CZ20012587A3 - Izolovaný protein, nukleová kyselina, virový vektor, farmaceutický prostředek, izolovaná populace T buněk, způsob posílení imunitní odpovědi, způsob odstranění nádorových buněk, způsob stimulace a/nebo namnoľení T buněk a způsob přípravy fúzního proteinu - Google Patents

Izolovaný protein, nukleová kyselina, virový vektor, farmaceutický prostředek, izolovaná populace T buněk, způsob posílení imunitní odpovědi, způsob odstranění nádorových buněk, způsob stimulace a/nebo namnoľení T buněk a způsob přípravy fúzního proteinu Download PDF

Info

Publication number
CZ20012587A3
CZ20012587A3 CZ20012587A CZ20012587A CZ20012587A3 CZ 20012587 A3 CZ20012587 A3 CZ 20012587A3 CZ 20012587 A CZ20012587 A CZ 20012587A CZ 20012587 A CZ20012587 A CZ 20012587A CZ 20012587 A3 CZ20012587 A3 CZ 20012587A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
protein
sequence
cells
neu
seq
Prior art date
Application number
CZ20012587A
Other languages
English (en)
Inventor
Martin A. Cheever
Dirk Gheysen
Original Assignee
Corixa Corporation
Smithkline Beecham
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Corixa Corporation, Smithkline Beecham filed Critical Corixa Corporation
Publication of CZ20012587A3 publication Critical patent/CZ20012587A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/43—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a FLAG-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Description

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY
Bez ohledu na obrovské investice jak finanční, tak intelektuální, rakovina zůstává jednou z největších příčin úmrtí. Například u žen mezi 35 a 74 lety je rakovina nečastější příčinou smrti. Rakovina prsu je nejběžnější rakovinou u žen a četnost jejího výskytu neustále narůstá. Bylo zjištěno, že tato choroba byla diagnostikována u jedné ženy z devíti. Standardní postupy pro léčbu rakoviny prsou jsou většinou kombinací chirurgického zákroku, ozařování a chemoterapie. V některých případech mohou tyto léčebné postupy být úspěšné. Bohužel, ve většině případů je rakovina prsu neléčitelná, pokud je diagnostikována po úvodní fázi. Proto je třeba neustále hledat další postupy včasné diagnostiky a nové terapie.
Běžnou charakteristickou nádorových chorob je nekontrolovaný buněčný růst. Rakovinné buňky podstoupí proces transformace z normálního fenotypu na nádorový fenotyp a jsou schopné nekontrolovatelného růstu. Zesílení a nepřiměřená exprese běžných somatických genů je první jev vedoucí k transformaci normální buňky na nádorovou. Maligní fenotypové charakteristiky kódované onkogeny se změní během buněčného dělení při vzniku transformovaných buněk. Alespoň 40 onkogenů spolupracujících v nádorových buňkách je zodpovědných nebo alespoň spolupracujících na transformaci. Tyto onkogeny byly rozděleny do několika skupin v závislosti • · · · · · • · · · · ná jejich přesné funkci, nebo lokalizaci produktu příslušného genu, kterým je protein exprimovaný onkogenem.
Onkogeny sou nezbytné pro některé aspekty normální buněčné fyziologie. V této souvislosti je HER-2/neu onkogen člen tyrosinkinázové rodiny glykoproteinových receptorů a sdílí vysoký stupeň podobnosti s receptorem epidermálního růstového faktoru (EGFR). HER-2/neu onkogen hraje důležitou roli při buněčném růstu a diferenciaci. HER-2/neu onkogen indukuje vznik nádorového onemocnění kvantitativním mechanizmem, jehož výsledkem je zvýšená nebo neregulovaná exprese normálního buněčného produktu.
Glykoprotein označovaný pl 85 je proteinový produkt HER-2/neu onkogenu. Tento onkogen amplifikován a tím je zvýšena exprese pl 85 v celé řadě různých typů rakoviny, jako je rakovina prsu, vaječníků, tlustého střeva, plic a prostaty. Exprese pl85 odpovídá míře maligní transformace a vyskytuje se v 50 až 60 % duktálních karcinomů, 20 až 40 % invazivních nádorů prsu a podstatné části adenokarcinomů vaječníků, prostaty, tlustého střeva a plic. Exprese HER2/neu onkogenu je úzce spjata nejenom s maligním fenotypem, ale také s agresivitou příslušného nádoru. Jeho zvýšená exprese odpovídá špatné prognóze jak u rakoviny prsu, tak u rakoviny vaječníků.
Protein pl 85 je transmembránová molekula s předpokládanou molekulovou hmotností asi 185 kD o délce 1255 aminokyselin. Obsahuje extracelulámí doménu (ECD) dlouhou 645 aminokyselin s minimálně 40 % identitou s EGFR, silně hydrofóbní transmembránovou doménu a intracelulární doménu (ICD) obsahující karboxy konec o délce 580 aminokyselin s alespoň 80 % identitou s EGFR.
Je třeba vyvinout protinádorovou vakcínu namířenou proti nádorům exprimujícím HER-2/neu onkogen, léčebný prostředek a způsob, jak vyvolat a zlepšit imunitní reakci proti produktům HER-2/neu genu. Navrhovaný vynález je zaměřen na tyto otázky a některé další faktory.
PODSTATA VYNÁLEZU
Navrhovaný vynález popisuje HER-2/neu p 185 fúzní proteiny, nukleové kyseliny kódující HER2/neu fuzní proteiny a virové vektory obsahující nukleotidové sekvence kódující HER-2/neu fúzní proteiny pro použití při imunizaci teplokrevných živočichů proti nádorovým onemocněním spojeným s nadměrnou expresí HER-2/neu onkogenu. Fúzní proteiny nebo nukleové kyseliny podle navrhovaného vynálezu mohou být přítomné v prostředku, který zahrnuje farmaceuticky přijatelný nosič, např. emulze olej ve vodě, a který dále může obsahovat některé další aktivní složky, kterými mohou být např. imunostimulační substance, jako jsou SBAS-2, 3D-MPL, QS21, • · · · · · · • ···· · · · «····· · · · · · · · nebo kombinace 3D-MPL a QS21. Prostředek podle navrhovaného vynálezu může být použitelný a měl by mít formu vakcíny. Fúzní proteiny, nukleové kyseliny, virové vektory, farmaceutické prostředky a/nebo vakcíny mohou být podávány jednorázově (pro jedince se zvýšeným rizikem vzniku nebo remise nádorového onemocnění, nebo v případě, že riziko vzniku nádorového onemocnění je vysoké) nebo v opakujících se cyklech (pro jedince se zvýšeným rizikem vzniku nebo remise nádorového onemocnění, nebo v případě, že riziko vzniku nádorového onemocnění je vysoké). Složky nebo prostředky podle navrhovaného vynálezu jsou použitelné při léčbě jednoho nebo více existujících nádorů, při prevenci vzniku nádoru nebo jeho prevenci u teplokrevných živočichů včetně lidí.
Navrhovaný vynález dále popisuje způsob inhibice nebo prevence vývoje rakoviny u pacientů vyvoláním nebo zlepšením imunitní odpovědi proti HER-2/neu proteinům, zahrnujícím podání farmaceutického prostředku nebo vakcíny pacientům. Pacienti mohou trpět rakovinou prsu, vaječníků, tlustého střeva, plic nebo prostaty, kdy v tomto případě navrhovaný způsob popisuje léčbu choroby, nebo u pacientů se zvýšeným rizikem vzniku těchto chorob, pak se jedná o prevenci. V jedné konkrétní variantě navrhovaného vynálezu je podání farmaceutického prostředku nebo vakcíny spojeno s transfekcí buněk teplokrevných živočichů ex vivo pomocí molekuly nukleové kyseliny podle navrhovaného vynálezu nebo infekcí buněk teplokrevných živočichů ex vivo virovým vektorem obsahujícím molekulu nukleové kyseliny podle navrhovaného vynálezu a následným doručením transfekovaného nebo infikované buňky do teplokrevného živočicha.
Navrhovaný vynález dále popisuje způsob odstraňování nádorových buněk z biologického vzorku zahrnujícího kontakt tohoto biologického vzorku s T buňkami specificky reagujícími s HER-2/neu fúzním proteinem, přičemž tento kontakt musí probíhat za takových podmínek a po natolik dostatečnou dobu, aby umožnil odstranění všech buněk exprimující příslušný protein ze vzorku. V rámci dalšího aspektu navrhovaného vynálezu je popisován způsob inhibice rozvoje rakoviny u pacientů zahrnující podání biologického vzorku ošetřeného, jak bylo popsáno výše, pacientovi. V další variantě navrhovaného vynálezu je popisován způsob stimulace a/nebo expanze T buněk specifických pro HER-2/neu fúzní protein zahrnující kontakt T buněk s: (i) fúzním proteinem, jak je popsán výše, (ii) polynukleotidem kódujícím tento fúzní protein a/nebo (iii) s antigen presentující buňkou, která exprimuje tento fúzní protein, za podmínek dostatečných pro umožnění stimulace a/nebo expanze T buněk. Izolované T buněčné populace obsahující T buňky připravené jak bylo popsáno výše, jsou také navrhovaným vynálezem ······ · ····· · • · · · · · ··· · ♦· · * »* · popsány. Navrhovaný vynález také popisuje způsob inhibice vzniku rakoviny u pacientů, zahrnující podání efektivního množství T buněčné populace, popsané výše, pacientovi.
V další konkrétní variantě navrhovaného vynálezu je popsán způsob inhibice rozvoje rakoviny u pacientů zahrnující: (a) inkubaci CD4+ a/nebo CD8+ T buněk izolovaných z pacientů, s: (i)
HER-2/neu fuzními proteiny (ii) polynukleotidem kódujícím tento fůzní protein a (iii) antigen presentující buňkou exprimující tento fůzní protein, (b) podání efektivního množství proliferujících T buněk pacientovi, což vyvolá inhibici rozvoje rakoviny u pacienta. Proliferující buňky mohou, ale nemusí, být před podáním do pacienta klonovány.
Navrhovaný vynález popisuje způsob přípravy HER-2/neu fúzního proteinu způsobem zahrnujícím kroky: (a) zavedením expresního vektoru obsahující polynukleotid kódující HER2/neu fůzní protein do buňky, (b) namnožení transfekovaných buněk a (c) přečištění exprimovaného proteinu. V nejvhodnější variantě navrhovaného vynálezu se jedná o CHO buňky. V další vhodné variantě jsou buňky inkubovány v suspenzi za bezsérových podmínek. Exprimovaný protein může být přečištěn ve dvou krocích zahrnujících iontoměničovou chromatografii na Q sepharóze na vysokotlaké koloně, a hydrofóbní chromatografií na fenyl sepharóze 6 za nízkého průtoku.
Tyto a další aspekty navrhovaného vynálezu se stanou zřejmé pomocí uvedených citací a následujícího detailního popisu a připojených kreseb. Všechny uvedené reference jsou připojeny jako citace.
Navrhovaný vynález popisuje prostředky schopné ovlivnění, zejména pak vyvolání nebo posílení imunitní reakce proti proteinovému produktu exprese onkogenu HER-2/neu včetně nádorů u teplokrevných živočichů, kde amplifíkovaný gen HER-2/neu v nádoru nevyžaduje expresi proteinového produktu přítomnou na nádoru. Například, zvýšená exprese genu může být spojena s iniciací a časnými stádii vývoje nádoru, ale exprese proteinu může být následně snížena nebo zcela potlačena. Navrhovaný vynález může být využit pro zlepšení efektivní imunitní reakce proti EER-2/neu pozitivním nádorům, navíc je využitelný pro prevenci vzniku HER-2/neu pozitivních nádorů a je schopen vyvolat regresi existujících nádorů exprimujících HER-2/neu protein. Používány jsou následující zkratky:
ECD - extracelulární doména
ICD - intracelulámí doména
PD - fosforylační doména (tzn. doména, na které probíhá fosforylace, která je uvnitř intracelulámí domény)
APD - je fragment fosforylační domény, který je uvnitř fosforylační domény • · ·· · · · · ··» ···· ··· • «····· · ····· · • · · · · · · · · 9 «· · · · · ·
KD - kinázová doména, která je uvnitř intracelulámí domény.
Produkt exprese HER-2/neu genu je zde označován jako HER-2/neu protein, dále je znám pod názvy pl 85 nebo c-erbB2.
HER-2/neu fúzní protein ECD-ICD je také označován jako ECD-ICD nebo ECD-ICD fúzní protein, popisuje fúzní protein (nebo jeho fragmenty) obsahující extracelulární doménu (nebo její fragmenty) a intracelulámí doménu (nebo její fragmenty) proteinu HER-2/neu. Jak je zde používán, ECD-ICD protein nezahrnuje podstatnou část transmembránové domény HER-2 /neu, lépe pak neobsahuje žádnou část transmembránové domény HER-2 /neu.
HER-2/neu ECD-PD fúzní protein, také označovaný jako ECD-PD nebo ECD-PD tužní protein, nebo HER-2/neu ECD-ÁPD fúzní protein, také označovaný jako ECD-ÁPD nebo ECD-ÁPD popisují fúzní proteiny nebo jejich fragmenty obsahující extracelulární doménu (nebo její fragmenty) a fosforylační doménu (nebo její fragmenty) proteinu HER-2/neu. Jak je zde používán, ECD-PD a ECD-ÁPD protein nezahrnuje podstatnou část transmembránové domény HER-2 /neu, lépe pak neobsahuje žádnou část transmembránové domény HER-2 /neu.
Termín HER-2/neu fúzní protein ECD-ICD a HER-2/neu fúzní protein ECD-PD a příbuzné termíny ve svém smyslu dále zahrnují jejich fragmenty, homology a funkční ekvivalenty (společně označované jako varianty), takové, do jakých je jedna aminokyselina vložena, deletována nebo nahrazena jinou aminokyselinou, nebo molekulou, kterou není aminokyselina, které v nej vhodnější variantě navrhovaného vynálezu buď (i) zvyšují rozvoj nebo posílení imunitní odpovědi vzhledem k HER-2/neu proteinu, nebo (ii) podstatně ovlivňují rozvoj nebo posílení imunitní odpovědi vzhledem k HER-2/neu proteinu (např. varianty stimulující odpověď pomocných T buněk, nebo cytotoxických T buněk, nebo stimulujících produkci protilátek. Specifickými nelimitujícími příklady variant včetně fragmentů, homologů a funkčních ekvivalentů HER-2/neu fúzního proteinu ECD-ICD a HER-2/neu fúzního proteinu ECD-PD jsou v detailu popsány dále. Tyto variant mohou být v podstatě identické, nebo velmi podobné fúznímu proteinu obsahujícímu přirozené polypeptidové složky a ponechávajícímu si schopnost stimulovat imunitní reakci.
Termín fúzní protein. Popisuje protein obsahující alespoň dva polypeptidy kovalentně spojené, kde jeden zpeptidů pochází z jedné proteinové sekvence nebo domény a druhý polypeptid pochází z jiné proteinové sekvence nebo domény. Polypeptidy mohou být spojeny buď přímo, nebo prostřednictvím kovalentní spojky, např. aminokyselinové spojky, jako je polyglycinová spojka nebo jiný typ chemické spojky, např. cukerná spojky, lipidická spojka, spojka tvořená mastnou kyselinou, spojka tvořená polyéterem, např. PEG, atd. (viz. Hermanson, Bioconjugate Techniques (1996)). Polypeptidy tvořící fúzní proteiny jsou obvykle napojeny C-koncem na Nkonec, ačkoliv je možné je také napojit C-koncem na C-koncem, N-koncem na N-konec nebo Nkoncem na C-konec. Polypeptidy fuzního proteinu mohou být v libovolném pořadí. Termín fúzní protein také popisuje konzervativně modifikované varianty, polymorfní varianty, alely, mutanty, následky mezi druhové homologie polypeptidy, které ovlivní strukturu fúzního proteinu. Fúzní proteiny mohou být připraveny kovalentním navázáním řetězce aminokyselin jedné proteinové sekvence na řetěz aminokyselin jiné proteinové sekvence, tzn. přípravou rekombinantního polynukleotidu kontinuálně kódujícího fúzní protein. Fúzní proteiny mohou obsahovat 2, 3, 4 nebo více různých řetězců aminokyselin ze stejného nebo různých zdrojů. Různé řetězce aminokyselin ve fúzním proteinu mohou být přímo napojeny nebo mohou být spojeny prostřednictvím chemické spojovací skupiny, nebo aminokyselinové skupiny. Fúzní proteiny mohou obsahovat i další složky, které jsou v detailu popsány dále.
Termín protein, jak je zde používán, je zaměnitelný s termínem polypeptid anebo peptid. Nukleové kyseliny popisují deoxyribonukleotidy nebo ribonukleotidy a jejich polymery buď v jedno nebo dvouřetězcové formě. Termín zahrnuje nukleové kyseliny obsahující známé nukleotidové analogy nebo modifikovaný řetězec zbytků, které jsou syntetické, přirozeně se vyskytující, i nepřirozeně se vyskytující, s podobnými vazebnými vlastnostmi, jako je to u nukleových kyselin a které jsou metabolizovány způsobem podobným nukleotidům. Příklady těchto analogů jsou např. fosforothioáty, fosforamidáty, methylfosfonáty, chirální methylfosfonáty, 2-O-methylribonukleotidy, komplexy peptid-nukleová kyselina (PNA).
Pokud není uvedeno jinak, konkrétní nukleotidová sekvence implicitně zahrnuje konzervativní modifikované varianty (např. degenerativní substituce kodónů) a komplementární sekvence, stejně jako sekvence výslovně uvedené. Degenerované substituce kodónů mohou být získány generováním sekvencí, kde na třetí pozici jednoho nebo více zvolených (nebo všech) kodónů probíhá substituce se smíšenou bází a/nebo skupinou deoxyinosinu (Batzer et al. (1991) Nucleic Acid. Res. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; Rossolini et al. (1994) Mol. Cell. Probec 8:91-98). Termín nukleová kyselina, jak je zde používán, je zaměnitelný s termínem gen, cDNA, mRNA, oligonukleotid a polynukleotid.
Polynukleotidová sekvence obsahující fúzní protein podle navrhovaného vynálezu hybridizuje za příslušných podmínek s nukleotidovou sekvencí kódující každého i individuálních polypeptidů tvořících fúzní protein. Polynukleotidová sekvence kódující individuální polypeptidy fúzního • · ·· ·· · · ··· ·«·· ··· polypeptidu tedy zahrnuje konzervativně modifikované varianty, polymorfní varianty, alely, mutanty, podsekvence a mezidruhové homology.
Procentuální sekvenční identita je stanovovány porovnáním dvou optimálně srovnaných sekvencí pomocí srovnávacího okénka, kde část polynukleotidové sekvence ve srovnávacím okénku může obsahovat adice nebo delece (spoje) vzhledem k referenční sekvenci (ta, která neobsahuj adice a delece) pro optimální nastavení těchto dvou sekvencí. Procentuální shoda je spočtena stanovením počtu pozic, ve kterých se nacházejí identické nukleotidy nebo aminokyseliny v obou sekvencích, čímž získáme počet shodných pozic a vydělíme počet shodných pozic celkovým počtem pozic ve srovnávacím okénku a vynásobením výsledku 100 tak, abychom získali procenta sekvenční identity. Termín podstatná identita polynukleotidové sekvence znamená, že polynukleotidy dosahují alespoň 25 % sekvenční identity. Procentuální identita může být v intervalu od 25 % do 100 %. Většina preferovaných variant má sekvenční identitu alespoň 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % až 99 % nebo vyšší, vzhledem k referenční sekvenci za použití popisovaného programu, nejlépe BLAST za použití standardních parametrů tak, jak jsou pospány výše. Odborník v oboru vidí, že tyto hodnoty mohou být upraveny tak, aby byla stanovena odpovídající identita proteinu kódovaných dvěma nukleotidovými sekvencemi srovnáním degenerace kodónů, aminokyselinové podobnosti, polohy čtecího rámce apod. V podstatě identické pro aminokyselinovou sekvenci znamená, pro potřeby navrhovaného vynálezu, sekvenční identitu alespoň 40 %. Vhodnější procentová identita polypeptidů může být v intervalu od 40 do 100 %. Ve vhodnějších variantách navrhovaného vynálezu je to alespoň 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, nebo 99 %. Polypeptidy, které jsou v podstatě stejné, sdílejí sekvenci, jak bylo uvedeno výše, kromě takových pozic, které nejsou identické a odlišují se pouze konzervativní aminokyselinovou záměnou. Konzervativní aminokyselinová záměna popisuje takovou náhradu aminokyselinových zbytků, které mají podobné postranní řetězce. Například skupina aminokyselin s alifatickým postranním řetězcem, jako je glycin, alanin, valin, leucin a izoleucin, skupina aminokyselin s hydroxyíovým postranním řetězcem, jako je serin a threonin, skupina aminokyselin s postranním řetězcem obsahujícím amid, jako je asparagin a glutamin, skupina aminokyselin s aromatickým postranním řetězcem, jako je fenylalanin, tyrozin a tryptofan, skupina aminokyselin s bazickým postranním řetězcem, jako je lysin, arginin a histidin a skupina aminokyselin obsahujících v postranním řetězci síru, jako je cystein a methionin. Nejvhodnější konzervativní aminokyselinové záměny jsou: valin-leucin-izoleucin, fenylalanin8 ·· ·· ·· · · ··· ···· · · • ······ · ····· · • · · · · · · ··· · ·· » · · · týrozin, lysin-arginin, alanin-valin, kyselina asparagová-kyselina glutamová a asparaginglutamin.
Optimální srovnání sekvencí pro porovnání může být odvozeno podle algoritmů Smith a Waterman (1981) Add. Apl. Math. 2:482, identifikačním algoritmem podle Needleman a Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443 a pomocí techniky vyhledávání podobnosti podle Pearson a Lipman (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 85:2444, pomocí počítačové implementace těchto algoritmů (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA a TFASTA v Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI) nebo pomocí vyhledávání.
Nej vhodnějším příkladem algoritmu vhodného pro stanovení procentuální sekvenční identity a sekvenční podobnosti jsou BLAST a BLAST 2.0 algoritmy popsané v Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 a Altschul et. al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. BLAST a BLAST 2.0 jsou používány s parametry popisovanými dále tak, aby byla stanovena procentuální sekvenční identita pro nukleové kyseliny a proteiny podle navrhovaného vynálezu. Software provádějící BLAST analýzu je veřejně dostupný prostřednictvím National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov). Kumulativní skóre je vypočteno za použití parametrů M (získaný počet párů shodných sekvencí, vždy větší než 0) a N (skóre neshodujících se zbytků je vždy menší než 0), pro nukleotidové sekvence. Pro aminokyselinové sekvence je tato hodnota vypočítávána jako kumulativní skóre. Postupování srovnání v každém směru je zastaveno: když kumulativní hladina skóre klesne pod hodnotu X z maximální dosažené hodnoty, kumulativní skóre klesne na nulu nebo níže, díky akumulaci jedné nebo více negativně započtených hodnot, nebo pokud je dosažen konec sekvence. Parametry algoritmu BLAST, WTX stanovují rychlost a citlivost srovnávání. Program BLASTN (pro nukleotidové sekvence) postupuje v předem zvolených krocích po 11 (W) a předpokládá (E) 10, M = 5, N = -4 a srovnává oba řetězce. Program BLASTP, pro aminokyselinové sekvence, používá předem zvolenou délku kroku 3 a předpokládá (E) 10 a BLOSUM62 skórovací hodnota (viz. Henikoff a Henikoff (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915) srovnání (B) 50, předpoklad (E) 10, M = 5, N = -4 a porovnává oba řetězce.
Dalším důkazem, že nukleotidové sekvence jsou v podstatě identické, je to, že dvě molekuly navzájem hybridizují, nebo hybridizují s třetí nukleotidovou kyselinou za středně, lépe pak vysoce přísných podmínek. Míra přísnosti hybridizačních podmínek je závislá na sekvenci a v různých případech bude různá. Další sekvence hybridizují specificky za vyšších teplot. Rozsáhlý popis hybridizačních technik nukleových kyselin je popsán v Tijssen, Techniques in • ······ · ····· · · • · · · ···· ··· · ·· · · ·· ···
Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Probes, „OverView of principles of hybridization and the stratégy of nucleic acid assays“ (1993). Obecně, přísné podmínky jsou zvoleny asi o 5 až 10 °C níže než bod tání (Tm) specifické sekvence při definované iontové síle pH. Tm je teplota (za definované iontové síly a pH), při které 50 % cílové sekvence dokonale hybridizuje se sondou. Obvykle přísné podmínky jsou ty, kde koncentrace soli je nižší, než asi 1,0 M sodných iontů, lépe pak asi 0,01 až 1,0 M sodných iontů (nebo jiných solí) při pH od 7 do 8,3 a teplota je alespoň 30 °C pro krátké sondy (10 až 50 nukleotidů) a alespoň asi 60 °C pro dlouhé sondy (více než 50 nukleotidů). Přísné podmínky mohou být také vytvořeny přidáním destabilizačního agens, kterým je například formamid. Pro selektivní a specifickou hybridizací je pozitivní signál brán pouze v případě alespoň dvojnásobku pozadí, lépe pak desetinásobku pozadí.
Příklad přísných hybridizačních podmínek může být: 50 % formamid, 5 x SSC a 1 % SDS, inkubace při 42 °C nebo 5 x SSC, 1 % SDS, inkubace při 65 °C s promýváním v 0,2 x SSC a 0,1 % SDC v 65 °C.
Pro účely navrhovaného vynálezu, středně přísné podmínky znamenají například promytí v roztoku 5 x SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0), hybridizace při 50 °C až 65 °C, 5 x SSC přes noc a promytí 2 x při 65 °C po dobu 20 minut s 2 x, 0,5 x a 0,2 x SSC, 0,1 % SDS. Takto hybridizované sekvence DNA také spadají do rámce navrhovaného vynálezu.
Proliferace T buněk, jak je zde popisována, zahrnuje množení T buněk stejně jako stimulaci T buněk vedoucí k množení, tzn. iniciace procesů vedoucích k mitóze a mitózu jako takovou. Způsoby detekce proliferace T buněk jsou popsány dále.
Fúzní proteiny podle navrhovaného vynálezu
A.Intra a extracelulámí domény HER-2/neu proteinu
HER-2/neu protein byl zvolen jako cíl protinádorové vakcíny na základě důkazů, které jsou popsány výše. Největším problémem tohoto postupuje izolovat dostatečné množství HER-2/neu proteinu. Jednou možností, jak vyřešit tento problém, je exprimovat ECD a ICD nezávisle v savčích buňkách. ECD je exprimována ve velkých kvantech jako sekvenční protein, tzn. asi 20 mg ECD proteinu bylo získáno z jednoho litru myší buněčné kultury. Bohužel míra exprese ICD byla nízká, tzn. pouze asi 0,2 mg ICD proteinu bylo získáno z jednoho litru HEK-293 buněk. Navíc vzniklý ICD protein byl v buněčném lyzátu velmi labilní a během přečišťování použitelných množství způsoboval celou řadu nečekaných problémů.
• ·
• · · · í : : t · • · · · · · • · • · · · ·
Jak je uvedeno výše, HER-2/neu je vlastní onkoprotein a imunologická tolerance k vlastním proteinům potlačuje imunitní reakci. Míra imunologické tolerance k různým částem konkrétního proteinu může záviset na tom, zda konkrétní část tohoto proteinu je exprimována uvnitř nebo z vnější strany buněčné membrány. ECD se nachází na buněčném povrchu a je uvolňována. Naopak ICD a všechny její součásti se obvykle nacházejí uvnitř buňky a nejsou uvolňovány. ECD tedy obvykle přichází do kontaktu s imunitním systémem, zatímco ICD je relativně od imunitního systému oddělena. Výsledkem je určitá imunologická tolerance k ECD, která je vyšší než tolerance k ICD části. HER-2/neu proteinu. Tedy pro vakcíny podle navrhovaného vynálezu ICD protein a ICD peptidy a jejich varianty, včetně PD proteinů a PD peptidů indukují relativně silnější intenzitu imunitní reakce než ECD protein a ECD peptidy. Ačkoliv ICD a její varianty jsou více imunogenní než ECD a její varianty, protilátky proti ECD a jejím variantám jsou přínosné a žádoucí. ECD se nachází na povrchu buněk, zatímco ICD a její součásti nejsou sekretovány a jsou udržovány uvnitř buňky. Tedy protilátková odpověď proti ECD může mít vyšší terapeutický přínos a i z tohoto důvodu je vhodnějším způsobem podle navrhovaného vynálezu. ECD sama o sobě není příliš imunogenní. Jelikož ICD (včetně PD a APD) jsou více imunogenní než ECD, ECD-ICD fúzní protein anebo ECD-PD fúzní protein je více imunogenní než ECD sama o sobě. ECD-ICD fúzní protein nebo ECD-PD fúzní protein bude tedy efektivnější pro indukci protilátek proti ECD než ECD samo o sobě a je preferovanou variantou navrhovaného vynálezu.
V navrhovaném vynálezu ECD nebo jeho varianty jsou kombinovány, napojeny nebo fúzovány (přímo nebo nepřímo) s ICD nebo jejími variantami, lépe pak s PC nebo jejími variantami. ECD představuje strukturu pro indukci protilátek, které reagují s HER-2/neu proteinem na buněčném povrchu, zatímco ICD nebo PD zvyšují imunogenicitu ECD. Tato kombinace je překvapivě efektivnější pro indukci imunitní odpovědi proti ECD než ECD sama o sobě.
ECD nebo části ECD mohou být kombinovány s ICD nebo jejími variantami, včetně částí ICD, jako je PD nebo její varianty a včetně částí PD (tzn. APD).
ECD podle navrhovaného vynálezu je nejvhodněji lidské, krysí, nebo myší ECD. Lidské ECD je zobrazeno na obr. 9. jako sekvence č. 3. Krysí ECD je zobrazeno na obrázku č. 14. jako sekvence č. 8.
ICD podle navrhovaného vynálezu je většinou lidská, krysí nebo myší ICD. Lidská ICD je zobrazena na obr. 7. jako sekvence č. 1 a zahrnuje oblast od Lys676 do Val 1255. Krysí ICD je zobrazena na obr. 8 jako sekvence č. 2 a zahrnuje oblasti do Lys677 do Vall256.
• r · · ·
··» · · · ·· ·· ·
FD podle navrhovaného vynálezu je většinou lidská, krysí nebo myší PD. Liská FD je zobrazena na obr. 10 jako sekvence č. 4. Lidská PD může být lidská APD, která je zobrazena na obr. 11 jako sekvence č. 5. Krysí PD je zobrazena na obr. 8 jako sekvence č. 2 a zobrazuje oblast od Gln991 do Val 1256. Krysí PD může být krysí APD, která je zobrazena na obr. 8 jako sekvence č. 2 a zahrnuje oblast Gln991 až Arg 1049.
V jedné konkrétní variantě může být lidské ECD fúzováno s buď (i) lidskou ICD nebo krysí ICD (ii) lidskou PD nebo APD nebo krysí PD nebo APD. V další variantě podle navrhovaného vynálezu krysí ECD může být fúzováno s (i) lidskou ICD nebo krysí ICD (ii) lidskou PD nebo APD nebo krysí PD nebo APD.
