EA021100B1 - Усовершенствованное определение экспрессии генов - Google Patents

Abstract

В изобретении предложен олигонуклеотид, праймер или зонд, содержащий нуклеотидную последовательность, указанную в любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 или 63. Олигонуклеотид, праймер или зонд применим для определения статуса метилирования гена. Олигонуклеотиды могут быть использованы для диагностики или лечения рака.

Description

Настоящее изобретение относится к определению экспрессии генов СТЛС1В, СТЛС2, РКАМЕ и/или МадеА3. Более конкретно, изобретение относится к способам определения метилированных или неметилированных форм СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеАЗ и к соответствующим олигонуклеотидам, праймерам, зондам, парам праймеров и наборам. Способы согласно изобретению включают в себя способы амплификации, в частности, основанные на флуоресценции способы ПЦР в режиме реального времени и ПЦР с анализом в конечной точке, и имеют диагностическое, прогностическое и терапевтическое применение.

Описание предшествующего уровня техники настоящего изобретения

Раково-тестикулярные (РТ) антигены

Раково-тестикулярные (РТ) антигены представляют собой класс ассоциированных с опухолями антигенов, экспрессия которых в норме ограничена зародышевыми клетками в семенниках, яичниках или трофобластными клетками. Обычно такие антигены не экспрессируются в соматических тканях взрослого организма (Ытркоп е! а1., №! Кеу. Сапсег, 5(8): 615-625 (2005); §саи1аи е! а1., 1ттипо1. Ке\ге\У5. 188: 22-32 (2002); §саи1аи е! а1., Сапе. 1ттип., 4: 1-15 (2004)).

Регуляция генов РТ-антигенов нарушается у пациентов, страдающих раковыми заболеваниями, приводя к аномальной экспрессии указанных антигенов при целом ряде опухолей. Первый идентифицированный РТ-антиген, МАОЕ-1, был идентифицирован в начале 1990-х годов при клонировании Тклеточных эпитопов (уап бет Вгиддеп е! а1., 1991 §с1епсе 13; 254(5038): 1643-7; уап бет Вгиддеп е! а1., 1999 8с1епсе 254: 1643-1647; ТтауеткаН е! а1., 1992 1ттиподепе!ю8, 35(3): 145-152; и патент США № 5342774, включенные в настоящий документ посредством ссылки). После этого методика серологического анализа библиотеки экспрессирующих клонов (8ЕКЕХ) (§аЫп е! а1., Ргос. Ν;·ιΐ1. Асаб. δα. И8А, 92(25) 1181011813 (1995) и патент США № 5698396), анализ экспрессии рекомбинантного антигена на поверхности дрожжей (КАУ8) (МЕсНо е! а1., Сапе. 1ттип., 3: 5-16 (2003)) и анализ дифференциальной экспрессии мРНК (Оите е! а1., 1п!. 1. Сапе, 85(5): 726-732 (2000)) позволили идентифицировать дополнительные РТантигены. Иммуногенность некоторых РТ-антигенов у пациентов, страдающих раковыми заболеваниями, делает их идеальной мишенью для разработки противоопухолевых вакцин.

Идентификация ассоциированных с опухолями антигенов, узнаваемых клеточными или гуморальными эффекторами иммунной системы, открыли новые перспективы для иммунотерапии раковых заболеваний. Концепция иммунотерапии основана на предположении, что антигенные белки, экспрессируемые в опухолях, можно использовать в качестве мишеней в терапевтических подходах на основе аутологичной иммунной системы. Специфичная по отношению к антигену иммунотерапия раковых заболеваний (А8С1) обеспечивает возможность направленного лечения. А8С1 имеет два основных компонента: опухолевые антигены, чтобы направлять иммунный ответ специфично против злокачественной клетки, и адъювантные системы, которые включают в себя иммуностимулирующие соединения, выбранные для усиления противоопухолевого иммунного ответа.

СТАО1В. Раково-тестикулярным антигеном, представляющим в настоящее время интерес для применения в иммунотерапии раковых заболеваний, является раково-тестикулярный антиген 1В, кодируемый геном СТАО1В (также известным под названием гена ΝΥ-ΞδΟ-1). Указанный антиген вначале идентифицировали с использованием 8ЕКЕХ в плоскоклеточной карциноме пищевода в конце 90-х годов в Нью-Йоркском отделении Института Людвига по исследованию рака (СНеп е! а1., РNАδ И8А, 94(5): 1914-1918 (1997); и патент США № 5804381, включенные в настоящий документ посредством ссылки). Белок СТАО1В содержит 180 аминокислот и обнаружен в целом ряде опухолей, включая без ограничения рак яичника, рак легкого, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак пищевода, рак мочевого пузыря и меланомы (КошкЫ 1 е! а1. Опсо1. Кер. 2004 Мау; 11(5): 1063-7; №сйо1аои Т. е! а1., 1ттипо1. Се11 Вю1. 2006 1ип; 84(3): 303-17; §идйа Υ. е! а1. Сапсег Кек. 2004 Маг 15; 64(6): 2199-204; Уе1а/цне/ ЕР е! а1. Сапсег 1ттип. 2007 1и1 12; 7: 11 и 1ипдЫ1и!Ь е! а1. 2001, 1п!. 1. Сапе, 92(6): 856-860). Спонтанные гуморальные и клеточные иммунные ответы против такого антигена описаны у пациентов с СТАО1В-позитивными опухолями, и идентифицирован ряд ограниченных НЬА (антиген лейкоцитов человека) класса I и II пептидов (1адет е! а1., 1998 I. Ехр. Меб., 187(2): 265-270; ΥатадисЫ е! а1., 2004 С1ш. Сапе. Кек., 10(3): 890-961; и Нау1к е! а1., 2004 Ргос. N311. Асаб. δει. И8А, 101 (29): 10697-10702). Примерами патентной литературы являются патенты США № 6140050, 6251603, 6242052, 6274145, 6338947, 6417165, 6525177, 6605711, 6689742, 6723832, 6756044 и 6800730, включенные в настоящий документ посредством ссылки.

В клиническом испытании три частично перекрывающихся полученных из СТАО1В пептида с мотивами связывания с НЬА-А2 (157-167, 157-165 и 155-163) использовали в вакцине для лечения двенадцати пациентов с метастатическими экспрессирующими ΝΥ-ΞδΟ-1 опухолями. Это исследование показало, что синтетические пептиды ΝΥ-ΞδΟ-1 можно безопасно вводить и что они способны вызывать потенциально полезные Т-клеточные ответы (1адет е! а1., 2000 РNАδ И8А, 97(22): 12198-12203).

Разными группами в белке было идентифицировано несколько эпитопов МНС (главного комплекса гистосовместимости) класса I и II. Подобная коллагену область на Ν-конце содержит по меньшей мере

- 1 021100 один эпитоп МНС класса I, называемый А31. Центральная область содержит несколько эпитопов МНС класса 2, называемых ЭК1, ΌΡ2. ΌΡ4. ЭК7 и ΌΡ4. Эта область также содержит несколько эпитопов МНС класса I, называемых В35, В51, С\уЗ и Сет6. Считается, что С-конец содержит по меньшей мере два эпитопа класса II (ЭК4 и ΌΡ4) и один эпитоп класса I (А2).

СТАС2. Вследствие высокой степени сходства последовательности с СТАС1 следующим раковотестикулярным антигеном, представляющим возможный интерес для иммунотерапии, является СТАС2 (также известный как ген под названием ЬАСЕ-1). Описаны два транскрипта СТАО2, ЬАСЕ-!а и ЬАОЕШ ЬАОЕЧЪ не полностью сплайсируется и кодирует предполагаемый белок примерно из 210 аминокислотных остатков, тогда как генный продукт ЬАОЕЧа содержит 180 аминокислотных остатков (§ип е! а1. Сапсег Iттиηο1. НптипоОюг. 200б: 55: 644-652).

Ν-концевые области белков ЬАОЕ-1 и ΝΥ-Β80-1 высококонсервативны и, предположительно, имеют идентичность более 97%. Однако, ЬАОЕ-1 отличается от ΝΥ-Β80-1 в центральных областях, которые идентичны только на 62%. С-концы ΝΥ-Ρ50-1 и ЬАОЕЛа высококонсервативны (идентичность более 97%). Однако С-конец ЬАОЕЧЪ длиннее и, предположительно, имеет идентичность менее 50% с такой же областью в ЕАОЕЧа/ΝΥ -Е§0-1.

Общая информация, имеющая отношение к указанным двум белкам, доступна на веб-сайте ЫСК (см. ететет.сапсег1ттипйу.огд/СТба1аЪаке).

РКАМЕ. Антиген РКАМЕ, преимущественно экспрессируемый в меланоме, сначала выделили в виде гена, кодирующего антиген меланомы человека, узнаваемый реактивными по отношению к меланоме цитотоксическими Т-клетками (СТЬ). РКАМЕ не был определен как РТ-ген из-за следовых уровней его экспрессии в некоторых нормальных тканях взрослого организма, включая эндометрий и надпочечники. Однако, РКАМЕ проявляет другие основные свойства РТ-генов, т.е. высокую экспрессию в семенниках и усиленную регуляцию в различных опухолях, включая меланому (97%), саркому (80%), мелкоклеточный рак легкого (70%), почечно-клеточную карциному (40%) и рак головы и шеи (29%). В случае указанного гена наблюдали пять альтернативно сплайсируемых вариантов транскрипта, кодирующих один и тот же белок. Предполагаемый белок из 509 аминокислот имеет хорошо охарактеризованные эпитопы, презентируемые молекулами НЬА-А24 и НЬА-А2.

МадеАЗ. Гены МАОЕ относятся к семейству раково-тестикулярных антигенов. Семейство генов МАОЕ насчитывает более 20 представителей и включает в себя гены МАОЕ А, В, С и Ό (§сап1ап е! а1., (2002) Iттиηо1 Кеу. 188: 22-32; СНоте/ е! а1, (2001) Сапсег Кек. 61(14): 5544-51). Гены расположены в виде кластера в Х-хромосоме (Ьисак е! а1., 1998 Сапсег Кек. 58: 743-752; Ьисак е! а1., 1999 Сапсег Кек 59: 4100-4103; Ьисак е! а1., 2000 Ш!. 1. Сапсег 87: 55-60; Ьигдшп е! а1., 1997 Оепотюк 46: 397-408; Микса!еШ е! а1., 1995 Ргос. №!1. Асаб. §сг И8А 92: 4987-4991; Ро1б е! а1., 1999 Оепотюк 59: 161-167; Кодпег е! а1., 1995 Оепотюк 29: 725-731) и их функция еще не определена (ОЬтап е! а1. 2001, Ехр Се11 Кек. 265(2): 18594). Гены МАОЕ высоко гомологичны, и представители семейства МАОЕ-А, в частности, гомологичны на 60-98%.

Ген МАОЕ-А3 человека экспрессируется в различных типах опухолей, включая меланому (Риги1а е! а1. 2004 Сапсег §ск 95, 962-968), рак мочевого пузыря, печеночноклеточную карциному (Οίιι е! а1. 2006. СНиюа1 ВюсйетюОу 39, 259-266), карциному желудка (Нопба е! а1. 2004 ВпОкН 1оигпа1 оЕ Сапсег 90, 838843), рак прямой и ободочной кишки (Ктт е! а1. 2006 \Уог1б 1оита1 оЕ Оак!гоеп!его1оду 12, 5651-5657) и рак легкого (НМРЛ) (§сап1ап е! а1. 2002 Iттипо1. Кеу. 188: 22-32; 1апд е! а1. 2001 Сапсег Кек. 61, 21: 79597963). Экспрессии ни в одной нормальной ткани взрослого организма, за исключением только зародышевых семенников или плаценты, не наблюдается (Наак е! а1. 1988 Ат. 1. Кергоб. Iттипо1. МюгоЪю1. 18: 47-51; ТакайакЫ е! а1. 1995 Сапсег Кек 55: 3478-382).

Важно иметь количественные высокопроизводительные анализы, позволяющие специфично выявлять пациентов, экспрессирующих СТАО1В, СТАО2 и/или РКАМЕ, которым может быть полезна иммунотерапия, отслеживать экспрессию СТАО1В, СТАО2 и/или РКАМЕ в целях определения дозы, идентифицировать образцы, экспрессирующие СТАО1В, СТАО2 и/или РКАМЕ, в клинических испытаниях или просто идентифицировать пациентов раковым заболеванием на ранних стадиях. Описан ряд применимых диагностических способов и применение экстракции РНК и ОТ-ПЦР (например, в публикациях Обипк1 е! а1., Сапсег Кекеагсй 63, 6076-6083, 2003; §йагта е! а1., Сапсег НптипПу. уо1. 3, р. 19, 2003).

Самым большим недостатком имеющихся анализов является то, что они требуют выделения РНК, чтобы оценить экспрессию СТАО1В, СТАО2 и/или РКАМЕ. Получение фиксированной формалином, залитой парафином (РРРЕ) опухолевой ткани является обычным способом консервации опухолевой ткани в клинических центрах. Фиксация в формалине изменяет структуру молекул РНК в ткани, вызывая поперечное связывание, а также частичную деградацию. Частичная деградация приводит к образованию более мелких кусочков РНК длиною 100-300 оснований. Такие структурные изменения в РНК ограничивают применение РНК, экстрагированной из РРРЕ-ткани, для измерения уровней экспрессии СТАО1В, СТАО2 и/или РКАМЕ.

Метилирование генов

Метилирование генов является важным регулятором экспрессии генов. В частности, метилирование по остаткам цитозина, обнаруженное в динуклеотидных парах СрО в промоторной области специфичных

- 2 021100 генов, может вносить вклад во многие патологические состояния посредством понижающей регуляции экспрессии генов. Например, аномальное метилирование генов супрессоров опухолей может приводить к повышающей или понижающей регуляции таких генов и, следовательно, ассоциировано с наличием и развитием многих раковых заболеваний (НоГГтапп е! а1. 2005 ВюсИет. Се11 ΒίοΙ. 83: 296-321). Профили аномального метилирования генов часто специфичны для источника ткани. Соответственно, определение статуса метилирования специфичных генов может иметь прогностическое и диагностическое применение и может быть использовано как для определения относительной стадии заболевании, так и для прогнозирования ответа на некоторые типы терапии (Ьаий. 2003 №!. Кеу. Сапсег 3: 253-266).

Статус метилирования СТАС1В, СТАС2 и/или РКАМЕ в некоторой степени исследовали в раковых тканях. Было высказано предположение, что метилирование ДНК является молекулярным механизмом, непосредственно отвечающим за высокую экспрессию гена РКАМЕ при хроническом миелоидном лейкозе (СЕМ). Анализ промотора, экзона 1 и экзона 2 РКАМЕ показал, что РКАМЕ имеет три островка СрС: островок 201 п.н. расположен в промоторе, островок 204 п.н. находится в экзоне 1 и островок 310 п.н. находится в экзоне 2, из которых только для СрС-островка в экзоне 2 показана эпигенетическая регуляция (Соте/-Котап е! а1. Ьеикет1а КекеагсИ 31 (2007) 1521-1528). В ходе сочетания экспериментов по укорочению ДНК/трансфекции с метилированием ДНК также показано, что изменения профиля метилирования в определенных частях регуляторных областей РКАМЕ достаточны для его повышающей регуляции в клетках, которые обычно не экспрессируют данный ген.

Также был исследован статус метилирования ЬАСЕ-1 (Эе §те! е! а1. (1999) Мо1еси1аг аий Се11и1аг Вю1оду: 7327-7335). Из-за высокого сходства последовательностей ЬАСЕ-1 и Б-АСЕ-2^У-Е8О-1 было трудно найти различия в статусе метилирования промоторных последовательностей этих двух генов.

Специфичную к метилированию ПЦР (М8Р) с визуализацией результатов в геле (основанный на геле М§Р-анализ) широко применяют для определения эпигенетического сайленсинга генов (Ек1е11ег М е! а1. Сапсег Ке8 2001; 61: 3225-9), хотя разработаны количественные тесты на основе других методов (Ьайй Р/ν., ΝηΙ. Кеу. Сапсег 2003; 3: 253-66; Еайк е! а1. №с1ею Ашйк Кек. 2000; 28: Е32; М1кекка Т. е! а1. 1. Мо1. И1адп. 2007).

Имеется ряд основанных на флуоресценции способов мониторинга в режиме реального времени реакций амплификации нуклеиновых кислот. Одна из таких методик описана в патенте США № 6090552 и Европейском патенте № 0912597 и имеет коммерческое наименование АтрИЯиог®. Указанный способ также подходит для мониторинга реакций амплификации нуклеиновых кислот в конечной точке. У1аккепЬгоеск с соавторами (У1аккепЬгоеск е! а1., 2008. 1оигпа1 оГ Мо1ес. И1адп., У10, №. 4) описывают стандартизованный прямой М§Р-анализ в режиме реального времени с применением методики АтрИЯиог®.

Целью настоящего изобретения являются усовершенствованные анализы, которым не свойственны недостатки существующих анализов.

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к усовершенствованным способам и/или анализам для измерения экспрессии. Настоящее изобретение, кроме того, относится к некоторым типам терапии, в частности, основанным на антигенспецифичной иммунотерапии раковых заболеваний (А8С1) лечении пациентов, у которых выявлена экспрессия СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеА3, путем применения олигонуклеотидов, праймеров, зондов, пар праймеров, наборов и/или способов, описанных в настоящем документе. Экспрессию (белка) СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеА3 регистрируют, определяя статус метилирования гена СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеА3, а не измеряя уровень экспрессии самого гена. Авторы настоящего изобретения показали, что результат, показывающий статус метилирования в предлагаемых авторами тестах метилирования, хорошо согласуется с результатами, полученными с использованием анализа ОТ-ПЦР для экспрессии СТАС1В, СТАС2 и/или РКАМЕ в образцах НМРЛ, меланомы и рака молочной железы. В случае образцов, например, тонкоигольных биоптатов немелкоклеточного рака легкого, для которых количественная ОТ-ПЦР оказывается сложной, экспрессия белка, выявляемая благодаря определению статуса метилирования гена МадеА3, предоставляет ценную альтернативу. Таким образом, анализы применимы для отбора пациентов (подходящих) для лечения, для прогнозирования вероятности успешного лечения пациента и могут быть использованы для помощи при выборе терапии для пациента.

В одном аспекте настоящего изобретения предлагается олигонуклеотид, праймер или зонд, содержащий или по существу состоящий или состоящий из нуклеотидной последовательности, указанной в любой из 5ЕС ГО ΝΟ: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 или 63; и такой олигонуклеотид, праймер или зонд применим для определения статуса метилирования гена.

Олигонуклеотид, праймер или зонд предпочтительно содержит, по существу состоит или состоит из следующих непрерывно следующих друг за другом последовательностей в порядке от 5'- к 3'-концу:

(а) первой нуклеотидной последовательности длиной примерно от 6 до 30 нуклеотидов, причем нуклеотид в указанной первой нуклеотидной последовательности помечен первым остатком, выбранным из донорного остатка и акцепторного остатка пары для молекулярного переноса энергии, причем донор- 3 021100 ный остаток при возбуждении испускает флуоресценцию при одной или нескольких конкретных длинах волн, а акцепторный остаток поглощает и/или гасит указанную флуоресценцию, испускаемую указанным донорным остатком;

(b) второй одноцепочечной нуклеотидной последовательности, содержащей, по существу состоящей или состоящей примерно из 3-20 нуклеотидов;

(c) третьей нуклеотидной последовательности, содержащей, по существу состоящей или состоящей примерно из 6-30 нуклеотидов, причем нуклеотид в указанной третьей нуклеотидной последовательности помечен вторым остатком, выбранным из указанного донорного остатка и указанного акцепторного остатка, и указанный второй остаток является представителем указанной группы, которым не помечена указанная первая нуклеотидная последовательность, причем указанная третья нуклеотидная последовательность комплементарна в обратном порядке указанной первой нуклеотидной последовательности, так что может образовываться дуплекс между указанной первой нуклеотидной последовательностью и указанной третьей нуклеотидной последовательностью таким образом, что указанные первый остаток и второй остаток оказываются рядом друг с другом, так что когда донорный остаток возбуждается и испускает флуоресценцию, акцепторный остаток поглощает и гасит указанную флуоресценцию, испускаемую указанным донорным остатком; и (б) находящейся на З'-конце праймера четвертой одноцепочечной нуклеотидной последовательности, содержащей, по существу состоящей или состоящей примерно из 8-40 нуклеотидов, которая содержит на своем З'-конце любую из нуклеотидных последовательностей, указанных в 8ЕО ГО N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38,40,42, 44, 62 и 63;

причем когда указанной дуплекс не образуется, указанный первый остаток и указанный второй остаток разделены на такое расстояние, которое предотвращает молекулярный перенос энергии между указанным первым и вторым остатком.

Специфичные нуклеотидные последовательности на 3'-конце позволяют определять статус метилирования гена СТЛС1В, СТЛС2, РКАМЕ и/или МадеА3. Такие праймеры предпочтительно связываются с неметилированными формами гена СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеА3 после обработки соответствующим реагентом (которые обсуждаются в настоящем документе). Свойства таких олигонуклеотидов обсуждаются в настоящем документе, и такое обсуждение применимо с соответствующими поправками. Специфичные нуклеотидные последовательности способны праймировать осуществляемый полимеразой нуклеиновых кислот синтез нуклеотидной последовательности, комплементарной цепи нуклеиновой кислоты, содержащей часть метилированной или неметилированной ДНК гена СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеА3.

Наиболее предпочтительно олигонуклеотид, праймер или зонд состоит из нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО N0: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 или 61 и применим для амплификации части представляющего интерес гена.

Кроме того, предлагается пара праймеров, включающая в себя праймер, содержащий или по существу состоящий или состоящий из любой из нуклеотидных последовательностей 8Е0 ГО N0: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 или 63. Подходящие пары праймеров могут быть легко определены специалистом в данной области на основе смыслового и антисмыслового праймера, направляющих амплификацию соответствующей части рассматриваемого гена (который обсуждается в настоящем документе). Примеры пары праймеров согласно изобретению указаны в табл. 1. В п.6 формулы изобретения также перечислены подходящие пары праймеров.

В следующем аспекте предлагается набор, содержащий по меньшей мере один праймер, пару праймеров или набор праймеров, содержащий или по существу состоящий или состоящий из любой из нуклеотидных последовательностей 8Е0 ГО N0: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,

21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 или 63. Набор предназначен для определения статуса метилирования гена, в частности такого гена, как СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеА3.

В следующем аспекте изобретение относится к способу определения статуса метилирования гена СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеА3 в ДНК-содержащем образце, предусматривающему (a) осуществление контакта/обработки ДНК-содержащего образца реагентом, который избирательно модифицирует неметилированные остатки цитозина в ДНК с получением определяемых модифицированных остатков, но который не модифицирует метилированные остатки цитозина;

(b) амплификацию по меньшей мере части представляющего интерес метилированного или неметилированного гена с использованием по меньшей мере одной пары праймеров, из которых по меньшей мере один праймер сконструирован так, чтобы он связывался только с последовательностью метилированной или неметилированной ДНК, соответственно, после обработки реагентом, причем по меньшей мере один праймер в паре праймеров содержит, по существу состоит или состоит из любой из нуклеотидных последовательностей 8Е0 ГО N0: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,

22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 или 63 (в зависимости от ситуации).

- 4 021100

В следующем аспекте предлагается способ диагностики рака или предрасположенности к развитию рака, предусматривающий определение статуса метилирования гена СТЛО1В, СТЛО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ в образце с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, описанных в настоящем документе, причем присутствие неметилированного СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ в образце является показателем наличия рака или предрасположенности к развитию рака.

В следующем аспекте предлагается способ определения наличия позитивной по СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ опухоли, предусматривающий определение статуса метилирования гена СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ в образце с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, описанных в настоящем документе, причем присутствие неметилированного СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ является показателем наличия позитивной по СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ опухоли. Под позитивной по СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеАЗ опухолью подразумевают любую опухоль или опухолевые клетки (выделенные из организма пациента), которые экспрессируют антиген СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеАЗ.

Кроме того, изобретение относится к способу идентификации и/или отбора пациента, подходящего для лечения иммунотерапевтическим средством на основе СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеАЗ, предусматривающему определение статуса метилирования гена СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеАЗ в образце, полученном от пациента, с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, которые описаны в настоящем документе, причем если ген СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеАЗ не метилирован, то субъекта (предпочтительно) идентифицируют и/или отбирают для лечения иммунотерапевтическим средством на основе СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеАЗ. Таким образом, пациентов с неметилированным СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеАЗ предпочитают пациентам, у которых ген метилирован.

Альтернативно, если ген не метилирован, то субъекта предпочтительно не идентифицируют и не выбирают для лечения иммунотерапевтическим средством на основе СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеАЗ.

В родственном аспекте изобретение относится к способу прогнозирования вероятности успешного лечения рака, предусматривающему определение статуса метилирования гена СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеАЗ в образце, полученном от пациента, с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, которые описаны в настоящем документе, причем если ген не метилирован, то вероятность успешного лечения иммунотерапевтическим средством на основе СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеАЗ выше, чем в том случае, когда ген метилирован.

Альтернативно, отсутствие неметилированного СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеАЗ в образце свидетельствует, что вероятность устойчивости к лечению иммунотерапевтическим средством на основе СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеАЗ выше, чем в том случае, когда ген не метилирован. Таким образом, выявление метилированного гена СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеАЗ свидетельствует о том, что возможность успешного лечения иммунотерапевтическим средством мала.

В следующем родственном аспекте изобретение относится к способу подбора подходящей схемы лечения рака, предусматривающему статуса метилирования гена СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеАЗ в образце, полученном от пациента, с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, которые описаны в настоящем документе, причем если ген не метилирован, то для лечения выбирают иммунотерапевтическое средство.

Альтернативно, если ген не метилирован, то лечение иммунотерапевтическим средством противопоказано.

Также предлагается способ лечения рака у субъекта, предусматривающий введение иммунотерапевтического средства, причем субъекта для лечения выбирают на основе измерения статуса метилирования гена СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеАЗ согласно любому из способов согласно изобретению или с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, которые описаны в настоящем документе.

Предпочтительно во всех различных описанных в настоящем документе аспектах выявление неметилированного гена СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеАЗ соответствует повышенному уровню белка СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеАЗ.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения пациента, предусматривающему измерение статуса метилирования гена СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеАЗ согласно любому из способов согласно изобретению и/или с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, которые описаны в настоящем документе, и затем введение пациенту композиции, содержащей СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеАЗ, описанной в настоящем документе. Композицию предпочтительно вводят, если обнаружено, что ген СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеАЗ неметилирован.

В следующем аспекте предлагается способ лечения пациента, подверженного рецидиву опухоли, экспрессирующей СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеАЗ, когда у пациента была удалена опухолевая

- 5 021100 ткань, причем способ предусматривает измерение статуса метилирования гена СТЛО1В, СТЛО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ в опухолевой ткани любым из способов согласно изобретению или с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, которые описаны в настоящем документе, и затем введение пациенту композиции, содержащей СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ, описанной в настоящем документе. Композицию предпочтительно вводят, если обнаружено, что ген СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ является неметилированным.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предлагается применение композиции, содержащей СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ, для производства лекарственного средства для лечения страдающего опухолью пациента, причем пациент отобран для лечения на основе измерения статуса метилирования гена СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ согласно любому из способов, предлагаемых в изобретении, или с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, которые описаны в настоящем документе. Также предлагается композиция, содержащая СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ, для применения при лечении страдающего опухолью пациента, причем пациент отобран для лечения на основе измерения статуса метилирования гена СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ согласно любому из способов, предлагаемых в изобретении, или с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, которые описаны в настоящем документе.

