JP2004510425A - Wt1特異的免疫療法のための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(連邦政府の助成による研究または開発に関する提示)
本発明は、部分的に、NIH SBIR 第I期助成金番号IR43 CA81752−01A1のもとの政府支援によってなされた。政府は、本発明における特定の権利を有し得る。
【0002】
(発明の背景)
(技術分野)
本発明は、一般に悪性疾患(例えば、白血病および癌)の免疫療法に関する。より詳細には、本発明は、WT1に対する免疫応答を生じるかまたは増強するための組成物、ならびに悪性疾患を予防および/または処置するためのそのような組成物の使用に関連する。
【0003】
(関連技術の説明)
癌および白血病は、米国内および世界中で重大な健康問題である。そのような疾患の検出および処置における前進がなされてきたが、ワクチンまたは癌および白血病の予防または処置のための他の普遍的に首尾良い方法は、現在のところ利用可能ではない。これらの疾患の管理は、現在のところ、早期診断および積極的な処置の組合せに依存し、これは、種々の処置(例えば、手術、放射線治療、化学療法およびホルモン療法)のうちの1つ以上を含み得る。特定の癌のための処置方針は、特定の腫瘍マーカーの分析を含む種々の予後変数に基づいて頻繁に、選択される。しかし、確立されたマーカーの使用は、頻繁に、解釈するのが困難な結果を導き、そして多くの癌患者において高い致死率が観察され続けている。
【0004】
免疫療法は、癌および白血病の処置および生存率を実質的に改善する能力を有する。最近のデータによって、白血病は、骨髄移植の関連で免疫療法(例えば、ドナーリンパ球注入)によって治癒され得ることが実証される。そのような治療は、腫瘍関連抗原(TAA)に対する免疫応答の生成または増強を含み得る。しかし、現在までのところ、比較的わずかなTAAしか既知ではなく、そしてそのような抗原に対する免疫応答の生成は、まれに例外が存在するが、治療的に有益であるとは示されていない。
【0005】
従って、白血病および癌の予防および治療のための改善された方法についての当該分野における必要性が存在する。本発明は、これらの必要性を満たし、そしてさらに他の関連する利点を提供する。
【0006】
(発明の簡単な要旨)
簡潔に述べると、本発明は、疾患(例えば、白血病および癌)の診断および治療のための組成物および方法を提供する。1つの局面において、本発明は、ネイティブのWT1の免疫原性部分またはその改変体(これは、抗原特異的抗血清および/またはT細胞株もしくはクローンと反応するその改変体の能力が実質的に減少されないように、1つ以上の置換、欠失、付加および/または挿入で異なる)を含むポリペプチドを提供する。特定の実施形態において、このポリペプチドは、ネイティブWT1ポリペプチドの16を超えない連続したアミノ酸残基を含む。他の実施形態において、このポリペプチドは、ネイティブのWT1ポリペプチドのアミノ酸残基1〜174の免疫原性部分またはその改変体を含み、ここでこのポリペプチドは、このネイティブのWT1ポリペプチドのアミノ酸175〜449内に存在する16を超えない連続するアミノ酸残基を含む。この免疫原性部分は、好ましくはMHCクラスI分子および/またはMHCクラスII分子に結合する。特定の実施形態において、このポリペプチドは、以下からなる群から選択される配列を含む:(a)表II〜XLVIのうちの任意の1つ以上において示される配列、(b)前述の配列の改変体(これは、抗原特異的抗血清および/またはT細胞株もしくはクローンと反応するその改変体の能力が実質的に減少されないように、1つ以上の置換、欠失、付加および/または挿入で異なる)、および(c)上記のポリペプチドの模倣物(抗原特異的抗血清および/またはT細胞株もしくはクローンと反応するその模倣物の能力が実質的に減少されないような模倣物)。
【0007】
他の実施形態において、このポリペプチドは、以下からなる群から選択される配列を含む:(a)ALLPAVPSL(配列番号(SEQ ID NO.)34)、GATLKGVAA(配列番号88)、CMTWNQMNL(配列番号49および配列番号258)、SCLESQPTI(配列番号199および配列番号296)、SCLESQPAI(配列番号198)、NLYQMTSQL(配列番号147および配列番号284)、ALLPAVSSL(配列番号35および配列番号255)、RMFPNAPYL(配列番号185および配列番号293)、VLDFAPPGA(配列番号241)、VLDFAPPGAS(配列番号411)、(b)前述の配列の改変体(これは、抗原特異的抗血清および/またはT細胞株もしくはクローンと反応するその改変体の能力が実質的に減少されないように、1つ以上の置換、欠失、付加および/または挿入で異なる)、ならびに(c)上記のポリペプチドの模倣物(抗原特異的抗血清および/またはT細胞株もしくはクローンと反応するその模倣物の能力が実質的に減少されないような模倣物)。模倣物は、1つ以上のアミノ酸模倣物と組み合わせてアミノ酸を含み得るか、または完全に非ペプチド模倣物であり得る。
【0008】
さらなる局面において、本発明は、WT1タンパク質の免疫原性部分の改変体を含むポリペプチドを提供し、ここでこの改変体は、抗原特異的抗血清および/またはT細胞株もしくはクローンと反応するその改変体の能力がネイティブのWT1タンパク質と比較して増強されるようなその免疫原性部分内の1位と3位との間のアミノ酸位置での置換に起因して、その免疫原性部分が異なる。
【0009】
本発明は上記のWT1ポリペプチドをコードするWT1ポリヌクレオチドをさらに提供する。
【0010】
他の局面において、本発明は、薬学的組成物およびワクチンを提供する。薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と組み合わせて、上記のポリペプチドもしくは模倣物および/または以下のうちの1つ以上を含み得る:(i)WT1ポリヌクレオチド;(ii)WT1ポリペプチドに特異的に結合するその抗体またはその抗原結合フラグメント;(iii)WT1ポリペプチドと特異的に反応するT細胞、あるいは(iv)WT1ポリペプチドを発現する抗原提示細胞。ワクチンは、上記のポリペプチドおよび/または以下のうちの1つ以上を含む:(i)WT1ポリヌクレオチド;(ii)WT1ポリペプチドを発現する抗原提示細胞、または(iii)抗イディオタイプ抗体、および非特異的免疫応答エンハンサー。特定の実施形態において、ネイティブのWT1ポリペプチドの23未満の連続するアミノ酸残基、好ましくは17未満のアミノ酸残基が、そのような薬学的組成物およびワクチン内に使用されるWT1ポリペプチド内に存在する。免疫応答エンハンサーは、アジュバントであり得る。好ましくは、免疫応答エンハンサーは、T細胞応答を増強する。
【0011】
本発明はさらに、患者に上記の薬学的組成物またはワクチンを投与することを含む、患者において免疫応答を増強または誘導するための方法を提供する。特定の実施形態において、患者はヒトである。
【0012】
本発明はさらに、患者に上記の薬学的組成物またはワクチンを投与することを含む、患者において悪性疾患の発達を阻害するための方法を提供する。悪性疾患としては、白血病(例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病)および癌(例えば、乳癌、肺癌、甲状腺癌もしくは胃腸癌、または黒色腫)が挙げられるがそれらに限定されない。この患者は、悪性疾患に罹患していてもよいが、罹患している必要はなく、そしてこの薬学的組成物またはワクチンの投与は、そのような疾患の発病を阻害し得るか、または既存の疾患の進行および/もしくは転移を阻害し得る。
【0013】
本発明はさらに、他の局面において、骨髄および/もしくは末梢血またはその画分からWT1を発現する細胞を除去するための方法を提供する。この方法は、骨髄、末梢血または骨髄もしくは末梢血の画分と、WT1ポリペプチドと特異的に反応するT細胞とを接触させる工程を含み、ここでこの接触させる工程は、骨髄、末梢血または画分中の骨髄性細胞またはリンパ性細胞の数の10%未満、好ましくは5%未満およびより好ましくは1%未満までのWT1陽性細胞の除去を可能にするに十分な条件および時間で行われる。骨髄、末梢血および画分は、WT1発現と関連する疾患に罹患している患者から得られ得るか、またはそのような疾患に罹患していないヒトもしくは非ヒト哺乳動物から得られ得る。
【0014】
関連する局面において、本発明は、上記のように調製された骨髄、末梢血または骨髄もしくは末梢血の画分を患者に投与する工程を含む、患者における悪性疾患の発達を阻害するための方法を提供する。そのような骨髄、末梢血または画分は、自己由来であり得るか、または関連するかもしくは関連しないヒトもしくは非ヒト動物(例えば、同系または同種異系)に由来し得る。
【0015】
他の局面において、本発明は、T細胞の刺激(または、初回免疫(priming))および/または拡大(expansion)を可能にするに十分な条件下および時間でWT1ポリペプチドとT細胞とを接触させることを含む、T細胞刺激および/または拡大のための方法を提供する。そのようなT細胞は、自己由来のWT1特異的細胞、同種異系のWT1特異的細胞、同系のWT1特異的細胞または関連しないWT1特異的細胞であり得、そしてインビトロまたはインビボで刺激され得る。特定の実施形態において、拡大されたT細胞は、骨髄、末梢血または骨髄もしくは末梢血の画分内に存在し得、そしてクローン性(clonal)であり得る(が、その必要はない)。特定の実施形態において、T細胞は、刺激および/または拡大の間に哺乳動物中に存在し得る。WT1特異的T細胞は、例えば、ドナーリンパ球注入において使用され得る。
【0016】
関連する局面において、上記で調製されたT細胞を患者に投与する工程を含む、患者における悪性疾患の発達を阻害するための方法が提供される。そのようなT細胞は、特定の実施形態において、自己由来、同系または同種異系であり得る。
【0017】
本発明はさらに、他の局面において、患者におけるWT1発現と関連する悪性疾患のための免疫または治療の有効性をモニタリングするための方法を提供する。そのような方法は、患者における抗体、CD4+T細胞応答および/またはCD8+T細胞応答をモニタリングすることに基づく。特定のそのような局面において、方法は、以下の工程を包含し得る:(a)以下の、(i)WT1ポリペプチド;(ii)WT1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または(iii)WT1ポリペプチドを発現する抗原提示細胞、のうちの1つ以上とともに第1の生物学的サンプルをインキュベートする工程であって、ここでこの第1の生物学的サンプルは、治療または免疫の前に患者から得られ、そしてここでこのインキュベーションは、免疫複合体が形成するのを可能にするのに十分な条件下および時間で行われる、工程;(b)WT1ポリペプチドと、WT1ポリペプチドに特異的に結合する生物学的サンプルにおける抗体との間に形成される免疫複合体を検出する工程;(c)治療または免疫の後に、同じ患者から得られる第2の生物学的サンプルを用いて、工程(a)および(b)を反復する工程;ならびに(d)第1および第2の生物学的サンプルにおいて検出される免疫複合体の数を比較する工程、およびそれから、この患者におけるこの治療または免疫の有効性をモニタリングする工程。
【0018】
上記の方法の特定の実施形態において、この検出する工程は以下を含む:(a)この免疫複合体に結合し得る検出試薬とともにこの免疫複合体をインキュベートする工程であって、ここでこの検出試薬はレポーター基を含む、工程、(b)非結合検出試薬を除去する工程、および(c)このレポーター基の存在または非存在を検出する工程。この検出試薬は、例えば、WT1ポリペプチドに特異的に結合する抗体に結合し得る、第2の抗体またはその抗原結合フラグメントあるいはプロテインAのような分子を含み得る。他の実施形態において、レポーター基は、WT1ポリペプチドに結合し、そして検出する工程は、非結合WT1ポリペプチドを除去する工程、およびその後にこのレポーター基の存在または非存在を検出する工程を包含する。
【0019】
さらなる局面において、患者におけるWT1発現と関連する悪性疾患のための免疫または治療の有効性をモニタリングするための方法は、以下の工程を包含し得る:(a)以下(i)WT1ポリペプチド;(ii)WT1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または(iii)WT1ポリペプチドを発現する抗原提示細胞、のうちの1つ以上とともに第1の生物学的サンプルをインキュベートする工程であって、ここでこの第1の生物学的サンプルは、CD4+T細胞および/またはCD8+T細胞を含み、そして治療または免疫の前に患者から得られ、そしてここでこのインキュベーションは、T細胞の、特異的な活性化、増殖および/または溶解を可能にするに十分な条件下および時間で行われる、工程;(b)T細胞の活性化、増殖および/または溶解の量を検出する工程;(c)CD4+および/またはCD8+T細胞を含む第2の生物学的サンプルを用いて、工程(a)および(b)を反復する工程であって、ここでこの第2の生物学的サンプルは、治療または免疫後に同じ患者から得られる、工程;ならびに(d)第1および第2の生物学的サンプル中のT細胞の活性化、増殖および/または溶解の量を比較する工程、およびそれによってこの患者におけるこの治療または免疫の有効性をモニタリングする工程。
