbs de PSCA tiñen la superficie celular de una manera puntuada (ver el Ejemplo 5), sugiriendo que PSCA podría localizarse en regiones específicas de la superficie celular. Es conocido que las proteínas ancladas por GPI se agrupan en microdominios enriquecidos en glucolípidos e insolubles en detergentes (DIGS) de la superficie celular. Estos microdominios, que incluyen caveolas y balsas de esfingolípido-colesterol, se cree que desempeñan funciones críticas en la transducción de señales y el transporte molecular. Thy-1, un homólogo de PSCA, se ha demostrado anteriormente que transmite señales a las src quinasas a través de la interacción en microdominios lipídicos. Los experimentos de fraccionamiento subcelular en el laboratorio de los presentes inventores confirman la presencia de PSCA en DIGS.

Además, algunos de los anticuerpos de la invención son anticuerpos internalizadores, es decir, los anticuerpos se internalizan en la célula en el momento de la unión o después del a misma. Además, algunos de los anticuerpos inducen la inhibición del crecimiento de las células de cáncer positivas para PSCA.

Una caracterización de dichos anticuerpos, por ejemplo en especímenes de cáncer prostático, demuestra que la proteína PSCA se sobreexpresa en los cánceres prostáticos comparado con las células normales y que la expresión de la misma aparentemente se encuentra regulada positivamente durante la progresión y metástasis del cáncer prostático. Estos anticuerpos resultan útiles en estudios de la biología y la función del PSCA, así como en el reconocimiento in vivo de los cánceres asociados a PSCA, por ejemplo el cáncer prostático humano, las metástasis de cáncer prostático al hueso y los carcinomas de vejiga.

La secuencia de aminoácidos de PSCA presentada en la presente invención puede utilizarse para seleccionar regiones específicas de la proteína PSCA para generar anticuerpos. Por ejemplo, los análisis de hidrofobicidad y de hidrofilicidad de la secuencia de aminoácidos de PSCA pueden utilizarse para identificar regiones hidrofílicas en la estructura del PSCA. Las regiones de la proteína PSCA que muestran estructura inmunogénica, así como otras regiones y dominios, pueden identificarse fácilmente utilizando diversos otros procedimientos conocidos de la técnica, tales como el análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf. Los fragmentos que contienen dichos residuos resultan particularmente adecuados para generar clases específicas de anticuerpos anti-PSCA. Entre los fragmentos particularmente útiles se incluyen, aunque sin limitarse a los mismos, las secuencias TARIRAVGLLTVISK y SLNCVDDSQDYYVGK.

Tal como se describe en el Ejemplo 2, posteriormente, se generó un anticuerpo policlonal de conejo contra el fragmento anteriormente indicado, preparado en forma de un péptido sintético, y se purificó por afinidad utilizando una proteína de fusión PSCA-glutatión-S-transferasa. El reconocimiento de PSCA por este anticuerpo se estableció mediante análisis de inmunotransferencia y de inmunoprecipitación de extractos de células 293T transfectadas con PSCA y una proteína de fusión GST-PSCA. Este anticuerpo también identificó la expresión en superficie celular de PSCA en células 293T y LAPC-4 transfectadas por PSCA utilizando la separación celular activada por fluorescencia (FACS).

Además, se generó un anticuerpo policlonal de oveja contra el último fragmento indicado, preparado en forma de péptido sintético, y se purificó por afinidad utilizando una columna Affi-gel para péptidos (también mediante el procedimiento del Ejemplo 2). Se estableció el reconocimiento de PSCA por este anticuerpo mediante análisis de inmunotransferencia y de inmunoprecipitación de extractos de células LNCaP transfectadas por PSCA. Este anticuerpo también identificó la expresión en superficie celular de PSCA en células LNCaP transfectadas por PSCA utilizando separación celular activada por fluorescencia (FACS) y análisis de inmunohistoquímica.

Los procedimientos para preparar una proteína para la utilización como inmunógeno y para preparar conjugados inmunogénicos de una proteína con un portador, tal como BSA, KLH u otras proteínas portadoras son bien conocidos de la técnica. En algunas circunstancias puede utilizarse la conjugación directa utilizando, por ejemplo, reactivos carbodiimida; en otros casos, pueden resultar efectivos reactivos de unión, tales como aquellos suministrados por Pierce Chemical Co., Rockford, IL. La administración de un inmunógeno PSCA se lleva a cabo generalmente mediante inyección a lo largo de un periodo de tiempo adecuado y utilizando un adyuvante adecuado, tal como se entiende de manera general en la técnica. Durante el programa de inmunización, pueden extraerse títulos de los anticuerpos para determinar que la formación de anticuerpo es adecuada.

Como composiciones farmacéuticas, resultan preferentes las preparaciones de anticuerpo monoclonal. Las líneas de células inmortalizadas que secretan un anticuerpo monoclonal deseado pueden prepararse utilizando el procedimiento estándar de Kohler y Milstein o modificaciones que afecten a la inmortalización de los linfocitos o de las células de bazo, tal como se conoce de manera general. Las líneas celulares inmortalizadas que secretan los anticuerpos deseados se criban mediante inmunoensayo en el que el antígeno es la proteína PSCA o fragmento de la misma. Al identificar el cultivo celular inmortalizado apropiado que secreta el anticuerpo deseado, las células pueden cultivarse in vitro o mediante producción en líquido ascites.

Los anticuerpos monoclonales deseados seguidamente se recuperan del sobrenadante de cultivo o del sobrenadante del ascites. Los fragmentos de los anticuerpos monoclonales de la invención (por ejemplo Fab, F(ab')_{2}, fragmentos Fv, proteínas de fusión) que contienen la parte inmunológicamente significativa (es decir, una parte que reconoce y se une a PSCA) pueden utilizarse como antagonistas, así como los anticuerpos intactos. Los anticuerpos humanizados dirigidos contra PSCA también resultan útiles. Tal como se utiliza en la presente invención, un anticuerpo de PSCA humanizado es una molécula de inmunoglobulina que es capaz de unirse a PSCA y que comprende una región FR que presenta sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana y una CDR que presenta sustancialmente la secuencia de aminoácidos de la inmunoglobulina no humana o una secuencia manipulada para que se una a PSCA.

La utilización de fragmentos inmunológicamente reactivos, tales como Fab, Fab' o F(ab')_{2} con frecuencia resulta preferible, especialmente en un contexto terapéutico, debido a que estos fragmentos generalmente son menos inmunogénicos que la inmunoglobulina completa. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que presentan los anticuerpos monoclonales o anticuerpos monoclonales antiidiotípicos de la invención.

La generación de un anticuerpo monoclonal (MAb) capaz de unirse a PSCA de superficie celular se describe en el Ejemplo 5. El mapado de epítopos de este MAb indica que reconoce un epítopo sobre la proteína PSCA.

Asimismo, pueden producirse anticuerpos o fragmentos, utilizando la tecnología actual, por medios recombinantes. Las regiones que se unen específicamente a las regiones deseadas de la proteína PSCA también pueden producirse en el contexto de anticuerpos quiméricos o injertados con CDR de origen en múltiples especies.

El anticuerpo o fragmento del mismo de la invención puede marcarse con un marcador detectable o conjugarse con una segunda molécula, tal como un agente terapéutico (por ejemplo un agente citotóxico), resultando de esta manera en un inmunoconjugado. Por ejemplo, el agente terapéutico incluyen, aunque sin limitación, un fármaco antitumoral, una toxina, un agente radioactivo, una citoquina, un segundo anticuerpo o un enzima. Además, la invención proporciona una realización en la que el anticuerpo de la invención se une a un enzima que convierte un profármaco en un fármaco citotóxico.

El inmunoconjugado puede utilizarse para dirigir la segunda molécula a una célula positiva para PSCA (Vitetta, E.S. et al., Immunotoxin therapy, 1993, en: DeVita, Jr., V.T. et al., editores, Cancer: Principles and Practice of Oncology, 4a edición, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 2624-2636).

Entre los ejemplos de agentes citotóxicos se incluyen, aunque sin ilimitación, ricina, doxorubicina, daunorubicina, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxi-antracina-diona, actinomicina D, toxina diftérica, exotoxina de Pseudomonas (PE) A, PE40, abrina y glucocorticoide y otros agentes quimioterapéuticos, así como isótopos radioactivos. Entre los marcadores detectables adecuados se incluyen, aunque sin limitación, un isótopo radioactivo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante de metales o un enzima.

Además, la proteína recombinante de la invención que comprende la región ligante de antígeno de cualquier de los anticuerpos monoclonales de la invención puede utilizarse para tratar el cáncer. En esta situación, la región ligante de antígeno de la proteína recombinante se une a por lo menos una parte funcionalmente activa de una segunda proteína que presenta actividad terapéutica. La segunda proteína puede incluir, aunque sin limitación, un enzima, linfoquina, oncostatina o toxina. Entre las toxinas adecuadas se incluyen doxorubicina, daunorubicina, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxi-antracina-diona, actinomicina D, toxina diftérica, exotoxina de Pseudomonas (PE) A, PE40, ricina, abrina, glucocorticoide e isótopos
radioactivos.

Las técnicas para conjugar o unir agentes terapéuticos a anticuerpos son bien conocidas (ver, por ejemplo, Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en: Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (editores), páginas 243 a 56 (Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en: Controlled Drug Delivery (2a edcición), Robinson et al. (editores), páginas 623-53 (Marcel Dekker, Inc., 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en: Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (editores), páginas 475 a 506, 1985, y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58, 1982. La utilización de anticuerpos de PSCA como agentes terapéuticos se describe adicionalmente en la subsección titulada "INMUNOTERAPIA DEL CÁNCER PROSTÁTICO", posteriormente.

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Moléculas de ácidos nucleicos codificantes de PSCA

Se describen diversas moléculas de ácidos nucleicos codificantes de proteínas PSCA y fragmentos de las mismas, preferentemente en forma aislada, incluyendo ADN, ARN, híbrido ADN/ARN y moléculas relacionadas, moléculas de ácidos nucleicos complementarias a la secuencia codificante de PSCA o puna parte de las mismas, y aquéllas que se hibridan al gen de PSCA o a ácidos nucleicos codificantes de PSCA. Las moléculas de ácidos nucleicos particularmente preferidas presentan una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica o complementaria a las secuencias de ADN humanas o murinas dadas a conocer en la presente memoria. Se contemplan específicamente moléculas de ADN genómico, ADNcs, ribozimas y moléculas antisentido, así como ácidos nucleicos basados en un esqueleto alternativo o que incluyen bases alternativas, derivadas de fuentes naturales o sintéticas.

Por ejemplo, las moléculas antisentido pueden ser ARNs u otras moléculas, incluyendo ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) o moléculas que no son ácidos nucleicos, tales como derivados fosforotioato, que se unen específicamente a ADN o a ARN de una manera dependiente de los pares de bases. Un experto en la materia podrá obtener fácilmente estas clases de moléculas de ácidos nucleicos utilizando las secuencias de PSCA indicadas en la presente memoria. Por conveniencia, las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de PSCA se denominan en la presente invención moléculas de ácidos nucleicos codificantes de PSCA, genes PSCA o secuencias de PSCA.

La secuencia de nucleótidos de un ADNc codificante de una forma alélica de PSCA humano se proporciona en la fig. 1A. La secuencia de nucleótidos de un ADNc codificante de un homólogo murino de PSCA ("PSCA murino") se proporciona en la fig. 2. Los clones genómicos de PSCA humano y murino también han sido aislados, tal como se describe en el Ejemplo 4. Los clones genómicos tanto humanos como murinos contienen tres exones codificantes de las regiones traducidas y 3' no traducidas del gen PSCA. Se supone la existencia de un cuarto exón codificante de una región 5' no traducida basándose en la homología de PSCA con otros miembros de las familias de los genes Ly-6 y Thy-1 (fig. 8).

El gen del PSCA humano se localiza en el cromosoma 8q24.2. El antígeno 2 de célula madre humana (RIG-E), así como otro homólogo de Ly-6 humano recientemente identificado (E48) también se localizan en esta región, sugiriendo que podría existir en este locus una familia grande de genes relacionados (Brakenhoff et al., supra, 1995; Mao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5910-5914, 1996). De manera integrante, el cromosoma 8q se ha informado de que es una región de ganancia y amplificación alélicas en la mayoría de cánceres prostáticos avanzados y recurrentes (Cher et al., Genes Chrom. Cancer 11:153-162, 1994). El gen c-myc se localiza próximo a PSCA en el cromosoma 8q24 y se han observado copias adicionales de c-myc (a través de ganancia o amplificación alélicas) en 68% de los tumores prostáticos primarios y en 96% de las metástasis (Jenkins et al., Cancer Res. 57:524-531, 1997).

Se enseñan cebadores que permiten la amplificación específica de moléculas de ácidos nucleicos de PSCA, de cualquier parte específica de las mismas, y sondas que selectiva o específicamente se hibridan a moléculas de ácidos nucleicos de PSCA o a cualquier parte de las mismas. Las sondas de ácidos nucleicos pueden marcarse con un marcador detectable. Entre los ejemplos de un marcador detectable se incluyen, aunque sin limitación, un isótopo radioactivo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante de metales o un enzima. Estas sondas marcadas pueden utilizarse para diagnosticar la presencia de una proteína PSCA como medio para diagnosticar células que expresan una proteína PSCA. Las tecnologías para generar sondas de ADN y de ARN son bien conocidas.

Tal como se utiliza en la presente memoria, una molécula de ácidos nucleicos se dice que se encuentra "aislada" en el caso de que la molécula de ácidos nucleicos se encuentre sustancialmente separada de moléculas de ácidos nucleicos contaminantes que codifiquen polipéptidos diferentes de PSCA. Un experto en la materia podrá utilizar fácilmente procedimientos de aislamiento de ácidos nucleicos para obtener una molécula de ácidos nucleicos aislada codificante de PSCA.

Asimismo, se describen fragmentos de las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de PSCA. Tal como se utiliza en la presente memoria, un fragmento de una molécula de ácidos nucleicos codificante de PSCA se refiere a una parte reducida de la secuencia codificante de PSCA completa. El tamaño del fragmento se determinará a partir de su uso pretendido.

Por ejemplo, si el fragmento se selecciona para que codifique una parte activa de la proteína PSCA, tal como un dominio activo, un sitio de unión efector o un dominio de unión de GPI, el fragmento deberá ser suficientemente grande para codificar la región o regiones funcionales de la proteína PSCA. Si el fragmento debe utilizarse como sonda de ácidos nucleicos o como cebador de PCR, la longitud del fragmento se selecciona de manera que se obtenga un número relativamente reducido de falsos positivos durante el sondeo/cebado.

Los fragmentos de PSCA humano que resultan particularmente útiles como sondas de hibridación selectiva o cebadores de PCR pueden identificarse fácilmente a partir de la secuencia de PSCA completa utilizando procedimientos conocidos de la técnica. Un conjunto de cebadores de PCR que resultan útil para el análisis de RT-PCR comprende 5'-TGCTTGCCCTGTTGATGGCAG- y 3'-CCAGAGCAGCAGGCCGAGTGCA-.

Procedimientos para aislar otras moléculas de ácidos nucleicos codificantes de PSCA

Las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de PSCA indicadas en la presente memoria permiten el aislamiento de homólogos de PSCA, isoformas alternativamente procesadas, variantes alélicas y formas mutantes de la proteína PSCA, así como las secuencias codificantes y génicas de los mismos. La fuente más preferente de homólogos de PSCA son los organismos mamíferos.

Por ejemplo, una parte de la secuencia codificante de PSCA descrita en la presente memoria puede sintetizarse y utilizarse como sonda para obtener ADN codificante de un miembro de la familia PSCA de proteínas a partir de organismos que no son variantes alélicas humanas de la proteína PSCA humana descrita en la presente memoria, y secuencia genómica que contiene el gen PSCA. Los oligómeros que contienen aproximadamente 18 a 20 nucleótidos (codificantes de un tramo de aproximadamente 6 a 7 aminoácidos) se preparan y se utilizan para cribar bibliotecas de ADN genómico o de ADNc para obtener la hibridación bajo condiciones restrictivas o condiciones de suficiente astringencia para eliminar un nivel indebido de falsos positivos. En una forma de realización particular, se utilizó ADNc codificante de PSCA humano para aislar un ADNc de longitud completa codificante del homólogo murino de PSCA, tal como se describe en el Ejemplo 3 en la presente memoria. El clon murino codifica una proteína con una identidad de la secuencia de aminoácidos de 70% respecto al PSCA humano.

Además, la secuencia de aminoácidos de la proteína PSCA humana puede utilizarse para generar sondas de anticuerpo para cribar bibliotecas de expresión preparadas a partir de células. Típicamente puede utilizarse antisuero policlonal procedente de mamíferos, tales como conejos, inmunizados con la proteína purificada (tal como se describe posteriormente) o anticuerpos monoclonales, para sondear una biblioteca de expresión, preparada a partir de un organismo diana, para obtener la secuencia codificante apropiada para un homólogo de PSCA. La secuencia de ADNc clonada puede expresarse en forma de una proteína de fusión, expresarse directamente utilizando sus propias secuencias de control, o expresarse mediante la construcción de un casete de expresión utilizando secuencias de control apropiadas para el huésped particular utilizado para la expresión del enzima.

Pueden obtenerse clones genómicos que contienen los genes PSCA utilizando procedimientos de clonación molecular bien conocidos de la técnica. En una forma de realización, se obtuvo un clon genómico humano de aproximadamente 14 kb que contenía los exones 1 a 4 del gen PSCA mediante cribado de una biblioteca de fago lambda con una sonda de ADNc de PSCA humano, tal como se describe más completamente en el Ejemplo 4 en la presente memoria. En otra forma de realización, se obtuvo un clon genómico de aproximadamente 10 kb que contenía el gen murino de PSCA mediante cribado de una biblioteca de BAC (cromosoma artificial bacteriano) murino con un ADNc de PSCA murino (también descrito en el Ejemplo 4).

Además, pueden prepararse pares de cebadores oligonucleótidos para la utilización en una reacción en cadena de polimerasa (PCR) para amplificar/clonar selectivamente una molécula de ácidos nucleicos codificante de PSCA o fragmento de la misma. Es bien conocido de la técnica un ciclo de desnaturalización/hibridación/extensión de PCR para la utilización de dichos cebadores de PCR, y pueden adaptarse fácilmente para la utilización en el aislamiento de otras moléculas de ácidos nucleicos codificantes de PSCA. Pueden identificarse fácilmente regiones del gen PSCA humano que resultan particularmente adecuados para la utilización como sonda o como cebador.

Los homólogos no humanos de PSCA, las variantes alélicas naturales de PSCA y las secuencias geonómicas de PSCA comparten un grado elevado de homología con las secuencias de PSCA humano descritas en la presente memoria. En general, estas moléculas de ácidos nucleicos se hibridan con la secuencia de PSCA humano bajo condiciones restrictivas. Estas secuencias típicamente contienen una homología de por lo menos 70%, preferentemente de por lo menos 80%, más preferentemente de por lo menos 90%, con la secuencia de PSCA humano.

Las condiciones restrictivas son aquéllas que: (1) utilizan una fuerza iónica reducida y temperatura elevada para el lavado, por ejemplo NaCl 0,015 M/nitrato sódico 0,0015 M/SDS al 0,1% a 50ºC, o (2) utilizan durante la hibridación un agente desnaturalizante tal como formamida, por ejemplo formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con NaCl 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC.

Otro ejemplo es la utilización de formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), SDS al 0,1% y dextrán sulfato al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC y SDS al 0,1%. Un experto en la materia podrá determinar y variar fácilmente las condiciones de astringencia apropiadamente para obtener una señal de hibridación clara y detectable.

Moléculas de ADN recombinante que contiene ácidos nucleicos codificantes de PSCA

También se describen moléculas de ADN recombinante (ADNr) que contienen una secuencia codificante de PSCA o un fragmento de la misma. Tal como se utiliza en la presente memoria, una molécula de ADNr es una molécula de ADN que ha sido sometida a manipulación molecular in vitro. Los procedimientos para generar moléculas de ADNr son bien conocidos de la técnica, por ejemplo ver Sambrook et al., Molecular Cloning, 1989. En las moléculas de ADNr preferentes, una secuencia de ADN codificante de PSCA que codifica una proteína PSCA o un fragmento de PSCA, se encuentra operablemente ligada a una o más secuencias de control de expresión y/o secuencias de vector. La molécula de ADNr puede codificar la proteína PSC completa o puede codificar un fragmento de la proteína PSCA.

La elección de vector y/o de secuencias de control de expresión a las que se liga operablemente la secuencia codificante de PSCA depende directamente, tal como es bien conocido de la técnica, de las propiedades funcionales deseadas, por ejemplo la expresión de proteínas, y de la célula huésped que debe transformarse. Un vector contemplado es capaz, como mínimo, de dirigir la replicación o la inserción en el cromosoma del huésped y preferentemente también la expresión de la secuencia codificante de PSCA incluida en la molécula de ADNr.

Los elementos de control de expresión que se utilizan para regular la expresión de una secuencia codificante de proteína operablemente ligada son conocidos de la técnica e incluyen, aunque sin limitación, promotores inducibles, promotores constitutivos, señales de secreción, intensificadores, terminadores de transcripción y otros elementos reguladores. Preferentemente se utiliza un promotor inducible que se controle con facilidad, por ejemplo que responde a un nutriente en el medio de la célula huésped.

