ES2531483T3

ES2531483T3 - Péptidos HER-2

Info

Publication number: ES2531483T3
Application number: ES06785065.1T
Authority: ES
Inventors: Pravin T. P. Kaumaya
Original assignee: Ohio State University Research Foundation
Current assignee: Ohio State University Research Foundation
Priority date: 2005-06-15
Filing date: 2006-06-15
Publication date: 2015-03-16
Anticipated expiration: 2026-06-15
Also published as: CA2612394C; US20110086055A1; WO2006138675A2; JP2012136555A; EP1912680A2; US20140010831A1; AU2006261342B2; JP5222134B2; US9452204B2; US7691396B2; EP1912680B1; JP2009500298A; CA2612394A1; US20070060516A1; JP5542865B2; WO2006138675A9; US8470333B2; AU2006261342A1; EP1912680A4

Abstract

Una composición que comprende un péptido quimérico, en la que el péptido quimérico comprende un epítopo B de HER-2, un epítopo auxiliar T (Th) y un enlazador que une el epítopo B de HER-2 al epítopo Th, en la que: la secuencia del epítopo B de HER-2 es LHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCV (SEC ID Nº 6); el epítopo Th comprende una secuencia seleccionada entre: KLLSLIKGVIVHRLEGVE (SEC ID Nº 10); NSVDDALINSTIYSYFPSV (SEC ID Nº 11); PGINGKAIHLVNNQSSE (SEC ID Nº 12); QYIKANSKFIGITEL (SEC ID Nº 13); FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEC ID Nº 14); LSEIKGVIVHRLEGV (SEC ID Nº 15); FFLLTRILTIPQSLN (SEC ID Nº 16); o TCGVGVRVRSRVNAANKKPE (SEC ID Nº 17); y el enlazador es de 1 a 15 aminoácidos.

Description

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En algunos ejemplos, las eliminaciones y adiciones se encuentran en el extremo amino, en el extremo carboxi o en ambos, de una de las secuencias mostradas anteriormente. Por ejemplo, el equivalente de epítopo B de HER-2 tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 % idéntica, al menos un 80 % idéntica, al menos un 90 % idéntica o al menos un 95 % idéntica a las secuencias del epítopo B de HER-2 correspondientes. Las secuencias que son al menos 90 % idénticas tienen no más de 1 modificación, es decir, cualquier combinación de eliminaciones, adiciones o sustituciones, en 10 aminoácidos de la secuencia de referencia. El porcentaje de identidad se determina comparando la secuencia de aminoácidos de la variante con la secuencia de referencia usando el proyecto MEGALIGN del programa DNA STAR.

Por equivalentes funcionales que son más largos que una secuencia del epítopo B de HER-2 correspondiente, el equivalente funcional puede tener una secuencia que sea al menos 90 % idéntica a la secuencia del epítopo B HER2 y las secuencias que flanquean las secuencias del epítopo B de HER-2 en la proteína HER-2 de tipo silvestre.

Los equivalentes funcionales de los epítopos B de HER-2 se pueden identificar mediante la modificación de la secuencia del epítopo y el posterior ensayo del polipéptido resultante para determinar la capacidad de estimular una respuesta inmune, por ejemplo, la producción de anticuerpos. Por ejemplo, dichos ensayos generalmente se pueden realizar mediante la preparación de un péptido quimérico que comprenda el polipéptido modificado y un epítopo Th, la inyección del péptido quimérico en un animal de ensayo y el ensayo de los anticuerpos. Dichos anticuerpos se pueden encontrar en varios fluidos corporales incluyendo sueros y ascitis. En resumen, se aísla una muestra de fluido corporal de un animal de sangre caliente, tal como un ser humano, para el que se desea determinar si están presentes los anticuerpos específicos del polipéptido HER-2/neu. Se incuba el fluido corporal con el polipéptido HER-2/neu en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la formación de inmunocomplejos entre el polipéptido y los anticuerpos específicos de la proteína y luego se ensayan, preferentemente usando una técnica de ELISA. En dicha técnica, se mide el cambio colorimétrico a 490 nm. Los epítopos que inducen la producción de anticuerpos que presentan un título igual a 10.000 o superior para la proteína HER-2/neu, pueden ser útiles. Como se usa en el presente documento, un título de 10.000 se refiere a un valor de absorbancia de 0,2 por encima del fondo.