【0020】
本発明はさらに、患者におけるWT1発現と関連する悪性疾患の発達を阻害するための方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する:(a)以下(i)WT1ポリペプチド;(ii)WT1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または(iii)WT1ポリペプチドを発現する抗原提示細胞、のうちの1つ以上とともに、患者から単離されたCD4+T細胞および/またはCD8+T細胞を、そのT細胞が増殖するようにインキュベートする工程;ならびに(b)増殖されたT細胞の有効量をこの患者に投与する工程、およびそれからこの患者における悪性疾患の発達を阻害する工程。特定の実施形態において、T細胞をインキュベートする工程は、1回以上反復され得る。
【0021】
他の局面においては、本発明は、患者内でのWT1発現に関連する悪性疾患の発達を阻害するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する:(a)患者から単離されたCD4+T細胞および/またはCD8+T細胞を、このT細胞が増殖するに、以下:(i)WT1ポリペプチド;(ii)WT1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または(iii)WT1ポリペプチドを発現する抗原提示細胞のうちの、1つ以上とともにインキュベートする工程;(b)増殖した一つ以上の細胞をクローニングする工程;および(c)患者に対してクローン化したT細胞の有効量を投与する工程。
【0022】
他の局面においては、方法が、患者内でのWT1発現に関連する悪性疾患の存在または非存在を決定するために提供され、これは以下の工程を包含する:(a)患者から単離されたCD4+T細胞および/またはCD8+T細胞を一つ以上の(i)WT1ポリペプチド;(ii)WT1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または(iii)WT1ポリペプチドを発現する抗原提示細胞とともにインキュベートする工程;および(b)T細胞の特異的な活性化の存在または非存在を検出し、それによってWT1発現に関連する悪性疾患の存在または非存在を決定する工程。特定の実施形態においては、検出の工程は、T細胞の増殖の存在または非存在を検出する工程を含む。
【0023】
さらなる局面においては、本発明は、患者内でのWT1発現に関連する悪性疾患の存在または非存在を決定するための方法を提供し、これは以下の工程を包含する:(a)患者から得られた生物学的なサンプルを、以下:(i)WT1ポリペプチド;(ii)WT1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または(iii)WT1ポリペプチドを発現する抗原提示細胞のうちの1以上とともにインキュベートする工程であって、ここで、このインキュベーションは、免疫複合体が形成されるのを可能にするに十分な条件かつ時間で行われる、工程;および(b)WT1ポリペプチドとWT1ポリペプチドと特異的に結合する生物学的なサンプル中の抗体との間に形成される免疫複合体を検出し、それによってWT1発現に関連する悪性疾患の存在または非存在を決定する工程。
【0024】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付する図面を参照すれば明白になる。本明細書中に開示されたすべての参考文献は、各々が個々に援用されたかのようにその全体が参考として本明細書中に援用される。
【0025】
(発明の詳細な説明)
上述のように、本発明は、一般に、悪性疾患の免疫療法および診断のための組成物および方法に関する。本明細書中に記載される組成物としては、WT1ポリペプチド、WT1ポリヌクレオチド、WT1ポリペプチドを発現する抗原提示細胞(APC、例えば、樹状細胞)、薬剤(例えば、WT1ポリペプチドに結合する抗体)および/またはWT1に特異的な免疫系細胞(例えば、T細胞)が挙げられ得る。本発明のWT1ポリペプチドは、一般に、ウィルムス腫瘍遺伝子産物(WT1)またはその改変体の少なくとも一部を含む。本発明の核酸配列は、一般に、このようなポリペプチドの全てもしくは一部をコードするDNA配列またはRNA配列、あるいはこのような配列に相補的であるDNA配列またはRNA配列を含む。抗体は、一般に、免疫系タンパク質またはその抗原結合フラグメントであり、これは、WT1ポリペプチドの一部に結合し得る。このような組成物内で使用され得るT細胞は、一般に、WT1ポリペプチドに特異的であるT細胞(例えば、CD4+および/またはCD8+)である。本明細書中に記載される特定の方法は、さらに、本明細書中に提供されるようなWT1ポリペプチドを発現する抗原提示細胞を使用する。
【0026】
本発明は、ウィルムス腫瘍(WT)遺伝子産物(例えば、WT1)に対して惹起される免疫応答が、WT1遺伝子の発現の増加によって特徴付けられる悪性疾患を患う患者に、予防的利益および/または治療的利益を提供し得るという知見に基づく。このような疾患としては、白血病(例えば、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、急性リンパ性白血病(ALL)および小児期ALL)、ならびに多くの癌(例えば、肺、乳房、甲状腺および胃腸の癌、ならびに黒色腫)が挙げられるが、これらに限定されない。WT1遺伝子は、元々、ウィルムス腫瘍を有する患者の染色体11p13における細胞性欠失に基づいて同定および単離された(Callら、米国特許第5,350,840号を参照のこと)。この遺伝子は10のエキソンからなり、そしてジンクフィンガー転写因子をコードし、そしてマウスWT1タンパク質およびヒトWT1タンパク質の配列は、図1ならびに配列番号319および320に提供される。
【0027】
(WT1ポリペプチド)
本発明の文脈において、WT1ポリペプチドは、本明細書に記載される場合、ネイティブWT1(すなわち、遺伝的に改変されていない生物によって発現されるWT1タンパク質)またはその改変体の少なくとも免疫原性部分を含むポリペプチドである。WT1ポリペプチドは、任意の長さであり得が、但し、ネイティブタンパク質またはその改変体の少なくとも免疫原性部分を含む。言い換えると、WT1ポリペプチドは、オリゴペプチド(すなわち、ペプチド結合によって連結される比較的少数のアミノ酸残基(例えば、8〜10残基)からなる)、全長WT1タンパク質(例えば、ヒトまたは非ヒト動物(例えば、マウス)内に存在する全長WT1タンパク質)あるいは中間のサイズのポリペプチドであり得る。特定の実施形態において、ネイティブWT1ポリペプチドの少数の連続するアミノ酸残基を含むWT1ポリペプチドの使用が、好ましい。このようなポリペプチドは、T細胞応答の生成が所望される特定の使用のために好ましい。例えば、このようなWT1ポリペプチドは、ネイティブWT1ポリペプチドの、23未満の連続するアミノ酸残基、好ましくは18以下の連続するアミノ酸残基、そしてより好ましくは15以下の連続するアミノ酸残基を含み得る。ネイティブWT1ポリペプチドの連続する9つのアミノ酸残基を含むポリペプチドは、一般に、このような目的のために適切である。ネイティブタンパク質由来のさらなる配列および/または異種配列は、任意のWT1ポリペプチド内に存在し得、そしてこのような配列は、(必要ではないが)さらなる免疫原性特性または抗原性特性を保有し得る。本明細書中に提供されるようなポリペプチドは、さらに、他のポリペプチドまたは非ポリペプチド化合物と(共有結合的にかまたは非共有結合的に)会合され得る。
【0028】
「免疫原性部分」は、本明細書中で使用される場合、B細胞表面抗原レセプターおよび/またはT細胞表面抗原レセプターによって認識される(すなわち、特異的に結合される)ポリペプチドの部分である。特定の好ましい免疫原性部分は、MHCクラスI分子またはMHCクラスII分子に結合する。本明細書中で使用される場合、免疫原性部分は、このような結合が当該分野で公知の任意のアッセイを使用して検出可能である場合、MHCクラスI分子またはMHCクラスII分子「に結合する」といわれる。例えば、ポリペプチドがMHCクラスIに結合する能力は、125Iで標識されたβ2ミクログロブリン(β2m)のMHCクラスI/β2m/ペプチドヘテロ三量体複合体への取り込みを促進する能力をモニターすることによって間接的に評価され得る(Parkerら、J.Immunol.152:163,1994を参照のこと)。あるいは、当該分野で公知の機能的ペプチド競合アッセイが、使用され得る。特定の免疫原性部分は、表II〜XIVの1つ以上に列挙される1つ以上の配列を有する。代表的な免疫原性部分には、以下が挙げられるが、これらに限定されない:RDLNALLPAVPSLGGGG(ヒトWT1残基6〜22;配列番号1)、PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE(ヒトおよびマウスWT1残基117〜139;それぞれ、配列番号2および3)、GATLKGVAAGSSSSVKWTE(ヒトWT1残基244〜262;配列番号4)、GATLKGVAA(ヒトWT1残基244〜252;配列番号88)、CMTWNQMNL(ヒトおよびマウスのWT1残基235〜243;それぞれ、配列番号49および258)、SCLESQPTI(マウスWT1残基136〜144;配列番号296)、SCLESQPAI(ヒトWT1残基136〜144;配列番号198);NLYQMTSQL(ヒトおよびマウスのWT1残基225〜233;それぞれ、配列番号147および284);ALLPAVSSL(マウスWT1残基10〜18;配列番号255);またはRMFPNAPYL(ヒトおよびマウスのWT1残基126〜134;それぞれ、配列番号185および配列番号293)、VLDFAPPGA(ヒトWT1残基37〜45;配列番号241)、またはVLDFAPPGAS(ヒトWTの残基37〜46;配列番号411)。さらなる免疫原性部分は、本明細書中に提供され、そしてその他は、一般に、周知の技術(例えば、Paul、Fundamental Immunology、第3版、243〜247(Raven Press,1993)およびその中に引用される参考文献において要約される技術)を使用して同定され得る。免疫原性部分を同定するための代表的な技術としては、抗原特異的抗血清および/またはT細胞株もしくはクローンと反応する能力についてのポリペプチドのスクリーニングが挙げられる。ネイティブWT1ポリペプチドの免疫原性部分は、(例えば、ELISAおよび/またはT細胞反応性アッセイにおいて)実質的に全長WT1の反応性以上であるレベルで、このような抗血清および/またはT細胞と反応する部分である。言い換えると、免疫原性部分は、全長ポリペプチドの反応性に類似するかまたはそれよりも大きなレベルで、このようなアッセイにおいて反応し得る。このようなスクリーニングは、一般に、HarlowおよびLane、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1998に記載されるような、当業者に周知の方法を使用して実施され得る。
【0029】
あるいは、免疫原性部分は、Tsitesプログラム(RothbardおよびTayler、EMBO J.7:93〜100、1988;Deavinら、Mol.Immunol.33:145〜155、1996を参照のこと)のようなコンピュータ分析を使用して同定され得、このコンピュータ分析は、Th応答を誘発する可能性を有するペプチドモチーフについて検索する。マウスクラスI MHCまたはクラスII MHCおよびヒトクラスI MHCまたはクラスII MHCへの結合について適切なモチーフを有するCTLペプチドは、BIMAS(Parkerら、J.Immunol.152:163、1994)および他のHLAペプチド結合予測分析に従って同定され得る。免疫原性を確認するために、ペプチドは、HLA A2トランスジェニックマウスモデル、および/または樹状細胞、線維芽細胞もしくは末梢血細胞を使用するインビトロ刺激アッセイを使用して、試験され得る。
【0030】