En una forma de realización el vector que contiene una molécula de ácidos nucleicos codificante de PSCA incluir un replicón procariótico, es decir una secuencia de ADN que presenta la capacidad de dirigir la replicación autónoma y el mantenimiento de la molécula de ADN recombinante intracromosómicamente en la célula huésped procariótica, tal como una célula huésped bacteriana, transformada con el mismo. Este tipo de replicaciones son bien conocidos de la técnica. Además, los vectores que incluyen un replicón procariótico también pueden incluir un gen la expresión del cual proporciona un marcador detectable, tal como una resistencia a fármaco. Los genes bacterianos de resistencia a fármaco típicos son aquellos que proporcionan resistencia a ampicilina o a tetraciclina.

Los vectores que incluyen un replicón procariótico pueden incluir además un promotor procariótico o vírico capaz de dirigir la expresión (transcripción y traducción) de la secuencia codificante de PSCA en una célula huésped bacteriana, tal como E. coli. Un promotor es un elemento de control de expresión formado por una secuencia de ADN que permite que se produzca la unión de la ARN polimerasa y la transcripción. Las secuencias de promotor compatibles con huéspedes bacterianos típicamente se proporcionan en vectores plásmidos que contienen sitios de restricción convenientes para la inserción de un segmento de ADN de la presente invención. También pueden utilizarse diversos vectores víricos bien conocidos por los expertos en la materia, tales como, por ejemplo, varios vectores retrovíricos bien conocidos.

Asimismo, pueden utilizarse vectores de expresión compatibles con células eucarióticas, preferentemente los compatibles con células de vertebrado, para variar moléculas de ADNr que contienen una secuencia codificante de PSCA. Los vectores de expresión de células eucarióticas son bien conocidos de la técnica y se encuentran disponibles de varios proveedores comerciales. Típicamente dichos vectores se proporcionan con sitios de restricción convenientes para la inserción del segmento de ADN deseado. Son vectores típicos de este tipo, PSVL y pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1/pML2d (International Biotechnologies, Inc.), pTDTI (ATCC nº 31.255), el vector pCDM8 descrito en la presente memoria, y vectores de expresión eucarióticos similares.

Los vectores de expresión de célula eucariótica utilizados para construir las moléculas de ADNr pueden incluir adicionalmente un marcador seleccionable que resulte efectivo en una célula eucariótica, preferentemente un marcador de selección de resistencia a fármaco. Un marcador de resistencia a fármaco preferente es el gen la expresión del cual resulta en resistencia a la neomicina, es decir el gen neomicina fosfotransferasa (neo) (Southern et al., J. Mol. Anal. Genet. 1:327-341, 1982). Alternativamente, el marcador seleccionable puede encontrarse presente en un plásmido independiente, y los dos vectores pueden introducirse mediante cotransfección de la célula huésped, y seleccionarse mediante cultivo en presencia del fármaco apropiado para el marcador seleccionable.

El vector puede ser un vector plásmido, cósmido o fago codificante de la molécula de ADNc comentada anteriormente. Además, se describe un sistema de huésped-vector que comprende el vector plásmido, cósmido o fago transfectado en una célula huésped eucariótica adecuada. Entre los ejemplos de células huésped eucarióticas adecuadas se incluyen una célula de levadura, una célula vegetal o una célula animal, tal como una célula de mamífero. Entre los ejemplos de células adecuadas se incluyen LnCaP, LAPC-4 y otras líneas celulares de cáncer prostático. El sistema de huésped-vector resulta útil para la producción de una proteína PSCA. Alternativamente, la célula huésped puede ser procariótica, tal como una célula bacteriana.

Células huésped transformadas

Se describen células huésped transformadas con una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína PSCA o un fragmento de la misma. La célula huésped puede ser procariótica o eucariótica. Las células eucarióticas útiles para la expresión de una proteína PSCA no se encuentran limitadas, con la condición de que la línea celular sea compatible con los procedimientos de cultivo celular y compatible con la propagación del vector de expresión y la expresión de un gen PSCA. Entre las células huésped eucarióticas preferentes se incluyen, aunque sin limitación, las células de levadura, de insecto y de mamífero, preferentemente células de vertebrado, tales como aquéllas de un ratón, rata, mono o línea celular fibroblástica humana. También pueden utilizarse las líneas celulares de cáncer prostático, tales como las líneas celulares LnCaP y LAPC-4. Puede utilizarse cualquier huésped procariótico para expresar una molécula de ADNr codificante de PSCA. El huésped procariótico preferente es E. coli.

La transformación de los huéspedes celulares apropiados con una molécula de ADNr se consigue mediante procedimientos bien conocidos que típicamente dependen del tipo de vector utilizado y del sistema huésped utilizado. Con respecto a la transformación de las células huésped procarióticas, típicamente se utilizan los procedimientos de electroporación y de tratamiento salino, ver, por ejemplo, Cohen et al., Proc. Acad. Sci. USA 69:2110, 1972, y Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982. Con respecto a la transformación de las células de vertebrado con vectores que contienen ADNr, típicamente se utilizan procedimientos de electroporación, lípidos catiónicos o tratamiento salino, ver, por ejemplo, Graham et al., Virol. 52:456, 1973; Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1373-76, 1979.

Las células transformadas con éxito, es decir las células que contienen una molécula de ADNr de la presente invención, pueden identificarse mediante técnicas bien conocidas. Por ejemplo, las células que resultan de la introducción de un ADNr pueden clonarse para producir colonias individuales. Las células de estas colonias pueden recolectarse, lisarse y examinarse su contenido de ADN para la presencia del ADNr utilizando un procedimiento tal como el descrito por Southern, J. Mol. Bol. 98:503, 1975, o Berent et al., Biotech. 3:208, 1985, o las proteínas producidas a partir de las células sometidas a ensayo mediante un procedimiento inmunológico.

Procedimientos recombinantes de generación de proteínas PSCA

Además se describen procedimientos para producir una proteína PSCA utilizando una de las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de PSCA descritas en la presente memoria. En términos generales, la producción de una proteína PSCA recombinante típicamente puede implicar las etapas siguientes (Maniatis, supra).

En primer lugar, se obtiene una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína PSCA o un fragmento de la misma, tal como la molécula de ácidos nucleicos ilustrada en la fig. 1A. La molécula de ácidos nucleicos codificante de PSCA seguidamente se sitúa en ligamiento operable con secuencias de control adecuadas, tal como se ha descrito anteriormente, para generar una unidad de expresión que contiene la secuencia codificante de PSCA. La unidad de expresión se utiliza para transformar un huésped adecuado y el huésped transformado se cultiva bajo condiciones que permiten la producción de la proteína PSCA. Opcionalmente la proteína PSCA se aísla a partir del medio o de las células; la recuperación y purificación de la proteína puede no resultar necesaria en algunos casos en los que pueden tolerarse algunas impurezas.

Cada una de las etapas anteriores puede llevarse a cabo en una diversidad de maneras. Por ejemplo, las secuencias codificantes deseadas pueden obtenerse a partir de fragmentos genómicos y utilizarse directamente en un huésped apropiado. La construcción de vectores de expresión que son operables en una diversidad de huéspedes se consigue utilizando una combinación apropiada de replicones y secuencias de control. Las secuencias de control, vectores de expresión y procedimientos de transformación dependen del tipo de célula huésped utilizada para expresar el gen y se comentaron en detalle anteriormente. Los sitios de restricción adecuados pueden, si no se encuentran normalmente disponibles, añadirse a los extremos de la secuencia codificante de manera que proporcionen un gen extraíble para insertarlo en dichos vectores. Un experto en la materia podrá adaptar fácilmente cualquier huésped/sistema de expresión conoci-
do de la técnica para la utilización con secuencias codificantes de PSCA con el fin de producir una proteína PSCA.

Ensayos para identificar ligandos de PSCA y otros agentes ligantes

Asimismo, se describen ensayos y procedimientos que pueden utilizarse para detectar e identificar ligandos de PSCA y otros agentes y constituyentes celulares que se unen a PSCA. Específicamente, pueden identificarse ligandos de PSCA y otros agentes y constituyentes celulares que se unen a PSCA por la capacidad del ligando de PSCA u otro agente o constituyente de unirse a PSCA y/o por la capacidad de inhibir/estimular la actividad de PSCA. Los ensayos de actividad de PSCA (por ejemplo de unión) utilizando una proteína PSCA resultan adecuados para la utilización en procedimientos de cribado de alto rendimiento.

En una forma de realización, el ensayo comprende mezclar PSCA con un agente de ensayo o extracto celular. Tras mezclar bajo condiciones que permitan la asociación de PSCA con el agente o componente del extracto, la mezcla se analiza para determinar si el agente/componente se encuetnra unido a PSCA. Los agentes/componentes de unión se identifican como aquellos capaces de unirse a PSCA. Alternativa o consecutivamente, la actividad de PSCA puede evaluarse directamente como un medio para identificar agonistas y antagonistas de la actividad de PSCA.

Alternativamente, pueden identificarse las dianas que se unan a una proteína PSCA utilizando un sistema de dos híbridos en levadura (Fields, S. y Song, O., Nature 340:245-246, 1989) o utilizando un ensayo de unión-captura (Harlow, supra). En el sistema de dos híbridos en levadura, una unidad de expresión codificante de una proteína de fusión constituida por una subunidad de un factor de transcripción de dos subunidades y la proteína PSCA se introduce y se expresa en una célula de levadura. La célula se modifica adicionalmente para que contenga: (1) una unidad de expresión codificante de un marcador detectable la expresión del cual requiere el factor de transcripción de dos subunidades para la expresión, y (2) una unidad de expresión que codifica una proteína de fusión constituida por la segunda subunidad del factor de transcripción y un segmento clonado de ADN. Si el segmento clonado de ADN codifica una proteína que se une a la proteína PSCA, la expresión resulta en la interacción del PSCA y la proteína codificada. Lo anterior permite que las dos subunidades del factor de transcripción entren en proximidad de unión, permitiendo la reconstitución del factor de transcripción. Esto resulta en la expresión del marcador detectable. El sistema de dos híbridos en levadura resulta particularmente útil en el cribado de una biblioteca de ADNc codificante de segmentos para parejas de unión celular de PSCA.

Entre las proteínas PSCA que pueden utilizarse en los ensayos anteriormente indicados se incluyen, aunque sin limitación, una proteína PSCA aislada, un fragmento de una proteína PSCA, una célula que ha sido alterada para expresar una proteína PSCA, o una fracción de una célula que ha sido alterada para expresar una proteína PSCA. Además, la proteína PSCA puede ser la proteína PSCA entera o un fragmento definido de la proteína PSCA. Resultará evidente para un experto ordinario en la materia que, con la condición de que la proteína PSCA pueda someterse a ensayo para la unión de agente, por ejemplo por un desplazamiento de peso molecular o de actividad, puede utilizarse el presente ensayo.

El procedimiento utilizado para identificar si un agente/componente celular se une a una proteína PSCA se basa principalmente en la naturaleza de la proteína PSCA utilizada. Por ejemplo, puede utilizarse un ensayo de retardo en gel para determinar si un agente se une a PSCA o a un fragmento del mismo. Alternativamente, pueden adoptarse tecnologías de inmunodetección y de biochip para la utilización con la proteína PSCA. El experto en la materia puede utilizar fácilmente numerosas técnicas conocidas en la técnica para determinar si un agente particular se une a una proteína PSCA.

Pueden someterse a ensayo adicionalmente agentes y componentes celulares para la capacidad de modular la capacidad de una proteína PSCA utilizando un sistema de ensayo libre de células o un sistema de ensayo celular. A medida que las actividades de la proteína PSCA se definan mejor, podrán utilizarse ensayos funcionales basados en la actividad identificada.

Tal como se utiliza en la presente memoria, un agente se dice que antagoniza la actividad de PSCA cuando el agente reduce la actividad de PSCA. El antagonista preferente antagonizará selectivamente PSCA no afectando a ninguna otra proteína celular. Además, el antagonista preferente reducirá la actividad de PSCA en más de 50%, más preferentemente en más de 90%, todavía más preferentemente eliminará la totalidad de la actividad de PSCA.

Tal como se utiliza en la presente memoria, se dice que un agente agoniza la actividad de PSCA cuando el agente incrementa la actividad de PSCA. El agonista preferente agonizará selectivamente PSCA no afectando a ninguna otra proteína celular. Además, el antagonista preferente incrementará la actividad de PSCA en más de 50%, más preferentemente en más de 90%, todavía más preferentemente más de doblando la actividad de PSCA.

Los agentes que se someten a ensayo en el procedimiento anteriormente indicado pueden seleccionarse aleatoriamente o seleccionarse o diseñarse racionalmente. Tal como se utiliza en la presente memoria, un agente se dice que se ha seleccionado aleatoriamente cuando el agente se selecciona aleatoriamente sin considerar las secuencias específicas de la proteína PSCA. Un ejemplo de agente aleatoriamente seleccionado es la utilización de una biblioteca química o una biblioteca combinatorial de péptidos o un caldo de crecimiento de un organismo o extracto vegetal.

Tal como se utiliza en la presente memoria, un agente se dice que ha sido racionalmente seleccionado o diseñado cuando el agente se ha seleccionado de manera no aleatoria considerando la secuencia del sitio diana y/o la conformación del mismo en relación a la acción del agente. Los agentes pueden seleccionarse racionalmente o diseñarse racionalmente mediante la utilización de las secuencias peptídicas que constituyen la proteína PSCA. Por ejemplo, un agente péptido racionalmente seleccionado puede ser un péptido cuya secuencia de aminoácidos sea idéntica a un fragmento de una proteína PSCA.

Los agentes sometidos a ensayo en los procedimientos de la presente invención pueden ser, a título de ejemplos, péptidos, moléculas pequeñas y derivados de vitaminas, así como carbohidratos. Un experto en la materia podrá reconocer fácilmente que no existe límite a la naturaleza estructural de los agentes utilizados en el presente procedimiento de cribado.

Una clase de agentes de la presente invención son agentes péptidos cuyas secuencias de aminoácidos se seleccionan basándose en la secuencia de aminoácidos de la proteína PSCA. Los agentes péptidos pequeños pueden servir como inhibidores competitivos del ensamblaje de la proteína PSCA.

Pueden prepararse agentes péptidos utilizando procedimientos estándares de síntesis de péptidos en fase sólida (o en fase solución), tal como es conocido de la técnica. Además, el ADN codificante de estos péptidos puede sintetizarse utilizando instrumentación de síntesis de oligonucleótidos disponible comercialmente y producirse recombinantemente utilizando sistemas estándares de producción recombinante. La producción mediante síntesis de péptidos en fase sólida resulta necesaria si deben incluirse aminoácidos no codificados génicamente.

Otra clase de agentes de la presente invención son anticuerpos inmunoreactivos en posiciones críticas de la proteína PSCA. Tal como se ha descrito anteriormente, los anticuerpos se obtienen mediante inmunización de sujetos mamíferos adecuados con péptidos que contienen como regiones antigénicas aquellas partes de la proteína PSCA destinadas a ser dianas de los anticuerpos. Entre las regiones críticas pueden incluirse los dominios identificados en la fig. 15.

Los extractos celulares sometidos a ensayo en los procedimientos de la presente invención pueden ser, a título de ejemplos, extractos acuosos de células o tejidos, extractos orgánicos de células o tejidos, o fracciones celulares parcialmente purificadas. Un experto en la materia reconocerá fácilmente que no existe ningún límite al origen del extracto celular utilizado en el procedimiento de cribado de la presente invención.

Pueden utilizarse agentes que se unen a una proteína PSCA, tal como un anticuerpo de PSCA, para modular la actividad de PSCA, para dirigir agentes anticáncer a células de mamífero apropiadas, o para identificar agentes que bloqueen la interacción con PSCA. Las células que expresan PSCA pueden reconocer o identificarse mediante la utilización de un agente de unión a PSCA.

El modo en que utilizará el agente de unión a PSCA depende de la naturaleza del mismo. Por ejemplo, puede utilizarse un agente de unión a PSCA para: administrar toxinas conjugadas, por ejemplo una toxina diftérica, la toxina del cólera, ricina o exotoxina de Pseudomonas, a una célula que expresa PSCA; modular la actividad de PSCA para eliminar directamente las células que expresan PSCA. Por ejemplo, puede utilizarse un agente inhibidor de PSCA para inhibir directamente el crecimiento de las células que expresan PSCA, mientras que puede utilizarse un agente de unión a PSCA como agente diagnóstico.

Existen múltiples usos diagnósticos de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona procedimientos para diagnosticar en un sujeto, por ejemplo en un animal o sujeto humano, un cáncer asociado a la presencia de la proteína PSCA. En una forma de realización, el procedimiento comprende determinar cuantitativamente el número de proteínas PSCA en la muestra (por ejemplo una muestra de células o de líquidos biológicos) utilizando cualquiera de entre una combinación de anticuerpos de la invención. A continuación, el número determinado de esta manera puede compararse con la cantidad en una muestra procedente de un sujeto normal. La presencia de una cantidad mediblemente diferente (es decir, el número de PSCA en la muestra de ensayo excede el número de una muestra normal) en las muestras indica la presencia de cáncer. PSCA se sobreexpresa en una célula cuando el número de PSCA en la muestra de ensayo excede el número de una muestra normal.

Además, la invención proporciona procedimientos para realizar el seguimiento del desarrollo del cáncer (por ejemplo el cáncer prostático) o de trastornos asociados con PSCA en un sujeto mediante la medición de la cantidad de PSCA en una muestra de un sujeto en diversos puntos del tiempo. Lo expuesto anteriormente se lleva a cabo a fin de determinar un cambio en la cantidad de PSCA en la muestra, por ejemplo para determinar si el cambio es un cambio reducido de la cantidad o un cambio grande, es decir la sobreexpresión de PSCA. En una forma de realización, el procedimiento comprende determinar cuantitativamente en una primera muestra de un sujeto la presencia de una proteína PSCA y comparar la cantidad determinada de esta manera con la cantidad presente en una segunda muestra del sujeto, obteniendo dichas muestras en diferentes puntos del tiempo, siendo una diferencia en las cantidades determinadas indicativa del desarrollo del cáncer.

La muestra puede proceder de un animal o de un ser humano. Además, la muestra puede ser una muestra celular. Por ejemplo, utilizando los procedimientos de la invención, puede evaluarse tejido prostático, tejido de vejiga, tejido neuroendocrino y hueso (cualquier tejido en el que pueda metastizar carcinoma de próstata y de vejiga, por ejemplo nódulo, pulmón, hígado, páncreas) para la presencia de cáncer o de lesión metastásica. Alternativamente la muestra puede ser un líquido biológico, por ejemplo orina, suero sanguíneo o plasma.

Según la práctica de la invención, la detección puede llevarse a cabo mediante medios de detección inmunológica que implican histología, transferencia, ELISA y ELIFA. En el caso de que la muestra sea una muestra de tejido o de células puede encontrarse fijarse en formalina, incluirse en parafina o congelarse.

La invención asimismo proporciona procedimientos para determinar una diferencia en la cantidad y distribución de PSCA en secciones de tejido procedentes de un tejido neoplásico que debe someterse a ensayo respecto a la cantidad y distribución de PSCA en secciones de tejido de un tejido normal. En una forma de realización, el procedimiento comprende poner en contacto tanto el tejido que debe someterse a ensayo y el tejido normal con un anticuerpo monoclonal que forma específicamente un complejo con PSCA y detectar de esta manera la diferencia en la cantidad y distribución de PSCA.

Además, la invención proporciona un procedimiento para diagnosticar una condición neoplásica o preneoplásica en un sujeto. Este procedimiento comprende obtener de un sujeto una muestra de un tejido, detectar una diferencia en la cantidad y distribución de PSCA al utilizar el procedimiento anterior, siendo una diferencia medible clara indicativa de dicha condición neoplásica o preneoplásica.

De acuerdo con la práctica de la invención, el anticuerpo puede dirigirse al epítopo al que se dirige el anticuerpo monoclonal de la invención. Además, la sección de tejido puede ser de vejiga, próstata, hueso o músculo.

La invención proporciona asimismo procedimientos para detectar y determinar cuantitativamente la concentración de PSCA en una muestra de líquido biológico. En una forma de realización el procedimiento comprende poner en contacto un soporte sólido con un exceso de un anticuerpo monoclonal que forma (preferentemente que forma específicamente) un complejo con PSCA bajo condiciones que permiten que el anticuerpo monoclonal se una a la superficie del soporte sólido. El soporte sólido resultante al que se une el anticuerpo monoclonal seguidamente se pone en contacto con una muestra de líquido biológico de manera que PSCA en el líquido biológico se una al anticuerpo y forma un complejo de PSCA-anticuerpo. El complejo puede marcarse directa o indirectamente con un marcador detectable. Alternativamente, PSCA o el anticuerpo pueden marcarse antes de la formación del complejo. Seguidamente, el complejo puede detectarse y determinarse cuantitativamente, detectando y determinando cuantitativamente de esta manera la concentración de PSCA en la muestra de líquido biológico. Una concentración elevada de PSCA en la muestra respecto a las células normales es indicativa de una condición neoplásica o preneoplásica.

De acuerdo con la práctica de la invención, el líquido biológico incluye, aunque sin limitación, extracto de tejido, orina, sangre, suero y flema. Además, el marcador detectable incluye, aunque sin limitación, un enzima, biotina, un fluoróforo, un cromóforo, un metal pesado, un isótopo paramagnético o un isótopo radioactivo.

