JP2013505008A - 患者が免疫療法に対するレスポンダーかそうでなきかを同定するための方法 - Google Patents

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Abstract

１つ以上の遺伝子の発現差異に基づき、患者を、療法に対するレスポンダーまたはノンレスポンダーとして特徴付けるための方法が提供される。遺伝子発現プロファイル、遺伝子発現プロファイルを表す核酸配列を含むマイクロアレイ、ならびに新規診断キットおよび治療方法もまた提供される。キットおよび方法は、例えば、ＭＡＧＥ発現腫瘍を患う、遺伝子発現プロファイルにより特徴づけられる癌患者の特定の集団の治療に関する。
【選択図】なし

Description

コンパクトディスク上で提出される材料
出願人は、本明細書によって、２００９年１０月６日に出願された米国仮出願第６１／２７８３８７号において出願された、２００９年１０月６日に作成された「ＶＲ６３９３３Ｐ_ｐｅ．ｔｘｔ」（ファイルサイズ２３．３３０ＭＢ）；および２００９年１０月６日に作成された「ＶＲ６３９３３Ｐ_ｒｑ．ｔｘｔ」（ファイルサイズ１５．７６７ＭＢ）と名付けられたファイルを含むコンパクトディスクのマテリアルに言及し、その恩典を本明細書で主張する。計２つのコンパクトディスク（複製を含む）が、本パラグラフにおいて言及される。
これらのディスク上のｐｅデータを利用するために、下記コマンドをＲセッションで打ち込むことにより、ＶＲ６３９３３Ｐ_ｐｅ．ｔｘｔ ＡＳＣＩＩファイルをＲセッションにインポートすること：
ｐｅ＜−ｒｅａｄ．ｔａｂｌｅ（"ＶＲ６３９３３Ｐ_ｐｅ．ｔｘｔ"）
ｐｅ＜−ｕｎｓｔａｃｋ（ｐｅ）
これらのディスク上のｒｑデータを利用するために、下記コマンドをＲセッションで打ち込むことにより、ＶＲ６３９３３Ｐ_ｒｑ．ｔｘｔ ＡＳＣＩＩファイルをＲセッションにインポートすること：
ｒｑ＜−ｓｃａｎ（"ＶＲ６３９３３Ｐ_ｒｑ．ｔｘｔ．"）
このデータの一般公開は本明細書の他の場所で開示される。
発明の分野
本発明は遺伝子発現プロファイル；患者を分類するための方法；マイクロアレイ；および本明細書で記載される方法およびマイクロアレイの使用により選択された患者集団の治療に関する。
メラノーマ表皮内のメラニン細胞に起因する腫瘍である。遠隔転移（癌に関する米国連合委員会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ）（ＡＪＣＣ）分類に従いステージＩＶ）において悪性メラノーマを有する患者は１年の生存期間中央値を有し、長期存率は５％にすぎない。ステージＩＶメラノーマに対する標準化学療法ですら、わずか８〜２５％の治療奏功率を有するが、全生存には効果はない。局所転移（ステージＩＩＩ）を有する患者は、原発性および局所転移の十分な外科的制御後であっても、２〜３年の生存期間中央値を有し、長期生存のチャンスは非常に低い（Ｂａｌｃｈ ｅｔ ａｌ.、１９９２）。ステージＩ〜ＩＩＩメラノーマを有するほとんどの患者は、腫瘍を外科的に除去しているが、これらの患者は、実質的な再発のリスクを維持している。よって、依然として、メラノーマ進行を防止し、転移性メラノーマに対する改善された治療計画および原発腫瘍が除去された患者のためのアジュバント治療を有することが必要である。
２つの型の肺癌が存在する：非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）。名称は、単純に腫瘍中で見いだされた細胞の型を説明する。ＮＳＣＬＣは、扁平上皮癌、腺癌、および大細胞癌を含み、肺癌の約８０％を占める。ＮＳＣＬＣは、治癒が困難で、使用できる治療は、可能な限りの延命と、疾患の症状の軽減を目的とする傾向がある。ＮＳＣＬＣは最も一般的な型の肺癌であり、不良転帰と関連している（Ｇａｔｚｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ., １９９４）。すべてのＮＳＣＬＣ患者のうち、約２５％のみが診断時に局所疾患を有し、依然として外科的切除の可能性がある（ＡＪＣＣ分類に従いステージＩＢ、ＩＩＡまたはＩＢ）。しかしながら、これらの患者の５０％超が完全な外科切除後２年以内に再発するであろう。よって、これらの患者のためのより良好な治療を提供する必要がある。
従来の化学療法は、有害物質を患者に投与し、ある程度、腫瘍／癌細胞による毒物の積極的な取り込みを期待することに基づく。これらの有害物質は、患者の免疫系に悪影響をし、個体は身体的に弱まり、感染しやすくなる。
癌患者がすべて現在の癌治療に応答するわけではないことが知られており、３０％以下の癌患者のみがいずれかの一定の治療に応答すると考えられる。治療に応答しない癌は、抵抗性として説明される。多くの場合、患者が治療に応答するかどうかを確立するための信頼できる方法が存在しない。しかしながら、区別することができないので、レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方である患者に治療を行うことは、資源の非効率的な使用となり、さらに悪いことに、患者に損害を与える可能性がある。というのは、前に記載したように、多くの癌治療は著しい副作用、例えば重度の免疫抑制、嘔吐および／または脱毛症を有するからである。多くの場合、必要ではない場合、または有効ではない場合に、患者は治療を受けると考えられる。
抗原、ペプチド、ＤＮＡなどに基づく次世代の癌治療は現在、多くのグループにより研究されている。これらの療法の多くの背後にある戦略は、しばしば癌免疫療法と呼ばれ、患者の免疫系を刺激し、癌と闘わせるものである。これらの療法は、そのような治療を受ける副作用が、癌治療を受けている患者が現在遭遇する副作用に比べ、最小に抑えられると予測されるので、好都合である可能性がある。癌免疫療法で使用される抗原は、ＡＳＣＩ、すなわち抗原−特異的癌免疫療法と呼ばれることがある。
１９８０年代初頭には、Ｖａｎ ＰｅｌおよびＢｏｏｎは、腫瘍細胞上で提示された抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞の発見を発表した。これにより、第１の腫瘍−特異的、共通抗原：メラノーマＡＧＥ−１（ＭＡＧＥ−１、その後ＭＡＧＥ−Ａ１に改名）のキャラクタリゼーションに至った。この後、同じ発現パターンを共有する多くの遺伝子が同定された：これらは広範囲の腫瘍型、例えば、メラノーマ、肺癌、膀胱癌、乳癌、頭頸部癌において発現される。これらは精巣を除く正常細胞では発現されない。しかしながら、精巣におけるこの発現は、これらの生殖系列細胞はＭＨＣクラスＩ分子を発現しないので、通常は抗原発現に至らない。特有の発現プロファイルから、癌精巣（ＣＴ）遺伝子の名称が、これらの遺伝子のために提案された。
ＭＡＧＥ抗原は、メラノーマ関連抗原遺伝子（ＭＡＧＥ）のファミリーによりコードされる抗原である。ＭＡＧＥ遺伝子は、メラノーマ細胞（悪性メラノーマを含む）およびいくつかの他の癌、例えばＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、頭頸部扁平上皮癌、膀胱移行細胞癌および食道癌上で優位に発現されるが、精巣および胎盤を除く正常組織では検出できない（Gaugler et al Human gene MAGE-3 codes for an antigen recognized on a melanoma by autologous cytolytic T lymphocytes J Exp Med. 1994 Mar 1;179(3):921-930）； Weynants et al Expression of mage genes by non‐small‐cell lung carcinomas Int. J Cancer. 1994 Mar 15;56(6):826-829, Patard et al Int J. Cancer 64: 60, 1995）。ＭＡＧＥ−Ａ３は、６９％のメラノーマで発現され（Ｇａｕｇｌｅｒ, １９９４）、４４％のＮＳＣＬＣ（Ｙｏｓｈｉｍａｔｓｕ １９８８）、４８％の頭頸部扁平上皮癌、３４％の膀胱移行細胞癌、５７％の食道癌、３２％の結腸癌および２４％の乳癌（Van Pel, et al Genes coding for tumor antigens recognized by cytolytic T lymphocytes Immunological Reviews 145, 229‐250, 1995, 1995）においても検出され得る。ＭＡＧＥタンパク質を発現する癌はＭａｇｅ関連腫瘍として知られている。
癌患者の診断および予後を助けるために、例えば、疾患の転移、再発または進行のリスクがないため、さらなる治療を必要としない患者を識別するために、最近では大量の研究がなされている。
ＷＯ２００６／１２４８３６は、いくつかの発癌過程にわたるある遺伝子発現サインを同定し、よって、患者の予後およびこれらの過程を標的とする治療薬への感度を規定する。特異的な癌遺伝子はＭｙｃ、Ｒａｓ、Ｅ２、Ｓ３、Ｓｒｃおよびβカテニンである。
ＵＳ２００６／０２６５１３８は、一般に、適切な治療を与えることができる原発腫瘍を同定するための、遺伝子プロファイルを作成する方法を開示する。
ＵＳ２００６／０２４０４４１およびＵＳ２００６／０２５２０５７は、ある遺伝子の発現差異に基づいて肺癌を診断する方法を記載する。
ＵＳ２００６／０２３４２５９は、前立腺癌に関連するある遺伝子発現プロファイルの同定および使用に関する。
ＷＯ２００６／１０３４４２は、エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性腫瘍のサブセットにおいて発現される遺伝子発現プロファイルを記載し、これは、あるホルモン療法、例えばタモキシフェンおよびある化学療法への応答に対する予測サインとして機能する。
ＷＯ２００６／０９３５０７は結腸直腸癌患者を良好な予後または悪い予後を有するものとして特徴付けるのに有用である遺伝子プロファイルを記載し、この場合、良好な予後を有する患者は化学療法に好適である。
ＷＯ２００６／０９２６１０は、ある遺伝子の発現差異および疾患に対する新規マーカー、特にＴＳＢＹ１、ＣＹＢＡおよびＭＴ２Ａに基づきメラノーマ進行をモニタするための方法を記載する。
ＷＯ２００５／０４９８２９は、ｅｒｂＢ受容体キナーゼ阻害剤、例えばゲフィニチブである化学治療薬へのある癌の感度を予測するために使用され得る、マーカー遺伝子の単離された組を記載する。
マイクロアレイ遺伝子プロファイリングは、いずれの治療介入に関係なく、癌患者がある療法に応答するかどうかを予測するため、または疾患の予後を評価するための強力な技術であることが示されている。多くの大規模臨床試験が、乳癌および濾胞性リンパ腫の異なる予後と関連すると考えられるプロファイル立証するために、現在進行中である（Dave, 2004; Hu, 2006; Weigelt, 2005）。
腫瘍細胞を含む細胞は、何百もの、実に何千もの遺伝子を発現する。ある療法に応答する患者と応答しない患者の間の遺伝子の発現差異は、応答することができるように、患者への治療の特定的な調整を可能にする。
ＷＯ２００６／１２４８３６ ＵＳ２００６／０２６５１３８ ＵＳ２００６／０２４０４４１ ＵＳ２００６／０２５２０５７ ＵＳ２００６／０２３４２５９ ＷＯ２００６／１０３４４２ ＷＯ２００６／０９３５０７ ＷＯ２００６／０９２６１０ ＷＯ２００５／０４９８２９
Balch CM. Cutaneous melanoma: prognosis and treatment results worldwide. Semin Surg Oncol. 1992 Nov-Dec;8(6):400-14. Gaugler et al Human gene MAGE-3 codes for an antigen recognized on a melanoma by autologous cytolytic T lymphocytes J Exp Med. 1994 Mar 1;179(3):921-930 Weynants et al Expression of mage genes by non‐small‐cell lung carcinomas Int. J Cancer. 1994 Mar 15;56(6):826-829 Patard et al Int J. Cancer 64: 60, 1995 Van Pel, et al Genes coding for tumor antigens recognized by cytolytic T lymphocytes Immunological Reviews 145, 229‐250, 1995, 1995 Dave SS, Wright G, Tan B et al. Prediction of survival in follicular lymphoma based on molecular features of tumor-infiltrating immune cells. N.Engl.J.Med. 2004;351:2159-2169 Hu Z, Fan C, Oh DS et al. The molecular portraits of breast tumors are conserved across microarray platforms. BMC.Genomics 2006;7:96. Weigelt B, Hu Z, He X et al. Molecular portraits and 70-gene prognosis signature are preserved throughout the metastatic process of breast cancer. Cancer Res. 2005;65:9155-9158.
１つの態様では、本発明は、
（ａ）患者由来のサンプルにおける１つ以上の遺伝子の発現レベルを決定する工程であって、遺伝子（複数可）は表１から選択される工程；
（ｂ）パラメータがトレーニングセットにより規定されたアルゴリズムを用いて、（ａ）の発現レベルに基づき、患者をレスポンダーまたはノンレスポンダー群のいずれかに分類する工程
を含む、患者を適切な免疫療法に対するレスポンダーまたはノンレスポンダーとして分類する方法を提供する。
１つの態様では、本発明は、
（ａ）患者由来のサンプルを、表１の１つ以上の遺伝子の遺伝子産物の発現差異について分析する工程、および
（ｂ）工程（ａ）の結果に基づき、サンプルが由来する患者を、レスポンダーまたはノンレスポンダーとして特徴付ける工程であって、標準またはトレーニングセットを参照または比較することにより、あるいはパラメータが標準またはトレーニングセットから得られたアルゴリズムを使用することにより実施される、工程
を含む、患者をある療法に対するレスポンダーまたはノンレスポンダーとして特徴付ける方法を提供する。
１つの実施形態では、患者由来のサンプルの表１の１つ以上の遺伝子の遺伝子産物の発現差異について分析を得ることにより、患者を治療する方法を提供する。結果は、患者を免疫療法薬に対するレスポンダーまたはノンレスポンダーとして特徴付け、特徴付け工程は、標準またはトレーニングセットを参照または比較することにより、あるいはパラメータが標準またはトレーニングセットから得られたアルゴリズムを使用することにより実施される。患者はその後、患者がその免疫療法薬に対するレスポンダーとして特徴付けられた場合、適切な免疫療法薬の少なくとも１つの投与のために選択される。
１つの実施形態では、患者由来のサンプルを入手し、患者由来のサンプルを表１の１つ以上の遺伝子の遺伝子産物の発現差異について分析することにより、患者が免疫療法薬に対するレスポンダーであるか、またはノンレスポンダーであるかを決定する方法を提供する。結果は、患者が免疫療法薬に対するレスポンダーか、またはノンレスポンダーとして特徴付けられるかを決定し、特徴付け工程は、標準またはトレーニングセットを参照または比較することにより、あるいはパラメータが標準またはトレーニングセットから得られたアルゴリズムを使用することにより実施される。
１つの実施形態では、工程（ｂ）は、数学的判別関数または決定木に基づく。決定木は少なくとも１つの二変数分類工程を含み得る。
さらなる実施形態では、本発明は、患者由来のサンプル中で、標的配列が表３で示される表１に列挙された１つ以上のプローブセットより認識される遺伝子産物を分析することを含み、特徴付け工程は、標準またはトレーニングセットを参照または比較することにより、あるいはパラメータが標準またはトレーニングセットから得られたアルゴリズムを使用することにより実施される、患者を療法に対するレスポンダーまたはノンレスポンダーとして特徴付ける方法を提供する。
例示的な実施形態では、表１の１つ以上の遺伝子またはプローブセットは、表１で列挙される少なくとも６３の遺伝子または表１で列挙される少なくとも７４のプローブセットである。
例示的な実施形態では、本発明の方法は、表２、５、７または９で特定される、遺伝子の発現レベルまたはプローブセットの遺伝子産物の測定結果を決定することを含む。これらの表中の各遺伝子およびプローブセットならびに遺伝子またはプローブセットの群は、本発明の特定の態様を形成する。表２、５、７および９中の遺伝子およびプローブセットは、表１における遺伝子およびプローブセットの特定のサブセットを表す。
ＭＡＧＥ−Ａ３ ＡＳＣＩまたは任意の免疫療法アプローチに対するレスポンダー患者とノンレスポンダー患者の間で区別するために使用することができる予測遺伝子プロファイルもまた提供され、ここで、プロファイルは表１で列挙される遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子を含む。
１つの実施形態では、本明細書で記載される遺伝子プロファイルが提供され、ここで、遺伝子は、表１で列挙されるプローブセットにより認識される遺伝子である。
さらなる態様では、プロファイルは、表１で列挙される遺伝子すべてを含み、またはそれらから構成され、あるいは表１で列挙されるプローブセットにより認識され、または標的とされる遺伝子すべてを含み、またはそれらから構成される。
１つの態様では、本発明は、表１で列挙される遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子産物の配列に相補的で、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドプローブを含むマイクロアレイを提供し、ここで、表１の遺伝子に相補的で、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドプローブまたはプローブセットは、前記マイクロアレイ上のプローブまたはプローブセットの少なくとも５０％を構成する。
１つの態様では、本発明は、表１で列挙される遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子産物の配列に相補的で、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドプローブを含むマイクロアレイを提供する。
１つの態様では、本発明は少なくとも６３の、表１で列挙される遺伝子の複数の検出試薬が結合された固体表面を提供し、その検出試薬は、遺伝子または遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現を検出することができる。
１つの態様では、本発明は、表１で列挙される１つ以上の遺伝子または表１で列挙される遺伝子の遺伝子産物の発現を検出するための手段を含む診断キットを提供する。発現は、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ遺伝子産物とハイブリダイズするプローブにより検出され得る。
１つの態様では、本発明は表１の１つ以上の遺伝子または表１で列挙される遺伝子の遺伝子産物の遺伝子産物、例えばｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ、を同定する１つ以上のプローブを提供する。
１つの態様では、本発明は、表１の１つ以上の遺伝子産物、または本明細書で記載される遺伝子プロファイルの遺伝子産物の発現差異（例えば上方制御）の同定のためのＰＣＲ（または他の公知の技術）の使用を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は療法に対するレスポンダーとして特徴付けられた患者を治療する方法であって、本明細書で記載されるように治療を施す、ワクチンまたは免疫原性組成物を患者に投与することを含む方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、本明細書で記載される方法または本明細書で記載される診断キットの使用に従い療法に対するノンレスポンダーとして特徴付けられた患者を治療する方法であって、別の療法または療法の組み合わせを施すことを含む方法を提供し、例えば化学療法および／または放射線療法が本明細書で記載されるワクチンまたは免疫原性組成物の代わりに、またはそれに加えて使用され得る。
さらなる実施形態では、本発明は、本明細書で記載される方法、本明細書で記載されるマイクロアレイの使用、本明細書で記載される遺伝子プロファイルの使用または本明細書で記載される診断キットの使用に従いレスポンダーとして特徴付けられた患者の治療のための薬剤の調製における、腫瘍関連抗原を含む組成物の使用を提供する。
リーブワンアウトクロスバリデーション（Ｌｅａｖｅ Ｏｎｅ Ｏｕｔ Ｃｒｏｓｓ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）（ＬＯＯＣＶ）に対するスキームを示す。 各ループにおける分類のための最良の１００ＰＳを選択するＬＯＯＣＶの結果を示す。白丸＝ノンレスポンダー、ＡＳ０２Ｂ群。黒丸＝レスポンダー、ＡＳ０２Ｂ群。白三角＝ノンレスポンダー、ＡＳ１５群。黒三角＝レスポンダー、ＡＳ１５群。 プローブセット（ＰＳ）が各ＬＯＯＣＶにおける１００トップｓ２ｎ（信号対ノイズ比）内にある度数（Ｘ軸上のＰＳ数）を示す。 第ＩＩ相メラノーマ治験におけるすべての患者を用いたアジュバントによる全生存に対するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線（ＫＭ）を示す。実線＝ＡＳ１５群。点線＝ＡＳ０２Ｂ群。 ＬＯＯＣＶ分類に基づく遺伝子サインによる全生存に対するＫＭを示す。実線＝遺伝子サイン陽性（ＧＳ＋）；点線＝遺伝子サイン陰性（ＧＳ−）。 アジュバントおよびＬＯＯＣＶ分類に基づく遺伝子サインによる全生存Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を示す。太い実線＝ＡＳ１５群、ＧＳ＋。太い点線＝ＡＳ１５群、ＧＳ−。細い実線＝ＡＳ０２Ｂ群、ＧＳ＋。細い点線＝ＡＳ０２Ｂ群、ＧＳ−。 １００ＰＳ（リーブワンアウトではない）を用いたサンプルの分類を示す。白丸＝ノンレスポンダー、ＡＳ０２Ｂ群。黒丸＝レスポンダー、ＡＳ０２Ｂ群。白三角＝ノンレスポンダー、ＡＳ１５群。黒三角＝レスポンダー、ＡＳ１５群。 表５で特定されるＰＣＲにより測定された２２遺伝子を用いた対応するサンプルのリーブワンアウト分類を示す。白丸＝ノンレスポンダー、ＡＳ０２Ｂ群。黒丸＝レスポンダー、ＡＳ０２Ｂ群。白三角＝ノンレスポンダー、ＡＳ１５群。黒三角＝レスポンダー、ＡＳ１５群。 表５で特定される２２遺伝子を用いたサンプルの分類を示す（リーブワンアウトではない）。白丸＝ノンレスポンダー、ＡＳ０２Ｂ群。黒丸＝レスポンダー、ＡＳ０２Ｂ群。白三角＝ノンレスポンダー、ＡＳ１５群。黒三角＝レスポンダー、ＡＳ１５群。 ＮＳＣＬＣ第ＩＩ相治験設計を示す。 ＮＳＣＬＣ治験に対する無病期間に対するＫＭ曲線を示す。丸付き実線＝ＭＡＧＥ−Ａ３；四角付き点線＝プラセボ。 この適用例で使用されるＣｏｘ−ＳＰＣＡ方法を示す。 ＰＣＲにより測定された表６で列挙される２３遺伝子を用いたカットオフとしてメジアンを有する、ＬＯＯＣＶ分類に基づく遺伝子プロファイルによる生存曲線を示す。太い実線＝ＭＡＧＥ免疫療法、ＧＳ＋。太い点線＝ＭＡＧＥ免疫療法、ＧＳ−。細い実線＝プラセボ、ＧＳ＋。細い点線＝プラセボ、ＧＳ−。 ＬＯＯＣＶ分類を用いてＰＣＲにより測定した表６に列挙される２３遺伝子を用いた、１２９ＮＳＣＬＣサンプルにおけるプラセボ（左パネル）およびワクチン群（右パネル）間のリスクスコア分布を示す。黒菱形＝再発；白菱形＝非再発。 表６に列挙される分類指標において、Ｑ−ＰＣＲによる２３遺伝子を用いた分類に基づく臨床成績を示す（リーブワンアウトではない）。太い実線＝ＭＡＧＥ免疫療法、ＧＳ＋。太い点線＝ＭＡＧＥ免疫療法、ＧＳ−。細い実線＝プラセボ、ＧＳ＋。細い点線＝プラセボ、ＧＳ−。 表６に列挙される分類指標において、Ｑ−ＰＣＲにより２３遺伝子を用いた分類に基づくプラセボ（左パネル）およびワクチン群（右パネル）の間のリスクスコアを示す（リーブワンアウトではない）。黒菱形＝再発；白菱形＝非再発。 表５で列挙される２２遺伝子を用いた１２９ＮＳＣＬＣサンプルにおいてカットオフとしてメジアンを有する、ＬＯＯＣＶ分類に基づく遺伝子プロファイルによる生存曲線を示す。太い実線＝ＭＡＧＥ免疫療法、ＧＳ＋。太い点線＝ＭＡＧＥ免疫療法、ＧＳ−。細い実線＝プラセボ、ＧＳ＋。細い点線＝プラセボ、ＧＳ−。 ＬＯＯＣＶ分類を用いて表５に列挙される２２遺伝子を用いた、１２９ＮＳＣＬＣサンプルにおけるプラセボ（左パネル）およびワクチン群（右パネル）間のリスクスコア分布を示す。黒菱形＝再発；白菱形＝非再発。 表５に列挙される分類指標において、Ｑ−ＰＣＲによる２２遺伝子を用いた分類に基づく臨床成績を示す（リーブワンアウトではない）。太い実線＝ＭＡＧＥ免疫療法、ＧＳ＋。太い点線＝ＭＡＧＥ免疫療法、ＧＳ−。細い実線＝プラセボ、ＧＳ＋。細い点線＝プラセボ、ＧＳ−。 表５に列挙される分類指標において、Ｑ−ＰＣＲによる２２遺伝子を用いた分類に基づくリスクスコアを示す（リーブワンアウトではない）。黒菱形＝再発；白菱形＝非再発。 タンパク質Ｄ１／３−ＭＡＧＥ３−ＨＩＳタンパク質を示す。
配列識別子および表：
下記配列識別子は配列リストに含められる：
配列番号：１−１００−表３に示されるプローブセット標的配列
配列番号：１０１−タンパク質Ｄ−ＭＡＧＥ−Ａ３融合タンパク質
配列番号：１０２−１０６−ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列
配列番号：１０７−１１３−ＭＡＧＥペプチド配列
表１：１００ＰＳおよび対応する遺伝子リスト
表１Ａ：すべてのサンプルおよびＬＯＯＣＶにおいて選択される回数を用いて選択された１００ＰＳ
表２：表１からの２７ＰＳおよび２１遺伝子のサブセット
表３：１００ＰＳ標的配列
表４：１００ＰＳ分類指標特徴に対する平均、標準偏差（Ｓｄ）およびＰＣ１係数
表５：メラノーマにおける２２遺伝子の好適なサブセット
表６：メラノーマにおける２２遺伝子分類指標特徴に対する平均、標準偏差（Ｓｄ）およびＰＣ１係数
表７：ＮＳＣＬＣにおける２３遺伝子の好適なサブセット
表８：ＮＳＣＬＣにおける２３遺伝子分類指標特徴に対する平均、標準偏差（Ｓｄ）およびＰＣ１係数
表９：ＮＳＣＬＣにおける２２遺伝子の好適なサブセット
表１０：ＮＳＣＬＣにおける２２遺伝子分類指標特徴に対する平均、標準偏差（Ｓｄ）およびＰＣ１係数
表１１：メラノーマサンプルにおけるＱ−ＰＣＲにより測定した個々の遺伝子の分類性能
表１２：ＮＳＣＬＣサンプルにおけるＱ−ＰＣＲにより測定した個々の遺伝子の分類性能
表１３：メラノーマサンプルにおけるマイクロアレイにより測定した個々の遺伝子の分類性能。
発明の詳細な説明
予測遺伝子プロファイル
外科切除後の、悪性メラノーマを有する患者由来の処置前腫瘍組織に対して実施された分析において、ある遺伝子が療法に応答する可能性がより高い患者（レスポンダー）では、応答する可能性がより低い患者（ノンレスポンダー）と比べて異なって発現されたことを確認した。
本発明者らは、患者の療法に対する応答の可能性を予測する遺伝子プロファイルを発見した。
「遺伝子プロファイル」により、その発現が患者の療法に対する応答と相関する１つのまたは１組の遺伝子が意図される。というのも、その１つのまたは１組の遺伝子が療法に対し有利な応答を有する患者と療法に対し不十分な応答を有する患者の間で発現差異を示すからである。本発明の１つの実施形態では、「遺伝子プロファイル」という用語は、表１で列挙される遺伝子または本明細書で記載される表１の遺伝子の任意の選択を示す。
本明細書では、例えば、抗癌治療に対する「有利な応答」（または「有利な臨床応答」）は当業者により、別の治療またはいずれの治療もなしで起こる腫瘍増殖に比べ、腫瘍増殖速度の減少を示すとして認識される生物学的または身体的応答を示す。療法に対する有利な臨床応答としては、被験体が経験する症状の緩和、予測される、または達成される生存期間の増加、腫瘍増殖速度の減少、腫瘍増殖の休止（不変）、転移性病変の数および質量の退行、および／または全腫瘍質量の退行（それぞれ、治療なし、または他の治療に応答して起こるものと比較）が挙げられる。アジュバント癌治療の場合、有利な臨床応答としては、再発なし、または再発率の遅延、または無病生存期間もしくは時間間隔の増加が挙げられる。
本発明との関連では、「発現差異」は遺伝子が正常発現に比べ上方制御または下方制御されることを意味する。遺伝子の発現差異を計算するための統計学的方法は本明細書の他の場所で記載される。
いくつかの態様では、本発明は患者を療法に対するレスポンダーまたはノンレスポンダーとして特徴付けるための遺伝子プロファイルを提供し、プロファイルは、表１の少なくとも１つの遺伝子の発現差異を含み、または、プロファイルは、表１で列挙される遺伝子を含むもしくはそれらから構成される。プロファイルはレスポンダーまたはノンレスポンダーを示し得る。１つの実施形態では、本明細書で記載される遺伝子プロファイルは、レスポンダーを示す。
表１のプローブセットにより認識され、または標的とされる遺伝子配列は表３で列挙される。
「表１の遺伝子」により、表１、２、５、７または９において「遺伝子名」下で列挙される遺伝子が意味される。「遺伝子産物」により、自然の、または人工的な手段により産生されるかどうかに関わらず、遺伝子の任意の転写または翻訳産物が意味される。
本発明の１つの実施形態では、本明細書で言及される遺伝子は、「遺伝子名」を示す列で規定される、表１、２、５、７または９で列挙されるものである。別の実施形態では、本明細書で言及される遺伝子は、その産物が表１で列挙されるプローブセットにより認識され得る遺伝子である。
理論に束縛されるものではないが、表１で同定される遺伝子サインは、実際、レスポンダーとして指定される患者における免疫／炎症、例えばＴ細胞浸潤／活性化応答を示し、例えば、サインはＴ細胞活性化マーカーを表し得ることが仮定される。サインはまた、Ｔｈ１マーカー、例えば細胞性免疫応答の誘導に有利に働く傾向のあるインターフェロン経路のメンバーを表し得る。この応答の存在は、患者の身体が疾患、例えば癌と闘うのを助けると考えられ、免疫療法の実施後、これによって、患者は前記免疫療法に対しより応答性となる。
よって、本発明のサインは一般に、関連疾患、例えば癌の診断および／または予後と特定的に関連するマーカー／遺伝子、例えば癌遺伝子に焦点を当てておらず、むしろ、患者が適切な免疫療法、例えば癌免疫療法に応答するかどうかを予測する。
本明細書で同定された遺伝子プロファイルは、腫瘍の微小環境を示すと考えられる。少なくともこの態様では、腫瘍の正確な微小環境が、患者が適切な癌免疫療法に応答するかどうかへのカギとなると考えられる。
サインの生物学は、作用のＡＳＣＩモードと関連する。というのは、Ｔ細胞マーカーおよびＴｈ１マーカー、例えばインターフェロン経路のメンバーの上方制御を示すレスポンダー患者の腫瘍における免疫エフェクター細胞の存在に有利に働く特異的な腫瘍微小環境（ケモカイン）の存在を示唆する遺伝子を含むからである。転移性メラノーマにおける最近の遺伝子発現プロファイリング研究は、腫瘍がＴ細胞関連転写物の存在または非存在に基づき分離され得ることを明らかにした（Ｈａｒｌｉｎ、２００９）。腫瘍中のリンパ球の存在は、６つのケモカインのサブセットの発現と相関し（ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０）、これらの６つの遺伝子のうち３つ（ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０）が表１の１００ＰＳ中に存在する。
１つの実施形態では、本発明は１つ以上（例えば、実質的にすべて）の表１で列挙される遺伝子を使用する。好適には、本発明は表１で列挙される少なくとも６３の遺伝子または７４のプローブセットを使用する。
好適には、表１の１つ以上の遺伝子は、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７、少なくとも６８、少なくとも６９、少なくとも７０、少なくとも７１、少なくとも７２、少なくとも７３、少なくとも７４、少なくとも７５、少なくとも７６、少なくとも７７、少なくとも７８、少なくとも７９、少なくとも８０または実質的にすべての、表１で列挙される遺伝子および／またはそれらの任意の組み合わせである。
好適には、表１の１つ以上のプローブセットは、少なくとも７４、少なくとも７５、少なくとも７６、少なくとも７７、少なくとも７８、少なくとも７９、少なくとも８０、少なくとも８１、少なくとも８２、少なくとも８３、少なくとも８４、少なくとも８５、少なくとも８６、少なくとも８７、少なくとも８８、少なくとも８９、少なくとも９０または実質的にすべての、表１で列挙されるプローブセットおよび／またはそれらの任意の組み合わせである。
遺伝子リストの関連では、実質的にすべては少なくとも９０％、例えば９５％、特に９６、９７、９８または９９％の与えられたリスト中の遺伝子である。
１つの態様では本発明は、転移性設定で使用される。
レスポンダー（または、ノンレスポンダー）であると考えられる患者において、遺伝子が常に上方制御され、または常に下方制御される場合、閾値が確立され、２つの群の分離が十分であるとすれば、この単一の遺伝子を使用して、患者がレスポンダーであるか、またはノンレスポンダーであるかを確立することができる。
１つの態様では、本発明は１つ以上の前記遺伝子を含むレスポンダーを同定するための遺伝子プロファイルを提供し、この場合５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９または１００％の遺伝子が上方制御される。対照的に、ノンレスポンダーでは、遺伝子／遺伝子群が上方制御されない、または下方制御される。
本発明との関連では、サンプルは治療が必要な可能性のある患者由来の任意の生物学的組織または流体とすることができる。サンプルは、痰、血液、尿由来、または固形組織、例えば原発腫瘍もしくは転移からの生検由来、または前に除去した組織の切片由来としてもよい。
サンプルは、例えば、針生検、外科切除サンプルまたはリンパ節組織を含む、またはそれらから構成されることができる。これらの方法は、生検を入手することを含み、これは任意で、クリオスタット切片法により分画され、腫瘍細胞が総細胞集団の約８０％まで濃縮される。ある実施形態では、これらのサンプルから抽出された核酸は、当技術分野でよく知られた技術を用いて増幅され得る。選択されたマーカーのレベルは、検出することができ、例えばＭａｇｅ陽性ノンレスポンダー患者の統計学的に有効な群と比較することができる。
癌に関する分析では、生物学的サンプルはサンプルが癌または腫瘍細胞を含む機会を最大にするように得られ、例えば、癌または腫瘍由来とすることができ、例えば新鮮サンプル（凍結サンプルを含む）またはパラフィン中で保存されたサンプルとすることができる。とは言ったものの、パラフィン中で保存されたサンプルは、分解を受ける可能性があり、観察されるプロファイルが変更される可能性がある。当業者は、プロファイルのパラメータを再較正することにより観察されるこれらの変化をうまく補償することができる。
１つの態様では、生物学的サンプルは例えば腫瘍または癌組織由来の生検サンプルである。
１つの態様では、癌免疫療法は、メラノーマ、肺癌、例えばＮＳＣＬＣ、膀胱癌、頸部癌、結腸癌、乳癌、食道癌および／または前立腺癌、例えば肺癌および／またはメラノーマ、特にメラノーマの治療のためのものである。
本発明との関連では、「レスポンダー」は、癌／腫瘍（複数可）が根絶され、減少されまたは改善される（完全レスポンダーまたは部分レスポンダー；混合レスポンダー）あるいは単純に安定化され、疾患が進行しない（「不変」）人間である。癌に関する「完全臨床レスポンダー」は、標的病変がすべて消失した場合である。
癌に関して、「部分臨床レスポンダー」または「部分レスポンダー」は、腫瘍／癌のすべてが、治療にある程度応答する場合であり、例えば、前記癌が３０、４０、５０、６０％以上減少した場合である。
