MXPA03002983A

MXPA03002983A - Composiciones y metodos `para la inmunoterapia especifica de wt1.

Info

Publication number: MXPA03002983A
Application number: MXPA03002983A
Authority: MX
Inventors: Jeremy Boydston
Original assignee: Corixa Corp
Priority date: 2000-10-06
Filing date: 2001-10-03
Publication date: 2004-12-06
Also published as: US20030072767A1; EP1328287B1; KR20030081314A; EP1328287A4; ES2311027T3; DE60135005D1; ATE402189T1; WO2002028414B1; JP2004510425A; CA2425072C; KR100858231B1; JP2008154588A; EP1328287A1; CA2425072A1; CN100545174C; AU9660801A; CN1505526A; NZ540397A; WO2002028414A1; JP4130359B2

Abstract

Se describen composiciones y metodos para la terapia de enfermedades malignas, tales como leucemia y cancer. Las composiciones comprenden uno o mas de entre un polinucleotido de WT1, un polipeptido de WT1, una celula de presentacion de antigeno que presenta un polipeptido de WT1, un anticuerpo que se une especificamente a un polipeptido de WT1I; o una celula T que reacciona especificamente con un polipeptido de WT1. Tales composiciones pueden utilizarse, por ejemplo, para la prevencion y tratamiento de enfermedades metastaticas.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA I U OTERAPIA DE WT1 ESPECÍFICO Esta invención se realizó en parte con apoyo g ubernamental bajo N I H SBI R Fase I número de concesión I R43 CA81752-01 A1 . El gobierno puede tener algunos derechos en esta invención.

CAM PO DE LA I NVENCIÓN La presente invención se refiere generalmente a la inmunoterapia de enfermedades malignas tales como leucemia y cánceres. La invención se refiere más específicamente a composiciones para generar o mejorar una respuesta inm unológica a WT1 , y al uso de tales composiciones para evitar y/o tratar enfermedades malignas.

ANTECEDENTES DE LA I NVENCIÓN El cáncer y la leucemia son problemas de salud significativos en los Estados Unidos y en todo el m u ndo . Aunque se han hecho avances en la detección y tratamiento de tales enfermedades, actualmente no se encuentra disponible ninguna vacuna u otro método umversalmente exitoso para la prevención o tratamiento del cáncer y la leucemia. La administración de las enfermedades actualmente se basa en una combinación de diagnósticos iniciales y tratamiento agresivo, los cuales pueden incluir una o más variedades de tratamientos tales como cirugía, tratamiento, q uimioterapia y terapia hormonal . El curso del tratamiento para un cáncer particular frecuentemente se selecciona con base en una variedad de parámetros pronosticados, que incluyen un análisis de marcadores de tumor específico. Sin em bargo, el uso de marcadores establecidos frecuentemente conduce a un resultado que es difícil de interpretar, y la elevada mortalidad continúa observándose en m uchos pacientes de cáncer. Las inmunoterapias tienen el potencial de mejorar substancialmente el tratamiento y sobrevivencia al cáncer y leucemia . Datos recientes demuestran que la leucemia puede curarse por inmunoterapia en el contexto de transplante de médula ósea (por ejemplo, infusiones de linfocitos donadores). Tales terapias pueden invol ucrar la generación o acentuación de una respuesta inmunológ ica a un antígeno asociado con tumores (TAA) . Sin em bargo , a la fecha se conocen relativamente pocos TAAs y la generación de una respuesta in munológ ica contra tales antígenos, sin excepción rara, no ha mostrado ser benéfica terapéuticamente. De acuerdo con lo anterior, existe la necesidad en la materia de métodos mejorados para la prevención y terapia de la leucemia y del cáncer. La presente invención satisface estas necesidades y proporciona además otras ventajas relacionadas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En resumen , esta invención proporciona composiciones y métodos para el diagnóstico y terapia de enfermedades tales como la leucem ia y el cáncer. En un aspecto, la presente invención proporciona polipéptidos que comprenden una porción inm unogénica de un WT1 nativo, o una variante del mismo que difiera en una o más substituciones, eliminaciones, adiciones, y/o inserciones de manera tal que la capacidad de la variante para reaccionar con antisueros de antígeno específico y/o líneas de células T o clones no ha disminuido completamente. En algunas modalidades, el polipéptido comprende no más de 16 residuos de aminoácido consecutivos de un polipéptido de WT1 nativo. En otras modalidades, el polipéptido comprende una porción inmunogénica de los residuos aminoácidos 1 -174 de un polipéptido de WT1 nativo o una variante del mismo, en la que el polipéptido comprende no más de 16 residuos aminoácidos consecutivos presentes en los aminoácidos 175 a 449 del polipéptido de WT1 nativo. La porción inmunogénica se une preferentemente a una MHC clase I y/o molécula de clase I I . En algunas modalidades, el polipéptido comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en (a) secuencias relatadas en una o varias de las Tablas I I - XLVI , (b) variantes de las secuencias anteriores que difieren en una o más substituciones, eliminaciones y/o inserciones de manera tal que la capacidad de la variante para hacerse reaccionar con antisueros de antígeno específico y/o líneas de células T o clones no disminuye substancialmente y (c) imitadores de los polipéptidos relatados con anterioridad, de manera tal que la capacidad del imitador para hacerse reaccionar con antisueros de antígeno específico y/o líneas de células T o clones no disminuye substancialmente. En otras modalidades, el polipéptido comprende una seleccionada a partir del grupo que consiste en (a) ALLPAVPSL (NO DE ID DE SEC: 34), GATLKGVAA (NO DE ID DE SEC: 88), CMTWNQMNL (NOs DE I D DE SEC: 49 y 258), SCLESQPTI (NOs DE ID DE SEC: 199 y 296), SCLESQPAI (NO DE ID DE SEC: 198), NLYQ TSQL (NOs DE I D DE SEC: 147 y 284) , ALLPAVSSL (NOs DE I D DE SEC: 35 y 255), RMFPNAPYL (NOs DE I D DE SEC: 1 85 y 293), VLDFAPPGA (NO DE I D DE SEC: 241 ), VLDFAPPGAS (NO DE ID DE SEC: 41 1 ), (b) variantes de las secuencias anteriores que difieren en una o más substituciones, eliminaciones, adiciones y/o inserciones de manera tal que la capacidad de la variante para reaccionar con antisueros de antígeno específico y/o líneas de células T o clones no disminuye substancialmente y (c) imitadores de los polipéptidos relatados con anterioridad, de manera tal que la capacidad del imitador para reaccionar con antisueros de antígeno específico y/o líneas de células T o clones no disminuye substancialmente. Los imitadores pueden comprender aminoácidos en combinación con uno o más imitadores de aminoácido o pueden ser imitadores no péptidos completamente. En aspectos adicionales, la presente invención proporciona polipéptidos que comprenden una variante de una porción inmunogénica de una proteína de WT1 , en la que la variante difiere de la porción inmunogénica debido a substituciones entre las posiciones de aminoácidos 1 y 3 en la porción inmunogénica de manera tal que la capacidad de la variante de reaccionar con antisueros de antígeno específico y/o líneas de células T o clones se acentúa con relación a una proteína de WT1 nativo. La presente invención proporciona además los polinucleótidos de WT1 que codifican un polipéptido de WT1 como se describió anteriormente. En otros aspectos, la presente invención proporciona composiciones y vacunas farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender un polipéptido o imitador como se describió anteriormente y/o uno o más de entre (i) un polinucleótido de WT1 ; (ii) un anticuerpo o fragmento de unión de antígeno del mismo que se une específicamente a un polipéptido de WT1 ; (iii) una célula T que reacciona específicamente con un polipéptido de WT1 o (iv) una célula de presentación de antígeno que expresa un polipéptido de WT1 , en combinación con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Las vacunas comprenden un polipéptido como se describió anteriormente y/o uno o más de entre (i) un polipéptido de WT1 , (¡i) una célula de presentación de antígeno que expresa un polipéptido de WT1 o (iii) un anticuerpo anti-idiotípico, y un acentuador de respuesta inmunológica no específica. En algunas modalidades, menos de 23 residuos aminoácidos consecutivos, preferentemente menos de 1 7 residuos aminoácidos, de un polipéptido de WT1 nativo se encuentran presentes en un polipéptido de WT1 empleado en tales composiciones y vacunas farmacéuticas. El acentuador de respuesta inmunológica puede ser un adyuvante. Preferentemente, un acentuador de respuesta inmunológica acentúa una respuesta de células T. La presente invención proporciona además métodos para acentuar o inducir una respuesta inmunológica en un paciente, que comprende administrarle a un paciente una composición o vacuna farmacéuíica como se describió con anterioridad. En algunas modalidades, el paciente es un ser h umano. La presente invención proporciona además métodos para inhibir el desarrollo de una enfermedad maligna en un paciente, que comprende administrarle a un paciente una composición farmacéutica o vacuna como se describió con anterioridad . Las enfermedades malignas incluyen , pero no se limitan a, leucemias (por ejemplo, m ieloide ag udo , linfocítica aguda y m ieloide crónica) y cánceres (por ejemplo, cáncer de pecho , pulmón, tiroides o gastrointestinal o un melanoma) . El paciente puede, pero no necesita , afligirse con la enfermedad maligna, y la administración de la com posición farmacéutica o vacuna puede inhibir el inicio de tal enfermedad , o puede inhibir el progreso y/o metástasis de una enfermedad existente. La presente invención proporciona además, . en otros aspectos, métodos para eliminar células de expresión de WT1 de médula ósea y/o sang re periférica o fragmentos de las mismas, que comprende contactar la médula ósea, sang re periférica o un fragmento de médula ósea o sangre periférica con células T que reaccionan específicamente con un polipéptido de WT1 , en el que la etapa para contactar se lleva a cabo bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la eliminación de células positivas a WT1 a menos del 1 0% , preferentemente menos del 5% y más preferentemente menos de 1 % , del número de células mieloides o linfáticas en la médula ósea, sang re periférica o fragmentos. La médula ósea, sangre periférica y fragmentos pueden obtenerse de un paciente afligido con una enfermedad asociada con la expresión de WT1 , o puede obtenerse de un ser humano o un mam ífero no humano no afligido con tal enfermedad. En aspectos relacionados , la presente invención proporciona métodos para inhibir el desarrollo de una enfermedad maligna en un paciente, que com prende administrarle a un paciente médula ósea, sangre periférica o un frag mento de médula ósea o sangre periférica preparada como se describió anteriormente. Tal médula ósea, sangre periférica o fragmentos pueden ser autólogas, o pueden derivarse de un ser humano o animal no humano relacionado o no relacionado (por ejemplo, singenético o alogénico). En otros aspectos, la presente invención proporciona métodos para estimular (o imprimar) y/o expandir las células T, que comprende contactar las células T con un polipéptido de WT1 bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la estimulación y/o expansión de las células T. Tales células T pueden ser autólogas, alogénicas, singenéticas o células T de WT1 específico no relacionadas, y pueden estimularse in vitro o in vivo. Las células T expandidas pueden , en algunas modalidades, estar presentes en la médula ósea, sangre periférica o un fragmento de médula ósea o sangre periférica, y pueden (pero no necesitan) ser clónales. En algunas modalidades, las células T pueden estar presentes en un mam ífero du rante la estim ulación y/o expansión. Las célu las T de WT1 específico pueden utilizarse, por ejemplo, en infusiones de linfocitos donadores. En aspectos relacionados, se proporcionan los métodos para inhibir el desarrollo de una enfermedad maligna en un paciente, q ue comprende administrarle a un paciente células T preparadas como se describió con anterioridad. Tales células T pueden, en algunas modalidades, ser autólogas, singenéticas o alogénicas. La presente invención proporciona además, en otros aspectos, métodos para monitorear la efectividad de una inmunización o terapia para una enfermedad maligna asociada con la expresión de WT1 en un paciente. Tales métodos se basan en el monitoreo de anticuerpos, respuestas a células T CD4+ y/o células T CD8+ en el paciente. En algunos de tales aspectos, un método puede comprender las etapas para: (a) incubar una primera muestra biológica con uno o más de entre: (i) un polipéptido de WT1 ; (ii) un polipéptido que codifica un polipéptido de WT1 ; en la que la primera muestra biológica se obtiene a partir de un paciente antes de una terapia o inmunización, y en la que la incubación se realiza bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir inmunocomplejos para formar; (b) detectar inmunocomplejos formados entre el polipéptido de WT1 y anticuerpos en la muestra biológica que se unen específicamente al polipéptido de WT1 ; (c) repetir las etapas (a) y (b) utilizar una segunda muestra biológica obtenida a partir del mismo paciente que sigue la terapia o inmunización; y (d) comparar el número de inmunocomplejos detectados en las muestras biológicas primera y segunda, y monitorear a partir de ellas la efectividad de la terapia o inmunización en el paciente. En algunas modalidades de los métodos anteriores, la etapa de detección comprende (a) incubar los inmunocomplejos con un agente reactivo de detección que sea capaz de unirse a los inmunocomplejos, en los que el agente reactivo de detección comprende un grupo relator, (b) eliminar el agente reactivo de detección no unido, y (c) detectar la presencia o ausencia del grupo relator. El agente reactivo de detección puede comprender, por ejemplo, un segundo anticuerpo, o fragmento de unión de antígeno del mismo, capaz de unirse a los anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido de WT1 o una molécula tal como Proteína A. En otras modalidades, un grupo relator se une al polipéptido de WT1 , y la etapa de detección comprende eliminar el polipéptido de WT1 no unido y subsecuentemente detectar la presencia o ausencia del grupo relator. En aspectos adicionales, los métodos para monitorear la efectividad de una inmunización o terapia de una enfermedad maligna asociada con la expresión de WT1 en un paciente pueden comprender las etapas para: (a) incubar una primera muestra biológica con uno o más de entre: (i) un polipéptido de WT1 ; (ii) un polipéptido que codifica un polipéptido de WT1 ; o (¡ii) una célula de presentación de antígeno que expresa un polipéptido de WT1 , en la que la muestra biológica comprende células T CD4+ y/o CD8 se obtiene de un paciente antes de la terapia o inmunización, y donde la incubación se realiza bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la activación específica, proliferación y/o lisis de las células T; (b) detetctar una cantidad de activación, proliferación y/o lisis de las células T; (c) repetir las etapas (a) y (b) utilizando una segunda muestra biológica que comprende células T CD4+ y/o CD8+, en la que la segunda muestra biológica se obtiene del mismo paciente siguiendo la terapia o inmunización; y (d) comparar ia cantidad de activación, proliferación y/o lisis de células T en las muestras biológicas primera y segunda, y monitorear a partir de ellas la efectividad de la terapia o inmunización en el paciente. La presente invención proporciona además métodos para inhibir el desarrollo de una enfermedad maligna asociada con la expresión de WT1 en un paciente, que comprende las etapas para: (a) incubar células T CD4+ y CD8+ aisladas de un paciente con uno o más de entre: (i) un polipéptido de WT1 ; (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido de WT1 ; o (iii) una célula de presentación de antígeno que expresa un polipéptido de WT1 , de manera tal que proliferen las células T, y (b) administrarle al paciente una cantidad efectiva de las células T proliferadas, e inhibir a partir de ellas el desarrollo de una enfermedad maligna en el paciente. En algunas modalidades, la etapa para incubar las células T puede repetirse una o más veces. En otros aspectos, la presente invención proporciona métodos para inhibir el desarrollo de una enfermedad maligna asociada con expresión de WT1 en un paciente, que comprende las etapas para: (a) incubar células T de CD4+ y/o CD8+ aisladas de un paciente con uno o más de entre: (i) un polipéptido de WT1 ; (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido de WT1 ; o (iii) una célula de presentación de antígeno que expresa un polipéptido de WT1 , de manera tal que proliferen las células T; (b) clonar una o más células que proliferaron; y (c) administrarle al paciente una cantidad eficaz de células T clonadas. En otros aspectos, se proporcionan métodos para determinar la presencia o ausencia de una enfermedad maligna asociada con la expresión de WT1 en un paciente, que comprende las etapas para: (a) incubar células T de CD4+ y/o CD8+ aisladas de un paciente con uno o más de entre: (i) un polipéptido de WT1 ; (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido de WT1 ; o (iii) una célula de presentación de antígeno que expresa un polipéptido de WT1 ; y (b) detectar la presencia o ausencia de activación específica de células T, determinando a partir de ellas la presencia o ausencia de una enfermedad maligna asociada con la expresión de WT1 . En algunas modalidades, la etapa de detección comprende detectar la presencia o ausencia de proliferación de células T. En aspectos adicionales, la presente invención proporciona métodos para determinar la presencia o ausencia de una enfermedad maligna asociada con la expresión de WT1 en un paciente, que comprende las etapas para: (a) incubar una muestra biológica obtenida a partir de un paciente con uno o más de entre: (i) un polipéptido de WT1 ; (ii) un polipéptido que codifica un polipéptido de WT1 ; o (¡ii) una célula de presentación de antígeno que expresa un polipéptido de WT1 , en la que la incubación se realiza bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la formación de los inmunocomplejos; y (b) detectar inmunocomplejos formados entre el polipéptido de WT1 y anticuerpos en la muestra biológica que se unen específicamente al polipéptido de WT1 ; y determinar a partir de ellos la presencia o ausencia de una enfermedad maligna asociada con la expresión de WT1 . Estos y otros aspectos de la presente invención se volverán aparentes tras la referencia a la siguiente descripción detallada y dibujos anexos. Todas las referencias descritas en la presente se incorporan en la presente para referencia en su totalidad como si cada una se incorporase individualmente.

BREVE D ESCRI PCIÓN DE LAS FIG URAS La Figura 1 representa gráficamente una comparación de las secuencias de proteína de WT1 de ratón (MO) y humana (HU) (NOs DE ID DE SEC: 320 y 319 respectivamente). La Figura 2 es un Western Blot que ilustra la detección de anticuerpos de WT1 específico en paciente con malignidades hematológicas (AML). La pista 1 muestra marcadores de peso molecular; la pista 2 muestra un control positivo (línea celular de leucemia humana positiva inmunoprecipitada con un anticuerpo de WT1 específico); la pista 3 muestra un control negativo (línea celular positiva a WT1 inmunoprecipitada con sueros de ratón); y la pista 4 muestra una línea celular positiva a WT1 inmunoprecipitado con sueros de un paciente con AML. Para las pistas 2-4, el inmunoprecipitado se separó por electrofóresis de gel y se sondeó con un anticuerpo de WT1 específico. La Figura 3 es un Western Blot que ilustra la detección de una respuesta de anticuerpo de WT1 específico en ratones B6 inmunizados con TRAMP-C, una línea celular tumorosa positiva a WT1 . Las pistas 1 , 3 y 5 muestran marcadores de peso molecular, y las pistas 2, 4 y 6 muestran un control positivo de WT1 específico (N180, Santa Cruz Biotechnology, expansión de polipéptidos de 180 aminoácidos de la región N-terminal de la proteína de WT1 , que migra en el Western Blot a 52 kD). El anticuerpo principal utilizado fue WT1 80 en la pista 2, sueros de ratones B6 no inmunizados en la pista 4 y los sueros de los ratones B6 inmunizados en la pista 6. La Figura 4 es un Western Blot que ilustra la detección de anticuerpos de WT1 específico en ratones inmunizados con los péptidos de WT1 representativos. Las pistas 1 , 3 y 5 muestran marcadores de peso molecular y las pistas 2, 4 y 6 muestran un control positivo de WT1 específico (N1 80, Santa Cruz Biotechnology, expansión de polipéptidos de 180 aminoácidos de la región N-terminal de la proteína de WT1 , que migra en el Western Blot a 52 kD). El anticuerpo primario utilizado fue WT1 80 en la pista 2, sueros de ratones B6 no inmunizados en la pista 4 y sueros de los ratones B6 inmunizados en ia pista 6. Las Figuras 5A a 5C son gráficas que ilustran la estimulación de respuestas de células T proliferantes en ratones inmunizados con péptidos de WT1 representativos. Las pruebas de incorporación de timidina se realizaron utilizando una línea celular T y dos clones diferentes, como se indica, y los resultados se expresaron como cpm. Los controles indicados en el eje x son sin antígeno (No Ag) y B6/medios; los antígenos utilizados fueron p6-22 humano (p1 ), p1 17-139 (p2) o p244-262 humano (p3) . La Figura 6A y 6B son histogramas que ilustran la estimulación de las respuestas de células T proliferantes en ratones inmunizados con péptidos de WT1 representativos. Tres semanas después de la tercera inmunización, las células de bazo de los ratones que se habían inoculado con la Vacuna A o la Vacuna B se cultivaron solo con medio (medio) o células de bazo y medio (B6/medio), células de bazo B6 impulsadas con los péptidos p6-22 (p6), p117-139 (p117), p244-262 (p244) (Vacuna A; Figura 6A) o p287-301 (p287), p299-313 (p299), p421-435 (p421) (Vacuna B; Figura 6B) y células de bazo impulsadas con un péptido de control irrelevante (péptido irrelevante) a 25 g/ml y se analizaron después de 96h durante la proliferación por incorporación de (3H)-timidina. Las barras representan el índice de estimulación (SI), el cual se calcula como la media aritmética de las cavidades experimentales dividido entre la media aritmética del control (células de bazo B6 sin antígeno). Las Figuras 7A-7D son histogramas que ¡lustran la generación de líneas de células T proliferantes y clones específicos para p117-139 y p6-22. Después de la inmunización in vivo, se llevaron a cabo las tres estimulaciones in vitro iniciales (IVS) utilizando los tres péptidos de Vacuna A o B, respectivamente. Se realizaron IVS subsecuentes como estimulaciones de péptido sencillas utilizando solamente los dos péptidos relevantes p117-139 y p6-22. Los clones se derivaron tanto de las líneas de células específicas T p6-22 y p117-139, como se indica. Las células T se cultivaron solo con medio (medio) o células de bazo y medio (B6/sin antígeno), células de bazo B6 impulsadas con los péptidos p6-22 (p6), p117-139 (p 117) o un péptido de control irrelevante (péptido irrelevante) a 25 pg/ml y se probaron después de 96 hr durante la proliferación por incorporación de (3H)- timidina. Las barras representan el índice de estimulación (SI), el cual se calcula como la media aritmética de las cavidades experimentales divida por la media aritmética del control (células de bazo B6 sin antígeno). Las Figuras 8A y 8B presentan los resultados del Análisis TSITES de WT1 humano (NO DE I D DE SEC: 31 9) para péptidos que tienen el potencial de producir respuestas Th. Las regiones indicadas por "A" son puntos intermedios de AMPHI de bloques, "R" indica residuos que se acoplan al motivo Rothbard/Taylor, "D" indica residuos que se acoplan al motivo lAd, y 'd' indica residuos que se acoplan al motivo lEd. Las Figuras 9A y 9B son gráficas que ilustran la producción de CTL específicos de péptido de WT1 en ratones inmunizados con péptidos de WT1 . La Figura 9A ¡lustra la lisis de las células objetivo por líneas celulares alogénicas y la Figura 9B muestra la lisis de líneas celulares recubiertas con péptido. En cada caso, el % de lisis (como se determina por pruebas convencionales de liberación de cromo) se muestra en tres proporciones ejecutor.objetivo. Los resultados se proporcionan para las células de linfoma (LSTRA y E10), así como también E 10 + p235-243 (E10+P235). Las células E1 0 son referidas en la presente también como células EL-4. Las Figuras 1 0A-10D son gráficas que ilustran la producción de CTL de WT1 específico, el cual mata las líneas celulares tumorosas positivas a WT1 pero no matan las líneas celulares negativas a WT1 , que siguen la vacunación de ratones B6 con el péptido de WT1 P1 17.

La Figura 10A ilustra que las células T de ratones B6 no inmunizados no mate las líneas celulares tumorosas positivas a WT1. La Figura 10B ilustra la lisis de las células objetivo por las líneas celulares alogénicas. Las Figuras 10C y 10D demuestran la lisis de líneas celulares tumorosas positivas a WT1, en comparación con las líneas celulares negativas a WT1 en dos experimentos diferentes. Además, las Figuras 10C y 10D muestran la lisis de las líneas celulares recubiertas con péptido (línea celular negativa a WT1 E10 recubierta con el péptido de WT1 relevante P117). En cada caso, el % de lisis (como se determina por las pruebas convencionales de liberación de cromo) se muestra en tres proporciones ejecutonobjetivo indicadas. Se proporcionan los resultados para las células de linfoma (E10), células de cáncer prostético (TRAMP-C), una línea celular de fibroblastos transformados (BLK-SV40), así como también E10+p117. Las Figuras 11A y 11B son histogramas que ilustran la capacidad de los CTL específicos P117-39 de péptido representativo para someter a lisis a las células tumorosas positivas a WT1. Tres semanas después de la tercera inmunización, las células de bazo de los ratones que se habían inoculado con los péptidos p235-243 o p117-139 se estimularon in vitro con el péptido relevante y se probó su capacidad de someter a lisis los objetivos incubados con los péptidos de WT1 así como también las células tumorosas positivas y negativas a WT1. Las barras representan la media aritmética de lisis específica en pruebas de liberación de cromo llevadas a cabo por triplicado con una proporción E:0 de 25:1. La Figura 11A muestra la actividad citotóxica de la línea de células T específica ?235-243 contra la línea celular negativa a WT1 EL-4 (EL-4, negativa a WT1 ); EL-4 impulsada con el péptido relevante (utilizada para inmunización así como también para estimulación) p235-243 (EL-4+p235); EL-4 impulsada con los péptidos irrelevantes p1 17-139 (EL-4+p1 17), p126-134 (EL-4+p126) o p130-138 (EL-4 + p130) y las células tumorosas positivas a WT1 BLK-SV40 (BLK-SV40, positivas a WT1 ) y TRAMP-C (TRAMP-C, positivas a WT1 ), como se indica. La Figura 1 1 B muestra la actividad citotóxica de la línea celular T específica p1 17-139 contra EL-4; EL-4 impulsada con el péptido relevante P1 17-139 (EL-4+p1 17) y EL-4 impulsada con los péptidos irrelevantes p123-1 31 (EL-4+p123), o p128-1 36 (EL-4+p128); BLK-SV40 y TRAMP-C, como se indica. Las Figuras 12A y 12B son histogramas que ilustran la especificidad de lisis de las células tumorosas positivas a WT1 , como se demuestran por la inhibición objetivo fría. Las barras representan la media aritmética de % de lisis específica en pruebas de liberación de cromo llevadas a cabo por triplicado con una proporción E:0 25: 1 . La Figura 12A muestra la actividad citotóxica de la línea de células T específica p1 17-139 contra la línea celular negativa a WT1 EL-4 (EL-4, negativa a WT1 ) ; la línea celular tumorosa positiva a WT1 TRAMP-C (TRAMP-C, positiva a WT1 ); células de TRAMP-C incubadas con un exceso diez veces mayor (en comparación con el objetivo caliente) de células EL-4 impulsadas con el péptido relevante p1 17-139 (TRAMP-C + p 1 17 objetivo fría) sin etiquetación de 1Cr y células de TRAMP-C incubadas con EL-4 impulsadas con un péptido irrelevante sin etiquetación de Cr (TRAMP-C + objetivo frío irrelevante), como se indica. La Figura 12B muestra la actividad citotóxica de la línea de células T específica p1 17-139 contra la línea celular negativa a WT1 EL-4 (EL-4, negativa a WT1 ); la línea celular tumorosa positiva a WT1 BLK-SV40 (BLK-SV40, positiva a WT1 ); células BLK-SV40 incubadas con el objetivo frío relevante (BLK-SV40+p1 17 objetivo frío) y células BLK-SV40 incubadas con el objetivo frío irrelevante (BLK-SV40+objetivo frío irrelevante), como se indica. Las Figuras 1 3A-13C son histogramas que representan gráficamente una evaluación del 9mero epítope de CTL en p1 17-1 39. La línea de CTL específicos al tumor p1 17- 39 se probó contra los péptidos en aa1 17-139 con contenido o que carece de un motivo de unión de H-2 clase I y tras la reestimulación con p126-1 34 o p1 30-1 38. Las barras representan la media aritmética de % de lisis específica en pruebas de liberación de cromo realizadas por triplicado con una proporción E: 0 de 25: 1 . La Figura 13A muestra la actividad citotóxica de la línea de células T específica p1 1 7- 39 contra la línea celular negativa a WT1 EL-4 (EL-4, negativa a WT1 ) y células EL-4 impulsadas con los péptidos p1 17-139 (EL-4+p1 17) , p1 19-127 (EL-4 + p1 19) , p120-128 (EL-4+p120), p123-1 31 (EL-4+p123), p126-134 (EL-4+p126), p128-136 (EL-4+p128), y p1 30-138 (EL-4+p130). La Figura 13B muestra la actividad citotóxica de la línea de CTL después de la reestimulación con p126-134 contra la línea celular negativa a WT1 ET-4, células ET-4 impulsadas con p 17-139 (EL-4+p1 17), p126-134 (EL-4+p126) y la línea celular tumorosa positiva a WT1 TRAMP-C. La Figura 13C muestra la actividad citotóxica de la línea CTL después de la reestimulación con p130-138 contra EL-4, células EL-4 impulsadas con p1 17-139 (EL-4+p1 17), p130-138 (EL-4+p130) y la línea celular tumorosa positiva a WT1 TR.AMP-C. La Figura 14 representa una reactividad de anticuerpo de suero a WT1 en 63 pacientes con AML. La reactividad de anticuerpo de suero a la proteína de WT1 /N-térm¡no se evaluó por ELISA en pacientes con AML. Las pistas primera y segunda representan los controles positivo y negativo, respectivamente. Las pistas primera y segunda representan los controles positivo y negativo, respectivamente. El anticuerpo WT1 80 de WT1 específico comercialmente obtenido se utilizó para el control positivo. Las siguientes 63 pistas representan los resultados utilizando sueros derivados de cada paciente individual. Los valores OD representados gráficamente se derivaron de la ELISA utilizando una dilución de suero 1 :500. La figura incluye datos acumulativos derivados de 3 experimentos separados. La Figura 15 representa la reactividad de anticuerpos de suero para las proteínas de WT1 y las proteínas de control en 2 pacientes con AML. La reactividad del anticuerpo de suero a las proteínas de WT1 /tamaño natural, WT1 N-término, TRX y Ra12 se evaluó por ELISA en 2 pacientes con AML. Los valores ODL representados gráficamente se derivaron de ELISA utilizando una dilución de suero 1 :500. AML-1 y AML-2 denotan suero proveniente de 2 de los pacientes individuales en la Figura 1 con reactividad de anticuerpos demostrada a WT1 /tamaño natural. La proteína de WT1 de tamaño natural se expresó como proteína de fusión con Ra12. La proteína de WT1/N-término se expresó como una prDteína de fusión con TRX. Las proteínas de control Ra12 y TRX se purificaron de manera similar. Los resultados confirman que la reactividad de anticuerpo de suero contra las proteínas de fusión de WT1 se dirige contra las porciones WT1 de la proteína. La Figura 16 representa gráficamente la reactividad de anticuerpo de suero a WT1 en 81 pacientes con CML. La reactividad de anticuerpo de suero a la proteína de WT1 /tamaño natural se evaluó por ELISA en pacientes con AML. Las pistas primera y segunda representan los controles positivo y negativo, respectivamente. El anticuerpo WT1 80 de WT1 específico comercialmente obtenido se utilizó para el control positivo. Las siguientes 81 pistas representan resultados que utilizan sueros derivados de cada paciente individual. Los valores OD representados gráficamente fueron de ELISA utilizando una dilución de suero 1 :500. La figura incluye datos acumulativos de 3 experimentos separados. La Figura 17 representa gráficamente reactividad de anticuerpo a las proteínas de WT1 y las proteínas de control en 2 pacientes con CML. La reactividad del anticuerpo de suero a las proteínas de WT1/tamaño natural, WT1 /N-término, TRX y Ra12 se evaluó por ELISA en 2 pacientes con CML. Los valores OD representados gráficamente provinieron de la ELISA utilizando una dilución de suero 1 :500. La CML-1 y la CML-2 denotan suero derivado de 2 de los pacientes individuales en la Figura 3 con reactividad de anticuerpo demostrada al WT1 /tamaño natural. La proteína de WT1/tamaño natural se expresó como una proteína de fusión con Ra12.

La proteína de WT1 /N-término se expresó como una proteína de fusión con TRX. Las proteínas de control Ra 12 y TRX se purificaron de manera similar. Los resultados confirman que la reactividad de anticuerpo de suero contra las proteínas de fusión WT1 se dirige contra las porciones de WT1 de la proteína. La Figura 1 8 proporciona las características de las proteínas de WT1 recombinantes utilizadas para análisis serológicos. La Figura 1 9A-1 9E es una gráfica de barras que representa las respuestas de anticuerpos en ratones producidos por vacunación con dosis diferentes de proteína de WT1 . La Figura 20A y 20E es una gráfica de barras de las respuestas de células T proliferantes en ratones inm unizados con proteína de WT1 . La Fig ura 21 es una fotografía de DC hum anas, exam inadas por m icroscopía fluorescente, q ue expresa WT1 tras infección adeno WT1 y Vacuna WT1 . La Figura 22 es una fotografía q ue dem uestra que la expresión WT1 en las DC humanas es reproducible tras la infección adeno WT1 y no se induce por una infección Adeno de control. La Figura 23 es una gráfica de una prueba ELISPOT I FN-gamma que m uestra q ue la imprimación in vitro de gen completo WT1 produce respuestas de células T de WT1 específico.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA I NVENCIÓN Como se observó con anterioridad, la presente invención se refiere generalmente a com posiciones y métodos para la ¡nmunoterapia y diagnóstico de enfermedades malig nas. Las composiciones descritas en la presente pueden incluir polipéptidos de WT1 , polinucleótidos de WT1 , células que presentan antígeno (APC, por ejemplo, células dendríticas) que expresan un polipéptido de WT1 , agentes tales como anticuerpos que se unen a un polipéptido de WT1 y/o células del sistema inmunológico (por ejemplo, células T) específicas para WT1 . Los polipéptidos de WT1 de la presente invención comprenden generalmente al menos una porción de un producto genético de Tumor de Wilm us (WT1 ) o una variante del mismo. Las secuencias de ácido nucleico de la presente invención comprenden generalmente una secuencia de ADN o ARN que codifica toda o una porción de tal polipéptido, o que es com plementaria a tal secuencia. Los anticuerpos son generalmente proteínas del sistema inmunológ ico, o fragmentos de unión de antígeno de las mismas, que son capaces de unirse a una porción de un polipéptido de WT1 . Las células T que pueden em plearse en tales composiciones son generalmente células T (por ejemplo, CD4+ y/o CD8+) q ue son específicas para un polipéptido de WT1 . Algunos métodos descritos en la presente emplean además cél ulas que presentan antígeno que expresan un polipéptido de WT1 como se proporciona en la presente. La presente invención se basa en el descubrimiento de que una respuesta inm unológica surgida contra un producto genético de Tumor de Wilm us (WT) (por ejemplo, WT1 ) puede proporcionar beneficio profiláctico y/o terapéutico a lo pacientes afligidos con enfermedades malignas caracterizadas por una creciente expresión genética de WT1. Tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, leucemias {por ejemplo, leucemia mieloide aguda (A L), leucemia mieloide crónica (CML), leucemia linfocítica aguda (ALL) y ALL infantil), así como también muchos cánceres tales como cánceres de pulmón, pecho, tiroides y gastrointestinal y melanomas. El gen WT1 se identificó originalmente y se aisló sobre la base de una eliminación citogénica en el cromosoma 1 p 13 en pacientes con Tumor de Wilmus {ver Cali et al., Patente de E.U. No. 5,350,840). El gen consiste en 10 exones y codifica un factor de transcripción de dedo de cinc, y se proporcionan secuencias de proteínas de WT1 de ratón y humanas en la Figura 1 y los NOs DE ID DE SEC:319 y 320.