También se describe un kit diagnóstico que comprende un anticuerpo que reconoce y se une a PSCA (un anticuerpo anti-PSCA), y un conjugado de un marcaje detectable y una pareja de unión específica del anticuerpo anti-PSCA. El marcaje incluye, aunque sin limitación, enzimas, marcajes radioactivos, cromóforos y fluorescentes.

Inmunoterapia del cáncer prostático

Debido a que la proteína PSCA se sobreexpresa en muchos tumores prostáticos en comparación con las glándulas normales contiguas, es una diana para la inmunoterapia del cáncer prostático. Entre estos procedimientos inmunoterapéuticos se incluye la utilización de terapia de anticuerpos, vacunas in vivo y enfoques de inmunoterapia ex vivo.

En un enfoque, la invención proporciona anticuerpos de PSCA que pueden utilizarse sistémicamente para tratar el cáncer prostático. Por ejemplo, puede introducirse anticuerpo de PSCA no conjugado (incluyendo anticuerpo monoclonal, policlonal, quimérico, humanizado y fragmentos de los mismos (por ejemplo proteínas recombinantes)) en un paciente de manera que el anticuerpo se una a PSCA en las células de cáncer prostático y medie en la inhibición del crecimiento de estas células (incluyendo la destrucción de las mismas) y el tumor, mediante mecanismos entre los que puede incluirse la citolisis mediada por el complemento, la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, la alteración de la función fisiológica de PSCA y/o la inhibición de la unión de ligandos o de las rutas de transducción de señales. Además de los anticuerpos de PSCA no conjugados, los fragmentos de los mismos, y las proteínas recombinantes de la invención, los anticuerpos de PSCA conjugados a agentes tóxicos, tales como ricina, también pueden utilizarse terapéuticamente para administrar el agente tóxico directamente a las células de tumor prostático que portan PSCA, destruyendo de esta manera el tumor.

La inmunoterapia del cáncer prostático con anticuerpos de PSCA puede seguir las enseñanzas generadas a partir de diversos enfoques utilizados con éxito con otros tipos de cáncer, incluyendo, aunque sin limitación, el cáncer de colon (Arlen et al., Crit. Rev. Immunol. 18:133-138, 1998), el mieloma múltiple (Ozaki et al., Blood 90:3179-3186, 1997; Tsunenari et al., Blood 90:2437-2444, 1997), el cáncer gástrico (Kasprzyk et al., Cancer Res. 52:2771-2776, 1992), el linfoma de células B (Funakoshi et al., J. Inmunother. Emphasis Tumor Immunol. 19:93-101, 1996), la leucemia (Zhong et al., Leuk. Res. 20:581-589, 1996), el cáncer colorrectal (Moun et al., Cancer Res. 54:6160-6166, 1994; Velders et al., Cancer Res. 55:4398-4403, 1995) y el cáncer de mama (Shepard et al., J. Clin. Immunol. 11:117-127, 1991).

Por ejemplo, una manera de aplicar los anticuerpos monoclonales antitumorales clínicamente es administrarlos en forma no modificada, utilizando anticuerpos monoclonales de la invención que muestran actividad antitumoral (por ejemplo actividad ADCC y CDC) y/o capacidad internalizadora in vitro y/o en modelos animales (ver, por ejemplo, Hellstrom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1499-1502, 1985). Para detectar las actividades ADCC y CDC pueden someterse a ensayo anticuerpos monoclonales para el lisado de células tumorales diana marcadas con ^{51}Cr durante un periodo de incubación de 4 horas. Las células diana se marcan con ^{51}Cr y después se exponen durante 4 horas a una combinación de células efectoras (en la forma de linfocitos humanos purificados mediante la utilización de un medio de separación de linfocitos) y anticuerpo, que se añade en concentraciones, por ejemplo, que varían entre 0,1 \mug/ml y 10 \mug/ml. La liberación de ^{51}Cr a partir de las células diana se mide como evidencia de la lisis de las células tumorales (citotoxicidad). Entre los controles se incluyen la incubación de células diana solas o con linfocitos o con anticuerpos monoclonales separadamente. Se mide la cantidad total de ^{51}Cr que puede liberarse y se calcula ADCC como porcentaje de eliminación de células diana observado con anticuerpo monoclonal más células efectoras comparado con células diana incubadas solas. El procedimiento para CDC es idéntico al utilizado para detectar ADCC excepto en que se añade suero humano como fuente del complemento (diluido entre 1:3 y 1:6) en lugar de las células efectoras.

Asimismo, se describen vacunas formuladas para contener una proteína PSCA o fragmento de la misma. La utilización de un antígeno tumoral en una vacuna para generar inmunidad humoral o mediada por células para la utilización en terapia anticáncer es bien conocida de la técnica y se ha utilizado en el cáncer prostático utilizando los inmunógenos PSMA humano y PAP de roedor (Hodge et al., Int. J. Cancer 63:231-237, 1995; Fong et al., J. Immunol. 159:3113-3117, 1997). Estos procedimientos pueden ponerse en práctica fácilmente utilizando una proteína PSCA, o fragmento del a misma, o una molécula de ácidos nucleicos codificante de PSCA y vectores recombinantes capaces de expresar y presentar apropiadamente el inmunógeno PSCA.

Por ejemplo, pueden utilizarse sistemas de administración de genes víricos para administrar una molécula de ácidos nucleicos codificante de PSCA. Entre los diversos sistemas de administración de genes víricos que pueden utilizarse en la práctica de este aspecto de la invención se incluyen, aunque sin limitación, vaccinia, de la viruela aviar, de la viruela del canario, adenovirus, influenza, poliovirus, virus adenoasociado, lentivirus y virus sindbus (Restifo, Curr. Opin. Immunol. 8:658-663, 1996). También pueden utilizarse sistemas de administración no víricos mediante la utilización de ADN desnudo codificante de una proteína PSCA o fragmento del a misma introducido en el paciente (por ejemplo intramuscularmente) para inducir una respuesta antitumoral. En una forma de realización, puede utilizarse ADNc de PSCA humano de longitud completa. En otra forma de realización pueden utilizarse moléculas de ácido nucleico de PSCA codificantes de epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL). Los epítopos de CTL pueden determinarse utilizando algoritmos específicos (por ejemplo Epimer, Brown University) para identificar péptidos dentro de una proteína PSCA que son capaces de unirse óptimamente a alelos HLA especificados.

También pueden utilizarse anticuerpos anti-PSCA antiidiotípicos en terapia anticáncer como vacuna para inducir una respuesta inmunológica en células que expresan una proteína PSCA. Específicamente, la generación de anticuerpo antiidiotípicos es bien conocida en la técnica y puede adaptarse fácilmente a la generación de anticuerpos anti-PSCA antiidiotípicos que imiten un epítopo sobre una proteína PSCA (ver, por ejemplo, Wagner et al., Hybridoma 16:33-40, 1997; Foon et al., J. Clin. Invest. 96:334-342, 1995; Herlyn et al., Cancer Immunol. Immunother. 43:65-76, 1996). Este tipo de anticuerpo antiidiotípico puede utilizarse en terapia antiidiotípica, tal como en la práctica actual con otros anticuerpos antiidiotípicos dirigidos contra antígenos tumorales.

Asimismo, la invención proporciona procedimientos para inhibir la actividad celular (por ejemplo la proliferación, activación o propagación celulares) de una célula que expresa múltiples antígenos PSCA sobre la superficie de la misma. Este procedimiento comprende reaccionar los inmunoconjugados de la invención (por ejemplo una mezcla heterogénea u homogénea) con la célula, de manera que los antígenos PSCA sobre la superficie celular formen un complejo con los inmunoconjugados. Cuanto mayor sea el número de antígenos PSCA sobre la superficie celular, mayor será el número de complejos PSCA-anticuerpo que podrán utilizarse. Cuanto mayor sea el número de complejos PSCA-anticuerpo, mayor será el grado de inhibición de la actividad celular. Un sujeto con una condición neoplásica o preneoplásica puede tratarse de acuerdo con este procedimiento en el caso de que la inhibición de la actividad celular resulte en la muerte celular.

Una mezcla heterogénea incluye anticuerpos de PSCA que reconocen epítopos diferentes o iguales, estando conjugado cada anticuerpo con el mismo agente terapéutico o con agentes terapéuticos diferentes. Una mezcla homogénea incluye anticuerpos que reconocen el mismo epítopo, estando conjugado cada anticuerpo con el mismo agente terapéutico.

Asimismo, la invención proporciona procedimientos para inhibir la actividad biológico de PSCA mediante el bloqueo de la unión de PSCA con su ligando. El procedimiento comprende poner en contacto una cantidad de PSCA con un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención bajo condiciones que permitan un inmunoconjugado de PSCA o un complejo PSCA-anticuerpo, bloqueando de esta manera la unión de PSCA con su ligando e inhibiendo la actividad de PSCA.

En otra forma de realización, la invención proporciona procedimientos para inhibir selectivamente la expresión de antígeno PSCA por una célula haciendo reaccionar cualquiera o una combinación de los inmunoconjugados de la invención con la célula en una cantidad suficiente para inhibir la célula. Entre estas cantidades se incluyen una cantidad para eliminar la célula o una cantidad suficiente para inhibir el crecimiento o proliferación celular. Tal como se ha comentado supra, la dosis y régimen de dosificación dependerán de la naturaleza de la enfermedad o trastorno que debe tratarse asociado a PSCA, su población, el sitio al que deben dirigirse los anticuerpos, las características de la inmunotoxina particular y el paciente. Por ejemplo, la cantidad de inmunoconjugado puede encontrarse comprendida en el intervalo de entre 0,1 y 10 mg/kg de peso de paciente.

Procedimientos para identificar proteínas PSCA y genes PSCA y ARN

La invención proporciona procedimientos para identificar células, tejidos u organismos que expresan una proteína PSCA o un gen PSCA. Estos procedimientos pueden utilizarse para diagnosticar la presencia de células o de un organismo que expresa una proteína PSCA in vivo o in vitro. Los procedimientos de la presente invención resultan particularmente útiles para determinar la presencia de células que median en condiciones patológicas de la próstata. Específicamente, la presencia de una proteína PSCA puede identificarse mediante la determinación de si se expresa una proteína PSCA. La expresión de una proteína PSCA puede utilizarse como medio para diagnosticar la presencia de células, tejidos o un organismo que expresa una proteína o gen PSCA.

Puede utilizarse una diversidad de técnicas inmunológicas y genéticas moleculares para determinar si se expresa/produce una proteína PSCA en una célula o muestra particular. En general, se prepara un extracto que contiene proteínas. A continuación, el extracto se somete a ensayo para determinar si se produce una proteína PSCA en la célula.

Diversos procedimientos para la detección de proteínas son bien conocidos de la técnica y pueden utilizarse para la detección de proteínas PSCA y células que expresan PSCA. Para llevar a cabo un ensayo diagnóstico basado en proteínas, se obtiene y prepara una muestra de proteínas adecuada utilizando técnicas convencionales. Las muestras de proteínas pueden prepararse, pro ejemplo, simplemente hirviendo una muestra con SDS. A continuación, la proteína extraída puede analizarse para determinar la presencia de una proteína PSCA utilizando procedimientos conocidos. Por ejemplo, la presencia de variantes de tamaño o carga específica de una proteína pueden identificarse utilizando la movilidad en un campo eléctrico. Alternativamente pueden utilizarse anticuerpos con fines de detección. Un experto en la materia podrá adaptar fácilmente los procedimientos analíticos de proteínas conocidos para determinar si una muestra contiene una proteína PSCA.

Promotor de PSCA y otros elementos reguladores de la expresión

Además se describen secuencias de control de expresión presentes en orientación 5' respecto al gen PSCA nuevamente identificado en una forma que puede utilizarse para generar vectores de expresión y animales transgénicos. Específicamente, los elementos de control de expresión de PSCA, tales como el promotor de PSCA, que puede identificarse fácilmente como situado 5' respecto al codón de inicio ATG en el gen PSCA, y que puede utilizarse para dirigir la expresión de una secuencia de ADN codificante de proteína operablemente ligada. Debido a que PSCA se expresa predominantemente en células prostáticas, los elementos de control de expresión resultan particularmente útiles para dirigir la expresión de un transgén introducido de un modo específico de tejido. Un experto en la materia podrá utilizar fácilmente el promotor del gen PSCA y otros elementos reguladores en vectores de expresión utilizando procedimientos conocidos de la técnica.

En las células eucarióticas, pueden encontrarse secuencias reguladoras cadena arriba, cadena abajo y dentro de la región codificante del gen. Las secuencias reguladoras eucarióticas comprenden una secuencia de promotor y en ocasiones por lo menos una secuencia intensificadora. En un gen eucariótico típico, la secuencia de promotor reside cadena arriba y proximal respecto a la región codificante del gen, y debe orientarse en una dirección para controlar la expresión del gen. En un gen eucariótico típico, las secuencias intensificadoras pueden residir cadena arriba, cadena abajo e incluso dentro de la región codificante del gen, y puede orientarse en cualquiera de los dos sentidos para incrementar o para suprimir la expresión del gen.

Se describe un fragmento de ADN que contiene 9k de secuencias cadena arriba de la región codificante de PSCA. La capacidad de este fragmento de PSCA para regular la expresión de un transgén operablemente ligado se ha sometido a ensayo utilizando una serie de constructos de informador quiméricos transfectados en las células. Los constructos de informador quimérico demuestran un patrón de expresión similar al del PSCA endógeno nativo, y el fragmento de PSCA regula la expresión del transgén al encontrarse ligado en la orientación directa. De esta manera, este fragmento de PSCA comprende una región reguladora cadena arriba de PSCA que muestra actividad de tipo promotor.

Los transcritos de PSCA se encuentran presentes asimismo a un nivel significativamente más alto en las células de tumor prostático pero no en la hiperplasia prostática benigna. De esta manera, los transcritos de PSCA resultan detectables predominantemente en la próstata, y resultan detectables a un nivel más alto en muestras de tumor prostático. El nivel significativamente más alto de transcritos de PSCA, o sobreexpresión, tal como es conocida en la técnica, puede determinarse midiendo y comparando la cantidad de transcritos de PSCA detectables en una próstata normal con la de una muestra de tumor prostático. Esta comparación puede llevarse a cabo mediante procedimientos bien conocidos de la técnica, incluyendo el análisis northern y los ensayos de RT-PCR, y cuantificarse las diferencias en los niveles de transcrito. De esta manera, la presencia de una cantidad mediblemente diferente de transcritos de PSCA (es decir, el número de transcritos de PSCA en la muestra de ensayo excede el número de una muestra normal) en las muestras puede utilizarse para indicar la presencia de cáncer prostático.

El patrón de acumulación de transcritos de PSCA y de proteínas es conocido y se ha aislado y caracterizado la región reguladora cadena arriba de PSCA. Se ha sometido a ensayo una serie de constructos quiméricos que comprenden la región reguladora cadena arriba de PASCA operablemente ligada a un transgén. La región reguladora cadena arriba de PSCA regula la expresión del transgén en diversas células prostáticas y líneas celulares, y en la vejiga y en menor gradeo en el riñón. De esta manera, la región cadena arriba de PSCA regula la expresión de un transgén de una manera predominantemente prostática.

Se produjeron fragmentos de ADN de 9 kb, 6 kb, 3 kb y 1 kb derivados de la región situada cadena arriba 5' respecto al gen PSCA, tal como se muestra en la figura 42, mediante técnicas descritas en la presente memoria. La región cadena arriba de PSCA de 9 kb (pEGFP-PSCA) está implicada en la actividad reguladora génica y fue depositada el 17 de mayo de 1999 en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 y se ha identificado con el nº ATCC PTA-80. Se obtuvo el fragmento de 9 kb mediante amplificación utilizando un cebador de T7 y RIhPSCA3'-5 (5'-gggaattcgcacagccttcagggtc-3').

Usos del fragmento que presenta actividad reguladora génica

Se describen procedimientos (por ejemplo procedimientos de terapia génica) para dirigir un gen de interés a células/sitio canceroso de la próstata enferma de manera que la proteína codificada por el gen de esta manera pueda expresarse directa o indirectamente, mejorando el estado de enfermedad.

Se introduce una célula susceptible con un vector de expresión que expresa un transgén (por ejemplo un gen terapéutico) bajo el control de una región corriente arriba de PSCA que presenta una actividad de expresión génica significativamente incrementada en células de tumor prostático. La utilización de un vector de expresión que expresa un gen terapéutico predominantemente en células de tumor prostático permite la expresión de los genes terapéuticos en la célula diana, tal como células de tumor prostático.

Tras infectar una célula susceptible, un transgén (por ejemplo un gen terapéutico) es regulado por una región corriente arriba de PSCA que presenta una actividad de expresión génica incrementada en un vector, que expresa la proteína codificada por el transgén. La utilización de un vector génico bastante específico de próstata permitirá la expresión selectiva de los genes específicos en células diana, por ejemplo células de cáncer prostático.

Las regiones de PSCA que presentan una actividad incrementada de expresión génica pueden modificarse, por ejemplo mediante mutaciones, deleciones e inserciones de secuencias, de manera que produzcan moléculas derivadas. Entre las modificaciones se incluyen multiplicar el número de secuencias que pueden unirse a proteínas reguladoras específicas de células prostáticas y delecionar secuencias que no son funcionales en la región de PSCA que presenta actividad de expresión génica. Entre otras modificaciones se incluyen añadir intensificadores, mejorando de esta manera la eficiencia de la región de PSCA que presenta actividad promotora. Los intensificadores pueden funcionar de una manera independiente de la posición y pueden localizarse cadena arriba, dentro o cadena abajo de la región transcrita.

Las moléculas derivadas conservan la propiedad funcional de la región situada cadena arriba de PSCA, presentando una actividad incrementada de expresión génica, es decir, la molécula que presenta dichas sustituciones todavía permite la expresión sustancialmente específica del tejido prostático de un gen de interés localizado 3' respecto al fragmento. La modificación se permite con la condición de que las moléculas derivadas conserven su capacidad de regular la expresión génica de una manera sustancialmente específica de la próstata comparado con un fragmento de PSCA que presente sólo actividad promotora.

Se construyó un vector mediante la inserción de una secuencia heteróloga (gen terapéutico) cadena abajo de la región cadena arriba de PSCA que presenta actividad promotora.

Entre los ejemplos de genes terapéuticos se incluyen genes suicidas. Existen secuencias génicas la expresión de las cuales produce una proteína o agente que inhibe el crecimiento de las células de tumor prostático o la muerte de las mismas. Entre los genes suicidas se incluyen genes codificantes de enzimas (por ejemplo enzimas de profármaco), oncogenes, genes supresores tumorales, genes codificantes de toxinas, genes codificantes de citoquinas o un gen codificante de oncostatina. El propósito del gen terapéutico es inhibir el crecimiento o eliminar la célula de cáncer prostático o producir citoquinas u otros agentes citotóxicos que directa o indirectamente inhiban el crecimiento o eliminen las células de cáncer prostático.

Entre los enzimas de profármaco adecuados se incluyen timidina quinasa (TK), xantina-guanina fosforibosiltransferasa (GPT) de E. coli o citosina desaminasa (CD) de E. coli o hipoxantina fosforibosiltransferasa (HPRT).

Entre los oncogenes y genes supresores tumorales adecuados se incluyen neu, EGF, ras (entre ellos H, K y N ras), p53, gen supresor del tumor retinoblastoma (Rb), producto génico del tumor de Wilm, fosfotirosina fosfatasa (PTPasa) y nm23. Entre las toxinas adecuadas se incluyen las exotoxinas A y S de Pseudomonas, la toxina diftérica (DT), las toxinas LT de E. coli, toxina Shiga, toxinas de tipo Shiga (SLT-1, -2), ricina, abrina, suporina y gelonina.

Entre las citoquinas adecuadas se incluyen interferones, interleuquinas GM-CSF, factor de necrosis tumoral (TNF) (Wong G. et al., GM-CSF humano: Molecular Cloning of the complementary DNA and purification of the natural and recombinant proteins, Science 228:810, 1985); patente WO nº 9323034 (1993); Horisberger MA et al., Cloning and sequence analyses of cDNAs for interferon- and virus-induced human Mx proteins reveal that they contain putative guanine nucleotide-binding sites: functional study of the corresponding gene promoter, Journal of Virology 64(3):1171-81, marzo de 1990; Li YP et al., Proinflammatory cytokines tumor necrosis factor-alpha and IL-6, but not IL-1, down-regulate the osteocalcin gene promoter, Journal of Immunology 148(3):788-94, 1 de febrero de 1992; Pizarro T.T. et al., Induction of TNF alpha and TNF beta gene expression in rat cardiac transplants during allograft rejection, Transplantation 56(2):399-404, agosto de 1993) (Breviario F. et al., Interleukin-1-inducible genes in endothelial cells. Cloning of a new gene related to C-reactive protein and serum amyloid P component, Journal of Biological Chemistry 267(31):22190-7, 5 de noviembre de 1992; Espinoza-Delgado I. et al., Regulation of IL-2 receptor subunit genes in human monocytes. Differential effects of IL-2 and IFN-gamma, Journal of Immunology 149(9):2961-8, 1 de noviembre de 1992; Algate, P.A. et al., Regulation of the interleukin-3 (IL-3) receptor by IL-3 in teh fetal liver-derived FL5-12 cell line, Blood 83(9):2459-68, 1 de mayo de 1994; Cluitmans F.H. et al., IL-4 down-regulates IL-2-, IL-3- and GM-CSF-induced cytokine gene expression in peripheral blood monocytes, Annals of Hematology 68(6):293-8, junio de 1994; Lagoo, A.S. et al., IL-2, IL-4 and IFN-gamma gene expression versus secretion in superantigen-activated T cells. Distinct requirement for costimulatory signals through adhesion molecules, Journal of Immunology 152(4):1641-52, 15 de febrero de 1994; Martinez, O.M. et al., IL-2 and IL-5 gene expression in response to alloantigen in liver allograft recipents and in vitro, Transplantation 55(5):1159-66, mayo de 1993; Pang G. et al., GM-CSF, IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-6, IL-8, IL-10, ICAM-1 and VCAM-1 gene expression and cytokine production in human duodenal fibroblasts stimulated with lypopolysaccharide, IL-1-alpha and TNF-alpha, Clinical and Experimental Immunology 96(3):437-43, junio de 1994; Ulich, T.R. et al., Endotoxin-induced cytokine gene expression in vivo. III. IL-6 mRNA and serum protein expression and the in vivo hematologic effects of IL-6, Journal of Immunology 146(7):2316-23, 1 de abril de 1991; Mauviel, A. et al., Leukoregulin, a T cell-derived cytokine, induces IL-8 gene expression and secretion in human skin fibroblasts. Demonstration and secretion in human skin fibroblasts. Demonstration of enhanced NF-kappa B binding
and NF-kappa B-driven promoter activity, Journal of Immunology 149(9):2969-76), 1 de noviembre de 1992.

