MXPA06013834A

MXPA06013834A - Anticuerpos y moleculas relacionadas que enlazan a proteinas psca.

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Publication number: MXPA06013834A
Application number: MXPA06013834A
Authority: MX
Inventors: Aya Jakobovits; Arthur B Raitano; Pia M Challita-Eid; Jean Gudas; Xiao-Chi Jia; Robert Kendall Morrison; Karen Jane Meyrick Morrison; Hui Shao
Original assignee: Agensys Inc
Priority date: 2004-05-28
Filing date: 2005-05-17
Publication date: 2007-03-01
Also published as: PL1753871T3; IL179332A0; RU2006146666A; EP1753871A2; AU2005250370A1; NO338744B1; EP2428522A1; EP2583981A2; EP1753871B1; CA2567449C; NO20065874L; RU2381234C2; JP2008500833A; CA2567449A1; AU2005250370B2; IL179332A; EP1753871A4; WO2005118864A2; NZ551627A; EP2583981A3

Abstract

Se describen anticuerpos y moleculas derivadas de los mismos que enlazan a la proteina PSCA novedosa y variantes de los mismos, en donde PSCA exhibe expresion especifica de tejido en el tejido adulto normal, y es aberrantemente expresada en los canceres listados en la Tabla 1. Consecuentemente, PSCA proporciona un objetivo de diagnostico, de pronostico, profilactico y/o terapeutico para el cancer. El gen PSCA o fragmento del mismo, o su proteina codificada, o variantes del mismo, o un fragmento del mismo, se pueden utilizar para inducir una respuesta inmune humoral o celular; los anticuerpos o celulas T reactivos con PSCA se pueden utilizar en la inmunizacion activa o pasiva.

Description

ANTICUERPOS Y MOLÉCULAS RELACIONADAS QUE ENLAZAN A PROTEÍNAS PSCA CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención descrita en la presente se relaciona a anticuerpos, así como a fragmentos de enlace de los mismos y moléculas diseñadas a partir de los mismos, que enlazan proteínas, llamadas PSCA. La invención además se relaciona a métodos de diagnóstico, pronóstico, profilácticos y terapéuticos y composiciones útiles en .el tratamiento de cánceres que expresan PSCA. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer es la segunda causa principal de muerte humana junto a la enfermedad coronaria. Mundialmente, millones de gentes mueren de cáncer cada año. En los Estados Unidos solamente, como es reportado por la Sociedad Americana de Cáncer, el cáncer causa la muerte de mucho más de medio millón de gentes anualmente, con arriba de 1.2 millones de nuevos casos diagnosticados por año. Mientras que las muertes de la enfermedad del corazón han estado declinando significativamente, aquellas que resultan del cáncer generalmente están en aumento. En la parte inicial de la siguiente centuria, el cáncer se predice que llegará a ser la causa principal de muerte. Mundialmente, varios cánceres resaltan como los causantes de muerte principales. En particular, los carcinomas del pulmón, próstata, seno, colon, páncreas, ovario y vejiga representan las causas primarias de muerte por cáncer. Estos y virtualmente todos los otros carcinomas comparten una característica letal común. Con muy pocas excepciones, la enfermedad metastática de un carcinoma es fatal. Además, aún para aquellos pacientes con cáncer quienes inicialmente sobreviven a sus cánceres primarios, la experiencia común ha mostrado que sus vidas son dramáticamente alteradas. Muchos pacientes con cáncer experimentan fuertes ansiedades inducidas por la conciencia del potencial para la recurrencia o la falla del tratamiento. Muchos pacientes con cáncer experimentan debilitaciones físicas después del tratamiento. Además, muchos pacientes con cáncer experimentan una recurrencia. Mundialmente, el cáncer de próstata es el cuarto cáncer más prevalente en los hombres. En Norteamérica y Europa del Norte, este es por mucho el cáncer más común en hombres y es la segunda causa principal de muerte por cáncer en los hombres. En los Estados Unidos solamente, más de 30,000 hombres mueren anualmente de esta enfermedad segundo solamente al cáncer de pulmón. A pesar de la magnitud de estas cifras, todavía no hay tratamiento efectivo para el cáncer de próstata metastático. La prostatectomía quirúrgica, la terapia de radiación, la terapia de ablación de hormona, la castración quirúrgica y la quimioterapia continúan siendo las modalidades de tratamiento principales. Desafortunadamente, estos tratamientos no son efectivos para muchos y están frecuentemente asociados con consecuencias indeseadas . En el frente de diagnóstico, la falta de un marcador de tumor de próstata que pueda detectar precisamente los tumores localizados, en etapa temprana permanece como una limitación significante en la diagnosis y el manejo de esta enfermedad. Aunque el ensayo de antígeno específico de próstata de suero (PSA) ha sido una herramienta muy útil, sin embargo su especificidad y utilidad general ampliamente se considera que carece de varios aspectos importantes. El progreso en la identificación de marcadores específicos adicionales para el cáncer de próstata se ha mejorado por la generación de xenoinjertos de cáncer de próstata que pueden recapitular diferentes etapas de la enfermedad en ratones. Los xenoinjertos de LAPC (Los Angeles Prostate Cáncer) son xenoinjertos de cáncer de próstata que han sobrevivido al pasaje en varios ratones inmuno deficientes combinados (SCID) y han exhibido la capacidad para imitar la transición de la dependencia de andrógeno a la independencia de andrógeno (Klein y colaboradores, 1997, Nat. Med. 3:402) . Los marcadores de cáncer de próstata más recientemente identificados incluyen PCTA-1 (Su y colaboradores, 1996, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93: 7252), antígeno de membrana específica de próstata (PSM) (Pinto y colaboradores, Clin Cáncer Res 1996 septiembre 2 (9): 1445-51), STEAP (Hubert, y colaboradores, Proc Nati Acad Sci U S A. 1999 diciembre 7; 96(25): 14523-8) y el antígeno de célula madre de próstata (PSCA) (Reiter y colaboradores, 1998, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95: 1735). Mientras que los marcadores previamente identificados tales como FSA, PSM, PCTA y PSCA han facilitado los esfuerzos para diagnosticar y tratar el cáncer de próstata, hay necesidad para la identificación de marcadores adicionales y objetivos terapéuticos para los cánceres de próstata y cánceres relacionados con el fin de mejorar adicionalmente la diagnosis y la terapia. El carcinoma de célula renal (RCC) tiene en cuenta aproximadamente 3 por ciento de malignidades de adulto. Una vez que los adenomas alcanzan un diámetro de 2 a 3 cm, existe el potencial maligno. En el adulto, los dos tumores renales malignos principales son el adenocarcinoma de célula renal y ol carcinoma de célula transicional de la pelvis renal o uréter. La incidencia del adenocarcinoma de célula renal se estima en más de 29,000 casos en los Estados Unidos, y más de 11,600 pacientes murieron de esta enfermedad en 1998. El carcinoma de célula transicional es menos frecuente, con una incidencia de aproximadamente 500 casos por años en los estados Unidos.

Xa cirugía hn s o la terapia primaria para el adenocarcinoma de célula renal por muchas décadas. Hasta recientemente, la enfermedad metastática ha sido refractaria a cualquier terapia sistémica. Con los desarrollos recientes en terapias sistémicas, particularmente inmunoterapias, el carcinoma de célula renal metastático puede ser tratado agresivamente en pacientes apropiados con una posibilidad de respuestas durables. No obstante, hay una necesidad restante para terapias efectivas para estos pacientes. De todos los nuevos casos de cáncer en los Estados Unidos, el cáncer de vejiga representa aproximadamente 5 por ciento en hombres (quinto neoplasmo más común) y 3 por ciento en mujeres (octavo neoplasmo más común) . La incidencia está incrementándose lentamente, concurrente con un incremento en la población de más edad. En 1998, hubo un estimado de 54,500 casos, incluyendo 39,500 en hombres y 15,000 en mujeres. La incidencia ajustada a la edad en los Estados Unidos es 32 por 100,000 para hombres y ocho por 100,000 en mujeres. La relación de hombres/mu eres histórica de 3:1 puede ser disminuida relacionada con los patrones de fumadores en mujeres. Hubo un estimado de 11,000 muertes para el cáncer de vejiga en 1998 (7,800 en hombres y 3,900 en mujeres). La incidencia del cáncer de vejiga y la mortalidad fuertemente se incrementan con la edad y será un problema incrementado conforme la población llegue a ser de más edad.

La mayoría de ios cánceres de vejiga recurren en la vejiga. El cáncer de vejiga es manejado con una combinación de resección transuretral de la vejiga (TUR) y la quimioterapia o inmunoterapia i nt ravesi cal . La naturaleza multifocal y recurrente del cáncer de vejiga puntualiza las limitaciones del TUR. La mayoría de los cánceres invasivos de músculo no son curados por el TUR solo. La cistectomía radical y la aesviación urinaria es el medio más efectivo para eliminar el cáncer pero lleva un impacto indeseable en la función urinaria y sexual. Continúa existiendo una necesidad significante para modalidades de tratamiento que sean oenélic s para pacientes de cáncer de vejiga. Un estimado de 130,200 casos de cáncer colorrectal ocurrió en el 2000 en los Estados Unidos, incluyendo 93,800 casos de cáncer de colon y 36,400 de cáncer rectal. Los cánceres color rectales son los terceros cánceres más comunes en hombres y mujeres. La proporciones de incidencia declinaron significativamente durante 1992-1996 (-2.1% por año). La investigación sugiere que estas declinaciones han sido debido a la clasificación incrementada y la remoción de pólipo, previniendo la progresión de pólipos a cánceres invasivos. Hubo un estimado de 56,300 muertes (47,700 de cáncer de colon, 8,600 de cáncer rectal) en el 2000, teniendo en cuenta aproximadamente 11% todas las muertes de cáncer de los Estados Unidos.

En la actualidad, la cirugía es la forma más común de terapia para el cáncer colorrectal, y para cánceres que no se han difundido, es frecuentemente curativa. La quimioterapia, o quimioterapia más radiación, será antes o después de la cirugía en la mayoría de los pacientes cuyo cáncer ha perforado profundamente la pared intestinal o se ha difundido a los nodos de linfa. Una colostomía permanente (creación de una abertura abdominal para la eliminación de desechos del cuerpo) es ocasionalmente necesaria para el cáncer de colon y es infrecuentemente requerida para el cáncer rectal. Existe una necesidad continua por modalidades efectivas de diagnóstico de tratamiento para el cáncer colorrectal . Hubo un estimado de 164,100 nuevos casos de cáncer de pulmón y bronquial en el 2000, teniendo en cuenta 14% de todos los diagnósticos de cáncer de los Estados Unidos. La proporción de incidencia del cáncer de pulmón y bronquial está declinando significativamente en los hombres, desde uno alto de 86.5 por 100,000 en 1984 a 70.0 en 1996. En los años de 1990, la proporción de incremento entre las mujeres llegó a ser lenta. En 1996, la proporción de incidencia en las mujeres fue de 42.3 por 100,000. El cáncer de pulmón y bronquial causó un estimado de 156,900 muertes en el 2000, teniendo en cuenta 28% de todas las muertes de cáncer. Durante 1992-1996, la mortalidad de cáncer de pulmón declinó significativamente entre los hombres (-1.7% por año) mientras que las proporciones para las mujeres estuvieron todavía significativamente incrementadas (0.9% por año). Desde 1987, más mujeres han muerto cada año de cáncer de pulmón que de cáncer de seno, que, para arriba de 40 años, fue la causa mayor de muerte de cáncer en mujeres. La disminución de la incidencia de cáncer de pulmón y las proporciones de mortalidad más probablemente resultaron de las proporciones de fumadores disminuidos sobre los previos 30 años; sin embargo, la disminución de los patrones de fumadores entre las mujeres estuvo detrás de aquellos de los hombres. De interés, aunque la declinación en uso de tabaco en adultos ha disminuido, el uso de tabaco en jóvenes se está incrementando nuevamente. Las opciones de tratamiento para el cáncer de pulmón y bronquial son determinados por el tipo y la etapa del cáncer e incluyen cirugía, terapia de radiación y quimioterapia. Para muchos cánceres localizados, la cirugía es usualmente el tratamiento de elección. Debido a que la enfermedad usualmente se ha difundido por el tiempo en que es descubierta, la terapia de radiación y la quimioterapia son frecuentemente necesarias en combinación con la cirugía. La quimioterapia sola o combinada con radiaciones es el tratamiento de elección para el cáncer de pulmón de célula pequeña; en este régimen, un porcentaje grande de pacientes experimentan remisión, que en algunos casos de duración larga. Sin embargo, hay una necesidad actual para el tratamiento efectivo y procedimientos de diagnóstico para cánceres de pulmón y bronquiales. Un estimado de 182,800 nuevos casos invasivos de cáncer de seno se esperan que ocurran entre las mujeres en los Estados Unidos durante el 2000. Adicionalmente, aproximadamente 1,400 nuevos casos de cáncer de seno se esperan que sean diagnosticados en hombres en el 2000. Después del incremento de aproximadamente 4% por año en los años de 1980, las proporciones de incidencia de cánceres en mujeres se han nivelado los años de 1990 a aproximadamente 110.6 casos por 100,000. En los estados Unidos solamente, hubo un estimado de 41,200 muertes (40,800 mujeres, 400 hombres) en el 2000 debido al cáncer de seno. El cáncer de seno se clasifica segundo entre las muertes de cáncer en mujeres. De acuerdo con los datos más recientes, las proporciones de mortalidad declinaron significativamente durante 1992-1996 con las disminuciones más grandes en mujeres más jóvenes, tanto blancas como negras. Estas disminuciones fueron probablemente el resultado de la detección temprana y el tratamiento mejorado . Tomando en cuenta las circunstancias médicas y las preferencias del paciente, el tratamiento del cáncer de seno puede involucrar lumpectomía (remoción local del tumor) y remoción de los nodos de linfa bajo el brazo; mastectomía (remoción quirúrgica del seno) y remoción de los nodos de linfa bajo el brazo; terapia de radiación; quimioterapia; o terapia de hormonas. Frecuentemente, dos o más métodos se utilizan en combinación. Numerosos estudios han mostrado que, para la enfermedad de etapa temprana, las proporciones de supervivencia a largo plazo después de la lumpectomía más la radioterapia son similares a las proporciones de supervivencia después de las mastectomía radical modificada. Avances significantes en las técnicas de reconstrucción proporcionan varias opciones para la reconstrucción de seno después de la mastectomía. Recientemente, tal reconstrucción se ha hecho al mismo tiempo como la . mastectomía . La excisión local del carcinoma ductal in situ (DCIS) con cantidades adecuadas de tejido de seno normal circundante puede prevenir la recurrencia local del DCIS. La radiación al seno y/o tamoxifen puede reducir la oportunidad de que ocurra el DCIS en el tejido de seno restante. Esto es importante debido a que el DCIS, si se deja sin tratar puede desarrollarse un cáncer de seno invasivo. No obstante, existen efectos secundarios serios o secuelas a estos tratamientos. Por lo tanto, hay una necesidad por tratamientos de cáncer de seno eficaces. Hubo un estimado de 23,100 nuevos casos de cáncer ovárico en los Estados Unidos en el 2000. Esto tiene en cuenta 4% de todos los cánceres entre las mujeres y se clasifica segundo entre los cánceres ginecológicos. Durante 1992-1996, las proporciones de incidencia de cáncer ovárico estuvieron significativamente declinando. Consecuente al cáncer ovárico hubo un estimado de 14,000 muertes en el 2000. El cáncer ovárico causa más muertes que cualquier otro cáncer del sistema reproductor femenino. La cirugía, la terapia de radiación y la quimioterapia son opciones de tratamiento para el cáncer ovárico. La cirugía usualmente incluye la remoción de uno o ambos ovarios, las trompas de falopio (salpingo-oforectomía) , y el útero (histerectomía) . En algunos tumores muy tempranos, solamente el ovario involucrado será removido, especialmente en mujeres jóvenes quienes desean tener niños. En la enfermedad avanzada se hace un intento para remover toda la enfermedad intra-abdominal para aumentar el efecto de la quimioterapia. Continua existiendo una necesidad importante para opciones de tratamiento efectivas para el cáncer ovárico. Hubo un estimado de 28,300 nuevos casos de cáncer pancreático en los Estados Unidos en el 2000. Durante los pasados 20 años, las proporciones de cáncer pancreático han declinado en los hombres. Las proporciones entre las mujeres han permanecido aproximadamente constantes pero puede estar comenzando a declinar. El cáncer pancreático causó un estimado de 28,200 muertes en el 2000 en los Estados Unidos. Durante los pasados 20 años, hubo una ligera disminución pero significante en las proporciones de mortalidad entre los hombres (aproximadamente -0.9% por año) mientras que las proporciones se han incrementado ligeramente entre las mujeres . La cirugía, la terapia de radiación, y la quimioterapia son opciones de tratamiento para el cáncer pancreático. Estas opciones de tratamiento pueden prolongar la supervivencia y/o aliviar los síntomas en muchos pacientes pero no son probables que produzcan una cura para la mayoría. Hay una necesidad significante por opciones adicionales terapéuticas y de diagnóstico para cánceres. Estos incluyen el uso de anticuerpos, vacunas y moléculas pequeñas con modalidades de tratamiento. Adicionalmente, también hay una necesidad de utilizar estas modalidades como herramientas de investigación para diagnosticar, detectar, monitorear, y además establecer el estado de la técnica en todas las áreas de tratamiento de cáncer y estudios. La utilidad terapéutica de los anticuerpos monoclonales (mAbs) (G. Kohier y C. Milstein, Nature 256: 495-497 (1975)) está siendo realizada. Los anticuerpos monoclonales ahora se han aprobado como terapias en el transplante, cáncer, enfermedad infecciosa, enfermedad cardiovascular e inflamación. Diferentes isotipos tienen diferentes funciones efectoras. Tales diferencias en la función son reflejadas en las estructuras tridimensionales distintas de los diversos isotipos de inmunoglobulina (P.M. Alzari y colaboradores, Annual Rev. Immunol . , 6:555-580 (1988) ) . Debido a que los ratones son convenientes para la inmunización y el reconocimiento de la mayoría de los antígenos humanos como foráneos, los mAbs contra objetivos humanos con potencial terapéutico típicamente han sido de origen murino. Sin embargo, los mAbs murinos tienen desventajas evidentes como terapéuticos humanos. Ellos requieren dosificaciones más frecuentes ya que los mAbs tienen una vida media en circulación más corta en humanos que los anticuerpos humanos. Más críticamente, la administración repetida de anticuerpos de murmo al sistema inmune humano causa que el sistema inmune humano responda al reconocer la proteína de ratón como un foráneo y generar una respuesta de anticuerpo anti-ratón humano (HAMA) . Tal respuesta HAMA puede dar por resultado la reacción alérgica y la evacuación rápida del anticuerpo de mupno del sistema haciendo de esta manera el tratamiento mediante el anticuerpo de murino inútil. Para evitar tales efectos, los intentos para crear sistemas inmunes humanos dentro de ratones se han intentado. Los intentos iniciales abrigaron esperanzas para crear ratones transgénicos capaces de responder a antígenos con anticuerpos que tienen secuencias humanas (Ver Bruggemann y colaboradores, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86: 6709-6713 (1989)), pero fueron limitadas por la cantidad de DNA que podría ser establemente mantenido por los vehículos de clonación disponibles. El uso de los vectores de clonación de cromosoma artificial de levadura (YAC) condujo a la manera para introducir fragmentos de línea germinal grandes del sitio Ig humano en mamíferos transgénicos. Esencialmente una mayor parte de los genes de región V, D, y J humanos arreglados con el mismo espaciamiento encontrado en el genoma humano y las regiones constantes humanas se introdujeron en ratones utilizando YACs. Una raza de ratón transgénico es conocido como ratón XenoMouse(r) y es comercialmente disponible de Abgenix, Inc. ( Fremont CA) . BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona anticuerpos así como fragmentos de enlace de los mismos y moléculas diseñadas a partir de los mismos, que enlazan a proteínas PSCA y fragmentos de polipéptido de proteínas PSCA. La invención comprende anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos de murino y de otros mamíferos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y completamente humanos, y anticuerpos marcados con un marcador detectable o agente terapéutico. En ciertas modalidades, hay una condición de que la secuencia de ácido nucleico completa de la Figura 3 no sea codificada y/o la secuencia de aminoácidos completa de la Figura 2 no sea preparada. En ciertas modalidades, la secuencia de ácido nucleico completa de la Figura 3 es codificada y/o la secuencia de aminoácidos completa de la Figura 2 es preparada, cualquiera de las cuales están en formas de dosis unitarias humanas respectivas. La invención además proporciona métodos para detectar la presencia y estados de polinucleótidos y proteínas PSCA en varias muestras biológicas. Así como métodos para identificar células que expresan PSCA. Una modalidad de esta invención proporciona métodos para monitorear productos de gen PSCA en un tejido o muestra hematológica que tiene o que se sospecha de tener alguna forma de desregulación del crecimiento tal como cáncer. La invención además proporciona varias composiciones inmunogénicas o terapéuticas y estrategias para tratar cánceres que expresan PSCA tales como los cánceres de tejido listados en la Tabla I, incluyendo terapias dirigidas a inhibir la transcripción, traducción, procesamiento o función del PSCA así como vacunas de cáncer. En un aspecto, la invención proporciona composiciones, y métodos que las comprenden, para tratar un cáncer que expresa PSCA en un sujeto humano en donde la composición comprende un portador adecuado para el uso humano y una dosis unitaria humana de uno o más de un agente que inhibe la producción o función de PSCA. De preferencia, el portador es un portador únicamente humano. En otro aspecto de la invención, el agente es una porción que es inmunorreactiva con la proteína PSCA. Ejemplos no limitativos de tales porciones incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos (tales como anticuerpos de cadena individual, monoclonales, policlonales, humanizados, quiméricos o humanos) , equivalentes funcionales de los mismos (ya sea que ocurre naturalmente o sintético) , y combinaciones de los mismos. Los anticuerpos pueden ser conjugados a una porción de diagnóstico o terapéutica. En otro aspecto, el agente es una molécula pequeña como se define en la presente. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. El cDNA y la secuencia de aminoácidos de PSCA (también llamado "PSCA v.l" o "PSCA variante 1") se muestra en la Figura ÍA. La metionina de inicio está subrayada. La estructura de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 18-389 incluyendo el codón de detención. El cDNA y la secuencia de aminoácidos de PSCA variante 2 (también llamado "PSCA v.2") se muestra en la Figura IB. El codón para la metionina de inicio está subrayado. La estructura de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 56-427 incluyendo el codón de detención. El cDNA y la secuencia de aminoácidos de PSCA variante 3 (también llamado "PSCA v.3") se muestra en la Figura 1C. El codón para la metionina de inicio está subrayado. La estructura de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 423-707 incluyendo el codón de detención. El cDNA y la secuencia de aminoácidos de PSCA variante 4 (también llamado "PSCA v.4") se muestra en la Figura ID. El codón para la metionina de inicio está subrayado. La estructura de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 424-993 incluyendo el codón de detención. El cDNA y la secuencia de aminoácidos de PSCA variante 5 (también llamado "PSCA v.5") se muestra en la Figura 1E. El codón para la metionina de inicio está subrayado. La estructura de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 910-1479 incluyendo el codón de detención. El cDNA y la secuencia de aminoácidos de PSCA variante 6 (también llamado "PSCA v.6") se muestra en la Figura 1F. El codón para la metionina de inicio está subrayado. La estructura de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 83-427 incluyendo el codón de detención. Figure 1G. Variantes SNP de PSCA v.2, PSCA v.7 hasta v.18. Las proteínas Las proteínas PSCA v.7 hasta v.18 tienen 123 aminoácidos. Las variantes PSCA v.7 hasta v.18 son variantes con diferencia de nucleótido individual de PSCA v.2, y codifican para la misma proteína como v.2. Aunque estas variantes de SNP se muestran por separado, ellas también se pueden presentar en combinaciones y en cualquiera de las variantes de transcripto listadas en lo anterior en las Figuras ÍA hasta 1F. Figure ÍH. Variantes de SNP de PSCA v.4, PSCA v.19 hasta v.30. Las proteínas PSCA v.19 hasta v.30 tienen 189 aminoácidos. Las variantes PSCA v.19 hasta v.30 son variantes con diferencia de nucleótido individual de las proteínas PSCA v.4. PSCA v.9, v.10, v.ll, v.24 y v.25 que difieren de PSCA v.l por un aminoácido. PSCA v.23, v.28, v.29 y v.30 codifican para la misma proteína como v.4. Aunque estas variantes de SNP se muestran por separado, ellas también pueden presentarse en cualquiera de las combinaciones y en cualquiera de las variantes de transcripto v.3 y v.4. Figura II. Expresión de variantes PSCA. (II (a)) Los cebadores se diseñaron para diferenciar entre las variantes PSCA v.l/v.2/v.4, PSCA v.3 y PSCA v.5. Los cebadores A y B, indicados por flechas pequeñas arriba de los exones en la figura resultan en un producto de PCR de 425 bp para PSCA v.l/v.2/v4, un producto de PCR de 300 bp para PSCA v3 y un producto de PCR de 910 bp para PSCA v.5. (II (b) ) el cDNA de primera hebra se preparó de la vejiga normal, cerebro, corazón, riñon, hígado, pulmón, próstata, bazo, músculo esquelético, testículo, páncreas, colon, estómago, acumulaciones de cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñon, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de seno, metástasis de cáncer y cáncer de páncreas. La normalización se realizó mediante la PCR utilizando cebadores para actina. La PCR semi-cuantitativa, utilizando los cebadores específicos de variantes se realizaron en 30 ciclos de amplificación. Los resultados muestran la expresión de PSCA v.5 principalmente en el cáncer de seno, la metástasis de cáncer, y el cáncer de páncreas, y en el nivel inferior en el cáncer de colon y el cáncer de pulmón. El producto de PCR de PSCA v.l/v.2/v.4 se detectó en el cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñon, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de seno, metástasis de cáncer y cáncer de páncreas. Entre los productos normales, el producto de PCR de PSCA v.l/v.2/v.4 se detectó solamente en la próstata, estómago y en el nivel inferior en el riñon y el pulmón, mientras que PSCA v.5 no se detectó en cualquier tejido normal. El producto detectado de PCR de. PSCA v.3 no se detectó en cualquiera de las muestras probadas . Figura 1J. Expresión de PSCA v.4 y PSCA v.5. U(a) Los cebadores se diseñaron para diferenciar entre PSCA v.4 y PSCA v.5 como es indicado por las flechas marcadas B y C en la figura. Los cebadores específicos para PSCA v.4 conducen a un producto de PCR de 460 bp, mientras que los cebadores específicos para PSCA v.5 conducen a un producto de PCR de 945 bp en tamaño. lJ(b) El cDNA de primera hebra se preparó de la vejiga normal, cerebro, corazón, riñon, hígado, pulmón, próstata, baso, músculo esquelético, testículo, páncreas, colon, estómago, acumulaciones de cáncer de próstata, cáncer de vejiga, acumulación de multi-xenoinjerto (xenoinjertos de cáncer de próstata, cáncer de riñon y cáncer de vejiga). La normalización se realizó mediante PCR utilizando cebadores para actina. La PCR semi-cuantitativa, utilizando los cebadores específicos de variante se realizaron en 30 ciclos de amplificación. Los resultados muestran la expresión de PSCA v.4 en cáncer de cáncer de próstata, cáncer de vejiga, y la acumulación de multi-xenoinjerto, riñon normal y próstata. PSCA v.5 se detectó solamente en la próstata normal y el cáncer de vejiga. Figura 2. Secuencias de Aminoácidos de anticuerpos PSCA. Figura 2A. La secuencia de aminoácidos de Hal-4.117 VH . Subrayada está la región constante de cadena pesada. Figura 2B. La secuencia de aminoácidos de Hal-4.117 VL. Subrayada está la región constante de cadena ligera. Figura 2C. La secuencia de aminoácidos de Hal-4.120 VH. Figura 2D. La secuencia de aminoácidos de Hal-4.120 VL. Subrayada está la región constante de cadena ligera. Figura 2E. La secuencia de aminoácidos de Hal-5.99 VH . Subrayada está la región constante de cadena pesada. Figura 2F. La secuencia de aminoácidos de Hal-5.99 VL. Subrayada está la región constante de cadena ligera. Figura 2G. La secuencia de aminoácidos de Hal-4.121 VH . Subrayada está la región constante de cadena pesada. Figura 2H. La secuencia de aminoácidos de Hal-4.121 VL c.5. Subrayada está la región constante de cadena ligera. Figura 21. La secuencia de aminoácidos de Hal-4.121 VL c.26. Subrayada está la región constante de cadena ligera. Figura 2J. La secuencia de aminoácidos de Hal-1.16 VH . Subrayada está la región constante de cadena pesada. Figura 2K. La secuencia de aminoácidos de Hal-1.16 VL. Subrayada está la región constante de cadena ligera. Figura 2L. La secuencia de aminoácidos de Hal-4.5 VH . Subrayada está la región constante de cadena pesada. Figura 2M. La secuencia de aminoácidos de Hal-4.5 VL. Subrayada- está la región constante de cadena ligera. Figura 2N. La secuencia de aminoácidos de Hal-4.40 VH . Subrayada está la región constante de cadena pesada. Figura 20. La secuencia de aminoácidos de Hal-4.40 VL. Subrayada está la región constante de cadena ligera. Figura 2P. La secuencia de aminoácidos de Hal-4.37 VH. Subrayada está la región constante de cadena pesada. Figura 2Q. La secuencia de aminoácidos de Hal-4.37 VL. Subrayada está la región constante de cadena ligera. Figura 2R. La secuencia de aminoácidos de Hal-1.43 VH . Subrayada está la región constante de cadena pesada. Figura 2S. La secuencia de aminoácidos de Hal-1.43 VL. Subrayada está la región constante de cadena ligera. Figura 2T. La secuencia de aminoácidos de Hal-1.152 VH . Subrayada está la región 11 constante de cadena pesada. Figura 2U. La secuencia de aminoácidos de Hal-1.152 VL. Subrayada está la región constante de cadena ligera. Figura 3. Secuencias de Nucleótidos y Aminoácidos de anticuerpos PSCA. Figura 3A. El cDNA y secuencia de aminoácidos de Hal-4.117 VH. Subrayada está la región constante de cadena pesada. Figura 3B. El cDNA y secuencia de aminoácidos de Hal-4.117 VL. Subrayada está la región constante de cadena ligera. Figura 3C. El cDNA y secuencia de aminoácidos de Hal-4.120 VH . Subrayada está la región constante de cadena pesada. Figura 3D. El cDNA y secuencia de aminoácidos de Hal-4.120 VL. Subrayada está la región constante de cadena ligera. Figura 3E. El cDNA y secuencia de aminoácidos de Hal-5.99 VH. Subrayada está la región constante de cadena pesada. Figura 3F. El cDNA y secuencia de aminoácidos de Hal-5.99 VL. Subrayada está la región constante de cadena ligera. Figura 3G. El cDNA y secuencia de aminoácidos de Hal-4.121 VH. Subrayada está la región constante de cadena pesada. Figura 3H. El cDNA y secuencia de aminoácidos de Hal-4.121 VL c.5. Subrayada está la región constante de cadena ligera. Figura 31. El cDNA y secuencia de aminoácidos de Hal-4.121 VL c.26. Subrayada está la región constante de cadena ligera. Figura 3J. El cDNA y secuencia de aminoácidos de Hal-1.16 VH. Subrayada está la región constante de cadena pesada. Figura 3K. El cDNA y secuencia de aminoácidos de Hal-1.16 VL. Subrayada está la región constante de cadena ligera. Figura 3L. El cDNA y secuencia de aminoácidos de Hal-4.5 VH . Subrayada está la región constante de cadena pesada. Figura 3M. El cDNA y secuencia de aminoácidos de Hal-4.5 VL. Subrayada está ía región constante de cadena ligera. Figura 3N. El cDNA y secuencia de aminoácidos de Hal-4.40 VH . Subrayada está la región constante de cadena pesada. Figura 30. El cDNA y secuencia de aminoácidos de Hal-4.40 VL. Subrayada está la región constante de cadena ligera. Figura 3P. El cDNA y secuencia de aminoácidos de Hal-4.37 VH . Subrayada está la región constante de cadena pesada. Figura 3Q. El cDNA y secuencia de aminoácidos de Hal-4.37 VL. Subrayada está la región constante de cadena ligera. Figura 3R. El cDNA y secuencia de aminoácidos de Hal-1.43 VH. Subrayada está la región constante de cadena pesada. Figura 3S. El cDNA y secuencia de aminoácidos de Hal-1.43 VL. Subrayada está la región constante de cadena ligera. Figura 3T. El cDNA y secuencia de aminoácidos de Hal-1.152 VH. Subrayada está la región constante de cadena pesada. Figura 3U. El cDNA y secuencia de aminoácidos de Hal-1.152 VL. Subrayada está la región constante de cadena ligera. Figura 4. Alineación de anticuerpos PSCA a las Secuencias V-D-J de línea germinal. Figura 4A. Alineación de Hal-4.117 VH (SEQ ID NO: 13) a VH4-31 humano. Figura 4B.

Alineación de Hal-4.117 VL (SEQ ID NO: 14) a L19 humano. Figura 4C. Alineación de Hal-4.120 VH (SEQ ID NO: 15) a VH4-31 humano. Figura 4D. Alineación de Hal-4.120 VL (SEQ ID NO: 16) a 02 humano. Figura 4E. Alineación de Hal-5.99 VH (SEQ ID NO: 17) a VH4-34 humano. Figura 4F. Alineación de Hal-5.99 VL (SEQ ID NO: 18) a A27 humano. Figura 4G. Alineación de Hal-4.121 VH (SEQ ID NO: 19) a VH4-34 humano. Figura 4H. Alineación de Hal-4.121 c.5 VL (SEQ ID NO: 20) a 08 humano. Figura 41. Alineación de Hal-4.121 c.26 VL (SEQ ID NO: 21) a A3 humano. Figura 4J. Alineación de Hal-1.16 VH (SEQ ID NO: 22) a VH6-1 humano. Figura 4K. Alineación de Hal-1.16 VL (SEQ ID NO: 23) a B3 humano. Figura 4L. Alineación de Hal-4.37 VH (SEQ ID NO: 28) a VH4-31 humano. Figura 4M. Alineación de Hal-4.37 VL (SEQ ID NO: 29) a 02 humano. Figura 5. Expresión de la proteína PSCA en líneas de células de murino, rata y humano recombinantes. Las líneas de células de murino, rata y humanas indicadas se infectaron con retrovirus que llevan el cDNA de PSCA humano y un gen de resistencia a neomicina o virus de control con solamente el gen de resistencia neomicina. La línea de células recombinantes estables se seleccionaron en la presencia de G418. La expresión de PSCA se determinó mediante el manchado de FACS con el MAb anti-PSCA 1G8 (5 ug/ml) . Se muestra el perfil de FACS de cada línea de células que demuestra un desplazamiento fluorescente solamente en la línea infectada de PSCA indicativa de la expresión de PSCA de superficie de célula. Estas líneas son útiles en el desarrollo de MAb como inmunógenos, reactivos de clasificación MAb, y en ensayos funcionales. Figura 6. Purificación de la Proteína PSCA de E. Coli. La cepa de E . coli . BL21 pLysS se transformó con el vector pET-21b que codifica los aminoácidos 21-94 del cDNA de PSCA. La proteína PSCA se expresó mediante la inducción de cultivos en fase logarítmica con IPTG y se purificó mediante la cromatografía de afinidad de ya sea las fracciones solubles o insolubles de las bacterias lisadas. Se muestran los geles de manchado de azul de Coomasie SDS-PAGE de las fracciones eluídas. Esta proteína es útil como un inmunógeno MAb y pAb y como un reactivo de clasificación de anticuerpo. Figura 7. Purificación de la proteína PSCA glicosilada recombinante expresada de las células de 293T.

Las células de 293T se transfectaron con el vector psecTag2 que lleva un cDNA de PSCA que codifica los aminoácidos 28-100. Una línea de células que secreta PSCA recombinante estable se creo mediante la selección de fármaco con higromicina B. La proteína PSCA presente en el medio de cultivo acondicionado se purificó mediante la cromatografía de afinidad utilizando el MAb 1G8. Se muestra el gel SDS-PAGE manchado con azul de Coomasie en las fracciones eluídas de bajo pH. El embarramiento de amplio peso molecular de la proteína demuestra la glicosilacíón de la proteína PSCA recombinante como se observa en el PSCA endógenamente expresado. Figura 8. Purificación de proteína GST-PSCA de E.

Coli. La cepa de E . coli BL21 DE3 se transformó con pGEX-2T que codifica los aminoácidos 18-98 de PSCA fusionada a glutationa-S-transferasa (GST) . La proteína GST-PSCA se indujo con isopropil-beta-D-tiogalactopiranosido (IPTG) de los cultivos de fase logarítmica y se purificaron de las bacterias lisadas mediante la cromatografía de afinidad con la matriz de agarosa de glutationa. Se muestra un gel manchado con azul de Coomasie SDS-PAGE de las fracciones eluídas de glutationa que contienen GST-PSCA. Se indican la proteína de fusión GST-PSCA intacta y un producto de degradación menor que contiene GST. Esta proteína es útil como un inmunógeno MAb y pAb y como un reactivo de clasificación Ab . Figura 9. Clasificación por los anticuerpos de PSCA humano mediante FACS. La concentración de anticuerpo de los sobrenadantes se determinó mediante ELISA. 50ul/cavidad de (puro) se adicionó a placas FACS de 96 cavidades y se diluyo en serie. Las células que expresan PSCA se adicionaron (endógenas o recombinantes, 50,000 células/cavidad) y la mezcla se incubó a 4°C durante dos horas. Después de la incubación, las células se lavaron con solución reguladora FACS y además se incubaron con 100 ul de anticuerpo de detección (anti-hlgG-PE) durante 45 minutos a 4°C. Al final de la incubación, las células se lavaron con solución reguladora FACS, se fijaron con formaldehído y se analizaron utilizando FACScan. Los datos se analizaron utilizando el software CellQuest Pro. Los histogramas sólidos representan datos de las células de control negativos y los histogramas abiertos indican datos de las células positivas de PSCA. Figura 10. Clasificación de afinidad relativa de PSCA MAbs mediante FACS. 21 diluciones en serie 1:2 de cada anticuerpo PSCA se incubaron con células S 780 (50,000 células por cavidad) durante la noche a 4°C (las concentraciones de MAb finales variaron de 40nM a 0.038pM) . Al final de la incubación, las células se lavaron e incubaron con el anticuerpo de detección anti-hlgG-PE. Después del lavado de los anticuerpos secundarios no enlazados, las células se analizaron mediante FACS y la intensidad de fluorescencia media de cada punto obtenida utilizando el software CellQuest Pro. La afinidad se calculó con el software Graphpad Prism utilizando una ecuación de Dosis-Respuesta Sigmoidal (pendiente variable) . Un análisis de FACS representativo que representa la titulación de enlace para PSCA MAb 4.121 se presenta en la Figura. Figura 11. Expresión del PSCA de murino y mono cinomolgus en células 293T y el reconocimiento por los MAbs de PSCA anti-humano. Las células 293T se transfectaron transientemente con el vector pCDNA3.1 que lleva el cDNA de PSCA murino, el cDNA de PSCA de simio o con el vector vacío (neo) . Dos días después de la transfección, las células se recolectaron y se mancharon con ya sea MAb Hal-4.117 anti-PSCA humano p MAb 1G8 de murino (5 ug/ml) . Se muestra el perfil FACS que demuestra que el MAb Hal-4.117 resaltado a la proteína PSCA humana enlaza a tanto la proteína PSCA de murino como de simio expresada en las células 293T. El 1G8 MAb de murino enlaza al PSCA de simio pero no al PSCA de murino. Tales resultados demuestran la habilidad para seleccionar MAbs que reaccionan cruzadamente con el antígeno de otra especie. La reacción cruzada de MAbs será útil para estudiar la expresión y la toxicidad en esas especies. Figura 12. Internalización o incorporación del PSCA después de la incubación con Mab 4.121. El MAb 4.121 de PSCA se incubó con las células PC3-PSCA a 4°C durante 90 min para permitir el enlace de los anticuerpos a la superficie de la célula. Las células luego se dividieron en dos alícuotas y se incubaron a ya sea 37°C (para permitir la internalización del anticuerpo) o 4°C (control de no internalización). Después de la incubación a 37°C o 4°C, el MAb 4.121 de PSCA restante enlazado a la superficie de la célula se removió con un lavado con ácido. La permeabilización y la incubación subsecuentes con un anticuerpo de detección secundaria permitió la detección del MAb 4.121 de PSCA internalizado. Las células se analizaron utilizando FACS o se observaron bajo el microscopio de fluorescencia. Aproximadamente 30% de Mab 4.121 de PSCA se internalizó después de la incubación a 37°C durante dos horas. Figura 13. Anticuerpos a PSCA median la exterminación dependiente de saporina en las células que expresan PSCA. Las células B300.19 (750 células/cavidad) se sembraron en una placa de 96 cavidades en el día 1. Al siguiente día un volumen igual del medio que contiene una concentración 2X del anticuerpo primario indicado junto con un exceso de 2 veces de anticuerpo policlonal anti-humano (Hum-Zap) o anti-cabra (Goat-Zap) conjugado con toxina de saporina (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA) se adicionó a cada cavidad. Las células se dejaron incubar durante 5 días a 37 grados C. Al final del periodo de incubación, MTS (Promega) se adicionó a cada cavidad y la incubación se continúo durante 4 horas adicionales. La OD a 450 nM se determinó. Los resultados en la Figura 13 (A) muestran que los anticuerpos de PSCA HA1-4.121 y HA1-4.117 median la citotoxicidad dependiente de saporina en las células B300.19-PSCA, mientras que un anticuerpo IgG?, no específico de control no tuvo efecto. Los resultados en la Figura 13 (B) muestran que la adición de un anticuerpo conjugado con saporina secundario que no reconoce Fe humano, no logró mediar la citotoxicidad. Figura 14. Citotoxicidad mediada por el complemento de PSCA Mabs. Los anticuerpos PSCA (0-50 µg/ml) se diluyeron con solución reguladora RHB (RPMI 1640, Gibco Life Technologies, 20 mM HEPES) . Las células que expresan B300.19-PSCA se lavaron en solución reguladora RHB y se resuspendieron a una densidad de 106 células/ml. En un ensayo típico, 50 µl de anticuerpo PSCA, 50 µl de suero de complemento de conejo diluido (Cedarlane, Ontario, Can), y 50 µl de una suspensión de células se adicionaron conjuntamente en una placa de 96 cavidades de cultivo de tejido de fondo plano. La mezcla se incubó durante 2 hr. a 37°C en una incubadora de C02 al 5% para facilitar la lisis de célula mediada por complemento. 50 µl de Azul Alamar (Biosource Intl. Camarillo, CA) se adicionó a cada cavidad y la ecuación se continúo durante 4-5 hr a 37°C. La fluorescencia en cada cavidad se leyó utilizando un fluorómetro de 96 cavidades con excitación a 530 nm y emisión a 590 nm. Los resultados muestran que los anticuerpos PSCA que tienen una IgGi (HA1-4.121) o un isotipo de IgG2 (HA1-5.99.1) pero no un isotipo de IgG4 (HA1-6.46) fueron capaces de mediar la lisis dependiente de complemento de las células objetivo. Figura 15. Generación de fragmentos F(ab')2 de MAb Hal-4.121 mediante la digestión de pepsina. 20 mgs de MAb Hal-4.121 en solución reguladora de acetato de sodio 20 mM pH 4.5 se incubó con y sin pepsina inmovilizada (Pierce. Rockford IL) por lo tiempos indicados. MAb intacto y los fragmentos Fe digeridos se removieron mediante la cromatografía de proteína A. Se muestra un gel manchado de Coomasie SDS-PAGE del MAb no reducido, no digerido, intacto, alícuotas no reducidas de material digerido se tomaron los tiempos indicados, y una muestra reducida del producto F(ab')2 digerido final. Figura 16. Enlace del mAb humano anti-PSCA recombinante a PSCA mediante citometría de flujo. (16A) células 293T se transfectaron con construcciones de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera del mAb humano anti-PSCA. El sobrenadante se recolectó después de 48 horas y se analizó para el enlace a PSCA. (16B) mAb humano anti-PSCA se purificó del sobrenadante de hibridoma y se utilizó para los ensayos de enlace de PSCA. El enlace de PSCA se probó como sigue. Células parentales PC3 o PC3-PSCA se incubaron con el mAbs humano anti-PSCA descrito en lo anterior durante 30 minutos sobre hielo. Las células se lavaron y se incubaron con Ig anti-humano conjugado con PE durante 30 minutos sobre hielo. Las células se lavaron y luego se analizaron mediante la citometría de flujo. Figura 17. Detección de la proteína PSCA mediante inmunohistoquímica. La expresión de la proteína PSCA en muestras de tumor de pacientes de cáncer se detectó utilizando el anticuerpo HA1-4.117. Tejidos incrustados en parafina, fijados en formalina se cortaron en secciones de 4 mieras y se montaron sobre platinas de vidrio. Las secciones se deslavaron, se rehidrataron y se trataron con la solución de recuperación de antígeno (Antigen Retrieval Citra Solution; BioGenex, 4600 Norris Canyon Road, San Ramón, CA, 94583) a alta temperatura. Las secciones luego se incubaron en anticuerpo anti-PSCA monoclonal humano conjugado con fluoresceína Hal-4.117, durante 16 hora a 4°C. Las platinas se lavaron tres veces en solución reguladora y además se incubaron con anti-Fluoresceína de conejo durante 1 hora y, después del lavado en solución reguladora, se sumergieron en anticuerpo secundario de inmunoglobulina anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa DAKO EnVision+™ (DAKO Corporation, Carpenteria, CA) durante 30 minutos. Las secciones luego se lavaron en solución reguladora, se revelaron utilizando el equipo DAB (SIGMA Chemicals) , se contramarcharon con hematoxilina, y se analizaron mediante la microscopía de campo brillante. Los resultados muestran la expresión de PSCA en las células de tumor del adenocarcinoma de próstata (Panel A, Panel B) , carcinoma transicional de vejiga (Panel C) y adenocarcinoma ductal pancreático (Panel D) . Estos resultados indican que PSCA es expresado en cánceres humanos y que los anticuerpos dirigidos a este antígeno son útiles como reactivos de diagnóstico. Figura 18. MAb Hal-4.120 de PSCA Inhibe el crecimiento de los Xenoinjertos de Cáncer de Próstata Subcutáneos. Células de tumor LAPC-9AI (2.0 x 106 células) se inyectaron subcutáneamente en ratones SCID machos. Los ratones se aleatorizaron en grupo (n=10 en cada grupo) y el tratamiento se inició intraperitonealmente (i.p.) en el Día 0 con HA1-4.120 o el control MAb de isotipo como es indicado. Los animales se trataron dos veces cada semana para un total de 7 dosis hasta el día 28 del estudio. El crecimiento del tumor se monitoreo utilizando mediciones de calibre cada 3 a 4 días como es indicado. Los resultados muestran que el anticuerpo monoclonal anti-PSCA humano Hal-4.120 significativamente inhibió el crecimiento de los xenoinjertos de cáncer de próstata humano implantados subcutáneamente en ratones SCID (p< 0.05) . Figura 19. MAb Hal-5.99 de PSCA Inhibe el Crecimiento de los Xenoinjertos de Cáncer de Próstata Establecidos en ratones SCID. Células de tumor LAPC-9AI (2.0 x 106 células) se inyectaron subcutáneamente en ratones SCID machos. Cuando el volumen del tumor alcanzó 50 mm3, los ratones se aleatorizaron en grupos (n=10 en cada grupo) y el tratamiento se inició intraperitonealmente (i.p.) con HA1-5.99.1 o el control MAb de isotipo como es indicado. Los animales se trataron dos veces a la semana para un total de 5 dosis hasta el día 14 del estudio. El crecimiento del tumor se monitoreo utilizando mediciones de calibre cada 3 a 4 días como es indicado. Los resultados muestran que el anticuerpo monoclonal anti-PSCA completamente humano Hal-5.99 significativamente inhibió el crecimiento de los xenoinjertos de cáncer de próstata humano independientes de andrógeno establecidos, implantados subcutáneamente en ratones SCID (p< 0.05) . Figura 20. MAb Hal-4.121 de PSCA Inhibe el Crecimiento de los Xenoinjertos de Cáncer de Próstata Humano Dependientes de Andrógeno Establecido. Las células de tumor LAPC-9AD (2.5 x 106 células) se inyectaron subcutáneamente en ratones SCID machos. Cuando el volumen del tumor alcanzó 40 mm3, los ratones se aleatorizaron en grupos (n=10 en cada grupo) y el tratamiento se inició intraperitonealmente (i.p.) con concentraciones incrementadas de HA1-4.121 o el control MAb de isotipo como es indicado. Los animales se trataron dos veces cada semana para un total de 7 dosis hasta el día 21 del estudio. El crecimiento del tumor se monitoreo utilizando mediciones de calibre cada 3 a 4 días como es indicado. Los resultados de este estudio demostraron que HA1-4.121 inhibió el crecimiento de los xenoinjertos de próstata independientes de andrógeno humano subcutáneos establecidos en ratones SCID. Los resultados fueron estadísticamente significantes para el grupos de dosis de 300 ug en los días 14, 17 y 21 (p<0.05, prueba de Kruskal-Wallis, de dos lados con a=0.05) y para el grupo de dosis de 700 ug en los días 10, 14, 17 y 21 (p<0.05, prueba de Kruskal-Wallis, de dos lados con =0.05). Figura 21. Células de tumor LAPC-9AD dependientes de andrógeno, derivadas de pacientes (2.0 x 106 células) se inyectaron en los lóbulos dorsales de las próstatas de ratones SCID machos. Los tumores se dejaron crecer mediante aproximadamente 10 días tiempo en el cual los ratones se aleatorizaron en grupos. El tratamiento con 500 ug humano de HA1-4.117, HA1-4.121 o el control MAb de Isotipo se inició 10 días después de la implantación del tumor. Los anticuerpos se suministraron intraperitonealmente dos veces a la semana para un total de 7 dosis. Cuatro días después de la última dosis, los animales se sacrificaron y los tumores primarios se extirparon y se pesaron. Los resultados muestran que los anticuerpos monoclonales anti-PSCA humanos HA1-4.121 (p<0.01) y Hal-4.117 (p<0.05) significativamente inhibieron el crecimiento de los xenoinjertos de cáncer de próstata LAPC-9AD ortotópicamente implantados en ratones SCID. Figura 22. MAb Hal-4.121 de PSCA Prolonga la Supervivencia de Ratones SCID con Tumores de Próstata Dependientes de Andrógeno, Humanos Ortotópicos establecidos. Las células de tumor LAPC-9AD dependientes de andrógeno, derivados de pacientes, (2.0 x 106 células) se inyectaron en los lóbulos dorsales de las próstatas de ratones SCID machos. Los tumores se dejaron crecer por aproximadamente 9 días tiempo en el cual los ratones se aleatorizaron en grupos. Los animales aleatorizados en el grupo de supervivencia incluyen 11 ratones en el control MAb de isotipo y 12 ratones en el grupo tratado con HA1-4.121. Los animales se trataron i.p. con 1000 ug de Hal-4.121 o 1000 ug de control MAb de isotipo dos veces a la semana por un total de 9 dosis. Los resultados demostraron que HA1-4.121 significativamente (prueba de log-clasificación: p<0.01) prolongó la supervivencia de los ratones SCID con los tumores de próstata dependientes de andrógeno humanos. Dos ratones en el grupo tratado con HA1-4.121 permanecieron libres de tumores palpables 110 días después del último tratamiento. Figura 23. Inhibición Aumentada del Crecimiento de Tumor de Próstata con HA1-4.21 y Terapia de Combinación de Taxotere. Células de tumor LAPC-9AI (2 x 106 células por animal) se inyectaron subcutáneamente en ratones SCID machos. Cuando el volumen del tumor alcanzó 65 mm3, los animales se aleatorizaron y se asignaron a cuatro grupos diferentes (n=10 en cada grupo) como es indicado. Al comienzo del día 0, Hal-4.121 o el control MAb de isotipo se administraron i.p. dos veces a la semana a una dosis de 500 ug para un total de 6 dosis. La última dosis se dio en el día 17. Taxotere se dio intravenosamente en una dosis de 5 mg/kg en los días 0, 3 y 7. El crecimiento del tumor se monitoreó cada 3-4 días utilizando mediciones de calibre. Los resultados de este estudio demuestran que HA1-4.121 como un agente individual inhibió el crecimiento de xenoinjertos de próstata independientes de andrógeno en los ratones SCID por 45% cuando se comparó con el tratamiento de anticuerpo de control solo en el día 28 (prueba de ANOVA/Tukey: p<0.05) . La administración del control MAb de isotipo más taxotere inhibió el crecimiento del tumor por 28% cuando se comparó con el tratamiento de anticuerpo de control solo, que no fue estadísticamente significante. La administración de HA1-4.121 en combinación con Taxotere, aumentó el efecto y dio por resultado una inhibición de 69% del crecimiento del tumor cuando se comparó con el anticuerpo de control solo (prueba de ANOVA/Tukey: p<0.01) . Una diferencia estadísticamente significante también se demostró cuando el grupo de combinación de HA1-4.121 más Taxotere se comparó a ya sea el grupo HA1-4.121 o el grupo de control MAb de isotipo más Taxotere (prueba de ANOVA/Tukey: p<0.05) . Figura 24. MAbs de PSCA Humano Inhibe el Crecimiento de Xenoinjertos de Cáncer Pancreático en ratones SCID/HPAC Humano. Las células de cáncer pancreáticas (2 x 106/ratón) se inyectaron subcutáneamente en ratones SCID ICR inmunodeficientes (Taconic Farm, Germantown, NY) . Los ratones se aleatorizaron en grupos (n= 10 animales/grupo) y el tratamiento con el anticuerpo monoclonal PSCA humano indicado se inició en mismo día. Los anticuerpos (500 mg/ratón) se suministraron intraperitonealmente dos veces a la semana por un total de 8 dosis. Los resultados demostraron que los anticuerpos monoclonales anti-PSCA humanos Hal-4.121, Hal-4.117 y Hal-1.16 significativamente inhibieron el crecimiento de los xenoinjertos de cáncer pancrático humano subcutáneamente implantados en ratones SCID. Los análisis estadísticos se realizaron una prueba t (dos lados, a=0.05). Figura 25. Hal-4.121 MAb de PSCA Inhibe el Crecimiento de Tumores Pancreáticos Implantados Ortotópicamente en Ratones SCID. Células HPAC (3.0 x 106 células) se implantaron ortotópicamente en la pancreata de ratones SCID. Los ratones se asignaron aleatoriamente a tres grupos (n=9 en cada grupo) como es indicado. El tratamiento con HA1-4.121 (250 ug o 1000 ug) o control MAb de isotipo (1000 ug) se inició en el día de la implantación. Los anticuerpos se administraron i.p. dos veces a la semana para un total de 10 dosis. Trece días después de la última dosis, los animales se sacrificaron y los tumores primarios se extirparon y se pesaron. Los resultados de estos estudios demostraron que HA1-4.121 significativamente inhibió el crecimiento ortotópico de los xenoinjertos de cáncer pancreático humano en ratones SCID en ambos niveles de dosis examinados. El tratamiento con 250 ug y 1000 ug de AGS-PSCA inhibió en crecimiento del tumor por 66% y 70%, respectivamente (prueba de Kruskal- allis/Tukey : p<0.01 y p<0.01, respectivamente). Figura 26. HA1-4.121 Mab de PSCA inhibe la metástasis. En la autopsia, la metástasis visible en los nodos de linfa y los órganos distantes se observaron en el grupo tratado con anticuerpo de control. No se observaron metástasis visibles en ambos grupos tratados con HA1-4.121. Los nodos de linfa, los pulmones y los hígados se removieron de todos los animales y se examinaron histológicamente para la presencia del tumor metastático. Las secciones de los pulmones y los nodos de linfa removidos de cada animal se mancharon para la citoqueratina humana y el número de metástasis se determinó microscópicamente. Los resultados del análisis histológico demostró una reducción significante de la metástasis de nodo de linfa (LN) en el animal tratado con HA1-4.121 (p=0.0152 como es detectado por la prueba exacta de Fishers) . La incidencia de la metástasis y la invasión también se disminuyó significativamente de los animales tratados con ambas concentraciones de HA1-4.121 (p=0.0152 como es' detecto por la prueba exacta de Fishers) . El número de metástasis de pulmón disminuyo significativamente los ratones tratados con la dosis de 1.0 mg de HA1-4.121 solamente (p=0.0498 como es detecto por la prueba exacta de Fishers) .