上述のように、組成物は、ネイティブWT1タンパク質の改変体を含み得る。ポリペプチド「改変体」は、本明細書中で使用される場合、そのポリペプチドの免疫原性が保持されるように、1つ以上の置換、欠失、付加および/または挿入においてネイティブポリペプチドと異なる(すなわち、この改変体が抗原特異的抗血清および/またはT細胞株もしくはクローンと反応する能力は、ネイティブポリペプチドに対して実質的に減少されない)、ポリペプチドである。言い換えると、改変体が抗原特異的抗血清および/またはT細胞株もしくはクローンと反応する能力は、ネイティブポリペプチドに対して増強され得るかまたは不変であり得るか、あるいはネイティブポリペプチドに対して50%未満、そして好ましくは20%未満減少され得る。このような改変体は、一般に、本明細書中に記載されるように、上記のポリペプチド配列の1つを改変すること、および改変されたポリペプチドと抗血清および/またはT細胞との反応性を評価することによって、同定され得る。本発明の関連において、WT1ポリペプチドの免疫原性部分内の比較的少数の置換(例えば、1〜3)は、ポリペプチドが免疫応答を誘発する能力を増強するように作用し得ることが、見出されている。適切な置換は、一般に、上記のようにコンピュータプログラムを使用することによって同定され得、そしてその効果は、本明細書中に記載されるように、改変されたポリペプチドと抗血清および/またはT細胞との反応性に基づいて確認される。従って、特定の好ましい実施形態において、WT1ポリペプチドは、免疫原性部分内の1〜3アミノ酸残基が置換され、その結果、抗原特異的抗血清および/またはT細胞株もしくはクローンと反応する能力が、改変されていないポリペプチドに対するその能力よりも統計学的に大きい、改変体を含む。このような置換は、好ましくは、このポリペプチドMHC結合部位内に位置され、これは、上記の通りに同定され得る。好ましい置換は、MHCクラスI分子またはMHCクラスII分子への結合を増加させる。
【0031】
特定の改変体は、保存的置換を含む。「保存的置換」は、あるアミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸に置換される置換であり、その結果、ペプチド化学の当業者は、そのポリペプチドの二次構造およびハイドロパシーの性質が実質的に変化していないことを予測する。アミノ酸置換は、一般に、残基の、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および/または両親媒性の性質における類似性に基づいてなされ得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ;正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニンが挙げられ;そして類似の親水性値を有する荷電していない極性ヘッド(head)基を持つアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン;グリシンおよびアラニン;アスパラギンおよびグルタミン;ならびにセリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシン、が挙げられる。保存的変化を示し得るアミノ酸の他の基としては、以下が挙げられる:(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr;(2)cys、ser、tyr、thr;(3)val、ile、leu、met、ala、phe;(4)lys、arg、his;および(5)phe、tyr、trp、his。改変体はまた(または、あるいは改変体は)非保存的変化を含む。改変体はまた(または、あるいは改変体は)、例えば、このポリペプチドの免疫原性、二次構造および疎水性性質に対して最小の影響を有するアミノ酸の欠失または付加によって改変され得る。
【0032】
好ましい実施形態において、WT1のN末端(アミノ酸1〜249)の改変体ペプチドが構築され、ここで、この改変体ポリペプチドは、全長WT1ポリペプチドおよび/またはWT1のN末端ポリペプチドを認識する抗体に結合可能である。抗体の非限定的な例は、抗WT1抗体WT180(Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA)である。
【0033】
上述のように、WT1ポリペプチドは、翻訳と同時(co−translationally)または翻訳後(post−translationally)にタンパク質の移行を指向するタンパク質のN末端において、シグナル(またはリーダー)配列に結合体化され得る。ポリペプチドはまた(または、あるいはポリペプチドは)、このポリペプチド(例えば、ポリ−His)の合成、精製または同定の容易さのために、あるいはこのポリペプチドの固体支持体への結合を増強するために、リンカーもしくは他の配列に結合体化され得る。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンのFc領域に結合体化され得る。
【0034】
WT1ポリペプチドは、任意の種々の周知技術を使用して調製され得る。本明細書中に記載されるようなWT1ポリヌクレオチドによってコードされる組換えポリペプチドは、このポリヌクレオチドから容易に調製され得る。一般に、当業者に公知の任意の種々の発現ベクターを使用して、組換えWT1ポリペプチドを発現し得る。発現は、組換えポリペプチドをコードするDNA分子を含む発現ベクターを用いて形質転換されたか、またはこの発現ベクターを用いてトランスフェクトされた、任意の適切な宿主細胞において達成され得る。適切な宿主細胞としては、原核生物細胞、酵母細胞および高等真核生物細胞が挙げられる。好ましくは、使用される宿主細胞は、E.coli細胞株、酵母細胞株または哺乳動物細胞株(例えば、COSもしくはCHO)である。組換えタンパク質または組換えポリペプチドを培養培地へ分泌する適切な宿主/ベクター系からの上清は、まず、市販のフィルターを使用して濃縮され得る。次いで、この濃縮物は、適切な精製マトリクス(例えば、アフィニティーマトリクスまたはイオン交換樹脂)に適用され得る。最終的に、1つ以上の逆相HPLC工程を使用して、組換えポリペプチドをさらに精製し得る。このような技術を使用して、ネイティブポリペプチドまたはその改変体を調製し得る。例えば、ネイティブポリペプチドの改変体をコードするポリヌクレオチドは、一般に、標準的な変異誘発技術(例えば、オリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発)を使用して調製され得、そしてDNA配列の切片は、短縮型ポリペプチドの調製を許容するように除去され得る。
【0035】
特定の部分および他の改変体はまた、当業者に周知の技術を使用する合成手段によって生成され得る。例えば、約500未満のアミノ酸、好ましくは約100未満のアミノ酸、そしてより好ましくは約50未満のアミノ酸を有するポリペプチドが、合成され得る。ポリペプチドは、メリーフィールド固相合成法(アミノ酸が、成長するアミノ酸鎖に連続的に付加される)のような任意の商業的に利用可能な固相技術を使用して合成され得る。Merrifield、J.Am.Chem.Soc.85:2149〜2146、1963を参照のこと。ポリペプチドの自動化合成のための装置は、Applied BioSystems,Inc.(Foster City,CA)のような供給業者から市販されており、そして製造業者の指示書に従って操作され得る。
【0036】
一般に、本明細書中に記載されるようなポリペプチドおよびポリヌクレオチドが、単離される。「単離された」ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、その元々の環境から取り出されたものである。例えば、その天然系に共存するいくつかまたは全ての物質から分離される場合に、天然に存在するタンパク質が、単離される。好ましくは、このようなポリペプチドは、少なくとも約90%純粋、より好ましくは少なくとも約95%純粋、そして最も好ましくは少なくとも約99%純粋である。例えば、天然の環境の一部でないベクター中にクローニングされる場合に、ポリヌクレオチドは、単離されたとみなされる。
【0037】
さらなる局面において、本発明は、WT1ポリペプチドの模倣物を提供する。このような模倣物は、1つ以上のアミノ酸模倣物と連結したアミノ酸を含み得るか(すなわち、WT1タンパク質内の1つ以上のアミノ酸が、アミノ酸模倣物により置換され得る)または全体的に非ペプチド模倣物であり得る。アミノ酸模倣物はアミノ酸と立体配置的に類似する化合物であるが故に、そのアミノ酸模倣物は、抗原特異的抗血清および/またはT細胞株あるいはクローンと反応する能力を実質的に減少させずにWT1ポリペプチド内のアミノ酸と置換され得る。非ペプチド模倣物はアミノ酸を含まない化合物であり、そしてWT1ポリペプチドと類似する全体的な配座を有するが故に、WT1特異的抗血清および/またはT細胞株あるいはクローンと反応する模倣物の能力は、WT1ポリペプチドの能力と比較して実質的に減少されない。このような模倣物は、ペプチド配列の三次元構造を評価する標準的な技術(例えば、核磁気共鳴技術および計算的技術)に基づき設計され得る。WT1ポリペプチドの1つ以上の側鎖官能基が、必ずしも同じサイズまたは容積を有しないが、類似の化学的および/または物理的特性(これは、類似する生物学的応答を生じる)を有する基により置換される場合に、模倣物が設計され得る。本明細書中に記載される実施形態において、模倣物が、WT1ポリペプチドに置換され得ることが理解されるべきである。
【0038】
他の例示的な実施形態において、ポリペプチドは、本明細書中に記載の複数のポリペプチドを含む融合ポリペプチドであるか、または本明細書中に記載の少なくとも1つのポリペプチドおよび無関係な配列(例えば、既知の腫瘍タンパク質)を含む融合ポリペプチドであり得る。融合パートナーは、例えば、Tヘルパーエピトープ(免疫学的融合パートナー)、好ましくは、ヒトによって認識されるTヘルパーエピトープを提供することを補助し得るか、またはこの融合パートナーは、ネイティブ組換えタンパク質よりも高収量でこのタンパク質(発現エンハンサー)を発現させることを補助し得る。特定の好ましい融合パートナーは、免疫学的融合パートナーおよび発現増強融合パートナーの両方である。他の融合パートナーは、このポリペプチドの溶解度を上昇させるか、またはこのポリペプチドが所望の細胞内画分に標的化されるように、選択され得る。なお、さらなる融合パートナーとしては、このポリペプチドの精製を容易にする親和性タグが挙げられる。
【0039】
融合ポリペプチドは、一般に、化学的結合体化を含む標準的な技術を使用して調製され得る。好ましくは、融合ポリペプチドは、組換えポリペプチドとして発現され、発現系において、非融合性ポリペプチドに比べて、増大したレベルの産生を可能にする。簡潔には、このポリペプチドをコードするDNA配列は、別々に集められ、そして適切な発現ベクターに連結され得る。1以上のポリペプチド成分をコードするDNA配列の3’末端は、ペプチドリンカーを伴ってかまたはこれを伴わずして、第2のポリペプチド成分をコードするDNA配列の5’末端と連結し得、その結果、この配列のリーディングフレームのフェーズ(相)が一致する。このことによって、両方の成分ポリペプチドの生物学的活性を保持する単一の融合ポリペプチドへと翻訳されることを可能にする。
【0040】
ペプチドリンカー配列は、ポリペプチドの各々がその2次構造および3次構造にフォールドすることを確実にするのに十分な距離だけ、第1のポリペプチド成分および第2のポリペプチド成分を分離するのに使用され得る。このようなペプチドリンカー配列は、当該分野において周知の標準的な技術を使用して、融合ポリペプチドに組み込まれる。適切なペプチドリンカー配列は、以下に因子に基いて選択される:(1)これらのペプチドリンカーが可撓性の延びたコンフォメーションをを選定し得ること;(2)これらのペプチドリンカーが、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド上に機能的なエピトープと相互作用し得る2次構造を採用し得ないこと;および(3)このポリペプチド機能性エピトープと反応し得る、疎水性残基および荷電した残基の欠如。好ましいペプチドリンカー配列は、Gly残基、Asn残基、およびSer残基を含む。他のほぼ中性のアミノ酸(例えば、ThrおよびAla)はまた、このリンカー配列に使用される。アミノ酸配列は、Marateaら、Gene 40:39〜46、1985;Murphyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:8258〜8262、1986;米国特許第4,935,233号および米国特許第4,751,180号に開示されたアミノ酸配列を含むリンカーとして有用に使用され得る配列である。このリンカー配列は、一般的に、1〜約50のアミノ酸酸長であり得る。第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが、非必須のN末端アミノ酸領域を有し、このアミノ酸領域が機能的ドメインを分離し、空間的な干渉を阻止するのに使用され得る場合、リンカー配列は必要とされない。
【0041】
連結されたDNA配列は、適切な転写調節エレメントまたは翻訳調節エレメントに作動可能に連結する。DNAの発現を担う調節エレメントは、第1のポリペプチドをコードするDNAに5’末端でのみ位置付けられる。同様に、翻訳を終止するための終止コドンおよび転写終止シグナルは、第2のポリペプチドをコードするDNA配列の3’にのみ存在する。
【0042】