Oblast HER-2/neu PD je 268 aminokyselin dlouhá, intracelulámí a může být fosforylována proteinovou tyrosinkinázou. Tato oblast nesdílí žádnou identitu s odpovídající oblastí tyrosinkinázových receptorů. Tedy specifita a jedinečnost této domény jí činí velmi výhodnou pro použití v protinádorové vakcíně. Bohužel exprese této domény samotné v baktériích a savčích buňkách je problematické. Například výsledný PD protein je velmi labilní a nehodí se pro velkoobjemovou produkci. V jedné konkrétní variantě navrhovaného vynálezu je tento problém vyřešen fúzováním celé intracelulámí domény nebo fosforylační domény k celé části extracelulární domény proteinu HER-2/neu. ECD-ICD fúzní proteiny a ECD-PD fuzní proteiny podle navrhovaného vynálezu jsou rozpustné, sekretované a stabilní v kultivačním médiu. Pomocí tohoto systému je možné vyprodukovat velké množství intracelulámí domény nebo fosforylační domény pro přípravu protinádorové vakcíny, zejména vakcíny proti rakovině prsu, tato vakcína je však použitelná proti všem druhům rakoviny charakteristickým expresí HER2/neu proteinu. Pro další zvýšení exprese intracelulámí domény nebo fosforylační domény, nebo jejich variant ve formě fúzních proteinů s extracelulární doménou nebo jejími variantami, ECDICD a ECD-PD fúzní proteiny představují vylepšenou formu protinádorové vakcíny.
PD je sekretována pomocí zavedení sekretorní signální sekvence před N-konec PD tak, aby byl získán rozpustný sekretorický rekombinantní protein. Sekreční proces je preferovaný, neboť rekombinovaný protein se hromadí v kultivačním médiu. Neboť tento protein není asociován s jinými intracelulárními proteiny, nedochází k proteolýze. Tento protein poté může být přečištěn snadněji a levněji.
Jak popisuje příklad 3, pFLAGCMV-1 expresní plazmid (Kodak) je použit pro stanovení, která oblast HER-2/neu intracelulámí domény je schopna sekrece. Proteiny jsou exprimovány jako fúzní proteiny s preprotrypsin sekrečním signálem a FLAG-tag na N-konci. HEK-293 buňky byly transfekovány tímto konstruktem a kultivační médium bylo testováno na přítomnost FLAG-tag fúzních proteinů pomocí western blotu pomocí FLAG-tag M2 protilátky jako sondy. Výsledky na obr. 4 ukazují, že nebyla sekretována plná délka ICD ani KD, ale PD byla rozpustná, sekretována a detekovatelná v kultivačním médiu. Tyto výsledky ukazují, že plná délka struktury ICD nebo KD není schopná projít standardní sekretorní drahou proteinů skrz buněčnou membránu.
Jak popisuje příklad 4, jelikož ECD obsahuje sekretorní signální sekvenci a může být exprimována dobře, jako sekretorní protein, bylo ECD použito jako fuzní partner pro PD. ECDPD fúzní protein byl exprimován v HEK-293 buňkách. Sekrece rozpustného ECD-PD fúzního proteinu byla stanovena ELISA technikou pomocí HER-2/neu ECD specifických protilátek a následně western blotem pomocí HER-2/neu specifických protilátek. Jak ukazuje obr. 6, rozpustné ECD-PD proteiny exprimované v HEK-293 byly sekretovány do kultivačního média.
B. Imunogenicita fuzní ch proteinů podle navrhovaného vynálezu
Nejvhodnější varianta navrhovaného vynálezu je zaměřena na fúzní protein složený z konkrétních částí (tzn. HER-2/neu fúzní protein ECD-ICD nebo HER-2/neu fúzní protein ECD-PD) proteinu, expresního produktu HER-2/neu genu, který je schopen vyvolat protilátkovou odpověď a může být rozeznán T lymfocyty. Z toho vyplývá, že imunitní reakce T buněk může být používána v profylaktickém režimu nebo pro léčbu nádorů, u kterých je prokázána zvýšená exprese HER-2/neu proteinu. V další variantě navrhovaného vynálezu je popisováno použití molekul nukleové kyseliny kódujících tento ECD-ICD fuzní protein nebo ECD-PD fúzní protein nebo jejich varianty, samostatně nebo ve formě virového vektoru.
Obecně, CD4+ T buněčné populace fungují jako pomocné buňky a induktory prostřednictvím uvolňováním lymfokinů po stimulaci specifickým antigenem, přesto část CD4+ buněk může fungovat jako cytotoxické T lymfocyty (CTL). Podobně CD8+ buňky fungují jako buňky přímo likvidující antigenní cíle, přesto v celé řadě případů mohou sekretovat lymfokiny, kterými zajišťují pomocnou nebo DTH funkci. Bez ohledu na překrývající se funkce, fenotypy CD4 a CD8 znaků jsou spojeny s rozeznáváním peptidů na MHC antigeny třídy I nebo II. Rozeznávání antigenů v kontextu třídy I nebo třídy II opravňuje CD4+ a CD8+ buňky reagovat na různé antigeny, nebo stejné antigeny prezentované za různých okolností. Vazba imunogenního peptidu na MHC třídy II obvykle probíhá v případě antigenů zpracovávaných antigen prezentujícím buňkami. Jak je popisováno v navrhovaném vynálezu, ECD-ICD fúzní protein nebo ECD-PD fúzní protein, jako expresní produkt HER-2/neu onkogenu je rozeznáván T buňkami. Rozpuštěný HER-2/neu fúzní protein ECD-ICD nebo HER-2/neu fúzní protein ECD-PD je degradován na peptidové fragmenty. Peptidové fragmenty z ECD-ICD fúzního proteinu nebo ECD-PD fúzního proteinu se vážou na MHC antigeny. Pomocí spektra peptidů navázaných na MHC antigeny na povrchu buňky a jejich rozeznání T buňkami v kombinaci peptid + vlastní MHC antigen, HER2/neu luzní protein ECD-ICD nebo HER-2/neu fúzní protein ECD-PD (včetně těch, které jsou exprimovány na maligních buňkách ) se stávají imunogenní pro T buňky. Specifíta T buněčného receptoru umožňuje jednotlivým T buňkám rozlišit mezi proteinovými fragmenty, které se odlišují v jediné aminokyselině. Během imunitní reakce proti peptidovému fragmentu z HER2/neu fúzního proteinu ECD-ICD nebo HER-2/neu fúzního proteinu ECD-PD T buňky exprimují T buněčný receptor s vysokou afinitou vázající peptid v komplexu s MHC a tím se stávají aktivované a je u nich vyvolána proliferaění reakce. V prvním okamžiku po setkání s peptidem pouze malé množství T buněk sekretuje lymfokiny, proliferuje a diferencuje se na efektorové a paměťové T buňky. Primární imunitní odpověď probíhá in vivo, ale je obtížné je detekovat in vitro. Při dalším setkání se stejným antigenem paměťové T buňky rozběhnou imunitní odpověď daleko rychleji a v daleko silnější intenzitě. Sekundární reakce probíhá jak in vivo, tak in vitro. In vitro reakce je snadno stanovitelná měřením intenzity reakce, mírou produkce cytokinů, nebo stanovením cytolytické aktivity T buněčné populace reagující na antigen. Konkrétní intenzita proliferaění reakce T buněčné populace proti konkrétnímu antigenu je vztažena na intenzitu proliferace před podáním antigenu.
C. Fúzní proteiny podle navrhovaného vynálezu
V jedné konkrétní variantě navrhovaného vynálezu jsou popisovány HER-2/neu fuzní proteiny ECD-ICD, jejich varianty nebo polynukleotidy, které kódují tyto HER-2/neu fúzní proteiny ECD-ICD. Nejvhodnější nukleotidové kyseliny jsou DNA. U HER-2/neu fúzních proteinů ECDICD podle navrhovaného vynálezu mohou být ECD a ICD polypeptidy spojeny přímo nebo pomocí spojky, např. aminokyseliny nebo jiného typu chemické spojky. V nejvhodnější variantě HER-2/neu fúzní protein ECD-ICD složen z kompletní části HER-2/neu ECD fúzované přímo na celou část HER-2/neu ICD.
V další variantě velikost ECD v ECD-ICD fúzním proteinu může být pozměněna postupným odstraňováním od 1 do asi 100 aminokyselin z karboxy-konce ECD, nejlépe asi 100 aminokyselin. Podobně velikost ICD v ECD-ICD fúzním proteinu může být pozměněna postupným odebíráním od 1 do asi 100 aminokyselin od N-konce a/nebo od C-konce ICD. Výsledná varianta může být zvolena na základě antigenicity a/nebo imunogenicity za použití příslušných testovacích technik, které jsou popsány v literatuře anebo zde v popisu navrhovaného vynálezu.
• · ·· ·· ·· ··· ···· ··· ··«··· · ····· ·
V jiné variantě prostředek podle navrhovaného vynálezu zahrnuje HER-2/neu fúzní protein ECD-PD, jeho varianty, nebo molekulu nukleové kyseliny kódující tento HER-2/neu fúzní protein ECD-PD. V jedné variantě HER-2/neu ECD je fúzován s HER-2/neu APD. Je vhodné, aby nukleové kyseliny byly molekuly DNA. V HER-2/neu fúzním proteinu ECD-PD mohou být ECD, PD nebo APD polypeptidové komponenty přímo fúzovány nebo spojeny spojkou, např. peptidem. V nejvhodnější variantě je HER-2/neu fúzní protein ECD-PD podle navrhovaného vynálezu složen z HER-2/neu ECD fúzovaného přímo na HER-2/neu PD nebo na HER-2/neu APD. Zde a dále v popisu je nejvhodnější variantou fúzního proteinu podle navrhovaného vynálezu HER-2/neu PD fúzní protein.
V jiné variantě velikost ECD v ECD-PD fúzním proteinu je měněna postupným odstraňováním od 1 do asi 100 aminokyselin z karboxy-konce ECD, nejlépe asi 100 aminokyselin. Podobně velikost PD v ECD-PD fúzním proteinu může být pozměněna postupným odebíráním aminokyselin od N-konce PD. Nejvhodnější variantou je PD. Výsledná varianta může být zvolena na základě antigenicity a/nebo imunogenicity za použití příslušných testovacích technik, které jsou popsány v literatuře anebo zde v popisu navrhovaného vynálezu.
Tabulka 1 ukazuje, že odstranění 100 aminokyselin zkarboxy konce ECD nemá vliv na míru exprese a stabilitu ECD-PD fúzního proteinu.
TABULKA 1 zkrácené ECD-PD, shrnutí
Klon oblast delece (bp/aa) počet bp počet aa relativní exprese
A5 1655-1882/552-628 228 76 ***
B4 1660-1866/ 554-622 207 69 **
B9 1595-1891 /532-631 297 99 ***
C2 1681-1902/ 561-634 222 74 *
C7 1612-1902/ 538-634 291 97 )|e * jf: ajc
F10 1634-1951 / 545-651 318 106 ****
ECD-PD WT - - - *
Varianty ECD-ICD fúzního proteinu a ECD-PD fúzního proteinu také zahrnují různé strukturní formy přirozeného ECD-ICD fúzního proteinu a ECD-PD fúzního proteinu. Díky přítomnosti ionizovatelných amino- a karboxy- skupin může být HER-2/neu fúzní protein ECD-ICD nebo ECD-PD ve formě kyseliny, bazické soli nebo v neutrální formě. Nezávislé aminokyselinové skupiny mohou být také modifikovány oxidací nebo redukcí.
··· · ·· ·· *· ···
Další varianty v rámci navrhovaného vynálezu popisují ECD-ICD fúzní proteiny nebo ECD-PD fúzní proteiny, kde primární aminokyselinová struktura přirozeného HER-2/neu ECD-ICD proteinu nebo nativního HER-2/neu ECD-PD proteinu je modifikována tvorbou kovalentních nebo agregujcích konjugátů s jinými peptidy nebo polypeptidy, chemickými skupinami, jako jsou glykosyly, lipidy, fosfáty, acetylové skupiny a podobně. Kovalentní deriváty mohou být připraveny například vazbou konkrétní funkční skupiny na postranní řetězec aminokyseliny nebo na její N- či C-konec. Navrhovaný vynález dále popisuje HER-2/neu fúzní protein ECD-ICD a HER-2/neu fúzní protein ECD-PD s nebo bez glykosylace. ECD-ICD fúzní protein a ECD-PD fuzní protein je exprimován v kvasinkách nebo v savčím expresním systému a může být podobný nebo lehce odlišný v co se molekulární hmotnosti a exprese týče od nativní molekuly v závislosti na použitém expresním systému. Exprese DNA kódujícího polypeptidů v baktériích, jako jsou E. coli, typicky dává vzniknout neglykosylovaným molekulám. N-glykosylační místa eukaryotických proteinů charakteristická aminokyselinovou sekvencí ASN-A1-Z, kde Al je jakákoliv aminokyselina kromě Pro a Z je Ser nebo Thr. Varianty HER-2/neu ECD-ICD nebo ECD-PD fúzních proteinů mají inaktivovaná N-glykosylační místa a mohou být produkována technikami známými v současném stavu techniky, jako je syntéza oligonukleotidů a ligace, specifická mutageneze, které jsou popisovány v rámci navrhovaného vynálezu. Další možností je, že N-glykosylační místa mohou být přidána do HER-2/neu fúzního proteinu ECD-ICD nebo ECD-PD.
ECD-ICD fúzní proteiny podle navrhovaného vynálezu, což samozřejmě zahrnuje varianty, zahrnují také možné kombinace lidských a ne-lidských peptidů. Ne-lidské peptidy mohou být polypeptidy z jakéhokoliv savce, jako je např. krysa, myš,morče, kůň, kráva, práce, ovce, pes atd.
V jedné variantě ECD-ICD fúzní proteiny zahrnují:
(i) lidské ECD-lidské ICD fúzní proteiny, které jsou vytvořeny spojením lidského ECD, obr. 9 (sekvence č. 3) s lidským ICD, jehož aminokyselinová sekvence zahrnuje Lys676 až Vall255, jak je zobrazeno na obr. 7 (sekvence č.l) s nebo bez chemických aminokyselinových spojek a jejich varianty.
(ii) krysí ECD-krysí ICD fúzní proteiny, které jsou vytvořeny spojením krysího ECD, obr.
(sekvence č. 8) s krysím ICD, jehož aminokyselinová sekvence zahrnuje Lys677 až Vall256, jak je zobrazeno na obr. 8 (sekvence č.2) s nebo bez chemických aminokyselinových spojek a jejich varianty.
(iii) lidská ECD-krysí ICD fúzní proteiny, které jsou vytvořeny spojením lidská ECD, obr.
(sekvence č. 3) s krysím ICD, jehož aminokyselinová sekvence zahrnuje Lys677 až ·· ···· »· · ··« · * · · * » · ·
Vall256, jak je zobrazeno na obr. 8 (sekvence č.2) snebo bez chemických aminokyselinových spojek a jejich varianty.
(iv) krysí ECD-lidská ICD fúzní proteiny, které jsou vytvořeny spojením krysího ECD, obr. 14 (sekvence č. 8) a lidská ICD, jehož aminokyselinová sekvence zahrnuje Lys676 až Val 1255, jak je zobrazeno na obr. 7 (sekvence č.l) s nebo bez chemických aminokyselinových spojek a jejich varianty.
Jakékoliv varianty ECD-ICD fúzních proteinů podle navrhovaného vynálezu jsou zahrnují ve variantách navrhovaného vynálezu. V jedné variantě toho vynálezu jsou tyto varianty v podstatě identické, nebo velmi podobné přirozenému HER-2/neu ECD-ICD proteinu a ponechávají si schopnost stimulovat imunitní odpověď. Lidská DNA sekvence kódující ECD protein je zobrazena na obr. 15 (sekvence č. 9) a zahrnuje nukleotidy 1 až 1959. Lidská DNA sekvence kódující ICD protein je zobrazena na obr. 15 (sekvence č. 9) a zahrnuje nukleotidy 2026 až 3765. Vliv jakékoliv sekvenční modifikace na schopnosti HER-2/neu ECD-ICD fúzního proteinu indukovat imunitní reakci musí být stanovena, například analýzou schopnosti mutovaného HER2/neu ECD-ICD fúzního proteinu indukovat T buněčnou odpověď za použití technik zde popsaných, nebo analýzou schopnosti mutovaného HER-2/neu ECD-ICD fúzního proteinu stimulovat produkci protilátek.
ECD-PD fúzní proteiny podle navrhovaného vynálezu, což samozřejmě zahrnuje varianty, zahrnují také možné kombinace lidských a ne-lidských peptidů. Ne-lidské peptidy mohou být polypeptidy z jakéhokoliv savce, jako je např. krysa, myš,morče, kůň, kráva, práce, ovce, pes atd. V jedné variantě ECD-PD fúzní proteiny zahrnují;
(i) lidské ECD-lidské PD fúzní proteiny, zobrazené na obr. 12 (sekvence č. 6) a jejich varianty, včetně fúzních proteinů, které jsou vytvořeny spojením lidského ECD, obr. 9 (sekvence č. 3) s lidským PD obr. 10 (sekvence č. 4) snebo bez chemických aminokyselinových spojek a jejich varianty.
(ii) krysí ECD-krysí PD fúzní proteiny, které jsou vytvořeny spojením krysího ECD, obr. 14 (sekvence č. 8) s krysím PD, jehož aminokyselinová sekvence zahrnuje Gln991 až Vall256, jak je zobrazeno na obr. 8 (sekvence č.2) snebo bez chemických aminokyselinových spojek a jejich varianty.
(iii) lidská ECD-krysí PD fúzní proteiny, které jsou vytvořeny spojením lidská ECD, obr. 9 (sekvence č. 3) s krysím PD, jehož aminokyselinová sekvence zahrnuje Gln991 až Vall256, jak je zobrazeno na obr. 8 (sekvence č.2) snebo bez chemických aminokyselinových spojek a jejich varianty.
(iv) krysí ECD-lidská PD fúzní proteiny, které jsou vytvořeny spojením krysího ECD, obr. 14 (sekvence č. 8) a lidská PD obr. 10 (sekvence č.4) s nebo bez chemických aminokyselinových spojek a jejich varianty.
Jakékoliv varianty ECD-PD fúzních proteinů podle navrhovaného vynálezu jsou zahrnují ve variantách navrhovaného vynálezu. V jedné variantě toho vynálezu jsou tyto varianty v podstatě identické, nebo velmi podobné přirozenému HER-2/neu ECD-PD proteinu a ponechávají si schopnost stimulovat imunitní odpověď. Lidská DNA sekvence kódující ECD protein je zobrazena na obr. 15 (sekvence č. 9) a zahrnuje nukleotidy 1 až 1959. Lidská DNA sekvence kódující PD protein je zobrazena na obr. 15 (sekvence č. 9) a zahrnuje nukleotidy 2968 až 3765. Vliv jakékoliv sekvenční modifikace na schopnosti EÍER-2/neu ECD-PD fúzního proteinu indukovat imunitní reakci musí být stanovena, například analýzou schopnosti mutovaného HER2/neu ECD-PD fúzního proteinu indukovat T buněčnou odpověď za použití technik zde popsaných, nebo analýzou schopnosti mutovaného HER-2/neu ECD-PD fúzního proteinu stimulovat produkci protilátek.
V další variantě ECD-PD fúzní proteiny jsou ECD-APD fúzní proteiny podle navrhovaného vynálezu, což samozřejmě zahrnuje varianty, zahrnují také možné kombinace lidských a nelidských peptidů. Ne-lidské peptidy mohou být polypeptidy z jakéhokoliv savce, jako je např. krysa, myš,morče, kůň, kráva, práce, ovce, pes atd. V jedné variantě ECD-APD fúzní proteiny zahrnují:
(i) lidské ECD-lidské APD fúzní proteiny, zobrazené na obr. 13 (sekvence č. 7) a jejich varianty, včetně fúzních proteinů, které jsou vytvořeny spojením lidského ECD, obr. 9 (sekvence č. 3) s lidským APD obr. 11 (sekvence č. 5) s nebo bez chemických aminokyselinových spojek a jejich varianty.
(ii) krysí ECD-krysí APD fúzní proteiny, které jsou vytvořeny spojením krysího ECD, obr. 14 (sekvence č. 8) s krysím APD, jehož aminokyselinová sekvence zahrnuje Gln991 až Argl049, jak je zobrazeno na obr. 8 (sekvence č.2) s nebo bez chemických aminokyselinových spojek a jejich varianty.
(iii) lidská ECD-krysí APD fúzní proteiny, které jsou vytvořeny spojením lidská ECD, obr. 9 (sekvence č. 3) s krysím APD, jehož aminokyselinová sekvence zahrnuje Gln991 až Argl049, jak je zobrazeno na obr. 8 (sekvence č.2) s nebo bez chemických aminokyselinových spojek a jejich varianty.
• « ♦ · (iv) krysí ECD-lidská APD fúzní proteiny, které jsou vytvořeny spojením krysího ECD, obr. 14 (sekvence č. 8) a lidská ÁPD obr. 11 (sekvence č.5) s nebo bez chemických aminokyselinových spojek a jejich varianty.
Jakékoliv varianty ECD-ÁPD fúzních proteinů podle navrhovaného vynálezu jsou zahrnují ve variantách navrhovaného vynálezu. V jedné variantě toho vynálezu jsou tyto varianty v podstatě identické, nebo velmi podobné přirozenému HER-2/neu ECD-ÁPD proteinu a ponechávají si schopnost stimulovat imunitní odpověď. Lidská DNA sekvence kódující ECD protein je zobrazena na obr. 15 (sekvence č. 9) a zahrnuje nukleotidy 1 až 1959. Lidská DNA sekvence kódující ÁPD protein je zobrazena na obr. 15 (sekvence č. 9) a zahrnuje nukleotidy 2968 až 3144. Vliv jakékoliv sekvenční modifikace na schopnosti HER-2/neu ECD-ÁPD fúzního proteinu indukovat imunitní reakci musí být stanovena, například analýzou schopnosti mutovaného HER-2/neu ECD-ÁPD fúzního proteinu indukovat T buněčnou odpověď za použití technik zde popsaných, nebo analýzou schopnosti mutovaného HER-2/neu ECD-ÁPD fúzního proteinu stimulovat produkci protilátek.
V nejvhodnější variantě je HER-2/neu ECD-PD fúzní protein podle navrhovaného vynálezu ECD-PD fúzní protein.
V několika konkrétních variantách fúzní proteiny podle navrhovaného vynálezu mohou obsahovat fúzního partnere, jako je např. imunologický fúzní partner, nebo posilovač exprese. Fúzní partner může například spolupracovat na vytváření epitopu pro pomocné T buňky (imunologický fúzní partner), nejlépe T buněčný epitop rozeznávaný lidskými pomocnými T buňkami, nebo může napomáhat expresi fúzního proteinu (posilovač exprese) tak, aby bylo dosaženo vyšších výtěžků rekombinantního fúzního proteinu. Někteří vhodní fúzní partneři mají funkce jako imunologické, tak posilující expresi. Dalším fúzním partnerem může být molekula zvyšující rozpustnost fúzního protein u nebo umožňující fúznímu proteinu směrování do cílové oblasti. Dalšími fúzními partnery mohou být např. afinitní tágy umožňující přečišťování fúzního proteinu.
Dále jsou popisovány fúzní proteiny obsahující fúzní polypeptidy tak, jak jsou zde popisovány, zároveň s nepříbuzným imunogenním proteinem. Je vhodné, aby tento imunogenní protein byl schopný vyvolat silnou reakci. Příklady těchto proteinů jsou tetanový toxoid, tuberkulin a hepatotoxin (viz. např. Stoute et al. (1997) New Engl. J. Med. 336:86-91). V další variantě je imunologický fúzní partner odvozen od protein D, povrchového proteinu gram-negativní baktérie Haemophilus Influenza B (WO 91/18 926). Je vhodné, aby deriváty proteinu D obsahovaly přibližně první třetinu tohoto proteinu (tzn. prvních 100 až 110 aminokyselin od N-konce) a « · deriváty proteinu D mohou být lipidovány. V některých preferovaných variantách prvních 109 aminokyselin lipoproteinu D je připojeno na N-konec, čímž je získán fúzní protein s dalšími exogenními T buněčnými epitopy, který zvyšuje míru exprese v E.coli (tím funguje zároveň jako posilovač exprese). Lipidický řetězec zajišťuje optimální prezentaci fúzního proteinu antigen prezentujícím buňkám. Dalšími fúzními partnery jsou nestrukturální proteiny chřipkového viru, NS1 (hemaglutinin). Obvykle je používáno prvních 81 aminokyselin od N-konce, ačkoliv je možné použít i jiné fragmenty obsahující epitopy pomocných T buněk.
V další variantě je imunologickým fúzním partnerem protein známý jako LYTA, nebo jeho části (zejména C-konec). LYTA pochází z Streptococcus Pneumoniae, produkujícím N-acetyl-Lalaninamidázu, známou jako amidáza LYTA (kódována genem LytA, Gene 43:265-292, 1986). LYTA je autolysin specificky degradující některé vazby peptidoglykanové kostry. C-terminální doména LYTA proteinu je zodpovědná za afinitu k cholinu nebo k některým cholinovým analogům, jako jsou DEAE. Tato vlastnost byla využita pro vývoj E.coli C-LYTA expresního plazmidu použitelného pro expresi fúzních proteinů. Přečištění hybridních proteinů obsahujících C-LYTA fragment na amino konci již bylo pospáno (Biotechnolgy 10:795-798, 1992).
V nejvhodnější variantě opakované části řetězce LYTA mohou být vloženy do fúzního proteinu. Opakující se část se nachází na C-terminálním konci a začíná na aminokyselině 178. Nejvhodnější část této opakující se sekvence je v oblasti 188 až 305.
V nej vhodnější variantě fúzní proteiny obsahují fúzní partnery. Preferovanými fuzními partnery mohou být např. Ral2 nebo LelF. Konkrétně navrhovaný vynález popisuje způsob použití Ral2 nebo LelF sekvencí jako fúzních partnerů pro zajištění stabilního a vysokého výtěžku exprese rekombinantních fúzních polypeptidů, nebo pro potlačení tolerance. Ral2 je 14 kD C-terminální fragment MTB32A kódující sekvence z M.tuberculosis, který je exprimován sám o sobě s vysokou efektivitou a během přečišťování zůstává rozpustný. LelF je antigen z Leishmanie, který je homologní eukaryotnímu ribozomálnímu proteinu elF a který je schopný stimulace Thl a/nebo CTL imunitní reakce (viz. např. patent US 5 876 966, US 5 876 735 a US 5 879 687). Navrhovaný vynález využívá vlastností polypeptidů Ral2 a LelF a popisuje rekombinantní molekuly nukleové kyseliny, expresní vektory, hostitelské buňky a způsoby stabilního a vysokého výtěžku exprese fúzních polypeptidů obsahujících kromě HER-2/neu fúzních proteinů polypeptidy Ral2 nebo LelF. Rekombinantní nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptidy obsahující Ral2 nebo LelF a fúzní proteiny podle navrhovaného vynálezu mohou být připraveny pomocí standardních technik genového inženýrství. Rekombinantní nukleové kyseliny jsou připraveny tak, aby polynukleotidové sekvence fúzních partnerů byly umístěny směrem na 5‘ ·
vzhledem k zvolené sekvenci fúzního proteinu. Někdy může být výhodou umístit polynukleotidovou sekvenci fúzního partnera v 3‘ směru vzhledem k polynukleotidové sekvenci fúzního proteinu, který připravujeme, nebo vložit polynukleotidovou sekvenci fúzního proteinu do místa mezi fúzními partnery polynukleotidu. Jakýkoliv vhodný polynukleotid kódující fúzního partnera, jeho část, nebo variantu tak, jak je zde popsáno, může být použit pro přípravu rekombinantních aminokyselin kódujích fúzní proteiny podle navrhovaného vynálezu.
Nukleové kyseliny kódující fúzní partnery podle navrhovaného vynálezu mohou být připravovány jakoukoliv vhodnou metodou známou v současném stavu techniky. Příklady těchto technik mohou zahrnují klonování a restrikci vhodných sekvencí, nebo přímou chemickou syntézu, technikou, jako je např. fosfotriesterová technika podle Narag et al. (1979) Meth. Enzymol., 68:90-99, fosfodiesterová technika podle Brown et al. (1979) Meth. Enzymol., 68: 109-151, diethyfosforamidová technika podle Beaucage et al. (1981) Tetra Lett., 22:1859-1862 a syntézou v pevné fázi. Patent US 4 458 066.
Rekombinantní nukleové kyseliny kódující fúzní polypeptidy obsahující fúzní partnery a požadované fúzní proteiny mohou být připraveny za použití techniky známé v současném stavu techniky. Jak je uvedeno výše, rekombinantní nukleové kyseliny jsou připraveny tak, aby polynukleotidové sekvence fúzních partnerů v 5‘ směru vzhledem k polynukleotidové sekvenci kódující požadovaný protein. Polynukleotidové sekvence kódující fúzní partnery a fúzní proteiny mohou být také pozměněny, aby byla zajištěna jejich fúze a následná exprese.
Rekombinantní nukleové kyseliny mohou dále obsahovat další nukleové sekvence, jako jsou např. sekvence kódující afinitní tágy, které umožňují přečištění proteinu.
D. Varianty fúzních proteinů podle navrhovaného vynálezu
CD4+ T buňky obvykle rozeznávají antigeny, které jsou odvrhovány nádorovými buňkami. Naopak, za normálních podmínek vazba peptidů na MHC třídy I je možná pouze u proteinů přítomných vcytoplazmě a syntetizovaných pouze cílovou buňkou, proteiny pocházející z vnějšího prostředí jsou nepřípustné. Výjimkou z tohoto případu je vazby exogenních peptidů s přesným vazebným motivem pro třídu I, které se nacházejí vně buněk ve vysoké koncentraci. Tedy, CD4+ aCD8+ T buňky mají velmi odlišné funkce a rozeznávají zcela odlišné typy antigenů v závislosti na tom, kde se příslušný antigen nachází.
Dalším příkladem přípravy aminokyselinové substituce pro produkci variant podle navrhovaného vynálezu je identifikace a nahrazení aminokyselin v T buněčném motivu s potenciální vazbou na molekuly MHC třídy II (pro CD4+ T buněčnou odpověď) nebo MHC třídy I (pro CD8+ T • « «9 » · * · « a« · · · * a ···« <··<··· · · 9 « · · « · • · λ · a « * »·· · ·« «· · · ·· buněčnou odpověď). Peptidové segmenty (HER-2/neu ECD-ICD nebo ECD-PD fúzních proteinů) s motivem, který by se teoreticky měl vázat na molekuly MHC třídy II, mohou být identifikovány pomocí počítačové analýzy. Například analyzační software na proteinové sekvence, T Sites, zahrnující některé počítačové algoritmy určené pro rozeznání potenciálních míst rozeznávaných T buňkami (Feller et al. (1991), Nátuře, 349:720-721). Dva vyhledávací algorytmy jsou používány: 1) AMPHI algoritmus popisovaný v Feller et al. (1991), Nátuře, 349:720-721, identifikuje motivy epitopů podle alfa-helikální periodicity a amfipathicity, 2) Rothbard and Taylor algorytmus identifikující epitopy podle náboje a polarity (Rothbard et al. (1988), EMBO, 7:93-100). Segmenty obsahující oba motivy jsou pravděpodobně nejvhodnější pro vazbu na MHC II molekuly. CD8+ T buňky rozeznávají peptidy s vazbou na MHC I molekuly. Parker et al. (1994), J. Immunol., 152-163, zjistil, že peptidy vázající se na příslušné MHC molekuly sdílejí podobný sekvenční motiv. Pepidový motiv pro vazbu do zářezů molekuly HLA-A2.1 byly definovány Edmanovou degradací peptidů vymytých zHLA-A2.1 molekul zkultivovaných linií (tabulka 2, Falk et al. (1991), Nátuře, 351:290-296). Způsob identifikace typického nebo průměrného peptidu vázajícího se na HLA-A2.1 o délce 9 aminokyselin s dominantními vazebnými polohami 2 (L) a 9 (V). Obvykle se vyskytující zbytky se silnou vazbou byly identifikovány v pozicích 2 (M), 4 (E,K), 6 (V) a 8 (K). Tento identifikovaný motiv představuje průměr velkého množství vázajících se peptidů.