Figura 27. MAbs de PSCA humano inhibe el Crecimiento de Tumores de Vejiga SW780 en Ratones SCID. Células de cáncer de vejiga S 780 humano (2 x 106/ratón) se inyectaron subcutáneamente en ratones SCID ICR inmunodeficientes (Taconic Farm, Germantown, NY) . Los ratones se aleatorizaron en grupos (n=10 animales/grupo) y el tratamiento con el MAb de PSCA humano indicado inició el mismo día. Los anticuerpos (250 mg/ratón) se suministraron intraperitonealmente dos veces a la semana por un total de 7 dosis. Los resultados demostraron que HA1-4.117 (p=0.014), HA1-4.37 (p=0.0056), HA1-1.78 (p=0.001), Hal-5.99 (p=0.0002) y HA1-4.5 (p=0.0008) significativamente inhibieron el crecimiento de los tumores de vejiga SW780 implantados subcutáneamente en ratones SCID. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando una prueba t (dos lados, a=0.05) . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Resumen de las Secciones I.) Definiciones II.) Polinucleótidos PSCA II. A) Usos de Polinucleótidos PSCA II.A.l.) Monitoreo de Anormalidades Genéticas II. A.2.) Modalidades Antisentido II. A.3.) Cebadores y Pares de Cebadores II. A.4.) Aislamiento de Moléculas de Acido Nucleico que Codifican PSCA II. .5.) Moléculas de Acido Nucleico Recombinantes y Sistemas de Hospedero-Vector III.) Proteínas Relacionadas con PSCA III. .) Modalidades de Proteína que llevan Porción III. B.) Expresión de Proteína Relacionada con PSCA III. C.) Modificaciones de Proteínas Relacionadas con PSCA III. D.) Usos de Proteínas Relacionas con PSCA IV.) Anticuerpos PSCA V.) Respuestas Inmunes Celulares de PSCA VI.) Animales Transgénicos de PSCA VII.) Métodos para la Detección de PSCA VIII.) Métodos para Monitorear el Estado de los Genes Relacionados con PSCA y sus Productos IX.) Identificación de Moléculas que Interactúan con PSCA X.) Métodos Terapéuticos y Composiciones X.A.) Vacunas Anti-Cáncer X.B.) PSCA como un Objetivo para la Terapia Basada en Anticuerpo X.C.) PSCA como un Objetivo para las Respuestas Inmunes Celulares X.C.l. Vacunas de Minigen X.C.2. Combinaciones de Péptidos CTL con Péptidos Ayudantes X.C.3. Combinaciones de Péptido CTL con Agentes de Cebado de Célula T X.C.4. Composiciones de Vacuna que Comprenden DC Pulsado con Péptidos CTL y/o HTL X.D.) Inmunoterapia Adoptiva X.E.) Administración de Vacunas para Propósitos Terapéuticos o Profilácticos XI.) Modalidades de Diagnóstico y Pronóstico de PSCA. XII.) Inhibición de la Función de Proteína de PSCA XII. A.) Inhibición de PSCA con Anticuerpos Intracelulares XII. B.) Inhibición de PSCA con Proteínas Recombinantes XII. C.) Inhibición de la Transcripción o Traducción de PSCA XILD. ) Consideraciones Generales para Estrategias Terapéuticas XIII.) Identificación, Caracterización y Uso de Moduladores de PSCA XIV.) RNAi y Uso Terapéutico de RNA de Interferencia Pequeña (siRNAs) XV.) EQUIPOS/Artículos de Manufactura I.) Definiciones: A menos que se defina de otra manera, todos los términos de la técnica, anotaciones y otros términos científicos o terminología utilizados en la presente se proponen para tener los significados comúnmente entendidos por aquellos de habilidad en la técnica a la cual esta invención pertenece. En algunos casos, los términos con significados comúnmente entendidos son definidos en la presente para claridad y/o para referencia, y la inclusión de tales definiciones en la presente no deben ser consideradas necesariamente que representan una diferencia sustancial sobre lo que generalmente se entiende en la técnica. Muchas de las técnicas y procedimientos descritos o referidos en la presente son bien entendidos y comúnmente empleados utilizando la metodología convencional por aquellos expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular ampliamente utilizadas descritas en Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Como es apropiado, los procedimientos que involucran el uso de equipos comercialmente disponibles y reactivos generalmente se llevan se cabo de acuerdo con los protocolos y/o. parámetros definidos por el fabricante a menos que se mencione de otra manera . Los términos "cáncer de próstata avanzado", "cáncer de próstata localmente avanzado", "enfermedad avanzada" y "enfermedad localmente avanzada" significan cánceres de próstata que se han extendido a través de la cápsula de próstata, y se proponen que incluyen la enfermedad de etapa C bajo el sistema de la Asociación Urológica Americana (AUA), enfermedad de etapa Cl - C2 bajo el sistema Whitmore-Jewett, y la enfermedad de la etapa T3 - T4 y N+ bajo el sistema de TNM (tumor, nodo, metástasis) . En general, la cirugía no es recomendada para pacientes con enfermedad localmente avanzada, y estos pacientes tienen efectos sustancialmente menos favorables comparados con los pacientes que tienen cáncer de próstata clínicamente localizados (confinado al órgano) . La enfermedad localmente avanzada es clínicamente identificada por la evidencia palpable de induración más allá del borde lateral de la próstata, o asimetría o induración arriba de la base de la próstata. El cáncer de próstata localmente avanzado es actualmente diagnosticado patológicamente después de la prostatectomía radical sí el tumor invade o penetra la cápsula prostética, se extiende en el margen quirúrgico, o invade las vesículas seminales. "Alteración del patrón de glicosilación nativo" se propone para propósitos en la presente para dar a entender la supresión de una o más porciones de carbohidrato encontradas en el PSCA de secuencia nativa (ya sea al remover el sitio de glicosilación implícito o al suprimir la glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos) , y/o al adicionar uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el PSCA de secuencia nativa. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas, que involucran un cambio en la naturaleza y las proporciones de las diversas porciones de carbohidrato presentes. El término "análogo" se refiere a una molécula que es estructuralmente similar o comparte atributos similares o correspondientes con otra molécula (por ejemplo, una proteína relacionada con PSCA) . Por ejemplo, un análogo de una proteína PSCA puede ser específicamente enlazado por un anticuerpo o célula T que específicamente enlaza PSCA. El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio a menos que claramente se indique de otra manera. Por lo tanto, un "anticuerpo" puede estar ocurriendo naturalmente o hecho por el hombre tales como los anticuerpos monoclonales producidos por la tecnología de hibridoma convencional. Los anticuerpos anti-PSCA comprenden anticuerpos monoclonales y policlonales así como fragmentos que contienen el dominio de enlace de antígeno y/o una o más regiones de determinación de complementariedad de estos anticuerpos. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a cualquier forma de anticuerpo o fragmento del mismo específicamente enlaza a PSCA y/o exhibe la actividad biológica deseada y específicamente cubre los anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo mientras que ellos específicamente enlazan a PSCA y/o exhiben la actividad biológica deseada. Cualquier anticuerpo específico puede ser utilizado en los métodos y las composiciones proporcionadas en la presente. Así, en una modalidad el término "anticuerpo" comprende una molécula que comprende por lo menos una región variable de una molécula de inmunoglobulina de cadena ligera y por lo menos una región variable de una molécula de cadena pesada que en combinación forman un sitio de enlace específico para el antígeno objetivo. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo IgG. Por ejemplo, el anticuerpo es un anticuerpo IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4. Los anticuerpos útiles en los presentes métodos y composiciones se pueden generar en el cultivo de células, en fago, o en varios animales, incluyendo pero no limitados a vacas, conejos, cabras, ratones, ratas, hámsteres, conejillos de indias, ovejas, perros, gatos, monos, chimpancés, simios. Por lo tanto, en una modalidad, un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo de mamífero. Las técnicas de fago se pueden utilizar para aislar un anticuerpo inicial o para generar variantes con características de especificidad o avidez alteradas. Tales técnicas son de rutina y bien conocidas en el arte. En una modalidad, el anticuerpo se produce por medios recombinantes conocidos en el arte. Por ejemplo, un anticuerpo recombinante se puede producir al transfectar una célula hospedera con un vector que comprende una secuencia de DNA que codifica el anticuerpo. Uno o más vectores pueden ser utilizados para transfectar la secuencia de DNA que expresa por lo menos una región VL y una región VH en la célula hospedera. Descripciones ejemplares de medios recombinantes de generación y producción de anticuerpo incluyen Delves, ANTIBODY PRODUCTION: ESSENTIAL TECHNIQUES (Wiley, 1997); Shephard y colaboradores, MONOCLONAL ANTIBODIES (Oxford University Press, 2000); Goding, MONOCLONAL ANTIBODTES: PRINCIPIES AND PRACTICE (Academic Press, 1993); CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons, más reciente edición) . Un anticuerpo de la presente invención puede ser modificado por medios recombinantes para incrementar la eficacia más grande del anticuerpo en mediar la función deseada. Así, está dentro del alcance de la invención que los anticuerpos pueden ser modificados por sustituciones utilizando medios recombinantes. Típicamente, las sustituciones serán sustituciones conservativas. Por ejemplo, por lo menos un aminoácido en la región constante del anticuerpo puede ser reemplazado con un residuo diferente. Ver, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,624,821, Patente Norteamericana No. 6,194,551, Solicitud No. WO 9958572; y Angal y colaboradores, Mol. Immunol. 30:105-08 (1993). La modificación en los aminoácidos incluye supresiones, adiciones, sustituciones de aminoácidos. En algunos casos, tales cambios se hacen para reducir actividades indeseadas, por ejemplo, la citotoxicidad dependiente del complemento. Frecuentemente, los anticuerpos se marcan al unir, ya sea covalentemente o no covalentemente, una sustancia que proporciona una señal detectable. Una amplia variedad marcas y técnicas de conjugación son conocidas y son reportadas extensivamente en tanto la literatura científica como de patentes. Estos anticuerpos pueden ser clasificados para enlazar al PSCA normal o defectuoso. Ver por ejemplo, ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH (Oxford University Press, 1996) . Los anticuerpos adecuados con las actividades biológicas deseadas pueden ser identificados siguiendo los ensayos in vi tro incluyen pero no limitados a: proliferación, migración, adhesión, crecimiento en agar blando, angiogénesis, comunicación célula-célula, apoptosis, transporte, transducción de señal y los siguientes ensayos in vivo tal como la inhibición del crecimiento de tumor. Los anticuerpos proporcionados en la presente también pueden ser útiles en aplicaciones de diagnóstico. Como anticuerpos de captura o no neutralizantes, ellos pueden ser clasificados por la habilidad para enlazar al antígeno específico sin inhibir la actividad de enlace de receptor o biológica del antígeno. Como anticuerpos neutralizantes, los anticuerpos pueden ser útiles en ensayos de enlace competitivos. Ellos también se pueden utilizar para cuantificar el PSCA o su receptor. Un "fragmento de anticuerpo" se define como por lo menos una porción de la región variable de la molécula de inmunoglobulina que enlaza su objetivo, es decir, la región de enlace de antígeno. En una modalidad esta específicamente cubre solo anticuerpos anti-PSCA y clones de los mismos (incluyendo, anticuerpos agonistas, antagonista y neutralizantes) y composiciones de anticuerpo anti-PSCA con especificidad poliepitópica. El anticuerpo de los presentes métodos y composiciones puede ser monoclonal o policlonal. Un anticuerpo puede estar en la forma de un fragmento de anticuerpo de enlace de antígeno que incluye un fragmento Fab, fragmento F(ab')2, una región variable de cadena individual y los similares. Los fragmentos de moléculas intactas pueden ser generados utilizando métodos bien conocidos en la técnica e incluye la digestión enzimática y medios recombinantes. Como se utiliza en la presente, cualquier de forma del "antígeno" se puede utilizar para generar un anticuerpo que es específico para PSCA. Así, el antígeno de inducción puede ser un epítope individual, múltiples epítopes o la proteína completa sola o en combinación con uno o más agentes mejoradotes de inmunogenicidad conocidos en la técnica. El antígeno inducción puede ser una proteína de longitud completa aislada, una proteína de superficie de la célula (por ejemplo, inmunizante con células transfectadas con por lo menos una porción del antígeno) , o una proteína soluble (por ejemplo, inmunizante con solamente la porción de dominio extracelular de la proteína) . El antígeno se puede producir en una célula genéticamente modificada. El DNA que codifica el antígeno puede ser genómico o no genómico (por ejemplo, cDNA) y codifica por lo menos una porción del dominio extracelular. Como se utiliza en la presente, el término "porción" se refiere al número mínimo de aminoácidos o ácidos nucleicos, como sea apropiado, para constituir un epítope inmunogénico del antígeno de interés. Cualquiera de los vectores genéticos adecuados para la transformación de las células de interés puede ser empleado, incluyendo pero limitado a vectores adenovirales, plásmidos y vectores no virales, tales como lípidos catiónicos. En una modalidad, el anticuerpo de los métodos y composiciones en la presente específicamente enlaza a por lo menos una porción del dominio extracelular del PSCA de interés. Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos proporcionados en la presente pueden ser conjugados a un "agente bioactivo". Como se utiliza en la presente, el término "agente bioactivo" se refiere a cualquier compuesto que ocurre naturalmente o sintético que enlaza al antígeno y/o aumenta o media un efecto biológico deseado para aumentar las toxinas que exterminan células. En una modalidad, los fragmentos de enlace útiles en la presente invención son fragmentos biológicamente activos. Como se utiliza en la presente, el término biológicamente activo se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que es capaz de enlazar el epítope antigénico deseado y directa o indirectamente ejercer un efecto biológico. Los efectos directos incluyen, pero no están limitados a la modulación, estimulación y/o inhibición de una señal de crecimiento, la modulación, estimulación y/o inhibición de una señal anti-apoptótica, la modulación, estimulación y/o inhibición de una señal apoptótica o necrótica, modulación, estimulación y/o inhibición de la cascada de ADCC, y la modulación, estimulación y/o inhibición de la cascada de CDC. Los anticuerpos "biespecíficos" también son útiles en los presentes métodos y composiciones. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo biespecífico" se refiere a un anticuerpo, típicamente un anticuerpo monoclonal, que tiene especificidades de enlace para por lo menos dos epítopes antigénicos diferentes. En una modalidad, los epítopes son del mismo antígeno. En otra modalidad, los epítopes son de dos diferentes antígenos. Los métodos para hacer anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se pueden producir recombinantemente utilizando la co-expresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina. Ver, por ejemplo, Milstein y colaboradores, Nature 305:537-39 (1983). Alternativamente, los anticuerpos biespecíficos pueden ser preparados utilizando el enlace químico. Ver, por ejemplo, Brennan y colaboradores, Science 229:81 (1985). Los anticuerpos biespecíficos incluyen fragmentos de anticuerpo biespecífico . Ver, por ejemplo, Hollinger, y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 90:6444-48 (1993), Gruber, y colaboradores, J. Immunol. 152:5368 (1994). Los anticuerpos monoclonales en la presente específicamente incluyen anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesado y/o ligera es idéntica con, u homologa a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es idéntica con, u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de tales anticuerpos, mientras que ellos específicamente enlazan el antígeno objetivo y/o exhiben la actividad biológica deseada (Patente Norteamericana No. 4,816,567; y Morrison y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 81:6851-6855 (1984) ) . El término "Agente Quimioterapéutico" se refiere a todos los compuestos químicos que son efectivos en inhibir el crecimiento del tumor. Ejemplo no limitativos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes de alquilación; por ejemplo, mostazas de nitrógeno, compuestos de etilenimina y sulfonatos de alquilo; antimetabolitos; por ejemplo, ácido fólico, purina o antagonistas de pirimidina; inhibidores mitóticos; por ejemplo, alcaloides de vincapervinca y derivados de podofilotoxina, antibióticos citotóxicos, compuestos que dañan o interfieren con la expresión de DNA, y los antagonistas del receptor de factor de crecimiento. Además, los agentes quimioterapéuticos incluyen agentes citotóxicos (como es definido en la presente) , anticuerpos, moléculas biológicas y moléculas pequeñas. El término "secuencias optimizadas en codón" se refieren a secuencias de nucleótidos que se han optimizado para una especie hospedera particular al reemplazar cualquiera de los codones que tienen una frecuencia de utilización de menos de aproximadamente 20%. Las secuencias de nucleótidos que se han optimizado para la expresión en una especie hospedera dada mediante la eliminación de las secuencias de poliadenilación espurias, la eliminación de las señales empalme de exón/intrón, la eliminación las repeticiones similares a transposon y/o la optimización del contenido de GC además de la optimización de codón son referidas en la presente como "secuencias mejoradas en la expresión" . Una "librería combinatoria" es una recolección de diversos compuestos químicos generados por ya sea la síntesis química o la síntesis biológica al combinar un número de "bloques de construcción" químicos tales como reactivos. Por ejemplo, una librería química combinatoria lineal, tal como una librería de polipéptido (por ejemplo, muteína), se forma al combinar un conjunto de bloques de construcción químicos llamados aminoácidos en cada manera posible para una longitud de compuesto dada (es decir, el número de aminoácidos en un compuesto de polipéptido) . Numerosos compuestos químicos se sintetizan a través de tal mezclado combinatorio de los bloques de construcción químicos (Gallop y colaboradores, J. Med. Chem. 37 (9) : 1233-1251 (1994)). La preparación y la clasificación de librerías combinatorias, es bien conocido para aquellos expertos en la técnica. Tales librerías químicas combinatorias incluyen, pero no están limitadas a, librerías de péptido (ver, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,010,175, Furka, Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991), Houghton y colaboradores, Nature, 354:84-88 (1991)), peptoides (Publicación de PCT No. WO 91/19735), péptidos codificados (Publicación de PCT WO 93/20242), bio-oligómeros aleatorios (Publicación de PCT WO 92/00091), benzodiazepinas (Patente Norteamericana No. 5,288,514), diversómeros tales como hidantoínas, benzodiazepinas y dipéptidos (Hobbs y colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 90:6909-6913 (1993)), polipéptidos vinilogos (Hagihara y colaboradores, J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992)), pept idomiméticos no peptidales con un escalafón de Beta-D-Glucosa (Hirschmann y colaboradores, J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992)), síntesis orgánicas análogas de librerías de compuestos pequeños (Chen y colaboradores, J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994)), oligocarbamatos (Cho, y colaboradores, Science 261:1303 (1993)) y/o fosfonatos de , peptidilo (Campbell y colaboradores, J. Org. Chem. 59:658 (1994)). Ver, generalmente, Gordon y colaboradores, J. Med. Chem. 37:1385 (1994), librerías de ácido nucleico (ver, por ejemplo, Stratagene, Corp.), librerías de ácido nucleico de péptidos (ver, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,539,083), librerías de anticuerpos (ver, por ejemplo, Vaughn y colaboradores, Nature Biotechnology 14 ( 3) : 309-314 (1996) y PCT/US96/10287 ) , librerías de carbohidratos (ver, por ejemplo, Liang y colaboradores, Science 274:1520-1522 (1996) y Patente Norteamericana No. 5,593,853), y librerías de molécula orgánica pequeña (ver, por ejemplo, benzodiazepinas, Baum, C&EN, 18 de enero, página 33(1993); isoprenoides, Patente Norteamericana No. 5,569,588; tiazolidinonas y metatiazanonas, Patente Norteamericana No. 5,549,974; pirrolidinas, Patentes Norteamericanas Nos. 5,525,735 y 5,519,134; compuestos de morfolino, Patente Norteamericana No. 5,506, 337; benzodiazepinas, Patente Norteamericana No. 5,288,514; y los similares). Los dispositivos para la preparación de librerías combinatorias son comercialmente disponibles (ver, por ejemplo, 357 NIPS, 390 NIPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY; Sy phony, Rainin, Woburn, MA; 433A, Applied Biosystems, Foster City, CA; 9050, Plus, Millipore, Bedford, NÍA) . Un número de sistemas robóticos bien conocidos también se han desarrollado para las químicas en fase de solución. Estos sistemas incluyen estaciones de trabajo automatizadas tal como el aparato de síntesis automatizado desarrollado por Takeda Chemical Industries, LTD. (Osaka, Japón) y muchos sistemas robóticos utilizando brazos robóticos (Zymate H, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass.; Orea, Hewlett-Packard, Palo Alto, California) , que imitan las operaciones sintéticas manuales realizadas por un químico. Cualquiera de los dispositivos anteriores son adecuados con el uso con la presente invención. La naturaleza y la implementación de modificaciones a estos dispositivos (si las hay) de modo que ellos puedan operar como es discutido en la presente serán evidentes para las personas expertas en la técnica relevante. Además, numerosas librerías combinatorias son por sí mismas comercialmente disponibles (ver, por ejemplo, ComGenex, Princeton, NJ; Asinex, Moscow, RU; Tripos, Inc., St . Louis, MO; ChemStar, Ltd, Moscow, RU; 3D Pharmaceuticals, Exton, PA; Martek Biosciences, Columbia, MD; etc.). Como se utiliza en la presente, el término "sustitución conservativa" se refiere a sustituciones de aminoácidos que son conocidas para aquellos expertos en la técnica y se puede hacer generalmente sin alterar la actividad biológica de la molécula resultante. Aquellos de habilidad en esta técnica reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos individuales en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (ver, por ejemplo, Watson y colaboradores, MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, The Benjamin/Cummings Pub. Co . , página 224 (4- Edición 1987)). Tales sustituciones ejemplares de preferencia se hacen de acuerdo con aquellas expuestas en las Tablas III (a-b) . Por ejemplo, tales cambios incluyen sustituir cualquier isoleucina (I), valina (V) y leucina (L) por cualquier otro de estos aminoácidos hidrofóbicos; ácido aspártico (D) para ácido glutámico (E) y viceversa; glutamina (Q) para asparagina (N) y viceversa; y serina (S) para treonina (T) y viceversa. Otras sustituciones también pueden ser consideradas conservativas, dependiendo del ambiente del aminoácido particular y su función en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, glicina (G) y alanina (A) frecuentemente pueden ser intercambiables, como puede la alanina (A) y valina (V) . La metionina (M) , que es relativamente hidrofóbica, frecuentemente puede ser intercambiada con leucina e isoleucina, y algunas veces con valina. Lisina (K) y arginina (R) son frecuentemente intercambiables en las ubicaciones en las cuales la característica significante de residuo de aminoácido es su carga y las diferentes pK' s de estos dos residuos de aminoácido no son significantes. Todavía otros cambios pueden ser considerados "conservativo" en ambientes particulares (ver, por ejemplo Tabla III (a) en la presente; páginas 13-15 "Biochemistry" 2- ED., Lubert Stryer ed (Stanford University) ; Henikoff y colaboradores, PNAS 1992 Volumen 89 10915-10919; Lei y colaboradores, J Biol Chem 19 de mayo de 1995; 270(20) : 11882-6) . Otras sustituciones también son permisibles y se pueden determinar empíricamente o de acuerdo con las sustituciones conservativas conocidas. El término "agente citotóxico" se refiere a una sustancia que inhibe o previene la actividad de expresión de las células, función de las células y/o causa destrucción de las células. El término se propone para incluir isótopos radiactivos, agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungal, de plantas o animales, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas. Ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, pero no están limitados a auristatinas, auristatina e, auromicinas, maitansinoides, itrio, bismuto, ricina, ricina A-cadena, combrestatina, duocarmicinas, dolostatinas, doxorubicina, daunorubicina, taxol, cisplatin, ccl065, bromuro de etidio, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colquicina, dihidroxi antracin diona, actinomicina, toxina de difteria, exotoxina de pseudomonas (PE)A, PE40, abrina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, retstrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, caliqueamicina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, y agentes glucocorticoides y otros agentes quimioterapéuticos, así como radioisótopos tales como At211', j lSl ^ j ias ^ ?90 ? ^186 ^ Re188 ^ Sm153 ^ B i212 Q 213 ^ p32 e i s ó t opo s radiactivos de Lu incluyendo Lu177. Los anticuerpos también pueden ser conjugados a una enzima de activación de pro-fármaco anti-cáncer capaz de convertir el pro-fármaco a su forma activa. Como se utiliza en la presente, el término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de enlace de antígeno, los fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH-VL) . Al utilizar un enlazador que es demasiado corto permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se hacen emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de enlace de antígeno. Los diacuerpos son descritos más completamente en, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90:6444-48 (1993). El "producto de gen" se utiliza en la presente para indicar un péptido/proteína o mRNA. Por ejemplo, un "producto de gene de la invención" es algunas veces referido en la presente como "secuencia de aminoácidos de cáncer", "proteína de cáncer", "proteína de un cáncer listado en la Tabla I", un "mRNA de cáncer", "mRNA de un cáncer listado en la Tabla I", etc. En una modalidad, la proteína de cáncer es codificada por un ácido nucleico de la Figura 1. La proteína de cáncer puede ser un fragmento, o alternativamente, ser la proteína de longitud completa codificada por los ácidos nucleicos de la Figura 1. En una modalidad, una secuencia de aminoácidos de cáncer se utiliza para determinar la identidad o similitud de secuencia. En otra modalidad, las secuencias son variantes alélicas que ocurren naturalmente de una proteína codificada por un ácido nucleico de la Figura 1. En otra modalidad, las secuencias son variantes de secuencia como es descrito adicionalmente en la presente. Anticuerpos "heteroconjugados" son útiles en los presentes métodos y composiciones. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo heteroconjugado" se refiere a dos anticuerpos covalentemente unidos. Tales anticuerpos pueden ser preparados utilizando métodos conocidos en la química de proteína sintética, incluyendo la utilización de agentes de reticulación. Ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,676,980. Los ensayos "de clasificación de alto rendimiento" para la presencia, ausencia, cuantificación u otras propiedades de ácidos nucleicos o productos de proteína particulares son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. De manera similar, los ensayos de enlace y los ensayos de gen reportador son similarmente bien conocidos. Así, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,559,410 divulga métodos de clasificación de alto rendimiento para proteínas; la Patente Norteamericana No. 5,585,639 divulga métodos de clasificación de alto rendimiento para el enlace de ácido nucleico (es decir, en arreglos) ; mientras que las Patentes Norteamericanas Nos. 5,576,220 y 5,541,061 divulgan métodos de alto rendimiento de clasificación para el enlace de ligando/anticuerpo. Además, los sistemas de clasificación de alto rendimiento son comercialmente disponibles (ver, por ejemplo, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ; Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precisión Systems, Inc., Natick, MA; etc.). Estos sistemas típicamente automatizan los procedimientos completos, incluyendo todo el pipeteo de la muestra y del reactivo, suministro de líquidos, incubaciones sincronizadas y lecturas finales de la microplaca en el detector (es) apropiado para el ensayo. Estos sistemas configurables proporcionan el arranque de alto rendimiento y rápido así como un alto grado de flexibilidad y actualización. Los fabricantes de tales sistemas proporcionan protocolos detallados para varios sistemas de alto rendimiento. Así, por ejemplo, Zymark Corp. proporciona boletines técnicos que describen los sistemas de clasificación para detectar la modulación de la transcripción de gen, enlace de ligando y los similares. El término "homologo" se refiere a una molécula que exhibe homología a otra molécula, por ejemplo, que tiene secuencias de residuos químicos que son los mismos o similares en posiciones correspondientes. En una modalidad, el anticuerpo proporcionado en la presente es un "anticuerpo humano". Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo en el cual esencialmente las secuencias completas de las secuencias de cadena ligera y cadena pesada, incluyendo las regiones de determinación complementarias (CDRs), son de genes humanos. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales humanos se preparan mediante la técnica de trioma, técnica de célula B humana (ver, por ejemplo, Kozbor y colaboradores, Immunol. Today 4:72 (1983), técnica de transformación de EBV (ver, por ejemplo, Colé y colaboradores, MONOCLONAL ANTIBODIES AND CÁNCER THERAPY 77-96 (1985)) o la utilización de la exhibición de fago (ver, por ejemplo, Marks y colaboradores, J. Mol. Biol. 222:581 (1991)). En una modalidad específica, el anticuerpo humano se genera en un ratón transgénico. Las técnicas para hacer tales anticuerpos parcial o completamente humanos son conocidas en la técnica y cualquiera de tales técnicas, pueden ser utilizadas. De acuerdo con una modalidad particularmente preferida, las secuencias de anticuerpo completamente humanas se hacen en un ratón transgénico diseñado para expresar genes de anticuerpo de cadena pesada y ligera humanos. Una descripción ejemplar de la preparación de ratones transgénicos que producen anticuerpos humanos se encuentran en la Solicitud No. WO 02/43478 y la Patente Norteamericana No. 6,657,103 (Abgenix) y su progenie. Las células B de ratones transgénicos que producen el anticuerpo deseado luego pueden ser fusionadas para hacer líneas de célula de hibridoma para la producción continua del anticuerpo. Ver, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; y 5,545,806; y Jakobovits, Adv. Drug Del. Rev. 31:33-42 (1998); Green, y colaboradores, J. Exp. Med. 188:483-95 (1998). "Antígeno de Leucocito Humano" o "HLA" es una proteína del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) de clase I o clase II humana (ver, por ejemplo, Stites y colaboradores, IMMUNOLOG?", Q- EDICIÓN, Lange Publishing, Los Altos, CA (1994) . Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo humanizado" se refiere a formas de anticuerpos que contienen secuencias de anticuerpo no humano (por ejemplo, murino) así como anticuerpos humanos. Tales anticuerpos son anticuerpos quiméricos que contienen la secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de por lo menos uno, y típicamente dos, dominios de variable, en los cuales todos los circuitos o sustancialmente todos los circuitos hipervariables corresponden aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Ver por ejemplo, Cabilly Patente Norteamericana No. 4,816,567; Queen y colaboradores, (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA 86:10029-10033; y ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH (Oxford University Press 1996) . Los términos "hibridar", "hibridación", "hibrida" y los similares, utilizados en el contexto de polinucleótidos, se proponen para referirse a condiciones de hibridación convencionales, de preferencia tal como la hibridación en formamida al 50%/6XSSC/SDS al 0.1%/100 µg/ml de ssDNA, en la cual las temperaturas para la hibridación son arriba de 37 grados centígrados y temperaturas para el lavado en 0.1XSSC/SDS al 0.1% están arriba de 55 grados centígrados. Las frases "aislado" o "biológicamente puro" se refieren al material que es sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan al material como se encuentra en su estado nativo. Así, los péptidos aislados de acuerdo con la invención de preferencia no contienen materiales normalmente asociados con los péptidos en su medio ambiente in si tu . Por ejemplo, un polinucleótido se dice que es "aislado" cuando éste es sustancialmente separado de polinucleótidos contaminantes que corresponden o son complementarios a genes diferentes a los genes PSCA o que codifican polipéptidos diferentes al producto de gen de PSCA o fragmentos del mismo. Una persona experta fácilmente puede emplear los procedimientos de aislamiento de ácido nucleico para obtener un polinucleótido PSCA aislado. Una proteína se dice que es "aislada," por ejemplo, cuando se emplean métodos físicos, mecánicos o químicos para remover las proteínas de PSCA de constituyentes celulares que están normalmente asociados con la proteína. Una persona experta fácilmente puede emplear los métodos de purificación estándares para obtener una proteína PSCA aislada. Alternativamente, una proteína aislada se puede preparar por medios químicos. Las "marcas adecuadas" incluyen radionúclidos, enzimas, substratos, cofactores, inhibidores, porciones fluorescentes, porciones quimioluminescentes, partículas magnéticas y los similares. Las patentes que enseñan el uso de tales marcas incluyen las Patentes Norteamericanas Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; y 4,366,241. Además, los anticuerpos proporcionados en la presente pueden ser útiles como el componente de enlace de antígeno de fluorocuerpos . Ver por ejemplo, Zeytun y colaboradores, Nat. Biotechnol. 21:1473-79 (2003) . El término "mamífero" se refiere a cualquier organismo clasificado como un mamífero, incluyendo ratones, ratas, conejos, perros, gatos, vacas, caballos y humanos. En una modalidad de la invención, el mamífero es un ratón. En otra modalidad de la invención, el mamífero es un humano. Los términos "cáncer de próstata metastático" y "enfermedad metastática" significan cánceres de próstata que se han difundido a los nodos de linfa regionales o a sitios distantes, y se proponen para incluir la enfermedad de etapa D del sistema de AUA y la etapa TxNxM+ bajo el sistema de TNM. Como es el caso con el cáncer próstata localmente avanzado, la cirugía es generalmente no indicada para pacientes con enfermedad metastática, y la terapia hormonal (ablación de andrógeno) es una modalidad de tratamiento preferida. Los pacientes con cáncer de próstata metastático eventualmente desarrollan un estado refractario de andrógeno dentro de 12 a 18 meses de iniciación del tratamiento. Aproximadamente la mitad de estos pacientes refractarios de andrógeno mueren dentro de 6 meses después de desarrollar ese estado. El sitio más común para la metástasis del cáncer de la próstata es el hueso. Las metástasis de hueso de cáncer de próstata son frecuentemente osteoblásticas antes que osteolíticas (es decir, resulta la formación de hueso puro) . Las metástasis del hueso se encuentran más frecuentemente en la médula espinal, seguido por el fémur, pelvis, caja toráxica, cráneo y húmero. Otros sitios comunes para la metástasis incluyen los nodos de linfa, pulmón, hígado y cerebro. El cáncer de próstata metastático es típicamente diagnosticado por la linfadenectomía pélvica abierta o laparoscópica, exploraciones de radionúclido de cuerpo completo, radiografía esquelética y/o biopsia de lesión del hueso. El término "modulador" o "compuesto de prueba" o "candidato de fármaco" o equivalentes gramaticales como se utiliza en la presente describen cualquier molécula, por ejemplo, proteína, oligopéptido, molécula orgánica pequeña, polisacárido, polinucleótido, etc., que son probados para la capacidad para directa o indirectamente alterar el fenotipo de cáncer o la expresión de una secuencia de cáncer, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico o de proteína o efectos de secuencias de cáncer (por ejemplo, señalización, expresión de gen, interacción de proteína, etc.) En un aspecto, un modulador neutralizará el efecto de una proteína de cáncer de la invención. Por "neutralizar" se propone que una actividad de una proteína es inhibida o bloqueada, junto con el efecto consecuente sobre la célula. En otro aspecto, un modulador neutralizará el efecto de un gen, y su proteína correspondiente, de la invención al normalizar los niveles de la proteína. En las modalidades preferidas, los moduladores alteran los perfiles de expresión, o los ácidos nucleicos o proteínas de perfil de expresión, proporcionados en la presente, o rutas efectoras corriente abajo. En una modalidad, el modulador suprime un fenotipo de cáncer, por ejemplo a una impresión de tejido normal. En otra modalidad, un modulador indujo un fenotipo de cáncer. Generalmente, una pluralidad de mezclas de ensayo es corrida en paralelo con diferentes concentraciones de agente para obtener una respuesta diferencial a las diversas concentraciones. Típicamente, una de estas concentraciones sirve como un control negativo, es decir, en concentración cero o por debajo del nivel de detección. Los moduladores, candidatos de fármaco o compuestos de prueba comprenden numerosas clases químicas, aunque típicamente son moléculas orgánicas, de preferencia compuestos orgánicos pequeños que tienen un peso molecular de más de 100 y menos de aproximadamente 2.500 Daltons. Las moléculas pequeñas preferidas son de menos de 2000, o menos de 1500 o menos de 1000 o menos de 500 D. Los agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente enlace de hidrógeno y típicamente incluyen por lo menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, de preferencia por lo menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos frecuentemente comprenden estructuras de carbono cíclicas o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los moduladores también comprenden biomoléculas tales como péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. Particularmente se prefieren los péptidos. Una clase de moduladores son péptidos, por ejemplo de aproximadamente cinco a aproximadamente 35 aminoácidos, con de aproximadamente cinco a aproximadamente 20 aminoácidos que son preferidos, y de aproximadamente 7 a aproximadamente 15 que son particularmente preferidos. De preferencia, la proteína moduladora de cáncer es soluble, e incluye una región de no transmembrana, y/o tiene un Cys N-terminal para ayudar en la solubilidad. En una modalidad, el C-terminal del fragmento se conserva como un ácido libre y el N-terminal es una amina libre para ayudar en el acoplamiento, es decir, la cisteína. En una modalidad, una proteína de cáncer de la invención es conjugada a un agente inmunogénico como se discutió en la presente. En una modalidad, la proteína de cáncer es conjugada a BSA. Los péptidos de la invención, por ejemplo, de longitudes preferidas, pueden ser enlazados entre sí u otros aminoácidos para crear un péptido/proteína más larga. Los péptidos moduladores pueden ser digestiones de proteínas que ocurren naturalmente como es resumido en lo anterior, péptidos aleatorios o "péptidos aleatorios" desviados. En una modalidad preferida, los moduladores basados en péptido/proteína son anticuerpos, y fragmentos de los mismos, como se definió en la presente. Los moduladores de cáncer también pueden ser ácidos nucleicos. Los agentes de modulación de ácido nucleico pueden ser ácidos nucleicos ocurren naturalmente, ácidos nucleicos aleatorios o ácidos nucleicos aleatorios "desviados". Por ejemplo, las digestiones de genomas procarióticos o eucarióticos se pueden utilizar en un procedimiento análogo aquel resumido anteriormente para proteínas. El término "anticuerpo monoclonal", como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las mutaciones que ocurren naturalmente posibles que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un solo epítope antigénico. En contraste, las preparaciones de anticuerpo (policlonal) convencionales típicamente incluyen una multitud de anticuerpos dirigidos contra (o específicos para) diferentes epítopos. En una modalidad, el anticuerpo policlonal contiene una pluralidad de anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de epítope, afinidades o avideces dentro de un solo antígeno que contiene múltiples epítopes antigénicos. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como es obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se va a considerar como que requiere la producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que son utilizados de acuerdo con la presente invención se pueden hacer por el método de hibridoma primero descrito por Kohier y colaboradores, Nature 256:495 (1975), o se puede hacer por métodos de DNA recombinantes (ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana Nos. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de librerías de anticuerpo de fago utilizando las técnicas descritas en Clackson y colaboradores, Nature 352:624-628 (1991) y Marks y colaboradores, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por ejemplo. Estos anticuerpos monoclonales usualmente enlazarán con por lo menos un Kd de aproximadamente 1 µM, más usualmente por lo menos aproximadamente 300 nM, típicamente por lo menos aproximadamente 30 nM, de preferencia por lo menos aproximadamente 10 nM, más de preferencia por lo menos aproximadamente 3 nM o mejor, usualmente determinado por ELISA. Una "porción", como en la porción biológica de una proteína relacionada con PSCA, se refiere a cualquier patrón de aminoácidos que forman parte de la secuencia primaria de una proteína, que está asociada con una función particular (por ejemplo interacción de proteína-proteína, interacción de proteína-DNA, etc.) o modificación (por ejemplo que es fosforilada, glicosilada o amidada) o localización (por ejemplo secuencia secretoria, secuencia de localización nuclear, etc.) o una secuencia que está correlacionada con ser inmunogénica, ya sea humoralmente o celularmente . Una porción puede estar ya sea contigua o capaz de ser alineada a ciertas posiciones que son generalmente correlacionadas con una cierta función o propiedad, en el contexto de porciones de HLA, "porción" se refiere al patrón de residuos en un péptido de longitud definida, usualmente un péptido de aproximadamente 8 a aproximadamente 13 aminoácidos para un porción de HLA de clase I y de aproximadamente 6 a aproximadamente 25 aminoácidos para una porción de HLA de clase II, que es reconocida por una molécula de HLA particular. Las porciones de péptido para el enlace de HLA son típicamente diferentes de cada proteína codificada por cada alelo de HLA humano y difieren en el patrón de los residuos de fijación primarios y secundarios. Las porciones que ocurren frecuentemente se exponen en la Tabla V. Un "excipiente farmacéutico" comprende un material tal como un adyuvante, un portador, agentes de ajustes y regulación del pH, agentes de ajuste de tonicidad, agentes humectantes, conservador y los similares. "Farmacéuticamente aceptable" se refiere a una composición no tóxica, inerte y/o que es fisiológicamente compatible con humanos u otros mamíferos. El término "polinucleótido" significa una forma polimérica de nucleótidos de por lo menos 10 bases o pares de bases en longitud, ya sea ribonucleótidos o deoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido y se propone para incluir formas de una sola y doble de hebra de DNA y/o RNA. En la técnica, este término frecuentemente se utiliza intercambiablemente con "oligonucleótidos". Un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos divulgada en la presente en donde timidina (T) , se muestra para el ejemplo en la Figura 1, también puede ser uracilo (U) ; esta definición pertenece a las diferencias entre las estructuras químicas de DNA y RNA, en particular la observación de que una de las cuatro bases mayores en RNA es uracilo (U) en lugar de timidina (T) . El término "polipéptido" significa un polímero de por lo menos aproximadamente 4, 5, 6, 7 o 8 aminoácidos. Por toda la especificación, se utilizan las designaciones estándares de tres letras o de una sola letra para aminoácido. En la técnica, este término es frecuentemente utilizado intercambiablemente con "péptido" o "proteína". Un "residuo de fijación primario" de HLA es un aminoácido en una posición específica junto a una secuencia de péptido que se entiende que proporciona un punto de contacto entre el péptido inmunogénico y la molécula de HLA. Uno a tres, usualmente dos, residuos de fijación primarios dentro de un péptido de longitud definida generalmente define una "porción" para un péptido inmunogénico. Estos residuos se entienden que se fijan en estrecho contacto con la ranura de enlace de péptido de una molécula de HLA, con sus cadenas laterales encajadas en cavidades específicas de la ranura de enlace. En una modalidad, por ejemplo, los residuos de fijación primarios para una molécula de clase I de HLA están localizados en la posición 2 (a partir de la posición de amino terminal) y en la posición de carboxilo terminal de un epítope de péptido de 8, 9, 10, 11 o 12 residuos de acuerdo con la invención. Alternativamente, en otra modalidad, los residuos de fijación primarios de un péptido enlaza a una molécula de clase II de HLA están espaciados con relación entre sí, antes que a las terminales de un péptido, donde el péptido es generalmente de por lo menos de 9 aminoácidos en longitud. Las posiciones de fijación primarias para cada porción y superporción se exponen en la Tabla IV (a). Por ejemplo, los péptidos análogos pueden ser creados al alterar la presencia o ausencia de residuos particulares en las posiciones de fijación primarias y/o secundarias mostradas en la Tabla IV. Tales análogos se utilizan para modular la afinidad de enlace y/o cobertura de población de un péptido que comprende una porción o superporción de HLA particular. "Radioisótopos" incluyen, pero no están limitados a los siguientes (usos ejemplares no limitativos también se exponen en la Tabla IV (I) ) . Por "aleatorizado" o equivalentes gramaticales como se aplica en la presente a ácidos nucleicos y proteínas se propone que cada ácido nucleico y péptido consiste de nucleótidos esencialmente aleatorios y aminoácidos, respectivamente. Estos péptidos aleatorios (o ácidos nucleicos, discutidos en la presente) pueden incorporar cualquier nucleótido o aminoácido en cualquier posición. El proceso sintético se puede diseñar para generar proteínas o ácidos nucleicos aleatorizados, para permitir la formación de todas o la mayor parte de las combinaciones posibles sobre la longitud de la secuencia, formando de esta manera una librería de agentes proteináceos bioactivos, candidatos aleatorizados . En una modalidad, una librería es "completamente aleatorizada" sin preferencias de secuencia o constantes en cualquier posición. En otra modalidad, la librería es una librería "aleatoria desviada". Esto es, algunas posiciones dentro de la secuencia ya sea que son mantenidas constantes o se seleccionan de un número limitado de posibilidades. Por ejemplo, los residuos de nucleótidos o aminoácidos se aleatorizan dentro de una clase definida, por ejemplo, de aminoácidos hidrofóbicos, residuos hidrofílicos, residuos esféricamente desviados (ya sea pequeños o grandes) , hacia la creación de dominios en enlace de ácido nucleico, la creación de cisteínas, para reticulación, prolinas para dominios SH-3, serinas, treoninas, tirosinas o histidinas para sitios de fosforilación, etc., o a purines, etc.

Una molécula de DNA o RNA "recombinante" es una molécula de DNA o RNA que se ha sometido a la manipulación molecular in vi tro . Como se utiliza en la presente, el término "Fv de cadena individual" o "scFv" o anticuerpo de "cadena individual" se refiere a fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena de polipéptido. Generalmente, el polipéptido Fv además comprende un enlazador de polipéptido entre los dominios VH y VL que permite que el sFv forme la estructura deseada para el enlace de antígeno. Para una revisión de sFv, ver Pluckthun, THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, volumen 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994) . Ejemplos no limitativos de "moléculas pequeñas" incluyen compuestos que enlazan o interactúan con PSCA, ligandos incluyendo hormonas, neuropéptidos, quimioquinas, odorantes, fosfolípidos y equivalentes funcionales de los mismos que enlazan y de preferencia inhiben la función de proteína PSCA. Tales moléculas pequeñas no limitativas de preferencia tienen un peso molecular de menos aproximadamente 10 kDa, más de preferencia por debajo de aproximadamente 9, aproximadamente 8, aproximadamente 7, aproximadamente 6, aproximadamente 5 o aproximadamente 4 kDa. En ciertas modalidades, las moléculas pequeñas físicamente se asocian con, o enlazan, la proteína PSCA; no se encuentran las rutas metabólicas que ocurren naturalmente; y/o son más solubles en soluciones acuosas que no acuosas. Como se utiliza en la presente, el término "específico" se refiere al enlace selectivo del anticuerpo al epítope de antígeno objetivo. Los anticuerpos pueden ser probados para la especificidad de enlace al comparar el enlace al antígeno apropiado al enlace al antígeno irrelevante o mezcla de antígenos bajo un conjunto de condiciones dado. Si el anticuerpo enlaza al antígeno apropiado por lo menos 2, 5, 7 y de preferencia 10 veces más que al antígeno irrelevante o mezcla de antígenos entonces se considera que es específico. En una modalidad, un anticuerpo específico es uno que solamente enlaza al antígeno PSCA, pero no enlaza al antígeno irrelevante. En otra modalidad, un anticuerpo específico es uno que enlaza al antígeno PSCA humano pero no enlaza a un antígeno PSCA. no humano con 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más grande homología de aminoácidos con el antígeno PSCA. En otra modalidad, un anticuerpo específico es uno que enlaza al antígeno PSCA humano y enlaza al antígeno PSCA murino, pero con un grado más alto de enlace al antígeno humano. En otra modalidad, un anticuerpo específico es uno que enlaza al antígeno PSCA humano y enlaza al antígeno PSCA de primate, pero con un grado más alto de enlace al antígeno humano. En otra modalidad, el anticuerpo específico enlaza al antígeno PSCA humano y cualquier antígeno PSCA no humano, pero con un grado más alto de enlace al antígeno humano o cualquier combinación de los mismos. La "severidad" de las reacciones de hibridación es fácilmente determinable por uno de habilidad ordinario en la técnica, y generalmente es un cálculo empírico dependiendo de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración de sal. En general, las sondas más grandes requieren temperaturas más altas para el recocido apropiado, mientras que sondas más cortas necesitan temperaturas inferiores. La hibridación generalmente depende de la habilidad de las secuencias de ácido nucleico desnaturalizadas para el recocimiento cuando las hebras complementarias están presentes en un ambiente por debajo de su temperatura de fusión. Entre más alto es el grado de homología deseado entre la sonda y la secuencia hibridable, más alta es la temperatura relativa que puede ser utilizada. Como resultado, esto sigue que las temperaturas relativas más altas tenderán a hacer las condiciones de reacción más severas, mientras que las temperaturas inferiores menos severas. Para detalles adicionales y explicación de la severidad de las reacciones de hibridación, Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

"Condiciones severas" o "condiciones de alta severidad", como define en la presente, son identificadas por, pero no limitadas a, aquellas que: (1) emplean intensidad iónica baja y alta temperatura para el lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0.015 M/citrato de sodio 0.0015 M/ dodecil sulfato de sodio al 0.1% en 50°C; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0.1%/Ficol al 0.1%/polivinilpirrolidona al 0.1%/solución reguladora de fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42°C; o (3) se emplean formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0.75 M, citrato de sodio 0.075 M) , fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio al 0.1%, 5 x solución de Denhardt, DNA de esperma de salmón sonicado (50 µg/ml), SDS al 0.1% y sulfato de dextrano al 10% a 42°C, con lavados a 42°C en 0.2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida al 50% a 55°C, seguido por un lavado de alta severidad que consiste de 0.1 x SSC que contiene EDTA a 55°C. "Condiciones moderadamente severas" se describen por, pero no se limitadas a, aquellas en Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de la solución de lavado y las condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, intensidad iónica y % de SDS) menos severas que aquellas descritas en lo anterior. Un ejemplo de condiciones moderadamente severas es la incubación durante la noche a 65 °C en una solución que comprende: albúmina de suero bovino al 1%, fosfato de sodio 0.5 M pH 7.5, EDTA al 1.25 mM y SDS al 7% 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM) , seguido por el lavado de los filtros en 2 x SSC/SDS al 1% a 50°C y 0.2 X SSC/SDS al 0.1% a 50°C. La persona experta reconocerá como ajustar la temperatura, la intensidad iónica, etc. como sea necesario para acomodar los factores tales como la longitud de sonda y los similares. Una "superporción" de HLA es una especificidad de enlace de péptido compartido por las moléculas de HLA codificadas por dos o más alelos de HLA. Las frecuencias fenotípicas totales de los supertipos de HLA en diferentes poblaciones étnicas se exponen en la Tabla IV (f ) . Los constituyentes no limitativos de varios supertipos son como sigue : A2: A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A*0205, A*0206, A*6802, A*6901, A*0207 A3: A3, All, A31, A*3301, A*6801, A*0301, A*1101, A*3101 B7: B7, B*3501-03, B*51, B*5301, B*5401, B*5501, B*5502, B*5601, B*6701, B*7801, B*0702, B*5101, B*5602 B44: B*3701, B*4402, B*4403, B*60 (B*4001), B61 (B*4006) Al: A*0102, A*2604, A*3601, A 301, A*8001 A24: A*2'4, A*30, A*2403, A*2404, A*3002, A*3003 B27: B*1401-02, B*1503, B*1509, B*1510, B*1518, B*3801-02, B*3901, B*3902, B*3903-04, B 801-02, B*7301, B*2701-08 B58: B*1516, B*1517, B*5701, B*5702, B58 B62: B*4601, B52, B*1501 (B62), B*1502 (B75), B*1513 (B77) La cobertura de población calculada dada por las combinaciones del supertipo de HLA diferentes se expone en la Tabla IV (g) . Como se utiliza en la presente "para tratar" o "terapéutico" y términos gramaticalmente relacionados, se refieren a cualquier mejora de cualquier consecuencia de enfermedad, tal como la supervivencia prolongada, menos morbidez y/o disminución de efectos secundarios que son los subproductos de una modalidad terapéutica alternativa; como es fácilmente apropiado en la técnica, la erradicación completa de la enfermedad es un punto preferido pero no un requerimiento para un acto de tratamiento. Un "animal transgénico" (por ejemplo, un ratón o rata) es un animal que tiene células que contiene un transgen, el transgen que se introdujo en el animal o uno ancestro del animal en una etapa prenatal, por ejemplo, una etapa embriónica. Un "transgen" es un DNA que está integrado en el genoma de una célula de la cual se desarrolla un animal transgénico. Como se utiliza en la presente, una "vacuna" de HLA o de respuesta inmune celular es una composición que contiene o codifica uno o más péptidos de la invención. Existen numerosas modalidades de tales vacunas, tal como un coctel de uno o más péptidos individuales; uno o más péptidos de la invención comprendida por un péptido poliepitópico; o ácidos nucleicos que codifican tales péptidos o polipéptidos individuales, por ejemplo, un minigen que codifica un péptido poliepitópico. El "uno o más péptidos" puede incluir cualquier número entero de unidad completa de 1-150 o más, por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, o 150 o más péptidos de la invención. Los péptidos o polipéptidos opcionalmente pueden ser modificados, tal como por lipidación, adición de la dirección u otras secuencias. Los péptidos de clase I de HLA de la invención se pueden mezclar con, o enlazar a, péptidos de clase II de HLA, para facilitar la activación de tanto los linfocitos T citotóxicos y los linfocitos T ayudantes. Las vacunas HLA también pueden comprender células que presentan antígeno pulsado de péptido, por ejemplo, células dendríticas. El término "variante" se refiere a una molécula que exhibe una variación de un tipo o norma descrito, tal como una proteína que tiene uno o más residuos de aminoácidos diferentes en la(s) posición (es) correspondiente de una proteína específicamente descrita (por ejemplo la proteína PSCA mostrada en la Figura 1) . Un análogo es un ejemplo de una proteína variante. Las isoformas de empalme y polimorfismos de nucleótidos individuales (SNPs) son ejemplos adicionales de variantes. Las "proteínas relacionadas con PSCA" de la invención incluyen aquellas específicamente identificadas en la presente, así como variantes alélicas, variantes de sustitución conservativa, análogos y homólogos que pueden ser aislados/generados y caracterizados sin experimentación indebida siguiendo los métodos resumidos en la presente o fácilmente disponibles en la técnica. Las proteínas de fusión que combinan partes de diferentes proteínas PSCA o fragmentos de las mismas, así como proteínas de fusión de una proteína PSCA y un polipéptido heterólogo, también son incluidos. Tales proteínas PSCA son colectivamente referidas como las proteínas relacionadas con PSCA, las proteínas de la invención o PSCA. El término "proteína relacionada con PSCA" se refiere a un fragmento de polipéptido o una secuencia de proteína PSCA de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, o más de 25 aminoácidos; o por lo menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 330, 335, 339 o más aminoácidos . II.) Polinucleótidos PSCA Un aspecto de la invención proporciona polinucleótidos correspondientes o complementarios a todo o parte de un gen PSCA, mRNA, y/o secuencia de codificación, de preferencia en forma aislada, incluyendo polinucleótidos que codifican una proteína relacionada con PSCA y fragmentos de la misma, DNA, RNA, híbrido de DNA/RNA y moléculas relacionadas, polinucleótidos u oligonucleótidos complementarios a un gen PSCA o secuencia de mRNA o una parte del mismo, y polinucleótidos u oligonucleótidos que hibridan un gen PSCA, mRNA o un polinucleótido que codifica PSCA (colectivamente, "polinucleótidos PSCA"). En todos los casos cuando son referidos en esta sección, T también puede ser U en la Figura 1. Las modalidades de un polinucleótido PSCA incluyen: un polinucleótido PSCA que tiene la secuencia mostrada en la Figura 1, la secuencia de nucleótido PSCA como se muestra en la Figura 1 en donde T es U; por lo menos 10 nucleótidos contiguos de un polinucleótido que tiene la secuencia como se muestran en la Figura 1; o, por lo menos 10 nucleótidos contiguos de un polinucleótido que tiene la secuencia como se muestra en la Figura 1 donde T es U. Los polinucleótidos que codifican porciones relativamente largas de una proteína PSCA también están dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 1 (o 20 o 30 o 40 etc.) aproximadamente el aminoácido 20, (o 30, o 40 o 50 etc.) de la proteína "o variante" PSCA mostrada en la Figura 1 o Figura 3 se pueden generar mediante una variedad de técnicas bien conocidas en el arte. Los fragmentos de polinucleótido pueden incluir cualquier porción de la secuencia de PSCA como se muestra en la Figura 1. II. A.) Usos de Polinucleótidos PSCA II. A.1. Monitoreo de Anormalidades Genéticas Los polinucleótidos de los párrafos precedentes tienen un número de diferentes usos específicos. El gen PSCA humano mapea a la localización cromosómica expuesta en el ejemplo intitulado "Mapeo Cromosómico de PSCA". Por ejemplo, debido a que el gen PSCA mapea a este cromosoma, los polinucleótidos que codifican diferentes regiones de las proteínas PSCA se utilizan para caracterizar anormalidades citogenéticas de esta localización cromosómica, tales como anormalidades que son identificadas por ser asociadas con varios cánceres. En ciertos genes, una variedad de anormalidades cromosómicas incluyendo rearreglos se han identificado como anormalidades citogenéticas frecuentes en un número de diferentes cánceres (ver por ejemplo, Krajinovic y colaboradores, Mutat. Res. 382 ( 3-4 ): 81-83 (1998); Johansson y colaboradores, Blood 86 ( 10) : 3905-3914 (1995) y Finger y colaboradores, P.N.A.S. 85 ( 23 ): 9158-9162 (1988)). Así, los polinucleótidos que codifican regiones específicas de las proteínas PSCA proporcionan nuevas herramientas que pueden ser utilizadas para delinear, con precisión más grande que lo posible previamente, las anormalidades citogenéticas en la región cromosómica que codifica PSCA que pueden contribuir al fenotipo maligno. En este contexto, estos polinucleótidos satisfacen una necesidad en la técnica para expandir la sensibilidad de clasificación cromosómica con el fin de identificar anormalidades cromosómicas más tenues y menos comunes (ver por ejemplo, Evans y colaboradores, Am. J. Obstet. Gynecol 171 (4 ): 1055-1057 (1994)). Además, como PSCA se mostró que es altamente expresado en la próstata y otros cánceres, los polinucleótidos PSCA se utilizan en métodos que estiman el estado de los productos de gen de PSCA en tejidos normales contra cancerosos. Típicamente, los polinucleótidos que codifican regiones específicas de las proteínas PSCA se utilizan para estimar la presencia de perturbaciones (tales como supresiones, inserciones, mutaciones puntuales o alteraciones que dan por resultado una pérdida de un antígeno etc.) en regiones específicas del gen PSCA, tales como regiones que contienen una o más porciones. Ensayos ejemplares incluyen tanto ensayos de RT-PCR así como el análisis de polimorfismo de conformación de una sola hebra (SSCP) (ver, por ejemplo, Marrogi y colaboradores, J. Cutan. Pathol. 26(8) :369-378 (1999), ambos de los cuales utilizan polinucleótidos que codifican regiones específicas de una proteína para examinar estas regiones dentro de la proteína. II. A.2. Modalidades Antisentido Otras modalidades relacionadas con los ácidos nucleicos específicamente contempladas de la invención divulgadas en la presente son el DNA genómico, cDNAS, ribozimas y moléculas antisentido, así como moléculas de ácido nucleico basadas en una cadena principal alternativa o que incluye bases alternativas, ya sea derivadas de fuentes naturales o sintetizadas, e incluye moléculas capaces de inhibir la expresión de RNA o de proteína de PSCA. Por ejemplo, las moléculas antisentido pueden ser RNAs u otras moléculas, incluyendo ácidos nucleicos de péptido (PNAs) o moléculas no de ácido nucleico tales como derivados de fosforotioato que específicamente enlazan al DNA o RNA de una manera dependiente del par de base. Una persona experta fácilmente puede obtener estas clases de moléculas de ' ácido nucleico utilizando los polinucleótidos PSCA y secuencias de polinucleótidos divulgadas en la presente. La tecnología antisentido comprende la administración de oligonucleótidos exógenos que enlazan a un polinucleótido objetivo localizado dentro de las células. El término "antisentido" se refiere al hecho de que tales oligonucleótidos son complementarios a sus objetivos intracelulares, por ejemplo, PSCA. Ver por ejemplo, Jack Cohén, Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, 1989; y Synthesis 1:1-5 (1988). Los oligonucleótidos antisentido PSCA de la presente invención incluyen derivados tales como S-oligonucleótidos (derivados de fosforotioato o S-oligos, ver, Gato Cohén, supra ) , que exhiben acción inhibitoria del crecimiento de célula de cáncer aumentada. Los S-oligos ( fosforotioatos de nucleósido) son análogos isoelectrónicos de un oligonucleótido (O-oligo) en el cual un átomo de oxígeno no encuentre del grupo fosfato es reemplazado por un átomo de azufre. Los S-oligos de la presente invención se pueden preparar mediante el tratamiento de los O-oligos correspondientes con 3H-1, 2-benzoditiol-3-ona-1, 1-dióxido, que es un reactivo de transferencia de azufre. Ver, por ejemplo, Iyer, R.P. y colaboradores, J. Org. Chem. 55:4693-4698 (1990); y Iyer, R.P. y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254 (1990). Los oligonucleótidos antisentido PSCA adicionales de la presente invención incluyen oligonucleótidos antisentido de morfolino conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Partridge y colaboradores, 1996, Antisense & Nucleic Acid Drug Development 6: 169-175) . Los oligonucleótidos antisentido PSCA de la presente invención típicamente pueden ser el RNA o DNA que es complementario a, y establemente híbrida con los primeros 100 codones 5' o los últimos codones 100 3' de una secuencia genómica de PSCA o el mRNA correspondiente. La complementariedad absoluta no es requerida, aunque se prefieren altos grados de complementariedad. El uso de un oligonucleótido complementario a esta región permite la hibridación selectiva al mRNA de PSCA y no al mRNA que especifica otras subunidades regulatorias de la proteína quinasa. En una modalidad, los oligonucleótidos antisentido PSCA de la presente invención son fragmentos de 15 a 30-mer de la molécula de DNA antisentido que tienen una secuencia que híbrida al mRNA de PSCA. Opcionalmente, el oligonucleótido antisentido de PSCA es un oligonucleótido de 30-mer que es complementario a una región en los primeros 10 codones 5' o los últimos 10 codones 3' de PSCA. Alternativamente, las moléculas antisentido son modificadas para emplear ribozimas en la inhibición de la expresión de PSCA, ver, por ejemplo, L. A. Couture & D. T. Stinchcomb; Trends Genet 12:510-515 (1996) . II. A.3. Cebadores y Pares de Cebadores Las modalidades específicas adicionales de estos nucleótidos de la invención incluyen cebadores y pares de cebadores, que permiten la amplificación específica de polinucleótidos de la invención de cualquiera de las partes específicas de los mismos, y sondas que selectivamente o específicamente hibridan o moléculas de ácido nucleico de la invención o cualquier parte de las mismas. Las sondas pueden ser marcadas con un marcador detectable, tal como, por ejemplo, un radioisótopo, compuesto fluorescente, compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, quelator de metal o enzima. Tales sondas y cebadores se utilizan para detectar la presencia de un polinucleótido PSCA en una muestra y como un medio para detectar una célula que expresa una proteína PSCA. Ejemplos de tales sondas incluyen polipéptidos que comprenden toda o parte de la secuencia de cDNA de PSCA humana mostrada en la Figura 1. Ejemplos de pares de cebadores capaces de amplificar específicamente los mRNAs de PSCA también se describen en los ejemplos. Como será entendido por la persona experta, un gran número de diferentes cebadores y sondas se pueden preparar basados en las secuencias proporcionadas en la presente y utilizadas efectivamente para amplificar y/o detectar un mRNA de PSCA. Los polinucleótidos PSCA de la invención son útiles para una variedad de propósitos, incluyendo pero no limitados a su uso como sondas y cebadores para la amplificación y/o detección del (os) gen (es) PSCA, mRNA(s) o fragmentos de los mismos; como reactivos para la diagnosis y/o prognosis del cáncer de próstata y otros cánceres; como secuencias de codificación capaces de dirigir la expresión de polipéptidos PSCA; como herramientas para modular o inhibir la expresión del (os) gen (es) PSCA y/o la traducción del (os) transcripto (s) de PSCA; y como agentes terapéuticos. La presente invención incluye el uso de cualquier sonda como es descrito en la presente para identificar y aislar un PSCA o secuencia de ácido nucleico relacionado con PSCA de una fuente que ocurre naturalmente, tales como humanos u otros mamíferos, así como la secuencia de ácido nucleico aislada per se, que comprendía toda o la mayoría de las secuencias encontradas en la sonda utilizada. II. A.4. Aislamiento de las Moléculas de Acido Nucleico que Codifican PSCA Las secuencias cDNA de PSCA descritas en la presente permiten el aislamiento de otros polinucleótidos que codifican el (os) producto (s) de gen PSCA, así como el aislamiento de polinucleótidos que codifican homólogos del producto de gen PSCA, isoformas alternativamente empalmadas, variantes alélicas y formas mutantes de un producto de gen PSCA así como polinucleótidos que codifican análogos de proteínas relacionadas con PSCA. Varios métodos de clonación molecular que pueden ser empleados para aislar cDNAs de longitud completa que codifican un gen PSCA son bien conocidos (ver, por ejemplo, Sambrook, J. y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2- edición, Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel y colaboradores, Eds., Wiley y Sons, 1995) . Por ejemplo, las metodologías de clonación de lambda fago se pueden emplear convenientemente, utilizando los sistemas de clonación comercialmente disponibles (por ejemplo, Lambda ZAP Express, Stratagene) . Los clones de fago que contiene los cDNAs del gen PSCA se pueden identificar al sondear con un cDNA de PSCA marcado o fragmento del mismo. Por ejemplo, en una modalidad, un cDNA de PSCA (por ejemplo, la Figura 1) o una porción del mismo se pueden sintetizar y utilizar como una sonda para recuperar cDNAs sobrepuestos y de longitud completa correspondientes a un gen PSCA. Un gen PSCA por sí mismo se puede aislar al clasificar las librerías de DNA genómico, las librerías de cromosoma artificial bacteriana (BACs), librerías de cromosoma artificial de levadura (YACs) y los similares, con sondas y cebadores de DNA de PSCA. II. A.5. Moléculas de Acido Nucleico Recombinantes y Sistemas de Hospedero-Vector La invención también proporciona moléculas de DNA o RNA recombinantes que contienen un polinucleótido PSCA, un fragmento, análogo o homólogo del mismo, incluyendo pero no limitado a fagos, plásmidos, fagémidos, cósmicos, YACs, BACs, así como varios vectores virales y no virales bien conocidos en la técnica, y células transformadas o transfectadas con tales moléculas de DNA o RNA recombinantes. Los métodos para generar tales moléculas son bien conocidos (ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, 1989, supra ) . La invención además proporciona un sistema de hospedero-vector que comprende una molécula de DNA recombinante que contiene un polinucleótido PSCA, fragmento, análogo u homólogo del mismo dentro de una célula hospedera procariótica o eucariótica adecuada. Ejemplos de células hospederas eucarióticas adecuadas incluyen una célula de levadura, una célula de planta o una célula de animal, tal como una célula de mamífero o célula de insecto (por ejemplo, una célula infectable de baculovirus tal como una célula Sf9 o HighFive) . Ejemplos de células mamíferas adecuadas incluyen varias líneas de células de cáncer de próstata tales como DU145 y TsuPrl, otras líneas de células de cáncer de próstata transfectables o transducibles, células primarias (PrEC), así como un número de células mamíferas rutinariamente utilizadas para la expresión de proteínas recombinantes (por ejemplo, células COS, CHO, 293, 293T) . Más particularmente, un polinucleótido que comprende la secuencia de codificación de PSCA o un fragmento, análogo u homólogo del mismo se puede utilizar para generar proteínas PSCA o fragmentos de las mismas utilizando cualquier número de sistemas de hospedero-vector rutinariamente utilizados y ampliamente conocidos en la técnica. Una amplia gama de sistemas de hospedero-vector adecuados para la expresión de proteínas PSCA o fragmentos de las mismas, están disponibles ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, 1989, supra ; Current Protocols in Molecular Biology, 199b, supra ) . Los vectores preferidos para la expresión mamífera incluyen pero no están limitados a pcDNA 3.1 myc-His-tag (Invitrogen) y el vector retroviral pSRDDtkneo (Muller y colaboradores, 1991, MCB 11:1785).