この融合ポリペプチドは、関連性のない免疫原性タンパク質(例えば、リコール(recall)応答を惹起することが可能な免疫原性タンパク質)とともに、本明細書中に記載されるようなポリペプチドを含み得る。このようなタンパク質の例としては、破傷風タンパク質、結核タンパク質、および肝炎タンパク質が挙げられる(例えば、Stouteら、New Engl.J.Med.、336:86−91、1997を参照のこと)。
【0043】
1つの好ましい実施形態において、この免疫学的融合パートナーは、Mycobacterium sp.由来である(例えば、Mycobacterium tuberculosis由来のRa12フラグメント)。Ra12組成物および異種のポリヌクレオチド/ポリペプチドの配列の発現および/または免疫原性を増強するためのこれらの使用方法が、米国特許出願 60/158,585に記載され、この開示が、本明細書中で、全体が参考として援用される。簡潔には、Ra12とは、Mycobacterium tuberculosis MTB32Aの核酸の部分配列であるポリヌクレオチド領域をいう。MTB32Aは、M.tuberculosisの毒性株および非毒性株の遺伝子によってコードされる分子量32KDのセリンプロテアーゼである。MTB32Aの核酸配列およびアミノ酸配列は、(例えば、米国特許出願 60/158,585;Skeikyら、Infection and Immun.(1999)67:3998〜4007(これらは、本明細書中で参考として援用されている)に)記述されている。MTB32Aコード配列のC末端フラグメントは、高いレベルで発現し、そしてこの精製プロセスに全体をとおして可溶性のポリペプチドであり得る。さらに、Ra12は、これらが融合された異種の免疫ポリペプチドの免疫原性を増強し得る。1つの好ましいRa12融合ポリペプチドは、MTB32Aのアミノ酸残基192〜323に対応する14KDのC末端フラグメントを含む。他の好ましいRa12ポリペプチドは、一般に、Ra12ポリペプチドの部分をコードする、少なくとも約15の連続するヌクレオチド、少なくとも約30ヌクレオチド、少なくとも約60ヌクレオチド、少なくとも約100ヌクレオチド、少なくとも約200ヌクレオチド、または少なくとも約300ヌクレオチドを含む。Ra12ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列(すなわち、Ra12ポリペプチドまたはその一部分をコードする内因性配列)を含み得るか、またはこのような配列の改変体を含み得る。Ra12ポリヌクレオチド改変体は、1以上の、置換、付加、欠失、および/または挿入を含み得、その結果、このコードされる融合ポリペプチドの生物学的活性は、ネイティブRa12ポリペプチドを含む融合ポリペプチドと比較して実質的に減少しない。改変体は、好ましくは、ネイティブのRa12ポリペプチドまたはその一部分をコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも約70%の同一性、より好ましくは少なくとも約80%の同一性、そして最も好ましくは少なくとも約90%の同一性を示す。
【0044】
他の好ましい実施形態において、免疫学的融合バートナーは、プロテインD、グラム陰性細菌Haemophilus influenza Bの表面タンパク質から誘導される(WO 91/18926)。好ましくは、プロテインD誘導体は、このタンパク質の約3分の1(例えば、はじめのN末端の100〜110のアミノ酸)を含み、そしてプロテインD誘導体は、脂質化され得る。特定の好ましい実施形態において、リポタンパク質D融合パートナーの最初の109残基がN末端において含まれ得、さらなる外因性T細胞エピトープを有するポリペプチドを提供し、E.coliにおける発現レベルを増大する(従って、発現エンハンサーとして機能し得る)。この脂質テイルは、抗原提示細胞の最適な抗原提示を確実にする。他の融合パートナーとしては、インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質である、NS1(血球凝集素)が挙げられる。代表的には、このN末端の81アミノ酸が使用さるが、T細胞エピトープを含む異なるフラグメントが使用され得る。
【0045】
別の実施形態において、この免疫学的融合パートナーは、LYTAとして既知のタンパク質またはその部分(好ましくは、C末端部分)である。LYTAは、Streptococcus pneumoniaeに由来し、そしてこれは、アミダーゼLYTA(これは、LytA遺伝子にコードされる;Gene 43:265〜292、1986)として既知のN−アセチル−L−アラニンアミダーゼを合成する。LYTAは、ペプチドグリカン骨格において特定の結合を特異的に溶かす自己溶解素である。このLYTAタンパク質のC末端ドメインは、コリンまたはいくつかのコリンアナログ(例えば、DEAE)に対する親和性を担う。この特性は、融合タンパク質の発現に有用なプラスミドを発現するE.coliのC−LYTAの開発について活用されてきた。C−LYTAフラグメントをアミノ末端領域に含むハイブリッドタンパク質の精製が記載された(Biotechnology 10:795〜798、1992を参照のこと)。好ましい実施形態において、LYTAの反復部分が融合ポリペプチドに組み込まれ得る。反復部分は、残基178で開始するC末端領域において見出される。特定の好ましい反復部分は、残基188〜305を取り込む。
【0046】
さらに別の例示的な実施例としては、融合ポリペプチド、およびこれらをコードするポリヌクレオチドが挙げられ、ここでこの融合パートナーは、米国特許第5,633,234号に記載のように、エンドソーム画分またはリソソーム画分にポリペプチドを指向し得る標的化シグナルを含む。本発明の免疫学的なポリペプチドは、この標的化シグナルと融合される場合に、MHCクラスII分子とより効率的に会合し、そして、それによって、このポリペプチドに対して特異的であるCD4+T細胞の増強されたインビボ刺激を提供する。
【0047】
本発明は、融合パートナーの付加をすることなしにE.coliにおいて組換え的に発現され得るWT1ポリペプチドの短縮形態を提供する。これらの短縮形態の例は、配列番号342〜346に示され、そしてこれらは配列番号337〜341に示されるポリヌクレオチドによってコードされる。これらの短縮のバリーションにおいて、WT1の最初の76アミノ酸は、このタンパク質のC末端に融合され得、E.ccoliにおいてより容易に発現する組換えタンパク質を生成し得る。E.coliに加えて、例えば、B.megateriumのような他の宿主がまた使用され得る。このタンパク質は、さらにヒスチジンタグを用いずに調製され得る。
【0048】
他の実施形態において、異なるサブユニットが作製され、そしてネイティブWT1の順番とは異なる順番で共に融合され得る。さらに、融合が例えば、Ra12と共になされ得る。例示的な融合タンパク質は、配列番号332〜336において示され、そしてこれらは配列番号327〜331に示されるポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【0049】
(WT1ポリヌクレオチド)
本明細書中に記載されるWT1ポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドは、本発明により含まれるWT1ポリヌクレオチドである。このようなポリヌクレオチドは、一本鎖(コードまたはアンチセンス)または二本鎖であり得、そしてDNA(ゲノム、cDNAまたは合成)またはRNA分子であり得る。さらなるコード配列または非コード配列が、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得るが、存在する必要はなく、そしてポリヌクレオチドは、他の分子および/または支持物質に連結され得るが、連結される必要はない。
【0050】
WT1ポリヌクレオチドは、ネイティブなWT1タンパク質をコードし得るか、または本明細書中に記載されるWT1の改変体をコードし得る。ポリヌクレオチド改変体は、ネイティブなWT1タンパク質と比較して、コードされるポリペプチドの免疫原性が減少されないような1つ以上の置換、付加、欠失、および/または挿入を含み得る。コードされるポリペプチドの免疫原性に対する効果は、一般的に本明細書中に記載されるように評価され得る。好ましい改変体は、ネイティブなWT1配列の免疫原性部分をコードするヌクレオチド位置、20%以下、好ましくは、10%以下でヌクレオチド置換、欠失、挿入および/または付加を含む。特定の改変体は、ネイティブな遺伝子またはその一部と実質的に相同的である。このようなポリヌクレオチド改変体は、WT1ポリペプチド(または相補配列)をコードする天然に存在するDNA配列と、中程度のストリンジェント条件下でハイブリダイズし得る。適切な中程度のストリンジェントな条件は以下を含む:5×SSC、0.5%SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)の溶液での前洗浄;50℃〜65℃、5×SSCにおける一晩のハイブリダイゼーション;続いて、それぞれ0.1%SDS含有2×SSC、0.5×SSC、および0.2×SSCを用いた65℃で20分間の2回の洗浄。このようにハイブリダイズするDNA配列はまた、本発明の範囲内である。
【0051】
遺伝コードの縮重の結果として、WT1ポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが当業者に理解される。いくつかのこれらのポリヌクレオチドは、任意のネイティブな遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用頻度における差異に起因して変動するポリヌクレオチドが、特に本発明により意図される。
【0052】
一旦、上記のようにWT1の免疫原性部分が同定されると、WT1ポリヌクレオチドが、任意の種々の技術を使用して調製され得る。例えば、WT1ポリヌクレオチドが、WT1を発現する細胞から調製されるcDNAから増幅され得る。このようなポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を介して増幅され得る。このアプローチのために、配列特異的プライマーが、免疫原性部分の配列に基づいて設計され得、そして購入され得るか、または合成され得る。例えば、ヒトWT1遺伝子のPCR増幅のための適切なプライマーには以下が挙げられる:第1工程−P118:1434−1414:5’GAGAGTCAGACTTGAAAGGAGT3’(配列番号5)およびP135:5’CTGAGCCTCAGCAAATGGGC3’(配列番号6);第2工程−P136:5’GAGCATGCATGGGCTCCGACGTGCGGG3’(配列番号7)およびP137:5’GGGGTACCCACTGAACGGTCCCCGA3’(配列番号8)。マウスWT1遺伝子のPCR増幅のためのプライマーには以下が挙げられる:第1工程−P138:5’TCCGAGCCGCACCTCATG3’(配列番号9)およびP139:5’GCCTGGGATGCTGGACTG3’(配列番号10);第2工程−P140:5’GAGCATGCGATGGGTTCCGACGTGCGG3’(配列番号11)およびP141:5’GGGGTACCTCAAAGCGCCACGTGGAGTTT3’(配列番号12)。
【0053】
次いで、増幅された部分を使用して、全長遺伝子が、周知の技術を使用してヒトゲノムDNAライブラリーまたは適切なcDNAライブラリーから単離され得る。あるいは、全長遺伝子が、複数のPCRフラグメントから構築され得る。WT1ポリヌクレオチドはまた、オリゴヌクレオチド成分を合成し、そして完全なポリヌクレオチドを産生するために共に成分を連結することにより調製され得る。
【0054】
WT1ポリヌクレオチドはまた、当該分野において公知の任意の方法によって合成され得、その方法には化学合成が挙げられる(例えば、固相ホスホラミダイト化学合成)。ポリヌクレオチド配列における改変はまた、標準的な変異誘発技術(例えば、オリゴヌクレオチド指向性、部位特異的変異誘発(Adelmanら、DNA 2:183、1983を参照のこと)、を使用して導入され得る。あるいは、DNAが適切なRNAポリメラーゼプロモーター(例えば、T7またはSP6)とともにベクターに組み込まれる場合、RNA分子は、WT1ポリペプチドをコードするDNA配列のインビトロまたはインビボでの転写により産生され得る。特定の部分を使用して、本明細書中に記載されるような、コードされるポリペプチドを調製し得る。さらに、またはあるいは、コードされるポリペプチドがインビボで産生されるように、患者に対して一部が投与され得る(例えば、WT1ポリペプチドをコードするcDNA構築物を有する樹状細胞のような抗原提示細胞をトランスフェクトし、そしてそのトランスフェクトされた細胞を患者に投与することによる)。
【0055】
WT1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは一般的に、インビトロまたはインビボにおいてそのポリペプチドを産生するために使用され得る。コード配列に相補的なWT1ポリヌクレオチド(すなわち、アンチセンスポリヌクレオチド)はまた、プローブとしてまたはWT1発現を阻害するために使用され得る。アンチセンスRNAに転写され得るcDNA構築物もまた、組織の細胞に導入され、アンチセンスRNAの産生を促進し得る。