Entre los factores de crecimiento se incluyen factores \alpha y \beta de crecimiento transformante (TGF\alpha y TGF\beta), citoquinas factores estimuladores de colonias (Shimane M. et al., Molecular cloning and characterization of G-CSF induced gene cDNA, Biochemical and Biophysical Research Communications 199(1):26-32, 28 de febrero de 1994; Kay, A.B. et al., Messenger RNA expression of the cytokine gene cluster, interleukin 3 (IL-3), IL-4, IL-5, and granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, in allergen-induced late-phase cutaneous reactions in atopic subjects, Journal of Experimental Medicine 173(3):775-8, 1 de marzo de 1991; de Wit H. et al., Differential regulation of M-CSF and IL-6 gene expression in monocytic cells, British Journal of Haematology 86(2):259-64, febrero de 1994; Sprecher E. et al., Detection of IL-1 beta, TNF-alpha, and IL-6 gene transcription by the polymerase chain reaction in keratinocytes, Langerhans cells and peritoneal exudate cells during infection with herpes simplex virus-1, Archives of Virology 126(1-4):253-69, 1992).

Son vectores adecuados los vectores víricos, incluyendo adenovirus, lentivirus, vectores retrovíricos y vectores víricos adenoasociados (AAV).

Preferentemente el vector vírico seleccionado debe cumplir los criterios siguientes: 1) el vector debe ser capaz de infectar las células tumorales y de esta manera deben seleccionarse los vectores víricos que presentan un rango de huéspedes apropiado; 2) el gen transferido debe ser capaz de persistir y de expresarse en una célula durante un periodo prolongado de tiempo, y 3) el vector debe ser seguro para el huésped y causar una transformación celular mínima. Los vectores retrovíricos y adenovirus ofrecen un medio eficiente, útil y en la actualidad el mejor caracterizado, de introducir y expresar genes foráneos eficientemente en células de mamífero. Estos vectores presentan rangos de huéspedes y de tipo celular muy amplios, expresan genes estable y eficientemente. La seguridad de estos vectores ha sido demostrada por muchos grupos de investigación. De hecho, muchos se encuentran en ensayo clínico.

Entre otros vectores víricos que pueden utilizarse para la transferencia génica en células para la corrección de trastornos se incluyen retrovirus tales como el virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV), papovavirus, tales como JC, SV40, polioma, virus de Epstein-Barr (EBV), virus del papiloma, por ejemplo virus del papiloma bovino de tipo 1 (BPV), virus vaccinia y poliovirus y otros virus humanos y animales.

Los adenovirus presentan varias propiedades que los hacen atractivos como vehículos de clonación (Bachettis et al., Transfer of gene for thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA, PNAS USA 74:1590, 1977; Berkner, K.L., Development of adenovirus vectors for expression of heterologous genes, Biotechniques 6:616, 1988; Ghosh-Choudhury, G. et al., Human adenovirus cloning vectors bases on infectious bacterial plasmids, Gene 50:161, 1986; Hag-Ahmand, Y. et al., Development of a helper-independent human adenovirus vector and its use in the transfer of the herpes simplex virus thymidine kinase gene, J. Virol. 57:257, 1986; Rosenfeld, M. et al., Adenovirus-mediated transfer of a recombinant \alpha1-antitrypsin gene to the lung epithelium in vivo, Science 252:431, 1991.

Por ejemplo, los adenovirus presentan un genoma de tamaño intermedio que se replica en los núcleos celulares; muchos serotipos son clínicamente inocuos; los genomas adenovíricos aparentemente son estables a pesar de la inserción de genes foráneos; los genes foráneos aparentemente se mantienen sin pérdida ni reorganización, y los adenovirus pueden utilizarse como vectores de expresión transitoria de nivel elevado con un periodo de expresión de hasta 4 semanas a varios meses. Algunos estudios bioquímicos y genéticos extensivos sugieren que resulta posible sustituir hasta 7-7,5 kb de secuencias heterólogas por secuencias adenovíricas nativas, generando vectores viables condicionales independientes del auxiliar (Kaufman, R.J., Identification of the component necessary for adenovirus translational control and their utilization in cDNA expression vectors, PNAS USA 82:689, 1985).

AAV es un parvovirus humano pequeño con un genoma de ADN monocatenario de aproximadamente 5 kb. Este virus puede propagarse en forma de provirus integrado en varios tipos celulares humanos. Los vectores AAV presentan varias ventajas para la terapia génica en el ser humano. Por ejemplo, son trópicos para las células humanas, aunque también pueden infectar otras células de mamífero; (2) no se ha asociado ninguna enfermedad a AAV en el ser humano ni en otros animales; (3) los genomas integrados de AAV aparentemente son estables en sus células huésped; (4) no existe evidencia de que la integración de AAV altere la expresión de los genes o promotores del huésped o promueva su reorganización; (5) los genes introducidos pueden rescatarse de la célula huésped mediante infección por un virus ayudante, tal como un adenovirus.

El sistema de vector HSV-1 facilita la introducción de prácticamente cualquier gen en células no mitóticas (Geller et al., An efficient deletion mutant packaging system for a defective herpes simplex virus vectors: Potential applications to human gene therapy and neuronal physiology, PNAS USA 87:8950, 1990).

Otro vector para la transferencia génica de mamíferos es el vector basado en virus del papiloma bovino (Sarver, N. et al., Bovine papilloma virus DNA: A novel eukaryotic cloning vector, Mol. Cell. Biol. 1:486, 1981).

El virus vaccinia y otros vectores basados en el virus de la viruela proporcionan un sistema de transferencia génica de mamífero. El virus vaccinia es un virus ADN bicatenario grande, de tamaño genómico 120 kilodaltons (kd) (Panicali, D. et al., Construction of poxvirus as cloning vectors: Insertion of the thymidine kinase gene from herpes simplex virus into the DNA of infectious vaccine virus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4927, 1982; Smith et al., Infectious vaccinia virus recombinants that express hepatitis B virus surface antigens, Nature 302:490, 1983).

Los retrovirus son paquetes diseñados para insertar genes víricos en células huésped (Guild, B. et al., Development of retrovirus vectors useful for expressing genes in cultured murine embryonic cells and hematopoietic cells in vivo, J. Virol. 62:795, 1988; Hock, R.A. et al., Retrovirus mediated transfer and expression of drug resistance genes in human hemopoietic progenitor cells, Nature 320:275, 1986).

El retrovirus básico consiste de dos cadenas idénticas de ARN empaquetadas en una proteína provírica. El núcleo se encuentra circundado por una capa protectora denominada cubierta que se deriva de la membrana del huésped anterior aunque ha sido modificada con glucoproteínas contribuidas por el virus.

Preferentemente, para el tratamiento de defectos, enfermedades o daños en células de la próstata, entre los vectores de la invención se incluyen un gen terapéutico o transgén, por ejemplo un gen codificante de TK. Los vectores genéticamente modificados se administran en la próstata para tratar defectos o enfermedades tales como el cáncer prostático mediante la introducción de un producto o productos génicos terapéuticos en la próstata que incrementan la producción de moléculas endógenas que presentan efectos mejoradores in vivo.

Las tareas básicas son el aislamiento del gen de interés, unirlo a un fragmento que presente actividad reguladora génica, seleccionar el vehículo vector apropiado para transportar el gen de interés en el cuerpo, administrar el vector que presenta el gen de interés en el cuerpo y conseguir la expresión correcta del gen de interés en una célula diana. La presente invención proporciona el empaquetamiento de genes clonados, es decir los genes de interés, de manera que pueden inyectarse directamente en el flujo sanguíneo u órganos relevantes de los pacientes que los necesitan. El empaquetamiento protege al ADN foráneo frente a la eliminación por el sistema inmunológico y lo dirige a los tejidos o células apropiados.

Conjuntamente con el gen de interés humano o animal puede insertarse otro gen, por ejemplo un marcador seleccionable, que permita la fácil identificación de las células que han incorporado el retrovirus modificado. El punto esencial del procedimiento de la terapia génica es que el gen nuevo debe expresarse en las células diana a un nivel apropiado con una duración satisfactoria de la expresión.

La mayoría de las técnicas utilizadas para construir vectores y similares son ampliamente puestas en práctica en la técnica, y a la mayoría de los expertos les resultan familiares los materiales estándares que describen condiciones y procedimientos específicos. Sin embargo, por conveniencia, los párrafos siguientes pueden servir de guía.

Procedimientos generales para la construcción de vectores

La construcción de vectores adecuados que contienen las secuencias codificantes y de control del gen terapéutico deseado utiliza técnicas de ligación y de restricción estándares, que son bien comprendidas por la técnica (ver Maniatis et al., en: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982). Los plásmidos aislados, secuencias de ADN u oligonucleótidos sintetizados se corta, ajustan y religan en la forma deseada.

La escisión del ADN específico de sitio se lleva a cabo mediante tratamiento con el enzima (o enzimas) de restricción adecuado bajo condiciones que son generalmente comprendidas por la técnica, y los particulares de las cuales son especificadas por el fabricante de estos enzimas de restricción disponibles comercialmente (ver, por ejemplo, el catálogo de productos de New England Biolabs.). En general, se corta aproximadamente 1 \mug de plásmido o de secuencias de ADN con una unidad de enzima en aproximadamente 20 \mul de solución tampón. Típicamente se utiliza un exceso de enzima de restricción para garantizar la digestión completa del ADN sustrato.

Los tiempos de incubación de aproximadamente una hora a dos horas a aproximadamente 37ºC son factibles, aunque pueden tolerarse variaciones. Tras cada incubación, se eliminan proteínas mediante extracción con fenol/clorofor-
mo y después puede realizarse una extracción con éter, y se recuperan los ácidos nucleicos a partir de las fracciones acuosas mediante precipitación con etanol. Si se desea, puede llevarse a cabo la separación de tamaños de los fragmentos cortados mediante electroforesis en gel de poliacrilamida o en gel de agarosa utilizando técnicas estándares. Se encuentra una descripción general de separaciones por tamaño en: Methods in Enzymology 65:499-560, 1980.

Pueden generarse extremos romos en los fragmentos cortados por restricción mediante tratamiento con el fragmento grande de la ADN polimerasa I de E. coli (Klenow) en presencia de los cuatro desoxinucleótido trifosfatos (dNTPs) utilizando tiempos de incubación de aproximadamente 15 a 25 minutos a una temperatura de entre 20ºC y 25ºC en Tris 50 mM (pH 7,6), NaCl 50 mM, MgCl_{2} 6 mM, DTT 6 mM y dNTPs 5 a 10 \muM. El fragmento Klenow rellena en los extremos cohesivos 5' pero hace retroceder las cadenas únicas 3' protuberantes, aunque se encuentren presentes los cuatro dNTPs. Si se desea, puede llevarse a cabo una reparación selectiva suministrando únicamente uno de los dNTPs, o con dNTPs seleccionados, dentro de las limitaciones dictadas por la naturaleza de los extremos cohesivos. Tras el tratamiento con Klenow, la mezcla se extrae con fenol/cloroformo y se hace precipitar con etanol. El tratamiento bajo condiciones apropiadas con nucleasa Sl o Bal-31 resulta en la hidrólisis de cualquier parte monocatenaria.

Las ligaciones se llevan a cabo en volúmenes de 10 a 50 \mul bajo las condiciones y temperaturas estándares utilizando ADN ligasa de T4. Los protocolos de ligación son estándares (D. Goeddel (editor), Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, 1991). En la construcción de vectores con "fragmentos de vector", el fragmento de vector comúnmente se trata con fosfatasa alcalina bacteriana (BAP) o fosfatasa alcalina intestinal bovina (CIP) con el fin de eliminar el fosfato 5' y evitar la religación del vector. Alternativamente, la religación puede evitarse en vectores que han sido doblemente digeridos mediante digestión adicional con enzima de restricción de los fragmentos no deseados.

Entre los vectores adecuados se incluyen sistemas de vector vírico, por ejemplo ADV, RV y AAV (R.J. Kaufman, "Vectors used for expression in mammalian cells", en: Gene Expression Technology, editado por D.V. Goeddel, 1991).

Muchos procedimientos para insertar transgenes funcionales de ADN son conocidos de la técnica. Por ejemplo, entre los procedimientos no con vectores se incluyen la transfección física no vírica de ADN en las células, por ejemplo la microinyección (DePhamphilis et al., BioTechnique 6:662-680, 1988), transfección mediada por liposomas (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1987; Felgner y Holm, Focus 11:21-25, 1989, y Felgner et al., Proc. West. Pharmacol. Soc. 32:115-121, 1989) y otros procedimientos conocidos de la técnica.

Administración de vectores modificados en un sujeto

Una manera de introducir ADN en una célula diana es introducirlo en un saco o vesícula limitado por membranas, tal como un esferoplasto o un liposoma, o mediante precipitación con fosfato de calcio (CaPO_{4}; Graham F. y Van der Eb, A., Virology 52:456, 1973; Schaefer-Ridder, M. et al., Liposomes as gene carriers: Efficient transduction of mouse L cells by thymidine kinase gene, Science 215:166, 1982; Stavridis, J.C. et al., Construction of transferrin-coated liposomes for in vivo transport of exogenous DNA to bone marrow erythroblasts in rabbits, Exp. Cell Res. 164:568-572, 1986).

Puede construirse una vesícula de manera que su membrana se fusione con la membrana externa de una célula diana. El vector de la invención en vesículas puede dirigirse a las células prostáticas.

Los esferoplastos se mantienen en tampón de elevada fuerza iónica hasta que puedan fusionarse a través de la célula diana de mamífero utilizando fusógenos tales como el polietilenglicol.

Los liposomas son vesículas artificiales de fosfolípidos. Las vesículas presentan un tamaño comprendido entre 0,2 y 4,0 micrómetros y pueden atrapar 10% a 40% de un tampón acuoso que contiene macromoléculas. Los liposomas protegen al ADN de las nucleasas y facilitan su introducción en las células diana. La transfección también puede producirse mediante electroporación.

Antes de la administración los vectores modificados se suspenden en PBS completo a una densidad seleccionada para la inyección. Además de PBS, puede utilizarse cualquier solución osmóticamente equilibrada que sea fisiológicamente compatible con el sujeto para suspender e inyectar los vectores modificados en el huésped.

Para la inyección, la suspensión celular se aspira en la jeringa y se administra en receptores anestesiados. Pueden llevarse a cabo múltiples inyecciones utilizando este procedimiento. El procedimiento de suspensión vírica permite de esta manera la administración de vectores genéticamente modificados en cualquier sitio predeterminado de la próstata, es relativamente no traumático, permite múltiples administraciones simultáneamente en varios sitios diferentes o en el mismo sitio utilizando la misma suspensión vírica. Múltiples inyecciones pueden consistir de una mezcla de genes terapéuticos.

Usos de los vectores modificados

Se describen procedimientos para mantener e incrementar la expresión de genes terapéuticos utilizando un fragmento que presenta actividad de expresión.

Los procedimientos se ejemplifican mediante formas de realización en las que se inyectan en un sujeto vectores modificados que portan un gen terapéutico.

En una primera forma de realización, se expresa un producto proteína que comprende cultivar el sistema de vector huésped de la invención de manera que se produce la proteína en el huésped y se recupera la proteína producida de esta manera. Este procedimiento permite la expresión de los genes de interés en organismos tanto unicelulares como multicelulares. Por ejemplo, en un ensayo in vitro, las células prostáticas que presentan el vector que comprende un gen de interés (por ejemplo el gen ras) pueden utilizarse en pocillos de microtitulación, a modo de medio sin restricciones, para el producto del gen ras. Se añade a los pocillos una muestra de un sujeto con el fin de detectar la presencia de anticuerpos dirigidos contra el gen ras. Este ensayo puede ayudar en la determinación cuantitativa y cualitativa de la presencia de anticuerpos de ras en la muestra para la evaluación clínica de si el sistema inmunológico del sujeto está combatiendo la enfermedad asociada con los niveles elevados de ras.

En una segunda forma de realización, el cáncer prostático metastizado se trata mediante terapia génica, es decir, la corrección de un fenotipo de enfermedad in vivo mediante la utilización de las moléculas de ácido nucleico de la invención.

El sujeto de la terapia génica puede ser un sujeto humano, equino, porcino, bovino, murino, canino, felino o aviar. Otros mamíferos también se encuentran incluidos en la presente invención.

El modo de administración y régimen de dosificación más efectivo para las moléculas de la presente invención depende de la localización exacta del tumor prostático bajo tratamiento, de la severidad y desarrollo del cáncer, de la salud del sujeto y de la respuesta al tratamiento y del criterio del médico responsable. De acuerdo con lo anterior, las dosis de las moléculas deben ajustarse al sujeto individual.

Las moléculas pueden administrarse directa o indirectamente mediante otra célula; las células autólogas resultan preferentes, aunque las células heterólogas se encuentran comprendidas.

La interrelación entre las dosis para animales de diversos tamaños y especies y el ser humano basada en mg/m^{2} de área superficial ha sido descrita en Freireich, E.J. et al., Cancer Chemother. Rep. 50(4):219-244, 1966. Pueden realizarse ajustes del régimen de dosificación para optimizar la respuesta de inhibición y de eliminación del crecimiento de las células tumorales, por ejemplo las dosis pueden dividirse y administrarse diariamente o reducirse la dosis proporcionalmente dependiendo de la situación (por ejemplo, pueden administrarse diariamente varias dosis divididas o reducirse proporcionalmente dependiendo de la situación terapéutica específica).

Resulta evidente que la dosis de las moléculas de la invención necesarias para conseguir el tratamiento pueden modificarse adicionalmente mediante la optimización del programa.

Generación de animales transgénicos

Asimismo, se describen mamíferos no humanos transgénicos que comprenden ácidos nucleicos de PSCA. Por ejemplo, en una aplicación, pueden generarse animales no humanos deficientes en PSCA utilizando procedimientos estándares para inactivar un homólogo de PSCA o, en el caso de que los animales no sean viables, pueden utilizarse moléculas antisentido de PSCA inducibles para regular la actividad/expresión de homólogos de PSCA. Alternativamente, puede alterarse un animal para que contenga una molécula de ácidos nucleicos codificante de PSCA humano o una unidad de expresión de PSCA antisentido que dirija la expresión de la proteína PSCA o la molécula antisentido de una manera específica de tejido. En estos usos, se genera un mamífero no humano, por ejemplo un ratón o una rata, en los que se altera la expresión del gen homólogo de PSCA mediante inactivación o activación y/o se sustituye por un gen PSCA humano. Lo anterior puede conseguirse utilizando una diversidad de procedimientos conocidos de la técnica, tal como la recombinación dirigida. Tras la generación, el animal deficiente en homólogo de PSCA, el animal que expresa PSCA (humano u homólogo) de una manera específica de tejido, o un animal que expresa una molécula antisentido puede utilizarse para: (1) identificar procesos biológicos y patológicos mediados por la proteína PSCA, (2) identificar proteínas u otros genes que interaccionan con las proteínas PSCA, (3) identificar agentes que pueden suministrarse exógenamente para superar una deficiencia de proteína PSCA, y (4) servir como cribado apropiado para identificar mutaciones dentro del gen PSCA que incrementan o reducen la actividad.

Por ejemplo, resulta posible generar ratones transgénicos que expresan el minigén humano codificante de PSCA de una manera específica de tejido y someter a ensayo el efecto de la sobreexpresión de la proteína en tejidos y células que normalmente no contienen la proteína PSCA. Esta estrategia ha sido utilizada con éxito para otros genes, por ejemplo bcl-2 (Veis et al., Cell 75:229, 1993). Este tipo de enfoque puede aplicarse fácilmente a la proteína/gen PSCA y puede utilizarse para tratar la cuestión de un potencial efecto beneficioso o perjudicial de las proteínas PSCA en un tejido específico.

Además, se describe un animal transgénico que presenta células germinales y somáticas que comprenden un oncogén que se encuentra ligado a una región cadena arriba de PSCA efectiva para la expresión de dicho gen en los tejidos de dicho ratón para la promoción de un cáncer asociado con el oncogén, produciendo de esta manera un modelo de ratón de dicho cáncer.

