EA016818B1 - Слитые белки, содержащие антигены отторжения опухоли ny-eso-1 и lage-1 - Google Patents

Abstract

Предложены слитые белки, содержащие антиген, имеющий происхождение из NY-ESO-1, связанный с антигеном, имеющим происхождение из LAGE-1, которые могут дополнительно содержать носители, партнеры по слиянию или т.п. Также предложены способы получения таких слитых белков, изготовления их в виде препарата и их применения. Такие белки полезны в качестве компонентов вакцин для индукции иммунного ответа против ряда клеток, несущих раковые антигены.

Description

В целом, настоящее изобретение относится к полипептидам и конструкциям, содержащим антиген, имеющий происхождение от одного или обоих из антигенов отторжения опухоли ΝΥ-Ε8Θ-1 и ЬЛСЕ-1.

Предшествующий уровень техники

Антигены рака яичка (СТ) представляют собой класс опухольассоциированных антигенов, экспрессия которых обычно ограничена половыми клетками в яичках, яичниках или клетками трофобласта. Эти антигены обычно не экспрессированы в соматических тканях взрослых. См. 81тркоп, е! а1., Ναι. Вег. Сапсег, 5(8):615-625 (2005); 8сап1ап, е! а1., 1ттипо1. Вс\зс\\ъ. 188:22-32 (2002); 8сап1аи, е! а1., Сапе. 1ттип., 4:1-15 (2004).

Регуляция генов антигенов СТ нарушена у пациентов со злокачественными новообразованиями, что приводит к аберрантной экспрессии этих антигенов при широком спектре опухолей. Первый идентифицированный антиген СТ, МАСЕ-1, был идентифицирован в начале 1990-х гг. клонированием Тклеточных эпитопов (уап бег Вгиддеп е! а1., 1991, 8с1епсе 13; 254(5038): 1643-7; уап бег Вгиддеп е! а1., 1999, 8с1епсе 254:1643-1647; Тгауегкап, е! а1., 1992, 1ттиподепе!1с8, 35(3):145-152 и патент США № 5342774, включенные посредством ссылки). С того времени применение методики серологического анализа экспрессионных библиотек (8ΕΒΕΧ) (8аЫп, е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А, 92(25): 11810-11813 (1995) и патент США № 5698396), экспрессии рекомбинантных антигенов на поверхности дрожжей (ΚΛΥ8) (М1ксйо, е! а1., Сапе. 1ттип., 3:5-16 (2003)) и дифференциального анализа экспрессии матричной РНК (мРНК) (Сиге, е! а1., 1п!. I. Сапе, 85(5):726-732 (2000)) привело к идентификации приблизительно 90 антигенов СТ, и ожидают, что их число увеличится в ближайшие годы. Иммуногенность некоторых антигенов СТ у пациентов со злокачественными новообразованиями делает их идеальными мишенями для разработки вакцин от опухолей.

ΝΥ-Ε8Θ-1. Антигеном рака яичка, рассматриваемым в настоящее время для применения в иммунотерапии злокачественных опухолей, является ΝΥ-Ε8Θ-1. Данный антиген был впервые идентифицирован посредством 8ΕΒΕΧ при плоскоклеточном раке пищевода в конце 90-х гг. в Нью-Йоркском отделении Института Людвига по исследованию злокачественных новообразований (№ν Уогк Вгапсй о£ !1е Ьибте1д 1пШ!и!е £ог Сапсег Векеагсй) (Сйеп, е! а1., ΡΝΑ8 И8А, 94(5):1914-1918 (1997) и патент США № 5804381, включенный посредством ссылки).

Длина белка ΝΥ-Ε8Θ-1 составляет 180 аминокислот, и он может быть описан состоящим из трех областей:

Ν-концевой области, примерно или приблизительно 1-70 аминокислоты, центральной области, примерно или приблизительно 71-134 аминокислоты и С-концевой области, примерно или приблизительно 135-180 аминокислоты.

Коллагеноподобная область содержит примерно или приблизительно, или приближенно 15-73 аминокислоты Ν-концевой области (см. фиг. 1).

Белок ΝΥ-Ε8Θ-1 был обнаружен при широком спектре опухолей, включая, без ограничения, рак яичника, рак легкого, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак пищевода, рак мочевого пузыря и меланомы (№с1ю1аои Т., е! а1., 1ттипо1. Се1. I. Вю1. 2006 Лт; 84(3):303-17 и 1ипдЫи1й, е! а1., 2001, 1п!. I. Сапе, 92(6):856-860). Спонтанные гуморальные и клеточные иммунные ответы против этого антигена были описаны у пациентов с ΝΥ-ΕδΘ-1-положительными опухолями, и были идентифицированы несколько пептидов, ограниченных НЬА (Нитап Ьеикосу!е Апбдеп, человеческий лейкоцитарный антиген) I класса и II класса (1адег, е! а1., 1998, I. Εχρ. Меб., 187(2):265-270; ΥатадисЫ, е! а1., 2004, С1т. Сапе. Век., 10(3):890-961 и Оау18, е! а1., 2004, Ргос. Νι!1. Асаб. δα. И8А, 101 (29):10697-10702). Примерами из патентной литературы являются патенты США №№ 6140050; 6251603; 6242052; 6274145;

6338947; 6417165; 6525177; 6605711; 6689742; 6723832; 6756044 и 6800730, все включено посредством ссылки.

В клиническом исследовании три частично перекрывающихся пептида, имеющих происхождение от ΝΥ-Ε8Θ-1, с мотивами связывания НБА-А2 (157-167, 157-165 и 155-163) были использованы в качестве вакцины для лечения двенадцати пациентов с метастатическими ΝΥ-ΕδΘ-1-экспрессирующих опухолей. В данном исследовании было показано, что синтетические пептиды ΝΥ-Ε8Θ-1 могут быть безопасно введены и могут приводить к возникновению потенциально полезных Т-клеточных ответов (1адег, е! а1., 2000, Ρ^δ, И8А, 97(22):12198-12203).

Различными группами в белке были идентифицированы несколько эпитопов МНС (главного комплекса гистосовместимости) I и II классов, см., например, фиг. 1. Эти эпитопы являются только примером эпитопов, описанных для данного белка, и список на фиг. 1 не является исчерпывающим. Кроме того, по меньшей мере один или более из эпитопов, упомянутых и/или перечисленных на фиг. 1, не были подтверждены экспериментально. Коллагеноподобная область на Ν-конце содержит по меньшей мере один эпитоп МНС I класса, называемый здесь А31. Центральная область включает несколько эпитопов МНС 2 класса, называемых здесь ΌΒ1, ΌΒ2, ΌΒ4, ΌΒ7 и ΌΡ4. Область также содержит несколько эпитопов МНС I класса, называемых здесь В35, В51, С\\'3 и С\\'6. Предполагают, что С-конец содержит по меньшей мере два эпитопа II класса (ΌΒ 4 и ΌΡ4) и один эпитоп I класса (А2).

БАСР-!. Также был идентифицирован другой антиген рака яичка, БАСБ-!. Были описаны два

- 1 016818 транскрипта ЬАОЕ-1, ЬАОЕ-1а и ЬАОЕ-1Ь. ЬАОЕ-1Ь является продуктом незавершенного сплайсинга и кодирует предполагаемый белок длиной приблизительно 210 аминокислотных остатков, в то время как продукт гена ЬАСЕ-1а содержит 180 аминокислотных остатков (8ип с1 а1. Сапсег 1ттипо1 1ттипо111сг 2006: 55: 644-652).

Ν-концевые области белков ЬАОЕ-1 и ΝΥ-Ξ8Ο-1 высококонсервативны и, как предполагают, идентичны более чем на 97%. Однако ЬАОЕ-1 отличается от ΝΥ-Η8Ο-1 в центральных областях, которые идентичны только на 62%. С-концы ΝΥ-Η8Ο-1 и ЬАОЕ-1а являются высококонсервативными (идентичны более чем на 97%). Тем не менее, С-конец ЬАОЕ-1Ь длиннее и не консервативен и, как предполагают, идентичен той же области ЕАОЕ-13/ΝΥ-Е8О-1 менее чем на 50%.

Общая информация, относящаяся к этим белкам, доступна на веб-сайте Института Людвига по исследованию злокачественных новообразований (ЫСК) (см. \у\у\у.сапсепттшШу.огд/СТба1аЬа5е).

Краткое изложение сущности изобретения

Согласно настоящему изобретению предложен иммуногенный слитый белок, содержащий:

(1) ΝΥΈ8Ο-1 или его фрагмент, соединенный с (2) ЬАОЕ-1 или его фрагментом, в котором по меньшей мере один из ΝΥ-ЕЗОЛ и/или ЬАОЕ-1 процессирован или частично процессирован или является фрагментом, включающим один или более эпитопов ΝΥ-Ξ8Ο-1 или ЬАОЕ-1. Согласно настоящему изобретению также предложен иммуногенный слитый белок, содержащий:

(1) ЬАОЕ-1 или его фрагмент, соединенный с (2) ΝΥ-Ξ8Ο-1 или его фрагментом, в котором по меньшей мере один из ΝΥ-Β8Ο-1 и/или ЬАОЕ-1 процессирован или частично процессирован или является фрагментом, включающим один или более эпитопов ΝΥ-Β8Ο-1 или ЬАОЕ-1. Таким образом, также предложены полипептиды и слитые белки, содержащие процессированный или частично процессированный ΝΥ-Β8Ο-1 или его фрагмент, включающий один или более эпитоп ΝΥ-Ξ8Ο-1. Также предложены полипептиды и слитые белки, содержащие процессированный или частично процессированный ЬАОЕ-1 или его фрагмент, включающий один или более эпитопы ЬАОЕ-1. Также предложены композиции и способы, включающие такие слитые белки и полипептиды.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показано несколько эпитопов МНС (главного комплекса гистосовместимости) I и II классов на белке ΝΥ-Ξ8Ο-1, которые были идентифицированы различными группами. Эти эпитопы являются только примером эпитопов, описанных для данного белка, поэтому перечень на фиг. 1 не является исчерпывающим. Более того, по меньшей мере один или более эпитопов, упомянутых и/или перечисленных на фиг. 1, не были подтверждены экспериментально. Описанная аминокислотная последовательность ΝΥ-Β8Ο-1 определена здесь в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 49.

На фиг. 2 показана конструкция А, слитый белок, содержащий непроцессированный ΝΥ-Β8Ο-1 и процессированный ЬАОЕ-1, такой как ЬАОЕ-1а. В этом воплощении С-конец ΝΥ-Β8Ο-1 соединен с Νконцом процессированного ЬАОЕ-1 вместе с гистидиновой аффинной меткой с образованием слитого белка длиной 288 аминокислот (аа). Дополнительные подробности о конструкции А представлены в табл. 1 (8ЕО ГО ΝΟ: 1; 8ЕО ГО ΝΟ: 3).

На фиг. 3 показана конструкция Б, слитый белок, содержащий первую треть белка Ό без его секреторной сигнальной последовательности (например, аминокислоты с 20 по 127), непроцессированный ΝΥ-Ξ8Ο-1 и процессированный ЬАОЕ-1, такой как ЬАОЕ-1а. В этом воплощении 127 аминокислота белка Ό присоединена к Ν-концу ΝΥ-Ξ8Ο-1, С-конец которого соединен с Ν-концом процессированного ЬАОЕ-1 с образованием слитого белка длиной 398 аминокислот. Дополнительные подробности о конструкции Б представлены в табл. 1 в разделе 1.6 (8ЕО ГО ΝΟ: 2; 8ЕО ГО ΝΟ: 4).

На фиг. 4 показана конструкция В, слитый белок, содержащий частично процессированный ΝΥЕ8Ο-1 и процессированный ЬАОЕ-1, такой как ЬАОЕ-1а. В этом воплощении С-конец частично процессированного ΝΥ-Β8Ο-1 присоединен к Ν-концу процессированного ЬАОЕ-1 с образованием слитого белка длиной 242 аминокислоты. Дополнительные подробности о конструкции В представлены в табл. 1 (8ЕО ГО ΝΟ: 5; 8ЕО ГО ΝΟ: 7).

На фиг. 5 показана конструкция Г, слитый белок, содержащий первую треть белка Ό без его секреторной сигнальной последовательности (например, аминокислоты с 20 до примерно или приблизительно 127), частично процессированный ΝΥ-Β8Ο-1 и процессированный ЬАОЕ-1, такой как ЬАОЕ-1а. В этом воплощении 127 аминокислота белка Ό присоединена к Ν-концу частично процессированного ΝΥ-ΞδΟ1, С-конец которого присоединен к Ν-концу процессированного ЬАОЕ-1 с образованием слитого белка длиной 352 аминокислоты. Дополнительные подробности этого воплощения представлены в табл. 1 (8ЕО ГО ΝΟ: 6; 8ЕО ГО ΝΟ: 8).

На фиг. 6 показана конструкция Д, слитый белок, содержащий процессированный ΝΥ-Ξ8Ο-1 и процессированный ЬАОЕ-1, такой как ЬАОЕ-1а. В этом воплощении С-конец процессированного ΝΥ-Ξ8Ο-1 присоединен к Ν-концу процессированного ЬАОЕ-1 с образованием слитого белка длиной 211 аминокислот. Дополнительные подробности о конструкции Д представлены в табл. 1 (8ЕО ГО ΝΟ: 9; 8ЕО ГО ΝΟ: 11).

- 2 016818

На фиг. 7 показана конструкция Е, слитый белок, содержащий первую треть белка Ό без его секреторной сигнальной последовательности (например, аминокислоты с 20 до примерно или приблизительно 127), процессированный ΝΥ-Ε8Θ-1 и процессированный ЬЛСЕ-1, такой как ЬАСЕ-1а. В этом воплощении 127 аминокислота белка Ό присоединена к Ν-концу процессированного ΝΥ-Ε8Θ-1, С-конец которого присоединен к Ν-концу процессированного ЬАСЕ-1 с образованием слитого белка длиной 321 аминокислота. Дополнительные подробности о конструкции Е представлены в табл. 1 (8ЕС ΙΌ N0: 10; 8ЕС ΙΌ N0: 12).

На фиг. 8 показано альтернативное воплощение конструкции Д, а именно Д', в котором С-конец процессированного ЬАСЕ-1 присоединен к Ν-концу процессированного ΝΥ-Ε80-1 с образованием слитого белка длиной 212 аминокислот. Дополнительные подробности этого воплощения, конструкции Д', представлены в табл. 1 (8ЕС ΙΌ Ν0: 21; 8ЕС ΙΌ Ν0: 23).