Polipéptidos de WT1 En el contexto de la presente invención, un polipéptido de WT1 es un polipéptido que comprende al menos una porción inmunogénica de un WT1 nativo (es decir, una proteína de WT1 expresada por un organismo que no es genéticamente modificado), o una variante del mismo, como se describe en la presente. Un polipéptido de WT1 puede ser de cualquier tamaño, con la condición de que comprenda al menos una porción inmunogénica de una proteína nativa o una variante de la misma. En otras palabras, un polipéptido de WT1 puede ser un oligopéptido (es decir, que consiste de un número relativamente reducido de residuos de aminoácidos, tales como 8-10 residuos, unidos por enlaces de péptidos), una proteína de WT1 de tamaño natural (por ejemplo, presente en un ser h um ano o un animal no humano, tal como un ratón) o un polipéptido de tamaño intermedio. En alg unas modalidades , se prefiere el uso de ios polipéptidos de WT1 que contienen un número pequeño de residuos de aminoácido consecutivos de un polipéptido de WT1 nativo. Se prefieren tales polipéptidos para alg unos usos en los cuales se desea la generación de una respuesta de células T. Por ejem plo, tal polipéptido de WT1 puede contener menos de 23 , preferentemente no más de 1 8, y m uy preferentemente no más de 1 5 residuos de am inoácidos consecutivos, de un polipéptido de WT1 nativo . Los polipéptidos que comprenden nueve residuos de am inoácidos consecutivos de un polipéptido de WT1 nativo son generalmente adecuados para tales propósitos. Las secuencias adicionales derivadas de la proteína nativa y/o secuencias heterólogas pueden estar presentes en cualqu ier polipéptido de WT1 , y tales secuencias pueden (pero no necesitan) poseer propiedades inmunogénicas o antigénicas adicionales. Los polipéptidos como se proporcionan en la presente pueden asociarse además (covalentemente o no covalentemente) con otros compuestos polipéptidos o no polipéptidos . U na "porción inm unogénica" , como se utiliza en la presente es una porción de polipéptido q ue se reconoce (es decir, unida específicamente) por un receptor de antígeno de superficie de células B y/o células T. Algunas porciones inm unogénicas preferidas unidas a una molécula MHC de clase I o clase I I . Como se utiliza en la presente, se dice que una porción inmunogénica se "une a" una molécula MHC clase I o clase II si tal unión es detectable utilizando cualquier prueba conocida en la materia. Por ejemplo, la capacidad de un polipéptido de unirse a HC clase I puede evaluarse directamente al monitorear la capacidad de mejorar la incorporación de 2-microglobulina etiquetada con 125l (ß2??) en complejos heterotrimérlcos de péptido/p2m/MHC clase I (ver, Parker et al., J. ¡mmunol. 152: 163, 1994). Alternativamente, pueden emplearse las pruebas funcionales de competencia de péptidos que se conocen en la materia. Algunas porciones inmunogénicas tienen una o más de las secuencias relatadas en una o más de las Tablas 11 -XIV. Las porciones inmunogénicas representativas incluyen, pero no se limitan a, RDLNALLPAVPSLGGGG (residuos de WT1 humano 6-22; NO DE ID DE SEC: 1), PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE (residuos de WT1 humano y de ratón 117-139; NOs DE ID DE SEC: 2 y 3 respectivamente), GATLKGVAAGSSSSVKWTE (residuos de WT1 humano 224-262; NO DE ID DE SEC: 4), GATLKGVAA (residuos de WT1 humano 244-252; NO DE ID DE SEC: 88), CMTW QM L (residuos de WT1 humano y de ratón 235-243; NOs DE ID DE SEC: 49 y 258 respectivamente), SCLESQPTI (residuos de WT1 de ratón 136-144; NO DE ID DE SEC: 296), SCLESQPAI (residuos de WT1 humano 136-144; NO DE ID DE SEC:198), NLYQMTSQL (residuos de WT1 humano y de ratón 225-233; NOs DE ID DE SEC: 147 y 284 respectivamente); ALLPAVSSL (residuos de WT1 de ratón 10-18; NO DE ID DE SEC: 255); RMFPNAPYL (residuos de WT1 humano y de ratón 126-134; NOs DE ID DE SEC: 185 y 293 respectivamente), VLDFAPPGA (residuos de WT1 humano 37-45; NO DE ID DE SEC: 241), o VLDFAPPGAS (residuos de WT1 humano 37-46; NO DE ID DE SEC: 41 1 ) . Se proporcionan en la presente porciones inm unogénicas adicionales , y otras pueden identificarse generalmente utilizando técnicas bien conocidas, tales como las resumidas en Paul , Fundamental Immunology, 3a ed . , 243-247 (Raven Press, 1 993) y las referencias citadas en la presente. Las técnicas representativas para identificar porciones inmunogénicas incluyen polipéptidos de examinación para conocer la capacidad de reacción con antisueros de antígeno específico y/o líneas de células T o clones. U na porción inmunogénica de un polipéptido de WT1 nativo es una porción que reacciona con tales antisueros y/o cél u las T a un nivel q ue no es substancialmente menor que la reactividad del WT1 de tamaño natural (por ejemplo, en una ELI SA y/o prueba de reactividad de células T). En otras palabras, puede hacerse reaccionar una porción inm unogénica en tales pruebas a un nivel que sea similar a o mayor que la reactividad del polipéptido de tamaño natural . Tales exam inaciones pueden realizarse generalmente utilizando métodos bien conocidos por aq uellos expertos en la materia, tales como los descritos en Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 988. Alternativamente , pueden identificarse porciones inmunogénicas utilizando análisis por computadora, tales como el prog rama Tsites (ver Rothbard y Taylor, EMBO J. 7:93- 1 00 , 1 988; Deavin et al. Mol. Immunol. 33: 145-155 , 1 996) , cuyas búsquedas de motivos de péptido que tienen el potencial de producir respuestas de Th 1 . Los péptidos de CTL con motivos apropiados para unirse a M HC de clase I o clase I I m urina y humana pueden identificarse de acuerdo con B I MAS (Parker et al. , J . Immunol. 52: 1 63, 1 994) y otros análisis de predicción de unión de péptido de HLA. Para confirm ar la inmunogenicidad, puede probarse un péptido utilizando un modelo de ratón transgénico H LA A2 y/o una prueba de estim ulación in vitro utilizando células dend ríticas , fibroblastos o células de sang re periférica. Como se observó con anterioridad, una composición puede comprender una variante de una proteína de WT1 nativo. Una "variante" de polipéptido , como se utiliza en la presente, es un polipéptido que difiere de un polipéptido nativo en una o más substituciones, eliminaciones, adiciones y/o inserciones, tales como q ue se retiene ia inmunogenicidad del polipéptido (es decir, la capacidad de la variante de reaccionar con antisueros de antígeno específico y/o líneas de células T o clones no disminuye substancialmente con relación al polipéptido nativo). En otras palabras, la capacidad de u na variante de reaccionar con antisueros de antígeno específico y/o l íneas de células T o clones puede acentuarse o permanecer sin cam bio , con relación al polipéptido nativo, o puede disminuir en menos de 50% , y preferentemente menos de 20%, con relación al polipéptido activo. Tales variantes pueden identificarse generalmente modificando una de las secuencias de polipéptidos anteriores y evaluando la reactividad del polipéptido modificado con antisueros y/o células T como se describe en la presente. Se ha descubierto q ue en el contexto de la presente invención , un número relativamente peq ueño de substituciones (por ejemplo, 1 a 3) en una porción inmunogén ica de un polipéptido de WT1 puede servir para acentuar la capacidad del polipéptido de producir una respuesta inmunológica. Las substituciones adecuadas pueden identificarse generalmente utilizando programas de computadora, como se describió con anterioridad, y el efecto confirmado con base en la reactividad del polipéptido modificado con antisueros y/o células T como se describe en la presente. De acuerdo con lo anterior, en algunas modalidades preferidas, un polipéptido de WT1 comprende una variante en la cual de 1 a 3 aminoácidos residen en una porción inmunogénica se substituyen de manera tal que la capacidad de hacerse reaccionar con antisueros de antígeno específico y/o líneas de células T o clones sea estadísticamente mayor que para el polipéptido no modificado. Tales substituciones se ubican preferentemente en un sitio de unión de MHC del polipéptido, el cual puede identificarse como se describió con anterioridad. Las substituciones preferidas permiten una unión creciente a las moléculas MHC clase I o clase I I. Algunas variantes contienen substituciones conservadoras. Una "substitución conservadora" es una en la cual se substituye un aminoácido por otro aminoácido que tenga propiedades similares, de manera tal que el experto en la materia de la química de péptidos esperaría que la estructura secundaria y naturaleza hidropática del polipéptido permaneciese substancialmente sin cambios. Las substituciones de aminoácido puede realizarse generalmente sobre la base de similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polar no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina, y valina; glicina y alanina; asparagina y glutamina; y serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Otros grupos de aminoácidos que pueden representar cambios conservadores incluyen: (1 ) ala, pro, gly, asp, gln , asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg , his; y (5) phe, tyr, trp, his. Una variante puede también, o alternativamente, contener cambios no conservadores. Las variantes pueden también (o alternativamente) modificarse, por ejemplo, por la eliminación o adición de aminoácidos que tengan una influencia mínima sobre la inmunogenicidad, estructura secundaria y naturaleza hidropática del polipéptido. En una modalidad preferida, se construye un polipéptido de variante del N-término de WT1 (aminoácidos 1 -249) , en el que el polipéptido de variante es capaz de unirse a un anticuerpo que reconoce el WT1 de tamaño natural y/o el polipéptido de N-término de WT1 . Un ejemplo no limitante de anticuerpo es un anticuerpo de WT1 WT1 80 (Santa Cruz Biotechnology, Inc. , Santa Cruz, CA). Como se observó anteriormente, los polipéptidos WT1 pueden conjugarse a una secuencia de señales (o líder) en el extremo N-terminal de la proteína que dirige de manera co-traducción o posttraducción la transferencia de la proteína. Un polipéptido puede también, o alternativamente, conjugarse a un enlazador u otra secuencia para facilidad de síntesis, purificación o identificación del polipéptido (por ejemplo, poli-His), o para acentuar la u nión del polipéptido a un soporte sólido. Por ejem plo, puede conjugarse un polipéptido en una región Fe de inm u noglobulina. Los polipéptidos de WT1 pueden prepararse utilizando cualquier variedad de técnicas bien conocidas. Los polipéptidos recombinantes codificados por un polinucleótido de WT1 como se describe en la presente pueden prepararse fácilmente a partir del polinucleótido. En general , puede emplearse cualquier variedad de vectores de expresión conocidos por aquellos expertos en la materia a fin de expresar los polipéptidos de WT1 recom binantes. La expresión puede alcanzarse en cualquier célula huésped apropiada que se haya transformado o transfectado con un vector de expresión que contenga una molécula de ADN q ue codifica un polipéptido recombinante. Las células huésped adecuadas incluyen células procarióticas, de levadura y eucarióticas superiores . Preferentemente, las células huésped em pleadas son E. coli, levadura o una l ínea celular mamífera tal como COS o CHO. Los sobrenadantes derivados de sistemas vectoriales/de huésped adecuados que seg regan proteína o polipéptido recom binante en el medio de cu ltivo pueden concentrarse primeramente utilizando un filtro comercialmente disponible. El concentrado puede aplicarse después a una matriz de purificación adecuada tal como una matriz de afinidad o una resina de intercam bio iónico . Finalmente, pueden emplearse una o más etapas de HPLC de fase inversa para purificar adicionalmente un polipéptido recombinante. Tales técnicas pueden utilizarse para preparar polipéptidos nativos o variantes de los mismos.

Por ejem plo, los polinucleótidos que codifican una variante de un polipéptido nativo pueden prepararse generalmente utilizando técnicas de mutagénesis convencionales, tales como mutagénesis de sitio específico dirig ida a oligonucleótidos, y pueden eliminarse secciones de ADN para permitir la preparación de polipéptidos truncados . Tam bién pueden generarse alg unas porciones y otras variantes por medios sintéticos , utilizando técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, pueden sintetizarse los polipéptidos que tienen menos de 500 am inoácidos, preferentemente menos de aproximadamente 1 00 aminoácidos, y más preferentemente menos de 50 aminoácidos. Los polipéptidos pueden sintetizarse utilizando cualquiera de las técn icas de fase sólida comercialmente disponibles, tales como el método de síntesis de fase sólida errifield, en el q ue los am inoácidos se ag regaron secuencialmente a una cadena de aminoácidos en desarrollo. Ver Merrifield , J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146, 1 963. El equipo para la síntesis autom atizada de polipéptidos se encuentra comercialmente disponible por proveedores tales como Applied BioSystems, Inc. (Foster City, CA) , y pueden operarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En general, los polipéptidos y polinucleótidos como se describe en la presente son aislados. Un polipéptido o polinucleótido "aislado" es uno q ue se elim ina de su am biente orig inal . Por ejemplo, una proteína de generación natural es aisladas si se separa de alguno o todos los materiales coexistentes en el sistema natural. Preferentemente, tales polipéptidos son al menos aproximadamente 90% puros , más preferentemente al menos aproximadamente 95% puros y muy preferentemente al menos aproximadamente 99% puros. U n polinucleótido se considera aislado si , por ejem plo, se clona en un vector que no sea parte del ambiente natural. En aspectos adicionales, la presente invención proporciona im itadores de los polipéptidos de WT1 . Tales im itadores pueden comprender am inoácidos enlazados a uno o más im itadores de aminoácido (es decir, pueden reemplazarse uno o más aminoácidos en la proteína de WT1 por un imitador de am inoácido) o pueden ser im itadores com pletamente no péptidos. Un im itador de aminoácido es un com puesto q ue es si milar de manera conform acional a un am inoácido de manera tal que puede substituirse por un am inoácido en un polipéptido de WT1 sin disminuir substancialmente la capacidad de reaccionar con antisueros de antígeno específico y/o líneas de células T o clones. Un im itador no péptido es un compuesto que no contiene aminoácidos, y q ue tiene una conformación general que es similar a un polipéptido de WT1 de manera tal q ue la capacidad del im itador de reaccionar con antisueros de antígeno específico y/o líneas de células T o clones no disminuye substancialmente con relación a la capacidad de un polipéptido de WT1 . Tales imitadores pueden diseñarse con base en técnicas convencionales (por ejemplo, resonancia magnética nuclear y técnicas com putacionales) q ue evalúan la estructura tridimensional de una secuencia de péptidos . Los imitadores pueden diseñarse donde se reemplacen una o más de las funcionalidades de cadena lateral del polipéptido de WT1 por grupos que no necesariamente tengan el mismo tamaño o volumen, pero que tienen propiedades químicas y/o físicas similares que producen respuestas biológicas similares. Debe comprenderse que, en las modalidades descritas en la presente, puede substituirse un imitador por un polipéptido de WT1 . En otras modalidades ilustrativas, un polipéptido puede ser un polipéptido de fusión que comprenda múltiples polipéptidos como se describe en la presente, o que comprende al menos un polipéptido como se describe en la presente y una secuencia no relacionada, tal como una proteína de tumor conocida. Por ejemplo, un socio de fusión puede ayudar a proporcionar epítopes auxiliares T (un socio de fusión inmunológico) , preferentemente epítopes auxiliares T reconocidos por seres humanos, o pueden ayudar a expresar la proteína (un acentuador de expresión) con rendimientos superiores que la proteína recombinante nativa. Algunos socios de fusión preferidos son los socios de fusión de acentuación tanto inmunológicos como de expresión. Otros socios de fusión pueden seleccionarse a fin de incrementar la solubilidad del polipéptido o para permitir que el polipéptido se seleccione como objetivo a compartimientos intracelulares deseados. Los socios de fusión aún adicionales incluyen etiquetas de afinidad, que facilitan la purificación del polipéptido. Los polipéptidos de fusión pueden prepararse generalmente utilizando técnicas convencionales, que incluyen conjugación química. Preferentemente, se expresa un polipéptido de fusión como polipéptido recombinante, permitiendo la producción de niveles crecientes, con relación a un polipéptido no fusionado, en un sistema de expresión. En resumen , las secuencias de ADN que codifican los componentes de polipéptido pueden ensamblarse separadamente, y ligarse a un vector de expresión apropiado . El extremo 3' de la secuencia de ADN que codifica un componente de polipéptido se l iga, con o sin un enlazador de péptidos, al extremo 5' de una secuencia de ADN que codifica el segundo componente de polipéptido de manera que las tramas de lectura de las secuencias se encuentren en fase. Esto perm ite la traducción en un solo polipéptido de fusión que mantiene la actividad biológica de ambos polipéptidos componentes. Puede emplearse una secuencia de enlazador de péptidos para separar los com ponentes de polipéptido primero y segundo por una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se doble en sus estructuras secundaria y terciaria . Tal secuencia de enlazador de péptidos se incorpora al polipéptido de fusión utilizando técnicas convencionales bien conocidas en la materia. Las secuencias adecuadas de enlazador de péptidos pueden seleccionarse con base en los sig uientes factores: (1 ) su capacidad de adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad de adoptar una estructura secu ndaria que pudiese i nteractuar con epítopes funcionales en los polipéptidos primero y segundo; y (3) la falta de residuos hidrofóbicos o cargados que pueden reaccionar con los epítopes funcionales de polipéptidos. Las secuencias preferidas de enlazador de péptidos contienen resid uos de Gly, Asn y Ser. Otros am inoácidos neutrales cercanos, tales como Thr y Ala pueden utilizarse también en la secuencia enlazadora. Las secuencias de aminoácidos q ue pueden emplearse útilmente como enlazadores, incluyen aquellos descritos en Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986; la Patente de E.U. No. 4,935,233 y la Patente de E.U. No. 4,751,180. La secuencia de enlazador puede ser generalmente desde 1 hasta aproximadamente 50 aminoácidos de largo. Las secuencias de enlazador no se requieren cuando los polipéptidos primero y segundo tienen regiones de aminoácidos N-terminales no esenciales que pueden utilizarse para separar los dominios funcionales y evitar interferencia estérica. Las secuencias de ADN ligadas se enlazan operablemente a elementos reguladores adecuados de transcripción o de traducción. Los elementos reguladores responsables de la expresión de ADN se encuentran ubicados solamente 5' a la secuencia de ADN que codifica los primeros polipéptidos. De manera similar, los codones de paro requeridos para terminar las señales de terminación de traducción y transcripción se encuentran presentes solamente 3' a la secuencia de ADN que codifica el segundo polipéptido. El polipéptido de fusión puede comprender un polipéptido como se describe en la presente junto con una proteína inmunogénica no relacionada, tal como una proteína inmunogénica capaz de producir una respuesta de memoria. Los ejemplos de tales proteínas incluyen proteínas de tétanos, tuberculosis y hepatitis {ver, por ejemplo, Stoute et al., New Engl. J. Meó., 336:86-91, 1997). En una modalidad preferida, el socio de fusión inmunológica se deriva de un Mycobacterium sp., tal como un fragmento Ra12 derivado de la Mycobacterium tuberculosis. Las composiciones y métodos de Ra12 para su uso para acentuar la expresión e/o inmunogenicidad de secuencias de polinucleótido/polipéptido heterólogas se describen en la Solicitud de Patente de E.U. 60/158,585, cuya descripción se incorpora para referencia en su totalidad. En resumen, Ra12 se refiere a una región de polinucleótido que es una subsecuencia de un ácido nucléico TB32A Mycobacterium tuberculosis. MTB32A es una protasa de serina de peso molecular de 32KD codificada por un gen en cepas virulentas y no virulentas de M. tuberculosis. La secuencia de nucleotidos y la secuencia de aminoácidos de MTB32A se han descrito (por ejemplo, Solicitud de Patente de E.U. No. 60/158,858; ver también, Skeiky et al., Infection and Immun. (1999) 67:3998-4007, incorporada en la presente para referencia). Los fragmentos C-terminales de la secuencia de codificación MTB32A se expresan a niveles altos y permanecen como polipéptidos solubles a través del proceso de purificación. Además, Ra12 puede acentuar la inmunogenicidad de los polipéptidos inmunogénicos heterólogos con la que se fusiona. Un polipéptido de fusión Ra12 preferida comprende un fragmento C-terminal de 14KD correspondiente a los residuos de aminoácidos 192 a 323 de MTB32A. Otros polinucleótidos Ra12 preferidos comprenden generalmente al menos aproximadamente 15 nucleotidos consecutivos, al menos aproximadamente 30 nucleotidos, al menos aproximadamente 60 nucleotidos, al menos aproximadamente 100 nucleotidos, al menos aproximadamente 200 nucleotidos, o al menos aproximadamente 300 nucleotidos que codifican una porción de un polipéptido Ra12. Los polinucleótidos Ra 12 pueden com prender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica un polipéptido Ra1 2 o una porción del mismo) o puede com prender una variante de tal secuencia. Las variantes de polinucleótido Ra 1 2 pueden contener una o más substituciones, adiciones , eliminaciones e/o inserciones de manera tal q ue la actividad biológica del polipéptido de fusión codificado no disminuye substancialmente, con relación a un polipéptido de fusión que com prende un polipéptido Ra12 nativo . Las variantes exhiben preferentemente al menos una identidad de aproximadamente 70% , más preferentemente una identidad de al menos 80% , y muy preferentemente al menos una identidad de al menos aproximadamente 90% a una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido Ra12 nativo o una porción del mismo . En otras modalidades preferidas, un socio de fusión in munológico se deriva de la proteína D, una proteína de superficie de la bacteria Haemophilus influenza B (WO 91 /1 8926) gram-negativo. Preferentemente, un derivado de la proteína D comprende aproximadamente el primer tercio de la proteína (por ejemplo, los primeros 100-1 1 0 am inoácidos N-terminales) , y puede lipidarse un derivado de proteína D. En algunas modalidades preferidas, los primeros 1 09 residuos de un socio de fusión de Lipoproteína D se incluyen en el N-término para proporcionar el polipéptido con epítopes adicionales de células T exógenas y para incrementar el nivel de expresión en E. coli (funcionando as í como un acentuador de expresión) . La cola de lípidos asegura una presentación óptima del antígeno a la células que presentan antígeno . Otros socios de fusión incluyen la proteína no estructu ral del virus de la infl uenza , NS 1 (hemaglutinina) . Típicamente, se utilizan los 81 aminoácidos N-term inales, aunque pueden utilizarse fragmentos diferentes que incluyen epítopes auxiliares T. En otra modalidad, el socio de fusión inmunológico es la proteína conocida como LYTA, o una porción de la misma (preferentemente una porción C-terminal) . LYTA se deriva del Streptococcus pneumoniae, el cual sintetiza una amidasa de N-acetil-L-alanina conocida com o am idasa de LYTA (codificada por el gen LytA; Gene 43: 265-292 , 1 986) . LYTA es una autolisina q ue degrada específicamente algu nos enlaces en la estructura principal de peptidog licano . El dominio C-terminal de la proteína LYTA es responsable de la afinidad hacia la colina o hacia algunos análogos de colina tales como DEAE. Esta propiedad se ha explotado para el desarrollo de E. coli C-LYTA que expresa plásmidos útiles para la expresión de proteínas de fusión . Se ha descrito la purificación de proteínas h íbridas con contenido del frag mento C-LYTA en el térm ino am ino (ver Biotechnology 70: 795-798, 1 992) . En una modalidad preferida , puede incorporarse u na porción de repetición de LYTA en un polipéptido de fusión. Una porción de repetición se encuentra en la región C-term inal que com ienza en el residuo 1 78. Una porción de repetición particularmente preferida incorpora los residuos 188-305. Aún otra modalidad ilustrativa implica polipéptidos de fusión, y los polinucleótidos que los codifican, en los que el socio de fusión comprende una señal objetivo capaz de dirigir un polipéptido al compartimiento endosom al/lisosomal , como se describe en la Patente de E. U . No. 5,633, 234. Un polipéptido inmu nogénico de la invención , cuando se fusiona con esta señal objetivo, se asociará más eficazmente con las moléculas MHC de clase I I y proporcionará así una estimulación in vivo acentuada de célu las T CD4+ específica para el polipéptido. La invención proporciona formas truncadas de polipéptidos de WT1 que pueden expresarse recombinantemente en E. coli sin la adición de un socio de fusión. Los ejemplos de estas formas truncadas se muestran en los NOs DE I D DE SEC: 342-346, y se codifican por los polinucleótidos mostrados en el NOs DE I D DE SEC: 337-341 . En las variaciones de estos truncamientos, los primeros 76 aminoácidos de WT1 pueden fusionarse al C-término de la proteína, creando una proteína recom binante que es más fácil de expresarse en E. coli. También pueden utilizarse otros huéspedes además de E. coli, tales como, por ejem plo , B, megaterium. La proteína puede prepararse adicional mente sin una etiqueta de histidina. En otras modalidades, pueden elaborarse diferentes subunidades y fusionarse conjuntamente en un orden que difiera del WT1 nativo. Además, las fusiones pueden elaborarse, por ejem plo, con Ra12. Las proteínas de fusión ejem plares se muestran en los NOs DE I D DE SEC:332-336 y pueden codificarse por los polinucleótidos mostrados en los NOs DE I D DE SEC: 327-331 .

Polinucleótidos de WT1 Cualquier polinucleótido que codifica un polipéptido de WT1 como se describe en la presente es un polinucleótido de WT1 contemplado por la presente invención. Tales polinucleótidos pueden ser de cepa sencilla (codificación o antidetección) o de doble cepa, y pueden ser moléculas de ADN (genómicas, cADN o sintéticas) o ARN . Las secuencias adicionales de codificación o de no codificación pueden, pero no necesitan, estar presentes en un polinucleótido de la presente invención, y un polinucleótido puede, pero no necesita, enlazarse a otras moléculas y/o materiales de apoyo. Los polinucleótidos de WT1 pueden codificar una proteína de Wt1 nativo, o pueden codificar una variante de WT1 como se describió con anterioridad. Las variantes de polinucleótido pueden contener una o más substituciones, adiciones, eliminaciones y/o inserciones de manera tal que la inmunogenicidad del polipéptido codificado no disminuye, con relación a una proteína de WT1 nativo. El efecto en la inmunogenicidad del polipéptido codificado puede evaluarse generalmente como se describió con anterioridad. Las variantes preferidas contienen substituciones de nucleótido, eliminaciones, inserciones y/o adiciones en no más del 20%, preferentemente a no más del 10%, de las posiciones de nucleótido que codifican una porción inmunogénica de una secuencia de WT1 nativo. Algunas variantes son substancialmente homologas a un gen nativo, o una porción del mismo. Tales variantes de polinucleótido son capaces de hibridizarse bajo condiciones moderadamente severas a una secuencia de ADN de generación natural que codifica un polipéptido de WT1 (o una secuencia complementaria). Las condiciones adecuadas moderadamente severas incluyen el preenjuague en una solución de 5 X SSC, SDS al 0.5%, 1 .0 mM de EDTA (pH 8.0); hibridizar a 50°C-65°C, 5X SSC, durante toda la noche; seguido de enjuague dos veces a 65°C durante 20 minutos con cada 2X, 0.5X y 0.2X SSC con contenido de SDS al 0.1 %). Tales secuencias de ADN hibridizantes se encuentran también dentro del alcance de esta invención. El experto en la materia apreciará que, como resultado de la degeneración del código genético, existen muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido de WT1. Algunos de estos polipéptidos soportan una homología mínima a la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. Sin embargo, los polinucleótidos que varían debido a las diferencias en el uso de un codón se contemplan específicamente por la presente invención. Una vez que se identifica una porción inmunogénica de WT1 , como se describió con anterioridad, puede prepararse un polinucleótido de WT1 utilizando cualquier variedad de técnicas. Por ejemplo, puede amplificarse un polinucleótido de WT1 a partir de cADN preparado de células de expresión de WT1 . Tales polinucleótidos pueden amplificarse a través de una reacción de cadena de polimerasa (PCR). Para este planteamiento, pueden diseñarse los imprimadores de secuencia específica con base en la secuencia de la porción inmunogénica y pueden adquirirse o sintetizarse. Por ejemplo, los imprimadores adecuados para la amplificación de PCR de un gen de WT1 humano incluyen: primera etapa - P118:1434-1414: 5' GAG AGT CAG ACT TGA AAG CAGT 3' (NO DE ID DE SEC: 5) y P135: 5' CTG AGC CTC AGC AAA TGG GC 3' (NO DE ID DE SEC: 6); segunda etapa -P 136: 5' GAG CAT GCA TGG GCT CCG ACG TGC GGG 3' (NO DE ID DE SEC: 7) y P137: 5' GGG GTA CCC ACT GAA CGG TCC CCG A 3' (NO DE ID DE SEC: 8). Los imprimadores para la amplificación de PCR de un gen de WT1 de ratón incluyen: primera etapa - P138: 5' TCC GAG CCG CAC CTC ATG 3' (NO DE ID DE SEC: 9) y P139: 5' GCC TGG GAT GCT GGA CTG 3' (NO DE ID DE SEC: 10), segunda etapa - P140: 5' GAG CAT GCG ATG GGT TCC GAC GTG CGG 3' (NO DE ID DE SEC: 11) y P141: 5' GGG GTA CCT CAA AGC GCC ACG TGG AGT TT 3' (NO DE ID DE SEC: 12). Después puede utilizarse una porción amplificada para aislar un gen de tamaño natural de una biblioteca de ADN genómico humano o de una biblioteca de cADN adecuado, utilizando técnicas bien conocidas. Alternativamente, puede construirse un gen de tamaño natural a partir de múltiples fragmentos de PCR. También pueden prepararse polinucleótidos de WT1 al sintetizar los componentes oligonucleótidos, y ligar conjuntamente los componentes para generar el polinucleótido completo. También pueden sintetizarse los polinucleótidos de WT1 por cualquier método conocido en la materia, incluyendo la síntesis química (por ejemplo, síntesis química de fosforamidita de fase sólida). Las modificaciones en una secuencia de polinucleótidos pueden introducirse también utilizando técnicas de mutagénesis convencionales, tales como mutagénesis de sitio específico dirigida al oligon ucleótido (ver, Adelman et al. , DNA 2: 1 83 , 1983). Alternativamente, las moléculas de ARN pueden generarse por la transcripción in vitro o in vivo de secuencias de ADN que codifican un polipéptido de WT1 , siempre y cuando el ADN se encuentre incorporado en un vector con un mejorador adecuado de polimerasa de ARN (tal como T7 o SP6) . Pueden utilizarse alg unas porciones para preparar un polipéptido codificado , como se describe en la presente. Además, o alternativamente, puede administrársele una porción a un paciente de manera tal q ue el polipéptido codificado se genera in vivo [por ejemplo, transfectando las células q ue presentan antígeno tales como las células dendríticas con una construcción de cADN que codifican un polipéptido de WT1 , y administrándole al paciente las células transfectadas) . Los polinucleótidos que codifican un polipéptido de WT1 pueden utilizarse generalmente para la producción del polipéptido, in vitro o in vivo. Los polinucleótidos de VVT1 que son com plementarios a una secuencia de codificación (es decir, polinucleótidos de antidetección) pueden utilizarse también como sonda o para inhibir la expresión de WT1 . Las construcciones de cADN que pueden transcribirse en ARN de antidetección pueden introducirse también en células de tejidos para facilitar la producción de ARN de antidetección. Cualq uier polinucleótido puede modificarse adicionalmente para incrementar la estabilidad in vivo. Las posibles m odificaciones incluyen, pero no se limitan a, la adición de secuencias distintivas en los extremos 5' y/o 3'; el uso de fosforotioato o 2' O-metilo en lugar de enlaces de fosfodiesterasa en la estructura principal; y/o la inclusión de bases no tradicionales tales como inosina, queosina y wibutosina, así como también acetilo-, metilo-, tío- y otras formas modificadas de adenina, citidina, guanina, timina y uridina. Las secuencias de nucleótidos como se describen en la presente pueden unirse a una variedad de otras secuencias de nucleótidos que utilizan técnicas establecidas de ADN recombinante. Por ejemplo, puede clonarse un polinucleótido en cualquier variedad de vectores de clonación, incluyendo plásmidos, fagémidos, derivados de lambda fagos y cósmidos. Los vectores de interés particular incluyen vectores de expresión , vectores de réplica, vectores de generación de sondas. En general, un vector contendrá un origen de réplica funcional en al menos un organismo, sitios de endonucleasa de restricción conveniente y uno o más marcadores seleccionares. Otros elementos dependerán del uso deseado, y serán aparentes para aquellos expertos en la materia. En algunas modalidades, pueden formularse polinucleótidos a fin de permitir la entrada en una célula de un mamífero, y la expresión del mismo. Tales formulaciones son particularmente útiles para propósitos terapéuticos, como se describe a continuación. Aquellos expertos en la materia apreciarán que existen muchas maneras de lograr la expresión de un polinucleótido en una célula objetivo, y puede emplearse cualquier método adecuado. Por ejemplo, puede incorporarse un polinucleótido en un vector viral tal como, pero no se limita a, adenovirus, virus adeno-asociado, retrovirus, o vacunas u otros virus de viruela (por ejemplo, virus de la viruela aviar) . Las técnicas para incorporar ADN en tales vectores son conocidos por aquellos expertos en la materia. U n vector retroviral puede transferir adicionalmente o incorporar un gen para un marcador seleccionable (a fin de ayudar en la identificación o selección de células transducidas) y/o un residuo objetivo, tal com o un gen q ue codifica un ligante para u n receptor o una célula objetivo específico , para volver al vector de objetivo específico. Seleccionar como objetivo tam bién puede realizarse utilizando un anticuerpo, por métodos conocidos por los expertos en la materia. Las construcciones de cADN en tal vector pueden utilizarse, por ejemplo, para transfectar líneas celulares humanas o animales para su uso en el establecimiento de modelos de tumor positivo a WT1 que pueden utilizarse para realizar protección contra tumores y experimentos de inm unoterapia adoptiva para demostrar inhibió de desarrollo tumoral o de leucemia o la lisis de tales cél ulas . Otras form ulaciones terapéuticas para los polin ucleótidos incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, cuentas, y sistemas basados en l ípidos que incluyen em ulsiones de aceite en ag ua, colonias micelares, colonias micelares mezcladas, y liposomas. Un sistema coloidal preferido para su uso como vehículo de suministro in vitro e in vivo es un liposoma (es decir, una vesícula de membrana artificial). La preparación y uso de tales sistemas es bien conocido en la materia.

Anticuerpos y Fragmentos de los mismos La presente invención proporciona además agentes de unión, tales como anticuerpos y fragmentos de unión de antígeno de los mismos, que se unen específicamente a un polipéptido de WT1 . Como se utiliza en la presente, se dice que un agente se "une específicamente" a un polipéptido de WT1 si reacciona en un nivel detectable (por ejemplo, en una ELISA) con un polipéptido de WT1 , y no reacciona detectablemente con proteínas no relacionadas bajo condiciones similares. Como se utiliza en la presente, "unión" se refiere a una asociación no covalente entre dos moléculas separadas de manera tal que se forma un "complejo". La capacidad de unirse puede evaluarse, por ejemplo, al determinar una constante de unión para la formación del complejo. La constante de unión es el valor obtenido cuando se divide la concentración del complejo por el producto de las concentraciones componentes. En general, se dice que dos compuestos "se unen", en el contexto de la presente invención, cuando la constante de unión para la formación del complejo excede aproximadamente 103 L/mol. La constante de unión puede determinarse utilizando métodos bien conocidos en la materia. Cualquier agente que satisfaga los requisitos anteriores puede ser un agente de unión. En una modalidad preferida, un agente de unión es un anticuerpo o un fragmento de unión de antígeno del mismo. Algunos anticuerpos se encuentran comercialmente disponibles, por ejemplo, por Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Alternativamente, pueden prepararse anticuerpos por cualquier variedad de técnicas conocidas por aquellos expertos en la materia. Ver, por ejemplo, Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1 998. En general , los anticuerpos pueden producirse por técnicas de cultivo celular, q ue incluyen la generación de anticuerpos m onoclonales como se describe en la presente, o a través de la infección de genes de anticuerpos en huéspedes bacterianos adecuados o de cél ulas m am íferas, con objeto de perm itir la producción de anticuerpos recombinantes. En una técnica , un inm unogen que comprende el polipéptido se inyecta inicialmente en una g ran variedad de mam íferos (por ejemplo, ratones, ratas , conejos, ovejas o cabras). En esta etapa, los polipéptidos de esta invención pueden servir como el inmunogen sin modificación . Alternativamente , particularmente para los polipéptidos relativamente cortos, puede producirse una respuesta inmunológica superior si el polipéptido se une a una proteína portadora, tal como albúmina de suero bovino o hemocianina de lapa de Keyhole. Se inyecta el inm unogen en el h uésped animal , preferentemente de acuerdo con un program a predeterminado q ue incorpora una o más inmunizaciones de refuerzo , y se sangran los animales periódicamente. Los anticuerpos policlonales específicos para el polipéptido pueden purificarse después a partir de tales antisueros, por ejem plo, por cromatog rafía de afinidad utilizando el polipéptido acoplado a un soporte sólido adecuado. Los anticuerpos monoclonales específicos para el polipéptido antigénico de interés puede prepararse, por ejem plo, utilizando la técnica de Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6:51 1 -519, 1 976, y mejoras a la misma . En resumen , estos métodos im plican la preparación de líneas celulares inm ortales capaces de producir anticuerpos q ue tienen la especificidad deseada (es decir, reactividad con el polipéptido de interés) . Tales líneas celulares pueden producirse, por ejemplo, a partir de células de bazo obtenidas de un animal i nmunizado como se describió con anterioridad . Las células de bazo se inmortalizan después, por ejemplo, por fusión con un socio de fusión de célula de mieloma , preferentemente uno que sea singenético con el animal inmunizado. Puede emplearse una variedad de técnicas de fusión . Por ejemplo, las células de bazo y células de mieloma pueden combinarse con un detergente no iónico durante unos cuantos m inutos y colocarse en placas después a una densidad baja en un medio selectivo que soporte el desarrollo de células híbridas, pero no de células de mieloma . Una técnica de selección preferida utiliza selección de HAT (hipoxantina, am inopterina , timidina). Después de un tiem po suficiente, generalmente alrededor de 1 a 2 semanas , se observan colonias de híbridos. Se seleccionan colonias sencillas y sus sobrenadantes de cultivo probaron su actividad de unión contra el polipéptido. Se prefieren los h ibridomas que tienen una alta reactividad y especificidad. Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse a partir de los sobrenadantes de colonias de hibridoma en desarrollo. Además, pueden emplearse diversas técnicas para mejorar el rendimiento, tal como inyección de la línea celular de hibridoma en la cavidad peritoneal de un huésped vertebrado adecuado, tal como un ratón . Los anticuerpos monoclonales pueden cosecharse después a partir del fluido de ascitis o la sangre. Los contam inantes pueden eliminarse de los anticuerpos por técnicas convencionales , tales como cromatografía, filtración de gel, precipitación, y extracción . Los polipéptidos de esta invención pueden utilizarse en el proceso de purificación , por ejemplo, en una etapa de cromatografía de afinidad . En alg unas m odalidades, puede preferirse el uso de fragmentos de unión de antígeno de anticuerpos. Tales fragmentos incluyen fragmentos de Fab, los cuales pueden prepararse utilizando técnicas convencionales. En resumen, las inmunoglobulinas pueden purificarse a partir de suero de conejo por crom atografía de afinidad en colum nas de cuentas de Proteína A (Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1 988) y se digieren por papaína para entregar fragmentos de Fab y Fe. Los frag mentos de Fab y Fe pueden separarse por cromatog rafía de afinidad en la columnas de cuentas de proteína A. Los anticuerpos monoclonales y fragmentos de los mismos pueden acoplarse a uno o más agentes terapéuticos. Los agentes adecuados a este respecto i ncluyen agentes radioactivos y quim ioterapéuticos, los cuales pueden utilizarse, por ejemplo, para purgar méd ula ósea autóloga in vitro) . Los agentes terapéuticos representativos incluyen radionúclidos, inductores de diferenciación, drogas , toxinas, y derivados de los mismos. Los radionúclidos preferidos incluyen 90Y, 23l , 25l , 131 l , 186Re, 1 88Re, 21 1At, y 21 2Bi. Las drogas preferidas incl uyen análogos de metotrexato, y pirimldina y purina. Los inductores de diferenciación preferidos incluyen ésteres de forbol y ácido butírico. Las toxinas preferidas incluyen ricino, abrina, toxina de difteria , toxina de cólera, gelonina, exotoxina de Pseudomonas , toxina de Shigella, y proteína antiviral pokeweed . Para propósitos de diag nóstico, puede utilizarse acoplamiento de agentes radioactivos a fin de facilitar el rastreo de metástasis o para determinar la ubicación de tumores positivos a WT1 . Un agente terapéutico puede acoplarse (por ejemplo, unido covalentemente) a un anticuerpo monoclonal adecuado sea directamente o indirectamente (por ejemplo, a través de un grupo enlazador) . Una reacción directa entre un agente y un anticuerpo es posible cuando cada uno posee un substituto capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un g rupo n ucleofílicc , tal como un g rupo amino o sulf idrilo, en uno puede ser capaz de reaccionar con un grupo con contenido de carbonilo, tal como un anh ídrido o un haluro ácido, o con un grupo alq uilo q ue contenga un buen grupo residual (por ejemplo, un haluro) en el otro. Alternativamente, puede ser deseable acoplar un agente terapéutico y un anticuerpo a través de un grupo enlazador. Un grupo enlazador puede funcionar como u n espaciador para distanciar un anticuerpo de un agente con objeto de evitar la interferencia con capacidades de unión. Un grupo enlazador puede servir también para incrementar la reactividad quím ica de un substituto en un agente o un anticuerpo , e incrementar así la eficacia de acoplamiento. Un incremento en la reactividad química puede facilitar tam bién el uso de agentes , o grupos funcionales en agentes, los cual no sería posible de otra manera.

Será evidente para aquellos expertos en la materia que una variedad de agentes reactivos bifuncionales o polifuncionales, tanto homo como hetero funcionales (tales como aquellos descritos en el catálogo de la Pierce Chemical Co., Rockford, IL), pueden emplearse como el grupo enlazador. El acoplamiento puede realizarse, por ejemplo, a través de grupos amino, grupos carbóxilo, grupos sulfhidrilo o residuos de carbohidrato oxidados. Existen numerosas referencias que describen tal metodología, por ejemplo, Patente de E.U. No. 4,671,958, para Rodwell, et al. Donde un agente terapéutico es más potente cuando se encuentra en forma libre la porción de anticuerpo de los inmunoconjugados de la presente invención, puede ser deseable utilizar un grupo enlazador que sea segmentable durante o después de la internalización en una célula. Se ha descrito un número de diferentes grupos enlazadores segmentables. Los mecanismos para la liberación intracelular de un agente de estos grupos enlazadores incluyen segmentación por reducción de un enlace de bisulfuro {por ejemplo, Patente de E.U. No. 4,489,710, para Spitler), por la irradiación de un enlace fotolábil (por ejemplo, la Patente de E.U. No. 4,625,014, para Senter et al.), por hidrólisis de cadenas laterales de aminoácidos derivados {por ejemplo, la Patente de E.U. No. 4,638,045, para Kohn, et al.), por hidrólisis mediada con complemento de suero {por ejemplo, la Patente de E.U. No. 4,671,958, para Rodwell et al.), e hidrólisis catalizada con ácido {por ejemplo, la Patente de E.U. No. 4,569,789, para Blattler et ai.).