Composiciones

Se describe una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácidos nucleicos de PSCA o un vector de expresión codificante de una proteína PSC o codificante de un fragmento de la misma y, opcionalmente, un portador adecuado. La invención proporciona asimismo una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo que reconoce y se une a la proteína PSCA. En una forma de realización, el anticuerpo o fragmento del mismo se conjuga o se une a un fármaco terapéutico o a un agente citotóxico.

Entre los portadores adecuados para las composiciones farmacéuticas se incluye cualquier material que, al combinarse con la molécula de la invención, conserva la actividad de la molécula y no es reactivo con los sistemas inmunológicos del sujeto. Entre los ejemplos se incluyen, aunque sin limitación, cualquiera de los portadores farmacéuticos estándares, tales como solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsión de aceite/agua y diversos tipos de agente humectante. Entre otros portadores también pueden incluirse soluciones estériles y tabletas, incluyendo tabletas recubiertas y cápsulas. Típicamente dichos portadores contienen excipientes, tales como almidón, leche, azúcar, determinados tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico o sales de los mismos, estearato de magnesio o de calcio, talco, grasas vegetales o aceites, gomas, glicoles u otros excipientes conocidos. Dichos portadores también pueden incluir aditivos saborizantes y colorantes u otros ingredientes. Se formulan composiciones que comprenden dichos portadores mediante procedimientos convencionales bien conocidos. Dichas composiciones también pueden formularse en diversas composiciones de lípidos tales como, por ejemplo, liposomas, así como en diversas composiciones poliméricas, tales como microesferas de polímero.

También se describe una composición diagnóstica que comprende una molécula de ácidos nucleicos de PSCA, una sonda que se hibrida específicamente con una molécula de ácidos nucleicos de la invención o con cualquier parte de la misma, o un anticuerpo de PSCA o fragmento del mismo. La molécula de ácidos nucleicos, la sonda o el anticuerpo o fragmento del mismo pueden marcarse con un marcador detectable. Entre los ejemplos de un marcador detectable se incluyen, aunque sin limitación, un isótopo radioactivo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante de metales o un enzima.

Ejemplos Ejemplo 1 Identificación y caracterización molecular de un antígeno superficial de célula prostática (PSCA) Materiales y métodos

Xenoinjertos LAPC-4: se generaron xenoinjertos LAPC-4 tal como se describe en Klein et al., Nature Med. 3:402-408, 1997.

RDA, análisis northern y RT-PCR: el análisis representacional de diferencias de tumores LAPC-4 dependientes e independientes de andrógenos se llevó a cabo según la descripción anterior (Braun et al., Mol. Cell. Biol. 15:4623-4630, 1995). Se aisló el ARN total utilizando sistemas de aislamiento de ARN Ultraspec® (Biotecx, Houston, TX) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se sondearon filtros northern con un fragmento RDA de 660 pb correspondiente a la secuencia codificante y parte de la secuencia 3' no traducida de PSCA o un fragmento de \sim400 pb de PSA. El filtro de múltiples tejidos humanos se obtuvo de Clontech y se sondeó tal como se ha especificado. Para el análisis de transcriptasa inversa (RT)-PCR, se sintetizó el ADNc de primera cadena a partir del ARN total utilizando el kit GeneAmp RNA PCR core (Perkin Elmer-Roche, New Jersey). Para la RT-PCR de los transcritos de PSCA humano, se utilizaron los cebadores 5'-tgcttgccctgttgatggcag- y 3'-ccagagcagcaggccgagtgca- para amplificar un fragmento de \sim320 pb. Se llevó a cabo el ciclado térmico en 25-25 ciclos de 95ºC durante 30 segundos, 60º durante 30 segundos y 72º durante 1 minuto, seguido de la extensión a 72º durante 10 minutos. Se utilizaron los cebadores para GAPDH (Clontech) como controles. Para el PSCA de ratón, los cebadores utilizados fueron 5'-ttctcctgctggccacctac- y 3'-gcagctcatcccttcacaat-.

Ensayo de hibridación in situ para el ARNm de PSCA: para la hibridación in situ del ARNm, se linearizó el plásmido PCR \pi (1 \mug, Invitrogen, San Diego, CA) que contenía el gen PSCA de longitud completa generando ribosondas marcadas con digoxigenina sentido y antisentido. Se llevó a cabo la hibridación in situ en un instrumento automático (Ventana Gen II, Ventana Medical Systems) tal como se ha descrito anteriormente (Magi-Galluzzi et al., Lab. Invest. 76:37-43, 1997). Se obtuvieron especímenes de próstata a partir de una base de datos anteriormente descrita que se expandió hasta \sim130 especímenes (Magi-Galluzzi et al., supra). Los portaobjetos se leyeron y se puntuaron según el porcentaje de células positivas (0=0%; 1=<25%; 2=25 a 50%; 3=>50%) y la intensidad de tinción (0=0; 1=1+; 2=2+; 3=3+). Las dos puntuaciones se multiplicaron, proporcionando una puntuación global de 0 a 9.

Resultados

ADNc de PSCA humano: se utilizó análisis representacional de diferencias (RDA), una técnica de hibridación subtractiva basada en PCR, para comparar la expresión génica en variantes dependientes e independientes de hormonas de un xenoinjerto de cáncer prostático humano (LAPC-4) y para aislar ADNc regulados positivamente en la sublínea LAPC-4 independiente de andrógenos. Se clonaron, secuenciaron y comprobaron para expresión diferencial múltiples genes. Se identificó un fragmento de 660 pb (clon nº 15) que se observó que se encontraba altamente sobreexpresado en tumores xenoinjertados comparado con la próstata normal.

La comparación de la expresión de este clon con el de PSA en próstata normal y en tumores xenoinjertados sugiere que el clon nº 15 era relativamente específico de cáncer (fig. 9).

El análisis de secuencias reveló que el clon nº 15 no presentaba ninguna correspondencia exacta en las bases de datos, aunque compartía una homología de nucleótidos de 30% con el antígeno 2 de células madre, un miembro de la superfamilia Thy-1/Ly-6 de antígenos de superficie celular anclados por glucosilfosfatidilinositol (GPI). El clon nº 15 codifica una proteína de 123 aminoácidos que es idéntica al 30% a SCA-2 (también denominada RIG-E) y contiene varios residuos cisteína altamente conservados característicos de la familia génica Ly-6/Thy-1 (fig. 3). Consistente con esta homología con una familia de proteínas ancladas por GPI, el clon nº 15 contiene tanto una secuencia de señal hidrofóbica aminoterminal como un tramo carboxi-terminal de aminoácidos hidrofóbicos precedido por un grupo de aminoácidos pequeños que definen un sitio de escisión/unión para el enlace de GPI (Udenfriend y Kodukula, Ann. Rev. Biochem. 64:563-591, 1995). También contiene cuatro sitios de N-glucosilación predecidos. Debido a su fuerte homología con el antígeno 2 de células madre, el clon nº 15 se redenominó antígeno de célula madre prostática (PSCA). A continuación, se llevó a cabo el análisis de RACE-PCR 5' y 3' utilizando ADNc obtenido del xenoinjerto LAPC-4 independiente de andrógenos y se obtuvo la secuencia de nucleótidos de ADNc de longitud completa (incluyendo las regiones codificantes y no traducidas). La secuencia de nucleótidos del ADNc de longitud completa codificante de PSCA humano se muestra en la fig. 1A y la secuencia de aminoácidos traducida se muestra en la fig. 1B y
en la fig. 3.

PSCA se expresa en células prostáticas: se examinó mediante el análisis de transferencia northern la distribución del ARNm de PSCA en tejidos humanos normales. Los resultados, mostrados en la fig. 9B, demuestran que PSCA se expresa predominantemente en la próstata, con un nivel de expresión más bajo en la placenta. Pueden detectarse cantidades reducidas de ARNm en riñón e intestino delgado tras la exposición prolongada y a aproximadamente 1/100 del nivel observado en el tejido prostático. El análisis de RT-PCR de la expresión de PSCA en los tejidos humanos normales también demuestra que la expresión de PSCA se encuentra restringida. En un panel de tejidos normales, se detectó un nivel elevado de expresión de ARNm de PSCA en la próstata, detectando un nivel significativo de expresión en placenta y amígdalas (fig. 7A). El análisis de RT-PCR del ARNm de PSCA en una diversidad de xenoinjertos de cáncer prostático, líneas celulares de cáncer prostático y otras líneas celulares, y en próstata normal mostraron un nivel elevado de expresión restringido a la próstata normal, a los xenoinjertos de cáncer prostático LAPC-4 y LAPC-9 y a la línea celular de cáncer ovárico A431 (fig. 7B).

El transcrito principal de PSCA en la próstata normal es de \sim1 kb (fig. 9B). Se analizó la expresión de PSCA de ratón mediante RT-PCR en bazo, hígado, pulmón, próstata, riñón y testículo de ratón. Al igual de PSCA humano, el PSCA murino se expresaba predominantemente en la próstata. La expresión también puede detectarse en el riñón a un nivel similar al observado en la placenta en tejidos humanos.

La expresión de PSCA, PSMA y PSA en líneas celulares de cáncer prostático y xenoinjertos se comparó mediante análisis de transferencia northern. Los resultados mostrados en la fig. 10 demuestran una expresión de nivel elevado específica del cáncer prostático tanto de PSCA como de PSMA, mientras que la expresión de PSA no es específica del cáncer prostático.

PSCA se expresa en un subconjunto de células basales en la próstata normal: la próstata normal contiene dos poblaciones principales de células epiteliales: células luminales secretorias y células basales subyacentes. Se llevaron a cabo hibridaciones in situ en múltiples secciones de próstata normal utilizando una ribosonda antisentido específica para PSCA para localizar su expresión. Tal como se muestra en la fig. 11, PSCA se expresa exclusivamente en un subconjunto de células basales normales. Se observa poca o nula tinción en estroma, células secretorias o linfocitos infiltrantes. La hibridación con ribosondas PSCA de cadena sentido no mostró ninguna tinción de fondo. La hibridación con una sonda antisentido para GAPDH confirmó que el ARN en todos los tipos celulares se encontraba intacto. Debido a que las células basales representan las células progenitoras putativas para las células secretorias terminalmente diferenciadas, estos resultados sugieren que PSCA podría ser un marcador de células madre/progenitoras específico de la próstata (Bonkhoff et al., Prostate 24:114-118, 1994). Además, debido a que las células basales son independientes de andrógenos, la asociación de PSCA con las células basales plantea la posibilidad de que PSCA podría desempeñar un papel en la progresión del cáncer prostático independiente de andrógenos.

PSCA se sobreexpresa en las células de cáncer prostático: el análisis inicial de comparación de la expresión de PSCA en próstata normal y en tumores xenoinjertados LAPC-4 sugiere que PSCA se sobreexpresaba en el cáncer prostático. Tal como se ha demostrado mediante el análisis de transferencia northern mostrado en la fig. 9, los tumores de cáncer prostático LAPC-4 expresan fuertemente PSCA; sin embargo, prácticamente no hay expresión detectable en la muestra de BPH. En contraste, la expresión de PSA es claramente detectable en la próstata normal, a niveles 2 a 3 veces superiores a los observados en los tumores LAPC-4. De esta manera, la expresión de PSCA en el cáncer prostático aparentemente es la inversa de la observada con PSA. Aunque PSA se expresa más fuertemente en tejido normal que en tejido prostático maligno, PSCA presenta un nivel de expresión más elevado en el cáncer
prostático.

Para confirmar la expresión de PSCA y su valor en el diagnóstico del cáncer prostático, se analizaron veintiséis especímenes de cáncer prostático incluidos en parafina mediante hibridación in situ de ARNm para la expresión de PSCA. Se obtuvieron especímenes a partir de tumores primarios extraídos mediante prostatectomía radical o resección transuretral en todos los casos excepto en uno. Todos los especimenes se sondearon con un constructo sentido y un constructo antisentido con el fin de controlar para la tinción de fondo. Se asignó a los portaobjetos una puntuación compuesta, tal como se describe en la sección Materiales y Métodos, indicando una puntuación de 6 a 9 expresión fuerte, y una puntuación de 4, expresión moderada. 102/126 (81%) de los cánceres se tiñó fuertemente para PSCA, mientras que otros 9/126 (7%) mostraron tinción moderada (figs. 11B y 11C). La neoplasia intraepitelial prostática de grado elevado, la lesión precursora putativa del cáncer prostático invasivo, se teñía fuertemente positiva para PSCA en 82% (97/118) de los especímenes (fig. 11B) (Yang et al., Am. J. Path. 150:693-703, 1997). Las glándulas normales se tiñeron consistentemente menos que las glándulas malignas (fig. 11B). Se obtuvieron nueve especímenes de pacientes tratados previamente a la cirugía con terapia de ablación hormonal. Siete de nueve (78%) de estos cánceres residuales, presumiblemente independientes de andrógenos, sobreexpresaban PSCA, un porcentaje similar al observado en cánceres no tratados. Debido a que un porcentaje elevado de especímenes expresaba ARNm de PSCA, no pudo calcularse una correlación estadística entre la expresión de PSCA y las características patológicos, tales como el estadio y grado del tumor. Estos resultados sugieren que la sobreexpresión de ARNm de PSCA es una característica común del cáncer prostático dependiente e independiente de andrógenos.

PSCA se expresa en líneas celulares de cáncer prostático independiente de andrógenos: aunque PSCA se clonó inicialmente utilizando hibridación subtractiva, el análisis de transferencia northern demostró una expresión fuerte de PSCA en tumores xenoinjertados LAPC-4 tanto dependientes como independientes de andrógenos (fig. 9). Además, se detectó expresión de PSCA en todos los xenoinjertos de cáncer prostático, incluyendo los xenoinjertos LAPC-4 y LAPC-9.

Asimismo, se detectó expresión de PSCA en las líneas PC3 y DU145 de cáncer prostático independiente de andrógenos negativo para receptor de andrógenos mediante análisis de la reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa. Estos datos sugieren que PSCA puede expresar en ausencia de receptor de andrógenos funcional.

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Ejemplo 2 Caracterización bioquímica de PSCA

El presente experimento muestra que PSA es una proteína de superficie celular glucosilada anclada por GPI.

Materiales y métodos

Anticuerpos policlonales e inmunoprecipitaciones: se generó antisuero policlonal de conejo contra el péptido sintético -TARIRAVGLLTVISK- y se purificó por afinidad utilizando una proteína de fusión PSCA-glutatión-S-transferasa. Se infectaron transitoriamente células 293T con vectores de expresión pCDNA II (Invitrogen, San Diego, CA) que contenían PSCA, CD59, E25 o únicamente vector mediante precipitación con fosfato de calcio. La inmunoprecipitación se llevó a cabo según ha sido descrita anteriormente (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press), 1988). Brevemente, se marcaron células con 500 \muCi de marcaje trans35S (ICN, Irvine, CA) durante seis horas. Lis lisados celulares y medios condicionados se incubaron con 1 \mug de anticuerpo anti-PSCA de conejo purificado y 20 \mul de proteína A-sefarosa CL-4B (Pharmacia Biotech, Suecia) durante dos horas. Para la desglucosilación, se trataron inmunoprecipitados durante la noche a 37ºC con 1 \mug de N-glucosidasa F (Boehringer Mannheim) o con 0,1 \mug de neuraminadasa (Sigma, St. Louis, MO) durante 1 hora, seguido de una noche en 2,5 mU de O-glucosidasa (Boehringer Mannheim).

Citometría de flujo: para el análisis de citometría de flujo de la expresión en superficie celular de PSCA, se tiñeron suspensiones de células individuales con 2 \mug/ml de anticuerpo anti-PSCA purificado y una dilución 1:500 de IgG anticonejo marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Jackson Laboratories, West Grove, PA). Los datos se adquirieron de un FACScan (Becton Dickinson) y se analizaron utilizando el programa informático LYSIS II. Las muestras de control se tiñeron únicamente con anticuerpo secundario. Se analizó el enlace glucosilfosfatidil-inositol digiriendo 2 x 10^{6} células con 0,5 unidades de fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol (PI-PLC, Boehringer Mannheim) durante 90 minutos a 37ºC. Las células se analizaron antes y después de la digestión mediante escaneo FACS o inmunotransferencia.

Resultados

PSCA es una glucoproteína anclada por GPI expresada sobre la superficie celular: la secuencia de aminoácidos de PSCA deducida predice que PSCA se encuentra fuertemente glucosilado y anclado a la superficie celular a través de un mecanismo GPI. Con el fin de someter a ensayo estas predicciones, los presentes inventores produjeron un anticuerpo policlonal purificado por afinidad cultivado contra un péptido PSCA único (ver Materiales y Métodos). Este péptido no contiene sitios de glucosilación y se predijo, basándose en la comparación con la estructura tridimensional de CD59 (otro homólogo de PSCA anclado por GPI), que se localizaba en una parte expuesta de la proteína madura (Kiefer et al., Biochem. 33:4471-4482, 1994). El reconocimiento de PSCA por el anticuerpo purificado por afinidad se demostró mediante inmunotransferencia y análisis de inmunoprecipitación de extractos de células 293T transfectadas con PSCA y con una proteína de fusión GST-PSCA. El anticuerpo policlonal inmunoprecipita predominantemente en una banda de 24 kd, procedente de células transfectadas con PSCA pero no de células falsamente transfectadas (fig. 12A). También se encuentran presentes tres bandas más pequeñas, siendo la más pequeña de \sim10 kd. El inmunoprecipitado se trató con N-glucosidasas y O-glucosidasas con el fin de determinar si estas bandas representaban formas glucosiladas de PSCA. La N-glucosidasa F desglucosiló PSCA, mientras que la O-glucosidasa no presentó ningún efecto (fig. 12A). Es conocido que algunas proteínas ancladas por GPI presentan formas tanto unidas a membrana como formas secretadas (Fritz y Lowe, Am. J. Physiol. 270:G176-G183, 1996). La fig. 12B indica que parte de PSCA se secreta en el sistema 293T sobreexpresante. La forma secretada de PSCA migra hasta un peso molecular más bajo que la forma asociada a la superficie celular, reflejando quizás la falta de enlace covalente de GPI. Este resultado podría reflejar el nivel elevado de expresión en la línea celular 293T y necesita confirmarse en líneas celulares de cáncer prostático e in vivo.

Se utilizó el análisis de separación celular activada por fluorescencia (FACS) para localizar la expresión de PSCA en la superficie celular. Se tiñeron células 293T falsamente transfectadas no permeabilizadas, células 293T que expresaban PSCA y células LAPC-4 con anticuerpo purificado por afinidad o únicamente con anticuerpo secundario. La fig. 12C muestra la expresión en superficie celular de PSCA en células 293T transfectadas con PSCA y en células LAPC-4, pero no en células falsamente transfectadas. Para confirmar que dicha expresión en la superficie celular se encontraba mediada por un enlace covalente de GPI, las células se trataron con fosfolipasa C específica de GPI (PLC). Una reducción de más de un log de la intensidad de fluorescencia indicó que PSCA había sido liberado de la superficie celular por la PLC.

También se confirmó mediante inmunotransferencia la recuperación del PSCA en medio condicionado posterior a la digestión. La especificidad de la digestión con fosfolipasa C para las proteínas ancladas por GPI se confirmó llevando a cabo el mismo experimento en células 293T transfectadas con antígeno CD59 unido por GPI o proteína E25a transmembranal no unida por GPI (Deleersnijder et al., J. Biol. Chem. 271:19475-19482, 1996). La digestión con PLC redujo la expresión en superficie celular de CD59 en el mismo grado que PSCA pero no presentó ningún efecto sobre E25. Estos resultados apoyan la predicción de que PSCA es una proteína de superficie celular glucosilada anclada por GPI.

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Ejemplo 3 Aislamiento de ADNc codificante de homólogo murino de PSCA

Se utilizó ADNc de PSCA humano para la búsqueda en bases de datos EST con el fin de identificar los homólogos para potenciales experimentos con transgénicos y con knockouts. Un EST obtenido a partir de ratón fetal y otro de riñón neonatal eran 70% idénticos al ADNc humano a niveles tanto de nucleótidos como de aminoácidos. La homología entre los clones de ratón y el PSCA humano incluía regiones de divergencia entre PSCA humano y sus homólogos anclados por GPI, indicando que estos clones probablemente representan el homólogo de ratón de PSCA. El alineamiento de estos ESTs y la extensión 5' utilizando RACE-PCR proporcionó la secuencia codificante completa (fig. 2).

Ejemplo 4 Aislamiento de genes PSCA humanos y murinos

El presente experimento muestra que PSCA se localiza en el cromosoma 8, banda q24.2.

Materiales y métodos

Clonación genómica: los clones del fago lambda que contiene el gen PSCA humano se obtuvieron mediante cribado de una biblioteca genómica humana (Stratagene) con una sonda de ADNc de PSCA humano (Sambrook et al., Molecular Cloning (Cold Spring Hrbor), 1989). Se obtuvieron clones de BAC (cromosoma artificial bacteriano) que contenían el gen PSCA murino mediante cribado de una biblioteca BAC murina (Genoma Systems, Inc., St. Louis, MO) con una sonda de ADNc de PSCA murino. Se subclonaron un fragmento NotI humano de 14 kb y un fragmento EcoRI murino de 10 kb en pBluescript (Stratagene), se secuenciaron y se maparon por restricción.