De acuerdo con otras realizaciones, se proporcionan péptidos quiméricos y composiciones que comprenden uno o más péptidos quiméricos. De acuerdo con diversas realizaciones, los péptidos quiméricos comprenden un epítopo B de HER-2, un epítopo auxiliar T (Th) y un enlazador que une el epítopo B de HER-2 con el epítopo Th. Se entenderá que se puede usar cualquier epítopo Th adecuado. Por ejemplo, se puede usar un epítopo Th promiscuo. Como se usa en el presente documento, un epítopo Th "promiscuo" es aquel que promueve la liberación de citocinas, ayudando a saltarse la restricción del MHC. Se entenderá además que se puede usar cualquier enlazador adecuado. Por ejemplo, dependiendo del epítopo Th usado, el epítopo B de HER-2 puede estar enlazado bien al extremo amino o al extremo carboxi del epítopo Th. La ubicación y la selección del epítopo Th depende de las características estructurales del epítopo B de HER-2, ya sea α helicoidal o giro β o hebra. En Kaumaya et al., "DE NOVO" ENGINEERING OF PEPTIDE IMMUNOGENIC AND ANTIGENIC DETERMINANTS AS POTENTIAL VACCINES, in Peptides, Design, Synthesis and Biological Activity (1994), pág. 133-164, se describen métodos de selección de los epítopos Th adecuados. En la revisión titulada "Synthetic Peptides: Dream or Reality" de Kaumaya et al., y publicada en PEPTIDES IN IMMUNOLOGY, Wiley and Sons, Ltd. (1996), se presenta un resumen de las respuestas inmunes generadas por varios epítopos Th que contienen quimeras de epítopos de linfocitos B.

En algunos ejemplos, el epítopo Th puede ser de aproximadamente 14 a aproximadamente 22, de aproximadamente 15 a 21 o de 16 aminoácidos de longitud. En otras realizaciones, los ejemplos de epítopos Th adecuados incluyen, pero sin limitación:

KLLSLIKGVIVHRLEGVE, SEC ID Nº 10;

NSVDDALINSTIYSYFPSV, SEC ID Nº 11;

PGINGKAIHLVNNQSSE, SEC ID Nº 12;

QYIKANSKFIGITEL, SEC ID Nº 13;

FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE, SEC ID Nº 14;

LSEIKGVIVHRLEGV, SEC ID Nº 15;

FFLLTRILTIPQSLN, SEC ID Nº 16; o

TCGVGVRVRSRVNAANKKPE, SEC ID Nº 17.

En otros ejemplos, el enlazador puede ser un péptido de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 aminoácidos, de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 aminoácidos o de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 aminoácidos de longitud. Por ejemplo, el enlazador puede ser un péptido que tenga la secuencia de aminoácidos Gly-Pro-Ser-Leu, SEC ID Nº 18. Los péptidos quiméricos pueden ser lineales o ciclados. Además, los epítopos B de HER-2, los epítopos Th y/o el enlazador pueden estar en forma retroinversa. Así pues, el epítopo B de HER-2 podría estar en forma retroinversa. Como alternativa, el epítopo B de HER-2 y el epítopo Th podrían estar en forma retroinversa. En otro ejemplo, el epítopo B de HER-2, el epítopo Th y el enlazador podrían estar en forma retroinversa.