На фиг. 9 показана конструкция Ж, слитый белок, содержащий процессированный НУ-Е80-1. процессированный ЬАСЕ-1, такой как ЬАСЕ-1а, и коллагеноподобную область, такую как коллагеновая область из ΝΥ-Β80-1. В этом воплощении С-конец коллагеноподобной области присоединен, например, к Ν-концу процессированного ЬАСЕ-1. В свою очередь С-конец процессированного ЬАСЕ-1 присоединен к Ν-концу процессированного ΝΥ-Β80-1 с образованием слитого белка длиной 289 аминокислот. Дополнительные подробности о конструкции Ж представлены в табл. 1 (8ЕС ΙΌ Ν0: 13; 8ЕС ΙΌ Ν0: 15).

На фиг. 10 показана схема типичного рекомбинантного полипептида, содержащего ΝΥ-Β80-1 с частично процессированным коллагеноподобным доменом. Эпитопы, показанные на фиг. 10-13, являются только примерами эпитопов, описанных для данного белка, и не были подтверждены экспериментально.

На фиг. 11 показана схема типичного слитого белка, содержащего первую треть белка Ό без его секреторной сигнальной последовательности (например, аминокислоты с 20 до примерно или приблизительно 127) и ΝΥ-Β80-1 с частично процессированным коллагеноподобным доменом.

На фиг. 12 показана схема типичного рекомбинантного полипептида, содержащего ΝΥ-Β80-1 с частично процессированным коллагеноподобным доменом.

На фиг. 13 показана схема типичного слитого белка, содержащего первую треть белка Ό без его секреторной сигнальной последовательности (например, аминокислоты с 20 до примерно или приблизительно 127) и ΝΥ-Β80-1 с процессированным коллагеноподобным доменом.

Фиг. 14 представляет собой схему, показывающую несколько эпитопов, идентифицированных в процессированном белке ЬАСЕ-1 а. Эти эпитопы являются просто примером эпитопов, описанных для данного белка, поэтому этот список не является исчерпывающим. Во избежание сомнений эпитопы, описанные и/или перечисленные в графических материалах, могут быть или могут не быть подтверждены экспериментально (то есть они могут быть предполагаемыми и тому подобное), если здесь не указано иное. Полная аминокислотная последовательность ЬАСЕ-1а изложена в перечне последовательностей как 8ЕС ΙΌ Ν0: 58. Полная аминокислотная последовательность ЬАСЕ-1Ь (ЬАСЕ-1Ь не изображен на данной фигуре) изложена в перечне последовательностей как 8ЕС ΙΌ Ν0: 71.

На фиг. 15 показана схема обоих ΝΥ-Β80-1 и ЬАСЕ-1, так же как и количество эпитопов МНС (главного комплекса гистосовместимости) Ι и ΙΙ классов. Эти эпитопы являются только примером эпитопов, описанных для данного белка, поэтому этот список не является исчерпывающим; один или более описанные и/или упомянутые эпитопы не были подтверждены экспериментально.

На фиг. 16 показана структура слитого белка NУ-Ε80-1/^АСΕ-1.

На фиг. 17 в схематической форме суммированы пятнадцать конструкций и уровни их продукции.

Р = белок Ό; С (серый блок) = коллагеноподобный домен ΝΥ-Ρ80-1; С (белый блок) = процессированный коллагеноподобный домен; Ь = Ьаде 1 без коллагеноподобного домена; Ν = ΝΥ-Ρ80-1 без коллагеноподобного домена; черная стрелка = полигистидиновая метка; (-) = низкий уровень продукции; (+) = незначительная продукция; (++) = высокий уровень продукции; (+++) = наилучший уровень продукции. Аминокислотные последовательности восьми конструкций и кодирующие их нуклеотидные последовательности суммированы в табл. 4 и списке последовательностей.

На фиг. 18 суммирован скрининг № 1, 76-дневное исследование с использованием мышей СВ6Е1 для оценки каждого из ЬУЬ076, ЬУЬ079, ЬУЬ78, ЬУЬ68, ЬУЬ020, ЬУЬ26, ЬУЬ024, ЬУЬ30, чтобы определить, обеспечивает ли внутримышечная иммунизация слитым белком с адъювантом защиту против подкожного заражения перевиваемыми опухолями (Β16/ΝΥΒ801).

На фиг. 19 подведен итог роста опухоли Β-16-ΝΥ-Β80-1 у контрольных мышей, используемых в 76-дневном исследовании.

На фиг. 20 показана выживаемость мышей, иммунизированных непроцессированным NΥ-Ε80-1, ЬУЬ030, ЬУЬ068, ЬУЬ079 или ЬУЬ026.

На фиг. 21 суммированы NΥ-Ε80-1-специфичные иммунные ответы, как оценено твердофазным иммуноферментным анализом (ЕЫ8А), клеточным сортером с возбуждением флуоресценции (ЕАС8) и вестерн-блоттингом, а также ЬАСЕ-1а (6е3 коллагеноподобного домена)-специфичные иммунные ответы, как оценено посредством ЕЫ8А и ЕАС8.

На фиг. 22 суммирован план эксперимента скрининга № 2, 105-дневного исследования для опреде

- 3 016818 ления того, обеспечивает ли внутримышечная иммунизация выбранными слитыми белками с адъювантом защиту против заражения Β16/ΝΥ-Ε8Ο-1 и заражения В16/ЕА6Е-1а. Показано заражение Β16/ΝΥΕδΟ-1.

На фиг. 23 суммирован скрининг № 2 и показано заражение В16/ЬА6Е-1а.

На фиг. 24 показана выживаемость мышей, иммунизированных ЬУЕ078, ЬУЕ068, непроцессированным ΝΥ-Ε8Ο-1, ЕУЪ024 и ЕУЬ076 после заражения Β16/ΝΥ-Ε8Ο-1. См. фиг. 24.

На фиг. 25 показана выживаемость мышей, иммунизированных ЬУЕ076, ΕΑΟΕ-1;·ι без коллагеноподобной области, ЬУЕ024, непроцессированным ΝΥ-Ε8Ο-1, ЕУЪ078 или ЕУЪ068 после введения Β16/ΕΑΟΕ-1α.

Фиг. 26. В столбцах 1-8, слева направо, показаны результаты ΕΕΙ8Α, проведенного для выявления возможных иммунных ответов против человеческого коллагена у мышей, иммунизированных одним из следующего: (1) буферов (контроль); (2) непроцессированного ΝΥ-Ε8Ο-1; (3) ΡΑΟΕ-1η без коллагеноподобного домена; (4) ЕУЬ068; (5) ЕУЪ078; (6) ЕУЪ024; (7) ЕУЬ076. Положительный контроль (8 столбец) содержит моноклональное антитело против человеческого коллагена 1 (тАЬ против человеческого коллагена 1).

Подробное описание изобретения

Слитые белки. Слитые белки по изобретению применимы для лечения рака и, более конкретно, для лечения меланомы; рака молочной железы; рака предстательной железы; рака мочевого пузыря, включая переходноклеточный рак; рака легких, включая немелкоклеточный рак легких (Ν8ί.Εί.'); рака головы и шеи, включая рак пищевода; плоскоклеточного рака; рака желудочно-кишечного тракта; рака печени; опухолей головного мозга; лейкемии и различных сарком.

Основываясь на профилях экспрессии ΕΑΟΕ-1 и ΝΥ-Ε8Ο-1, слитый белок по изобретению быть эффективным приблизительно при 37% раков молочной железы. Лечение по настоящему изобретению может быть также особенно подходяще для лечения пациентов, которым не подходит направленная терапия Нег2/пеи. Предполагают, что слитый белок по изобретению может быть также эффективным у приблизительно 35% больных раком предстательной железы, 35% больных раком мочевого пузыря, 40% больных меланомой и 35% больных ΝδΟΕΟ (немелкоклеточным раком легкого). В одном воплощении слитый белок по изобретению может сделать возможным лечение большей популяции пациентов, потому что пациентам с опухолями, экспрессирующими как ΝΥ-ΕδΟ-1, так и/или ΕΑΟΕ-1 (включая Ε·ΑΟΕ-1;·ι и ΕΑΟΕ-Λ), можно вводить слитый белок по настоящему изобретению.

Слитый белок по изобретению может также быть более иммуногенным, чем его отдельные белкикомпоненты, по следующим причинам:

удаление одного или более коллагеноподобных доменов может снизить потенциальную иммунотолерантность соединения, которая обусловлена его гомологией со структурой естественного эндогенного коллагена, или возможное добавление гетерологичного партнера по слиянию может дополнительно стимулировать СЭ4 Т-клеточные ответы. Таким образом, слитые белки применимы для индукции иммуногенного ответа на такие раковые антигены, как ΝΥ-ΕδΟ-1, или ΕΑΟΕ-1, или на оба из них.

ΝΥ-ΕδΟ-1, используемый в изобретении, может представлять собой непроцессированный, частично процессированный или процессированный ΝΥ-ΕδΟ-1 или любой его фрагмент, содержащий один или более эпитопов, способные вызывать иммунный ответ на ΝΥ-ΕδΟ-1. В контексте данного описания предполагают, что непроцессированный белок ΝΥ-ΕδΟ-1 обозначает белок, состоящий из около или примерно 1-180 аминокислот, и который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичен встречающемуся в природе белку (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 49). При использовании здесь термин 'ΈΑΟΕ-1 относится к одному или более членам семейства ΕΑΟΕ-1, таким как Ε·ΑΟΕ-1;·ι и ΕΑΟΕ-Λ, как описано ниже. Предполагают, что белок непроцессированный ΒΑΟΕ-Λ обозначает белок, идентичный 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 58 на 95, 96, 97, 98, 99 или 100%. Сходным образом предполагают, что белок непроцессированный ΕΑΟΕ1Ь обозначает белок, идентичный встречающемуся в природе белку (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 71) на 95, 96, 97, 98, 99 или 100%.

В одном воплощении идентичность относится ко всей длине последовательности. Таким образом, изобретение также включает указанные слитые белки с консервативными заменами. Консервативные замены хорошо известны и обычно устанавливаются как стандартные счетные матрицы в компьютерных программах выравнивания последовательностей. Эти программы включают РАМ250 (Бауйой Μ.Ο. е1 а1., (1978), Α тобе1 оГ еуо1ийопату сйапдек ίη рто1ет5, Αΐΐηκ оГ Рго1еш кедиепсе апб йгисШге 5(3) Μ.Ο. Бауйой (еб.), 345-352), №Июпа1 Β^отеб^са1 Векеатсй Еоипбайоп, ^акЫпдоп, и Β1о5ит 62 (81етеп Нешкой апб бог|а О. Нешкой (1992), апб Апино ас1б киЬк(Ни11оп тайтшек Ггот рго!ет Ь1оскк), Ргос. №111. Αсаб. δα. υδΑ 89 (Β^осйет^5ί^у): 10915-10919.

В общих чертах замены в пределах следующих групп являются консервативными заменами, но замены между группами рассматривают как неконсервативные. Следующие группы представляют собой:

1) аспартат/аспарагин/глутамат/глутамин;

2) серин/треонин;

- 4 016818

3) лизин/аргинин;

4) фенилаланин/тирозин/триптофан;

5) лейцин/изолейцин/валин/метионин;

6) глицин/аланин.

Предполагают, что частично процессированный в контексте данного описания обозначает белок ΝΥ-Ε8Θ-1 или ЬАСЕ-1 (по обстоятельствам), у которого удалено большинство коллагеноподобных областей, но который все еще содержит или состоит из эпитопа А31, обнаруженного в этой области.

В одном воплощении частично процессированный ΝΥ-Ε8Θ-1 и/или ЬАСЕ-1 содержит или состоит из ряда аминокислот с аминокислоты 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 или 52 до аминокислоты 175, 176, 177, 178, 179 или 180 или любой комбинации этих аминокислот, например с 48 аминокислоты до 180 аминокислоты или с 46 до 178 аминокислоты. В одном воплощении частично процессированный ΝΥ-Ε8Θ-1 или ЬАСЕ-1 содержит или состоит из примерно или точно аминокислот с 48 по 180 (или примерно или точно 48-210 аминокислот в случае ЬАСЕ-1Ь). В одном воплощении под термином «примерно» в данном контексте можно понимать, что до +/- 10% общего числа аминокислот последовательности, возможно, добавлены или удалены из последовательности. В одном воплощении частично процессированный ΝΥΕ8Θ-1 содержит или состоит из аминокислот с 48 по 180 ΝΥ-Ε8Θ-1.

В одном воплощении частично процессированный ЬАСЬ-1Ь содержит или состоит из ряда аминокислот с аминокислоты 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 или 52 до аминокислоты 205, 206, 207, 208, 209 или 210 или любой комбинации этих аминокислот, например с 48 аминоислоты до 210 аминокислоты или с 46 до 208 аминокислоты. В одном воплощении частично процессированный ЬАСЬ-1Ь содержит или состоит из примерно или точно аминокислот с 48 по 210. В одном воплощении под термином около в данном контексте можно понимать, что до ±10% общего числа аминокислот последовательности, возможно, добавлены или удалены из последовательности. В одном воплощении частично процессированный ЬАСЬ-1Ь содержит или состоит из аминокислот с 48 по 210 ЬАСЬ-1Ь.

Предполагают, что процессированный в контексте данного описания обозначает белок ΝΥ-Ε8Θ-1 или ЬАСЬ-1 (по обстоятельствам), у которого удалены коллагеноподобные области (включая удаление эпитопа А31). В одном воплощении процессированный ΝΥ-Ε8Θ-1 и/или ЬАСЬ-1 содержит или состоит из примерно или точно аминокислот 71-180 (или примерно или точно из аминокислот 71-210 в случае ЬАСЬ-1Ь).

В одном воплощении процессированный ΝΥ-Ε8Θ-1 или ЬАСЬ-1 содержит или состоит из ряда аминокислот с аминокислоты 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 или 75 до аминокислоты 175, 176, 177, 178, 179 или 180 или любой комбинации этих аминокислот, например с 71 аминокислоты до 180 аминокислоты или с 69 до 178 аминокислоты. В одном воплощении процессированный ΝΥ-Ε8Θ-1 или ЬАСЬ-1Ь содержит или состоит из примерно или точно аминокислот с 71 по 180 (или примерно или точно из аминокислот 71-210 в случае ЬАСЬ-1Ь).

В одном воплощении под термином примерно в данном контексте можно понимать, что до ±10% аминокислот от общего числа аминокислот последовательности, возможно, добавлены или удалены из последовательности. В одном воплощении процессированный ΝΥ-Ε8Θ-1 или ЬАСЬ-1 содержит или состоит из аминокислот с 71 по 180 ΝΥ-Ε8Θ-1 или ЬАСЬ-1.

В одном воплощении процессированный ЬАСЬ-1 Ь содержит или состоит из ряда аминокислот с аминокислоты 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 или 75 до аминокислоты 205, 206, 207, 208, 209 или 210 или любой комбинации этих аминокислот, например с 71 аминокислоты до 210 аминокислоты или с 69 до 208 аминокислоты. В одном воплощении процессированный ЬАСЬ-1Ь содержит или состоит из примерно или точно аминокислот с 71 по 210. В одном воплощении под термином примерно в данном контексте можно понимать, что до ±10% аминокислот от общего числа аминокислот последовательности, возможно, добавлены или удалены из последовательности. В одном воплощении процессированный ЬАСЬ1Ь содержит или состоит из аминокислот с 71 по 210 ЬАСЬ-1Ь.

