KR20030048009A - Ｈｅｒ-2/ｎｅｕ 관련 악성 종양의 치료 및 진단용 조성물및 방법 - Google Patents

Ｈｅｒ-2/ｎｅｕ 관련 악성 종양의 치료 및 진단용 조성물및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20030048009A
KR20030048009A KR10-2003-7002207A KR20037002207A KR20030048009A KR 20030048009 A KR20030048009 A KR 20030048009A KR 20037002207 A KR20037002207 A KR 20037002207A KR 20030048009 A KR20030048009 A KR 20030048009A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
polypeptide
neu
sequence
protein
Prior art date
Application number
KR10-2003-7002207A
Other languages
English (en)
Inventor
핸드짐머만수잔
치버마르틴에이
포이테레사엠
로드스마이클제이
칼로스마이클디
맥네일패트리샤디
베드빅토마스에스
Original Assignee
코릭사 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 코릭사 코포레이션 filed Critical 코릭사 코포레이션
Publication of KR20030048009A publication Critical patent/KR20030048009A/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464406—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Abstract

본 발명은 암, 특히 Her-2/neu 관련 암의 치료 및 진단용 조성물 및 이의 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 하나 이상의 Her-2/neu 폴리펩타이드, 이의 면역원성 부분, 당해 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 당해 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제공 세포 및 당해 폴리펩타이드를 발현하는 세포에 특이적인 T 세포를 포함한다. 기재된 조성물은 예를 들어, Her-2/neu 관련 악성 종양의 진단, 예방 및/또는 치료에 유용하다.

Description

ＨＥＲ-2/ＮＥＵ 관련 악성 종양의 치료 및 진단용 조성물 및 방법{Compositions and methods for the therapy and diagnosis of HER-2/NEU-associated malignancies}
재정적인 자원은 물론 인재에 대한 막대한 투자에도 불구하고 암은 주요 사망 원인 중 하나로서 남아있다. 예를 들어, 암은 35세 내지 74세 범위에 속하는 여성의 주요 사인이다. 특히, 유방암은 여성들의 가장 일반적인 악성종양으로서, 유방암 발생 빈도는 증가하고 있는 추세이다. 여성 9명중 1명은 유방암으로 진단받고 있다. 유방암을 치료하는 표준 방법으로는 주로 수술, 방사선치료 및 화학요법의 복합 처치가 이루어지고 있다. 이 방법들은 몇몇 악성종양에서는 약간 뛰어난 성공을 거두었다. 하지만, 이 방법들은 모든 악성종양에 대해 성공을 거두지 못했고, 특정 단계 이상으로 진행된 경우 치료를 시도했을 때 가장 흔히 치료할 수 없는 것이 유방암이다. 따라서, 예방과 치료에 대한 다른 대안적 방법이 필요하다.
악성종양의 일반적 특징은 제어되지 않는 세포 성장이다. 암 세포는 정상적인 표현형에서 자율 성장할 수 있는 악성 표현형으로 변형하는 과정을 겪는 것으로 나타난다. 체세포 유전자의 증폭과 과잉발현은 정상 세포를 악성 세포로 변형시키는 일반적인 초기 현상으로 생각되고 있다. 종양원성 유전자에 의해 암호화된 악성 표현형은 세포 분열 동안 형질전환된 세포 자손으로 전달된다.
종양유전자에 관련된 지속적인 연구로 악성 세포에서 작동성으로 형질전환에 주요 역할을 하거나 관련이 있는 40개 이상의 종양유전자를 동정하였다. 종양유전자는 이의 유전자 산물(예를 들어, 종양유전자에 의해 발현되는 단백질)의 추정상의 기능이나 위치에 근거하여 여러 그룹으로 분류되고 있다.
종양유전자는 일부 정상 세포 생리학의 측면에서 필수 인자로 생각되고 있다. 이와 관련하여 HER-2/neu종양유전자는 타이로신 단백질 키나제계 종양유전자의 구성원으로서 상피 성장인자 수용체와 고도의 상동성을 보유하고 있다. HER-2/neu는 아마도 세포 성장 및/또는 분화에 큰 역할을 하는 것으로 생각되고 있다. HER-2/neu는 본래 정상적인 유전자 산물의 발현 증가 또는 조절불능에 의해 나타나는 정량적 기작을 통해 악성종양을 유도하는 것으로 보인다.
HER-2/neu(p185)는 HER-2/neu종양유전자의 단백질 산물이다. HER-2/neu유전자는 다양한 암, 예를 들어 유방암, 난소암, 결장암, 폐암, 전립선암 및 혈액암등에서 증폭되어 HER-2/neu단백질을 과잉발현시킨다. HER-2/neu는 악성 형질전환과 관련이 있는 것이다. 도관 상피내 암종의 경우에는 50 내지 60%에서 나타나고, 모든 유방암의 경우에는 20 내지 40%에서 나타나며, 난소, 전립선, 결장 및 폐에서 나타나는 선암의 경우에는 상당한 비율에서 관찰되었다. HER-2/neu는 본래 모든 침입성 유방암의 1/4에서 발견되는 악성종양의 공격성은 물론 악성 표현형과 관련이 있는 것이다. HER-2/neu과잉발현은 유방암 및 난소암의 빈약한 예후와도 상호관련이 있다. HER-2/neu는 아미노산 길이가 약 1255개이고 상대적 분자량이 185kd인 경막 단백질이다. 상피 성장인자 수용체(EGFR)와 40%의 상동성이 있는 약 645aa의 세포외 결합 도메인(ECD)과, 고도 소수성인 경막 앵커 도메인(TMD) 및 EGFR과 80%의 상동성이 있는 약 580개 aa의 카복시 말단 세포질 도메인(CD)을 갖고 있다.
HER-2/neu종양유전자가 관계된 암의 현행 치료법에는 난점이 있기 때문에 당해 기술분야에는 개선된 화합물과 조성물이 요구되고 있다. 본 발명은 이와 같은 요구를 충족시키고 기타 다른 관련된 잇점을 제공하기 위한 것이다.
발명의 개요
본 발명은 한 측면에서 본 명세서에 상세히 설명되는 바와 같이 면역원성, 즉 면역 반응, 구체적으로 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유인할 수 있는 HER-2/neu 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 조성물을 제공한다. 바람직한 한 양태로서, 본 조성물은 서열 3에 제시된 바와 같은 HLA-B44 제한된 자연 가공의 HER-2/neu 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드 서열 또는 이 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 조성물이다.
본 발명은 또한 상기 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 단편, 변형체 및/또는 유도체를 제공하며, 이 단편, 변형체 및/또는 유도체는 면역원성 활성 수준이 본 명세서에 제시된 폴리펩타이드 서열의 면역원성 활성의 약 50% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 수준인 것이 좋다.
또한, 본 발명은 이와 같은 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터 및 이 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포를 제공한다.
다른 측면으로서, 본 발명은 전술한 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 생리학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.
이와 같은 본 발명의 관점에 있어서, 약제학적 조성물, 예를 들어 백신 조성물은 예방용 또는 치료용 조성물이다. 이와 같은 조성물은 일반적으로 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 면역자극제, 예를 들어 보조제를 함유한다.
본 발명은 또한 (a) 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원 결합 단편 및 (b) 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 측면으로서, 본 발명은 (a) 전술한 바와 같은 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제공 세포 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 항원 제공 세포로는 수지상 세포, 대식세포, 단핵구, 섬유아세포 및 B 세포를 포함한다.
관련된 관점으로서, 본 발명은 (a) 전술한 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제공 세포 및 (b) 면역자극제를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 다른 측면으로서 전술한 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질 및 이 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를, 일반적으로 생리적 허용성 담체 및/또는 면역자극제를 함유하는 약제학적 조성물, 예를 들어 백신 조성물 형태로 제공한다. 이 융합 단백질은 본 명세서에 기술된 바와 같은 복수의 면역원성 폴리펩타이드 또는 이의 일부/변형체를 포함할 수 있고, 추가로 상기 폴리펩타이드(들)의 발현, 정제 및/또는 면역원성을 용이하게 하는 하나 이상의 폴리펩타이드 단편을 포함할 수 있다.
또 다른 측면으로서, 본 발명은 HER-2/neu 폴리뉴클레오타이드 조성물, 바람직하게는 ICD 영역 일부 또는 전체를 암호화하는 HER-2/neu 폴리뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 서열 3에 제시된 바와 같은 적어도 HLA-B44 제한된 자연 가공성의 HER-2/neu 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 투여하는 것을 포함하여, 환자의 면역반응, 바람직하게는 사람 환자의 T 세포반응을 자극하는 방법을 제공한다. 환자는 암환자(이 경우에 상기 방법은 질병 치료를 위한 것임)이거나 암에 걸릴 위험이 있는 것으로 생각되는 환자(이 경우에는 예방적 치료를 위한 것임)일 수 있다.
본 발명은 또한, 다른 측면으로서 본 발명의 폴리펩타이드와 특이적으로 반응하는 T 세포와 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계를 포함하되, 이 접촉 단계가 상기 단백질을 발현하는 세포를 샘플로부터 제거하기에 충분한 조건과 시간 동안 실시되는 것을 특징으로 하는 생물학적 샘플로부터 종양 세포를 제거하는 방법을 제공한다.
이와 관련된 측면으로서, 본 발명은 전술한 바와 같이 처리된 생물학적 샘플을 환자에게 투여하는 것을 포함하여 환자 중의 암 발생을 억제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 다른 측면으로서, (i) 전술한 바와 같은 폴리펩타이드; (ii) 이 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및/또는 (iii) 이 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제공 세포 중 하나 또는 그 이상과 T 세포를 접촉시키되, T 세포를 자극 및/또는 확충시키기에 충분한 시간과 조건하에 접촉시키는 단계를 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드에 특이적인 T 세포를 자극 및/또는 확충시키는 방법을 제공한다. 또한, 전술한 바와 같이 제조된 T 세포를 함유하는 분리된 T 세포 집단도 제공한다.
또 다른 측면으로서, 본 발명은 전술한 바와 같은 유효량의 T 세포 집단을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 환자 중의 암 발생을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) (i) 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드의 적어도 면역원성분을 포함하는 폴리펩타이드; (ii) 이 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (iii) 상기 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제공 세포 중 하나 또는 그 이상과 환자에서 분리한 CD4+및/또는 CD8+T 세포를 항온처리하는 단계; 및 (b) 증식된 T 세포의 유효량을 환자에게 투여하여 환자 중의 암 발생을 억제하는 단계를 포함하여, 환자 중의 암 발생을 억제하는 방법을 제공한다. 증식된 세포는 환자에게 투여하기 전에 클로닝할 수 있으나, 반드시 필요한 것은 아니다.
또 다른 측면으로서, 본 발명은 (a) 전술한 폴리펩타이드에 결합하는 결합제와 환자 유래의 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계; (b) 결합제에 결합하는 폴리펩타이드의 양을 샘플 중에서 측정하는 단계; 및 (c) 측정된 폴리펩타이드 함량과 소정의 컷오프값을 비교하여 환자 중의 암의 존부 여부를 결정하는 단계를 포함하여, 환자 중의 암의 존부 여부, 바람직하게는 암을 검사하는 방법을 제공한다. 바람직한 양태로서, 결합제는 항체, 보다 바람직하게는 모노클로날 항체인 것이 좋다.
본 발명은 또한 다른 측면으로서, 환자 중의 암의 진행을 모니터하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (a) 1차적으로 환자에게서 얻은 생물학적 샘플을 전술한 폴리펩타이드에 결합하는 결합제와 접촉시키는 단계; (b) 결합제에 결합하는 폴리펩타이드의 양을 샘플 중에서 측정하는 단계; (c) 그 다음 2차적으로 환자에게서 얻은 생물학적 샘플을 사용하여 단계 (a)와 (b)를 반복하는 단계; 및 (d) 단계 (c)에서 측정된 폴리펩타이드 함량을 단계 (b)에서 측정된 함량과 비교하여 환자 중의 암의 진행을 모니터하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면으로서, 본 발명은 전술한 폴리펩타이드에 결합하는 모노클로날 항체와 같은 항체 뿐만 아니라 이와 같은 항체를 함유하는 진단 키트를 제공한다. 진단 키트는 전술한 바와 같은 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머를 함유하는 것이다.
이상 설명드린 본 발명의 관점 및 기타 다른 관점은 다음의 상세한 설명과 첨부하는 도면을 참조로 하여 명백하게 알 수 있을 것이다. 본 명세서에 개시된 모든 참고문헌은 각각 개별적으로 인용되고 있지만 전체적으로 참고인용된 것이다.
본 발명은 개괄적으로 암, 특히 유방암의 치료 및 진단에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 적어도 HER-2/neu 단백질의 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩타이드 및 이 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 이와 같은 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 사람의 악성종양을 진단 및 치료하는 약제학적 조성물, 예컨대 백신 및 기타 다른 조성물에 유용하다.
도 1은 AdV로 초회항원자극된 CD8+T 세포주에서 나타나는 ICD 반응성을 입증하는51Cr 방출 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 정상 공여체의 PBMC를 재조합 AdV를 발현하는 ICD로 감염된 DC로 초회항원자극하였다. 분석에는 표준 4시간51Cr 방출 분석을 사용하고; 표적은 표시된 바 대로 ICD 또는 EGFP를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스로 감염되거나 감염되지 않은 자가유래의 B-LCL을 사용하였다. 각 데이터 점은 3회 측정치의 평균값이다.
도 2는 MCF-7 종양 세포 상에 존재하는 표면 Her-2/neu의 유동 세포분석 결과를 나타내는 그래프이다. 세포는 표면 Her-2/neu에 대한 mAb로 염색한 뒤, PE에 접합시킨 2차 토끼 항마우스 Ig 항체로 염색시켰다. 표지된 세포는 유동 세포 측정기로 분석하였다. 평균 형광강도 값은 다음과 같았다: MCF-7 = 32; MCF-7 + RTV-H2V = 165; MCF-7 + Ad-H2N = 683; MCF-7+RTV-H2N + Ad-H2N = 651.
도 3은 Her-2/neu를 암호하는 플라스미드 DNA를 예방접종한 결과 EL4-Her-2/neu의 성장이 억제됨을 예시한 것이다. 마우스(5마리/그룹)에게 0일째와 21일째 pVR101 Her-2/neu, pVR1012-ECD 또는 pVR1012-ICD(100㎍)를 접종하여 면역화(i.m.)하였다. 그 다음, 35일째 200,000개의 EL4-Her-2/neu 세포를 경피로 마우스에게 투여하여 공격하였다. 종양 크기는 종양 공격 후 25일 동안 모니터하였다.
도 4는 ECD 단백질 서브유니트를 제외시킨 Her-2/neu ICD를 예방접종한 결과 EL4-Her-2/neu의 성장이 부분적으로 억제됨을 예시한 것이다. 마우스(4마리/그룹)에게 0일째와 21일째 몬타나이드(Montanide) 720중의 Her-2/neu ICD 또는 Her-2/neu ECD 단백질(50㎍)을 접종하여 면역화시켰다. 35일째 200,000개의 EL4-Her-2/neu 세포를 경피로 마우스에게 투여하여 공격하였다. 종양 크기는 종양 공격 후 25일 동안 모니터하였다.
<서열목록에 대한 설명>
서열 1은 Her-2/neu 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 제시한 것이다.
서열 2는 Her-2/neu 단백질의 아미노산 서열을 제시한 것이다.
서열 3은 Her-2/neu 단백질의 아미노산 1021-1030에 상응하는, 자연가공된 HLA-B44 제한된 Her-2/neu 에피토프의 아미노산 서열을 제시한 것이다.
서열 4는 클론 HICD_CT_His_암호_영역의 분석된 cDNA이다.
서열 5는 클론 HICD_플러스_8_HIS의 분석된 cDNA이다.
서열 6은 클론 HICD_천연_암호_영역의 분석된 cDNA이다.
서열 7은 클론 HICD_in-pPDM_암호_영역의 분석된 cDNA이다.
서열 8은 서열 4에 개시된 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 9는 서열 6에 개시된 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 10은 서열 7에 개시된 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 11은 서열 5에 개시된 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 12는 17D5 T 세포 클론의 TCR 베타쇄인 클론 68499의 분석된 cDNA이다.
서열 13은 17D5 T 세포 클론의 TCR 알파쇄인 클론 68498의 분석된 cDNA이다.
서열 14는 서열 12에 개시된 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 15는 서열 13에 개시된 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 16은 프라이머 PDM-44의 DNA 서열이다.
서열 17은 프라이머 PDM-45의 DNA 서열이다.
서열 18은 프라이머 PDM-591의 DNA 서열이다.
서열 19는 프라이머 PDM-592의 DNA 서열이다.
서열 20은 프라이머 PDM-72의 DNA 서열이다.
서열 21은 프라이머 PDM-61의 DNA 서열이다.
서열 22는 프라이머 TCR V알파-16.5'의 DNA 서열이다.
서열 23은 프라이머 TCR 알파 3'의 DNA 서열이다.
서열 24는 프라이머 TCR V베타-14.5'의 DNA 서열이다.
서열 25는 프라이머 TCR 베타 3'의 DNA 서열이다.
본 발명은 개괄적으로 암, 구체적으로 유방암의 치료 및 진단에 유용한 조성물 및 그 용도에 관한 것이다. 하기 상세히 설명되는 바와 같이, 예시되는 본 발명의 조성물은 Her-2/neu 폴리펩타이드, 특히 면역원성 폴리펩타이드, 이 폴리펩타이드들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 항체, 다른 결합제, 항원 제공 세포(APC) 및 면역계 세포(예, T 세포)를 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 실시에는 구체적인 별다른 지시가 없는한 바이러스학, 면역학, 미생물학, 분자생물학 및 재조합 DNA 기법에서 당업자에게 통상적인 방법을 이용할 수 있으며, 그 대부분은 예시적 목적으로 하기에 설명되고 있다. 이와 같은 기법들은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[참조:Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd Edition, 1989); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual(1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II(D.Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis(N.Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization(B.Hames & S.Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation(B.Hames & S.Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture(R.Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)]을 참조할 수 있다.
상기 또는 하기 기재여부를 불문하고 본 명세서에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원들은 전체적으로 참조인용된 것이다.
본 명세서 및 첨구되는 청구의 범위에 사용되는 단수형 용어는 뚜렷하게 다른 의미가 표명되어 있지 않은 이상 복수의 의미도 포함하는 것이다.
HER-2/NEU 폴리펩타이드 조성물
본 명세서에 사용된 "폴리펩타이드"라는 용어는 통상적인 의미인 아미노산의 서열로서 사용되고 있다. 폴리펩타이드는 특정 길이의 생성물만을 한정하는 것이아니며, 폴리펩타이드의 정의에는 펩타이드, 올리고펩타이드 및 단백질이 포함되고, 이 용어들은 구체적인 다른 표시가 없는 한 본 명세서에서 서로 바꿔서 사용할 수 있다. 이 용어는 또한 폴리펩타이드의 발현후 변형, 예컨대 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등은 물론 자연 발생 및 비자연 발생으로 나타나는 당해 기술분야에 공지된 다른 변형들을 배제하는 것이 아니다. 폴리펩타이드는 단백질 전체이거나 또는 이의 준서열(subsequence)일 수 있다. 본 발명에 내용 중에서 목적으로 하는 특정 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 면역원성 성질에 실질적인 역할을 하는 에피토프, 즉 항원성 결정인자를 포함하고 면역반응을 자극할 수 있는 아미노산 준서열이다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 예를 들어 증폭된 HER-2/neu유전자가 악성종양과 관련이 있는 온혈 동물 중의 악성종양에 있어서 HER-2/neu종양유전자에 의해 발현되는 단백질 생성물에 대하여 면역성을 유도하거나 향상시키는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 악성종양과 증폭된 HER-2/neu유전자의 관련성은 이 유전자의 단백질 발현 생성물이 종양 상에 존재해야만 하는 것을 요구하지는 않는다. 예를 들어, 이 단백질 발현 생성물의 과잉발현은 종양의 개시와 관련이 있는 것으로서 점차 단백질 발현이 상실될 수도 있다. 본 발명의 한 양태는 생체내에서 Her-2/neu 발현 암 세포에 대한 효과적인 면역 반응을 유도하거나 향상시키는 방법을 포함한다.
보다 구체적으로 설명하면, 한 측면에서 본 발명은 흉선 의존적 림프구(이하, "T 세포")에 의해 인식될 수 있는 HER-2/neu유전자의 단백질 발현 생성물의특정 부분을 기초로 한 폴리펩타이드(HER-2/neu폴리펩타이드)를 제공하며, 따라서 면역 T 세포 반응은 이와 같은 단백질이 과잉발현되거나 과잉발현되어온 악성종양을 치료하거나 또는 예방하는데 사용할 수 있다.
이와 관련하여 특히 바람직한 폴리펩타이드는 Her-2/neu 단백질의 ICD 영역에서 얻어지는 것으로서, 바람직하게는 서열 2에 제시된 아미노산 약 676 내지 1255 유래의 영역 일부 또는 전체를 포함하는 것이고, 보다 바람직하게는 적어도 서열 3에 제시된 자연 가공된 HLA-B44 제한된 Her-2/neu 에피토프를 포함하는 것이다.
일반적으로, CD4+ T 세포 집단은 특정 항원의 자극을 받았을 때 림포킨이 방출되면서 보조인자(helper)/유도인자(inducer)로서 작용하는 것으로 생각되나, CD4+ 세포의 서브세트는 세포독성 T 림프구(CTL)로서 작용할 수 있다. 이와 마찬가지로, CD8+ T 세포도 항원성 표적을 직접 용해시켜 작용하는 것으로 생각되지만, 다양한 환경하에서 이 T 세포는 림포킨을 분비하여 보조인자 또는 DTH 기능을 제공할 수 있다. 기능 중복의 가능성에도 불구하고 CD4와 CD8의 표현형 마커는 부류 II 또는 부류 I의 MHC 항원에 결합된 펩타이드들의 인식과 연관이 있다. 부류 II 또는 부류 I MHC와 관련하여 항원의 인식은 다른 환경하에 제시되는 동일한 항원이나 다른 항원들에 대한 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 반응을 지령한다. 부류 II MHC 항원에 대한 면역원성 펩타이드들의 결합은 항원 제공 세포들에 의해 함유된 항원들에서 가장 일반적으로 나타난다. 따라서, CD4+ T 세포는 일반적으로 종양 세포의 외부에 있는 항원들을 인식한다. 이와 반대로, 정상 환경하에서는 부류 I의 MHC에 대한 펩타이드들의 결합은 단지 세포질에 존재하고 표적 자체에 의해 합성된 단백질에 대해서만 일어나며, 외부 환경에 있는 단백질은 배제된다. 이와 같은 현상의 예외는 세포 외부에 고농도로 존재하는 정확한 부류 I 결합 모티프를 가진 외인성 펩타이드들의 결합이다. 따라서, CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포는 매우 다른 기능을 가진 것이며, 이 항원들이 정상적으로 존재하는 위치를 반영해볼 때 다른 항원들을 인식하는 경향이 있다.
본 발명에 개시된 바와 같이, HER-2/neu종양유전자에 의해 발현되는 단백질 생성물의 폴리펩타이드부는 T 세포에 의해 인식된다. HER-2/neu폴리펩타이드는 순환시 펩타이드 단편으로 분해된다. 상기 폴리펩타이드의 펩타이드 단편은 주요 조직접합성 복합체(MHC) 항원에 결합한다. 세포 표면 상의 MHC 항원에 결합된 펩타이드가 나타나고 이와 같이 조합된 펩타이드와 자가 MHC 항원을 숙주 T 세포가 인식하므로써 HER-2/neu폴리펩타이드(예를 들어, 악성 세포 상에서 발현되는 경우)는 T 세포에 대해 면역원성인 것이다. 이와 같은 T 세포 수용체의 정교한 특이성으로 인하여 각 T 세포는 하나의 아미노산 잔기 차이를 가진 펩타이드들을 구별할 수 있게 된다.
폴리펩타이드 유래의 펩타이드 단편에 대한 면역 반응 동안에 펩타이드-MHC 복합체에 대해 고친화도 결합성을 가진 T 세포 수용체를 발현하는 T 세포는 그 펩타이드-MHC 복합체에 결합하여 활성화되고 증식 유도된다. 펩타이드와 처음 만나면, 몇몇 면역 T 세포는 림포킨을 분비하고, 증식한 뒤 작동인자(effector)와 기억 T 세포로 분화한다. 1차 면역 반응은 생체내에서 일어나는 바 시험관내에서 측정하기가 어려웠다. 이후 기억 T 세포가 동일한 항원과 만나면 보다 빠르고 보다 강력한 면역 반응을 유도한다. 2차 반응은 생체내 또는 시험관내에서 일어날 수 있다. 시험관내 반응은 증식율이나, 사이토킨 생성율, 또는 항원에 재노출된 T 세포 집단의 세포용해 활성의 발생을 측정하므로써 쉽게 평가된다. 특정 항원에 대한 반응으로 T 세포 집단이 실질적으로 증식한다는 것은 그 항원에 이미 노출되었거나 초회항원자극된 바 있음을 나타내는 것으로 생각된다.
본 발명의 특정 화합물은 일반적으로 상기 펩타이드의 발현을 유도하며, DNA 분자가 바이러스 또는 다른 전달 벡터에 존재할 수 있는 HER-2/neu폴리뉴클레오타이드 분자를 포함한다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드는 면역 반응을 자극하는 성질을 보유하는 변형체를 포함한다. 이와 같은 변형체는 천연 폴리펩타이드의 다양한 구조 형태를 포함한다. 이온성 아미노기와 카복실기의 존재로 인하여, 예를 들어 HER-2/neu폴리펩타이드는 산성염 또는 염기성염의 형태이거나 중성 형태일 수 있다. 각 아미노산 잔기는 또한 산화 또는 환원에 의해 변형될 수 있다.
또한, 본 발명은 글리코실화되거나 글리코실화되지 않은 HER-2/neu폴리펩타이드를 포함한다. 효모 또는 포유동물 발현계에서 발현된 폴리펩타이드는 발현계에 따라 천연 분자와 비교하여 분자량과 글리코실화 패턴이 유사하거나 약간 상이할 수 있다. 예를 들어, 이. 콜리과 같은 세균에서 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA의 발현은 일반적으로 비글리코실화된 분자를 제공한다. 진핵세포 단백질의 N-글리코실화 부위는 아미노산 3중자 Asn-A1-Z (여기에서, A1은 Pro를 제외한 모든 아미노산이고, Z는 Ser 또는 Thr이다)으로 특징지워진다. N-글리코실화 부위가 불활성화된 HER-2/neu폴리펩타이드의 변형체는 당업자에게 공지된 기법, 예를 들어 올리고뉴클레오타이드 합성 및 연결 또는 부위 특이적 돌연변이유발법 등으로 만들 수 있고, 본 발명의 범위에 속하는 것이다. 또는, N-결합된 글리코실화 부위가 HER-2/neu폴리펩타이드에 첨가될 수도 있다.
HER-2/neu폴리펩타이드는 일반적으로 이 단백질을 암호화하는 게놈이나 cDNA 클론을 사용하여 수득할 수 있다. 전장의 HER-2/neu를 암호화하는 게놈 서열은 서열 1에 제시하였으며, 이로부터 추론되는 아미노산 서열은 서열 2에 제시하였다. 이와 같은 클론들은 HER-2/neu단백질을 발현하는 클론들에 대해 적당한 발현 라이브러리를 선별하여 분리할 수 있다. 라이브러리의 제조와 선별은 일반적으로 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있으며, 이 방법들은 예를 들어 본 명세서에 참고인용된 문헌[참조:Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]에 기술되어 있다. 간략히 설명하면, 박테리오파아지 발현 라이브러리를 평판배양하여 필터로 전이시킬 수 있다. 그 다음, 필터를 검출 시약과 항온처리한다. 이러한 내용의 본 발명에 있어서, "검출 시약"은 HER-2/neu단백질에 결합할 수 있는 모든 화합물을 의미하며, 이 검출 시약은 당업자에게 공지된 다양한 방법 중 어떤 방법에 의해서도 검출될 수 있는 것이다. 일반적으로 검출 시약은 리포터 기에 결합된 단백질 A, 단백질 G, IgG 또는 렉틴와 같은 "결합제"를 포함한다. 바람직한 리포터 기로는 효소, 기질, 보조인자(cofactor), 억제제, 염료, 방사능핵종, 발광기, 형광기 및 바이오틴을 포함한다. 보다 바람직하게는, 리포터 그룹은 테트라메틸벤지딘 또는 2,2'-아지노-디-3-에틸벤즈-티아졸린 설폰산과 같은 기질과 항온처리하여 검출할 수 있는 양고추냉이 퍼옥시다제이다. HER-2/neu단백질을 발현하는 게놈 또는 cDNA 서열을 함유하는 플라크는 당업자에게 공지된 기법으로 분리 및 정제한다. 적당한 방법은, 예를 들어 문헌[참조:Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]에 기술되어 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명의 폴리펩타이드 조성물은 또한 본 발명의 폴리펩타이드, 구체적으로 본 명세서에 개시된 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드 또는 이의 면역원성 단편이나 변형체에 대하여 발생된 T 세포 및/또는 항체들과 면역학적으로 반응성인 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 명세서에 기술된 하나 이상의 폴리펩타이드, 또는 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드 서열에 함유된 인접 핵산 서열에 의해 암호화된 하나 이상의 폴리펩타이드, 또는 이의 면역원성 단편이나 변형체, 또는 보통 내지 높은 엄중(stringency) 조건하에 상기 하나 이상의 서열에 하이브리드화하는 하나 이상의 핵산 서열과 면역학적으로 반응성인 T 세포 및/또는 항체를 유도할 수 있는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명은 또 다른 측면으로서, 본 명세서에 기술된 폴리펩타이드의 적어도 약 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 50개 또는 100개의 인접 아미노산 또는 그 이상(이들의 중간 길이도 모두 포함함)의 인접 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드 단편,예를 들어 서열 2 내지 3, 8 내지 11 및 14와 15에 제시된 폴리펩타이드 단편 또는 서열 1, 4 내지 7 및 12와 13에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 서열을 제공한다.
또 다른 측면으로서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 폴리펩타이드 조성물의 변형체를 제공한다. 본 발명에 포함되는 폴리펩타이드 변형체는 일반적으로 본 명세서에 제시된 폴리펩타이드 서열과 그 길이를 따라 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일성(하기 기술되는 바와 같이 측정됨)을 나타내는 것이다.
바람직한 한 양태로서, 본 발명에 의해 제공되는 폴리펩타이드 단편 및 변형체는 본 명세서에 구체적으로 제시된 폴리펩타이드와 반응하는 항체 및/또는 T 세포와 면역학적으로 반응한다.
본 명세서에 사용된 폴리펩타이드 "변형체"라는 용어는 일반적으로 본 명세서에 구체적으로 개시된 폴리펩타이드와 하나 이상의 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입으로 차이가 있는 폴리펩타이드이다. 이와 같은 변형체는 자연발생적이거나 또는 예를 들어 전술한 본 발명의 폴리펩타이드 서열 중 하나 이상을 변형시키고 당해 기술분야에 공지된 다양한 기법을 사용하거나(사용하여) 본 명세서에 기술된 바와 같이 면역원성 활성을 평가하여 합성적으로 만들 수도 있다.
예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드 변형체의 특정 예로는 하나 이상의 일부, 예를 들어 N-말단 리더 서열 또는 경막 도메인이 제거된 것을 포함한다. 다른 변형체 예로는 작은 일부(예, 1개 내지 30개 아미노산, 바람직하겐느 5개 내지 15개 아미노산)가 성숙 단백질의 N 및/또는 C-말단으로부터 제거된 변형체를 포함한다.
대부분 변형체는 보존적 치환을 포함하고 있다. "보존적 치환"이란 아미노산이 펩타이드 화학 기술 분야의 숙련된자가 폴리펩타이드의 2차 구조와 수치료성이 실질적으로 변화되지 않을 것으로 예상할 수 있는 유사한 성질을 가진 다른 아미노산으로 치환된 것을 의미한다. 전술한 바와 같이, 변형은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 폴리펩타이드의 구조에 이루어지는 바, 목적하는 특성, 예를 들어 면역원성 특성이 있는 변형체 또는 유도체 폴리펩타이드를 암호화하는 기능성 분자를 수득할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드와 동등하거나 또는 심지어 향상된 면역원성 변형체 또는 그 일부를 얻기 위하여 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변형시킬 필요가 있는 경우에는 당업자는 일반적으로 표 1에 기재된 암호화 DNA 서열의 하나 이상의 코돈을 변화시킬 수 있다.
