JP2008500833A - Pscaタンパク質に結合する抗体および関連分子 - Google Patents
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Abstract
Description
本特許出願は、係属中の米国特許出願番号第10/857,484号(2004年5月28日出願)に関連し、この10/857,484号は、米国仮特許出願番号第60/475,064号(2003年5月30日出願)に対する優先権を主張する;本出願は、米国仮特許出願番号第60/616,381号(2004年10月5日出願);米国仮特許出願番号第60/617,881号(2004年10月12日出願);および米国仮特許出願番号第60/621,310号(2004年10月21日出願);米国仮特許出願番号第60/633,077号(2004年12月2日出願);および米国仮特許出願番号第60/672,000号(2005年4月14日出願)に関連する。本出願は、PCT特許出願番号PCT/US2004/017231(2004年5月28日出願)に関連する。この段落で列挙された各出願の内容は、全体が参考として本明細書に援用される。
適用なし
(発明の分野)
本明細書に記載される本発明は、PSCAと称されるタンパク質に結合する抗体、ならびにその結合フラグメントおよびそれから操作された分子に関する。本発明はさらに、PSCAを発現する癌の処置において有用な、診断方法、予後方法、予防方法および治療方法、ならびに組成物に関する。
癌は、冠動脈疾患(coronary disease)に次いで第2の主要なヒトの死因である。世界中で、毎年何百万人もの人々が、癌で亡くなっている。the American Cancer Societyによって報告されるように、米国内のみで、癌は、年間50万人を超える人々の死亡を引き起こし、1年に120万人を超える新規症例が診断されている。心疾患による死亡が有意に減少している一方で、癌によってもたらされる死亡は、一般に増加している。次世紀の早い時期に、癌は、死亡の主要な原因となることが予測される。
Kleinら,Nat.Med.,1997年,第3巻,p.402 Suら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996年,第93巻,p.7252 Pintoら,Clin Cancer Res,1996年9月2日,第9号,p.1445−51 Hubertら,Proc Natl Acad Sci USA.,1999年12月7日,第96巻,第25号,p.14523−8 Reiterら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998年,第95巻,p.1735 G.KohlerおよびC.Milstein,Nature,1975年,第256巻,p.495−497 P.M.,Alzariら,Annual Rev.Immunol.,1988年,第6巻,p.555−580 Bruggemannら,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,1989年,第86巻,p.6709−6713
本発明は、PSCAタンパク質およびPSCAタンパク質のポリペプチドフラグメトに結合する抗体、ならびにその結合フラグメントおよびそれから操作された分子を提供する。本発明は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、マウスおよび他の哺乳動物の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体、ならびに検出可能なマーカーもしくは治療因子で標識された抗体を含む。特定の実施形態において、図3の全核酸配列がコードされないこと、および/または図2の全アミノ酸配列が調製されないという条件が存在する。特定の実施形態において、図3の全核酸配列がコードされること、および/または図2のアミノ酸配列が調製される(そのいずれかはそれぞれのヒト単位用量形態である)。
(節の概要)
I.)定義
II.)PSCAポリヌクレオチド
II.A.)PSCAポリヌクレオチドの使用
II.A.1.)遺伝子異常のモニタリング
II.A.2.)アンチセンス実施形態
II.A.3.)プライマーおよびプライマー対
II.A.4.)PSCAコード核酸分子の単離
II.A.5.)組換え核酸分子および宿主−ベクター系
III.)PSCA関連タンパク質
III.A.)モチーフを有するタンパク質の実施形態
III.B.)PSCA関連タンパク質の発現
III.C.)PSCA関連タンパク質の改変
III.D.)PSCA関連タンパク質の用途
IV.)PSCA抗体
V.)PSCA細胞性免疫応答
VI.)PSCAトランスジェニック動物
VII.)PSCAの検出のための方法
VIII.)PSCA関連遺伝子およびこれらの産物の状態をモニターするための方法
IX.)PSCAと相互作用する分子の同定
X.)治療法および組成物
X.A.)抗癌ワクチン
X.B.)抗体ベースの治療に関する標的としてのPSCA
X.C.)細胞性免疫応答のための標的としてのPSCA
X.C.1. ミニ遺伝子ワクチン
X.C.2. CTLペプチドとヘルパーペプチドとの組み合わせ
X.C.3. CTLペプチドとT細胞感作薬剤との組み合わせ
X.C.4. CTLペプチドおよび/またはHTLペプチドが適用されたDC
を含むワクチン組成物
X.D.)養子免疫療法
X.E.)治療目的または予防目的でのワクチン投与
XI.)PSCAの診断実施形態および予後実施形態
XII.)PSCAタンパク質機能の阻害
XIII.)PSCAのモジュレータの同定、特徴付けおよび使用
XIV.)RNAiおよび小さい干渉RNA(siRNA)の治療的使用
XV.)キット/製造物品
。
そうではないと定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語、記号、および他の科学用語もしくは術語は、本発明が関する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有することが、意図される。いくつかの場合において、一般的に理解される意味を有する用語が、明確さのため、および/またはすぐに参照するために、本明細書において定義される。本明細書においてそのような定義を含めることは、当該分野において一般的に理解されることに対する実質的な差異を示すと、必ずしも解釈されるべきではない。本明細書において記載または参照される技術および手順のうちの多くは、当業者によって十分に理解され、そして当業者によって従来の方法(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd.edition(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Yに記載される広く使用されている分子クローニング方法論)を使用して、一般的に使用される。適切な場合、市販のキットおよび試薬の使用を含む手順が、そうではないと記載されない限りは、製造業者が規定したプロトコルおよび/またはパラメーターに従って、一般的には実行される。
同じポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメイン(VL)に結合体化している重鎖可変ドメイン(VH)を含む(VH−VL)。同じ鎖の2つのドメイン間での対合を可能にするには短か過ぎるリンカーを使用することによって、それらのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合させられ、2つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、EP 404,097;WO93/11161;およびHollingerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444−48(1993)において、より完全に記載される。
A2:A*0201、A*0202、A*0203、A*0204、A*0205、A*0206、A*6802、A*6901、A*0207
A3:A3、A11、A31、A*3301、A*6801、A*0301、A*1101、A*3101
B7:B7、B*3501−03、B*51、B*5301、B*5401、B*5501、B*5502、B*5601、B*6701、B*7801、B*0702、B*5101、B*5602
B44:B*3701、B*4402、B*4403、B*60(B*4001)、B61(B*4006)
A1:A*0102、A*2604、A*3601、A*4301、A*8001
A24:A*24、A*30、A*2403、A*2404、A*3002、A*3003
B27:B*1401−02、B*1503、B*1509、B*1510、B*1518、B*3801−02、B*3901、B*3902、B*3903−04、B*4801−02、B*7301、B*2701−08
B58:B*1516、B*1517、B*5701、B*5702、B58
B62:B*4601、B52、B*1501(B62)、B*1502(B75)、B*1513(B77)。
種々のHLAスーパータイプの組み合わせによって提供される計算上の集団適用範囲は、表IV(g)において示される。
本発明の一局面は、PSCA遺伝子、PSCA mRNAおよび/またはPSCAコード配列のうちのすべてもしくは一部と対応するかもしくは相補的なポリヌクレオチド(好ましくは単離された形態である)(PSCA関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびそのフラグメント、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、および関連分子;PSCA遺伝子配列もしくはPSCA mRNA配列またはその一部に対して相補的な、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド;PSCA遺伝子、PSCA mRNA、PSCAコードポリヌクレオチドにハイブリダイズする、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(集合的に、「PSCAポリヌクレオチド」)を含む)を提供する。すべての場合、この節において言及される場合、Tはまた、図1におけるUであり得る。
II.A.1.遺伝子異常のモニタリング
前段落のポリヌクレオチドは、多数の異なる特定の使用を有する。上記ヒトPSCA遺伝子は、「PSCAの染色体マッピング」と題する実施例において示される染色体位置にマッピングされる。例えば、上記PSCA遺伝子は、この染色体にマッピングされるので、上記PSCAタンパク質の種々の領域をコードするポリヌクレオチドが、この染色体位置の細胞遺伝学的異常(例えば、種々の癌に関連すると同定される異常)を特徴付けるために使用される。特定の遺伝子において、種々の染色体異常(再配列を含む)が、多数の種々の癌における頻繁な細胞遺伝学的異常として同定されている(例えば、Krajinovicら、Mutat.Res.382(3−4):81−83(1998);Johanssonら、Blood 86(10):3905−3914(1995)およびFingerら、P.N.A.S.85(23):9158−9162(1988)を参照のこと)。従って、上記PSCAタンパク質の特定領域をコードするポリヌクレオチドは、悪性疾患表現型に寄与し得るPSCAをコードする染色体領域中の細胞遺伝学的異常を、以前に可能であったよりも正確に示すために、使用され得る。この文脈において、これらのポリヌクレオチドは、より微妙でかつ一般的ではない染色体異常を同定するために、染色体スクリーニングの感度を拡張するための当該分野における必要性を満たす(例えば、Evansら、Am.J.Obstet.Gynecol 171(4):1055−1057(1994)を参照のこと)。
本明細書において開示される発明の他の具体的に企図される核酸関連実施形態は、ゲノムDNA、cDNA、リボザイム、およびアンチセンス分子、ならびに代替的骨格に基づくかまたは代替的塩基を含む核酸分子(天然供給源に由来しても合成されてもよい)であり、PSCAのRNAもしくはタンパク質の発現を阻害可能な分子を含む。例えば、アンチセンス分子は、RNAであっても、他の分子(ペプチド核酸(PNA)または非核酸分子(例えば、塩基対依存性様式でDNAもしくはRNAに特異的に結合するホスホロチオエート誘導体))であってもよい。当業者は、上記PSCAポリヌクレオチドおよび本明細書において開示されるポリヌクレオチド 配列を使用してこれらの種類の核酸分子を容易に取得し得る。
本発明のこれらのヌクレオチドのさらなる具体的実施形態としては、本発明のポリヌクレオチドもしくはその特定部分の特異的増幅を可能にする、プライマーおよびプライマー対;ならびに本発明の核酸もしくはその任意の部分に対して選択的もしくは特異的にハイブリダイズするプローブが挙げられる。プローブは、検出可能なマーカー(例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生体発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤、または酵素)で標識され得る。そのようなプローブおよびプライマーは、サンプル中のPSCAポリヌクレオチドの存在を検出するため、およびPSCAタンパク質を発現する細胞を検出するための手段として、使用される。
本発明のPSCAポリヌクレオチドは、種々の目的(が挙げられるがこれらに限定はされないPSCA遺伝子、PSCA mRNAもしくはそれらのフラグメントの増幅および/もしくは検出のためのプローブおよびプライマーとしての使用;前立腺癌および他の癌の診断および/もしくは予後判定のための試薬としての使用;PSCAポリペプチドの発現を指向可能なコード配列としての使用;PSCA遺伝子および/もしくはPSCA転写物の発現を調節もしくは阻害するためのツールとしての使用;ならびに治療剤としての使用が挙げられるがこれらに限定はされない)のために有用である。
本明細書において記載されるPSCA cDNA配列は、PSCA遺伝子産物の単離、ならびにPSCA遺伝子産物ホモログをコードするポリヌクレオチド、PSCA遺伝子産物の選択的スプライスアイソフォーム、PSCA遺伝子産物の対立遺伝子改変体、PSCA遺伝子産物の変異形態、ならびにPSCA関連タンパク質のアナログをコードするポリヌクレオチドの単離を包含する。PSCA遺伝子をコードする全長cDNAを単離するために使用され得る種々の分子クローニング方法が、周知である(例えば、Sambrook,J.ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d edition,Cold Spring Harbor Press,New York,1989;Current Protocols in Molecular Biology. Ausubelら、Eds.,WileyおよびSons,1995を参照のこと)。例えば、λファージクローニング方法論が、市販のクローニングシステム(例えば、Lambda ZAP Express,Stratagene)を使用して、簡便に使用され得る。PSCA遺伝子cDNAを含むファージクローンは、標識されたPSCA cDNAまたはそのフラグメントでプロービングすることによって、同定され得る。例えば、一実施形態において、PSCA cDNA(例えば、図1)またはその部分が、合成され得、そしてPSCA遺伝子に対応する重複cDNAおよび全長cDNAを回収するためのプローブとして使用され得る。PSCA遺伝子自体が、ゲノムDNAライブラリー、細菌人工染色体ライブラリー(BAC)、酵母人工染色体ライブラリー(YAC)などを、PSCA DNAプローブまたはPSCA DNAプライマーを用いてスクリーニングすることによって、単離され得る。
本発明はまた、PSCAポリヌクレオチド、そのフラグメント、アナログもしくはホモログを含む、組換えDNA分子もしくは組換えRNA分子(ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、YAC、BAC、ならびに当該分野で周知である種々のウイルスベクターおよび非ウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定はされない)、ならびにそのような組換えDNA分子もしくはRNA分子で形質転換もしくはトランスフェクトされた細胞を提供する。そのような分子を生成するための方法は、周知である(例えば、Sambrookら、1989,(前出)を参照のこと)。