В еще одном варианте предлагается применение композиции, содержащей СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ, для производства лекарственного средства для лечения пациента, подверженного рецидиву опухоли, экспрессирующей СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ, причем пациент для лечения отобран на основе измерения статуса метилирования гена СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ любым из способов согласно изобретению или с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, которые описаны в настоящем документе. Также предлагается композиция, содержащая СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ, для применения для лечения пациента, подверженного рецидиву опухоли, экспрессирующей СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ, причем пациент для лечения отобран на основе измерения статуса метилирования гена СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ любым из способов согласно изобретению или с использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, которые описаны в настоящем документе.

Подробное описание изобретения

Изобретение относится к анализу для определения присутствия и/или количества метилированного или неметилированного гена СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ в ДНК-содержащем образце. Для разработки этого анализа было необходимо идентифицировать области, чувствительные к метилированию, в гене СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ, и разработать конкретные олигонуклеотиды, которые могут отличать неметилированные формы гена СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ от метилированных форм таких генов.

Соответственно, в первом аспекте в настоящем изобретении предлагается олигонуклеотид, праймер или зонд, содержащий или по существу состоящий или состоящий из любой из нуклеотидных последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 1, 2, З, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 1З, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 2З, 24, 25, 26, 27, 28, 29, З0, З1, З2, ЗЗ, З4, З5, З6, З7, З8, З9, 40, 41, 42, 44, 61, 62 или 6З. Эти олигонуклеотиды применимы для определения статуса метилирования представляющего интерес гена. Олигонуклеотиды могут служить в качестве праймеров и/или зондов. В некоторых вариантах олигонуклеотиды выявляют неметилированную форму гена. В некоторых вариантах эти олигонуклеотиды содержат структуру шпильки, которая описана в настоящем документе, представлены последовательностью 8Е0 ГО N0: 4З. Такие предпочтительные олигонуклеотиды содержат, по существу состоят или состоят из нуклеотидных последовательностей, указанных в 8ЕЦ ГО N0: 1, З, 5, 7, 9, 11, 1З, 15, 17, 19, 21, 2З, 25, 27, 29, З1, ЗЗ, З5, З7, З9, 41 или 61 для выявления неметилированной формы гена.

Термины гены или представляющий интерес ген согласно изобретению предпочтительно означают гены СТА01В, и/или СТА02, и/или РКАМЕ, и/или МадеАЗ.

СТА01В является обозначением гена, утвержденным Комитетом по номенклатуре генов НИОО. Ген локализован в Х-хромосоме (положение Хс|28) и последовательность гена представлена под номерами доступа И87459 и ХМ_00ЕЗ27. Единый идентификационный номер гена Е№0000001840ЗЗ. Ген кодирует раково-тестикулярный антиген 1В [Ното 8ар1еи8]. СТАО1В часто взаимозаменяемо называют СТАО1В, или СТАО, или СТАО1, или ΝΥ-Β8Ο-1, или Е8О1, или ЬАОЕ-2, или ЬАОЕ2В, все указанные названия использованы в настоящем документе. Гипометилирование указанного гена может быть связано с развитием раковых заболеваний, таких как меланома, рак легкого (включая НМРЛ), рак предстательной железы или рак яичника, например.

СТАО2 является обозначением гена, утвержденным Комитетом по номенклатуре генов НИОО. Ген локализован в Х-хромосоме (положение Хс|28) и последовательность гена указана под номером доступа А10128ЗЗ. Единый идентификационный номер гена Е№000000126890. Ген кодирует раковотестикулярный антиген 2 [Ното каргеик]. СТАО2 часто взаимозаменяемо называют СТАО2, или

- 6 021100

САМЕЬ, или Е8О2, или ЬЛСЕ-1, или ЬАСЕ-2Ъ, или МОС3803, или МОС138724, все указанные названия использованы в настоящем документе. Гипометилирование указанного гена может быть связано с развитием раковых заболеваний, таких как меланома, рак легкого (включая НМРЛ), рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак головы и шеи, рак яичника, рак шейки матки, рак прямой и ободочной кишки, карцинома пищевода или печеночноклеточная карцинома.

РКАМЕ является обозначением гена, утвержденным Комитетом по номенклатуре генов НИОО. Ген локализован в хромосоме 22 (положение 22ц11.22) и последовательность гена указана под номерами доступа И65011 и ИМ206953. Единый идентификационный номер гена ЕМ§О00000185686. Ген кодирует антиген, преимущественно экспрессируемый в меланоме [Ното 8ар1еп8]. РКАМЕ часто взаимозаменяемо называют МАРЕ или О1Р4; все приведенные названия использованы в настоящем документе. Гипометилирование указанного гена может быть связано с развитием раковых заболеваний, таких как рак шейки матки, рак предстательной железы, рак легкого, рак яичника, рак молочной железы или плоскоклеточная карцинома головы и шеи.

МАОЕА3 и МАОЕА6 являются обозначениями генов, утвержденными Комитетом по номенклатуре генов НИОО. Ген МАОЕА3 локализован в хромосоме X (положение ц28) и последовательность гена указана под номерами доступа ИМ_005362 и ЕЫ§000000197172. Ген МАОЕ-А3 кодирует семейство антигенов меланомы А, 3. Ген МАОЕА6 локализован в Х-хромосоме (положение ц28). МАОЕ-А3 часто взаимозаменяемо называют МАОЕ-3 или МАОЕА3. Подобным образом МАОЕ-А6 часто взаимозаменяемо называют МАОЕ-6 или МАОЕА6; все указанные названия использованы в настоящем документе. Гипометилирование указанных генов может быть связано с развитием раковых заболеваний, таких как, например, меланома или рак легкого (включая НМРЛ).

Динуклеотиды СрО, чувствительные к метилированию, обычно сконцентрированы в областях промоторов и/или экзонов и/или интронов генов человека. В некоторых вариантах осуществления статус метилирования гена оценивают, определяя уровни метилирования в области промотора, интрона, экзона 1 и/или экзона 2 гена. Промотор представляет собой область выше стартового сайта транскрипции (Τδδ), простирающуюся примерно на 10 т.п.н., 4 т.п.н., 3 т.п.н., 1 т.п.н., 500 п.н. или от 150 до 300 п.н. от Τδδ. Когда распространение СрО в области промотора довольно незначительно, то уровни метилирования можно оценивать в областях интронов и/или экзонов. Областью, используемой для оценки, может быть область, которая содержит последовательности как интрона, так и экзона и, следовательно, перекрывает обе области.

Термин состояние метилирования или статус метилирования относится к присутствию или отсутствию 5-метилцитозина (5-тСу1) в одном или множестве динуклетидов СрО в последовательности ДНК. Гиперметилирование определяют как увеличение уровня метилирование выше нормальных уровней. Таким образом, термин относится к аномальному метилированию цитозина (5-тСу1) в конкретных сайтах СрО в гене, часто в области промотора. Нормальные уровни метилирования могут быть определены посредством измерения уровня метилирования, например, в нераковых клетках.

Гипометилирование относится к пониженному присутствию 5-тСу1 в одном или множестве динуклеотидов СрО в последовательности ДНК (тестируемого образца ДНК) по сравнению с количеством 5-тСур обнаруженным в соответствующих динуклеотидах СрО в нормальной последовательности ДНК (найденным в подходящем образце). Опять же, нормальные уровни метилирования могут быть определены посредством измерения уровня метилирования, например, в нераковых клетках. В соответствии с настоящим изобретением гипометилирование гена СТАО1В, СТАО2 и/или РКАМЕ (или в некоторых аспектах МадеА3) является показателем повышенной экспрессии этого ассоциированного с опухолью антигена гена, которая является надежным показателем наличия рака.

Во втором аспекте изобретение относится к способу определения присутствия и/или количества метилированного или неметилированного гена в ДНК-содержащем образце, предусматривающему стадию осуществления контакта ДНК-содержащего образца по меньшей мере с одним олигонуклеотидом, содержащим, по существу состоящим или состоящим из любой из нуклеотидных последовательностей ЛТ) ГО N0: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 или 63. Способ предпочтительно предусматривает дополнительную стадию оценки того, является ли ген метилированным или неметилированным. Оценка может зависеть от того, связывается ли олигонуклеотид стабильно с ДНК в ДНК-содержащем образце, как обсуждается в настоящем документе.

Методы оценки статуса метилирования основаны на разных подходах. Можно применять любую подходящую методику, в которой используют олигонуклеотиды согласно изобретению. В одном варианте осуществления в подходах к выявлению мотивов метилированных динуклеотидов СрО используют реагент, который избирательно модифицирует неметилированные остатки цитозина в ДНК с образованием определяемых модифицированных остатков. Реагент не модифицирует метилированные остатки цитозина и, таким образом, позволяет отличать неметилированные молекулы нуклеиновой кислоты от метилированных молекул в способе на последующем этапе, который предпочтительно может предусматривать амплификацию нуклеиновой кислоты. В одном варианте осуществления реагент может действовать,

- 7 021100 избирательно дезаминируя неметилированные остатки цитозина. Следовательно, после воздействия регентом неметилированная ДНК содержит другую нуклеотидную последовательность, отличающуюся от последовательности соответствующей метилированной ДНК. Дезаминирование цитозина приводит к появлению остатка урацила, который обладает такими же свойствами спаривания, как тимин, и, следовательно, имеет другое поведение при спаривании оснований, отличающееся от поведения цитозина. Такой способ позволяет отличать метилированные остатки цитозина от неметилированных.

В обычно применяемых методиках оценки различий по последовательности используют олигонуклеотидные праймеры. Возможны два способа конструирования праймеров. Во-первых, могут быть сконструированы праймеры, которые сами по себе не охватывают все возможные сайты метилирования ДНК. Изменения последовательности в сайтах дифференциального метилирования локализованы между двумя участками связывания праймеров, и визуализация изменения последовательности требует дополнительных стадий анализа. Во-вторых, могут быть сконструированы праймеры, которые специфично гибридизуются либо с метилированным, либо с неметилированным вариантов исходной обрабатываемой последовательности. После гибридизации может быть осуществлена реакция амплификации и продукты амплификации проанализированы с использованием любой системы регистрации, известной в данной области техники. Присутствие продукта амплификации указывает, что праймер гибридизовался с ДНК. Специфичность праймера свидетельствует о том, была ли модифицирована ДНК или нет, что, в свою очередь, указывает, была ли ДНК метилирована или нет. Если существует достаточная область комплементарности, например, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 нуклеотидов, с мишенью, то праймер также может содержать дополнительные остатки нуклеотидов, которые не мешают гибридизации, но могут быть полезны для других манипуляций. Примерами таких других остатков могут быть участки расщепления эндонуклеазами рестрикции, участки для связывания лиганда или для связывания фактора или линкеры или повторы, или остатки, необходимые в целях визуализации. Олигонуклеотидные праймеры могут не быть или быть такими, что они являются специфичными по отношению к модифицированных метилированным остаткам. Предпочтительные олигонуклеотиды для применения в качестве праймеров содержат, по существу состоят или состоят из любой из нуклеотидных последовательностей З1Т) ГО N0: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 или 61.

Следующим и часто дополнительным путем для того, чтобы отличить модифицированную нуклеиновую кислоту от немодифицированной, является использование олигонуклеотидных зондов. Такие зонды могут гибридизоваться непосредственно с модифицированной нуклеиновой кислотой или с дополнительными продуктами модифицированной нуклеиновой кислоты, такими как продукты, полученные при амплификации. В основанных на зондах анализах используют гибридизацию олигонуклеотидов с конкретными последовательностями и последующую регистрацию гибрида. Также могут иметь место дополнительные стадии очистки перед регистрацией продукта амплификации, например, стадия преципитации. Олигонуклеотидные зонды можно метить с использованием любой системы регистрации, известной в данной области техники. Такие системы включают без ограничения флуоресцирующие остатки, меченые радиоактивными изотопами остатки, биолюминесцентные остатки, люминесцентные остатки, хемилюминесцентные остатки, ферменты, субстраты, рецепторы или лиганды. Олигонуклеотиды для применения в качестве зондов могут содержать, по существу состоять или состоять из любой из нуклеотидных последовательностей ЗЕЦ ГО N0: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 или 63. Предпочтительный олигонуклеотидный зонд предпочтительно содержит, по существу состоит или состоит из нуклеотидной последовательности, выбранной из ЗЕЦ ГО N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24,26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 и 61.

Термин олигонуклеотидный праймер в настоящем документе используют взаимозаменяемо с термином праймер. Подобным образом олигонуклеотидный зонд в настоящем документе используют взаимозаменяемо с термином зонд.

В предпочтительных вариантах осуществления статус метилирования гена (или его части, особенно островков СрС) определяют, используя специфичную по отношению к метилированию ПЦР (МЗР).

Методика МЗР известна специалистам в данной области техники. В способе МЗР ДНК может быть амплифицирована с использованием пары праймеров, сконструированных таким образом, чтобы отличать неметилированную ДНК от метилированной ДНК, пользуясь различиями в последовательностях после обработки бисульфитом натрия (Негтап ТО. е! а1., Ргос. №11. АсаД Зек ИЗА 1996 Зер 3; 93(18): 9821-6 и \У0 97/46705). Конкретным примером методики МЗР является способ, названный количественной МЗР в режиме реального времени (ЦМЗР), который позволяет проводить надежную количественную оценку метилированной ДНК в режиме реального времени.

Способы, осуществляемые в режиме реального времени, как правило, основаны на непрерывном оптическом мониторинге процесса амплификации и использовании флуоресцентно меченых реагентов, включение которых в продукт можно количественно оценить и количественная оценка которых является показателем количества копий этой последовательности в матрице. Таким меченым реагентом может быть флуоресцирующий краситель, который предпочтительно связывает двухцепочечную ДНК и флуо- 8 021100 ресценция которого значительно повышается при связывании двухцепочечной ДНК. Альтернативно, можно использовать меченые праймеры и/или меченые зонды. Они находят конкретное применение в хорошо известных и коммерчески доступных методиках амплификации в режиме реального времени, таких как ТАС)\1А\®. МОЬЕСиЬАК ΒΕΑΟΘΝ8®, АМРиРЬиОК® и 8ΟΘΚΡΙΘΝ® О/\\А® и т.д. Часто такие способы в режиме реального времени используют вместе с полимеразной цепной реакцией (ПЦР).

В методике ТацМап используют линейные гидролитические олигонуклеотидные зонды, которые содержат флуоресцирующий краситель и гасящий краситель. При возбуждении возбужденный флуоресцирующий краситель передает энергию на расположенную рядом молекулу гасящего красителя, а не флуоресцирующего (принцип РРЕТ). Зонды ТацМап отжигаются с внутренними областями ПЦРпродукта и расщепляются экзонуклеазной активностью полимеразы, когда она реплицирует матрицу. При этом прекращается активность гасителя, и репортерный краситель начинает испускать флуоресценцию, которая увеличивается в каждом цикле пропорционально степени расщепления зонда.

Молекулярные маяки также содержат флуоресцирующий и гасящий красители, но они сконструированы так, что их структура принимает форму шпильки, если они находятся свободно в растворе, при этом приводя оба красителя в непосредственную близость так, что происходит резонансный перенос энергии флуоресценции (РРЕТ). Когда маяк гибридизуется с мишенью на стадии отжига, шпилька линеаризуется, и оба красителя (донор и акцептор/гаситель) расходятся. Усиление флуоресценции, регистрируемой от донора, будет коррелировать с количеством имеющегося ПЦР-продукта.

В случае зондов-скорпионов специфичное для последовательности праймирование и регистрацию ПЦР-продукта осуществляют, используя один олигонуклеотид. Зонд-скорпион поддерживает конфигурацию стебель-петля в негибридизованном состоянии и между флуорофором и гасителем происходит РРЕТ. З'-Часть стебля также содержит последовательность, которая комплементарна продукту удлинения праймера. Такая последовательность связана с 5'-концом специфичного праймера неамплифицируемым мономером. После удлинения праймера скорпиона специфичная последовательность зонда способна связываться со своим комплементом в удлиненном ампликоне, при этом раскрывая петлю шпильки, отдаляя друг от друга флуорофор и гаситель и обеспечивая сигнал флуоресценции.

В анализе Нса\утс1Ну1 праймирование является специфичным для метилирования, но такую специфичность обеспечивают неудлиняемые олигонуклеотидные блокаторы, а не сами праймеры. Блокаторы связываются с обработанной бисульфитом ДНК специфичным по отношению к метилированию образом, и сайты из связывания перекрывают сайты связывания праймера. Когда блокатор связывается, праймер не может связываться, и поэтому ампликон не образуется. Неаууте1йу1 можно использовать в сочетании с регистрацией в режиме реального времени.

Системы кПЦР и кОТ-ПЦР Р1ехог™ используют преимущество специфичного взаимодействия между двумя модифицированными нуклеотидами, чтобы осуществлять количественный ПЦР-анализ. Один из ПЦР-праймеров содержит флуоресцирующую метку рядом с остатком изо-бС на 5'-конце. Второй ПЦР-праймер не метят. Реакционная смесь содержит дезоксинуклеотиды и изо-бСТР, модифицированный гасителем дабцилом. Дабцил-изо-бСТР предпочтительно включается в положение, комплементарное остатку изо-бС. Включение дабцил-изо-бСТР в указанное положение приводит к гашению флуоресцирующего красителя на комплементарной цепи и снижению флуоресценции, что обеспечивает возможность количественной оценки во время амплификации. В случае таких множественных реакций используют пары праймеров с разными флуорофорами для каждой последовательности-мишени.

Таким образом, олигонуклеотиды, содержащие, по существу состоящие или состоящие из любой из нуклеотидных последовательностей 8ЕЦ ΙΌ ΝΘ: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 или 63, можно применять в качестве праймеров или зондов в вышеупомянутых способах определения статуса метилирования представляющего интерес гена.

В предпочтительном варианте изобретение относится к способу определения присутствия и/или количества представляющего интерес метилированного или неметилированного гена в ДНК-содержащем образце в режиме реального времени, предусматривающему (a) осуществление контакта/обработки ДНК-содержащего образца реагентом, который избирательно модифицирует неметилированные остатки цитозина в ДНК с образованием определяемых модифицированных остатков, но который не модифицирует метилированные остатки цитозина;

(b) амплификацию по меньшей мере части представляющего интерес метилированного или неметилированного гена с использованием по меньшей мере одной пары праймеров, по меньшей мере один праймер из которой конструируют так, чтобы он связывался только с последовательностью метилированной или неметилированной ДНК, соответственно, после обработки реагентом, причем по меньшей мере один праймер в паре праймеров содержит, по существу состоит или состоит из любой из нуклеотидных последовательностей 8ЕЦ ГО ΝΘ: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 или 63.

Представляющим интерес геном в способах согласно изобретению предпочтительно является ген

- 9 021100

СТЛО1В, СТЛО2, МадеА3 и/или РКАМЕ. Предпочтительно по меньшей мере один праймер в паре праймеров представляет собой праймер, содержащий структуру стебель-петля, несущую донорный и акцепторный остаток пары для молекулярного переноса энергии, расположенные так, что в отсутствие амплификации акцепторный остаток гасит флуоресценцию, испускаемую донорным остатком (при возбуждении), а во время амплификации структура стебель-петля нарушается и при этом разделяет донорный и акцепторный остатки в достаточной степени, чтобы получить регистрируемый сигнал флуоресценции. Сигнал можно регистрировать в режиме реального времени, получая показание присутствия представляющего интерес метилированного или неметилированного гена. Праймер в паре праймеров, который содержит, по существу состоит или состоит из любой из нуклеотидных последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,41, 42, 44, 61, 62 или 63, предпочтительно несет структуру стебель-петля.

В некоторых вариантах определяют количество генных копий метилированного или неметилированного гена. В данном случае способ, описанный в настоящем документе, предпочтительно предусматривает следующую дополнительную стадию:

(с) количественная оценка результатов регистрации в режиме реального времени по сравнению со стандартной кривой для представляющего интерес метилированного или неметилированного гена с получением выходных данных о количестве генных копий.

Предпочтительно стадия (с) дополнительно характеризуется тем, что амплификацию считают достоверной, если значение порогового цикла меньше или равно 40.

Для таких генов, как ген СТАС1В, СТАС2, МадеА3 и/или РКАМ, регистрация неметилированного варианта гена может иметь первостепенное значение.

Способы согласно изобретению позволяют регистрировать присутствие представляющего интерес метилированного или неметилированного гена в образце в режиме реального времени. Так как способы согласно изобретению являются количественными способами, то (относительные) количества метилированной или неметилированной формы представляющего интерес гена также могут быть определены по мере протекания реакции.

Однако, не обязательно использовать способы, осуществляемые в режиме реального времени. Могут быть осуществлены анализы только для того, чтобы выявить, присутствует ли ДНК-мишень в образце или нет. В способах регистрации амплификации в конечной точке используют такие же методики, которые широко используют для ПЦР в режиме реального времени. Таким образом, способы согласно изобретению могут включать способ определения присутствия и/или количества представляющего интерес метилированного или неметилированного гена в ДНК-содержащем образце в конечной точке.

Таким образом, изобретение относится к способу определения присутствия и/или количества представляющего интерес метилированного или неметилированного гена в ДНК-содержащем образце (в конечной точке), предусматривающему (a) осуществление контакта и/или обработку ДНК-содержащего образца реагентом, который избирательно модифицирует неметилированные остатки цитозина в ДНК с получением определяемых модифицированных остатков, но который не модифицирует метилированные остатки цитозина;

(b) амплификацию по меньшей мере части представляющего интерес метилированного или неметилированного гена с использованием по меньшей мере одной пары праймеров, из которых по меньшей мере один праймер сконструирован так, чтобы он связывался только с последовательностью метилированной или неметилированной ДНК, соответственно, после обработки реагентом, причем по меньшей мере один праймер в паре праймеров содержит, по существу состоит или состоит из любой из нуклеотидных последовательностей 8ЕО ГО N0: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 или 63.

Как указано выше, представляющим интерес геном в способах согласно изобретению предпочтительно является СТАО1В, СТАО2, МадеА3 и/или РКАМЕ. Предпочтительно по меньшей мере один праймер в паре праймеров представляет собой праймер, содержащий структуру стебель-петля, несущую донорный и акцепторный остаток пары для молекулярного переноса энергии, обладающие свойствами, которые описаны в настоящем документе. Праймер в паре праймеров, который содержит, по существу состоит или состоит из любой из нуклеотидных последовательностей 8Е0 ГО N0: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 61, 62 или 63, предпочтительно несет структуру стебель-петля.

Для генов СТА01В, СТА02, МадеА3 и/или РКАМ определение неметилированного варианта гена может иметь первостепенное значение. Праймеры, содержащие, по существу состоящие или состоящие из любой из нуклеотидных последовательностей 8Е ОГО N0: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 или 61, были сконструированы в целях выявления неметилированной ДНК СТА01В, СТА02 и/или РКАМЕ после обработки реагентом.

Отсутствие неметилированного гена является показателем присутствия метилированного гена.

В том случае когда требуется количество генных копий метилированного или неметилированного

- 10 021100 гена, способ может предусматривать дополнительную стадию (с) количественный анализ результатов регистрации по сравнению со стандартной кривой для представляющего интерес метилированного или неметилированного гена с получением выходных данных о количестве генных копий.

Все варианты осуществления изобретения применимы в случае аспектов изобретения, относящихся к результатам в конечной точке, и, таким образом, применимы с соответствующими поправками. В анализах в конечной точке можно использовать устройство для регистрации флуоресценции на планшетах или другое оборудование, подходящее для определения флуоресценции в конце амплификации.

Способы согласно изобретению наиболее предпочтительно представляют собой способы ех νίνο или ίη νίΐΓο, осуществляемые на любом подходящем (ДНК-содержащем) тестируемом образце. Однако, в одном варианте осуществления способ также может предусматривать стадию получения образца. Тестируемый образец является ДНК-содержащим образцом, в частности ДНК-содержащим образцом, содержащим представляющий интерес ген. Способы согласно изобретению можно применять для диагностики заболевания, в частности, когда (известно, что) метилирование представляющего интерес гена связано с частотой заболевания.

ДНК-содержащий образец может включать любой подходящий образец ткани или жидкость организма. Предпочтительно тестируемый образец получают из организма человека. В случае применений, связанных с раковыми заболеваниями, образец может включать образец ткани, взятый из ткани, которая предположительно является злокачественной, или из репрезентативной жидкости организма.

Гипометилирование гена СТЛО1В, СТЛО2, МадеАЗ и/или РКАМЕ ассоциировано с раком легкого, и, следовательно, изобретение может быть применимо в случае рака легкого. Таким образом, в одном варианте тестируемый образец, используемый в способах согласно изобретению, содержащий ген СТАО1В, СТАО2, МадеАЗ и/или РКАМЕ, предпочтительно содержит клетки легкого или нуклеиновую кислоту (молекулы) из клеток легкого. Наиболее предпочтительно образец представляет собой образец фиксированной формалином, залитой парафином (РРРЕ) ткани. Существует два типа рака легкого: немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) и мелкоклеточный рак легкого (МРЛ). Названия просто описывают тип клетки, обнаруженной в опухолях. Тестируемый образец предпочтительно содержит клетки или нуклеиновую кислоту из немелкоклеточной карциномы легкого (НМРЛ). НМРЛ включает в себя плоскоклеточную карциному, аденокарциному и крупноклеточную карциному, и на его долю приходится около 80% случаев рака легкого. В предпочтительном варианте осуществления, когда раком является НМРЛ, образец представляет собой образец ткани легкого или образец слюны или образец сыворотки. НМРЛ трудно поддается лечению, а имеющиеся способы лечения направлены на достижение цели продления жизни, насколько это возможно, и облегчение симптомов заболевания. НМРЛ является наиболее распространенным типом рака легкого и ассоциирован с неблагоприятными исходами.

Гипометилирование гена СТАО1В, СТАО2, МадеАЗ и/или РКАМЕ также связано с меланомой, и, таким образом, изобретение может быть применимо к меланоме. Меланома представляет собой пигментированное, поверхностное образование, которое было хорошо определено в гистопатологическом отношении. Меланомы в ранней фазе радиального роста (КОР) могут внедряться в эпидермис и сосочковый слой дермы, но не способны к метастазированию; резекция на такой стадии приводит к почти полному излечению. Последующая фаза вертикального роста (УОР) означает переход в более агрессивную стадию, которая способна к метастазированию. Таким образом, изменения в экспрессии генов, происходящие при переходе КОР/УОР, представляют большой интерес. Таким образом, в дополнительных вариантах осуществления следующий предпочтительный тестируемый образец, используемый в способах согласно изобретению, содержит клетки меланомы или нуклеиновую кислоту из клеток меланомы. Предпочтительно тестируемый образец получают из кожного очага.

Гипометилирование гена СТАО1В, СТАО2, МадеАЗ и/или РКАМЕ также связано с раком молочной железы, и, следовательно, изобретение может быть применимо в случае рака молочной железы. Существует две основных группы рака молочной железы: неинвазивная карцинома и инвазивная карцинома. К неинвазивным карциномам относится лобулярная карцинома ίη δίΐιι и протоковая карцинома ίη δίΐιι. К сожалению, раковые заболевания молочной железы часто прорастают через базальную мембрану, и примерно в 95% случаев рак молочной железы представляет собой инфильтрующие или инвазиивные карциномы. Наиболее распространенным типом инвазивного рака молочной железы (около 75%) является инвазивная протоковая карцинома, возникающая в млечных протоках и проникающая через стенки протоков. Инвазивная лобулярная карцинома возникает в молочных железах, и на ее долю приходится от 10 до 15% инвазивных раковых заболеваний молочной железы. Менее распространенные типы инвазивного рака молочной железы включают следующие типы: воспалительный рак молочной железы, рак соска Педжета, медуллярную карциному, муцинозную карциному, филлоидную опухоль и тубулярную карциному. Редко (примерно 1%) в молочных железах развиваются саркомы (рак соединительной ткани). У людей могут развиваться тот или иной или сочетание инвазивного и неинвазивного рака молочной железы. Таким образом, в дополнительных вариантах следующий предпочтительный тестируемый образец, используемый в способах согласно изобретению, содержит клетки молочной железы или молекулы нуклеиновой кислоты из клеток молочной железы. Наиболее предпочтительно тестируемый образец по- 11 021100 лучают из ткани молочной железы.