「進行性疾患」は、標的病変のサイズの２０％増加または１つ以上の新規病変の出現またはこれらの両方を表す。
進行性疾患（ＰＤ）を有する患者は、さらに非混合応答を有するＰＤに対する分類指標となり得、または癌に関して、Ｉ型またはＩＩ型の「混合臨床レスポンダー」または「混合レスポンダー」を有する進行性疾患は、腫瘍／癌のうち、治療に応答するものもあり、不変なまままたは進行するものもある場合として規定される。
ノンレスポンダー（ＮＲ）は、患者が、混合応答を有しない進行性疾患を有する、および少なくとも１つの標的病変の消失を示さない混合応答ＩＩを有する進行性疾患を有する患者として規定される。
レスポンダーでは、癌が安定化され、その後、安定期間は、治療を受けていない患者に比べ、生活の質および／または患者の平均余命が増加される（例えば６ヶ月超の間不変）ようなものとなる。
いくつかの実施形態では、「レスポンダー」という用語は、「混合レスポンダー」を含まない可能性がある。
新規患者のレスポンダー（遺伝子サイン陽性）またはノンレスポンダー（遺伝子サイン陰性）としての予測特徴付けは、「標準」またはトレーニングセットを参照することにより、またはそのパラメータがトレーニングセットから得られた数学的モデル／アルゴリズム（分類指標）を使用することにより実施することができる。標準は、レスポンダーまたはノンレスポンダーであることが知られている人間／患者（複数可）のプロファイルとしてもよく、またはその代わりに、数値としてもよよい。そのような予め決定された標準は、任意の好適な形態、例えば印刷されたリストまたは図表、コンピュータソフトウエアプログラム、または他の媒体で提供され得る。
標準は、好適には公知のレスポンダーまたはノンレスポンダー状態を有する１または複数の患者における１つまたは複数の遺伝子産物の発現に対する値、またはその関数であり、そのため、標準情報を患者由来のサンプルにおける同じ遺伝子の発現に関する情報と比較することにより、患者においてレスポンダーまたはノンレスポンダー状態についての結論が引き出される。標準は、表１の１つ以上の遺伝子を用いて、およびレスポンダーまたはノンレスポンダーであることがわかっている１つ以上の個体の分析から得ることができる。
トレーニングセットから得られるトレーニングデータまたはパラメータの非制限的例は、下記実施例１で記載されるサンプル正規化のために使用される参照データセット、参照分位点、プローブ効果またはＲオブジェクトフォーマットデータである。レスポンダーまたはノンレスポンダーとしての患者の分類におけるこれらの具体例の使用が、本発明の特定的な態様を形成する。
１つの態様では、統計的分析は標準またはトレーニングセットを参照することにより実施される。表１の遺伝子リストは、比較群としてトレーニングセットにおける患者の臨床成績（レスポンダーおよびノンレスポンダー）を用い、各プローブセットの信号対ノイズ比を計算することにより作成された。トレーニングセットから誘導された分類指標パラメータはその後、新規サンプルに対する分類を予測するために使用される。
本明細書の関連では、トレーニングセットは、臨床成績を遺伝子プロファイルと相関させることができ、適切な統計的モデル／プログラムを訓練して、新規サンプルに対しレスポンダーおよび／またはノンレスポンダーを同定するために使用することができるサンプル群を示すことが意図される。
理論に束縛されるものではないが、表１の１００遺伝子のうち少なくとも６８は、トレーニングセットにおける変化に対し抵抗性であると考えられる。これらの遺伝子はこの発明の特定の態様を形成する。これらの遺伝子は表１Ａの列５から同定することができる。
１つの態様では、患者をレスポンダーまたはノンレスポンダーとして特徴付けるために、数学的モデル／アルゴリズム／統計学的方法が使用される。
特徴付けのためたのアルゴリズムは、任意の１つの遺伝子および任意の１つの公知のレスポンダーまたはノンレスポンダーからの遺伝子発現情報を使用し、好適には、目的変数ありの主成分分析に基づくが、任意の好適な特徴付けアルゴリズム、例えば実施例１〜７の任意のアルゴリズムを使用してもよい。
特定的に、アルゴリズムは、実施例１で示される判別分析アルゴリズムを用いた目的変数ありの主成分分析または実施例３で示されるｃｏｘ決定規則を用いた目的変数ありの主成分分析を使用して、公知の臨床成績を有する個体またはトレーニングセットから標準を作成してもよい。
そのため、１つの態様では、本発明はまた新規患者をレスポンダーまたはノンレスポンダーとして特徴付けるための分類指標の開発に関し、分類指標のパラメータは、公知の臨床成績（レスポンダーおよびノンレスポンダー）を有するトレーニングセットから得られる。
遺伝子リストは、信号対ノイズ比、Ｂａｌｄｉ分析古典的Ｔ検定のバリエーション、および／またはピアソン相関係数（Ｐｅａｒｓｏｎｓ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）および／または線形判別分析を使用して作成してもよい。例えば、Golub T, Slonim D, Tamayo P et al. Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science 1999; 286: 531-536. Van 't Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ, He YD, Hart AA, Mao M, Peterse HL, van der Kooy K, Marton MJ, Witteveen AT, et al. (2002) Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature, 415(6871), 530-556を参照されたい。
分類指標は、目的変数ありの主成分、判別分析、最近接重心、ｋＮＮ、サポートベクターマシンまたは分類に適切な他のアルゴリズムを使用し；分類のために時間（例えば、生存期間、無病期間）を使用するアルゴリズムを含む。また、分類は、当技術分野でよく知られた他の数学的方法を用いて達成することができる。
分類指標は、実施例１および／または２で例示されるＤＡ決定規則を有するＳＰＣＡまたは実施例３および／または４で例示されるＳＰＣＡ−Ｃｏｘ決定規則を含み得る。いくつかの実施形態では、開示される方法は、５０％、６０％または７０％超の精度、例えば約７０％の精度で、レスポンダーおよびノンレスポンダーを正確に予測する。
１つの実施形態では、レスポンダーおよびノンレスポンダーは、治療不成功までの時間（ＴＴＦ）／全生存（ＯＳ）を参照することにより規定され、これは連続変数であり、例えば数ヶ月で測定され得る。治療不成功までの時間変数が大きい場合、患者はレスポンダーであると考えられる。治療不成功までの時間変数が小さい場合、患者はノンレスポンダーであると考えられる。一般に、このアプローチを使用すると、混合レスポンダーもまた、レスポンダーと同じ群となる。
治療不成功は、患者が本明細書で規定されるレスポンダー、部分レスポンダー、混合レスポンダーまたは不変の規定に入らない場合である。
１つの態様では、ノンレスポンダーは、６ヶ月以下のＴＴＦを有するものとして規定され得る。
１つの態様では、レスポンダーは、６ヶ月超の、例えば７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４以上の月のＴＴＦを有するものとして規定され得る。
本発明の１つの態様では、治療に対する患者応答は無病期間（ＤＦＩ）または無病生存率（ＤＦＳ）であり、これらは連続変数であり、例えば月で測定され得る。ＤＦＩおよびＤＦＳは、例えば、アジュバント治療において使用され；これは、腫瘍が除去され、再発を回避または遅延させるため、または同等に無病期間または生存率を延長させるために治療が提供される場合である。
ＤＦＩおよびＤＦＳは患者の臨床情報または測定された患者のパラメータ、例えばバイオマーカーまたは遺伝子発現プロファイルに相関させることができ、新規患者の応答を予測するための数学的モデルを構築するために使用することができる。
１つの態様では、本発明の方法は、表１で列挙される遺伝子の発現レベルまたはプローブセットの遺伝子産物の測定値を決定することを含む。
１つの態様では、本発明は、肺癌およびメラノーマの両方に対する免疫療法、好適には癌精巣抗原、例えばＭａｇｅに基づく免疫療法に対するレスポンダーまたはノンレスポンダーとして患者を予測または同定するための、表１で列挙される、１つ以上（例えば、実質的にすべて）の遺伝子またはプローブセットの使用を含む。好適には本発明は、表１で列挙される、少なくとも６３の遺伝子または７４のプローブセットを使用する。
表１
Figure 2013505008
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１つの態様では、本発明の方法は、表２で列挙される、遺伝子の発現レベルまたはプローブセットの遺伝子産物の測定値を決定することを含む。
表２
Figure 2013505008
表１で列挙されるプローブセットに対する標的配列は、下記で提供される。
表３
Figure 2013505008
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１つの態様では、本発明は正規化遺伝子またはプローブセット強度マトリクスを作成する前処理工程を実施し、このマトリクスを信号対ノイズ比統計的分析に供し、異なって発現される遺伝子またはプローブセットを同定し、その後、遺伝子またはプローブセットを最も異なって発現される遺伝子の順でランクづけすることにより、作成された遺伝子プロファイルを提供する。
１つの実施形態では、閾値は、関連遺伝子の発現の測定量または各患者に対する遺伝子強度ベクトルから誘導した「指標」をプロットすることにより確立してもよい。一般に、レスポンダーおよびノンレスポンダーは、異なる軸／焦点についてクラスタリングされる。閾値は、古典的統計学的方法により、または単純に「最良適合線」をプロットすることにより、２つの群間の中立点を確立することにより、クラスター間のギャップで確立することができる。例えば、予め規定された閾値を超える値は、レスポンダーとして指定することができ、例えば、予め指定された閾値未満の値は、ノンレスポンダーとして指定することができる。
１つの実施形態では、任意のある分類指標の性能は分析することができる。徹底的な性能分析が、閾値レベルを変化させ、閾値の各値に対し、モデルの予測能力（感度、特異性、陽性および陰性予測値、精度）を計算することによりが実施される。この分析は、ある分類指標のための適切な閾値を選択するのに役立つ可能性がある。
さらに、分類指標の性能分析は、ある閾値に対し、モデルの感度、特異性、陽性および陰性予測値、ならびに精度を評価するために実施することができる。本発明の１つ以上の態様により提供されるプロファイルの好適な実施形態では、性別に密接に相関する遺伝子の効果は排除される。
１つの実施形態では、腫瘍サンプルを、Ｑ−ＰＣＲによりメラノーマにおいて判別と見いだされた遺伝子のサブセットを使用して評価されたそれらの遺伝子プロファイルに従い分類する方法が提供される（実施例１）。
１つの実施形態では、ＮＳＣＬＣ癌腫瘍サンプルを、Ｑ−ＰＣＲによりメラノーマにおいて判別と見いだされた遺伝子のすべてまたはサブセットを使用して評価されたそれらの遺伝子プロファイルに従い分類する方法が提供される。
分類指標は、目的変数ありの主成分分析およびＣｏｘ比例ハザードモデルの使用を含み；遺伝子発現プロファイルに加えて、このアプローチでは、トレーニングセット中のサンプルの全生存（ＯＳ）、ＤＦＩまたはＤＦＳが腫瘍ステージおよび外科手術状態と共に使用され、モデルパラメータが計算され、その後に試験セット遺伝子発現に基づき、試験セットに対するリスク指標が計算される。
遺伝子プロファイルが同定され、サンプルに対する分析が実施された時点で、例えば、レスポンダーを１つの色で、ノンレスポンダーを別の色で示すヒートマップとして結果を示す方法はたくさんある。それにも関わらず、より多くの定性的情報が、結果を、閾値を有するスペクトルとして示す指標として表すことができ、例えば閾値を超えると、患者はレスポンダーであると考えられ、閾値未満だと、患者はノンレスポンダーであると考えられる。情報をスペクトルとして表す利点は、医師がノンレスポンダーと考えられるが、閾値付近に位置するそれらの患者に治療を提供すべきかどうかを決定することを可能にすることである。
本発明との関連では、「免疫療法」は、一般的には抗原に対する免疫応答を刺激することに基づく療法を意味し、この場合、応答により、関連する疾患の治療、寛解および／または進行の遅延が得られる。これに関して、治療は通常予防的治療を含まない。
この明細書の関連では、「癌免疫療法」は癌を治療するための免疫療法を意味する。１つの態様では、免疫療法は、癌精巣抗原、例えばＭａｇｅ（下記でより詳細に記載）に基づく。
好都合なことに、本発明の新規方法は、適切な免疫療法治療に応答する可能性のある患者の同定を可能にする。これにより、それらから恩恵を受ける患者に対し資源の適切なチャネリングが促進され、さらには、その治療から恩恵を受けない患者が、彼らにとってより有利であり得る別の治療を使用することが可能になる。
本発明は、例えば、ＭＡＧＥ−発現癌を有する患者において、適切な免疫療法に応答する可能性のある癌患者、例えばメラノーマ、乳癌、膀胱、肺癌、ＮＳＣＬＣ、頭頸部癌、扁平上皮癌、結腸癌および食道癌を有する患者を同定するために使用され得る。一実施形態では、本発明はそのような癌、特に肺およびメラノーマにおいてアジュバント（術後、例えば無病）設定で使用され得る。本発明はまた、転移性設定で癌治療において有用性を見いだしている。
免疫活性化遺伝子は、適切な免疫応答を促進し、増加させまたは刺激する遺伝子を意味することが意図される。免疫応答遺伝子および免疫活性化遺伝子は本明細書では同じ意味で使用される。
マイクロアレイ
細胞、例えば癌／腫瘍細胞により発現される遺伝子の分析のために重要な技術は、ＤＮＡマイクロアレイ（遺伝子チップ技術としても知られている）であり、この場合、何百以上ものプローブ配列（例えば５５、０００プローブセット）がガラス表面に結合される。プローブ配列は一般にすべて２５塩基長または６０塩基長であり、公知の遺伝子由来の配列である。これらのプローブは一般に、任意の特定の遺伝子に対し、１組の１１の個々のプローブで配列され（プローブセット）、ガラス表面上で予め規定されたパターンで固定される。適切な生物学的サンプルに暴露されると、これらのプローブは特定の遺伝子の関連ＲＮＡまたはＤＮＡにハイブリダイズする。洗浄後、チップは、適切な方法および量、例えば記録された色強度により「読み取られる」。特定の遺伝子の発現差異は、記録された測定値／強度に比例する。この技術は下記でより詳細に記載される。
マイクロアレイは、互いに分離され、典型的には約１００／ｃｍ２〜１０００／ｃｍ２の間の密度で配列されるが、より大きな密度、例えば１００００／ｃｍ２で配列され得る、別々の領域、典型的には核酸のアレイである。マイクロアレイ実験の原理は、ある細胞株または組織由来のｍＲＮＡを使用して、「標的」と呼ばれる標識サンプル、典型的には標識ｃＤＮＡを作成し、これは、規則配列で固体表面上に固定された多くの核酸配列、典型的にはＤＮＡ配列に同時にハイブリダイズするというものである。
何万もの転写物種が同時に検出され、定量され得る。多くの異なるマイクロアレイステムが開発されており、今日最も普通に使用されるシステムは、配列させた材料に従い２つの群に分けることができる：相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）およびオリゴヌクレオチドマイクロアレイ。配列された材料は一般に、プローブと呼ばれるが、ノーザンブロット分析で使用されるプローブと同等であるからである。ｃＤＮＡアレイのためのプローブは通常、ベクター特異的または遺伝子特異的プライマーのいずれかを使用して、ｃＤＮＡライブラリまたはクローンコレクションから作成されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物であり、スライドガラスまたはナイロン膜上にスポットとして規定された位置にプリントされる。スポットは典型的には１０-３００μｍのサイズであり、大体同じ距離だけ離されている。この技術を使用して、３０，０００を超えるｃＤＮＡから構成されるアレイを、従来の顕微鏡スライドの表面上に固定することができる。オリゴヌクレオチドアレイでは、短い２０-２５塩基長は、シリコンウエハ上へのフォトリソグラフィー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘからの高密度オリゴヌクレオチドアレイ）あるいはインクジェット技術（Ｒｏｓｅｔｔａ Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓにより開発され、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにライセンス供与されている）のいずれかによりインサイチューで合成される。また、予め合成されたオリゴヌクレオチドを、スライドガラス上にプリントさせることができる。合成オリゴヌクレオチドに基づく方法は、利点を提供する。というのは配列情報のみが、配列されるＤＮＡを作成するのに十分であり、ｃＤＮＡ源の時間のかかる処理は必要とされないからである。また、プローブは、ある転写物の最も特有の部分を表すように設計することができ、密接に関係する遺伝子またはスプライスバリアントの検出を可能にする。短いオリゴヌクレオチドは、より特異性の低いハイブリダイゼーションまたは減少した感度となる可能性があるが、予め合成されたより長いオリゴヌクレオチド（５０-１００塩基長）の配列が最近開発され、これらの不利を中和している。
よって、患者が本発明の遺伝子サインを示すかどうかを確認するためにマイクロアレイを実施する際には、下記工程が実施される：サンプルからｍＲＮＡを入手し、核酸標的を調製すること、アレイを、典型的にはマイクロアレイの製造者により示唆される条件下で（好適にはストリンジェントハイブリダイゼーション条件、例えば３Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、５０℃）接触させ、アレイ上の対応するプローブに結合させること、必要であれば、洗浄して結合していない核酸標的を除去すること、および結果を分析すること。
ｍＲＮＡは対象の配列、例えば表１におけるものに対して、当技術分野で知られている方法、例えばプライマー特異的ｃＤＮＡ合成により濃縮され得ることは、認識されるであろう。例えば、ＰＣＲ技術を使用することにより、集団はさらに増幅され得る。標的またはプローブは標識され、標的分子のマイクロアレイへのハイブリダイゼーションの検出が可能になる。好適な標識としては、プローブ中に組み込むことができる同位体または蛍光標識が挙げられる。
標的遺伝子／プロファイルが同定されると、マイクロアレイに代わるいくつかの別の分析方法を使用して、遺伝子（複数可）が異なって発現されるかどうかを測定することができる。
１つの態様では、本発明は表１で列挙される遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子産物の配列に相補的およびハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドプローブを含むマイクロアレイを提供する。好適には、表１の遺伝子に相補的およびハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドプローブまたはプローブセットは前記マイクロアレイ上の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または実質的にすべてのプローブまたはプローブセットを構成する。
好適には、マイクロアレイは、表２に列挙される遺伝子の遺伝子産物の配列に相補的およびハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドプローブを含む。
好適には、本発明による検出試薬またはマイクロアレイを有する固体表面は、例えば、表１の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４，１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１，２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２，５３、５４、５６、５７、５８、５９、６０、６１，６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２または８３遺伝子から発現されるｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを検出することができる検出試薬またはプローブを含む。
場合によっては、ＰＣＲは、マイクロアレイよりもより感度の高い技術であり、よってより低レベルの異なって発現される遺伝子を検出することができる。
別の実施形態では、患者は、ＰＣＲ技術、特に定量ＰＣＲ（再検討のために、Ginzinger D Experimental haematology 30 ( 2002) p 503 - 512 and Giuliette et al Methods, 25 p 386 (2001)を参照されたい）に基づく診断キットを用いて、彼の／彼女の腫瘍が本発明の遺伝子サインを発現するかどうかを確認するために診断され得る。
分析技術としては、定量実時間ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ−ＰＣＲまたはＱ−ＰＣＲ）とも呼ばれる実時間ポリメラーゼ連鎖反応が挙げられ、これは、サンプル中に存在するあるＤＮＡ分子の特定の部分を同時に定量および増幅するために使用される。
手順は、ポリメラーゼ連鎖反応の一般的なパターンに従うが、ＤＮＡは、各増幅ラウンド後に定量される（「実時間」態様）。３つの普通の定量方法は、（１）二本鎖ＤＮＡとインターカレートする蛍光染料、（２）相補ＤＮＡとハイブリダイズすると蛍光を発する修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブおよび（３）蛍光染料を放出する伸長中にＤＮＡポリメラーゼによりハイブリダイズされる増幅配列に相補的なＴａｑｍａｎプローブの使用である。
実時間ポリメラーゼ連鎖反応の後ろにある基本理念は、サンプル中に存在する特定のｃＤＮＡ（および、よってｍＲＮＡ）が豊富なほど、増幅の反復サイクル中に検出されるのが早くなる。ＤＮＡの増幅を追跡する様々なシステムが存在し、それらはしばしば、実時間増幅中に新たに合成されたＤＮＡ分子中に組み込まれる蛍光染料の使用を含む。実時間ポリメラーゼ連鎖反応装置は、熱サイクルプロセスを制御するものであり、その後、蛍光ＤＮＡの存在量を、よって、あるサンプルの増幅進行を検出することができる。典型的には、あるｃＤＮＡの時間に伴う増幅は、初期平坦期、続いて対数期を有する曲線に従う。最後に、実験試薬が使い切られると、ＤＮＡ合成が遅くなり、対数曲線が平坦になり、プラトーとなる。
また、標的遺伝子（複数可）のｍＲＮＡまたはタンパク質産物は、ノーザンブロット分析、ウエスタンブロットおよび／または免疫組織化学的検査により測定され得る。
１つの態様ではプロファイル／サインを同定するための分析は、癌精巣抗原が発現される患者サンプルに対し実施される。
単一の遺伝子が例えば、Ｑ−ＰＣＲにより分析されると、遺伝子発現は、一定のままである遺伝子、例えば、正規化で使用するのに好適であり得る、記号Ｈ３Ｆ３Ａ、ＥＩＦ４Ｇ２、ＨＮＲＮＰＣ、ＧＵＳＢ、ＰＧＫ１、ＧＡＰＤＨまたはＴＦＲＣを有する遺伝子を参照することにより正規化することができる。正規化は、一定の遺伝子に対し得られる値を、検討中の遺伝子に対して得られるＣｔ値から減算することにより実施することができる。
遺伝子の発現差異を定量するのに使用される１つのパラメータは、２つの異なる実験条件間での遺伝子のｍＲＮＡ−発現レベルを比較するためのメトリックであるフォールドチェンジである。その演算定義は研究者間で異なる。しかしながら、フォールドチェンジが高いほど、関連遺伝子の発現差異が十分分離される可能性が高くなり、患者がどのカテゴリ（レスポンダーまたはノンレスポンダー）に入るかを決定するのがより容易になる。
フォールドチェンジは、例えば、少なくとも２、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０または３０であってもよい。
発現差異を定量するために使用される別のパラメータは、「ｐ」値である。ｐ値が低いほど、異なって発現される遺伝子が多くなる可能性があり、これにより、本発明のプロファイルにおいて使用するための良好な候補者となると考えられる。Ｐ値は、例えば０．１以下、例えば０．０５以下、特に０．０１以下を含み得る。本明細書ではＰ値は、較正された「Ｐ」値および／または較正されていない「Ｐ」値を含む。
サンプル分類のために使用することができる遺伝子を同定するための別のパラメータは、信号対ノイズ比であり、このアルゴリズムは、群内の標準偏差の和により加重して比較される２つの群間の発現レベルの差を測定する。よって、低い群内分散で、群間で最も高い発現差異を有する遺伝子をランク付けするのに使用され得る。
本発明はまた、本明細書で記載される構成要素／要素を含み、それらから実質的に構成され、またはそれらから構成される、本明細書で記載される本発明に従う別個の実施形態に及ぶ。
本発明は、例えば遺伝子の階層的な分類により特徴付けられるように、例えば、Wu et al 2007(Hierarchical classification of equivalent genes in prokaryotes-Nucleic Acid Research Advance Access）により記載されるように本明細書で列挙される遺伝子の機能等価物に及ぶ。
理論に束縛されるものではないが、サインの特徴を示すのは正確な意味においては必ずしも遺伝子ではなく、むしろ、基本的に重要な遺伝子機能であると考えられる。よって、免疫活性化遺伝子に対し機能的に等価な遺伝子、例えば表１で列挙されるものはサイン中で使用され得、例えば、Journal of the National Cancer Institute Vol 98, No. 7 April 5 2006を参照されたい。
遺伝子は特異的プローブにより同定され、よって、当業者は上記遺伝子の説明は何がプローブにハイブリダイズするかの現在の理解に基づく説明であることを理解するであろう。しかしながら、遺伝子のために使用される命名法に関わらず、所定の条件下での関連プローブへのハイブリダイゼーションを繰り返すことにより、必要な遺伝子が同定され得る。
本発明は、患者を、免疫療法、例えば癌免疫療法、例えば癌精巣免疫療法、特に、とりわけメラノーマのためのＭａｇｅ免疫療法に対するレスポンダーまたはノンレスポンダーとして予測または同定するための、本発明によるプロファイル（複数可）の使用に及ぶ。
よって、本発明は、サンプルが由来する患者を、本発明による免疫療法に対するレスポンダーまたはノンレスポンダーとして特徴付ける目的で、本発明によるプロファイル／遺伝子（複数可）の発現に基づき、患者由来のサンプルを分析する方法を含む。
１つの態様では、本発明は、サンプルが由来する患者が、免疫療法、例えば本発明による癌免疫療法に対するレスポンダーまたはノンレスポンダーとなる可能性があるかを同定する目的で、サンプル中の、本明細書で同定された遺伝子由来のポリヌクレオチドの発現レベルを測定するための方法であって、
サンプルからＲＮＡを単離する工程、
任意で前記遺伝子に対しサンプルからｃＤＮＡのコピーを増幅させる工程、および
サンプル中のｃＤＮＡレベルを定量する工程
を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、患者由来のサンプルに対し本発明によるプロファイルを同定するための分析を実施するための少なくとも１つの構成要素を含み、その結果が、サンプルが由来する患者を免疫療法に対するレスポンダーまたはノンレスポンダーとして指定するために使用され得る診断キットを提供する。
キットは、ＰＣＲ（例えばＱＰＣＲ）、マイクロアレイ分析、免疫組織化学的検査または１つ以上の遺伝子の発現差異にアクセスするために使用され得る他の分析技術のための材料／試薬を含み得る。
本発明はまた、１つ以上、例えば少なくとも５つの、本発明に関連して本明細書で記載される遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡにハイブリダイズすることができる１組のプローブを含む診断キット、例えば少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４，１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１，２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２，５３、５４、５６、５７、５８、５９、６０、６１，６２、６３，６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２または８３の、表１の遺伝子のｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡにハイブリダイズすることができる１組のプローブを含む診断キットを提供する。
別の実施形態では、本発明は診断キットに関する。例えば、診断キットはそのようなマイクロアレイを含み、マイクロアレイは、マイクロアレイ基板、および本発明の遺伝子サインを示すことができる、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４，１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１，２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２，５３、５４、５６、５７、５８、５９、６０、６１，６２、６３，６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２または８３の、表１の遺伝子から発現されたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡにハイブリダイズすることができるプローブを含む。
１つの態様では、本発明は、本発明によるサインの同定のために適合されたマイクロアレイを提供する。
いくつかの実施形態では、本発明はまた、基板および、本発明において使用される１つ以上の遺伝子、例えば表１から発現されるｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ部分にハイブリダイズするのに好適なプローブに及ぶ。
市販のマイクロアレイは、分析の精度を支援するためにどの時点においても、検討中の遺伝子の発現差異を特徴付けるのに必要とされるものよりはるかに多くのプローブを含む。よって、１つ以上のプローブセットが同じ遺伝子を認識し得る。
よって、１つの実施形態では、複数のプローブまたはプローブセットが、発現差異、例えば、本明細書で記載される本発明の任意の態様に従う遺伝子の上方制御を同定するために使用される。
診断キットは、例えばプローブを含んでもよく、これはマイクロアレイに配列される。
特に、例えば、本明細書で記載される１つ以上のプローブセットを含む、調製されたマイクロアレイは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘなどの会社により容易に調製され得、よって、本発明による、プロファイルを同定するための特異的なテストおよび任意で試薬が提供される。
一実施形態では、マイクロアレイまたは診断キットはさらに、遺伝子、例えばＭａｇｅ遺伝子を発現する関連癌精巣抗原の存在の有無に対し試験することができる。
よって、１つの態様では、本発明は、適切な条件下での、前記ハイブリダイゼーションに好適なプローブおよび／またはプローブセットを提供する。本発明はまた、本発明による遺伝子プロファイルの同定のための、例えば本明細書で記載されるプローブ、またはその機能等価物の使用に及ぶ。
いくつかの実施形態では、本明細書で記載される本発明は前記サインの同定のための、本明細書で列挙されるプローブ（またはその機能的類似体）のすべての並べ替えの使用に及ぶ。
１つの態様では、本発明は、本発明による遺伝子プロファイルが患者由来のサンプル中に存在するかどうかを確立するための、免疫活性化遺伝子の少なくとも１つの遺伝子産物の発現差異を同定するためのプローブの使用を提供する。
ハイブリダイゼーションが使用される本発明の実施形態では、ハイブリダイゼーションは一般に、ストリンジェント条件下、例えば３Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、５０℃で実施される。
標的遺伝子（複数可）／プロファイルが同定されると、同じ標的にハイブリダイズする別のプローブを設計することは十分熟練者の能力の範囲内である。そのため、本発明はまた、記載されるサイン／プロファイルを提供するために、適切な条件下で、本発明の遺伝子（複数可）の同じ発現差異を測定するプローブに及ぶ。
本発明はまた、癌患者が適切な免疫療法による治療に対するレスポンダーまたはノンレスポンダーであるかの分析における関連プローブの使用に及ぶ。
本発明はまた、本発明によるサインの同定のための公知のマイクロアレイの使用（およびこれを使用するプロセス）に及ぶ。
核酸プローブは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００以上のヌクレオチドの長さであってもよく、全長遺伝子を含んでもよい。本発明において使用するためのプローブは、ストリンジェント条件下、表１で列挙される遺伝子から発現されるｍＲＮＡ（またはそのｃＤＮＡ）に特異的にハイブリダイズすることができるものである。
本発明はさらに、本明細書で記載される本発明の任意の実施形態を使用して、薬物治療前後に、発現プロファイルを分析する工程を含む、組織または細胞サンプルに対する薬物の効果をスクリーニングする方法に関する。そのため、本発明は、遺伝子プロファイルを、例えば、Ｍａｇｅ抗原特異的癌免疫療法を用いた治療後に改善された生存期間を有する患者のものに変え（すなわち、遺伝子プロファイルをレスポンダーのものに変える）、患者が、例えば、Ｍａｇｅ抗原特異的癌免疫療法から利益を得るようにすることができる、薬物のためのスクリーニング方法を提供する。
本発明はさらに、例えば、本明細書で記載される本発明の任意の実施形態による発現プロファイルを分析し、これを標準と比較し、患者がＭａｇｅ特異的免疫療法から利益が得られるかどうかを診断する工程を含む、患者診断の方法を提供する。
本発明は、患者により提供された腫瘍組織サンプルから本発明の任意の実施形態による発現プロファイルを分析し、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４，１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１，２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２，５３、５４、５６、５７、５８、５９、６０、６１，６２、６３，６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２または８３の表１の前記遺伝子が発現されるかどうかを評価する工程を含む、患者診断の方法を含む。
よって、臨床適用では、ヒト患者由来の組織サンプルは、本明細書で記載される本発明の任意の実施形態の発現の存在の有無に対し、スクリーニングされ得る。
別の態様では、本発明はどの抗原（複数可）が腫瘍によって発現されたかを決定するために腫瘍由来サンプルを分析し、よって治療的有効量の適切な抗原特異的癌免疫療法薬の投与を可能にする工程をさらに含む方法を提供し、例えば腫瘍がＭＡＧＥ（例えばＭａｇｅ Ａ３）陽性であることが見いだされた場合、適切な治療は、例えば、Ｍａｇｅ Ａ３抗原特異的免疫療法の実施を含み得る。
患者の腫瘍組織などのサンプルは、本発明の任意の実施形態の１つ以上の遺伝子、例えば実質的にすべての遺伝子が異なって発現され（例えば上方制御）、マイクロアレイ分析または他の適切な分析により、例えば本明細書で記載されるように検出され得る場合、本発明の遺伝子サインを示すと考えられる。
さらなる特定的な実施形態は下記で実施される。
いくつかの実施形態では、方法は下記を含む：