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Los ejemplos de péptidos quiméricos adecuados incluyen, pero sin limitación:

KLLSLIKGVIVHRLEGVE-GPSL-CHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVA, SEC ID Nº 19;

KLLSLIKGVIVHRLEGVE-GPSL-VACAHYKDPPFCVA, SEC ID Nº 20;

5 KLLSLIKGVIVHRLEGVE-GPSL-VARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPL, SEC ID Nº 21; KLLSLIKGVIVHRLEGVE-GPSL-IWKFPDEEGACQPL, SEC ID Nº 22; KLLSLTKGVIVHRLEGVE-GPSL-LHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCV, SEC ID Nº 23; KLLSLIKGVIVHRLEGVE-GPSL-ACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEK, SEC ID Nº 24; KLLSLIKGVIVHRLEGVE-GPSL-CPLHNQEVTAEDGTQRCEK, SEC ID Nº 25; o

10 KLLSLIKGVIVHRLEGVE-GPSL-CPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRAS, SEC ID Nº 26.

Los péptidos de SEC ID Nº 19-26 tienen un epítopo Th, un enlazador GPSL y un epítopo B de HER-2.

Los péptidos quiméricos y las composiciones que comprenden los péptidos pueden ser inmunógenos útiles para

15 inducir la producción de anticuerpos que interactúen con y se unan al dominio extracelular de la proteína HER-2. Los péptidos quiméricos también pueden ser útiles como herramientas de laboratorio para la detección de anticuerpos contra la proteína HER-2 en el suero de un sujeto. Los péptidos quiméricos pueden generar una respuesta de anticuerpos en un sujeto y que dichos anticuerpos puedan (a) inmunoprecipitar la proteína HER-2; (b) unirse al receptor de HER 2 intacto en células que sobreexpresan ER-2 en cultivo; y (c) reducir la proliferación de células que

20 sobreexpresan HER-2 in vitro. Los péptidos quiméricos también se pueden usar para inmunizar a un sujeto y retrasar o prevenir el desarrollo de tumores. Los péptidos quiméricos se pueden usar en vacunas para proporcionar un efecto protector.

De acuerdo con realizaciones adicionales de la presente invención, se proporcionan composiciones que

25 comprenden una mezcla de dos o más de los péptidos quiméricos. En algunos ejemplos, el epítopo B de HER-2 de cada uno de los dos o más péptidos quiméricos es diferente. En otros ejemplos, uno de los epítopos B de HER-2 se selecciona entre las SEC ID Nº 2-5 y el otro de los epítopos B de HER-2 se selecciona entre las SEC ID Nº 6-8.

Los epítopos B de HER-2 y los péptidos quiméricos se pueden sintetizar usando sintetizadores de péptidos

30 disponibles en el mercado. Por ejemplo, se pueden usar los métodos químicos descritos en Kaumaya et al., "DE NOVO" ENGINEERING OF PEPTIDE IMMUNOGENIC AND ANTIGENIC DETERMINANTS AS POTENTIAL VACCINES, en Peptides, Design, Synthesis and Biological Activity (1994), pág. 133-164.

Por ejemplo, los epítopos B de HER-2 se pueden sintetizar colinealmente con el epítopo Th para formar un péptido

35 quimérico. La síntesis de péptidos se puede realizar usando la química de Fmoc/t-But. Los epítopos B de HER-2 y los péptidos quiméricos se pueden ciclar de cualquier manera adecuada. Por ejemplo, se pueden crear enlaces disulfuro usando restos de cisteína protegidos de forma diferencial, la oxidación de yodo, la adición de agua para impulsar la eliminación de Acm y la formación concomitante de un enlace disulfuro y/o el método de cloruro de sililosulfóxido.

40 Los epítopos B de HER-2 y los péptidos quiméricos también se pueden producir usando sistemas de traducción carentes de células y moléculas de ARN derivadas de construcciones de ADN que codifican el epítopo o el péptido. Como alternativa, los epítopos o péptidos quiméricos se crean mediante la transfección de células huésped con vectores de expresión que comprenden una secuencia de ADN que codifica el respectivo epítopo o péptido

45 quimérico y luego la inducción de la expresión del polipéptido en las células huésped. Para la producción recombinante, se introducen construcciones recombinantes que comprenden una o más de las secuencias que codifican el epítopo, el péptido quimérico o una variante de los mismos en células huésped mediante métodos convencionales tales como transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, carga por

50 legrado, introducción balística o infección.

