KR20090122426A - 종양 거부 항원 ｎｙ-ｅｓｏ-１ 및 ｌａｇｅ-１을 포함하는 융합 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 LAGE-1으로부터 유래된 항원에 연결된 NY-ESO-1으로부터 유래된 항원을 포함하고, 담체, 융합 파트너 등을 추가로 포함할 수 있는 융합 단백질을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 융합 단백질을 제조하고, 제형화시키고, 이용하는 방법을 제공한다. 이러한 단백질은 다양한 암-항원-포함 세포에 대해 면역 반응을 유도하는 유용한 백신 성분이다.

Description

종양 거부 항원 ＮＹ-ＥＳＯ-１ 및 ＬＡＧＥ-１을 포함하는 융합 단백질{FUSION PROTEINS COMPRISING THE TUMOR REJECTION ANTIGENS NY-ESO-1 AND LAGE-1}

본 발명은 일반적으로 종양 거부 항원(tumor rejection antigen) NY-ESO-1 및 LAGE-1 중 하나 또는 둘 모두로부터 유래된 항원을 포함하는 폴리펩티드 및 작제물에 관한 것이다.

암 고환(CT) 항원은 고환, 난소 또는 영양막 세포에서 일반적으로 생식 세포로 제한된 발현을 갖는 종양 관련 항원 부류이다. 이러한 항원은 보통 성인 신체 조직에서 발현되지 않는다. 문헌[Simpson, et al., Nat. Rev. Cancer, 5(8):615-625 (2005); Scanlan, et al., Immunol. Reviews, 188:22-32 (2002); Scanlan, et al., Canc. Immun., 4:1-15 (2004)]을 참조하라.

CT 항원의 유전자 조절이 암 환자에서 붕괴되어, 매우 다양한 종양에서 상기 항원의 이상 발현이 발생한다. 확인되는 첫번째 CT 항원인 MAGE-1은 T-세포 에피토프 클로닝에 이해 1990년대 초반에 확인되었다(van der Bruggen et al, 1991 Science 13;254(5038):1643-7; van der Bruggen et al, 1999 Science 254:1643-1647; Traversari, et al, 1992 Immunogenetics, 35(3):145-152; 및 미국 특허 제 5,342,774호, 참조로서 본원에 포함됨). 그 이후, 혈청학적 발현 클로닝 기술(SEREX)(Sahin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(25):11810-11813 (1995) 및 미국 특허 제5,698,396호), 효모 표면에서의 재조합 항원 발현(RAYS)(Mischo, et al., Canc. Immun., 3:5-16 (2003)) 및 감별 mRNA 발현 분석(Gure, et al., Int. J. Canc., 85(5):726-732 (2000))으로 약 90개의 CT 항원이 확인되었고, 이의 수는 이후 증가할 것으로 예상된다. 암 환자에서의 몇몇 CT 항원의 면역원성은 이들을 종양 백신의 개발에서의 이상적인 표적이 되도록 한다.

NY - ESO -1. 암 면역요법에 사용하기 위한 현재 흥미로운 암 고환 항원은 NY-ESO-1이다. 이 항원은 90년대 후반에 루드비히 암연구소(Ludwig Institute for Cancer Research)의 뉴욕 지부에서 식도 편평세포 암종에서 SEREX에 의해 처음 확인되었다(Chen, et al., PNAS USA, 94(5):1914-1918 (1997); 및 미국 특허 제5,804,381호, 참조로서 본원에 포함됨).

단백질 NY-ESO-1은 180개 아미노산 길이이며, 이는 하기의 3 영역으로 구성되는 것으로 기술될 수 있다:

·N-말단 영역 약 또는 대략 아미노산 1 내지 70,

·중심 영역 약 또는 대략 아미노산 71 내지 134, 및

·C-말단 영역 약 또는 대략 아미노산 135 내지 180.

콜라겐 유사 영역은 N-말단 영역의 약 또는 대략 아미노산 15 내지 73을 포함한다(도 1 참조).

단백질 NY-ESO-1은 난소암, 폐암, 유방암, 전립선암, 식도암, 방광암 및 흑 색종을 포함하나 이에 제한되지는 않는 매우 다양한 종양에서 발견된다(Nicholaou T, et al, Immunol Cell Biol. 2006 Jun;84(3):303-17 and Jungbluth, et al. 2001, Int. J. Canc., 92(6):856-860). 상기 항원에 대한 자발적 체액성 및 세포성 면역 반응이 NY-ESO-1-양성 종양을 갖는 환자에서 기술되어 있고, 다수의 HLA(인간 백혈구 항원) 클래스 Ⅰ- 및 Ⅱ-제한 펩티드가 확인되었다(Jager, et al., 1998 J. Exp. Med., 187(2):265-270; Yamaguchi, et al., 2004 Clin. Canc. Res., 10(3):890-961; and Davis, et al., 2004 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(29):10697-10702). 특허 문헌의 예는 미국 특허 번호 제6,140,050호; 제6,251,603호; 제6,242,052호; 제6,274,145호; 제6,338,947호; 제6,417,165호; 제6,525,177호; 제6,605,711호; 제6,689,742호; 제6,723,832호; 제6,756,044호; 및 제6,800,730호가 있으며, 이들 모두는 참조로서 본원에 포함된다.

한 임상 실험에서, HLA-A2에 대한 결합 모티프를 갖는 3개의 부분적으로 중복되는 NY-ESO-1-유래 펩티드(157-167, 157-165 및 155-163)가 전이성 NY-ESO-1 발현 종양을 갖는 12명의 환자를 치료하기 위한 백신에 사용되었다. 이러한 연구는 합성 NY-ESO-1 펩티드가 안전하게 투여될 수 있으며, 잠재적으로 이로운 T 세포 반응을 발생시킬 수 있음을 입증하였다(Jager, et al., 2000 PNAS USA, 97(22):12198-12203).

단백질에서 다수의 MHC(주 조직적합 복합체) 클래스 Ⅰ 및 Ⅱ 에피토프가 다양한 그룹에 의해 확인되었고, 예를 들어 도 1을 참조하라. 이러한 에피토프는 단지 단백질에 대해 보고된 대표적인 에피토프이며, 도 1의 목록은 총망라된 것이 아 니다. 또한, 보고되고/되거나 도 1에 나열된 에피토프 중 하나 이상은 실험에 의해 확인되지 않았다. N-말단 내의 콜라겐 유사 영역은 본원에서는 A31로 언급되는 하나 이상의 MHC 클래스 Ⅰ 에피토프를 포함한다. 중심 영역은 본원에서 DR1, DR2, DR4, DR7 및 DP4로 언급되는 여러 MHC 클래스 2 에피토프를 포함한다. 이러한 영역은 또한 본원에서 B35, B51, Cw3 및 Cw6으로 언급되는 여러 MHC 클래스 Ⅰ 에피토프를 포함한다. C-말단은 2개 이상의 클래스 Ⅱ 에피토프(DR4 및 DP4) 및 1개의 클래스 Ⅰ 에피토프(A2)를 포함하는 것으로 생각된다.

LAGE -1. 추가의 암 고환 항원 LAGE-1이 또한 확인되었다. LAGE-1a 및 LAGE1b의 2개의 LAGE-1 전사체가 기재되었다. LAGE-1b는 불완전하게 스플라이싱(splicing)되며, 약 210개의 아미노산 잔기의 추정 단백질을 코딩하는 반면, LAGE-1a 유전자 생성물은 180개의 아미노산 잔기를 포함한다(Sun et al. Cancer Immunol Immunother 2006: 55: 644-652).

LAGE-1 및 NY-ESO-1 단백질의 N-말단 영역은 고도로 보존되어 있으며, 97% 이상의 동일성을 갖는 것으로 생각된다. 그러나, 중심 영역에서 LAGE-1는 NY-ESO-1과 상이하며, 단지 62%가 동일하다. NY-ESO-1 및 LAGE-1a의 C-말단은 고도로 보존되어 있다(97% 이상의 동일성). 그러나, LAGE-1b의 C-말단은 더 길고, 보존되어 있지 않으며, LAGE-1a/NY-ESO-1의 동일 영역과 50% 미만의 동일성을 갖는 것으로 생각된다.

상기 단백질의 관한 일반적인 정보는 LICR 웹 사이트(참조: www.cancerimmunity.org/CTdatabase)에서 이용가능하다.

발명의 개요

본 발명은, (ⅱ) LAGE-1 또는 이의 단편에 연결된 (ⅰ) NY-ESO-1 또는 이의 단편을 포함하는 면역원성 융합 단백질을 제공하며, 여기서 NY-ESO-1 및/또는 LAGE-1 중 하나 이상은 트렁케이션(truncation)되거나 부분적으로 트렁케이션되거나, NY-ESO-1 또는 LAGE-1의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 단편이다. 본 발명은 또한 (ⅱ) NY-ESO-1 또는 이의 단편에 연결된 (ⅰ) LAGE-1 또는 이의 단편을 포함하는 면역원성 융합 단백질을 제공하며, 여기서 NY-ESO-1 및/또는 LAGE-1 중 하나 이상은 트렁케이션되거나 부분적으로 트렁케이션되거나, NY-ESO-1 또는 LAGE-1의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 단편이다. 따라서, 트렁케이션되거나 부분적으로 트렁케이션된 NY-ESO-1, 또는 NY-ESO-1의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 NY-ESO-1의 단편을 포함하는 폴리펩티드 및 융합 단백질이 또한 제공된다. 트렁케이션되거나 부분적으로 트렁케이션된 LAGE-1, 또는 LAGE-1의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 LAGE-1의 단편을 포함하는 폴리펩티드 및 융합 단백질이 또한 제공된다. 상기 융합 단백질 및 폴리펩티드를 포함하는 조성물 및 방법이 또한 제공된다.

도면의 간단한 설명

도 1은 다양한 그룹에 의해 확인된 NY-ESO-1 단백질 상의 다양한 MHC(주 조직적합 복합체) 클래스 Ⅰ 및 Ⅱ 에피토프를 도시한다. 이러한 에피토프는 단지 단백질에 대해 보고된 대표적인 에피토프이며, 따라서 도 1의 목록은 총망라된 것이 아니다. 또한, 보고되고/되거나 도 1에 나열된 에피토프 중 하나 이상은 실험에 의해 확인되지 않았다. NY-ESO-1에 대해 보고된 아미노산 서열은 본원에서 서열 목록 번호:49에 제공된다.

도 2는 전장 NY-ESO-1 및 트렁케이션된 LAGE-1, 예를 들어, LAGE-1a를 포함하는 융합 단백질인 작제물 A를 도시한다. 이러한 구체예에서, NY-ESO-1의 C-말단은 히스티딘 친화성 태그(tag)와 함께 트렁케이션된 LAGE-1의 N-말단에 융합되어, 288개의 아미노산 길이의 융합 단백질이 생성된다. 작제물 A의 추가의 세부사항은 표 1에 제공되어 있다(서열 목록 번호:1; 서열 목록 번호:3).

도 3은 분비 신호를 갖지 않는 단백질 D의 1/3(예를 들어, 아미노산 20 내지 127), 전장 NY-ESO-1 및 트렁케이션된 LAGE-1, 예를 들어, LAGE-1a를 포함하는 융합 단백질인 작제물 B를 도시한다. 이러한 구체예에서, 단백질 D의 아미노산 127은 NY-ESO-1의 N-말단에 융합되고, NY-ESO-1의 C-말단은 트렁케이션된 LAGE-1의 N-말단에 융합되어, 398개의 아미노산 길이의 융합 단백질이 생성된다. 작제물 B의 추가의 세부사항은 섹션 1.6의 표 1에 제공되어 있다(서열 목록 번호:2; 서열 목록 번호:4).

도 4는 부분적으로 트렁케이션된 NY-ESO-1 및 트렁케이션된 LAGE-1, 예를 들어, LAGE-1a를 포함하는 융합 단백질인 작제물 C를 도시한다. 이러한 구체예에서, 부분적으로 트렁케이션된 NY-ESO-1의 C-말단은 트렁케이션된 LAGE-1의 N-말단에 융합되어, 242개의 아미노산 길이의 융합 단백질이 생성된다. 작제물 C의 추가의 세부사항은 표 1에 제공되어 있다(서열 목록 번호:5; 서열 목록 번호:7).