Puede ser deseable acoplar más de un agente a un anticuerpo. En una modalidad, las moléculas múltiples de un agente se acoplan a una molécula de anticuerpo. En otra modalidad, puede acoplarse más de un tipo de agente a un anticuerpo. Independientemente de la modalidad particular, pueden prepararse inmunoconjugados con más de un agente en una variedad de maneras. Por ejemplo, puede acoplarse más de un agente directamente a una molécula de anticuerpo, o pueden utilizarse enlazadores que proporcionan múltiples sitios para la unión. Alternativamente, puede utilizarse un portador. Un portador puede soportar los agentes en una variedad de maneras, incluyendo la unión covalente sea directamente o a través de un grupo enlazador. Los portadores adecuados incluyen proteínas tales como albúminas (por ejemplo, la Patente de E.U. No. 4,507,234, para ato et al.), péptidos y polisacáridos tales como aminodextrano (por ejemplo, la Patente de E.U. No. 4,699,784, para Shih et al.). Un portador también puede soportar un agente por unión no covalente o por encapsulación, tal como en una vesícula liposomal (por ejemplo, la Patente de E.U. Nos. 4,429,008 y 4,873,088). Los portadores específicos para agentes de radionúclidos incluyen pequeñas moléculas radiohalogenadas y compuestos quelantes. Por ejemplo, la Patente de E.U. No. 4,735,792 describe pequeñas moléculas radiohalogenadas representativas y su síntesis. Un quelante de radionúclido puede formarse a partir de compuestos quelantes que incluyen aquellos con contenido de átomos de nitrógeno y azufre como átomos donadores para unir el metal, óxido metálico, radionúclido. Por ejemplo, la Patente de E.U. No. 4,673,562, para Davlson et al. describe compuestos quelantes representativos y su síntesis. Puede utilizarse una variedad de rutas de administración para los anticuerpos e inmunoconjugados. Típicamente, la administración será intravenosa, intramuscular, subcutánea o en el lecho de un tumor resecado. Será evidente que la dosis precisa del anticuerpo/inmunoconjugado variará dependiendo del anticuerpo utilizado, la densidad de antígeno en el tumor, y la tasa de despeje del anticuerpo. También proporcionados en la presente se encuentran los anticuerpos anti-idiotípicos que imitan una porción inmunogénica de WT1. Tales anticuerpos pueden surgir contra un anticuerpo, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, que se une específicamente a una porción inmunogénica de WT1, utilizando técnicas bien conocidas. Los anticuerpos anti-idiotípicas que imitan una porción inmunogénica de WT1 son esos anticuerpos que se unen a un anticuerpo, o fragmento de unión de antígeno del mismo, que se une específicamente a una porción inmunogénica de WT1, como se describe en la presente.

Células T Las composiciones inmunoterapéuticas pueden también, o alternativamente, comprender células T específicas para WT1. Tales células pueden prepararse generalmente in vitro o ex vivo, utilizando procedimientos convencionales. Por ejemplo, las células T pueden estar presentes en (o aislarse de) la médula ósea, sangre periférica o un fragmento de médula ósea de la sangre periférica de un mamífero, tal como un paciente, que utiliza un sistema de separación celular comercialmente disponible, tal como el sistema CEPRATE™, disponible por CellPro Inc., Bothell WA (ver también la Patente de E.U. No. 5,240,856; la Patente de E.U. No. 5,215,926; WO 89/06280; WO 91/16116 y WO 92/07243). Alternativamente, las células T pueden derivarse de seres humanos relacionados o no relacionados, animales no humanos, líneas celulares o cultivos. Las células T pueden estimularse con polipéptido de WT1, polinucleótido que codifica un polipéptido de WT1 y/o una célula de presentación de antígeno (APC) que expresa un polipéptido de WT1. Tal estimulación se realiza bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la generación de células T que son específicas para el polipéptido de WT1. Preferentemente, un polipéptido o polinucleótido de WT1 se encuentra presente en un vehículo de suministro, tal como una microesfera, para facilitar la generación de células T de antígeno específico. En resumen, las células T que pueden aislarse a partir de un paciente o un donador relacionado o no relacionado por técnicas rutinarias (tal como por centrifugación de gradiente de densidad Ficoll/Hypaque de los linfocitos de sangre periférica), se incuban con el polipéptido de WT1. Por ejemplo, las células T pueden incubarse in vltro durante 2-9 días (típicamente 4 días) a 37°C con polipéptido de WT1 (por ejemplo, 5 a 25 pg/ml) o células que sintetizan una cantidad comparable de polipéptido de WT1. Puede ser deseable incubar un alícuota separado de una muestra de células T en ausencia de polipéptido de WT1 para servir como control. Las células T se consideran específicas para un polipéptido de WT1 si las células T matan células objetivo recubiertas con un polipéptido de WT1 o que expresan un gen que codifica tal polipéptido. La especificidad de células T puede evaluarse utilizando cualquier variedad de técnicas convencionales. Por ejemplo, en una prueba de liberación de cromo o prueba de proliferación, un índice de estimulación con un aumento de más del doble en lisis y/o proliferación, en comparación con los controles negativos, indica la especificidad de las células T. Tales pruebas pueden realizarse, por ejemplo, como se describe en Chen et al., Cáncer Res. 54:1065-1070, 1994. Alternativamente, la detección de la proliferación de células T puede llevarse a cabo por una variedad de técnicas conocidas. Por ejemplo, la proliferación de células T puede detectarse midiendo una tasa creciente de síntesis de ADN (por ejemplo, por cultivos de etiquetación de impulsos de células T con timidina tritiada y midiendo la cantidad de timidina tritiada incorporada en ADN). Otras maneras de detectar la proliferación de células T incluyen medir los incrementos en la producción de interleuquina-2 (IL-2), flujo de Ca2+, o toma de tinta, tal como 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio. Alternativamente, puede medirse la síntesis de linfoquinas (tales como interferón-gamma) o puede cuantificarse el número relativo de células T que pueden responder a un polipéptido de WT1. El contacto con un polipéptido de WT1 (200 ng/ml - 100 pg/ml, preferentemente 100 ng/ml - 25 g ml) durante 3-7 días debe dar como resultado al menos un incremento del doble en la proliferación de las células T y/o contacto como se describió con anterioridad durante 2-3 horas debe dar como resultado la activación de las células T, se m ide utilizando pruebas de citoquina convencionales en las cuales un incremento del doble en el n ivel de liberación de citoq ui na (por ejemplo, TN F o I FN-?) es indicativo de la activación de células T (ver Coligan et al . , Current Protocols in I mm unology, vol . 1 , Wiley I nterscience (Greene 1 998) . Las células T de WT1 específico pueden expandirse utilizando técnicas convencionales. En modalidades preferidas , las células T se derivan de un paciente o donador relacionado o no relacionado y se le administran al paciente después de la estim ulación y expansión. Las célu las T que se han identificado en respuesta a un polipéptido de WT1 , polinucleótido o APC de expresión de WT 1 pueden ser CD4+ y/o CD/8+. La activación específica de C D4+ o CD/8+ puede detectarse en una variedad de maneras. Los métodos para detectar la activación de células T específicas incluyen detectar la proliferación de células T, la producción de citoquinas (por ejemplo, linfoq uinas), o la generación de actividad citolítica (es decir, generación de células T citotóxicas específicas para WT1 ). Para las células T CD4+, un método preferido para detectar la activación de células T específica es la detección de la proliferación de célu las T. Para las células T CD8+, un método preferido para detectar la activación de cél ulas T específica es la detección de la generación de actividad citolítica . Para propósitos terapéuticos, las células T CD4+ o CD8+ que proliferan en respuesta al polipéptido de WT1 , polinucleótido o APC puede expandirse en nú mero sea in vitro o in vivo. La proliferación de tales células T in vitro puede realizarse en u na variedad de maneras. Por ejemplo, las células T pueden volverse a exponer al polipéptido de WT1 , con o sin la adición de factores de desarrollo de células T, tal como la interleuquina 2, y/o células estimuladoras que sintetizan un polipéptido de WT1 . Se prefiere la adición de células estim uladoras cuando se generan respuestas de células T CD8\ Las células T pueden desarrollarse en grandes nú meros in vitro con la retención de especificidad en respuesta a la reestimulación interm itente con el polipéptido de WT1 . En resumen, para la estimulación in vitro primaria (IVS), pueden colocarse grandes números de linfocitos (por ejemplo, más de 4* 1 07) en frascos con medios con contenido de suero humano. El polipéptido de WT1 (por ejemplo, péptido a 1 0 pg/m l) puede agregarse directamente , junto con toxoide de tétanos (por ejemplo, 5 pg/ml) . Los frascos pueden incubarse después (por ejemplo, 37°C durante 7 d ías) . Durante una segunda IVS , las células T se cosechan después y se colocan en nuevos frascos con 2-3* 1 07 de células mononucleares de sangre periférica irradiadas . El polipéptido de WT1 (por ejemplo, 1 0 g/ml) se agrega directamente. Los frascos se incuban a 37°C durante 7 días. El día 2 y el día 4 después de la seg unda IVS , pueden agregarse 2-5 unidades de interleuquina-2 (I L-2) . Para una tercera IVS, las células T pueden colocarse en cavidades y estimularse con las propias células B del paciente transformadas con EBV recubiertas con el péptido. Puede agregarse I L-2 los días 2 y 4 de cada ciclo. Tan pronto las células muestran ser células T citotóxicas específicas, pueden expandirse utilizando un ciclo de estimulación de 10 días con I L-20 superior (20 unidades) los días 2, 4 y 6. Alternativamente, pueden expandirse en número una o más células T que proliferan en presencia del polipéptido de WT1 mediante clonación. Los métodos para clonar células son bien conocidos en la materia, e incluyen dilución limitante. Las células T contestadoras pueden purificarse a partir de la sangre periférica de pacientes sensibilizados por centrifugación de gradiente de densidad y rosetas de células rojas de borrego y establecerse en cultivo por la estimulación con e! antígeno nominal en presencia de células de relleno autólogas irradiadas. Con objeto de generar las líneas de células T CD4+, se utiliza el polipéptido de WT1 como el estímulo antigénico y los linfocitos de sangre periférica autóloga (PBL) o líneas celulares linfoblastoides (LCL) inmortalizadas por infección con el virus de Epstein Barr se utilizan como células que presentan antígeno. Con objeto de generar líneas de células T de CD8+, las células que presentan antígeno autólogo transfectadas con un vector de expresión que produce el polipéptido de WT1 pueden utilizarse como células estimuladoras. Las líneas de células T establecidas pueden clonarse 2-4 días después de la estimulación de antígeno colocando en placas las células T estimuladas a una frecuencia de 0.5 células por cavidad en placas de fondo plano de 96 cavidades con 1 * 106 células PBL o LCL irradiadas e interleuquina-2 recombinante (rl L2) . (50 U/ml). Las cavidades con desarrollo clonal establecido pueden identificarse aproximadamente a 2-3 semanas después de la colocación en placas inicial y se reestimulan con antígeno apropiado en presencia de células que presentan antígeno autólogo, se expanden subsecuentemente por la adición de dosis bajas de rl L2 (1 0 U/ml) 2-3 d ías después de la estim ulación de antígeno. Los clones de células T pueden mantenerse en placas de 24 cavidades por reestimulación periódica con antígeno y rl L2 aproximadamente cada dos semanas . En alg unas modalidades, la células T alogénicas pueden im primarse (es decir, sensibilizarse a WT1 ) in vivo y/o in vitro. Tal im primación puede lograrse contactando las células T con un polipéptido de WT1 , un polinucleótido que codifica tal polipéptido o una célula que prod uce tal polipéptido bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para perm itir la im primación de células T. En general, se considera que las células T se im primarán si, por ejem plo, el contacto con un polipéptido de WT1 da como resultado la proliferación y/o activación de las células T, midiéndose por pruebas de proliferación convencional, liberación de cromo y/o liberación de citoq uina como se describe en la presente. Un índice de estim ulación con un incremento de más del doble en la proliferación o lisis, y con un incremento de más del triple en el nivel de citoqui na, en comparación con los controles negativos , indica la especificidad de las células T. Pueden em plearse célu las imprimadas in vitro, por ejem plo, en un transplante de médula ósea o como una infusión de linfocitos donadores. Las células T específicas para WT1 pueden matar células que expresan la proteína de WT1 . La introducción de genes q ue codifican cadenas receptoras de células T (TCR) para WT1 se utilizan como medio para mejorar cuantitativamente y cualitativamente las respuestas a WT1 que soportan las células de leucemia y cáncer. Las vacunas para reforzar el número de células T que pueden reaccionar con células positivas a WT1 son un método para seleccionar como objetivo las células que soportan WT1 . La terapia de células T con células T específicas para WT1 es otro método . Un método alternativo es introducir las cadenas de TCR específicas para WT1 en cél ulas T u otras células con potencial lítico . En una modalidad adecuada, las cadenas alfa y beta TCR se clonan a partir de una línea de células T de WT1 específico y se utiliza para la terapia de células T adoptivas, tal como se describe en WO 96/30516, incorporado en la presente para referencia.

Com posiciones v Vacunas Farmacéuticas. En alg unos aspectos, polipéptidos , polinucleótidos, anticuerpos y/o célu las T pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas o vacunas. Alternativamente, una composición farmacéutica puede comprender una célula de presentación de antígeno (por ejemplo, una célula dendrítica) transfectada con un polinucleótido de WT1 de manera tal que la célu la de presentación de antígeno expresa un polipéptido de WT1 . Las composiciones farmacéuticas comprenden uno o más de tales compuestos o células y un portador o excipiente fisiológ icamente aceptable. Algunas vacunas pueden comprender uno o m ás de tales com puestos o cél ulas y un acentuador de respuesta in m unológ ica no específica, tal como un adyuvante o liposoma (en el cual se incorpora el compuesto) . Las com posiciones farmacéuticas y vacunas pueden contener además un sistema de sum inistro , tal como microesferas biodegradables las cuales se describen , por ejemplo, en las Patente de E. U . Nos. 4,897 ,268 y 5, 075, 1 09. Las composiciones farmacéuticas y vacunas en el alcance de la presente invención pueden contener también otros compuestos, los cuales pueden ser biológ icamente activos o inactivos. En alg unas modalidades, composiciones farmacéuticas y vacunas se encuentran diseñadas para producir respuestas de células T específicas para un polipéptido de WT1 en un paciente, tal como un humano. En general , las respuestas de cél ulas T pueden favorecerse a través de! uso de polipéptidos relativamente cortos (por ejemplo, que comprenden menos de 23 residuos de am inoácido consecutivos de un polipéptido de WT 1 nativo , preferentemente 4-1 6 residuos consecutivos, más preferentemente 8-16 residuos consecutivos y aún más preferentemente 8-1 0 residuos consecutivos. Alternativamente, o en además, una vacuna puede comprender un acentuador de respuesta inmunológica no específica que acentúa preferencialmente una respuesta de células T. En otras palabras, el acentuador de respuesta inmunológ ica puede acentuar el nivel de una respuesta de células T a un polipéptido de WT1 por una cantidad q ue es proporcionalmente mayor q ue la cantidad por la cual se acentúa una respuesta de adyuvante. Por ejem plo, cuando se compara con un adyuvante basado en aceite convencional, tal como CFA, una acentuador de respuesta inmunológica q ue acentúa preferencialmente una respuesta de células T puede acentuar una respuesta de célu las T proliferantes al menos dos veces, una respuesta lítica en al menos 1 0% , y/o la activación de células T al menos dos veces en comparación con las líneas celulares de control negativo a WT1 , aunque no acentúan detectablemente una respuesta de anticuerpos . La cantidad por la cual se acentúa una respuesta de células T o de anticuerpos a un polipéptido de WT1 puede determinarse generalmente utilizando cualqu ier técnica representativa conocida en la materia , tal como las técnicas proporcionadas en la presente. Una composición farmacéutica o vacuna puede contener ADN que codifica uno o más de los polipéptidos como se describe con anterioridad, de manera tal que el polipéptido se genera in situ. Como se observó anteriormente, el ADN puede estar presente en cualquier variedad de sistemas de suministro conocidos por los expertos en la materia , incluyendo los sistem as de expresión de ácido nucléico, sistemas de expresión bacterianos y virales y sistemas de expresión mam íferos . Los sistemas de expresión de ácido n ucléico apropiados contienen el ADN necesario , las secuencias de cADN o ARN para la expresión en el paciente (tal como un mejorador adecuado y señal de term inación) . Los sistemas de sumin istro bacterianos im plican la administración de una bacteria (tal como BacHIus-Calmette-Guerrin) que exprese una porción inm unogénica del polipéptido en su superficie celular. En una modalidad preferida , el ADN puede introducirse utilizando un sistema de expresión viral (por ejemplo, vacunas u otros virus de viruela , retrovirus , o adenovirus) , el cual puede implicar el uso de u n virus com petente de réplica, no patogén ico (defectuoso) . Las técnicas para incorporar el ADN en tales sistemas de expresión son bien conocidos por aquellos expertos en la materia. El ADN puede ser también "descubierto", como se describe, por ejemplo, en Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993 y revisado por Cohén, Science 259:1691-1692, 1993. La captación de ADN descubierto puede aumentar al recubrir el ADN en cuentas biodegradables, las cuales se transportan eficazmente a las células. Como se observó con anterioridad, una composición farmacéutica o vacuna puede comprender una célula de presentación de antígeno que expresa un polipéptido de WT1. Para propósitos terapéuticos, como se describe en la presente, la célula de presentación de antígeno es preferentemente una célula dendrítica autóloga. Tales células pueden prepararse y transfectarse utilizando técnicas convencionales, tales como las descritas por Reeves et al., Cáncer Res. 56:5672-5677, 1996; Tuting et al., J. Immunol. 760:1139-1147, 1998; y Nair et al., Nature Biotechnol. 6:364-369, 1998). La expresión de un polipéptido de WT1 en la superficie de una célula de presentación de antígeno puede confirmarse por la estimulación in vitro y la proliferación convencional así como también las pruebas de liberación de cromo, como se describe en la presente. Aunque puede emplearse cualquier portador conocido por aquellos expertos en la materia en las composiciones farmacéuticas de esta invención, el tipo de portador variará dependiendo del modo de administración. Las composiciones de la presente invención pueden formularse para cualquier manera apropiada de administración, incluyendo por ejemplo, administración tópico, oral, nasal, intravenosa, intracraneal, ¡ntraperitoneal , subcutánea o intramuscular. Para la administración parenteral , tal como la inyección subcutánea , el portador comprende preferentemente agua , salm uera, alcohol, una grasa, una cera, o un regulador. Para la administración oral, pueden emplearse cualquiera de los portadores anteriores o un portador sólido, tal como manitol , lactosa, almidón , estearato de magnesio , sacarina de sodio , talco , celulosa, glucosa, sacarosa , y carbonato de mag nesio. Las microesferas biodegradables (por ejemplo, poliglicolato de polilactato) pueden emplearse también como portadores para las composiciones farmacéuticas de esta invención . Para algunas aplicaciones tópicas, se prefiere la form ulación como crema o loción, utilizando com ponentes bien conocidos. Tales com posiciones pueden comprender también reguladores (por ejemplo, salm uera regulada neutral o salmuera regulada de fosfato) , carbohidratos (por ejemplo, glucosa, mañosa, sacarosa o dextranos) , manitol , proteínas, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes, agentes quelantes tales como EDTA o glutationa, adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio) y/o conservadores. Alternativamente, las composiciones de la presente invención pueden formularse como un liofilizado. Los compuestos pueden encapsularse también en liposomas que utilizan tecnología bien conocida. En una modalidad de la presente invención, las com posiciones com prenden un reg u lador que comprende uno o más azúcares que incluyen, pero no se limitan a , trehalosa , maltosa, sacarosa, fructosa , y glucosa, cada una en una concentración generalmente entre aproximadamente 1 y 25% , típicamente entre aproximadamente 7 y 1 3%. En una modalidad adicional , la concentración se encuentra entre 8 y aproximadamente 1 2% . Todavía en una modalidad adicional la concentración es de aproximadamente 10% . En un aspecto adicional de la presente invención , las composiciones pueden comprender etanolamina; cisteína; o Polisorbato-80, generalmente a concentraciones eficaces para acentuar la eficacia, estabilidad y/o solubilidad de la formulación. Puede emplearse cualquier variedad de acentuadores de respuesta inm unológica , tales como adyuvantes, en las vacunas de la invención. La mayoría de los adyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger el antígeno del catabolismo rápido , tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulador para las respuestas inm unologicas, tales como el lípído A, Bortadella pertussis o las proteínas derivadas de Mycobacterium tuberculosis. Los acentuadores adecuados de respuestas in m unolog icas no específicas incluyen adyuvantes basados en alumbre (por ejemplo, Alhydrogel, Rehydragel , fosfato de aluminio, Algam ulin, hidróxido de aluminio); adyuvantes basados en aceite (adyuvante de Freund (FA), Specol, RI BI , TiterMax, Montan ide ISA50 o Montanide ISA 720 (Seppic, Francia); citoquinas (por ejemplo, GM-CS F o Flat3-ligante) ; microesferas; adyuvantes basados en copolímero de bloq ue no iónico; adyuvantes basados en amoniobromuro de dioctadecilo de dimetilo (DDA) AS-1 , AS-2 (Sm ith Kline Beecham) ; adyuvantes basados en el sistema Adyuvante Ribi; QS21 (Aq uila) ; adyuvantes basados en saponina (saponina cruda, la saponina Quil A); adyuvantes basados en dipéptido de m uramilo (MDP) tales como SAF (adyuvante Syntex en su forma microfluidizada (SAF-m)); bromuro de amonio de dimetiio-dioctadecilo (DDA); adyuvantes basados en complemento humano m. vaccae y derivados; adyuvantes basados en el com plejo de estim ulación inmunológ ica (¡scom) ; toxinas desactivadas; y agentes infecciosos aten uados (tales como M. tuberculosis). Los adyuvantes il ustrativos adicionales para su uso en las composiciones farmacéuticas incluyen , SAF (Chiron , California , Estados Unidos) , ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron) , la serie de adyuvantes SBAS (por ejemplo, SBAS-2 o S BAS-4, disponible por SmithKIine Beecham, Rixensart, Bélgica) , Detox (Enhanzyn®) (Corixa, Hamilton, MT), RC-529 (Corixa, Ham ilton, MT) y otros 4-fosfatos de glucosam inida de aminoalquiio (AG Ps), tales como aquellos descritos en las Solicitudes de Patente pendiente de E. U . Nos. 08/853, 826 y 09/074, 720, cuyas descripciones se incorporan en la presente para referencia en sus totalidades, y los adyuvantes de éter de polioxietileno tales como aquellos descritos en WO 99/52549A1 . Otros adyuvantes preferidos incluyen moléculas de adyuvantes de la fórmula general (l): HO(CH2CH20)n-A-R, en la que, n es 1 -50, A es un enlace o -C(O)-, R es Ci-50 alquilo o Fenil C^so alq uilo. Una modalidad de la presente invención consiste en una form ulación de vacunas que comprende un éter de polioxietileno de la fórm ula general (I) , en la que n se encuentra entre 1 y 50, preferentemente 4-24, m uy preferentemente 9; el com ponente R es C1 -50, preferentemente C4-2o alquilo y muy preferentemente C1 2 alquilo , y A es un enlace. La concentración de los éteres de polioxietileno debe encontrarse en el rango de 0.1 -20% , preferentemente de 0.1 - 1 0% , y muy preferentemente en el rango 0. 1 -1 %. Los éteres de polioxietileno preferidos se seleccionan a partir del siguiente g rupo: éter de polioxietileno-9-laurilo, éter de polioxietilen-9-esteorilo, éter de polioxietilen-8 — esteorilo , éter de polioxietilen-4-iau rilo, éter de polioxietilen-35-laurilo, y éter de polioxietilen-23-laurilo. Los éteres de polioxietileno tales como éter de laurilo de polioxietileno se describen en el Manual Merck (1 2a edición: entrada 7717) . Estas moléculas adyuvantes se describen en WO 99/52549. El éter de polioxietileno de acuerdo con la fórm ula general (I) anterior, si se desea, puede combinarse con otro adyuvante. Por ejemplo, una combinación de adyuvante preferida es- preferentemente con CpG como se describe en la solicitud de Patente del R. U. GB 9820956.2. Como se observó anteriormente, en alg unas modalidades, se seleccionan los acentuadores de respuestas inmunológicas por su capacidad para producir o acentuar preferencialmente una respuesta de células T (por ejemplo, CD4+ y/o CD8+) a un polipéptido de WT1 . Tales acentuadores de respuesta inm unológica son bien conocidos en la materia, e incluyen (pero no se limitan a) Montanide ISA50, Seppic MONTAN I DE I SA 720, citoq uinas (por ejemplo, GM-CSF, Flat3-ligante), microesferas, adyuvantes basados en amoniobromuro de dioctadecilo de dimetilo (DDA), AS-1 (Smith Kline Beecham), AS-2 (Smith Kline Beecham), adyuvantes basados en el sistema Ribi Adyuvant, QS21 (Aquila), adyuvantes basados en saponina (saponina cruda, la saponina Quil A), adyuvante Syntex en su forma microfluidizada (SAF-m), MV, ddMV (Génesis), adyuvantes basados en complejo de estimulación inmunológica (iscom) y toxinas desactivadas. En otro aspecto de la presente invención, las composiciones pueden comprender adyuvantes para producir una respuesta predominantemente de tipo Th1. Algunos adyuvantes preferidos para producir una respuesta predominantemente de tipo Th1 incluyen, por ejemplo, una combinación de lípido A de monofosforilo, preferentemente lípido A de monofosforilo 3-de-O-acilado, junto con una sal de aluminio. Los adyuvantes de MPL®, tales como MPL-SE, se encuentran disponibles por Corixa Corporation (Seattle, WA; ver, por ejemplo, las Patentes de E.U. Nos. 4,436,727; 4,877,611; 4,866,034 y 4,912,094, incorporada en la presente en su totalidad). Los oligonucleótidos con contenido de CpG (en los cuales el dinucleotido de CpG es no metilado) inducen también una respuesta predominantemente Th1. Tales oligonucleótidos son bien conocidos y se describen, por ejemplo, en WO 96/02555, WO 99/33488 y las Patentes de E.U. Nos. 6,008,200 y 5,856,462. Se describen también las secuencias de ADN inmuno estimulador, por ejemplo, por Sato et al., Science 273:352, 1996. Otro adyuvante preferido comprende una saponina, tal como Quil A, o derivados de la misma, incluyendo QS21 y QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc. , Fram ingham , MA) ; Escina; Digitonina; o las saponinas Gypsophila o Chenopodium quinoa. Otras formulaciones preferidas incluyen más de una saponina en las combinaciones adyuvantes de la presente invención , por ejemplo, combinaciones de al menos dos del sig uiente g rupo q ue com prende QS21 , QS7, Quil A, ß-escina, o digitonina. Las composiciones y vacunas descritas en la presente pueden administrarse como parte de una form ulación de liberación sostenida (es decir, una form ulación tal como una cápsula o esponja que ejecuta una liberación lenta del com puesto tras la administración) . Tales form ulaciones pueden prepararse generalmente utilizando una tecnolog ía bien conocida y administrándose, por ejemplo, por im plantación oral , rectal o subcutánea , o por la implantación en el sitio objetivo deseado. Las formulaciones de liberación sostenida pueden contener un polipéptido, polinucleótido, anticuerpo o célula dispersa en una matriz portadora y/o contenida en un depósito rodeado por una membrana de control de tasa. Los portadores para su uso en tales formulaciones son biocompatibles , y pueden tam bién ser biodegradables ; preferentemente la form ulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación del componente activo. La cantidad de compuesto activo contenida en una formulación de liberación sostenida depende del sitio de implantación , la tasa y la duración esperada de liberación y la naturaleza de la condición a tratarse o evitarse.

Terapia de Enfermedades Malignas En aspectos adicionales de la presente invención, pueden utilizarse las com posiciones y vacunas descritas en la presente invención para inhibir el desarrollo de enfermedades malignas (por ejemplo, enfermedades progresivas o metastáticas o enfermedades caracterizadas por una carga tu moral pequeña tales como una enfermedad residual m ín ima) . En general, pueden utilizarse tales métodos para evitar, retrasar o tratar una enfermedad asociada con la expresión de WT1 . En otras palabras , pueden utilizarse los métodos terapéuticos proporcionados en la presente para tratar una enfermedad existente asociada con WT1 , o puede utilizarse para evitar o retrasar el inicio de tal enfermedad en un paciente que carezca de enfermedades o que se vea afligido con una enfermedad que no se encuentre aún asociada con la expresión de WT1 . Como se utiliza en la presente, una enfermedad se "asocia con la expresión de WT1 " si las célu las enfermas (por ejemplo, células tumorosas) en algún m omento du rante el transcurso de la enfermedad generan detectablemente n iveles superiores de un polipéptido de WT1 que las células normales del mismo tejido. La asociación de expresión de WT1 con una enfermedad maligna no requiere que se encuentre presente el WT1 en un tumor. Por ejemplo , la sobreexpresión de WT1 puede estar involucrada con el inicio de un tumor, pero la expresión de la proteína puede perderse subsecuentemente. Alternativamente, una enfermedad maligna que no se encuentra caracterizada por un incremento en la expresión de WT1 puede, posteriormente, progresar hasta una enfermedad que se caracteriza por la expresión creciente de WT1 . De acuerdo con lo anterior, cualquier enfermedad maligna en la que las células enfermas expresadas anteriormente, expresan actualmente o se espera que expresen subsecuentemente niveles crecientes de WT1 se considera "asociada con la expresión de WT1 ". Puede llevarse a cabo la inmunoterapia utilizando cualquier variedad de técnicas, en la cual los com puestos o células proporcionadas en la presente funcionen para eliminar las células de expresión de WT1 de un paciente. Tal elim inación puede tener lugar como resultado para mejorar o inducir una respuesta i nmunológica en un paciente específico para WT1 o una célula q ue expresa QT1 . Alternativamente, las cél ulas de expresión de WT 1 pueden elimi narse ex vivo (por ejemplo, por tratamiento de médula ósea autóloga , sangre periférica o un frag mento de médula ósea o sangre periférica) . Los fragmentos de médula ósea o sangre periférica pueden obtenerse utilizando cualq uier técnica convencional en la materia. En tales métodos, las composiciones farmacéuticas y vacunas pueden administrársele a un paciente. Como se utiliza en la presente, un "paciente" se refiere a cualq uier animal de sang re caliente, preferentemente u n ser humano. Un paciente puede o puede no verse afligido con una enfermedad malig na. De acuerdo con lo anterior, pueden util izarse las anteriores composiciones farm acéuticas y vacunas para evitar el inicio de una enfermedad (es decir, profilácticamente) o para tratar un paciente afligido con una enfermedad (por ejemplo, para evitar o retrasar el prog reso y/o metástasis de una enfermedad existente). Un paciente afligido con una enfermedad puede tener una enfermedad residual mínima (por ejemplo, una carga tumoral baja en un paciente con leucemia en remisión completa o parcial o un paciente con cáncer después de la reducción de la carga tumoral después de la radioterapia de cirugía y/o quimioterapia) . Tal paciente puede inm unizarse para inhibir una reincidencia (es decir, evitar o retrasar la reincidencia, o disminuir la severidad de una reincidencia). En algunas modalidades preferidas , el paciente se ve afligido con leucemia {por ejemplo, A L, CIVI L, ALL o ALL infantil) , u n síndrome m ielodisplástico (M DS) o un cáncer (por ejemplo, cáncer gastrointestinal, de pulmón , de tiroides o de pecho o un melanoma) , donde el cáncer o leucemia es positivo a WT1 (es decir, reacciona detectablemente con un anticuerpo anti-WT1 , como se proporciona en la presente o expresa mARN de WT1 a un nivel detectable por RT-PCR, como se describe en la presente) o sufre de una enfermedad autoinm une dirigida contra las células de expresión de WT1 . Otras enfermedades asociadas con sobreexpresión de WT1 incluyen cáncer de riñon (tal como carcinoma celular renal, o tumor de Wilms) , como se describe en Satoh , F. , et al . , Pathol. Int. 50(6) :458-71 (2000) , y Campbell C. E. et al. , Int. J. Cáncer 78(2): 1 82-8 (1 998) ; y mesotelioma, como se describe en Amin, K. M . et al . , Am. J. Pathol. 146(2) :344-56 (1995). Harada et al . (Mol. Urol. 3(4) :357-364 (1999) describen la expresión genética de WT1 en tumores de células germinales testiculares humanos . Nonomura et al. Hinyokika Kiyo 45(8): 593-7 (1999) describen la presentación molecular de cáncer testicular utilizando reacción de cadena de polimerasa de los genes de cáncer testicular específico. Shimizu et al., Int. J. Gynecol. Pathol. 19(2):158-63 (2000) describen la detección inmunohistoquímica del gen del tumor de Wilms (WT1) en tumores ovarianos epiteliales. La sobreexpresión de WT1 se describió también en pequeños tumores celulares redondos desmoplásticos, por Barnoud, R. et al., Am. J. Surg. Pathol. 24(6):830-6 (2000); y Pathol. Res.Pract. 194(10):693-700 (1998). La sobreexpresión de T1 en glioblastomas y otros cánceres se describió por Menssen, H.D. et al., J. Cáncer Res. Clin. Oncol. 126(4):226-32 (2000), "Wilms tumor gene (WT1) expression in lung cáncer, colon cáncer and glioblastoma cell lines compared to freshly isolated tumor specimens." Otras enfermedades que muestran sobreexpresión de WT1 incluyen enfermedades asociadas con EBV, tales como linfoma de Burkitt y cáncer nasofaríngeo (Spinsanti P. et al., Leuk. Lymphoma 38(5-6):611-9 (2000), "Wilms' tumor gene expression by normal and malignant human B lymphocytes". En Leukemia 14(9):1634-4 (2000), Pan et al., describen el tratamiento de IL-12 in vitro de células mononucleares de sangre periférica proveniente de pacientes con leucemia o síndromes mielodisplásticos, y reportó un incremento en la citotoxicidad y reducción en la expresión genética de WT1. En Leukemia 13(6):891-900 (1999), Patmasiriwat et al., reportaron la expresión de WT1 y GATA1 en el síndrome mielodisplástico y leucemia aguda. En Leukemia 13(3):393-9 (1999), Tamaki et al. reportaron que el gen tumoroso de Wilms' WT1 es un buen marcador para el diagnóstico de progreso de la enfermedad de síndromes mielod isplásticos. La expresión del gen tumoroso de Wilms' WT1 en tu mores sólidos , y su im plicación en el desarrollo celular tumoroso, se discutió con relación a las líneas celulares de cáncer gástrico, cáncer de colon , cáncer de pulmón , cáncer de pecho , línea celular tumorosa de células germ inales, cáncer ovariana , cáncer uterino, línea celular de cáncer de tiroides , carcinoma hepatocelular, en Oji et al . , Jpn. J. Cáncer Res. 90(2) : 1 94-204 (1 999) . Las com posiciones proporcionadas en la presente pueden utilizarse solas o en combinación con reg ímenes terapéuticos convencionales tales como cirugía , irradiación, quimioterapia y/o transplante de méd u la ósea (autólogo , singenéico , alogénico o no relacionado). Como se describe m ás detalladamente a continuación , los agentes de unión y las células T como se proporcionan en la presente pueden utilizarse para purgar las células germ inales autólogas. Tal purga puede ser benéfica antes de, por ejem plo , el transplante de médula ósea o la transfusión de sang re o componentes de las m ismas. Los agentes de unión , células T, células de presentación de antígeno (APC) y composiciones proporcionadas en la presente pueden utilizarse adicional m ente para expandir y estimular (o imprimar) las células T de WT1 específico autólogas, alogénicas, singenéicas o no relacionadas in vltro y/o in vivo. Tales células T de WT1 específico pueden utilizarse, por ejemplo , en infusiones de linfocito donador. Las rutas y frecuencia de administración, así como también la dosis, variarán de persona a persona, y pueden establecerse fácilmente utilizando técnicas convencionales. En general, las composiciones farmacéuticas y vacunas pueden administrarse por inyección (por ejemplo, intracutánea, intramuscular, intravenosa o subcutánea), intranasalmente (por ejemplo, por aspiración) u oralmente. En algunos tumores , las composiciones farmacéuticas o vacunas pueden administrarse localmente (por ejemplo, por rectocoloscopía , gastroscopía, videoendoscopía, angiografía u otros métodos conocidos en la materia). Preferentemente, pueden administrarse entre 1 y 1 0 dosis durante un periodo de 52 semanas . Preferentemente, se administran 6 dosis, a intervalos de 1 mes, y pueden adm inistrarse vacunaciones de refuerzo periódicamente después de ello. Los protocolos alternos pueden ser apropiados para pacientes individuales. Una dosis adecuada es una cantidad de compuesto que, cuando se administra como se describió con anterioridad , es capaz de mejorar una respuesta ¡nmunológ ica anti-tum orosa que es de al menos 1 0-50% por encima del nivel basal (es decir, no tratada) . Tal respuesta puede monitorearse midiendo los anticuerpos anti-tumorosos en un paciente o por la generación dependiente de vacunas de células ejecutoras citolíticas capaces de matar las células tumorosas del paciente in vitro. Tales vacunas tam bién deben ser capaces de ocasionar una respuesta ¡nm unológica que conduzca a un resultado clínico mejorado (por ejemplo, remisiones completas o parciales más frecuentes, o una sobrevivencia sin enfermedad más larga y/o total) en pacientes vacunados en comparación con pacientes no vacunados. En general , para composiciones farmacéuticas y vacunas q ue comprenden uno o más polipéptidos, la cantidad de cada polipéptido presente en una dosis oscila desde aproximadamente 1 00 pg hasta 5 mg . Los tamaños de dosis adecuada variarán con la talla del paciente, pero típicamente oscilará desde aproximadamente 0.1 ml_ hasta aproximadamente 5 ml_. En general , una dosis y régi men de tratam iento apropiados proporcionan el(los) com puesto(s) activo(s) en una cantidad suficiente para proporcionar beneficio terapéutico y/o profiláctico. Tal respuesta puede monitorearse estableciendo un resultado clínico mejorado (por ejemplo, remisiones completas o parciales más frecuentes , o una sobrevivencia sin enfermedad más larga y/o total) en pacientes tratados en comparación con paciente nos tratados. Los incrementos para las respuestas inm unológ icas preexistentes a WT1 se correlacionan generalmente con un resultado clínico mejorado. Tales respuestas inmunológicas pueden evaluarse generalmente utilizando pruebas de proliferación convencional, citotoxicidad o citoquina, q ue pueden realizarse utilizando muestras obtenidas de un paciente antes y después del tratamiento. En aspectos adicionales , los métodos para inhibir el desarrollo de una enfermedad m al igna asociada con la expresión de WT1 im plican la admin istración de células T autólogas que se han activado en respuesta a un poiipéptido de WT1 o APC de expresión de WT1 , como se describe con anterioridad . Tales células T pueden ser CD4+ y/o CD8+, y pueden proliferarse como se describe anteriormente. Las células T pueden administrarse al paciente en una cantidad eficaz para inhibir el desarrol lo de una enfermedad maligna. Típicamente, aproximadamente 1 *109 a 1 *101 1 células T/M2 se adm inistran ¡ntravenosamente, por intracavidad o en el lecho de un tumor resecado. Será evidente al experto en la materia que el número de células y la frecuencia de administración dependerán de la respuesta del paciente. En algunas modalidades, las células T pueden estimulares antes de un transplante de médula ósea autóloga. Tal estim ulación puede tener lugar in vivo o in vitro. Para la estim ulación in vitro, la médula ósea y/o la sangre periférica (o un fragmento de médula ósea o sang re periférica) obtenidas de un paciente pueden contactarse con un polipéptido de WT 1 , un polinucleótido q ue codifique un polipeptido de WT1 y/o una APC que exprese un polipéptido de WT1 bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la estimulación de células T como se describe con anterioridad . Las células germinales de médula ósea, sangre periférica y/o las células T de WT1 específico pueden administrársele después a un paciente utilizando técnicas convencionales . En modalidades relacionadas, las células T de un donador relacionado o no relacionado pueden estimularse antes de un transplante de médula ósea singenéico o alogénico (relacionado o no relacionado). Tal estim ulación puede ocurrir in vivo o in vitro. Para la estimulación in vitro, la médula ósea y/o sangre periférica (o un fragmento de médula ósea o sangre periférica) obtenidas de un donador relacionado o no relacionado pueden contactarse con un polipéptido de WT1 , polinucleótido de WT1 y/o APC que exprese un polipéptido de WT1 bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la estimulación de células T como se describió con anterioridad . Las células germinales de médula ósea, sang re periférica y/o las células T de WT1 específico pueden admin istrársele después a un paciente utilizando técnicas convencionales. En otras modalidades, las células T de WT1 específico como se describen en l a presente pueden utilizarse para eliminar células de expresión de WT1 de la médula ósea autóloga, la sangre periférica o un fragmento de médula ósea o sangre periférica (por ejemplo, sangre periférica enriquecida CD34* (PB) antes de la administración a un paciente). Tales métodos pueden realizarse contactando médula ósea o PB con tales células T bajo condiciones y durante un tiem po suficiente para permitir la reducción de células de expresión de WT1 a menos de 1 0% , preferentemente menos de 5% y más preferentemente menos de 1 % del nú mero total de células mieloides o linfáticas en la médula ósea o sang re periférica. El grado al cual se han eliminado tales células puede determ inarse fácilmente por métodos convencionales tales como, por ejemplo, análisis de PCR cualitativos y cuantitativos, morfología, inmunohistoquímica y análisis de FACS. La médula ósea o PB (o un fragmento del mismo) pueden administrársele después a un paciente utilizando técn icas convencionales.