１．患者由来のサンプルを、表１の１つ以上の遺伝子の遺伝子産物の発現について分析する工程；
２．遺伝子産物の発現レベルの正規化工程；
３．正規化された発現レベルを標準と比較する工程であって、ここで、標準は、公知のレスポンダーまたはノンレスポンダー状態を有する１または複数の患者における表１の１つまたは複数の遺伝子産物の発現の値または関数であり、よって、標準情報を患者由来のサンプルの同じ遺伝子の発現に関する情報と比較すると患者においてレスポンダーまたはノンレスポンダー状態についての結果が引き出され得る、工程；
４．サンプルが由来する患者をレスポンダーまたはノンレスポンダーとして特徴付ける工程；および
５．任意で、免疫療法薬に対するレスポンダーとして特徴付けられた場合、少なくとも１つの適切な免疫療法薬の投与のための患者を選択する工程を含む。
１つの態様では、正規化は、「内部」参照、例えば同じサンプル由来の１つまたは複数のハウスキーピング遺伝子の発現を用いて実施される。１つの態様では、正規化は、外部参照、例えば１または複数の異なる個体から誘導されたものを用いて実施される。
１つの態様ではサンプルの特徴付けはマイクロアレイを用いて実施される。１つの態様では、サンプルの特徴付けは、核酸増幅技術、例えばＰＣＲを用いて実施される。
１つの態様ではマイクロアレイに基づく技術を使用する新規サンプルの特徴付けは、標準またはトレーニングセットに匹敵する遺伝子発現値を生成させるためのサンプルおよび遺伝子正規化の前処理工程を含む。サンプル正規化は、付属書類１に例示されたＧＣＲＭＡアルゴリズム（Ｗｕ，２００４）を使用して、例えば好適なトレーニングデータから計算された参照ＧＣＲＭＡパラメータを用いて実施され得る。トレーニングデータで計算され得るパラメータの例は、参照分位点およびプローブ効果である。遺伝子正規化は、Ｚ−スコア計算を用いて実施することができ、この場合、プローブセット特異的平均が、プローブセット値から減算され、この平均を中心とする発現値がその後、プローブセット特異的標準偏差により加重される。
１つの態様では、Ｑ−ＰＣＲを用いた新規サンプルの特徴付けは、ある参照またはハウスキーピング遺伝子を用いた患者生データの正規化の前処理工程を含む。Ｚ−スコア計算は、標準またはトレーニングセットからのパラメータを用いて実施され得る。
１つの態様では、メラノーマ患者を比較し、特徴付ける工程は、下記アルゴリズムを用いて、患者をレスポンダー（Ｒ）もしくは遺伝子サイン（ＧＳ）＋またはノンレスポンダー（ＮＲ，ＧＳ−）として特徴付けるために、表１で列挙される１００プローブセットまたは８３遺伝子を使用する。：
Figure 2013505008
Figure 2013505008
ここで、
ｔｅｓｔｓｅｔは、１００ＰＳに対する正規化マイクロアレイデータを含む１００行を有するマトリクスである。
Ｍ８．ｔｒａｉｎ．ｐａｒａｍｅｔｅｒｓは、下記を含むクラスリストのオブジェクトである：
１．１００ＰＳの文字リスト
２．トレインセット中の各ＰＳに対する１００平均値のベクトル
３．トレインセット中の各ＰＳに対する１００ｓｄ値のベクトル
４．トレインマトリクスのｓｖｄ分解のＵマトリクスを含む１００行および５６列のマトリクス
５．トレイン中のレスポンダー群のＰＣ１平均値
６．トレイン中のレスポンダー群のＰＣ１ ｓｄ値
７．トレイン中のノンレスポンダー群のＰＣ１平均値
８．トレイン中のノンレスポンダー群のＰＣ１ ｓｄ値
トレーニングセット中の各群の平均およびｓｄ(有効３桁まで四捨五入)は下記の通りである:
Figure 2013505008
１００ＰＳ分類指標特徴に対する平均、標準偏差（Ｓｄ）およびＰＣ１係数
Figure 2013505008
Figure 2013505008
Figure 2013505008
１つの態様では、メラノーマ患者を比較し、特徴付ける工程は、単一の遺伝子発現値が第１の主成分（ＰＣ１）の代わりに使用される、上記で特定されるアルゴリズムを用いて患者を特徴付けるために、それぞれ、表１３で言及される１００プローブセットまたは８３遺伝子のいずれか１つを使用する。
１つの態様では、メラノーマ患者を比較し、特徴付ける工程は、下記アルゴリズムを用いて、患者をレスポンダー（Ｒ）もしくは遺伝子サイン（ＧＳ）＋またはノンレスポンダー（ＮＲ，ＧＳ−）として特徴付けるために、表５で列挙される２２遺伝子を使用する：
Figure 2013505008
Figure 2013505008
ここで、
Ｔｅｓｔｓｅｔ．ＲＤａｔａは、２２遺伝子に対する正規化対数スケールＰＣＲデータを含む２２行を有するマトリクスである。
Ｍ８．ｔｒａｉｎ．ｐａｒａｍｅｔｅｒｓは、下記を含むクラスリストのオブジェクトである：
１．２２遺伝子名の文字リスト
２．トレインセット中の各遺伝子に対する２２平均値のベクトル
３．トレインセット中の各遺伝子に対する２２ｓｄ値のベクトル
４．トレインマトリクスのｓｖｄ分解のＵマトリクスを含む２２行および２２列のマトリクス
５．トレイン中のレスポンダー群のＰＣ１平均値
６．トレイン中のレスポンダー群のＰＣ１ ｓｄ値
７．トレイン中のノンレスポンダー群のＰＣ１平均値
８．トレイン中のノンレスポンダー群のＰＣ１ ｓｄ値
２２遺伝子分類指標特徴に対する平均、標準偏差（Ｓｄ）およびＰＣ１係数
Figure 2013505008
トレーニングセット中の各群の平均およびｓｄ(有効３桁まで四捨五入)は下記の通りである:
Figure 2013505008
１つの態様では、メラノーマ患者を比較し、特徴付ける工程は、単一の遺伝子発現値が第１の主成分（ＰＣ１）の代わりに使用される、上記で特定されるアルゴリズムを用いて患者を特徴付けるために、それぞれ、表１１で言及される２２遺伝子のいずれか１つを使用する。
１つの態様では、ＮＳＣＬＣ患者を比較し、特徴付ける工程は、下記アルゴリズムを用いて、患者をレスポンダー（非再発もしくは遺伝子サイン＋（ＧＳ＋），１）またはノンレスポンダー（再発，ＧＳ−，０）として特徴付けるために、表７で列挙される２３遺伝子を使用する：
Figure 2013505008
Figure 2013505008
ここで、
Ｔｅｓｔｓｅｔ．ＲＤａｔａは、２３遺伝子に対する正規化対数スケールＰＣＲデータを含む２３行を有するマトリクスである。
Ｍ４．ｔｒａｉｎ．ｐａｒａｍｅｔｅｒｓは、下記を含むクラスリストのオブジェクトである：
１．２３遺伝子名の文字リスト
２．トレインセット中の各遺伝子に対する２３平均値のベクトル
３．トレインセット中の各遺伝子に対する２３ｓｄ値のベクトル
４．トレインマトリクスのｓｖｄ分解のＵマトリクスを含む２３行および２３列のマトリクス
５．リスクスコア計算におけるＢｔｒｅａｔｍｅｎｔ
６．リスクスコア計算におけるＢＰＣ１ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ
７．トレインにおけるメジアンリスクスコア
２３遺伝子分類指標特徴に対する平均、標準偏差（Ｓｄ）およびＰＣ１係数
Figure 2013505008
ここで、Ｂｔｒｅａｔｍｅｎｔ０‐０．２４２９０３３
およびＢＰＣ１ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ＝０．１７２００６２は、トレーニングセットから得られた。
新規サンプルのリスクスコアは、トレーニングセットのメジアンリスクスコア＝−０．３２３９４７２８８と比較され、リスクスコアがこの値より低い場合、サンプルはＧＳ＋（レスポンダー，非再発，１）と分類される。
１つの態様では、ＮＳＣＬＣ患者を比較し、特徴付ける工程は、単一の遺伝子発現値が第１の主成分（ＰＣ１）の代わりに使用される、上記で特定されるアルゴリズムを用いて患者を特徴付けるために、それぞれ、表１２で言及される２３遺伝子のいずれか１つを使用する。
１つの態様では、ＮＳＣＬＣ患者を比較し、特徴付ける工程は、下記アルゴリズムを用いて、患者をレスポンダー（非再発もしくは遺伝子サイン＋（ＧＳ＋），１）またはノンレスポンダー（再発，ＧＳ−，０）として特徴付けるために、表９で列挙される２２遺伝子を使用する：
Figure 2013505008
Figure 2013505008
ここで、
Ｔｅｓｔｓｅｔ．ＲＤａｔａは、２２遺伝子に対する正規化対数スケールＰＣＲデータを含む２２行を有するマトリクスである
Ｍ４．ｔｒａｉｎ．ｐａｒａｍｅｔｅｒｓは、下記を含むクラスリストのオブジェクトである：
１．２２遺伝子名の文字リスト
２．トレインセット中の各遺伝子に対する２２平均値のベクトル
３．トレインセット中の各遺伝子に対する２２ｓｄ値のベクトル
４．トレインマトリクスのｓｖｄ分解のＵマトリクスを含む２２行および２２列のマトリクス
５．リスクスコア計算におけるＢｔｒｅａｔｍｅｎｔ
６．リスクスコア計算におけるＢＰＣ１ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ
７．トレインにおけるメジアンリスクスコア。
２２遺伝子分類指標特徴に対する平均、標準偏差（Ｓｄ）およびＰＣ１係数
Figure 2013505008
ここで、Ｂｔｒｅａｔｍｅｎｔ＝−０．１９３１４６９９３およびＢＰＣ１ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ＝−０．１６３７０４８１７は、トレーニングセットから得られた。
新規サンプルのリスクスコアは、トレーニングセットのメジアンリスクスコア＝−０．２５７３７４２１と比較され、リスクスコアがこの値より低い場合、サンプルはＧＳ＋（レスポンダー，非再発，１）と分類される。
免疫療法薬
さらなる態様では、本発明は、適切な免疫療法、例えば、それに対するレスポンダーとして同定した後の癌免疫療法、例えば癌精巣免疫療法を用いてレスポンダー患者を治療する方法を提供する。
よって、いくつかの実施形態では、本発明は、例えば患者由来のサンプルの適切な分析により示されるように、少なくとも１つの免疫活性化遺伝子の発現差異に基づき、患者をレスポンダーとして最初に特徴付けた後、治療的有効量の適切な免疫療法（例えば癌免疫療法、例えばＭａｇｅ癌免疫療法）を投与する工程を含む、患者を治療する方法を提供する。特に、この場合、患者は、本明細書で記載される１つ以上の実施形態に基づいてレスポンダーとして特徴付けられる。
１つの態様では、免疫療法は適切なアジュバント（免疫賦活剤）を含み、下記記載を参照されたい。
本発明のさらに別の実施形態では、例えば、Ｍａｇｅ発現腫瘍を患う患者を治療する方法が提供され、この方法は、患者が本発明の遺伝子サインを発現するかどうかを決定し、その後、例えば、Ｍａｇｅ特異的免疫療法薬を投与することを含む。さらなる実施形態では、患者は、治療、例えば、任意の腫瘍の外科手術による切除または他の化学療法もしくは放射線療法治療を最初に受けた後、疾患の再発を防止または寛解するために例えば、Ｍａｇｅ特異的免疫療法を用いて治療される。
本発明のさらなる態様は、Ｍａｇｅ発現腫瘍を患う患者を治療する方法であり、本方法は、患者の腫瘍が、患者により与えられた生物学的サンプルから、本発明の任意の実施形態によるプロファイルを発現するかどうかを決定し、その後、Ｍａｇｅ特異的免疫療法薬を前記患者に投与することを含む。
Ｍａｇｅ発現腫瘍が除去／治療されるように処置されている、Ｍａｇｅ発現腫瘍の再発を起こしやすい患者を治療する方法もまた、提供され、本方法は、患者により与えられた生物学的サンプルから、患者の腫瘍が本発明の任意の実施形態より選択された１つ以上の遺伝子を発現するかどうかを決定し、その後、Ｍａｇｅ特異的免疫療法薬を投与することを含む。
本発明はまた、治療または使用方法として下記の使用を提供する：
ＭＡＧＥ抗原またはそのペプチドを含むＭａｇｅ特異的免疫療法薬、
ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質またはペプチドを含むＭＡＧＥ抗原、
ペプチドＥＶＤＰＩＧＨＬＹを含むＭＡＧＥ抗原、
運搬体タンパク質に融合またはコンジュゲートされたＭＡＧＥ抗原またはペプチド、例えばこの場合、運搬体タンパク質は、タンパク質Ｄ、ＮＳ１もしくはＣＬｙｔＡまたはそれらの断片から選択される、および／または
さらに、アジュバントを含む、Ｍａｇｅ特異的免疫療法薬、例えば、この場合、アジュバントは下記のうちの１つ以上またはそれらの組み合わせを含む：３Ｄ−ＭＰＬ；アルミニウム塩；ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド；サポニン含有アジュバント、例えばＱＳ２１またはＩＳＣＯＭ；水中油型エマルジョン；およびリポソーム。
本発明はまた、レスポンダーとして指定された患者、例えば癌患者の治療のための薬剤の製造における、免疫療法、例えば癌免疫療法、特にＭａｇｅ免疫療法の使用に及ぶ。
最初にノンレスポンダーとして特徴付けられた一人の患者がその後、放射線療法後、レスポンダーとして特徴付けられたことが観察された。興味深いことに、本発明者らもまた、例えば患者を放射線療法に供する、または、炎症刺激薬薬、例えばインターフェロンまたはＴＬＲ３（例えば、ＷＯ ２００６／０５４１７７に記載）、４、７、８もしくはＴＬＲ９アゴニスト（例えばＣｐＧモチーフを含む、特に高用量、例えば０．１〜７５ｍｇ／Ｋｇが、例えば毎週投与される）を投与することにより、少なくとも幾人かのノンレスポンダーにおいてレスポンダープロファイルを誘導する可能性があると考えている。例えばKrieg, A. M., Efler, S. M., Wittpoth, M., Al Adhami, M. J. & Davis, H. L. Induction of systemic TH1-like innate immunity in normal volunteers following subcutaneous but not intravenous administration of CPG 7909, a synthetic B-class CpG oligodeoxynucleotide TLR9 agonist. J. Immunother. 27, 460-471 (2004)を参照されたい。
高用量のＣｐＧは、例えば吸入され、または皮下投与され得る。
本発明はさらに、Ｍａｇｅ発現腫瘍を患う患者またはＭａｇｅ発現腫瘍を除去／治療するために治療（例えば、外科手術、化学療法または放射線療法）を受けた患者の治療のための薬剤の製造におけるＭａｇｅ特異的免疫療法の使用を提供し、前記患者は、本発明の遺伝子サインを発現する。
その後、免疫療法は、例えばレスポンダーに、またはレスポンダープロファイルが誘導された時点で、実施され得る。
１つの態様では、本発明は、Ｍａｇｅ発現腫瘍を患う患者の治療のための薬剤の製造におけるＭａｇｅ特異的免疫療法の使用を提供し、前記患者は、本発明の任意の実施形態から選択される１つ以上の遺伝子を発現するそれらの腫瘍により特徴付けられる。
本発明はまた、Ｍａｇｅ発現腫瘍から再発しやすい患者の治療のための薬剤の製造におけるＭａｇｅ特異的免疫療法の使用を提供し、前記患者は、本発明の任意の実施形態から選択される１つ以上の遺伝子を発現するそれらの腫瘍により特徴付けられる。
好都合なことに、本発明により、治療提供者は、適切な免疫療法を受けることから臨床的利益を得るそれらの患者集団を標的とすることが可能になる。スクリーニング後、レスポンダーとして判断／特徴付けされた少なくとも６０％の患者、例えば７０、７５、８０、８５％以上の患者が、免疫療法から臨床的利益を受け、これは療法、例えば癌療法を用いて、一般的に観察される現在のレベルを超えて著しく増加することが予測される。
好都合なことに、癌免疫療法が化学療法と同時に、またはその後に与えられる場合、化学療法により減少する可能性のある患者の免疫応答の上昇を支援することができる。
さらなる実施形態では、免疫療法は外科手術、化学療法および／または放射線療法前に与えられ得る。
本発明において使用するのに好適な抗原特異的癌免疫療法薬（ＡＳＣＩ）としては、例えばＭａｇｅ特異的免疫応答を上昇させることができるものが挙げられる。そのような免疫療法薬は、Ｍａｇｅ遺伝子産物、例えばＭａｇｅ−Ａ抗原、例えばＭａｇｅ−Ａ３に対する免疫応答を上昇させることができる。免疫療法薬は一般に、Ｍａｇｅ遺伝子産物由来の少なくとも１つのエピトープを含む。そのようなエピトープは、任意で担体に共有結合により結合され、任意でアジュバントの存在下、ペプチド抗原として存在し得る。また、より大きなタンパク質断片が使用され得る。例えば、本発明において使用するための免疫療法薬は、ＭＡＧＥ−Ａ１のアミノ酸１９５−２７９に対応する、またはそれらを含む抗原を含み得る。しかしながら、使用するための断片およびペプチドは、好適に提供される場合、Ｍａｇｅ特異的免疫応答を上昇させることができなければならない。本発明で使用され得るペプチドの例としては、ＭＡＧＥ−３．Ａ１ノナペプチドＥＶＤＰＩＧＨＬＹ［配列番号］（Marchand et al.、International Journal of Cancer 80(2)、219‐230を参照されたい)、および下記ＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドが挙げられる：
ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ； ［配列番号：１０７］
ＭＥＶＤＰＩＧＨＬＹ； ［配列番号：１０８］
ＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡ； ［配列番号：１０９］
ＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲ； ［配列番号：１１０］
ＬＫＹＲＡＲＥＰＶＴ； ［配列番号：１１１］
ＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥＴＳ；および ［配列番号：１１２］
ＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ； ［配列番号：１１３］。
別のＡＳＣＩとしては、癌精巣抗原、例えばＮＹ−ＥＳＯ１、ＬＡＧＥ１、ＬＡＧＥ２が挙げられ、例えばこれらの詳細は、www.cancerimmunity.org/CTdatabaseから得ることができる。ＡＳＣＩはまた、癌精巣特異的でない他の抗原、例えばＰＲＡＭＥおよびＷＴ１を含む。
癌免疫療法は、例えば、下記で記載される１つ以上の抗原に基づいてもよい。
本発明の１つの実施形態では、使用される抗原は、ＭＡＧＥ腫瘍抗原、例えば、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４、ＭＡＧＥ５、ＭＡＧＥ６、ＭＡＧＥ７、ＭＡＧＥ８、ＭＡＧＥ９、ＭＡＧＥ１０、ＭＡＧＥ１１またはＭＡＧＥ１２から構成されてもよく、またはそれらを含んでもよい。これらのＭＡＧＥ抗原をコードする遺伝子は、染色体Ｘ上に配置され、互いにそれらのコード配列において６４〜８５％ホモロジーを共有する（Ｄｅ Ｐｌａｅｎ, １９９４）。これらの抗原は時としてＭＡＧＥ Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ２、ＭＡＧＥ Ａ３、ＭＡＧＥ Ａ４、ＭＡＧＥ Ａ５、ＭＡＧＥ Ａ６、ＭＡＧＥ Ａ７、ＭＡＧＥ Ａ８、ＭＡＧＥ Ａ９、ＭＡＧＥ Ａ１０、ＭＡＧＥ Ａ１１および／またはＭＡＧＥ Ａ１２（ＭＡＧＥ Ａファミリー）として知られている。１つの実施形態では、抗原はＭＡＧＥ Ａ３である。
１つの実施形態では、２つの別のＭＡＧＥファミリーのうちの１つからの抗原が使用され得る：ＭＡＧＥ ＢおよびＭＡＧＥ Ｃグループ。ＭＡＧＥ Ｂファミリーは、ＭＡＧＥ Ｂ１（ＭＡＧＥ Ｘｐ１、およびＤＡＭ １０としても知られている）、ＭＡＧＥ Ｂ２（ＭＡＧＥ Ｘｐ２およびＤＡＭ ６としても知られている）ＭＡＧＥ Ｂ３およびＭＡＧＥ Ｂ４を含み−Ｍａｇｅ Ｃファミリーは現在、ＭＡＧＥ Ｃ１およびＭＡＧＥ Ｃ２を含む。
一般論として、ＭＡＧＥタンパク質は、タンパク質のＣ末端に向かって配置されたコア配列サインを含むものとして規定することができる（例えばＭＡＧＥ Ａ１ ３０９アミノ酸タンパク質に関しては、コアサインはアミノ酸１９５−２７９に対応する）。
よって、コアサインのコンセンサスパターンは、下記のように記載され、ここで、ｘは任意のアミノ酸を表し、小文字残基は保存され（保存バリアントが許容される）大文字残基は完全に保存される。
コア配列サイン
ＬｉｘｖＬ（２ｘ）Ｉ（３ｘ）ｇ（２ｘ）ａｐＥＥｘｉＷｅｘｌ（２ｘ）ｍ（３−４ｘ）Ｇｘｅ（３−４ｘ）ｇｘｐ（２ｘ）ｌｌｔ（３ｘ）ＶｑｅｘＹＬｘＹｘｑＶＰｘｓｘＰ（２ｘ）ｙｅＦＬＷＧｐｒＡ（２ｘ）Ｅｔ（３ｘ）ｋｖ
保存的置換はよく知られており、一般に配列アライメントコンピュータプログラムにおいてデフォルトスコアマトリクスとして設定される。これらのプログラムは、ＰＡＭ２５０（Dayhoft M.O. et al., (1978), “A model of evolutionary changes in proteins”, In “Atlas of Protein sequence and structure” 5(3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352)、National Biomedical Research Foundation、Washington、およびBlosum62(Steven Henikoft and Jorja G. Henikoft (1992), “Amino acid substitution matricies from protein blocks”)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919を含む。
一般論として、下記群内の置換は保存的置換であるが、群間での置換は、非保存であると考えられる。群は下記の通りである：
i) アスパラギン酸/アスパラギン/グルタミン酸/グルタミン
ii) セリン/スレオニン
iii) リシン/アルギニン
iv) フェニルアラニン/チロシン/トリプトファン
v) ロイシン/イソロイシン/バリン/メチオニン
vi) グリシン/アラニン。
一般に、および本発明のの関連では、ＭＡＧＥタンパク質は、このコア領域では、ＭＡＧＥ Ａ１のアミノ酸１９５〜２７９と約５０％以上同一、例えば７０、８０、９０、９５ ９６、９７、９８または９９％同一である。
ＭＡＧＥタンパク質誘導体もまた、当技術分野で知られており、ＷＯ９９／４０１８８を参照されたい。そのような誘導体は、様々な腫瘍型の治療のために好適である治療ワクチン製剤（免疫療法薬）において使用するのに好適である。
いくつかのＣＴＬエピトープがＭＡＧＥ−３タンパク質上で同定されている。１つのそのようなエピトープ、ＭＡＧＥ−３．Ａ１は、ＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ．Ａ１との関連で提示された場合、ＣＴＬに対し特異的なエピトープを構成するＭＡＧＥ−３タンパク質のアミノ酸１６８と１７６の間に配置されるノナペプチド配列である。近年、２つの追加のＣＴＬエピトープが、メラノーマ細胞および自己リンパ球の混合培養においてＣＴＬ応答を開始する能力により、ＭＡＧＥ−３タンパク質のペプチド配列上で同定されている。これらの２つのエピトープはそれぞれ、ＨＬＡ．Ａ２（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ， １９９４）およびＨＬＡ．Ｂ４４（Ｈｅｒｍａｎ， １９９６）アレルに対し特異的な結合モチーフを有する。
本発明のさらなる実施形態では、腫瘍抗原は、下記抗原のうちの１つ、または抗原に対し免疫応答を誘導することができるその免疫原性部分を含む、またはそれから構成され得る：ＳＳＸ−２；ＳＳＸ−４；ＳＳＸ−５；ＮＡ１７；ＭＥＬＡＮ−Ａ；チロシナーゼ；ＬＡＧＥ−１；ＮＹ−ＥＳＯ−１；ＰＲＡＭＥ；Ｐ７９０；Ｐ５１０；Ｐ８３５；Ｂ３０５Ｄ；Ｂ８５４；ＣＡＳＢ６１８（ＷＯ００／５３７４８において記載）；ＣＡＳＢ７４３９（ＷＯ０１／６２７７８において記載）；Ｃ１４９１；Ｃ１５８４；およびＣ１５８５。
１つの実施形態では、抗原は、Ｐ５０１Ｓ（プロステインとしても知られている）を含んでもよく、またはこれから構成されてもよい。Ｐ５０１Ｓ抗原は、Ｐ５０１Ｓタンパク質の大部分を肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のタンパク質ＬｙｔＡのＣ末端部分を含む細菌融合タンパク質と組み合わせた組換えタンパク質であってもよく、この場合、ＷＯ０３／１０４２７２において記載されるように、破傷風トキソイドのＰ２ユニバーサルＴヘルパーペプチドが挿入されており、すなわちＣＬｙｔＡ−Ｐ２−ＣＬｙｔａ（「ＣＰＣ」融合パートナー）を含む融合物である。
１つの実施形態では、抗原は、Ｗｉｌｍ腫瘍遺伝子により発現されたＷＴ−１、または約または大体アミノ酸１−２４９を含むそのＮ末端断片ＷＴ−１Ｆ；Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子により発現された抗原、またはその断片を含んでもよく、またはそれらから構成されてもよい。１つの実施形態では、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗原は、ＷＯ００／４４８９９に記載される、下記融合タンパク質の１つであってもよい。
さらなる実施形態では、抗原は、「ＥＣＤ−ＩＣＤ」または「ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質」とも呼ばれる「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質」を含んでもよく、またはそれらから構成されてもよく、これはＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の細胞外ドメイン（またはその断片）および細胞内ドメイン（またはその断片）を含む融合タンパク質（またはその断片）を示す。１つの実施形態では、このＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ膜貫通ドメインの実質的な部分は含まず、またはＨＥＲ−２／ｎｅｕ膜貫通ドメインのいずれも含まない。
さらなる実施形態では、抗原は、「ＥＣＤ−ＰＤ」または「ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質」とも呼ばれる「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質」あるいは「ＥＣＤ−ΔＰＤ」または「ＥＣＤ−ΔＰＤ融合タンパク質」とも呼ばれる「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ΔＰＤ融合タンパク質」を含んでもよく、またはそれらから構成されてもよく、これはＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の細胞外ドメイン（またはその断片）およびリン酸化ドメイン（またはその断片、例えば、ΔＰＤ）を含む融合タンパク質（またはその断片）を示す。１つの実施形態では、ＥＣＤ−ＰＤおよびＥＣＤ−ΔＰＤ融合タンパク質は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ膜貫通ドメインの実質的な部分は含まず、またはＨＥＲ−２／ｎｅｕ膜貫通ドメインのいずれも含まない。
１つの実施形態では、抗原はＭａｇｅまたは免疫学的融合物または発現エンハンサーパートナーに結合された他の適切なタンパク質を含んでもよい。融合タンパク質は、ある疾患に関連する２つ以上の抗原を含有するハイブリッドタンパク質を含んでもよく、または抗原および発現エンハンサーパートナーのハイブリッドであってもよい。
１つの実施形態では、ＭＡＧＥ抗原は全長ＭＡＧＥタンパク質を含んでもよい。別の実施形態ではＭａｇｅ抗原は、ＭＡＧＥ抗原のアミノ酸３〜３１２を含み得る。
別の実施形態で、ＭＡＧＥ抗原はＭＡＧＥタンパク質由来の１００、１５０、２００、２５０または３００のアミノ酸を含んでもよく、ただし、抗原が、免疫療法治療において使用される場合、ＭＡＧＥに対する免疫応答を発生させることができることを条件とする。
抗原およびパートナーは化学的にコンジュゲートされてもよく、または組換え融合タンパク質として発現され得る。抗原およびパートナーが組換え融合タンパク質として発現される一実施形態では、これによって、非融合タンパク質に比べ、発現系で生成されるレベルの増加が可能になる。よって、融合パートナーは、Ｔヘルパーエピトープ、好ましくはヒトによって認識されるＴヘルパーエピトープの提供を支援する（免疫学的融合パートナー）、および／または天然組換えタンパク質よりも高い収率でタンパク質を発現するのを支援することができる（発現エンハンサー）。１つの実施形態では、融合パートナーは、免疫学的融合パートナーおよび発現増強パートナーの両方となり得る。
本発明の１つの実施形態では、使用され得る免疫学的融合パートナーは、タンパク質Ｄ、グラム陰性菌ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）Ｂ（ＷＯ９１／１８９２６）の表面タンパク質またはその誘導体から誘導される。タンパク質Ｄ誘導体は、そのタンパク質の最初の１／３、またはそのタンパク質の最初の大体もしくは約１／３を含み得、特に最初のＮ末端１００−１１０アミノ酸または大体、最初のＮ末端１００−１１０アミノ酸を含み得る。
１つの実施形態では、融合タンパク質は最初の１０９残基（またはそれから１０８残基）またはタンパク質Ｄのアミノ酸２０〜１２７を含む。
使用され得る他の融合パートナーとしては、インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質、ＮＳ１（ヘマグルチニン）が挙げられる。典型的には、ＮＳ１のＮ末端８１アミノ酸が使用され得るが、Ｔ−ヘルパーエピトープを含むならば、異なる断片が使用され得る。
別の実施形態では、免疫学的融合パートナーはＬｙｔＡとして知られているタンパク質である。ＬｙｔＡは、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、アミダーゼＬｙｔＡ、（ＬｙｔＡ遺伝子によりコードされる（Ｇｅｎｅ、４３ （１９８６） ｐａｇｅ ２６５‐２７２）ペプチドグリカン骨格中のある結合を特異的に分解する自己溶菌酵素を合成する肺炎球菌に由来する。ＬｙｔＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリンまたはいくつかのコリン類似体、例えばＤＥＡＥに対する親和性に関与する。この特性が、融合タンパク質の発現に有用な大腸菌Ｃ−ＬｙｔＡ発現プラスミドの開発に利用された。そのアミノ末端にＣ−ＬｙｔＡ断片を含むハイブリッドタンパク質の精製は記載されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： １０、（１９９２） ｐａｇｅ ７９５‐７９８）。１つの実施形態では、分子のＣ末端部分が使用され得る。実施形態は、残基１７８で開始するＣ末端で見られるＬｙｔＡ分子の繰り返し部分を使用し得る。１つの実施形態では、ＬｙｔＡ部分は残基１８８−３０５を組み込むことができる。
本発明の１つの実施形態では、Ｍａｇｅタンパク質は、誘導体化遊離チオールを含み得る。そのような抗原はＷＯ９９／４０１８８において記載されている。特に、カルボキシアミド化またはカルボキシメチル化誘導体が使用され得る。
本発明の１つの実施形態では、腫瘍関連抗原は、Ｍａｇｅ−Ａ３−タンパク質Ｄ分子を含む。この抗原および下記で要約されたものは、ＷＯ９９／４０１８８においてより詳細に記載される。
本発明のさらなる実施形態では、腫瘍関連抗原は、下記融合タンパク質のいずれかを含み得る：リポタンパク質Ｄ断片、ＭＡＧＥ１断片、およびヒスチジンテールの融合タンパク質；ＮＳ１−ＭＡＧＥ３、およびヒスチジンテールの融合タンパク質；ＣＬＹＴＡ−ＭＡＧＥ１−ヒスチジンの融合タンパク質；ＣＬＹＴＡ−ＭＡＧＥ３−ヒスチジンの融合タンパク質。
本発明のさらなる実施形態は、核酸免疫療法薬の使用を含み、これは、本明細書で記載されるＭａｇｅ特異的腫瘍関連抗原をコードする核酸分子を含む。そのような配列は好適な発現ベクターに挿入され、ＤＮＡ／ＲＮＡワクチン接種のために使用され得る。核酸を発現する微生物ベクターもまた、ベクター化された送達免疫療法薬として使用され得る。そのようなベクターとしては、例えば、ポックスウイルス、アデノウイルス、アルファウイルスおよびリステリアが挙げられる。
核酸配列を得るための従来の組換え技術、および発現ベクターの作成はManiatis et al.、Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor、1982‐1989において記載される。
タンパク質に基づく免疫療法薬では、本発明のタンパク質は、液体形態または凍結乾燥形態で提供される。
各ヒト用量は、１〜１０００μｇのタンパク質、例えば３０−３００μｇ、例として２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０μｇを含むことが一般的に予測される。
本明細書で記載される方法（複数可）は、ワクチンアジュバント、および／または免疫賦活性サイトカインまたはケモカインをさらに含む組成物を含み得る。
本発明において使用するのに好適なワクチンアジュバントは市販されており、例えば、Ｆｒｅｕｎｄ不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）；Ｍｅｒｃｋアジュバント６５（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｃ．、Ｒａｈｗａｙ、ＮＪ）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）；アルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムゲル（ａｌｕｍ）またはリン酸アルミニウム；カルシウム、鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；カチオンまたはアニオン誘導体化多糖；ポリホスファゼン；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドＡおよびクィルＡである。サイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦまたはインターロイキン−２、−７、または−１２、およびケモカインもまた、アジュバントとして使用され得る。
製剤においては、アジュバント組成物は、主にＴｈ１型の免疫応答を誘導することが望ましい。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は投与された抗原に対する細胞性免疫応答の誘導を助ける傾向がある。応答が主にＴｈ１型である１つの実施形態によれば、Ｔｈ１型サイトカインのレベルは、Ｔｈ２型サイトカインのレベルより大きな程度まで増加するであろう。これらのサイトカインのレベルは、標準アッセイ法を用いて容易に評価され得る。サイトカインファミリーの再検討のために、Ｍｏｓｍａｎｎ ａｎｄ Ｃｏｆｆｍａｎ、Ａｎｎ. Ｒｅｖ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. ７：１４５‐１７３、１９８９を参照されたい。
したがって、主にＴｈ１型応答を誘発するために使用され得る好適なアジュバントとしては、例えばモノホスホリルリピドＡ、例えば３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）のアルミニウム塩との組み合わせが挙げられる。３Ｄ−ＭＰＬまたは他のトール様受容体４（ＴＬＲ４）リガンド、例えばアミノアルキルグルコサミニドホスフェート（ＷＯ９８／５０３９９、ＷＯ０１／３４６１７およびＷＯ０３／０６５８０６において開示される）もまた、主にＴｈ１型応答を生成させるために単独で使用され得る。
優先的にＴｈ１型免疫応答を誘導し得る他の公知のアジュバントとしては、ＴＬＲ９アゴニスト、例えば非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが挙げられる。オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドが非メチル化であることを特徴とする。そのようなオリゴヌクレオチドはよく知られており、例えばＷＯ９６／０２５５５において記載される。
好適なオリゴヌクレオチドは下記を含む:
Figure 2013505008