TABULKA 2: HLA-A2.1 restrikční motiv
pozice aminokyselin hodnota
1 2 3 4 5 6 7 8 9
aminokyselina s dominantní vazebnou pozicí L V +3
aminokyselina se silnou vazbou M E K V K +2
aminokyselina se slabou vazbou I L F K M Y A Y F P M S G P D T I K Y N G V H I L T A Y H E S L +1
Peptidový motiv tak, jak je v současné době definován, není příliš striktní. Některé HLA-A2.1 vazebné peptidy neobsahují ani jednu z dominantních vazebných aminokyselin a pouze « * *· ** · 99 9 9 9 9 9 9 9 99 « ·**··· · ·*·»·· « « « 9 «· 9 9 9 9
9 9 9 99 9 9 99 999 aminokyseliny přiléhající k vazebným místům hrají roli při umožnění nebo neumožnění vazby.
Ne každý peptid odpovídající uvedenému popisu se bude vázat a budou se vázat některé peptidy, které tento motiv neobsahují. Přesto je tento motiv dostatečný, aby umožnil identifikaci některých peptidů schopných vazby. Všechny MHC molekuly a jim odpovídající motivy mají mezi dominantními vazebnými polohami 2 a 9 6 aminokyselin.
Po identifikaci peptidových motivů na HER-2/neu ECD-ICD nebo ECD-PD fúzních proteinech je možno odhadnout, zda aminokyselinové substituce budou konzervativní nebo nekonzervativní. Tento typ substitucí je používán pro produkci vylepšených ECD-ICD nebo ECD-PD fúzních proteinů nebo polypeptidů, které jsou účinnější a lépe reagují. Příkladem takto účinných proteinů nebo peptidů jsou ty, které váží s vyšší afinitou stejné MHC molekuly jako přirozený protein nebo polypeptidy neumožňující rozeznání přirozených polypetidů nebo proteinů T buňkami. Příkladem polypeptidů s širokou křížovou reaktivitou je takový polypeptid indukující širší spektrum imunitní reakce (tzn. váže se na širší spektrum MHC molekul) než přirozený polypeptid. Podobně jedna nebo více aminokyselin ležící mezi peptidovými motivy a mající pouze spojovací funkci (tzn. nereaguje s MHC molekulou nebo T buněčným receptorem), může být substituována konzervativně nebo nekonzervativně. Každému odborníkovi v oboru je zřejmé, že polypetidy obsahující jednu nebo více aminokyselinových substitucí je třeba testovat pro přínosné nebo nežádoucí imunologické interakce celou řadou technik včetně těch, popisovaných zde pro sledování T buněčného rozeznání.
Varianty v rámci navrhovaného vynálezu také zahrnují modifikace včetně delecí nebo adicí aminokyselin, které mají minimální vliv na požadované imunologické vlastnosti polypeptidů, jak bylo popsáno výše. Každý odborník v oboru může předpokládat, že je možné využít zkrácené nebo nepřirozeně rozšířené formy HER-2/neu ECD-ICD nebo ECD-PD fúzních proteinů, zajišťující požadované imunologické funkce alespoň přibližně odpovídající vlastnostem přirozených HER-2/neu ECD-ICD nebo ECD-PD fúzních proteinů. Cysteinové zbytky mohou být deletovány nebo nahrazeny jinou aminokyselinou, aby bylo zabráněno tvorbě nežádoucích intramolekulárních disulfidických vazeb během renaturace. Další možnosti mutageneze jsou modifikace přilehlých dibazických aminokyselinových zbytků pro zvýšení exprese v kvasinkovém expresním systému, kde je přítomna aktivita proteázy KEX2.
4 ·· 99
9 9 4 9 * ••r*»*’*··**· · ···· · · * ·** · * * · · · ·· · · · * «9 4« 9« ·« *9 99
Příprava fúzních proteinů podle navrhovaného vynálezu
A. Polynukleotidová sekvence kódující fúzní protein
Navrhovaný vynález popisuje izolaci a přečištění polynukleotidů kódujících HER-2/neu fuzní proteiny. Podle navrhovaného vynálezu, může být použita jakákoliv sekvence kódující aminokyselinovou sekvenci fúzního proteinu.
Pro vyklonování plné délky kódující sekvence nebo homologních variant pro přípravu HER2/neu fúzních polynukleotidů, mohou být použity značené DNA sondy z jakékoliv části HER2/neu nukleotidové sekvence nebo komplementárního řetězce pro hledání v cDNA knihovně, pro identifikaci kódující sekvence jednotlivých složek fúzního proteinu. Nukleotidová sekvence kódující HER-2/neu může být z jakéhokoliv vhodného savce, např. krysy, myši, koně, krávy, ovce, psa a pod.
V jedné konkrétní variantě je HER-2/neu sekvence lidská, krysí nebo myší. Sekvence myšího HER-2/neu je uvedena na Obr 19 (sekvence č. 11). Myší HER-2/neu může být také amplifikována zRNA z myšího mozku při použití následujících primerů: 5' primer CATTGGA GCTGGCGGCCTGGTGCCGTTG (sekvence č. 12) a 3' primer GGCCTTCTGGTTCATA CTGGCACATCCAGGC (sekvence č. 13).Myší aminokyselinová sekvence HER-2/neu je na obr. 20 (sekvence č. 14). Další varianty aminokyselinové sekvence pro myší HER-2/neu jsou popsány v Nagata et al., J. Immunol. 159:1336-1343 (1997).
Tyto klony mohou být izolovány prohledáním příslušné expresní knihovny pro klony exprimující plnou délku HER-2/neu proteinu. Příprava knihovny a její prohledání, může být provedeno jakoukoliv technikou známou v současném stavu techniky, jako jsou techniky popisované v Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour, NY (1989), uvedeno zde jako citace. Zkráceně, může být připravena bakteriofágová expresní knihovna a poté přenesena na filtry. Tyto filtry pak jsou inkubovány s detekčním agens. V kontextu navrhovaného vynálezu, detekční agens je jakákoliv složka schopná vazby na HER-2/neu protein, která může být následně detekována jakýmkoliv způsobem známým v současném stavu techniky. Obvyklé detekční reagens obsahuje vazebnou složku jako je protein A, protein G, IgG a nebo lektin s navázanou značkou. Nejvhodnější značkou je enzym, substrát, kofaktor, inhibitor, barvivo, radionuklid, luminiscenční skupina, fluorescenční skupina a biotin. Lépe pak je značkou křenová peroxidáza, kterou je možno detekovat pomocí substrátu jako je tetramethylbenzidin nebo 2,2'azino-di-3-ethylbenzthiazolin sírová kyselina. Oblasti obsahující genomovou cDNA sekvenci kódující a exprimující HER-2/neu protein jsou izolovány a přečištěny technikami známými • 9 99 99 · 9
999 9 · 9 9 · ·
999999 9 9 9 · 9 9
9 9 9 9
999 9 99 99 9 v současném stavu techniky. Vhodné jsou techniky popisované v Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour, NY (1989).
Izolace kódujících sekvencí může být provedeno například pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) za použití dvou degenerovaných oligonukleotidových primerů určených na základě kódující sekvence, jak je zde uvedena. Požadované nukleové kyseliny je také možné klonovat za použití jiných známých amplifikačních technik. Příklady protokolů popisujících in vitro amplifikační techniky, včetně PCR, ligázové řetězové reakce (LCR), Qp-replikázové amplifikace a jiných technik na bázi RNA polymeráz, jsou uvedeny v Sambrook and Ausubel, a v patentu US 4 683 202, PCR protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al, ed. 1990), Amheim and Levinson C&EN str. 36-47 (říjen, 1990), The Jornal ofNIH Research, 3:81-94 (1991), Kwoh et al. (1989) Proč Nati Acad. Sci. USA 86:1173, Guatelli et al (1990) Proč. Nati Acad. Sci. USA 87:1874, Lomell et al., (1989) J. Clin. Chem. 35:1826, Landegren et al., (1988) Science 241:1077-1080, VanBrunt (1990) Biotechnology 8:291-294, Wu et al., (1989) Gene 4:560, Barringer et al., (1990) Gene 89:117.Vylepšené techniky klonování in vitro amplifikovaných nukleových kyselin jsou popsány v Wallace et al., patent US 5 426 039. Vhodné primery pro použití při amplifikaci nukleových kyselin podle navrhovaného vynálezu jsou založeny na uvedených sekvencích.
Podle navrhovaného vynálezu, polynukleotidy podle navrhovaného vynálezu, které kódují fuzní proteiny, jejich fragmenty nebo funkční ekvivalenty, mohou být použity pro přípravu rekombinantních molekul nukleových kyselin, které zajistí expresi fúzních proteinů, jejich fragmentů nebo funkčních ekvivalentů, v příslušných hostitelských buňkách, produkty fúzních polypeptidů kódované těmito polynukleotidy mohou být pozměněny pomocí molekulární manipulace s kódující sekvencí.
Díky dědičné degeneraci genetického kódu, je možné použít i jiné sekvence DNA kódující v podstatě stejné, nebo funkčně ekvivalentní aminokyselinové sekvence, které mohou být použity v navrhovaném vynálezu pro expresi fúzních proteinů. Jedná se o DNA sekvence schopné hybridizace s kódující sekvencí nebo jejím komplementární řetězcem, za mírně, středně nebo velmi přísných podmínek, jak jsou zde popsány.
Alternativní nukleotidové sekvence použitelné v rámci navrhovaného vynálezu, jsou sekvence obsahující delece, adice nebo substituce různých nukleotidů, což vede k sekvenci kódující stejný nebo funkčně ekvivalentní produkt. Tento genový produkt sám o sobě může obsahovat delece, adice nebo substituce aminokyselin, které vedou k nepozorovatelné změně a dají tak vzniknout funkčně ekvivalentnímu antigennímu epitopu. Tyto konzervativní aminokyselinové substituce mohou být na základě polarity, náboje, rozpustnosti, hydrofobicity, hydrofilicity a nebo amfipatické povahy použitých aminokyselin. Např. negativně nabité aminokyseliny jsou kyselina asparagová a glutamová, pozitivně nabité jsou lysin, histidin a arginin, aminokyseliny s nenabitou polární skupinou a s podobnou mírou hydrofilicity jsou glycin, asparagin, glutamin, serin, threonin a tyrozin, aminokyseliny s nepolární skupinou jsou valin, alanin, izoleucin, leucin, fenylalanin, prolin, methionin a tryptofan.
Nukleotidové sekvence podle navrhovaného vynálezu mohou být upraveny změnou kódující sekvence tak aby bylo ovlivněno jejich zpracování a exprese. Např. pomocí technik známých v současném stavu techniky je možno zavést mutace, pro vložení nebo odstranění restrikčních míst, pro změnu glykosylace, fosforylace, pro zesílení nebo oslabení translačních, iniciačních a/nebo terminačních sekvencí, nebo pro přípravu variant kódujících oblastí, které zajistí in vitro modifikace atd. Každý odborník v současném stavu techniky zná řadu způsobů, jak připravit různé alternativy popisovaného konstruktu. Těmito technikami může být např. cílená mutageneze, PCR amplifikace za použití degenerovaných primerů, vystavení exprimujících buněk chemickým mutagenům nebo ozáření, pomocí chemické syntézy požadovaného oligonukleotidu (např. v kombinaci s ligací a/nebo klonováním pro přípravuvelkého spektra nukleových kyselin) a dalších technik známých v současném stavu techniky (Giliman et al., (1979) Gene 8:81-97, Hutchinson et al., (1978) J. Biol. Chem. 253:6551, Roberts et al., (1987) Nátuře 328:731-734). Je vhodné aby manipulacemi nebyla ovlivněna imunogenicita fúzního proteinu.
V jedné variantě navrhovaného vynálezu je syntetizována kódující sekvence fuzního proteinu naráz, za použití chemické syntézy, známé v současném stavu techniky (Caruthers et al., (1980) Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 7:215-233, Crea et al., (1980) Nuc. Acids Res. 9(10):2331, Matteucci et al., (1980) Tetrahedron Letter 21:719 (1980) a Chow et al., (1981) Nuc. Acids Res. 9(12):2807-2817).
B. Syntéza polypeptidu
Další možností je připravit fúzní proteiny pomocí chemické syntézy aminokyselinového řetězce naráz. Např. peptidy mohou být syntetizovány technikou na pevné fázi, jako je např. Merrifíeldova technika syntézy na pevné fázi, kde jsou aminokyseliny postupně přidávány a rostoucímu řetězci aminokyselin (viz, Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2146). Vybavení pro automatickou syntézu polypeptidů je komerčně dostupné např. od firmy Perkin Elmer Biosystems, lne. (Foster City, CA) a poté je třeba postupovat podle návodu výrobce.
Syntetizované peptidy mohou být odmyty z pevné fáze a přečištěny, např. preparativní vysokotlakou chromatografií (Creighton, Proteins Structures and Molecular Principles, 50-60 (1983)). Složení synteticky připravených polypeptidů může být ověřeno aminokyselinovou sekvenční analýzou (např. Edmanovou reakcí, Creighton, Proteins Structures and Molecular Principles, 34-49 (1983)).
Dále je možné do sekvence zavést neklasické aminokyseliny, nebo chemické analogy aminokyselin. Neklasickými aminokyselinami mohou být D-izomery běžně se vyskytujících aminokyselin, α-aminoizobutyrát, 4-aminobutyrát, Abu, 2-aminobutyrát, γ-Abu, ε-Ahx, 6aminohexanoát, Aib, 2-aminoizobutyrát, 3-aminopropionát, ornitin, norleucin, norvalin, hydroxyprolin, sarkosin, citrullin, kyselina cysteinová, T-butyloglycin, t-butylalanin, fenylglycin, cyklohexylalanin, β-alanin, fluoro- aminokyseliny, aminokyseliny jako jsou βmethylaminokyseliny, Ca-methylamino kyseliny, Να-methylaminokyseliny a další analogy aminokyselin. Všechny aminokyseliny mohou být navíc v D (pravotočivé) nebo L (levotočivé) formě.
C. Spojovací skupiny
V další variantě jsou polypeptidy fúzního proteinu, tzn. ECD a ICD, nebo ECD a PD spojeny pomocí spojovací skupiny. Může se jednat o chemickou spojku, jako je např. sukcinidyl-(Nmaleinoimidyl)-cyklohexan-l-karboxylát (SMCC). Spojovací skupina může být také další aminokyselinová sekvence Jako je např. polyglicynová spojka.
V konkrétní variantě podle navrhovaného vynálezu je kódující sekvence každého polypeptidu ve fúzním proteinu přímo napojena na amino- nebo karboxy- konec prostřednictvím peptidové vazby v libovolném směru.
Další možností je, že aminokyselinová spojka může být orientována tak že odděluje první a druhý polypeptidový segment vzdáleností dostatečnou pro to, aby každý z polypeptidů mohl vytvořit přirozenou sekundární a terciální strukturu. Sekvence pro takovou aminokyselinovou spojku je spojena se sekvencí kódující fůzní protein za použití standartních technik dobře známých v současném stavu techniky. Vhodné peptidové spojky mohou být zvoleny na základě následujících faktorů: (1) schopnosti flexibilně zaujmout vhodnou konformaci, (2) schopnosti zaujmout takovou sekundární strukturu, která může souviset s funkčními epitopy na prvním a druhém polypeptidu a (3) neobsahuje hydrofobní nebo nabité oblasti, které by reagovaly s funkčními epitopy polynukleotidu. Nejvhodnější sekvence pro peptidovou spojku obsahují aminokyseliny Gly, Asn a Ser. Je možné použít i další neutrální aminokyseliny jako jsou Thr a
Ala. Aminokyselinové sekvence použitelné jako spojky jsou popsány vMaratea et al., (1985) Gene 40:39-46, Murphy et al., (1986) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, patent US 4 935 233 a patent US 4 751 180. Sekvence spojky může být dlouhá 1 až 50 aminokyselin. Sekvence spojky nejsou nutné pokud první a druhý polypeptid obsahují neesenciální N-koncovou aminokyselinovou oblast, která může být použita pro oddělení funkčních domén a zabránit sterickému bránění.
Dalšími použitelnými chemickými spojkami jsou cukerné spojky, lipidové spojky, spojky tvořené mastnými kyselinami, polyetherové spojky, jako je PEG, atd. (viz. Hermanson, Bioconjugate Techniques (1996)).
D. Další polypeptidy
Jak je uvedeno výše, fúzní proteiny mohou být napojeny najeden nebo více dalších polypeptidů. Např. fúzní proteiny mohou být napojeny na jednu nebo více kopií jednoho nebo druhého polypeptidů obsažené ve fúzním proteinu. Dále mohou být na fúzní proteiny napojeny takové polypeptidy jako nepř. Ral2 nebo LelF, jak je uvedeno výše. Fúzní polypeptidy mohou být také napojeny na afinitní tágy použité k přečištění a izolaci proteinu. Např. polyhistidinový tag umožňuje použití metalové chelatační afinitní chromatografie pro přečištění fuzních proteinů. Dalšími příklady afinitních tagů jsou např. Strep-tag, PinPoint, maltózu vázající protein, glutathion S-transferáza, atd (viz např. Glick & Pasternak, Molecular Biotechnology Principles and Applications of Recombinant DNA (2. vydání, 1999)).
V jedné variantě, jsou fúzní proteiny napojeny na lipidovou skupinu, jako je mykolová kyselina, lipoaribdomanin (LAM) nebo deriváty trehalózy.
Jak je popsáno výše, v jedné variantě, tyto fúzní proteiny jsou produkovány rekombinantní expresí nukleových kyselin kódujících fúzní protein, tyto fúzní produkty mohou připraveny ligací příslušných nukleových kyselin kódujících požadované aminokyselinové sekvence dohromady, pomocí technik známých v současném stavu techniky, ve správném čtecím rámci, a nakonec jsou exprimovány pomocí technik známých v současném stavu techniky. Další možností je připravit tento produkt pomocí technik syntézy proteinů, např. púza použití syntetizátoru peptidů. Do polynukleotidu je možné dále připojit další kódující sekvence pro jiné molekuly, jako jsou např. cytokiny nebo adjuvantní molekuly.
······ · ····· · • · · · · · • · · · ·· · · · ·
E. Modifikace sekvencí
Varianty fuzního proteinu podle navrhovaného vynálezu, které si ponechávají schopnost vyvolávat imunitní reakci mohou být identifikovány pomocí modifikace sekvence v jednom nebo několika aspektech, jak je uvedeno výše, a otestováním příslušného fúzního proteinu na schopnost stimulace imunitní odpovědi, např. T-buněčné odpovědi, nebo protilátkové odpovědi. Tyto testy mohou probíhat např. přidáním modifikovaného fúzního proteinu k T-buňkám a stanovením jejich reakce. Přirozeně se vyskytující varianty jednotlivých polypeptidových komponent fúzního proteinu mohou být také izolovány např. prohledáním vhodné cDNA knihovny nebo genomové knihovny pomocí DNA sekvencí kódujících jednotlivé peptidy nebo jejich varianty.
Výše popsané sekvenční modifikace mohou být zavedeny použitím standartních rekombinačních technik, nebo automatickou syntézou modifikovaného fúzního proteinu. Např. mutace mohou být do přesného místa zavedeny syntézou oligonukleotidů obsahujících mutovanou sekvenci, která přiléhá restrikčnímu místu a umožňuje tak iigaci do přirozené sekvence. Po vložení této oblasti je získána sekvence kódující analog s požadovanou aminokyselinovou inzercí, substitucí nebo delecí.
Další možností je použití místně specifické mutageneze pomocí oligonukleotidu pro přípravu genu kde příslušný kodón je nahrazen podle požadavků, zda se má jednat o inzerci substituci nebo deleci. Příklady technik pro přípravu alternativních sekvencí, jsou uvedeny v Walder et al., (1986) Gene, 42:133, Bauer et al., (1985) Gene 37:73, Craik (1985) Biotechniques, January: 1219, Smith et al., Genetic Engeneering: Principles and Methods, Plenům Press (1981), patent US 4 518 584 a patent US 4 737 462.
Mutace v nukleotidové sekvenci připravené pro expresi HER-2/neu fúzních proteinů musí, samozřejmě, zachovávat příslušný čtecí rámec kódující sekvence a neměly by vytvářet komplementární oblasti které by hybridizovaly a vytvářely sekundární mRNA struktury, jako jsou smyčky nebo vlásenky, které by nepříznivě ovlivnily translaci mRNA. Ačkoliv je možné místo mutace předem stanovit, není možné předem zcela přesně odhadnout per se povahu mutace. Např. Pro zvolení optimální charakteristiky mutace na daném místě, je možné do příslušného kodónů zavést náhodnou mutagenezi a exprimované HER-2/neu fúzní proteiny pak otestovat na požadované parametry. Ne všechny mutace v nukleotidové sekvenci kódující HER2/neu fúzní protein budou exprimované ve výsledném proteinu. Např. nukleotidová substituce může být provedena tak aby zvýšila expresi, zejména pro potlačení smyček v sekundární struktuře při transkripci mRNA (viz evropská patentová přihláška 75 4444A), nebo pro zavedení ······ · · · · · · · • · · · · · • · · · ·· · · · · · kodónů, které usnadňují translaci v zvolených expresních systémech, jako je dobře známé preferované kodóny E. coli pro expresi v E. coli.
F. Expresní vektory
HER-2/neu fúzní proteiny a jejich varianty, podle navrhovaného vynálezu, jsou připraveny nejlépe pomocí technik rekombinační DNA. Jedná se o inzerce sekvence DNA kódující HER2/neu fúzní protein do expresního vektoru a jeho exprese v rekombinantním mikrobiálním, savčím, houbovém nebo hmyzím expresním systému za podmínek podporujících expresi a sekreci fúzního proteinu. DNA sekvence kódující HER-2/neu fúzní protein podle navrhovaného vynálezu může být získána z cDNA fragmentů a krátkých oligonukleotidových spojek, nebo ze série oligonukleotidů které vytvoří umělý gen, který je schopen inzerce do rekombinantního expresního vektoru a exprese.
Rekombinantní expresní vektory obsahují DNA sekvence kódující HER-2/neu fúzní protein operativně připojený k vhodným transkripčním nebo translačním regulačním oblastem pocházejícím ze savčích, houbových, mikrobiálních, virových nebo hmyzích genů. Tyto regulační oblasti obsahují promotor transkripce, operátor sekvence, pokud je nutný, sekvence kódující oblasti mRNA pro vazbu na ribozóm a sekvence kontrolující ukončení transkripce nebo translace. Dále mohou být připojeny oblasti jako je replikační počátek a volitelná značka umožňující rozeznání úspěšně transformovaných jedinců.
DNA oblasti jsou operativně napojené pokud jsou si funkčně podobné. Např. DNA pro signální peptid (sekretorní značka) je operativně připojena k polypeptidu pouze pokud je exprimován jako jako prekurzor, který se účastní sekrece polypeptidu, promotor je operativně připojen ke kódující sekvenci pokud kontroluje transkripci sekvence a ribozomální vazebné místo je operativně připojeno pouze pokud je na pozici umožňující translaci. Obecně, operativně připojené, znamená souvislé a v případě sekretorních signálů ve čtecím rámci. DNA sekvence kódující HER-2/neu fúzní proteiny exprimované v mikroorganismech by neměla obsahovat introny, které by předčasně ukončili transkripci DNA do mRNA.
Expresní vektory pro bakterie mohou obsahovat volitelné značky a bakteriální počátek replikace odvozený od komerčně dostupných plazmidů obsahujících genetické prvky velmi dobře známého klonovacího vektoru pBR322 (ATCC 37017). Tyto komerční vektory jsou např. pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden), pGEMI (Promega Biotec, Madison, WI), pET28b (Novagen) a pPDM (modifikovaný pET28b, Corixa). Tyto pBR322 “kostry” jsou kombinovány s vhodným promotorem a strukturální sekvencí tak aby mohly být exprimovány.
Έ. coli je obvykle transformována za použití derivátů pBR322, plazmidu odvozeného z E.coli (Bolivar et al., (1977) Gene, 2:95). Plazmid pBR322 obsahuje geny rezistence k ampicilinu a tetracyklinu a tím slouží jako snadný znak pro selekci pozitivně transformovaných buněk. Promotory běžně používané v rekombinantních mikrobiálních expresních vektorech jsou βlaktamáza (penicilináza) a laktózový promotorový systém (Chang et al., (1978) Nátuře, 275:615, Goeddel et al., (1979) Nátuře 281:544), tryptofanový promotorový systém (Goeddel et al., (1980) Nucl. Acid. Res., 8:4057 a evropská patentová přihláška 36 776) a tac promotor (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 412 (1982)). Poměrně vhodný bakteriální expresní systém je fágový λ PL promotor a cI857ts termolabilní represor. Dostupné plazmidové vektory dostupné z ATCC obsahující deriváty λΡ;, promotoru jsou plazmid pHUB2, rezident E. coli kmen JMB9 (ATCC 37 092) a pPLc28, rezident E. coli kmen RR1 (ATCC 53082).
Vhodné promotorové sekvence v kvasinkových vektorech jsou promotory alkohol oxidázy, metallothioneinu, 3-fosfoglycerol kinázy (Hitzeman et al., (1980) J. Bil. Chem. 255:202073) nebo jiné glykolytické enzymy (Hess et al., (1968) J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 a Holland et al., )(1978) Biochem 14:4900), jako jsou enoláza, glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza, hexokináza, pyruvátdekarboxyláza, fosfofruktokináza, glukózo-6-fosfátizomeráza, 3-fosfo-glycerátmutáza, pyruvátkináza, triozofosfátizomeráza, fosfoglukonázizomeráza a glukokináza. Vhodné vektory a promotory pro použití v kvasinkových expresních vektorech jsou dále popsány v evropské patentové přihlášce 73 657.
Nejvhodnější kvasinkové vektory mohou být sestaveny pomocí DNA sekvence zpBR322 pro selekci a replikaci v E. coli (Ampr gen a počátek replikace) a kvasinkové DNA kódující na glukózou potlačovaný ADH2 promotor a α-faktor jako sekretorní signál. Promotor ADH2 je popsán v Rusell et al., (1982) J. Biol. Chem., 258:2674 a Beier et al., (1989) Nátuře, 300:724. Kvasinkový α-faktor, který zajišťuje sekreci heterologních proteinů může výt vložen mezi promotor a strukturní gen který má být exprimován (viz např. Kurjan et al., (1982) Cell, 30:933 a Bitter et al., (1984) Proč. Nati. Acad. Sci USA 81:5330. Tato sekvence může být pozměněna tak, že obsahuje nedaleko 3'-konce jedno nebo více použitelných restrikčních míst, které umožní fůzi této sekvence s cizorodým genem.
Transkripční a translační kontrolní sekvence v expresním vektoru používané pro transformaci buněk z obratlovců mohou být virového původu. Např. běžně používané promotory a enhancery jsou izolované např. z polyomavirů, adenoviru 2, simian viru (SV40) a lidského cytomegaloviru. DNA sekvence odvozené od virového genomu SV40, např. časné a pozdní promotory, enhancery, spojovací a polyadenylalační oblasti původem z SV40, mohou být použity pro expresi heterologní sekvence DNA. Použitelné jsou časné i pozdní promotory, neboť oba jsou snadno izolovatelné z viru jako fragmenty obsahující také SV40 virové počátky replikace (Fiers et al., (1978) Nátuře, 273:113). Je možné také použít větší i menší fragmenty SV40 o délce asi 250 bp, od místa Hind III až do místa Bgl II, uvniř kterých je také přítomen virový počátek replikace. Dále je možné použít, virové genomové promotory, kontrolní a signální sekvence, které jsou kompatibilní se zvolenými hostitelskými buňkami. Příklady vektorů mohou být syntetizovány podle Okayama et al., (1983) Mol. Cel. Biol., 3:280.
Použitelný systém pro stabilní a dostatečnou míru exprese savčí cDNA v myších mamárních epiteliálních buňkách může být připraven podle Cosman et al., (1986) Mol Immunol., 23:935. Vhodný eukaryotický vektor pro expresi fúzních proteinů podle navrhovaného vynálezu je pDC406 (McMahan et al., (1991) EMBO J., 10:2821) který obsahuje regulační sekvence z SV40, lidského viru získané imunodeficience (HIV) a Epstain-Barrova viru (EBV). Další vektory jsou pDC409 a pDC410, odvozené od pDC406. pDC410 byl odvozen od pDC406 náhradou EBV počátku replikace sekvencí kódující SV40 velký T-antigen. Plazmid pDC409 se odlišuje od pDC406 tak, že Bgl II restrikční místo stranou od mnohočetného klonovacího místa bylo odstraněno, a tím se stalo Bgl II restrikční místo uvnitř mnohočetného klonovacího místa jedinečné. Je také možno použít jakékoliv jiné vektory umožňující expresi proteinů pod kontrolou CMV promotoru, SV40 časného promotoru, SV40 pozdního promotoru, metalothioneinového promotoru, myšího mamárního nádorového virového promotoru, promotoru z Rousova sarkomaviru, polyhedrinového promotoru, nebo jiných promotorů schopných efektivně zajistit expresi v savčích buňkách.
Kromě transkripčních a a translačních kontrolních sekvencí, některé expresní systémy mají znaky zajišťující genovou amplifikaci, jako je neomycin, thymidinkináza, hygromycin B fosfotransferáza a dihydrofolátreduktáza.
Použitelné buněčné linie umožňující epizomální replikaci expresních vektorů, jako jsou pDC406 a pDC409, obsahující EBV počátek replikace jsou CV-l/EBNA (ATCC CRL 10478). CV1/EBNA buněčná linie byla odvozena transfekcí linie CV-1 genem kódujícím jaderný antigen-I EBV viru (EBNA-I) a konstitutivně exprimujícím EBNA-I pod kontrolou CNV velmi časného enhanceru / promotoru.
Nejvhodnější vektory pro expresi savčích buněk v kultuře jsou pFLAGCMV-1 (Kodak), pcDNA3.1/hyg (Invitrogen) a pEE14-GC (CellTech).
G. Hostitelské buňky
Transformované hostitelské buňky jsou buňky které budou transformovány nebo transfekovány expresním vektorem konstruovaným pomocí technik rekombinantním DNA a obsahujícím sekvence kódující HER-2/neu fúzní protein podle navrhovaného vynálezu. Transformované hostitelské buňky mohou exprimovat požadovaný HER-2/neu fuzní protein, ale hostitelská buňka transformovaná za účelem klonování nebo amplifikace HER-2/neu DNA nepotřebuje exprimovat HER-2/neu fúzní protein. Exprimovaný HER-2/neu fuzní protein by měl být sekretovaný do kultivačního média, v závislosti na použité DNA. Odborník v současném stavu techniky může předpokládat, že pokud HER-2/neu fúzní protein bude sekretována do supernatantu, pak bude v tomto supernatantu také rozpustný.