【0056】
任意のポリヌクレオチドがさらに改変され、インビボにおける安定性を増加し得る。可能な改変には以下が挙げられるが、これらに限定されない;5’および/または3’末端における隣接配列の付加;骨格におけるホスホジエステラーゼ結合に代わるホスホロチオエートまたは2’O−メチルの使用;および/または非伝統的な塩基(例えば、イノシン、キュェオシンおよびワイブトシン)、ならびにアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンのアセチル形態、メチル形態、チオ形態および他の改変形態の包含。
【0057】
本明細書中に記載されるようなヌクレオチド配列が、確立された組換えDNA技術を使用して、種々の他のヌクレオチド配列に結合され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、任意の種々のクローニングベクターにクローン化され得る、そのベクターには、プラスミド、ファージミド、λファージ誘導体およびコスミドが挙げられる。特定の目的のベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ産生ベクターおよび配列決定ベクターが挙げられる。一般的には、ベクターは、少なくとも1つの生物体において機能的な複製起点、都合のよい制限エンドヌクレアーゼ部位および1つ以上の選択マーカーを含む。他のエレメントは、所望される用途に依存し、そして当業者において明らかである。
【0058】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、哺乳動物の細胞に入り、そしてそこで発現することを可能にするように処方され得る。以下に記載されるように、このような処方物は、治療目的のために特に有用である。当業者は、標的細胞においてポリヌクレオチドの発現を達成するための多くの方法が存在すること、および任意の適切な方法が使用され得ることを理解する。例えば、ポリヌクレオチドがウイルスベクター(例えば、限定しないが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスまたはワクシニアウイルスまたは他にポックスウイルス(例えば鳥類ポックスウイルス))に組み込まれ得る。DNAをこのようなべクターに組み込むための技術は、当業者において周知である。さらにレトロウイルスベクターは、選択マーカー(形質導入された細胞の同定または選択を援助するために)についての遺伝子および/またはベクターを標的特異的にするための標的部分(例えば、特定の標的細胞上のレセプターに対するリガンドをコードする遺伝子)を伝達または組み込み得る。標的化はまた、当業者において公知の方法により、抗体を使用して達成され得る。例えば、腫瘍防御および養子免疫療法実験(腫瘍あるいは白血病増殖阻害またはこのような細胞の溶解を実証するため)を実施するために使用され得るWT1陽性腫瘍モデルを樹立する際の使用のために、そのようなベクター内のcDNA構築物を使用して、ヒトまたは動物細胞株にトランスフェクトし得る。
【0059】
ポリヌクレオチドについての他の治療的処方物は、コロイド分散系(例えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフィア、ビーズ)および脂質ベースの系(O/Wエマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソーム)を含む。インビトロおよびインビボにおける送達ビヒクルとして使用するために好ましいコロイド系はリポソームである(すなわち、人工膜小胞)。このような系の調製および使用は、当該分野において周知である。
【0060】
(抗体およびそのフラグメント)
本発明は、さらにWT1ポリペプチドに特異的に結合する結合薬剤(例えば、抗体、およびその抗原結合フラグメント)を提供する。本明細書中で使用されるように、薬剤がWT1ポリペプチドと検出可能なレベル(例えば、ELISA内)で反応し、類似の条件下で、関連しないタンパク質と検出可能に反応しない場合、薬剤はWT1ポリペプチドに「特異的に結合する」と言われる。本明細書中で使用される場合、「結合」とは、「複合体」が形成されるような2つの別々の分子間の非共有結合的会合を言う。結合する能力は、例えは、その複合体の形成についての結合定数を決定することにより評価され得る。この結合定数は、その複合体の濃度をその成分濃度の積で除算して得られた値である。一般的に、複合体形成についての結合定数が約103L/molを超える場合、2つの化合物は、本発明の文脈中において「結合する」と言われる。この結合定数は、当該分野において周知の方法を使用して決定され得る。
【0061】
上記の要求を満足する任意の薬剤が結合薬剤となり得る。好ましい実施形態において、結合薬剤は、抗体であるか、またはその抗原結合フラグメントである。特定の抗体が、例えば、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA)から商業的に入手可能である。あるいは、抗体は、当業者に公知の任意の種々の技術により調製され得る。例えば、HarlowおよびLane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988を参照のこと。一般的に、抗体は、細胞培養技術により産生され得、その技術には本明細書中に記載されるようなモノクローナル抗体の産生、または組換え抗体の産生を可能にするために、適切な細菌細胞宿主または哺乳動物細胞宿主に抗体遺伝子をトランスフェクトすることによるものが挙げられる。1つの技術において、ポリペプチドを含む免疫原は、初めに任意の広範な種々の哺乳動物に注射される(マウス、ラット、ウサギ、ヒツジまたはヤギ)。この工程において、本発明のポリペプチドは改変を伴わずに免疫原として作用し得る。あるいは、特に比較的短いポリペプチドに対して、ポリペプチドがキャリアタンパク質(例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン)に結合される場合、優れた免疫応答が誘発され得る。この免疫原は、好ましくは、1つ以上のブースター免疫を組み込んだ予め決定されたスケジュールに従って、動物宿主に注射され、そしてこの動物は定期的に採血される。次いで、このペプチドに対して特異的なポリクローナル抗体は、そのような抗血清から、例えば適切な固形支持体と結合されたポリペプチドを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。
【0062】
目的の抗原性ポリペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体が、例えば、KohlerおよびMilstein(Eur.J.Immunol.6:511−519、1976)の技術およびそのさらに改善された技術を使用して調製され得る。手短に言うと、これらの方法は、所望される特異性(すなわち、目的のポリペプチドとの反応性)を有する抗体を産生し得る不死細胞株の調製を含む。このような細胞株が、例えば、上記のように免疫化された動物から得られた脾臓細胞から産生され得る。次いで、この脾臓細胞は、例えば、ミエローマ細胞融合パートナー(好ましくは、この免疫化された動物と同系である)との融合により不死化される。種々の融合技術が使用され得る。例えば、脾臓細胞およびミエローマ細胞を数分間非イオン性界面活性剤と組み合わせ、次いで、ハイブリッド細胞の増殖を支持するが、ミエローマ細胞の増殖は支持しない選択培地上に低密度でプレートし得る。好ましい選択技術はHAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)選択を使用する。十分な時間(通常、約1〜2週間)の後、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一コロニーが選択され、そしてその培養上清が、そのポリペプチドに対する結合活性について試験される。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
【0063】
モノクローナル抗体が、増殖するハイブリドーマコロニーの上清から単離され得る。さらに、種々の技術(例えば、適切な脊椎動物宿主(例えば、マウス)の腹腔内へのハイブリドーマ細胞株の注入)が、収率を増強するために使用され得る。次いで、モノクローナル抗体が腹水または血液から収集され得る。混入物は、従来の技術(例えば、クロマトグラフィー、ゲルろ過、沈澱および抽出)によって抗体から除去され得る。本発明のポリペプチドは、精製プロセス(例えば、アフィニティークロマトグラフィー工程)において使用され得る。
【0064】
特定の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントの使用が好まれ得る。そのようなフラグメントには、Fabフラグメントが挙げれるが、これは標準的な技術を使用して調製され得る。手短に言うと、免疫グロブリンが、プロテインAビーズカラム上のアフィニティークロマトグラフィーにより、ウサギ血清から精製され得(HarlowおよびLane、Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory、1988)、そしてFabフラグメントおよびFcフラグメントを産生するためにパパインにより消化され得る。FabフラグメントおよびFcフラグメントが、プロテインAビーズカラム上のアフィニティークロマトグラフィーにより分離され得る。
【0065】
モノクローナル抗体およびそのフラグメントは、1以上の治療剤に結合され得る。この点に関して適切な薬剤は、例えば、自己骨髄をインビトロでパージするために使用され得る、放射性トレーサーおよび化学療法剤を含む。代表的な治療剤は、放射性核種、分化誘導剤、薬物、毒素、およびそれらの誘導体を含む。好ましい放射性核種は、90Y、123I、125I、131I、186Re、188Re、211At、および212Biを含む。好ましい薬物は、メトトレキセート、ならびにピリミジンアナログおよびプリンアナログを含む。好ましい分化誘導剤は、ホルボールエステルおよび酪酸を含む。好ましい毒素は、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン(gelonin)、Pseudomonas外毒素、Shigella毒素、およびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質を含む。診断目的については、放射性薬剤の結合が、転移の追跡を容易にするためか、またはWT1−陽性腫瘍の位置を決定するために、使用され得る。
【0066】
治療剤は、直接的または間接的(例えば、リンカー基を通じて)のいずれかで、適切なモノクローナル抗体に結合(例えば、共有結合)され得る。薬剤と抗体との間の直接的な反応は、各々が他方と反応し得る置換基を保有する場合に可能である。例えば、一方の求核基(例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基)は、他方のカルボニル含有基(例えば、無水物または酸ハライド)と、または他方に対する良好な脱離基(例えば、ハライド)を含むアルキル基と反応することが可能であり得る。
【0067】
あるいは、治療剤および抗体をリンカー基を通じて結合させることが所望され得る。リンカー基は、結合能力を妨害することを回避するために、薬剤から抗体を離すスペーサーとして機能し得る。リンカー基はまた、薬剤または抗体上の置換基の化学反応性を増大させるように働き得、それにより結合効率を増大させる。化学反応性における増大はまた、薬剤、または薬剤上の官能基の使用を容易にし得るが、これは、そうでなければ可能ではない。
【0068】
種々の二官能性試薬または多官能性試薬(ホモ官能性およびヘテロ官能性の両方)(例えば、Pierce Chemical Co.、Rockford、ILのカタログに記載されるもの)が、リンカー基として用いられ得ることは、当業者に明らかである。結合は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基または酸化した糖質残基を通じてもたらされ得る。このような方法論を記載している多数の参考文献(例えば、Rodwellらに対する米国特許第4,671,958号)が存在する。
【0069】
本発明の免疫結合体の抗体部分を含まないときに治療剤がより強力である場合、細胞中へのインタナリゼーションの間またはその際に切断可能であるリンカー基を使用することが所望され得る。多くの異なる切断可能なリンカー基が、記載されている。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出についての機構は、ジスルフィド結合の還元による切断(例えば、Spitlerに対する米国特許第4,489,710号)、光不安定結合の照射による切断(例えば、Senterらに対する米国特許第4,625,014号)、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解による切断(Kohnらに対する米国特許第4,638,045号)、血清補体媒介加水分解による切断(例えば、Rodwellらに対する米国特許第4,671,958号)、および酸触媒加水分解による切断(例えば、Blattlerらに対する米国特許第4,569,789号)を含む。