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはまた、単独で、または他のアジュバントと組み合わされて使用され得る。例えば、増強された系は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドおよびサポニン誘導体の組み合わせ、特にＷＯ００／０９１５９およびＷＯ００／６２８００において開示されるＣｐＧとＱＳ２１の組み合わせを含む。
製剤はさらに、水中油型エマルジョンおよび／またはトコフェロールを含み得る。
単独で、または他のアジュバントと組み合わされて使用され得る別の好適なアジュバントはサポニン、例えばＱＳ２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）である。例えば、増強された系は、モノホスホリルリピドＡおよびサポニン誘導体の組み合わせ、例えばＷＯ９４／００１５３に記載されるＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組み合わせ、またはＷＯ９６／３３７３９において記載されるように、ＱＳ２１がコレステロールで反応停止される反応源性の低い組成物を含む。他の好適な製剤は水中油型エマルジョンおよびトコフェロールを含む。ＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを、例えば、水中油型エマルジョン中に含む特に強力なアジュバント製剤はＷＯ９５／１７２１０に記載される。
別の実施形態では、アジュバントは、リポソーム組成物で製剤化され得る。
使用される３Ｄ−ＭＰの量は一般に少ないが、免疫療法製剤に依存し、１用量あたり１−１０００μｇ、例えば１用量あたり１−５００μｇ、例として１用量あたり１〜１００μｇ、特に１用量あたり２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０μｇの領域とすることができる。
一実施形態では、アジュバント系は、３つの免疫賦活剤：ＣｐＧオリゴヌクレオチド、３Ｄ-ＭＰＬおよびＱＳ２１を含み、リポソーム製剤または水中油型エマルジョンのいずれかで提示され、例えばＷＯ９５／１７２１０において記載される。
本発明のアジュバントまたは免疫療法薬中のＣｐＧまたは免疫賦活性オリゴヌクレオチドの量は、一般に少ないが、免疫療法製剤に依存し、１用量あたり１−１０００μｇ、例えば１用量あたり１−５００μｇの領域とすることができる。
本発明のアジュバント中で使用するためのサポニンの量は、１用量あたり１−１０００μｇ、例えば１用量あたり１−５００μｇ、例として１用量あたり１〜１００μｇ、特に用量あたり２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０μｇの領域とすることができる。
一般に、各ヒト用量は、０．１−１０００μｇの抗原、例えば０．１−５００μｇ、例として０．１−１００μｇ、特に０．１〜５０μｇ、とりわけ２５または５０μｇを含むことが予測される。特定の免疫療法薬のための最適量は、ワクチン接種した被験体における適切な免疫応答の観察を含む標準研究により確認することができる。最初のワクチン接種後、被験体は、１回または数回の追加免疫を十分間隔をあけて受けることができる。
他の好適なアジュバントとしてはＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ、Ｆｒａｎｃｅ）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、Ｒｉｂｉ Ｄｅｔｏｘ、ＲＣ−５２９（ＧＳＫ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）および他のアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ＡＧＰｓ）が挙げられる。
したがって、本明細書で開示される抗原およびアジュバントを含む、本発明の方法において使用するための免疫原性組成物が提供され、ここで、アジュバントは１つ以上の３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１、ＣｐＧオリゴヌクレオチドまたはこれらのアジュバントの２つ以上の組み合わせを含む。免疫原性組成物内の抗原は、水中油型または水中油型エマルジョンビヒクルまたはリポソーム製剤中で提示され得る。
１つの実施形態では、アジュバントは１つ以上の３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１および免疫賦活性ＣｐＧオリゴヌクレオチドを含み得る。一実施形態では３つの免疫賦活剤すべてが存在する。別の実施形態では３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１が水中油型エマルジョン中、ＣｐＧオリゴヌクレオチドなしで提示される。
本発明の方法において使用するための組成物は、本明細書で記載される腫瘍関連抗原、またはその融合タンパク質、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を含み得る。
この明細書の関連では、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）という用語の使用は、非制限的であることを意図し、すなわち、含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）ことを意味する。
実施形態は特定的に想定され、この場合、ある１つまたは複数の要素を含む本発明の態様は、別の実施形態として、関連する要素から構成される、またはそれらから本質的に構成される前記態様に限定される。
下記実施例は、方法を説明するために示されており、これらは、本発明の粒子を調製するために使用され得る。
本明細書における文書の詳解は、本発明に背景を与え、本発明の理解を助けることを意図する。文書およびコメントは知られており、または関連分野では普通の一般知識であることを認めることを決して意図しない。
１つ以上の態様では、本発明は、下記パラグラフ１〜１０１のいずれか１つに記載される実施形態を提供する。
１）よって、本発明は表１からの１つ以上の遺伝子を使用し得る。
２）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＳＴＡＴ１を有し、任意で表１で同定される１．２〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
３）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＰＳＭＢ９を有し、任意で表１で同定される１．１および１．３〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
４）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＪＡＫ２を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．２および１．４〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
５）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＩＴＧＡ３を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．３および１．５〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
６）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＰＳＭＢ１０を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．４および１．６〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
７）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＣＸＣＬ９を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．５および１．７〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
８）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＲＡＲＲＥＳ３を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．６および１．８〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
９）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＩＬ２ＲＧを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．７および１．９〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
１０）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＣＸＣＬ１０を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．８および１．１０〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
１１）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＣＤ８Ａを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．９および１．１１〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
１２）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＵＢＤを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．１０および１．１２〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
１３）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＧＰＲ１７１を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．１１および１．１３〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
１４）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＫＬＲＤ１を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．１２および１．１４〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
１５）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＨＬＡ−Ｂを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．１３および１．１５〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
１６）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＬＣＰ１を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．１４および１．１６〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
１７）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＨＬＡ−ＤＲＡを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．１５および１．１７〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
１８）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＣＹＴＩＰを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．１６および１．１８〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
１９）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＩＬ２３Ａを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．１７および１．１９〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
２０）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＴＲＡ＠を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．１８および１．２０〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
２１）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＨＬＡ−ＤＲＡを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．１９および１．２１〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
２２）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＴＡＲＰを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．２０および１．２２〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
２３）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＩＴＫを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．２１および１．２３〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
２４）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号を有し、遺伝子はプローブセット２１１７９６_ｓ_ａｔにより同定されるものであり、任意で表１で同定される１．１〜１．２２および１．２４〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
２５）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＨＬＡ−Ｂを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．２３および１．２５〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
２６）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＨＬＡ−ＤＱＡ１を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．２４および１．２６〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
２７）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＨＯＭＥＲ１を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．２５および１．２７〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
２８）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＴＲＧＣ２を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．２６および１．２８〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
２９）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子はプローブセット２１６９２０_ｓ_ａｔにより同定されるものであり、任意で表１で同定される１．１〜１．２７および１．２９〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
３０）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＨＬＡ−Ａを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．２８および１．３０〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
３１）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＨＬＡ−ＤＭＡを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．２９および１．３１〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
３２）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＨＬＡ−Ｆを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．３０および１．３２〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
３３）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＳＬＡＭＦ７を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．３１および１．３３〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
３４）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＫＩＡＡ１５４９を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．３２および１．３４〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
３５）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＬＯＮＲＦ２を有し、任意で表１で同定される１．３５〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
３６）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＦＡＭ２６Ｆを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．３４および１．３６〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
３７）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号Ｃ１ｏｒｆ１６２を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．３５および１．３７〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
３８）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＦＡＭ２６Ｆを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．３６および１．３８〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
３９）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＧＢＰ５を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．３７および１．３９〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
４０）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子はプローブセット２３２３７５_ａｔにより同定されるものであり、任意で表１で同定される１．１〜１．３８および１．４０〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
４１）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＳＬＩＴＲＫ６を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．３９および１．４１〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
４２）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＧＢＰ４を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．４０および１．４２〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
４３）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＥＰＳＴＩ１を有し、任意で表１で同定される１．１〜．４１および１．４３〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
４４）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＡＫＲ１Ｃ２を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．４２および１．４４〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
４５）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＩＴＧＡＬを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．４３および１．４５〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
４６）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＣＤＣ４２ＳＥ２を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．４４および１．４６〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
４７）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＤＺＩＰ１を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．４５および１．４７〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
４８）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＰＴＧＥＲ４を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．４６および１．４８〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
４９）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＨＣＰ５を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．４７および１．４９〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
５０）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＵＴＹを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．４８および１．５０〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
５１）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＫＬＲＢ１を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．４９および１．５１〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
５２）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＦＡＭ２６Ｆを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．５０および１．５２〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
５３）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＨＩＬＳ１を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．５１および１．５３〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
５４）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号Ｃ２０ｏｒｆ２４を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．５２および１．５４〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
５５）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号Ｂ２Ｍを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．５３および１．５５〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
５６）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＺＮＦ２８５Ａを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．５４および１．５６〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
５７）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＴＭＥＭ５６を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．５５および１．５７〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
５８）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＩＲＦ１を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．５６および１．５８〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
５９）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＴＲＧＶ９を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．５７および１．５９〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
６０）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子はプローブセット２３８５２４_ａｔにより同定される記号ＮＡを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．５８および１．６０〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
６１）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＳＬＣ２６Ａ２を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．５９および１．６１〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
６２）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＣＸＣＬ２を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．６０および１．６２〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
６３）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＩＣＯＳを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．６１および１．６３〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
６４）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子はプローブセット２１３１９３_ｘ_ａｔにより同定されるものであり、任意で表１で同定される１．１〜１．６２および１．６４〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
６５）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＣＣＬ５を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．６３および１．６５〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
６６）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＬＯＣ２８４７５７を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．６４および１．６６〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
６７）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＣＤ８６を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．６５および１．６７〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
６８）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＫＬＲＤ１を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．６６および１．６８〜４．４８８として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
６９）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子はプローブセット２１１９０２_ｘ_ａｔにより同定されるものであり、任意で表１で同定される１．１〜１．６７および１．６９〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
７０）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＳＬＡＭＦ６を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．６８および１．７０〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
７１）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＴＯＸを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．６９および１．７１〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
７２）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＧＺＭＫを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．７０および１．７２〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
７３）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＣＤＣ４２ＳＥ２を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．７１および１．７３〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
７４）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＰＰＰ１Ｒ１６Ｂを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．７２および１．７４〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
７５）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＥＡＦ２を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．７３および１．７５〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
７６）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＵＳＰ９Ｙを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．７４および１．７６〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
７７）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＦＡＭ２６Ｆを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．７５および１．７７〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