El epítopo B de HER-2 y el péptido quimérico se pueden expresar en células huésped adecuadas tales como, por ejemplo, células de mamífero, levaduras, bacterias, células de insectos u otras células bajo el control de promotores apropiados usando técnicas convencionales. Los huéspedes adecuados incluyen, pero sin limitación, E. coli, P.

55 pastoris, células COS y células 293 HEK. Tras la transformación adecuada de la cepa huésped y el crecimiento de la cepa huésped hasta una densidad celular apropiada, se recogen las células por centrifugación, se rompen mediante medios físicos o químicos y se conserva el extracto bruto resultante para la posterior purificación del epítopo o péptido quimérico.

60 Para aislar el polipéptido recombinante, se pueden usar procedimientos convencionales para aislar proteínas recombinantes a partir de células huésped transformadas tales como el aislamiento por extracción inicial a partir de sedimentos de células o del medio de cultivo de células, seguido de la precipitación salina, y una o más etapas de cromatografía, incluyendo la cromatografía de intercambio iónico acuoso, etapas de cromatografía de exclusión por tamaño, y la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y la cromatografía de afinidad.

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Para producir epítopos glicosilados y péptidos quiméricos, se pueden usar técnicas recombinantes. Por ejemplo, se pueden emplear células de mamífero tales como células Cos-7 y Hep-G2 en las técnicas recombinantes. Como alternativa, los epítopos glicosilados y los péptidos quiméricos se pueden producir usando la síntesis de Fmoc/t-But convencional. Por ejemplo, se pueden añadir una o más unidades de azúcar a los péptidos usando una metodología quimioenzimática empleando endo-β-N-acetilglucosaminidasas como la enzima clave para la transferencia de oligosacáridos.

También se pueden aislar variantes naturales de los epítopos B de HER-2 mediante, por ejemplo, la exploración de un ADNc o una biblioteca genómica apropiada con una secuencia de ADN que codifique el polipéptido.

De acuerdo con realizaciones adicionales, se proporcionan péptidos multivalentes que comprenden una pluralidad, es decir, al menos dos de los epítopos B de HER-2 o equivalentes funcionales de los mismos y un epítopo Th. Los epítopos B de HER-2 y el epítopo Th están conectados a un molde. Por ejemplo, los epítopos B de HER-2 y el epítopo Th pueden estar conectados a un molde de lámina β del núcleo. En otro ejemplo, el molde puede ser dos hebras en las que se alternan restos de leucina y lisina, que están conectadas por un enlazador. El enlazador es un aminoácido o un péptido de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 aminoácidos, de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 aminoácidos o de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 aminoácidos de longitud. Por ejemplo, el enlazador puede ser la secuencia de aminoácidos Gly-Pro-Ser-Leu, SEC ID Nº 18.

Los péptidos multivalentes se pueden sintetizar de cualquier manera adecuada. Por ejemplo, los péptidos multivalentes se pueden preparar empleando una estrategia combinatoria de Fmoc/t-Butilo, Fmoc/bencilo y Bocbencilo, así como un cuarto nivel de estrategia de grupos protectores diferenciales (Npys). Los detalles de dicha metodología se presentan en Larimore et al. (1995) Journal of Virology 69: 6077-6089.

De acuerdo con otras realizaciones más de la presente invención, se proporcionan polinucleótidos aislados que codifican los epítopos B de HER-2 y los péptidos quiméricos descritos en el presente documento. Los presentes polinucleótidos también comprenden polinucleótidos que tienen secuencias que son capaces de hibridarse con las secuencias de nucleótidos de los epítopos B de HER-2 o los péptidos quiméricos en condiciones rigurosas y/o en condiciones muy rigurosas. Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (Tf) del complejo de unión o de la sonda de ácido nucleico, como se describe en Berger y Kimmel (1987) “Guide to Molecular Cloning Techniques”, Methods in Enzymology, vol 152, Academic Press. La expresión "condiciones rigurosas”, como se usa en el presente documento, es la "rigurosidad" que se produce dentro de un intervalo de aproximadamente la Tf-5 (5 grados por debajo de la temperatura de fusión de la sonda) a aproximadamente 20 ºC por debajo de la Tf. Como se usa en el presente documento, las condiciones "muy rigurosas" emplean al menos 0,2 x tampón SSC y al menos 65 ºC. Como se reconoce en la técnica, las condiciones de rigurosidad se pueden alcanzar variando una serie de factores tales como la longitud y la naturaleza, es decir, el ADN o ARN, de la sonda; la longitud y la naturaleza de la secuencia diana, la concentración de las sales y de otros componentes tales como la formamida, el sulfato de dextrano y el polietilenglicol, de la solución de hibridación. Todos estos factores pueden variar para generar condiciones de rigurosidad que sean equivalentes a las condiciones mencionadas anteriormente.