예를 들어, 특정 아미노산은 기질 분자 상의 결합 부위 또는 항체의 항원 결합 영역 등과 같은 구조들과 상호작용성 결합력의 인지할 수 있는 상실 없이 단백질 구조에서 다른 아미노산 대신 치환될 수 있다. 그 단백질의 생물학적 기능적 활성을 나타내는 단백질의 상호작용적 능력과 성질이 있다면 단백질 서열은 물론 이의 기본 DNA 암호 서열에 특정 아미노산 서열의 치환이 이루어질 수 있으며, 그럼에도 불구하고 유사한 성질을 가진 단백질이 얻어질 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 조성물의 펩타이드 서열이나 이 펩타이드를 암호화하는 상응하는 DNA 서열에는 생물학적 용도 또는 활성에 인지할 수 있는 상실 없이 다양한 변화가 이루어질 수 있다.
이와 같은 변화를 만들 때, 아미노산의 수치료 지수가 고려되어야 한다. 단백질에 상호작용성 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 수치료성 아미노산 지수의 중요성은 당해 기술분야에 널리 알려져 있다(참고 인용되는 문헌 Kyte and Doolittle, 1982 참조). 아미노산의 상대적인 수치료 특성은 최종 단백질의 2차 구조에 기여하여 결과적으로 그 단백질과 다른 분자, 예를 들어 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등의 상호작용을 나타내는 것으로 인정되고 있다. 각 아미노산의 수치료 지수는 소수성과 전하 특성에 기초하여 결정되어진다(Kyte and Doolittle, 1982). 그 값은 다음과 같다: 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
특정 아미노산은 수치료 지수 또는 값이 유사한 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 그 결과 생물학적 활성이 유사한 단백질, 즉 생물학적 기능적 등가 단백질을 얻을 수 있다는 것은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 이와 같은 변화를 만들 때, 수치료 지수가 ±2 이내인 아미노산으로의 치환이 바람직하고, 특히 ±1 이내인 아미노산으로의 치환이 더 바람직하며, ±0.5 이내인 아미노산으로의 치환이 특히 더 바람직하다. 또한, 당업자라면 유사한 아미노산의 치환이 친수성에 기초하여 효과적으로 실시될 수 있다는 것을 잘 알고 있을 것이다. 미국 특허 제4,554,101호(그 전체적으로 본 발명에 구체적으로 참고인용됨)는 인접 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 경우 단백질의 최대 국소 평균 친수성이 단백질의 생물학적 성질과 상호관련이 있음을 기술하고 있다.
미국 특허 제4,554,101호에 기술된 바와 같이, 아미노산 잔기마다 할당된 친수성 값은 다음과 같다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파테이트(+3.0±1);글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 즉, 아미노산은 친수성 값이 유사한 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 생물학적 등가, 특히 면역학적으로 등가인 단백질을 만들 수 있다. 이러한 변화에서, 친수성 값이 ±2 범위내인 아미노산으로의 치환이 바람직하고, 특히 ±1 범위내의 아미노산으로의 치환이 더 바람직하며, ±0.5 범위내의 아미노산으로의 치환이 더욱 더 바람직하다.
간략히 전술한 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환체의 상대적 유사성, 예를 들어 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 이와 같은 다양한 특징을 고려한 치환의 예는 당해 기술분야에 잘 알려져 있고, 그 예로는 아르기닌과 라이신; 글루타메이트와 아스파테이트; 세린과 트레오닌; 글루타민과 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신이 있다.
또한, 폴리뉴클레오타이드는 생체내 안정성을 증가시키기 위한 추가 변형을 실시할 수 있다. 가능한 변형으로는, 5' 및/또는 3' 말단에 인접한 서열의 첨가; 주쇄에 포스포디에스테라제 결합보다는 포스포로티오에이트 또는 2' O-메틸 결합의 이용; 및/또는 이노신, 퀘오신 및 위부토신과 같은 비통상적인 염기는 물론 아세틸, 메틸, 티오 및 다른 변형된 형태의 아데닌, 시티딘, 구아닌, 티민 및 우리딘의 내포가 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
아미노산 치환은 또한 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는양친매성의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음전하의 아미노산으로는 아스파르트산과 글루탐산이 있고, 양전하의 아미노산으로는 라이신과 아르기닌이 있으며, 친수성값이 유사한 전하를 띠지 않은 극성 헤드기를 가진 아미노산으로는 류신, 이소류신 및 발린; 글리신과 알라닌; 아스파라긴과 글루타민; 및 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 타이로신이 있다. 보존적 변화를 나타낼 수 있는 아미노산의 다른 그룹으로는 (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; (5) phe, tyr, trp, his 이 있다. 변형체는 또한, 또는 양자택일로 비보존적 변화를 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 변형 폴리펩타이드는 천연 서열과 5개 아미노산 또는 그 이하의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 차이가 있는 것이 좋다. 변형체는 또한(또는 양자택일로) 예를 들어 폴리펩타이드의 면역원성, 2차 구조 및 수치료 특성에 최소 영향을 미치는 아미노산의 결실이나 첨가에 의해 변형될 수 있다.
전술한 바와 같이, 폴리펩타이드는 단백질의 N-말단에 시그날(또는 리더) 서열을 포함할 수 있어, 해독과 동시에 또는 해독 후 단백질의 전이를 유도할 수 있다. 이 폴리펩타이드는 또한 폴리펩타이드의 합성, 정제 또는 동정을 용이하게 하거나 폴리펩타이드의 고체 지지체에 대한 결합을 향상시키기 위하여 링커 또는 다른 서열에 접합시킬 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 면역글로불린 Fc 영역에 접합될 수 있다.
폴리펩타이드 서열을 비교할 때, 두 서열 중의 아미노산 서열이 하기 기재되는 바와 같이 최대 상응성이 나타나게 정렬시켰을 때 동일한 경우에는 "동일성"이 있는 것이라 할 수 있다. 두 서열간의 비교는 일반적으로 비교창 상의 서열을 비교하여 서열 유사성이 있는 국소 영역들을 동정하고 비교함으로써 실시한다. 본 명세서에 사용된 "비교창"이란 용어는 약 20개 이상의 인접 위치의 단편, 보통 30개 내지 약 75개, 40개 내지 약 50개의 단편을 의미하는 것으로, 두 서열을 적당하게 정렬시킨 후 서열을 동일한 수의 인접 위치의 참조 서열과 비교할 수 있다.
비교 서열들의 최적의 정렬은 디폴트(default) 변수를 사용하여 메갈라인 프로그램(Lasergene suite of bioinformatics software(DNASTAR, Inc., Madison, WI)을 사용하여 실시할 수 있다. 이 프로그램은 다음과 같은 참조문헌에 기술된 몇몇 정렬도를 구체화한 바 있다: Dayhoff, M.O.(1978) A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships; In Dayhoff, M.O.(ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC. Vol.5, Suppl.3, pp.345-358; Hein J.(1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol.183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M.(1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W.(1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D.(1971) Comb.Theor 11:105; Saitou, N.Nei, M.(1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R.(1973) Numerical Taxonomy- the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur,W.J. and Lipman, D.J.(1983) Proc.Natl.Acad., Sci.USA 80:726-730.
또는, 비교 서열들의 최적 정렬은 문헌[참조:Smith and Waterman(1981) Add.APL. Math 2:482]에 기술된 국소 동일성 알로리듬, 문헌[참조:Needleman and Wunsch(1970) J.Mol.Biol. 48:443]에 기술된 동일성 정렬 알고리듬, 문헌[참조:Pearson and Lipman(1988) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:2444]에 기술된 유사성 방법에 대한 연구, 이들 알고리듬(GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA; Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group(GCG), 575 Science Dr., Madison, WI)의 전산 처리 또는 검색으로 수행할 수 있다.
서열 동일성% 및 서열 유사성%를 측정하는데 적합한 알고리듬 중 바람직한 일예는 문헌[참조:Altschul et al.(1977) Nucl.Acids Res. 25:3389-3402 및 Altschul et al.(1990) J,Mol.Biol. 215:403-410]에 각각 기술되어 있는 BLAST 알고리듬과 BLAST 2.0 알고리듬이다. BLAST 및 BLAST 2.0은 본 명세서에 기술된 변수들과 함께 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 서열 동일성%를 측정하는데 사용할 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 용이하게 입수할 수 있다. 아미노산 서열의 경우에는 득점 매트릭스를 사용하여 누적값을 계산할 수 있다. 누적된 정렬 값이 최대 값 보다 X만큼 떨어지거나, 하나 이상의 마이너스 값의 잔기 정렬들의 축적으로 인하여 누적값이 0 또는 그 이하가 되거나 또는 어느 한 서열의 말단에 도달하게 되면 각 방향으로 진행되는 단어 적중의 전개를 중지시킨다. BLAST 알고리듬 변수 W, T 및 X는 정렬의 민감도와 속도를 결정한다.
바람직한 하나의 방법으로서, "서열 동일성 %"는 20개 위치 이상의 비교 창에 있는 2개의 적절하게 정렬된 서열을 비교하여 측정한다. 이 때 비교 창에 있는 폴리펩타이드 서열의 일부는 두 서열을 최적으로 정렬시키기 위하여 대조 서열(즉, 첨가나 결실을 포함하지 않는 서열)과 비교했을 때 20% 이하, 보통 5 내지 15%, 또는 10 내지 12%의 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 동일성 %는 두 서열에 존재하는 동일한 아미노산 잔기의 위치의 수를 측정하여 정합 위치의 수를 얻고, 이 정합 위치의 수를 대조 서열의 위치의 총 수(즉, 창 크기)로 나눈 뒤, 그 결과값에 100을 곱하여 서열 동일성 %를 얻는다.
예시적인 다른 양태로서, 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 복수의 폴리펩타이드를 포함하거나 본 명세서에 기재된 하나 이상의 폴리펩타이드와 공지의 종양 단백질과 같은 무관련 서열을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 융합 파트너는 예를 들어 T 헬퍼 에피토프(면역학적 융합 파트너), 바람직하게는 사람에 의해 인식되는 T 헬퍼 에피토프를 제공하는데 도움을 주거나 또는 천연의 재조합 단백질 보다 높은 수율로 단백질(발현 인핸서)을 발현시키는데 도움을 줄 수 있다. 바람직한 특정 융합 파트너는 면역학 및 발현 양자를 모두 향상시키는 융합 파트너이다. 또한, 폴리펩타이드가 목적하는 세포내 구획으로 표적화될 수 있도록 하거나 폴리펩타이드의 용해성을 증가시키기 위하여 다른 융합 파트너를 선택할 수도 있다. 또 다른 융합 파트너로는 폴리펩타이드의 정제를 용이하게 하는 친화성 태그를 포함한다.
융합 폴리펩타이드는 일반적으로 화학적 접합을 비롯한 표준 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 바람직하게는, 융합 폴리펩타이드는 발현계에서 비융합된 폴리펩타이드에 비하여 생산 함량이 증가된 재조합 폴리펩타이드로서 발현되는 것이 좋다. 간략히 설명하면, 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 DNA 서열은 각각 조합되어 적당한 발현 벡터에 결합될 수 있다. 제1 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 DNA 서열의 3' 말단이 제2 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 DNA 서열의 5' 말단에 펩타이드 링커의 존부를 불문하고 서열의 판독 프레임이 유지되는 상태로 결합된다. 이와 같이 하면, 두 폴리펩타이드 성분의 생물학적 활성을 보유하는 하나의 융합 폴리펩타이드로 해독될 수 있다.
펩타이드 링커 서열은 각각의 폴리펩타이드가 자신의 2차 및 3차 구조로 접힐 수 있는 충분한 거리를 두고 제1 폴리펩타이드 성분과 제2 폴리펩타이드 성분을 분리시키는데 사용할 수 있다. 이와 같은 펩타이드 링커 서열은 당해 기술분야에 공지된 표준 기법을 사용하여 융합 폴리펩타이드에 포함시킨다. 적합한 펩타이드 링커 서열은 다음과 같은 요인에 근거하여 선택할 수 있다: (1) 유연하게 전개된 입체적 구조를 형성할 수 있는 능력; (2) 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드 상의 기능적 에피토프들과 상호작용할 수 있는 2차 구조를 형성하지 않는 성질; (3) 폴리펩타이드 기능성 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 잔기 또는 전하를 띤 잔기의 부족. 바람직한 펩타이드 링커 서열로는 Gly, Asn 및 Ser 잔기가 있다. 다른 중성 부근의 아미노산인 Thr 및 Ala도 링커 서열에 사용될 수 있다. 링커로서 유용하게 이용될 수 있는 아미노산 서열로는 문헌[참조:Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8258-8262, 1986; 미국 특허 제4,935,233호 및 미국 특허 제4,751,180호]에 개시된 것을 포함한다. 링커 서열은 일반적으로 아미노산 길이가 1 내지 약 50개일 수 있다. 링커 서열은 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드가 기능적 도메인을 분리하여 입체 장애를 방지할 수 있는데 사용할 수 있는 비필수 N-말단 아미노산 영역을 가진 경우에는 필요하지 않다.
결합된 DNA 서열은 적합한 전사 또는 해독 조절 인자에 작동가능하게 결합된다. DNA의 발현에 중요한 역할을 하는 조절 인자는 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열의 5'측에만 위치한다. 이와 마찬가지로, 해독을 종결시키는데 필요한 종결 코돈 및 전사 종결 시그날은 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열의 3' 측에만 존재한다.
융합 폴리펩타이드는 관련이 없는 면역원성 단백질, 예를 들어 조회 반응을 유도할 수 있는 면역원성 단백질과 함께 본 명세서에 기술된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 이와 같은 단백질의 예로는 파상풍, 결핵균 및 간염 단백질을 포함한다[예를 들어, Stoute et al. New Engl.J.Med., 336: 86-91, 1997].
바람직한 한 양태로서, 면역학적 융합 파트너는 마이코박테리아 종 유래의 것, 예를 들어 인형결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 유래의 Ra12 단편일 수 있다. 이종 폴리뉴클레오타이드/폴리펩타이드 서열의 발현 및/또는 면역원성을 향상시키는데 사용하기 위한 Ra12 조성물 및 이의 사용 방법에 대해서는 그 전체 내용이 본 발명에 참고인용되는 미국 특허 출원번호 60/158,585호에 설명되어 있다. 간략히 설명하면, Ra12는 인형결핵균 MTB32A 핵산의 준서열인 폴리뉴클레오타이드 영역을 의미한다. MTB32A는 인형결핵균의 독성 균주 및 무독성 균주 중의 유전자에 의해 암호화된 32KD 분자량의 세린 프로테아제이다. MTB32A의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은 문헌[참조:예를 들어, 미국 특허 출원번호 60/158,585호; Skeiky et al., Infection and Immun.(1999) 67:3998-4007, 본 발명에 참고인용됨]에 제시되어 있다. MTB32A 암호 서열의 C-말단 단편은 다량으로 발현하여 정제 과정을 통해 용해성 폴리펩타이드로서 남아 있는다. 더욱이, Ra12는 여기에 융합된 이종의 면역원성 폴리펩타이드의 면역원성을 향상시킬 수 있다. 바람직한 Ra12 융합 폴리펩타이드의 하나는 MTB32A의 아미노산 잔기 192 내지 323에 상응하는 14KD C-말단 단편을 포함하는 것이다. 다른 바람직한 Ra12 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 Ra12 폴리펩타이드의 일부를 암호화하는 약 15개 이상의 연속 뉴클레오타이드, 약 30개 이상의 뉴클레오타이드, 약 60개 이상의 뉴클레오타이드, 약 100개 이상의 뉴클레오타이드, 약 200개 이상의 뉴클레오타이드 또는 약 300개 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. Ra12 폴리뉴클레오타이드는 천연 서열(즉, Ra12 폴리펩타이드 또는 이의 일부를 암호화하는 내인성 서열)을 포함하거나 또는 이러한 서열의 변형체를 포함할 수 있다. Ra12 폴리뉴클레오타이드 변형체는 암호화된 융합 폴리펩타이드의 생물학적 활성이 천연의 Ra12 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드에 비하여 실질적으로 감소되지 않는 정도의 하나 이상의 치환, 첨가, 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 변형체는 바람직하게는 천연의 Ra12 폴리펩타이드 또는 이의 일부를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 동일성을 나타내는 것이좋다.
다른 바람직한 양태로서, 면역학적 융합 파트너는 그람 음성 세균인 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenza) B의 표면 단백질인 단백질 D(WO 91/18926)에서 유래하는 것이다. 바람직하게는, 단백질 D 유도체는 이 단백질의 대략 처음 1/3(즉, 처음 N-말단의 100 내지 110개 아미노산)을 포함하는 것이 좋으며 단백질 D 유도체는 지질화될 수 있다. 바람직한 특정 양태로서, N-말단 상에 리포단백질 D 융합 파트너의 처음 109개 잔기를 포함하여 추가 외인성 T-세포 에피토프를 갖고 이. 콜리에서의 발현량이 증가된(즉, 발현 인핸서) 폴리펩타이드를 제공할 수 있다. 지질 꼬리는 항원 제공 세포에 대하여 항원의 최적 제시에 도움을 준다. 다른 융합 파트너로는 독감 바이러스인 NS1 유래의 비구조 단백질(헤마글루티닌)을 포함한다. 일반적으로, T-헬퍼 에피토프를 포함하는 다른 단편들도 사용될 수 있지만 N-말단의 81개 아미노산이 사용된다.
또 다른 양태에서, 면역학적 융합 파트너는 LYTA로 알려진 단백질이나 또는 이의 일부(바람직하게는 C-말단 일부)이다. LYTA는 아미다제 LYTA로 알려진 N-아세틸-L-알라닌 아미다제(LytA 유전자에 의해 암호화됨; Gene 43: 265-292, 1986)를 합성하는 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)에서 유래하는 것이다. LYTA는 펩티도글리칸 주쇄 중의 특정 결합을 특이적으로 분해하는 자기분해제이다. LYTA 단백질의 C-말단 도메인은 콜린이나 DEAE와 같은 일부 콜린 유사체에 대한 친화성에 주요 역할을 한다. 이와 같은 성질은 융합 단백질의 발현에 유용한 이. 콜리 C-LYTA 발현 플라스미드의 개발에 이용된 바 있다. 아미노 말단에 C-LYTA단편을 함유하는 하이브리드 단백질의 정제에 대해서도 개시된 바 있다(Biotechnology 10:795-798, 1992). 바람직한 양태로서, LYTA의 반복 부분을 융합 폴리펩타이드에 포함시킬 수 있다. 반복 부분은 잔기 178에서 시작하는 C-말단 영역에서 발견된다. 특히 바람직한 반복 부분은 잔기 188 내지 305를 포함하는 것이다.
또 다른 예시적 양태는 융합 파트너가 미국 특허 제5,633,234호에 기술된 바와 같은 엔도솜/리소좀 구획으로 폴리펩타이드를 유도할 수 있는 표적 시그날을 포함하는 융합 폴리펩타이드 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이와 같은 표적 시그날과 융합된 경우 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드는 MHC 부류 II 분자와 보다 효율적으로 결합하여, 이 폴리펩타이드에 특이적인 CD4+T-세포의 세포내 자극을 향상시킨다.
본 발명의 폴리펩타이드는 다양한 공지의 합성 및/또는 재조합 기법을 사용하여 제조하며, 재조합 기법에 대해서는 이하 보다 상세하게 설명된다. 일반적으로 약 150개 미만의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드, 그 일부 및 다른 변형체는 당업자에게 공지된 기법을 사용하여 합성법으로 제조할 수 있다. 예시적 일 예로서, 이러한 폴리펩타이드는 아미노산을 성장하는 아미노산쇄에 연속적으로 첨가하는 메리필드 고상 합성법과 같은 상용화된 고상 기법을 사용하여 합성한다[Merrifield, J.Am.Chem.Soc. 85:2149-2146, 1963]. 폴리펩타이드의 자동 합성 장치는 퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템스 디비젼(Foster City, CA)과 같은 공급회사들로부터 구매할 수 있으며, 제조자의 지시에 따라 작동시킬 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 폴리펩타이드 조성물(예를 들어, 융합 폴리펩타이드)은 분리된 것이다. "분리된" 폴리펩타이드는 본래 환경에서 분리된 것이다. 예를 들어, 자연 발생의 단백질 또는 폴리펩타이드는 자연계에 공존하는 물질 일부 또는 전체로부터 독립된 것이라면 분리된 것이다. 바람직하게는, 이와 같은 폴리펩타이드는 정제되기도 하는데, 예를 들어 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 99% 이상 정제된 것이 좋다.
폴리뉴클레오타이드 조성물
본 발명은 다른 측면으로서 Her-2/neu 폴리뉴클레오타이드 조성물을 제공한다. "DNA"와 "폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 특정 종의 총 게놈 DNA으로부터 분리된 DNA 분자를 의미하는 것으로, 본 명세서에서는 대부분 서로 바꾸어가며 사용되고 있다. 본 명세서에 사용된 "분리된"이란 폴리뉴클레오타이드가 다른 암호 서열로부터 실질적으로 독립되어 있고, DNA 분자가 무관련 암호 DNA, 예를 들어 큰 염색체 단편이나 다른 기능적 유전자 또는 폴리펩타이드 암호 영역 등을 대부분 포함하지 않는 것을 의미한다. 물론, 이 용어는 본래 분리된 자체의 DNA 분자를 의미하지만, 인위적으로 분절에 이후 첨가된 유전자 또는 암호 영역을 배제하는 것은 아니다.
당업자에게는 자명하듯이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 조성물은 게놈 서열, 게놈외 서열 및 플라스미드 암호 서열 및 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 등을 발현하거나 발현하도록 조작된 것일 수 있는 이보다 작은 조작된 유전자 단편을포함할 수 있다. 이와 같은 단편은 자연에서 분리되거나 인위적으로 합성 변형된 것일 수 있다.
또한, 당업자에게 자명하듯이 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 일본쇄(암호 또는 안티센스) 또는 이본쇄일 수 있고, DNA 분자(게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 포함하고 1 대 1 방식으로 DNA 분자에 상응하는 HnRNA 분자 및 인트론을 포함하지 않는 mRNA 분자를 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에는 추가 암호 서열 또는 비암호 서열이 포함될 수 있지만 반드시 필요한 것은 아니며, 폴리뉴클레오타이드는 다른 분자 및/또는 지지체 물질에 결합될 수 있지만, 반드시 결합될 필요는 없다.
폴리뉴클레오타이드는 천연 서열(즉, 본 발명의 폴리펩타이드/단백질 또는 그 일부를 암호화하는 내인성 서열)을 포함하거나 이와 같은 서열의 변형체 또는 유도체, 바람직하게는 면역원성 변형체 또는 유도체를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 측면으로서, 서열 1, 4 내지 7 및 12와 13에 제시된 폴리뉴클레오타이드 일부 또는 전체, 서열 1, 4 내지 7 및 12와 13에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열의 상보체, 및 이의 축퇴성 변형체를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 조성물을 제공한다. 바람직한 특정 양태로서, 본 명세서에 제시된 Her-2/neu 폴리뉴클레오타이드 서열은 Her-2/neu 단백질의 ICD 영역의 면역원성 에피토프 서열, 바람직하게는 서열 3에 제시된 에피토프 서열을 암호화하는 것이다.
다른 관련 양태로서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 서열과 실질적인 동일성이 있는 폴리뉴클레오타이드 변형체, 예를 들어 본 명세서에 기술된 방법(예를 들어, 하기 기술되는 표준 변수를 사용하는 BLAST 분석법)을 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열과 비교했을 때 서열 동일성이 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상인 서열을 포함하는 변형체를 제공한다. 당업자라면, 이와 같은 수치는 두 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 단백질의 상응하는 동일성을 나타내기 위하여 코돈 축퇴성, 아미노산 유사성, 판독 프레임 위치조정 등을 고려하여 적절하게 조정할 수 있는 것임을 잘 알고 있을 것이다.
일반적으로, 폴리뉴클레오타이드 변형체는 하나 이상의 치환, 첨가, 결실 및/또는 삽입을, 바람직하게는 변형체 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 면역원성이 본 명세서에 구체적으로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 비하여 유의적으로 감소되지 않을 정도로 포함하는 것이 좋다. "변형체"란 용어는 또한 이종 기원의 상동성 유전자를 포함하는 것으로 이해해야 한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 서열 중 하나 이상과 동일하거나 상보성인 다양한 길이의 인접 서열 신장부를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편을 제공한다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 하나 이상의 서열의 적어도 약 10개, 15개, 20개, 30개, 40개, 50개, 75개, 100개, 150개, 200개, 300개, 400개, 500개 또는 1000개 또는 그 이상의 인접 뉴클레오타이드는 물론 이 사이의 중간 길이의 서열을 모두 포함하는 폴리뉴클레오타이드도 제공한다. 본 내용에서 "중간 길이"란 인용된 수치 사이의 모든 길이, 예를 들어, 16, 17, 18, 19 등; 21, 22, 23 등; 30, 31, 32 등; 50, 51, 52, 53 등; 100, 101, 102, 103 등; 150, 151, 152, 153 등; 200 내지 500, 500 내지 1000 등에 속하는 모든 정수에 속하는 모든 길이를 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 명세서에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편이나 이의 상보성 서열과 중간 내지 높은 엄중 조건하에 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 조성물을 제공한다. 하이브리드화 기법은 분자생물학 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예시적인 것으로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 다른 폴리뉴클레오타이드와의 하이브리드화를 시험하기에 적합한 중간 엄중 조건은 5XSSC, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA(pH 8.0) 용액으로 예비세척하는 단계; 50 내지 60℃에서 5XSSC 하에 하룻밤동안 하이브리드화하는 단계; 그 다음 65℃에서 20분 동안 각각 0.1% SDS를 함유하는 2X, 0.5X 및 0.2X SSC로 각각 2회씩 세척하는 단계를 포함하는 것이다. 당업자라면, 하이브리드화의 엄중도는 하이브리드화 용액의 염 함량 및/또는 하이브리드화가 수행되는 온도를 변화시키는 등의 방법으로 용이하게 조작될 수 있음을 잘 알고 있을 것이다. 예를 들어, 다른 양태로서, 적합한 높은 엄중한 하이브리드화 조건은 하이브리드화 온도를 예를 들어 60 내지 65℃ 또는 65 내지 70℃로 증가시키는 것을 제외하고는 전술한 바와 같다.
바람직한 특정 양태로서, 전술한 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드 변형체, 단편 및 하이브리드화 서열은 본 명세서에 구체적으로 기술된 Her-2/neu 폴리펩타이드 서열과 면역학적으로 교차반응성인 폴리펩타이드를 암호화한다. 다른 바람직한 양태에서,이와 같은 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 구체적으로 제시된 폴리펩타이드의 면역원성 활성의 약 50% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 수준을 보유하는 폴리펩타이드를 암호화한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 단편은 암호 서열 자체의 길이에 관계없이 그 전체 길이를 상당히 변화시킬 수 있는 다른 DNA 서열, 예를들어 프로모터, 폴리아데닐화 시그날, 추가 제한효소 부위, 다중 클로닝 부위, 다른 암호 단편 등과 조합될 수 있다. 따라서, 거의 어떤 길이의 핵산 단편도 이용할 수 있으며, 전체 길이는 사용하고자 하는 재조합 DNA 프로토콜에서의 제조와 사용의 용이성에 의해서만 제한된다. 예를 들어, 전체 길이가 약 10,000, 약 5000, 약 3000, 약 2000, 약 1000, 약 500, 약 200, 약 100, 약 50염기쌍(그 중간 길이도 모두 포함해서)인 예시적인 폴리뉴클레오타이드 단편은 본 발명의 많은 실시에 유용한 것으로 생각된다.
폴리뉴클레오타이드 서열을 비교할 때, 두 서열 중의 뉴클레오타이드 서열이 하기 기재되는 바와 같이 최대 상응성이 나타나게 정렬시켰을 때 동일한 경우에는 "동일성"이 있는 것이라 할 수 있다. 두 서열간의 비교는 일반적으로 비교창 상의 서열을 비교하여 서열 유사성이 있는 국소 영역들을 동정하고 비교함으로써 실시한다. 본 명세서에 사용된 "비교창"이란 용어는 약 20개 이상의 인접 위치의 단편, 보통 30개 내지 약 75개, 40개 내지 약 50개의 단편을 의미하는 것으로, 두 서열을 적당하게 정렬시킨 후 서열을 동일한 수의 인접 위치의 참조 서열과 비교할 수 있다.
비교 서열들의 최적의 정렬은 디폴트(default) 변수를 사용하여 메갈라인 프로그램(Lasergene suite of bioinformatics software(DNASTAR, Inc., Madison, WI)을 사용하여 실시할 수 있다. 이 프로그램은 다음과 같은 참조문헌에 기술된 몇몇 정렬도를 구체화한 바 있다: Dayhoff, M.O.(1978) A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships; In Dayhoff, M.O.(ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC. Vol.5, Suppl.3, pp.345-358; Hein J.(1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol.183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M.(1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W.(1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D.(1971) Comb.Theor 11:105; Santou, N.Nes, M.(1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R.(1973) Numerical Taxonomy- the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur,W.J. and Lipman, D.J.(1983) Proc.Natl.Acad., Sci. USA 80:726-730.
또는, 비교 서열들의 최적 정렬은 문헌[참조:Smith and Waterman(1981) Add.APL. Math 2:482]에 기술된 국소 동일성 알로리듬, 문헌[참조:Needleman and Wunsch(1970) J.Mol.Biol. 48:443]에 기술된 동일성 정렬 알고리듬, 문헌[참조:Pearson and Lipman(1988) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:2444]에 기술된유사성 방법에 대한 연구, 이들 알고리듬(GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA; Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group(GCG), 575 Science Dr., Madison, WI)의 전산 처리 또는 검색으로 수행할 수 있다.
서열 동일성% 및 서열 유사성%를 측정하는데 적합한 알고리듬 중 바람직한 일예는 문헌[참조:Altschul et al.(1977) Nucl.Acids Res. 25:3389-3402 및 Altschul et al.(1990) J,Mol.Biol. 215:403-410]에 각각 기술되어 있는 BLAST 알고리듬과 BLAST 2.0 알고리듬이다. BLAST 및 BLAST 2.0은 본 명세서에 기술된 변수들과 함께 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 서열 동일성%를 측정하는데 사용할 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 용이하게 입수할 수 있다. 예시적 일 예로, 뉴클레오타이드 서열에 대하여 변수 M(정합 잔기의 쌍에 대한 보상 점수; 항상 >0) 및 N(부정합 잔기에 대하여 패널티 점수; 항상 <0)을 사용하여 누적값을 계산할 수 있다. 누적된 정렬 값이 최대 값 보다 X만큼 떨어지거나, 하나 이상의 마이너스 값의 잔기 정렬들의 축적으로 인하여 누적값이 0 또는 그 이하가 되거나 또는 어느 한 서열의 말단에 도달하게 되면 각 방향으로 진행되는 단어 적중의 전개를 중지시킨다. BLAST 알고리듬 변수 W, T 및 X는 정렬의 민감도와 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오타이드 서열의 경우)은 디폴트로서 단어길이(W) 11, 예상치(E) 10을 사용하고 BLOSUM62 득점 매트릭스(Henikoff and Henikoff(1989) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:10915) 정렬은 (B) 50, 예상치(E) 10, M=5, N=-4 및 두 쇄의 비교값을 사용한다.
바람직하게는, "서열 동일성 %"는 20개 위치 이상의 비교 창에 있는 2개의 적절하게 정렬된 서열을 비교하여 측정한다. 이 때 비교 창에 있는 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부는 두 서열을 최적으로 정렬시키기 위하여 대조 서열(즉, 첨가나 결실을 포함하지 않는 서열)과 비교했을 때 20% 이하, 보통 5 내지 15%, 또는 10 내지 12%의 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 동일성 %는 두 서열에 존재하는 동일한 핵산 염기의 위치의 수를 측정하여 정합 위치의 수를 얻고, 이 정합 위치의 수를 대조 서열의 위치의 총 수(즉, 창 크기)로 나눈 뒤, 그 결과값에 100을 곱하여 서열 동일성 %를 얻는다.
유전자 코드의 축퇴성으로 인하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 다수개 존재한다는 것은 당업자라면 잘 알고 있을 것이다. 이러한 폴리뉴클레오타이드 중 몇가지는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 최소의 상동성을 보유하기도 한다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용의 차이로 인해 상이한 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 구체적 예로 포함되는 것이다. 또한, 본 명세서에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자들도 본 발명의 영역에 속하는 것이다. 대립유전자는 뉴클레오타이드의 하나 이상의 변이, 예를 들어 결실, 첨가 및/또는 치환에 의해 변화된 내인성 유전자이다. 그 결과 얻어지는 mRNA 및 단백질은 구조나 기능이 변화될 수 있으나, 반드시 그런 것은 아니다. 대립유전자는 표준 기법(예를 들어, 하이브리드화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)으로 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 명세서에 제시된 폴리펩타이드의면역원성 변형체 및/또는 유도체를 제조하기 위하여 부위 특이적 돌연변이유발법과 같은 돌연변이유발 방법을 사용할 수 있다. 이 방법에 의하면, 폴리펩타이드 서열에 특정 변형들을 이들을 암호화하는 기본 폴리뉴클레오타이드의 돌연변이유발을 통해 이룰 수 있다. 이 기법은 예를 들어 폴리뉴클레오타이드에 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열의 변화를 도입시켜 전술한 변형을 하나 이상 포함하는 서열 변형체를 제조하고 시험하는 직접적인 방법을 제공한다.