Métodos Diagnósticos La presente invención proporciona además métodos para detectar una enfermedad m aligna asociada con la expresión de WT1 , y para monitorear la eficacia de una inm unización o terapia para tal enfermedad. Tales métodos se basan en el descubrimiento, en la presente invención, de que una respuesta ¡nm unológica específica para la proteína de WT1 puede detectarse en pacientes afligidos con tales enfermedades , y de que los métodos q ue acentúan tales respuestas inmunológicas pueden proporcionar un beneficio preventivo o terapéutico. Para determinar la presencia o ausencia de una enfermedad maligna asociada con expresión de WT1 , puede probarse el nivel de células T específicas para WT1 de un paciente. En algunos métodos, una muestra biológ ica que comprende células T CD4+ y CD8+ aisladas de un paciente se incuba con un polipéptido de WT1 , un polinucleótido que codifica un polipéptido de WT1 y/o una APC que expresa un polipéptido de WT 1 , y se detecta la presencia o ausencia de activación específica de las células T, como se describe en la presente. Las m uestras biológicas adecuadas incluyen , pero no se lim itan a , células T aisladas. Por ejemplo , las células T pueden aislarse de un paciente por técnicas ruti narias (tales como por centrifugación de gradiente de densidad Ficoll/Hypaque de linfocitos de sang re periférica) . Las células T pueden incubarse in vitro durante 2-9 d ías (típicamente 4 días) a 37°C con polipéptido de WT1 (por ejemplo, 5-25 pg/ml). Puede ser deseable incubar otro alícuota de una m uestra de células T en ausencia del polipéptido de WT1 para servir como control. Para las células T CD4+, la activación se detecta preferentemente evaluando la proliferación de células T. Para las células CD8+, la activación se detecta preferentemente evaluando la actividad citotóxica. U n nivel de proliferación q ue es al menos dos veces m ayor y/o un nivel de actividad citolííica que es al menos 20% mayor que en pacientes sin enfermedad indica la presencia de una enfermedad maligna asociada con la expresión de WT1 . Puede realizarse una correlación adicional, utilizando métodos conocidos en la materia, entre el nivel de proliferación y/o actividad citolítica y la respuesta pronosticada a la terapia. En particular, los pacientes que exhiben un anticuerpo superior, pueden esperar respuestas proliferante y/o lítica para mostrar una mayor respuesta a la terapia. En otros métodos, una muestra biológica obtenida a partir de un paciente se prueba para el nivel de anticuerpo específico para WT1 . La muestra biológica se incuba con un polipéptido de WT1 , un polinucleotido que codifica un polipéptido de WT1 y/o una APC que expresa un polipéptido de WT1 bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que se formen los inmunocompiejos. Después se detectan los inmunocompiejos formados entre el polipéptido de WT1 y anticuerpos en la muestra biológica que se unen específicamente al polipéptido de WT1 . Una muestra biológica para su uso en tales métodos puede ser cualquier muestra obtenida a partir de un paciente que esperaría contener anticuerpos. Las muestras biológicas adecuadas incluyen sangre, suero, ascitis, médula ósea, efusión pleural, y fluido cerebroespinal. La muestra biológica se incuba con el polipéptido de WT1 en una mezcla de reacción bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que se formen inmunocompiejos entre el polipéptido y los anticuerpos específicos para WT1 . Por ejemplo, una muestra biológica y el polipéptido de WT1 pueden incubarse a 4°C durante 24-28 horas. Después de la incubación, la mezcla de reacción se prueba para la presencia de inmunocomplejos. La detección de inmunocomplejos formados entre el polipéptido de WT1 y los anticuerpos presentes en la muestra biológica pueden realizarse por una variedad de técnicas conocidas, tales como radioinmunopruebas (RIA) y pruebas inmunoabsorbentes de enzima enlazada (ELISA). Las pruebas adecuadas son bien conocidas en la materia y se describen ampliamente en la literatura científica y la de patentes (por ejemplo, Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Las pruebas que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, la técnica de inmunoprueba de doble sandwich de anticuerpo monoclonal de David et al. (Patente de E.U. No.4,376,110); pruebas de sándwich de anticuerpo monoclonal-policlonal (Wide et al., en irkham y Hunter, eds., Radioimmunoassay Methods, E. y S. Livingstone, Edinburgh,1970); el método "Western Blot" de Gordon et al. (Patente de E.U. No. 4,452,901); inmunoprecipitación de ligante etiquetado (Brown et al., J. Biol. Chem. 255:4980-4983, 1980); pruebas inmunoabsorbentes de enzima enlazada como se describen, por ejemplo, por Raines y Ross (J. Biol. Chem. 257:5154-5160, 1982); técnicas inmunocitoquímicas, que incluyen el uso de fluorocromos (Brooks et al., Clin. Exp. Immunol. 39:477, 1980); y la neutralización de actividad (Bowen-Pope et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:2396-2400, 1984). Otras inmunopruebas incluyen, pero no se limitan a, aquellas descritas en las Patentes de E.U. Nos. 3,817,827; 3,850,752; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3, 996, 345; 4, 034,074; y 4, 098,876. Para propósitos de detección , el poli péptido de WT1 puede ser etiquetado o no etiquetado. El polipéptido de WT1 no etiquetado puede utilizarse en pruebas de agl utinación o en combinación con agentes reactivos de detección etiquetada q ue se unen a los inmunocom plejos (por ejemplo, anti-inmunog lobulina, proteína G , proteína G , proteína A o una lectina y anticuerpos secundarios, o fragmentos de unión de antígeno de los mismos, capaces de unirse a los anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido de WT1 ) . Si el polipéptido de WT1 se etiqueta, el grupo relator puede ser cualquier grupo relator adecuado conocido en la materia, incl uyendo radioisótopos, g rupos fl uorescentes , g ru pos lu min iscentes, enzimas , biotina y partículas de tinte. En alg unas pruebas , el polipéptido de WT1 no etiquetado se inmoviliza en un soporte sólido. El soporte sólido puede ser cualquier material conocido por el experto en la materia al cual puede unirse el polipéptido. Por ejemplo, el soporte sólido puede ser una cavidad de prueba en una placa de microtitulación o una nitrocelulosa u otra membrana adecuada. Alternativamente, el soporte puede ser una cuenta o disco, tal como vidrio , fibra de vidrio , látex o un material de plástico tal como poliestireno o polivinilcloruro . El soporte puede ser también u na partícula magnética o un sensor de fibra óptica, tal como aquellos descritos, por ejemplo, en la Patente de E. U . No. 5,359, 681 . El polipéptido puede inmovilizarse en el soporte sólido utilizando una variedad de técnicas conocidas por aquellos expertos en la materia, que se describen ampliamente en la literatura científica y la de patente. En el contexto de la presente invención, el término "inmovilización" se refiere tanto a asociación no covalente, tal como absorción, como a unión covalente (la cual puede ser un enlace directo entre el antígeno y los grupos funcionales en el soporte o puede ser un enlace a manera de un agente degradante). Se prefiere la inmovilización por absorción a una cavidad en una placa de microtitulacion o a una membrana. En tales casos, la absorción puede lograrse contactando el polipéptido de WT1 , en un regulador adecuado, con el soporte sólido para una cantidad suficiente de tiempo. El tiempo de contacto varía con la temperatura, pero típicamente se encuentra entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 1 día. En general, contactar una cavidad de una placa de microtitulacion plástica (tal como poliestireno o polivinilcioruro) con una cantidad de polipéptido que oscila desde aproximadamente 10 ng hasta aproximadamente 10 g, y preferentemente aproximadamente 1 00 ng hasta aproximadamente 1 g , es suficiente para inmovilizar una cantidad adecuada de polipéptido. Después de la inmovilización, los sitios restantes de unión de proteína en el soporte se bloquean típicamente. Cualquier agente de bloqueo adecuado conocido por los expertos en la materia, tales como albúmina de suero bovino, Tween 20™ (Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO), suero de cabra normal desactivado por calor (NGS), o BLOTTO (solución regulada de lecha en polvo desgrasada que contiene también un conservador, sales, y un agente de anti-espumación). El soporte se incuba después con una muestra biológica sospechosa de contener un antígeno específico. La muestra puede aplicarse pura , o más frecuentemente, puede diluirse, generalmente en una solución regulada que contiene una pequeña cantidad (0. 1 %-5.0% por peso) de proteína, tal como BSA, NGS , o BLOTTO. En general , un tiempo de contacto apropiado (es decir, tiempo de incubación) es un periodo de tiempo que es suficiente para detectar la presencia de anticuerpo que une específicamente WT1 en una m uestra q ue contiene tal un anticuerpo. Preferentemente, el tiempo de contacto es suficiente para alcanzar un nivel de unión que es de al menos aproximadamente 95% del alcanzado a equilibrio entre el anticuerpo unido y el no unido. Aquellos expertos en la materia reconocerán q ue el tiem po necesario para alcanzar el equil ibrio puede determ inarse fácilmente probando el nivel de unión que ocurre en un periodo de tiem po. A temperatura ambiente, un tiempo de incubación de aproximadamente 30 es generalmente suficiente. La m uestra no unida puede elim inarse después enjuagando el soporte sólido con un regulador apropiado, tal como PBS con contenido de 0. 1 % de Tween 20™ . Después puede agregarse un agente reactivo de detección que se une a los inmunocomplejos y que comprende un grupo relator. El agente reactivo se incuba con el inmunocom plejo para una cantidad de tiem po suficiente para detectar el anticuerpo unido . Una cantidad apropiada de tiem po puede determinarse generalmente probando el nivel de unión q ue ocurre en un periodo de tiem po. El agente reactivo de detección no unido se elimina después y el agente reactivo de detección se detecta utilizando el grupo relator. El método em pleado para detectar el grupo relator depende de la naturaleza del gru po relator. Para los grupos radioactivos, el conteo de escintilación o métodos autoradiográficos son generalmente apropiados. Los métodos espectroscópicos pueden utilizarse para detectar tintes, grupos luminiscentes y g rupos fluorescentes. La biotina puede detectarse utilizando avidina , acoplada a un grupo relator diferente (comúnmente un grupo radioactivo o fluorescente o una enzima). Los grupos relatores de enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina y oxidasa de glucosa) puede detectarse generalmente por la adición de substrato (generalmente durante un periodo de tiempo específico) , seg uido por análisis espectroscópico u otro análisis de los productos de reacción. I ndependientemente del método específico empleado, un nivel de agente reactivo de detección unido que es al menos dos veces mayor que el entorno (es decir, el nivel observado para una muestra biológica obtenida a partir de un paciente sin enfermedades) indica la presencia de una enfermedad maligna asociada con la expresión de WT1 . En general, los métodos para monitorear la eficacia de una inmunización o terapia involucran los cambios de monitoreo en el nivel de anticuerpos o células T específicas para WT1 en el paciente. Los métodos en los cuales los niveles de anticuerpos se monitorean pueden comprender las etapas para: (a) incubar una primera m uestra biológ ica, obtenida de un paciente antes de una terapia o inmunización, con un polipéptido de WT1 , en el que se lleva a cabo la in munización bajo condiciones y du rante un tiempo suficiente para permitir la formación de inm unocompléjos ; (b) detectar in m unocom plejos formados entre el polipéptido de WT1 y anticuerpos en la muestra biológica que se unen específicamente al polipéptido de WT1 ; (c) repetir las etapas (a) y (b) utilizar una seg unda m uestra biológica tomada del paciente después de la terapia o inm unización ; y (d) com parar el n úmero de inm unocomplejos detectados en las m uestras biológ icas primera y seg unda . Alternativamente, un polinucleótido q ue codifica un polipéptido de WT1 , o una APC de expresión de polipéptido de WT1 puede em plearse en lugar del polipéptido de WT1 . En tales métodos, se detectan los inmunocomplejos entre el polipéptido de WT1 codificado por el polinucleótido, o expresado por la APC, y los anticuerpos en la muestra biológica . Los métodos en los cuales se monitorean la activación de células T y/o el número de precursores de WT1 específico pueden comprender las etapas para: (a) incubar una primera m uestra biológ ica que comprende células CD4+ y/o CD8+ (por ejemplo, médula ósea, sang re periférica, o un frag mento de las mismas), obtenida de un paciente antes de una terapia o inm unización , con un polipéptido de WT1 , en el que se lleva a cabo la incubación bajo condiciones y durante un tiem po suficiente para perm itir la activación específica, proliferación y/o lisis de células T; (b) detectar una cantidad de activación, proliferación y/o l isis de células T; (c) repetir las etapas (a) y (b) utilizar una segunda m uestra biológ ica q ue com prende células CD4+ y/o CD8+, y tomadas del mismo paciente tras la terapia o inmunización ; y (d) com parar la cantidad de activación , proliferación y/o lisis de células T en las muestras biológicas primera y segunda. Alternativamente, puede emplearse un polinucleótido que codifica un polipéptido de WT1 , o una APC que expresa un polipéptido de WT1 en lugar del polipéptido de WT1 . Una muestra biológica para su uso en tales métodos puede ser cualquier muestra obtenida de un paciente que esperaría contener anticuerpos, células T de CD4+ y/o células T de CD8+. Las muestras biológicas adecuadas incluyen sangre, sueros, ascitis, médula ósea, efusión pleural y fluido cerebroespinal. Una primera muestra biológica puede obtenerse antes del inicio de terapia o inmunización o por partes mediante una terapia o régimen de vacunación. La segunda muestra biológica debe obtenerse de manera similar, pero después de una terapia o inmunización adicional. La segunda muestra biológica puede obtenerse al término de, o por partes mediante, terapia o inmunización, siempre y cuando tenga lugar al menos una porción de terapia o inmunización entre el aislamiento de las muestras biológicas primera y segunda. Las etapas de incubación y detección para ambas muestras pueden realizarse generalmente como se describió con anterioridad. Un incremento estadísticamente significativo en el número de inmunocomplejos en la segunda muestra con relación a la primera muestra refleja la terapia o inmunización exitosa. Los siguientes Ejemplos se ofrecen a manera de ilustración y no a manera de limitación.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 IDENTIFICACIÓN DE UNA RESPUESTA INMUNOLÓGICA A WT1 EN PACIENTES CON MALIGNIDADES HEMATO LÓGICAS Este Ejemplo ¡lustra la identificación de una respuesta inmunológica existente en pacientes con una malignidad hematológica. Para evaluar la presencia de respuestas preexistentes de anticuerpos específicos a WT1 en pacientes, se analizaron sueros de pacientes con leucemia mielógena aguda (AML), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia mielógena crónica (CML), y anemia aplástica severa utilizando análisis de Western Blot. Se probó la capacidad de los sueros para inmunoprecipitar WT1 a partir de la línea celular leucémica humana K562 (American Type Culture Collection, Manassas, VA). En cada caso, los inmunoprecipitados se separaron por electrofóresis de gel, se transfirieron a membrana y se sondearon con el anticuerpo anti WT1 WT180 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Este análisis de Western Blot identificó anticuerpos potenciales de WT1 específico en pacientes con malignidades hematológicas. Un Western Blot representativo que muestra los resultados para un paciente con AML se muestra en la Figura 2. Se reconoció una proteína de 52 kD en el inmunoprecipitado generado utilizando los sueros del paciente por el anticuerpo de WT1 específico. La proteína de 52 kD migró ai mismo tamaño que el control positivo. Estudios adicionales analizaron los sueros de pacientes con AML y CML para la presencia de anticuerpos a las proteínas de WT1 tru ncadas y de tamaño natural. Las construcciones de CDNA que representan la región del WT1 hum ano/tamaño natural (aa 1 -449), el N-término (aa 1 -249) (WT1 /N-término) y el C-término (aa 267-449) (WT1 /C-término) se subclonaron en los vectores pET28 modificados. Las proteínas de WT1 /tamaño natural y WT1 /N-término se expresaron como proteínas de fusión Ra12. Ra 12 es el fragmento C-terminal de una proteína de tuberculosis Mycobacterium segregada, denotada como MTB32B. (Skeiky et al. , Infect. Immun. 67: 3998 , 1 999). La región de fusión Ra 12-WT1 /tamaño natural se clonó 3' a una etiq ueta de histidina en un vector pET28 modificado con etiq ueta de histidina . La región WT1 /N-término se subclonó en un vector pET28 modificado que tiene una etiqueta de 5' histidina seguida de la región de fusión de tioredoxina (TRX)-WT /N-término seguida de una etiqueta de 3' histidina. La región de codificación WT1 /C-término se subclonó en un vector pET28 modificado sin un socio de fusión que contenga solamente la etiqueta de histidina 5' y 3' , seguida por un sitio de Trombina y EK. Se transformaron BL21 pLysS E. coli (Stratagene, La Jolla, CA) con las tres construcciones de expresión de WT1 , se desarrollaron toda la noche y se indujeron con isopropil-^-D-tiogalactosida (IPTG). Las proteínas de WT1 se purificaron como se explica a continuación se cosecharon las células y se sometieron a lisis por incubación en 1 0m M de Tris, pH de 8.0 con Tabletas I nhibidoras de Proteasa Completa Boehringer annheim Biochemicals , I ndianápolis, IN) a 37°C seguido de rondas repetidas de sonificación . Los cuerpos de inclusión se enjuagaron dos veces con 10mM de Tris, pH de 8.0. Las proteínas se purificaron después por cromatografía de afinidad de quelante metálico en resina de ácido níquel-nitrilotriacético (QIAGEN Inc., Valencia, CA; Hochuli et al., Biologically Active Molecules: 217, 1989) seguida por cromatografía en una resina de intercambio de anión de Fuente Q (Amersham Pharmacia Biotech, Upsala, Suecia). La identidad de las proteínas de WT1 se confirmó por secuencias N-terminales. Se estudiaron los sueros de pacientes adultos con AML o CIVIL de nova para la presencia de AB de WT1 específico. Las proteínas recombinantes se absorbieron en placas de microcavidades TC (Nunc, Roskilde, Dinamarca). Las placas se enjuagaron con PBS/Tween 20 al 0.5% y se bloquearon con BSA al 1%/PBS/Tween 20 al 0.1%. Después de enjuagar, se agregaron las diluciones de suero y se incubó durante toda la noche a 4°C. Se enjuagaron las placas y se agregó anticuerpo secundario IgG-HRP anti-humano de asno (Jackson-lmmunochem, West Grove, PA) y se incubó durante 2h a temperatura ambiente. Se enjuagaron las placas, se incubaron con solución de substrato de peroxidasa T B (Kirkegaard and Perry Laboratories, MA), se extinguió con 1N de H2S04, y se leyó inmediatamente (Cyto-Fluor 2350; Millipore, Bedford, MA). Para la inspección serológica, se probaron sueros humanos por ELISA sobre un rango de diluciones seriales desde 1:50 hasta 1:20,000. Se definió una reacción positiva corno un valor OD de un suero diluido 1:500 que excedió el valor OD medio de los sueros de donadores normales (n=96) por tres desviaciones estándar (WT1/tamaño natural, WT1C-término). Debido a un entorno superior en los donadores normales a la proteína de WT 1 /N-térm¡no se definió una reacción positiva al WT1 /N-término como un valor OD de suero diluido 1 :500 que excedió el valor OD medio de los sueros de donadores normales por cuatro desviaciones estándar. Para verificar que la respuesta AB del paciente se dirigió contra el WT1 y no la parte de fusión Ra 1 2 o TRX de la proteína o posibles proteínas contaminantes E. coli, los controles incluyeron solo la proteína Ra1 2 y TRX purificadas de manera similar. Las m uestras que mostraron reactividad contra las proteínas Ra12 y/o TRX se excluyeron del análisis. Para evaluar la presencia de inmunidad a WT1 , se determinó el Ab a proteínas de WT1 de tam año natural recombinante y truncadas en los sueros de las personas normales y pacientes con leucem ia. La reactividad de anticuerpos se analizó por reactividad de ELISA a la proteína de WT1 /tamaño natural , proteína de WT1 /N-térm ino y la proteína de WT1 /C-término. Solamente 2 de los 96 donadores normales tuvieron anticuerpos de suero reactivos con la proteína de WT1 /tamaño natural (Figura 1 8) . Una de esas personas tuvo anticuerpos a la proteína de WT1/N-térm ino y una tuvo anticuerpos a la proteína de WT1 /C-térm ino. En cam bio, 1 6 de 63 pacientes (25%) con AML tuvieron anticuerpos de suero con la proteína de WT1 /tamaño natural. En contraste marcado, solamente 2 de 63 pacientes (3%) tuvieron reactividad a la proteína de WT1 /C-término. Quince de 81 pacientes ( 19%) con CML tuvieron anticuerpos de suero reactivos con la proteína de WT1 /tamaño natural y 1 2 de 81 pacientes (1 5%) tuvieron anticuerpos de suero reactivos con proteína de WT1 /N-térm ¡no. Solamente 3 de 81 pacientes (3%) tuvieron reactividad con la proteína de WT1 /C-término. (Figuras 1 6 y 17) . Estos datos demostraron que las respuestas Ab a WT1 son detectables en algunos pacientes con AML y CML. La mayor incidencia de anticuerpos en pacientes con leucemia proporciona u na fuerte evidencia de que la Inm unización a la proteína de WT1 ocu rrió como resultado de pacientes q ue soportan malig nidades que expresan o en alg ún momento expresaron WT1 . Sin limitarse a teoría específica alg una, se considera que las respuestas de anticuerpos a WT1 observadas muy probablemente son resultado de pacientes que se vuelven inm unes a WT1 en sus propias células de leucem ia y proporcionan evidencia directa de que WT1 puede ser inm unogénica a pesar de ser una "auto" proteína. La presencia de anticuerpos a WT1 im plica fuertemente que las respuestas de células T auxiliares concurrentes se encuentren presentes también en los mism os pacientes. WT1 es u na proteína interna. Consecuentemente, las respuestas de CTL son propensas a ser más eficaces en términos de terapia de leucemia y el brazo más tóxico de la in m unidad . Consecuentemente, estos datos proporcionan evidencia de que las vacunas terapéuticas dirigidas contra VVT1 serán capaces de producir una respuesta inmunológica a WT1 . La mayoría de los anticuerpos detectados fueron reactivos con epítopes en el N-térm ino aunq ue solamente un peq ueño subgrupo de pacientes mostró una débil respuesta de anticuerpos al C-término. Esto es consistente con las observaciones en el modelo animal , donde la inmunización con péptidos derivó del anticuerpo producido por el N-término, respuestas de células T auxiliares y CTL, mientras q ue ning uno de los péptidos probados a partir del anticuerpo producido por el C-térm ino o las respuestas de células T (Gaiger et al. , Blood 96: 1 334,2000) .

EJ EMPLO 2 I NDUCCI ÓN DE ANTICUERPOS A WT1 EN RATON ES I NMU NIZADOS CON LÍNEAS CELULARES DE EXP RESIÓN DE WT1 Este Ejemplo ilustra el uso de células de expresión de WT1 para inducir una respuesta in vivo de anticuerpos de WT1 específico. La detección de anticuerpos existentes a WT1 en pacientes con leucemia denotó fuertemente q ue es posible inmunizar a la proteína de WT1 a fin de producir inm unidad a WT1 . Para probar si la inmunidad a WT1 puede generarse por vacunación, se inyectaron ratones con TRAMP-C , una línea celular tumorosa positiva a WT1 de origen B6. En resumen, se inm un izaron ratones B6 macho con 5*106 células TRAMP-C subcutáneamente y se aumentó con 5*1 06 células a intervalos de tres semanas. Tres semanas después de la inm unización final , se obtuvieron sueros y se prepararon suspensiones celulares individuales de bazos en un medio de RPMI 1 640 (G I BCO) con 25 µ ? de ß-2-mercaptoetanol, 200 unidades de penicilina por mi , 1 0 mM de L-glutamina, y suero bovino fetal al 10% . Después de la inmunización a TRAMP-C, fue detectable una respuesta de anticuerpos de WT1 específico en los animales inmunizados. Se muestra un Western Blot representativo en la Figura 3. Estos resultados muestran que la inmunización a la proteína de WT1 puede producir una respuesta inmunologica a la proteína de WT1.

EJEMPLO 3 INDUCCIÓN DE TH Y RESPUESTAS DE ANTICUERPOS EN RATONES INMUNIZADOS CON PÉPTIDOS DE WT1 Este Ejemplo ilustra la capacidad de inmunización con los péptidos de WT1 para producir una respuesta inmunologica específica para WTL Los péptidos adecuados para producir Ab y respuestas de células T proliferantes se identificaron de acuerdo con el programa Tsites (Rot bard y Taylor, EMBO J. 7:93-100, 1988; Deavin et al., Mol. Immunol. 33:145-155, 1996), el cual busca motivos de péptido que tengan potencial para producir respuestas de Th. Los péptidos mostrados en la Tabla I se sintetizaron y secuenciaron Tabla I Péptidos de WT1 Para la inmunización, los péptidos se agruparon como se explica a continuación: Grupo A: p6-22 humano: 10.9 mg en 1 ml (10pl=100pg) p1 17-139 humano/ratón: 7.6mg en 1 ml (14µ?= 100pg) p244-262 humano: 4.6mg en 1 ml (22 µ? = 100 pg) Grupo B: p287-301 humano/ratón: 7.2mg en 1 ml (14pl=100pg) p299-313 de ratón: 6.6mg en 1 ml (1 5 µ? = 100Mg) p421 -435 humano/ratón: 3.3mg en 1 mi (30 l=100µg) Control: (100 pg de péptido de FBL) + CFA/I FA Control: (100 pg de péptido de CD45) + CFA/I FA El Grupo A contuvo péptidos presentes en la porción del término amino de WT1 (exón 1 ) y el Grupo B contuvo péptidos presentes en el término carboxi, el cual contiene una región de cuatro dedos de cinc con homología de secuencia a otras proteínas de unión de ADN. En el grupo B, p287-301 y p299-313 se derivaron del exón 7, el dedo de cinc 1, y p421-435 se derivaron del exón 10, del dedo de cinc IV. Los ratones B6 se inmunizaron con un grupo de péptidos de WT1 o con un péptido de control. Los péptidos se disolvieron en 1ml de agua estéril para la inyección, y se inmunizaron los ratones B6 3 veces a intervalos de tres semanas. Los adyuvantes utilizados fueron CFA/IFA, GM-CSF, y Montinide. La presencia de anticuerpos específicos para WT1 se determinó después como se describe en los Ejemplos 1 y 2, y se evaluaron las respuestas de células T proliferantes utilizando una prueba convencional de incorporación de timidina, en la cual se cultivaron las células en presencia de antígeno y se evaluó la proliferación midiendo la radioactividad incorporada (Chen et al., Cáncer Res. 54:1065-1070, 1994). En particular, se cultivaron los linfocitos en placas de 96 cavidades a 2*105 células por cavidad con 4*105 células de bazo singenéico irradiadas (3000 rads) y el péptido designado. La inmunización de ratones con el grupo de péptidos designados como Grupo A produjo una respuesta de anticuerpos a WT1 (Figura 4). No se detectaron anticuerpos después de la inmunización a la Vacuna B, la cual es consistente con la carencia de una respuesta de células T auxiliares derivada de la inmunización con la Vacuna B. P117-139 produjo respuestas de células T proliferantes (Figuras 5A-5C). Los índices de estimulación (SI) variaron entre 8 y 72. Otros péptidos (P6-22 y P299-313) mostraron también producir respuestas de células T proliferantes. La inmunización con P6-22 dio como resultado un índice de estimulación (SI) de 2.3 y la inmunización con P299-313 dio como resultado un SI de 3.3. Los controles positivos incluyeron células T estimuladas ConA, así como también células T estimuladas con antígenos conocidos, tales como CD45 y FBL, y las líneas alogénicas de células T (DeBruijin et al., Eur. J. ímmunol. 27:2963-2970, 1991). Las Figuras 6A y 6B muestran la respuesta proliferante observada para cada uno de los tres péptidos en la vacuna A (Figura 6A) y la vacuna B (Figura 6B). La Vacuna A produjo respuestas de células T proliferantes a los péptidos inmunizantes p6-22 y p 117-139, con índices de estimulación (SI) que varían entre 3 y 8 (líneas masivas). No se detectó ninguna respuesta proliferante a p244-262 (Figura 6A). Se llevaron a cabo estimulaciones in vitro subsecuentes como estimulaciones de péptido individuales utilizando solamente p6-22 y p1 7-139. La estimulación de la línea de células T específica de la Vacuna A con p117- 39 dio como resultado la proliferación a p117-139 sin respuesta a p6-22 (Figura 7A). Los clones derivados de la línea fueron específicos para p 17-139 (Figura 7B). En cambio, la estimulación de la línea de células T específica de la Vacuna A con p6-22 dio como resultado en la proliferación a p6-22 sin respuesta a p117-139 (Figura 7C). Los clones derivados de la línea fueron específicos para p6-22 (Figura 7D). Estos resultados muestran que la vacunación con péptidos de WT1 pueden producir respuestas de anticuerpos a la proteína WT1 y respuestas de células T proliferantes a los péptidos inmunizantes.

EJEMPLO 4 IN DUCCIÓN DE RESPUESTAS DE CTL EN RATONES I NMUNIZADOS CON PÉPTI DOS WT1 Este Ejemplo ¡lustra la capacidad de los péptidos de WT1 para producir inm u nidad de CTL. Los péptidos (9-meros) con motivos apropiados para unirse a la M HC clase I se identificaron utilizando un análisis de predicción de unión de péptido BIMAS HLA (Parker et al. , J. Immunol. 152: 133, 1994). Los péptidos identificados en tales análisis se muestran en las Tablas I I-XLIV. En cada una de estas tablas, la puntuación refleja la afinidad de unión teórica (medio tiempo de disociación) del péptido a lá molécula MHC indicada. Los péptidos identificados utilizando el programa Tsites (Rothbard y Taylor, EMBO J. 7:93-1 00, 1 988; Deavin et al . , Mol. Immunol. 33: 145-155, 1 996), el cual busca motivos de péptido que tengan el potencial de producir respuestas de Th se m uestran tam bién en las Figuras 8A y 8B, y la Tabla XLV.

Tabla II Resultados del Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano parpara HLA A1 Humano.

Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 137 CLESQPAIR (NO DE 18.000 ID DE SEC: 47) 2 80 GAEPHEEQC (NO DE 9.000 ID DE SEC:87) 3 40 FAPPGASAY (NO DE 5.000 ID DE SEC:74) 4 354 QCDFKDCER (NO DE 5.000 ID DE SEC:162) 5 2 GSDVRDLNA (NO DE 3.750 ID DE SEC:101) 6 152 VTFDGTPSY (NO DE 2.500 ID DE SEC:244) 7 260 WTEGQSNHS (NO 2.250 DE ID DE SEC:247) 8 409 TSEKPFSCR (NO DE 1.350 ID DE SEC:232) 9 73 KQEPSWGGA (NO 1.350 DE ID DE SEC:125) 10 386 KTCQRKFSR (NO DE 1.250 ID DE SEC:128) 11 37 VLDFAPPGA (NO DE 1.000 ID DE SEC:241) 12 325 CAYPGCNKR (NO DE 1.000 ID DE SEC:44) 13 232 QLECMTWNQ (NO 0.900 DE ID DE SEC: 167) 14 272 ESDNHTTPI (NO DE 0.750 ID DE SEC:71) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 15 366 RSDQLKRHQ (NO DE 0.750 ID DE SEC:193) 16 222 SSDNLYQMT (NO DE 0.750 ID DE SEC:217) 17 427 RSDELVRHH (NO DE 0.750 ID DE SEC:191) 18 394 RSDHLKTHT (NO DE 0.750 ID DE SEC:192) 19 317 TSEKRPFMC (NO DE 0.675 ID DE SEC.-233) 20 213 QALLLRTPY (NO DE 0.500 ID DE SEC:160) Tabla ill Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos de WT1 Humano para HLA A 020 Humano.

Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia 1 126 RMFPNAPYL (NO DE 313.968 ID DE SEC:185) 2 187 SLGEQQYSV (NO DE 285.163 ID DE SEC:214) 3 10 ALLPAVPSAL (NO DE 181.794 ID DE SEC: 34) 4 242 NLGATLKGV (NO DE ID 159.970 DE SEC: 146) 5 225 NLYQMTSQL (NO DE 68.360 ID DE SEC: 147) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 6 292 GVFRGIQDV (NO DE 51.790 ID DE SEC: 103) 7 191 QQYSVPPPV (NO DE 22.566 ID DE SEC: 171) 8 280 ILCGAQYRI (NO DE 17.736 ID DE SEC: 116) 9 235 CMTWNQMNL (NO 15.428 DE ID DE SEC: 49) 10 441 NMTKLOLAL (NO DE 15.428 ID DE SEC: 149) 11 7 DLNALLPAV (NO DE 11.998 ID DE SEC: 58) 12 227 YQMTSQLEC (NO DE 8.573 ID DE SEC: 251) 13 239 NQMNLGATL (NO DE 8.014 ID DE SEC: 151) 14 309 TLVRSASET (NO DE 7.452 ID DE SEC: 226 15 408 KTSEKPFSC (NO DE 5.743 ID DE SEC: 129) 16 340 LQMHSRKHT (NO DE 4.752 ID DE SEC: 139) 17 228 QMTSQLECM (NO DE 4.044 ID DE SEC: 169) 18 93 TVHFSGQFT (NO DE 3.586 ID DE SEC: 235) 19 37 VLDFAPPGA (NO DE 3.378 ID DE SEC: 241) 20 86 EQCLSAFTV (NO DE 3.068 ID DE SEC: 69) Tabla IV Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para HLA A 0205 Humano.

Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 10 ALLPAVPSL (NO DE 42.000 ID DE SEC:34) 2 292 GVFRGIQDV (NO DE 24.000 ID DE SEC-.103) 3 126 RMFPNAPYL (NO DE 21.000 ID DE SEC:185) 4 225 NLYQMTSQL (NO DE 21.000 ID DE SEC:147) 5 239 NQMNLGATL (NO DE 16.800 ID DE SEC 51) 6 302 RVPGVAPTL (NO DE 14.000 ID DE SEC:195) 7 441 NMT LQLAL (NO DE 7.000 ID DE SEC:149) 8 235 CMTWNQMNL (NO 7.000 DE ID DE SEC:49) 9 187 SLGEQQYSV (NO DE 6.000 ID DE SEC:214) 10 191 QQYSVPPPV (NO DE 4.800 ID DE SEC:171) 11 340 LQMHSRKHT (NO DE 4.080 ID DE SEC:139) 12 242 NLGATLKGV (NO DE 4.000 ID DE SEC:146) 13 227 YQMTSQLEC (NO DE 3.600 ID DE SEC:251) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 14 194 SVPPPVYGC (NO DE 2.000 ID DE SEC:218) 15 93 TVHFSGQFT (NO DE 2.000 ID DE SEC:235) 16 280 ILCGAQYRI (NO DE 1.700 ID DE SEC:116) 17 98 GQFTGTAGA (NO DE 1.200 ID DE SEC:99) 18 309 TLVRSASET (NO DE 1.000 ID DE SEC:226) 19 81 AEPHEEQCL (NO DE 0.980 ID DE SEC:30) 20 73 KQEPSWGGA (NO 0.960 DE ID DE SEC:125) Tabla V Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para HLA A24 Humano.

Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 302 RVPGVAPTL (NO DE ID DE 16.800 SEC: 195) 2 218 RTPYSSDNL (NO DE ID DE 12.000 SEC: 194) 3 356 DFKDCERRF (NO DE ID DE 12.000 SEC: 55) 4 126 RMFPNAPYL (NO DE ID DE 9.600 SEC: 185) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 5 326 AYPGCNKRY (NO DE 7.500 ID DE SEC: 42) 6 270 GYESDNHT (NO DE 7.500 ID DE SEC: 106)T 7 239 NQMNLGATL (NO DE 7.200 ID DE SEC: 151) 8 10 ALLPAVPSL (NO DE 7.200 ID DE SEC: 34) 9 130 NAPYLPSCL (NO DE 7.200 ID DE SEC: 144) 10 329 GCNKRYFKL (NO DE 6.600 ID DE SEC: 90) 11 417 RWPSCQKKF (NO DE 6.600 ID DE SEC: 196) 12 47 AYGSLGGPA (NO DE 6.000 ID DE SEC: 41) 13 180 DPMGQQGSL (NO 6.000 DE ID DE SEC: 59) 14 4 DVRDLNALL (NO DE 5.760 ID DE SEC: 62) 15 285 QYRIHTHGV (NO DE 5.000 ID DE SEC: 175) 16 192 QYSVPPPVY (NO DE 5.000 ID DE SEC: 176) 17 207 DSCTGSQAL (NO DE 4.800 ID DE SEC: 61) 18 441 NMTKLQLAL (NO DE 4.800 ID DE SEC: 149) 19 225 NLYQMTSQL (NO DE 4.000 ID DE SEC: 147) 20 235 CMTW Q L (NO 4.000 DE ID DE SEC:49) Tabla VI Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para HLA A3 Humano.

Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 436 NMHQRNMTK (NO 40.000 DE ID DE SEC: 148) 2 240 Q NLGATL (NO DE 20.000 I D DE SEC: 168) 3 88 CLSAFTVH F (N O DE 6.000 ID DE SEC: 48) 4 126 RMFPNAPYL (NO DE 4.500 I D DE SEC: 185) 5 169 AQFPNHSFK (NO DE 4.500 I D DE SEC: 36) 6 10 ALLPAVPSL (NO DE 4.050 ID DE SEC: 34) 7 137 CLESQPAIR (NO DE 4.000 ID DE SEC: 47) 8 225 N LYQMTSQL (NO DE 3.000 I D DE SEC: 147) 9 32 AQWAPVLDF (NO DE 2.700 ID D E SEC: 37) 10 280 I LCGAQYRI (NO DE 2.700 I D DE SEC: 1 16) 1 1 386 KTCQRKFSR (NO DE 1 .800 ID DE SEC: 128) 12 235 CMTWNQMNL (NO 1 .200 DE ID DE SEC: 49) 13 441 N MTKLQLAL (NO DE 1.200 I D DE SEC: 149) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del medio Inicial Residuo Subsecuente tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 14 152 VTFDGTPSY (NO DE ID 1.000 DE SEC: 244) 15 187 SLGEQQYSV (NO DE ID 0.900 DE SEC: 214) 16 383 FQCKTCQRK (NO DE ID 0.600 DE SEC: 80) 17 292 GVFRGIQDV (NO DE ID 0.450 DE SEC: 103) 18 194 SVPPPVYGC (NO DE ID 0.405 DE SEC: 218) 19 287 RIHTHGVFR (NO DE ID 0.400 DE SEC: 182) 20 263 GQSNHSTGY (NO DE ID 0.360 DE SEC: 100) Tabla VII Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BI AS HLA para la Unión de Péptidos de WT1 Humano para HLA A68 Humano Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 100 FTGTAGACR (NO DE 100.000 ID DE SEC: 84) 2 386 KTCQRKFSR (NO DE 50.000 ID DE SEC: 128) 3 368 DQLKRHQRR (NO DE 30.000 ID DE SEC: 60) 4 312 RSASETSEK (NO DE 18.000 ID DE SEC: 190) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 5 337 LSHLQMHSR (NO DE 15.000 ID DE SEO: 141) 6 364 FSRSDQL R (NO DE 15.000 ID DE SEC: 83) 7 409 TSEKPFSCR (NO DE 15.000 ID DE SEC: 232) 8 299 DVRRVPGVA (NO DE 12.000 ID DE SEC: 63) 9 4 DVRDLNALL (NO DE 12.000 ID DE SEC: 62) 10 118 SQASSGQAR (NO DE 10.000 ID DE SEC: 216) 11 343 HSRKHTGEK (NO DE 9.000 ID DE SEC: 111) 12 169 AQFPNHSFK (NO DE 9.000 ID DE SEC: 36) 13 292 GVFRGIQDV (NO DE 8.000 ID DE SEC: 103) 14 325 CAYPGCNKR (NO DE 7.500 ID DE SEC: 44) 15 425 FARSDELVR (NO DE 7.500 ID DE SEC:75) 16 354 QCDFKDCER (NO DE 7.500 ID DE SEC: 162) 17 324 MCAYPGCNK (NO DE 6.000 ID DE SEC: 142) 18 251 AAGSSSSVK (NO DE 6.000 ID DE SEC: 28) 19 379 GVKPFQCKT (NO DE 6.000 ID DE SEC: 104) 20 137 CLESQPAIR (NO DE 5.000 ID DE SEC: 47) Tabla VIII Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos de WT1 Humano para HLA A 1101 Humano Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 386 KTCQRKFSR (NO DE 1.800 ID DE SEC: 128) 2 169 AQFPNHSFK (NO DE 1.200 ID DE SEC: 36) 3 436 N HQRNMTK (NO 0.800 DE ID DE SEC: 148) 4 391 KFSRSDHLK (NO DE 0.600 ID DE SEC: 120) 5 373 HQRRHTGV (NO DE 0.600 ID DE SEC: 109) 6 383 FQCKTCQRK (NO DE 0.600 . ID DE SEC: 80) 7 363 RFSRSDQL (NO DE 0.600 ID DE SEC: 178) 8 240 QMNLGATLK (NO DE 0.400 ID DE SEC: 168) 9 287 RIHTHGVFR (NO DE 0.240 ID DE SEC: 182) 10 100 FTGTAGACR (NO DE 0.200 ID DE SEC: 84) 11 324 MCAYPGCNK (NO DE 0.200 ID DE SEC: 142) 12 251 AAGSSSSV (NO DE 0.200 ID DE SEC: 28) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 13 415 SCRWPSCQK (NO 0.200 DE ID DE SEC: 201) 14 1 8 SQASSGQAR (NO DE 0.120 ID DE SEC: 216) 15 292 GVFRGIQDV (NO DE 0.120 ID DE SEC: 103) 16 137 CLESQPAIR (NO DE 0.080 ID DE SEC: 47) 17 425 FARSDELVR (NO DE 0.080 ID DE SEC: 75) 18 325 CAYPGCNKR (NO DE 0.080 ID DE SEC: 44) 19 312 RSASETSEK (NO DE 0.060 ID DE SEC: 190) 20 65 PPPPHSFI (NO DE ID 0.060 DE SEC: 156)K Tabla IX Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido B1MAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humanos para HLA A 3101 Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 386 KTCQRKFSR (NO DE 9.000 ID DE SEC: 128) 2 287 RIHTHGVFR (NO DE 6.000 ID DE SEC: 182) 3 137 CLESQPAIR (NO DE 2.000 ID DE SEC: 47) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 4 118 SQASSGQAR (NO DE 2.000 ID DE SEC: 216) 5 368 DQLKRHQRR (NO DE 1.200 ID DE SEC: 60) 6 00 FTGTAGACR (NO DE 1.000 ID DE SEC: 84 7 293 VFRGIQDVR (NO DE 0.600 ID DE SEC: 238) 8 325 CAYPGCNKR (NO DE 0.600 ID DE SEC:44) 9 169 AQFPNHSFK (NO DE 0.600 ID DE SEC: 36) 10 279 PILCGAQYR (NO DE 0.400 ID DE SEC: 155) 11 436 NMHQRNMTK (NO 0.400 DE ID DE SEC: 148) 12 425 FARSDELVR (NO DE 0.400 ID DE SEC: 75) 13 32 AQWAPVLDF (NO DE 0.240 ID DE SEC: 37) 14 240 QMNLGATLK (NO DE 0.200 ID DE SEC: 168) 15 354 QCDFKDCER (NO DE 0.200 ID DE SEC:162) 16 373 HQRRHTGVK (NO DE 0.200 ID DE SEC: 109) 17 383 FQCKTCQRK (NO DE 0.200 ID DE SEC: 80) 18 313 SASETSEKR (NO DE 0.200 ID DE SEC: 197) 19 358 KDCERRFSR (NO DE 0.180 ID DE SEC: 118) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 20 391 KFSRSDHLK (NO DE 0.180 ID DE SEC: 120) Tabla X Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIIUIAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para HLA A 3302 Humano Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 337 LSHLQMHSR (NO DE 15.000 ID DE SEC: 141) 2 409 TSEKPFSCR (NO DE 15.000 ID DE SEC:232 3 364 FSRSDQLKR (NO DE 15.000 ID DE SEC: 83) 4 137 CLESQPAIR (NO DE 9.000 ID DE SEC: 47) 5 368 DQLKRHQRR (NO DE 9.000 ID DE SEC: 60) 6 287 RIHTHGVFR (NO DE 4.500 ID DE SEC: 182) 7 210 TGSQALLLR (NO DE 3.000 ID DE SEC: 223) 8 425 FARSDELVR (NO DE 3.000 ID DE SEC.-75) 9 313 SASETSEKR (NO DE 3.000 ID DE SEC: 197) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 10 293 VFRGIQDVR (NO DE 3.000 ID DE SEC: 238) 11 354 QCDFKDCER (NO DE 3.000 ID DE SEC:162) 12 100 FTGTAGACR (NO DE 3.000 ID DE SEC: 84) 13 118 SQASSGQAR (NO DE 3.000 ID DE SEC: 216) 14 325 CAYPGCNKR (NO DE 3.000 ID DE SEC: 44) 15 207 DSCTGSQAL (NO DE 1.500 ID DE SEC: 61 16 139 ESQPAIRNQ (NO DE 1.500 ID DE SEC: 72) 17 299 DVRRVPGVA (NO DE 1.500 ID DE SEC: 63) 18 419 PSCQKKFAR (NO DE 1.500 ID DE SEC: 159) 19 272 ESDNHTTPI (NO DE 1.500 ID DE SEC:71) 20 4 DVRDLNALL (NO DE 1.500 ID DE SEC: 62) Tabla XI Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para HLA B14 Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 362 RRFSRSDQL (NO DE 1.000.000 ID DE SEC: 187) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 2 332 KRYFKLSHL (NO DE 300.000 ID DE SEC: 127) 3 423 KKFARSDEL (NO DE 150.000 ID DE SEC: 122) 4 390 RKFSRSDHL (NO DE 150.000 ID DE SEC: 183) 5 439 QRNMTKLQL (NO DE 20.000 ID DE SEC: 173) 6 329 GCNKRYFKL (NO DE 10.000 ID DE SEC: 90) 7 10 ALLPAVPSAL (NO DE 10.000 ID DE SEC: 34) 8 180 DPMGQQGSL (NO 9.000 DE ID DE SEC: 59) 9 301 RRVPGVAPT (NO DE 6.000 ID DE SEC: 189) 10 126 RMFPNSPYL (NO DE 5.000 ID DE SEC: 185) 11 371 KRHQRRHTG (NO DE 5.000 ID DE SEC: 126) 12 225 NLYQMTSQL (NO DE 5.000 ID DE SEC: 147) 13 144 IRNQGYSTV (NO DE 4.000 ID DE SEC: 117) 14 429 DELVRHHNM (NO DE 3.000 ID DE SEC: 53) 15 437 MHQRNMTKL (NO DE 3.000 ID DE SEC: 143) 16 125 AR FPNAPY (NO DE 3.000 ID DE SEC: 38) 17 239 NQMNLGATL (NO DE 3.000 ID DE SEC: 151) 18 286 YRIHTHGVF (NO DE 3.000 ID DE SEC: 252) 19 174 HSFKHEDP (NO DE 3.000 ID DE SEC: 110) 20 372 RHQRRHTGV (NO DE 3.000 ID DE SEC: 181) Tabla Xll Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptído BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para HLA B40 Humano Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 81 AEPHEEQCL (NO DE 40.000 ID DE SEC: 30) 2 429 DELVRHHNM (NO DE 24.000 ID DE SEC: 53) 3 410 SEKPFSCRW (NO DE 20.000 ID DE SEC: 207) 4 318 SE RPFMCA (NO DE 15.000 ID DE SEC: 208) 5 233 LECMTWNQ (NO 12.000 DE ID DE SEC: 131) 6 3 SDVRDLNAL (NO DE 10.000 ID DE SEC: 206) 7 349 GEKPYQCDF (NO DE 8.000 ID DE SEC: 91) 8 6 RDLNALLPA (NO DE 5.000 ID DE SEC: 177) 9 85 EEQCLSAFT (NO DE 4.000 ID DE SEC: 65) 10 315 SETSEKRPF (NO DE 4.000 ID DE SEC: 209) 11 261 TEGQSNHST (NO DE 4.000 ID DE SEC: 221) 12 23 GCALPVSGA (NO DE 3.000 ID DE SEC: 89) 13 38 LDFAPPGAS (NO DE 3.000 ID DE SEC:130) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del I nicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 14 273 SDNHTTPI L (NO DE 2.500 I D DE SEC: 204) 15 206 TDSCTGSQA (NO DE 2.500 I D DE SEC: 220) 16 24 CALPVSGAA (NO DE 2.000 I D DE SEC: 43) 1 7 98 GQFTGTAGA (NO DE 2.000 I D DE S EC: 99) 18 30 GAAQWAPVL (NO DE 2.000 I D DE SEC: 86) 19 84 H EEQCLSAF (NO DE 2.000 I D DE SEC: 107) 20 26 LPVSGAAQW (NO DE 2.000 ID DE SEC: 138) Tabla XIII Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 H umano para HLA B60 Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del I nicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 81 AEPHEEQCL (NO DE 160.000 I D DE SEC: 30) 2 3 SDVRDLNAL (NO DE 40.000 ID DE SEC: 206) 3 429 DELVRHHNM (NO DE 40.000 I D DE SEC: 53) 4 233 LECMTWNQM (NO 22.000 DE I D DE SEC: 1 31 ) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 5 273 SDNHTTPIL (NO DE 20.000 ID DE SEC: 204) 6 209 CTGSQALLL (NO DE 8.000 ID DE SEC: 52) 7 30 GAAQWAPVL (NO DE 8.000 ID DE SEC: 86) 8 318 SEKRPFMCA (NO DE 8.000 ID DE SEC: 208) 9 180 DMPGQQGSL (NO 8.000 DE ID DE SEC: 59) 10 138 LESQPAIRN (NO DE 5.280 ID DE SEC: 132) 11 239 NQMLLGATL (NO DE 4.400 ID DE SEC: 151) 12 329 GCNKRYFKL (NO DE 4.400 ID DE SEC: 90) 13 130 NAPYLPSCL (NO DE 4.400 ID DE SEC: 144) 14 85 EEQCLSAFT (NO DE 4.400 ID DE SEC: 65) 15 208 SCTGSQALL (NO DE .4.000 ID DE SEC: 202) 16 207 DSCTGSQAL (NO DE 4.000 ID DE SEC: 61) 17 218 RTPYSSDNL (NO DE 4.000 ID DE SEC: 194) 18 261 TEGQSNHST (NO DE 4.000 ID DE SEC: 221) 19 18 LGGGGGCAL (NO DE 4.000 ID DE SEC: 134) 20 221 YSSDNLYQ (NO DE 2.200 ID DE SEC: 253) Tabla XIV Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptídos WT1 Humano para HLA B61 Humano Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 318 SEKRPFMCA (NO DE 20.000 ID DE SEC: 208) 2 429 DELVRHHNM (NO DE 16.000 ID DE SEC: 53) 3 298 QDVRRVPGV (NO DE 10.000 ID DE SEC: 164) 4 81 AEPHEEQCL (NO DE 8.000 ID DE SEC: 30) 5 233 LEC TWNQM (NO 8.000 DE ID DE SEC: 131) 6 6 RDLNALLPA (NO DE 5.500 ID DE SEC: 177) 7 85 EEQCLSAFT (NO DE 4.000 ID DE SEC: 65) 8 261 TEGQSNHST (NO DE 4.000 ID DE SEC: 221) 9 206 TDSCTGSQA (NO DE 2.500 ID DE SEC: 220) 10 295 RGIQDVRRV (NO DE 2.200 ID DE SEC: 179) 11 3 SDVRDLNAL (NO DE 2.000 ID DE SEC: 206) 12 250 VAAGSSSSV (NO DE 2.000 ID DE SEC: 236) 13 29 SGAAQWAPV (NO DE 2.000 ID DE SEC: 211) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del I nicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 14 315 SETSEKRPF (NO DE 1 .600 ID DE SEC: 209) 15 138 LESQPAI RN (NO DE 1.200 ID DE SEC: 132) 16 244 GATLKGVAA (NO DE 1 .100 I D DE SEC: 88) 17 20 GGGGCALPV (NO DE 1. 100 I D DE SEC: 92) 18 440 RNMTKLQLA (NO DE 1.100 ID DE SEC: 186) 1 9 23 GCALPVSGA (NO DE 1 .100 I D DE SEC: 89) 20 191 QQYSVPPPV (NO DE 1 .000 I D DE SEC: 171 ) Tabla XV Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para HLA B6 Humano Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 146 NQGYSTVTF (NO DE 21 1.200 ID DE SEC: 150) 2 32 AQWAPVLDF (NO DE 96.000 I D DE SEC: 37) 3 263 GQSNHSTGY (NO DE 96.000 ID DE SEC: 100) 4 88 CLSAFTVH F (NO DE 96.000 I D DE SEC: 48) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 5 17 SLGGGGGCA (NO DE 9.600 ID DE SEC: 215) 6 239 NQMNLGATL (NO DE 8.800 ID DE SEC: 151) 7 191 QQYSVPPPV (NO DE 8.000 ID DE SEC: 171) 8 98 GQFTGTAGA (NO DE 8.000 ID DE SEC: 99) 9 384 QCKTQRKF (NO DE 6.000 ID DE SEC: 163) 10 40 FAPPGASAY (NO DE 4.800 ID DE SEC: 74) 11 227 YQMTSQLEC (NO DE 4.800 ID DE SEC: 251) 12 187 SLGEQQYSV (NO DE 4.400 ID DE SEC: 214) 13 86 EQCLSAFTV (NO DE 4.400 ID DE SEC: 69) 14 152 VTFDGTPSY (NO DE 4.400 ID DE SEC: 244) 15 101 TGTAGACRY (NO DE 4.000 ID DE SEC: 224) 16 242 NLGATLKGV (NO DE 4.000 ID DE SEC: 146) 17 92 FTVHFSGQF (NO DE 4.000 ID DE SEC: 85) 18 7 DLNALLPAV (NO DE 4.000 ID DE SEC: 58) 19 123 GQAR FPNA (NO DE 4.000 ID DE SEC: 98) 20 280 ILCGAQYRI (NO DE 3.120 ID DE SEC: 116) Tabla XVI Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para HLA B7 Humano.

Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 180 DPMGQQGSL (NO 240.000 DE ID DE SEC: 59) 2 4 DVRDLNALL (NO DE 200.000 ID DE SEC: 62) 3 302 RVPGVAPTL (NO DE 20.000 ID DE SEC: 195) 4 30 GAAQWAPVL (NO DE 12.000 ID DE SEC: 86) 5 239 NQMNLGATL (NO DE 12.000 ID DE SEC: 151) 6 130 NAPYLPSCL (NO DE 12.000 ID DE SEC: 144) 7 10 ALLPAVPSL (NO DE 12.000 ID DE SEC: 34) 8 299 DVRRVPGVA (NO DE 5.000 ID DE SEC: 63) 9 208 SCTGSQALL (NO DE 4.000 ID DE SEC: 202) 10 303 VPGVAPTLV (NO DE 4.000 ID DE SEC: 242) 11 18 LGGGGGCAL (NO DE 4.000 ID DE SEC: 134) 12 218 RTPYSSDNL (NO DE 4.000 ID DE SEC: 194) 13 207 DSCTGSQAL (NO DE 4.000 ID DE SEC: 61) 14 209 CTGSQALLL (NO DE 4.000 ID DE SEC: 52) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 15 329 GCN KRYFKL (NO DE 4.000 I D DE SEC: 90) 16 235 CMTWNQMNL (NO 4.000 DE ID DE SEC: 49) 17 44 NMTKLQLAL (NO DE 4.000 I D DE SEC: 149) 18 126 RMFPNAPYL (NO DE 4.000 ID DE SEC: 185) 1 9 225 N LYQMTSQL (NO DE 4.000 I D DE SEC: 147) 20 143 AI RNQGYST (NO DE 3.000 I D DE SEC: 33) Tabla XVI I Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido B I MAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para H LA B8 Humano.

Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del I nicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 329 GCNKRYFKL (NO DE 16.000 ID DE SEC: 90) 2 4 DVRDLNALL (NO DE 12.000 I D DE SEC: 62) 3 316 ETSEKRPF (NO DE 3.000 I D DE SEC: 73) 4 1 80 DPMGQQGSL (NO 1.600 DE I D DE SEC: 59) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 5 208 SCTGSQALL (NO DE 0.800 ID DE SEC: 202) 6 130 NAPYLPSCL (NO DE 0.800 ID DE SEC: 144) 7 244 GATLKGVAA (NO DE 0.800 ID DE SEC: 88) 8 30 GAAQWAPVL (NO DE 0.800 ID DE SEC: 86) 9 299 DVRRVPGVA (NO DE 0.400 ID DE SEC: 63) 10 420 SCQKKFARS (NO DE 0.400 ID DE SEC: 200) 11 387 TCQRKFSRS (NO DE 0.400 ID DE SEC: 219) 12 225 NLYQMTSQL (NO DE 0.400 ID DE SEC: 147) 13 141 QPAIRNQGY (NO DE 0.400 ID DE SEC: 170) 14 10 ALLPAVPSL (NO DE 0.400 ID DE SEC: 34) 15 207 DSCTGSQAL (NO DE 0.400 ID DE SEC: 61) 16 384 QCKTQRKF (NO DE 0.400 ID DE SEC: 163) 17 136 SCLESQPAI (NO DE 0.300 ID DE SEC:198) 18 347 HTGEKPYQC (NO DE 0.300 ID DE SEC: 112). 19 401 HTRTHTGKT (NO DE 0.200 ID DE SEC: 114) 20 332 KRYFKLSHL (NO DE 0.200 ID DE SEC: 127) Tabla XVIII Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para HLA B 2702 Humano.

Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 332 KRYF LSHL (NO DE 900.000 ID DE SEC: 127) 2 362 RRFSRSDQL (NO DE 900.000 ID DE SEC: 187) 3 286 YRIHTHGVF (NO DE 200.000 ID DE SEC: 252) 4 125 ARMFPNAPY (NO DE 200.000 ID DE SEC: 38) 5 375 RRHTGVKPF (NO DE 180.000 ID DE SEC: 188) 6 32 AQWAPVLDF (NO DE 100.000 ID DE SEC: 37) 7 301 RRVPGVAPT (NO DE 60.000 ID DE SEC: 189) 8 439 QRNMTKLQL (NO DE 60.000 ID DE SEC: 173) 9 126 RMFPNAPYL (NO DE 22.500 ID DE SEC:185) 10 426 ARSDELVRH (NO DE 20.000 ID DE SEC: 39) 11 146 NQGYSTVTF (NO DE 20.000 ID DE SEC: 150) 12 144 IRNQGYSTV (NO DE 20.000 ID DE SEC: 117) 13 389 QRKFSRSDH (NO DE 20.000 ID DE SEC: 172) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del I nicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 14 263 GQSNHSTGY (NO DE 20.000 I D DE SEC: 100) 15 416 CRWPSCQKK (NO 20.000 DE I D DE SEC: 50) 16 191 QQYSVPP PV (NO DE 10.000 I D DE SEC: 171 ) 17 217 LRTPYSSDN (NO DE 10.000 I D DE SEC: 140) 18 107 CRYGPFGPP (NO DE 10.000 I D DE SEC: 51 ) 19 98 GQFTGTAGA (NO DE 10.000 ID DE SEC: 99) 20 239 NQMNLGATL (NO DE 6.000 I D DE SEC: 151 ) Tabla XIX Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para HLA B 2705 Humano Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 332 KRYFKLSHL (NO DE 30000.000 ID DE SEC: 127) 2 362 RRFSRSDQL (NO DE 30000.000 ID DE SEC: 1 87) 3 416 CRWPSCQKK (NO 10000.000 DE ID DE SEC: 50) 4 439 QRNMTKLQL (NO DE 2000.000 ID DE SEC: 173) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 5 286 YRIHTHGVF (NO DE 1000.000 ID DE SEC: 252) 6 125 ARMFPNAPY (NO DE 1000.000 ID DE SEC: 38) 7 294 FRGIQDVRR (NO DE 1000.000 ID DE SEC: 81) 8 432 VRHHNMHQR (NO 1000.000 DE ID DE SEC: 243) 9 169 AQFPNHSFK (NO DE 1000.000 ID DE SEC: 36) 10 375 RRHTGVKPF (NO DE 900.000 ID DE SEC: 188) 11 126 RMFPNAPYL (NO DE 750.000 ID DE SEC: 185) 12 144 IRNQGYSTV (NO DE 600.000 ID DE SEC: 117) 13 301 RRVPGVAPT (NO DE 600.000 ID DE SEC: 189) 14 32 AQWAPVLDF (NO DE 500.000 ID DE SEC: 37) 15 191 QQYSVPPPV (NO DE 300.000 ID DE SEC: 171) 16 373 HQRRHTGVK (NO DE 200.000 ID DE SEC: 109) 17 426 ARSDELVRH (NO DE 200.000 ID DE SEC: 39) 18 383 FQCKTCQRK (NO DE 200.000 ID DE SEC: 80) 19 239 NQMNLGATL (NO DE 200.000 ID DE SEC: 151) 20 389 QRKFSRSDH (NO DE 200.000 ID DE SEC: 172) Tabla XX Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para HLA B 3501 Humano Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 278 TPILCGAQY (NO DE 40.000 ID DE SEC: 227) 2 141 QPAIRNQGY (NO DE 40.000 ID DE SEC: 170) 3 219 TPYSSDNLY (NO DE 40.000 ID DE SEC: 231) 4 327 YPGCNKRYF (NO DE 20.000 ID DE SEC: 250) 5 163 TPSHHAAQF (NO DE 20.000 ID DE SEC: 228) 6 180 DPMGQQGSL (NO 20.000 DE ID DE SEC: 59) 7 221 YSSDNLYQM (NO DE 20.000 ID DE SEC: 253) 8 26 LPVSGAAQW (NO DE 10.000 ID DE SEC: 138) 9 174 HSFKHEDPM (NO DE 10.000 ID DE SEC: 110) 10 82 EPHEEQCLS (NO DE 6.000 ID DE SEC: 68) 11 213 QALLLRTPY (NO DE 6.000 ID DE SEC:160) 12 119 QASSGQARM (NO 6.000 DE ID DE SEC: 161) 13 4 DVRDLNALL (NO DE 6.000 ID DE SEC: 62) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 14 40 FAPPGASAY (NO DE 6.000 ID DE SEC:74) 15 120 ASSGQARMF (NO DE 5.000 I D DE SEC: 40) 16 207 DSCTGSQAL (NO DE 5.000 I D DE SEC: 61 ) 17 303 VPGVAPTLV (NO DE 4.000 ID DE SEC: 242) 1 8 316 ETSEKRPFM (NO DE 4.000 I D DE SEC: 73) 19 1 52 VTFDGTPSY (NO DE 4.000 I D DE SEC:244) 20 412 KPFSCRWPS (NO DE 4.000 I D DE SEC: 123) Tabla XXI Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido B I MAS H LA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para HLA B 3701 H umano Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del I nicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 3 SDVRDLNAL (NO DE 40.000 ID DE SEC: 206) 2 273 SDNHTTPI L (NO DE 40.000 ID DE SEC: 204) 3 81 AEPHEEQCL (NO DE 10.000 I D DE SEC: 30) 4 298 QDVRRVPGV (NO DE 8.000 ID DE SEC: 164) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 5 428 SDELVRHHN (NO DE 6.000 ID DE SEC: 203) 6 85 EEQCLSAFT (NO DE 5.000 ID DE SEC: 65) 7 208 SCTGSQALL (NO DE 5.000 ID DE SEC: 202) 8 4 DVRDLNALL (NO DE 5.000 ID DE SEC: 62) 9 209 CTGSQALLL (NO DE 5.000 ID DE SEC: 52) 10 38 LDFAPPGAS (NO DE 4.000 ID DE SEC:130) 11 223 SDNLYQMTS (NO DE 4.000 ID DE SEC: 205) 12 179 EDPMGQQGS (NO 4.000 DE ID DE SEC: 64) 13 206 TDSCTGSQA (NO DE 4.000 ID DE SEC: 220) 14 6 RDLNALLPA (NO DE 4.000 ID DE SEC: 177) 15 84 HEEQCLSAF (NO DE 2.000 ID DE SEC: 107) 16 233 LECMTWNQM (NO 2.000 DE ID DE SEC: 131) 17 429 DELVRHHNM (NO DE 2.000 ID DE SEC: 53) 18 315 SETSEKRPF (NO DE 2.000 ID DE SEC: 209) 19 349 GEKPYQCDF (NO DE 2.000 ID DE SEC: 91) 20 302 RVPGVAPTL (NO DE 1.500 ID DE SEC:195) Tabla XXII Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para HLA B 3801 Humano Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 437 MHQRN TKL (NO DE 36.000 ID DE SEC: 143) 2 434 HHN HQRNM (NO 6.000 DE ID DE SEC: 108) 3 372 RHQRRHTGV (NO DE 6.000 ID DE SEC: 181) 4 180 DPMGQQGSL (NO 4.000 DE ID DE SEC: 59) 5 433 RHHNMHQRN (NO 3.900 DE ID DE SEC: 180) 6 165 SHHAAQFPN (NO DE 3.900 ID DE SEC: 213) 7 202 CHTPTDSCT (NO DE 3.000 ID DE SEC: 45) 8 396 DHLKTHTRT (NO DE 3.000 ID DE SEC: 57) 9 161 GHTPSHHAA (NO DE 3.000 ID DE SEC: 94) 10 302 RVPGVAPTL (NO DE 2.600 ID DE SEC:195) 11 417 RWPSCQKKF (NO DE 2.400 ID DE SEC: 196) 12 327 YPGCNKRYF (NO DE 2.400 ID DE SEC: 250) 13 208 SCTGSQALL (NO DE 2.000 ID DE SEC: 202) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 14 163 TPSHHAAQF (NO DE 2.000 ID DE SEC: 228) 15 120 ASSGQARMF (NO DE 2.000 ID DE SEC: 40) 16 18 LGGGGGCAL (NO DE 2.000 ID DE SEC: 134) 17 177 KHEDPMGQQ (NO 1.800 DE ID DE SEC: 121) 18 83 PHEEQCLSA (NO DE 1.800 ID DE SEC: 154) 19 10 ALLPAVPSL (NO DE 1.300 ID DE SEC: 34) 20 225 NLYQ TSQL (NO DE 1.300 ID DE SEC: 147) Tabla XXIII Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para HLA B 3901 Humano Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 437 MHQRN TKL (NO DE 135.000 ID DE SEC: 143) 2 332 KRYFKLSHL (NO DE 45.000 ID DE SEC: 127) 3 434 HHNMHQRN (NO 30.000 DE ID DE SEC: 108) 4 362 RRFSRSDQL (NO DE 30.000 ID DE SEC: 187) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 5 372 RHQRRHTGV (NO DE 30.000 ID DE SEC: 181) 6 10 ALLPAVPSL (NO DE 9.000 ID DE SEC:34 7 439 QRN TKLQL (NO DE 7.500 ID DE SEC: 173) 8 390 RKFSRSDHL (NO DE 6.000 ID DE SEC: 183) 9 396 DHLKTHTRT (NO DE 6.000 ID DE SEC: 57) 10 239 NQMNLGATL (NO DE 6.000 ID DE SEC:151) 11 423 KKFARSDEL (NO DE 6.000 ID DE SEC: 122) 12 126 RMFPNAPYL (NO DE 6.000 ID DE SEC:185) 13 225 NLYQ TSQL (NO DE 6.000 ID DE SEC:147) 14 180 DPMGQQGSL (NO 6.000 DE ID DE SEC: 59) 15 144 IRNQGYSTV (NO DE 5.000 ID DE SEC: 117) 16 136 SCLESQPAI (NO DE 4.000 ID DE SEC:198) 17 292 GVFRGIQDV (NO DE 3.000 ID DE SEC:103) 18 302 RVPGVAPTL (NO DE 3.000 ID DE SEC:195) 19 208 SCTGSQALL (NO DE 3.000 ID DE SEC: 202) 20 207 DSCTGSQAL (NO DE 3.000 ID DE SEC: 61) Tabla XXIV Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para HLA B 3902 Humano Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 239 NQMNLGATL (NO DE 24.000 ID DE SEC:151) 2 390 RKFSRSDHL (NO DE 20.000 ID DE SEC: 183) 3 423 KKFARSDEL (NO DE 20.000 ID DE SEC: 122) 4 32 AQWAPVLDF (NO DE 5.000 ID DE SEC: 37) 5 146 NQGYSTVTF (NO DE 5.000 ID DE SEC: 150) 6 130 NAPYLPSCL (NO DE 2.400 ID DE SEC: 144) 7 225 NLYQMTSQL (NO DE 2.400 ID DE SEC.147) 8 30 GAAQWAPVL (NO DE 2.400 ID DE SEC: 86) 9 441 NMTKLQLAL (NO DE 2.400 ID DE SEC:149) 10 302 RVPGVAPTL (NO DE 2.400 ID DE SEC:195) 11 126 R FPNAPYL (NO DE 2.000 ID DE SEC:185) 12 209 RTPYSSDNL (NO DE 2.000 ID DE SEC: 194) 13 209 CTGSQALLL (NO DE 2.000 ID DE SEC: 52) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicia! Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 14 332 KRYFKLSHL (NO DE 2.000 I D DE SEC: 127) 15 1 80 DPMGQQGSL (NO 2.000 DE I D DE SEC: 59) 16 437 HQRNMTKL (NO DE 2.000 I D DE SEC: 143) 17 207 DSCTGSQAL (NO DE 2.000 I D DE SEC: 61 ) 18 208 SCTGSQALL (NO DE 2.000 I D DE SEC: 202) 19 329 GCNKRYFKL (NO DE 2.000 I D DE SEC: 90) 20 10 ALLPAVPSL (NO DE 2.000 ID DE SEC: 34) Tabla XXV Resultados de Análisis de Predicción de Unión de Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano a HLA B 4403 Humano.

Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del I nicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 315 SETSEKRPF (NO DE 80.000 ID DE SEC: 209) 2 349 GEKPYQCDF (NO DE 80.000 I D DE SEC: 91 ) 3 84 HEEQCLSAF (NO DE 60.000 ID DE SEC: 107) 4 410 SEKPFSCRW (NO DE 48.000 ID DE SEC: 207) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 5 429 DELVRHHNM (NO DE 24.000 ID DE SEC: 53) 6 278 TPILCGAQY (NO DE 15.000 ID DE SEC: 227) 7 141 QPAIRNQGY (NO DE 9.000 ID DE SEC: 170) 8 40 FAPPGASAY (NO DE 9.000 ID DE SEC:74) 9 213 QALLLRTPY (NO DE 9.000 ID DE SEC:160) 10 318 SEKRPFMCA (NO DE 8.000 ID DE SEC: 208) 11 81 AEPHEEQCL (NO DE 8.000 ID DE SEC: 30) 12 152 VTFDGTPSY (NO DE 4.500 ID DE SEC;244) 13 101 TGTAGACRY (NO DE 4.500 ID DE SEC: 224) 14 120 ASSGQARMF (NO DE 4.500 ID DE SEC: 40) 15 261 TEGQSNHST (NO DE 4.000 ID DE SEC: 221) 16 85 EEQCLSAFT (NO DE 4.000 ID DE SEC: 65) 17 233 LECMTWNQM (NO 4.000 DE ID DE SEC: 131) 18 104 AGACRYGPF (NO DE 4.000 ID DE SEC: 31) 19 3 SDVRDLNAL (NO DE 3.000 ID DE SEC: 206) 20 185 QGSLGEQQY (NO DE 3.000 ID DE SEC: 166) Tabla XXVI Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para HLA B 5101 Humano Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 303 VPGVAPTLV (NO DE 314.600 ID DE SEC: 242) 2 180 DPMGQQGSL (NO 242.000 DE ID DE SEC: 59) 3 250 VAAGSSSSV (NO DE 157.300 ID DE SEC: 236) 4 130 NAPYLPSCL (NO DE 50.000 ID DE SEC: 144) 5 30 GAAQWAPVL (NO DE 50.000 ID DE SEC: 86) 6 20 GGGGCALPV (NO DE 44.000 ID DE SEC: 92) 7 64 PPPPPHSFI (NO DE 40.000 ID DE SEC: 157) 8 29 SGAAQWAPV (NO DE 40.000 ID DE SEC: 211) 9 18 LGGGGGCAL (NO DE 31.460 ID DE SEC: 134) 10 295 RGIQDVRRV (NO DE 22.000 ID DE SEC: 179) 11 119 QASSGQARM (NO 18.150 DE ID DE SEC: 161) 12 418 WPSCQKKFA (NO DE 12.100 ID DE SEC: 246) 13 82 EPHEEQCLS (NO DE 12.100 ID DE SEC: 68) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del medio Inicial Residuo Subsecuente tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 14 110 GPFGPPPPS (NO DE 11.000 ID DE SEC: 96) 15 272 ESDNHTTPI (NO DE ID 8.000 DE SEC:71) 16 306 VAPTLVRSA (NO DE 7.150 ID DE SEC:237) 17 280 ILCGAQYRI (NO DE ID 6.921 DE SEC: 116) 18 219 TPYSSDNLY (NO DE 6.600 ID DE SEC: 231) 19 128 FPNAPYLPS (NO DE 6.500 ID DE SEC: 79) 20 204 TPTDSCTGS (NO DE 6.050 ID DE SEC: 230) Tabla XXVII Resultados de Análisis de Predicción de Unión de Péptido BI AS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano a HLA B 5102 Humano Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 295 RGIQDVRRV (NO DE 290.400 ID DE SEC: 179) 2 303 VPGVAPTLV (NO DE 200.000 ID DE SEC: 242) 3 180 DPMGQQGSL (NO 133.100 DE ID DE SEC: 59) 4 250 VAAGSSSSV (NO DE 110.000 ID DE SEC: 236) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 5 30 GAAQWAPVL (NO DE 55.000 ID DE SEC: 86) 6 130 NAPYLPSCL (NO DE 50.000 ID DE SEC: 144) 7 20 GGGGCALPV (NO DE 44.000 ID DE SEC: 92) 8 29 SGAAQWAPV (NO DE 44.000 ID DE SEC: 211 9 64 PPPPPHSFI (NO DE 40.000 ID DE SEC: 157) 10 119 QASSGQARM (NO 36.300 DE ID DE SEC: 161) 11 110 GPFGPPPPS (NO DE 27.500 ID DE SEC: 96) 12 412 KPFSCRWPS (NO DE 25.000 ID DE SEC: 123) 13 18 LGGGGGCAL (NO DE 24.200 ID DE SEC: 134) 14 24 CALPVSGAA (NO DE 16.600 ID DE SEC: 43) 15 219 TPYSSDNLY (NO DE 15.000 ID DE SEC: 231) 16 292 GVFRGIQDV (NO DE 14.641 ID DE SEC:103) 17 136 SCLESQPAI (NO DE 14.520 ID DE SEC.198) 18 418 WPSCQKKFA (NO DE 12.100 ID DE SEC: 246) 19 269 TGYESDNHT (NO DE 11.000 ID DE SEC: 225) 20 351 KPYOCDFKD (NO DE 11.000 ID DE SEC: 124) Tabla XXVIII Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para HLA B 5201 Humano Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 191 QQYSVPPPV (NO DE 100.000 ID DE SEC:171) 2 32 AQWAPVLDF (NO DE 30.000 ID DE SEC: 37) 3 243 LGATLKGVA (NO DE 16.500 ID DE SEC: 133) 4 303 VPGVAPTLV (NO DE 13.500 ID DE SEC: 242) 5 86 EQCLSAFTV (NO DE 12.000 ID DE SEC: 69) 6 295 RGIQDVRRV (NO DE 10.000 ID DE SEC: 179) 7 98 GQFTGTAGA (NO DE 8.250 ID DE SEC:99) 8 292 GVFRGIQDV (NO DE 8.250 ID DE SEC:103) 9 29 SGAAQWAPV (NO DE 6.000 ID DE SEC: 211) 10 146 NQGYSTVTF (NO DE 5.500 ID DE SEC: 150) 11 20 GGGGCALPV (NO DE 5.500 ID DE SEC: 92) 12 239 NQ NLGATL (NO DE 4.000 ID DE SEC:151) 13 64 PPPPPHSFI (NO DE 3.600 ID DE SEC: 157) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 14 273 SDN HTTPIL (NO DE 3.300 ID DE SEC: 204) 15 286 YRIHTHGVF (NO DE 3.000 ID DE SEC: 252) 16 269 TGYESDNHT (NO DE 3.000 I D DE SEC: 225) 17 406 TGKTSEKPF (NO DE 2.750 ID DE SEC: 222) 1 8 327 YPGCNKRYF (NO DE 2.750 ID DE SEC: 250) 1 9 7 DLNALLPAV (NO DE 2.640 I D DE SEC: 58) 20 04 AGACRYGPF (NO DE 2.500 I D DE SEC: 31 ) Tabla XXIX Resultados de Análisis de Predicción de U nión de Péptido BI MAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 H umano a HLA B 5801 Humano.

Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del I nicial Residuo Subsecuente medio tiem po de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 230 TSQLECMTW (NO DE 96.800 I D DE SEC: 234) 2 92 FTVHFSGQF (NO DE 60.000 I D DE SEC: 85) 3 120 ASSGQARMF (NO DE 40.000 I D DE SEC: 40) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 4 168 AAQFPNHSF (NO DE 20.000 ID DE SEC: 29) 5 408 KTSEKPFSC (NO DE 12.000 ID DE SEC: 129) 6 394 RSDHLKTHT (NO DE 9.900 ID DE SEC:192) 7 276 HTTPILCGA (NO DE 7.200 ID DE SEC: 115) 8 218 RTPYSSDNL (NO DE 6.600 ID DE SEC: 194) 9 152 VTFDGTPSY (NO DE 6.000 ID DE SEC:244) 10 40 FAPPGASAY (NO DE 6.000 ID DE SEC:74) 11 213 QALLLRTPY (NO DE 4.500 ID DE SEC: 160) 12 347 HTGEKPYQC (NO DE 4.400 ID DE SEC: 112) 13 252 AGSSSSVKW (NO DE 4.400 ID DE SEC: 32) 14 211 GSQALLLRT (NO DE 4.356 ID DE SEC: 102) 15 174 HSFKHEDPM (NO DE 4.000 ID DE SEC: 110) 16 317 TSEKRPF C (NO DE 4.000 ID DE SEC: 233) 17 26 LPVSGAAQW (NO DE 4.000 ID DE SEC: 138) 18 289 HTHGVFRGI (NO DE 3.600 ID DE SEC: 113) 19 222 SSDNLYQMT (NO DE 3.300 ID DE SEC: 217) 20 96 FSGQFTGTA (NO DE 3.300 ID DE SEC: 82) Tabla XXX Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para HLA CW0301 Humano.

Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 10 ALLPAVPSL (NO DE 100.000 ID DE SEC:34) 2 332 KRYFKLSHL (NO DE 48.000 ID DE SEC: 127) 3 126 RMFPNAPYL (NO DE 36.000 ID DE SEC:185) 4 3 SDVRDLNAL (NO DE 30.000 ID DE SEC: 206) 5 239 NQ NLGATL (NO DE 24.000 ID DE SEC:151) 6 225 NLYQMTSQL (NO DE 24.000 ID DE SEC:147) 7 180 DPMGQQGSL (NO 20.000 DE ID DE SEC: 59) 8 362 RRFSRSDQL (NO DE 12.000 ID DE SEC: 187) 9 329 GCNKRYFKL (NO DE 10.000 ID DE SEC: 90) 10 286 YRIHTHGVF (NO DE 10.000 ID DE SEC: 252) 11 301 RRVPGVAPT (NO DE 10.000 ID DE SEC: 189) 12 24 CALPVSGAA (NO DE 10.000 ID DE SEC: 43) 13 136 SCLESQPAI (NO DE 7.500 ID DE SEC: 198) 14 437 MHQRNMTKL (NO DE 7.200 ID DE SEC: 143) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 15 390 RKFSRSDHL (NO DE 6.000 ID DE SEC: 183) 16 423 KKFARSDEL (NO DE 6.000 ID DE SEC: 122) 17 92 FTVHFSGQF (NO DE 5.000 ID DE SEC: 85) 18 429 DELVRHHNM (NO DE 5.000 ID DE SEC: 53) 19 130 NAPYLPSCL (NO DE 4.800 ID DE SEC: 144) 20 30 GAAQWAPVL (NO DE 4.000 ID DE SEC: 86) Tabla XXXI Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para HLA CW0401 Humano Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 356 DFKDCERRF (NO DE 120.000 ID DE SEC: 55) 2 334 YFKLSHLQM (NO DE 100.000 ID DE SEC: 248) 3 180 D PGQQGSL (NO 88.000 DE ID DE SEC: 59) 4 163 TPSHHAAQF (NO DE 52.800 ID DE SEC: 228) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 5 327 YPGCNKRYF (NO DE 40.000 ID DE SEC: 250) 6 285 QYRIHTHGV (NO DE 27.500 ID DE SEC: 175) 7 424 KFARSDELV (NO DE 25.000 ID DE SEC: 119) 8 326 AYPGCNKRY (NO DE 25.000 ID DE SEC: 42) 9 192 QYSVPPPVY (NO DE 25.000 ID DE SEC: 176) 10 417 RWPSCQKKF (NO DE 22.000 ID DE SEC: 196) 11 278 TPILCGAQY (NO DE 12.000 ID DE SEC: 227) 12 10 ALLPAVPSL (NO DE 11.616 ID DE SEC: 34) 13 141 QPAIRNQGY (NO DE 1.000 ID DE SEC: 170) 14 303 VPGVAPTLV (NO DE 11.000 ID DE SEC: 242) 15 219 TPYSSDNLY (NO DE 10.000 ID DE SEC: 231) 16 39 DFAPPGASA (NO DE 7.920 ID DE SEC: 54) 17 99 QFTGTAGAC (NO DE 6.000 ID DE SEC: 165) 18 4 DVRDLNALL (NO DE 5.760 ID DE SEC: 62) 19 70 SFIKQEPSW (NO DE 5.500 ID DE SEC: 210) 20 63 PPPPPPHSF (NO DE 5.280 ID DE SEC: 158) Tabla XXXII Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para HLA CW0602 Humano.

Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 332 KRYFKLSHL (NO DE 9.680 ID DE SEC: 127) 2 239 NQMNLGATL (NO DE 6.600 ID DE SEC: 151) 3 130 NAPYLPSCL (NO DE 6.600 ID DE SEC: 144) 4 7 DLNALLPAV (NO DE 6.000 ID DE SEC: 58) 5 441 NMTKLQLAL (NO DE 6.000 ID DE SEC: 149) 6 225 NLYQMTSQL (NO DE 6.000 ID DE SEC: 147) 7 4 DVRDLNALL (NO DE 6.000 ID DE SEC: 62) 8 3 SDVRDLNAL (NO DE 4.400 ID DE SEC: 206) 9 10 ALLPAVPSL (NO DE 4.000 ID DE SEC: 34) 10 213 QALLLRTPY (NO DE 3.300 ID DE SEC: 160) 11 319 EKRPF CAY (NO DE 3.000 ID DE SEC: 67) 12 30 GAAQWAPVL (NO DE 2.200 ID DE SEC: 86) 13 242 NLGATLKGV (NO DE 2.200 ID DE SEC: 146) 14 292 GVFRGIQDV (NO DE 2.200 ID DE SEC: 103) Rango Posición Listado de Residuo Puntuación (Cálculo del Inicial Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 15 207 DSCTGSQAL (NO DE 2.200 ID DE SEC: 61) 16 362 RRFSRSDQL (NO DE 2.200 ID DE SEC: 187) 17 439 QRNMTKLQL (NO DE 2.200 ID DE SEC: 173) 18 295 RGIQDVRRV (NO DE 2.200 ID DE SEC: 179) 19 423 KKFARSDEL (NO DE 2.200 ID DE SEC: 122) 20 180 DPMGQQGSL (NO DE 2.200 ID DE SEC: 59) Tabla XXXIII Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para HLA CW0702 Humano Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 319 EKRPF CAY (NO DE 26.880 ID DE SEC: 67) 2 326 AYPGCNKRY (NO DE 24.000 ID DE SEC: 42) 3 40 FAPPGASAY (NO DE 14.784 ID DE SEC: 74) 4 192 QYSVPPPVY (NO DE 12.000 ID DE SEC: 176) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 5 278 TPILCGAQY (NO DE 12.000 ID DE SEC: 227) 6 219 TPYSSDNLY (NO DE 12.000 ID DE SEC: 231) 7 213 QALLLRTPY (NO DE 8.800 ID DE SEC: 160) 8 125 ARMFPNAPY (NO DE 8.000 ID DE SEC: 38) 9 327 YPGCNKRYF (NO DE 6.600 ID DE SEC: 250) 10 152 VTFDGTPSY (NO DE 5.600 ID DE SEC: 244) 11 141 QPAIRNQGY (NO DE 4.800 ID DE SEC: 170) 12 345 RKHTGEKPY (NO DE 4.000 ID DE SEC: 184) 13 185 QGSLGEQQY (NO DE 4.000 ID DE SEC: 166) 14 101 TGTAGACRY (NO DE 4.000 ID DE SEC: 224) 15 375 RRHTGV PF (NO DE 4.000 ID DE SEC: 188) 16 263 GQSNHSTGY (NO DE 4.000 ID DE SEC: 100) 17 163 TPSHHAAQF (NO DE 3.000 ID DE SEC: 228) 18 33 QWAPVLDFA (NO DE 2.688 ID DE SEC: 174) 19 130 NAPYLPSCL (NO DE 2.640 ID DE SEC: 144) 20 84 HEEQCLSAF (NO DE 2.400 ID DE SEC: 107) Tabla XXXIV Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para una MHC Clase I Db de Ratón Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 235 CMTWNQMNL (NO 5255.712 DE ID DE SEC: 49) 2 126 RMFPNAPYL (NO DE 1990.800 ID DE SEC: 185) 3 221 YSSDNLYQM (NO DE 930.000 ID DE SEC: 253) 4 228 QMTSQLECM (NO DE 33.701 ID DE SEC: 169) 5 239 NQMNLGATL (NO DE 21.470 ID DE SEC: 151) 6 441 NMTKLQLAL (NO DE 19.908 ID DE SEC: 149) 7 437 MHQRN TKL (NO DE 19.837 ID DE SEC: 143) 8 136 SCLESQPAI (NO DE 11.177 ID DE SEC: 198) 9 174 HSFKHEDPM (NO DE 10.800 ID DE SEC: 110) 10 302 RVPGVAPTL (NO DE 10.088 ID DE SEC: 195) 11 130 NAPYLPSCL (NO DE 8.400 ID DE SEC: 144) 12 10 ALLPAVPSL (NO DE 5.988 ID DE SEC: 34) 13 208 SCTGSQALL (NO DE 4.435 ID DE SEC: 202) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del I nicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 14 209 CTGSQALLL (NO DE 3.548 ID DE SEC: 52) 15 238 WNQMN LGAT (NO 3.300 DE I D DE SEC: 245) 16 218 RTPYSSDNL (NO DE 3.185 I D DE SEC: 194) 17 24 CALPVSGAA (NO DE 2.851 ID DE SEC: 43) 18 1 8 LGGGGGCAL (NO DE 2.177 I D DE SEC: 1 34) 19 142 PAIRNQGYS (NO DE 2.160 I D DE SEC: 1 52) 20 30 GAAQWAPVL (NO DE 1 .680 I D DE SEC: 86) Tabla XXXV Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para MHC Clase I Db de Ratón Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del I nicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 1 12 FGPPPPSQA (NO DE 48.000 ID DE SEC: 76) 2 122 SGQARM FPN (NO DE 36.000 I D DE SEC: 212) 3 1 04 AGACRYGPF (NO DE 30.000 I D DE SEC: 31 ) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 4 218 RTPYSSDNL (NO DE 28.800 ID DE SEC: 194) 5 130 NAPYLPSCL (NO DE 20.000 ID DE SEC: 144) 6 302 RVPGVAPTL (NO DE 20.000 ID DE SEC: 195) 7 18 LGGGGGCAL (NO DE 20.000 ID DE SEC: 134) 8 81 AEPHEEQCL (NO DE 10.000 ID DE SEC: 30) 9 29 SGAAQWAPV (NO DE 7.200 ID DE SEC: 211) 10 423 KKFARSDEL (NO DE 7.200 ID DE SEC: 122) 11 295 RGIQDVRRV (NO DE 7.200 ID DE SEC: 179) 12 390 RKFSRSDHL (NO DE 6.000 ID DE SEC: 183) 13 332 KRYFKLSHL (NO DE 6.000 ID DE SEC: 127) 14 362 RRFSRSDQL (NO DE 6.000 ID DE SEC: 187) 15 417 RWPSCQKKF (NO DE 6.000 ID DE SEC: 196) 16 160 YGHTPSHHA (NO DE 6.000 ID DE SEC: 249) 17 20 GGGGCALPV (NO DE 6.000 ID DE SEC: 92) 18 329 GCNKRYFKL (NO DE 5.000 ID DE SEC: 90) 19 372 RHQRRHTGV (NO DE 4.500 ID DE SEC: 181) 20 52 GGPAPPPA (NO DE 4.000 ID DE SEC: 93) Tabla XXXVI Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para una MHC Clase I Kb de Ratón.

Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 329 GCNKRYFKL (NO DE 24.000 ID DE SEC: 90) 2 225 NLYQ TSQL (NO DE 10.000 ID DE SEC: 147) 3 420 SCQKKFARS (NO DE 3.960 ID DE SEC: 200) 4 218 RTPYSSDNL (NO DE 3.630 ID DE SEC: 194) 5 437 HQRNMTKL (NO DE 3.600 ID DE SEC: 143) 6 387 TCQRKFSRS (NO DE 3.600 ID DE SEC: 219) 7 302 RVPGVAPTL (NO DE 3.300 ID DE SEC: 195) 8 130 NAPYLPSCL (NO DE 3.000 ID DE SEC: 144) 9 289 HTHGVFRGI (NO DE 3.000 ID DE SEC: 113) 10 43 PGASAYGSL (NO DE 2.400 ID DE SEC: 153) 11 155 DGTPSYGHT (NO DE 2.400 ID DE SEC: 56) 12 273 SDNHTTPIL (NO DE 2.200 ID DE SEC: 204) 13 126 RMFPNAPYL (NO DE 2.200 ID DE SEC: 185) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 14 128 FPNAPYLPS (NO DE 2.000 ID DE SEC: 79) 15 3 SDVRDLNAL (NO DE 1.584 I DE SEC: 206) 16 207 DSCTGSQAL (NO DE 1.584 ID DE SEC: 61) 17 332 KRYFKLSHL (NO DE 1.500 ID DE SEC: 127) 18 18 LGGGGGCAL (NO DE 1.320 ID DE SEC: 134) 19 233 LECMTWNQ (NO 1.320 DE ID DE SEC: 131) 20 441 NMTKLQLAL (NO DE 1.200 ID DE SEC: 149) Tabla XXXVII Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para MHC Clase I Kd de Ratón Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 285 QYRIHTHGV (NO DE 600.000 ID DE SEC: 175) 2 424 KFARSDELV (NO DE 288.000 ID DE SEC: 119) 3 334 YFKLSHLQ (NO DE 120.000 ID DE SEC: 248) 4 136 SCLESQPTI (NO DE 115.200 ID DE SEC: 199) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 5 239 NQMNLGATL (NO DE 115.200 ID DE SEC: 151) 6 10 ALLPAVSSL (NO DE 115.200 ID DE SEC: 35) 7 47 AYGSLGGPA (NO DE 86.400 ID DE SEC: 41) 8 180 DPMGQQGSL (NO 80.000 DE ID DE SEC: 59) 9 270 GYESDNHTA (NO DE 72.000 ID DE SEC: 105) 10 326 AYPGCNKRY (NO DE 60.000 ID DE SEC: 42) 11 192 QYSVPPPVY (NO DE 60.000 ID DE SEC: 176) 12 272 ESDNHTAPI (NO DE .57.600 ID DE SEC: 70) 13 289 HTHGVFRGI (NO DE 57.600 ID DE SEC: 113) 14 126 DVRDLNALL (NO DE 57.600 ID DE SEC: 62) 15 4 CTGSQALLL (NO DE 57.600 ID DE SEC: 52) 16 208 SCTGSQALL (NO DE 48.000 ID DE SEC: 202) 17 441 NMTKLQLAL (NO DE 48.000 ID DE SEC: 149) 18 207 DSCTGSQAL (NO DE 48.000 ID DE SEC: 61) 19 130 NAPYLPSCL (NO DE 48.000 ID DE SEC: 144) 20 235 CMTWNQM L (NO 48.000 DE ID DE SEC: 49) Tabla XXXVIII Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para una MHC Clase I Kk de Ratón Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 81 AEPHEEQCL (NO DE 40.000 ID DE SEC: 30) 2 85 EEQCLSAFT (NO DE 40.000 ID DE SEC: 65) 3 429 DELVRHHNM (NO DE 20.000 ID DE SEC: 53) 4 315 SETSEKRPF (NO DE 20.000 ID DE SEC: 209) 5 261 TEGQSNHST (NO DE 20.000 ID DE SEC: 221) 6 410 SEKPFSCRW (NO DE 10.000 ID DE SEC: 207) 7 272 ESDNHTTPI (NO DE 10.000 ID DE SEC: 71) 8 318 SEKRPFMCA (NO DE 10.000 ID DE SEC: 208) 9 138 LESQPAIRN (NO DE 10.000 ID DE SEC: 132) 10 233 LECMTWNQM (NO 10.000 DE ID DE SEC: 131) 11 298 QDVRRVPGV (NO DE 10.000 ID DE SEC: 164) 12 84 HEEQCLSAF (NO DE 10.000 ID DE SEC: 107) 13 349 GEKPYQCDF (NO DE 10.000 ID DE SEC: 91) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 14 289 HTHGVFRGI (NO DE 10.000 I D DE SEC: 1 13) 15 179 EDPMGQQGS (NO 8.000 DE I D DE SEC: 64) 16 136 SCLESQPAI (NO DE 5.000 I D DE SEC: 198) 17 280 I LCGAQYRI (NO DE 5.000 I D DE SEC: 1 16) 18 273 SDNHTTPI L (NO DE 4.000 I D DE SEC: 204) 19 428 SDELVRH H N (NO DE 4.000 I D DE SEC: 203) 20 3 SDVRDLNAL (NO DE 4.000 I D DE SEC: 206) Tabla XXXIX Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptído BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para MHC Clase I Ld de Ratón Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del medio I nicial Residuo Subsecuente tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 163 TPSHHAAQF (NO DE 360.000 I D DE SEC: 228) 2 327 YPGCNKRYF (NO DE 300.000 I D DE SEC: 250) 3 180 DPMGQQGSL (NO 150.000 DE I D DE SEC: 59) 4 26 LPVSGAAQW (NO DE 93.600 I D DE SEC: 138) Rango Posición Listado de Residuo Puntuación (Cálculo del Inicial Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 5 278 TPILCGAQY (NO DE 72.000 ID DE SEC: 227) 6 141 QPAIRNQGY (NO DE 60.000 ID DE SEC: 170) 7 219 TPYSSDNLY (NO DE 60.000 ID DE SEC: 231) 8 303 VPGVAPTLV (NO DE 60.000 ID DE SEC: 242) 9 120 ASSGQARMF (NO DE 50.000 ID DE SEC: 40) 10 63 PPPPPPHSF (NO DE 45.000 ID DE SEC: 158) 11 113 GPPPPSQAS (NO DE 45.000 ID DE SEC: 97) 12 157 TPSYGHTPS (NO DE 39.000 ID DE SEC: 229) 13 207 DSCTGSQAL (NO DE 32.500 ID DE SEC: 61) 14 110 GPFGPPPPS (NO DE 30.000 ID DE SEC: 96) 15 82 EPHEEQCLS (NO DE 30.000 ID DE SEC: 68) 16 412 KPFSCRWPS (NO DE 30.000 ID DE SEC: 123) 17 418 WPSCQKKFA (NO DE 30.000 ID DE SEC: 246) 18 221 YSSDNLYQM (NO DE 30.000 ID DE SEC: 253) 19 204 TPTDSCTGS (NO DE 30.000 ID DE SEC: 230) 20 128 FPNAPYLPS (NO DE 30.000 ID DE SEC: 79) Tabla XL Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BI MAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 Humano para un H LA A20 de ganado.

Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del I nicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 350 EKPYQCDFK (NO DE 1000.00 I D DE SEC: 66) 2 319 EKRPFMCAY (NO DE 500.000 I D DE SEC: 67) 3 423 KFARSDEL (NO DE 500.000 ID DE SEC: 122) 4 345 RKHTGEKPY (NO DE 500.000 ID DE SEC: 1 84) 5 390 RKFSRSDH L (NO DE 500.000 ID DE SEC: 1 83) 6 137 CLESQPAI R (NO DE 120.000 ID DE SEC: 47) 7 380 VKPFQCKTC (NO DE 100.000 I D DE SEC: 239) 8 407 GKTSEKPFS (NO DE 100.000 I D DE SEC: 95) 9 335 FKLSH LQMH (NO DE 100.000 I D DE SEC: 78) 1 0 247 LKGVAAGSS (NO DE 100.000 ID DE SEC: 135) 1 1 370 LKRHQRRHT (NO DE 100.000 ID DE SEC: 136) 12 258 VKWTEGQSN (NO DE 100.000 I D DE SEC: 240) 13 398 LKTHTRTHT (NO DE 100.000 ID DE SEC: 137) 14 331 N KRYFKLSH (NO DE 100.000 ID DE SEC: 145) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 15 357 FKDCERRFS (NO DE 1 00.000 ID DE SEC: 77) 16 385 C TCQRKFS (NO DE 100.000 ID DE SEC: 46) 17 294 FRGIQDVRR (NO DE 80.000 ID DE SEC: 81 ) 18 368 DQLKRHQRR (NO DE 80.000 ID DE SEC: 60) 19 432 VRHHNM HQR (NO 80.000 DE I D DE SEC: 243) 20 1 18 SQASSGQAR (NO DE 80.000 I D DE SEC: 216) Tabla XLI Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 de Ratón para MHC Clase I A 0201 de Ratón Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Su bsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 126 RMFPNAPYL (NO DE 313.968 I D DE SEC: 293) 2 187 SLGEQQYSV (NO DE 285.163 I D DE SEC: 299) 3 10 ALLPAVSSL (NO DE 181 .794 I D DE SEC: 255) 4 225 N LYQMTSQL (NO DE 68.360 I D DE SEC: 284) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 5 292 GVFRGIQDV (NO DE 51.790 ID DE SEC: 270) 6 93 TLHFSGQFT (NO DE 40.986 ID DE SEC: 302) 7 191 QQYSVPPPV (NO DE 22.566 ID DE SEC: 290) 8 280 ILCGAQYRI (NO DE 17.736 ID DE SEC: 274) 9 441 NMTKLHVAL (NO DE 15.428 ID DE SEC: 285) 10 235 CMTWNQMNL (NO 15.428 DE ID DE SEC: 258) 11 7 DLNALLPAV (NO DE 11.998 ID DE SEC: 261) 12 242 NLGATLKGM (NO DE 11.426 ID DE SEC: 283) 13 227 YQ TSQLEC (NO DE 8.573 ID DE SEC: 307) 14 239 NQMNLGATL (NO DE 8.014 ID DE SEC: 286) 15 309 TLVRSASET (NO DE 7.452 ID DE SEC: 303) 16 408 KTSEKPFSC (NO DE 5.743 ID DE SEC: 277) 17 340 LQMHSRKHT (NO DE 4.752 ID DE SEC: 280) 18 228 QMTSQLECM (NO DE 4.044 ID DE SEC: 289) 19 37 VLDFAPPGA (NO DE 3.378 ID DE SEC: 304) 20 302 RVSGVAPTL (NO DE 1.869 ID DE SEC: 295) Tabla XLII Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 de Ratón para una MHC Clase I Db.

Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 221 YSSDNLYQM (NO DE 312.000 ID DE SEC: 308) 2 126 RMFPNAPYL (NO DE 260.000 ID DE SEC: 293) 3 235 C TWNQMNL (NO 260.000 DE ID DE SEC: 258) 4 437 MHQRNMTKL (NO DE 200.000 ID DE SEC: 281) 5 238 WNQ NLGAT (NO 12.000 DE ID DE SEC: 305) 6 130 NAPYLPSCL (NO DE 8.580 ID DE SEC: 282) 7 3 SDVRDLNAL (NO DE 7.920 ID DE SEC: 298) 8 136 SCLESQPTI (NO DE 7.920 ID DE SEC: 296) 9 81 AEPHEEQCL (NO DE 6.600 ID DE SEC: 254) 10 10 ALLPAVSSL (NO DE 6.600 ID DE SEC: 255) 11 218 RTPYSSDNL (NO DE 6.000 ID DE SEC: 294) 12 441 NMTKLHVAL (NO DE 3.432 ID DE SEC: 285) 13 228 Q TSQLECM (NO DE 3.120 ID DE SEC: 289) Rango Posición Listado de Residuo Puntuación (Cálculo del Inicial Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 14 1 74 HSFKHEDPM (NO DE 3.120 I D DE SEC: 272) 15 242 NLGATL G (NO DE 2.640 I D DE SEC: 283) 16 261 TEGQSN HGI (NO DE 2.640 ID DE SEC: 301 ) 17 225 N LYQ TSQL (NO DE 2.640 ID DE SEC: 284) 1 8 207 DSCTGSQAL (NO DE 2.600 I D DE SEC: 263) 19 1 1 9 QASSGQARM (NO 2.600 DE I D DE SEC: 288) 20 18 LGGGGGCGL (NO DE 2.600 I D DE SEC: 279) Tabla XLII I Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido BIMAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 de Ratón para MHC Clase I Kb de Ratón Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 329 GCNKRYFKL (NO DE 24.000 ID DE SEC: 268) 2 225 NLYQMTSQL (NO DE 10.000 ID DE SEC: 284) 3 420 SCQKKFARS (NO DE 3.960 ID DE SEC: 297) 4 218 RTPYSSDN L (NO DE 3.630 ID DE SEC: 294) Rango Posición Listado de Residuo Puntuación (Cálculo del Inicial Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 5 437 HQRNMTKL (NO DE 3.600 ID DE SEC: 281) 6 387 TCQRKFSRS (NO DE 3.600 ID DE SEC: 300) 7 289 HTHGVFRGI (NO DE 3.000 ID DE SEC: 273) 8 130 NAPYLPSCL (NO DE 3.000 ID DE SEC: 282) 9 43 PGASAYGSL (NO DE 2.400 ID DE SEC: 287) 10 155 DGAPSYGHT (NO DE 2.400 ID DE SEC: 260) 11 126 RMFPNAPYL (NO DE 2.200 ID DE SEC: 293) 12 128 FPNAPYLPS (NO DE 2.000 ID DE SEC: 267) 13 207 DSCTGSQAL (NO DE 1.584 ID DE SEC: 263) 14 3 SDVRDLNAL (NO DE 1.584 ID DE SEC: 298) 15 332 KRYFKLSHL (NO DE 1.500 ID DE SEC: 276) 16 233 LEC TWNQM (NO 1.320 DE ID DE SEC: 278) 17 18 LGGGGGCGL (NO DE 1.320 ID DE SEC: 279) 18 242 NLGATLKGM (NO DE 1.200 ID DE SEC: 283) 19 123 GQARMFPN (NO DE 1.200 ID DE SEC: 269)a 20 441 NMTKLHVAL (NO DE 1.200 ID DE SEC: 285) Tabla XLIV Resultados de Análisis de Predicción de U nión del Péptido BI MAS HLA para la Unión de Péptidos WT1 de Ratón para una MHC Clase I Kd , Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 1 285 QYRIHTHGV (NO DE 600.000 I D DE SEC: 291 ) 2 424 KFARSDELV (NO DE 288.000 ID DE SEC: 275) 3 334 YFKÑSHLQM (NO DE 120.000 I D DE SEC: 306) 4 136 SCLESQPTI (NO DE 1 1 5.200 ID DE SEC: 296) 5 239 NQMNLGATL (NO DE 1 15.200 I D DE SEC: 286) 6 1 0 ALLPAVSSL (NO DE 1 15.200 ID DE SEC: 255) 7 47 AYGSLGGPA (NO DE 86.400 I D DE SEC: 256) 8 180 DPMGQQGSL (NO 80.000 DE I D DE SEC: 262) 9 270 GYESDN HTA (NO DE 72.000 I D DE SEC: 271 ) 10 192 QYSVPPPVY (NO DE 60.000 I D DE SEC: 292) 1 1 326 AYPGCNKRY (NO DE 60.000 ID DE SEC: 257) 12 289 HTHGVFRGI (NO DE 57.600 ID DE SEC: 273) 13 4 DVRDLNALL (NO DE 57.600 I D DE SEC: 264) Rango Posición Listado de Puntuación (Cálculo del Inicial Residuo Subsecuente medio tiempo de Disociación de una molécula que contiene ésta subsecuencia) 14 126 RMFPNAPYL (NO DE 57.600 ID DE SEC: 293) 15 209 CTGSQALLL (NO DE 48.000 ID DE SEC: 259) 16 86 EQCLSAFTL (NO DE 48.000 ID DE SEC: 265) 17 302 RVSGVAPTL (NO DE 48.000 ID DE SEC: 295) 18 218 RTPYSSDNL (NO DE 48.000 ID DE SEC: 294) 19 272 ESDNHTAPI (NO DE 48.000 ID DE SEC: 266) 20 225 NLYQMTSQL (NO DE 48.000 ID DE SEC: 284) Tabla XLV Resultados de Análisis de Predicción de Unión del Péptido de sitios T para la Unión de Péptidos WT1 Humano capaz de producir una Respuesta Auxiliar de Células T Péptido Secuencia p6-23 RDLNALLPAVPSLGGGG (NO DE ID DE SEC: 1) p30-35 GAAQWA (NO DE ID DE SEC: 309) p45-56 ASAYGSLGGPAP (NO DE ID DE SEC: 310) P91-105 AFTVHFSGQFTGTAG (NO DE ID DE SEC: 311) p117-139 PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE (NO DE ID DE SEC: 2 P167-171 HAAQF (NO DE ID DE SEC: 312) p202-233 CHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSD LYQMTSQL (NO DE ID DE SEC: 313) p244-2S2 GATLKGVAAGSSSSVKWTE (NO DE ID DE SEC: 4) P287-318 RIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVRSASETS (NO DE ID DE SEC: 314) p333-336 RYFK (NO DE ID DE SEC: 315) ?361-374 ERRFSRSDQLKRHQ (NO DE ID DE SEC: 316) p389-410 QRKFSRSDHLKTHTRTHTGKTS (NO DE ID DE SEC: 317) ?421-411 CQKKFARSDELVRHHNMHQRN (NO DE ID DE SEC: 318) Ciertos Péptidos CTL (mostrados en la Tabla XLVI) se seleccionaron para estudios adicionales. Para cada péptido en la Tabla XLVI, se proporcionan las puntuaciones obtenidas utilizando los análisis de predicción de unión del péptido BIMAS HLA.

Tabla XLVI Secuencias del Péptido WT1 y Predicciones de Unión del Péptido HLA Péptido Secuencia Comentarios P329-227 GCNKRYFKL (NOs DE ID DE Puntuación 24.000 SEC: 90 y 168) ?225-233 NLYQMTSQL (NOs DE ID DE Se une también a la clase li SEC:147 y 284) y HLA A2, Kd, Puntuación 10.000 p235-243 CMTWNQ NL (NOs DE ID Se une también a HLA A2, DE SEC: 49 y 258 Puntuación 5,255,712 P126-134 RMFPNAPYL (NOs DE ID DE Se une también a Kd, clase SEC: 185 y 293 II y HLA A2, Puntuación 1,990,800 p221-229 YSSDNLYQM (NOs DE ID DE Se une también a Ld, SEC: 253 y 308) Puntuación 312.000 P228-236 QMTSQLECM (NOs DE ID DE Puntuación 3,120 SEC: 169 y 289) Péptido Secuencia Comentarios p239-247 NQMNLGATL (NOs DE ID DE Se une también a HLA A SEC: 151 y 286) 0201, Kd, Puntuación 8,015 p136-144 SCLESQPTI (NO DE ID DE Se une también a Kd, 1-no de Ratón SEC:296) acoplamiento para Humano P136-144 SCLESQPAI (NO DE ID DE Puntuación 7,920 Humano SEC: 198) p10-18 de ALLPAVSSL (NO DE ID DE Se une también a Kd, HLA Ratón SEC: 255) A2, 1-no acoplamiento para Humano p10-18 ALLPAVPSL (NO DE ID DE Puntuación 6,600 Humano SEC: 34) La unión de péptido a MHC murina C57B1/6 se confirmó utilizando la línea de células de leucemia RMA-S, como se describe por Ljunggren et al., Nature 346:476-480, 1990. En resumen, las células RMA-S se cultivaron durante 7 horas a 26°C en un medio completo complementado con FCS ai 1%. Un total de 106 células RMA-S se agregaron en cada cavidad de una placa de 24 cavidades y se incubaron solas o con el péptido designado (25 ug/ml) durante 16 horas a 26°C y 3 horas adicionales a 37°C en un medio completo. Las células se enjuagaron después tres veces y se tiñeron con anticuerpo anti D o anti- b conjugado con isotiocianato de fluoresceína (PharMingen, San Diego, CA). Las células etiquetadas se enjuagaron dos veces, se volvieron a suspender y se fijaron en 500 ul de PBS con paraformaldehído al 1% y se analizó para intensidad de fluorescencia en un citómetro de flujo (Becton-Dickinson FACSCalibur®). El porcentaje de incremento de moléculas Db o Kb en la superficie de las células RMA- S se midió por intensidad fluorescente media incrementada de células incubadas con péptidos comparadas con el de células incubadas solo en el medio. Los ratones se inmunizaron con los péptidos capaces de unirse a la M HC clase I murina. Después de la inmunización , se estimularon las células de bazo in vitro y se probó la capacidad de someter a lisis los objetivos incubados con péptidos de WT1 . Se evaluaron los CTL con una prueba convencional de liberación de cromo (Chen et al. , Cáncer Res. 54:1 065-1070, 1 994) . Se incubaron 1 06 células objetivo a 37°C con 1 50µ?? de sodio 51 Cr durante 90 minutos, en presencia o ausencia de péptidos específicos . Se enj uagaron las células tres veces y se volvieron a suspender en RPMI con suero bovino fetal al 5%. Para la prueba, se incubaron 1 04 células objetivo de etiquetadas con 5 Cr con diferentes concentraciones de células ejecutoras en un volumen final de 200µ? en placas de 96 cavidades con fondo en U . Los sobrenadantes se eliminaron después de 4 a 7 horas a 37°C , y el porcentaje de lisis específica se determinó por la fórm ula: % de lisis = 1 00 * (liberación experimental - liberación espontánea)/(liberación máxima-liberación espontánea) . Los resultados , presentados en la Tabla XLVI I , m uestran que algunos péptidos de WT1 pueden unirse a las moléculas MHC clase I , lo cual es esencial para generar CTL. Además, varios péptidos fueron capaces de producir CTL específicos de péptido (Figuras 9A y 9B) , como se determina utilizando pruebas de liberación de cromo. Después de la inmunización a los péptidos de CTL p1 0-1 8 humano, p1 36-144 humano , p136-144 ratón y p235-243, se generaron líneas de CTL de péptido específico y se establecieron clones. Estos resultados indican que los CTL de péptido específico puede matar células malignas que expresen WT1 .

Tabla XLVI I Unión de Péptidos de CTL de WT1 a antígenos de clase I B6 de ratón Péptido Afinidad de unión a MHC Clase I de ratón Control positivo 91 % Control negativo 0.5-1 .3% p235-243 33.6% p136-144 ratón 27.9% p136-144 humano 52% p10-18 humano 2.2% p225-233 5.8% p329-337 1 .2% p126-134 0.9% P221 -229 0.8% p228-236 1 .2% p239-247 1 % EJ EMPLO 5 USO DE UN POLI PÉPTI DO DE WT1 PARA PRODUCI R CTL DE WT1 ESPECÍFICO EN RATONES Este Ejem plo ilustra la capacidad de un polipéptido de WT1 representativo para producir inm unidad de CTL capaces de matar líneas de células tumorosas positivas a WT1 . P 1 1 7-1 39, un péptido con motivos apropiados para unirse a MHC clase I y clase I I , se identificó como se describió anteriormente utilizando los análisis de predicción de unión de péptido TSITES y BI AS HLA. Se inmunizaron los ratones como se describe en el Ejemplo 3. Después de la inmunización , se estimularon las células de bazo in vitro y se probó su capacidad de someter a lisis los objetivos incubados con péptidos de WT1 , así como también células tumorosas positivas y negativas a WT1 . Se evaluaron CTL con una prueba convencional de liberación de cromo. Los resultados, presentados en las Figuras 1 0A-1 0D, muestran que P 1 1 7 puede producir CTL de WT1 específico capaces de matar células tumorosas positivas a WT1 , mientras que no se observó ning una muerte de células negativas a WT1 . Estos resultados demuestran que los CTL específicos de péptido no mata células malignas con expresión de WT1 y la vacuna y la terapia de células T son eficaces contra las malignidades que expresan WT1 . Se realizaron inmunizaciones similares utilizando los 9-meros péptidos de unión M HC clase I p136-144, p225-233, p235-243, así como también el 23-mero péptido p 1 1 7-1 39. Después de la inmunización, las células de bazo se estimularon in vitro con cada uno de los 4 péptidos y se probó su capacidad de someter a lisis los objetivos incubados con péptidos de WT1 . Se generaron CTL específicos para p136-144, p235-243 y p1 7-139, pero no para p225-233. Los datos de CTL para p235-243 y p1 17-139 se presentan en las Figuras 1 1 A y 1 1 B. Los datos para los péptidos p1 36-144 y p225-233 no se representan gráficamente. La lisis de CTL demanda que los péptidos de WT1 objetivo se procesen endógenamente y presenten en asociación con moléculas MHC de clase I de células tumorosas. Los CTL específicos de péptido de WT1 anterior se probó para su capacidad de someter a lisis líneas de células tumorosas positivas contra negativas a WT1 . Los CTL específicos para p235-243 sometió a lisis los objetivos incubados con los péptidos p235-243, pero falló en someter a lisis las líneas celulares que expresaron las proteínas de WT1 (Figura 1 1 A). En marcado contraste, los CTL específicos para p1 17-139 sometió a lisis los objetivos incubados con los péptidos p1 17-139 y también sometió a lisis las células malignas que expresan WT1 (Figura 1 1 B). Como control negativo, los CTL específicos para p1 17-139 no sometieron a lisis la EL-4 negativa a WT1 (también referida en la presente como E10). La especificidad de lisis de WT1 específico se confirmó por inhibición de objetivo frío (Figuras 12A-12B). Las células ejecutoras se colocaron en placas para varios ejecutores: proporciones de objetivo en placas con fondo en U de 96 cavidades. Se agregó un exceso de diez veces (en comparación con el objetivo frío) del objetivo recubierto con péptido indicado sin etiquetación de 5 Cr. Finalmente, se agregaron 1 04 células objetivo etiquetadas con Cr y se incubaron las placas a 37°C durante 4 horas. El volumen total por cavidad fue de 200 µ|. La lisis de TRAMP-C por CTL específicos p1 17-139 se bloqueó de 58% a 36% por EL-4 incubada con el péptido relevante p1 17-139, pero no con EL-4 incubada con un péptido irrelevante (Figura 12A). De manera similar, la lisis de BLK-SV40 se bloqueó de 1 8% a 0% por El-4 incubada con el péptido relevante p1 17-139 (Figura 12B). Los resultados validan que los CTL específicos de péptido de WT1 matan específicamente células malignas por reconocimiento de WT1 procesada. Varios segmentos con motivos de CTL putativos se encuentran contenidos en p1 17-139. Para determinar la secuencia precisa del epítope de CTL se sintetizaron todos los 9-meros péptidos potenciales en p1 17-1 39 (Tabla XLVII I). Dos de estos péptidos (p126-134 y p130-138) mostraron unirse a moléculas de clase I H-2b (Tabla XLVI II). Los CTL generados por inmunización con p1 17-139 sometieron a lisis los objetivos incubados con p126-134 y p1 30-1 38, pero no los otros 9-meros péptidos en p 1 1 7-139 (Figura 1 3A). La línea de CTL específica p1 17-1 39 se reestimuló sea con p126-134 o p130-138. Después de la reestimulación con p126-134 o p130-138, ambas líneas de células T demostraron lisis específica de péptido, pero solamente los CTL específicos p130-138 mostraron una lisis de una línea de células tumorosas positivas a WT1 (Figuras 13B y 13C). Consecuentemente, p130-138 parece ser el epítope procesado naturalmente.