Под другими фрагментами подразумевают те, которые при включении в слитый белок по изобретению приводят к образованию окончательного белка с желаемыми свойствами и преимуществами слитых белков по изобретению.

ΝΥ-Ε8Θ-1. В соответствии с вышеизложенным предложены модифицированные антигены, содержащие антиген, имеющий происхождение из антигена отторжения опухоли ΝΥ-Ε8Θ-1, где коллагеновая область частично процессирована или процессирована полностью. В некоторых воплощениях удалено больше, чем коллагеновая область. В некоторых воплощениях модифицированный антиген генетически модифицирован. В некоторых воплощениях модифицированный антиген является рекомбинантным. В некоторых воплощениях предложены полипептиды, содержащие антиген, как описано выше. В некоторых воплощениях типичные полипептиды содержат гетерологичный белок, такой как белок Ό от НаеторЫ1и8 тПиепхае типа В или его фрагмент. В некоторых воплощениях предложены конструкции, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую вышеупомянутые полипептиды.

В некоторых воплощениях предложен иммуногенный полипептид, содержащий ΝΥ-Ε8Θ-1 или его фрагмент, где ΝΥ-Ε8Θ-1 не содержит коллагеноподобную область. В других ΝΥ-Ε8Θ-1 частично про

- 5 016818 цессирован или процессирован или содержит любой его фрагмент, включающий один или более эпитоп. В некоторых воплощениях такие полипептиды имеют консервативные замены. В некоторых воплощениях такие полипептиды и конструкции применимы в качестве профилактического средства для предотвращения или существенного облегчения рецидива рака.

Таким образом, в некоторых воплощениях одна или более аминокислота удалена из коллагеновых областей. Более конкретно, в некоторых воплощениях 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 или 73 аминокислоты удалены из части, включающей коллагеновую область, то есть примерно 1-73 аминокислоты 8ЕО ГО N0: 49. Аминокислоты могут быть удалены из смежных положений в коллагеновой области или не из смежных положений. Другими словами, в некоторых воплощениях аминокислота удалена из любого из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 или 73 положений или любой их комбинации в пределах данной области 8ЕО ГО N0: 49. Специалистам в данной области техники понятно, что в некоторых воплощениях части аминокислотной последовательности сохранены таким образом, что определенные их эпитопы сохранены в получаемом полипептиде.

В некоторых воплощениях использован фрагмент центральной области или С-концевой области ΝΥ-Ε8Ο-1. Таким образом, в некоторых воплощениях полипептиды могут содержать один или более фрагментов аминокислотной последовательности, изложенной в 8ЕО ГО N0: 49, то есть фрагменты, содержащие одно или более из аминокислотных положений 74-75, 76-80, 81-85, 86-90, 91-95, 96-100, 101105, 106-110, 111-115, 116-120, 121-125, 126-130, 131-135, 136-140, 141-145, 146-150, 151-155, 156-160, 161-165, 166-170, 171-175, 176-180 или любое их сочетание. Специалистам в данной области техники понятно, что в некоторых воплощениях аминокислотная последовательность сохранена таким образом, что определенные эпитопы сохранены в получаемом полипептиде.

ЬАСЕ-1. В некоторых воплощениях предложен модифицированный антиген, содержащий антиген, имеющий происхождение от антигена отторжения опухоли ЬАСЕ-1, где коллагеновая область частично процессирована или процессирована полностью. В некоторых воплощениях удалено больше, чем коллагеновая область. В некоторых воплощениях модифицированный антиген генетически модифицирован. В некоторых воплощениях модифицированный антиген является рекомбинантным. В некоторых воплощениях предложены полипептиды, содержащие антиген, как описано выше. В некоторых воплощениях антиген имеет происхождение от антигена отторжения опухоли ЬАСЕ-1а. В некоторых воплощениях антиген имеет происхождение от антигена отторжения опухоли ЬАСЕ-1Ь. В других воплощениях типичные слитые белки содержат гетерологичный белок, такой как белок Ό от НаеторЫ1ик тПиспхас типа В или его фрагмент. В некоторых воплощениях предложены конструкции, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую вышеупомянутые полипептиды.

В некоторых воплощениях предложен иммуногенный полипептид, содержащий ЬАСЕ-1 или его фрагмент, где ЬАСЕ-1 не содержит коллагеноподобную область. В других ЬАСЕ-1 частично процессирован или процессирован или содержит любой его фрагмент, который включает один или более эпитоп. В некоторых воплощениях полипептид содержит гибрид полипептида ЬАСЕ-1 и коллагеноподобной области ΝΥ-ЕЗО-Ь В некоторых воплощениях полипептид содержит часть коллагеновой области ΝΥЕ80-1 или всю эту область, соединенную с частично процессированным или процессированным ЬАСЕ1. В некоторых воплощениях такие полипептиды имеют консервативные замены. В некоторых воплощениях такие полипептиды и конструкции применимы в качестве профилактического средства для предотвращения или существенного облегчения рецидива рака.

Таким образом, в некоторых воплощениях одна или более аминокислота удалена из коллагеновой области или даже из Ν-концевых аминокислот. Более конкретно, в некоторых воплощениях 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 или 73 аминокислоты удалены из коллагеновой области или даже из Ν-концевых аминокислот, то есть примерно 1-73 аминокислоты 8ЕО ГО N0: 58 (ЬАСЕ-1а) или 8ЕО ГО N0: 71 (ЬАСЕ-1Ь). Аминокислоты могут быть удалены из смежных положений в этой области или не из смежных положений. Другими словами, в некоторых воплощениях одна или более аминокислоты удалены из любого из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 или 73 положений, или любой их комбинации, в пределах 8ЕО ГО N0: 58 (ЬАСЕ-1а) или 8ЕО ГО N0: 71 (ЬАСЕ-1Ь). Специалистам в данной области техники понятно, что в некоторых воплощениях части аминокислотной последовательности сохранены таким образом, что определенные их эпитопы сохранены в получаемом полипептиде.

В некоторых воплощениях используют фрагмент центральной области или С-концевой области ЬАСЕ-1. Таким образом, в некоторых воплощениях полипептид может содержать один или более фрагментов аминокислотной последовательности, изложенной в 8Е0 ГО N0: 58 (ЬАЕЕ-1а) или 8Е0 ГО N0:

- 6 016818 (ЬАСЕ-1Ь), то есть фрагменты, содержащие одно или более из аминокислотных положений 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81-85, 86-90, 91-95, 96-100, 101-105, 106-110, 111-115, 116-120, 121-125, 126-130, 131-135, 136-140, 141-145, 146-150, 151-155, 156-160, 161-165, 166-170, 171-175, 176-180 или любое их сочетание. Специалистам в данной области техники понятно, что в некоторых воплощениях аминокислотная последовательность сохранена таким образом, что определенные эпитопы сохранены в получаемом полипептиде.

В одном аспекте согласно изобретению предложен слитый белок, содержащий непроцессированный ΝΥ-Ε8Ο-1.

В одном аспекте согласно изобретению предложен слитый белок, содержащий частично процессированный ΝΥ-Ε8Ο-1.

В одном аспекте согласно изобретению предложен слитый белок, содержащий процессированный ΝΥ-Ε8Ο-1.

В одном аспекте согласно изобретению предложен слитый белок, содержащий непроцессированный ЬЛСЕ-1.

В одном аспекте согласно изобретению предложен слитый белок, содержащий частично процессированный ЬЛСЕ-1.

В одном аспекте согласно изобретению предложен слитый белок, содержащий процессированный ЬЛСЕ-1.

В одном аспекте ЬЛСЕ-1, используемый в изобретении, представляет собой ЬАСЕ-1а.

В одном аспекте ЬЛСЕ-1, используемый в изобретении, представляет собой ЬАСЕ-1Ь.

В одном аспекте изобретения Ν-конец НУ-Е8О-1 соединен с С-концом ЬЛСЕ-1.

В одном аспекте в изобретении С-конец КГ-Е8О-1 соединен с Ν-концом ЬЛСЕ-1.

Иммуногенность слитых белков по изобретению может быть дополнительно увеличена и/или характеристики получения белка могут быть дополнительно улучшены включением фрагмента из другого гетерологичного антигена, например белка Ό, поверхностного белка грамотрицательной бактерии НаешорЫ1и8 шПиепха В. Дополнительную информацию об иммунологических партнерах по слиянию, имеющих происхождение от белка Ό, можно получить из νΟ 91/18926.

Белки для включения в партнера по слиянию по настоящему изобретению могут быть химически конъюгированы или могут быть экспрессированы в виде рекомбинантных слитых белков. В одном воплощении слитый белок экспрессирован в виде рекомбинантного слитого белка.

Другой гетерологичный партнер по слиянию может способствовать представлению Т-хелперных эпитопов (иммунологический партнер по слиянию) или может способствовать экспрессии данного белка с высоким выходом (усилитель экспрессии). В одном воплощении другой гетерологичный партнер по слиянию может быть как иммунологическим партнером по слиянию, так и усилителем экспрессии.

В одном воплощении белок Ό или его производное содержит примерно или точно первую 1/3 белка, например примерно или точно аминокислоты с 1 по 109 белка Ό. В этом воплощении аминокислоты 2Ьуз и/или 3-Т11Г последовательности нативного белка Ό могут быть заменены аминокислотами 2-Азр и/или 3-Рго. В другом воплощении белок Ό или его производное содержит или состоит из примерно или точно 20-127 аминокислот белка Ό. В одном воплощении белок Ό для использования в настоящем изобретении не содержит секреторную последовательность белка. В большинстве случаев в слитых белках по настоящему изобретению производное белка Ό не содержит липидов.

В одном воплощении белок Ό дополнительно содержит аминокислоты Ме1, Азр и Рго, например соединенные с Ν-концом фрагмента белка Ό (т.е. конструкция может содержать или состоять из МЭР 20-127 белок Ό). Полагают, что эти три дополнительные аминокислоты могут способствовать стабильности белка и/или увеличивать уровень экспрессии этого белка.

В одном аспекте согласно изобретению предложен слитый белок, где Ν-концевой фрагмент (т.е. первая треть) белка Ό (как описано выше) соединен с Ν-концом слитого белка по изобретению или его иммуногенного фрагмента. Более конкретно, слияние белка Ό и Ν-конца слитого белка по изобретению может быть произведено таким образом, что в последний замещает С-концевой фрагмент белка Ό, который был удален. Таким образом, Ν-конец белка Ό становится Ν-концом слитого белка.

В слитый белок по изобретению могут быть включены другие гетерологичные партнеры по слиянию или их фрагменты, вместо или в дополнение к белку Ό, например неструктурный белок вируса гриппа, Ν81 (гемагглютинин); обычно может быть использована 81 Νконцевая аминокислота, хотя могут быть использованы другие фрагменты при условии, что они содержат Т-хелперные эпитопы;

Ьу1А, имеющий происхождение от 81тер1ососси5 рпеишошае, синтезирующего Ν-ацетил-Ьаланинамидазу Ьу1А, кодируемую геном Ьу1А (Сепе, 43 (1986) раде 265-272), как, например, повторяющаяся часть молекулы Ьу1А, обнаруженная на С-конце, например, начиная с 178 остатка, как, например, 188-305 остатки. В одном воплощении гетерологичный партнер по слиянию представляет собой СЬу1А. В другом воплощении гетерологичный партнер по слиянию представляет собой СРС, слитый белок, содержащий СЬу1А-Р2-СЬу1А, как описано в XVО 03/104272. Очистка гибридных белков, содержащих

- 7 016818 фрагмент С-Ьу1А на их Ν-концах, была описана в В1о1есЬио1оду: 10, (1992) раде 795-798.

Слитые белки по изобретению могут дополнительно содержать аффинную метку, например гистидиновый хвост (также известный как Ык-метка), содержащий от 1 до 10, например от 6 или 10 гистидиновых остатков. Эти остатки могут быть расположены, например, в концевой части, такой как Сконцевая или Ν-концевая часть белка. Аффинная метка может быть включена для дополнительного улучшения очистки белка.

Определенные специфичные слитые белки по изобретению могут, например, быть конструированы, как описано в графических материалах. Каждое из воплощений, изложенных в графических материалах, отражает независимые аспекты изобретения. Дополнительные примеры конструкций слитых белков по настоящему изобретению даны в табл. 1-4 и в перечне последовательностей.

Нуклеиновые кислоты. Настоящее изобретение также включает нуклеиновые кислоты и полинуклеиновые кислоты, такие как ДНК, кодирующие слитые белки по изобретению. Способы по изобретению могут быть осуществлены обычными рекомбинантными методиками, такими как описанные в Машайк е1 а1., Мо1еси1аг С1ошид - А ЬаЬога1огу Мапиа1; Со1б Брйид НагЬог, 1982-1989. В частности, способ может включать стадии:

1) изготовления реплицируемого или интегративного вектора экспрессии, способного в клеткехозяине экспрессировать ДНК-полимер, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок или его иммуногенное производное;

2) трансформации клетки-хозяина указанным вектором;

3) культивирования указанной трансформированной клетки-хозяина в условиях, делающих возможной экспрессию указанного ДНК-полимера для получения указанного белка; и

4) выделения указанного белка.

Термин трансформация использован здесь для обозначения введения чужеродной ДНК в клеткухозяина. Это может быть осуществлено, например, трансформацией, трансфекцией или инфекцией подходящей плазмидой или вирусным вектором с применением, например, обычных методик, как описано в Сеиейс Еидшеепид; Ебк. 8.М. Кшдктаи аиб АЭ. Кшдктаи; В1аск\\'е1 I БДеиййс РиЬйсайоик; ОхГогб, Еид1аиб, 1988. Термин трансформированный или трансформант будет в дальнейшем относиться к получаемой клетке-хозяину, содержащей и экспрессирующей рассматриваемый чужеродный ген. Векторы экспрессии, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие слитые белки по настоящему изобретению, являются новыми и также образуют часть изобретения.

Реплицируемые векторы экспрессии могут быть изготовлены по изобретению расщеплением вектора, совместимого с клеткой-хозяином, для предоставления линейного сегмента ДНК с интактным репликоном и комбинированием в условиях лигирования указанного линейного сегмента с одной или более молекулами ДНК, которые совместно с указанным линейным сегментом кодируют желаемый продукт, как, например, ДНК-полимер, кодирующий белок по изобретению или его производное. Таким образом, если желательно, ДНК-полимер может быть предварительно образован или образован в процессе конструирования вектора.