【0070】
1よりも多くの薬剤を抗体に結合させることが所望され得る。1つの実施形態では、薬剤の複数の分子が、1つの抗体分子に結合され得る。別の実施形態では、1よりも多い型の薬剤が、1つの抗体に結合され得る。特定の実施形態にも関わらず、1よりも多い薬剤を有する免疫結合体が、種々の様式で調製され得る。例えば、1よりも多い薬剤が、抗体分子に直接的に結合され得るか、または付着のために複数の部位を提供するリンカーが、使用され得る。あるいは、キャリアが使用され得る。キャリアは、種々の様式において薬剤を保有し得、この様式は、直接的かまたはリンカー基を通じてかのいずれかでの共有結合を含む。適切なキャリアは、アルブミンのようなタンパク質(例えば、Katoらに対する米国特許第4,507,234号)、ペプチドおよびアミノデキストランのようなポリサッカリド(Shihらに対する米国特許第4,699,784号)を含む。キャリアはまた、非共有結合によってか、または例えば、リポソームビヒクル内でのカプセル化によって薬剤を保有し得る(例えば、米国特許第4,429,008号および同第4,873,088号)。放射性核種薬剤に特異的なキャリアは、放射性ハロゲン化低分子およびキレート化合物を含む。例えば、米国特許第4,735,792号は、代表的な放射性ハロゲン化低分子およびそれらの合成を開示している。放射性核種キレートは、金属、または金属酸化物、放射性核種を結合するためにドナー原子として窒素原子および硫黄原子を含むキレート化合物を含むキレート化合物から形成され得る。例えば、Davisonらに対する米国特許第4,673,562号は、代表的なキレート化合物およびそれらの合成を開示している。
【0071】
抗体および免疫結合体について、種々の投与経路が使用され得る。代表的には、投与は、静脈内、筋肉内、皮下、または切除された腫瘍のベッドにおいてである。抗体/免疫結合体の正確な用量は、使用される抗体、腫瘍上の抗原密度、および抗体のクリアランスの速度に依存して変動することが明らかである。
【0072】
また、WT1の免疫原性部分を模倣する抗イディオタイプ抗体が、本明細書中に提供される。このような抗体は、周知の技術を使用して、WT1の免疫原性部分に特異的に結合する、抗体、またはその抗原結合フラグメントに対して惹起され得る。WT1の免疫原性部分を模倣する抗イディオタイプ抗体は、本明細書中に記載されるように、WT1の免疫原性部分に特異的に結合する、抗体、またはその抗原結合フラグメントに結合する抗体である。
【0073】
(T細胞)
免疫治療組成物はまた、またはあるいは、WT1に特異的なT細胞を含む。このような細胞は、一般に、標準的な手順を使用して、インビトロまたはエキソビボで調製され得る。例えば、T細胞は、市販の細胞分離系(例えば、CellPro Inc.Bothell WAから入手可能なCEPRATETM系)を使用して、哺乳動物(例えば、患者)の骨髄、末梢血あるいは骨髄または末梢血の画分内に存在し得る(またはそれらから単離され得る)(米国特許第5,240,856号;米国特許第5,215,926号;WO89/06280;WO91/16116およびWO92/07243もまた参照のこと)。あるいは、T細胞は、関連しているかまたは関連していない、ヒト、非ヒト動物、細胞株または培養物に由来し得る。
【0074】
T細胞は、WT1ポリペプチド、WT1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および/またはWT1ポリペプチドを発現する抗原提示細胞(APC)で刺激され得る。このような刺激は、WT1ポリペプチドに特異的であるT細胞の生成を許容するに十分な条件下および時間で行われる。好ましくは、WT1ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、抗原特異的T細胞の生成を容易にするために、送達ビヒクル(例えば、ミクロスフェア)内に存在する。簡潔には、T細胞は、慣用的な技術によって(例えば、末梢血リンパ球のFicoll/Hypaque密度勾配遠心分離によって)、患者または関連しているかもしくは関連していないドナーから単離され得、WT1ポリペプチドとインキュベートされる。例えば、T細胞は、WT1ポリペプチド(例えば、5μg〜25μg/ml)または匹敵する量のWT1ポリペプチドを合成する細胞とともに、37℃で2〜9日間(代表的には4日間)インビトロでインキュベートされ得る。コントロールとして働くWT1ポリペプチドの非存在下で、T細胞サンプルの別々のアリコートをインキュベートすることが所望され得る。
【0075】
T細胞は、このT細胞がWT1ポリペプチドでコーティングされているか、またはこのようなポリペプチドをコードする遺伝子を発現している標的細胞を殺傷する場合に、WT1ポリペプチドに特異的であるとみなされる。T細胞の特異性は、任意の種々の標準的な技術を使用して評価され得る。例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイにおいては、陰性コントロールと比較して、溶解および/または増殖における刺激指数の2倍を超える上昇は、T細胞特異性を示す。このようなアッセイは、例えば、Chenら、Cancer Res.54:1065〜1070、1994に記載されるように行われ得る。あるいは、T細胞の増殖の検出が、種々の公知の技術によって達成され得る。例えば、T細胞増殖は、DNA合成の上昇した速度を測定することによって(例えば、トリチウム化チミジンでT細胞の培養物をパルス標識し、そしてDNA中に取り込まれたトリチウム化チミジンの量を測定することによって)検出され得る。T細胞増殖を検出する他の様式は、インターロイキン−2(IL−2)産生、Ca2+フラックス、または色素(例えば、3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニル−テトラゾリウム)の取り込みにおける上昇を測定することを包含する。あるいは、リンホカイン(例えば、インターフェロンγ)の合成が、測定され得るか、またはWT1ポリペプチドに応答し得るT細胞の相対数が、定量され得る。サイトカイン放出(例えば、TNFまたはIFN−γ)のレベルにおける2倍の上昇がT細胞活性化を示す標準的なサイトカインアッセイを使用して測定した場合に、WT1ポリペプチド(200ng/ml〜100μg/ml、好ましくは100ng/ml〜25μg/ml)との3〜7日間の接触は、T細胞の増殖において少なくとも2倍の上昇を生じるはずであり、そして/または上記のような2〜3時間の接触は、T細胞の活性化を生じるはずである(Coliganら、Current Protocols in Immunology、第1巻、Wiley Interscience(Greene 1998)を参照のこと)。WT1特異的T細胞は、標準的な技術を使用して拡大され得る。好ましい実施形態において、このT細胞は、患者または関連しているか、もしくは関連していないドナーに由来し、そして刺激および拡大の後に患者に投与される。
【0076】
WT1ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはWT1発現APCに応答して活性化されたT細胞は、CD4+および/またはCD8+であり得る。CD4+またはCD8+T細胞の特異的活性化が、種々の様式で検出され得る。特異的T細胞活性化を検出するための方法は、T細胞の増殖、サイトカイン(例えば、リンホカイン)の産生、または細胞溶解活性の生成(すなわち、WT1に特異的な細胞傷害性T細胞の生成)を検出することを包含する。CD4+T細胞については、特異的T細胞活性化を検出するために好ましい方法は、T細胞の増殖の検出である。CD8+細胞については、特異的T細胞活性化を検出するために好ましい方法は、細胞溶解性活性の生成の検出である。
【0077】
治療目的のために、WT1ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはAPCに応答して増殖するCD4+T細胞またはCD8+T細胞は、インビトロまたはインビボのいずれかで数の上では増殖され得る。インビトロでのこのようなT細胞の増殖は、種々の様式で達成され得る。例えば、T細胞は、T細胞増殖因子(例えば、インターロイキン−2)、および/またはWT1ポリペプチドを合成する刺激性細胞を添加してか、または添加することなく、WT1ポリペプチドに再び曝露され得る。刺激性細胞の添加は、CD8+T細胞応答を生成する場合に好ましい。T細胞は、WT1ポリペプチドでの断続的な再刺激に応答する特異性を保持したまま、インビトロで多数に増殖され得る。簡潔には、一次的なインビトロ刺激(IVS)については、多数のリンパ球(例えば、4×107よりも多い)が、ヒト血清を含む培地を有するフラスコ中に置かれ得る。WT1ポリペプチド(例えば、10μg/mlでのペプチド)が、破傷風毒素(例えば、5μg/ml)とともに、直接的に添加され得る。次いで、これらのフラスコが、インキュベートされ得る(例えば、37℃で7日間)。第2のIVSについては、次いで、T細胞が収集され、そして2〜3×107の照射された末梢血単核細胞を有する新しいフラスコ中に置かれる。WT1ポリペプチド(例えば、10μg/ml)が、直接的に添加される。これらのフラスコが、37℃で7日間インキュベートされる。第2のIVSの2日および4日後に、2〜5単位のインターロイキン−2(IL−2)が、添加され得る。第3のIVSについては、T細胞は、ウェル中に置かれ得、そしてこのペプチドでコーティングされた、個体独自のEBV形質転換B細胞で刺激され得る。IL−2が、各々の周期の2日目および4日目に添加され得る。これらの細胞が特異的な細胞傷害性T細胞であることが示されるとすぐに、これらは、2日目、4日目および6日目で、より多いIL−2(20単位)を用いて、10日の刺激周期を使用して拡大され得る。
【0078】
あるいは、WT1ポリペプチドの存在下で増殖する1以上のT細胞が、クローニングによって、数の上で拡大され得る。細胞をクローニングするための方法は、当該分野において周知であり、そして限界希釈を含む。応答性T細胞は、密度勾配遠心分離およびヒツジ赤血球細胞ロゼッティングにより感作された患者の末梢血から精製され得、そして照射された自己充填細胞(autologous filler cell)の存在下で名目上の抗原で刺激することによって培養物中で樹立され得る。CD4+T細胞株を生成するために、WT1ポリペプチドが、抗原性刺激として使用され、そしてエプスタイン−バーウイルスでの感染により不死化された自己末梢血リンパ球(PBL)またはリンパ芽球腫細胞株(LCL)は、抗原提示細胞として使用される。CD8+T細胞株を生成するために、WT1ポリペプチドを産生する発現ベクターでトランスフェクトされた自己抗原提示細胞が、刺激性細胞として使用され得る。樹立されたT細胞株は、1×106の照射されたPBL細胞またはLCL細胞および組換えインターロイキン−2(rIL−2)(50U/ml)を有する96ウェル平底プレートに、1ウェルあたり0.5の細胞の頻度で、刺激されたT細胞をプレートすることによって抗原刺激の2〜4日後にクローニングされ得る。樹立されたクローン増殖を有するウェルは、最初のプレーティングのおよそ2〜3週間後に同定され、そして自己抗原提示細胞の存在下で適切な抗原で再刺激され、次いで、抗原刺激の2〜3日後での低用量のrIL2(10U/ml)の添加によって拡大され得る。T細胞クローンは、およそ2週間毎の抗原およびrIL2での定期的な再刺激によって24ウェルプレートにおいて維持され得る。
【0079】
特定の実施形態では、同種異系T細胞が、インビボおよび/またはインビトロで初回免疫され得る(すなわち、WT1に感作される)。このような初回免疫は、WT1ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはこのようなポリペプチドを産生する細胞と、T細胞とを、T細胞を初回免疫することを許容する条件下かつ時間で、接触させることによって達成され得る。一般に、T細胞は、例えば、本明細書中に記載される標準的な増殖、クロム放出アッセイおよび/またはサイトカイン放出アッセイにより測定されるように、WT1ポリペプチドとの接触がT細胞の増殖および/または活性化を生じる場合に、初回免疫されるとみなされる。陰性コントロールと比較して、増殖または溶解における2倍よりも大きい上昇、およびサイトカインレベルにおける3倍よりも大きい上昇の刺激指数は、T細胞特異性を示す。インビトロで初回免疫された細胞は、例えば、骨髄移植において、またはドナーリンパ球注入として、用いられ得る。
【0080】
