MX2007006441A - Prognosis de cancer de pulmon. - Google Patents

Prognosis de cancer de pulmon.

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Abstract

Se lleva a cabo un metodo para proporcionar un pronostico de cancer de pulmon analizando la expresion de un grupo de genes; los perfiles de la expresion de genes en una variedad de medios, como las microdisposiciones, se incluyen como equipos que los contienen.

Description

PROGNOSIS DEL CÁNCER DE PULMÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a la prognosis del cáncer de pulmón basada en los perfiles de expresión génica de muestras biológicas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer de pulmón es la causa principal de muertes por cáncer en los países desarrollados, matando cada año a aproximadamente 1 millón de personas en todo el mundo. En el año 2003 se esperan en EE. UU. aproximadamente 171 ,900 casos nuevos, que representan aproximadamente 13% de todos los diagnósticos de cáncer. El cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC) representa la mayoría de los carcinomas broncogénicos (-75%), mientras que el resto es de carcinomas de pulmón de célula pequeña (SCLC). El NSCLC está comprendido de 3 subtipos principales: adenocarcinoma, 40%; escamoso, 40%; y cáncer de células grandes, 20%. El adenocarcinoma ha reemplazado al carcinoma de célula escamosa como el subtipo histológico más frecuente durante los últimos 25 años, con un máximo a principios de los años 1990. Esto puede estar asociado con el uso de cigarrillos "bajos en alquitrán", que resulta en una inhalación mas profunda del humo del cigarro: Wingo y otros (1999). La tasa de supervivencia general de 10 años de los pacientes con NSCLC es un deprimente 8-10%. Aproximadamente 25-30% de los pacientes con NSCLC tienen la enfermedad en la etapa I, y de estos 35-50% recaerán en el transcurso de 5 años después del tratamiento quirúrgico. Dependiendo de la etapa, el 5 adenocarcinoma tiene una tasa de recaída más alta que el carcinoma de célula escamosa; aproximadamente 65% y 55% de pacientes con SCC y adenocarcinoma respectivamente sobreviven a los 5 años: Mountain y otros (1987). Actualmente no es posible identificar a los pacientes con un alto riesgo de recaída. La capacidad de identificar a los pacientes con alto riesgo 10 entre el grupo de enfermos en la etapa I, permitirá considerar una intervención terapéutica adicional que dé la posibilidad de mejorar la supervivencia. En realidad, pruebas clínicas recientes han mostrado que la terapia adyuvante posterior a la resección de los tumores de pulmón puede mejorar la supervivencia: Kato y otros (2004). Específicamente, Kato y otros 15 demostraron que la quimioterapia adyuvante con uracilo-tegafur mejora la supervivencia entre los pacientes con adenocarcinoma en etapa patológica I completamente resecado, particularmente la enfermedad T2. Recientemente se han utilizado los perfiles de expresión génica en microarreglo para definir las signaturas pronosticas de los pacientes con 20 adenocarcinoma de pulmón (Beer y otros (2002)); sin embargo, no muchos estudios han investigado los perfiles de expresión génica de la prognosis en la población con carcinoma de célula escamosa. Aquí, los presentes autores han estudiado los perfiles de 134 muestras de SCC y 10 muestras de pulmón •'I liln i llf H8ltt«----r-mü---«- t;i * • *-*- i--»<-i- - •- - -- •* - -.r. i i.. -., i --i . . . li l, i-.. -A .. . . --?TT i l normal igualadas en el chip Affymetrix U133A. Por agrupación jerárquica y modelación de Cox se han identificado genes que se correlacionan con la prognosis del paciente. Estas signaturas se pueden usar para identificar a los pacientes que se pueden beneficiar de una terapia adyuvante después de la cirugía inicial.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un método para determinar el estado del cáncer de pulmón, obteniendo una muestra biológica de un paciente con cáncer de pulmón; y midiendo biomarcadores asociados con los genes marcadores que corresponden a los seleccionados del cuadro 1 , cuadro 4, cuadro 5 o cuadro 7, en donde el grado de expresión de los genes marcadores por arriba o por abajo de puntos de corte predeterminados es indicativo del estado del cáncer de pulmón. La presente invención provee un método de clasificación de pacientes de cáncer de pulmón, obteniendo una muestra biológica de un paciente con cáncer de pulmón; y midiendo biomarcadores asociados con los genes marcadores que corresponden a los seleccionados del cuadro 1 , cuadro 4, cuadro 5 o cuadro 7, en donde el grado de expresión de los genes marcadores por arriba o por abajo de puntos de corte predeterminados, es indicativo de la etapa del cáncer de pulmón. La presente invención provee un método para determinar el ?HÜ ?SÍII protocolo de tratamiento de un paciente de cáncer de pulmón, obteniendo una muestra biológica de un paciente con cáncer de pulmón; y midiendo biomarcadores asociados con los genes marcadores que corresponden a los seleccionados del cuadro 1 , cuadro 4, cuadro 5 o cuadro 7, en donde el grado 5 de expresión de los genes marcadores por arriba o por abajo de puntos de corte predeterminados, es suficientemente indicativo del riesgo de recurrencia para permitir a un médico determinar el grado y tipo de terapia recomendada para prevenir la recurrencia. La presente invención provee un método de tratamiento de un 10 paciente de cáncer de pulmón, obteniendo una muestra biológica de un paciente con cáncer de pulmón; y midiendo biomarcadores asociados con los genes marcadores que corresponden a los seleccionados del cuadro 1 , cuadro 4, cuadro 5 o cuadro 7, en donde el grado de expresión de los genes marcadores por arriba o por abajo de puntos de corte predeterminados, es 15 indicativo de un riesgo de recurrencia alto; y tratando al paciente con terapia adyuvante si es un paciente de alto riesgo. La presente invención provee un método para determinar si un paciente de cáncer de pulmón está en riesgo alto o bajo de mortalidad, obteniendo una muestra biológica de un paciente con cáncer de pulmón; y 20 midiendo biomarcadores asociados con los genes marcadores que corresponden a los seleccionados del cuadro 4, en donde el grado de expresión de los genes marcadores por arriba o por abajo de puntos de corte predeterminados, es suficientemente indicativo del riesgo de mortalidad para permitir a un médico determinar el grado y tipo de terapia recomendada. La presente invención provee un método para generar un informe del pronóstico de un paciente de cáncer de pulmón, determinando los resultados de cualquiera de los métodos aquí descritos, y preparando un 5 informe que presenta los resultados, e informes de pacientes generados con el mismo. La presente invención provee una composición que comprende por lo menos un grupo de sondas seleccionadas del grupo que consiste en: los genes marcadores que corresponden a los seleccionados del cuadro 1 , 10 cuadro 4, cuadro 5 o cuadro 7. La presente invención provee un equipo para hacer una prueba para determinar la prognosis del cáncer de pulmón en una muestra biológica, que comprende: materiales para detectar secuencias aisladas de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de las mismas, de una combinación 15 de genes seleccionados del grupo que consiste en los genes marcadores que corresponden a los seleccionados del cuadro 1 , cuadro 4, cuadro 5 o cuadro 7. La presente invención provee artículos para determinar el estado del cáncer de pulmón, que comprende: materiales para detectar secuencias 20 aisladas de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de las mismas, de una combinación de genes seleccionados del grupo que consiste en los genes marcadores que corresponden a los seleccionados del cuadro 1 , cuadro 4, cuadro 5 o cuadro 7. t- | ||t ( > i ", rtv*-.m-..**:v..?m*: .. i .. .. ? .M i - -. ..i !, . i . . i ,. t l . , L A -1 i - i . . -.1 í i La presente invención provee un microarreglo o chip de gen para realizar el método aquí descrito. La presente invención provee un portafolio diagnóstico/pronóstico que comprende secuencias aisladas de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de las mismas, de una combinación de genes seleccionados del grupo que consiste en los genes marcadores que corresponden a los seleccionados del cuadro 1 , cuadro 4, cuadro 5 o cuadro 7.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A y 1 B representan la agrupación jerárquica de 129 pacientes con SCC de pulmón. Las figuras 2A y 2B representan gráficas de AUC contra el número de genes. La figura 3 representa tasas de error de LOOCV contra varios puntos de corte en el grupo de entrenamiento de 65 muestras. Las figuras 4A y 4B representan gráficas de Kaplan Meier de la signatura de 50 genes en el grupo de prueba. Las figuras 5A y 5B representan que la agrupación no supervisada identifica la ruta de diferenciación epidérmica como regulada negativamente en pacientes de alto riesgo. La figura 5A muestra que la agrupación de pacientes basada en los 121 superiores mostró dos agrupaciones de pacientes. La mayoría de los genes de la agrupación 1 fueron regulados negativamente (verde). La figura 5B es una curva de Kaplan Meier de grupos de pacientes agrupados definidos por los 20 genes relacionados con la epidermis. Las figuras 6A-6D representan la verificación de los datos de expresión génica usando RT-PCR de tiempo real. Se seleccionaron 4 genes (NTRK2, FGFR2, VEGF, KRTI3) para RT-PCR. La expresión se correlaciona muy bien con los datos del chip Affymetrix (R=0.71-0.96).
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN El cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC) representa la mayoría de los carcinomas de pulmón (-75%) y está comprendido de 3 subtipos principales: escamoso, 40%; adenocarcinoma, 40%; y cáncer de célula grande, 20%. Aproximadamente 25-30% de los pacientes con NSCLC tienen la enfermedad en la etapa I, y de estos 35-30% recaerán en el transcurso de 5 años después de tratamiento quirúrgico. La histopatología y los biomarcadores genéticos actuales son insuficientes para identificar a los pacientes que están en un alto riesgo de recaída. Como se describe en la presente invención, se determinó el perfil de 129 carcinomas primarios de pulmón de célula escamosa y 10 tejidos de pulmón normal igualados usando el chip de gen Affymetrix U133A. La agrupación jerárquica no supervisada identificó 2 agrupaciones de pacientes con carcinoma de pulmón que no tenían correlación con la etapa de la enfermedad, pero que tenían una supervivencia general mediana significativamente diferente (p=0.036). Se utilizaron entonces modelos de riesgo proporcional de Cox para identificar un grupo óptimo de 50 genes (cuadro 1 ) en un grupo de entrenamiento de 65 5 pacientes, de los que se predijo significativamente la supervivencia en un grupo de prueba de 64 pacientes. Esta signatura alcanzó 52% de especificidad y 82% de sensibilidad y dio un valor predictivo general de 71 %.
El análisis de Kaplan-Meier mostró una clara y significativa estratificación de los pacientes de alto y de bajo riesgo (p=0.0075). La identificación de 10 signaturas pronosticas permite la identificación de los pacientes de carcinoma de pulmón de célula escamosa con alto riesgo, que se verían beneficiados de una terapia adyuvante posterior a la cirugía inicial.
CUADRO 1 15 SEQ Posición SEQ Posición SEQ Posición SEQ Posición ID ID ID ID NO: NO: NO: NO: 228 1 18 14 4 27 279 40 284 2 79 15 310 28 280 41 76 3 230 16 42 29 267 42 124 4 416 17 10 30 189 43 281 5 409 18 80 31 103 44 86 6 78 19 12 32 194 45 20 303 7 420 20 440 33 268 46 311 8 58 21 75 34 252 47 443 9 53 22 60 35 461 48 287 10 254 23 63 36 372 49 13 11 91 24 283 37 414 50 378 12 270 25 29 38 362 13 446 26 221 39 Un biomarcador es cualquier indicio del grado de expresión de un gen marcador indicado. Los indicios pueden ser directos o indirectos y pueden medir la sobreexpresión o subexpresión del gen, dados los parámetros fisiológicos y en comparación con un control interno, tejido normal u otro carcinoma. Los biomarcadores incluyen, sin limitación, ácidos nucleicos (tanto sobreexpresión como subexpresión, y directos e indirectos). El uso de ácidos nucleicos como biomarcadores puede incluir cualquier método conocido en la técnica, que incluye, sin limitación, medir la amplificación de ADN, ARN, micro ARN, pérdida de heterocigocidad (LOH), polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs, Brookes (1999), ADN microsatélite, hipometilación o hipermetilación de ADN. El uso de proteínas como biomarcadores puede incluir cualquier método conocido en la técnica, que incluye, sin limitación, medir la cantidad, actividad, modificaciones tales como glicosilación, fosforilación, ADP-ribosilación, ubiquitinación, etc, inmunohistoquímica (IHC). Otros biomarcadores incluyen imagografía, cuenta celular y marcadores de apoptosis. Los genes indicados aquí provistos son aquellos asociados con un tipo de tumor o tejido particular. Un gen marcador se puede asociar con muchos tipos de cáncer, pero siempre y cuando la expresión del gen esté suficientemente asociada con un tipo de tumor o tejido, identificado como específico para una célula de cáncer de pulmón usando el algoritmo aquí descrito; el gen se puede usar en la invención reclamada para determinar el estado y la prognosis del cáncer. Se conocen en la técnica muchos genes asociados con uno o más canceres. La presente invención provee genes marcadores preferidos e incluso combinaciones de genes marcadores más preferidas. Estos se describen aquí en detalle. Un gen marcador corresponde a la secuencia designada por una 5 SEQ ID NO cuando contiene esa secuencia. Un segmento o fragmento de gen corresponde a la secuencia de dicho gen cuando contiene una porción de la secuencia referida, o su complemento, suficiente para distinguirlo como la secuencia del gen. Un producto de expresión de gen corresponde a dicha secuencia cuando su ARN, ARNm, o ADNc se hibrida con la composición que 10 tiene dicha secuencia (por ejemplo una sonda), o en el caso de un péptido o proteína, es codificada por tal ARNm. Un segmento o fragmento de un producto de expresión de gen corresponde a la secuencia de dicho gen o producto de expresión de gen cuando contiene una porción del producto de expresión del gen referido o su complemento, suficiente para distinguirlo como 15 la secuencia del gen o el producto de expresión del gen. Los métodos, composiciones, artículos y equipos de la invención descritos y reclamados en esta especificación incluyen uno o más genes marcadores. "Marcador" o "gen marcador" se usa en toda esta especificación para referirse a genes y productos de expresión de genes que corresponden a 20 cualquier gen, cuya sobreexpresión o subexpresión está asociada con un tipo de tumor o tejido. Los genes marcadores preferidos se describen en mayor detalle en el cuadro 8. La presente invención provee un método para determinar el estado de cáncer del pulmón, obteniendo una muestra biológica de un paciente con cáncer de pulmón; y midiendo los biomarcadores asociados con los genes marcadores, que corresponden a los seleccionados del cuadro 1 , cuadro 4, cuadro 5 o cuadro 7, en donde el grado de expresión de los genes marcadores por arriba o por abajo de puntos de corte predeterminados, es indicativo del estado del cáncer de pulmón. La presente invención provee un método de clasificación de pacientes de cáncer de pulmón, obteniendo una muestra biológica de un paciente con cáncer de pulmón; y midiendo los biomarcadores asociados con los genes marcadores, que corresponden a los seleccionados del cuadro 1 , cuadro 4, cuadro 5 o cuadro 7, en donde el grado de expresión de los genes marcadores por arriba o por abajo de puntos de corte predeterminados, es indicativo de la etapa del cáncer de pulmón. La etapa puede corresponder a cualquier sistema de clasificación, que incluye, sin limitación, el sistema TNM o pacientes con perfiles de expresión génica similares. La presente invención provee un método para determinar el protocolo de tratamiento de un paciente de cáncer de pulmón, obteniendo una muestra biológica del paciente con cáncer de pulmón; y midiendo los biomarcadores asociados con los genes marcadores, que corresponden a los seleccionados del cuadro 1 , cuadro 4, cuadro 5 o cuadro 7, en donde el grado de expresión de los genes marcadores por arriba o por abajo de puntos de corte predeterminados, es suficientemente indicativo del riesgo de recurrencia para permitir a un médico determinar el grado y tipo de terapia recomendada para prevenir la recurrencia. La presente invención provee un método de tratamiento de un paciente de cáncer de pulmón, obteniendo una muestra biológica de un paciente con cáncer de pulmón; y midiendo los biomarcadores asociados con los genes marcadores, que corresponden a los seleccionados del cuadro 1 , cuadro 4, cuadro 5 o cuadro 7, en donde el grado de expresión de los genes marcadores por arriba o por abajo de puntos de corte predeterminados, es indicativo de un alto riesgo de recurrencia; y tratando al paciente con terapia adyuvante si es un paciente de alto riesgo. La presente invención provee un método para determinar si un paciente de cáncer de pulmón está en riesgo de mortalidad alto o bajo, obteniendo una muestra biológica de un paciente con cáncer de pulmón; y midiendo los biomarcadores asociados con los genes marcadores, que corresponden a los seleccionados del cuadro 4, en donde el grado de expresión de los genes marcadores por arriba o por abajo de puntos de corte predeterminados, es suficientemente indicativo del riesgo de mortalidad, para permitir a un médico determinar el grado y tipo de terapia recomendada. En los métodos anteriores, la muestra se puede preparar mediante cualquier método conocido, que incluye, sin limitación, preparación de tejido en masa y microdisección de captura con láser. La preparación de tejido en masa se puede obtener, por ejemplo, de una biopsia o un espécimen quirúrgico. En los métodos anteriores, la medición de la expresión génica también puede incluir medir el grado de expresión de por lo menos un gen expresado constitutivamente en la muestra. En los métodos anteriores, la especificidad es de preferencia de por lo menos aproximadamente 40% y la sensibilidad es de por lo menos 5 aproximadamente 80%. En los métodos anteriores, los puntos de corte predeterminados son de por lo menos aproximadamente 1.5 veces de sobreexpresión o subexpresión en la muestra con respecto a las células benignas o tejido normal. 10 En los métodos anteriores, los puntos de corte predeterminados tienen un valor p de sobreexpresión por lo menos estadísticamente significativo en la muestra que tiene las células metastáticas, con respecto a las células benignas o el tejido normal, preferiblemente el valor p es menor de 0.05. 15 En los métodos anteriores, la expresión génica se puede medir mediante cualquier método conocido, que incluye, sin limitación, en un microarreglo o chip de gen, la amplificación de ácido nucleico realizada por reacción en cadena de polimerasa (PCR), tal como reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR), midiendo o detectando una 20 proteína codificada por el gen, por ejemplo mediante un anticuerpo específico para la proteína, o midiendo una característica del gen, tal como amplificación, metilación, mutación y variación alélica del ADN. El microarreglo puede ser por ejemplo un arreglo de ADNc o un arreglo de oligonucleótido. Todos estos métodos pueden contener adicionalmente uno o más reactivos de control interno. La presente invención provee un método para generar un informe del pronóstico de cáncer de pulmón de un paciente, determinando los resultados de cualquiera de los métodos aquí descritos y preparando un informe que presenta los resultados e informes de paciente generados con los mismos. El informe puede contener adicionalmente una determinación del resultado del paciente y/o la probabilidad de riesgo con respecto a la población de pacientes. La presente invención provee una composición que comprende por lo menos un grupo de sondas seleccionada del grupo que consiste en: los genes marcadores seleccionados del cuadro 1 , cuadro 4, cuadro 5 o cuadro 7. La presente invención provee un equipo para hacer una prueba para determinar la prognosis de cáncer de pulmón en una muestra biológica, que comprende: materiales para detectar secuencias aisladas de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de las mismas, de una combinación de genes seleccionada del grupo que consiste en los genes marcadores que corresponden a los del cuadro 1 , cuadro 4, cuadro 5 o cuadro 7. El equipo puede comprender adicionalmente reactivos para realizar un análisis de microarreglo, y/o un medio a través del cual se analizan dichas secuencias de ácido nucleico, sus complementos o porciones. La presente invención provee artículos para determinar el estado del cáncer de pulmón, que comprenden: materiales para detectar secuencias aisladas de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de las mismas, de una combinación de genes seleccionada del grupo que consiste en los genes marcadores que corresponden a los del cuadro 1 , cuadro 4, cuadro 5 o cuadro 7. Los artículos pueden contener adicionalmente reactivos para realizar un 5 análisis de microarreglo, y/o un medio a través del cual se analizan dichas secuencias de ácido nucleico, sus complementos o porciones. La presente invención provee un microarreglo o chip de gen para realizar el método que se reclama en la reivindicación 1 , 2, 5, 6 ó 7. El microarreglo puede contener secuencias aisladas de ácido nucleico, sus 10 complementos, o porciones de las mismas, de una combinación de genes seleccionada del grupo que consiste en los genes marcadores seleccionados del cuadro 1 , cuadro 4, cuadro 5 o cuadro 7. Preferiblemente, el microarreglo es capaz de medir o caracterizar por lo menos 1.5 veces la sobreexpresión o subexpresión. Preferiblemente, el microarreglo provee un valor p de 15 sobreexpresión o subexpresión estadísticamente significativo. Preferiblemente, el valor p es menor de 0.05. El microarreglo puede contener un arreglo de ADNc o un arreglo de oligonucleótido, y/o uno o más reactivos de control interno. La presente invención provee un portafolio 20 diagnóstico/pronóstico que comprende secuencias aisladas de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de las mismas, de una combinación de genes seleccionada del grupo que consiste en los genes marcadores que corresponden a los del cuadro 1 , cuadro 4, cuadro 5 o cuadro 7. k U-u if IfflFT I^TPT^W i--.iá.»i-U -t -4 J.ii J i .ÍÍ J ?.l.. I ÍÚ Jt.IL.-L.j-i **í i ? Preferiblemente, el portafolio es capaz de medir o caracterizar por lo menos 1.5 veces la sobreexpresión o subexpresión; preferiblemente, el portafolio provee un valor p de sobreexpresión o subexpresíón estadísticamente significativo. Preferiblemente, el valor p es menor de 0.05. Se ha encontrado que muy raramente la sola presencia o ausencia de secuencias particulares de ácido nucleico en una muestra de tejido, tiene un valor diagnóstico o pronóstico. Por otra parte, cada vez se está considerando más importante la información acerca de la expresión de varias proteínas, péptidos o ARNm. La sola presencia de secuencias de ácido nucleico que tienen el potencial de expresar proteínas, péptidos o ARNm (tales secuencias referidas como "genes") dentro del genoma, no determina si una proteína, péptido o ARNm es expresado en una célula dada. Si un gen dado es capaz o no de expresar proteínas, péptidos o ARN, y la extensión en que ocurre dicha expresión, si ésta ocurriera, es determinada por una variedad de factores complejos. Sin importar las dificultades para comprender y determinar estos factores, el análisis de la expresión génica puede proveer información útil acerca de la ocurrencia de eventos importantes tales como génesis de tumor, metástasis, apoptosis y otros fenómenos clínicamente relevantes. Las indicaciones relativas del grado en el que los genes son activos o inactivos se pueden encontrar en los perfiles de expresión génica. Los perfiles de expresión génica de esta invención se usan para proveer diagnosis, estado, prognosis y protocolo de tratamiento para los pacientes con cáncer de pulmón.
La preparación de la muestra requiere la recolección de muestras del paciente. Las muestras del paciente utilizadas en el método de la invención son las que se sospecha que contienen las células enfermas, tales como las células tomadas de un nodulo en un aspirado de aguja fina (FNA) de tejido. También es adecuado el uso de preparaciones de tejido en masa obtenido de una biopsia o un espécimen quirúrgico, y la microdisección de captura de láser (LCM). La tecnología LCM es una manera de seleccionar las células por estudiar, minimizando la variabilidad causada por la heterogeneidad del tipo de célula. Consecuentemente se pueden detectar fácilmente los cambios moderados o pequeños en la expresión del gen marcador entre las células normales o benignas y las cancerosas. Las muestras también pueden comprender células epiteliales circulantes extraídas de la sangre periférica. Estas se pueden obtener de acuerdo con varios métodos, pero el método preferido es la técnica de separación magnética que se describe en la patente de EE. UU. No. 6,136,182. Una vez que se ha obtenido la muestra que contiene las células de interés, se obtiene el perfil de expresión génica de los genes del portafolio apropiado usando un biomarcador. Los métodos preferidos para establecer los perfiles de expresión génica incluyen la determinación de la cantidad de ARN que es producida por un gen que puede codificar una proteína o péptido. Esto se hace mediante PCR de transcriptasa inversa PCR (RT-PCR), RT-PCR competitiva, RT-PCR de tiempo real, RT-PCR de visualización diferencial, análisis de Northern Blot y otras pruebas relacionadas. Aunque es posible realizar estas técnicas utilizando reacciones de PCR individuales, es mejor amplificar el ADN complementario (ADNc) o el ARN complementario (ARNc) producido del ARNm, y analizarlo por medio del microarreglo. El experto en la materia 5 conoce varias configuraciones de arreglo diferentes y sus métodos de producción, y se describen en patentes de EE. UU. tales como las Nos. 5,445,934, 5,532,128; 5,556,752; 5,242,974; 5,384,261 ; 5,405,783; 5,412,087; 5,424,186; 5,429,807; 5,436,327; 5,472,672; 5,527,681 ; 5,529,756; 5,545,531 ; 5,554,501 ; 5,561 ,071 ; 5,571 ,639; 5,593,839; 5,599,695; 5,624,711 ; 5,658,734, 10 y 5,700,637. La tecnología de microarreglo permite la medición de la concentración del ARNm de estado estable de miles de genes simultáneamente, presentando con ello una herramienta poderosa para identificar efectos tales como la aparición, detención, o modulación de la 15 proliferación celular no controlada. Actualmente tienen amplio uso dos tecnologías de microarreglo. La primera consiste en arreglos de ADNc, y la segunda en arreglos de oligonucleótido. Aunque existen diferencias en la construcción de estos chips, esencialmente todo el análisis y el resultado de los datos finales son los mismos. El producto de estos análisis normalmente 20 consiste en mediciones de la intensidad de la señal recibida de una sonda marcada, usada para detectar una secuencia de ADNc de la muestra, que se hibrida con una secuencia de ácido nucleico en un sitio conocido en el microarreglo. Normalmente la intensidad de la señal es proporcional a la T Tüi?irai----^ r~. rr---r?t_rn ; p GT cantidad de ADNc, y por lo tanto ARNm, expresado en las células de la muestra. Un gran número de estas técnicas está disponible y son de utilidad. Los métodos preferidos para determinar la expresión géníca se pueden encontrar en las patentes de EE. UU. Nos. 6,271 ,002; 6,218,122; 6,218,114 y 5 6,004,755. El análisis del grado de expresión se realiza comparando estas intensidades de señal. Esto se hace mejor generando una matriz de relación de las intensidades de expresión de los genes en una muestra de prueba, contra las de una muestra de control. Por ejemplo, las intensidades de 10 expresión génica de un tejido enfermo se pueden comparar con las intensidades de expresión generadas del tejido benigno o normal del mismo tipo. Una relación de estas intensidades de expresión indica las veces de cambio de expresión génica entre las muestras de prueba y de control. Los perfiles de expresión génica también se pueden presentar de 15 varias maneras. El método más común es disponer intensidades de fluorescencia en bruto o matriz de relación en un dendograma gráfico en donde las columnas indican las muestras de prueba y las filas indican los genes. Los datos se disponen de tal manera que los genes que tienen perfiles de expresión similares quedan cercanos entre sí. La relación de expresión de 20 cada gen es visualizada como un color. Por ejemplo, una relación menor de 1 (que indica regulación negativa) puede aparecer en la porción azul del espectro, mientras que una relación mayor de 1 (que indica regulación positiva) puede aparecer como un color en la porción roja del espectro. Se tienen disponibles comercialmente programas de software para computadora para presentar dichos datos, que incluyen el software "GENESPRING" de Silicon Genetics, Inc., y "DISCOVERY" e "INFER" de Partek, Inc. Para medir concentraciones de proteína para determinar la expresión génica, cualquier método conocido es adecuado siempre que dé como resultado una especificidad y sensibilidad adecuadas. Por ejemplo, las concentraciones de proteína se pueden medir uniendo la proteína a un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo específico para la proteína, y midiendo la cantidad de proteína unida al anticuerpo. Los anticuerpos se pueden marcar mediante reactivos radiactivos, fluorescentes u otros reactivos detectables para facilitar la detección. Los métodos de detección incluyen, sin limitación, la prueba de inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA) y técnicas de inmunoblot. Los marcadores modulados usados en los métodos de la invención se describen en los ejemplos. Los genes que se expresan diferencialmente son regulados positivamente o negativamente en los pacientes con diversos pronósticos de cáncer de pulmón. La regulación positiva y la regulación negativa son términos relativos que significan que se encuentra una diferencia detectable (mas allá de la contribución del ruido del sistema usado para medirlo) en la cantidad de expresión de los genes con respecto a cierta línea basal. En este caso, la línea basal se determina basándose en el algoritmo. Los genes de interés en las células enfermas están regulados positivamente o negativamente con respecto a la línea basal usando el mismo método de medición. Enfermo, en este contexto, se refiere a una alteración del estado de un cuerpo que interrumpe o perturba, o que tiene el potencial de perturbar, la acción apropiada de las funciones corporales, como ocurre con la proliferación sin control de las células. Se diagnostica a alguien una enfermedad cuando algún aspecto del genotipo o fenotipo de esa persona es consistente con la presencia de la enfermedad. Sin embargo, el acto de realizar una diagnosis o prognosis puede incluir la determinación de cuestiones de la enfermedad/estado, tales como determinar la probabilidad de recaída, el tipo de terapia y el monitoreo de la terapia. En el monitoreo de la terapia se hacen juicios clínicos con respecto al efecto de un curso de terapia dado, comparando la expresión de los genes en el tiempo para determinar si los perfiles de expresión génica han cambiado o están cambiando a patrones más consistentes con el tejido normal. Los genes se pueden agrupar de tal manera que la información obtenida acerca de una serie de genes del grupo provee una base sólida para hacer un juicio clínicamente relevante, tal como una diagnosis, prognosis o elección de tratamiento. Estas series de genes forman el portafolio de la invención. Como con la mayoría de los marcadores diagnósticos, frecuentemente es deseable utilizar el menor número de marcadores, suficientes para hacer un juicio médico correcto. Esto impide un retraso en el tratamiento que está en espera de análisis ulterior, así como también el uso improductivo de tiempo y recursos.
Un método para establecer el portafolio de expresión génica es mediante el uso de algoritmos de optimización, tales como el algoritmo de varianza media usado ampliamente para establecer portafolios de reserva. Este método se describe en detalle en la publicación de patente de EE. UU. No. 20030194734. Esencialmente, el método consiste en el establecimiento de una serie de entradas (reservas en aplicaciones financieras, aquí expresión medida por la intensidad), que optimizarán el retorno (por ejemplo la señal que es generada) que se recibe para usarlo, minimizando la variabilidad del retorno. Están disponibles muchos programas comerciales de software para realizar dichas operaciones. Se prefiere "Wagner Associates Mean-Variance Optimization Application", referida en toda la especificación como "software Wagner". Este software utiliza funciones de la "Wagner Associates Mean-Variance Optimization Library" para determinar una frontera eficiente y una opción es el portafolio óptimo en el sentido de Markowitz. El uso de este tipo de software requiere que los datos del microarreglo sean transformados de tal manera que se puedan tratar como una entrada en la vía de retorno de reserva, y se usan mediciones de riesgo cuando el software se usa con fines de análisis financiero. El proceso de selección de un portafolio también puede incluir la aplicación de reglas heurísticas. Preferiblemente, dichas reglas se formulan basándose en la biología y en la comprensión de la tecnología usada para producir resultados clínicos. Muy preferiblemente se aplican a la salida del método de optimización. Por ejemplo, el método de varianza media de selección de portafolio se puede aplicar a los datos del microarreglo para varios genes expresados diferencialmente en sujetos con cáncer. La salida del método sería una serie optimizada de genes que podría incluir algunos genes que son expresados en la sangre periférica, así como también en tejido enfermo. Si las muestras usadas en el método de prueba se obtienen de la sangre periférica, y si algunos genes expresados diferencialmente en casos de cáncer también pueden ser expresados diferencialmente en la sangre periférica, entonces se puede aplicar una regla heurística en la cual se selecciona un portafolio de una frontera eficiente, excluyendo aquellos que son expresados diferencialmente en la sangre periférica. Desde luego, la regla se puede aplicar antes de la formación de la frontera eficiente, por ejemplo, aplicando la regla durante la preselección de datos. Se pueden aplicar otras reglas heurísticas que no necesariamente están relacionas con la biología en cuestión. Por ejemplo, se puede aplicar una regla en que solamente un porcentaje prestablecido del portafolio puede ser representado por un gen o grupo de genes particulares. El software disponible comercialmente, tal como el software Wagner, acomoda fácilmente estos tipos de heurística. Esto puede ser de utilidad por ejemplo cuando factores diferentes de la exactitud y la precisión (por ejemplo cargos de derechos anticipados), tienen un impacto sobre la conveniencia de incluir uno o más genes. Los perfiles de expresión génica de esta invención también se pueden usar en conjunto con otros métodos diagnósticos no genéticos, útiles en la diagnosis, prognosis o monitoreo del tratamiento del cáncer. Por ejemplo, en algunas circunstancias es bueno combinar la potencia diagnóstica de los métodos basados en la expresión génica anteriormente descritos con datos de marcadores convencionales, tales como los marcadores de proteína 5 de suero (por ejemplo, el antígeno de cáncer 27.29 ("CA 27.29")). Existe una gama de dichos marcadores que incluyen analitos tales como CA 27.29. En uno de tales métodos, se extrae periódicamente sangre de un paciente tratado y después se somete a un inmunoensayo con enzima para uno de los marcadores de suero anteriormente descritos. Cuando la concentración del 10 marcador sugiere el retorno de tumores o el fracaso de la terapia, se toma una fuente de muestra susceptible de análisis de expresión génica. Cuando existe una masa sospechosa, se toma un aspirado de aguja fina (FNA) y se toman los perfiles de expresión génica de la masa y después se analizan como se describe arriba. Alternativamente, se pueden tomar muestras de tejido de 15 áreas adyacentes al tejido del cual se removió previamente un tumor. Este enfoque puede ser particularmente útil cuando otros análisis producen resultados ambiguos. Los equipos hechos de acuerdo con la invención incluyen pruebas formateadas para determinar los perfiles de expresión géníca. Estos 20 pueden incluir todos o algunos de los materiales necesarios para realizar las pruebas, tales como reactivos e instructivos, y un medio a través del cual se analizan los biomarcadores. Los artículos de esta invención incluyen representaciones de los l • l ;!'!,t»*'».-----is-?--Hfl ¥. I i --1----1 ---- -- i ?? i i i! Í i : p-TT" perfiles de expresión génica útiles para tratamiento, diagnosis, prognosis y determinación de otra manera de las enfermedades. Estas representaciones del perfil se reducen a un medio que puede ser leído automáticamente por una máquina, tal como medios legibles en computadora (magnéticos, ópticos, y similares). Los artículos también pueden incluir instrucciones para determinar los perfiles de expresión génica en dichos medios. Por ejemplo, los artículos pueden comprender un CD ROM que tiene instrucciones de computadora para comparar perfiles de expresión génica del portafolio de genes anteriormente descrito. Los artículos también pueden tener perfiles de expresión génica registrados digitalmente, de tal manera que se puedan comparar con los datos de expresión génica de los pacientes. Alternativamente los perfiles se pueden registrar en diferente formato de representación. Un registro gráfico es uno de tales formatos. Los algoritmos de agrupación, tales como los que se incorporan en el software "DISCOVERY" e "INFER", de Partek, Inc., anteriormente mencionados, pueden ayudar a visualizar mejor dichos datos. Diferentes tipos de artículos de fabricación de acuerdo con la invención son medios o pruebas formateadas usadas para revelar perfiles de expresión génica. Estos pueden comprender, por ejemplo, microarreglos en los cuales complementos de secuencia o sondas se fijan a una matriz con la que se combinan las secuencias indicativas de los genes de interés, creando un determinante legible de su presencia. Alternativamente, los artículos de acuerdo con la invención se pueden crear en equipos reactivos para realizar hibridación, amplificación y generación de señal indicativa del grado de expresión de los genes de interés para detectar el cáncer. La invención se ilustra adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos no limitativos. Todas las referencias aquí citadas se incorporan en la presente.
EJEMPLOS Los genes analizados de acuerdo con esta invención normalmente se relacionan con secuencias de ácido nucleico de longitud completa que codifican la producción de una proteína o péptido. El experto en la materia reconocerá que la identificación de secuencias de longitud completa no es necesaria desde un punto de vista analítico. Esto es, de acuerdo con los principios bien conocidos se pueden seleccionar porciones de las secuencias o ESTs para las cuales se pueden diseñar sondas para determinar la expresión génica del gen correspondiente.
EJEMPLO 1 Métodos Población de pacientes En este estudio se evaluaron 134 muestras recién congeladas de SCC de pulmón resecado quirúrgicamente, y 10 muestras de pulmón normal igualadas de 133 pacientes individuales (LS-71 y LS-136 fueron muestras duplicadas de diferentes áreas del mismo tumor), de todas las etapas de carcinoma de pulmón de célula escamosa. Estas muestras se recolectaron de pacientes del Hospital de la Universidad de Michigan (EE. UU.) entre octubre de 1991 y julio de 2002, con el consentimiento del paciente y la aprobación del Comité de Revisión Institucional (IRB). Porciones de los carcinomas de pulmón resecados fueron seccionadas y evaluadas por el patólogo de estudio mediante tinción rutinaria de hematoxilina y eosina (H&E). Las muestras elegidas para el análisis contenían más de 70% de células de tumor. Aproximadamente una tercera parte de los pacientes (con proporciones iguales para cada etapa) recibieron radioterapia o quimioterapia después de la cirugía. Setenta y siete pacientes fueron negativos para ganglio linfático. Estuvieron disponibles datos de seguimiento de todos los pacientes. La edad media del paciente fue de 68±10 (escala de 42-91 ), con aproximadamente 45% de los pacientes de 70 años o más. Un paciente (LS-3) probablemente murió de causas relacionadas con la cirugía y por lo tanto no fue utilizado para identificar signaturas pronosticas. También, 3 especimenes tuvieron histología mixta y tampoco se incluyeron en la determinación del perfil pronóstico (LS-76, LS-84, LS-112).
Análisis de microarreqlo Para el aislamiento de ARN, se cortaron de cada muestra de 20 a 40 secciones para crióstato de 30 µm, que corresponden en total a aproximadamente 100 mg de tejido. Antes, entre tanto, y después de cortar las secciones para el aislamiento del ARN, se cortaron secciones de 5 µm para tinción de hematoxilina y eosína, para confirmar la presencia de células de tumor. Se aisló ARN total con RNAzol B (Campro Scientific, Veenedaal, Países Bajos), y se disolvió en H20 tratada con DEPC (0.1 %). Aproximadamente 2 ng de ARN total se volvieron a suspender en 10 µl de agua, y se hicieron 2 rondas de amplificación basada en ARN polimerasa T7 para producir aproximadamente 50 µg de ARN amplificado. La calidad del ARN se verificó usando el Agilent Bioanalyzer. La relación ribosomal media (28s/18s) de todas las muestras fue de 1.5 (escala: 1.0-2.1 ). Se amplificaron 4 microgramos de ARN total, se marcaron, y un ARN se fragmentó y se hibridó en el chip Affymetrix U133A, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se extrajeron datos del microarreglo usando el software Affymetrix MAS 5. La expresión génica global se escaló a una intensidad promedio de 600 unidades. Después los datos se normalizaron usando un método de normalización cuantil de trazador.
Análisis estadístico Se realizaron 3 métodos estadísticos complementarios para identificar la signatura genética pronostica óptima: modelación de regresión de riesgo proporcional de Cox, bootstrap, y una validación cruzada fuera de 20% (L20OCV). La modelación de regresión de riesgo proporcional de Cox univariable se hizo para identificar genes que estaban asociados significativamente con la supervivencia general. La puntuación de Cox se definió como la suma de las señales del chip basadas en el logaritmo de base 2 del gen seleccionado, multiplicadas por sus puntuaciones z de la regresión de Cox. Similarmente, se calcularon puntuaciones de Cox para los pacientes en el grupo de prueba con los mismos genes seleccionados del grupo de entrenamiento. Se aplicó una serie de puntos de corte (percentil del índice de riesgo para los pacientes en el grupo de tratamiento), para predecir el resultado clínico de los pacientes en el grupo de prueba, comparando la puntuación de Cox de los pacientes en el grupo de prueba con un punto de corte para el índice de riesgo. Si la puntuación de Cox del paciente era mas alta que el punto de corte, el paciente se clasificó como de "alto riesgo", de otra manera se puso en el grupo de "bajo riesgo". Se hizo un análisis de Kaplan-Meier para explorar las características de supervivencia de los pacientes de alto y bajo riesgo. Se usó un punto de corte de supervivencia de 3 años, puesto que la mayoría de los pacientes de esta población que recaerán tendrán esta ocurrencia en el transcurso de 3 años: Kiernan y otros (1993). También, muchos de estos pacientes murieron después de 3 años debido a enfermedades no relacionadas con el cáncer: Kieman y otros (1993). Este razonamiento también se empleó cuando se hizo la modelación de Cox. El método bootstrap también se empleó para proveer un medio más severo para definir los genes pronósticos. Usando los mismos grupos de entrenamiento y prueba creados anteriormente, se seleccionaron 65 muestras, con reemplazo del grupo de entrenamiento, y después se hizo regresión de Cox en estas muestras. Se registró cada valor p y puntuación z del gen. Este paso se repitió 400 veces, dando así 400 valores p y puntuaciones z para cada gen. Se removió el 5% superior e inferior de los valores p de cada gen, y después se definió el valor p medio y la posición de cada gen (basada en el valor p medio). Similarmente, se removió el 5% superior e inferior de las puntuaciones z de cada gen en el grupo de entrenamiento, y se calculó las suma de las restantes. Se definieron varios números de genes superiores basándose en el valor p medio, su señal de chip basada en el logaritmo de base 2 se multiplicó por la suma de sus puntuaciones z. Esto igualó sus puntuaciones de Cox, particularmente el índice de riesgo. También se calcularon de esta manera las puntuaciones de Cox de los pacientes del grupo de prueba. Se hicieron curvas de característica de operador receptor (ROC) para los pacientes de los grupos de entrenamiento y prueba, y se registró el área bajo la curva (AUC) de cada clasificador de gen. Después, los valores de AUC se graficaron contra varios números de clasificadores de gen para determinar el número óptimo de genes que provee valores de AUC estables en el grupo de entrenamiento. También se hizo un L20OCV para confirmar el número de genes óptimos del clasificador. Las primeras muestras se dividieron en 5 grupos con el mismo número de muestras o con números de muestras muy cercanos. Se generaron 5 pares de grupos de entrenamiento y prueba con el grupo de entrenamiento, consistiendo en 80% de muestras, y el grupo de prueba consistiendo en el restante 20%. Por lo tanto, cada muestra se eligió exactamente una vez en un grupo de prueba. Se hizo modelación de regresión de Cox para seleccionar los genes pronósticos superiores (de 2 a 200) en el grupo de entrenamiento, y los genes seleccionados se probaron en el grupo de prueba correspondiente. Se hizo ROC para calcular el AUC. Se calculó el AUC media de los 5 grupos de prueba para el número de genes de 2 a 200. Esto se repitió 100 veces y después se calculó la media de 100 AUC's para los números de genes de 2 a 200. Se gráfico el AUC media contra el número de genes (2 a 200) y se seleccionó el número óptimo de genes en la signatura. Se hizo agrupación jerárquica con GeneSpring 7.0 (Silicon Genetics) para identificar agrupaciones mayores de pacientes e investigar su asociación con covariables de pacientes. Antes de agruparlos, se eliminaron los genes que tenían un coeficiente de variación (CV) menor de 0.3 (elegido arbitrariamente), a fin de reducir el impacto de los genes que exhibieron cambio mínimo de su expresión en la serie de datos. De esta manera, se creó una serie de datos con 11 ,101 genes para análisis de agrupación. La intensidad de señal de cada gen se dividió entre el grado de expresión medio de ese gen de todos los pacientes. Las muestras se agruparon utilizando una correlación de Pearson como medición de similitud. Los genes se agruparon de la misma manera.
Resultados Perfiles de microarreqlo De los 144 microarreglos, 141 dieron datos excelentes (% presente > 40, factor de escalación < 10), mientras que las 3 muestras restantes (LS76, LS78, LS82) dieron resultados aceptables (% presente > 30, factor de escalación < 15). El cuadro 2 muestra la clasificación clínica- patológica de las 134 muestras de SCC analizadas por medio del microarreglo. Todas las muestras se incluyeron en el análisis de agrupación inicial. Se filtraron los genes de la serie de datos que no estaban presentes en por lo menos el 10% de todas las muestras (incluyendo las normales). Esto dejó 14,597 genes para el análisis.
CUADRO 2 Muestras de paciente por etapa Nota. Una etapa duplicada, IIB, 77 muestras negativas de ganglio linfático Agrupación jerárquica no supervisada Para agrupación no supervisada, la serie de datos se filtró adicionalmente eliminando los genes que tuvieron una variación baja de expresión en toda la serie de datos (CV <30%). Las 134 muestras de SCC y las 10 muestras de pulmón normales inicialmente se agruparon basándose en la agrupación de k-medias no supervisadas de los 11 ,101 genes restantes. Las muestras de pulmón normal tuvieron un perfil distinto de los carcinomas y se agruparon juntas. Las 2 muestras duplicadas de SCC (LS-71 y LS-136) se agruparon entre sí demostrando la reproducibilidad del análisis del microarreglo. De los 133 carcinomas únicos de paciente, se eliminaron 4 del análisis ulterior puesto que el paciente murió debido a la cirugía (LS3), o la muestra tenía histología mixta (LS-76, LS-84, LS-112). Cuando se agruparon las 129 muestras usando los 11 ,101 genes, se formaron 2 agrupaciones mayores, una con 55 pacientes y la otra con 74 pacientes (figura 1A). No se identificó asociación significativa entre la etapa de tumor, diferenciación o género de paciente y las dos agrupaciones. Hubo proporciones aproximadamente iguales de cada etapa presente en ambas agrupaciones (la agrupación 1 consiste en 31 pacientes en etapa I, 15 pacientes en etapa II y 9 pacientes en etapa lll; la agrupación 2 consiste en 42 pacientes en etapa I, 18 pacientes en etapa II y 14 pacientes en etapa II). Sin embargo, los pacientes de la agrupación 1 y 2 mostraron curvas de supervivencia significativamente separadas (figura 1 B, p=0.036), indicando que existen perfiles de expresión, sin considerar la etapa, que estuvieron asociados con la supervivencia general (figura 1B). Identificación de signaturas de gen pronóstico Para identificar los genes que podrían estratificar adicionalmente a los pacientes de etapa temprana en grupos pronósticos buenos y malos, se hicieron varios análisis estadísticos complementarios. Esto incluyó: 1 ) modelación de Cox en un grupo de tratamiento y validación de signaturas pronosticas en un grupo de prueba de muestras; 2) bootstrap, y 3) L20OCV. En primer lugar, las 139 muestras de SCC se dividieron en grupos de entrenamiento y de prueba con igual número de etapas representadas en ambos grupos. Los dos grupos mostraron tiempos similares de supervivencia media general. El grupo de entrenamiento de 65 pacientes se analizó usando un método de bootstrap (véase la sección de métodos) para determinar el número óptimo de genes para usar en la signatura pronostica. Cuando se graficaron números crecientes de genes contra el AUC de un análisis de característica de operador de receptor, se podía ver que el rendimiento de signatura empezó a formar una meseta a alrededor de los 50 genes (figura 2A). Se usó un procedimiento LS20OCV para confirmar el número óptimo de genes pronósticos en el grupo de entrenamiento de 65 pacientes. El resultado mostró que una signatura tenía un rendimiento estable cuando el número de genes alcanza 50. Por lo tanto, los 50 genes clasificados arriba se usarían como la signatura. El clasificador de 580 genes demostró un valor predictivo general del 70% cuando se usa en el grupo de prueba de 64 pacientes (figura 2B).
Después se usó un procedimiento LOOCV en el grupo de entrenamiento de 65 pacientes para determinar el punto de corte óptimo del índice de riesgo. Se calcularon tasas de error con varios puntos de corte. Esto indicó que el punto de corte en el percentil 58% dio la tasa de error más baja (figura 3). Por lo tanto, se utilizó el percentil 58% de pacientes como el punto corte para determinar la supervivencia. Entonces se examinó el rendimiento de la signatura pronostica en el grupo de prueba utilizando este punto de corte. La signatura alcanzó 52.4% de especificidad y 81.8% de sensibilidad en el grupo de prueba (figura 3). La gráfica de Kaplan-Meier también mostró buena separación entre el grupo predicho de alto riesgo y el grupo de pacientes de bajo riesgo (p=0.0075). Se hizo un análisis multivariable incluyendo sexo, diferenciación, etapa, tamaño del tumor, edad y estado de ganglio linfático. Ninguno de los parámetros, excepto la signatura de 50 genes, tuvo un valor p significativo (cuadro 3). También se hizo un análisis de Kaplan-Meier usando la signatura de 50 genes y un punto de corte de riesgo de 58%. El grupo de alto riesgo estuvo bien separado del grupo de bajo riesgo en todos los pacientes (p=0.0075, figura 4A) y cuando se probaron solo aquellos con enfermedad en la etapa I (p=0.029; figura 4B).
CUADRO 3 Análisis multivariable EJEMPLO 2 Identificación de una signatura pronostica robusta Aunque los presentes autores usaron un método de bootstrap para evitar problemas de muestreo aleatorio en el método de entrenamiento-prueba, se podría identificar una signatura pronostica más robusta si se utilizaran las 129 muestras en el grupo de entrenamiento. Por lo tanto, también se seleccionó una signatura de gen mediante el método bootstrap del grupo de datos completo de 129 pacientes. Los genes se clasificaron basándose en su valor p medio y se identificaron los primeros 100 genes (cuadro 4). De estos genes, 23 fueron comunes con los 50 genes superiores identificados en el método de entrenamiento-prueba. Los presentes autores tienen datos sobre el tiempo de recaída (TTR) de 16 pacientes. El TTR medio fue de 21.7 meses, 88% de los pacientes recayendo en el transcurso de 3 años. Puesto que la mayoría de líliltllU los pacientes que murieron después de los 3 años murieron de causas no relacionadas con el cáncer, los presentes autores eligieron un punto de corte de 36 meses para clasificar a los pacientes que tendrán una muerte relacionada con el cáncer de pulmón. Los clasificadores definidos por los presentes autores se probaron con o sin un punto corte de 36 meses. Las signaturas tuvieron un rendimiento mejor en el grupo de prueba cuando se usó un punto de corte de 3 años. Por lo tanto, una signatura de gen seleccionada con límite de tiempo es mejor que sin límite de tiempo. 1-H--11-- L11- CUADRO 4 SEQ Posición SEQ Posición SEQ Posición SEQ Posición ID NO: ID NO: ID NO: ID NO: 452 1 107 26 200 51 89 76 191 2 77 27 234 52 158 77 303 3 13 28 58 53 149 78 378 4 461 29 386 54 98 79 270 5 91 30 120 55 29 80 79 6 225 31 305 56 35 81 409 7 290 32 302 57 311 82 76 8 252 33 16 58 310 83 450 9 194 34 432 59 279 84 413 10 21 35 381 60 384 85 365 11 206 36 269 61 298 86 135 12 161 37 75 62 48 87 18 13 36 38 209 63 222 88 460 14 207 39 293 64 425 89 393 15 37 40 20 65 56 90 375 16 315 41 83 66 398 91 396 17 87 42 408 67 453 92 86 18 288 43 388 68 470 93 190 19 369 44 443 69 261 94 204 20 235 45 372 70 462 95 65 21 337 46 286 71 162 96 433 22 383 47 289 72 131 97 439 23 228 48 57 73 284 98 471 24 248 49 215 74 326 99 124 25 423 50 144 75 114 100 EJEMPLO 3 Identificación de un subgrupo de pacientes de SCC de alto riesgo La agrupación jerárquica no supervisada anteriormente descrita identificó dos grupos de pacientes que difieren significativamente en cuanto a supervivencia general. Un análisis de bootstrap realizado en los dos grupos de pacientes encontró 121 genes (no únicos) cuyo grado de expresión fue significativamente diferente entre los grupos de alto y de bajo riesgo (p < 0.001 , diferencia media > 3 veces; cuadro 5). De manera interesante, la mayoría de estos genes (118) fueron regulados negativamente en el grupo de 5 alto riesgo (figura 5A, agrupación 1 ). El análisis de ruta demostró que los genes implicados en las funciones de desarrollo epidérmico, incluyendo queratinas y proteínas pequeñas ricas en prolina, estuvieron significativamente enriquecidos en este grupo de datos. Estos datos, mostrados en el cuadro 6, indican que hay dos subtipos principales de SCC, 10 uno de los cuales tiene un perfil de expresión génica consistente con una diferenciación deficiente y por lo tanto tiende a ser más agresivo. Cuando se usaron los genes implicados solamente en la diferenciación epidérmica para agrupar las muestras de paciente (cuadro A), se mantuvieron los dos grupos diferenciados pronósticamente (figura 5B). Estos datos indican que hay dos 15 subtipos principales de SCC, uno de los cuales tiene un perfil de expresión génica consistente con una diferenciación deficiente y por lo tanto tiende a ser más agresivo. La falta de expresión de los genes de diferenciación epidérmica puede estar asociada con un subgrupo de tumores cuya diferenciación es revertida y por lo tanto es más agresiva. r-TSaifi-eBfflí^ i ¡ • i « ¡ . i d i - . -- ; p GT CUADRO A Lista de 20 genes asociados con la ruta de diferenciación epidérmica ID de serie de Título del gen Símbolo del sonda gen 206581 at Basonuclina 1 BNC1 204636 at Colágeno (tipo XVII, alfa 1 COL17A1 204136 at Colágeno, tipo Vil, alfa 1 COL7A1 200606 at Desmoplakina DSP 201324_at Proteína 1 de la membrana epitelial EMP1 202345_s_at Proteína 5 de unión de ácido graso FABP5 207935 s at Queratina 13 KRT13 209351 at Queratina 14 KRT14 204734 at Queratina 15 KRT15 209800 at Queratina 16 KRT16 205157 s at Queratina 17 KRT17 212236 x at Queratina 17 KRT17 201820_at Queratina 5 KRT5 206300_s_at Hormona similar a la hormona PTHLH paratiroidea 210355_at Hormona similar a la hormona PTHLH paratiroidea 211756_at Hormona similar a la hormona PTHLH paratiroidea 213796 at Proteína pequeña 1A rica en prolina SPRR1A 214549 x at Proteína pequeña 1A rica en prolina SPRR1A 205064_at Proteína pequeña 1 B rica en prolina SPRR1 B (comifin) 208539 x at Proteína pequeña 2A rica en prolina SPRR2A CUADRO 5 CUADRO 5 (Continuación) CUADRO 6 Lista de rutas enriquecidas significativamente ID de Cuenta Clase de GO Gen # GO gen U133a Categoría Valor p 8544 17 Diferenciación epidérmica 56 P 7.31 E-12 6325 3 Arquitectura de la 12 P 2.75E-04 cromatína 7586 3 Digestión 15 P 7.08E-04 7156 4 Adhesión de célula 39 P 0.004886 homofílica 7148 3 Control de la forma y 28 P 0.007914 tamaño de la célula 7565 3 Embarazo 28 P 0.007914 165 2 Cascada de MAPKKK 15 P 0.008242 6805 2 Metabolismo xenobíótico 15 P 0.008242 7169 3 Señalización del receptor 41 P 0.029293 de tirosina cinasa 6832 2 Transporte de molécula 29 P 0.049333 pequeña EJEMPLO 4 Signaturas de expresión génica para la prognosis del cáncer Métodos RT-PCR cuantitativa en tiempo real: Se normalizaron muestras de ARN total por medio de D026o-Las pruebas de calidad incluyeron análisis por electroforesis capilar usando un Bioanalyzer (Agilent). Para ARNa, se usó el equipo de amplificación Ribobeast™ 1 -Round Aminoallyl-aRNA (Epicentre). Todas las síntesis de ADNc de primera cadena, síntesis de ADN de segunda cadena, transcripción in vitro de ARNa, tratamiento con DNasa, purificación y otros pasos, se hicieron de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para cada muestra se transcribió inversamente ARNa en ADNc de primera cadena y se usó para RT-PCR cuantitativa en tiempo real. La reacción de síntesis de la primera cadena de ADNc contenía 100 ng de ARNa, 1 µl de iniciador T7-Oligo(dT) 50 ng/µl, 0.25 µl de dNTPs 10 mM, 1 µl de amortiguador de transcriptasa inversa Superscript™ lll 5X, 0.25 µl de transcriptasa inversa Superscript™ lll 200 U/µl (Invitrogen Corp), 0.25 µl de DTT 100 mM, y 0.25 µl de inhibidor de RNasa 0.3 U/µl (Epicentre), en un volumen total de reacción de 5 µl. Se hicieron análisis de RT-PCR cuantitativos en tiempo real en un sistema de detección de secuencia ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems). Cada reacción contenía 10 µl de mezcla TaqMan® Universal PCR Master Mix 2X (Applied Biosystems), 5 µl de molde de ADNc, y 1 µl de mezcla Assays-on-Demand Gene Expression Assay Mix 20X (Applied Biosystems) en un volumen de reacción total de 20 µl. La PCR consistió en un paso de activación de UNG a 50 °C durante 2 minutos y un paso de activación de enzima inicial a 95 °C durante 10 minutos, seguido por 40 ciclos de 95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 minuto.
Inmunohistoquímica Se realizó un estudio de inmunohistoquímica (IHC) en microarreglos de tejido conteniendo 60 carcinomas de pulmón de célula escamosa. Las áreas de tumor que representan mejor la morfología general se seleccionaron para generar un microarreglo de tejido (TMA) como lo describió previamente Kononen y otros (1998). Todos los controles se tiñeron negativamente para el fondo.
Análisis de ruta Se hizo análisis de ruta, primero mapeando los genes en el chip Affy U133A para las categorías de proceso biológico de Ontología de Gen (GO). Las categorías que tuvieron por lo menos 10 genes en el chip U133A se usaron para análisis de ruta subsiguientes. Los genes que se seleccionaron de los análisis de datos se mapearon a las categorías de proceso biológico GO. Después se calculó la probabilidad de distribución hipergeométrica de los genes para cada categoría. Una categoría que tenía un valor p menor de 0.05 y que tenía por lo menos 2 genes, se consideró sobre representado en la lista de genes seleccionada.
Identificación del grupo núcleo de genes pronósticos Brevemente, se seleccionaron al azar 400 grupos de entrenamiento de 65 pacientes de 129 pacientes con SCC de pulmón. Para cada grupo de entrenamiento se hizo regresión de Cox para identificar los genes significativos a 5% de significancia (esto es, P <0.05). Los 331 genes que son significativos en más del 40% de los grupos de prueba se usan como los grupos núcleo de genes. Estos 331 genes se muestran en el cuadro 7.
Verificación de los resultados del microarreglo Para confirmar los resultados del microarreglo, los presentes autores realizaron inicialmente RT-PCR cuantitativa TaqMan® en 4 genes (FGFR2, KRT13, NTRK2, y VEGF). La correlación entre las plataformas varió de 0.71 a 0.96, indicando que los datos de expresión fueron reproducibles. Después se hizo una inmunohistoquímica en microarreglos de tejido para confirmar la expresión de varias de estas proteínas dentro de las células de tumor. Se observaron varios grados de expresión de varias queratinas, además de las proteínas tirosina cinasa FGFR2 y NTKR2 en células SCC.
Identificación de un grupo núcleo de genes pronósticos En el análisis previo se identificó un grupo de 50 genes de un solo grupo de entrenamiento de 65 pacientes. Un problema con este enfoque es que los genes identificados como predictores de prognosis pueden ser inestables, puesto que la signatura molecular depende mucho de la selección de pacientes en los grupos de entrenamiento. El uso de validación por muestreo aleatorio repetido puede evitar esta inestabilidad. Por lo tanto, los presentes autores generaron al azar 400 grupos de entrenamiento de 65 pacientes de los 129 pacientes con SCC de pulmón, e hicieron una regresión de Cox para identificar los genes significativos a 5% de significancia (esto es, P < 0.05). Los 331 genes que fueron significativos en mas de 40% de los grupos de entrenamiento se identificaron como un grupo núcleo de genes pronósticos en el cáncer de pulmón de célula escamosa. Estos genes son las SEQ ID Nos: del cuadro 7.
CUADRO 7 Trescientos treinta y un genes de núcleo Aunque la invención anterior se ha descrito en cierto detalle a manera de ilustración y ejemplo con fines de claridad de comprensión, las descripciones y ejemplos no se deben considerar limitativos del alcance de la invención.
CUADRO 8 SEQ ID Nos, y descripciones de genes 1 1255_g_at activador de guanilato ciclasa 1 A GUCA1A L36861 (retina) 2 200619_at factor de empalme 3b, subunidad 2 SF3B2 NM_006842 3 200650_s_at lactato deshidrogenasa A LDHA NM_005566 5 4 200727_s_at homólogo 2 de la proteína relacionada ACTR2 AA699583 con actina ARP2 5 200728_at homólogo 2 de la proteína relacionada ACTR2 BE566290 con actina ARP2 6 200737_at fosfoglicerato cinasa 1 PGK1 NM_000291 7 200795_at similar a SPARC 1 (mast9, hevin) SPARCL1 NM_004684 8 200810_s_at proteína de unión de ARN inducible por CIRBP NM_001280 frió 9 200811_at proteína de unión de ARN ¡nducible por CIRBP NM_001280 frío n 1° 200824_at glutation S-transferasa pi GSTP1 NM_000852 0 11 200836_s_at proteína asociada con microtúbulo 4 MAP4 NM_002375 12 200840_at lisil-ARNt sintetasa KARS NM_005548 13 200863_s_at RAB1 1A, miembro de la familia de RAB1 1A AI215102 oncogenes RAS 14 200893_at factor de empalme 10, rico en SFRS10 NM_004593 arginina/serina 15 200951_s_at ciclina D2 CCND2 AW026491 16 200970_s_at proteína 1 de retículo endoplásmico SERP1 AL136807 asociada con estrés 17 200993_at importina 7 IPO7 AA939270 5 18 201003_x_at enzima E2 de conjugación con UBE2V1 NM_003349 ubiquitina, variante 1 19 201033_x_at proteína ribosomal, grande, P0 RPLP0 NM_001002 20 20 047_x_at RAB6A, miembro de la familia de RAB6A BC003617 oncogenes RAS 21 201067_at ATPasa 2, proteasoma (prosoma, PSMC2 BF215487 macropain), subunidad 26S 22 201 125_s_at integrina, beta 5 ITGB5 NM_002213 23 201151_s_at tipo muscleblind MBNL1 BF512200 24 201152_s_at tipo muscleblind MBNL1 N31913 0 25 201 154_x_at proteína ribosomal L4 RPL4 NM_000968 26 201 170 s at clase B que contiene dominio básico de BHLHB2 NM_003670 hélice-lazo-hélice, 2 27 201 175 at proteína 2 de transmembrana TMX2 NM 015959 relacionada con tioredoxina CUADRO 8 (Continuación) 201236_s_at miembro 2 de la familia BTG BTG2 NM_006763 201251_at piruvato cinasa, músculo PKM2 NM_002654 201286_at sindecan 1 SDC1 Z48199 201287_s_at sindecan 1 SDC1 NM_002997 201351_s_at tipo YMEl- 1 YME1L1 AF070656 201353_s_at bromodominio adyacente al BAZ2A AI653126 dominio del dedo de zinc, 2A 201361_at proteína hipotética MGC5508 MGC5508 NM_024092 201447_at unión de ARN asociada con TIA1 H96549 granulo citotóxico TIA1 201448_at variante 1 de transcrito de unión TIA1 AL046419 de ARN asociada con granulo citotóxico TIA1 201449_at variante 1 de transcrito de unión TIA1 AL567227 de ARN asociada con granulo citotóxico TIA1 201545_s_at proteína nuclear 1 de unión de PABPN1 NM_004643 poli(A) 201623_s_at aspartil-ARNt sintetasa DARS BC000629 201667_at proteína de unión de espacio, 1 GJA1 NM_000165 alfa 201683_x_at marco de lectura abierto 92 de C14orf92 BE783632 cromosoma 14 201718_s_at banda 4J de proteína de EPB41L2 BF511685 membrana de eritrocito, de tipo 2 201725_at marco de lectura abierto 7 del C10orf7 NM 306023 cromosoma 10 201779_s_at proteína 13 de dedo de anillo RNF13 AF070558 201780_s_at proteína 13 de dedo de anillo RNF13 NM_007282 201801_s_at miembro 1 de la familia 29 de SLC29A1 AF0791 17 portadores de soluto (transportadores de nucleósido) 201820_at queratina 5 KRT5 NM_000424 201892_s_at IMP (inosina monofosfato) IMPDH2 NM 000884 deshidrogenasa 2 202006_at tirosina fosfatasa de proteína no PTPN12 NM_002835 receptora de tipo 12 202170_s_at aminoadipato-semialdehído AASDHPPT AF151057 deshidrogenasa- fosfopanteteinil transferasa 202181 at KIAA0247 KIAA0247 NM 014734 CUADRO 8 (Continuación) 52 202219_at miembro 8 de la familia 6 de portadores SLC6A8 NM 005629 de soluto 53 202223_at proteína 1 de membrana integral ITM1 NM_002219 54 202253_s_at dinamina 2 DNM2 NM_004945 55 202288_at proteína 1 de asoc. de proteína 12 de FRAP1 U88966 unión de FK506 -rapamicina 56 202349_at miembro A de la familia 1 de torsina TOR1A NM_000113 (torsina A) 57 202364_at interactor MAX 1 MXI1 NM_005962 58 202397_at factor de transporte nuclear 2 NUTF2 NM_005796 59 202418 at homólogo del factor de interacción de YIF1 NM_020470 Yip1 60 202471 s at isocitrato deshidrogenasa 3 (NAD+) IDH3G NM_004135 gamma 61 202489 s at regulador 3 de transporte iónico que FXYD3 BC005238 contiene el dominio de FXYD 62 202496_at autoantígeno RCD-8 NM_014329 63 202503_s_at producto del gen KIAA0101 KIAA0101 NM_014736 64 202504_at proteína asociada con el grupo D de TRIM29 NM 012101 ataxía-telangiectasia 65 202530_at proteína cinasa 14 activada por MAPK14 NM 001315 mitógeno 66 202602_s_at factor 1 específico de TAT de VIH HTATSF1 NM_014500 67 202746_at proteína 2A de membrana integral ITM2A AL021786 68 202747_s_at proteína 2A de membrana integral ITM2A NM_004867 69 202753_at subunidad p44S10 de partícula P44S10 NM_014814 reguladora de proteosoma 70 202755_s_at glipican 1 GPC1 AI354864 71 202756_s_at glipican 1 GPC1 NM_002081 72 202831_at glutatión peroxidasa 2 GPX2 NM_002083 73 202887_s_at transcrito 4 inducible por daño al ADN DDIT4 NM_019058 74 202935_s_at SRY-caja 9 SOX9 AI382146 75 202990_at fosforilasa, glicógeno; hígado PYGL NM_002863 76 203040_s_at hidroximetilbilano sintasa HMBS NM_000190 77 203082_at proteína de ensamble de ribosoma, de BMS1 L NM_014753 tipo BMS1 (levadura) 78 203190_at NADH deshidrogenasa (ubiquinona) Fe- NDUFS8 NM_002496 -S proteína 8 79 203196 at miembro 4 del cásete de unión de ATP, ABCC4 AI948503 subfamilia C (CFTR/MRP) 80 203211 s at proteína 2 relacionada con MTMR2 AK027038 miotubularina CUADRO 8 (Continuación) 81 203368_at cisteína enriquecida con dominios 1 CRELD1 NMJD15513 de tipo EGF 82 203372_s_at supresor 2 de señalización de citocina SOCS2 AB004903 83 203378_at proteína Pcf 11 del complejo II de pre- PCF11 AB020631 rompimiento de ARNm 203491_s_at translokina PIG8 AI123527 84 85 203494_s_at translokina PIG8 NM_014679 86 203545_at homólogo 8 de glicosilación enlazado ALG8 NM_024079 a asparagina 87 203555_at tirosina fosfatasa de proteína no PTPN18 NM_014369 receptora de tipo 18 88 203573_s_at subunidad alfa de Rab geranilgeranil RABGGTA NM_004581 transferasa 89 203589_s_at factor de transcripción Dp-2 TFDP2 NM_006286 90 203611_at factor 2 de unión de repetición TERF2 NM_005652 telomérico 91 203638_s_at receptor 2 del factor de crecimiento de FGFR2 NM_022969 fibroblasto 92 203639_s_at receptor 2 del factor de crecimiento de FGFR2 M80634 fibroblasto 93 203691_at inhibidor de proteasa 3, derivado de la PI3 NM_002638 piel 94 203726_s_at laminina, alfa 3 LAMA3 NM_000227 95 203759_at alfa-2,3-sialiltransferasa 4 de ST3 ST3GAL4 NM_006278 beta-galactósido 96 203787_at proteína 2 de unión de ADN de una SSBP2 NM_012446 sola cadena 97 203798_s_at tipo visínina 1 VSNL1 NM_003385 98 203809_s_at homólogo 2 de oncogen viral de AKT2 AA769075 timoma murino v-akt 99 203853_s_at proteína de unión 2 asociada con GAB2 NM_012296 GRB2 100 203885_at RAB21 , miembro de la familia de RAB21 NM_014999 oncogenes RAS 101 203924_at glutation S-transferasa A2 GSTA1 NM_000846 102 203953_s_at Claudina 3 CLDN3 BE791251 103 203964_at interactor N-myc (y STAT) NMI NM_004688 °4 203974_at dominio de hidrolasa de tipo haloácido HDHD1A NM_012080 deshalogenasa que contiene 1A 105 204014_at fosfatasa 4 de especificidad doble DUSP4 NM_001394 106 204036_at receptor 2 acoplado con proteína G y EDG2 AW269335 ácido lisofosfatídico, diferenciación endotelial CUADRO 8 (Continuación) 107 204037_at EDG2 BF055366 108 204038_s_at EDG2 NM_001401 109 204047_s_at regulador 2 de fosfatasa y actina PHACTR2 AW295193 110 204049_s_at PHACTR2 NM_014721 111 204136_at colágeno, tipo Vil, alfa 1 COL7A1 NM_000094 112 204151_x_at miembro C1 de la familia 1 de aldo- AKR1C1 NM_001353 ceto reductasa 113 204154_at cisteína dioxigenasa de tipo I CDO1 NM_001801 114 204206_at proteína de unión MAX MNT NM_020310 115 204268_at proteína A2 de unión de calcio S100 S100A2 NM_005978 116 204326_x_at metalotioneina 1X MT1X NM_002450 117 204367_at factor de transcripción Sp2 SP2 D28588 118 204379_s_at receptor 3 del factor de crecimiento de FGFR3 NM_000142 fibroblasto 119 204385_at cinureninasa (L-cinurenina hidrolasa) KYNU NM_003937 20 204388_s_at monoamino oxidasa A MAOA NM_000240 121 204455_at antígeno 1 de pénfigo buloso BPAG1 NM_001723 122 204460_s_at homólogo de RAD1 RAD1 AF074717 123 204469_at tirosina fosfatasa de proteína, de tipo PTPRZ1 NM_002851 receptor, polipéptido Z 1 124 204493_at agonista de muerte del dominio de BID NM_001196 interacción con BH3 125 204532 x at UDP glicosil transferasa, familia 1 , UGT1A9 NM_021027 polipéptido A9 126 204542_at sialiltransferasa SIAT7B NM_006456 127 204547_at RAB40B, miembro de la familia de RAB40B NM_006822 oncogenes RAS 128 204614_at inhibidor de serina (o cisteína) SERPINB2 NM_002575 proteinasa, clade B, miembro 2 129 204621 _s_at receptor nuclear, subfamilia 4, grupo NR4A2 AI935096 A, miembro 2 130 204622_x_at NR4A2 NM_006186 131 204633 s at proteína cinasa 1 activada por RPS6KA5 AF074393 mitógeno nuclear y estrés 132 204636_at colágeno, tipe XVII, alfa 1 COL17A1 NM_000494 133 204672_s_at dominio 6 de repetición de anquirina ANKRD6 NM_014942 134 204734_at queratina 15 KRT15 NM_002275 135 204753_s_at factor hepático de leucemia HLF AI810712 136 204754_at factor hepático de leucemia HLF W60800 137 204755_x_at factor hepático de leucemia HLF M95585 138 204855 at inhibidor de serina (o cisteína) SERPINB5 NM 002639 proteinasa, clade B, miembro 5 CUADRO 8 (Continuación) 139 204887_s_at cinasa 4 de tipo polo PLK4 NM_014264 140 204952_at homólogo de proteína asociada con C4.4A NM_014400 metástasis anclada en GPI 141 204971_at cistatina A (stefin A) CSTA NM_005213 142 205014_at proteína de unión del factor de FGFBP NM_005130 crecimiento de unión a heparina 143 205022_s_at supressor 1 del punto de verificación CHES1 NM_005197 144 205054_at nebulina NEB NM_004543 145 205064_at proteína pequeña 1 B rica en prolina SPRR1 B NM_003125 146 205081_at proteína 1 rica en cisteína CRIP1 NM_001311 147 205141_at angiogenina, ribonucleasa, familia ANG NM_001 145 Rnasa A, 5 148 205157_s_at queratina 17 KRT17 NM_000422 149 205176_s_at proteína de unión de integrina beta 3 ITGB3BP NM_014288 (beta-3-endonexina) 150 205206_at secuencia 1 del síndrome de Kallmann KAL1 NM_000216 151 205219_s_at galactocinasa 2 GALK2 NM_002044 152 205267_at dominio de POU, clase 2, factor de POU2AF1 NM_006235 ' asociación 1 153 205367 at proteína adaptadora con 2 dominios APS NM_020979 de homología de pleckstrin y homología de src 154 205372_at gen 1 de adenoma pleiomórfico PLAG1 NM_002655 155 205450_at fosforilasa cinasa, alfa 1 (músculo) PHKA1 NM_002637 156 205490_x_at proteína de unión de espacio, beta 3 GJB3 BF060667 ¡ 157 205569_at proteína 3 de membrana asociada con LAMP3 NM_014398 lisosoma 158 205595_at desmogleina 3 DSG3 NM_001944 ¡ 159 205618_at Gla (G-ácido carboxiglutámico) 1 rica PRRG1 NM_000950 en prolina 160 205623_at aldehido deshidrogenasa 3 ALDH3A1 NM_000691 161 205624_at carboxipeptidasa A3 (mastocito) CPA3 NM_001870 162 205789_at antígeno CD1 D, polipéptido d CD1 D NM_001766 163 205839_s_at proteína 1 asociada con el receptor BZRAP1 NM_004758 (periférico) de benzodiazepina 164 205961_s_at proteína 1 de interacción con PC4 y PSIP1 NM_004682 SFRS1 165 205968_at rectificador retrasado del canal de KCNS3 NM_002252 compuerta de voltaje de K+, subfamilia S, miembro 3 166 205969 at arilacetamida desacetilasa (esterasa) AADAC NM 001086 CUADRO 8 (Continuación) 167 206032_at desmocolina 3, variante de transcrito DSC3 AI797281 Dsc3a 168 206033_s_at desmocolina 3, variante de transcrito DSC3 AI797281 Dsc3a 169 206068_s_at acil-Coenzima A deshidrogenasa, ACADL AI367275 cadena larga 170 206094_x_at familia de UDP glicosiltransferasa 1 , UGT1A6 NM_001072 polipéptido A6 171 206122_at SRY-caja 20 SOX15 NM_006942 172 206164_at miembro 2 de la familia del canal de CLCA2 NM_006536 cloruro, activado por calcio 173 206165_s_at miembro 2 de la familia del canal de CLCA2 NM_006536 cloruro, activado por calcio 174 206166_s_at canal de cloruro 2 activado por calcio CLCA2 NM_006536 175 206300_s_at hormona similar a la hormona PTHLH NM_002820 paratiroidea 176 206331_at tipo receptor de calcitonina CALCRL NMJ305795 177 206400_at lectina, unión de galactósido, soluble, LGALS7 NM_002307 7 178 206461_x_at metalotioneina 1 H MT1 H NM_005951 179 206561_s_at miembro B10 de la familia 1 de aldo- AKR1 B10 NM_020299 ceto reductasa 180 206566 at miembro 1 de la familia 7 d eportador SLC7A1 NM_003045 soluble (transportador de aminoácido catiónico, sistema y+) 181 206581_at basonuclina BNC1 NM_001717 182 206641 at miembro 17 de la superfamilia de TNFRSF17 NM_001192 receptores del factor de necrosis tumoral 183 206653_at polipéptido G de polimerasa (ARN) lll POLR3G BF062139 (dirigido por AND) 184 206658_at proteína hipotética MGC10902 UPK3B NM_030570 185 206756_at carbohidrato (N-acetilglucosamina-6- CHST7 NM_019886 O) sulfotransferasa 7 186 206912_at caja forkhead E1 FOXE1 NM_004473 187 207029_at ligando KIT KITLG NM_000899 188 207126_x_at polipéptido A1 de la familia de UDP UGT1A1 /// NM_000463 glicosiltransferasa 1 189 207499_x_at proteína hipotética FLJ 10043 SMAP-1 NM_017979 190 207513_s_at proteína 189 de dedo de zinc ZNF189 NM_003452 191 207620 s at serina cinasa de proteína dependiente CASK NM 003688 de calcio/calmodulina CUADRO 8 (Continuación) 192 207935_s_at queratina 13 KRT13 NM_002274 193 208153_s_at homólogo 2 del supresor de tumor FAT2 NM_001447 FAT 194 208228_s_at receptor 2 del factor de crecimiento de FGFR2 M87771 fibroblasto 195 208502_s_at factor 1 de transcripción de PITX1 NM_002653 homeodominio de tipo apareado 196 208539_x_at proteína pequeña 2B rica en prolina SPRR2A NM_006945 197 208581_x_at metalotioneina 1X MT1X NM_005952 198 208596_s_at polipéptído A3 de la familia de UDP UGT1A3 NM_019093 glicosiltransferasa 1 199 208657_s_at septina 9 9-Sep AF142408 200 208692_at proteína ribosomal S3 RPS3 U 14990 201 208737 at ATPasa de transporte de H+ lisosomal ATP6V1G1 BC003564 de 13 kDa, subunidad V1 , isoforma G 1 202 208758 at 5-aminoimidazol-4-carboxamida ATIC D89976 ribonucleótido formiltransferasa/IMP ciclohidrolasa 203 208798_x_at golgin-67 GOLGIN-67 AF204231 204 208856_x_at proteína ribosomal grande, PO RPLP0 BC003655 205 208870 x at ATP sintasa de transporte de H+, ATP5C1 BC000931 complejo mitocondrial F1 , polipéptido gamma 1 206 208933_s_at lectina 8 de unión de galactósido, LGALS8 AI659005 soluble, 207 208935_s_at lectina 8 de unión de galactósido, LGALS8 L78132 soluble, 208 208950 s at miembro A1 de la familia 7 de ALDH7A1 BC002515 aldehido deshidrogenasa 209 209009_at esterasa D/formilglutation hidrolasa ESD BC001 169 210 209041_s_at enzima de conjugación de ubiquitina UBE2G2 BG395660 E2G 2 211 2091 17_at proteína 2 de unión del dominio WW WBP2 U79458 212 209122_at proteína relacionada con la ADFP BC005127 diferenciación de adiposa 213 209125_at queratina 6A KRT6A J00269 214 209126_x_at queratina 6, isoforma K6f KRT6B L42612 215 209204_at dominio LIM solo 4 LMO4 AI824831 216 209212_s_at factor de transcripción BTEB2 KLF5 AB030824 217 209215 at proteína similar al transportador de TETRAN L11669 tetraciclina CUADRO 8 (Continuación) 218 209220_at glipican 3 GPC3 L47125 219 209260_at stratifin SFN BC000329 220 209296 at proteína fosfatasa 1 B (anteriormente PPM1 B AF136972 2C), dependiente de magnesio, isoforma beta 221 209309_at glicoproteína zinc-alfa-2 AZGP1 D90427 222 209339_at homólogo 2 de seven in absentia SIAH2 U76248 223 209351_at queratína 14 KRT14 BC002690 224 209380_s_at CFTR/MRP, miembro 5 ABCC5 AF146074 225 209411_s_at proteína 3 de unión de ARF que GGA3 AW008018 contiene oreja de adaptina gamma, asociada con Golgi 226 209446_s_at Similar a la proteína hipotética — BC001743 FLJ10803 227 209457_at fosfatasa 5 de doble especificidad DUSP5 U 16996 228 209509_s_at dolicil-fosfato DPAGT1 BC000325 229 209587_at proteína backfoot de homeobox Bft U70370 expresada en miembro posterior 230 209647_s_at IMAGE: 2972022 SOCS5 AW664421 231 209699_x_at dihidrodiol deshidrogenasa AKR1C2 U05598 232 209719_x_at antígeno 1 de carcinoma de célula SCCA1 U19556 escamosa 233 209720 s at inhibidor de serina (o cisteína) SERPINB3 U19556 proteinasa, clade B (ovoalbúmina), miembro 3 234 209727_at activador de gangliósído GM2 GM2A M76477 235 209748_at 4 de paraplegia espástica SPG4 AB029006 236 209792_s_at kalikreina 10 KLK10 BC002710 237 209800_at queratina 16 KRT16 AF061812 238 209863_s_at CUSP TP73L AF091627 239 209878_s_at homólogo A del oncogen viral de RELA M62399 reticuloendoteliosis v-rel 240 209897_s_at homólogo 2 de slit (Drosophila) SLIT2 AF055585 241 209959_at miembro 3 del grupo A de la NR4A3 U 12767 subfamilia 4 del receptor nuclear 242 209963_s_at receptor de eritropoyetina EPOR M34986 243 210020_x_at NB-1 CALML3 M58026 244 210052_s_at TPX2, homólogo de la proteína TPX2 AF098158 asociada con microtúbulo 245 210064_s_at uroplakina 1 B UPK1 B NM_006952 246 210065 s at uroplakina Ib UPK1 B NM 006952 CUADRO 8 (Continuación) 247 210084_x_at triptasa alfa II de mastocito — AF206665 248 210133_at ligando 11 de quimocina (motivo C-C) CCL11 D49372 249 210135_s_at homeobox 2 de estatura corta SHOX2 AF022654 250 210264_at receptor 35 acoplado con la proteína GPR35 AF089087 G 251 210355_at proteína de tipo paratiroidea PTHLH J03580 252 210406_s_at RAB6A, miembro de la familia de RAB6A AL136727 oncogenes RAS 253 210505_at alcohol deshidrogenasa ADH7 U07821 254 210512_s_at factor de crecimiento endotelial VEGF AF022375 vascular 255 210829_s_at proteína 2 de unión al ADN de una SSBP2 AF077048 cadena 256 210876_at anexina A2 ANXA2 M62896 257 21 1002_s_at proteína de motivo tripartita TRIM29 TRIM29 AF230389 beta 258 211 105 s at factor nuclear 1 de células T NFATC1 U80918 activadas, citoplásmico, dependiente de calcineurina 259 211194_s_at p73H TP73L AB010153 260 21 1195_s_at p51 delta TP73L AB010153 261 21 1272_s_at diacilglicerol cinasa, alfa 80 kDa DGKA AF064771 262 211361_s_at hurpina hurpina AJ001696 263 211401 s at receptor 2 del factor de crecimiento FGFR2 AB030078 de fibroblasto 264 211452_x_at clona FLB4816 PRO1252 — AF 130054 265 21 1456_x_at metalotioneina de tipo 1H — AF333388 266 21 1474 s at inhibidor de serina (o cisteína) SERPINB6 BC004948 proteinasa, clade B (ovalbúmina), miembro 6 267 211527_x_at factor de permeabilidad vascular VEGF M27281 268 211547_s_at proteína de lisencefalia de Miller- LIS1 L13387 Dieker 269 21 1548_s_at hidroxiprostaglandina deshidrogenasa HPGD J05594 15-(NAD) 270 211596_s_at repeticiones ricas en leucina y LRIG1 AB050468 dominios 1 de tipo inmunoglobulina 271 211634_x_at inmunoglobulina pesada constante IGHM M24669 mu 272 21 1635_x_at IgM factor reumatoide RF-TT1 , — M24670 cadena VH 273 21 1653 x at seudo-clordecona AKR1 C2 M33376 CUADRO 8 (Continuación) 274 211689 s at proteasa de transmembrana, TMPRSS2 AF270487 serina 2 275 211721_s_at proteína de dedo de zinc 551 ZNF551 BC005868 276 211734 s at Fc IgE, alta afinidad I, receptor FCER1A BC005912 para a-polipéptido 277 21 1756_at hormona similar a la hormona PTHLH BC005961 paratiroidea 278 211834_s_at p73Lp63p51 p40KET TP73L AB042841 279 212061_at KIAA0332 SR140 AB002330 280 212092_at KIAA1051 PEG10 BE858180 281 212094_at KIAA1051 PEG10 BE858180 282 212162_at FLJ12811 — AK022873 283 212189 s at componente del complejo COG4 AK022874 oligomérico de Golgi 4 284 212228_s_at proteína hipotética DKFZp434K046 DKFZP434 AC004382 K046 285 212236_x_at citoqueratina 17 KRT17 Z19574 286 212252_at proteína cinasa dependiente de CAMKK2 AA181179 Ca + calmodulina, cinasa 2ß 287 212255_s_at FLJ10822 fis FLJ 10822 AK001684 288 212286 at dominio de repetición de anquirina ANKRD12 AW572909 12 289 212311_at proteína KIAA0746 KIAA0746 AA522514 290 212314_at proteína KIAA0746 KIAA0746 AB018289 291 212424_at muerte celular programada 1 1 PDCD11 AW026194 292 212441_at KIAA0232 KIAA0232 D86985 293 212458 at relacionado con sprouty, que SPRED2 H97931 contiene dominio EVH1 2 294 212466_at relacionado con sprouty, que SPRED2 AW 138902 contiene dominio EVH1 2 295 212570_at proteína KIAA0830 KIAA0830 AL573201 296 212573_at proteína KIAA0830 KIAA0830 AF131747 297 212595_s_at proteína 2 asociada con DAZ DAZAP2 AL534321 298 212599_at candidato de susceptibilidad de AUTS2 AK025298 autismo, 2 299 212600_s_at ubiquinol-citocromo c reductasa, UQCRC2 AV727381 proteína de núcleo II 300 212662_at receptor de poliovirus PVR BE615277 301 212680_x_at regulador (inhibidor) de proteína PPP1 R14B BE305165 fosfatasa 1 , subunidad 14B 302 212836 at polimerasa (dirigida al ADN), delta POLD3 D26018 3, subunidad accesoria CUADRO 8 (Continuación) 303 212841_s_at proteína de interacción con PPFIBP2 AI692180 PTPRF, proteína de unión 2 304 212864_at CDP-diacilglicerol slntasa CDS2 Y16521 (fosfatidato citidililtransferasa) 2 305 212914_at homólogo 7 de cromobox CBX7 AV648364 306 212980_at AHA1 , activador del homólogo 2 AHSA2 AL050376 de proteína ATPasa de choque de calor de 90 kDa 307 213023_at utrofina UTRN NM_007124 308 213034_at proteína KIAA0999 KIAA0999 AB023216 309 213093_at proteína cinasa C, alfa PRKCA AI471375 310 213199_at proteína DKFZP586P0123 DKFZP586 AL080220 P0123 311 213325_at relacionado con el receptor de PVRL3 AA129716 poliovirus 3 312 213366_x_at ATP sintasa, polipéptido gamma 1 ATP5C1 AV71 1183 del complejo mitocondrial F1 de transporte de H+ 313 213425_at miembro 5A, familia de sitio de WNT5A AI968085 integración de MMTV, de tipo wingless 314 213440_at RAB1A, miembro de la familia de RAB1A AL530264 oncogenes RAS 315 213471_at nefronoftisis 4 NPHP4 AB014573 316 213490_s_at proteína cinasa activada por MAP2K2 AI762811 mitógeno, cinasa 2 317 213518_at proteína cinasa C, iota PRKCI AI689429 318 213680_at queratina 6A KRT6B AI831452 319 213700_s_at piruvato cinasa, músculo PKM2 AA554945 320 213721_at SRY-box 2 SOX2 L07335 321 213722_at SRY-box 2 SOX2 AW007161 322 213796_at proteína pequeña rica en prolina SPRR1A AI923984 SPRK 323 213808_at clona 23688 ADAM23 BE674466 324 213843_x_at proteínas accesorias SLC6A8 AW276522 BAP31 BAP29 325 213880 at receptor 5 acoplado con proteína LGR5 AL524520 G que contiene repetición rica en leucina 326 213913_s_at proteína KIAA0984 KIAA0984 AW134976 327 214073_at cortactina CTTN BG475299 328 214100 x at IMAGE: 1964520 AI284845 CUADRO 8 (Continuación) 329 214260_at subunidad 8 de homólogo COPS8 AI079287 fotomorfogénico constitutivo de COP9 330 214441_at sintaxina 6 STX6 NM_005819 331 214549_x_at proteína pequeña 1A rica en prolina SPRR1A NM_005987 332 214580_x_at queratina 6B KRT6B AL569511 333 214680_at tirosina cinasa neurotrófica, receptor, NTRK2 BF674712 tipo 2 334 214688_at incrementador de split 4 de tipo TLE4 BF217301 transducina 335 214735_at proteína de unión de fosfoinósitido PIP3-E AW166711 PIP3-E 336 214812_s_at KIAA0184 KIAA0184 D80006 337 214829_at aminoadipato-semialdehído sintasa AASS AK023446 338 214965_at proteína hipotética MGC26885 4 MGC26885 AF07057 339 21501 1_at ARN, U17D nucleolar pequeño RNU17D AJ006835 340 215030_at factor 1 de unión de secuencia de GRSF1 AK023187 ARN rica en G 341 215125_s_at UDP glicosiltransferasa, polipéptido UGT1A9 AV691323 A9, familia 1 342 215189_at queratina, pelo, básica, 6 (monilethrix) KRTHB6 X99142 343 215354_s_at proteína 1 rica en prolina, ácido PELP1 BC002875 glutámico y leucina 344 215372_x_at proteína hipotética LOC151878 LOC151878 AU 146794 345 215382_x_at triptasa alfa II de mastocito AF206666 346 215561_s_at receptor de interleucina de tipo I IL1 R1 AK026803 347 215786_at proteína asociada con el virus x de la HBXAP AK022170 hepatitis C 348 215812_s_at transportador de creatina SLC6A10 U41 163 349 216052_x_at Artemina ARTN AF1 15765 350 216147_at Septina 11 11 -Sep AL353942 351 216221_s_at homólogo 2 de pumilio PUM2 D87078 352 216248_s_at miembro 2, grupo A de la subfamilia NR4A2 S77154 de receptor nuclear 353 216258_s_at secuencia UV-B reprimida, HUR 7, BE148534 354 216263_s_at marco de lectura abierto 120 del C14orf120 AK022215 cromosoma 14 355 216288_at receptor 1 de cisteinil leucotrieno CYSLTR1 AU 159276 356 216412_x_at IgG para el virus Puumala G2, región — AF043584 V de la cadena ligera 357 216594 x at miembro C1 de la familia 1 de aldo- AKR1C1 S68290 ceto reductasa CUADRO 8 (Continuación) 358 216603_at Miembro de la familia 7 de portador de — AL365343 soluto 359 216722_at Seudogen 1 de homeobox 2 similar a VENTX2P1 AF164963 VENT 360 216918_s_at Isoformas 1 y 3 de antígeno 1 de DST AL096710 penfigoide buloso 361 217003_s_at tMDC II, isoforma [d] — AJ132823 362 217097_s_at Proteína hipotética DKFZp564F013 PHTF2 AC004990 363 217165_x_at metalotioneina 1 F (funcional) MT1 F M10943 364 217198_x_at inmunoglobulina pesada constante IGHG1 U80164 gamma 1 365 217227_x_at inmunoglobulina locus lambda IGLVJC X93006 366 217272 s at Inhibidor de serina (o Hurpin AJOO 1698 cisteína)proteinasa, clade B, miembro 13 367 217312_s_at Colágeno de tipo Vil, región COL7A1 L23982 intergénica 368 217388_s_at cinureninasa (L-cinurenina hidrolasa) KYNU D55639 369 217418_x_at Miembro 1 , subfamilia A, 4 dominios MS4A1 X12530 de transmembrana 370 217480_x_at similar a la cadena de Ig kappa LOC339562 M20812 371 217528_at Canal de cloruro, miembro 2 de la CLCA2 BF003134 familia activada por calcio 372 217622_at Marco de lectura abierto del C22orf3 AA018187 cromosoma 22 373 217626_at IMAGE: 3089210 AKR1 C2 /// BF508244 AKR1C1 374 217746_s_at Proteína de interacción 6 de muerte PDCD6IP NM_013374 celular programada 375 217783_s_at similar a yippee YPEL5 NM_016061 376 217786_at homólogo de SKB1 SKB1 NM_006109 377 217811_at selenoproteína T SELT NM_016275 378 217841_s_at proteína fosfatasa metilesterasa-1 PME-1 NM_016147 379 217860 at NADH deshidrogenasa (ubiquinona) 1 NDUFA10 NM_004544 subcomplejo alfa, 10 380 217922_at Manosidasa, alfa, clase 1A, miembro 2 MAN1A2 AL157902 381 217994_x_at proteína hipotética FLJ20542 FLJ20542 NM_017871 382 218070_s_at GDP-manosa pirofosforilasa A GMPPA NM_013335 383 218092_s_at proteína de unión de Rev de VIH-1 HRB NM_004504 384 218192_at inositol hexafosfato cinasa 2 IHPK2 NM_016291 385 218236 s at proteina cinasa D3 PRKD3 NM 005813 CUADRO 8 (Continuación) 386 218238_at proteína 4 de unión de GTP GTPBP4 NM. .012341 387 218239_s_at proteína 4 de unión de GTP GTPBP4 NM. .012341 388 218288_s_at proteína hipotética MDS025 MDS025 NM. .021825 389 218305_at importina 4 IPO4 NM. _024658 390 218331_s_at marco de lectura abierto 18 del C10orf18 NM_ .017782 cromosoma 10 391 218355_at miembro 4A de la familia cinesina KIF4A NM. _012310 392 218384_at proteína estable al calor 1 regulada por CARHSP1 NM. _014316 calcio 393 218460_at proteína hipotética FLJ20397 FLJ20397 NM. .017802 394 218483_s_at proteína hipotética FLJ21827 FLJ21827 NM. _020153 395 218507_at proteína 2 inducible por hipoxia HIG2 NM. .013332 396 218546_at proteína hipotética FLJ14146 FLJ14146 NM. _024709 397 218657_at factor II de intercambio de nucleótido RAPGEFL NM. _016339 de guanina de enlace 398 218696_at factor 2a de iniciación de traducción EIF2AK3 NM 004836 eucariótico, cinasa 3 399 218699_at RAB7, miembro de la familia similar a RAB7L1 BG338251 oncogen RAS 1 400 218750_at proteína hipotética MGC5306 MGC5306 NM_0241 16 401 218769_s_at repetición de ankirina, familia A (tipo ANKRA2 NM_023039 RFXANK), 2 402 218796_at proteína hipotética FLJ20116 C20orf42 NM_017671 403 218834_s_at proteína 1 de unión de proteína 5 de HSPA5BP1 NM_017870 70 kDa de choque de calor (proteína regulada por glucosa, 78 kDa) 404 218957_s_at proteína hipotética FLJ 11848 FLJ 11848 NM_025155 405 218960_at proteasa de transmembrana, serina 4 TMPRSS4 NM_016425 406 218962_s_at proteína hipotética FLJ 13576 FLJ 13576 NM_022484 407 218990_s_at proteína pequeña 3 rica en prolina SPRR3 NM_005416 408 219129_s_at proteína hipotética FLJ11526 L SAP30 NM_024632 409 219132_at homólogo 2 de pellino PELI2 NM_021255 410 219154_at miembro F, familia del gen homólogo RHOF NM_024714 Ras 411 219155_at proteína de transferencia de PITPNC1 NMJ312417 fosfatidilinositol, citoplásmica 1 412 219201_s_at homólogo 1 de gastrulación girada TWSG1 NM_020648 413 219217_at proteína hipotética FLJ23441 FLJ23441 NM_024678 414 219241_x_at proteína hipotética FLJ20515 SSH3 NM_017857 415 219245 s at proteína hipotética FLJ13491 FLJ13491 AI309636 CUADRO 8 (Continuación) 416 219250_s_at fibronectina proteína 3 de FLRT3 NM. .013281 transmembrana rica en leucina 417 219347_at motivo 15 tipo nudix (porción X NUDT15 NM. .018283 enlazada a difosfato de nucleósido) 418 219389_at proteína hipotética FLJ 10052 FLJ 10052 NM. .017982 419 219554_at glicoproteína C de tipo Rh RHCG NM. .016321 420 219582_at receptor opioide del factor de OGFRL1 NM. .024576 crecimiento de tipo 1 421 219704_at proteína de unión de la caja Y YBX2 NM. .015982 específica de célula germinal 422 219732_at gen 3 relacionado con plasticidad PRG-3 NM. .017753 423 219741_x_at proteína de dedo de zinc 552 ZNF552 NM. .024762 424 219756_s_at proteína hipotética FLJ22792 POF1 B NM. .024921 425 219854_at proteína de dedo de zinc 14 (KOX 6) ZNF14 NM_ .021030 426 219936_s_at receptor 87 acoplado con proteína G GPR87 NM. .023915 427 219959_at cofactor de molibdeno sulfurasa MOCOS NM. .017947 428 219962_at enzima 2 convertidora de angiotensina ACE2 NM. .021804 I (peptidil dipeptidasa A) 429 219995_s_at proteína hipotética FLJ13841 FLJ13841 NM. .024702 430 219997_s_at subunidad 7B homólogo COPS7B NM. .022730 fotomorfogénico constitutivo de COP9 431 220046_s_at ciclina L1 CCNL1 NM. .020307 432 220177_s_at proteasa de transmembrana, serina 3 TMPRSS3 NM. .024022 433 220285_at marco de lectura abierto 77 del C9orf77 NM. .016014 cromosoma 9 434 220466_at proteína hipotética FLJ13215 FLJ13215 NM. .025004 435 220664_at proteína pequeña 2C rica en prolina SPRR2C NM. .006518 436 220668_s_at ADN (citosina-5-)-metiltransferasa 3 DNMT3B NM. .006892 beta 437 221004_s_at proteína de membrana integral 2C ITM2C NM. .030926 438 221045_s_at homólogo de periodo 3 PER3 NM. .016831 439 221047_s_at MAP/cinasa 1 reguladora de la afinidad MARK1 NM. .018650 de microtúbulo 440 221050_s_at proteína 2 de unión de GTP GTPBP2 NM. .019096 441 221064 s at marco de lectura abierto 28 del C16orf28 NM. .023076 cromosoma 16 442 221096_s_at proteína hipotética PRO1580 PRO1580 NM. _018502 443 221234 s at factor 2 de transcripción de zipper de BACH2 NM. _021813 leucina básica, homología de BTB y CNC 444 221286 s at proteína adaptadora de caspasa PACAP NM 016459 proapoptótica CUADRO 8 (Continuación) 445 221305_s_at polipéptido A8, familia UDP UGT1A8 NM_019076 glicosiltransferasa 1 446 221326_s_at delta-tubulina TUBD1 NM_016261 447 221480_at ribonucleoproteína nuclear heterógena HNRPD BG 180941 D 448 221513 s at UTP14, ribonucleoproteína nucleolar UTP14C/ BC001 149 pequeña U3, homólogo C /homólogo A UTP14A 449 221514_at ribonucleoproteína nucleolar pequeña UTP14A BC001149 U3, homólogo A 450 221580_s_at proteína hipotética MGC5306 MGC5306 BC001972 451 221597_s_at proteína HSPC171 HSPC171 BC003080 452 221622_s_at proteína del hipotálamo no HT007 AF246240 caracterizada HT007 453 221649_s_at homólogo peter pan PPAN BC000535 454 221679_s_at dominio de abhidrolasa 6 ABHD6 AF225418 455 221770_at ribulosa-5-fosfato-3-epimerasa RPE BE964473 456 221790_s_at proteína adaptadora del receptor de ARH AL545035 LDL 457 221795_at Similar a la proteína hipotética AI346341 FLJ20093 458 221796_at Similar a la proteína hipotética AA707199 FLJ20093 459 221854_at ESTs PKP1 AI378979 460 221884_at sitio 1 de integración viral ecotrópico EVI1 BE466525 461 243_g_at proteína 4 asociada con microtúbulo MAP4 M64571 462 31846 at miembro D de la familia de genes RHOD AW003733 homólogos de ras 463 33323_r_at stratifina SFN X57348 464 33850_at proteína 4 asociada con microtúbulo MAP4 W28892 465 34858_at dominio de tetramerización-del canal de KCTD2 D79998 potasio 2 466 37512_at 3-hidroxiesteroide epimerasa RODH U89281 467 41037_at miembro 4 de la familia del dominio de TEAD4 U63824 TEA 468 41469_at elafina PI3 L10343 469 44111_at clasificación 33B de proteína vacuolar VPS33B AI672363 470 49049_at homólogo de deltex 3 DTX3 N92708 471 49077_at fosfatasa metilesterasa-1 de proteína PME-1 AL040538 472 59625_at proteína nucleolar 3 NOL3 AI912351 473 65438 at proteína KIAA1609 KIAA1609 AA195124 Referencias Beer y otros (2002) "Gene-expression profiles predict survival of patients wíth lung adenocarcinoma", Nat Med 8:816-824. Brookes (1999) "The essence of SNPs", Gene 23: 177-186. Kato y otros (2004) "A Randomized Trial of Adjuvant Chemotherapy with Uracil-Tegafur for Adenocarcinoma of the Lung", N Engl J Med 350:1713-1721. Kiernan y otros (1993) "Stage I non-small cell cáncer of the lung results of surgical resection at Faírfax Hospital", Va Med Q 120:146-149. Kononen y otros (1998) "Tíssue microarrays for hígh-throughput molecular profiling of tumor specimens", Nat Med 4:844-847. Mountain y otros (1987) "Lung cáncer classification: the relationship of disease extent and cell type to survival in a clinical triáis population", J Surg Oncol 35 :147 -156. Wingo y otros (1999) "Annual Report to the ?ation on the Status of Cáncer, 1973-1996, With a Special Section on Lung Cáncer and Tobacco Smoking", J Nati Cáncer Inst 91 :675-690.