부위 특이적 돌연변이유발법은 결실 접합부의 양 측이 교차하는 안정한 이본쇄를 형성하기에 충분한 크기와 서열 복잡성을 가진 프라이머 서열을 제공하기 위하여 충분한 수의 인접 뉴클레오타이드는 물론 목적한 돌연변이의 DNA 서열을 암호화하는 특정 올리고뉴클레오타이드 서열을 사용하여 돌연변이를 만들 수 있다. 돌연변이는 폴리뉴클레오타이드 자체의 성질을 개선, 변화, 감소, 변형 또는 다른 변화를 일으키고(또는) 암호화된 폴리펩타이드의 성질, 활성, 조성, 안정성 또는 1차 서열을 변화시키기 위하여 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 실시될 수 있다.
본 발명의 특정 양태로서, 본 발명자들은 암호화된 폴리펩타이드의 하나 이상의 성질, 예를 들어 폴리펩타이드 백신의 면역원성을 변화시키기 위하여 개시된 폴리뉴클레오타이드 서열을 돌연변이시키는 방법을 고찰한다. 부위 특이적 돌연변이유발법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고, 폴리펩타이드는 물론 폴리뉴클레오타이드의 변형체를 제조하는데 널리 사용되고 있다. 예를 들어, 부위 특이적 돌연변이유발법은 종종 DNA 분자의 특정 부위를 변화시키는데 사용되기도 한다. 이와 같은 양태에서, 일반적으로 약 14개 내지 약 25개 뉴클레오타이드 정도의 길이를 포함하고 이 서열의 접합부 양측의 약 5개 내지 약 10개 잔기가 변화된 프라이머를 사용한다.
당업자에게는 자명하듯이, 부위 특이적 돌연변이유발법은 일본쇄 및 이본쇄 형태로 모두 존재하는 파아지 벡터를 종종 이용한다. 부위 지시성 돌연변이유발법에 유용하나 일반적인 벡터로는 M13 파아지와 같은 벡터를 포함한다. 이 파아지는 쉽게 입수할 수 있고, 그 사용법 역시 당업자에게 일반적으로 잘 알려져 있다. 이본쇄 플라스미드는 목적 유전자를 플라스미드에서 파아지로 전이시키는 단계를 없앤 부위 지시성 돌연변이유발법에 통상적으로 이용된다.
일반적으로, 본 발명에 따른 부위 지시성 돌연변이유발법은 먼저 목적하는 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 일본쇄 벡터를 수득하거나 또는 이본쇄 벡터의 두 쇄를 용해 분리시킨다. 목적하는 돌연변이된 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 일반적으로 합성법으로 제조한다. 이 프라이머를 그 다음 일본쇄 벡터에 어닐링시키고, 이. 콜리의 폴리머라제 I 클리나우 단편과 같은 DNA 중합 효소로 처리하여 돌연변이 보유 쇄를 완전히 합성한다. 그 결과, 제1 쇄는 본래의 비돌연변이 서열을 암호화하고 제2 쇄는 목적하는 돌연변이를 보유하는 이종이본쇄를 형성시킨다. 그 다음 이 이종이본쇄 벡터를 사용하여 적당한 세포, 예를 들어 이. 콜리 세포를 형질전환시키고, 돌연변이된 서열 배열을 보유하는 재조합 벡터를 포함하는 클론을 선발한다.
부위 지시성 돌연변이유발법을 사용하여 선발된 펩타이드 암호화 DNA 단편의 서열 변형체를 제조하는 방법은 매우 유용한 종을 생산하는 수단으로서, 펩타이드의 서열 변형체 및 이를 암호화하는 DNA 서열을 수득할 수 있는 다른 방법이 있는 것처럼, 이 방법에만 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 목적하는 펩타이드 서열을 암호화하는 재조합 벡터는 서열 변형체를 얻기 위하여 하이드록실아민과 같은 돌연변이유발제로 처리할 수 있다. 이 방법과 프로토콜에 대한 구체적인 사항은 같은 목적에 대하여 문헌[참조:각각 참고인용되는 Maloy et al., 1994; Segal, 1976; Prokop and Bajpai, 1991; Kuby, 1994; 및 Maniatis et al., 1982]에 교시된 내용을 참조할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "올리고뉴클레오타이드 지시성 돌연변이유발법"이란 용어는 특정 핵산 분자의 농도를 초기 농도에 비해 증가시키거나, 또는 검출 시그날의 농도를 증가시키는 주형 의존적 과정 및 벡터 매개의 전파, 예를 들어 증폭을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "올리고뉴클레오타이드 지시성 돌연변이유발법"이란 용어는 주형에 의존적인 프라이머 분자의 신장을 포함하는 과정을 의미한다. 주형 의존적 과정이란 용어는 새로 합성된 핵산 쇄의 서열이 공지된 상보성 염기쌍 규칙(예를 들어, Watson, 1987)에 따르는 RNA 또는 DNA 분자의 핵산 합성을 의미한다. 일반적으로, 벡터를 매개로 한 방법론은 핵산 단편을 DNA 또는 RNA 벡터에 도입시킨 뒤, 벡터를 클론 중폭시키고, 증폭된 핵산 단편을 회수하는 과정을 포함한다. 이러한 방법론의 예는 전체적으로 참고인용되는 미국 특허 제4,237,224호에 제시되어 있다.
본 발명의 폴리펩타이드 변형체를 생산하는 또 다른 방법으로, 미국 특허 제5,837,458호에 개시된 바와 같은 반복적 서열 재조합법을 이용할 수 있다. 이 방법에서는 재조합과 선별 또는 선발을 반복 실시하여, 예컨대 면역원성 활성이 증강된 본 발명의 각 폴리뉴클레오타이드 변형체를 "진화"시킨다.
본 발명의 다른 양태에서는, 본 명세서에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열을 핵산 하이브리드화의 프로브 또는 프라이머로서 유리하게 사용할 수 있다. 이러한 자격으로 본 명세서에 개시된 15개 뉴클레오타이드 길이의 인접 서열과 동일한 서열이거나 상보적 서열인 약 15개 이상의 뉴클레오타이드 길이의 인접 서열을 가진 서열 영역을 포함하는 핵산 단편은 특별한 용도가 있을 것으로 생각되고 있다. 이 보다 긴 인접의 동일하거나 상보성인 서열, 예컨대 약 20개, 30개, 40개, 50개, 100개, 200개, 500개, 1000개의 길이를 가진 서열(그 중간 길이도 모두 포함함) 및 심지어 최고 전장의 서열 역시 특정 양태에서는 유용할 것이다.
이와 같은 핵산 프로브는 당해 서열에 특이적으로 하이브리드화하는 능력이 있어서 소정 샘플 중의 상보성 서열의 존재를 검출하는데 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 돌연변이 종의 프라이머를 제조하는데 필요한 서열 정보로서의 용도 또는 다른 유전자 구조를 제조하는데 사용하기 위한 프라이머로서의 용도와 같은 다른 용도도 예상할 수 있다.
본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드 서열과 동일하거나 상보성인 10 내지 14개, 15 내지 20개, 30개, 50개 또는 심지어 100 내지 200개의 뉴클레오타이드 정도(중간 서열도 포함함)의 인접 뉴클레오타이드 신장부로 이루어진 서열 영역을 가진 폴리뉴클레오타이드 분자는 특히 예를 들어 서던 및 노던 블롯팅에 사용하기 위한 하이브리드화 프로브로서 유용할 것으로 생각된다. 이로써 유전자 생성물이나이의 단편을 다양한 세포 종류 및 다양한 세균 세포에서도 분석할 수 있게 된다. 단편의 전체 크기는 물론 상보성 신장부의 크기는 궁극적으로 특정 핵산 단편의 목적하는 용도 또는 적용에 따라 달라질 수 있다. 이보다 작은 단편은 일반적으로 하이브리드화 양태에서 사용될 수 있는 것으로 나타나며, 이 때 인접한 상보성 영역의 길이는 다양하여 약 15개 내지 약 100개 뉴클레오타이드 사이일 수 있고, 이보다 큰 인접한 상보성 신장부는 검출하고자 하는 상보성 서열의 길이에 따라 사용할 수 있다.
약 15 내지 25개 길이의 뉴클레오타이드로 이루어진 하이브리드화 프로브의 사용은 안정하고 선택성이 있는 이본쇄 분자를 형성시킨다. 15개 이상의 염기를 가진 신장부 상에 인접한 상보성 서열을 가진 분자는 일반적으로 하이브리드의 안정성과 선택성을 증가시켜 수득되는 특정 하이브리드 분자의 정도와 질을 향상시키는데 바람직하다. 따라서, 일반적으로 15개 내지 25개 인접 뉴클레오타이드의 유전자 상보성 신장부를 가진 핵산 분자, 또는 필요한 경우에는 이보다 더 긴 신장부를 가진 핵산 분자를 디자인하는 것이 바람직할 것이다.
하이브리드화 프로브는 본 명세서에 개시된 임의 서열 중 임의 부분 중에서 선택될 수 있다. 필요한 모든 것은 프로브 또는 프라이머로서 사용하고자 하는 본 명세서에 기술된 서열이나, 또는 전장의 서열을 비롯하여 길이가 최고 약 15개 내지 25개의 뉴클레오타이드 범위인 상기 서열의 임의의 연속 일부를 검토하는 것이다. 프로브 서열 및 프라이머 서열의 선택은 다양한 요인에 따라 좌우될 수 있다. 예를 들어, 전체 서열의 말단쪽 유래의 프라이머를 이용하고자 할 수도 있다.
작은 폴리뉴클레오타이드 단편은 흔히 자동 올리고뉴클레오타이드 합성기를 사용하여 실시되듯이, 예를 들어 화학적 방법으로 단편을 직접 합성하므로써 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 미국 특허 제4,683,202호(참고인용됨)에 게시된 PCRTM기법과 같은 핵산 재생 기법, 재조합 생산을 위해 재조합 벡터에 선택된 서열을 도입시키는 방법, 및 분자생물학 기술분야의 당업자에게 일반적으로 공지된 다른 재조합 DNA 기법을 사용하여 단편을 수득할 수도 있다.
본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 목적하는 전체 유전자 또는 유전자 단편의 상보성 신장부를 가진 이본쇄 분자를 선택적으로 형성할 수 있는 능력에 따라 사용될 수 있다. 계획된 용도에 따라, 일반적으로 표적 서열에 대해 다양한 선택성 정도의 프로브를 얻기 위하여 다양한 하이브리드화 조건을 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 높은 선택성을 요구하는 용도인 경우에는 일반적으로 비교적 엄중한 조건을 이용하여 하이브리드를 형성시키는 것이 바람직할 것이며, 예를 들어 약 50℃ 내지 약 70℃ 범위의 온도에서 약 0.02M 내지 약 0.15M 범위의 염 농도와 같은 비교적 낮은 염 및/또는 고온의 조건을 선택할 수 있다. 이와 같은 선택 조건은 프로브와 주형이나 표적 쇄 사이의 부정합이 존재한다면 이 부정합이 유지되기가 거의 어려운 바 관련 서열을 분리하기에 특히 적합할 것이다.
물론, 기본 주형에 하이브리드화된 돌연변이 프라이머 쇄을 이용하는 돌연변이체를 제조하는 것이 요구되는 몇몇 용도의 경우에는 이종이본쇄를 형성시키기 위하여 일반적으로 엄중도가 낮은(감소된 엄중도) 하이브리드화 조건이 필요할 것이다. 이와 같은 경우에는, 약 20℃ 내지 약 55℃ 범위의 온도에서 약 0.15M 내지 약 0.9M의 염과 같은 염 조건을 이용하는 것이 바람직할 것이다. 따라서, 교차-하이브리드화 종은 대조 하이브리드화에 비하여 양의 하이브리드화 시그날을 나타내어 쉽게 확인할 수 있다. 어떤 경우든지, 온도 증가와 같은 방식으로 하이브리드 이본쇄를 불안정화시키는 포름아마이드의 함량을 증가시킴으로써 보다 엄중한 조건을 만들 수도 있다는 것은 널리 알려져 있다. 따라서, 하이브리드화 조건은 쉽게 조작할 수 있는 바, 일반적으로 목적 결과에 따라 선택할 수 있는 방법이다.
폴리뉴클레오타이드 동정, 특성 및 발현
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 조성물은 잘 알려진 다양한 기법 중 임의의 방법을 사용하여 동정, 제조 및/또는 조작할 수 있다[일반적으로, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989 및 다른 유사 문헌].
주형에 의존적인 다수의 방법들은 샘플에 존재하는 목적으로 하는 표적 서열을 증폭시키는데 이용할 수 있다. 가장 잘 알려진 증폭 방법 중 하나는 전체적으로 본 명세서에 각각 참고 인용되고 있는 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 상세하게 설명되어 있는 폴리머라제 연쇄 반응(PCRTM)이다. 간략히 설명하면, PCRTM에서는 표적 서열의 대향하는 상보적 쇄 상의 영역들에 상보적인 2개의 프라이머 서열을 제조한다. 반응 혼합물에 DNA 폴리머라제(예, Taq 폴리머라제)와 함께 과량의 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트를 첨가한다. 샘플에표적 서열이 존재하면 프라이머는 이 표적에 결합하고 폴리머라제는 프라이머가 표적 서열을 따라 뉴클레오타이드 상에 첨가하여 신장되게 한다. 반응 혼합물의 온도를 상승 및 저하시켜 신장된 프라이머를 표적으로부터 분리하여 반응 생성물을 형성시키고, 과량의 프라이머는 표적 및 반응 생성물에 결합시켜 상기 과정을 반복시킨다. 바람직하게는, 증폭된 mRNA의 함량을 정량하기 위하여 역전사 및 PCRTM증폭 절차를 실시하는 것이 좋다. 폴리머라제 연쇄 반응 방법론은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
대부분이 PCRTM증폭 기법의 변형인 기타 다른 다수의 주형 의존적 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고 쉽게 이용할 수도 있다. 예를 들어, 이와 같은 몇몇 방법으로는 문헌[참조:Eur.Pat.Appl.Publ.No. 320, 308 및 미국 특허 제4,883,750호]에 기술된 리가제 연쇄 반응(LCR이라 부르기도 함); PCR 국제특허출원번호 PCT/US87/00880호에 기술된 큐베타 레플리카제(Qbeta Replicase); 쇄 치환 증폭(SDA) 및 수복 연쇄 반응(RCR)이 있다. 또 다른 증폭 방법은 영국 특허 출원번호 2,202,328호 및 PCT 국제특허출원번호 PCT/US89/01025에 설명되어 있다. 다른 핵산 증폭 절차로는 전사에 기초한 증폭 시스템(TAS)(PCT 국제특허공개번호 WO88/10315), 예를 들어 핵산 서열에 기초한 증폭(NASBA) 및 3SR이 있다. 유럽특허출원번호 329,822호에서는 일본쇄 RNA("ssRNA") 및 이본쇄 DNA(dsDNA)를 반복하여 합성하는 것을 포함하는 핵산 증폭법이 설명되어 있다. PCT 국제특허공개번호 WO89/06700호에서는 표적 일본쇄 DNA("ssDNA")에 프로모터/프라이머 서열을 하이브리드화한 뒤 이 서열의 많은 RNA 카피를 전사시키는 것을 기초로 한 핵산 서열 증폭 방법에 대하여 설명하고 있다. "RACE"(Frohman, 1990) 및 "일방향 PCR"(Ohara, 1989)과 같은 다른 증폭 방법들도 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 증폭 부분은 공지의 기법에 따라 적합한 라이브러리(예, 종양 cDNA 라이브러리)로부터 전장의 유전자를 분리하는데 사용할 수 있다. 이와 같은 기법에서, 라이브러리(cDNA 또는 게놈 라이브러리)는 증폭에 적합한 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머를 사용하여 선별한다. 바람직하게는, 라이브러리는 보다 큰 분자를 포함하는 것으로 크기 선발한다. 또한, 무작위로 프라이밍된 라이브러리는 유전자의 5' 및 상류 영역을 동정하는데 바람직한 것이다. 게놈 라이브러리는 인트론과 신장성 5' 서열을 수득하는데 바람직하다.
하이브리드화 기법에서, 부분 서열은 공지의 기법을 사용하여 표지할 수 있다(예, 닉해독이나32P를 이용한 말단 표지화). 그 다음, 일반적으로 이와 같이 표지된 프로브와 변성된 세균 콜로니를 함유하는 필터(또는 파아지 플라크를 함유하는 론)를 하이브리드화시켜 세균 또는 박테리오파아지 라이브러리를 선별한다[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]. 하이브리드화한 콜로니 또는 플라크를 선발하여 증식시키고, 추가 분석을 위하여 DNA를 분리한다. 추가된 서열의 양을 측정하기 위하여, 예를 들어 부분 서열 유래의 프라이머와 벡터 유래의 프라이머를 이용한 PCR로 cDNA 클론을 분석할 수 있다. 제한 지도와 부분 서열을 만들어 하나 이상의 중첩 클론을 동정한다. 그 다음, 일련의 결실 클론 형성을 포함하는 표준 기법을 사용하여 전체 서열을 결정할 수 있다. 그 결과 얻어지는 중첩 서열을 조합하여 하나의 인접 서열을 만들 수 있다. 적합한 단편을 공지의 기법으로 결합시켜 전장의 cDNA 분자를 얻을 수 있다.
또는, 전술한 바와 같은 증폭 기법은 부분 cDNA 서열로부터 전장의 암호 서열을 수득하는데 유용하게 사용될 수 있다. 이와 같은 증폭 기법 중 하나는 유전자의 공지 영역에서 단편을 생성시키는 제한효소를 이용하는 역 PCR(Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16:8186, 1988)이다. 그 다음, 단편을 분자내 결합에 의해 환형화하고, 공지 영역에서 얻어지는 서로 다른 프라이머들을 이용하는 PCR의 주형으로 사용한다. 대안적 방법으로, 부분 서열에 인접한 서열은 링커 서열에 특이적인 프라이머와 공지 영역에 특이적인 프라이머를 이용한 증폭으로 회수할 수 있다. 증폭된 서열은 일반적으로 동일한 링커 프라이머와 공지 영역에 특이적인 제2 프라이머를 이용한 2차 증폭으로 처리된다. 공지 서열로부터 반대 방향으로 신장을 개시시키는 2개의 프라이머를 이용하는 이 절차에 대한 변형예는 WO96/38591에 설명되어 있다. 이와 같은 다른 기법으로, "cDNA 말단의 급속 증폭법" 또는 RACE로 알려진 방법이 있다. 이 기법은 공지 서열의 5' 및 3' 서열을 동정하기 위하여 폴리A 영역이나 벡터 서열에 하이브리드화하는 외부 프라이머 및 내부 프라이머의 사용을 포함한다. 또 다른 기법으로는 캡춰 PCR(Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1:111-19, 1991) 및 워킹 PCR(Parker et al., Nucl.Acids Res. 19:3055-60, 1991)이 있다. 증폭을 이용하는 다른 방법들도 전장의 cDNA 서열을 수득하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명의 폴리펩타이드, 또는 이의 융합 단백질 또는 이의 기능적 등가물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이나 이의 단편은 적당한 숙주 세포에서 폴리펩타이드를 직접 발현시키기 위한 재조합 DNA 분자에 사용할 수 있다. 유전자 코드의 고유 축퇴성으로 인하여 실질적으로 동일하거나 기능적으로 등가인 아미노산 서열을 암호화하는 다른 DNA 서열을 만들고, 이 서열을 사용하여 소정의 폴리펩타이드를 클로닝 및 발현시킬 수 있다.
당업자라면 잘 알고 있는 바와 같이 몇몇 경우에는 비자연발생의 코돈을 보유하는 폴리펩타이드 암호성 뉴클레오타이드 서열을 생산하는 것이 유리할 수도 있다. 예를 들어, 특정 원핵 또는 진핵 숙주가 선호하는 코돈을 선발하여 단백질 발현율을 증가시키거나 자연 발생의 서열에서 얻어진 전사체의 반감기보다 더 긴 반감기와 같은 바람직한 성질을 가진 재조합 RNA 전사체를 제조할 수 있다.
더욱이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 당해 기술분야에 공지된 방법으로 조작하여 다양한 목적, 예를 들어 비제한적으로 유전자 생성물의 클로닝, 가공 및/또는 발현을 변화시키는 변형을 위해 폴리펩타이드 암호 서열을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 무작위 단편화 및 유전자 단편들과 합성 올리고뉴클레오타이드의 PCR 재조립에 의한 DNA 셔플링(shuffling)을 이용하여 뉴클레오타이드 서열을 조작할 수 있다. 또한, 부위 지시성 돌연변이유발법을 이용하여 새로운 제한 부위를 삽입하거나, 글리코실화 패턴을 변화시키거나, 코돈 선호성을 변화시키거나, 접목 변형체를 만들거나 또는 돌연변이를 도입시키는 등의 변이를 일으킬 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 천연 핵산 서열, 변형된 핵산 서열 또는 재조합 핵산 서열을 이종 서열에 결합시켜 융합 단백질을 암호화할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 활성의 억제제에 대한 펩타이드 라이브러리를 선별하기 위하여 시판용 항체가 인식할 수 있는 키메라 단백질을 암호화하는 것이 유용할 수 있다. 융합 단백질은 또한 폴리펩타이드 암호 서열과 이종 단백질 서열 사이에 절단 부위가 위치하도록 조작될 수 있고, 따라서 폴리펩타이드는 절단되어 이종 부로부터 정제될 수 있다.
목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 당해 기술분야에 공지된 화학적 방법을 사용하여 완전히 또는 부분적으로 합성될 수 있다[Caruthers, M.H. et al.(1980) Nucl.Acid.Res.Symp.Ser. 215-223, Horn,T.et al.(1980) Nucl.Acids Res. Symp.Ser. 225-232]. 또는, 단백질 자체를 폴리펩타이드 또는 이의 일부의 아미노산 서열을 합성하는 화학적 방법을 사용하여 생산할 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 합성은 다양한 고상 기법을 사용하여 수행할 수 있고[Roberge, J.Y.et al.(1995) Science 269:202-204], 자동 합성은 예를 들어 ABI 431A 펩타이드 합성기(Perkin Elmer, Palo Alto, CA)를 사용하여 실시할 수 있다.
새로 합성한 펩타이드는 정제용 고성능 액체 크로마토그래피[예, Creighton, T.(1983) Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, N.Y.]나 또는 당해 기술분야에 잘 알려진 비슷한 다른 기법을 사용하여실질적으로 정제할 수 있다. 합성 펩타이드의 조성은 아미노산 분석이나 서열분석(예, 에드만 분해법)으로 확인할 수 있다. 또한, 폴리펩타이드 또는 이의 임의의 일부분의 아미노산 서열은 직접 합성법으로 변화시키고(또는) 다른 단백질 또는 이의 임의의 일부분 유래의 서열과 화학적 방법으로 조합하여 변형 폴리펩타이드를 생성시킬 수 있다.
목적하는 폴리펩타이드를 발현시키기 위하여, 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이나 기능적 등가물을 적당한 발현 벡터, 즉 삽입된 암호 서열의 전사와 해독에 필요한 인자를 포함하는 벡터에 삽입시킬 수 있다. 이와 같이 목적한 폴리펩타이드를 암호화하는 서열과 적당한 전사 및 해독 조절 인자를 함유하는 발현 벡터를 작제하기 위하여 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있다. 이와 같은 방법으로는 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성법 및 생체내 유전자 재조합법이 있다. 이와 같은 기법은 예를 들어 문헌[참조:Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., and Ausubel, F.M. et al.(1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.]에 설명되어 있다.
다양한 발현 벡터/숙주 시스템을 이용하여 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함시키고 발현시킬 수 있다. 그 예로는, 비제한적으로 재조합 박테리오파아지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 세균과 같은 미생물; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터(예, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포계; 바이러스 발현 벡터(예, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 형질전환되거나 세균 발현 벡터(예, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포계; 또는 동물 세포계 등이 있다.
발현 벡터에 존재하는 "조절 인자" 또는 "조절 서열"로는 전사 및 해독을 수행하기 위하여 숙주 세포 단백질과 상호작용하는 벡터의 비해독 영역, 즉 인핸서, 프로모터, 5' 및 3' 비해독 영역이 있다. 이와 같은 인자들은 강도와 특이성이 다양할 수 있다. 사용되는 벡터계와 숙주에 따라 구성형 프로모터 및 유도형 프로모터를 비롯한 임의의 수의 적합한 전사 및 해독 인자를 사용할 수 있다. 예를 들어, 세균계에 클로닝하는 경우에는, PBLUESCRIPT 파지미드(Stratagene, La Jolla, Calif.) 또는 PSPORT1 플라스미드(Gibco BRL, Gaithersburg, MD) 등의 하이브리드 lacZ 프로모터와 같은 유도형 프로모터를 사용할 수 있다. 포유동물 세포계에서는 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스 유래의 프로모터가 일반적으로 바람직하다. 폴리펩타이드를 암호화하는 서열의 복수 카피를 포함하는 세포주가 필요한 경우에는 SV40 또는 EBV를 기초로 한 벡터를 적당한 선택성 마커와 함께 사용하는 것이 유리하다.
세균계에서는 발현된 폴리펩타이드의 목적 용도에 따라 다수의 발현 벡터 중 임의의 벡터를 선발할 수 있다. 예를 들어, 항체를 유도하기 위하여 다량이 필요한 경우에 정제 용이한 융합 단백질의 다량 발현을 유도하는 벡터를 사용할 수 있다. 이와 같은 벡터로는, 목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열이 아미노 말단 Met에 대한 서열 및 이후 하이브리드 단백질을 생산하기 위한 베타 갈락토시다제의 7개 잔기에 대한 서열과 정확한 프레임으로 벡터에 결합될 수 있는BLUESCRIPT(Stratagene)과 같은 다기능성 이. 콜리 클로닝 및 발현 벡터; pIN 벡터(Van Heeke, G. and S.M. Schuster(1989) J.Biol.Chem 264:5503-5509) 등이 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. pGEX 벡터(Promega, Madison, Wis.)도 역시 글루타치온 S-트란스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 이종 폴리펩타이드를 발현시키는데 사용할 수 있다. 일반적으로, 이와 같은 융합 단백질은 용해성이므로, 용균된 세포로부터 글루타치온-아가로스 비드에 대한 흡착 후 유리 글루타치온 존재하의 용출에 의해 용이하게 정제할 수 있다. 이와 같은 시스템에서 제조된 단백질에는 목적하는 클로닝된 폴리펩타이드가 의지에 따라 GST 부로부터 방출될 수 있도록 헤파린, 트롬빈 또는 XA 인자 프로테아제 절단 부위를 포함시킬 수 있다.
효모, 사카로마이세스 세레비지애의 경우 알파 인자, 알코올 옥시다제 및 PGH와 같은 구성성 또는 유도성 프로모터를 함유한 많은 벡터가 사용될 수 있다 (참조: 상기 Ausubel et al. 및 Grant et al. (1987) Methods Enzymol. 153:516-544).
식물 발현 벡터를 사용하는 경우, 폴리펩타이드를 코딩하는 서열의 발현은 많은 프로머터에 의해 시동될 수 있다. 예를 들면, CaMV의 35S 및 19S 프로모터와 같은 바이러스 프로모터는 단독으로 또는 TMV의 오메가 리더 서열과 조합하여 사용할 수 있다(Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311). 다른 방안으로서, RUBISCO의 작은 아단위와 같은 식물 프로머터 또는 열 쇼크 프로모터를 사용할 수 있다(Coruzzi, G. et al., (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R. et al. (1984) Science 224:838-843; 및 Winter, J. et al., (1991) Results Probl. CellDiffer. 17:85-105). 이들 작제물은 직접적인 DNA 형질전환 또는 병원체-매개된 형질감염에 의해 식물 세포내로 도입할 수 있다. 이러한 기술들은 많은 문헌에 기술되어 있다(참조: Hobbs, S. 또는 Murry, L. E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y.; pp. 191-196).
또한, 해당 폴리펩타이드를 발현하기 위해 곤충 시스템을 사용할 수 있다. 예를 들면, 한 가지 이러한 시스템으로서, 오토그라파 캘리포르니카 핵 다형 바이러스(AcNPV)가 스포돕테라 프루기페르다 세포 또는 트리코플루시아 유충에서 외래 유전자를 발현하는 벡터로 사용한다. 폴리펩타이드를 코딩하는 서열은 폴리헤드린 유전자와 같은 바이러스의 비필수 영역내로 클로닝하고 폴리헤드린 프로모터의 조절하에 설정할 수 있다. 폴리펩타이드-코딩 서열의 성공적인 삽입은 폴리헤드린 유전자를 불활성으로 만들고 피복 단백질이 결여된 재조합 바이러스를 생성한다. 그런 다음, 이 재조합 바이러스를 사용하여 예를 들면 스포돕테라 프루기페르다 세포 또는 트리코플러시아 유충을 감염시킬 수 있다(Engelhard, E.K. et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:3224-3227).
포유류 숙주 세포의 경우 많은 바이러스-계 발현 시스템이 일반적으로 이용되고 있다. 예를 들면, 아데노바이러스가 발현 벡터로 사용되는 경우, 해당 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 후기 프로모터와 3조 리더 서열로 이루어진 아데노바이러스 전사/해독 복합체내로 연결할 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 E1 또는 E3 영역을 사용하여 감염된 숙주 세포에서 그 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 살아있는 바이러스를 얻을 수 있다(Logan, J. and Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad.Sci. 81:3655-3659). 또한, 전사 인핸서, 예를 들면 로우스 육종 바이러스 (RSV) 인핸서를 사용하여 포유류 숙주 세포에서 발현을 증가시킬 수 있다.
또한, 특정 개시 시그날을 사용하여 해당 폴리펩타이드를 코딩하는 서열의 해독을 보다 효율적으로 달성할 수 있다. 이러한 시그날은 ATG 개시 코돈 및 인접한 서열을 포함한다. 폴리펩타이드를 코딩하는 서열, 이의 개시 코돈 및 상류 서열이 적절한 발현 벡터내로 삽입되는 경우, 어떠한 추가적인 전사 또는 해독 조절 시그날도 필요하지 않을 수 있다. 그러나, 단지 코딩 서열 또는 이의 일부분이 삽입되는 경우 ATG 개시 코돈을 포함한 외인성 해독 조절 시그날이 제공되어야 한다. 또한, 개시 코돈은 전체 삽입체의 해독을 보장하기 위해서는 정확한 판독 프레임에 있어야 한다. 외인성 해독 요소 및 개시 코돈은 천연 및 합성의 여러 기원으로부터 유래될 수 있다. 발현 효율은 문헌[참조:Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162]에 기술된 것과 같이 사용된 특정 세포 시스템에 적절한 인핸서의 삽입에 의해 강화될 수 있다.
또한, 숙주 세포 균주는 삽입된 서열의 발현을 조절하는 능력 또는 원하는 양상으로 발현된 단백질을 프로세싱하는 능력에 대해 선택할 수 있다. 폴리펩타이드의 그러한 변형은 이들로 한정되는 것은 아니지만 아세틸화, 카복실화, 당화, 인산화, 지질화 및 아실화를 포함한다. 단백질의 "prepro" 형태를 분해하는 해독 후 프로세싱을 또한 사용하여 정확한 삽입, 폴딩 및/또는 기능을 촉진할 수 있다. 외래 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱을 보장하기 위해, 해독 후 활성에 대한 특정한 세포의 기계적 및 특징적인 메카니즘을 갖는 CHO, COS, HeLa, MDCK, HEK293 및WI38과 같은 상이한 숙주 세포가 선택될 수 있다.
재조합 단백질의 장기간, 고수율 생산을 위해, 일반적으로 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들면, 해당 폴리뉴클레오타이드를 안정하게 발현하는 세포주는 바이러스 복제 오리진 및/또는 내인성 발현 요소 및 선택 마커 유전자를 동일하거나 별개의 벡터상에 함유할 수 있는 발현 벡터를 사용하여 형질전환시킬 수 있다. 벡터의 도입 후, 세포는 증식 배지에서 1-2일 동안 성장시킨 다음 선별 배지로 옮긴다. 선별 마커의 목적은 선별 내성을 제공하는데 있으며 그의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 성장과 회수를 허용한다. 안정하게 형질전환된 세포의 내성 클론은 세포 유형에 적합한 조직 배양 기술을 사용하여 증식시킬 수 있다.