도 5는 분비 신호를 갖지 않는 단백질 D의 1/3(예를 들어, 아미노산 20 내지 약 또는 대략 127), 부분적으로 트렁케이션된 NY-ESO-1 및 트렁케이션된 LAGE-1, 예를 들어, LAGE-1a를 포함하는 융합 단백질인 작제물 D를 도시한다. 이러한 구체예에서, 단백질 D의 아미노산 127은 부분적으로 트렁케이션된 NY-ESO-1의 N-말단에 융합되고, NY-ESO-1의 C-말단은 트렁케이션된 LAGE-1의 N-말단에 융합되어, 352개의 아미노산 길이의 융합 단백질이 생성된다. 이러한 구체예의 추가의 세부사항은 표 1에 제공되어 있다(서열 목록 번호:6; 서열 목록 번호:8).

도 6은 트렁케이션된 NY-ESO-1 및 트렁케이션된 LAGE-1, 예를 들어, LAGE-1a를 포함하는 융합 단백질인 작제물 E를 도시한다. 이러한 구체예에서, 트렁케이션된 NY-ESO-1의 C-말단은 트렁케이션된 LAGE-1의 N-말단에 융합되어, 211개의 아미노산 길이의 융합 단백질이 생성된다. 작제물 E의 추가의 세부사항은 표 1에 제공되어 있다(서열 목록 번호:9; 서열 목록 번호:11).

도 7은 분비 신호를 갖지 않는 단백질 D의 1/3(예를 들어, 아미노산 20 내지 약 또는 대략 127), 트렁케이션된 NY-ESO-1 및 트렁케이션된 LAGE-1, 예를 들어, LAGE-1a를 포함하는 융합 단백질인 작제물 F를 도시한다. 이러한 구체예에서, 단백질 D의 아미노산 127은 트렁케이션된 NY-ESO-1의 N-말단에 융합되고, NY-ESO-1의 C-말단은 트렁케이션된 LAGE-1의 N-말단에 융합되어, 321개의 아미노산 길이의 융합 단백질이 생성된다. 작제물 F의 추가의 세부사항은 표 1에 제공되어 있다(서열 목록 번호:10; 서열 목록 번호:12).

도 8은 트렁케이션된 LAGE-1의 C-말단이 트렁케이션된 NY-ESO-1의 N-말단에 융합되어, 212개의 아미노산 길이의 융합 단백질이 생성되는, 작제물 E의 대안적 구체예, 즉 E'를 도시한다. 이러한 구체예인 작제물 E'의 추가의 세부사항은 표 1에 제공되어 있다(서열 목록 번호:21; 서열 목록 번호:23).

도 9는 트렁케이션된 NY-ESO-1, 트렁케이션된 LAGE-1, 예를 들어, LAGE-1a, 및 콜라겐 유사 영역, 예를 들어, NY-ESO-1으로부터의 콜라겐 영역을 포함하는 융합 단백질인 작제물 G를 도시한다. 이러한 구체예에서, 콜라겐 유사 영역의 C-말단은, 예를 들어, 트렁케이션된 LAGE-1의 N-말단에 융합된다. 차례로, 트렁케이션된 LAGE-1의 C-말단은 트렁케이션된 NY-ESO-1의 N-말단에 융합되어, 289개의 아미노산 길이의 융합 단백질이 생성된다. 작제물 G의 추가의 세부사항은 표 1에 제공되어 있다(서열 목록 번호:13; 서열 목록 번호:15).

도 10은 부분적으로 트렁케이션된 콜라겐 유사 도메인을 갖는 NY-ESO-1을 포함하는 예시적인 재조합 폴리펩티드의 개략도를 도시한다. 도 10-13에 도시된 에피토프는 단지 단백질에 대해 보고된 대표적인 에피토프이며, 실험에 의해 확인되지 않았다.

도 11은 분비 신호를 갖지 않는 단백질 D의 1/3(예를 들어, 아미노산 20 내지 약 또는 대략 127) 및 부분적으로 트렁케이션된 콜라겐 유사 도메인을 갖는 NY-ESO-1을 포함하는 예시적인 융합 단백질의 개략도를 도시한다.

도 12는 부분적으로 트렁케이션된 콜라겐 유사 도메인을 갖는 NY-ESO-1을 포함하는 예시적인 재조합 폴리펩티드의 개략도를 도시한다.

도 13은 분비 신호를 갖지 않는 단백질 D의 1/3(예를 들어, 아미노산 20 내지 약 또는 대략 127) 및 트렁케이션된 콜라겐 유사 도메인을 갖는 NY-ESO-1을 포함하는 예시적인 융합 단백질의 개략도를 도시한다.

도 14는 트렁케이션된 LAGE-1a 단백질 내에서 확인된 다수의 에피토프를 도시하는 개략도이다. 이러한 에피토프는 단지 단백질에 대해 보고된 대표적인 에피토프이며, 따라서 상기 목록은 총망라된 것이 아니다. 불확실성을 피하기 위해, 상기 도에 보고되고/되거나 나열된 에피토프는 본원에 달리 언급되지 않는 경우 실험에 의해 확인되거나 확인되지 않을 수 있다(즉, 이들은 예측될 수 있다). 완전한 LAGE-1a 아미노산 서열은 서열 목록 번호:58로서 서열 목록에 나열되어 있다. 완전한 LAGE-1b 아미노산 서열(LAGE-1b는 상기 도에 도시되어 있지 않음)은 서열 목록 번호:71로서 서열 목록에 나열되어 있다.

도 15는 둘 모두의 NY-ESO-1 및 LAGE-1, 뿐만 아니라 다수의 MHC(주 조직적합 복합체) 클래스 Ⅰ 및 Ⅱ 에피토프의 개략도를 도시한다. 이러한 에피토프는 단지 단백질에 대해 보고된 대표적인 에피토프이며, 따라서 상기 목록은 총망라된 것이 아니고; 보고되고/되거나 나열된 에피토프의 하나 이상은 실험에 의해 확인되지 않았다.

도 16은 NY-ESO-1/LAGE-1 융합 디자인의 개략도를 도시한다.

도 17에는 개략도 형식의 15개의 작제물 및 이들의 생성 수준이 요약되어 있다. P = 단백질 D; C (회색 박스) = NY-ESO-1 콜라겐 유사 도메인; C (백색 박스) = 트렁케이션된 콜라겐 유사 도메인; L = 콜라겐 유사 도메인을 갖지 않는 Lage 1; N = 콜라겐 유사 도메인을 갖지 않는 NY-ESO-1; 흑색 화살표 = 폴리 히스티딘 태그; (-) = 낮은 생성; (+) = 약간의 생성; (++) = 높은 생성; (+++) = 최대의 생성. 작제물 중 8개에 대한 아미노산 서열 및 이들을 엔코딩하는 누클레오티드 서열이 표 4 및 서열 목록에 요약되어 있다.

도 18에는 융합 단백질 + 애쥬번트를 이용한 근내 면역화가 이식 종양(B16/NYESO1)을 이용한 피하 공격에 대해 보호를 제공하였는지의 여부를 결정하기 위한, CB6F1 마우스를 이용하여 LVL076, LVL079, LVL78, LVL68, LVL020, LVL26, LVL024, LVL30 각각을 평가하는 76일의 실험인 스크리닝 #1이 요약되어 있다.

도 19에는 76일의 실험에서 사용된 대조군 마우스에서의 B-16-NY-ESO-1 종양 성장이 요약되어 있다.

도 20은 전장 NY-ESO-1, LVL030, LVL068, LVL079 또는 LVL026으로 면역화된 마우스의 생존을 도시한다.

도 21에는 ELISA, FACS 및 웨스턴 블롯(Western Blot)에 의해 평가된 NY-ESO-1 특이적 면역 반응, 및 ELISA 및 FACS에 의해 평가된 LAGE-1a(콜라겐 유사 도메인을 갖지 않음) 특이적 면역 반응이 요약되어 있다.

도 22에는 선택된 융합 단백질 + 애쥬번트를 이용한 근내 면역화가 B16/NY-ESO-1 공격 및 B16/LAGE-1a 공격에 대해 보호를 제공하는지의 여부를 결정하는 105일의 실험인 스크리닝 #2의 실험 디자인이 요약되어 있다. B16/NY-ESO-1 공격이 도시되어 있다.

도 23에는 스크리닝 #2가 요약되어 있고, B16/LAGE-1a 공격이 도시되어 있다.

도 24는 LVL078, LVL068, 전장 NY-ESO-1, LVL024 및 LVL076으로 면역화된 마우스의 B16/NY-ESO-1 공격 후의 생존을 도시한다. 도 24를 참조하라.

도 25는 LVL076, 콜라겐 유사 영역을 갖지 않는 LAGE-1a, LVL024, 전장 NY-ESO-1, LVL078 또는 LVL068로 면역화된 마우스의 B16/LAGE-1a 공격 후의 생존을 도시한다.

도 26. 좌측에서 우측으로의 컬럼 1-8은 (1) 완충용액(대조군); (2) 전장 NY-ESO-1; (3) 콜라겐 유사 도메인을 갖지 않는 LAGE-1a; (4) LVL068; (5) LVL078; (6) LVL024; (7) LVL076 중 하나로 면역화된 마우스에서의 가능한 인간 콜라겐 특이적 면역 반응을 검출하기 위해 수행된 ELISA의 결과를 도시한다. 양성 대조군(컬럼 8)은 항-인간 콜라겐 1 모노클로날 항체(mAb 항-인간 콜라겐 Ⅰ)를 포함한다.

발명의 상세한 설명

융합 단백질. 본 발명의 융합 단백질은 암의 치료, 더욱 구체적으로 흑색종; 유방암; 전립선암; 이행세포암종을 포함하는 방광암; 비소세포 폐암종(NSCLC)을 포함하는 폐암; 식도암종을 포함하는 두경부암; 편평세포암종; 위장관의 암종; 간암; 뇌종양; 백혈병; 및 다양한 육종의 치료에 유용하다.

LAGE-1 및 NY-ESO-1의 발현 프로파일에 기초하여, 본 발명에 따른 융합 단백질은 유방암의 약 37%에서 효과적인 잠재성을 갖는다. 본 발명에 따른 치료는 또한 Her2/neu 표적 요법에 적합하지 않은 환자의 치료에 특히 적합할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질은 또한 전립선 암 환자의 약 35%, 방광암 환자의 35%, 흑색종 환자의 40%, 및 NSCLC(비소세포 폐암종)를 갖는 환자의 35%에서 효과적인 것으로 예측된다. 한 구체예에서, NY-ESO-1 및/또는 LAGE-1(LAGE-1a 및 LAGE-1b를 포함함) 둘 모두를 발현하는 종양을 갖는 환자에 본 발명의 융합 단백질이 제공될 수 있으므로, 본 발명의 융합 단백질은 보다 넓은 집단의 환자가 치료되는 것을 가능케 할 수 있다.

본 발명에 따른 융합 단백질은 또한 하기와 같은 이유로 이의 개별적 성분의 단백질 보다 면역원성일 수 있다:

·콜라겐 유사 도메인 중 하나 이상의 제거는 이의 천연 내생 콜라겐 구조와의 상동성에 의해 화합물의 잠재적 면역내성을 감소시킬 수 있거나,

·이종성 융합 파트너의 임의의 첨가는 CD4 T-세포 반응을 추가로 자극할 수 있다. 따라서, 융합 단백질은 NY-ESO-1 또는 LAGE-1, 또는 둘 모두와 같은 암 항원에 대한 면역원성 반응을 유도하는데 유용하다.