Claims (45)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Un método para determinar el estado del cáncer del pulmón, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) medir biomarcadores asociados con los genes marcadores que corresponden a los seleccionados del cuadro 1 , cuadro 4, cuadro 5 o cuadro 7 en una muestra, en donde el grado de expresión de los genes marcadores por arriba o por abajo de puntos de corte predeterminados es indicativo del estado del cáncer de pulmón.
2.- Un método para clasificar pacientes de cáncer de pulmón, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) medir biomarcadores asociados con los genes marcadores que corresponden a los seleccionados del cuadro 1 , cuadro 4, cuadro 5 o cuadro 7 en una muestra, en donde el grado de expresión de los genes marcadores por arriba o por abajo de puntos de corte predeterminados es indicativo de la etapa del cáncer de pulmón.
3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque la etapa corresponde a la clasificación del sistema TNM.
4.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque la etapa corresponde a pacientes con perfiles de expresión génica similares.
5.- Un método para determinar el protocolo de tratamiento de un paciente de cáncer de pulmón, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) medir biomarcadores asociados con los genes marcadores que corresponden a los seleccionados del cuadro 1 , cuadro 4, cuadro 5 o cuadro 7 en una muestra, en donde el grado de expresión de los genes marcadores por arriba o por abajo de puntos de corte predeterminados es suficientemente indicativo del riesgo de recurrencía para permitir a un médico determinar el grado y tipo de terapia recomendada para prevenir la recurrencia.
6.- Un método de tratamiento de un paciente de cáncer de pulmón, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) medir biomarcadores asociados con los genes marcadores que corresponden a los seleccionados del cuadro 1 , cuadro 4, cuadro 5 o cuadro 7 en una muestra, en donde el grado de expresión de los genes marcadores por arriba o por abajo de puntos de corte predeterminados es indicativo de un riesgo de recurrencia alto; y (b) tratar al paciente con terapia adyuvante si es un paciente de alto riesgo.
7.- Un método para determinar sí un paciente de cáncer de pulmón está en riesgo alto o bajo de mortalidad, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) medir biomarcadores asociados con los genes marcadores que corresponden a los seleccionados del cuadro 4 en una muestra, en donde el grado de expresión de los genes marcadores por arriba o por abajo de puntos de corte predeterminados es suficientemente indicativo del riesgo de mortalidad para permitir a un médico determinar el grado y tipo de terapia recomendada.
8.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , 2, 5, 6 ó 7, caracterizado además porque la muestra se prepara mediante un método seleccionado del grupo que consiste en preparación de tejido en masa y microdisección de captura de láser.
9.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , 2, 5, 6 ó 7, caracterizado además porque comprende adicionalmente medir el grado de expresión de por lo menos un gen expresado constitutivamente en la muestra.
10.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , 2, 5, 6 ó 7, caracterizado además porque la muestra se obtiene de un tumor primario.
11.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , 2, 5, 6 ó 7, caracterizado además porque la especificidad es de por lo menos 40% aproximadamente.
12.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , 2, 5, 6 ó 7, caracterizado además porque la sensibilidad es de por lo menos 80% aproximadamente.
13.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , 2, 5, 6 ó 7, caracterizado además porque los puntos de corte predeterminados son por lo menos 1.5 veces de sobreexpresión o subexpresión en la muestra con respecto a las células benignas o tejido normal.
14.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , 2, 5, 6 ó 7, caracterizado además porque los puntos de corte predeterminados tienen un valor p de sobreexpresión por lo menos estadísticamente significativo en la muestra que tiene células metastáticas con respecto a las células benignas o tejido normal.
15.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el valor p es menor de 0.05.
16.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , 2, 5, 6 ó 7, caracterizado además porque la expresión génica se mide en un microarreglo o chip de gen.
17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el microarreglo es un arreglo de ADNc o un arreglo de oligonucleótído.
18.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el mícroarreglo o chip de gen comprende uno o más reactivos de control interno.
19.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , 2, 5, 6 ó 7, caracterizado además porque la expresión génica es determinada por amplificación de ácido nucleico realizada por reacción en cadena de polimerasa (PCR) de ARN extraído de la muestra.
20.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque dicha PCR es una reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR).
21.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque la RT-PCR comprende adicionalmente uno o más reactivos de control interno.
22.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , 2, 5, 6 ó 7, caracterizado además porque la expresión génica es detectada midiendo o detectando una proteína codificada por el gen.
23.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque la proteína es detectada por un anticuerpo específico para la proteína.
24.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , 2, 5, 6 ó 7, caracterizado además porque la expresión génica es detectada midiendo una característica del gen.
25.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque la característica medida se selecciona del grupo que consiste en amplificación, metilación, mutación y variación alélica de ADN.
26.- Un método para generar un informe del pronóstico de un paciente de cáncer de pulmón, caracterizado porque comprende los pasos de: determinar los resultados de cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 5, 6 ó 7; y preparar un informe que presente los resultados.
27.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque el informe contiene una determinación del resultado del paciente y/o la probabilidad de riesgo con respecto a la población de pacientes.
28.- Una composición, caracterizado porque comprende por lo menos un grupo de sondas seleccionadas del grupo que consiste en: los genes marcadores que corresponden a los seleccionados del cuadro 1 , cuadro 4, cuadro 5 o cuadro 7.
29.- Un equipo para hacer una prueba para determinar la prognosis del cáncer de pulmón en una muestra biológica, caracterizado porque comprende: materiales para detectar secuencias aisladas de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de las mismas, de una combinación de genes seleccionados del grupo que consiste en los genes marcadores que corresponden a los seleccionados del cuadro 1 , cuadro 4, cuadro 5 o cuadro 7.
30.- El equipo de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque comprende adicionalmente reactivos para hacer un análisis de microarreglo.
31.- El equipo de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque comprende adicionalmente un medio mediante el cual se prueban dichas secuencias de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de las mismas.
32.- Artículos para determinar el estado del cáncer de pulmón, que comprende: materiales para detectar secuencias aisladas de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de las mismas, de una combinación de genes seleccionados del grupo que consiste en los genes marcadores que corresponden a los seleccionados del cuadro 1 , cuadro 4, cuadro 5 o cuadro 7.
33.- Los artículos de conformidad con la reivindicación 32, caracterizados además porque comprenden adicionalmente reactivos para hacer un análisis de microarreglo.
34.- Los artículos de conformidad con la reivindicación 32, caracterizados además porque comprenden adicionalmente un medio mediante el cual se prueban dichas secuencias de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de las mismas.
35.- Un microarreglo o chip de gen, caracterizado porque se usa para realizar el método que se reclama en la reivindicación 1 , 2, 5, 6 0 7.
36.- El microarreglo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque comprende secuencias aisladas de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de las mismas, de una combinación de genes seleccionados del grupo que consiste en los genes marcadores que corresponden a los seleccionados del cuadro 1 , cuadro 4, cuadro 5 o cuadro 7.
37.- El mícroarreglo de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque la medición o caracterización es por lo menos 1.5 veces de sobreexpresión o subexpresión.
38.- El microarreglo de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque la medición provee un valor p de sobreexpresión o subexpresión estadísticamente significativo.
39.- El microarreglo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado además porque el valor p es menor de 0.05.
40.- El microarreglo de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque comprende un arreglo de ADNc o un arreglo de oligonucleótido.
41.- El microarreglo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado además porque comprende uno o más reactivos de control interno.
42.- Un portafolio diagnóstico/pronóstico, caracterizado porque comprende secuencias aisladas de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de las mismas, de una combinación de genes seleccionados del grupo que consiste en los genes marcadores que corresponden a los seleccionados del cuadro 1 , cuadro 4, cuadro 5 o cuadro 7.
43.- El portafolio de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque la medición o caracterización es por lo menos 1.5 veces de sobreexpresión o subexpresión.
44.- El portafolio de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado además porque la medición provee un valor p de sobreexpresión o subexpresión estadísticamente significativo.
45.- El portafolio de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado además porque el valor p es menor de 0.05.
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