형질전환 세포주의 회수를 위해 많은 선별 시스템을 사용할 수 있다. 이들 시스템에는 이들로 한정되는 것은 아니지만 tk-또는 aprt-세포에서 사용할 수 있는 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(Wigler, M. et al. (1977) Cell 11:223-32) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Lowy, I. et al. (1990) Cell 22:817-23) 유전자가 포함된다. 또한, 항대사, 항생 또는 살균 내성이 선별 기본으로 사용할 수 있다; 예를 들면, 메톡트렉세이트에 대해 내성을 제공하는 dhfr(Wigler, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70); 아미노글리코시드, 네오마이신 및 G-418에 내성을 제공하는 npt(Colbere-Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14); 및 클로르설푸론 및 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 각각에 내성을 제공하는 als 또는 pat(상기 Murry). 추가적인 선별 유전자, 예를 들면 세포가 트립토판 대신에 인돌을 이용하도록 하는 trpB 또는 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 사용하도록 하는 hisD(Hartman, S. C. 및 R. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51). 안토시아닌, 베타-글루쿠로니다제 및 이의 기질 GUS 및 루시퍼라제 및 이의 기질과 같은 시각적인 마커가 형질전환체를 동정하고 더불어 특정 벡터 시스템에 기인하는 일시적이거나 안정한 단백질 발현의 양을 정량하는데 널리 이용되어 왔다(Rhodes, C.A. et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131).
비록 마커 유전자 발현의 유무가 해당 유전자가 또한 존재함을 제시할지라도, 그의 존재 및 발현은 검증할 필요가 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드를 코딩하는 서열이 마커 유전자 서열내에 삽입되는 경우, 서열을 함유하는 재조합 세포는 마커 유전자 기능의 부재에 의해 동정할 수 있다. 다른 방안으로서, 마커 유전자는 단일 프로모터의 조절하에 폴리펩타이드-코딩 서열과 직렬로 배치할 수 있다. 유도 또는 선별에 반응한 마커 유전자의 발현은 보통 그 직렬 유전자의 발현을 가리킨다.
다른 방안으로서, 원하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하고 발현하는 숙주 세포는 당업자에게 알려진 여러 절차에 의해 동정할 수 있다. 이들 절차는 이들로 한정하는 것은 아니지만 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드화 및 단백질 생검정 또는 면역검정 기술을 포함하며, 이들의 예로는 핵산 또는 단백질의 검출 및/또는 정량을 막, 용액 또는 칩 기반 기술이 포함된다.
산물에 특이적인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용하여 폴리뉴클레오타이드-코딩된 산물의 발현을 검출 및 측정하는 여러 프로토콜이 본 분야에 알려져 있다. 이의 예로는 효소-연결된 면역흡착 검정(ELISA), 방사선면역검정(RIA) 및 형광 활성화된 세포 분류(FACS)가 포함된다. 주어진 폴리펩타이드상의 두개 비-간섭 에피토프에 반응하는 모노클로날 항체를 이용한 모노클로날-기본 면역검정이 일부 용도로 바람직할 수 있으나, 경쟁 결합 검정이 또한 사용될 수 있다. 이들 및 기타 검정법이 문헌[참조:Hampton, R. et al. (1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul. Minn.) 및 Maddox, D.E. et al. (1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216).
다양한 표지 및 결합 기술이 당업자에 알려져 있으며 여러 핵산 및 아미노산 검정에 사용할 수 있다. 표지된 하이브리드화를 유도하는 수단 또는 폴리뉴클레오타이드와 연관된 서열을 검출하는 PCR 프로브는 표지된 뉴클레오타이드를 사용한 올리고표지화, 니크 해독, 말단-표지화 또는 PCR 증폭을 포함한다. 다른 방도로서, 서열 또는 이의 일부는 mRNA 프로브의 생성을 위한 벡터내로 크로닝할 수 있다. 이러한 벡터는 본 분야에 알려져 있고 구입할 수 있으며 T7, T3 또는 SP6와 같은 적절한 RNA 폴리머라제 및 표지된 뉴클레오타이드의 첨가에 의해 RNA 프로브를 시험관내 합성하는데 사용할 수 있다. 이들 절차는 여러 시판 키트를 사용하여 실시할 수 있다. 사용할 수 있는 적합한 리포터 분자 또는 표지로는 방사성핵종, 효소, 형광체, 발광체 또는 색소원뿐만 아니라 기질, 보조인자, 억제제, 자석 입자 등이 포함된다.
해당하는 폴리뉴클레오타이드 서열로 형질전환된 숙주 세포는 단백질의 발현 및 세포 배양물로부터의 회수에 적합한 조건하에서 배양할 수 있다. 재조합 세포에 의해 생성된 단백질은 사용된 서열 및/또는 벡터에 따라 세포내로 분비 또는 내재할 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 함유한 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 세포막을 통해 코딩된 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 시그날 서열을 함유하도록 설계할 수 있다. 다른 재조합 작제법을 사용하여 해당 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 가용성 단백질의 정제를 촉진하는 폴리펩타이드 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 연결할 수 있다. 이러한 정제 촉진 도메인은 이들로 한정하는 것은 아니지만 고정된 금속에 정제를 허용하는 히스티딘-트립토판 모듈과 같은 금속 킬레이트화 펩타이드, 고정된 면역글로불린에 정제를 허용하는 단백질 A 도메인 및 FLAGS 연장/친화성 정제 시스템에 사용되는 도메인(Immunex Corp., Seattle, Wash.)을 포함한다. 정제 도메인과 코딩된 폴리펩타이드사이에 인자 XA 또는 엔테로키나제에 특이한 것(Invitrogen, San Diego, Calif.)과 같은 절단가능한 링커 서열의 도입은 정제를 촉진하는데 사용할 수 있다. 한 가지 그러한 발현 벡터는 해당 폴리펩타이드를 함유한 융합 단백질의 발현과 티오레독신 또는 엔테로키나제 절단 부위 앞에 6개의 히스티딘 잔기를 코딩하는 핵산을 제공한다. 히스티딘 잔기는 문헌[참조:Porath, J. et al. (1992, Prot. Exp. Purif. 3:263-281)]에 기술된 바와 같이 IMIAC(고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피)에서 정제를 촉진하는 한편, 엔테로키나제 절단 부위는 융합 단백질로부터 목적하는 폴리펩타이드를 정제하는 수단을 제공한다. 융합 단백질을 함유한벡터는 문헌[참조:Kroll, D.J. et al., 1993, DNA Cell Biol. 12:441-453]에 기술되어 있다.
재조합 제조 방법이외에, 본 발명의 폴리펩타이드 및 이의 단편은 고체상 기술(Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154)을 사용하여 직접적인 펩타이드 합성에 의해 제조할 수 있다. 단백질 합성은 수동 기술 또는 자동화에 의해 실시할 수 있다. 자동화 합성은 예를 들면 Applied Biosystems 431A 펩타이드 합성기 (Perkin Elmer)를 사용하여 달성할 수 있다. 다른 방도로서, 여러 단편을 별도로 화학 합성하고 화학 방법에 의해 결합시켜 전체 길이의 분자를 제조할 수 있다.
항체 조성물, 이의 단편 및 기타 결합제
다른 측면으로서, 본 발명은 또한 본원에 기술된 종양 폴리펩타이드 또는 이의 일부분, 변이체 또는 유도체에 면역학적 결합을 나타내는 항체 및 항원-결합 단편과 같은 결합제를 제공한다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 본 발명의 폴리펩타이드와 검출가능한 수준으로 반응하고 (예를 들면, ELISA 검정내에서) 유사한 조건하에서 무관한 폴리펩타이드와 검출될 정도로 반응하지 않는 경우 그 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하고/하거나 면역학적으로 결합하고/하거나 면역학적으로 반응한다고 말한다.
본원에 사용된 면역학적 결합은 일반적으로 면역글로불린 분자와 이에 특이적인 항원사이에서 일어나는 유형의 비-공유결합 상호작용을 가리킨다. 면역학적 결합 상호작용의 세기 또는 친화성은 상호작용의 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있으며, Kd가 작다는 것은 친화성이 크다는 것을 의미한다. 선택된 폴리펩타이드의 면역학적 결합 특성은 본 분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 정량할 수 있다. 한 가지 이러한 방법은 항원-결합 부위/항원 복합체 형성 및 해리의 속도를 측정하는 것을 포함한다. 이들 속도는 복합체 파트너, 상호작용의 친화성 및 양 방향에서의 속도에 대등하게 영향을 미치는 기하학적 파라미터에 의해 좌우된다. 따라서, 개시 속도 상수 (Kon)과 오프 속도 상수 (Koff) 모두는 농도 및 결합과 해리의 실제 속도를 계산함으로써 결정할 수 있다. Koff/Kon의 비율은 친화성과 무관한 모든 파라미터를 배제할 수 있게하며 이에 따라 해리 상수 Kd와 대등하다 (참조: Davies et al. (1990) Annual Rev. Biochem. 59:439-473).
항체의 항원 결합 부위 또는 결합 부분은 항원 결합에 참여하는 면역글로불린 분자의 일부분을 의미한다. 항원 결합 부위는 중쇄(H)와 경쇄(L)의 N-말단 가변(V) 영역의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. 중쇄와 경쇄의 V 영역내에 세 개의 고도의 분지는 초가변 영역이라고 하며 이 영역은 프레임워크 영역 또는 FRs 알려진 보다 더 보존된 인접 분지사이에 존재한다. 따라서, 용어 FR은 면역글로불린의 초가변 영역사이 및 그에 인접하는 것으로 천연적으로 발견되는 아미노산 서열을 가리킨다. 항체 분자에서 경쇄의 세 개 초가변 영역 및 중쇄의 세 개 초가변 영역은 삼차원 공간에서 서로 배치하여 항원 결합 표면을 형성한다. 항원 결합 표면은 결합된 항원의 삼차원 표면에 상보적이며 중쇄와 경쇄 각각의 초가변 영역은 상보성-결정 영역 또는 CDR이라고 한다.
결합제는 또한 본원에 제공된 대표적인 검정법을 사용하여 유방암과 같은 암환자와 암이 없는 사람사이를 구분할 수 있다. 예를 들면, 종양 단백질과 결합하는 항체 또는 다른 결합제는 바람직하게는 암 환자의 약 20% 이상에서, 더욱 바람직하게는 약 30% 이상에서 암의 존재를 지시하는 시그날을 발생할 것이다. 다른 방안으로 또는 추가로, 항체는 암이 없는 사람의 약 90% 이상에서 암의 부재를 지시하는 음성 시그날을 발생할 것이다. 결합제가 이 요건을 충족하는지를 결정하기 위해 암 환자 및 암이 없는 사람 (표준 임상 시험을 사용하여 결정됨)으로부터 채취된 생물학적 샘플 (예, 혈액, 혈청, 타액, 뇨 및/또는 종양 생검)이 결합제와 결합하는 폴리펩타이드의 존재에 대해 본원에 기술된 바와 같이 검정할 수 있다. 바람직하게는, 만족할 정도의 유의적인 수의 암 샘플 및 암이 없는 샘플을 검정할 것이다. 각 결합제는 상기 기준을 충족해야 한다. 그러나, 당업자는 결합제를 감도의 개선을 위해 병합하여 사용할 수 있음을 인지할 것이다.
상기 요건을 충족하는 어떠한 물질도 결합제가 될 수 있다. 예를 들면, 결합제는 펩타이드 성분을 보유하거나 보유하지 않은 리보좀, RNA 분자 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 바람직한 양태로서, 결합제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 항체는 당업자에게 알려진 여러 기술중 어느 것을 사용하여도 제조할 수 있다 (참조: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). 일반적으로, 항체는 본원에 기술된 모노클로날 항체의 형성을 포함한 세포 배양 기술 또는 재조합 항체의 생성을 위해 항체 유전자를 적합한 세균 또는 포유류 세포 숙주내로 형질감염시켜 제조할 수 있다. 한 가지 기술로서, 폴리펩타이드를 포함한 면역원을 여러 포유류 (예, 마우스, 랫트, 토끼,양 또는 염소)중 어는 것에 초기 주사한다. 이 단계에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 변형없이 면역원으로 작용할 수 있다. 다른 방안으로, 특히 비교적 짧은 폴리펩타이드의 경우, 이 폴리펩타이드가 담체 단백질, 예를 들면 소 혈청 알부민 또는 삿갓조개 헤모시아닌에 연결하는 경우 우수한 면역 반응을 나타낼 수 있다. 면역원은 동물 숙주내로, 바람직하게는 1회 이상의 추가접종 면역화를 포함한 예정된 일정에 따라 주사하며 동물로부터 정기적으로 채혈한다. 이어서, 폴리펩타이드에 특이적인 폴리클로날 항체를 그러한 항혈청으로부터 예를 들면 적합한 고체 지지체에 결합된 폴리펩타이드를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
해당 항원성 폴리펩타이드에 특이적인 모노클로날 항체는 예를 들면 문헌[참조:Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976]의 기술 및 이로부터 개선된 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 요약하면, 이들 방법은 목적하는 특이성 (즉, 해당 폴리펩타이드와의 반응성)을 갖는 항체를 제조할 수 있는 불멸화 세포를 제조하는 것을 포함한다. 이러한 세포주는 예를 들면 상기된 바와 같이 면역화된 동물로부터 얻은 비장 세포로부터 생성할 수 있다. 이어서, 비장 세포를 예를 들면 골수종 세포 융합 파트너, 바람직하게는 면역화된 동물과 친연성인 것과 융합하여 불멸화한다. 여러 융합 기술을 사용할 수 있다. 예를 들면, 비장 세포 및 골수종 세포를 수분 동안 비이온성 세정제와 결합한 다음 하이브리드 세포의 성장을 지지하지만 골수종 세포의 성장은 지지하지 않는 선별 배지상에 저밀도로 플레이팅할 수 있다. 바람직한 선별 기술은 HAT (하이포크산틴, 아미놉테린, 티미딘) 선별을 사용한다. 충분한 시간 후, 보통 1 내지 2주 후 하이브리드 콜로니가관찰된다. 단일 콜로니를 선별하고 이들의 배양 상등물을 폴리펩타이드에 대한 결합 활성에 대해 시험한다. 고도의 반응성 및 특이성을 갖는 하이브리도마가 바람직하다.
모노클로날 항체는 성장하는 하이브리도마 콜로니의 상등액으로부터 분리할 수 있다. 또한, 마우스와 같은 적합한 척추 숙주의 복강내로 하이브리도마 세포주를 주사하는 것과 같은 여러 기술을 사용하여 수율을 높일 수 있다. 그런 다음, 모노클로날 항체를 복수액 또는 혈액으로부터 수확할 수 있다. 항체로부터 오염물을 제거하는 것은 통상의 기술, 예를 들면 겔 여과, 침전 및 추출 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 정제 과정에서, 예를 들면 친화성 크로마토그래피 단계에서 사용할 수 있다.
항체 분자의 면역학적 결합 특성을 나타낼 수 있는 항원-결합 부위를 포함한 많은 치료학적으로 유용한 분자가 본 분야에 알려져 있다. 단백질분해 효소 파파인은 IgG 분자를 우선적으로 분해시켜 수개의 단편을 생성하며 이 가운데 두개 (F(ab) 단편)는 각각 완전한 항원-결합 부위를 포함한 공유 이종이량체를 포함한다. 효소 펩신은 IgG 분자를 분해시켜 양 항원-결합 부위를 포함한 F(ab')2단편을 포함한 수개의 단편을 제공할 수 있다. Fv 단편은 IgM 및 드물게는 IgG 또는 IgA 면역글로불린 분자의 우선적인 단백질 분해에 의해 생성할 수 있다. 그러나, Fv 단편은 본 분야에 알려진 재조합 기술을 사용하여 보다 공통적으로 유도된다. Fv 단편은 천연 항체 분자의 항원 인지 및 결합능중 대부분을 유지하는 항원-결합 부위를 포함한 비-공유 VH::VL이종이량체를 포함한다[문헌참조: Inbar et al., (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2659-2662; Hochman et al.(1976) Biochem 15:2705-2710; 및 Ehrlich et al.(1980) Biochem 19:4091-4096].
일본쇄 Fv("sFv") 폴리펩타이드는 펩타이드-암호화 링커에 의해 결합된 VH- 및 VL-암호화 유전자를 포함하는 유전자 융합체로부터 발현되는 공유 결합된 VH::VL이종이량체이다[문헌참조: Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(16): 5879-5883]. 항체 V 영역으로부터 유래하는, 천연적으로는 응집되어 있는 -- 그러나, 화학적으로는 분리된 -- 경쇄 및 중쇄의 폴리펩타이드를 항원 결합 부위의 구조와 실질적으로 유사한 3차원 구조로 중첩할 수 있는 sFv 분자로 전환시킬 수 있는 화학적 구조를 식별하는 다수의 방법이 개시되어 있다[문헌참조: 미국 특허 제5,091,513호 및 제5,132,405호(Huston et al.) 및 미국 특허 제4,946,778호(Ladner et al.)].
전술한 분자는, 각각 CDRS에 대한 지지체를 제공하고 CDR의 서로에 대한 공간적 관계를 한정하는 중쇄 및 경쇄 FR 세트 사이에 각각 배치된 중쇄 및 경쇄 CDR 세트를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "CDR 세트"는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 3개의 초가변 영역을 의미한다. 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에서부터 비롯하여, 이들 영역은 각각 "CDR1", "CDR2" 및 "CDR3"로 표시한다. 따라서, 항원 결합 부위는 각각의 중쇄 및 경쇄 V 영역으로부터의 CDR 세트를 포함하여 6개의 CDR을 포함한다. 하나의 CDR(예를 들어, CDR1, CDR2 또는 CDR3)을 포함하는 폴리펩타이드를 본원에서는 "분자 인식 단위"라고 한다. 다수의 항원-항체 복합체의 결정학적 분석은, CDR의 아미노산 잔기가 결합된 항원과 광범위한 접촉을 형성하고 있으며, 여기서 가장 광범위한 항원 접촉은 중쇄 CDR3와 형성하고 있음을 입증하고 있다. 따라서, 분자 인식 단위는 항원 결합 부위의 특이성에 주요한 작용을 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "FR 세트"는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 CDR 세포 중의 CDR을 프레이밍하는 4개의 플랭킹 아미노산 서열을 의미한다. 일부 FR 잔기는 결합된 항원에 접촉할 수 있으나, FR, 특히 CDRS에 직접 인접해 있는 FR 잔기는 V 영역이 항원 결합 부위로 중첩하는데 주요한 역할을 한다. FR내에서, 특정한 아미노 잔기 및 특정한 구조적 특징은 매우 고도로 보존적이다. 이와 관련하여, 모든 V 영역의 서열은 약 90개 아미노산 잔기의 내부 디설파이드 루프를 함유한다. V 영역이 결합 부위로 중첩할 경우, CDR은 항원 결합 표면을 형성하는 돌출형 루프 모티프로서 나타난다. 일반적으로, 정확한 CDR 아미노산 서열에 관계없이 -- CDR 루프의 특정의 "표준" 구조로의 중첩 형태에 영향을 미치는 FR의 보존적 구조 영역이 존재하는 것으로 인지되어 있다. 또한, 특정한 FR 잔기가 항체 중쇄 및 경쇄의 상호작용을 안정화시키는 비공유 도메인간의 접촉에 참여하는 것으로 공지되어 있다.
비사람 면역글로불린 유래의 항원 결합 부위를 포함하는 다수의 "사람화" 항체 분자로는 설치류의 V 영역을 보유하는 키메라 항체 및 사람의 불변 도메인에 융합되어 있는 이들의 관련된 CDR[문헌참조: Winter et al. (1991) Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224; Shaw etal(1987) J Immunol. 138:4534-4538; 및 Brown et al.(1987) Cancer Res. 47:3577-3583], 적합한 사람 항체 불변 도메인과 융합하기 전에 사람 지지성 FR에 이식되어 있는 CDR[문헌참조: Riechmann et al.(1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536; 및 Jones et al. (1986) Nature 321:522-525] 및 재조합적으로 베니어링된 설치류 FR에 의해 지지되어 있는 설치류 CDR[문헌참조: 1992년 12월 23일에 공개된 유럽 특허 공개공보 제519,596호] 등이 개시되어 있다. 이들 "사람화" 분자는 이들 잔기의 사람 수용체에서의 치료학적 적용의 기간 및 효능을 한정하는 설치류 항사람 항체 분자에 대한 바람직하지 않은 면역학적 반응을 최소화시키도록 디자인된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "베니어링된 FR" 및 "재조합적으로 베니어링된 FR"은, 천연의 FR 폴리펩타이드 중첩 구조의 실질적으로 전부를 보유하는 항원 결합 부위를 포함하는 이종 개체 분자를 제공하기 위해, 예를 들어, 설치류 중쇄 또는 경쇄 V 영역으로부터의 FR 잔기를 사람의 FR 잔기로 선택적으로 치환시킨 것을 의미한다. 베니어링 기법은 항원 결합 부위의 리간드 결합 특성이 항원 결합 표면내의 중쇄 및 경쇄 CDR 세트의 구조 및 상대적 배치에 의해 본질적으로 결정된다는 이해에 기초한 것이다[문헌참조: Davies et al. (1990) Ann. Rev. Biochem. 59:439-473]. 따라서, 항원 결합 특이성은 CDR 구조, 이들 서로간의 상호작용 및 V 영역 도메인의 나머지와의 이들의 상호작용이 철저하게 유지되는 사람화 항체에서만 보존될 수 있다. 베니어링 기법을 사용하여, 면역계와 쉽게 접하는 외부(예를 들어, 용매-접근가능한) FR 잔기를 사람 잔기와 선택적으로 치환시켜, 약하게면역원성이거나 실질적으로 비면역원성인 베니어링된 표면을 포함하는 하이브리드 분자를 제공할 수 있다.
베니어링 공정은 문헌[참조: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed., U.S. Dept. of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1987]에서 카벳(Kabat) 등에 의해 축적된 사람 항체 가변 도메인에 대한 입수가능한 서열 데이터, 카벳 데이터베이스의 갱신물 및 다른 입수용이한 미국 및 외국 데이터베이스(핵산 및 단백질 데이터베이스 모두)를 이용한다. V 영역 아미노산의 용매 접근가능성은 사람 및 마우스의 항체 단편에 대한 공지의 3차원 구조로부터 추론할 수 있다. 마우스의 항원 결합 부위를 베니어링하는데에는 일반적인 2단계를 이용한다. 먼저, 당해의 항체 분자의 가변 도메인의 FR을 전술한 공급원으로부터 수득된 사람 가변 도메인의 상응하는 FR 서열과 비교한다. 다음, 가장 상동성인 사람 V 영역을 상응하는 마우스 아미노산과 잔기끼리 비교한다. 사람의 대응물과 상이한 마우스의 FR내 잔기를 당해 기술 분야에 익히 공지된 재조합 기법으로 사람 부분에 존재하는 잔기로 치환시킨다. 잔기 스위칭은 적어도 부분적으로 노출된(용매 접근가능한) 유전자 부분만을 사용하여 수행하고, V 영역 도메인의 3차 구조에 유의한 효과를 미칠 수 있는 아미노산 잔기, 예를 들어, 프롤린, 글리신 및 하전을 띤 아미노산으로 치환시킨다.
이와 같은 방식으로, 생성된 "베니어링된" 마우스의 항원 결합 부위는 마우스의 CDR 잔기, CDR에 실질적으로 인접한 잔기, 매봉되거나 거의 매봉된 것으로 확인되는(용매 접근불가능한) 잔기, 중쇄 도메인과 경쇄 도메인 사이의 비공유(예를들어, 정전기적 및 소수성) 접촉에 참여하는 것으로 간주되는 잔기 및 CDR 루프의 "표준" 3차 구조에 영향을 미치는 것으로 간주되는 FR의 보존적 구조 영역으로부터의 잔기를 보유하도록 디자인한다. 다음, 이들 디자인 기준을 사용하여, 마우스의 항원 결합 부위의 중쇄 및 경쇄 둘 다의 CDR을, 마우스의 항체 분자의 항원 특이성을 나타내는 재조합 사람 항체의 발현을 위해 포유동물 세포를 형질감염시키는데 사용할 수 있는 사람-표시 FR에 결합시킨 재조합 뉴클레오타이드 서열을 제조한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명의 모노클로날 항체는 하나 이상의 치료제에 결합시킬 수 있다. 이와 관련하여 적합한 제제는 방사성핵종, 분화 유도제, 약물, 독소 및 이들의 유도체를 포함한다. 바람직한 방사성핵종은90Y,123I,125I,131I,186Re,188Re,211At 및212Bi를 포함한다. 바람직한 약물은 메토트렉세이트 및 피리미딘 및 퓨린 유사체를 포함한다. 바람직한 분화 유도제는 포르볼 에스테르 및 부티르산을 포함한다. 바람직한 독소는 리신, 아브린, 디프테리아 독소, 콜레라 독소, 젤로닌, 슈도모나스 외독소, 쉬겔라 독소 및 미국자리공 항바이러스 단백질을 포함한다.
치료제는 적합한 모노클로날 항체에 직접적으로 또는 간접적으로(예를 들어, 링커 그룹을 통해) 연결(예를 들어, 공유 결합)될 수 있다. 제제와 항체 사이의 직접적인 반응은 각각이 다른 것과 반응할 수 있는 치환체를 보유할 때 가능하다. 예를 들어, 한쪽 상의 아미노 또는 설프하이드릴 그룹과 같은 친핵성 그룹은 다른 쪽 상의 우수한 이탈 그룹(예를 들어, 할라이드)을 함유한 알킬 그룹, 또는 무수물또는 산 할라이드와 같은 카보닐-함유 그룹과 반응할 수 있다.
달리, 치료제와 항체는 링커 그룹을 통해 결합시키는 것이 바람직할 수 있다. 링커 그룹은 결합력과의 접촉을 피하기 위해 제제로부터 항체를 격리시키기 위해 스페이서로서 작용할 수 있다. 또한, 링커 그룹은 제제 또는 항체 상의 치환체의 화학적 반응성을 증대시키는 작용을 할 수 있으며, 이에 따라 결합능을 증가시켜 준다. 화학 반응성의 증가는 또한 그밖의 경우에는 불가능한 제제 또는 제제상의 작용성 그룹의 사용을 촉진할 수 있다.
호모- 및 헤테로-작용성에 상관없이 다양한 이작용성 또는 다작용성 시약(예를 들어, Pierce Chemical Co.(Rockford, IL)의 카달로그에 기술되어 있는 것)이 링커 그룹으로 사용될 수 있음은 당업자에게는 자명할 것이다. 결합은, 예를 들어, 아미노 그룹, 카복실 그룹, 설프하이드릴 그룹 또는 산화된 탄수화물 잔기를 통해 이루어질 수 있다. 이와 같은 방법에 관한 참고 문헌은 다수 있으며, 예로써 로드웰(Rodwell) 등에게 허여된 미국 특허 제4,671,958호를 들 수 있다.
치료제가 본 발명의 면역결합제의 항체 부분으로부터 유리될 때 보다 더 효과적인 경우, 세포내로 내재화하는 동안 또는 내재화할 때 절단가능한 링커 그룹을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 다수의 상이한 절단가능한 링커 그룹이 공개되어 있다. 이들 링커 그룹으로부터 제제의 세포내 방출에 대한 메카니즘은 디설파이드 결합의 환원[문헌참조: 스피틀러(Spitler)에게 허여된 미국 특허 제4,489,710호], 광분해성 결합의 방사[문헌참조: 센터(Senter) 등에게 허여된 미국 특허 제4,625,014호], 유도체화된 아미노산 측쇄의 가수분해[문헌참조: 콘(Kohn) 등에게허여된 미국 특허 제4,638,045호], 혈청 보체-매개된 가수분해[문헌참조: 로드웰 등에게 허여된 미국 특허 제4,671,958호] 및 산-촉매된 가수분해[문헌참조: 블라틀러(Blattler) 등에게 허여된 미국 특허 제4,569,789호]에 의한 분해를 포함한다.
하나 이상의 제제를 항체에 결합시키는 것이 바람직할 수 있다. 한 양태에서, 제제의 복수 분자를 하나의 항체 분자에 결합시킨다. 또 다른 양태에서, 제제의 하나 이상의 유형을 하나의 항체에 결합시킬 수 있다. 특정 양태와 상관없이, 하나 이상의 제제를 가진 면역결합체는 다양한 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 제제를 항체 분자에 직접 결합시키거나, 다수의 결합 부위를 제공하는 링커를 사용할 수 있다. 달리, 담체를 사용할 수 있다.
담체는 직접적으로 또는 링커 그룹을 통해 공유 결합을 포함한 다양한 방법으로 제제를 보유할 수 있다. 적합한 담체는 알부민[문헌참조: 카토(Kato) 등에게 허여된 미국 특허 제4,507,234호]과 같은 단백질, 펩타이드 및 아미노덱스트란[문헌참조: 시흐(Shih) 등에게 허여된 미국 특허 제4,699,784호]과 같은 다당류를 포함한다. 담체는 또한 리포좀 소포내에서와 같은 캡슐화 또는 비공유 결합에 의해 제제를 함유할 수 있다[문헌참조: 미국 특허 제4,429,008호 및 제4,873,088호]. 방사성핵종 제제에 특이적인 담체는 방사능 할로겐화 소분자 및 킬레이트화 화합물을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제4,735,792호에는 예시적인 방사능 할로겐화 소분자 및 이들의 합성법이 개시되어 있다. 방사성핵종 킬레이트제는 금속 또는 금속 산화물, 방사성핵종을 결합시키기 위한 공여 원자로서 질소 및 황 원자를 함유하는 것을 포함하는 킬레이트화 화합물로부터 형성될 수 있다. 예를 들어, 데이비슨(Davison) 등에게 허여된 미국 특허 제4,673,562호에는 예시적인 킬레이트화 화합물 및 이들의 합성법이 개시되어 있다.
T 세포 조성물
본 발명은 또 다른 국면에서 본원에 개시된 Her-2/neu 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 또는 유도체에 대해 특이적인 T 세포를 제공한다. 한 바람직한 양태에서, T 세포는 서열 3에 제시된 Her-2/neu 펩타이드에 특이적이다. 이러한 세포는 일반적으로 표준 절차를 사용하여 시험관내 또는 생체내에서 제조할 수 있다. 예를 들어, T 세포는 Isolex™ 시스템(구입원: Nexell Therapeutics, Inc.)과 같은 세포 분리 시스템 시판품을 사용하여 환자의 골수, 말초혈, 또는 골수 또는 말초혈의 분획으로부터 분리할 수 있다[문헌참조: Irvine, 미국 특허 제5,240,856호, 미국 특허 제5,215,926호, 제WO 89/06280호, 제WO 91/16116호 및 제WO 92/07243호]. 달리, T 세포는 관련되거나 무관한 사람, 비사람 동물, 세포주 또는 배양물로부터 유래할 수 있다.
T 세포는 종양 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 이러한 폴리펩타이드를 발현시키는 항원 제공 세포(APC)로 자극할 수 있다. 이러한 자극은 폴리펩타이드에 대해 특이적인 T 세포를 생성하기에 충분한 조건하에 및 시간 동안 실시한다. 바람직하게는, 종양 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 특이적인 T 세포의 생성을 촉진하기 위해 미소구와 같은 전달 비히클내에 존재한다.
T 세포가 종양 폴리펩타이드로 피복된 표적 세포 또는 상기 폴리펩타이드를암호화하는 유전자를 발현시키는 표적 세포를 특이적으로 증식시키거나, 분비하거나 사멸시킬 경우, 이는 종양 폴리펩타이드에 대해 특이적인 것으로 간주된다. T 세포 특이성은 임의의 다양한 표준 기술을 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 크롬 방출 검정법 또는 증식 검정법에서, 용해 및/또는 증식에 있어서 네가티브 대조군에 비하여 2배 이상 증가의 자극 지수는 T 세포 특이성을 가리킨다. 이러한 검정법은, 예를 들어, 문헌[참조: Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994]에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다. 달리, T 세포의 증식의 검출은 다양한 공지된 기법에 의해 달성할 수 있다. 예를 들어, T 세포 증식은 DNA 합성의 증가 속도를 측정함으로써(예를 들어, T 세포의 배양물을 삼중수소화 티미딘으로 펄스-표지시키고, DNA내로 삽입된 삼중수소화 티미딘의 양을 측정함으로써) 검출할 수 있다. 3 내지 7일 동안 종양 폴리펩타이드(100ng/ml 내지 100㎍/ml, 바람직하게는 200ng/ml 내지 25㎍/ml)와의 접촉은 전형적으로는 T 세포의 증식을 2배 이상 증가시킬 것이다. 상기한 바와 같이 2 내지 3일 동안의 접촉은 표준 사이토킨 검정을 사용하여 측정한 바와 같이, T 세포의 활성화 결과를 초래하여야 하며, 여기서, 사이토킨(예를 들어, TNF 또는 IFN-γ) 방출의 수준이 2배 증가한 것은 T 세포 활성화의 지표이다[문헌참조: Coligan et al., Current Protocols in Immunology, vol. 1, Wiley Interscience (Greene 1998)]. 종양 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 종양 폴리펩타이드-발현 APC에 대한 반응으로 활성화된 T 세포는 CD4+및/또는 CD8+일 수 있다. 종양 폴리펩타이드-특이적 T 세포는 표준 기술을 사용하여 증식시킬 수 있다. 바람직한 양태에서, T 세포는 환자 또는 관련되거나 무관한 공여자로부터 유도시켜, 자극 및 증식 후에 환자에게 투여한다.