Utilizando estos vectores de expresión, PSCA puede ser •expresado en varias líneas de células de cáncer de próstata y no próstata, incluyendo por ejemplo 293, 293T, rat-1, NIH 3T3 y TsuPrl. Los sistemas de hospedero-vector de la invención son útiles para la producción de una proteína PSCA o fragmento de la misma. Tales sistemas de hospedero-vector se pueden emplear para estudiar las propiedades funcionales de PSCA y mutaciones o análogos de PSCA. La proteína PSCA humana recombinante o un análogo o homólogo o un fragmento de la misma se puede producir por las células mamíferas transfectadas con una construcción que codifica un nucleótido relacionado con PSCA. Por ejemplo, las células 293T se pueden transfectar con un plásmido de expresión que codifica PSCA o fragmento, análogo u homólogo del mismo, una proteína relacionada con PSCA es expresada en las células 293T y la proteína PSCA recombinante se aisla utilizando métodos de purificación estándares (por ejemplo, la purificación de afinidad utilizando anticuerpos anti-PSCA) . En otra modalidad, una secuencia de codificación de PSCA es subclonada en el vector retroviral pSRaMSVtkneo y utilizada para infectar varias líneas de células mamíferas, tales como NIH 3T3, TsuPrl, 293 y rat-1 con el fin de establecer las líneas de células que expresa PSCA. Otros diversos sistemas de expresión bien conocidos en la técnica también pueden ser empleados. Las construcciones de expresión que codifican un péptido guía unido en la estructura a una secuencia que codificación PSCA se puede utilizar para la generación de una forma secretada de proteína PSCA recombinante . Como se discutió en la presente, la redundancia en el código genético permite la variación en las secuencias de gen PSCA. En particular, es conocido en la técnica que las especies hospederas específicas frecuentemente tienen preferencias de codón específicas, y así se puede adaptar la secuencia divulgada como es preferido para un hospedero deseado. Por ejemplo, las secuencias de codón de análogo preferidas típicamente tienen codones raros (es decir, codones que tienen una frecuencia de utilización de menos de aproximadamente 20% en las secuencias conocidas del hospedero deseado) reemplazados con codones de frecuencia más alta. Las preferencias de codón para una especie específica se calculan, por ejemplo, al utilizar tablas de utilización de codón disponibles en la INTERNET tal como en URL dna . affrc . go . jp/-nakamura/codon. html . Las modificaciones de secuencia adicionales son conocidas que aumentan la expresión de proteína en un hospedero celular. Estos incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación espurias, señales de sitio de empalme de exón/intrón, repeticiones similares a transposon y/u otras secuencias bien caracterizadas que son perjudiciales para la expresión del gen. El contenido de GC de la secuencia se ajusta a niveles promedio para un hospedero celular dado, como es calculado por referencia a genes conocidos expresados en la célula hospedera. Donde es posible, la secuencia es modificada para evitar las estructuras de mRNA secundarias de horquilla predichas. Otras modificaciones útiles incluyen la adición de una secuencia de consenso de iniciación traduccional en el inicio de la estructura de lectura abierta, como es descrito en Kozak, Mol. Cell Biol., 9:5073-5080 (1989). Las personas expertas entienden que la regla general que' los ribosomas eucarióticos inician la traducción exclusivamente en el codón AUG 5' próximo es anulado solamente por las condiciones raras (ver, por ejemplo, Kozak PNAS 92 ( 7 ): 2662-2666, (1995) y Kozak NAR 15(20) :8125-8148 (1987)). III.) Proteínas relacionadas con PSCA Otro aspecto de la presente invención proporciona proteínas relacionadas con PSCA. Modalidades específicas de proteínas PSCA comprenden un polipéptido que tiene todo o parte de la secuencia de aminoácidos de PSCA humano como se muestra en la ' Figura 1, de preferencia la Figura IA. Alternativamente, las modalidades de las proteínas PSCA comprenden polipéptidos variantes, homólogos o análogos que tienen alteraciones en la secuencia de aminoácidos de PSCA mostrada en la Figura 1. Las modalidades de un polipéptido PSCA incluyen: un polipéptido PSCA que tiene una secuencia mostrada en la Figura 1, una secuencia de péptido de un PSCA como se muestra en la Figura 1 en donde T es U; por lo menos 10 nucleótidos contiguos de un polipéptido que tiene la secuencia como se muestra en la Figura 1; o, por lo menos 10 péptidos contiguos de un polipéptido que tiene la secuencia como se muestra en la Figura 1 donde T es U . Las abreviaciones de aminoácidos se proporcionan en la Tabla II. Las sustituciones de aminoácido conservativas frecuentemente se pueden hacer en una proteína sin alterar ya sea la conformación o la función de la proteína. Las proteínas de la invención pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 sustituciones conservativas. Las modalidades de la invención divulgadas en la presente incluyen una variedad de variantes o análogos de proteínas PSCA aceptados en la técnica tales como polipéptidos que tienen inserciones de aminoácido, supresiones y sustituciones. Las variantes de PSCA se pueden hacer útiles a métodos conocidos en la técnica tal como mutagénesis dirigida al sitio, exploración de alanina y mutagénesis de PCR. La mutagénesis dirigida al sitio (Cárter y colaboradores, Nucí. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller y colaboradores, Nucí. Acids Res., 10:6487 (1987)), mutagénesis de cásete (Wells y colaboradores, Gene, 34:315 (1985)), la mutagénesis de selección restricción (Wells y colaboradores, Philos. Trans. R. Soc. Londres SerA, 317:415 (1986)) u otras técnicas conocidas se pueden realizar en el DNA clonado para producir el DNA de variante de PSCA. El análisis de aminoácido de exploración también se puede emplear para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua que está involucrada en una actividad biológica específica tal como una interacción de proteína-proteína. Entre los aminoácidos de exploración preferidos están los aminoácidos neutros, relativamente pequeños. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido de exploración preferido entre este grupo debido a que este elimina la cadena lateral más allá del beta-carbono y es menos probable que altere la conformación de cadena principal de la variante. La alanina también es típicamente preferida debido a que es el aminoácido más común. Además, éste frecuentemente se encuentra en las posiciones tanto ocultas como expuestas (Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman & Co., N. Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)). Sí la sustitución de alanina no produce cantidades adecuadas de variante, se puede utilizar un aminoácido isostérico. Como se define en la presente, las variantes de PSCA, análogos u homólogos, tienen el atributo distintivo de tener por lo menos un epítope que es "reactivo cruzadamente" con una proteína de PSCA que tiene una secuencia de aminoácido de la Figura 1. Como se utiliza en esta oración, "reactivo cruzadamente" significa que un anticuerpo o célula T que específicamente enlaza a una variante de PSCA también específicamente enlaza a una proteína PSCA que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 1. Un polipéptido deja de ser una variante de una proteína mostrada en la Figura 1, cuando no contiene por más tiempo cualquier epítope capaz de ser reconocido por un anticuerpo o célula T que específicamente enlaza a la proteína PSCA de partida. Aquellos expertos en la técnica entienden que los anticuerpos que reconocen proteínas enlazan a epítopes de tamaño variable, y un agrupamiento en el orden de aproximadamente cuatro o cinco aminoácidos, contiguo o no contiguo, se considera como un número típico de aminoácidos en un epítope mínimo. Ver, por ejemplo, Nair y colaboradores, J. Immunol 2000 165(12): 6949-6955; Hebbes y colaboradores, Mol Immunol (1989) 26 ( 9) : 865-73; Schwartz y colaboradores, J Immunol (1985) 135(4) :2598-608. Otras clases de variantes de proteína relacionada con PSCA comparten 70%, 75%, 80%, 85% o 90% o más similitud con una secuencia de aminoácidos de la Figura 1, o un fragmento de la misma. Otra clase específica de variantes o análogos de proteína PSCA comprenden una o más de las porciones biológicas PSCA descritas en la presente o actualmente conocidas en la técnica. Así, comprendidos por la presente invención están análogos de fragmentos PSCA (nucleico o aminoácido) que han alterado las propiedades funcionales (por ejemplo, inmunogénicas) con relación al fragmento de partida. Se va a preciar que las porciones ahora o que llegan a ser parte de la técnica van a ser aplicadas a las secuencias nucleicas o de aminoácidos de la Figura 1. Como se discute en la presente, las modalidades de la invención reclamadas incluyen polipéptidos que contienen menor que la secuencia de aminoácidos completa de una proteína PSCA mostrada en la Figura 1. Por ejemplo, las modalidades representativas de la invención comprenden péptidos/proteínas que tiene cualquiera de 4 , 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más aminoácidos contiguos de una proteína PSCA mostrada en la Figura 1. Las proteínas relacionadas con PSCA se generan utilizando la tecnología de síntesis de péptido estándar o utilizando métodos de segmentación química bien conocidos en al técnica. Alternativamente, los métodos recombinantes se pueden utilizar para generar moléculas de ácido nucleico que codifica una proteína relacionada con PSCA. En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico proporcionan un medio para generar fragmentos definidos de una proteína PSCA (o variantes, homólogos o análogos de los mismos) . III. A.) Modalidades de Proteína que llevan Porción Las modalidades ilustrativas adicionales de la invención, divulgadas en la presente incluyen polipéptidos PSCA que comprenden los residuos de aminoácidos de una o más de las porciones biológicas contenidas dentro de una secuencia de polipéptido PSCA expuesta en la Figura 1. Varias porciones son conocidas en la técnica, y una proteína puede ser evaluada para la presencia de tales porciones por un número de sitios de la Internet públicamente disponibles (ver, por ejemplo, direcciones URL: pfam. wustl . edu/; searchlauncher . bcm. tmc. edu/seq-search/struc-predict . html; psort . ims . u-tokyo. ac.jp/; cbs .dtu.dk/; ebi . ac. uk/interpro/sean. html; expasy . ch/tools/scnpsitl .html; Epimatrix™ y Epimer™, Brown Universidad, brown. edu/Research/TB-HIV Lab/epimatrix/epimatrix. html; y BIMAS, bimas . dcrt . nih . gov/ . ) . Las subsecuencias que llevan porción de todas las proteínas variantes de PSCA se exponen y se identifican en las Tablas V-XVIII y XXII-LI. La Tabla IV (h) expone varias porciones frecuentemente ocurrentes basadas en búsquedas pfam (ver la dirección URL pfam. wustl.edu/) . Las columnas de la Tabla IV (h) lista (1), la abreviación del nombre de la porción, (2) el por ciento de identidad encontrada entre los diferentes miembros de la familia de porciones, (3) el nombre o descripción de la porción y (4) la función más común; la información de localización está incluida sí la porción es relevante para la localización. Los polipéptidos que comprenden una o más de las porciones PSCA discutidas en lo anterior son útiles para poner en claro las características específicas de un fenotipo maligno en la vista de la observación que las porciones PSCA discutidas en lo anterior están asociadas con la desregulación del crecimiento y debido a que el PSCA es sobreexpresado en ciertos cánceres (ver, por ejemplo, la Tabla I) . La caseína quinasa II, cAMP y la proteína quinasa dependiente de camp, y proteína quinasa C, por ejemplo, son enzimas conocidas que están asociadas con el desarrollo del fenotipo maligno (ver por ejemplo, Chen y colaboradores, Lab Invest., 78 (2) : 165-174 (1998); Gaiddon y colaboradores, Endocrinology 136 ( 10) : 331-4338 (1995); Hall y colaboradores, Nucleic Acids Research 24 ( 6) : 1119-1126 (1996); Peterziel y colaboradores, Oncogene 18 ( 46) : 6322-6329 (1999) y O'Brian, Oncol. Rep. 5(2): 305-309 (1998)). Además, tanto la glicosilación como la miristoilación son modificaciones de proteína también asociadas con el cáncer y la progresión del cáncer (ver por ejemplo, Dennis y colaboradores, Biochem. Biophys. Acta 1473 (1) : 21-34 (1999); Raju y colaboradores, Exp. Cell Res. 235 (1) : 145-154 (1997)). La amidación es otra modificación de la proteína también asociada con el cáncer y la progresión del cáncer (ver por ejemplo, Treston y colaboradores, J. Nati. Cáncer Inst. Monogr. (13):169-175 (1992) ) . En otra modalidad, las proteínas de la invención comprenden uno o más de los epítopes inmunorreactivos identificados de acuerdo con los métodos aceptados en la técnica, tal como los péptidos expuestos en las Tablas V-XVIII y XXII-LI. Los epítopes CTL se pueden determinar utilizando algoritmos específicos para identificar péptidos dentro de una proteína PSCA que son capaces de enlazar óptimamente a alelos de HLA especificados (por ejemplo, Tabla IV; Epi •matri'xTM y Epi•merTM, Brown Uni•versi•dad, URL brown . edu/Research/TB-HIV Lab/epimatrix/epimatrix. html; y BIMAS, URL bimas . dcrt . nih . gov/ . ) . Además, los procesos para identificar péptidos que tienen suficiente afinidad de enlace para las moléculas HLA y que están correlacionados con ser epítopes inmunogénicos, son bien conocidos en la técnica, y son llevados a cabo sin experimentación indebida. Además, los procesos para identificar péptidos que son epítopes inmunogénicos, son bien conocidos en la técnica y se llevan a cabo sin experimentación indebida ya sea in vi tro o in vivo . También conocidos en la técnica están los principios para crear análogos de tales epítopes con el fin de modular la inmunogenicidad. Por ejemplo, se comienza con un epítope que lleva una porción CTL o HTL (ver, por ejemplo, las porciones/superporciones de clase I de HLA y clase II de HLA de la Tabla IV) . El epítope es análogo al sustituir un aminoácido en una de las posiciones especificadas y al reemplazarlo con otro aminoácido especificado en esa posición. Por ejemplo, en la base de los residuos definidos en la Tabla IV, se puede sustituir un residuo perjudicial en favor de cualquier otro residuo, tal como un residuo preferido; sustituir un residuo menos preferido con un residuo preferido; o sustituir un residuo preferido que ocurre originalmente con otro residuo preferido. Las sustituciones pueden ocurrir en las posiciones de fijación primarias o en otras posiciones en un péptido; ver, por ejemplo, la Tabla IV.

Una variedad de referencias reflejan la técnica que consideran la identificación y generación de epítopes en una proteína de interés así como análogos de la misma. Ver, por ejemplo, WO 97/33602 por Chesnut y colaboradores,; Sette, Immunogenetics 1999 50 ( 3-4 ): 201-212 ; Sette y colaboradores, J. Immunol. 2001 166 (2 ): 1389-1397 ; Sidney y colaboradores, Hum. Immunol . 1997 58(1): 12-20; Kondo y colaboradores, Immunogenetics 1997 45 ( ) : 249-258 ; Sidney y colaboradores, J. Immunol. 1996 157 (8 ): 3480-90 ; y Falk y colaboradores, Nature 351:290-6 (1991); Hunt y colaboradores, Science 255:1261-3 (1992); Parker y colaboradores, J. Immunol . 149:3580-7 (1992); Parker y colaboradores, J. Immunol. 152:163-75 (1994)); Kast y colaboradores, 1994 152 (8 ): 3904-12 ; Borras-Cuesta y colaboradores, Hum. Immunol. 2000 61 (3) : 266-278 ; Alexander y colaboradores, J. Immunol. 2000 164(3); 164 (3) : 1625-1633; Alexander y colaboradores, PMID: 7895164, Ul: 95202582; O' Sullivan y colaboradores, J. Immunol. 1991 147 (8) :2663-2669; Alexander y colaboradores, Immunity 1994 1(9):751-761 y Alexander y colaboradores, Immunol . Res. 1998 18 (2) :79-92. Modalidades relacionadas de la invención incluyen polipéptidos que comprenden combinaciones de las diferentes porciones expuestas en la(s) Tabla(s) IV(a), IV(b), IV(c), IV (d) y IV (h) y/o, uno o más de los epítopes de CTL predichos de las Tablas V-XVIII y XXII-LI, y/o uno o más de los epítopes de HTL predichos de las Tablas XLVIII-LI, y/o una o más de las porciones que enlazan célula T conocidas en la técnica. Las modalidades preferidas no contienen inserciones, supresiones o sustituciones ya sea dentro de las porciones o dentro de las secuencias de intervención de los polipéptidos. Además, las modalidades que incluyen un número de residuos de aminoácidos ya sea N-terminales y/o C-terminales en cualquiera de estas porciones pueden ser deseables (para, por ejemplo, incluir una porción más grande de la arquitectura de polipéptido en el cual está localizado la porción) . Típicamente, el número de residuos de aminoácidos N-terminales y/o C-terminales en cualquier lado de una porción está entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 residuos de aminoácido, de preferencia 5 a aproximadamente 50 residuos de aminoácido. Las proteínas relacionadas con PSCA están englobadas en muchas formas, de preferencia en forma aislada. Una molécula de proteína PSCA purificada estará sustancialmente libre de otras proteínas o moléculas que imparten el enlace del PSCA al anticuerpo, célula T u otro ligando. La naturaleza y el grado de aislamiento y purificación dependerán del uso propuesto. Las modalidades de una proteína relacionada con PSCA incluyen las proteínas relacionada con PSCA purificadas y funcionales, proteínas relacionadas con PSCA solubles. En una modalidad, una proteína PSCA soluble, funcional o fragmento de la misma retiene la habilidad para ser enlazada por el anticuerpo, célula T u otro ligando. La invención también proporciona proteínas PSCA que comprenden fragmentos biológicamente activos de una secuencia de aminoácidos PSCA mostrada en la Figura 1. Tales proteínas exhiben propiedades de la proteína PSCA de partida, tal como la habilidad para inducir la generación de anticuerpos que específicamente enlazan a un epítope asociado con la proteína PSCA de partida; que es enlazado por tales anticuerpos; para inducir la activación de HTL o CTL; y/o, para ser reconocido por HTL o CTL que también específicamente enlaza la proteína de partida. Los polipéptidos relacionados con PSCA que contienen estructuras particularmente interesantes pueden ser predichos y/o identificados utilizando varias técnicas analíticas bien conocidas en el arte, incluyendo, por ejemplo, los métodos de análisis Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf analysis, o basado en la inmunogenicidad. Los fragmentos que contienen tales estructuras son particularmente útiles en generar anticuerpos anti-PSCA específicos de subunidad o células T o en identificar factores celulares que enlazan a PSCA. Por ejemplo, los perfiles de hidrofilicidad pueden ser generados y los fragmentos de péptido inmunogénicos identificados, utilizado el método de Hopp, T.P. y Woods, K.R., 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 78:3824-3828. Los perfiles de hidropaticidad pueden ser generados, y los fragmentos de péptido inmunogénicos identificados, utilizando el método de Kyte, J. y Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-132. El por ciento (%) de perfiles de Residuos Accesibles puede ser generado, y los fragmentos de péptidos inmunogénicos identificados, utilizando el método de Janin J. , 1979, Nature 277:491-492. Los perfiles de flexibilidad promedio se pueden generar y los fragmentos de péptidos inmunogénicos identificados, utilizando el método de Bhaskaran R. , Ponnuswamy P.K., 1988, Int, J. Pept. Protein Res. 32:242-255. Los perfiles de beta-vuelta pueden ser generados, y los fragmentos de péptido inmunogénicos identificados, utilizando el método de Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294. Los epítopes de CTL pueden ser determinados utilizando algoritmos específicos para identificar péptidos dentro de una proteína PSCA que son capaces de enlazar óptimamente a alelos de HLA especificados (por ej emplo, al utilizar el sitio SYFPEITHI en la Red Mundial URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com; los listados en la Tabla IV (A)- , , , TM ' • (E) ; Epimatrix y Epimer , Brouwn University, URL (brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix. html) ; y BIMAS, URL bimas.dcrt.gov/). Ilustrando esto, los epítopes de péptidos de PSCA que se presentan en el contexto de las moléculas de Clase I de MHC humanas, por ejemplo HLA-A1, A2, A3, All, A24, B7 y B35 fueron predichos (ver, por ejemplo las Tablas V-XVIII, XXII-LI). Específicamente, la secuencia de aminoácidos completa de la proteína PSCA y las porciones relevantes de otras variantes, es decir, para 9 residuos flanqueantes de predicciones de Clase I de HLA en cualquier lado de una mutación puntual o unión de exón y para los 14 residuos flanqueantes de predicciones de la Clase II de HLA en cualquier lado de una mutación puntual o unión de exón correspondiente a esa variante, se introdujeron en el algoritmo de Búsqueda de Porción de Péptido de HLA encontrado en el sitio de la red de Bioinformatics and Molecular Analysis Section (BIMAS) listada en lo anterior; además del sitio SYFPEITHI, en URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/. El algoritmo de búsqueda de porción de péptido de HLA fue desarrollado por el Dr. Ken Parker basado en el enlace de las secuencias de péptido especificas en la hendidura de las moléculas de Clase I HLA, en particular HLA-A2 (ver, por ejemplo Falk y colaboradores, Nature 351:290-6(1991); Hunt y colaboradores, Science 255:1261-3 (1992); Parker y colaboradores, J. Immunol . 149:3580-7(1992); Parker y colaboradores, J. Immunol. 152:163-75(1994). Este algoritmo permite la localización y clasificación de péptidos de 8-mer, 9-mer y 10-mer de una secuencia de proteína completa para el enlace predicho a HLA-A2 así como otras numerosas moléculas de Clase I de HLA. Muchos péptidos de enlace de Clase I de HLA son 8-, 9-, 10 u 11-mer. Por ejemplo, para HLA-A2,de Clase I, los epítopes de preferencia contienen una leucina (L) o metionina (M) en la posición 2 y una valina (V) o leucina (L) en el C-terminal (ver, por ejemplo Parker y colaboradores, J. Immunol. 149:3580-7(1992)). Los resultados seleccionados de los péptidos de enlace predicho de PSCA se muestran en las Tablas V-XVIII y XXII-LI en la presente. En las Tablas V-XVIII y XXII-XLVIII, los candidatos seleccionados, 9-mers y 10-mers, para cada miembro de familia se muestran junto con su localización, la secuencia de aminoácidos de cada péptido específico, y un registro de enlace estimado. En las Tablas XLVIII-LI, los candidatos seccionados 15-mers, para cada miembro de familia se muestran junto con su localización, la secuencia de aminoácidos de cada péptido específico y un registro de enlace estimado. El registro de enlace corresponde al tiempo medio estimado de disociación de los complejos que contienen el péptido a 37°C en pH 6.5. Los péptidos con el registro de enlace más alto se predicen que son los más herméticamente enlazados a la Clase I de HLA sobre la superficie de la célula para el período más grande de tiempo y así representan los mejores objetivos inmunogénicos para el reconocimiento de célula T.

El enlace actual de los péptidos a un alelo HLA se puede evaluar mediante la estabilización de la expresión de HLA sobre la línea de células defectuosas de procesamiento de antígeno T2 (ver, por ejemplo, Xue y colaboradores, Prostate 30:73-8 (1997) y Peshwa y colaboradores, Prostate 36:129-38 (1998)). La inmunogenicidad de péptidos específicos se puede evaluar in vi tro mediante la estimulación de los linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) en la presencia de células que presentan antígeno tales como células dendríticas. Se va a apreciar que cada epítope predicho por el sitio BIMAS, los sitios Epimer™ Y Epimatriz™, o especificados por las porciones de Clase I o Clase II de HLA disponibles en la técnica o que llegan a ser parte de la técnica tales como se exponen en la Tabla IV (o determinado utilizando el sitio de la Red Mundial URL syfpeithi . bmi-heidelberg.com/, o BIMAS, bimas.dcrt.nih.gov/) van a ser "aplicados" a una proteína PSCA de acuerdo con la invención. Como se utiliza en este contexto "aplicado" significa que una proteína PSCA es evaluada, por ejemplo, visualmente o mediante métodos de búsqueda de patrones basados en computadora, como es apreciado por aquellos de habilidad en la técnica relevante. Cada subsecuencia de una proteína PSCA de 8, 9, 10 u 11 residuos de aminoácidos que lleva una porción de Clase I de HLA, o una subsecuencia de 9 o más residuos de aminoácidos que llevan una porción de Clase II de HLA están dentro del alcance de la invención. III. B.) Expresión de proteínas relacionadas con PSCA En una modalidad descrita en los ejemplos que siguen, PSCA puede ser convenientemente expresado en células (tales como células 293T) transfectadas con un vector de expresión comercialmente disponible tal como un vector de expresión inducido con CMV que codifica PSCA c'on un 6XHis C-terminal y el fragmento MYC (pcDNA3.1/mycHIS, Invitrogen o Tag5, GenHunter Corporation, Nashville TN) . El vector Tag5 proporciona una señal de secreción IgGK que puede ser utilizada para facilitar la producción de una proteína PSCA secretada en células transfectadas. El PSCA marcado con HIS secretado en el medio de cultivo puede ser purificado, por ejemplo, utilizando una columna de níquel usando técnicas estándares. III. C.) Modificaciones de proteínas relacionadas con PSCA Las modificaciones de las proteínas relacionadas con PSCA tales como modificaciones covalentes son incluidas dentro del alcance de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar los residuos de aminoácidos dirigidos de un polipéptido PSCA con un agente de derivación orgánico que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas de los residuos N- o C-terminales de una proteína PSCA. Otro tipo de modificación covalente de un polipéptido PSCA incluido dentro del alcance de esta invención comprende alterar el patrón de glicosilación nativo de una proteína de la invención. Otro tipo de modificación covalente de PSCA comprende enlazar un polipéptido PSCA a uno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo polietilenglicol (PEG) poliprolilenglicol o polioxialquilenos, en la manera expuesta en las patentes norteamericanas Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 o 4,179,337. Las proteínas relacionadas con PSCA de la presente mención también pueden ser modificadas para formar una molécula quimérica que comprende PSCA fusionada a otra, polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácidos. Tal molécula quimérica puede ser sintetizada químicamente o recombinantemente. Una molécula quimérica puede tener una proteína de la invención fusionada a otro antígeno asociado con tumor o fragmento del mismo. Alternativamente, una proteína de acuerdo con la invención puede comprender una fusión de fragmentos de una secuencia de PSCA (amino o ácidos nucleicos) tal que una molécula se crea que es no, a través de su longitud, directamente homologa a las secuencias de amino o de ácido nucleico mostradas en la Figura 1. Tal molécula quimérica pueden comprender múltiples de la misma subsecuencia de PSCA. Una molécula quimérica puede comprender una fusión de una proteína relacionada con PSCA con un fragmento de epítope de polihistidina, que proporciona un epítope al cual el níquel inmovilizado puede enlazar selectivamente, con citoquinas o con factores de crecimiento. El fragmento de epítope generalmente se coloca en el amino- o carboxilo-terminal de una proteína PSCA. En una modalidad alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión de una proteína relacionada con PSCA con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también referida como una "inmunoadhesma") , tal fusión podría ser a la región Fe de una molécula IgG. Las fusiones Ig de preferencia incluyen la sustitución de una forma soluble (suprimida de dominio de transmembrana o inactivado) de un polipéptido PSCA en lugar de por lo menos una región variable dentro de una molécula Ig. En una modalidad preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye la articulación, CH2 CH3, o la articulación, regiones CH1, CH2 Y CH3 de la molécula IgGI . Para la producción de fusiones de mmunoglobulina ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,428,130 expedida el 27 de junio de 1995. III. D.) Usos de proteínas relacionadas con PSCA Las proteínas de la invención tienen un número de diferentes usos específicos. Como PSCA es altamente expresado en próstata y otros cánceres, las proteínas relacionadas con PSCA se utilizan en métodos que estiman el estado de los productos de gen PSCA en tejidos normales contra cancerosos, para de esta manera poner en claro el fenotipo maligno. Típicamente, los polipéptidos de regiones especificas de una proteína PSCA se utilizan para estimar la presencia de perturbaciones (tales como supresiones, inserciones, mutaciones puntuales etc.) en esas regiones (tales como regiones que contienen una o mas porciones) . Los ensayos ejemplares utilizan anticuerpos o células T que dirigen las proteínas relacionadas con PSCA que comprenden los residuos de aminoácido de una o más de las porciones biológicas contenidas dentro de una secuencia de polipéptido PSCA con el fin de evaluar las características de esta región en tejidos normales contra cancerosos o para inducir una respuesta inmune al epítope. Alternativamente, las proteínas relacionadas con PSCA que contienen los residuos de aminoácidos tiene uno o más de las porciones biológicas en una proteína PSCA se utilizan para clasificar factores que interactúan con esa región de PSCA. Los fragmentos/subsecuencias de proteína PSCA son particularmente útiles en generar en caracterizar anticuerpos específicos de dominio (por ejemplo, anticuerpos que reconocen un epítope extracelular u intracelular de una proteína PSCA) para identificar agentes o factores celulares que enlazan a PSCA o un dominio estructural particular del mismo, en varios contextos terapéuticos y de diagnóstico, incluyendo pero no limitados a ensayos de diagnóstico, vacunas para el cáncer y métodos para preparar tales vacunas. Las proteínas codificadas por los genes PSCA, o por análogos u homólogos o fragmentos de las mismas, tienen una variedad de usos, incluyendo pero no limitados a generar anticuerpos y en métodos para identificar ligandos y otros agentes y constituyentes celulares que enlazan a un producto de gen PSCA. Los anticuerpos resaltados contra una proteína PSCA o fragmentos de la misma son útiles en ensayos de diagnóstico y de pronóstico y metodologías de formación de imagen en el manejo de cánceres humanos caracterizados por la expresión de la proteína PSCA, tale como aquellos listados en la Tabla I. Tales anticuerpos pueden ser expresados intracelularmente y utilizados en métodos para tratar pacientes con tales cánceres. Los ácidos nucleicos son proteínas relacionadas con PSCA también se utilizan en generar respuestas de HTL o CTL. Varios ensayos inmunológicos útiles para la detención de proteínas PSCA son utilizados, incluyendo pero no limitados a varios tipos de radioinmunoensayos, ensayos inmunosorbentes enlazados a enzima (ELISA) , ensayos inmunofluorescentes enlazados a enzimas (ELIFA) , métodos inmunocitoquímicos y los similares. Los anticuerpos pueden ser marcados y utilizados como reactivos de formación de imagen inmunológicos capaces de detectar las células que expresan PSCA (por ejemplo en métodos de formación de imagen radioscintigráficos) . Las proteínas PSCA también son particularmente útiles en generar vacunas para el cáncer, como es descrito adicionalmente en la presente. IV.) Anticuerpos PSCA Otro aspecto de la invención proporciona anticuerpos que enlazan a proteínas relacionadas con PSCA. Los anticuerpos preferidos específicamente enlazan a una proteína relacionada con PSCA y no enlazan (o enlazan débilmente) a péptidos o proteínas que no son proteínas relacionadas con PSCA bajo condiciones fisiológicas. En este contexto, ejemplos de condiciones fisiológicas incluyen: 1) solución salina regulada de fosfato; 2) solución salina Tris-regulada que contiene Tris 25 mM y NaCl 150 mM; o solución salina normal (NaCl al 0.9%); 4) suero de animal tal como suero humano; o 5) una combinación de cualquiera de 1) hasta 4); estas reacciones que de preferencia toman lugar a pH 7.5, alternativamente en un intervalo de pH 7.0 a 8.0 o alternativamente en un intervalo de pH de 6.5 a 8.5; también, estas reacciones que toman lugar a una temperatura entre 4°C a 37 °C. Por ejemplo, los anticuerpos que enlazan PSCA pueden enlazar proteínas relacionadas con PSCA tales como homólogos o análogos de las mismas. Los anticuerpos PSCA de la invención son particularmente útiles en el cáncer (ver, por ejemplo, Tabla I) ensayos de diagnostico y de pronostico y metodologías de formación de imagen. De manera similar, tales anticuerpos son útiles en el tratamiento, diagnosis y/o prognosis de próstata y otros cánceres, al grado del PSCA que también es expresado o sobreexpresado en estos otros cánceres. Además, los anticuerpos intracelularmente expresados (por ejemplo anticuerpos de cadena individual) son terapéuticamente útiles en tratar cánceres en los cuales está involucrada la expresión de PSCA, tales como los cánceres de próstata avanzados o metastáticos u otros cánceres avanzados o metastáticos . La invención también proporciona varios ensayos inmunológicos útiles para la detención y cuantificación de PSCA y proteínas relacionadas con PSCA mutantes. Tales ensayos pueden comprender uno o más anticuerpos PSCA capaces de reconocer y enlazar una proteína relacionada con PSCA, como sea apropiado. Estos ensayos se realizan dentro de varios formatos de ensayo inmunológicos bien conocidos en la técnica, incluyendo pero no limitados a varios tipos de radioinmunoensayos, ensayos inmunosorbentes enlazados a enzimas (ELISA) , ensayos inmunofluorecentes enlazados a enzimas (ELIFA) y los similares. Los ensayos no de anticuerpo inmunológicos de la invención también comprende ensayos de inmunogenicidad de células T (inhibitorios o estimulatorios) así como ensayos de enlace del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC). Además, los métodos de formación de imagen inmunológicos capaces de detectar el cáncer de próstata y otros cánceres que expresan PSCA también se proporcionan por la invención, incluyendo pero no limitados a los métodos de formación de imagen radioscintigráficos utilizando anticuerpos PSCA marcados. Tales ensayos son clínicamente útiles en la detección, monitoreo y prognosis de cánceres que expresan PSCA tales como el cáncer de próstata. Los anticuerpos PSCA también se utilizan en métodos para purificar una proteína relacionada con PSCA y para aislar homólogos de PSCA y moléculas relacionadas. Por ejemplo, un método para purificar una proteína relacionada con PSCA comprende incubar un anticuerpo PSCA, que se ha acoplado a una matriz sólida, con un lisado u otra solución que contiene una proteína relacionada con PSCA bajo condiciones que permiten que el anticuerpo PSCA enlace a la proteína relacionada con PSCA; lavar la matriz sólida para eliminar las impurezas y eluir la proteína relacionada con PSCA del anticuerpo acoplado. Otros usos de anticuerpos PSCA de acuerdo con la invención incluyen la generación de anticuerpos anti-idiotípicos que imitan una proteína de PSCA. Varios métodos para la preparación de anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden preparar al inmunizar un hospedero mamífero adecuado utilizando una proteína relacionada con PSCA, péptido o fragmento, en forma aislada o inmunoconjugada (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Eds., Harlow, and Lañe (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Además, las proteínas de fusión de PSCA también pueden ser utilizadas, tal como la proteína de fusión PSCA GST. En una modalidad particular, una proteína de fusión GST que comprende toda o la mayor parte de la secuencia de aminoácidos de la Figura 1 se produce, luego se utiliza como inmunógeno para generar anticuerpos apropiados. En otra modalidad, una proteína relacionada con PSCA se sintetiza y se utiliza como un inmunógeno. Además, las técnicas de inmunización de DNA desnudo conocidas en el arte se utilizan (con o sin proteína relacionada con PSCA purificada o celdas que expresan PSCA) para generar una respuesta inmune al inmunógeno codificado (para revisión, ver Donnelly y colaboradores, 1997. Ann. Rev. Immunol. 15:61-648) . La secuencia de aminoácidos de una proteína PSCA como se muestra en la Figura 1 se puede analizar para seleccionar regiones especificas de la proteína PSCA para generar anticuerpos. Por ejemplo, los análisis de hidrofobicidad e hidrofilicidad de una secuencia de aminoácidos de PSCA se utilizan para identificar regiones hidrofílicas en la estructura PSCA. Regiones de una proteína PSCA que muestra estructura inmunogénica, así como otras regiones y dominios, fácilmente se pueden identificar utilizando otros diversos métodos conocidos en la técnica, tales como el análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf . Los perfiles de hidrofilicidad pueden ser generados utilizando el método de Hopp, T.P. y Woods, K.R., 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 78:3824-3828. Los perfiles de hidropaticidad se pueden generar utilizando el método de Kyte, J. y Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-132. El por ciento (%) de perfiles de Residuos Accesibles se pueden generar utilizando el método de Janin J. , 1979, Nature 277:491-492. Los perfiles de flexibilidad promedio se pueden generar utilizando el método de Bhaskaran R., Ponnuswamy P.K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255. Los perfiles de beta-vuelta se pueden generar utilizando el método de Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294. Así, cada región identificada por cualquiera de estos programas o métodos está dentro del alcance de la presente invención. Los métodos preferidos para la generación de anticuerpos PSCA se ilustran adicionalmente por medio de los ejemplos proporcionados en la presente. Los métodos para preparar una proteína o polipéptido para el uso como un inmunógeno son bien conocidos en la técnica. También bien conocido en la técnica están los métodos para preparar conjugados inmunogénicos de una proteina con un portador, tal como BSA, KLH u otra proteína portadora. En algunas circunstancias, la conjugación directa utilizando, por ejemplo, reactivos de carbodiimida es utilizada; en otros casos los reactivos de enlace tales como aquellos suministrados por Pierce Chemical Co . , Rockford. IL, son efectivos. La administración de un inmunógeno de PSCA frecuentemente se conduce mediante la inyección durante un período de tiempo adecuado y con el uso de un adyuvante adecuado como es entendido en la técnica. Durante el programa de inmunización, los títulos de anticuerpos pueden ser tomados para determinar la precisión de la formación de anticuerpos . Los anticuerpos monoclonales PSCA se pueden producir por varios medios conocidos en la técnica. Por ejemplo, las líneas de células inmortalizadas que secretan un anticuerpo monoclonal deseado se preparan utilizando la tecnología de hibridoma estándar de Kohier y Milstein o modificaciones que inmortalizan células B que producen anticuerpo, como es generalmente conocido. Las líneas de células inmortalizadas que secretan los anticuerpos deseados se clasifican por inmunoensayo en el cual el antígeno es una proteína relacionada con PSCA. Cuando el cultivo de células inmortalizada apropiado es identificado, las células pueden ser expandidas y los anticuerpos producidos ya sea de cultivos m vi tro o de fluido de ascitis.

Los anticuerpos o fragmentos de la invención también se peden producir, por medios recombinantes. Las regiones que enlazan específicamente a las regiones deseadas de una proteína PSCA también se pueden producir en el contexto de la región quimérica o que determina la complementariedad (CDR) de los anticuerpos injertados de origen de múltiples especies. Los anticuerpos PSCA humanizados o humanos también pueden ser producidos, y se prefieren para el uso en contextos terapéuticos. Los métodos para humanizar anticuerpos de murino y otros anticuerpos no de humano, al sustituir uno o más de los CDRs de anticuerpo no de humano para la secuencias de anticuerpo humano correspondientes, son bien conocidos (ver por ejemplo Jones y colaboradores, 1986, Nature 321:522-525; Riechmann y colaboradores, 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen y colaboradores, 1988, Science 239: 1534-1536). Ver también Cárter y colaboradores, 1993, Proc. Nati. Acad. Sci USA 89: 4285 y Sims y colaboradores, 1993, J. Immunol: 151:2296. Los métodos para producir anticuerpos monoclonales completamente humanos incluyen los métodos de exhibición de fago y transgénicos (para revisión, ver Vaughan y colaboradores, 1998, Nature Biotechnology 16:535-539). Los anticuerpos monoclonales PSCA completamente humanos se pueden generar utilizando tecnologías de clonación que emplean librerías combinatorias de gen Ig humanos grande (es decir, exhibición de fago) (Griffiths y Hoogenboom, Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries. En: Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic y Therapeutic Applications in Man, Clark, M. (Ed.), Nottingham Academia, páginas 45-64 (1993); Burton y Barbas, Human Antibodies from combinatorial libraries. Id., páginas 65-82). Los anticuerpos monoclonales PSCA completamente humanos también se pueden preparar utilizando ratones transgénicos diseñados para contener los sitios del gen de inmunoglobulina humana como es descrita en la solicitud de patente de PCT W098/24893, Kucherlapati y Jakobovits y colaboradores, publicada el 3 de Diciembre de 1997 (ver también, Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7 (4) : 607-614; patentes norteamericanas 6,162,963 expedida el 19 de Diciembre del 2000; 6,150,584 expedida el 12 de Noviembre del 2000 y 6,114,598 expedida el 5 de Septiembre del 2000) . Este método evita la manipulación in vi tro requerida con la tecnología de exhibición de fago y eficientemente produce anticuerpos humanos auténticos de alta afinidad. La reactividad de los anticuerpos PSCA con una proteína relacionada con PSCA se puede establecer mediante un número de medios bien conocidos, incluyendo el manchado de Western, inmunoprecipitación, ELISA y los análisis FACS utilizando, como sea apropiado, las proteínas relacionadas con PSCA, células que expresan PSCA o extracto de las mismas. Un anticuerpo PSCA o fragmento del mismo puede ser marcado con un marcador detectable o conjugado a una segunda molécula. Los marcadores detectables adecuados incluyen, pero no están limitados a, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelator de metal o una enzima. Además, los anticuerpos bi-específicos, específicos para dos o más epítopes PSCA se generan utilizando métodos generalmente conocidos en la técnica. Los anticuerpos homodiméricos también se pueden generar mediante técnicas de reticulación conocidas en el arte (por ejemplo, Wolf y colaboradores, Cáncer Res. 53:2560-2565). En una modalidad, la invención proporciona anticuerpos monoclonales identificados como Hal-1.16, Hal-5.99, Hal-4.117, Hal-4.20, Hal-4.121, Hal-4.37 que fueron enviados (por la vía Federal Exprés) a la Recolección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 el 4 de Mayo del 2005 y asignados con 'los números de acceso PTA-6698 y PTA-6703 y PTA-6699 y PTA-6700 y PTA-6701 y PTA-6702 respectivamente. V.) Respuestas Inmunes Celulares de' PSCA El mecanismo mediante el cual las células T reconocen los antígenos ha sido delineado. Las composiciones de vacuna de epítope de péptido eficaces de la invención inducen respuestas inmunes terapéuticas o profilácticas en segmentos muy amplios de la población mundial. Para un entendimiento del valor y la eficacia de las composiciones de la invención que induce respuestas inmunes celulares, se proporciona una breve revisión de la tecnología relacionada con inmunología. Un complejo de una molécula HLA y un antígeno peptídico actúa como ligando reconocido por las células T restringidas de HLA (Buus, S. y colaboradores, Cell 47:1071, 1986; Babbitt, B.P. y colaboradores, Nature 317:359,1985; Townsend, A. y Bodmer, H., Annu. Rev. Immunol. 7:601, 1989; Germain, R. N., Annu. Rev. Immunol . 11:403, 1993). A través del estudio de los análogos de antígeno sustituidos con aminoácido individual y la secuenciación de los péptidos naturalmente procesados, endógenamente enlazados, los residuos críticos que corresponden a las porciones requeridas para el enlace específico a las moléculas de antígeno de HLA se han identificado y se exponen en la Tabla IV (ver que también, por ejemplo Southwood, y colaboradores, J Immunol. 160:3363, 1998; Ra mensee, y colaboradores, Immunogenetics 41:178, 1995., Rammensee y colaboradores, SYFPEITHI, vía de acceso de World Web en URL (134.2.96.221/scripts.hlaserver.dll/home. htm) ; Sette, A. and Sydney, J. Curr. Opin. Immunol. 10:478, 1998; Engelhard, V. H., Curr. Opin. Immunol . 6:13, 1994; Sette, A. y Grey, H. M., Curr. Opin. Immunol. 4:79, 1992; Sinigaglia, F. y Hammer, J. Curr. Biol. 6:52, 1994; Ruppert y colaboradores, Cell 74:929-937, 1993; Kondo y colaboradores, J. Immunol . 155:4307-4312, 1995; Sydney y colaboradores, J. Im unol. 157:3480-3490, 1996; Sydney y colaboradores, Human Immunol. 45:79-93, 1996; Sette, A. y Sydney, J. Immunogenetics Noviembres de 1999; 50 (3-4) :201-12, Review). Además, los análisis cristalográficos de rayos x de los complejos de HLA-péptido han revelado cavidades dentro de la segmentación/hendidura de enlace de péptidos de las moléculas de HLA que acomodan de un modo específico al alelo, residuos portados por ligando de péptido; estos residuos a su vez determinan la capacidad de enlace de HLA de los péptidos en los cuales están presentes (ver, por ejemplo Madden, D. R. Annu. Rev. Immunol. 13:587, 1995; Smith y colaboradores, Immunity 4:203, 1996; Fremont y colaboradores, Immunity 8:305, 1998; Stern y colaboradores, Structure 2:245, 1994; Jones, E.Y. Curr. Opin. Immunol. 9:75, 1997; Brown, J. H. y colaboradores, Nature 364:33; 1993; Guo, H.C. y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90:8052, 1993; Guo, H. C. y colaboradores, 360:364, 1992; Silver, M.L. y colaboradores, Nature 360:367, 1992; Matsumura, M. y colaboradores, Science 257:927, 1992; Madden y colaboradores, Cell 70:1035,1992; Fremont, D. H. y colaboradores, Science 257:919, 1992; Saper, M. A., Bjorkman, P. J. Y Wiley, D.C., J. Mol. Biol. 219:277, 1991). Por consiguiente, la definición de las porciones de enlace de HLA específicas de alelo de Clase I y Clase II o superporciones de Clase I Clase II permite la identificación de regiones dentro de una proteína que están correlacionadas con el enlace a antígeno (s) de HLA particulares. Así, mediante un proceso de identificación de porción de HLA, se han identificado candidatos para vacunas basadas en epítope; tales candidatos pueden ser además evaluados mediante los ensayos de enlace de HLA-péptido para determinar la afinidad de enlace y/o el período de tiempo de asociación del epítope y su molécula de HLA correspondiente.

El trabajo confirmatorio adicional puede ser realizado para seleccionar, entre estos candidatos de vacuna, epítopes con características preferidas en términos de la cobertura de población y/o inmunogenicidad. Varias estrategias pueden ser utilizadas para evaluar la inmunogenicidad celular, incluyendo: 1) Evaluación de los cultivos de células T primarios de individuos normales (ver, por ejemplo Wentworth, P. A. y colaboradores, Mol. Immunol . 32:693, 1995; E. y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 91:2105, 1994; Tsai, V. y colaboradores, J. Immunol. 158:1796, 1997; Kawashima, I y colaboradores, Human Immunol . 59:1, 1998). Este procedimiento involucra en la estimulación de linfocitos de sangre periférica (PBL) de sujetos normales con un péptido de prueba en la presencia células que presentan antígeno in vi tro durante un período de varias semanas. Las células T específicas para el péptido llegan hacer activadas durante este tiempo son detectadas utilizando, por ejemplo, un ensayo de liberación de linfocina o 51Cr que involucra células objetivo sensibilizadas de péptido. 2) La inmunización de ratones transgénicos HLA (ver por ej empl o Wentworth, P. A. y colaboradores J. Immunol . 26:97, 1996; Wentworth, P. A. y colaboradores, Int. Immunol . 8:651, 1996; Alexander, J. y colaboradores, J. Immunol. 159:4753, 1997). Por ejemplo, en tales métodos los péptidos en el adyuvante de Freund incompleto se administran subcutáneamente a los ratones transgénicos de HLA. Varias semanas después de la inmunización, los esplenocitos son removidos y cultivados in vi tro en la presencia del péptido de prueba por aproximadamente una semana. Las células T específicas de péptido son detectadas utilizando, por ejemplo, el ensayo de liberación de 51Cr que involucra las células objetivo sensibilizadas de péptido y las células objetivo que expresan antígeno endógenamente generado. 3) La demostración de respuestas de célula T de recordación de individuos inmunes quienes han sido ya sea efectivamente vacunados y/o de pacientes crónicamente enfermos (ver, por ejemplo Rehermann, B. y colaboradores, j.

Exp. ed. 181:1047, 1995, Doolan, D. L. y colaboradores., Immunity 7:97, 1997; Bertoni, R. y colaboradores, J. Clin. Invest. 100:503, 1997; Threlkeld, S. C. y colaboradores, J. Immunol. 159:1648, 1997; Diepolder, H. M. y colaboradores, J. Virol. 71:6011, 1997). Por consiguiente, las respuestas de recordación son detectadas al cultivar PBL de sujetos que sean expuesto al antígeno debido a la enfermedad y así han generado una respuesta inmune "naturalmente" o de pacientes quienes se vacunaron contra el antígeno. El PBL de sujetos son cultivados in vi tro durante 1-2 semanas en la presencia del péptido de prueba más las células que presentan antígeno (APC) para permitir la activación de las células T de "memoria", como es comparado con las células T "naive". Al final del periodo de cultivo, la actividad de la célula T es detectada utilizando ensayos que incluyen la liberación de 51Cr que involucra objetivos sensibilizados de péptido, proliferación de célula T o liberación de linfocina. VI.) Animales Transgénicos de PSCA Los ácidos nucleicos que codifican una proteína relacionada con PSCA también pueden ser utilizados para generar ya sea animales transgénicos o animales "inactivados" que, a su vez son útiles en el desarrollo y clasificación de reactivos terapéuticamente útiles. De acuerdo con técnicas establecidas, el cDNA que codifica PSCA puede ser utilizado para clonar el DNA genómico que codifica PSCA. Las secuencias genómicas clonadas luego pueden ser utilizadas para generar animales transgénicos que contiene células que expresan DNA que codifica PSCA.' Los métodos para generar animales transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas, han llegado a ser convencionales en la técnica y son descritos, por ejemplo, en las patentes norteamericanas Nos. 4,736,866 expedida el 12 de Abril de 1988, y 4,870,009 expedida el 26 de Septiembre de 1989. Típicamente, células particulares serían dirigidas para la incorporación de transgen PSCA con aumentadores específicos de tejido. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgen que codifica PSCA pueden ser utilizados para examinar el efecto de la expresión incrementada de DNA que codifica a PSCA. Tales animales pueden ser utilizados como animales probadores para reactivos aunque confieren protección de, por ejemplo, condiciones patológicas asociadas con su sobreexpresión. De acuerdo con este aspecto de la invención, un animal se trata con un reactivo y una incidencia reducida de una condición patológica, comparada con animales no tratados que llevan el transgen indicaría una intervención terapéutica potencial para la condición patológica . Alternativamente, homólogos no humanos de PSCA pueden ser utilizados para construir un animal "inactivado" de PSCA que tiene un gen defectuoso alterado que codifica PSCA como un resultado de la recombinación homologa entre gen endógeno que codifica PSCA y el DNA genómico alterado que codifica PSCA introducido en una célula embriónica del animal. Por ejemplo, cDNA que codifica PSCA puede ser utilizado para clonar DNA genómico que codifica PSCA de acuerdo con técnicas establecidas. Una porción de DNA genómico que codifica PSCA puede ser suprimido o remplazado con otro gen, tal como un gen que codifica un marcador seleccionable que puede ser utilizado para monitorear la integración. Típicamente varios kilobases de DNA flanqueante no alterado (ambos en los extremos 5' y 3' ) son incluidos en el vector (ver, por ejemplo Thomas y Capecchi, Cell, .51:503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homólogos) . El vector se introduce en una línea de células madre embriónica (por ejemplo mediante electroporación) y las células en las cuales el DNA introducido se ha recombinado homólogamente con el DNA endógeno son seleccionadas (ver, por ejemplo Li y colaboradores, Cell, 69:915 (1992)). Las células seleccionadas luego se inyectan en un blastocisto de un animal (por ejemplo un ratón o rata) para formar quimeras de agregación (ver por ejemplo Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), páginas. 113-152). Un embrión quimérico luego puede ser implantado en un animal adoptivo hembra seudopreñada adecuado y el embrión llevado al término para crear un animal "inactivado". La progenie que alberga el DNA homólogamente recombinante en sus células terminales puede ser identificada mediante técnicas estándares y utilizada para reproducir animales en el cual todas las células del animal contienen el DNA homólogamente recombinado. Los animales inactivados pueden ser caracterizados, por ejemplo, por su habilidad para defenderse contra ciertas condiciones patológicas o para su desarrollo de condiciones patológicas debido a la ausencia de un polipéptido PSCA. VII.) Métodos para la Detección de PSCA Otro aspecto de la presente invención se relaciona a métodos para detectar polinucleótidos PSCA y proteínas relacionadas con PSCA, así como métodos para identificar una célula que expresa PSCA. El perfil de expresión de PSCA lo hace un marcador de diagnóstico para la enfermedad metastasizada . Por consiguiente, el estado de los productos de gen de PSCA proporciona información útil para predecir una variedad de factores incluyendo la susceptibilidad a la enfermedad de etapa avanzada, la velocidad de la progresión y/o agresividad del tumor. Como se discutió en detalle en la presente, el estado de los productos de gen de PSCA en muestras de pacientes se puede analizar mediante una variedad de protocolos que son bien conocidos en la técnica incluyendo el análisis inmunohistoquímico, la variedad de técnicas de manchado de Northern incluyendo la hibridación in si tu , análisis de RT-PCR (por ejemplo en las muestras micro-disectadas de captura de láser) , análisis de manchado de Western y el análisis de arreglo de tejido. Más particularmente, la invención proporciona ensayos para la detección de polinucleótidos PSCA en una muestra biológica tal como suero, hueso, próstata y otros tejidos, orina, semen, preparaciones de células y los similares. Los polinucleótidos PSCA detectables incluyen, por ejemplo, un gen PSCA o fragmento del mismo, mRNA de PSCA, mRNAs de PSCA de variante de empalme alternativo, y moléculas de DNA o RNA recombinantes que contienen un polinucleótido PSCA. Un número de métodos para amplificar y/o detectar la presencia de polinucleótidos PSCA son bien conocidos en la técnica y se pueden emplear en la práctica de este aspecto de la invención. En una modalidad, un método para detectar mRNA de PSCA en una nuestra biológica comprende producir cDNA de la muestra mediante la trascripción inversa utilizando por lo menos un cebador; la amplificación del cDNA así producido utilizando polinucleótidos PSCA como cebadores de sentido y antisentido para amplificar cDNAs de PSCA en el mismo; y detectar la presencia del cDNA de PSCA amplificado. Opcionalmente, la secuencia del cDNA de PSCA amplificado puede ser determinada.

En otra modalidad, un método para detectar un gen PSCA en una muestra biológica comprende primero aislar el DNA genómico de la muestra; amplificar el DNA genómico aislado utilizando polinucleótidos PSCA como cebadores de sentido y antisentido; y detectar la presencia del gen PSCA amplificado. Cualquier número de combinaciones de sonda de sentido y antisentido pueden ser diseñados a partir de una secuencia de nucleótidos de PSCA (ver, por ejemplo la Figura 1) y utilizada para este propósito. La invención también proporciona ensayos para detectar la presencia de una proteína PSCA en un tejido u otra muestra biológica tal como suero, semen, hueso, próstata, orina, preparaciones de células y los similares. Los métodos para detectar una proteína relacionada con PSCA también son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, inmunoprecipitación, análisis inmunohistoquímico, análisis de manchado de Western, ensayos de enlace molecular, ELISA, ELIFA y los similares. Por ejemplo, un método para detectar la presencia de una proteína relacionada con PSCA en una muestra biológica comprende primero poner en contacto la muestra con un anticuerpo PSCA, un fragmento reactivo con PSCA del mismo o una proteína recombinante que contiene una región de enlace de antígeno de un anticuerpo PSCA; y luego detectar el enlace de la proteína relacionada con PSCA en la muestra.

Los métodos para identificar una célula que expresa PSCA también están dentro del alcance de la invención. En una modalidad, un ensayo para identificar una célula que expresa un gen PSCA comprende detectar la presencia de mRNA de PSCA en la célula. Los métodos para la detección de mRNA particulares en células son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, los ensayos de hibridación utilizando sondas de DNA complementarias (tal como la hibridación in si tu utilizando ribosondas de PSCA marcadas, manchado de Northern y técnicas relacionadas) y varios ensayos de amplificación de ácido nucleico (tales como RT-PCR utilizando cebadores complementarios específicos para PSCA y otros métodos de detección de tipo de amplificación, tales como, por ejemplo, DNA ramificado, SISBA, TMA y los similares) . Alternativamente, un ensayo para identificar una célula que expresa un gen PSCA comprende detectar la presencia de la proteína relacionada con PSCA en la célula o secretada por la célula. Varios métodos para la detección de proteínas son bien conocidos en la técnica y son empleados para la detección de proteínas relacionadas con PSCA y células que expresan proteínas relacionadas con PSCA. El análisis de expresión de PSCA también es útil como una herramienta para identificar y evaluar agentes que modulan la expresión del gen de PSCA. Por ejemplo, la expresión de PSCA es significativamente regulada hacia arriba -7 en el cáncer de próstata, y se expresa en cánceres de los tejidos listados en la Tabla I. La identificación de una molécula o agente biológico que inhibe la expresión de PSCA o la sobreexpresión en células de cánceres es de valor 5 terapéutico. Por ejemplo, tal agente puede ser identificado al utilizar una clasificación que cuantifica la expresión de PSCA mediante RT-PCR, hibridación de ácido nucleico o enlace de anticuerpo. VIII.) Métodos para Monitorear el Estado de los Genes 10 Relacionados con PSCA y sus Productos La oncogénesis se conoce que es un proceso multietapas donde el crecimiento celular llega a ser progresivamente desrregulado y las células progresan de un estado fisiológico normal a precancerosos y luego a estados 15 cancerosos (ver, por ejemplo, Alers y colaboradores, Lab Invest. 77 (5) : 437-438 (1997) y Isaacs y colaboradores, Cáncer Surv. 23:19-32 (1995)). En este contexto, el examen de una muestra biológica para la evidencia del crecimiento celular desrregulado (tal como la expresión de PSCA aberrante en 20 cánceres) permite la detección temprana de tal fisiología aberrante, antes de que un estado patológico tal como cáncer haya progresado a una etapa en que las opciones terapéuticas sean más limitadas o la prognosis es empeorada. En tales exámenes, el estado del PSCA en una muestra biológica de 25 interés puede ser comparado, por ejemplo, al estado de PSCA en una muestra normal correspondiente (por ejemplo, una muestra de aquel individuo o alternativamente otro individuo que no es afectado por una patología) . Una alteración en el estado de PSCA en la muestra biológica (como es comparado con la muestra normal) proporciona evidencia del crecimiento celular desrregulado. Además de la utilización de una muestra biológica que no es afectada por una patología como una muestra normal, también se puede utilizar un valor normativo predeterminado tal como un nivel normal predeterminado de la expresión de mRNA (ver, por ejemplo, Grever y colaboradores, J. Comp. Neurol. 1996 edición 9; 376 (2 ): 306-14 y la patente norteamericana No. 5,837,501) para comparar el estado de PSCA en una muestra. El término "estado" en este contexto se utiliza de acuerdo con su significado aceptado en la técnica y se refiere a la condición o estado de gen y su producto. Típicamente, las personas expertas utilizan un número de parámetros para evaluar la condición o estado de un gen y su producto. Estos incluyen, pero no están limitados a la localización de productos de gen expresados (incluyendo la localización de células que expresan PSCA) así como el nivel de la actividad biológica de los productos de gen expresado (tales como mRNA de PSCA, polinucleótidos y polipéptidos). Típicamente, una alteración en el estado de PSCA comprende un cambio en la localización de PSCA y/o células que expresan PSCA y/o un incremento en el mRNA de PSCA y/o expresión de proteína . El estado de PSCA en una muestra puede ser analizado por un número de medios bien conocidos en la técnica, incluyendo sin limitación, en el análisis inmunohistoquímico, la hibridación in si tu, el análisis de RT-PCR en las muestras micro-disectadas de capturas de láser, análisis de manchado de Western y el análisis de arreglo de tejido. Los protocolos típicos para evaluar el estado de un gen PSCA y los productos de gen se encuentran, por ejemplo en Ausubel y colaboradores, eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (manchado de Northern) , 4 (manchado de Southern), 15 (Inmunomanchado) y 18 (análisis de PCR) . Así, el estado de PSCA en una muestra biológica se evalúa por varios métodos utilizados por personas expertas incluyendo, pero no limitados al análisis de Southern geonómico (para examinar, por ejemplo perturbaciones en un gen PSCA) , análisis de Northern y/o análisis de PCR del mRNA de PSCA (para examinar, por ejemplo alteraciones en las secuencias de polinucleótidos o niveles de expresión de mRNAs de PSCA) y el análisis de Western y/o inmunohistoquímico) para examinar, por ejemplo alteraciones en la secuencias de polipéptido, alteraciones en la localización de polipéptido dentro de una muestra, alteraciones en los niveles de expresión de proteínas PSCA y/o asociaciones de proteínas PSCA con asociados de enlace de polipéptido) . Los polinucleótidos PSCA detectables incluyen, por ejemplo, un gen PSCA o fragmento del mismo, mRNA de PSCA, variantes de empalme alternativas, mRNAs de PSCA y moléculas de DNA o RNA recombinantes que contienen un polinucleótido PSCA. El perfil de expresión de PSCA lo hace un marcador de diagnóstico para la enfermedad local y/o metastasizada y proporciona información sobre el crecimiento potencial oncogénico de una muestra biológica. En particular, el estado de PSCA proporciona información útil para predecir la su susceptibilidad a etapas de enfermedad particulares, progresión y/o agresividad del tumor. La invención proporciona métodos y ensayos para determinar el estado de PSCA y el diagnóstico de cánceres que expresan PSCA, tales como cánceres de los tejidos listados en la Tabla I. por ejemplo, debido a que el mRNA de PSCA también es altamente expresado en la próstata y otros cánceres con relación al tejido de próstata normal, los ensayos que evalúan los niveles de transcriptos de PSCA o proteínas y una muestra biológica pueden ser utilizados para diagnosticar una enfermedad asociada con la desregulación de PSCA, y pueden proporcionar información de pronóstico útil en definir opciones terapéuticas apropiadas. El estado de expresión de PSCA proporciona información incluyendo la presencia, etapa y localización de las células displásicas, precancerosas y cancerosas, prediciendo la susceptibilidad a varias etapas de la enfermedad y/o para calibrar la agresividad del tumor. Además, el perfil de expresión lo hace útil como un reactivo de formación de imagen para la enfermedad metastasizada. Consecuentemente, un aspecto de la invención se dirige a los diversos métodos de pronóstico y de diagnóstico moleculares para examinar el estado del PSCA en muestras biológicas tales como aquellos de individuos que sufren de, o que se sospechan de sufrir de una patología caracterizada por el crecimiento celular desrregulado, tal como cáncer. Como es descrito en lo anterior, el estado de PSCA en una muestra biológica se puede examinar por un número de procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el estado de PSCA en una muestra biológica tomada de una localización específica en el cuerpo puede ser examinada al evaluar la muestra para la presencia o ausencia de células que expresan PSCA (por ejemplo aquellas que expresan mRNAs de PSCA o proteínas) . Este examen puede proporcionar evidencias del crecimiento celular desrregulado, por ejemplo, cuando las células que expresan PSCA se encuentran en una muestra biológica que normalmente no contiene tales células (tal como un nodo de linfa) debido a que tales alteraciones en el estado de PSCA en una muestra biológica están frecuentemente asociadas con el crecimiento celular desrregulado.

Específicamente como un indicador de crecimiento celular desrregulado es la metástasis de células de cáncer de un órgano de origen (tal como la próstata) a un área diferente del cuerpo (tal como un nodo de linfa) . En este contexto, la evidencia del crecimiento celular desrregulado es importante por ejemplo debido a que oculta la metástasis del nodo de linfa puede ser detectada en una proporción substancial de pacientes con cáncer de próstata, y tales metástasis están asociadas con predictores conocidos de la progresión de enfermedad (como por ejemplo Murphy y colaboradores, Prostate 42 (4) :315-317 (2000); Su y colaboradores, Semen. Surg. Oncol. 18(1): 17-28 (2000) y Freeman y colaboradores, J Urol Agosto de 1995 154 (2 Pt 1) :474-8) . En un aspecto, la invención proporciona métodos para monitorear los productos del gen PSCA al determinar el estado de los productos de gen PSCA expresados por las células de un individuo que se sospecha que tiene una enfermedad asociada con el crecimiento celular desrregulado (tal como hiperplasia o cáncer) y luego al comparar el estado así determinado con respecto al estado de los productos del gen PSCA en una muestra normal correspondiente. La presencia de productos de gen PSCA aberrantes en la muestra de prueba con relación a la muestra normal proporciona una indicación de la presencia del crecimiento celular desrregulado dentro de las células del individuo.

En otro aspecto, la invención proporciona ensayos útiles en determinar la presencia de cáncer en un individuo, que comprende detectar un incremento significante en el mRNA de PSCA con la expresión de proteína en una célula de prueba o muestra de tejido con relación a los niveles de expresión en la célula o tejido normal correspondiente. La presencia de mRNA PSCA puede ser, por ejemplo, evaluado en tejidos incluyendo pero no limitados aquellos listados la Tabla I. La presencia de la expresión de PSCA significante en cualquiera de estos tejidos es útil para indicar la emergencia, presencia y/o severidad de un cáncer, puesto que los tejidos normales correspondientes no expresan mRNA de PSCA o lo expresan a niveles inferiores. En una modalidad relacionada, el estado de PSCA se determina al nivel de la proteína antes que al nivel del ácido nucleico; por ejemplo, tal método comprende determinar el nivel de proteína PSCA expresada por las células en una muestra de tejido de prueba y al comparar el 'nivel así determinado con el nivel de PSCA expresado en una muestra normal correspondiente. En una modalidad, la presencia de proteína PSCA es evaluada, por ejemplo, utilizando métodos inmunohistoquímicos . Los anticuerpos de PSCA o asociados de enlace capaces de detectar la expresión de proteína PSCA se utilizan en una variedad de formatos de ensayo bien conocidos en la técnica para este propósito.