Los polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican un epítopo B de HER-2 o un péptido quimérico se pueden sintetizar en su totalidad o en parte usando métodos químicos o métodos recombinantes que sean adecuados. Los polinucleótidos que codifican un epítopo B de HER-2 se pueden obtener mediante la exploración de una biblioteca genómica o biblioteca de ADNc con anticuerpos inmunoespecíficos para la proteína HER-2 para identificar los clones que contengan dichos polinucleótidos.

Los polinucleótidos son útiles para producir un epítopo B de HER-2 o un péptido quimérico. Por ejemplo, una molécula de ARN que codifique un péptido quimérico multivalente se puede usar en un sistema de traducción carente de células para preparar dichos polipéptidos. Como alternativa, se puede introducir una molécula de ADN que codifique un epítopo B de HER-2 o un péptido quimérico en un vector de expresión y usarla para transformar células. Los vectores de expresión adecuados incluyen, pero sin limitación, secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético, por ejemplo, derivadas de SV40, plásmidos bacterianos, ADN de fagos; plásmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, ADN viral tal como vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de la pseudorrabia, baculovirus y retrovirus. La secuencia de ADN se puede introducir en el vector de expresión mediante cualquier procedimiento adecuado.

De acuerdo con realizaciones adicionales, se proporcionan construcciones recombinantes que comprenden uno o más de los polinucleótidos que codifican uno o más epítopos B de HER-2 o péptidos quiméricos. Las construcciones adecuadas incluyen, por ejemplo, vectores tales como un vector de plásmido, fagémido o viral, en el que se ha insertado una secuencia que codifica el epítopo B de HER-2 o el péptido quimérico. En el vector de expresión, la secuencia de ADN que codifica el epítopo o el péptido quimérico está unida operativamente a una secuencia de control de la expresión, es decir, un promotor que dirige la síntesis del ARNm. Los ejemplos representativos de dichos promotores incluyen el promotor LTR o SV40, lac o trp de E. coli, el promotor PL del fago λ y otros promotores conocidos por controlar la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o en virus. El vector de expresión también puede contener un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción y un terminador de la transcripción. Por ejemplo, los vectores de expresión recombinantes también pueden incluir un origen de

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En segundo lugar, se ha ensayado la inmunogenicidad de los epítopos de linfocitos B en ratones transgénicos neu-N desarrollados por Guy et al. Los ratones transgénicos neu-N generaron altos títulos de anticuerpos (datos no mostrados) contra las construcciones peptídicas similares a los observados en los ratones FVB/n, a pesar de que estos ratones tienen bajos niveles basales de IgG específica de neu tras la vacunación con una vacuna de células enteras específica de neu.

Ejemplo 4 -Reactividad cruzada de péptidos de unión a herceptina con herceptina (trastuzumab)

Se ensayó si los péptidos configuracionales de los sitios de unión a trastuzumab podían reconocer la herceptina mediante ELISA. Como se muestra en la Fig. 4, diversos péptidos de la región de unión de 563-626 se unieron a trastuzumab. La unión máxima se produjo con el epítopo ciclado 563-598 que posee los 3 enlaces disulfuro. Este resultado se opone a la unión de los anticuerpos con HER-2 debida a la glicosilación por FACS.