Mapado cromosómico mediante hibridación in situ por fluorescencia: se llevó a cabo el análisis cromosómico in situ por fluorescencia (FISH) tal como se ha descrito anteriormente utilizando clones solapantes de fago lambda humano (Rowley et al., PNAS USA 87:9358-9362, 1990; H. Shizuya, PNAS USA 89:8794).

Resultados

Estructura del gen PSCA: se obtuvieron y maparon por restricción clones genómicos humanos y murinos de aproximadamente 14 kb y 10 kb, respectivamente. Se muestra en la fig. 8 una representación esquemática de las estructuras génicas de PSCA y Ly-6/Thy-1 humanos y murinos. Los clones genómicos tanto humanos como murinos contiene tres exones codificantes de las regiones traducidas y 3' no traducidas del gen PSCA. Se presume la existencia de un cuarto exón codificante de una región 5' no traducida, basándose en la homología de PSCA con otros miembros de las familias génicas de Ly-6 y Thu-1 (fig. 8).

El gen PSCA humano se localiza en el cromosoma 8q24.2: el análisis de transferencia southern del ADN genómico de LAPC-4 reveló que PSCA se encuentra codificado por un gen de una copia. Otros miembros de la familia del gen Ly-6 contienen cuatro exones, incluyendo un primer exón codificante de una región 5' no traducida, y tres exones adicionales codificantes de la regiones traducidas y 3' no traducidas. Se obtuvieron clones genómicos de PSCA humano y murino que contenían todos los exones excepto el primer exón 5' inferido, mediante cribado de bibliotecas de fago lambda. Los clones de PSCA de ratón y humano presentaban una organización genómica similar. El clon humano se utilizó para localizar PSCA mediante análisis de hibridación in situ por fluorescencia. La cohibridación de clones solapantes de fago lambda PSCA humano resultó en el marcaje específico de únicamente el cromosoma 8 (fig. 13). El noventa y siente por ciento de las señales detectadas se localizaba en el cromosoma 8q24, de entre los que 87% era específico del cromosoma 8q24.2 Estos resultados demuestran que PSCA se localiza en el cromosoma 8, banda q24.2.

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Ejemplo 5 Generación de anticuerpos monoclonales que reconocen diferentes epítopos de PSCA Materiales y métodos

Generación y producción de anticuerpos monoclonales: se inmunizaron ratones BALB/c tres veces con una proteína de fusión de PSCA purificado-glutatión-S-transferasa (GST) que contenía los aminoácidos 22 a 99 de PSCA (fig. 1B). Brevemente, la secuencia codificante de PSCA correspondiente a los aminoácidos 18 a 98 de la secuencia de aminoácidos de PSCA humano se amplificó por PCR utilizando el par de cebadores siguiente:

5'-GGAGAATTCATGGCACTGCCCTGCTGTGCTAC

3'-GGAGAATTCCTAATGGGCCCCGCTGGCGTT

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La secuencia de PSCA amplificada se clonó en pGEX-2T (Pharmacia), se utilizó para transformar E. coli y se aisló la proteína de fusión.

Se fusionaron células de bazo con células de mieloma HL-1 utilizando una técnica estándar de hibridoma. Los hibridomas que eran positivos para PSCA según los análisis ELISA y FACS (ver los Resultados) se subclonaron. Se produjo líquido ascites en ratones C.B. 17 scid/scid y se purificaron anticuerpos monoclonales (mAbs) utilizando una columna de afinidad de proteína G (Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.). También se produjo mAb 1G8 de PSCA en Cell-Pharm System 100 según recomendaciones del fabricante (Unisyn Technologies, Hopkinton, MA).

ELISA for el cribado de hibridoma. Se inmovilizó GST o PSCA-GST sobre placas Reacti-Bind de anhídrido maleico-poliestireno activado (Pierce, Rockford, IL). Se añadieron 50 \mul de medio de hibridoma a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron 3 veces con 200 \mul de PBS que contenía BSA al 0,1% y Tween-20 al 0,05% y se incubaron durante 1 hora con 100 \mul de IgG antiratón (1:4.000) marcado con fosfatasa alcalina (Promega, Madison, WI). Las placas se revelaron con un sustrato de fosfatasa alcalina (Bio-Rad, Hercules, CA).

Cultivo celular. Se obtuvo LNCaP de ATCC y se transfectó establemente con vector de expresión pCDNA II (Invitrogen) que contenía PSCA o vector solo (Reiter, R. et al., 1998). Se prepararon células 293T transfectadas transitoriamente con PSCA o vector solo tal como se ha descrito anteriormente (Reiter, R. et al., 1998). Se propagaron explantes de xenoinjerto LAPC-9 en medio PrEGM (Clonetics, San Diego, CA) tras la digestión en pronasa al 1% durante 18 minutos a temperatura ambiente. Antes del análisis de FACS, se pasaron células LAPC-9 a través de una membrana de 40 \mum para obtener suspensiones de células individuales.

Inmunofluorescencia. Se cultivaron células sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-L-lisina. Se llevaron a cabo ensayos de inmunofluorescencia en células fijadas permeabilizadas y no permeabilizadas. Para la fijación, las células se trataron con paraformaldehído al 2% en PBS-CM (PBS, CaCl_{2} 100 \muM, MgCl_{2} 1 mM) durante 30 minutos en la oscuridad, se refrescaron con NH_{4}Cl 50 \muM en PBS-CM-BSA (PBS, CaCl_{2} 100 \muM, MgCl_{2} 1 mM, BSA al 0,2%) durante 10 minutos y se lavaron dos veces con PBS-CM-BSA. Para la permeabilización, las células se trataron adicionalmente con PBS-CM-BSA-saponina (saponina al 0,075% (Sigma) en PBS-CM-BSA) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadió mAb primario a una concentración de 2 a 5 mg/ml en PBS-CM-BSA (más saponina en casos de permeabilización) durante 60 minutos y se lavaron dos veces con PBS-CM-BSA. Se añadió anticuerpo IgG antiratón de cabra conjugado con FITC (diluido 1:500 en PBS-CM-BSA +/- saponina; Southern Biotechnology, Birmingham, AL) durante 30 minutos y se lavaron 3 veces con PBS-CM. Se montaron los portaobjetos en vectashield (Vector Laboratory, Inc., Burlingame, CA).

Citometría de flujo. Se incubaron células (1 x 10^{6}) durante 30 minutos a 4ºC con 100 \mul de mAb a una concentración de 2 \mug/ml en PBS que contenía suero de feto bovino al 2% o medio condicionado por hibridoma. Tras el lavado, las células se tiñeron con una dilución 1:500 de IgG antiratón de cabra conjugado con FITC (Southern Biotechnology, Birmingham, AL). Los datos se adquirieron en un FACScan (Becton Dickinson) y se analizaron mediante la utilización del programa informático LYSIS II.

Inmunotransferencia e inmunoprecipitación. Se llevó a cabo la inmunoprecipitación tal como ha sido descrito (Harlow, E. y Lane, D., 1988). Brevemente, se marcaron células con 500 \muCi de marcaje trans35 (ICN) durante 6 horas. Se incubaron lisados celulares con 3 \mug de mAb y 20 \mul de proteína A-sefarosa CL-4B (Pharmacia Biotech) durante 2 horas. Para la inmunotransferencia, se prepararon extractos de proteínas mediante lisado de células en 1X SDS-tampón de muestras Laemmli y sometiendo a ebullición durante 5 minutos. Las proteínas se separaron en geles de SDS-poliacrilamida al 12,5% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se incubaron con 2 \mug de mAb en 10 ml de tampón de bloqueo (leche desnatada al 5% en TBST). Se revelaron los filtros utilizando el sistema de detección de quimioluminiscencia intensificada de Amersham (Amersham, Arlington Heights, IL).

Inmunohistoquímica. Se obtuvieron del Department of Pathology del Beth-Israel Deaconess Medical Center-Harvard Medical School y de UCLA, muestras de tejido normal fijadas en formalina e incluidas en parafina. Se seleccionaron especímenes de prostatectomía radical primaria de una base de datos anteriormente descrita (Magi-Galluzzi, C. et al., 1997). Se obtuvieron metástasis óseas y especímenes de biopsia primaria correspondientes del Department of Pathology de UCLA. Se tiñeron tejidos normales y se puntuaron independientemente en dos instituciones con el fin de garantizar la reproducibilidad. Se tiñeron especímenes obtenidos de UCLA utilizando modificaciones de una técnica de inmunoperoxidasa anteriormente descrita (Said, J.W. et al., 1998). Se llevó a cabo la recolección de antígenos en secciones de parafina utilizando un vaporizador comercial y tampón citrato 0,01 M, pH 6,0. Tras la incubación con mAbs de PSCA durante 50 minutos (ver posteriormente), los portaobjetos se trataron secuencialmente con IgG antiratón de conejo, IgG anticonejo de cerdo y IgG anticerdo de conejo, todos ellos conjugados con biotina. A continuación, los portaobjetos se incubaron con estreptavidina-peroxidasa y se llevó a cabo la localización de anticuerpo utilizando la reacción de diaminobencideno. Se tiñeron especímenes obtenidos de Beth-Israel-Deaconess-Harvard Medical School tal como se ha descrito anteriormente, utilizando un instrumento automático Ventana NexES (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) (Magi-Galluzzi, C. et al., 1997). Se realizó la recuperación de los antígenos mediante microondas durante 15 minutos en EDTA, pH 8,05 a 750W. Se utilizaron mAbs purificados a una concentración de \sim1 \mug/\mul de ascites SCID a las concentraciones siguientes: 1G8=1:20, 3E6=1:30, 2H9=1:50, 4A10=1:100, 3C5=1:100. Se produjo mAb IG8 en CellPharm System 100 y se utilizó a una concentración de 1:10. Los controles positivos eran LAPC-9 y LNCaP-PSCA y los controles negativos eran LNCaP y anticuerpo irrelevante del isotipo correspondiente. Para aproximar las condiciones de descalcificación, se trataron los portaobjetos de estos especímenes durante 20 minutos en Decal-Stat (Lenger, NY) previamente a la tinción con mAbs de PSCA.

Se cultivaron anticuerpos monoclonales (mAbs) contra una proteína de fusión PSCA-GST sin las secuencias de señal aminoterminales y carboxilo-terminales de PSCA. Se seleccionaron fusiones positivas mediante ELISA utilizando la proteína de fusión PSCA-GST y GST solo. De los 400 hibridomas cribados, 28 reconocieron la fusión PSCA-GST pero no GST solo. Estas fusiones se cribaron secundariamente mediante citometría de flujo de células 293T no permeabilizadas transfectadas con PSCA y células 293T falsamente transfectadas. Se realizó el cribado secundario mediante FACS con el fin de seleccionar los clones capaces de reconocer PSCA sobre la superficie celular, planteando la hipótesis de que estos posteriormente podrían resulta útiles para aplicaciones de direccionamiento in vivo. De esta manera se identificaron siete fusiones positivas (mAbs 2A2, 3G3, 4A10, 1G8, 3E6, 3C5 y 2H9), de entre las cuales cinco (mAbs 4A10, 1G8, 3E6, 3C5 y 2H9) se subclonaron y se purificaron.

Los mAbs se sometieron a ensayo para su capacidad de inmunoprecipitar PSCA y/o de reconocer PSCA sobre membranas de inmunotransferencia. Todos los mAbs fueron capaces de inmunoprecipitar PSCA a partir de células 293T-PSCA, así como a partir de tumores xenoinjertados de cáncer prostático LAPC-9 que expresaban niveles elevados de PSCA endógeno (figura 37). De manera similar, todos los mAbs detectaron PSCA mediante inmunotransferencia, aunque los mAbs 2H9 y 3E6 reconocieron únicamente la forma desglucosilada de \sim12 kd de PSCA (figura 34).

La localización en PSCA de los epítopos reconocidos por los cinco mAbs se determinó mediante análisis de inmunotransferencia utilizando tres proteínas de fusión PSCA-GST truncadas. Los mAbs 4A10, 2H9 y 3C5 reconocen un epítopo que reside dentro de la parte aminoterminal de PSCA (es decir, los aminoácidos 21 a 50); mAb 1G8 reconoce un epítopo dentro de la región intermedia de PSCA (es decir, los aminoácidos 46 a 85) y mAb 3E6 reacciona dentro de la parte carboxilo-terminal de PSCA (aminoácidos 85 a 99) (figura 15). Los cinco mAbs son IgG, tal como se describe en la figura 15. Estos resultados demuestran que los cinco mAbs pueden detectar PSCA en múltiples ensayos y reconocer por lo menos tres epítopos diferentes en PSCA.

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Los mAbs de PSCA tiñen la superficie celular de las células de cáncer prostático

La utilidad de los mAbs para estudiar la biología de PSCA y para potenciales aplicaciones técnicas, tal como en aplicaciones de transporte in vivo, depende de su capacidad de reconocer el antígeno de interés en la membrana plasmática (Liu, H. et al., 1997; McLaughlin, P. et al., 1998; Wu, Y. et al., 1995; Tokuda, Y. et al., 1996). Con el fin de determinar la capacidad de los mAbs 2H9, 3E6, 1G8, 4A10 y C5 de reconocer PSCA específicamente sobre la superficie celular de las células de cáncer prostático, se transfectaron células LNCaP con PSCA (LNCaP-PSCA) y células LAPC-9 se examinaron mediante citometría de flujo e inmunofluorescencia indirecta. Al igual que con las células 293T-PSCA, la totalidad de los cinco mAbs fueron capaces de detectar PSCA sobre la superficie celular de células LNCap-PSCA y/o LAPC-9 no permeabilizadas mediante citometría de flujo (figura 33). Las células LNCaP falsamente transfectadas y LNCaP transfectadas con un vector que contenía neomicina solo (LNCaP-neo), ninguna de las cuales expresa niveles detectables de ARNm de PSCA, eran ambas negativas.

Se llevó a cabo un análisis de inmunofluorescencia en células tanto permeabilizadas como no permeabilizadas con el fin de determinar si la proteína PSCA se localiza en la superficie celular (Liu, H. et al., 1997). Las células LNCaP-PSCA no permeabilizadas mostraban una clara reactividad en la superficie celular con los mAbs 1G8, 3E6, 4A10 y 3C5 pero no se tiñeron con mAb 2H9 (mAb 2H9 tampoco detectó PSCA en células LNCaP-PSCA mediante FACS). Las células LAPC-9 mostraron reactividad en la superficie celular con los cinco Mabs (figura 35). LNCaP-neo, tal como se predijo, era negativo tanto con como sin permeabilización. La permeabilización de LNCaP-PSCA y LAPC-9 resultó en tinción tanto membranal como citoplasmática. Todos los mAbs produjeron un patrón de tinción punteado sobre la superficie celular, que era más pronunciado con los mAbs 3E6, 3C5 y 4A10 (figura 35). Este patrón podría reflejar la agregación o agrupamiento de PSCA en regiones de la superficie celular. Estos resultados demuestran que la totalidad de los cinco mAbs reacciona con PSCA sobre la superficie celular de las células de cáncer prostático intactas.

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Tinción inmunohistoquímica de PSCA en la próstata normal

El ARNm de PSCA se localiza en un subconjunto de células basales en la próstata normal, sugiriendo que PSCA podría ser un marcador de superficie celular para las células madre/progenitoras prostáticas (Reiter, R. et al., 1998). Con el fin de someter a ensayo la posibilidad de que la proteína PSCA sea un marcador de las células basales, se examinó la expresión de PSCA inmunohistoquímicamente en secciones incluidas en parafina de próstata normal. Los mAbs 1G8 y 2H9 tiñeron el citoplasma de células tanto basales como secretorias, mientras que mAb 3E6 reaccionó predominantemente con las células basales (figura 38). Las glándulas atróficas, que expresan citoqueratinas de las células basales, se tiñeron fuertemente con los tres mAbs (figura 38) (O'Malley, F.P. et al., 1990). Los mAbs 3C5 y 4A10 proporcionaron una fuerte tinción de fondo y/o tinción nuclear no específica en secciones de parafina y no se utilizaron más. Estos resultados sugieren que, aunque el ARNm de PSCA se detecta específicamente en las células basales, la proteína PSCA puede detectarse en ambas capas celulares epiteliales (es decir, basal y secretoria) de la próstata, aunque existen algunas diferencias en los patrones de tinción de los anticuerpos individuales.

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Análisis inmunohistoquímico de los tejidos normales

Los estudios iniciales de los presentes inventores indicaron que la expresión de PSCA en hombres era mayoritariamente específica de la próstata, con niveles bajos de ARN detectable en riñón e intestino delgado. También se detectó ARNm de PSCA en la placenta. La especificidad de próstata de la expresión de la proteína PSCA se sometió a ensayo mediante tinción inmunohistoquímica de 20 tejidos utilizando mAb 1G8 (ver la Tabla 1). Se confirmó la tinción positiva del tejido con mAb 1G8 con los mAbs 2H9 y/o 3E6 con el fin de garantizar la reproducibilidad con mAbs dirigidos contra epítopos diferentes. También se llevó a cabo tinción y puntuación independientemente en dos instituciones con el fin de confirmar los resultados. Tal como se predijo a partir del análisis del ARN, la placenta proporcionó resultados positivos con todos los mAbs sometidos a ensayo, detectando tinción citoplasmática en los trofoblastos (figura 39A). En el riñón se detectó tinción en los conductos recolectores y túbulos contorneados, pero no en los glomérulos (figura 39A). El epitelio transicional de la vejiga y el uréter, que no había sido examinado previamente al nivel de ARNm, proporcionó resultados positivos con todos los mAbs sometidos a ensayo (figura 39A). El único otro tejido con inmunorreactividad significativa fue el colon, en el que células individuales situadas profundamente dentro de las criptas presentaron una intensa tinción positiva (figura 39A). La doble tinción con cromogranina indicó que estas células eran de origen neuroendocrino.

Con el fin de confirmar que la reactividad de mAb en la vejiga representaba PSCA, se llevó a cabo análisis de transferencia northern en tres muestras de vejiga normales obtenidas en una cistectomía radical y se compararon con la expresión de PSCA en próstata, riñón y el xenoinjerto LAPC-9 (figura 39B). Se detectó ARNm de PSCA en la vejiga a niveles inferiores a los observados en la próstata, confirmando el resultado inmunohistoquímico. No se detectó ninguna señal en los tres especímenes de riñón, consistentemente con la observación anterior de los presentes inventores de que la expresión de PSCA en el riñón es significativamente inferior que en la próstata (Reiter, R. et al., 1998). LAPC-9, un cáncer prostático xenoinjertado establecido a partir de metástasis ósea, expresa niveles muy elevados de ARNm de PSCA en comparación con la vejiga y próstata normales (Whang, Y.E. et al., 1998). Estos resultados confirman que la expresión de PSCA en hombres es en gran parte predominantemente prostática; sin embargo, también se produce un nivel detectable de expresión de proteína PSCA en el urotelio, conductos colectores renales y células neuroendocrinas colónicas.

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La proteína PSCA se expresa en una mayoría de cánceres prostáticos localizados

En el estudio anterior de los presentes inventores, se expresó ARNm en \sim80% de los tumores y aparentemente se expresaba a un nivel más alto en glándulas normales que malignas (Reiter, R. et al., 1998). Con el fin de determinar si la proteína PSCA puede detectarse en cánceres prostáticos y si los niveles de proteína PSCA se encuentran incrementados en glándulas malignas en comparado con glándulas benignas, se inmunotiñeron con mAb 1G8 especímenes patológicos incluidos en parafina de cánceres prostáticos primarios y metastásicos (figuras 21 y 28). También se tiñeron casos aislados con mAbs 3E6 o 2H9 con el fin de confirmar la especificidad de la tinción. Doce de 15 cánceres primarios se tiñeron positivamente (figura 21), incluyendo 2/2 casos con focos de neoplasia intraepitelial prostática de grado elevado. La intensidad de tinción variaba, con 7 casos de tinción equivalente en glándulas cancerosas y normales contiguas, y 5 con tinción significativamente más fuerte con cáncer. En algunos casos se producía una expresión fuerte en las glándulas malignas y una tinción no detectable en tejido normal contiguo (figura 21; paciente 1). Además, en algunos casos la tinción era heterogénea, tiñéndose algunas glándulas malignas más fuertemente que otras (figura 21; paciente 2). Globalmente, los tumores pobremente diferenciados se tiñeron más fuertemente que los bien diferenciados, sugiriendo que la sobreexpresión de PSCA podría correlacionarse con el grado tumoral (figura 21; paciente 3). Estos resultados demuestran que la proteína PSCA se expresa en el cáncer prostático. Resulta consistente con los estudios in situ anteriores de ARNm de los presentes inventores que PSCA aparentemente se sobreexpresa en un porcentaje significativo de cánceres, quizás concertadamente con un grado tumoral más alto.

El presente estudio describe la primera caracterización de la expresión de la proteína PSCA utilizando cinco anticuerpos monoclonales dirigidos contra PSCA. Debido a que estos mAbs reconocen epítopos sobre el exterior de la superficie celular, podrían presentar utilidad en el diagnóstico y terapia del cáncer prostático (Liu, H. et al., 1997). Una posibilidad es que estos mAbs podrían utilizarse para localizar sitios de enfermedad metastásica, de manera similar al escaneo Prostascint, que utiliza un anticuerpo dirigido contra PSMA (Sodee, D.B. et al., 1996). Otra posibilidad es que pueden utilizarse para reconocer células de cáncer prostático terapéuticamente, solos o conjugados con un isótopo radioactivo u otra toxina. En la actualidad se están evaluando enfoques similares utilizando anticuerpos dirigidos contra epítopos extracelulares en PSMA (Murphy, G.P. et al., 1998; Liu, H. et al., 1997; Liu, H. et al., 1998).