本発明の別の局面は、PSCA関連タンパク質を提供する。PSCAタンパク質の特定の実施形態は、図1(好ましくは図1A)に示されるヒトPSCAのアミノ酸配列の全体もしくは一部分を有するポリペプチドを含む。あるいは、PSCAタンパク質の実施形態は、図1に示されるPSCAのアミノ酸配列中に変更を有する、改変体、ホモログまたはアナログのポリペプチドを含む。
本明細書において開示される、さらなる例示的な本発明の実施形態は、図1に示されるPSCAポリペプチド配列内に含まれる1つ以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含むPSCAポリペプチドを含む。当該分野において公知である種々のモチーフ、および、タンパク質は、多数の公的に利用可能なインターネットサイトによって、このようなモチーフの存在について評価され得る(例えば、URLアドレス:pfam.wustl.edu/;searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq−search/struc−predict.html;psort.ims.u−tokyo.ac.jp/;cbs.dtu.dk/;ebi.ac.uk/interpro/scan.html;expasy.ch/tools/scnpsit1.html;EpimatrixTMおよびEpimerTM,Brown University,brown.edu/Research/TB−HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html;およびBIMAS,bimas.dcrt.nih.gov/を参照のこと)。
以下の例において記載される実施形態において、PSCAは、市販の発現ベクター(例えば、C末端の6XHisおよびMYCタグを有するPSCAをコードするCMV駆動発現ベクター(pcDNA3.1/mycHIS,InvitrogenまたはTag5,GenHunter Corporation,Nashville TN))でトランスフェクトされた細胞(例えば、293T細胞)において都合よく発現され得る。このTag5ベクターは、トランスフェクトされる細胞において分泌型PSCAタンパク質の生成を促進するために使用され得るIgGK分泌シグナルを提供する。培養培地中の分泌型HISタグ化PSCAは、例えば、標準技術を用いるニッケルカラムを使用して、精製され得る。
PSCA関連タンパク質の改変(例えば、共有結合改変)は、本発明の範囲内に含まれる。共有結合改変の1つの型は、PSCAポリペプチドの標的化アミノ酸残基と、有機性誘導体化剤(これは、選択された側鎖またはPSCAタンパク質のN末端残基もしくはC末端残基と反応することができる)とを反応させることを包含する。本発明の範囲内に含まれるPSCAポリペプチドの共有結合改変の別の型は、本発明のタンパク質のネイティブグリコシル化パターンを変更することを包含する。PSCAの共有結合改変の別の型は、PSCAポリペプチドを、種々の非タンパク質ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン)のうちの1つに、米国特許第4,640,835号;同第4,496,689号;同第4,301,144号;同第4,670,417号;同第4,791,192号または同第4,179,337号に記載される様式で、連結することを包含する。
本発明のタンパク質は、多くの種々の具体的な用途を有する。PSCAは、前立腺癌および他の癌において高く発現されるので、PSCA関連タンパク質は、正常組織 対 癌組織におけるPSCA遺伝子産物の状態(status)を評価する方法において使用される。それによって、悪性表現型を評価する。代表的には、PSCAタンパク質の特定の領域に由来するポリペプチドは、これらの領域(例えば、1つ以上のモチーフを含む領域)における混乱(例えば、欠失、層移入、点変異など)の存在を評価するために使用される。例示的アッセイは、正常組織 対 癌組織におけるこの領域の特性を評価するため、またはこのエピトープに対する免疫応答を誘発させるために、PSCAポリペプチド配列内に含まれる生物学的モチーフのうちの1つ以上のアミノ酸残基を含むPSCA関連タンパク質を標的とする、抗体またはT細胞を利用する。あるいは、PSCAタンパク質中の生物学的モチーフのうちの1つ以上のアミノ酸残基を含むPSCA関連タンパク質は、PSCAのその領域と相互作用する因子についてスクリーニングするために使用される。
本発明の別の局面は、PSCA関連タンパク質に結合する抗体を提供する。好ましい抗体は、生理的条件下で、PSCA関連タンパク質に特異的に結合しかつPSCA関連タンパク質ではないペプチドにもタンパク質にも結合しない(または弱くしか結合しない)。この状況において、生理学的条件の例としては、以下が挙げられる:1)リン酸緩衝化生理食塩水;2)Tris緩衝化生理食塩水(25mM Trisおよび150mM NaClを含む);または通常生理食塩水(0.9% NaCl);4)動物血清(例えば、ヒト血清);または5)1)〜4)のいずれかの組み合わせ;これらの反応は、好ましくは、pH7.5で生じるか、代わりにpH7.0〜8.0の範囲で、または代わりにpH6.5〜8.5の範囲で生じる;また、これらの反応は、4℃〜37℃の間の温度で生じる。例えば、PSCAを結合する抗体は、PSCA関連タンパク質(例えば、そのホモログもしくはアナログ)を結合し得る。
T細胞が抗原を認識する機構は、詳述されている。効果的なペプチドエピトープワクチン、本発明の組成物は、全世界の集団の非常に広い区分(segment)で、治療的免疫応答または予防的免疫応答を誘導する。細胞性免疫応答を誘導する本発明の組成物の価値および有効性の理解のために、免疫学関連技術の簡単な総説が、提供される。
1)正常固体からの初代T細胞培養物の評価(例えば、Wentworth,P.A.ら,Mol.Immunol.32:603,1995;Celis,E.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2105,1994;Tsai,V.ら,J.Immunol.158:1796,1997;Kawashima,I.ら,Human Immunol.59:1,1998を参照のこと)。この手順は、抗原提示細胞の存在下で、試験ペプチドで正常被験体からの末梢血リンパ球(PBL)をインビトロで数週間にわたって刺激することを包含する。このペプチドに対して特異的なT細胞は、この時間の間に活性状態になり、ペプチドで感作した標的細胞に関連する例えば、リンホカイン放出アッセイまたは51Cr放出アッセイを使用して検出される。
2)HLAトランスジェニックマウスの免疫(例えば、Wentworth,P.A.ら,J.Immunol.26:97,1996;Wentworth,P.A.ら,Int.Immunol.8:651,1996;Alexander,J.ら,J.Immunol.159:4753,1997を参照のこと)。例えば、このような方法において、不完全フロイントアジュバント中のペプチドが、HLAトランスジェニックマウスへ皮下投与される。免疫して数週間後、脾細胞が取り出され、試験ペプチドの存在下で約1週間にわたってインビトロで培養される。例えば、ペプチドで感作した標的細胞および内因的に生成された抗原を発現する標的細胞を必要とする51Cr放出アッセイを使用して、ペプチド特異的T細胞が検出される。
3)有効にワクチン接種された免疫患者からおよび/または慢性的に疾患の患者から、T細胞応答の惹起(recall)の実証(例えば、Rehermann,B.ら,J.Exp.Med.181:1047,1995;Doolan,D.L.ら,Immunity 7:97,1997;Bertoni,R.ら,J.Clin.Invest.100:503,1997;Threlkeld,S.C.ら,J.Immunol.159:1648,1997;Diepolder,H.M.ら,J.Virol.71:6011,1997を参照のこと)。従って、惹起応答は、疾患に起因して抗原に曝され、従って、「天然に」免疫応答を発生させた被験体に由来するか、または抗原に対してワクチン接種した患者に由来するPBLを培養することによって検出される。被験体に由来するPBLは、「未処理(naive)」T細胞と比較して、「記憶」T細胞の活性化を可能にするために、試験ペプチドと抗原提示細胞(APC)との存在下で、インビトロで1〜2週間培養される。培養期間の終わりに、アッセイ(ペプチド感作標的に関連する51Cr放出、T細胞増殖、またはリンホカイン放出が挙げられる)を用いて、T細胞活性を検出する。
PSCA関連タンパク質をコードする核酸はまた、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物のいずれかを生成するために使用され得る。次に、これら動物は、治療的に有用な試薬の開発およびスクリーニングにおいて有用である。確立された技術に従って、PSCAをコードするcDNAは、PSCAをコードするゲノムDNAをクローニングするために使用され得る。このクローニングされたゲノム配列は、その後、PSCAをコードするDNAを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を生成するために使用され得る。トランスジェニック動物、特にマウスまたはラットのような動物を生成するための方法は、当該分野においては従来通りであり、例えば、米国特許第4,736,866号(1988年4月12日発行)、および同第4,870,009号(1989年9月26日発行)に記載される。代表的には、特定の細胞が、組織特異的エンハンサーを組み込むPSCAトランスジーンについての標的となる。
本発明の別の局面は、PSCAポリヌクレオチドおよびPSCA関連タンパク質を検出するための方法、ならびにPSCAを発現する細胞を同定するための方法に関する。PSCAの発現プロフィールによって、これが、転移した疾患についての診断マーカーになる。従って、PSCA遺伝子産物の状態は、種々の要因(進行した病期の疾患に対する係りやすさ、進行の速度、および/または腫瘍の攻撃性が挙げられる)を推定するために有用な情報を提供する。本明細書で詳細に議論されるように、患者サンプルにおけるPSCA遺伝子産物の状態は、当該分野で周知の種々のプロトコル(免疫組織化学分析、種々のノーザンブロッティング技術(インサイチュハイブリダイゼーション、RT−PCR分析(例えば、レーザー捕捉微小切開サンプル(laser capture micro−dissected sample)上での)が挙げられる)、ウェスタンブロット分析および組織アレイ分析が挙げられる)によって分析され得る。
腫瘍形成は、細胞増殖が徐々に無調節になり、細胞が正常な生理学的状態から前癌性状態、その後、癌状態へと進行する多段階プロセスであることが公知である(例えば、Alersら,Lab Invest.77(5):437−438(1997)およびIsaacsら,Cancer Surv.23:19−32(1995)を参照のこと)。この状況において、無調節になった細胞増殖の証拠(例えば、癌における異常なPSCA発現)に関して、生物学的サンプルを試験することは、病的状態(例えば、癌)が、治療選択肢がより制限されるかたもしくは予後がより悪化する段階へと進行してしまう前に、このような異常な生理状態の初期の検出を可能にする。このような試験において、目的の生物学的サンプルにおけるPSCAの状態が、例えば、対応する正常サンプル(例えば、その病状に罹患していないその個体由来のサンプルまたは代わりにその病状に罹患していない別の個体由来のサンプル)におけるPSCAの状態と比較され得る。生物学的サンプルにおけるPSCAの状態における(正常サンプルと比較した場合の)変化は、無調節になった細胞増殖の証拠を提供する。正常サンプルとしての、病状に罹患していない生物学的サンプルを使用することに加えて、サンプルにおいてPSCA状態を比較するために、所定の基準値(例えば、所定の正常レベルのmRNA発現)がまた使用され得る(例えば、Greverら,J.Comp.Neurol.1996 Dec 9;376(2):306−14および米国特許第5,837,501号を参照のこと)。
本明細書で開示されるPSCAタンパク質およびPSCA核酸配列は、当業者がPSCAと相互作用するタンパク質、低分子および他の因子、ならびに当該分野で受け入れられた種々のプロトコルのうちのいずれか1つを介して、PSCAによって活性化される経路を同定することを可能にする。例えば、いわゆる相互作用トラップシステム(「ツーハイブリッドアッセイ」ともいわれる)のうちの1つが利用され得る。いくつかのシステムにおいて、分子は、レポーター遺伝子の発現を指向する転写因子と相互作用して再構成し、その際に、レポーター遺伝子の発現が、アッセイされる。他のシステムは、真核生物転写活性化因子の再構成を介して、インビトロでタンパク質間相互作用を同定する。例えば、米国特許第5,955,280号(1999年9月21日発行)、同第5,925,523号(1999年7月20日発行)、同第5,846,722号(1998年12月8日発行)および同第6,004,746号(1999年12月21日発行)を参照のこと。アルゴリズムはまた、タンパク質機能のゲノムベースの推定のために当該分野で入手可能である(例えば、Marcotteら,Nature 402:4 November 1999,83−86を参照のこと)。
制限されたセットの組織において通常発現されるが、表Iに列挙されるもののような癌においても発現されるタンパク質としてのPSCAの同定は、このような癌の処置に対する多くの治療的アプローチを切り開く。
本発明は、PSCA関連タンパク質またはPSCA関連核酸を含む癌ワクチンを提供する。PSCAの発現を考慮すると、癌ワクチンは、非標的組織に対して最小限の影響歯科伴わないか、または何ら影響を及ぼさずに、PSCAを発現する癌を妨げ、かつ/またはPSCAを発現する癌を処置する。抗癌治療として、細媒介性体液性免疫応答を生成するワクチンにおいて腫瘍抗原を生成することは、当該分野で周知であり、ヒトPSMA免疫原および齧歯類PAP免疫原を使用して、前立腺癌において使用されてきた(Hodgeら,1995,Int.J.Cancer 63:231−237;Fongら,1997,J.Immunol.159:3113−3117)。
CTLエピトープは、対応するHLA対立遺伝子を結合するPSCAタンパク質内のペプチド同定するために特定のアルゴリズムを用いて決定され得る(例えば、表IVを参照のこと;EpimerTMおよびEpimatrixTM、Brown University(URL brown.edu/Research/TB−HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html);ならびにBIMAS,(URL bimas.dcrt.nih.gov/;SYFPEITHI URL syfpeithi.bmi−heidelberg.com/)。好ましい実施形態において、PSCA免疫原は、当該分野で周知の技術を用いて同定される1つ以上のアミノ酸配列(例えば、表V〜XVIIIおよび表XXII〜LIに示される配列またはHLAクラスIモチーフ/スーパーモチーフによって特定される8アミノ酸、9アミノ酸、10アミノ酸もしくは11アミノ酸のペプチド(例えば、表IV(A)、表IV(D)、もしくは表IV(E))および/またはHLAクラスIIモチーフ/スーパーモチーフを含む少なくとも9アミノ酸のペプチド(例えば、表IV(B)または表IV(C))を含む。当該分野で認識されているように、このHLAクラスI結合溝は、特定のサイズ範囲のみのペプチドが、溝に嵌って結合し得るように本質的に末端で閉じており、一般に、HLAクラスIエピトープは、8アミノ酸長、9アミノ酸長、10アミノ酸長、または11アミノ酸長である。対照的に、このHLAクラスII結合溝は、本質的に末端が開いている;従って、約9つ以上のアミノ酸のペプチドが、HLAクラスII分子によって結合され得る。HLAクラスIとHLAクラスIIとの間の結合溝の差異に起因して、HLAクラスIモチーフは、特定の長さである。すなわち、クラスIモチーフの2位は、このペプチドのアミノからカルボキシ方向で、2番目のアミノ酸である。クラスIIモチーフにおけるアミノ酸位置は、全体のペプチドではなく、互いに対してのみ相対的であるのみである。すなわち、さらなるアミノ酸が、モチーフ保有配列のアミノ末端および/またはカルボキシル末端に付加され得る。HLAクラスIIエピトープは、しばしば、9アミノ酸長、10アミノ酸長、11アミノ酸長、12アミノ酸長、13アミノ酸長、14アミノ酸長、15アミノ酸長、16アミノ酸長、17アミノ酸長、18アミノ酸長、19アミノ酸長、20アミノ酸長、21アミノ酸長、22アミノ酸長、23アミノ酸長長、24アミノ酸、または25アミノ酸長であるか、または25アミノ酸より長い。