７８）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＦＬＪ３１４３８を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．７６および１．７８〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
７９）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＳＨＲＯＯＭ３を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．７７および１．７９〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
８０）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＴＮＦＡＩＰ３を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．７８および１．８０〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
８１）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＨＬＡ−Ｆを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．７９および１．８１〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
８２）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＣＤ３Ｄを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．８０および１．８２〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
８３）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＭＡＰ１Ｂを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．８１および１．８３〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
８４）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＳＲＰＸ２を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．８２および１．８４〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
８５）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＡＡＤＡＴを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．８３および１．８５〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
８６）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＡＲＨＧＡＰ１５を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．８４および１．８６〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
８７）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＭＣＭ１０を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．８５および１．８７〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
８８）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＴＣ２Ｎを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．８６および１．８８〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
８９）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＡＰ２Ｂ１を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．８７および１．８９〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
９０）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＧＯＬＧＡ７を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．８８および１．９０〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
９１）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＴＮＦＲＳＦ９を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．８９および１．９１〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
９２）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＲＮＦ１４４Ｂを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．９０および１．９２〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
９３）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子はプローブセット２０９６７１_ｘ_ａｔにより同定されるものであり、任意で表１で同定される１．１〜１．９１および１．９３〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
９４）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＵＢＡＳＨ３Ｂを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．９２および１．９４〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
９５）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＢＴＮ３Ａ１を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．９３および１．９５〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
９６）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＧＣＨ１を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．９４および１．９６〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
９７）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＤＥＮＮＤ２Ｄを有し、任意で表１で同定される１．１〜１．９５および１．９７〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
９８）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号Ｃ４ｏｒｆ７を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．９６および１．９８〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
９９）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＴＮＦＡＩＰ３を有し、任意で表１で同定される１．１〜１．９７および１．９９〜１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
１００）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＧＢＰ５を有し、任意で表１で同定される１．１００として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
１０１）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＧＢＰ１を有し、任意で１．１〜１．９９として標識される遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
１つ以上の態様では、本発明は、下記パラグラフ１〜１０１のいずれか１つに記載される実施形態を提供する。パラグラフ３〜１０１における「遺伝子」という表現は、パラグラフ２〜１００のいずれか１つに言及する場合、パラグラフ２〜１００で言及した特定の遺伝子を置換することを意図せず、それに追加することを意図する。
１）よって、本発明は表１からの１つ以上の遺伝子を使用し得る。
２）別の態様では、本発明はパラグラフ１に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＳＴＡＴ１を有し、任意で表１で同定される１．２〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
３）別の態様では、本発明はパラグラフ１または２に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＰＳＭＢ９を有し、任意で表１で同定される１．３〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
４）別の態様では、本発明はパラグラフ１−３に従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＪＡＫ２を有し、任意で表１で同定される１．４〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
５）別の態様では、本発明はパラグラフ１−４のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＩＴＧＡ３を有し、任意で表１で同定される１．５〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
６）別の態様では、本発明はパラグラフ１−５のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＰＳＭＢ１０を有し、任意で表１で同定される１．６〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
７）別の態様では、本発明はパラグラフ１−６のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＣＸＣＬ９を有し、任意で表１で同定される１．７〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
８）別の態様では、本発明はパラグラフ１−７のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＲＡＲＲＥＳ３を有し、任意で表１で同定される１．８〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
９）別の態様では、本発明はパラグラフ１−８のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＩＬ２ＲＧを有し、任意で表１で同定される１．９〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
１０）別の態様では、本発明はパラグラフ１−９のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＣＸＣＬ１０を有し、任意で表１で同定される１．１０〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
１１）別の態様では、本発明はパラグラフ１−１０のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＣＤ８Ａを有し、任意で表１で同定される１．１１〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
１２）別の態様では、本発明はパラグラフ１−１１のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＵＢＤを有し、任意で表１で同定される１．１２〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
１３）別の態様では、本発明はパラグラフ１−１２のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＧＰＲ１７１を有し、任意で表１で同定される１．１３〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
１４）別の態様では、本発明はパラグラフ１−１３のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＫＬＲＤ１を有し、任意で表１で同定される１．１４〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
１５）別の態様では、本発明はパラグラフ１−１４のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＨＬＡ−Ｂを有し、任意で表１で同定される１．１５〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
１６）別の態様では、本発明はパラグラフ１−１５のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＬＣＰ１を有し、任意で表１で同定される１．１６〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
１７）別の態様では、本発明はパラグラフ１−１６のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＨＬＡ−ＤＲＡを有し、任意で表１で同定される１．１７〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
１８）別の態様では、本発明はパラグラフ１−１７のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＣＹＴＩＰを有し、任意で表１で同定される１．１８〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
１９）別の態様では、本発明はパラグラフ１−１８のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＩＬ２３Ａを有し、任意で表１で同定される１．１９〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
２０）別の態様では、本発明はパラグラフ１−１９のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＴＲＡ＠を有し、任意で表１で同定される１．２０〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
２１）別の態様では、本発明はパラグラフ１−２０のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子はＨＬＡ−ＤＲＡを有し、任意で表１で同定される１．２１〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
２２）別の態様では、本発明はパラグラフ１−２１のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＴＡＲＰを有し、任意で表１で同定される１．２２〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
２３）別の態様では、本発明はパラグラフ１−２２のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＩＴＫを有し、任意で表１で同定される１．２３〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
２４）別の態様では、本発明はパラグラフ１−２３のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子はプローブセット２１１７９６_ｓ_ａｔにより同定されるものであり、任意で表１で同定される１．２４〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
２５）別の態様では、本発明はパラグラフ１−２４のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＨＬＡ−Ｂを有し、任意で表１で同定される１．２５〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
２６）別の態様では、本発明はパラグラフ１−２５のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＨＬＡ−ＤＱＡ１を有し、任意で表１で同定される１．２６〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
２７）別の態様では、本発明はパラグラフ１−２６のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＨＯＭＥＲ１を有し、任意で表１で同定される１．２７〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
２８）別の態様では、本発明はパラグラフ１−２７のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＴＲＧＣ２を有し、任意で表１で同定される１．２８〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
２９）別の態様では、本発明はパラグラフ１−２８のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子はプローブセット２１６９２０_ｓ_ａｔにより同定されるものであり、任意で表１で同定される１．２９〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
３０）別の態様では、本発明はパラグラフ１−２９のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＨＬＡ−Ａを有し、任意で表１で同定される１．３０〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
３１）別の態様では、本発明はパラグラフ１−３０のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＨＬＡ−ＤＭＡを有し、任意で表１で同定される１．３１〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
３２）別の態様では、本発明はパラグラフ１−３１のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＨＬＡ−Ｆを有し、任意で表１で同定される１．３２〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
３３）別の態様では、本発明はパラグラフ１−３２のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＳＬＡＭＦ７を有し、任意で表１で同定される１．３３〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
３４）別の態様では、本発明はパラグラフ１−３３のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＫＩＡＡ１５４９を有し、任意で表１で同定される１．３４〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
３５）別の態様では、本発明はパラグラフ１−３４のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＬＯＮＲＦ２を有し、任意で表１で同定される１．３５〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
３６）別の態様では、本発明はパラグラフ１−３５のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＦＡＭ２６Ｆを有し、任意で表１で同定される１．３６〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
３７）別の態様では、本発明はパラグラフ１−３６のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号Ｃ１ｏｒｆ１６２を有し、任意で表１で同定される１．３７〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
３８）別の態様では、本発明はパラグラフ１−３７のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＦＡＭ２６Ｆを有し、任意で表１で同定される１．３８〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
３９）別の態様では、本発明はパラグラフ１−３８のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＧＢＰ５を有し、任意で表１で同定される１．３９〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
４０）別の態様では、本発明はパラグラフ１−３９のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子はプローブセット２３２３７５_ａｔにより同定されるものであり、任意で表１で同定される１．４０〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
４１）別の態様では、本発明はパラグラフ１−４０のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＳＬＩＴＲＫ６を有し、任意で表１で同定される１．４１〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
４２）別の態様では、本発明はパラグラフ１−４１のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＧＢＰ４を有し、任意で表１で同定される１．４２〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
４３）別の態様では、本発明はパラグラフ１−４２のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＥＰＳＴＩ１を有し、任意で表１で同定される１．４３〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
４４）別の態様では、本発明はパラグラフ１−４３のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＡＫＲ１Ｃ２を有し、任意で表１で同定される１．４４〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
４５）別の態様では、本発明はパラグラフ１−４４のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＩＴＧＡＬを有し、任意で表１で同定される１．４５〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
４６）別の態様では、本発明はパラグラフ１−４５のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＣＤＣ４２ＳＥ２を有し、任意で表１で同定される１．４６〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
４７）別の態様では、本発明はパラグラフ１−４６のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＤＺＩＰ１を有し、任意で表１で同定される１．４７〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
４８）別の態様では、本発明はパラグラフ１−４７のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＰＴＧＥＲ４を有し、任意で表１で同定される１．４８〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
４９）別の態様では、本発明はパラグラフ１−４８のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＨＣＰ５を有し、任意で表１で同定される１．４９〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
５０）別の態様では、本発明はパラグラフ１−４９のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＵＴＹを有し、任意で表１で同定される１．５０〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
５１）別の態様では、本発明はパラグラフ１−５０のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＫＬＲＢ１を有し、任意で表１で同定される１．５１〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
５２）別の態様では、本発明はパラグラフ１−５１のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＦＡＭ２６Ｆを有し、任意で表１で同定される１．５２〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
５３）別の態様では、本発明はパラグラフ１−５２のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＨＩＬＳ１を有し、任意で表１で同定される１．５３〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
５４）別の態様では、本発明はパラグラフ１−５３のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号Ｃ２０ｏｒｆ２４を有し、任意で表１で同定される１．５４〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
５５）別の態様では、本発明はパラグラフ１−５４のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号Ｂ２Ｍを有し、任意で表１で同定される１．５５〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
５６）別の態様では、本発明はパラグラフ１−５５のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＺＮＦ２８５Ａを有し、任意で表１で同定される１．５６〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
５７）別の態様では、本発明はパラグラフ１−５６のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＴＭＥＭ５６を有し、任意で表１で同定される１．５７〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
５８）別の態様では、本発明はパラグラフ１−５７のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＩＲＦ１を有し、任意で表１で同定される１．５８〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
５９）別の態様では、本発明はパラグラフ１−５８のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＴＲＧＶ９を有し、任意で表１で同定される１．５９〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
６０）別の態様では、本発明はパラグラフ１−５９のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子はプローブセット２３８５２４_ａｔにより同定される記号ＮＡを有し、任意で表１で同定される１．６０〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
６１）別の態様では、本発明はパラグラフ１−６０のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＳＬＣ２６Ａ２を有し、任意で表１で同定される１．６１〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
６２）別の態様では、本発明はパラグラフ１−６１のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＣＸＣＬ２を有し、任意で表１で同定される１．６２〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
６３）別の態様では、本発明はパラグラフ１−６２のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＩＣＯＳを有し、任意で表１で同定される１．６３〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
６４）別の態様では、本発明はパラグラフ１−６３のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子はプローブセット２１３１９３_ｘ_ａｔにより同定されるものであり、任意で表１で同定される１．６４〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
６５）別の態様では、本発明はパラグラフ１−６４のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＣＣＬ５を有し、任意で表１で同定される１．６５〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
６６）別の態様では、本発明はパラグラフ１−６５のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＬＯＣ２８４７５７を有し、任意で表１で同定される１．６６〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
６７）別の態様では、本発明はパラグラフ１−６６のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＣＤ８６を有し、任意で表１で同定される１．６７〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
６８）別の態様では、本発明はパラグラフ１−６７のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＫＬＲＤ１を有し、任意で表１で同定される１．６８〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
６９）別の態様では、本発明はパラグラフ１−６８のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子はプローブセット２１１９０２_ｘ_ａｔにより同定されるものであり、任意で表１で同定される１．６９〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
７０）別の態様では、本発明はパラグラフ１−６９のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＳＬＡＭＦ６を有し、任意で表１で同定され１．７０〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
７１）別の態様では、本発明はパラグラフ１−７０のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＴＯＸを有し、任意で表１で同定される１．７１〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
７２）別の態様では、本発明はパラグラフ１−７１のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＧＺＭＫを有し、任意で表１で同定される１．７２〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
７３）別の態様では、本発明はパラグラフ１−７２のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＣＤＣ４２ＳＥ２を有し、任意で表１で同定される１．７３〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
７４）別の態様では、本発明はパラグラフ１−７３のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＰＰＰ１Ｒ１６Ｂを有し、任意で表１で同定される１．７４〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
７５）別の態様では、本発明はパラグラフ１−７４のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＥＡＦ２を有し、任意で表１で同定される１．７５〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
７６）別の態様では、本発明はパラグラフ１−７５のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＵＳＰ９Ｙを有し、任意で表１で同定される１．１．７６〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
７７）別の態様では、本発明はパラグラフ１−７６のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＦＡＭ２６Ｆを有し、任意で表１で同定される１．７７〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