치료 목적상, 종양 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 APC에 반응하여 증식하는 CD4+또는 CD8+T 세포는 시험관내 또는 생체내에서 수적으로 증식시킬 수 있다. 이러한 T 세포의 시험관내 증식은 다양한 방법으로 달성할 수 있다. 예를 들어, T 세포는 T 세포 성장 인자, 예를 들어, 인터류킨-2 및/또는 종양 폴리펩타이드를 합성하는 자극 세포를 첨가하거나 첨가하지 않고서 종양 폴리펩타이드에 재노출시킬 수 있다. 달리, 종양 폴리펩타이드의 존재하에 증식하는 하나 이상의 T 세포는 클로닝에 의해 수적으로 증식시킬 수 있다. 세포를 클로닝하는 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 제한 희석을 포함한다.
T 세포 수용체 조성물
T 세포 수용체(TCR)는 디설파이드 결합에 의해 결합되어 있는 T-세포 수용체 α쇄 및 β쇄로 불리는 2개의 상이한, 고도로 가변성인 폴리펩타이드 쇄로 이루어져 있다[문헌참조: Janeway, Travers, Walport. Immunobiology. Fourth Ed., 148-159. Elsevier Science Ltd/Garland Publishing. 1999]. α/ β 이종이량체 복합체는 세포 막에서 불변 CD3 쇄와 복합체를 이룬다. 이들 복합체는 MHC 분자에 결합된 특이적 항원성 펩타이드를 인식한다. TCR 특이성의 거대한 다양성은 체세포 유전자 재배열을 통해 거의 유사한 면역글로불린 다양성을 발생시킨다. β쇄 유전자는 50개을 초과하는 가변부(V), 2개의 다양성 부위(D), 10개 이상의 결합(J) 절편 및 2개의 불변 영역 절편(C)을 함유한다. α쇄 유전자는 70개를 초과하는 절편 및 60개를 초과하는 J 절편을 함유하나, D 절편은 함유하지 않으며, 1개의 C 절편을 함유한다. 흉선에서의 T 세포 발생 동안, β쇄의 D 내지 J 유전자 재배열, 이어서 DJ에 대한 V 유전자 절편 재배열이 발생한다. 이러한 기능적 VDJβ엑손을 전사시키고 스플라이싱하여, Cβ에 결합시킨다. α쇄의 경우, Vα유전자 절편을 Jα유전자 절편에 대해 재배열하여, 기능적 엑손을 생성시킨 다음, Cα에 전사시키고 스플라이싱한다. 다양성은 β쇄의 V, D 및 J 절편 사이 및 α쇄에서의 V 및 J 절편 사이의 P 및 N-뉴클레오타이드의 무작위 첨가에 의해 재조합 공정 동안 추가로 증가시킨다[문헌참조: Janeway, Travers, Walport. Immunobiology. Fourth Ed., 98 and 150. Elsevier Science Ltd/Garland Publishing. 1999].
본 발명은 다른 국면에서 본원에 개시된 Her-2/neu 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 또는 유도체에 대해 특이적인 T 세포를 제공한다. 특히, 본 발명은 제공된 TCR의 특이성을 결정하는 VJ 또는 VDJ 결합 서열에 대한 핵산 및 아미노산 서열을 제공한다. 예를 들어, Her-2/Neu 펩타이드에 특이적인 TCR을 암호화하는 cDNA를 표준 분자 생물학적 및 재조합 DNA 기법을 이용하여 Her-2/Neu 폴리펩타이드에 특이적인 T 세포로부터 분리할 수 있다.
본 발명은 또한 적합한 포유동물 숙주 세포, 예를 들어, 본원에 개시된 Her-2/Neu 폴리펩타이드에 특이적인 TCR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 형질감염되어, Her-2/Neu 폴리펩타이드에 특이적인 숙주 세포를 만드는 비특이적 T 세포를제공한다. TCR의 α 및 β쇄는 별개의 발현 벡터 또는 달리 내부 진입 부위(IRES)의 유전자 하류의 캡-독립적 해독을 위한 IRES를 또한 함유하는 단일 발현 벡터에 함유될 수 있다. Her-2/Neu 폴리펩타이드에 특이적인 TCR을 발현시키는 상기 숙주 세포는 아래에 상세하게 논의된 바와 같은 Her-2/Neu-관련된 악성 종양의 채용된 면역요법에 사용할 수 있다.
본 발명의 추가의 국면에서, 본원에 인용된 Her-2/Neu 폴리펩타이드에 특이적인 클로닝된 TCR은 Her-2/Neu-관련된 암의 진단을 위한 키트에 사용할 수 있다. 예를 들어, Her-2/Neu-관련된 종양-특이적 TCR의 핵산 서열 또는 이의 부분은 생물학적 샘플에서 특이적인 TCR을 암호화하는 재배열된 유전자의 발현의 검출을 위한 프로브 또는 프라이머로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 Her-2/Neu 폴리펩타이드에 특이적인 TCR을 암호화하는 메신저 RNA 또는 DNA를 검출하기 위한 검정법을 제공한다.
약제학적 조성물
추가의 양태에서, 본 발명은 세포 또는 동물에 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료제의 사용과 함께 투여하기 위한 약제학적으로 허용되는 용액 중의 본원에 개시된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, T-세포 및/또는 항체 조성물의 제형에 관한 것이다.
본원에 개시된 조성물은 필요한 경우 다른 제제, 예를 들어, 다른 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 다양한 약제학적으로 활성인 제제와 함께 투여할 수 있다는 것은 이해될 것이다. 사실, 추가의 제제가 표적 세포 또는 숙주 조직과의 접촉에유의적으로 유해하게 작용하지 않는 한 추가로 포함시킬 수 있는 다른 성분에 대한 제한은 실질적으로 없다. 따라서, 당해 조성물은 특정 사례에서 필요로 하는 다양한 다른 제제와 함께 전달할 수 있다. 이러한 조성물은 숙주 세포 또는 다른 생물학적 공급원으로부터 정제할 수 있거나, 달리 본원에 기술된 바와 같이 화학적으로 합성할 수 있다. 마찬가지로, 이러한 조성물은 또한 치환되거나 유도체화된 RNA 또는 DNA 조성물을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 국면에서, 본원에 기술된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 항체 및/또는 T-세포 조성물을 생리학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 특정의 바람직한 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 예방학적 및 치료학적 백신용으로 사용하기 위한 본 발명의 면역학적 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드 조성물을 포함한다. 백신 제제는 일반적으로 문헌[참조: M.F. Powell and M.J. Newman, eds., "Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach)," Plenum Press (NY, 1995)]에 기술되어 있다. 일반적으로, 이러한 조성물은 하나 이상의 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드 조성물을 하나 이상의 면역자극제와 함께 포함할 것이다.
본원에 기술된 임의의 약제학적 조성물은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 약제학적으로 허용되는 염을 함유할 수 있다는 것은 명백할 것이다. 이러한 염은, 예를 들어, 유기 염기(예를 들어, 1차, 2차 및 3차 아민과 염기성 아미노산과의 염) 및 무기 염기(예를 들어, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘및 마그네슘 염)를 포함한 약제학적으로 허용되는 무독성 염기로부터 제조할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명의 예시적인 면역원성 조성물(예를 들어, 백신 조성물)은 폴리펩타이드가 동일 반응계에서 발생하도록 하나 이상의 상기한 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 포함한다. 위에서 주지된 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드는 당업자에게 공지된 임의의 다양한 전달 시스템으로 투여할 수 있다. 사실, 다수의 유전자 전달 기법이 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[참조: Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, 1998] 및 본원에 인용된 참고문헌에 기술되어 있다. 적합한 폴리뉴클레오타이드 발현 시스템은 물론 환자의 체내에서 발현하는데 필요한 DNA 조절 서열(예를 들어, 적합한 프로모터 및 종결 시그날)을 함유한다. 달리, 세균 전달 시스템은 폴리펩타이드의 면역원성 부분을 이의 세포 표면에서 발현시키거나 이러한 에피토프를 분비하는 세균(예를 들어, 바실러스-칼메트-구에린)의 투여를 포함할 수 있다.
따라서, 특정한 양태에서, 본원에 기술된 면역원성 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 다수의 공지된 바이러스계 시스템을 사용하여 적합한 포유동물 숙주 세포내로 도입한다. 한 예시적인 양태에서, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위해 편리하고 효과적인 기반을 제공한다. 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 특정 뉴클레오타이드 서열은 당해 분야에 공지된 기법을 이용하여 벡터내로 삽입하고, 레트로바이러스 입자에 팩키징시킬 수 있다. 다음, 재조합 바이러스를 분리하여, 피검체에게 전달할 수 있다. 다수의 예시적인 레트로바이러스시스템이 기술되어 있다[문헌참조예: 미국 특허 제5,219,740호; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al., (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; 및 Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109].
또한, 다수의 예시적인 아데노바이러스계 시스템이 또한 기술되어 있다. 숙주 게놈내로 통합된 레트로바이러스와는 달리, 아데노바이러스는 염색체외에 존재하며, 이에 따라 삽입에 의한 돌연변이 유발과 관련된 위험은 최소화한다[문헌참조: Haj-Ahmad and Graham (1986) J. Virol. 57:267-274; Bett et al. (1993) J. Virol. 67:5911-5921; Mittereder et al. (1994) Human Gene Therapy 5:717-729; Seth et al. (1994) J. Virol. 68:933-940; Barr et al.(1994) Gene Therapy 1:51-58; Berkner, K.L. (1988) BioTechniques 6:616-629; 및 Rich et al. (1993) Human Gene Therapy 4:461-476].
다양한 아데노-관련된 바이러스(AAV) 벡터 시스템이 또한 폴리뉴클레오타이드 전달을 위해 개발되었다. AAV 벡터는 당해 분야에 익해 공지된 기법을 이용하여 용이하게 작제할 수 있다[문헌참조: 미국 특허 제5,173,414호 및 5,139,941호; 국제 특허 공개 공보 제WO 92/01070호 및 제WO 93/03769호; Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B.J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. andImmunol. 158:97-129; Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling and Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169; 및 Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179:1867-1875].
유전자 전달에 의해 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 전달하는데 유용한 추가의 바이러스 벡터는 백시니아 바이러스 및 조류 수두바이러스와 같은 수두 바이러스 계열로부터 유래된 것을 포함한다. 예를 들어, 새로운 분자를 발현하는 백시니아 바이러스 재조합체를 다음과 같이 작제할 수 있다. 먼저, 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 이것이 백시니아 프로모터 및 플랭킹 백시니아 DNA 서열, 예를 들어, 티미딘 키나제(TK)를 암호화하는 서열에 인접하도록 적합한 벡터내로 삽입한다. 다음, 당해 벡터를 사용하여 세포를 감염시켜, 세포를 동시에 백시니아로 감염시킨다. 상동 재조합을 이용하여 백시니아 프로모터와 함께 해당 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 바이러스 게놈내로 삽입시킬 수 있다. 생성된 TK.sup.(-) 재조합체는 세포를 5-브로모데옥시우리딘의 존재하에서 배양하고, 이에 대해 내성인 바이러스 플라크를 선택함으로써 선별할 수 있다.
백시니아계 감염/형질감염 시스템은 유기체의 숙주 세포에서 본원에 기술된 하나 이상의 폴리펩타이드의 유도성, 일시성 발현 또는 공발현을 제공하는데 편리하게 사용할 수 있다. 당해 특정 시스템에서, 세포를 우선 시험관내에서 박테리오파아지 T7 RNA 폴리머라제를 암호화하는 백시니아 바이러스 재조합체로 감염시킨다. 당해 폴리머라제는 단지 T7 프로모터를 갖는 주형만을 전사시킨다는 점에서 특이성을 나타낸다. 감염 후, 세포를 T7 프로모터에 의해 구동되는 해당 폴리뉴클레오타이드로 감염시킨다. 백시니아 바이러스 재조합체로부터 세포질내에 발현된 폴리머라제를 감염된 DNA를 RNA로 전사시킨 다음, RNA를 숙주 해독 기작에 의해 폴리펩타이드로 해독시킨다. 당해 방법은 다량의 RNA 및 이의 해독 산물의 고수준의 일시적 세포질내 생성을 제공한다[문헌참조: Elroy-Stein and Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1990) 87:6743-6747; Fuerst et al. Proc. Natl. Sci. USA (1986) 83:8122-8126].
달리, 계두 및 카나리폭스 바이러스와 같은 아비폭스바이러스를 또한 해당 암호화 서열을 전달하기 위해 사용할 수 있다. 포유동물 병원체로부터의 면역원을 발현시키는 재조합 아비폭스바이러스는 비조류 종에 투여될 때 보호 면역성을 제공하는 것으로 공지되어 있다. 아비폭스 벡터의 사용은 특히 사람 및 기타 포유동물 종에서 바람직한데, 이는 아비폭스 속의 구성원이 민감성 조류 종에서만이 풍부하게 복제할 수 있고, 이에 따라 포유동물 세포에는 감염되지 않기 때문이다. 재조합 아비폭스 바이러스를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 백시니아 바이러스의 제조와 관련하여 상기된 바와 같이 유전자 재조합을 사용한다[문헌참조: 제WO 91/12882호; 제WO 89/03429호; 및 제WO 92/03545호].
임의의 다수의 알파바이러스 벡터를 또한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 조성물의 전달에 사용할 수 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제5,843,723호, 제6,015,686호, 제6,008,035호 및 제6,015,694호에 기술된 벡터이다. 베네주엘라 말 뇌염(VEE)을 기초로 한 특정 벡터를 또한 사용할 수 있으며, 이의 대표적인 예는 미국 특허 제5,505,947호 및 제5,643,576호에서 찾아볼 수 있다.
또한, 문헌[참조: Michael et al. J. Biol. Chem. (1993) 268:6866-6869 및 Wagner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:6099-6103]에 기술된 아데노바이러스 키메라 벡터와 같은 분자 결합 벡터가 또한 본 발명하에 유전자 전달을 위해 사용할 수 있다.
이들 및 기타 공지된 바이러스계 전달 시스템에 관한 추가의 예시적인 정보는 문헌[참조: Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321, 1989; Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8:17-21, 1990; 미국 특허 제4,603,112호, 제4,769,330호 및 제5,017,487호; 제WO 89/01973호; 미국 특허 제4,777,127호; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO91/02805; Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252:431-434, 1991; Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219, 1994; Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498-11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88:2838-2848, 1993; 및 Guzman et al., Cir. Res. 73:1202-1207, 1993]에서 찾아볼 수 있다.
특정한 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 표적 세포의 게놈내로 통합할 수 있다. 이러한 통합은 상동 재조합(유전자 치환)을 통해 특정 위치 및 배향으로 존재할 수 있거나, 이는 무작위 비특이적 위치(유전자 증대)로 통합될 수 있다. 또 다른 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 DNA의 별개 에피좀 단편으로서 세포내에 안정하게 유지될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드 단편 또는 "에피좀"은 숙주 세포 주기와 독립적으로 또는 숙주 세포 주기와 동시에 유지 및 복제를 허용하기에충분한 서열을 암호화한다. 발현 작제물이 세포에 전달되고 세포에서 폴리뉴클레오타이드가 유지되는 방식은 사용된 발현 작제물의 유형에 의존한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 문헌[참조: Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993 및 Cohen, Science 259:1691-1692, 1993]에 기술되고 개설된 바와 같이 "나출형" DNA로서 투여하고/전달한다. 나출형 DNA의 유입은 세포내로 효율적으로 이송되는 DNA를 생체분해성 비드에 피복시킴으로써 증가시킬 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 입자 충격 방식을 통해 전달할 수 있으며, 이 가운데 다수가 기술되어 있다. 한 대표적인 예로써, 가스-구동된 입자 가속은 파우더젝트 파마슈티칼스 피엘씨(Powderject Pharmaceuticals PLC; Oxford, UK) 및 파우더젝트 백신즈 인코포레이티드(Powderject Vaccines Inc.; Madison, WI)에 의해 제조된 것과 같은 장치로 달성할 수 있으며, 이 가운데 몇몇은 미국 특허 제5,846,796호, 제6,010,478호, 제5,865,796호, 제5,865,807호 및 유럽 특허 제0500 799호에 기술되어 있다. 이러한 방식은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 입자와 같은 미세 입자의 무수 산제를 휴대용 장치로 발생된 헬륨 가스 제트내에서 고속으로 가속시키고, 입자를 해당 표적 조직내로 추진시키는 니들-비함유 전달 방식을 제공한다.
관련된 양태에서, 본 발명의 조성물의 가스-구동된 니들-비함유 주사에 유용할 수 있는 다른 장치 및 방법은 바이오젝트, 인코포레이티드(Bioject, Inc.; Portland, OR)에 의해 제공된 것을 포함하며, 이 가운데 몇몇은 미국 특허제4,790,824호, 제5,064,413호, 제5,312,335호, 제5,383,851호, 제5,399,163호, 제5,520,639호 및 제5,993,412호에 기술되어 있다.
또 다른 양태에 따라, 본원에 기술된 약제학적 조성물은 본 발명의 면역원성 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 항체, T-세포 및/또는 APC 조성물 이외에 하나 이상의 면역자극제를 함유한다. 면역자극제는 외인성 항원에 대한 (항체 및/또는 세포-매개된) 면역 반응을 증강시키거나 강화시키는 물질을 가리킨다. 면역자극제의 한 가지 바람직한 유형은 애쥬반트를 포함한다. 다수의 애쥬반트는 신속한 신진대사로부터 항원을 보호하도록 고안된 물질, 예를 들어, 수산화알루미늄 또는 광유, 및 면역 반응 자극제, 예를 들어, 지질 A, 보르타델라 페르투시스(Bortadella pertussis) 또는 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 유도된 단백질을 함유한다. 특정 애쥬반트가 시판되고 있으며, 예로는 프로인트 불완전 애쥬반트 및 완전 애쥬반트(Difco Laboratories; Detroit, MI); 머크 애쥬반트 65(Merck and Company, Inc.; Rahway, NJ); AS-2(SmithKline Beecham; Philadelphia, PA); 알루미늄 염, 예를 들어, 수산화알루미늄 겔(칼륨명반) 또는 인산알루미늄; 칼슘, 철 또는 아연의 염; 아실화된 티로신의 불용성 현탁액; 아실화된 당; 양이온적으로 또는 음이온적으로 유도체화된 다당류; 폴리포스파젠; 생체분해성 미세구체; 모노포스포릴 지질 A 및 퀼 A이다. 사이토킨, 예를 들어, GM-CSF, 인터류킨-2, -7, -12 및 기타 유사한 성장 인자를 또한 애쥬반트로서 사용할 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 보조 조성물은 바람직하게는 Th1 유형의 면역 반응을 우세하게 유도하는 것이다. 고수준의 Th1-유형 사이토킨(예를 들어, IFN-γ, TNFα, IL-2 및 IL-12)은 투여된 항원에 대해 세포 매개된 면역 반응의 유도를 조력하는 경향이 있다. 대조적으로, 고수준의 Th2-유형 사이토킨(예를 들어, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10)은 체액성 면역 반응의 유도를 조력하는 경향이 있다. 본원에 제공된 바와 같은 백신의 적용 후, 환자는 Th1- 및 Th2-유형 반응을 포함한 면역 반응을 지지할 것이다. 반응이 우세하게 Th1-유형인 바람직한 양태에서, Th1-유형 사이토킨의 수준은 Th2-유형 사이토킨의 수준보다 더 많은 정도로 증가한다. 이들 사이토킨의 수준은 표준 검정을 사용하여 용이하게 평가할 수 있다. 사이토킨의 부류의 개관을 위해서는 문헌[참조: Mosmann and Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989]을 참고한다.
Th1-유형 반응을 우세하게 유도하는 특정의 바람직한 애쥬반트는, 예를 들어, 모노포스포릴 지질 A, 바람직하게는 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A와 알루미늄 염과의 혼합물을 포함한다. MPLR애쥬반트가 코릭사 코포레이션(Corixa Corporation; Seattle, WA)[문헌참조: 미국 특허 제4,436,727호, 제4,877,611호, 제4,866,034호 및 제4,912,094호]에서 구입가능하다. CpG-함유 올리고뉴클레오타이드(여기서, CpG 디뉴클레오타이드는 비메틸화되어 있음)가 또한 Th1 반응을 우세하게 유도한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 익히 공지되어 있으며, 예를 들어, 제WO 96/02555호, 제WO 99/33488호 및 미국 특허 제6,008,200호 및 제5,856,462호에 기술되어 있다. 면역자극성 DNA 서열은 또한 문헌[참조: Sato etal., Science 273:352, 1996]에 기술되어 있다. 또 다른 바람직한 애쥬반트는 사포닌(예를 들어, Quil A) 또는 QS21 및 QS7를 포함한 이의 유도체(Aquila Biopharmaceuticals Inc.; Framingham, MA); 에스신; 디지토닌; 또는 깁소필라(Gypsophila) 또는 체노포듐 퀴노아(Chenopodium quinoa) 사포닌을 포함한다. 다른 바람직한 제형은 본 발명의 애쥬반트 배합물, 예를 들어, QS21, QS7, Quil A, β-에스신 또는 디지토닌을 포함하는 그룹 중 2개 이상의 배합물에 하나 이상의 사포닌을 포함한다.
달리, 사포닌 제형은 키토산 또는 다른 다가양이온성 중합체, 폴리락타이드 및 폴리락타이드-코-글리콜라이드 입자, 폴리-N-아세틸 글루코스아민계 중합체 매트릭스, 다당류 또는 화학적으로 변형된 다당류로 구성된 입자, 리포좀 및 지질계 입자, 글리세롤 모노에스테르로 구성된 입자로 이루어진 백신 비히클과 배합할 수 있다. 사포닌을 또한 콜레스테롤의 존재하에 제형화시켜, 리포좀 또는 ISCOM과 같은 미세 구조를 형성시킬 수 있다. 또한, 사포닌을 비입자성 용액 또는 현탁액에서 또는 파우시라멜라 리포좀 또는 ISCOM과 같은 미립 구조에서 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르와 함께 제형화시킬 수 있다. 사포닌은 또한 CarbopolR과 같은 부형제와 제형화시킬 수 있거나, 점성을 증가시키거나 락토즈와 같은 분말 부형제와 함께 무수 산제 형태로 제형화시킬 수 있다.
한 바람직한 양태에서, 애쥬반트 시스템은 모노포스포릴 지질 A와 사포닌 유도체와의 배합물, 예를 들어, WO94/00153에 기술된 QS21과 3D-MPLR애쥬반트와의 배합물 또는 WO96/33739에 기술된 바와 같이 QS21이 콜레스테롤로 급냉된 보다 덜 반응원성인 조성물을 포함한다. 다른 바람직한 제형은 수중유 에멀젼 및 토코페롤을 포함한다. 수중유 에멀젼에 QS21, 3D-MPLR애쥬반트 및 토코페롤을 사용한 특히 바람직한 다른 애쥬반트 제형이 WO95/17210호에 기술되어 있다.
또 다른 증강된 애쥬반트 시스템은 CpG-함유 올리고뉴클레오타이드와 사포닌 유도체와의 배합물, 특히 제WO 00/09159에 개시되어 있는 바와 같은 CpG와 QS21의 배합물을 포함한다. 바람직하게는, 당해 제형은 추가로 수중유 에멀젼과 토코페롤을 포함한다.
본 발명의 조성물에 사용하기 위한 추가의 예시적인 애쥬반트는 Montanide ISA 720(Seppic, France), SAF(Chiron, California, United States), ISCOMS(CSL), MF-59(Chiron), 애쥬반트의 SBSA 시리즈(예를 들어, SBAS-2 또는 SBAS-4, 구입원: SmithKline Beecham; Rixensart, Belgium), Detox(EnhanzynR)(Corixa, Hamilton, MT), RC-529(Corixa, Hamilton, MT) 및 전체 내용이 본원에 참고로 인용된 계류중인 미국 특허원 제08/853,826호 및 제09/074,720호에 기술된 바와 같은 기타 아미노알킬 글루코스아미니드 4-포스페이트(AGP) 및 제WO 99/52549A1호에 기술된 바와 같은 폴리옥시에틸렌 에테르 애쥬반트를 포함한다.
다른 바람직한 애쥬반트는 다음 화학식 I의 애쥬반트 분자를 포함한다:
HO(CH2CH2O)n-A-R
상기식에서,
n은 1 내지 50이고,
A는 결합 또는 -C(O)-이고,
R은 C1-50알킬 또는 페닐 C1-50알킬이다.
본 발명의 한 양태는 화학식 I의 폴리옥시에틸렌 에테르(여기서, n은 1 내지 50, 바람직하게는 4 내지 24, 가장 바람직하게는 9이고; R은 C1-50, 바람직하게는 C4-20알킬, 가장 바람직하게는 C12알킬이고; A는 단일 결합이다)를 포함하는 백신 제형으로 구성된다. 폴리옥시에틸 에테르의 농도는 0.1 내지 20%의 범위, 바람직하게는 0.1 내지 10%, 가장 바람직하게는 0.1 내지 1%의 범위이어야 한다. 바람직한 폴리옥시에틸렌 에테르는 하기 그룹으로부터 선택된다: 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-9-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-8-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸-4-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-35-라우릴 에테르 및 폴리옥시에틸렌-23-라우릴 에테르. 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르와 같은 폴리옥시에틸렌 에테르는 머크 인덱스(12thedition: entry 7717)에 기술되어 있다. 이들 애쥬반트 분자는 제WO 99/52549호에 기술되어 있다.
상기 화학식 I에 따르는 폴리옥시에틸렌 에테르는 필요한 경우 다른 애쥬반트와 배합할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 애쥬반트 배합물은 바람직하게는 계류중인 영국 특허원 제9820956.2호에 기술된 바와 같이 CpG와 배합한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본원에 기술된 면역원성 조성물은 항원제공 세포(APC), 예를 들어, 수지상 세포, 대식세포, B 세포, 단핵세포 및 효율적인 APC가 되도록 공학적으로 조작될 수 있는 기타 세포를 통해 숙주에 전달할 수 있다. 이러한 세포는 반드시 필요한 것은 아니지만, 항원을 제시하는 능력을 증가시키고, T 세포 반응의 활성화 및/또는 유지를 향상시키며, 항-종양 효과 자체를 가지고/가지거나 수용체에게 면역학적으로 적합할 수 있도록(즉, 정합된 HLA 일배체형) 변형시킬 수 있다. APC는 일반적으로 다양한 생물학적 체액 및 기관으로부터 분리할 수 있으며, 자가, 동종이형, 유전자동계형 또는 이종 세포일 수 있다.
본 발명의 특정한 바람직한 양태는 항원 제공 세포로서 수지상 세포 또는 이의 선조 세포를 이용한다. 수지상 세포는 고도로 효능적인 APC이며[문헌참조: Banchereau and Steinman, Nature 392:245-251, 1998], 예방 또는 치료학적 항종양 면역성을 나타내기 위한 생리학적 애쥬반트로서 효과적인 것으로 제시되어 있다[문헌참조: Timmerman and Levy, Ann. Rev. Med. 50:507-529, 1999]. 일반적으로, 수지상 세포는 이들의 전형적인 모양[원위치에서 방사상, 시험관내에서 뚜렷한 세포질 돌기(수지상 돌기)가 가시화], 이들의 수용 능력, 고도의 효율을 갖는 과정 및 존재하는 항원 및 천연 T 세포 반응을 활성화하는 능력을 기준으로 하여 동정할 수 있다. 수지상 세포는 물론 생체내 또는 생체외에서 수지상 세포에서 흔히 발견되지 않는 특이적 세포-표면 수용체 또는 리간드를 발현하도록 공학적으로 조작할 수 있으며, 이와 같이 변형된 수지상 세포는 본 발명에 의해 고려된다. 수지상 세포의 대안으로서, 분비된 소포 항원-부하된 수지상 세포(소위 엑소좀)를 백신내에서 사용할 수 있다[문헌참조: Zitvogel et al., Nature Med. 4:594-600, 1998].
수지상 세포 및 선조 세포는 말초혈, 골수, 종양-침윤 세포, 종양 주변 조직-침윤 세포, 림프절, 비장, 피부, 제대혈 또는 기타 다른 적합한 조직 또는 체액으로부터 채취할 수 있다. 예를 들어, 수지상 세포는 말초혈로부터 수확된 단핵세포의 배양물에 GM-CSF, IL-4, IL-13 및/또는 TNFα와 같은 사이토킨의 배합물을 가함으로써 생체외에서 분화시킬 수 있다. 달리, 말초혈, 제대혈 또는 골수로부터 수확한 CD34 양성 세포를 GM-CSF, IL-3, TNFα, CD40 리간드, LPS, flt3 리간드 및/또는 수지상 세포의 성숙 및 증식을 유도하는 기타 화합물(들)의 배합물을 배양 배지에 첨가함으로써 수지상 세포로 분화시킬 수 있다.
수지상 세포는 통상적으로 "미성숙" 및 "성숙" 세포로 분류되는데, 이러한 분류는 2개의 잘 특성화된 표현형을 구분할 수 있는 간단한 방법을 제공해 준다. 그러나, 이러한 분류법이 분화의 모든 가능한 중간 단계를 배제하는 것으로 해석되어서는 안된다. 미성숙 수지상 세포는 항원 흡수 및 처리에 대한 고도의 능력을 가진 APC로서 특징지워지며, 이는 Fcγ 수용체 및 만노즈 수용체의 고도의 발현과 상관관계가 있다. 성숙 표현형은 전형적으로 이러한 마커의 보다 낮은 발현 및 I형 및 II형 MHC, 흡착 분자(예를 들어, CD54 및 CD11) 및 공자극 분자(예를 들어, CD40, CD80, CD86 및 4-1BB)와 같이 T 세포 활성화를 담당하는 세포 표면 분자의 높은 발현에 의해 특징지워진다.
APC는 일반적으로 본 발명의 폴리뉴클레오타이드(또는 이의 일부 또는 다른 변이체)로 형질감염시킬 수 있으며, 이에 따라 항원 또는 이의 면역원성 부분을 세포 표면상에서 발현시킨다. 이와 같은 형질감염은 생체외에서 발생할 수 있으며,이러한 형질감염 세포를 함유한 조성물 또는 백신은 본원에 기술된 바와 같이 치료용으로 사용할 수 있다. 달리, 수지상 또는 다른 항원 제공 세포를 표적화하는 유전자 전달 비히클을 환자에게 투여할 수 있으며, 결과적으로 생체내에서 형질감염이 이루어진다. 수지상 세포의 생체내 또는 생체외 형질감염은, 예를 들어, 일반적으로 제WO 97/24447호에 기술된 방법 또는 문헌[참조: Mahvi et al., Immunology and cell Biology 75:456-460, 1997]에 기술된 유전자 건 방법과 같은 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 수지상 세포의 항원 부하는 수지상 세포 또는 선조 세포를 폴리펩타이드, DNA(나출형 또는 플라스미드 벡터내) 또는 RNA와 함께 배양하거나, 항원-발현 재조합 세균 또는 바이러스(예를 들어, 백시니아, 계두, 아데노바이러스 또는 렌티바이러스 벡터)와 함께 배양하여 달성할 수 있다. 부하하기 전에 폴리펩타이드는 T 세포 조력을 제공하는 면역학적 파트너(예를 들어, 담체 분자)에 공유적으로 연결시킬 수 있다. 달리, 수지상 세포를 비결합된 면역학적 파트너로 별도로 또는 폴리펩타이드의 존재하에서 펄스시킬 수 있다.
본 발명의 조성물에 당업자에게 공지된 임의의 적합한 담체를 사용할 수 있는 한편, 담체의 종류는 전형적으로 투여 방식에 따라 다양하다. 본 발명의 조성물은, 예를 들어, 국소, 경구, 비내, 점막내, 정맥내, 두개골내, 복강내, 피하 및 근육내 투여를 포함한 임의의 적합한 투여 방식에 대해 제형화시킬 수 있다.