En una modalidad adicional, se puede evaluar el estado de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de PSCA en una muestra biológica con el fin de identificar las perturbaciones en la estructura de estas moléculas. Estas perturbaciones pueden incluir inserciones, supresiones, sustituciones y los similares. Tales evaluaciones son útiles debido a que las perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos se observan en un gran número de proteínas asociados con un fenotipo desregulado de crecimiento (ver, por ejemplo, Marrogi y colaboradores, 1999, J. Cutan. Pathol. 26 ( 8 ): 369-378 ) . Por ejemplo, una mutación en la secuencia de PSCA puede ser indicativa de la presencia o promoción de un tumor. Tales ensayos por lo tanto tienen valor de diagnóstico y predictivo donde una mutación en PSCA indica una pérdida potencial de la función o incremento en el crecimiento de tumor. Una amplia variedad de ensayos para observar perturbaciones en secuencias de nucleótidos y ' de aminoácidos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el tamaño y la estructura de las secuencias de ácidos nucleico o aminoácidos de los productos del gen PSCA son observados por los protocolos de Northern, Southern, Western, PCR y secuenciación de DNA discutidos en la presente. Además, otros métodos para observar perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos tal como el análisis de polimorfismo de conformación de una hebra son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas No. 5,382,510 expedida el 7 de septiembre de 1999, y 5,952,170 expedida el 17 de enero de 1995). Adicionalmente, se puede examinar el estado de metilación de un gen PSCA en una muestra biológica. La desmetilación y/o hipermetilación aberrante de las islas de CpG en las regiones regulatorias 5' del gen frecuentemente ocurren en células inmortalizadas y transformadas, y pueden dar por resultado la expresión alterada de varios genes. Por ejemplo, la hipermetilación de promotor de la glutationa S-transferasa pi-clase (una proteína expresada en la próstata normal pero no expresada en >90% de carcinomas de próstata) aparece para la transcripción permanentemente silenciosa de este gen y es la alteración genómica más frecuentemente detectada en los carcinomas de próstata (De Marzo y colaboradores, Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999)). Además, esta alteración está presente por lo menos en 70% de los casos de neoplasia intraepitelial prostática de alto grado (PIN) (Brooks y colaboradores, Cáncer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7:531-536). En otro ejemplo, la expresión del gen específico de tumor LAGE-I (que no es expresado en la próstata normal pero es expresado en 25-50% de cánceres de próstata) es inducido por la deoxi-azacitidina en células linfoblastoides, sugiriendo que la expresión tumoral es debido a la desmetilación (Lethe y colaboradores, Int. J. Cáncer 76 ( 6) : 903-908 (1998)). Una variedad de ensayos para examinar el estado de metilación de un gen son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar, en procedimientos de hibridación de Southern, las enzimas de restricción sensibles a la metilación que no pueden segmentar secuencias que contienen sitos CpG metilados para estimar el estados de metilación de las islas de CpG. Además, MSP (PCR específica de metilación) puede perfilar rápidamente el estado de metilación de todos los sitios CpG presentes en una isla de CpG de un gen ciado. Este procedimiento involucra la modificación inicial de DNA mediante bisulfito de sodio (que convertirá .todas las citosinas no mutiladas a uracilo) seguido por la amplificación utilizando cebadores específicos para el DNA metilado contra el no metilado. Los protocolos que involucran la interferencia de metilación también pueden ser encontrados por ejemplo en Current Protocols In Molecular Biology, Unit 12, Frederick M. Ausubel y colaboradores, eds., 1995. La amplificación del gen es un método adicional para estimar el estado de PSCA. La amplificación del gen se mide en una muestra directamente, por ejemplo, entre el manchado de Southern o manchado de Northern convencionales para cuantificar la transcripción de mRNA (Thomas, 1980, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:5201 5205), el manchado de puntos (análisis de DNA) , o la hibridación in situ, utilizando una sonda apropiadamente marcada, basada en las secuencias proporcionadas en la presente. Alternativamente, los anticuerpos so empleados piara reconocer dúplexes específicos, incluyendo dúplexes de DNA, dúplexes de RNA y dúplexes híbridos de DNA RNA o dúplexes de proteína DNA. Los anticuerpos a su vez son marcados y en ensayo llevado a cabo donde el dúplex es enlazado a una superficie, de modo que la formación de dúplex sobre la superficie, la presencia del anticuerpo enlazado al dúplex puede ser detectada. El tejido de biopsia o la sangre periférica se pueden analizar convenientemente para la presencia de células de cáncer utilizando por ejemplo, Northern, manchado de puntos o el análisis de RT-PCR para detectar la expresión PSCA. La pr.esenci.ri del RNA de PSCA amplificable por RT-PCR proporciona una indicación de la presencia de cáncer. Los ensayos de RT-PCR son bien conocidos en la técnica. Los ensayos de detección de RT-PCR para células de tumor en sangre periférica están actualmente siendo evaluados para el uso en la diagnosis y el manejo de un número de tumores sólidos humanos. En el campo del cáncer de próstata, estos incluyen ensayos de RT-PCR para la detección de células que expresan PSA y PSM (Verkaík y colaboradores, 1997, Urol. Res. 25:373-384; Ghossein y colaboradores, 1995, J. Clin. Oncol. 13:1195-2000; Heston y colaboradores, 1995, Clin. Chem. 41:1687-1688) . Un aspecto adicional de la invención es una estimación de la susceptibilidad de un individuo por desarrollar cáncer. En una modalidad, un método para predecir la susceptibilidad al cáncer comprende detectar el mRNA de PSCA o la proteína PSCA en una muestra de tejido, su presencia que indica la susceptibilidad al cáncer, en donde el grado de la expresión de mRNA de PSCA se correlaciona con el grado de susceptibilidad. En una modalidad específica, la presencia de PSCA en próstata u otro tejido es examinada, con la presencia cié PSCA en la muestra que proporciona una indicación de la susceptibilidad al cáncer de próstata (o la emergencia o existencia de un tumor de próstata) . De manera similar, se puede evaluar la integridad de las secuencias de núcleo!. cios y ci aminoácidos de PSCA en una muestra biológica, con el fin de identificar las perturbaciones en la estructura de estas moléculas tales como inserciones, supresiones, sustituciones y los similares. La presencia de una o más perturbaciones en los productos del gen PSCA en la muestra en una indicación de la susceptibilidad al cáncer (o la emergencia o existencia de un tumor) . La invención también comprende un método para calibrar la agresividad del tumor. En una modalidad, un método para calibrar la agresividad de un tumor comprende la determinación del nivel del mRNA de PSCA o la proteína de PSCA es expresada por las células de tumor, comparando el nivel así determinado con el nivel del mRNA PSCA o la proteína PSCA expresada en un tejido normal correspondiente tomado del mismo individuo o una muestra de referencia de tejido normal, en donde el grado de mRNA de PSCA o la expresión de proteína PSCA en la muestra de tumor con relación a la muestra normal indica el grado de agresividad. En una modalidad específica, la agresividad de un tumor se evalúa al determinar el grado al cual el PSCA se expresa en las células de tumor, con los niveles de expresión más altos que indican tumores más agresivos. Otra modalidad es la evaluación de la integridad de la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos PSCA en una muestra biológica, con el fin de identificar las perturbaciones en la estructura de estas moléculas tales como inserciones, supresiones, sustituciones y los similares. La presencia de una o más perturbaciones indica tumores más agresivos. Otra modalidad de esta invención se dirige a métodos para observar la progresión de una malignidad en un individuo a través del tiempo. En una modalidad, los métodos para observar la progresión de una malignidad en un individuo a través del tiempo comprende determinar el nivel de mRNA de PSCA c La protelr.a PSCA expresada por las células en una muestra de tumor, comparar el nivel así determinado con el nivel del mRNA de PSCA o la proteína PSCA expresada en una muestra de tejido equivalente tomada del mismo individuo en un tiempo diferente, en donde el grado de mRNA de PSCA o la expresión de proteína PSCA y la muestra de tumor a través del tiempo proporciona informació sobre la progresión del cáncer. En una modalidad específica, la progresión de un cáncer se evalúa al determinar la expresión de PSCA en las células de tumor a través del tiempo, donde la expresión incrementada a través del tiempo indica una progresión del cáncer. También, se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleótidos y de aminoácido de PSCA en una muestra biológica con el ' fin de identificar las perturbaciones en la estructura de estas moléculas tales como inserciones, supresiones, sustituciones y los similares, en donde la presencia de una o más perturbaciones indica una progresión del cáncer. Los procedimientos de diagnóstico anteriores pueden ser combinados con cualquiera de una amplia variedad de protocolos de pronóstico y de diagnóstico conocidos en la técnica. Por ejemplo, otra modalidad de la invención se dirige a métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen PSCA y los productos del gen PSCA (o perturbaciones en el gen PSCA y los productos del gen PSCA) y un factor que es asociado con la malignidad, como un medio para diagnosticar y pronosticar el estado de una muestra de tejido. Una amplia variedad de factores asociados con la malignidad pueden ser utilizados, tal como la expresión de gen asociado con la malignidad (por ejemplo, la expresión de PSA, PSCA y PSM para el cáncer de próstata, etc.) así como observaciones citológicas gruesas (ver, por ejemplo, Bocking y colaboradores, 1984, Anal. Quant. Cytol. 6(2):74-88; Epstein, 1995, Hum. Pathol. 26(2):223-9; Thorson y colaboradores, 1998, Mod. Pathol. 11 ( 6) : 543-51; Baisden y colaboradores, 1999, Am. J. Surg. Pathol. 23 ( 8 ) : 918-24 ) . Los métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen PSCA y los productos del gen PSCA (o perturbaciones en el gen PSCA y los productos del gen FSCA) y otro factor que fue asociado con la malignidad son útiles, por ejemplo, debido a la presencia de un conjunto de factores específicos que coinciden con la enfermedad proporciona información crucial para diagnosticar y pronosticar el estado de una muestra de tejido. En una modalidad, los métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen PSCA y los productos del gen PSCA (o perturbaciones en el gen PSCA y los productos del gen PSCA) y otro factor asociado con la malignidad comprende detectar la sobreexpresión de mRNA de PSCA o proteína en una muestra de tejido, detectar la sobreexpresión de mRNA de PSCA o ptoteiria en una muestra de tejido (o expresión de PSCA o PSM) , y observar la coincidencia de mRNA de PSCA o proteína y mRNA de PSCA o sobreexpresión de proteína (o expresión de PSCA o PSM) . En una modalidad específica, la presencia de mRNA de PSCA y PSA en el tejido de próstata es examinado, donde la coincidencia de la sobreexpresión de mRNA de PSCA y PSA en la muestra indica la existencia de cáncer de próstata, susceptibilidad al cáncer de próstata o la emergencia o estado de un tumor de próstata. Los métodos para detectar y cuantificar la expresión de mRNA de PSCA o proteína son descritos en la presente, 'y las tecnologías de detección y cuantificación del ácido nucleico y proteína estándares, son bien conocidos en la técnica. Los métodos estándares para la detección y cuantificación cié mRNA de PSCA incluye la hibridación in situ usando ribosondas de PSCA marcadas, manchado de Northern y técnicas relacionadas utilizando sondas ele polinucleótido de PSCA, análisis de RT-PCR utilizando cebadores específicos para PSCA, y otros métodos de detección de tipo amplificación, tal como, por ejemplo, DNA ramificado, SISBA, TMA y los similares. En una modalidad específica, el RT-PCR semi-cuantitativo se utiliza para detectar y cuantificar la expresión de mRNA de PSCA. Cualquier número de cebadores capaces de amplificar el PSCA pueden ser utilizados para este propósito, incluyendo pero no limitados a los diversos conjuntos de cecadoi específicamente descritos en la presente. En una modalidad específica, los anticuerpos policlonales o monoclonales específicamente reactivos con la proteína PSCA de tipo silvestre se pueden utilizar en un ensayo inmunohistoquímico de tejido de biopsia. IX.) Identificación de Moléculas que Interactúan con PSCA La proteína PSCA y las secuencias de ácido nucleico divulgadas en la presente permiten una persona experta identificar proteínas, moléculas pequeñas y otros agentes que interactúan con PSCA, así como rutas activadas por PSCA por la vía de cualquiera de una variedad de protocolos aceptados en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar uno de los llamados sistemas de atrapamiento de interacción (también referidos como el "ensayo de dos híbridos") . En tales sistemas, las moléculas interactúan y reconstituyen un factor de transición que dirige la expresión de un gen reportador, después de lo cual se analiza la expresión del gen reportador. Otros sistemas identifican interacciones de proteína-proteína in vivo a través de la reconstitución de un activador transcripcional eucariótico, ver, por ejemplo, la patento norteamericana No. 5,955,280 expedida el 21 de septiembre de 1999, 5,925,523 expedida el 20 de julio de 1999, 5,846,722 expedida el 8 de diciembre de 1998 y 6,004,746 expedida el 21 de diciembre de 1999. Los algoritmos también están disponibles en la técnica para las predicciones basadas en el genoma de la función de la proteína (ver, por ejemplo, Marcotte, y colaboradores, Nature 402:4 noviembre de 1999, 83-86) . Alternativamente se pueden clasificar librerías de péptido para identificar moléculas que interactúan con las secuencias de proteína PSCA. En tales métodos, los péptidos que enlazan a PSCA son identificados por librerías de clasificación que codifican una recolección aleatoria o controlada de aminoácidos. Los péptidos codificados por las librerías se expresan como proteínas de fusión de proteínas de recubrimiento de bacteriófago, las partículas de bacteriófago luego son clasificadas contra la(s) proteína (s) de PSCA. Por consiguiente, los péptidos que tienen amplia variedad de usos, tales como reactivos terapéuticos, de pronóstico o de diagnóstico, son identificados de esta manera sin ninguna información adicional sobre la estructura del ligando esperado en la molécula receptora. Las librerías de péptidos típicos y los métodos de clasificación que pueden ser utilizados para identificar moléculas que interactúan con las secuencias de proteína PSCA son divulgadas por ejemplo en las patentes norteamericanas Nos. 5,723,286 expedida el 3 de marzo de 1998 y 5,733,731 expedida el 31 de marzo de 1998. Alternativamente, las líneas de células que expresan PSCA se utilizan para identificar interacciones de proteína-proteína mediadas por PSCA. Tales interacciones pueden ser examinadas utilizando técnicas de inmunoprecipitación (ver, por ejemplo, Hamilton B.J., y colaboradores, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 261:646- 51) . La proteína PSCA puede ser inmunoprecipitada de líneas de células que expresan PSCA utilizando anticuerpos anti-PSCA. Alternativamente, los anticuerpos contra His-tag pueden ser utilizados en una línea de célula diseñada para expresar fusiones de PSCA y un His-tag (vectores mencionados en lo anterior) . El complejo inmunoprecipitado puede ser examinado para la asociación de la proteína mediante procedimientos tal como el manchado de Western, marcación con 35S-metionina de proteínas, microsecuenciación de proteína, manchaao de plata y electroforesis de gel bidimensional. Las moléculas pequeñas y ligandos que interactúan con PSCA pueden ser identificadas a través de modalidades relacionadas de tales ensayos de clasificación. Por ejemplo, se pueden identificar moléculas pequeñas que interfieren con la función de proteína, incluyendo moléculas que interfieren con la habilidad del PSCA para mediar la fosforilación y des-fosforilación, interacción con moléculas de DNA o RNA como una indicación de la regulación de los ciclos celulares, señalización del segundo mensajero o tumorigénesis. De manera similar, las moléculas pequeñas que modulan el canal de ion relacionado con PSCA, bomba de proteínas o las funciones de comunicación de las células son identificados y utilizados ' para tratar pacientes que tienen un cáncer que expresa PSCA (ver, por ejemplo, Hille, B., Ionic Channels of Excitable Membranes 2nd Ed., Sinauer Assoc, Sunderland, MA, 1992). Además, los ligandos que regulan la función de PSCA pueden ser identificados basados en su habilidad para enlazar PSCA y activar una construcción reportadora. Los métodos típicos se discuten por ejemplo en la patente norteamericana No. 5,928,868 expedida el 27 de julio de 1999, e incluye métodos para formar l qandos do híbridos en los cuales por lo menos un ligando es una molécula pequeña. En una modalidad ilustrativa, las células diseñadas para expresar una proteína de fusión de PSCA y una proteína que enlaza DNA se utilizan para co-expresar una proteína de fusión de un ligando híbrido/molécula pequeña y una proteína activadora transcripcional de librería de cDNA. Las células además contienen un gen reportador, la expresión del cual es condicionado en la proximidad de la primera y la segunda proteína de fusión entre sí, un evento que ocurre solamente sí el ligando híbrido enlaza sitios objetivos en ambas proteínas híbridas. Aquellas células que expresan el gen reportador son seleccionadas y la molécula pequeña no conocida o el ligando no conocido es identificado. Este método proporciona un medio para identificar, moduladores, que activ n o inhi en PSCA . Una modalidad de esta invención comprende un método para clasificar una molécula que interactúa con una secuencia de aminoácido de PSCA mostrada en la Figura 1, que comprende las etapas de poner en contacto una población de moléculas con una secuencia de aminoácidos de PSCA, permitir que la población de moléculas y la secuencia de aminoácidos PSCA interactúen bajo condiciones que facilitan una interacción, determinar la presencia de una molécula que interactúa con la secuencia de aminoácidos de PSCA, y luego separar las moléculas que no interactúan con la secuencia de aminoácidos de PSCA de las moléculas que lo hacen. En una modalidad específica, el método además comprende purificar, caracterizar e identificar una molécula que interactúa con la secuencia de aminoácidos de PSCA. La molécula identificada puede ser utilizada para modular una función realizada por PSCA. En una modalidad preferida, la secuencia de aminoácidos de PSCA se pone en contacto con una librería de péptidos. X.) Métodos Terapéuticos y Composiciones La identificación de PSCA como una proteína que es normalmente expresada en un conjunto restringido de tejidos, pero que también os expresado en cánceres tales como aquellos listados en la Tabla I, abre un número de procedimientos terapéuticos al tratamiento de tales cánceres. Por supuesto, las terapias antitumorales dirigidas han SIGO útiles cuando la proteína ciirigida es expresada en tejidos normales, aún en tejidos de órganos normales vitales. Un órgano vital es uno que es necesario para mantener la vida, tal como el corazón o el colon. Un órgano no vital es uno que puede ser removido después de lo cual el individuo todavía es capaz de sobrevivir. Ejemplos de órganos no vitales en el ovario, seno y próstata. Por ejemplo, Hercept in<S es una sustancia farmacéutica probada por la FDA que consiste de un anticuerpo que es inmunoreactivo con la proteína variadamente conocida como HER2, HER2/neu y erb-b-2. Este es comercializado por Genentech y ha sido un agente antitumoral comercialmente exitoso. Las ventas de Herceptin® alcanzaron casi $400 millones en 2002. Herceptin© es un tratamiento para el cáncer de seno metastático positivo de HER2. Sin embargo, la expresión de HER2 no está limitada a tales tumores. La misma proteína se expresa en un número de tejidos normales. En particular, se conoce que HER2/neu está presente en el riñon y el corazón normal, así estos tejidos están presentes en todos los recipientes humanos de Herceptin. La presencia de HER2/neu en el riñon normal también es confirmado por Latif, Z., y colaboradores, B. .U. International (2002) 89:5-9. Como se muestra en este artículo (que evaluó sí el carcinoma de célula renal debe ser una indicación preferida para los anticuerpos anti-HER2 tal como Herceptin) tanto la proteína y el mRNA se producen en tejidos renales benignos. Notablemente, la proteína HER2/neu se sobreexpresó fuertemente en el tejido renal benigno.

A pesar del hecho de que el HER2/neu se expresa en tales tejidos vitales como el corazón y el riñon, el Herceptin es un fármaco muy útil, aprobado por la FDA y comercialmente exitoso. El efecto de Herceptin en el tejido cardiaco, es decir, "cardiotoxicidad", meramente ha sido un efecto secundario al tratamiento. Cuando los pacientes se trataron con Herceptin solamente, cardiotoxicidad significante ocurrió en un muy bajo porcentaje de pacientes. Para minimizar la cardiotoxicidad hay un requerimiento de entrada más severo para el tratamiento con HER2/neu. Los factores tal como la predisposición a la condición cardiaca son evaluados antes cié que pueda ocurrir el tratamiento. De observación particular, aunque el tejido de riñon es indicado para exhibir la expresión normal, posiblemente a una expresión más alta que el tejido cardiaco, el riñon no tiene cualquiera de los efectos secundarios del Herceptin apreciable. Además, del arreglo diverso de tejidos normales en los cuales HER2 es expresado, hay muy poca recurrencia sobre cualquier efecto secundario. Solamente el tejido cardiaco ha manifestado algún efecto secundario apreciable en todo esto. Un tejido tal como riñon, donde la expresión HER2/neu es especialmente notable, no ha sido la base para algún efecto secundario. Además, los efectos terapéuticos favorables se han encontrado para las terapias antitumorales que dirigen el receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) ; Erbitux (ImClone). EGFR también se expresa en numerosos tejidos normales. Han existido efectos secundarios muy limitados en los tejidos normales después del uso de la terapéutica con anti-EGFR. Un efecto secundario general que ocurre con el tratamiento de EGFR es un salpullido de la piel severo observado en 100% de los pacientes que se someten al tratamiento . Así, la expresión de una proteína objetivo en el tejido normal, aún el tejido normal vital, no afecta la utilidad de un agente de dirección para la proteína como un terapéutico para ciertos tumores en los cuales la proteína también es sobreexpresada. Por ejemplo, la expresión en los órganos vitales no está y no es perjudicial por sí mismo. Además, los órganos considerados como no indispensables, tal como la próstata y el ovario, pueden ser removidos sin afectar la mortalidad. Finalmente, algunos órganos vitales no son afectados por la expresión del órgano normal debido a un inmunoprivilegio . Los órganos in unoprivilegiados son órganos que son protegidos de la sangre por una barrera de sangre-órgano y así no son accesibles a la inmunoterapia. Ejemplos de órganos inmunoprivilegiados son el cerebro y el testículo. Por consiguiente, ios procedimientos terapéuticos que inhiben la actividad de una proteína PSCA son útiles para pacientes que sufren de un cáncer que expresa PSCA. Estos procedim entos terapéuticos generalmente caen en tres clases. La primera clase modula la función de PSCA conforme se relaciona al crecimiento de célula tumoral que conduce a la inhibición o retardo del crecimiento de la célula tumoral e induce su exterminación. La segunda clase comprende varios métodos para inhibir el enlace o asociación de una proteína PSCA con su asociado de enlace con otras proteínas. La tercera clase comprende una variedad de métodos para inhibir la transcripción de un gen PSCA o la traducción de mRNA de PSCA. X.A.) Vacunas Anti-Cáncer La invención proporciona vacunas para cáncer que comprenden una proteína relacionada con PSCA o ácido nucleico relacionado con PSCA. En vista de la expresión de PSCA, las vacunas para cáncer previenen y/o tratan cánceres que expresan PSCA con efectos mínimos o sin efectos en los tejidos no objetivo. El uso de un antígeno de tumor en una vacuna que genera respuestas inmunes humorales mediadas por células como terapia anti-cáncer es bien conocido en la técnica y se ha empleado en el cáncer de próstata utilizando inmunógenos PSMA de humano y PAP de roedor (Hodge y colaboradores, 1995, Int. J. Cáncer 63:231-237; Fong y colaboradores, 1997, J. Immunol. 159:3113-3117). Tales métodos pueden ser fácilmente practicados al emplear una proteína relacionada con PSCA, o una molécula de ácido nucleico que codifica PSCA y vectores recombinantes capaces de expresar y presentar el inmunógeno de PSCA (que típicamente comprende un número de epítopes de célula T o anticuerpo) . Las personas expertas entienden que una amplia variedad de sistemas de vacuna para el sistema de epítopes inmunoreactivos son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Heryln y colaboradores, Ann Med febrero de 1999 31(l):66-78; Maruyama y colaboradores, Cáncer Immunol I munother junio del 2000 49 (3) : 123-32) . Brevemente, tales métodos para generar una respuesta inmune (por ejemplo, mediada por célula y/o humoral) en un mamífero, comprende las etapas de: exponer el sistema inmune del mamífero a un epítope inmunoreactivo (por ejemplo, un epítope presente en una proteína PSCA mostrada en la Figura 1 o análogo u homólogo de la misma) de modo que el mamífero genera una respuesta inmune que es específica para ese epítope (por ejemplo, generar anticuerpos que específicamente reconoce ese epítope) . La proteína PSCA completa, regiones inmunogénicas o epítopes de la misma se pueden combinar y suministrar por varios medios. Tales composiciones de vacuna pueden incluir, por ejemplo, lipopéptidos (ejemplo, Vitiello, A. y colaboradores, J. Clin. Invest. 95:341, 1995), composiciones de péptido encapsuladas en poli (DL-lacturo-co-glicoluro) ("PLG") microesferas (ver, por ejemplo, Eldrydge, y colaboradores, Molec:. Immunol. 28:287-294, 1991: Alonso y colaboradores, Vaccine 12:299-306, 1994; Jones y colaboradores, Vaccine 13:675-681, 1995), composiciones de péptido contenidas en complejos inmunoestimulantes (ISCOMS) (ver, por ejemplo, Takahashi y colaboradores, Nature 344:873-875, 1990; Hu y colaboradores, Clin Exp Immunol. 113:235-243, 1998), sistemas de péptido de antígeno múltiples (MAPs) (ver, por ejemplo, Tam, J. P., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 85:5409-5413, 1988; Tam, J.P., J. Immunol. Methods 196:17-32, 1996) , péptidos formulados como péptidos multivalentes; péptidos para el uso en sistemas de suministro balístico, péptidos típicamente cristalizados, vectores de suministro viral (Perkus, M.E. y colaboradores, In: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S.H.E., ed., p. 379, 1996; Chakrabarti, S. y colaboradores, Nature 320:535, 1986; Hu, S.L. y colaboradores, Nature 320:537, 1986; Kieny, M.-P. y colaboradores, AIDS Bio/Technology 4:790, 1986; Top, F.H. y colaboradores, J. Infect . Dis. 124:148, 1971; Chanda, P.K. y colaboradores, Virology 175:535, 1990), partículas de origen viral o sintético (por ejemplo, Kofler, N. y colaboradores, J. Immunol. Methods. 192:25, 1996; Eldridge, J.H. y colaboradores, Sem. Hematol. 30:16, 1993; Falo, L.D., Jr . y colaboradores, Nature Med. 7:649, 1995), adyuvantes (Warren, H.S., Vogel, F.R., y Chedid, L.A. Annu. Rev. Immunol . 4:369, 1986; Gupta, R.K. y colaboradores, Vaccine 11:293, 1993), liposomas (Reddy, R. y colaboradores, J. Imm?nol. 148:1585, 1992; Rock, K.L., Immunol . Today 17:131, 1996) o, cDNA desnudo o absorbido en partículas, (Ulmer, J.B. y colaboradores, Science 259:1745, 1993; Robinson, H. L., Hunt, L.A., y Webster, R.G., Vaccine 11:957, 1993; Shiver, J. W. y colaboradores, In: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S.H.E., ed., p. 423, 1996; Cease, K. B., y Berzofsky, J. A., Annu. Rev. Immunoi . 12:923, 1994 y Eldridge, J. H. y colaboradores, Sem. Hematol . 30:16, 1993). Las tecnologías de suministro dirigidas a la toxina, también conocidas como dirección mediada por receptor, tales como aquellas de Avant Immunotherapeutics, Inc. (Needham, Massachussets) también pueden ser utilizadas. En pacientes con cáncer asociado al PSCA, las composiciones de vacunas de la invención también pueden ser utilizadas en conjunción con otros tratamientos utilizados para el cáncer, por ejemplo, cirugía, quimioterapia, terapias de fármaco, terapias de radiación, etc. incluyendo el uso en combinación con adyuvantes inmunes tales como IL-2, IL-12, GM-CSF, y los similares. Vacunas Celulares: Los epítopes CTL pueden ser determinados utilizando algoritmos específicos para identificar péptidos dentro de la proteína PSCA que enlazan a alelos de HLA correspondientes (ver por ejemplo, Tabla IV; Epimer™ y Epimatrix™, Brown University (URL brown . edu/Research/TB- HIV Lab/epimatrix/epimatrix.html) ; y BIMAS (URL bimas . der . nih . gov/; SYFPEITHI a URL syfpeithi .bmi-heidelberg . com/ ) . En una modalidad preferida, un inmunógeno de PSC? contiene una o más secuencias de aminoácidos identificadas utilizando técnicas bien conocidas en el arte, tales como las secuencias mostradas en las Tablas V-XVIII y XX1I-L1 o un péptido de 8, 9, 10 ó 11 aminoácidos especificados por una porción/superporción de Clase I de HLA (por ejemplo, Tabla IV (A), Tabla IV (D) , o Tabla IV (E) ) y/o un péptido de por lo menos 9 aminoácidos que comprende una porción/superporción de Clase II de HLA (por ejemplo, Tabla IV (B) o Tabla IV (C) ) . Como es apreciado en la técnica, la hendidura de enlace de Clase I de HLA es esencialmente cerrada en el extremo de modo que los péptidos de solamente un intervalo de tamaño parK cul ai. pueden fijarse en la hendidura y ser enlazados, generalmente epítopes de Clase I de HLA son de 8 , 9, 10, ó 11 aminoácidos de largo. En contraste, la hendidura de enlace de Clase II de HLA es esencialmente de extremo abierto; por lo tanto un péptido de aproximadamente 9 o más aminoácidos puede ser enlazado por una molécula de Clase II de HLA. Debido a las diferencias de la hendidura de enlace entre la Clase I y II de HLA, las porciones de clase I de HLA son de longitud específica, es decir, la posición dos de una porción de Clase I es el segundo aminoácido en una dirección de amino a carboxilo del péptido. Las porciones de aminoácido en una porción de Clase II son relativamente solamente entre sí, no el péptido total, es decir, los aminoácidos adicionales puede ser unido a las terminales arrimo y/o carboxilo de una secuencia que lleva porción. Los epítopes de Clase II de HLA son frecuentemente de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ó 25 aminoácidos de largo, o más largos que 25 aminoácidos . Una amplia variedad de métodos para generar una respuesta inmune en un mamífero son conocidos en la técnica (por ejemplo, como la primera etapa en la generación de hibridomas). Los métodos para generar una respuesta inmune en un mamífero comprenden exponer el sistema inmune del mamífero a un epítope inmunogénico sobre una proteína (por ejemplo, una proteína PSCA) de modo que se genera una respuesta inmune. Una modalidad típica consiste de un método para generar una respuesta inmune al PSCA en un hospedero, al poner el contacto al hospedero con una cantidad suficiente de por lo menos una célula B de PSCA o epítope de célula T citotóxica o análogo del mismo; y por lo menos un intervalo periódico después volver a poner en contacto el hospedero con la célula B de PSCA o el epítope de célula T citotóxica o análogo del mismo. Una modalidad específica consiste de un método para generar una respuesta inmune contra una proteína relacionada con PSCA o un péptido multiepitópico hecho por el hombre que comprende: administrar inmunógeno de PSCA (por ejemplo una proteína de PSCA o un fragmento de péptido de la misma, una proteina de fusión de PSCA o análogo, etc.) en una preparación de vacuna a un humano u otro mamífero. Típicamente, tales preparaciones de vacuna además contienen un adyuvante adecuado (ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 6,146,635} o un epítope ayudante universal tal como un péptido PADRETM (Epimmune Inc., San Diego, CA; ver, por ejemplo, Alexander y colaboradores, J. Immunol. 2000 164(3); 164 (3) : 1625-1633; Alexander y colaboradores, Immunity 1994 1(9): 751-761 y Alexander y colaboradores, Immunol. Res. 1998 18(2): 79-92). Un método alternativo comprende generar una respuesta inmune en un individuo contra un inmunógeno de PSCA al: administrar in vivo al músculo o en la piel del cuerpo del individuo en una molécula de DNA que comprende una secuencia de DNA que codifica un inmunógeno de PSCA, la estrogén icos; alqu los inferiores hidroxilados; sulfóxido de dimetilo; y urea también se administraron. Además, se puede administrar un anticuerpo antiidiotípico que imita PSCA con el fin de generar i na respuesta al antígeno objetivo. Vacunas de Acido Nucleico: Las composiciones de vacuna de la invención incluyen modalidades mediadas por ácido nucleico. El DNA o RNA que codifica proteínas (s) de la invención se puede administrar a un paciente. Los métodos de inmunización genética pueden ser empleados para generar respuestas humorales e inmunes celulares profilácticas o terapéuticas dirigidas contra células de cáncer que expresan PSCA. Las construcciones que comprenden DNA que codifica una proteína/inmunógeno relacionado con PSCA y las secuencias rreeqguullaattoorriiaass aapprrooppiadas pueden ser inyectadas directamente en e1 mu =cu 1 o o 1a p i K de un individuo, tal que las células del músculo o la pie 1 captan la construcción y expresan la proteína/inmunógen de PSCA codificado. Alternativamente, una vacuna comprende na proteína relacionada con PSCA. La eexxpprreessiióónn ddeell iinnprri.unógeno de proteína relacionado con PSCA dando por resultado en la generación de inmunidad humoral y celular profiláctica o terapéutica contra las células que llevan una proteína PSCA. Varias técnicas de inmunización genéticas profilácticas y terapéuticas conocidas en la técnica pueden ser utilizadas (para revisión, ver la informao i ón y la' re ter er.c cis uiblicadas en la dirección de Internet genweb.com). El suministro basado en ácido nucleico es descrito, por ejemplo, en Wolff y colaboradores, Science 247:1465 (1990) as í como las patentes norteamericanas Nos. 5,580,859; 5,589, 466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; WO 98/04 720. Ejemplos de tecnologías de suministro basados en DNA incluyen "DNA desnudo", suministro facilitado (bupivicaína, polimeros, mediado por péptido) complejos de lípido catiónico y el suministro mediado por partícula ("pistola génica" o un suministro mediado por presión (ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,922,687). Para propósitos de inmunización terapéutica o profiláctica, las proteínas de la invención pueden ser expresadas por la vía de receptores virales o bacterianos. Varios sistemas d i suministro de gen viral que puede ser utilizado en la práctica de la invención, incluyen, pero no están limitados, e vaccinia, fowlpox, canarypox, adenovirus, influenza, poliovi.rus, virus adeno asociado, lentivirus y virus sindbis (por, por ejemplo, Restifo, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8:658-663; Tsang y colaboradores, J. Nati. Cáncer Inst. 87:982-990 (1995)). Los sistemas de suministro no virales también pueden ser empleados al introducir el DNA desnudo que codifica una proteína relacionada con PSCA al paciente (por ejemplo, intramuscular o intradérmicamente) para inducir una respuesta antitumoral Los viru3 de vaccinia se utilizan, por ejemplo, como un vector pa: a expresar secuencias de nucleótidos que codifican los pépt dos de la invención. En la introducción a un hospedero, el ' /i rus de vaccinia recombinante expresa el péptido inmunogénic o de proteína, y de esta manera induce una respuesta inmune c.el hospedero. Los vectores de vaccinia y métodos útiles e n los protocolos de inmunización son descritos en, por ejemplo, la patente norteamericana No. 4,722,848. Otro vector es BCG (Bacille Calmette Guerin) . Los vectores de BCG son descritos en Stover y colaboradores, Nature 351:456-46f) (1991). Una amplia variedad de otros vectores útiles para la administración terapéutica o inmunización de 1 DS péptidos de la invención, por ejemplo vectores de virus adeno y adeno-asociados, vectores retrovirales, vectores de Salmonella typhi, vectores de toxina de ántrax detoxificada y los similares, serán evidentes para aquilellos expertos en la técnica a partir de la descripción en la presente . Así, los sistemas de suministro de gen se utilizan para suministrar luna molécula de ácido nucleico relacionada con PSCA. En una modalidad, el cDNA de PSCA humano de longitud completa es empleado. En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico de PSCA que codifican el linfocito T citctóxico (CTL) específico y/o epítopes de anticuerpo son empleadas.

Vacunas x Vi vo Varias strategias ex vivo también pueden ser empleadas para generar una respuesta inmune. Un procedimiento involucra el uso de células que presentan antígeno (APCs) tales como células dendríticas (DC) para presentar antígeno PSCA un sistema inmune del paciente. Las células dendríticas exprésan moléculas de clase I y II de MHC, co-estimulador de B7, e IL-12, y de esta manera son células que presentan antígeno altamente especializadas. En el cáncer de próstata, las células dendríticas autólogas pulsadas con péptidos del antígeno de membrana específico de próstata (PSMA) están sido utilizadas en un experimento clínico de Fase I para estimtlar los sistemas inmunes de pacientes con cáncer de próstata (Tjoa y colaboradores, 1996, Prostate 28:65-69; Murphy y colaboradores, 1996, Prostate 29:371-380). Así, las células dendríticas pueden ser utilizadas para presentar péptidos PSCA a células T en el contexto de las moléculas de cíasfe I o II de MHC. En una modalidad, las células dondrít cc > autólogas se pulsan con péptidos PSCA capaces de enlazar a las moléculas de Clase I y/o Clase II de MHC. En otra modal Ldad, las células dendríticas se pulsan con la proteína PSCA completa. Todavía otra modalidad involucra diseñar la sobreexpresión de un gen PSCA en células dendríticas utili zando varios vectores de implementación conocidos en la écnica, tales como adenovirus (Arthur y colaboradores, 19917, C ncer Gene Ther. 4:17-25), retrovirus (Henderson y colab aradores, 1996, Cáncer Res. 56:3763-3770), lentivirus, virus adeno-asociado, transfección de DNA (Ribas y co1 aboradore 199K- Cáncer Res. 57:2865-2869), o transfección de RNA derivada de tumor (Ashley y colaboradores, 1997, J- ExP • Med- 186:1177-1182). Las células que expresan PSCA también pueden ser diseñadas para expresar moduladores inmun s, tal como GM-CSF y utilizados como agentes inmunizantes. X.B. ) PSCA como un Objetivo para la Terapia Basada en Anticuerpo PSCA es un objetivo atractivo para las estrategias terapéuticas basadas en anticuerpo. Un número de estrategias de anticuerpo son conocidas en la técnica para dirigirse a las moléculas tanto extracelulares e intracelulares (ver, por ejemplo, la exterpiinación mediada por complemento y ADCC así como el uso de anticuerpos) . Debido a que el PSCA es expresado por células de cáncer de varios linajes con relación a las células normales correspondientes, se prepara la administración sistémica de composiciones inmunoreactivas de PSCA que exr iben excelente sensibilidad sin efectos tóxicos, no espe íficos y/o no de objetivo causados por el enlace de la composición inmunoreactiva a órganos no objetivo y tejidos. Los anticuerpos específicamente reactivos con dominios de PSCA son útiles para tratar cánceres que -expresan PSCA sis émi amen é, ya sea como conjugados con una toxina o agente terapéutico o como anticuerpos desnudos capaces de inhibir la proliferación o función celular. Los anticuerpos PSCA pueden ser introducidos en un paciente tal que 2.1 anticuerpo enlaza a PSCA y modula una función, tal como una interacción con un asociado de enlace y consecuentemente media la destrucción de las células de tumor y/o inhibo el crecimiento de las células de tumor. Los mecanismos mediante los cuales tales anticuerpos ejercen un efecto terapéutico pueden incluir la histolisis mediada por complemento, citot xicidad celular dependiente de anticuerpo, modulac ón de la íunción fisiológica de PSCA, inhibición del enlace de ligandc o las rutas de transducción de señal, modulación de la diferenciación celular del tumor, alteración de los perfiles del factor de angiogénesis de tumor y/o apoptosis. Ejemplos incluyen Rituxan© para Linforna no de Hodgkins, Hercepti.n® para el cáncer de seno metastático y Erbitux® para el c áncer colorectal. Aquellos expertos en la técnica entienden que los anticuerpos puedeih ser utilizados para dirigir y enlazar específicamente moléculas inmunogénicas tal como una región inmunogénica de una secuencia de PSCA mostrado en la Figura 1. Además, las personas expertas entienden que es de rutina conjugar anticuerpos a agentes citotóxicos (ver, por ejemplo, Slevers y colaboradores, Blood 93:11 3678-3684 (1 de junio de 1999) ) . Cuando 1 os agenLß ci totóxicos y/o terapéuticos son suministrados directamente a las células, tal como al conjugar los anticuerpos específicos para una molécula expresada por esta célula (por ejemplo PSCA), el agente c itotóx co ej e rce rá su efecto biológico conocido (es decir, citotoxicidad) sobre esas células. Una ampl a variedad de composiciones y métodos para utilizar conjugados de anticuerpo-agente citotóxico para exterminar célulap son conocidos en la técnica. En el contexto de can :eres, Los métodos típicos comprenden administrar a un rramífero que tiene un tumor en una cantidad biológicamente efectiva de un conjugado que comprende un agente citotóxico y/o terapéutico seleccionado enlazado a un agente de direcci ón (por ejemplo, un anticuerpo anti-PSCA) que enlaza un Tiarcaclor (por ejemplo PSCA) expresado, accesible al enlace o localizado sobre la superficie de la célula. Una modali .dad típica es un método para suministrar un agente citotóxico y/o terapéutico a una célula que expresa PSCA, que comprohdc- conjugar el agente citotóxico a un anticuerpo que inmunoespecíficamente enlaza un epítope de PSCA, y exponer la célula. al conjugado de anticuerpo-agente. Otra modalidad ilustrativa es un método para tratar un individuo que se sospecha que sufre de cáncer metastasizado, que comprende una etapa de administrar parenteralmente al individuo una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéu!" LC ramen r.e e fec t iva de un a nticuerpo conj ugado a un agente citotóxico y/o terapéutico. La inmun Dterapia de cáncer utilizando anticuerpos ant.i-PSCA se puede hacer de acuerdo con varios procedimientos que sean empleados exitosamente en el tratamiento de otros tipos de cáncer, incluyendo pero no limitados a cáncer de colon (Arlen y colaboradores, 1998, Crit. Rev. Immunol . 18:133-138), mieloma múltiple (Ozaki y colaboradores, 1997, Blood 90:3179-3186 Tsunenari y colaboradores, 1997, Blood 90:2437-2444), cárncer gástrico (Kasprzyk y colaboradores, 1992, Cáncer Res 52:2771-2776), linfoma de célula B (Funakoshi y colaboradores, 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19 93-101), leucemia (Zhong y colaboradores, 1996, Leuk. Res. 20:581-589), cáncer colorectal (Moun y colaboradores, 19 94, Cáncer Res. 54:6160-6166; Velders y colaboradores, 199 5, Cáncer Res. 55:4398-4403), y cáncer de seno (Shepard y colaboradores, 1991, J. Clin. Immunol. 11:117-127). Algunos procedimientos terapéuticos involucran la conjugación cel anticuerpo desnudo a una toxina o radioisótopo, tal como la conjugación de Y91 o I131 a anticuerpos anti-CD20 {por ejemplo, ZevalinTM, IDEC Pharmaceuticals Cfrp. or Bexxar™, Coulter Pharmaceuticals) respectivamente, mientras que otros involucran la co-administración de anticuerpos y otros agentes terapéuticos, tales como HerceptinTM (trastuzuMAb) con paclitaxel (Cenen ech, Inc.). Los anticuerpos pueden ser conjugados a un agente terapéutico. Para tratar el cáncer de próstata, por ej mplo, los anticuerpos PSCA se pueden administrar en conjunción cor. radiación, quimioterapia o ablación de hormona. También, los anticuerpos pueden ser conjugados a una toxina tal como caliqueamicina (por ejemplo, Mylotarg™, Wyeth-A erst , Madison, NJ, un anticuerpo IgG4 capa humanizado recombinanto conjugado a una caliqueamicina de antibiótico antitumoral) o un maytansinoide (por ejemplo, Profármaco Activado de Tumor basado en taxano, TAP, platform, ImmunoGen, Cambridge, MA, también ver por ejemplo, la patente norteamericana 5,4 16,064) o Auristatina E (Nat Biotechnol. julio del 2003; 21 ( 7):778-84 (Seattle Genetics)). Aunque lá terapia de anticuerpo PSCA es útil para todas las etapas de cáncer, la terapia de anticuerpo puede ser art i cul arrnen :e apropiada en cánceres avanzados o metast Katicos . El tratamiento con la terapia de anticuerpo de la invención es indicado para pacientes quienes han recibido una o más rondas ie quimioterapia. Alternativamente, la terapia de anticuerpo de la invención se combina con un régimen quimioterapéutico de radiación para pacientes quienes no han recibido tratamiento quimioterapéutico. Adicionalmente, la terapia de anticuerpo puede permitir el iso de dosificación reducidas de quimioterapia concomitante, particularmente ara pacientes quienes no toleran la toxicidad del agente quimioterapéutico muy bien. Fan y colaboradores (Cáncer Res. 53:4637-4642, 1993), Prewett y colaboradores (International J. of Onco. 9:217-224, 1996), y Hancock y colaboradores, (Cáncer Res. 51:4575-4580, 1991; describen' el uso de varios anticuerpos junto con agentes quimioterapéuticos . Aunque la terapia de anticuerpo PSCA es útil para todas las etapas de cáncer, la terapia de anticuerpo puede ser particularmente apropiada en cánceres avanzados y metastáticos. El tratamiento con la terapia de anticuerpo de la invención es indicado para pacientes quienes han recibiendo uno o más rondas de quimioterapia. Alternativamente, la terapia de anticuerpo de la invención se combina con un régimen quimioterapéutico o de radiación para pacientes quien* s no han recibido tratamiento quimioterapéutico . Adici onalmente, la terapia de anticuerpo puede permitir el uso de dosificaciones reducidas de quimioterapia concomitante, particularmente para pacientes quienes no toleran la toxicidad del agente quimioterapéutico muy bien. Los pacientes con cáncer pueden ser evaluados para la presencia y el nivel de expresión de PSCA, de preferencia utilizando estimacliones inmunohistoquímicas de tejido de tumor, formación qe imagen de PSCA cuantitativo, u otras técnicas que indican confiablemente en la presencia y el gr ado de exp r es i ór: de PSC?. El análisis i nmunohistoquim Ico de biopsias de tumor o muestras quirúrgicas es preferido para este propósito. Lo 3 métodos para análisis inmunohistoquímico de tejidos de tumor' son bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos monoclonales anti-PSCA que tratan los cánceres de próstata y otros cánceres incluyen aquellos que inician una respuesta inmune potente contra el tumor o aquellos que son directamente citotóxicos. A este respecto, los anticuerpos monoclonales anti-PSCA (MAbs) pueden inducir la lisis de la célula de tumor por ya sea un mecanismo de citotoxicidad de célula mediada por complemento dependiente de anticuerpos a pesar de PSCA, ambos de los cuales requieren una porción Fe intacta de la molécula de inmunoglobulina para la introducción con los sitios receptores de Fe de la célula efectora sobre proteínas de complemento. Además, los MAbs anti-PSCA que ejercen un efecto biológico directo sobre el crecimiento de tumor son útiles para tratar cánceres que expresan PSCA. Los mecanismos mediante los cuales los MAbs directamente citotóxicos actúan incluyen: inhibición del ccrreecciimmiieennttoo ddee llaa célula, modulación de la diferenciación celular, modulación de los perfiles del factor de angiogénesis de tumor y la inducción de apoptosis. El (los) mecanismo (s) mediante el cual un MAb anti-PSCA particular ejercer un efecto antitumoral se evalúa utilizando cualquier número de ensayos in vi tro que evalúan la muerte celular tal como la lisis de c élula ADCC, ADMMC, mediada por complemento y asi sucesivamente, como es generalmente conocido en la técnica . En algunos pacientes, el uso de anticuerpos monoclonales de mu riño y otros no humanos, o MAbs quimérico humano/ratón puede n inducir respuestas inmunes moderadas a fuertes contra el anticuerpo no humano. Este puede dar por resultado la evacu ición del anticuerpo de la circulación y la eficacia reducida La mayoría de los casos severos, tal respuesta inmune r. uede conducir a la formación extensiva de complejos inmunes que, potencialmente, pueden causar falla renal. Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales preferidos utiliz, dos en los métodos terapéuticos de la invención son aque Líos que son ya sea completamente humanos o humanizados y que enlazan específicamente el antígeno PSCA objetivo con alt¿ afinidad pero exhiben baja o nada de antigenicidad en e paciente. Los métoi os terapéuticos de la invención contemplan la administración de MAbs anti-PSCA individuales así como combinaciones, o cócteles, de diferentes MAbs. Tales cócteles de MAb pueden tener ciertas ventajas mientras que ellos contengan MAbs qi e dirigen diferentes epítopes, exploran diferentes mecanis:nos efectores o combinan MAbs directamente citotóxicos con MAbs que depende de la funcionalidad efectora inmune. Tales MAbs en combinación pueden exhibir efectos terapéuticos sinergísticos. Además, los MAbs anti-PSCA pueden ser administrados concomitantemente con otras modalidades terapéuticas inclilyendo pero no limitados a varios agentes qu oterapé?t icos , bloqueadores de andrógeno, moduladores inmunes (por ejemplo, IL-2, GM-CSF), cirugía o radiación. Los MAbs anti-PSCA se administran en su forma "desnuda" o no conjugada, o pueqien tener un(os) agente(s) terapéutico (s) conjugados a éstos Las forrmulaciones de anticuerpo anti-PSCA se administran por la vía de cualquier ruta capaz de suministrar los anticuerpos a una célula de tumor. Las rutas de administración i : cluyen, pero no están limitadas a, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica y 1fs similares. El tratamiento generalmente involucra la admi istración respectiva de una preparación de anticuerpo anti PSCA, por la vía de una ruta aceptable de administración t¿ 1 como la inyección intravenosa (IV), típicamente en un i dosis en el intervalo de aproximadamente 0.1, .2, .3, .4, 5, .6, .7, .8, .9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, o 25 mg/kg de peso corporal. En general, las dosis en el inte] valo de 10-1000 mg de MAb por semana son efectivas y bien toler cias . Basado jn la experiencia clínica con el MAb de Herceptin en el tratamiento de cáncer de seno metastático, una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal del paciente IV, seguido por dosis cada semana de aproximadamente 2 mg/kg IV de la preparación de MAb anti-PSCA representa un régimen de dosificación aceptable. De preferencia, la dosis de carga inicial se administra como una infusión de 90 minutos o mas tiempo. La dosis de mantenimiento periódico se administra como una infusión de 30 minutos mas t; mpo, con la condición de que la dosis inicial sea bien tolerada. Como es apreciado por aquellos expertos en la técmica, varios factores pueden influenciar al régimen de dosis i eal en un caso particular. Tales factores incluyen, por ejemplo, la afinidad de enlace y la vida medía del Ab o los MAbs utilizados, el grado de expresión de PSCA en el paciente, el grado de circulación de antígeno PSCA de cubierta, el nivel de concentración de anticuerpo de estado permanente deseado la frecuencia de tratamiento, y la influencia de agentes quimioterapéuticos u otros agentes utilizados en combinación con el método de tratamiento de la invención, así como el estado de salud de un paciente particular. Opcionalm nte, los pacientes deben ser evaluados para los niveles de PSCA en una muestra dada (por ejemplo, los niveles de circulación de antígeno PSCA y/o células que expresan PSCA) con el fin de ayudar en la determinación del régimen de dosificación más efectivo, etc. Tales evaluaciones también se utilizan para monitorear propósitos por toda la terapia, y son út Lies para calibrar el éxito terapéutico en combinación con la evaluación de otros parámetros (por ejemplo, citologíja de orina y/o niveles InmunoCyt en la terapia de cáncer de vejiga, o por analogía, niveles de PSA de suero en la ter|apia del cáncer de próstata) . Los ant cuerpos anti-PSCA anti-idiotípicos también pueden ser utilizados en la terapia anti-cáncer, como una vacuna para indu ir una respuesta inmune a células que expresan una proteína relacionada con PSCA. En particular, la generación de ant icuerpos anti-idiotípicos es bien conocido en la técnica; esta metodología puede ser fácilmente aceptada para generar anticuerpos anti-PSCA anti-idiotípicos que imitan un epítope en una proteína relacionada con PSCA (ver, por e emplo, Wag er y colaboradores, 1997, Hybridoma 16: 33-40; Foon y colaboradores, 1995, J. Clin. Invest. 96:334-342; Herlyn y colaboradores, 1996, Cáncer Immunol. Immunother. 43:65 76) . Tal anticuerpo anti-idiotípico puede ser un 1 i zade c-n 1 as estrategias de vacuna de cáncer. Un objet o de la presente invención es proporcionar anticuerpo PSCA, que inhiben o retardan el crecimiento de células de tumor que expresan PSCA. Un objeto adicional de esta invención e s proporcionar métodos para inhibir la angiogenesis y otras funciones biológicas y de otra manera reducir 'el crecimíento de tumor en mamíferos, de preferencia humanos, utilizanctJo tales anticuerpos PSCA, y en particular utilizando tales anticuerpos PSCA combinados con la radiación y quimioterapia o ambos . En una modalidad, hay una sinergia cuando los tumores, incluyendo tumores humanos, se tratan con anticuerpos PSCA en conjunción con agentes quimioterapéuticos o radiación o comtinaciones de los mismos. En otras palabras, la inhibición del crecimiento de tumor mediante un anticuerpo PSCA se aumenta más que lo esperado cuando se combina con los agentes quimioterapéuticos o la radiación o combinaciones de los mismos. La sinergia puede ser mostrada, por ejemplo, por inhibición más grande de crecimiento del tumor con el tratamiento combir. ado que lo que sería expectado a partir de un tratamiento de solamente anticuerpos PSCA o el efecto aditivo del trataraiento con un anticuerpo PSCA y un agente quinaoterapéutico o radiación. De preferencia, la sinergia se demuestra mediante: la remisión del cáncer donde la remisión no es esperada de L tratamiento ya sea de un anticuerpo PSCA desnudo o con tra amiento utilizando una combinación aditiva de un anticuerpo PSCA y un agente quimioterapéutico o radiación. El metodo para inhibir el crecimiento de células de tumor utilizando un anticuerpo PSCA y una combinación de quimioterapia o radiación o ambos comprende administrar el anticuerpo PSCA ntes, durante o después de comenzar la quimioterapia o erapia de radiación, así como cualquier nitrógeno) , estreptozocina, ciclofosfamida, carmustina (BCNU) , lomustinlia (CCNU) , doxorubicina (adriamicina), daunorubi ciña, procarbazina, mitomicina, citarabina, etoposido, metotrexato, 5-fluorouracilo, vinblastina, vincristina, bleomicina, paclitaxel (taxol), docetaxel (taxotere) , al .desleucina, asparaginasa, busulfan, carboplatin, .adribina, dacarbazina, floxuridina, fludarabina, hidrjcxiurea, ifosfamida, interferona alfa, leuprolida, megest:rol, melfalan, mercaptopurina, plicamicina, mitotano, pegaspargasa, pentostatina, pipobroman, plicamicina, es?tpreptozocina, tamoxifen, teniposido, testolactona, tio>kguanina, tiotepa, mostaza de uracilo, vinorelbina, clorambucilo, taxol y combinaciones . de los mismos . La fuente; de radiación, utilizada en combinaciones de un anticuerpo PSCA, puede ser ya sea externa o interna al paciente que es tratado. Cuando la fuente es externa al pací ente , l 1: or pi a es conocida como terapia de radiación de haz externo. Con la fuente de radiación se interna al paciente, el tratamiento es llamado para braquiterapia (BT) La radiac ion se administra de acuerdo con técnicas estándares bien conocidas utilizando el equipo estándar manufacturado para este propósito, tal como AECL Theratron y Varian Clínac. La dosis de radiación depende de numerosos factores como es bien conocido en la técnica. Tales factores incluyen el órganf que es tratado, los órganos sanos en la ruta de la radiación que podría inadvertidamente ser afectados adversaniente, la tolerancia del paciente para la terapia de radiac: ón y el área del cuerpo en necesidad del tratamiento. La do sis típicamente será entre 1 y 100 Gy y más particularmente entre 2 y 80 Gy. Algunas dosis que se han reportado incluye 35 Gy a la médula espinal, 15 Gy a los niños, 20 Gy al hígado y 65-80 Gy a la próstata. Se debe enfatizar, sin embargo, que la invención no está limitada a cualquier dosis particular. La dosis será determinada por el médico tratante de acuerdo con los factores particulares en ma situación dada] incluyendo los factores mencionados en lo anterior . La dist ncia entre la fuente de la radiación externa y el punto de entrada en el paciente puede ser cualquier distancia, que representa un balance aceptable entre la exterminación de células objetivo y la minimización de los efectos secundarios. Típicamente, el agente de radiación externa está entre el 70 y 100 cm desde el punto de entrada al paciente. La braquiterapia es generalmente llevada a cabo al colocar la fuente de radiación en el paciente. Típicamente, la fuente de radiacion se coloca aproximadamente 0.3 cm desde el tejido que es tratado. Las técnicas conocidas incluyen la braquiterapia interfstlcial, intercavi taria y de superficie.

Las semillas radiactivas pueden ser implantadas permanentemente o temporalmente. Algunos átomos radioactivos típicos que se han utilizado en implantes permanentes incluyen yodo-125 radón. Algunos átomos radioactivos típicos que se han utilizado en implantes temporales incluyen radio, cesio-137 e ir idio-192. Algunos átomos radioactivos adicionales que se han utilizado en la braquiterapia incluyen americio-241 y o o-198. La dosis de radiación para la braquiterapia puede ser la misma como aquella mencionada en lo anterior para la terapia de radiación de haz externo. Además de los faclores mencionados en lo anterior para determinar la dos is de la terapia de radiación de haz externo, la naturaleza del átomo radioactivo utilizado también se toma en cuenta en determinar la dosis de braqui erapia . X.C. ) PSCA como un Objetivo para Respuestas Inmunes Celulares Las vacurlias y métodos para preparar vacunas que contienen una cantidad inmunológicamente efectiva de uno o más péptidos que er.lazan HLA como es descrito en la presente y además son modalidades de la invención. Además, las vacunas de acuerdo con la invención comprenden composiciones de uno o mas de los péptidos reclamados. Un péptido puede estar presente en una vaduna individualmente. Alternativamente, el péptido puede exis tir como un homopolímero que comprende múltiples copias c.el mismo péptido, o como un heteropolímero de varios péptidos. Los polímeros tienen la ventaja de reacción inmunolcgica incrementada y, donde diferentes epítopes de péptico se utilizan para constituir el polímero, la habilidad adicional para inducir anticuerpos y/o CTLs que reaccionan con diferentes determinantes antigénicos del organismo patogénico o el péptido relacionado con el tumor dirigido para una respuesta inmune. La composición puede ser una región que ocuirre naturalmente de un antígeno o puede ser preparada, por ejemplo, recombinantemente o por síntesis química . Los portadores que pueden ser utilizados con las vacunas de la invención son bien conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, tiroglobulina, albúminas tal como albúmina de suero rumano, toxoide de tétano, poliaminoácidos tal como poli L-lisina, poli L-ácido glutámico, influenza, proteína de núcleo de virus de hepatitis B, y los similares.