Los mAbs de PSCA tiñen la superficie celular de una manera puntuada, sugiriendo que PSA podría localizarse en regiones específicas de la superficie celular. Las proteínas ancladas por GPI es conocido que se agrupan en microdominios enriquecidos en glicolipídos insolubles en detergentes (DIGS) de la superficie celular (Varma, R. y Mayor, S., 1998). Estos microdominios, que incluyen caveolas y balsas de esfingolípido-colesterol, se cree que desempeñan funciones críticas en la transducción de señales y el transporte molecular (Anderson, R., Caveolae, 1993; Friedrichson, T. y Kurzchalia, T.V., 1998; Hoessli, D.C. y Robinson, P.J., 1998). Thy-1, un homólogo de PSCA, se ha demostrado previamente que transmite señales a las quinasas src a través de la interacción en microdominios lipídicos (Thomas, P.M. y Samuelson, L.E., 1992; Stefanova, I. et al., 1991). Los experimentos preliminares de fraccionamiento subcelular en el laboratorio de los presentes inventores confirman la presencia de PSCA en DIGS (Xavier, R. et al., 1998).

Las proteínas ancladas por GPI también se ha informado de que se localizan en prostasomas, vesículas de almacenamiento unidas a membrana liberadas por las células epiteliales prostáticas (Ronquist, G. y Brody, I., 1985). CD59, un inhibidor anclado por GPI de la citolisis mediada por el complemento, se encuentra a concentraciones elevadas en prostasomas de las células epiteliales de la próstata normal y en secreciones prostáticas (Rooney, I. et al., 1993). Se detecta proteína PSCA en las células secretorias prostáticas.

Al contrario que el resultado anterior de los presentes inventores de que el ARNm de PSCA se localizaba exclusivamente en las células basales, los resultados actuales sugieren que la proteína PSCA podría encontrarse presente en células tanto basales como secretorias. Se han descrito diferencias similares en la localización en la próstata del ARNm y de las proteínas para PSMA y el receptor de andrógeno (Magi-Galuzzi, C. et al., 1997; Kawakami, M. y Nakayama, J., 1997). Una posible explicación para la presencia de proteína PSCA en las células secretorias es que el ARNm de PSCA se transcribe en células progenitoras basales pero la expresión de la proteína PSCA persisten debido a que las células basales se diferencian formando células secretorias. Otra posibilidad es que la proteína PSCA podría transferirse de las células basales a las secretorias después de la traducción.

Las diferencias de intensidad de tinción de células basales y células secretorias provocadas por los mAbs 3E6, 1G8 y 2H9 podrían reflejar los diferentes epítopos reconocidos por los anticuerpos y/o diferencias en la modificación post-traduccional de PSCA en células basales y en células secretorias. En apoyo de esta posibilidad está la observación de que cinco mAbs no reaccionan igualmente con PSCA en todos los ensayos o líneas celulares. mAb 2H9 reconoce PSCA sobre la superficie celular de LAPC-9 pero no de LNCaP-PSCA, sugiriendo que el epítopo reconocido por este anticuerpo puede encontrarse alterado u oscurecido en el último tipo celular. Los presentes inventores también han observado que el mAb 3E6 no tiñe cánceres tan fuertemente como los mAbs 1G8 y 2H9 en algunos casos, sugiriendo que podría reaccionar con determinadas formas de PSCA preferencialmente.

Aunque es mayoritariamente específico de la próstata en el ser humano, PSCA también se expresa a niveles más bajos en urotelio, células neuroendocrinas colónicas y túbulos renales y conductos recolectores. La tinción observada en los túbulos renales y conductos recolectores resulta interesante en el aspecto de que estas estructuras derivan embriológicamente del brote ureteral del conducto mesonéfrico, sugiriendo un posible motivo para los patrones de tinción observados en el riñón. La ausencia de ARNm de PSCA detectable en especímenes de riñón podría reflejar niveles bajos de expresión o la posibilidad de que las muestras se habían obtenido principalmente del córtex renal, mientras que los conductos recolectores se encuentran localizados en la médula renal.

El impulso principal para identificar los genes de superficie celular específicos de la próstata es el deseo de desarrollar terapias no tóxicas selectivas. PSMA, otra proteína "restringida a la próstata" también se ha demostrado que se expresa en duodeno, en células neuroendocrinas colónicas y túbulos renales proximales (Silver, D.A. et al., 1997). Los informes preliminares sobre la terapia de vacuna de PSMA indican que no se ha producido toxicidad significativa (Tjoa, B.A. et al., 1998).

La expresión de PSCA en urotelio y riñón aparentemente es más baja que en la próstata normal y significativamente inferior a la observada en muchos de los cánceres prostáticos evaluados. Por lo tanto, las terapias dirigidas contra PSCA podrían ser relativamente selectivas para el cáncer, de manera similar a cómo los anticuerpos Her-2/neu presentan como diana principal los cánceres de mama que sobreexpresan Her-2/neu (Disis, M.L. y Cheever, M.A., 1997).

La expresión de PSCA en urotelio y riñón plantea la posibilidad de que pueda expresarse en carcinomas transicionales y de células renales. Dos de los cánceres de vejiga examinados expresan PSCA, uno de ellos a niveles similares a LAPC-9, sugiriendo que PSCA podría sobreexpresarse en algunos casos de carcinoma celular transicional. Resultará necesario un estudio más completo de los especímenes de cáncer de vejiga para someter a ensayo esta posibilidad.

Los datos en la presente memoria apoyan la observación anterior de los presentes inventores de que PSCA se expresa en la mayoría de cánceres prostáticos. De manera similar, la proteína PSCA se sobreexpresa en algunos tumores prostáticos comparado con glándulas normales contiguas, apoyando su utilización como diana para la terapia del cáncer prostático. En contraste con los estudios in situ del ARNm, los resultados actuales sugieren que la expresión de la proteína PSCA podría correlacionarse con el estadio y/o grado del cáncer. Se han observado diferencias similares entre el ARN y la expresión de proteínas para la timosina Beta-15 (Bao, L. et al., 1996).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Expresión de PSCA en tejidos normales

1

*mAb 3E6 reacciona con el túbulo contorneado distal, mientras que mAb 1G8 reacciona con túbulos distales y, en algunos casos, con túbulos proximales.

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Ejemplo 6

El presente experimento muestra que la expresión de PSCA se amplifica en metástasis óseas de cáncer prostático.

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Materiales y métodos

Se diluyó (dilución 1/20) suero de caballo (NHS) (GIBCO nº 26050-070) en caseína al 1%, PBST. Los anticuerpos de la invención que reconocen PSCA se diluyeron en NHS 1/100, PBST.

El sistema de detección incluía HRP-Ig antiratón de conejo (DAKO P260), HRP-Ig anticonejo de cerdo (DAKO P217), HRP-Ig anticerdo de conejo (DAKO P164). Cada uno de ellos se diluyó 1/100 en NHS 1/100, PBST.

Se preparó solución madre de tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina (DAB) (Fluka) mediante la disolución de 5 g en 135 ml de Tris 0,05 M, pH 7,4. Se prepararon alícuotas de DAB de 1 ml/vial y se congelaron a -20ºC. Se preparó una solución de trabajo de DAB mediante la adición de 1 ml de DAB a 40 ml de tampón DAB y 40 microlitros de H_{2}O_{2} al 50%.

Se preparó tampón DAB mediante la combinación de 1,36 g de imidazol (Sigma nº I-0125) y 100 ml de D_{2}-H_{2}O, ajustando después el pH a 7,5 con HCl 5N. Tras el ajuste del pH, se añadieron 20 ml de Tris 0,5 M, pH 7,4, y 80 ml de D_{2}-H_{2}O.

\newpage

Se corrió una sección de un tejido/tumor conocido y que previamente se había demostrado que era positiva para el anticuerpo, conjuntamente con el portaobjetos del paciente. Este portaobjetos sirvió como "control positivo" para ese anticuerpo. Se incubó una sección del espécimen de ensayo del paciente con un anticuerpo de control negativo en lugar del anticuerpo primario. Este portaobjetos sirvió como "control negativo" para el ensayo.

El procedimiento de tinción fue el siguiente. Se aplicaron muestras de hueso a los portaobjetos. A continuación, los portaobjetos se hornearon durante la noche a 60ºC. Los portaobjetos se desparafinaron en 4 cambios de xileno durante 5 minutos cada uno y se pasaron a través de una serie gradada de alcohol etílico (100% x 4, 95% x 2) a agua corriente, después se transfirió a NBF y se fijó durante 30 minutos. Los portaobjetos fijados se dejaron bajo agua corriente durante 15 minutos, se transfirieron a H_{2}O_{2} al 3%-MeOH, se incubaron durante 10 minutos y se lavaron en agua corriente durante 5 minutos, y después se enjuagaron en agua desionizada.

A continuación, los portaobjetos se sometieron a tampón citrato 0,01 M, pH 6,0, se calentaron a 45ºC durante 25 minutos, se enfriaron durante 15 minutos y después se lavaron en PBS. A continuación, los portaobjetos se enjuagaron en PBS y se introdujeron en un DAKO Autostainer programado utilizando el programa siguiente de cuatro etapas. El programa de cuatro etapas era el siguiente. El portaobjetos se enjuaga en PBS y se bloquea con 1/20 NHS en caseína al 1% en PBST durante 10 minutos. A continuación, se aplica el anticuerpo primario y se incuba durante 30 minutos seguido de un enjuague con tampón. Seguidamente se aplica HRP-Ig antiratón de conejo y se incuba durante 15 minutos, seguido de otro enjuague con tampón. Se aplica HRP-Ig anticonejo de cerdo y se incuba durante 15 minutos, seguido de un enjuague con tampón. Se aplica HRP-Ig anticerdo de conejo y se incuba durante 15 minutos, seguido de un enjuague con tampón.

A continuación, se aplica DAB al portaobjetos y se incuba durante 5 minutos, seguido de un enjuague con tampón. Se aplica un segundo DAB y se incuba durante 5 minutos, seguido de un enjuague con tampón.

Se extraen los portaobjetos del Autostainer y se introducen en soportes para portaobjetos, se enjuagan en agua corriente y se contratiñen con hematoxilina de Harris (15 segundos). A continuación, el portaobjetos se lava en agua corriente, se sumerge en ácido-alcohol, se lava en agua corriente, se sumerge en solución de bicarbonato sódico y se lava en agua corriente. Seguidamente los portaobjetos se deshidratan en alcoholes etílicos gradados (95% x 2, 100% x 3) y Propar x 3 y se cubren con Permount.

La proteína PSCA se expresa fuertemente en cánceres prostáticos metastásicos a hueso

El cáncer prostático es único entre los tumores humanos en su propensión a metastizar preferentemente al hueso y de inducir respuestas osteoblásticas. Se examinaron inmunohistoquímicamente nueve secciones de metástasis óseas de cáncer prostático (figura 28). Todas reaccionaron intensa y uniformemente con mAb 1G8 (y/o 3E6). En dos casos pudieron observarse micrometástasis no fácilmente detectables en secciones con hematoxilina y eosina tras la tinción con mAb 1G8 (figura 28; paciente 5). Globalmente, la tinción en metástasis óseas era más fuerte y más uniforme que en tumores primarios. En tres casos se encontraban disponibles especímenes de biopsia procedentes de tumores primarios para la comparación. Todos eran débilmente positivos para PSCA en comparación con la metástasis ósea correspondiente, sugiriendo que la expresión de PSCA se encontraba incrementada en el hueso. En un espécimen de biopsia, se observó tinción débil únicamente en un foco pequeño de glándulas malignas, mientras que el resto del tumor era negativo (figuras 21 y 28; paciente 4). En dos casos se obtuvieron especímenes de biopsia 10 y 15 años antes de la metástasis ósea, indicativo de un periodo de latencia prolongado entre el desarrollo de la lesión primaria y las lesiones metastásicas. Para descartar la posibilidad de que la tinción fuerte del hueso estuviera causada por el procedimiento de descalcificación utilizado para preparar las secciones de hueso, los tres especímenes de biopsia primaria también se trataron con tampón de descalcificación. Aunque este tratamiento incrementó la tinción de fondo, no alteró la reactividad epitelial significativamente, indicando que la fuerte señal en el hueso era improbable que estuviese causada por el procedimiento de descalcificación. Estos resultados sugieren que en las metástasis a hueso del cáncer prostático el PSCA podría seleccionarse o regularse positivamente.

Las figs. 21 a 23 muestran que las muestras de hueso de metástasis óseas de cáncer prostático eran positivos para PSCA. Se examinaron nueve secciones de metástasis óseas de cáncer prostático. Se observó una tinción intensa consistente en nueve metástasis óseas de cáncer prostático y todos reaccionaron intensa y uniformemente con mAb 1G8 (y/o 3E6). En dos casos el patólogo no pudo identificar con facilidad la metástasis hasta que la tinción con 1G8 puso de manifiesto la lesión. Globalmente la tinción de las metástasis óseas aparentemente era más fuerte y más uniforme que en los tumores primarios.

Dichos resultados sugieren que PSA podría encontrarse muy sobreexpresado en las metástasis de cáncer prostático a hueso. Lo anterior resulta particularmente interesante debido a que Sca-2, un homólogo próximo de PSCA, se ha informado recientemente de que suprime la actividad de osteoclastos en la médula ósea. Si PSCA presentase actividad similar, podría proporcionar una explicación para la tendencia de las metástasis de cáncer prostático de producir una respuesta osteoblástica, debido a que la inhibición de la actividad osteoclástica desequilibraría el equilibrio de actividad en el hueso hacia la formación de hueso. Otra posibilidad es que PSCA podría estar implicado en la adhesión al hueso, debido a que otros miembros de la familia Ly-6/Thy-1 se encuentran implicados en procesos similares. Se ha observado una expresión heterogénea de PSCA en varios cánceres primarios de próstata. Estos resultados apoyan adicionalmente la utilización de PSCA como nueva diana para la enfermedad en estadio avanzado.

Uno de los resultados más intrigantes del presente estudio es la tinción consistentemente intensa observada en las nueve metástasis óseas de cáncer prostático. LAPC-9, un xenoinjerto establecido a partir de metástasis óseas, también se tiñó intensamente para PSCA. En tres pacientes los especímenes de biopsia primaria correspondiente mostraron niveles reducidos en comparación con las metástasis óseas. Podrían haberse ignorado áreas de fuerte expresión de PSCA en los tumores primarios de los tres pacientes examinados debido a que únicamente se encontraban disponibles biopsias para el análisis. Se detectó la expresión heterogénea de PSCA en por lo menos un tumor primario correspondiente, así como en el número de tumores primarios para los que no se encontraban disponibles lesiones metastásicas correspondientes. Además, en dos casos el tumor primario se muestreó por lo menos una década antes de producirse las metástasis óseas, haciendo surgir la posibilidad de que los clones que expresaban niveles elevados de PSCA dentro del tumor primario se hubiesen desarrollado después de la biopsia inicial. Estos resultados demuestran claramente la expresión de PSCA en las metástasis óseas, apoyando adicionalmente su utilización como diana para la enfermedad en estadio avanzado.

Ejemplo 7

El presente experimento muestra que la expresión de PSCA es más elevada en carcinomas de vejiga que en la vejiga normal.

Se obtuvieron de pacientes tejidos de próstata, vejiga, riñón, testículos e intestino delgado (incluyendo cáncer prostático y carcinomas de vejiga y de riñón). A continuación, estos tejidos se examinaron para la unión con PSCA utilizando análisis de transferencia northern y western de la manera siguiente.

Para los análisis de transferencia northern, se extrajeron muestras de tejido y una muestra de tejido de menos de 0,5 x 0,5 cm se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Las muestras se homogeneizaron en 7 ml de Ultraspec (Biotecx, Houston, Texas) utilizando un homogeneizador polytron utilizando el protocolo proporcionado por Biotecx (Ultraspec^{TM} RNA Isolation System, Biotecx Bulletin nº 27, 1992).

Tras la cuantificación, se cargaron 20 \mug de ARN purificado de cada muestra en un gel de formaldehído-agarosa al 1%. Las condiciones de corrido y de transferencia eran las mismas que las utilizadas en el Ejemplo 1. Los filtros se sondearon separadamente con PSCA marcado y un control interno, la actina. Los filtros se lavaron y se expusieron durante varias horas-toda la noche.

Para los análisis de transferencia western, las muestras de tejido se extrajeron y se tomó una muestra de tejido de 0,5 x 0,5 cm y se trituró rápidamente en un volumen igual de 2X tampón para muestras caliente (SDS al 5%, glicerol al 20%). Las muestras se incubaron a 100ºC durante 5 minutos, se centrifugaron con vórtex y se clarificaron durante 30 minutos. Se determinaron las concentraciones de proteína con el kit de ensayo de proteínas DC de Biorad (Richmond, CA). Se cargaron 40 \mug/muestra en un gel para proteínas de poliacrilamida al 12%. Se llevó a cabo la transferencia a un filtro de nitrocelulosa mediante procedimientos estándares (Towbin et al., PNAS 76:4350, 1979). Se llevó a cabo una transferencia western mediante incubación del filtro con anticuerpo primario IG8 seguido de un anticuerpo secundario, es decir, HRP-IgG \alpharatón de cabra. La detección se llevó a cabo con el kit de detección ECL de Amersham (Arlington Heights, IL).

1G8 reconoció y se unió a PSCA sobre la superficie de las células de LAPC9 y un carcinoma de vejiga (denominado "Bladder" (Rob)) en un análisis de transferencia western (fig. 6). En la fig. 6, todos los tejidos excepto LAPC9 eran normales. Un análisis de transferencia northern confirmó el nivel elevado de PSCA en el tejido de carcinoma de vejiga (denominado "Bladder" (Rob)) (también denominado Kid CA, Rob) y LAPC9) (fig. 25).

Ejemplo 8

El presente experimento demuestra que el número de copia de PSCA se incrementa en grado similar al número de copia de c-myc (figura 17). Lo anterior es importante debido a que la amplificación de c-myc se correlaciona con un resultado pobre. De esta manera, los datos sugieren que la amplificación de PSCA también podría ser un factor predictivo de un resultado pobre.

FISH con sondas de enumeración cromosómica y una sonda para c-myc

El procedimiento FISH es bien conocido (Qian, J. et al., "Chromosomal Anomalies in Prostatic Intraepithelial Neoplasia and Carcinoma Detected by Fluorescence in vivo Hybridization", Cancer Research 55:5408-5414, 1995). Brevemente, se desparafinaron, deshidrataron e incubaron en 2X SSC a 75ºC durante 15 minutos secciones tejido (las muestras 34 y 75 eran de dos pacientes), se digirieron en solución de pepsina [4 mg/ml en NaCl al 0,9% (pH 1,5)] durante 15 minutos a 37ºC, se enjuagaron en 2X SSC a temperatura ambiente durante 5 minutos y se secaron al aire.

Se seleccionaron sondas de ADN fluorescente marcadas directamente para PSCA y para la región 8q24 (c-myc). Se utilizó el ADNc de PSCA (fig. 1) para identificar un clon cromosoma bacteriano artificial (bac) de 130 kb (sonda de PSCA) que a su vez se utilizó en el análisis FISH siguiendo el protocolo del fabricante (Genome Systems Inc.). El clon bac identificado de esta manera y utilizado en el análisis FISH era BACH-265B12 (Genome Systems Inc., número de control 17424).

Se llevó a cabo hibridación de dos sondas en las secciones seriadas de 5 \mum utilizando una sonda de PSCA marcada con SG conjuntamente con una sonda marcada con SO para 8q24 (c-myc). Las sondas y el ADN diana se desnaturalizaron simultáneamente en un horno a 80ºC durante 5 minutos y cada portaobjetos se incubó a 37ºC durante la noche.

Se llevaron a cabo lavados posteriores a la hibridación en urea 1,5 M/0,1X SSC a 45ºC durante 30 minutos y en 2X SSC a temperatura ambiente durante 2 minutos. Se contratiñeron núcleos con 4,6-diamidino-2-fenilindol y el compuesto p-fenilendiamina.

Se realizó un recuento del número de señales de FISH con un microscopio Zeiss Axioplan dotado de un filtro de triple pase (I02-104-1010; VYSIS). Se realizó un recuento del número de señales de c-myc y de señales de PSCA para cada núcleo y se calculó una proporción c-myc:PSCA media global. Los resultados se muestran en la figura 17.

Los resultados muestran que el número de copia del gen PSCA es más elevado en las muestras de cáncer prostático (figura 17). El gen PSCA se localiza en 8q24.2. El incremento del número de copia génica se debe tanto a una ganancia en el cromosoma 8 como a la amplificación del gen PSCA (figura 17). Resulta interesante que el incremento del número de copia del gen PSCA es similar al incremento del número de copia génica de c-myc (figura 17), que también se localiza en 8q24. Un estudio anterior ha demostrado que una ganancia del cromosoma 8 y la amplificación de c-myc son marcadores potenciales de la progresión del carcinoma prostático (R.B. Jenkins et al., Cancer Research 57:524-531, 1997).