약제학적 조성물에 사용하기 위한 담체는 생체적합성이고, 또한 생체분해성일 수 있다. 특정한 양태에서, 제형은 바람직하게는 비교적 일정한 수준의 활성 성분 방출을 제공한다. 그러나, 다른 양태에서, 투여시 보다 신속한 방출이 바람직할 수 있다. 이러한 조성물의 제형은 공지 기술을 이용하는 당업자의 수준에 속한다. 이와 관련하여 유용한 대표적인 담체는 폴리(락타이드-코-글리코라이드), 폴리아크릴레이트, 라텍스, 전분, 셀룰로즈, 덱스트란 등의 미세입자를 포함한다. 다른 예시적인 지연 방출 담체는 비액체 친수성 코어(예를 들어, 가교된 다당류 또는 올리고당류) 및 임의로 인지질과 같은 양쪽성 화합물을 포함한 외층을 포함한 거대분자 바이오벡터를 포함한다[문헌참조: 미국 특허 제5,151,254호 및 국제 특허 공개 공보 제WO 94/20078호, 제WO 94/23701호 및 제WO96/06638호]. 서방성 제형에 함유된 활성 화합물의 양은 이식 부위, 방출 속도 및 예상되는 기간 및 치료 또는 예방하고자 하는 증세의 성질에 의존한다.
또 다른 예시적인 양태에서, 생체분해성 미세구체(예를 들어, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)를 본 발명의 조성물에 대한 담체로서 사용한다. 적합한 생체분해성 미세구체는, 예를 들어, 미국 특허 제4,897,268호, 제5,075,109호, 제5,928,647호, 제5,811,128호, 제5,820,883호, 제5,853,763호, 제5,814,344호, 제5,407,609호 및 제5,942,252호에 기술되어 있다. 제WO 99/40934호 및 본원에 인용된 참고문헌에 기술된 바와 같은 변형된 B형 간염 코어 단백질 담체 시스템이 또한 다수의 용도에 유용할 것이다. 다른 예시적인 담체/전달 시스템은, 숙주에서 I 부류-제한된 세포독성 T 림프구 반응을 유도할 수 있는, 미국 특허 제5,928,647호에 기술된 바와 같은 미립자-단백질 복합체를 포함한 담체를 사용한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 종종 추가로 하나 이상의 완충제(예를 들어, 중성 완충 염수 또는 인산염 완충 염수), 탄수화물(예를 들어, 글루코즈, 만노즈,수크로즈 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 폴리펩타이드 또는 아미노산, 예를 들어, 글리신, 산화방지제, 살균제, 킬레이트화제, 예를 들어, EDTA 또는 글루타치온, 애쥬반트(예를 들어, 수산화알루미늄), 제형을 수용체의 혈액과 함께 등장성, 저장성 또는 약한 저장성으로 만드는 용질, 현탁화제, 증점제 및/또는 보존제를 포함할 것이다. 달리, 본 발명의 조성물은 동결건조물로서 제형화시킬 수 있다.
본원에 기술된 약제학적 조성물은 밀봉된 앰풀 또는 바이알과 같은 단일 용량 또는 수회 용량 용기에 제공될 수 있다. 이러한 용기는 전형적으로 사용시까지 제형의 무균성 및 안정성을 보존하는 방식으로 밀봉된다. 일반적으로는, 제형은 오일 또는 수성 비히클에 현탁제, 용제 또는 에멀젼으로 저장될 수 있다. 달리, 약제학적 조성물은 사용하기 직전에 무균 액체 담체의 첨가만을 필요로 하는 동결건조 상태로 저장될 수 있다.
경구, 비경구, 정맥내, 비후내 및 근육내 투여 및 제형을 포함한 다양한 치료 섭생에서 본원에 기술된 특정 조성물을 사용하기 위해 적합한 용량 및 치료 섭생의 개발은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 이의 일부는 일반적인 예시의 목적상 아래에 간단히 논의되어 있다.
특정 용도에서, 본원에 기술된 약제학적 조성물은 경구 투여를 통해 동물에 전달할 수 있다. 이러한 경우에, 이들 조성물은 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 제형화시키거나, 경질 또는 연질-쉘 젤라틴 캡슐에 밀봉하거나, 정제로 압축시키거나, 식품에 직접 혼입할 수 있다.
활성 화합물은 부형제와 함께 혼입하거나, 섭취가능한 정제, 협부 정제, 트로키제, 캡슐제, 엘릭서제, 현탁제, 시럽제, 웨이퍼제 등의 형태로 사용할 수 있다[문헌참조: Mathiowitz et al., Nature 1997 Mar 27; 386(6623):410-4; Hwang et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1998; 15(3):243-84; 미국 특허 제5,641,515호, 제5,580,579호 및 제5,792,451호]. 정제, 트로키제, 환제, 캡슐제 등은 또한 임의의 다양한 추가의 성분을 함유할 수 있으며, 예를 들어, 결합제, 예를 들어, 검 트라가칸트, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들어, 인산이칼슘; 붕해제, 예를 들어, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등; 활택제, 예를 들어, 스테아르산마그네슘; 및 감미제, 예를 들어, 수크로즈, 락토즈 또는 사카린을 첨가하거나 박하, 동록유 또는 체리향과 같은 풍미제를 첨가할 수 있다. 용량 단위형이 캡슐제인 경우, 이는 상기 유형의 물질 이외에 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 다른 재료는 피복제로서 존재하거나, 달리 용량 단위의 물리적 형태를 변형시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 환제 또는 캡슐제는 셀락, 당 또는 둘 다로 피복시킬 수 있다. 물론, 임의의 용량 단위형을 제조하는데 사용되는 임의의 재로는 약제학적으로 순수하여야 하며, 사용된 양에서 실질적으로 무독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 서방성 제제 및 제형내로 혼입할 수 있다.
전형적으로는, 이들 제형은 비록 활성 성분(들)의 퍼센트가 다양할 수 있으나, 전체 제형을 기준으로 하여 적어도 약 0.1%의 상기 화합물을 함유하며, 편리하게는 약 1 또는 2중량% 또는 용량% 내지 약 60 또는 70중량% 또는 용량% 이상일 수 있다. 물론, 각각의 치료학적으로 유용한 조성물 중의 활성 화합물(들)의 양은 적합한 용량을 화합물의 임의의 제공된 단위 용량으로 수득할 수 있는 방식으로 제조할 수 있다. 용해성, 생체이용성, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 저장 수명과 같은 요소 뿐만 아니라, 다른 약리학적 요인이 약제 제형을 제조하는 분야의 숙련가에 의해 고려될 것이며, 이러한 경우에 다양한 용량 및 치료 섭생이 바람직할 수 있다.
경구 투여의 경우, 본 발명의 조성물은 구강세정액, 치약, 협부 정제, 경구 스프레이 또는 설하 경구 투여 제형의 형태로 하나 이상의 부형제와 함께 혼입할 수 있다. 달리, 활성 성분은 붕산나트륨, 글리세린 및 중탄산칼륨을 함유한 것과 같은 경구 용액에 혼입되거나, 치약에 분산되거나 물, 결합제, 연마제, 풍미제, 발포제 및 습윤제를 포함할 수 있는 조성물에 치료학적으로 유효한 양으로 첨가할 수 있다. 달리, 당해 조성물은 설하에 위치되거나 구강내에서 용해될 수 있는 정제 또는 용액 형태를 취할 수 있다.
특정한 상황에서, 본원에 기술된 약제학적 조성물은 비경구, 정맥내, 근육내 또는 복강내로 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 방식은 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 이 가운데 몇몇은, 예를 들어, 미국 특허 제5,543,158호, 제5,641,515호 및 제5,399,363호에 기술되어 있다. 특정한 양태에서, 유리 염기 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서의 활성 화합물의 용제는 하이드록시프로필셀룰로즈와 같은 계면활성제와 적합하게 혼합된 물 중에서 제조할 수 있다. 분산제는 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 및 오일 중에서 제조할 수 있다. 통상의 저장 및 사용 조건하에서, 이들 제제는 일반적으로는 미생물의 성장을 억제하는 보존제를 함유한다.
주사용으로 적합한 대표적인 약제학적 형태는 멸균된 수성 용제 또는 분산제 및 멸균 주사 용제 또는 분산제의 즉석 제제를 위한 멸균 분말을 포함한다[문헌참조: 미국 특허 제5,466,468호]. 모든 경우에 있어서, 당해 형태는 멸균되어야 하고, 주사가 용이한 정도로 유동적이어야 한다. 제조 및 저장 조건하에서 안정하여야 하고, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 함유한 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적합한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 피복물의 사용, 분산제의 경우에 필요한 입자 크기의 유지 및/또는 계면활성제의 사용에 의해 유지시킬 수 있다. 미생물 작용의 억제는 다양한 항균 및 항진균 물질, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 촉진시킬 수 있다. 다수의 경우에, 당 또는 염화나트륨과 같은 등장성 물질을 포함하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물의 지연된 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용하여 달성할 수 있다.
한 양태에서, 수성 용제로 비경구 투여하기 위해, 용제는 필요한 경우 적합하게 완충시켜야 하며, 액체 희석제를 우선 충분한 염수 또는 글루코즈로 등장성으로 만들어야 한다. 이들 특정 수성 용제는 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시와 관련하여 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 1회 용량을 1ml의 등장성 NaCl 용액에 용해시킬 수 있으며, 1000ml의 피하 관세액에 첨가하거나 제안된 주입 부위에주사할 수 있다[문헌참조: "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 및 1570-1580]. 용량에서의 약간의 변화는 치료할 환자의 상태에 따라 필수적으로 발생할 것이다. 또한, 사람에게 투여하는 경우, 제제는 물론 바람직하게는 FDA 사무국의 생물제제 표준에 의해 요구되는 바와 같은 무균성, 발열원성 및 일반적인 안정성 및 순도 표준을 충족시킬 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본원에 기술된 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화시킬 수 있다. 약제학적으로 허용되는 예시적인 염은 (단백질의 유리 아미노 그룹과 형성되는) 산 부가 염 및 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산과 형성되는 산 부가염을 포함한다. 유리 카복실 그룹과 형성된 염은 또한 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제2철과 같은 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도할 수 있다. 제형화시 용제는 용량 제제와 일치하는 방식으로 및 치료학적으로 효과적인 양으로 투여할 것이다.
담체는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 피복제, 희석제, 항균 및 항진균 물질, 등장성 및 흡수 지연 제제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 추가로 포함할 수 있다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 물질의 사용은 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 통상적인 매질 또는 제제가 활성 성분과 혼화되지 않는 경우를 제외하고는, 치료학적 조성물에서의 이들의 사용은 고려된다. 보충적인 활성 성분을 또한 조성물에 혼입할 수 있다. 구 "약제학적으로 허용되는"은 사람에게 투여할 경우에 알레르기 또는 유사한 유해 반응을 유발하지 않는 분자 자체 및 조성물을 가리킨다.
특정한 양태에서, 약제학적 조성물은 비내 분무, 흡입 및/또는 기타 에어로졸 전달 비히클에 의해 전달할 수 있다. 유전자, 핵산 및 펩타이드 조성물을 비내 에어로졸 분무를 통해 폐로 직접 전달하는 방법이 미국 특허 제5,756,353호 및 제5,804,212호에 기술되어 있다. 또한, 비내 미세입자 수지[문헌참조: Takenage et al., J. Controlled Release 1998 Mar 2;52(1-2):81-7] 및 리소포스파티딜-글리세롤 화합물[문헌참조: 미국 특허 제5,725,871호]을 사용한 약물의 전달은 약학 분야에 익히 공지되어 있다. 또한, 폴리테트라플루오로에틸렌 지지 매트릭스의 형태로 예시적인 경점막 약물 전달이 미국 특허 제5,780,045호에 기술되어 있다.
특정한 양태에서, 리포좀, 나노캡슐, 미세입자, 지질 입자, 소포 등을 본 발명의 조성물을 적합한 숙주 세포/유기체내로 도입하는데 사용한다. 특히, 본 발명의 조성물은 지질 입자, 리포좀, 소포, 나노구체 또는 나노입자 등에 캡슐화된 형태로 제형화시킬 수 있다. 달리, 본 발명의 조성물은 담체 비히클의 표면에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합시킬 수 있다.
강력한 약물 담체로서 리포좀 및 리포좀-유사 제제의 형성 및 사용은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다[문헌참조: Lasic, Trends Biotechnol 1998 Jul;16(7):307-21; Takakura, Nippon Rinsho 1998 Mar; 56(3):691-5; Chandran et al., Indian J Exp Biol. 1997 Aug;35(8):801-9; Margalit, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1995; 12(2-3):233-61; 미국 특허 제5,567,434호, 제5,552,157호, 제5,565,213호, 제5,738,868호 및 제5,795,587호; 각 문헌의 전체 내용은 본원에참고로 상세하게 인용되어 있음].
리포좀은 T 세포 현탁액, 1차 간세포 배양물 및 PC 12 세포를 포함한 다른 절차에 의해 정상적으로 감염되기 어려운 다수의 세포 유형에 성공적으로 사용되어 왔다[문헌참조: Renneisen et al., J Biol Chem. 1990 Sep 25;265(27):16337-42; Muller et al., DNA Cell Biol. 1990 Apr;9(3):221-9]. 또한, 리포좀은 바이러스계 전달 시스템의 특징인 DNA 길이 제약을 받지 않는다. 리포좀은 유전자, 다양한 약물, 방사능 치료제, 효소, 바이러스, 전사 인자, 알로스테릭 작동인자 등을 다양한 배양 세포주 및 동물에 도입하는데 효과적으로 사용되어 왔다. 또한, 리포좀의 사용은 전신 투여 후 자가면역 반응 또는 허용되지 않는 독성과 무관한 것으로 보인다.
특정한 양태에서, 리포좀은 수성 매질 중에 분산되어 자발적으로 멀티라멜라 동심성 다중층 소포(멀티라멜라 소포(MLV)라고도 함)를 형성하는 인지질로부터 형성시킨다.
또한, 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물의 약제학적으로 허용되는 나노캅셀 제형을 제공한다. 나노캅셀제는 일반적으로 안정하고 재생가능한 방식으로 화합물을 포집할 수 있다[문헌참조: Quintanar-Guerrero et al., Drug Dev Ind Pharm. 1998 Dec;24(12):1113-28]. 세포내 중합 오버로딩으로 인한 역효과를 회피하기 위해 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 상기 초미세 입자(크기 약 0.1㎛)를 디자인할 수 있다. 당해 입자는 예를 들어, 문헌[참조: Couvreur et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1988;5(1):1-20; zur Muhlenet al., Eur J Pharm Biopharm. 1998 Mar; 45(2):149-55; Zambaux et al. J Controlled Release. 1998 Jan 2;50(1-3):30-40; 및 미국 특허 제5,145,684호]에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.
암 치료 방법
본 발명의 추가의 양태에서, 본원에 기술된 약제학적 조성물은 암 치료, 특히 유방암 및 기타 Her-2/neu-관련 악성 종양의 면역치료를 위해 사용될 수 있다. 당해 방법에서, 본원에 기술된 약제학적 조성물은 환자, 전형적으로 온혈 동물, 바람직하게는 사람에게 투여된다. 환자는 암을 앓거나 앓지 않을 수 있다. 따라서, 당해 약제학적 조성물을 사용하여 암의 진행을 예방하거나 암에 걸린 환자를 치료할 수 있다. 약제학적 조성물 및 백신은 1차 종양의 수술적 제거 및/또는 방사선 치료 약물 또는 통상적인 화학 치료 약물의 투여와 같은 치료전에 또는 치료후에 투여될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 약제학적 조성물은 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 비강내, 진피내, 항문, 질내, 국소 경로 및 경구 경로로의 투여를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 투여될 수 있다.
특정 양태 내에서, 면역치료는 치료가, 면역 반응 개질제(예를 들어, 본원에 제공되는 바와 같은 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드)의 투여와 함께 종양에 대해 반응하는 내인성 숙주 면역계의 생체내 자극에 의존하는 능동 면역치료일 수 있다.
또 다른 양태내에서, 면역 치료는 치료가, 확립된 종양 면역 반응성을 갖고 직간접적으로 항종양 효과를 매개할 수 있고 반드시 온전한 숙주 면역계에 의존하지 않는 제제(예를 들어, 작동세포 또는 항체)의 투여를 포함하는 수동 면역 치료일 수 있다. 작동세포의 예는 본원에 제공된 폴리펩타이드를 발현하는 상기 논의된 바와 같은 T 세포, T 림프구(예를 들어, CD8+세포독성 T 림프구 및 CD4+T-헬퍼 종양 침투 림프구), 킬러 세포(예를 들어, 천연 킬러 세포 및 림포킨 활성 킬러 세포), B 세포 및 항원 제공 세포(예를 들어, 수지상 세포 및 마크로파아지)를 포함한다. 본원에 언급된 폴리펩타이드에 대해 특이적인 T 세포 수용체 및 항체 수용체가 클로닝 및 발현될 수 있고 입양 면역을 위해 또 다른 매개 세포 또는 작동세포로 전달될 수 있다. 본원에 제공된 폴리펩타이드를 또한 사용하여 수동 면역을 위해 항체 또는 항-이디오타입 항체(본원 및 미국 특허 제4,918,164호에 제공된 바와 같음)를 제조할 수 있다.
작동세포는 일반적으로 본원에 기술된 바와 같이 시험관내에서 성장시켜 입양 면역을 위해 충분한 양으로 수득될 수 있다. 단일 항원 특이적 세포를 생체내에서 항원 인지를 보유하는 수십억의 수로 확충하기 위한 배양 조건은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 당해 시험관내 배양 조건은 전형적으로, 흔히, 사이토킨(예 IL-2) 및 비-분열 영양 세포의 존재하에 항원을 사용하여 간헐적으로 자극시키는데 사용한다. 상기 주지된 바와 같이, 본원에 제공된 바와 같은 면역반응성 폴리펩타이드를 사용하여 항원-특이적 T 세포 배양물을 신속하게 확충시켜 면역치료를 위해 충분한 수의 세포를 제조할 수 있다. 특히, 항원-제공 세포(수지상, 마크로파아지, 단핵구, 섬유아세포 및/또는 B 세포)를 면역반응성 폴리펩타이드와 펄스시키거나 당해 기술 분야에 널리 공지된 표준 기술을 사용하여 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드로 형질감염시킬 수 있다. 예를 들어, 항원-제공 세포는 재조합 바이러스 또는 기타 발현계에서의 발현을 증가시키기 위해 적당한 프로모터를 갖는 폴리뉴클레오타이드로 형질감염시킬 수 있다. 치료에 사용하기 위한 배양한 작동세포는 광범위하게 성장시키고 분포될 수 있고 생체내에서 장기간 생존할 수 있어야만 한다. 연구는 배양된 작동세포가, IL-2가 보충된 항원과 반복적으로 자극시켜 상당한 수로 생체내에서 성장하고 장기간 생존할 수 있도록 유도될 수 있음을 보여준다[문헌참조: Cheever et al., Immunological Reviews 157:177, 1997].
또한, 본원에 언급된 폴리펩타이드를 발현하는 벡터를 환자로부터 채취한 항원 제공 세포로 도입하여 동일 환자에게 재이식되는 이식물을 위해 생체외에서 클론적으로 증식시킬 수 있다. 형질감염된 세포는 당해 분야에 공지된 임의의 수단을 사용하여, 바람직하게는 멸균 형태로 정맥내, 강내, 복강내 또는 근육내 투여로 환자에게 재도입될 수 있다.
본원에 기술된 치료학적 조성물의 투여 경로 및 투여 횟수 및 투여량은 환자 마다 다양하고 표준 기술을 사용하여 용이하게 확립될 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물 및 백신은 주사(예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내 또는 피부내), 비강내(예를 들어, 흡인) 또는 경구적으로 투여될 수 있다. 바람직하게, 1 내지 10회 투여량이 52주에 걸쳐 투여될 수 있다. 바람직하게 6회 투여량이 1개월 간격으로 투여되고 백신화를 위한 부스터는 이후에 주기적으로 투여될 수 있다. 또 다른 프로토콜이 각 환자에게 적합할 수 있다. 적합한 투여량은 상기된 바와 같이 투여되는 경우, 항 종양 면역반응을 촉진시킬 수 있고 기본(즉, 비처리된) 수준을 10 내지 50% 이상 초과하는 화합물의 양이다. 당해 반응은 환자내의 항 종양 항체를 측정하거나 시험관내에서 환자의 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 세포용해성 작동세포의 백신 의존적으로 합성하여 모니터할 수 있다. 당해 백신은 또한 면역 반응을 유발하여 백신 투여되지 않은 환자와 비교하여 백신 투여된 환자내에서의 임상적 결과(예를 들어, 보다 빈번한 완화, 완전하거나 부분적이거나 보다 장기간 동안 질환이 없는 생존)를 개선시킬 수 있어야만 한다. 일반적으로, 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물 및 백신을 위한 각각의 폴리펩타이드의 양은 숙주 kg당 25㎍ 내지 5㎎ 범위의 투여량이다. 적합한 투여량은 환자의 크기에 따라 다양하지만 전형적으로 범위는 약 0.1 mL 내지 약 5mL이다.
일반적으로, 적합한 투여량 및 처리 섭생은 치료학적 및/또는 예방학적 이득을 제공하기에 충분한 양으로 활성 화합물을 제공한다. 당해 반응은 비처리된 환자와 비교하여 처리된 환자내에서 개선된 임상적 결과(보다 빈번한 완화, 완전하거나 부분적이거나 장기간 동안 질환이 없는 생존)를 확립하여 모니터할 수 있다. 종양 단백질에 대해 기존의 면역 반응의 증가는 일반적으로 개선된 임상적 결과와 관련이 있다. 당해 면역 반응은 일반적으로 표준 증식, 세포 독성 또는 사이토킨 분석을 사용하여 평가할 수 있고 처리 전후의 환자로부터 수득한 샘플을 사용하여 수행할 수 있다.
암 검출 및 진단 조성물, 방법 및 키트
또 다른 양태에서, 환자로부터 수득한 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액, 혈청, 객담, 오줌 및/또는 종양 생검)내 하나 이상의 Her-2/neu 단백질 및/또는 당해 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 존재함을 기준으로 암이 환자에게서 검출될 수 있다. 또 다른 말로, 본 발명의 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드를 마커로서 사용하여 암의 존재 유무를 지적할 수 있다. 본원에 제공된 결합제를 통해 생물학적 샘플내에서 제제와 결합하는 항원 수준을 검출할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브를 사용하여 암의 존재 또는 부재를 암시하는 종양 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준을 검출할 수 있다. 샘플내에서 폴리펩타이드 마커를 검출하기 위해 결합제를 사용하기 위한 다양한 분석 포맷이 당해 기술 분야의 통상적인 기술자에게 공지되어 있다[문헌참조: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]. 일반적으로, 환자내 암의 존재 유무는, (a) 환자로부터 채취한 생물학적 샘플을 결합제와 접촉시키는 단계, (b) 샘플내에서 결합제와 결합하는 폴리펩타이드의 수준을 검출하는 단계 및 (c) 미리 결정된 컷 오프 값과 폴리펩타이드의 수준을 비교하는 단계에 의해 결정될 수 있다.
바람직한 양태에서, 분석은 샘플에 잔류하는 폴리펩타이드에 결합하고 이를 제거하기 위해 고형 지지체상에 고정화된 결합제의 용도를 포함한다. 결합된 폴리펩타이드는 이어서 리포터 그룹을 포함하고 결합제/폴리펩타이드 복합체에 특이적으로 결합하는 검출 시약을 사용하여 검출될 수 있다. 당해 검출 시약은 예를 들어, 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 결합제와 특이적으로 결합하는 항체 또는 기타 제제(예를 들어, 항-면역글로불린, 단백질 G, 단백질 A 또는 렉틴)를 포함할 수 있다. 또한 폴리펩타이드가 리포터 그룹이 표지되고 결합제와 샘플을 항온처리한 후 고정화된 결합제와 결합되는 경쟁 분석법을 사용할 수 있다. 샘플의 성분이 표지된 폴리펩타이드의 결합제로의 결합을 어느정도 억제하는지는 샘플과 고정화된 결합제의 반응성을 암시하는 것이다. 고형 지지체는 종양 단백질이 부착될 수 있는 당해 기술 분야의 기술자에게 공지된 임의의 물질일 수 있다. 예를 들어, 고형 지지체는 미세역가 플레이트 또는 니트로셀룰로스 또는 기타 적합한 막내의 시험 웰일 수 있다. 또한 지지체는 비드 또는 디스크, 예를 들어, 유리, 섬유 유리, 라텍스 또는 플라스틱 재료, 예를 들어, 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드일 수 있다. 지지체는 또한 예를 들어, 미국 특허 제5,359,681호에 기술된 바와 같은 자기성 입자 또는 섬유 광학 센서일 수 있다. 결합제는 특허 문헌 및 과학 문헌에 충분히 기술되어 있는 당해 기술 분야의 기술자에게 공지된 다양한 기술을 사용하여 고형 지지체상에 고정화될 수 있다. 본원에서, 용어 "고정화"는 비공유 결합(예를 들어, 흡착) 및 공유 결합(제제와 지지체상의 작용기와의 직접적인 결합일 수 있거나 가교제에 의한 결합일 수 있다) 둘 다를 언급한다. 미세역가 플레이트내의 웰 또는 막으로의 흡착에 의한 고정화가 바람직하다. 당해 경우에, 흡착은 적합한 완충액내에서 결합제를 적합한 시간동안 고형 지지체와 접촉시킴에 의해 성취될 수 있다. 접촉 시간은 온도에 따라 다양하지만 전형적으로 1 시간 내지 1일이다. 일반적으로, 플라스틱 미세역가 플레이트(예를 들어, 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드)의 웰을 약 10ng 내지 약 10㎍ 및 바람직하게는 100ng 내지 약 1㎍의 범위에 있는 결합제의 양과 접촉시키는 것이 적당한 양의 결합제를 고정화시키는데 충분하다.
고형 지지체로의 결합제의 공유 결합은 일반적으로 먼저 지지체와 결합제상의 작용 그룹(예를 들어, 하이드록실 또는 아미노 그룹) 둘다와 반응하는 이작용성 시약을 지지체와 반응시켜 성취될 수 있다. 예를 들어, 결합제는 벤조퀴논을 사용하거나 지지체상의 알데하이드 그룹을 결합 파트너상의 아민 및 활성 수소와 축합시켜 적당한 중합체 피복을 갖는 지지체에 공유적으로 결합될 수 있다[문헌참조: Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, at A12-A13].
특정 양태에서, 분석은 2개의 항체 샌드위치 분석이다. 당해 분석은 먼저 고형 지지체, 통상적으로는 미세역가 플레이트의 웰상에 고정화된 항체를 샘플과 접촉시켜 샘플내의 폴리펩타이드가 고정화된 항체와 결합하도록 함으로써 수행될 수 있다. 이어서 비결합 샘플을 고정화된 폴리펩타이드 항체 복합체로부터 제거하고 리포터 그룹을 포함하는 검출 시약(바람직하게 폴리펩타이드상의 상이한 부위에 결합할 수 있는 제2 항체)을 첨가한다. 고형 지지체에 결합된 채로 남아있는 검출 시약의 양은 특이적 리포터 그룹에 적합한 방법을 사용하여 결정된다.
보다 특히, 상기한 바와 같이 항체가 지지체상에 고정화된 후, 지지체상의 잔여 단백질 결합 부위를 전형적으로 차단한다. 당해 기술 분야의 기술자에게 공지된 임의의 적합한 차단제는 예를 들어, 소 혈청 알부민 또는 트윈 20TM(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)이다. 이어서 고정화된 항체는 샘플과 항온처리하고 폴리펩타이드가 항체에 결합하도록 한다. 샘플은 항온처리하기 전에 적합한 희석제(예를 들어, 인산 완충 식염수(PBS))로 희석시킬 수 있다. 일반적으로, 적합한 접촉 시간(즉, 항온처리 시간)은 암을 앓는 환자로부터 수득한 샘플내에 폴리펩타이드의 존재 여부를 검출하는데 충분한 시간이다. 바람직하게, 접촉 시간은 결합되고 결합되지 않은 폴리펩타이드 사이에 평형화가 약 95% 이상 이루어진 결합 수준을 성취하는데 충분하다. 당해 기술 분야의 기술자는 평형을 이루는데 필요한 시간이 시간 경과에 따라 발생하는 결합 수준을 분석하여 용이하게 결정될 수 있는 것으로 인지할 것이다. 일반적으로 실온에서, 약 30분의 항온처리 시간이면 충분하다.
이어서 비결합 샘플은 0.1% 트윈 20TM을 포함하는 PBS와 같은 적당한 완충액으로 고형 지지체를 세척하여 제거할 수 있다. 이어서 리포터 그룹을 포함하는 제2 항체를 고형 지지체에 첨가할 수 있다. 바람직한 리포터 그룹은 상기된 그룹을 포함한다.
이어서, 검출 시약은 결합된 폴리펩타이드는 검출하는데 충분한 시간동안 고정화된 항체 폴리펩타이드 복합체와 항온처리한다. 적당한 양의 시간은 일반적으로 시간 경과에 따라 발생하는 결합 수준을 분석하여 결정될 수 있다. 이어서 비결합된 검출 시약을 제거하고 결합된 검출 시약을 리포터 그룹을 사용하여 검출한다. 리포터 그룹을 검출하는데 사용되는 방법은 리포터 그룹의 고유 특성에 의존한다. 방사능 그룹에 대해 섬광 계수 또는 방사선사진 방법이 일반적으로 적당하다. 분광 측정 방법을 사용하여 염료, 발광 그룹 및 형광 그룹을 검출할 수 있다.비오틴은 상이한 리포터 그룹(통상적으로 방사능 또는 형광 그룹 또는 효소)에 커플링된 아비딘을 사용하여 검출할 수 있다. 효소 리포터 그룹은 일반적으로 기질을 첨가(일반적으로 특정 시간 동안)한 후 반응 생성물의 분광 측정 또는 기타 분석으로 검출할 수 있다.
유방암과 같은 암의 존재 유무를 결정하기 위해, 고형 지지체에 결합된 채로 남아있는 리포터 그룹으로부터 검출된 시그날은 일반적으로 미리 결정된 컷 오프 값에 상응하는 시그날과 비교한다. 하나의 바람직한 양태에서, 암을 검출하기 위한 컷 오프 값은 고정화된 항체를 암이 없는 환자 기원의 샘플과 항온처리하는 경우 수득되는 평균 시그날이다. 일반적으로, 미리 결정된 컷 오프 값 이상의 3개의 표준 오차인 시그날을 발생하는 샘플은 암에 대해 양성인 것으로 여겨진다. 또 다른 바람직한 양태에서, 컷 오프 값은 문헌[참조: Sackett et al., Clinical Epidemiology:A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, p. 106-7]의 방법에 따라 리시버 오퍼레이터 커브(Receiver Operator Curve)를 사용하여 결정한다. 간략하게, 당해 양태에서, 컷 오프 값은 여러쌍의 진정한 양성 비율(즉, 감도) 및 거짓 양성 비율(100%-특이성)에 대한 플롯으로부터 결정할 수 있고 당해 비율은 진단 시험 결과에 대한 각각의 가능한 컷 오프 값에 상응한다. 상단 왼손 코너에 가장 근사치인 플롯상의 컷 오프 값(즉, 가장 큰 면적을 포괄하는 값)이 가장 정확한 컷 오프 값이고 당해 방법에 의해 결정된 컷 오프 값보다 높은 시그날을 발생시키는 샘플은 양성인 것으로 여겨질 수 있다. 또한, 컷 오프 값은 플롯을 따라 왼쪽으로 이동시켜 거짓 양성 비율을 최소화할 수 있거나 오른쪽으로 이동시켜 거짓 음성 비율을 최소화할 수 있다. 일반적으로 당해 방법에 의해 결정된 컷 오프 값 보다 큰 시그날을 발생하는 샘플은 암에 대해 양성인 것으로 여겨진다.