Las v cuna puedeii contener un diluyente fisiológicamente tolerable (es decir, aceptable) tal como agua, o solución salina. De prefererjicia solución salina regulada con fosfato. Las vacunas tambiéh típicamente incluyen un adyuvante. Los adyuvantes tal como el adyuvante de Freund incompleto, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, o alumbre son ejemplos de materiales bien conocidos en la técnica. Adicionalmente, cerno se divulga en la presente, las respuestas de CTL pueden ser cebadas al conjugar péptidos de la invención a lípidos, tal como tripamitoil-S-gl i ce i le steinl i ser Ll-ser ina (P?CSS). Además, un adyuvante tal como los ¡ligonucleótidos que contienen citosina-fosforotiolada-guanina sintética (CpG) se han encontrado que incrementan la respuesta de CTL de 10 a 100 veces (ver, por ejemplo, Davila y Celis, J. Iinmuno1. 165:539-547 (2000)). En la inmunización con una composición de péptido de acuerdo con 1 a invención, por la vía de inyección, aerosol, oral, transdérmica, transmucosal, intrapleural, intratecal u otras rutas adecuadas, el sistema inmune del hospedero responde a la vacuna al producir cantidades grandes de CTL y/o HTLs específicos para el antígeno deseado. Consecuentemente, el hospedero llega a ser por lo menos parcialmente inmune al desarrollo posterior de células que expresan o sobreexdresan antígeno PSCA, o deriva por lo menos algún beneficio terapéutico cuando el antígeno fue asociado al tumor. En algunaf modalidades, puede ser deseable combinar los componentes de péptido de Clase I con componentes que inducen o facilitan la neutralización del anticuerpo y/o las respuestas de cél ala T ' ayudantes dirigidas al antígeno objetivo. Una moaalidad preferida de tal composición comprende epítopes de Clase I y Clase II de acuerdo con la invención. Una modalidad alternativa de tal composición comprende un epítcpe de clase I y/o clase II de acuerdo con la invención, j unto con un epítope de HTL reactivo cruzadamente tal como la molécula PADRE™ (Epimmune, San Diego, CA) (descrita por ejemplo, en la patente norteamericana No. 5,736,142) . Una vacuna de la invención también puede incluir células que presí ntan antígeno (APC) , tales como células dendríticas (DC), como un vehículo para presentar péptidos de la invención. Las composiciones de vacuna pueden ser creadas in vi tro, despue;s de la movilización de las células dendrír. ica y ia recolección, mediante lo cual la carga de las células dendríticas ocurre in vi tro . Por ejemplo, las células dendríticas se tr,msfectan, por ejemplo, con un minigen de acuerdo con la ir vención, o son pulsadas con péptidos. La célula dendrítica luego puede ser administrada a un paciente para inducir resspuestas inmunes in vivo . Las composiciones de vacuna, ya sea ba sadas en DNA o en péptido, también pueden ser administradas i/i vivo en combinación con la movilización de la célula denjdrítica mediante lo cual la carga de la célula dendrítica que ocurre in vivo . De pre rencia, los siguientes principios se utilizan cuando se selecciona un arreglo de epítopes para la inclusión en una composición poliepitópica para el uso en una vacuna, o para seleccionar epítopes discretos que son incluidos en una vacuna y/o que son codificados por ácidos nucleicos tal comp un minigen. Es preferido que cada uno de los siguientes p incipios sean balanceados con el fin de hacer la sel c Lón. Los múltiples epítopes que son incorporados en u ?a composición de vacuna dada pueden ser, pero no necesitan ser, contiguos en secuencia en el antígeno nativo del cual se derivan los epítopes. 1. ) Se seleccionan epítopes que, en la administración, mi nimizan las respuestas inmunes que se han observado que es1 án correlacionadas con una evacuación de tumor. Para la Cl ise I de HLA esto incluye 3-4 epítopes que provienen de por lo menos un antígeno asociado al tumor (TAA) . Para la Clase II de HLA se emplea una exposición racionada similar; nuevamente 3-4 epítopes se seleccionan de al menos un TAA (v er, por ejemplo, Rosenberg y colaboradores, Science 278:1447- .450) . Los epítopes de un TAA pueden ser utilizados en corfibinación con epítopes de uno o más TAA adicionales para tproducir una vacuna que se dirige a tumores con patrones de xpresión variables de TAAs frecuentemente expresados . 2. ) Se seleccionan epítopes que tienen la afinidad de enlace necesari os establecida para ser correlacionados con inmunogenicioac : ara Ciase 1 cié HLA en IC50 de 500 nM o menos , f recuenteménte 200 nM o menos; y para la Clase II un IC50 de 1000 nM o iftenos . 3 . ) Suf icientes péptidos que llevan superposición, o un arreglo suficiente de péptidos que llevan porción específicas de alelos, se seleccionan para dar la cobertura de pob1 ;: i ón amp1 i a. Por ejemplo, es preferible tener por lo menos 80% de cober tura de la población. Un análisis de Monte Cario, una evalu ación como estadística conocida en la técnica, puede s r empleada para estimar la amplitud, o redundancia de, la cobertura de la población. 4. ) Cuaihdo se seleccionan epítopes de antígenos relacionados con cánceres frecuentemente es útil seleccionar análogos debido a. que el paciente puede tener tolerancia desarrollada al ep >ítope nativo. 5. ) De relevancia particular son los epítopes referidos como "epiítopes empalmados". Los epítopes empalmados ocurren donde por lo menos dos epítopes se sobreponen en una secuencia de pépti.do dada. Una secuencia de péptido empalmada puede comprender célula B, epítopes de clase I de HLA y/o clase II de HLA. Cuando se proporcionan epítopes empalmados, un objetivo general es proporcionar el número más grande de epítopes por secuencia. Así, un aspecto es evitar la provisión de un péptido que es más largo que el amino terminal del epítope amino terminal y el carboxilo terminal del epítope de ce rboxilo terminal en el péptido. Cuando se proporciona una secuencia multi-epitópica, tal secuencia comprende epítopes empalmados, es generalmente importante cl asi f icar la seci encía con el fin de asegurar de que esta no tenga propiedades patológicas u otras propiedades biológicas nocivas . 6. ) Si se crea una proteína poliepitópica, o cuando se crea un minigen, un objetivo es generar el péptido más pequeño que comprende los epítopes de interés. Este principio es similar, sino es que el mismo que el empleado cuando se selecciona un péptido que comprende epítopes empalmados. Sin embargo, con un péptido poliepitópico artificial, el objetivo de minimización de tamaño es balanceado contra la necesidad para integrar cualquiera de las secuencias espaciadoras entre los epítopes en la proteína poliepitópica. Residuos de aminoácidos espaciadores pueden ser, por ejemplo , introducidos para evitar los epítopes con??nci onal es (ur: epít.ope reconocido por el sistema inmune, no presente en el antígeno .objetivo, y solamente creado por la yuxtaposición hecha por el hombre de epítopes) , o para facilitar la segrrentación entre epítopes y de esta manera aument r la presputación de epítope. Los epítopes conjuncionales ge neralmente se evitan debido a que el recipiente puede generar una respuesta inmune a ese epítope no nativo. De particular interés es un epítope conjuncional que es un "epítope dominante". Un epítope dominante puede conducir a tal respuesta razona de que las respuestas inmunes a otros epítopes son disminuidas o suprimidas. 7.) Donde las secuencias de múltiples variantes de la misma proteína objetivo están presentes, también se pueden seleccionar epítopes de péptido potenciales en la base de su conservación. Por ejemplo, un criterio para la conservación se puede definir C[Ue la secuencia completa de un péptido que enlaza clase I de HLA o el núcleo 9-mer completo de un péptido que enlaz clase II es conservado en un porcentaje diseñado de las secuencias evaluadas para un antígeno de proteína específicp. X.C.l. Vacunas de Minigen Un núm ro de diferentes procedimientos están disponibles los cuales permiten el suministro simultáneo de epítopes múltiple Los ácidos nucleicos que codifican los péptidos de la iinvención son una modalidad particularmente útil de la invencion. Los epítopes para la inclusión en un minigen de preferencia se seleccionan de acuerdo con las guías expuestas en la sección previa. Un medio preferido para administrar ácido ; nucleicos que codifican péptidos de la invención utiliza construcciones de minigen que codifican un péptido que comorende uno o múltiples epítopes de la invención. El uso del minigenes multi-epítopes es descrito enseguida y en, Ishioka y colaboradores, J. Immunol . 162:3915-3925, 19 )9; An, L. y Whitton, J. L., J. Virol. 71:2292, 1997; Thbmson, S. A. y colaboradores, J. Immunol. 157:822, 1996; WHiil. ton, J. L. y colaboradores, J. Virol. 67:348, 1993; Hanke, R. y colaboradores, Vaccine 16:426, 1998. Por ejemplo, un plásmido de DNA multi-epítope que codifica los epit. opes que llevan superporción y/o porción derivado de PSCA, el epítope de célula T ayudante universal PADRE™ o epítopes HTL múltiples de PSCA (ver, por ejemplo, las Tablas V-XVTip) y XXII a Ll), y una secuencia de señal de transloc ción de retículo endoplásmico puede ser diseñado. Una vacuna tamb Lén puede comprender epítopes que son derivados de otros TAAs. La inmutjiogenicidad de un minigen multi-epitópico puede ser confirmada en ratones transgénicos para evaluar la magnitud de las respuestas de inducción de CTL contra los epítopes probados, Además, la inmunogenicidad de los epítopes codificados de DNA i vi vo puede ser correlacionada con las respuestas in vi tro de líneas CTL específicas contra las células objetivo ransfectadas con el plásmido de DNA. Así, estos experimentos pueden mostrar que el minigen sirve para tanto: 1.) generar una respuesta de CTL y 2.) que las células reconocidas de C|TLs inducidas que expresan los epítopes codificados . Por ejerrpío, para crear de una secuencia de DNA que codifica los epítopes seleccionados (minigen) para la expresión en células humanas, las secuencias de aminoácido de los epítopes puede;n ser traducidos inversamente. Una tabla de utilización de collones humana puede ser utilizada para guiar la elección del codón para cada aminoácido. Estas secuencias de DNA que codifican epítope pueden ser directamente unidas, de modo que cuanfo se traducen, se crea una secuencia de polipéptido conti nua. Para optimizar la expresión y/o inmunogenicidad, elementos adicionales pueden ser incorporados en el diseño de minigen. Ejemplos de secuencias de aminoácidos qiµe pueden ser traducidas inversamente e incluidas en la secuencia minigen incluyen: epítopes de clase I de HLA, epítqpes de clase II de HLA, epítopes de anticuerpo, una s icuencia de señal de ubicuit inización, y/o la señal de dirección de retículo endoplásmico. Además, la presentación de HIA en los epítopes de CTL o HTL puede ser mejorada e incluír secuencias flanqueantes sintéticas (por ej epip1 o , po 1 i. -a i ar. ir.a) o que ocurren naturalmente adyacentes a los epítopes de CTL o HTL; estos objetivos, más grandes que comprenden el (los) epítope (s) que están dentro del alcance de la invención. La secuencia de minigen puede ser convertida de DNA al ensamblar oligonucleótidos que codifican las hebras más y menos del minigen. Los oligonucleótidos sobrepuestos (30-100 bases de largo) pueden ser sintetizados, fosforilados, purificados y recocidos bajo condiciones apropiadas utilizando técnicas bien conocidas. Los extremos de oligonucleótidos pueden ser unidos, por ejemplo, utilizando T4 DNA ligasa. Este minigen sintético, que codifica el polipéptido de e¡j>ítope, luego pueden ser clonados en un vector de expresion deseado . Las se puericias regulatorias estándares bien conocidas para aquellos expertos en la técnica de preferencia son incluidas en 1 vector para asegurar la expresión de las células objetivo, Varios elementos de vector son deseados: un promotor con un sitio de clonación corriente abajo para inserción en el minigen; una señal de poliadenilación para la terminación de transcripción eficiente; un origen de replicación de E . coli ; y un marcador seleccionado de E . coli (por ejemplo, r sistencia a ampicilina o canamicina) . Numerosos promotcires pueden ser utilizados para este propósito, por ej emplo, el promotor citomegalovirus humano (hCMV) . Ver, por ejemplo, ias patentes norteamericanas Nos. 5,580,859 y 5,5 9,466 para otras secuencias de promotor adecuadas . Las modi ficaciones de vector adicional pueden ser deseadas para opt imizar la expresión de minigen y la inmunogenicidad. En algunos casos, se requieren intrones para la expresión de gen eficiente, y uno o más intrones sintéticos o cjue ocurren naturalmente podrían ser incor porados en La región transcrita del minigen. La inclusión de secúencias de estabilización de mRNA y las secuencias para 1 a replicación en células mamíferas también puede ser cons i derada para incrementar la expresión de minigen. Una vez que se selecciona un vector de expresión, el minigen se cl na en la región polienlazadora corriente abajo del promoto . Este plásmido se transforma en una cepa de E . Coli apropia da y el DNA se prepara utilizando técnicas estándares. La orientación y la secuencia de DNA del minigen, así como otro elementos incluidos en el vector, son confirmados utilizando el mapeo de restricción y el análisis de secuencia de DKA Las células bacterianas que albergan el plásmido correcto pueden ser almacenadas como un banco de célula mae tro y u -i banco ié célula de trabajo. Además, las secuencias inmunoestimuladoras (ISSs o CpGs) se present.an que desempeñan una función en la inmunogen cidad clis las vacunas de DNA. Estas secuencias pueden ser incluícas en el vector, fuera de la secuencia de codificación en e minigen, sí es deseado para aumentar la inmunogenicidad. En algu as modalidades, un vector de expresión bi-cistrónico que permite la producción de ambos de los epítopes codifica ios de minigen y una segunda proteína (incluidos para umentar o disminuir la inmunogenicidad) puede ser utilizad o . Ejemplos de proteínas o polipéptidos que podrían aumentar benéficamente la respuesta immune sí son co-expresados inc uyen las citoquinas (por ejemplo, IL-2, IL-12, GM-CSF), mo léculas que inducen citoquina (por ejemplo, LelF) , moléculas coestimuladoras, o para respuesta de HTL, proteínas de enlac e de pan-DR (PADRE™, Epimmune, San Diego, CA) . Epítopes ayudantes (HTL) pueden ser unidos a las señales de dirección intr. celular y expresados por separado de los epítopes CTL expresados; esto permite la dirección de los epítopes de HTL ¿ un compartimiento celular diferente que aquel de los epítopes CTL. Si es requerido, esto podría facilitar la entraadcta más eficientemente a los epítopes HTL en la ruta de la cl ase II de HLA, mejorando de esta manera inducción de HTL. En contraste a la inducción de HTL o CTL, específicamente d .sminuye la respuesta inmune mediante la co-expresión de moléculas inmunosupresoras (por ejemplo, TGF-ß) puede ser b snéfico en ciertas enfermedades. C idad ? terapéuticas de DNA de plásmido pueden ser producidas por ejemplo, mediante fermentación de E . coli , seguido por purifi cación. Las alícuotas del banco de células de trabajo se utilizan para inocular el medio de crecimiento, y crecen a la satu ración en matraces agitados o un bioreactor de acuerdo con técnicas bien conocidas. El DNA de plásmido puede ser purificado utilizando tecnología de bioseparación estándares tal como las resinas de intercambio aniónico de fase sólida por Cl AGEN, Inc. (Valencia, California). Sí es requerido, el DNA superenrollado puede ser aislado de las formas circulare y lineales abiertas utilizando la electroforesis de rel u otros métodos.

El DNA d plásmido codificado se puede preparar por inyección utiliza do una variedad de formulaciones. La más simple de estas es la reconstitución de DNA liofilizado en la solución salina reguladora de fosfato (PBS) estéril. Este procedimiento, corocido como "DNA desnudo" está actualmente siendo utilizado para la administración intramuscular (IM) en experimentos clí nicos. Para maximizar los efectos inmunoterapéuticos de las vacunas de DNA de minigen, un método alternativc para formular DNA de plásmido purificado puede ser dése ifcle. Una variedad de métodos han sido descritos, y nuevas técnicas pueden llegar a ser disponibles. Los lípidos catiór icos, glicolípidos y liposomas fusogénicas también podrían sfer utilizadas en la formulación (ver, por ejemplo, como es escrito por WO 93/24640; Mannino & Gould-Fogerite, BioTeohniques 6(7): 682 (1988); patente norteame cana No . 5,279,833; WO 91/06309; y Felgner, y colaboradores, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84:7413 (1987). Además, péptidos ;y compuestos referidos colectivamente como compuestos protectores, interactivos, no condensantes (PINC) también se podrían formar en complejos al DNA de plásmido purificado para influenciar las variables tales como estabilidad, dispersión intramuscular, o el tráfico a órganos específicos o tipos de célula, La sensibilización de la célula objetivo se puede utilizar como un ensayo funcional para la expresión y la presentación de clase I de HLA de los epítopes CTL codificados por minigen. Por ejemplo, el DNA de plásmido se introduce en una línea de célula mamífera que es adecuada como un objetivo óara los ensayos de liberación de cromo de CTL estándares. El método de transfección utilizado será dependiente de la formulación final. La electroporación puede ser utilizada para el DNA "desnudo", mientras que los lípidos catiónicos permit n la transfección in vi tro directa. Un plásmido que expre;sa proteína fluorescente verde (GFP) puede ser co-transfectado para permitir el enriquecimiento de células transfect adas utilizando la clasificación celular activada con fluorescencia (FACS). Estas células luego son marcadas con cr mo-51 (blCr) y utilizadas como células objetivo para lípeas de células específicas de epítope; citólisis, detectada por la liberación blC,r, indica contra la producción de, y la presentación de HLA de, epítopes de CTL codificados con m nigen. La expresión del epítopes HTL puede ser evaluada en rana manera análoga utilizando ensayos para estimar la activic ad de HTL. La i mlunogenicidad in vivo es un segundo procedimiento par i la prueba funcional de las formulaciones de DNA de minige n. Los ratones transgénicos que expresan proteínas HLA hulmanas apropiadas son inmunizados con el producto de DNA. La dosis o ruta de administración son dependientes de la formulación (por ejemplo, IM para DNA en PBS, intraper i toneal (i.p.) para el DNA formado en complejo con lípido) . Vein iún días después de la inmunización los esplenocitos son recolectados y reestimulados durante una semana en l prese icia de péptidos que codifican cada epítope que es probado. Después, para las células efectoras de CTL, los ensayos se conducen para la citólisis de las células objetivo cargadas con péptido, marcadas con :Cr utilizando técnicas estándarc La lisis de las células objetivo que se sensibilizaron mediante el HLA cargado con epítopes de péptido, correspondientes a epítopes codificados de minigen, demuestra la funci ón de la vacuna de DNA para la inducción in vivo de CTLs . La inmunogenicidad de epítopes de HTL es confirmada en rato?es transgénicos de una manera análoga. Alternati.vamente, los ácidos nucleicos pueden ser administrados utilizando el suministro balístico como es descrito, por ejemplo en la patente norteamericana No. 5,204,253. Utilizando esta técnica, las partículas comprendidas solamente de DNA son administradas. En una modalidad alternativa, el DNA puede ser adherido a partículas, tales como partículas de oro. Los mini.genes también pueden ser suministrados utilizando otros sistemas cié suministro bacterianos o virales bien conocidos en la técnica, por ejemplo, una construcción de expresión que codifica epítopes de la invención puede ser incorporara en un vector viral tal como vaccinia.

X.C.2. Combinaciones de Péptidos CTL con Péptidos Ayudantes Las composiciones de vacuna que comprenden péptidos CTL de la invención pueden ser modificadas, por ejemplo de manera análoga, para proporcionar atributos deseados, tal como la vida medlia del suero mejorado, cobertura de la población empleada o inmunogenicidad aumentada. Por ejemplo, la habilidad de un 'péptido para inducir la actividad de CTL puede ser aumentada al enlazar el péptido a una secuí ncia que contiene por lo menos un epítope que es capaz de ir ducir una respuesta de célula T ayudante. Aunque un péptido CTL puede ser enlazado directamente a un péptido ayudante T ' . frecuentemente los conjugados de epítope CTL/epítope HTL son enlazados por una molécula espaciadora.

El espaciador est á típicamente comprendido de moléculas neutras, relativamiente pequeñas tales como aminoácidos o miméticos de aminoá cidos, que están sustancialmente sin carga bajo condiciones fisiológicas. Los espaciadores son típicamente seleccionados de, por ejemplo, Ala, Gly u otros espaciadores neutrc s de aminoácidos no polares o aminoácidos polares neutros, Será entendido que el espaciador opcionalmente presénte no necesita estar comprendido de los mismos residuos y así puede ser un hetero- u homo-oligómero .

Cuando está presentíe, el espaciador usualmente será de por lo menos uno o dos residuos, más usualmente de tres a seis residuos y algunas veces 10 o más residuos. El epítope de péptido CTL puede ser enlazado al epítope de péptido ayudante T ya sea directamente o por la vía de un espaciador ya sea en el animo o carbcxi terminal del péptido CTL. El amino terminal de ya sea el péptido inmunogénico o el péptido ayudante T puede ser acilado. Los epít Dpes de péptido HTL también pueden ser modificados para alterar sus propiedades biológicas. Por ejemplo, ellos se pueden modificar para incluir D-aminoácidos para incrementar su resistencia a proteasas y así prolongar su vida media en el suero, o ellos se pueden conjugar a otras moléculas tales corrió lípidos, proteínas, carbohidratos, y los similares para incrementar su actividad biológica. Por ejemplo, un péptido ayudante T puede ser conjugado a una o más cadenas de ácido palmítico en ya sea el amino o carboxilo terminal . X.C.3. Combinaciones de Péptidos CTL con Agentes de Cebado de Célula T. En algunas modalidades puede ser deseable incluir en las composiciones farmacéuticas de la invención por lc menos un componente que ceba el linfocito B o el linfocito T. Los lípidos se han dentificado como agentes capaces de cebar CTL m vivo . Por éjemplo, los residuos de ácido palmítico pueden ser unidos a los grupos e- y a- amino y un residuo de lisina luego enlazacµos, por ejemplo, por la vía de uno o más residuos de enlace tales como Gly, Gly-Gly-, Ser, Ser-Ser, o los similares, a urfi péptido inmunogénico. El péptido lipidado luego puede ser administrado ya sea directamente en una mi cela o partíc la, incorporada en una liposoma, o emulsificado en un adyuvante, por ejemplo, adyuvante de Freund incompleto En una modalidad preferida, una composición inmunogénica particularmente efectiva comprende ácido palmítico un .do a los grupos e- y a- amino de Lys, que es unido por la Ka del enlace, por ejemplo, Ser-Ser, al amino terminal del péptido inmunogénico. Como oti o ejemplo de cebado de lípido de las respuestas de CTL, las lipoproteínas de E . coli , tal como tripalmitoil-S-glic :erilcisteinliseril-serina (PCSS) se puede utilizar para ceba r el CTL específico de virus cuando se une covalentemente a un pépt. ido apropiado (ver, por ejemplo, Deres, y colaboracores, Nature 342:561, 1989). Los péptidos de la invención puedén ser acoplados a P3CSS, por ejemplo, ,y el lipopéptido a dministrado a un individuo para cebar específicamente una respuesta inmune al antígeno objetivo. Además, debido a que la inducción de los anticuerpos neutralizante tarrlbién puede ser cebada con epítopes conjugados con P3C|S SS, dos de tales composiciones pueden ser combinadas para nducir más efectivamente ambas de _ las respuestas humoral s y mediadas por célula. X.C.4. Composiciones de Vacuna que Comprende DC Pulsado con Péptidcjs CTL y/o HTL Una modalidad de una composición de vacuna de acuerdo con la inv snción comprende la administración ex vivo de un cóctel de áéptidos que llevan epítope a PBMC, o DC aislado de los rrjismos, de la sangre del paciente. Una sustancia farmacéutica para facilitar la recolección DC puede ser utilizada, tal como Progenipoietin™ (Pharmacia-Monsanto, St. Louis, MO) o GM-CSF/1L-4. Después de la pulsación del DC con péptidos y antes de la reinfusión en pacientes, el DC se lava para remover el péptido no enlazado. En esta modalidad, una vacuna comprende DCs pulsados con péptido que presentan los epítopes de péptido pulsados formados en complejo con moléculas HLA en sis superficies. El DC pu ede ser pulsado ex vivo con un cóctel de péptidos, algunos de los cuales estimulan la respuesta de CTL a PSCA. Opcionalmente, un péptido de célula T ayudante (HTL) tal como un péptido de clase II de HLA sueltamente restringido natural o artificial, puede ser incluido para facilitar la respuesta de CTL. Así, una vacuna de acuerdo con la invención se utiliza para tratar un cáncer que expresa o sobreexpresa PSCA. X.D.) Inmunoterapia Adoptiva Los pépti.dos relacionados con péptidos antigénicos se utilizan para inducir una respuesta CTL y/o HTL ex vivo también. Las células CTL o HTL resultantes, pueden ser utilizadas para tratar tumores en pacientes que no responden a otras formas convencionales de terapia, o no responderán a un péptido de vacur a terapéutica de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Las respuestas CTL o HTL ex vivo a un antígeno particular son inducidas al incubar en el cultivo de tejido del pacien e, o células precursoras de CTL o HTL genéticamente compatibles junto con una fuente de células que presentan antígeno (APC) , tales como células dendríticas, y el péptido inmuno?énico apropiado. Después de un tiempo de incubación apropiado (de manera típica aproximadamente 7-28 días) en el cual las células precursoras son activadas y expandidas en la s células efectoras, las células son infusionadas nuevamente al paciente, donde ellas destruirán (CTL) o facilita rán la destrucción (HTL) de su célula objetivo específ ca (por ejemplo, una célula de tumor) . Las células dendríticas transfectadas también pueden ser utilizadas como células que presentan antígeno. X . E . ) Administración de Vacunas para Propósitos Terapéuticos o Profilácticos Las comr. osiciones farmacéuticas y la vacuna de la invención típicamente se utilizan para tratar y/o prevenir un cáncer que expre ¿i o obreexpresa PSCA. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones de péptido y/o ácido nucleico se administran a un paciente en una cantidad suficiente para inducir una respubsta de célula B, CTL y/o HTL efectiva al antígeno y para cuirar o por lo menos parcialmente detener o hacer lentos los síntomas y/o complicaciones. Una cantidad adecuada para realizar esto se define como "dosis terapéuticamente ifecpva". Las cantidades efectivas para este uso dependejran en, por ejemplo, la composición particular adminis>|trada, la manera de administración, la etapa y la severida.id de la enfermedad que es tratada, el peso y el estado gener 1 de salud del paciente y el buen juicio del médico que prescribe. Para coraposiciones farmacéuticas, los péptidos inmunogénicos de la invención, o DNA que los codifica, generalmente se administran a un individuo que lleva un tumor que expresa PSCA. Los péptidos o DNA que los codifica pueden ser administrados individualmente o como fusiones de uno o más secuencias de péptido. Los pacientes pueden ser tratados con los péptidos .nmunogénicos por separado o en conjunción con otros tratamientos, tales como cirugía, como sea apropiado . Para el uso terapéutico, la administración debe generalmente comenzar en la primera diagnosis del cáncer asociado con PSCA Esto es seguido por dosis de refuerzo hasta que por lc menos los síntomas son sustancialmente abatidos y por jan período después. La modalidad de la composición de vacuna (es decir, incluyendo, pero no limitado a modalidades tales como cócteles de péptido, polipéptidos poliepi tópicos, mi. nigenes, o CTLs específicos de TAA o células dendríticas pulsadas) suministrada al paciente puede variar de acuerdo con la etapa de la enfermedad o el estado de salud del pacie nte. Por ejemplo, en un paciente con un tumor que expresa PSCA, una vacuna que comprende CTL específico de PSCA puede ser más eficaz en exterminar las células de tumor en el paciente con enfermedad avanzada que las modalidades alt ernativas . Es gene raímente importante proporcionar una cantidad del epítoóe de péptido suministrado por un modo de administración suf cíente para estimular efectivamente una respuesta de célu La T citotóxica; las composiciones que estimulan respuestas de célula T ayudante también pueden ser dadas de acuerdo con esta modalidad de la invención. La (ios i f ! caclón para una inmunización terapéutica inicial generalment e ocurre en un intervalo de dosificación unitario donde el vralor inferior es de aproximadamente 1, 5, 50, 500, o 1,000 vg y el valor más alto es aproximadamente 10,000; 20,000; 0,000; o 50,000 µg . Los valores de dosificación para un humano típicamente varían de aproximadamente 50 0 µg a aproximadamente 50,000 µg por paciente de 70 kil ogramos. Las dosis de refuerzo de entre aproximadamente 1.0 µg a aproximadamente 50,000 µg de péptido conforme a un régimen de refuerzo durante semanas a meses puede ser administrado dependiendo de la respuesta del paciente y la cor dición como es determinada al medir la actividad específica de CTL y HTL obtenida de la sangre del paciente. La adminíLstración debe continuar hasta que por lo menos los síntomas clínicos o las pruebas de laboratorio indican que la neoplasia, ha sido eliminada o reducida y por un período después. Las dosificaciones, rutas de administración y programas de dosificación se ajustan de acuerdo con las metodologías conocidas en el arte. En ciertas modalidades, los péptidos y composiciones de la presente invención se emplean en estados de enfermedad serios, esto es, que amenazan la vida o situaciones que potencialmente amenaza la vida. En tales casos, como un resultado de las cantidades mínimas de sustancias extrañas y la naturaleza no tóxica relativa de los péptidos en compo iciones preferidas de la invención, es posible y se puede sentir deseable por el médico tratante administrar excesos sustanciales de esas composiciones de péptido con relaciones a esas cantidades de dosificación establecidas . Las composiciones de vacuna de la invención también se pueden utilizar puramente como agentes profilácticos. Generalmente, la dosificación para una inmunización profiláctica inici al generalmente ocurre en un intervalo de dosificación unitaria donde el valor inferior es de aproximadamente 1, 5, 50, 500, o 1000 µg y el valor más alto es de aproximadamente 10,000; 20,000; 30,000; o 50,000 µg Los valores de dosificación para un humano típicamente varían de aproximadamente 500 µg a aproximadamente 50,000 µg por paciente de 70 kilogramos. Este es seguido por dosificaciones de refuerzo entre aproximadamente 1.0 µg a aproximadamente 50,000 µg de péptido administradas en intervalos definidos de aproximadamente cuatro semanas a seis meses después de la administración ic al do la vacuna. La inmunogenicidad de la vacuna se puede estimar al medir la actividad específica de CTL y HTL obtenida de una muestra de la sangre del paciente. Las composiciones farmacéuticas para tratamiento terapéutico se posponen para administración parenteral, tópica, oral, nasal, intratecal o local (por ejemplo, una crema o ungüento tópico) . De preferencia, las composiciones farmacéuticas se administran parenteralmente, por ejemplo, intravenosamente, subcutáneamente, intradérmicamente o intramuscularmente . Así, la invención proporciona composiciones para la administración parenteral que comprende una solución de los péptidos inmunogénicos disueltos o suspendidos en un portador aceptable, de preferencia un portador acuoso. Una variedad de portadores acuosos pueden ser utilizados, por ej emplo, agua, agua regulada con fosfato, solución salina al 3.8%, glicina al 0.3%, ácido hialurónico y los similares. Estás composiciones pueden ser esterilizadas mediante técnicas de esterilización bien conocidas, convencionales, o pueden ser filtradas de manera estéril. Las soluciones acuosas resultantes pueden ser envasadas para el uso como se encuce-ntran, o liofilizadas, la preparación liofilizada que es combinada con una solución estéril antes de la administració:' Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuiticamente aceptables como se ha requerido para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes ajustadores del pH y de regulación, agentes ajustadores de tonicidad, agentes humectantes, conservadores y los similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolauratq de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc. La concentración de péptidos de la invención en las formulaciones farmacéuticas puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente 0.1%, usualmente en o por lo menos aproximadamente 2% o tanto como 20% a 50% o más en peso, y será seleccionado principalmente por los volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado. Una forma de dosis unitaria humana de una composición típicamente se incluye una composición farmacéutica que comprende una dosis unitaria humana de un portador estable, en una modalidad de un portador acuoso, y se administra en un volumen/cantidad que es conocido para aquellos expertos en la técnica para ser utilizado para la aclmi ni st ración ele tales composiciones humanas (ver, por ejemplo, Remington 's Pharmaceutical Sciences, 17th Edition, A. Gennaro, Ed itor, Mack Publishing Co . , Easton, Pennsylvania, 1985 i . Por ejemplo, una dosis de péptido para la inmunización inicial puede ser de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 000 µg, generalmente 100-5,000 µg, para un paciente d'e 70 kg Por ejemplo, para ácidos nucleicos una inmunización inici l puede ser realizada utilizando un vector de expresión en la forma de ácido nucleico desnudo administrado IM (o SC o ID) en las cantidades de 0.5-5 mg en múltiple sitios. El ácido nucleico (0.1 a 1000 µg) también se puede administrar utilizando una pistola génica. Después de un período de incubación de 3-4 semanas, luego se administra una dosis de refuerzo. El refuerzo puede ser virus fo lpox recombmante administrado en una dosis de 5-107 a 5xl09 pfu, Para anticuerpos, un tratamiento generalmente involucra la administración repetida de la preparación de anticuerpo anti-PSCA, por la vía de una ruta aceptable de administración tal como la inyección intravenosa (IV), típicamente una dosis en el intervalo de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal. En general, las dosis en el intervalo de 10-500 mg de Mab por semana son efectivas y bien toleradas. Además, una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal del paciente IV, seguido por dosis cada semana de aproximadamente 2 mg/kg IV de la preparación Mab anti-PSCA representa un régimen de dosificación aceptable. Como es apreciado por aquellos expertos en la técnica, varios factores pueden influenciar la dosis ideal en un caso particular. Tales factores incluyen, por ejemplo, la vida media de una composición, la afinidad de enlace de un Ab, la inmunogenicidad de una sustancia, el grado de expresión de PSCA en el paciente , el grado de antígeno PSCA de cubierta en circulación, el nivel de concentración de estado permanente deseado, la frecuenpia del tratamiento y la influencia de los agentes quimioteraóé?t Leos u otros agentes utilizados en combinación con el método de tratamiento de la invención, así como el estado de salud de un paciente particular. Las dosis unitarias humanas preferidas no limitativas son, por ejemplo, 500 µg - 1 mg, 1 mg 50 mg, 50 mg - 100 mg, 100 mg - 200 mg, 200 mg - 300 mg, 400 mg - 500 mg, 500 mg - 600 mg, 600 mg 700 mg, 700 mg - 00 mg, 800 mg - 900 mg, 900 mg - I g, o 1 mg - 700 mg. En ciertas modalidades, la dosis está en un intervalo de 2-5 mg/kg de peso corporal, por ejemplo, con el seguimiento en dosi 3 cada semana de 1-3 mg/kg; 0.5 mg, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mg/kg de peso corporal seguido, por ejemplo en dos o tr]es o cuatro semanas por dosis cada semana; 0.5 - 10 mg/kg de peso corporal, seguido en dos, tres o cuatro semanas por] dosis cada semana; 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 40(j) mg m2 del área del cuerpo cada semana; 1 - 600 mg m2 de área corporal cada semana;' 225 - 400 mg m2 del cuerpo cada semana; esto puede ser seguido por dosis cada semana de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 19, 11, 12 o más semanas. En una modalidad, las formas de dosis unitarias humanas de polir ucleótidos comprenden un intervalo de dosificación adec ado o cantidad efectiva que proporciona algún efecto terapéutico. Como es apreciado por un experto ordinario en la técnica un efecto terapéutico depende de un número de factores, incluyendo la secuencia de polinucleótido, el peso molecular del polinucleótido y la rut ele adm is t.r ación. Las dosificaciones generalmente se seleccionan por e1 médico tratante u otro profesional del cuidado de la salud de acuerdo con una variedad de parámetros conocidos en la técnica, tal como la severidad de síntomas, la historia del paciente y los similares. Generalmente, para un polinucleótido de aproximadamente 20 bases, un intervalo de dosificación puede ser seleccionado de, por ejemplo, un límite inferior independientemente seleccionado tal como aproximadamente 0 1, 0.25, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 o 500 mg/kg hasta un límite superior independientemente seleccionado, mayor que el límite inte ior, (i aproximadamente 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1030, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 o 10,000 mg/kg. Por ejemplo, una dosis puede ser de aproximada =nte cualquiera de las siguientes: 0.1 a 100 mg/kg, 0.1 a 50 mg/kg, 0.1 a 25 mg/kg, 0.1 a 10 mg/kg, 1 a 500 mg/kg, 100 a 400 mg/kg, 200 a 300 mg/kg, 1 a 100 mg/kg, 100 a 200 mg /kg, 300 a 400 mg/kg, 400 a 500 mg/kg, 500 a 1000 mg/kg, SOC a 5000 mg/kg, o 500 a 10,000 mg/kg. Generalmente, las rutas parenterales de administración pueden requerir dosis más altas de polinucleótido comparadas es que la aplicación más directa del nucleótido al tejido enfermo, como lo hacen los pDlinucleótidos de longitud incrementada. En una modalidad, las formas de dosis unitarias humanas de células T comprenden un intervalo de dosificación adecuada o cantidad efectiva que proporciona algún efecto terapéutico. Como es apreciado por uno de habilidad ordinaria en la técnica, un efecto terapéutico depende de un número de factores. Las dosi Eicaciones generalmente son seleccionadas por el médico trat ¿nte u otro profesional del cuidado de la salud de acuerdo ce n una variedad de parámetros conocidos en la técnica, tal como la severidad de los síntomas, historia del paciente y 1 DS similares. Una dosis puede ser de aproximadamente 10 células a aproximadamente 106 células, aproximadamente 10 células a aproximadamente 108 células, aproximadamente lfja a aproximadamente 1011 células, o aproximadamente 10b a aproximadamente 5 x 10vlO células. Una dosis también pued ser de aproximadamente 106 células/m2 a aproximadamente 1 10 células/m2, o aproximadamente 106 células/m- a aproxiríadamente 108 células/rrr. La(s) proteína(s) de la invención y/o ácidos nucleicos que codi ican la(s) proteína (s) también pueden ser administradas por la vía de liposomas, que también pueden servir para: 1) diriqir la(s) proteína (s), a un tejido particular, tal como tejido linfoide; 2) para dirigir selectivamente célt ilas enfermas; o, 3) para incrementar la vida media de la composición de péptido. Los liposomas incluyen emulsiones , espumas, micelas, monocapas insolubles, cristales líquido:;, dispersiones de fosfolípido, capas laminares y los sirr ilares. En estas preparaciones, el péptido que es suministrad ) se incorpora como parte de un liposoma, solo o en conjun :ión con una molécula que enlaza a un receptor prevalent* entre las células linfoides, tales como anticuerpos monoclc nales que enlazan al antígeno CD45, o con otras -composicione terapéuticas o inmunogénicas. Así, los liposomas ya sea 11 enos o decorados con un péptido deseado de la invención se pueedén dirigir al sitio de las células linfoides, donde el liposoma luego se administra a las composiciones de péptido. Los liposomas para el uso de acuerdo con la invención se forman de lípidos que forman vesícula estándar, que generalmente incluyen fosfolípidos neutros y negativamente cargados y un esterol, tal como colesterol. La selacción de lípidos generalmente es guiada por la consideración de, por ejemplo, el tamaño de liposoma, estabilidad de ácido y estabilidad de los liposomas en la corriente sanguínea. Una variedad de métodos están disponibles para preparar liposomas, como es descrito en, por ejemplo, Szoka, y colaboradores, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), y las patentes norteamericanas Nos. 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028, y 5,019,369. Para la ciirección a las células del sistema inmune, un ligando que es incorporado en el líposoma puede incluir, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos para 1 os determinantes que la superficie de la célula de las células del sistema inmune deseadas. Una suspensión de ?ppsoma que contiene un péptido puede ser administrado intravenosamente, localmente, tópicamente, etc. en una dosis que varía de acuerdo con, inter. alia, las maneras de administración, el péptido que es suministrado y la etapa de la enf?rmedad que es tratada. Para composiciones sólidas, se pueden utilizar portadores sólidos no tóxicos convencionales que incluyen, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearat o de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa , sacarosa, carbonato de magnesio y los similares. Para administración oral, una composición no tóxica farmacéuticamente aceptable se forma al incorporar cualquiera de los excipientes normalmente empleados, tales como aquellos portadores previamente listados, y generalmente 10-95% del ingredie ite activo, esto es, uno o más péptidos de la invención, y más de preferencia a una concentración de ¡ — i "6 . Para administración en aerosol, los péptidos inmunogénicos de preferencia se suministran en forma finamente dividida junto con un surfactante y propelente. Los porcentajes típicos de péptidos son de aproximadamente 0.01%-20% en peso, de preferencia de aproximadamente 1%-10%. El surfactante, por supuesto, debe ser no tóxico, y de preferencia solublje en el propelente. Representativos de tales agentes y los esteres o esteres parciales de ácidos grasos contienen de aproximadamente de 6 a 22 átomos de carbono, tales como ácido caproico, octanoico, láurico, palmítico, esteárico, linoléico, linolénico, olestérico y oleico con un cohol polihídrico alifático o anhídrido cíclico. Los esteres mezclados, tales como glicéridos mezclados o naturales pueden ser empleados. El surfactante puede constituir aproximadamente 0.1%-20% en peso de la composición, de o >referencia de aproximadamente 0.25-5%. El resto de la composición es ordinariamente propelente. Un portador también puede ser incluido, como sea deseado, como con, por ejemplo, lecitina para el suministro intranasal XI.) Modalidades de Diagnóstico y Pronóstico de PSCA Como e divulgado en la presente, los polinucleótidos PS "A, polipéptidos, células T citotóxicas reactivas (CTL) élulas T ayudantes reactivas (HTL) y anticuerpos antipc lipéptidos se utilizan en ensayos de diagnóstico, prono ticos y terapéuticos bien conocidos que examinan las condic iones asociadas con el crecimiento celular regulado tal como c áncer, en particular los cánceres listados en la Tabla I (ver, por ejemplo, tanto su patrón específico de la expresión ce tejido así como su sobreexpresión en ciertos cánceres cómo es descrito por ejemplo en el Ejemplo titulado "Análisis de expresión de PSCA en tejidos normales, y muestras de pacientes") . PSCA puece ser analogizado a un PSA de antígeno asociado a próstata, el marcador arquitípico que se ha utilizado por lo: profesionales médicos por años para identificar y moni orear la presencia de cáncer de próstata (ver, por ejempl o , Merrill y colaboradores, J. Urol. 163(2) :503-5120 (2300); Polascik y colaboradores, J. Urol. agosto; 162 (2) :293- •306 (1999) y Fortier y colaboradores, J. Nat . Cáncer Inst. 91(19) .1635-1640(1999) ) . Una variedad de estos marcadores c e diagnóstico también se utilizan en el contexto similares incluyendo p533 y K-ras (ver, por ejemplo, Tulchinsky y colaboradores, Int J Mol Med 1999 julio 4 (1) : 99-102 y Minimoto y colaboradores, Cáncer Detect Prev 2000;24 (1) :1-12) . Por lo tanto, esta descripción de polinucleótidos PSCA y polipéptidos (así como sondas de polinucleótido PSCA y anticuerpos anti-PSCA utilizados para identificar la presencia de estas moléculas) y sus propiedades permite a las personas expertas utilizar estas moléculas en métodos que son análogos de aquellos utilizados, por ejemplo, en una variedad de ensayos de diagnóstico dirigidos al examen de las condiciones asociadas en el cáncer. Las modalidades típicas de métodos de diagnóstico que utilizan los polinucieótidos PSCA, polipéptidos, células T reactivas y anticuerpos son análogas a aquellos métodos de los ensayos de diagnóstico bien establecidos, que emplean, por ejemplo, polinucleótidos PSA, polipéptidos, células T reactivas y ant.ic aerpos. Por ejemplo, precisamente como polinucleótidos PSA son utilizados como sondas (por ejemplo, en el análisis de Northern, ver, por ejemplo, Sharief y colaboradores, Biochem. Mol. Biol. Int. 33 (3) : 567-74 ( 1994 ) ) y cebadores (por ejejmplo en el análisis de PCR, ver, por ejemplo, Okegawa y colaboradores, J. Urol. 163(4): 1189-1190 (2000) ) para observar la presencia y/o el nivel de mRNAs de PSA en métodos para monitorear la sobreexpresión de PSCA a la metástasis de cánceres de próstata, los polinucleótidos PSCA descritos en la presente se pueden utilizar de la misma manera para detectar la sobreexpresión. de PSA o la metástasis del cáncer de pro tata y otros cánceres que expresan este gen. Alternativamente, precisamente como los polipéptidos PSA se utilizan para generar anticuerpos específicos para PSA que luego pueden ser expresados para observar la presencia y/o el nivel de proteína s PSA en métodos para monitorear la sobreexpresión de 1 a proteína PSA (ver, por ejemplo, Stephan y colaboradores, Urology 55(4):560-3 (2000)) o la metástasis de células de p róstata (ver, por ejemplo, Alanen y colaboradores, Pathol. Res. Pract. 192(3) :233-7 (1996)), los polipéptidos de PSCA descritos en la presente se pueden utilizar para generar anticuerpos para el uso en la detección de la sobreexpresion de PSCA o la metástasis de células de próstata y células de otros cánceres que expresan este gen. Específicarnente, debido a que la metástasis involucra los movímientos de células de cáncer de un órgano de origen (tal como el pulmón o glándula de próstata, etc.) a un área diferente del cuerpo (tal como un nodo de linfa) , los ensayos que examinó n una muestra biológica para la presencia de células que expresan polinucleótidos y/o polipéptidos PSCA se pueden utiliz ir para proporcionar evidencia de la metástasis. Por e~ emplo, cuando una muestra biológica de tejido que normalme nte no contiene células que expresan PSCA (nodo de linfa) se encuentra que contiene células que expresan PSCA tal como la expresión de PSCA observada en LAPC4 y LAPC9, los xenoinjertos aislados del nodo de linfa y dentro de las células de cáncer, como es comparado con el tejido no maligno correspondiente . El polipéptido PSCA y las composiciones inmunogénicas tambi .én son útiles en vista del fenómeno de la localización de prroteína subcelular alterada en estados de enfermedad. La alteración de células del estado normal a enfermo causa carrbios en la morfología celular y será frecuentemente asociado con cambios en la localización/distri.bución de proteína subcelular. Por ejemplo, las protei.ñas de membrana celular que se expresan en una manera polar"izada en células normales 'pueden ser alteradas en la enfermedad, dando por resultado la distribución de la proteína de una manera no polar sobre la superficie de la céjlula completa. El fenómeno de la localización de proteína subcelular alterada en un estado de enfermedad se ha demostrado con la expresión de proteína MUC1 y Her2 mediante el uso de medios inmunohistoquímicos . Las células epiteliales normales tiene una distribución apical típica de MUC1, además de alguna localiz:ación supranuclear de la glicoproteína, mientras que las lesiones malignas frecuentemente demuestran un patrón de manchado apolar (Díaz y colaboradores, The Breas L Journal, 40-45 (2001); Zhang y colaboradores, Clinical Cáncer Research, 4; 2669-2676 (1998) : Cao, y colaboradores, The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 45 1547-1557 (1997)). Además, el epitelio de seno normal es ya slea negativo para la proteína Her2 o exhibe solamente una distribución basolateral mientras que las cé1 u 1 as malí gna s pueden expresar la proteína sobre la superficie de la célula completa (De Potter, y colaboradores, International Jou|rnal of Cáncer, 44; 969-974 (1989): McCormick, y olaboradores, 117; 935-943 (2002)). Alternat ivamente, La distribución de la proteína puede ser alterada de una s uperficie solamente la localización para incluir la expre sión citoplásmica difusa en el estado enfermo. Tal ejem Dio se puede observar con MUC1 (Diaz, y colaboradores, The Breast Journal, 7:40-45 (2001)). La alteración y la localización/distribución de una proteína en la célula, como es detectado por los métodos inmunohistoquímicos, también puede proporcionar información valiosa concerniente a la favorabilidad de ciertas modalidades de tr atamiento. Este último punto es ilustrado por una situación donde una proteína puede ser intracelular en el tejido normal, pero la superficie de la célula en células malignas; la localización de la superficie de la célula hace a la, células favorablemente disponibles a los regímenes de diag óstico y tratamiento basado en anticuerpo. Cuando tal alteración de la localización de la proteína ocurre para PSCA, la proteína PSCA y las respuestas inmunes relacionadas con La misma son muy útiles. Por consiguiente, incluir menos que 1 a secuencia de PSA completa para funcionar en la reacción en cadena de polimerasa. En el contexto de tales reacciones dé PCR, las personas expertas generalmente crearan una variedad de diferentes fragmentos de polinucleótido que pueden ser utilizados como cebadores con el fin de amplificar diferentes porciones de un polinucleótido de interés o para optimizar reacciones de amplificación (ver, por ejemplo, Caetano- Anolles, G, Biotechniques 25(3 :472-476, 478-480 (1998); Robertson y colaboradores, Methods Mol. Biol. 98:121-154 (1998)). Una ilustración adicional del uso de tales fragmentos se proporciona en el Ejemplo intitulado "Análisis de expresión de PSCA en tejidos normales, y muestras de pacientes", donde un fragmento de pflinucleótido de PSCA se utiliza como una sonda para mostrar ia expresión de RNAs de PSCA en células de cáncer. Además, la.s secuencias de polinucleótidos variantes típicamente se utilizan como cebadores y sondas para los mRNAs correspondientes en PCR y de los análisis de Northern (ver, por ejemplo, Sawai y colaboradores, Fetal Diagn. Ther. 1996 noviembre-diciembre 11(6): 407-13 y Current Protocols In Molecular Biology, Volumen 2, Unit 2, Frederick M. Ausubel y colaboradores, eds , 1995) ) . Los fragmentos de polinucleótido y variantes son ,i tiles en ei contesto donde son capaces de enlazar a una secuencia de polinucleótido objetivo (por ejemplo, un polinucleótido PSCA mostrado en la Figura 1 o por un experto en la técnica basado en las porciones disponibles en la técnica. Los fragmentos de polipéptido, variantes o análo gos son típicamente utilizados en este contexto mientras que ellos comprende un epítope capaz de generar un antic lerpo o célula T específica para una secuencia de po lipéptido objetivo (por ejemplo, un polipéptido PSCA mostrado en la Figura 1) . Como se rruestra en la presente, ios polinucleótidos PSCA y polipéptidos (así como las sondas de polinucleótido PSCA y anticuerpo anti-PSCA o células T utilizadas para identificar la ¡ resencia de estas moléculas) exhiben propiedades especí icas que se hacen útiles en diagnosticar cánceres tales corno aquellos listados en la Tabla I. Los ensayos de diagnost ico que miden la presencia de productos de gen PSCA, con el f .n de evaluar la presencia o inicio de una condición de enfermedad descrita en la presente, tal como cáncer de próstata , se utilizan para identificar pacientes para medidas prevéntivas o monitoreo adicional, como se ha hecho tan éxitosamente con PSA. Además, estos materiales satisfacen una ne esidad en la técnica por moléculas que tienen característ cas similares o complementarias a PSA en situaciones donde, por ejemplo, una diagnosis definida de metástasis de orig< n prostético no se puede hacer en la base de una prueba para PSA solamente (ver, por ejemplo, Alanen y colaboradores, Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996)), y consecuentemente, 1 os materiales tales como polinucleótidos y polipéptidos PSCA (así como las ondas polinucleótido PSCA y los anticuerpos anti-PSCA utilizados para identificar la presencia de estas} moléculas) necesitan ser empleados para confirmar una metástasis de origen prostético. Finalmente, además de sus usos en ensayos de diagnóstico, los polinucleótidos PSCA divulgados en la presente tienen un número de otras utilidades tal como su uso en la identificadón de anormalidades cromosómicas asociadas oncogenéticas en 1 a región cromosómica a la cual el gen PSCA mapea (ver el Ejerrpío intitulado "Mapeo Cromosómico de PSCA" enseguida) . Por ot.ra parte, además de su uso en ensayos de diagnóstico, las proteínas relacionadas con PSCA y polinucleótidos divulgados en la presente tienen otras utilidades tal cfmo su uso en el análisis forénsico de tejidos de origen no conocidos (ver, por ejemplo, Takahama K Forensic Sci Int 1996 junio 28;80(l-2): 63-9). Adicionalmente, las proteínas relacionadas con PSCA o polinucleótidos de la invención se pueden utilizar para tratar una condicion patológica caracterizada por la sobre-expresión de PSCA. La secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos de la Figura 1, o fragmentos de cualquiera, se pueden utilizar pa: generar una respuesta inmune a un antígeno de PSCA Los anticuerpos u otras moléculas que reaccionan con PÍSCA se pueden utilizar para modular la función de esta e lée?la, y de esta manera proporcionar un beneficio terapéutico . XII . ) Inhibició i de la Función de la Proteína PSCA La invencion incluye varios métodos y composiciones para inhibir el enl.ace de PSCA a su asociado de enlace o su asociación con ot-pa(s) proteína (s) así como métodos para inhibir la función ide PSCA. XII. A.) Inhibición de PSCA con Anticuerpos Intraceluíares En un pr ocedimiento, un vector recombinante que codifica anticuerpos de cadena individual que específicamente enlazan a PSCA se introducen en células que expresan PSCA por la vía de tecnclogias de transferencia de gen. Por consiguiente, el ajnticuerpo anti-PSCA de cadena individual codificado se expresa intracelularmente, se enlaza a la proteína PSCA, y de esta manera inhibe su función. Los métodos para diseñar tales anticuerpos de cadena individual intracelular son bien conocidos. Tales anticuerpos intracelulares, taijibién conocidos como "intracuerpos", son específicamente diirigidos a un compartimiento particular dentro de la céLula, proporcionando control donde la actividad inhibitoria del tratamiento es enfocada. Esta tecnología se ha aplicado exitosamente en la técnica (para revisión, ver Richerdson y Marasco, 1995, TIBTECH vol. 13). Los intracuerpos se han mostrado que eliminan virtualmente la expresión de los receptores de la superficie de la célula de otra manera abundante (ver, por ejemplo, Richardson y colaboradores, 199!), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92: 3137-3141; Beerli y colaboradores, 1994, J. Biol. Chem. 289: 23931-23936; Deshaue y colaboradores, 1994, Gene Ther. 1: 332-337) . Los anticuerpos de cadena individual comprenden los dominios variables de la cadena pesada y ligera unidas por un polipéptido enlazador flexible, y son expresados como un polipéptido individual. Opcionalmente, los anticuerpos de cadena individual se expresan como un fragmento de región variable de t adena individual unido a la región constante de cadena ligera. Las señales de tráfico intracelular bien conocidas son diseñadas en vectores de polinucleótido recombinantes pue codifican tales anticuerpos de cadena uuiviuual con ei fin de dirigir precisamente el mtracuerpo al compartimiento mtracelular deseado. Por ejemplo, los intracuerpos dirigidos al retículo endoplásmico (ER) se diseñan para incorporar un péptido de guía y, opcionalmente una señal de retensión ER C-terminal, tal como la porción de aminoácido KDEL. os intracuerpos propuestos para ejercer actividad en el núcleo se diseñan para incluir una señal de localizarían nuclear. Las porciones de lípidos unen a los intracuerpos con e 1 fin de enlazar el intracuerpo al sitio citosólico de la membrana de plasma. Los intracuerpos también pueden se r di igidc>s para ejercer función en el citosol. Por ejemplo, los intracuerpos citosólicos se utilizan para secuestrar factores dentro del citosol, para de esta manera prevenirlos de que sean transportados a su destino celular natural . En una modalidad, los intracuerpos se utilizan para capturar PSCA en ei núcleo, para de esta manera prevenir su actividad dentro de1 núcleo. Las señales ,de dirección nuclear se diseñan en tales intracuerpos PSCA con el fin de lograr la dirección deseada, Tales intracuerpos PSCA se diseñan para enlazar especificanente a un dominio de PSCA particular. En otra modalidad, los intracuerpos citosólicos que específicamente enl azan una proteína de PSCA se utilizan para prevenir que el PSCA gane acceso al núcleo, para de esta manera prevenirlo de que ejerza cualquier actividad biológica dentro del núcleo por ejemplo, previniendo al PSCA de la formación de comple jos de transcripción con otros factores). Con el fin de dirigir específicamente la expresión de tales intracuerpos a células particulares, la transcripción del intracuerpo se coloca bajo el control regulatorio de un promotor específico de tumor apropiado y/o aumentador. Con el pin de dirigir la expresión de intracuerpo específicamente a ia próstata, por ejemplo, el promotor de PSA y/o promotor/aumentador puede ser utilizado (Ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,919,652 expedida el 6 de julio 1999) . XII. B. ) Inhibición de PSCA con Proteínas Recombinantes En otro procedimiento, las moléculas recombinantes enlazan a fe esta manera inhiben ía función de PSCA.

Por ejemplo, estJas moléculas recombinantes previenen o inhiben el PSCA de ingresar/enlazar a su(s) asociado (s) de enlace o el asocriamiento con otra(s) proteína (s). Tales moléculas recombinantes pueden contener, por ejemplo, la (si parte (s) reactiva ( 3) de una molécula de anticuerpo específica de PSCA. En una modalidad particular, el dominio de 'enlace de PSCA de un asoci ado de enlace de PSCA se diseña en una proteína de fusión dimérica, mediante lo cual la proteína de fusión comprende dios dominios de enlace de ligando de PSCA enlazados a la porción Fe de una IgG humana, tal como IgGi humana. Tal porción de IgG puede contener, por ejemplo, los dominios CH2 y CH3 y la región de enlace, pero no el dominio CHi . Tales proteínas de fusión diméricas se administran en forma soluble a pacientes que sufren de un cáncer asociado con la expresión PSCA, mediante lo cual la proteína de fusión imérica específicamente enlaza PSCA y bloquea la interacción de PSCA con un asociado de enlace. Tales proteínas de fusión diméricas además se combinan en proteínas multiméricas utilizando tecnologías de enlace de anticuerpo conocidas. XII. C. ) Inhibición de la Transcripción o Traducción de PSCA La presente invención también comprende varios métodos y composiciones para inhibir la transcripción de un gen PSCA. De manera similar la invención también proporciona métodos y composici. ones para Inhibir la traducción de mRNA de PSCA en la proteína En un procedimiento, un método para inhibir la transcripción del gen PSCA comprende poner en contacto el gen PSCA con un po Linucleótido antisentido PSCA. En otro procedimiento, un método para inhibir la traducción de mRNA de PSCA comprende poner el contacto un mRNA PSCA con un polinucleótido aritisentido. En otro procedimiento, una ribozima específica de PSCA se utiliza para segmentar un mensaje de PSCA, para de esta manera inhibir la traducción. Tales métodos basados en antisentido y ribozima también se pueden dirigir a las regiones regulatorias del gen PSCA, tal como los elementos promotores y/o aumentadores de PSCA. De manera similar, las proteínas capaces de inhibir un factor de transcripción de gen PSCA se utilizan para inhibir la transcripción de rr RNA de PSCA. Los diversos polinucleótidos y composiciones útijles en los métodos mencionados en lo anterior se han descrito anteriormente. El uso de las moléculas antisantido y ribozima para inhibir la transcripción y traducción en bien conocida en la técnica, Otros factores que inhiben la transcripción de PSCA al i nfer er i r cor la activación t anscripcional de PSCA también son útiles para tratar cánceres que expresan PSCA. De manera similar, los factores que interfieren con el procesamiento de I}*SCA son útiles para tratar cánceres que expresan PSCA. Los métodos de tratamiento de cáncer que utilizan tales fac ores también dan dentro del alcance de la invención. XII. D (onsideraciones Generales para Estrategias Terapéuticas Las tecn 'logias de transferencia de gen y terapia génica se pueden utilizar para suministrar moléculas de polinucleótido ter, péuticas a células de tumor que sintetizan PSCA (es decir, antisentido, ribozima, polinucleótidos que codifican intracue rpos y otras moléculas inhibitorias de PSCA) . Un número de procedimientos de terapia génica son conocidos en la técnica. Los vectores recombinantes que codifican polinuc leótidos antisentido PSCA, ribozimas, factores capaces de interferir con la transcripción de PSCA, y así sucesivamente, se pueden suministrar a las células de tumor objetivo ut ílizando tales procedimientos de terapia génica. Los procedimientos terapéuticos anteriores se pueden combinar c DG¡ cualquiera de una amplia variedad de regímenes de terapia quirúrgica, quimioterapia o de radiación. Los prfcedimientos terapéuticos de la invención pueden permitir el uso de dosificaciones reducidas de quimioterapia (u otras terapias) y/o administración menos frecuente, una ventaja para todos los pacientes y particularmente para aquellos que no toleran la toxicidad del agente qu i mi oter apéut i co muy bien . La acti1 Kdad antitumoral de una composición particular (por ejemplo, antisentido, ribozima, intracuerpo) o una composición de tales composiciones, se puede evaluar utilizando varios s istemas de ensayo in vi tro e in vi vo . Los ensayos in vi tro que evalúan la actividad terapéutica incluyen los ensayos de crecimiento de célula, ensayos de agar blando y otros ensayos indicativos de la actividad de promoción del tumor, ensayos de enlace capaces de determinar el grado al cual una composición terapéutica inhibirá el enlace de PSCA a un asociado de enlace, etc. In vi vo , el efecto de una composición terapéutica PSCA se puede evaljaar en un modelo de animal adecuado. Por ejemplo, se pueden utilizar modelos de cánceres de próstata xenogénicos, en donde las explantas de cáncer de próstata humano o tejidos do xenoinjerto de pasaje se introducen en animales inmunocomprometidos, tales como ratones desnudos o SCID (Klein y colaboradores, 1997, Nature Medicine 3: 402-408). Por ejemplo, lia Solicitud de patente de PCT W098/16628 y la patente norteamericana 6,107,540 describen varios modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata humano capaces de recapitular e1 desarrollo de tumores primarios, la micromet.ástasis, y la formación de metastasas osteoblásticas características de la enfermedad de etapa tardía. La eficacia se puede producir µtilizando ensayos que miden la inhibición de la formación de tumor, la regresión de tumor o metástasis, y los similares. Los ensayjos in vivo que evalúan la promoción de la apoptosis son útil 2S en evaluar composiciones terapéuticas, En una modalidad, los xenoinjertos de ratones que llevan tumor tratados coh la composición terapéutica se pueden examinar para la presencia de focos apoptóticos y comparados con los ratones que llevan xenoinjerto de control no tratado. Al grado al cual 1 DS focos apoptóticos se han encontrado en los tumores de los ratones tratados proporcionan una indicación de la ef icacia terapéutica de la composición. Las composiciones terapéuticas utilizadas en la práctica de los métodos anteriores se pueden formular en composiciones farrracéuticas que comprenden un portador adecuado para el mécodo de suministro deseado. Los portadores adecuados incluyen cualquier material que cuando se combina con la composición terapéutica, retiene la función antitumoral de la fomposición terapéutica y es generalmente no reactiva con el sistema inmune del paciente. Ejemplos incluyen, pero no elstán limitados a, cualquiera de un número de portadores farma :éuticos estándares tales como soluciones salinas reguladas con fosfato, estériles, agua bacter lost.ár. i ca , los similares (ver, generalmente, Remington's Pharmacbeutical Sciences 16th Edición, A. Osal., Ed., 1980). Las folrmulaciones terapéuticas se pueden sol?bilizar y administrar por la vía de cualquier ruta capaz de suministrar la composición terapéutica al sitio del tumor. Las rutas potencialmente efectivas de la administración incluyen, pero no están limitadas a, intravenosa, parenteral, intraperitoneal, i . tramuscular, intratumoral, intradérmica, intraórgano, ortot :ópica, y los similares. Una formulación preferida para 1 inyección intravenosa comprende la composición terapéutica en una solución de agua bacteriostática conservada, agua no conservada estéril y/o diluida en bolsas de cloruro de polivinilo o de polietileno que contienen cloruro de sodio estéril al 0.9% para Inyección, USP. Lais preparaciones de proteína terapéuticas pueden ser liofilizadas y almacenas como polvos estériles, de preferencia bajo vacío, y luego reconstituidas en agua bacteriostática ,auíp contiene por ejemplo, el conservador de alcohol bencílico) <b en agua estéril antes de la inyeccióon. Las dosificaciones y protocolos de administración ara el tratamiento de cánceres utilizando los métodos anteriores variarár I con el método y el cáncer objetivo, generalmente dependieran de un número de otros factores apreciados en la técnica XIII.) Identific ación, Caracterización Uso de Moduladores de PSCA Métodos cara Identificar y Utilizar Moduladores En una modalidad, la clasificación se realiza para identificar modulares que inducen o suprimen un perfil de expresión particular, suprimen o inducen rutas específicas, de preferencia generando el fenotipo asociado de esta manera.