本発明のワクチン組成物は、核酸媒介様式を包含する。本発明のタンパク質をコードするDNAまたはRNAが、患者に投与され得る。遺伝子免疫法は、PSCAを発現する癌細胞に対して指向される、予防的または治療的な体液性免疫応答および細胞性免疫応答を生成するために使用され得る。PSCA関連タンパク質/免疫原および適切な調節配列をコードするDNAを含む構築物は、筋肉または皮膚の細胞がこの構築物を取り込み、そのコードされたPSCAタンパク質/免疫原を発現するように、個体の筋肉または皮膚に直接注射され得る。あるいは、ワクチンは、PSCA関連タンパク質を含む。PSCA関連タンパク質免疫原の発現は、PSCAタンパク質を有する細胞に対する予防的または治療的な体液性免疫および細胞性免疫の生成を生じる。当該分野で公知の種々の予防的および治療的な遺伝子免疫技術が、使用され得る(総説に関しては、インターネットアドレス genweb.comにおいて発表された情報および参考文献を参照のこと)。核酸ベースの送達は、例えば、Wolffら,Science 247:1465(1990)、ならびに米国特許第5,580,859号;同第5,589,466号;同第5,804,566号;同第5,739,118号;同第5,736,524号;同第5,679,647号;WO 98/04720に記載される。DNAベースの送達技術の例としては、「裸のDNA」、促進された(ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性)送達、陽イオン性脂質複合体、および粒子媒介性(「遺伝子銃」)または圧力媒介性送達(例えば、米国特許第5,922,687号を参照のこと)が挙げられる。
種々のエキソビボストラテジーがまた、免疫応答を生成するために使用され得る。1つのアプローチは、PSCA抗原を患者の免疫系に提示するために、抗原提示細胞(APCs)(例えば、樹状細胞(DC))の使用を包含する。樹状細胞は、MHCクラスI分子およびMHCクラスII分子、B7 共刺激因子、ならびにIL−12を発現し、よって、高度に専門化された抗原提示細胞である。前立腺癌において、前立腺特異的膜抗原(PSMA)のペプチドを適用した自己由来の樹状細胞は、前立腺癌患者の免疫系を刺激するために、フェーズI臨床試験において使用されている(Tjoaら,1996,Prostate 28:65−69;Murphyら,1996,Prostate 29:371−380)。従って、樹状細胞は、MHCクラスI分子またはMHCクラスII分子の状況においてT細胞にPSCAペプチドを提示するために使用され得る。一実施形態において、自己由来の樹状細胞には、MHCクラスI分子および/またはMHCクラスII分子に結合することができるPSCAペプチドが適用される。別の実施形態において、樹状細胞には、完全PSCAタンパク質が適用される。なお別の実施形態は、当該分野で公知の種々の実行ベクター(implementing vector)(例えば、アデノウイルス(Arthurら,1997,Cancer Gene Ther.4:17−25)、レトロウイルス(Hendersonら,1996,Cancer Res.56:3763−3770)、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、DNAトランスフェクション(Ribasら,1997,Cancer Res.57:2865−2869)、または腫瘍由来RNAトランスフェクション(Ashleyら,1997,J.Exp.Med.186:1177−1182))を用いて樹状細胞におけるPSCA遺伝子の過剰発現を操作する工程を包含する。PSCAを発現する細胞はまた、免疫モジュレーター(例えば、GM−CSF)を発現するために操作され得、免疫因子として使用され得る。
PSCAは、抗体ベースの治療ストラテジーに関する魅力的な標的である。多くの抗体のストラテジーが、細胞外分子および細胞内分子の両方について当該分野で公知である(例えば、補体およびADCC媒介死滅ならびにイントラボディー(intrabody)の使用)。PSCAは、対応する正常細胞に対して種々の鶏痘の癌細胞によって発現されるので、PSCA免疫反応性組成物の全身投与が準備され、これは、非標的器官および非標的組織への免疫反応性組成物の結合によって引き起こされる毒性の、非特異的かつ/または非標的効果なしに、優れた感受性を示す。PSCAのドメインと特異的に反応する抗体は、毒素もしくは治療剤との結合体としてか、または細胞増殖もしくは細胞機能を阻害することができる裸の抗体としてかのいずれかで、PSCA発現癌を全身的に処置するために有用である。
本明細書で記載される免疫原性有効量の1つ以上のHLA結合ペプチドを含むワクチンおよびワクチンを調製する方法は、本発明のさらなる実施形態である。さらに、本発明に従うワクチンは、本願ペプチドのうちの1つ以上の組成物を含む。ペプチドは、個々にワクチン中に存在し得る。あるいは、このペプチドは、同じペプチドの複数のコピーを含むホモポリマーとしてか、または種々のペプチドのヘテロポリマーとして存在し得る。ポリマーは、増大した免疫学的反応の利点を有し、異なるペプチドエピトープが、ポリマーを構成するために使用される場合、病原性生物または免疫応答のために標的とされる腫瘍関連ペプチドの異なる抗原決定基と反応する抗体および/またはCTLを誘導するさらなる能力を有する。この組成物は、天然に存在する抗原領域であり得るか、あるいは例えば、組換えによって調製され得るかまたは化学合成によって調製され得る。
1.)投与した際に、腫瘍クリアランスと相関することが観察される、免疫応答を模倣するエピトープが、選択される。HLAクラスIについては、これは、少なくとも1つの腫瘍関連抗原(TAA)に由来する3〜4個のエピトープを含む。HLAクラスIIについては、類似の原理が、採用される;繰り返すと、3〜4個のエピトープが少なくとも1つのTAAから選択される(例えば、Rosenbergら,Science 278:1447−1450を参照のこと)。1つのTAAに由来するエピトープは、頻繁に発現されるTAAの変動する発現パターンを有する腫瘍を標的とするワクチンを生成するために、1個以上のさらなるTAAに由来するエピトープと組み合わせて使用され得る。
2.)免疫原性と相関することが確認された必須の結合親和性を有するエピトープが選択される:HLAクラスIについては、500nM以下、しばしば200nM以下のIC50;およびクラスIIについては、1000nM以下のIC50。
3.)十分なスーパーモチーフ保有ペプチド、または十分な一連の対立遺伝子特異的モチーフ保有ペプチドが、広く集団を網羅するために選択される。例えば、少なくとも80%集団を網羅することが好ましい。モンテカルロ分析(当該分野で公知の統計的評価法)が、集団網羅の幅、重複を評価するために採用され得る。
4.)癌関連抗原に由来するエピトープを選択する場合、患者が、ネイティブエピトープに対する寛容性を発生させ得るので、アナログを選択することがしばしば有用である。
5.)「ネスト化(nested)エピトープ」といわれるエピトープが、特に関連している。ネスト化エピトープは、少なくとも2個のエピトープが、所定のペプチド配列中に重複している場合に存在する。ネスト化ペプチド配列は、B細胞エピトープ、HLAクラスIエピトープおよび/またはHLAクラスIIエピトープを含み得る。ネスト化エピトープを提供する場合、一般的な目的は、1配列につき最大数のエピトープを提供することである。従って、局面は、そのペプチドにおけるアミノ末端エピトープのアミノ末端およびカルボキシル末端エピトープのカルボキシル末端より長いペプチドを提供することは避けることである。複数エピトープ配列(例えば、ネスト化エピトープを含む配列)を提供する場合、一般に、病的特性または他の有害な生物学的特性を有さないことを保証するために、その配列をスクリーニングすることが重要である。
6.)ポリエピトープタンパク質が作製される場合、またはミニ遺伝子を作製する場合、目的は、目的のエピトープを包含する最小のペプチドを生成することである。この原理は、ネスト化エピトープを含むペプチドを選択する場合に採用されるものとは同じでない場合、類似である。しかし、人工ポリエピトープペプチドを使用すると、大きさを最小にする目的は、ポリエピトープタンパク質中のエピトープ間に任意のスペーサー配列を組み込む必要性に対してバランスがとられる。スペーサーアミノ酸残基は、例えば、接合部エピトープ(免疫系によって認識されるが、標的抗原中に存在しない、エピトープに並置して人工的に作製されるのみであるエピトープ)を避けるために、またはエピトープ間の切断を促進し、それによってエピトープ提示を高めるために、導入され得る。接合部エピトープは、一般に、レシピエントが、その非ネイティブエピトープに対する免疫応答を生成し得るので、回避されるべきである。「優性エピトープ」である接合部エピトープが特に考慮される。優性エピトープは、他のエピトープに対する免疫応答が、減少されるかまたは抑制されるそのような集中的な(zealous)応答をもたらし得る。
7.)同じ標的タンパク質の多数の改変体の配列が存在する場合、潜在的なペプチドエピトープはまた、それらの保存性に基づいて選択され得る。例えば、保存性に関する基準は、HLAクラスI結合ペプチド全体の配列またはクラスII結合ペプチドの9マーコア全体が、特定のタンパク質抗原に対して評価される配列の指定された割合が保存されていると規定し得る。
複数のエピトープの同時の送達を可能にする多くの種々のアプローチが、利用可能である。本発明のペプチドをコードする核酸は、本発明の特に有用な実施形態である。ミニ遺伝子中に含めるためのエピトープは、好ましくは、前節において示された基準に従って選択される。本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ましい手段は、本発明の1つまたは複数のエピトープを含むペプチドをコードするミニ遺伝子構築物を利用する。
本発明のCTLペプチドを含むワクチン組成物は、望ましい属性(例えば、改善された血清半減期、拡げられた集団網羅または高められた免疫原性)を提供するために、改変され得る(例えば、アナログにされ得る)。
いくつかの実施形態において、Bリンパ球またはTリンパ球を感作する少なくとも1つの成分を含む本発明の薬学的組成物中に含まれることが望ましい。脂質は、CTLをインビボで感作することができる薬剤であると同定された。例えば、パルミチン酸残基は、リジン残基のe−アミノ基およびα−アミノ基に結合され得、次いで、例えば、1つ以上の連結残基(例えば、Gly、Gly−Gly−、Ser、Ser−Serなど)を介して免疫原性ペプチドに連結され得る。この脂質化ペプチドは、次いで、ミセルまたは粒子中に直接投与され得るか、リポソームに組み込まれ得るか、またはアジュバント(例えば、不完全フロイントアジュバント)中に乳化され得る。好ましい実施形態において、特に有効な免疫原性組成物は、Lysのe−アミノ基およびα−アミノ基に結合されたパルミチン酸(これは、連結(例えば、Ser−Ser)を介して、免疫原性ペプチドのアミノ末端に結合されている)を含む。
本発明に従うワクチン組成物の一実施形態は、エピトープ保有ペプチドのカクテルを患者の血液に由来するPBMCまたは患者の血液から単離されたDCにエキソビボで投与することを包含する。DCを採取することを容易にするための医薬が使用され得、例えば、ProgenipoietinTM(Pharmacia−Monsanto,St.Louis,MO)またはGM−CSF/IL−4である。DCにペプチドを適用した後でかつ患者に再度注入する前に、このDCは、結合していないペプチドを除去するために洗浄される。この実施形態において、ワクチンは、ペプチドが適用されたDCを含み、このDCは、それらの表面上のHLA分子と複合体化した、適用されたペプチドエピトープを提示する。
抗原性PSCA関連ペプチドは、同様にエキソビボでCTL応答および/またはHTL応答を誘起するために使用される。得られたCTL細胞またはHTL細胞は、他の従来の型の治療に応答しないか、または本発明に従う治療用ワクチンペプチドもしくは核酸に対して応答しない患者における腫瘍を処置するために使用され得る。特定の抗原に対するエキソビボでのCTL応答またはHTL応答は、この患者の、または遺伝的に適合性のCTL前駆細胞もしくはHTL前駆細胞を、組織培養において、抗原提示細胞(APC)(例えば、樹状細胞)の供給源、および適切な免疫原性ペプチドと一緒にインキュベートすることによって誘導される。前駆細胞が活性化されかつエフェクター細胞に発展される適切なインキュベーション期間(代表的には、約7〜28日間)の後、この細胞を患者に注入して戻すと、これらの細胞は、それらの特異的標的細胞(例えば、腫瘍細胞)を破壊する(CTL)かまたはその破壊を促進する(HTL)。トランスフェクトした樹状細胞はまた、抗原提示細胞として使用され得る。
本発明の薬学的組成物およびワクチン組成物は、代表的には、PSCAを発現または過剰発現する癌を処置および/または予防するために使用される。治療適用において、ペプチド組成物および/または核酸組成物は、抗原に対する有効なB細胞、CTLおよび/またはHTL応答を誘発しかつ症状および/もしくは合併症を治癒または少なくとも部分的に停止もしくは遅延させるために十分な量で、患者に投与される。このことを達成するために十分な量は、「治療上有効な用量」として規定される。この用途に有効な量は、例えば、投与される特定の組成物、投与様式、処置される疾患の病期および重篤度、患者の体重および全身の健康状態、ならびに指示する医師の判断に依存する。
本明細書で開示されるように、PSCAポリヌクレオチド、PSCAポリペプチド、PSCA反応性細胞毒性T細胞(CTL)、PSCA反応性ヘルパーT細胞(HTL)および抗PSCAポリペプチド抗体が、無調節になった細胞増殖(例えば、癌、特に表Iに列挙されている癌(例えば、組織発現のその特定のパターンおよび例えば、実施例標題「正常組織、および患者標本におけるPSCAの発現分析」において記載されるような特定の癌における過剰発現の両方を参照のこと))と関連する状態を試験する、周知の診断アッセイ、予後アッセイ、および治療アッセイにおいて使用され得る。
本発明は、PSCAのその結合パートナーへの結合またはPSCAの他のタンパク質との会合を阻害するための種々の方法および組成物、ならびにPSCA機能を阻害するための方法を包含する。
1つのアプローチにおいて、PSCAに特異的に結合する単鎖抗体をコードする組み換えベクターが、遺伝子移入技術を介してPSCA発現細胞内に導入する。従って、コードされる単鎖抗PSCA抗体が、細胞内で発現され、PSCAタンパク質に結合し、それによってその機能を阻害する。そのような細胞内単鎖抗体を設計する方法は、周知である。そのような細胞内抗体(「イントラボディ(intrabody)としてもまた公知」)は、細胞内の特定の区画に対して特異的に標的化され、このことによって活性阻害処置が集中される場所を制御する。この技術は、当該分野に首尾よく適用されている(総説としては、RichardsonおよびMarasco,1995,TIBTECH 第13巻を参照のこと)。イントラボディは、そうでなければ豊富な細胞表面レセプターの発現を実質的に排除することが示されている。(例えば、Richardsonら、1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:3137−3141;Beerliら、1994,J.Biol.Chem.289:23931−23936;Deshaneら、1994,Gene Ther.1:332−337を参照のこと)。