관련 양태에서, 결합제가 니트로셀룰로스와 같은 막상에 고정화되어 있는 유동 통과 또는 스트립 시험 포맷으로 분석이 수행된다. 유동 통과 시험에서, 샘플내 폴리펩타이드는 샘플이 막을 통과함으로써 고정화된 결합제와 결합한다. 이어서 제2 표지된 결합제는 제2 결합제를 포함하는 용액이 막을 통과하여 유동함으로써 결합제-폴리펩타이드 복합체와 결합한다. 이어서 결합된 제2 결합제의 검출은 상기한 바와 같이 수행될 수 있다. 스트립 시험 포맷에서, 결합제가 결합되어 있는 막의 한쪽 말단을 샘플을 포함하는 용액에 침지시킨다. 샘플은 막을 따라 제2 결합제를 포함하는 영역을 통과하여 고정화된 결합제 영역으로 이동한다. 고정화된 항체의 영역에서 제2 결합제의 농도는 암이 존재함을 지적한다. 전형적으로 당해 부위에서 제2 결합제의 농도는 육안으로 판독될 수 있는 라인과 같은 패턴을 형성한다. 상기 패턴의 부재는 결과가 음성임을 지적한다. 일반적으로, 막상에 고정화된 결합제의 양은 생물학적 샘플이, 2개의 항체 샌드위치 분석에서 상기 논의된 포맷으로 양성 시그날을 발생시키는데 충분한 폴리펩타이드의 수준을 포함하는 경우 육안으로 식별가능한 패턴을 형성하도록 선택된다. 당해 분석에 사용하기 위해 바람직한 결합제는 항체 및 이의 항원 결합 단편이다. 바람직하게, 막상에 고정화된 항체의 양은 25ng 내지 약 1㎍이고 보다 바람직하게는 약 50ng 내지 약 500ng이다. 상기 시험은 전형적으로 매우 소량의 생물학적 샘플과 함께 수행될 수있다.
물론, 본 발명의 종양 단백질 또는 결합제와 함께 사용하는데 적합한 다수의 기타 분석 프로토콜이 존재한다. 상기된 것은 단지 예시하고자 하는 것이다. 예를 들어, 상기 프로토콜이 생물학적 샘플내에서 종양 폴리펩타이드와 결합하는 항체를 검출하기 위해 종양 폴리펩타이드의 용도를 변형시킬 수 있다는 것은 당해 기술 분야의 기술자에게 명백할 것이다. 당해 종양 단백질 특이적 항체 검출은 암의 존재와 관련될 수 있다.
암은 또한 생물학적 샘플내에서 종양 단백질과 특이적으로 반응하는 T 세포의 존재를 기준으로 다르게 검출될 수 있다. 특정 방법에서, 환자로 부터 분리된 CD4+및/또는 CD8+T 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 종양 폴리펩타이드, 당해 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 당해 폴리펩타이드의 적어도 면역원 부위를 발현하는 APC로 항온처리하고 T 세포의 특이적 활성화의 존재 또는 부재를 검출한다. 적합한 생물학적 샘플은 분리된 T 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, T 세포는 통상적인 기술(예를 들어, 말초 혈액 림프구의 피콜(Ficol)/하이파크(Hypaque) 밀도 농도 구배 원심분리에 의해 환자로부터 분리될 수 있다. 세포를 37℃에서 폴리펩타이드(예를 들어, 5 내지 25㎍/ml)로 시험관내에서 2 내지 9일(전형적으로 4일)동안 한온처리할 수 있다. 대조군으로서 사용하기 위해 Her-2/neu 폴리펩타이드가 없는 또 다른 적정액의 T 세포 샘플을 항온처리하는 것이 바람직할 수 있다. CD4+T 세포를 위해 T 세포의 증식을 평가함에 의해 바람직하게 활성화가 검출된다. CD8+T 세포에 대해 활성화는 바람직하게 세포용해 활성을 평가함에 의해 검출된다. 2배 이상인 증식 수준 및/또는 질환이 없는 환자보다 20% 이상이 초과하는 세포용해 활성 수준은 환자에게 암이 존재함을 지적한다.
상기 주지된 바와 같이, 암은 또한 생물학적 샘플내에 Her-2/neu 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA의 수준을 기준으로 검출될 수 있다. 예를 들어, 2개 이상의 올리뉴클레오타이드 프라이머를 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 사용하여 생물학적 샘플로부터 유래된 종양 cDNA의 일부를 증폭시킬 수 있고 이때 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 하나 이상은 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(즉, 이에 하이브리드화하는)에 대해 특이적이다. 이어서 증폭된 cDNA를 분리하고 겔 전기영동과 같은 당해 분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 분리한다. 유사하게, 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 특이적으로 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드가 생물학적 샘플내 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 존재를 검출하기 위한 하이브리드화 분석법에 사용될 수 있다.
분석 조건하에서 하이브리드화를 수행하기 위해, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브는 뉴클레오타이드 길이가 10개 이상 및 바람직하게는 20개 이상인 본 발명의 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 일부와 약 60% 이상, 바람직하게는 약 75% 이상 및 보다 바람직하게는 약 90% 이상 동일한 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함해야만 한다. 바람직하게, 올리고뉴클레오타이드 프라이머및/또는 프로브는 상기 정의된 바와 같이 적당한 엄중 조건하에서 본원에 기술된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화한다. 본원에 기술된 진단 방법에 유용하게 사용될 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및/또는 프로브는 바람직하게 뉴클레오타이드 길이가 10개 내지 40개 이상이다. 바람직한 양태에서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 본원에 기술된 바와 같은 서열을 갖는 DNA 분자의 10개 이상의 연속 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 15개 이상의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다. PCR계 분석 및 하이브리드화 분석을 위한 기술이 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다[문헌참조: Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263, 1987; Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989].
하나의 바람직한 분석법은 RT-PCR을 사용하는 것인데 이때 PCR은 역 전사와 연계하여 적용된다. 전형적으로, RNA는 생검 조직과 같은 생물학적 샘플로부터 추출되고 역전사되어 cDNA 분자로 된다. 하나 이상의 특이적 프라이머를 사용한 PCR 증폭은 예를 들어, 겔 전기영동을 사용하여 분리되고 가시화될 수 있는 cDNA 분자를 생성한다. 증폭은 시험 환자로부터 및 암을 앓지 않는 개인으로부터 채취한 생물학적 샘플에 대해 수행될 수 있다. 증폭 반응은 2배수로 여러 희석된 cDNA에 대해 수행될 수 있다. 암과 무관한 샘플의 동일 희석물과 비교하여 시험 환자의 여러 희석물에서 2배 또는 그 이상의 발현량이 증가한 경우 전형적으로 양성인 것으로 여겨진다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 조성물은 암의 진행에 대한 마커로서 사용될 수 있다. 당해 양태에서, 암의 진단을 위해, 상기된 바와 같은 분석을 시간 경과에 따라 수행할 수 있고 반응성 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 수준의 변화를 평가한다. 예를 들어, 6개월 내지 1년동안 24 내지 72시간마다 분석을 수행할 수 있고 그 이후 필요한 만큼 수행할 수 있다. 일반적으로, 검출된 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 수준이 시간 경과에 따라 증가하는 환자의 경우 암은 진행성이다. 반대로, 반응성 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 수준이 시간 경과에 따라 일정한 상태로 유지되거나 감소하는 경우 암은 진생성이 아니다.
특정 생체내 진단 분석법은 종양에 대해 직접적으로 수행될 수 있다. 하나의 상기 분석법은 종양 세포를 결합제와 접촉시킴을 포함한다. 이어서 결합된 결합제는 리포터 그룹을 통해 직간접적으로 검출될 수 있다. 당해 결합제는 또한 조직학적 응용에 사용될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오타이드 프로브는 상기 응용 범위내에서 사용될 수 있다.
상기 주지된 바와 같이, 감도를 개선시키기 위해 다중 종양 단백질 마커는 주어진 샘플내에서 분석될 수 있다. 본원에 제공된 상이한 단백질에 특이적인 결합제가 단일 분석법과 조합될 수 있음은 명백하다. 종양 단백질 마커는 감도를 최적화하는 조합을 결정하기 위한 통상적인 실험을 토대로 선택될 수 있다. 추가로 또는 또 다르게 본원에 제공된 종양 단백질의 분석은 기타 공지된 종양 항원에 대한 분석과 조합될 수 있다.
본 발명은 추가로, 상기 진단 방법내에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 당해 키트는 전형적으로 진단 분석을 수행하는데 필요한 2개 이상의 성분을 포함한다. 당해 성분들은 화합물, 시약, 컨테이너 및/또는 장치일 수 있다. 예를 들어, 키트내의 하나의 컨테이너는 종양 단백질에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 당해 항체 또는 단편은 상기된 바와 같은 지지체 물질과 부착시켜 제공될 수 있다. 하나 이상의 추가의 컨테이너는 분석에 사용될 시약 또는 완충액과 같은 요소를 포함할 수 있다. 당해 키트는 또한 항체 결합의 직간접적인 검출에 적합한 리포터 그룹을 포함하는 상기된 바와 같은 검출 시약을 포함한다.
또한, 키트는 생물학적 샘플내에 종양 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준을 검출하도록 디자인될 수 있다. 당해 키트는 일반적으로 상기된 바와 같이 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머를 포함한다. 당해 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어, PCR 또는 하이브리드화 분석에서 사용될 수 있다. 상기 키트내에 존재할 수 있는 추가의 성분은 제2 올리고뉴클레오타이드 및/또는 진단 시약 또는 컨테이너를 포함하여 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 검출을 용이하게 한다.
하기 실시예는 예시하고자 제공되는 것이지 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1
재조합 아데노바이러스로 감염된 수지상 세포를 사용한 Her-2/neu 특이적 CD8 + T 세포의 프라이밍
EIA가 제거된 아데노 바이러스(AdV) 벡터 및 Her-2/neu의 세포내 도메인(ICD; 서열 1의 뉴클레오타이드 약 2026 내지 3765)에 대한 재조합체를 작제하고 건강한 기증자로부터 수득한 수지상 세포(DC)를 감염시키는데 사용한다. 자극제로서 AdV-ICD-감염된 DC를 포함하고 응답wk로서 자가 PBMC를 포함하는 초벌 배양을 개시한다. 제1 재자극 전에, 배양물에 CD8+ 세포를 집적배양하고 CD8+ 집적된 집단을 AdV-ICD 감염된 DC로 재자극한다. 이어서 ICD에 대한 레트로바이러스 재조합체로 형질도입된 자가 섬유아세포를 재자극한다. 이어서, 시험관내 제4 자극을 수행하고 수득한 T 세포주를 표준 4시간51Cr-방출 분석에 의해 ICD 특이적 CTL 활성에 대해 시험한다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 벌크 T 세포주가 백시니아-ICD로 감염된 자가 B-LCL을 용해시키지만 백시니아-EGFP 또는 감염되지 않은 B-LCL 표적물로 감염된 C-LCL은 용해시키지 않기때문에 벌크 T 세포주는 ICD에 대해 특이적인 활성을 포함한다. 도 1의 각각의 데이타 포인트는 3회 측정의 평균치이다.
2회 이상의 자극 후에 T 세포주를 ICD를 발현하는 자가 섬유아세포에 응답하여 γ-IFN을 분비하는 능력에 대해 시험한다. γ-IFN ELISPOT 분석은 ICD 또는 EGFP로 형질도입된 자가 섬유아세포에 대한 응답자로서 ICD-프라임된 CD8+ T 세포주를 사용하여 수행한다. 당해 분석에서, 2 x 103개의 섬유아세포 자극제를 웰당 2 x 104 응답 T 세포로 3개의 웰에 플레이팅한다. 3개의 웰에 대한 평균 엘리스팟수는 ICD 섬유아세포에 대해 344이고 EGFP 섬유아세포에 대해서는 22이다. 따라서, T 세포주는 ICD-특이적 γ-IFN 분비를 입증한다.
CD8+ ICD 특이적 T 세포주의 부류 I 제한을 조사하기 위해, 항체 차단 실험을 우치 부류 I 분자에 대해 특이적인 항체를 사용하여 수행한다. 자극제는 모노클로날 항체 W6/32(HLA-A, -B 및 -C 반응성), 모노클로날 항체 BB123.2(HLA-B 및 -C 반응성) 또는 모노클로날 항체 BB7.2(HLA-A2 특이적)와 예비 항온처리한다. T-세포 반응은 표준 밤샘 γ-IFN 엘리스팟 분석을 사용하여 측정한다. 응답 세포는 7회 자극을 위해 시험관내에서 배양된 ICD 특이적 CTL 주이고 웰당 15,000 세포로 사용된다. 자극제는 레트로바이러스에 의해 ICD 또는 EGFP로 형질도입된 자가 섬유아세포이고 웰당 2,000 세포로 사용된다. 자극제는 분석에 첨가되기 전에 20분동안 지시된 mAb(50㎍/ml)와 항온처리한다. 분석을 3회 수행한다.
표 2에 나타낸 바와 같이, W6/32 또는 BB123.2 항체중 하나로 자극 세포를 항온처리하는 경우 ICD-형질도입된 섬유아세포의 인지를 완전히 차단시키는 반면에 BB7.2와의 항온 처리는 γ-IFN 분비에 대해 어떠한 효과를 나타내지 않는다. 이들 결과는 ICD-특이적 활성이 HLA-B 또는 C- 대립형질에 의해 제한되어 있음을 지적한다.
ICD 특이적 γ-IFN 분비에 대한 HLA-부류 I 항체 차단
자극제 첨가된 항체
부재 BB7.2 W6/32 BB123.2
Fibro/EGFP 3 7 3 4
Fibro/ICD 167 213 4 5
벌크 주로부터 분리된 ICD-특이적 클론을 확충시키고 추가로 전장 Her-2/neu를 인지하는 능력을 특징화한다. 추가로, HLA 부류 I에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 클론의 HLA 제한을 조사한다. 실험은 표준 밤샘 γ-IFN 엘리스팟 분석이다. 응답세포는 ICD 특이적 T 세포주인 17D5이다. 자극제는 형질도입되지 않거나 EGFP, ICD 또는 전장 Her2/neu(H2N)로 레트로바이러스에 의해 형질도입된 자가 섬유아세포이다. 웰당 10,000개의 17D5 세포 및 10,000개의 자극제를 사용한다. 분석에서 25㎍/ml의 항체를 사용한다. 3회 분석을 수행하고 표준 오차는 3회에 대해 0 내지 +/- 18이다.
표 3에 나타낸 바와 같이, 클론은 특이적으로 ICD 또는 전장 Her-2/neu로 형질도입된 자가 섬유아세포를 인지하지만 형질도입되지 않은 섬유아세포 또는 부적절한 항원 EGFP가 형질도입된 섬유아세포는 인지하지 않는다. 추가로, 당해 반응성은 pan-HLA 부류 I 모노클로날 항체 w6/32 및 HLA-B 및 -C 대립 형질(BB123.2)에 특이적인 모노클로날 항체에 의해 완전히 차단되지만 HLA-A2(BB7.2)에 대해 특이적인 항체에 의해서는 차단되지 않는다. 이들 결과는 이러한 Her2/neu-특이적 클론이 HLA-B 또는 -C 대립형질에 의해 제한되고 클론이 유래한 벌크 세포주에 대해 관찰된 HLA 제한의 패턴이 동일함을 지적한다.
추가의 분석은 반응이 HLA-B4402에 의해 제한됨을 지적한다. 이들 분석은 상이한 HLA-B 및 -C 대립형질과 일치하고 AdV-ICD 또는 AdV-EGEP로 감염된 한 판넬의 대립 유전자성 섬유아세포를 인지하는 클론 17D5의 능력을 시험하여 수행한다. 재조합 레트로바이러스로 형질도입되거나 재조합 AdV로 감염된 자가 섬유아세포를 대조군으로서 사용한다.
ICD-특이적 클론 17DS의 Her-2/neu 반응성 HLA-제한을 시험하는 γIFN 엘리스팟 분석
자극제 차단 항체
부재 W6/32 BB123.2 BB7.2
Fibros 0 0 0 0
Fibro/EGFP 0 0 1 0
Fibro/ICD 162 3 1 165
Fibros-H2N 104 0 0 98
T 세포 단독 0 0 0 0
Her-2/neu 특이적 클론을 Her-2/neu를 발현하는 사람 종양 세포를 인지하는 능력에 대해 시험한다. 유방 암종 세포주 MCF-7은 천연적으로 세포 표면에서 낮은 수준의 Her-2/neu를 발현하고 또한 HLA-b4402이다. Her-2/neu에 대한 레트로바이러스 재조합체로 MCF-7을 형질도입하는 즉시 Her-2/neu의 표면 수준이 유동 세포측정 분석에 이어서 Her-2/neu 특이적 모노클로날 항체로 염색시킴에 의해 측정되는 바와 같이 약 5배 증가한다. AdV-Her-2/neu에 의한 MCF-7 세포의 감염은 종양 세포상에 표면 Her-2/neu를 20배 증가시킨다. 이들 결과는 도 2에 도시한다.
T 세포 클론은 Her-2/neu를 암호화하는 아데노바이러스로 감염된 MCF-7 세포에 응답하여 γ-IFN을 분비한다. 그러나, 당해 클론은 MCF-7 세포 또는 Her-2/neu를 발현하는 레트로바이러스로 형질도입된 MCF-7 세포를 인지하는 것으로 나타나지 않았다. 클론은 ICD 또는 Her2/neu로 형질도입된 사람 섬유아세포를 인지하고 형질도입된 섬유아세포가 형질도입된 MCF-7 세포와 유사한 수준의 단백질을 발현하기 때문에 당해 결과가 유일하게 항원 발현 수준에 의한 것으로 단정할 수 는 없다.
실시예 2
Her-2/Neu에 대한 HLA-B44 제한된 천연적으로 가공된 에피토프의 동정
본 실시예는 상기된 T 세포 클론중 하나가 인지하는 에피토프의 특성을 기술한다. 당해 클론은 ICD 또는 전장 Her-2/neu 단백질을 발현하는 APC를 인지한다. 당해 클론에 대한 HLA-제한 요소는 감마 인터페론 엘리스팟 분석에서 APC로서 T 세포 클론과 다양한 HLA 대립 형질에서 일치되는 판넬의 대립 형질 세포주를 사용하여 HLA-B4402인 것으로 밝혀졌다. 이것은 B-4402 재조합 레트로바이러스로 HLA-B44-음성, Her-2/neu-양성 APC를 형질도입하여 인지 부위를 부여함으로써 확인되었다. 클론이 인지하는 ICD 영역은 일련의 5개의 ICD 단편을 발현하는 재조합 레트로바이러스를 사용하여 B44+ APC를 형질도입시킴으로써 협소화된다. 이들 단편중 2개의 클론에 의한 인지(감마 인터페론 방출에 의해 입증된 바와 같음)는 에피토프가 Her-2/neu 서열내 975번 위치에서 시작하는 235개의 아미노산 단편내에 포함됨을 지적한다. 상기 단편으로부터 추정되는 B44 결합 9량체 및 10량체 펩타이드를선택하고 합성한다. 합성된 13개의 펩타이드중 하나가 클론에 의해 인지되고 에피토프인 것으로 결정되었다. 이것은 감마 인터페론 방출 및 TNF-알파 방출 분석에 의해 입증되었다. 이러한 천연적으로 가공된 Her-2/neu 에피토프의 서열은 Her-2/neu 단백질 서열에서 1021 내지 1030에 위치하는 EEYLVPQQGF(서열 3)이다.
실시예 3
Her-2/neu DNA 및 폴리펩타이드 백신화는 Her-2/Neu-발현 종양의 성장을 억제한다.
재료 및 방법
동물: 8 내지 12주된 암컷 C57B1/6 마우스를 공급원[Charles River Laboratories(Wilmington, MA)]로부터 구입하고 코릭사 코포레이션에 있는 동물 보육실에 유지한다.
항체 및 시약: 래트 항 쥐 CD4(GK 1.5) 및 래트 항 쥐 CD8(2.43) 하이브리도마 세포주를 ATCC로부터 구입하였다. 항체는 복수액으로부터 정제한다. Ab-5, 항 사람 Her-2/neu ECD-특이적 항체는 공급원[Oncogene Research Products(Cambridge, MA)]로부터 구입하였다. 몬트아니드 720은 제조원[Seppic Inc.](Fairfield, NJ)로부터 구입하였다.
종양 세포주: C57BL 마우스로 부터 최초 유래된 쥐 가슴샘종인 EL4를 ATCC로부터 구입하였다. EL4 세포는 표준 전기천공 프로토콜을 사용하여 전장 사람 Her-2/neu로 형질감염시킨다. Her-2/neu를 안정하게 발현하는 EL4 세포는 네오마이신을 사용하여 시험관내 약물 선택에 따라 수득한다. Her-2/neu 발현은 유동 세포 측정 분석으로 확인한다.
Her2neu 백신: Her-2/neu 플라스미드 DNA 백신(pVR1012-Her-2/neu)는 VR1012(Vical, San Diego, CA)에 삽입된 전장 사람 Her-2/neu cDNA로 이루어져 있다. ECD 플라스미드 DNA 백신(pVR1012-ICD)는 Her-2/neu의 아미노산 1 내지 695를 암호화하는 DNA로 이루어져 있고 ICD 플라스미드 DNA 백신(pVR1012-ECD)는 VR1012의 아미노산 692 내지 1256을 암호화하는 DNA로 이루어져 있다. 대량의 세포내 독소 유리된 플라스미드 DNA를 키트(Qiagen Inc.(Valecia, CA)) 시약 및 표준 기술을 사용하여 제조한다. 플라스미드 DNA 백신을 근육내로(100㎍) 0일 및 21일째에 전달한다. ICD(아미노산 676 내지 1256) 및 ECD(아미노산 22 내지 653) 재조합 서브유니트 단백질을 코릭사 코포레이션에서 제조한다. 간단하게, ECD 단백질을 L 세포의 안정한 형질감염으로 제조하고 DEAE, 역상 HPLC 및 모노 S 칼럼 크로마토그래피를 조합하여 정제한다. ICD 단백질을 이. 콜리에서 제조하고 하이(High) Q 이온 교환에 이어서 니켈 수지 친화성 크로마토그래피을 통해 가용화된 봉입체로부터 정제한다. 재조합 단백질 백신을 7:2(몬트아니드 720: 단백질) 비율에서 몬타니드 720과 혼합하고 피하내로 투여한다.
생체내 종양 모델: 종양 보호 실험을 위한 EL4-Her-2/neu 세포의 공급원을 확실히 일관성있게 하기 위해, 세포를 생체내로 통과(복강내)시켜 확충하고 개별 실험에 사용하기 위한 적정액으로 동결시킨다. 피하내로 주사된 200,000 EL4-Her-2/neu 세포를 사용하여 종양을 옆구리에 확립한다. 촉지 종양은 전형적으로 주사한지 8일 내지 10일 이내에 발육한다. 종양 크기는 마이크로캘리퍼 기구를 사용하여 종양의 면적(길이 x 넓이)을 측정하여 결정된 바와 같이 mm2로 표현한다.
작동 T 세포의 생체내 고갈: 0일 및 21일째에 마우스를 플라스미드 DNA 또는 단백질로 면역화시켜 작동인자 T 세포를 생성시킨다. 실험 개시 후 35일, 38일 및 42일째에 정제된 항 CD4 또는 항 CD8 항체를 하루 100㎍으로 복강내 투여하여 CD4 및 CD8 세포를 고갈시킨다. 고갈된 비장 세포의 유동 세포 측정 분석은 표적 집단중 98% 초과의 세포가 고갈되었음을 지적한다.
면역 혈청의 입양 전달: 면역 혈청을 Her-2/neu 플라스미드 DNA 또는 ICD 단백질 면역화된 마우스의 채혈을 통해 수득한다. 각각의 그룹에서 12 마리의 마우스 기원의 혈청을 6마리의 순수한 수혈(정맥내) 마우스에 전달하기 위해 풀(pool)시킨다. 면역 혈청의 항-Her-2/neu 항체 역가를 혈청 전달 전에 ELISA로 평가한다.
시험관내 사이토킨 분석: 마우스(4/그룹)를 0일 및 21일째에 몬트아니드(s.q.) 또는 몬트아니드 단독중에서 100㎍의 pVR1012 또는 pVR1012-Her-2/neu(i.m) 또는 ICD 단백질 50㎍으로 면역화시킨다. 제2 면역화한지 2주 후에 2.5 x 105췌장 세포를 수거하고 매질 단독, ICD 또는 ECD 단백질(10㎍/ml)로 시험관내에서 자극시킨다. 시험관내 자극한지 48시간 후에 상등액으로부터 IFNγ분비를 ELISA로 평가한다. 값은 4마리의 마우스에 대한 3개의 웰의 평균치이다.
결과
Her-2/neu 단백질 서브유니트 및 플라스미드 DNA 백신이 종양 보호를 매개한다.
동계 Her-2/neu 발현 종양 세포주를 주입시키는 경우 이에 대한 보호 면역 반응을 유발하는 전장 또는 절단된 형태의 Her-2/neu 중 하나로 이루어진 Her-2/neu 백신의 능력을 평가한다. C57B1/6 마우스를 전장 Her-2/neu, Her-2/neu의 ICD 또는 ECD 부분을 암호화하는 플라스미드 DNA로 면역화시킨다 2회의 DNA 면역화후, 마우스에 전장 사람 Her-2/neu(EL4-Her-2/neu)로 형질감염된 EL4 세포를 피하내로 주입하고 종양 성장을 모니터한다. 순수 마우스에서, EL4-Her-2/neu 세포는 피하 투여한지 14 내지 20일 이내에 거대 고형 종양을 형성한다. Her-2/neu 플라스미드 DNA, 전장 ICD 또는 ECD 서브유니트로의 백신화는 종양 세포의 성장을 상당히 억제한다(도 3). 대다수의 마우스는 종양 발육으로부터 완전히 보호되지만 소수의 동물은 종양 투여 후 3주 이내까지 종양 발육을 지연시킨다. 유사한 수준의 종양 보호가 절단된 Her-2/neu 작제물 및 전장 Her-2/neu 작제물 둘다로 성취된다는 것은 흥미롭다.
어느 단백질 서브유니트 백신이 또한 종양 보호를 유발하는데 효과적인지를 결정하기 위해, 마우스를 ICD 또는 ECD 단백질 및 애쥬반트로 면역화시키고 EL 4-Her-2/neu를 투여한 다음 종양 성장을 모니터한다. 도 4에 나타낸 결과는 ICD 단백질을 사용한 백신화가, 종양 발육 마우스의 빈도 및 종양을 갖는 마우스의 평균 종양 크기가 감소되는 부분적인 보호 면역 반응을 유발시킴을 입증한다. 당해 대표적인 실험에서, ICD 백신화는 하나의 동물을 완전히 보호하고 종양 발육(23일째에 162mm2) 마우스의 평균 종양 크기를 감소시킨다. 이것을 순수 그룹의 4/4 마우스의 종양 성장(평균 종양 크기 527mm2) 및 ECD 백신화된 그룹에서 4/4 마우스의 종양 성장(평균 종양 크기 462mm2)와 비교한다.
예상치 않게, Her-2/neu DNA 백신화와 비교하여 단백질 백신화가 DNA 백신화만큼 효과적이지 못함이 명백하다.
상기 모델에서 관찰된 보호가 Her-2/neu 특이적인지를 결정하기 위해, 마우스를 전장 Her-2/neu 또는 벡터 대조 플라스미드 DNA로 백신화하고 이어서 EL4 또는 EL4-Her-2/neu 모세포중 하나를 투여한다. 종양의 성장을 다음 10일 내지 25일 동안 모니터한다. 이들 결과는 종양 성장의 보호가 단지 Her-2/neu 플라스미드 DNA로 면역화된 마우스에서만 일어남을 입증하였고 이것은 Her-2/neu에 대한 면역성이 유발되고 보호를 위해 요구되는 것임을 제안한다. 추가로, 종양 보호가 Her-2/neu 특이적이라는 증거는 Her-2/neu 플라스미드 DNA로의 백신화가 EL4 세포의 성장을 막지 못한다는 관찰에 의해 제공된다. 유사 결과는 ICD 단백질이 백신으로서 사용되는 경우 관찰된다(데이타는 나타내지 않음). 이를 종합해 보면, 이들 결과는 Her-2/neu 백신에 의해 매개되는 종양 보호가 Her-2/neu 특이적임을 지적한다.
Her-2/neu 단백질 서브유니트 또는 플라스미드 DNA 백신에 의해 매개되는 종양 보호의 기작
Her-2/neu 플라스미드 DNA 또는 단백질 백신화와 함께 종양 보호를 매개하는데 관여하는 면역 반응의 특성을 결정하기 위해, 본 발명자는 이후에 일련의 생체내 고갈 및 입양 전달 실험을 수행하였다. 제1 실험은 CD4 및 CD8 작동 T 세포 각각의 역할을 평가하기 위해 디자인한다. 마우스를 전장 Her-2/neu 또는 대조군 플라스미드 DNA로 2회 면역화시킨다. 제2 면역화한지 2주 후에 마우스를 생체내에서 항 CD4 또는 항 CD8 항체로 처리하여 작동 T 세포를 고갈시킨다. 98%를 초과하는 CD4 또는 CD8 비장 T 세포는 7일 동안에 걸쳐 항체를 3회 투여하여 고갈된다. 3일 후 마우스에 EL4-Her-2/neu를 투여하고 종양 성장을 모니터한다. 도 1에 나타낸 이전의 실험과 일치하여 완전한 종양 보호가 Her-2/neu 플라스미드 DNA(비처리된 그룹)로 백신화된 마우스에서 관찰된다. 반대로, CD8 작동 T 세포가 아닌 CD4 작동 T 세포의 생체내 고갈은 Her-2/neu DNA 백신화에 의해 매개된 종양 보호를 완전히 철회한다. 유사 결과는 CD4 고갈된 작동 T 세포가 아닌 CD8 작동 T 세포의 입양 전달은 종양 투여에 대해 보호 작용을 부여한다(데이타는 나타내지 않음). 총체적으로 이들 결과는 당해 시스템에서 플라스미드 DNA 백신화에 의해 매개된 보호가 CD8 작동 T 세포가 아닌 CD4 작동 T 세포가 존재하느냐에 결정된다는 것을 제안한다.
ICD 단백질을 사용한 백신화 후 유사한 실험을 수행하여 당해 백신에 의해 유발된 면역 반응에서 CD4 및 CD8 T 세포의 약할을 결정한다. 다시, 마우스를 애쥬반트중의 ICD 단백질로 면역화하고 부스트시키고 생체내 항체 처리에 의해 CD4 및 CD8 작동 T 세포를 고갈시키고 이어서 EL4-Her-2/neu를 투여한다. 그 결과는 CD4 또는 CD8 T 세포의 고갈이 ICD 백신화로 수득된 부분적인 보호를 철회시킴을 지적하고 이것은 CD4 및 CD8 작동 T 세포 둘다가 ICD 단백질 매개 종양 보호에 중용한 역할을 하고 있음을 제안한다. 입양 전달 실험의 결과는 또한 CD4 및 CD8 작동 세포 둘다가 ICD 단백질 백신화에 의해 유발되는 면역 반응에 중요함을 지적한다(데이타는 나타내지 않음).
항 Her-2/neu 항체가 종양 세포에 대해 항 증식 효과를 나타낼 수 있다는 것은 공지되어 있기때문에 본 발명자는 플라스미드 DNA 또는 단백질 백신화에 의해 유발되는 항체가 관찰된 보호에 기여하는 지를 조사하였다. 당해 의문점을 해결하기 위해, 마우스를 전장 Her-2/neu DNA 또는 ICD 단백질로 면역화하고 부스트시킨다. Her-2/neu 면역 마우스 기원의 혈청 또는 비 면역 마우스 기원의 대조군 혈청을 수거하고 이어서 EL-4-Her-2/neu가 투여된 순수 마우스에 전달한다. Her-2/neu DNA 면역 혈청으로부터의 결과는 항체의 전달이 보호를 제공하지 못함을 지적한다. 이들 결과는 플라스미드 DNA 백신화로 수득한 항-Her-2/neu 항체의 수준이 매우 낮은 경우 어느 정도 예견될 수 있다(데이타는 제공되지 않음). 유사하게 당해 혈청에 존재하는 항-ICD 항체의 역가(10,000 내지 100,000)가 상당히 높다고 하더라도 항-ICD 함유 혈청의 전달은 보호 작용이 없다. 이를 종합해 보면, 이들 결과는 항체가 EL4-Her-2/neu 종양 세포를 사용한 당해 모델에서 관측된 보호를 매개하지 않음을 제안한다.