Выбор вектора будет отчасти определяться клеткой-хозяином, которая может быть прокариотической или эукариотической, но в большинстве случаев представляет собой клетки Е. сой или СНО (клетки яичников китайского хомячка). Подходящие векторы включают плазмиды, например ТМСР14 или рЕТ21 или рЕТ26, рс^NА3, бактериофаги, космиды и рекомбинантные вирусы. В одном воплощении, в котором экспрессия происходит в бакуловирусе, дрожжах или клетках-хозяевах СНО, может быть использован один из следующих векторов: рЕЕ14, рР1С2А, рР1С2В, рР1С2С, рЭМТ-ЭЕ8Т48 и рАс8С2. Изготовление реплицируемого вектора экспрессии может быть проведено обычным образом подходящими ферментами для рестрикции, полимеризации и лигирования ДНК способами, описанными, например, Машайк е1 а1., упомянутыми выше.

Рекомбинантную клетку-хозяина получают согласно изобретению трансформацией клетки-хозяина реплицируемым вектором экспрессии по изобретению в условиях трансформации. Подходящие условия трансформации являются обычными и описаны, например, в Машайк е1 а1., упомянутой выше или ΌΝΑ С1ошид Уо1. II, Э.М. С1оуег еб., 1ВЬ Ргекк Ыб, 1985. Выбор условий трансформации определяется клеткой-хозяином. Таким образом, бактериальный хозяин, такой как Е. сой, может быть обработан раствором СаС1₂ (Сойеи е1 а1., Ргос. №11. Асаб. 8сЕ, 1973, 69, 2110) или раствором, содержащим смесь ВЬС1, МиС1₂, ацетата калия и глицерина, и затем 3-[№морфолино]-пропансульфоновой кислотой, РЬС1 и глицерином. Клетки млекопитающих в культуре могут быть трансформированы кальциевой копреципитацией векторной ДНК на клетки. Изобретение также включает клетку-хозяина, трансформированную реплицируемым вектором экспрессии по изобретению.

ДНК может быть кодон-оптимизирована стандартными методиками для дополнительного облегчения экспрессии в соответствующем хозяине.

Культивирование трансформированной клетки-хозяина в условиях, делающих возможной экспрессию ДНК-полимера, проводят обычным образом, как описано, например, в Машайк е1 а1. и ΌΝΑ С1ошид, упомянутых выше. Таким образом, предпочтительно клетку-хозяина снабжают питательными

- 8 016818 веществами и культивируют при температуре менее 50°С. Белки по настоящему изобретению могут быть экспрессированы в прокариотах или эукариотах, таких как дрожжи, но их часто экспрессируют в Е. сой. Конкретные штаммы Е. со11 включают такие как

АЕ58: криптический Л-лизоген, имеющий происхождение из N99, представляющего собой да1 Ε::Τη 10,Δ-8(ε61Ό-ρ§1),Δ-Η1(ετο<61Α),Ν⁺ и с1857 (те£: Ргос. Асаб. 8с1. И8А νοί. 82, рр. 88-92, 1апиату 1985, Вюсйетщбу);

ВЬЕ (ΌΕ3) Nονадеη, VI, И8А (номер по каталогу 69053-4): может быть использован ВЬЕ, представляющий собой гесА^- производное ВЬ21. В большинстве случаев включают селектируемый маркер, например, устойчивости к канамицину или устойчивости к ампициллину для облегчения установления успешного встраивания рекомбинантного гена/конструкции в систему экспрессии.

Продукт выделяют обычными способами в соответствии с клеткой-хозяином и в соответствии с локализацией продукта экспрессии (внутриклеточного или секретируемого в культуральную среду или в периплазму клетки). Таким образом, там, где клетка-хозяин является бактериальной, такой как Е. со11, она может, например, быть лизирована физически, химически или ферментами, и из получаемого лизата может быть выделен белковый продукт. Там, где клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, продукт может в большинстве случаев быть выделен из питательной среды или из свободных от клеток экстрактов. Обычные методики выделения белков включают селективное осаждение, адсорбционную хроматографию и аффинную хроматографию, включая колонку для аффинной хроматографии с моноклональным антителом.

Белки по настоящему изобретению представлены либо в растворимой, либо в жидкой форме, либо в лиофилизированной форме. Согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая композиция, такая как вакцина, содержащая слитый белок по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент.

При введении фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть введены в фармацевтически приемлемых препаратах. Такие препараты могут обычно содержать фармацевтически приемлемые концентрации солей, буферных агентов, консервантов, совместимых носителей, дополнительных агентов, усиливающих иммунный ответ, таких как адъюванты и цитокины, и, возможно, другие терапевтические агенты.

Несомненно, количества будут зависеть от конкретного состояния, подлежащего лечению, тяжести состояния, индивидуальных данных пациента, включая возраст, физическое состояние, морфометрические данные и массу тела, продолжительности лечения, характера сопутствующей терапии (если ее проводят), конкретного пути введения и подобных факторов, в объеме знаний и компетенции практикующего врача. Эти факторы хорошо известны специалистам в данной области техники и могут быть рассмотрены при обычном проведении исследования. В большинстве случаев предпочтительно использование максимальной дозы отдельных компонентов или их комбинаций, т.е. наибольшей безопасной дозы в соответствии со здравым медицинским смыслом. Тем не менее, специалистам в данной области техники будет ясно, что пациент может настаивать на меньшей дозе или переносимой дозе по медицинским причинам, физиологическим причинам или по практически любым другим причинам. Ожидают, что в большинстве случаев каждая доза для человека будет содержать от 1 до 1000 мкг белка и предпочтительно 30-300 мкг.

В одном аспекте фармацевтические композиции, используемые для введения слитых белков по изобретению, будут представлять собой вакцину. Вакцина может, возможно, содержать один или более другие опухольассоциированные антигены, полипептиды и/или пептиды. Например, члены, принадлежащие семействам ΜΑΟΕ, БАСЕ и ΟΑΟΕ.

Комбинация ΝΥ-Ε8Ο-1/Ε·ΛΟΕ-1 и ΜΑ6Ε. В одном воплощении настоящего изобретения предложена композиция, содержащая (а) антигенный компонент, содержащий антиген ΝΥ-Ε8Ο-1 или ^Α^Ε-1 или слитый белок, как описано здесь, и (б) антигенный компонент, содержащий антиген ΜΑ^Ε или слитый белок. В одном воплощении композиция может дополнительно содержать адъювант, как описано здесь.

Антиген ΜΑ^Ε для применения в комбинации может содержать антиген ΜΑ^Ε полной длины. Альтернативно, антиген ΜΑ^Ε может содержать иммуногенную часть ΜΑ^Ε, где 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислот аминокислотной последовательности могут быть удалены или замещены. В одном воплощении настоящего изобретения 2 аминокислоты могут быть удалены из Ν-конца последовательности ΜΑ^Ε. В одном воплощении настоящего изобретения, где антиген представляет собой ΜΑ^Ε-А3 или его иммуногенную часть, последовательность ΜΑ^Ε-А3 может представлять собой последовательность от 3 до 314 аминокислоты ΜΑ^Ε-Α3.

В одном воплощении настоящего изобретения предложена композиция, содержащая антиген ΝΥΕ8Ο-1/^Α^Ε-1 и/или слитый белок, как описано здесь, и слитый белок, содержащий антиген ΜΑ^Ε-А3. В альтернативном воплощении слитый белок, содержащий антиген ΜΑ^Ε-А3, содержит или состоит из антигена ΜΑ^Ε-А3 и белка-партнера по слиянию, содержащего примерно, или приблизительно, или приближенно первые 109 аминокислот белка Ό, где одна, или две, или более аминокислоты из белка Ό, возможно, замещены и где, возможно, присутствует сигнальная последовательность белка Ό в дополне

- 9 016818 ние к первым 109 аминокислотам белка Ό.

Слитые белки по настоящему изобретению могут, возможно, дополнительно содержать одну или более аминокислоту в качестве линкеров между последовательностями антигена и партнеров по слиянию, или белков-партнеров по слиянию, или между антигеном и Ηίδ-хвостом, если он присутствует. Аминокислоты могут быть неродственными последовательностям антигена и/или партнера по слиянию.

Слитые белки по настоящему изобретению, как описано здесь, могут дополнительно содержать аминокислоты Ме1-Азр-Рго на Ν-конце последовательности слитого белка. Аминокислота Ме1 может иметь происхождение от исходной последовательности белка Ό или может иметь происхождение от неродственной последовательности.

В одном воплощении последовательность слитого белка, содержащего МАСЕ-А3 и белок Ό, для использования в комбинациях по настоящему изобретению показана в 8ЕС) ΙΌ N0: 98. 8ЕС) ΙΌ N0: 98 от Ν-конца содержит следующие характерные участки:

1-18 аминокислоты сигнальная последовательность белка ϋ, включая 1-Ме1 и замены 2-Азр и З-Рго для нативных аминокислотных положений (аа) 2-1_уз и 3-ТНг белка ϋ;

19-127 аминокислоты включают аминокислоты с 20 по 127 белка ϋ;

128-129 аминокислоты	неродственные аминокислоты МеЕАзр в 128-129 аа для создания сайта клонирования;
130-441 аминокислоты	фрагмент МАСЕЗ (3-314 аминокислоты МАСЕЗ);
442-443 аминокислоты	неродственные аминокислоты С1у-С1у;
444-451 аминокислоты	7 Ыз-хвост.

Настоящее изобретение также включает способы изготовления указанных вакцин/композиций и слитые белки и вакцины/композиции, которые получают или которые можно получить описанными способами.

Изготовление вакцин в целом описано в Уаеете Эезщп (Тйе зиЪиш 1 апб абщуап! арргоаей (ебз. Ро\те1 I М.Р. & №\ттап М.1). (1995) Р1епит Рге88 Νο\ν Уогк). Инкапсуляция в липосомы описана Ри11ег1оп, патент США № 4235877.

Слитые белки по настоящему изобретению могут быть снабжены адъювантами в вакцинной композиции по изобретению. Подходящие адъюванты включают соли алюминия, такие как гель гидрата окиси алюминия (квасцы) или фосфат алюминия, но могут также представлять собой соль кальция, железа или цинка или могут представлять собой нерастворимую суспензию ацилированного тирозина или ацилированные сахара, катионно или анионно дериватизированные полисахариды, или полифосфазены. Другие известные адъюванты включают СрС-содержащие олигонуклеотиды. Эти олигонуклеотиды характеризуются тем, что динуклеотид СрС не метилирован. Такие олигонуклеотиды хорошо известны и описаны, например, в АО 96/02555.

В композиции по изобретению может быть желательным, чтобы адъювантная композиция индуцировала иммунный ответ преимущественно ТН1-типа. В одном воплощении предложена адъювантная система, включающая, например, комбинацию монофосфориллипида А, предпочтительно 3-де-Оацилированного монофосфориллипида А (3Э-МРЬ), совместно с солью алюминия. СрСолигонуклеотиды могут также индуцировать ТН1-ответ и могут также быть включены.

В одном воплощении предложена композиция, содержащая слитый белок, как описано здесь, и адювантную композицию, содержащую комбинацию монофосфориллипида А и производного сапонина, в частности комбинацию ^821 и 3Э-МРЬ, как раскрыто в АО 94/00153, или менее реактогенную композицию, где ^821 блокирован холестерином, как раскрыто в АО 96/33739. Одна композиция, которая может быть использована, содержит ^821, 3Э-МРЬ и токоферол, например, в эмульсии типа масло в воде, описана в АО 95/17210. Другая адъювантная композиция для использования в настоящем изобретении может содержать ^821, 3Э-МРЬ и СрС или их эквивалент, например, в эмульсии типа масло в воде или в виде липосомной композиции.

Соответственно, в одном воплощении настоящего изобретения предложена вакцина, содержащая слитый белок по изобретению и адъювант, например, как описано выше. Настоящее изобретение также включает способы изготовления вакцин и композиций, содержащих слитые белки, как описано здесь.

В настоящем изобретении также предполагают доставку нуклеиновых кислот, полипептидов или пептидов, описанных здесь, для вакцинации. Доставка полипептидов и пептидов может быть осуществлена в соответствии со стандартными протоколами вакцинации, хорошо известными в данной области техники. В другом воплощении доставка нуклеиновых кислот может быть осуществлена ех у1уо способами, т.е. удалением клетки из субъекта, генетическим конструированием клетки для включения антигена, ассоциированного с раком, и возвращением конструированной клетки в субъекта. В большинстве случаев это может включать т уйго введение функциональной копии гена в клетку(клетки) субъекта и

- 10 016818 возврат генетически конструированной клетки(клеток) субъекту. Функциональная копия гена находится под функциональным контролем регуляторных элементов, которые делают возможной экспрессию гена в генетически конструированной клетке(клетках). Множество методик трансфекции и трансдукции, а также подходящих векторов экспрессии хорошо известны специалисту в данной области техники, некоторые из которых описаны в заявке РСТ АО 95/00654. Согласно изобретению также предполагают доставку нуклеиновых кислот ίη νίνο с использованием векторов, таких как вирусы и направленные липосомы.

Список сокращений

СО - коллагеноподобная область,

А/Осо11 - без коллагеноподобной области (коллагеноподобного домена),

ΡΌ1/3 - первая треть белка Ό.

Типичные воплощения слитых белков и кодирующие их нуклеотидные последовательности представлены в табл. 1-3.

Таблица 1 Представлены типичные воплощения слитых белков и кодирующие их нуклеотидные последовательности. Каждая нуклеотидная последовательность описана по существу, обозначена уникальным идентификатором нуклеотидной последовательности (8ЕЦ Ю N0:) и изложена в перечне последовательностей. Каждый слитый белок описан по существу, обозначен уникальным идентификатором аминокислотной последовательности (8ЕЦ 1Р N0:) и изложен в перечне последовательностей.