WT1に特異的なT細胞は、WT1タンパク質を発現する細胞を殺傷する。WT1のためのT細胞レセプター(TCR)鎖をコードする遺伝子の導入は、WT1を保有する、白血病細胞および癌細胞に対する応答を量的かつ質的に改善する手段として使用される。WT1陽性細胞と反応し得るT細胞の数を増加させるためのワクチンは、WT1を保有する細胞を標的化するための一つの方法である。WT1に特異的なT細胞を用いたT細胞療法は別の方法である。代替的な方法は、WT1に特異的なTCR鎖をT細胞または溶解能を有する他の細胞に導入することである。適切な実施形態において、このTCRα鎖およびTCRβ鎖は、WO96/30516(これは、本明細書中において、参考として援用される)に記載されるように、WT1特異的T細胞株からクローン化され、そして養子T細胞治療のために使用される。
【0081】
(薬学的組成物およびワクチン)
特定の局面において、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体および/またはT細胞が、薬学的組成物またはワクチンに組み込まれ得る。あるいは、薬学的組成物は、WT1ポリヌクレオチドでトランスフェクトされた抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)を含み得、この結果、この抗原提示細胞は、WT1ポリペプチドを発現する。薬学的組成物は、1以上のこのような化合物または細胞、および薬理学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。特定のワクチンは、1以上のそのような化合物または細胞、および非特異的免疫応答エンハンサー(例えば、アジュバントまたはリポソーム(これらの中に化合物が取り込まれる))を含み得る。薬学的組成物およびワクチンは、送達系(例えば、米国特許第4,897,268号および同第5,075,109号に開示される生分解性ミクロスフェアのような)をさらに含み得る。本発明の範囲内の薬学的組成物およびワクチンはまた、生物学的に活性または不活性であり得る、他の化合物を含み得る。
【0082】
特定の実施形態において、薬学的組成物およびワクチンは、患者(例えば、ヒト)においてWT1ポリペプチドに特異的なT細胞応答を誘発するように設計される。一般的に、T細胞応答は、比較的短いポリペプチド(例えば、ネイティブWT1ポリペプチドの23未満の連続アミノ酸残基、好ましくは4〜16の連続残基、より好ましくは、8〜16の連続残基、およびなおより好ましくは、8〜10の連続残基を含む)の使用を介して支持され得る。あるいは、またはさらに、ワクチンは、T細胞応答を優先的に増強する非特異的免疫応答エンハンサーを含み得る。換言すると、この免疫応答エンハンサーは、WT1ポリペプチドに対するT細胞応答のレベルを、抗体応答が増強される量より比例的により多い量に増強し得る。例えば、標準的なオイルベースのアジュバント(例えば、CFA)と比較する場合、T細胞応答を優先的に増強する免疫応答エンハンサーは、WT1陰性コントロール細胞株に比べて増殖性T細胞応答を少なくとも2倍、溶解性応答を少なくとも10%、および/またはT細胞の活性化を少なくとも2倍増強し得るが、抗体応答を検出可能に増強しない。WT1ポリペプチドに対するT細胞応答または抗体応答が増強される量は、一般的に、当該分野で公知の任意の代表的技術(例えば、本明細書中に提供される技術)を使用して決定され得る。
【0083】
薬学的組成物またはワクチンは、上記のようなポリペプチドの1以上をコードするDNAを含み得、その結果、このポリペプチドはインサイチュで生成される。上記のように、DNAは、当業者に公知の種々の送達系のいずれかの中に存在し得、これらの送達系としては、核酸発現系、細菌発現系およびウイルス発現系ならびに哺乳動物発現系が挙げられる。適切な核酸発現系は、患者における発現に必要なDNA配列、cDNA配列またはRNA配列(例えば、適切なプロモーターおよび終結シグナル)を含む。細菌送達系は、細菌(例えば、Bacillus−Calmette−Guerrin)の投与を含み、その細菌は、その細胞表面上でポリペプチドの免疫原性部分を発現する。好ましい実施形態において、このDNAは、ウイルス発現系(例えば、ワクシニアウイルスまたは他のポックスウイルス、レトロウイルス、あるいはアデノウイルス)を使用して導入され得、これらの発現系は、非病原性(欠損性)の複製コンピテントなウイルスの使用を含み得る。このような発現系にDNAを組み込むための技術は、当業者に周知である。このDNAはまた、例えば、Ulmerら、Science 259:1745−1749、1993に記載され、そしてCohen,Science 259:1691−1692、1993に総説されるように、「裸」であり得る。裸のDNAの取り込みは、細胞に効率的に輸送される生分解性ビーズ上にこのDNAをコートすることによって増加され得る。
【0084】
上記のように、薬学的組成物またはワクチンは、WT1ポリペプチドを発現する抗原提示細胞を含み得る。治療目的のために、本明細書中に記載されるように、抗原提示細胞は、好ましくは、自己の樹状細胞である。このような細胞は、Reevesら、Cancer Res.56:5672−5677,1996;Tutingら、J.Immunol.160:1139−1147,1998;およびNairら、Nature Biotechnol.16:364−369,1998に記載のような、標準的な技術を使用して調製およびトランスフェクトされ得る。抗原提示細胞の表面上のWT1ポリペプチドの発現は、本明細書中に記載のような、インビトロ刺激および標準的な増殖、ならびにクロム放出アッセイによって確証され得る。
【0085】
当業者に公知の任意の適切なキャリアは、本発明の薬学的組成物において使用され得るが、キャリアの型は、投与形態に依存して変化する。本発明の組成物は、任意の適切な投与形式(例えば、局所的投与、経口投与、経鼻投与、静脈内投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与または筋肉内投与を含む)について処方され得る。非経口投与(例えば、皮下注射)のために、キャリアは、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックスまたは緩衝液を含む。経口投与のために、上記のキャリアのいずれか、または固体キャリア(例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウム)が、使用され得る。生分解性ミクロスフェア(例えば、ポリ乳酸ポリグリコール酸)もまた、本発明の薬学的組成物のためのキャリアとして使用され得る。特定の局所適用のために、周知の成分を使用するクリームまたはローションとしての処方物が、好ましい。
【0086】
このような組成物はまた、緩衝液(例えば、中性の緩衝化生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水)、炭水化物(例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン)、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸(例えば、グリシン)、抗酸化剤、キレート剤(例えば、EDTAまたはグルタチオン)、アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)および/または保存剤を含み得る。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として処方され得る。化合物はまた、周知の技術を使用してリポソーム内にカプセル化され得る。本発明の1つの実施形態において、組成物は、以下を含むがこれらに限定されない糖の1つ以上を含む緩衝液を含み、これらの各々は、一般的に約1%と25%との間の濃度にあり、代表的には約7%と約13%との間の濃度にある:トレハロース、マルトース、スクロース、フルクトース、およびグルコース。さらなる実施形態において、この濃度は約8%と約12%との間である。さらなる実施形態において、この濃度は、約10%である。本発明のさらなる局面において、この組成物は、エタノールアミン;システイン;またはPolysorbate−80を含み得、これらは一般に、この処方物の、効力、安定性および/または溶解性を増強するのに有効な濃度にある。
【0087】
任意の種々の非特異的免疫応答エンハンサー(例えば、アジュバント)が、本発明のワクチンにおいて使用され得る。多くのアジュバントは、迅速な異化から抗原を保護するように設計された物質(例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油)、および免疫応答の刺激物質(例えば、脂質A、Bortadella pertussisまたはMycobacterium tuberculosis誘導タンパク質)を含む。適切な非特異的免疫応答エンハンサーとしては、以下が挙げられる:ミョウバンベースのアジュバント(例えば、Alhydrogel、Rehydragel、リン酸アルミニウム、Algammulin、水酸化アルミニウム);オイルベースのアジュバント(フロイントアジュバント(FA)、Specol、RIBI、TiterMax、Montanide ISA50またはMontanide(Seppic,France)ISA 720);サイトカイン(例えば、GM−CSFまたはFlat3リガンド);ミクロスフェア;非イオン性ブロックコポリマーベースのアジュバント;ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDA)ベースのアジュバントAS−1、AS−2(Smith Kline Beecham);Ribi Adjuvant系ベースのアジュバント:QS21(Aquila);サポニンベースのアジュバント(粗サポニン、サポニンQuil A);ムラミルジペプチド(MDP)ベースのアジュバント(例えば、SAF(微小流動体化(microfluidized)形態のSyntexアジュバント(SAF−m)));ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDA);ヒト補体ベースのアジュバントm.vaccaeおよび誘導体;免疫刺激複合体(iscom)ベースのアジュバント;不活性化毒素;および弱毒化した感染因子(例えば、M.tuberculosis)。
【0088】
本発明の薬学的組成物の用途のためのさらなる例示的なアジュバントとしては、SAF(Chiron,California,United States)、ISCOMS(CSL)、MF−59(Chiron)、アジュバントのSBASシリーズ(例えば、SmithKline Beecham,Rixensart,Belgiumから入手可能な、SBAS−2またはSBAS−4)、Detox(Enhanzyn(登録商標))(Corixa,Hamilton,MT)、RC−529(Corixa,Hamilton,MT)および他のアミノアルキルグルコサミニド4−ホスフェート(glucosaminide 4−phosphate)(AGP)(例えば、係属中の米国特許出願番号08/853,826および同09/074,720(これらの開示は、本明細書中において全体が参考として援用される)において記載されるようなAGP)、ならびに例えば、WO99/52549A1に記載されるものようなポリオキシエチレンエーテルアジュバントが挙げられる。
【0089】
他の好ましいアジュバントとしては、以下の一般式のアジュバン分子が挙げられる:
(I):HO(CH2CH2O)n−A−R、
ここで、nは1〜50であり、Aは結合または−C(O)−であり、RはC1〜50アルキルまたはフェニルC1〜50アルキルである。
【0090】
本発明の1つの実施形態は、一般式(I)のポリオキシエチレンエーテルを含むワクチン処方物からなり、ここで、nは1と50との間であり、好ましくは4〜24であり、最も好ましくは9であり;R成分は、C1〜50であり、好ましくは、C4〜C20アルキル、および最も好ましくはC12アルキルであり、そしてAは結合である。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、0.1〜20%、好ましくは、0.1〜10%、および最も好ましくは0.1〜1%の範囲にあるべきである。好ましいポリオキエチレンエーテルは、以下の群から選択される:ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−9−ステオリルエーテル(polyoxyethylene−9−steoryl ether)、ポリオキシエチレン−8−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−4−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−35−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−23−ラウリルエーテル。ポリオキシエチレンラウリルエーテルのようなポリオキシエチレンエーテルは、Merckインディックス(12版:エントリー7717)に記載されている。これらのアジュバント分子は、WO99/52549に記載される。
【0091】
上記の一般式(I)に従うポリオキシエチレンエーテルは、所望の場合、別のアジュバントと結合され得る。例えば、好ましいアジュバントの組み合わせは、好ましくは、係属中の英国特許出願GB9820956.2に記載されるようなCpGとである。