En ot: modalidad, teniendo identificados los genes diferencialmente expresados importante en un estado particular; las clasificaciones se realizan para identificar moduladores que alteran la expresión de los genes indivi dual s, y sean incrementan o disminuyen. En otra modalidad, la cíasificación se realiza para identificar modulares que alteiran una función biológica del producto de expresión de un gen diferencialmente expresado. Nuevamente, teniendo ?cientif?c.ada la importancia de un gen en un estado particular, las ele sificaciones se realizan para identificar agentes que enlazaifi y/o modulan la actividad biológica del producto de gen . Además, las clasificaciones se hacen para genes que son inducidos en respuesta a un agente candidato. Después de la identificación de un modulador (uno que suprime un patrón de expresión de cáncer que conduce un patrón de expresión normal, o un modulador de un gen de cáncer que conduce a la expresión del gen como en el tejido normal) una clasificación se realiza para identificar genes que son específicamente modulados en respuesta al agente. La comparación de los perfiles de exprés ion entre el tejido normal y el tejido de cáncer tratado con el agente revela genes que no son expresados en el tejido normal o el tejido de cáncer, pero son expresados en el tejido tratado con el agente, y viceversa. Las secuencias específicas de agente se identifican y se utilizan por los métodos descritos en la presente para gen es de cáncer o proteínas. En particular estas secuencias y las proteínas que ellos codifican se utilizan en marca r o identificar células tratadas con el agente. Además, los anticuerpos son resaltados contra las proteínas inducida 3 por el agente y utilizados para dirigir terapéuticas novec osas a la muestra de tejido de cáncer tratada . Ensayos ce Ident i fi ca ción A Clasificación Relacionada con el Modulador Ensayos Relacionados con la Expresión de Gen Las proteínas, ácidos nucleicos y anticuerpos de la invención se utilizan en ensayos de clasificación. Las proteínas asociadas con el cáncer, anticuerpos, ácidos nucleicos, proteínas modificadas y células que contienen estas secuencias se utilizan en ensayos de clasificación, tal como la evaluación del efecto de los candidatos de fármacos sobre un "perfil de expresión de gen", perfil de expresión de polipéptidos o su alteración de la función biológica. En una modalidad, se ut ilizan los perfiles de expresión, de preferencia en cor- junción con las técnicas de clasificación de alto rendimiento para permitir el monitoreo para la expresión del perf :il de genes después del tratamiento con un agente candidato Ipor ejemplo, Davis, GF, y colaboradores, J ¡2002); Zlokarnik, y colaboradores, Science 279:84-8 (1998); HKid, Genome Res 6:986-94,1996). Las prc¡teínas de cáncer, anticuerpos, ácidos nucleicos, proteínías modificadas y células que contienen las proteínas o genes de cáncer nativas o modificadas se utilizan en ensayos de cíasificación. Esto es, la presente invención comprende métodos para clasificar composiciones que modulan el fenotipo de cáncer o una función fisiológica de una proteína de cáncer de la invención. Esto se hace en un gen por si mismo o ail evaluar el efecto de los candidatos de fármaco en un 'perfil de expresión de gen" o función biológica. En ur a modalidad, se utilizan perfiles de expresión, de preherencia en conjunción con las técnicas de clasificación de alto rendimiento para permitir el monitoreo después del tra tamiento con un agente candidato, ver Zlokamik, supra . Una variedad de ensayos se ejecutan dirigidos a los genes y proteínas de la invención. Los ensayos se corren en un nivel de ácido nucleico o proteína individual. Esto es, teniendo identificado un gen regulador como regulado hacia arriba en el caneer, los compuestos de prueba se clasifican por la habilidad Dará modular la expresión de gen o para enlazar a la proteína de cáncer de la invención. "Modulación" en este contexto incluye un incremento o una disminución en la expresión de en. La cantidad preferida de modulación dependerá del cambio original de ia expresión de gen en el tejido normal contra el tejido que se somete al cáncer, con cambios de por lo menos 10%, de preferencia 50%, más de preferencia 100-30 0%, y en algunas modalidades 300-1000% o más grande. Así, si un exhibe un incremento de 4 veces en el tejido de cáncer comparado con el tejido normal, una disminución de apr Dximadamente cuatro veces es frecuentemente deseada; de manera similar, una disminución de 10 veces en el tejido de cánc ?G comparado con el. tejido normal frecuentemente se desea un valor objetivo de un incremento de 10 veces en la expresión por el compuesto de prueba. Los moduladores aue exacerban el tipo de expresión de gen observada en el cáncer también son útiles, por ejemplo, como un objetivo regulado hacia arriba en análisis adicionales. La cantidad de expresión de gen se monitorea utilizando sondas de ácido nucleico y la cuantificación de niveles de exprés ón de gen, o alternativamente, un producto de gen mismos es monitoreado, por ejemplo, a través del uso de ant. i cue rpos a proleína de cáncer y los inmunoensayos estándares. Las técnicas proteómicas y de separación también permiten la cuantificación de la expresión. Monitoreo de la expresión para Identificar Compuestos que Mod"Ufican la Expresión de Gen En una modalidad, el monitoreo de la expresión de gen, es decir, un perfil de expresión, se monitorea simultáneamente pa::a un número de entidades. Tales perfiles típicamente involucrarán uno o más de los genes de la Figura 1. En esta modalidad, por ejemplo, las sondas de ácido nucleico de canee r se unen a biochips para detectar y cuantificar las secuencias de cáncer en una célula particular. Alternativamente, se puede utilizar la PCR. Así, una serie, por ejemplo, de cavidades de una placa microtítulo, se puede utilizar con cebadores suministrados en cavidades deseadas. Una reacción de PCR luego se puede realizar y analizar para cada cavidad. El monijtoreo de expresión se realiza para ídc-ntificar compuc stos que modifican ia expresión do una o más secuencias asociadas con cáncer, por ejemplo, una secuencia de pol inucleótido expuesta en la Figura 1. Generalmente, un modular de prueba se adiciona a las células antes del análisis. Además, las clasificaciones también se proporcionan para identificar agentes que modulan el cáncer, modulan las proteí.nas de cáncer de la invención, enlazan a una proteína de cáncer de la invención, o interfieren con el enlace de una pr teína de cáncer de la invención y un anticuerpo u otro ásociado de enlace. En una mtDdalidad, ios métodos de clasificación de alto rendimiento involucran proporcionar una librería que contiene un gran número de compuestos terapéuticos potenciales (compuestos candidatos) . Tales "librerías químicas combínate rías" luego so clasifican en uno o más ensayos para identificar a aquellos miembros de la librería (particularmente especies o subclases químicas) que exhiben una actividad característica deseada. Los compuestos así identificados pueden servir como "compuestos de guía" convencionales, cemo compuestos para clasificación, o como terapéuticos . En ciert s modalidades, las librerías combinatorias de moduladores potenciales se clasifican por una habilidad para enlazar un polipéptido de cáncer o para modular la actividad. Convencionalmente, nuevas entidades químicas con propiedades útiles se generan al identificar un compuesto químico (llamado un "compuesto de guía") con alguna propiedad o actividad deseable, por ejemplo, actividad de inhibición, creación de variantes del compuesto de guía y evaluación de la propiedad y actividad de sus compuestos variantes, Frecuentemente , los métodos de clasificación de alto rendimiento (HTS) se emplean para tal análisis. que en l za pe ro no es catalizado o alterado por la enzima. La marca también puede ser una porción o compuesto, tal como, tal como una marca de epitope o biotin que específicamente enlaza estreptavidina . Por ejemplo para el ejemplo de biotin, la est reptaví di na [se marca como es descrito en lo anterior, para proporcionar de esta manera una señal detectable para la secuencia objetivó enlazada. La estreptavidina marcada no enlazada es típicamente removida antes del análisis. Como será apreciado por aquellos expertos en la técnica, estos ensayos pueden ser ensayos de hibridación directa o pueden comprender "ensayos de intercalación", que incluyen el uso ce múltiples sondas, como es generalmente resumido en la patentes norteamericana Nos. 5,681,702 5,597,909; 5,545, 730; 5,594,117; 5,591,584; 5,571,670 5,580,731; 5,571, 670; 5,591,584; 5,624,802; 5,635,352 5,594,118; 5,359, 100; 5,124,246; y 5,681,697. En esta modalidad, en general, el ácido nucleico objetivo se prepara como es resumido en lo anterior, y luego se adiciona el biochip que comprende una pluralidad de sondas de ácido nucleico, bajo condiciones que permiten la formación de un complejo de hibridación. Una var iedad de condiciones de hibridación se utiliza en ,_a pre er.te invención, incluyendo condiciones de alta, moderada y baja severidad como es resumido en lo anterior. Los ensayos generalmente se corren bajo condiciones de severidad que permite la formación del complejo de hibridación de sonitia de marca solamente en la presencia del objetivo. La severidad puede ser controlada al alterar un parámetro de la e;tapa que es una variable termodinámica, incluyendo, pero no limitada a, temperatura, concentración de formamida, concentración de sal, pH de la concentración de la sal caotrópica, concentración de solvente orgánico, etc. Estos parámetros también, se pueden utilizar para controlar el enlace no específico, como es generalmente resumido en la patente norteamericana No. 5,681,697. Así, puede ser deseable realizar ciertas etapas en condiciones de más alta severidad para reducir el enl.ace no especifico. Las reacciones resumidaas en la presente se pueden realizar en una variedad de maneras. Los componentes de la reacción se pueden adicionar simultáneamente, o secuencialmente, len diferentes ordenes, con modalidades preferidas resumidas enseguida. Además, la reacción puede incluir una vari< dad de otros reactivos. Estos incluyen, sales, solucione reguladoras, proteínas neutras, por eejjeemmpplloo,, aallbbúúmmiinnaa,, detergentes, etc. que se pueden utilizar para facilitar la hibridación de y detección óptima, y/o reducir las interacciones no específicas o de fondo. Los reactivos que de ctra mejoran la eficiencia del ensayo, tales como los inhibidores de proteasa, inhibidores de nucleasa, aaggeenntteess aannttii--mmiiccrrbbianos, etc. también se pueden utilizar como sea apropiado, dependiendo de los métodos de preparación de la muestra y la pureza del objetivo. Los datos de ensayo se analizan para determinar los niveles de expresión de los genes individuales, y los cambios en los nieles de expresión como entre los estados, formando un perfil de expresión de gen. Ensayos Pielacionados con la Actividad Biológica La invención proporciona métodos para identificar o clasificar un comóuesto que modula la actividad de un gen relacionado con cjáncer o proteína de la invención. Los métodos comprenden adicionar un compuesto de prueba, como es definido en lo aJiterior, a una célula que comprende una proteína de canee:: de la invención. Las células contienen ácido nucleico recombinante que codifica una proteína de cáncer de la invención. En otra modalidad, se prueba una librería de agentes candidatos sobre una pluralidad de células . En un aspecto, los ensayos se evalúan en la presencia o ausencia o la exposición previa o subsecuente de señales tisioloai cas, por ejemplo, hormonas, anticuerpos, péptidos, antígenfs, citoquinas, factores de crecimiento, potenciales de aipción, agentes farmacológicos incluyendo quimioterapéu icos radiación, carcinogénicos, u otras células (es deciir, contactos de célula-célula) . En otro ejemplo, la determinación se hace en diferentes etapas del ciclo celular. De esta manera, se identifican compuestos que modulan genes o pr Dteínas de la invención. Los compuestos con a ct i v iciad fa rmaco 1 Dgica son capaces de aumentar o interferir la actividad de lp proteína de cáncer de la invención. Una vez identificadas, las estructuras similares se evalúan para identificar carafteri sti cas estructurales críticas del compuesto . En una jnodalidad, se proporciona un método para modular (por ejemplo, inhibir) la división de la célula de cáncer; el método comprende la administración de un modulador de cáncer. En otra modalidad, se proporciona un método para modular (por ejemplo, inhibir) el cáncer; el método comprende de un modulador de cáncer. En una modalidad adicional, se proporcionan métodos para tratar células o individuos con cár.cer; el método comprende la administración de un modulador de cáncer. En una mo a 1 idad , se proporci ona un método para modular los estados de un una célula que expresa un gen de la invención. Como se utiliza en la presente el estado comprende tales parámetros aceptados en la técnica tal como el crecimiento, proliferación, supervivencia, función, apoptosis, senesc ncia, localización, actividad enzimática, transducción de se;ñal, etc. de una célula. En una modalidad, un inhibidor de cáncer es un anticuerpo como es discutido en lo anterior. En ofjra modalidad, el inhibidor de cáncer es una la clase de proteínas a la cual el objetivo pertenece, por ejemplo, sustratos para enzimas, o ligandos y receptores. Uso del Crecimiento en Agar Blando y la Formación de Colonia para Identificar y Caracterizar Moduladores Las célullas normales requieren un sustrato sólido para fijarse y crecer. Cuando las células se transforman, ellas pierden su fenotipo y crecen desunidas del sustrato, Por ejemplo, las células transformadas pueden crecer en cultivo o suspension agitada o suspendidas en medio semi-sólido tal como agar semi-sólido blando. Las células transformadas, cuándo se transfectan con genes supresores de tumor, pueden regenerar el fenotipo normal y una vez nuevamente requiere de un sustrato sólido para unirse y crecer. El crecimiento en agar blando o la formación de colonia en ensayos se utilizan para identificar moduladores de secuencias de cáncer, que cuando se expresan en células hospederas, inhiben la proliferación y transformación celular anormal. Un modu ador reduce o elimina la habilidad de la célula hospedera para crecer suspendida en el medio sólido o semisólido, tal como agar. Las técnicas para el crecimiento en agar blando o la formación de colonia en ensayos de suspensión se describen en Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (3rd ed., 1994). Ver también, los métodos de la sección de Garkavtsev y colaboradores, (1996), supra .

Evaluación de la Inhibición de Contacto y la Limitación de Densidad de Crecimiento para Identificar y Caracteri ar Moduladores Las células normales típicamente crecen en un patrón plano y organizado en el cultivo de células hasta que ellas tocan otras células. Cuando las células se tocan entre sí, ellas inhiben el contacto y se detiene el crecimiento.

Las células transformadas, sin embargo, no se inhiben en el contacto y continúan creciendo a altas densidades en focos desorganizados. Así, las células transformadas crecen a una densidad de saturación más alta que las células normales correspondientes . Esto es detectado morfológicamente por la formación de una monocapa desorientada de células o células en los focos. Alternativamente, el índice de marcación con (3H) -timidina en censidad de saturación se utiliza para medir la limitación de densidad del crecimiento, de manera similar un MTT o ensayo de azul. Alamar revelará la capacidad de proliferación de las células y la habilidad de los moduladores para afectar a las mismas. Ver, Freshney (1994), supra . Las célula s transformadas, cuando se transfectan con genes supresores de tumor, pueden regenerar un fenotipo normal y llegar a inhibir el contacto y crecerían a una densidad inferior En este ensayo, el índice de marcación con ( 3H) -timidi na en la densidad de saturación es un método preferido para medir la limitación de densidad del crecim i ent.o La células hospederas transformadas se transfectan con una secuencia asociada con cáncer y se cultivan durante 24 horas a una densidad de saturación en condiciones del medio no limitativas. El porcentaje de marcación de oé1 u1 as con (?) -timidina se determina mediante el cpm incorporado El creoimiento independiente del contacto se utiliza para ident ificar moduladores de secuencias de cáncer, que han conducido a la proliferación y transformación celular anormal. Un modulador reduce o elimina el crecimiento independiente del contacto, y regresa a las células un fenotipo normal. Evaluacipn De Factor de Crecimiento o Dependencia del Suero para Identificar y Caracterizar Moduladores Las célilas transformadas tienen dependencia del suero inferior que sus contrapartes normales (ver, por ejemplo, Temin, Jl. Nati. Cáncer Inst. 37:167-175 (1966); Eagle y colaboradores, J. Exp. Med 131: 836-879 (1970)); Freshney, supra . Esto en parte debido a la liberación de varios factores de crecimiento por las células transformadas. El grado del factor de crecimiento o dependencia del suero de las células hospederas transformadas se puede comparara con aquella del control. Por ejemplo, el factor de crecimiento o dependencia del sµero de una célula se monitorea en métodos para identificar v caracterizar compuestos que modulan las secuencias asociad s con cáncer de la invención. Uso de N veles Marcadores Específicos de Tumor para Identificar y Caracterizar Moduladores Las cél ulas de tumor liberan una cantidad incrementada de c iertos factores (después en la presente "marcadores espec ificos de tumor") que sus contrapartes normales. Por ejemplo, un activador de plasminógeno (PA) se libera del gliomai humano a un nivel más alto que de las células del cerebro normal (ver, por ejemplo, Gullino, Angiogenesis, T Umor Vascularization, and Potential Interference with Tumor Growth, in Biological Responses in Cáncer, pp . I"78- i? 4 (Mihicii (ed.) 1985)). De manera similar, del Factor de Angiogénesis de Tumor (TAF) se libera un nivel más alto en las células del tumor que sus contrapartes normales. Ver, por ejemplo, Folkman, Angiogenesis and Cáncer, Sem. Cánc Bi o" . (1992)), mientras que bFGF se libera de los tumores endoteliales (Ensoli, B y colaboradores) . Varias técnicas que miden la liberación de estos factores son desqritas en Freshney (1994), supra . También, ver, Unkless y colaboradores, J. Bíol. Chem. 249:4295-4305 (1974) Stricklan i & Beers, J. Biol. Chem. 251 :5694-5702 (1976) Whur y colaboradores, Br . J. Cáncer 42:305 312 (1980) Gullino, Angiogenesis, Tumor Vascularization, and Potential Interférence with Tumor Growth, in Biological Responses in Cáncer, pp. 178-184 (Mihich (ed. ) 1985); Freshney,- Anticancer Res. 5:111-130 (1985). Por ejemplo, los niveles de marcadDr específicos de tumor se monitorean en métodos para identificar y caracterizar compuestos que modulan las secuencias asociadas con cáncer de la invención. Invasividad en Matrigel para Identificar y Caracterizar Moduladores El grado de invasividad en Matrigel o un constituyente de matriz extracelular se pueden utilizar como un ensayo para i dentificar y caracterizar compuestos que modulan las secuencias asociadas con cáncer. Las células de tumor exhiben una correlación positiva entre la malignidad e invasividad de Las células en Matrigel o algún otro constituyente de matriz extracelular. En este ensayo, las células tumorigénicas típicamente se utilizan como células hospedera. La expresión de un gen supresor de tumor en estas células hospederas disminuiría la invasividad de las células hospederas. Las técnicas descritas en Cáncer Res. 1999; 59:6010; Freshney (1994), supra , pueden ser utilizadas. Brevemente, el nivel de invasión de las células hospederas se mide al utilizar filtros recubiertos con Matrigel o algún otro constituyente: de matriz extracelular. La penetración en el gel, o a través del extremo distante del filtro, se clasifica como ir vasividad y se clasifica histológicamente por el número de c élulas y la distancia movida, o mediante la premarcación de las células con 125 y al contar la radioactividad en el extremo distante del filtro o fondo del disco. Ver, por ej emplo, Freshney (1984), supra . Evaluaci n del Crecimiento de Tumor In Vivo para Identificar y Caraeterizar Moduladores Los efectos de las secuencias asociadas con cáncer en el crecimiento de las células se prueban en organismos transgénicos o imrriuno-suprimidos . Los organismos transgénicos se preparan en una variedad de maneras aceptadas en la técnica. Por ejemplo, los organismos transgénicos inactivados, por ejemplo, mamíferos tales como ratones, se hacen, en el cual un gen de cáncer se interrumpe o en el cual se insertar un gen de cáncer. Los ratones transgénicos inactivados se haqen mediante la inserción de un gen marcador u otro gen heteróllogo en el sitio de gen de cáncer endógeno en el genoma del ratón por la vía de la recombinación homologa. Tales ratones también se pueden hacer al sustituir el gen de cáncer endógeno con una versión mutada del gen de cáncer, o al mutár el gen de cáncer endógeno, por ejemplo, mediante la exposición al carcinógeno. Para preparar animales quiméricos transgénicos, por ejemplo, ratones, una construcción de DNA se introduce en los núcleos de las c élulas madre embriónicas. Las células que contienen la lesi bu. genética recientemente diseñadas inyectan en un embrión de L ratón hospedero, que es re-implantado en una hembra reci iente. Algunos de estos embriones se desairo! lan en ratones quiméricos que poseen células germinales algunas de las cuales son derivadas de la línea de célula mutante. Por lo tanto, al reproducir los ratones quiméricos es posable obtener una nueva línea de ratones que contiene la lesión genética introducida (ver, por ejemplo, Capecchi y colaboradores, Science 244:1288 (1989)). Los ratones quiméricos pueden ser derivados de acuerdo con la patente norteamericana 6,365,797, expedida el 2 abril del 2002; patente no rteamericana 6,107,540 expedida el 22 de agosto del 2000; Hogan y colaboradores, Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labor tor y (1988} anci Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practiqal Approach, Robertson, ed., IRL Press, Washington, D.C. (1987) Alternativamente, varios animales hospederos inmuno-suprimí dos o inmuno-deficientes pueden ser utilizados. Por ejemplo, un ratón "desnudo" genéticamente atímico (ver, por ejemplo, Giovanella y colaboradores, J. Nati. Cáncer Inst. 52:921 (197 4)), un ratón SCID, un ratón timectomizado, o in ratón irradiado (ver, por ejemplo, Bradley y colaboradores, Br. J. Cáncer 38:263 (1978); Selby y colaboradores, Br. J. Cáncer 41:52 (1980)) puede ser utilizado como un hospedero. Las células de tumor transpl tables de manera típica aproximadamente 106 proteína se mide utilizando inmunoensayos tal como el manchado de Western, ELISA y los similares con un anticuerpo que selectivamente enlaza al polipéptido de cáncer o un fragmento del mismo. Para la medición del mRNA, se prefiere la ampl i ficaeion, por ejemplo, utilizando PCR, LCR, o ensayos de hibridación, por ejemplo, hibridación de Northern, protección de RNAsa, manchado de puntos. El nivel de proteína o mRNA se detecta utilizando agentes de detección directa o indirectamente marcados, por ejemplo, ácidos nucleicos fluorescente o radioactivamente marcados, anticuerpos radioactivos o enzimáticamente marcados y los similares, como es descrito en la presente . Alternat ivamente, un sistema de gen reportador puede ser ideado utilizando un promotor de proteína de cáncer operablemente en azado a un gen reportador tal como luciferasa, prote ina fluorescente verde, CAT, o P-gal. La construcción reportadora típicamente se transfecta en una célula. Después del tratamiento con un modulador potencial, la cantidad de la transcripción, traducción o actividad del gen reportador se; mide de acuerdo con técnicas estándares conocidas para aquellos de habilidad en la técnica (Davis GF, supra ; González, J. & Negulescu, P. Curr. Opin. Biotechnol. 1998: 9:624) . Como es resumido en lo anterior, las clasificaciones in vitro se hacen en genes individuales y productos de gene 3. Esto es, teniendo identificado un gen particular diferepcialmente expresado como importante en un estado particular, la clasificación de los moduladores de la expresión de gen o producto de gen mismo es realizada. En una modalidad, se realiza la clasificación para modulares de expresión de gen(es) específico (s) . Típicamente, la expresión de solamente uno o unos cuantos genes es evaluada. En otra modalidad, las clasificaciones se diseñan para primero eneontrar diseños que enlazan a proteínas diferencialmente expresadas. Estos compuestos luego se evalúan por la habilidad para modular la actividad diferencialmente expresada. Además, una vez que se ident. i f i ß n los compuestos candidatos iniciales, las variantes pueden ser además clasificadas para mejor evaluar las relaciones de estructura actividad. Ensayos_ jde Enlace para Identificar y Caracterizar Modulares Los ensa yos de enlace de acuerdo con la invención, un producto de ge n purificado o aislado de la invención es generalmente util izado. Por ejemplo, los anticuerpos se generan a una proteína de la invención, y los inmunoensayos se corren para de lerrainar la cantidad y/o la localización de la proteína. Alternativamente, las células que comprenden las proteínas de caneer se utilizan en los ensayos. Así, los métodos comprenden combinar una proteína de cáncer de la invención y un compuesto candidato tal como un ligando, y determinar el enlace del c:ompuesto a la proteína de cáncer de la invención. Las modalidades preferidas se uti.Lizan en la proteína de cáncer humana; o también se pueden desarrollar y utilizar modelos de animales de enfermedad humana. También, otras proteínas mamíferas o análogas también pueden ser utilizadas como es apreciado por aquellos de habi .idad en la técnica. Además, en algunas modalidades, se ?tilizan proteínas de cáncer variantes o derivadas . Generalmente, la proteína de cáncer de la invención, o el 1t.gando, es enlazada no difundiblemente a un soporte insoluole El soporte puede ser, por ejemplo, uno que tiene áreas de recepción de muestra aisladas (una placa de microtítulo, un a rreglo, etc.). Los soportes insolubles se pueden hacer de ;ualquier composición a la cual se pueden enlazar las compo siciones, se separa fácilmente del material soluble, y es de otra manera compatible con el método de clasificación total. La superficie de cada uno de los soportes puede ser sólida o porosa y de cualquier forma conveniente . Ejemplos de soportes insolubles adecuados incluyen placas de microtitulo, arreglos, membranas y cuentas. Estos típicamente hacen de vidrio, plástico (por ejemplo poliestireno) , polisacárido, nylon, nitrocelulosa, o Teflon™, etc. Las placas de microtítulo y arreglos son especialmente convenientes debic.o a que un número grande de ensayos se puede llevar a cabo simultáneamente, utilizando cantidades pequeñas de reactivos y muestras. La manera particular de enlace de la composición al soporte no es crucial mientras que sea compatible; con los reactivos y los métodos globales de la invención, mantenga la actividad de la composición y no sea difundible. Los métodos preferidos de enlace incluyen el uso de anticuerpo 5 que no bloquean esféricamente ya sea el sitio de enlace del ligando o la secuencia de activación cuando se une la proteína al soporte, el enlace directo a suporte "pegajoso" o iónicos, reticulación química, la síntesis i la p;|oteína o agente sobre la superficie, etc. Después del enlacé de la proteína o ligando/agente de enlace al soporte, el material no enlazado en exceso se remueve mediante lavado, Las áreas que reciben la muestra luego pueden ser bloque das a través de la incubación con albúmina de suero bovino (BSA) , caseína u otra proteína inocua u otra porción. Una vez que una proteína de cáncer de la invención se enlaza al soporte, y se adiciona un compuesto de prueba al ensayo. Alternativamente, el agente de enlace candidato se enlaza al soporte; y luego se adiciona la proteína de cáncer de la invención. Los agentes de enlace incluyen anticuerpos específicos, agentes de enlace no naturales identificados en las clasificacion s de librerías químicas, o análogos de péptido, etc. De particular interés son los ensayos para identificar agentes que tienen una baja toxicidad para las células humanas. Una amplia variedad de ensayos pueden ser utilizados para este propósito, incluyendo ensayos de proliferación, ensayos cAMP, ensayos de enlace de proteína-proteína in vi tro marcados, ensayos de desplazamiento de movilidad electrc forética, inmunoensayos para enlace de proteína, ensayos funcionales (ensayos de fosforilación, etc.) y los similares . Una det erminación del enlace del compuesto de prueba (ligando, agente de enlace, modulador, etc.) a una proteína de cáncer de la invención se puede hacer en un número de maneras J El compuesto de prueba puede ser marcado, y el enlace determinado directamente, por ejemplo, al unir toda o una porciór. de la proteína de cáncer de la invención a un soporte sólido, al adicionar un compuesto candidato marcado (por ejemplo, una marca fluorescente), al deslavar el reactivo en exceso, y al determinar si la marca está presente en el soporte sóLido. Se pueden utilizar varias etapas de bloqueo y lavado como sea apropiado. En ciertas modalidades, solamente uno de los componentes es marcado, por ejemplo, una proteína de la invención o ligandos marcados. Alternativamente, más de un componente es marcado con diferentes marcas, por ejemplo, I"""", pai a l s pro pinas y un fluoróforo para el compuesto, También son útiles los reactivos de proximidad. Por ejemplo, reactivos de apagamiento o de transferencia de energía Enlace Cpmpetitivo para Identificar y Caracterizar Moduladores En una modalidad, el enlace del "compuesto de prueba" se determina mediante en ensayo de enlace competitivo con un "competidor'". El competidor es una porción de enlace que enlaza a la molécula objetivo (por ejemplo, una proteína de cáncer de 1a invenció) . Los competidores incluyen compuestos tales como anticuerpos, péptidos asociados de enlace, ligando, c. Bajo ciertas circunstancias, el enlace competitivo entre el compuesto de prueba y el competidor ddeessppllaazzaa eell ccoommppuesto de prueba. En una modalidad, el compuesto de prufeba es marcado. Ya sea el compuesto de prueba, el competidor o ambos, se adiciona a la proteína durante un tiempc suficiente para permitir el enlace. Las incubaciones se realizan a una temperatura que facilita la actividad óptima, típicamente entre cuatro y 40°C. Los periodos de incubación típicamente son optimizados, por ejemplo, para facilitar la clasificación de alto rendimiento rápida; típicamente entre cero y una hora será suficiente. El reactivo en exoesp es generalmente removido o deslavado. El segundo componente luego es adicionado, y la presencia o ausencia del compfnente marcado es seguid, para indicar el enlace En una modalidad, el competidor se adiciona primero, seguido por el compuesto de prueba. El desplazamiento del competidor es una indicación de que el compuesto de pruekia está enlazado a la proteína de cáncer y así es capaz de enlazar a, y potencialmente modular, la actividad de la proteína de cáncer. En esta modalidad, cualquier modalidcjd puede ser marcada. Así, por ejemplo, sí el competidor es marcado, la presencia de la marca en la solución de lavaco del compuesto de post-prueba indica el desplazamiento por- el compuesto de prueba. Alternativamente, sí el cc)nvpu sto c Í prueba es marcado, la presencia de marca sobre el soporte i.ndica el desplazamiento. En una modalidad alternativa, el compuesto de prueba se adicior a primero, con la incubación y el lavado seguiao por e_ ompetidor. La ausencia de enlace por el competidor indic que el compuesto de prueba enlaza la proteína de caneer con afinidad más alta que el competidor. Así, sí el compue to de prueba es marcado, la presencia de la marca sobre el so DOrte, acoplado con una falta de enlace del competidor, indica que el compuesto de prueba enlaza a, y de esta manera potenóialmente modula la proteína de cáncer de la invención . Por consiguiente, los métodos de enlace competitivos comp enden la clasificación diferencial para identificar agentes que son capaces de modular la actividad de las proteínas de cáncer de la invención. En esta modalidad, los mé ':odos comprenden combinar una proteína de cáncer y un comp* tir en una primera muestra. Una segunda muestra comprende un compuesto de prueba, la proteína de cáncer y un compet idor. El enlace del competidor se determina para ambas muestre s, y un cambio, o diferencia en el enlace entre las dos mués tras indica la presencia de un agente capaz de enlazar a la p roteína de cáncer y potencialmente modular su actividad. Es :o es, sí el enlace del competidor es diferente en la s egunda muestra con relación a la primera muestra, el agente es capaz de enlazar a la proteína de cáncer. Alternat. vamente, la clasificación diferencial se utiliza para icient i f icar candidatos de fármacos que enlazan a la proteína de cá cer nativa, pero no pueden enlazar a las proteínas de cánc< ;r modificadas. Por ejemplo, la estructura de la proteína de cáncer se modela y se utiliza en un diseño de fármaco racione .1 para sintetizar agentes que interactúan con ese sitio, a <3entes que generalmente no enlazan a las proteínas modificadas en el sitio. Además, tales candidatos de fármacos que afectan la actividad de una proteína de cáncer n t iva ta bién son identificados a clasificar fármacos por la habilidad para ya sea aumentar o reducir la actividad de tales proteínas Los cont :roles positivos y controles negativos se pueden utilizar e los ensayos. Las muestras de control de prueba de preferencia se realizan por lo menos por triplicado para obtener resi Itados estadísticamente significantes. La incubación de todas las muestras ocurre durante un tiempo suficiente para p rmitir el enlace del agente a la proteína, Después de la incubación, las muestras se lavan libres del material no espec ticamente enlazado y la cantidad de agente generalmente marc do, enlazado, se determina. Por ejemplo, donde se emplea una radiomarca, las muestras pueden ser contadas en un • :ontador de centelleo para determinar la cantidad de co pue sto enlazado. Una va iedad de otros reactivos pueden ser iinncclluuiiddooss eenn llooss ensayos de clasificación. Estos incluyen, reactivos similar s a sales, proteínas neutras, por ejemplo albúmina, detergentes, etc. que se utilizan para facilitar el enlace de proteína-proteína óptimo y/o reducir las interacciones no específicas o de fondo. También se pueden utilizar reactivos que de otra manera mejoran la eficiencia del ensayo, tales como inhibidores de proteasa, inhibidores de nucleasa, agentes anti-microbianos, etc. La mezcla de componentes se adiciona en un orden que proporciona el enlace necesario Uso de Polinucleótidos para Regular hacia Abajo o Inhibir una Proteíha de la Invención Los moduladores de polinucleótido de cáncer se pueden introducir a una célula que contiene la secuencia de nucleótidos objet vo mediante' la formación de un conjugado con una molécula de enlace de ligando, como es descrito en WO 91/04753. Las moléculas de enlace de ligando adecuadas incluye, pero nc están limitadas a, receptores de la superficie de la célula, factores de crecimiento, otras citoquinas, u otrc s ligandos que enlazan a los receptores de la superficie de 1a célula. De preferencia, la conjugación de la molécula de enlace de ligando no interfiere sustancialmente con la habilidad de la molécula de enlace del ligando para rila zar a su molécula un receptor correspondiente, o bloquear la entrada del oligonucleótido de sentido o antisentido o sobre acción conjugada con la célula. Alternativamente, un modulador de polinucleótido de cáncer puede ser introducido en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleitio objetivo, por ejemplo, mediante la formación de un complejo de polinucleótido-lípido como es descrito en WO 90 10448. Se entiende que el uso de moléculas antisentido o in, ctivaciones en y en modelos inactivados también pueden s ;r utilizados en ensayos de clasificación como es discutido en lo anterior, además de los métodos de tratamiento Nucleótipos Inhibitorios y Antisentido En ciertas modalidades, la actividad de una proteína asociada con cáncer es regulada hacia abajo, o completamente inhibida, mediante el uso de polinucleótido antisentido o RN£ nuclear pequeño inhibitorio (snRNA) , es decir, un ácido nucleico complementario a, y que de preferencia puede hibridar específicamente a, una secuencia de ácido nucleico de mRNA de codificación, por ejemplo, una proteína de cáncer' de la invención, mRNA, o una subsecuencia de la misma. El erilace de polinucleótido antisentido al mRNA rreedduuccee llaa ttrraadduucccciión y/o la estabilidad del mRNA. En el contexto de esta invención, los polinucleótidos anltisent ido pueden comprender nucleótidos que ocurren naturalmente, o especies sintéticas formadas de subunidades que ocurren naturalmente o sus homólogos cercanos. Los polinucleótidos antisentido también pueden tener porciones ble azúcar alteradas o enlaces de inter-azúcar. Ejemplares entre estos están el fosforotioato u otras especies que cont ienen azufre que son conocidas para el uso en la técnica. os análogos están comprendidos por esta invención mientras que ellos funcionan de manera efectiva para hibridarse con los nucleótidos de la invención. Ver, por ejemplo, Isis Pha maceuticals, Carlsbad, CA; Sequitor, Inc., Natick, MA. Tales Klir.ucieótidos antisentido fácilmente se pueden sintetizar utilizando medios recombinantes, o se pueden sintetizar in vi tro . El equipo para tales síntesis es vendido por varios vendedores, incluyendo Applied Biosystems. La preparación de otros oligonucleótidos tales como fosforotioatos y derivados alquilados también es bien conocido para aquelíos expertos en la técnica. Las moléculas ant i sentido como se utilizan en la presente, oligonupleótidos antisentido o de sentido. Los oligonucleótidos de sentido se pueden emplear, por ejemplo, para bloquear la transcripción mediante el enlace a la hebra antisentido. El oiigonucleótido de antisentido y de sentido comprende una secuencia de ácido nucleico de una sola hebra (ya sea RNA DNA) capaz de enlazar el mRNA objetivo sentido) o la secuencia de DNA (antisentido) para moléculas de cáncer. Los ol Lgonucleótidos antisentido o de sentido, de acuerdo con la p.resente invención, comprenden un fragmento generalmente de por lo menos aproximadamente 12 nucleótidos, de preferencia de; aproximadamente 12 a 30 nucleótidos. La habilidad para derivar un oligonucleótido antisentido o de sentido, basado en una secuencia de cDNA que codifica una proteína dada se describe en, por ejemplo, Stein &Cohen (Cáncer Res. 48:2659 (1988 y van der Krol y colaboradores, (BioTechniques 6:958 (1988)). Ribozim= s Ademá de los polinucleótidos antisentido, las ribozimas se pueden utilizar para dirigir e inhibir la transcripción de 1as secuencias de nucleótidos asociadas con cáncer. Una rittozima es una molécula de RNA que catalíticamente se gmenta otras moléculas de RNA. Diferentes clases de ribozima s han sido descritas, incluyendo ribozimas del grupo I, ribozimas de cabeza de martillo, ribozimas de horquilla, RNase P, y ribozimas de hachuela (ver, por ejemplo, Castanotto y colaboradores, Adv. in Pharmacology 25: 289-317 (1994) pa a una revisión general de las propiedades de diferentes ribozimas) . Las características generales de las ribozimas de horquilla son Rescritas, por ejemplo, en Hampel y colaboradores, 1Sucl. Acids Res. 18:299-304 (1990); Publicación cié patente Europea No. 0360257; patente norteamericana No. 5,254,678. Los métodos de preparación son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica (ver, por ejemplo, WO 94/2 877; Ojwang y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 90 : 6340-6344 (1993); Yamada y colaboradores, Human Gene Therapy 1:39-45 (1994); Leavitt y colaboradores, Proc. Nati. Acad Sci. USA 92:699-703 (1995); Leavitt y colaboradores, Human Gene Therapy 5: 1151-120 (1994); y Yamada y colaboradores, Virology 205: 121-126 (1994)). Uso de Mpd ladores en la Clasificación Fenotípica En una modalidad, un compuesto de prueba se administra a una ¡población de células de cáncer, que tienen un perfil de expresión de cáncer asociado. Por "administración" o "contacto" en la presente se propone que el modular se adiciona a las células de tal manera para permitir que el modulador actúe sobre la célula, ya sea mediante la captacion de una acción intracelular, o mediante la acción en la superficie de la célula. En algunas modalidades, un ácido nucleico que codifica un agente proteinaceo (es decir, un péptido) se coloca en una construcción viral tal como una construcción viral adenoviral o retroviral, y se adiciona a la célula, tal que la expresión del agente de p sptido es realizada, por ejemplo, PCT US97/01019. También se pueden utilizar sistemas de terapia de gen regulables, una. vez que el modulador se ha administrado a las células, las qélulas se lavan sí es deseado y se dejan incubar bajo condiciones preferentemente fisiológicas por algún periodo. Las células luego se recolectan y se genera un nuevo perfil de ex 1resión de gen. Así, por ejemplo, el tejido de cáncer se clasif ica para agentes que modulan, por ejemplo, inducen o suprimen, el fenotipo de cáncer. Un cambio en por lo menos un gen, de preferencia a muchos, del perfil de expresión indica qr e el agente tienen un efecto de actividad de cáncer. De mane a similar, la alteración de una función biológica o una ruta señalización es indicativa de la actividad del mod lador. Al definir tal señal para el fenotipo de cáncer , se idean clasificaciones par5a nuevos fármacos que altera : el fenotipo. Con este procedimiento, el objetivo de fármaco necesita ser conocido y no necesita ser representado en la plataforma de clasificación de expresión de gen/proteína or :iginal, ni al nivel de transcripto para la proteína objetivo, necesaria para el cambio. La función de inhibición del modulador servirá como un marcador suplente Como eís resumido en lo anterior, las clasificaciones se hacen para estimar genes o productos de genes. Esto es, t Miendo identificado un gen diferencialmente expresado particular como importante en un estado particular, se realiza la clasificación de moduladores de ya sea la expresión del gen o el producto de gen mismo. Uso de Moduladores para Afectar los Péptidos de la Invención Las mediciones de la actividad de polipéptido de cáncer, o de fenotipo de cáncer se realizan utilizando una variedad de ensayos. Por ejemplo, de los moduladores en la función de un (os) polipéptido (s) de cáncer se miden al examinar los parám tros descritos en lo anterior. Un cambio fisiológico que afecta la actividad se utiliza para estimar la influencia de un compuesto de prueba sobre los polipéptidos de esta invención. Cuando los efectos funcionales son de terminados utilizando células intactas o animales, una varié dad de efectos se puede estimar tal como, en el caso de un cáncer asociado con tumores sólidos, crecimiento de tumor, metástasis de tumor, neovascularización liberación de hormona, cambios transcripcionales ambos de los marcadores genéticos conocidos y no caracterizados (por ejemplo, el manchado de Northern), cambio del metabolismo ele la célula tal como el crecimiento de la fcélula o cambios en el pH, y cambios en los segundos mensajeros intracelulares tal como cGNIP. Métodos para Identificar la Caracterización de Secuencias Asociadas con Cáncer La expr sión de varias secuencias de gen está correlacionada có el cáncer , Por consiguiente, los desórdenes basados en genes rie cáncer, mutantes o variantes son determinados. En una modalidad, la invención proporciona métodos para identificar células que contienen genes de cáncer variantes, por ejemplo, la determinación de la presencia de, toda o parte, la secuencia de por lo menos un gen de cáncer endógeno en una célula. Esto se realiza utilizando cualquie [r número de técnicas de secuenciación. La invención comprende métodos para identificar el genotipo de cáncer de un individuo, por ejemplo, la determinación de toda o parte de la secuencia de por lo menos un gen de la invención en el inc.ividuo. Esto se hace generalmente en por lo menos un tejide del individuo, por ejemplo, un tejido expuesto en la Tabla I, y puede incluir la evaluación de un número de tejidos o diferentes muestras del mismo tejido. El método puede incluir la comparación de la secuencia del gen secuenciado a un gen de cáncer conocido, es decir, un gen de tipo silvestre para determinar la presencia de miembros de la familia, homologías, mutaciones o variantes. La secuencia de toda o parte del gen luego puede ser comparada a la secuencia de gen de cáncer conocido para determinar sí existe alguna diferencia. Esto se hace utilizando cualquier número de programas de homc logia conocida, tal como BLAST, Bestfit, etc. La presencia do una diferencia en la secuencia entre el gen de cáncer del paciente y el gen de cáncer conocido se correlaciona con un estado de enfermedad o una propensión para un estado de enfermedad, como es resumido en la presente . En una rr.odalidad preferida, los genes de cáncer se utilizan como sondas para determinar el número de copias del gen de cáncer en el genoma. Los genes de cáncer se utilizan como sondas para determinar localización cromosómica de los genes de cáncer Información tal como la localización cromosómica encuer tra uso en la provisión de una diagnosis o prognosis cn par ticuiar cuando animalidades cromosómicas tales como translfcaciones y los similares son identificadas en el sitio del gen de cáncer. XIV.) RNAi y Uso Terapéutico del RNA de Interferencia Pequeña (siRNAs) La presente invención también se dirige hacia oligonucleótidos siRNA, particularmente RNAs de doble hebra que comprende por lo menos un fragmento de la región de codificación de PSCA o regiones 5" UTR, o complemento, o cualquier oligonucleótido antisentido específico a la secuencia de PSCA. En una modalidad tales oligonucleótidos se utilizan para porter en claro una función de PSCA, o se utilizan para cíasificar o evaluar moduladores de la función o expresión de PSCA. En otra modalidad, la expresión de gen ce- PSCA se reciuce al utilizar la transfección de siRNA y da por resultado la capacidad proliferativa significativamente disminuida de las células de cáncer transformadas que expresan endógenamente el antígeno; células tratadas con siRNAs de PSCA eápecíficas mostraron supervivencia reducida como es medido, pfr ejemplo, mediante una lectura metabólica de la viabilidad celular, la correlación con la capacidad proliferativa reducida. Así, las composiciones de siRNA de PSCA comprenden siRNA (RNA de doble hebra) que corresponde a la secuencia de ORF de ácido nucleico de la proteína PSCA o subsecuencias de la misma; estas subsecuencias son generalmente 5, 6| 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o máis de 35 nucleótidos de RNA contiguos en longitud y confie ;ne secuencias que son complementarias y no complementarias a por lo menos una porción de la secuencia de codificación de mRNA. En una modalidad preferida, las subsecuencias son de 19-25 nucleótidos en longitud, más de preferencia 21-23 nucleótidos en longitud. La interferencia de RNA es un procedimiento novedoso para silenciar genes in vi tro e ín vivo, de esta manera los RN?s de doble hebra pequeños (siRNAs) son agentes terapéuticos valiosos. El poder de los siRNAs para silenciar actividades de gen específicas ahora ha sido llevado a modelos de animal .?s de enfermedad y su utiliza en humanos también. Por eje>mplo, la infusión hidrodinámica de una solución de siRNA en un ratón con un siRNA contiene un objetivo particular se ha probado que es terapéuticamente e f ec t iva El traba jo pionero por Song y colaboradores, indica que un tipo de ácido nucleico completamente natural, RNAs de interferencia pequeña (siRNAs), sirvieron como agentes terapéuticos aún sin modificación química adicional (Song, E., y colaboradores, "RN? interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis" Nat. Med. 9(3): 347-51(2003)).

Este trabajo proporcionó la primera evidencia in vivo de que la infusión de siRNAs en un animal podría librar la enfermedad. En ese caso, los autores dieron a los ratones inyecciones de siPNA diseñadas para silenciar la proteína FAS un receptor de muerte celular que cuando se sobre activa durante la respuesta inflamatoria induce los hepatocitos y otras células a rrorir) . Al siguiente día, a los animales se les dio un antiquerpo específico de Fas. Los ratones de control muriero de falla del hígado aguda dentro de uno cuantos días, mi ntras que arriba de 80% de los ratones tratados con siRNA permanecieron libres de enfermedad seria y sobrevivieron. Ap oximadamente 80% a 90% de sus células del hígado incorporar n los oligonucleótidos de siRNA desnudos, Además, las mole ulas de RNA funcionaron durante 10 días antes de perder su efecto después de 3 semanas. Para uso en la terapia humana, siRNA se suministra por métodos efic .entes que inducen actividad de RNAi de duración larga. U na mayor notificación para uso clínico es suministrar siRNAs a las células apropiadas. Los hepatocitos se observan que son particularmente receptivos al RNA exógeno. Hoy en o%a, los objetivos localizados en el hígado son atractivos dekj>ido a que el hígado es un órgano que puede ser fácilmente dir igido por las moléculas de ácido nucleico y vectores virales, Sin embargo, otros objetivos de tejido y órgano son preferidos también. Las fornulaciones de siRNAs con compuestos que promueven el trán; ito a través de las membranas celulares se utilizan para me orar la administración de siRNAs en la terapia. El siRNA sintético químicamente modificado, que son resistentes a nu< leasas y tienen estabilidad en el suero tienen duración umentada concomitante de los efectos de RNAi, son una modallidad adicional, Así, la tecnología de siRNA es un medio terapéutico para la malignidad humana por el suministro de moléculas de siRNA dirigidas a PSCA a individuos con los cánceres, tales como aquellos listtados en la Tabla 1. Tal administración de siRNAs conduce al crecimiento reducido de células de cáncer que expresan PSCA, y proporcionan una terapia antitumoral, diminuyendo la morbosidad y/o mortalidad asociada con la malignidad . La efectividad de esta modalidad de la inactivación del producto de gen es significante cuando se mide in vi tro e in vivo . La efect vidad in vi tro es fácilmente demostrable a través de la aplicación de siRNAs a las células en cultivo (como es descrito en lo anterior) o alícuotas de biopsias de pacientes de cáncer cuando se utilizan métodos in vi tro para detectar la exprésion reducida de la proteína PSCA. XV. ) Equipos/Artículos de Manufactura Para us<p en las aplicaciones de laboratorio, de pronostico, profá lácticas, de diagnóstico y terapéuticas descritas en la presente, los equipos están dentro del alcance de la invtención. Tales equipos pueden comprender un portador, paquete o contenedor que tiene compartimientos para recibir uno o más contenedores tales como frasquitos, tubos y los similares, cada uno del (os) contenedor (es) que comprende uno de los elementos separados para ser utilizados en el método, junto ccn una etiqueta o inserto que comprende instrucciones para el uso, tal como un uso descrito en la presente , Por ejemplo, el (los) contenedor (es) puede comprender una sonda que está o puede ser detectablemente marcada. Tal sonda puede ser un anticuerpo o polinucleótido especifico para una proteína o un gen o mensaje de la invención, respectivamente. Donde el método utiliza la hibridación de ácido nucleico para detectar el ácido nucleico objetivo, el equipo también puede contener contenedores que contienen nucleótido(s) para la amplificación de la secuencia de ácido nucleico objetivo. Los equipos pueden comprender un contenedor que corrjprende un reportador, tal como una proteína que enlaza biotin, tal como avidina o estreptavidina, enlazado a una molécula reportadora, tal como una marca enzimática, fluorescente o de radioisótopo; tal reportador puede ser utilizado con, por ejemplo, un ácido nucleico o anticuerpo. El e guipo puede incluir toda o parte de la secuencia de aminoácidos en la Figura 1, Figura 2 o Figura 3 o análogos de las mismas, o una molécula de ácido nucleico que codifica tales secuencias de aminoácidos. El equióo de la invención típicamente comprenderá el contenedor descrito en lo anterior y uno más contenedores asociados con el mismo que comprenden materiales deseables desde un punto de vista comercial y para el usuario, incluyendo soluciones reguladoras, diluyentes, filtros, agujas, jeringas; etiquetas de portador, paquete, contenedor, frasquito y/o tubo que lista los contenidos y/o instrucciones como secuencia (s) de aminoácidos, molécula (s) pequeña (s) secuencia (s) de ácido nucleico y/o anticuerpo (s) , por ejemplo, materiales útiles para la diagnosis o prognosis, profilaxis y/o el tratamiento de neoplasias de tejidos tales como aquellos expuestos en la Tabla I es proporcionado. El articulo de manufactura típicamente comprende por lo menos un contenedor y por lo menos una etiqueta. Los contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frasquitos, jeringas y tubos ce prueba. Los contenedores se pueden formar de una variedad de materiales tales como vidrio, metal o plástico. El contenedor puede contener secuencia (s) de aminoácidos, molébula(s) pequeña (s), secuencia (s) de ácido nucleico, población (es) de células y/o anticuerpo (s) . En una modalidad, el contenedor contiene un polinucleótido para el uussoo eenn eell eexxaammeenn del perfil de expresión de mRNA de una célula, junto con reactivos utilizados para este propósito. En otra modalidad un contenedor comprende un anticuerpo, fragmento de enlacie del mismo o proteína de enlace específica para el uso en la evaluación de la expresión de proteína de PSCA en células de tejidos o para propósitos relevantes de laboratorio, pronóstico, diagnóstico, profilácticos y terapéuticos; ind:. caciones y/o instrucciones para tales usos pueden ser incluidos sobre o con tal contenedor, como pueden ser los reactivos y otras composiciones o herramientas utilizadas para estos propósito. En otra modalidad, un contenedor compreride materiales para inducir una respuesta inmune celular humoral, junto con indicaciones y/o instrucciones asociadas. En otra modalidad, un contenedor comprende materia es para la inmunoterapia adoptiva, tales como células T citotóxicas (CTL) o células T ayudantes (HTL) , junto con indicaciones y/o instrucciones asociadas, reactivos y otras composiciones o herramientas utilizadas para tal propósito también bueden ser incluidos. El contenedor puede contener alternativamente una composición que es efectiva para el tratamiento, diagnosis, prognosis o profilaxis de una composición y pueden tener un orificio de accesc estéril (por ejemplo el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasquito que tiene un tapón pe rforable mediante una aguja de inyección hipodérmica) . Los agentes activos en la composición pueden ser un anticuerpo capas de enlazar específicamente PSCA y modular la función de PSCA. El artículo de manufactura además puede comprender un segundo contene]por que comprende una solución reguladora ffaarrmmaaccééuuttiiccaammeennttee aceptable, tal como solución salina regulada con fosfato, solución de Ringer y/o solución de dextrosa. Además puede incluir otros materiales deseables desde un punto ce vista comercial y para el usuario, incluyendo otras soluciones reguladoras, diluyente, filtros, agitadores, agujas, jeringas y/o insertos de paquete con indicaciones y/o i nstrucciones para el uso. EJEMPLOS: Varios aspectos de la invención se describen adicionalmente y son ilustrados por medios de los diversos ejemplos que sigu sn, ninguno de los cuales se propone para limitar el alcance de la invención. Ejemplo 1 Análisis de Expresión de Variantes de PSCA en Tejidos Noriales y Muestras de Pacientes Previame nte, PSCA, referido en la presente como PSCA v.l, se ide ntificó como un antígeno expresado en el cáncer de próstat Su expresión se detectó en mayor que 80% de los cánceres dé próstata primarios y en la mayoría de las metástasis de próstata. También se ha mostrado que es expresado en el cáncer de vejiga, cáncer de ovario y el cáncer pancreático ; estos cánceres son listados en la Tabla I. Mediante el análisis inmunohistoquímico, PSCA se ha mostrado que es sobreexpresado sobre la superficie de la célula de la mayoría de carcinomas transcicionales uroteliales, y en 60% de adenocarcinomas pancreáticos primarios. Los dat os de expresión de PSCA se han reportado en publicaciones de patentes ( PCT/US98/04664 , PCT/US/28883, PCT/US00/19967) y en artículos revisados escudriñosamente (Saffran y colabpradores., Proc Nati Acad Sci EUA. 2001 Febrero 27; 98(5) ; 2658-2663; Amara y colaboradores, Cáncer Res. 15 de Jun o del 2001; 61 ( 12 ): 4660-65, Reiter y colaboradores, Proc Nati Acad Sci EUA. 17 de Febrero de 1998; 95(4) :1735-40; Afg ani y colaboradores, Cáncer Res. 1 de Junio del 2001; 61(11) :4320-24) . La expresión específica de diferentes variantes de PSCA se estudia en muestras de pacientes normales y con cáncer. Los cebaqores se diseñaron para diferenciar entre PSCA v.l/v.2/v.4, PSCA v.3 y PSCA v.5. PSCA v.l/v.2/v.4 condujo a un produlcto de PCR de 425 bp, PSCA v.3 conduce a un producto de PCR de 300 bp, mientras que PSCA v.5 conduce un producto de PCR de 910 bp en tamaño (Figura II (a)), El cDNA de primera hebra se preparó a partir de la vejiga normal, derebro, corazón, riñon, hígado, pulmón, próstata, bazo, músculo esquelético, testículo, páncreas, ccoolloonn,, eessttóómmaaggoo,, a acumulación de cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñon, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de ovarioj cáncer de seno, metástasis de cáncer y cáncer de páncreas (Figura II (b) ) . La normalización se realizó mediante PCR utilizando cebadores para actina. La PCR semi-cuantitativa, utilizando los cebadores específicos de variantes se realizó en 30 ciclos de amplificación. Los res altados muestran la expresión de PSCA v.5 principalmente en el cáncer de seno, metástasis de cáncer y cáncer de páncrea?, y en nivel inferior en el cáncer de colon y cáncer de pulnón. El producto de PSCA v.l/v.2/v.4 se muítixenoinj ertos, riñon normal y próstata. PSCA v.5 se detectó solamente en la próstata normal y el cáncer de vej iga . La expresión restringida de las variantes de PSCA en tejidos nórmale:s y la expresión detectada en muestras de pacientes con cáncer indica que las variantes de PSCA son objetivos terapéuticos, de pronóstico, de laboratorio, profilácticos y de diagnóstico para cánceres humanos. EJEMPLO 2 Variantes de Empalme de PSCA Como se útiliza en la presente, el término variante incluye variantes de trascripto y polimosfirmos de nucleótido individual (SNPs) . Las variantes de transcriptos son variantes de mRNA rhaduro del mismo gen que surge mediante de la trascripción alternativa o el empalme alternativo. Los trascriptos alternativos son transcriptos del mismo gen pero inicia la trascripc Ii.o,n de diferentes puntos. Las variantes de empalme son varian es de mRNA empalmadas diferentemente del mismo trascripto. En las eucariotas, cuando un gen multi-exón es trascripto del DNA genómico, al RNA inicial se empalma para producir mNRA, funcional, que tiene solamente exones y es utilizado para la traducción en una secuencia de aminoácidos. Por consiguiente, un gen dado puede tener de cero a muchos transcritos alternativos y cada trascripto puede tener de ce ro a muchas variantes de empalme. Cada variante de trascripto tiene una constitución de exón única, y puede tener dife rentes porciones de codificación y/o de no codificación (extremo 5' o 3' ) del transcripto original. Las variantes de transcripto pueden codificar para las mismas, similares o diferentes proteínas, tales proteínas que tienen la misma o una funcion similar o una función diferente. Las proteínas variantefe pueden ser expresadas en el mismo tejido al mismo tiempo, en un tejido diferente al mismo tiempo, o en el mismo tejido en diferentes tiempos, o en un tejido diferentes en un t;iempo diferente. Las proteínas codificadas por una variante de transcripto pueden tener similares o diferentes localiz ciones subcelulares o extracelulares (por ejemplo, secretadas contra intracelulares) . Las variantes de transcriptos son identificadas por una variedad de métodos aceptados en la técnica. Por ejemplo, los transcriptos ai ternativos y las variantes de empalme son identificadas por la clonación de longitud completa, o mediante del uso de transcripto de longitud completa y secuencias EST. Primero, todas las ESTs humanas se agruparon en agrupaciones que muestran la identidad directa o indirecta entre sí. Segundo, las ESTs en la misma agrupación fueron además agrupadas en su agrupación y ensambladas en una secuencia consensúa1. La secuencia de gen original se compara la(s) secuencia (s) consensual u otras secuencias de longitud completa, Cada secuencia consensual es una variante de empalme potenqial para ese gen. Varias modalidades de confirmación son conocidas en la técnica, tal como la identificación de la variante mediante el análisis de Northern, la clonación de longitud completa o mediante del uso de librerías ce sondas, etc. Aún cuando una variante es identificada que no es todavía un clon de longitud completa esa porción de la variante es muy útil como una herramienta de investigación, ror ejemplo, para la generación de antígeno o para la clonación adicional de la variante de empalme de longitud completa, utilizando técnicas conocidas en el arte. Además, están disponibles los programas de computadora en la técnica que identifican variantes de transcripto basado en secuencias genómicas. Los programas de identificación de variante de transcripto de base genómica incluyen FgenesH (A. Salamov y V. Solovyev, "Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA", Genome Research. Abril del 2000; 10(4) :5 6-22); Grail(URL compbio.ornl.gov/Grail-bin/EmptyGrailform) y GenScan(URL genes.mit.edu/GENSCAN.html). Para una discusión general de los protocolos de identificación de variante de empalme ver, por ej emplo South n, C, A genomic perspective on human porteases, FEBS Let t. 8 de Junio del 2001; 498 (2-3) : 214-8, de Souza, S.J y colaboradores, Identification of human chromosome 22 transcribed sequences with ORF expressed sequence tags, Proc. Nati Acad Sci EUA. Noviembre del 2000 7; 97 (23) : 12690-3 Para confirmar adicionalmente los parámetros de una variante de transcripto, una variedad de técnicas están disponibles en el arte, tal como la clonación de longitud completa, validaci 3n proteómica, validación basada en PCR y la validación 5' RACE etc. (ver, por ejemplo validación Proteomica: Brennan, S.O., y colaboradores., Albumin banks península: a new termination variant characterized by electrospray mass spectrometry, Biochem Biophys Acta. 17 de Agosto de 1999; 1433 (1-2) : 321-6; Ferranti P y colaboradores, Differential splicing of premessenger RNA produces múltiple forms de caprine alpha (si) -casein, Eur J Biochem. 1 de Octubre de 1997; 2¡49(1) : 1-7. Para validación basada en PCR: Wellman S y colaboradores, Specific reverse transcription-PCR quantification of vascular endothelial growth factor (VEGF) splice variants by LightCycler technology, Clin Chem. Abril del 2001; 47 (4) : 654¡ -60; Jia, H.P. y colaboradores, Discovery of new human beta-defensins using a genomics-based approach, Gene. 24 de Enero del 2001; 263 ( 1-2 ): 211-8. Para la validación basada en PCR y 5' RACE: Brigle, K.E. y colaboradores, Orgamization of the murine reduced folate cerrier gene and ¡Ldentification of variant splice forms, Biochem Biophys Acta. 7 de Agosto de 1997; 1353 (2) : 191-81 Es conocido en la técnica que las regiones genómicas son moduladas en cánceres. Cuando la región genómica a la cual] se mapea un gen, es modulada en un cáncer particular, los transcriptos alternativos o variantes de empalmen del gen son modulados también. En la presente se divulga que PSCA tiene un perfil de expresión particular relacionado con cáncer (ver, por ejemplo, Tabla I) . Los transcriptos alternativos y variantes de empalme de PSCA también están invo lucrados en cánceres, por ejemplo en uno o más de estos tejidos y en ciertos tejidos adicionales también. Las variantes de esta manera sirven como marcadores/antígenos asociados con el tumor. Utilizando el gen de PSCA de longitud completa junto con las secuencias EST, se identificaron cuatro variantes de transcripto adicionales, designadas como PSCA v.2, v.3., v.4, ¿ v.5. Los límites de los exones en el transcripto original, PSCA v.l se mostraron en la Tabla VI. Las secuencias para PSCA y las variantes de PSCA se exponen en la Figura 1. Ejemplo3 Polimorfismos de Nucleótido Individual de PSCA Un polimcjrfismo de nucleótido individual (SNP) es una variación de pares de bases individual en una secuencia de nucleótidos en lana localización específica. En cualquier punto dado del gencma, hay cuatro posibles pares de bases de nucleótidos: A/T, |C/G, G/C y T/A. Como se utiliza en la presente, un alelo és uno de una serie de formas alternativas de un gen dado, di1firiendo en la secuencia de DNA y afectando un producto (RNA y/o proteínas) Un SNP c ue ocurre en un cDNA es llamado un cSNP. Este cSNP puede cambiar los aminoácidos de la proteína codificada por el gen y así cambiar la función de la proteína. Algunos SNPs causan enfermedades heredadas; otros contribuyen a vari aciones cuantitativas en el fenotipo y las reacciones a fac tores ambientales incluyendo dietas y fármacos entre los individuos. Por lo tanto, la existencia de un SNP y/o combinaciones de alelos (llamados haplotipos) tienen muchas aplicaciones exitosas, tal como la diagnosis de enfermedades heredadas determinación de reacciones de fármaco y dosificación, identificación de genes indispensables para enfermedades, y análisis de la relación genética entre los individuos (P. Nowotny, J. M. Kwon y A. M. Goate, "SNP analysis to dissect human traits", Curr. Opin. Neurobiol. Octubre del 2001; jl (5) : 637-641; M. Pirmohamed y B. K. Park, "Genetic susceptibility to adverse drug reactions". Trends Pharmacol. Sci. Jur|?io del 2001; 22(69:298-305; J. H. Riley, C. J. Alian, E. Lai y A. Roses, "The use of single nucleotide polymorphisms in tihe isolation of common disease genes", Pharmacogenomics . Febrero del 2000; l(l):39-47 R. Judson. J.

C. Stephens y A. Windemuth, "The predictive power of haplotypes in clinical response". Pharmacogenomics. Febrero del 2000; 1 (1) : 15-2(5) .

Los SNPs son identificados por una variedades de métodos aceptados en la técnica (P. Bean, "The promising voyage of SNP targét discovery", Am. Clin. Lab. Octubre- Noviembre del 2001 ; 20(9):18-20; K. M. Weiss, "In search of human variation", Genome Res. Julio del 1998; 8 (7 ): 691-697 ; M. M. She, "Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies", Cli n. Chem. Febrero del 2001; 47 (2) : 164-172) .