본 발명에 사용된 NY-ESO-1은 전장, 부분적으로 트렁케이션되거나 트렁케이션된 NY-ESO-1, 또는 NY-ESO-1에 대해 면역 반응을 유발시킬 수 있는 하나 이상의 에피토프를 포함하는 NY-ESO-1의 임의의 단편일 수 있다. 본 명세서의 문맥에서의 전장 NY-ESO-1 단백질은 약 또는 대략 1 내지 180개의 아미노산을 갖고, 천연 발생 단백질(서열 목록 번호:49)과 95, 96, 97, 98, 99% 이상 또는 100% 동일성을 갖는 단백질을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "LAGE-1"은 하나 이상의 LAGE-1 패밀리 일원, 예를 들어 하기 행에 기재되는 LAGE-1a 및 LAGE 1b를 의미한다. "전장 LAGE-1a" 단백질은 서열 목록 번호:58과 95, 96, 97, 98, 99% 또는 100% 동일한 단백질을 의미한다. 유사하게, "전장 LAGE-1b" 단백질은 천연 발생 단백질(서열 목록 번호:71)과 95, 96, 97, 98, 99% 또는 100% 동일한 단백질을 의미한다.

한 구체예에서, 상기 동일성은 서열 전장에 걸쳐 존재한다. 따라서, 본 발명은 또한 보존성 치환을 갖는 상기 융합 단백질까지 확대된다. 보존성 치환은 널리 공지되어 있으며, 일반적으로 서열 정렬 컴퓨터 프로그램에서 디폴트 스코어링 매트릭스(default scoring matrices)로 설정된다. 이러한 프로그램은 하기의 것을 포함한다: PAM250 (Dayhoft M.O. et al., (1978), "A model of evolutionary changes in proteins", "Atlas of Protein sequence and structure" 5(3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington, 및 Blosum 62 (Steven Henikoft and Jorja G. Henikoft (1992), and "Amino acid substitution matricies from protein blocks"), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919.

일반적인 용어에서, 하기 그룹 내의 치환이 보존성 치환이나, 그룹 사이의 치환은 비보존성으로 간주된다. 그룹은 다음과 같다:

ⅰ) 아스파테이트/아스파라긴/글루타메이트/글루타민,

ⅱ) 세린/트레오닌,

ⅲ) 리신/아르기닌,

ⅳ) 페닐알라닌/티로신/트립토판,

ⅴ) 루신/이소루신/발린/메티오닌,

ⅵ) 글리신/알라닌.

본 명세서의 문맥에서 "부분적으로 트렁케이션된"은 콜라겐 유사 영역 대부분이 영역 제거되었으나, 상기 영역에서 발견되는 에피토프 A31을 여전히 포함하거나 이로 구성되는, NY-ESO-1 또는 LAGE-1 단백질(적절한 경우)을 의미한다.

한 구체예에서, 부분적으로 트렁케이션된 NY-ESO-1 및/또는 LAGE-1은 아미노산 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 또는 52로부터 아미노산 175, 176, 177, 178, 179 또는 180까지의 아미노산, 또는 이러한 아미노산의 임의의 조합, 예를 들어, 아미노산 48로부터 아미노산 180 또는 아미노산 46으로부터 아미노산 178까지의 아미노산의 범위를 포함하거나 이로 구성된다. 한 구체예에서, 부분적으로 트렁케이션된 NY-ESO-1 또는 LAGE-1은 약 또는 정확히 아미노산 48 내지 180(또는 LAGE-1b의 경우 약 또는 정확히 아미노산 48 내지 210)을 포함하거나 이로 구성된다. 한 구체예에서, 상기 문맥 내의 용어 "약"은 상기 서열의 아미노산의 전체 수의 +/- 10% 이하의 아미노산이 상기 서열에 임의로 추가되거나 이로부터 결실되는 것을 의미한다. 한 구체예에서, 부분적으로 트렁케이션된 NY-ESO-1은 NY-ESO-1의 아미노산 48 내지 180을 포함하거나 이로 구성된다.

한 구체예에서, 부분적으로 트렁케이션된 LAGE-1b는 아미노산 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 또는 52로부터 아미노산 205, 206, 207, 208, 209 또는 210까지의 아미노산, 또는 이러한 아미노산의 임의의 조합, 예를 들어, 아미노산 48로부터 아미노산 210 또는 아미노산 46으로부터 아미노산 208까지의 아미노산의 범위를 포함하거나 이로 구성된다. 한 구체예에서, 부분적으로 트렁케이션된 LAGE-1b는 약 또는 정확히 아미노산 48 내지 210을 포함하거나 이로 구성된다. 한 구체예에서, 상기 문맥 내의 용어 "약"은 상기 서열의 아미노산의 전체 수의 +/- 10% 이하의 아미노산이 상기 서열에 임의로 추가되거나 이로부터 결실되는 것을 의미한다. 한 구체예에서, 부분적으로 트렁케이션된 LAGE-1b는 LAGE-1b의 아미노산 48 내지 210을 포함하거나 이로 구성된다.

본 명세서 내의 문맥에서 "트렁케이션된"은 콜라겐 유사 영역이 제거(A31 에피토프의 제거를 포함함)된 NY-ESO-1 또는 LAGE-1 단백질(적절한 경우)을 의미한다. 한 구체예에서, 트렁케이션된 NY-ESO-1 및/또는 LAGE 1은 약 또는 정확히 아미노산 71 내지 180(또는 LAGE-1b의 경우 약 또는 정확히 아미노산 71 내지 210)을 포함하거나 이로 구성된다.

한 구체예에서, 트렁케이션된 NY-ESO-1 또는 LAGE-1은 아미노산 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 또는 75로부터 아미노산 175, 176, 177, 178, 179 또는 180까지의 아미노산, 또는 이러한 아미노산의 임의의 조합, 예를 들어, 아미노산 71로부터 아미노산 180 또는 아미노산 69로부터 아미노산 178까지의 아미노산의 범위를 포함하거나 이로 구성된다. 한 구체예에서, 트렁케이션된 NY-ESO-1 또는 LAGE-1은 약 또는 정확히 아미노산 71 내지 180(또는 LAGE-1b의 경우 약 또는 정확히 아미노산 71 내지 210)을 포함하거나 이로 구성된다.

한 구체예에서, 상기 문맥 내의 용어 "약"은 상기 서열의 아미노산의 전체 수의 +/- 10% 이하의 아미노산이 상기 서열에 임의로 추가되거나 이로부터 결실되는 것을 의미한다. 한 구체예에서, 트렁케이션된 NY-ESO-1 또는 LAGE-1은 NY-ESO-1 또는 LAGE-1의 아미노산 71 내지 180을 포함하거나 이로 구성된다.

한 구체예에서, 트렁케이션된 LAGE-1b는 아미노산 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 또는 75로부터 아미노산 205, 206, 207, 208, 209 또는 210까지의 아미노산, 또는 이러한 아미노산의 임의의 조합, 예를 들어, 아미노산 71로부터 아미노산 210 또는 아미노산 69로부터 아미노산 208까지의 아미노산의 범위를 포함하거나 이로 구성된다. 한 구체예에서, 트렁케이션된 LAGE-1b는 약 또는 정확히 아미노산 71 내지 210을 포함하거나 이로 구성된다. 한 구체예에서, 상기 문맥 내의 용어 "약"은 상기 서열의 아미노산의 전체 수의 +/- 10% 이하의 아미노산이 상기 서열에 임의로 추가되거나 이로부터 결실되는 것을 의미한다. 한 구체예에서, 트렁케이션된 LAGE-1b는 LAGE-1b의 아미노산 71 내지 210을 포함하거나 이로 구성된다.

"기타 단편"은 본 발명의 융합 단백질에 통합되는 경우 본 발명의 융합 단백질의 요망되는 특성 및 이점을 갖는 최종 단백질을 발생시키는 단편을 의미한다.

NY-ESO-1. 전술된 바에 따르면, 종양 거부 항원 NY-ESO-1으로부터 유래된 항원을 포함하는 변형된 항원이 제공되며, 여기서 콜라겐 영역은 부분적으로 트렁케이션되거나 완전히 트렁케이션된다. 몇몇 구체예에서, 콜라겐 영역 이상이 제거된다. 몇몇 구체예에서, 변형된 항원은 유전학적으로 변형된다. 몇몇 구체예에서, 변형된 항원은 재조합 항원이다. 몇몇 구체예에서, 전술된 문장에서 기재된 바와 같은 항원을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 몇몇 구체예에서, 예시적 폴리펩티드는 이종성 단백질, 예를 들어 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 타입 B로부터의 단백질 D 또는 이의 단편을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 전술된 폴리펩티드를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 작제물이 제공된다.

몇몇 구체예에서, NY-ESO-1 또는 이의 단편을 포함하는 면역원성 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 NY-ESO-1은 콜라겐 유사 영역을 포함하지 않는다. 다른 것들 중에서, NY-ESO-1은 부분적으로 트렁케이션되거나 트렁케이션되거나, 하나 이상의 에피토프를 포함하는 NY-ESO-1의 임의의 단편을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 이러한 폴리펩티드는 보존성 치환을 갖는다. 몇몇 구체예에서, 이러한 폴리펩티드 및 작제물은 암 재발의 예방 또는 실질적 개선을 위한 예방법으로 유용하다.

따라서, 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 아미노산이 콜라겐 영역으로부터 제거된다. 더욱 구체적으로, 몇몇 구체예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 또는 73개의 아미노산이 콜라겐 영역을 포함하는 부분, 즉 서열 목록 번호:49의 대략 아미노산 1-73으로부터 제거된다. 아미노산은 콜라겐 영역 내의 인접한 위치, 또는 인접하지 않은 위치로부터 제거될 수 있다. 다시 말하면, 몇몇 구체예에서, 아미노산이 서열 목록 번호:49의 부분 내의 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 또는 73중 임의의 위치, 또는 이의 임의의 조합으로부터 제거된다. 당업자는 몇몇 구체예에서 아미노산 서열의 부분이 보존되어 이러한 부분 내의 특정 에피토프가 생성된 폴리펩티드 내에 보유되는 것을 이해한다.

몇몇 구체예에서, NY-ESO-1의 중심 영역 또는 C-말단 영역의 단편이 이용된다. 따라서, 몇몇 구체예에서, 폴리펩티드는 서열 목록 번호:49에 나열된 아미노산 서열의 하나 이상의 단편, 즉 아미노산 위치 74-75, 76-80, 81-85, 86-90, 91-95, 96-100, 101-105, 106-110, 111-115, 116-120, 121-125, 126-130, 131-135, 136-140, 141-145, 146-150, 151-155, 156-160, 161-165, 166-170, 171-175, 176-180, 또는 이의 임의의 조합 중 하나 이상을 함유하는 단편을 포함할 수 있다. 당업자는 몇몇 구체예에서 아미노산 서열이 보존되어 특정 에피토프가 생성된 폴리펩티드 내에 보유되는 것을 이해한다.

LAGE-1. 몇몇 구체예에서, 종양 거부 항원 LAGE-1으로부터 유래된 항원을 포함하는 변형된 항원이 제공되며, 여기서 콜라겐 영역은 부분적으로 트렁케이션되거나 완전히 트렁케이션된다. 몇몇 구체예에서, 콜라겐 영역 이상이 제거된다. 몇몇 구체예에서, 변형된 항원은 유전학적으로 변형된다. 몇몇 구체예에서, 변형된 항원은 재조합 항원이다. 몇몇 구체예에서, 전술된 문장에 기재된 바와 같은 항원을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 몇몇 구체예에서, 항원은 종양 거부 항원 LAGE-1a로부터 유래된다. 몇몇 구체예에서, 항원은 종양 거부 항원 LAGE-1b로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 예시적 융합 단백질은 이종성 단백질, 예를 들어 헤모필루스 인플루엔자 타입 B로부터의 단백질 D 또는 이의 단편을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 전술된 폴리펩티드를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 작제물이 제공된다.