７８）別の態様では、本発明はパラグラフ１−７７のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＦＬＪ３１４３８を有し、任意で表１で同定される１．７８〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
７９）別の態様では、本発明はパラグラフ１−７８のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＳＨＲＯＯＭ３を有し、任意で表１で同定される１．７９〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
８０）別の態様では、本発明はパラグラフ１−７９のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＴＮＦＡＩＰ３を有し、任意で表１で同定される１．８０〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
８１）別の態様では、本発明はパラグラフ１−８０のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＨＬＡ−Ｆを有し、任意で表１で同定される１．８１〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
８２）別の態様では、本発明はパラグラフ１−８１のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＣＤ３Ｄを有し、任意で表１で同定される１．８２〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
８３）別の態様では、本発明はパラグラフ１−８２のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＭＡＰ１Ｂを有し、任意で表１で同定される１．８３〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
８４）別の態様では、本発明はパラグラフ１−８３のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＳＲＰＸ２を有し、任意で表１で同定される１．８４〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
８５）別の態様では、本発明はパラグラフ１−８４のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＡＡＤＡＴを有し、任意で表１で同定される１．８５〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
８６）別の態様では、本発明はパラグラフ１−８５のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＡＲＨＧＡＰ１５を有し、任意で表１で同定される１．８６〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
８７）別の態様では、本発明はパラグラフ１−８６のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＭＣＭ１０を有し、任意で表１で同定される１．８７〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
８８）別の態様では、本発明はパラグラフ１−８７のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＴＣ２Ｎを有し、任意で表１で同定される１．８８〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
８９）別の態様では、本発明はパラグラフ１−８８のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＡＰ２Ｂ１を有し、任意で表１で同定される１．８９〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
９０）別の態様では、本発明はパラグラフ１−８９のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＧＯＬＧＡ７を有し、任意で表１で同定される１．９０〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
９１）別の態様では、本発明はパラグラフ１−９０のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＴＮＦＲＳＦ９を有し、任意で表１で同定される１．９１〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
９２）別の態様では、本発明はパラグラフ１−９１のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＲＮＦ１４４Ｂを有し、任意で表１で同定される１．９２〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
９３）別の態様では、本発明はパラグラフ１−９２のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子はプローブセット２０９６７１_ｘ_ａｔにより同定されるものであり、任意で表１で同定される１．９３〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
９４）別の態様では、本発明はパラグラフ１−９３のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＵＢＡＳＨ３Ｂを有し、任意で表１で同定される１．９４〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
９５）別の態様では、本発明はパラグラフ１−９４のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＢＴＮ３Ａ１を有し、任意で表１で同定される１．９５〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
９６）別の態様では、本発明はパラグラフ１−９５のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＧＣＨ１を有し、任意で表１で同定される１．９６〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
９７）別の態様では、本発明はパラグラフ１−９６のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＤＥＮＮＤ２Ｄを有し、任意で表１で同定される１．９７〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
９８）別の態様では、本発明はパラグラフ１−９７のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号Ｃ４ｏｒｆ７を有し、任意で表１で同定される１．９８〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
９９）別の態様では、本発明はパラグラフ１−９８のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＴＮＦＡＩＰ３を有し、任意で表１で同定される１．９９〜１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
１００）別の態様では、本発明はパラグラフ１−９９のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＧＢＰ５を有し、任意で表１で同定される１．１００として標識される１つ以上の遺伝子と組み合わされる。
１０１）別の態様では、本発明はパラグラフ１〜１００のいずれか１つに従い１つ以上の遺伝子を使用し、ここで、遺伝子は記号ＧＢＰ１を有する。
（実施例）
実施例１
ＭＡＧＥ００８ Ｍａｇｅメラノーマ臨床試験：
この進行中の治験では、ｒｅｃＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質（組換えｍａｇｅ融合タンパク質）は、２つの異なる免疫アジュバントと組み合わされる：ＡＳ０２Ｂ（ＱＳ２１、ＭＰＬ）またはＳ１５（ＱＳ２１、ＭＰＬおよびＣｐＧ７９０９）のいずれか。目的は、安全性プロファイル、臨床応答および免疫応答の観点からアジュバントを区別することであった。
この実験では、２つのアジュバント組成物は２つの免疫賦活剤の混合物で構成されている：
１．ＱＳ２１（南アメリカの樹木キラヤサポナリアモリーナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）由来の精製された天然サポニン分子）、および
２．ＭＰＬ（３デ−Ｏ−アセチル化モノホスホリルリピドＡ−Ｓ．ミネソタ（ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）ＬＰＳ由来の、リピドＡの解毒誘導体）。
ＡＳ０２Ｂは、ＱＳ２１およびＭＰＬの水中油型エマルジョンである。
動物モデルでは、これらのアジュバントは、体液性およびＴＨ１型の細胞性免疫応答の両方、例えばＩＦＮαを産生するＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞を誘導することがうまく示されている。（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ.、１９９９； Ｇeｒａｒｄ ｅｔ ａｌ.、２００１）。さらに、この型のアジュバント中で製剤化された組換えタンパク質の注入により、全身性抗腫瘍応答の誘導に至り：実際、ワクチン接種された動物は、腫瘍抗原を発現するように遺伝子操作されたマウス腫瘍細胞による攻撃に対し保護されることが示され、退行性腫瘍は、ＣＤ８、ＣＤ４およびＮＫ細胞により、およびマクロファージにより高度に浸潤されることが示された。
第２のアジュバント系はＡＳ１５であり：それは第３の免疫賦活剤、すなわちＣｐＧ７９０９（別名ＣｐＧ２００６上記として知られている）を、ＭＰＬおよびＱＳ２１の他にリポソーム製剤中に含む。動物モデル（主にマウス）では、ＣｐＧ７９０９の追加はさらに、誘導される免疫および抗腫瘍応答を改善することが示されている（Ｋｒｉｅｇ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ、２００１； Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ.、２００４）。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は直接、ＴＬＲ９トリガーにより樹状細胞活性化を刺激する。さらに、マウスでは、ＣｐＧ７９０９の全身適用は移入されたＴ細胞の腫瘍中への浸潤を著しく増加させる（Ｍｅｉｄｅｎｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ., ２００４）。
研究概観
１．設計
ＭＡＧＥ００８治験は、下記の通りである：
オープン
無作為
２群（ＡＳ０２Ｂ対ＡＳ１５）
総計６８の患者。
上記のように、ｒｅｃＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質は、ＡＳ０２ＢまたはＡＳ１５アジュバント系のいずれかと組み合わされる。
２．患者集団
ｒｅｃＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質は、局所または遠隔皮膚および／またはリンパ節病変（切除不能ステージＩＩＩおよびステージＩＶ Ｍ１ａ）を有する進行性転移性メラノーマの患者に投与される。腫瘍によるＭＡＧＥ−Ａ３遺伝子の発現は、定量ＰＣＲにより評価した。選択された患者は、メラノーマに対する前処置を受けず（ｒｅｃＭＡＧＥ−Ａ３が一次治療として与えられる）、内臓疾患を有さなかった。
３．免疫化スケジュール
治療スケジュールの方法
ＭＡＧＥ００８臨床試験において従った免疫化スケジュールは下記とした：
Figure 2013505008
上記治療計画の両方に対し、追加のワクチン接種が要求に応じ治療後に与えられ得る。
上記臨床試験において可能性のある参加者をスクリーニングするために、我々は免疫化の前に腫瘍の生検を受理した。ＲＮＡを、ＭＡＧＥ−Ａ３定量ＰＣＲのために生検から抽出し、このＲＮＡはまた、マイクロアレイによる遺伝子発現プロファイリングのために使用した。目標は、ワクチン接種前生検において臨床応答と関連する遺伝子セットを同定し、患者の臨床成績を予測する数学的モデルを開発することであり、そのためこの抗原特異的癌免疫療法薬から利益を得る可能性のある患者が、適正に同定され、選択される。遺伝子プロファイリング分析は、マイクロアレイ分析に対するインフォームドコンセントに署名した患者由来の生検に対してのみ実施した。
１．材料および方法
１．１．腫瘍標本およびＲＮＡ精製
６５の患者由来のワクチン接種前に得られた６５の腫瘍生検を、Ｍａｇｅ００８ Ｍａｇｅ−３メラノーマ臨床試験から使用した。これらはＲＮＡ安定化溶液ＲＮＡｌａｔｅｒ中で新鮮凍結保存した。
全ＲＮＡをＴｒｉｐｕｒｅ方法（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ. Ｎｏ. １ ６６７ １６５）を使用して精製した。提案されたプロトコルに続いて、ＤＮＡｓｅ処置を有するＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット−浄化プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ Ｃａｔ. Ｎｏ. ７４１０６）を使用した。メラニン量が高い（外観検査により決定）サンプルからのＲＮＡをさらに、ＣｓＣｌ遠心分離を用いて処理した。
ＲＮＡの定量は、２６０ｎｍでの光学密度およびＱｕａｎｔ−ＩＴ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−分子プローブＲ１１４９０）を用いて最初に完了した。
１．２．マイクロアレイ分析のためのＲＮＡラベリングおよび増幅
臨床研究中に受理された生検サイズが小さいために、増幅方法を、マイクロアレイ分析のためにＲＮＡのラベリングと共に使用した：Ｎｕｇｅｎ ３’ ｏｖａｔｉｏｎビオチンキット（５０ｎｇのＲＮＡのラベリング−ＯｖａｔｉｏｎビオチンシステムＣａｔ；２３００−１２、２３００−６０）。５０ｎｇの全ＲＮＡの開始入力を使用した。
１．３．マイクロアレイチップ、ハイブリダイゼーションおよびスキャニング
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＨＧ−Ｕ１３３．Ｐｌｕｓ ２．０遺伝子チップを標準Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルに従い、ハイブリダイズさせ、洗浄し、スキャンした。
１．１．１遺伝子サイン分析のために使用される患者の定義
バイナリ分類アプローチを使用して、患者を遺伝子サイン（ＧＳ）陽性（ＧＳ＋）またはＧＳ陰性（ＧＳ−）群に割り当てた。トレーニングセットは遺伝子サイン分析に対するインフォームドコンセントを与え、良質のマイクロアレイデータおよび少なくとも６回のワクチン接種を有する５６の評価可能患者から構成した。
この遺伝子サイン分析のために、レスポンダー（Ｒ）は、臨床活性の客観的徴候を提示する患者として規定し、これらは下記を含んだ；客観的応答（完全応答（ＣＲ）、部分応答（ＰＲ）、不変（ＳＤ）、混合応答（ＭＲ）。ノンレスポンダー（ＮＲ）は、進行性疾患（ＰＤ）として規定した。
少なくとも６回のワクチン接種を有する評価可能患者のみを遺伝子プロファイル分析のために使用したが、これが大体免疫応答が検出された時であるからである。
遺伝子プロファイル分析に対するレスポンダー（Ｒ）は、生物学的活性の徴候を示す患者であり、これらは下記を含む：完全および部分レスポンダー（ＣＲ、ＰＲ）、不変（ＳＤ）、混合応答１（ＭｘＲ１）を有する進行性疾患（ＰＤ）および少なくとも１つの標的病変の消失を有するＰＤ ＭｘＲ２。
ノンレスポンダー（ＮＲ）：ＰＤ Ｎｏ ＭｘＲ、少なくとも１つの標的病変の消失を示さなかったＰＤ ＭｘＲ２および進行性疾患Ｎｏ ＭｘＲ。
この臨床研究における２群でのトレーニングセット分布（２つの免疫アジュバントを比較する）は、２２Ｒ（ＡＳ１５群で１４およびＡＳ０２Ｂ群で８）および３４ＮＲ（１３ＡＳ１５、２１ＡＳ０２Ｂ）から構成された。
サンプル正規化
ＲＮＡの増幅およびラベリング後、ＨＧ−Ｕ１３３ ｐｌｕｓ２ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐへのハイブリダイゼーションを実施した。スキャニング後に得られたＣＥＬファイルをＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒからのｇｃｒｍａパッケージにおけるＧＣＲＭＡアルゴリズム（Ｗｕ, ２００４）の修正版を用い、すべての患者を使用し、良質マイクロアレイデータ（換算係数およびｇｃｒｍａ正規化に基づく）を用いて正規化した。アルゴリズムは、このアレイセットを用いて得られた前処理パラメータを保存するように適合させた。パラメータは２つの型を有する：分位点正規化に必要な平均経験分布、およびプローブセット（ＰＳ）要約を実施するためのプローブ特異的効果。これらのパラメータを、６５サンプルから得、トレーニングセット中の５６サンプルに適用し、各プローブセットに対する要約値を得た。
１．４．非存在/存在および非特異的フィルタリング
正規化のために使用された６５サンプル全てにおいて非存在と呼ばれたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセット（ＰＳ）を、ＰＡＮＰプログラム（１．８．０ソフトウエアバージョン）のＲ実行を用いて除去した。これにより、データセットが５４，６１３から約２８，１００ＰＳまで減少する。
正規化ハイブリダイゼーションサンプルの四分位範囲（ＩＱＲ）フィルタリングプローブセット（ＰＳ）を、各サンプルに関連する結果とは関係なくフィルタリングさせる。この非特異的フィルタリングの目的は、ほとんど識別力をしない傾向があるので（Ｈｅｉｄｅｂｒｅｃｋ ｅｔ ａｌ., ２００４）、サンプル全体にわたって大体一定の発現を示す遺伝子を取り除くことである。
トレーニングセット（５６サンプル）の発現マトリクスにおいて１．７以上の四分位範囲を有するＰＳのみを保持する四分位フィルタを実行した。この工程により、ＰＳサイズが２８，１００から約５０４５に減少した。
特徴正規化
要約およびフィルタリングしたＰＳをその後、Ｚ−スコア計算を用いて正規化した。各それそれの患者発現ＰＳ値に対するＺ−スコアは、下記のように計算する：ＰＳ特異的平均をＰＳ値から減算し、この平均中心発現値をその後、ＰＳ特異的標準偏差により加重させる。Ｚ−スコア計算に関与するＰＳ特異的平均および標準偏差は、トレーニングセットから計算されたものである。
特徴選択
臨床成績患者データの分類において特徴として使用される関連ＰＳの選択は、信号対ノイズ比にあり、トレーニングセットにおける５６サンプルに対する正規化、Ｚ−スコア発現マトリクスを用いて得られる：
Figure 2013505008
最も高い絶対信号対ノイズ比スコアを有する１００ＰＳを分類指標特徴（表１）として選択した。この数は、適切であると評価した。というのも、別の技術（すなわちＱ−ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて測定するのに実行可能な遺伝子数であるからである。
遺伝子選択の上記方法を、次のセクションで記載される交差検定により試験した。
分類方法のリーブワンアウトクロスバリデーション（ＬＯＯＣＶ）
方法の性能の推定値を得、分類指標のための適切なカットオフを得るために；分類スキームを開発し、リーブワンアウトによる交差検定を使用し、各交差検定ループでのレポーターリストの再計算を用いて試験した。
最初に、四分位範囲（ＩＱＲ）が１．７未満である（〜５０００ＰＳが、各交差検定に残っている）プローブセット（ＰＳ）を廃棄する非特異的フィルタを適用した。その後、Ｚ−スコア正規化を、各トレーニングセット内で実施し、テストサンプルに適用した。Ｇｏｌｕｂら（Ｇｏｌｕｂ, １９９９）により記載されるように信号対ノイズ比（ｓ２ｎ）を用いて遺伝子をランク付けし、最良の１００ＰＳ（絶対ｓ２ｎスコア）を分類指標特徴として選択した。
目的変数ありの主成分−判別分析（ＳＰＣＡ）に基づく分類アルゴリズムを、選択されたＰＳを用いて構築した（Ｂａｉｒ ａｎｄ Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ、ＰＬＯＳ Ｂｉｏｌ ２００４ ａｎｄ Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ ｅｔ ａｌ.、ＰＮＡＳ ２００２）。分類指標は、分類指標特徴として選択されたＰＳのみを用いたトレーニングセットの発現マトリクスの特異値分解に基づく。第１の主成分（ＰＣ１）におけるトレーニングセットの各群（ＲおよびＮＲ）の平均および標準偏差を計算する。テストサンプルを分類するために、そのＺ−スコア発現値をトレインセットにより規定されるＰＣ１に与え、ＰＣ１における各群の平均までの距離を使用して、サンプルがレスポンダーまたはノンレスポンダー群に属する確率を計算する。分類指標結果は、サンプルがレスポンダー（ＧＳ＋）である確率である指標であり、０〜１の範囲である。
図１／２１は、ＬＯＯＣＶのためのスキームを示す。
図２／２１は、各ループにおける分類のための最良の１００ＰＳを選択するＬＯＯＣＶの結果を示す。
感度（Ｓｅ）および特異性（Ｓｐ）を性能指標として使用した。Ｓｅは、レスポンダーとして予測されるサンプル中の真陽性（ＴＰ）の割合として規定され、Ｓｐはノンレスポンダーとして予測される患者中の真陰性（ＴＮ）の割合として規定される。
０．４１と０．４７の間のいずれの値も同じ感度および特異性を有することが図２／２１から見ることができる。０．４３のカットオフをとることを決定した。このカットオフは、３２／５６サンプルをレスポンダー（Ｒ）として分類し、感度は１７／２２（０．７７）であり、特異性は１９／３４（０．５６）である。特に、ＡＳ１５群では感度および特異性のみがより高く、；それぞれ、０．７９および０．６９である。重要なことには、すべての客観的レスポンダー（ＣＲおよびＰＲ）は正確に分類される。
ＬＯＯＣＶにより構築された５６分類指標の各々における選択された特徴の安定性を、すべてのサンプルを使用して選択した特徴と比較した。
表１Ａ．すべてのサンプルを使用して選択された１００ＰＳおよびＬＯＯＣＶにおいて選択された回数
Figure 2013505008
Figure 2013505008
Figure 2013505008
図３／２１は、各ＬＯＯＣＶにおいてＰＳが１００トップｓ２ｎ内にあった度数を示す。全てのサンプルを用いて選択されたＰＳは黒色で示される。全てのサンプルを用いて選択された１００ＰＳのうちの６８はまた、ＬＯＯＣＶの少なくとも５０で選択され、全てのサンプルを用いて選択された１００ＰＳのリストは、独立した患者の応答を予測するのに使用される分類指標特徴となるであろう（表１）。
全生存（ＯＳ）に対する遺伝子サインの影響
Ｃｏｘ回帰では、ハザードは、イベント（死、疾患進行）が期間中に起こる確率を表す。ベースラインハザードは、全てのサンプルにより共有されると仮定され、ハザードに効果を有する説明変数である共変量が、モデルに追加される。ハザード比は共変量がハザードに対して有する効果を定量化する。これは変数の相対リスクを反映する。
例えば、下記表２におけるように０．４のハザード比を有する治療は、遺伝子サイン陽性患者が、遺伝子サイン陰性患者に比べ、ある期間あたり６０％の減少した死のリスクを有することを意味する。０．４は、予測されるＨＲの平均であり、９５％の信頼区間もまた、モデルにおいて推定されることに注意されたい。
図４／２１は、第ＩＩ相メラノーマ治験において、全ての患者を用いてアジュバントによるＯＳに対するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線（ＫＭ）を示す；ハザード比（ＨＲ）：０．５５（９５％ＣＩ［０．２８；１．０６］）。トレーニングセット中の５６患者のみを使用する場合の推定ハザード比は０．４１（９５％ ＣＩ［０．１９１；０．８８］）である。全生存（ＯＳ）に対するＧＳの影響を推定するために、ＬＯＯＣＶにより０．４３のカットオフを用いて得られた分類を使用した（セクション１．４）；図５／２１のグラフはＧＳによるＯＳに対するＫＭを示す。
多変量Ｃｏｘ−モデルを、共変量としてアジュバントおよびＧＳを用いてフィッティングすると、ＧＳに対し下記ＨＲが得られる：
Figure 2013505008
ＧＳによる推定生存期間中央値は下記である：
Figure 2013505008
ＬＯＯＣＶ分類に基づくアジュバントおよび遺伝子サインによる全生存Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を図６／２１に示し、ＨＲは下記の通りである。
Figure 2013505008
上記のように、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＡＳＣＩに対する臨床応答を予測するためのある遺伝子発現プロファイルに基づく分類指標が開発され、第ＩＩ相メラノーマ治験（ＧＳＫ２４９５５３／００８）において交差検定された。分類指標性能は、ＬＯＯＣＶを用いて推定され、０．７７の感度および０．５６の特異性が得られた。ＡＳ１５群のみでの特異性は０．７９であり、感度は０．６９である。この分類により、ＧＳ＋集団における全生存に対するハザード比が著しく減少し、ＡＳ１５群ではより重要な効果が得られた。
分類指標特徴選択の安定性もまた評価し、トレーニングセット中の１つのサンプルを取り除くことに対しロバストであることが見いだされた。ＭＡＧＥ−Ａ３−ＡＳＣＩの臨床効果に連結されたサインの生物学（ｓ２ｎによる、トレーニングセットにおける全ての５６患者を用いたトップ１００ＰＳ；表１）は、ＡＳＣＩ作用様式に関連し、というのも、これは、Ｔ細胞マーカーの上方制御を示すレスポンダー患者の腫瘍における免疫エフェクター細胞の存在に有利である特異的腫瘍微小環境（ケモカイン）の存在を示唆する遺伝子を含むからである。転移性メラノーマにおける最近の遺伝子発現プロファイリング研究は、腫瘍は、Ｔ細胞関連転写物の存在の有無に基づき分離され得ることを明らかにした（Ｈａｒｌｉｎ, ２００９）。腫瘍中のリンパ球の存在は６つのケモカインのサブセット（ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０）の発現と相関し、これらの６つの遺伝子のうちの３つ（ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０）が１００ＰＳに存在する。興味深いことに、ＨＬＡ分子もまた、レスポンダー患者において上方制御されることが見いだされた。腫瘍細胞におけるＨＬＡ分子の下方制御は、免疫監視を逃れる機構であることが仮定されている（Ａｐｔｓｉａｕｒｉ, ２００８）。
インジェヌイティパスウェイアナリシス（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ）からのトップの生物学的機能は、１００ＰＳサイン中での免疫関連遺伝子の濃縮を確認した（ｐ−値は、補助機能に対して得られた範囲である）：
Figure 2013505008
４．新規サンプルの臨床成績予測
臨床成績予測を実施するためにここで記載する工程は、Ｒスクリプトとして書かれている。ある患者に対して臨床成績予測を実施する前に、患者Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘジーンチップデータの２つの連続正規化に取り組む；サンプルおよび遺伝子正規化。これらの正規化の目標は、予測スキームが開発されたトレーニングセットデータに正確にスケーリングすることにより、匹敵する患者に対し遺伝子発現値を生成させることである。トレーニングセットは、第ＩＩ相メラノーマ治験からの５６サンプルから構成される。トレーニングセットおよびサンプル正規化に関する詳細は、前のセクションに記載されており、下記パラグラフでより詳細に記載される。
４．１サンプル正規化
前処理としても知られているサンプル正規化は、各サンプルに対するＣＥＬファイルをはじめとして実施され、下記態様を処理する：
１．バックグラウンド生Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘオリゴヌクレオチドプローブ強度に対して較正すること；
２．バックグラウンド較正されたプローブ強度を、分位点正規化手順を用いて正規化すること。
３．チップ定義ファイル（ＣＤＦ）において規定されるプローブ−ＰＳマッピングに従い、プローブ強度を単一プローブセット強度に変換すること。ＣＤＦファイルは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘにより使用され、提供されるジーンチップアレイ（ｈｇｕ１３３ｐｌｕｓ２）に特異的である。この最後の工程は要約と呼ばれる。
この工程の目標は、未知の患者データのプローブセット（ＰＳ）強度の分布を、トレーニングセットのＰＳ強度分布に対しフィッティングさせることである。これは、ＧＣＲＭＡアルゴリズム（Ｗｕ, ２００４）を用いて実施される。このアルゴリズムは、参照マイクロアレイデータセット上で規定される前処理パラメータを説明するように適合させた。パラメータは２つの型を有する：分位点正規化に必要な平均経験分布、およびＰＳ要約を実施するためのプローブ特異的効果。
参照ＧＣＲＭＡパラメータは、第ＩＩ相メラノーマ治験からの６５サンプルを用いて構築し、これらを新規患者サンプルに、ｒｅｆｐｌｕｓ Ｒパッケージに基づくコードを用いて適用する。
付属書類１コードチャンクは、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒにおいて入手されるＲｅｆＰｌｕｓ Ｒパッケージ（Ｈａｒｂｒｏｎ ｅｔ ａｌ., ２００７）に含まれるコードの修正である。ＲｅｆＰｌｕｓコードは、参照データセットから計算された正規化パラメータを考慮して、あるサンプルハイブリダイゼーションのＧＣＲＭＡ正規化を実施するように修正される。参照データセットは前のセクションで記載されるデータセットである（６５患者）。ＲｅｆＰｌｕｓは最初に、参照データセット正規化のために設計されるが、ＧＣＲＭＡではなくＲＭＡアルゴリズムを使用する。ＲＭＡとＧＣＲＭＡの間の唯一の差異は、バックグラウンド較正工程にある。ＲｅｆＰｌｕｓは、ｒｍａｐｌｕｓ Ｒ関数に埋め込まれたｂｇ．ｃｏｒｒｅｃｔ．ｒｍａ Ｒ関数を、ｂｇ．ａｄｊｕｓｔ．ｇｃｒｍａ Ｒ関数により置き換えることにより、ＧＣＲＭＡバックグラウンド較正を実施することができた。ＲｅｆＰｌｕｓコード修正は、２００７年１０月に実施され、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅから入手可能である。サンプルを付属書類１のＧＣＲＭＡ対応の修正ＲｅｆＰｌｕｓコードを用いて正規化するために、パラメータとして、正規化するデータ（ＡｆｆｙＢａｔｃｈクラスの）、参照データセットについて計算されている参照分位点（ｒ．ｑオプション）およびプローブ効果（ｐ．ｅオプション）に加えて、ＧＣＲＭＡバックグラウンド較正対応ｒｍａｐｌｕｓ関数を呼び出さなければならない。参照分位点およびプローブ効果は、ＧＳＫから入手可能で、ＵＳＰＴＯに、上記で参照されるコンパクトディスク上で提出される、ｒｑ．ｔｘｔおよびｐｅ．ｔｘｔファイルに含まれる。
サンプルを付属書類１のＧＣＲＭＡ対応、修正ＲｅｆＰｌｕｓコードを用いて正規化するために（図５）、パラメータとして、正規化するデータ（ＡｆｆｙＢａｔｃｈクラスの）、参照データセットについて計算されている参照分位点（ｒ．ｑオプション）およびプローブ効果（ｐ．ｅオプション）に加えて、ＧＣＲＭＡバックグラウンド較正対応ｒｍａｐｌｕｓ関数を呼び出さなければならない。参照分位点およびプローブ効果は、ＧＳＫの企業知的財産の長から入手可能で、それぞれＶＲ６３９３３Ｐ_ｒｑ．ｔｘｔおよびＶＲ６３９３３Ｐ_ｐｅ．ｔｘｔと名付けられた、ｒｑ．ｔｘｔおよびｐｅ．ｔｘｔファイルに含まれる。これらのファイルはまた、２００９年１０月６日に出願された米国優先出願番号第６１／２７８３８７号に関してコンパクトディスク上でＵＳＰＴＯに提出され、米国出願番号第６１／２７８３８７号のファイル履歴をＵＳＰＴＯから、入手可能な時に注文することにより入手可能である。
その一方で、これらのファイルはまた、ｈｔｔｐｓ：／／ｓｉｔｅｓ．ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ｖｒ６３９３３／ｖｒ６３９３３ｒ_ｆｉｌｅｓでｚｉｐファイルとして入手可能である（ｈｔｔｐｓアドレス中、文字「ｒ」と単語「ｆｉｌｅｓ」の間に「_」があることに注意されたい）。ウェブサイト上のファイルはそれぞれ、ＶＲ６３９３３Ｐ_ｒｑ．ｚｉｐおよびＶＲ６３９３３Ｐ_ｐｅ．ｚｉｐと名付けられる。これらの２つのファイルのコピーを入手するために、このパラグラフにおいて提供されるアドレスにナビゲートし、各ファイルに対し、ハイパーテキスト「Ｄｏｗｎｌｏａｄ」を選択すること。プロンプトで「Ｓａｖｅ」オプションを選択し、所望の場所に保存すること。普通にｚｉｐファイルを開くようにファイルを開き、ＡＳＣＩＩ（．ｔｘｔ）ファイルとして所望の場所に保存すること。その後、本出願の最初の２つのパラグラフの指示に従うこと。
要約されたプローブセット（ＰＳ）を、その後、Ｚ−スコア計算を用いて正規化し；これは分類指標特徴として選択されたＰＳに適用する。この第２の正規化工程の目標はデータを通して同様の発現パターンを共有するが、異なる絶対発現値範囲を有する遺伝子を同一とすることである。
各個々の患者発現ＰＳ値に対するＺ−スコアを下記の通り計算する：ＰＳ特異的平均をＰＳ値から減算し、この平均中心発現値をその後、ＰＳ特異的標準偏差により加重する。Ｚ−スコア計算に関与するＰＳ特異的平均および標準偏差は、トレーニングセットから計算されたものである（表４）。
患者生データをトレーニングセットパラメータを用いて正規化させた時点で、患者に対する臨床成績の予測のための決定規則（分類指標または分類スキーム）に供することができる。
４．２ 新規サンプルの分類のためのアルゴリズム
正規化された患者ＰＳに基づき患者臨床成績を予測するために、目的変数ありの主成分（ＳＰＣＡ）−判別分析（ＤＡ）決定規則を、適用する（Ｂａｉｒ、２００４； Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ、２００２から適合）。ＳＰＣＡ−ＤＡワークを呼び出す予測プロセスは下記のように機能する：
分類のために使用されるプローブセットは、分類指標特徴（１００ＰＳ）のみであり、トレーニングセットに基づくモデル開発中に同定された（表１）
分類する患者の正規化された発現プロファイル（分類指標特徴）は、分類指標特徴の線形結合を用いて、トレーニングセットにより規定された第１の主成分（ＰＣ１）空間において提示される（線形結合における各特徴に対する係数は、トレーニングセットの特異値分解により得られ、それらは表４で提供される）
ＰＣ１におけるテストサンプルのレスポンダーおよびノンレスポンダー群の平均までの標準化距離は、下記式を用いて得られる：
Figure 2013505008
ｉ＝テストサンプル
Ｋ＝レスポンダー（Ｒ）またはノンレスポンダー（ＮＲ）
平均_ＰＣ１Ｋ＝トレーニングセットにおけるＲまたはＮＲ群のＰＣ１平均
ｓｄ_ＰＣ１Ｋ＝トレーニングセットにおけるＲまたはＮＲ群のＰＣ１標準偏差
トレーニングセット中の各群の平均およびｓｄ(有効３桁まで四捨五入)は下記の通りである:
Figure 2013505008
各サンプルに対する指標(サンプルがレスポンダーである確率)は下記を用いて得られる:
Figure 2013505008
ＰＲが０．４３より大きい場合、サンプルは遺伝子サイン陽性（レスポンダー，Ｒ）として分類される
方法を例示する目的でこの分類指標をトレーニングセットに適用すると、図７／２１が生成する。
新規サンプルを予測するためのアルゴリズム