8ЕО Ю N0:	ТАБЛИЦА 1 ОПИСАНИЕ КОНСТРУКЦИЙ	КОМПОНЕНТЫ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬ- НОСТИ
Гибрид ΝΥ-Ε50-1 с коллагеноподобным доменом/1_АОЕ1а без коллагеноподобного домена
1	Воплощение А - нуклеотидная последовательность гибрида ΝΥЕ5О-1 с коллагеноподобным доменом/1_АОЕ1а УУО соП (кодоноптимизирована)
Коллагеноподобный домен	1-210 пары оснований (Ьр)
ΝΥ-Ε80-1	1-537 Ьр
Линкер	538-543 Ьр
ЬАСЕ1а	544-846 Ьр
Ηϊδ-метка	847-864 Ьр
Стоп-кодон	865-867 Ьр
2	Воплощение Б - нуклеотидная последовательность 1/3 белка ϋ/гибрид ΝΥ-Ε80-1 с коллагеноподобным доменом/1_А(ЗЕ1а Ж) соП (кодон-оптимизирована)
Последовательность инициации ΜϋΡ	1-9 Ьр
1/3 белка ϋ	10-333 Ьр
Коллагеноподобный домен	334-540 Ьр
ΝΥ-Ε80-1	334-867 Ьр
Линкер	868-873 Ьр
1_А6Е1а	874-1176 Ьр
Ηΐδ-метка	1177-1194 Ьр
Стоп-кодон	1195-1197 Ьр
3	Воплощение А - аминокислотная последовательность гибрида ΝΥЕ8О-1 с коллагеноподобным доменом/1_АОЕ1а МО соП с Н13-меткой
Коллагеноподобный домен	1-70 аминокислотные

- 11 016818

	положения (аа)
ΝΥ-ΕδΟ-1	1-179 аа
Линкер	180-181 аа
1_АСЕ1а	182-282 аа
Ηϊδ-метка	283-288 аа
4 Воплощение Б - аминокислотная последовательность 1/3 белка
О/гибрид ΝΥ-Ε5Ο-1 с коллагеноподобным доменом/1_А6Е1а МО соП
с Н 1*8-меткой
Последовательность инициации 1УЮР	1-3 аа
1/3 белка ϋ	4-111 аа
Коллагеноподобный домен	112-180 аа
ΝΥ-ΕδΟ-1	112-289 аа
Линкер	290-291 аа
1_АСЕ1а	292-392 аа
Ηϊδ-метка	393-398 аа

Гибрид процессированного ΝΥ-Ε5Ο-1 с коллагеноподобным доменом /1_АСЕ1аМО соИ

5	Воплощение В - гибрид процессированного ΝΥ-Ε8Ο-1 с коллагеноподобным доменомЛ.А6Е1а МО соП (кодоноптимизирован)
Коллагеноподобный домен	1-72 Ьр
ΝΥ-ΕδΟ-1	1-399 Ьр
Линкер	400-405 Ьр
1_АСЕ1а	406-708 Ьр
Ηϊδ-метка	709-726 Ьр
Стоп-кодон	727-729 Ьр
6	Воплощение Г - нуклеотидная последовательность 1/3 белка ϋ/гибрид процессированного ΝΥ-Ε8Ο-1 с коллагеноподобным доменом/ЬАСЕ1а МО соП (кодон-оптимизирована)
Последовательность инициации ΜϋΡ	1-9 Ьр
1/3 белка ϋ	10-333 Ьр
Коллагеноподобный домен	334-402 Ьр
ΝΥ-Ε8Ο-1	334-729 Ьр
Линкер	730-735 Ьр
1_А(ЭЕ1а	736-1038 Ьр
Ηϊδ-метка	1039-1056 Ьр
Стоп-кодон	1057-1059 Ьр
7	Воплощение В - гибрид процессированного ΝΥ-Ε8Ο-1 с коллагеноподобным доменом/1_АСЕ1а МО соП с Ηϊδ-меткой
Коллагеноподобный домен	1-24 аа
ΝΥ-ΕδΟ-1	1-133 аа
Линкер	134-135 аа
1_АОЕ1а	136-236 аа
Ηϊδ-метка	237-242 аа
8	Воплощение Г - аминокислотная последовательность 1/3 белка О/гибрид процессированного ΝΥ-Ε8Ο-1 с коллагеноподобным доменом/1_АСЕ1а МО соП с Ηϊβ-меткой
Последовательность инициации ΜϋΡ	1-3 аа
1/3 белка ϋ	4-111 аа
Коллагеноподобный домен	112-134 аа
ΝΥ-Ε8Ο-1	112-243 аа
Линкер	244-245 аа
1_АОЕ1а	246-346 аа
Ηϊδ-метка	347-352 аа

Гибрид ΝΥ-ΕδΟ-Ί/ί-ΑΘΕΊβ без коллагеноподобного домена и соседней области, богатой цистеином (8 аа)

9	Воплощение Д - нуклеотидная последовательность гибрида ΝΥЕ8О-1/1_АОЕ1а МО соП (кодон-оптимизирована)
ΝΥ-ΕδΟ-1	1-306 Ьр
Линкер	307-312 Ьр
1_АСЕ1а	313-615 Ьр
Ηϊδ-метка	616-633 Ьр
Стоп-кодон	634-636 Ьр

I Воплощение Ё - нуклеотидная последовательность 1/3 белка

- 12 016818 ϋ/гибрид ΝΥ-ΕδΟ-Ι/ϊ-ΑΘΕΙβ МО соП (кодон-оптимизирована)

Последовательность инициации ΜϋΡ	1-9 Ьр
1/3 белка ϋ	10-333 Ьр
ΝΥ-Ε8Ο-1	334-636 Ьр
Линкер	637-642 Ьр
1_АСЕ1а	643-945 Ьр
Ηΐδ-метка	946-963 Ьр
Стоп-кодон	964-966 Ьр
11	Воплощение Д - аминокислотная последовательность гибрида ΝΥΕ8Ο-1/ίΑΘΕΐ3 \ΝΟ соП с Ηϊδ-меткой
ΝΥ-Ε8Ο-1	1-102 аа
Линкер	103-104 аа
1_АСЕ1а	105-205 аа
Ηΐδ-метка	206-211 аа
12	Воплощение Е - аминокислотная последовательность 1/3 белка О/гибрид ΝΥ-Ε8Ο-1/ίΑΟΕΐ3 МО соП с Ηϊδ-меткой
Последовательность инициации ΜϋΡ	1-3 аа
1/3 белка ϋ	4-111 аа
ΝΥ-Ε8Ο-1	112-212 аа
Линкер	213-214 аа
1_АСЕ1а	215-315 аа
Ηΐδ-метка	316-321 аа

Гибрид 1_АСЕ1а с коллагеноподобным доменом/ΝΥ-ΕδΟ-Ι без

коллагеноподобного домена

Воплощение Ж - нуклеотидная последовательность гибрида 1_АСзЕ1а с коллагеноподобным доменом/ΝΥ-ΕδΟ-Ι МО соП (кодоноптимизирована)

Коллагеноподобный домен ΝΥ-Ε8Ο-1

ЬА6Е1а

Линкер

ΝΥ-Ε8Ο-1

Ηΐδ-метка

1-210 Ьр

211-540 Ьр

541-546 Ьр

547-849 Ьр

850-867 Ьр

868-870 Ьр

Стоп-кодон

1/3 белка О/гибрид ЬАСЕ1а с коллагеноподобным доменом/ΝΥ-ΕδΟ1ΧΝΟ соП (кодон-оптимизирован)

Последовательность инициации МОР

1/3 белка ϋ

Коллагеноподобный домен ΝΥ-Ε8Ο-1

ЬАСЕЩ

Линкер

ΝΥ-Ε8Ο-1

Ηΐδ-метка

Стоп-кодон

1-9 Ьр

10-333 Ьр

334-540 Ьр

541-870 Ьр

871-876 Ьр

877-1179 Ьр

1180-1197 Ьр

1198-1200 Ьр

Воплощение Ж - аминокислотная последовательность гибрида 1_А6Е1а с коллагеноподобным доменом/ΝΥ-ΕδΟ-Ι \Л/О со11 с Ηΐδметкой

Коллагеноподобный домен ΝΥ-Ε8Ο-1

1_АСЕ1а

Линкер

ΝΥ-Ε8Ο-1

183-283 аа

Ηΐδ-метка

284-289 аа

1/3 белка О/гибрид 1_А6Е1а с коллагеноподобным доменом/ΝΥ-ΕδΟ1 МО соП с Ηϊδ-меткой (кодируемый 5ЕО Ю N0:14)

Последовательность инициации ΜϋΡ

1/3 белка ϋ

Коллагеноподобный домен ΝΥ-Ε8Ο-1

1_АСЕ1а

Линкер

ΝΥ-Ε8Ο-1

1-3 аа

4-111 аа

112-180 аа

181-290 аа

291-292 аа

293-393 аа

Ηΐε-метка

394-399 аа

Гибрид процессированного 1_А6Е1а с коллагеноподобным доменом/ΝΥЕ8О-1 без коллагеноподобного домена

Гибрид процессированного 1_А6Е1а с коллагеноподобным доменом/ΝΥ-ΕδΟ-Ι МО соП (кодон-оптимизирован)

- 13 016818

Коллагеноподобный домен ΝΥ-Ε8Ο-1	1-72 Ьр
1_А(ЗЕ1а	73-402 Ьр
Линкер	403-408 Ьр
ΝΥ-Ε8Ο-1	409-711 Ьр
Ηΐδ-метка	712-729 Ьр
Стоп-кодон	730-732 Ьр
18	1/3 белка ϋ/гибрид процессированного 1_А6Е1а с коллагеноподобным доменом/ΝΥ-ΕδΟ-Ι УУО соП (кодоноптимизирован)
Последовательность инициации ΜϋΡ	1-9 Ьр
1/3 белка ϋ	10-333 Ьр
Коллагеноподобный домен ΝΥ-ΕδΟ-1	334-402 Ьр
1_АОЕ1а	403-732 Ьр
Линкер	733-738 Ьр
ΝΥ-ΕδΟ-1	739-1041 Ьр
Ηΐδ-метка	1042-1059 Ьр
Стоп-кодон	1060-1062 Ьр
19	Гибрид процессированного 1_А(ЗЕ1а с коллагеноподобным доменом/ΝΥ-ΕδΟ-Ι УУО соП с Ηϊδ-меткой (кодируемый 8ЕО Ю N0:17)
Коллагеноподобный домен ΝΥ-ΕδΟ-1	1-24 аа
1.АСЕ1а	25-134 аа
Линкер	135-136 аа
ΝΥ-Ε8Ο-1	137-237 аа
Ηΐδ-метка	238-243 аа
20	1/3 белка О/гибрид процессированного 1_А(ЭЕ1а с коллагеноподобным доменом/ΝΥ-ΕδΟ-Ι УУО соП с Ηΐδ-меткой (кодируемый 8ЕО Ю N0:18)
Последовательность инициации ΜϋΡ	1-3 аа
1/3 белка ϋ	4-111 аа
Коллагеноподобный домен ΝΥ-ΕδΟ-1	112-134 аа
1_А(ЗЕ1а	135-244 аа
Линкер	245-246 аа
ΝΥ-ΕδΟ-1	247-347 аа
Ηΐδ-метка	348-353 аа

Гибрид Ι-ΑΘΕΙθ/ΝΥ-ΕδΟ-Ι без коллагеноподобного домена и соседней области, богатой цистеином (8 аа)

21	Воплощение Д’ - нуклеотидная последовательность гибрида ίΑΘΕΙβ/ΝΥ-ΕδΟ-Ι УУО соП (кодон-оптимизирована)
1_АСЕ1а	1-309 Ьр
Линкер	310-315 Ьр
ΝΥ-ΕδΟ-1	316-618 Ьр
Ηΐδ-метка	619-636 Ьр
Стоп-кодон	637-639 Ьр

| 1/3 белка ϋ/гибрид Ι-ΑΟΕΙβ/ΝΥ-ΕδΟΙ УУО соП (кодон-оптимизирован)

Последовательность инициации ΜϋΡ	1-9 Ьр
1/3 белка ϋ	10-333 Ьр
1_А<ЗЕ1а	334-639 Ьр
Линкер	640-645 Ьр
ΝΥ-ΕδΟ-1	646-948 Ьр
Ηΐδ-метка	949-966 Ьр
Стоп-кодон	967-969 Ьр
23	Воплощение Д’ - аминокислотная последовательность гибрида ίΑΟΕΙβ/ΝΥ-ΕδΟ-Ι УУО соП с Ηϊδ-меткой
1_АСЕ1а	1-103 аа
Линкер	104-105 аа
ΝΥ-ΕδΟ-1	106-206 аа
Ηΐδ-метка	207-212 аа
24	1/3 белка ϋ/гибрид Ι_ΑΘΕ13/ΝΥ-Ε5Ο-1 УУО (кодируемый 8ЕО Ю N0:22)	соП с Ηϊδ-меткой
Последовательность инициации МОР	1-3 аа
1/3 белка О	4-111 аа
1_АСЕ1а	112-213 аа
Линкер	214-215 аа
ΝΥ-ΕδΟ-1	216-316 аа

- 14 016818

Ηϊδ-метка | 317-322 аа

Гибрид ΝΥ-ΕδΟ-Ι/ίΑΟΕΙβ без коллагеноподобного домена и соседней области, богатой цистеином (8 аа), с Н18-меткой на Ν-конце

Λδ I Ηϊβ-энтерокиназный сайт^У-Е8О-1/1 А6Е1а (кодон-оптимизирован)

Последовательность Ηϊδ-метки	1-36 Ьр
Энтерокиназный сайт	37-72 Ьр
ΝΥ-Ε80-1	73-375 Ьр
Линкер	376-381 Ьр
1_АСЕ1а	382-684 Ьр
Стоп-кодон	685-687 Ьр
26	Ηι'8-энтерокиназный сайт^У-Е8О-1/1_АОЕ1а (кодируемый ЗЕО Ю N0:25)
Н 15-метка (10 Ηϊδ)	1-12 аа
Энтерокиназный сайт	13-24 аа
ΝΥ-Ε8Ο-1	25-125 аа
Линкер	126-127 аа
1_А(ЗЕ1а	128-228 аа

I ΗΪ8-ΝΥ-ΕδΟ-1/[Α(3Εΐ3 (кодон-оптимизирован)

Последовательность Ηϊδ-метки	1-21 Ьр
ΝΥ-Ε80-1	22-324 Ьр
Линкер	325-330 Ьр
1_АСЕ1а	331-633 Ьр
Стоп-кодон	634-636 Ьр

I Ηί8-ΝΥ-Ε80-1/ίΑΘΕΐ3 (кодируемый ЗЕО Ю N0:26)

Ηϊδ-метка (6 Ηϊδ)	1-7 аа
ΝΥ-Ε8Ο-1	8-108 аа
Линкер	109-110 аа
ЬАСЕ1а	111-211 аа

Гибрид процессированного ΝΥ-Ε8Ο-1 с коллагеноподобным доменом/1_АОЕ1а без коллагеноподобного домена с Ηϊδ-меткой на Ν-конце