몇몇 구체예에서, LAGE-1 또는 이의 단편을 포함하는 면역원성 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 LAGE-1은 콜라겐 유사 영역을 포함하지 않는다. 다른 것들 중에서, LAGE-1은 부분적으로 트렁케이션되거나 트렁케이션되거나, 하나 이상의 에피토프를 포함하는 LAGE-1의 임의의 단편을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 폴리펩티드는 LAGE-1 폴리펩티드와 NY-ESO-1의 콜라겐 유사 영역의 하이브리드를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 폴리펩티드는 부분적으로 트렁케이션되거나 트렁케이션된 LAGE-1에 연결된 NY-ESO-1 콜라겐 영역의 일부 또는 전부를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 이러한 폴리펩티드는 보존성 치환을 갖는다. 몇몇 구체예에서, 이러한 폴리펩티드 및 작제물은 암 재발의 예방 또는 실질적 개선을 위한 예방법으로 유용하다.

따라서, 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 아미노산이 콜라겐 영역, 또는 N-말단 아미노산으로부터 제거된다. 더욱 구체적으로, 몇몇 구체예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 또는 73개의 아미노산이 콜라겐 영역 또는 N-말단 아미노산, 즉 서열 목록 번호:58(LAGE-1a) 또는 서열 목록 번호:71(LAGE-1b)의 대략 아미노산 1-73으로부터 제거된다. 아미노산은 상기 영역 내의 인접한 위치, 또는 인접하지 않은 위치로부터 제거될 수 있다. 다시 말하면, 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 아미노산이 서열 목록 번호:58(LAGE-1a) 또는 서열 목록 번호:71(LAGE-1b) 내의 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 또는 73 중 임의의 위치, 또는 이의 임의의 조합으로부터 제거된다. 당업자는 몇몇 구체예에서 아미노산 서열의 부분이 보존되어 이러한 부분 내의 특정 에피토프가 생성된 폴리펩티드 내에 보유되는 것을 이해한다.

몇몇 구체예에서, LAGE-1 중심 영역 또는 C-말단 영역의 단편이 이용된다. 따라서, 몇몇 구체예에서, 폴리펩티드는 서열 목록 번호:58(LAGE-1a) 또는 서열 목록 번호:71(LAGE-1b)에 나열된 아미노산 서열의 하나 이상의 단편, 즉 아미노산 위치 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81-85, 86-90, 91-95, 96-100, 101-105, 106-110, 111-115, 116-120, 121-125, 126-130, 131-135, 136-140, 141-145, 146-150, 151-155, 156-160, 161-165, 166-170, 171-175, 176-180, 또는 이의 임의의 조합 중 하나 이상을 함유하는 단편을 포함할 수 있다. 당업자는 몇몇 구체예에서 아미노산 서열이 보존되어 특정 에피토프가 생성된 폴리펩티드 내에 보유되는 것을 이해한다.

한 양태에서, 본 발명은 전장 NY-ESO-1을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.

한 양태에서, 본 발명은 부분적으로 트렁케이션된 NY-ESO-1을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.

한 양태에서, 본 발명은 트렁케이션된 NY-ESO-1을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.

한 양태에서, 본 발명은 전장 LAGE-1을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.

한 양태에서, 본 발명은 부분적으로 트렁케이션된 LAGE-1을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.

한 양태에서, 본 발명은 트렁케이션된 LAGE-1을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.

한 양태에서, 본 발명에서 사용되는 LAGE-1은 LAGE-1a이다.

한 양태에서, 본 발명에서 사용되는 LAGE-1은 LAGE-1b이다.

본 발명의 한 양태에서, NY-ESO-1의 N-말단은 LAGE-1의 C-말단에 융합된다.

본 발명의 한 양태에서, NY-ESO-1의 C-말단은 LAGE-1의 N-말단에 융합된다.

본 발명의 융합 단백질의 면역원성은 추가로 증가되고/되거나, 단백질의 생성 특성은 추가의 이종성 항원, 예를 들어, 그람 네거티브 박테리아 헤모필루스 인플루엔자 B의 표면 단백질인 단백질 D로부터의 단편의 통합에 의해 추가로 개선될 수 있다. 단백질 D로부터 유래된 면역학적 융합 파트너에 대한 추가의 정보는 WO 91/18926호로부터 수득될 수 있다.

본 발명의 융합 파트너에 포함시키기 위한 단백질은 화학적으로 컨쥬게이션될 수 있거나, 재조합 융합 단백질로 발현될 수 있다. 한 구체예에서, 융합 단백질은 재조합 융합 단백질로 발현된다.

추가의 이종성 융합 파트너는 T 조력(T helper) 에피토프(면역학적 융합 파트너)를 제공하는 것을 도울 수 있거나, 높은 수율(발현 인핸서)로 단백질을 발현시키는 것을 도울 수 있다. 한 구체예에서, 추가의 이종성 융합 파트너는 면역학적 융합 파트너 및 발현 인핸싱 파트너 둘 모두일 수 있다.

한 구체예에서, 단백질 D 또는 이의 유도체는 단백질의 약 또는 정확히 처음 1/3, 예를 들어, 단백질 D의 약 또는 정확히 아미노산 1 내지 109를 포함한다. 이러한 구체예에서, 천연 단백질 D 서열의 아미노산 2-Lys 및/또는 3-Thr은 아미노산 2-Asp 및/또는 3-Pro로 치환될 수 있다. 한 추가 구체예에서, 단백질 D 또는 이의 유도체는 단백질 D의 약 또는 정확히 아미노산 20 내지 127을 포함하거나 이로 구성된다. 한 구체예에서, 본 발명에 사용하기 위한 단백질 D는 단백질의 분비 서열을 포함하지 않는다. 일반적으로, 본 발명의 융합 단백질에서, 단백질 D 유도체는 지질화되지 않는다.

한 구체예에서, 단백질 D는, 예를 들어, 단백질 D 단편의 N-말단에 융합된 아미노산 Met, Asp 및 Pro를 추가로 포함한다(즉, 작제물은 "MDP - 20-127 단백질 D"를 포함하거나 이로 구성될 수 있다). 상기 3개의 추가 아미노산이 단백질의 안정성을 도울 수 있고/있거나 단백질 발현 수준을 증가시킬 수 있는 것으로 생각된다.

한 양태에서, 본 발명은 단백질 D의 N-말단 단편(즉, 1/3)(상기 기재된 바와 같음)이 본 발명의 융합 단백질 또는 이의 면역원성 단편의 N-말단에 융합된 융합 단백질을 제공한다. 더욱 구체적으로, 단백질 D 및 본 발명의 융합 단백질의 N-말단의 융합은 본 발명의 융합 단백질의 N-말단이 절제된 단백질 D의 C-말단 단편을 대체하도록 실시될 수 있다. 따라서, 단백질 D의 N-말단은 융합 단백질의 N-말단이 된다.

단백질 D 대신 또는 단백질 D에 더하여, 예를 들어 하기와 같은 다른 이종성 융합 파트너 또는 이의 단편이 본 발명의 융합 단백질에 포함될 수 있다:

·인플루엔자 바이러스로부터의 비-구조 단백질 NS1(헤마글루티닌). 통상적으로, N-말단의 81개의 아미노산이 사용될 수 있으나, 다양한 단편이 사용될 수 있으며, 단, 이들은 T 조력 에피토프를 포함한다;

·LytA 유전자, 예를 들어, 잔기 188-305와 같이 잔기 178에서 시작하는 C 말단에서 발견되는 LytA 분자의 반복 부분에 의해 코딩되는 N-아세틸-L-알라닌 아미다아제 LytA(Gene, 43 (1986) page 265-272)를 합성하는, 스트렙토코쿠스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae)로부터 유래된 LytA. 한 구체예에서, 이종성 융합 파트너는 CLytA이다. 한 추가 구체예에서, 이종성 융합 파트너는 WO03/104272호에 기재된 바와 같이 CLytA-P2-CLytA를 포함하는 융합 단백질인 CPC이다. 아미노 말단에 C-LytA 단편을 함유하는 하이브리드 단백질의 정제가 문헌[Biotechnology: 10, (1992) page 795-798]에 기재되어 있다.

본 발명의 융합 단백질은 친화성 태그, 예를 들어, 1 내지 10개, 예를 들어, 6 또는 10개의 히스티딘 잔기를 포함하는 히스티딘 꼬리(his-태그로도 공지되어 있음)를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 잔기는 말단 부분, 예를 들어, 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단 부분에 존재할 수 있다. 친화성 태그는 단백질의 정제를 추가로 개선시키기 위해 통합될 수 있다.

본 발명의 특정한 특이적 융합 단백질은, 예를 들어, 도에 기재된 바와 같이 작제될 수 있다. 도에 나열된 구체예 각각은 본 발명의 독립적 양태를 나타낸다. 본 발명에 따른 융합 단백질의 작제물의 추가예는 표 1-4 및 서열 목록에 제공되어 있다.

핵산. 본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질을 엔코딩하는 핵산 및 폴리핵산, 예를 들어, DNA까지 확대된다. 본 발명의 방법은, 예를 들어, 문헌[Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989]에 기재된 바와 같은 통상적인 재조합 기술에 의해 수행될 수 있다. 특히, 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:

ⅰ) 숙주 세포 내에서 융합 단백질 또는 이의 면역원성 유도체를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 DNA 중합체를 발현시킬 수 있는 복제성 벡터 또는 통합 발현 벡터를 제조하는 단계;

ⅱ) 상기 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;

ⅲ) 상기 DNA 중합체의 발현을 허용하는 조건하에서 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 상기 단백질을 생성시키는 단계; 및

ⅳ) 상기 단백질을 회수하는 단계.

용어 '형질전환시키는'은 외래 DNA의 숙주 세포로의 도입을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 이는, 예를 들어, 문헌[Genetic Engineering; Eds. S.M. Kingsman and A.J. Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, England, 1988]에 기재된 바와 같은 통상적인 기술을 이용하여 적절한 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 이용한 형질전환, 트랜스펙션 또는 감염에 의해 달성될 수 있다. 용어 '형질전환된' 또는 '형질전환주'는 이후 외래 관심 유전자를 함유하고 발현하는 생성된 숙주 세포에 적용될 것이다. 본 발명의 융합 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터는 신규하며, 또한 본 발명의 일부를 형성한다.

숙주 세포와 양립되는 벡터를 분해시켜 온전한 레플리콘을 갖는 선형 DNA 세그먼트를 생성시키고, 상기 선형 세그먼트를 요망되는 생성물을 엔코딩하는 상기 선형 세그먼트와 함께 하나 이상의 DNA 분자, 예를 들어 본 발명의 단백질을 엔코딩하는 DNA 중합체 또는 이의 유도체와 라이게이션 조건하에서 결합시킴으로써, 본 발명에 따라 복제성 발현 벡터가 제조될 수 있다. 따라서, DNA 중합체가 요망시 미리 형성될 수 있거나, 벡터의 작제 동안 형성될 수 있다.

벡터의 선택은 숙주 세포에 의해 부분적으로 결정될 것이고, 이는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있으나, 일반적으로 대장균(E. coli) 또는 CHO 세포이다. 적절한 벡터는 플라스미드, 예를 들어, TMCP14 또는 pET21 또는 pET26, pcDNA3, 박테리오파아지, 코스미드 및 재조합 바이러스를 포함한다. 발현이 바큘로바이러스, 효모 또는 CHO 숙주 세포에서 발생하는 한 구체예에서, pEE14, pPICZA, pPICZB, pPICZC, pDMT-DEST48 및 pAcSG2의 벡터 중 하나가 사용될 수 있다. 복제성 발현 벡터의 제조는, 예를 들어 상기 인용된 문헌[Maniatis et al.]에 기재된 방법에 의해 DNA의 제한, 중합반응 및 라이게이션에 적절한 효소로 통상적으로 수행될 수 있다.

재조합 숙주 세포는 형질전환 조건하에서 본 발명의 복제성 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시킴으로써 본 발명에 따라 제조된다. 적절한 형질전환 조건은 통상적이며, 예를 들어, 문헌[Maniatis et al. 상기 인용됨, 또는 "DNA Cloning" Vol. II, D.M. Glover ed., IRL Press Ltd, 1985]에 기재되어 있다. 형질전환 조건의 선택은 숙주 세포에 의해 결정된다. 따라서, 대장균과 같은 박테리아 숙주가 CaCl₂의 용액(Cohen et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 1973, 69, 2110) 또는 RbCl, MnCl₂, 아세트산 칼륨 및 글리세롤의 혼합물을 포함하는 용액으로 처리된 후, 3-[N-모르폴리노]-프로판-술폰산, RbCl 및 글리세롤로 처리될 수 있다. 배양물 내의 포유동물 세포는 벡터 DNA의 세포로의 칼슘 공동-침전에 의해 형질전환될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 복제성 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포까지 확대된다.