ライブラリ(ジーンフィルタ)

#### 分類するためにtestsetをロード (正規化 マイクロアレイ データ)

ロード("testset.RData") ### 分類するためのサンプルを含むExpressionSet



testset<-data ###(バッチ番号に従いxx を修正)


### トレーニングセットパラメータをロード ##############

ロード("M8.train.parameters.RData")

PS<-M8.train.parameters[[1]]

M8.train.means<-M8.train.parameters[[2]]

M8.train.sd<-M8.train.parameters[[3]]

M8.train.U<-M8.train.parameters[[4]]

M8.trainPC1barRs<-M8.train.parameters[[5]]

M8.trainPC1sdRs<-M8.train.parameters[[6]]

M8.trainPC1barNRs<-M8.train.parameters[[7]]

M8.trainPC1sdNRs<-M8.train.parameters[[8]]


################################## テストセット上でのSPCAの使用 - #######################
testset<-testset[PS,]

test<-(exprs(testset)-M8.train.means)/M8.train.sd

PCtest<-t(test) %*% M8.train.U

PC1test<-PCtest[,1]

distanceR<-c()
distanceNR<-c()
probR<-c()
probNR<-c()
SPCAclass<-c()

for (i in 1:ncol(test)) {
distancesR<-abs(PCtest[i,1]-M8.trainPC1barRs)/M8.trainPC1sdRs

distancesNR<-abs(PCtest[i,1]-M8.trainPC1barNRs)/M8.trainPC1sdNRs

distanceR<-c(distanceR,distancesR)
distanceNR<-c(distanceNR,distancesNR)

probRs<-exp(-distancesR/2)/(exp(-distancesR/2)+exp(-distancesNR/2))

probNRs<-exp(-distancesNR/2)/(exp(-distancesR/2)+exp(-distancesNR/2))

probR<-c(probR,probRs)
probNR<-c(probNR,probNRs)

}


cutoff=0.43
clust<-ifelse(as.vector(probR)>cutoff, R,NR))

ここで、
ｔｅｓｔｓｅｔは、１００ＰＳに対する正規化マイクロアレイデータを含む１００行を有するマトリクスである。
Ｍ８．ｔｒａｉｎ．ｐａｒａｍｅｔｅｒｓは、下記を含むクラスリストのオブジェクトである：
１．１００ＰＳの文字リスト
２．トレインセット中の各ＰＳに対する１００平均値のベクトル
３．トレインセット中の各ＰＳに対する１００ｓｄ値のベクトル
４．トレインマトリクスのｓｖｄ分解のＵマトリクスを含む１００行および５６列のマトリクス
５．トレイン中のレスポンダー群のＰＣ１平均値
６．トレイン中のレスポンダー群のＰＣ１ ｓｄ値
７．トレイン中のノンレスポンダー群のＰＣ１平均値
８．トレイン中のノンレスポンダー群のＰＣ１ ｓｄ値
表４：１００ＰＳ分類指標特徴に対する平均、標準偏差（Ｓｄ）およびＰＣ１係数
Figure 2013505008
Figure 2013505008
Figure 2013505008
実施例２．
Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲデータを用いたメラノーマ分類指標
マイクロアレイによる遺伝子発現プロファイリングのために使用されるＲＮＡを、１００ＰＳ（８３遺伝子）からの２２遺伝子および正規化のための５参照遺伝子（ＧＵＳＢ、ＰＧＫ１、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＥＩＦ４Ｇ２、ＨＮＲＮＰＣ）（表３）を含むカスタムＴａｑｍａｎ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙ （ＡＢＩ、ＰＮ４３４２２５９）において試験した。
この分析のために；総数５４のメラノーマサンプルを含んだ（５２はまた、マイクロアレイ分析のために使用し、２の追加のものでは、マイクロアレイハイブリダイゼーションが良質ではなかった）。
表５．メラノーマサンプルにおいてＰＣＲに基づく分類指標を構築するために使用される２２遺伝子＋参照遺伝子に対するＡＢＩ Ｔａｑｍａｎ Ａｓｓａｙ番号
Figure 2013505008
Figure 2013505008
５００ｎｇ（ＯＤ２６０測定）の全ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成を、１ｘ第一鎖緩衝液、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０ｍＭのジチオスレイトール、２０ＵのｒＲＮａｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ．Ｎ２５１１）、２５０ｎｇのランダムヘキサマーおよび２００ＵのＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｃａｔ．２８０２５−０１３）を含む２０μｌの混合物中、１時間３０分間、４２℃で実施した。２００ｎｇの全ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを、ＴａｑＭａｎ緩衝液、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．４ｍＭのｄＵＴＰ、０．６２５ＵのＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ、０．０５ＵのＵＮＧを含む２００μｌの総体積中で混合し、製造者勧告に従いＴａｑＭａｎ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙにロードした。ＴａｑＭａｎ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ７９００ＨＴ上で動作させた。増幅プロファイルは５０℃で２分の１サイクル、９４．５℃で１０分の１サイクルならびに９７℃で３０秒および５９．７℃で１分の４０サイクルとした。生データをＳＤＳ ２．２ソフトウエア（ＡＢＩ）を用いて分析した。Ｃｔ値を、自動ベースラインおよび閾値としての０．１５を用いて得た。
２２遺伝子Ｑ−ＰＣＲデータを用いたＳＰＣＡ−ＤＡ分類のリーブワンアウトクロスバリデーション：
分類スキームを開発し、リーブワンアウトによる交差検定を使用し、Ｑ−ＰＣＲにより測定した２２遺伝子全てを使用して（すなわち、分類指標特徴再計算なし）、試験した。
最初に、Ｚ−スコア正規化を、各トレーニングセットを用いて実施し、テストサンプルに適用した。次に、目的変数ありの主成分−判別分析（ＳＰＣＡ−ＤＡ）に基づくマイクロアレイデータに適用された同じ分類アルゴリズムを構築し、そのループ内で除外されたサンプルの各々に適用した（Ｂａｉｒ ａｎｄ Ｔｉｂｓｈｉｒａｉ, ＰＬＯＳ Ｂｉｏｌ ２００４ ａｎｄ Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ ｅｔ ａｌ., ＰＮＡＳ ２００２）。
マイクロアレイから０．４３カットオフを使用して、３３／５４サンプルをＧＳ＋として分類し、感度は８５％（１７／２０）であり、特異性は５３％（１８／３４）である。マイクロアレイのように、ＡＳ１５群は、より良好な性能、９２％感度および５７％特異性を有する。
ＰＣＲデータについて計算された０．４７のカットオフを用いて、３１／５４サンプルをＧＳ＋として分類し、感度は８５％（１７／２０）であり、特異性は５９％（２０／３４）である。
ＰＣＲで試験した５２サンプルはマイクロアレイモデル中にあった。我々は１００ＰＳ（特徴選択を有する）を用いるＬＯＯ ＳＰＣＡ−ＤＡマイクロアレイおよび２２遺伝子を用いるＬＯＯ ＳＰＣＡ−ＤＡ ＰＣＲ（特徴選択なし）について対応するサンプルの分類を比較し、どちらも０．４３の確率のカットオフを用いた。リーブワンアウトモデル間のサンプル分類の一致は、両方の分類で同じラベルを有する５２サンプル中４９である（ボーダーラインサンプルが誤分類された）。
図８／２１は、ＬＯＯ ＳＰＣＡ−ＤＡ ＰＣＲにより２２遺伝子を用いて得られた分類指標を示す（特徴選択なし）。
トレーニングセットから誘導されたパラメータを用いた新規サンプルの分類
分類指標における２２遺伝子に対するＱ−ＰＣＲ発現レベルに基づく新規患者臨床成績の予測のために、実施例１のマイクロアレイに基づく分類指標に対して前に示したように、目的変数ありの主成分（ＳＰＣＡ）−判別分析（ＤＡ）決定規則を適用する（Ｂａｉｒ, ２００４； Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ, ２００２から適合）。
患者生データを参照遺伝子を用いて正規化させ、対数変換させた時点（これは発現マトリクスと呼ばれる）で、患者に対する臨床成績の予測のための決定規則（分類指標または分類スキーム）に供することができる。
発現マトリクスはトレーニングセットからの平均および標準偏差（Ｓｄ）を用いてＺ−スコア化される（表６）
分類する患者のＺ−スコア化された正規化発現プロファイル（分類指標特徴）は、分類指標特徴の線形結合を用いて、トレーニングセットにより規定された第１の主成分（ＰＣ１）空間において提示される（線形結合における２２の特徴の各々に対する係数は、トレーニングセットの特異値分解により得られ、それらは表６で提供される）
表６：２２遺伝子分類指標特徴に対する平均、標準偏差（Ｓｄ）およびＰＣ１係数
Figure 2013505008
ＰＣ１におけるテストサンプルのレスポンダーおよびノンレスポンダー群の平均までの標準化距離は、下記式を用いて得られる：
Figure 2013505008
ｉ＝テストサンプル
Ｋ＝レスポンダー（Ｒ）またはノンレスポンダー（ＮＲ）
平均_ＰＣ１Ｋ＝トレーニングセットにおけるＲまたはＮＲ群のＰＣ１平均
ｄ_ＰＣ１Ｋ＝トレーニングセットにおけるＲまたはＮＲ群のＰＣ１標準偏差
トレーニングセット中の各群の平均およびｓｄ(有効３桁まで四捨五入)は下記の通りである:
Figure 2013505008
各サンプルに対する指標(サンプルがレスポンダーである確率)は下記を用いて得られる:
Figure 2013505008
ＰＲが０．４７より大きい場合、サンプルは遺伝子サイン陽性（レスポンダー，Ｒ）として分類される
この分類指標をトレーニングセットに適用すると、６９％一致に対し、０．８５（１７／２０）の感度のおよび０．５９（２０／３４）特異性で、２２遺伝子がトレインセットを分類することができることを示す図９／２１が生成する。
成績予測コード

### テストサンプル新たな転移性メラノーマＴＬＤＡ２ ２２遺伝子の分類のためのスクリプト

### Mage008TLDA.SPCA.DA.Mel4patent.Rに基づく

### M8.train.parameters.22genes.TLDA2.RDataを必要とする (トレーニングセットパラメータ)

ライブラリ(ジーンフィルタ)

#### 分類するためにtestsetをロード (対数スケール 正規化 PCR データ)

ロード("testset.RData") ### 分類するためのサンプルを含むExpressionSet

###トレーニングセットパラメータをロード##############

ロード("M8.train.parameters.22genes.TLDA2.RData")

PS<-M8.train.parameters[[1]]

M8.train.means<-M8.train.parameters[[2]]

M8.train.sd<-M8.train.parameters[[3]]

M8.train.U<-M8.train.parameters[[4]]

M8.trainPC1barRs<-M8.train.parameters[[5]]

M8.trainPC1sdRs<-M8.train.parameters[[6]]

M8.trainPC1barNRs<-M8.train.parameters[[7]]

M8.trainPC1sdNRs<-M8.train.parameters[[8]]

######################### テストセット上でのSPCAの使用 - #######################
testset<-testset[PS,]

test<-(exprs(testset)-M8.train.means)/M8.train.sd

PCtest<-t(test) %*% M8.train.U

PC1test<-PCtest[,1]

distanceR<-c()
distanceNR<-c()
probR<-c()
probNR<-c()
SPCAclass<-c()

for (i in 1:ncol(test)) {
distancesR<-abs(PCtest[i,1]-M8.trainPC1barRs)/M8.trainPC1sdRs

distancesNR<-abs(PCtest[i,1]-M8.trainPC1barNRs)/M8.trainPC1sdNRs

distanceR<-c(distanceR,distancesR)
distanceNR<-c(distanceNR,distancesNR)

probRs<-exp(-distancesR/2)/(exp(-distancesR/2)+exp(-distancesNR/2))

probNRs<-exp(-distancesNR/2)/(exp(-distancesR/2)+exp(-distancesNR/2))

probR<-c(probR,probRs)
probNR<-c(probNR,probNRs)

}
cutoff=0.47
clust<-ifelse(as.vector(probR)>cutoff,R,NR)


####################

###(バッチ番号に従いxx次の行を修正)
write.table(cbind(pData(testset),probR),file="testset_batch_xx_TLDA2_22genes_classification.txt",sep="\t")
ここで、
Ｔｅｓｔｓｅｔ．ＲＤａｔａは、２２遺伝子に対する正規化対数スケールＰＣＲデータを含む２２行を有するマトリクスである
Ｍ８．ｔｒａｉｎ．ｐａｒａｍｅｔｅｒｓは、下記を含むクラスリストのオブジェクトである：
１．２２遺伝子名の文字リスト
２．トレインセット中の各遺伝子に対する２２平均値のベクトル
３．トレインセット中の各遺伝子に対する２２ｓｄ値のベクトル
４．トレインマトリクスのｓｖｄ分解のＵマトリクスを含む２２行および２２列のマトリクス
５．トレイン中のレスポンダー群のＰＣ１平均値
６．トレイン中のレスポンダー群のＰＣ１ ｓｄ値
７．トレイン中のノンレスポンダー群のＰＣ１平均値
８．トレイン中のノンレスポンダー群のＰＣ１ ｓｄ値。
実施例３
ＰＣＲにより評価された２３遺伝子のサブセットを用いたＮＳＣＬＣサンプルの分類
バックグラウンド：ＮＳＣＬＣ第ＩＩ相臨床試験
これは、腫瘍の完全外科切除後の、ＭＡＧＥ−Ａ３陽性、ステージＩＢおよびＩＩ ＮＳＣＬＣ患者における二重盲検プラセボ対照概念証明治験である（ＣＰＭＳ２４９５５３／００４）。ＡＳＣＩ薬（抗原特異的癌免疫療法薬）は、タンパク質−ＤおよびＨｉｓｔ−テールとの融合物における組換えＭＡＧＥ−Ａ３融合タンパク質である。これは、ＡＳ０２Ｂ免疫アジュバントと組み合わされる。ＡＳ０２Ｂは、ＱＳ２１およびＭＰＬの水中油型エマルジョンである。ＱＳ２１は、南アメリカの樹木キラヤサポナリアモリーナ由来の精製された天然サポニン分子であり、ＭＰＬは、３デ−Ｏ−アセチル化モノホスホリルリピドＡ−Ｓ．ミネソタＬＰＳ由来の、リピドＡの解毒誘導体である。この二重盲検、無作為化、プラセボ対照治験は、再発までの時間を評価するように設計した（図１１／２１）。
図１０／２１は、ＮＳＣＬＣ第ＩＩ相治験設計を示す。ＭＡＧＥ−Ａ３−陽性の、完全に切除された、ステージＩＢまたはＩＩ ＮＳＣＬＣを有する総計１８２の患者を、２年にわたり登録し、無作為にＭＡＧＥ−Ａ３を標的とするＡＳＣＩまたはプラセボ（２：１比）のいずれかを受けるように割り当てた。最大１３用量を、２７ヶ月の期間にわたり投与した。主分析を切除日から２８ヶ月のメジアン追跡調査期間後に実施し、２００６年１１月に公開した。
この治験は、この患者集団における癌免疫療法に対する活性の証拠を最初に提供した。主分析時に、６７の患者は疾患再発を示した：ｒｅｃＭＡＧＥ−Ａ３＋ＡＳ０２Ｂ ＡＳＣＩ群で４１（３３．６％）およびプラセボ群で２６（４３．３％）。Ｃｏｘ回帰分析を使用して、各患者の個々の時間事象を考慮しながら、無病期間（ＤＦＩ）の相対的な改善を計算した。結果は、プラセボと比べた場合、ＡＳＣＩを受けた群における、２８ヶ月メジアン追跡調査後の癌再発リスクの２７％相対減少を示す（ハザード比＝０．７３；ＣＩ＝０．４４−１．２；ｐ＝０．１０８、片側ログランク検定）（図１１／２１）。
無病生存率（ＤＦＳ）および全生存（ＯＳ）に対するハザード比は、それぞれ、０．７３（ＣＩ：０．４５−１．１６）、および０．６６（ＣＩ＝０．３６−１．２０）であった。
これらの結果を、最終分析時にさらに確認した（２００７年１２月−４４ヶ月のメジアン追跡調査）：ＤＦＩではＨＲ０．７５（ＣＩ＝０．４６−１．２３）、ＤＦＳでは０．７６（ＣＩ＝０．４８−１．２１）およびＯＳでは０．８１（ＣＩ＝０．４７−１．４０）。
図１１／２１は、ＮＳＣＬＣ治験に対する無病期間の間のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を示す。この研究からのサンプルを使用してこの患者集団におけるＡＳＣＩ−治療臨床応答を予測する可能なバイオマーカーとしてのメラノーマサインの使用を決定した。
ＰＣＲデータを用いたＮＳＣＬＣサンプルの分類
１００ＰＳ（表１）からの２３遺伝子のサブセットを、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＮＳＣＬＣ臨床試験（ＭＡＧＥ００４；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）からのサンプルを用いてＬＯＯ分類指標を構築するために使用した。
表７．ＮＳＣＬＣサンプルにおいてＰＣＲに基づく分類指標を構築するために使用される２３遺伝子に対するＡＢＩ Ｔａｑｍａｎ Ａｓｓａｙ番号（実施例２におけるメラノーマ分類指標と同じ参照遺伝子）
Figure 2013505008
Figure 2013505008
方法
１２９腫瘍標本（ワクチン接種前）を、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＮＳＣＬＣ臨床試験（ＭＡＧＥ００４； ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）から使用した。これらはＲＮＡｌａｔｅｒ、ＲＮＡ安定化溶液中で保存された新鮮凍結サンプルであった。全ＲＮＡをＴｒｉｐｕｒｅ方法（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．１ ６６７ １６５）を使用して精製した。提案されたプロトコルに続いて、ＤＮＡｓｅ処置を有するＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット−浄化プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ Ｃａｔ．Ｎｏ．７４１０６）を使用した。ＲＮＡの定量は、２６０ｎｍでの光学密度を用いて最初に完了した。
５００ｎｇの全ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成を、１ｘ第一鎖緩衝液、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０ｍＭのジチオスレイトール、２０ＵのｒＲＮａｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ．Ｎ２５１１）、２５０ｎｇのランダムヘキサマーおよび２００ＵのＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｃａｔ．２８０２５−０１３）を含む２０μｌの混合物中、１時間３０分間、４２℃で実施した。
２００ｎｇの全ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを、ＴａｑＭａｎ緩衝液、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．４ｍＭのｄＵＴＰ、０．６２５ＵのＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ、０．０５ＵのＵＮＧを含む２００μｌの総体積中で混合し、製造者勧告に従いＴａｑＭａｎ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙにロードした。
ＴａｑＭａｎ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ７９００ＨＴ上で動作させた。増幅プロファイルは５０℃で２分の１サイクル、９４．５℃で１０分の１サイクルならびに９７℃で３０秒および５９．７℃で１分の４０サイクルとした。生データをＳＤＳ２．２ソフトウエア（ＡＢＩ）を用いて分析した。Ｃｔ値を、自動ベースラインおよび閾値としての０．１５を用いて得た。
２３遺伝子Ｑ−ＰＣＲデータを用いたＳＰＣＡ−Ｃｏｘ分類のリーブワンアウトクロスバリデーション：
この臨床試験はプラセボおよび処置群を含み、Ｃｏｘ比例ハザードモデルに基づき、共変量として治療、遺伝子プロファイル、ステージ、外科手術および組織学的型に加えて治療と遺伝子プロファイルの間の交互作用項（主成分１として要約）を用いて、リスクスコアを推定するために無病期間（ＤＦＩ）を使用する分類指標を開発した。
各遺伝子に対するＣｔ値を、５参照遺伝子の幾何平均を用いて正規化し、対数変換させた。その後、遺伝子を各トレーニングセットにおいてＺ−スコアより正規化し、これらのパラメータをテストセットに適用した。
Ｚ−スコア正規化後、特異値分解（ＳＶＤ）をトレーニングセットにおいて実施し、第１の主成分（ＰＣ１）を得た。この第１成分を、処置との交互作用項を有するＣｏｘ回帰において使用し、トレインセットにおける共変量係数を推定し；Ｃｏｘ回帰を外科手術効果の組織診断、ステージおよび型のために調整する。この回帰からの係数を使用して、トレーニングセットおよびテストサンプル（除外されたサンプル）におけるリスクスコアを計算する。トレインセットのメジアンリスクスコアをカットオフ値として使用し、患者を遺伝子サイン（ＧＳ）＋または遺伝子サイン（ＧＳ）−と分類する。この方法はＣｏｘ−ＳＰＣＡと呼ばれ、図１２／２１において説明される。
図１３／２１および１４／２１は、それぞれ、プラセボおよびワクチン群中での、カットオフとしてのメジアンおよびリスクスコア分布を有する、ＬＯＯＣＶ分類に基づく遺伝子プロファイルによる生存曲線を示す。リスクスコア分布は下記の通りである：
Figure 2013505008
Ｃｏｘ−ＳＰＣＡアルゴリズムを用いた新規サンプルの分類
分類指標における２３遺伝子に対するＱ−ＰＣＲ発現レベルに基づく新規患者臨床成績の予測のために、目的変数ありの主成分（ＳＰＣＡ）−Ｃｏｘ決定規則を適用する：
患者生データを参照遺伝子を用いて正規化し、対数変換させた時点で、患者に対する臨床成績の予測のための決定規則（分類指標または分類スキーム）に供することができる。
発現マトリクスはトレーニングセットからのパラメータを用いてＺ−スコア化する（表８）
表８：２３遺伝子分類指標特徴に対する平均、標準偏差（Ｓｄ）およびＰＣ１係数
Figure 2013505008
分類する患者のＺ−スコア化された正規化発現プロファイル（分類指標特徴）は、トレーニングセットにより、分類指標特徴の線形結合を用いて規定された第１の主成分（ＰＣ１）空間において提示される（線形結合における２３の特徴の各々に対する係数は、トレーニングセットの特異値分解により得られ、それらは表８で提供される）
新規サンプルに対するリスクスコアは下記式を用いて計算される:
Figure 2013505008
ここで、Ｂｔｒｅａｔｍｅｎｔ＝−０．２３２０５１４５７およびＢＰＣ１ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ＝０．１７６７３６５８６は、トレーニングセットから得られた
新規サンプルのリスクスコアは、トレーニングセットのメジアンリスクスコア＝−０．３１５３２４１９５と比較され、リスクスコアがこの値より低い場合、サンプルはＧＳ＋（レスポンダー，非再発，１）と分類される。
図１５／２１および１６／２１は、分類指標における２３遺伝子に対するＱ−ＰＣＲ発現レベルに基づく臨床成績を示す。ＨＲに対するＧＳの影響は下記の通りである：
Figure 2013505008
成績予測コード
### テストサンプル新たな切除ＮＳＣＬＣ ＴＬＤＡｍｅｒｇｅ２３遺伝子の分類のためのスクリプト