別のアプローチにおいて、組み換え分子がPSCAに結合し、それによってPSCA機能を阻害する。例えば、これらの組み換え分子は、PSCAがその結合パートナーにアクセス/結合すること、または他のタンパク質と会合することを防ぐかまたは阻害する。そのような組み換え分子は、例えば、PSCA特異的抗体分子の反応性部分を含み得る。特定の実施形態において、PSCA結合パートナーのPSCA結合ドメインが二量体の融合タンパク質内に設計され、それによってこの融合タンパク質はヒトIgG(例えば、ヒトIgG1)のFc部分に連結された2つのPSCAリガンド結合ドメインを含む。そのようなIgG部分は、例えばCH2ドメインおよびCH3ドメインならびにヒンジ領域を含むが、CH1ドメインは含まない。そのような二量体融合タンパク質は、PSCAの発現に関連する癌に罹患している患者に可溶性形態で投与され、それによってその二量体タンパク質がPSCAに特異的に結合し、PSCAの結合パートナーとの相互作用をブロックする。そのような二量体融合タンパク質はさらに、公知の抗体連結技術を使用して多量体タンパク質と組み合わされる。
本発明はまた、PSCA遺伝子の転写を阻害するための種々の方法および組成物を包含する。同様に、本発明はまた、PSCA mRNAのタンパク質への翻訳を阻害するための方法および組成物を提供する。
遺伝子移入および遺伝子治療技術は、PSCAを合成している腫瘍細胞へ治療的ポリヌクレオチド(すなわち、アンチセンス、リボザイム、イントラボディをコードするポリヌクレオチドおよび他のPSCA阻害分子)を送達するために使用され得る。多数の遺伝子治療アプローチが、当該分野において公知である。PSCAアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、PSCA転写に干渉し得る因子などをコードする組み換えベクターが、そのような遺伝子治療アプローチを使用して腫瘍細胞を標的化するために送達され得る。
(モジュレータを同定および使用する方法)
一実施形態において、特定の発現プロフィールを誘導または抑制し、特定のパスウェイを抑制または誘導し、好ましくはそれによって関連する表現型を生成するモジュレータを同定するために、スクリーニングが実施される。別の実施形態において、特定の状態において重要な差示的に発現した遺伝子を同定する場合、個々の遺伝子の発現を改変する(増加させるかまたは減少させるかのいずれか)モジュレータを同定するために、スクリーニングが実施される。別の実施形態において、示差的に発現した遺伝子の発現産物の生物学的機能を改変するモジュレータを同定するために、スクリーニングが実施される。再度、特定の状態において遺伝子の重要性が同定されている場合、結合し、そして/またはその遺伝子産物の生物学的活性を調節する因子を同定するために、スクリーニングが実施される。
(遺伝子発現関連アッセイ)
本発明のタンパク質、核酸および抗体は、スクリーニングアッセイにおいて使用される。癌関連タンパク質、抗体、核酸、修飾タンパク質およびこれらの配列を含む細胞が、ポリペプチドの発現プロフィールである「遺伝子発現プロフィール」または生物学的機能の改変についての候補薬物の効果を評価するようなスクリーニングアッセイにおいて使用される。一実施形態において、発現プロフィールが使用され、好ましくは、候補因子で処置された後の遺伝子発現プロフィールのモニタリングを可能にするハイスループットスクリーニング技術と組み合わされる。(例えば、Davis,GFら、J Biol Screen 7:69(2002);Zlokarnikら、Science 279:84−8(1998);Heid,Genome Res 6:986−94,1996を参照のこと)。
一実施形態において、遺伝子発現モニタリング(すなわち、発現プロフィール)が、多数の実体に対して同時にモニタリングされる。そのようなプロフィールは、代表的に、1つ以上の図1の遺伝子を包含する。この実施形態において、癌の核酸プローブがバイオチップに付着され、特定の細胞における癌配列を検出および定量する。あるいは、PCRが使用され得る。このようにして、一連の、例えばマイクロタイターウェルのプレートが、所望のウェルにおいて分注されたプライマーと一緒に使用され得る。次いでPCR反応が実施され、各ウェルに対して分析される。
本発明は、本発明の癌関連遺伝子またはタンパク質の活性を調節する化合物を同定またはスクリーニングする方法を提供する。この方法は、本発明の癌タンパク質を含む細胞に、上で規定されたような試験化合物を加える工程を包含する。この細胞は、本発明の癌タンパク質をコードする組み換え核酸を含む。別の実施形態において、候補因子のライブラリが、複数の細胞について試験される。
適したモジュレータを同定するためのアッセイは、ハイスループットスクリーニングに適用可能である。従って、好ましいアッセイは、癌遺伝子の転写の増強または阻害、ポリペプチド発現の阻害または増強、およびポリペプチド活性の阻害または増強を検出する。
正常細胞は、接着および増殖のために固形基材を必要とする。細胞が形質転換される場合は、細胞はこの表現型を失い、基材から離れて増殖する。例えば、形質転換された細胞は、攪拌された懸濁培地または半固形培地(例えば、半固形寒天または軟寒天)において増殖し得る。この形質転換された細胞は、腫瘍抑制遺伝子でトランスフェクションされた場合、正常の表現型を再生し、再度、接着して増殖するための固形基材を必要とする。アッセイにおける軟寒天増殖またはコロニー形成は、宿主細胞中で発現されたときに異常な細胞増殖および形質転換を阻害する、癌配列のモジュレータを同定するために使用される。モジュレータは、固形培地または半固形培地(例えば、寒天)中で懸濁されて増殖する宿主細胞の能力を、低減または排除する。
正常細胞は、代表的に、他の細胞に触れるまでは、細胞培養中において平坦かつ整理されたパターンで増殖する。細胞が互いに触れ合うと、細胞は接触阻害され、増殖を止める。しかしながら、形質転換された細胞は接触阻害されず、乱れた病巣において高密集度で増殖し続ける。従って、形質転換された細胞は、対応する正常細胞よりも、より高い飽和密集度まで成長する。これは、病巣における細胞の乱れた単層の形成によって、形態学的に検出される。あるいは、飽和密集地点における(3H)−チミジンでの標識指標が、成長の密集阻害を測定するために使用され、同様にMTTまたはAlmarブルーアッセイが細胞の成長能力およびモジュレータのそれに影響を及ぼす能力を明らかにする。上述のFreshney(1994)を参照のこと。形質転換された細胞は、腫瘍抑制遺伝子でトランスフェクションされた場合、正常の表現型を再生し得、接触阻害され、より低い密集度で成長するようになる。
形質転換された細胞は、その正常対応物よりも低い血清依存性を有する(例えば、Temin,J.Natl.Cancer Inst.37:167−175(1966);Eagleら、J.Exp.Med 131:836−879(1970));Freshney(上述)を参照のこと)。これは、形質転換された細胞による種々の成長因子の放出に部分的に起因する。形質転換された細胞の成長因子または血清依存性の程度が、コントロールの程度と比較され得る。例えば、細胞の成長因子または血清依存性は、本発明の癌関連配列を調節する化合物を同定および特徴づけするための方法において、モニタリングされる。
腫瘍細胞は、対応する正常細胞よりも増加した量の特定の因子(本明細書中では以後「腫瘍特異的マーカー」と呼ぶ)を放出する。例えば、プラスミノーゲン活性化因子(PA)が、正常脳細胞よりも高レベルでヒトグリオーマから放出される(例えば、Gullino,Angiogenesis,Tumor Vascularization,and Potential Interference with Tumor Growth,Biological Responses in Cancer,pp.178−184(Mihich編、1985)を参照のこと)。同様に、腫瘍血管新生因子(TAF)が、正常細胞よりも腫瘍細胞において高レベルで放出される。例えば、Folkman,Angiogenesis and Cancer,Sem.Cancer Biol.(1992)を参照のこと。一方、bFGFは内皮腫瘍から放出される(Ensoli,Bら)。
マトリゲルまたは細胞外マトリクス構成物質への侵襲性の程度は、癌関連配列を調節する化合物を同定および特徴付けするためのアッセイにおいて使用され得る。腫瘍細胞は、悪性度と、マトリゲルまたは何らかの他の細胞外マトリクス構成物質への細胞の侵襲性との間に、正の相関を示す。このアッセイにおいて、代表的に発癌性細胞が、宿主細胞として使用される。これらの宿主細胞における腫瘍抑制遺伝子の発現は、その宿主細胞の侵襲性を減少させる。上述のCancer Res.1999;59:6010;Freshney(1994)に記載されている技術が、使用され得る。簡潔に述べると、宿主細胞の侵襲性のレベルは、マトリゲルまたは何らかの他の細胞外マトリクス構成物質でコーティングされたフィルターを使用して測定される。ゲル内への侵入またはフィルターの遠位側を通る侵入が、侵襲性としてランク付けされ、細胞数もしくは移動した距離によって組織学的に、または細胞を125Iで予め標識し、そしてそのフィルターの遠位側もしくはディッシュの底部上で放射能をカウントすることによってランク付けされる。例えば、上述のFreshney(1984)を参照のこと。
細胞成長についての癌関連配列の効果は、トランスジェニック生物または免疫抑制生物において試験される。トランスジェニック生物は、種々の当該分野において認められている方法において調製される。例えば、癌遺伝子が破壊されているかまたは癌遺伝子が挿入されているノックアウトトランスジェニック生物(例えば、マウスのような哺乳動物)が作製される。ノックアウトトランスジェニックマウスは、相同組み換えを介したマウスゲノムにおける内在性癌遺伝子部位へのマーカー遺伝子または他の異種遺伝子の挿入によって作製される。そのようなマウスはまた、内在性癌遺伝子を、その癌遺伝子の変異したバージョンで置換するか、またはその内在性癌遺伝子を例えば発癌物質に曝露することによって変異させることにより、作製され得る。
調節活性を有する化合物を同定するためのアッセイは、インビトロで実施され得る。例えば、癌ポリペプチドがまず潜在的モジュレータと接触され、そして適した時間(例えば、0.5〜48時間)インキュベートされる。一実施形態において、この癌ポリペプチドレベルが、タンパク質またはmRNAのレベルを測定することによって、インビトロで決定される。タンパク質のレベルは、その癌ポリペプチドまたはそのフラグメントに選択的に結合する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング、ELISAなどのようなイムノアッセイを使用して測定される。mRNAの測定のためには、例えば、PCR、LCRを使用した増幅またはハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、ノザンブロッティング、RNAse保護、ドットブロッティング)が好ましい。タンパク質またはmRNAのレベルは、本明細書中に記載されるように、直接的または間接的に標識された検出因子(例えば、蛍光分子によって標識された核酸もしくは放射能により標識された核酸、放射能により標識された抗体もしくは酵素的に標識された抗体など)を使用して検出される。
本発明に従う結合アッセイにおいて、本発明の精製または単離された遺伝子産物が、一般的に使用される。例えば、本発明のタンパク質に対する抗体が生成され、そしてイムノアッセイが行われて、タンパク質の量および/または局在を決定する。あるいは、癌タンパク質を含む細胞が、アッセイにおいて使用される。
一実施形態において、「試験化合物」の結合は、「競合因子」との競合的結合アッセイによって決定される。この競合因子は、標的分子(例えば、本発明の癌タンパク質)に結合する結合部分である。競合因子は、抗体、ペプチド、結合パートナー、リガンドなどの化合物を含む。特定の状況下で、この試験化合物とこの競合因子との競合的結合は、試験化合物と取って代わる。一実施形態において、この試験化合物は標識される。試験化合物と競合因子のいずれか、またはその双方が、結合するのに十分な時間、そのタンパク質に加えられる。最適な活性を促進する温度(代表的に、4℃と40℃との間)において、インキュベーションが実施される。インキュベーション時間は、代表的に、例えば迅速なハイスループットスクリーニングを促進するために最適化され;代表的には、0時間と1時間との間が十分である。過剰量の試薬は、一般的に、除去されるかまたは洗い流される。次いで第二の成分が加えられ、標識された成分の存在または非存在が続いて結合を示す。
癌のポリヌクレオチドモジュレータが、WO 91/04753に記載されるように、リガンド結合分子との結合体の形成によって、標的ヌクレオチド配列を含有する細胞内に導入され得る。適したリガンド結合分子としては、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、または細胞表面レセプターに結合する他のリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、リガンド結合分子の結合体は、そのリガンド結合分子の、対応する分子またはレセプターに結合する能力を実質的に妨害しないし、センスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの結合体化バージョンの細胞への侵入をブロックもしない。あるいは、癌のポリヌクレオチドモジュレータは、WO 90/10448に記載されるように、例えばポリヌクレオチド−脂質複合体の形成によって、標的核酸配列を含有する細胞内へ導入され得る。処理の方法に加えて、アンリセンス分子の使用またはノックアウトおよびノックインモデルもまた、上で議論されたようなスクリーニングアッセイにおいて使用され得ることが理解される。
特定の実施形態において、癌関連タンパク質の活性は、アンチセンスポリヌクレオチドまたは阻害性の小さい核RNA(snRNA)(すなわち、本発明の癌タンパク質、mRNA、またはその部分配列のようなコーディングmRNA核酸配列に相補的であり、かつ好ましくは特異的にハイブリダイズし得る核酸)の使用によって、ダウンレギュレートされるかまたは完全に阻害される。アンチセンスポリヌクレオチドのそのmRNAへの結合は、そのmRNAの翻訳および/または安定性を低減させる。
アンチセンスポリヌクレオチドに加えて、リボザイムが、癌関連ヌクレオチド配列の転写を標的および阻害するために使用され得る。リボザイムは、他のRNA分子を触媒的に切断するRNA分子である。グループIリボザイム、ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイム、RNase P、およびアックスヘッド(axhead)リボザイムを含む異なる種類のリボザイムが記載されている(異なるリボザイムの特性の一般的な総説については、例えば、Castanottoら、Adv.in Pharmacology 25:289−317(1994)を参照のこと)。
一実施形態において、試験化合物は、関連する癌発現プロフィールを有する癌細胞の集団に投与される。本明細書中において、「投与」または「接触」とは、モジュレータが、取り込まれて細胞内で作用するかまたは細胞表面において作用するかに関わらず、モジュレータがその細胞に対して作用するのを可能にするような様式で、その細胞に加えられることを意味する。いくつかの実施形態において、タンパク質性因子(すなわち、ペプチド)をコードする核酸が、アデノウイルス構築物またはレトロウイルス構築物のようなウイルス構築物内に入れられ、細胞に加えられ、その結果、そのペプチド因子の発現が達成される(例えば、PCT US97/01019)。制御可能な遺伝子治療系もまた、使用され得る。一旦、そのモジュレータが細胞に投与されると、その細胞は所望される場合は洗浄され、そして好ましい生理学的条件下である程度の時間インキュベートされる。次いで、その細胞が回収され、新しい遺伝子発現プロフィールが生成される。従って、例えば癌組織が、癌表現型を調節(誘導または抑制)する因子についてスクリーニングされる。発現プロフィールの少なくとも1つ(好ましくは、多く)の遺伝子における変化が、その因子が癌の活性について効果を有することを示す。同様に、生物学的機能またはシグナル伝達経路が変わっていることは、モジュレータ活性の指標である。癌の表現型についてそのような特徴を規定することにより、その表現型を変更する新しい薬物についてのスクリーニングが考案される。このアプローチでは、薬物の標的は既知である必要はなく、元来の遺伝子/タンパク質発現スクリーニングプラットフォームにおいて提示されている必要はなく、その標的タンパク質についての転写のレベルも変化する必要もない。モジュレータ阻害機能は、代理マーカーとして機能する。