DNA는 관련 숙주의 발현을 추가로 촉진하기 위한 표준 기술에 의해 최적화된 코돈일 수 있다.

DNA 중합체의 발현을 허용하는 조건하에서 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 것은, 예를 들어, 상기 인용된 문헌[Maniatis et al. and "DNA Cloning"]에 기재된 바와 같이 통상적으로 수행된다. 따라서, 바람직하게는, 세포는 영양소가 공급되고, 50℃ 미만의 온도에서 배양된다. 본 발명의 단백질은 원핵생물 또는 진핵생물, 예를 들어, 효모에서 발현될 수 있으나, 종종 대장균에서 발현된다. 대장균의 특정 균주는 다음과 같다:

·AR58: gal E::Tn 10,Δ-8(chlD-pgl), Δ-H1(cro-chlA),N⁺, 및 cl857(참조: Proc.Natl.Acad.Sci.USA vol82,pp.88-92,January 1985 Biochemistry)인 N99로부터 유래된 잠복 λ 용해소원

·BLR(DE3) Novagen, WI, USA (catalogue number: 69053-4)(BLR은 BL21의 recA^- 유도체임)가 사용될 수 있다. 일반적으로, 카나마이신 내성 또는 앰피실린 내성과 같은 선택 마커가 재조합 유전자/작제물의 발현 시스템으로의 성공적인 통합의 확인을 촉진하기 위해 통합된다.

생성물은 숙주 세포 및 발현 생성물의 국소화에 따라 통상적인 방법에 의해 회수된다(세포내, 또는 배양 배지 또는 세포 원형질막 주위공간으로 분비됨). 따라서, 숙주 세포가 박테리아, 예를 들어, 대장균인 경우, 이는, 예를 들어, 물리적, 화학적 또는 효소적으로 용해될 수 있고, 단백질 생성물은 생성된 용해질로부터 분리된다. 숙주 세포가 포유동물인 경우, 생성물은 일반적으로 영양소 배지 또는 세포를 포함하지 않는 추출물로부터 분리될 수 있다. 통상적인 단백질 분리 기술은 선택 침전, 흡착 크로마토그래피, 및 모노클로날 항체 친화성 컬럼을 포함하는 친화성 크로마토그래피를 포함한다.

본 발명의 단백질은 액체 형태로 가용성인 형태로 또는 동결건조된 형태로 제공된다. 본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 백신과 같은 약제 조성물을 제공한다.

투여시, 본 발명의 치료 조성물은 약학적으로 허용되는 제제로 투여될 수 있다. 이러한 제제는 통상적으로 약학적으로 허용되는 농도의 염, 완충제, 보존제, 양립성 담체, 보충 면역 잠재화 작용제(supplementary immune potentiating agent), 예를 들어, 애쥬번트 및 사이토카인, 및 임의로 다른 치료제를 함유할 수 있다.

양은 물론 보건의의 지식 및 의견 내에서 치료되는 특정 질환, 질환의 중증도, 연령, 신체 상태, 크기 및 체중을 포함하는 개별적 환자의 파라미터, 치료 지속기간, 동반 치료(존재시)의 특성, 특정 투여 경로 등의 요인에 좌우될 것이다. 이러한 요인은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 이는 통상적인 실험 내에서 다루어질 수 있다. 일반적으로, 개별적 성분 또는 이의 조합물의 최대 용량, 즉 확실한 임상적 판단에 따른 안전한 가장 높은 용량이 사용되는 것이 바람직하다. 그러나, 환자는 임상적 이유, 심리학적 이유 또는 실질적으로 임의의 다른 이유로 보다 적은 용량 또는 내성 용량을 고수할 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 일반적으로, 각각의 인간 용량은 1 내지 1000㎍, 바람직하게는 30 내지 300㎍의 단백질을 포함할 것이 예상된다.

한 양태에서, 본 발명의 융합 단백질을 투여하기 위해 사용되는 약제 조성물은 백신일 것이다. 백신은 하나 이상의 다른 종양 관련 항원, 폴리펩티드 및/또는 펩티드, 예를 들어, MAGE, LAGE 및 GAGE 패밀리에 속하는 일원을 임의로 함유할 수 있다.

NY - ESO -1/ LAGE -1 및 MAGE 의 조합물 . 본 발명의 한 구체예에서, (a) 본원에 기재된 NY-ESO-1 또는 LAGE-1 항원을 포함하는 항원 성분 또는 융합 단백질, 및 (b) MAGE 항원을 포함하는 항원 성분 또는 융합 단백질을 포함하는 조성물이 제공된다. 한 구체예에서, 조성물은 본원에 기재된 애쥬번트를 추가로 포함할 수 있다.

조합물에 사용하기 위한 MAGE 항원은 전장 MAGE 항원을 포함할 수 있다. 대안적으로, MAGE 항원은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 이 이상의 아미노산이 아미노산 서열에서 결실되거나 치환될 수 있는 MAGE의 면역원성 부분을 포함할 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 2개의 아미노산이 MAGE 서열의 N-말단으로부터 결실될 수 있다. 항원이 MAGE-A3이거나 이의 면역원성 부분인 본 발명의 한 구체예에서, MAGE-A3의 서열은 MAGE-A3의 아미노산 3 내지 314일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, NY-ESO-1/LAGE-1 항원 및/또는 본원에 기재된 융합 단백질, 및 MAGE-A3 항원을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 조성물이 제공된다. 한 대안적 구체예에서, MAGE-A3 항원을 포함하는 융합 단백질은 MAGE-A3 항원, 및 단백질 D의 약 또는 대략 처음 109개의 아미노산을 포함하는 융합 파트너 단백질을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서 단백질 D로부터의 1개 또는 2개 또는 이 이상의 아미노산은 임의로 치환되고, 단백질 D의 신호 서열은 단백질 D의 처음 109개의 아미노산에 더하여 임의로 존재한다.

본 발명의 융합 단백질은 추가로 항원과 융합 파트너 또는 융합 파트너 단백질의 서열 사이, 또는 존재시 항원과 His 꼬리 사이에 "링커"로서 하나 이상의 아미노산을 임의로 포함할 수 있다. 아미노산은 항원 및/또는 융합 파트너의 서열과 관련이 없을 수 있다.

본원에 기재된 바와 같이 본 발명의 융합 단백질은 융합 단백질 서열의 N-말단에 아미노산 Met-Asp-Pro를 추가로 포함할 수 있다. Met 아미노산은 본래의 단백질 D 서열로부터 유래될 수 있거나, 관련되지 않은 서열로부터 유래될 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명의 조합물에 사용하기 위한 MAGE-A3 및 단백질 D를 포함하는 융합 단백질의 서열이 서열 목록 번호:98에 도시되어 있다. N-말단으로부터의 서열 목록 번호:98은 하기 특징을 포함한다:

아미노산 1-18 1-Met, 및 단백질 D의 천연 아미노산 2-Lys 및 3-Thr에 대한 2-Asp 및 3-Pro의 치환을 포함하는 단백질 D의 신호 서열

아미노산 19-127 단백질 D의 아미노산 20 내지 127 포함

아미노산 128-129 클로닝 부위를 발생시키기 위한 아미노산 128-129에서의 관련되지 않은 아미노산 Met-Asp

아미노산 130-441 MAGE3의 단편(MAGE3의 아미노산 3-314)

아미노산 442-443 관련되지 않은 아미노산 Gly-Gly

아미노산 444-451 7개의 his 꼬리.

본 발명은 또한 상기 백신/조성물을 제조하는 방법, 및 기재된 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 융합 단백질 및 백신/조성물까지 확대된다.

백신 제법은 일반적으로 문헌[Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds. Powell M.F. & Newman M.J). (1995) Plenum Press New York)]에 기재되어 있다. 리포솜 내의 피막형성이 미국 특허 제4,235,877호(Fullerton)에 기재되어 있다.

본 발명의 융합 단백질은 본 발명의 백신 제형에서 애쥬번팅될 수 있다. 적절한 애쥬번트는 알루미늄 염, 예를 들어, 수산화알루미늄 겔(명반) 또는 알루미늄포스페이트를 포함하나, 칼슘, 철 또는 아연의 염일 수도 있거나, 아실화된 티로신 또는 아실화된 당, 양이온 또는 음이온적으로 유도된 다당류 또는 폴리포스파젠의 불용성 현탁액일 수 있다. 기타 공지된 애쥬번트는 CpG 함유 올리고누클레오티드를 포함한다. 올리고누클레오티드는 CpG 디누클레오티드가 메틸화되지 않은 것을 특징으로 한다. 이러한 올리고누클레오티드는 널리 공지되어 있고, 예를 들어, WO 96/02555호에 기재되어 있다.

본 발명의 제형에서, 애쥬번트 조성물이 우선적으로 TH1 유형의 면역 반응을 유도하는 것이 요망될 수 있다. 한 구체예에서, 예를 들어 모노포스포릴 지질 A, 바람직하게는 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)와 알루미늄 염의 조합물을 포함하는 애쥬번트 시스템이 제공된다. CpG 올리고누클레오티드는 또한 TH1 반응을 유도할 수 있으며, 또한 포함될 수 있다.

한 구체예에서, 본원에 기재된 융합 단백질, 및 모노포스포릴 지질 A 및 사포닌 유도체의 조합물, 특히 WO 94/00153호에 기재된 QS21 및 3D-MPL의 조합물을 포함하는 애쥬번트 조성물, 또는 WO 96/33739호에 기재된 QS21이 콜레스테롤로 켄칭된 덜 반응성인 조성물을 포함하는 조성물이 제공된다. 사용될 수 있는 한 제형은, 예를 들어, 물 중 오일 에멀젼 중에 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 포함하며, 이는 WO 95/17210호에 기재되어 있다. 본 발명에 사용하기 위한 또 다른 애쥬번트 제형은, 예를 들어, 물 중 오일 에멀젼 중에 또는 리포솜 제형으로서 QS21, 3D-MPL 및 CpG 또는 이의 동등물을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질, 및 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 애쥬번트를 포함하는 백신이 제공된다. 본 발명은 또한 백신을 제조하는 방법, 및 본원에 기재된 융합 단백질을 포함하는 조성물까지 확대된다.

본 발명은 또한 예방접종을 위한 본원에 기재된 바와 같은 핵산, 폴리펩티드 또는 펩티드의 전달을 고려한다. 폴리펩티드 및 펩티드의 전달은 당 분야에 널리 공지된 표준 예방접종 프로토콜에 따라 달성될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 핵산의 전달은 생체외 방법, 즉 피검체로부터 세포를 분리시키고, 암 관련 항원을 포함하도록 세포를 유전 공학처리하고, 공학처리된 세포를 피검체에 재도입시킴으로써 달성될 수 있다. 일반적으로, 이는 피검체의 세포(들)로의 기능적 카피의 유전자의 시험관내 도입, 및 유전 공학처리된 세포(들)의 피검체로의 복귀를 포함할 수 있다. 기능적 카피의 유전자는 유전 공학처리된 세포(들)에서 유전자의 발현을 허용하는 조절 성분의 작동가능한 조절하에 존재한다. 다양한 트랜스펙션 및 형질도입 기술, 뿐만 아니라 적절한 발현 벡터가 당업자에게 널리 공지되어 있고, 이중 일부가 PCT 출원 WO 95/00654호에 기재되어 있다. 바이러스 및 표적화된 리포솜과 같은 벡터를 이용하는 생체내 핵산 전달이 또한 본 발명에 따라 고려된다.