Tabla XLVlll Unión de los 9meros Péptidos de CTL de WT1 en p 17-139 a los antígenos de clase I B6 de ratón Péptido Afinidad de unión a MHC Clase I de ratón P117-125 PSQASSGQA (NO DE ID DE SEC:221) 2% P118-126 SQASSGQAR (NO DE ID DE SEC: 216) 2% P119-127 QASSGQARM (NOs DE ID DE SEC: 2% 161 y 288) P120-128 ASSGQAR F (NO DE ID DE SEC: 40) 1% P121-129 SSGQARMFP (NO DE ID DE SEC: 222) 1% P122-130 SGQARMFPN (NO DE ID DE SEC: 212) 1% P123-131 GQARMFPNA (NOs DE ID DE SEC: 98 1% y 269) P124-132 QARMFPNAP (NO DE ID DE SEC: 223) 1% P125-133 ARMFPNAPY (NO DE ID DE SEC: 38) 1% P126-134 RMFPNAPYL (NOs DE ID DE SEC: 185 79% y 293) P127-135 MFPNAPYLP (NO DE ID DE SEC: 224) 2% P128-136 FPNAPYLPS (NOs DE ID DE SEC: 79 y 1% 267) P129-137 PNAPYLPSC (NO DE ID DE SEC: 225) 1% P130-138 NAPYLPSCL (NOs DE ID DE SEC: 144 79% y 282) P131-139 APYLPSCLE (NO DE ID DE SEC: 226) 1% EJE P LO 6 I DENTI FICACIÓN DE mARN DE WT1 ESPECÍFI CO EN LÍN EAS DE CÉLULAS TUMOROSAS DE RATÓN Este Ejemplo ¡lustra el uso de RT-PCR para detectar mARN de WT1 específico en células y líneas celulares. Se aislaron células mononucleares por centrifugación de gradiente de densidad , e inmediatamente después se congelaron y almacenaron a -80°C hasta q ue se analizaron por RT-PCR para la presencia de mARN de WT1 específico. RT-PCR se realizó generalmente como se describe por Fraizer et al . , Blood 86:4704-4706, 1995. El ARN total se extrajo de 1 07 células de acuerdo con los procedimientos convencionales. Se volvieron a suspender los comprim idos de ARN en 25 µ ? de agua tratada con dietilpirocarbonato y se utilizó directamente para transcripción inversa. La región de dedo de cinc (exones 7 y 1 0) se amplificó por PCR como un cADN de ratón de 330 bp. La amplificación se llevó a cabo en un termoreciclador durante una ronda o, cuando fue necesario, dos rondas secuenciales de PCR. Se utilizaron Polimerasa de ADN AmpliTaq (Perkin Elmer Cetus , Norwalk, CT) , 2.5 m M de MgCI2 y 20 pmol de cada imprimador en un volumen de reacción total de 50 µ? . Se sometieron a electrofóresis de veinte µ? de alícuotas de los productos de PCR en geles de agarosa al 2% teñidos con bromuro de etidio. Se fotografiaron los geles con película Polaroid (Polaroid 667, Polaroid Ltd. , Hertfordshire, Inglaterra) . Se tomaron precauciones contra la contaminación cruzada después de las recomendaciones de Kwok y Higuchi , Nature 339:237-238 , 1 989. Los controles negativos incluyeron mezclas de cADN- y agente reactivo- PCR con agua en lugar de cADN en cada experimento. Para evitar negativos falsos, se evaluó la presencia de ARN intacto y la generación de cADN adecuada para cada muestra por una PCR de control utilizando imprimadores de ß-actina. Las muestras que no se amplificaron con estos imprimadores fueron excluidas del análisis. Los imprimadores para amplificación de WT1 en las líneas de células de ratón fueron: P115: 1458-1478: 5' CCC AGG CTG CAA TAA GAG ATA 3' (imprimador delantero; NO DE ID DE SEC: 21); y P116: 1767-1787: 5' ATG TTG TGA TGG CGG ACC AAT 3' (imprimador inverso; NO DE ID DE SEC: 22) {ver Inoue et al, Blood 88:2267-2278, 1996; Fraizer et al., Blood 86:4704-4706, 1995). Los imprimadores de beta actina utilizados en las reacciones de control fueron: 5' GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA 3' (imprimador de detección; NO DE ID DE SEC: 23); y 5' GTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC 3' (imprimador de antidetección; NO DE ID DE SEC: 24) Los imprimadores para uso en la amplificación de WT1 humano incluyen: P117:954-974: 5' GGC ATC TGA GAC CAG TGA GAA 3' (NO DE ID DE SEC: 25); y P118: 1434-1414: 5' GAG AGT CAG ACT TGA AAG CAGT 3" (NO DE ID DE SEC: 5). Para RT-PCR anidada, los imprimadores pueden ser: P119: 1023-1043: 5' GCT GTC CCA CTT ACA GAT GCA 3' (NO DE ID DE SEC: 26); y P120: 1345-1365: 5' TCA AAG CGC CAG CTG GAG TTT 3' (NO DE ID DE SEC: 27). La Tabla XLVIII muestra los resultados de análisis de PCR de WT1 de líneas de células tumorosas de ratón. En la Tabla IV, (+++) indica un fuerte producto de amplificación de PCR de WT1 en la primera etapa RT PCR, (++) indica un producto de amplificación de WT1 que es detectable por la primera etapa de RT PCR de WT1, (+) Indica un producto que es detectable solo en la segunda etapa de RT PCR de WT1, e (-) indica la PCR negativa de WT1.

Tabla XLIX Detección de mARN de WT1 en líneas de células tumorosas Línea Celular mARN de WT1 K562 (leucemia humana; ATCC): Control positivo; +++ (lozzio y Lozzio, Blood 45:321-334, 1975). TRAMPC (próstata de SV40 transformado, B6); +++ Foster et al., Cáncer Res. 57:3325-3330, 1997 BLK-SV40 HD2 (SV40-transf. Fibroblastos, B6; + + ATCC); Nature 276:510-511, 1978 CTLL (células T, B6; ATCC); Gillis, Nature + 268:154-156, 1977) FM (sublínea FBL-3, leucemia, B6); Glynn y Fefer, + Cáncer Res.28:434-439, 1968 BALB 3T3 (ATCC); Aaroston y Todaro, J. Celi. + Physiol. 72:141-148, 1968 S49.1 (Linfoma, de tipo células T, B/C; ATCC); + Horibata y Harris, Exp. Cell. Res. 60:61, 1970 BNL CL.2 (hígado embriónico, B/C; ATCC); Nature + 276:510-511, 1978 MethA (sarcoma. B/C); oíd et al., Ann. NY Acad. Sci. 707:80-106, 1962 P3.6.2.8.1 (mieloma, B/C; ATCC); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 66:344, 1970 P2N (leucemia, DBA/2; ATCC); elling et al., J. Immunol. 777. 267-1274, 1976 BCL1 (linfoma, B/C; ATCC); Slavin y Strober, Nature 272:624-626, 1977 LSTRA (linfoma, B/C); Glynn et al., Cáncer Res. 28:434-439, 1968 E10/EL-4 (linfoma, B6); Glynn et al., Cáncer Res. 28:434-439, 1968 EJEMPLO 7 EXPRESIÓN EN E. COLI DE WT1 DE CONSTRUCCIÓN DE FUSIÓN DE TRX DE WT1. El marco de lectura de apertura truncada de WT1 (WT1B) se amplificó por PCR con los siguientes imprimadores: Imprimador Delantero comenzando en el aminoácido 2 P-37 (NO DE ID DE SEC: 342) 5' ggctccgacgtgcgggacctg 3' Tm 64°C Imprimador Inverso que crea el sitio EcoRI después de un codón de paro P-23 (NO DE ID DE SEC: 343) 5' gaattctcaaagcgccagctggagtttggt 3' Tm 63°C. La PCR se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones: 10µ? 10X de regulador Pfu 1µ? de 10mM de dNTPs 2µ? de 10µ? de cada oligo 83µ?. de agua estéril 1 .5µ? de polimerasa de ADN de Pfu (Stratagene, La Jolla, CA) 50 ng de ADN (pPDM FL WT1 ) 96°C de 2 minutos 96°C 20 segundos63°C 15 segundos 72°C 3 minutos * 40 ciclos 72°C 4 minutos El producto de PCR se digirió con enzima de restricción de EcoRI , gel purificado y se clonó después en el vector pTrx 2H (un vector pET28 modificado con una fusión de Trx en el N-terminal y dos etiquetas de His que rodean la fusión de Trx. Después de la fusión de Trx existen sitios de segmentación de proteasa para la trombina y la enteroquinasa). Se digirió la construcción pTrx2H con las enzimas de restricción Stul y EcoRI . Las construcciones correctas se confirmaron por análisis de secuencia de ADN y se transformaron después en las células de huésped de expresión BL21 (DE3) pLys S y BL21 (DE3) CodonPlus.

EJEMPLO 8 EXPRESIÓN EN E. COLI DE WT1 DE CONSTRUCCIONES DE FUSIÓN DE ETIQUETA DE A HIS. El marco de lectura de apertura N-terminal de WT1 (WT1A) se amplificó por PCR con los siguientes imprimadores: Imprimador Delantero comenzando en el aminoácido 2 P-37 (NO DE I D DE SEC: 344) 5' ggctccgacgtgcgggacctg 3' Tm 64°C I mprimador Inverso que crea el sitio EcoRI después de un codón de paro artificial colocado después del aminoácido 249. PDM-335 (NO DE I D DE SEC: 345) 5' gaattctcaaagcgccagctggagtttggt 3' Tm 64°C. La PCR se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones: 10µ? 10X de regulador Pfu 1 µ? de 10mM de dNTPs 2µ? de 10µ? de cada oligo 83µ? de agua estéril 1.5µ? de polimerasa de ADN de Pfu (Stratagene, La Jolla, CA) 50 ng de ADN (pPDM FL WT1 ) 96°C de 2 minutos 96°C 20 segundos 63°C 1 5 segundos 72°C 1 minuto * 40 ciclos 72°C 4 minutos El producto de PCR se digirió con enzima de restricción de EcoRI , gel purificado y se clonó después en pPDM, un vector pET28 modificado con una etiqueta de His en marco, que se había digerido con las enzimas de restricción Eco72RI y EcoRI . El producto PCR se transformó también en el vector pTrx 2H. Se digirió la construcción pTrx2H con las enzimas de restricción Stu l y EcoRI . Las construcciones correctas se confirmaron por análisis de secuencia de ADN y se transformaron después en las células de huésped de expresión BL21 (DE3) pLys S y BL21 (DE3) CodonPlus.

EJEMPLO 9 EXPRESIÓN EN E. COLI DE WT1 DE CONSTRUCCIONES DE FUSIÓN DE ETIQUETA DE B HIS. El marco de lectura de apertura truncada de WT1 (WT1A) se amplificó por PCR con los siguientes imprimadores: Imprimador Delantero comenzando en el aminoácido 250 PDM-346 (NO DE ID DE SEC: 346) 5' cacagcacagggtacgagagc 3' Tm 58°C Imprimador I nverso que crea el sitio EcoRI después de un codón de paro. P-23 (NO DE ID DE SEC: 347) 5' gaattctcaaagcgccagctggagtttggt 3' Tm 63°C. La PCR se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones: 10µ I 1 0X de regulador Pfu 1 µ? de 10mM de dNTPs 2µ? de 10µ? de cada oligo 83pL de agua estéril 1 .5µ? de polimerasa de ADN de Pfu (Stratagene, La Jolla, CA) 50 ng de ADN (pPDM FL WT1 ) 96°C de 2 minutos 96°C 20 segundos 63°C 15 segundos 72°C 1 minuto * 40 ciclos 72°C 4 minutos El producto de PCR se digirió con enzima de restricción de EcoRI , gel purificado y se clonó después en pPDM, un vector pET28 modificado con una etiqueta de His en marco, que se había digerido con las enzimas de restricción Eco72l y EcoRI . El producto PCR se transformó también en el vector pTrx 2H . Se digirió la construcción pTrx 2H con las enzimas de restricción Stul y EcoRI . Las construcciones correctas se confirmaron por análisis de secuencia de ADN y se transformaron después en las células de huésped de expresión BL21 (DE3) pLys S y BL21 (DE3) CodonPlus. Para los Ejemplos 7-9, se describen los siguientes NOs DE I D DE SEC: El NO DE I D DE SEC: 327 es la secuencia de cADN determinada para Trx_WT1_B El NO DE I D DE SEC: 328 es la secuencia de cADN determinada para Trx_WT1_A El NO DE I D DE SEC: 329 es la secuencia de cADN determinada para Trx_WT1 El NO DE I D DE SEC: 330 es la secuencia de cADN determinada para WT1_A El NO DE I D DE SEC: 331 es la secuencia de cADN determinada para WT1_B El NO DE ID DE SEC: 332 es la secuencia de aminoácido pronosticada codificada por el NO DE ID DE SEC: 327 El NO DE ID DE SEC: 333 es la secuencia de aminoácido pronosticada codificada por el NO DE ID DE SEC: 328 El NO DE ID DE SEC: 334 es la secuencia de aminoácido pronosticada codificada por el NO DE ID DE SEC: 329 El NO DE ID DE SEC: 335 es la secuencia de aminoácido pronosticada codificada por el NO DE ID DE SEC: 330 El NO DE ID DE SEC: 336 es la secuencia de aminoácido pronosticada codificada por el NO DE ID DE SEC: 331 EJEMPLO 10 FORMAS TRUNCADAS DE WT1 EXPRESADO EN E. COLI Se amplificaron tres marcos de lectura de WT1 por PCR utilizando los siguientes imprimadores: Para WT1 Tr2: PDM-441 (NO DE ID DE SEC: 348) 5'cacgaagaacagtgcctgagcgcattcac 3' Tm 63°C PDM-442 (NO DE ID DE SEC: 349) 5' ccggcgaattcatcagtataaattgtcactgc 3' TM 62°C Para WT1 Tr3: PDM-443 (NO DE ID DE SEC: 350) 5' caggcttgctgctgaggacgccc 3' Tm 64°C PDM-444 (NO DE ID DE SEC: 351) 5' cacggagaattcatcactggtatggtttctccacc Tm 64°C Para WT1 Tr4: PDM-445 (NO DE ID DE SEC: 352) 5' cacagcaggaagcacactggtgagaaac 3' Tm 63°C PDM-446 (NO DE ID DE SEC: 353) 5' ggatatctgcagaattctcaaagcgccagc 3' TM 63°C La PCR se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones: 10µ? 10X de regulador Pfu 1µ? de 10mM de dNTPs 2µ? de 10µ? de cada oligo 83µ?_ de agua estéril 1.5µ? de polimerasa de ADN de Pfu (Stratagene, La Jolla, CA) 50 ng de ADN (pPDM FL WT1) 96°C de 2 minutos 96°C 20 segundos 63°C 15 segundos 72°C 30 segundos * 40 ciclos 72°C 4 minutos Los productos de PCR se digirieron con EcoRI y se clonaron en pPDM His (un vector pET28 modificado con una etiqueta de His en marco en el extremo 5') el cual se ha digerido con Eco72l y EcoRI. Las construcciones se confirmaron como correctas mediante el análisis de secuencia y se transformaron en las células BL21 pLys S y BL21 CodonPlus o células pLys S y BLR CodonPlus.

EJE PLO 1 1 EXPRESIÓN DE WT1 C (aminoácidos 76-437) Y WT1 D(aminoácidos 91 - 437) EN E. COLI El marco de lectura WT1 C se amplificó por PCR utilizando los siguientes imprimadores: PDM-504 (NO DE ID DE SEC: 354) 5' cactccttcatcaaacaggaac 3' Tm 61 °C PDM-446 (NO DE I D DE SEC: 355) 5' ggatatctgcagaattctcaaagcgccagc 3' Tm 63°C La PCR se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones: 10µ? 10X de regulador Pfu 1 µ? de 10mM de dNTPs 2µ? de 10µ? de cada oligo 83µ?_ de agua estéril 1 .5 µ I de polimerasa de ADN de Pfu (Stratagene, La Jolla, CA) 50 ng de ADN (pPDM FL WT1 ) 96°C de 2 minutos 96°C 20 segundos 63°C 15 segundos 72°C 2 minutos * 40 ciclos 72°C 4 minutos El producto de PCR se digirió con EcoRI y se clonó en pPDM His el cual se había digerido con Eco72l y EcoRI. La secuencia se confirmó mediante el análisis de secuencia y se transformó después en BLR pLys S y BLR que se co-transformó con CodonPlus RP.

EJEMPLO 12 PRODUCCIÓN SINTÉTICA DE WT1 TR-1 POR RECOCIMIENTO DE OLIGOS SOBREPUESTOS Este ejemplo se llevó a cabo para determinar el efecto de mbio de uso de codón de prolina en la expresión. Se recocieron los siguientes pares de oligos: 1. PDM-505 (NO DE ID DE SEC: 356) 5 ggttccgacgtgcgggacctgaacgcactgctg 3' PDM-506 (NO DE ID DE SEC: 357) 5 ctgccggcagcagtgcgttcaggtcccgcacgtcggaacc 3' 2. PDM-507 (NO DE ID DE SEC: 358) 5 ccggcagttccatccctgggtggcggtggaggctg 3' PDM-508 (NO DE ID DE SEC: 359) 5 cggcagtgcgcagcctccaccgccacccagggatggaa 3' 3. PDM-509 (NO DE ID DE SEC: 360) 5 cgcactgccggttagcggtgcagcacagtgggctc 3' PDM-510 (NO DE ID DE SEC: 361) 5 cagaactggagcccactgtgctgcaccgctaac 3' 4. PDM-511 (NO DE ID DE SEC: 362) 5 cagttctggacttcgcaccgcctggtgcatccgcatac 3' PDM-512 (NO DE ID DE SEC: 363) 5 cagggaaccgtatgcggatgcacaggcggtgcgaagtc 3' 5. PDM-513 (NO DE ID DE SEC: 364) 5 ggttccctgggtggtccagcacctccgcccgcaacgcc 3' PDM-514 (NO DE ID DE SEC: 365) 5 ggcggtgggggcgttgcgggcggaggtgctggaccacc 3' 6. PDM-515 (NO DE ID DE SEC: 366) 5 cccaccgcctccaccgcccccgcactccttcatcaacag 3' PDM-516 (NO DE ID DE SEC: 367) 5 ctaggttcctgtttgatgaaggagtgcgggggcggtgga 3' 7. PD -517 (NO DE ID DE SEC: 368) 5 gaacctagctggggtggtgcagaaccgcacgaagaaca 3' PDM-518 (NO DE ID DE SEC: 369) 5 ctcaggcactgttcttcgtgcggttctgcaccacccccag 3' 8. PD -519 (NO DE ID DE SEC: 370) 5 gtgcctgagcgcattctgagaattctgcagat 3' PDM-520 (NO DE ID DE SEC: 371) 5' gtgtgatggatatctgcagaattctcagaatgcg 3' Cada par oligo se combinó separadamente y después se recoció. Después se ligaron los pares conjuntamente y se utilizó un µ? de mezcla de ligación para las condiciones de PCR expuestas a continuación: 10µ? 10X de regulador Pfu 1µ? de 10mM de dNTPs 2 I de 10µ? de cada oligo 83µ?_ de agua estéril 1.5µ? de polimerasa de ADN de Pfu (Stratagene, La Jolla, CA) 96°C de 2 minutos 96°C 20 segundos 63°C 15 segundos 72°C 30 segundos * 40 ciclos 72°C 4 minutos El producto de PCR se digirió con EcoRI y se clonó en pPDM His el cual se había digerido con Eco72RI y EcoRI. La secuencia se confirmó y se transformó después en BLR pLys S y BLR que se co-transformó con CodonPlus RP. Para los ejemplos 10-12, se describen los siguientes NOs DE ID DE SEC: El NO DE ID DE SEC: 337 es la secuencia de cADN determinada para WT1_Tr1 El NO DE ID DE SEC: 338 es la secuencia de cADN determinada para WT1_Tr2 El NO DE ID DE SEC: 339 es la secuencia de cADN determinada para WT1_Tr3 El NO DE ID DE SEC: 340 es la secuencia de cADN determinada para WT1_Tr4 El NO DE ID DE SEC: 341 es la secuencia de cADN determinada para WT1_C El NO DE ID DE SEC: 342 es la secuencia de aminoácido pronosticada por el NO DE ID DE SEC: 337 El NO DE ID DE SEC: 343 es la secuencia de aminoácido pronosticada por el NO DE ID DE SEC: 338 El NO DE ID DE SEC: 344 es la secuencia de aminoácido pronosticada por el NO DE ID DE SEC: 339 El NO DE ID DE SEC: 345 es la secuencia de aminoácido pronosticada por el NO DE ID DE SEC: 340 El NO DE ID DE SEC: 346 es la secuencia de aminoácido pronosticada por el NO DE ID DE SEC: 341 La secuencia WT1 C representa un polinucleótido que tiene las regiones de codificación de TR2, TR3, y TR4. La secuencia sintética WT1 TR-1 representa un polinucleótido en el cual los codones alternativos para la prolina se substituyeron para los codones nativos, produciendo un polinucleótido capaz de expresar WT1 TR-1 en E. coli.

EJEMPLO 13 EVALUACIÓN DE LOS EFECTOS HISTOPATOLÓGICOS Y TOXICOLOG ICOS SISTEMICOS DE INMUNIZACIÓN DE WT1 EN RATONES El propósito de este ejemplo es analizar la inmunogenicidad y los efectos histopatológicos y toxicológicos sistémicos de la inmunización de proteína de WT1 en una titulación de dosis múltiple en ratones. Se resume el diseño experimental para la inmunización de ratones con la proteína WT1 en la Tabla L.

Tabla L Diseño Experimental de Inmunización de WT1 en Ratones La vacunación a la proteína de WT1 utilizando MPL-SE como adyuvante, en un estudio de titulación de dosis múltiple (oscilando las dosis desde 25 g, 100 g a 1 000pg de proteína de WT1 ) en ratones C57/B6 hembras produjo una fuerte respuesta de anticuerpos de WT1 específico (Figura 1 9) y respuestas celulares de células T (Figura 20). No se observó ningún efecto histológico o toxicológico sistémico de inmunización con proteína de WT1 . No se observó ninguna evidencia histológica de toxicidad en los siguientes tejidos: glándula adrenal, cerebro, intestino ciego, colon, duodeno, ojo, médula de fémur, vesícula biliar, corazón, íleo, yeyuno, riñon, laringe, glándula lacrimal, hígado, pulmón, nodo linfático, músculo, esófago, ovario, páncreas, paratiroides, glándula salival, esternón, y médula, bazo, estómago, timo, tráquea, vejiga urinaria y útero. Se puso énfasis especial en la evaluación de la toxicidad hematopoyética potencial. La proporción mieloide/eitroide en el esternón y médula de fémur fue normal. Todos los conteos evaluables de células de sangre y química de sangre (BUN, creatinina, bilirrubina, albúmina, globulina) estuvieron en el rango normal (Tabla Ll). Dada la inmunidad existente con WT1 que se encuentra presente en algunos pacientes con leucemia y que la vacunación a la proteína de WT1 puede producir Ab de WT1 específico y respuestas celulares de células T en ratones sin toxicidad a los tejidos normales, estos experimentos validan WT1 como una vacuna de tumor/leucemia.

Tabla Ll Química clínica v análisis de hematoloqía Tabla Ll: Estudio de Titulación de Dosis de WT1 Química Clínica y Análisis de Hematología Animal K/uL M/uL g/dl % fL Pg % # WBC RBC Hg. HCT MCV MCH MCHC Normal 5.4-16.0 6.7-12.5 10.2-16.6 32-54 31-62 9.2-20.8 22.0-35.5 Grupo 1 1(0) 5.6 8.41 12.8 43.5 53 15.2 29.4 2(0) 5.5 9.12 13.4 47.5 53 14.7 28.2 3(0) 7.5 9.22 13.5 48 54 14.7 28.1 4(0) 3.9 9.27 13.6 46 52 14.7 29.6 Media 5.6 9.0 13.3 46.3 53.0 14.8 28.8 STD 1.5 0.4 0.4 2.0 0.8 0.3 0.8 Grupo 2 5(1.5) 6.6 9 13.1 46 54 14.5 28.5 6(1.6) 5.2 8.58 12.6 44 53 14.7 28.6 7(1.7) 7.8 9.21 13.6 46 53 14.7 29.6 8(1.8) 6.3 NA NA 41 NA NA NA Media 6.5 8.9 13.1 44.3 53.3 14.6 28.9 STD 1.1 0.3 0.5 2.4 0.6 0.1 0.6 Grupo 3 9(2.5) 8.3 9.16 13.6 50.3 55 14.9 27.1 10(2.6 5 8.78 13 44.2 50 14.8 29.3 11(2.7) 4 8.94 13.2 48.3 54 14.7 27.3 Tabla Ll: Estudio de Titulación de Dosis de WT1 Química Clínica y Análisis de Hematología Animal K/uL ÑÍTÜL g/d %~ fL ¡ J % # WBC RBC Hg. HCT CV MCH MCHC Normal 5.4-16.0 6.7-12.5 10.2-16.6 32-54 31-62 9.2-20.8 22.0-35.5 12 (2.8) 8.2 NA NA 41 NA NA NA Media 6.4 9.0 13.3 46.0 53.0 14.8 27.9 STD 2.2 0.2 0.3 4.2 2.6 0.1 1.2 Grupo 4 13(3.5) 6.1 8.82 13.1 46 54 14.9 28.5 14(3.6) 6.1 8.64 12.9 46 54 15 28 15(3.7) 9.3 8.93 13.2 48 55 14.8 27.5 16(3.8) 4.8 8.19 12.6 44 55 15.3 28.6 Media 6.6 8.6 13.0 46.0 54.5 15.0 28.2 STD 1.9 0.3 0.3 1.6 0.6 0.2 0.5 Grupo 5 17(4.5) 3.1 8.48 12.6 46 54 14.9 27.5 18(4.6) 5.7 9.12 13.7 48 54 15 28.5 19(4.7) 5.3 8.58 13 44.5 55 15.2 29.2 20(4.8) 5.3 NA NA 40 NA NA NA Media 4.9 8.7 13.1 44.6 54.3 15.0 28.4 STD 1.2 0.3 0.6 3.4 0.6 0.2 0.9 Grupo 6 21(1.1) 3.5 9.36 13.5 37.6 40 14.4 35.9 22(1.2) 6.9 8.93 13.6 37.3 42 15.3 36.6 23(1.3) 3.6 8.3 12.5 35.3 43 15.1 35.5 24(1.4) NA NA NA NA NA NA NA Animal K/uL M/uL g/dl % fL pg % # WBC RBC Hg. HCT MCV MCH W1CHC Media 4.7 8.9 13.2 36.7 41.7 14.9 36.0 STD 1.9 0.5 0.6 1.3 1.5 0.5 0.6 Grupo 7 25(2.1) 4 NA NA 40 NA NA NA 26(2.2) 7.4 9.12 13.2 38.5 42 14.5 34.3 27(2.3) 4.5 8.19 12.1 34.5 42 14.8 35.1 28(2.4) 5.8 8.25 12.3 34.1 41 14.9 36.1 Media 5.4 8.5 12.5 36.8 41.7 14.7 35.2 STD 1.5 0.5 0.6 2.9 0.6 0.2 0.9 Grupo 8 29(3.1) 5.1 8.53 12.6 34.9 41 14.7 36 30(3.2) 7.6 8.42 13 36.1 43 15.4 35.9 31(3.3) 3.4 8.45 12.6 34.9 41 14.9 36.1 32(3.4) 6.1 8.11 12.3 34.8 43 15!2 35.5 Media 5.6 8.4 12.6 35.2 42.0 15.1 35.9 STD 1.8 0.2 0.3 0.6 1.2 0.3 0.3 Grupo 9 33(4.1) NA NA NA NA NA NA NA 34(4.2) 4.5 8.63 12.8 36.2 42 14.8 35.2 35(4.3) 3.9 8.85 13 36.6 41 14.7 35.6 36(4.4) 4.7 8.14 12.3 33.8 42 15.1 36.3 Media 4.4 8.5 12.7 35.5 41.7 14.9 35.7 STD 0.4 0.4 0.4 1.5 0.6 0.2 0.6 Tabla Ll (continuación): Estudio de Titulación de Dosis de WT1 Química Clínica y Análisis de Hematología Animal Sí/no K/uL Abs. Abs. Abs. Abs. Abs. Abs.

# Aglutin. Plaquetas Baso Eos Bandas Polys Llnf Mono de plaque. Normal No 150-1500 0.0-0.15 0.0-0.51 0.0-0.32 8.0-42.9 8.0-18.0 0.0-1.5 Grupo 1 K/uL K/uL K/uL K/uL K/uL K/uL 1(0) Sí 726 0 56 0 336 5208 0 2(0) No 860 0 0 0 55 5445 0 3(0) No 875 0 375 0 525 6525 75 4(0) Sí 902 0 0 0 156 3744 0 Media 840.8 0.0 107.8 0.0 268.0 5230.5 18.8 STD 78.4 0.0 180.1 0.0 207.0 1144.8 37.5 Grupo 2 5(1.5) No 1193 0 132 0 792 5214 462 6(1.6) No 1166 0 52 0 624 4472 52 7(1.7) No 1087 0 234 0 1170 6396 0 8(1.8) Si- NA 0 126 0 126 5922 126 Media 1148.7 0.0 136.0 0.0 678.0 550 .0 160.0 STD 55.1 0.0 74.8 0.0 433.1 840.5 207.9 Grupo 3 9(2.5) No 705 0 166 0 664 7387 83 10(2.6) No 1140 0 150 0 500 4350 0 11(2.7) No 952 0 120 0 680 3200 0 12(2.8) Sí NA 0 164 0 656 7216 164 Media 932.3 0.0 150.0 0.0 625.0 5538.3 61.8 STD 218.2 0.0 21.2 0.0 83.9 2090.6 78.6 Animal Sí/no K/uL Abs. Abs. Abs. Abs. Abs. Abs.

# Agl utin. Plaquetas Baso Eos Bandas Polys Llnf Mono de plaque. N ormal No 150-1500 0.0-0.15 0.0-0.51 0.0-0.32 8.0-42.9 8.0-18.0 0.0-1.5 Grupo 4 13(3.5) No 785 0 488 0 732 4636 244 14(3.6) Sí 973 0 0 0 488 5307 305 15(3.7) Sí 939 0 465 0 558 7812 465 16(3.8) Sí 1622 0 192 0 480 4080 48 Media 1079.8 0.0 286.3 0.0 564.5 5458.8 265.5 STD 370.6 0.0 233.4 0.0 1 17.0 1647.1 172.4 Grupo 5 17(4.5) No 892 0 31 0 620 2449 0 18(4.6) S í 966 57 1 14 0 855 4674 0 19(4.7) Sí 883 0 53 0 742 4452 53 20(4.8) Sí NA 0 1 06 0 53 5141 0 Media 913.7 14.3 76.0 0.0 567.5 4179.0 1 3.3 STD 45.5 28.5 40.4 0.0 356.2 1 1 88.5 26.5 Tabla Ll (continuación): Estudio de Titulación de Dosis de WT1 Química Clínica y Análisis de Hematología Animal Sí/no K/uL Abs. Abs. Abs. Abs. Abs. Abs.

# Aglutin. Plaquetas Baso Eos Bandas Polys Llnf Mono Q plaque. Normal No 150-1500 0.0-0.15 0.0-0.51 0.0-0.32 8.0-42.9 8.0-18.0 0.0-1.5 Grupo 6 21(1.1) Si 784 0 35 0 385 2870 210 22(1.2) Sí 806 0 69 0 207 6486 138 23(1.3) Sí 790 0 180 0 396 2988 36 24(1.4) NA NA NA NA NA NA NA NA Media 793.3 0.0 94.7 0.0 329.3 4114.7 128.0 STD 11.4 0.0 75.8 0.0 106.1 2054.5 87.4 Grupo 7 25(2.1) Sí NA 0 80 0 200 3720 0 26(2.2) Si 753 0 0 0 518 6734 148 27(2.3) Sí 725 0 90 0 225 4140 45 28(2.4) Sí 792 0 232 0 754 4814 0 Media 756.7 0.0 100.5 0.0 424.3 4852.0 48.3 STD 33.7 0.0 96.5 0.0 263.0 1333.1 69.8 Grupo 8 29(3.1) Sí 784 0 153 0 561 4233 153 30(3.2) Sí 512 0 152 0 304 6992 152 31(3.3) Sí 701 0 0 0 238 3094 68 32(3.4) Sí 631 0 305 0 305 5368 122 Media 657.0 0.0 152.5 0.0 352.0 4921.8 123.8 STD 115.1 0.0 124.5 0.0 142.8 1663.3 39.9 Animal Sí/no K/uL Abs. Abs. Abs. Abs. Abs. Abs.

# Aglutin. Plaquetas Baso Eos Bandas Polys Linf Mono u plaque. Normal No 150-1500 0.0-0.15 0.0-0.51 0.0-0.32 8.0-42.9 8.0-18.0 0.0-1.5 Grupo 9 33(4.1) NA NA NA NA NA NA NA 34(4.2) Sí 724 0 125 0 540 3780 45 35(4.3) Sí 758 0 117 0 429 3315 39 36(4.4) Sí 808 0 47 0 329 4089 235 Media Sí 763.3 0.0 96.3 0.0 432.7 3728.0 106.3 STD 42.3 0.0 42.9 0.0 105.5 389.6 111.5 Tabla Ll (continuación): Estudio de Titulación de Dosis de WT1 Química Clínica y Análisis de Hematología Animal mg/dl mg/dl g/dl g/dl g/dl mg/dl # BUN Creatinina proteína albúmina globulina Bilirubina T. T.

Normal 13.9-28.3 0.3-1.0 4.0-8.6 2.5-4.8 1.5-3.8 0.10-0.90 Grupo 1 1(0) NA NA NA NA NA NA 2(0) 28 0.5 4.9 3.7 1.2 0.3 3(0) 25 0.5 4.9 3.8 1.1 0.2 4(0) 27 0.5 4.7 3.7 1 0.2 Media 26.7 0.5 4.8 3.7 1.1 0.2 STD 1.5 0.0 0.1 0.1 0.1 0.1 Tabla Ll (continuación): Estudio de Titulación de Dosis de WT1 Química Clínica y Análisis de Hematología Animal mg/dl mg/dl g/dl g/dl g/dl mg/dl # BUN Creatinina proteína albúmina globulina Bilirubina Normal 13.9-28.3 0.3-1.0 4.0-8.6 2.5-4.8 1.5-3.8 0.10-0.90 Grupo 2 5(1.5) 34 0.5 4.6 3.6 1 0.2 6(1.6) 31 0.4 4.6 3.3 1.3 0.2 7(1.7) 34 0.6 4.9 4 0.9 0.3 8(1.8) NA NA NA NA NA NA Media 33.0 0.5 4.7 3.6 1.1 0.2 STD 1.7 0.1 0.2 0.4 0.2 0.1 Grupo 3 9(2.5) NA NA NA NA NA NA 10(2.6) 33 0.5 4.6 3.6 1 0.3 11(2.7) NA NA NA NA NA NA 12(2.8) 31 0.5 4.8 3.7 1.1 0.2 Media 32.0 0.5 4.7 3.7 1.1 0.3 STD 1.4 0.0 0.1 0.1 0.1 0.1 Grupo 4 13(3.5) 32 0.7 4.6 3.4 1.2 0.2 14(3.6) 34 0.4 4.8 3.8 1 0.2 15(3.7) 30 0.4 4.7 3.4 1.3 0.2 Tabla Ll (continuación): Estudio de Titulación de Dosis de WT1 Química Clínica y Análisis de Hematología Animal mg/dl mg/dl g/dl g/dl g/dl mg/dl # BUN Creatinina proteína albúmina globulina Bilirubina T. T. 16(3.8) 24 0.3 5.1 3.8 1.3 0.2 Media 30.0 0.5 4.8 3.6 1.2 0.2 STD 4.3 0.2 0.2 0.2 0.1 0.0 Grupo 5 17(4.5) 22 0.4 4.6 3.3 1.3 0.2 18(4.6) 31 0.5 4.9 3.7 1.2 0.2 19(4.7) 23 0.6 4.8 3.6 1.2 0.2 20(4.8) 28 0.5 4.5 3.4 1.1 0.2 Medio 26.0 0.5 4.7 3.5 1.2 0.2 STD 4.2 0.1 0.2 0.2 0.1 0.0 Grupo 6 21(1.1) 28 0.3 5.1 3.4 1.7 0.2 22(1.2) 36 0.3 5.1 3.8 1.3 0.2 23(1.3) 32 0.4 4.9 3.5 1.4 0.1 24(1.4) NA NA NA NA NA NA Media 32.0 0.3 5.0 3.6 1.5 0.2 STD 4.0 0.1 0.1 0.2 0.2 0.1 Grupo 7 25(2.1) 32 0.2 5 3.4 1.6 0.2 26(2.2) 24 0.3 4.2 2.8 1.4 0.1 27(2.3) 28 0.3 4.8 3.2 1 .6 0.2 28(2.4) 27 0.3 5 3.4 1.6 0.1 Medio 27.8 0.3 4.8 3.2 1.6 0.2 STD 3.3 0.0 0.4 0.3 0.1 0.1 G ru po 8 29(3.1 ) 32 0.3 4.9 3.3 1.6 0.2 30(3.2) NA NA NA NA NA NA 31 (3.3) 18 0.3 4.8 3.1 1.7 0.2 32(3.4) 26 0.2 4.2 2.9 1 .3 0 Media 25.3 0.3 4.6 3.1 1.5 0.1 STD 7.0 0.1 0.4 0.2 0.2 0.1 G ru po 9 33(4.1 ) 25 0.2 4.1 2.7 1 .4 0.3 34(4.2) NA NA NA NA NA NA 35(4.3) 23 0.2 4.7 3.1 1 .6 0.2 36(4.4) 29 0.3 4.7 3.2 1.5 0.3 Media 25.7 0.2 4.5 3.0 1.5 0.3 STD 3.1 0.1 0.3 0.3 0.1 0.1 Abreviaciones WBC: glóbulos blancos; RBC: glóbulos os; Hg : hemog lobina; HCT : hematocrito; MCV: volumen corpuscular medio; MCH : hemoglobina corpuscular media; MCHC: concentración de hemoglobina corpuscular media; Plt: plaquetas; Abs. : Absoluto; Baso: basófilos; Eos: eosinófilos; Abs. Bandas: neutrofilos inmaduros; Polys: células polimorfonucleares; Linf. : linfocitos; Mono: monocitos; BUN: niírógeno de urea de sangre.

EJEMPLO 14 PRODUCCIÓN DE RESPUESTAS DE CÉLULAS T DE WT1 ESPECÍFICO HUMANO POR IMPRIMACIÓN IN VITRO DE GEN COMPLETO Este Ejemplo demuestra que las respuestas de células T de WT1 específico pueden generarse a partir de la sangre de personas normales. Las células dendríticas (DC) se diferenciaron de los cultivos de monocitos derivados de PBMC de donadores normales por desarrollo durante 4-1 0 días en medio de RPMI con contenido de suero humano al 10%, 50 ng/ml de GMCSF y 30 ng/ml de IL-4. Después del cultivo, se infectó DC 16 horas con virus de vacunas de expresión de WT1 recombinante a un M.O. I. de 5, o durante 3 días con adenovirus de expresión de WT1 recombinante a un M.O. I. de 10 (Figuras 21 y 22). Los virus de vacunas se inactivaron por irradiación U.V. Las células T CD8+ se aislaron por selección positiva utilizando cuentas magnéticas, y se iniciaron cultivos de imprimación en placas de 96 cavidades. Los cultivos se reestimularon cada 7-10 días utilizando células dendríticas autólogas adeno o vacunas infectadas para expresar el WT1 . Después de 3-6 ciclos de estimulación, se pudo identificar las líneas CD8+ que produjeron específicamente interferón-gamma cuando se estimularon con células dendríticas o fibroblastos de expresión de WT1 autólogas. La actividad de WT1 específico de estas líneas pudo mantenerse después de ciclos de estimulación adicionales. Estas líneas demostraron reconocer específicamente las células dendríticas autólogas infectadas de WT1 de vacunas o adeno específicamente reconocidas pero no células dendríticas autólogas infectadas con EGFP de vacunas o adeno por pruebas de Elispot (Figura 23).

EJEMPLO 15 FORMULACIÓN DE RA12-WT1 PARA INYECCIÓN: USO DE EXCIPIENTES PARA ESTABILIZAR EL PRODUCTO LIOFILIZADO. Este ejemplo describe la formulación que permite la completa solubilización de Ra 12-WT1 liofilizado. La siguiente formulación le permitió a la proteína recombinante Ra12-WT1 disolverse en un medio acuosos después de liofilizarse hasta la sequedad: La concentración de Ra 12-WT1 recombinante: 0.5-1 .0 mg/ml; Regulador: 1 0-20 mM de etanolamina, pH de 10.0; 1 .0-5.0 mM de Cisteína; Tween-80 al 0.05% (Polisorbato-80); Azúcar: Trehalosa al 10% (T5251 , Sigma, MO), Maltosa al 10% (M9171 , Sigma, MO), Sacarosa al 10% (S7903, Sigma, MO), Fructosa al 10% (F2543, Sigma, MO), Glucosa al 10% (G7528, Sigma, MO). Se descubrió que la proteína liofilizada con el excipiente de azúcar se disolvía significativamente más que sin el excipiente de azúcar. El análisis por SDS-PAGE teñida de coomasie no mostró signos de sólidos restantes en el material disuelto.