Por ejemplo, los SNPs son identificados mediante la secuenciación de flragmentos de DNA que muestran polimorfismo mediante los métodos basados en gel tal como el polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) y la electroforesis de gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) . Ellos también se descubrieron mediante la secuenciación directa de mués tras de DNA acumuladas de diferentes individuos o al comparar secuencias de diferentes muestras de DNA. Con la acumulación rápida de datos de secuencia en bases de datos públicas y privadas, también se descubrieron SNPs al comparar secuencí is utilizando programas de computadora (Z. Gu, L. Hillier y ?. Y. Kwok, "Single nucleotide polymorphism hunting in cyberp ce", Hum. Mutat. 1998; 12 (4 ): 221-225) . Los SNPs pueden ser verificados y el genotipo o haplotipo de un individuo puede er determinado mediante una variedad de métodos incluyeir.do la secuenciación directa y los microarreglos de lto rendimiento (P. Y. Kwok, "Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms", Annu. Rev. Genomics Hum. Gene" . 2001; 2:235-258; M. Kokoris, K. Dix, K. Moynihan, J. Math is, B. Edwin, P. Grass, B. Hiñes y A. Duesterhoeft, "Hi jh-throughput SNP genotyping with the Masscode system". Mol. Diagn. Diciembre del 2000; 5(4):329-340) . Utilizanco los métodos descritos en lo anterior, tres SNP fueron identificados en el trascripto para PSCA v.2. La variante 2 se utilizó, antes que para la variante 1 del ejemplo, ya que esta tuvo menos bases ambiguas que la variante 1. Por c msiguiente, los SNPs fueron identificados en PSCA v.2, en las posiciones 57 (t/c) , 367 (c/t), 424 (a/c), 495 (c/g), 99 (c/t), 563 (c/t), 567 (g/a), 634 (t/g), 634, (t/g), 835 g/a), 847 (g/a), 878 (g/a) y 978 (c/g). Los transcriptos o p oteínas con alelos alternativos fueron designados como variantes de PSCA v.6 hasta v.18, como se muestra en la Figura IB y la Figura 1G. El cambii de nucleótido en v.6 cambió el codon de inicio de 1.1 y . sí, la traducción no iniciaría hasta el siguiente ATG (AUG en mRNA) dando por resultado una proteína de 9 AA más corta que la proteína v.l. Los cambios de nucleótido para v. 7 y v.8 fueron silenciosos al nivel de la proteína . Doce de =stos 13 SNPs también estuvieron presentes en la variante 4. as 12 variantes de SNP con relación a PSCA de RNA. El RNA de IfSCA transcrito que representa la región de codificación de amp.noácidos cDNA- del gen PSCA se utiliza en sistemas de tradu :ción in vi tro tal como el TnT™ Coupled Reticulolysate Sy£ tem (Promega, Corp., Madison, Wl) para sintetizar proteíne PSCA. B. Construcci nes Bacterianas: Construcd:iones pGEX : Para generar proteínas PSCA recombinantes de bacterias que son fusionadas a la proteína glutationa S-trans::erasa (GST) , toda o partes de la secuencia que codifica la proteína cDNA de PSCA son clonadas en la familia pGEX de los -vectores de fusión de GST (Amersham Pharmacia Biotech , Piscataway, NJ) . Estas construcciones permiten la expresión controlada de secuencia de proteína PSCA recombinante con GST fusionado en el amino-terminal y un epítope de seis histidinas (6X His) en el carboxilo-terminal. Las eti uetas GST y 6X His permiten la purificación de la proteína de fusión recombinante a partir de las bacterias inducidas con la matriz de afinidad apropiada y permite el recono cimiento de la proteína de fusión con los anticuerpos anti-GST y anti-His. La etiqueta 6X His es generada al adicicnar seis codones de histidina al cebador de clonación en el extremo 3' , por ejemplo, de la estructura de lectura abierta (GRF) . Un sitio de segmentación proteolítico, tal como el sitio de reconocimiento PreScission™ en pGEX-6p-1, puede ser empleado tal que permite la segmentación de la etiqueta GST de la proteína relacionada con PSCA. El gen de resistencia de amjpicilina y el origen pBR322 ' permite la selección y el mantenimiento de los plásmidos pGEX en E. coli . Construcciones pMAL: Para generar, en las bacterias, las proteínas PSCA recombinantes que son fusionadas a la prjoteína de enlace de maltosa (MBP) , toda o parte de la secuencía de codificación de proteínas cDNA PSCA son fusionadas al gen MBP mediante la clonación en los vectores pMAL-c2X y pMAL-p2X (New England Biolabs, Beverly, MA) . Estas constru aciones permiten la expresión controlada de las secuencias d a proteínas PSCA recombinantes con MBP fusionadas en al amino-terminal y una etiqueta de epítope 6X His en el carboxilo-terminal . Las etiquetas MBP y 6X His permiten la purificación de la proteína recombinante a partir de bacterias induc idas con la matriz de afinidad apropiada y permite el reconocimiento de la proteína de fusión con los anticuerpos anti- BP y anti-His. La etiqueta de epítope 6X His se genera al adicionar seis codones de histidina al cebador de clonación 3' . Un sitio de reconocimiento del factor Xa permite a la segmentación de la etiqueta pMAL a partir de PSCA Los vectores pMAL-c2X y pMAL-p2X son optimizados para expresar la proteína recombinante en el citoplasma o periplasma respectivamente. La expresión del periplasma aumenta el plegamiento de las proteínas con los enlaces de disulfuro Construcqiones pET: Para expresar PSCA en células bacterianas, toda o partes de la secuencia de codificación de proteína cDNA PSCA son clonadas en la familia pET de vectores (Novagen, Madison, Wl). Estos vectores permiten la expresión herméticamente cont rolada de la proteína PSCA recombinante en bacterias con y ¡in fusión a proteínas que aumentan la solubilidad, tal corno NusA y tioredoxina (Trx) y etiquetas de epítope, tales corno 6X His y S-Tag™ que ayudan a la purificación y detj ección de la proteína recombinante. Por ejemplo, se hacen construcciones utilizando el sistema de fusión 43.1 pET Nue.A tal que las regiones de la proteína PSCA son expresadas come fusiones amino-terminales a NusA. C. Construccic nes de Levadura: Construcqiones pESC: Para expresar PSCA en la especie de leva iura Saccharomyces cerevisiae para la generación de proteína recombinante y estudios funcionales, toda o partes de la secuencia de codificación de proteína cDNA PSCA son clor adas en la familia pESC de vectores cada una de las cuales contiene uno de cuatro marcadores seleccionables, HlS3, TRP1, LEU2 y URA3 (Stratagene, La Jolla, CA) . Estos vectores permiten expresión controlada del mismo plásmido de hasta dos genes diferentes o secuencias clonadas que conti nen cualquiera de las etiquetas de epítope Flag™ o Myc en la misma célula de levadura. Este sistema es útil para confirmar las interacciones de proteína-proteína de la PSCA. Además la expresión en levadura produce modificaciones po s-traduccionales similares, tales como glicosilaciones y fosforilaciones, que se encuentran cuando se expresan en células eucarióticas. Construcciones pESP: Para expresar PSCA en la especie de lavadura Saccharomyces pombe, toda o partes de la secuencia de codificación de proteínas cDNA PSCA son clonadas en la familia pESP de ve ctores. Estos vectores permiten el nivel alto controlado de expresión de una secuencia de proteína PSCA que es fusior ada a ya sea el amino terminal o en el carboxilo terminal a GST que ayuda a la purificación de la proteína recombinante. Una etiqueta de epítope Flag™ permite la detección de la proteína recombinante con el anticuerpo anti-Flag TM Ejemplo 5 Producción de PSQA Recombinante en Sistemas Eucarióticos Superiores A. Construcciones de Mamíferos: Para expresar PSCA recombinante en células-eucarióticas, las secuencias de cDNA PSCA de longitud completa o parcial o variantes de las mismas, pueden ser clonadas en cualqvjiiera de una variedad de vectores de expresión conocida en la técnica. Una o más de las siguientes regiónes de PSCA son expresadas en estas construcciones, aminoácidos 1 a 123, o cualquiera de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 , 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 2' , 30 o más aminoácidos contiguos de PSCA v.l, variantes de EjSCA o análogos de los mismos, Las construcciones pueden ser transfectadas en cualquiera de una amplia variedad de células mamíferas tales como células 293T. Los lisados de células 293T transfectados pueden ser sondeados con el suero policlonal anti-PSCA descrito en la pres!ente . Construcc roñes pcDNA4/H?sMax : Para expresar PSCA en células mamíferas, una ORF de PSCA, o porciones de la misma, de PSCA son clonadas en la versión A de pcDNA4/H?sMax (Invitrogen, Carlsbad, CA) . La expresión de proteínas es inducida del promotor de citomegalovirus (CMV) y el aumentador de traducción SP16. La proteína recombinante tiene XpressTM y epítopes de seis histidmas ( 6X His) fusionados a la mmo-termmal . Él vector pcDNA4/H?sMax también contienen la señal de poliade :n?lac?ón de hormona de crecimiento bovina ((BBGGHH)) yy llaa sseeccuueennccia de terminación de transcripción para aumentar la estabilidad de mRNA junto con el origen SV40 para la replicación episomal y el rescate del vector simple en lineas de células que expresan el antígeno T grande. El gen de resistencia Ze Dcín permite la selección de células mamíferas que expresan la protema y el gen de resistencia de ampicilina y el rigen ColEl permite la selección y el mantenimiento del plasma en E. coli . Construccliiones pcDNA3.1/MycHis: Para expresar PSCA en células mamíferas, una ORF de PSCA, o porciones de la misma de PSCA con jan sitio de iniciación de traducción Kozak consensual se cío )n? en la versión A de pcDNA3.1/MycHis (Invitrogen, Caris>bad, CA) . La expresión de proteína es inducida del promot:or de citomegalovirus (CMV) . Las proteínas recombinantes tienen el epítope myc epítope 6X His fusionados al carb Dxilo terminal. El vector pcDNA3.1/MycHis también contiene 1 a señal de poliadenilación de hormona de crecimiento bovina (BGH) y la secuencia de terminación de transcripción para aumentar la estabilidad de mRNA, junto con el origen SV40 pa :a la replicación episomal y rescate de vector simple en líneas de células que expresan el antígeno T grande. El gen de resistencia de neomicina puede ser utilizado, ya que permite la selección de células mamíferas que expresan la proteína y el gen de resistencia a ampicilina y el origen ColEl permite la selección y el mantenimiento del' plasmo en E. coli . Construcción pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO: Para expresar PSCA en células mamfLferas y para permitir la detección de las proteínas recombinantes utilizando fluorescencia, una ORF de PSCA, o porciones ce las mismas, con un sitio de iniciación de traducción Kozak consensual son clonados en pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO (Invitroc en, CA) . La expresión de proteínas es inducida del promot:or de citomegalovirus (CMV) . Las proteínas recombinantes tienen la Proteína Fluorescente Verde (GFP) fusionada al carboxilo terminal facilitando la detección in vivo, no invasiva y los estudios de biología celular. El vector pcDNA3.1CT-GEP-TOPO también contiene la señal de poliadenilación de hormona de crecimiento bovina (BGH) y la secuencia de terminación de transcripción para aumentar la estabilidad de mPNA junto con el origen SV40 para la replicación episoma 1 de rescate del vector simple en líneas de células que expresan el antígeno T grande. El gen de resistencia a Neomicina permite la selección de células mamíferas que expre1san la proteína, y el gen de resistencia a ampicilina y el qrigen ColEl permite la selección y el mantenimiento del plasma en el E . coli . Construcciones adicionales con unk fusión GFP amino-terminal se hacen en pcDNA3.1/NT-GFP-TOPp que abarca la longitud completa de una proteína PSCA. PAPtag: Ulna ORF de PSCA, o porciones de la misma, es clonada en Papta?g-5 (GenHunter Corp. Nashville, TN) . Esta construcción genera una fusión de fosfatasa alcalina en el carboxilo-terminal fe una proteína PSCA mientras que funciona la secuencia de señal IgG? a la mino-terminal. También se generan construcciones en las cuales la fosfatasa alcalina con una secuencia de señal IgG? amino-terminal es la fusionada al amino terminal de una proteína PSCA. Las proteínas PSCA recombinantes resultantes se optimizan para la secreción en el medio de células mamíferas transfectadas y pueden ser utilizadas para rectificar proteínas tales como ligandos o receptores que interactúan con proteínas PSCA. La expresión de prote ína es inducida del promotor CMV y las proteínas recombina ntes también contienen los epítopes myc y 6X His fusionados en carboxilo-terminal que facilita la detección y purificación. El gen de resistencia Zeocin presente en el vector permite la selección de células mamíferas que expresan la proteína recombinante y el gen de resistencia ampicilina permite la selección del plásmido en E. coli . ptag5 : Un ORF de PSCA, o porciones de la misma, se clonó en pTag-5. Este vector es similar a pAPtag pero sin fusión de fosfataisa alcalina. Esta construcción genera proteína PSCA con uma secuencia de señal IgG? amino-terminal y las etiquetas de epítope myc y 6X His en el carboxilo terminal que fácil ta la detección y la purificación por afinidad. La proteína PSCA recombinante resultante es optimizada para la ecreción en el medio de células mamíferas transfectadas, y s utiliza como inmunógeno ligando para identificar proteínas tales como ligandos o receptores que interactúan con las proteínas PSCA. La expresión de proteína es inducida del promotor CMV. El gen de resistencia a zeocin presente en el veptor permite la selección de las células mamíferas que expresan la proteína, y el gen de resistencia a ampicilina permite la selección del plásmido en E. coli . PsecFc: Una ORF de PSCA, porciones de la misma, se clonó en psecFc. Eil vector psecFc se ensambló al clonar la inmunoglobulina Gl (IgG)Fc (enlace, regiones CH2, CH3) en pSecTag2 (Invitrogén, California). Esta construcción genera una fusión de IgGl Fe en el carboxilo terminal de las proteínas PSCA, mi entras que la fusión de la secuencia y señal IgGK a N-terrr.inal . También se utilizan fusiones de PSCA utilizando la regi ím IgGl Fe de murino. Las proteínas PSCA recombinante resultantes se optimizan para la secreción en el medio de células mamíferas transfectadas, y se pueden utilizar como inmunógenos o para identificar proteínas tales como ligandos o receptores que interactúan con la proteína PSCA. La expresión de proteínas es inducida del promotor CMV. El gen de resisten cia a higromicina presente en el vector permite la selecci 5n de células mamíferas que expresan la proteína recombinante, y el gen de resistencia a ampicilina permite la selección del plásmido en E. coli La Figura 8 muestra en la expresión y purificación de la proteína PSCA psecFc de las células 293T. Construcciones pSRa: Para generar líneas de células mamíferas que expresan PSCA constitutivamente, ORF de PSCA, porciones de las mismas, de PSCA se clonaron en construcciones pSRco. Retrovirus anfotrópicos y ecotrópicos se generaron mediante la transfección de construcciones de pSRaa: en la lí nea de empaquetamiento 293T-10A1 o la cotransfección de pSRa y un plásmido ayudante (que contiene secuencias de empacuetamiento suprimidas) en las células 293, respectivamente. EL retrovirus se utiliza para infectar una variedad de líneas de células mamíferas, dando por resultado la integración de gen clonado, PSCA, en las líneas de células hospederas La expresión de proteína es inducida desde una repetición terminal larga (LTR) . El gen de resistencia a Neomicina presente en el rector permite la selección de células mamíferas que expresa la proteína, y el gen de resistencia a ampicilina y el origen ColEl permite la selección y el mar.tenimiento del plásmido de E. coli . Los vectores retrovirales después pueden ser utilizados para la infección y generación de varias líneas de células utilizando, por ejemplo, las células PC3, NIH 3T3, TsuPrl, 293 o rat-1. La Figura 6 muestra la expresión de PSCS en líneas de células de murino, de rata y de humano recombinantes utilizando la constitución PSCA.pSRa. Las líneas de células de murino, de rata y de humano indicadas se infectaron con el retrovirus que lleva el cDNA de PSCA humano y un gen de resistencia a neomicina o con solamente el gen de resistencia a neomicina. Las líneas de células recombinantes estables se crearon mediante la selección del fármaco G418. La expresión de PSCA se determinó mediante el manchado FACS con el 1G8 anti-PSCA MAb (5 pg/ml) . Se muestra el perfil FACS de cada línea de célula que muestra una desviación fluorescente solamente en la línea infectada de PSCA indicando la expresión de PSCA que la superficie de la célula. Estas líneas son útiles en el desarrollo de MAb como inmunógeno, reactivos de clasificación de MAb y en ensayos funcionales, Se hacen construcciones de pSRa adicionales que fusionan una etiqueta de epitope tal como la etiqueta PLAG™ al carboxilo terminal de las secuencias de PSCA para permitir la detección utilizando anticuerpos anti-Flag. Por ejemplo la secuencia FLAG™ 5' gat tac aag gat gac gac gat aag 3' (SEQ ID NO:76) se adiciona al cebador de clonación en el extremo 3' de la ORF. Las construcciones pSRa adicionales se hacen para producir tanto GFP de arrimo terminal y carboxilo terminal y las proteínas de fusión myc/6X His de las proteínas PSCA de longitud completa. Vectores Virales Adicionales : Se hacen construcciones adaJcionales para el suministro mediado viral y la expresión de P SCA. El alto título de virus que conduce a la expresión de alto nivel de PSCA se logra en sistemas de suministro virales tales como los vectores adenovirales y los vectores de amplicón de herpes. Las secuencias de codificación de PSCÁ o fragmentos de las mismas se amplifican mediante PCR y se subclonan en el vector de lanzadera AdEasy (Stratagene) . La recombinación y el empaquetamiento del virus se realizan de aci erdo con las instrucciones del fabricante para generar vectores adenovirales . Alternativamente, las secuencias de codificación de PSCA o fragmento de las mismas se clonan en el vector HSV-1 (Imgenex) para generar vectores virales de herpes, Los vectores virales después se utilizan para la infección de varias líneas de células tales como células PC3, NIH 3T3, 293 o rat-1. Sistemas de Expresión Regulada: Para controlar la expresión de PSCA en células mamíferas, las secuencias de codificación de PSC , o porciones de las mismas, se clonan en sistemas de expresi .ón mamíferos regulados tal como el sistema T-Rex (Invitrogen), el sistema GeneSwitch (Invitrogen) y el sistema Ecdysone herméticamente regulado (Sratagene) . Estos sistemas permiten el estudio de los efectos temporales y dependientes de la concentración del PSCA recombinante. Estos vectores después se utilizan para controlar la expresión de PSCA en varias líne as de células tales como células PC3, NIH 3T3, 293 o rat-1. B. Sistemas cjie Expresión de Baculovirus Para generar proteínas PSCA recombinantes en un sistema de expresión de baculovirus, la ORF de PSCA, o porciones de la misma, se clonan en el vector de transferencia de bdculovirus pBlueBac 4.5 (invitrogen), que proporciona un His-tag en el N-terminal. Específicamente, pBlueBac-PSCA es co-transfectado con el pBac-N-Blue de plásmido ayudante (Invitrogen) en células de insecto SF9 (Spodoptera Frugiperda) para generar baculovirus recombinantes (ver el manual de instrucción de Invitrogen para detalles). El baculovirus luego se recolecta del sobrenadante de células y se purifica mediante el ensayo de placa . La proteína PSCA recombinante luego se genera mediante la infección de células de insecto HighFIve (Invitrogen) con baculovirus purificado. La proteína PSCA recombinante puede ser detectada utilizando anti-PSCA o anticuerpo anti-His-tag. La proteína PSCA puede ser purificada y utiliz :ada en varios ensayos basados en células o ccoommoo iinnmmuunnóóggeennoo pp>ara generar anticuerpos policlonales y monoclonales específicos para PSCA. C. Vectores de Expresión para Ortólogos de PSCA Ortólogos de ratón y de mono de PSCA se clonaron en la Versión A de pe:DNA3.1/MycHis (Invitrogen, Carlsbad, CA) .

La expresión de ¡proteína es inducida del promotor de citomegalovirus (CMV) . Las proteínas recombinantes tienen el epítope myc y el epítope 6X His fusionado al carboxilo-terminal. Estos vectores permiten la expresión de los ortólogos de PSCA para analizar la reactividad cruzada de los anticuerpos PSCA anti-humanos monoclonales.

Los ortologos de ratón y de mono de PSCA también se clonaron en cons trucciones pSRa. Las construcciones pSRa permiten la generación de líneas de células mamíferas que expresan ortólogos PSCA constitutivamente. La expresión de proteína es inducida del promotor de citomegalovirus (CMV) . Las proteínas re combinantes tienen el epítope myc y el epítope 6X His fusionado al carboxilo-terminal . Estos vectores permiten la expresión de ortólogos de PSCA para analizar la react ividad cruzada de los anticuerpos de PSCA antihumano monoclonales y para estudiar la actividad funcional de lqs ortólogos de PSCA. Los retrovirus anfotrópicos y ecotrópicos se generaron mediante la transfección de construcciones pSRa en la línea de empaquetamiento 2S 3T-10A1 o la co-transfección de pSRa y un plásmido ayudante (que contiene secuencias de empaquetamiento suprimidas) en las células 293, respectivamente. El retrovirus se utiliza para infectar una variedad de líneas de células mamíferas, que da por resultado la integración del gel clonado, el ortólogo de PSCA, en las líneas de células hospederas. La Fióura 7 muestra la expresión de PSCA.pcDNA3.1/MycHis de ratón y de simio después de la transfección en células 293T. Las células 293T se transfectaron con ya sea PSCA. pcDNA3.1/MycHis de ratón o PSCA-pcDNA3.1/MycHns de simio o el control de vector 3) valo es de p arfil ele aminoácido normalizados que se encuentran entre 0 y i- Los per iles de Hidrofilicidad, Hidropaticidad y Porcentajes de Residuos Accesibles se utilizaron para determinar estiramientos de aminoácidos hidrofílicos (es decir, valores mayores que 0.5 en el perfil de Hidrofilicidad y Porcentaje de esiduos Accesibles, y valores menores que 0.5 en el perfi de Hidropaticidad) . Tales regiones son probables que sean expuestos al medio ambiente acuoso, estén presentes en la superficie de la proteína, y así disponibles para el reconocimiento inmune, tal como mediante anticuerpos. Los p rfiles de Flexibilidad Promedio y Beta-vuelta, det rminan estiramiento de aminoácidos (es decir, valores ma Ores que 0.5 en el perfil de Beta-vuelta y el perfil de Flexibilidad Promedio) que no están contenidos en las estructur is secundarias tales como láminas beta y hélices alfa. Tales regiones también son más probables que sean expuestas en la proteína y así accesibles al reconocimiento inmune, tal como mediante anticuerpos. Las se ¡uencias antigénicas de las proteínas variantes de PSCA indicadas, por ejemplo, mediante los perfiles descrito: en lo anterior se utilizan para preparar inmunógenos, ya ea péptidos o ácidos nucleicos que los codifican, para g ¡nerar anticuerpos anti-PSCA terapéuticos y de diagnóstico. E inmunógeno puede ser cualquiera de 5, 6, Y XY 11, !5, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más de 50 aminoácidos contiguos, o los ácidos nucleicos correspondientes que los codifican, de las variantes de proteína de PSCA listadas en la Figura 1 de la cual los perfiles de aminoácido pueden ser deducidos debido , que la variante contiene la secuencia que es la misma como una variante representada. En particular, los inmunógeno de péptido de la invención pueden comprender, una región de pép tido de por lo menos 5 aminoácidos de la Figura 1 en cualqu ier incremento de número entero que incluye una posición de amiinoácido que tiene un valor mayor que 0.5 en el perfil de H .drofilicidad; una región de péptido de por lo menos 5 aminoácidos de la Figura 1 en cualquier incremento de número entero que incluye una posición de aminoácido que tiene u valor menor que el 0.5 en el perfil de Hidropaticidad; u na región de péptido de por lo menos 5 aminoácidos de la Figura 1 en cualquier incremento de número entero que incluye una posición de aminoácidos que tiene un valor mayor que 0. 5 en los perfiles de Por ciento de Residuos Accesibles; una región de péptido de por lo menos 5 aminoácidos de la Figura 1 en cualquier incremento de número entero que incluy : una posición de aminoácidos que tiene un valor mayor que 0. 5 en los perfiles de Flexibilidad Promedio; y, una región de >éptido de por lo menos 5 aminoácidos de la Figura 1 en cualquier incremento de número entero que incluye 4 de protel na rsc *K está compuesta de 9.52% de hélice alfa, 8.99% de hebra ex :endida, y 81.48% de espiral aleatoria. La variante 6 de proteína PSCA está compuesto de 24.56% de hélice alfa, 21.9 % de hebra extendida y 53.51% de espiral aleatoria. El anal sis para la presencia potencial de los dominios de transniembrana en las proteínas variantes de PSCA se llevó a cabo utilizando una variedad de algoritmos de predicción de transmembrana accesados del servidor de biología molécula. ExPasy localizado en la Red Mundial en ( . expasy . ch/tools/ Ej emp1o 7 Generacidn de Anticuerpos Policlonales PSCA Los anticuerpos policlonales pueden ser cultivados en un mamífero, p ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inrtiun izante y, sí se desea, un adyuvante. Típicamente, el agente inmunizante y/o adyuvante serán inyectados en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o int raperitoneales . Además de la inmunización con una variante de proteína PSCA de longitud completa, se emplean algoritmos de computadora en el diseño de inmunógenos que, basado en el análisis de" secuencia de aminoácido contiene carácter isticas de ser antigénicos y disponibles para ei reconocimiento por el sistema inmune del hospedero inmunizado (ver el Ejemplo intitulado "Perfiles de Anuigeni cidad y Es)ltruot?ra Secundaria") . Tales regiones serán predichas que son hidrofílicas, flexibles, en conformaciones de beta-vuelta, y ser expuestas sobre la superficie de la proteína . Por ejemblo, las proteínas de fusión bacterianas recombinantes o péptidos que contienen regiones hidrofílicas, flexibles, beta-vuelta de las variantes de proteína PSCA se utilizan como antíqenos para generar anticuerpos policlonales en conejos Blan :os de Nueva Zelanda o anticuerpos monoclonales como es descrito en el Ejemplo intitulado Generación de Anticuerpos Monoclonales PSCA (MAbs)". Por ejemplo, en la var iante 1 de PSCA, tales regiones incluyen, pero no están limitadas a, los aminoácidos 28-56 y los aminoácidos 66-94, Para la variante 3, tales regiones incluyen, pero no están limitadas a, aminoácidos 7-39 y aminoácidos 70-94. Para la variante 4 tales regiones incluyen, pero no están limitadas a, 6-18, aminoácidos 27-39, aminoácidos 103-133 y 177-189. Para la variante 6, tales regiones incluyen, pero no están limitadas a, aminoácidos 19-35 y aminoácido 57-85. Es útil conjugar el agente inmunizante a una proteína conocida que es inmunogénica en el mamífero que es i nmunizado. Ejemplos de tales proteínas ininu nog ni c s i no uyen, pero no están limitadas a, hemocianina de laóa de punta (KLH) , albúmina de suero, tiroglobulina de be vina, inhibidor de tripsina de soya. En una modalidad, n péptido que codifica los aminoácidos 103-133 de la variante 4 de PSCA es conjugado a KLH y utilizado para inmunizar a un conejo. Alternativamente el agente inmunizante! puede incluir toda o porciones de las proteínas variantes de PSCA, análogos o proteínas de fusión de las mismas. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de las variantes de PSCA pueden ser fusionadas utilizando técnicas de DNA re combinantes a cualquiera de una variedad de asociados de proteína de fusión que son bien conocidos en la técnica, tal como glutationa-S-transferasa (GST) y las proteínas de fusión marcadas con HIS. En una modalidad, la s i a p va r i ¡ K i de PSCA, los aminoácidos 18-98 se fusionaron a GST utilizando técnicas recombinantes en el vector de expresicn pGEX, expresado, purificado y utilizado para inmunizar t nto conejos como ratones para generar anticuerpos pol cf onales y monoclonales respectivamente, Tales proteínas de fusión se purifican de bacterias inducidas utilizando la matri z de afinidad apropiada, Otras prc teínas de fusión bacterianas recombinantes que pueden ser empleadas incluyen la proteína de enlace de maltosa, LacZ, tiotedoxina, NusA, o una región constante de inmunoglobulina (ver la sección intitulada "Producción de PSCA v Sistemas Procariór icos" y Protocolos Actuales en Biología Molecular, Volumen 2, Unidad 16, Frederick M. Ausubul y colaboradores, eds., 1995; Linsley, P.S., Brady, W. , Ornes, M. , Kosmai e, !.., Da le, N., y Ledbetter, L. (1991) J.Exp. Med. 174, 561-566) . Además de las proteínas de fusión derivadas de bacterias, tambié n se utilizan antígenos de proteína expresados de mamíferos. Estos antígenos se expresan de vectores de exprés, ion mamíferos tales como los vectores de fusión Tag5 y Fe (ver la sección intitulada "Producción de PSCA Recombinante ;n Sistemas Eucarióticos") , y retienen las modificaciones postf-traduccionales tales como glicosilaciones encontradas en la roteína nativa. En una modalidad, el cDNA de la variante 1 ds PSCA, menos el péptido guía N-terminal y el fijador GPI C-terminal se clonó en ei vector de secreción mamífero Tag5, y se expresó en células 293T. La proteína recombinante se pur ificó mediante la cromatografía de quelate de metal a partir del sobrenadantes de cultivo de tejido de células 293T que expresan establemente el vector recombinante. La proteína PSCA Tag5 purificada luego se utilizó como inmunógeno. Durante fl protocolo de inmunización, es útil ar al ar.tí ono on adyuvantes que aumentan la respuesta inmujne del animal hospedero. Ejemplos de adyuvantes incluyen , pero no está limitados a, adyuvante de Freund completo (C? ) y adyuvante de MPL-TDM (monofosforil Lípido A, trehalosa dicorinomicolato sintético) . En un prc tocólo típico, los conejos se inmunizan inioi al mente de nanera subcutánea con hasta 200 µg, típicamente 100-2(1)0 µg, de proteína de fusión o péptido conjugado a KLH mezclado en el adyuvante de Freund completo (CFA) . Los conejos luego se inyectan subcutáneamente cada dos se an s con asta 2C0 µg, típicamente 100-200 µg, del .inmunógeno en el adyuvante de Freund incompleto (IFA).

Sangrados de pru ba se toman aproximadamente 7-10 días después de cada inmunización y se utilizan para monitorear el título del antisuoro mediante ELISA. Para probar la reactividad y especificidad del suero inmune, tal como el suero de conejo derivado de la inmunización ccn uáa fusión de GST de la proteína variante 3 o 4 PSCA, el cDNA ce la variante de PSCA de longitud completa respectiva se clona en el vector de expresión pCDNA 3.1 myc-his (Invitrogen, ver el Ejemplo intitulado "Producción de PSCA Recombinan e en Sistemas Eucarióticos"). Después de la transfección de las construcciones en las células 293T, los lisados de célula se sondean con el suero anti-variante y con el anticuerpo anti-His (Santa Cruz Biotechnologies, Santa CCrruuzz,, CCAA)) ppaarraa ddeeterminar la reactividad específica a la proteína variante desnaturalizada utilizando la técnica de manchado de Western. Además, el suero inmune se prueba mediante la microscopía ele fluorescencia, citometría de flujo e inmunoprecipitación contra 293T y otras células que expresan la variant 2 de PSCA recombinante para determinar el libre . Ejemplo 8 Generación de anticuerpos Monoclonales de PSCA (MAbsj En una | modalidad, los Anticuerpos Monoclonales "MAbs") terapéuticos a PSCA y variantes de PSCA comprenden aquellos que reaccionan con epítopes específicos para cada proteína o específicos a secuencias en común entre las variantes que enlazarían, internalizarían, interrumpirían o modularían la funcion biológica de la PSCA o variantes de PSCA, por ejemplo, aquellas que interrumpirían la interacción con ligandos y asociados de enlace. Los inmunógenos para la generación de tales MAbs incluyen aquellos designados para codificar o contenér el dominio extracelular o la secuencia de proteína de PSCA completa, las regiones predichas para contener porciones funcionales y regiones de la variante de proteína de PSCA predichas para ser antigénicas del análisis de computadora de la secuencia de aminoácidos. Los inmunógenos inclqyen péptidos, proteínas bacterianas recombinantes tale como las proteínas de fusión GST-PSCA (Figura 8) y la prc : teína del vector PSCA pET marcado con His (Figura 6) y las proteínas marcadas con His purificadas expresadas de mamíflero (Figura 7) y las proteínas de fusión laO FC de humano ,ie murino. Además, las células diseñadas a través de la tranBducción retroviral para expresar altos niveles de la vaniante 1 de PSCA, tal como RAT1-PSCA. 293T-PSCA, 3T3-PSCJA o 300.19-PSCA se utilizan para inmunizar ratones (Figura 5¡ Para genlerar Anticuerpos Monoclonales a PSCA, los ratones primero se inmunizaron en la planta del pie (FP) con, t ipi c amente , 5-50 ug de inmunógeno de proteína o entre 106 y 10' de células quíe expresan PSCA-mezcladas en un adyuvante adecuado. Ejemplos de adyuvantes adecuados para la inmunización de FP son TiterMax (Sigma) para la inyección de FP inicial seguido por gel de alumbre con Inmuneasy (Qiagen) . Después de la iny acción inicial los ratones se inmunizaron subsecuentemente dos veces a la semana hasta el tiempo en que se sacrifican as células B obtenidas del nodo de linfa utilizadas para fusión. Durante el protocolo de inmunización los sangrados de prueba se torraron para monitorear el título y la especificidad de la respuesta inmune. En la mayoría de los casos, una vez que la reactividad y especificidad apropiada se obtuvo como es determinado mediante ELISA, manchado de Western, inmunoprefipitación, microscopía de fluorescencia o análisis cirométri o de flujo, la generación de fusión de hibridoma luego se llevó a cabo utilizando la fusión de electrocélula (BTX, ECM2000) . En una modalidad, la invención proporciona anticuerpos monoc onales designados, Hal-1.16, Hal-5.99, Hal-4.117, Hal-4.120, Hal-4.121, y Hal-4.37. Los anticuerpos se identificaron ' se muestran que reaccionan y enlazan con la superficie de 1a célula o PSCA inmovilizado. Los MAbs a PSCA se generaron utilizando XenoMouse technology© en do de los sitios de cadena pesada y cadena ligera capa de mur ino se han mactivado en una mayoría de los sitios de inmunoc lobulina de cadena pesada y capa ligera humana se han i :nsertado: Hal-1.16 se generó después de inmunizar Xenomic. que oroduce gamma 1 humana (13 veces con PSCA-GST); Ha1-5. í 9 se generó después de inmunizar Xenomice que produce gama 2 humana, 6 veces con células Ratl-PSCA seguido por dos inyecciones con PSCA-tag5; Hal-4.117, HAi-4.3/, -ai-4.1 ¿ 0 , y riai-4.121 se generaron después de inmunizar Xenomic* ; que produce gama 1 humana, 6 veces con células Ratl-PSCA seguido por 4 inyecciones con PSCA-tag5. Los MAbs anti-PSCA , Hal-1.16, Hal-5.99, Hal-4.117, Hal-4.120, y Ha 1-4.121 en la ?an el PSCA de superficie de la célula endógeno expresado en las células de xenoinjerto de cáncer de próstata . Los anticuerpos designados Hal-5.99, Hal-4.117, Hal-4.120, Hal-4. 7, Hal-1.16 y Hal-4.121 se enviaron (por la vía Express Federa1) a la Colección Americana de Cultivo Tipo (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 el 4 de mayo del 2004 y signados números de acceso PTA-6703 y PTA-6699 y PTA-6700 y PTA-6702 y PTA-6698 y PTA-6701, respectivamente, Las sec encías de codificación de DNA para anti PSCA M?.bs HH - 1.16, Hdl-5.99, Hal-4.117, Hal-4.120, Hal-4.121, y Hal-4.37, se determinaron después de aislar el mRNA de las células de hibridoma respectivas con el reactivo Trizol (Life Tec :fnnologies, Gibco BRL) . El RNA total se purificó y se culanrifioó. Los cDNAs de primera hebra se generaron de RNA total con oligo (dT) 1218 cebado utilizando el sistema de Preamplificación Gibco BRL Superscript. El cDNA de primera hebra se amplificó utilizando los cebadores de cadena pesada vairiables de inmunoglobulina humana, y los cebadores de cacena ligera variables de inmunoglobulina humana. Los prodluctos de PCR se clonaron en el vector pCRScript (Strat:agene, La Jolla) . Varios clones se secuenciaron y 1.as regiones de cadena pesada y ligera variables se deterjminaron . Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de las regiones de cadena pesada y ligera variables se listan en la Figura 2 y Figura 3. La alineación de anticuerpos PSCA a las secuencias V-D-J de línea germinal mostradas en la Fi .gura 4A-Figura 4M. Ejemplo _9 Clasificacióh e Identificación de Anticuerpos PSCA Los nticuerpos generados utilizando los procedimientos exiuestos en el ejemplo intitulado "Generación de Ani : uf'¡ r,ps M o -_! on.aKs PSCA (MAbs)" se clasificaron y se identificaron ut ilizando una combinación de ensayos incluyendo ELISA, FACS, agrupamiento de epítope, y afinidad para el PSCA expresado en la superficie cae las células, A. Cíasificación de MAb Humano de PSCA Mediante FACS. La clasi ficación de hibridoma primario para MAbs a PSCA se real i ?ó rn solante FACS. El protocolo fue como sigue: 50 ul/cavidad de sobrenadante de hibridoma (puro) o anticuerpos purificados (en diluciones en serie) se adicionaron a plac as FACS de 96 cavidades y se mezclaron con células que expresan PSCA (endógenas o recombinantes, 5000 células/cavidad) . La mezcla se incubó a 4CC durante dos horas. Al final d la incubación, las células se lavaron con solución reguladora FACS y se incubaron con 100 ul de anticuerpo de detección (anti-hlgG-PE) durante 45 minutos a 4°C. Al final de la incubación, las células se lavaron con Solución Regulador-a FACS, se agitaron con Formaldehído y se analizaron utili ando FACScan. Los datos se analizaron utilizando el software CellQuest Pro. Los histogramas llenos indican datos de: células de control negativas, y los histogramas abiert os presentan datos de células positivas de PSCA (Figura 9) . Los h. bridomas positivos identificados de clasificaciones p rimarías se transfirieron a placas de 24 cavidades y lo sobrenadantes se recolectaron para clasificaciones confirmatorias. Las clasificaciones confirmatorias in Kuyeron el análisis de FACs en B300.19-PSCA/300.19-neo, P.atl-PSCA/Ratl-neo, PC3-PSCA/neo, SW780 (línea de células de cáncer de vejiga), LAPC9AI (línea de célula de cáncer de próstata), HPAC (línea de célula de cáncer pancreático) , y el ensayo de ELTSA utilizando Tag5-PSCA, GST-PSC A, GST-PSCA N-term, Med. C-Term y pET-PSCA. B. Análisis de Afinidad Relativo a MAb Humano de PSCA Los >oí enaaante di hibpdoma se probaron para determinar su afinidad de enlace relativo al PSCA de superficie de célula. Los sobrenadantes de hibridoma se diluyeron en serie solución Reguladora FACS (FB), de µg/ml a ¡ub-ng/ml; y se evaluaron en un ensayo de enlace FACS utilizando células} LAPC9AI. Los anticuerpos de alta afinidad dieron altos valores de MFI . Los valores de MFI de cada punto se obtuvieron ut Ll izando el software CellQuest Pro y se ut i ! i za ron pa ra e 1 cálculo oe afinidad utilizando el software Graphpad Prism (T bla VII y Tabla VIII): Ecuación de Dosis-Respuesta Sigmoidal (pendiente variable) . Los resultados del análisis de afinic ad relativos se exponen en la Figura 10. C. Agrupa iento de Epítopes Los anticuerpos PSCA se agruparon de acuerdo con el epítope al evaluad su patrón de enlace en la célula LAPC9A1.

En breve, una pequeña cantidad de cada uno de los anticuerpos se biotiniló; luego cada uno de los anticuerpos biotinilados se incubaron con LAPC9A1 en la presencia de una cantidad en habilidad para reaccionar con PSCA de origen de ratón y de simio. Esta propiedad es útil para entender las consecuencias del acoplamiento ce MAb de PSCA sobre las células y tejidos cuando se utilizar modelos de animales de ratón y de simio. Los genes PSC? de mono Cynomolgus y de ratón, se clonaron, expresados en un retrovirus e infectados transientemente en células 293-T se incubaron con los anticuerpos 1 i. siguiente protocolo. Los anticuerpos de pr aeba se incubaron con células 293-T que expresan PSCA de ir ono Cynomulgus o de murino o células 293T que expresan el gen neo-gen solamente como un control neg tivo. l reconc)Cimiento electo se determinó utilizando el anticuerpo de detecciones secundario anti-hlgG-PE. Un histograma representativo que representa la reactividad cruzada específica se presenta en la Figura 11. El resumen presentado en l a Tabla X muestra que todos excepto uno de los anticuerpos PSCA pnti-humanos reaccionan cruzadamente con PSCA de mono y solamente un anticuerpo de PSCA antihumano reacciona cruzadamente con PSCA de ratón. B. Déterminación de Afinidad Mediante FACS Un panel de siete (7) de anticuerpos PSCA antihumanos se prot aron para su afinidad de enlace a PSCA en células SW780, un¿ linea de células de cáncer de vejiga humano que expresa a alto nivel de PSCA. 23 diluciones en serie 1:2 de anticu rpos purificados se incubaron con células SW780 (50,000 célu las por cavidad) durante la noche a 4°C con la concentración final de 167 nM a 0.01 pM. Al final de la incubación, las c élulas se lavaron y se incubaron con el anticuerpo de det ección anti-hlgG-PE durante 45 min a 4°C. Después de lavar los anticuerpos de detección no enlazados, las células se an alizaron mediante FACS; los valores de MFI de cada punto se obtuvieron utilizando el software CellQuest Pro y se utilizaran para el cálculo de afinidad utilizando el software Graphpald Prism: ecuación de Dosis-Respuesta Sigmoidal (pendier te variable) (Tabla VII y Tabla VIII) . Los valores de afinida d de los siete (/) anticuerpos se expone en la Tabla IX. Ejemplo 11 Inte rnalización de Anticuerpo PSCA La int señalización de Hal-4.121 se estudió utilizando có 1 ? 1a.1; PC3-PSCA. En breve, Hal-4.121 se incubó con células a 4°C durante 90 min para permitir el enlace de los anticuerpos a la superficie de la célula. Las células luego so dividií >ron on dos grupos y las incubaciones continuaron en ya sea 3/°C para permitir la internalización del anticuerpo o n 4°C como controles (sin internalización). Un lavado con áci do después de la incubación a 37°C/4°C se empleó p ca remover el PSCA 4.121 enlazado a la superficie de la célula. La permeabilización subsecuente permitió la detección de aint cuerpos enlazados al PSCA internalizado.

Después cíe 1 a ncubación con anticuerpos ele detección secundarios, las félulas se analizaron utilizando FACS o se observaron bajo microscopio de fluorescencia. Aproximadamente 30% de Hal -4.121 se internalizó después de la incubación a 37 A. du ante Jos h or ? ( Fi gura 12). Ejemplo 12 Exterminación Secundaria Mediada por Anticuerpo Los ant cuerpos a PSCA median la exterminación dependiente de saporina en células que expresan PSCA. Las células que expresan B300.19-PSCA (750 células/cavidad) se sembraron en una placa de 96 cavidades en el día 1. Al siguiente día un volumen igual al medio que contiene una concentración 2X del anticuerpo primario indicado junto con un exceso de 2 veees del anticuerpo policlonal antihumano (Hum-Zap) o anti- cabra (Goat-Zap) conjugado con toxina de saporina (Advance d Targeting Systems, San Diego, CA) se adicionó a cada cavidad. Las células se dejaron incubar durante 5 días a 37 grados C. Al final del período de incubación, MTS i Promega) se adicionó a cada cavidad y la incubación se con inuó durante 4 horas adicionales. La OD a 450 nM se déternuno . Los resultados en la Figura 13 (A) muestran que los anticuerpos de PSCA HA1-4.121 y Hal-4.117 median la toxicid ad dependiente de saporina en las células B300.19-PSCA miéntras que un anticuerpo IgGl humanos no específico, de corfrtrol no tuvo efecto. Los resultados en la Figura 13 (B) muéstran que la adición de un anticuerpo conjugado con saporiña secundario que no reconoció Fe humano, no logró mediar la citotoxicidad (Figura 13 (A) y Figura 13 (B) ) . Estos resi ltados indican de los fármacos o proteínas citotóxicas puede i ser suministradas selectivamente a las células que exprfesan PSCA utilizando un anti-PSCA MAb apropiado . Ejemplo 13 Citotoxididad Mediada Inmune por Anticuerpo Los anticuerpos PSCA se evaluaron para determinar su habilidad para mediar la citotoxicidad dependiente inmune. Los anticuerpos PSCA (0-50 µg/ml) se diluyeron con solución reguladora RHB (FPMI 1640, Gibco Life Technologies, 20 mM HEPES). Las células que expresan B300.19-PSCA se lavaron en solución reguladora RHB y se resuspendió a una densidad de 106 células/ml . En un ensayo típico, 50 µl de anticuerpo PSCA, 50 µl de suero de complemento de conejo diluido (Cedarlane, Ontar io, Can) , y 50 µl de una suspensión de célula se adicionaron conjuntamente en una placa de 96 cavidades de cultivo de tejido de fondo plano. La mezcla se incubó durante 12 hr. a 37°C en una incubadora de C02 al 5% para facilitar la lisis de célula mediada por complemento. Luego, 50 µl de Azul Alamar (Biosource Intl. Camarillo, CA) se adicionó a cada cavidad y la incubación se continuo durante 4-5 hr adicionales a 37°C. La fluorescencia en cada cavidad se leyó ir.i lazando un fluorómetro de 96 cavidades con excitación en 530 nm y emisión en 590 nm. Los resultados muestran que los anticuerpos PSCA que tienen un Igl (HA1-4.121) o un _ sotipo TgG2 (HAl -5.99.1) pero no un isotipo IgG4 (IIA1-6.46) fueron capaces de mediar la lisis dependiente de complementos (Figura 14 ) . La ADCC (Citotoxicidad Celular Dependiente de Anticuerpo) es un ataque lítico inmuno mediado en células enlazadas con anticuerpo dirigido a un antígeno de superficie de la célula espe dfico. En este caso, es PSCA. Las células inmunes reconocen la porción Fe del anticuerpo a través del enlace a los rece'ptores Fc? en la superficie de leucocito, monocito y células NK que activan un ataque lítico que da por resultado la muerte celular. La habilidad de los anticuerpos PSCA para mediar esta reacción puede ser evaluada al marcar células de tumor .. n vi tro con 51cromo, europio o una molécula fluorescente y ali incubarlas en la presencia de MAbs PSCA humano junto con células mononucleares de sangre periférica. La lisis espeel fica de las células de tumor se pueden determinar al med ir el por ciento de lisis de la célula de tumor dirigida. Los puntos finales comunes que son determinados incluyen la liberación de radioactividad, europio o tinte fluorescente de las células muertas utilizando un método de detección apropiado. Alternativamente, la liberación de una enzima intracelular JJ4 tal como lactato deshidrogenasa (LDH) puede ser medida. Ejemplo 14 Generación de Fragmentos F(Ab')2 La gener -ación de fragmentos F(Ab')2 de MAbs es útil p á va est ud i a r 1 os efectos de las moléculas MAb que retienen su sitio de enlacte de antígeno bivalente pero carecen del dominio Fe efector inmune en modelos terapéuticos in vi tro e in vi vo . 20 mas de MAb Hal-4.121 en solución reguladora de acetato de sodio 20 mM pH 4.5 se incubaron con y sin pepsina inmovilizada (Pierce. Rockford IL) durante los tiempos indicados. Los ffragmentos MAb y Fe digerido intacto se removieron mediante la cromatografía de proteína A. Mostrado en la Figura 15 está un gel manchado de Coomasie SDS-PAGE de MAb o reducido, no digerido, intacto, alícuotas no reducidas de material digerido tomadas en los tiempos indicados, y una muestra reducida del producto F(ab')2 digerido final. Este reactivo puede ser utilizado para tratar animales que llevan tumores que exprésan PSCA. La actividad antitumoral observada con este fraginento de anticuerpo puede distinguirse de la actividad bíológi?a intrínseca de la actividad mediada por los mecanismos dependientes inmunes. Ejemplo 15 Expresión de Anticuerpos Humanos Utilizando Métodos de DNA Recombinantes Para e presar anti-PSCA recombinantemente en células transfect idas, las secuencias de cadena pesada y ligera variables mti-PSCA se clonaron corriente arriba del IgGl de cadena pesada humana y las regiones constantes Igk de cadena ligera re p ct i vam ntc. Los casetes de cadena pesada y cadena ligera humana anti-PSCA completa se clonaron corriente abajo del promot or/aumentador de CMV en un vector de clonación. Un sit .o de poliadenilación se incluyó corriente aoa o do La s -cuenciu do codificación de MAb. Las construcciones qu 5 expresan anti-PSCA MAb recombinante se transfectaron en células 293-T, Cos y CHO. El anticuerpo HA1-4.121 secreta<jio de las células 293-T recombinantes se evaluó para el en Lace al PSCA de la superficie de la célula en la Figura Pia -3A y se comparó con el mismo anticuerpo producido del hibridoma original (Figura 16). Ejemplo 16 Ensayos de _En1_aco de Clase I y Clase II de HLA Los ensayos de enlace de clase I y clase II de HLA utilizando molécul as HLA purificadas se realizaron de acuerdo con los protocolo:i divulgados (por ejemplo, publicaciones de PCT WO 94/20127 y WO 94/03205; Sidney y colaboradores, Current Protocols in Immunology 18.3.1 (1998); Sidney, y colaboradores, J Immunol. 154:247 (1995); Sette, y colaboradores, Me 1. Immunol. 31:813 (1994)). Brevemente, moléculas MHC puri.ficadas (5 a 500 nM) se incuban con varios inhibidores de péptido no marcados y péptidos de sonda 1¿ ~ I -radiomarcados 10 nM como es descrito. Después de la incubación, los complejos de MHC-péptido se separan del péptido libre medi ante la filtración en gel y la fracción de péptido enlazado es determinada. Típicamente, en experimentos preliminares, cada preparación de MHC es titulado en la presencia de canti dades fijas de péptidos radiomarcados para determinar la con :entración de moléculas HLA necesarias para enlazar 10-20% de la radioactividad total. Toda la inhibición subsecuente y lo ensayos de enlace directos se realizan utilizando estas concentraciones de HLA. Puesto c ue bajo estas condiciones [marca] < [HLA] e ICr,r, [HLAJ , los valores de IC50 medidos son aproximaciones razonables de lo 5 valores KD reales. Los inhibidores de péptido son tipieatmente probados a concentraciones que varían de 120 µg/ml. a .2 pg/ml, y se prueban en dos a cuatro experimentos comp etamente independientes. Para permitir la comparación de los datos obtenidos en diferentes experimentos, una cifra de enlace relativa se calcula para peo' a_ dt._d r ei LC < del control positivo para la inhibición por el IC50 para cada péptido probado (típicamente versiones no mar adas del péptido de sonda radiomarcado) . Para propósitos de base de datos, y comparaciones ini.er -expei unen t os , se compilan los valores de enlace relativos. Estos vjalores subsecuentemente se pueden convertir nuevamente en valpres IC50 nM al dividir el IC50 nM de los asegurar la cober ura de población amplia. De manera similar, los epítopes de cLase II de HLA se seleccionan de PSCA para proporcionar cobertura de población amplia, es decir, ambos de los epítopes que llevan superposición HLA DR-1-4-7 y los epítopes que llevam la posición HLA DR-3 se seleccionan para la inclusión en la construcción de minigen. Los epítopes CTL y HTL seleccionado luego se incorporan en un minigen para la expresión en un vector de expresión. Tal construcción adicionalmente puede incluir secuencias que firigen los epítopes HTL al retículo endoplásmico. Por jemplo, la proteína Ii puede ser fusionada a uno o m s epito -es HTL como es descrito en la técnica, en donde la secuenci CLIP de la proteína Ii se remueve y se reemplaza con una secuencia de epítope de clase II de HLA de mmooddoo qsuuee eell eeppíítt..ooppe de clase II de HLA se dirige a retículo eiKepl ásrrp co, dcrcie el epítope enlaza una molécula de clase II de HLA. Este ejerrjplo ilustra los métodos que son utilizados para la const rucción de un plásmido de expresión que lleva minigen. Otros vectores de expresión que pueden ser utilizados para las composiciones de minigen son disponibles y conocidos para aguellos expertos en la técnica. El plásmldo de DNA de minigen de este ejemplo contiene una secuencia Kozak consensual y una secuencia de señal de cadena ligera Ig capa de murino consensual seguido por los epí l opes CK y/o HTL s leccionados de acuerdo con los principios divulgados en la presente. La secuencia codifica una estructura de lectura abierta utilizada para la etiqueta de epítcpe de anti.cuerpo Myc y His codificada para el vector pcDNA 3. L Myc-His. Los oligonucleótidos sobrepuestos que pueden promediar, por ejemplo, aproximadamente 70 nucleótidos en longitud con 15 nucleótidos sobrepuestos, se sintetizan con HPLC purificada. Los oligonucleótidos codifican los epítopes de péptido seleccionados así como nucleótidos enlazadores apropiados, secuencia Kozak y la secuencia de señal. El minigen de multiepítope final se ensambla al extender los oligonucleótidos sobrepuestos en tres conjuntos de regiones utilizando PCR. Una máquina de PCR Perkin/Elmer 9600 se utiliza y un total de 30 ciclos se realizan utilizando las siguientes condiciones: 95 °C durante 15 seg, temperatura de recocidos (5°C por debajo de la Tm calculada más baja de cada par de cebador) durante 30 seg y 72°C durante 1 min. Por cjcmp Lo, un minigen se prepara como sigue. Para una primera reacc ón de PCR, 5 µg de cada uno de dos oligonucleótidos sé recosen y se extienden: En un ejemplo utilizando ocho oli[gonucleótidos, es decir, cuatro pares de cebadores, los oli|gonucleótidos 1+2, 3+4, 5+6, y 7+8 se combinan en reaccilones de 100 µl que contienen solución reguladora de Pfu polimerasa (lx=KCL 10 mM, (NH4)2S04 10 mM, Tri s -c l oru ro 20 mM , pH 8 K 5 , MgS04 2 rnM , Tr i tón X- 1 00 al 0 . 1 % , 100 µg/ml de BSA), 0.25 mM de cada dNTP, y 2.5 U de PfU polimerasa. El producto de dímero de longitud completa se puri fi c. en ae1 , 1 as cios reacciones que contienen el producto de 1+2 y 3+4, y el producto de 5+6 y 7+8 se mezclan, se recosen y se extienden durante 10 ciclos. La mitad de las dos reacciones luego se mezclan, y 5 ciclos de recocido y extensión se IIO? •an a cabo antes de que los cebadores flanqueantes sean adicionados para amplificar el producto de longitud completa El producto de longitud completa se purifica en gel y se clona en pCR-blunt (Invitrogen) y los clones individuales se clasifican mediante secuenciación. Ejemplo 18 La Construcción de Plásmido y el Grado al cual se Induce la I nmunogenicidael El grado al cual una construcción de plásmido, por ejemplo un plásmiqo construido de acuerdo con el Ejemplo previo, es capaz de inducir inmunogenicidad se confirma m vi tro al deterrrinar ia presentación de epítope mediante APC después de la t ransducción o transfección del APC con una construcción de áoído nucleico que expresa epítope. Tal estudio determina las "antigenicidad" y permite el uso de APC humano. El ensayo c etermina la habilidad del epítope que es presentado mediante el APC en un contexto que es reconocido por una célula T ai cuantificar la densidad de complejos de epítope-HLA clase I sobre la superficie de la célula. La cuantificación se puede realizar al medir directamente la cantidad de péptido diluido de la APC (ver, por ejemplo, S i j t s y coi abo radores, J. Immunol . 156:683-692, 1996; Demotz y colaboradores, tature 342:682-684, 1989) ; o el número de complejos de pépti do-HLA clase I puede ser estimado al medir la cantidad de li sis o la hibridación de linfocina inducido por las células ob ctivo enfermas o transfectadas, y luego al determinar la concentración de péptido necesario para obtener los niveles equivalentes de lisis o liberación de linfocina (ver, por ejempl< , Kageyama y colaboradores, J. Immunol . 154 : 56 ' - :' , K, 19K,< Alternat ivamente, la inmunogenicidad se confirma a través de inyecciones in vivo en ratones y la estimación subsecuente in vi tro de la actividad de CTL y HTL, que se analizan utilizanció ensayos de citotoxicidad y proliferación, respectivamente, corno es detallado, por ejemplo en Alexander y colaboradores, Iprrmunity 1 : 751-761, 1994. Por e np Ko, para confirmar la capacidad de una construcción de m: nigen de DNA que contiene por lo menos un péptido de superporción HLA-A2 para inducir CTLs in vivo, ratones transgéni :os HLA-A2.1/Kb, por ejemplo, se inmunizan intramuscularmente con 100 µg de cDNA desnudo. Como un medio para comparar el nivel de CTLs inducido por la inmunización de cDNA como un grupo de control de animales también se i nmun i xa con una c:omposición de pépi.ido actual que comprende múltiples epítopes sintetizados como un solo polipéptido como serían codificados por el minigen. Los espl enocitcs de animales inmunizados se estimulan dos veees con cada una de las composiciones respectivas (epítcpes de péptido codificados en el minigen o el péptido poliepitópico) , luego se analizan para la actividad de citotoxicidad específica de péptido en un ensayo de liberación de ülC.r. Los resultados indican la magnitud de la respuesta de CTL dirigida contra el epítope A2-restringido, indicando de esta manera la inmunogenicidad in vivo de la vacuna de minigen y la vacuna poliepitópica. Por lo tanto, se encuentra que el minigen induce las respuestas i nmunes dirigidas hacia los epítopes de pépt i (io de supe re.icrción HLA-A2 corno lo hace la vacuna de péptido poliepitóp ico. Un análisis similar también se realiza utilizando otros modelos de ratón transgénicos HLA-A3 y HLA-B7 para estime r la inducción de CTL mediante los epítopes QC porcioi xrporcion de HLA-A3 y HLA-B7, mediante lo cual también se encuentra que el minigen induce las respuestas inmune s apropiadas dirigidas hacia los epítopes proporcionados . Para copíirmar la capacidad de un minigen que codifica epítope de clase II para inducir HTLs in vivo, ratones transgénicos DR, o para aquellos epítopes que reaccionan crux.ac amerite con la molécula MHC de ratón apropiada, ratón : Ab-restringido, por ejemplo, se inmunizan intramuscularmente con 100 µg de DNA de plásmido. Como un med i o pa ra cornpa rar el nivel de HTLs inducido por la inmunización de CNA como un grupo de animales de control también se inmuniza con una composición de péptido actual emulsificada en e dyuvante de Freund completo. Las células CD4+ T, es decir , HTLs, se purifican de esplenocitos de animales inmunizados y se estimulan con cada una de las composiciones re pectivas (péptidos codificados en el minigen) . La resp aesta HTL se mide utilizando un ensayo de proliferación de incorporación de H-tim?dina (ver, por ejemplo, Alexander y colaboradores, Immunity 1 : 751-761, 1994) . Los results dos indican la magnitud de la respuesta de HTL, demostrando de esta manera la inmunogenicidad in vivo del minigen. Los mini. genes de DNA, construidos como es descrito en el Ejemplo pre vio, también se pueden confirmar como una vacuna en combinac ion con un agente de refuerzo utilizando un protocolo de refu rzo de cebado. El agente de refuerzo puede consistir de proteína recombinante (por ejemplo, Barnett y colaboradores, Ai' s Res. y Human Retroviruses 14, Supplement 3:S299-S309, 1998 o vaccinia recombinante, por ejemplo, que expresan minigen > DNA que codifica la proteína completa de interés (ver, po ejemplo, Hanke y colaboradores, Vaccine 16:439-445, 1998; Sedegah y colabo ado es, Proc. Nati. Acad. Sci USA 95:7648-53 , 1998; Hanke y McMichael, Immunol. Letters 66:177-181, 1999; y Robinson y colaboradores, Nature Med. 5:526- 34, 1999) . Por ejemplo, la eficacia del minigen de DNA utilizado en un j¡>rotocolo de refuerzo de cebado se evalúa inicialmente en ratones transgénicos. En este ejemplo, ratones transgénicos A2.1/Kh se inmunizan IM con 100 µg de un minigen de DNA que codifica los péptidos inmunogénicos incluyendo por lo menos un péptido que lleva la superporción HLA-A2. Después de un periodo de incubación (que varía de 3-9 seman s ; , lo r t c nes se refuerzan IP con 107 pfu/ratón de un virus de vaccinia recombinante que expresa la misma secuencia codificada por el minigen de DNA. Los ratones de control se i nmun i ' n con 100 ug le DNA o vaccinia recombinante sin la secuencia ae mirngen, o con DNA que codifica el minigen, pero sin el refuerzo de vaccinia. Después de un periodo adicional de incubación de dos semanas, los esplenocitos de los ratones se analizan mcdiatamente para la actividad específica de péptido en un ensayo ELISPOT. Adicionalmente, los esplenocitos se stimulan in vi tro con los epítopes de péptido A2-restringidos codificados en el minigen y la vaccinia recombin inte, luego se analizan para la actividad específica de péptido en una ELISA de IFN alfa, beta y/o gama . que se ha encargadD con los epítopes de péptido in vi tro . Ejemplo 20 Uso de péptidos para evaluar una respuesta inmune Los pept idos de la invención se pueden utilizar para analizar un. respuesta inmune para la presencia de anticuerpos espec fieos, CTL o HTL dirigida a PSCA. Tal análisis puede ser realizado en una manera descrita por Ogg y colaboradores, Science 279:2103-2106, 1998. En este Ejemplo, los péptidos de ac uerdo con la invención se utilizan como un reactivo para propositos de diagnóstico o de pronóstico, no como un inmunógeno En este ejemplo complejos tetraméricos de antígeno de leucocito humano altamente sensible ("tetrámeros") se utilizan para un análisis de sección transversal de, por ejemplo, frecuenci as de CTL específicas ele PSCA HLA-A*0201 de individuos positiv DS de HLA A*0201 en diferentes etapas de la enfermedad o des ués de la inmunización que comprende un péptido PSCA que contiene una porción A* 0201. Los complejos tetraméricos se sintetizan como es descrito (Musey y colaboradores, N. Engl. J. Med. 337:1267, 1997). Brevemente, la cadena pesada e HLA purificada, (A*0201 en este ejemplo) y ß2-microglobulina se sintetizan por medio de un sistema de expresión procarió tico. La cadena pesada se modifica mediante la supresión del extremo citosólico de transmembrana y la adición de COOH-terminal de una secuencia que contiene un sitio de biotinilación enzimático BirA. La cadena pesada, ß2-microglobulina y el péptido se repliegan mediante dilución. El produ Ko replegado de 45 kD se aisla mediante la cromatografía líquida de proteína rápida y luego se biotinila mediante BirA en la presencia de biotin (Sigma, St . Louis, Missouri) , adenosina 5' trifosfato y magnesio. El conjugado estreptavidina-fic eritrina se adiciona a una relación molar 1:4, y el producto tetramépco se concentra a 1 mg/ml. El producto resultante es referido como un tetrámero-ficoeritrina Para el análisis de muestra de sangre de pacientes, aproximadamente un millón cíe PBMCs se centrifugan a 300 g durante 5 minutos y se resuspenden en 50 µl de solución salina regulada con fosfato fría. El análisis tricolor se eali A con l 'ri i < 'icoeritrina, junto con un anti-CD8-Tricolor, y anti-CD38. Las PBMCs se incuban con tetrámero y anticuerpos en hielo durante 30 a 60 min y luego se lavan dos veces antes de la i: i.j ación en formaldehído. Las compuertas se aplican para contener >99.98% de muestras de control. Los controles para les tetrámeros incluyen tanto individuos negativos de A*02()l y donadores no enfermos positivos de A*0201. El porcentaje de células manchadas con el tetrámero luego se determina mediante citometría de flujo. Los resultados indican el número de células en la muestra de PBMC que contiene CTLs restringido de epítope, para de esta manera fácilmente indicar el grado de respuesta inmune al epítope PSCA y así el est do de exposición a PSCA, o la exposición a una vacuna que indi.ace una respuesta protectora o terapéutica. F.j emplo 21 Inducción de Respuestas Inmunes Utilizando un Protocolo de Refuerzo de Cebado Un protc coló de refuerzo de cebado similar en su principio implíci to a aquel utilizado para confirmar la eficacia de una vacuna de DNA en ratones transgénicos, tal como es descrito anteriormente en el Ejemplo intitulado "La Construcción de Plásmido y el Grado al Cual Induce Inmunogenicidad", también puede ser utilizado para la administración de la vacuna a humanos. Tal régimen de vacuna puede incluir una administración inicial de, por ejemplo, DNA desnudo seguido pe r el refuerzo utilizando virus recombinante que codifica la va cuna, o proteína/polipéptido recombinante o una mezcla de péptido administrado en un adyuvante. Por ejeemplo, la inmunización inicial se puede realizar utilizando un vector de expresión, tal como aquel construido en e 1 Ejemplo intitulado "Coinstrucción de Plásmidos de DNA de Multi-Epítope de "Minigen"" en la forma de ácido nucleico desnudo administrado IM (o SC o ID) en las oan11aacies de 0.5 5 mg en múltiples sitios. El ácido nucleico (0.1 a 1000 µg) tó.mbién puede ser administrado utilizando una pistola génica Después de un período de incubación de 3-4 semanas, una dos Ls de refuerzo luego se administra. El refuerzo pude ser virus fo lpox recombinante al administrar una dosis de 5-10 ' a 5xl09 pfu. Un virus recombinante alternativo, tal c orno un MVA, cañar.ipox, adenovirus, o virus adeno-asociado, tatnbién puede ser utilizado para el refuerzo, o la proteína po.Liepitópica o una mezcla de los péptidos puede ser administrado. Para evaluación de la eficacia de la vacuna, muestras eje sangre del paciente se obtienen antes de la inmunización así como en intervalos después de la administración de la vacuna inicial y dosis de refuerzo de la vacuna. Las células mononucleares de sangre periférica se aislan de ia sangre heparinizada fresca mediante la centrifugación de gradiente de densidad Ficoll-Hypaque, se forman alícuotas en medio de congelación y se almacena congelado. Las muc-jslras se analizan para la actividad de CTL y HTL. El análisis de los resultados indica que se genera una magnitud de respuesta suficiente para lograr una inmunidad terapéutica o protectora contra PSCA. Ejemplo 22 PoUinucleótidos Complementarios Las secuencias complementarias a las secuencias que codifican PSCA (F igura 1 o Figura 3), o cualquiera de las partes de la misrra, se utilizan para detectar, disminuir o inhibir la expresión de PSCA que ocurre naturalmente. Aunque el uso ele ol igonu?leóti dos que comprenden de aproximadamente 15 a 30 pares de base es descrito, esencialmente el mismo procedimiento es utilizado con fragmentos de secuencia más pequeños o más grandes. Los oligonucleótidos apropiados se diseñan utilizand D, por ejemplo, el software OLIGO 4.06 (National Biosciences) y la secuencia de codificación de PSCA. Para inhibir la transcripción, un oligonucleótido complementario se diseña do la secuencia 5' más única y se utiliza para prevejnir el enlace de promotor a la secuencia de codificación. Para inhibir la traducción, un oligonucleótido complemen ario se diseña para prevenir en enlace ribosomal a un transcripto que codifica PSCA. Ejemplo 23 Purificación de PSCA que ocurre Naturalmente o Recombinante ic v. n. i .pos ?specí ticos de PSCA El PSCA que ocurre naturalmente o recombinante sustancialmente se purifica mediante la cromatografía de inmunoafinidad uti lizando anticuerpos específicos para PSCA. Una columna de inmunoafinidad se construye al acoplar covalentemente e 1 anticuerpo anti-PSCA a una resina cromatográfica act ivada, tal como una SEPHAROSE activada con CNBr (Amersham Phármacia Biotech) . Después del acoplamiento, la resina se fc loquea y se lava de acuerdo con las instrucciones del fabricante, Los med .os que contienen PSCA se pasan sobre la columna de inmunoafinidad, y la columna se lava bajo condiciones que pe rmiten la absorbencia preferencial de PSCA (por ejemplo, solí: clones reguladores de concentración iónica alta en la preser cía de detergentes) . La columna se eluye bajo condiciones q¡ue rompen el enlace de anticuerpo/PSCA (por ejemplo, una solución reguladora de pH 2 a pH 3, o a una alta concentración de un caótropo, tal como urea o ion tiocianato) y se colecta GCR.P Ejemplo 24 Identificació? de Moléculas que Interactúan con PSCA PSCA, o fragmentos biológicamente activos de la misma, se marcan ton el reactivo 121 1 Bolton-Hunter . (Ver, por ejemplo, Bolcon y colaboradores, (1973) Biochem. J. 133:529. ) . Las moléculas candidatas previamente arregladas en las cavidades de na placa de multi-cavidades se incuban con el PSCA marcado, se lavan y se analizan cualquiera de las cavidades con e complejo de PSCA marcado. Los datos obtenidos utiliza •on diferentes concentraciones de PSCA se utilizan para calcular valores para el número, afinidad y asociación de PSCA con las moléculas candidatas. Ejemplo 25 Ens yo ln Vivo p ra la Promoción de Crecimiento de Tumor de PSCA El efecto de la proteína PSCA sobre el crecimiento de la célula de tumor se evalúa in vivo al evaluar el desarrollo del tumpr y el crecimiento de células que expresan o que carecen de PSCA. Por ejemplo, los ratones SCID se inyectan subcutáneamente en cada flanco con 1 x 10b de ya sea 3T3, o líneas de célula de cáncer de próstata (por ejemplo, células PC3) que contienen el vector vacío tkNeo o PSCA. Se pueden utilizar por lo menos dos estrategias: (1) la expresión de PSCA Constitutiva bajo regulación de un promotor tal como un promot 3r constitutivo obtenido de los genomas de virus tal como e 1 virus de polioma, virus fowlpox (UK 2,211,504 publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como Adenovirus 2¡), virus de papiloma bovino, virus de sarcoma de ave, titomegaiovirus, un retrovirus, virus de hepatitis B y Virus 40 de Simio (SV40), o de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promot o ele i nm?noglobul Lna, siempre y cuando tales promotores sean c ompatibles con los sistemas de célula hospedera, y (2) Expresión regulada bajo control, de un sistema de vector i nducible, tal como eedisona, tetraciclina, etc., siempre y cuando tales promotores sean compatibles con los sistemas de célula hospedera. El volumen de tumor luego se monitorea mediante la medición del calibre en la aparición de los tumores palpables y seguido a través del tiempo para determinar si las células que expresan PSCA crecen a una velocidad más rápida y sí los tumores producidos por las células que expresan PSCA demuestran características de agresividad alterada (por ejemplo, metástasis aumentada, vascularización, responsividad reducida a fármacos quimioterapéuticos] Adicional mente, les ratones pueden ser implantados con 1 10" de las mismas células ortotópicamente para determinar si la PSCA tiene un efecto en el crecimiento local en la próstata y ei PSCA afecta la habilidad de las células para metastasizars 3, específicamente a nodos de linfa, y hueso (Miki T y co aboradores, Oncol Res. 2001; 12: 209; Fu X y colaboradores, Int J Cáncer. 1991, 49:938). El efecto de PSCA en la formación deJ tumor del hueso y el crecimiento se puede estimar al inyectar células de tumor de próstata intratibialmente . El ensayo también es útil para determinar el efecto inh ib i r.or i o de P CA de las composiciones terapéuticas candidatas, tales como por ejemplo, intracuerpos PSCA, moléculas antisenti do de PSCA y ribosimas. Ejemplo 26 Inhibición Mediada po_r __Anticuerpo__Monocional de PSCA de los Tumores In Vivo La expre ;sión significante de PSCA sobre la superficie de la c;élula de tejidos de tumor, junto con su expresión . i c t _va en tejidos normales hace al PSCA un buen objetivo para1 la terapia de anticuerpo. De manera similar, PSCA es un objetivo para la inmunoterapia basada en célula T. Así, la eficacia terapéutica de MAbs anti-PSCA en modelos de ratón d xenoinjerto de cáncer de próstata humano, y modelos de ratón de xenoinjerto de cáncer pancreático hum no se evalúa a 1 util zar líneas de células recombinantes tales como PC3-PS : y 3T3-PSCA (ver, por ejemplo, Ka.ghn, M.E., y colaborado )res, Invest Urol, 1979. 17(1): 16-23), así como los modelos ce xenoinjerto de próstata humano tal como LAPC 9AD (Saffran <J al PNAS 1999, 10:1073-1078). La efica ía del anticuerpo en el crecimiento de ttuummoorr yy llaa ffoorrmmaacciiión de metástasis se estudia, por ejemplo, en modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata o pancreático ortotópico de ratón. Los anticuerpos pueden ser no conjugados, como e s discutido en este Ejemplo, o pueden ser conjugados a una modalidad terapéutica, como es apreciado en la técnica, MAbs anti-PSCA inhibe la formación de ambos xenoinjertos pancreáticos y de próstata. Los MAbs anti-PSCA también retardan el crecimiento de tumores ortotópicos establecidos y pr Dlonga l a supervivencia de ratones que llevan tumor. Estos resultados indican la utilidad de los MAbs anti-PSCA en el tratamiento del cáncer de próstata de etapas local y avanzada, cáncer pancreático y aquellos cánceres expuestos en la Tabla 1. (Ver, por ejemplo, Saffran, D. , y colaboradores, PNAS 10:1073-10/8 o ei sitio de la red mundial URL pnas . or(?/cgi/doi/10.1073/pnas .051624698 ) . La administración de los MAbs anti-PSCA conduce al retardo del crecir?iento de tumor ortotópico establecido y la inhibición de metástasis en sitios distantes, dando por resultado una pro ongación significante de supervivencia de los ratones que 11svan tumor. Estos estudios indican que PSCA es un objetivo at..-activo para la inmunoterapia y demuestran el potencial terapéutico de los MAbs anti-PSCA para el tratamiento del cáncer de próstata y pancreático local y metastático. Este ejemplo demuestra que los anticuerpos monoclonales de PSfSA no conjugados son efectivos para inhibir el crecimiento de xenoinjertos de tumor de próstata humano cultivado en ratones SCID; por consiguiente también es efectiva una combinación de tales anticuerpos monoclonales eficaces . Inhibición de tumo|r utilizando múltiples MAbs de PSCA a t ena.' s y Métodos Anticuerpos Monoclonales de PSC?: Los anti cuerpos monoclonales se cultivaron contra PSCA como es descr ito en el Ejemplo intitulado "Generación de Anticuerpos Monoc onales PSCA (MAbs)". Los anticuerpos se ccaarraacctteerriizzaann ppoorr ELISA, manchado de Western, FACS y de inmunoprecipitación por su capacidad para enlazar PSCA. Los datos de mapeo de epítope para los MAbs anti-PSCA como es determinado por ELISA y el análisis de Western, reconocen epítopes sobre la proteína PSCA. Se realiza el análisis inmunohistoquímico de los tejidos de cáncer de próstata y células con estos anticuerpos . Los ant icuerpos monoclonales se purifican de ascitis o sobreña dantes de cultivo de tejido de hibridoma mediante la cromatografía de proteína-G o Proteína-A Sepharose, se dializan contra PBS, se esterilizan en filtros y se agitan -2é°C. Las determinaciones de proteína y se realizan mediante el ensayo Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA) Un anticuerpo mónoclonal terapéutico o un cóctel que comprende una mezcla de anticuerpo monoclonales individuales se prepara y se utiliza para el tratamiento de ratones que reciben inyeccione$ s ubc111á n s u or t o fópicas de xenoinjertos de tumor LAPC9 y HPAC. Líneas de Célula y Xenoinjertos Las lineas de células de cáncer de próstata, línea de célula PC3 y LNCaP así. como la línea de fibroblasto NIH 3T3 (Colección Americana de Cultivo Tipo) se mantienen en RPMI y DMEM respeqtivamente, suplementado con L-glutamina y FBS al 10?. Població ic células PC3-PSCA y 3T3-PSCA se generan mediante l transferencia de gen retroviral como es descrito en Hubert, R.S., y colaboradores, Proc Nati Acad Sci U S A, 1999. 96(25 :14523. Eí xeno. ijerto LAPC-9, que expresa un receptor andrógeno de tipo silvestre y produce antígeno específico de próstata (PSA), se hace pasar en ratones inmunodeficientes (SCID) combinados severos de ICR machos de 6 a 8 semanas de edad (Taconic Fa?ms) mediante el implante de trocar s.c.