29	Ηϊδ-энтерокиназный сайт-коллагеноподобный домен- процессированный ΝΥ-ΕδΟ-Ι/ίΑΟΕΙβ (кодон-оптимизирован)
Последовательность Ηΐδ-метки	1-36 Ьр
Энтерокиназный сайт	37-72 Ьр
Коллагеноподобный домен	73-141 Ьр
ΝΥ-Ε5Ο-1	73-468 Ьр
Линкер	469-474 Ьр
ЬАСЕ1а	475-777 Ьр
Стоп-кодон	778-780 Ьр
30	Ηϊδ-энтерокиназный сайт-коллагеноподобный домен- процессированный ΝΥ-ΕδΟ-Ι/ΙΑΟΕΙβ (кодируемый 8ЕО Ю N0:29)
Ηϊδ-метка (10 Ηϊδ)	1-12 аа
Энтерокиназный сайт	13-24 аа
Коллагеноподобный домен	25-47 аа
ΝΥ-Ε5Ο-1	25-156 аа
Линкер	157-158 аа
1_АСЕ1а	159-259 аа
31	Ηι'8-коллагеноподобный домен-процессированный ΝΥ-Ε8Ο- 1/ЬАСЕ1а (кодон-оптимизирован)
Последовательность Ηϊδ-метки	1-21 Ьр
Коллагеноподобный домен	22-90 Ьр
ΝΥ-Ε8Ο-1	22-417 Ьр
Линкер	418-423 Ьр
1_АСЕ1а	424-726 Ьр
Стоп-кодон	727-729 Ьр
32	Ηι'8-коллагеноподобный домен-процессированный ΝΥ-Ε8Ο- 1/1_АСЕ1а (кодируемый 8ЕО Ю N0:31)
Ηϊδ-метка (6 Ηϊδ)	1-7 аа
Коллагеноподобный домен	8-30 аа
ΝΥ-Ε8Ο-1	31-139 аа
Линкер	140-141 аа
ЬАСЕ1а	142-242 аа

Гибрид ΝΥ-Ε8Ο-1 с коллагеноподобным доменом/1_АОЕ1а без коллагеноподобного домена с Ηϊδ-меткой на Ν-конце

- 15 016818 зз

Ηίδ-энтерокиназный сайт-коллагеноподобный домен-ΝΥ-ΕδΟ1/1_АСЗЕ1а (кодон-оптимизирован)

Последовательность Ηϊδ-метки

Энтерокиназный сайт

Коллагеноподобный домен

ΝΥ-Ε8Ο-1

Линкер

1_АСЕ1а

1-36 Ьр

37-72 Ьр

73-279 Ьр

73-606 Ьр

607-612 Ьр

613-915 Ьр

916-918 Ьр

Стоп-кодон ί

Ηΐδ-энтерокиназный сайт-коллагеноподобный домен-ΝΥ-ΕδΟ1/1_АСЕ1а (кодируемый 8ЕО Ю N0:33)

Ηίδ-метка (10 Ηΐδ)

Энтерокиназный сайт

Коллагеноподобный домен

ΝΥ-Ε8Ο-1

1-12 аа

25-93 аа

Линкер

1_А(ЗЕ1а

203-204 аа

Н|5-коллагеноподобный оптимизирован)

Последовательность Ηϊδ-метки

Коллагеноподобный домен

ΝΥ-Ε8Ο-1

ΛΟΜβΗ-ΝΥ-ΕδΟ-Ι/ίΑΟΕΙβ (кодонЛинкер

1_АСЕ1а

Стоп-кодон

1-21 Ьр

22-228 Ьр

22-555 Ьр

556-561 Ьр

562-864 Ьр

865-867 Ьр

Ηίδ-коллагеноподобный домен-МУ-Е8О-1/1_АСЕ1а (кодируемый 8ЕО Ю N0:35)

Ηίδ-метка (6 Ηΐδ) 1-7 аа

Коллагеноподобный домен 8-76 аа

ΝΥ-Ε8Ο-1 77-185 аа

Линкер

1_АСЕ1а

186-187 аа

188-288 аа

Гибрид ίθρβΙθ/ΝΥ-ΕδΟ-Ι без коллагеноподобного домена и соседней области, богатой цистеином (8 аа), с Ηίδ-меткой на Ν-конце
37	| Ηίδ-энтерокиназный сайт-1 АСЕ1а/МУ-Е8О-1 (кодон-оптимизирован)
Последовательность Ηΐδ-метки	1-36 Ьр
Энтерокиназный сайт	37-72 Ьр
ЬАСЕ1а	73-378 Ьр
Линкер	379-384 Ьр
ΝΥ-Ε8Ο-1	385-687 Ьр
Стоп-кодон	688-690 Ьр
38	Ηίδ-энтерокиназный сайт-1_АСЕ1а/МУ-Е8О-1 (кодируемый ЗЕО Ю
	N0:37)
Ηΐδ-метка (10 Ηΐδ)	1-12 аа
Энтерокиназный сайт	13-24 аа
1_АСЕ1а	25-126 аа
Линкер	127-128 аа
ΝΥ-Ε8Ο-1	129-229 аа
39	I Ηίδ-ίΑΘΕΙβ/ΝΥ-ΕδΟ-Ι (кодон-оптимизирован)
Последовательность Ηΐδ-метки	1-21 Ьр
ЬАСЕ1а	22-327 Ьр
Линкер	328-333 Ьр
ΝΥ-Ε8Ο-1	334-636 Ьр
Стоп-кодон	637-639 Ьр
40	| Ηΐδ- Ι Α6Εΐ3/ΝΥ-ΕδΟ-1 (кодируемый 8ЕО Ю N0:39)
Ηίδ-метка (6 Ηΐδ)	1-7 аа
1_АСЕ1а	8-109 аа
Линкер	110-111 аа
ΝΥ-Ε8Ο-1	112-212 аа
Гибрид процессированного 1_АСЕ1а с коллагеноподобным доменом/ΝΥ-
	ΕδΟ-1 без коллагеноподобного домена с Ηίδ-меткой на Ν-конце
41	Ηίδ-энтерокиназный сайт-коллагеноподобный домен-
	процессированный 1_АСЕ1а/ЫУ-Е6О-1 (кодон-оптимизирован)
	Последовательность Ηΐδ-метки |	1-36 Ьр

- 16 016818

Энтерокиназный сайт	37-72 Ьр
Коллагеноподобный домен ΝΥ-Ε8Ο-1	73-141 Ьр
1_А(ЗЕ1а	142-471 Ьр
Линкер	472-477 Ьр
ΝΥ-Ε8Ο-1	478-780 Ьр
Стоп-кодон	781-783 Ьр
42	Ηΐδ-энтерокиназный сайт-коллагеноподобный домен- процессированный ίΑΟΕΙβ/ΝΥ-ΕδΟ-Ι (кодируемый δΕΟ Ю N0:41)
Н 13-метка (10 Ηΐδ)	1-12 аа
Энтерокиназный сайт	13-24 аа
Коллагеноподобный домен ΝΥ-Ε8Ο-1	25-47 аа
1_А6Е1а	48-157 аа
Линкер	158-159 аа
ΝΥ-Ε8Ο-1	160-260 аа
43	Ηΐδ-коллагеноподобный домен-процессированный ΐ-ΑΟΕΙβ/ΝΥ-ΕδΟ1 (кодон-оптимизирован)
Последовательность Ηΐδ-метки	1-21 Ьр
Коллагеноподобный домен ΝΥ-Ε8Ο-1	22-90 Ьр
1_А6Е1а	91-420 Ьр
Линкер	421-426 Ьр
ΝΥ-Ε8Ο-1	427-729 Ьр
Стоп-кодон	730-732 Ьр
44	Ηΐδ-коллагеноподобный домен-процессированный ΐ-ΑΟΕΊβ/ΝΥ-ΕδΟ1 (кодируемый δΕΟ Ю N0:43)
Ηΐδ-метка (6 Ηΐδ)	1-7 аа
Коллагеноподобный домен ΝΥ-Ε8Ο-1	8-30 аа
1_АСЕ1а	31-140 аа
Линкер	141-142 аа
ΝΥ-Ε8Ο-1	143-243 аа

Гибрид ЬАСЕ1а с коллагеноподобным доменом/ΝΥ-ΕδΟ-Ι без коллагеноподобного домена с Ηΐδ-меткой на Ν-конце

I Ηΐδ-энтерокиназный сайт-коллагеноподобный домен-1_АСЗЕ1 а/ΝΥЕЗО-1 (кодон-оптимизирован)

Последовательность Ηΐδ-метки	1-36 Ьр
	Энтерокиназный сайт	37-72 Ьр
	Коллагеноподобный домен ΝΥ-Ε8Ο-1	73-279 Ьр
	1_АСЕ1а	280-609 Ьр
	Линкер	610-615 Ьр
	ΝΥ-Ε8Ο-1	616-918 Ьр
	Стоп-кодон	919-921 Ьр
46	Ηΐδ-энтерокиназный сайт-коллагеноподобный ΕδΟ-1 (кодируемый δΕΟ Ю N0:45)	домен-1_АСЕ1аЛ\ГГ-
	Н:з-метка (10 Н:з)	1-12 аа
	Энтерокиназный сайт	13-24 аа
	Коллагеноподобный домен ΝΥ-Ε8Ο-1	25-93 аа
	1_А(ЗЕ1а	94-203 аа
	Линкер	204-205 аа
	ΝΥ-Ε8Ο-1	206-306 аа
47	Ηΐδ-коллагеноподобный домен-ЬАСЕ1а/МУ-Е6О-1 (кодон- оптимизирован)
	Последовательность Ηΐδ-метки	1-21 Ьр
	Коллагеноподобный домен ΝΥ-Ε8Ο-1	22-228 Ьр
	1_АСЕ1а	229-558 Ьр
	Линкер	559-564 Ьр
	ΝΥ-Ε8Ο-1	565-867 Ьр
	Стоп-кодон	868-870 Ьр
48	Ηΐδ-коллагеноподобный ΛΟΜβΗ-ίΑΘΕΙβ/ΝΥ-ΕδΟ-Ι (кодируемый δΕΟ Ю N0:47)
	Ηΐδ-метка (6 Ηΐδ)	1-7 аа
	Коллагеноподобный домен ΝΥ-Ε8Ο-1	8-76 аа
	1_АСЕ1а	77-186 аа
Линкер	187-188 аа
	ΝΥ-Ε8Ο-1	189-289 аа

- 17 016818

Таблица 2 Представлены дополнительные типичные воплощения слитых белков и кодирующие их нуклеотидные последовательности. Каждая нуклеотидная последовательность описана по существу, обозначена уникальным идентификатором нуклеотидной последовательности (8ЕР ГО ΝΟ:) и изложена в перечне последовательностей. Каждый слитый белок описан по существу, обозначен уникальным идентификатором аминокислотной последовательности (8ЕР ГО ΝΟ:) и изложен в перечне последовательностей.

5ЕО	ТАБЛИЦА 2	КОМПОНЕНТЫ
Ю	ОПИСАНИЕ КОНСТРУКЦИЙ	ПОСЛЕДОВАТЕЛЬ-
N0:		НОСТИ
Частично процессированный ΝΥ-Ε50-1 с коллагеноподобным доменом
50	Процессированный ΝΥ-Ε3Ο-1 с коллагеноподобным доменом
	(кодон-оптимизирован)
Коллагеноподобный домен	1-72 Ьр
ΝΥ-Ε80-1	1-399 Ьр
Ηΐδ-метка	400-417 Ьр
Стоп-кодон	418-420 Ьр
51	Процессированный ΝΥ-Ε8Ο-1 с коллагеноподобным доменом с Ηϊδ-
	меткой (кодируемый 5ЕО Ю N0:50)
Коллагеноподобный домен	1-24 аа
ΝΥ-Ε8Ο-1	1-133 аа
Ηΐδ-метка	134-139 аа
52	1/3 белка ϋ/процессированный ΝΥ-Ε80-1 с коллагеноподобным
	доменом (кодон-оптимизирован)
Последовательность инициации ΜϋΡ	1-9 Ьр
1/3 белка ϋ	10-333 Ьр
Коллагеноподобный домен	334-402 Ьр
ΝΥ-Ε8Ο-1	334-729 Ьр
Ηΐδ-метка	730-747 Ьр
Стоп-кодон	748-750 Ьр
53	1/3 белка О/процессированный ΝΥ-Ε80-1 с коллагеноподобным доменом с Ηϊδ-меткой (кодируемый 8ЕО Ю N0:52)
	Последовательность инициации МЭР	1-3 аа
	1/3 белка ϋ	4-111 аа
	Коллагеноподобный домен	112-134 аа
	ΝΥ-Ε80-1	112-243 аа
	Ηΐδ-метка	244-249 аа
	ΝΥ-Ε80-1 \7О соП
54	| ΝΥ-Ε80-1 ννο соП (кодон-оптимизирован)
	ΝΥ-Ε80-1	1-306 Ьр
	Ηΐδ-метка	307-324 Ьр
	Стоп-кодон	325-327 Ьр
55	I ΝΥ-Ε80-1 У7О соП с Ηϊδ-меткой (кодируемый 8ЕО Ю N0:54)
ΝΥ-Ε80-1	1-102 аа
Ηΐδ-метка	103-108 аа
56	I 1/3 белка 0/ΝΥ-Ε8Ο-1 Ж) соП (кодон-оптимизирован)
	Последовательность инициации МОР	1-9 Ьр
	1/3 белка ϋ	10-333 Ьр
	ΝΥ-Ε80-1	334-636 Ьр
	Ηΐδ-метка	637-654 Ьр
	Стоп-кодон	655-657 Ьр
57	1/3 белка 0/ΝΥ-Ε80-1 ΧΛ/Ο соП с Ηϊδ-меткой (кодируемый 5ЕО Ю
	N0:56) Последовательность инициации МОР	1-3 аа
	1/3 белка ϋ	4-111 аа
	ΝΥ-Ε8Ο-1	112-212 аа
	Ηΐδ-метка	213-218 аа

- 18 016818

Таблица 3

Представлены дополнительные типичные воплощения слитых белков и кодирующие их нуклеотидные последовательности. Каждая нуклеотидная последовательность описана по существу, обозначена уникальным идентификатором нуклеотидной последовательности (8ΕΡ ГО ΝΟ:) и изложена в перечне последовательностей. Каждый слитый белок описан по существу, обозначен уникальным идентификатором аминокислотной последовательности (8ΕΡ ГО ΝΟ:) и изложен в перечне по следовательностей.