EJEMPLO 16 FORMU LACIONES DE U NA VAC U NA DE PROTEÍ NA DE WT1 Este Ejemplo describe la inducción de respuestas inmunológicas de WT1 específico después de la inmunización con la proteína de WT1 y 2 formulaciones adyuvantes diferentes. De acuerdo con este ejemplo, la proteína de WT1 en combinación con MPL-S E induce u na fuerte respuesta de Ab e l nterferón-? (I FN-?) a WT1 . A continuación se describen los métodos utilizados para inducir respuestas inm unológicas de WT1 específico después de la in munización de la proteína WT1 utilizando MP L-SE o Enhanzyn como adyuvante en los ratones C57/B6. Los ratones C57/B6 se inmunizaron con 20 µ9 de rRa12-WT1 combinado sea con adyuvantes de MPL-SE o de Enhanzyn. Se inmunizó un g rupo de ratones de control se inmunizó con rRa12-WT1 sin adyuvante o se inmunizó un grupo solo con salmuera. Se dieron tres inmunizaciones intram usculares (I M) , tres semanas después. Los bazos y los sueros se cosecharon 2 semanas después de la inmunización postfinal. Los sueros se analizaron para respuestas de anticuerpos por ELISA en placas recubiertas con fusión de Ra1 2-WT1 , Ra 12 o WT1 TRX. Se observaron niveles similares de titulaciones de anticuerpos IgG2a e igG 1 en ratones inmunizados con Ra l 2-WT1 +MPL-S E y Ra 12-WT1 + Enhanzyn. Los ratones inmunizados con rRa 1 2-WT1 sin adyuvante mostraron niveles inferiores de anticuerpos lgG2a. Se evaluaron las respuestas de CD4 al medir la producción de l nterferón-? después de la estimulación de esplenocitos in vitro con rRa12-WT1, rRa12 o con péptidos de WT1 p6, p117 y p287. Ambos adyuvantes mejoraron las respuestas de CD4 en ratones inmunizados solo con rRA12-WT1. Además, los resultados indican que rRA-12WT1+MPL-SE indujo una respuesta más fuerte de CD4 que rRA12-WT1 +Enhanzyn. Las lecturas de IFN-? oscilaron desde 1.4-1.6 en los ratones inmunizados con rRA12-WT1 + PL-SE en comparación con 1-1.2 en los ratones inmunizados con rRA12-WT1+Enhanzyn. Las respuestas de péptido se observaron solamente contra p 117, y después solamente en ratones inmunizados con rRal 2-WT1 +MPL-SE. Las respuestas fuertes de IFN-? al control positivo, ConA, se observaron en todos los ratones. Solo se observaron las respuestas a ConA en los ratones de control negativo inmunizados con salmuera indicando que las respuestas fueron específicos para rRA12-WT1.

EJEMPLO 17 CONSTRUCCIÓN DE UNA BIBLIOTECA DE WT1 MUTADA ALEATORIAMENTE La secuencia de ácido nucléico de WT1 humano mutó aleatoriamente utilizando un método de reacción de cadena de polimerasa en presencia de 8-oxo- dGTP y dPTP (Journal of Molecular Biology 1996; 255:589-603). El gen WT1 humano no empalmado completo se describe en el NO DE ID DE SEC: 380 y la secuencia de proteína correspondiente se establece en NO DE ID DE SEC: 404. Se utilizó una variante de empalme de WT1 como plantilla para las reacciones de PCR y se describe en los NOs DE ID DE SEC: 381 (ADN) y 408 (proteína). Las condiciones se seleccionaron de manera que la frecuencia de alteraciones de ácido nucléico condujo a un cambio objetivo en la secuencia de aminoácido, generalmente 5-30% del producto PCR. El producto PCR mutado se amplificó después en ausencia de los análogos nucleótidos utilizando los cuatro dNTPs normales. Este producto PCR se subclonó en vectores de expresión mamífera y vectores virales para la inmunización. Esta biblioteca, por ende, contiene una población mixta de clones de WT1 mutados aleatoriamente. Se seleccionaron y secuenciaron varios clones. Las secuencias de ADN variante de WT1 mutadas se describen en los NOs DE ID DE SEC:377-379 y las secuencia de aminoácido pronosticadas de las variantes se establecen en los NOs DE I D DE SEC:405-407. Estas secuencias alteradas, y otras de la biblioteca, pueden utilizarse como inmunogenes para inducir respuestas más fuertes de células T contra la proteína de WT1 en células cancerosas.

EJEMPLO 18 CONSTRUCCIÓN DE FUSIONES DE WT1 -LAMP Se construyó una fusión tripartita utilizando la reacción de cadena de polimerasa y oligonucleotidos sintéticos con contenido de las uniones deseadas de la proteína-1 de membrana asociada lisosomal humana (LAMP-1 ) y una variante de empalme de la secuencia WT1 humana. La variante de empalme de WT1 y la secuencia de LAMP-1 utilizada para estas fusiones se describen en los NOs DE ID DE SEC:381 y 383. Específicamente, el péptido de señal de LAMP-1 (pares base 1 -87 de LAMP) se fusionó al extremo 5-prima del marco de lectura abierta del WT1 humano (1 ,290 pares base en longitud) , después se fusionaron la transmembrana y el dominio citoplásmico de LAMP-(pares base 1 161 a 1281 de LAMP) al extremo 3-prima de la secuencia de WT1 . La secuencia de la construcción WT1 -LAMP resultante se establece en el NO DE I D DE SEC: 382 (ADN) y el NO DE I D DE SEC: 409 (proteína). La construcción se diseñó de manera que cuando se expresa en células eucarióticas, el péptido de señal dirige la proteína al retículo endoplásmico (ER) donde las señales de localización en la transmembrana y el dominio citoplásmico de LAMP-1 dirigen el transporte de la proteína de fusión a la ubicación lisosomal donde se cargan los péptidos en moléculas MHC de Clase I I .

EJEMPLO 1 9 CONSTRUCCIÓN DE FUS IONES DE WT1 -U BIQUITI NA PARA PRESENTACIÓN DE MHC CLASE I MEJORADA El marco de lectura abierta de ubiquitina humana (NO DE ID DE SEC: 384) se mutó de manera tal que los nucleótidos que codifican el último aminoácido codifican una alanina en lugar de una glicina. Este marco de lectura abierta mutado se clonó en el marco justo corriente arriba del primer codón de una variante de empalme del WT1 humano (NO DE ID DE SEC: 381 y 408, ADN y proteína, respectivamente). La mutación G->A evita el empalme de co-traducción de la proteína naciente por las proteasas que normalmente procesan la poli-ubiquitina durante la traducción. El ADN y la secuencia de aminoácido pronosticada para la construcción resultante se establecen en el NOs DE I D DE SEC:385 y 410, respectivamente. La proteína resultante demostró una citotoxicidad celular disminuida cuando se expresó en células humanas. Mientras no fue posible generar líneas estables que más eficaz de la proteína por las células T CD8+ de WT1 específico.

EJEMPLO 20 CONSTRUCCIÓN DE UN ADENOVI RUS QUE EXPRESA WT1 HUMANO Una variante de empalme de WT1 humano (NO DE ID DE SEC: 381 ) se clonó en un vector serotipo 5 de adenovirus eliminado E1 y E3. La expresión del gen WT1 se controla por el mejorador CMV mediando niveles elevados de expresión de proteína de WT1 . - La infección de células humanas con este agente reactivo conduce a un nivel alto de expresión de la proteína WT1 . La naturaleza antigénica de las proteínas adenovirales introducidas en la célula huésped durante y producido a niveles bajos subsecuente a la infección puede actuar para incrementar la vigilancia inmunológica y el reconocimiento inmunológico de WT1 como un objetivo inmunológico. Este vector puede utilizarse también para generar respuestas inmunológicas contra la proteína de WT1 cuando se inocula en pacientes humanos. Si estos pacientes son positivos para las células tumorosas de expresión de WT1 la respuesta inmunológica podría tener un efecto terapéutico o curativo en el transcurso de la enfermedad.

EJEMPLO 21 CONSTRUCCIÓN DE UN VECTOR DE VIRUS DE VACUNAS DE EXPRESIÓN DE WT1 HUMANO Una variante de empalme del gen WT1 humano de tamaño natural (NO DE I D DE SEC: 381 ) se clonó en el lugar de quinasa de timidina de la cepa de Reserva Western de la virus de vacunas que utiliza el vector de lanzadera pSC1 1 . El gen WT1 se encuentra bajo el control de un mejorador de virus de vacunas híbridas que media la expresión genética a través el transcurso de infección de virus de vacunas. Este agente reactivo puede utilizarse para expresar la proteína WT1 en células humanas in vivo o in vitro. WT1 es una auto proteína que se sobreexpresa en las mismas células tumorosas humanas. Consecuentemente, las respuestas inmunológicas a WT1 suministradas como proteína son poco propensas a conducir el reconocimiento mediado con Histocompatibilidad Mayor Clase I (MHC clase I) de WT1 . Sin embargo, la expresión de la proteína en el compartimiento intracelular por el vector de virus de vacunas permitirá un alto nivel de presentación de MHC Clase I y el reconocimiento de la proteína de WT1 por las células T CD8+. La expresión de la proteína de WT1 por el vector de virus de vacunas conducirá también a la presentación de los péptidos de WT1 en el contexto de MHC Clase II y consecuentemente al reconocimiento por las células T CD4+.

Los usos de esta invención incluyen su uso como una vacuna contra el cáncer. La inmunización de pacientes humanos que soportan los tumores positivos a WT1 podrían conducir a una respuesta terapéutica o curativa. La expresión de WT1 en la célula conducirá al reconocimiento de la proteína tanto por células T positivas a CD4 como CD8.

EJEMPLO 22 GENERACIÓN DE CLONES DE CÉLULAS T DE CD8+ DE WT1 ESPECÍFICO QUE UTI LIZAN IMPRIMACIÓN DE GEN COMPLETO Las células dendríticas (DC) se diferenciaron de los cultivos de monocito derivadas de PBMC de donadores normales por desarrollo durante 4-6 días en un medio de RPMI con contenido de suero humano al 10%, 50 ñg/ml de GM-CSF y 30 ng/ml de IL-4. Después del cultivo, se infectaron las DC 16 horas con virus de vacunas de expresión de WT1 recombinante (descrito en el Ejemplo 21 ) en una multiplicidad de infección (MOI) de 5 o durante 3 días con adenovirus de expresión de WT1 recombinante a un MOI de 10. Los virus de vacunas se inactivaron por irradiación U.V. Las células T CD8+ se aislaron por empobrecimiento negativo utilizando cuentas magnéticas y se iniciaron los cultivos de imprimación en placas de 96 cavidades. Los cultivos se reestimularon cada 7-1 0 días utilizando células dendríticas autólogas infectadas con adeno virus o de vacunas diseñadas para expresar WT1 . Después de 4-5 ciclos de estimulación, las líneas de células T CD8+ pudo identificarse que produjeron específicamente interferón-gamma cuando se éstimularon con células dendríticas de expresión de WT1 autólogo o fibroblastos. Estas líneas se clonaron y demostraron reconocer específicamente fibroblastos autólogos transducidos de WT1 pero no fibroblastos transducidos de EGFP por pruebas Elispot. El gen del tumor de Wilms' (WT1 ) participa en la leucemiogénesis y se sobreexpresa en la mayoría de las leucemias humanas así como también en varios tumores sólidos. Estudios anteriores en seres humanos han demostrado la presencia de respuestas de anticuerpos (Ab) de WT1 específico en 16/63 (25%) de AML y en 15/81 (19%) de pacientes CML estudiados. Los estudios anteriores en ratones han demostrado que las vacunas basadas en péptido de WT1 producen respuestas de Ab, Th y CTL de WT1 específico. El uso de péptidos como vacunas en seres humanos se encuentra limitado por su restricción HLA y la tendencia a producir respuestas específicas de péptido y solamente en una minoría de pacientes de CTL de tumor específico. Las ventajas de la inmunización de gen completo son que pueden incluirse varios epítopes auxiliares y CTL en una sola vacuna, sin restringir la vacuna a los tipos de Hla específico. Los datos descritos en la presente demuestran la inducción de respuestas inmunológicas de WT1 específico que utilizan la imprimación in vitro de gen completo y que pueden generarse clones de células T CD8+ de WT1 específico. Dada que se encuentra presente la inmunidad existente a WT1 en algunos pacientes con leucemia y que WT1 murina y humana son 96% idénticas a nivel de aminoácido y la vacunación a la proteína WT1 , ADN o péptidos puede producir respuestas de Ab específicos y celulares de células T en ratones sin toxicidad a los tejidos normales en ratones, estos experimentos de imprimación in vitro humanos proporcionan validación adicional de WT1 como una vacuna contra tumor/leucemia. Además, la capacidad de generar clones de células T CD8+ de WT1 específico puede conducir al tratamiento de malignidades asociadas con la sobreexpresión de WT1 utilizando células T diseñadas genéticamente.

EJEMPLO 23 CONSTRUCCIONES RECOMB1 ANTES PARA LA ELABORACIÓN CLÍNICA DE WT1 Se elaboraron cinco construcciones como se describe detalladamente a continuación, para la producción de WT1 de grado clínico.

Diseño de Ra1 2/WT-E (NOs DE ID DE SEC:388 (cADN) y 391 (proteína)) y WT-1 E (NOs DE I D DE SEC :386 (cADN) y 395 (proteína) con etiqueta de No H is: El marco de lectura WT-1 E se amplificó por PCR con los siguientes imprimadores para la construcción de no fusión de no His: PDM-780 (NO DE ID DE SEC: 396) 5' gacgaaagcatatgcactccttcatcaaac 3' Tm 60°C. PDM-779 (NO DE ID DE SEC: 397) 5' cgcgtgaattcatcactgaatgcctctgaag 3' Tm 63°C Se utilizaron las siguientes condiciones de reciclaje de PCR: 10 µ? de reg ulador 1 0X Pfu, 1 µ ? de 1 0 mM de dNTPs, 2 µ? de 10µ cada oligo, 83µ ? de agua estéril, 1 .5µ? de polimerasa de ADN Pfu (Stratagene, La Jolla , CA) , 50 ng de ADN (pPDMRa 1 2 WT-1 No His). La reacción se desnaturalizó inicialmente a 96°C durante 2 minutos , seguida de 40 ciclos de 96°C durante 20 seg undos, 62°C durante 1 5 segundos , y 72°C durante 1 minuto y 40 segundos. Esto fue seguido de una extensión final de 72°C durante 4 minutos. El producto de PCR se digirió con Ndel y EcoRI y se clonó en pPDM His (un vector pET28 modificado) que se había digerido con Ndel y EcoRI . La construcción se confirmó a través del análisis de secuencia y se transformó después en células BLR (DE3) pLys S y HMS 174 (DE3) pLys . Esta construcción - pPDM WT-1 E se digirió después con Ncol y Xba l y se utilizó como estructura principal vectorial para el inserto de Ncol y Xbal de pPDM Ra12 WT-1 F (ver a continuación) . La construcción se confirmó mediante análisis de secuencia y se transformó después en células BLR (DE3) pLys S y HMS 174 (DE3) pLys S . La expresión de proteína se confirmó por SDS-PAGE teñido de Coomasie y análisis de secuencia de proteína N-term inal.

Diseño de Ra12-WT-1 -F (a. a. 1 -281 ) con etiqueta de No His (NOs DE ID DE SEC: 389 (cADN) y 393 (proteína)) : El marco de lectura Ra 12 WT-1 se amplificó por PCR con los siguientes imprimadores: PDM-777 (NO DE I D DE SEC: 398) 5' cgataagcatatgacggccgcgtccgataac 3' Tm 66°C PDM-779 (NO DE I D DE S EC: 399) 5' cgcgtgaattcatcactgaatgcctctgaag 3' Tm 63°C Se utilizaron las siguientes condiciones de ciclaje de PCR: 10 µ? de regulador 1 0X Pfu, 1 µ? de 10 mM de dNTPs, 2 µ? de 10µ? cada oligo, 83µ? de agua estéril, 1 .5µ? de polimerasa de ADN Pfu (Stratagene, La Jolla, CA) , 50 ng de ADN (pPDM a 12 WT-1 No His). La reacción se desnaturalizó ¡nicialmente a 96°C durante 2 minutos, seguida de 40 ciclos de 96°C durante 20 segundos, 58°C durante 15 segundos, y 72°C durante 3 minutos. Esto fue seguido de una extensión final de 72°C durante 4 minutos. El producto de PCR se digirió con Ndel y se clonó en pPDM His que se había digerido con Ndel y Eco721. La secuencia se confirmó mediante el análisis de secuencia y se transformó después en células BLR (DE3) pLys S y HMS 174 (DE3) pLys. La expresión de proteína se confirmó por SDS-PAGE teñido de Coomasie y análisis de secuencia de proteína N-terminal.

Diseño de Ra12-WT1 con etiqueta de No His (NO DE ID DE SEC: 390 (cADN) y 392 (proteína)): El marco de lectura de Ra12 WT-1 se amplificó por PCR con los siguientes imprimadores: PDM-777 (NO DE ID DE SEC: 400) 5' cgataagcatatgacggccgcgtccgataac 3' Tm 66°C PDM-778 (NO DE ID DE SEC: 401 ) 5' gtctgcagcggccggctcaaagcgccagc 3' Tm 70°C Se utilizaron las siguientes condiciones de ciclaje de PCR: 10 µ? de regulador 10X Pfu, 1 µ? de 10 mM de dNTPs, 2 µ? de 1 0µ? cada oligo, 83µ? de agua estéril, 1 .5µ? de polimerasa de ADN Pfu (Stratagene, La Jolla, CA), 50 ng de ADN (pPDMRa12 WT-1 No His). La reacción se desnaturalizó inicialmente a 96°C durante 2 minutos, seguida de 40 ciclos de 96°C durante 20 segundos, 68°C durante 1 5 segundos, y 72°C durante 2 minutos y 30 segundos. Esto fue seguido de una extensión final de 72°C durante 4 minutos. El producto de PCR se digirió con Notl y Ndel y se clonó en pPDM His que se había digerido con Ndel y EcoRI . La secuencia se confirmó mediante el análisis de secuencia y se transformó después en células BLR (DE3) pLys S y HMS 174 (DE3) pLys. La expresión de proteína se confirmó por SDS-PAGE teñido de Coomasie y análisis de secuencia de proteína N-terminal.

Diseño de WT-1 C (a. a. 69-430) en E. coli sin etiq ueta de H is NOs DE ID DE SEC: 387 (cADN) y 394 (proteína)): El marco de lectura de WT-1 C se amplificó por PCR con los siguientes imprimadores: PDM-780 (NO DE ID DE SEC: 402) 5' gacgaagcatatgcactccttcataaac 3' Tm 60°C PDM-778 (NO DE ID DE SEC: 403) 5' gtctgcagcggccgctcaaagcgccagc 3' Tm 70°C Se utilizaron las siguientes condiciones de ciclaje de PCR: 10 µ? de regulador 1 0X Pfu, 1 µ? de 1 0 mM de dNTPs, 2 µ? de 1 0µ? cada oligo, 83µ? de agua estéril, 1 .5 l de polimerasa de ADN Pfu (Stratagene, La Jolla, CA), 50 ng de ADN (pPDMRa12 WT-1 No His). La reacción se desnaturalizó inicialmente a 96°C durante 2 minutos, seguida de 40 ciclos de 96°C durante 20 segundos, 62°C durante 15 segundos, y 72°C durante 2 minutos. Esto fue seguido de una extensión final de 72°C durante 4 minutos. El producto de PCR se digirió con Ndel y se clonó en pPDM His que se había digerido con Ndel y Eco72l . La secuencia se confirmó mediante el análisis de secuencia y se transformó después en células BLR (DE3) pLys S y HMS 174 (DE3) pLys. La expresión de proteína se confirmó por SDS-PAGE teñido de Coomasie y análisis de secuencia de proteína N-terminal.

EJEMPLO 24 GENERACIÓN DE CLONES DE CÉLULAS T CD8+ DE WT1 ESPECÍFICO QUE UTILIZAN IMPRI MACIÓN DE GEN COMPLETO E IDENTI FICACIÓN DE UN EPÍTOPE DE WT1 RESTRI NGI DO HLA-A2 En este Ejemplo, los vehículos de suministro de virus Adeno o Vacunas se utilizaron para generar líneas de células T de WT1 -específico. Un clon de células T derivado de la línea mostró ser específico para WT1 y además, se identificó el epítope reconocido por este clon. Las células dendríticas (DC) se diferenciaron de los cultivos de monocitos derivados de PBMC de donadores normales por desarrollo durante 4-6 días en un medio de RPMI con contenido de suero humano 1 0%, 50 ng/mi de GM-CSF y 30 ng/ml de IL-4. Después del cultivo, se infectaron las DC 16 horas con virus de vacunas de expresión de WT1 recombinante en una multiplicidad de infección (MOI) de 5 o durante 2-3 días con adenovirus de expresión de WT1 recombinante a un MOI de 3- 10. Los virus de vacunas se inactivaron por irradiación U .V. Las células T CD8+ se aislaron por empobrecimiento negativo utilizando anticuerpos para las células CD4, CD14, CD16, CD19 y CD56+, seguido de cuentas magnéticas específicas para la porción de Fe de estos Abs. Los cultivos de imprimación se iniciaron en placas de 96 cavidades. Los cultivos se reestimularon cada 7-14 días utilizando células dendríticas autólogas infectadas con adenovirus o de vacunas diseñadas para expresar WT1 . Después de 4-5 ciclos de estimulación, pudieron identificarse las líneas de células T CD8+ que produjeron específicamente interferón-? (I FN-?) cuando se estimuló con células dendríticas de expresión de WT1 autólogas o fibroblastos. Estas líneas se clonaron y demostraron reconocer específicamente fibroblastos autólogos transducidos de WT1 pero no controlaron los fibroblastos transducidos por pruebas de Elispot. Para analizar adicionalmente la restricción de HLA de estos clones de células T de CD8+ de WT1 específico, los fibroblastos derivaron de un donador adicional (D475) , que comparten solamente el alelo HLA-A2 con el donador (D349) a partir del cual se estableció el clon de células T, se sometieron a transducción con WT1 . El análisis de ELISPOT demostró el reconocimiento de estas células objetivo D475 por el clon de células T. Para demostrar adicionalmente la restricción de HLA A2 y demostrar que este epítope se expresa por células tumorosas que sobreexpresan "naturalmente" WT1 (como parte de su transformación maligna), se probó la línea de células de leucemia K562. K562 se sometió a transducción con la molécula HLA A2, y se utilizaron células K562 negativas a HLA-A2 como controles para la liberación de I FN-? no específica. La prueba de ELISPOT demostró que las células T reconocieron la línea de células K562 positiva a A2, pero no las células K562 negativas a A2. La prueba adicional de especificidad y restricción de HLA-A2 del reconocimiento se documentó por los experimentos de bloqueo de anticuerpo HLA-A2. Para definir adicionalmente el epítope de WT1 , se generaron 4 construcciones retrovirales de WT1 . Los fibroblastos 475 donadores se sometieron a transducción con estas construcciones. Las pruebas ELISPOT demostraron el reconocimiento de los fibroblastos D475 transducidos con la construcción WT1 Tr1 (aa2-aa92), demostrando así que el epítope de WT1 se encuentra ubicado en los primeros 91 aminoácidos N-terminales de la proteína WT1 . Para mapear finamente el epítope , se sintetizaron los péptidos 15meros de la proteína de WT1 , sobreponiéndose por 1 1 aminoácidos. El clon de células T de WT1 específico reconoció dos péptidos 1 5meros de sobreposición, el péptido 9 (QWAPVLDFAPPGASA) (NO DE I D DE SEC: 412) y péptido 10 (VLDFAPPGASAYGSL) (NO DE ID DE SEC: 413). Para caracterizar adicionalmente el epítope mínimo reconocido, se utilizaron los péptidos 9mero y 10mero compartidos de los 15meros (5 totales) para analizar la especificidad del clon. El clon reconoció específicamente el 9mero, VLDFAPPGA (NO DE I D DE SEC: 241 ), y el 10mero, VLDFAPPGAS (NO DE ID DE SEC: 41 1 ).

EJEMPLO 25 CLONACIÓN Y SECUENCIACIÓN DE CADENAS ALFA Y BETA TCR DERIVADAS DE UNA CÉLULA T CD8 ESPECÍFICA PARA WT1 Se clonaron las cadenas alfa y beta de receptor de células T receptoras (TCR) derivadas de clones de células T CD8+ específicas para WT1 . Se lleva a cabo el análisis de secuencia para demostrar el origen familiar de las cadenas alfa y beta del TCR. Además, se identifican los segmentos de diversidad única y unión (que contribuyen a la especificidad de la respuesta) . El mARN total de 2*106 células derivadas de un clon de células T CD8+ de WT1 específico se aisla utilizando el agente reactivo Trizol y el cADN se sintetiza utilizando juegos Ready-to-go (disponibles) (Pharmacia). Para determinar las secuencias Va y en un clon, se sintetiza un panel de imprimadores específicos de subtipo Va y ?ß (con base en las secuencias de imprimador generadas por Clontech, Palo Alto, Ca) y se utiliza en reacciones RT-PCR con cADN generado a partir de cada clon. Las reacciones de RT-PCR demuestran cuál secuencia Va y ?ß se expresa por cada clon. Para clonar las cadenas alfa y beta TCR de tamaño natural a partir de un clon , se diseñan imprimadores que expandan los nucleótidos de TCR de codificación de iniciador y terminador. Las reacciones convencionales RT-PCR de 35 ciclos se establecen utilizando cADN sintetizado a partir del clon de CTL y los imprimadores anteriores que utilizan la polimerasa termoestable a prueba de lecturas PWO (Roche, Basilea, Suiza). Las bandas específicas resultantes (~850 bp para alfa y ~950 para beta) se ligan al vector despuntado de PCR (I nvitrogen, Carlsbad , CA) y se transform aron en E. coli. Se identifica el E. coli transformado con plásmidos con contenido de cadenas alfa y beta de tamaño natural , y se generan las preparaciones de g ran escala de los plásmidos correspondientes . Los plásmidos con contenido de cadenas alfa y beta de TCR de tamaño natural se secuencian después utilizando métodos convencionales. Se determina así la región de unión de diversidad (DJ) q ue contribuye a la especificidad del TCR. A partir de los anterior se apreciará que, aunque se han descrito en la presente modalidades específicas de la invención para propósitos de ilustración , pueden elaborarse diversas modificaciones sin desviarse del espíritu y alcance de la invención. De acuerdo con lo anterior, la invención no se lim ita excepto por las reivindicaciones anexas.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en: (a) secuencias proporcionadas en los NOs DE ID DE SEC:327-331, 337-341, y 377-390; (b) complementos de las secuencias proporcionadas en los NOs DE ID DE SEC:327- 331, 337-341, y 377-390; (c) secuencias que consisten de al menos 20 residuos contiguos de una secuencia proporcionadas en los NOs DE ID DE SEC:327-331, 337-341, y 377-390; (d) secuencias que se hibridizan a una secuencia proporcionada en los NOs DE ID DE SEC:327-331, 337-341, y 377-390, bajo condiciones moderadamente severas; (e) secuencias que tiene una identidad de al menos 75% con una secuencia de los NOs DE ID DE SEC:327-331, 337-341, y 377-390; (f) secuencias que tienen una identidad de al menos 90% con una secuencia de los NOs DE ID DE SEC:327-331, 337-341, y 377-390; y (g) variantes degenerados de una secuencia proporcionada en los NOs DE ID DE SEC:327-331, 337-341, y 377-390. 2. Un polipéptido aislado caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste en: (a) secuencias codificadas por un polinucleótido según la reivindicación 1 ; y (b) secuencias que tienen una identidad de al menos 70% con una secuencia codificada por un polinucleótido según la reivindicación 1 ; y (c) secuencias que tienen una identidad de al menos 90% con una secuencia codificada por un polinucleótido según la reivindicación 1 ; (d) secuencias establecidas en los NOs DE ID DE SEC:241 , 332-336, 342-346, 391 -395, y 404-413; (e) secuencias que tienen una identidad de al menos 70% establecida en los NOs DE ID DE SEC:241 , 332-336, 342-346, 391 -395, y 404-413; y (f) secuencias que tienen una identidad de al menos 90% establecida en los NOs DE ID DE SEC:241 , 332-336, 342-346, 391 -395, y 404-41 3; 3. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido según la reivindicación 1 , caracterizado porque se enlaza operablemente a una secuencia de control de expresión. 4. Una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión según la reivindicación 3. 5. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión de antígeno del mismo, caracterizado porque se une específicamente a un polipéptido según la reivindicación 2. 6. Un método para detectar la presencia de un cáncer en un paciente, caracterizado porque comprende las etapas para: (a) obtener una muestra biológica del paciente; (b) contactar la muestra biológica con un agente de unión que se une a un pdlipéptido según la reivindicación 2; (c) detectar en ia muestra una cantidad de polipéptido que se une al agente de unión; y (d) comparar la cantidad de polipéptido con un valor de corte predeterminado y determinar a partir de él la presencia de un cáncer en un paciente. 7. Una proteína de fusión caracterizada porque comprende al menos un polipéptido según la reivindicación 2. 8. Un oligonucleótido que hibridiza a una secuencia recitada en Jos NOs DE I D DE SEC:327-331 , 337-341 , y 377-390 bajo condiciones moderadamente severas. 9. Un método para estimular y/o expandir las células T específicas para una proteína de tumor, caracterizada porque comprende contactar células T con al menos un componente seleccionado a partir del grupo que consiste en: (a) polipéptidos según la reivindicación 2; (b) polinucleótidos según la reivindicación 1 ; y (c) células de presentación de antígeno que expresan un polinucleótido según la reivindicación 1 , bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la estimulación y/o expansión de células T. 10. Una población de células T aisladas, caracterizada porque comprende células T preparadas según el método de la reivindicación 9. 1 1 . Una composición caracterizada porque comprende un primer componente seleccionado a partir del grupo que consiste en portadores e inmunoestimulantes fisiológicamente aceptables, y un segundo componente seleccionado a partir del grupo que consiste en: (a) polipéptidos según la reivindicación 2; (b) polinucleótidos según la reivindicación 1 ; (c) anticuerpos según la reivindicación 5; (d) proteínas de fusión según la reivindicación 7; (e) poblaciones de células T según la reivindicación 10; y (f) células de presentación de antígeno que expresan un polipéptido según la reivindicación 2. 12. Un método para estimular una respuesta inmunológica en un paciente, caracterizado porque comprende administrarle al paciente una composición según la reivindicación 1 1 . 1 3. Un método para el tratamiento de un cáncer en un paciente, caracterizado porque comprende administrarle al paciente una composición según la reivindicación 1 1 . 14. Un método para determinar la presencia de un cáncer en un paciente, caracterizado porque comprende las etapas para: (a) obtener una muestra biológica del paciente; (b) contactar la muestra biológica con un oligonucleótido según la reivindicación 8; (c) detectar en la muestra una cantidad de polinucleótido que se hibridiza al oligonucleótido; y (d) comparar la cantidad de polinucleótido que hibridiza al oligonucleótido con un valor de corte predeterminado, y determinar así la presencia del cáncer en el paciente. 15. Un juego de diagnóstico caracterizado porque comprende al menos un oligonucleótido según la reivindicación 8. 16. Un juego de diagnóstico caracterizado porque comprende al menos un anticuerpo según la reivindicación 5 y un agente reactivo . de detección , en el que el agente reactivo de detección comprende un grupo relator. 17. Un método para inhibir el desarrollo de un cáncer en un paciente, caracterizado porque comprende las etapas para: (a) incubar células T de CD4+ y/o CD8+ aisladas de un paciente con al menos un componente seleccionado a partir del grupo que consiste en: (i) polipéptidos según la reivindicación 2; (ii) polinucleótidos según la reivindicación 1 ; y (iii) células de presentación de antígeno que expresan un polipéptido según la reivindicación 2, de manera tal que proliferan las células T; (b) administrarle al paciente una cantidad eficaz de las células T proliferantes, e inhibir así el desarrollo de un cáncer en el paciente. 18. Una composición caracterizada porque comprende un polipéptido de WT1 resuspendido en un regulador que comprende al menos un azúcar seleccionado a partir del grupo que consiste en trehalosa, maltosa, sacarosa, fructosa, y glucosa, en una concentración de entre aproximadamente 7 y aproximadamente 13%. 19. La composición según la reivindicación 18, caracterizada porque dicha concentración se encuentra entre aproximadamente 8 y aproximadamente 12%. 20. La composición según la reivindicación 1 8, caracterizada porque dicha concentración es de aproximadamente 10%. 21 . Una composición caracterizada porque comprende un polipéptido de WT1 resuspendido en un regulador que comprende al menos 2 azúcares seleccionados a partir del grupo , que consiste en trehalosa, maltosa, sacarosa, fructosa, y glucosa, a una concentración de entre aproximadamente 7 y aproximadamente 13%. 22. La composición según la reivindicación 21 , caracterizada porque dicha concentración se encuentra entre aproximadamente 8 y aproximadamente 12%. 23. La composición según la reivindicación 21 , caracterizada porque dicha concentración es de aproximadamente 10%. 24. Una composición caracterizada porque comprende un polipéptido de WT1 resuspendido en un regulador que comprende al menos 3 azúcares seleccionados a partir del grupo que consiste en trehalosa, maltosa, sacarosa, fructosa, y glucosa, a una concentración de entre aproximadamente 7 y aproximadamente 13%. 25. La composición según la reivindicación 24, caracterizada porque dicha concentración se encuentra entre aproximadamente 8 y aproximadamente 12%. 26. La composición según la reivindicación 24, caracterizada porque dicha concentración es de aproximadamente 10%. 27. Una composición caracterizada porque comprende un polipéptido de WT1 resuspendido en un regulador que comprende: (a) al menos un azúcar seleccionado a partir del grupo que consiste en trehalosa, maltosa, sacarosa, fructosa, y glucosa , a una concentración de entre aproximadamente 7 y aproximadamente 13%; (b) etanolamina; (c) cisteína; y (d) Polisorbato-80. 28. La composición según la reivindicación 27, caracterizada porque dicha concentración se encuentra entre aproximadamente 8 y aproximadamente 12%. 29. La composición según la reivindicación 27, caracterizada porque dicha concentración es de aproximadamente 10%. 30. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 18-29 en las que el polipéptido de WT1 comprende un polipéptido de fusión Ra12-WT1 . 31 . Una composición caracterizada porque comprende un polipéptido de WT1 y MPL-SE. 32. La composición según la reivindicación 31 , caracterizada porque el polipéptido de WT1 comprende un polipéptido de fusión de Ra12-WT1 . 33. Una composición caracterizada porque comprende un polipéptido de WT1 y Enhanzyn. 34. La composición según la reivindicación 33, caracterizada porque el polipéptido de WT1 comprende un polipéptido de fusión Ra 12-WT1 . 35. Una vacuna caracterizada porq ue comprende un polipéptido seg ún la reivindicación 2, caracterizada porque se encuentra en com binación con un acentuador de respuesta inm unológica no específica. 36. La vacuna seg ún la reivindicación 35, caracterizada porque el acentuador de respuesta inmunológica es un adyuvante. 37. La vacuna seg ún la reivindicación 35, caracterizada porq ue el acentuador de respuesta inm unológica se selecciona a partir del grupo que consiste en adyuvantes basados en alumbre, adyuvantes basados en aceite, Specol, RIBI , TiterMax, Montanide ISA50 o Montanide ISA 720, GM-CSF, adyuvantes basados en copolímero de bloq ue no iónico, adyuvantes basados en amoniobromuro de dioctadecilo de dimetilo (DDA) AS-1 , AS-2 , adyuvantes basados en el sistema Adyuvante Ribi, QS21 , Quii A, SAF (adyuvante Syntex en su forma microfluidizada (SAF-m) , brom uro de amonio de dimetil-dioctadecilo (DDA) , adyuvantes basados en com plemento humano m. vaccae, ISCOMS, MF-59, S BAS-2, SBAS-4, Enhanzyn®, RC-529, AGPs, PL-S E, QS7, Escina ; Digitonina; y las saponinas Gypsophiía, Chenopodium quinoa. 38. Una vacuna caracterizada porque comprende-. a. un polipéptido de WT1 según la reivindicación 2, en el que el polipéptido comprende una porción inmunológico de WT1 ; y b . un acentuador de respuesta no específica que acentúa preferencialmente una respuesta celular T en un paciente. 39. Una vacuna según la reivindicación 38, caracterizada porque el acentuador de respuesta inmunologica se selecciona a partir del grupo que consiste en adyuvantes basados en alumbre, adyuvantes basados en aceite, Specol, RI Bl , TiterMax, Montanide ISA50 o ontanide I SA 720, GM-CSF, adyuvantes basados en copolímero de bloque no iónico, adyuvantes basados en amoniobromuro de dioctadecilo de dimetilo (DDA) AS-1 , AS-2, adyuvantes basados en el sistema Adyuvante Ribi , QS21 , Quil A, SAF (adyuvante Syntex en su forma microfluidizada (SAF-m)) ; brom u ro de amonio de dimetilo-dioctadecilo (DDA), adyuvantes basados en com plemento humano m. vaccae, ISCOMS , MF-59, SBAS-2, SBAS-4, Enhanzyn®, RC-529, AGPs, MPL-SE, QS7, Escina; Digitonina; y las saponinas Gypsophiía, Chenopodium quinoa 40. Una vacuna caracterizada porque comprende un polinucleótido según la reivindicación 1 , caracterizada porque se encuentra en com binación con un acentuador de respuesta inmunologica no específica. 41 . La vacuna según la reivindicación 40, caracterizada porque el acentuador de respuesta inm unologica es una adyuvante. 42. La vacuna según la reivindicación 40, caracterizada porque el acentuador de respuesta inmunologica se selecciona a partir del grupo que consiste en adyuvantes basados en alumbre, adyuvantes basados en aceite, Specol, IBI, TiterMax, Montanide ISA50 o ontanide ISA 720, GM-CSF, adyuvantes basados en copolímero de bloque no iónico, adyuvantes basados en amoniobromuro de dioctadecilo de dimetilo (DDA) AS-1, AS-2, adyuvantes basados en el sistema Adyuvante Ribi, QS21, Quil A, SAF (adyuvante Syntex en su forma microfluidizada (SAF-m)), bromuro de amonio de dimetil-dioctadecilo (DDA), adyuvantes basados en complemento humano m. vaccae, ISCOMS, MF-59, SBAS-2, SBAS-4, Enhanzyn®, RC-529, AGPs, MPL-SE, QS7, Escina; Digitonina; y las saponinas Gypsophila, Chenopodium qulnoa. 43. Una vacuna caracterizada porque comprende: c. un polinucleótido según la reivindicación 1, en el que el polinucleótido codifica una porción inmunogénica de WT1; y d. un acentuador de respuesta inmunológica no específica que acentúa preferencialmente una respuesta de células T en un paciente. 44. Una vacuna según la reivindicación 43, caracterizada porque el acentuador de respuesta inmunológica se selecciona a partir del grupo que consiste en adyuvantes basados en alumbre, adyuvantes basados en aceite, Specol, RIBI, TiterMax, Montanide ISA50 o Montanide ISA 720, GM-CSF, adyuvantes basados en copolímero de bloque no iónico, adyuvantes basados en amoniobromuro de dioctadecilo de dimetilo (DDA) AS-1, AS-2, adyuvantes basados en el sistema Adyuvante Ribi, QS21, Quil A, SAF (adyuvante Syntex en su forma microfluidizada (SAF-m)), bromuro de amonio de dimetil-dioctadecilo (DDA), adyuvantes basados en complemento humano m. vaccae, ISCOMS, MF-59, SBAS-2, SBAS-4, Enhanzyn®, RC-529, AGPs, MPL-SE, QS7, Escina; Digitonina; y las saponinas Gypsophila, Chenopodium quinoa. RES U WI E N Se describen composiciones y métodos para la terapia de enfermedades malignas, tales como leucemia y cáncer. Las composiciones comprenden uno o más de entre un polinucleotido de WT1 , un poiipéptido de WT1 , una célula de presentación de antígeno que presenta un poiipéptido de WT1 , un anticuerpo que se une específicamente a un poiipéptido de WT1 ; o una célula T que reacciona específicamente con un poiipéptido de WT1 . Tales composiciones pueden utilizarse, por ejemplo, para la prevención y tratamiento de enfermedades metastáticas.