Ejemplo 5 -Reactividad cruzada de los anticuerpos peptídicos con la proteína HER-2

Para determinar si los anticuerpos generados por los epítopos de herceptina-péptido muestran diferencias en su capacidad para reconocer el receptor de HER-2, se ensayó la unión de anticuerpos purificados de FVB/n con la línea humana de células de cáncer de mama BT474 que sobreexpresa HER-2. La Figura 5C, D muestra que tanto la construcción 597-626 como la construcción 613-626 se desplazan con respecto a los anticuerpos murinos normales. Sin embargo, las construcciones 563-598 y 585-598 mostraron poco cambio en comparación con los anticuerpos murinos normales (Fig. 5A, B). La construcción 563-598 contiene dos de los tres contactos que HER-2 hace con trastuzumab. El epítopo 597-626, que contiene el último punto de contacto con trastuzumab consiste en 11 aminoácidos que reconocen la proteína nativa (Fig. 5C). La versión más corta de esta secuencia 613-626 también reconoce la proteína nativa de una manera similar (Fig. 5D). Una explicación plausible para la falta de reconocimiento del epítopo 563-598 y 585-598 es que hay un posible sitio de glicosilación en los restos 571-573 (NGS), con el resto de azúcar voluminoso de gran tamaño interfiriendo estéricamente, lo que evita la unión de ese epítopo.

Ejemplo 6 -Exposición tumoral

Para entender mejor el posible beneficio clínico asociado con la introducción de restricciones de configuración en vacunas de epítopos de linfocitos B, ratones transgénicos tanto FVB/N como neu-N se expusieron a la línea de células tumorales NT2.5 derivada de un tumor de mama espontáneo aislado de un ratón transgénico neu-N. Como consecuencia de la sobreexpresión de neu, estos ratones desarrollan adenocarcinomas de mama espontáneos de una manera similar a la observada en los pacientes de cáncer de mama humanos, por lo que son un modelo adecuado para estudiar el cáncer de mama en seres humanos. Se expusieron grupos de ratones FVB/n a 5 x 106 células NT2.5 s.c. (parte inferior del abdomen) dos semanas después de la inmunización final. Se tomaron medidas de los tumores dos veces a la semana hasta el día 55. Se calcularon los volúmenes tumorales con la fórmula (medición larga x medición corta2)/2. Cabe señalar, que tras el día 30, los tumores de los ratones FVB/n comenzaron a reducirse, indicando un rechazo del tumor. En estudios posteriores de los tumores usando ratones FVB/n, se midieron los tumores hasta el día 30. Los ratones inmunizados con las construcciones NC y SS 563-598 resultaron tener volúmenes tumorales medios en el día 30 de 166,517 y 173,7292 mm3, respectivamente, mientras que los ratones no inmunizados resultaron tener un volumen tumoral medio de 346,6563 mm3 (datos no mostrados). Hacia el día 33, los ratones inmunizados con 613-626 y 585-598CYC mostraron una reducción del volumen tumoral en comparación tanto con los ratones no inmunizados como con los inmunizados con MVF. Aunque parece haber un cierto éxito moderado en términos de reducción de la carga tumoral de los ratones inmunizados con los epítopos de linfocitos B de unión a trastuzumab, casi todos los ratones desarrollaron tumores.

Ejemplo 7 -Diseño y evaluación de nuevos epítopos de linfocitos B configuracionales de unión a pertuzumab

Se diseñaron las 3 secuencias peptídicas que aparecen en la Tabla 2 para definir con mayor precisión la secuencia mínima para generar un anticuerpo similar al del sitio de unión a pertuzumab. Estos complejos epítopos peptídicos configuracionales se han sintetizado, purificado con éxito y ciclado con los enlaces disulfuro correctos. El epítopo 266-296 (enlace SH entre Cys268 y Cys295), el epítopo 298-333 (enlace SH entre Cys 299 y Cys311) y el epítopo 315-333 (enlace SH entre Cys 315 y Cys 331) deberían permitir la delimitación del epítopo mínimo de unión a pertuzumab.

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