Другие ДНК-содержащие образцы для применения в способах согласно изобретению включают образцы для диагностических, прогностических или индивидуализированных медицинских применений. Такие образцы могут быть получены, например, из хирургических образцов, таких как биоптаты или тонкоигольные пунктаты, из залитых парафином тканей, из замороженных образцов опухолевых тканей, из свежих образцов опухолевых тканей или из свежей или замороженной жидкости организма. Неограничивающими примерами являются цельная кровь, костный мозг, спинномозговая жидкость, перитонеальная жидкость, плевральная жидкость, лимфа, сыворотка, плазма, моча, хилус, экскременты, эякулят, мокрота, сосочковый аспират, слюна, образцы мазков, образцы смывов ободочной кишки и образцы щеточной биопсии. Ткани и жидкости организма могут быть собраны с использованием любого подходящего способа, множество таких способов хорошо известно в данной области техники. Оценка залитого парафином образца может быть осуществлена непосредственно или на срезе ткани.

Термины образец, образец, полученный от пациента и образец пациента используют взаимозаменяемо, и термины предназначены для обозначения ДНК-содержащих образцов, полученных от пациента, которые описаны выше.

Способы согласно изобретению могут быть осуществлены на очищенных или неочищенных ДНКсодержащих образцах. Однако в предпочтительном варианте осуществления перед стадией (а) (стадией обработки реагентом) или в качестве предварительной стадии ДНК выделяют/экстрагируют/очищают из ДНК-содержащего образца. Можно использовать любую подходящую методику выделения ДНК. Примеры способов очистки можно найти в стандартных публикациях, таких как Мо1еси1аг С1ошпд - А ЬаЬота!оту Мапиа1 (ТЫтб Εάίίίοη), ЗатЬгоок апб Ки88е11 (см., в частности, приложение 8 и главу 5 в указанной публикации). В одном предпочтительном варианте очистка заключается в преципитации ДНК спиртом. Предпочтительные спирты включают этанол и изопропанол. Подходящими способами очистки также являются способы, основанные на преципитации солью. Таким образом, в одном конкретном варианте способ очистки ДНК включает в себя использование высокой концентрации соли для осаждения примесей. Соль может содержать, по существу состоять или состоять, например, из ацетата калия и/или ацетата аммония. Способ может дополнительно предусматривать стадии удаления осажденных примесей с последующим извлечением ДНК с использованием преципитации спиртом.

В альтернативном варианте осуществления способ очистки ДНК основан на использовании органических растворителей для экстракции примесей из клеточных лизатов. Таким образом, в одном варианте осуществления способ включает в себя использование фенола, хлороформа и изоамилового спирта для экстракции ДНК. Используют подходящие условия, чтобы гарантировать, что примеси отделены в органическую фазу и что ДНК осталась в водной фазе.

В дополнительных наборах используют магнитные шарики, мембраны на основе диоксида кремния и т.д. Такие наборы хорошо известны в данной области техники и коммерчески доступны. В способах согласно изобретению можно использовать набор для очистки ДНК ΡυΚΕΟΕΝΕ®.

В предпочтительных вариантах осуществления таких способов очистки экстрагированную ДНК извлекают, используя преципитацию спиртом, такую как преципитация этанолом или изопропанолом.

Получение фиксированной формалином, залитой парафином (ΡΤΡΕ) опухолевой ткани является обычным способом консервации опухолевой ткани в клинических центрах. Такие ΡΡΡΕ-залитые образцы требуют стадии удаления парафина перед экстракцией ДНК. В предпочтительном варианте осуществления образцы ΡΡΡΕ-тканей или материал образца, иммобилизованный на предметных стеклах, сначала депарафинизируют обработкой ксилолом. Период контакта с ксилолом должен быть достаточным, чтобы обеспечить возможность контакта и взаимодействия ксилола с образцом. В более предпочтительном варианте осуществления ΡΡΡΕ-образцы депарафинизируют в 100%-м ксилоле в течение примерно 2 ч. Указанную стадию можно повторить еще раз, чтобы гарантировать полную депарафинизацию. После обработки ксилолом образцы регидратируют, используя 70%-й этанол.

Способы согласно изобретению в соответствующих случаях также могут предусматривать (также перед стадией (а) или в качестве предварительной стадии) количественную оценку выделенной/экстрагированной/очищенной ДНК в образце. Количественная оценка ДНК в образце может быть осуществлена любыми подходящими способами. Количественная оценка нуклеиновых кислот может быть, например, основана на использовании спектрофотометра, флуориметра или УФ-трансиллюминатора. Примеры подходящих способов описаны в стандартных публикациях, таких как Мо1еси1аг С1ошпд - А ЬаЬога1оту Мапиа1 (ТЫтб Нб|11оп). ЗатЬгоок апб Ки88е11 (см., в частности, приложение 8 в указанной публикации). В предпочтительном варианте осуществления для количественной оценки ДНК можно использовать такие наборы, как набор для количественной оценки днДНК Ρί^^^η®, распространяемый Мо1еси1аг ГгоЬех, 1пуйтодеп.

Способы согласно изобретению могут быть основаны на использовании реагента, который избирательно модифицирует неметилированные остатки цитозина в ДНК с образованием определяемых модифицированных остатков. Способ действия реагента уже был объяснен. В предпочтительном варианте осуществления реагент, который избирательно модифицирует неметилированные остатки цитозина в

- 12 021100

ДНК с образованием определяемых модифицированных остатков, но который не модифицирует метилированные остатки цитозина, содержит, по существу состоит или состоит из бисульфитного реагента (Рготтег е1 а1., Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8с1. И8А 1992 89: 1827-1831). В данной области техники известно несколько бисульфитсодержащих реагентов, и подходящие наборы для осуществления реакции дезаминирования коммерчески доступны (такие как набор для метилирования ДНК ΕΖ от Ζуто Кекеагсй). Особенно предпочтительный реагент для применения в способах согласно изобретению содержит, по существу состоит или состоит из бисульфита натрия.

После обработки ДНК в образце реагентом необходимо выявить различие в нуклеотидной последовательности, обусловленное воздействием реагента. Выявление осуществляют, используя методику амплификации нуклеиновой кислоты. Как уже указано, функционально значимое метилирование чаще всего ассоциировано с областями промоторов. В частности, так называемые островки СрО характеризуются относительно высокой частотой встречаемости остатков СрО и часто расположены вблизи стартового сайта транскрипции гена. В случае некоторых генов, таких как, например, МАОЕ-3, распространение СрО в области промотора довольно редко. В таком случае в отношении метилирования можно оценивать области интронов и экзонов генов. Существуют различные компьютерные программы, позволяющие идентифицировать островки СрО в представляющем интерес гене. Соответственно, способы согласно изобретению могут предусматривать амплификацию по меньшей мере части метилированного или неметилированного представляющего интерес гена с использованием по меньшей мере одной пары праймеров. Как обсуждалось выше, поскольку представляющие интерес остатки, статус метилирования которых необходимо исследовать, обычно встречаются в ограниченных островках СрО и/или в области промотора и/или в областях интронов и/или в областях экзонов представляющего интерес гена, то пара праймеров обычно амплифицирует только часть гена (в данной области), а не полностью ген. Любая подходящая часть гена может быть амплифицирована способами согласно изобретению при условии, что продукт амплификации можно регистрировать в качестве надежного показателя присутствия представляющего интерес гена. Особенно легко регистрируемыми продуктами амплификации являются продукты размером примерно от 50 до 250 п.н. Еще более предпочтительно амплификация с использованием по меньшей мере одной пары праймеров для амплификации представляющего интерес метилированного или неметилированного гена дает продукт амплификации размером примерно от 100 до 200 п.н. или от 50 до 100 п.н. Это особенно важно для образцов ткани, особенно залитых парафином образцов, когда обычно получают ДНК ограниченного качества, и могут требоваться ампликоны меньшего размера. В предпочтительном варианте осуществления регистрируемый продукт амплификации содержит, по меньшей мере, любую из нуклеотидных последовательностей 8ЕО ГО N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 62 и 63. Предпочтительно получают продукт амплификация размером (приблизительно) 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 или 150 п.н.

По меньшей мере один праймер в паре праймеров и предпочтительно оба праймера конструируют так, чтобы они связывались только с последовательностью метилированной или неметилированной ДНК после обработки реагентом. Таким образом, праймер действует, позволяя отличать метилированный ген от неметилированного благодаря спариванию оснований либо только с метилированной формой гена (который остается немодифицированным после обработки реагентом), либо с неметилированной формой гена (который модифицируется реагентом) в зависимости от применения способов. Поэтому праймер должен охватывать по меньшей мере один сайт метилирования в представляющем интерес гене. Предпочтительно праймер связывается с областью гена, включающей в себя по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 сайтов метилирования. Наиболее предпочтительно праймер конструируют так, чтобы он связывался с последовательностью, в которой все остатки цитозина в парах СрО на участке связывания праймера метилированы или не метилированы - т.е. с полностью метилированной или полностью неметилированной последовательностью. Однако, если только один или несколько сайтов метилирования являются функционально значимыми, праймер может быть сконструирован так, чтобы он связывался с последовательностью-мишенью, в которой только такие остатки должны быть метилированы (остаются в виде цитозина) или неметилированы (превращаются в урацил) для того, чтобы происходило эффективное связывание. Другие (не являющиеся функционально значимыми) потенциальные сайты метилирования можно полностью обойти посредством конструирования подходящего праймера, или могут быть сконструированы праймеры, которые независимо связываются с учетом статуса метилирования таких менее значимых сайтов (например, благодаря включению смеси остатков О и А в соответствующее положение в последовательность праймера). Соответственно, продукт амплификации ожидается только в том случае, если присутствовала метилированная или неметилированная форма представляющего интерес гена в исходном ДНК-содержащем образце. Дополнительно или альтернативно, подходящим может быть случай, когда по меньшей мере один праймер в паре праймеров связывается только с последовательностью не- 13 021100 метилированной ДНК после обработки реагентом, а другой праймер связывается только с метилированной ДНК после обработки - например, когда ген содержит функционально важные сайты, которые метилированы и отделены от функционально важных сайтов, которые неметилированы.

Предпочтительно по меньшей мере один праймер в паре праймеров представляет собой праймер, содержащий структуру стебель-петля или шпильку, несущую донорный и акцепторный остаток пары для молекулярного переноса энергии. Такой праймер по необходимости является или не является праймером, который отличает метилированную ДНК от неметилированной ДНК. Праймер расположен так, что в отсутствие амплификации акцепторный остаток гасит флуоресценцию, испускаемую донорным остатком при возбуждении. Таким образом, перед амплификацией или в отсутствие амплификации, направляемой праймером, структура стебель-петля или шпилька остается интактной. Флуоресценцию, испускаемую донорным остатком, эффективно принимает акцепторный остаток, что приводит к гашению флуоресценции.

Во время амплификации конфигурация структуры стебель-петля или шпилька изменяется. В частности, после того, как праймер включается в продукт амплификации и, в частности, в двухцепочечную ДНК (особенно во время второго раунда амплификации), структура стебель-петля или шпилька нарушается. Такое изменение структуры разделяет донорный и акцепторный остатки на достаточное расстояние, так что акцепторный остаток больше не способен эффективно гасить флуоресценцию, испускаемую донорным остатком. Таким образом, донорный остаток генерирует регистрируемый сигнал флуоресценции. Такой сигнал регистрируют в реальном времени, получая показатель количества генных копий представляющего интерес метилированного или неметилированного гена.

Таким образом, в способах согласно изобретению можно использовать олигонуклеотиды для амплификации нуклеиновых кислот, которые метят определяемыми метками, используя метки молекулярного переноса энергии (МЕТ). Праймеры содержат донорный и/или акцепторный остаток пары МЕТ и включаются в амплифицированный продукт реакции амплификация, так что амплифицированный продукт содержит как донорный, так и акцепторный остаток пары МЕТ.

Когда амплифицированный продукт является двухцепочечным, пара МЕТ, включенная в амплифицированный продукт, может быть на одной и той же цепи или, когда амплификация представляет собой тройную амплификацию, на противоположных цепях. В некоторых случаях, когда полимераза, используемая при амплификации, обладает 5'-З'-экзонуклеазной активностью, один из остатков пары МЕТ может быть отщеплен, по меньшей мере, от некоторой популяции амплифицированного продукта под действием экзонуклеазной активности. Такая экзонуклеазная активность не вредна для способов амплификации согласно изобретению.

Способы согласно изобретению, которые обсуждаются в настоящем документе, могут быть адаптированы ко многим способам амплификации последовательностей нуклеиновой кислоты, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР), тройную амплификацию и другие системы амплификации.

В предпочтительном варианте осуществления МЕТ представляет собой резонансный перенос энергии флуоресценции (РКЕТ), при котором олигонуклеотиды метят донорным и акцепторным остатками, причем донорным остатком является флуорофор, и акцепторный остаток может быть флуорофором, так что энергия флуоресценции, испускаемой донорным остатком, поглощается акцепторным остатком. Акцепторный остаток может быть гасителем. Таким образом, праймером для амплификации является праймер в виде шпильки, который содержит как донорный, так и акцепторный остатки и имеет такую конфигурацию, что акцепторный остаток гасит флуоресценцию донора. Когда праймер включается в продукт амплификации, его конфигурация изменяется, гашение прекращается, и флуоресценция донорного остатка может быть зарегистрирована.

Способы согласно изобретению позволяют выявлять продукт амплификации без предварительного отделения не включившихся олигонуклеотидов. Кроме того, способы позволяют непосредственно выявлять продукт амплификации благодаря включению меченого олигонуклеотида в продукт.

В предпочтительном варианте осуществления способы согласно изобретению также включают в себя определение экспрессии эталонного гена. Эталонные гены важны для того, чтобы можно было проводить сравнение между разными образцами. В результате подбора подходящего гена, который, как полагают, стабильно и гарантированно экспрессируется в разных сравниваемых образцах, регистрация амплификации эталонного гена вместе с представляющим интерес геном учитывает вариабельность среди образцов, например, вариабельность по количеству вводимого материала, эффективности ферментов, разрушению образцов и т.д. Эталонный ген в идеальном случае должен в присутствии достаточного количества вводимой ДНК быть геном, который константно экспрессируется в образцах в условиях испытания. Таким образом, результаты, полученные для представляющего интерес гена, могут быть нормализованы относительно соответствующего количества копий эталонного гена. Подходящие эталонные гены для настоящего изобретения включают гены β-актина, глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы (ОАРЭН), рибосомной РНК, таких как ген рибосомной РНК 188, и ген РНК-полимеразы II (Кайотс А. е1 а1., ВюсЕет. ВюрЕук. Ке8. Соттип. 2004 1аи 2З; З1З(4): 856-62). В особенно предпочтительном варианте осуществления эталонным геном является ген β-актина.

- 14 021100

Таким образом, способы согласно изобретению могут дополнительно характеризоваться амплификацией по меньшей мере части эталонного гена с использованием по меньшей мере одной пары праймеров, причем по меньшей мере одним праймером в паре праймеров является праймер, содержащий структуру стебель-петля, обладающую указанными выше свойствами.

Любая походящая часть эталонного гена может быть амплифицирована способами согласно изобретению при условии, что продукт амплификации можно регистрировать в качестве надежного показателя присутствия эталонного гена. Особенно легко регистрируемыми продуктами амплификации являются продукты размером примерно от 50 до 250 п.н. Еще более предпочтительно амплификация с использованием по меньшей мере одной пары праймеров для амплификации эталонного гена дает продукт амплификации размером примерно от 50 до 150 п.н. Это особенно важно в случае образцов ткани, особенно залитых парафином образцов, когда обычно получают ДНК ограниченного качества.

В вариантах осуществления, в которых эталонный ген включают в способы согласно изобретению, способы дополнительно могут характеризоваться тем, что стадия способов, на которой осуществляют количественную оценку результатов регистрации (в реальном времени) по сравнению со стандартной кривой для представляющего интерес метилированного или неметилированного гена, также предусматривает количественную оценку результатов регистрации в режиме реального времени эталонного гена по сравнению со стандартной кривой для эталонного гена, чтобы в каждом случае получить данные о выходе количества генных копий, и необязательно дополнительно предусматривает нормализацию результатов путем деления количества генных копий представляющего интерес метилированного или неметилированного гена на количество генных копий эталонного гена.

Опять же, способы могут отличаться тем, что амплификацию считают достоверной, когда значение порогового цикла меньше или равно 40.

Для амплификации по меньшей мере части эталонного гена обычно используют по меньшей мере одну пару праймеров. Предпочтительно по меньшей мере одним праймером в паре праймеров является праймер, содержащий структуру стебель-петля, несущую донорный и акцепторный остаток пары молекулярного переноса энергии, как в случае представляющего интерес гена. Способ действия такой структуры во время амплификации объясняется выше.

Праймеры в виде шпилек для применения в способах согласно изобретению наиболее предпочтительно представляют собой праймеры, которые описаны в патенте США № 6090552 и Европейском патенте № 0912597, содержание которых включено в настоящее описание в полном объеме. Такие праймеры коммерчески известны как праймеры Атрййиог®. Таким образом, в особенно предпочтительном варианте осуществления праймер, содержащий структуру стебель-петля, используемый для амплификации части представляющего интерес гена и/или эталонного гена, содержит, по существу состоит или состоит из следующих непрерывно следующих друг за другом последовательностей в порядке от 5'- к 3'концу:

(a) первой нуклеотидной последовательности длиной примерно от 6 до 30 нуклеотидов, причем нуклеотид в указанной первой нуклеотидной последовательности помечен первым остатком, выбранным из донорного остатка и акцепторного остатка пары для молекулярного переноса энергии, причем донорный остаток при возбуждении испускает флуоресценцию при одной или нескольких конкретных длинах волн, а акцепторный остаток поглощает и/или гасит указанную флуоресценцию, испускаемую указанным донорным остатком;

(b) второй одноцепочечной нуклеотидной последовательности, содержащей, по существу состоящей или состоящей примерно из 3-20 нуклеотидов;

(c) третьей нуклеотидной последовательности, содержащей, по существу состоящей или состоящей примерно из 6-30 нуклеотидов, причем нуклеотид в указанной третьей нуклеотидной последовательности метят вторым остатком, выбранным из указанного донорного остатка и указанного акцепторного остатка, и указанный второй остаток является представителем указанной группы, которым не помечена указанная первая нуклеотидная последовательность, причем указанная третья нуклеотидная последовательность комплементарна в обратном порядке указанной первой нуклеотидной последовательности, так что может образовываться дуплекс между указанной первой нуклеотидной последовательностью и указанной третьей нуклеотидной последовательностью таким образом, что указанные первый остаток и второй остаток оказываются рядом друг с другом, так что когда донорный остаток возбуждается и испускает флуоресценцию, акцепторный остаток поглощает и гасит указанную флуоресценцию, испускаемую указанным донорным остатком; и (б) находящейся на 3'-конце праймера четвертой одноцепочечной нуклеотидной последовательности, содержащей, по существу состоящей или состоящей примерно из 8-40 нуклеотидов, которая содержит на своем 3'-конце любую из нуклеотидных последовательностей, указанных в 8ЕО ГО N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 62 и 63 (и таким образом способной праймировать синтез полимеразой нуклеиновых кислот нуклеотидной последовательности, комплементарной цепи нуклеиновой кислоты, содержащей часть метилированной или неметилированной ДНК гена); причем когда указанной дуплекс не образуется, указанный первый остаток и указанный второй остаток раз- 15 021100 делены на такое расстояние, которое предотвращает молекулярный перенос энергии между указанным первым и вторым остатком.

В особенно предпочтительном варианте осуществления донорный остаток и акцепторный остаток образуют пару для резонансного переноса энергии флуоресценции (РКЕТ). Молекулярный перенос энергии (МЕТ) представляет собой процесс, при котором энергия нерадиоактивно переходит от донорной молекулы к акцепторной молекуле. Резонансный перенос энергии флуоресценции (РКЕТ) является формой МЕТ. РКЕТ возникает благодаря определенным свойствам некоторых химических соединений; при возбуждении под действием конкретных длин волн света они испускают свет (т.е. они флуоресцируют) с другой длиной волны. Такие соединения называют флуорофорами. В случае РКЕТ энергия нерадиоактивно передается на длинное расстояние (10-100 А) между донорной молекулой, которая является флуорофором, и акцепторной молекулой. Донор поглощает фотон и нерадиоактивно передает такую энергию акцептору (Рбтк!ет, 1949, Ζ. №ЦигГогкс1т А4: 321-327; С1едд, 1992, Мебюбк Еп/уто1. 211: 353-388). Когда два флуорофора, спектры возбуждения и эмиссии которых перекрываются, находятся близко друг к другу, возбуждение одного флуорофора будет заставлять его испускать свет с длинами волн, которые поглощаются вторым флуорофором и которые стимулируют второй флуорофор, в свою очередь, заставляя его флуоресцировать. Другими словами, энергия возбужденного состояния первого (донорного) флуорофора передается благодаря индуцированному резонансом диполь-дипольному взаимодействию на находящийся рядом второй (акцепторный) флуорофор. В результате время жизни донорной молекулы уменьшается и его флуоресценция гасится, тогда как интенсивность флуоресценции акцепторной молекулы увеличивается и деполяризуется. Когда энергия возбужденного состояния донора переносится на акцептор, не являющийся флуорофором, флуоресценция донора гасится без последующего испускания флуоресценции акцептором. В таком случае акцептор функционирует как гаситель. И гасители, и акцепторы могут быть использованы в настоящем изобретении. Пары молекул, которые могут осуществлять резонансный перенос энергии флуоресценции (РКЕТ), называют парами РКЕТ. Чтобы происходил перенос энергии, донорная и акцепторная молекулы обычно должны находиться в тесной близости друг с другом (до 70-100 А) (С1едд, 1992, Мебюбк Еп/уто1. 211: 353-388; §е1уш, 1995, Ме!Нобк Еп/уто1. 246: 300-334). Эффективность переноса энергии быстро снижается с увеличением расстояния между донорной и акцепторной молекулами. Согласно Рбгк!ег (1949, Ζ. №ЦигГогкс1т А4:321-327) эффективность переноса энергии пропорциональна Όχ10^-6, где Ό означает расстояние между донором и акцептором. Фактически это означает, что РКЕТ может наиболее эффективно происходит до достижения расстояний около 70 А. Молекулы, которые обычно используют в РКЕТ, обсуждаются в отдельном разделе. Является ли флуорофор донором или акцептором, определяется его спектрами возбуждения и испускания и флуорофором, с которым он составляет пару. Например, РАМ наиболее эффективно возбуждается светом с длиной волны 488 нм и испускает спектр света от 500 до 650 нм с максимумом испускания 525 нм. РАМ является подходящим донорным флуорофором для применения с ГОЕ, ТАМКАН КОХ (каждый из которых имеет максимум возбуждения при 514 нм).

В одном особенно предпочтительном варианте осуществления указанным донорным остатком является флуоресцеин или его производное, а указанным акцепторным остатком является дабцил. Предпочтительно производное флуоресцеина содержит, по существу состоит или состоит из 6-карбоксифлуоресцеина.

Метки МЕТ могут быть связаны в любой подходящей точке праймеров. В особенно предпочтительном варианте осуществления донорный и акцепторный остатки расположены на комплементарных нуклеотидах в структуре стебель-петля, так чтобы когда структура стебель-петля интактна, остатки находились в тесной физической близости друг к другу. Однако праймеры согласно изобретению можно метить остатками в любом положении, эффективно обеспечивающем возможность МЕТ/РКЕТ между соответствующими донором и акцептором в отсутствие амплификации и разделение донора и акцептора после того, как праймер включается в продукт амплификации.

Последовательность структуры стебель-петля или шпилька не зависит от нуклеотидной последовательности гена-мишени (представляющего интерес гена или эталонного гена), так как она не связывается с ней. Соответственно, могут быть сконструированы универсальные последовательности структуры стебель-петля или шпилька, которые затем могут быть объединены со специфичным для последовательности праймером, чтобы облегчить регистрацию в режиме реального времени представляющей интерес последовательности. Основное требование к последовательности заключается в том, чтобы последовательность образовывала структуру стебель-петля/шпилька, которая является стабильной в отсутствие амплификации (и, следовательно, обеспечивает эффективное гашение). Таким образом, специфичная для последовательности часть праймера связывается с матричной цепью и направляет синтез комплементарной цепи. Следовательно, праймер становится частью продукта амплификации в первом раунде амплификации. Когда комплементарная цепь синтезируется, амплификация происходит вдоль структуры стебель-петля/шпилька. При этом происходит разделение молекул флуорофора и гасителя, приводя к генерированию флуоресценции по мере протекания амплификации.

Структура стебель-петля предпочтительно находится на 5'-конце специфичной для последова- 16 021100 тельности части праймера, используемого для амплификации.

Как указано выше, такую детекторную последовательность обычно метят парой РКЕТ. Предпочтительно один остаток из пары РКЕТ находится по направлению, вблизи или на 5'-конце последовательности, а другой остаток находится по направлению, вблизи или на 3'-конце последовательности, так что когда структура стебель-петля или шпилька остается интактной, эффективно происходит РКЕТ между двумя остатками.

Как подробно описано в экспериментальном разделе, праймеры необходимо тщательно выбирать, чтобы гарантировать чувствительность и специфичность способов согласно изобретению. Соответственно, особенно предпочтительным праймером для применения при определении статуса метилирования гена является праймер, содержащий, по существу состоящий или состоящий из нуклеотидной последовательности, указанной в виде

5’- АОСОАТССОТГСОАОСАТСОСиоаААССТСССССАСАСТС -3’ (КЕО ГО ΝΟ: 1),

5' - ААААСААСАСААССССААААА - 3' (ЗЕф ГО ΝΟ. 2), и/или

5’ - АСССАТОССТГСОАССАТСОСиААААСААСАСААССССААААА - 3’ (3Ε0 ГО ΝΟ.

3), и/или

5’ - ОСААООТСССССАОАСТО - 3’ (5Еф ГО N0.4), и/или

5’- АОСОАТСЮОТГСаАОСАТСОСиоаОТГаОАОАОТГОТТТОТТТО - 3' (8Е0 ГО ΝΟ.