이들 생체내 고갈 및 입양 전달 실험의 결과는 CD4+ T 세포가 당해 모델에서 항 종양 면역 반응을 유발하는데 주요 역할을 한다는 것을 지적한다. CD4+ T 세포가 보호를 매개하는 기작을 보다 완전하게 밝히기 위해, 본 발명자는 Her-2/neu DNA 또는 ICD 단백질로 백신화후 T 세포의 사이토킨 분비 프로필을 조사하였다.그 결과는 하기 표에 요약되어 있고 이것은 재조합 ICD 또는 ECD 단백질로 시험관내 재자극후 즉시 Her-2/neu 플라스미드 DNA 백신화된 마우스 기원의 비장 세포가 비자극된 세포와 비교하여 상당한 수준의 IFNγ를 분비함을 입증한다. ICD 단백질 백신화된 마우스 기원의 비장 세포는 또한 ECD 단백질이 아닌 ICD 단백질에 의한 시험관내 자극에 응답하여 IFNγ를 생산한다. 이들 동일 배양물에서 IL4 및 IL5의 수준은 Th1형 면역 반응과 일관성있게 검출 한계 이하이다. 이들을 종합해 보면, 이들 결과는 당해 모델에서 IFNγ가 Her-2/neu 백신에 의해 매개되는 보호작용에 중요한 역할을 할 수 있음을 제안한다.
Her-2/neu DNA 또는 단백질 백신화에 따른 IFNγ생산
백신a 배지b IFNγ(ng/ml) ICD ECD
pVR1012-Her-2/neu 0.32c 4.17 1.27
pVR1012 0.61 0.36 0.42
ICD 단백질 0.31 2.16 0.01
단독의 애쥬반트 1.30 1.23 1.35
a마우스(4/그룹)를 0일째 및 21일째에 몬트아니드(s.q.) 또는 단독의 몬트아니드중에서 100㎍의 pVR1012 또는 VR1012-Her-2/neu(i.m) 또는 50㎍의 ICD 단백질로 면역화시킨다.b제2 면역화한지 2주 후에 비장 세포를 수거하고 단독의 매질, ICD 또는 ECD 단백질(10㎍/ml)로 시험관내 자극시킨다.cIFNγ분비를 시험관내 자극한지 48시간 후에 ELISA로 분석한다. 값은 4마리의 별도의 마우스에 대한 3개의 웰에 대한 평균치이다.
실시예 4
Her-2/Neu에 특이적인 T 세포 클론은 사람 종양 세포를 인지한다
Her-2/neu에 특이적인 T 세포 클론을 실시예 1에 기술된 바와 같이 Her-2/neu의 ICD에 대한 아데노바이러스 재조합체로 감염된 자가 수지상 세포로 시험관내에서 프라이밍하여 유도한다. 세포내에서 Her-2/neu를 발현하는 사람 종양을 인지하는 당해 T 세포 클론의 능력을 결정하기 위해, 하기의 실험을 수행한다.
사람 종양 세포주 SKBR3(유방 암종) 및 SKOV3(난소 암종) 둘다는 Her-2/neu를 과발현한다. 사람 종양 세포주 HCT-116(결장 암종) 및 MCF-7(유방 암종)은 거의 Her-2/neu 단백질을 발현하지 않는다. HLA 분류에 의해 지적된 바와 같이 이들 종양중 MCF-7 만이 천연적으로 HLA-B4402(당해 클론에 대한 제한 대립 형질)을 발현한다. HLA-B4402에 대한 레트로바이러스 재조합체를 사용하여 SKOV3, SKBR3 및 HCT-116 종양 세포주를 형질도입한다. 유동 세포측정 분석을 수행하여 모 세포주 및 형질도입된 종양 세포주 및 섬유아세포 주 대조군상에서 HLA 분류 I, HLA-B44 및 Her-2/neu 발현을 조사한다. 종양 세포주 또는 섬유아세포주를 하기의 FITC-표지된 모노클로날 항체로 염색한다: IgG(Becton Dickinson, 음성 대조군); 항-HLA 분류 I 항체(Sigma); HLA-B44(One Lambda)를 포함하는 HLA-B 분자의 아그룹과 결합하는 항-Bw4 항체; 항-Her-2/neu 항체 CN2,(온코진 사이언스(Oncogene Sciences) 공급원의 Ab2). 샘플을 고정시키고 유동 세포측정으로 분석한다.
결과는 시험된 모든 세포주가 예상되는 바와 같이 세포 표면에서 HLA-분류 I를 발현시킴을 입증한다. 종양 모 세포주 SKBR3, SKOV3 또는 HCT-16이 아닌 자가 섬유아세포 및 MCF-7 종양 세포가 HLA-B44를 발현한다. HLA-B44 레트로바이러스로 형질도입후에 수득된 각각의 종양 세포주는 HLA-B44를 발현한다. 예상되는 바와같이, SKBR3 및 SKOV3 종양 세포주 둘다는 세포 표면에서 Her-2/neu를 발현하고 이의 수준은 레트로바이러스에 의해 Her-2/neu로 형질도입된 자가 섬유아세포에 의해 발현된 Her-2/neu의 양에 필적할만하다. 반대로, MCF-7, HCT-116 및 비 형질도입된 섬유아세포는 세포 표면에 Her-2/neu를 거의 발현하지 않는다. Her-2/neu에 대한 레트로바이러스 재조합체로 형질도입된 MCF-7 세포는 SKBR3 및 SKOV3에 의해 발현되는 수준과 필적할만한 수준의 Her-2/neu를 발현한다.
상기 세포주를 인지하는 Her-2/neu-특이적 CTL 클론(클론 17D5)의 능력을 IFNγELISA 및 TNFα 생분석으로 시험한다. 표 5는 IFNγELISA의 결과를 나타낸다. 클론 17D5는 Her-2/neu를 발현하도록 형질도입된 자가 HLA-B4402 양성 섬유아세포에 응답하여 IFNγ를 특이적으로 분비한다. 중요하게, 클론 17D5는 HLA-B4402 음성 모 세포주 또는 대조군 형질도입된 종양 세포주가 아닌 HLA-B4402로 형질도입된 SKBR3 및 SKOV3 종양 세포에 응답하여 IFNγ를 특이적으로 분비한다. 클론 17D5는 HLA-B4402로 형질도입된 HCT-116 종양 세포주를 인지하지 않는다. 상기 결과는 HCT-116 세포가 매우 낮은 수준의 Her-2/neu를 발현하기 때문에 예상된다. 17D5는 또한 Her-2/neu로 형질도입된 유방 종양 세포주 MCF-7 또는 MCF-7를 인지하지 않는다. 이들 결과는 HER-2/neu 레트로바이러스로 형질도입된 MCF-7 세포상의 Her-2/neu 수준이 상응하는 형질도입된 섬유아세포상의 Her-2/neu의 수준과 유사하기 때문에 MCF-7에 의해 발현되는 HLA-B4402의 수준이 불충분하다는 것으로 가장 적절하게 설명된다. (이것은 Her-2/neu-재조합체 아데노바이러스로 감염을 통한 MCF-7에서 매우 높은 수준의 Her-2/neu를 발현시켜 극복될 수 있다)
ICD 특이적 T 세포 클론 17D51에 의한 종양 인지를 입증하는 IFNγELISA
자극제 Ave O.D.2
FIB 0.09
H2N Fib 1.14
HCT116-EGFP 0.11
HCT116-B44 0.10
SKBR3 0.08
SKBR3-B44 1.81
SKOV3-EGFP 0.10
SKOV3-B44 1.22
MCF7 0.09
MCF7-H2N 0.09
단독의 T 세포 0.10
단독의 매질 0.1
1표준 IFNγELISA는 클론 17D5 세포를 지적된 자극제 또는 단독의 매질과 항온처리하여 수득된 24시간 상등액을 사용하여 수행한다. 17D5 T 세포 및 자극제는 각각 분석에서 웰당 10,000 세포로 사용된다. 96웰 플레이트에서 3회 분석을 수행한다. T 세포 없이 항온처리된 자극제로부터의 상등액은 대조군으로서 포함되고 어떠한 값도 기본값을 초과하지 않는다(데이타는 나타내지 않음). ELISA후에 참조로서 570nm을 사용하여 450nm에서 판독한다.2나타낸 데이타는 3개의 웰에 대한 O.D 판독의 평균치이다.
TNFα 생분석의 결과는 IFN-γ의 결과와 일관성이 있다.
ELISA: 클론 17D5는 HLA-B4402 발현 레트로바이러스 작제물로 형질도입된 SKBR3 및 SKOV3 둘 다에 응합하여 특이적으로 TNFα를 분비한다(참조: 표 6).
T 세포 클론 17D51에 의한 종양 인지를 입증하는 TNFα생분석
T 세포 + APC Ave O.D.2
FIB 0.902
H2N FIB 0.327
HCT116-EGFP 1.036
HCT116-B44 0.978
SKBR3 1.057
SKBR3-B44 0.359
SKOV3-EGFP 1.070
SKOV3-B44 0.381
MCF7 1.073
MCF7-H2N 0.878
단독의 T 세포 0.995
단독의 매질 1.038
1클론 17D5 T 세포(웰당 10,000 세포)를 지적된 APC(10,000세포/웰) 또는 3개의 96웰 플레이트에서 단독의 매질중에서 항온처리한다. 4시간 상등액을 수거하고 TNFα-민감성 세포주 WEHI에 첨가하고 96웰 플레이트에 30,000 세포/웰로 도말한다. WEHI 세포를 상등액과 밤새 항온처리하고 알로마르 블루를 웰당 10분 1의 최종 용적으로 첨가한다. O.D. 570nm 내지 630nm를 알로마르 블루를 첨가한지 7시간 및 24시간 후에 판독한다. 나타낸 결과는 24시간의 시점이다.2O.D. 값은 3개의 웰의 평균 값이고 TNFα민감성 WEHI 세포의 상대적 생존력을 지적하고 보다 낮은 수치는 세포가 많이 사멸되어 TNFα 분비가 증가하였음을 나타낸다.
상기 결과는 이들이 ICD 재조합 아데노바이러스로 프라이밍된 CD8+ T 세포가 Her-2/neu를 과발현하는 사람 종양 세포를 인지할 수 있음을 입증하기 때문에 중요하다. 20% 내지 40%의 사람 유방 암종 및 특정 비율의 난소, 폐 및 결장 암종이 Her-2/neu를 과발현한다. 이들 데이타는 Her-2/neu-양성 종양에 대한 백신으로서의 ICD의 용도를 지지한다.
실시예 5
이. 콜리에서 사람 Her-2/neu HICD의 발현
본 실시예는 재조합 사람 Her-2/neu ICD(HICD) 단백질을 발현하는 작제물을 기술하고 있다.
사람 ICD에 대한 개방 판독 프레임은 이. 콜리내에서 재조합 단백질을 발현하기 위해 PCR 증폭시키고 변형된 pET28 벡터에 서브클로닝한다. N-말단 히스티딘 태그를 갖는 것과 하나가 프로테아제 절단 부위를 갖고 다른 하나는 이를 갖지 않는 2개의 작제물을 작제한다.
HICD + 8 HIS(서열 5 및 11)의 작제
ICD 암호 영역은 본래에 하기 프라이머를 사용하여 pGS10 ATG 플라스미드로부터 PCR 증폭되었다:
PDM-44(서열 16):
5'atctctggcgcgctggatgacgatgacaagaaacgacggcagcagaag
PDM-45(서열 17):
5'cagggcgcgccactcgagtcattacactggcacgtccagacccag
PCR 조건은 하기와 같다: 10㎕ 10X Pfu 완충액(Stratagene, La Jolla, CA), 1.25㎕의 10mM dNTP(Sigma, St. Louis, MO), 3㎕ 10μM PDM-44 올리고, 3㎕ 10μM PDM-45 올리고, 80㎕ 멸균수, 2㎕ Pfu DNA 폴리머라제,―5ng pGS10△ATG DNA. 열순환 조건은 다음과 같다: 96℃에서 2분동안 단일 변성 단계에 이어서 96℃에서 30초동안, 68℃에서 15초동안 및 72℃에서 6분 45초 동안 40회 및 72℃에서 10분동안 최종 연장. 추가의 분석때까지 샘플을 4℃에서 유지한다. 상기 PCR 생성물을PDM-44 프라이머에 포함된 BssHII 부위와의 프레임내 8개의 His 태그 암호화 영역을 포함하는 변형된 pT7 블루 플라스미드에 클로닝한다. 벡터 및 PCR 생성물을 BssHII 및 AscI로 분해한다. 배향이 올바른 작제물을 스크리닝하고 이어서 서열분석한다. 상기 작제물을 NcoI 및 AscI 부위에서 pET14b(Novagen, Madison, WI)에 클로닝한다. 당해 작제물을 이어서 NcoI 및 HindIII 부위에서 pET28b(Novagen, Madison, WI) 벡터에 클로닝한다. 최종 작제물은 엔테로키나제 절단 부위 및 8개의 히스티딘 태그를 포함한다.
pPDM 암호화 서열에서 HICD의 작제(서열 7 및 10)
ICD 암호화 영역은 하기의 프라이머를 사용하여 cDNA 주형으로부터 PCR 증폭되었다:
PDM-591(서열 18) 5'cacaaacgacggcagcagaagatccggaag3'
PDM-592(서열 19) 5'gcgccactcgagtcattacactggcacgtc3'
PCR 조건은 다음과 같다: 10㎕ 10X Pfu 완충액(Stratagene, La Jolla, CA), 1㎕의 10mM dNTP(Sigma, St. Louis, MO), 2㎕ 10μM PDM-591 및 -592 올리고, 83㎕ 멸균수, 1.5㎕ Pfu DNA 폴리머라제, 1㎕의 cDNA. 열순환 조건은 다음과 같다: 96℃에서 2분동안 초기 변성 단계에 이어서 96℃에서 30초동안, 66℃에서 15초동안 및 72℃에서 5분 동안 40회 및 이후 72℃에서 6분동안 최종 연장시킨다. PCR 생성물을 XhoI로 분해하고 Eco 72I 및 XhoI로 분해된 프레임내에 His 태그를 갖는 pPDM His 변형된 pET28에 클로닝한다. 서열 분석을 하여 올바른 작제물인지 확인한 다음 발현을 위해 BLR pLysS 세포를 형질전환시킨다.
HICD CT His 암호화 영역(서열 4 및 8)의 작제
ICD 암호 영역은 하기의 프라이머를 사용하여 cDNA 주형으로부터 PCR 증폭되었다:
PDM-72(서열 20) 5'cgacttcatatgaaacgacggcagcagaagatc3'
PDM-61(서열 21)
5'ccacgtctagagaaggcgcgccatctggatcattaatgatgatgatgatgatgcactggcacgtccagacccaggta3'
PCR 조건은 다음과 같다: 10㎕ 10X Pfu 완충액(Stratagene, La Jolla, CA), 1㎕의 10mM dNTP(Sigma, St. Louis, MO), 2㎕ 10μM PDM-72 올리고, 2㎕ 10μM PDM-61 올리고, 83㎕ 멸균수, 1.5㎕ Pfu DNA 폴리머라제, 1㎕의 cDNA. 열순환 조건은 다음과 같다: 96℃에서 2분동안 초기 변성 단계에 이어서 96℃에서 30초동안, 66℃에서 15초동안 및 72℃에서 5분 동안 40회 및 이후 72℃에서 6분동안 최종 연장시킨다. PCR 생성물을 NdeI 및 NotI로 분해하고 NdeI 및 NotI로 분해된 프레임내에 His 태그를 갖는 pPDM His 변형된 pET28에 클로닝한다. 서열 분석을 하여 올바른 작제물인지 확인한 다음 발현을 위해 BLR pLysS 세포를 형질전환시킨다.
HICD 순수 암호화 영역(서열 6 및 9)의 작제
사람 Her-2/neu의 ICD 영역의 C-말단 부위를 KpnI 및 AscI로 분해시켜 VR102 사람 Her-2/neu로부터 분리한다. 이러한 704 염기쌍의 삽입체를 C-말단 His 태그를 갖고 또한 KpnI 및 AscI로 분해시킨(이러한 분해는 작제물로부터 C-말단 His 태그를 제거하고 이어서 704 염기쌍의 삽입체로 대체된다) pET28HICD에 서브클로닝한다. 서열 분석을 통해 올바른 작제물인지 확인한다.
실시예 6
her-2/neu에 특이적인 CD8 T 세포로부터 유래된 TCR 알파 및 베타 쇄의 클로닝 및 서열 분석
본 실시예는 실시예 4에 기술된 Her-2/neu에 특이적인 CD8 T 세포 클론 기원의 T 세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 쇄의 클로닝 및 서열 분석을 기술하고 있다. 서열 분석은 TCR의 알파 쇄가 Vα16 계열에 속하고 베타 쇄가 Vβ14에 속한다는 것을 입증한다. 추가로, 유일한 다변성 및 연결 절편(반응의 특이성에 기여함)을 동정한다.
CTL 클론 17D5 기원의 2 x 106세포로부터의 총 mRNA를 트리졸 시약을 사용하여 분리하고 cDNA를 레디 투 고우 키트(Pharmacia)를 사용하여 합성한다. 당해 클론중의 Vα및 Vβ서열을 결정하기 위해 Vα및 Vβ서브타입 특이적 프라이머의 한 판넬을 합성(제조사(Clontech, Palo Alto, CA)로부터 합성된 프라이머 서열을 기준으로)하고 각각의 클론으로부터 합성된 cDNA와의 RT-PCR 반응에 사용한다. RT-PCR 반응은 각각의 클론이 Vβ14 서브패밀리에 상응하는 공통된 Vβ서열을 발현한다. 추가로, 클론으로부터 합성된 cDNA를 사용하여 발현된 Vα 서열이 Vα16인 것으로 결정한다. 클론 17D5 기원의 완전한 TCR 알파 및 베타 쇄를 클로닝하기 위해, 개시 인자 및 종결 인자 암호화 TCR 뉴클레오타이드 범위를 포괄하도록 프라이머를디자인한다. 프라이머는 다음과 같다:
TCR V 알파-16 5'(센스)(BamHI 부위 - - - Kozak--TCR 알파 서열)
(서열 22): GGATCC---GCCGCCACC--ATGGCCTCTGCACCCATCTCGATCR 알파 3'(안티센스)(SalI 부위--TCR 알파 불변 서열)(서열 23): GTCGAC---TCAGCTGGACCACAGCCGCAG
TCR V 베타-14. 5'(센스)(BamHI 부위---Kozak--TCR 알파 서열) (서열 24):
GGATCC---GCCGCCACC--ATGGGCCCCCAGCTCCTTGGCTA
TCR 베타 3'(안티센스)(SalI 부위---TCR 베타 불변 서열)(서열 25): GTCGAC---TCAGAAATCCTTTCTCTTGAC.
표준 35회 RT-PCR 반응을 CTL 클론으로부터 합성된 cDNA 및 프루프리딩(proofreading) 열안정성 폴리머라제 PWO(Roche, Basel, Switzerland)를 사용한 상기 프라이머를 사용하여 확립한다. 수득한 특이적 밴드(알파는 ∼850 bp이고 베타는 ∼ 950이다)를 PCR 평활 벡터(Invitrogen, Carsbad, CA)에 연결하고 이. 콜리를 형질전환시킨다. 전장 알파 및 베타 쇄를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 이. 콜리를 동정하고 거대 규모의 상응하는 플라스미드 제제를 합성한다. 전장 TCR 알파 및 베타 쇄를 포함하는 플라스미드를 서열 분석한다. 서열 분석 반응은 전장 TCR 알파 및 베타 쇄가 클로닝되었음을 입증한다. 알파 및 베타 쇄에 대한 cDNA 서열은 서열 13 및 12에 각각 나타내고 아미노산 서열은 각각 서열 15 및 14에 나타낸다. 블라스트 검색으로 Vα가 Vα 16 계열에 속하고 Vβ가 Vβ14 계열에 속하는 것임을 확인한다. TCR의 특이성에 기여하는 다변성-연결(DJ) 영역이 유일하다.
본 발명의 특정 양태가 설명을 목적으로 기술되었지만 본원에 기술된 것으로부터 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 다양하게 변형될 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구의 범위에 의해서만 제한된다.

Claims (12)

  1. 환자의 면역 반응을 유도하는데 효과적인 분리된 폴리뉴클레오타이드(여기서, 폴리뉴클레오타이드는 필수적으로 서열 3으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다) 조성물.
  2. 면역 반응을 유도하는데 효과적인 분리된 폴리펩타이드(여기서, 폴리펩타이드는 필수적으로 서열 3으로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다) 조성물.
  3. 약제학적으로 허용되는 담체와 배합된 제1항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제2항에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 면역자극제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 면역자극제가 애쥬반트(adjuvant)를 포함하는 약제학적 조성물.
  6. 제1항에 따른 폴리뉴클레오타이드 유효량을 환자에게 투여함을 포함하는, 환자의 면역 반응을 유도하기 위한 방법.
  7. 제6항에 있어서, 환자가 HLA-B44 양성인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 환자가 유방암 환자인 방법.
  9. 서열 1의 약 2026번 내지 3765번의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 유효량을 환자에게 투여함을 포함하는, 환자의 면역 반응을 유도하기 위한 방법.
  10. 제9항에 있어서, 환자가 유방암 환자인 방법.
  11. 서열 13에 제시된 TCR-알파 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 조성물.
  12. 서열 12에 제시된 TCR-베타 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 조성물.
KR10-2003-7002207A 2000-08-14 2001-08-14 Ｈｅｒ-2/ｎｅｕ 관련 악성 종양의 치료 및 진단용 조성물및 방법 KR20030048009A (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22515200P 2000-08-14 2000-08-14
US60/225,152 2000-08-14
US23642800P 2000-09-28 2000-09-28
US60/236,428 2000-09-28
US27052001P 2001-02-21 2001-02-21
US60/270,520 2001-02-21
PCT/US2001/041733 WO2002014503A2 (en) 2000-08-14 2001-08-14 Compositions and methods for the therapy and diagnosis of her-2/neu-associated malignancies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20030048009A true KR20030048009A (ko) 2003-06-18

Family

ID=27397445

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2003-7002207A KR20030048009A (ko) 2000-08-14 2001-08-14 Ｈｅｒ-2/ｎｅｕ 관련 악성 종양의 치료 및 진단용 조성물및 방법

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20020193329A1 (ko)
EP (1) EP1366153A2 (ko)
JP (1) JP2004522412A (ko)
KR (1) KR20030048009A (ko)
CN (1) CN1537164A (ko)
AU (1) AU2001295008A1 (ko)
BR (1) BR0113235A (ko)
CA (1) CA2419533A1 (ko)
HU (1) HUP0600780A2 (ko)
IL (1) IL154415A0 (ko)
MX (1) MXPA03001389A (ko)
NO (1) NO20030714L (ko)
PL (1) PL365789A1 (ko)
WO (1) WO2002014503A2 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101010063B1 (ko) * 2008-07-25 2011-01-21 삼표이앤씨 주식회사 레일고정구조
WO2023008815A1 (ko) * 2021-07-28 2023-02-02 주식회사 애스톤사이언스 Her2 백신 조성물

Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU6620300A (en) 1999-08-03 2001-02-19 Ohio State University, The Polypeptides and polynucleotides for enhancing immune reactivity to her-2 protein
TWI259206B (en) * 2002-09-24 2006-08-01 Univ Nat Cheng Kung A DNA vaccine containing a tumor associated gene and a cytokine gene and the method producing thereof
WO2004061105A1 (en) * 2003-01-03 2004-07-22 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti Spa Rhesus her2/neu, nucleotides encoding same, and uses thereof
CA2532460C (en) * 2003-07-21 2012-04-24 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. Synthetic gene encoding human epidermal growth factor 2/neu antigen and uses thereof
BR122018071808B8 (pt) 2003-11-06 2020-06-30 Seattle Genetics Inc conjugado
NZ579482A (en) 2004-06-01 2011-02-25 Genentech Inc Antibody drug conjugates and methods
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
NZ580115A (en) 2004-09-23 2010-10-29 Genentech Inc Cysteine engineered antibody light chains and conjugates
CN100381460C (zh) * 2004-11-30 2008-04-16 北京市肿瘤防治研究所 Her-2模拟抗原表位及含有该表位的肽
ES2531483T3 (es) 2005-06-15 2015-03-16 The Ohio State University Research Foundation Péptidos HER-2
US20100234283A1 (en) 2009-02-04 2010-09-16 The Ohio State University Research Foundation Immunogenic epitopes, peptidomimetics, and anti-peptide antibodies, and methods of their use
JP2013504585A (ja) 2009-09-09 2013-02-07 セントローズ， エルエルシー 細胞外標的化薬物複合体
CA2793890C (en) 2010-04-15 2017-08-15 Spirogen Developments Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
KR101839163B1 (ko) 2010-06-08 2018-03-15 제넨테크, 인크. 시스테인 조작된 항체 및 접합체
CA2816426A1 (en) 2010-11-17 2012-06-07 Genentech, Inc. Alaninyl maytansinol antibody conjugates
JP5987053B2 (ja) 2011-05-12 2016-09-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド フレームワークシグネチャーペプチドを用いて動物サンプルにおける治療抗体を検出するための多重反応モニタリングｌｃ−ｍｓ／ｍｓ法
EP2750713B1 (en) 2011-10-14 2015-09-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN102357246B (zh) * 2011-11-02 2013-04-03 江苏省中医药研究院 一种egfr与her2联合多肽表位疫苗
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
EP2906253B9 (en) 2012-10-12 2019-04-10 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine - anti-psma antibody conjugates
ES2703151T3 (es) 2012-10-12 2019-03-07 Adc Therapeutics Sa Conjugados de anticuerpos de pirrolobenzodiazepinas
CN105102004B (zh) 2012-10-12 2019-01-25 Adc疗法责任有限公司 吡咯并苯并二氮杂卓-抗cd22抗体结合物
ES2680153T3 (es) 2012-10-12 2018-09-04 Adc Therapeutics Sa Conjugados de anticuerpos anti-PSMA-pirrolobenzodiazepinas
EP2906297B1 (en) 2012-10-12 2017-12-06 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
PT2906296T (pt) 2012-10-12 2018-06-01 Medimmune Ltd Conjugados de pirrolobenzodiazepina-anticorpo
ME03486B (me) 2012-10-12 2020-01-20 Medimmune Ltd Pirolobenzodiazepini i njihovi konjugati
CN105246894A (zh) 2012-12-21 2016-01-13 斯皮罗根有限公司 用于治疗增殖性和自身免疫疾病的非对称吡咯并苯并二氮杂卓二聚物
BR112015014669B1 (pt) 2012-12-21 2023-09-26 Medimmune Limited Compostos pirrolobenzodiazepinas, conjugados compreendendo os mesmos e uso destes para tratar uma doença proliferativa
US20160031887A1 (en) 2013-03-13 2016-02-04 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
BR112015021965B1 (pt) 2013-03-13 2022-05-03 Medimmune Limited Conjugados e compostos de pirrolobenzodiazepinas, composição farmacêutica, uso dos mesmos para o tratamento de uma doença proliferativa e método de síntese dos ditos compostos
EP2968596B1 (en) 2013-03-13 2019-03-06 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2015023355A1 (en) 2013-08-12 2015-02-19 Genentech, Inc. 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1h-benzo[e]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US9950078B2 (en) 2013-10-11 2018-04-24 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP3054986B1 (en) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP3054983B1 (en) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
AU2014364927A1 (en) 2013-12-16 2016-07-07 Genentech, Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
EP3082874A2 (en) 2013-12-16 2016-10-26 Genentech, Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
BR112016013258A2 (pt) 2013-12-16 2018-01-16 Genentech Inc composto conjugado anticorpo-droga, composição farmacêutica, método para tratar câncer e kit
EP3193940A1 (en) 2014-09-10 2017-07-26 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2016040825A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Anthracycline disulfide intermediates, antibody-drug conjugates and methods
KR20170052600A (ko) 2014-09-12 2017-05-12 제넨테크, 인크. 시스테인 가공된 항체 및 콘주게이트
MX2017003523A (es) 2014-09-17 2017-11-08 Genentech Inc Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de anticuerpo-disulfuro de las mismas.
BR112017011111A2 (pt) 2014-11-25 2017-12-26 Adc Therapeutics Sa conjugados de pirrolobenzodiazepina-anticorpo
KR20170086121A (ko) 2014-12-03 2017-07-25 제넨테크, 인크. 4급 아민 화합물 및 그의 항체-약물 접합체
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
WO2017165734A1 (en) 2016-03-25 2017-09-28 Genentech, Inc. Multiplexed total antibody and antibody-conjugated drug quantification assay
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
EP3458101B1 (en) 2016-05-20 2020-12-30 H. Hoffnabb-La Roche Ag Protac antibody conjugates and methods of use
US20170370906A1 (en) 2016-05-27 2017-12-28 Genentech, Inc. Bioanalytical analysis of site-specific antibody drug conjugates
CN109476648B (zh) 2016-06-06 2022-09-13 豪夫迈·罗氏有限公司 司维司群抗体-药物缀合物和使用方法
EP3496763A1 (en) 2016-08-11 2019-06-19 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepine prodrugs and antibody conjugates thereof
CN110139674B (zh) 2016-10-05 2023-05-16 豪夫迈·罗氏有限公司 制备抗体药物缀合物的方法
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
UA125198C2 (uk) 2017-02-08 2022-01-26 Ейдісі Терапьютікс Са Кон'югати піролобензодіазепін-антитіло
ES2926144T3 (es) 2017-04-18 2022-10-24 Medimmune Ltd Conjugados de pirrolobenzodiazepina
JP7408396B2 (ja) 2017-04-20 2024-01-05 アーデーセー セラピューティクス ソシエテ アノニム 併用療法
WO2018229222A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Adc Therapeutics Sa Dosage regimes for the administration of an anti-cd19 adc
HRP20220311T1 (hr) 2017-08-18 2022-05-13 Medimmune Limited Konjugati pirolobenzodiazepina
BR112020004307A2 (pt) 2017-09-20 2020-11-10 Ph Pharma Co., Ltd. análogos de tailanestatina
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
EP3847265A4 (en) * 2018-09-05 2023-02-15 The Regents of University of California COMPOSITION OF NY-ESO-1 SPECIFIC T LYMPHOCYTE RECEPTORS LIMITED ON MULTIPLE MOLECULES OF THE MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX
EP3870235A1 (en) 2018-10-24 2021-09-01 F. Hoffmann-La Roche AG Conjugated chemical inducers of degradation and methods of use
CN113227119A (zh) 2018-12-10 2021-08-06 基因泰克公司 用于与含Fc的蛋白质进行位点特异性缀合的光交联肽
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
KR20240006547A (ko) 2021-05-04 2024-01-15 주식회사 애스톤사이언스 Her2 백신 조성물

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993014781A1 (en) * 1992-01-24 1993-08-05 The Regents Of The University Of California Novel peptides and method for altering the activity of allosteric proteins
US5869445A (en) * 1993-03-17 1999-02-09 University Of Washington Methods for eliciting or enhancing reactivity to HER-2/neu protein
US5801005A (en) * 1993-03-17 1998-09-01 University Of Washington Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
EP1064022A4 (en) * 1998-03-13 2004-09-29 Epimmune Inc HLA BINDING PEPTIDES AND THEIR APPLICATIONS
CA2330212A1 (en) * 1998-05-08 1999-11-18 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Compositions and methods for active vaccination
EP1147190B1 (en) * 1999-01-29 2010-07-14 Corixa Corporation Her-2/neu fusion proteins

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101010063B1 (ko) * 2008-07-25 2011-01-21 삼표이앤씨 주식회사 레일고정구조
WO2023008815A1 (ko) * 2021-07-28 2023-02-02 주식회사 애스톤사이언스 Her2 백신 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
CN1537164A (zh) 2004-10-13
WO2002014503A2 (en) 2002-02-21
MXPA03001389A (es) 2004-05-04
HUP0600780A2 (en) 2007-01-29
CA2419533A1 (en) 2002-02-21
NO20030714D0 (no) 2003-02-14
BR0113235A (pt) 2004-06-08
WO2002014503A3 (en) 2003-09-18
PL365789A1 (en) 2005-01-10
AU2001295008A1 (en) 2002-02-25
US20020193329A1 (en) 2002-12-19
NO20030714L (no) 2003-04-11
EP1366153A2 (en) 2003-12-03
JP2004522412A (ja) 2004-07-29
IL154415A0 (en) 2003-09-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20030048009A (ko) Ｈｅｒ-2/ｎｅｕ 관련 악성 종양의 치료 및 진단용 조성물및 방법
US20020177552A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of colon cancer
JP2004526401A (ja) 肺癌の治療および診断のための組成物および方法
CA2411278A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of colon cancer
US20080219990A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
EP1516049A2 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US20070161034A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of colon cancer
JP2008510464A (ja) 肺癌の治療および診断のための組成物および方法
WO2001018046A2 (en) Ovarian tumor sequences and methods of use therefor
WO2002039885A2 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
KR20030028474A (ko) 유방암의 치료 및 진단을 위한 조성물 및 방법
US20080311109A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
WO2001094409A2 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of pancreatic cancer
US20060083749A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
US20040037842A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of colon cancer
WO2003022126A2 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of colon cancer
WO2003029468A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20020156011A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of colon cancer
WO2002024057A2 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid