BR112012006088A2 - métodos para caracterizar um paciente como respondedor ou não respondedor a uma terapia, para tratar um paciente, para determinar se um paciente é um respondedor ou um não respondedor a uma imunoterapêutica, uso de uma lista de gene, microarranjo, kit de diagnostic, composição, uso de uma composição, e, superfície sólida - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA CARACTERIZAR UM PACIENTE COMO RESPONDER OU NÃO RESPONDER A UMA TERAPIA, PARA TRATAR UM PACIENTE, PARA DETERMINAR SE UM PACIENTE É UM RESPONDEDOR OU NÃO RESPONDEDOR A UMA IMUNOTERAPÊUTICA, USO DE UMA LISTA DE GENE, MICROARRANJO, KIT DE DIAGNOSTIC, COMPOSIÇÃO, USO DE UMA COMPOSIÇÃO, E, SUPERFÍCIE SÓLIDA. Métodos para caracterização de pacientes como respondedores ou não respondedpres á terapia com base em expressão diferencial de um ou mais genes são providos. Perfis de expressão de genes, microarranjos compreendendo sequências de ácido nucleico representando perfis de expressão de genes, e novos kits de diagnósticos e métodos de tratamento também são providos. Os kits e métodos referem-se ao tratamento de populações específicas de, por exemplo, pacientes com câncer, como caracterizado por seu perfil de expressão de genes, sofrendo de tumores expressando MAGE.

Description

“MÉTODOS PARA CARACTERIZAR UM PACIENTE COMO RESPONDEDOR OU NÃO RESPONDEDOR A UMA TERAPIA, PARA - TRATAR UM PACIENTE, PARA DETERMINAR SE UM PACIENTE É " UM RESPONDEDOR OU UM NÃO RESPONDEDOR A UMA “ 5 IMUNOTERAPÊUTICA, USO DE UMA LISTA DE GENE, MICROARRANIO, KIT DE DIAGNOSTIC, COMPOSIÇÃO, USO DE UMA COMPOSIÇÃO, E, SUPERFÍCIE SÓLIDA”

MATERIAL APRESENTADO EM UM DISCO COMPACTO Requerentes apresentam aqui por referência o material do disco compacto contendo os arquivos denominados: "VR63933P pe.txt" criado em 6 de outubro de 2009 (tamanho do arquivo 23.330 MB); e "VR63933P rq.txt" criado em 6 de outubro de 2009 (tamanho do arquivo

15.767 MB) depositados em pedido provisório dos Estados Unidos da 7 América 61/278387 depositado em 6 de outubro de 2009, cujo benefício de é - 15 reivindicado aqui. Um total de dois discos compactos (incluindo duplicatas) serve como referência no presente parágrafo. Para utilizar os dados de pe nesses discos, importar o arquivo ASCII VR63933P pe.txt em uma sessão R por digitação nos seguintes comandos em uma sessão R: pe <- read.table("VR63933P pe.txt") pe <- unstack(pe) Para utilizar os dados rq nesses discos, importar o arquivo ASCIH VR63933P rq.txt em uma sessão R por digitação nos seguintes comandos na sessão R: rq <- scan("VR63933P ra.txt.") A versão pública desses dados é descrita em outro local aqui.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a perfis de expressão de genes; métodos para classificar pacientes; microarranjos; e tratamento de populações de pacientes selecionados através de uso de métodos e microarranjos como descrito aqui.

- FUNDAMENTOS " Melanomas são tumores originando-se de células de & 5 melanócitos na epiderme. Pacientes com melanoma maligno em metástase distante (estágio IV de acordo com a classificação de American Joint Commission on Cancer (AJCC)) têm um tempo de sobrevivência médio de um ano, com uma taxa de sobrevivência de longo prazo de apenas 5%. Mesmo a quimioterapia padrão para melanoma de estágio IV tem taxas de resposta terapêutica de apenas 8-25%, mas sem efeito em sobrevivência global. Pacientes com metástases regionais (estágio II) têm uma sobrevivência média de dois a três anos com chance muito baixa de sobrevivência de longo prazo, mesmo após um adequado controle cirúrgico 7 das metástases primária e regional (Balch et a/., 1992). Maioria dos pacientes -. 15 com melanoma de estágio | a III têm seu tumor removidos cirurgicamente, mas esses pacientes mantêm um risco substancial de relapso. Deste modo permanece uma necessidade para prevenir progressão de melanoma, e ter regimes de tratamento melhorados para melanoma metastático e tratamentos ajudantes para pacientes tendo tido um tumor primário removido.

Há dois tipos câncer de pulmão: câncer de pulmão de célula não pequena (NSCLC) e câncer de pulmão de célula pequena (SCLC). Os nomes simplesmente descrevem o tipo de célula encontrada nos tumores. NSCLC inclui carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, e carcinoma de células grandes e contagens para cerca de 80% de cânceres de pulmão.

—NSCLC é difícil de curar e tratamentos disponíveis tendem a ter o objetivo de prolongar vida, tanto quanto possível, e aliviar sintomas de doença. NSCLC é o tipo mais comum de câncer de pulmão e é associado com maus resultados (Gatzmeier et al., 1994). De todos NSCLC pacientes, apenas cerca de 25% têm doença loco-regional no tempo de diagnóstico e são ainda propícios à excisão cirúrgica (estágios IB, IIA ou IIB de acordo com a classificação AJCC). No entanto, mais do que 50% desses pacientes terão um relapso - dentro dos dois anos seguintes da completa ressecção cirúrgica. Há, assim, ' uma necessidade para proporcionar um melhor tratamento para esses s 5 pacientes.

Quimioterapia tradicional é baseada em administração substâncias tóxicas para o paciente e baseando-se, em parte, na ingestão agressiva do agente tóxico pelas células de tumor/câncer. Essas substâncias tóxicas adversamente afetam o sistema imune do paciente, deixando o indivíduo fisicamente enfraquecido e suscetível à infecção.

Sabe-se que nem todos pacientes com câncer respondem a tratamentos correntes de câncer. Pensa-se que apenas 30% ou menos das pessoas sofrendo de um câncer responderão a qualquer dado tratamento. Os 7 cânceres que não respondem a tratamento são descritos como resistentes. Em - 15 muitos exemplos, não houve métodos para estabelecer se os pacientes responderão ao tratamento. No entanto, tratamento de administração a pacientes que são ambos, respondedores e não respondedores, porque eles não podem ser diferenciados é um uso ineficiente de recursos e, ainda pior, pode ser danoso para o paciente porque, conforme já discutido, muitos tratamentos — de câncer têm significantes efeitos colaterais, como severa imunossupressão, êmese e/ou alopécia. Pensa-se que, em um número de casos, os pacientes recebem tratamento, quando não é necessário ou quando não será efetivo.

Uma nova geração de tratamentos de câncer baseada em antígenos, peptídeos, DNA e semelhantes está correntemente sob investigação por vários grupos. A estratégia atrás de muitas terapias, frequentemente referidas como imunoterapia de câncer, é estimular o sistema imune do paciente na luta contra o câncer. Essas terapias são prováveis de ser vantajosas devido aos efeitos colaterais, de tomar tais tratamentos, são esperados como sendo mínimos em comparação aos efeitos colaterais correntemente encontrados por pacientes sofrendo de tratamento de câncer. Um antígeno usado na imunoterapia de câncer pode ser referido como um . ASCI, que é imunoterapêutica de câncer específica de antígeno. ' No início dos anos 80, Van Pel e Boon publicaram a , 5 — descoberta de células T citolíticas direcionadas contra um antígeno apresentado em células de tumor. Isso conduziu à caracterização do primeiro antígeno compartilhado específico de tumor: Melanoma AGE-1I (MAGE-I, subsequentemente —re-nomeado MAGE-AI). Isto foi seguido pela identificação de um grande número de genes compartilhando o mesmo padrão de expressão: eles são expressos na ampla faixa de tipos de tumor como, melanoma, cânceres de pulmão, bexiga, mama, cabeça e de pescoço. Eles não são expressos em células normais, exceto de testículo. No entanto, essa expressão no testículo normalmente não conduz à expressão de antígeno, ' conforme essas linhas celulares germinativas não expressam moléculas de - 15 classe! MHC, Devido a seu peculiar perfil de expressão, o nome de genes de câncer de testículo (CT) foi proposto para esses genes.

Antígenos MAGE são antígenos codificados pela família de genes de antígeno associados com melanoma (MAGE). Genes MAGE são predominantemente expressados em células de melanoma (incluindo melanoma maligno) e alguns outros cânceres incluindo NSCLC (câncer de pulmão não de célula pequena), carcinoma de célula escamosa de cabeça e pescoço, carcinoma de célula transicional de bexiga e carcinoma de esôfago, mas não são detectáveis em tecidos normais exceto no testículo e a placenta Gaugler er al Human gene MAGE-3 codes for an antigen recognized on a —melanoma by autologous cytolytic T Iymphocytes J Exp Med. 1994 Mar 1;179(3):921-930); Weynants et al Expression of mage genes by non-small- cell lung carcinomas Int. J Cancer. 1994 Mar 15;56(6):826-829, Patard et al Int J. Cancer 64: 60, 1995). MAGE-A3 é expressado em 69% de melanomas (Gaugler, 1994), e pode também ser detectado em 44% de NSCLC

(Yoshimatsu 1988), 48% de carcinoma de célula escamosa de cabeça e pescoço, 34% de carcinoma de célula transicional de bexiga, 57% de . carcinoma de esôfago, 32% de cânceres de cólon e 24% de cânceres de mama ' (Van Pel, et al Genes coding for tumor antigens recognized by cytolytic T & 5 Iymphocytes Immunological Reviews 145, 229-250, 1995, 1995.); Inoue 1995; Fujie 1997; Nishimura 1997). Cânceres expressando proteínas MAGE são conhecidos como tumores associados de Mage.

Uma grande quantidade de trabalho foi realizada em tempos recentes para auxiliar no diagnóstico e prognóstico de pacientes de câncer, por exemplo, para identificar aqueles pacientes que não requerem ainda tratamento porque eles não têm risco de metástase, recorrência ou progressão da doença.

WO 2006/124836 identifica certas assinaturas de expressão de " gene sobre várias vias oncogênicas, por meio disso definindo o prognóstico .- 15 do paciente e sensibilidade a agentes terapêuticos que objetivam essas vias. Os oncogenes específicos são; Myc, Ras, E2, S3, Src e beta-catenina.

US 2006/0265138 descreve um método de gerar um perfil genético, geralmente para identificar o tumor primário de modo que apropriado tratamento pode ser dado.

US 2006/0240441 e US 2006/0252057 descrevem métodos de diagnosticar câncer de pulmão baseada na expressão diferencial de alguns Benes.

US 2006/0234259 refere-se à identificação e uso de certos perfis de expressão de genes de relevância para câncer de próstata.

WO 2006/103442 descreve perfis de expressão de genes expressados no subconjunto de tumores positivos de receptor de estrogênio (ER), que agem como uma assinatura preditiva para resposta a certas terapias de hormônio como tamoxifeno e também certas quimioterapias.

WO 2006/093507 descreve um perfil de gene útil para caracterizar um paciente com câncer colorretal como tendo um bom prognóstico ou um prognóstico ruim, em que pacientes com um bom . prognóstico são apropriados para quimioterapia. 7 WO 2006/092610 descreve um método para monitorar & 5 progressão de melanoma baseada em expressão diferencial de alguns genes e novos marcadores para a doença, em particular TSBY1, CYBA e MT2A.

WO 2005/049829 descreve um conjunto isolado de genes marcadores que podem ser empregados para prever a sensibilidade de certos cânceres a um agente quimioterapêutico, que é um inibidor de receptor erbB —quinase, como gefitinib.

A formação do perfil de gene de microarranjo foi mostrada como sendo uma técnica poderosa para prever se pacientes de câncer responderão a uma terapia ou para avaliar o prognóstico da doença, 7 indiferente de quaisquer intervenções terapêuticas. Várias tentativas clínicas .- 15 em grande escala estão correntemente em progresso para validar os perfis acreditados como sendo associados com diferentes prognoses em câncer de mama e linfoma folicular (Dave, 2004; Hu, 2006; Weigelt, 2005).

Células, incluindo células de tumor, expressam muitas centenas e mesmo milhares de genes. Expressão diferencial de genes entre

20. pacientes que respondem a uma terapia comparada a pacientes que não respondem, pode possibilitar uma adaptação sob medida específica de tratamento para pacientes prováveis de responder ao mesmo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Em um aspecto a invenção provê um método de classificar um — paciente como um respondedor ou não respondedor a uma imunoterapia apropriada compreendendo as etapas de: (a) determinar os níveis de expressão de um ou mais genes em uma amostra derivada do paciente, em que o(s) gene(s) são selecionados da Tabela 1;

(b) classificar o paciente para ou um grupo respondedor ou não respondedor com base nos níveis de expressão de (a) usando um algoritmo . cujos parâmetros foram definidos por um conjunto de treino. " Em um aspecto a invenção provê um método de caracterizar & 5 um paciente como um respondedor ou não respondedor a uma terapia compreendendo as etapas: (a) analisar uma amostra derivada do paciente para expressão diferencial de produtos de gene de um ou mais genes de Tabela 1, e (b) caracterizar o paciente do qual a amostra foi derivada como um respondedor ou não respondedor, com base nos resultados de etapa (a), em que a etapa de caracterização é realizada por referência ou comparação a um padrão ou um conjunto de treino ou usando um algoritmo cujos parâmetros formam obtidos de um padrão ou conjunto de treino. : Em uma forma de realização provê-se um método de . 15 tratamento de um paciente por obtenção de uma análise de uma amostra derivada do paciente para expressão diferencial de produtos de gene de um ou mais genes de Tabela 1. Os resultados caracterizam um paciente como um respondedor ou não respondedor a uma imunoterapêutica e a etapa de caracterização é realizada por referência ou comparação a um padrão ou um — conjunto de treino ou usando um algoritmo cujos parâmetros formam obtidos de um padrão ou conjunto de treino.

O paciente é então selecionado para pelo menos uma administração de uma imunoterapêutica apropriada se o paciente for caracterizado como um respondedor à imunoterapêutica.

Em uma forma de realização provê-se um método de — determinação se um paciente é um respondedor ou um não respondedor a uma imunoterapêutica por obtenção de uma amostra derivada do paciente e análise da amostra derivada do paciente para expressão diferencial de produtos de gene de um ou mais genes de Tabela 1. Os resultados determinam se o paciente é caracterizado como um respondedor ou não respondedor a uma imunoterapêutica e a etapa de caracterização é realizada por referência ou comparação a um padrão ou um conjunto de treino ou usando um algoritmo . cujos parâmetros formam obtidos de um padrão ou conjunto de treino. , Em uma forma de realização, etapa (b) é baseada em uma " 5 função discriminante matemática ou uma árvore de decisões. A árvore de decisões pode envolver pelo menos uma etapa de classificação bivariada.

Em outra forma de realização, a presente invenção provê um método para caracterizar um paciente como um respondedor ou não respondedor à terapia compreendendo analisar, em uma amostra derivada do — paciente, um produto de gene reconhecido por um ou mais dos conjuntos de sonda listados em Tabela 1, cujas sequências alvo são mostradas em Tabela 3, em que a etapa de caracterização é realizada por referência ou comparação a um padrão ou um conjunto de treino ou usando um algoritmo cujos ' parâmetros formam obtidos de um padrão ou conjunto de treino.

215 Em uma forma exemplar de realização, o um ou mais genes ou conjuntos de sonda de Tabela 1 são pelo menos 63 genes listados em Tabela 1 ou pelo menos os 74 conjuntos de sonda listados em Tabela 1.

Em uma forma exemplar de realização, os métodos da invenção envolvem determinar os níveis de expressão dos genes ou medição — dos produtos de genes dos conjuntos de sonda especificados em Tabelas 2, 5, 7 ou 9. cada gene e conjunto de sonda nestas tabelas bem como grupos de genes ou conjuntos de sonda formam um aspecto específico desta invenção. Os genes e conjuntos de sonda em Tabelas 2, 5, 7 e 9 representam subconjuntos específicos dos genes e conjuntos de sonda em Tabela 1.

Provê-se também um perfil de gene preditivo que pode ser usado para diferenciar entre um paciente respondedor e um paciente não respondedor a MAGE-A3 ASCI ou qualquer abordagem imunoterapêutica, em que o perfil compreende um ou mais genes selecionados entre os genes listados em Tabela 1.

Em uma forma de realização provê-se um perfil de gene como descrito aqui, em que os genes são genes reconhecidos pelos conjuntos de . sonda listados em Tabela 1.

' Em um outro aspecto um perfil compreende ou consiste de & 5º todos os genes listados em Tabela 1 ou compreende ou consiste de todos os genes reconhecidos ou marcados pelos conjuntos de sonda listados em Tabela

LL Em um aspecto a invenção provê um microarranjo compreendendo sondas de polinucleotídeos complementares e hibridizáveis para uma sequência do produto de gene de pelo menos um gene selecionado entre os genes listados em Tabela 1, em que sondas de polinucleotídeos ou conjuntos de sonda complementares e hibridizáveis para os genes de Tabela 1 constituem pelo menos 50% das sondas ou conjuntos de sonda no referido + microarranjo.

215 Em um aspecto a invenção provê um microarranjo compreendendo sondas de polinucleotídeos complementares e hibridizáveis para uma sequência do produto de gene de pelo menos um gene selecionado entre os genes listados em Tabela 1.

Em um aspecto a invenção provê uma superfície sólida à qual são ligados to uma pluralidade de agentes de detecção de pelo menos 63 dos genes listados em Tabela 1, cujos agentes de detecção são capazes de detectar a expressão dos genes ou polipeptídeos codificados pelos genes. Em um aspecto a invenção provê um kit de diagnóstico compreendendo meios para detectar a expressão de um ou mais dos genes listados em Tabela | ou de produtos de gene dos genes listados em Tabela 1. A expressão pode ser detectada por meio de sondas hibridizando com produtos de genes mMRNA ou cDNA. Em um aspecto a invenção provê uma ou mais sondas para identificar produtos de gene, por exemplo, MRNA ou cDNA, de um ou mais genes de Tabela 1 ou de produtos de gene dos genes listados em Tabela 1. Em um aspecto a invenção provê o uso de PCR (ou outras . técnicas conhecidas) para identificação de diferencial expressão (como 7 regulação positiva) de um ou mais de produtos de gene de Tabela 1, ou de " 5 - produtos de gêne dos perfis de gene como descrito aqui.

Em outra forma de realização, a presente invenção provê um método de tratamento de um paciente caracterizado como um respondedor à terapia, compreendendo administrar uma terapia, vacina ou composição imunogênica como descrito aqui para o paciente.

10 Em outra forma de realização, a presente invenção provê um método de tratamento de um paciente caracterizado como um não respondedor a uma terapia de acordo com métodos descritos aqui ou uso de um kit de diagnóstico como descrito aqui, compreendendo administrar uma 7 terapia altemativa ou uma combinação de terapias, por exemplo, - 15 quimioterapia e/ou radioterapia podem ser usadas em vez de ou além de uma vacina ou composição imunogênica como descrito aqui.

Em outra forma de realização, a presente invenção provê uso de uma composição compreendendo um antígeno associado a tumor na preparação de um medicamento para o tratamento de pacientes caracterizados como respondedores de acordo com métodos descritos aqui, uso de um microarranjo como descrito aqui, uso de um perfil de gene como descrito aqui ou uso de um kit de diagnóstico como descrito aqui.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Figura 1/21 mostra o esquema para a validação cruzada por — exclusãoindividual (LOOCV).

Figura 2/21 mostra os resultados do LOOCV selecionando o melhor 100 PS para classificação em cada circuito. Círculos abertos = não respondedor, ramo ASO02B. Círculos fechados = respondedor, ramo ASO02B. Triângulo aberto = não respondedor, ramo AS15. Triângulo fechado = respondedor, ramo AS15. Figura 3/21 mostra o número de vezes que um conjunto de . sondas (PS) estava dentro de 100 s2n de topo (sinal para ruído) em cada , LOOCV (número PS no eixo X).

. 5 “— Figura 4/21 mostra as curvas de Kaplan-Meier (KM) para sobrevivência global por adjuvante com todos pacientes na experiência melanoma Fase II. Linha sólida = ramo AS15. Linha pontilhada = ramo ASO02B.

Figura 5/21 mostra o KM para sobrevivência global por " assinatura de genes baseada em classificação LOOCV. Linha sólida = assinatura de genes positiva (GS+); linha pontilhada = assinatura de genes negativa (GS-).

Figura 6/21 mostra curvas de Kaplan-Meier de sobrevivência ' global por adjuvante e assinatura de genes baseada em classificação LOOCV.

. 15 Linha sólida pesada = ramo AS1I5, GS+. Linha pontilhada pesada = ramo AS15, GS-. Linha sólida clara = ramo AS02B, GS +. Linha pontilhada clara = ramo AS02B, GS-.

Figura 7/21 mostra classificação de amostras usando 100 PS (sem exclusão individual). Círculos abertos = não respondedor, ramo ASO02B. Círculos fechados = respondedor, ramo ASO2B, Triângulo aberto = não respondedor, ramo AS15. Triângulo fechado = respondedor, ramo AS15. Figura 8/21 mostra classificação por exclusão individual de amostras correspondentes usando os 22 genes medidos por PCR especificado em Tabela 5. Círculos abertos = não respondedor, ramo ASO2B. Círculos — fechados =respondedor, ramo ASO02B. Triângulo aberto = não respondedor, ramo AS15, Triângulo fechado = respondedor, ramo AS15. Figura 9/21 mostra classificação de amostras usando os 22 genes especificados em Tabela 5 (sem exclusão individual). Círculos abertos = não respondedor, ramo ASO02B. Círculos fechados = respondedor, ramo

ASO02B. Triângulo aberto = não respondedor, ramo AS15. Triângulo fechado = respondedor, ramo AS15.

. Figura 10/21 mostra o projeto de experiência Fase II NSCLC.

' Figura 11/21 mostra a curva KM para intervalo livre de doença & 5 —paraa experiência NSCLC. Linha sólida com círculos = MAGE-A3; linha tracejada com quadrados = placebo.

Figura 12/21 mostra a metodologia Cox-SPCA usada nos exemplos deste pedido. Figura 13/21 mostra curvas de sobrevivência por perfil de genes baseado na classificação LOOCV com mediano como corte usando os 23 genes listados em Tabela 6 medidos por PCR. Linha sólida pesada = imunoterapia MAGE, GS+. Linha pontilhada pesada = imunoterapia MAGE, GS-. Linha sólida clara = placebo, GS +. Linha pontilhada clara = placebo, ' GS-.

- 15 Figura 14/21 mostra distribuição do escore de risco dentre placebo (painel à esquerda) e ramo de vacina (painel à direita) nas 129 amostras de NSCLC usando os 23 genes listados em Tabela 6 medidos por PCR usando classificação LOOCV. Diamantes fechados = relapso; diamantes abertos = não relapso.

Figura 15/21 mostra o resultado clínico baseado em classificação usando os 23 genes por Q-PCR no classificador como listados em Tabela 6 (sem exclusão individual). Linha sólida pesada = imunoterapia MAGE, GS+. Linha pontilhada pesada = imunoterapia MAGE, GS-. Linha sólida clara = placebo, GS +. Linha pontilhada clara = placebo, GS-.

Figura 16/21 mostra o escore de risco dentre placebo (painel à esquerda) e ramo de vacina (painel à direita) baseado na classificação usando os 23 genes por Q-PCR no classificador como listados em Tabela 6 (sem exclusão individual), Diamantes fechados = relapso ; diamantes abertos = não relapso.

Figura 17/21 mostra curvas de sobrevivência por perfil de genes baseado em classificação LOOCV com mediano como corte em 129 . amostras de NSCLC usando os 22 genes listados em Tabela 5. Linha sólida ' pesada = imunoterapia MAGE, GS+. Linha pontilhada pesada = imunoterapia 1 5 MAGE, GS- Linha sólida clara = placebo, G8 +. Linha pontilhada clara = placebo, GS-. Figura 18/21 mostra distribuição do escore de risco dentre placebo (painel à esquerda) e ramo de vacina (painel à direita) em 129 amostras de NSCLC usando os genes listados em Tabela 5 usando classificação LOOCV.

Diamantes fechados = relapso; diamantes abertos = não relapso.

Figura 19/21 mostra o resultado clínico baseado na classificação usando os 22 genes por Q-PCR no classificador como listados ' em Tabela 5 (sem exclusão individual). Linha sólida pesada = imunoterapia .- 15 MAGE, GS+. Linha pontilhada pesada = imunoterapia MAGE, GS-. Linha sólida clara = placebo, GS +. Linha pontilhada clara = placebo, GS-. Figura 20/21 mostra o escore de risco baseado na classificação usando os 22 genes por Q-PCR no classificador como listados em Tabela 5 (sem exclusão individual). Diamantes fechados = relapso; diamantes abertos =nãorelapso.

Figura 21/21 mostra ta proteína D 1/3 - MAGE3 — proteína HS.

Identificadores de sequências e Tabelas: Os seguintes identificadores de sequência são incluídos na — listagem de sequências: SEQ ID NO: 1-100 —Sequências alvo de conjuntos de sondas mostrados em Tabela 3 SEQ ID NO: 101 — Proteína D — proteína de fusão MAGE-A3 SEQ ID NO: 102-106 —sequências de oligonucleotídeos CpG

SEQ ID NO:107- 113 —-sequências de peptídeos MAGE Tabela 1: 100 PS e lista de genes correspondente. . Tabela 1A: 100 PS selecionado usando todas as amostras e os ' tempos selecionados em LOOCV vo - — Tabela 2: Subconjunto de 27 PS e 21 genes da Tabela 1. | Tabela 3: 100 sequências alvo PS. Tabela 4: Média, desvios padrão (Sd) e Coeficientes PC, para características de classificador de 100 PS. Tabela 5: Subconjunto apropriado de 22 genes em melanoma. Tabela 6: Média, desvios padrão (Sd) e coeficientes PC1 para características de classificador de 22 genes in melanoma. Tabela 7: Subconjunto apropriado de 23 genes em NSCLC Tabela 8: Média, desvios padrão (Sd) e coeficientes PC1 para . características de classificador de 23 genes em NSCLC. 215 Tabela 9: Subconjunto apropriado de 22 genes em NSCLC Tabela 10: Média, desvios padrão (Sd) e coeficientes PC1 para características de classificador de 22 genes em NSCLC. Tabela 11: Desempenho de classificação de genes individuais medido por Q-PCR em amostras de melanoma Tabela 12: Desempenho de classificação de genes individuais medido por Q-PCR em amostras de NSCLC Tabela 13: Desempenho de classificação de genes individuais medido por microarranjo em amostras de melanoma

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Perfil de Gene Preditivo Análise realizada em tecido de tumor de pré-tratamento de pacientes tendo melanoma maligno, após ressecção cirúrgica, identificou que certos genes foram diferencialmente expressados em pacientes que foram mais prováveis para responder à terapia (respondedores), em comparação aos pacientes que foram menos prováveis de responder (não respondedores). Os presentes inventores descobriram um perfil de gene que é . preditivo da probabilidade da resposta do paciente à terapia. " Por "perfil de gene" entende-se um gene ou um conjunto de À 5 —genesa expressão de que correlaciona com paciente resposta à terapia devido ao gene ou conjunto de genes exibe(m) expressão diferencial entre pacientes tendo uma favorável resposta à terapia e pacientes tendo uma pobre resposta à terapia. Em uma forma de realização da invenção o termo “perfil de gene” se refere aos genes listados em Tabela 1 ou a qualquer seleção dos genes de —Tabelal que é descrita aqui.

Como usado aqui, uma “resposta favorável (ou “resposta clínica favorável”), por exemplo, a um tratamento anticâncer se refere a uma resposta biológica e física que é reconhecida por aqueles versados na técnica ' como indicando uma taxa diminuída de crescimento de tumor, comparado a .- 15 crescimento de tumor que ocorreria com um tratamento alternado ou a ausência de qualquer tratamento. Uma resposta clínica favorável à terapia pode incluir uma diminuição de sintomas experimentados pelo indivíduo, um aumento no tempo de sobrevivência esperado ou conseguido, uma taxa diminuída de crescimento de tumor, cessação de crescimento de tumor (doença estável), regressão no número ou massa de lesões metastáticas, e/ou regressão da massa de tumor global (cada como comparado a que ocorreria na ausência de terapia, ou em resposta a uma terapia alternada). No caso de terapia de câncer ajudante, uma resposta clínica favorável pode incluir uma ausência ou relapso ou atraso em taxa de relapso ou aumento em tempo de — sobrevivência livre de doença ou tempo de intervalo.

"Expressão diferencial" no contexto da presente invenção significa que o gene é regulado de modo positivo ou regulado de modo negativo em comparação à sua expressão normal. Métodos estatísticos para calcular expressão diferencial de genes são discutidos em outra parte aqui.

Em alguns aspectos, a invenção provê um perfil de gene para caracterizar um paciente como um respondedor ou não respondedor à terapia, . em que o perfil compreende expressão diferencial de pelo menos um gene de ' Tabela 1, ou em que o perfil compreende ou consiste dos genes listados em % 5 Tabela 1. Um perfil pode ser indicativo do respondedor ou não respondedor.

Em uma forma de realização, os perfis de gene descritos aqui são indicativo de respondedores.

As sequências de gene reconhecido ou objetivado pelos conjuntos de sonda de Tabela 1 são listados em Tabela 3. Por “genes de Tabela 1” é entendido os genes listados abaixo “Nome de Gene” em Tabela 1, 2, 5, 7 ou 9. Por “produto de gene” é entendido qualquer produto de transcrição ou translação dos genes, se produzido por meios natural ou artificial. ' Em uma forma de realização da invenção, os genes referidos . 15 aquisão aqueles listados em Tabela 1, 2, 5, 7 ou 9 como definido na coluna indicando “Nome de Gene”. Em outra forma de realização, os genes referidos aqui são genes o produto de que são capazes de ser reconhecido pelos conjuntos de sonda listados em Tabela 1. Enquanto não desejando estar limitado por teoria, formula-se a hipótese de que a assinatura de genes identificados na Tabela | é de fato indicativa de uma resposta imune/inflamatória, tal como uma resposta de infiltração/ativação de célula T nos pacientes que são designados como respondedores, por exemplo, a assinatura pode representar um marcador de ativação de célula T.

A assinatura pode também representar marcador Th1 incluindo membros de via de interferon que tende a favorecer a indução de respostas imunes mediadas de célula.

Pensa-se que a presença dessa resposta auxilia o corpo do paciente para lutar contra a doença, como câncer, após administração da imunoterapia assim tornando um paciente mais respondente à referida imunoterapia.

Deste modo, as assinaturas da presente invenção geralmente não se focam em marcadores/genes especificamente associados com o . diagnóstico e/ou prognóstico da doença relevante, por exemplo, câncer como ' oncogenes, mas sim são preditivas de se o paciente responderá a uma & 5 —imunoterapia apropriada, como imunoterapia de câncer. " Pensa-se que um perfil de gene identificado aqui seja um indicativo do microambiente do tumor. Pelo menos nesse aspecto, o microambiente correto do tumor parece ser chave para se o paciente responde a uma apropriada imunoterapia de câncer.

A biologia da assinatura é relevante ao modo ASCI de ação uma vez que contém genes que sugerem a presença do microambiente de tumor específico (quimiocinas) que favor presença de células de efetoras imune nos pacientes de tumor de respondedor que mostram regulação positiva ' de marcadores de célula T e marcadores Th1l incluindo membros de via de . 15 interferon Um recente estudo de formação de perfil de expressão de gene em melanoma metatástica revelou que tumores poderiam ser segregados baseado na presença ou ausência de transcritos associados com célula T (Harlin, 2009). A presença de linfócitos em tumores correlacionados com a expressão do subconjunto de seis quimiocinas (CCL2, CCL3, CCLA, CCL5, CXCLS9, —CXCLIO), três desses seis genes (CCL5, CXCL9, CXCLI1O) estão presentes na 100 PS de Tabela 1.

Em uma forma de realização a invenção emprega um ou mais (como substancialmente todos) os genes listados em Tabela 1. De modo apropriado a invenção emprega pelo menos 63 dos genes ou 74 de conjuntos —desondalistados em Tabela 1.

De modo apropriado, o um ou mais genes de Tabela 1 são pelo menos 63, pelo menos 64, pelo menos 65, pelo menos 66, pelo menos 67, pelo menos 68, pelo menos 69, pelo menos 70, pelo menos 71, pelo menos 72, pelo menos 73, pelo menos 74, pelo menos 75, pelo menos 76, pelo menos 77, pelo menos 78, pelo menos 79, pelo menos 80 ou substancialmente todos os genes listados em Tabela 1 e/ou qualquer combinação dos mesmos.

. De modo apropriado, o um ou mais conjuntos de sonda de 7 Tabela 1 são pelo menos 74, pelo menos 75, pelo menos 76, pelo menos 77, “ 5 pelomenos 78, pelo menos 79, pelo menos 80, pelo menos 81, pelo menos 82, pelo menos 83, pelo menos 84, pelo menos 85, pelo menos 86, pelo menos 87, pelo menos 88, pelo menos 89, pelo menos 90 ou substancialmente todos os conjuntos de sonda listados em Tabela 1 e/ou qualquer combinação dos mesmos.

Substancialmente todos no contexto das listas de gene serão pelo menos 90%, tal 95%, particularmente 96, 97, 98 ou 99% dos genes na lista de dados.

Em um aspecto a invenção é empregado na configuração ' metatástica.

215 Se um gene for sempre regulado de modo positivo ou sempre regulado de modo negativo em pacientes que são considerados como ser respondedores (ou alternativamente não respondedores) então esse gene único pode ser usado para estabelecer se o paciente é um respondedor ou um não respondedor uma vez que um limiar é estabelecido e desde que a separação —dosdoisgrupos seja adequada.

Em um aspecto a invenção provê um perfil de gene para identificar um respondedor compreendendo um ou mais de referidos genes em que 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 ou 100% dos genes são regulados de modo positivo. Em contraste em não respondedores o gene/genes não é/são — regulados de modo positivo ou é/são regulados de modo negativo.

No contexto da presente invenção, a amostra pode ser de qualquer tecido biológico ou fluido derivado de um paciente potencialmente em necessidade de tratamento. A amostra pode ser derivada de catarro, sangue, urina, ou de tecidos sólidos como biópsia de um tumor primário ou metástase, ou de seções de tecidos previamente removidos. Amostras poderiam compreender ou consistir de, por exemplo, . núcleos de biópsia de agulha, amostras de ressecção cirúrgica ou tecido de ' linfonodo. Esses métodos incluem obtendo uma biópsia, que é opcionalmente T 5 — fracionada por secionamento de criostato para enriquecer células de tumor para cerca de 80% da população celular total. Em certas formas de realização, ácidos nucleicos extraídos dessas amostras podem ser amplificados usando técnicas bem conhecidas na arte. Os níveis de marcadores selecionados pode ser detectado e pode ser comparado com grupos estatisticamente válidos de, —porexemplo, pacientes de não respondedor positivo Mage.

Para análise em relação ao câncer, a amostra biológica será tomada assim como para maximizar a oportunidade para a amostra para conter câncer ou células de tumor e pode, por exemplo, ser derivado do º câncer ou tumor tal como uma amostra fresca (incluindo amostras . 15 congeladas)ouuma amostra que foi preservada em parafina. Tendo referido isso, amostras preservadas em parafina podem sofrer de degradação e o perfil observado pode ser modificado. Uma pessoa versada trabalhando no campo consegue compensar essas mudanças observadas por configurando novamente os parâmetros do perfil. Em um aspecto a amostra biológica é uma amostra de biópsia, por exemplo, de um tumor ou tecido canceroso.

Em um aspecto a imunoterapia de câncer é para o tratamento de melanoma, câncer de pulmão por exemplo NSCLC, câncer de bexiga, câncer de pescoço, câncer de cólon, câncer de mama, carcinoma de esôfago e/ou câncer de próstata, como câncer de pulmão e/ou melanoma, em particular melanoma.

“Respondedor” no contexto da presente invenção inclui pessoas onde o(s) câncer/tumor(es) é(são) erradicado(s), reduzido(s) ou melhorado(s) (Respondedor Completo ou Respondedor Parcial; Respondedor

Misto) ou simplesmente estabilizado tal que a doença não está progredindo (“Doença estável”). “Respondedor clínico completo” em respeito de câncer é . em que todas das lesões alvo desaparecem. S “Respondedor clínico parcial” ou “Respondedor parcial” com Y S relaçãoa câncer é em que todos os tumores/cânceres respondem ao tratamento em alguma extensão, por exemplo, onde referido câncer é reduzido por 30, 40, 50, 60% ou mais. “Doença progressiva” representa 20% de aumento em tamanho de lesões alvo ou a aparência de um ou mais novas lesões ou ambas dessas.

Pacientes com doença progressiva (PD) podem ainda ser classificados para PD sem resposta mista ou doença progressiva com “Respondedor clínico misto” de tipo I ou II ou “Respondedor misto” em relação ao câncer é definido como um em que alguns dos tumores/cânceres ] respondem ao tratamento e outros permanecem não mudados ou progridem. 215 Não Respondedores (NR) são definidos como pacientes com doença progressiva sem resposta mista e doença progressiva com resposta mista Il que não mostraram desaparecimento de pelo menos uma lesão alvo. Em respondedores onde o câncer é estabelecido então o período de estabilização é tal que a qualidade de vida e/ou expectativa de vida — de pacientes é aumentada (por exemplo, doença estável por mais do que 6 meses) em comparação a um paciente que não recebe tratamento.

Em algumas formas de realização, o termo “respondedor” pode não incluir um “Respondedor misto”. Uma caracterização preditiva do novo paciente como um — respondedor (assinatura de genes positiva) ou não respondedor (assinatura de genes negativa) pode ser realizada por referência a um “padrão” ou um conjunto de treino ou por usando um modelo matemático /algoritmo (classificador) cujos parâmetros foram obtidos de um conjunto de treino. O padrão pode ser o perfil da pessoa/paciente(s) que é conhecido para ser um respondedor ou não respondedor ou alternativamente pode ser um valor numérico.

Tais padrões pré-determinados podem ser providos em qualquer . forma apropriada, tal como uma lista impressa ou diagrama, programa de ' sofiware de computador, ou outros meios de comunicação. vos Ú — ” O padrão é de modo apropriado um valor para, ou uma função de, uma expressão de um produto de gene ou produtos em um paciente ou pacientes que têm um conhecido estado de respondedor ou não respondedor, tal que comparação da informação padrão com informação com respeito à expressão do mesmo genes na amostra derivada do paciente permite uma — conclusão para ser tirada sobre estado de respondedor ou não respondedor no paciente.

O padrão pode ser obtido usando um ou mais genes de Tabela 1, e de análise de um ou mais indivíduos que são conhecidos para ser respondedores ou não respondedores. : Não limitando exemplos de dados de treinamento ou . 15 parâmetros obtidos do conjunto de treino são o conjunto de dados de referência, quantis de referência, efeitos de sonda ou os dados de formato de objeto R usados para normalização de amostra como discutido em Exemplo 1 abaixo.

Uso desses exemplos específicos na classificação de pacientes como respondedores ou não respondedores forma um aspecto específico desta invenção.

Em um aspecto, a análise estatística é realizada por referência a um padrão ou conjunto de treino.

A lista de genes em Tabela 1 foi gerada calculando o sinal para ruído de cada conjunto de sonda usando o resultado clínico (Respondedor e Não Respondedor) dos pacientes no conjunto de — treino como os grupos na comparação.

Parâmetros de classificador derivados do conjunto de treino são então usados para prever a classificação para novas amostras.

Conjunto de treino no contexto da presente especificação é pretendido para referir-se a um grupo de amostras para que os resultados clínicos possam estar correlacionados com o perfil de gene e possam ser empregados para treinar um apropriado modelo estatístico/programa para . identificar respondedores e/ou não respondedor para novas amostras. ' Enquanto não desejando estar limitado por teoria, pensa-—se v S —quepelomenos68 dos 100 genes em Tabela 1 são resistentes a mudanças no conjunto de treino. Esses genes formam um aspecto específico desta invenção. Esses genes podem ser identificado de coluna 5 de Tabela 1A.

Em um aspecto, um modelo matemático/algoritmo/método estatístico é empregado para caracterizar o paciente como respondedor ou não —respondedor.

O algoritmo para caracterização usa expressão de gene informação de qualquer um gene e qualquer um respondedor ou não respondedor conhecido e é de modo apropriado baseado em análise de : componente principal supervisionada, embora qualquer algoritmo apropriado . 15 de caracterização possa ser usado, por exemplo qualquer um dos algoritmos dos Exemplos 1 -7.

Especificamente o algoritmo pode gerar um padrão de um indivíduo ou um conjunto de treino com um resultado clínico conhecido usando a análise de componente principal supervisionada com algoritmo de análise discriminante como mostrado em exemplo 1 ou a análise de componente principal supervisionada com a regra de decisões de Cox como mostrado em exemplo 3.

Assim, em um aspecto a invenção também se refere ao desenvolvimento do classificador para caracterização do novo paciente como um respondedor ou não respondedor, os parâmetros do classificador sendo obtidos de um conjunto de treino com resultado clínico conhecido (Respondedor e Não Respondedor).

As listas de gene podem ser geradas usando sinal para ruído, análise de Baldi uma variação do teste T clássico, e/ou coeficiente de correlação de Pearsons e/ou análise discriminante Linear. Ver por exemplo Golub T, Slonim D, Tamayo P et al. Molecular classification of cancer: class . discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science 1999; 7 286: 531—536. Van 't Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ, He YD, Hart AA, . 5 MaoM, Peterse HL, van der Kooy K, Marton MJ, Witteveen AT, et al. (2002) Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature, 415(6871), 530-556.

O classificador poderia usar componentes principais supervisionados, análise discriminante, centróide mais próximo, kNN, máquinas de vetor de suporte ou outros algoritmos apropriados para classificação; incluindo algoritmos que usa tempo (por exemplo tempo de sobrevivência, tempo de intervalo livre de doença) para classificação. Alternativamente, classificação pode ser conseguida usando outros métodos . matemáticos que são bem conhecidos na arte.

2 AS O classificador pode compreender um SPCA com regra de decisão DA exemplificada em exemplo 1 e/ ou 2 ou a regra de decisão de SPCA-Cox exemplificada em exemplo 3 e/ou 4.

Em algumas formas de realização, os métodos descritos são maiores que 50%, 60% ou 70% precisos como cerca de 70% precisos em —preverrespondedores e não respondedores corretamente.

Em uma forma de realização o respondedor e não respondedor são definidos por referência para o tempo para falha de tratamento (TTFY/ sobrevivência global (OS), que é uma variável contínua e pode por exemplo ser medida em meses. Em que o tempo para falha de tratamento variável é grande então o paciente será considerado como sendo um respondedor. Em que o tempo para falha de tratamento variável é pequena então paciente será considerada para ser um não respondedor. Geralmente usando essa abordagem os respondedores mistos são também agrupados com os respondedores.

Falha de tratamento é onde o paciente não cai com a definição de respondedor, respondedor parcial, misto respondedor ou doença estável . como definido aqui. : Em um aspecto não respondedores podem ser definidos como x 5 —aquelescomum TTF de6 meses ou menos.

Em um aspecto os respondedores podem ser definidos como aqueles com um TTF de mais do que 6 meses, por exemplo 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou mais meses.

Em um aspecto da invenção, a resposta de paciente a um tratamento é o intervalo livre de doença (DFI) ou sobrevivência livre de doença (DFS) que são variáveis contínuas e pode, por exemplo, ser medidas em meses. DFI e DFS são usados, por exemplo, em um tratamento com adjuvante; que é o caso quando o tumor foi removido e o tratamento provê-se ' para evitar ou retardar relapso ou equivalentemente para estender o intervalo ' 15 livrede doença ou sobrevivência.

DFI e DFS podem estar correlacionados com a informação clínica de pacientes ou parâmetros de pacientes medidos como biomarcadores ou um perfil de expressão de genes e podem ser usados para construir um modelo matemático para prever a resposta do novo paciente.

Em um aspecto, os métodos da invenção envolvem determinar os níveis de expressão dos genes ou medição dos produtos de genes dos conjuntos de sonda listados em Tabela 1.

Em um aspecto, a invenção envolve uso de um ou mais (como substancialmente todas) os genes ou conjuntos de sonda listados em Tabela 1 para prever ou identificar um paciente como um respondedor ou não respondedor para imunoterapia para ambos, câncer de pulmão e melanoma, de modo apropriado imunoterapia baseada em um câncer de testículo antígeno como Mage. De modo apropriado à invenção emprega pelo menos 63 dos genes ou 74 de conjuntos de sonda listados em Tabela 1.

Tabela 1 Símbolo de gene | Símbolo de gene de acordo 1D Affy de acordo com|com anotação R2.9 Anotação Affymetrix ' AFFX- ' LI HUMISGF3A/M9793 | STATI STATI by SMBa - |

Y [16 [203915 a exe exe [19 [204533 a Jexcro je ÔNúNN | 110 [205758 coa [e "| [Lg [asa — [MBA [TRBCD | Y TRA /// TRAC /// TRAI HLA-DRA 122 123 TRBC1 /// TRBC2? HLA-DQA! TARP /// TRGC2 HLA-A /// HLA-A291 /// 217436 x at HLA-A HLA-B /// HLA-G /// HLA-H /// HLA-J

1.34

Símbolo de gene | Símbolo de gene de acordo anotação R2.9 Anotação Affymetrix

E - : " 145 CDC42SE2 DZIP1 DZIP1 FAM26F

1.53

1.54 L55 156 : [161 [209774xa exe À jexaa : [1.66 [205685 at ———JCos6 —Jcps

KLRDI CD3D

MAPIB [1.86 [222962 sat Memo Meo

Símbolo de gene |Símbolo de gene de acordo ID Affy de acordo com|com anotação R2.9 Anotação Affymetrix : : [189 [234907 xa — [GOLGAT — [NA [190 [2075365a — |[TNFRSEO — |[INFRSP | x Rg 209671 x at

1.94 [1% [22108 sa ——|DENNDOID —V|DENNDIDO UÚiíúÚ| [1.98 [202644 sa | TNFAIRR | tNFrAzBa *; Anotação de R2.6 que se torna NA em R2.9 Em um aspecto, os métodos da invenção envolvem determinar os níveis de expressão dos genes ou medição dos produtos de genes dos ' conjuntos de sonda listados em Tabela 2. - 5 Tabela? tias o iate Tara Conjunto de sonda anotação R2.9 com Anotação Affymetrix AFFX- HUMISGF3A/M97935 MB at | STATI DZIP1 HOMER]

ICOS KIAA1549 HLA-A /// HLA-A29.1 /// HLA-B /// HLA-G /// HLA-H 217436 x at HLA-A //l HLA-J 222962 s at

| conjunto de sonda — Nome do gene|Símbolo de gene de acordo Conjunto de sonda anotação R2.9 com Anotação Affymetrix . . - . *: Anotação de R2.6 que se torna NA in R2.9 As sequências alvo para os conjuntos de sonda listados em Tabela 1 são providas abaixo.

Ú Tabela 3 [SEQ ID NO:1] Tagoeattaccettctgacactetetatgtagectecetgatettettteagetectetattaaas gaaaagttctttatgttaattatttacatettectecagegcecttectetgcetactggggtect cetattctttaggtttaatittaaatatgtcacetectaagagaaacettoccagaccactettte , 1552497 a at taaaatgaatcttetaggctgggcatggtggetcacacetegtaateccagtactttegrage ceaagggegggagatcacttgaggtcaggapttcaagaccagectggocaacttggtgaa % accccgtetttactaaaaatacaaaaaaattagecaggcgtegtiggtgcaccectaaaate coagetactigagagactgaggcaggagaategottgaacecaggagetggagetteca Btgagccaaaatcatgccaatetattccagtetg [SEQ ID NO:2] [SEQ ID NO:3] geatgecttegacteatggacagagttetttnggattgtcactgaattticaatetitaatoasg tatggatctgatettegeatgatettttingtgaatgctaacaccattttgcagttttttttitotatt ttaaacatttttettttcactgccgancecnnngecttacgattitatnnggaaageaaggac 1552613 s at entgctattattnntntaatitgccatcatttatgtatatinnggaaggtatgagacccacaag cacaantgatcattttnatingttnginngtingaaacttcagcagaatagatatetgcatgc tttatgaangttgttgottcggtaagageccatgggatgccagaaattaacatttetttectec catgggntgatgatgctegctattagataaangtitagctgtggnaccaagicacateatitie atagaaaaagatnactigtagocttattttagaagtatgaccttttggtetetitga [SEQ ID NO:4] Caggtggcacaaattaaatecatcttgaagacttcacacattaatitegtgaagaacttgac attctttitagaagacttatgatticaatttgctaccaatgagaagaggcaaateaacaaatitet caatttategggectataattatagtatataatetatctgatagaaaatitgataagaaaateta 1553132 a at atgaatittatcagatatccaaagtaaageaaatetittaaaactgcaacaagagacacaga cagtaaaatcaaagtattattaggatgactaaataaattataaagtctgtgagaatateaaco atagatagttctttctatattatgttittgctttigtattttaagotttacttagnatattcaaaacetg, gtatateaagtetetgttagtactatiggcatttagaagactttaccattatttcagtectagge attattgattaggtettggotecactetitacet

[SEQ ID NO: 5] Acacttggttgggtectoacatettteacacticcacoagectgeactacteceteaaagea 1554240 a at cacgtcatgtttetteatocggcagectegategttttttecetetitaatgatigacgtacttage . agotatcteteagtgaactgtgagegtaaagegctatacttgtettgttoacettgggatgatg . ceteatgatateteagggegtgggacatetagtaggtegcttgacataa . - [SEQ ID NO: 6] 7 1555759 a at cecgtgeceacatoaaggagtatttetacaccagtggcaagtgctecaacecageagteg, TF tetttgteaceegaaagaaccgecaagigigtgccaacecagagaagaaategeticags agtacate [SEQ ID NO: 7] ccattetgagtacttetecgeaaacectitettteattaaggactegtittacatgaagggtgca aaagtaggataaaaatgagaaccctagggtgaaacacgtgacagaagaataaagactatt 1555852 at gaatagtectettetetacecatggacnttgenatttttatatingattitaaggaaatataactt agtagtaaagagatgagcattcaagtcaggcagacctgaattitaeggtcaaggetgegeca cteaaaagetatatgacctetatatgageagettaticaacctotittaacetocattttgteate tgtagaatgatgataaatgcetageteagaaggatteo [SEQ ID NO: 8] atgttcactgtatgtegccaagectaatatgagagctatgtattatagagtttatectacagece 1562031 at taccttcaggaaacttatetactggacaaacaaaaatiticaaatatacaaaaaattctaaate gaacattgtaattatetagcataggcaaatatagacagtaacagacaggtttacaattattaa , gaaagegcagecags [SEQ ID NO: 9] - Atcgaggaagatatactgccaagtcaggaagaaaaaatccacctegttcagtgattteagg aactgctgaagaaaatcaccagtgagtatcagtttetgcaagagaatetaatgcagecttto 1562051 at ctteteateggaatececcagetagtetettggtigactgagagteteggggagagggoa 7 gagaatggatttattctetectagetititaacagtcaagaagegctetegtcctaagegse actggteaaaccettagtetecatcagaattatetggataaggctaggcacagtggcteacg cetgtaateacageactttgggaggetgaggegogtggateacetgaggteagaagttea agaccagcctggctetittagtagas [SEQ ID NO:10] gaaaattectggcagttteaactetgatagacattgctaacctegttctccaaagagectgaa ceaatttetetttecteaacagtgtatgactetttececeatetattetecageactgaggatta agtaactttcatitttstcagtetgacagatataaageagaacatttctgcataaggttctaca 1563473 at gtaatttttagattttatgaccctttagattatgccetacataatgatgateaaataticagaaact acattgtacctggccttaggettggaatiggatacaaaattaaatgaaaccagoetttteceet cagettgatcecatotectggastiggcagacaaatgaacaaataaaatgagageaaaac tetatggtteacatigtgctagagaaatecataagettagetaacttttgtitgataaactetat attcattaatatcacaaatgaatticataaaataccgtatgcattatgteccagesg [SEQ ID NO:11] Gggcaggacatgctgtaceaatecctgaageteactaatescatttegatitiggcegaac tacgtatccagecaggaaaccccaattacacgcetgteactgaagtetagagetectgaagt cteteaatacatetatcaggtetacgacageatttigaaaaactaacaagacteggtecagta 200615 s at cecttcaaccatgetgtgatcggtgcaagteaagaactcettaactggaagaaattgtattect gegtagaatetgaacacactgaggecacetageaagetagtaactagtetaacoetegtecta acattagggcacaacctettegatagttitagcttoctetgaacatttgtaaccactgcticag teaceteceacetettgecacetgetgetgetatetgtecttacttgteggettetecatgetet gecaatggoetggotttitotacace

[SEQ ID NO:12] Gecacagactgaactegcagggagtgeageaggaaggaacaaagacaggcaaaces caacgtagcectgggcteactgtgetegggoategegggatoctecacagagaggages ' gaccaattctegacagacagatgtigggaggatacagaggagatgccactteteacteac W 201474 s at cactaccagecagectecagaaggccecagagagacectgcaagaccacggagegas - -— cegacacttgaatetagtaataggcagegggecetgecaceceatecagecagacecea % gotgaaccatgcgteaggggoctagaggtegagttettagetatecttgactttetatacea gectggetetgeceeteceecatgggetgtgteetaaggeccatttragaagetgagegeta gttecaaaaacctetecte [SEQ ID NO:13] Acaggagtcagtgteteggetttttectetgageceagetgcetegagageggtetegetgte actggcetggetectaggggaacagaccagtgacccragaaaageataacaceaatecea EBggetggetetgcactaagegaaaattgcactaaatgaatetogttecaaagaactaceco 202531 ttttcagetgagecetggggactettecaaagecagtgaatgtgaaggaaactececetectt at Ccggggcaatecteceteagecteagaggagetetaceetgetecetectitagetaaggs gettgggaaaaaaactteggcactttttegtegte gatettgecacatttetgatcagaggtgta cactaacatttececegagetettggcctitecatttatitatacagtgecttgcteggggeco accacceceteaagececageageceteaacageeccagegagegaagtetgagege cttggtatgacttaa [SEQ ID NO: 14] tctttggettattactgtctttacttetaaagaagttagetigaactgaggagtaaaagtgtgta , catatataatatacccttacattatgtatgagggatttttitaaattatattgaaatectgccetag aagtacaataggaaggctaaataataataacctettttetggttettetiggegoatgagett « 202643 s at gtgtatacactgcttgcataaacteaaccagetgectttttaaaggegagetetagtectttttet —— gtaattcactitatttatittattacaaacttcaagattatttaagtgaagatatttettcagetete Bggaaaatgecacagtgttetectgagagaacatectigetttgagteaggetgtgggeaa Bgttectgaccacagegagtaaattgegcctettigatacacttttactigcotececaggaaas aaggaattgcatecaagetatacatacatattcategatetttegtgettetecttateaaacte cage [SEQ ID NO:15] catcocatggtaccetggtatigggacageaaaagecagtaaccatgagtatgaggaaat ctetttotettgetggettacagtttetetgtgtectttetegttectgteatatitgctetagaasg aaaaaaaaaaaaprapeggaaatecattttecccagagataaagectgccattttegege 202644 s at tctgtacttatggectgaaaatatttetgatecataactetacacagectttacteatactattag goacactttececttagagececcotaagtittteccagacgaatetttataatttectttocaaa gataccaaataaacttcagtetttteatetaattctettaaagttgatatcttaatattttetetiga toeattatttocattettaatetgaaaaaaagtaattatitatacttattataaaaagtatitgaaatt goeacatttaattgtecetaatagaaagecacctattetttgtiggat [SEQ ID NO:16] Tacacgcgttatetacgggcegegageceegegtggecacggteactegeatectges ccagacgetettcaggtaccagggecacgtgggtgcategctgategteggeggcetas acctgactggacegeagetetacggegtgeatececatggetectacagecgtetgecett cacagecctegectetggicaggacgeggecetggegtetagaagaceggttceas 202659 at ccgaacatgacgetggaggetgetcagggegetgetggiggaagecgteacegecagga tcttggegtgacetgggetecggggecaatgtegacegcatgtgtgatcacaaagactegog ccaagetgctgoggacactgageteacecacagagecegtgaagagetetggecgeta cractttgtgcetggaaceacagetetectgacccagacagtgaagecactaacectega getagtggaggaaactetecaggctategagetegagta

[SEQ ID NO:17] Gattatcaattaccacaccatcteccatgaagaaagggaacegtgaagtactaagegeta gaggaagcagccaagteggttagtggaagcatgattggtgcecagttagectetacags ' 203915 at atgteggaaacctecticcaggegaggtteagtgaatigtetaggagagettgtcteteges ] agaatttaaacctatactcactttcccaaatigaatcactegcteacactectgateatttagas ” = = tgctgtecggtegagatcecaceegaacetettatetaateatgaaactecetagttecttea | - tgtaacttecotgaaaaatctaagtgiticataaattteagagtetetgacecacttace [SEQ ID NO:18] Gaaacgggggegectggaagatetegtegagegctetigctategegtcaacaacage ttggaccatgagtaccaaccacggeccegtegaggtgateateagttetecgaaggagatg 204070 at gttggtcagaagatgaagtacagtattetgagcaggaactgtgagcactttgtegeceage tgagatatggcaagtecegetgtaaacaggtggaaaaggccaagetigaagtegetete gecacggcgettggaatectggttettectegatectetttigegattaggagataccaaaa aaaagcaacagectgaageagecacaaaatectetetiagaageagetetggegetee [SEQ ID NO: 19] ttetggetggaacggacgatgeceegaaticecacectgaagaaccetagaggatetígtia ctgaataccacgggaacttttcggcctggagtegtetetetaagegacteggetgagagtet 204116 at gcagecagactacagtgaacgactetgcetegteagtgagatteccecaaaaggagese - ccecttggggaggegoctggggectococatgcaaccageatagececetacteggeeee Cecatgttacacectaaagoctgaaacetgaaceccaatectetgacagaagaacecoag Egegtectgtagecetaagtggtactaactttecticaticaacecacetgcgteteatacteace ' teaccecactgtegetgatttegaatittgtecceccatetaageace [SEQ ID NO0:20] Í Gtgatggttggcttgagtacctttttaaatetageccagtataaacattagectgettaatattt agacatttataggtagaattctgagcactcaacteatetttegcattttaaagtaaaaacaagt 204224 s at Btgacttegaggaccaaagaaattgtcagctatacatttatetttatgaacteatttatattectt TF. tttaatgactcgttegttetaacatttectagaaptettcttataaagetetaatgtatecacagge tgttgtettattagtaaatecaaagtaatgactttetctgtittactetagtctitagtacticaaaa ttacottttcatatecatgatcttgagtccatttagagratititaagaatttgatgtattteaata cactgticaaaattaaattgtttaattitatetateagtatetatettccetgaagttggtcctattta [SEQ ID NO: 21] Atggettgatgtageagteatageaagtttgtaaatagcatetatgttacactetectagagt ataaaatotgaatetititetagctaaattgtaattgaaactggoteattecagtitatigatitea caataggosttaaatiggcaaacattcatatttttacttcatttttaaaacaactgactgatagtt 204529 s at ctatattttcaaaatatttaaaaataaaaagtattcccaagtgattttaatitaaaaacaaatigo TF ctrtgteteatigateagacaaaaagaaactagtattaagggaagegcaaacacatttatttt Bgtactgcagaaaaattegcttttttetateactttttgtetaategttagtaaateteatitaagtec tittatgtataaaactgccaaatecttacctegstattitattagatecagaaacagattiggaaa cagctaaattacaacttitacatatggoetetgtcttattgttteticatactetegtetetatitaatet tittttategaacetetigegoeetat

[SEQ ID NO: 22] Taactetaccectggcactataatgtaagetetactgaggtectatgttettagtegatettete accctgcttcaaatatiteceteacetitecoatettecaaggstactaaggaatetttetegottt . gEgggtttatcagaattoteagaateteaaataactaaaagetatecaateaaatetectttita 7 204533 at aagaategctetttactteategacttecactgccatecteceaageggoccaaatictttcas - =—"— tggetacetacatacaaticcaaacacatacaggaagetagaaatatetgaaaatetatete " taagtattcttatitaatgaaagactgtacaaagtataagtcttagatgtatatatttcctatatte ttttcagtgtacatggaataacatetaattaagtactategtatcaatgagtaacaggaaaatitt aaaaatacagatagatatatectetecatgtiacataagataaategtgctgaateggttticaaa taaaaatgagegtactetectggaaatatt [SEQ ID NO: 23] i ggaactaatgteccetgagatgtttatcaaaaaagaagaattacaagaactaaagtegtgcesg atgtggaggatgaagactgggacatatcatecctagaggaagagatatctitaggaaaaa - aatcteggaaagaacagaaggaacctecacetgcgaaaaatgaaccacattttgcteatgt 204556 s at gotaaatgcctggggeegcatttaatectaaggggccaaagegagaaggacttcaagaaa mo atgaatcaagcacattaaaaagcagcttagtaactegtgactgattggagegacacttcagat gtotaattccacategtcagaagattaticcagaagecagcagtattteagtateacagtettte agtaatttgcctecatgattetagtectictgeettacegtetiteccacageaacacagaga ctgattcaaagaacaatgetctetttaatggcacccaatacagtatigaaaatcagatcatea acagtatttegaagcatgtaaagetetitaagacticogetectectiaaaaata [SEQ ID NO:24] ' Cagatcctecaaaggcacacgttgeceaceaceccatetetgaceatgaggecacecte = aggtgctgggecetgggettetacectecggagateacgetgacetggeagegegatgg * Egaggaacagacccaggacacagagcttgtegagaccaggectgcageggategaac 204806 x at cttccagaagtgggcegctetegtggtecetictagagaggaacagagatacacatgccea FZ. tgtgcageacgaggggcetgecocagececteatectgagatgeggageagtetececage ccaccatececategtgageategttgetegecttgttetecttagagetetegteactega getgtggtegetgetgigatgtagaggaagaagageteagatagaaacagagggageta cteteaggetgcagteactgacagtecccagggetetaggetatoteteacagetaataaa Btgtgagacagettecttgtetgggac [SEQ ID NO:25] Agcagcttattgtttetetgaaagtgtetetagttttactttectaaggaattaccaagaatate ctttaaaatttaaaaggatggcaagttecatcagazagctttatitigagatgtaaaaagatte 204897 at ccaaacgteggttacattagecattcatetategteagaagtecagaatigggacacttaates tceaccttgtaacagttttgtgtaacteceagtgatgetgtacacatatitraagggtetttctca aagaaatattaagcatetittottgctcagtegtitttotgaatigcttggttgtaattiaaatictga gectgatattgatate [SEQ ID NO0:26] Tactcatgectttttgtttaggataaataggtaagcacaaagagcteticaaaatoagaaaa aacaataggagtecttecttgtettttetgtgatetetetectigtttetgagacttictetaceatt 205097 at aagctctattttagcttteagttatictagtttgtiteccatggaatetgtoctaaactegtatttt 7 gtcagtgacagtettgccagteageaattictaacageattitaaatgagtttgatetacagta aatattgatgacaatgacagcttttaactcttcaagteacctaaagoctattatecaggaggatt tagaagtcacatticataaaacccaagngctategetetattaticatgatagetegeceaca ggtcatgaatigag

[SEQ ID NO: 27] Goggceatgtgacceatcattgaactggtgggacagecaccteaggagetegegegeate cgggagcaacagetgteagecaacateategaggageteaggeaatiteagegectear . tegetectacttcaacategtettgattgacaagcagggtattgaccgagaccegetacateg . aacctgteacececgaggaaateticacaticattgatgactacctactgagcaateagga 205499 at - : gttgacccagogtegggagceaaagggacatatgcgagtgaactigagocaggecatggt x taaagtcaagggaaaagctectetagttagetgaaacteggacctaataaaaggaggaaa tettttoccacagttetagggacaggactetgaggteggtgagttigacaaatectgcagte tttecaggcatecttttaggactgtgtaatagtttecctagaagctaggtagggactgaggac aggectigggeagtggett [SEQ ID NO:28] Gaaggaggcttaggactttecactectegotgagagaggaagagetgcaacggaattag gaagaccaagacacagatcacccggggcttacttageetacagategtectaceggaacs tgggetggeccageatagggetageaaatitgagttggatgattgtttitactcaaggeaac 205685 at cagaggaaacttgcatacagagacagatatactgggagaaatgactitgaaaacctgget ctaaggtgggatcactaagggatggggcagtetetgoccaaacataaagagaactcetesg Bggagcctgagecacaaazatettcctttattttatgtaaacceteaagegttatagactgcea tgctagacaagcttegtecatgtaatattcoecatetttttacectgcecetgcetigattagacte ctageaccetggetagttte [SEQ ID NO:29] Cagcccttgcattgcagaggggececatgaaagaggacagectaceccetitacaaataga + atttgagcatcagtgaggttiaaactaaggccotettgaatetetgaatitgagatacaaacat . Bttcetgggatcactgatgacttittatactttgtaaagacaattgttggagagececteacas - 205758 at agocetggectengeteaactageagatacagggatgaggcagacetgactetettaage aggotgagageccaaactgctgtoeccaaacategcacttectigettaagegtategtacaag caatgcetgeccatiggagagaaaaaactiaagtagataaggaaataagaaccactcata attettcaccttaggaataatctectgttaatategtetacattettcctgattatittetacacata e [SEQ ID NO:30] Gatcttaaagecacggagaagecteteatettategoatigacaaagagaagaccateca cottaccetgaaagtegtgaageccagtgatgaggagetecectigtttettetagagteag gtgatgaggcaaagagegcacctectecaggtgcgaagetecageteagtegeacaagt 205890 s at gaaagcaatgatogagactaagacgggtataatecetgagacecagattetgacttgcaat Tm. ggaaagagactggaagateggaagatgatggcagattacggcatcagaaagggcaact tactcttectggoeatettatigtattegaggegtgaccaccectggggategggetetiggcage Bggteaaaaagcttatitettttaatetettacteaacgaacacatettetgatgattteccaaaat taatgagaatgagatgagtagagtaagatttgggtgggatgegtaggatgaagtatatige ceaactetatetttetitea [SEQ ID NO:31] Tgaaggategtgactgcgecatggectagatetgctgcagtetcctitectgtegaggete cacteaaagetggeatectectatgicacetagagtetegatcaaageaatacaccetacat gtagaatgtgatgticagaactcaaacagegcteaccaggeagtetecttettecttgeatgag 206082 at gatgcaagatgcaacagtitetettcacattggaaggacaccectggatgcecetaaceas tagacctgtaaaacttcactecagtggocactictgaatetetgtaagetitatttateticace cetetagagagaagatetittaccaaagectetagtgtacegtectectettacteatecate ccagicaacatgatettetcaatgaaataaagegaatttaatattetatagtatatecagettete cagatctettaagactetactatagaggccteges

[SEQ ID N0:32] aaacctctettagatetggaaccaaatecaagettactegcetegggagecacegatecag attcattaagaccttctgacaccetgegagaagtcactettactgtectaagtogaaaacttt geaacagccaaagtiactacaacggoegaccctittateaccaaagacateggtetetecag ' 206666 at gagatgccaaaggecagaaggattcctgtaagggtgactcagggeggeccectigatetata aaggtegtettccacgetatagtetetggaggteatgaatetegtetigocacaaagectgga : atctacaccctgttaaccaagaaataccagacttggatcaaaageaacettgtecegecte atacaaattaagtitacaaataattttattggatecacttgcttetittttcctaatatectegcage ttagagttgggtgtaagtaaageagagcacatatggggtecatttttecacttgta [SEQ ID NO0:33] agaccagtacaaactactcaagaggaagategetetagetgeegatttecagaagaaga agaaggaggatgtgaactgtgaaatggaagtcaatageggctettgggactttcttgaaaag aagcaaggaaatatgagtcatcegetatcacagettteaaaageaagaacaceatectaca 207536 s at taatacccaggattccoccaacacacgttetttictaaateccaatgagttggectttaaaaat na geaccacttttittttttttttegacaggsteteactetgteacecaggctegagtecagtege accaccatgegctetetgcagectigacetetgggageteaagtgatectectgeoteagtet cctgagtagetggaactacaaggaagggccaccacacetgactaactttitetittttette gtaaagatggcatttcgecatgttgtacaggctggtoteaaactectagegtteactitggect cccaaagtectgggatiacagacatgaactgcoaggeceggecaaaataatecaccact [SEQ ID NO:34] ttgccttgtaaticgacagetetacagaaacaaagataatgaaaattacccaaatetgaaaa aggctoteateaacatacttttagteaccacgggotacateatatgctttgttecttaceacatt , 20765] at Btecgaatecegtatacecteagecagacagaagtcataactgattgcteaaccaggattt ' 7 cactcttcaaagecaaagaggctacactgctectggetgtgtegaacetgtecttgatect atcctgtactateaceteteaaaageaticegeteaaageteactgagacttttgceteacet aaagagaccaaggcteagaaagaaaaatiaagatgtgaaaataatgcataaaagacage attttttgtectacceaattetegecttactaga [SEQ ID NO: 35] Ttetetacttegetottggaacataattteteatggoagottttactaaactgagtatigageca gcatttactecaggaccecaacatagaactocagaaagactetgactectettcttgccaas 207795 s at aaaaatggettigggtaccggtgoaactettacttcatttecagtgaacagaaaactiggaac gaaagtcggcatetetgtgetteteagaaatecagectegeticageticaaaacacagatga actggattttatgagetecagtcaacaattttactegattggacictettacagtgaggagea caccegectggttetaggagaategetetgcacteteccagtatetattitecateattte [SEQ ID NO:36] Gtggecggageagetgagagoctaccetggagggegagtgegtggagtggctecgcaga tacctggagaacgggaapgagacgotgeagegogeggacececeaaagacacacete acccacoaceceatetetgaccateaggecacectraggtgeteggcectagacttíctac cetgeggagatcacactgacctggeagegsgatggegaggaccaaacteaggacactg 208729 x at |. agettgtggagaccagaccageaggagatagaaccttocagaagtggecagctetagta Btgccttetggagaagagcagagatacacatgccatgtacageatgagesggctecegaa gocceeteacectgagateggagecgtetteccagtecacegtececategtagacattett Betggoctggetgtectageagttgtggteateggagetgtagtegeteetatgatetgtasg gaggaagagcteaggtggaaaageagggagetacteteagegeteg

[SEQ ID NO0:37] Gaagtaagcctceatcateagagectttecteaaaactggagteccaaateteateagetttt Bgttttttttcagecactaagaaccecctetgcettttaactetagaatttggacttggaccagatet . aacatcttgaatactetgcectetagagecttcagecttaatggaagetiggatecaaggag . . 208885 at gtgtaatggaateggaateaagecacteggeaggeatggagetataactaageatectta - - Bgggttetgcctetecaggeattageceteacattagatetagttactetggtatggetaatac - . ctgteaacatttegaggcaatectacettgettttgcttetagagettageatatetgattgttet caggccatattatcaatgtttacttttttggtactataaaagoetttetgccaccectaaacteca BEgBggacaatatgtgccaateaatageacecetacteacatacacacacaccetagecag ctgteaaggge ISEQ ID NO:38]

208894 at Cgatcaccaatgtacctccagaggtaactgtgcteacgaacagecctetggaactgaga ' gagcccaacgtecteatetegttteatagacaagttcacecea | | [SEQ ID NO:39]

Gaattgcaaaactgacatcccatttcacageaatagtgacctttatitaaattettetettata Bgtttatgcttettaaatcatttiteaacctaaacagecaatttetaageagacaggaaaactaa ataataagttaattiaatataacaaagatgcaggttectegcteattecagtaatetetitaaaas 209606 at caaaactaatatttattttetagattatecctgtgaataattgagaactttttegagtcaagtate | = aataaaggtgtggcagaatataataatetggactattttetataggataattgctggettataa aatcttagegtttgcttatgcecagtagetectgcggaggcttaataatagegcaatttigaattt Bgttcaaacctgtaatggcttgtaaacaaagatgaccateagetettteteacatetatagtga . caataaagcgggaagtataagatitaataggagegettaagetticatgagaaccatggaa Nm agatgtggtctgagatgggtgctgcaaagat 7 [SEQ ID NO:40] Tcetegaacegaacagcagtgettecaagataatetttggatcagggaccagacteageat ceggecaaatatecagaacectgaccetgecgtetaccagetgagagactetaaatecag tgacaagtctgtetgectattcaccgattttgatteteaaacaaatgtgtcacaaagtaaggat tetgatgtgtatatcacagacaaaactetectagacatgagetetatggacticaagageaa

209671 x at

—— cagtgctgtggectggageaacaaatetgactttgcatgtgcaaacgecticaacaacage ! attatteccagaagacaccttettececageceagaaagttectgtgatgteaagetggtega gaaaagctttgaaacagatacgaacctaaactttcaaaacctgtcagtgattggettcegaa tectectectgaaagtggecgeggtttaatetgeteatgacgetgeggetgtggtccagetga gatctgcaagattgtaagacagoectegtgetecet [SEQ ID NO: 41]

Ggaaatttggatgaagggagctagaagaaatacagegatttttttttttttttaagatggagt cttactetgttgctaggcetggagtecagtggtegcgateteagetecetgeaacetecacete ctgggticaaacaattetectgceteagectecegagtactgggaatataggtgcacgeca |

209770 at ccacacccaacaaatttttetacttttagtacagatgagggtteactatetiggccaggatgg

- tetegatetettgaceteatgatecacecaceteggteteccaaagtgetgggattacagge ttgagccacegggtgaccgegcttacagepatatttttaatecegttatggactetgtetecag gagaggggtetatecaceectgeteattggtegatgttaaaccaatattccttteaactgcte cctgetagggaaaaactactecteattateateattattattgctetecactgtatecectetae ctggcatgtgcttgteaag

[SEQ ID NO: 42] Agagagacacagctgcagaggcecacctegattgcgcectaatetetttgagcateacttasg gagaagtcttctatttatttatttatttatitatttatttetttetittagaagattctatettaatatttta ' tgtgtaaaataaggttatgattgaatctacttgcacacteteccattatatttattetitatittagg ' . 209774 x at tcaaacccaagttagtteaatectgatteatatttaattteaagatagaagegtttecagatatte - -— tetagteatttgttaatatttettogtgatgacatatcacatgtcagecactgtgatagaggctg - . aggaatccaagaaaatggccagtaagatcaategtgacggcagggaaatetatetetetet attttgtaactgtaaagatgaatgtcagttegttatitattgaaatgatttcacagtgtgtggtcaa catttcteatgttgaagetttaagaactaaaategttctaaatatecettggacattttatetettte ttgtaagatactgccttgtttaategttaattatecagtetttecete [SEQ ID NO: 43] ' Aaatgatacactactgctgcagcteacaaacacctetgcatattacatgtacetectectgo tecteaagagtegteggtetattttgccatcateacetgetgtetgettagaagaacggctttetg ctgcaatggagagaaatcataacagacggtggcacaaggageccatettttecteategs 209813 x at ttattgtecctagaagocgtettetgaggatetagttgggctitettteteggttteggecatttea T— gttcteatgtgtgtactattctateattatigtataacggtttteaaaccagtgggcacacagag aacctcactetgtaataacaatgaggaatagecacggegatetecageacceaateteteca tgttttecacagetectecagecaacecaaatagegectectatagtgtagacatectgcgg cttetagecttgtecetetettagtegttetttaateagataactgcctegaagecttteattttaca cgccctgaageagtettetttgeta [SEQ ID NO: 44] » Geottctgaagcagecaatgtegatgcaacaacatttetaactttaggtaaactgggattatsg 7 ttgtagtttaacattttgtaactgtetegcttatagtttacaagtgagacccgatatgtcattatgo - atacttatattatcttaagcategtgtaatectggatgtgtacagtacagtacttaacttgtaattt 210439 at gaatctagtatggtegttctgttttcagetgacttggacaacetgactgegctttgcacagetett | cectgagttetitecagetttetetetetegegtggegtategggaggagaaccticatget ggceccacetggectegstigtceaagetgtgcetegacacatecteateccaageatggga cacctcaagatgaataataaticacaaaatttetetgaaateaaatecagttttaagaggage cacttatcaaagagat [SEQ ID NO:45] | gaaagactctgactgctettctigccaagaaaaategettigggtaccgetegcaactettact tcatttecagtgaacagaaaacttggaacgaaagtcggcatetetgtectteteagaaatec agcectgettcagettcaaaacacagatgaacteggattttatgagctecagteaacaattttac 210606 x at tggattggactetettacagtgaggageacaccgecteggtigtgggagaategetetgeac tcteccagtatetatttecateatttgaaacttttaatacaaagaactgcatagcgtataateca aatggaaatgctttagatgaatcctgtgaagataaaaatcgttatatetgtaageaacagete atttaaatgtttettegggcagagaaggtggagagtaaagacccaacattactaacaatgat acagttgcatgttatattattactaattetctacttetegagteta [SEQ ID NO:46] aaaggccacactgegtgtgccetggocacagetatettecetgaceacgtggagetgagetg Bgtgggtgaateggaaggagetecacagtegegtcageacggacecgeagececteaa Bggagcagecegeceteaatgactecagatactgcetgageagecgectgagggtetegs ccaccettetggeagaacececgeaaccacttecgetgtcaagtecagttetacgggctete 210915 x at z—— Bggagaatgacgagtggacccaggatagggecaaacecgtcacecagategtcageges gaggocctggggtagagcagactegtggctttaccteggtgtectaccageaagggetecte tetgecaceatectetatgagatectgetagggaaggecaccatgtatgctgtgctggtcasg cgceccttgtettgatggecatggticaagagaaageatttetgaaggcagecetggaagte gagttaggagocttetaacccgteatggttteaatacacattettetitigecage

[SEQ ID NO:47] ggaacaagacttcaggtcacgctegatatecagaacectgacectgcegtgtaceagetg agagactotaaatecagtgacaagtctegtetecetaticacegattttgattetocaaacaaat . glgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactetgctagacatgagegte . 210972 x at tatggacttcaagagcaacagtgctgtggcetggagoaacaaatetgactttecatgtgca - aacgcecttcaacaacageattattccagaagacacettettececageccagaaagíteot . gtgatgtcaagetggtegagaaaagctitgaaacagatacgaacctaaacttteaaaacot gtcagtgattgggticegaatectectectgaaagtggecggegtttaatetgcteatgacget geggetgtggtecagetgagatetgcaagattgtaagacagectgtgetecet [SEQ ID NO:48] Gaaggagacgetetggeggettgaagaatttagacgatitgccagettgaggeteaage tgcattggocaacatagctgtggacaaagecaacttggaaatcatgacaaagegetecaa ctatactccgateacceaatgacaagtticaccecaccagtggtcaatetcacegtggettega 210982 s at aatggaaaacctgtcaccacaggagteteagagacagtettcetgcecagegaagacea cettttocgeaagttecactatetecoetticetgcceteaactgaggacgtttacgactgcag ggtegagcactggeggottegatgagectetteteaageactgggagtttgatectecaage ceteteccagagactacagagaacgtggteteteccecteggectgactetegatetegte gegcatcattatigagaccate [SEQ ID NO:49] aaatgatacactactgctgcageteacaaacaccetetgcatattacatgtaccetectectgot * ceteaagagtetegtetattttgecateateacetgetgtetgettggaagaacgegctttetgo tgcaatggagagaaatcataacagacggtggcacaaggaggccatettttceteategatt b 211144 x at attgtecetagaagcegtettctgaggatetagttggectttctitotgggtttaggccattteag - ' ni ttetcatgtetetactattctateattattgtataateggittitoaaaccagtgggcacacagaga acctceagtctgtaataacaatgaggaatagecatggegatetecageaccaatetetecat gttttocacageteotecagecaacecaaatagegcectectatagtgtagacagectecas cttetagecttgtecetotettagtettetitaateagataactgcctegaagectiteatittaca cgece [SEQ ID NO: 50] Cagaaacctcegatatataattgtatagattttaaaagttttatitittacatctatestagtttttga Eggtgectattataaagtattacggaagtttectgtitttaaagtaaategtettttagtegtgatttat 211149 at taagttgtagtcaccatagtgatageccataaataattectggaaaattgtattttataacagt 7 agaaaacatatagtcagtgaagtaaatattitaaaggaaacattatatagatttgataaatett Bgtttataattaagagtttottatagaaaagagaticagaatgataacctettitagagaacaaa taagtgacttatttititaaagetagatgactttgaaatgctatactgtectgctigtacaacatg Btttggggtgaages [SEQ ID NO:51] getgttgcaattggetetttetaaateategtgacgttttgactegoettgagattcagatgcataa titttaattataattattgtgaagtggagagecteaagataaaactetgteaticagaagatgat 211339 s at tttactcagettatocaaaattatctetetttactttttagaattttgtacattatcttttaggatectt = aattagagatgatttetegaacaticagtctagaaagaaaacattggaatigacteatetetg tggittggtitagaaaattccccetgtecateggtattacctttttoaageteagatteatetaatec tcaactgtacatgtgtacattetteacetectagtaccetatecogeaaaategegcttectgs cteggtttitetetteteacatittttaaategtococtetetitgtagagaa

[SEQ ID NO:52] Gecatcagaageagagateteccacacecaaaageccacactegigtgoctggecaca Bgetttetaccecgaccacgtggagetgagetegtegeteaategegaageagetgcacas . tggggtcageacagacocgeagecocteaaggageagecegeceteaatgactecaga * 211796 s at tactgcetgageagecgectgaggateteggecacettetggoagaacececgeaacea .- — — 7 - - - | ettecgeteteaagtecagttetacggegeteteggagaatgacgagtegacecaggatas . ggccaaacetgteacecagategteagegecgaggectgggtagageagactgtgge ticacctecgagtottaccageaaggeggtectgtetgocaceatectetatgagatettgeta gggaaggecacctigtatectetectggtcagtecectegtectratggecatggticaaga gaaagga [SEQ ID NO:53] Gaatcgtttctetgtgaacticcagaaageagecaaatecticagtetcaagateteagact cacagctgggggatgcegegatgtatttetetegcttataggagtecatactetegegctas gagttaccaacteactitoegggaaggggaccaaacteteggtcataccaaatatecagaac cetgacectgcegtgtaccagetgagagactetaaatecagtgacaagtetgtetecetatt 211902 x at caccgatttigatictcaaacaaatgtetcacaaagtaaggattctgatetetatateacaga caaaactgtgctagacatgaggtcetategacticaagagcaacagtgetetegcctagas caacaaatetgactttgcatgtgcaaacgccticaacaacagoattattocagaagacacet tettececageccagaaagttcetgtgategtcaagetggtegagaaaagctttgaaacaga tacgaacctaaactttcaaaaccteteagtgatteggticegaatectectoctgaaagtes s ceggegtttaatetgcteatgacgctecgetigtegtes

- [SEQ ID NO:54]

A Ctgagagecctacetggaggegccetgtecgtagagtggetecgcagatacetagagaacg Bgaaggagacgetgcagegegoggaceececáaagacacatgtgacecaceacecea tetetgaccatgaggecacceetgaggtectagaceeteggottctaccetgcggagatoa

211911 x at cactgacctggcagegggatggcgaggaccaaacteaggacacogagettgtegagac —— Ccagaccagcaggagatagaaccttecagaagtegecagctatastegteccttctagas aagagcagagatacacatgccatgtacageatgaggggetgcegaagececteacecte agatgggagecatettcccagtecacceatececategtggegcattettgctegectageta tcectagcagttgtegtcateggagcetetegtegetactetgatetetaggaggaagagete aggtggaaaaggagegagctactetoagectg [SEQ ID NO:55] Accaatgaggttcctgaggteacagtettitecaagtetecegtgacactggeteagecea 212671 s at acacceteatetgtettetegacaacatetttectectgtagteaacatcacntggetgagea =. atgggcacteagteacagaagetegtttetgagaccagettectetecaagagtgateattec ttettcaagatcagttaceteacettectocettetenteatgagatttatgactecaagetes agcactgggegcctegatgagectettetgaaacacteggagecte [SEQ ID NO:56] Tgactccagatactgcctgageagecgectgagggtetegaccacetictggeagaace ccecgeaacceactticogetgteaagiccagttetacgggeteteggagaatgacgagtega cccaggatagggecaaaccegtcacecagatogticagegecragegectggggtagas 213193 x at cagactgtggctitaccteggigtectaccageaagggetectetetgccaceatectetat ZK— gagatcetgetagggaaggecaccectegtatectgtectegicagencecttgtetigates ccatggtcaagagaaaggatttetgaaggcagecetggaagtagagttaggagettetaa ccecgteatggtiteaatacacattettetittgecagegettetgaagagetgeteteacetete tgeateccaatagatatececctatgtgcatgcacacetecacacteacgectgaaatetec ctaacccaggegggaccttageategcctaagtga

[SEQ ID NO: 57] Bggaacactgcteteagacattacaagactggacctgggaaaacgcatcotggacecac gaggaatatataggtetaatgggacagatatatacaaggacaaagaatetacegtgcaag * 213539 at tteattategaatgtgccagagctetetegagetggatccagecacegtggetggeateatt . 7 Bgtcactgatgteattgccactetgetecttgettteggagtettetgetttgctegacateaga . — ctggaaggctgtctggggetgcegacacacaagetetgttgaggaatgaccaggtetate - agecectecgagategagatgatgeteagtacagecacettggaggaaactegectesg aacaagtgaacctgagactggtggcttctagaagcagecattaccaactgtacet [SEQ ID NO: 58] tgctegagtccactgceaatetgaaacaategaaacageaacttgctgcetatcangage aagcagaacgictgcacaagegggtgactgaactigaatetgttagtagecaageaaatg cagtacatactcataagacagaattaaatcagacaatacaagaantenaanngncacng 213793 s at aaantgaaggaagaggaaatagaaagotiaaaacaagaaattgataateccagagaact -—- acaagaacagagegattctttgactcagaaactacaggaagtagaaattcggaacaaaga cctggagggacaactgtetgacttagageaacgtotggagaaaagtcagaatgaacaas aagcttttegcaataacctgaagacactettagaaattctggatggaaagatatitgaactaa cagaattacgagataacttggocaagetactagantgcagctaaggaaagtgaaattton Bgtgcenattaattaaaagatacactgtetetettcataggactetitaggctetgcatea [SEQ ID NO: 59] ggttcacettggcateaatitecectgaaacttagetgtectgggattattetecttgtettegt . tgttactgggttgagtegtttcagtgacatccttaatacagaaatcatcaatagaaaaatecas tgtggacattcaacagagcaggaataaaacaacagagagacceggetetettaaactgces x 214470 at aatatattggcagcaactecgagagaaatgcttgttattticteacactgteaaccecttggaat : aacagtetagetgattettecaccaaagaatecagectectegcttaticgagataaggatga attgatacacacacagaacctgatacgtgacaaagcaattctgtittggattiggattaaatttt teattatcagaaaagaactggaagteganaaacggcictitittaaatictaatgacttagaa 1 attagagetratectaaagaaaacagctetatitecateteaca [SEQ ID NO: 60] Aaatgatacactactgctgcageteacaaacacctetgeatattacatgtacetectectge tecteaagagtgtegtetatitigocatcateacetgetgtetgentenaagaacggonnne tgctgeaatggagagaantcataacagacggtggcacaaggaggeennentntecteat 215806 x at cgennattgtecetagaagegtettetgaggatetagttegectitotitetegatitagece -- atttcagtteteatgtetetactattcrateattattgtataatggttttcaaaccagtgggcaca cagagaacctcagtetgtaataacaatgaggaatagccatggogatetecageaccaatet ctccatgttttecacagetectocagecaacecaaatagegectgetatagtgtaganann ctgoggoettetagocttgtecetetettagtattetitaateagataactgectggaagecttte attttacacgecetgaageagtettetttgota [SEQ ID NO:61] ' Cactactgctgcageteacaaacacctetecatattacatgtacetectectgetectoaas agtgtggtctattttgccateateacetgetgtetectingaagaacgectitetgetgcaats gagagaaatcataacagacgetggcacaaggagegccatettttceteateggttatigtec 216920 s at ctagaagegtennennannnnnnnnttggectttetitetgggtttageccattteagttet T-— catgtgtgtactattctatctattgtataategttttecaaaccagtgggcacacagagaacete actctgtaataacaatgaggaatagocatggegatetecageaceaatetetecatatitico acagoetectecagecaacecaaatagegccetectatagtatagacagectgcggetteta gecttgtecetetettagigttetitaatoagataactgcetggaagcctiteattttacacgec ctgaagcagtcttetttgetagtigaattatetggtetetititecgtaata

[SEQ ID NO:62] tacctggagggcacctgcatggagtggetecgeagacacetagagaacgggaaggas acgetgeagegegeggacececcenaagacacacgtgacecacencectnncicigaa - catgaggcataacgaggtncteggettctggegcttetacectgcggagateacatigacetg . 217436 x at Bcagcgggategsgaggaccagacecaggacategagctegtggagaccaggecea . o caggggatggaaccttecagaagtgegcggtigtggtagtecctictagagaggaacas x agatacacatgccatgtecagcacaagegggontgcecaagececteatectaagatggs ageccetotececageccaccatececatigtggatateattgctegecteggttetectigga getgtggteactennnannnnnnnnnnNctgtgatgtggaggaagaagageteagat agaaaaggagegagctacteteaggetgeaageagecaaagtgeccagegetet [SEQ ID NO:63] ctegttttateagtaateteticecacecatgotgacagteaactggcageateaticogtecet Etggaaggattteggcetacttttgteteagetgtegatggacteagettecaggectrtttett 217478 s at acttaaacttcacaccagaaccttetgacattttetectgcattgtracteacgaaatigaces =-— ctacacagcaattgcetatteggtaccccggaacgcactgcecteagatetgetggagaat Bgtgcigtgteggegtggectttggectggstetgcteggeateategtggegcattgtteteat catctacttecggaagocttgcteaggtgactgattettocagaccagagtttgatgeccage agotteggecatecaaacagaggatgeteagattteteacatectgeo [SEQ ID NO:64] Gaacaggtgaccataactetgccaaatatagaaagtigaaggaagtagtaaaaticagtat . cgtaaagaacaacagcaacaacaaatetegaatticagecaggactecceaatetigtaaaa 219551 at cattctecatetgaagataagatgtececageatetecaatagatgatategaaagagaact x = Baaggcagaagetagtetaategaccagatgagtagttetgatagttoateagattccaaa : agttcatcatettcaagtagtgaggatagttctagtgactcagaagatgaagattgcaaatec tetacttetgatacagggaattgtgteteaggacatectaccatgacacagtacaggatteot gatatagatgoccagtcataatagatttegagacaacagtggccttctgatgaatacttt [SEQ ID NO0:65] Tteteactttteatecaggaagecgagaagageaagaatoctectgcagectatttecaac agaaaatactigaatatgaggaacagaagaaacagaagaaaccaagggaaaaaactet gaaataagagctgtggtgaataagaatgactagagctacacaccatttetegacttcagec 221081 s at ccetgecagtetggcaggatcageaaaactgteageteccaaaatecatatecteactetga no gtettggtatccagetattgeticaaactgegtetetgagatttggatecetggtattgatttete aggactttagaggegctetgacaccatgcteacagaactegecteagagetecatttítigca gaggtgacacaggtaggaaacagtagtacatetettgtagacacttegttagaagetecte caactgcecteteccateattataacatettcaacacagaacacactttgtggtogaaagect cagoectetetacatgaagtetg [SEQ ID NO:66] Tetaccetgeggagateacgetgacetggeagegggategggaggaacagacecage acacagagcttetegagaccaggoctgcaggggatggaaccttccagaagtgggecge tetggtggtgcctnctagagaggaacagagatacacatgccatgtgcageacgagese 221875 x at ctgececagececteatectgagatgggagcagtetececageccaceatececategte Bgcatcgttgcteggocttgttgtectiggagetgtggtcactegagetategtegetgetat gatgtggaggaagaagagcteagatagaaacagagegagctacteteaggcetegcagtet gagacagcecttccttgteteggactgagaageaagatatcaatetagcagaattgcacttet Boecteacgaacata

Sequência Alvo [SEQ ID N0:67] Aacacctgtgetaggteagtetggeacgtaagatgaacatcectaccaacacagagetea 222838 at ccatctettatacttaagtgaaaaacatgeggaageggaaages gaategctectttigat " 7 atgttecetgacacatatetigaategagacctecetaccaagigatgaaagtetigaaaaa 7 cttaataacaaatgcttgttgggcaagaateggattigaggattatetteteteagaaaggeat a tgtgaaggaattgagccagatetetetecetactgcaaaaccectatigtagta * [SEQ ID NO0:68] Aaacttteccatetagataatgatgateacatagrettgatgtacggacattaaaagecaga 222962 s at tttettcattcaattetegttatetetettttactetitaaaatigateaagecactgaateactttgo —-— atttcagtttatatatatagagagaaagaagegtetetgctettacattattgtegagecetgte atagaaatatgtaaaatctcatattatttittttitaatitititattttttatgacageggteteactats tcacectggetggagtgcagtagtecgategoeggcacactge [SEQ ID NO:69] Aaatgactgcattcgtetettttttazagegtagagattaaactgtatagacagcatagegate aaaggaaccaagcegtttetetaggattigagactggtacgtgtacgatgaacctectecttte 223575 at ttttetgagaagagetttgaagacattttattaacagcttaatttttetetittactecataggaac ttattttaatagtaacattaacaacaagaatactaagactgtttaggaatittaaaaagetacta Bgtgagaaaccaaatgatagettgtagagcetgatgactocaaacaaagocateacoegeoa ttettectectrettotegtactacagetecaagggecetteacettcatgtetgaaates + [SEQ ID NO: 70] Bggcagetgeagacaagtegttaactegtttagcagaatggcategttectectgctegaate tttttategattaaagttaaaggcattaatgatgtaaaagaactgattgaagaaaagecoett 2 aagatgggeggtattaatgctecctggaaatectttctacgtegatageteagetectagece 223593 at ttacttgagagcatcectteteticagoettetecagaacagategatgtggccetticcagetatta goeacaacttataaaagaatotitatgaagaaattaaactagettgggcatggtecgtcacac ctataatcccageactttgggaggcagaggagggaggatcactigaacccaggaattca ggctgcagtaagetacgatcacaceactecactetggeetgcatecactetggectacats gcagaacaagacccetgtetetaaaaaaagagaaagaaatcaaactaateatectgcteat [SEQ ID NO: 71] Acagttcaaccagtgaccgactteteteteatgetgtttaccecacacacaattteceactea attctgaaaataagaacctegttaatagegttggaaagctetetactetattcatatattgttettte atgctagtegagagtegtetcattageatettaattttagagttgtgaaatgatittaccaatta 225996 at Beaattgaatgtgtatititittctetitaataagaagagcaaatitgaataaataagctegteta gataaacttaataatcatgcttiticttetitagagatagetgatgtgttgtcatatecteteata caggtcactcatetggectrtctetitetgaagittaagtetggitigaatatetaataatactact cagcatttcttgttgcetaagtgagacgaaacttaaatettatgatatitacttcatgtattettot actettcatttcaat [SEQ ID NO: 72] aatggettctatgatcagaacteggaaaacagtenatcttategtagaagaggtncteage aagtgtacagtatttaccttcettitgtetiacatngegctritiaaatittecattaatiteaacataa ttatgggaacaagtgtacagaagaatttittttttaagatatetgagaacttttcatagatgaac 226084 at titttaacaaatetttteatitacaggaaattecaaagaaaattctcaagtgatagtctititttita Tr agtgtttegtaagacaaaaatigaataatgttitttgaagttotggcaagatigaagtetgatat tgcagtaatgatatttattiaaaaacccataactaccaggaataatgataceteceacecettg attcccataacataaaagtectactigagagtggeggagaategcategtagegctactttte agggecttgacaagtacatcacecagtggtatectacatacttettteaagatottcaacceat gaggtaaaagagccaagttcaaagaacccetagoacaaatitecttiag

[SEQ ID NO: 73] Acagggteagacteatagggtcateggagtacatacageagttgaaggactttactacoga tgacctgttgcagctattaatgtcatgtecccaagitgaattaaticagtgteteactaaagas . ttgaatgagaaacaaccatctttatettttgegtottgotatacttcatctgttetetecagacatg . 228316 at aaaaaagttgegcattaagctactticaagaaatcaataaagelgggatagatgcagtagaaa " .... Bgtettatgataaatgattectittgetecatagaaaagtegcaagaagtigecaaatatatette . acagaatggctttgacaaattatetaatgacatcacgtetattettegateteaggetgcagtt acagaaattteteaagaggatgacgcagteaacetaategaacatetettittggtagttetat atcttaaccagetgagggagcttgtacaacacettats [SEQ ID NO: 74] Btactggcectteggattgaaagtatacagtgatgaaatitecteccactetttcatecttega 228362 s at Bgtgttatattctittagatecgageceteaaagaaacatttaatattetetttigccaaticagtt = geatgctetetggetttacttttaaggatetgetgotectgttecaaatagattttecagaattte agctgcagaaaactaactggagataggcatcgggtgacagatgtaaaaatcagaagaat gatgataacaactgctatcaagatccageceaae [SEQ ID NO: 75] Aataacttcatttoctacaaggtataaaaagiggteaagteaatetgaagegecttttetac acaggaatatattatcgggaacaaagtatttectgetgccttaactetttaggatgcatagga 228400 at taaaatgataaagaccattttaatatcagaaagegttetettattaatititasataaaactteac 7 atttcttaategggageteaticagaaactaaataategtttctcaaagtetggtcaggatac . gatctgeateagaatectiggaatecttgttaaaaataccaattgctatgacaaaaccaagte tgctggaaactgcattteageaggttteceategttattctgategtatitiaacatttgagagoca - ctaccaatcatcetgtacagttectacte [SEQ ID NO: 76] Aaccaatacacaaaattttcctateteagaatetegtegagcataatagattetatitegtet gettgegattttttttttocatagaatitattaagtgaagtttetaaaactttgcttetectgateco gegtgaaptgtacatcataagaatecatagtacttigaagtaccatigcaccaagategtetga 228492 at ctgaattcatagtoacacttttatitgaaagaaagaattgttetagttttititoattatictaaaac tettgttgttagatacaagattitaattaagatctaagotectgcttatitaatetaattctaageta crattttagaaaaaacattigttttaagatticcaagaaacctgigagttaatactatatttaaaa gagaattggtaaatitigaatetetgtaatatittggaacctegtitaaaaaccaaatatacetgc aaatagatacagoctatectatactatita [SEQ ID NO: 77] Tgetgcetgatagectttatettecteateataaagagetacagaaaatateactecaagece caggececagatecteacteagatectecagecaagettiteatecateccageggaatea cttacctatgccagcacaactttcaaacteteagaagnnnnnnnanNAAANANANANANAA 228532 at nnatgctcaaattaaagtaacaaactaactcagctiticcaatgagecttgaatecatttecte - teateteagecetatetteacacateacttteacttttitacaaattttagaccaccacetgtate aaactecagtcggagttetitagatetgatctggcaatgctatecageatetitagagacea atggteagtottttectegecagaggaaagattgatggecetecceacttgaactgacagect gtganncccttgggggeatagactgcettecttggacecticeaaagtgtgtegtacngas ctcagtgcacagagtattcacccagceateatgaateaactte

[SEQ ID NO: 78] ' tgaagaaagttetectectgateacagecatettggcagtegetetiggttteccagtetete aagaccaggaacgagaaaaaagaagtatcagtgacagoegatgaattagettcagegtttt 229152 at ttgtgttocettacecatatocatttegeccacttecaccaattceatttecaagatttecategt 1 7 ttagacgtaattttectattccaatacetgaatetgcceetacaactececticetagegaaaa - gtaaacaagaaggaaaagtcacgataaacctggtcacetgaaatigaaattgagecactte ” cttgaagaatcaaaattcctgttaataaaagaaaaacaaatgtaatigaaatagcacacage attctetagtcaatatetitagtgatettetttaata [SEQ ID NO: 79] getgatttagcttatagaagaggaaccagaaatttgtecttgaataatenttcecetettagea ctggatctigatagcagttgttateateattettetgatttitacateteteaceegatgectatet ccagttagttttetgcagetgaaatictggaaaatctatttagaacaggageageagatectt 229390 at aaaagtaaagccacagagcategcaactgaattegcaaaagagaatattaaatetitetttea Bggotogeatecaaaagaatataacactecaageatgaaagagtegcagcaaattteate actgtatactttcaatecgaagggecagtactacagcatgttgcacaaatatetcaacagaa aagagaagactcacagtatcagetetactgaaggagatacggtegattcctettettggotit gtagatteatetggtataaacageactectgasttatgaccttttgaatgagtas [SEQ ID NO: 80] Gtgtteggctggatettigatageagttgttateateattettetgatttttacatetgteaceos - 22039] s at atgcctatetecagttagttttetacagetgaaattetegaaaatetatitagaacaggagea =— geagatecttaaaagtaaagecacagagcatgcaactgaattggoaaaagagaatattaa atgtttctttgagggctegeatecaaaagaatataacactccaageatgaaagagtggeas O caaatttcateactgtatactttcaatecgaagggecagtactacageat [SEQ ID NO: 81] 229543 at tctactcattcaaaaggteataactcaggagtectetitataccagatgaatctacaaageca 7 agaacaggaatcaccgtatetecttcagtagacctgatactegtgagtettetettttetettga catatttet [SEQ ID NO: 82] ttagectecteaagoatatetgactggeatgatectgcattgigattacetagaagggaaaaa caaccectgggaatittatecaggaagttegaacaateacaaacaaaagigegagegcas aaggaanngecacattaatectnnnnnnnnttatctttitetectnagaggeacaagtgaa agcagaagectgaaaaggoctgaagegeaaagettggeggegattraaaggeagaacga 229625 at gcaaatgatgcaggagageggagagactecatcaggaacaagtgagacaaategagata gcecaaacaaaatiggctggcagageaacagaaaategcaggaacaacagatgcaggaac aggctgcacageteageacaacattccaagetcaaaatagaagectteteagtgagetes agcacgcecagaggactgttaataacgatgatccatetetitiactctaaagtgctaaatate Eggagtttectttttitactetttateactgatgacacaacagaaaagaaactegtagacettggsg acaatca [SEQ ID NO: 83] Gceacgtecaaggteatectgagggctetageggacnaaggggacctgcaaptatntet cccetgnncacceetgaagaagectetitecaccacegentacgacatggeccgaaatgco tatcactteaagegtetgcteaageggoetegtegacaagggoteageaggtgaceggea 231229 at hgggggectoaggetecticacectggecaagaageagegcectecaagtecaageteaa ggtoaagaggcaacgacageagaggtggcgotetegecagegececttiggacagea aggtcactactggegctecaaacaggggcacaagegecttateaageganttcgaaggst Egecaagtgccactecaatiaatgaggcaggecagrgcaageagtoagggetgceaaga ncgoecattggeteagtgcagtgggaa

[SEQ ID NO: 84] Bgaacaggagcaactactaaaagagegatitraaaaagaaagcagaataatgaaaaate 231577 s at agatacaggatctccagacgaaaatgagacgacgaaagecatetaccataagetaaaga . = ccagagecttectgtcaceectaaccaagecataatigaaacaatittagaatitegaacaa " gegteactacatttgataataattagatcttgcateataacaccaaaagtttataaagecatet . — ggtacaatgatcaaaato + [SEQ ID NO: 85] aacacctcttaagtctagcacactgcagtgaggecaggeaccteagtactagecagese catcagaaggtgctaageccetetetecacaateccaagacggagaccacagectacace 232234 at aaatccagecettgatttecetgetgoctecataaacagaaagagetetgctegatcogeta 7 agggatcagggagaggaagaaagagegategegteggaggcacecectocagtgote ctactggticecaagetacaggteggegigggaaagectttateaggtateateaacagett ctcaattaaagatttgatttaticaagtategtgaaaaaattctacaategaaactcttattagat getgennnnnnngtgctategaccacgcacatacagecatectetiteasg [SEQ ID NO: 86] acataccttgggitgatccacttaggaacctcagataataacatetgecacgtatagageaa ttgctatgtoccaggeactetactagacacttcatacagtitagaaaatcagategetetaga 232311 at tcaaggcaggagcaggaaccaaaaagaaagecataaacataagaaaaaaaatggaas Bggtggnaaacagagtacaataacatgagtaatttgateggeagctattatgaactgagaa atgaactitgaaaagtatctigggeccaaatcatetagactettgagtgatgtettaaggaat . getatgagtgctgagagggceateagaagtectigagagectec [SEQ ID NO: 87] O gaatatttgaatctacetagtgagintntagngcategnttttgtenggnatectggaaange noncencaaaaagntannntttececentteaaaancatgcaccectgaagaagctetttg 232375 at tacaggattgggtitattctgttattaagacaaaggcateategcectitagatgagaggece 7 gtetetetttgggatttggeaateageatnecatetetgteateacceattattgagaaaataga tggattggttocetetetecagtectetegagcagttggactgetetetetgeteteaggate atactgtgagaacaatttaaatatgctaagcacatgtcaggaaacagttttgtggtctttaga cactcegetgtagecattecgttecattticagetgatr [SEQ ID NO: 88] gaagtecatectttggtecaaageatetegaagaggaagaagagaggaatgagaaagaa ggaagtgatgcaaaacatctecaaagaagtettttggaacaggaaaatcatticaccactea cagggtcaaatatgaaatacaaaaccacgaaccaateaacagaattititatecttocaagat gecagetceattgtacagaaacattttagaaaaagaaageggaacttcageaacteggaate 232481] s at acagaatacctaaggaaaaacattgctcagetecagectratategaggracattatecte gagceccacgaagagctgaagttaategaaacattaatgtactcacgtccaaggaagetatt agtggaacagacaaaaaatgagtatttigaacttaaagotaatitacatgctgaacctgacta tttagaagtcctggagcagcaaacatagategagagtitgaggectttcgcagaaatecta tgattctgttttaagtecatacettgtaaataagteccttacgtgagtetgicatcaatoagaac ctaage [SEQ ID NO: 89] 234907 x at Agaagagattctgctgtctacatcaatacacctgaatagttegacagaaaatigaaatotitt aactaattctaactatgaageacagtgaaatagaaagttagect

[SEQ ID NO: 90] Gacagtgagctggcacagagttagggaaatigactgteteteatattegetagtgagagt gatctettggaattgtatateaaaatittaatetacatacattttgtctagcaatictactatiggs tatttatatagtacatataaatatnaatetatatetitagiaaatatatacttatagttagtaaatat . 235175 a antttatatctatitagtaaatatactaaatgtcagenntetgagnecaagetnaagecatea - a | - tatnccctgtgacctgcatentacatnegtecagatgenctgaageaagtgannnnteac . aaaagaagtgaaaatggcctettcetegcettaacigatgacattaccttetgaaatticetteto ctggeteatectggetcaaaagetececcactaageaacttgigacacecacetetgeces cagagaacaacccccetitgactetaattttectttaccaacccaaatectgtaaaategteco aacctatetec [SEQ ID NO: 91] Accetgeacteccaaagattttetecagategetagtteontttittaaaaattetecagatat 235276 at Bgaaaatteteacttacttcatgaccagaactatetagaatatgtgtegggetataaacatet 7 tgettaaccaaatatetatetaggcagaggtaaccaggagagaageaagacttectgcota aaggagcccaccattttactttticacatttaatetgccacegttgaateaatigoaataaaacet gactegcaggtgactegacaggaaateccaaagttecaccatttetategctta [SEQ ID NO: 92] gaaacccatgctettactatgaaagaacgttagtacccaggttttecatgagattetetacac aggcaagaagetecatagaagtggcatttgaagesgtetegeagaggeagtectetetita 236328 at tceacactgegttccatttoctigcaaataagaagtctattitoccagtaaccctigeagttaagag . tgtgoccatgigatigagitetagecaatggagtetgageaaaagtgatataagecacttte aggtetagectttacaaacatecteagecttetetatecetgccaaggtgaccttegagget o gettaticcagactggettigatagaaggteactacticatetgtatigga [SEQ ID NO: 93] Atgaatcagtgttactaggacttatncagtacttaaaatagcaacttggcattetttattitett cetggttetittatttegagggataataaatetetaagttatitecattaaaatittgaaatetttat 237515 at atactttatgtgteccattttaaagtatatgcaagttctaageaataatctecategttatacaag Bgltgacatattttgtcctgaaatttttagttaacatttcaagaatgataaaatgaacaccotgta aattacccttetececetececetecatgaaaacctigeggattttettgtectagaacacntace acaatetggtgcaaagoctttet [SEQ ID NO: 94] Aaatgtacccttgatttgatectaatgctetatitaggectgaaggaageacacactaaata tetgagtgctiticagattecatetatgctgaaaaagaatetaggagaataaacncatttcaat tagcecttaanannnnnnnnnanaannnnagccecactaaageccagtagggcatage 238524 at agagaacactgcaccaggattcagatetegattetaantttigttetgaaaaatageaagte - acactggcatgecatttaacetetecgggocteaatitecactatagatagtaccetgategtet cagtaagacaactgatgtaactttgccaaacaagtagaattatecttectectttgteetgete tgtcctagettitaatacttggtctgcectaacattttectgtatgtatttetttatoccagatatte gaacaattectageaaggaaaagtaatgacggatttteatticocaatatagtetegeaaas aaatgaaagettitacttoetectigetaaticaat [SEQ ID NO: 95] Aacaatgtgcagetiteaactegetegagectgetatictgtggacagtgagatetttectt ggcactgicaatagacaatctecgtagagaaattccaagetgaaagecaataatettataat 238581 at aaaatagagaticitcagaagatgaaaggaattaccagcatggaaattgtgtcatagectta 7 agggcetaaagaagaagccttttetttictgiteacectcaccaagageacaacttaaatage gcattttataacotgaacacaatttatattggacttaattattatgtetaatatetitataatecttt agatottataaatatetegtataaggaateccatataatetgccaaaaatctgagtecatttaa titaatgcttgettatagtgcta

1D Conjunto Sonda | Sequência Alvo [SEQ ID NO: 96] gettetacaagtetgecacatcaatecgegtaategceccagtettaticacagacagaacttt gtttcctetgattttaaaataccgegtetgttoctecategaccagagtaattggcacattttaa > 238587 at tgcataagctggggettteatittcccagectetettcaccateactecattggtagetagga . gettattgettoaceecagtategagttcagattacagtettttecattacatitagaticataga . atctgaatggetgattaaatggecatetgatggctgaaagagegecegtatittteacteteta . gtgaaaggcttggaggagtttoetactt [SEQ ID NO: 97] taaaaataagtegccagctetetectitataaacagtetitagactggtttetateatgcecett gatgtaccagagatatgtttaaccaacctagttttgttgattctgacaateteacacacatttaa 239012 at gaatttaccatttttcaggcacttticaatettaaaaaaaattaaatccaattatigaaaateagt = tigacaaacaacocecactecatnnceenggenanaaaaaaaaaaaaanaanaacaaa agcagetaattcagtgatacaaactctetaagetggcaaaticococaactegecaaggaa atagcacatatttattntetecceatetitactecaaatttaggaccetettectetgataacacagt cttttaggttacttgaaateagececcatttaaagactoetttgcggeaceaage [SEQ ID NO: 98] Gaaatggcacattttctggatetgagagttggtcaaaagatcacaaaaaaagtcaaaaaat aattctactctgtgaatgaaaaateggatattinngtacttaccctcataageattaaaagaaa 24406] at ataatgcatgaaattccatagaaatgtecctateatgttatacigacteaaaccagaagacct agagtatgatattgctaatataatacatetegteggtatgagtegaagtatetgtetgagattt . atcattgccatagtgtaaaagagttgaattagettccactigactagatgagagetettagtte ttatt a [SEQ ID NO: 99] Cecagecgcetataacttttaacaattcecatatetectttattocactaagatgagtecagtat 244393 x at atatttecatetgtecaagegcttcetaaatgtagecaangecaagecaacaceagteacate —— atcnaaatcaaagegcattteggeaatecagectetgaticagggaagtticcaagigtote atgaagtetttgttttacatctttetgtecottacaggtetageactegtectatgtaggtaacat gtgetee [SEQ ID NO: 100] Ctggatatatcaagactgagttgatttctgtgtetgaagtteacoctictagacticagacca cagacaacctgetececatgtetoctgaggagtttgacgagegtegteteggatagteggete tgtagaattcgacagtatgatgaacacagtatagagcatgaatitititeatettetetagega AFFX- cagttitectteteatetgtgattecetectegetactetgttecttcacatectetetttetaggga HUMISGF3A/M979 | aatgaaagaaageccageaaattcgetgcaacetetigatagcaagtgaatttttetetaac 35 MB at tcagaaacatcagttactetgaagggcateategcatettactgaaggtaaaatigaaageca ttctctgaagagtggetticacaagtgaaaaacatecagatacacccaaagtateaggacg agaatgagegtcectttgggaaaggagaagttaageaacatetagoaaatettatgcataaa Bgtcagtgcecaactettatagegtigttegataaatcagtegttatttagggaactectigacgt aggaacggtaaatiteteteggas Em um aspecto a invenção provê-se um perfil de gene gerado realizando etapas de pré-processamento para produzir uma matriz de intensidade de gene normalizado ou conjunto de sonda e submetendo esta matriz a uma análise estatística de sinal para ruído para identificar os genes ou — conjunto de sondas diferencialmente expressados e então classificar os genes ou conjunto de sondas em ordem dos genes mais diferencialmente expressados. , Em uma forma de realização um limiar pode ser estabelecido : traçando em gráfico uma medição da expressão do gene relevante ou um R 5 “índice” derivado do vetor de intensidade de gene para cada paciente. Geralmente os respondedores e os não respondedores serão agrupados em cerca de um eixo/ponto focal diferente. Um limiar pode ser estabelecido no espaço (gap) entre os agrupamentos por métodos clássicos estatísticos ou simplesmente traçando uma “linha de melhor ajuste” para estabelecer o piso do meio entre os dois grupos. Valores, por exemplo, acima do limiar pré- definido podem ser designados como respondedores e valores, por exemplo, abaixo do limiar pre-designado podem ser designados como não - respondedores.

Em uma forma de realização o desempenho de qualquer dado O 15 —classificador pode ser analisado. Uma análise de desempenho exaustiva é feita variando o nível do limiar e calculando, para cada valor do limiar, a capacidade preditiva do modelo (sensibilidade, especificidade, valor de predição positivo e negativo, precisão ). Esta análise pode auxiliar em selecionar um limiar apropriado para um dado classificador.

Além disso, a análise de desempenho do classificador pode ser feita para um dado valor de limiar para avaliar a sensibilidade, especificidade, valores de predição positivo e negativo e precisão do modelo.

Em uma forma de realização apropriada dos perfis providos por um ou mais aspectos da invenção os efeitos dos genes que estão intimamente correlacionados com o gênero estão excluídos.

Em uma forma de realização provê-se um método de classificar amostras de tumor de acordo com o seu perfil de gene avaliado por Q-PCR usando um subconjunto dos genes verificados como discriminantes em melanoma (Exemplo 1).

Em uma forma de realização provê-se um método de classificar amostras de tumor de câncer NSCLC de acordo com seu perfil de : gene avaliado por Q-PCR usando todos ou um subconjunto dos genes ' verificados como discriminantes em melanoma.

Um classificador pode compreender o uso de uma análise de componente principal supervisionada e o modelo de acaso proporcional de Cox; além do perfil de expressão de genes, nesta abordagem pode-se usar sobrevivência global (OS), DFI ou DES das amostras no conjunto de treino junto com o estágio do tumor e estado de cirurgia para calcular os parâmetros —domodelo e subsequentemente calcular um índice de risco para o conjunto de teste, baseado na conjunto de teste de expressão de genes.

Uma vez que o perfil de gene foi identificado e a análise nas . amostras foi realizada então se tem vários modos de apresentar os resultados, por exemplo, como um mapa de calor mostrando respondedores em uma cor e - 15 não respondedores em outra cor.

Mesmo assim, uma informação mais qualitativa pode ser representada como um índice que mostra os resultados como um espectro com um limiar, por exemplo, acima do limiar os pacientes são considerados como respondedores e abaixo do limiar os pacientes são considerados como não sendo respondedores.

À vantagem de apresentar a informação -como um espectro é que ela mostra ao médico para decidir se deve proporcionar tratamento para estes pacientes apesar de não serem respondedores, mas que estão localizados próximo do limiar. “Imunoterapia” no contexto da invenção significa terapia baseada em estimular uma resposta imune, geralmente a um antígeno, em que a resposta resulta no tratamento, melhora e/ou retardo da progressão da doença associada com o mesmo.

Tratamento neste contexto não deve geralmente incluir tratamento profilático. “Imunoterapia de câncer” no contexto deste relatório significa imunoterapia para o tratamento de câncer.

Em um aspecto a imunoterapia é baseada em um antígeno de câncer de testículo, como Mage (discutido em maiores detalhes abaixo). . Com vantagem o novo método da invenção permite a , identificação de pacientes que provavelmente respondem a um tratamento de i " 5 " imunoterapia apropriado.

Isto facilita a apropriada canalização de recursos aos pacientes que se irão beneficiar dos mesmos e o que é mais importante pacientes que não se beneficiarão do tratamento irão usar tratamentos alternativos que podem ser mais benéficos para os mesmos.

Esta invenção pode ser usada para identificar pacientes com — câncer que provavelmente irão responder a uma imunoterapia apropriada, por exemplo, pacientes com melanoma, câncer de mama, bexiga, pulmão, NSCLC, cabeça e pescoço, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de - cólon, e carcinoma esofageano, como em pacientes com cânceres expressando MAGE.

Em uma forma de realização, a invenção pode ser usada em um 2 15 conjunto adjuvante (pós-operativo, por exemplo, sem doença) em tais cânceres, particularmente pulmão e melanoma.

A invenção também encontra utilidade no tratamento de cânceres com um conjunto metastático.

O gene de ativação imune é destinado a significar um gene que facilita, aumenta ou estimula uma resposta imune apropriada.

O gene de resposta imune e gene de ativação imune são usados de modo interpermutável aqui.

Microgrupos Uma técnica importante para a análise dos genes expressados por células, como células de câncer/tumor, é microarranjo de DNA (também — conhecida como tecnologia de chip de gene), onde centenas ou mais sequências de genes (como 55.000 conjuntos de sonda) são fixadas a uma superfície de vidro.

As sequências de sonda são geralmente todas de 25 mers ou 60 mers e são sequências de genes conhecidos.

Estas sondas são geralmente dispostas no conjunto de 11 sondas individuais para qualquer gene particular (um conjunto de sondas) e são fixadas no padrão pré-definido sobre a superfície de vidro. Uma vez expostas a uma amostra biológica apropriada ' estas sondas hibridizam para o RNA ou DNA relevante do gene particular. ] Após lavagem, o chip é “lido” por um método apropriado e a quantidade " 5- - “como intensidade de cor registrada. A expressão diferencial do gene particular é proporcional à medida / intensidade registrada. Esta tecnologia é discutida em maiores detalhes abaixo.

Um microarranjo é uma rede de regiões discretas, tipicamente ácidos nucleicos, que são separados um do outro e são tipicamente arranjados em uma densidade de entre, cerca de 100/em” a 1000/cm?, mas podem ser arranjados em maiores densidades como 10000 /emº”. O princípio de um experimento de microarranjo, é que mMRNA a partir de uma dada linhagem de : células ou tecido é usado para gerar uma amostra rotulada, tipicamente CcDNA rotulado, chamado o “alvo”, que é hibridizado em paralelo a um número os grande de sequências de ácido nucleico, tipicamente sequências de DNA, imobilizadas em uma superfície sólida em um arranjo ordenado.

Dezenas de centenas de espécies de transcrito podem ser detectadas e quantificadas simultaneamente. Apesar de muitos diferentes sistemas de microarranjos terem sido desenvolvidos, os sistemas mais comumente usados hoje em dia podem ser divididos em dois grupos, de acordo com o material arranjado em rede: microarranjos de oligonucleotídeo de DNA complementar (CDNA). O material arranjado em rede foi geralmente chamado a sonda, porque ele é equivalente à sonda usada na análise northern blot. Sondas para redes de cDNA são geralmente produtos da reação de — cadeia polimerase (PCR) gerada a partir de bibliotecas de cDNA ou coleções de clone, usando ou iniciadores específicos para vetor ou específicos para genes, e são impressas sobre lâminas de vidro ou membranas de nylon como pontos em locais definidos. Os pontos são tipicamente de 10-300 um de tamanho e são distanciados em cerca da mesma distância. Usando esta s1 técnica, redes consistindo de mais de 30.000 cDNAs podem ser fixadas sobre a superfície da lâmina de microscópio convencional Para redes de . oligonucleotídeos, apenas 20-25mers são sintetizados in situ, ou por ' fotolitografia sobre pastilhas de silício (redes de oligonucleotídeo de alta . 5 - densidade de Affymetrix ou por tecnologia de jato de tinta (desenvolvida por Rosetta “Inpharmatics, e licenciada para Agilent Technologies). Alternativamente, oligonucleotídeos pré-sintetizados podem ser impressos em lâminas de vidro. Métodos com base em oligonucleotídeos sintéticos oferecem a vantagem que porque a informação de sequência sozinha é — suficiente para gerar o DNA a ser colocado em rede, não é requerida uma manipulação consumidora de tempo dos recursos de cDNA. Também, sondas podem ser projetadas para representar a parte mais singular de um dado . transcrito, tornando possível a detecção dos genes intimamente relacionados ou variantes.. Apesar de oligonucleotídeos curtos poderem resultar em uma “os hibridização menos específica e sensibilidade reduzida, a disposição em redes de oligonucleotídeos mais longos, pré-sintetizados (50-100 mers) foi recentemente desenvolvida para superar estas desvantagens.

Assim ao realizar um microarranjo para se certificar que um paciente apresenta a assinatura de genes da presente invenção, as seguintes etapas são realizadas: obter MRNA da amostra e preparar marcações de ácidos nucleicos, contatar a rede sob condições, tipicamente como sugerido pelos fabricantes dos microarranjos (de modo apropriado, condições de hibridização estringentes como 3X SSC, 0,1% SDS, a 50 ºC) para ligar sondas correspondentes sobre a rede, lavar, se necessário, para remover as — marcações de ácido nucleico não ligadas e analisar os resultados.

Será notado que o MRNA pode ser enriquecido para sequências de interesse como as em Tabela 1 por métodos conhecidos na arte, como síntese de CDNA específico para iniciador. A população pode ser ainda amplificada, por exemplo, usando tecnologia PCR. Os alvos ou sondas são rotulados para permitir a detecção da hibridização da molécula alvo para o microarranjo. Os rótulos apropriados incluem rótulos isotópicos ou : fluorescentes que podem ser incorporados na sonda. ' Uma vez que um gene alvo /perfil foi identificado existem — vários métodos analíticos alternativos para o microarranjo que podem ser usados para medir se o(s) gene(s) é/são diferencialmente expressados.

Em um aspecto, a invenção provê um microarranjo compreendendo sondas de polinucleotídeos complementares e hibridizáveis para uma sequência do produto de gene de pelo menos um dos genes > — selecionados entre os genes listados em Tabela 1. De modo apropriado, sondas de polinucleotídeos ou conjuntos de sonda complementares e hibridizáveis para os genes de Tabela 1 constituem pelo menos 50%, pelo - menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou substancialmente todas as sondas ou conjuntos de sonda em referido o 15 —microarranjo.

De modo apropriado, o microarranjo compreende sondas de polinucleotídeos complementares e hibridizáveis para uma sequência do produto de gene dos genes listados em Tabela 2.

De modo apropriado, a superfície sólida com agentes de — detecção ou microarranjo de acordo com a invenção compreende agentes de detecção ou sondas que são capazes de detectar MRNA ou cDNA expressados a partir de, por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52,53, 54, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, —65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79 80, 81,82 ou 83 genes em Tabela 1.

Em algum caso, PCR é uma técnica mais sensível do que o microarranjo e assim pode detectar níveis menores de genes diferencialmente expressados.

Em uma forma de realização alternativa, um paciente pode ser diagnosticado para verificar se o seu tumor expressa a assinatura de genes da : invenção usando um kit de diagnóstico baseado em tecnologia PCR, em ' particular PCR Quantitativo (para uma revisão ver Ginzinger D Experimental " 5 —haematology 30 ( 2002)p 503- 512 e Giuliette et al Methods, 25 p 386 (2001).

As técnicas analíticas incluem reação de cadeia polimerase em tempo real, também chamada reação de cadeia polimerase em tempo real quantitativa (QORT-PCR ou Q-PCR), que é usada para simultaneamente quantificar e amplificar uma parte específica da dada molécula de DNA presente na amostra.

O procedimento segue o padrão geral de reação de cadeia - polimerase, mas o DNA é quantificado após cada ciclo de amplificação (o aspecto de “tempo real”). Três métodos de quantificação comuns são o uso de O 15 (1) corantes que intercalam com o DNA de filamento duplo, (2) sondas de oligonucleotídeo de DNA modificadas que fluorescem quando hibridizadas com um DNA complementar (3) sóndas complementares Tagman para sequência especificada que são hidrolisadas por DNA polimerase durante o alongamento que libera um corante fluorescente.

A idéia por trás da reação de cadeia polimerase em tempo real é que quanto mais abundante um cDNA particular (e assim mRNA) está na amostra, mais cedo ele será detectado durante os ciclos repetidos de amplificação. Vários sistemas existem que permitem que a amplificação de DNA seja seguida e eles com frequência envolvem o uso de um corante — fluorescente que é incorporado em moléculas de DNA recentemente sintetizadas durante a amplificação em tempo real. As máquinas de reação de cadeia polimerase em tempo real, que controlam o processo de ciclos térmicos, podem então detectar a abundância de DNA fluorescente e assim o progresso de amplificação da dada amostra. Tipicamente, amplificação do

Em uma forma de realização alternativa, um paciente pode ser diagnosticado para verificar se o seu tumor expressa a assinatura de genes da . invenção usando um kit de diagnóstico baseado em tecnologia PCR, em ] particular PCR Quantitativo (para uma revisão ver Ginzinger D Experimental " 5 haematology 30 ( 2002) p 503 — 512 e Giuliette et al Methods, 25 p 386 (2001).

As técnicas analíticas incluem reação de cadeia polimerase em tempo real, também chamada reação de cadeia polimerase em tempo real quantitativa (QRT-PCR ou Q-PCR), que é usada para simultaneamente quantificar e amplificar uma parte específica da dada molécula de DNA presente na amostra.

O procedimento segue o padrão geral de reação de cadeia - polimerase, mas o DNA é quantificado após cada ciclo de amplificação (o aspecto de “tempo real”). Três métodos de quantificação comuns são o uso de O 15 (1) corantes que intercalam com o DNA de filamento duplo, (2) sondas de oligonucleotídeo de DNA modificadas que fluorescem quando hibridizadas com um DNA complementar (3) sondas complementares Taqgman para sequência especificada que são hidrolisadas por DNA polimerase durante o alongamento que libera um corante fluorescente.

A idéia por trás da reação de cadeia polimerase em tempo real é que quanto mais abundante um cDNA particular (e assim mRNA) está na amostra, mais cedo ele será detectado durante os ciclos repetidos de amplificação. Vários sistemas existem que permitem que a amplificação de DNA seja seguida e eles com frequência envolvem o uso de um corante — fluorescente que é incorporado em moléculas de DNA recentemente sintetizadas durante a amplificação em tempo real. As máquinas de reação de cadeia polimerase em tempo real, que controlam o processo de ciclos térmicos, podem então detectar a abundância de DNA fluorescente e assim o progresso de amplificação da dada amostra. Tipicamente, amplificação do dado cDNA com o passar do tempo segue uma curva, com uma fase plana inicial, seguida por uma fase exponencial. Finalmente, à medida que os . reagentes da experimenta são usados, a síntese de DNA se torna lenta e a ' curva exponencial fica plana em um platô.

" 5 " Alternativamente, o produto de mRNA ou proteína do(s) gene(s) alvo pode ser medido por análise Northern Blot, Western Blot e/ou imunohistoquímica.

Em um aspecto a análise para realizar o perfil/assinatura é realizada em uma amostra de paciente em que um antígeno de câncer de testículo é expressado. Quando um único gene é analisado, por exemplo, por Q-PCR então a expressão do gene pode ser normalizada por referência a um gene que - permanece constante, por exemplo, genes com o símbolo H3F3A, EIF4G2, HNRNPC, GUSB, PGK1, GAPDH ou TFRC podem ser apropriados para 7 15 empregar na normalização. À normalização pode ser realizada subtraindo o valor obtido para o gene constante a partir do valor Ct obtido para o gene sob consideração. Um parâmetro usado na quantificação da expressão diferencial de genes é a mudança de vezes, que é uma métrica para comparar nível de expressão do MRNA do gene entre duas condições experimentais distintas. Sua definição aritmética difere entre investigadores. No entanto, quanto maior a mudança de vezes o mais provavelmente a expressão diferencial dos genes relevantes será adequadamente separada, tornando mais fácil decidir em que categoria (respondedor ou não respondedor) o paciente estará incluído. A mudança de vezes pode, por exemplo, ser de pelo menos 2, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20 ou 30. Outro parâmetro também usado para quantificar a expressão diferencial é o valor “p”. Pensa-se que quanto menor do valor p, o mais diferencialmente expressado o gene provavelmente será, o que o torna um bom candidato para uso nos perfis da invenção. Os valores p podem, por exemplo, incluir 0,1 ou menos, como 0,05 ou menos, em particular 0,01 ou : menos. Os valores p como usados aqui incluem os valores “P” corrigidos e/ou " também valores “P” não corrigidos.

" Outro parâmetro para identificar genes que poderiam ser usados para a classificação da amostra é o algoritmo sinal para ruído, que mede a diferença em nível de expressão entre os dois grupos sendo comparados ponderando a soma do desvio do padrão intragrupo. Ele pode ser ainda usado para classificar os genes com maior diferença de expressão entre —gruposcom baixa dispersão intragrupo. A invenção também se estende a formas de realização separadas de acordo com a invenção descrita aqui, que compreendem, . consistem essencialmente de, ou consistem dos e componentes/elementos descritos aqui. GC 15 A invenção se estende aos equivalentes funcionais de genes ' listados aqui, por exemplo, como caracterizado por classificação hierárquica de genes como descrito por Hongwei Wu et al 2007(Hierarchical classification of equivalent genes in prokaryotes- Nucleic Acid Research Advance Áccess). Apesar de não se desejar limitar por teorias, pensa-se que não é necessário que o gene per se seja característico da assinatura, mas ao contrário, é a função do gene que é fundamentalmente importante. Assim um gene funcionalmente equivalente a um gene de ativação imune como os listados em Tabela 1 pode ser empregado na assinatura, ver por exemplo, Journalofthe National Cancer Institute Vol 98, No. 7 April 5 2006. Os genes foram identificados por sondas específicas e assim um versado na técnica irá entender que a descrição dos genes acima é a descrição baseada na compreensão corrente do que hibridiza a sonda. No entanto, sem levar em conta a nomenclatura usada para os genes por repetição da hibridização para a sonda relevante sob as condições prescritas, o gene requerido pode ser identificado. . A invenção se estende ao uso do perfil (s) de acordo com a ' invenção para predizer ou identificar um paciente como um respondedor ou . 5 — não respondedor à imunoterapia, como imunoterapia de câncer, por exemplo, imunoterapia de câncer de testículo, em particular imunoterapia Mage, especialmente para melanoma.

Assim a invenção inclui um método de analisar a amostra derivada do paciente, baseada em expressão do perfil /gene(s) de acordo com a invenção com a finalidade de caracterizar o paciente do qual a amostra foi derivada como um respondedor ou não respondedor à imunoterapia de acordo com a presente invenção. , Em um aspecto a invenção provê um método para medir os níveis de expressão de polinucleotídeos a partir dos genes identificados aqui "15 na amostra para o fim de identificar se o paciente, do qual a amostra foi ' derivada, provavelmente será um respondedor ou não respondedor à imunoterapia, tal imunoterapia de câncer de acordo com a presente invenção compreendendo as etapas: isolar o RNA da amostra, opcionalmente amplificar as cópias do cDNA da amostra para referidos genes, e quantificar os níveis de CDNA na amostra.

Em algumas formas de realização, a invenção provê um kit de diagnóstico compreendendo pelo menos um componente para realizar uma —análiseem uma amostra derivada do paciente para identificar um perfil de acordo com a invenção, cujos resultados podem ser usados para designar um paciente do qual a amostra foi derivada como um respondedor ou não respondedor à imunoterapia.

O kit pode compreender materiais/reagentes para PCR (como

QPCR), análise de microarranjo, imunohistoquímica ou outra técnica analítica pode ser usada para acessar a expressão diferencial de um ou mais genes. . A invenção também provê um kit de diagnóstico ' compreendendo um conjunto de sondas capazes de hibridizar para MRNA ou S 5 “cDNA de um ou mais, como pelo menos 5 genes descritos aqui em relação com a invenção, por exemplo, um kit de diagnóstico compreendendo um conjunto de sondas capaz de hibridizar para MRNA ou seu cDNA de pelo menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26,27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43,45, 46,47, 48,49,50,51,52,53, 54, 56,57, 58, 59, 60, 61,62, 63,64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,71,72,73, 74,75, 76,77, 78 ,79 80, 81, 82 ou 83 genes em Tabela 1. Em outra forma de realização, esta invenção refere-se a kits de diagnósticos.

Por exemplo, kits de diagnósticos contendo estes microarranjos compreendendo um substrato de microarranjo e sondas que são capazes de ' 75 hibridizar em mRNA ou cDNA expressados a partir de, por exemplo, 5, 6, 7, ' 8,9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,31,32,33, 34,35, 36, 37,38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48,49, 50, 51, 52,53, 54, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63,64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,71, 72,73, 74, 75, 76, 77, 78 ,79 80, 81, 82 ou 83 genes em Tabela 1 são capazes de demonstrar a assinatura de genes da invenção.

Em um aspecto a invenção provê microarranjos adaptados para a identificação da assinatura de acordo com a invenção.

Em algumas formas de realização, a invenção também se estende aos substratos e sondas apropriados para hibridizando em uma porção —demRNA oucDNA expressada a partir de um ou mais genes empregados na invenção, por exemplo, da Tabela 1. Os microarranjos comercialmente disponíveis contém muito mais sondas do que são requeridas para caracterizar a expressão diferencial dos genes sob consideração em qualquer momento, de modo a auxiliar a precisão da análise. Assim, um ou mais conjuntos de sonda pode reconhecer um gene. . Assim, em uma forma de realização, sondas múltiplas ou ' conjuntos de sondas são usados para identificar expressão diferencial, como " 5 — regulação positiva do gene de acordo com qualquer aspecto da invenção aqui descrita.

O kit de diagnóstico pode, por exemplo, compreender sondas, que são dispostas em um microarranjo.

Especificamente, microarranjos preparados, por exemplo, contendo um ou mais conjuntos de sonda descritos aqui podem ser prontamente preparadas por empresas como Affymetrix, assim provendo um teste específico e opcionalmente reagentes para identificar o perfil, de acordo - com a invenção, Em uma forma de realização, os microarranjos ou kits de ' ' 5 — diagnósticos serão adicionalmente capazes de testar a presença ou ausência do ' gene expressando antígeno de câncer de testículo relevante como o gene Mage.

Assim, em um aspecto, a invenção provê uma sonda e/ou conjunto de sondas apropriados para a referida hidridização, sob condições apropriadas. A invenção também se estende ao uso de sondas, por exemplo, como descrito aqui ou equivalentes funcionais das mesmas, para a identificação de um perfil de gene de acordo com a presente invenção.

Em algumas formas de realização, a invenção aqui descrita se estende ao uso de todas as permutas das sondas listadas aqui (ou análogos — funcionaisdasmesmas) para identificação da referida assinatura.

Em um aspecto a invenção provê uso de uma sonda para a identificação de expressão diferencial de pelo menos um produto de gene de um gene de ativação imune para estabelecer se um perfil de gene de acordo com a presente invenção está presente na amostra derivada do paciente.

Em formas de realização da presente invenção em que hibridização é empregada, hibridização geralmente será realizada sob ' : condições severas, como 3X SSC, 0,1% SDS, a 50 ºC. ' Uma vez que o gene(s)alvo/perfil foi/foram identificados então " 5 — estábem de acordo com a capacidade do versado na técnica projetar sondas alternativas que hibridizam para o mesmo alvo. Assim a invenção também se estende às sondas, que sob as condições apropriadas medem a mesma expressão diferencial do(s) gene(s) da presente invenção para prover uma assinatura/perfil como descrito.

A invenção também se estende ao uso de uma sonda relevante em análise de se um paciente com câncer será um respondedor ou não respondedor ao tratamento com uma imunoterapia apropriada.

- A invenção também se estende ao uso (e processos empregando o mesmo) de microarranjos conhecidos para a identificação da C 15 assinatura de acordo com a invenção.

' Uma sonda de ácido nucleico pode ter pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 ou mais nucleotídeos de comprimento e pode compreender o gene de comprimento completo. As sondas para uso na invenção são as que são capazes de hibridizar especificamente para MRNA —(ouseucDNA) expressado entre os genes listados em Tabela 1 sob condições estringentes.

A presente invenção ainda refere-se a um método de triagem dos efeitos de um fármaco sobre uma amostra de tecido ou célula compreendendo a etapa de analisar um perfil de expressão, empregando qualquer forma de realização da invenção descrita aqui antes e após o tratamento com o fármaco. A invenção assim provê um método para triagem para um fármaco, que iria alterar o perfil de gene ao de um paciente tendo melhorada sobrevivência seguindo tratamento com, por exemplo, imunoterapia específica para antígeno Mage de câncer (isto é, para alterar o perfil de gene ao de um respondedor), de modo a permitir ao paciente se beneficiar de, por exemplo, imunoterapia específica para antígeno Mage de . câncer. ' A presente invenção ainda provê um método de diagnose de paciente compreendendo, por exemplo, a etapa de analisar o perfil de expressão de acordo com qualquer forma de realização da invenção descrita aqui e comparando o mesmo com um padrão para diagnosticar se o paciente iria se beneficiar da imunoterapia específica para Mage.

A invenção inclui um método de diagnose de paciente compreendendo a etapa de analisar o perfil de expressão de acordo com qualquer forma de realização da invenção a partir de amostra de tecido de tumor dada por um paciente e avaliando se, por exemplo, 1, 2,3,4,5,6,7,8, . 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,31,32,33,34,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, ' 75 52,53, 54, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63,64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72,73, 74,75, 76, 77, 78, 79 80, 81, 82 ou 83 dos referidos genes na Tabela 1 são expressados.

Assim, em aplicações clínicas, as amostras de tecido de um paciente humano podem ser triadas para a presença e/ou ausência da — expressão de qualquer forma de realização da invenção descrita aqui.

Em um aspecto alternativo, a invenção provê um método ainda compreendendo as etapas de analisar uma amostra derivada de tumor para determinar que o(s) antígeno(s) é (são) expressado(s) pelo tumor e assim permite(m) a administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma imunoterapêutica de câncer específica de antígeno apropriada, por exemplo, onde o tumor é verificado como sendo positivo para MAGE (como Mage A3), tratamento apropriado pode, por exemplo, incluir a administração da imunoterapia específica de antígeno Mage A3.

A amostra como tecido de tumor de um paciente é considerada como apresentando a assinatura de genes da invenção se um ou mais genes, como substancialmente todos os genes de qualquer forma de realização da . invenção, são diferencialmente expressos (como regulados de modo positivo), ' e podem ser detectados por análise do microarranjo ou outra análise . 5 apropriada, por exemplo, como descrito aqui. Outras formas de realização específicas são descritas abaixo. Em algumas formas de realização o método compreende as etapas de: lanalisar uma amostra derivada do paciente para uma — expressão dos produtos de gene de um ou mais genes de Tabela 1, 2normalização do nível de expressão dos produtos de gene; 3comparação do nível de expressão normalizado com um - padrão, em que o padrão é um valor para, ou uma função de, expressão de um produto de gene ou produtos de Tabela | em um paciente ou pacientes que , "s tem um conhecido estado de respondedor ou não respondedor, de modo que ' comparação da informação do padrão com informação com relação à expressão dos mesmos genes na amostra derivada do paciente permite que uma conclusão seja alcançada sobre o estado de respondedor ou não respondedor no paciente; A4caracterizar o paciente do qual a amostra foi derivada como um respondedor ou não respondedor; e Sopcionalmente incluir a etapa de selecionar o paciente para pelo menos uma administração de uma imunoterapêutica apropriada se o paciente for caracterizado como um respondedor à imunoterapêutica.

Em um aspecto, a normalização é realizada usando uma referência “interna” como a expressão do gene house keeping ou genes a partir da mesma amostra. Em um aspecto a normalização é realizada usando uma referência externa, como a derivada de um indivíduo ou indivíduos diferentes.

Em um aspecto a caracterização da amostra é realizada usando um microarranjo.

Em um aspecto a caracterização da amostra é realizada : usando uma técnica de amplificação de ácido nucleico como PCR. ' Em um aspecto a caracterização da nova amostra usando uma .- 5 técnicaàbasede microarranjo inclui a etapa de pré-processamento de amostra e normalização de gene para produzir valores de expressão de gene comparáveis ao padrão ou conjunto de treino.

À normalização da amostra pode ser realizada usando o algoritmo GCRMA (Wu, 2004) exemplificado em Apêndice 1, por exemplo, com parâmetros de referência GCRMA calculados a partir dos dados de treino apropriados.

Exemplos de parâmetros que podem ser calculados sobre dados de treino são os quantis de referência e efeitos de sonda.

A normalização de genes pode ser realizada usando um : cálculo do escore Zem que uma média específica do conjunto de sondas é subtraída do valor do conjunto de sondas e este valor de expressão centrado " 75 na média é então ponderado por um desvio padrão específico do conjunto de . sondas.

Em um aspecto a caracterização da nova amostra usando Q- PCR envolve uma etapa de pré-processamento de normalização de dados brutos do paciente usando alguns genes de referência ou housekeeping.

O — cálculo do escore Z pode ser realizado usando parâmetros de um padrão ou conjunto de treino.

Em um aspecto, as etapas de comparar e caracterizar um paciente com melanoma utilizam os 100 conjuntos de sonda ou 83 genes listados em Tabela | para caracterizar um paciente como um respondedor (R) ou assinatura de genes (GS)+ ou um não respondedor (NR,GS-) usando o seguinte algoritmo: Algoritmo 1 library(genefilter) HH load testset to classify (normalized microarray data)

load("testset.RData") H&!tt ExpressionSet containing samples to classify ; testset<-data fffit(modify xx according to batch number) ' Hifi Load training set parameters HHHHHHHHHHHHRHHH

- 5 load("M8.train.parameters.RData") PS<-M8.train.parameters[[1]] MB.train.means<-M8.train.parameters[[2]] M3.train.sd<-M8.train.parameters[[3]] M8.train.

U<-M8.train.parameters[[4]] :

M3.trainPC1barRs<-M8.train.parameters[[5]] MB8.trainPC1sdRs<-M8.train.parameters[[6]] M38.trainPC1barNRs<-M8.train.parameters|[7]]

- MB8.trainPC1sdNRs<-M8&.train.parameters[[8]] HHHBHHHAHHARAHABHARBRAARAARARNBAAHHA Use SPCA on test os set - HHHHHHHHHAHEAAARARARARARA ' testset<-testset[PS,] test<-(exprs(testset)-MS$.train.means)/M8.train.sd PCtest<-t(test) %*% M8.train.

U PCltest<-PCtest[,1]

distanceR<-c() distanceNR<-c() probR<-c() probNR<-c()

SPCAclass<-c()

for (i in 1:ncol(test)) (

distancesR<-abs(PCtest[i,1]- M8.trainPC1barRs)/M8.trainPC1sdRs distancesNR <-abs(PCtest[i,1]- M3.trainPC1barNRs)/M8.trainPC1sdNRs distanceR<-c(distanceR,distancesR) distanceNR<-c(distanceNR distancesNR) : probRs<-exp(-distancesR/2)/(exp(-distancesR/2)+exp(- ' distancesNR/2)) i . 5 — probNRs<-exp(-distancesNR/2)/(exp(-distancesR/2)+exp(- distancesNR/2)) probR<-c(probR,probRs) probNR<-c(probNR,probNRs) ) cutoff=0.43 clust<-ifelse(as.vector(probR)>cutoff, R.NR)) em que : - —testset é uma matriz com 100 fileiras contendo os dados normalizados do microarranjo para 100 PS - 15 - “M$jtrain.parameter é um objeto da lista de classe contendo

1. uma lista de caracteres do 100 PS

2. um vetor de 100 valores médios para cada PS no conjunto de treino

3. um vetor de valores 100 sd para cada PS no conjunto de treino

4. uma matriz de 100 fileiras e 56 colunas contendo a matriz U de decomposição svd da matriz de treino

5. o valor médio de PC1 do grupo respondedor no treino

6. ovalor PCI sd do grupo respondedor no treino

7. o valor médio de PC1 do grupo não respondedor no treino

8. ovalor PCI sd do grupo não respondedor no treino A média e sd de cada grupo no conjunto de treino (arredondado para três dígitos significantes) são:

a “ — Média, desvios padrão (Sd) e coeficientes de PC, para os ' recursos de classificador 100 PS [ ]JM&a | sa [Pi 0,0556 ' “ ] : 228492 at 1,388 234907 x at 1553132 a at [239012 at UN 6533 |1,694 |-0,0656 | nove [7445 J1sos [oomo | HUMISGF3A/M97935 MB at 7A45 1,504 -0,0819 1562031 at 6,653 232375 at 211911 x at

[o |Mé& Ts Trci 1,258 214470 at 23231] at 7,001 ”, : [207536 sa NÃ 4073 175 |-0106 | ] 2,268 : - ' 0,114 -0,1161 -0,1165 -0,1168

Po [M&a sd [PI | 216920 s at 5,641 |1,862 210972 x at -0,1224 205890 s at 2,983 |-0,1225 232234 at 6,877 2,249 |-0,1228 - 207651] at -0,1229 . 202531 at -0,1234 2,698 | -0,1242 : 213193 x at 6,825 2,768 |-0,1257 204116 at 6,106 |2,683 213539 at 7,398 [2,851 211339 s at 5,602 -0,1266 2,733 211796 s at 6,946 2,921 -0,1271 205758 at 7,338 [3,285 |[-0,1275 Em um aspecto, as etapas de comparar e caracterizar um paciente com melanoma utiliza qualquer um dos 100 conjuntos de sonda ou 83 genes mencionados em Tabela 13 individualmente para caracterizar um - paciente usando o algoritmo especificado acima em que valores de expressão — degeneúnicosão usados em vez do primeiro componente principal (PC1). ' Em um aspecto, as etapas de comparar e caracterizar um . paciente com melanoma utilizam os 22 genes listados em Tabela 5 para caracterizar um paciente como um respondedor (R) ou assinatura de genes (GS)+ ou um não respondedor (NR, GS-) usando o seguinte algoritmo: Algoritmo 2 HHH Script for classification of test-samples fresh metatasic melanoma TLDA?2 22 genes ff! based on Mage008TLDA.SPCA.DA.Mel4patent.R HA needs — MG8.train.parameters.22genes.TLDA2.RData (training set parameters) library(genefilter) HH load testset to classify (log-scaled normalized PCR data) load("testset.RData") tt ExpressionSet containing samples to classify ftHt Load training set parameters HAHHHHHHHARHHHAH load("MS8.train.parameters.22genes.TLDA2 .RData") PS<-M8.train.parameters[[1]] MB8.train.means<-M8.train.parameters[[2]] " M3.train.sd<-M8 .train.parameters[[3]] " — M8.train. U<-M8.train.parameters[[4]] M8.trainPC1barRs<-M8.train.parameters[[5]] M8.trainPC1sdRs<-M3.train.parameters[[6]] MB.trainPC1barNRs<-M8.train.parameters[[7]] M8.trainPC1sdNRs<-M8.train.parameters[[8]] HitAIAAAAAENAARAAAAARARE Use SPCA on test set -

HHHANHABAHADO RARA testset<-testset[PS,] : test<-(exprs(testset)-M38.train.means)/M8.train.sd PCtest<-t(test) %*% MS$.train.U “os PCItest<-PCtest[,1] ' distanceR<-c() distanceNR<-c() probR<-c() probNR<-c() SPCAclass<-c() for (i in 1:ncol(test)) ( distancesR<-abs(PCtest[i,1]- — |M8trainPCIbarRs)/M8 trainPC1sdRs distancesNR<-abs(PCtest[i,1]- |M8.trainPClbarNRs)/M8.trainPC1sdNRs distanceR <-c(distanceR,distancesR) distanceNR<-c(distanceNR,distancesNR) probRs<-exp(-distancesR/2)/(exp(-distancesR/2)+exp(- distancesNR/2))

probNRs<-exp(-distancesNR/2)/(exp(-distancesR/2)+exp(- distancesNR/2)) probR<-c(probR,probRs) Ú probNR<-c(probNR probNRs) - | ; - - cutoff=0.47 clust<-ifelse(as.vector(probR)>cutoff,R,NR)

HHABHHADABA HA AAAAADA Hitt(modify xx next line according to batch number) write.table(cbind(pData(testset),probR),file="testset batch xx TLDA?2 22genes classification.txt",sep="Wt") em que - - —TestsetRData é uma matriz com 22 fileiras contendo os dados PCR em escala log normalizados para os 22 genes : 15 - —“M8&.train.parameter é um objeto da lista de classe contendo

1. uma lista de caracteres dos nomes de 22 genes

2. um vetor de 22 valores médios para cada gene no conjunto de treino

3. um vetor de 22 valores sd para cada gene no conjunto de treino

4. uma matriz de 22 fileiras e 22 colunas contendo a matriz U de decomposição svd da matriz de treino

5. o valor médio de PC1 do grupo respondedor no treino

6. o valor PCI sd do grupo respondedor no treino

7. ovalor médio de PC1 do grupo não respondedor no treino

8. o valor PCI sd do grupo não respondedor no treino Média, desvios padrão (Sd) e coeficientes PC, para características de classificador de 22 genes

7O Coeficien Gene Média Sd te PCI -1,397 1,244 -0,1834 - 0,691 -0,2441 -0,1636 1 0,500 -0,2345 - CXCL9 -0,2349 IL2RG 0,657 CXCLI0 -0,830 0,896 -0,2181 SLC26A2 0,307 0,0660 CD86 -1,504 0,461 -0,2272 CD8A -1,342 0,879 -0,1881 -0,2385 1,470 0,734 -0,2414 GPR171 -1,683 0,698 -0,2180 PSCDBP -1,335 0,647 -0,2212 0,633 01437 1COS 0,697 TRBC] 2,714 1,313 -0,2026 - TRAG;TRAJI;TRDV2;TRAC;TRAV20 0,666 -0,2464 TARP;TRGC2 0,877 . -1,862 0,896 -0,2178 " CD3D 1,478 HLA-DMA -0,380 0,470 -0,2284 ' A média e sd de cada grupo no conjunto de treino (arredondado para três dígitos significantes) são: 1210 Em um aspecto, as etapas de comparar e caracterizar um — paciente com melanoma utiliza qualquer um dos 22 genes mencionados em Tabela 11 individualmente para caracterizar um paciente usando o algoritmo especificado acima em que valores de expressão de gene único são usados em vez do primeiro principal componente (PC1). Em um aspecto, as etapas de comparar e caracterizar um — paciente NSCLC utilizam os 23 genes listados em Tabela 7 para caracterizar um paciente como um respondedor (não relapso ou assinatura de genes + (GS+),1) ou um não respondedor (relapso, GS-,0) usando o seguinte algoritmo: Algoritmo 3 HH Script for classification of test-samples fresh resected ' NSCLC TLDAmerge 23 genes | . 5 HH based on Mage004.SPCA.Cox.classifier.contruction.

TLDAmerge.23genes.DFI.Squam ous.R HH needs M4.train.parameters.23genes.TLDAmerge.RData (training set parameters) library(genefilter) ft load testset to classify (log-scaled normalized PCR data) load("testset.RData") 4 ExpressionSet containing samples to - classify ft Load training set parameters HHHHHHHHHHHHAHA CG 15 load("MA.train.parameters.23genes.

TLDAmerge.RData") “ PS<-MA.train.parameters[[1]] MA .train.means<-M4.train.parameters[[2]] MA.train.sd<-M4.train.parameters[[3]] MA.train.

U<-MA.train.parameters[[4]] MA4.train.Btreatment<-M4.train.parameters[[5]] M4 -.train.Binteraction<-M4.train.parameters[[6]] M4.train.medianHR <-M4.train.parameters[[7]] HHHHAIARHRABARAAHAAAARAHARBAAAAAHHAR Use SPCA on test set - HHRHHHHHHHHHHHHARBAAHHA testset<-testset[PS,] test<-(exprs(testset)-MA4.train.means)/M4.train.sd PCtest<-t(test) %*% MA .train.U PCltest<-PCtest[,1] HR=MA.train.Btreatment+PC1test*MA4.train.Binteraction

TP classification=ifelse(HR<MA4.train.medianHR, 1,0)

HHBHHBURUBUAAUAARAAA Hittfi(modify xx next line according to batch number) Ú write.table(cbind(pData(testset),probR),file="testset batch xx & 5 | M4 TLDAmerge 23genes classification.txt",sep="") em que - —Testset.RData é uma matriz com 23 fileiras contendo os dados PCR em escala log normalizados para os 23 genes - “M4ltrainparameter é um objeto da lista de classe contendo :

1. uma lista de caracteres dos nomes dos 23 gene

2. um vetor de 23 valores médios para cada gene no conjunto - de treino

3. um vetor de 23 valores sd para cada gene no conjunto de “15 treino * 4. uma matriz de 23 fileiras e 23 colunas contendo a matriz U de decomposição svd da matriz de treino

5. Bruatamento EM Computação de escore de risco

6. Brciinteraçã EM computação de escore de risco

7. o escore de risco mediano em treino Média, desvios padrão (Sd) e coeficientes PC1 para características de classificador de 23 genes Coeficien Gene Média sd te PCI -2,35768 -0,12114 CCLS -0,9599 0,350039 -0,23097 136811 — 10260374 — |-0,19931 -0,52347 — 0276644 —|-0,2256 CXCL9 -0,87804 0,563437 -0,21386 IL2RG -0,83528 0,358042 -0,24997 CXCL1I10 -1,36857 0,615177 -0,17136 SLC26A2 0,255169 -0,05637 CD86 -1,7699 0,499237 -0,13267 CD8SA -1,33733 0,375334 -0,25173

Coeficien Gene Média te PC1 0,71367 —J0,546652 — |-0,21295 GZMK. =1,77411 0,529496 -0,24628 GPR171 -1,81327 0,32409 -0,19376 - PSCDBP -1,17746 0,3871117 -0,24162 - CXCL2 -1,16947 0,696255 -0,09696 - ICOS -2,15436 0,403522 -0,23497 TRBCI] -2,62512 1,01328] -0,12679 TRAQ:;TRAJI7;TRDV2;TRAC;TRAV20 | -1,19671 -0,25817 TARP;TRGC2 -2,22752 0,481252 -0,19299 185777 —J0,394118 — |-0,26077 CD3D —1,64584 0,397626 -0,25514 HLA-DMA -0,81144 0,380465 -0,22948 SLAMF7 -1,33744 0,464338 -0,21762 em que Bratamento0-0.2429033 € Bpciinteração= 0,1720062 foram obtidos do conjunto de treino.

O escore de risco da nova amostra é comparado ao escore de ' risco mediano do conjunto de treino = -0,323947288 e a amostra é -5 classificada GS+ (Respondedor, Não Relapso,1) se o escore de risco for menor do que este valor. ' Em um aspecto, as etapas de comparar e caracterizar um paciente NSCLC utiliza qualquer um dos 23 genes mencionados em Tabela 12 individualmente para caracterizar um paciente usando o algoritmo — especificado acima em que valores de expressão de gene único são usados em vez do primeiro principal componente (PC1).

Em um aspecto, as etapas de comparar e caracterizar um paciente NSCLC utiliza os 22 genes listados em Tabela 9 para caracterizar um paciente como um respondedor (não relapso ou assinatura de genes + 15º (GS+),]) ou um não respondedor (relapso, GS-,0) usando o seguinte algoritmo: Algoritmo 4 HHH Script for classification of test-samples fresh resected NSCLC TLDAmerge 22 genes fit based on Mage004.SPCA.Cox.classifier.contruction.

DFI.Squamous.R HH needs M4trainparameters.22genes.TLDA?2.RData (training set parameters) Í library(genefilter) SS “AHH loadtestsettoclassify (log-scaled normalized PCR data) load("testset.RData") ttf ExpressionSet containing samples to classify fit Load training set parameters HrHEHHHHHHHIHAHAR load("MA.train.parameters.22genes.TLDA2.RData") PS<-MA4.train.parameters|[[1]] MA,.train.means<-MA.train.parameters[[2]] MA;.train.sd<-M4.train.parameters[[3]] - MA train. U<-M4.train.parameters| [41] MA .train.Btreatment<-MA.train.parameters[[5]] C 15 MA.train.Binteraction<-MA4 .train.parameters|[6]] . MA.train.medianHR<-MA.train.parameters|[7]] HAHAHAHA RADAR AA MAAANATAZARATARTAÓAATAR Use SPCA on test set - HHHHHHHHHHHRAHHAAAABAHA testset<-testset[PS,] test<-(exprs(testset)-MA.train.means)/MA4.train.sd PCtest<-títest) %*% MA4 train. U PCltest<-PCtest[,1] HR=MA4.train.Btreatment+PC1test* MA .train.Binteraction classification=ifelse(HR<MA.train.medianHR, 1,0)

HAHHBAHRHHHBABHNARAA Htiftit(modify xx next line according to batch number) write.table(cbind(pData(testset),probR),file="testset batch xx —M4 TLDA?2 22genes classification.txt",sep="t") em que

- —TestsetRData é uma matriz com 22 fileiras contendo os dados PCR em escala log normalizados para os 22 genes - —“M4train.parameter é um objeto da lista de classe contendo é 5 1. uma lista de caracteres dos nomes dos 22 genes "

2. um vetor de 22 valores médios para cada gene no conjunto de treino

3. um vetor de 22valores sd para cada gene no conjunto de treino

4. uma matriz de 22 fileiras e 22 colunas contendo a matriz U de decomposição svd da matriz de treino

5. —Bratamenço EM Computação de escore de risco + 6. "Bpctinteração EM Computação de escore de risco

7. oescore de risco mediano em treino “15 Média, desvios padrão (Sd) e coeficientes PCI para características de ' classificador de 22 genes Gene coeficientes PC1 -2,37682 | 1,4632191 |-0,2613 CCLS -0,97196 |0,363545 )-0,23868 -1,38351 [0,272662 |-0,20067 -0,5328 — | 0,284196 CXCL9I -0,88518 |0,561561 |-0,21758 IL2RG -0,84755 |0,369696 |-0,25893 CXCLIO0 -1,38526 | 0,608373 SLC26A2 -1,45138 |/0,259368 |-0,06122 CD86 -1,78136 | 0,493304 |-0,1445 -1,35019 /0,38214 —|-0,26018 -0,72426 |[0,545598 |-0,2157T3 GZMK -1,7857 0,526042 |-0,25378 GPRI171 0,353983 |-0,1875 PSCDBP -1,19407 | 0,398912 |-0,24969 CXCL2 1,17377 | 0,679063 ICOS -2,16745 | 0,40877 -0,24479 0,999466 | -0,12889 TRAGO;TRAJI7;TRDV2;TRAC;TRAV20 | -1,20289 [0,392963 -0,26276 TARP;TRGC2 -2,27109 |0,528402 |-0,19113 187391 [0,4005727 |-0,26852 CD3D -1,66653 | 0,409356 |-0,26013 HLA-DMA. -0,81888 | 0,400541 em que Bratamento=-0,193146993and Bpciinteração= -0,163704817 foram obtidos do conjunto de treino.

O escore de risco da nova amostra é comparado ao escore de , risco mediano do conjunto de treino = -0,25737421 e a amostra é classificada a 5 —GS+ (Respondedor, Não Relapso,1) se o escore de risco for menor do que este valor.

Imunoterapêutica Em outro aspecto a invenção provê um método de tratar um paciente respondedor com uma imunoterapia apropriada, por exemplo, —imunoterapia de câncer como imunoterapia de câncer de testículo, após identificação do mesmo como-um respondedor à mesma.

Assim, em algumas formas de realização, a invenção provê um - método de tratamento de um paciente compreendendo a etapa de administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma imunoterapia apropriada “15 (por exemplo imunoterapia de câncer, como imunoterapia de câncer Mage), ' após primeiro caracterizar o paciente como um respondedor baseado em expressão diferencial de pelo menos um gene de ativação imune, por exemplo, como mostrado por apropriada análise da amostra derivada do paciente.

Em particular em que o paciente é caracterizado como um —respondedor baseado em um ou mais formas de realização descritas aqui.

Em um aspecto a imunoterapia compreende um adjuvante apropriado (imunoestimulante), Ver descrição abaixo.

Em ainda outra forma de realização da invenção provê-se um método de tratamento de um paciente sofrendo de, por exemplo, um tumor expressando Mage, o método compreendendo a determinação se o paciente expressa a assinatura de genes da invenção e então administração, por exemplo, uma imunoterapêutica específica para Mage.

Em outra forma de realização, o paciente é tratado com, por exemplo, a imunoterapia específica para Mage para prevenir ou melhor a recorrência da doença, após primeiro receber tratamento como ressecção por cirurgia de qualquer tumor ou outro tratamento quimioterapêutico ou radioterapia.

Um outro aspecto da invenção é um método de tratamento de " um paciente sofrendo de um tumor expressando Mage, o método ' . 5 — compreendendo a determinação se o tumor do paciente expressa um perfil de acordo com qualquer forma de realização da invenção de uma amostra biológica dada por um paciente e então administração de uma imunoterapêutica específica para Mage para referido paciente.

Provê-se também um método de tratamento de um paciente — suscetível à recorrência de tumor expressando Mage tendo sido tratado para removert/tratar um tumor expressando Mage, o método compreendendo a determinação se o tumor do paciente expressa um ou mais genes selecionados . dentre qualquer forma de realização da invenção a partir de uma amostra biológica dada por um paciente e então administração a imunoterapêutica “os específica para Mage. . A invenção também provê como método de tratamento ou uso empregando: * —“Imunoterapêutica específica para Mage compreendendo um antígeno MAGE ou peptídeo do mesmo, * antigeno MAGE compreendendo uma proteína ou peptídeo MAGE-A3, * antigeino MAGE compreendento o peptídeo EVDPIGHLY, * antígeno MAGE ou peptídeo fusionado ou conjugado a uma proteína veículo, por exemplo, em que a proteína veículo é selecionada dentre proteína D, NS1 ou CLytA ou fragmentos dos mesmos e/ou * —Imunoterapêutica específica para Mage ainda compreende um adjuvante, por exemplo, em que o adjuvante compreende um ou mais ou combinações de: 3D-MPL; sais de alumínio; oligonucleotídeos contendo

CpG; - adjuvantes contendo saponina como QS21 ou ISCOMs; emulsões óleo-em-água; e lipossomas.

A invenção também se estende ao uso de uma imunoterapia tal ' como uma imunoterapia de câncer, em particular imunoterapia Mage na i ” 5 —fabricaçãodeum medicamento para o tratamento de um paciente tal como um paciente com câncer designado como um respondedor, ao mesmo.

Observou-se que um paciente inicialmente caracterizado como um não respondedor foi subsequentemente caracterizado como respondedor após terapia de radiação.

De modo interessante, os inventores também — acreditam que pode ser possível induzir um perfil de respondedores em pelo menos alguns não respondedores, por exemplo, submetendo o paciente a terapia de radiação, ou administração de um estimulante inflamatório como . interferon ou TLR 3 (por exemplo como descrito em WO 2006/054177), : agonista 4, 7, 8 ou TLR 9 (por exemplo contendo um motivo CpG, em “15 particular administração de uma alta dose do mesmo como 0,1 a 75 mg por ' Kg administrado, por exemplo, semanalmente). Ver por exemplo Krieg, A.

M,, Efler, S.

M., Wittpoth, M., Al Adhami, M.

J. & Davis, H.

L.

Induction of systemic THIl-like innate immunity in normal volunteers seguintes subcutaneous but not intravenous administração of CPG 7909, a synthetic B- class CpG oligodeoxynucleotide TLR9 agonist.

J.

Immunother. 27, 460471 (2004). A dose elevada de CpG pode, por exemplo, ser inalada ou dada subcutaneamente.

A invenção ainda provê o uso de imunoterapia específica para Mage na fabricação de um medicamento para o tratamento de pacientes sofrendo de tumor expressando Mage ou pacientes que receberam tratamento (por exemplo cirurgia, quimioterapia ou radioterapia) para remover/tratar um tumor expressando Mage, referido paciente expressando a assinatura de genes da invenção.

A imunoterapia pode então ser administrada a por exemplo respondedores ou uma vez que o perfil dos respondedores foi induzido.

Em um aspecto a invenção provê uso de imunoterapia õ específica para Mage na fabricação de um medicamento para o tratamento de " S — pacientes sofrendo de um tumor expressando Mage, referido paciente caracterizado por seu tumor expressando um ou mais genes selecionados dentre qualquer forma de realização da invenção.

A invenção também provê uso de imunoterapia específica para Mage na fabricação de um medicamento para o tratamento de pacientes — suscetíveis a recorrência de tumor expressando Mage referido paciente caracterizado por seu tumor ter um ou mais genes selecionados dentre qualquer uma das formas de realização da invenção.

. Com vantagem, a invenção pode permitir previsores de tratamento para marcar as populações de pacientes que irão obter um “15 benefício clínico de receber uma imunoterapia apropriada, Espera-se que após " triagem pelo menos 60% de pacientes como 70, 75, 80, 85% ou mais de pacientes considerados/caracterizados como respondedores irão receber um benefício clínico da imunoterapia, que é um aumento significante sobre os níveis correntes observados com terapia como terapia de câncer geralmente.

Com vantagem se a imunoterapia de câncer é dada concomitantemente ou subsequente a quimioterapia, ela pode auxiliar a aumentar as respostas imunes do paciente, que tinham sido exauridas na quimioterapia.

Em outra forma de realização a imunoterapia pode ser dada —antesda cirurgia, quimioterapia e/ou radioterapia.

Imunoterapêutica de câncer específica para antígeno (ASCIs) apropriada para uso na invenção pode, por exemplo, incluir as capazes de elevar uma resposta imune específica para Mage. Esta imunoterapêutica pode ser capaz de elevar uma resposta imune a um produto de gene Mage, por exemplo, um antígeno Mage-A como Mage-A3. A imunoterapêutica irá geralmente conter pelo menos um epítopo de um produto de gene Mage. Este epítopo pode estar presente como um antígeno de peptídeo opcionalmente 7 ligado covalentemente a um veículo e opcionalmente na presença de um Í 5 adjuvante. Alternativamente fragmentos maiores de proteína podem ser usados. Por exemplo, a imunoterapêutica para uso na invenção pode compreender um antígeno que corresponde a ou compreende aminoácidos 195-279 de MAGE-ALI. Os fragmentos e peptídeos para uso devem no entanto, quando de modo apropriado apresentados ser capazes de elevar uma — resposta imune específica para Mage. Exemplos de peptídeos que podem ser usados na presente invenção incluem nonapeptídeo MAGE-3.Al EVDPIGHLY [Seq. ID No ] (ver Marchand et al., International Journal of . Cancer 80(2), 219-230), e os seguintes peptídeos MAGE-A3: FLWGPRAL V;[SEQ. ID NO: 107] 7 15 MEVDPIGHLY;[SEQ. ID NO: 108] + VHFLLLKYRA;[SEQ. ID NO:109] LVHFLLLKYR;[SEQ. ID NO:110] LKYRAREPVT;[SEQ. ID NO: 111] ACYEFLWGPRALVETS; e [SEQ. ID NO: 112] TQHFVQENYLEY;[SEQ. ID NO:113] ASCIs alternativos incluem antígenos de câncer de testículo como NY-ESO1, LAGE 1, LAGE 2, por exemplo, cujos detalhes podem ser obtidos de www.cancerimmunity.org/CTdatabase. ASCIs também incluem outros antígenos que podem não ser específicos para câncer de testículo como PRAMEe WTI.

A imunoterapia de câncer pode ser baseada, por exemplo, em um ou mais dos antígenos discutidos abaixo.

Em uma forma de realização da presente invenção, o antígeno a ser usado pode consistir ou compreender um antígeno de tumor MAGE, por

. exemplo, MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, MAGE 5, MAGE 6, - MAGE 7, MAGE 8, MAGE 9, MAGE 10, MAGE 11 ou MAGE 12. Os genes codificando estes antígenos MAGE estão localizados em cromossomo X e compartilham com cada outro 64 a 85% homologia em sua sequência de — codificação (De Plaen, 1994). Estes antígenos são às vezes conhecidos como MAGE Al, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A 10, MAGE Al 1 e/ou MAGE Al2 (A Família MAGE A). Em uma forma de realização, o antígeno é MAGE A3.

Em uma forma de realização, um antígeno de uma de duas de outras famílias MAGE pode ser usado: o grupo MAGE B e MAGE C. À família MAGE B inclui MAGE B1 (também conhecido como MAGE Xpl, e . DAM 10), MAGE B2 (também conhecido como MAGE Xp2 e DAM 6) . MAGE B3 e MAGE B4 — a família Mage C correntemente inclui MAGE C1 “15 eMAGEC?2.

' Em termos gerais, a proteína MAGE pode ser definida como contendo uma assinatura de sequência de núcleo para a extremidade C- terminal da proteína (por exemplo com relação MAGE Al a 309 proteína aminoácido, a assinatura de núcleo corresponde a aminoácido 195-279).

O padrão de consenso da assinatura de núcleo é assim descrito como a seguir em que x representa qualquer aminoácido, resíduos em letra minúscula são conservados (variantes conservativas permitidas) e resíduos em letra maiúscula são perfeitamente conservados.

assinatura de sequência de núcleo LixvL(2x)I(3x)e(2x)apEExi Wexl(2x)Mm(3-4x)Gxe(3- 4X)gxp(2x)IIt3x) Vgex YLx Yxq VPxsxP(2x)yeFL WGprA(2x)Et(3x)kv As substituições conservativas são conhecidas e são geralmente especificadas como as matrizes de escore de default em programas de computador de alinhamento de sequência. Estes programas incluem

& PAM250 (Dayhoft M.O. et al., (1978), “A model of evolutionary changes in . proteins”, In “Atlas of Protein sequence and structure” 5(3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington, e Blosum 62 (Steven Henikoft e Jorja G. Henikoft (1992), “Amino acid — substitution matricies from protein blocks”), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919.

Em termos gerais, a substituição dentro dos seguintes grupos são substituições conservativas, mas substituições entre grupos são consideradas não conservadas. Os grupos são: 1) Aspartato/asparagina/glutamato/glutamina 11) Serina/treonina 1i1) Lisina/arginina . iv) Fenilalanina/tirosina/triptofano . v) Leucina/isoleucina/valina/metionina 5 vi) Glicina/alanina ' Em geral e no contexto desta invenção, uma proteina MAGE será aproximadamente 50% ou mais idêntica, como 70, 80, 90, 95 96, 97, 98 ou 99% idêntica, nesta região de núcleo com aminoácidos 195 a 279 de MAGE AL.

Os derivados de proteina MAGE são também conhecidos na arte, ver: WO 99/40188. Estes derivados são apropriados para uso em formulações de vacina terapêuticas (Imunoterapêutica) que são apropriadas para o tratamento da faixa de tipos de tumor.

Vários epítopos CTL foram identificados na proteína MAGE-

3.Talepítopo, MAGE-3.AI, é uma sequência nonapeptídeo localizada entre aminoácidos 168 e 176 da proteina MAGE-3 que constitui um epítopo específico para CTLs quando apresentado em associação com a molécula HLA.Al MHC classe 1. Recentemente dois epítopos CTL adicionais foram identificados na sequência de peptídeo da proteina MAGE-3 para sua

. capacidade de montar uma resposta CTL na cultura mista de células de ? melanoma e linfócitos autólogos. Estes dois epítopos tem móvitos de ligação específicos para alelos HLA.A2 (Van der Bruggen, 1994) e HLA.B44 (Herman, 1996) respectivamente.

Em outra forma de realização da invenção, o antígeno de tumor pode compreender ou consistir de um dos seguintes antígenos, ou uma porção imunogênica do mesmo que é capaz de dirigir uma resposta imune ao antígeno: SSX-2; SSX-4; SSX-5; NAI7; MELAN-A; Tirosinase; LAGE-1; NY-ESO-1; PRAME; P790; P510; P835; B305D; B854; CASB618 (como — descrito em WO00/53748); CASB7439 (como descrito em WO01/62778); C1491; C1584; e C1585.

Em uma forma de realização, o antígeno pode compreender ou . consistir de PS01S (também conhecido como prosteína). O antígeno P501S . pode ser uma proteina recombinante que combina a maior parte da proteína “15 PS0lScoma proteína de fusão bacteriana compreendendo a parte C terminal . da proteína LytA de Streptococcus pneumoniae em que o peptídeo T auxiliar P2 universal de toxóide de tétano foi inserido, isto é, uma fusão compreendendo CLytA-P2-CLyta (o parceiro de fusão “CPC”), como descrito em WO03/104272.

Em uma forma de realização, o antígeno pode compreender ou consistir de WT-] expressado por gene de tumor de Wilm, ou seu fragmento N-terminal' WT-IF compreendendo cerca de ou aproximadamente aminoácidos 1-249; o antígeno expressado pelo gene Her-2/neu, ou um fragmento do mesmo. Em uma forma de realização, o antígeno Her-2/neu pode ser uma das seguintes proteínas de fusão que são descritas em WO00/44899, Em outra forma de realização, o antígeno pode compreender ou consistir de “proteína de fusão HER-2/neu ECD-ICD,” também referida como “proteína de fusão ECD-ICD” ou “ECD-ICD,” que se refere a uma

7 proteína de fusão (ou fragmentos da mesma) compreendendo o domínio . extracelular (ou fragmentos do mesmo) e o domínio intracelular (ou fragmentos do mesmo) da proteína HER-2/neu. Em uma forma de realização, esta proteína de fusão ECD-ICD não inclui uma porção substancial do —domínio da transmembrana HER-2/neu, ou não inclui qualquer um de domínio da transmembrana HER-2/neu.

Em outra forma de realização, o antígeno pode compreender ou consistir de “proteína de fusão HER-2/neu ECD-PD,” também referida como “ECD-PD” ou “proteína de fusão ECD-PD,” ou a “proteína de fusão HER-2/neu ECD-APD,' também referida como “proteína de fusão ECD- APD” ou “ECD-APD;” que se refere a proteínas de fusão (ou fragmentos das mesmas) compreendendo o domínio extracelular (ou fragmentos do mesmo) e . domínio de fosforilação (ou fragmentos do mesmo, por exemplo, APD) da . proteína HER-2/neu. Em uma forma de realização, as proteínas de fusão “15 ECD-PDe ECD-APD não incluem a substancial porção do domínio de ' transmembrana HER-2/neu, ou não incluem qualquer domínio de transmembrana HER-2/neu.

Em uma forma de realização, o antígeno pode compreender uma proteína Mage ou outra apropriada ligada a um parceiro imunológico de fusão ou melhorador ou expressão. As proteínas de fusão podem incluir uma proteína híbrida compreendendo dois ou mais antígenos relevantes para uma dada doença ou podem ser um híbrido de um antígeno e um parceiro melhorador de expressão.

Em uma forma de realização o antígeno MAGE pode — compreender a proteina MAGE de comprimento completo. Em um alternativa forma de realização o antígeno Mage pode compreender aminoácidos 3 a 312 do antígeno MAGE.

Em formas de realização alternativas o antígeno MAGE pode compreender 100, 150, 200, 250 ou 300 aminoácidos da proteina MAGE,

7 desde que o antígeno seja capaz de gerar uma resposta imune contra MAGE, . quando empregado em um tratamento imunoterapêutico.

O antígeno e parceiro podem ser quimicamente conjugados, ou podem ser expressados como uma proteína de fusão recombinante. Em uma — forma de realização em que o antígeno e parceiro são expressos como uma proteína de fusão recombinante, isto pode permitir a produção de níveis elevados em um sistema de expressão comparado a uma de proteína não fusão. Assim o parceiro de fusão pode auxiliar a prover os epítopos de auxiliar T(parceiro de fusão imunológico), preferivelmente epítopos de auxiliar T reconhecidos por humanos, e/ou auxiliar em expressão da proteína (melhorador da expressão) em maiores rendimentos do que a proteína recombinante nativa. Em uma forma de realização, o parceiro de fusão pode . ser tanto um parceiro de fusão imunológico como um parceiro melhorador da . expressão.

as Em uma forma de realização da invenção, o parceiro de fusão ' imunológico que pode ser usado é derivado de proteína D, uma proteína de superfície da bactéria gram-negativa, Haemophilus influenza B (WO 91/18926) ou um derivado da mesma. O derivado de proteína D pode compreender o primeiro 1/3 da proteína, ou aproximadamente ou cerca do primeiro 1/3 da proteína, em particular pode compreender os primeiros 100- 110 aminoácidos N-terminais ou aproximadamente os primeiros 100-110 aminoácidos N-terminais.

Em uma forma de realização a proteína de fusão compreende os primeiros 109 resíduos (ou 108 resíduos dos mesmos) ou aminoácidos 20 a 127 deproteinaD.

Outros parceiros de fusão que podem ser usados incluem a proteína não estrutura de vírus influenzae, NS1 (hemaglutinina). Tipicamente, os 81 aminoácidos N terminais de NS1 podem ser utilizados, apesar de diferentes fragmentos poderem ser usados desde que incluam os epítopos T-

. auxiliar.

. Em outra forma de realização o parceiro fusão imunológico é a proteina conhecida como LytA. LytA é derivado de Streptococcus pneumoniae que sintetiza uma N-acetil-L-alanina amidase, amidase LytA, — (codificada parao gene LytA (Gene, 43 (1986) pag. 265-272) uma autolisina que especificamente degrada algum as ligações na estrutura dorsal do peptidoglicano. O domínio C-terminal de proteína LytA é responsável pela afinidade para a colina ou alguns análogos de colina como DEAE. Esta propriedade foi explorada para o desenvolvimento de plasmídeos expressando Ecoli C-LytA utilizáveis para a expressão de proteína de fusão. Purificação de proteínas híbridas contendo fragmento C-LytA em seu término amino foi descrita (Biotechnology: 10, (1992) pag. 795-798). Em uma forma de “ realização, a porção C terminal da molécula pode ser usada. À forma de . realização pode utilizar a porção de repetição da molécula LytA encontrada “15 na terminação C terminal partindo em resíduo 178. Em uma forma de ' realização, a porção LytA pode incorporar resíduos 188 - 305.

Em uma forma de realização à presente invenção, a proteína Mage pode compreender um tiol livre derivatizado. Estes antígenos foram descritos em WO 99/40188. Em particular derivados carboxiamidados ou —carboximetilados podem ser usados.

Em uma forma de realização da presente invenção, o antígeno associado a tumor compreende uma molécula de Mage-A3-proteína D. Este antígeno e os resumidos abaixo são descritos em maiores detalhes em WO 99/40188.

Em outras formas de realização da presente invenção, o antígeno associado a tumor pode compreender qualquer uma das seguintes proteínas de fusão: uma proteína de fusão de fragmento de Lipoproteína D, fragmento MAGE, e cauda histidina; proteína de fusão de NS1-MAGES3, e cauda de histidina; proteína de fusão de CLYTA-MAGE 1 -Histidina; proteína

. de fusão de CLYTA-MAGE3-Histidina. . Outra forma de realização da presente invenção compreende usar uma imunoterapêutica de ácido nucleico, que compreende uma molécula de ácido nucleico codificando um antígeno específico de Mage associado a ' so tumores, como descrito aqui. Estas sequências podem ser inseridas no apropriado vetor de expressão e usadas para vacinação DNA/RNA. Os vetores microbianos expressando o ácido nucleico também podem ser usados como imunoterapêuticas com liberação de vetores. Estes vetores incluem, por exemplo, poxvírus, adenovírus, alfavírus e listeria.

10 As técnicas recombinantes convencionais para obter sequências de ácido nucleico, e produção de vetores de expressão são descritas em Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold . Spring Harbor, 1982-1989. : Para imunoterapêuticas com base em proteína, as proteínas da presente invenção são providas ou em forma líquida ou em forma liofilizada. ' É geralmente esperado que cada dose humana irá compreender 1 a 1000 ug de proteína, e por exemplo 30 - 300 ug como 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90ug.

O(s) método(s) como descrito(s) aqui pode(m) compreender uma composição ainda compreendendo um adjuvante de vacina, e/ou citocina ou quimiocina imunoestimulatória.

Os adjuvantes de vacina apropriados para uso na presente invenção são comercialmente disponíveis como, por exemplo, Adjuvante Incompleto e Adjuvante Completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, MD; Merck Adjuvante 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); sais de alumínio como gel hidróxido de alumínio (alume) ou fosfato de alumínio; sais de cálcio, ferro ou zinco, uma suspensão insolúvel de tirosina acilada, açúcares acilados, polissacarídeos derivatizados cationicamente ou anionicamente;

" polifosfazenos, microesferas biodegradáveis,; monofosforil lipídeo A e quil - A. Citocinas, como GM-CSF ou interleucina-2, -7, ou -12, e quimiocinas também podem ser usados como adjuvantes. Em formulações pode ser desejável que a composição de so — adjuvante induza uma resposta imune predominantemente do tipo Thl. Níveis elevados de citocinas de tipo Th1 (por exemplo, IFN-y, TNFa, IL-2 e IL-12) tendem a favorecer a indução de respostas imunes mediadas por células a um antígeno administrado. De acordo com uma forma de realização, em que a resposta é predominantemente de tipo Th1-, o nível de citocinas de tipo Th! irá aumentar em uma maior extensão do que o nível de citocinas de tipo Th2. Os níveis destas citocinas podem ser prontamente avaliados usando testes padrões. Para um estudo das famílias de citocinas, ver Mosmann e Coffman, . Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989.

. Assim, os adjuvantes apropriados que podem ser usados para elicitaruma resposta predominantemente tipo Th1 incluem, por exemplo, uma ' combinação de monofosforil lipídeo A, como 3-de-O-acilado monofosforil lipídeo A (3D-MPL) junto com um sal de alumínio. 3D-MPL ou outros ligandos de receptor de tipo tol! 4 (TLR4) como fosfatos de aminoalquil glucosaminida como descrito em WO 98/50399, WO 01/34617 e WO 03/065806 também podem ser usados sozinhos para gerar uma resposta predominantemente de tipo Th1. Outros adjuvantes conhecidos, que podem preferivelmente induzir uma resposta imune de tipo TH1, incluem de agonistas de TLR9 como CpG não metilado contendo oligonnucleotídeos. Os oligonnucleotídeos são caracterizados em que o di-nucleotíideo CpG é não metilado. Estes oligonnucleotídeos são bem conhecidos e são descritos em por exemplo WO 96/02555. Os oligonnucleotídeos apropriados incluem: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)

- Os oligonnucleotídeos contendo CpG- também podem ser ' usados sozinhos ou em combinação com outros adjuvantes.

Por exemplo, um sistema melhorado envolve a combinação do oligonnucleotídeo contendo CpG e uma saponina derivada particularmente da combinação de CpG e — QS21 como descrito em WO 00/09159 e WO 00/62800. A formulação pode adicionalmente compreender uma emulsão óleo em água e/ou tocoferol.

Outro adjuvante apropriado é uma saponina, por exemplo, QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA), que pode ser usada sozinha ou em combinação com outros adjuvantes.

Por exemplo, um ] sistema melhorado envolve a combinação de monofosforil lipídeo A e "a derivado de saponina, como a combinação de QS21 e 3D-MPL como descrito em WO 94/00153, ou uma composição menos reatogênica onde o QS21 é extinto com colesterol, com descrito em WO 96/33739. Outras apropriadas formulações compreendem uma emulsão óleo em água e tocoferol.

Uma formulação de adjuvante particularmente potente envolvendo QS21, 3D-MPL e tocofero]l em, por exemplo, uma emulsão óleo em água é descrita em WO 95/17210. Em outra forma de realização, os adjuvantes podem ser — formulados na composição lipossomal.

A quantidade de 3D-MPL usado é geralmente pequena, mas dependendo da formulação imunoterapêutica pode estar na região de 1- 1000ug por dose, por exemplo, 1-500ug por dose, € como 1 a 100ug por dose, particularmente 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90ug por dose.

Em uma forma de realização, o sistema adjuvante compreende três imunoestimulantes: um oligonucleotíideo CpG, 3D-MPL & QS21 ou apresentando na formulação lipossomal ou uma emulsão óleo em água como

' descrito em WO 95/17210.

. A quantidade de CpG ou oligonucleotídeos imunoestimulatórios nos adjuvantes ou imunoterapêuticas da presente invenção é geralmente pequenay mas dependendo da formulação B imunoterapêutica pode estar na região de 1-1000ug por dose, por exemplo, 1 500ug por dose. A quantidade de saponina para uso nos adjuvantes da presente invenção pode estar na região de 1-1000pug por dose, por exemplo, 1-500ug por dose, como 1 a 100ug por dose, particularmente 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80 —ou90ug por dose. Geralmente, espera-se que cada dose humana irá compreender 0,1-1000 ug de antígeno, por exemplo, 0,1-500 ug, como 0,1-100 ug, * particularmente 0,1 a 50 ug, especialmente 25 ou 50 ug. Uma quantidade . ótima para uma imunoterapêutica particular pode ser verificada por estudos 5 padrões envolvendo observação de respostas imunes apropriada em ' indivíduos vacinados. Seguindo uma vacinação inicial, os indivíduos irão receber uma ou várias imunizações de reforço espaçadas de modo adequado. Outros adjuvantes apropriados incluem Montanide ISA 720 (Seppic, França), SAF (Chiron, California, US), ISCOMS (CSL), MF-59 —(Chiron), Ribi Detox, RC-529 (GSK, Hamilton, MT) e outros 4-fosfatos de aminoalquil glucosaminida (AGPs). Assim, provê-se um composição imunogênica para uso no método da presente invenção compreendendo um antígeno como aqui descrito e um adjuvante, em que o adjuvante compreende um ou mais de 3D-MPL, —QS21,um oligonucleotídeo CpG ou uma combinação de dois ou mais destes adjuvantes. O antígeno dentro da composição imunogênica pode ser apresentado em uma veículo de emulsão óleo em água ou água em óleo ou em formulação de lipossomas. Em uma forma de realização, o adjuvante pode compreender

' um ou mais dentre 3D-MPL, QS21 e um oligonucleotídeo CpG . imunoestimulatório. Em uma forma de realização todos os três imunoestimulantes estão presentes. Em outra forma de realização 3D-MPL e QS21 são apresentados em uma emulsão óleo em água, e na ausência do so oligonucleotídeo CpG. o " Uma composição para uso no método da presente invenção pode compreender uma composição farmacêutica compreendendo antígeno associado a tumor como descrito aqui, ou uma proteína de fusão do mesmo, e : um excipiente farmaceuticamente aceitável. O uso da palavra compreendendo no contexto deste pedido é destinado a ser não limitativo, isto é, significando incluindo.

As formas de realização são especificamente visadas onde os ' aspectos da invenção compreendendo um certo elemento ou elementos são . limitados para referidos aspectos consistindo ou consistindo essencialmente “15 dosrelevantes elementos como formas de realização separadas. ' Os exemplos abaixo são mostrados para ilustrar a metodologia, que pode ser empregada para preparar partículas da invenção.

A discussão dos documentos neste relatório é destinada para dar contexto a uma invenção e auxiliar em sua compreensão. Ela não é, de nenhum modo, considerada como uma admissão de que o documento ou comentário é conhecido ou é de conhecimento geral comum no campo relevante.

Em um ou mais aspectos a invenção provê uma forma de realização como descrito em qualquer um dos parágrafos | a 101 abaixo.

1) Assim a invenção pode empregar um ou mais genes da Tabela 1.

2) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo STATI, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.2 a

7 1.100 identificados na Tabela 1. , . 3) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo PSMB9, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 e 1.3 a 1.100 identificados na Tabela 1.

4) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo JAK2, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.2 e 1.4 a 1.100 identificados na Tabela 1.

5) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes . de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo ITGA3, . opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o as grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.3 e 1.5 a 1.100 ' identificados na Tabela 1.

6) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo PSMBI1O, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 14 e 1.6 a 1.100 identificados na Tabela 1.

7) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo CXCLSO9, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.5 e 1.7 a 1.100 identificados na Tabela 1.

8) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo RARRES3, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o

' grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.6 e 1.8 a 1.100 ' identificados na Tabela 1. | 9) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo IL2RG, — opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.7 e 1.9 a 1.100 identificados na Tabela 1. 10) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafol, em que o gene tem o símbolo CXCLI1O, — opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.8 e 1.10 a 1.100 identificados na Tabela 1. , 11) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes . de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo CD8A, 5 opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o ' grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.9 e 1.11 a 1.100 identificados na Tabela 1. 12) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo UBD, — opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o gmpo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.10 e 1.12 a 1.100 identificados na Tabela 1. 13) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo GPRI71, — opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.11 e 1.13 a 1.100 identificados na Tabela 1. 14) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo KLRDI,

7 opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o . grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.12 e 1.14 a 1.100 identificados na Tabela 1. 15) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo HLA-B, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.13 e 1.15 a 1.100 identificados na Tabela 1. 16) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo LCP1, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.14 e 1.16 a 1.100 : identificados na Tabela 1.

: 17) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes “15 de acordocomo parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo HLA-DRA, ' opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.15 e 1.17 a 1.100 identificados na Tabela 1.

18) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo CYTIP, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.16 e 1.18 a 1.100 identificados na Tabela 1.

19) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo IL23A, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.17 e 1.19 a 1.100 identificados na Tabela 1.

20) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes

: de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo TRAQ, . opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.18 e 1.20 a 1.100 identificados na Tabela 1.

e) 21) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo HLA-DRA, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.19 e 1.21 a 1.100 identificados na Tabela 1.

22) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo TARP, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o . grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.20 e 1.22 a 1.100 . identificados na Tabela 1.

23) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes ' de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo ITK, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.21 e 1.23 a 1.100 identificados na Tabela 1.

24) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo, o gene é um identificado pelo conjunto de sonda 211796 s at, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.22 e 1.24 a 1.100 identificados na Tabela 1.

25) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo HLA-B, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.23 e 1.25 a 1.100 identificados na Tabela 1.

9% ' 26) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes . de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo HLA-DQAL, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.24 e 1.26 a 1.100 —identificadosna Tabela 1.

27) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo HOMERI, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.25 e 1.27 a 1.100 identificados na Tabela 1.

28) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo TRGC?2, . opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o . grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.26 e 1.28 a 1.100 identificados na Tabela 1.

' 29) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene é um identificado pelo conjunto de sonda 216920 s at, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.27 e

1.29a1.100 identificados na Tabela 1.

30) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo HLA-A, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.28 e 1.30 a 1.100 —identificadosna Tabela 1.

31) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo HLA-DMA, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.29 e 1.31 a 1.100

' identificados na Tabela 1.

. 32) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo HLA-F, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.30 e 1.32 a 1.100 identificados na Tabela 1.

33) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo SLAMF7, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 131 e 1.33 a 1.100 identificados na Tabela 1.

34) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes . de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo KIAA 1549, ' opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.32 e 1.34 a 1.100 ' identificados na Tabela 1.

35) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo LONRF?2, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.35 a 1.100 identificados na Tabela 1.

36) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo FAM26F, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.34 e 1.36 a 1.100 identificados na Tabela 1.

37) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo Clorfl62, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o

. grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.35 e 1.37 a 1.100 . identificados na Tabela 1.

38) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo FAM26F, — opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.36 e 1.38 a 1.100 identificados na Tabela 1, 39) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo GBP5, — opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.37 e 1.39 a 1.100 identificados na Tabela 1.

. 40) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes ' de acordo com o parágrafo 1, em que o gene é um identificado pelo conjunto 5 de sonda 232375 at, opcionalmente em combinação com um ou mais genes ' selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.38 e

1.40 a 1.100 identificados na Tabela 1.

41) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo SLITRKS6, — opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.39 e 1.41 a 1.100 identificados na Tabela 1.

42) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo GBP4, — opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.40 e 1.42 a 1.100 identificados na Tabela 1.

43) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo EPSTII

' opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o ' grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.41 e 1.43 a 1.100 identificados na Tabela 1. 44) Em outro aspecto à invenção emprega um ou mais genes —de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo AKRIC2 opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.42 e 1.44 a 1.100 identificados na Tabela 1. 45) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo ITGAL opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.43 e 145 a 1.100 . identificados na Tabela 1.

. 46) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo CDC42SE?2, ' opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.44 e 1.46 a 1.100 identificados na Tabela 1.

47) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo DZIPI1, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.45 e 1.47 a 1.100 identificados na Tabela 1.

48) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes —de acordo com o parágrafo |, em que o gene tem o símbolo PTGERA, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.46 e 1.48 a 1.100 identificados na Tabela 1.

49) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes

' de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo HCPS, . opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.47 e 1.49 a 1.100 identificados na Tabela 1.

50) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo UTY, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.48 e 1.50 a 1.100 identificados na Tabela 1.

51) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo KLRBI, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o . grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.49 e 1.51 a 1.100 . identificados na Tabela 1.

52) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes ' de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo FAM26F, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.50 e 1.52 a 1.100 identificados na Tabela 1.

53) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo HILSI1, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.51 e 1.53 a 1.100 identificados na Tabela 1.

54) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo C20orf24, . opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.52 e 1.54 a 1.100 identificados na Tabela 1.

' 55) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes . de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo B2M, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.53 e 1.55 a 1.100 identificados na Tabela 1.

56) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo ZNF285A, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.54 e 1.56 a 1.100 identificados na Tabela 1.

57) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo TMEMS56, + opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o . grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.55 e 1.57 a 1.100 identificados na Tabela 1.

' 58) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo IRFI, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.56 e 1.58 a 1.100 identificadosna Tabela |.

59) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo TRGV9, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.57 e 1.59 a 1.100 —identificadosna Tabelal.

60) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo NA identificado por conjunto de sonda 238524 at, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como

7 1.1a 1.58 e 1.60 a 1.100 identificados na Tabela 1.

. 61) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo SLC26A2, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.59 e 1.61 a 1.100 identificados na Tabela 1.

62) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo CXCL2, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.60 e 1.62 a 1.100 identificados na Tabela 1.

63) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes : de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo ICOS, . opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.61 e 1.63 a 1,100 ' identificados na Tabela 1.

64) Em outro aspecto à invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene é um identificado pelo conjunto de sonda 213193 x at, opcionalmente em combinação com um ou mais genes — selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.62 e

1.64 a 1.100 identificados na Tabela 1.

65) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo CCLS5, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.63 e 1.65 a 1.100 identificados na Tabela 1.

66) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo LOC284757 opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o

' grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.64 e 1.66 a 1.100 . identificados na Tabela 1.

67) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo CD8&6, ' 5 — opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.65 e 1.67 a 1.100 identificados na Tabela 1.

68) Em outro aspecto à invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo KLRDI, — opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.66 e 1.68 to 4.488 identificados na Tabela 1.

- 69) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes . de acordo com o parágrafo 1, em que o gene é um identificado pelo conjunto i 15 —desonda211902 x at, opcionalmente em combinação com um ou mais genes " selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.67 e

1.69 a 1.100 identificados na Tabela 1.

70) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo SLAMF6, — opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.68 e 1.70 a 1.100 identificados na Tabela 1.

71) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo TOX, — opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.69 e 1.71 a 1.100 identificados na Tabela 1.

72) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo GZMK,

. opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o : grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.70 e 1.72 a 1.100 ' identificados na Tabela 1. 73) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes “de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo CDCA42SE?2, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.71 e 1.73 a 1.100 identificados na Tabela 1. 74) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo PPPIRIG6B, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.72 e 1.74 a 1.100 - identificados na Tabela 1.

: 75) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes “15 de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo EAF2, . opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.73 e 1.75 a 1.100 identificados na Tabela 1.

76) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo USP9Y, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.74 e 1.76 a 1.100 identificados na Tabela 1.

77) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes —de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo FAM26F, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.75 e 1.77 a 1.100 identificados na Tabela 1.

78) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes

' de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo FLI31438, . opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o i grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.76 e 1.78 a 1.100 identificados na Tabela 1.

79) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo SHROOM;3, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.77 e 1.79 a 1.100 identificados na Tabela 1.

80) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo TNFAIP3, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o Ê grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.78 e 1.80 a 1.100 . identificados na Tabela 1.

81) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes ' de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo HLA-F, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.79 e 1.81 a 1.100 identificados na Tabela 1.

82) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo CD3D, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.80 e 1.82 a 1.100 identificados na Tabela 1.

83) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo MAPIB, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.81 e 1.83 a 1.100 identificados na Tabela 1.

' 84) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes . de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo SRPX2, ' opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.82 e 1.84 a 1.100 —identificadosna Tabela 1. B 85) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo AADAT, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.83 e 1.85 a 1.100 identificados na Tabela 1.

86) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo ARHGAPIS, . opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o . grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.84 e 1.86 a 1.100 identificados na Tabela 1.

" 87) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo MCMIO, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.85 e 1.87 a 1.100 identificados na Tabela 1.

88) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo TCIN, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.86 e 1.88 a 1.100 —identificadosna Tabela 1.

89) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo AP2BI1, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.87 e 1.89 a 1.100

' identificados na Tabela 1. . 90) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes ] de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo GOLGA7, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.88 e 1.90 a 1.100 identificados na Tabela 1.

91) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo TNFRSF9, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.89 e 1.91 a 1.100 identificados na Tabela 1.

92) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes . de acordo com o parágrafo |, em que o gene tem o símbolo RNF144B, - opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.90 e 1.92 a 1.100 ' identificados na Tabela 1.

93) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene é um identificado pelo conjunto de sonda 209671 x at, opcionalmente em combinação com um ou mais genes — selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.91 e

1.93 a 1.100 identificados na Tabela 1.

94) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo UBASH3B, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.92 e 1.94 a 1.100 identificados na Tabela 1.

95) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo BTN3AI, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o

' grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.93 e 1.95 a 1.100 . identificados na Tabela 1.

96) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo GCHI, — opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.94 e 1.96 a 1.100 identificados na Tabela 1.

97) Em outro aspecto à invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo DENND2D, — opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.95 e 1.97 a 1.100 identificados na Tabela 1.

. 98) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes Le de acordo com o parágrafo L,em que o gene tem o símbolo C4orf7, - opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o ' grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.96 e 1.98 a 1.100 identificados na Tabela 1.

99) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo TNFAIP3, — opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.97 e 1.99 a 1.100 identificados na Tabela 1.

100) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo GBPS5, — opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o grupo consistindo de genes rotulados como 1.100 identificados na Tabela 1.

101)Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo GBPI, opcionalmente em combinação com um ou mais genes selecionados dentre o

" grupo consistindo de genes rotulados como 1.1 a 1.99. . Em um ou mais aspectos a invenção provê uma forma de realização como descrito em qualquer um dos parágrafos 1 a 101 abaixo. À expressão "o gene", em parágrafos 3 a 101 quando fazendo referência a : 5 — qualquer um dos parágrafos 2 a 100,não é destinada a substituir o gene específico mencionado em parágrafos 2 a 100 mas para adicioná-lo. 1) Assim a invenção pode empregar um ou mais genes da Tabela 1. 2) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com o parágrafo 1, em que o gene tem o símbolo STATI, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.2 a

1.100 identificados na Tabela 1.

. 3) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes . de acordo com o parágrafo 1 ou 2, em que o gene tem o símbolo PSMB9, i 15 opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.3 a " 1.100 identificados na Tabela 1.

4) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-3, em que o gene tem o símbolo JAK2, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como

1.4a1.100 identificados na Tabela 1.

5) Em outro aspecto à invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-4, em que o gene tem o símbolo ITGA3, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.5 a 1.100 identificados na Tabela 1.

6) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-5, em que o gene tem o símbolo PSMBI1O, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.6 a 1.100 identificados na Tabela 1.

7) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes

: de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-6, em que o gene tem o símbolo . CXCLO9, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.7 a 1.100 identificados na Tabela 1. 8) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes S — deacordocom qualquer um dos parágrafos 1-7, em que o gene tem o símbolo RARRES3, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.8 a 1.100 identificados na Tabela 1. 9) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-8, em que o gene tem o símbolo IL2RG, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.9 a 1.100 identificados na Tabela 1.

10) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes * de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-9, em que o gene tem o símbolo . CXCLI10, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados comol.10a1.100 identificados na Tabela 1.

Í 11) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-10, em que o gene tem o símbolo CD8A, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.11 a 1.100 identificados na Tabela 1.

12) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-11, em que o gene tem o símbolo UBD, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.12 a 1.100 identificados na Tabela 1 13) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes —de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-12, em que o gene tem o símbolo GPR171, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.13 a 1.100 identificados na Tabela 1.

14) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-13, em que o gene tem o

' símbolo KLRDI1, opcionalmente em combinação com um ou mais genes . rotulados como 1.14 a 1.100 identificados na Tabela 1.

] 15) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-14, em que o gene tem o —símbolo HLA-B, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.15 a 1.100 identificados na Tabela 1.

16) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-15, em que o gene tem o símbolo LCP1, opcionalmente em combinação com um ou mais genes — rotulados como 1.16 a 1.100 identificados na Tabela 1.

17) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-16, em que o gene tem o . símbolo HLA-DRA, opcionalmente em combinação com um ou mais genes a rotulados como 1.17 a 1.100 identificados na Tabela 1.

18) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes Í de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-17, em que o gene tem o símbolo CYTIP, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.18 a 1.100 identificados na Tabela 1.

19) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes

20. de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-18, em que o gene tem o símbolo IL23A, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.19 a 1.100 identificados na Tabela 1.

20) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-19, em que o gene tem o símbolo TRAQ, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.20 a 1.100 identificados na Tabela 1.

21) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-20, em que o gene tem o símbolo HLA-DRA, opcionalmente em combinação com um ou mais genes

' rotulados como 1.21 a 1.100 identificados na Tabela 1. : . 22) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-21, em que o gene tem o símbolo TARP, opcionalmente em combinação com um ou mais genes — rotulados como 1.22 a 1.100 identificados na Tabela 1. 23) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-22, em que o gene tem o símbolo ITK, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.23 a 1.100 identificados na Tabela 1.

24) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-23, em que o gene é um identificado pelo conjunto de sonda 211796 s at, opcionalmente em . combinação com um ou mais genes rotulados como 1.24 a 1.100 identificados * na Tabela 1. 25) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes , de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-24, em que o gene tem o símbolo HLA-B, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.25 a 1.100 identificados na Tabela 1. 26) Em outro aspecto à invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-25, em que o gene tem o símbolo HLA-DQA1, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.26 a 1.100 identificados na Tabela 1.

27) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-26, em que o gene tem o — símbolo HOMERI, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.27 a 1.100 identificados na Tabela 1.

28) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-27, em que o gene tem o símbolo TRGC2, opcionalmente em combinação com um ou mais genes

. rotulados como 1.28 to1.100 identificados na Tabela 1. : 29) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes i de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-28, em que o gene é um identificado pelo conjunto de sonda 216920 s at, opcionalmente em — combinaçãocom um ou mais genes rotulados como 1.29 a 1.100 identificados na Tabela 1. 30) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-29, em que o gene tem o símbolo HLA-A, opcionalmente em combinação com um ou mais genes — rotulados como 1.30 a 1.100 identificados na Tabela 1. . 31) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-30, em que o gene tem o - símbolo HLA-DMA, opcionalmente em combinação com um ou mais genes . rotulados como 1.31 a 1.100 identificados na Tabela 1. 32) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes ' de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-31, em que o gene tem o símbolo HLA-F, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.32 a 1.100 identificados na Tabela 1. 33) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-32, em que o gene tem o símbolo SLAMF7, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.33 a 1.100 identificados na Tabela 1. 34) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-33, em que o gene tem o símbolo KIAAIS49, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.34 a 1.100 identificados na Tabela 1. 35) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-34, em que o gene tem o símbolo LONRF2, opcionalmente em combinação com um ou mais genes

' rotulados como 1.35 a 1.100 identificados na Tabela 1.

. 36) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-35, em que o gene tem o símbolo FAM26F, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.36 a 1.100 identificados na Tabela L Ns 37) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-36, em que o gene tem o símbolo Clorfl62, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.37 a 1.100 identificados na Tabela 1.

38) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-37, em que o gene tem o símbolo FAM26F, opcionalmente em combinação com um ou mais genes ' rotulados como 1.38 a 1.100 identificados na Tabela 1. .+ 39) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-38, em que o gene tem o I símbolo GBP5, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.39 a 1.100 identificados na Tabela 1. 40) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-39, em que o gene é um identificado pelo conjunto de sonda 232375 at, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.40 a 1.100 identificados na Tabela 1. 41) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-40, em que o gene tem o símbolo SLITRK6, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.41 a 1.100 identificados na Tabela 1. 42) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-41, em que o gene tem o símbolo GBP4, opcionalmente em combinação com um ou mais genes

' rotulados como 1.42 a 1.100 identificados na Tabela 1. . 43) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes : de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-42, em que o gene tem o símbolo EPSTI! opcionalmente em combinação com um ou mais genes —rotulados como 1.43 a 1.100 identificados na Tabela 1.º 44) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-43, em que o gene tem o símbolo AKRIC2 opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.44 a 1.100 identificados na Tabela 1. 45) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-44, em que o gene tem o símbolo ITGAL opcionalmente em combinação com um ou mais genes ó rotulados como 1.45 a 1.100 identificados na Tabela 1.

: 46) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-45, em que o gene tem o " símbolo CDCA42SE2, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.46 a 1.100 identificados na Tabela 1. 47) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-46, em que o gene tem o símbolo DZIPI, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.47 a 1.100 identificados na Tabela 1. 48) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-47, em que o gene tem o símbolo PTGERA, opcionalmente em combinação com um ou mais genes — rotulados como 1.48 a 1.100 identificados na Tabela |. 49) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-48, em que o gene tem o símbolo HCP5, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.49 a 1.100 identificados na Tabela 1.

' 50) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes . de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-49, em que o gene tem o ] símbolo UTY, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.50 a 1.100 identificados na Tabela 1. 51) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-50, em que o gene tem o simbolo KLRB1, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.51 a 1.100 identificados na Tabela 1. 52) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-51, em que o gene tem o símbolo FAM26F, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.52 a 1.100 identificados na Tabela 1.

. 53) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes o de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-52, em que o gene tem o símbolo HILS1, opcionalmente em combinação com um ou mais genes Í rotulados como 1.53 a 1.100 identificados na Tabela 1. 54) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-53, em que o gene tem o símbolo C200rf24, opcionalmente em combinação com um ou mais genes — rotulados como 1.54 a 1.100 identificados na Tabela 1.

55) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-54, em que o gene tem o símbolo B2M, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.55 a 1.100 identificados na Tabela 1.

56) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-55, em que o gene tem o símbolo ZNF285A, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.56 a 1,100 identificados na Tabela 1.

57) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes

O de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-56, em que o gene tem o . símbolo TMEMS56, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.57 a 1.100 identificados na Tabela 1. 58) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes —de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-57, em que o gene tem o símbolo IRF1, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.58 a 1.100 identificados na Tabela 1. 59) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-58, em que o gene tem o símbolo TRGV9, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.59 a 1.100 identificados na Tabela 1.

60) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes . de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-59, em que o gene tem o os símbolo NA identificado por conjunto de sonda 238524 at, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.60 a 1.100 identificados : na Tabela 1. 61) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-60, em que o gene tem o símbolo SLC26A2, opcionalmente em combinação com um ou mais genes — rotulados como 1.61 a 1.100 identificados na Tabela 1.

62) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-61, em que o gene tem o símbolo CXCL2, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.62 a 1.100 identificados na Tabela 1.

63) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-62, em que o gene tem o símbolo ICOS, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.63 a 1.100 identificados na Tabela 1.

64) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes

OC de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-63, em que o gene é um . identificado pelo conjunto de sonda 213193 x at, opcionalmente em ] combinação com um ou mais genes rotulados como 1.64 a 1.100 identificados na Tabela 1.

65) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-64, em que o gene tem o símbolo CCL5, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.65 a 1.100 identificados na Tabela 1. 66) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-65, em que o gene tem o símbolo LOC284757 opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.66 a 1.100 identificados na Tabela 1. 67) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes e de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-66, em que o gene tem o símbolo CD86, opcionalmente em combinação com um ou mais genes ' rotulados como 1.67 a 1.100 identificados na Tabela 1.

68) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-67, em que o gene tem o símbolo KLRDI1, opcionalmente em combinação com um ou mais genes —rotuladoscomo 1.68 to 4.488 identificados na Tabela 1.

69) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-68, em que o gene é um identificado pelo conjunto de sonda 211902 x at, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.69 a 1.100 identificados naTabelal.

70) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-69, em que o gene tem o símbolo SLAMF6, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.70 a 1.100 identificados na Tabela 1.

CO 71) Em outro aspecto à invenção emprega um ou mais genes - de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-70, em que o gene tem o símbolo TOX, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.71 a 1.100 identificados na Tabela 1.

ES 72) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-71, em que o gene tem o símbolo GZMK, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.72 a 1.100 identificados na Tabela 1.

73) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-72, em que o gene tem o símbolo CDC42SE?2, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.73 a 1.100 identificados na Tabela 1.

. 74) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes e de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-73, em que o gene tem o símbolo PPPIRI6B, opcionalmente em combinação com um ou mais genes : rotulados como 1.74 a 1.100 identificados na Tabela 1. 75) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-74, em que o gene tem o símbolo EAF2, opcionalmente em combinação com um ou mais genes —rotulados como 1.75 a 1.100 identificados na Tabela 1.

76) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-75, em que o gene tem o símbolo USP9Y, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.76 a 1.100 identificados na Tabela 1.

77) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-76, em que o gene tem o símbolo FAM26F, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.77 a 1.100 identificados na Tabela 1.

78) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes

JJ de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-77, em que o gene tem o . símbolo FLJ31438, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.78 a 1.100 identificados na Tabela 1. 79) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes —de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-78, em que o gene tem o símbolo SHROOMS;3, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.79 a 1.100 identificados na Tabela 1. 80) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-79, em que o gene tem o símbolo TNFAIP3, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.80 a 1.100 identificados na Tabela 1. 81) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-80, em que o gene tem o o símbolo HLA-F, opcionalmente em combinação com um ou mais genes —rotulados como 1.81 a 1.100 identificados na Tabela 1.

' 82) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-81, em que o gene tem o símbolo CD3D, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.82 a 1.100 identificados na Tabela 1.

83) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-82, em que o gene tem o símbolo MAPIB, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.83 a 1.100 identificados na Tabela 1.

84) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes — de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-83, em que o gene tem o símbolo SRPX2, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.84 a 1.100 identificados na Tabela 1.

85) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-84, em que o gene tem o

O símbolo AADAT, opcionalmente em combinação com um ou mais genes . rotulados como 1.85 a 1.100 identificados na Tabela 1. 86) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes ' de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-85, em que o gene tem o — símbolo ARHGAPIS, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.86 a 1.100 identificados na Tabela 1. 87) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-86, em que o gene tem o símbolo MCMI1O0, opcionalmente em combinação com um ou mais genes —rotulados como 1.87 a 1.100 identificados na Tabela 1. 88) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-87, em que o gene tem o símbolo TC2N, opcionalmente em combinação com um ou mais genes *. rotulados como 1.88 a 1.100 identificados na Tabela 1. 89) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes Í de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-88, em que o gene tem o símbolo AP2B1, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.89 a 1.100 identificados na Tabela 1. 90) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-89, em que o gene tem o símbolo GOLGA7, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.90 a 1.100 identificados na Tabela 1. 91) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-90, em que o gene tem o — símbolo TNFRSFS9, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.91 a 1.100 identificados na Tabela 1. 92) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-91, em que o gene tem o símbolo RNF144B, opcionalmente em combinação com um ou mais genes

O rotulados como 1.92 a 1.100 identificados na Tabela 1. . 93) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes i de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-92, em que o gene é um : identificado pelo conjunto de sonda 209671 x at, opcionalmente em — combinação com um ou mais genes rotulados como 1.93 a 1.100 identificados na Tabela 1. 94) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-93, em que o gene tem o símbolo UBASH3B, opcionalmente em combinação com um ou mais genes —rotulados como 1.94 a 1.100 identificados na Tabela 1. 95) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-94, em que o gene tem o símbolo BTN3A1, opcionalmente em combinação com um ou mais genes .* rotulados como 1.95 a 1.100 identificados na Tabela 1. 96) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes , de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-95, em que o gene tem o símbolo GCHI, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.96 a 1.100 identificados na Tabela 1. 97) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-96, em que o gene tem o símbolo DENND2D, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.97 a 1.100 identificados na Tabela 1. 98) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-97,em que o gene tem o símbolo —C4orf/, opcionalmente em combinação com um ou mais genes rotulados como 1.98 a 1.100 identificados na Tabela 1. 99) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-98, em que o gene tem o símbolo TNFAIP3, opcionalmente em combinação com um ou mais genes

O rotulados como 1.99 a 1.100 identificados na Tabela 1. . 100) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais : genes de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-99, em que o gene tem o , símbolo GBP5, opcionalmente em combinação com um ou mais genes — rotuladoscomo 1.100 identificados na Tabela 1. : 101) Em outro aspecto a invenção emprega um ou mais genes de acordo com qualquer um dos parágrafo 1 a 100, em que o gene tem o símbolo GBP].

EXEMPLOS EXPERIMENTAIS Exemplo | Experiência clínica de melanoma Mage MAGE008 Nesta experiência em andamento, a proteína recMAGE-A3 (proteína mage de fusão recombinante) é combinada com dois diferentes o. adjuvantes imunológicos: ou ASO02B (QS21, MPL) ou AS15 (QS21, MPL e — CpG7909). Os objetivos foram discriminar entre os adjuvantes em termos de ' perfil de segurânça, resposta clínica e resposta imunológica. Neste experimento, duas composições de adjuvante são feitas a partir de misturas de dois imunoestimulantes:

1. QS21 (molécula de saponina purificada de ocorrência —naturalda árvore sul-americana Quillaja Saponaria Molina), e

2. MPL (3 de-O-acetilado monofosforil lipídeo A - derivado ' destoxificado de lipídeo A, derivado de S. minnesota LPS). ASO02B é uma emulsão óleo em água de QS21 e MPL. Em modelos animais, estes adjuvantes foram mostrados com — sucesso como induzindo ambos os tipos humoral e TH 1 de respostas imunes mediadas celulares, incluindo IFNa produzindo células CD4 e CD8 T (Moore et al., 1999; Gérard er al., 2001). Além disso, a injeção de proteína recombinante formulada neste tipo de adjuvante leva á indução da resposta anti-tumor sistêmica: de fato, os animais vacinados foram mostrados como

" sendo protegidos contra desafios com células de tumor de murinos . geneticamente engenheiradas para expressar o antígeno de tumor, e tumores regredindo foram mostrados como sendo altamente infiltrados por células ' CD8, CD4 e NK e por macrófagos. O segundo sistema de adjuvante é ASI15: ele contém um terceiro imunoestimulante, ou seja CpG7909 (de outra forma conhecido como CpG 2006 supra), além de MPL e QS21, na formulação de lipossomas. Em modelos de animal (principalmente camundongos) foi mostrado que a adição de CpG7909 ainda melhora as respostas imunes induzidas e anti-tumor (Krieg e Davis, 2001; Ren er al, 2004). CpG oligodeoxinucleotídeos (ODNs) diretamente estimulam a ativação de células dendríticas através do disparo de TLR9. Além disso, em camundongos, a aplicação sistêmica de CpG7909 aumenta muito a infiltração de células T transferidas em tumores 1º (Meidenbauer et al., 2004). “15 Visão geral do estudo

1. Projeto A experimentação com MAGEO008 é: * aberta * —randomizada * dedoisramos(ASO02B versus AS15) * com68pacientesno total. Como descrito acima, a proteína reccMAGE-A3 é combinada com ou sistema adjuvante AS02B ou AS15.

2. População de Pacientes A proteína recMAGE-A3 é administrada a pacientes com melanoma metastático progressivo com lesões de pele e/ou linfonodo regionais ou distantes (estágio III e estágio IV Mla não ressectáveis). A expressão do gene MAGE-A3 pelo tumor foi avaliada por PCR quantitativo. Os pacientes selecionados não recebem tratamento anterior para melanoma

SO (recMAGE-A3 é dado com o tratamento de primeira linha ) e não tinham ' doença visceral. ' 3. Esquema de imunização . Esquemas do método de tratamento " O esquema de imunização seguido na experiência clínica com MAGEO008 foi: Ciclo 1: 6 vacinações em intervalos de 2 semanas (Semanas 1,3, 5,7,9,11) Ciclo 2: 6 vacinações em intervalos de 3 semanas (Semanas 15, 18, 21, 24, Ciclo 3: LM adações em intervalos de 6 semanas (Semanas 34, 40, 46, 52) Tratamento a longo — prazo 4 vacinações em intervalos de 3 meses, por exemplo, seguido por 4 vacinações em intervalos de 6 meses Para ambos os regimes de tratamento acima vacinações adicionais podem ser dadas após o tratamento, como requerido. : A fim de triar os participantes em potencial na experiência 22-10 clínica acima, os requerentes receberam biópsias do tumor antes de qualquer ' imunização. RNA foi extraído da biópsia para o PCR quantitativo de MAGE- . A3 e este RNA foi também usado para o perfil da expressão de genes por microarranjos. O objetivo foi identificar nas biópsias de pre-vacinação um conjunto de genes associados com a resposta clínica e desenvolver um modelo matemático que iria prever o resultado clínico do paciente, de modo que os pacientes que provavelmente se beneficiariam desta imunoterapêutica de câncer específica para o antígeno são identificados e selecionados de modo apropriado. A análise do perfil de genes foi realizada somente em biópsias de pacientes que assinaram um consentimento informando sobre a análise em microarranjo.

1. Materiais e métodos

1.1. Amostras de tumor e purificação de RNA 65 biópsias de tumor tomadas antes da vacinação dos 65 pacientes foram usadas para a experiência clínica de melanoma Mage008 Mage3. Estas foram congeladas logo e conservadas na solução de

" estabilização de RNAlater. . O RNA total foi purificado usando o método Tripure (Roche Ú Cat. No. 1 667 165). O protocolo fornecido foi seguido subsequentemente " pelo uso de um protocolo de limpeza Mini kit RNeasy - com tratamento com S —DNAse (Qiagen Cat. No. 74106). RNA das amostras cujo teor de melanina foi elevado (determinado por inspeção visual) foi ainda tratado usando centrifugação CsCl. Quantificação de RNA foi inicialmente completada usando densidade óptica a 260nm e kit de teste Quant-IT RiboGreen RNA —(Invitrogen — Molecular Probes R11490).

1.2.Rotulação e amplificação de RNA e para análise de microarranjo Devido ao tamanho pequeno da biópsia recebida durante o o. estudo clínico, um método de amplificação foi usado em conjunto com a * 15 rotulação do RNA para a análise de microarranjo: o kit de biotina Nugen 3º ' ovation (Rotulação de 50 ng de RNA — Sistema de biotina Ovation Cat. 2300- 12, 2300-60). Uma entrada de partida de 50ng de RNA total foi usada.

1.3. Chips de microarranjo, hibridizações e varredura Os chips de genes Affymetrix HG-U133.Plus 2.0 foram —hibridizados, lavados e escaneados de acordo com os protocolos padrões de Affymetrix. 111 Definição de pacientes usados para assinatura de análise genes Uma abordagem de classificação binária foi empregada para — designar pacientes á assinatura de grupos de genes (GS) positivos (GS+) ou a GS negativos (GS-). O conjunto de treino consistia de 56 pacientes avaliáveis que forneceram um consentimento informado para análise da assinatura de genes com dados do microarranjo de boa qualidade e com pelo menos 6 vacinações.

CO Para esta análise de assinatura de genes, Respondedores (R) - foram definidos como pacientes apresentando sinais objetivos de atividade clínica e estes incluíam resposta objetiva (Resposta completa (CR), Resposta ' parcial (PR), doença estável (SD), Resposta mista (MR). Não Respondedores (NR) foram definidos como doença progressiva (PD).

Somente pacientes avaliáveis com pelo menos 6 vacinações foram usados para a análise do perfil de gene porque é aproximadamente quando a resposta imune foi detectada.

Respondedores (R) para análise de perfil de gene são os pacientes apresentando sinais de atividade biológica e estes incluem: - respondedores completos e parciais (CR, PR), doença estável (SD), doença progressiva (PD) com Resposta mista 1 (MxR1) e PD MxR2 com desaparecimento de pelo menos uma lesão de marcador.

Não Respondedores (NR): PD sem MxR, PD MxR2 que não mostram desaparecimento de pelo menos uma lesão de marcador e Doença : progressiva sem MxR A distribuição do conjunto de treino em dois ramos deste estudo clínico (comparando dois adjuvantes imunológicos) consistia de 22 R (14 em ramo AS15 e 8 em ramo ASO02B) e 34 NR (13 AS15,21 ASO2B).

Normalização da amostra Após a amplificação e rotulação do RNA, hibridização para o chip de gene HG-U133 plus2 Affymetrix GeneChip foi realizada. Os arquivos de CEL obtidos após a varredura foram normalizados usando uma versão modificada do algoritmo GCRMA (Wu, 2004) no pacote germa de —Bioconductor usando todos os pacientes dados de microarranjo de boa qualidade (baseado em fator de escala e normalização gcrma). Este algoritmo foi adaptado para armazenar os parâmetros de pré-processamento obtidos com este conjunto de redes. Os parâmetros são de dois tipos: a distribuição média empírica necessária para a normalização do quantil, e os efeitos específicos da

CO sonda para realizar o sumário do conjunto de sonda (PS). Estes parâmetros . foram obtidos de 65 amostras e aplicados às 56 amostras no conjunto de ' treino para obter valores resumidos para cada conjunto de sonda. ' 1.4. Filtração ausente/ presente e não específica — — Conjuntos de sonda Affymetrix (PS) chamados ausentes em todas as 1 65 amostras usadas para a normalização foram removidos usando uma implementação R do programa PANP (versão de software 1.8.0 ). Isto reduz o conjunto de dados de 54.613 a cerca de 28.100 PS.

Os conjuntos de sonda filtrados na faixa interquartil (IQR) (PS) das amostras de hibridização normalizados são filtrados . independentemente da produção associada a cada amostra.

O objetivo disto é - que uma filtragem não específica é liberta de genes mostrando expressão grosseiramente constante através das amostras à medida que tendem a dar uma força de discriminação pequena (Heidebreck et al., 2004). Um filtro de interquantil que somente retém PS com faixa de . interquartil igual ou maior do que 1,7 na matriz de expressão do conjunto de treino (56 amostras) foi implementado.

Esta etapa reduziu o tamanho de PS de 28.100 até cerca de 5045. Normalização dos recursos Os PS resumidos e filtrados foram subsequentemente normalizados com um cálculo do escore Z.

O escore Z para cada valor de PS de expressão de paciente individual é calculado como a seguir: uma média específica de OS é subtraída do valor de PS, e este valor de expressão centrado na média é então ponderado por um desvio padrão específico de PS.

A médiae os desvios padrões específicos de PS envolvidos no e cálculo do escore Z são os calculados a partir do conjunto de treino.

Seleção dos recursos A seleção do PS relevante a ser usado como recursos na classificação dos dados do paciente com resultados clínicos consistindo no

SO escore de sinal para ruído é obtida usando a matriz de expressão e o escore zd . normalizados para as 56 amostras no conjunto de treino: 7 san= YR XNR R sda +sdyg Xp = Mean of Responders o Xwe = Mean or Non - Responders sd, = Standard deviation Responders sd, =Standard deviation Non - Responders Os 100 PS com maior escore absoluto de sinal para ruído foram selecionados como recursos do classificador (Tabela 1). Este número — foi estimado como apropriado porque é um número exeqiúível de genes para . medir com uma outra tecnologia (isto é, Q-RT-PCR). A metodologia acima de seleção de genes foi testada por 7 validação cruzada como descrito na próxima seção.

Método de classificação de validação cruzada de exclusão individual (LOOCV) of A fim de obter uma estimativa do desempenho da metodologia e escolher um corte apropriado para o classificador; um esquema de classificação foi desenvolvido e testado usando validação cruzada por exclusão individual com re-cálculo da lista de repórter em cada validação cruzada. i Primeiro um filtro não específico foi aplicado com o conjunto de sondas (PS) descartado cuja faixa de interquantil (IQR) foi menor do que 1,7 (-5000 PS permanecendo em cada validação cruzada). Subsequentemente , a normalização do escore Z foi realizada em cada conjunto de treino e aplicada à amostra de teste.

Genes foram classificados usando sinal-para ruído (s2n) como descrito por Golub et al. (Golub, 1999), e os melhores 100 PS (escore s2n absoluto) foram selecionados como recursos do classificador.

Um algoritmo de classificação baseado em uma análise supervisionada principal componente — discriminante (SPCA) foi construído —usandoPS selecionado (Bair e Tibshirani, PLOS Biol 2004 e Tibshirani et al.,

" PNAS 2002). O classificador é baseado em valor singular de decomposição o da matriz de expressão do conjunto de treino com apenas os PS selecionados como recursos do classificador. À média e desvio padrão de cada grupo (R e ' NR) do conjunto de treino no primeiro componente principal (PC,) são — calculados. Para classificar uma amostra de teste, seus valores de expressão de escore zd são projetados no PC, definido para o conjunto de treino e as distâncias em PC, para a média de cada grupo são usadas para calcular a probabilidade de a amostra pertencer ao grupo de Respondedor ou Não Respondedor. O resultado do classificador é assim um índice da probabilidade —daamostra ser Respondedor (GS+), estando na faixa de 0 a 1.

. Figura 1/21 mostra o esquema para LOOCV.

: Figura 2/21 mostra os resultados do LOOCV selecionando os melhores 100 PS para classificação em cada circuito.

Sensibilidade (Se) e especificidade (Sp) foram usados como indicadores do desempenho. Se é definido como a proporção de positivos . verdadeiros (TP) dentre as amostras preditivas como Respondedores, e Sp é definido como a proporção de negativos verdadeiros (TN) dentre pacientes | preditivos como Não Respondedores.

Pode ser visto do gráfico da Figura 2/21 que qualquer valor entre041 e 0,47 poderia ter a mesma sensibilidade e especificidade. Foi decidido tomar um corte de 0,43. Este corte iria classificar 32/56 amostras como Respondedor (R) e sensibilidade seria de 17/22 (0,77) com especificidade de 19/34 (0,56). Notavelmente, a sensibilidade e especificidade somente no ramo AS15 são maiores; 0,79 e 0,69 respectivamente. Importante, —todososrespondedores objetivos (CR e PR) são corretamente classificados.

A estabilidade dos recursos selecionados em cada um dos 56 classificadores construídos por LOOCV foi comparada com os recursos que foram selecionados usando todas as amostras.

TABELA 1A4. 100 PS SELECIONADOS USANDO TODAS AS

" AMOSTRAS E OS TEMPOS SELECIONADOS EM LOOCVY AffyID Símbolo de | Símbolo de gene de | vezes Cc gene de acordo | acordo com Anotação | selecionadas em ' com anotação | Affymetrix LOOCV R2.9 : 16 [203915 ar —Jexema exe 56 56 [19 [204533 at —Jexermo q exeo NO) ' . 117 [1.18 [210915 x at [Maga PRB) TRAQ /// TRAC ///|56 TRAG TRAJI7 /// TRAV20 56 ' 12 123 HLA-DQAI DQA?2 56

1.29 [217436 x at HLA-A /// HLA-A29.1 | 56

E LES HLA-A HLA-H /// HLA-J 217478 s at [131 [221875 x at

1.39

: Affy ID Simbolo — de | Símbolo de gene de | vezes 7 gene de acordo | acordo com Anotação | selecionadas em com anotação | Affymetrix LOOCV V R2.9 ' 144 | AFFX- 56 ” M97935 MB at STATI STATI

1.49 211149 at LOC100130224 1155 a o o - 55 , 1.53 |232234 at 232311 at — | BM - - 1ICOS 1562051 at EAF2 USP9Y USP9Y HLA-F CD3D

& Aff ID Símbolo de | Símbolo de gene de | vezes . gene de acordo | acordo com Anotação | selecionadas em com anotação | Affymetrix LOOCV »” R2.9 226084 at — | MAPIB . 205499 at SRPX2 SRPX2 223593 at 244061 at — | ARHGAPIS* 222962 s at | MCMIO MCMIO

TCON TCIN 200615 s at |APBI AP2BI [1.89 [234907 x at | GOLGATF [1.90 [207536 s at | TNFRSF9 TNFRSF9 239012 at RNFI14B RNF144B

1.92 [20967] x at TRA /// TRAC 238587 at UBASH3B UBASH3B 31 209770 at BTN3AI BTN3AI 27 - 204224 s at GCHI 221081 s at | DENND2D DENND2D 229152 at r 202644 s at | TNFAIP3 TNFAIP3 238581] at GBP5 GBP5

1.100 [231577 s at | GBPI1 GBP] *; Anotação de R2.6 que se torna NA em R2.9 Figura 3/21 mostra o número de vezes que PS estava dentro de ' 100 s2n de topo em cada LOOCV. Os PS selecionados também usando todas ' as amostras são indicados em preto. 68 dos 100 PS selecionados usando todas asamostras foram também selecionados em pelo menos 50 dos LOOCVs, a lista de 100 PS selecionados usando todas as amostras incluiria os recursos do classificador a serem usados para prever a resposta de pacientes independentes (Tabela 1). Impacto da assinatura de genes em sobrevivência global (OS) Em regressão Cox, o acaso representa a probabilidade que o evento (morte, progressão da doença) ocorre durante um período de tempo. Uma linha de base do acaso é considerada como sendo compartilhada com todas as amostras e co-variados que são variáveis explicativas que tem efeito sobre o acaso são adicionados ao modelo. A relação de acaso quantifica o efeito que um co-variado tem sobre o acaso. Ela reflete o risco relativo da variável.

O Por exemplo, um tratamento com uma relação de acaso de 0,4 . como na Tabela 2 abaixo significa que um paciente com assinatura de genes positiva tem um risco 60% reduzido de morte por um período de tempo ' comparado com pacientes com assinatura de genes negativa.

Note-se que 0,4 éamédiado HR esperado e os intervalos de 95% de confiança são também estimados no modelo.

Figura 4/21 mostra as curvas de Kaplan-Meier (KM) para OS por adjuvante com todos pacientes na experiência de melanoma Fase II; relação de acaso (HR): 0,55 (95%CI [0,28; 1,06]). A relação de acaso estimada quando usando somente os 56 . pacientes no conjunto de treino é 0,41 (95% CI [0.191; 0.88]). Para estimar o - impacto de GS sobre a sobrevivência global (OS), a classificação obtida por LOOCV com um corte de 0,43 foi usada (seção 1.4); o gráfico na Figura 5/21 mostra KM para OS por GS.

Ajustando um modelo Cox multivariado com adjuvante e GS . como co-variados obtém-se os seguintes HR para GS: HR inferior | superior . 0,95 0,95 0,197 Os tempos de sobrevivência medianos estimados por GS são: sobrevivência =| inferior | superior mediana 0,95 0,95 (meses) As curvas de Kaplan-Meier de sobrevivência global por adjuvante e assinatura de genes baseada em classificação LOOCV são — mostradas em Figura 6/21 e HR é como a seguir, HR inferior | superior 0,95 0,95 ASIS GS+ vs/0,268 |0,080 0,896 GS- ASOCB GS+ vs/0,433 |0,165 1,140 GS- Como discutido acima, um classificador baseado em um dada

O perfil de expressão de genes para prever uma resposta clínica a MAGE-A3 cc ASCI foi desenvolvido e validado cruzado na experiência com melanoma Fase Il (GSK 249553/008). O desempenho do classificador foi estimado ' usando LOOCV obtendo uma sensibilidade de 0,77 e especificidade de 0,56. A especificidade no ramo AS15 somente é 0,79 e sensibilidade 0,69. Esta classificação resultou em significante redução na relação de acaso para sobrevivência global na população GS+, com um efeito mais importante no ramo AS15.

A estabilidade da seleção do recurso do classificador foi também avaliada e foi verificada como robusta para remover uma amostra no . conjunto de treino. A biologia da assinatura ligada à eficácia clínica de - MAGE-A3-ASCI (100 PS de topo por s2n usando todos os 56 pacientes no conjunto de treino; Tabela 1) é relevante para o modo de ação de ASCI porque ele contém genes que sugerem a presença de um microambiente específico do tumor (quimiocinas) que favorecem a presença de células . efetuadoras imune no tumor dos pacientes respondedores que mostram regulação positiva de marcadores de células T-. Um recente estudo de perfil da expressão de gene em melanoma metastático revelou que tumores podem ser segregados com base na presença ou ausência de transcriptos associados a células T (Harlin,) 2009). A presença de linfócitos em tumores estava correlacionada com a expressão do subconjunto de seis quimiocinas (CCL2, CCL3, CCLA, CCL5, CXCL9, CXCLI1O), três dentre estes seis genes (CCLS, CXCL9, CXCLIO) estão presentes em 100 PS. De modo interessante, moléculas HLA foram também encontradas como sendo reguladas de modo — positivo nos pacientes respondedores . Foi postulado que a regulação negativa de moléculas HLA nas células de tumor pode ser o mecanismo para evadir a vigilância imune (Aptsiauri, 2008). As funções biológicas de topo da análise de Ingenuity Pathway confirmaram o enriquecimento de genes relacionados imunes na assinatura

O 100 PS (p-valor é a faixa obtida para as sub-funções): função biológica p-valor número de genes Cc apresentação de antígeno 5.53E-14 - 5.06E-03 27 Sinalização e interação célula-a-célula 5.40E-13 - 7.60E-03 28 Desenvolvimento Celular 1.58E-11 - 6.75E-03 27 . Morte celular 1.18E-09 - 5.80E-03 28 Movimento celular 3.56E-08 - 7.60E-03 19 Resposta imune mediada por célula 5.53E-14 - 7.60E-03 32 Resposta imune humoral 5.53E-14 - 7.60E-03 29 Desenvolvimento e função do sistema 4,44E-13-7.60E-03 32 hematológico Morfologia do tecido 4,44E-13 - 7.60E-03 23 Tráfico de células imunes 6.77E-13 - 7.60E-03 23

4. Predição do resultado clínico da nova amostra As etapas descritas aqui para realizar a predição do resultado . clínico foram escritas como escritos R. Antes de realizar a predição do — resultado clínico para um dado paciente, duas normalizações sucessivas dos dados do chip de genes do paciente Affymetrix são realizadas, as normalizações da amostra e gene. O objetivo destas normalizações é para produzir valores de expressão de genes para O paciente que serão comparáveis, por serem corretamente escalonados para os dados do conjunto —detreino a partir do qual o esquema de predição foi desenvolvido. O conjunto de treino consiste de 56 amostras da experiência de melanoma fase IL. Detalhes com relação à normalização do conjunto de treino é amostra foram descritos nas seções precedentes e ainda em detalhes nos seguintes parágrafos.

4.1 Normalização da amostra A normalização da amostra, também conhecida como pre- processamento é realizado partindo com o arquivo CEL para cada amostra e levando em conta os seguintes aspectos

1. Corrigir as intensidades de sondas de oligonucleotídeos —Aftymetrix brutas de fundo

2. Normalizar as intensidades de sondas de fundo corrigidas usando um procedimento de normalização do quantil.

O 3. Converter as intensidades de sondas em um conjunto de . sonda único seguindo um mapeamento de sondas para PS definido no Chip ” Definition File (CDF). O arquivo CDF é específico para a rede de chips de ' genes (hgul33plus2) usada e provida por Affymetrix. Esta última etapa é — chamada sumarização. i O objetivo desta etapa é adequar a distribuição das intensidades do conjunto de sonda (PS) dos dados desconhecidos do paciente para as distribuições da intensidade de PS do conjunto de treino. Isto é feito usando o algoritmo GCRMA (Wu, 2004). Este algoritmo foi adaptado para cuidar dos parâmetros de pré-processamento que são definidos em um . conjunto de dados de microarranjo de referência. Os parâmetros são de dois ' tipos: a distribuição empírica média necessária para a normalização do quantil, e os efeitos específicos da sonda para realizar a sumarização de PS. Os parâmetros GCRMA de referência foram construídos com 65 amostras do estudo de experiência de melanoma fase II e são aplicados à . nova amostra do paciente usando um código baseado no pacote refplus R.

A amostra de conveniência chunk do código do Apêndice 1 é uma modificação do código contido no pacote RefPlus R (Harbron et al., 2007), disponível em Bioconductor. O código RefPlus é modificado para realizar uma normalização GCRMA da dada amostra de hibridização , levando em conta os parâmetros de normalização calculados de um conjunto de dados de referência data. O conjunto de dados de referência é o conjunto descrito nas seções anteriores (65 pacientes). RefPlus é inicialmente projetado para normalização do conjunto de referência, mas usa o algoritmo RMA em —vezdeGCRMA., A única diferença entre RMA e GCRMA está na etapa de correção de fundo. RefPlus foi habilitado para realizar a correção de fundo de GCRMA por substituição da função bg.correct.rma R incrustada na função rmaplus R pela função bg.adjust.gcrma R. A modificação do código RefPlus foi feita em outubro de 2007 e é disponível de GlaxoSmithKline. Para

- normalizar a amostra com código RefPlus habilitado por GCRMA, . modificado do Apêndice 1, seria necessário chamar a função habilitada de ” rmaplus da correção de fundo de GCRMA com, como parâmetros, além dos ' dados para normalizar (de classe AffyBatch), os quantis de referência (opção rq)ecefeitoda sonda (opção p.e) que são calculados no conjunto de dados de referência. Os quantis de referência e efeitos de sonda estão contidos nos arquivos rq.txt e pe.txt files, disponíveis de GSK e submetidos ao USPTO em um disco compacto, como feita referência acima.

Para normalizar uma amostra com código RefPlus habilitado por GCRMA-, modificado de Apêndice 1 (Figura 5), seria necessário chamar . a função habilitada de rmaplus da correção de fundo de GCRMA com, como ' parâmetros, além dos dados para normalizar (de classe AffyBatch), os quantis de referência (opção r.q) e efeito da sonda (opção p.e) que são calculados no conjunto de dados de referência. Os quantis de referência e efeitos de sonda estão contidos nos arquivos rq.txt e pe.txt files, disponíveis de Head of R Corporate Intellectual Property at GSK, nomeados VR63933P rq.txt e VR63933P pe.txt, respectivamente. Estes arquivos também foram ' submetidos ao USPTO em um disco compacto com relação ao pedido de prioridade US número de série. 61/278387 depositado em 6 de outubro de — 2009 e podem ser obtidos por encomenda de arquivos do número de série US No. 61/278387 do USPTO quando se tornar disponível. No meio tempo, estes arquivos são também disponíveis como arquivos zipados em https://sites.google.com/site/vr63933/vr63933r files, (note-se que se tem um “ ” entre a letra “r” e a palavra “files” no endereço https) Os arquivos na rede são chamados VR63933P rq.zip e VR63933P pe.zip, respectivamente. Para obter cópias destes dois arquivos, deve-se navegar nos endereços dados neste parágrafo e selecionar o hipertexto “Download” para cada arquivo. Escolher a opção “Save” no prompt e salvar no local desejado. Abrir os arquivos de modo normal de um arquivo zipado e

2 salvar os mesmos como arquivos ASCII (.txt) em um local desejado. Então, - seguir as instruções nos primeiros dois parágrafos do presente pedido, 7 Os conjuntos de sonda (PS) sumarizados são , subsequentemente normalizados com um cálculo do escore Z-; este é aplicado —aosPS selecionados como recursos do classificador. O objetivo desta segunda etapa de normalização é tornar idênticos os genes que compartilham um padrão de expressão similar através de todos os dados mas que tem faixas de valor de expressão absoluta diferentes.

O escore Z para cada valor de PS de expressão de paciente individual é calculado como: uma média específica de PS é subtraída do valor . de PS, e este valor de expressão centrado na média é então ponderado para : um PS-desvio padrão específico. A média específica de PS e desvios padrões envolvidos no cálculo do escore Z são os calculados a partir do conjunto de treino (Tabela 4).

Uma vez que os dados brutos do paciente foram normalizados . com os parâmetros do conjunto de treino, eles podem ser submetidos a uma regra de decisão (classificador ou esquema de classificação) para predição do resultado clínico para o paciente.

4.2 Algoritmo para classificação das novas amostras Para predição do resultado clínico do paciente baseado no PS do paciente normalizado, uma de análise de componente principal (SPCA) — regra de decisão discriminante (DA) supervisionada é aplicada (adaptada de Bair, 2004; Tibshirani, 2002). O processo de predição evocando SPCA-DA trabalha como a seguir: * Os conjuntos de sonda usados para classificação são somente os recursos do classificador (100 PS) e foram identificados durante o desenvolvimento do modelo baseado no conjunto de treino (Tabela 1) * O perfil de expressão normalizado (recursos do classificador) do paciente a classificar é projetado no primeiro espaço do

O componente principal (PC,) definido para o conjunto de treino usando uma ' combinação linear dos recursos do classificador (os coeficientes para cada 7 recurso na combinação linear foram obtidos por decomposição de valor ' singular do conjunto de treino e são providos em Tabela 4) e A distância padronizada da amostra de teste em PCI para a média dos grupos de Respondedor e Não respondedor é obtida usando a seguinte equação: a, = Porméta PE : 2d PC, i= amostra de teste ' K= Respondedor (R) ou Não Respondedor (NR) - 10 Média PCik= média PC, de grupo R ou NR em conjunto de treino sd PCix= desvio padrão PC, de grupo R ou NR em conjunto de treino : * A média e sd de cada grupo no conjunto de treino (arredondado para três dígitos significantes) são: * O índice (probabilidade de amostra ser Respondedor) para cada amostra é obtido com: e

A e?+e? A amostra é classificada como assinatura de genes positiva (Respondedor,R) se seu Pr for maior do que 0,43 Aplicando este classificador ao conjunto de treino com o fim de exemplificar o método, produz-se a Figura 7/21. Algoritmo para prever uma nova amostra

O library(genefilter) - fittittt load testset to classify (normalized microarray data) " load("testset.

RData") ti! ExpressionSet containing samples to : classify testset<-data HHit(modify xx according to batch number) HiHt Load training set parameters HEHHHEHHHHHHAHAAA load("M8.train.parameters.RData") PS<-M8.train.parameters[[1]] M3.train.means<-MS8.train.parameters[[2]] MB8.train.sd<-M8.train.parameters[[3]] . M38.train.

U<-M8.train.parameters[[4]] . M3.trainPC1 barRs<-M8.train.parameters[[5]] M3.trainPC1 sdRs<-M8.train.parameters[[6]] MB .trainPC] barNRs<-MS8.train.parameters[[7]] M38.trainPC1 sdNRs<-M8.train.parameters[[8]] . HHAHHHAAAAAUHAAAHARARABARARAAAARARA Use SPCA on test set - HHBHHHHHHHHAHHHAHAHRARHA testset<-testset[PS,] test<-(exprs(testset)-M8.train.means)/M8.train.sd PCtest<-t(test) %*% MS$.train.U PCltest<-PCtest[,1] distanceR<-c() distanceNR<-c() probR<-c() probNR<-c() SPCAclass<-c() for (i in 1:ncol(test)) ( distancesR<-abs(PCtest[i,1]- M3.trainPC1 barRs)/M8.trainPC1sdRs oO distancesNR<-abs(PCtest[1,1]- . MS8.trainPC1barNRs)/M8.trainPC1sdNRs 7 distanceR <-c(distanceR distancesR) ' distanceNR<-c(distanceNR,distancesNR) probRs<-exp(-distancesR/2)/(exp(-distancesR/2)-+exp(- distancesNR/2)) probNRs<-exp(-distancesNR/2)/(exp(-distancesR/2)+exp(- distancesNR/2)) probR<-c(probR,probRs) probNR<-c(probNR,probNRs) : k ' cutoff=0.43 clust<-ifelse(as.vector(probR)>cutoff, R,NR)) em que - —testset é uma matriz com 100 fileiras contendo os dados ' normalizados do microarranjo para os 100 PS - —“M38train.parameter é um objeto da lista de classe contendo

1. uma lista de caracteres do 100 PS

2. um vetor de 100 valores médios para cada PS no conjunto de treino

3. um vetor de valores 100 sd para cada PS no conjunto de treino

4. uma matriz de 100 fileiras e 56 colunas contendo a matriz —Udedecomposição svd da matriz de treino

5. o valor médio de PCI do grupo respondedor no treino

6. ovalor PCI sd do grupo respondedor no treino

7. ovalor médio de PC1 do grupo não respondedor no treino

8. ovalor PCI sd do grupo não respondedor no treino

" Tabela 4: Média, desvios padrão (Sd) e Coeficientes PC, para os recursos ' de classificador 100 PS : 0,0372 , - 237515 NS IS5SI3 18 jo0245 | : 6,533 6,039 AFFX-HUMISGF3A/M97935 MB at [208729 x at 110389 1419 |-0106 |

: ELLER TR TRIO . : : -0:1088

OS : . [BT SA [8659 [19% [01 | [1555852 — [6989 [189 [011 |) : :

0.165 01168 0:1224

. [Lo | Més Tri 7 213193 x at 6,825 2,768 -0,1257 . 204116 at 6,106 " 213539 at 7,398 2,851 -0,1263 211339 s at 5,602 [2,061 - 210915 x at 6,533 2,733 -0,1267 211796 s at 6,946 2,921 -0,1271 205758 at 7,338 3,285 -0,1275 Exemplo 2. Classificador de melanoma usando dados Q-RT-PCR O RNA usado para o perfil de expressão de gene por microarranjo foi testado na rede Tagman Low Density feita sob encomenda —(ABI, PN 4342259) contendo 22 genes de 100PS (83 genes) e 5 genes de - referência para normalização (GUSB, PGK1, H3F3A, EIF4G2, HNRNPC) (Tabela 3). Para esta análise; um total de 54 amostras de melanoma foi incluído (52 também usados para análise de microarranjo e 2 adicionais — porque a hibridização do microarranjo não foi de boa qualidade=. Tabela 5. Números de teste ABI Tagman para 22 genes mais genes de referência usados para construir classificador com base em PCR em B amostras de melanoma E 92 genes em 100PS medidos por PCR Símbolo de genes quimiocina (C-C motivo) ligando 5º | Hs00174575 ml tirosina quinase) - fator regulatório de interferon 1 Hs00971960 m1 CXCL9 goela (motivo C-X-C) ligando Hs00171065 ml interleucina 2 receptor, gama ( 12RO imunodeficiência severa combinada ) 1500175950 ml CXCLIO quimiocina — (motivo — C-X-O) | on171042 m) ligando10 = família de veículo soluto 26 SLC26A2 transportador de sulfato), membro 2 Hs00164423 ml! CD86 molécula CD86 Hs01567025 ml] molécula CD8a Hs00233520 m1 Hs00197374 m) granzyme K (granzyme 3; triptase II) | Hs00157878 m1 GPR171 receptor copulado em proteina G 171 | Hs00664328 sl

; [ 122 genesem100PSmedidosporPCR Símbolo de genes . homologia —pleckstrina, — domínios *. PSCDBP (sinônimo: | Sec7 e proteina de ligação CYTIP) espiralada-espiral HSODISSTSA sul 1 CXCL2 quimiocina (motivo C-X-C) ligando Hs00236966 ml - 2 " Z ICOS co-estimulador de célula T indutível | Hs99999163 ml TRBCI] receptor de célula T beta constante2 | Hs00411919 ml TRAG;TRAIIT;TR DV2;TRAC;TRAV?2 | receptor de célula T lócus alfa Hs00948942 m1 o proteina de quadro de leitura TARP;TRGC2 alternada TCR gama Hs00827007 m1 célula T indutível por quinase Hs00950634 ml - Ca4ort7 cromossomo 4 quadro de leitura Hs00395131 m!1 aberta 7 CD3d molécula, delta (complexo - CD3D CD3-TCR) Hs00174158 m1 complexo histocompatibilidade HLA-DMA maior, classe 1I, DM alfa Hs00185435 ml PGK1 Hs99999906 ml Hs99999908 m1 HNRNPC Hs01028910 gl . EIF4G2 Hs01034743 gl H3F3A Hs02598545 el f A síntese de cCDNA de 500ng (medição OD>5o9) de RNA total foi realizada na mistura de 20 ul contendo 1x tampão de primeiro filamento, 0,5 mM de cada dNTP, 10 mM de ditiotreitol, 20 U de rRNase inibidor (Promega cat.N2511), 250ng de hexâmeros aleatórios e 200 U de M-MLV —transcriptase reversa ( Life Technologies cat. 28025-013 ) por 1h30 a 42ºC . cDNA correspondendo a 200 ng de RNA total foi misturado em volume total de 200 ul contendo tampão TaqMan, SmMM MgCl2, 0,4 mM dUTP, 0,625 U de Ampli Tag Gold DNA polimerase, 0,05 U de UNG e carregado em rede de baixa densidade TaqMan de acordo com recomendações do fabricante.

A rede de baixa densidade Tagman foi ciclada em um Applicated Biosystem 7900HT.

O perfil de amplificação foi 1 ciclo de 2 min a 50ºC, 1 ciclo de 10 min a 94,5 ºC e 40 ciclos de 30 s a 97ºC e 1 min a 59,7ºC.

Os dados brutos foram analisados usando software SDS 2.2 (ABI). Os valores de Ct foram

CO obtidos com uma linha de base automática e 0,15 como valor de limiar.

. Validação cruzada por exclusão individual de classificação SPCA-DA ” usando os dados Q-PCR de 22 genes: ' Um esquema de classificação foi desenvolvido e testado — usando validação cruzada por exclusão individual usando todos os 22 genes medidos por Q-PCR (isto é, sem recálculo do recurso do classificador). Primeiro, a normalização do escore Z foi realizada dentro de cada conjunto de treino e aplicada à amostra de teste. À seguir, o mesmo algoritmo de classificação aplicado aos dados do microarranjo baseados em —análisedo principal componente — discriminante supervisionada (SPCA-DA) ' foi construído e aplicado a cada uma das amostras excluídas no circuito (Bair ' e Tibshirai, PLOS Biol 2004 e Tibshirani et al., PNAS 2002). Usando o corte de 0,43 do microarranjo, 33/54 amostras são classificadas como GS+, sensibilidade é 85% (17/20) com especificidade 53% (18/34). Como no microarranjo, ramo AS15 teve melhor desempenho, 92% . sensibilidade e 57% especificidade. Usando um corte de 0,47 calculado em dados PCR, 31/54 amostras são classificadas como GS+, sensibilidade é 85% (17/20) e especificidade é 59% (20/34).

52 amostras testadas em PCR eram do modelo de microarranjo. Os requerentes compararam a classificação de amostras correspondentes em microarranio LOO SPCA-DA com 100PS (com seleção de característica) e LOO SPCA-DA PCR com 22 genes (sem seleção de característica), ambos com corte de probabilidade a 0,43. A concordância de classificação de amostra entre o modelo de exclusão individual é 49 dentre as 52 amostras tendo o mesmo rótulo em ambas as classificações (classificadas como erradas sendo as amostras limítrofes).

Figura 8/21 mostra os índices do classificador obtidos por LOO SPCA-DA PCR com 22 genes (sem seleção de característica).

o Classificação da nova amostra usando os parâmetros derivados do ' conjunto de treino Para predição dos resultados clínicos do novo paciente baseada em níveis de expressão de Q-PCR para os 22 genes no classificador, uma —regrade decisão de componente principal supervisionado (SPCA) - análise discriminante (DA) é aplicada (adaptada de Bair, 2004; Tibshirani, 2002) como mostrado previamente para o classificador com base em microarranjo do exemplo 1. Uma vez que os dados brutos do paciente foram normalizados usando os genes referência e log transformados (isto será chamado matriz de ' expressão), eles podem ser submetidos a uma regra de decisão (classificador . ou esquema de classificação) para predição do resultado clínico para o paciente. * A matriz de expressão é escore zd usando média e desvio padrão (Sd)do conjunto de treino (Tabela 6) ' * O perfil de expressão de escore zd normalizado (recursos do classificador) do paciente a classificar é projetado no primeiro espaço do componente principal (PC,) definido pelo conjunto de treino usando uma combinação linear dos recursos do classificador (os coeficientes para cada um — dos 22 recursos na combinação linear foram obtidos por decomposição de valor singular do conjunto de treino e são providos em Tabela 6).

Tabela 6: Média, desvios padrão (Sd) e coeficientes PC1 para características de classificador de 22 genes coeficiente Gene Média sd PC] C4orf7 -1,397 -0,1834 0,545 -0,2441 1,105 -0,1636 0,430 0,500 -0,2345 CXCL9 0,923 -0,2349 IL2RG 0,721 -0,2444 CXCL10 -0,830 0,896 -0,2181 SLC26A2 -0,745 0,307 0,0660 CD86 1,504 0,461 -0,2272

. 0,879 : -0,570 -0,2385 -1470 -0,2414 ac GPRI71 0,698 -0,2180 PSCDBP -1,335 0,647 . CXCL2 2,163 0,633 ICOS 0,697 -0,2029 1,313 -0,2026 TRAO;TRAJI7;TRDV2;TRAC;TRA V20 | -0,762 0,666 -0,2464 TARP;TRGC2 -2,405 -0,1904 -1,862 0,896 -0,2178 CD3D 0,806 -0,2452 HLA-DMA -0,380 0,470 -0,2284 * —A distância padronizada da amostra de teste em PC1 para a média de grupos de Respondedor e não Respondedor é obtida usando a . seguinte equação: d — PG mem PG,| Za Eu! 7 sd PC, 1= amostra de teste K= Respondedor (R) ou Não Respondedor (NR) média PC, = PC, média de grupo R ou NR em conjunto de ' treino

5. sd PCik= PC, desvio padrão de grupo R ou NR em conjunto de treino A média e sd de cada grupo no conjunto de treino (arredondado para três dígitos significantes) são: 2,055 média PCne * O índice (probabilidade ode amostra ser Respondedor) para cada amostra é obtido com — e 2 RE = e? te? * Aamostraé classificada como assinatura de genes positiva

. (Respondedor,R) se seu Pré maior do que 0,47 . Aplicando este classificador ao conjunto de treino, produz a " Figura 9/21 que mostra que os 22 genes podem se classificar no conjunto de ' treino com sensibilidade de 0,85 (17/20) e especificidade of 0,59 (20/34), para umaconcordânciade69%. ||| o i Código de predição de resultado ft Script for classification of test-samples fresh metatasic melanoma TLDA?2 22 genes Hit! based on Mage008TLDA.SPCA.DA.Mel4patent.R Hum needs M38.train.parameters.22genes. TLDA2.RData ' (training set parameters) - library(genefilter) tt! load testset to classify (log-scaled normalized PCR data) load("testset. RData") tfffft ExpressionSet containing samples to classify . Hit Load training set parameters tHHHHHHHIRHHAAR load("M8S.train.parameters.22genes. TLDA2.RData") i PS<-M8.train.parameters[|[1]] MB8.train.means<-MS8.train.parameters[[2]] MB8.train.sd<-M38.train.parameters[[3]] M38.train. U<-M8.train.parameters[[4]] MB8.trainPC] barRs<-M8.train.parameters[[5]] M8.trainPC1sdRs<-M8.train.parameters[[6]] MS3.trainPC1barNRs<-M8.train.parameters[[7]] M3.trainPC1sdNRs<-M8.train.parameters[[8]] HAAAARRAABARAAARAAARHARAERH Use SPCA on test set -

HHHIAAAR AAA RRRAAA testset<-testset[PS,] test<-(exprs(testset)-M38.train.means)/M8.train.sd

SO PCtest<-t(test) %*% MB8.train.U - PCltest<-PCtest|,1] U distanceR<-c() ' distanceNR<-c() ” probR<-c() probNR<-c() SPCAclass<-c() for (i in 1:ncol(test)) ( distancesR<-abs(PCtest[i,1]- M8trainPClbarRs)/M8.trainPC1sdRs ' distancesNR <-abs(PCtest[i,1]- ' MB8.trainPC1barNRs)/M8.trainPC 1sdNRs distanceR<-c(distanceR,distancesR) distanceNR<-c(distanceNR distancesNR) probRs<-exp(-distancesR/2)/(exp(-distancesR/2)+exp(- : distancesNR/2)) probNRs<-exp(-distancesNR/2)/(exp(-distancesR/2)+exp(- distancesNR/2)) probR<-c(probR,probRs) probNR<-c(probNR probNRs) ) cutoff=0.47 clust<-ifelse(as.vector(probR)>cutof,R,NR)

HHHIBABHBHAHARAABAAAA Hiti(modify xx next line according to batch number) write.table(cbind(pData(testset),probR),file="testset batch xx —TLDA?2 22genes classification.txt",sep="t") em que - —TestsetRData é uma matriz com 22 fileiras contendo os

CO dados PCR em escala log normalizados para os 22 genes - - —“MB8.train.parameter é um objeto da lista de classe contendo : 1. uma lista de caracteres dos nomes dos 22 genes -

2. um vetor de 22 valores médios para cada gene no conjunto de treino

3. um vetor de 22 valores sd para cada gene no conjunto de treino

4. uma matriz de 22 fileiras e 22 colunas contendo a matriz U —dedecomposição svd da matriz de treino ' 5. o valor médio de PC1 do grupo respondedor no treino . 6. ovalor PC] sd do grupo respondedor no treino

7. ovalor médio de PC1 do grupo não respondedor no treino

8. ovalor PCI sd do grupo não respondedor no treino 155 EXEMPLO3 . Classificação de amostras NSCLC com um subconjunto de 23 genes avaliados por PCR Antecedentes: Experiência clínica NSCLC Fase II. Este é uma experiência de conceito de prova controlado por * placebo duplo-cego em pacientes MAGE-A3 positivos, estágio IB e II NSCLC após uma completa ressecção cirúrgica do tumor (CPMS 249553/004). O agente ASCI (Antigen-Specific Cancer Immonotherapeutics) é a proteína de fusão MAGE-A3 recombinante em fusão com Proteína-D e uma cauda Hist. Ele é combinado com adjuvante imunológico ASO02B. —ASO2Béuma emulsão óleo em água de QS21 e MPL. QS21 é uma molécula de saponina purificada de ocorrência natural da árvore da América do Sul Quillaja Saponaria Molina, e MPL 3 de-O-acetilado monofosforil lipídeo A - derivado of lipídeo A dextoxificado, derivado de S. minnesota LPS. Esta experiência controlada por placebo, randomizada, duplo-cego foi projetada

* para avaliar o tempo até a recorrência (Figura 11/21). . Figura 10/21 mostra o projeto da experiência NSCLC Fase II . U Um total de 182 pacientes com MAGE-A3-positivo, completamente ' resseccionados, , NSCLC estágio IB ou II foram acompanhados durante 2 anose designados aleatoriamente para receber ou ASCI marcando MAGE-A3 ou placebo (relação 2:1). Um máximo de 13 doses foi administrado durante um período de 27 meses.

A análise principal foi realizada após um período de acompanhamento mediano de 28 meses desde a data de ressecção date e foi liberada em novembro de 2006. Esta experiência proporcionou a primeira evidência de ' atividade para uma imunoterapia de câncer nesta população de pacientes.

No . momento da análise principal, 67 pacientes tinham mostrado recorrência da doença: 41 em ramo recMAGE-A3 + ramo AS02B ASCI (33,6%) e 26 no ramo do placebo (43,3%). À análise de regressão Cox foi usada para calcular a melhora relativa em intervalo livre de doença (DFI) enquanto levando em . conta o tempo individual — para —evento de cada paciente.

Os resultados mostram uma redução relativa de 27% de risco de recorrência de câncer após ' um acompanhamento mediano de 28 meses no grupo recebendo o ASCI quando comparado a placebo (razão de acaso= 0,73; CI = 0,44 — 1,2; p = —0,108,um teste de grau log de um lado) (Figura 11/21). As razões de acaso para sobrevivência livre de doença (DFS) e sobrevivência global (OS) foram 0.73 (CI: 0,45 - 1,16), e 0,66 (CI = 0,36 - 1,20), respectivamente.

Estes resultados foram ainda confirmados no momento de —análisefinal (dezembro de 2007 — acompanhamento mediano de 44 meses): HR 0,75 para DFI (CI = 0,46 - 1,23), 0,76 para DFS (CI = 0,48 - 1,21) e 0,81 para OS (CI = 0,47 - 1,40). Figura 11/21 mostra a curva Kaplan-Meier para intervalo livre de doença para a experiência NSCLC.

Amostras deste estudo foram usadas a para determinar o uso de assinatura de melanoma como biomarcadores - potenciais preditivos da resposta clínica do tratamento ASCI nesta população de pacientes. ' Classificação de amostras NSCLC com dados de PCR: Um subconjunto de 23 genes de 100PS (Tabela-1) foi usado para construir um classificador LOO com as amostras da experiência clínica NSCLC MAGE-A3 (MAGEO004; GlaxoSmithKline) Tabela 7. Números de teste ABI Taqman para 23 genes usados para construir classificador baseado em PCR em amostras NSCLC (genes de — referência iguais ao classificador de melanoma em exemplo 2) . 23 genes em 100PS medido por PCR Símbolo do gene . CCLS quimiocina (C-C motivo) ligando 5 Hs00174575 ml Janus quinase 2 (uma proteína Hs01078136 mi tirosina quinase Z fator regulatório de interferon 1 Hs00971960 ml CXCL9 q sao (C-X-C motivo) ligando Hs00171065 m! receptor de interleucina 2, gama . IL2RG (imunodeficiência combinada severa) FHS00173550, 01 CXCLIO quimiocina (C-X-C motivo) ligando Hs00171042 ml ' família de veículo soluto 26 (sulfato SLC26A2 transporter), membro 2. Hs00164423 m1 molécula CD86 Hs01567025 m1 CDSA molécula CD8a Hs00233520 ml! ubiquitina D Hs00197374 ml granzyme K (granzyme 3; triptase ID) | HsS00157878 ml! receptor copulado a G proteína- 171 | Hs00664328 sl homologia — pleckstrina, Sec7 e PSCDBP domínios espiralado, com espiral, | HsSO0188734 ml proteína de ligação CXCL2 quimiocina (motivo C-X-C) ligando Hs00236966 ml 2 » ICOS co-estimulador de célula T indutível | Hs99999163 ml TRBCI receptor de célula T beta constante 2 | Hs00411919 m1 TRAQ;TRAJI;TR DV2;TRAC;TRA V2 | receptor de célula T alfa locus Hs00948942 ml o proteina de quadro de leitura TARP;TRGC2 altemada TCR gama; célula T | Hs00827007 ml constante receptor gama 2

; ' . | cromossomo 4 membro família SLAM 7 Métodos 129 amostras de tumor (pre-vacinação) foram usadas da experiência clínica NSCLC MAGE-A3 (MAGEO004; GlaxoSmithKline). Estas foram amostras recentemente congeladas conservadas em RNAlater, uma ' 5 — solução de estabilização de RNA.

RNA total foi purificado usando o método : Tripure (Roche Cat.

No. 1 667 165). O protocolo recomendado foi seguido subsequentemente pelo uso de um protocolo de limpeza Mini kit RNeasy com tratamento DNAse (Qiagen Cat.

No. 74106). Quantificação de RNA foi inicialmente completada usando densidade óptica a 260nm.

Síntese de cDNA de 500ng de RNA total foi realizada na mistura de 20 ul contendo 1x tampão de primeiro filamento, 0,5 mM de cada dNTP, 10 mM de ditiotreito]l, 20 U de inibidor rRNase (Promega cat.N2511), 250ng de hexâmeros aleatórios e 200 U de M-MLV transcriptase reversa ( Life Technologies cat. 28025-013 ) for 1h30 at 42ºC . cDNA correspondendo a 200 ng de RNA total foi misturado no volume total de 200 ul contendo tampão TagMan, SmM MgCl2, 0,4 MM dUTP, 0,625 U de Ampli Taq Gold DNA polimerase, 0,05 U de UNG e carregado na rede de TaqMan baixa densidade de acordo com as recomendação do fabricante.