5), и/или

и/или

и/или и/или и/или и/или и/или и/или и/или и/или и/или и/или и/или и/или и/или и/или

5' - ОООГГОСАСАСТГСТТТСТТГО - 3'(5Еф ГО ΝΟ. 8),

5' - АССОАТСССТТСОАССАТСССиТСОТССТСТТСТТТГТОТСТ - 3’<8НР ГО ΝΟ. 9),

5' - СТТААСССТАТГАТСТССАТСТС - 3’<8Е0 ГО ΝΟ. 10),

5’ - АОСОАТОСОТТСОАОСАТСССиСТТААСССГАТТАТСТССАТСТС - 3’ (8Εζ> ГО ΝΟ. 11),

5’-ΤΟΟταθΤΟΓΚ3ΤΓΤπ·ΟΤΟΤ-3’(8Ε(?ΙΠΝΟ. 12),

5’ - АСССАТОСОТГСОАССАТСОСиСОТООТПТСААСОАТт’АТГО 3’ (8ЕЦ ГО ΝΟ. 13),

5' - АСССААСАССГТСССТАТССТ - 3' (5Е0 ГО ΝΟ. 14),

5’ - АОСОАТССаТГСОАОСАТСССиАСССААСАССГГСССТАТССТ - ЗЧЗЕ0 ГО N0. 15),

5’ - ООТССтТСААССАТПТАТГС - 3’ (8Еф ГО ΝΟ. 16),

5' - АОСОАТСССТГССАОСАТССС1ЛТТГОТТГГООСАТОТГОТАТГГТ - 3' (3Ε0 ГО ΝΟ. 17),

5’ - ССТСАТССАСССААСАССТГ - 3’(8Еф ГО N0. 18),

5’ - АОСОАТОСОГГСОАОСАТСОСиССТСАТССАСССААСАССТГ - 3Ί3Ε0 ГО ΝΟ. 19),

5’ -ТГ1ТСТТТГСССАТСТТСТАТТТТ-3’(5Е0ГОКО. 20),

5’ - АССОАТСССТТССАССАТСССиТССОТГГСТАСТСТТТГАСТАТТСТТТ - 3’{5Е0 Π3ΝΟ. 21),

- 17 021100 и/или и/или и/или и/или и/или и/или и/или и/или и/или и/или и/или и/или и/или и/или и/или и/или и/или и/или

5'-ТССАСССГАСТТТСССГАСАТТС - 3’(5Ε<) Ι13ΝΟ. 22),

5’ - АОСОАТОСОТТСОАОСАТСОСШССАСССТАСТТТСССГАСАТТС - 3’(8ЕЦ ГО ΝΟ. 23),

5’ - ТСССЛТГОТЛСТС'ГТТТАСТЛТТСТТТ - 3’(8Е<3 ГО N0.24),

5’ - АОСОАТССОТТСОАССАТСОСиТТСТТГТССОАТАТТГГАТТГСТГГГ 3’(8ЕЦ ГО N0.25),

5’ - АААААСТССАСССТАСТГГСС - 3'(5Ер ГО N0.26),

5’ - АОСОАТОСОТТСОАОСАТСОСиАААААСТССАСССТАСГГТСС - 3Ύ3ΕΟ ГО ΝΟ. 27),

5’ -ΤΤΟΤΤΓΤΟΟΟΑΤΑΊΤΊΤΑΤΤΓθτπΤ-3’(8Ε9ΙΟΝΟ. 28),

5’ - АОСОАТОСОТГСОАОСАТСОСиОАООООАСККЗОТСТОААТОТО - 3Ύ8ΕΟ ГО ΝΟ. 29),

5’ - САТГССТСССТАСТСССААААА - 3’(5Щ ГО ΝΟ. 30),

5’ - АОСОАТСООТГССАССАТСОСиСАТГССТСССГАСТСССААААА - 3’(8ЕЦ ГО ΝΟ. 31),

5’ -ОАСОООАООООТОТОААТОТО- 3’(5ЕЦ ГО ΝΟ. 32),

5’ - АОСОАТОСОТГСОАОСАТСОСиТООТООАТОТГГТОООАТГГ - 3’(8ЕО ГО ΝΟ. 33),

5’ - СААСАТТГСТАССТСТАСГСССАССТГ - 3’(5Еф ГО ΝΟ. 34),

5’ - АОСОАТССОТГСОАОСАТСССиСААСАТТТСТАССТСТАСТСССАССТГ - 3’(5Еф

ΤΟΝΟ. 35),

5’ - ТОаТООАТОТТТГСЮОАТГГ - 3’(8ЕЦ ГО ΝΟ. 36),

5’ - АОСОАТОСОТТСОАОСАТСОСиОГГГТООААООАТГОАОАААТОО - 3’(5ЕЦ ГО ΝΟ. 37),

5’ -САСССГААССАСТАСАТААААСААА-3’(5ЕЦГО ΝΟ. 38),

5’ - АОСОАТОСОТГСОАОСАТСССиСАСССТААССАСТАСАТААААСААА - 3’(8Е<) ГО N0.39), и/или

5’ ОТГТТОС.ААССтАТТСАСтАЛЛТОО - 3’ (8Е0 ГО ΝΟ. 40), и/или

5’ - АОСОАТОСОТТСОАОСАТСОСиТАОООАОТАТАТАООТГСЗОООААОТТ- З'(ЗЕС) ГО N0.41), и/или

5’ - ААСАСАСААТААСАААСАСАААТТСАС - 3’ (5Е0 ГО ΝΟ. 42), и/или

5’ -АОСОАОТАТАТАСОТТООООААОТТ - 3’ (8ЕЦ ГО ΝΟ. 44), и/или

АОСОАТОСОТТСОАОСАТСОСиТООААТГГАОООТАОТАТТСГГ- 3' (5Еф ГО ΝΟ. 61),

- 18 021100 и/или

5’ - СССТССАССААСАТСААА - 3’ (8Е<} ГОΝΟ. 62),

5’- ТСОААТГГАССОТАОТАТТСТ - 3' (8ЕЦ ГО ΝΟ. 63),

ЗЕЦ ГО N0: 4 и 8 представляют собой последовательности прямого праймера (смыслового праймера), комплементарные подвергнутой превращению с использованием бисульфита неметилированной последовательности СТАО1В.

ЗЕЦ ГО N0: 12, 16 и 20 представляют собой последовательности прямого праймера (смыслового праймера), комплементарные подвергнутой превращению с использованием бисульфита неметилированной последовательности СТАО2.

ЗЕЦ ГО N0: 24, 28, 32, 36 и 40 представляют собой последовательности прямого праймера (смыслового праймера), комплементарные подвергнутой превращению с использованием бисульфита неметилированной последовательности РКАМЕ.

ЗЕЦ ГО N0: 43 представляет собой последовательность структуры в виде шпильки.

ЗЕЦ ГО N0: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33 и 37 содержат последовательность структуры в виде шпильки и последовательность ЗЕЦ ГО N0: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36 и 40, соответственно.

ЗЕЦ ГО N0: 2 и 6 представляют собой последовательность обратного праймера (антисмыслового праймера), комплементарную подвергнутой превращению с использованием бисульфита неметилированной последовательности промотора СТАО1В.

ЗЕЦ ГО N0: 10, 14 и 18 представляют собой последовательность обратного праймера, комплементарную подвергнутой превращению с использованием бисульфита неметилированной последовательности промотора СТАО2.

ЗЕЦ ГО N0: 22, 26, 30, 34 и 38 собой представляют последовательность обратного праймера, комплементарную подвергнутой превращению с использованием бисульфита неметилированной последовательности промотора РКАМЕ.

ЗЕЦ ГО N0: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35 и 39 содержат последовательность структуры в виде шпильки и последовательность ЗЕЦ ГО N0: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34 и 38.

ЗЕЦ ГО N0 42 и 44: представляют собой последовательности прямого и обратного праймера, комплементарные подвергнутой превращению с использованием бисульфита метилированной последовательности гена β-актина.

ЗЕЦ ГО N0: 41 содержит последовательность структуры в виде шпильки и последовательность ЗЕЦ ГО 44.

ЗЕЦ ГО N0: 63 представляет собой последовательность прямого праймера (смыслового праймера), комплементарную подвергнутой превращению с использованием бисульфита неметилированной последовательности МадеА3.

ЗЕЦ ГО N0: 61 содержит последовательность структуры в виде шпильки и последовательность ЗЕЦ ГО N0: 63.

ЗЕЦ ГО N0: 62: представляет собой последовательность обратного праймера, комплементарную подвергнутой превращению с использованием бисульфита неметилированной последовательности МадеА3.

Как подробно описано в экспериментальном разделе, выявлена наилучшая согласованность уровней экспрессии и метилирования СТАО2 для анализов, в которые включали праймеры с любой из последовательностей ЗЕЦ ГО N0: 9-12 и ЗЕЦ ГО N0: 21-20. Как подробно описано в экспериментальном разделе, выявлена наилучшая согласованность уровней экспрессии и метилирования РКАМЕ в анализах, в которых включали праймеры с любой из последовательностей ЗЕЦ ГО N0: 21-40.

Таким образом, в другом варианте осуществления предпочтительный праймер, связывающийся с областью СТАО2, содержит, по существу состоит или состоит из любой из нуклеотидных последовательностей ЗЕЦ ГО N0: 9-12 и ЗЕЦ ГО N0: 21-20. Предпочтительный праймер, связывающийся с областью РКАМЕ, содержит, по существу состоит или состоит из любой из нуклеотидных последовательностей З1Т) ГО N0: 21-40.

Продукты амплификации, образованные с использованием разных анализов гипометилирования, имели следующие последовательности:

- 19 021100

СГАС1В1 (129 п.н.)

ОаААССТСОССОАОАОТСК)Т1Т(ЮАТТТТАОТАТ1Т1Т1ТтТТТГАОСОТТАООТГ ТТСТТТТКПТАТГ1Т1ТОТГСТГАТАООТСТОТ1ТООТАТАОАТАТТГАОТТПТООСС ТГОТОТГОТПТ (81-011) ΝΟ. 45)

СГАС1В_2 (130 п.н.)

ΟΟΟπΟΟΑΟΑΟπΟΤΠΌΤΤΤΟΑαΠΟΤΑΠΤΓαΤΤΠΟΤΠΤΟΤΠΤΟΤΠΤΟΑΤΑΟΤ птоатоотоАаотооааопоооАОАтооооАооотАооопАоотаоооаАоо АООТОООООАОАТО(8ЕО ГО ΝΟ. 46)

СГАС2 (150 П.Н.) тоотоотопотттототАоаАтаоААоотатттотоооопАооАаопаоА ТАОПОТТТаТПТАОПТЩАТТПОТТПОТПТатПТАООАООТТТТООТООТОАО ОТОООООПОТОАОАТООАОАТААТАОООПААО (8Γ.ΓΙ ГО ΝΟ. 47)

СГАС2_2 (80 П.Н.)

ООТООТТГТОААООАТПТАПОТОТТТООТААТПАТТОТТТАТОПАОГГТОООАТ ТАООАТАОООААООТОТГОООТ(ЗЕ<2 ГО ΝΟ. 48)

СГАС2 3 (125 П.Н.)

ТТТТОТТТГОООАТОТТОТАТТТТПТПТОАТТАООООТООТТТТОААООАТТТТАТТ ΟΤΟΤΤΤΟΟΤΑΑΤΤΤΑΤΤΟΤΤΤΑΤΟΠΑΟΠΤΟΟΟΑΠΑΟΟΑΤΑΟΟΟΑΑΟΟΤΟΤΓΟΟΟ ТСОАТОАОО (8 К) Π3ΝΟ. 49)

РКАМЕ1:129 п.н.

ТОООТТТОТАОТСТПТАОТАПСПТГССЮАТАТПТАПТСТППТАООТОТОАП ТСТГААТАССТГГСТАТТСЮТОАТААААООАОТАОТПТСААТаТАСССАААСТАСО ΟΤΟΟΑΟΤΤΤΠΤΟ (5Е0 ГО ΝΟ. 50)

РКАМЕ_2:106 пл.

ТТОТТГГОООАТАТТГГАТГТОТТТГГГАООТаТаАТТТОТТААТАООТГГОТАТТОаТ ОАТААААООАОТАОТПТОААТОТАОООАААОТАОаОТООАОТтТ (5>Ер ГО ΝΟ.

51)

РКАМЕЗ: 120 пл.

ОАООООАООООТОТОААТОТаТООАТГПТатаОАОАОТСОАААТАТОСООАОПО ΑΟΟΟΟΑΟΤΑΤΟΤΟΤΟΟΟΠΤΓΑΟΑΑΑΟΤΤΤΤΟΟΟΑΑΑΤΤΟΑΤΓΠΤΟΟΟΑΟΤΑΟΟΟΑ ССААТО (8Е0 ГО ΝΟ. 52)

РЕАМЕ_4: 59 п.н.

АОТОПООАООТПТОАООПАОПТААОПОТПТААААТООААТОААООТОТГГО ΤΟ(8Ε()ΙΟΝΟ. 53)

РКАМЕ_6:50 п.н.

оотАатсстстАССТСТптАсаААоатоаалатАаАоатАСАААТогго (зео го ΝΟ. 54)

РКАМЕ_7: 98 пл.

ОТПТОСААООАПОАОАААТООООАПООПАОАТГАООПОТТГАОПТтООТ

Эти последовательности локализованы в СрО-богатых островках соответствующих генов. Соответственно, изобретение, кроме того, относится к олигонуклеотидам, праймерам и/или зондам, состоящим или комплементарным частям подвергнутых превращению с использованием бисульфита нуклеотидных последовательностей, указанных в 8Е0 ГО N0: 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 или 55.

Часть праймера, состоящая или комплементарная частям подвергнутой превращению с использованием бисульфита последовательности гена СТАО1В, СТАО2 и/или РКАМЕ, предпочтительно имеет длину менее 30 п.н.; предпочтительно 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18 или 17 п.н. Таким образом, специфичная для СТАО1В, СТАО2 и/или РКАМЕ часть такого предпочтительного праймера предпочтительно имеет длину от 28 до 16 п.н., или от 27 до 17 п.н. Таким образом, праймер может содержать любую последовательность из 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18 или 17 следующих друг за другом оснований, состоящую или комплементарную подвергнутым превращению с использованием бисульфита последовательностям.

Любой один или оба праймера (в паре праймеров) могут быть помечены или могут быть синтезированы так, чтобы они содержали структуру типа стебля-петли, или шпильки, несущую донорный и акцепторный остаток, предпочтительно на 5'-конце, как подробно обсуждается выше. В предпочтительном варианте осуществления один или оба праймера метят или синтезируют так, чтобы они содержали предпочтительно на 5'-конце структуру типа стебель-петля, содержащую, по существу состоящую или состоящую из нуклеотидной последовательности, указанной ниже

- 20 021100

Такую детекторную последовательность обычно метят парой РКЕТ. Предпочтительно один остаток из пары РКЕТ находится по направлению, вблизи или на 5'-конце последовательности, а другой остаток находится по направлению, вблизи или на З'-конце последовательности, так что, когда структура стебель-петля или шпилька остается интактной, эффективно происходит РКЕТ между двумя остатками. В особенно предпочтительном варианте осуществления структуру стебель-петля или шпилька, особенно нуклеиновую кислоту, содержащую, по существу состоящую или состоящую из последовательности, указанной в 8ЕС ГО N0: 1, метят на 5'-конце, используя РАМ, а на З'-конце, используя дабцил. Другие предпочтительные сочетания обсуждаются в настоящем документе, и такое обсуждение применимо в данном случае с соответствующими изменениями.

Указанные праймеры составляют отдельные аспекты настоящего изобретения. Дополнительные характеристики таких праймеров суммированы в подробном описании (в экспериментальной части) ниже. Следует отметить, что в настоящем изобретении могут использованы варианты олигонуклеотидов, праймеров и зондов (последовательностей). В частности, могут быть добавлены дополнительные фланкирующие последовательности, например, чтобы при необходимости повысить специфичность связывания или образования структуры стебель-петля. Варианты последовательностей предпочтительно имеют по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность нуклеотидной последовательности с нуклеотидными последовательностями праймеров и/или зондов, указанных в 8ЕС ГО N0: 1-42 и 8ЕС ГО N0: 44, 60, 61 и 62. Праймеры и структуры типа шпилек в подходящем случае могут содержать синтетические аналоги нуклеотидов или могут быть основаны, например, на ДНК, РНК или ПНК или их смесях. Подобным образом в соответствующих случаях могут быть использованы альтернативные флуоресцирующие донорные и акцепторные остатки/пары РКЕТ. В дополнение к мечению флуоресцирующими донорными и акцепторными остатками праймеры могут содержать модифицированные олигонуклеотиды и другие дополнительные группы и метки, при условии, что не нарушается функциональность в качестве праймера и/или структуры стебель-петля/шпилька в способах согласно изобретению.

В случае каждой пары праймеров по меньшей мере один праймер метят донорным и акцепторным остатком пары для молекулярного переноса энергии, расположенными так, что в отсутствие амплификации акцепторный остаток гасит флуоресценцию, испускаемую донорным остатком (после возбуждения), а во время амплификации структура стебель-петля нарушается, и при этом донорный и акцепторный остатки отделяются на достаточное расстояние, чтобы обеспечить регистрируемый сигнал флуоресценции, который регистрируют в реальном времени, получая показатель количества генных копий гена. Предпочтительно указанной донорный остаток и указанной акцепторный остаток представляют собой пару РКЕТ. В одном варианте указанный донорный остаток и указанный акцепторный остаток выбраны из 5-карбоксифлуоресцеина или 6карбоксифлуоресцеина (РАМ), 27'-диметокси-4'5'-дихлоро-6-карбоксифлуоресцеина (ГОЕ), родамина, 6карбоксиродамина (К6С), ^^№-тетраметил-6-карбоксиродамина (ТАМКА), 6-карбокси-Х-родамина (КОХ), 5-(2'-аминоэтил)аминонафталин-1-сульфоновой кислоты (ΕΌΛΝ8). антраниламида, кумарина, производных хелата тербия, малахитовой зелени, реактивного красного 4, дабцила, тетраметилродамина, пиренбутирата, эозина нитротирозина, этидия и техасского красного. В следующем варианте указанный донорный остаток выбран из флуоресцеина, 5-карбоксифлуоресцеина или 6-карбоксифлуоресцеина (РАМ), родамина, 5-(2'аминоэтил)аминонафталин-1-сульфоновой кислоты (ЕОАЖ), антраниламида, кумарина, производных хелата тербия, малахитовой зелени и реактивного красного 4, а указанный акцепторный остаток выбран из дабцила, родамина, тетраметилродамина, пиренбутирата, эозина нитротирозина, этидия и техасского красного. Предпочтительно указанным донорным остатком является флуоресцеин или его производное, а указанным акцепторным остатком является дабцил, наиболее предпочтительно донорным остатком является 6карбоксифлуоресцеин. Другие предпочтительные сочетания, особенно в мультиплексном контексте, обсуждаются в настоящем документе, и такие сочетания также предусмотрены в указанных аспектах изобретения.

Изобретение также относится к наборам, которые можно применять для осуществления способов согласно изобретению. Наборы могут включать любой из предпочтительных признаков, указанных в связи с различными способами (и применениями) согласно изобретению, описанными в настоящем документе. Таким образом, изобретение относится к набору для регистрации присутствия и/или количества представляющего интерес метилированного или неметилированного гена в ДНК-содержащем образце, включающему в себя по меньшей мере одну пару праймеров согласно изобретению. Предпочтительно набор содержит пару праймеров согласно изобретению для определения присутствия и/или количества неметилированного и/или метилированного гена СТАС1В, СТАС2, РКАМЕ и/или МадеАЗ и пару праймеров для определения присутствия и/или количества эталонного гена, в частности β-актина. Таким образом, набор может содержать пары праймеров, включающие в себя праймер, содержащий, по существу состоящий или состоящий из нуклеотидной последовательности, указанной в 8ЕС ГО N0: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 44, 60, 61 или 62. Предпочтительно по меньшей мере один праймер в каждой паре праймеров метят с использованием подходящей структуры типа стебель-петля или шпилька, чтобы

- 21 021100 облегчить регистрацию в реальном времени, как обсуждается выше (приведенное обсуждение применимо и в данном случае с соответствующими изменениями). Наиболее предпочтительно по меньшей мере один праймер в каждой паре праймеров содержит структуру типа стебель-петля или шпилька, которая содержит, по существу состоит или состоит из нуклеотидной последовательности, указанной в 8ЕЦ ГО N0: 43. Структуру типа стебель-петля метят подходящим донорным и акцепторным остатком, как обсуждается в настоящем документе (приведенное обсуждение применимо и в данном случае с соответствующими изменениями).

Как указано выше, дополнительные характеристики праймеров согласно изобретению суммированы в подробном описании (в экспериментальной части) ниже. В настоящем изобретении могут быть использованы варианты таких последовательностей, которые обсуждаются в настоящем документе. В соответствующих случаях могут быть использованы альтернативные флуоресцирующие донорные и акцепторные остатки/пары РКЕТ, которые обсуждаются в настоящем документе.

В одном варианте осуществления набор согласно изобретению дополнительно содержит реагент, который модифицирует неметилированный цитозин, который обсуждается в настоящем документе (предпочтительнее, чем метилированные остатки цитозина, которые защищены). Такой реагент применим для того, чтобы отличать метилированные остатки цитозина от неметилированных. В предпочтительном варианте осуществления реагент содержит бисульфит, предпочтительно бисульфит натрия. Такой реагент способен превращать неметилированные остатки цитозина в урацил, тогда как метилированные остатки цитозина остаются без превращения. Такое различие по остатку можно использовать для того, чтобы отличать метилированную нуклеиновую кислоту от неметилированной в используемом далее способе, таком как ПЦР с использованием праймеров, которые отличают цитозин от урацила (цитозин спаривается с гуанином, тогда как урацил спаривается с аденином).

Как обсуждается при описании способов согласно изобретению, могут быть использованы подходящие контроли, действующие в качестве контроля качества в случае таких способов. Соответственно, в одном варианте осуществления набор согласно изобретению дополнительно содержит, по существу состоит или состоит из одной или нескольких контрольных молекул нуклеиновой кислоты, статус метилирования которых известен. Такие (одна или несколько) контрольных молекул нуклеиновой кислоты могут включать обе нуклеиновых кислоты, которые заведомо являются или обработаны так, чтобы были метилированными, и/или молекулы нуклеиновых кислоты, которые заведомо являются или обработаны так, чтобы они были неметилированными. Одним из примеров подходящего внутреннего эталонного гена, который, как правило, не метилирован, но который может быть обработан так, чтобы он был метилированным, является ген β-актина.

Наборы согласно изобретению могут дополнительно включать подходящие буферы и другие реагенты для осуществления заявленных способов согласно изобретению. Таким образом, приведенное обсуждение, относящееся к способам согласно изобретению, применимо с соответствующими изменениями и в данном случае и для краткости не повторяется. В одном варианте осуществления набор согласно изобретению дополнительно содержит, по существу состоит или состоит из буферов для амплификации нуклеиновой кислоты.

Набор также дополнительно содержит, по существу состоит или состоит из ферментов, которые катализируют амплификацию нуклеиновой кислоты. Таким образом, набор также дополнительно может содержать, по существу состоять или состоять из подходящей полимеразы для амплификации нуклеиновой кислоты. Примерами являются полимеразы семейства А и семейства В, такие как Тац, РГи, УеиЕ и т.д.

Различные компоненты набора могут быть упакованы по отдельности в свои отделения или в подходящем случае могут, например, храниться вместе.

Набор также может содержать соответствующие инструкции по применению, которые могут быть, например, напечатаны на отдельном листе или включены в упаковку набора. Инструкции могут облегчить применение наборов согласно изобретению с использованием соответствующих устройств для регистрации амплификации в реальном времени или в конечной точке, некоторые из которых коммерчески доступны.

Последняя стадия способов согласно изобретению, осуществляемых в режиме реального времени, заключается в количественной оценке результатов регистрации в реальном времени по сравнению со стандартной кривой для представляющего интерес метилированного или неметилированного гена и необязательно эталонного гена (если его используют). Стандартные кривые могут быть получены с использованием набора стандартов. Каждый стандарт содержит известное количество копий или известную концентрацию представляющего интерес гена и/или эталонного гена, в зависимости от ситуации. Обычно значение флуоресценции исходного уровня можно считать фоновой флуоресценцией. Например, в одном варианте осуществления используют компьютерную программу Зециеисе ИеЕесЕюи ЗуЧет (8Ό8). В такой компьютерной программе по умолчанию установлен фоновый диапазон циклов от 3 до 15 для реакции амплификации до регистрации продуктов амплификации. Затем определяют пороговое значение флуоресценции на уровне статистического значимого значения выше фона. Обычно порог устанавливают на уровне 10 стандартных отклонений выше фоновой флуоресценции. Соответствующая компьютер- 22 021100 ная программа предлагается вместе с устройством для осуществления реакций амплификации в реальном времени. Компьютерная программа автоматически вычисляет фоновые и пороговые значения для реакции. Затем может быть определено значение порогового цикла (СТ) для каждого стандарта. Значение порогового цикла равно количеству циклов, необходимых для достижения порогового уровня амплификации. Таким образом, чем больше начальная концентрация стандарта гена в реакционной смеси, тем меньше количество циклов, необходимых для достижения конкретного выхода амплифицированного продукта. График С’1 против 1о§₁₀ известного начального количества копий набора стандартных ДНК дает прямую линию. Полученный график представляет собой стандартную кривую. Таким образом, значение СТ для амплификации представляющего интерес гена и эталонного гена, в случае его использования, может быть интерполировано с использованием соответствующей стандартной кривой, чтобы определить количество копий в ДНК-содержащем образце. Таким образом, выходными данными, получаемыми в способе, являются данные о количестве генных копий как для представляющего интерес гена, так и для эталонного гена. Результаты могут быть нормализованы делением количества генных копий представляющего интерес метилированного или неметилированного гена на количество генных копий эталонного гена. В предпочтительном варианте осуществления используют систему для быстрой ПЦР в реальном времени Аррйеб В1О8у8(ет8 7900 НТ для осуществления способов согласно изобретению. Предпочтительно используют компьютерную программу 8Ό8, предпочтительно включающую в себя подходящий алгоритм, такой как алгоритм АиЮ СТ для автоматического генерирования фоновых и пороговых значений для отдельных детекторов.

Хотя в способах согласно изобретению может быть использована любая подходящая методика амплификации, наиболее предпочтительно амплификацию осуществляют, используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Таким образом, хотя ПЦР является предпочтительным способом амплификации, для того, чтобы вводить модификации в основную методику, такую как гнездовая ПЦР, в объем изобретения также могут быть включены эквиваленты. Примеры включают без ограничения методики изотермальной амплификации, такие как КА8ВА, 38Р, ТМА и тройная амплификация, все указанные методики хорошо известны в данной области техники, а подходящие реагенты коммерчески доступны. Другие подходящие способы амплификации включают без ограничения лигазную цепную реакцию (ЬСР) (Вагтшдет е1 а1., 1990), МЬРА, избирательную амплификацию полинуклеотидных последовательностеймишеней (патент США № 6410276), праймируемую консенсусной последовательностью полимеразную цепную реакцию (патент США № 4437975), методику инвазивного расщепления (ТЫтб Жате Тесйпо1ощех. МабЕоп. Ж1), методику замещения цепи, произвольно праймируемую полимеразную цепную реакцию (\νΘ 90/06995) и амплификацию со смещением одноцепочечного разрыва (\νΘ 2004/067726).

Способы ПЦР в реальном времени согласно изобретению, как правило, предусматривают стадии снижения температуры, чтобы обеспечить возможность для отжига праймера, повышения температуры для удлинения праймера, повышения температуры для денатурации и снижения температуры для сбора данных. В одном конкретном варианте осуществления стадию сбора данных осуществляют при температуре примерно от 56 до 63°С, наиболее предпочтительно примерно при 57 или 62°С, так как было показано, что такая температура обеспечивает максимально чувствительное определение и максимально специфичные результаты, как обсуждается в разделе примеров.

В конкретном варианте температурный профиль полимеразной цепной реакции включает от 40 до 50 повторов, предпочтительно примерно 45 повторов цикла (a) примерно 50°С в течение примерно 2 мин, (b) примерно 95°С в течение примерно 10 мин, (c) примерно 95°С в течение примерно 15 с, (б) примерно 57°С в течение примерно 1 мин.

Предпочтительная схема реакции, которая, как показано, позволяет получать специфичные и чувствительные результаты в способах согласно изобретению, представляет собой следующую схему: стадия 1: 50°С в течение 2 мин, стадия 2: 95°С в течение 10 мин; стадия 3: 95°С в течение 15 с, 57°С в течение 30 с, 57°С в течение 30 с (= плато-сбор данных) в ходе 45 повторов.