### Mage004.SPCA.Cox.classifier.contruction.TLDAmerge.23genes.DFI.Squamous.Rに基づく

### M4.train.parameters.23genes.TLDAmerge.Rdataを必要とする(トレーニングセットパラメータ)

ライブラリ(ジーンフィルタ)


#### 分類するためにtestsetをロード (対数スケール 正規化 PCRデータ)

ロード("testset.RData") ### 分類するためのサンプルを含むExpressionSet

### トレーニングセットパラメータをロード ##############

ロード("M4.train.parameters.23genes.TLDAmerge.RData")

PS<-M4.train.parameters[[1]]

M4.train.means<-M4.train.parameters[[2]]

M4.train.sd<-M4.train.parameters[[3]]

M4.train.U<-M4.train.parameters[[4]]

M4.train.Btreatment<-M4.train.parameters[[5]]

M4.train.Binteraction<-M4.train.parameters[[6]]

M4.train.medianHR<-M4.train.parameters[[7]]


################################## テストセット上でのSPCAの使用 - #######################
testset<-testset[PS,]

test<-(exprs(testset)-M4.train.means)/M4.train.sd

PCtest<-t(test) %*% M4.train.U

PC1test<-PCtest[,1]

HR=M4.train.Btreatment+PC1test*M4.train.Binteraction
classification=ifelse(HR<M4.train.medianHR,1,0)

####################

###(バッチ番号に従いxx次の行を修正)
write.table(cbind(pData(testset),probR),file="testset_batch_xx_M4_TLDAmerge_23genes_classification.txt",sep="\t")
ここで、
Ｔｅｓｔｓｅｔ．ＲＤａｔａは、２３遺伝子に対する正規化対数スケールＰＣＲデータを含む２３行を有するマトリクスである
Ｍ４．ｔｒａｉｎ．ｐａｒａｍｅｔｅｒｓは、下記を含むクラスリストのオブジェクトである：
１．２３遺伝子名の文字リスト
２．トレインセット中の各遺伝子に対する２３平均値のベクトル
３．トレインセット中の各遺伝子に対する２３ｓｄ値のベクトル
４．トレインマトリクスのｓｖｄ分解のＵマトリクスを含む２３行および２３列のマトリクス
５．リスクスコア計算におけるＢｔｒｅａｔｍｅｎｔ
６．リスクスコア計算におけるＢＰＣ１ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ
７．トレインにおけるメジアンリスクスコア。
実施例４
ＰＣＲにより評価された２２遺伝子のサブセットを用いたＮＳＣＬＣサンプルの分類：
１００ＰＳ（表１）からの２２遺伝子のサブセットを、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＮＳＣＬＣ臨床試験（ＭＡＧＥ００４；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）からのサンプルを用いてＬＯＯ分類指標を構築するために使用した。
表９．ＮＳＣＬＣサンプルにおいてＰＣＲに基づく分類指標を構築するために使用される２２遺伝子に対するＡＢＩ Ｔａｑｍａｎ Ａｓｓａｙ番号（実施例２におけるメラノーマ分類指標と同じ参照遺伝子）
Figure 2013505008
方法
１３７腫瘍標本（ワクチン接種前）を、ＭＡＧＥ−Ａ３ ＮＳＣＬＣ臨床試験（ＭＡＧＥ００４；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）から使用した。これらはＲＮＡｌａｔｅｒ、ＲＮＡ安定化溶液中で保存した新鮮凍結サンプルであった。
全ＲＮＡをＴｒｉｐｕｒｅ方法（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．１ ６６７ １６５）を使用して精製した。提案されたプロトコルに続いて、ＤＮＡｓｅ処置を有するＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット−浄化プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ Ｃａｔ．Ｎｏ．７４１０６）を使用した。ＲＮＡの定量は、２６０ｎｍでの光学密度を用いて最初に完了した。
５００ｎｇの全ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成を、１ｘ第一鎖緩衝液、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０ｍＭのジチオスレイトール、２０ＵのｒＲＮａｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ．Ｎ２５１１）、２５０ｎｇのランダムヘキサマーおよび２００ＵのＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｃａｔ．２８０２５−０１３）を含む２０μｌの混合物中、１時間３０分間、４２℃で実施した。
２００ｎｇの全ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを、ＴａｑＭａｎ緩衝液、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．４ｍＭのｄＵＴＰ、０．６２５ＵのＡｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ、０．０５ＵのＵＮＧを含む２００μｌの総体積中で混合し、製造者勧告に従いＴａｑＭａｎ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙにロードした。
ＴａｑＭａｎ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ７９００ＨＴ上で動作させた。増幅プロファイルは５０℃で２分の１サイクル、９４．５℃で１０分の１サイクルならびに９７℃で３０秒および５９．７℃で１分の４０サイクルとした。生データをＳＤＳ ２．２ソフトウエア（ＡＢＩ）を用いて分析した。Ｃｔ値を、自動ベースラインおよび閾値としての０．１５を用いて得た。
２２遺伝子Ｑ−ＰＣＲデータを用いたＳＰＣＡ−Ｃｏｘ分類のリーブワンアウトクロスバリデーション：
この臨床試験はプラセボおよび処置群を含み、Ｃｏｘ比例ハザードモデルに基づき、共変量として治療、遺伝子プロファイル、ステージ、外科手術および組織学的型に加えて治療と遺伝子プロファイルの間の交互作用項（主成分１として要約）を用いて、リスクスコアを推定するために無病期間（ＤＦＩ）を使用する分類指標を開発した。
各遺伝子に対するＣｔ値を、５参照遺伝子の幾何平均を用いて正規化し、対数変換させた。その後、遺伝子を各トレーニングセットにおいてＺ−スコアより正規化し、これらのパラメータをテストセットに適用した。
Ｚ−スコア正規化後、特異値分解（ＳＶＤ）をトレーニングセットにおいて実施し、第１の主成分（ＰＣ１）を得た。この第１成分を、処置との交互作用項を有するＣｏｘ回帰において使用し、トレインセットにおける共変量係数を推定し；Ｃｏｘ回帰を外科手術効果の組織診断、ステージおよび型のために調整する。この回帰からの係数を使用して、トレーニングセットおよびテストサンプル（除外されたサンプル）におけるリスクスコアを計算する。トレインセットのメジアンリスクスコアをカットオフ値として使用し、患者を遺伝子サインＧＳ＋またはＧＳ−と分類する。この方法は別の文書でＣｏｘ−ＳＰＣＡと呼ばれる。この方法は図１２／２１において説明される。
図１７／２１および１８／２１は、それぞれ、プラセボおよびワクチン群中での、カットオフとしてのメジアンおよびリスクスコア分布を有する、ＬＯＯＣＶ分類に基づく遺伝子プロファイルによる生存曲線を示す。
リスクスコア分布
Figure 2013505008
Ｃｏｘ−ＳＰＣＡアルゴリズムを用いた新規サンプルの分類
分類指標における２２遺伝子に対するＱ−ＰＣＲ発現レベルに基づく新規患者臨床成績の予測のために、目的変数ありの主成分（ＳＰＣＡ）−Ｃｏｘ決定規則を適用する：
患者生データを参照遺伝子を用いて正規化し、対数変換させた時点で、患者に対する臨床成績の予測のための決定規則（分類指標または分類スキーム）に供することができる。
発現マトリクスはトレーニングセットのパラメータを用いてＺ−スコア化される（表１０）
表１０：２２遺伝子分類指標特徴に対する平均、標準偏差（Ｓｄ）およびＰＣ１係数
Figure 2013505008
分類する患者のＺ−スコア化された正規化発現プロファイル（分類指標特徴）は、トレーニングセットにより、分類指標特徴の線形結合を用いて規定された第１の主成分（ＰＣ１）空間において提示される（線形結合における２２の特徴の各々に対する係数は、トレーニングセットの特異値分解により得られ、それらは表１０で提供される）
新規サンプルに対するリスクスコアは下記式を用いて計算される:
Figure 2013505008
ここで、Ｂｔｒｅａｔｍｅｎｔ＝−０．１９３１４６９９３およびＢＰＣ１ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ＝０．１６３７０４８１７は、トレーニングセットから得られた。
新規サンプルのリスクスコアは、トレーニングセットのメジアンリスクスコア＝−０．０．２５７３７４２１と比較され、リスクスコアがこの値より低い場合、サンプルはＧＳ＋（レスポンダー，非再発，１）と分類される。
図１９／２１および２０／２１は、分類指標における２２遺伝子に対するＱ−ＰＣＲ発現レベルに基づく臨床成績を示す。
Figure 2013505008
成績予測コード
###テストサンプル新たな切除ＮＳＣＬＣ ＴＬＤＡｍｅｒｇｅ２２遺伝子の分類のためのスクリプト

### Mage004.SPCA.Cox.classifier.contruction. DFI.Squamous.Rに基づく

### M4.train.parameters.22genes.TLDA2.Rdataを必要とする(トレーニングセットパラメータ)

ライブラリ(ジーンフィルタ)


#### 分類するためにtestsetをロード (対数スケール正規化PCRデータ)

ロード("testset.RData") ### 分類するためのサンプルを含むExpressionSet

### トレーニングセットパラメータをロード ##############

ロード("M4.train.parameters.22genes.TLDA2.RData")

PS<-M4.train.parameters[[1]]

M4.train.means<-M4.train.parameters[[2]]

M4.train.sd<-M4.train.parameters[[3]]

M4.train.U<-M4.train.parameters[[4]]

M4.train.Btreatment<-M4.train.parameters[[5]]

M4.train.Binteraction<-M4.train.parameters[[6]]

M4.train.medianHR<-M4.train.parameters[[7]]




################################## テストセット上でのSPCAの使用 - #######################
testset<-testset[PS,]

test<-(exprs(testset)-M4.train.means)/M4.train.sd

PCtest<-t(test) %*% M4.train.U

PC1test<-PCtest[,1]

HR=M4.train.Btreatment+PC1test*M4.train.Binteraction
classification=ifelse(HR<M4.train.medianHR,1,0)

####################

###(バッチ番号に従いxx次の行を修正)
write.table(cbind(pData(testset),probR),file="testset_batch_xx_M4_TLDA2_22genes_classification.txt",sep="\t"))
ここで、
Ｔｅｓｔｓｅｔ．ＲＤａｔａは、２２遺伝子に対する正規化対数スケールＰＣＲデータを含む２２行を有するマトリクスである
Ｍ４．ｔｒａｉｎ．ｐａｒａｍｅｔｅｒｓは、下記を含むクラスリストのオブジェクトである：
１．２２遺伝子名の文字リスト
２．トレインセット中の各遺伝子に対する２２平均値のベクトル
３．トレインセット中の各遺伝子に対する２２ｓｄ値のベクトル
４．トレインマトリクスのｓｖｄ分解のＵマトリクスを含む２２行および２２列のマトリクス
５．リスクスコア計算におけるＢｔｒｅａｔｍｅｎｔ
６．リスクスコア計算におけるＢＰＣ１ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ
７．トレインにおけるメジアンリスクスコア。
実施例５
メラノーマサンプルにおけるＱ−ＰＣＲにより測定した個々の遺伝子の分類性能
実施例２からの２２遺伝子の各々を、第１の主成分の代わりに、単一の遺伝子発現値を使用する、メラノーマサンプルにおける多変量分類に適用されたアルゴリズムを用いることにより、一変量分類性能に対して評価した。
参照遺伝子を用いて発現値を正規化し、Ｚ−スコアを実施した後、各それぞれの遺伝子に対する発現レベルを、トレーニングセットにおける全てのサンプルを使用して分類指標を構築するために、使用した。トレーニングセットにおける各遺伝子の発現差異に対するｔ検定ｐ−値およびレスポンダー対ノンレスポンダーのフォールドチェンジを計算した。トレーニングセットにおける各サンプルがレスポンダーである確率を得、臨床ラベルとの一致を最大化することにより、最良のカットオフを各遺伝子に対して決定し、結果を次の表に示す：
表１１
Figure 2013505008
個々の遺伝子に対して得られた結果は、実施例２における全ての遺伝子を用いた多変量分類において得られた６９％の％一致に匹敵する。
実施例６
ＮＳＣＬＣサンプルにおけるＱ−ＰＣＲにより測定した個々の遺伝子の分類性能
実施例３からの２３遺伝子の各々を、第１の主成分の代わりに、単一の遺伝子発現値を使用する、ＮＳＣＬＣサンプルにおける多変量分類に適用されたアルゴリズム（Ｃｏｘ−ＳＰＣＡ）を用いることにより、分類性能に対して評価した。
参照遺伝子を用いて発現値を正規化し、Ｚ−スコアを実施した後、各それぞれの遺伝子に対する発現レベルを、実施例３で記載されるように分類指標を構築するために使用した。トレーニングセットにおける各サンプルに対するリスクスコアを得、サンプルを異なるカットオフに基づき、ＧＳ＋またはＧＳ−に割り当てた。各カットオフの性能を、各ＧＳ＋およびＧＳ−群におけるこのカットオフと関連する処置ＨＲを計算することにより評価した。１遺伝子あたりの最良のカットオフを、分類の交互作用項係数を最大化する、すなわち、ＧＳ＋およびＧＳ−における処置ＨＲ間の差を最大化することにより個々に決定した。下記表は、この最適化プロセスを用いて得られたＧＳ＋およびＧＳ−における処置ＨＲおよびそれらのＨＲと関連するｐ−値を示す。
表１２
Figure 2013505008
実施例７
メラノーマサンプルにおけるマイクロアレイにより測定した個々の遺伝子の分類性能
実施例１からの１００ＰＳの各々を、第１の主成分の代わりに、単一の遺伝子発現値を使用する、メラノーマサンプサンプルにおける多変量分類に適用されたアルゴリズムを用いることにより、一変量分類性能に対して評価した。
発現値（ｇｃｒｍａ）を正規化し、Ｚ−スコアを実施した後、各それぞれのＰＳに対する発現レベルを、トレーニングセットにおける全てのサンプルを用いて分類指標を構築するために使用した。トレーニングセットにおける各ＰＳの発現差異に対するｔ検定ｐ−値およびレスポンダー対ノンレスポンダーのフォールドチェンジを計算した。トレーニングセットにおける各サンプルがレスポンダーである確率を得、臨床ラベルとの一致を最大化することにより、最良のカットオフを各遺伝子に対して決定し、結果を次の表に示す：
表１３
Figure 2013505008
Figure 2013505008
Figure 2013505008
個々のPSに対して得られた結果は、実施例１における全ての遺伝子を用いた多変量分類において得られた６８％の％一致に匹敵する。
参考文献
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Van 't Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ, He YD, Hart AA, Mao M, Peterse HL, van der Kooy K, Marton MJ, Witteveen AT, et al. (2002) Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature, 415(6871), 530-556.

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付属書類１−ＧＣＲＭＡ対応、修正ＲｅｆＰｌｕｓ Ｒコード
require(affyPLM)
pe <- read.table("VR63933P_pe.txt")
pe <- unstack(pe)
rq <- scan("VR63933P_rq.txt ")
gcrmaplus <- function (Future, gcrmapara, r.q, p.e, bg = TRUE)
{
if (missing(r.q) & (missing(gcrmapara))) {
stop("Missing Reference Quantiles")
}
if (missing(p.e) & (missing(gcrmapara))) {
stop("missing Probe Effects")
}
if (!missing(gcrmapara)) {
r.q = gcrmapara[[1]]
p.e = gcrmapara[[2]]
cat("Use gcrmapara. \n")
}
else {
cat(Use Reference.Quantiles and Probe.Effects.\n")
}
if (bg == TRUE)
Future <- bg.adjust.gcrma(Future)
PM = pm(Future)
pm(Future) <- normalize.quantiles2 (PM, r.q)
rm(PM)
future <- gcrmaref.predict(Future, p.e)
return(future)
}
gcrmaref.predict <- function (Future, p.e)
{
PMindex <- pmindex(Future)
PM <- log2(pm(Future))
PM <- sweep(PM, 1, unlist(p.e))
pm(Future) <- PM
PMlist <- lapply(PMindex, function(x, y) intensity(y)[x,
], Future)
future <- t(sapply(PMlist, colMedians))
colnames(future) <- sampleNames(Future)
return(future)
}
normalize.quantiles2 <- function (X, Reference.Quantiles)
{
apply(X, 2, function(x, y) y[rank(x)], Reference.Quantiles)
}
colMedians <- function (mat) rowMedians(t(mat))

Claims (32)

  1. 患者をある療法に対するレスポンダーまたはノンレスポンダーとして特徴付ける方法であって、
    （ａ）患者由来のサンプルを、表１の１つ以上の遺伝子の遺伝子産物の発現差異について分析すること；および
    （ｂ）工程（ａ）の結果に基づき、前記サンプルが由来する患者を、レスポンダーまたはノンレスポンダーとして特徴付けること
    を含み、
    前記特徴付け工程は、標準またはトレーニングセットを参照または比較することにより、あるいはパラメータが標準またはトレーニングセットから得られたアルゴリズムを使用することにより実施される、方法。
  2. （ａ）患者由来のサンプルの、表１の１つ以上の遺伝子の遺伝子産物の発現差異について分析を得る工程であって、結果は、患者を免疫療法薬に対するレスポンダーまたはノンレスポンダーとして特徴付け、前記特徴付け工程は、標準またはトレーニングセットを参照または比較することにより、あるいはパラメータが標準またはトレーニングセットから得られたアルゴリズムを使用することにより実施されること；および
    （ｂ）前記患者が前記免疫療法薬に対するレスポンダーとして特徴付けられた場合、前記患者を、適切な免疫療法薬の少なくとも１つの投与のために選択すること、
    を含む、患者を治療する方法。
  3. 患者が免疫療法薬に対するレスポンダーであるか、またはノンレスポンダーであるかを決定する方法であって、
    （ａ）患者由来のサンプルを入手すること；および
    （ｂ）前記患者由来のサンプルを表１の１つ以上の遺伝子の遺伝子産物の発現差異について分析すること
    を含み、結果は、前記患者が免疫療法薬に対するレスポンダーか、またはノンレスポンダーとして特徴付けられるかを決定し、前記特徴付け工程は、標準またはトレーニングセットを参照または比較することにより、あるいはパラメータが標準またはトレーニングセットから得られたアルゴリズムを使用することにより実施される、方法。
  4. 前記表１の１つ以上の遺伝子は、表１で列挙される少なくとも６３の遺伝子または表２、５もしくは７で特定される実質的にすべての遺伝子である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 患者由来のサンプル中で、標的配列が表３で示される、１つ以上の、表１に列挙されたプローブセットより認識される遺伝子産物を分析することを含む、患者を療法に対するレスポンダーまたはノンレスポンダーとして特徴付ける方法であって、
    前記特徴付け工程は、標準またはトレーニングセットを参照または比較することにより、あるいはパラメータが標準またはトレーニングセットから得られたアルゴリズムを使用することにより実施される、方法。
  6. 表１の前記１つ以上のプローブセットは、表１で列挙されるプローブセットの少なくとも７４または表２、５もしくは７における遺伝子のためのプローブセット全てである、請求項５に記載の方法。
  7. 患者をレスポンダーとして同定し、前記患者を療法のために選択する工程をさらに含む、請求項１、または３〜６のいずれかで規定される方法。
  8. 前記標準はそれぞれ、公知の臨床成績を有する１または複数の患者からの、１または複数の患者由来のサンプルである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記療法または治療は癌免疫療法、好ましくはメラノーマおよび／または肺癌のための癌免疫療法である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
  10. 前記癌免疫療法はＭＡＧＥである、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ＭＡＧＥ免疫療法はＭＡＧＥ Ａ３免疫療法である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記表１の１つ以上の遺伝子は、少なくとも６３、少なくとも６８、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０または実質的にすべての、表１で列挙される遺伝子および／またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
  13. 前記表１の１つ以上のプローブセットは、少なくとも７４、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０または全ての、表１で列挙されるプローブセットおよび／またはそれらの任意の組み合わせである、請求項５〜１１のいずれかに記載の方法。
  14. 前記１つ以上の遺伝子は、それらの正常発現に比べ上方制御される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
  15. 少なくとも８０％の遺伝子が、それらの正常発現に比べ上方制御される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
  16. 前記遺伝子産物が上方制御および／または下方制御されたかを決定する工程をさらに含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
  17. 前記遺伝子産物が上方制御および／または下方制御されたという決定は、レスポンダーを示す、請求項１６に記載の方法。
  18. 遺伝子は免疫関連遺伝子である、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
  19. １つ以上の遺伝子産物の同定のためのプローブの使用を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 遺伝子発現を分析するためのマイクロアレイキットまたはＰＣＲの使用を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 患者が療法、例えば癌免疫療法に対するレスポンダーまたはノンレスポンダーである可能性があるかどうかの分析を実施するための、少なくとも６３の、表１の遺伝子またはそれから作成されるデータ、あるいは少なくとも７４の、表１のプローブセットまたはそれから作成されるデータの遺伝子リストの使用。
  22. 前記遺伝子リストは、実質的にすべての、表１の遺伝子またはプローブセットを含む、またはそれらから構成される、請求項２０に記載の使用。
  23. 表１で列挙される遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子産物の配列に相補的およびハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドプローブを含み、前記表１の遺伝子に相補的およびハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドプローブまたはプローブセットは、前記マイクロアレイ上の少なくとも５０％のプローブまたはプローブセットを構成する、マイクロアレイ。
  24. 表１で列挙される遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子産物の配列に相補的およびハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドプローブを含む、マイクロアレイ。
  25. 表２に列挙される遺伝子の遺伝子産物の配列に相補的およびハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドプローブを含む、請求項２３または請求項２４に記載のマイクロアレイ。
  26. 発現を測定するための手段、例えば、請求項１〜２０のいずれか１つの方法を実施するための、表１で列挙される１つ以上の遺伝子の、または表１で列挙される遺伝子の遺伝子産物の、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ遺伝子産物にハイブリダイズするプローブを含む、診断キット。
  27. 腫瘍関連抗原を含む組成物を患者に投与することを含む、請求項１〜２０の方法に従いレスポンダーとして特徴付けられた患者を治療する方法または請求項２３〜２５のマイクロアレイもしくは請求項２６の診断キットの使用。
  28. 請求項１〜２０の方法または請求項２３〜２５のマイクロアレイもしくは請求項２６の診断キットの使用に従い、レスポンダーを有すると決定された、またはレスポンダーとして特徴付けられた患者の治療のための、腫瘍関連抗原を含む組成物。
  29. 請求項１〜２０の方法または請求項２３〜２５のマイクロアレイもしくは請求項２６の診断キットの使用に従い、レスポンダーを有すると決定された、またはレスポンダーとして特徴付けられた患者の治療のための、薬剤の調製における、腫瘍関連抗原を含む、組成物の使用。
  30. 前記腫瘍関連抗原はＭＡＧＥ抗原である、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法、組成物または使用。
  31. 前記組成物はアジュバントをさらに含む、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法、組成物または使用。
  32. 少なくとも６３の、表１で列挙される遺伝子の複数の検出試薬が結合された固体表面であって、その検出試薬は前記遺伝子の発現または前記遺伝子によりコードされるポリペプチドを検出することができる、固体表面。
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