약어

CO 콜라겐 유사 영역

W/Ocoll 콜라겐 유사 영역(콜라겐 유사 도메인)을 갖지 않음

PD1/3 단백질 D 처음 1/3

융합 단백질 및 이를 엔코딩하는 누클레오티드 서열의 예시적 구체예가 표 1-3에 제공된다.

표 1. 융합 단백질 및 이를 엔코딩하는 누클레오티드 서열의 구체예가 제공된다. 각각의 누클레오티드 서열은 내용(subject matter)에 의해 기재되고, 독특한 누클레오티드 서열 인식자(서열 목록 번호:)에 의해 확인되고, 서열 목록에 나열되어 있다. 각각의 융합 단백질은 내용에 의해 기재되고, 독특한 아미노산 서열 인식자(서열 목록 번호:)에 의해 확인되고, 서열 목록에 나열되어 있다.

표 2. 융합 단백질 및 이를 엔코딩하는 누클레오티드 서열의 추가의 예시적 구체예가 제공된다. 각각의 누클레오티드 서열은 내용에 의해 기재되고, 독특한 누클레오티드 서열 인식자(서열 목록 번호:)에 의해 확인되고, 서열 목록에 나열되어 있다. 각각의 융합 단백질은 내용에 의해 기재되고, 독특한 아미노산 서열 인식자(서열 목록 번호:)에 의해 확인되고, 서열 목록에 나열되어 있다.

표 3. 융합 단백질 및 이를 엔코딩하는 누클레오티드 서열의 추가의 예시적 구체예가 제공된다. 각각의 누클레오티드 서열은 내용에 의해 기재되고, 독특한 누클레오티드 서열 인식자(서열 목록 번호:)에 의해 확인되고, 서열 목록에 나열되어 있다. 각각의 융합 단백질은 내용에 의해 기재되고, 독특한 아미노산 서열 인식자(서열 목록 번호:)에 의해 확인되고, 서열 목록에 나열되어 있다.

표 4. 실시예에 논의된 융합 단백질 및 이를 엔코딩하는 누클레오티드 서열이 제공된다. 각각의 누클레오티드 서열은 내용에 의해 기재되고, 독특한 누클레오티드 서열 인식자(서열 목록 번호:)에 의해 확인되고, 서열 목록에 나열되어 있다. 각각의 융합 단백질은 내용에 의해 기재되고, 독특한 아미노산 서열 인식자(서열 목록 번호:)에 의해 확인되고, 서열 목록에 나열되어 있다.

서열 목록으로부터 명백해지는 바와 같이, 표 4의 다수의 작제물은 전술된 표에 나열된 하나 이상의 구체예에 대해 유사한 디자인을 갖는다. 예를 들어, LVL068은 표 1에서 서열 목록 번호:45로 나열된 구체예와 동일한 디자인을 공유한다. LVL076은 표 1에서 서열 목록 번호:25로 나열된 구체예와 동일한 디자인을 공유한다. LVL078은 표 1에서 서열 목록 번호:33으로 나열된 구체얘와 동일한 디자인을 공유한다. LVL079는 표 1에서 서열 목록 번호:37로 나열된 구체예와 동일한 디자인을 공유한다.

또한, 표 4에 나열된 여러 융합 단백질 작제물, 즉 LVL155, LVL106, LVL156, LVL157, LVL151이 표 4에 나열된 다른 융합 단백질 서열, 즉 LVL068, LVL030, LVL076, LVL078, LVL024 각각의 통상적인 변형에 의해 생성되었다. 이러한 변형은 단백질 D와 키머(chimer)의 시작부(즉, NY-ESO-1 및 LAGE-1으로부터 유래된 부분) 사이의 아미노산 잔기의 제거, 및 his-태그와 키머의 시작부 사이의 아미노산의 제거를 포함한다. 따라서, 표 4의 특정 융합 단백질은 표 4의 다른 융합 단백질과 밀접하게 대응된다. 이러한 융합 단백질 사이의 대응은 표 5에 나열되어 있으며, 실시예 4에 더욱 상세하게 기술되어 있다.

표 5. LVL068, LVL030, LVL076, LVL078, LVL024와 변형된 LVL155, LVL106, LVL156, LVL157, LVL151 사이의 대응.

실시예 1. NY - LA1 키메라 단백질 디자인 및 생성

도 17에 요약된 바와 같이, 콜라겐 유사 도메인을 갖거나 갖지 않고, 단백질 D의 말단을 갖거나 갖지 않는 여러 NY-ESO-1/LAGE-1 융합 단백질을 디자인하였다. 디자인된 작제물은 대장균에서의 발현에 최적화된 코돈이었다. 합성 유전자를 올리고누클레오티드 및/또는 PCR 생성물로부터 어셈블리시켰다. 단편을 최적화된 유전자의 5' 말단 및 3' 말단에 NdeⅠ 및 XhoⅠ 부위 각각의 추가와 함께 KpnⅠ 및 SacⅠ 제한 부위를 이용하여 pGA4 백본(AmpR)으로 클로닝시켰다.

플라스미드 DNA를 형질전환된 박테리아로부터 정제하고, UV 분광법에 의해 농도를 결정하였다. 최종 작제물을 서열분석에 의해 확인하였다. 다양한 NY/LAGE 키메라 작제물에 대한 최적화된 코딩 서열을 NdeⅠ 및 XhoⅠ 제한 부위를 이용하여 pET19 (AmpR) 다중 클로닝 부위로 직접 서브클로닝시켜, NY/LAGE 키머 발현 플라스미드를 수득하였다. pET26으로의 클로닝을 위해, N-말단 히스티딘 꼬리를 첨가하기 위한 PCR 프라이머를 디자인하였다. 이러한 증폭은 다양한 작제물의 코딩 영역을 갖는 상에 6개의 히스티딘 꼬리를 첨가시켰다. 이러한 증폭된 단편을 NdeⅠ/XhoⅠ 제한 효소로 효소적으로 절단하고, 다양한 NY/LAGE 키메라 작제물을 이후 pET26(KanR) 다중 클로닝 부위에 클로닝시켜, 발현 플라스미드를 수득하였다. 최종 작제물을 서열분석에 의해 확인하였다.

진탕-플라스크 생성. 박테리아 숙주 균주의 성장 및 유도

배양

박테리아를 2.5L 진탕 플라스크에서 800 ml의 루리아-베르타니(Luria-Bertani)(LB) 브로쓰(BD) + 1%(w/v) 글루코오스(Laboratoire MAT, catalogue number: GR-0101) + 항생제(pET19에 대해 카르베니실린 100 ㎍/ml, pET26에 대해 카나마이신 40 ㎍/ml)에서 성장시켰다. 배양물을 O.D._{600 nm}가 약 0.8에 도달할때까지 BLR(DE3) 세포에 대해 37℃에서 인큐베이션시켰다.

유도

약 0.8의 O.D._{600 nm}에서, 배양물 BLR(DE3)을 1 mM의 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG; EMD Chemicals Inc., catalogue number: 5815)에서 유도시키고, 16℃에서 16-18시간 동안 인큐베이션시켰다. 5 내지 15 mg의 특정 단백질/800ml를 작제물 LVL106, 151, 155 및 157로 수득하였다. 각각의 작제물에 대한 단백질 생성은 도 17에 요약되어 있다.

실시예 2. 예비 정제 및 안정성의 요약

단백질의 추출 및 정제

세포를 원심분리에 의해 수거한 후, 물리적 또는 화학적 수단으로 파열시키고, 생성된 미정제 추출물을 관심 폴리펩티드를 분리시키기 위해 유지시켰다.

정제

발현된 재조합 단백질을 구아니딘 히드로클로라이드 용액에 용해시키고, 고정 금속 친화성 크로마토그래피(Immobilized Metal Affinity Chromatography)(IMAC) 수지 상에 로딩시켰다. 이후, 단백질을 컬럼 상에서 8M 및 4M 우레아 용액으로 세척하고, 이미다졸 농도를 증가시켜 용리시켰다. 이후, 단백질을 추가 사용을 위해 최종 4M 우레아 완충용액(pH 7.0)에서 탈염시켰다. SDS PAGE 및 웨스턴 블롯(Western Blot)에 의해 정제를 평가하여, 단백질의 정제 및 동일성을 확인하였다.

정제된 융합 단백질의 안정성 시험

안정성 분석을 37℃에서 수행하고, 단백질을 SDS-PAGE에 의해 평가하였다. 예비 안정성 분석은 주요 문제점을 나타내지 않았다.

예비 용해화 분석

단백질의 용해성을 하기 도표에 요약된 바와 같이 평가하였다.

도표 1. 융합 단백질 용해도. 약어: P-침전; S-침전 없음; NT-시험되지 않음.

실시예 3: 융합 단백질을 이용한 IM 면역화

융합 단백질을 하기 기재되는 바와 같이 일련의 근내 면역화 스크리닝 실험을 포함하여, 마우스 모델에서 전임상적으로 평가하였다. 선택된 마우스 모델은 C57BL6 마우스 및 Balb/c 마우스의 교배로부터 발생한 첫번째 세대인 CB6F1이었다. 이러한 마우스는 찰스 리버 래버러토리스, 인크사(Charles River Laboratories, Inc.)(251 Ballardvale Street, Wilmington, MA 01887-1000)에서 시판된다. 선택된 종양 세포주는 암 요법의 연구를 위한 시판되는 이식가능한 뮤린 흑색종인 B16(마우스 흑색종 세포주)이었다.

스크리닝 #1

실험 디자인. 76일의 실험에서, LVL076, LVL079, LVL078, LVL068, LVL020, LVL026, LVL024, LVL030의 각각을 평가하기 위해 CB6F1 마우스를 사용하여, 융합 단백질 + 애쥬번트를 이용한 근내 면역화가 이식 종양 세포(B16/NYESO1)를 이용한 피하 공격에 보호를 제공하는지의 여부를 결정하였다. 구체적으로, 마우스를 15㎍의 단백질 및 애쥬번트를 포함하는 50㎕의 주사액으로 근내 면역화시켰다. 선택된 애쥬번트는 AS15였다. AS15는 QS21, 3D-MPL 및 CpG를 포함하는 리포솜 애쥬번트 제형이다.

하기 1A 및 1B에 나열된 융합 단백질을 이용하여 실험을 수행하였다. 마우스를 그룹당 15마리의 마우스의 그룹으로 나누었다. 마우스를 하기와 같이 0일에 면역화시키고, 14일에 다시 면역화시켰다:

실험 1A

·LVL079

·LVL026

·LVL068

·LVL030

실험 1B

·LVL076

·LVL020

·LVL078

·LVL024

대조군

·항원 완충용액/AS15 완충용액

·전장 NY-ESO-1

·콜라겐 유사 도메인(CLD)을 갖지 않는 LAGE-1a

·MAGE A3

그룹당 6마리의 마우스를 28일에 피하 이식되는 B16/NY-ESO-1 종양으로 공격하였다. 전장 NY-ESO-1, 콜라겐 유사 도메인을 갖지 않는 LAGE-1a, 및 인간 콜라겐에 대한 항체 반응을 ELISA(IgG1 및 IgG2a)에 의해 0, 14, 28 및 76일에 평가하였다. 세포 매개 반응을 수거된 비장세포를 이용하여 28일에 FACS에 의해 평가하였다(NY-ESO-1 및 LAGE-1a 펩티드 풀(pool)을 이용한 재자극(3개의 3풀)). 스크리닝 #1의 실험 디자인은 도 18에 요약되어 있다.

결과. 4개의 대조군 중, 오직 전장 NY-ESO-1이 완충용액에 비해 약간의 보 호를 제공하였다. 도 19를 참조하라. 전장 NY-ESO-1 또는 LVL030를 투여 받은 마우스 중, 각각의 그룹으로부터 2마리가 실험 종반에 종양을 갖지 않았다. LVL068을 투여 받은 마우스 중, 4마리가 연구 종반에 종양을 갖지 않았다. LVL068 및 LVL078은 완충용액을 투여 받은 마우스에 비해 긴 생존을 제공하였다. 도 20을 참조하라. NY-ESO-1 특이적 면역 반응을 ELISA, FACS 및 웨스턴 블롯으로 평가하였다. LAGE-1a(콜라겐 유사 도메인을 갖지 않음) 특이적 면역 반응을 ELISA 및 FACS로 평가하였다. 도 21을 참조하라. 이러한 결과는 하기 도표에 요약되어 있다.