Способы согласно изобретению можно применять для выявления более одного представляющего интерес гена в одной и той же реакции. С использованием нескольких специфичных наборов праймеров может быть осуществлена амплификация нескольких нуклеиновых кислот-мишеней в одной и той же реакционной смеси. Такой режим называется мультиплексным. В предпочтительном варианте осуществления один или оба праймера для каждой мишени могут быть праймерами в виде шпилек, мечеными флуоресцирующим остатком и остатком для гашения, которые образуют пару РРЕТ. Амплификация нескольких нуклеиновых кислот-мишеней требует использования разных флуоресцирующих донорных и/или акцепторных остатков с разными длинами волн эмиссии для мечения разных наборов праймеров. В ходе регистрации и анализа после амплификации реакционную смесь освещают и регистрируют при каждой конкретной длине волны, характерной для каждого набора праймеров, используемых в реакции. Таким образом, можно определить, какие конкретные ДНК-мишени в смеси амлифицированы и мечены. В конкретном варианте осуществления используют две или более пар праймеров для амплификации раз- 23 021100 ных соответствующих последовательностей-мишеней. Таким образом, может быть определено присутствие и/или количество панели представляющих интерес метилированных/неметилированных генов в одном ДНК-содержащем образце.

Мультиплексный режим также можно использовать в контексте регистрации как представляющего интерес гена, так и эталонного гена в одной и той же реакции. Опять же, праймеры, меченые соответствующими различимыми донорными и/или акцепторными остатками, позволяют различать сигналы, генерируемые при амплификации представляющего интерес гена и эталонного гена, соответственно.

В одном варианте осуществления используют универсальный гаситель вместе с подходящими донорными флуорофорами, каждый из которых имеет отличный от других максимум длин волн эмиссии. Особенно предпочтительным гасителем является дабцил. Вместе с дабцилом в качестве гасителя каждый из следующих флуорофоров может быть использован для обеспечения мультиплексного режима: кумарин (максимум эмиссии 475 нм), ΞΌΆΝδ (491 нм), флуоресцеин (515 нм), люциферовый желтый (523 нм), ΕΟΌΡΥ (525 нм), эозин (543 нм), тетраметилродамин (575 нм) и техасский красный (615 нм) (Туад1 е! а1., №!иге Вю!есйпо1оду, уо1. 16, 1ап 1998; 49-53). Другие предпочтительные сочетания обсуждаются в настоящем документе.

В альтернативном варианте осуществления ДНК-содержащий образец может быть разделен, и способы согласно изобретению осуществляют на подходящих частях образца, чтобы получить результаты для прямого сравнения. Таким образом, когда выявляют оба гена - представляющий интерес ген и эталонный ген, образец может быть разделен на две части, обрабатываемые разными путями, чтобы обеспечить регистрацию амплификации представляющего интерес гена в реальном времени в одной части образца и регистрацию амплификации эталонного гена в реальном времени в другой части образца. Образец может быть еще дополнительно разделен, чтобы при необходимости обеспечить возможность проведения подходящих контрольных реакций. Преимущество такой схемы заключается в том, что может быть использована универсальная пара ЕКЕТ для мечения каждой пары праймеров и исключается требование регистрировать эмиссию в определенном диапазоне длин волн. Однако, такой способ основан на исходном получении достаточного образца, чтобы образец можно было разделить. Хотя можно использовать любой подходящий объем реакции, в одном конкретном варианте осуществления общий объем реакции для стадии амплификации составляет примерно от 10 до 40 мкл, болеее предпочтительно примерно от 10 до 30 мкл, наиболее предпочтительно около 12 мкл.

В одном аспекте олигонуклеотиды, праймеры или зонды, пары праймеров, наборы или способы согласно настоящему изобретению применяют для диагностики рака или предрасположенности к раку, причем присутствие неметилированного (или гипометилированного) СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеА3 в образце является показателем наличия рака или предрасположенности к раку. Таким образом, настоящее изобретение относится к наборам, способам и праймерам для диагностики рака или предрасположенности к раку.

Определение диагностика в используемом в настоящем документе смысле включает в себя скрининг в отношении наличия заболевания или стадии, предваряющей заболевание, идентификацию заболевания или стадии, предваряющей заболевание, мониторинг прохождения стадий и состояния и развития заболевания, проверку на предмет рецидива заболевания после лечения и мониторинг успешности конкретного лечения. Тесты также могут иметь прогностическое значение, и такой прогноз включен в определение термина диагностика. Прогностическое значение тестов можно использовать в качестве маркера возможной чувствительности к раку или в качестве маркера прогрессирования рака. Следовательно, пациенты группы риска могут быть идентифицированы до того, как появится возможность манифестации самого заболевания в виде симптомов, которые можно идентифицировать у пациента. В предпочтительном варианте осуществления рак выбран из рака легкого, меланомы или рака молочной железы. В предпочтительном варианте осуществления в способах и анализах для диагностики используют по меньшей мере один олигонуклеотид, содержащий, включающий в себя, по существу состоящий или состоящий из любой из нуклеотидных последовательностей §ЕЦ ГО N0: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, или 8 в случае маркера СТАО1В. В способах и анализах для диагностики используют по меньшей мере один олигонуклеотид, содержащий, включающий в себя, по существу состоящий или состоящий из любой из нуклеотидных последовательностей §ЕЦ ГО N0: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 в случае маркера СТАО2. В способах и анализах для диагностики используют по меньшей мере один олигонуклеотид, содержащий, включающий в себя, по существу состоящий или состоящий из любой из нуклеотидных последовательностей §Ш ГО N0: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 в случае маркера РКАМЕ. В предпочтительном варианте осуществления для диагностики рака или предрасположенности к раку используют олигонуклеотиды, содержащие, включающие в себя, по существу состоящие или состоящие из любой из нуклеотидных последовательностей §ЕЦ ГО N0: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 и 40, и выявляют неметилированную форму гена.

Тестирование может быть осуществлено с диагностической целью или вместе с терапевтической схемой. Анализы ОТ-ПЦР, в которых устанавливают прогностическое значение экспрессии СТАО1В,

- 24 021100

СТАО2 и/или РКАМЕ в случае НМРЛ, рака молочной железы или меланомы, находят применение в отборе пациентов, подходящих для лечения иммунотерапевтическим средством на основе СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ. Авторы настоящего изобретения показали, что анализ, разработанный для выявления неметилированного СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ с использованием олигонуклеотидов, праймеров или зондов, пар праймеров или наборов согласно изобретению, может надежно классифицировать образцы как образцы, экспрессирующие СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ. Результат определения статуса метилирования, полученный в тесте гипометилирования, хорошо согласуется с результатами, полученными с использованием существующего ОТ-ПЦР-теста для регистрации СТАО1В, СТАО2 и/или РКАМЕ, который осуществляют с использованием образцов РНК.

Когда используют образцы, например, тонкоигольный биоптат немелкоклеточного рака легкого, для которых количественная ОТ-ПЦР оказывается сложной, экспрессия белка, выявляемая благодаря определению статуса метилирования гена МадеАЗ, становится полезной альтернативой. Соответственно, тест на метилирование имеет клиническое применение. Таким образом, все способы согласно изобретению можно применять на образцах тонкоигольных биоптатов. В конкретных вариантах осуществления определяют статус метилирования гена МАОЕ-АЗ. Такие образцы, как указано выше, не подходят для осуществления альтернативных способов регистрации экспрессии (МАОЕ-АЗ). Такие образцы могут содержать только небольшое количество клеток и, следовательно, содержат низкие уровни ДНК. Например, такие образцы могут обеспечить только примерно от 70 до 150 мкг вводимой ДНК, используемой в каждом анализе. Как показано в примере 4, способы согласно изобретению эффективны при использовании образцов тонкоигольных биоптатов.

В следующем аспекте изобретение относится к способу прогнозирования вероятности успешного лечения рака у субъекта, предусматривающему (a) осуществление контакта/обработки ДНК-содержащего образца, полученного от субъекта, реагентом, который избирательно модифицирует неметилированные остатки цитозина в ДНК с получением определяемых модифицированных остатков, но который не модифицирует метилированные остатки цитозина;

(b) амплификацию по меньшей мере части неметилированного гена СТАО1В, СТАО2 и/или РКАМЕ с использованием по меньшей мере одной пары праймеров, из которых по меньшей мере один праймер сконструирован для связывания только с последовательностью неметилированной ДНК, соответственно, после обработки реагентом, причем по меньшей мере один праймер в паре праймеров содержит, по существу состоит или состоит из любой из нуклеотидных последовательностей 8Е0 ГО N0: 1, 2, З, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 1З, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 2З, 24, 25, 26, 27, 28, 29, З0, З1, З2, ЗЗ, З4, З5, З6, З7, З8, З9, 40, 41, 42, 44, 60 и 61;

(c) определение статуса метилирования гена СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ;

причем присутствие неметилированного СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ в образце указывает, что вероятность успешного лечения иммунотерапевтическим средством на основе СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ выше, чем в случае, когда не выявляют или выявляют более низкие уровни неметилированного гена СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ.

Стадия (с) заключается в выявлении того, образовался ли продукт амплификации. Выявление продукта амплификации (с использованием любого подходящего способа, который обсуждается в настоящем документе) свидетельствует о присутствии неметилированного или гипометилированного СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ в образце.

Конечно, также применима обратная ситуация и, таким образом, способы согласно изобретению могут быть аналогичным образом использованы для того, чтобы определить, существует ли возможная резистентность или возможно ли безуспешное лечение с использованием иммунотерапевтического средства СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ - отсутствие неметилированного СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ в образце свидетельствует о том, что вероятно будет иметь место резистентность к лечению и/или что лечение вероятно будет безуспешным. Праймеры, специфичные для метилированной ДНК, также могут быть использованы в дополнительных способах в некоторых вариантах.

Способы согласно изобретению также могут быть применимы для выбора подходящего курса лечения пациента - присутствие неметилированного СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ свидетельствует о том, что иммунотерапевтические средства СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ могут быть введены с пользой, тогда как отсутствие или низкий уровень неметилированного СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ свидетельствует, что иммунотерапевтические средства противопоказаны. Обсуждение, приведенное в отношении олигонуклеотидов, праймеров или зондов, пар праймеров, наборов или способов согласно изобретению, применимо к настоящему аспекту с соответствующими изменениями, и, следовательно, все варианты осуществления рассматриваются как подходящие для данного аспекта изобретения.

Термин вероятность успешного лечения означает вероятность того, что лечение рака с использованием любого одного или нескольких из перечисленных терапевтических средств, предпочтительно иммунотерапевтических средств СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ, или композиции, содержащей СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеАЗ, будет успешным.

- 25 021100

Резистентность определяют как пониженную вероятность того, что лечение рака с использованием любого одного из указанных иммунотерапевтических средств будет успешным и/или что будет необходима более высокая доза для достижения терапевтического эффекта.

Гипометилирование СТАО1В, СТАО2, ΡΚАМΕ и/или МадеАЗ может быть связано с некоторыми типами раковых заболеваний. Соответственно, в конкретном варианте осуществления изобретение относится к способу выявления предрасположенности или наличия рака молочной железы, рака легкого, включая НМРЛ, или меланомы в образце, включающему в себя определение статуса метилирования гена СТАО1В, СТАО2, ΡΚАМΕ и/или МадеАЗ с использованием олигонуклеотидов, праймеров или зондов, пар праймеров, наборов или способов согласно изобретению, причем выявление неметилированного СТАО1В, СТАО2, ΡΚАМΕ и/или МадеАЗ в образце является показателем предрасположенности или наличия рака, и в частности меланомы, рака легкого, включая немелкоклеточную карциному легкого (НМРЛ), или рак молочной железы. В следующем варианте осуществления опухоль или рак выбраны из рака предстательной железы, рака яичника, рака молочной железы, рака мочевого пузыря, рака головы и шеи, включая карциному пищевода, рака шейки матки, рака прямой и ободочной кишки, плоскоклеточной карциномы, рака печени, множественной миеломы и рака прямой и ободочной кишки.

В следующем аспекте предлагается способ выявления присутствия позитивной по СТАО1В, СТАО2, ΡΚАМΕ и/или МадеАЗ опухоли, предусматривающий определение статуса метилирования гена СТАО1В, СТАО2, ΡΚАМΕ и/или МадеАЗ в образце с использованием олигонуклеотидов, праймеров или зондов, пар праймеров, наборов или способов, описанных в настоящем документе, причем присутствие неметилированного СТАО1В, СТАО2, ΡΚАМΕ и/или МадеАЗ является показателем присутствия позитивной по СТАО1В, СТАО2, ΡΚАМΕ и/или МадеАЗ опухоли.

Тестирование может быть осуществлено с диагностической целью или вместе с терапевтической схемой. Тестирование также можно использовать для определения того, какую терапевтическую или профилактическую схему использовать для пациента, и использовать для контроля за эффективностью терапевтической схемы.

Соответственно, изобретение дополнительно относится к способу идентификации и/или отбора пациента, подходящего для лечения иммунотерапевтическим средством на основе СТАО1В, СТАО2, ΡΚАМΕ и/или МадеАЗ, предусматривающему определение статуса метилирования гена СТАО1В, СТАО2, ΡΚАМΕ и/или МадеАЗ в образце от пациента с использованием олигонуклеотидов, праймеров или зондов, пар праймеров, наборов или способов, описанных в настоящем документе, причем если ген СТАО1В, СТАО2, ΡΚАМΕ и/или МадеАЗ не метилирован, то субъекта идентифицируют и/или отбирают для лечения иммунотерапевтическим средством на основе СТАО1В, СТАО2, ΡΚАМΕ и/или МадеАЗ.

Альтернативно, если ген не метилирован, субъекта предпочтительно не отбирают для лечения иммунотерапевтическим средством на основе СТАО1В, СТАО2, ΡΚАМΕ и/или МадеАЗ.

В родственном аспекте изобретение относится к способу прогнозирования вероятности успешного лечения рака, предусматривающему определение статуса метилирования гена СТАО1В, СТАО2, ΡΚАМΕ и/или МадеАЗ в образце от пациента с использованием олигонуклеотидов, праймеров или зондов, пар праймеров, наборов или способов, описанных в настоящем документе, причем если ген не метилирован, то вероятность успешного лечения иммунотерапевтическим средством на основе СТАО1В, СТАО2, ΡΚАМΕ и/или МадеАЗ выше, чем в том случае, если ген метилирован.

Альтернативно, отсутствие неметилированного СТАО1В, СТАО2, ΡΚАМΕ и/или МадеАЗ в образце свидетельствует, что вероятность резистентности к лечению иммунотерапевтическим средством на основе СТАО1В, СТАО2, ΡΚАМΕ и/или МадеАЗ выше, чем в том случае, когда ген не метилирован. Таким образом, выявление метилированного гена СТАО1В, СТАО2, ΡΚАМΕ и/или МадеАЗ (или отсутствие выявления гипометилированного гена) свидетельствует, что вероятность успешного лечения иммунотерапевтическим средством является низкой.

Таким образом, популяция пациентов может быть отобрана для лечения на основе статуса метилирования их гена СТАО1В, СТАО2, ΡΚАМΕ и/или МадеАЗ. Такой отбор ведет к намного более целенаправленной и индивидуализированной форме терапии и, следовательно, приводит к повышенной доле успешных попыток лечения, так как пациенты будут подвергаться лечению лекарственными средствами, которые с наиболее высокой вероятностью окажутся эффективными.

В следующем родственном аспекте изобретение относится к способу выбора подходящей схемы лечения рака, предусматривающему определение статуса метилирования гена СТАО1В, СТАО2, ΡΚАМΕ и/или МадеАЗ в образце от пациента с использованием олигонуклеотидов, праймеров или зондов, пар праймеров, наборов или способов, описанных в настоящем документе, причем, если ген не метилирован, иммунотерапевтическое средство (в частности, иммунотерапевтические средства СТАО1В, СТАО2, ΡΚАМΕ и/или МадеАЗ) выбирают для лечения.

Альтернативно, если ген не метилирован, лечение иммунотерапевтическим средством противопоказано.

Также предлагается способ лечения рака у субъекта, предусматривающий введение иммунотерапевтического средства, причем субъект был отобран для лечения на основе измерения статуса метилирования гена СТАО1В, СТАО2, ΡΚАМΕ и/или МадеАЗ любым из способов согласно изобретению или с

- 26 021100 использованием олигонуклеотида, праймера или зонда, пары праймеров, набора или способа, которые описаны в настоящем документе. Предпочтительно в случае всех различных аспектов, описанных в настоящем документе, выявление неметилированного гена СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеА3 соответствует повышенному уровню белка СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и/или МадеА3.

Иммунотерапевтические средства СТАО1В, СТАО2, МАОЕ-А3 и/или РКАМЕ, применимые в настоящем изобретении, включают композиции на основе СТАО1В, СТАО2, МАОЕ-А3 и/или РКАМЕ. Примерами композиций, содержащих СТАО1В, СТАО2, МАОЕ-А3 и/или РКАМЕ, являются композиции, содержащие полноразмерные СТАО1В, СТАО2, МАОЕ-А3 или РКАМЕ, почти полноразмерные СТАО1В, СТАО2, МАОЕ-А3 и/или РКАМЕ и фрагменты СТАО1В, СТАО2, МАОЕ-А3 или РКАМЕ, например, пептиды СТАО1В, СТАО2, МАОЕ-А3 или РКАМЕ.

Примеры пептидов, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают следующие пептиды МАОЕ-А3

8ΕΟΙΏΝΟ	Последовательность пептида
ХГОЮМО: 64	ГЫА’ОРКАГУ
5Ε<}ΙΟΝΟ:65	ΕνΟΡΙΟΗίΥ
8ΕΟΪΠΝΟ; 66	ΜΗνηΡΚίΗΙΥ
8Γ:ρΐΓ)Ν():67	νΗΠ,Ι.Ι,ΚΥΡΑ
8Ер Π3ΝΟ: 68	ΙΛΉΗ.ΠΚΥΚ.
Ж} Ю N0:69	ίΚΥΚΑΚΕΡνΤ
ΧΚρΐΙ)ΝΟ:70	Λ€ΥΕΙ·ϊ.\νθΡΚΛΐνΐ-ΤΚ
8ΕΟΙϋΝΟ:71	ΤρίΙΓνΟΕΝΥΕΕΥ

Белок МАОЕ может быть полноразмерным МАОЕ-А3 или может содержать почти полный фрагмент МАОЕ3, например, аминокислоты 3-314 МАОЕ3 (всего 312 аминокислот), или другие фрагменты МАОЕ-А3, в которых от 1 до 10 аминокислот делетированы из Ν-конца и/или С-конца белка МАОЕ-А3.

В одном варианте осуществления белок, фрагмент или пептид СТАО1В, СТАО2, МАОЕ-А3 и/или РКАМЕ могут быть связаны с белком, являющимся партнером по слиянию.

Примеры антигенов, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают следующие антигены: СТАО1В, СТАО2 и/или РКАМЕ.

В качестве примера подходящие пептиды СТАО1В включают пептиды с мотивами связывания с НБА-А2, такие как пептиды 157-167, 157-165 и 155-163, которые описаны (см. публикации Бадег е! а1., Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А, 97(22): 12198-12203 (2000)). Пептиды СТАО1В могут включать один или несколько эпитопов МНС класса 1 или класса 2, например, эпитопы, известные как А31, ИК1, ИК2, ИК4, ИК7, ИР4, В35, В51, СА3, С\\6 и А2 (см. АО 2008/089074).

В качестве примера пептиды РКАМЕ могут включать пептиды с мотивами связывания с НБА-А2, такие как пептиды Ι.Υ\Ό8Ι.ΙΤΙ.. АЬ¥УП8ЬРРЬ, \Т1)С.1.1)\Т1.. 8ЬУ8РРЕА и 8Ι.Ι.ΟΙ 1П.С.1. (см. Ошп!аге1й е! а1., В1ооб, 1 8ер!етЬег 2008, νοί. 112, Νο. 5, рр. 1876-1885). Пептиды РКАМЕ могут включать один или несколько эпитопов МНС класса 1 или класса 2.

В качестве примера пептиды СТАО2 могут включать ЕРУКК1Ь8К, МБМАОЕАБАББ. 8БЙМА1ТОС, Б-ААОЕККУРК которые описаны (см. публикацию 8ип е! а1. Сапсег 1ттипо1оду, 1ттипо!йегару, νο1. 55, ШтЬег 6/Бипе, 2006).

Белок, фрагмент или пептид СТАО1В, СТАО2, МАОЕ-А3 и/или РКАМЕ и белок, являющийся партнером по слиянию, могут быть химически конъюгированы или могут быть экспрессированы в виде рекомбинантного слитого белка. В варианте осуществления, в котором антиген и партнер экспрессированы в виде рекомбинантного слитого белка, такое слияние может обеспечить повышенные уровни продуцирования в системе экспрессии по сравнению с неслитым белком. Таким образом, белок, являющийся партнером по слиянию, может помогать в предоставлении Т-хелперных эпитопов (иммунологический белок, являющийся партнером по слиянию), предпочтительно Т-хелперных эпитопов, узнаваемых в организме человека, и/или помогать в экспрессии белка (экспрессии энхансерного белка) на более высоких уровнях, чем в случае нативного рекомбинантного белка. В одном варианте осуществления белком, являющимся партнером в слиянии, могут быть оба белка - иммунологический белок-партнер по слиянию и белок-партнер, усиливающий экспрессию.

В одном варианте осуществления изобретения иммунологический белок, являющийся партнером по слиянию, который можно использовать, получают из белка Ό, поверхностного белка грамотрицательной бактерии НаеторЫ1и8 тЛиеп/а В (АО 91/18926) или его производного. Производное белка Ό может содержать первую 1/3 белка или приблизительно первую 1/3 белка. В одном варианте первые Ν-концевые 109 остатков белка Ό могут быть использованы в качестве партнера по слиянию, чтобы обеспечить антиген СТАО1В, СТАО2, МАОЕ-А3 и/или РКАМЕ дополнительными экзогенными Т-клеточными эпитопами и повысить уровень экспрессии в Е. сой (следовательно, действуя также в качестве энхансера экспрессии). В альтернативном варианте производное белка Ό может содержать 100-110 первых Νконцевых аминокислот или приблизительно 100-110 первых Ν-концевых аминокислот. В одном варианте белок Ό или его производное могут быть липидизированы, может быть использован липопротеид Ό: ли- 27 021100 пидный хвост может обеспечивать оптимальную презентацию антигена антигенпрезентирующим клеткам. В альтернативном варианте белок Ό или его производное не липидизированы. Последовательность секреции или сигнальная последовательность белка Ό относится примерно к аминокислотам 1-16, 17, 18 или 19 встречающегося в природе белка. В одном варианте последовательность секреции или сигнальная последовательность белка Ό относится к 19 ^концевым аминокислотам белка Ό. В одном варианте осуществления последовательность секреции или сигнальная последовательность включена в N конец белка Ό, являющегося партнером по слиянию. В используемом в настоящем документе смысле первая треть (1/3), первые 109 аминокислот и первые 100-110 Б-концевых аминокислот относятся к аминокислотам последовательности белка Ό, расположенным сразу после последовательности секреции или сигнальной последовательности. Аминокислоты 2-К и 3-Ь сигнальной последовательности необязательно могут быть заменены аминокислотами 2-М и 3-Ό.

В одном варианте осуществления антиген для иммунотерапии может быть слит с белком Ό в форме таких конструкций, как белок Ό - СТАО1В - Ηίδ или белок Ό - СТАО2 - Ηίδ или белок Ό - РКАМЕ - Ηίδ или белок Ό - МАОЕ-А3 - Ηίδ. Такой слитый белок может содержать сигнальную последовательность белка Ό, аминокислоты 1-109 белка Ό, антиген для иммунотерапии (который может быть представлен полноразмерной последовательностью или частичной последовательностью белка), спейсер и полигистидиновый хвост (Ηίδ), который может облегчать очистку слитого белка в ходе процесса очистки, например

ί) состоящая из 18 остатков сигнальная последовательность и первые 109 ^концевых остатков белка Ό;

ίί) два несвязанных остатка (метионин и аспарагиновая кислота); ίίί) антиген для иммунотерапии;

ίν) два остатка глицина, функционирующих в качестве шарнирной области; и ν) семь остатков гистидина.

Часть белка Ό, которая может быть использована, предпочтительно не содержит последовательности секреции или сигнальной последовательности. В некоторых вариантах белок, являющийся партнером по слиянию, содержит аминокислоты Меΐ-Аδр-Р^о на Оконце или в области Оконца последовательности слитого белка и не содержит последовательности секреции или сигнальной последовательности белка Ό. Например, белок, являющийся партнером по слиянию, может содержать или состоять примерно или точно из 17-127, 18-127, 19-127 или 20-127 аминокислот белка Ό.

В качестве примера подходящие антигена РКАМЕ, основанные на слияниях белков с белком Ό, описаны в \У0 2008/087102, и указанный документ включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

В другом варианте осуществления иммунным белком-партнером по слиянию может быть белок, известный как Ьу1А, или полученный из него белок. Ьу1А получают из 81гер1ососсщ риеитотае, который синтезирует К-ацетил-Е-аланинамидазу. амидазу Ьу1А (кодируемую геном Ьу1А (Оеие, 43 (1986), р. 265272)), аутолизин которого специфично разрушает некоторые связи в пептидогликановом остове. Сконцевой домен белка Ьу1А ответственен за аффинность к холину или к некоторым аналогам холина, таким как ЭЕЛЕ. Указанное свойство было использовано для разработки плазмид Е. соП, экспрессирующих С-Ьу1А, применимых для экспрессии слитых белков. Описана очистка гибридных белков, содержащих фрагмент С-ЬуМ. на своем аминоконце (Вю1есЬио1оду: 10, (1992) р. 795-798). В одном варианте может быть использована С-концевая часть молекулы. Может быть использована повторяющаяся часть молекулы Ьу1А, встречающаяся на С-конце, начиная с остатка 178. В одном варианте осуществления часть Ьу1А может включать в себя остатки 188-305.

Другие партнеры по слиянию включают неструктурный белок вируса гриппа, N81 (гемагглютинин). В одном варианте осуществления используют 81 ^концевую аминокислоту N81, хотя можно использовать разные фрагменты при условии, что они содержат Т-хелперные эпитопы.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антиген для применения в иммунотерапии может содержать дериватизованный свободный тиол. В одном варианте осуществления настоящего изобретения белок МАОЕ-А3 может содержать дериватизованный свободный тиол. Такие антигены описаны в \У0 99/40188. В частности, можно использовать карбоксиамидированные или карбоксиметилированные производные.

Антигены для иммунотерапии можно использовать в сочетании с другими иммунотерапевтическими антигенами в форме слияния или в смеси. Например, СТАО1В можно применять в виде слияния с СТАО2 или его фрагментом (см. документ \У0 2008/089074, который включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме).

Сочетания иммунотерапевтических средств либо в виде слитых белков, либо в виде смесей включают, например, любое сочетание из 2 или более СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ или МАОЕ3, хотя изобретение не ограничено указанными конкретными антигенами, и можно использовать любой иммунотерапевтический антиген. В качестве примера, антигены МАОЕ-3, например, были описаны как подходящие для приготовления в сочетании с N¥^80-1 (см. документ \У0 2005/105139, который включен в настоящий

- 28 021100 документ посредством ссылки в полном объеме).

В следующем варианте осуществления иммунотерапевтические средства для применения в настоящем изобретении могут содержать молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую иммунотерапевтический белок, фрагмент или пептид или слитый белок, которые описаны в настоящем документе. В одном варианте настоящего изобретения последовательности могут быть встроены в подходящий экспрессирующий вектор и использованы для ДНК/РНК-вакцинации. Микробные векторы, экспрессирующие нуклеиновую кислоту, также могут быть использованы в качестве вектора, доставляющего иммунотерапевтические средства.