癌ポリペプチド活性およびその癌の表現型の測定が、種々のアッセイを使用して実施される。例えば、癌ポリペプチドの機能に対するモジュレータの効果は、上述のパラメーターを試験することによって測定される。活性に影響する生理学的な変化が、本発明のポリペプチドに対する試験化合物の影響を評価するために使用される。機能的な結果がインタクトな細胞または動物を使用して決定される場合は、種々の効果が、例えば、固形腫瘍と関連する癌、腫瘍成長、腫瘍転移、心血管新生、ホルモン放出、既知および特徴付けされていない遺伝的マーカーに対する転写変化(例えば、ノザンブロッティングによる)、細胞成長またはpH変化のような細胞代謝における変化、およびcGNIPのような細胞内二次メッセンジャーにおける変化のような場合において、評価され得る。
種々の遺伝子配列の発現が、癌と相関する。従って、変異体または改変体癌遺伝子に基づく疾患が決定される。一実施形態において、本発明は、改変体癌遺伝子を含む細胞を同定する方法、例えば、細胞における少なくとも1つの内在性癌遺伝子の配列の全てまたは一部の存在を決定する方法を提供する。これは、多数の配列決定技術を使用して達成される。本発明は、個体における癌遺伝子型を同定する方法、例えば、その個体における本発明の少なくとも1つの遺伝子の配列の全てまたは一部を決定する方法を包含する。これは、一般的に、その個体の少なくとも1つの組織(例えば、表Iに示される組織)において行われ、そして多数の組織またはその組織の異なるサンプルの評価を包含する。この方法は、配列決定した遺伝子の配列を、既知の癌遺伝子(すなわち、野生型遺伝子)とを比較し、ファミリーのメンバー、相同性、変異または改変体を決定する工程を包含する。次いで、その遺伝子の全てまたは一部の配列が、既知の癌遺伝子の配列と比較され得、何らかの差異が存在するか否かを決定し得る。これは、多数の公知の相同性プログラム(例えば、BLAST、Bestfitなど)を使用して行われる。患者における癌遺伝子と既知の遺伝子との間の配列における差異の存在は、本明細書中に概説されるように、疾患状態または疾患状態に対する傾向と相関する。
本発明はまた、siRNAオリゴヌクレオチド、具体的には5’’UTR領域のPSCAコード領域の少なくともフラグメントを包含する二重鎖RNA、もしくは相補体、またはPSCA配列に特異的な任意のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。一実施形態において、そのようなオリゴヌクレオチドは、PSCAの機能を解明するために使用されるか、またはPSCAの機能または発現のモジュレータをスクリーニングもしくは評価するために使用される。別の実施形態において、PSCAの遺伝子発現が、siRNAトランスフェクションを使用することにより低減され、抗原を内在的に発現する形質転換した癌細胞の増殖能を顕著に減少させ;特異的なPSCA siRNAで処理された細胞は、例えば細胞の生存度の代謝読み出しによって測定すると、生存度の減少を示し、このことは、その増殖能の低減と相関する。従って、PSCA siRNA組成物は、PSCAタンパク質の核酸ORF配列に対応するsiRNA(二重鎖RNA)またはその部分配列を含み;これらの部分配列は、一般的に、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35または35より多くの連続RNAヌクレオチド長であり、mRNAコード配列の少なくとも一部に相補的で、一部に非相補的である。好ましい実施形態において、この部分配列は、19〜25ヌクレオチド長であり、最も好ましくは21〜23ヌクレオチド長である。
本明細書中で記載される研究室用途、予後用途、予防用途、診断用途および治療用途における使用のために、キットが本発明の範囲内に含まれる。そのようなキットは、1つ以上の容器(例えば、バイアル、チューブなど)を受容するために区画化されたキャリア、包装、または容器を備え得る。各容器は、使用(例えば、本明細書中に記載される使用)のための説明書を含む標識または挿入物と一緒に、上記方法において使用される別個の要素を含む。例えば、この容器は、検出可能な標識されか、または検出可能に標識され得るプローブを含み得る。そのようなプローブは、本発明のタンパク質または遺伝子またはメッセンジャー(message)にそれぞれ特異的な抗体またはポリヌクレオチドであり得る。この方法が標的核酸を検出するために核酸ハイブリダイゼーションを利用する場合、上記キットはまた、標的核酸配列の増幅のためのヌクレオチドを含む容器を有し得る。キットは、レポーター分子に結合した、ビオチン結合タンパク質(例えば、アビジンまたはストレプトアビジン)のようなレポーター(例えば、酵素、蛍光または放射能標識)を含む容器を備え得;そのようなレポーターは、例えば核酸または交代と一緒に使用され得る。このキットは、図1、図2もしくは図3におけるアミノ酸配列またはそれらのアナログ、あるいはそのようなアミノ酸配列をコードする核酸分子の全てまたは一部を含み得る。
(正常組織および患者標本におけるPSCA改変体の発現分析)
以前に、PSCA(本明細書中では、PSCA v.1と呼ぶ)を、前立腺癌において発現する抗原として同定した。その発現は、原発性前立腺癌の80%より多くにおいて、そして大多数の前立腺転移において検出された。膀胱癌、卵巣癌、および膵臓癌においても発現していることが示されており、これらの癌は表Iに列挙されている。免疫組織学的分析により、PSCAは、ほとんどの尿路上皮癌腫の細胞表面において、そして60%の原発性膵臓腺癌において過剰発現していることも示されている。このPSCA発現データは、特許出願(PCT/US98/04664、PCT/US/28883、PCT/US00/19967)および論文審査のある学術専門誌(Saffranら、Proc Natl Acad Sci USA.2001 Feb 27;98(5):2658−2663;Amaraら、Cancer Res.2001 Jun 15;61(12):4660−65;Reiterら、Proc Natl Acad Sci USA.1998 Feb 17;95(4):1735−40;Arganiら、Cancer Res.2001 Jun 1;61(11):4320−24)において報告されている。
(PSCAのスプライス改変体)
本明細書中で使用される場合、用語「改変体」は、転写改変体および一塩基多型(SNP)を包含する。転写改変体は、同一の遺伝子由来の成熟mRNAの改変体であり、これは選択的転写および選択的スプライシングによって生じる。選択的転写は、同一の遺伝子由来の転写物であるが、異なる点から転写を開始する。スプライス改変体は、同一の転写物から異なってスプライシングされたmRNA改変体である。真核生物では、ゲノムDNAから複数のエキソン遺伝子が転写されると、最初のRNAがスプライシングされて機能的mRNAを生成する。これは、エキソンのみを有し、アミノ酸配列への翻訳のために使用され得る。従って、遺伝子が0〜多数の選択的転写物を有し得るとすると、各転写物は、0〜多数のスプライス改変体を有し得る。各転写改変体は、独特のエキソン構成を有し、元々の転写物とは異なるコード領域および/または非コード領域部分(5’または3’末端)を有し得る。転写改変体は、同一のタンパク質、類似のタンパク質または異なるタンパク質をコードすることができ、そのようなタンパク質は、同一の機能、類似の機能、または異なる機能を有する。この改変体タンパク質は、同時に同一の組織で発現することもできるし、同時に異なる組織で発現することもできるし、異なる時期に同一の組織で発現することもできるし、異なる時期に異なる組織で発現することもできる。転写改変体によってコードされるタンパク質は、類似または異なる細胞内または細胞外局在(例えば、分泌型対細胞内)を有し得る。
FgenesH(A.SalamovおよびV.Solovyev,”Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA,”Genome Research.2000年4月;10(4):516−22);Grail(URL compbio.ornl.gov/Grail−bin/EmptyGrailForm)ならびにGenScan(URL genes.mit.edu/GENSCAN.html)が挙げられる。スプライス改変体同定プロトコルの一般的な考察については、Southan,C.,A genomic perspective on human proteases,FEBS Lett.2001年6月8日;498(2−3):214−8;de Souza,S.J.ら、Identification of human chromosome 22 transcribed sequences with ORF expressed sequence tags,Proc.Natl Acad Sci USA.2000年11月7日;97(23):12690−3を参照のこと。
(PSCAの一塩基多型)
一塩基多型(SNP)は、特異的な位置でのヌクレオチド配列における1個の塩基対の変化である。ゲノム上のどの点においても、4つの可能なヌクレオチド塩基対:A/T、C/G、G/CおよびT/Aが存在する。本明細書中で使用される場合、対立遺伝子は、所定の遺伝子の一連の代替的形態の一つであり、DNA配列において異なり、産物(RNAおよび/またはタンパク質)に影響する。
(原核生物系における組み換えPSCAの産生)
原核生物細胞において組み換えPSCAおよびPSCA改変体を発現させるために、全長または一部のPSCAおよびPSCA改変体のcDNA配列を、当該分野において公知の種々の発現ベクターのうちのいずれか1つにクローニングする。PSCA改変体の以下の領域の1つ以上が発現される:図1に提示される全長配列、またはPSCA由来の任意の8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30またはそれ以上の連続するアミノ酸、それらの改変体もしくははアナログ。
pCRII:インサイチュ研究でRNAに対するPSCAのセンスRNAプローブおよびアンチセンスRNAプローブを生成するために、PSCA cDNAの全てまたはそのフラグメントのいずれかをコードするpCRII構築物(Invitrogen,Carlsbad CA)を生成させる。このpCRIIベクターは、インサイチュハイブリダイゼーション実験におけるRNAのプローブとして使用するために、PSCA cDNAの転写を駆動するための、挿入物に隣接するSp6プロモーターおよびT7プロモーターを有する。これらのプローブは、PSCAの細胞および組織発現をRNAレベルで分析するために使用する。PSCA遺伝子のcDNAアミノ酸コード領域を示す転写されたPSCA RNAを、PSCAタンパク質の合成のために、TnTTM Coupled Reticulolysate System(Promega,Corp.,Madison,WI)のようなインビトロ翻訳計において使用する。
pGEX構築物:細菌において、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)タンパク質に融合した組み換えPSCAタンパク質を生成するために、PSCA cDNAタンパク質コード配列の全てまたは一部を、pGEXファミリーのGST融合ベクター(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)にクローニングする。これらの構築物により、GSTがアミノ末端に融合され、6個のヒスチジンエピトープ(6×His)がカルボキシ末端に融合した組み換えPSCAタンパク質の制御された発現が可能になる。このGSTおよび6×Hisタグにより、適切なアフィニティーマトリックスを用いて、誘導された細菌からその組み換え融合タンパク質を精製することが可能になり、抗GST抗体および抗His抗体によるその融合タンパク質の認識が可能になる。この6×Hisタグは、クローニングプライマーの、例えばオープンリディングフレーム(ORF)の3’末端において、6個のヒスチジンのコドンを加えることによって、生成される。タンパク質分解部位(例えば、pGEX−6P−1におけるPreScissionTM認識部位)が利用され得、その結果PSCA関連タンパク質からGSTタグを切断することが可能になる。アンピシリン耐性遺伝子およびpBR322複製起点により、選択およびE.coli内でのpGEXプラスミドの維持が可能になる。
pESC構築物:組み換えタンパク質の生成および機能的研究のために酵母種Saccharomyces cerevisiaeにおいてPSCAを発現するために、PSCA cDNAコード配列の全てまたは一部を、各々が4つの選択マーカー(HIS3、TRP1、LEU2およびURA3)のうちの1つを有するpESCファミリーのベクター(Stratagene,La Jolla,CA)にクローニングする。これらのベクターは、同一の酵母細胞内において、FlarTMまたはMycエピトープのいずれかを含む2つまでの異なる遺伝子またはクローニングされた配列の、同一のプラスミド由来の制御された発現を可能にする。この系は、PSCAのタンパク質−タンパク質相互作用を確認するのに有用である。加えて、酵母における発現は、真核生物細胞において発現した場合に見られるのと類似した翻訳後修飾(例えば、グリコシル化およびリン酸化)をもたらす。
(高等真核生物系における組み換えPSCAの産生)
(A.哺乳動物構築物)
真核生物細胞において組み換えPSCAを発現させるために、PSCA cDNA配列の全長もしくは一部、またはその改変体が、当該分野で公知の種々の発現ベクターのいずれか1つにクローニングされ得る。PSCAの以下の1つ以上の領域が、これらの構築物において発現される:PSCA v.1由来のアミノ酸1〜123、またはany 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個の連続するアミノ酸のいずれか、それらのPSCA改変体もしくはアナログ。
バキュロウイルス発現系において組み換えPSCAタンパク質を生成するために、PSCAのORFまたはその一部を、バキュロウイルス移入ベクターであるpBlueBac 4.5(Invitrogen)にクローニングする。このベクターは、N末端にHisタグを提供する。具体的には、pBlueBac−PSCAを、ヘルパープラスミドであるpBac−N−Blue(Invitrogen)と一緒にSF9(Spodoptera frugiperda)昆虫細胞に同時トランスフェクションし、組み換えバキュロウイルスを生成する(詳細については、Invitrogenの支持マニュアルを参照のこと)。次いでバキュロウイルスを、細胞上清から収集し、プラークアッセイによって精製する。
PSCAのマウスおよびサルオルソログを、pcDNA3.1/MycHis Version A(Invitrogen,Carlsbad,CA)にクローニングした。タンパク質発現は、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターによって駆動する。組み換えタンパク質は、カルボキシ末端に融合したmycエピトープおよび6×Hisエピトープを有する。これらのベクターにより、モノクローナル抗ヒトPSCA抗体の交差反応性をアッセイするための、PSCAオルソログの発現が可能になる。
(抗原性プロフィールおよび二次構造)
PSCA改変体1、3および4のアミノ酸プロフィールは、ExPasy分子生物学サーバ上の(.expasy.ch/cgi−bin/protscale.pl)のWorld Wide Web上のProtScaleにアクセスして見つけた。
(PSCAポリクローナル抗体の作製)