Pro zavedení expresního vektoru může být použita jakákoliv z technik pro zavádění cizorodé nukleotidové sekvence do hostitelské buňky známých v současném stavu techniky. Jedná se o techniky využívající např. Superfect (Quiagen), lipozómy, transfekci pomocí fosforečnanu vápenatého, polybren, fůze protoplastů, elektroporaci, mikroinjekci, plazmidové vektory, virové vektory, urychlovač biologických částic (gene gun) nebo jakoukoliv jinou z technik známých v současném stavu techniky pro zavádění klonované genomové DNA, cDNA syntetické DNA nebo i jiného genetického materiálu do hostitelské buňky (viz např. Sambrook et al., viz výše).
Vhodné hostitelské buňky pro expresi rekombinantních proteinů pod kontrolou příslušných promotorů jsou prokaryotní buňky, kvasinky a nebo eukaryotické buňky. Prokaryotické buňky jsou např. gram-negativní nebo gram-pozitivní bakterie, jako je E. coli nebo Bacilli. Vyšší eukaryotické buňky jsou zejména dobře známé buněčné linie hmyzího nebo savčího původu. Je také možné použít bezbuněčný translační systém pro produkci HER-2/neu fúzních proteinů za použití RNA připravené podle DNA konstruktu.Vhodné klonovací a expresní vektory pro použití vbakteriálních, houbových, kvasinkových a savčích hostitelských buňkách jsou popsány v např. Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York (1985).
Prokaryotické expresní hostitelské buňky mohou exprimovat HER-2/neu fuzní protein který nevyžaduje rozsáhlé proteolytické a disulfidické úpravy. Prokaryotické expresní vektory obecně obsahují jeden nebo více fenotypových selekčních znaků, tzn. genů kódujících proteiny přispívající k rezistenci na antibiotika nebo překonávají autotrofní požadavky a počátek replikace rozeznávaný hostitelskou buňkou tak aby zajistil amplifikaci v hostiteli. Vhodnými prokaryotickými hostiteli pro transformaci jsou např. E.coli (např. BL21 (DE3) CodonPlus E. coli), Bacillus subtilis, Salmonela typhimurium a různé druhy v rámci rodů Pseudomonas, Streptomyces a Staphylococcus, ačkoliv je možné použít celou řadu dalších. Rekombinantní
HER-2/neu fúzní proteiny mohou být exprimovány také v kvasinkách jako jsou P. pastoris. Je samozřejmně možné použiti kvasinky jiných rodů, jako Saccharomycetes, Schizosacharomyces nebo Kluyveromyces. Exprese v kvasinkách Pichia je dosaženo ligací genu, který má být exprimován a bakteriálního přenosového vektoru (např. pPICZ série od Invitrogen Co.), transformací kvasinek tímto vektorem a chromozomální integrací do lokusu alkohol oxidázy (AOX) kvasinkového genomu. Selekce rekombinovaných kvasinek je poté provedena pomocí např. Zeocin (Invitrogen Co.) a proteinová exprese je indukována přidáním methanolu do růstového média (Higgin et al., Pichia Protocols, Methods in Molecular Bilogy, Vol. 103, Humana Press (1998). Vhodným kmenem Pichia pro expresi proteinu je např. SMD1168 kmen. Je možné použít, v závislosti i jiné expresní systémy založené na jiných technikách, jako je třeba ESP systém (Stratagen).
Vhodné protokoly pro transformaci kvasinek jsou známé každému odborníkovi v současném stavu techniky. Příkladem mohou být techniky popsané v Hind et al., Proč. Nati. Acad. Sci USA 75:1929 (1978), zahrnující selekci Trp+ transformovaných buněk v selektivním médiu obsahujícím 0,67 % kvasinkové dusíkaté báze, 0,5 % aminokyselin, 2 % glukózy, 10 mg/ml adeninu a 20 mg/ml uracilu. Hostitelské kmeny transformované vektory obsahujícími ADH2 promotor mohou růst pro expresi v bohatém médiu obsahujícím 1 % kvasinkový extrakt, 2 % pepton a 1 % glukózový doplněk s 80 mg/ml adeninu a 80 mg/ml uracilu. Potlačení ADH2 promotoru je provedeno vyčerpáním glukózy z média. Syrový supernatant je přefiltrován a skladován při 4 °C do přečištění.
Pro expresi rekombinantního proteinu je také možné použít různé kultivační systémy založené na savčích nebo hmyzích (např. Spodoptera nebo Trichoplusia) buňkách.Využití baculovirových systémů pro produkci heterologního polypeptidu je popsáno např. v Luckow et al., (1988) BioTechnology, 6:47. Příklady vhodných savčích buněčných linií jsou např. COS-7 linie buněk z opičích ledvin (Gluzman (1981) Cell, 23:175) a další buňky schopné exprimovat patřičný vektor, např. CV-l/EBNA (ATCC CRL 10 478), L buňky, Cl27, 3T3, ovariální buňky z čínského křečka (CHO), COS, NS-1, HeLa, lidské embryonální ledvinné fibroblasty (HEK293) a BHK buňky. Savčí expresní vektory mohou obsahovat nepřepisované součásti (např. počátek replikace, vhodný promotor a/nebo enhancer napojený na exprimovaný gen a další k 5' a 3' konci přilehlé nepřepisované sekvence) a 5' nebo 3' nepřepisované sekvence (např. nezbytné vazebné místo na ribozóm, polyadenylační signální místo, sestřihová dárcovská i příjemcovská místa a terminátory transkripce). Nej vhodnější savčí expresní systém jsou ovariální buňky z čínského křečka (CHO).
H. Přečišťování fúzních proteinů podle navrhovaného vynálezu
Přečištěné HER-2/neu fúzní proteiny mohou být připraveny kultivací vhodných systémů hostitel/vektor tak aby exprimovaly rekombinantní produkt translace DNA podle navrhovaného vynálezu, který je poté přečištěn z kultivačního média nebo extraktu. Např. supematanty ze systémů sekretujících rekombinantní polypeptid do kultivačního média, mohou být nejprve zakoncentrovány za použití komerčně dostupných fdtrů pro zakoncentrování proteinů, jako jsou Amicon nebo Milipore Pellicon ultrafdtrační jednotka. Po zakoncentrování může být koncentrát přenesen na vhodnou přečišťovací jednotku. Např. vhodný afinitní nosič může obsahovat vazebný protein (tj. protein ke kterému se HER-2/neu fúzní protein naváže ve specifické interakci založené na struktuře), nebo lektin či protilátku.
Další možností je použít iontoměničovou chromatografii, např. kdy pevná fáze obsahuje připojenou skupinu diethylaminoethylu (DEAE). Pevnou fází může být akrylamid, agaróza, dextran, celulóza, polystyren, sepharóza nebo jiné, běžně používané pro přečišťování proteinů. Může být použit krok výměny kationtů. Vhodnými kationtovými iontoměniči mohou být pevné fáze obsahující sulfopropylové nebo karboxymethylové skupiny, lépe však sulfopropylové. Gelová filtrační chromatografie je také pro přečištěné HER-2/neu fúzních proteinů použitelná. Fúzní proteiny podle navrhovaného vynálezu jsou nejlépe přečišťovány aniontovou iontoměničovou chromatografii za použití např. monoQ kolon, nebo Q sepharózy a vysokotlaké chromatografie.
Další možností přečištění HER-2/neu fúzních proteinů je afinitní chromatografie. Např. monoklonální protilátky proti HER-2/neu fúzním proteinům mohou být využity pro afinitní chromatografii, za použití technik známých v současném stavu techniky.
Je také možné použít jeden nebo více kroků vysokotlaké kapalinové chromatografie na reverzní fázi (RP-HPLC) za použití RP-HPLC média (např. silikagel s připojenou methylovou nebo jinou alifatickou skupinou) pro izolaci HER-2/neu fúzních proteinů podle navrhovaného vynálezu. Některé nebo všechny výše uvedené přečišťovací kroky, v různých kombinacích, jsou rovněž použitelné pro izolaci mutovaných variant rekombinantního proteinu.
Rekombinantní HER-2/neu fúzní proteiny produkované v bakteriální kultuře, mohou být po úvodní extrakci z buněčné pelety, v jednom nebo několika krocích zahušťovány, vysolovány, a děleny iontoměničovou nebo dělící chromatografii. Vysokotlaká kapalinová chromatografie (HPLC) může být použita jako konečný přečišťovací krok. Mikrobiální buňky použité k expresi
HER-2/neu fúzních proteinů mohou být rozbity libovolnou technikou, včetně opakovaných cyklů zamrazení-roztavení, sonikací, mechanickým rozbitím nebo za použití lyzačních agens. Fermentace kvasinek exprimujících HER-2/neu fuzní proteiny jako sekretované proteiny značně zjednodušuje přečištění. Sekretované rekombinantní proteiny z velkoobjemového fermentátoru, mohou být přečištěny technikami popsanými vUrdal et al., (1984) J. Chromatog., 296:171. V této práci jsou popsány dvě následné HPLC na reverzní fázi, pro přečištění rekombinantního lidského GM-CSF na preparativní HPLC koloně.
HER-2/neu fuzní proteiny syntetizované v rekombinantních kulturách mohou obsahovat další buněčné příměsy, jako jsou proteiny, v množství a charakteru v které je závislé na přečišťovacích krocích, pomocí kterých je HER-2/neu fúzní protein izolován z kultury. Tyto příměsy jsou obvykle kvasinkového, prokaryotního nebo eukaryotního, ne-lidského, původu. Tyto preparáty obvykle neobsahují proteiny přirozeně asociované s HER-2/neu fúzním proteinem a v přírodě se vyskytují pouze ve svém přirozeném organismu.
Automatická syntéza proteinů představuje další možnost přípravy proteinů podle navrhovaného vynálezu. Např. může být použita jakákoliv technika syntézy na pevné fázi známá v současném stavu techniky, jako je např. Merrifieldova syntéza na pevné fázi, kde jsou aminokyseliny postupně přidávány k rostoucímu aminokyselinovému řetězci (viz Merrifield (1963) J.Am. Chem. Soc 85:2149-2146). Vybavení pro automatickou syntézu je komerčně dostupné od dodavatelů jako jsou Applied Biosystems lne. (Foster City, CA), postup je pak podle manuálu výrobce.
Obecně, polypeptidy (včetně fúzních proteinů) a polynukleotidy, jak jsou zde popisovány jsou izolovány. Jako izolovaný je takový polypeptid nebo polynukleotid je rozuměn takový, který je vyjmut ze svého přirozeného prostředí. Např. přirozeně se vyskytující protein je izolovaný pokud je oddělený od všech souvisejících materiálů z přirozeného prostředí. Je vhodné, aby tyto polypeptidy měly alespoň 90 % čistotu, lépe pak alespoň 95 % a nejlépe alespoň 99 % čistotu. Polynukleotid je izolovaný, např. pokud je vklonovaný do vektoru, který není součástí jeho přirozeného prostředí.
Vazebné složky
Navrhovaný vynález dále popisuje agens, jako např. protilátky a jejich fragmenty se schopností vázat antigen, které specificky váží HER-2/neu fúzní protein podle navrhovaného vynálezu. Jak je zde používáno, protilátka, nebo její fragment obsahující vazebné místo, se specificky váže na HER-2/neu fúzní protein pokud reagují v detekovatelné míře, tzn. alespoň s dvojnásobnou intenzitou, než je signál pozadí (např. ELISA) s HER-2/neu fúzním proteinem a nereaguje v detekovatelné míře s nepříbuznými proteiny za srovnatelných podmínek. Jak je zde používáno, vazba znamená nekovalentní asociaci mezi dvěma molekulami, které tak vytvoří komplex. Schopnost vázat se může být hodnocena např. stanovením vazebné konstanty pro tvorbu komplexu. Vazebná konstanta je hodnota získaná po vydělení koncentrace komplexu koncentrací složek. Obecně, dvě látky se vážou, ve smyslu navrhovaného vynálezu, pokud vazebná konstanta vzniku komplexu přesáhne asi 1031/mol. Vazebná konstanta může být stanovena pomocí technik známých v současném stavu techniky.
Vazebná složka by měla být schopna rozlišit mezi pacienty s a bez rakoviny, jako jsou nádory prsu, vaječníků, tlustého střeva, prostaty a plic, za použití popisovaných postupů. Jinak řečeno, protilátky, nebo jiná vazebná agens vázající HER-2/neu fúzní protein budou vyvolávat signál značící přítomnost onemocnění u alespoň 20 % pacientů s rakovinou a bude dávat negativní výsledek u alespoň 90 % pacientů bez rakoviny. Pro stanovení, zda vazebná agens splňují tyto požadavky, je třeba otestovat biologické vzorky (krev, séra, plasmu, moč a/nebo nádorové biopsie) z pacientů s a nebo bez rakoviny (což je stanoveno standardními klinickými testy), zda jsou v nich přítomny polypeptidy vážící vazebné složky. Je zřejmé, že je třeba otestovat statisticky významný počet vzorku s a bez rakoviny. Každá vazebná složka musí splňovat výše uvedená kriteria, každý odborník v oboru ví, že vazebné složky je pro zvýšení citlivosti možno používat v kombinaci.
Jakékoliv agens, které splňuje výše uvedené požadavky, může být vazebnou složkou. Např. vazebnou složkou může být ribozóm s nebo bez peptidové složky, molekula RNA nebo polypeptid. V nej vhodnější variantě navrhovaného vynálezu je vazebnou složkou protilátka, nebo její fragment obsahující vazebné místo.Protilátky mohou být připraveny pomocí technik známých v současném stavu techniky (viz Harlow and Lané, Antibodies: A Laboratory Manula, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Obecně, protilátky jsou připravovány kultivačními technikami, včetně přípravy monoklonálních protilátek , jak je zde popisováno, nebo pomocí transfekce genů kódujících protilátky do vhodných bakteriálních nebo savčích hostitelských buněk, tak aby yla zajištěna produkce protilátek. V jedné technice je imunogen obsahující např. fúzní protein nebo sekvenci odpovídající napojení jednotlivých polypeptidů fuzního proteinu podle navrhovaného vynálezu (označovanou jako spojovací oblast), injikován do nějakého savce (např. myš, krysa, králík, ovce, koza). V tomto kroku, fúzní proteiny podle navrhovaného vynálezu nebo spojovací oblast fúzního proteinu podle navrhovaného vynálezu slouží bez úpravy jako imunogen. Další možností je , pro relativně krátké sekvence , dobrá imunitní odpověď může být vyvolána po napojení těchto sekvencí na nosičový protein, jako je bovinní sérový albumin, nebo hemocyanin z přílipky přílivové. Imunogen je aplikován do hostitelského organismu, nejlépe podle předem stanoveného protokolu zahrnujícího jednu nebo více posilovačích dávek a zvířata jsou pak postupně vykrvována. Polyklonální protilátky specifické proti fúzním proteinům mohou být přečištěny z antiséra např. afinitní chromatografií s použitím fúzního polypeptidu navázaného na vhodnou pevnou fázi.
Polyklonální protilátky proti fúzním proteinům podle navrhovaného vynálezu mohou být zvoleny tak aby obsahovaly pouze ty polyklonální protilátky které jsou specificky imunoreaktivní s fúzním proteinem podle navrhovaného vynálezu a ne s jednotlivými polypeptidovými složkami fúzního proteinu. Tyto protilátky mohou být odstraněny pomocí křížové reakce s jednotlivými polypeptidy fúzního proteinu podle navrhovaného vynálezu.
Další možností je že i protilátky rozeznávající jednu nebo obě složky fúzního proteinu podle navrhovaného vynálezu mohou být využity v kontextu navrhovaného vynálezu.
Monoklonální protilátky specifické pro imunogenní fúzní proteiny podle navrhovaného vynálezu mohou být připraveny např. pomocí techniky podle Kohlera a Milsteina (1976) Eur. J. Immunol. 6:511-519, a její vylepšení. Tyto techniky zahrnují přípravu imortalizovaných buněčných linií schopných produkovat protilátky o příslušné specifitě (tzn. reaktivní s fúzním proteinem podle navrhovaného vynálezu). Tyto buňky mohou být připraveny např. z slezinných buněk zvířat imunizovaných, jak bylo popsáno výše. Slezinné buňky mohou být imortalizovány např. fúzí s myelomovými fúzními partnery, nejlépe syngenními s imunizovaným zvířetem. Byla vyvinuta celá řada různých fúzních technik. Např. je možné indukovat fúzi pomocí nepolárních detergentů po dobu několika minut a poté přenést v nízké hustotě do selekčního média podporujícího růst hybridomů ale ne myelomových buněk. Nejvhodnějším selekčním systémem je HAT (hypoxantin, aminopterin, thymidin) selekce. Po dostatečně dlouhé době, obvykle 1 až 2 týdny, jsou testovány kolonie hybridomů. Kolonie jsou po jedné kontrolovány a jejich supematanty testovány na vazebnou aktivitu proti fúznímu proteinu. Nej vhodnější jsou hybridomy produkující protilátky s maximální reaktivitou a specifitou.
Monoklonální protilátky mohou být izolovány ze supernatantů kolonií hybridomů. Navíc je možno použít celou řadu technik pro zvýšení výtěžku, jako je možnost přenést hybridomy do peritoneální dutiny vhodného hostitele, např. myši. Monoklonální protilátky pak mohou být izolovány z ascitické tekutiny nebo z krve. Nečistoty mohou být od protilátek odděleny konvenčními technikami, jako je chromatografie, gelová filtrace, precipitace a extrakce. Fúzní polypeptidy podle navrhovaného vynálezu mohou být také využity v procesu přečišťování např.
······ · ····· · · • · · « · « · • · · »· ·· · · · během afinitní chromatografie. Zkráceně, imunoglobuliny mohou být přečištěny z králičího séra afinitní chromatografií na kolonách obsahujících protein A (Harlow and Lané, Antibodies: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) a naštěpeny papainem tak aby vznikly Fab a Fc fragmnety. Fab a Fc fragmenty mohou být odděleny afinitní chromatografií na kolonách obsahujících protein A.
Monoklonální protilátky podle navrhovaného vynálezu mohou být navázány najedno nebo více léčiv. Vhodnými léčivy mohou být radionuklidy, induktory diferenciace, drogy, toxiny a jejich deriváty. Nejvhodnější radionuklidy jsou 90Y, 123I, 125I, 186Re, 188Re, 211At a 212Bi. Vhodným léčivem může být methotrexát a analogy pyrimidinů a purinů. Nej vhodnějšími induktory diferenciace jsou forbolestery a kyselina máselná. Nej vhodnějšími toxiny jsou ricin, abrin, difterický toxin, cholera toxin, gelonin, exotoxin Pseudomonád, Shigella toxin a antivirový toxin z rostliny líčidlo americké.
Terapeutická složka může být navázána (např. kovalentně napojena) na vhodnou monoklonální protilátku přímo, nebo nepřímo (pomocí spojky). Přímé napojení léčiva a protilátky je možné pouze pokud obě obsahují skupiny schopné spolu navzájem reagovat. Např. nukleofilní skupina, jako je amino- nebo sulfhydrilová skupina na jedné straně, je schopna reagovat se skupinou obsahující karbonyl, jako je anhydrid nebo kyselý halid, nebo s alkylovou skupinou obsahující dobře odštěpitelnou skupinu (např. halid) na straně druhé.
Může být žádoucí napojit léčivo na protilátku prostřednictvím spojovací skupiny. Tato spojka může fungovat jako rameno zajišťující odstup protilátky od léčiva, aby bylo zabráněno bránění ve vazbě. Tato spojovací skupina může také sloužit pro zvýšení chemické reaktivity substituované skupiny a tak zvýšit vazebnou efektivitu. Zvýšení chemické reaktivity může také zajistit použití agens, nebo funkčních skupin, které by jinak nebylo možno využít.
Každému odborníkovi v současném stavu techniky je jasné, že jako spojek je možné využít celou řadu bifunkčních nebo polyfunkčních reagens (viz katalog Pierce Chemical Co., Rockford, IL).
Je možno použít např. napojení přes aminoskupinu, karboxyl, sulfhydryl nebo oxidovaný cukerný zbytek. Rada referencí je uvedena v patentu US 4 671 958.
Pokud je léčivo účinnější pokud je uvolněné z imunokonjugátu podle navrhovaného vynálezu , může být využita spojovací skupina, která je štěpitelná během nebo po internalizaci do buňky.
Byla popsána celá řada štěpitelných skupin. Mechnismus intracelulámího štěpení léčiva z této spojky zahrnují štěpení pomocí redukce disulfidické vazby (patent US 4 489 710), ozářením fotolabilní vazby (patent US 4 625 014), hydrolýzou derivované aminovazby (patent US 4 638 ·»···· · ····· · • · · · · · ··· · ·· * · ·» ·
045), hydrolýzou způsobenou účinky komplementu (patent US 4 671 958) a kyselinou katalyzované hydrolýzy (patent US 4 569 789).
Může být třeba navázat na protilátku jedno nebo více typů léčiv. V jedné konkrétní variantě je na protilátku navázána celá řada stejných molekul. V jiné variantě je na protilátku navázáno více než jeden druh léčiva. Bez ohledu na konkrétní variantu, imunokonjugáty obsahující více než jeden druh léčiva mohou být připraveny celou řadou způsobů. Např. více nezjedná látka může být navázána přímo na molekulu protilátky, nebo na spojky, které zajišťují vazebná místa pro připojení. Je také možno využít nosiče.
Nosič může obsahovat léčiva navázaná různými způsoby, jako je kovalentní vazba a to jak přímá tak prostřednictvím spojky. Vhodnými nosiči mohou být proteiny jako jsou např. albuminy (patent US 4 507 234), peptidy a polysacharidy jako např. aminodextran (patent US 4 699 784). Nosič může také přenášet léčivo navázané nekovalentně pomocí enkapsulace, jako je tomu u lipozómů (patent US 4 429 008 a patent US 4 837 088). Nosičemi radionuklidů mohou být radiohalogenované malé molekuly a chelatační činidla. Např. patent US 4 735 792 popisuje příklad radiohalogenovaných malých molekul a jejich syntézu. Radionuklidové cheltátory mohou být ty, které obsahují atomy dusíku, nebo síry jako dárcovské atomy pro vazbu radionuklidů kovu nebo oxidů kovu. Např. patent US 4 673 562 popisuje řadu vhodných chelatačních činidel a jejich syntézu.
Pro podávání je možné použít libovolnou cestu aplikace. Obvykle se jedná o nitrožilní, svalovou podkožní aplikaci aplikaci do místa resekce nádoru. Je zřejmé, ža přesná dávka protilátky / imunokonjugátu, bude záviset na použité protilátce, denzitě nádoru a rychlosti vymizení protilátky.
Příklady dostupných vhodných protilátek proti fúzním proteinům podle navrhovaného vynálezu, jsou např. 8029K králičí polyklonální protilátka, myší monoklonální c-neu-3 protilátka (Calbiochem) a myší monoklonální protilátka Herceptin (patent US 5 677 171). Monoklonální c-neu-3 protilátka rozeznává sekvenční epitop v PD doméně, který v ECD-APD konstruktu chybí (1242 -1255 aa). Protilátka Herceptin se váže na konformační epitop ECD domény.
T-buňky
Imunoterapeutika mohou také obsahovat T-buňky specifické pro fúzní proteiny podle navrhovaného vynálezu. Tyto buňky mohou být připraveny in vitro nebo ex vivo za použití standartních technik. Např. T-buňky mohou být izolovány z kostní dřeně, periferní krve, z frakcí kostní dřeně nebo periferní krve pacientů za použití komerčně dostupných systémů pro dělení • · ·· ·* ·· • 9 * · * » · · • ···««· · « • · · · · · a « · 9 99 9 9 «9 · 9 · krve (viz. patent US 5 240 856, patent US 5 215 926, WO 89/06 280, WO 91/16 116 a WO 92/07 243). Je také možné použít T-buňky z nepříbuzných lidí, jiných savců, buněčných linií nebo kultur.
T-buňky mohou být stimulované HER-2/neu fúzním proteinem, polynukleotidem kódujícím HER-2/neu fúzní protein a/nebo antigen prezentující buňkou (APC) exprimující tento fúzní protein. Tato stimulace je prováděna za takových podmínek a po takovou dobu, která je dostatečná pro vznik T-buněk specifických pro fúzní protein. Aby vznikly specifické T-buňky je HER-2/neu fúzní protein nebo polynukleotid nejlépe prezentován na nosiči Jako je mikrosféra.
T-buňky jsou specifické pro HER-2/neu fúzní protein pokud tyto T-buňky zabíjejí cílové buňky pokryté fuzním proteinem, nebo exprimující polynukleotid který kóduje fúzní protein. Specifita T-buněk může být zhodnocena za použití technik známých v současném stavu techniky . Např. cytotoxickým testem za použití radioaktivního chrómu, stanovením proliferační aktivity, kdy stimulační index více než dvakrát přesáhne míru lýzy a proliferace u negativních kontrol. Tyto techniky je možno provádět např. podle Chen et al., (1994) Cancer Res. 54:1065-1070. Další možností je detekce T-buněčné proliferace pomocí celé řady dalších technik . Např. měřením nárůstu syntézy DNA (pulsováním buněčných kultur triciovaným thymidinem a stanovením množství thymidinu inkorporovaného do DNA). Přidáním HER-2/neu fúzního proteinu do média (100 ng/ml až 100 pg/ml, lépe pak 200 ng/ml až 25 pg/ml) po dobu 3 až 7 dnů, vede k zdvojnásobení proliferační aktivity T-buněk. Stejná inkubace po dobu 2 až 3 hodin, vede k aktivaci T-buněk, jak bylo stanoveno standartní cytokinovou technikou, kde bylo prokázáno zdvojnásobení hladiny uvolňovaných cytokinů (TNF nebo IFN-γ), což je důkazem T-buněčné aktivace (viz Coligan et al, Current Protocols in Immunology, vol. 1, Wiley Interscience (Greene 1998)). T-buňky, které jsou aktivovány v reakci na HER-2/neu fúzní protein, polynukleotid nebo fúzní protein exprimující APC, mohou být jak CD4+ tak CD8+. T-buňky specifické pro HER2/neu fúzní protein mohou být namnoženy za použití standartní ch technik. V jedné z nej vhodnějších variant, T-buňky pocházejí z pacienta, nebo z příbuzného či nepříbuzného dárce, a pacientovi jsou podány po namnožení a stimulaci.
Pro terapeutické účely, CD4+ nebo CD8+ T-buňky, které jsou aktivovány v reakci na HER-2/neu fúzní protein, polynukleotid nebo fúzní protein exprimující APC, mohou být namnoženy jak in vitro tak in vivo. Proliferace těchto buněk in vivo je dosaženo několika cestami. Např. T-buňky mohou být znovu vystaveny HER-2/neu fúznímu proteinu s a nebo bez dodání T-buněčných růstových faktorů, jako je interleukin-2, a/nebo stimulátorovým buňkám syntetizujícím HER2/neu fúzní protein. Je také možní, jednu nebo více T-buněk proliferujících v přítomnosti HER9 * · • 9 999 9 9 * 9 99 9 9 · a 9 · · · · ·
999 9 99 99 99
2/neu fúzního proteinu namnožit pomocí klonování. Techniky klonování jsou známé v současném stavu techniky, a zahrnují i limitní ředění. Po namnožení mohou být buňky podány zpět pacientovi, jak popisuje např. Chang et al., (1996) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 22:213.
Farmaceutické prostředky a vakcíny obsahující fúzní proteiny podle navrhovaného vynálezu
V jedné variantě navrhovaného vynálezu je popisován prostředek obsahující HER-2/neu fúzní protein nebo jeho varianty a HER-2/neu ICD proteiny, nebo jejich varianty. Fúzní proteiny jsou zejména ECD-ICD fúzní proteiny, ECD-PD fúzní proteiny nebo jejich varianty podle navrhovaného vynálezu, jak je popsáno dále. ICD protein je hlavně lidský ICD protein, který spadá do oblasti od Lys676 až Vall255 včetně, jak je zobrazeno na obr. 7 (sekvence č. 1), nebo krysí ICD protein, jehož aminokyselinová sekvence zahrnuje Lys676 až Vall256, jak je ukázáno na obr. 8 (sekvence č. 2). HER-2/neu ICD protein může být variantou části ICD proteinu, která je imunogenní nebo zvyšuje imunogenicitu prostředku. Např. část ICD proteinu může být HER2/neu PD protein, jak je zde popisován, HER-2/neu APD protein, jak je zde popisován, HER2/neu KD protein, jak je zde popisován, nebo HER-2/neu ICD protein, kde od N- nebo C-konce je postupně odebíráno 1 až 100 aminokyselin. Dále je možné řadu aminokyselin nahradit pomocí různých technik podle konkrétních variant navrhovaného vynálezu. V nej vhodnější variantě navrhovaného vynálezu jsou pouze konzervativní substituce aminokyselin, jak je popisováno výše. V některých konkrétních aspektech, polypeptidy, polynukleotidy, T-buňky a/nebo vazebné složky, které jsou zde popsány, mohou být obsaženy ve farmaceutickém prostředku, nebo imunogenním prostředku (tzn.vakcíny). Farmaceutické prostředky obsahují jednu z těchto složek a fyziologicky přijatelný nosič. Vakcíny mohou obsahovat jednu nebo více těchto složek a nespecifický posilovač imunitní reakce. Tento nespecifický posilovač imunitní reakce může být jakákoliv látka, která zesiluje imunitní reakci k cizorodému antigenu. Příklady nespecifických posilovačů imunitní odpovědi jsou adjuvans, biodegradovatelné mikrosféry (např. polylaktátgalaktosid) a lipozómy (do kterých jsou léčiva vestavěna, viz. např. patent US 4 235 877). Příprava vakcín je obecně popsána např. v Powell and Newman, eds. Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach), Plenům Press (NY, 1995). Vakcíny mohou být navrženy tak, aby vyvolávaly protilátkovou imunitu a/nebo buněčnou imunitu, jakou je aktivace CTL nebo CD4+ T-buněk.