도표 2. 특이적 면역성 요약. 약어: (-)-가장 낮은 반응; (+)-중간 반응; (++)-가장 높은 반응.

스크리닝 #2

실험 디자인. 105일의 실험에서, LVL076, LVL078, LVL068 및 LVL024의 각각을 평가하기 위해 CB6F1 마우스를 사용하여, 융합 단백질 + 애쥬번트를 이용한 근내 면역화가 B16/NYESO1 이식 종양 세포(2회의 면역화 후) 또는 B16/LAGE-1a 종양 세포(4회의 면역화 후)를 이용한 피하 공격에 보호를 제공하는지의 여부를 결정하였다. 구체적으로, 마우스를 15㎍의 단백질 및 25㎕의 AS15 애쥬번트를 포함하는 50㎕의 주사액으로 근내 면역화시켰다.

마우스를 그룹당 29마리의 마우스의 그룹으로 나누었다. 마우스를 하기에 따라 0, 14, 28 및 42일에 면역화시켰다:

실험

·LVL076

·LVL068

·LVL078

·LVL024

대조군

·항원 완충용액/AS15 완충용액

·전장 NY-ESO-1

·콜라겐 유사 도메인(CLD)을 갖지 않는 LAGE-1a

·MAGE A3

그룹당 10마리의 마우스를 28일에 피하 이식되는 B16/NY-ESO-1 종양 세포로 공격하였다. 그룹당 9마리의 마우스를 56일에 피하 이식되는 B16/LAGE-1A 종양 세 포로 공격하였다. 혈청을 채취하고, (ⅰ) 전장 NY-ESO-1, (ⅱ) 콜라겐 유사 도메인 갖지 않는 LAGE-1a, 및 (ⅱ) 인간 콜라겐에 대한 항체 반응을 ELISA(IgG1 및 IgG2a)에 의해 0, 14, 28, 42, 56, 84 및 105일에 평가하였다. 스크리닝 #2의 실험 디자인은 도 22 및 23에 요약되어 있다.

결과

B16- NYESO1 종양 공격.

LVL078을 투여 받은 마우스 중, 2마리가 B16-NY-ESO-1 공격 후 50일에 걸쳐 종양을 갖지 않았다. 전장 NY-ESO-1 또는 LVL024를 투여 받은 마우스 중, 각각의 그룹으로부터 2마리가 50일에 걸쳐 종양을 갖지 않았고, 3마리가 생존하였다. LVL068을 투여 받은 마우스 중, 3마리가 종양을 갖지 않았고, 4마리가 생존하였다. LVL076을 투여 받은 마우스 중, 3마리가 종양을 갖지 않았고, 5마리가 생존하였다. 도 24를 참조하라.

B16- LAGE1a 종양 공격.

LVL076 또는 콜라겐 유사 영역을 갖지 않는 LAGE-1a를 투여 받은 모든 마우스는 공격 후 40일 이전에 사망하였다. 완충용액 단독을 투여 받은 마우스 중, 1마리가 연구 종반에 종양을 갖지 않고 생존하였다. LVL024를 투여 받은 마우스 중, 1마리가 연구 종반에 종양을 갖지 않았다. 전장 NY-ESO-1을 투여 받은 마우스 중, 종양을 갖지 않는 마우스는 없었으나, 1마리가 연구 종반까지 생존하였다. LVL078을 투여 받은 마우스 중, 1마리가 종양을 갖지 않았다. LVL068를 투여 받은 마우스 중, 3마리가 종양을 갖지 않았다. LVL076을 투여 받은 마우스 중, 3마리가 연구 종반에 종양을 갖지 않았다. 도 25를 참조하라. 이러한 결과는 하기 도표에 요약되어 있다.

도표 3. B16- LAGE1a 종양 공격에 대한 보호. 약어: (-)-가장 낮은 반응; (±)-다음으로 낮은 반응; (+)-중간 반응; (++)-가장 높은 반응.

인간 콜라겐-특이적 면역 반응

NY-ESO-1의 콜라겐 유사 도메인이 인간 콜라겐 특이적 면역 반응을 자극하는지의 여부를 연구하기 위해, (1) 완충용액(대조군); (2) 전장 NY-ESO-1; (3) 콜라겐 유사 도메인을 갖지 않는 LAGE-1a; (4) LVL068; (5) LVL078; (6) LVL024; (7) LVL076 중 하나로 면역화된 마우스로부터 접종 후 14일에 혈청을 수집하고 풀링(pooling)하였다. 상기 7개의 혈청 풀 각각, 뿐만 아니라 mAb 항-인간 콜라겐 Ⅰ을 함유하는 양성 대조군에 대해 ELISA를 수행하였다. 콜라겐 유사 도메인은 마우스 항-인간 콜라겐 Ⅰ 항체 생성을 자극하지 않았다. 도 26을 참조하라. 콜라겐 Ⅲ 및 콜라겐 Ⅵ에 대해 유사한 연구(결과는 나타내지 않음)를 수행하였고; 마우스 항-인간 콜라겐 Ⅲ 또는 마우스 항-인간 콜라겐 Ⅵ 항체 생성이 검출되지 않았다.

실시예 4: 정치한 작제물

표 4에 나열된 작제물의 일부에 대해 통상적인 클로닝 기술을 이용하여 변형을 수행하였다. 구체적으로, LVL068, LVL030, LVL076, LVL078, LVL024를 변형시켜, LVL155, LVL106, LVL156, LVL157, LVL151을 생성시켰다. 2종류의 변형이 있으며, 첫번째는 단백질 D와 키머의 시작부 사이의 5개의 아미노산 잔기의 제거이다. 예를 들어, 이러한 변형을 LVL024(서열 목록 번호:74; 서열 목록 번호:75)를 이용하여 수행하여, LVL151(서열 목록 번호:90; 서열 목록 번호:91)을 생성시켰다. 따라서, LVL024는 LVL151과 대응된다. 두번째 유형의 변형은 his-태그와 키머의 시작부 사이의 아미노산의 제거이다. 이러한 변형을 LVL068(서열 목록 번호:80; 서열 목록 번호:81)을 이용하여 수행하여, LVL155(서열 목록 번호:92; 서열 목록 번호:93)를 생성시켰다. 따라서, LVL068은 LVL151과 대응된다. 변형된 각각의 융합 단백질 작제물, 및 이와 대응되는 융합 단백질 작제물이 상세한 설명의 표 5에 나열되어 있다.

이해되는 바와 같이, 상기 기재된 변형은 융합 단백질과 이의 대응되는 변형 융합 단백질 사이의 기능적 차이를 발생시키지 않는 것이 예상된다. 따라서, 표 5의 우측에 나열된 각각의 변형된 융합 단백질을 도표의 좌측에 나열된 대응되는 융합 단백질과 상호교환적으로 이용할 수 있는 것이 예상된다.

실시예 5.

실험 디자인. 105일의 실험에서, LVL068, LVL030, LVL076, LVL078, LVL024, 및 변형된 LVL155, LVL106, LVL156, LVL157, LVL151의 각각을 평가하기 위해 CB6F1 마우스를 사용하여, B16/NYESO1 이식 종양 세포(2회의 면역화 후) 또는 B16/LAGE- 1a 종양 세포(4회의 면역화 후)를 이용한 피하 공격에 대해 융합 단백질 + 애쥬번트를 이용한 근내 면역화를 연구하였다. 구체적으로, 마우스를 15㎍의 단백질 및 25㎕의 AS15 애쥬번트를 포함하는 50㎕의 주사액으로 근내 면역화시켰다.

마우스를 그룹당 29마리의 마우스의 그룹으로 나누었다. 마우스를 하기에 따라 0, 14, 28 및 42일에 면역화시켰다:

실험

·LVL068

·LVL030

·LVL076

·LVL078

·LVL024

·LVL155

·LVL106

·LVL156

·LVL157

·LVL151

대조군

·항원 완충용액/AS15 완충용액

·전장 NY-ESO-1

·콜라겐 도메인을 갖지 않는 LAGE-1a

·MAGE A3

그룹당 10마리의 마우스를 28일에 피하 이식되는 B16/NY-ESO-1 종양 세포로 공격하였다. 그룹당 9마리의 마우스를 56일에 피하 이식되는 B16/LAGE-1A 종양 세포로 공격하였다. 특정 면역 반응을 모니터하기 위해, 0, 14, 28, 42, 56, 84 및 105일에 ELISA(IgG1 및 IgG2a)에 의해 (ⅰ) 전장 NY-ESO-1, (ⅱ) 콜라겐 유사 도메인을 갖지 않는 LAGE-1a, 및 (ⅱ) 인간 콜라겐에 대해 혈청을 채취하고, 항체 반을 측정할 수 있다.

전술된 실시예는 예시로 제공되었으며, 이로 제한하려는 것은 아니다.

본 출원에서, 단수 표현의 관사는 상기 관사의 문법적 대상의 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 예를 들어, "성분"은 하나 이상의 성분을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "대략" 및 "약"은 모든 예에서 요망시 출원인에 의해 임의로 삭제되거나, 용어 "정확히"로 대체된다.

단위, 접두사 및 기호는 이의 SI 승인된 형태로 표시될 수 있다. 달리 지시되지 않는 경우, 핵산은 5'에서 3' 방향으로 좌측에서 우측으로 기재되며; 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 좌측에서 우측으로 각각 기재된다. 숫자 범위는 상기 범위를 규정하는 수를 포함한다. 아미노산은 이의 통상적으로 공지된 3개 문자의 기호, 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명법 위원회에에 권고된 1개 문자의 기로로 본원에 언급될 수 있다. 마찬가지로, 누클레오티드는 이의 통상적으로 인정된 1개 문자의 코드로 언급될 수 있다. 상기 정의된 용어는 전체적으로 명세서를 참조로 하여 더욱 충분히 규정된다.