ポリクローナル抗体は、例えば、免疫化剤、および、所望される場合、アジュバントの1回以上の注射により、哺乳動物において惹起され得る。代表的に、免疫化剤および/またはアジュバントは、複数回の皮下もしくは腹腔内への注射によって、哺乳動物に注射される。全長PSCAタンパク質改変体で免疫化することに加え、アミノ酸配列の解析に基づいて、抗原性があり、そして、免疫化された宿主の免疫系による認識に有効である特徴を含む免疫原の設計において、コンピュータのアルゴリズムが用いられる(「抗原性プロフィールおよび二次構造」という表題の実施例を参照のこと)。このような領域は、β−ターンの立体配置において、親水性かつ可撓性であり、そして、タンパク質の表面上に曝露されることが予測される。
(PSCAモノクローナル抗体(MAb)の作製)
一実施形態において、PSCAおよびPSCA改変体に対する治療用モノクローナル抗体(MAb)は、各タンパク質に特異的であるか、あるいは、PSCAもしくはPSCA改変体に結合するか、内部移行させるか、これらの生物学的な機能を妨害するか、または、調節する改変体の間に共通する配列に対して特異的なエピトープと反応する抗体(例えば、リガンドおよび結合パートナーとの相互作用を妨害する抗体)を含む。このようなMAbを作製するための免疫源としては、PSCAタンパク質の細胞外ドメインまたは全配列をコードするか、もしくは含むように設計されたもの、機能的モチーフを含むと予測される領域、および、アミノ酸配列のコンピュータ解析から、抗原性であると予測されるPSCAタンパク質改変体の領域が挙げられる。免疫源としては、ペプチド、組換え細菌タンパク質(例えば、GST−PSCA融合タンパク質(図8)およびHisタグ化PSCA pETベクタータンパク質(図6)および哺乳動物により発現させた、精製Hisタグ化タンパク質(図7)、ならびに、ヒトおよびマウスのIgG FC融合タンパク質)が挙げられる。さらに、細胞を、レトロウイルスの形質導入によって、高いレベルのPSCA改変体1を発現するように加工した(例えば、RAT1−PSCA)。293T−PSCA、3T3−PSCA、または300.19−PSCAは、マウスを免疫するために使用する(図5)。
(PSCA抗体のスクリーニングおよび同定)
「PSCAモノクローナル抗体(MAb)の作製」という表題の実施例に示される手順を用いて作製した抗体を、ELISA、FACS、エピトープグルーピング、および、細胞表面上に発現するPSCAに対する親和性を含む、アッセイの組み合わせを用いて、スクリーニングおよび同定した。
PSCAに対するMAbについての最初のハイブリドーマスクリーニングを、FACSにより行った。プロトコールは、以下の通りであった:50μl/ウェルのハイブリドーマ上清(希釈なし(neat))または(段階希釈した)精製抗体を、96ウェルのFACSプレートに加え、そして、PSCAを発現する細胞(内因性または組換え、50,000細胞/ウェル)と混合した。この混合物を、4℃にて2時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、細胞をFACS緩衝液で洗浄し、そして、100μlの検出抗体(抗hIgG−PE)と共に、4℃にて45分間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、細胞をFACS緩衝液で洗浄し、ホルムアルデヒドで固定し、そして、FACScanを用いて分析した。データを、CellQuest Proソフトウェアを用いて分析した。黒色のヒストグラムは、ネガティブコントロールの細胞からのデータを示し、白色のヒストグラムは、PSCA陽性細胞からのデータを表す(図9)。
ハイブリドーマの上清を試験して、細胞表面PSCAに対するそのそれぞれの結合親和性を決定した。ハイブリドーマの上清を、FACS緩衝液(FB)中でμg/ml〜ng/ml以下まで段階希釈し;そして、LAPC9AI細胞を用いる、FACS結合アッセイにおいて評価した。親和性の高い抗体が、高いMFI値を示した。各点におけるMFI値を、CellQuest Proソフトウェアを用いて取得し、そして、これを、Graphpad Prismソフトウェア:シグモイドの用量応答(可変勾配(variable slope))方程式を用いる、親和性の計算に用いた(表VIIおよび表VIII)。相対的な親和性の分析結果を、図10に示す。
PSCA抗体を、LAPC9AI細胞における結合パターンを評価することによって、エピトープに基づいてグルーピングした。簡単に述べると、少量の各抗体を、ビオチン化し;次いで、このビオチン化した抗体の各々を、過剰(100倍)量のビオチン化していない抗体の存在下で、LAPC9AIと共に、4℃にて1時間インキュベートした。一般に、過剰量の抗体は、同じエピトープに結合する場合、ビオチン化した抗体と競合する。インキュベーションの終了時に、細胞を洗浄し、そして、ストレプトアビジン−PEと共に4℃にて45分間インキュベートした。未結合のストレプトアビジン−PEを洗浄して除いた後、細胞を、FACSを用いて分析した。MFI測定を、データ分析に用いた(表VII)。表XIに示すように、黄色で強調した細胞は、自己競合(100%競合)を示し、そして、これらの細胞におけるMFIは、ビオチン化した抗体の各々についてのバックグラウンドのコントロールである。無色の細胞は、2つの抗体が互いに競合すること(低いMFI)を示し、高いMFI(青色で強調)は、2つの抗体が、2つの別個のエピトープに結合することを示す。同じ結合パターンを有する抗体は、複数の抗体の中でも、同じエピトープに結合する。試験した抗体の中には、6つのエピトープ群が存在する。表XIは、PSCA 4.121が、その固有のエピトープに結合することを示す。
(PSCA抗体の性質決定および発現)
(A.サルPSCAおよびマウスPSCAの交差反応性)
MAbを、マウス起源およびサル起源のPSCAに反応するその能力についてスクリーニングし、そして性質決定した。この特性は、マウス動物モデルおよびサル動物モデルを使用した際の、細胞および組織におけるPSCAのMAb結合の結果を理解するために有用である。カニクイザルおよびマウスのPSCA遺伝子をクローニングし、レトロウイルスにおいて発現させ、そして一時的に293−T細胞内に感染させた。 を、以下のプロトコールを用いて、対応する抗体とともにインキュベートした。試験抗体を、カニクイザルPSCAもしくはマウスPSCAのどちらかを発現する293−T細胞、またはthe−neo gene遺伝子のみを発現する293T細胞(ネガティブコントロールとして)と共にインキュベートした。特異的認識を、抗hIgG−PE二次検出抗体を使用して決定した。種による(specied)交差反応性を図示する棒グラフを、図11に示す。まとめを、表Xに示す。表Xは、抗ヒトPSCA抗体の1つを除き全てがサルPSCAと交差反応し、そして抗ヒトPSCA抗体の1つを除き全てがマウスPSCAと交差反応したことを示す。
7種の抗ヒトPSCA抗体のパネルを、SW780細胞(高レベルのPSCAを発現するヒト膀胱癌細胞株)上のPSCAに対するその結合親和性について試験した。精製抗体の23の1:2連続希釈系列を、SW780細胞(50,000細胞/ウェル)と共に、4℃で一晩、167nM〜0.01pMの終濃度でインキュベートした。インキュベーションの最後に、細胞を洗浄し、そして抗hIgG−PE検出抗体と共に4℃で45分間インキュベートした。未結合の検出抗体を洗い流した後、細胞を、FACSによって分析した;各点のMFI値を、Cell Quest Proソフトウェアを用いて得、このMFI値を、Graphpad Prismソフトウェア:シグモイド用量−応答(可変傾斜)方程式(表VIIおよび表VIII)を用いる親和性計算に用いた。7種の抗体の親和性の値を、表IXに示す。
(PSCA抗体内在化)
Hal−4.121の内在化を、PC3−PSCA細胞を用いて研究した。簡潔にいうと、Hal−4.121を、細胞と共に4℃で90分間インキュベートし、抗体を細胞表面に結合させた。次いで、細胞を、2つのグループに分け、そしてインキュベーションを37℃で続けて抗体を内在化させるか、あるいはコントロールとしてインキュベーションを4℃で続けた(内在化なし)。37℃/4℃インキュベーション後に、酸洗浄を用いて、細胞表面上に結合したPSCA 4.121を除去した。その後の透明化により、内在化PSCAに結合した抗体の検出が可能になった。二次検出抗体とのインキュベーション後、細胞を、FACSを用いて分析するか、または蛍光顕微鏡下で観察した。約30%のHal−4.121は、2時間の37℃でのインキュベーション後、内在化した(図12)。
(二次死滅を媒介する抗体)
PSCAに対する抗体は、PSCA発現細胞において、saporin界面活性剤死滅を媒介する。B300.19−PSCA発現細胞(750細胞/ウェル)を、1日目に、96ウェルプレート中に播種した。翌日、2×濃度の等容量の望ましい一次抗体を、2倍過剰量のsaporin毒素(Advanced Targeting Systems,San Diego,CA)と結合体化した抗ヒトポリクローナル抗体(Hum−Zap)もしくは抗ヤギポリクローナル抗体(Goat−Zap)と共に含有する培地を、各ウェルに添加した。細胞を、5日間37℃でインキュベートした。インキュベーション期間の最後に、MTS(Promega)を各ウェルに添加し、そしてインキュベーションをさらに4時間続けた。450nMにおけるODを、決定した。図13(A)の結果:PSCA抗体HA1−4.121およびHA1−4.117は、B300.19−PSCA細胞において、saporin界面活性剤細胞傷害を媒介した。一方、コントロール(非特異的ヒトIgG1)は、効果がなかった。図13Bの結果:二次saporin結合体化抗体の添加は、ヒトFcを認識せず、細胞傷害を媒介しなかった(図13(A)および図13(B))。これらの結果は、薬物もしくは細胞障害性タンパク質は、適切な抗PSCAMAbを用いて、PSCA発現細胞に選択的に送達され得ることを示す。
(抗体免疫によって媒介される細胞傷害)
PSCA抗体を評価し、免疫依存性細胞傷害を媒介するその能力を決定した。PSCA抗体(0〜50μg)を、PHB緩衝液(RPMI 1640,Gibco Life Technologies,20mM HEPES)で希釈した。B300.19−PSCA発現細胞を、RHB緩衝液中で洗浄し、そして106細胞/mlの密度で再度浮遊させた。代表的なアッセイにおいて、50μlのPSCA抗体、50μlの希釈したウサギ補体血清(Cedarlane,Ontario,Can)、ならびに50μlの細胞浮遊液を、平底組織培養96ウェルプレート内に、共に添加した。混合液を、5% CO2インキュベーター内で37℃で2時間インキュベートし、補体媒介性細胞溶解を促進した。次いで、50μlのAlamar Blue(Biosource Intl.Camarillo,CA)を各ウェルに添加し、そしてインキュベーションを37℃でさらに4〜5時間続けた。各ウェル中の蛍光を、96ウェルフルオロメーターを用いて、励起530nmおよび放出590nmで読み取った。この結果は、Ig1イソ型を有するPSCA抗体(HA1−4.121)もしくはIgG2イソ型を有するPSCA抗体(HA1−5.99.1)は、補体依存性溶解を媒介可能であったが、IgG4イソ型を有するPSCA抗体(HA1−6.46)は、補体依存性溶解を媒介しなかったことを示す(図14)。
(F(Ab’)フラグメントの産生)
MAbのF(Ab’)フラグメントの産生は、二価抗原結合部位を有するが免疫エフェクターFcドメインを欠くMAb分子の効果を、インビトロもしくはインビボの治療モデルにおいて研究するために有用である。20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)中の20mgのMAb Hal−4.121を、固定化したペプシン(Pierce.Rockford IL)と共に、またはこれなしで、指定時間にわたってインキュベートした。インタクトなMAbおよび切断したFcフラグメントを、プロテインAクロマトグラフィーによって除去した。図15において、インタクトな未切断非還元MAb、指定の時間で得た切断物質の非還元アリコート、および最終切断F(ab’)2産物の還元型サンプルの、SDS−PAGEクーマシー染色ゲルを示す。この試薬は、PSCA発現腫瘍を有する動物を処置するために使用され得る。この抗体フラグメントによって観察される抗腫瘍活性は、免疫依存性機構によって媒介される活性から、固有の生物学的活性を識別し得る。
(組換えDNA方法を用いるヒト抗体の発現)
抗PSCA MAbが組換え的にトランスフェクトされた細胞を発現させるため、抗PSCA可変重鎖および抗PSCA可変軽鎖の配列を、それぞれヒト重鎖IgH1および軽鎖Igκ定常領域の上流にクローニングした。完全抗PSCAヒト重鎖カセットおよび完全抗PSCAヒト軽鎖カセットを、クローニングベクター中のCMVプロモーター/エンハンサーの下流にクローニングした。ポリアデニル化部位は、MAbコード配列の下流を含んだ。組換え抗PSCA MAb発現構築物を、293T細胞、Cos細胞およびCHO細胞の中にトランスフェクトした。組換え293−T細胞から分泌されたHA1−4.121抗体を、図Pia−3Aにおける細胞表面のPSCAへの結合について評価し、そして元のハイブリドーマから産生された同じ抗体と比較した(図16)。
(HLAクラスIおよびクラスII結合アッセイ)
精製HLA分子を用いるHAクラスIおよびクラスII結合アッセイを、開示されているプロトコールに従って実施した(例えば、PST公開WO94/20127およびWO94/03205;Sidneyら,Current Protocols in Immunology 18.3.1(1998);Sidneyら,J.Immunol.154:247(1995);Setteら,Mol.Immunol.31:813(1994))。簡潔に言うと、記載のように、精製したMHC分子(5〜500nM)を、種々の未標識ペプチドインヒビターおよび1〜10nM 125I放射標識プローブペプチドと共に、インキュベートする。インキュベーション後、MHC−ペプチド複合体を、ゲル濾過によって遊離のペプチドから分離し、そしてペプチド結合した画分を決定する。代表的に、予備実験において、各MHC調製物を、固定量の放射標識ペプチドの存在下で滴定して、総放射活性の10〜20%の結合に必要なHLA分子の濃度を決定する。その後の全ての阻害アッセイおよび検出結合アッセイを、これらのHA濃度を用いて実施する。
(「ミニ遺伝子(Minigene)」マルチエピトープDNAプラスミドの構築)
本実施例は、ミニ遺伝子発現プラスミドの構築を考察する。ミニ遺伝子プラスミドは、無論、本明細書中で記載されるB細胞、CTLおよび/またはHTLエピトープもしくはエピトープアナログの種々の構造を含み得る。
(プラスミド構築物およびこのプラスミド構築物が免疫原性を誘導する程度)
プラスミド構築物(例えば、上記実施例に従って構築したプラスミド)が免疫原性を誘導する程度を、APCのエピトープ発現核酸構築物による形質導入もしくはトランスフェクション後にAPCによるエピトープ提示を決定することにより、インビトロで確認する。このような研究は、「抗原性」を決定し、ヒトAPCの使用を可能にする。このアッセイは、T細胞によって認識される状況において、APCによって提示されるエピトープの能力を、細胞表面上のエピトープ−HLAクラスI複合体の密度を定量することによって、決定する。定量を、APCから溶出されるペプチドの量の直接測定によって実施し得る(例えば、Sijtsら,J.Immunol.156: 683−692,1996;Demotzら,Nature 342:682−684,1989)。または、ペプチド−HLAクラスI複合体の数を、疾患もしくはトランスフェクトした標的細胞によって誘導される溶解もしくはリンホカイン放出の量を測定することによって見積もり、次いで、溶解およびリンホカイン放出の同等のレベルを得るために必要なペプチドの濃度を決定することができる(例えば、Kageyamaら,J.Immunol.154:567−576,1995)。
(複数抗原由来のポリエピトープ性ワクチン組成物)
本発明のPSCAペプチドエピトープを、他の標的腫瘍関連抗原由来のエピトープと組み合わせて使用して、PSCAおよびこのような他の抗原を発現する癌の予防もしくは処置に有用なワクチン組成物を作製する。例えば、ワクチン組成物は、PSCAおよびPSCA発現に関連する標的癌によってしばしば発現される腫瘍関連抗原由来の多数のエピトープを組み込む、1つのポリペプチドとして提供され得るか、あるいは、1種以上の別々のエピトープの混合物を含む組成物として投与され得る。あるいは、ワクチンは、インビトロでペプチドエピトープを入れ込んだミニ遺伝子構築物または樹状細胞として投与され得る。