Примеры подходящих вирусных векторов включают системы, основанные на ретровирусах, лентивирусах, аденовирусах, аденоассоциированных вирусах, вирусах герпеса, включая вирус простого герпеса, альфа-вирусах, поксвирусах, таких как птичий поксвирус и вирус осповакцины. Методики переноса генов с использованием таких вирусов известны специалистам в данной области техники. Ретровирусные векторы, например, можно использовать для стабильной интеграции полинуклеотида согласно изобретению в геном хозяина, хотя такая рекомбинация не является предпочтительной. Дефектные по репликации аденовирусные векторы, напротив, сохраняются в виде эписом и поэтому обеспечивают временную экспрессию. Векторы, способные управлять экспрессией в клетках насекомых (например, бакуловирусные векторы), в клетках человека, дрожжах и бактериях, можно использовать для получения определенных количеств белка, кодируемого полинуклеотидами согласно настоящему изобретению, например, для использования в качестве субъединичных вакцин или в иммуноанализах.

В предпочтительном варианте осуществления аденовирусом, используемым в качестве живого вектора, является дефектный по репликации аденовирус обезьян. Обычно такие вирусы содержат делецию Е1 и могут расти на линиях клеток, которые трансформированы геном Е1. Предпочтительными аденовирусами обезьян являются вирусы, выделенные из организма шимпанзе. В частности, С68 (также известный как Рап 9) (см. патент США № 608З716) и Рап 5, 6 и Рап 7 (\УО 0З/046124) являются предпочтительными для применения в соответствии с настоящим изобретением. Такие векторы могут быть подвергнуты обработке, чтобы встроить гетерологичный ген согласно изобретению так, чтобы мог быть экспрессирован генный продукт. Применение, получение и производство таких рекомбинантных аденовирусных векторов подробно описано в \УО 0З/046142.

Обычные методики рекомбинации для получения последовательностей нуклеиновых кислот и получение экспрессирующих векторов описаны (см. МатаДк е1 а1., Мо1еси1аг С1отпд - А ЬаЪогаЮгу Мапиа1; Со1й 8ргшд НагЪог, 1982-1989).

В случае основанных на белках композиций белки согласно настоящему изобретению могут быть приготовлены либо растворенными в жидкой форме, либо в лиофилизированной форме.

Каждая доза для человека может содержать от 1 до 1000 мкг белка. В одном варианте доза может содержать З0-З00 мкг белка.

Композиция для иммунотерапии, которая описана в настоящем документе, может дополнительно содержать адъювант для вакцины и/или иммуностимулирующий цитокин или хемокин. Таким образом, термин иммунотерапевтическое средство, используемый в настоящем документе, может охватывать все композиции для иммунотерапии, которые описаны в настоящем документе, включая подходящие адъюванты.

Подходящие вакцинные адъюванты для применения в соответствии с настоящим изобретением коммерчески доступны, такие как, например, неполный адъювант и полный адъювант Фройнда (ЭНсо ЬаЪогаЮпек, Юе1го11. М1); адъювант 65 Мегск (Мегск апй Сотрапу, 1пс., КаЕтау, N1); А8-2 (8тЕЕКЕпе ВеесЕат, РЫ1айе1рЫа, РА); соли алюминия, такие как гель гидроокиси алюминия (квасцы) или фосфат алюминия; соли кальция, железа или цинка; нерастворимая суспензия ацилированного тирозина; ацилированные сахара; дериватизованные катионами или анионами полисахариды; полифосфазены; биоразрушаемые микросферы; монофосфориллипид А и квил А. Цитокины, такие как ОМ-С8Р или интерлейкин 2, 7 или 12, и хемокины также можно использовать в качестве адъювантов.

В одном варианте осуществления адъювант может содержать сочетание монофосфориллипида А, такого как З-де-О-ацетилированный монофосфориллипид А (ЗП-МРЬ), с солью алюминия. Альтернативно, адъювант может содержать ЗП-МРЬ или другие лиганды 1о11-подобного рецептора 4 (ТЬК4), такие как аминоалкилглюкозаминидфосфаты, которые описаны в \УО 98/50З99, \УО 01/З4617 и \УО 0З/065806.

Другим адъювантом, который можно использовать, является сапонин, например, 0821 (Ас|ш1а ВюрЕагтасеиДса1к 1пс., РгаттдЕат, МА), который можно применять отдельно или в сочетании с другими адъювантами. Например, в одном варианте предлагается сочетание монофосфориллипида А и производного сапонина, такое как сочетание 0821 и ЗП-МРЬ, которое описано в \УО 94/0015З, или композиция, в которой 0821 гасится холестерином, как описано в \УО 96/ЗЗ7З9. Другие подходящие препараты содержат эмульсию типа масло в воде и токоферол. В одном варианте осуществления адъювант содержит 0821. ЗП-МРЬ и токоферол в эмульсии типа масло в воде, как описано в \УО 95/17210.

Другие адъюванты для применения в соответствии с настоящим изобретением могут содержать антагонисты ТЬК9, такие как неметилированные олигонуклеотиды, содержащие СрО, в которых динуклео- 29 021100 тид СрО не метилирован. Такие олигонуклеотиды хорошо известны и описаны, например, в АО 96/02555.

Подходящие олигонуклеотиды для применения в соответствии с настоящим изобретением (в данном контексте) могут включать

ЗЕЦ56	ТСС АТО АСС ТТС СТО АСО ТГ	СрС 1826
8ЕЦ57	ТСТ ССС АСС СТО ССС САТ	СрС 1758
ЗЕф58	АСС САТ САС ОТС ССС СОТ САС ССС АСС АСС
8Еф59	ТСС ТСС ТТТ ТСТ СОТ ТТТ ОТС ОТТ	СрО 2006, СрО 7909
8Еф60	ТСС АТС АСС ТТС СТО АТО СТ	СрС 1668

СрО-содержащие олигонуклеотиды также можно использовать отдельно или в сочетании с другими адъювантами. Например, в одном варианте адъювант содержит сочетание СрО-содержащего олигонуклеотида и производное сапонина, в частности сочетание СрО и Ц821, которое описано в АО 00/09159 и АО 00/62800.

Соответственно, предлагается композиция, содержащая иммунотерапевтическое средство, которое описано в настоящем документе, причем адъювант содержит одно или несколько из следующих средств: 3П-МРЬ, Οδ21, СрО-олигонуклеотид, простой или сложный эфир полиэтилена или сочетание двух или более таких адъювантов. В некоторых вариантах осуществления иммунотерапевтический компонент в композиции может быть представлен в наполнителе в виде эмульсии типа масло в воде или вода в масле или в липосомном препарате.

В одном варианте осуществления адъювант может содержать одно или несколько из следующих средств: 3П-МРЬ, Οδ21 и иммуностимулирующий СрО-олигонуклеотид. В одном варианте осуществления присутствуют все три адъювантных компонента. Компоненты могут присутствовать либо в липосомном препарате, либо в эмульсии типа масло в воде, как описано в АО 95/17210.

В другом варианте осуществления 30-МРЬ и Οδ21 присутствуют в эмульсии типа масло в воде и СрО-олигонуклеотид отсутствует.

Количество используемого 30-МРЬ обычно невелико, но в зависимости от препарата может быть в диапазоне 1-1000 мкг на дозу, предпочтительно 1-500 мкг на дозу, более предпочтительно от 1 до 100 мкг на дозу.

Количество СрО-олигонуклеотидов или иммуностимулирующих олигонуклеотидов в адъювантах согласно настоящему изобретению обычно невелико, но в зависимости от препарата может быть в диапазоне 1-1000 мкг на дозу, предпочтительно 1-500 мкг на дозу, более предпочтительно от 1 до 100 мкг на дозу.

Количество сапонина для применения в адъювантах согласно настоящему изобретению может быть в диапазоне 1-1000 мкг на дозу, предпочтительно 1-500 мкг на дозу, более предпочтительно 1-250 мкг на дозу, наиболее предпочтительно от 1 до 100 мкг на дозу.

Адъювантные препараты, которые описаны в настоящем документе, дополнительно могут содержать эмульсию типа масло в воде и/или токоферол или могут быть приготовлены в виде липосомной композиции.

Другие подходящие адъюванты включают монтанид КА 720 (§еррю, Ргапсе), 8АР (СЫгоп, СаПГогта, Ит!еб 81а!ек), КСОМ8 (С8Ь), МР-59 (СЫгоп), К1Ы1 ЭеЮх, КС-529 (О8К, НатШоп, МТ) и другие аминоалкилглюкозаминид-4-фосфаты (АОР).

В общем, каждая доза для человека может содержать 0,1-1000 мкг антигена, например 0,1-500 мкг, 0,1-100 мкг или от 0,1 до 50 мкг. Оптимальное количество конкретного иммунотерапевтического средства может установить в стандартных исследованиях, предусматривающих наблюдение соответствующих иммунных ответов у вакцинированных субъектов. После начальной вакцинации субъекты могут получать одну или несколько бустер-иммунизаций с соответствующими интервалами.

Альтернативно, композиция для применения в способе согласно настоящему изобретению может содержать фармацевтическую композицию, содержащую иммунотерапевтическое средство, которое описано в настоящем документе, в сочетании с фармацевтически приемлемым наполнителем.

Далее изобретение будет описано на основе обращения к следующим не ограничивающим примерам.

Описание графических материалов

Фиг. 1. Положение для анализов СТАО1В на хромосоме. Описан один потенциальный стартовый сайт транскрипции (Т§§). Начало структуры гена представлено следующим образом: незаштрихованными прямоугольниками обозначена область промотора из 300 п.н., за которой следует вертикальная линия, показывающая потенциальный Т§§, и затем заштрихованные прямоугольники представляют первые экзоны. Положения анализов указаны незаштрихованными прямоугольниками, за которыми следуют соответствующие им названия, (И) указывает анализ, специфичный для отсутствия метилирования (т.е. анализ, специфичный для гипометилирования). Количество подсчитанных СрО отмечено на протяжении области 20 т.п.н.

- 30 021100

Фиг. 2. Положение для анализов СТАО2 на хромосоме. Описан один потенциальный стартовый сайт транскрипции (ТЗЗ). Начало структуры гена представлено следующим образом: незаштрихованными прямоугольниками обозначена область промотора из 300 п.н., за которой следует вертикальная линия, показывающая потенциальный ТЗЗ, и затем заштрихованные прямоугольники представляют первые экзоны. Положения анализов указаны незаштрихованными прямоугольниками, за которыми следуют соответствующие им названия, (И) указывает анализ, специфичный для отсутствия метилирования (т.е. анализ, специфичный для гипометилирования). Количество подсчитанных СрО отмечено на протяжении области 20 т.п.н. СТАО2 также называют СТАО2_1.

Фиг. 3. Положение для анализов РКАМЕ на хромосоме. Описан один потенциальный стартовый сайт транскрипции (ТЗЗ). Начало структуры гена представлено следующим образом: незаштрихованными прямоугольниками обозначена область промотора из 300 п.н., за которой следует вертикальная линия, показывающая потенциальный ТЗЗ, и затем заштрихованные прямоугольники представляют первые экзоны. Положения анализов указаны незаштрихованными прямоугольниками, за которыми следуют соответствующие им названия, (И) указывает анализ, специфичный для отсутствия метилирования (т.е. анализ, специфичный для гипометилирования). Количество подсчитанных СрО отмечено на протяжении области 20 т.п.н.

Фиг. 4. Положение для одного анализа МАОЕ-А3 (анализа МАОЕ-А3 О0_2 и) на хромосоме. Описан один потенциальный стартовый сайт транскрипции (ТЗЗ). Начало структуры гена представлено следующим образом: незаштрихованными прямоугольниками обозначена область промотора из 300 п.н., за которой следует вертикальная линия, показывающая потенциальный ТЗЗ, и затем заштрихованные прямоугольники представляют первые экзоны. Положение анализа указано незаштрихованным прямоугольником с его соответствующим названием, (И) указывает анализ, специфичный для отсутствия метилирования (т.е. анализ, специфичный для гипометилирования). Количество подсчитанных СрО отмечено на протяжении области 20 т.п.н.

Фиг. 5. Схематичное общее описание методики АтрНЯиог®.

По меньшей мере один праймер (прямой праймер) в паре праймеров содержит структуру шпильки, несущую донорный (РАМ) и акцепторный остаток (дабцил) пары для молекулярного переноса энергии. На этой фигуре описан случай смыслового праймера, также называемого прямым праймером (прямой праймер), который связан с меченой шпилькой структурой. В отсутствие амплификации флуоресценция, испускаемая донорным остатком, эффективно поглощается акцепторным остатком, что приводит к гашению флуоресценции. Во время амплификации праймер включается в продукт амплификации. Во время второго раунда амплификации структура стебель-петля или шпилька нарушается. Акцепторный остаток больше не способен эффективно гасить флуоресценцию, испускаемую донорным остатком. Следовательно, донорный остаток генерирует регистрируемый сигнал флуоресценции.

Фиг. 6. Согласованность между результатами МЗ-ПЦР в реальном времени, полученными с использованием анализа деметилирования СТАО1В_1З, и данными экспрессии СТАО1В (гена, называемого НУ-ЕЗ0-1). полученными в ОТ-ПЦР в реальном времени для 48 образцов немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ). Вертикальная сплошная жирная линия указывает предел отсечения для анализа деметилирования, а горизонтальная жирная линия указывает предел отсечения экспрессии. Линейная регрессия указана черной линией; К=0,35.

Фиг. 7. Согласованность между результатами МЗ-ПЦР в реальном времени, полученными с использованием анализа деметилирования СТАО2_1_АЗ, и данными экспрессии СТАО2 (гена, называемого ЬАОЕ-1), полученными в ОТ-ПЦР в реальном времени для 48 образцов немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ). Вертикальная сплошная жирная линия указывает предел отсечения для анализа деметилирования, а горизонтальная жирная линия указывает предел отсечения экспрессии. Линейная регрессия указана черной линией; К=0,86; согласованность между двумя методиками составляет 87,5%.

Фиг. 8. Согласованность между результатами МЗ-ПЦР в реальном времени, полученными с использованием анализа деметилирования СТАО2_1_З, и данными экспрессии СТАО2 (гена, называемого ЬАОЕ-1), полученными в ОТ-ПЦР в реальном времени для 48 образцов немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ). Вертикальная сплошная жирная линия указывает предел отсечения для анализа деметилирования, а горизонтальная жирная линия указывает предел отсечения экспрессии. Линейная регрессия указана черной линией; К=0,88; согласованность между двумя методиками составляет 87,5%.

Фиг. 9. Согласованность между результатами МЗ-ПЦР в реальном времени, полученными с использованием анализа деметилирования СТАО2_2_З, и данными экспрессии СТАО2 (гена, называемого ЬАОЕ-1), полученными в ОТ-ПЦР в реальном времени для 48 образцов немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ). Вертикальная сплошная жирная линия указывает предел отсечения для анализа деметилирования, а горизонтальная жирная линия указывает предел отсечения экспрессии. Линейная регрессия указана черной линией; К=0,47; согласованность между двумя методиками составляет 68,8%.

Фиг. 10. Согласованность между результатами МЗ-ПЦР в реальном времени, полученными с использованием анализа деметилирования СТАО2_3_З, и данными экспрессии СТАО2 (гена, называемого ЬАОЕ-1), полученными в ОТ-ПЦР в реальном времени для 48 образцов немелкоклеточного рака легкого

- 31 021100 (НМРЛ). Вертикальная сплошная жирная линия указывает предел отсечения для анализа деметилирования, а горизонтальная жирная линия указывает предел отсечения экспрессии. Линейная регрессия указана черной линией; К=0,55; согласованность между двумя методиками составляет 66,7%.

Фиг. 11. Согласованность между результатами М8-ПЦР в реальном времени, полученными с использованием анализа деметилирования РКАМЕ_7_8, и данными экспрессии РКАМЕ, полученными в ОТ-ПЦР в реальном времени для 48 образцов немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ). Вертикальная сплошная жирная линия указывает предел отсечения для анализа деметилирования, а горизонтальная жирная линия указывает предел отсечения экспрессии. Линейная регрессия указана черной линией; К=0,62; согласованность между двумя методиками составляет 83,3%.

Фиг. 12. Согласованность между результатами М8-ПЦР в реальном времени, полученными с использованием анализа деметилирования РКАМЕ_1_А8, и данными экспрессии РКАМЕ, полученными в ОТ-ПЦР в реальном времени для 48 образцов немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ). Вертикальная сплошная жирная линия указывает предел отсечения для анализа деметилирования, а горизонтальная жирная линия указывает предел отсечения экспрессии. Линейная регрессия указана черной линией; К=0,39; согласованность между двумя методиками составляет 66,7%.

Фиг. 13. Согласованность между результатами М8-ПЦР в реальном времени, полученными с использованием анализа деметилирования РКАМЕ_2_8, и данными экспрессии РКАМЕ, полученными в ОТ-ПЦР в реальном времени для 48 образцов немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ). Вертикальная сплошная жирная линия указывает предел отсечения для анализа деметилирования, а горизонтальная жирная линия указывает предел отсечения экспрессии. Линейная регрессия указана черной линией; К=0,64; согласованность между двумя методиками составляет 79,2%.

Фиг. 14. Согласованность между результатами М8-ПЦР в реальном времени, полученными с использованием анализа деметилирования РКАМЕ_3_А8, и данными экспрессии РКАМЕ, полученными в ОТ-ПЦР в реальном времени для 48 образцов немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ). Вертикальная сплошная жирная линия указывает предел отсечения для анализа деметилирования, а горизонтальная жирная линия указывает предел отсечения экспрессии. Линейная регрессия указана черной линией; К=0,73; согласованность между двумя методиками составляет 85,4%.

Фиг. 15. Согласованность между результатами М8-ПЦР в реальном времени, полученными с использованием анализа деметилирования РКАМЕ_6А_8, и данными экспрессии РКАМЕ, полученными в ОТ-ПЦР в реальном времени для 48 образцов немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ). Вертикальная сплошная жирная линия указывает предел отсечения для анализа деметилирования, а горизонтальная жирная линия указывает предел отсечения экспрессии. Линейная регрессия указана черной линией; К=0,24; согласованность между двумя методиками составляет 66,7%.

Фиг. 16. Согласованность между результатами М8-ПЦР в реальном времени, полученными с использованием анализа деметилирования СТАО1В_1_8, и данными экспрессии СТАО1В (гена, называемого №Г-Е§0-1), полученными в ОТ-ПЦР в реальном времени для 31 образца меланомы. Вертикальная сплошная жирная линия указывает предел отсечения для анализа деметилирования, а горизонтальная жирная линия указывает предел отсечения экспрессии. Линейная регрессия указана черной линией.

Фиг. 17. Согласованность между результатами М8-ПЦР в реальном времени, полученными с использованием анализа деметилирования СТАО2_1_А8, и данными экспрессии СТАО2 (гена, называемого ЬАОЕ-1), полученными в ОТ-ПЦР в реальном времени для 31 образца меланомы. Вертикальная сплошная жирная линия указывает предел отсечения для анализа деметилирования, а горизонтальная жирная линия указывает предел отсечения экспрессии. Линейная регрессия указана черной линией; К=0,63; согласованность между двумя методиками составляет 74,2%.

Фиг. 18. Согласованность между результатами М8-ПЦР в реальном времени, полученными с использованием анализа деметилирования СТАО2_1_8, и данными экспрессии СТАО2 (гена, называемого ЬАОЕ-1), полученными в ОТ-ПЦР в реальном времени для 31 образца меланомы. Вертикальная сплошная жирная линия указывает предел отсечения для анализа деметилирования, а горизонтальная жирная линия указывает предел отсечения экспрессии. Линейная регрессия указана черной линией; К=0,62; согласованность между двумя методиками составляет 74,2%.

Фиг. 19. Согласованность между результатами М8-ПЦР в реальном времени, полученными с использованием анализа деметилирования СТАО2_2_8, и данными экспрессии СТАО2 (гена, называемого ЬАОЕ-1), полученными в ОТ-ПЦР в реальном времени для 31 образца меланомы. Вертикальная сплошная жирная линия указывает предел отсечения для анализа деметилирования, а горизонтальная жирная линия указывает предел отсечения экспрессии. Линейная регрессия указана черной линией; К=0,34; согласованность между двумя методиками составляет 51,6%.

Фиг. 20. Согласованность между результатами М8-ПЦР в реальном времени, полученными с использованием анализа деметилирования СТАО2_3_8, и данными экспрессии СТАО2 (гена, называемого ЬАОЕ-1), полученными в ОТ-ПЦР в реальном времени для 31 образца меланомы. Вертикальная сплошная жирная линия указывает предел отсечения для анализа деметилирования, а горизонтальная жирная линия указывает предел отсечения экспрессии. Линейная регрессия указана черной линией; К=0,58; согласованность между двумя методиками составляет 74,2%.

- 32 021100

Фиг. 21. Согласованность между результатами М8-ПЦР в реальном времени, полученными с использованием анализа деметилирования РКАМЕ_7_§, и данными экспрессии РКАМЕ, полученными в ОТ-ПЦР в реальном времени для З1 образца меланомы. Вертикальная сплошная жирная линия указывает предел отсечения для анализа деметилирования, а горизонтальная жирная линия указывает предел отсечения экспрессии. Линейная регрессия указана черной линией; К=0,70; согласованность между двумя методиками составляет 90,З%.

Фиг. 22. Согласованность между результатами М8-ПЦР в реальном времени, полученными с использованием анализа деметилирования РКАМЕ_1_А§, и данными экспрессии РКАМЕ, полученными в ОТ-ПЦР в реальном времени для 31 образца меланомы. Вертикальная сплошная жирная линия указывает предел отсечения для анализа деметилирования, а горизонтальная жирная линия указывает предел отсечения экспрессии. Линейная регрессия указана черной линией; К=0,26; согласованность между двумя методиками составляет 9З,5%.

Фиг. 2З. Согласованность между результатами М8-ПЦР в реальном времени, полученными с использованием анализа деметилирования РКАМЕ_2_§, и данными экспрессии РКАМЕ, полученными в ОТ-ПЦР в реальном времени для 31 образца меланомы. Вертикальная сплошная жирная линия указывает предел отсечения для анализа деметилирования, а горизонтальная жирная линия указывает предел отсечения экспрессии. Линейная регрессия указана черной линией; К=0,29; согласованность между двумя методиками составляет 90,З%.

Фиг. 24. Согласованность между результатами М8-ПЦР в реальном времени, полученными с использованием анализа деметилирования РКАМЕ_З_А§, и данными экспрессии РКАМЕ, полученными в ОТ-ПЦР в реальном времени для 31 образца меланомы. Вертикальная сплошная жирная линия указывает предел отсечения для анализа деметилирования, а горизонтальная жирная линия указывает предел отсечения экспрессии. Линейная регрессия указана черной линией; К=0,48; согласованность между двумя методиками составляет 90,З%.

Фиг. 25. Согласованность между результатами М8-ПЦР в реальном времени, полученными с использованием анализа деметилирования РКАМЕ_6_А§, и данными экспрессии РКАМЕ, полученными в ОТ-ПЦР в реальном времени для 31 образца меланомы. Вертикальная сплошная жирная линия указывает предел отсечения для анализа деметилирования, а горизонтальная жирная линия указывает предел отсечения экспрессии. Линейная регрессия указана черной линией; К=0,51; согласованность между двумя методиками составляет 90,З%.

Фиг. 26. Согласованность между результатами М8-ПЦР в реальном времени, полученными с использованием анализа деметилирования СТАО2_1_А§, и данными экспрессии СТАО2, полученными в ОТ-ПЦР в реальном времени для 28 образцов молочной железы. Вертикальная сплошная жирная линия указывает предел отсечения для анализа деметилирования, а горизонтальная жирная линия указывает предел отсечения экспрессии. Линейная регрессия указана черной линией; К=0,56; согласованность между двумя методиками составляет 71,4%.

Фиг. 27. Согласованность между результатами М8-ПЦР в реальном времени, полученными с использованием анализа деметилирования СТАС2_3_8, и данными экспрессии СТАО2, полученными в ОТ-ПЦР в реальном времени для 28 образцов рака молочной железы. Вертикальная сплошная жирная линия указывает предел отсечения для анализа деметилирования, а горизонтальная жирная линия указывает предел отсечения экспрессии. Линейная регрессия указана черной линией; К=0,34; согласованность между двумя методиками составляет 78,6%.

Экспериментальный раздел

Авторы исследовали статус метилирования разных РТ-генов в случае немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), меланомы и рака молочной железы с использованием анализов неметилированных генов для разных целей, таких как скрининг, регистрация, определение стадий, прогноз, предсказание и мониторинг заболевания, прогноз и мониторинг лечения (включая варианты вакцин).

Пример 1. Анализ РТ-антигенов: конструирование праймеров ίη хШсо

Разработали несколько анализов гипометилирования, предназначенных для целенаправленного выявления неметилированного варианта генной последовательности для РТ-антигенов СТАО1В (=ΝΥ-Βδ01), СТАО2 (=ЬАОЕ-1) и РКАМЕ.

Компьютерную программу РгйнегЗ, адаптированную в соответствии с требованиями М8Р (ЬйрУ/Гоккег.М.тй.ейи/праймерЗ/шрикЫт), использовали для конструирования ίη хШсо прямого (Е) и обратного (К) праймеров для выявления неметилированной формы СТАО1В, СТАО2 и РКАМЕ. Использовали следующие условия: размер ампликона: 50-120; размер праймера: 19-27; температура плавления: 55-65; максимальная З'-самокомплементарность = 0; окно 4000 п.н. вокруг Т88 (количество возвратов = 2000).

Положение И-праймеров СТАО1В, СТАО2 и РКАМЕ относительно стартового сайта транскрипции (Т88) показано на фиг. 1, 2 и 3, соответственно. Исследуемая область включала в себя область промотора и простиралась до первых экзонов.

Либо прямой, либо обратный праймер синтезировали так, чтобы они включали в себя подходящую структуру типа стебель-петля или шпилька, несущую донорный и акцепторный остаток на 5'-конце, несущем последовательность

- ЗЗ 021100

Разные сочетания праймеров, которые были подвергнуты тестированию, указаны в табл. 1 ниже. Принцип методики ПЦР с использованием праймеров АтрПЛиог описан на фиг. 5.