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Ejemplo 9 Constructo de gen informador que utiliza la región cadena arriba hPSCA de 9 kb para regular la expresión de la luciferasa

Se aisló el fragmento genómico NotI de 14 kb codificante del gen PSCA humano a partir de la biblioteca \lambdaFIXII codificante de ADN genómico humano (Stratagene) mediante cribado de la biblioteca con una sonda de ADNc de PSCA humano de longitud completa, tal como se describe en el Ejemplo 4 (Sambrook et al., Molecular Cloning, 1989; Cold Spring Harbor). El fragmento genómico de PSCA humano de 14 kb incluye 9kb de secuencias cadena arriba de PSCA que se utilizaron para regular la expresión de un gen informador.

Los vectores de gen regulador se ilustran en la figura 42 y se construyeron de la manera siguiente. Se subclonó el fragmento NotI de 14 kb a partir del vector \lambda en un vector Bluescript KS (Stratagene), resultando en el constructo pBSKS-PSCA (14 kb). La secuencia cadena arriba de PSCA se subclonó a partir de pBSKS-PSCA (14 kb) mediante amplificación por PCR utilizando un cebador correspondiente a la secuencia de T7 contenida dentro del vector Bluescript, y un cebador correspondiente a una secuencia contenida dentro del exón 1 de PSCA (cebador H3hPSCA3'-5, la secuencia de este cebador es la siguiente: 5'-gggaagcttgcacagccttcagggtc-3'). El cebador correspondiente al exón 1 de PSCA contenía una secuencia HindIII introducida para permitir la subclonación posterior tras la amplificación por PCR. El fragmento amplificado resultante se digirió con HindIII y se subclonó en el vector pGL3-basic (Promega), generando pGL3-PSCA (7 kb) que se utilizó para generar una serie de constructos por deleción de gen informador que contenían tramos variables de secuencias cadena arriba de PSCA operablemente ligadas al gen de la luciferasa (figura 42). Las partes delecionadas de las regiones cadena arriba de PSA se obtuvieron mediante subclonación de fragmentos de restricción procedentes de pGL3-PSCA (7 kb). La región cadena arriba de PSCA entre -9 kb y -7 kb se subclonó a partir del constructo pBSKS-PSCA (14 kb), el sitio NotI se convirtió en un extremo romo mediante Klenow y el fragmento se clonó en los sitios SacI/HindIII de pGL-PSCA (7 kb) con el fin de obtener el constructo pGL3-PSCA (9 kb). Las referencias a las secuencias cadena arriba de la región codificante de PSCA, tales como -9 kb y -6 kb (etc.) son relativas al codón ATG de inicio de traducción. Los constructos de gen informador pGL3-PSCA (9 kb), pGL3-PSCA (6 kb), pGL3-PSCA (3 kb) y pGL3-PSCA (1 kb) se ligaron operablemente al gen de la luciferasa (figura 42). El plásmido pGL3-CMV contiene el promotor de citomegalovirus (Boshart, M. et al., Cell 41:521-530, 1985) ligado al gen luciferasa y se utilizó como un control positivo. Además, el plásmido pGL3 no contiene secuencia de promotor y se utilizó como un plásmido de control negativo.

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Ejemplo 10 Ensayo de transfección utilizando un constructo de gen informador que contiene la región cadena arriba de hPSCA

Se transfectaron placas por triplicado de líneas celulares de próstata y no de próstata con Tfx50 (Boeringer Manheim) con el constructo de PSCA denominado pGL3-PSCA (9 kb) o el constructo de control positivo pGL3-CMV, ambos descritos en el Ejemplo 9, anteriormente, y se sometieron a ensayo para actividad de luciferasa (figura 43). Entre las células y líneas celulares transfectadas se incluyen PrEC (célula basal prostática independiente de andrógenos), LNCaP (línea celular secretoria prostática dependiente de andrógenos), LAPC4 (línea celular prostática dependiente de andrógenos), HT1376 (línea celular de vejiga) y 293T (línea celular renal). Las actividades de expresión de los constructos se expresan en forma de un porcentaje de la actividad del promotor de CMV. Se indican los errores estándar en la parte superior de las columnas.

Los resultados demuestran que los 9 kb de secuencias humanas cadena arriba de PSCA regulan la expresión del gen de la luciferasa de un modo específico de tejido similar a los patrones de expresión de ARNm observados para el hPSCA nativo mostrado en la figura 10 (Ejemplo 1). La luciferasa era fácilmente detectable en líneas celulares prostáticas tanto dependientes de andrógenos como independientes de andrógenos, y en la vejiga. La luciferasa también era detectable, aunque a nivel más bajo, en las células renales.

Ejemplo 11 Identificación de los elementos reguladores dentro de la región cadena arriba de PSCA

Se transfectaron placas por triplicado de PrEC (Clontech) o células LNCaP con los constructos de gen informador o el constructo de control positivo descrito en el Ejemplo 9, anteriormente, y se sometieron a ensayo para actividad de luciferasa. Los constructos de gen informador comprenden diversas longitudes de la región cadena arriba de hPSCA operablemente ligadas al gen de la luciferasa. El constructo de control positivo, pGL3-CMV, comprende el promotor de CMV operablemente ligado a la luciferasa. Las células se transfectaron utilizando un sistema de transfección Tfx50 (Promega). La expresión de la luciferasa en las células transfectadas se sometió a ensayo utilizando un sistema de ensayo dual de informador luciferasa (Promega) y se midió el nivel de expresión de luciferasa como unidad relativa de luciferasa (RLU).

La capacidad de los diversos tramos de diferente longitud de la región cadena arriba de hPSCA para regular la expresión de la luciferasa se expresan como porcentaje de actividad del constructo de control positivo que contiene el promotor de CMV. Se indican los errores estándar.

Los resultados mostrados en la figura 44 demuestran que 3 kb de las secuencias cadena arriba de hPSCA regula la expresión de la luciferasa tanto en células PrEc como en células LNCaP, aunque el nivel de luciferasa detectable es 6 veces más alto en las células LNCap comparado con las células PrEC. Esta comparación se basa en el nivel de luciferasa detectable. En contraste, 1 kb de secuencias cadena arriba de hPSCA no reguló la expresión de la luciferasa en ninguna de las líneas celulares.

Ejemplo 12 Un vector de transporte

Se diseñó un vector de transporte para delecionar la región codificante de PSCA endógeno mediante recombinación homóloga. La figura 40 ilustra un vector de transporte para el gen PSCA de ratón, y la estrategia para utilizar el vector de transporte para delecionar el gen PSCA endógeno contenido en una célula de ratón. Un vector de transporte que comprende un fragmento SpeI de 12 kb que contiene las secuencias cadena arriba de PSCA de ratón, un fragmento NotI/EcoRI que contiene el promotor PGK operablemente ligado a un gen neo' del vector pGT-N29 (New England BioLabs) y un fragmento BstXI/XhoI de 3,5 kb que contiene las secuencias cadena abajo de PSCA de ratón. La expresión constitutiva del gen de resistencia a la neomicina se encuentra controlado por el promotor PGK, y permite la selección con antibiótico de las células diana que contienen el vector de transporte.

Tal como entenderá el experto en la materia, el vector de transporte descrito en la presente memoria incluye, aunque sin limitación, el gen neo' para la selección de las células que contienen el vector de transporte o que pueden no contener ningún gen informador seleccionable. El vector de transporte también puede utilizarse para generar ratones transgénicos, conocidos en la técnica como ratones knock-in o knock-out, dependiendo de si el vector de transporte contiene un gen informador o no, respectivamente. Los ratones transgénicos pueden utilizarse como modelo animal para estudiar la función del gen PSCA en el desarrollo de la próstata en el ratón.

A título de ejemplo que no pretende ser limitativo, se utilizó el vector de transporte para delecionar las secuencias codificantes de PSCA de ratón genómicas endógenas de tipo salvaje en células madre embrionarias (ES) para generar células que fuesen heterocigóticas, que contenían un gen PSCA delecionado. Por ejemplo, las células heterocigóticas generadas utilizando el vector de transporte eran PSCA+/neo', tal como demuestran los resultados en la figura 40. El fenotipo de las células heterocigóticas o ratones transgénicos puede compararse con el de las células o animales PSCA de tipo salvaje.

Se construyó el vector de transporte de la manera siguiente. Los extremos del fragmento SpeI de 12 kb que contenía las secuencias cadena arriba de PSCA y parte del exón 1 se convirtieron en extremo romos y se unieron al fragmento NotI/EcoRI de extremos romos procedente de pGT-N29 (BioLabs) que contenía el gen de resistencia a la neomicina. El extremo 3' del gen de resistencia a la neomicina se unió a un fragmento BstXI/XhoI de 3,5 kb de extremos romos que contenía parte del exón 3 de PSCA y las secuencias cadena abajo. El fragmento resultante se clonó en pGT-N29 para generar el vector de transporte pGT-N29-mPSCA5'/3'.

El vector de transporte se transfectó en células ES mediante electroporación utilizando el procedimiento descrito en: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells; A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1987. Se seleccionaron las células resistentes a neomicina y se aisló el ADN genómico a partir de las células seleccionadas. Se llevó a cabo un análisis genómico de transferencia southern para determinar el resultado de la reacción de recombinación homóloga. Se digirieron 10 \mug del ADN de la reacción de recombinación homóloga y células ES no diana con EcoRI y se analizaron mediante el procedimiento de transferencia southern (Southern, E.M., J. Molec. Biol. 98:503, 1975). El filtro se sondeó con un fragmento XhoI/EcoRI que contenía las secuencias situadas 3' respecto a la región codificante de PSA. Los resultados muestran que la sonda detecta un fragmento de 10 kb que corresponde a las células no diana de control que son PSCA+/PSCA+ y un fragmento de 4 kb que corresponde a las células diana que son heterocigóticas y contienen PSCA+/neo'.

Ejemplo 13 Modelos de ratón transgénico para el cáncer prostático

Se contempla una estrategia para generar modelos de ratón transgénico para el cáncer prostático, utilizando las regiones cadena arriba del gen PSCA para regular la expresión de un oncogén, induciendo la formación de tumor en células basales prostáticas. Tal como se muestra en la figura 41, la estrategia implica la administración, por ejemplo la microinyección, de un vector de oncogén quimérico, que comprende la región cadena arriba del gen PSCA operablemente ligada a un transgén que codifica un producto génico que induce la formación de tumor. Otros investigadores han utilizado esta técnica, utilizando diferentes secuencias reguladoras prostáticas y no prostáticas operablemente ligadas a un oncogén. Por ejemplo, C3(1) es una secuencia reguladora predominantemente prostática (Moroulakou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:11236-11240, 1994) y la probasina es una secuencia reguladora específica de la próstata (Greenberg et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 92:3439-3443, 1995) y ambas secuencias reguladoras regulan la expresión de un transgén en las células secretorias prostáticas. La criptidina-2 es una secuencia reguladora predominantemente del intestino delgado (Garagenian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95:15382-15387) que causa la expresión de un oncogén en las células endocrinas prostáticas. En contraste, se contempla utilizar la región cadena arriba de PSCA para regular la expresión de un oncogén en las células basales prostáticas con el fin de generar un modelo de ratón transgénico para el cáncer prostático.

Las características clínicas del tumor prostático inducido pueden analizarse y compararse con las características conocidas de los tumores causados por el oncogén particular utilizado en la construcción del vector del oncogén quimérico. Además, pueden analizarse diversos tejidos y órganos del ratón transgénico mediante análisis de ADN, ARN y proteínas para determinar la presencia y los patrones de expresión del vector del oncogén quimérico.

Ejemplo 14 Ratones transgénicos que portan vectores quiméricos que comprenden secuencias cadena arriba de hPSCA y un transgén

Se sometieron a ensayo los patrones de expresión de los transgenes bajo el control de las regiones cadena arriba de hPSCA. Con este fin, se generaron ratones quiméricos que portaban vectores quiméricos que comprendían las secuencias cadena arriba de hPSCA y un transgén. Se construyeron vectores quiméricos que comprendían 9 kb o 6 k de secuencias cadena arriba de hPSCA operablemente ligadas a un transgén, y se representan esquemáticamente en la figura 45. Entre los transgenes se incluían ADNc de proteína fluorescente verde (GFP, Clontech) ligada a la secuencia de poliadenilación de SV40 (PSCA (9 kb)-GFP y PSCA (6 kb)-GFP), ADNc de proteína fluorescente verde ligado a una región 3' de la hormona del crecimiento humana que contiene un casete intrón que proporciona estabilidad al ARNm (PSCA (9 kb)-GFP-3'hGH y PSCA (6 kb)-GFP-3'hGH) (Brinster et al, PNAS 85:836-840, 1988) y el fragmento genómico codificante del antígeno T pequeño y grande de SV40, incluyendo un intrón (PSCA (9 kb)-SV40TAG y PSCA (6 kb)-SV40TAG) (Brinster et al., Cell 37:367-379, 1984).

Se utilizaron los vectores quiméricos para generar una línea de ratones transgénicos fundadores. Los vectores quiméricos linearizados se microinyectaron en huevos de ratón fertilizados derivados de los cruces entre ratones híbridos C57BL/6XC3H. Los ratones fundadores que portaban el vector quimérico se identificaron mediante análisis southern de ADN de la cola utilizando ADNc de GFP o ADN genómico de SV40 como sonda. El número de fundadores de cada línea de ratón transgénico se indica en el panel derecho de la figura 45.

Ejemplo 15 Las secuencias cadena arriba de hPSCA regulan la expresión del transgén en los ratones transgénicos

Se cruzaron dos ratones fundadores independientes que portaban el transgén PSCA (9 kb)-GFP con ratones Balb/c para obtener su progenie. A la edad de 8 semanas y de 12 semanas, se sacrificaron miembros de la camada transgénicos o no transgénicos macho y hembra. Tras el sacrificio, se sometieron a ensayo todos los tejidos urogenital y otros tejidos para la expresión de GFP mediante la observación de los tejidos fijados bajo iluminación fluorescente. Los resultados mostrados en la figura 46 muestran imágenes fluorescentes verdes de tejidos de próstata, vejiga y piel procedentes de una ratón no transgénico y de un ratón transgénico. Una de dos líneas fundadoras expresaba proteína GFP en próstata, vejiga y piel (figura 46). Entre los tejidos que no expresaban GFP se incluyen: vesícula seminal, hígado, estómago, riñón, pulmón, cerebro, testículo, páncreas, corazón, músculo esquelético, intestino delgado, colon y placenta.

Ejemplo 16 Patrón de expresión de transcritos de PSCA en tejido humano y de ratón

El panel superior de la figura 47 muestra una transferencia northern humana de múltiples tejidos (obtenido de Clontech), sondeada con una sonda de ADNc de PSCA humano de longitud completa. Los resultados demuestran que los transcritos de PSCA humano son abundantes en la próstata, y menos abundantes aunque fácilmente detectables en la placenta, pero no detectables en bazo, timo, testículo, ovario, intestino delgado, colon, leucocitos de sangre periférica (PBL), corazón, cerebro, pulmón, hígado, músculo, riñón y páncreas.

El panel inferior de la figura 47 muestra un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio del análisis de RT-PCR de los patrones de expresión de transcritos de PSCA murino en diversos tejidos de ratón. Se preparó el RT-PCR utilizando Ultraspec.RNA (Biotex) y kit de ciclado de ADNc (Invitrogen). Los cebadores correspondientes a una región dentro del exón 1 y del exón 3 de PSCA se utilizaron para amplificar un fragmento de 320 pb. La secuencia del cebador del exón 1 es la siguiente:

cebador 5': 5'-TTCTCCTGCTGGCCACCTAC-3'. La secuencia del cebador del exón 3 es la siguiente:

cebador 3': 5'-GCAGCTCATCCCTTCACAAT-3'. Como control, para demostrar la integridad de las muestras de ARN aisladas a partir de diversos tejidos de ratón, se amplificó un fragmento G3PD de 300 pb.

Los resultados mostrados en el panel inferior de la figura 47 demuestran que los transcritos del PSCA murino son detectables en próstata dorsal/lateral, próstata ventral, vejiga, estómago (cardias, cuerpo y píloro) y piel. En contraste, no eran detectables los transcritos de PSCA murino en próstata anterior, próstata ventral, vesícula seminal, uretra, testículo, riñón, duodeno, intestino delgado, colon, glándula salivar, bazo, timo, médula ósea, músculo esquelético, corazón, cerebro, ojo, pulmón e hígado. Los resultados de G3PDH demuestran que los transcritos aislados a partir de diversos tejidos de ratón se encontraban intactos.

<110> The Regents of the University of California

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<120> GPSCA: ANTÍGENO DE CÉLULA MADRE PROSTÁTICA Y SUS UTILIZACIONES

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<130> 30435.54WO02

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<140> Todavía desconocido

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<141> 1999-12-02

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<150> 09/038,261

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<151> 1998-03-10

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<150> 09/203,939

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<151> 1998-12-02

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<150> 08/814,279

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<151> 1997-03-10

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<150> 60/071.141

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<151> 1998-01-12

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<150> 60/074.675

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<151> 1998-02-13

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<160> 9

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<170> PatentIn ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 998

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<212> ADN

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<213> PSCA humano (hPSCA)

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<400> 1

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2

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<210> 2

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<211> 123

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<212> PRT

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<213> PSCA humano (hPSCA)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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4

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<210> 3

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<211> 441

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<212> ADN

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<213> PSCA murino (mPSCA)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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5

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<210> 4

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<211> 123

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<212> PRT

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<213> PSCA murino (mPSCA)

\newpage

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<400> 4

7

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<210> 5

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<211> 131

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<212> PRT

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<213> Antígeno 2 de células madre humanas (hSCA-2)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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8

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<210> 6

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<211> 123

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<212> PRT

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<213> PSCA humano (hPSCA)

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<400> 6

10

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<210> 7

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<211> 123

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<212> PRT

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<213> PSCA murino (mPSCA)

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<400> 7

11

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<210> 8

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> PSCA murino (mPSCA)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

ttctcctgct ggccacctac

\hfill

20

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<210> 9

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> PSCA murino (mPSCA)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcagctcatc ccttcacaat

\hfill

20

Claims (21)

1. Hibridoma denominado ATCC nº HB-12612 que produce un anticuerpo monoclonal.

2. Anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma según la reivindicación 1.

3. Fragmento Fab, F(ab')_{2} o Fv del anticuerpo según la reivindicación 2.

4. Proteína recombinante que comprende una región de unión de antígeno del anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2.

5. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 4 que es un anticuerpo quimérico.

6. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 5, en el que el anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado.

7. Anticuerpo anti-idiotípico que se une específicamente al anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2.

8. Inmunoconjugado que comprende el anticuerpo según la reivindicación 2, o un fragmento del mismo ligante de antígeno, unido a un marcaje detectable o a un agente terapéutico.

9. Inmunoconjugado según la reivindicación 8, en el que el agente terapéutico es un agente citotóxico seleccionado de entre el grupo constituido por doxorubicina, daunorubicina, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidro-antracina diona, actinomicina D, toxina diftérica, exotoxina de Pseudomonas (PE) A, PE40, ricina, abrina, glucocorticoide e isótopos radioactivos.

10. Procedimiento para detectar la presencia de una proteína PSCA en una muestra, comprendiendo el procedimiento poner en contacto la muestra con un anticuerpo según la reivindicación 2, o fragmento del mismo ligante de antígeno, y detectar la unión específica del anticuerpo o fragmento ligante de antígeno con la proteína PSCA.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la muestra es un tejido o líquido biológico.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el tejido es tejido de próstata, tejido de vejiga o hueso.

13. Procedimiento para diagnosticar el cáncer, comprendiendo el procedimiento:

poner en contacto una muestra de un sujeto con un anticuerpo según la reivindicación 2, o fragmento ligante de antígeno del mismo,

determinar la cantidad de anticuerpo o de fragmento ligante de antígeno que se une específicamente con la proteína PSCA en la muestra, y

comparar la cantidad de la proteína PSCA en la muestra con la cantidad en una muestra normal, siendo indicativa la presencia de una cantidad diferente de manera medible de proteína PSCA en la muestra del sujeto en comparación con la muestra normal de cáncer en el sujeto.

14. Procedimiento para realizar el seguimiento del desarrollo de un cáncer en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:

poner en contacto una muestra de un paciente de cáncer con un anticuerpo según la reivindicación 2, o fragmento ligante de antígeno del mismo,

determinar la cantidad de anticuerpo o fragmento ligante de antígeno que se une específicamente a PSCA en la muestra, y

comparar la cantidad determinada de esta manera con la cantidad presente en una segunda muestra del sujeto, obteniendo dichas muestras en diferentes puntos del tiempo, siendo indicativa una diferencia en las cantidades determinadas del desarrollo del cáncer.

15. Procedimiento según la reivindicación 13 ó 14, en el que la muestra es tejido prostático, tejido de vejiga o hueso.

16. Procedimiento según las reivindicaciones 11, 13 ó 14, en el que la muestra es sangre u orina.

17. Utilización de un anticuerpo según la reivindicación 2, o de un fragmento ligante de antígeno del mismo para la producción de un medicamento destinado a la inhibición de la proliferación de una célula cancerosa que expresa PSCA.

18. Utilización según la reivindicación 17, en la que la célula de cáncer es una célula de cáncer prostática.

19. Utilización según la reivindicación 17, en la que la célula de cáncer es una célula de carcinoma de vejiga.

20. Utilización de un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2, de un fragmento Fab, F(ab')_{2} o Fv del mismo o de una proteína recombinante que comprende una región ligante de antígeno del anticuerpo monoclonal para la producción de un diagnóstico.

21. Utilización de un inmunoconjugado según la reivindicación 9 para la producción de un medicamento destinado al tratamiento de cáncer prostático y carcinoma de vejiga.