Farmaceutické prostředky a vakcíny v rámci navrhovaného vynálezu mohou dále obsahovat další složky, které mohou být biologicky aktivní nebo neaktivní. Např. mohou obsahovat jednu nebo více imunogenních součástí nádorových antigenů, buď vestavěné ve fúzním polypeptidu nebo » · · * · *· *· · · · · · « 9 i 4 9 · Μ • ·····* · * ·» * « 9 · « ··· « 44 ·· jako nezávislé složky prostředku nebo vakcíny. Polypeptidy mohou, ale nemusí být spojeny s dalšími makromolekulami, jak popisuje patent US 4 372 945 a US 4 474 757. Farmaceutické prostředky a vakcíny mohou být použity jak k preventivnímu nebo terapeutickému použití. Farmaceutické prostředky nebo vakcíny mohou obsahovat polynukleotid kódující jeden nebo více HER-2/neu fúzních proteinů, např. HER-2/neu ECD-ICD a/nebo ECD-PD, jak je popsáno výše a tyto fůzní proteiny vznikají in šitu. Příslušné polynukleotidy mohou být DNA, RNA, modifikovaná nukleová kyselina, nebo DNA/RNA hybrid. Jak je uvedeno výše, polynukleotidy mohou být přítomné v jakémkoliv transportním systému, který je známý v současném stavu techniky, včetně expresních systému nukleových kyselin, bakterií a virových expresních systémů. Řada technik transportů genů je dobře známá v současném stavu techniky a je popsána např. vRolland (1998) Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198 a tam uvedených referencích. Vhodné expresní systémy nukleových kyselin obsahují nezbytné sekvence DNA umožňující expresi v pacientovi (jako jsou vhodné promotory a terminátory). Bakteriální transportní systémy zahrnují podání bakterií (jako např. BCG), které exprimují imunogenní částí fúzních proteinů na svém povrchu a nebo jsou schopné je sekretovat. V konkrétní variantě podle navrhovaného vynálezu může být DNA zavedena do buňky pomocí virového expresního systému (např. vakcínie, pox virus, retrovirus nebo adenovirus), což zahrnuje použití nepatogenních (defektivních) replikace neschopných virů. Vhodné systémy jsou popsány např. v Fisher-Hoch et al. (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:317-321; Flexner et al. (1989) Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86-103; Flexner at al. (1990) Vaccine 8:17-21, patent US 4 603 112, US 4 769 330, US 4 777 127, US 5 017 487, WO 89/01 973, GB 2 200 651, EP 0 345 242, WO 91/02 805, Berkner (1988) Biotechniques 6:616-627, Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434, Kolls et al. (1994) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 215-219, Kass-Eisler et al. (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:11498-11502, Guzman et al. (1993) Circulation 88:2838-2848 a Guzman et al. (1993) Cir. Res. 73:1202-1207. Techniky inkorporace DNA do těchto expresních systémů jsou dobře známé každému odborníkovi v současném stavu techniky. Molekula DNA může být také „nahá“, jak popisuje LJlmer et al. (1993) Science 259:1745-1749 a Cohen (1993) Science 259:1691-1692. Míra vstupu „nahé“ DNA do buňky může být zvýšena absorpcí DNA na biodegradovatelné kuličky, které slouží jako účinný transportér do buňky. Je zřejmé, ža vakcína může obsahovat jak polynukleotid, tak polypeptid. Tyto vakcíny zajišťují zlepšenou imunitní reakci.
Je zřejmé, že vakcíny mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné soli polynukleotidů a fúzních polypeptidů zde popisovaných. Tyto soli mohou být připraveny z farmaceuticky přijatelných netoxických zásad, včetně organických zásad (např. primární, sekundární a terciální aminy a • · · · · · • · · · · · ······ · ····· · · • · · · · · · · •·· · ·· ·· ·· ··· bazické aminokyseliny) a anorganických zásad (např. sodné, draselné, lithné, amonné, vápenaté a hořečnaté soli).
Pokud je v prostředku podle navrhovaného vynálezu použit některý vhodný nosič, známý v současném stavu techniky, jeho typ bude záviset na způsobu aplikace. Prostředky podle navrhovaného vynálezu mohou být připraveny pro příslušný způsob podání, jako je povrchové, orální, nasální, intravenózní, intrakraniální, intraperitoneální, subkutální nebo intramuskulámí.
Pro parenterální podání, jako je podkožní injekce, nosič většinou obsahuje vodu, fyziologický roztok, alkohol, mastnou kyselinu, vosk nebo pufr. Pro orální aplikaci může být nosičem látka jako manitol, laktóza, škrob, stearát hořečnatý, sacharin sodný, talek, celulóza, glukóza, sacharóza a uhličitan hořečnatý. Biodegradovatelné mikrokuličky (např. polylaktát, polyglykolát) mohou být použity jako nosiče ve farmaceutickém prostředku podle navrhovaného vynálezu.
Vhodné biodegradovatelné mikrokuličky jsou popsány např. v patentech US 4 897 268, US 5 075 109, US 5 928 647, US 5 811 128, US 5 820 883. HER-2/neu fúzní protein může být uzavřen v biodegradovatelné mikrokuličce anebo navázán na její povrch. V jedné konkrétní variantě je ECD-ICD fúzní protein podle navrhovaného vynálezu uzavřen uvnitř biodegradovatelné mikrokuličky.
Rovněž ECD-PD fúzní protein je uzavřen uvnitř biodegradovatelné mikrokuličky. Tyto mikrokuličky mohou obsahovat jak ECD-ICD fúzní protein, tak ECD-PD fúzní protein. Je vhodné, aby tyto mikrokuličky byly menší než asi 25 pm, lépe pak asi 1 až 10 pm. Uzavření v lipozomech je popsáno např. v patentu US 4 235 887.
Tyto prostředky mohou dále obsahovat pufr (neutrální fyziologický pufr nebo fosfát-fýziologický pufr), cukry (např. glukózu, manózu, sacharózu nebo dextrany), manitol, proteiny, polypeptidy nebo aminokyseliny, jako je glycin, antioxidanty, antibiotika, chelatační činidla, jako je EDTA nebo glutathion, adjuvans (např. hydroxid hlinitý), roztoky, které v prostředku ovlivňují isotonicitu, hypotonicitu, nebo hypertonicitu vzhledem ke krvi příjemce, zahušťovadla a/nebo ochranné složky. Prostředky podle navrhovaného vynálezu mohou mít formu lyofilizátu. Složky mohou být také uzavřeny uvnitř lipozómů pomocí technologií známých v současném stavu techniky. Jakákoliv z látek posilujících imunitní reakci nebo imunostimulační složka může být součástí vakcíny podle navrhovaného vynálezu. Např. může být použito adjuvans. Většina adjuvans obsahujíc látky určené k ochraně antigenů před degradací, jako je hydroxid hlinitý, nebo minerální olej, a stimulátory imunitní reakce, jako jsou lipid A, proteiny izolované z Bortadella Pertussis nebo Mycobacterium Tuberculosis. Vhodná adjuvans, která jsou komerčně dostupná, jsou např. Freunďs Incomplete Adjuvant a Complete Adjuvant (Difco Laboratories, • · · · · · · • ···· · · ·
Detroit, MI), Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, lne., Rahway, NJ) AS-2 (SmithKline Beecham), soli hliníku, jako je gel hydroxidu hliníku (alum) nebo fosforečnan hlinitý, soli vápníku, železa nebo zinku, nerozpustné suspenze acylovaného tyrosinu, acylovaných cukrů, kationtově nebo aniontové upravené polysacharidy, polyfosfazeny, biodegradovatelné mikrokuličky, monofosforyl, lipid A a quil A. Jako adjuvans mohou být použité také některé cytokiny, jako je GM-CSF, nebo interleukiny 2, 7 nebo 12.
V rámci zde popisované vakcínyje adjuvans použité v prostředku připravené tak, aby vyvolávalo imunitní reakci, zejména Thl typu. Vysoké hladiny Thl cytokinů (IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-12) vedou k indukci buněčné imunitní reakce proti podanému antigenu. Naopak, vysoké hladiny Th2 cytokinů (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10) vedou k indukci humorální imunitní reakce. Po aplikaci vakcíny, jak je zde popisována, u pacienta vznikne imunitní reakce zahrnující Thl a Th2 typy.
V nejvhodnější variantě navrhovaného vynálezu, kde většina imunitní reakce je Thl typu, hladiny Thl cytokinů vystoupí na daleko vyšší hodnotu než hladiny Th2 cytokinů. Hladiny těchto cytokinů mohou být stanoveny za použití standardních technik. Přehled rodin cytokinů je uveden v Mosmann and Coffman (1989) Ann. Ref. Immunol. 7:145-173.
Vhodná adjuvans vyvolávající zejména Thl typ odpovědi jsou kombinace monofosforyl lipidu A, lépe pak 3-de-O-acylovaného mohofosforyl lidpidu A (3D-MPL) současně se solemi hliníku. MPL adjuvans jsou dostupné od Corixa Corp. (Hamilton, MT, viz patenty US 4 436 727, US 4 877 611, US 4 866 034, US 4 912 094). CpG - obsahující oligonukleotidy (kde CpG dinukleotid je nemethylovaný) také indukují zejména Thl reakci. Tyto oligonukleotidy jsou dobře známé a popsané například v WO 96/02 555 a WP 99/33 488. Imunostimulační DNA sekvence jsou dále pospány v Sáto et al. (1996) Science 273:352. Dalším vhodným adjuvans je saponin, nejlépe QS21 (Aquila, USA), který může být použit sám nebo v kombinaci s jinými adjuvans. Např. jeden systém popisuje kombinaci monofosforyl lipidu A a derivátů saponinu, jako jsou kombinace QS21 a 3D-MPL popisované v WO 94/00 153 nebo slaběji reaktivní prostředky, kde QS21 je oslaben cholesterolem, jak popisuje WO 96/33 739. Další vhodné lékové formy obsahují emulze olej ve vodě a tokoferol. Velmi silné adjuvans obsahuje QS21, 3D-MPL a tokoferol v emulzi olej ve vodě, jak popisuje WO 95/17 210. QS21 a 3D-MPL jsou dále popisovány v EP 671 948 Bl.
Další vhodná adjuvans jsou Montanide ISA 720 (Seppic, Francie), SAF (Chiron, USA), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), série adjuvans SBAS (např. SBAS-2 nebo SBAS-4, SmitchKline Beecham, Belgie), Detox (Corixa Corp. Hamilton, MT), RC-529 (Corixa USA a aminoalkylglukosaminyd-4-fosfáty (AGP).
• · · · · · • · · · · · ·
V nejvhodnější variantě je adjuvans SBAS-2 (viz. EP 735898B1).
Vakcína zde popisovaná může být připraveny za použití technik dobře známých v současném stavu techniky zahrnující kombinaci antigenů, posilovače imunitní reakce a vhodného nosiče nebo excitientu. Prostředek zde popisovaný může být podáván jako součást postupně se uvolňující lékové formy (tzn. léková forma, jako jsou kapsule nebo gely, které po podání postupně uvolňují léčiva). Tyto lékové formy mohou být připraveny za použití dobře známých postupů (viz. Coombes et al. (1996), Vaccine 14:1429-1438) a podávány např. orálně, rektálně nebo pomocí podkožní implantace, nebo implantace do požadovaného cílového místa. Tyto postupně se uvolňující lékové formy mohou obsahovat polypeptid, polynukleotid, nebo protilátku přenášené v transportním systému nebo obsažené v částici pokryté membránou kontrolující rychlost uvolňování. Nosiče pro použití v této lékové formě jsou biokompatibilní a mohou být také biodegradovatelné. Je vhodné, aby léková forma zajišťovala relativně konstatní rychlost uvolňování aktivní složky. Těmito nosiči mohou být mikročástice složené z poly(laktitco-glycolit) stejně jako polyakrylát, latex, škrob, celulózu a dextran. Další nosiče s prodlouženým uvolňováním jsou supramolekulární biovektory, které obsahují nekapalné hydrofilní jádro (např. propojené polysacharidy nebo oligosacharidy) a mohou obsahovat vnější vrstvu obsahující amfifilní složku jako je fosfolipid (viz. např. patent US 5 151 254 a přihlášky PCT WO 94/20 078, WO 94/23 701 a WO 96/06 638). Množství aktivní složky obsažené v takové lékové formě závisí na zamýšleném místě účinku, intenzitě a trvání uvolňování léčiva a povaze poruchy, která má být léčena nebo preventována.
Je možné použít celé spektrum různých transportních systémů obsahujících farmaceutický prostředek nebo vakcínu tak, aby bylo dosaženo specifické imunitní reakce proti nádorovým buňkám. Těmito transportními systémy mohou být i antigen prezentující buňky (APC), jako jsou dendritické buňky, makrofágy, B-buňky, monocyty a další buňky, které jsou účinnými APC. Tyto buňky mohou, ale nemusí být geneticky upraveny tak, aby zvýšily svojí antigen prezentující kapacitu, aby se zlepšila aktivace a/nebo udržování T-buněčné odpovědi, aby bylo dosaženo protinádorového efektu a/nebo imunologické kompatibility s příjemcem (souhlasící E1LA haplotypy). APC mohou být izolovány z celé řady biologických tekutin a orgánů včetně nádorů a s nádorem související tkáně, mohou být autologní, alogenní, syngenní anebo xenogení.
Některé preferované varianty navrhovaného vynálezu využívají dendritických buněk nebo jejich progenitorů jako APC. Dendritické buňky jsou vysoce efektivní APC (Banchereau et al. (1998) Nátuře 392:245-251) a bylo prokázáno, že fungují jako účinné fyziologické adjuvans pro vyvolání profylaktické nebo terapeutické protinádorové imunity (Timmerman et al. (1999) Ann.
······ · ····· • · · · · · • · · · ·· · ·
Rev. Med. 50:507-529). Obecně dendritické buňky mohou být identifikovány podle svého typického tvaru (hvězdicovité in šitu, sjasnými cytoplazmatickými výběžky (dendrity viditelnými in vitro). Jejich schopnost rozběhnout proces a velmi efektivně prezentovat antigen zajišťuje velké spektrum aktivovaných T-buněk. Dendritické buňky mohou být samozřejmě geneticky upraveny tak, aby exprimovaly specifické povrchové receptory nebo ligandy, které se obvykle na dendritických buňkách in vivo nebo ex vivo nenacházejí, a tyto modifikované dendritické buňky jsou rovněž předmětem navrhovaného vynálezu. Jako alternativa dendritických buněk mohou být ve vakcíně použity dendritickými buňkami sekretované váčky naplněné antigenem (zvané exozomy) (Zitvogel et al. (1998) Nátuře Med. 4:594-600). Dendritické buňky a jejich progenitory mohou být získány z periferní krve, kostní dřeně, z buněk infiltruj ících nádor, z buněk infiltruj ících perinádorovou zónu, lymfatické uzliny, slezinu, pokožku nebo jiné vhodné tkáně či tekutiny. Např. dendritické buňky mohou být diferenciovány ex vivo po přidání kombinace cytokinů, jako je GM-CSF, IL-4, IL-13 a/nebo TNFa ke kultuře monocytů izolované z periferní krve. CD34 pozitivní buňky izolované z periferní krve, pupečníkové krve nebo kostní dřeně mohou být diferenciovány na dendritické buňky po přidání kombinace GM-CSF, IL-3, TNFa, CD40 ligandy, LPS, flt3 ligandy a/nebo jiných látek indukujících zrání a proliferaci dendritických buněk.
Dendritické buňky jsou obvykle děleny na nezralé a zralé, což je nejjednodušší způsob, jak odlišit jejich dva velmi odlišné fenotypy. Tato nomenklatura ovšem nezahrnuje všechny možné mezistupně diferenciace. Nezralé dendritické buňky jsou charakterizovány jako APC s vysokou kapacitou pro internalizaci antigenů a jeho zpracování, což odpovídá vysoké expresi Fcy receptorů a manózového receptoru. Zralý fenotyp je obvykle charakterizován nízkou expresí těchto znaků, ale vysokou expresí povrchových molekul zodpovědných za T-buněčnou aktivaci, jako jsou molekuly MHC třídy I a II, adhezivních molekul (např. CD54 a CD11) a kostimulačních molekul (CD40, CD80, CD86 a 4-1BB).
APC mohou být transfekovány polynukleotidy kódujícími fúzní proteiny podle navrhovaného vynálezu (nebo jeho variant), jako jsou fúzní proteiny nebo jejich varianty exprimované na buněčném povrchu. Tato transfekce může být provedena ex vivo a prostředek, nebo vakcína obsahující tyto transfekované buňky může být použita pro terapeutické účely, jak je zde popsáno. Transportní systémy genu zaměřené na dendritické buňky nebo další APC mohou být rovněž podávány pacientům, což vede k transfekci in vivo. In vivo a ex vivo dendritických buněk, například může být prováděna pomocí jakýchkoliv technik známých v současném stavu techniky, ······ · ····· • · · · · • · · · · jako ty, popisované v WO 97/24 447, nebo zařízení Gene gun popisovaná Mahvi et al. (1997) Immunology and Cell Biology 75:456-460.
Imunitní odpověď proti fúzním proteinům podle navrhovaného vynálezu
A. Detekce imunitní odpovědi proti fúzním proteinům podle navrhovaného vynálezu
Jedním z aspektů navrhovaného vynálezu jsou HER-2/neu fúzní proteiny (nebo polynukleotidy kódující HER-2/neu fúzní proteiny) použity pro vyvolání imunitní odpovědi proti HER-2/neu proteinu, včetně toho, který je exprimován na nádorových buňkách, které mají zvýšenou expresi HER-2/neu onkogenu. Vhodnými příklady těchto malignit jsou rakovina prsu, vaječníků, tlustého střeva, plic a prostaty. Imunitní odpověď proti HER-2/neu proteinu, vyvolaná pomocí HER-2/neu fúzního proteinu, může být dlouhodobá a může být detekována dlouhou dobu po imunizaci, bez ohledu na to, zda protein je v těle během testování přítomen nebo nepřítomen. Imunitní reakce proti HER-2/neu proteinu vyvolaná podáním HER-2/neu fúzního proteinu může být detekována stanovením přítomnosti nebo nepřítomnosti, nebo zvýšením specifické aktivace CD4+ nebo CD8+ T-buněk, nebo protilátek. Například, T-buňky izolované z imunizovaných jedinců pomocí standardních technik (např. Ficoll/Hypaque denzitním gradientu pomocí dělení periferních lymfocytů) a inkubací s HER-2/neu fúzním proteinem. Např. T-buňky mohou být inkubovány in vitro 2 až 9 dní (obvykle 4 dny) při 37 °C s HER-2/neu fúzním proteinem (obvykle 5pg/ml celkového proteinu nebo úměrné množství buněk syntetizující HER-2/neu protein). Může být žádoucí inkubovat další části vzorku T buněk v nepřítomnosti HER-2/neu fúzního proteinu, aby sloužily jako kontrola.
Specifická aktivace CD4+ nebo CD8+ T-buněk může být detekována různými způsoby. Technik pro detekci specifické T-buněčné aktivace je celá řada, např. proliferace T-buněk, produkce cytokinů (tzn. lymphokinů), nebo testování jejich cytolytické aktivity (tzn. vyvolání specifických cytotoxických T-buněk proti HER-2/neu fúznímu proteinu). Pro CD4+ T-buňky je nejvhodnější technika detekce specifické T-buněčné aktivace detekce proliferace T-buněk. Pro CD8+ T-buňky je nejvhodnější technikou detekce specifické T-buněčné aktivace, detekce jejich cytolytické aktivity.
Detekce proliferace T-buněk může být prováděna řadou technik známých v současném stavu techniky. Např. T-buněčná proliferace může být detekována měřením rychlosti syntézy DNA. Tbuňky, které jsou stimulované, vykazují zvýšenou míru syntézy DNA. Obvyklou technikou měření intenzity syntézy DNA je např. pulzování buněčných kultur T-buněk pomocí tritiovaného thymidinu, prekurzoru nukleosidu, který je inkorporován do nově tvořené DNA. Množství • · · · · · · ··· · ·· ·· ·· tritiovaného thymidinů, které je použito, může být stanoveno pomocí spektrofotometrie v kapalném scintilačním roztoku. Dalšími způsoby detekce T-buněčné proliferace je měření nárůstu produkce interleukinu-2 (IL-2), nárůst intracelulámího vápníku, akumulace barviva, jako je 3-(4,5-dimethylthialzol-2-yl)-2,5-difenyltetrazol. Je také možné měřit syntézu lymfokinů (např. interferonu γ), nebo relativní množství T-buněk reagujících na pl85HER'2/neu.
B. Detekce produkce protilátek v reakci proti fúznímu proteinu podle navrhovaného vynálezu
Navrhovaný vynález také popisuje HER-2/neu fúzní protein, který, kromě toho, že je imunogenní pro T-buňky, aktivuje B-buňky a ty produkují protilátky schopné rozeznávat HER-2/neu fuzní proteiny. Detekce těchto protilátek zajišťuje další způsob diagnózy nádorových onemocnění, u kterých je prokázána zvýšená exprese HER-2/neu onkogenu. Specifické protilátky (tj. ty, které vykazují vazebnou afinitu alespoň 10 1/mol nebo lepší) pro HER-2/neu fúzní proteiny mohou být nalezeny v celé řadě tělesných tekutin včetně séra a ascitické tekutiny. Zkráceně, tělní tekutiny jsou izolované z teplokrevných živočichů, jak je člověk, u kterých je žádoucí stanovit, zda je schopen tvořit specifické protilátky proti fuzním proteinům podle navrhovaného vynálezu. Tělesné tekutiny jsou inkubovány s HER-2/neu fuzními proteiny za podmínek a po dobu dostatečnou pro vznik imunokomplexů mezi HER-2/neu fúzními proteiny a protilátkami specifickými pro fúzní proteiny. Např. tělesné tekutiny a EÍER-2/neu fúzní proteiny mohou být inkubovány při 46 °C po dobu 24 až 48 hodin. Po této inkubaci je reakční směs testována na přítomnost imunokomplexů. Detekce těchto imunokomplexů, které vznikají mezi HER-2/neu fúzními proteiny a specifickými protilátkami mohou být provedeny celou řadou známých technik, jako jsou radioimmuno techniky (RIA) a ELISA techniky. Vhodné immuno techniky jsou např. sendvičová ELISA podle David et al. (patent US 4 376 110), monoklonál-polyklonál sendvičová technika (Wide et al., v Kirgham and Hunter, Radioimmunoassay Methods, I. and S. Livingstone, Edinburgh (1970)), technika „western blot“ podle Gordon et al. (patent US 4 452 901) imunoprecipitace značeného ligandu (Brown et al. (1980) J. Biol. Chem., 225:4980-4983) ELISA techniky, podle Raines et al. (1982) J. Biol. Chem. 275:5154-5160, imunocytochemické techniky, včetně použití fluorescenčních barviv (Brooks et al. (1980) Clin. Exp. Immunol., 39:477) a neutralizační techniky (Bowen - Pope et al. (1984) Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81:2396-2400), všechny jsou zde uvedeny jako reference. Kromě imunotechnik uvedených výše je možné použít celou řadu dalších imunotechnik, včetně těch, které jsou popsány v patentech US 3 817 827, US 3 850 752, US 3 901 654, US 3 935 074, US 3 984 533, US 3 996 354, US 4 034 074 a US 4 098 876, které jsou zde uvedeny jako reference. Pro detekce HER-2/neu fúzní proteiny (tzn. antigeny) mohou být značené nebo neznačené. Pokud jsou neznačené, fúzní proteiny jsou použitelné v aglutinačních technikách. Navíc, neznačené fúzní proteiny mohou být využity v kombinace se značenými molekulami, které jsou reaktivní s imunokomplexy, nebo v kombinaci se značenými protilátkami (sekundárními protilátkami), které jsou reaktivní s protilátkami namířenými proti HER-2/neu fúzním proteinům, jako jsou protilátky specifické na imunoglobulin. Další možností je, že fúzní proteiny mohou být značeny přímo. Pokud jsou značeny, může být pro značení použit např. radioizotop, fluorescenční značka, enzym, luminiscenční značka, částice barviva, apod. Tyto a další značky jsou velmi dobře známé v současném stavu techniky a jsou popsány např. v patentech US 3 766 162, US 3 791 932, US 3 817 837, US 3 996 345 a US 4 233 402, které jsou zde uvedeny jako reference. Při použití ELISA techniky jsou fúzní proteiny podle navrhovaného vynálezu absorbovány na povrch mikrotitračních jamek. Zbylá místa na povrchu jamky schopná vázat protein jsou blokována příslušným agens, jako je např. hovězí sérový albumin (BSA), tepelně inaktivované normální kozí sérum (NGS) nebo BLOTTO (pufrovaný roztok netučného suchého mléka obsahující ochrannou složku soli a protipěnící agens). Jamka je poté inkubována se vzorkem, o kterém se předpokládá, že obsahuje specifické protilátky. Vzorek může být aplikován přímo, nebo, jak je to obvyklé, může být naředěn obvykle pomocí pufrováného roztoku obsahujícího malé množství (0,1 % až 5 % hmotnosti) proteinu, jako je BSA, NGS nebo BLOTTO. Po dostatečně dlouhé inkubaci, která umožňuje specifickou vazbu, je z jamky vymyt nenavázaný protein a do jamky je přidán protidruhově specifický imunoglobulin, který nese značku. Touto značkou může být celá řada enzymů, např. křenová peroxidáza, β-galaktosidáza, alkalická fosfatáza a glukózová oxidáza. Po uplynutí dostatečného času umožňující specifickou vazbu je jamka opět promyta od nenavázaného konjugátu a je přidán substrát příslušného enzymu. Je ponechán dostatečný čas pro vyvinutí zabarvení, jehož denzita může být stanovena od oka nebo pomocí přístrojů. V jedné konkrétní variantě podle navrhovaného vynálezu je značka navázána přímo na HER-2/neu fúzní protein. Krok detekce imunokomplexů zahrnuje odstranění v podstatě veškerého nenavázaného HER-2/neu fúzního proteinu a poté detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti značky. V další konkrétní variantě podle navrhovaného vynálezu je značka navázána na další protilátku, která je schopna vazby na protilátky specifické pro HER-2/neu fúzní protein. Detekční krok zahrnuje (a) odstranění v podstatě všech nenavázaných protilátek (b) přidání sekundární protilátky (c) odstranění v podstatě všech nenavázaných sekundárních protilátek a (d) detekce přítomnosti nebo absence značky. Pokud protilátka specifická pro HER-2/neu fúzní protein pochází z člověka, sekundární protilátka je anti-human protilátka. V další konkrétní variantě pro detekci imunokomplexů je značka navázána na molekulu schopnou vazby na imunokomplexy. Detekční kroky zahrnují (a) přidání molekuly, (b) odstranění veškeré nenavázané molekuly a (c) detekce přítomnosti nebo nepřítomnosti značky. Příkladem molekuly schopné vazby na imunokomplexy je protein A. Je zřejmé, pro každého odborníka v současném stavu techniky, že pro detekci imunokomplexů, podle navrhovaného vynálezu, je možné použít celou řadu technik. Značky vhodné pro použití v jakékoliv z těchto technik mohou být např. radioizotopy, fluorescenční barviva, enzymy, luminiscenční barviva a barevné částice. V dalším aspektu podle navrhovaného vynálezu může být detekce imunokomplexů tvořených HER-2/neu fúzními proteiny a protilátkami z tělesných tekutin, které jsou specifické pro HER-2/neu fúzní proteiny, použitá pro sledování účinnosti protinádorové terapie, kde je využíván HER-2/neu fúzní protein u nádorových onemocnění, se kterými je spojená zvýšená exprese HER-2/neu onkogenu. Vzorky tělesných tekutin odebíraných z jedinců před a po začátku terapie mohou být testovány na přítomnost imunokomplexů pomocí výše popsaných technik. Zkráceně, množství imunokomplexů detekovaných ve všech vzorcích je srovnáno. Podstatné zvýšení množství imunokomplexů v druhém vzorku (odebraném po začátku terapie) vzhledem k prvnímu vzorku (před terapií) značí úspěšnou léčbu.
Nádorová terapie
Dalším aspektem navrhovaného vynálezu jsou prostředky zde popisované, které jsou využitelné pro imunoterapii rakoviny, jako je rakovina prsu, vaječníků, tlustého střeva, plic a prostaty.
V rámci této léčby je pacientům podáván farmaceutický prostředek a/nebo vakcína. Jak je zde popisováno, termín „pacient“ popisuje jakéhokoliv teplokrevného živočicha, nejlépe člověka. Pacient může, nebo nemusí trpět rakovinou. Z toho vyplývá, že býše uvedené farmaceutické prostředky a vakcíny mohou být použity pro prevenci vzniku rakoviny, nebo pro léčbu pacienta trpícího rakovinou. Rakovina může být diagnostikována pomocí standardních kritérií akceptovaných v současném stavu techniky, včetně prokázání přítomnosti maligního nádoru. Farmaceutické prostředky a vakcíny mohou být podávány buď před nebo po chirurgickém odstranění primárního nádoru a/nebo po takové léčbě, jako je radioterapie nebo konvenční chemoterapie. Pro podání může být využita jakákoliv vhodná technika včetně aplikace intravenózní, intraperitoneální, intramuskulární, subkutální, intranasální, intradermální, anální, vaginální, povrchové, sublinguální anebo orální.
V rámci navrhovaného vynálezu imunoterapie může být aktivní imunoterapii, kde léčba je založena na in vivo stimulaci endogenních mechanizmů imunitního systému hostitele proti nádoru pomocí aplikace látek ovlivňujících imunitní reakci (jako jsou fůzní polypeptidy a polynukleotidy podle navrhovaného vynálezu).
V jiných konkrétních variantách podle navrhovaného vynálezu může být imunoterapie pasivní imunoterapie, kde léčba zahrnuje podání agens zajišťujících reaktivitu imunitního systému proti nádoru (jako jsou efektorové buňky nebo protilátky), které mohou přímo nebo nepřímo zajistit protinádorový účinek a nejsou závislé na imunitním systému hostitele. Příklady efektorových buněk jsou např. T-buňky, jak bylo uvedeno výše, T-lymfocyty (jako jsou CD8+, cytotoxické lymfocyty a CD4+ T-pomocné nádor-infiltrující lymfocyty), zabíječské buňky (jako jsou NKbuňky a LAK buňky), B-buňky a antigen prezentující buňky (jako jsou dendritické buňky a makrofágy) exprimující fůzní proteiny podle navrhovaného vynálezu. T-buněčné receptory a protilátky specifické pro fůzní polypeptid podle navrhovaného vynálezu mohou být klonovány, exprimovány a vloženy do dalších vektorů nebo efektorových buněk pro adoptivní imunoterapii. Fůzní polypeptidy zde popisované mohou být použity pro tvorbu protilátek nebo antiidiotypových protilátek (jak je uvedeno výše v patentu US 4 918 164) pro pasivní imunoterapii. Efektorové buňky mohou být získány v dostatečném množství pro adoptivní imunoterapii pomocí namnožení in vitro, jak je zde popisováno. Kultivační podmínky pro namnožení jedné antigen specifické efektorové buňky na několik miliard se zachováním specifity vůči antigenu in vivo jsou dobře známé v současném stavu techniky. Tyto in vitro kultivační podmínky využívají nepřetržité stimulace antigenem obvykle v přítomnosti cytokinů (jako je IL-2) a nedělících se pomocných buněk. Jak je uvedeno výše, imunoreaktivní fůzní protein, jak je zde popisován, může být použit pro namnožení antigen specifických T-buněk, aby bylo dosaženo jejich dostatečné množství pro úspěšnou imunoterapii. Konkrétně, antigen prezentující buňky, jako jsou dendritické buňky, makrofágy, nebo B-buňky, mohou být pulzovány s imunoreaktivním fúzním proteinem nebo transfekovány jedním nebo více polynukleotidy za použití standardních technik dobře známých v současném stavu techniky. Např. antigen prezentující buňky mohou být transfekovány polynukleotidem obsahujícím promotor vhodný pro zvýšení exprese v rekombinantním viru nebo jiném expresním systému. Kultivované efektorové buňky použitelné v terapii musí být schopné růst a množit se v poměrně velkém množství a dlouhodobě přežívat in vivo. Studie prokázaly, že kultivované efektorové buňky mohou být indukovány pro růst in vivo a dlouhodobé přežití opakovanou stimulací antigenem a pomocí dodání IL-2 (viz. např. Cheever et al. (1997) Immunological Reviews 157:177). Další možností je využít vektor exprimující fůzní protein podle navrhovaného vynálezu, který může být zaveden do antigen prezentující buňky odebrané z pacienta a pomocí klonování namnožen ex vivo a transplantován zpátky stejnému • ·
pacientovi, transfekované buňky mohou být podány pacientovi za použití jakékoliv techniky známé v současném stavu techniky, nejlépe ve sterilní formě aplikací intravenózní, intrakavitámí, intraperitoneální nebo intratumorální.