8ЕО Ю N0:	ТАБЛИЦА 3 ОПИСАНИЕ	КОМПОНЕНТЫ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬ- НОСТИ
Гибрид 1_А(ЗЕ-1а и коллагеноподобного домена ΝΥ-Ε80-1 без коллагеноподобного домена 1_А0Е-1а
59	Гибрид 1_А(ЗЕ-1а Ж) соП и коллагеноподобного домена ΝΥ-Ε8Ο-1 (кодон-оптимизирован)
Коллагеноподобный домен ΝΥ-Ε80-1	1-210 Ьр
1_АСЗЕ-1а	211-540 Ьр
Ηϊδ-метка	541-558 Ьр
Стоп-кодон	559-561 Ьр
60	Гибрид 1_АОЕ-1а Ж) соП и коллагеноподобного Ηίδ-меткой (кодируемый 8ЕО Ю N0:59)	домена ΝΥ-Ε80-1 с
Коллагеноподобный домен ΝΥ-Ε80-1	1-70 аа
1_А<ЗЕ-1а	71-180 аа
Ηίδ-метка	181-186 аа
61	1/3 белка О/гибрид 1_А6Е-1а Ж) соП и коллагеноподобного домена ΝΥ-Ε80-1 с Ηίδ-меткой (кодон-оптимизирован)
Последовательность инициации ΜϋΡ	1-9 Ьр
1/3 белка ϋ	10-333 Ьр
Коллагеноподобный домен ΝΥ-Ε80-1	334-540 Ьр
1_А(ЗЕ-1а	541-870 Ьр
Ηΐδ-метка	871-888 Ьр
Стоп-кодон	889-891 Ьр
62	1/3 белка О/гибрид 1_АСЕ-1а \ΝΟ соП и коллагеноподобного домена ΝΥ-Ε80-1 с Ηίδ-меткой (кодируемый 8Е0 Ю N0:61)
Последовательность инициации 1\УЮР	1-3 аа
1/3 белка ϋ	4-111 аа
Коллагеноподобный домен ΝΥ-Ε80-1	112-180 аа
1_АСЕ-1а	181-290 аа
Ηϊδ-метка	291-296 аа
Гибрид процессированного ЬАбЕИа без коллагеноподобного домена с

- 19 016818

коллагеноподобным доменом ΝΥ-Ε8Ο-1
63	Гибрид процессированного 1_АСЕ-1а без коллагеноподобного домена с коллагеноподобным доменом ΝΥ-Ε8Ο-1
Коллагеноподобный домен ΝΥ-Ε8Ο-1	1-72 Ьр
1_АСЕ-1а	73-402 Ьр
Ηϊδ-метка	403-420 Ьр
Стоп-кодон	421-423 Ьр
64	Гибрид процессированного 1_АСЕ-1а АО соП с коллагеноподобным доменом ΝΥ-Ε8Ο-1 с Ηϊδ-меткой (кодируемый 8ЕО Ю N0:63)
Коллагеноподобный домен ΝΥ-Ε8Ο-1	1-24 аа
1_АСЕ-1а	25-134 аа
Ηϊδ-метка	135-140 аа
65	1/3 белка ϋ/гибрид процессированного 1_АСЕ-1а АО соП с коллагеноподобным доменом ΝΥ-Ε8Ο-1 с Ηϊδ-меткой (кодоноптимизирован)
Последовательность инициации ΜϋΡ	1-9 Ьр
1/3 белка ϋ	10-333 Ьр
Коллагеноподобный домен ΝΥ-Ε8Ο-1	334-402 Ьр
1_АСЕ-1а	403-732 Ьр
Ηϊδ-метка	733-750 Ьр
Стоп-кодон	751-753 Ьр
66	1/3 белка ϋ/гибрид процессированного 1_А(зЕ-1а АО соП с коллагеноподобным доменом ΝΥ-Ε8Ο-1 с Ηϊδ-меткой (кодируемый 8ЕО Ю N0:65)
Последовательность инициации ΜϋΡ	1-3 аа
1/3 белка ϋ	4-111 аа
Коллагеноподобный домен ΝΥ-Ε8Ο-1	112-134 аа
1_АСЕ-1а	135-244 аа
Ηϊδ-метка	245-250 аа
1_АОЕ-1а без коллагеноподобного домена и соседней области, богатой цистеином (8 аа)
67 | 1 АСЕ-1а АО соП (кодон-оптимизирован)

1_АСЕ-1а	1-309 Ьр
Ηϊδ-метка	310-327 Ьр
Стоп-кодон	328-330 Ьр
68 | 1 АСЕ-1а АО соП с Ηϊδ-меткой (кодируемый 8ЕО Ю N0:67)
ЬАСЕИа	1-103 аа
Ηϊδ-метка	104-109 аа
69 I 1/3 белка 0/ЬА0Е-1а АО соП (кодон-оптимизирован)
Последовательность инициации ΜϋΡ	1-9 Ьр
1/3 белка ϋ	10-333 Ьр
1_АСЕ-1а	334-639 Ьр
Ηϊδ-метка	640-657 Ьр
Стоп-кодон	6578-660 Ьр
70 1/3 белка О/1_АСЕ-1а АО соП с Ηϊδ-меткой (кодируемый 8ЕО Ю N0:69)
Последовательность инициации ΜϋΡ	1-3 аа
1/3 белка ϋ	4-111 аа
1_АСЕ-1а	112-213 аа
Ηϊδ-метка	214-219 аа

- 20 016818

Таблица 4

Представлены слитые белки, обсуждаемые в Примерах, и кодирующие их нуклеотидные последовательности. Каждая нуклеотидная последовательность описана по существу, обозначена уникальным идентификатором нуклеотидной последовательности (8Е^ ΙΌ N0:) и изложена в перечне последовательностей. Каждый слитый белок описан по существу, обозначен уникальным идентификатором аминокислотной по следовательности (8Е^ ΙΌ N0:) и изложен в перечне последовательностей.

ТАБЛИЦА 4
НАЗВАНИЕ КОНСТРУКЦИИ	НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ	АМИНОКИСЛОТНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
Б\/Б020	8ΕΩ Ю N0:72	8ΕΩ Ю N0:73
БХ/Б024	8ΕΩ Ю N0:74	8ΕΩ Ю N0:75
1Л/1_026	8ΕΩ Ю N0:76	8ΕΩ Ю N0:77
ΙΛ/1.030	8ΕΩ Ю N0:78	8ΕΩ Ю N0:79
1Л/1_068	8ΕΩ Ю N0:80	8ΕΩ Ю N0:81
ΙΛ/Ι-076	8ΕΩ Ю N0:82	8ΕΩ Ю N0:83
1Л/Ю78	3ΕΩ Ю N0:84	8ΕΩ Ю N0:85
Ι_νΐ_079	8ΕΩ Ю N0:86	8ΕΩ Ю N0:87
1Л/1-106	8ΕΩ Ю N0:88	8ΕΩ Ю N0:89
13/1.151	8ΕΩ Ю N0:90	8ΕΩ Ю N0:91
ΙΛ/Ι-155	8ΕΩ Ю N0:92	8ΕΩ Ю N0:93
Ι_νΐ_156	8ΕΩ Ю N0:94	8ΕΩ Ю N0:95
Ι_νΐ_157	8ΕΩ Ю N0:96	8ΕΩ Ю N0:97

Как будет ясно из перечня последовательностей, многие из конструкций табл. 4 имеют сходную структуру с одним или более воплощением, изложенным в предыдущих таблицах. Например, БУБ068 имеет сходную структуру с воплощением, изложенным как 8Е^ ΙΌ N0: 45, табл. 1. БУБ076 имеет сходную структуру с воплощением, изложенным как 8Е^ ΙΌ N0: 25, табл. 1. БУБ078 имеет сходную структуру с воплощением, изложенным как 8Е^ ΙΌ N0: 33, табл. 1. БУБ079 имеет сходную структуру с воплощением, изложенным как 8Е^ ΙΌ N0: 37, табл. 1.

В дополнение некоторые из конструкций слитых белков, изложенных в табл. 4, а именно БУБ155, БУБ106, БУБ156, БУБ157, БУБ151, были образованы обычными модификациями других последовательностей слитых белков, изложенных в табл. 4, а именно БУБ068, БУБ030, БУБ076, БУБ078, БУБ024 соответственно. Такие модификации включают удаление аминокислотных остатков между белком Ό и началом химерных конструкций (т.е. части, имеющей происхождение от любого из N7^80-1 и БАСЕ1) и удаление аминокислот между Ь18-меткой и началом химерных конструкций. Таким образом, определенные слитые белки табл. 4 хорошо соответствуют другим слитым белкам табл. 4. Соответствие между этими слитыми белками изложено в табл. 5 и описано более подробно в примере 4.

Таблица 5 Соответствие между БУБ068, БУБ030, БУБ076, БУБ078, БУБ024 и модифицированными БУБ^

ТАБЛИЦА 5
КОНСТРУКЦИЯ СЛИТОГО БЕЛКА	СООТВЕТСТВУЕТ	КОНСТРУКЦИИ СЛИТОГО БЕЛКА
ί.νΐ-068	13/1.155
Ι_νΐ_030	13/1.106
13/1.076	13/1.156
13/1.078	13/1.157
13/1.024	13/1.151

Примеры

Пример 1. Разработка и получение химерного белка NΥ-^Α1.

Некоторые слитые белки NΥ-Е80-1/^ΑСЕ-1 были разработаны с и без коллагеноподобного домена и с или без концевой области белка Ό, как суммировано на фиг. 17. Образованные конструкции были кодон-оптимизированы для экспрессии в ЕзсйепсЫа сой. Синтетический ген выстраивали объединением олигонуклеотидов и/или ПЦР-продуктов. Фрагмент клонировали в каркас рСА4 (АшрВ) с использованием сайтов рестрикции Κρηΐ и 8ас1 с добавлением сайтов ШеИ и Х1ю1 в 5'-конец и 3'-конец оптимизированного гена соответственно.

Плазмидную ДНК очищали из трансформированных бактерий и концентрацию определяли спектрометрией в ультрафиолете (УФ-спектрометрией). Конечную конструкцию проверяли секвенировани

- 21 016818 ем. Оптимизированную кодирующую последовательность для различных химерных конструкций ΝΥ/ЬАОЕ субклонировали непосредственно во множественный сайт клонирования рЕТ19 (АтрЕ) с использованием сайтов рестрикции Ше1 и ХКо! для получения химерных экспрессионных плазмид ΝΥ/БАОЕ. Для клонирования в рЕТ26 были разработаны ПЦР-праймеры для добавления Ν-концевого гистидинового хвоста. Эта амплификация приводила к добавлению хвоста из 6 гистидинов в фазе с кодирующей областью различных конструкций. Этот амплифицированный фрагмент ферментативно расщепляли рестриктазами Ше1/ХЕо1 и различные химерные конструкции ΝΥ/БАОЕ затем клонировали во множественный сайт клонирования рЕТ26 (КапЕ) для получения экспрессионной плазмиды. Конечные конструкции проверяли секвенированием.

Получение во встряхиваемой колбе. Рост и индукция бактериального штамма-хозяина Культивирование

Бактерии выращивали в 800 мл жидкой среды (ΒΏ) Лурия-Бертани (БВ) + 1% (процентное соотношение массы и объёма (^/ν)) глюкозы (РаЬогакже МАТ, номер по каталогу ΘΚ-0101) + антибиотик (карбенициллин 100 мкг/мл для рЕТ19, канамицин 40 мкг/мл для рЕТ26) в 2,5 л встряхиваемой колбе. Культуры инкубировали при 37°С для клеток ВЬЕ (ЭЕ3) до оптической плотности при 600 нм (О.Э.6оопт) приблизительно 0,8.

Индукция

При О.Э._600пт приблизительно 0,8 культуры ВБК (ЭЕ3) индуцировали 1 мМ изопропил-3-Э-1тиогалактопиранозидом (ΙΡΤΘ; ЕМЭ Сйет1са18 1пс., номер по каталогу 5815) и инкубировали в течение 16-18 ч при 16°С. С использованием конструкций ЕУЕ106, 151, 155 и 157 получали от 5 до 15 мг специфичного белка/800 мл. Образование белка для каждой конструкции суммировано на фиг. 17.

Пример 2. Краткое изложение предварительной очистки и стабильности.

Выделение и очистка белка

Клетки собирают центрифугированием и затем разрушают физическим или химическим способом и получаемый неочищенный экстракт сохраняют для выделения рассматриваемого полипептида.

Очистка

Экспрессированные рекомбинантные белки солюбилизировали раствором гидрохлорида гуанидина и наносили на смолу для аффинной хроматографии с использованием иммобилизованных металлов (1МАС). Белки затем отмывали на колонке 8М и 4М растворами мочевины перед элюированием возрастающей концентрацией имидазола. Белки затем обессоливали в конечном буфере с 4М мочевиной, рН 7,0 для дальнейшего применения. Очистку оценивали электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (8Э8-РАОЕ) и вестерн-блоттингом для верификации чистоты и идентичности белков.

Исследование очищенного слитого белка на стабильность

Исследования стабильности проводили при 37°С и белки оценивали посредством 8Э8-РАОЕ. Предварительное исследование стабильности не выявило больших проблем.

Предварительное исследование растворимости

Растворимость белков оценивали и суммировали в следующей схеме.

Схема 1

Растворимость слитых белков

БУФЕР	КОНСТРУКЦИЯ
ι_νι_ 076	ι.νι_ 079	ι_νι_ 78	ι_νι. 68	ι_νι_ 020	ι_νι_ 26	ι_νι_ 024	ι_νι_ 30
Однократный забуференный фосфатом физиологический раствор (РВ8 1Х); 1мМ трихлорэтилфосфат (ТСЕР); 1мМ этилендиамин тетрауксусная кислота (ΕϋΤΑ), рН 7,03	Р	8	8	Ρ	Ρ	Ρ	ΝΤ	Ρ
20 мМ Ν,Ν-6πο[2- гидроксиэтил]-глицин (В1С1пе);138мМ ЫаС1; 1мМ ТСЕР; 1мМ ΕϋΤΑ, рН 8,68	Р	5	Ρ	Ρ	Ρ	Ρ	ΝΤ	Ρ
20 мМ имидазол; 138 мМ №С1; 1 мМ ТСЕР; 1 мМ ΕϋΤΑ, рН 5,99	Р	8	Ρ	Ρ	Ρ	Ρ	ΝΤ	Ρ
10 мМ ацетат натрия; 5 мМ №С1; 1 мМ ТСЕР; 1 мМ ΕϋΤΑ, рН 4,99	з	8	8	δ	δ	δ	ΝΤ	δ
10 мМ лимонная кислота; 5 мМ ЫаС1; 1 мМ ТСЕР; 1 мМ ΕϋΤΑ, рН 3,7	ΝΤ	ΝΤ	8	δ	ΝΤ	ΝΤ	ΝΤ	δ

Обозначения: Р - осадок; 8 - осадка нет; ΝΤ - не исследовано.

- 22 016818

Пример 3. Внутримышечная иммунизация слитыми белками.

Слитые белки подвергали доклинической оценке в мышиной модели, включающей серию экспериментов скрининга с внутримышечными иммунизациями, как описано ниже. Выбранная мышиная модель представляла собой модель СВ6Р1, первое поколение, полученное от скрещивания мышей С57ВБ6 и мышей Ва1Ь/с. Такие мыши имеются в продаже от СЬаг1ек К!уег ЬаЬогаЮпек, 1ис., 251 Ва11агбуа1е 81гее(, ^11т1ид1ои, МА 01887-1000. Выбранная опухолевая клеточная линия представляла собой линию В16 (клеточная линия мышиной меланомы), перевиваемую мышиную меланому, имеющуюся в продаже для исследований способов лечения рака.