Таблица 1. Праймер и детекторные последовательности АтрПЛиог СТАО1В, СТАО2,

РКАМЕ, МадеА3 и АСТВ. Остаток АтрПЛиог подчеркнут

Название анализа Длина ампликона	Название праймера	Тип праймере»	5'-3’-последовательности Модификации детектора: 5’ РАМ и
		,-а.А	внутренний сГО-дабцил
СТАС1В_1_3_АМР 151 п.н.	СГАО1В_1_8_АМР	смысловой праймер АшрНЯиог	АОССАТОСОТГСОАОСАТСССиООА АООТОООООАОАОТО ί 5ЕО ГО ΝΟ. 1)
СТАО1В_1_А5	антисмысловой праймер	ААААСААСАСААССССААААА (5Еф ГО N0.2)
СТАС1В_1_АЗ_АМ Р 151 п.н.	СТА01В_1_А5_АМ Р	антисмысловой праймер АтрПЛиог	АОСОАТОСОТТСОАОСАТСОС1 1ААА АСААСАСААССССААААА (8Ер ГО N0.3)
СТАО1В_1_5	СМЫСЛОВОЙ праймер	ОСААООТОООООАОАОТО (5ЕО ГО N0.4)
СГАО1В_2_3_АМР 152 п.н.	СТАС1В23АМР	смысловой праймер АтрПЛиог	АССОАТОССТТССАССАТСОСТСОО ТГСОАСАОТТСТТТСТТТО (ЗЕО ГО N0.5)
СТАС1В2АЗ	антисмысловой праймер	САСАТСТСССССАССТССТ (ЗЕО ГО N0.6)
СТАО1В_2_А5_АМ Р 152 п.н.	СТАО1В_2_АЗ_АМ Р	антисмысловой праймер АшрНЯиог	АСССАТСССТТСОАОСАТСССиСАС АТСТСССССАССТССГ (ЗЕО ГО N0.7)
СТАО1В_2_5	смысловой праймер	ОООТТООАСАОТТОТТТОТТТО (5Ер ГО N0.8)
СТАС2_1_8_АМР 172 п.н.	СГАО2_1_5_АМР	смысловой праймер АтрПЛиог	АОССАТССОТТСОАОСАТСОСЕТОО ТОСТСТГСТПТТОТОТ (5Е0 ГО ΝΟ, 9)
СТАС21А5	антисмысловой праймер	СТГААСССГАТТАТСТССАТСТС (ЗЕрГОКО. 10)
СТАС2_1_А5_АМР 172 п.н.	СТАО2_1_А8_АМР	антисмысловой праймер АшрНЯиог	АССОАТСССТГССАССАТССГОЛ ГОТТ ААСССТАТГАТСТССАТСТС (ЗЕО ГО ΝΟ. 11)
СТАО2_1_5	смысловой праймер	ТОСТССТСТГОТТТТТСТОТ (5Е0 ГО ΝΟ. 12)
СТАО2_2_5_АМР 102П.Н.	СТАО2_2_5_АМР	смысловой праймер АтрПЛиог	АОССАТСССТТСОАОСАТСССиОСТ ООТПТОААООАТТТТАТТО (ЗЕО ГО ΝΟ, 13)
СТАС22А8	антисмысловой праймер	АСССААСАССТГСССТАТССТ (ЗЕО ΙϋΝΟ. 14)
СТАС2_2_АЗ_АМР 102 п.н.	СТАС2_2_А5_АМР	антисмысловой	АСГООАТОСОТТССАССАТСОСи.АСС
		праймер АтрПЛиог	СААСАССТТСССТАТССГ (ЗЕО ГО ΝΟ. 15)
СГАО2_2_5	смысловой праймер	ООТООТТГТОААООАТТТТАТТС (5ΕΟΙΟΝΟ. 16)
СТАО2_3_8_АМР 147 п.н.	СТАС2_3_3_АМР	смысловой праймер АтрПЛиог	АОССАТСССТГССАССАТСОСЕГТТТ ТОТТТТОСОАТОТТОТАТТТТ (ЗЕО ΙΌΝΟ. 17)
СТАО23А8	антисмысловой праймер	ССТСАТССАСССААСАССТГ (ЗЕО ГО ΝΟ, 18)
СТАС2_3_А5_АМР 147 п.н.	СГАС2_3_А5_АМР	снтисмысловой праймер АтрПЛиог	АСССАТСССТТССАСС.АТССС1ГОСТ САТССАСССААСАССТТ (5Е0 ГО ΝΟ. 19)
СТАО2_3_3	СМЫСЛОВОЙ праймер	ТГГЮГГГГОООАТСТГОТАТГГГ (5ΕΟΙΌΝΟ. 20)
РКАМЕ_1_3_АМР 143 п.н.	РКАМЕ_1_3_АМР	СМЫСЛОВОЙ праймер АтрПЛиог	АСССАТСССГГССАССАТСССиТСС СТТТСТАСТСТПТАОТАТТОТТТ (5Е0 ГО N0.21)
ΡΚΑΜΕΙΑ5	антисмысловой праймер	ТССАСССТАСТТТСССТАСАТГС (5Е0 ГОКО. 22)
РКАМЕ_1_А8_АМР 143 п.н.	РКАМЕ_1_А5_АМР	антисмысловой праймер АтрПЛиог	АОСОАТСССТТССАОСАТСОСТТСС АСССТАСТТТСССТАСАТГС (ЗЕО ГО N0.23)
РКАМЕ_1_3	смысловой праймер	ТООСТТТОТАСТОТТТТАОТАТТСТТ Τ(5Ε0ΙΟΝΟ. 24)
РКАМЕ_2_5_АМР 128 п.н.	РКАМЕ_2_3_АМР	смысловой праймер АтрПЛиог	АОСОАТОСОТТСОАОСАТСОСЕГТТО ТТТТСССАТАТТТТАТТГС'ПТГ (ЗЕО Π5Ν0. 25)
РКАМЕ_2_А5	антисмысловой праймер	АААААСТССАСССТАСТТТСС (ЗЕО ГОКЮ. 26)
РКАМЕ_2_А5_АМР 128 п.н.	РКАМЕ_2_А8_АМР	антисмысловой праймер АтрПЛиог	АОСОАТОСОТТСОАССАТСОСиААА ААСТССАСССТАСТТТСС (ЗЕО ГО N0. 27)
РКАМЕ_2_3	смысловой праймер	ТТСТГГГОООАТАТТТТАТТТСТГТТ (ЗЕО ГО N0.28)
РКАМЕ_3_5_АМР 141 п.н.	РКАМЕ_3_8_АМР	смысловой праймер АтрПЛиог	АСССАТСССТТСОАОСАТСССиСАС СССАССССТСТСААТСТС (ЗЕО ГО ΝΟ, 29)
РКАМЕЗА8	антисмысловой праймер	САТТССТСССТАСТСССААААА (ЗЕО ГОКЮ. 30)

- 34 021100

РКАМЕ_3_А8_АМР 141 л.н.	РРАМЕЗА8АМР	антисмысловой праймер Атрййиог	АЛСОАТЛСПТТСГтАОСАТСЛП 1САТ ТССТСССТАСТСССААААА (5ЕЦ ГО N0.31)
РКАМЕЗ_8	смысловой праймер	ΟΑΟΟΟΟΑΟΟΟΟΤΌΤΟΑΑΤΟΤΟ (8Е<2 ΙϋΝΟ. 32)
РКАМЕ_6_3_АМР 129 п.н.	РКАМЕ6_8_АМР	смысловой праймер Атрййиог	АСССАТСССТТСОАССАТСССШОО ТОСАТСТТТТССОАТТТ (3Εζ> ГО ΝΟ. 33)
РКАМЕ6АЗ	антисмысловой праймер	СААСАТТТСТАССТСТАСГСССАССТ Т(5Е0 ГО N0.341
РВАМЕ_6__АЗ_АМР 129 п.н.	РКАМЕ_6_А5_АМР	антисмысловой праймер Атрййиог	АОССАТСССТТССАССАТСОСиСАА САТТТСТАССТСТАСТСССАССГГ (δΕΟΙΌΝΟ. 35)
РКАМЕ_6_8	смысловой праймер	ТСОТСОАТОТП 1ОООАТТТ (8Ер ГО 140.36)
РКАМЕ_7__3_АМР 120 п.н.	РКАМЕ_7_3_АМР	смысловой праймер Атрййиог	АОСОАТССОТТСОАОСАТСОСиОТТ ТТООААООАТТОАОАААТОО (8ЕЦ ГО N0.37)
РКАМЕ_7_А8	антисмысловой праймер	САСССТААССАСГАСАТААААСААА (δΕΟΙϋΝΟ. 38)
РКАМЕ_7_АЗ_АМР 120 п.н.	РКАМЕ_7_АЗ_АМР	антисмысловой праймер Атрййиог	АОСОАТОСОТТСОАОСАТСОС ГАС ССГААССАСТАСАТААААСААА {ЗЕОГОИО. 39)
РКАМЕ_7_3	смысловой праймер	ОТТТТОСААООАТТОАСАААТОО <8ЕС?ГОК0. 40)
АСТВ_3_АМР 125 п.н.	АСТВ5АМР	смысловой праймер Атрййиог	АССОАТОСОТТСОАОСАТСОССТАО ООАОТАТАТАООТТООООААОТГ <5ЕОГОУО. 41)
АСТВ_АЗ	антисмысловой праймер	ААСАСАСААТААСАААСАСАААТГС АС (ЗЕ£> ГО ΝΟ. 42)
МАОЕ-АЗ 002 и 140 п.н.	МАОЕАЗ_СО_2_и_ РАМР	смысловой праймер Атрййиог	АОССАТОСОТТСОАССАТСОСиТСО ААТТТАОСОТАОТАТТСТ (5ЕС? ГО N0.61)
МАОЕАЗ_ОО_2_и_ А8	антисмысловой праймер	СССТССАССААСАТСААА (5Е<3 ГО N0.62)

Пример 2. Температурный градиент и выбор анализа

Материалы и способы

Температурный градиент для приготовления стандартного материала. ПЦР осуществляли, используя термоциклер М1 Кекеагсй РТС-200. Использовали следующие условия циклирования: стадия 1 5 мин при 95°С; стадия 2 на протяжении 35 повторов 30 с при 95°С, 30 с при температуре отжига, 30 с при 72°С; стадия 3, 30 мин при 72°С, выдерживание при 4°С. Температуру отжига устанавливали на нагревательном блоке прибора в виде градиента от 57 до 62°С.

Клонирование. ПЦР-продукты лигировали в векторы ТОРО® ТА (набор для клонирования ТОРО®, йц'Пгодеп®) и трансформировали компетентные клетки Е. Сой 0пе §йо!®. Плазмиды выделяли, используя набор О!Аргер® крш ш1б1ргер из Ц1адеп ОтЪН, согласно протоколу производителя. Клонированные ПЦР-продукты подтверждали секвенированием и сравнивали с опубликованными промоторными последовательностями.

Подготовка материала для стандартной кривой. Плазмиды линеаризовали расщеплением ферментом рестрикции ВатШ (Косйе) и затем очищали, используя набор для очистки продуктов ПЦР ОЕ Ацшск® (Ц1адеп ОтЪН; согласно протоколу производителя). Концентрации в препаратах для ПЦР или плазмидных препаратах определяли, используя УФ-спектрофотометрию. Готовили исходный раствор 2х10⁷ копий/5 мкл и хранили при -80°С вплоть до использования. Разведения для стандартных кривых (2х10⁶-2х10^! копий/5 мкл) в каждом эксперименте были свежеприготовленными.

М§-ПЦР в реальном времени. Количественную оценку СТАО1В, СТАО2, РКАМЕ и β-актина осуществляли в анализах М§Р в режиме реального времени. Анализы состояли из параллельных процессов амплификации/количественной оценки с использованием специфичного сочетания праймеров для каждой формы анализа Атрййиог®, используя либо устройство АШ Рпкт® 7900НТ (Аррйеб Вюкук!етк), либо 1-Сус1ег (ВюКаб). Использовали следующие условия циклирования: стадия 1 50°С в течение 2 мин; стадия 2 95°С в течение 15 мин; стадия 3 95°С в течение 15 с, 57°С в течение 30 с, 57°С в течение 30 с (плато-сбор данных); 45 повторов. Результаты обрабатывали, используя либо компьютерную программу 8Ό8 2.2.2 Аррйеб Вюкук!етк, либо компьютерную программу 1Сус1ег ίρ. версию 3.1, ВюКаб, и выражали в виде значений С! (номер цикла, при котором кривые амплификации пересекают пороговое значение, устанавливаемое автоматически компьютерной программой).

Результаты

Праймеры, соответствующие парам праймеров, описанным в табл. 1, использовали для получения ПЦР-продуктов для каждого анализа. С указанной целью короткие области СТАО1В_1, СТАО2_1 и РКАМЕ_7, которые описаны на фиг. 1-3, амплифицировали, используя обработанную бисульфитом универсальную неметилированную ДНК СрОепотеТМ в качестве материала матрицы. Для каждой пары праймеров тестировали несколько температур отжига (57-62°С), чтобы получить один ПЦР-продукт. Полученные ПЦР-продукты очищали и подвергали количественной оценке, а затем разбавляли, чтобы

- 35 021100 получить стандартный материал для каждого анализа. Начальные смеси для М8-ПЦР в реальном времени готовили, использовали очищенные ПЦР-продукты (специфичные для каждого анализа) в качестве матрицы и разные сочетания пар праймеров, которые описаны в табл. 1. В конечном итоге для дальнейшего исследования оставляли следующие анализы: СТАС1В_1_8АМР, СТАС1В_2_А8_АМР, СТАС2_1_8_АМР, СТАС2_1_А8_АМР, СТАС2_3_8_АМР, РРАМЕ_1_А8_АМР, РРАМЕ_2_8_АМР, РРАМЕ_3_А8_АМР, РРАМЕ_6_А8_АМР и РРАМЕ_7_8_АМР. Пример выполнения (включая все 6 точек данных) каждого анализа показан в табл. 2.

Таблица 2. Суммарные данные о наклонах и эффективностях ПЦР в РТ-анализах (* включены только 4 точки данных)

Название анализа	Наклон	К3	Эффективность
СТАО1В18АМР	-3,5841	0,9999	90,11%
СГАС1В2А5АМР*	-3,5044	0,9919	92,91%
СТАО21А8АМР	-3,2955	0,9998	101,11%
СТАО218 АМР	-3,5534	0,9980	91,17%
СТАО238АМР	-3,5971	1,0000	89,67%
РКАМЕ_1_Л8ЛМР	-3,4750	0,9960	100,86%
РКАМЕ28АМР	-3,5334	0,9993	91,87%
РКАМЕ З АЗ АМР	-3,7041	0,9990	86,20%
РКАМЕ 6 А8 АМР	-3,5841	0,9999	90,11%
РКАМЕ7 8АМР	-3,8679	0,9994	81,36%

Для некоторых анализов ПЦР-продукт клонировали в плазмиде и конструкцию использовали вместо ПЦР-продуктов в качестве материала для получения стандартной кривой.

Пример 3. Согласованность между анализами М8-ПЦР в реальном времени и результатами количественной ОТ-ПЦР в реальном времени в случае генов СТАС1В, СТАС2 и РРАМЕ

Материалы и способы

РНК из линий клеток, образцов легкого, образцов меланомы и образцов рака молочной железы экстрагировали, используя реагент Тприге (РосЬе, УПуоогбе, Ве1дшт) согласно инструкциям производителя, за исключением того, что преципитацию изопропанолом заменяли стадией очистки Р№а§у (Ц1адеп, Уеп1о, №(Ьег1апб8). Концентрацию РНК определяли на основе значения оптической плотности при 260 нм. ДНК из клеточных линий экстрагировали, используя либо набор для клеток и тканей Ригедепе (Οίадеп № 158767), или набор Ц1Аатр ОКА т1ш (Ц1адеп № 51304).

Образцы биопсии легкого, предоставленные СЗКВю в растворе РКА 1а1ег®, использовали для экстракции геномной ДНК. Примерно 10 мг тканей легкого нарезали на очень маленькие кусочки, используя лезвия безопасной бритвы, и осуществляли экстракцию, следуя способу экстракции фенолом. ДНК из фиксированных формалином залитых парафином (РРРЕ) тканей молочной железы экстрагировали, следуя тому же способу экстракции фенолом/хлороформом после обработки ксилолом.

ДНК из образцов биопсии меланомы экстрагировали, используя либо набор Ц1Аатр ОКА тин (Ц1адеп № 51304), либо набор для очистки Мах\уе11 16 Т188ие ЭВА (Рготеде А81030).

Для обработки ксилолом каждую пробирку, содержащую РРРЕ-ткани, инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч с 750 мкл ксилола (Мегск № 1.08681.1000), чтобы растворить парафин. Когда парафин полностью растворялся, добавляли 250 мкл 70% этанола и после перемешивания пробирки центрифугировали в течение 15 мин с максимальной скоростью. Супернатант удаляли и образцы сушили на воздухе при комнатной температуре.

ДНК экстрагировали из образцов, используя фенол/хлороформ: коротко, образцы сначала инкубировали в течение ночи с 50-100 мкг/мл протеиназы К (РосЬе) и 8Ό8 в конечной концентрации 1% при 48°С, встряхивая при 1100 об/мин, 1 объем фенола смеси фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1) из 1пуйгодеп добавляли к 1 объему образца и смесь переносили в пробирку, содержащую стабилизирующий фазы гель (РЬаке Ьоск Се1) (ЕррепбогГ). После тщательного перемешивания пробирки центрифугировали, чтобы разделить фазы, и извлекали верхнюю водную фазу, содержащую нуклеиновую кислоту. Экстракцию с использованием пробирок, содержащих стабилизирующий фазы гель, проводили еще раз. ДНК осаждали, добавляя 750 мкл раствора ЕЮН/КН₄Ас и 2 мкл гликогена (РосЬе). Затем ее растворяли в 50 мкл ЬоТЕ (3 мМ трис, 0,2 мМ ЕЭТА, рН 8,0).

ДНК количественно оценивали, используя набор для количественного анализа днДНК Рюодгееп® (Мо1еси1аг РгоЬек, № Р7589), следуя рекомендациям производителя. λ-ДНК, поставляемую в наборе, использовали для получения стандартной кривой. Данные собирали с использованием ридера планшетов Р1ио8(ат Са1аху (ВМС ЬаЬ 1есЬио1од1е8, Сегтапу).

Обработка бисульфитом: до 1,5 мкл ДНК в ЬоТЕ обрабатывали, используя набор для метилирования ДНК Е2 из 2уто РекеагсЬ (№ Ό5002). Коротко, аликвоты объемом 45 мкл смешивали с 5 мкл буфера для разведения М и инкубировали при 37°С в течение 15 мин, встряхивая при 1100 об/мин. Затем добавляли 100 мкл реагента для превращения РТ и образцы инкубировали при 70°С в течение 3 ч, встряхива- 36 021100 ния при 1100 об/мин в темноте. После превращения образцы обессоливали и десульфировали согласно инструкциям производителя, и элюирование осуществляли в 50 мкл трис-НС1 1 мМ, рН 8,0.

2,4 мкл Обработанной бисульфитом ДНК использовали в конечном объеме реакции 12 мкл, содержащем праймеры в конечной концентрации 100 нМ каждого (конкретные сочетания согласно табл. 1) и 2х-смесь из набора зондов для ПЦР ^иаη!^!ес! ^1а§еп № 204З45). Универсальную метилированную и неметилированную ДНК СрОепоте™ (СЬетюоп 1п!егпа!юпа1, СА, υδΆ; № в каталоге 87821 и № в каталоге 87822) включали в каждое определение в качестве негативного и позитивного контролей. Реакционные смеси вносили в З84-луночный планшет. Анализы проводили, используя оборудование АррНеб Вюзуз!ет 7900НТ. Использовали следующие условия циклирования: стадия 1 50°С в течение 2 мин, стадия 2 95°С в течение 10 мин, стадия З (45 повторов) 95°С в течение 15 с, 57°С в течение З0 с (или 62°С в случае β-актина), 57°С в течение З0 с (или 62°С в случае β-актина), соответствующие плато-сбору данных. Результаты обрабатывали, используя компьютерную программу 8Ώ8 2.2.2 от АррНеб В1озуз1етз, и выражали в значениях С1 (номера циклов, в которых кривые амплификации пересекают пороговое значение, устанавливаемое автоматически компьютерной программой). Значения С1 использовали для расчета количества копий на основании линейной регрессии значений, отложенных на стандартной кривой 20 - 2х 10⁶ эквивалентов генных копий. Вычисляли соотношение между представляющим интерес геном и β-актином, чтобы получить результат тестирования.

Синтез кДНК на 2 мкг суммарной РНК осуществляли в 20 мкл смеси, содержащей 1 х буфер для первой цепи, 0,5 мМ каждого άΝΓΡ, 10 мМ дитиотреитола, 20 ед. ингибитора РНКазы ^готе^а № в каталоге N2511), 2 мкМ олиго(бТ)15 и 200 ед. обратной транскриптазы М-МЬУ (ЫГе ТесЬпо1о§1ез № в каталоге 28025-01З) в течение 1 ч З0 мин при 42°С.

кДНК, соответствующую 50 нг суммарной РНК, амплифицировали в ПЦР в смеси объемом 25 мкл, содержащей буфер ТацМап, 5 мМ МдС12, 0,4 мМ άυΓΡ, 0,2 мМ каждого нуклеотида, 0,625 ед. ДНК-полимеразы АтрН Тад ОоЫ, 0,05 ед. υΝΟ, 0,2 мкМ каждого из олигонуклеотидных праймеров и 0,2 мкМ зонда ТацМап МОВ. Использовали специфичные олигонуклеотидные праймеры и зонды МОВ. Гены-мишени и ген βактина амплифицировали в количественной ПЦР, используя систему ТацМап сйепнзйу 7900 (РЕ Аррйеб Вюзуз!етз). Профиль амплификации включает 1 цикл в течение 2 мин при 50°С, 1 цикл 12 мин при 95°С и 40 циклов 15 с при 95°С и 1 мин при 60°С. Сигнал флуоресценции, генерируемый при распаде зонда ТацМат регистрировали в реальном времени в ходе всех стадий элонгации при 60°С. Необработанные данные анализировали, используя компьютерную программу регистрации последовательностей в реальном времени (Аррйеб Вюзуз!етз, А'аггтЩот иК). Вычисляли соотношение между геном-мишенью и β-актином, чтобы получить результат тестирования.

Конкретные условия

Для М8-ПЦР в реальном времени использовали следующие конкретные условия для стандартной кривой: по меньшей мере 4 точки в двух повторах; АС! (между повторами) < 1,5; эффективность ПЦР > 80%; Κ2 > 0,99; позитивные контроли должны быть позитивными; негативные контроли должны быть негативными.

Критерии для интерпретации результатов были основаны на значениях соотношения, рассчитанных с использованием стандартных эквивалентных копий представляющего интерес гена и копий β-актина: отношение = (копии представляющего интерес гена/копии β-актина) х 1000.

В случае экспрессии генов конкретные условия были такими, что ОТС имел С! больше З5, и позитивный контроль был позитивным с АС! повторов для гена-мишени и β-актина <2.

Результаты экспрессии гена вычисляли относительно экспрессии актина. Предел отсечения для экспрессии ΡΚАМΕ установлен на значении 1Е-04 копий/копию актина, и для СТАО1В и СТАО2 предел отсечения установлен на значении 1Е-05 копий/копию актина. Образцы были приемлемыми, если С! β-актина было меньше 2З, и АС! повторов <2, и если для гена-мишени АС! повторов было <2.

Таблица З. Критерии интерпретации результатов М8-ПЦР в реальном времени.

^Значение предела отсечения установлено конкретно для каждого анализа

Результаты	Статус метилирования/отсутствия метилирования
β-актин < 2,00 копий	Результат недостоверный
2,00 <р-актин < 200,00 копий и РТ-ген < 2,00 копий	Результат недостоверный
β-актин > 200,00 копий и РТ-ген < 2,00 копий	Результат МЕТИЛИРОВАННЫЙ (нет отношения)
β-актин > 2,00 копий и РТ-ген > 2,00 копий	Отношение: РТ- ген/ β-актин х 1000 > значение предела отсечения*	Результат НЕМЕТИЛИРОВАННЫЙ
β-актин > 2,00 копий и РТ-ген > 2,00 копий	Отношение: РТ-ген / β-актин х 1000 < значения предела отсечения *	Результат МЕТИЛИРОВАННЫЙ

- З7 021100

Результаты

Линии клеток

После подбора наиболее оптимальных условий Μδ-ПЦР в реальном времени с использованием альтернативного материала для стандартной кривой анализировали различные линии клеток в анализе деметилирования СТАС1В, СТАС2 и ΡΚΑΜΕ. Результаты сравнивали с результатами, полученными с использованием ОТ-ПЦР в реальном времени. Показан один анализ для каждого исследованного гена (СТАС1В, СТАС2, ΡΚΑΜΕ), см. табл. 4-6.

Таблица 4. Суммарные результаты Μδ-ПЦР в реальном времени, полученные с использованием анализа СТАС1В_1_8. по сравнению с данными ОТ-ПЦР в реальном времени (экспрессии) для 20 линий клеток; показанные результаты сортировали по значению отношения. Данные экспрессии - Ν/А: нет данных; негативный: не экспрессирующие образцы; экспрессирующие образцы указаны с использованием соответствующего значения.

Линия клеток	Отношение СГАС1В_1_8/ β-актин (копий) X 1000	Данные экспрессии СТАО1В
НЬ-60	0	ΝΑ
8Ш-480	0	Негативный
ЬИСар	1,81	Негативный
Ь5-174Т	28,17	Негативный
89/620	73,75	Негативный
НТ29	74,07	Негативный
МСР7	81,95	Негативный
КС1	85,54	Негативный
Ν(2[-Η460	93,52	Негативный
81ач	94,33	Негативный
Сей	99,43	Негативный
Т-470	116,29	Негативный
ЕГАСС3199	120,74	ΝΑ
РСЗ	140,68	Негативный
ЗК-МЕЬ-5	165,07	Негативный
СКЬ5815	180,51	Негативный
ЗКОУЗ	196,44	Негативный
К562	204,86	Негативный
СК1.2505	297,39	2,03Е-О2
СКТ5803	390,78	1,71Е-02

- 38 021100

Таблица 5. Суммарные результаты М8-ПЦР в реальном времени, полученные с использованием анализа СТАС1В_1_А8, по сравнению с данными ОТ-ПЦР в реальном времени (экспрессии) для 20 линий клеток; показанные результаты сортировали по значению отношения. Данные экспрессии - Ν/А: нет данных; негативный: не экспрессирующие образцы; экспрессирующие образцы указаны с использованием соответствующего значения; сомнительные образцы указаны в скобках.

Линия клеток	Отношение СТАС2_1_АЗ/ β-актин (копий)X1000	Данные экспрессии СТАО2
СКЬ5803	0	Негативный
Оег1	0	Негативный
К<31	0	Негативный
δίες	0	Негативный
5К-МЕЬ-5	0	[4,75Е-05]
НЬ-60	0	ΝΑ
Τ-47Ο	0	Негативный
РСЗ	0	Негативный
иАСС3199	1,11	ΝΑ
ΝΕΙ-Η460	1,36	Негативный
8\У-480	1,77	Негативный
8ХУ620	1,94	Негативный
МСР7	5,8	Негативный
ЬМСар	8,96	[2,23Е-05]
ΗΤ29	10,15	Негативный
К562	23,4	3,93Е-О3
8КОУЗ	28,73	Негативный
СКЬ5815	52,52	2,53Е-О3
СКЬ2505	153,86	3,63Е-О2
Ь5-174Т	169,91	2ДЗЕ-ОЗ

Таблица 6. Суммарные результаты М8-ПЦР в реальном времени, полученные с использованием анализа РКАМЕ_3_А8, по сравнению с данными ОТ-ПЦР в реальном времени (экспрессии) для 20 линий клеток; показанные результаты сортировали по значению отношения. Данные экспрессии - Ν/А: нет данных; негативный: не экспрессирующие образцы; экспрессирующие образцы указаны с использованием соответствующего значения.

Линия клеток	Отношение ΡΡΑΜΕ_3_Αδ/ β-актин (копий)X1000	Данные экспрессии РКАМЕ
КО1	1,79	2,75Е-05
НТ29	9,07	Негативный
МСР7	9,2	Негативный
δ\ν- 480_О1	24,65	Негативный
ЗХУ620	99,84	Κ44Ε-05
ΝΟΙ-Η460	116,05	2,65Е-03
1ТАСС3199	120,77	ΝΑ
СКЬ2505	150,82	К97Е-03
Т-471)	167,05	1.83Ε-Ο3
Ь5- 174ТС1	187,35	Негативный
РСЗ	190,74	3,48Е-03
СКЬ5815	233,9	8,38Е-05
СКЬ5803	251,42	2,99Е-02
δΚ-ΜΕΕ-5	271,66	К11Е-01
бГац	292,37	Позитивный
<3ег1	461,68	Позитивный
ЕКСар	487,28	2,36Е-02
НЬ-60_С1	588,05	ΝΑ
δκον3	659,56	9,69Е-03
К562	922,78	2,71Е-01

Одной из целей настоящего эксперимента было выявление подходящих позитивных и негативных

- 39 021100 линий клеток для анализов, проводимых на образцах раковых заболеваний. В том случае, когда данные МЗ-ПЦР в реальном времени сравнивали с данными экспрессии, наблюдали (табл. 4), что СКЕ2505 и СКЕ5803 имеют наиболее высокие отношения СТАО1В_1_З/в-актин и поэтому могут быть использованы в качестве позитивных линий клеток для деметилирования СТАО1В при использовании анализа СТАО1В_1_З. Линии клеток З\У-480 и НЬ-60 можно использовать в качестве негативных линий клеток для такого анализа.