Způsoby a četnost podávání terapeutických prostředků podle navrhovaného vynálezu stejně jako dávkování se odlišuje jedinec od jedince a může být stanoveno za použití standardních technik. Obvykle farmaceutický prostředek a vakcína mohou být podávány ve formě injekce (např. podkožní, intramuskulární, intravenózní), intranasálně (např. vdechováním) nebo orálně. Je vhodné, aby 1 až 10 dávek byly podány během asi 52 týdnů. Je lepší, aby 6 dávek bylo podáváno v intervalu jednoho měsíce a posilovači vakcíny mohou být podávány ve stejné periodě. Pro každého pacienta však může být vhodný jiný protokol. Vhodná dávka je množství látky, která, pokud je podána, jak bylo uvedeno výše, je schopná vyvolat protinádorovou imunitní odpověď v intenzitě alespoň 10 % až 50 % nad normální hladinu (tzn. neléčenou). Intenzita této odpovědi může být stanovena měřením protinádorových protilátek u pacientů nebo na vakcíně závislém vzniku cytolitických efektorových buněk schopných zabíjet nádorové buňky pacienta in vitro. Tyto vakcíny mohou být schopny vyvolat imunitní odpověď vedoucí ke zlepšenému klinickému obrazu (např. častější vymizení kompletní, Částečné nebo dlouhodobé poltačení relapsu) u pacientů, kteří dostali vakcínu vzhledem k neošetřeným pacientům. Obecně pro farmaceutické prostředky a vakcíny obsahující 1 nebo více fúzních proteinů je množství každého fúzního proteinu přítomného v dávce v rozmezí od 1 pg do 5 mg, lépe pak 100 pg až 5 mg a nejlépe 5 pg až 250 mg na kg hostitelovy hmotnosti. Vhodné dávky se budou odlišovat podle velikosti pacienta, ale obvykle budou v rozsahu od asi 0,1 ml do asi 5 ml.
Je vhodné, aby úvodní nebo primární imunizace proběhla pomocí HER-2/neu fúzního proteinu obsahujícího např. alespoň jednu z ECD, ICD nebo PD a následná posilovači imunizace aby proběhla pomocí HER-2/neu fúzního proteinu obsahujícího např. alespoň jednu z ECD, ICD nebo PD. Nej vhodnější ECD-ICD a/nebo ECD-PD fúzní proteiny pro imunizaci jsou ty, které jsou zde popsány. Každý odborník v současném stavu techniky může předpokládat, že navrhovaný vynález zahrnuje použití celého HER-2/neu fúzního proteinu stejně, jako rozdělení HER-2/neu fúzního proteinu na celé spektrum peptidů. Ani celý pl85HER'2/neu protein, ani peptid obsahující aminokyselinovou sekvenci celé HER-2/neu ECD domény (nebo části HER-2/neu ECD domény) není použit pro imunizaci sám o sobě.
Obecně, vhodná dávka a léčebný protokol zahrnuje aktivní složku v množství dostatečném pro vyvolání léčebného nebo preventivního přínosu. Tato odpověď může být sledována pomocí zlepšeného klinického obrazu (např. častější vymizení, kompletní, částečné nebo dlouhodobé • · fQ ····♦········
JJ ······ • · · · · · · · potlačení relapsu) u léčených pacientů vzhledem k neléčeným pacientům. Nárůst existující imunitní reakce proti HER-2/neu proteinu nebo fúznímu proteinu obvykle odpovídá zlepšenému klinickému obrazu. Tyto imunitní reakce mohou být sledovány použitím standardních technik, jako je proliferace, cytotoxický test nebo cytokinové techniky, které mohou být prováděny na vzorcích získaných z pacientů před a po léčbě.
Detekce rakoviny
A. Způsoby detekce rakoviny
Obecně, rakovina může být detekována u pacientů díky přítomnosti HER-2/neu proteinů a/nebo polynukleotidů kódujících tyto proteiny v biologickém vzorku (jako je krev, sérum, plazma, moč anebo nádorové biopsie) získaném z pacienta. Jinými slovy, tyto proteiny mhou být použity jako znaky ukazujícími na přítomnost nebo nepřítomnost takového druhu rakoviny, jako je rakovina prsu, vaječníků, tlustého střeva, plic, prostaty, atd. Vazebná složka popisovaná v navrhovaném vynálezu umožňuje detekci hladiny HER-2/neu proteinu v biologickém vzorku. Polynukieotidové primery a sondy mohou být použity pro detekci hladiny mRNA kódující HER2/neu protein, což je také znakem přítomnosti nebo nepřítomnosti rakoviny. Obecně, HER-2/neu nádorová sekvence může být přítomna v hladině, která je alespoň třikrát vyšší než v tkáni zdravé. Je známa celá řada technik v současném stavu techniky využívající vazebnou složku pro detekci polypeptidu ve vzorku (viz. např. Harlow and Lané, Antibodies: Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, 1988). Obecně, přítomnost nebo nepřítomnost rakoviny u pacienta může být stanovena (a) přidáním vazebné složky do biologického vzorku získaného z pacienta, (b) detekcí množství polypeptidu se vzorku, který se navázal na vazebnou složku a (c) srovnáním úrovně tohoto polypeptidu s předem stanovenou hodnotou.
V nej vhodnější variantě tato techniky zahrnuje použití vazebné složky imobilizované na pevný podklad pro navázání a odstranění příslušného polypeptidu ze vzorku. Navázaný polypeptid může být poté detekován za použití detekčních složek obsahujících značku, které se specificky váží na komplex vazebná složka/polypeptid. Tyto detekční systémy mohou zahrnovat např. vazebnou složku specificky se vázající k polypeptidu nebo protilátce nebo jiné agens, které se specificky váže na vazebné agens, jako je anti-imunoglobulin, protein G, protein A nebo lektin. Další možností je využít kompetetivní techniku, kde polypeptid je označen pomocí značky a je mu umožněno navázat se na imobilizovanou vazebnou složku po inkubaci vazebné složky se vzorkem. Míra, ve které složky vzorku znemožňují vazbu značeného polypeptidu na vazebnou složku, je přímo úměrná reaktivitě vzorků s imobilizovanou vazebnou složkou. Vhodnými
polypeptidy pro použití v takové technice jsou např. kompletní HER-2/neu nádorový protein a jeho části, na které se vazebné složky navazují a HER-2/neu fúzní protein a jeho části, na které se navazují vazebné složky. Pevnou fází může být jakýkoliv materiál známý v současném stavu techniky, na který je možno navázat nádorový protein. Např. pevnou fází může být testovací jamka na mikrotitrační destičce, nebo nitrocelulózová, či jiná vhodná membrána. Další možností je použít kuliček nebo disků vyrobených ze skla, taženého skla, latexu nebo z plastů, jako jsou polystyrén, nebo polyvinylchlorid. Pevnou fází mohou být také magnetické částice nebo vláknitý optický senzor, jak je popsáno v patentu US 5 359 681. Vazebná složka může být imobilizována na pevné fázi za použití celé řady technik známých v současném stavu techniky, které jsou velmi dobře pospány ve vědecké literatuře. V souvislosti navrhovaného vynálezu termín „imobilizace“ popisuje jak nekovalentní asociace, jako jsou absorpce, tak kovalentní navázání (které může být přímé mezi vazebnou složkou a funkční skupinou na pevné fázi, nebo může být uskutečněné prostřednictvím spojky). Imobilizace pomocí absorpce na jamky v mikrotitrační destičce nebo na membráně je nejvhodnější variantou. V těchto případech je absorpce dosaženo přidáním vazebné složky ve vhodném pufru k pevné fázi na dostatečně dlouho dobu. Tato doba je závislá na teplotě, ale obvykle je v rozsahu od 1 hodiny do asi 1 dne. Do jedné jamky na plastické mikrotitrační destičce (obvykle z polystyrénu nebo polyvinylchloridu) je přidáno množství vazebné složky v rozmezí od 10 ng do asi 10 pg a lépe pak od 100 ng do asi 1 pg, je dostatečné pro imobilizaci odpovídajícího množství vazebné složky.
Kovalentní navázání vazebné složky na pevnou fázi může být uskutečněno reakcí pevé fáze s bifunkční složkou reagující s podkladem a funkční skupinou, jako je hydroxyl nebo aminoskupina na vazebné složce. Například vazebná složka může být navázána kovalentně na povrch potažený za použití benzochinonu nebo kondenzací aldehydových skupin na podkladu s aminy a aktivními vodíky na vazebném partnerovi (viz. např. Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, A12-A13).
V některých variantách je tato technika sendvičová technika využívající dvou protilátek. Tato technika může být prováděna nejprve imobilizaci první protilátky na pevném povrchu, kterým je obvykle jamka mikrotitrační destičky se vzorkem tak, že polypeptidy ve vzorku se mohou vázat na imobilizovanou protilátku. Nenavázané vzorky jsou vymyty od imobilizovaných komplexů polypeptid-protilátka a je přidána detekční složka (obvykle druhá protilátka schopná vazby na jiné místo polypeptidů) obsahující značku. Množství detekovaného reagens, které zůstane navázané na pevném povrchu je poté stanoveno pomocí techniky vhodné pro konkrétní značku.
Konkrétněji, jakmile je protilátka imobiiizována na pevné fázi, jak je popsáno výše, zbývající místa schopná vázat protein na pevné fázi musí být zablokována. Je možné použít jakékoliv vhodné blokovací agens známé v současném stavu techniky, jako je BSA nebo Tween20™ (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Imobilizovaná protilátka je inkubována se vzorkem tak, aby se polypeptid mohl navázat na protilátku. Vzorek může být naředěný vhodným ředidlem, jako je například fosfátový roztok (PBS) před inkubací. Obecně, vhodný inkubační čas je taková doba, která je dostatečná pro detekci přítomnosti polypeptidů ve vzorku získaném z pacienta trpícího rakovinou prsu, vaječníků, tlustého střeva, plic nebo prostaty. Je vhodné, aby tento inkubační čas umožnil navázání alespoň 95 % hodnoty odpovídající rovnováze mezi navázaným a nenavázaným polypeptidem. Každý odborník v současném stavu techniky pochopí, že čas nezbytný pro dosažení rovnováhy může být stanoven pomocí intenzity vazby během času. Při pokojové teplotě je inkubační doba okolo 30 minut většinou dostatečná.
Nenavázaný vzorek může být poté odstraněn promytím pevného povrchu vhodným pufrem, jako je např. PBS obsahující 0,1 % Tween20™. Po té je možné přidat sekundární protilátku obsahující značku. Nej vhodnější značky jsou uvedeny výše.
Detekční složky je inkubována s imobilizovaným komplexem protilátka-polypeptid po dobu dostatečnou pro detekci navázaného polypeptidů. Dostatečný inkubační čas by měl být stanoven pomocí vyhodnocování míry vazby v průběhu času. Nenavázaná detekční složka je odstraněna a navázaná detekční složka je detekována pomocí navázané značky. Způsob detekce značky je závislý na její povaze. Pro radioaktivní značky se jedná zejména o scintilační součet nebo autoradiografické techniky. Pomocí spektroskopických technik je možné detekovat barviva, luminiscenční skupiny a fluorescenční skupiny. Biotin může být detekován za použití avidinu s navázanou značkou (obvykle radioaktivní nebo fluorescenční skupinou nebo s enzymem). Enzymatické značky je možné detekovat pomocí jejich substrátu (obvykle po specifickou dobu), což je následováno spektroskpickou nebo jinou analýzou reakčního produktu.
Pro stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti rakoviny, jako je rakovina prsu, vaječníků, tlustého střeva, plic nebo prostaty je třeba detekovaný signál, který byl získán z pevné fáze, porovnat se signálem odpovídajícím negativní kontrole. V jedné konkrétní variantě je limitní hodnota pro detekci rakoviny průměrný signál získaný, pokud je imobilizovaná protilátka inkubovaná se vzorky s pacientů bez rakoviny. Obvykle vzorek poskytující signál, který je o tři směrodatné odchylky nad limitní hodnotou brán jako pozitivní signál přítomnosti rakoviny. V jiné konkrétní variantě je limitní hodnota stanovena za použití Receiver Operátor Curve podle techniky Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicin, Little
Brown and Co., 1985, 106-107. Obecně, v této variantě je limitní hodnota stanovena z výnosu dvojic pravdivě pozitivních hodnot (tzn. citlivost) a falešně pozitivních hodnost (100 %specifity), které odpovídají každé možné limitní hodnotě pro diagnostický výsledek testu. Limitní hodnota výnosu, která je nejblíže hornímu levému rohu (tzn. hodnota, která zahrnuje největší oblast), je nepřesnější limitní hodnota a vzorek poskytující takový signál, který je vyšší než limitní hodnota stanovená touto technikou, je brán jako pozitivní. Další možností je posunout limitní hodnotu do leva ve výnosu tak, aby bylo minimalizováno množství falešných pozitivit, nebo do prava, aby bylo minimalizováno množství falešných negativit. Obecně, vzorek, která dává signál, který je vyšší než limitní hodnota, je brán jako pozitivní na přítomnost rakoviny.
V odpovídajících variantách mohou být tyto techniky prováděny v průtokovém nebo strip formátu, kde vazebná složky je imobilizována na membráně, jako je nitrocelulóza.
V průtokovém testu se polypeptidy ze vzorku naváží na imobilizovanou vazebnou složku při průchodu vzorku membránou. Sekundární, značená vazebná složka se poté váže na komplex vazebná složka-polypeptid, když roztok obsahující tuto sekundární vazebnou složku prochází skrz membránu. Detekce navázané sekundární vazebné složky může být provedena stejně, jak bylo uvedeno výše. V testu na strip formátu je jeden konec membrány, na který je navázána vazebná složka, ponořen do roztoku obsahující vzorek. Vzorek prochází skrz membránu a oblast obsahující sekundární vazebnou složku až do oblasti obsahující imobilizovanou vazebnou složku. Koncentrace druhé vazebné složky v oblasti imobilizované protilátky prokazuje přítomnost rakoviny. Obvykle koncentrace sekundární vazebné složky vytváří vzorek, jako je čára, který je patrný okem. Nepřítomnost tohoto signálu ukazuje na negativní výsledek. Obecně, množství vazebné složky imobilizované na membráně je zvoleno tak, aby ukázalo vizuálně zřetelný vzor v případě, že biologický vzorek obsahuje takové množství polypeptidu, které je dostatečné pro získání pozitivního signálu v sendvičové technice využívající dvě protilátky, jak bylo uvedeno výše. Nejvhodnější vazebné složky pro použití v těchto technikách jsou protilátky a jejich fragmenty vázající antigen. Množství protilátky imobilizované na membráně je v rozsahu od asi 25 ng do asi 1 pg, lépe pak od asi 50 ng do asi 500 ng. Tento typ testu může být obvykle prováděn s velmi malým množstvím biologického vzorku.
Samozřejmě existuje celá řada technik a protokolů, které využijí jak nádorový protein, tak vazebnou složku podle navrhovaného vynálezu. Například každému odborníkovi v současném stavu techniky je jasné, že výše uvedené protokoly je možné upravit tak, aby využívaly HER2/neu proteinů pro detekci protilátek vázající tyto polypeptidy v biologických vzorcích. Detekce *
• · • « ··· · · · · · · · « A · · · · · · · ,-,-1 9 ·»·» · » · ··· · · · □ / ······· ·«« · · · · · · · * těchto HER-2/neu protein specifických protilátek může souviset s přítomností rakoviny. Rakovina může také být detekována pomocí přítomnosti T-buněk specificky reagujících s HER2/neu fúzním proteinem v biologickém vzorku. Pomocí vhodných technik, biologické vzorky obsahující CD4+ a/nebo CD8+ T-buňky izolované z pacientů jsou inkubovány s HER-2/neu fúzním proteinem, polynukleotidem kódujícím tento fúzní protein a/nebo APC exprimujícími tento fúzní protein a je detekována přítomnost nebo nepřítomnost specifické aktivace Tbuněk.Vhodnými biologickými vzorky jsou například izolované T-buňky. T-buftky mohou být izolovány z pacientů pomocí standardních technik (jako je centrifugace periferních lymfocytů na Ficoll/Hipaque denzitním gradientu). T-buňky mohou být inkubovány in vitro po dobu 2 až 9 dní (obvkle 4 dny) při 37 °C v přítomnosti HER-2/neu fúzního proteinu (5 až 25 gg/ml). Je vhodné inkubovat část T-buněk v nepřítomnosti HER-2/neu fúzního proteinu, aby sloužily jako kontrolní vzorek. Pro stanovení aktivace CD4+ T-buněk je vhodné detekovat proliferační aktivitu T-buněk.
Pro stanovení aktivace CD8+ T-buněk je vhodné detekovat cytolytickou aktivitu těchto buněk. Pokud intenzita proliferace je alespoň dvojnásobná nebo vyšší a/nebo úroveň cytolytické aktivity je alespoň o 20 % vyšší než u zdravých pacientů, dá se u pacienta předpokládat přítomnost rakoviny. Jak je uvedeno výše, rakovinu je možné také detekovat na základě přítomnosti mRNA kódujícím HER-2/neu protein v biologickém vzorku. Například, je možné využít dva oligonukleotidové primery v polymerázové řetězové reakci (PCR) založené na amplifikaci části HER-2/neu cDNA pocházející z biologického vzorku, kde alespoň jeden z oligonukleotidových primerů je specifický (tzn. hybridizuje s) pro polynukleotid kódující HER-2/neu protein. Amplifikovaná cDNA je poté izolována a detekována za použití technik známých v současném stavu techniky, jako je gelová elektroforéza. Podobně, oligonukleotidové sondy, které specificky hybridizují s polynukleotidem kódujícím HER-2/neu protein nebo fúzní protein, mohou být využity v hybridizačních technikách pro detekci přítomnosti polynukleotidu kódujícího HER2/neu protein v biologickém vzorku.
Pro umožní hybridizace za vhodných podmínek oligonukleotidové primery a sondy by měli obsahovat sekvence s alespoň 60 %, lépe pak s 75 % a nejlépe s alespoň 90 % identitou k odpovídající části polynuklotidu kódujícího HER-2/neu protein nebo fúzní protein, který je dlouhý alespoň 10 nukleotidů, lépe pak 20 nukleotidů. Je vhodné, aby oligonukleotidové primery a/nebo sondy hybridizovaly s polynukleotidem kódujícím HER-2/neu protein nebo fúzní protein podle navrhovaného vynálezu za poměrně přísných podmínek, jak jsou definovány výše. Oligonukleotidové primery a/nebo sondy, které mohou být použity v diagnostice tak, jak je zde popsáno, by měly být alespoň 10 až 40 nukleotidů dlouhé. V konkrétní variantě • ·«···· · ·»4 · I · « « < · » · · •99 9 «* · · ·» oligonukleotidový primer obsahuje alespoň 10 následných nukleotidů, lépe pak alespoň 15 následných nukleotidů z DNA molekuly o sekvenci uváděné jako sekvence č. 6 nebo 7. Techniky pro PCR nebo hybridizační techniky jsou velmi dobře známé v současném stavu techniky (viz. např. Mullis et al. (1987), Cold Spring Harbour, Symp. Quant. Biol., 51:263, Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, (1989).
V jedné konkrétní variantě je využíváno RT-PCR, kde standardní PCR je použito ve spojení s reverzní transkripcí. Obvykle je RNA izolována z biologického vzorku, jako je tkáňová biopsie, a pomocí reverzního přepisu je získána molekula cDNA. Amplifikací PCR pomocí alespoň jednoho specifického primeru vznikne molekula cDNA, která může být izolována a vizualizována např. pomocí gelové elektroforézy. Tato amplifikace může probíhat na biologických vzorcích z testovaných pacientů a z jedinců, kteří netrpí rakovinou. Amplifikační reakce může probíhat na několika vzorcích s různě ředěnou cDNA. Dvojnásobný nárůst v expresi ve vzorku z testovaného pacienta ve srovnání s negativním vzorkem je bráno jako pozitivní nález.
V další variantě HER-2/neu proteiny nebo fúzní proteiny a polynukleotidy kódující tyto proteiny nebo fúzní proteiny jsou využity jako znaky pro sledování progrese rakoviny. V této variantě jsou techniky, jak byly popsány výše, pro diagnostiku rakoviny prováděny v průběhu léčby a je stanovována hladina reaktivního polypeptidu. Například, test může probíhat každých 24 až 72 hodin po dobu 6 měsíců až 1 roku, eventuelně v případě potřeby i déle. Obecně rakoviny postupuje u takových pacientů, u kterých hladina polypeptidu detekovaného pomocí vazebné složky narůstá. Naopak, nádorové onemocnění nepostupuje v případě, že hladina reaktivního polypeptidu zůstává konstatní nebo dokonce klesá v průběhu času.
Některé in vivo diagnostické techniky mohou být prováděny přímo na nádoru. Jendou z možností je smíchat nádorové buňky s vazebnou složkou. Množství navázané vazebné složky může být stanoveno přímo nebo nepřímo pomocí značky. Tato vazebná složky může být také použita v histologických aplikacích. V těchto aplikacích je samozřejmě možné také použít polynukelotidovou sondu.
Jak je uvedeno výše, pro zlepšení citlivosti různé HER-2/neu fúzní proteiny mohou být použity v jednom vzorku. Je zřejmé, že vazebné složky specifické pro různé proteiny, zde popisované, mohou být v jedné technice kombinovány. Dále je možno zároveň použít několik primerů nebo sond. Volba nádorového znaku může být založena na běžných experimentech pro stanovení kombinací, které vedou k ideální citlivosti. Navíc techniky pro nádorové proteiny zde popisované mohou být kombinované s technikami pro další známé nádorové antigeny.
» » * ·
B. Diagnostická souprava
Navrhovaný vynález dále popisuje soupravy pro výše uvedené diagnostické techniky. Tyto soupravy obvykle obsahují dvě nebo více složek nezbytných pro provedení diagnostické techniky. Soupravy mohou obsahovat látky, reagens, nádoby a/nebo vybavení. Například jedna nádoba s jednou soupravou může obsahovat monoklonální protilátku nebo její fragment, který se specificky váže na HER-2/neu fúzní protein. Tyto protilátky nebo fragmenty mohou být dodávány navázané na pevný materiál, jak je uvedeno výše. Jedna nebo více dalších nádob mohou obsahovat prvky, jako jsou reagens nebo pufry pro použití v této technice. Tyto soupravy mohou také obsahovat detekční reagens, které jsou popsány výše, obsahující značku umožňující detekci vazby protilátky.
Další možností je souprava pro detekci hladina mRNA kódující HER-2/neu protein v biologickém vzorku. Tyto soupravy obvykle obsahují alespoň jeden oligonukleotidový primer nebo sondu, jak byly popsány výše, které hybridizují s polynukleotidem kódující HER-2/neu protein nebo fúzní protein. Tyto oligonukleotidy mohou být použity například v PCR nebo hybridizační technice. Další složky, které mohou být přítomné v těchto soupravách, jsou další oligonukleotidy a/nebo diagnostická reagens nebo nádoby zajišťující detekci polynukleotidu kódujícího HER-2/neu protein.
Všechny publikace a patentové přihlášky uvedené v popisu jsou připojeny jako reference, stejně jako jednotlivé publikace nebo patentové přihlášky jsou specificky a jednotlivě připojeny jako reference.
Ačkoli v předchozím popisu jsou pro ilustraci uvedeny některé příklady pouze pro ilustraci a porozumění, každému odborníkovi v současném stavu techniky je jasné, že v navrhovaném vynálezu je možné uskutečnit řadu změn a modifikací, aniž by byl překročen rámec navrhovaného vynálezu a připojovaných nároků.
PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH
Obr. 1. zobrazuje mapu expresního plazmidů pFLAGCMV-l/ICD o velikosti 6,7 kb.
Obr. 2. zobrazuje mapu expresního plazmidů pFLAGCMV-l/KD o velikosti 5,7 kb.
Obr. 3. zobrazuje mapu expresního plazmidů pFLAGCMV-l/PD o velikosti 5,7 kb.
• « · · · · · • · · · · ···
Obr. 4. ukazuje, že fosforylační doména HER-2/neu je sekretována do kultivačního média a že intracelulární doména HER-2/neu a kinázová doména HER-2/neu nejsou do kultivačního média sekretovány, jak popisuje příklad 3.
Obr. 5. zobrazuje mapu pcDNA3.1/hygro/ECD-PD expresního vektoru o velikosti 8,3 kb.
Obr. 6. zobrazuje výsledek exprese fúzního proteinu ECD-PD v HEK-293 a CHO buňkách a ukazuje, že fuzní protein je sekretován do kultivačního média, jak popisuje příklad 4.
Obr. 7. zobrazuje plnou délku aminokyselinové sekvence lidského HER-2/neu proteinu (sekvence č. 1).
Obr. 8. zobrazuje plnou délku aminokyselinové sekvence krysího HER-2/neu proteinu (sekvence č. 2). Kinázová doména zahrnuje oblast od aminokyseliny 721 do aminokyseliny 998, včetně.
Obr. 9. zobrazuje aminokyselinovou sekvenci extracelulámího HER-2/neu proteinu (sekvence č. 3)·
Obr. 10. zobrazuje aminokyselinovou sekvenci fosforylační domény (PD lidského HER-2/neu proteinu (sekvence č. 4).
Obr. 11. zobrazuje aminokyselinovou sekvenci zvolené oblasti fosforylační domény (6PD) lidského HER-2/neu proteinu (sekvence č. 5).
Obr. 12 zobrazuje aminokyselinovou sekvenci fúzního proteinu zahrnující extracelulámí doménu (ECD) a fosforylační doménu (PD) lidského HER-2/neu proteinu (sekvence č. 6).
Obr. 13. zobrazuje aminokyselinovou sekvenci fúzního proteinu obsahující extracelulámí doménu (ECD) a zvolenou část fosforylační domény (APD) lidského HER-2/neu proteinu (sekvence č. 7).
Obr. 14. zobrazuje aminokyselinovou sekvenci extracelulámí domény (ECD) krysího HER-2/neu proteinu (sekvence č. 8).
Obr. 15. zobrazuje plnou délku nukleotidové sekvence (sekvence č. 9) DNA molekuly kódující lidský HER-2/neu protein. Plná délka této nukleotidové sekvence je popsána v WO 96/30 514, závěry této publikace jsou zde uvedeny jako reference.
Obr. 16. zobrazuje plnou délku nukleotidové sekvence (sekvence č. 10) DNA molekuly kódující krysí HER-2/neu protein. Plná délka této sekvence je popsána v Bargmann et al., (1986), Nátuře, 319:226-30, a Genebank/X03362, které jsou zde uvedeny jako reference.
Obr. 17. popisuje výsledky ELISA testu pro Herceptin vázající různé ECD-PD fuzní proteiny jak ze savčích buněk, tak z E.coli. Fúzní proteiny produkované v E.coli jsou ve stejném čtecím rámci s C nebo N-terminálním 6x histidinovým tágem (popisováno jako C-Histag a N-Histag).
• « ·· ·β ·· ··· · · · · ··· • ······ · ····· · ··· · ·· · · ·· ·
Obr. 18. zobrazuje srovnání HER-2/neu fúzního proteinu ECD-PD exprimováného v CH0-K1, které rostly v suspenzi za bezsérových podmínek a u Pichia buněk.
Obr. 19. zobrazuje nukleotidovou sekvenci myšího HER-2/neu.
Obr. 20. zobrazuje aminokyselinovou sekvenci myšího HER-2/neu.
PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU
Následující příklady jsou uváděny pouze pro ilustraci a nemohou být brány jako limit rámce navrhovaného vynálezu a připojených nároků.
V příkladech obecná molekulárně-biologická reagens, jako jsou oligonukleotidové primery, lipofectamin a restrikční endonukleázy, byla zakoupena od firmy Gibco/BRL (Grand Island, NY). Restrikční endonukleázy AatlI a PflM-1 byly zakoupeny od New England Biolabs (Beverly, MA). HER-2/neu ELISA kit a HER-2/neu specifická monoklonální protilátka Ab-3 byla zakoupena od Oncogene Science (Manhasset, NY). Expresní vektor pFLAGCMV-1 a protilátka FLAG-Tag M2 byly zakoupeny od firmy Kodak (Rochester, NY). Polymeráza Pfu byla zakoupena od firmy Strategene (La Jolla, CA) a expresní vektor pcDNA 3.1/hyg byl zakoupen od firmy Invitrogen (Carlsbad, CA).
PŘÍKLAD 1: Klonování ICD, KD a PD fragmentů z HER-2/neu do pFLAGCMV-1 expresního vektoru
Fragmenty DNA z HER-2/neu, které kódují intracelulámí doménu (ICD), kinázovou doménu (KD) a fosforylační doménu (PD), byly získány jednotlivě pomocí PCR. Restrikční místa pro enzymy Hind III a Xho I byly zavedeny na jejich 5' a 3' konce. Tato forma umožňuje klonování fragmentu DNA do expresního vektoru pFLAGCMV-1 (Kodak) v čtecím rámci s preprotrypsin vedoucí sekvencí a FLAG Tag sekvencí na N-konci. Produkty PCR byly přečištěny na gelu a klonovány do míst Hind III a Sal I na pFLAGCMV-1. Vzniklé expresní plazmidy byly označeny jako pFLAGCMV-1 /ICD (obr. 1), pFLAGCMV-l/KD (obr. 2) pFLAGCMV-l/PD (obr. 3).
PŘÍKLAD 2: Klonování ECD-PD fúzního proteinu do expresního vektoru pcDNA3.1/hyg
Fragment DNA kódující HER-2/neu PD byl amplifikován pomocí polymerázové řetězové reakce. Po přečištění na gelu byl klonován do míst Aat II Xho I na plazmidu pT7-HER-2/neu. Tímto postupem vznikl nový klonovací vektor pT7/ECD-PD, který spojuje ECD a PD dohromady (včetně Ser z transmembránové domény). Plazmid pT7/ECD-PD byl naštěpen • · ·· · · ·· • · · ···· ··· restrikčními enzymy Hind III a Xho I při 37 °C po dobu 1 hodiny. 2,7 kB dlouhý fragment DNA kódující ECD-PD fůzní protein byl přečištěn na gelu a vklonován do Hind III a Xho I míst plazmidu pcDNA3.1/hyg (Invitrogen). Vzniklý expresní vektor byl označen jako pcDNA3.1/hyg/ECD-PD (obr. 5).
PŘÍKLAD 3: Exprese ICD, KD a PD fragmentů HER-2/neu v HEK-293 buňkách
Expresní plazmid pFLAGCMV-1 (Kodak) byl použit pro stanovení oblasti intracelulámí domény HER-2/neu proteinu, která je sekreto vána do kultivačního média. Proteiny byly exprimovány jako fůzní proteiny s preprotrypsin sekrečním signálem a FLAG-Tagem na jejich N-konci, jak popisuje příklad 1.
Transfekce a růst ICD, KD a PD exprimujících buněčných linií byly prováděny následovně: lidské embryonální ledvinné fibroblasty (HEK-293 buňky) byly kultivovány v DMEM médiu obsahujícím 10 % fetálního hovězího séra. Jeden den před transfekcí bylo 1,5 x 105 buněk přeneseno do každé jamky šestijamkové destičky. Tranfekce proběhla za použití 1 pg plazmidového DNA pomocí lipofectaminu (Gibco/BRL) v bezsérovém médiu. Kultivační médium a buňky byly sebrány o 72 hodin později. Pro selekci stabilních transfektatnů byly buňky ponechány růst v médiu obsahujícím 200 pg/ml hygromycinu.