(Craft, N., y colaboradores, Nat Med. 1999, 5:280). Las suspension-es de célula individual de células de tumor LAPC-9 se preparan como es descrito en Craft, y colaboradores. Modelos de Ratón de Xenoinjerto Tumores Subcutáneos (s.c.) se generan mediante la inyección de 1 x lCr células de cáncer mezcladas en una dilución 1:1 con Matrigel (Collaborative Research)- en el flanco derecho dé ratones SCID machos. Para probar la eficacia de anticuerpo en la formación de tumor, es decir, inyecciones de anticuerpo se inician en el mismo día como las inyecciones de célula de tumor. Como un control, los ratones se inyectan con ya sea IgG de ratón purificado (ICN) o PBS; o un anticuerpo monoelonal purificado que reconoce un antígeno irrelevante no expresado en las células humanas. En estudios preliminares, no se encuentra diferencia entre IgG de ratón o PBS en el crecimiento de tumor. Los tamaños de tumor se determinan mediante? mediciones de calibre, y el volumen de tumor se calcula como longitud x ancho x altura. Los ratones con tumores subcutáneos mayores que 1.5 cm en diámetro se sacri fican . Las inyecciones ortotópicas se realizan bajo anestesia al utilizar ketamine/xilazina . Para estudios ortotópicos de próstata, se hace una incisión a través del abdomen para exponer la próstata y las células de tumor LAPC o PC3 (2 x 10d) nezcladas con Matrigel se inyectan en la cápsula de próstat en un volumen de 10 µl . Para monitorear el crecimiento de tumor, los tumores se palpan y la sangre se colecta en una base de cada semana para medir los niveles de PSCA. Los ratones se segregan en grupos para los tratamientos apropiados, con anti-PSCA o MAbs de control que son inyectados i.p. Los MAbs Anti-PSCA Inhiben el Crecimiento de Tumores de Cáncer de Xenoinjerto que expresan PSCA El efectc de los MAbs anti-PSCA sobre la formación del tumor se pruet a al utilizar modelos ortotópicos HPAC y LAPC9. Como es comparado con el modelo de tumor s.c., el modelo ortotópico, que requiere inyección de células de tumor directamente en el páncreas o próstata de ratón, respectivamente, da por resultado el crecimiento de tumor local, desarrollo de metástasis en sitios distantes, deterioro de la s alud de ratón y la muerte subsecuente (Saffran, D. , y colaboradores, PNAS supra ) . Estas características hacen el modelo ortotópico más representativo de la progresión de enfermedad humana y permite seguir el efecto terapéutico de los MAbs en puntos finales clínicamente relevantes . Por consiguiente, las células de tumor se inyectan en la próstata de ratón, y 2 días después, los ratones se segregan en dos grupos y se tratan con ya sea: a) 250-1000 µg, de anti-PSCA ?b, o b) anticuerpo de control tres veces por semana durante dos a cinco semanas. Una maybr ventaja de los modelos de cáncer ortotópicos es la habilidad para estudiar el desarrollo de la metástasis. La formación de metástasis en ratones que llevan tumores ortotópicos establecidos se estudia mediante el análisis de IHC en secciones de pulmón utilizando un anticuerpo contra una proteína de superficie de célula específica de tunjior tal como anti-CK20 para cáncer de próstata (Lin y colaboradores, Cáncer Detect Prev. (2001 25:202) . Otra ventaja de los modelos de cáncer de xenoinjerto es la habilidad para estudiar la neovascularizací ón y angiogénesis. El crecimiento del tumor es parcialmente dependiente del nuevo desarrollo de vaso sanguíneo. Aunque el sistema capilar y la red sanguínea en desa r ro11 o es de origen del hospedero, la iniciación y arquitectura de la neovasculatura es regulada por el tumor de xxeennooiinnjjeerrttoo ((DDaavviiddoff y colaboradores, Clin Cáncer Res. 2001) 7:2870; Solesvik y colaboradores, Eur J Cáncer Clin Oncol. (1984) 20:1295). El efecto del anticuerpo y la molécula pequeña de neovascularización se estudia de acuerdo con procedimientos ¿onocidos en la técnica, tal como mediante el análisis de IHC de tejidos de tumor y su microambiente circundante . Los rabones que llevan tumores ortotópicos establecidos se 1 ?!s administra en inyecciones de ya sea MAb anti-PSC? o antic jerpo ae control durante un periodo de 4 semanas. Los ratones en ambos grupos se dejan establecer una carga de tumor ta para asegurar una alta frecuencia de formación de metástasis en los pulmones del ratón. Los ratones Luego se sacrifican y sus vejigas, hígados, huesos y pulmones se analizan para la presencia de células de tumor mediante el análisis de IHC. Estos estudios demuestran una amplia eficacia ar.t itumoral de los anticuerpos anti-PSCA en la iniciación y La progresión del cáncer de próstata en modelos de ratón de xenoinjerto. Los anticuerpos anti-PSCA inhiben la formación de tumor de los tumores así como el retardo del crecimiento de tumores ya establecido se prolonga la supervivencia de los ratones tratados. Además, los MAbs anti-PSCA demuestrjan un efecto inhibitorio notable en la difusión del tumor de próstata local a sitios distantes, aún en la presencia de una carga de tumor grande. Así, los MAbs anti-PSCA son ef icaces en los mayores puntos finales clínicamente relevantes (crecimiento de tumor) , prolongación de la super vivmr i¿i y la s lud. Efectos <ae los MAbs de PSCA en el Crecimiento de Cáncer de Próstata Humano en Ratones Utilizando la metodología anterior, células de tumor LAPC- 9AI [2.0 x 10 células) se inyectaron subcutáneamente eb. ratones SCID machos. Los ratones se aleatorizaron en grupos (n=10 en cada grupo) y el tratamiento se inició i nt rapen tor.calmente (i.p.) en el. Día 0 con HA1-4.120 o el control MAb de isotipo como es indicado. Los animales se trataron dos veces cada semana para un total de 7 dosis hasta el día del estudio 28. El crecimiento de tumor se monitorea utilizanlio mediciones de calibre cada 3 a 4 días como es indicado. Los resultados muestran que el anticuerpo monoclonal anti-PSCA humano Hal-4.120 significativamente inhibieron el crecimiento de los xenoinjertos de cáncer de oros tata humano implantados subcutáneamente en ratones SCID (p<0.05) (Figura 18) En otro experimento, células de tumores LAPC-9AI (2.0 x 106 células) se inyectaron subcutáneamente en ratones SCID machos. Cuando el volumen del tumor alcanzó 50 mm3, los ratones se aleatori zaron en grupos (n=10 en cada grupo) y el tratamiento se iinició intraperitonealmente (i.p.) con HA1-5.99.1 o el cor trol de MAb de isotipo como es indicado, Los animales se tra carón dos veces a la semana para un total de 5 dosis hasta e„ día 14 del estudio. El crecimiento del tumor se monitorea utilizando mediciones de calibre cada 3 o 4 días como es indicado. Los resultados muestran que el anticuerpo monoclonal anti-PSCA completamente humano Hal-5.99 inhibió significativamente el crecimiento de los xenoinjertos aproximadamente 1 í días, tiempo en el cual los ratones se aleatorizaron en - rupos. El tratamiento con 500 mg humano de HA1-4.117, HA1-4.121 o MAb de control de Isotipo se inició 10 días después del implante del tumor. Los anticuerpos que se administraron intraperitonealmente dos veces a la semana para un total de 7 dosis. Cuatro días después de la última dosis, los animales se sacrificaron y los tumores primarios se extirparon y se pesaron. Los resultados muestran que los anticuerpos monoclonales anti-PSCA humanos Hal-4.121 (p<0.01) y Hal-4.117 (p<t0.05) significativamente inhibieron el crecimiento de Los xenoinjertos de cáncer de próstata LAPC-9AD ortotópioamente implantados en ratones SCID (Figura 21) . En otro experimento, células de tumor LAPC-9AD dependientes de a drógeno, derivados de pacientes (2.0 x 10 células) se inyc- ctaron en los lóbulos dorsales de las próstatas de ratones SCID machos. Los tumores se dejaron crecer durante ap oxi uñadamente 9 días tiempo en el cual los ratones se aleatorizaron en grupos. Los animales se aleatorizaron en grupos de supervivencia incluyen 11 ratones en el control de MAb de isotipo y 12 ratones en el grupo tratado con Hal-4 121. Los animales se trataron i.p. con 1000 ug de Hal-4.121 o 1000 ug de control de MAb de isotipo dos veces a la semana para un total de 9 dosis. Los resultados demostraron que Hal-4.121 significativamente (prueba de log-rank: p<0.01 prolongaron la supervivencia de los ratones SCID con tumores de próstata dependientes de andrógeno humano. Dos ratones en el grupo tratado con HA1-4.121 permanecieron libres de tumores palpables en el día 110, el último día del exp srimento (Figura 22). Efecto de los MAbs de PSCA en combinación con Taxotere en ratone Er >t ro experimento, células de tumor LAPC-9A1 (2 x 10° células por anilmal) se inyectaron subcutáneamente ratones SCID machos. Cuandjo el volumen del tumor alcanzó 65 mm3, los animales se aleatorizaron y se asignaron a cuatro grupos diferentes uv-10 en cada grupo) como es indicado. Comenzando en el día 0, Ha 1-4.121 o control de MAb se isotipo se administraron i.p. dos veces a la semana en una dosis de 500 ug para un total d 6 dosis. La última dosis se dio en el día 17. Taxotere se dio intravenosamente a una dosis de 5 mg/kg en los día 0, 3 y 7. El crecimiento del tumor se monitoreó cada 3-4 días utilizando mediciones de calibre. Los resultados de este estudio demuestran que HA1-4.121 como un solo agente inhib Ló el crecimiento de los xenoinjertos de próstata independíentes de andrógeno en ratones SCID por 45% cuando se compara con el tratamiento de anticuerpo de control solo en el día 28 (prueba de ANOVA/Tukey: p<0.05). La administración del control de MAb de isotipo más taxotere inhibió el crecimiento de tumor por 28% cuando se comparó con el tratamiento de anticuerpo de control solo, que no fue estadísticamente significante. La administración de HA1-4.121 en combinación con Taxotere, aumentó el efecto y dio por resultado una inh ibición de 69% del crecimiento de tumor cuando se comparó con el anticuerpo de control solo (prueba de ANOVA/Tukey: p<0.01). Una diferencia estadísticamente significante también se demostró cuando el grupo de combinación de Hal-4.121 más Taxotere se comparó con cualquiera de los grupos de Hal-4.121 o control de MAb de isotipo más Taxotere (prueba de ANOVA/Tukey: p<0.05) (Figura 23) . Efecto oe los MAbs de PSCA en el Crecimiento de Cáncer Pancreático Humano en Ratones En otro experimento, células de cáncer pancreático HP?C Humano (2 x 10'Vratones) se inyectaron subcutáneamente en ratones ICR SCID inmunodeficientes (Taconic Farm, Germanto n, NY) . Los ratones se aleatorizaron en grupos (n=10 animales/grupo) y el tratamiento con el anticuerpo monoclonal PSCx?. humano indicado inició el mismo día. Los anticuerpos 500 mg/ratón) sis suministraron intraperitonealmente dos veces a la semana para un total de 8 dosis. Los resultados demostraron que los anticuerpos monoclonales anti-PSCA humanos Hal-4.I21, Hal-4.117 y Hal-1.16 significativamente inhibieron el crecimiento de los xenoinjertos de cáncer pancreático humano subcutáneamente implantados en los ratones SCID. Los análisi estadísticos se realizaron utilizando una prueba t (dos lados, a=0.05) (Figura 24) . En otro experimento, células HPAC (3.0 x 106 células) se impla ntaron ortotópicamente en la pancreata de ratón SCID. Los r atones se asignaron aleatoriamente a tres grupos (n=9 en cada grupo) como es indicado. El tratamiento con HA1-4.121 (25C ug o 1000 ug) o el control MAb de isotipo (1000 ug) se inic Ló en el día del implante. Los anticuerpos se administraron i p. dos veces a la semana para un total de 10 dosis. Trece dias después de la última dosis, los animales se sacrificaron y los tumores primarios se extirparon y se pesaron. Los res litados de este estudio demostraron que HA1-4.121 signi: icativamente inhibió el crecimiento ortotópico de los xenoinjertos de cáncer pancreático humano en ratones SCID an ambos niveles de dosis examinados. El tratamiento con 50 ug y 1000 ug de AGS-PSCA inhibió el crecimiento del túmor por 66% y 70%, respectivamente (prueba Krus al-Wallis/Tuk|ey: p<0.01 y p<0.01, respectivamente) (Figura 25) . En la aiftopsia, las metástasis visibles a nodos de linfa y órganos distantes se observaron en el grupo tratado con nticuerpo c e control. Nc se observaron metástasis visibles en ambos grupos tratados con HA1-4.121. Los nodos de linfa, pulmones e hígados se removieron de todos los animales y se examinaron h .stológicamente para la presencia del tumor metastático. Secciones de los pulmones y nodos de linfa se removieron de cada animal se mancharon para la citoqueratina humana y el número de metástasis se determinó microscópicamente . Los resultados de los análisis histológicos demostraron una reducción significante en la metástasis de nodD de linfa (LN) en el animal tratado con HA1 -4 . 121 ( p=0 . 015 )2 como es detectado por la prueba exacta de Fishers). La incicpencia de metástasis e invasión también se disminuyó significativamente en los animales tratados con ambas concentraciones de HA1-4.121 (p=0.0152 como es detectado por la prueba exacta de Fishers) . El número de metástasis de pulmón disminuyó significativamente en los ratones tratados (pon la dosis 1.0 mg de HA1-4.121 solamente (p=0.0498 como es detectado por la prueba exacta de Fishers) (Figura 26) . Efecto je los MAbs de PSCA en el Crecimiento de Cáncer de Vejiga Humano en Ratones En otro experimento, las células de cáncer de vejiga SW780 Hiµmano (2 x 106/ratón) se inyectaron subcutáneamente fen ratones ICR SCID inmunodeficientes ¡Taconic Farm, Gerjrmantown, NY) . Los ratones se aleatorizaron en dos grupos n= 10 animales/grupo) y el tratamiento con el MAb de PSCA hurano indicado inició el mismo día. Los anticuerpos ( 50 mg/ratón) se suministraron intraperitonealmenlte dos veces a la semana para un total de 7 dosis. Los resultados demostraron que HA1-4.117 (p=0.014), HA1-4.37 (p=0.0056 ), HA1-1.78 (p=0.001), Hal-5.99 (p=0.0002) y HA1-4.5 (p=0.0008) significativamente inhibieron el crecimiento de 1 os tumores de vejiga SW780 implantados subcutáneamente a ratones SCID. Los análisis estadísticos se realizaron en una prueba t (dos lados, =0.05) (Figura 27). Los resr ltados de estos experimentos muestran que los MAbs de PSC? pueden ser utilizados para propósitos terapéuticos y de diagnóstico para tratar y manejar cánceres expuestos en la Tabla I. Ejemplo 27 Uso Terapéutico y| de Diagnóstico de Anticuerpos Anti-PSCA en Humanos Los anti cuerpos monoclonales anti-PSCA se utilizan de manera segura y efectiva para propósitos de diagnóstico, profilácticos, de pronóstico y/o terapéuticos en humanos. El manchado de Western y el análisis inmunohistoquímico de tejidos de cáncer y xenoinjertos de cáncer con MAb anti-PSCA muestra el mancr ado extensivo fuerte en carcinoma pero niveles significativamente menores o no detectables en tejidos normales. La detección de PSCA en carcinoma y en la enfermedad metastáKica demuestra la utilidad del MAb como un indicador de diagnóstico y/o de pronóstico. Los anticuerpos anti-PSCA por lo tanto se utilizan en aplicaciones de diagnóstico tal como la inmunohistoquímica de muestras de biopsias de riñ bn para detectar cáncer de pacientes sospechosos . Como es determinado por la citometría de flujo, MAb anti-PSCA especificamente enlaza a células de carcinoma. Así, los anticuerpos fnti-PSCA se utilizan en aplicaciones de formación de imagen de cuerpo completo de diagnóstico, tal como la radioinmuhoscintigrafía y radioinmunoterapia, (ver, por ejemplo, Potamianos S., y colaboradores, Anticancer Res 20 (2A) : 925-948 (2000)) para la detección de cánceres localizados y metastáticos que exhiben la expresión de PSCA.

El mudamiento o li .beración de un dominio extracelular de PSCA en el medio extracelular, tal como aquel observado para fosfodiesterasa alcalina B10 (Meerson, N.R., Hepatology 27:563-568 (1998) , permite la detección de diagnóstico de PSCA mediante los anticuerpos anti-PSCA en muestras de suero y/o de orina de pacientes sospechosos. Los an Kcuerpos anti-PSCA que específicamente enlazan PSCA se utilizan en aplicaciones terapéuticas para el tratamiento de cánceres que expresan PSCA. Los anticuerpos anti-PSCA se utilizan como una modalidad no conjugada y como formas conjugada en la cual los anticuerpos se unen a una de varias modalidades terapéuticas y de formación de imagen bien conocidas en la técnica, tales como profármacos, enzimas o radioisótopos. En estudios preclínicos, los anticuerpos anti- PSCA no conijugados y conjugados se prueban para la eficacia en la prevención de tumor e inhibición del crecimiento en los modelos de xenoinjerto de cáncer de ratón SCID, por ejempl , modelos de cáncer de riñon AGS-K3 y AGS-K6, (ver, por ejemplo, el Ejemplo intitulado "Inhibición Mediada por Anti uerpo Monoclonal de PSCA de Tumores In Vivo"). Cualquiera de los anticuerpos anti-PSCA conjugados y no conjugados se atilizan como una modalidad terapéutica en experimentos clíni eos humanos ya sea solos o en combinación con otros tratamientos como es descrito en los siguientes ejemplos . Ejemplo 28 Experimentos Clínicos Humanos para el Tratamiento y la Diagnosis de Carcinomas Humanos a través de uso de Anticuerpos Anti-PSCA Humanos In vivo Los t -cuerpos se utilizan de acuerdo con la presente invención , los cuales reconocen un epítope sobre PSCA, y se utili _an en el tratamiento de ciertos tumores tales como aquellos listados en la Tabla I. Basado en un número de factores , incluyendo niveles de expresión de PSCA, los tumores tale: como aquellos listados en la Tabla I actualmente son indicaciones preferidas. En relación con cada una de estas indicaciones, tres procedimientos clínicos son exitosamente practicados . I) . Ter, pia adjuntiva: En la terapia adjuntiva, los pacientes s< tratan con anticuerpos anti-PSCA en combinación con ul' agente quimioterapéutico o antineoplásico y/o de la terapia de radiación. Los objetivos de cáncer primarios, tales como aquellos listados en la Tabla I, se tratan bajo prot colos estándares mediante la adición de anticuerpos anti PSCA a la terapia de primera y segunda línea estándar. Los di eños de protocolo dirigen la efectividad como es estimado por la reducción en la masa de tumor así como la habilic id para reducir las dosis usuales de quimioterapia est ndar. Estas reducciones de dosificación permiten la terapia adicional y/o prolongada al reducir la toxicidad relac roñada con la dosis del agente quimioterapéutico . Los anticuerpos anti-PSCA se utilizan en varios experiment Osí. clínicos adjuntivos en combinación con los agentes quimiotierapéuticos o antineoplásicos adriamicina (carcinoma de prc stata avanzado) , cisplatin (carcinomas de cabeza y cuello y pulmón avanzado) , taxol (cáncer de seno) y doxorubicina (preclínico) . TI) . Mon Dterapia: En conexión con el uso de los anticuerpos anti PSCA en monoterapia de tumores, los anticuerpos se administran a pacientes sin un agente quimioterapéutico o antineoplásico. En una modalidad, la monoterapia de cor duee clínicamente en pacientes de cáncer de etapa linal con enfermedad metastática extensiva. Los pacientes muestran algo de estabilización de la enfermedad. Los experimentos demuestran un efecto en pacientes refractarios con tümores cancerosos, III). Agente de Formación de Imagen: A través del enlace de un radionúclido (por ejemplo, yodo o itrio (I131, a ant i cuerpo; anti-PSC?, los anticuerpos radiomarcados se utilizan como un agente de diagnóstico y/o formación de imagen. En tal función, los anticuerpos marcados localizan a ambos tumores sólidos, así como las lesiones metastáticas de células que expre ?san PSCA. En relación con el uso de los anticuerpos anti-PSCA como agentes de formación de imagen, los anticuerpos sé utilizan como un adjunto al tratamiento quirúrgico de tumores sólidos, tanto como una clasificación pre-quirúrgica as:, como un seguimiento post-operativo para determinar qué turror permanece y/o regresa. En una modalidad, un anticuerpo n xIn) -PSCA se utiliza como un agente de formación de imac n en el experimento clínico humano de Fase I en pacientes qué tienen un carcinoma que expresa PSCA (por analogía ver, por ejemplo, Divgi y colaboradores J. Nati. Cáncer Inst. 83:9 7-104 (199.1)). Los pacientes son seguidos con cámaras gama anteriores y posteriores estándares. Los resultados indicar que las lesiones primarias y las lesiones metastáticas son identificadas . Dosis v Futa de Administración Como es! apreciado por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica, las consideraciones de dosificación pueden ser determinadas a través de la comparación con los productos análogo que están en la clínica. Así, los anticuerpos anti-BSCA pueden ser administrados con dosis en el intervalo de 5 a 400 mg/m-, con las dosis menores utilizadas, por ejemplo, en relación con estudios de seguridad. La af:|Lnidad de los anticuerpos anti-PSCA con relación a la af'Lnidad de un anticuerpo conocido para su objetivo os un pairámctro utilizado por aquellos expertos en la técnica para determinan regímenes de dosis análogas. Además, los ant:icuerpos anti-PSCA que son anticuerpos completamente humanos, como es comparado con el anticuerpo quimérico, nene evacuación más lenta, por consiguiente, la dosificación en pacientes con anticuerpos anti-PSCA completamente humanos puede ser menor, puede que sean en el intervalo 50 a 300 mg/m2, y aún permanecer eficaz. La dosificación mg/pr, como es opuesta a la medición convencional en dosis en mg/kg, es una medición basada en el área de superficie y es una medición de dosificación conveniente que ei 3 diseñada para incluir pacientes de todos los tamaños desde infantes a adultos. Tres procedimientos de suministro distintos son útiles para el suministro de anticuerpos anti-PSCA. El suministro intravenoso convencional es una técnica de suministro estándar para muchos tumores. Sin embargo, en relación con tumores en la cavidad peritoneal, tales como tumores de los ovarios, ducto biliar, otros ductos y sus similares, la administración intraper itoneal se puede probar favorable para la obtención de alta dosis de anticuerpo en el tumor y también minimizar la evacuación del anticuerpo. De una manera si ..lar, ciertos tumores sólidos poseen vasculatura que es apropiada para la perfusión regional. La perfusión regional permite una alta dosis de anticuerpo en el sitio de un tumor y minimiza la evacuación a corto plazo del anticuerpo . Plan de ¡Desarrollo Clínico (CDP) Revisión: El CDP sigue y desarrolla tratamientos de anticuerpos anti-íj'SCA en relación con la terapia adjuntiva, monoterapia y corr.o un agente de formación de imagen. Los experimentos inic ialmente demuestran seguridad y después conforman eficacia en dosis repetidas. Los experimentos son de etiqueta abierta comparando la quimioterapia estándar con la terapia estándar más los anticuerpos anti-PSCA. Como será apreciado, un criterio que se puede utilizar en relación con el enrolamiento dcj pacientes es, en los niveles de expresión de PSCA on su; tuir res como es determinado mediante biopsia. Como con cualquier terapéutico basado en la infusión de proteina o anticuerpo, los problemas de seguridad son relacionados principalmente a (i) síndrome de liberación de citoquina, eá decir, hipotensión, fiebre, agitación, escalofríos; (ii) el desarrollo de una respuesta inmunogénica al material (es decir, el desarrollo de anticuerpos humanos por el paciente al terapéutico de anticuerpo, o respuesta de HAHA) ; y (iii) t Dxicidad a células normales que expresan PSCA. Las pruebas estándares y el seguimiento se utilizan para monitorear calda uno de estos problemas de seguridad. Los anticuerpos anti-PSCA se encuentran que son seguros en la administración hum|ana. Ejemplo 29 Experimento Clínjico Humano: Monoterapia con el Anticuerpo Anti-PSCA Humano Los anti cuerpos anti-PSCA son seguros en relación con el experimento adjuntivo discutido en lo anterior, un experimento clínido humano de Fase II confirma la eficacia y dosificación optina para la monoterapia. Tal experimento es real i ado. comarende los mismos análisis de seguridad y efecto, al experimento adjuntivo descrito en lo anterior con las excepción de que los pacientes no reciben quimioterapia concurrentemente con la recepción de dosis de anticuerpos anti-PSCA. Ejemplo 30 Experimento Clínico Humano: Formación de Imagen de Diagnóstico con Anticuerpo Anti-PSCA Una ve; nuevamente, como la terapia adjuntiva discutida antericr es segura dentro de los criterios de seguridad discutídos anteriormente, un experimento clínico humano se condace concerniente al uso de anticuerpos anti-PSCA como an agente de formación de imagen de diagnóstico. El protocolo se diseña de una manera sustancialmente s milar a aquellos descritos en la técnica, tal como en Divgi y colaboradores, J. Nati. Cáncer Inst . 83:97-104 (1991) Los anticuerpos se encuentran que son tanto seguros y eficaces;; cuando se utilizan como una modalidad de diagnóstico . Ejemplo 31 Terapia Adjunti va del Experimento Clínico Humano con el Anticuerpb Anti-PSCA Humano y el Tratamiento uimioterapéuticp, de Radiación y/o Terapia de Ablación de Hormona Un experimento clínico humano de fase I se inicia para estimar la s eguridad de seis dosis intravenosos de un anticuerpo anti-P£:CA humano en relación con el tratamiento de un tumor sólido, por ejemplo, un cáncer de un tejido listado en la Tabla T. En el estudio, l a seguridad de las dosis individuales de anticuerpos anti-PSCA cuando se utiliza como una terapia adjuntiva a un agente antineoplásico o quimioterapéutico o de ablación de hormona como es definido en la presente, tal como, sin limitación: cisplatin, topotecan, dexorubicina, adriamicina, taxol, Lupron, Zoladex, Eulexin, Casodex, Anandron o los similares, es estimado. El diseño experimental incluye suministros de aproximadamente seis dosis individual de un anticuerpo anti-PSCA con la dosificación de < nticuerpo escalada en aproximadamente 25 mg /m¿ a ap rox i ma (ll men t e K mg/rrr durante el curso del tratamiento de acu :rdo con el siguiente o similar programa . Día 0 Día 7 Día 14 Día 21 Día 28 Día 35 Dosi de M»\o 25 mu/m K m " 1 25 luq/K 1 75 mg /m' 225 mg /m' 275 mg /m2 u i : ? :o i ap i J + + + + + + (dosis estándar) Los paci entes son estrechamente seguidos durante semana después de cada administración del anticuerpo y la quimioterapia. En particular, los pacientes se estiman para los problemas de seguridad mencionados en lo anterior: (i) síndrome de líber;ición de citoquina, es decir, hipotensión, fiebre, agitación, escalofrío; (ii) el desarrollo de una respuesta inmunogé nica al material (es decir el desarrollo de anticuerpos humane s por el paciente para el terapéutico de anticuerpo humano, o respuesta HAHA) ; y (iii) toxicidad a células normales QUe expresan PSCA. Las pruebas estándares y el seguimiento se utilizan para monitorear cada uno de estos problemas de segur idad. Los pacientes también se estiman para el efecto clínico y particularmente la reducción en la masa del tumor como es demostrado por el MRI u otra formación de imagen . Los ant cuerpos anti-PSCA se demuestran que son seguros y eficaces . Los experimentos de Fase II confirman la eficacia y refina La dosificación óptima. Ejemplo 32 Interferencia de RNA (RNAi) La .tecno logia de interferencia de RNA (RNAi) es s i mp 1 emente una va riedad de ensayos de células relevantes a oncología. RNAi e s un mecanismo de silenciamiento de gen post-tanscripciona activado por el RNA de doble hebra (dsRNA) . RNAi induce la degradación del mRNA específico :onauc?cndo ;amb11 en la expresión de proteína y subsecuentemente fn la función de gen. En células de mamífero, este es isRNAs llamados RNA de interferencia corta (siRNA) tienen la composición correcta para activar la ruta de RNAi que dirige la degradación, específicamente algunos mRNAs. Ver, Elbas hir S.M., y colaboradores, Duplexes of 21-nucleotide RNAs Medíate RNA interference in Cultured Mammalian Cells, Nature 411 (6836) : 494-8 (2001) Así, la tecnología do RNÁi se utiliza exitosamente en células mamíferas para sileínciar genes dirigidos. La pérdida del control de proliferación celular es una marca de contraste de las células cancerosas; así, la estimación de la función de PSCA en los ensayos de supervivencia/prol i feración celular es relevante. Por consiguiente, RNAi se utilizó para investigar la función del antígeno PSCA. Para generar siRNA para PSCA, se utilizaron algoritmos que preclicen los oligonucleótidos que exhiben los parámetros moledulares críticos (contenido de G:C, l ernper a tur, fias i on. etc. y tiene la habilidad para significa tivamente reducir los niveles de expresión de la proteína PSCA cuanio se introduce en células. De acuerdo con este Ejemplo, se utilizan composiciones de siRNA de PSCA que comprenden siRNA (RNA de interferencia corta, de doble hebra) que corresponden a la secuencia ORF de ácido nucleico de la proteína PSCA o subsecuencias de la misma. Así, se utiliza subsecuencias de si. RNA que de esta manera son generalmente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o más que 35 nucleótidos de RNA contiguos en longitud. Estas secuencias de siRNÁ son complementarias y no complementarias a por lo menos una porción de la secuencia de codificación de mRNA. En una modal idad preferida, las subsecuencias son de 19-25 nucleótidos en longitud, mucho más de preferencia 21-23 nucleóta aos en lor gitud. En modalidades preferidas, estos siRNA logran la inactivación del antígeno PSCA en células que expresan la proteína que tiene efectos funcionales como es descrito enseguida. El siRNA seleccionado (PSCA.b oligo) se probó en numerosas líneas de células en el ensayo MTS de supervivencia/proliferación (mide la actividad metabólica celular) . Los ensa LOS colorimétricos basados en tetrazolio es decir, MTS) detectan células viables exclusivamente, puesto que las cé ulas vivientes son metabólicamente activas y por lo t ante pueden reducir ias sales de tetrazolio a compuestos de formazan coloreados; las células muertas, sin embargo no pueden hacerlo. Además, este PSCA.b oligo logró la inactivación del antígeno PSCA en células que expresan la oróteí na que tic e efectos funcionales como es descrito enseguida utilizando los siguientes protocolos. Transfecc iones siRNA de mamífero: El día antes de la transfección de siRNA, las diferentes líneas de células se colocaron en el medio (RPMI 1640 con FBS al 10% w/o antibióticos) en 2 l03 células/cavidad en 80 µl (formato de plata de 96 cavidades) para el ensayo de supervivencia/MTS .

En paralelo con el siRNA oligo específico de PSCA, las siguientes secuencias se incluyeron en cada experimento como ccoonnttrroolleess:: aa)) ccéélluulas transfectadas Mock con Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y solución reguladora de recocido (no siRNA ; b) siRN? específico de Luciferasa-4 (secuencia dirigida 5'-AAGGGACGAAGACGAACACUUCTT-3' ) (SEQ ID NO: 77); y c) siRNA específico de Eg5 (secuencia dirigida: 5' -AACTGAAGACCTGAAGACAATAA-3' ) (SEQ ID NO: 78). Los siRNAs se utilizaron en 10 :nM y 1 µg/ml de Lipofectamina 2000 de concentración final. El procedimiento fue como sigue: Los siRNAs primero se diluyeron en 0DTIMEM (medio de transfección libre de suero, Invitrogen) en 0.1 uM µM (10 veces concentrado) y se incubaron 5-10 miri a RT . La Lipofectamina 2000 se diluyó en 10 µg/ml (10 vec s concentrada) para el número total de transfecciones se incubó 5-10 minutos a temperatura ambiente (RT) . Cantidades apropiadas de Lipofectamina 2000 concentrada 10 veces diluida se mezclaron 1:1 con siRNA concentrado 10 veces diluido y se incubaron en RT durante 20-30" (solución de transfección concentrada 5 veces. 20 µls de las soluciones de transfección concentradas 5 veces se adicionaron a las muestras respectivas y se incubaron a 37 °C durante 96 horas antes del análisis Ensayo db MTS: El ensayo de MTS es un método colorimétrico para determinar el número de células viables en ensayos de prol i fe •ación, c Ltotoxicidad o quimiosensibilidad basado en un compue sto de tetrazolio [3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetpxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazolio, sal interna; MTS b) ] y un reactivo de acoplamiento de e 1 eL. t rón ( er osu 1 fa to dt- tena zi na; PES). Los ensayos se realizaron al adicionar una pequeña cantidad del Reactivo de Solución directamenlte a las cavidades de cultivo, incubando durante 1-4 horas y luego registrando la absorbencia en 490 nm con un lectot de placa de 96 cavidades. La cantidad de producto de formazan coloreado como es medido por la cantidad de absorbencia de 490 nm es directamente proporcional a la actividad mitocóndrica y/o el número de ' células vivas en el cultivo.

Con el íin de dirigirse a la función del PSCA en las cél ul as, l CA es silenciado al transfectar las líneas de células de PSCA que expresan endógenamente. Otra modalidad de la invención es un método para analizar la prol i feración celular relacionada con PSCA que es la medición de síntesis de DNA como un marcador para proliferación. Lo precursores de DNA marcados (es decir, 3H-Timidina) se utilizan y su incorporación al DNA se cuantifica. La in< orporación del precursor marcado en DNA es directamente propc rcionar a la cantidad de división celular que ocurre en el cultivo. Otro método utilizado para medir la proliferación cel lar es realizar ensayos clonogénicos. En estos ensayos, un número definido de células se colocan en placas sobre la matriz apropiada y se cuenta el número de colonias formadas después de un período de crecimiento después del tratamiento con si RNA. En la v lidación objetivo del cáncer de PSCA, la complementación d 1 análisis de supervivencia/proliferación celular con apoptosis y los estudios de perfilamiento del ciclo celular on considerados. La marca de compuesto bioquímico del proceso apoptótico es la fragmentación de DNA genómica, un ever to irreversible que lleva a la célula a morir. Un método para observar el DNA fragmentado en las células es la déte cción inmunológica de los fragmentos de DNA formados en complejo con historia mediante un inmunoensayo (es decir, ELISA de detección de muerte celular) que mide el enriquec .miento los fragmentos de DNA formados en complejos con hietona (mono- y oligo-nucleosomas) en el citoplasma de células apoptóticas. Este ensayo no requiere la ¡'. r ema r ca c i ón dc 1 a células y puede detectar la degradación de DNA en células qué no proliferan in vi tro (es decir, células de tumor recientemente aisladas) . Las moléculas efectoras más importantes para activar la muerte celular apoptótica son las caspasas. Las caspasas son prc teasas que cuando se activan segmentan numerosos sustratos en el sitio carboxi-terminal de un residuo de aspartato que media las etapas muy tempranas de la apoptosis en la ai K. ivaeión. Todas las caspasas se sintetizan como pro-enzimas y la activación involucra la segmentación en los residuos de aspartato, En particular, la caspasa 3 SÍ observa que desempeña una función central, en la iniciación de eventos celular de apoptosis. Los ensayos para la determinación de a activación de caspasa 3 detectan eventos tempranos de apoptlosis. Después de los tratamientos con RNAi, la detección de manchado de Western de la presencia de caspasa 3 activa D la segmentación proteolítica de productos [ es decir, PARP) encontrada en las células apoptóticas además soporta una inducción activa del apoptosis. Debido a que los mecanismos celulares que dan por resultado la apoptosis son complejos, cada uno tiene sus ventajas y limitaciones. La consideración de estos criterios/puntos finales tal como la morfología célula , condensación de cromatina, ampollamiento de la membrana, os cuerpos apoptóticos ayudan a soportar adicionalmente la muerte celular como apoptótica. Puesto que no todos los objet ivos de genes que regulan el crecimiento de las células son anti-apoptóticos, el contenido de DNA de células permeabili zadas se mide para obtener el perfil de contenido de DNA d el perfil del ciclo celular. Los núcleos de las células apoptóticas contienen menos DNA debido a la fuga al citoplasm (población sub-Gl) . Además, el uso de manchas de DNA es decir, yoduro de propidio) también diferencian entre las diferentes fases del ciclo celular en l pobl ción de c lulas debido a la presencia ele cantidades de diferentes de DMA en G0/G1, S y G2/M. En estos estudios se puede cuantificar as subpoblaciones . Para el c en PSCA, los estudios de RNAi facilitan el entendimiento de 1 a contribución del producto de gen en las rutas de cáncer. Tales moléculas de RNAi activas tienen uso en ensayos de ide ntificación para clasificar MAbs que son teraoéuticos antitumorales activos. Además, siRNA se administra como terapéuticas a pacientes con cáncer para reducir el crecimijento maligno de varios tipos de cáncer, incluyendo aquellob listados en la Tabla 1. Cuando PSCA desempeña una función en la supervivencia de la célula, la proliferación de 1Ja célula, tumorigénesis o apoptosis, es utilizada como un Dbjetivo para propósitos de diagnóstico, de p no t i co, 'ven i vos v/o terapéuticos. Ejemplo 33 Detección de la prbteína de PSCA 'en muestras de pacientes con cáncer mediante IHC La expre sión de la proteína PSCA en muestras de tumor de paciente s con cáncer se detectó utilizando el anticuerpo HA1-4.117. Los tejidos incrustados en parafina fijados en formalina se cortaron en 4 micro secciones y se montaron en platinas de vidrio. Las secciones se desceraron, se rehidrataron y s e trataron con solución de recuperación de antígeno (Antigen Retrieval Citra Solution; BioGenex, 4600 Norris Canyotn Road, San Ramón, CA, 94583) a alta temperatura. Las secciones luego se incubaron en anticuerpo anti-PSCA monoclonal humano conjugado con fluoresceína, Hal-4.117, durante 16 horas a 4°C. Las platinas se lavaron tres veces en solución reguladora y además se incubaron con anti-Fluoresceína ce Conejo durante 1 hora y, después del lavado en solución reguladora, se sumergieron en anticuerpos secundarios de iiimunoqlubulina de anticonejo de cabra conjugado con perox idasa DAKO EnVision+™ (DAKO Corporation, Carpenteria, CA) durante 30 minutos. Las secciones luego se lavaron en solución reguladora, se revelaron utilizando el equipo DAB (SIGMA hemicals), se contramancharon utilizando hematoxilina y se analizaron mediante la microscopía de campo brillante. Los resultados muestran la expresión de PSCA en las células de tumor del adenocarcinoma de próstata (A,B), carcinoma transic onal de vejiga (C) y el adenocarcinoma ductal pancreático (D) . Estos resultados indican que PSCA es expresado en caneeres humanos y que los anticuerpos dirigidos a este antígeno son útiles como reactivo de diagnóstico (Figura 17) . Estos re sultados indican que PSCA es un objetivo para las aplicpaciones de diagnóstico, pronóstico y terapéuticas en el cáncer . Pro toda esta solicitud, son referidos varios contenidos de daios del sitio de la red, publicaciones, solicitudes de pal ente y patentes. (Los sitios de la red son referidos por su Localizador de Recursos Uniformes, o URL, las direcciones sobre la Red Mundial) . Las discusiones de cada una de estas referencias son incorporadas en la presente por referencia en la presente en sus totalidades. La prese nte invención no va a ser limitada en el alcance por las medalidades divulgadas en la presente, que se proponen como úni :as ilustraciones de aspectos individuales de la invenci .on , y algunas que son funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. Varias modificaciones a los modelos y métodos de la invención, además cié aquella descritas en la presente, llegarán a ser evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción y enseñanzas anteriores, y se proponen de manera similar que caen denr.ro del alcance de la invención. Tales modificaciones u otras modalidades pueden ser practicadas sin apartarse del alcance y espíritu verdaderos de la invención. Tablas Tabla I: Tejidos que expresan PSCA cuando son malignos. Próstata Páncreas Vej iga Riñon Colón Pulmón Software 9.0 BLOSJJM62 (matriz de sustitución de blogue).

Entre más alto sea el valor, más probable es que se encuentre una sustitución en proteínas naturales relacionadas. (Ver la red mundial URL ikp .unibe . ch/manual/blosum62.html) A M N T V 4 0 -1 -1 -2 -1 0 0 -2 A -3 -4 -2 -1 -1 -1 -2 -2 C 6 2 -3 -1 -1 4 -3 1 -1 0 -2 0 -3 -4 -3 D 5 -3 -2 0 -3 1 -3 -2 0 -1 2 0 0 -1 -2 -3 2 E 6 -3 -1 0 -3 0 0 -3 -4 -3 -3 -2 -1 -1 1 3 F -2 -4 -2 -4 -3 O -2 -2 -2 O -2 -3 -2 -3 G -3 -1 -3 -2 1 -2 0 0 -1 -2 -3 -2 2 H 4 -3 2 1 -3 -3 -3 -3 -2 -1 3 -3 -1 I 5 -2 -1 0 -1 1 2 0 -1 -2 -3 -2 K 4 2 -3 -3 -2 -2 -2 -1 1 -2 -1 L 5 -2 -2 0 -1 -1 -1 1 -1 -1 M 6 -2 0 0 1 0 -3 -4 -2 N 7 -1 -2 -1 -1 -2 -4 -3 P 5 1 0 -1 -2 -2 -1 Q 5 -1 -1 -3 -3 -2 R 4 1 -2 -3 -2 S 5 0 -2 -2 T 4 -3 -1 V 11 W TABLA IV: Porciones/Superporciones de Clase I/II de HLA TABLA IV (A) : Superporciones/Porciones de Clase I de HLA SUPERPORCION PORCIÓN PORCIÓN PORCIÓN 2 (Fl jador Primario) 3 (Fijador Primario) C Terminal (Fijador Primario) Al TJLV VMMSS FWY A2 LIVM?GQ IVMATL A3 VSM?TLI RK lleva porción sí este tiene fijadores primarios en cada posición de finadcr primario para una porción o superporcion como es especifica<Uo en la tabla anterior. TABLA IV (B) : Supeiporción de Clase II de HLA W,F, Y,V,I,L A,V,I,L, P,C,S,T A,V,I,L,C,S,T,M,Y TABLA IV (C) : Porciones de Clase II de HLA PORCIONES 1° fija ior 1 2 3 4 5 1° fijador 6 1 8 9 DR4 preferido FMY1XVW M T I VSTCPALIM MH MH nocivo DR1 preferido MFLIVW?' PA Q VMAT SPL IC M AVM nocivo C CH FD C D GDE D DR7 preferido MF?WY IVMSACGPL IV nocivo C G GRD N G DR3 PORCIONES lo fijac or 1 2 3 1° fijador 4 5 1° fijador 6 Porción a LIVMFY D preferida Porción b LIVMFAY DNQEST KRH preferida Superpor- MFLIVWY VMSTACPLI de DR Los residuos en cu rsiva indican residuos menos preferidos o "tolerados" TABLA IV (D) : Super porciones de Clase I de HLA POSICIÓN: 1 2 3 4 5 6 7 8 C- terminal SUPER PORCIONES Al l°F?jador l°F? ador ?ILVMS FWY A2 1° Fijador l°F? ador LIVMAGQ LIVMAT A3 Preferido l°F ador YFW YFW YFW P l°F?jador VSMATil (4/5) (3/5) (4/5) (4/5) RK nocivo DE(3/5) DE P (5/5) (4/5) A24 l°F?jador l°F?jador YFWIVLMT FU Y WLM B7 Preferido FWY(5/5 1° Fi ador FWY FWY l°F? ador LIVM(3/ ¡) P (4/5) (3/5) VIFJW?? nocivo DE(3/5) DE G QN DE P(5/5) ; (3/5) (4/5) (4/5) (4/5) G(4/5); A(3/5) ; QN(3/5) B27 l°F?jador l°F?jador dor GPQNDE GDESTC RHKDE DE QNDGE DE ATIVLMF WY TABLA IV (F) : Resumen e HLA-supertipos Frecuenc Las fenotípicas totales de HLA-supertipos en diferentes pobllaciones étnicas Especificidad "recuencia ::enotíp?ca Supertipo Posición 2 C- Caucásico Negro Japonés Chino Hispánico Promedio Terminal N.A. B7 AILMVFWY 43.2 55.1 57.1 43.0 49.3 49.5 A3 AILMVST RK 37.5 42.1 45.8 52.7 43.1 44.2 A2 AILMVT AI MVfr 45 39.0 42.4 45.9 43.0 42.2 A24 YF(WIVLMT) FI(YWLM) 23.9 38.9 58.6 40.1 38.3 40.0 B44 E(D) FWYLI MVA 43.0 21.2 42.9 39.1 39.0 37.0 Al TI(LVMS) FWY 47.1 16.1 21.8 14.7 26.3 25.2 B27 FYL(WMI) 28.4 26.1 13.3 13.9 35.3 23.4 B62 QL(IVMP) FWY(MIV) 12.6 4.8 36.5 25.4 11.1 18.1 B58 ATS FWY(LIV) 10.0 25.1 1.6 9.0 5.9 10.3 TABLA IV (G) : Cobertura de población calculada, dada por diferentes combinaciones de HLA-supertipo HLA-supertipos Frecuencia fenotipica Caucásico Negros Japonés Chino Hispánico Promedio N.A. 83.0 86.1 87.5 88.4 86.3 86.2 A2,A3 y B7 99.5 98.1 100.0 99.5 99.4 99.3 A2,A3,B7,A24, 99.9 99.6 100.0 99.8 99.9 99.8 B44 y Al A2,A3,B7,A24 B44,A1,B27, B62, y B58 Las porciones ind can los residuos que definen especificidad del supertipo. Las porciones incorporan residuos determinados en la base de datos son reconocidos por múltiples alelos dentro del supertipo. Los residuos dentro de corchetes son residuos adiciona] es también predichos que son tolerados por múltiples alelos del supertipo .

Tabla V: Porciones, que Ocurren Frecuentemente Nombre % de identidad Descripción Función Potencial promedio La proteína que enlaza ácido nucleico que Dedo de Zinc, funciona como factor de transcripción, zf-C2H2 34% tipo C2H2 localización nuclear probable Localizada en la región de enlace de ligandos extracelular de los receptores y es de aproximadamente 200 residuos de Dominio de tipo aminoácido de largo con dos pares de III de cisteínas involucradas en enlaces de Fn3 20; fíbronectina disulfuro. Siete regiones d transmembrana Receptor de hidrofóbicas, con el N-termmal localizado transmembrana 7 extracelularmente mientras que el ( familia C-terminal es citoplásmico . Señal a través 7tm 1 19% rodopsina) de las proteínas G Tabla VII: Valores de MFI de cada uno de los puntos de datos Tabla VIII Afinidad calculada utilizando el software Graphpad Prism: Ecuación de Dosis-Respuesta Sigmoidal (pendiente variable) ecuación . Valores Kd PDP3 PDP3

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo monoclonal o un fragmento de enlace de antígenc del mismo, caracterizado porque comprende un sitio de enlace de antígeno que enlaza específicamente a una proteína PSCA (SEQ ID NO: 2), en donde el anticuerpo monoclonal es asi gnado A.T.C.C. Acceso No.: PTA-6698, PTA- 6703, PTA-6699, PT -6700, PTA-6701 o PTA-6702 2. El ant]ticuerpo o fragmento de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque el anticuerpo monoclonal compreijide una región variable de cadena pesada ¡VH) de la SEQ I!) NO: 22 y una región variable de cadena ligera (VL) de la SEQ ID NO: 23; una VH de la SEQ ID NO: 17 y una VL de la SEQ 1 D NO: 18; una VH de la SEQ ID NO: 13 y una VL de la SEQ ID N(f>: 14; una VH de la SEQ ID NO: 15 y una VL de la SEQ ID NO: 6; una VH de la SEQ ID NO: 19 y una VL de la SEQ ID NO: 20; o una VH de la SEQ ID NO: 28 y una VL de la SEQ ID NO: 29. 3 . El anlticuerpo o fragmento de conformidad con la reivindicación 1 o 2 , caracterizado porque el fragmento es un fragmento Fab, F(af' ) 2 , Fv o Sfv. 4. El anticuerpo o fragmento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento es acoplado a un marcador detectable, una tpxina, un agente terapéutico o un agente quimioterapéutico . o un agente de diagnóstico a una célula que expresa una proteína PSCA (SEQ ID NO: 2), caracterizado porque comprende: proporcionar un agente citotóxico o un agente de diagnóstico conjugado al anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de lps reivindicaciones 1, 2 o 3, para formar un conjugado de agente de anticuerpo o agente de fragmento; exponer la célula al conjugado de agente de anticuerpo o agente de fragmento. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el agente citotóxico o el agente de diagnóstico es se Leccionado del grupo que consiste de un marcador detectable, una toxina y un agente terapéutico. 16. El m todo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el marcador detectable es un radioisótopo, un q elator de metal, una enzima, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente o un compuesto quimioluminiscente . 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el radioisótopo comprende 212Bi, 131I, 131 0 186 In, 9 Y , Re, 211 At, 125 I, 5Re, 153 Sm, 213 Bi, 32 P o Lu, El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la toxina comprende ricina, cadena A de ricina, doxorubicina, daunorubicina, un maitansinoide, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colquicina, dihidroxi antracin diona, actinomici a, toxina de difteria, exotoxina de Pseudomonas (PE) A, PE40, abrina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa sarcina, gelonina, mitogelina, retstrictocina, fejnomicina, enomicina, curicina, crotina, caliqueamicina, .nhibidor de sapaonaria officinalis, glucocorticoide, aupstatina, auromicina, itrio, bismuto, combrestatina, dufcarmicinas, dolostanina, ccl065 o un cisplatin . 19. Un método para detectar una proteína PSCA (SEQ ID NO: 2) en una muestra biológica, caracterizado porque comprende las etapas de : proporciónar la muestra biológica y una muestra de control; poner en contacto la muestra biológica y la muestra de control con el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3, que específicamente enlaza a la proteína PSCA y; determinar una cantidad de un complejo de la sustancia con la proteína PSCA y el anticuerpo presente en la muestra biológica v la muestra de control, 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque además comprende: tomar la muestra biológica y la muestra de control de un paciente quien tiene o de quien se sospecha tener cáncer de próstata, páncreas, vejiga, riñon, colon, pulmón, ovario o de seno 21. Una domposición, caracterizada porque comprende siRNA (RNA de dobl 2 hebra) de PSCA que corresponde al ácido nucleico que codifi ca a una proteína expuesta en la Figura 2 o una subsecuencia de la misma, en donde la subsecuencia es de 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleótidos de RNA contiguos en longitud y contiene secuencias que son complementarias y no complementarias a por lo menos una porción de la secuencia de codificación de mRNA. 22. Un metodo para identificar una molécula que modula la proli :eración celular, caracterizado porque comprende : (a) intrcducir una molécula a un sistema, en donde la molécula es una composición que comprende siRNA (RNA de doble hebra) de P£¡CA que corresponde al ácido nucleico que codifica a una p oteína expuesta en la Figura 2 o una subsecuencia de la misma, en donde la subsecuencia es de 19, 20, 21, 22, 23, : 4 o 25 nucleótidos de RNA contiguos en longitud y conti .en secuencias que son complementarias y no complementarias a p or lo menos una porción de la secuencia de codificación de mRN A; y (b) déterminar la presencia o ausencia de una interacción entre 1 a molécula y la secuencia de nucleótidos o proteína, mediante lo cual la presencia de una interacción entre la molécula y la secuencia de nucleótidos identifica la molécula como un molécula que modula la proliferación celular . 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado 1 sistema está in vivo . 24. El metodo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado 1 sistema está in vi tro . 25. Un metodo para reducir el crecimiento de tumor de cáncer de pr stata, páncreas, vejiga, riñon, colon, pulmón, ovario o df seno en un mamífero, caracterizado porque comprende tratar e mamífero con una cantidad efectiva de una combinación de un nticuerpo monoclonal o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3 que específicamente en aza a PSCA (SEQ ID NO: 2) y radiación. 26. Un metodo para reducir el crecimiento de tumor de cáncer de p >rostata, páncreas, vejiga, riñon, colon, pulmón, ovario o df seno en un mamífero, caracterizado porque comprende tratar e mamífero con una cantidad efectiva de una combinación de un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3 que específicamente enlaza a PSCA (SEQ ID NO: 2) y un agente quimioterapéutico . 27. Uso e un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3, carácterizado porque es para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de próstata, páncreas, vejiga, riñon, colon, pulmón, ovario o de seno, en donde el anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo se administra en combinación con radiación o un agente quimioterapéutico.