A rede de baixa densidade Tagman foi ciclada em um Applicated Biosystem 7900HT.

O perfil de amplificação foi 1 ciclo de 2 min a 50ºC, 1 ciclo de 10 min a 94,5ºC e 40 ciclos de 30 s a 97ºCe Il mina 59,7ºC.

Os dados brutos foram analisados usando software SDS 2.2 (ABI).

Os valores de Ct foram obtidos com uma linha de base automática e 0,15 como valor de limiar. Validação cruzada de exclusão individual de classificação SPCA-Cox usando os dados Q-PCR de 23 genes: Esta experiência clínica continha um ramo placebo e um ramo tratado, um classificador foi desenvolvido que usa intervalo livre de doença (DFI) para estimar um escore de risco baseado em um modelo de acaso proporcional de Cox com uma interação entre tratamento e perfil de gene (sumarizado como componente principal 1) além do tratamento, perfil de gene, estágio, cirurgia e tipos histológicos como co-variadas.

Os valores Ct para cada gene foram normalizados com a média geométrica dos 5 genes de referência e log transformados. Subsequentemente, os genes foram normalizados por escore Z em cada conjunto de treino e estes parâmetros aplicados ao conjunto de teste.

Após a normalização de escore z, uma decomposição de valor . singular (SVD) é realizada no conjunto de treino para obter o primeiro Componente Principal (PC1). Este primeiro componente é usado na regressão | de Cox com interação com tratamento para estimar o coeficiente de co- variadas no conjunto de treino; a regressão de Cox é ajustada por histologia, estágio e tipo de efeitos de cirurgia. Os coeficientes desta regressão são usados para calcular o escore de risco no conjunto de treino e a amostra de teste (amostra deixada de lado). O escore de risco mediano do conjunto de treino é usado como valor de corte para denominar um paciente com assinatura de genes (GS)+ ou assinatura de genes (GS)-. Esta metodologia é —chamadaCox-SPCA e é ilustrada na Figura 12/21.

Figuras 13/21 e 14/21 mostram curvas de sobrevivência por perfil de genes baseado na classificação LOOCV com mediano como corte e distribuição do escore de risco dentre placebo e ramo de vacina, respectivamente. O escore de risco distribuição é como a seguir:

Impacto de GS em HR e | — J]HR tratamento GS+ | 0,466 [0,187;1,162] 1,216 [0,555;2,67 Classificação da nova amostra usando o algoritmo Cox-SPCA Para predição dos resultados clínicos do novo paciente baseado em níveis de expressão de Q-PCR para os 23 genes no classificador, uma regra de decisão principal componente supervisionado (SPCA) - Cox é aplicada: Uma vez que os dados brutos do paciente foram normalizados usando os genes de referência e log transformados, eles podem ser submetidos a uma regra de decisão (classificador ou esquema de classificação) para " 10 predição do resultado clínico para o paciente. * A matriz de expressão é escore zd usando os parâmetros do conjunto de treino (Tabela 8) Tabela 8. Média, desvios padrão (Sd) e PCl coeficientes para ' características de classificador de 23 genes coeficiente ' Gene Média PC] -2,35768 — | 1455544 -0,12114 CCL5 -0,9599 0,350039 -0,23097 136811 — [0,2260374 — |-0,19931 -0,52347 — | 0,276644 -0,2256 CXCLI -0,87804 0,563437 -0,21386 IL2RG -0,83528 0,358042 -0,24997 CXCLIO -1,36857 0,615177 -0,17136 SLC26A2 —1,44043 0,255169 -0,05637 CD86 —-1,7699 0,499237 -0,13267 CDA -1,33733 0,375334 -0,25173 -0,71367 — | 0,546652 -0,21295 177411 — |[0,529496 -0,24628 GPR171 -1,81327 0,32409 -0,19376 PSCDBP -1,17746 0,387117 -0,24162 CXCL2 -1,16947 0,696255 -0,09696 ICOS -2,15436 0,403522 —0,23497 TRBC1 -2,62512 1,013281 -0,12679 TRAGQ:TRAJI7;TRDV2;TRAC;TRAV20 | -1,19671 -0,25817 TARP;TRGC2 -2,22752 0,481252 -0,19299

. coeficiente ' Gene Média PCl . ” .

e O perfil de expressão normalizado em escore zd (recursos do classificador) do paciente a classificar é projetado no espaço do primeiro componente principal (PC,) definido pelo conjunto de treino usando uma combinação linear dos recursos do classificador (os coeficientes para cada um —dos23 recursos na combinação linear foram obtidos por decomposição do valor singular do conjunto de treino e são providos em Tabela 8) . * Um escore de risco para a nova amostra é calculado usando a equação: | nO > à log nO = PrectanlD + Peruana DP em que Bratamento=-0,232051457 : 10 é Bretinteração= 0,176736586 foram obtidos do conjunto de treino " O escore de risco da nova amostra é comparado ao escore de risco mediano do conjunto de treino = -0,315324195 e uma amostra é classificada GS+ (Respondedor, Não Relapso,1) se o escore de risco for menor do que este valor.

Figuras 15/21 e 16/21 mostram o resultado clínico baseado nos níveis de expressão de Q-PCR para os 23 genes no classificador. O impacto de GS em HR é como a seguir: [0,167;1,090] Código de predição de resultado

Ê HAHA Script for classification of test-samples fresh resected - NSCLC TLDAmerge 23 genes 7 HH based on ' Mage004.SPCA.Cox.classifier.contruction,. TLDAmerge.23genes.DFI.Squam ousR HH needs M4.train.parameters.23genes. ILDAmerge.RData (training set parameters) library(genefilter) Hit load testset to classify (log-scaled normalized PCR data) load("testset.RData") ftitt ExpressionSet containing samples to ' classify . HH! Load training set parameters titfHHAHHRAHHHHHR load("MA.train.parameters.23genes. TLDAmerge.RData") PS<-MA.train.parameters[[1]] MA .train.means<-MA.train.parameters[[2]] . Ma4.train.sd<-M4.train.parameters[[3]] MA train. U<-MA4 .train.parameters[[4]] MA.train.Btreatment<-M4 .train.parameters[[5]] MA train.Binteraction<-MA.train.parameters[[6]] MA .train.medianHR <-M4.train.parameters[[7]] HHBHAHHARDHRAN AAA AAA AAHARAAAAAEARHA Use SPCA on test Set - HHHHHHNHHHHHHBAHARHARARH testset<-testset[PS,] test<-(exprs(testset)-MA4.train.means)/M4.train.sd PCtest<-t(test) %*% MA .train.U PCltest<-PCtest[,1] HR=MA.train.Btreatment+PC1test* MA .train.Binteraction classification=ifelse(HR<MA.train.medianHR, 1,0)

HUHARUHRHAAARARHARAA

” Hitli(modify xx next line according to batch number) ' write.table(cbind(pData(testset),probR),file="testset batch xx 7 —M4 TLDAmerge 23genes classification.txt",sep="W") . em que " - —“TestsetRData é uma matriz com 23 fileiras contendo os dados PCR em escala log normalizados para os 23 genes - —“M4jitrain.parameter é um objeto da lista de classe contendo

1. uma lista de caracteres dos nomes dos 23 genes

2. um vetor de 23 valores médios para cada gene no conjunto . de treino : 3. um vetor de 23 valores sd para cada gene no conjunto de treino

4. uma matriz de 23 fileiras e 23 colunas contendo a matriz U —dedecomposição svd da matriz de treino . 5. —Bratamento EM computação de escore de risco

6. Bpctineração EM computação de escore de risco ' 7. o escore de risco mediano em treino EXEMPLO 4 Classificação de amostras de NSCLC com um subconjunto de 22 genes avaliados por PCR: Um subconjunto de 22 genes de 100PS (Tabela-1) foi usado para construir um classificador LOO com as amostras da experiência clínica MAGE-A3 NSCLC (MAGE004; GlaxoSmithKline) Tabela 9. Números de teste ABI Taqman para 22 genes usados para construir classificador baseado em PCR em amostras NSCLC (genes de referência iguais que no classificador de melanoma em exemplo 2)

: 22 genes em 100PS medidos por PCR 1 Símbolo de gene . fator regulatório de interferon 1 Hs00971960 ml .. CXCLI quimiocina (motivo C-X-C) ligando 9 Hs00171065 ml receptor de interleucina 2, gama . .2RG (imunodeficiência severa combinada ) 115001 75950. CXCLIO0 —-- quimiocina (motivo C-X-C) ligando 10º - | Hs00171042 m1 SLC26A2 família veículo soluto 26 (sulfato Hs00164423 ml transporter), membro 2 — CD86 molécula CD86 Hs01567025 ml] CD8$A molécula CD8a Hs00233520 ml Hs00197374 ml granzyme K (granzyme 3; triptase II) Hs00157878 ml GPR171 receptor copulado a G proteína- 171 Hs00664328 s1 homologia pleckstrina, Sec7 e domínios . PSCDBP (CYTIP) | espiralados e em espiral, | HsS00188734 ml proteína de ligação CXCL2 quimiocina (motivo C-X-C) ligando 2 Hs00236966 ml ' 1ICOS co-estimulador de célula T indutível Hs99999163 ml TRBC1 receptor de célula T beta constante 2 Hs00411919 ml TRAQ;TRAIHT;T RDV2;TRAC:TRA | receptor de célula T alfa locus Hs00948942 m1 V20 TCR gama proteína de quadro de leitura . TARP;TRGC2 altemado; “receptor de célula T | Hs00827007 ml gama constante 2 célula T quinase indutível por IL2- Hs00950634 ml] ' cromossomo 4 quadro de leitura aberta 7 Hs00395131 m1 CD3D E CD3d, delta (complexo CD3- Hs00174158 ml complexo de histocompatibilidade HLA-DMA principal, classe II, DM alfa FIS00185435 ml! Métodos 137 amostras de tumor (pre-vacinação) foram usadas da experiência clínica NSCLC MAGE-A3 (MAGEO004; GlaxoSmithKline). Estas eram amostras logo congeladas conservadas em RNAlater, uma solução de estabilizaçãodeRNA.

RNA total foi purificado usando o método Tripure (Roche Cat.

No. 1 667 165). O protocolo recomendado foi seguido subsequentemente pelo uso de um protocolo de limpeza Mini kit RNeasy com tratamento DNAse (Qiagen Cat.

No. 74106). Quantificação de RNA foi inicialmente completada

” usando densidade óptica a 260nm. ; Síntese de cDNA de 500ng de RNA total foi realizada na " misturas de 20 ul contendo 1x tampão primeiro filamento, 0,5 mM de cada ' dNTP, 10 mM de ditiotreitol, 20 U de rRNase inibidor (Promega cat.N2511), —250ng hexâmeros aleatórios e 200 U de M-MLV transcriptase reversa (Life Technologies cat. 28025-013 ) por 1h30 a 42ºC .

cDNA correspondendo a 200 ng de RNA total foi misturado em volume total de 200 ul contendo tampão TaqMan, SMM MgCl2, 0,4 mM dUTP, 0,625 U de Ampli Taq Gold DNA polimerase, 0,05 U de UNG e — carregado na rede de baixa densidade TaqMan de acordo com recomendações ' do fabricante. . A rede de baixa densidade Tagman foi ciclada em um Applicated Biosystem 7900HT. O perfil de amplificação foi | ciclo de 2 min a 50ºC, 1 ciclo de 10 min a 94,5ºC e 40 ciclos de 30 s a 97ºCelmina 59,7ºC. Os dados brutos foram analisados usando software SDS 2.2 (ABI). - Os valores de Ct foram obtidos com uma linha de base automática e 0,15 como valor de limiar. Validação cruzada de exclusão individual de classificação SPCA-Cox usando os dados de 22 genes Q-PCR: Esta experiência continha um ramo placebo e um tratado, um classificador foi desenvolvido que usa intervalo livre de doença (DFI) para estimar um escore de risco baseado em um modelo de acaso proporcional de Cox com uma interação entre tratamento e perfil de gene (sumarizado como o componente principal 1) além do o tratamento, perfil de gene, estágio, cirurgiaetipo histológico como co-variadas.

Os valores Ct para cada gene foram normalizados com a média geométrica de 5 genes de referência e log-transformada. Subsequentemente, os genes foram normalizados por escore Z em cada conjunto de treino e estes parâmetros aplicados ao conjunto de teste.

-* Após normalização do escore z, um valor de decomposição “ singular (SVD) é realizado no conjunto de treino para obter o primeiro " Componente Principal (PC1). Este primeiro componente é usado na regressão " Cox com interação com tratamento para estimar o coeficiente de co-variados no conjunto de treino; a regressão Cox é ajustada para histologia, estágio e tipo de efeitos de cirurgia. Os coeficientes desta regressão são usados para calcular o escore de risco no conjunto de treino e a amostra de teste (amostra à parte). O escore de risco mediano do conjunto de treino é usados como valor de corte para achar um paciente GS+ ou GS-. Esta metodologia é chamada —Cox-SPCA em outro documento. A metodologia é ilustrada na Figura 12/21.

. Figuras 17/21 e 18/21 mostram curvas de sobrevivência por . perfil de genes baseado na classificação LOOCV com tanto mediano como corte e distribuição do escore de risco dentre placebo e ramo de vacina, respectivamente.

Distribuição de escore de risco : Classificação da nova amostra usando o algoritmo Cox-SPCA Para predição do resultado clínico do novo paciente baseado em níveis de expressão Q-PCR para os 22 genes no classificador, uma regra de componente principal (SPCA) — decisão Cox supervisionada é aplicada: Uma vez que os dados brutos do paciente foram normalizados usando os genes de referência e transformados em log, eles podem ser submetidos a uma regra de decisão (classificador ou esquema de classificação) para predição do resultado clínico para o paciente.

* A matriz de expressão é de escore z usando os parâmetros — doconjunto de treino (Tabela 10) Tabela 10. Média, desvio padrão (Sd) e coeficientes PCI para características de classificador de 22 genes coeficientes PC] C 2,37682 | 1,432191 | -0,12613 CCLS -0,97196 |0,363545 )-0,23868 oC -1,38351 |[0,272662 |-0,20067 -0,5328 —[0,284196 |-0,23035 . CXCL9 -0,88518 |0,561561 |-0,21758 IL2RG -0,84755 /0,369696 |-0,25893 - CXCLIO -1,38526 | 0,608373 |-0,17545 SLC26A2 -1,45138 /0,259368 )-0,06122 -1,78136 | 0,4903304 |-0,1445 CD$A -1,35019 | 0,38214 -0,26018 0,72426 |0,545598 |-0,21573 -1,7857 | 0,526042 |-0,25378 GPR171 -1,81382 /0,353983 |-0,1875 PSCDBP -1,19407 | 0,398912 -0,24969 CXCL2 -1,17377 10,679063 |-0,10145 ICOS -2,16745 | 0,40877 -0,24479 - -2,63145 [0,0999466 |-0,12889 TRAG;TRAJI7;TRDV2;TRAC;TRAV20 | -1,20289 | 0,392963 |-0,26276 TARP;TRGC2 -2,27109 |/0,528402 |-0,19113 ' -1,87391 | 0,405727 |-0,26852 CD3D -1,66653 | 0,409356 |-0,26013 HLA-DMA -0,81888 |0,400541 |-0,23598 * O perfil de expressão normalizado de escore Z (recursos do classificador) do o paciente a classificar é projetado no primeiro espaço principal do componente (PC) definido pelo conjunto de treino usando uma ] combinação linear dos recursos do classificador (os coeficientes para cada uma das 22 características na combinação linear foram obtidos por decomposição do valor singular do conjunto de treino e eles são providos em Tabela 10) * Um escore de risco para à nova amostra é calculado usando a equação: tg O Anal + Boi DPOC em que Bratamento= -0.193146993 e Bpctinteração= 0,163704817 foram obtidos do conjunto de treino O escore de risco da nova amostra é comparado ao escore de risco mediano do conjunto de treino = -0,25737421 e a amostra é classificada GS+ (Respondedor, Não Relapso,1) se o escore de risco for menor do que e este valor, - Figuras 19/21 e 20/21 mostram o resultado clínico baseado em 7 Q-PCR níveis de expressão para os 22 genes no classificador. . Código de predição de resultado HH Script for classification of test-samples fresh resected NSCLC TLDAmerge 22 genes HAHA based on Mage004.SPCA.Cox.classifier.contruction.

DFI.Squamous.R HHh needs M4jtrainparameters.22genes.TLDA?2.RData : 10 (training set parameters) library(genefilter) ft! load testset to classify (log-scaled normalized PCR data) load("testset.

RData") fit ExpressionSet containing samples to : classify ti Load training set parameters HHHHHHHHHHHARH load("MA4.train.parameters.22genes.

TLDA2 .RData") PS<-MA .train.parameters[[1]] MA.train.means<-MA .train.parameters[[2]] M4.train.sd<-M4 .train.parameters[[3]] MA4.train.

U<-MA.train.parameters|[4]] M4.train.Btreatment<-MA.train.parameters[[5]] MA .train.Binteraction<-MA .train.parameters[[6]] M4.train.medianHR<-MA.train.parameters[[7]] HRHAHHAAAAHHHARARARABAARARAAAARARAARH Use SPCA on test set- HHHAHHAHAHAANHANAAÁAADAR testset<-testset[PS,] test<-(exprs(testset)-MA.train.means)/M4.train.sd

- PCtest<-t(test) %*% MA .train.U . PCltest<-PCtest[,1] 7 HR=MA4.train.Btreatment+PC!1 test* M4.train.Binteraction ' classification=ifelse(HR<MA.train.medianHR, 1,0) 7 HARE ” Hittf(modify xx next line according to batch number) write.table(cbind(pData(testset),probR),file="testset batch xx —M4 TLDA?2 22genes classification.txt",sep="Wt") em que : : Testset.RData é uma matriz com 22 fileiras contendo os dados ' PCR em escala log normalizados para os 22 genes . MA4.train.parameter é um objeto da lista de classe contendo : uma lista de caracteres dos nomes de 22 genes um vetor de 22 valores médios para cada gene no conjunto de treino . 1. um vetor de 22 valores sd para cada gene no conjunto de treino i 2. uma matriz de 22 fileiras e 22 colunas contendo a matriz U de decomposição svd da matriz de treino

3. Briatamento EM computação de escore de risco

4. Bpctinteração EM computação de escore de risco

5. 0 escore de risco mediano em treino Exemplo 5 Desempenho de classificação de genes individuais medido por Q-PCR em —amostrasde melanoma Cada um dos 22 genes do exemplo 2 foi avaliado para desempenho da classificação univariada usando o algoritmo aplicado a classificação multivariada em amostras de melanoma usando valores de expressão de gene único em vez do primeiro componente principal.

. Após normalização dos valores de expressão usando os genes - de referência e realizando um escore z-, os níveis de expressão para cada gene individual foram usados para construir o classificador usando todas as ' amostras em conjunto de treino. O valor p de teste t para expressão diferencial — de cada gene no conjunto de treino e a mudança de vezes de Respondedores versus Não Respondedores foi calculado. A probabilidade de cada amostra no conjunto de treino ser respondedor foi obtida e o melhor corte foi determinado para cada gene por maximização da concordância com rótulo clínico os resultados são mostrados na próxima tabela: Tabela11 . Concordância | valor p de | Mudança Gene (%) teste t de vezes T2 0,003 ] 0,010 CXCL9 4,6 TLIRG 169 ————jooo6 CXCLIO 69 —JooM SLC26A2 0,030 . CD86 67 om 18 | 0,095 . 0,001

CZK GPRI71 PSCDBP-=É 65 0,005 CXCL2 0,003 1COS 0,008 TRAG;TRANIT7;TRDV2;TRAC;TRAV20 0,001 TARP;TRGC2 0,003

0.062 — [30 0,076 45 CD3D 169 joou HLA-DMA 0,012 Os resultados obtidos para os genes individuais são comparáveis á % de concordância de 69% obtida em classificação multivariada com todos os genes in exemplo 2. Exemplo 6 Desempenho de classificação de genes individuais medido por Q-PCR em

: amostras NSCLC - Cada um dos 23 genes from exemplo 3 foi avaliado para desempenho de classificação usando o algoritmo aplicado á classificação ' multivariada em amostras NSCLC (Cox-SPCA) usando valores de expressão ' 5 —degeneúnicoem vez do primeiro componente principal.

Após normalização dos valores de expressão usando os genes de referência e realizando um escore z, os níveis de expressão para cada gene individual foram usados para construir um classificador como descrito em exemplo 3. O escore de risco para cada amostra no conjunto de treino foi obtido e as amostras foram designadas GS+ ou GS- baseado em diferentes ' cortes. Desempenho de cada corte foi avaliado por cálculo do tratamento HR - associado com este corte em cada grupo GS+ e GS-. O melhor corte por gene foi determinado individualmente por maximização do coeficiente de interação da classificação, que está maximizando a diferença entre tratamento HR em GSt+teGS-. Tabela abaixo mostra tratamento HR em GS+ e GS- obtidos * usando este processo de otimização e os valores p- associados com os de HR. Tabela 12 Gene Gs:ur [OS PD Ggsem [05 pr valor valor 0,182 133 CCLS5 RD ox7 — [oo [09 0,088 CXCL9 1L2RG 0.056 [1162 Jo66 |

CXCLIO SLC26A2 0,680 CD86 LIS9 0,209 [0024 1204 [06 | PUB 0230 — foot [143 [037 0,086 0,0082 | 1364 — [0,37 GPRI71 PSCDBP 0,025 CXCL2 0,635 1COS 0,2 0,78 TRAG;TRAJIT;TRDV3;TRAC;TRAV20 | 0,288 0,026 [143 TARP;TRGC2 [o747 Josi [103 |1 |

ITK 0,152 0,039 ' CD3D 0,217 0,033 - HLA-DMA 1,094 ”. SLAMF7 0,354 0,029 — [1,222 : Exemplo 7 Desempenho de classificação de genes individuais medido por microarranjo em amostras de melanoma Cada um dos 100 PS do exemplo 1 foi avaliado para — desempenho de classificação univariada usando o algoritmo aplicado á classificação multivariada em amostras de melanoma usando valores de expressão de gene único em vez do primeiro componente principal.

Após normalização dos valores de expressão (germa) e realizando um escore z-, os níveis de expressão para cada PS individual foram ' 10 — usados para construir o classificador usando todas as amostras em conjunto de treino.

O valor p de teste t para expressão diferencial de cada PS no conjunto de treino e a mudança de vezes de Respondedores versus Não Respondedores foram calculados.

A probabilidade de cada amostra no conjunto de treino ser respondedor foi obtida e o melhor corte foi determinado para cada gene por - 15 maximização da concordância com o rótulo clínico e os resultados são mostrados na próxima tabela: Tabela 13 Concordância Conjunto de sonda (%) p-valor teste t | FC 225996 at 0,0002 205890 s at 0,0002 223575 at 0,0002 232481 s at 0,0011 213793 s at 0,0004 217436 x at 0,0004 228400 at 0,0025 204116 at 232375 at 0,0005 244393 x at 7O 0,0007 215806 x at 75 0,0004 0,0005 0:0010 208729 x at 0,0007 204806 x at 0,0006

Concordância : . e - [204533 at [68 [0008 [60 . | [Boss sa [68 [on Ra [mana [6 [ong Tog ' [37515ar 68 Jooma lo4 | - [O08885.ar [68 [0031 [28 3 | HovIsa A Merss amar |

HUMISGF3A/M97935 MB at | 71 0,0033

3,1 [Bosco [68 [om [oa ———| [os sat j66 o joos Di 204897 at [68 lo 24

Concordância | povelor teste + | - 22 ” .

B -

E 3,1 563473 at (66 foooso —|33 : - [2135339 Tg > jooos8s 43 | jaM061at "66 joos —[Dg | [2090770 at 68 —joom [18 | [38587 a UU 66 > lfooog = 19 0,004] [23902 at 68 ———[0,0069 [29s2a 68 fome 53 poxa sar = j66 foo6s 1 | Os resultados obtidos para o PS individual são comparáveis à % de concordância de 68% obtidos em classificação multivariada com todos os genes no exemplo 1.

REFERÊNCIAS Dave SS, Wright G, Tan B et al. Prediction of survival in

- follicular Iymphoma based on molecular features of tumor-infiltrating Sc immune cells. N.Engl.J.Med. 2004;351:2159-2169 Hu Z, Fan C, Oh DS et al. The molecular portraits of breast ] tumors are conserved across microarray platforms. BMC.Genomics 2006;7:96. " Weigelt B, Hu Z, He X et al. Molecular portraits and 70-gene prognosis signature are preserved throughout the metastatic process of breast cancer. Cancer Res. 2005;65:9155-9158.

Golub T, Slonim D, Tamayo P et al. Molecular classification —ofcancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring.

' Science 1999; 286: 531—536 - Bair E, Tibshirani R. Semi-supervised methods to predict patient survival from gene expression data. PLoS Biology 2004;2(4):511-522.

Tibshirani R, Hastie T, Narasimhan B et al. Diagnosis of —multiplecancer types by shrunken centroids of gene expression. PNAS 2002; - 99(10): 6567-6572 Harlin H, Meng Y, Peterson AC et al. Chemokine expression in melanoma metastases associated with CD8+ T-cell recruitment. Cancer Res. 2009;:69(7):3077-85. Epub 2009 Mar 17 Wu H, Mao F, Olman V, Xu Y Hierarchical classification of functionally equivalent genes in prokaryotes. Nucleic Acids Res. 2007;35(7):2125-40, Epub 2007 Mar 11.

Van 't Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ, He YD, Hart AA, Mao M, Peterse HL, van der Kooy K, Marton MJ, Witteveen AT, et al. (2002) Van 't Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ, He YD, Hart AA, Mao M, Peterse HL, van der Kooy K, Marton MJ, Witteveen AT, et al. (2002) Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature, 415(6871), 530-556.

Ginzinger DG. ,Gene quantification using real-time

. quantitative PCR: an emerging technology hits the mainstream Exp Hematol. Sc 2002 Jun;30(6):503-12. Review. Balch CM. Cutaneous melanoma: prognosis and treatment ] results worldwide. Semin Surg Oncol. 1992 Nov-Dec;8(6):400-14. | Weynants P, Lethé B, Brasseur F, Marchand M, Boon T. Expression of mage genes by non-small-cell lung carcinomas. Int J Cancer. 1994 Mar 15;56(6):826-9. Gaugler B, Van den Eynde B, van der Bruggen P, Romero P, Gaforio JJ, De Plaen E, Lethé B, Brasseur F, Boon T. Human gene MAGE-3 — codes for an antigen recognized on a melanoma by autologous cytolytic T , lymphocytes. J Exp Med. 1994 Mar 1;179(3):921-30.

* Patard JJ, Brasseur F, Gil-Diez S, Radvanyi F, Marchand M, François P, Abi-Aad A, Van Cangh P, Abbou CC, Chopin D, et al. Expression of MAGE genes in transitional-cell carcinomas of the urinary —bladder. IntJ Cancer. 1995 Feb 20;64(1):60-4.

- Moore A, McCarthy L, Mills KH. The adjuvant combination monophosphory] lipid A and QS21 switches T cell responses induced with a soluble recombinant HIV protein from Th2 to Th1. Vacine. 1999 Jun 4;17(20- 21):2517-27.

Gérard CM, Baudson N, Kraemer K, Bruck C, Garçon N, Paterson Y, Pan ZK, Pardoll D, Therapeutic potential of protein and adjuvant vaccination on tumour growth. Vacine. 2001 Mar 21;19(17-19):2583-9.

Maniatis et al, Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989. , Krieg AM, Davis HL. Enhancing vaccines with immune stimulatory CpG DNA. Curr Opin Mol Ther. 2001 Feb;3(1):15-24. Review. Ren J, Zheng L, Chen Q, Li H, Zhang L, Zhu H. Co- administration of a DNA vaccine encoding the prostate specific membrane antigen and CpG oligodeoxynucleotides suppresses tumour growth. J Transl

- Med. 2004 Sep 9;2(1):29. - Wu Z, Irizarry RA, Gentleman R, Martinez-Murillo F, Spencer F.

A model-based background adjustment for oligonucleotide expression ' arrays.

J Am Stat Ass. 2004; 99: 909-917 3 -

- Apêndice 1 — código permitido por GCRMA- RefPlus R modificado . require(affyPLM) CÚ pe <- read.table("VR63933P pe.txt") , pe <- unstack(pe) rq <- scan("VR63933P rq.txt") germaplus <- function (Future, gcrmapara, r.q9, p.e, bg = TRUE) t if (missing(r.q) & (missing(gcrmapara))) f stop("Missing Reference Quantiles") ' ) . if (missing(p.e) & (missing(gcrmapara))) ( stop("missing Probe Effects") ) if (!missing(gcrmapara)) ( - r.q = germapara[[1]] p.e = gcrmapara[[2]] cat("Use germapara.n") ) else cat("Use Reference.Quantiles and Probe.Effects.n")

J if(bg == TRUE) Future <- bg.adjust.gcrma(Future) PM = pm(Future) pm(Future) <- normalize.quantiles2(PM, r.q) rmm(PM) future <- germaref.predict(Future, p.e) return(future)

“ ) Sc germaref.predict <- function (Future, p.e) í Ú PMindex <- pmindex(Future) PM <- log2(pm(Future)) PM <- sweep(PM, 1, unlist(p.e)) pmí(Future) <- PM PMlist <- lapply(PMindex, function(x, y) intensity(y)[X, 1], Future) future <- tisapply(PMlist, colMedians)) ' colnames(future) <- sampleNames(Future) - return(future) ) normalize.quantiles2 <- function (X, Reference.Quantiles) í . apply(X, 2, function(x, y) y[rank(x)], Reference.Quantiles) ) colMedians <- function (mat) rowMedians(t(mat))

Claims (32)

1. : REIVINDICAÇÕES . 1. Método para caracterizar um paciente como respondedor ou CU não respondedor a uma terapia, caracterizado pelo fato de compreender as ' etapas de: (a) analisar uma amostra derivada do paciente para expressão diferencial de produtos de gene de um ou mais genes de Tabela 1, e (b) caracterizar o paciente do qual a amostra foi derivada como um respondedor ou não respondedor, com base nos resultados de etapa (a), em que a etapa de caracterização é realizada por referência ou comparação a um padrão ou um conjunto de treino ou usando um algoritmo ' cujos parâmetros formam obtidos de um padrão ou conjunto de treino. .
2. 2. Método para tratar um paciente caracterizado pelo fato de compreender as etapas de (a) obter uma análise de uma amostra derivada do paciente para expressão diferencial de produtos de gene de um ou mais genes de - Tabela 1, em que os resultados distinguem um paciente como um respondedor ou não respondedor a uma imunoterapêutica e em que a etapa de | caracterização é realizada por referência ou comparação a um padrão ou um conjunto de treino ou usando um algoritmo cujos parâmetros formam obtidos —deum padrão ou conjunto de treino; e (b) selecionando o paciente para pelo menos uma administração de uma imunoterapêutica apropriada se o paciente for caracterizado como um respondedor à imunoterapêutica.
3. 3. Método para determinar se um paciente é um respondedor ouum não respondedor a uma imunoterapêutica, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) obter uma amostra derivada do paciente; e (b) analisar a amostra derivada do paciente para expressão diferencial de produtos de gene de um ou mais genes de Tabela 1, em que os

   . resultados determinam se o paciente é caracterizado como um respondedor ou Sc não respondedor a uma imunoterapêutica e em que a etapa de caracterização é realizada por referência ou comparação a um padrão ou um conjunto de treino ' ou usando um algoritmo cujos parâmetros formam obtidos de um padrão ou conjunto detreino.
4. 4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o um ou mais genes de Tabela 1 são pelo menos 63 genes listados em Tabela 1 ou substancialmente todos os genes especificados em Tabelas 2, 5 ou 7.
5. 5. Método para caracterizar um paciente como um respondedor ' ou não respondedor à terapia, caracterizado pelo fato de compreender . analisar, em uma amostra derivada do paciente, um produto de gene reconhecido por um ou mais dos conjuntos de sonda listados em Tabela 1, cujas sequências alvo são mostradas em Tabela 3, em que a etapa de caracterização é realizada por referência ou ; comparação a um padrão ou um conjunto de treino ou usando um algoritmo : cujos parâmetros formam obtidos de um padrão ou conjunto de treino.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o um ou mais conjuntos de sonda de Tabela 1 são pelo menos 74 — dos conjuntos de sonda listados em Tabela 1 ou todos os conjuntos de sonda para genes em Tabelas 2, 5 ou 7.
7. 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações |, ou 3 a 6, caracterizado pelo fato de compreender a outra etapa de identificar um paciente como um respondedor, e selecionando o paciente para terapia.
8. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o padrão é uma amostra derivada do paciente ou amostras de um paciente ou pacientes, respectivamente, tendo um resultado clínico conhecido.
9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações | a
10. . 8, caracterizado pelo fato de que a terapia ou tratamento é imunoterapia de . câncer, preferivelmente imunoterapia de câncer para melanoma e/ou câncer " de pulmão. ' 10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado —pelofatodequeaimunoterapia de câncer é MAGE.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a imunoterapia MAGE é imunoterapia MAGE A3,
12. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o um ou mais genes de Tabela 1 são pelo menos 63, pelo menos 68, pelo menos 70, pelo menos 75, pelo menos 80 ou ' substancialmente todos os genes listados em Tabela 1 e/ou qualquer . combinação dos mesmos.
13. 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 11, caracterizado pelo fato de que o um ou mais conjuntos de sonda de Tabela l são pelo menos 74, pelo menos 75, pelo menos 80, pelo menos 85, - pelo menos 90 ou todos os conjuntos de sonda listados em Tabela 1 e/ou qualquer combinação dos mesmos.
14. 14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações | a 13, caracterizado pelo fato de que o um ou mais genes são regulados de — modo positivo em comparação com sua expressão normal.
15. 15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que pelo menos 80% dos genes são regulados de modo positivo em comparação com sua expressão normal,
16. 16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações | al5,caracterizado pelo fato de ainda compreender a etapa de determinação de se produtos de gene são regulados de modo positivo e/ou regulados de modo negativo.
17. 17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a determinação de que produtos de gene são regulados de

    . modo positivo e/ou regulados de modo negativo indica um respondedor. :
18. 18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que genes são genes relacionados imunes. ,
19. 19. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de compreender o uso “de “uma sonda para a identificação do um ou mais produtos de gene.
20. 20. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de compreender o uso de um kit de microarranjo ou PCR para analisar a expressão do gene.
21. 21. Uso de uma lista de gene de pelo menos 63 dos genes na ' Tabela 1 ou dados gerados a partir da mesma ou pelo menos 74 dos conjuntos - de sonda na Tabela 1 ou dados gerados a partir da mesma, caracterizado pelo fato de ser para realizar uma análise de se um paciente será provavelmente um respondedor ou não respondedor a uma terapia, como imunoterapia de câncer.
22. 22. Uso de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo - fato de que a lista de genes compreende ou consiste de substancialmente todos os genes ou conjuntos de sonda em Tabela 1.
23. 23. Microarranjo caracterizado pelo fato de compreender sondas de polinucleotídeos complementares e hbhibridizáveis para uma — sequência do produto de gene de pelo menos um gene selecionado entre os genes listados em Tabela 1, em que sondas de polinucleotídeos ou conjuntos de sonda complementares e hibridizáveis para os genes de Tabela 1 constituem pelo menos 50% das sondas ou conjuntos de sonda na referido microarranjo.
24. 24. Microarranjo caracterizado pelo fato de compreender sondas de polinucleotídeos complementares e hibridizáveis para uma sequência do produto de gene de pelo menos um gene selecionado entre os genes listados em Tabela 1.
25. 25. Microarranjo de acordo com a reivindicação 23 ou a
26. - reivindicação 24, caracterizado pelo fato de compreender sondas de i polinucleotídeos complementares e hibridizáveis para uma sequência do i produto de gene dos genes listados em Tabela 2. , 26. Kit de diagnóstico, caracterizado pelo fato de compreender 5 —meiosparamedira expressão, por exemplo, sondas hibridizando em produtos de genes MRNA ou cDNA, do um ou mais dos genes listados em Tabela 1 ou dos produtos de gene dos genes listados em Tabela 1 para realizar o método como definido nas reivindicações 1 a 20.
27. 27. Método para tratar um paciente distinguido como um —respondedor como definido no método de acordo com as reivindicações 1 a ' 20 ou uso do microarranjo como definido nas reivindicações 23 a 25 ou o kit - de diagnóstico de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de compreender administrar uma composição compreendendo um antígeno associado a tumor para o paciente.
28. 28. Composição, caracterizada pelo fato de compreender um - antígeno associado a tumor para o tratamento de pacientes determinados como tendo, ou distinguidos como, um respondedor de acordo com o método como definido nas reivindicações 1 a 20 ou uso do microarranjo como definida nas reivindicações 23 a 25 ou o kit de diagnóstico como definido na reivindicação 26.
29. 29. Uso de uma composição compreendendo um antígeno associado a tumor, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de pacientes determinados como tendo ou distinguidos como um respondedor de acordo com o método como definido nas reivindicações 1 a 20 ou uso do microarranjo como definida nas reivindicações 23 to 25 ou o kit de diagnóstico como definido na reivindicação 26.
30. 30. Método, composição ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizados pelo fato de que o antígeno
31. - associado a tumor é um antígeno MAGE. i 31. Método, composição ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, caracterizados pelo fato de que a composição ] ainda compreende um adjuvante.
32. 32. Superfície sólida à qual são ligados uma pluralidade de agentes de detecção de pelo menos 63 dos genes listados em Tabela 1, caracterizada pelo fato de que os agentes de detecção são capazes de detectar a expressão dos genes ou polipeptídeos codificados pelos genes.