(免疫応答を評価するためのペプチドの使用)
本発明のペプチドを、特定の抗体の存在に対する免疫応答(PSCAに対するCTLもしくはHTL)を分析するために使用し得る。このような分析は、Oggら,Science 279:2103−2106,1998によって記載される様式で実施され得る。本実施例において、本発明に従うペプチドを、免疫原としてではなく、診断または予後診断の目的のための試薬として、使用する。
(プライムブーストプロトコールを使用する免疫応答の誘導)
遺伝子組み換えマウスにおけるDNAワクチンの有効性を確認するために使用した、基本的な原則において同様のプライムブーストプロトコール(例えば、表題「プラスミド構築およびそれが免疫原性を誘導する程度」の実施例において上に記載される)はまた、ヒトに対するワクチンの投与のために使用され得る。このようなワクチンレジメンは、例えば、そのままのDNAを最初に投与し、次いでこのワクチンをコードする組換えウイルスを使用するか、または組換えのタンパク質/ポリペプチドもしくはアジュバントにおいて投与されるペプチド混合物を使用するブーストを行う工程を包含する。
(相補的ポリヌクレオチド)
PSCAコード配列に対する配列相補性(図1または図3)、またはその任意の部分を、天然に存在するPSCAの発現を検出するか、減少させるか、または阻害するために使用する。約15〜30塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用が、記載されるが、本質的に同じ手順を、より小さい配列フラグメントまたはより大きい配列フラグメントを用いて使用する。適切なオリゴヌクレオチドを、例えば、OLIGO 4.06ソフトウェア(National Biosciences)およびPSCAのコード配列を使用して設計する。転写を阻害するために、相補的オリゴヌクレオチドを、最も固有な5’配列から設計し、そしてコード配列に結合するプロモーターを妨げるために使用する。翻訳を阻害するために、相補的オリゴヌクレオチドを、PSCAをコードする転写物に対するリボソームの結合を妨げるように設計する。
(PSCA特異的抗体を使用した天然に存在するPSCAまたは組換えPSCAの精製)
天然に存在するPSCAまたは組換えPSCAを、PSCAに特異的な抗体を使用した免疫親和性クロマトグラフィーによって実質的に精製する。免疫親和性カラムを、活性化したクロマトグラフィー樹脂(例えば、CNBr活性化SEPHAROSE(Amersham Pharmacia Biotech))に抗PSCA抗体を共有結合させることによって構築した。結合させた後、この樹脂を、ブロックし、そして製造業者の指示書に従って洗浄する。
(PSCAと相互作用する分子の同定)
PSCA、またはその生物学的に活性なフラグメントを、121 1 Bolton−Hunter試薬によって標識する(例えば、Boltonら、(1973)、Biochem.J.133:529を参照のこと)。複数ウェルプレートのウェル中に予め配列した候補分子を、標識したPSCAと一緒にインキュベートし、洗浄し、そして標識PSCA複合体を含む任意のウェルを、アッセイする。異なる濃度のPSCAを使用して得られたデータを、候補分子を伴うPSCAの数、PSCAと候補分子との親和性、およびPSCAと候補分子との会合についての値を計算するために使用する。
(PSCAの腫瘍増殖促進についてのインビボアッセイ)
腫瘍細胞の増殖におけるPSCAタンパク質の効果を、PSCAを発現する細胞またはPSCAを欠く細胞の腫瘍発生および腫瘍増殖を評価することによって、インビボで評価する。例えば、SCIDマウスに、1×106個の、空tkNeoベクターもしくはPSCAを含む3T3または前立腺癌細胞株(例えばPC3細胞)のいずれかを、側腹部に皮下注射する。少なくとも以下の2つのストラテジーを、使用し得る:(1)ウイルス(例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス(英国特許第2,211,504号(1989年7月5日公開)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス2)、ウシパピローマウイルス、トリサルコーマウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス40(SV40))のゲノムまたは異種の哺乳動物プロモーター(例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター)から得られるプロモーター(例えば、構成的プロモーター)の調節下における構成的なPSCA発現(但し、このようなプロモーターが宿主細胞系と適合性である)、および(2)誘導性のベクターシステムの制御(例えば、エクジソン、テトラサイクリンなど)下における調節された発現(但し、このようなプロモーターが宿主細胞系と適合性である)。その後、腫瘍体積を、PSCA発現細胞がより速い速度で増殖するか否か、およびPSCA発現細胞によってもたらされた腫瘍が変化した病原力の特性(例えば、増強した転移、血管新生、化学療法剤に対する減少した応答性)を示すか否かを決定するために、触診可能な腫瘍の出現におけるキャリパーの測定によってモニタリングし、そして長期にわたって追跡する。
(インビボにおける腫瘍のPSCAモノクローナル抗体媒介性の阻害)
腫瘍組織の細胞表面におけるPSCAの顕著な発現(正常組織における制限的な発現を伴う)は、PSCAを、抗体療法の良好な標的にする。同様に、PSCAは、T細胞ベースの免疫療法の標的である。したがって、ヒト前立腺癌の異種移植片マウスモデルおよびヒト膵臓癌の異種移植片マウスモデルにおける抗PSCA MAbの治療的有効性を、PC3−PSCAおよび3T3−PSCAのような組換え細胞株(例えば、Kaighn,M.E.ら、Invest Urol、1979.17(1):16−23を参照のこと)およびヒト前立腺の異種移植片モデル(例えば、LAPC 9AD(Saffranら、PNAS 1999、10:1073−1078)を使用することによって評価する。
(材料および方法)
(PSCAモノクローナル抗体)
モノクローナル抗体を、表題「PSCAモノクローナル抗体(MAb)の産生」の実施例に記載されるように、PSCAに対して産生した。これらの抗体を、PSCAに結合するそれらの能力について、ELISA、ウェスタンブロット、FACS、および免疫沈降によって特徴付ける。ELISAおよびウェスタン分析によって決定されるような、抗PSCA MAbに対するエピトープのマッピングデータは、PSCAタンパク質上のエピトープを認める。これらの抗体を用いて、前立腺癌の組織および細胞の免疫組織化学的な分析を行う。
前立腺癌細胞株(PC3細胞株およびLNCaP細胞株)および線維芽細胞株NIH 3T3(American Type Culture Collection)を、それぞれ、L−グルタミンおよび10% FBSを補充したRPMIならびにDMEM中で維持する。
皮下(s.c.)腫瘍を、Matrigel(Collaborative Research)と1:1の希釈度にて混合した1×106個の癌細胞の、雄SCIDマウスの右側腹部における注射によってもたらす。腫瘍形成に対する抗体の効力を試験するために、すなわち、抗体の注射を、腫瘍細胞の注射と同じ日に始める。コントロールとして、マウスに、精製したマウスIgG(ICN)もしくはPBS;または細胞中で発現されない無関係の抗原を認識する精製したモノクローナル抗体のいずれかを注射する。予備的な研究では、腫瘍増殖において、マウスIgGまたはPBSの間に、違いは見出されない。腫瘍のサイズを、キャリパーの測定によって決定し、そしてその腫瘍体積を、長さ×幅×高さとして算出する。直径1.5cmより大きい皮下腫瘍を有するマウスを、屠殺する。
腫瘍形成に対する抗PSCA MAbの効果を、HPAC同所性モデルおよびLAPC9同所性モデルを使用することによって試験する。s.c.腫瘍モデルと比較すると、この同所性モデル(マウスの膵臓または前立腺において、それぞれ、直接的な腫瘍細胞の注射を必要とする)は、局所的な腫瘍増殖、遠位部位における転移の発生、マウスの健康の悪化、およびその後の死を生じる(Saffran,D.ら、PNAS、前出)。これらの特徴は、同所性モデルをヒトの疾患の進行をより代表するものにし、そしてこれらの特徴は、本発明者らが臨床的に関連する終末点におけるMAbの治療効果を追跡すること可能にする。
上記の方法論を使用して、LAPC−9AI腫瘍細胞(2.0×106個の細胞)を、雄SCIDマウスに皮下注射した。これらのマウスを、群(各群においてn=10)へと無作為化し、そして処置を、示されるようなHA1−4.120またはアイソタイプMAbコントロールを用いて、0日目において腹腔内(i.p.)に開始した。動物を、研究の28日目までに、1週間に2回、合計7用量で処置した。腫瘍増殖を、示される通り、3日毎〜4日毎にキャリパーの測定を使用してモニタリングした。これらの結果は、ヒト抗PSCAモノクローナル抗体Hal−4.120が、SCIDマウスにおいて皮下に移植したヒト前立腺癌の異種移植片の増殖を有意に阻害したことを示す(p<0.05)(図18)。
別の実験において、LAPC−9AI腫瘍細胞(動物1匹あたり2×106個の細胞)を、雄SCIDマウスに皮下注射した。腫瘍体積が65mm3に達した場合、動物を、無作為化し、そして示されるように、4つの異なる群(各群においてn=10)に割り当てた。0日目の最初に、Ha1−4.121またはアイソタイプMAbコントロールを、500ugの用量にて1週間に2回、合計6用量でi.p.に投与した。最後の用量を、17日目に与えた。タキソテールを、0日目、3日目および7日目に5mg/kgの用量で静脈内に与えた。腫瘍増殖を、3日毎〜4日毎にキャリパーの測定を使用してモニタリングした。この研究から得た結果は、単一の薬剤としてのHA1−4.121は、28日目にコントロール抗体による処置単独と比較した場合に、SCIDマウスにおいてアンドロゲン依存性の前立腺異種移植片の増殖を45%阻害した(ANOVA/Tukey検定:p<0.05)。アイソタイプMAbコントロールにタキソテールを加えた投与は、コントロール抗体による処置単独と比較した場合に、腫瘍増殖を28%阻害した(このことは、統計学的に有意ではなかった)。タキソテールと組み合わせたHA1−4.121の投与は、その効果を増強し、そしてコントロール抗体単独と比較した場合に、腫瘍増殖の69%の阻害を生じた(ANOVA/Tukey検定:p<0.01)。統計学的な有意差はまた、HA1−4.121にタキソテールを加えた組み合わせの群をHA1−4.121の群またはアイソタイプMAbコントロールにタキソテールを加えた群のいずれかと比較した場合に示された(ANOVA/Tukey検定:p<0.05)(図23)。
別の実験において、ヒトHPAC膵臓癌細胞(マウス1匹あたり2×106個)を、免疫不全ICR SCIDマウス(Taconic Farm、Germantown、NY)に皮下注射した。これらのマウスを、群(n=10の群1つあたりの動物数)へと無作為化し、そして示したヒトPSCAモノクローナル抗体による処置を、同日に開始した。抗体(マウス1匹あたり500mg)を、1週間に2回、合計8用量で腹腔内に送達した。これらの結果は、ヒト抗PSCAモノクローナル抗体Ha1−4.121、Ha1−4.117およびHa1−1.16が、SCIDマウスにおいて皮下に移植したヒト膵臓癌の異種移植片の増殖を有意に阻害したことを示した。統計分析を、t検定を使用して行った(両側性、a=0.05)(図24)。
別の実験において、ヒトSW780膀胱癌細胞(マウス1匹あたり2×106個)を、免疫不全ICR SCIDマウス(Taconic Farm、Germantown、NY)に皮下注射した。これらのマウスを、群(n=10の群1つあたりの動物数)へと無作為化し、そして示したヒトPSCA MAbによる処置を、同日に開始した。抗体(マウス1匹あたり250mg)を、1週間に2回、合計7用量で腹腔内に送達した。これらの結果は、HA1−4.117(p=0.014)、HA1−4.37(p=0.0056)、HA1−1.78(p=0.001)、Ha1−5.99(p=0.0002)およびHA1−4.5(p=0.0008)が、SCIDマウスにおいて皮下に移植したSW780膀胱腫瘍の増殖を有意に阻害したことを示した。統計分析を、t検定を使用して行った(両側性、a=0.05)(図27)。
(ヒトにおける抗PSCA抗体の治療的使用および診断的使用)
抗PSCAモノクローナル抗体を、ヒトにおいて、診断目的、予防目的、予後目的および/または治療目的のために、安全かつ有効に使用する。抗PSCA MAbを用いた癌の組織および癌の異種移植片のウェスタンブロットならびに免疫組織化学的な分析は、癌腫において、強い広範な染色を示すが、正常組織において、有意に、より低いレベル、または検出不可能なレベルを示す。癌腫および転移性の疾患におけるPSCAの検出は、診断的指標および/または予後の指標としてのMAbの有用性を示す。したがって、抗PSCA抗体を診断用途(例えば、腎臓の生検標本の免疫組織化学)に使用して、疑わしい患者から癌を検出する。
(インビボでのヒト抗PSCA抗体の使用によるヒトの癌腫の処置および診断のための、ヒトの臨床試験)
PSCA上のエピトープを認識する抗体を、本発明に従って使用し、そして表Iに記載されるような特定の癌の処置において使用した。PSCAの発現レベルを含む多くの因子に基づいて、表Iに記載されるような腫瘍は、現在、好ましい指標である。これらの指標の各々と関連して、3つの臨床的アプローチを、首尾よく実行する。
当業者によって認識されるように、投薬における考慮を、診療所にある類似の製品によって決定し得る。したがって、抗PSCA抗体を、5mg/m2〜400mg/m2の範囲の用量で(例えば、安全性研究に関連して、使用される、より低い用量で)投与し得る。抗PSCA抗体の標的についての公知の抗体の親和性に対する抗PSCA抗体の親和性は、類似の用量レジメンを決定するために当業者によって使用される1つのパラメータである。さらに、完全ヒト抗体である抗PSCA抗体は、そのキメラ抗体に比べて、より緩徐なクリアランスを有し;したがって、患者におけるこのような完全ヒト抗PSCA抗体を用いた投薬は、より低いもの(おそらく、50mg/m2〜300mg/m2の範囲)であり得、そしてなお有効なままである。mg/m2での投薬は、mg/kgにおける用量からなる従来の測定とは対照的に、表面積に基づく測定であり、そして乳児から成人までの全てのサイズの患者を含むように設計される好都合な投薬測定である。
概要:このCDPは、補助的療法、単独療法に関連した抗PSCA抗体による処置および造影剤としての抗PSCA抗体を追求し、そして開発する。試験は、最初に安全性を示し、その後、反復用量における効力を確認する。試験を、標準的な化学療法と抗PSCA抗体を加えた標準的な療法とを比較する非盲検である。認識される通り、患者の記録と合わせて利用され得る1つの判定基準は、生検によって決定されるような、患者におけるPSCAの発現レベルである。
(ヒトの臨床試験:ヒト抗PSCA抗体による単独療法)
抗PSCA抗体は、上で議論される補助的な試験に関連して、安全であり、ヒトの第2相臨床試験は、単独療法についての効力および最適な投薬を確認する。このような試験は、達成され、そして患者が抗PSCA抗体の用量の受容と同時に化学療法を受けないことを除いて、上記の補助的な試験と同じ安全性および転帰の分析を必要とする。
(ヒトの臨床試験:抗PSCA抗体による画像診断)
再び、上で議論されるように、補助的療法は、上で議論された安全性の判定基準の範囲内で安全であり、ヒトの臨床試験を、診断用造影剤としての抗PSCA抗体の使用について実施する。そのプロトコールを、Divgiら、J.Natl.Cancer Inst.83:97−104(1991)にあるような当該分野において記載される様式と実質的に同様の様式で設計する。この抗体は、診断的様式として使用した場合、安全でありかつ有効であることが見出される。
(ヒト抗PSCA抗体ならびに化学療法、放射線療法、および/またはホルモン消失(hormone ablation)療法によるヒトの臨床試験の補助的療法)