Также можно определить наилучшие позитивные и негативные линии клеток для анализа тестируемых СТАО2 и РКАМЕ (табл. 7 и 8).

Таблица 7. Наилучшая позитивная линия (линии) клеток и негативная линия (линии) клеток для анализов деметилирования СТАО2

Анализ	Наилучшая позитивная линия (линии) клеток	Негативная линия (линии) клеток
СТА02_1_3	СКЕ2505	СКЬ5803/ОЕКЬ
СТАО21А8	СКТ25О5/Е8-174-Т	СКЬ5803/ОЕКЕ
СТАС2_2„8	СКТ5815/К562	СКЬ5803
СТАС2_3_3	К562	СКЬ5803,СЕКЬ

Таблица 8. Наилучшая позитивная линия (линии) клеток и негативная линия (линии) клеток для анализов деметилирования РКАМЕ

Анализ	Наилучшая позитивная линия (линии) клеток	Негативная (линии)	ЛИНИЯ
РКАМЕ 1 А5	НЬбО/ЬпСар	МСР7
РКАМЕ23	К562	МСР7 / НТ29
РКАМЕ_3_А8	К562	КО1/МСР7
РКАМЕ 6_А8	К562	КО1/МСР7
РКАМЕ_7_5	ОЕКЬ	МСР7/НТ29

Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ)

Образец НМРЛ использовали для исследования экспрессии СТАО1В, СТАО2 и РКАМЕ в ОТПЦР в реальном времени, а также статуса их метилирования в МЗ-ПЦР в реальном времени. Обнаружено, что 3 образца непригодны по меньшей мере для одного способа, и поэтому сравнивали результаты, полученные для 48 образцов НМРЛ. Сравнение результатов выражали графически. Не обнаружено хорошей согласованности для СТАО1В в случае анализа СТАО1В_1_З (фиг. 6). При сравнении экспрессии СТАО2 с результатами, полученными в 4 анализах деметилирования, наилучшую согласованность получали в анализах СТАО2_1З (фиг. 8) и СТАО2_1АЗ (фиг. 7), в которых показана 87,5% согласованность между двумя методиками. В случае СТАО2_2_З (фиг. 9) и СТАО2_3_З (фиг. 10) обнаружена меньшая согласованность, 68,8 и 66,7%, соответственно. Что касается РКАМЕ, то наблюдали диапазон согласованности от 66,7 до 85,4%, в зависимости от анализа (фиг. 11-15). Наилучшую согласованность с данными экспрессии наблюдали в анализе деметилирования РКАМЕ_3_АЗ (фиг. 14), причем показана согласованность 85,4%. В табл. 9 показаны суммарно все результаты, полученные при сравнении экспрессии генов и метилирования генов а образцах НМРЛ.

Таблица 9. Суммарные результаты, показывающие коэффициенты корреляции Пирсона (К) и результаты определения согласованности для образцов немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ).

* Стандартная кривая РКАМЕ_2_З не удовлетворяла условиям

Анализ	К	Согласован н ость
СГАО1В_1_5	0,35	/
СГАС2_1_3	0,88	87,5%
СТАС2_1_АЗ	0,86	87,5%
СТАС2_2_3	0,47	68,8%
СТАС2_3_3	0,55	66,7%
РКАМЕ_1_А8	0,39	66,7%
РКАМЕ_2_5 *	0,64	79,2%
РКАМЕ_3_А5	0,73	85,4%
РКАМЕ_6_АЗ	0,24	66,7%
РКАМЕ75	0,62	83,3%

Образцы меланомы

ДНК и РНК экстрагировали из 31 образца тканей меланомы в растворе КЛА 1а1ег®. Подобно исследованиям в случае НМРЛ такие образцы меланомы использовали для исследования экспрессии СТАО1В, СТАО2 и РКАМЕ в ОТ-ПЦР в реальном времени, а также статуса их метилирования в МЗ-ПЦР в реальном времени. Подобно НМРЛ не обнаружено хорошей согласованности с данными экспрессии, полученными в случае применения анализа деметилирования СТАО1В_1_З. В случае гена СТАО2 наилучшую согласованность наблюдали в 3 анализах: СТАО2_1_З (фиг. 18), СТАО2_1_АЗ (фиг. 17) и СТАО2_3З

- 40 021100 (фиг. 20), по всех анализах показана согласованность 74,2% между двумя методиками. В случае гена РКАМЕ во всех анализах РКАМЕ (фиг. 21-25) показана хорошая согласованность (90,З и 9З,5%). Однако только для РКАМЕ_7_8 (табл. 9) показан приемлемый коэффициент корреляции Пирсона К, вероятно вследствие небольшого количества негативных образцов (2) в данной группе. Результаты согласованности и корреляции, полученные на образцах меланомы, суммированы в табл. 10.

Таблица 10. Суммарные результаты, показывающие коэффициенты корреляции Пирсона (К) и результаты согласованности для образцов меланомы

Анализ	Е	Согласованность
СТАО1В_1_8	0	/
СТАО218	0,62	74,2%
СТЛС.2 1Л8	0,63	74,2%
СТАО2_2_8	0,34	51,6%
СТАО238	0,58	74,2%
РЕАМЕ1А8	0,26	93,5%
РКАМЕ2 8	0,29	90,3%
РКАМЕ_3_А8	0,48	90,3%
РЕАМЕ_6_А8	0,51	90,3%
РЕАМЕ 7 5	0,70	90,3%

Образцы рака молочной железы

Образцов раковых заболеваний молочной железы использовали для исследования экспрессии СТАО2 в ОТ-ПЦР в реальном времени, а также статуса его метилирования в М8-ПЦР в реальном времени. Обнаружено, что 1 образец непригоден по меньшей мере для одного способа, и поэтому сравнивали результаты, полученные для 28 образцов раковых заболеваний молочной железы. Согласованность результатов, полученных для анализов СТАО2_1_А8 и СТАО2_З_8, составляла, соответственно, 71,4% (фиг. 26) и 78,6% (фиг. 27).

Заключение

Обнаружено, что раково-тестикулярные (РТ) антигены, которые в нормальных тканях экспрессируются почти исключительно в семенниках, кроме семенников экспрессируются в раковых тканях. Как показано в настоящем исследовании, экспрессия РТ-генов может быть исследована в ОТ-ПЦР в реальном времени, а также опосредованно благодаря исследованию статуса метилирования промотора гена (или близко расположенной области). Действительно, аномальная экспрессия может быть связана с гипометилированием. Исследования на линиях клеток выявили позитивные и негативные контрольные линии клеток для всех анализов, включая анализ деметилирования СТАО1В. В тканях НМРЛ, меланомы и рака молочной железы можно было показать некоторую согласованность между экспрессией генов и статусом гипометилирования генов, за исключением анализов СТАО1В. Наилучшая согласованность для экспрессии СТАО2 была получена с использованием анализов деметилирования СТАО2_1_8 и СТАО2_1_А8, в обоих случаях показана согласованность 87,5% на образцах НМРЛ и 74,2% на образцах меланомы. Тогда как в случае анализа СТАО_2_З8 получено 78,6% на образцах рака молочной железы. Что касается РКАМЕ, то наилучшую согласованность получили с использованием анализа деметилирования РКАМЕ_З_А8 в НМРЛ (85,4%) и анализа РКАМЕ_1_А8 в меланоме (9З,5%). Два анализа осуществляли на раковых тканях молочной железы: СТАО2_1_А8 и СТАО2_З_8, соответственно, показали согласованность 71,4 и 78,6%.

Пример 4. Диагностика немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) с использованием анализов гипометилирования МАОЕ-АЗ

Материалы и способы

ДНК экстрагировали из материала тонкоигольной биопсии (ΡΝΉ).

Подобно примеру З, каждый образец и линию клеток анализировали в отношении количества ДНК, используя набор для количественного определения днДНК Ркодгееп® (Мо1еси1аг РгоЪек, № Р7589), следуя рекомендациям производителя. Данные собирали и анализировали, используя устройство для считывания планшетов Р1ио81аг Оа1аху (ВМО ЬаЪ 1есЬио1од1ек, Оегтапу). Как описано ранее, до 1,5 мкг ДНК обрабатывали, используя набор для метилирования ДНК Е2 из 2уто КекеагсЕ (подробности см. в примере 2), элюирования осуществляли в 25 мкл. Затем 2,4 мкл обработанной бисульфитом ДНК в общем объеме реакции 12 мкл, содержащем каждый из праймеров в конечной концентрации 100 нМ, подвергали анализам М8Р в реальном времени в отношении β-актина (также как в примере З) и МАОЕ-АЗ (МАОЕАЗ ОО_2 и) (табл. 1). В качестве смеси для ПЦР использовали Пас.] кирегпих с Кох из Вю-Кай (№ 1725855). Плазмидную конструкцию (клонированный ПЦР-продукт в клонирующем векторе ТОРО® из 1пуйгодеп НГе 1есЬпо1од1ек) использовали для получения стандартов. Реакционные смеси вносили в З84луночный планшет. Анализы проводили, используя оборудование АррПей ВюкуПет 7900НТ. Использовали следующие условия циклирования для анализа β-актина: стадия 1 50°С в течение 2 мин, стадия 2 95°С в течение 10 мин, стадия З 95°С в течение 15 с, затем 62°С в течение 1 мин (плато-сбор данных), 45 повторов. Использовали следующие условия циклирования для анализа МАОЕ-АЗ ОО_2: стадия 1 50°С

- 41 021100 в течение 2 мин; стадия 2 95°С в течение 10 мин; стадия 3 95°С в течение 15 с, затем 59°С в течение 1 мин (плато-сбор данных), 45 повторов. Результаты обрабатывали, используя либо компьютерную программу 5Ό5 2.2.2 из АррНеб Вюкук!етк, и выражали в значениях С! (номера циклов, в которых кривые амплификации пересекают пороговое значение, устанавливаемое автоматически компьютерной программой). Значения С! использовали для расчета количества копий на основании линейной регрессии значений, отложенных на стандартной кривой 20 - 2x10 эквивалентов генных копий. Вычисляли соотношение между представляющим интерес геном и β-актином, чтобы получить результат тестирования.

Результаты

В данном разделе описаны результаты, полученные с использованием образцов тонкоигольной биопсии (РNВ), взятых у пациентов с немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ) с поздней стадией заболевания, которые не подвергались резекции опухоли и для которых не могли получить данные об экспрессии.

После экстракции ДНК и превращения (обработки бисульфитом), 35 РNВ подвергали анализу гипометилирования МАОЕ-А3 ОО_2 и (табл. 1). Для интерпретации результатов использовали такие же критерии, как в примере 3 (табл. 3). Так как было невозможно сравнить тест гипометилирования с кОТПЦР, предел отсечения для теста гипометилирования приходилось устанавливать опосредованно. На основании результатов, полученных в таком же анализе на фиксированных формалином, залитых парафином (РРРЕ) тканях легкого и тканях в растворе КNА1а!е^ от пациентов с !В- и П-стадиями НМРЛ, выбранный предел отсечения составляет 112. Соответствующие результаты представлены в табл. 11. Следует отметить, что значение предела отсечения можно корректировать для того, чтобы он лучше соответствовал данным экспрессии.

Таблица 11. Статус метилирования в 35 образцах тонкоигольной биопсии (РNВ) от пациентов с немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ). Линия Ьпсар представляет собой линию клеток, используемую в качестве позитивного контроля в тесте гипометилирования, тогда как линия Όϋ145 представляет собой линию клеток, используемую в качестве негативного контроля в данном анализе. Анализ осуществляли, используя предел отсечения 112 для вычисляемого отношения.

Детектор	Образец	©(анализ МАОЕ-АЗ СО_2Ц)	Копии МАОЕ- АЗ	Отношение ген/Ь- актин (копий) X 1000	СТАТУС МЕТИЛИРОВАНИЯ
МАСЕАЗ	233057_С1	33,75	68.85	37.19	41 ЩТЦРПЦМ111ЧИ. -
МАСЕАЗ	233058_С1	31.05	359.64	262.90	НЕМЕТИЛИРОВАННЫЙ
МАСЕАЗ	233059 С.1	36.79	10.71	5.91
МАС.ЕАЗ	233060_С1	34.22	51.78	24.29
МАСЕАЗ	233061. С,1	34.07	56.49	255.84	НЕМЕТИЛИРОВАННЫЙ
МАСЕАЗ	233062_С1	30.70	444,05	215.36	НЕМЕТИЛИРОВАННЫЙ
МАСЕАЗ	233063 С1	34.70	38.49	30.64	Μ1Ίψ[ΙΙΙ·ι.·ι1Λ4Ιΐ:,Ιΐ'Ι
МАСЕАЗ	233064 С.1	26.07	7549.74	442.02	НЕМЕТИЛИРОВАННЫЙ
МАСЕАЗ	233065_С1	34.54	42.55	70.62	ΜΙ,ηΐΊ,ΙΡιιΙΙΛΙΓ,ΙΜΜ ΜΙ ΐΐήμΐΙΊ,ΙΙ ιΙΙΊΜΙΙ
МАСЕАЗ	233066_С1	36.12	16.10	2.62
МАСЕАЗ	233067 С1	36.73	11.10	12. Ή 41 ΙΓΗΜΙΌΙΜΙΙΗΙ.μΐ ·'
МАСЕАЗ	233068_С1	39.29	2.32	0.8 ММИДПРОНЛЙПКШ ’
МАСЕАЗ	233069 С.1	Не определяли	0.00	0,00 \Н ΠΡΙίΠΜΊΚ υΐιιπιιι-
МАСЕАЗ	233070_С1	33.99	59.43	16.77 41 II |ИРИЮП|1|.ГЧ
МАСЕАЗ	233071_С1	Нс определяли	0.00	0.0, '0 1)1 ΙΙΙΡΟΙΙΜΙΙ,Ι'ΙΙΙ
МАСЕАЗ	233072 С1	Не определяли	0.00
МАСЕАЗ	233073_С1	30.79	422.20	561,79	111 .МЕТИЛ ИР( )ΒΛΙ 11 ιι,ιι-ι м< ι:ι 1И|чιιι мιιιμΓι ι π ;μείή.ιι ИРОВА1 ιΓπ,ιι-ί
МАСЕАЗ	233074 С1	33.74	69.27	47.80
МАСЕАЗ	233075_С1	29,59	879.02	554.36
МАСЕАЗ	233076„С 1	Не определяли	0.00	ο,οο μι !ϊί·!ίπ·ύΐ»Λίηπ»:ΐ!
МАСЕАЗ	23.3077_С1	29.41	980.70	186.65	НЕМЕТИЛИРОВАННЫЙ
МАСЕАЗ	233078 С1	28,64	1567.01	609.72	НЕМЕТИЛИРОВАННЫЙ
МАСЕАЗ	233079 С1	36.24	15,04	0.96
МАСЕАЗ	233080_С1	31.40	290.03	245.69	НЕМЕТИЛИРОВАННЫЙ
МАСЕАЗ	233081 С1	29,53	908.41	230,92	НЕМЕТИЛИРОВАННЫЙ
МАСЕАЗ	233082_С1	32,43	154.15	45.57	ΜΠ.Ι.Ι.ίνΚΜΙΗΙ.,Κ.·
МАСЕАЗ	233083_С1 233084_С1 _	31,76 36.01	233.19	162.65	НЕМ ЕТИЛИРОВАННЫИ
МАСЕАЗ	17,32	145.84	НЕМЕТИЛИРОВАННЫЙ
МАСЕАЗ	233085_С1	36.22	15.15	61.27	ΜΚ,,Β, ΚΚ,ΚΜΗ.Ι,.Η--
МАСЕАЗ	233086, 01	31.28	311.56	213.53	НЕМЕТИЛИРОВАННЫЙ
МАСЕАЗ	233087_С1	26.57	5583.40	338.05	НЕМЕТИЛИРОВАННЫЙ
МАСЕАЗ	233088_С1	32.09	190.33	124.20	НЕМЕТИЛИРОВАННЫЙ ^НВШ^{11.:.НГ
МАСЕАЗ	233089_С1	34.18	52.80	25.14
МАСЕАЗ	233090. О!	36.18	15.57	1.50
МАС.ЕАЗ	233091_С1	34,78	36.55	269.73	НЕМЕТИЛИРОВАННЫЙ
МАСЕАЗ	Ьпсар а С1	30,23	592.88	1995.86	НЕМЕТИЛИРОВАННЫЙ
МАСЕАЗ МАСЕАЗ	Ьпсар Ь О1	29.93	714.43	2616.01	НЕМЕТИЛИРОВАННЫЙ
О1.Л45_а_С1	Не определяли	0.00	0.00	41 1И 1ИРОВМ1НЫН \П 1ШГО»1>ВЛ(1Г1ЫИ -
МАСЕАЗ	□1.Л45_Ь_<?.1	41.93	0.00	0.00

- 42 021100

При установлении значения предела отсечения 112 процент пациентов с гипометилированием МАОЕ-АЗ составил 45,7%. Такие пациенты, вероятно, экспрессируют МАОЕ-АЗ.

Заключение

Анализ деметилирования/гипометилирования может представлять особый интерес в случае таких типов образцов, для которых кОТ-ПЦР оказалось сложным. Таким случаем является использование образцов тонкоигольной биопсии (ΕΝΉ). Так как способ является неинвазивным, в будущем он может быть распространен на других пациентов с НМРЛ.

Настоящее изобретение не ограничено объемом конкретных вариантов, описанных в настоящем документе. Безусловно различные модификации изобретения в дополнение к модификациям, описанным в настоящем документе, будут очевидны для специалистов в данной области, исходя из приведенного выше описания и прилагаемых фигур. Подразумевается, что такие модификации подпадают под объем прилагаемой формулы изобретения. Кроме того, считается, что все варианты, описанные в настоящем документе, широко применимы и в случае необходимости их можно сочетать с любым и всеми другими совместимыми вариантами.

В настоящем документе цитированы различные публикации, описания которых включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

Claims (26)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Олигонуклеотид, содержащий или по существу состоящий или состоящий из любой из нуклеотидных последовательностей ЗЕО ГО N0: 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, З9 или 40, причем указанный олигонуклеотид, праймер или зонд применим для определения статуса метилирования РКАМЕ (преимущественно экспрессируемого в меланоме) гена.
2. 2. Олигонуклеотид по п.1, содержащий или по существу состоящий или состоящий из указанных ниже непрерывно следующих друг за другом последовательностей в порядке от 5'- к З'-концу (a) первой нуклеотидной последовательности длиной примерно от 6 до 30 нуклеотидов, причем нуклеотид в указанной первой нуклеотидной последовательности помечен первым остатком, выбранным из донорного остатка и акцепторного остатка пары для молекулярного переноса энергии, причем донорный остаток при возбуждении испускает флуоресценцию при одной или нескольких конкретных длинах волн, а акцепторный остаток поглощает и/или гасит указанную флуоресценцию, испускаемую указанным донорным остатком;

   (b) второй одноцепочечной нуклеотидной последовательности, содержащей, по существу состоящей или состоящей примерно из 3-20 нуклеотидов;

   (c) третьей нуклеотидной последовательности, содержащей, по существу состоящей или состоящей примерно из 6-30 нуклеотидов, причем нуклеотид в указанной третьей нуклеотидной последовательности помечен вторым остатком, выбранным из указанного донорного остатка и указанного акцепторного остатка, и указанный второй остаток является представителем указанной группы, которым не помечена указанная первая нуклеотидная последовательность, причем указанная третья нуклеотидная последовательность комплементарна в обратном порядке указанной первой нуклеотидной последовательности, так что может образовываться дуплекс между указанной первой нуклеотидной последовательностью и указанной третьей нуклеотидной последовательностью таким образом, что указанные первый остаток и второй остаток оказываются рядом друг с другом, так что когда донорный остаток возбуждается и испускает флуоресценцию, акцепторный остаток поглощает и гасит указанную флуоресценцию, испускаемую указанным донорным остатком; и (ά) находящейся на З'-конце праймера четвертой одноцепочечной нуклеотидной последовательности, содержащей, по существу состоящей или состоящей примерно из 8-40 нуклеотидов, которая содержит на своем З'-конце любую из нуклеотидных последовательностей, указанных в 8Е0 ГО N0: 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 или 40 (и способной праймировать осуществляемый полимеразой нуклеиновых кислот синтез нуклеотидной последовательности, комплементарной цепи нуклеиновой кислоты, содержащей часть метилированной или неметилировэнной ДНК гена РКАМЕ); причем когда указанной дуплекс не образуется, указанный первый остаток и указанный второй остаток разделены на такое расстояние, которое предотвращает молекулярный перенос энергии между указанным первым и вторым остатком.
3. 3. Олигонуклеотид по любому из предшествующих пунктов, который представляет собой праймер или зонд.
4. 4. Пара праймеров, содержащая праймер по любому из предшествующих пунктов.
5. 5. Пара праймеров, содержащих или по существу состоящих или состоящих из нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО N0: 21 и 8ЕО ГО N0: 22; 8ЕО ГО N0: 23 и 8ЕО ГО N0: 24; 8ЕО ГО N0: 25 и 5ЕО ГО N0: 26; 5ЕО ГО N0: 27 и 5ЕО ГО N0: 28; 5ЕО ГО N0: 29 и 5ЕО ГО N0: 30; 5ЕО ГО N0: 31 и 5ЕО ГО N0: 32; 5ЕО ГО N0: 33 и 5ЕО ГО N0: 34; 5ЕО ГО N0: 35 и 5ЕО ГО N0: 36; 5ЕО ГО N0: 37 и 5ЕО ГО N0: 38 или 5ЕО ГО N0: 39 и 5ЕО ГО N0: 40.
6. 6. Набор для определения статуса метилирования гена, содержащий по меньшей мере один олигонуклеотид по любому из пп.1-3 или пару праймеров по п.4.

   - 43 021100
7. 7. Способ определения присутствия и/или количества неметилированного гена РКАМЕ в ДНКсодержащем образце, предусматривающий (a) осуществление контакта/обработки ДНК-содержащего образца реагентом, который избирательно модифицирует неметилированные остатки цитозина в ДНК с получением определяемых модифицированных остатков, но который не модифицирует метилированные остатки цитозина;

   (b) амплификацию по меньшей мере части представляющего интерес неметилированного гена с использованием по меньшей мере одной пары праймеров, из которой по меньшей мере один праймер сконструирован так, чтобы он связывался только с последовательностью неметилированной ДНК после обработки реагентом.
8. 8. Способ по п.7, в котором по меньшей мере один праймер в паре праймеров содержит, по существу состоит или состоит из любой из нуклеотидных последовательностей 8Е0 ГО N0: 21-40.
9. 9. Способ диагностики наличия рака или предрасположенности к раку, предусматривающий определение статуса метилирования, по меньшей мере, гена РКАМЕ в образце с использованием олигонуклеотида по любому из пп.1-3, пары праймеров по п.4, набора по п.6 или способа по любому из пп.7-8, причем присутствие неметилированного РКАМЕ в образце является показателем наличия рака или предрасположенности к раку.
10. 10. Способ идентификации и/или отбора пациента, подходящего для лечения иммунотерапевтическим средством на основе РКАМЕ, предусматривающий определение статуса метилирования гена РКАМЕ в образце, полученном от пациента, с использованием олигонуклеотида по любому из пп.1-3, пары праймеров по п.4, набора по п.6 или способа по любому из пп.7-8, причем если ген РКАМЕ не метилирован, то субъекта идентифицируют и/или отбирают для лечения иммунотерапевтическим средством на основе РКАМЕ.
11. 11. Способ прогнозирования вероятности успешного лечения рака, предусматривающий определение статуса метилирования гена РКАМЕ в образце, полученном от пациента, с использованием олигонуклеотида по любому из пп.1-3, пары праймеров по п.4, набора по п.6 или способа по любому из пп.7-8, причем если ген не метилирован, то вероятность успешного лечения иммунотерапевтическим средством на основе РКАМЕ выше, чем в том случае, когда ген метилирован.
12. 12. Способ подбора подходящей схемы лечения рака, предусматривающий определение статуса метилирования гена РКАМЕ в образце, полученном от пациента, с использованием олигонуклеотида по любому из пп.1-3, пары праймеров по п.4, набора по п.6 или способа по любому из пп.7-8, причем если ген не метилирован, иммунотерапевтическое средство отбирают для лечения.
13. 13. Способ лечения рака у субъекта, предусматривающий введение композиции, содержащей или кодирующей РКАМЕ, причем субъект отобран для лечения на основе измерения статуса метилирования гена РКАМЕ с использованием олигонуклеотида по любому из пп.1-3, пары праймеров по п.4, набора по п.6 или способа по любому из пп.7-8.
14. 14. Способ лечения пациента, предусматривающий измерение статуса метилирования гена РКАМЕ с использованием олигонуклеотида по любому из пп.1-3, пары праймеров по п.4, набора по п.6 или способа по любому из пп.7-8 и затем введение пациенту композиции, содержащей или кодирующей РКАМЕ.
15. 15. Способ лечения пациента, подверженного рецидиву опухоли, экспрессирующей РКАМЕ, причем пациент был подвергнут процедурам по удалению опухолевой ткани, предусматривающий измерение статуса метилирования гена РКАМЕ в опухолевой ткани с использованием олигонуклеотида по любому из пп.1-3, пары праймеров п.4, набора по п.6 или способа по любому из пп.7-8 и затем введение пациенту композиции, содержащей или кодирующей РКАМЕ.
16. 16. Способ по любому из пп.14-15, в котором композиция содержит РКАМЕ, содержит полноразмерный РКАМЕ, по существу полноразмерный РКАМЕ или фрагменты РКАМЕ, например пептиды РКАМЕ.
17. 17. Способ по п.13-16, в которых белок, фрагмент или пептид РКАМЕ связан с белком-партнером по слиянию.
18. 18. Способ по п.17, в котором белком, являющимся партнером по слиянию, является белок Ό, поверхностный белок грамотрицательной бактерии НаеторЫ1и8 тЛиеп/а В или его производное.
19. 19. Способ по п.17, в котором белком-партнером по слиянию является ЬуЕА или его производное, содержащее или состоящее из части повтора молекулы ЬуЕА, находящегося на С-конце, начиная с остатка 178, или содержащее остатки 188-305.
20. 20. Способ по п.17, в котором белком-партнером по слиянию является N81 (гемагглютинин) или его производное, содержащее 81 ^концевую аминокислоту N81.
21. 21. Способ по любому из пп.13-20, в котором композиция содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, фрагмент или пептид РКАМЕ или его слитый белок.
22. 22. Способ по п.21, в котором молекула нуклеиновой кислоты находится в составе экспрессирующего вектора.
23. 23. Способ по любому из пп.13-22, в котором композиция, содержащая белок, фрагмент или пептид РКАМЕ, или композиция, содержащая нуклеиновую кислоту, дополнительно содержит один или более

    - 44 021100 из адъюванта, иммуностимулирующего цитокина и хемокина.
24. 24. Способ по п.23, в котором адъювант содержит один или более из монофосфориллипида А или его производного, сапонина или его производного и антагониста ТЬК9.
25. 25. Способ по п.24, в котором агонистом ТЬК9 является СрО-содержащий олигонуклеотид.
26. 26. Способ по любому из пп.23-25, в котором адъювант приготовлен в эмульсии типа масло в воде или эмульсии типа вода в масле, необязательно содержащей холестерин и/или токоферол, или приготовлен в виде липосомной композиции.