Buňky a kultivační média byly pomocí western blot analýzy testovány na přítomnost FLAG-Tag fúzních proteinů: kultivační média a buněčné lyzáty z transfekovaných HEK-293 buněk byly děleny na 7,5 % SDS polyacrylamidovém gelu. Proteiny byly přeneseny elektroforeticky na polyvinylidendifluoridové (PVDF) filtry. PVDF filtry byly nejprve inkubovány s 5 % hovězím sérovým albuminem vTBST (20 mM Tris pH 7,5 150 mM NaCl, 0,01 % Tween 20) a poté inkubovány 1 hodinu s primární protilátkou a nakonec další hodinu inkubovány s kozí anti-myší protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou. Imunobloty byly vyvinuty pomocí ECL systému (Amersham Corp.). Myší monoklonální protilátky c-neu Ab-3 („Ab-3“) (Oncogene Science), byly použity pro detekci HER-2/neu proteinu. Protilátka Ab-3 rozeznává karboxykonec lidského HER-2/neu proteinu. Pro detekci FLAG-Tag fúzních proteinů monoklonální protilátka M2 (Kodak) byla použita jako primární protilátka v analýze.
Výsledky uvedené na obr. 4 ukazují, že ani celá délka ICD, ani KD není sekretována, ale PD byla detekována v kultivačním médiu. Výsledky naznačují, že struktura KD neumožňuje průchod proteinu skrz buněčnou membránu.
PŘÍKLAD 4: Exprese ECD-PD fúzního proteinu v HEK-293 a CHO buňkách pomocí pcDNA3.1/hyg expresního vektoru
ECD-PD fúzní protein s preprotrypsinovým sekrečním signálem a FLAG-Tag na jeho N-konci byly připraveny stejně, jak je uvedeno v příkladu 2.
Transfekce a růst ECD-PD exprimujících buněčných linií byla provedena následovně: HEK-293 a CHO buňky byly kultivovány v DMEM médiu obsahujícím 10 % fetálního hovězího séra. Jeden den před transfekcí bylo 1,5 x 105 buněk přeneseno do každé jamky šestijamkové destičky. Transfekce proběhla za použití 1 pg plazmidového DNA pomocí lipofectaminu (Gibco/BRL) v bezsérovém médiu. Kultivační médium a buňky byly sebrány o 72 hodin později. Pro selekci stabilních transfektatnů byly buňky ponechány růst v médiu obsahujícím 200 pg/ml hygromycinu.
Sekrece rozpustného ECD-PD fúzního proteinu byla stanovena pomocí ELISA techniky s HER2/neu ECD specifickými protilátkami následovně: mikrotitrační destičky byly potaženy HER2/neu specifickou myší protilátkou (Oncogene Science) tak, aby vychytaly HER-2/neu protein ze vzorku. Testovací vzorek byl inkubován na destičce přes noc při pokojové teplotě, poté 1 hodinu s detekční protilátkou a další hodinu s kozí anti-králičí protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou. Po přidání substrátu této peroxidázy o-fenylendiamin vznikl zabarvený produkt. Množství tohoto produktu bylo měřeno spektrofotometricky. Absorbance při 490 nm odpovídá množství HER-2/neu proteinu ve vzorku. Podobně, sekrece rozpustného ECD-PD fúzního proteinu byla stanovena pomocí western blot analýzy s HER-2/neu PD specifickými protilátkami následovně: kultivační média a buněčné lyzáty z transfekováných HEK-293 buněk byly děleny na 7,5 % SDS polyacrylamidovém gelu. Proteiny byly přeneseny elektroforeticky na polyvinylidendifluoridové (PVDF) filtry. PVDF filtry byly nejprve inkubovány s 5 % hovězím sérovým albuminem v TBST (20 mM Tris pH 7,5 150 mM NaCl, 0,01 % Tween 20) a poté inkubovány 1 hodinu s primární protilátkou a nakonec další hodinu inkubovány s kozí anti-myší protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou. Imunobloty byly vyvinuty pomocí ECL systému (Amersham Corp.). Myší monoklonální protilátky c-neu Ab-3 („Ab-3“) (Oncogene Science), byly použity pro detekci HER-2/neu proteinu. Protilátka Ab-3 rozeznává karboxykonec lidského HER-2/neu proteinu. Pro detekci FLAG-Tag fúzních proteinů monoklonální protilátka M2 (Kodak) byla použita jako primární protilátka v analýze. Výsledky jsou zobrazeny na obr. 6.
* · · · ·· ·· ··· »··· · · ·
PŘÍKLAD 5: Klonování lidského ECD-ÁPD fúzního proteinu do pcDNA3.1/hyg expresního vektoru
Lidský ECD-APD fúzní protein zobrazený na obr. 13 (sekvence č. 7) byl připraven pomocí PCR za použití následujících primerů:
PDM-251 5 '-cctgaatcgcgaacccaagtgtgcaccggcac-3' (sekvence č. 15) Tm 69 °C.
PDM-279 5 '-ctggactcgagtcattagcggtgcctgtggtgg-3' (sekvence č. 16) Tm 69 °C.
Polymerázová řetězová reakce probíhala za následujících podmínek: 10 μΐ 10 x Pfu pufru (Stratagene), 1 μΐ 10 mM dNTP, 2 μΐ 10 μΜ směsi oligonukleotidů, 83 μΐ sterilní vody, 1,5 μΐ Pfu DNA polymerázy a 50 ng templátů při 96 °C po dobu 2 minut x 1 cyklus, (96 °C po dobu 20 vteřin, 69 °C po dobu 15 vteřin, 72 °C po dobu 5 minut) x 40 cyklů, 72 °C po dobu 5 minut x 1 cyklus. Produkt PCR reakce byl naštěpen enzymy Nru I a Xho I a vklonován do pPDM His vektoru (modifikovaný pET28 vektor obsahující His tag ve čtecím rámci se slepým restrikčním místem pro Eco 721), který byl naštěpen Eco 721 a Xho I. Sekvence byla potvrzena a rekombinantní plazmid byl přenesen do BL21 pLys pro expresi v E.coli. Konstrukt byl poté naštěpen BamHI a Xho I a klonován do pcDNA3.1/hyg/ECD-PD, který byl naštěpen stejnými restrikčními enzymy.
PŘÍKLAD 6: Exprese lidského ECD-PD-Ct-Hís tag fúzního proteinu v E.coli
Lidský ECD-PD fúzní protein byl klonován do pcDNA3.1/hyg vektoru, jak bylo popsáno v příkladu 2, a použit jako templát pro konstrukci hECD-PD ve čtecím rámci s 6 krát se opakujícím histidinovým tágem na C-konci. Polynukleotid hECD-PD byl amplifikován pomocí PCR za použití následujících primerů:
AW28 hECD-PD primer pro kódující sekvenci obsahující Nco I místo:
5'-GGGccatggggAGCACCCAAGTGTGCACCGGC-3' (sekvence č. 17)
AWO29 hECD-PD primer pro komplementární sekvenci obsahující Xho I místo bez stopkodónu:
5'-GGGctcgagCACTGGCACGTCCAGACCCAGG-3' (sekvence č. 18)
PCR produkt byl poté rozštěpen Nco I a Xho I restrikčních enzymů, přečištěn a ligován do pET28b expresního vektoru, který byl rozštěpen stejnými dvěma enzymy. Produktem ligace byly transformovány NovaBlue buňky a některé kolonie byly zvoleny pro testování. Tam, kde byly potvrzeny klony hECD-PD-C-r-His pomocí sekvenování DNA, byly buňky použity pro další expresi proteinu.
Pro expresi proteinu hECD-PD-Cy-His klony byly transformovány do BL21 (DE3) CodonPlusRiu E.coli kompetentních buněk. Standardní minitest pro expresi byl proveden s transformovanými klony, aby byl stanoven výtěžek. Nej lepší výsledek byl získán, pokud buňky rostly na TB médiu při 37 °C po dobu 2 hodin.
E.coli, které produkovaly hECD-PD-Cy-His byly poté přečištěny na monoQ koloně a resuspendovány v 20 mM Tris-HCL (pH 8) pufru. Získaný protein byl testován a byla zjištěna jeho pozitivní vazebná kapacita na Herceptin pomocí western blotu a ELISA techniky (obr. 17). Vazebná aktivita pro Herceptin byla později ztracena, pravděpodobně díky denaturaci proteinu.
PŘÍKLAD 7: Exprese lidského Ny-His tag-ECD-PD fúzního proteinu v E.coli
Lidský ECD-PD fůzní protein byl klonován do pPDM expresního vektoru pomocí 5' Nde I a 3' Xho I restrikcních míst. ECD-PD insert byl spojen ve čtecím rámci sN-koncovým 6 krát se opakujícím histidinovým tágem.
Pro expresi proteinu,pPDM vektor obsahující Ντ-His tag-ECD-PD fůzní protein byl transformován do BL21 (DE3) CodonPlus-Riu E.coli kompetentních buněk. Standardní minitest pro expresi byl proveden s transformovanými klony, aby byl stanoven výtěžek. Nejlepší výsledek byl získán, pokud buňky rostly na TB médiu při 30 °C po dobu 2 hodin.
E.coli s nepřečištěným Ny-His tag-ECD-PD fúzním proteinem byly rozeznány pomocí myší cneu-3 protilátky a pomocí králičí anti-ECD protilátky. Po přečištění byly E.coli obsahující NyHis tag-ECD-PD rozeznány pomocí vazby Herceptinu jak pomocí western blotu, tak pomocí ELISA techniky (obr. 17).
PŘÍKLAD 8: Exprese myšího ECD-PD-Cy-His tag fúzního proteinu v E.coli
Myší ECD-PD fůzní protein byl klonován do pcDNA3.1 vektoru, jak bylo popsáno v příkladu 2, pro klonování lidského podle navrhovaného vynálezu fúzního proteinu. Tento kontrukt byl použit jako templát pro konstrukci mECD-PD ve čtecím rámci s 6 krát se opakujícím histidinovým tágem na C-konci po stopkodónu. Nco I místo uvnitř mECD-PD/pcDNA3.1 konstruktu (pár baží 1932 otevřeného čtecího rámce) bylo mutováno cílenou mutagenezí za použití následujících primerů:
AWO38 primer:
5'-GGCCCCTCCAGCCCGATGGACAGCACCTTCTACCG-3' (sekvence č. 19)
AWO39 primer:
5-CGGTAGAAGGTGCTGTCCATCGGGCTGGAGGGGCC-3' (sekvence č. 20) • · ·· ·· · · • · · ···· ···
Jakmile byla sekvence potvrzena, mECD-PD fúzní konstrukt byl amplifikován pomocí PCR za použití následujících primerů:
AWO36 primer pro kódující sekvenci obsahující Nco I restrikční místo:
5'-GGGccatggGTACCCAAGTGTGTACCGG-3' (sekvence č. 21)
AWO37 primer pro komplementární sekvenci obsahující Xho I restrikční místo:
5'-GGGctcgagTCAATGGTGATGGTGATGGTGTCATGGCACATCCAGGCCTAGGTAC TCAGGG-3' (sekvence č. 22)
PCR produkt byl poté rozštěpen Nco I a Xho I restrikčních enzymů, přečištěn a ligován do pET28b expresního vektoru, který byl rozštěpen stejnými dvěma enzymy.
Produktem ligace byly transformovány NovaBIue buňky a některé kolonie byly zvoleny pro testování. Čtyři kolonie byly zvoleny pro sekvenční analýzu. Ty klony mECD-PD-CT-His obsahující správnou sekvenci byly transformovány do BL21 (DE3) CodonPlus-Riu E.coli kompetentních buněk. Standardní minitest pro expresi byl proveden s transformovanými klony, aby byl stanoven výtěžek. Nejlepší výsledek byl získán, pokud buňky rostly na 2 x YT médiu při 30 °C po dobu 3 hodin.
PŘÍKLAD 9: Exprese Ral2-mECD-PD-CT-His tag fúzního proteinu v E.coli
Myší ECD-PD fuzní protein byl klonován do pET28b expresního vektoru, jak bylo popsáno v příkladu 8. Sekvence Ral2 byla amplifikována pomocí PCR za použití následujících primerů, které přidávaly Nco I restrikční místo na 5 'a 3' konce:
Ral2.JC05: 5'-CCGccatggGCACGGCCGCTGCCGATAACTTCC-3' (sekvence č. 23) Ral2.JC06: 5'-GCGccatggCGGCCGGGGGTCCCTCGGCC-3' (sekvence č. 24)
Pro přípravu fúze Ral2 s mECD-PD byl Ral2 PCR produkt naštěpen Nco I restrikčním enzymem a ligován do Nco I naštěpeného a pomocí CIAP ošetřeného pET28b-mECD-PD vektoru. Produkt ligace byl transformován do NovaBIue buněk a ty byly ponechány, aby vytvořily několik kolonií. Díky tomu, že ligace neměla specifický směr, bylo pro preparaci plazmidu odebráno dvakrát tolik kolonií než obvykle. Tyto klony byly testovány pomocí štěpení pomocí restrikčního enzymu Afí III, aby byla zjištěna správná orientace insertu. Byla analyzována sekvence jen několika správně orientovaných klonů. Jeden klon se správnou sekvencí byl transformován do BL21 (DE3) CodonPlus-Riu E.coli kompetentních buněk. Standardní minitest pro expresi byl proveden s transformovanými klony, aby byl stanoven výtěžek. Nejlepší výsledek byl získán, pokud buňky rostly na 2 x LB médiu při 37 °C po dobu 3 hodin.
• · · · · · ·* ···· ··· • ····«· · ····« ·
PŘÍKLAD 10: Exprese LeIF-mECD-PD-CT-His tag fúzního proteinu v E.coli
Myší ECD-PD fúzní protein byl klonován do pET28b expresního vektoru, jak bylo popsáno v příkladu 8. Sekvence LelF byla amplifikována pomocí PCR za použití následujících primerů, které přidávaly Nco I restrikční místo na 5'a 3' konce:
LeIF.JC03: 5'-CGCccatggCGCAGAATGATAAGATCGCCC-3' (sekvence č. 25)
LeIF.JC04: 5'-GCCccatggCGTCGCGCATGAACTTCTTCGTC-3' (sekvence č. 26)
Pro přípravu fúze LelF s mECD-PD byl LelF PCR produkt naštěpen Nco I restrikčním enzymem a ligován do Nco I naštěpeného a pomocí CIAP ošetřeného pET28b-mECD-PD vektoru. Produkt ligace byl transformován do NovaBlue buněk a ty byly ponechány, aby vytvořily několik kolonií. Díky tomu, že ligace neměla specifický směr, bylo pro preparaci plazmidu odebráno dvakrát tolik kolonií než obvykle. Tyto klony byly testovány pomocí štěpení pomocí restrikčního enzymu Kpn I, aby byla zjištěna správná orientace insertu. Byla analyzována sekvence jen několika správně orientovaných klonů. Jeden klon se správnou sekvencí byl transformován do BL21 (DE3) CodonPlus-Riu E.coli kompetentních buněk. Standardní minitest pro expresi byl proveden s transformovanými klony, aby byl stanoven výtěžek. Nej lepší výsledek byl získán, pokud buňky rostly na 2 x YT médiu při 30 °C po dobu 3 hodin.
PŘÍKLAD 11: Exprese ECD-PD fúzního proteinu v Pichia
ECD-PD fúzní protein použitý pro expresi v Pichia vypadá stejně jako ten,který je určený pro expresi v CHO buňkách se dvěma změnami: (i) přirozený sekreční signál sekvence HER-2/neu genu byly nahrazeny alfa pre-pro signálními sekvencemi Saccharomyces cerevisiae a (ii) Ckonec rekombinantního proteinu byl prodloužen jedním glycinem a šesti histidiny.
Expresní kazeta pro ECD-PD fúzní protein byla integrována do SMD1168 Pichia kmene za použití sféroplastové techniky. 6 klonů integrujících několik kopií bylo zvoleno z přibližně 250 klonů pomocí kvantitativní dot-blot analýzy. Zvolené klony byly indukovány 72 hodin v pufrováném médiu obsahujícím methanol (BMMY-1 % methanol) na třepačce. Všech 6 klonů vykazovalo stejné expresní profily v bezbuněčném supernatantu i celkovém buněčném extraktu.
V bezbuněčném supernatantu sekrece ECD-PD rekombinantního proteinu o plné délce byla velmi slabá a byla detekovatelná pouze pomocí western blotu za použití c-neu-3 myší protilátky (Calbiochem). Sekrece a akumulace (maximum po 72 hodinách) přibližně 70 kDa proteinu bylo viditelné na SDS-PAGE značené stříbrem a detekovatelné na western blotu za neredukujících podmínek pomocí myší protilátky Herceptin. Tento protein nebyl detekován pomocí myší c-neu3 protilátky nebo myší anti-histidinové protilátky (Qiagen).
V celkovém buněčném extraktu nebyl na SDS-PAGE za použití barvení stříbrem pomocí DAIICHI barvícího kitu žádný specifický proužek. Dva proužky byly detekovatelné na western blotu za použití myší c-neu-3 nebo myší anti-histidinové protilátky. Jeden proužek měl stejnou molekulovou hmotnost jako ten, který byl pozorován u sekreto váného ECD-PD produktu po expresi vCHO buňkách. Druhý proužek vypadal jako „oblak“ v rozmezí od 100 do 120 kDa. Tyto dva signály by mohly odpovídat ECD-PD rekombinantnímu proteinu uloženému v ER a jsou způsobené různým stupněm glykosilace.
PŘÍKLAD 12: Exprese ECD-PD a ECD-APD fúzních proteinů v CHOK1 buňkách
Plazmidy pcDNA3.1/hyg/ECD-PD a pcDNA3.1/hyg/ECD-APD byly naštěpeny restrikčním enzymem Xba I a fragmenty DNA obsahující sekvence kódující ECD-PD a ECD-APD fúzní proteiny byly přečištěny na gelu jako Xba I fragmenty 2783 a 2166 bp. Každý fragment byl přenesen do vektoru pEE14-GS (CellTech) rozštěpeného pomocí Xba I (klonovací místo po směru od CMV velmi časného promotoru). Po ligaci byla provedena transformace do DH5a kompetentních buněk E.coli. Z 16 kolonií analyzovaných pomocí restrikčních enzymů byly dvě pozitivní pro ECD-PD a jedna pozitivní pro ECD-APD. Získané plazmidy byly připraveny ve velkém množství a přečištěny na dvojitém CsCl-EtBr gradientu centrifugací. Plazmidy byly analyzovány pomocí restrikčních enzymů a sekvenovány na 5' a 3' spojích mezi insertem a vektorem a nebyly nalezeny žádné abnormality.
transfekce CHOK1 buněk pocházejících z Master Cell Bank MCB CHO-K1 028W 1996/2 SHF P31, rostoucích v suspenzi v bezsérových podmínkách, byla provedena pomocí pEE14-ECD-PD a pEE14-ECD-APD plazmidy za použití klasické DNA kalcium-fosfát koprecipitační techniky. Buňky byly spočítány 48 hodin po transfekci a přeneseny do 96-jamkových destiček v hustotě 5000 buněk na jamku. Transfekované buňky byly selektovány pomocí glutaminsyntázy (GS) expresního systému popsaného vCrockett et al. (1990) Biotech., 8:662 a namnoženy v přítomnosti 30 μΜ methioninsulfoxyiminu (MSX) v GMEM médiu bez glutaminu a doplněném aditivy (kyselina glutamová, asparagin, nukleosidy) a 5 % dialyzovaným fetálním hovězím sérem (FBS). Buňky byly třikrát promyty během prvního týdne a dvakrát během druhého týdne po transfekci. Během třetího promytí bylo přidáno 20 % upravené médium. Během pátého promytí koncentrace MSX byla zvýšena na 50 μΜ, aby byla zvýšena intenzita selekce.
······ · ··*·· · • · · · · · • · · · · · ·
Transfekované MSX klony byly 3 až 5 týdnů po transfekci přeneseny na 24-jamkové destičky a byly sebrány jejich supematanty. Exprese ECD-PD a ECD-APD fúzních proteinů byla testována pomocí western blotu s využitím Herceptin protilátky za neredukujících podmínek. Exprese ECD-PD fúzního proteinu byla prokázána v 18 z 52 testovaných klonů, zatímco 13 ze 47 klonů bylo pozitivních pro expresi ECD-APD. Zvolené klony, které exprimovaly fúzní proteiny, byly poté readaptovány na růst v bezsérovém médiu. V závislosti na úrovni exprese, růstu a životaschopnosti bylo zvoleno 5 klonů nesoucích ECD-PD konstrukt a 3 klony nesoucí ECDAPD konstrukt pro další testování a charakterizaci. Pro ECD-PD konstrukt nej silnější expresi vykazoval klon 560 F3.
Exprese byla stanovována při 33 °C v přítomnosti nebo nepřítomnosti butyrátu sodného (2 mM) a DMSO (2 %). Některé klony byly indukovatelné pomocí NaB nebo DMSO. Exprese ECD-PD a ECD-APD v CEÍOK1 buňkách byla analyzována pomocí western blotu a SDS-PAGE barvené buď stříbrem nebo Coomassieblue. Myší monoklonální protilátky Herceptin a c-neu-3 stejně jako 8029K králičí polyklonální protilátka byly použity pro analýzu na western blotu. Analýza supernatantů z klonů exprimujících ECD-PD a ECD-APD prokázala proužek na barvených gelech v oblasti 150 kDa a 98 kDa. Stejné proužky byly prokázány pomocí Herceptinu a pomocí 8029K polyklonání protilátky, stejně jako pomocí c-neu-3 protilátky pro ECD-PD (obr. 18). Buňky CHO exprimující HER-2/neu fúzní protein jsou rozeznávány protilátkou Herceptin (obr. 18).
Úroveň exprese fúzních proteinů byla zároveň sledována s ohledem na svojí stabilitu během pasážování buněk. 5 ECD-PD klonů a 2 ECD-APD klony byly sledovány během pasážování a stabilita exprese byla hodnocena pomocí western blot analýzy. Ze 7 analyzovaných klonů 4 byly stabilní déle než 32 pasáží, ačkoli jeden z nich opakovaně prokázal vysokou úmrtnost a v druhém se objevovaly obří buňky.
Produkce v malém množství byla započata s dvěma nej lepšími ECD-PD a ECD-APD klony. Buňky byly kultivovány v suspenzi za bezsérových podmínek po dobu 120 hodin při 33 °C a v přítomnosti 2 mM butyrátu sodného. Exprese obou fúzních proteinů byla stanovována pomocí western blotu s protilátkou Herceptin a pomocí SDS-PAGE za použití DAIICHI kitu. Oba fúzní proteiny byly exprimovány v množství přibližně 100 pg/ml.
PŘÍKLAD 13: Přečištění ECD-PD a ECD-APD fúzních proteinů po expresi v CHO buňkách
Po expresi v CHO buňkách a sekreci, ECD-PD a ECD-APD fúzní proteiny byly přečištěny na iontoměničové chromatografii na Q sepharóze a vysokotlaké koloně. Před nástřikem supernatantů • · · · · · · • · · · · · » · ······ · ····· · • · · · · ·· · do kolony bylo pH upraveno na 6.5 přidáním 1 M HC1. Pro chromatografii byl použit 1 ml Q sepharózy pro vysokotlakou chromatografii (Pharmacia) a Cl0/10 kolona (Pharmacia).
Kolona byla nejprve vyvážena 10 objemy H2O při průtoku 4 ml za minutu, poté jedním objemem 0,5 M NaOH při průtoku 4 ml za minutu a 10 objemy pufru A (20 mM Bis-Tris propan pH 6,5 50 mM NaCl) při průtoku 4 ml za minutu. Vzorek byl poté nastříknut na kolonu a procházel při průtoku 1 ml za minutu. Poté byla kolona promyta pufrem A při průtoku 1 ml za minutu, dokud optická denzita při 280 nm nedosáhla 0,1, a poté byla kolona promyta 20 objemy. Po vymytí byl otočen průtok a proběhl další promývací krok 3 objemy.
Vyprázdnění kolony probíhalo při průtoku 1 ml za minutu, nejprve pufrem B (20 mM Bis-Tris propan pH 6,5 - 250 mM NaCl) a poté pufrem C (20 mM Bis-Tris propan pH 6,5 - 1 mM NaCl). Fúzní proteiny se uvolnily s pufrem B.
Fúzní proteiny byly dále přečišťovány pomocí hydrofobní chromatografie na fenylsafaróze 6 při vysokém průtoku a nízké substituci. Vyprazdňovací roztok obsahující ECD-PD a ECD-APD fúzní proteiny (pufr B) byl po přidání pevného síranu amonného (AMS) (140 g/1 roztoku) zahuštěn na 1 M síran amonný. Roztok byl upraven, aby jeho pH bylo 7.
Pro chromatografii byla použita kolona Cl0/10 (Pharmacia) naplněná 0,5 ml Phenyl Sepharose 6 Fast Flow s nízkou substitucí (Pharmacia). Kolona byla nejprve vyvážena 10 objemy H2O při průtoku 4 ml za minutu, poté jedním objemem 0,5 M NaOH při průtoku 4 ml za minutu a 10 objemy pufru D (1 mM PO4 pH 7,0 - 1 M AMS) při průtoku 4 ml za minutu. Po vyvážení byl nastříknut vzorek a ponechán procházet skrz kolonu při průtoku 0,5 ml za minutu. Kolona byla poté promyta pufrem D při 0,5 ml za minutu, dokud optická denzita při 280 nm nedosáhla 0 a poté při průtoku 1 ml za minutu ještě 10 objemy. Před vyprázdněním byl průtok otočen a kolona bylo promyta 3 dalšími objemy. Vyprázdnění probíhalo při průtoku 1 ml za minutu v pufru E (1 mM PO4 pH 7,0).
Přečištěné fúzní proteiny byly analyzovány pomocí SDS-PAGE a následně barveny pomocí DAIICHI kitu a nebo western blotem pomocí 8029K králičí polyklonální protilátky nebo myší Herceptin protilátky. Analýza vykázala, že míra čistoty po těchto dvou přečišťovacích krocích je přibližně 90 % (BioRat GS-700 Imaging Denzitometer). Western blot analýza prokázala, že monomery zůstávají v jednom proužku během celého přečišťování a že hladina oxidace nebyla zvýšena a detekovatelné epitopy nebyly během přečišťování zničeny, což porkázala vazba Herceptin protilátky. Celkové množství všech fúzních proteinů, které byly získány, bylo stanoveno pomocí barevné proteinové techniky (DOC TCA BCA). Testy prokázaly, že 2 a 4 mg • · · · · · • · · · · · · • · ····· ·
ECD-PD a ECD-APD fúzních proteinů byly přečištěny ze 75 ml kultur s hladinou čistoty přibližně 90 %.

Claims (92)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Izolovaný protein vyznačující se tím, že obsahuje extracelulámí doménu proteinu HER-2/neu fúzovanou s fosforylační doménou proteinu HER-2/neu je schopen vyvolat imunitní reakci u teplokrevných živočichů.
  2. 2. Protein podle nároku 1 vyznačující se tím, že tento protein má sekvenci alespoň z 80 % shodnou se sekvencí č. 6, nebo obsahuje tento protein sekvenci alespoň z 80 % shodnou se sekvencí č. 3, fúzovanou se sekvencí s alespoň 80 % identitou se sekvencí č. 4.
  3. 3. Protein podle nároku 1 vyznačující se tím, že tento protein obsahuje sekvenci alespoň z 80 % shodnou se sekvencí č. 3, přímo fúzovanou s aminokyselinovou sekvencí s alespoň 80 % identitou se sekvencí zahrnující Gin 991 až Val 1256 ze sekvence č. 2, nebo kde tento protein obsahuje sekvenci alespoň z 80 % shodnou se sekvencí č. 3, fúzovanou s aminokyselinovou sekvencí s alespoň 80 % identitou se sekvencí zahrnující Gin 991 až Val 1256 ze sekvence č. 2.
  4. 4. Protein podle nároku 1 vyznačuj ící se tím, že tento protein obsahuje sekvenci alespoň z 80 % shodnou se sekvencí č. 8, přímo fúzovanou se sekvencí s alespoň 80 % identitou se sekvencí č. 4, nebo kde tento protein obsahuje sekvenci alespoň z 80 % shodnou se sekvencí č. 8, fúzovanou se sekvencí s alespoň 80 % identitou se sekvencí č. 4.
  5. 5. Protein podle nároku 1 vyznačující se tím, že tento protein obsahuje sekvenci alespoň z 80 % shodnou se sekvencí č. 8, přímo fúzovanou s aminokyselinovou sekvencí zahrnující Gin 991 až Val 1256 ze sekvence č. 2, nebo kde tento protein obsahuje sekvenci alespoň z 80 % shodnou se sekvencí č. 8, fúzovanou se sekvencí s alespoň 80 % identitou s aminokyselinovou sekvencí zahrnující Gin 991 až Val 1256 ze sekvence č. 2.
  6. 6. Protein podle nároku 1 vyznačující se tím, že extracelulámí doména proteinu HER2/neu je fúzována s fosforylační doménou proteinu HER-2/neu pomocí chemické spojky.
  7. 7. Protein podle nároku 6 vyznačující se tím, že chemická spojka je aminokyselinová spojka.
  8. 8. Nukleová kyselina kódující protein podle nároku 1.
  9. 9. Virový vektor obsahující polynukleotidovou sekvenci kódující protein podle nároku 1.
    • · · · · φ • · · · · « ·
  10. 10. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje protein podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.
  11. 11. Farmaceutický prostředek podle nároku 10 vyznačující se tím, že tento farmaceutický prostředek je vakcína.
  12. 12. Farmaceutický prostředek podle nároku 10 vyznačující se tím, že dále obsahuje imunostimulátor.
  13. 13. Farmaceutický prostředek podle nároku 12 vyznačující se tím, že protein je přítomen v emulzi olej - voda.
  14. 14. Farmaceutický prostředek podle nároku 12 vyznačuj ící se tím, že imunostimulátorem je SBAS2, 3D-MPL, QS21 nebo kombinace 3D-MPL a QS21.
  15. 15. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje molekulu nukleové kyseliny podle nároku 8, a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.
  16. 16. Farmaceutický prostředek podle nároku 15 vyznačující se tím, že tento farmaceutický prostředek je vakcína.
  17. 17. Farmaceutický prostředek podle nároku 15 vyznačující se tím, že dále obsahuje imunostimulátor.
  18. 18. Farmaceutický prostředek podle nároku 15 vyznačující se tím, že molekula nukleové kyseliny je molekula DNA.
  19. 19. Způsob vyvolání nebo posílení imunitní odpovědi proti HER-2/neu proteinu vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje podání proteinu podle nároku 1 teplokrevnému zvířeti v takovém množství, které je dostatečné pro vyvolání nebo posílení imunitní odpovědi.
  20. 20. Způsob podle nároku 19 v y z n a č u j í c í se t í m, že protein je podáván ve formě vakcíny.
  21. 21. Způsob vyvolání nebo posílení imunitní odpovědi proti HER-2/neu proteinu vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje podání molekuly nukleové kyseliny podle nároku 8 teplokrevnému zvířeti v takovém množství, které je dostatečné pro vyvolání nebo posílení imunitní odpovědi.