SEQUENCE LISTING <110> Denis Martin Remi Palmantier <120> Novel Fusion Protein <130> VB62288 <160> 98 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 867 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NY-ESO-1/LAGE construct <400> 1 atgcaggcgg aaggccgtgg caccggtggt agcaccggcg atgcggatgg tccgggcggt 60 ccgggtattc cggacgggcc tggtggtaat gcgggtgggc caggtgaagc gggtgcgacc 120 ggtggtcgtg gtccgcgggg ggcaggcgca gcacgtgcat ctggtccggg tggtggtgca 180 ccgcgcggtc cgcatggtgg tgcggcgagc ggcctgaatg gttgctgccg ttgcggtgcg 240 cgtggtccgg aaagccgtct gctggaattt tatctggcca tgccgtttgc gaccccgatg 300 gaagcggaac tggcccgtcg tagcctggct caagatgcac cgccgctgcc ggttccgggc 360 gtgctgctga aagaatttac cgtgagcggc aacattctga ccattcgtct gacggcggca 420 gaccatcgtc agctgcaact gagcattagc agctgcctgc aacagctgtc tctgctgatg 480 tggattaccc agtgctttct gccggtgttt ctggcccagc cgccgtctgg tcaacgtggt 540 ggcgcgcgtc gtccggattc tcgcctgctg gaactgcata ttaccatgcc gttcagctct 600 ccaatggagg ccgaattagt gcgtcgcatt ctgagccgtg atgcggcacc gctgccgcgt 660 ccaggtgcgg ttctgaaaga cttcaccgta tctggcaacc tgctgtttat ccgtctgacc 720 gcagcggacc accgccaatt acaattatct atcagctctt gtttacaaca actgtcgctg 780 ttaatgtgga tcactcaatg tttcctgcca gtattcctgg ctcaggcccc gagcggtcag 840 cgtcgtcacc accaccacca ccactaa 867 <210> 2 <211> 1197 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NY-ESO-1/LAGE constructs <400> 2 atggatccaa gcagccattc atcaaatatg gcgaataccc aaatgaaatc agacaaaatc 60 attattgctc accgtggtgc tagcggttat ttaccagagc atacgttaga atctaaagca 120 cttgcgtttg cacaacaggc tgattattta gagcaagatt tagcaatgac taaggatggt 180 cgtttagtgg ttattcacga tcacttttta gatggcttga ctgatgttgc gaaaaaattc 240 ccacatcgtc atcgtaaaga tggccgttac tatgtcatcg actttacctt aaaagaaatt 300 caaagtttag aaatgacaga aaactttgaa acccaggcgg aaggccgtgg caccggtggt 360 agcaccggcg atgcggatgg tccgggcggt ccgggtattc cggacgggcc tggtggtaat 420 gcgggtgggc caggtgaagc gggtgcgacc ggtggtcgtg gtccgcgggg ggcaggcgca 480 gcacgtgcat ctggtccggg tggtggtgca ccgcgcggtc cgcatggtgg tgcggcgagc 540 ggcctgaatg 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gtcgctgtta atgtggatca ctcaatgttt cctgccagta 600 ttcctggctc aggccccgag cggtcagcgt cgt 633 <210> 95 <211> 211 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 95 Met His His His His His His Gly Ala Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu 1 5 10 15 Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu 20 25 30 Leu Ala Arg Arg Ser Leu Ala Gln Asp Ala Pro Pro Leu Pro Val Pro 35 40 45 Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile 50 55 60 Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg Gln Leu Gln Leu Ser Ile Ser Ser 65 70 75 80 Cys Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu 85 90 95 Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser Gly Gln Arg Gly Gly Ala Arg 100 105 110 Arg Pro Asp Ser Arg Leu Leu Glu Leu His Ile Thr Met Pro Phe Ser 115 120 125 Ser Pro Met Glu Ala Glu Leu Val Arg Arg Ile Leu Ser Arg Asp Ala 130 135 140 Ala Pro Leu Pro Arg Pro Gly Ala Val Leu Lys Asp Phe Thr Val Ser 145 150 155 160 Gly Asn Leu Leu Phe Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg Gln Leu 165 170 175 Gln Leu Ser Ile Ser Ser Cys Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp 180 185 190 Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Ala Pro Ser Gly 195 200 205 Gln Arg Arg 210 <210> 96 <211> 864 <212> DNA <213> Homo Sapien <400> 96 atgcatcatc atcatcatca ccaggcggaa ggccgtggca ccggtggtag caccggcgat 60 gcggatggtc cgggcggtcc gggtattccg gacgggcctg gtggtaatgc gggtgggcca 120 ggtgaagcgg gtgcgaccgg tggtcgtggt ccgcgggggg caggcgcagc acgtgcatct 180 ggtccgggtg gtggtgcacc gcgcggtccg catggtggtg cggcgagcgg cctgaatggt 240 tgctgccgtt gcggtgcgcg tggtccggaa agccgtctgc tggaatttta tctggccatg 300 ccgtttgcga ccccgatgga agcggaactg gcccgtcgta gcctggctca agatgcaccg 360 ccgctgccgg ttccgggcgt gctgctgaaa gaatttaccg tgagcggcaa cattctgacc 420 attcgtctga cggcggcaga ccatcgtcag ctgcaactga gcattagcag ctgcctgcaa 480 cagctgtctc tgctgatgtg gattacccag tgctttctgc cggtgtttct ggcccagccg 540 ccgtctggtc aacgtggtgg cgcgcgtcgt ccggattctc gcctgctgga actgcatatt 600 accatgccgt tcagctctcc aatggaggcc gaattagtgc gtcgcattct gagccgtgat 660 gcggcaccgc tgccgcgtcc aggtgcggtt ctgaaagact tcaccgtatc tggcaacctg 720 ctgtttatcc gtctgaccgc agcggaccac cgccaattac aattatctat cagctcttgt 780 ttacaacaac tgtcgctgtt aatgtggatc actcaatgtt tcctgccagt attcctggct 840 caggccccga gcggtcagcg tcgt 864 <210> 97 <211> 288 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 97 Met His His His His His His Gln Ala Glu Gly Arg Gly Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ser Thr Gly Asp Ala Asp Gly Pro Gly Gly Pro Gly Ile Pro Asp Gly 20 25 30 Pro Gly Gly Asn Ala Gly Gly Pro Gly Glu Ala Gly Ala Thr Gly Gly 35 40 45 Arg Gly Pro Arg Gly Ala Gly Ala Ala Arg Ala Ser Gly Pro Gly Gly 50 55 60 Gly Ala Pro Arg Gly Pro His Gly Gly Ala Ala Ser Gly Leu Asn Gly 65 70 75 80 Cys Cys Arg Cys Gly Ala Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe 85 90 95 Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg 100 105 110 Arg Ser Leu Ala Gln Asp Ala Pro Pro Leu Pro Val Pro Gly Val Leu 115 120 125 Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr 130 135 140 Ala Ala Asp His Arg Gln Leu Gln Leu Ser Ile Ser Ser Cys Leu Gln 145 150 155 160 Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe 165 170 175 Leu Ala Gln Pro Pro Ser Gly Gln Arg Gly Gly Ala Arg Arg Pro Asp 180 185 190 Ser Arg Leu Leu Glu Leu His Ile Thr Met Pro Phe Ser Ser Pro Met 195 200 205 Glu Ala Glu Leu Val Arg Arg Ile Leu Ser Arg Asp Ala Ala Pro Leu 210 215 220 Pro Arg Pro Gly Ala Val Leu Lys Asp Phe Thr Val Ser Gly Asn Leu 225 230 235 240 Leu Phe Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg Gln Leu Gln Leu Ser 245 250 255 Ile Ser Ser Cys Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln 260 265 270 Cys Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Ala Pro Ser Gly Gln Arg Arg 275 280 285 <210> 98 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> Protein D-MAGE-A3-His <400> 98 Met Asp Pro Lys Thr Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Gly Val Leu 1 5 10 15 Ala Gly Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys 20 25 30 Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro 35 40 45 Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp 50 55 60 Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val 65 70 75 80 Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe 85 90 95 Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr 100 105 110 Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Met 115 120 125 Asp Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu Glu 130 135 140 Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala Thr 145 150 155 160 Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val Thr 165 170 175 Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln Ser Pro 180 185 190 Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu Trp Ser 195 200 205 Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro Ser Thr 210 215 220 Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg Lys Val 225 230 235 240 Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro 245 250 255 Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp Gln Tyr 260 265 270 Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln Leu Val 275 280 285 Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr Ile 290 295 300 Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp Asn 305 310 315 320 Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile Ile 325 330 335 Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu Leu 340 345 350 Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu Gly Asp 355 360 365 Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu 370 375 380 Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu Trp 385 390 395 400 Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His His 405 410 415 Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu His 420 425 430 Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu Gly Gly His His His His His 435 440 445 His His 450

Claims (29)

1. (b) LAGE-1 또는 이의 단편에 연결된, (a) NY-ESO-1 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질로서, NY-ESO-1 및/또는 LAGE-1 중 하나 이상이 트렁케이션(truncation)되거나 부분적으로 트렁케이션되거나 NY-ESO-1 또는 LAGE-1의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 단편인, 융합 단백질.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 NY-ESO-1이 전장 NY-ESO-1, 부분적으로 트렁케이션된 NY-ESO-1 또는 트렁케이션된 NY-ESO-1, 또는 NY-ESO-1의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 NY-ESO-1의 임의의 단편으로부터 선택된 융합 단백질.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 LAGE-1이 전장 LAGE-1, 부분적으로 트렁케이션된 LAGE-1 또는 트렁케이션된 LAGE-1, 또는 LAGE-1의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 LAGE-1의 임의의 단편으로부터 선택된 융합 단백질.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NY-ESO-1 또는 LAGE-1이 천연 발생 NY-ESO-1 또는 LAGE-1과 95, 96, 97, 98, 99% 이상 또는 100% 동일한 융합 단백질.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LAGE-1이 LAGE-1a인 융 합 단백질.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NY-ESO-1의 N-말단이 상기 LAGE-1의 C-말단에 융합된 융합 단백질.
7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NY-ESO-1의 C-말단이 상기 LAGE-1의 N-말단에 융합된 융합 단백질.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질이 이종성 융합 파트너를 추가로 포함하는 융합 단백질.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 이종성 융합 파트너가 단백질 D 또는 이의 유도체 또는 단편인 융합 단백질.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 단백질 D 유도체가 단백질 D의 처음 1/3, 예를 들어, 단백질 D의 아미노산 20 내지 127을 포함하는 융합 단백질.
11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 상기 단백질 D 유도체가 지질화되지 않은 융합 단백질.
12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 Met, Asp 및 Pro를 추가로 포함하는 융합 단백질.
13. 제 12 항에 있어서, 상기 아미노산 Met, Asp 및 Pro가 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 단백질 D 이종성 융합 파트너의 N-말단에 융합된 융합 단백질.
14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질이 재조합 융합 단백질인 융합 단백질.
15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질이 친화성 태그(tag)를 추가로 포함하는 융합 단백질.
16. 제 15 항에 있어서, 상기 친화성 태그가 1 내지 10의 히스티딘 잔기를 포함하는 히스티딘 꼬리인 융합 단백질.
17. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 목록 번호:3, 서열 목록 번호:4, 서열 목록 번호:7, 서열 목록 번호:8, 서열 목록 번호:11, 서열 목록 번호:12, 서열 목록 번호:15, 서열 목록 번호:16, 서열 목록 번호:19, 서열 목록 번호:20, 서열 목록 번호:23, 서열 목록 번호:24, 서열 목록 번호:26, 서열 목록 번호:28, 서열 목록 번호:30, 서열 목록 번호:32, 서열 목록 번호:34, 서열 목록 번호:36, 서열 목록 번호:38, 서열 목록 번호:40, 서열 목록 번호:42, 서열 목록 번호:44, 서열 목록 번호:46, 서열 목록 번호:48, 서열 목록 번호:51, 서열 목록 번호:53, 서열 목록 번호:55, 서열 목록 번호:57, 서열 목록 번호:60, 서열 목록 번호:62, 서열 목록 번호:64, 서열 목록 번호:66, 서열 목록 번호:68, 서열 목록 번호:70, 서열 목록 번호:73, 서열 목록 번호:75, 서열 목록 번호:77, 서열 목록 번호:79, 서열 목록 번호:81, 서열 목록 번호:83, 서열 목록 번호:85, 서열 목록 번호:87, 서열 목록 번호:89, 서열 목록 번호:91, 서열 목록 번호:93, 서열 목록 번호:95 및 서열 목록 번호:97로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
18. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 목록 번호:81, 서열 목록 번호:85, 서열 목록 번호:93 및 서열 목록 번호:97로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자.
20. 제 19 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
21. 제 20 항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
22. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 제 19 항에 따른 핵산 분자, 또는 제 20 항에 따른 벡터를 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신.
23. 제 22 항에 있어서, 애쥬번트, 및/또는 면역자극성 사이토카인 또는 케모카인을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
24. 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서, 상기 융합 단백질이 물 중 오일 또는 오일 에멀젼 비히클 중의 물로 제공되는 면역원성 조성물.
25. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 3D-MPL, QS21 또는 CpG 올리고누클레오티드의 애쥬번트 중 하나 이상을 포함하는 면역원성 조성물.
26. 제 22 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 다른 항원을 추가로 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신.
27. 제 22 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로 사용하기 위한 면역원성 조성물 또는 백신.
28. 암, 예를 들어, 유방 흑색종; 유방암; 전립선암; 이행세포암종을 포함하는 방광암; 비소세포 폐암종(NSCLC)을 포함하는 폐암; 식도암종을 포함하는 두경부암; 편평세포암종; 위장관의 암종; 간암; 뇌종양; 백혈병; 및 다양한 육종을 치료하기 위한 약제의 제조에서의, 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제 19 항의 핵산 분자 또는 제 20 항의 벡터 또는 제 22 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항의 조성물 또는 백신의 용도.
29. 제 28 항에 있어서, Her2/neu 표적 요법에 적합하지 않은 환자를 치료하기 위한 용도.

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