Скрининг № 1

План эксперимента. В 76-дневном исследовании мышей СВ6Р1 использовали для оценки каждого из ЬУЪ076, ЬУЪ079, ЬУЪ078, ЬУЪ068, ЬУЪ020, ЬУЪ026, ЬУЪ024, ЬУЪ030 для определения того, обеспечивала ли внутримышечная иммунизация слитым белком и адъювантом защиту против подкожного заражения перевиваемыми опухолевыми клетками (В16/ЫУЕ8О1). Конкретно, мышей иммунизировали внутримышечно 50 мкл инъекциями, содержащими 15 мкг белка и адъювант. Выбранный адъювант представлял собой А815. А815 является липосомной адъювантной композицией, содержащей 0821, 3ΌМРЬ и СрС.

Исследования проводили со слитыми белками, изложенными в 1А и 1Б ниже. Мышей разделяли на две группы по 15 мышей на группу. Мышей иммунизировали в 0 день и повторно в 14 день следующим образом.

Исследование 1А:

ЬУЪ079;

ЬУЪ026;

ЬУЪ068;

ЬУЪ030.

Исследование 1Б:

ЬУЪ076;

ЬУЪ020;

ЬУЪ078;

ЬУЪ024.

Контроли:

буфер антигена/буфер А815; непроцессированный ΝΥ-Ξ8Ο-1;

ЬАСЕ-1а без коллагеноподобного домена (СБЭ);

МАСЕ А3.

По шесть мышей на группу заражали подкожной трансплантацией опухолей В16/№Х-Е8О-1 в 28 день. Гуморальный ответ на непроцессированный ΝΥ-Ξ8Ο-1, ЬАСЕ-1а без коллагеноподобного домена и человеческий коллаген оценивали на 0, 14, 28 и 76 день твердофазным иммуноферментным анализом (ЕЫ8А) (1дС1 и 1дС2а). Клеточно-опосредованный ответ оценивали клеточным сортером с возбуждением флуоресценции (РАС8) на 28 день с использованием собранных спленоцитов (повторная стимуляция 3 пулов из 3 пулами пептидов ΝΥ-Ξ8Ο-1 и ЬАСЕ-1а). План эксперимента скрининга № 1 кратко изложен на фиг. 18.

Результаты. Из четырех контролей только непроцессированный ΝΥ-Ξ8Ο-1 обеспечивал некоторую защиту по сравнению с буфером. См. фиг. 19. В группах мышей, получавших либо непроцессированный ΝΥ-Ξ8Ο-1, либо ЬУБ030, у двух из каждой группы не было опухоли при окончании исследования. Из мышей, получавших ЬУБ068, у четырех не было опухоли при окончании исследования. ЬУБ068 и ЬУБ078 обеспечивали более длительную выживаемость по сравнению с мышами, получавшими буферы. См. фиг. 20. NΥ-Е8Ο-1-специфичные иммунные ответы оценивали посредством ЕЫ8А, РАС8 и вестернблоттинга. ЬАСЕ-1а (без коллагеноподобного домена)-специфичные иммунные ответы оценивали посредством ЕЫ8А и РАС8. См. фиг. 21. Эти результаты суммированы в следующей схеме.

- 23 016818

Схема 2

Краткое изложение специфичного иммунитета

Иммуноген	Защита Β16/ΝΥЕ8О-1
141.068	++
41.078	+
141.076	+
41.024	+
141.030	+
141.020	+
41.079	-
141.026	-

ΝΥ-Ε5Ο-1специфичный иммунитет	1_А6Е1аспецифичный иммунитет
++	++
++	++
++	+
++	+
++	+
+	+
+	+
+	+

Обозначения: (-) - наименьший ответ; (+) - средний ответ; (++) - наибольший ответ.

Скрининг № 2

План эксперимента. В 105-дневном исследовании мышей СΒ6Ε1 использовали для оценки каждого из ЦУЬ076, ΕνΕ078, ЬУЬ068 и ЬУЬ024 для определения того, обеспечивала ли внутримышечная иммунизация слитым белком и адъювантом защиту против подкожного заражения трансплантированными опухолевыми клетками Β16/ΝΥΕδΟ1 (после двух иммунизаций) или опухолевыми клетками Β16/ΝΥΕ8Ο-1β (после четырех иммунизаций). Конкретно мышей иммунизировали внутримышечно 50 мкл инъекциями, содержащими 15 мкг белка и 25 мкл адъюванта Αδ15.

Мышей разделяли на группы по 29 мышей на группу. Мышей иммунизировали в 0, 14, 28 и 42 дни следующим образом.

Исследование:

ЦУЬ076;

ЦУЬ068;

νΕ078;

цуь024.

Контроли: буфер антигена/буфер Αδ15; непроцессированный ΝΥ-ΕδΟ-1;

ΕΑΘΕ-1ι без коллагеноподобного домена (СЬИ); ΜΑΟΕ Α3.

По десять мышей на группу заражали подкожной трансплантацией опухолевых клеток Β16/ΝΥΕδΟ-1 на 28 день. По девять мышей на группу заражали подкожной трансплантацией опухолевых клеток Β16/ΕΑΘΕ-1Α на 56 день. На 0, 14, 28, 42 56, 84 и 105 дни брали сыворотку и гуморальный ответ на (1) непроцессированный ΝΥ-ΕδΟ-1, (2) ΕΑΘΕ-1ι без коллагеноподобного домена и (3) человеческий коллаген оценивали посредством ΕΟ8Α (1дО1 и 1дО2а). План эксперимента скрининга № 2 суммирован на фиг. 22 и 23.

Результаты.

Заражение опухолью Β16-ΝΥΕ8Ο1.

Из мышей, получавших 141.078, у двух не было опухоли в течение более чем 50 дней после заражения Β16-ΝΥ-Ε8Ο-1. Из мышей, получавших либо непроцессированный ΝΥ-ΕδΟ-1, либо 141.024, у двух из каждой группы не было опухоли в течение более чем 50 дней, три были живы. Из мышей, получавших 141.068, у трех не было опухоли, и четыре были живы. Из мышей, получавших 141.076, у трех не было опухоли, и пять были живы. См. фиг. 24.

Заражение опухолью В16-^ΑΘΕ1а.

Все мыши, получавшие ΕνΕ076 или ΕΑΘΕ-1ι без коллагеноподобной области, умерли ранее 40 дня после заражения. Из мышей, получавших только буфер, выжила одна, и до окончания исследования у нее не было опухоли. Из мышей, получавших ΕνΕ024, у одной не было опухоли при окончании исследования. У всех мышей, получавших непроцессированный ΝΥ-ΕδΟ-1, были опухоли, но одна была еще жива при окончании исследования. Из мышей, получавших ΕνΕ078, у одной не было опухоли. Из мышей, получавших ΕνΕ068, у трех не было опухоли. Из мышей, получавших ΕνΕ076, у трех не было опухоли при окончании исследования. См. фиг. 25. Эти результаты суммированы в следующей схеме.

- 24 016818

Схема 3

Защита против заражения опухолью В1б-БАСЕ1а

Иммуноген	ΝΥ-Ε80-1	ЬАСЕ-1 а
Защита	Специфичный иммунитет	Защита	Специфичный иммунитет
1X1.068	++	++	++	++
ΙΧΙ.078	++	++	++	++
1X1.024	+	++	-	+
1X1.076	+	+	-	+

Обозначения: (-) - наименьший; (±) - следующий наименьший ответ; (+) - средний ответ; (++) - наибольший ответ.

Специфичные иммунные ответы против человеческого коллагена

Для изучения того, стимулировал ли коллагеноподобный домен ΝΥ-Ε8Ο-1 специфичные иммунные ответы против человеческого коллагена, на 14 день после заражения собирали и объединяли сыворотку от мышей, иммунизированных одним из следующего: (1) буферами (контроль); (2) непроцессированным ΝΥ-Ε8Ο-1; (3) БАСЕ-1а без коллагеноподобного домена; (4) Б\Б0б8; (5) ЬУЬ078; (б) Б\Б024; (7) Б\Б07б. ЕЫ8Л проводили для каждого из этих семи пулов сыворотки, а также для положительного контроля, содержащего моноклональное антитело (шЛЪ) против человеческого коллагена I типа. Коллагеноподобный домен не стимулировал выработку мышиных антител против человеческого коллагена I типа. См. фиг. 2б. Сходные исследования (результаты не показаны) были проведены для коллагена III типа и коллагена VI типа; не было выявлено выработки ни мышиных антител против человеческого коллагена III типа, ни мышиных антител против человеческого коллагена VI типа.

Пример 4. Очищенные конструкции.

Модификации проводили с применением обычных методик клонирования на некоторых из конструкций, перечисленных в табл. 4. Конкретно БХБ0б8, ΙΧΙ.030, 1Х1.07б, 1X1.078, БХБ024 были модифицированы с образованием ΙΧΙ.155, Ь'УЬЮб, П\Ы5б, ΙΧΙ.157, П\Ы51. Было два типа модификаций, первый из которых представлял собой удаление 5 аминокислотных остатков между белком Ό и началом химерных конструкций. Например, эту модификацию проводили с 1X1.024 (8ЕС) II) ΝΟ: 74; 8ЕС) II) ΝΟ: 75) с образованием ΙΧΙ.151 (8Ε^ ГО ΝΟ: 90; 8ЕС) ГО ΝΟ: 91). Таким образом, Б\Т024 соответствует П\Ы51. Второй тип модификаций представлял собой удаление аминокислот между Ηΐδ-меткой и началом химерной конструкции. Эту модификацию проводили с 1Х1.0б8 (8Ε^ ГО ΝΟ: 80; 8ЕС) ГО ΝΟ: 81) с образованием Б\Т155 (8Ε^ ГО ΝΟ: 92; 8ЕС) ГО ΝΟ: 93). Таким образом, 1Х1.0б8 соответствует Б\Т151. Каждая конструкция слитого белка, которая была модифицирована, и конструкция слитого белка, которой она соответствует, изложена в табл. 5 описания.

Следует понимать, что согласно ожиданиям описанные выше модификации не приведут к функциональным различиям между слитым белком и его соответствующим модифицированным слитым белком. Таким образом, ожидают, что каждый модифицированный слитый белок, перечисленный с правой стороны в табл. 5, можно использовать взаимозаменяемо с его соответствующим слитым белком, перечисленным с левой стороны схемы.

Пример 5.

План эксперимента. В 105-дневном исследовании мышей СВбТ1 используют для оценки каждого из ПУБ0б8, БХБ030, 1Х1.07б. БХЕ078, ΙΧΙ.024 и модифицированных 1ХЫх\ |.\'Ы0б. БХЕ15б, ΙΧΙ.1Χ. IXI. 151 для изучения внутримышечной иммунизации слитым белком и адъювантом против подкожного заражения трансплантированными опухолевыми клетками Β16/ΝΥΕ8Ο1 (после двух иммунизаций) или опухолевыми клетками В1б/NΥΕ8Ο-1а (после четырех иммунизаций). Конкретно мышей иммунизируют внутримышечно 50 мкл инъекциями, содержащими 15 мкг белка и 25 мкл адъюванта А8 15.

Мышей разделяют на группы по 29 мышей на группу. Мышей иммунизируют на 0, 14, 28 и 42 дни следующим образом.

Исследование:

Б\Т0б8;

Б\Т030;

Б\Т07б;

Б\Т078;

Б\Т024;

П\Ы55;

П\Ы0б;

П\Ы5б;

П\Ы57;

Ь\Ь151.

- 25 016818

Контроли:

буфер антигена/буфер Ά815;

непроцессированный ΝΥ-Ε8Ο-1;

ЬАОЕ-1а без коллагеноподобного домена;

ΜΆΟΕ А3.

По десять мышей на группу заражают подкожной трансплантацией опухолевых клеток Β16/ΝΥΕ8Ο-1 на 28 день. По девять мышей на группу заражают подкожной трансплантацией опухолевых клеток Β16/ΕΆΟΕ-1Ά на 56 день. Для мониторинга специфичного иммунного ответа на 0, 14, 28, 42, 56, 84 и 105 дни можно брать сыворотку и оценивать гуморальный ответ на (1) непроцессированный ΝΥ-Ε8Ο-1, (2) ΕΆΟΕ-1α без коллагеноподобного домена и (3) человеческий коллаген посредством ΕΕΙ8Ά (1дО1 и 1§С2а).

Предшествующие примеры представлены в качестве иллюстрации, но никоим образом не являются огр аничивающими.

Использованные в данном описании термины, которые указывают на неопределенное количество, могут означать один или более. В качестве примера элемент обозначает один или более элементов. Предполагают, что в каждом случае при использовании здесь термины приблизительно и примерно могут быть удалены или заменены термином точно по требованию заявителя.

Единицы, приставки и символы могут быть обозначены в их форме, приемлемой в Международной системе единиц (СИ). Если не указано иное, нуклеиновые кислоты пишут слева направо в 5'-3'ориентации; аминокислотные последовательности пишут слева направо в ориентации от Ν-конца к Сконцу соответственно. Численные интервалы включают числа, задающие интервал. Аминокислоты могут здесь быть названы либо их общеизвестными трехбуквенными символами, либо однобуквенными символами, рекомендованными ΙϋΡΆϋ-ΐυΒ ВюсЕеш1са1 Уотепс1аЩге СоттНыоп. Сходным образом, нуклеотиды могут быть названы их общепринятыми однобуквенными кодами. Определенные выше термины определены более полно посредством ссылки на все описание.

Claims (10)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Слитый белок, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ЕУБ106 (8ΕΡ ΙΌ ΝΟ: 89), БУБ030 (8Ερ ΙΌ ΝΟ: 79), БУБ155 (8Ερ ΙΌ ΝΟ: 93), БУБ068 (8ΕΡ ΙΌ ΝΟ: 81), БУБ157 (8Ερ ΙΌ ΝΟ: 97) и БУБ078 (8Ερ ΙΌ ΝΟ: 85).
2. 2. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок по п.1.
3. 3. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.2.
4. 4. Клетка-хозяин, трансформированная вектором по п.3.
5. 5. Иммуногенная композиция или вакцина, содержащая слитый белок по п.1.
6. 6. Иммуногенная композиция по п.5, дополнительно содержащая адъювант и/или иммуностимулирующий цитокин или хемокин.
7. 7. Иммуногенная композиция или вакцина по п.5 или 6, где слитый белок присутствует в эмульсионном наполнителе типа масло в воде или типа вода в масле.
8. 8. Иммуногенная композиция или вакцина по п.6 или 7, содержащая один или более из следующих адъювантов: 3И-МРБ (3-де-О-ацилированный монофосфориллипид Ά), Р821 или СрС-олигонуклеотид.
9. 9. Иммуногенная композиция или вакцина по любому из пп.5-8, дополнительно содержащая один или более других антигенов.
10. 10. Применение слитого белка по п.1, или молекулы нуклеиновой кислоты по п.2, или вектора по п.3, или композиции или вакцины по любому из пп.5-9 в изготовлении лекарственного средства для лечения рака.