  22. 22. Způsob podle nároku 21 vyznačuj ící se tím, že protein je podáván ve formě vakcíny.
  23. 23. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že podání zahrnuje transfekci buněk teplokrevného zvířete ex vivo pomocí nukleové kyseliny a následným navrácením transfekovaných buněk teplokrevnému zvířeti.
  24. 24. Způsob vyvolání nebo posílení imunitní odpovědi proti HER-2/neu proteinu vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje podání virového vektoru podle nároku 9 teplokrevnému zvířeti v takovém množství, které je dostatečné pro vyvolání nebo posílení imunitní odpovědi.
  25. 25. Způsob podle nároku 24 vyznačující se tím, že podání zahrnuje infekci buněk teplokrevného zvířete ex vivo virovým vektorem a následným navrácením transfekovaných buněk teplokrevnému zvířeti.
  26. 26. Izolovaný protein obsahující extracelulámí doménu proteinu HER-2/neu fúzovanou s částí fosforylační domény proteinu HER-2/neu vyznačující se tím, že tento protein je schopen vyvolat imunitní reakci u teplokrevných živočichů.
  27. 27. Protein podle nároku 26 vyznačující se tím, že tento protein má sekvenci alespoň z 80 % shodnou se sekvencí č. 7, nebo kde tento protein obsahuje sekvenci alespoň z 80 % shodnou se sekvencí č. 3, fúzovanou se sekvencí s alespoň 80 % identitou se sekvencí č. 5.
  28. 28. Protein podle nároku 26 vyznačující se tím, že tento protein obsahuje sekvenci alespoň z 80 % shodnou se sekvencí č. 3, přímo fúzovanou se sekvencí s alespoň 80 % identitou s aminokyselinovou sekvencí zahrnující Gin 991 až Arg 1049 ze sekvence č. 2, nebo kde tento protein obsahuje sekvenci alespoň z 80 % shodnou se sekvencí č. 3, fúzovanou se sekvencí s alespoň 80 % identitou s aminokyselinovou sekvencí zahrnující Gin 991 až Arg 1049 ze sekvence č. 2.
  29. 29. Protein podle nároku 26 vyznačující se tím, že tento protein obsahuje sekvenci alespoň z 80 % shodnou se sekvencí č. 8, přímo fúzovanou se sekvencí s alespoň 80 % identitou se sekvencí č. 5, nebo kde tento protein obsahuje sekvenci alespoň z 80 % shodnou se sekvencí č. 8, fúzovanou se sekvencí s alespoň 80 % identitou se sekvencí č. 5.
  30. 30. Protein podle nároku 26 vyznačující se tím, že tento protein obsahuje sekvenci alespoň z 80 % shodnou se sekvencí č. 8, přímo fúzovanou se sekvencí s alespoň 80 % • · · · · · · • · · · · · * • · ···· · v ·«···· · ····· * identitou s aminokyselinovou sekvencí zahrnující Gin 991 až Arg 1049 ze sekvence č. 2, nebo kde tento protein obsahuje sekvenci alespoň z 80 % shodnou se sekvencí č. 8, fúzovanou se sekvencí s alespoň 80 % identitou s aminokyselinovou sekvencí zahrnující Gin 991 až Arg 1049 ze sekvence č. 2.
  31. 31. Protein podle nároku 26 vyznačující se t i m, že extracelulární doména proteinu HER2/neu je fúzována s částí fosforylační domény proteinu HER-2/neu pomocí chemické spojky.
  32. 32. Protein podle nároku 31 vyznačující se tím, že chemická spojka je aminokyselinová spojka.
  33. 33. Nukleová kyselina kódující protein podle nároku 26.
  34. 34. Virový vektor obsahující polynukleotidovou sekvenci kódující protein podle nároku 26.
  35. 35. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje protein podle nároku 26 a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.
  36. 36. Farmaceutický prostředek podle nároku 35 vyznačující se tím, že tento farmaceutický prostředek je vakcína.
  37. 37. Farmaceutický prostředek podle nároku 35 vyznačující se tím, že dále obsahuje imunostimulátor.
  38. 38. Farmaceutický prostředek podle nároku 37 vyznačující se tím, že protein je přítomen v emulzi olej - voda.
  39. 39. Farmaceutický prostředek podle nároku 37 vyznačující se tím, že imunostimulátorem je SBAS2, 3D-MPL, QS21 nebo kombinace 3D-MPL a QS21.
  40. 40. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje molekulu nukleové kyseliny podle nároku 33, a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.
  41. 41. Farmaceutický prostředek podle nároku 40 vyznačuj icí se tím, že tento farmaceutický prostředek je vakcína.
  42. 42. Farmaceutický prostředek podle nároku 40 vyznačující se tím, že dále obsahuje imunostimulátor.
    • · ·· ·· * · · · · · · ···
  43. 43. Farmaceutický prostředek podle nároku 40 vyznačující se tím, že molekula nukleové kyseliny je molekula DNA.
  44. 44. Způsob vyvolání nebo posílení imunitní odpovědi proti HER-2/neu proteinu vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje podání proteinu podle nároku 26 teplokrevnému zvířeti v takovém množství, které je dostatečné pro vyvolání nebo posílení imunitní odpovědi.
  45. 45. Způsob podle nároku 44 vyznačuj i cí se tím, že protein je podáván ve formě vakcíny.
  46. 46. Způsob vyvolání nebo posílení imunitní odpovědi proti HER-2/neu proteinu vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje podání molekuly nukleové kyseliny podle nároku 33 teplokrevnému zvířeti v takovém množství, které je dostatečné pro vyvolání nebo posílení imunitní odpovědi.
  47. 47. Způsob podle nároku 46 vyznačuj ící se tím, že protein je podáván ve formě vakcíny.
  48. 48. Způsob podle nároku 46 vyznačující se tím, že podání zahrnuje transfekci buněk teplokrevného zvířete ex vivo pomocí nukleové kyseliny a následným navrácením transfekovaných buněk teplokrevnému zvířeti.
  49. 49. Způsob vyvolání nebo posílení imunitní odpovědi proti HER-2/neu proteinu vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje podání virového vektoru podle nároku 34 teplokrevnému zvířeti v takovém množství, které je dostatečné pro vyvolání nebo posílení imunitní odpovědi.
  50. 50. Způsob podle nároku 49 vyznačující se tím, že podání zahrnuje infekci buněk teplokrevného zvířete ex vivo virovým vektorem a následným navrácením transfekovaných buněk teplokrevnému zvířeti.
  51. 51. Izolovaný protein obsahující extracelulámí doménu proteinu HER-2/neu fúzovanou s intracelulární doménou proteinu HER-2/neu vyznačující se tím, že tento protein je schopen vyvolat imunitní reakci u teplokrevných živočichů.
  52. 52. Protein podle nároku 51 vyznačující se tím, že tento protein obsahuje sekvenci alespoň z 80 % shodnou se sekvencí č. 3, přímo fúzovanou se sekvencí s alespoň 80 % identitou s aminokyselinovou sekvencí zahrnující Lys 676 až Val 1255 ze sekvence č. 1, • · nebo kde tento protein obsahuje sekvenci alespoň z 80 % shodnou se sekvencí č. 3, fúzovanou se sekvencí s alespoň 80 % identitou s aminokyselinovou sekvencí zahrnující Lys 676 až Val 1255 ze sekvence č. 1 pomocí buď chemické nebo aminokyselinové spojky.
  53. 53. Protein podle nároku 51 vyznačující se tím, že tento protein obsahuje sekvenci alespoň z 80 % shodnou se sekvencí č. 3, přímo fúzovanou se sekvencí s alespoň 80 % identitou s aminokyselinovou sekvencí zahrnující Lys 677 až Val 1256 ze sekvence č. 2, nebo kde tento protein obsahuje sekvenci alespoň z 80 % shodnou se sekvencí č. 3, fúzovanou se sekvencí s alespoň 80 % identitou s aminokyselinovou sekvencí zahrnující Lys 677 až Val 1256 ze sekvence č. 2 pomocí buď chemické nebo aminokyselinové spojky.
  54. 54. Protein podle nároku 51 vyznačující se tím, že tento protein obsahuje sekvenci alespoň z 80 % shodnou se sekvencí č. 8, přímo fúzovanou se sekvencí s alespoň 80 % identitou s aminokyselinovou sekvencí zahrnující Lys 676 až Val 1255 ze sekvence č. 1, nebo kde tento protein obsahuje sekvenci alespoň z 80 % shodnou se sekvencí č. 8, fúzovanou se sekvencí s alespoň 80 % identitou s aminokyselinovou sekvencí zahrnující Lys 676 až Val 1255 ze sekvence č. 1 pomocí buď chemické nebo aminokyselinové spojky.
  55. 55. Protein podle nároku 51 vyznačující se tím, že tento protein obsahuje sekvenci alespoň z 80 % shodnou se sekvencí č. 8, přímo fúzovanou se sekvencí s alespoň 80 % identitou s aminokyselinovou sekvencí zahrnující Lys 677 až Val 1256 ze sekvence č. 2, nebo kde tento protein obsahuje sekvenci alespoň z 80 % shodnou se sekvencí č. 8, fúzovanou se sekvencí s alespoň 80 % identitou s aminokyselinovou sekvencí zahrnující Lys 677 až Val 1256 ze sekvence č. 2 pomocí buď chemické nebo aminokyselinové spojky.
  56. 56. Protein podle nároku 51 vyznačující se tím, že extracelulámí doména proteinu HER2/neu je fúzována s intracelulámí doménou proteinu HER-2/neu pomocí chemické spojky.
  57. 57. Protein podle nároku 56 vyznačující se tím, že chemická spojka je aminokyselinová spojka.
  58. 58. Nukleová kyselina kódující protein podle nároku 51.
  59. 59. Virový vektor obsahující polynukleotidovou sekvenci kódující protein podle nároku 51.
  60. 60. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje protein podle nároku 51 a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.
    9 * 99 «* 99
    999 9 » »9 ·«·
    9»· 9 · » e « ·
    9 999999 * ··#·· 9
    9 9 «9 9*9
    99*9 99 9· 99 r
  61. 61. Farmaceutický prostředek podle nároku 60 vyznačuj icí se tím, že tento farmaceutický prostředek je vakcína.
  62. 62. Farmaceutický prostředek podle nároku 60 vyznačující se tím, že dále obsahuje imunostimulátor.
  63. 63. Farmaceutický prostředek podle nároku 62 vyznačující se tím, že protein je přítomen v emulzi olej - voda.
  64. 64. Farmaceutický prostředek podle nároku 62 vyznačující se tím, že imunostimulátorem je SBAS2, 3D-MPL, QS21 nebo kombinace 3D-MPL a QS21.
  65. 65. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje molekulu nukleové kyseliny podle nároku 58, a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.
  66. 66. Farmaceutický prostředek podle nároku 65 vyznačující se tím, že tento farmaceutický prostředek je vakcína.
  67. 67. Farmaceutický prostředek podle nároku 65 vyznačující se tím, že dále obsahuje imunostimulátor.
  68. 68. Farmaceutický prostředek podle nároku 65 vyznačující se tím, že molekula nukleové kyseliny je molekula DNA.
  69. 69. Způsob vyvolání nebo posílení imunitní odpovědi proti HER-2/neu proteinu vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje podání proteinu podle nároku 51 teplokrevnému zvířeti v takovém množství, které je dostatečné pro vyvolání nebo posílení imunitní odpovědi.
  70. 70. Způsob podle nároku 69 vyznačuj i cí se tím, že protein je podáván ve formě vakcíny.
  71. 71. Způsob vyvolání nebo posílení imunitní odpovědi proti HER-2/neu proteinu vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje podání molekuly nukleové kyseliny podle nároku 58 teplokrevnému zvířeti v takovém množství, které je dostatečné pro vyvolání nebo posílení imunitní odpovědi.
  72. 72. Způsob podle nároku 71 vyznačuj ici se tim, že protein je podáván ve formě vakcíny.
  73. 73. Způsob podle nároku 71 vyznačující se tím, že podání zahrnuje transfekci buněk teplokrevného zvířete ex vivo pomocí nukleové kyseliny a následným navrácením transfekováných buněk teplokrevnému zvířeti.
    • · · · • · · · • · · · · • · · • * · ·
  74. 74. Způsob vyvolání nebo posílení imunitní odpovědi proti HER-2/neu proteinu vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje podání virového vektoru podle nároku 59 teplokrevnému zvířeti v takovém množství, které je dostatečné pro vyvolání nebo posílení imunitní odpovědi.
  75. 75. Způsob podle nároku 74 vyznačující se tím, že podání zahrnuje infekci buněk teplokrevného zvířete ex vivo virovým vektorem a následným navrácením transfekovaných buněk teplokrevnému zvířeti.
  76. 76. Způsob potlačení vzniku rakoviny u pacientů technikou vyznačující se tím, že zahrnuje podání efektivního množství fúzního polypeptidu podle nároků 1, 26 nebo 51, které potlačí vznik rakoviny u pacienta.
  77. 77. Způsob potlačení vzniku rakoviny u pacientů technikou vyznačující se tím, že zahrnuje podání efektivního množství polynukleotidu podle nároků 8, 33 nebo 58, které potlačí vznik rakoviny u pacienta.
  78. 78. Způsob potlačení vzniku rakoviny u pacientů technikou vyznačující se tím, že zahrnuje podání efektivního množství antigen prezentujících buněk exprimujících fúzní polypeptid podle nároků 1, 26 nebo 51, které potlačí vznik rakoviny u pacienta.
  79. 79. Způsob podle nároku 78 vyznačující se tím, že antigen prezentující buňky jsou dendritické buňky.
  80. 80. Způsob podle nároku 76 až 79 vyznačující se tím, že rakovina je rakovina prsu, vaječníků, tlustého střeva nebo prostaty.
  81. 81. Způsob odstranění nádorových buněk z biologického vzorku vyznačující se tím, že zahrnuje kontakt biologického vzorku s T-buňkami specificky reagujícími s HER-2/neu fúzním proteinem, kde fúzní protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci kódovanou polynukleotidovou sekvencí zahrnující:
    (i) polynukleotidy uvedené jako sekvence č. 8, 33 nebo 58 (ii) sekvence komplementární k výše uvedené sekvenci ······ · · · · · · · · • · · · · · · • ·· · · » · ··· kde tento kontakt probíhá za podmínek a po dobu dostatečnou pro odstranění buněk exprimujících antigen ze vzorku.
  82. 82. Způsob podle nároku 81 vyznačující se tím, že biologický vzorek je krev nebo její frakce.
  83. 83. Způsob potlačení vzniku rakoviny u pacientů technikou vyznačující se tím, že zahrnuje podání biologického vzorku ošetřeného podle způsobu podle nároku 81, pacientovi.
  84. 84. Způsob stimulace a/nebo namnožení T-buněk specifických proti HER-2/neu fúznímu proteinu vyznačující se tím, že zahrnuje kontakt T-buněk s:
    (i) fúzní protein podle nároků 1, 26 nebo 51 (ii) polynukleotidem kódujícím tento fúzní protein, nebo (iii) antigen prezentujícími buňkami exprimujícími tento fúzní protein za podmínek a po dobu dostatečnou pro stimulaci a namnožení T-buněk.
  85. 85. Izolovaná populace T-buněk zahrnující T-buňky připravené podle způsobu podle nároku 84.
  86. 86. Způsob potlačení vzniku rakoviny u pacientů technikou vyznačující se tím, že zahrnuje podání efektivního množství T-buněčné populace podle nároku 85, pacientovi.
  87. 87. Způsob potlačení vzniku rakoviny u pacientů technikou vyznačující se tím, že zahrnuje:
    a) inkubaci CD4+ a/nebo CD8+ T-buněk izolovaných z pacienta s alespoň jednou složkou z následujících:
    (i) fúzní protein podle nároků 1, 26 nebo 51 (ii) polynukleotidem kódujícím tento fúzní protein, nebo (iii) antigen prezentujícími buňkami exprimujícími tento fúzní protein tak, že tyto se tyto T-buňky začnou množit a
    b) podání efektivního množství proliferujících T-buněk pacientovi, které zabrání vzniku rakoviny.
    • · · · ··· ···· ··· _ . ··· ······
    21 *············· ° 1 ♦♦····· ··· · ·· ·· ·· ·
  88. 88. Způsob potlačení vzniku rakoviny u pacientů technikou vyznačující se tím, že zahrnuje:
    a) inkubaci CD4+ a/nebo CD8+ T-buněk izolovaných z pacienta s alespoň jednou složkou z následujících:
    (i) fúzní protein podle nároků 1, 26 nebo 51 (ii) polynukleotidem kódujícím tento fúzní protein, nebo (iii) antigen prezentujícími buňkami exprimujícími tento fuzní protein tak, že tyto se tyto T-buňky začnou množit a
    b) klonování alespoň jedné proliferující buňky
    c) podání efektivního množství nakloňovaných T-buněk pacientovi, které zabrání vzniku rakoviny.
  89. 89. Způsob přípravy fúzního proteinu podle nároků 1, 26 nebo 51 vyznačující se tím, že zahrnuje:
    a) zavedení expresního vektoru obsahujícího polynukleotid podle nároků 8, 33 nebo 58 do buňky,
    b) kultivaci transfekované buňky
    c) přečištění exprimovaného proteinu
  90. 90. Způsob podle nároku 89 vyznačující se tím, že tyto buňky jsou CHO buňky.
  91. 91. Způsob podle nároku 89 vyznačující se tím, že tyto buňky jsou kultivovány v suspenzi za bezsérových podmínek.
  92. 92. Způsob podle nároku 89 vyznačující se tím, že exprimovaný protein je přečištěn dvoustupňovým procesem, zahrnujícím
    a) aniontovou iontoměničovou chromatografii na Q sepharóze a vysokotlaké koloně
    b) hydrofobní chromatografii na Phenyl Seprharose 6 Fast Flow s nízkou substitucí.
CZ20012587A 1999-01-29 2000-01-28 Izolovaný protein, nukleová kyselina, virový vektor, farmaceutický prostředek, izolovaná populace T buněk, způsob posílení imunitní odpovědi, způsob odstranění nádorových buněk, způsob stimulace a/nebo namnoľení T buněk a způsob přípravy fúzního proteinu CZ20012587A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11797699P 1999-01-29 1999-01-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20012587A3 true CZ20012587A3 (cs) 2002-05-15

Family

ID=22375831

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20012587A CZ20012587A3 (cs) 1999-01-29 2000-01-28 Izolovaný protein, nukleová kyselina, virový vektor, farmaceutický prostředek, izolovaná populace T buněk, způsob posílení imunitní odpovědi, způsob odstranění nádorových buněk, způsob stimulace a/nebo namnoľení T buněk a způsob přípravy fúzního proteinu

Country Status (20)

Country Link
EP (1) EP1147190B1 (cs)
JP (1) JP5164300B2 (cs)
KR (1) KR100766653B1 (cs)
CN (1) CN1201004C (cs)
AT (1) ATE474048T1 (cs)
AU (1) AU780109B2 (cs)
BR (1) BR0007840A (cs)
CA (1) CA2361009C (cs)
CZ (1) CZ20012587A3 (cs)
DE (1) DE60044665D1 (cs)
ES (1) ES2348708T3 (cs)
HK (1) HK1044798A1 (cs)
HU (1) HUP0105303A2 (cs)
IL (1) IL144371A0 (cs)
MX (1) MXPA01007721A (cs)
NO (1) NO20013701L (cs)
NZ (1) NZ513062A (cs)
TR (1) TR200102191T2 (cs)
WO (1) WO2000044899A1 (cs)
ZA (1) ZA200106179B (cs)

Families Citing this family (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7198920B1 (en) 1999-01-29 2007-04-03 Corika Corporation HER-2/neu fusion proteins
US7378096B2 (en) 1999-09-30 2008-05-27 Health Research, Inc. Stress protein compositions and methods for prevention and treatment of cancer and infectious disease
WO2001023421A2 (en) 1999-09-30 2001-04-05 Corixa Corporation Stress protein compositions and methods for prevention and treatment of cancer and infectious disease
AU2744201A (en) * 1999-12-29 2001-07-09 Corixa Corporation Murine neu sequences and methods of use therefor
US7060279B2 (en) * 2000-03-30 2006-06-13 Dendreon Corporation Compositions and methods for dendritic cell-based immunotherapy
US7229623B1 (en) 2000-08-03 2007-06-12 Corixa Corporation Her-2/neu fusion proteins
IL154415A0 (en) * 2000-08-14 2003-09-17 Corixa Corp Polynucleotides that encode her-2/neu polypeptides and pharmaceutical compositions containing the same
DK1326638T3 (da) * 2000-10-18 2008-03-25 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacciner mod cancer
PT2266603E (pt) 2000-10-18 2012-11-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacinas tumorais
GB0109297D0 (en) 2001-04-12 2001-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
EP2241309A3 (en) 2001-07-10 2012-12-26 Corixa Corporation Methods for encapsulation of proteins and adjuants in microspheres
WO2005117986A2 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Genentech, Inc. Antibody drug conjugates and methods
WO2004067716A2 (en) 2003-01-24 2004-08-12 Agensys, Inc. Nucleic acids and corresponding proteins entitled 254p1d6b useful in treatment and detection of cancer
CA2527904A1 (en) 2003-06-06 2005-05-26 Agennix Incorporated Lactoferrin as an adjuvant in cancer vaccines
EP1641819B1 (en) * 2003-06-25 2009-04-22 BN ImmunoTherapeutics, Inc. Purification of her-2 variants
CN101094864A (zh) 2003-06-25 2007-12-26 法麦克萨有限公司 Her－2变体的纯化
CN100558894C (zh) * 2003-07-21 2009-11-11 P.安杰莱蒂分子生物学研究所 编码人表皮生长因子2/neu抗原的合成基因及其用途
GB0321615D0 (en) 2003-09-15 2003-10-15 Glaxo Group Ltd Improvements in vaccination
PT2489364E (pt) 2003-11-06 2015-04-16 Seattle Genetics Inc Compostos de monometilvalina conjugados com anticorpos
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
DK1791565T3 (en) 2004-09-23 2016-08-01 Genentech Inc Cysteingensplejsede antibodies and conjugates
ITMI20041965A1 (it) * 2004-10-15 2005-01-15 Augusto Amici "dna codificante forme tronche e chimeriche della proteina p185neu e suoi usi terapeutici"
GB0427131D0 (en) * 2004-12-10 2005-01-12 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel combination
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
EP2390369A1 (en) 2006-06-02 2011-11-30 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Method for identifying whether a patient will be responder or not to immunotherapy based on the differential expression of the GZMB gene
EP2489367A1 (en) 2007-05-24 2012-08-22 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Lyophilised antigen composition
IN2012DN03025A (cs) 2009-09-09 2015-07-31 Ct Se Llc
GB0917457D0 (en) 2009-10-06 2009-11-18 Glaxosmithkline Biolog Sa Method
SI2528625T1 (sl) 2010-04-15 2013-11-29 Spirogen Sarl Pirolobenzodiazepini in njihovi konjugati
EP2579897A1 (en) 2010-06-08 2013-04-17 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
WO2012074757A1 (en) 2010-11-17 2012-06-07 Genentech, Inc. Alaninyl maytansinol antibody conjugates
ES2567276T3 (es) 2011-05-12 2016-04-21 Genentech, Inc. Método de LC-MS/MS de monitoreo de múltiples reacciones para detectar anticuerpos terapéuticos en muestras de animales usando péptidos de cambio de marco
KR101877598B1 (ko) 2011-10-14 2018-07-11 메디뮨 리미티드 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨주게이트
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
EP2906297B1 (en) 2012-10-12 2017-12-06 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
PT2906253T (pt) 2012-10-12 2018-11-05 Medimmune Ltd Conjugados de anticorpo anti-psma de pirrolobenzodiazepina
EP2906298B1 (en) 2012-10-12 2018-10-03 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
LT2906251T (lt) 2012-10-12 2017-12-11 Adc Therapeutics Sa Pirolobenzodiazepino-anti-cd22 antikūno konjugatai
EP2906250B1 (en) 2012-10-12 2018-05-30 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-anti-psma antibody conjugates
RS58921B1 (sr) 2012-10-12 2019-08-30 Medimmune Ltd Pirolobenzodiazepini i njihovi konjugati
MX364328B (es) 2012-10-12 2019-04-23 Medimmune Ltd Conjugados del anticuerpo pirrolobenzodiazepina.
AU2013366490B9 (en) 2012-12-21 2018-02-01 Medimmune Limited Unsymmetrical pyrrolobenzodiazepines-dimers for use in the treatment of proliferative and autoimmune diseases
JP6307519B2 (ja) 2012-12-21 2018-04-04 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ピロロベンゾジアゼピンおよびその結合体
NZ710746A (en) 2013-03-13 2018-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US20160031887A1 (en) 2013-03-13 2016-02-04 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
SG11201507214SA (en) 2013-03-13 2015-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
SG11201601005XA (en) 2013-08-12 2016-03-30 Genentech Inc 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1h-benzo[e]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
EP3054986B1 (en) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP3054983B1 (en) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US9950078B2 (en) 2013-10-11 2018-04-24 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
JP6425327B2 (ja) * 2013-12-12 2018-11-21 国立大学法人東京農工大学 タンパク質−磁性粒子複合体及びその製造方法
WO2015095227A2 (en) 2013-12-16 2015-06-25 Genentech, Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
WO2015095212A1 (en) 2013-12-16 2015-06-25 Genentech, Inc. 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1h-benzo[e]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
CN105873614B (zh) 2013-12-16 2020-10-30 基因泰克公司 肽模拟化合物及其抗体-药物缀合物
CN106687141A (zh) 2014-09-10 2017-05-17 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其缀合物
SG11201701128YA (en) 2014-09-12 2017-03-30 Genentech Inc Cysteine engineered antibodies and conjugates
JP6622293B2 (ja) 2014-09-12 2019-12-18 ジェネンテック， インコーポレイテッド アントラサイクリンジスルフィド中間体、抗体−薬物複合体、及び方法
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2016044560A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and antibody disulfide conjugates thereof
MX2017006770A (es) 2014-11-25 2018-02-09 Adc Therapeutics Sa Conjugados de pirrolobenzodiazepina y anticuerpo.
WO2016090050A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Genentech, Inc. Quaternary amine compounds and antibody-drug conjugates thereof
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
US20170315132A1 (en) 2016-03-25 2017-11-02 Genentech, Inc. Multiplexed total antibody and antibody-conjugated drug quantification assay
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
PL3458101T3 (pl) 2016-05-20 2021-05-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Koniugaty PROTAC-przeciwciało i sposoby ich stosowania
EP3465221B1 (en) 2016-05-27 2020-07-22 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bioanalytical method for the characterization of site-specific antibody-drug conjugates
EP3464280B1 (en) 2016-06-06 2021-10-06 F. Hoffmann-La Roche AG Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
CN109689111B (zh) 2016-08-11 2024-04-05 基因泰克公司 吡咯并苯并二氮杂䓬前药及其抗体缀合物
WO2018065501A1 (en) 2016-10-05 2018-04-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods for preparing antibody drug conjugates
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
ES2871001T3 (es) 2017-02-08 2021-10-28 Adc Therapeutics Sa Conjugados de pirrolobenzodiazepinas y anticuerpos
PT3612537T (pt) 2017-04-18 2022-08-29 Medimmune Ltd Conjugados de pirrolobenzodiazepina
JP7408396B2 (ja) 2017-04-20 2024-01-05 アーデーセー セラピューティクス ソシエテ アノニム 併用療法
WO2018229222A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Adc Therapeutics Sa Dosage regimes for the administration of an anti-cd19 adc
MY194477A (en) 2017-08-18 2022-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
BR112020004307A2 (pt) 2017-09-20 2020-11-10 Ph Pharma Co., Ltd. análogos de tailanestatina
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
CA3115110A1 (en) 2018-10-24 2020-04-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugated chemical inducers of degradation and methods of use
EP3894427A1 (en) 2018-12-10 2021-10-20 Genentech, Inc. Photocrosslinking peptides for site specific conjugation to fc-containing proteins
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
IL299121A (en) * 2020-07-14 2023-02-01 Hoffmann La Roche Tests for fixed dose combinations
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
KR102584276B1 (ko) * 2023-03-30 2023-10-10 주식회사 애스톤사이언스 Her2 백신, 및 면역관문 억제제의 조합 요법

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE155813T1 (de) * 1989-05-19 1997-08-15 Genentech Inc Her2 extrazellulare domäne
US5801005A (en) * 1993-03-17 1998-09-01 University Of Washington Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
JPH0914357A (ja) * 1995-06-27 1997-01-14 Honda Motor Co Ltd 伝動ベルト用ブロック

Also Published As

Publication number Publication date
CN1345374A (zh) 2002-04-17
CA2361009C (en) 2012-10-23
ATE474048T1 (de) 2010-07-15
KR100766653B1 (ko) 2007-10-15
EP1147190A1 (en) 2001-10-24
HK1044798A1 (en) 2002-11-01
NO20013701L (no) 2001-09-28
WO2000044899A1 (en) 2000-08-03
AU2742600A (en) 2000-08-18
IL144371A0 (en) 2002-05-23
JP2002535004A (ja) 2002-10-22
NO20013701D0 (no) 2001-07-27
TR200102191T2 (tr) 2001-12-21
NZ513062A (en) 2003-10-31
CN1201004C (zh) 2005-05-11
DE60044665D1 (de) 2010-08-26
MXPA01007721A (es) 2003-07-14
CA2361009A1 (en) 2000-08-03
AU780109B2 (en) 2005-03-03
JP5164300B2 (ja) 2013-03-21
KR20010101865A (ko) 2001-11-15
ZA200106179B (en) 2002-12-24
BR0007840A (pt) 2002-01-22
HUP0105303A2 (en) 2002-05-29
ES2348708T3 (es) 2010-12-13
EP1147190B1 (en) 2010-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ20012587A3 (cs) Izolovaný protein, nukleová kyselina, virový vektor, farmaceutický prostředek, izolovaná populace T buněk, způsob posílení imunitní odpovědi, způsob odstranění nádorových buněk, způsob stimulace a/nebo namnoľení T buněk a způsob přípravy fúzního proteinu
US7229623B1 (en) Her-2/neu fusion proteins
US8568733B2 (en) HER-2/neu fusion proteins
EP1183348B1 (en) Compositions for the treatment and diagnosis of breast cancer and methods for their use
AU2002367594B2 (en) Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US20020039573A1 (en) Compounds and methods for prevention and treatment of HER-2/neu associated malignancies
WO2002013847A2 (en) Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
KR20020007354A (ko) 폐암의 치료 및 진단에 유용한 화합물 및 방법
MXPA03002983A (es) Composiciones y metodos `para la inmunoterapia especifica de wt1.
CA2383615A1 (en) Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
CA2401070A1 (en) Compositions and methods for diagnosis and therapy of malignant mesothelioma
US20020150588A1 (en) SPAS-1 cancer antigen
US7704701B2 (en) Diagnosis of prostate cancer with SPAS-1 cancer antigen
AU2005202415A1 (en) HER-2/neu fusion proteins
US20030157119A1 (en) Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
CA2375049A1 (en) Compositions and methods for the therapy, diagnosis and monitoring of breast cancer
JP4942906B2 (ja) 卵巣癌の治療および診断のための組成物および方法
US20020082216A1 (en) Compositions and methods for the therapy, diagnosis and monitoring of breast cancer
KR20070017209A (ko) ＨＥＲ-２/ｎｅｕ 융합단백질