ヒトの第1相臨床試験を開始して、固形腫瘍(例えば、表Iに記載される組織の癌)の処置に関するヒト抗PSCA抗体の6個の静脈内用量の安全性を評価する。この研究において、本明細書中で定義されるような、抗腫瘍性薬剤または化学療法剤またはホルモン消失剤(例えば、シスプラチン、トポテカン、ドキソルビシン、アドリアマイシン、タキソール、Lupron、Zoladex、Eulexin、Casodex、Anandronなどであるが、これらに限定されない)についての補助的療法として利用される抗PSCA抗体の単一用量の安全性を、評価する。この試験の設計は、ほぼ約25mg/m2から約275mg/m2まで上昇する抗体の投薬量を用いた抗PSCA抗体のほぼ6個の単一用量の送達を含み、この送達は、以下のスケジュールまたは類似のスケジュールに従う処置の経過にわたる:
(RNA干渉(RNAi))
RNA干渉(RNAi)技術を、腫瘍学に関する種々の細胞アッセイに導入する。RNAiは、二本鎖RNA(dsRNA)によって活性化される転写後の遺伝子抑制機構である。RNAiは、タンパク質発現の変化、およびその後の遺伝子機能の変化を生じる、特異的なmRNAの分解を誘導する哺乳動物細胞において、短い干渉(short interfering)RNA(siRNA)といわれるこれらのdsRNAは、いくつかのmRNAに対して特異的な分解のためのRNAi経路の標的性を活性化する正しい組成を有する。Elbashir S.M.ら、Duplexes of 21−nucleotide RNAs Mediate RNA interference in Cultured Mammalian Cells、Nature 411(6836):494−8(2001)を参照のこと。したがって、RNAi技術を哺乳動物細胞において首尾よく使用して、標的遺伝子を抑制する。
(癌患者の標本におけるPSCAタンパク質のIHCによる検出)
癌患者から得た腫瘍標本中のPSCAタンパク質の発現を、抗体HA1−4.117を使用して検出した。ホルマリン固定し、パラフィン包理した組織を、4ミクロンの切片に切断し、そしてスライドガラス上に載せた。この切片を、この切片から蝋を除去し、再水和し、そして高温にて抗原回収(antigen retrieval)溶液(Antigen Retrieval Citra Solution;BioGenex、4600 Norris Canyon Road、San Ramon、CA、94583)によって処理した。次いで切片を、フルオレセインと結合体化したヒトモノクローナル抗PSCA抗体(Ha1−4.117)において、4℃にて16時間インキュベートした。これらのスライドカラスを、緩衝液中で3回洗浄し、そして緩衝液中での洗浄後、ウサギ抗フルオレセインと一緒に、1時間さらにインキュベートし、そしてDAKOEnVision+TMペルオキシダーゼと結合体化したヤギ抗ウサギ免疫グロブリンの二次抗体(DAKO Corporation、Carpenteria、CA)に30分間浸した。次いでこれらの切片を、緩衝液中で洗浄し、DABキット(SIGMA Chemicals)を用いて現像し、ヘマトキシリンを用いて対比染色し、そして明視野の顕微鏡によって分析した。これらの結果は、前立腺の腺癌の腫瘍細胞におけるPSCAの発現(A、B)、前立腺の移行上皮癌(transitional carcinoma)におけるPSCAの発現(C)および膵管の腺癌におけるPSCAの発現(D)を示す。これらの結果は、PSCAがヒトの癌において発現されること、およびこの抗原を指向する抗体が診断試薬として有用であることを示す(図17)。
前立腺
膵臓
膀胱
腎臓
結腸
肺
卵巣
乳房。
Claims (46)
- PSCAタンパク質(配列番号 )に対して特異的に結合する抗原結合部位を含む、抗体またはそのフラグメント(配列番号 )。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項1に記載の抗体またはフラグメント。
- 前記抗体がA.T.C.C.受託番号 を割り当てられている、請求項2に記載の抗体またはフラグメント。
- 前記抗体がA.T.C.C.受託番号 を割り当てられている、請求項2に記載の抗体またはフラグメント。
- 前記モノクローナル抗体がヒト化抗体である、請求項2に記載の抗体またはフラグメント。
- 前記フラグメントが、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、FvフラグメントまたはSfvフラグメントである、請求項1に記載の抗体またはフラグメント。
- 前記抗体が完全ヒト抗体である、請求項1に記載の抗体またはフラグメント。
- 前記抗原結合部位がマウス抗原結合ドメインである、請求項1に記載の抗体またはフラグメント。
- 組換え産生される、請求項1に記載の抗体またはフラグメント。
- 前記組換えタンパク質が、抗原結合領域を含む、請求項9に記載の抗体またはフラグメント。
- 前記抗体が検出可能なマーカー、毒素、治療剤、または化学療法剤に結合される、請求項1に記載の抗体またはフラグメント。
- 前記検出可能なマーカーは、放射性同位体、金属キレート剤、酵素、蛍光化合物、生物発光化合物または化学発光化合物である、請求項11に記載の抗体またはフラグメント。
- 前記放射性同位体が、212Bi、131I、131In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32PまたはLuを含む、請求項12に記載の抗体またはフラグメント
- 前記毒素が、リシン、リシンA鎖、ドキソルビシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、メイタンシノイド、タキソール、エチジウムブロマイド、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、Pseudomonas体外毒素 (PE) A、PE40、アブリン、アブリンA鎖、モデクシンA鎖、αサルシン、ゲロニン、マイトジェリン、レツトリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、curicin、クロチン、カリケアマイシン、sapaonaria officinalisインヒビター、糖質コルチコイド、アウリスタチン、アウロマイシン、イットリウム、ビスマス、コンブレスタチン、デュオカルマイシン、ドロスタチン、cc1065、またはシスプラチンを含む、請求項11に記載の抗体またはフラグメント。
- 前記抗原結合部位が、図2(配列番号 )中のタンパク質のアミノ酸のエピトープに特異的に結合する、請求項1に記載の抗体またはフラグメント。
- 請求項2に記載のモノクローナル抗体を産生するトランスジェニック動物。
- 請求項2に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
- 請求項2に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
- 重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む一本鎖である、請求項18に記載のベクター。
- ヒト単位用量形態で請求項1に記載の抗体またはフラグメントを含む薬学的組成物。
- 生物学的サンプル中のPSCAタンパク質の存在を検出するためのアッセイであって、該アッセイは、該サンプルを請求項1に記載の抗体と接触させる工程、および該サンプル中のPSCAタンパク質(配列番号 )の結合を検出する工程を包含する、アッセイ。
- 被験体においてPSCA(配列番号 )を発現する細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、
PSCAタンパク質(配列番号 )に特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む一本鎖モノクローナル抗体をコードするベクターを、該被験体に投与する工程であって、その結果、ベクターが該一本鎖モノクローナル抗体コード配列を該癌細胞に送達し、該コードされた一本鎖抗体が該癌細胞内で細胞内発現される、工程
を包含する、方法。 - 細胞毒性因子または診断因子をPSCAタンパク質(配列番号 )を発現する細胞に送達する方法であって、該方法は、
請求項1に記載の抗体またはフラグメントに結合された細胞毒性因子または診断因子を提供し、抗体因子結合体またはフラグメント因子結合体を形成させる工程;および
該細胞を該抗体因子結合体またはフラグメント因子結合体に曝露する工程
を包含する、方法。 - 前記細胞毒性因子または前記診断因子が、検出可能なマーカー、毒素および治療因子からなる群より選択される、請求項23に記載の方法。
- 前記検出可能なマーカーが、放射性同位体、金属キレート剤、酵素、蛍光化合物、生物発光化合物または化学発光化合物である、請求項24に記載の方法。
- 前記放射性同位体が、212Bi、131I、131In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32PまたはLuを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記毒素が、リシン、リシンA鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、メイタンシノイド、タキソール、エチジウムブロマイド、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、Pseudomonas体外毒素 (PE) A、PE40、アブリン、アブリンA鎖、モデクシンA鎖、αサルシン、ゲロニン、マイトジェリン、レツトリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、curicin、クロチン、カリケアマイシン、sapaonaria officinalisインヒビター、糖質コルチコイド、アウリスタチン、アウロマイシン、イットリウム、ビスマス、コンブレスタチン、デュオカルマイシン、ドロスタチン、cc1065またはシスプラチンを含む、請求項24に記載の方法。
- 生物学的サンプル中のPSCAタンパク質(配列番号 )を検出するための方法であって、該方法は、
該生物学的サンプルおよびコントロールサンプルを提供する工程;
該生物学的サンプルおよび該コントロールサンプルを、該PSCAタンパク質に特異的に結合する請求項1に記載の抗体と接触させる工程;ならびに
該生物学的サンプルおよび該コントロールサンプル中に存在する、該PSCAタンパク質を含む物質と該抗体との複合体の量を決定する工程
を包含する、方法。 - 請求項28に記載の方法であって、
表Iに列挙された癌を有するかまたは表Iに列挙された癌を有すると考えられる患者から前記生物学的サンプルおよび前記コントロールサンプルを採取する工程
をさらに包含する、方法。 - 図2に示されるタンパク質またはその部分配列をコードする核酸に対応するPSCA siRNA(二重鎖RNA)を含む組成物であって、ここで、該部分配列は、長さが19、20、21、22、23、24または25個の連続したRNAであり、かつmRNAコード配列の少なくとも一部に対して相補的である配列および相補的でない配列を含む、組成物。
- 細胞増殖を調節する分子を同定するための方法であって、該方法は、
(a)以下:
(i)配列番号1のヌクレオチド配列
(ii)図3に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
(iii)図3に示されるアミノ酸配列に対して90%以上同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;および
(iv)(i)、(ii)または(iii)のヌクレオチド配列のフラグメント
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸を含む系に分子を導入する工程;あるいは(i)、(ii)、(iii)または(iv)のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質を含む系に試験化合物を導入する工程;ならびに
(b)該分子と該ヌクレオチド配列またはタンパク質との間の相互作用が存在するかまたは存在しないかを決定する工程
を包含し、それによって、該分子と該ヌクレオチド配列またはタンパク質との間の相互作用の存在が、該分子を細胞増殖を調節する分子として同定する、方法。 - 前記系がインビボである、請求項31に記載の方法。
- 前記系がインビトロである、請求項31に記載の方法。
- 前記分子が、前記(i)、(ii)、(iii)または(iv)のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを含む、請求項31に記載の方法。
- 前記分子が、図2に示されるタンパク質またはその部分配列をコードする核酸に対応するPSCA siRNA(二重鎖RNA)組成物であり、ここで、該配列は、長さが19、20、21、22、23、24または25個の連続したRNAヌクレオチドであり、かつmRNAコード配列の少なくとも一部に対して相補的である配列および相補的でない配列を含む、請求項31に記載の方法。
- 被験体において癌を処置するための方法であって、該方法は、請求項31に記載の方法によって同定される分子を、癌と診断された被験体に投与する工程を包含し、それによって、該分子は該被験体において癌を阻害するかまたは遅延させる、方法。
- 前記癌は、表Iに示される癌である、請求項36に記載の方法。
- 表Iに列挙される癌を処置するための治療剤を同定するための方法であって、該方法は、
(a)以下:
(i)配列番号1のヌクレオチド配列;
(ii)図3に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(iii)図3に示されるアミノ酸配列に対して90%以上同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;ならびに
(iv)(i)、(ii)または(iii)のヌクレオチド配列のフラグメント
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸を含む系に分子を導入する工程;あるいは(i)、(ii)、(iii)または(iv)のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質を含む系に試験化合物を導入する工程;ならびに
(b)該分子と該ヌクレオチド配列またはタンパク質との間の相互作用が存在するかまたは存在しないかを決定する工程
を包含し、それによって、該分子と該ヌクレオチド配列またはタンパク質との間の相互作用の存在が、該分子を表Iに列挙される組織の癌を処置するための治療剤として同定する、方法。 - 前記系がインビトロである、請求項38に記載の方法。
- 前記系がインビボである、請求項38に記載の方法。
- 前記分子が、前記(i)、(ii)、(iii)または(iv)のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを含む、請求項38に記載の方法。
- 前記分子が、図2に示されるタンパク質またはその部分配列をコードする核酸に対応するPSCA siRNA(二重鎖RNA)を含む組成物であり、ここで、該部分配列は、長さが19、20、21、22、23、24または25個の連続したRNAヌクレオチドであり、かつmRNAコード配列の少なくとも一部に対して相補的である配列および相補的でない配列を含む、請求項38に記載の方法。
- 被験体において癌を処置するための方法であって、該方法は、請求項38に記載の方法によって同定される分子を、癌と診断された被験体に投与する工程を包含し、それによって、該分子が該被験体において癌を阻害するか遅延させる、方法。
- 前記癌が、表Iに示される癌である、請求項43に記載の方法。
- 哺乳動物において腫瘍増殖を減少させるための方法であって、該方法は、該哺乳動物をPSCA(配列番号 )に特異的に結合するモノクローナル抗体(配列番号 )と放射線との組み合わせの有効量で処置する工程を包含する、方法。
- 哺乳動物において腫瘍増殖を減少させるための方法であって、該方法は、該哺乳動物をPSCA(配列番号 )に特異的に結合するモノクローナル抗体(配列番号 )と化学療法剤との組み合わせの有効量で処置する工程を包含する、方法。
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