【0092】
上記のように、特定の実施形態において、免疫応答エンハンサーは、WT1ポリペプチドに対するT細胞応答(例えば、CD4+および/またはCD8+)を優先的に誘発または増強する、それらの能力について選択される。このような免疫応答エンハンサーは、当該分野で周知であり、そしてこれには、以下が挙げられる(しかし、これらに限定されない):Montanide ISA50、Seppic MONTANIDE ISA 720、サイトカイン(例えば、GM−CSFまたはFlat3リガンド)、ミクロスフェア、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDA)ベースのアジュバント、AS−1(Smith Kline Beecham)、AS−2(Smith Kline Beecham)、Ribi Adjuvant系ベースのアジュバント、QS21(Aquila)、サポニンベースのアジュバント(粗サポニン、サポニンQuil A)、微小流動体化形態のSyntexアジュバント(SAF−m)、MV、ddMV(Genesis)、免疫刺激複合体(iscom)ベースのアジュバントおよび不活性化毒素。
【0093】
本発明の別の局面において、組成物は、主要なTh−1型応答の惹起のためのアジュバントを含み得る。主要なTh−1型応答の惹起のための特定の好ましいアジュバントとしては、例えば、モノホスホリル脂質A、好ましくは、3−デ−O−アシル化モノホスホリル脂質Aと、アルミニウム塩との組み合わせを含む。MPL(登録商標)アジュバント(例えば、MPL−SE)は、Corixa Corporation(Seattle,WA;例えば、米国特許第4,436,727号;同4,877,611号;4,886,034号および4,912,094号(これらは、本明細書中で全体が参考として援用される)を参照のこと;)から入手可能である。CpG含有オリゴヌクレオチド(この中において、CpGジヌクレオチドはメチル化されていない)はまた、主にTh1応答を誘導する。そのようなオリゴヌクレオチドは、周知であり、例えば、WO 96/02555、WO99/33488および米国特許第6,008,200号および同第5,856,462号において、記載される。免疫刺激性DNA配列はまた、例えば、Satoら,Science 273:352,1996によって記載される。別の好ましいアジュバントは、サポニン(例えば、Quil A)またはQS21およびQS7を含むその誘導体(Aquila Biopharmaceuticals Inc.,Framingham,MA);Escin;Digitonin;あるいはGypsophilaサポニンまたはChenopodium quinoaサポニンを含む。他の好ましい処方物としては、本発明のアジュバントの組み合わせ(例えば、少なくとも2つの、以下からなる群より選択される組み合わせ:QS21、QS7、Quil A、β−エスシン(β−escin)またはジギトニン)中の1以上のサポニンが挙げられる。
【0094】
本明細書中に記載される組成物およびワクチンは、徐放性処方物(すなわち、投与後に化合物の緩やかな放出をもたらす、カプセルまたはスポンジのような処方物)の一部として投与され得る。このような処方物は、一般的に、周知の技術を使用して調製され得、そして例えば、経口、直腸または皮下の埋め込みによるか、または所望の標的部位への埋め込みによって投与され得る。徐放性処方物は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体または細胞を含み得、これらは、キャリアマトリックス中に分散されるか、そして/または速度制御性の膜に囲まれたリザーバ内に含まれる。このような処方物内での使用のためのキャリアは、生体適合性であり、そしてまた生分解性であり得;好ましくは、処方物は、比較的一定レベルの活性成分の放出を提供する。徐放性処方物内に含まれる活性化合物の量は、埋め込み部位、速度および予想される放出時間、ならびに処置または予防されるべき状態の性質に依存する。
【0095】
(悪性疾患の治療)
本発明のさらなる局面において、本明細書中に記載の組成物およびワクチンは、悪性疾患(例えば、進行性または転移性の疾患、あるいは小さい腫瘍負荷(例えば、最小の残留性疾患)によって特徴付けられる疾患)の発症を阻害するために使用され得る。一般的に、このような方法は、WT1発現に関連する疾患を予防、遅延または処置するために使用され得る。換言すると、本明細書中に提供される治療方法は、既存のWT1関連疾患を処置するために使用され得るか、あるいは疾患を有さない患者において、またはWT1発現に未だ関連付けられていない疾患に罹患している患者において、このような疾患の発症を予防または遅延させるために使用され得る。
【0096】
本明細書中で使用される場合、疾患の経過の間のいずれかの時点で疾患細胞(例えば、腫瘍細胞)が、その同じ組織の正常細胞より検出可能に高レベルでWT1ポリペプチドを生成する場合、その疾患は、「WT1発現に関連する」。WT1発現の悪性疾患との関連は、WT1が腫瘍上に存在することを必要としない。例えば、WT1の過剰発現は、腫瘍の開始に関連し得るが、そのタンパク質の発現は、その後消失し得る。あるいは、WT1発現の増加によって特徴付けられない悪性疾患は、後の時点で、WT1発現の増加によって特徴付けられる疾患に進行し得る。従って、疾患細胞が、増加レベルのWT1を先に発現したか、現在発現するか、または後に発現することが予想される任意の悪性疾患は、「WT1発現に関連する」するとみなされる。
【0097】
免疫治療は、任意の種々の技術を使用して実行され得、ここで、本明細書中に提供される化合物または細胞は、患者からWT1発現細胞を除去するように機能する。このような除去は、WT1またはWT1を発現する細胞に特異的な免疫応答を患者において増強または誘導する結果として生じ得る。あるいは、WT1発現細胞は、エキソビボで除去され得る(例えば、自己骨髄、末梢血、あるいは骨髄または末梢血の画分の処置によって)。骨髄または末梢血の画分は、当該分野の任意の標準的技術を使用して得られ得る。
【0098】
このような方法において、薬学的組成物およびワクチンは、患者に投与され得る。本明細書中で使用される場合、「患者」とは、任意の温血動物(好ましくは、ヒト)をいう。患者は、悪性疾患に罹患していてもよいし、していなくてもよい。従って、上記の薬学的組成物およびワクチンは、疾患の発生を予防するために(すなわち、予防的に)使用され得るか、または疾患に罹患した患者を処置するために(例えば、既存の疾患の進行および/または転移を、予防または遅延させるために)使用され得る。疾患に罹患した患者は、最小の残留性疾患(例えば、完全または部分的寛解における白血病患者中の低い腫瘍負荷、あるいは外科的な放射線療法および/または化学療法後の腫瘍負荷の減少後の癌患者)を有し得る。このような患者は、再発を阻害するために免疫化され得る(すなわち、再発を予防または遅延させるか、あるいは再発の重篤度を低下させる)。特定の好ましい実施形態において、患者は、白血病(例えば、AML、CML、ALLまたは幼少期ALL)、脊髄形成異常症候群(MDS)または癌(例えば、胃腸癌、肺癌、甲状腺癌または乳癌、あるいは黒色腫)に罹患し、ここで、白血病の癌は、WT1陽性(すなわち、本明細書中に提供されるような、抗WT1抗体と検出可能に反応するか、または本明細書中に記載されるように、RT−PCRによって検出可能なレベルでWT1 mRNAを発現する)か、またはWT1発現細胞に対する自己免疫疾患に罹患する。
【0099】
WT1の過剰発現に関連する他の疾患としては、Satoh F.ら、Pathol.Int.50(6):458〜71(2000)およびCampbell C.E.ら、Int.J.Cancer 78(2):182〜8(1998)に記載されるような腎臓癌(例えば、腎細胞癌腫またはウィルムス腫瘍);およびAmin,K.M.ら、Am.J.Pathol.146(2):344〜56(1995)に記載されるような中皮腫が挙げられる。Haradaら(Mol.Urol.3(4):357〜364(1999))は、ヒト精巣の生殖細胞腫瘍におけるWT1遺伝子発現を記述している。Nonomuraら、Hinyokika Kiyo 45(8):593〜7(1999)によって、精巣癌特異的遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応を使用して精巣癌の分子的な足場(staging)が記載される。Shimizuら、Int.J.Gynecol.Pathol.19(2):158〜63(2000)によって、上皮卵巣腫瘍におけるこのウィルムス腫瘍遺伝子(WT1)の免疫組織化学的検出が記載される。
【0100】
WT1過剰発現はまた、Barnoud、R.ら、Am.J.Surg.Pathol.24(6):830〜6(2000)およびPathol.Res.Pract.194(10):693〜700(1998)によって、繊維形成性小円形細胞腫瘍において記載されている。神経膠腫および他の癌におけるWT1過剰発現が、Menssen,H.D.ら,J.Cancer Res.Clin.Oncol.126(4):226〜32(2000)”Wilms’ tumor gene(WT1) expression in lung cancer,colon cancer and glioblastoma cell lines compared to freshly isolated tumor specimens”によって、記載されている。WT1過剰発現を示す他の疾患としては、EBV関連疾患(例えば、バーキットリンパ腫および鼻咽腔癌)(Spinsanti P.ら、Leuk.Lymphoma 38(5〜6):611〜9(2000),”Wilms’tumor gene expression by normal and malignant human B hyphocytes”)が挙げられる。
【0101】
Leukemia 14(9):1634〜4(2000)において、Panらは、白血病または脊髄形成異常症候群(myelodysplastic syndrome)を有する患者由来の末梢血単核細胞のインビトロIL−12処置を記載し、そして細胞傷害性の増加およびWT1遺伝子発現における減少を報告した。Leukemia 13(6):891〜900(1999)において、Patmasiriwatらは、脊髄形成異常症候群および急性白血病におけるWT1およびGATA1の発現を報告した。Leukemia 13(3):393〜9(1999)において、Tamakiらは、ウィルムス腫瘍遺伝子WT1が、脊髄形成異常症候群の疾患の進行の診断についての良好なマーカーであることを報告した。固形癌におけるウィルムス腫瘍遺伝子WT1の発現、および腫瘍細胞増殖におけるその改善が、胃癌、結腸癌、肺癌、乳癌の細胞株、生殖細胞の腫瘍細胞株、卵巣癌、子宮癌、甲状腺癌細胞株の細胞、肝臓細胞癌腫の関連において、Ojiら Jpn.J.Cancer Res.90(2):194〜204(1999)で議論されている。
【0102】
本明細書中に提供される組成物は、単独か、あるいは手術、照射、化学療法および/または骨髄移植(自己、同系、同種異系または無関係の)のような従来の治療レジメンと組み合わせて使用され得る。以下により詳細に議論されるように、本明細書中に提供される結合剤およびT細胞は、自己性の幹細胞をパージするために使用され得る。このようなパージング(purging)は、例えば、骨髄移植あるいは血液またはその成分の輸血の前に有益であり得る。本明細書中に提供される結合剤、T細胞、抗原提示細胞(APC)および組成物は、さらに、インビトロおよび/またはインビボで、自己、同系、同種異系または無関係のWT1特異的T細胞を、拡大および刺激(または初回刺激)するために使用され得る。このようなWT1特異的T細胞は、例えば、ドナーリンパ球注入において使用され得る。
【0103】
投与の経路および頻度、ならびに投薬量は、個体間で変化し、そして標準的な技術を使用して容易に確立され得る。一般的に、薬学的組成物およびワクチンは、注射によって(例えば、皮内、筋肉内、静脈内または皮下)か、鼻内(例えば、吸入によって)にか、または経口的に投与され得る。いくつかの腫瘍において、薬学的組成物またはワクチンは、局所的に(例えば、直腸鏡検査(rectocoloscopy)、胃鏡検査、ビデオ内視鏡検査(videoendoscopy)、血管造影または当該分野で公知の他の方法によって)投与され得る。好ましくは、1〜10用量が、52週の期間にわたって投与され得る。好ましくは、6用量が、1ヶ月間隔で投与され、そしてブースターワクチン接種が、その後定期的に与えられ得る。代替的プロトコルは、個々の患者に適切であり得る。適切な用量は、上記のように投与される場合に、基底(すなわち、未処置)レベルより少なくとも10〜50%大きい、抗腫瘍免疫応答を促進し得る化合物の量である。このような応答は、患者における抗腫瘍抗体を測定することによってか、またはインビトロで患者の腫瘍細胞を殺傷し得る細胞溶解性エフェクター細胞のワクチン依存性の生成によってモニターされ得る。このようなワクチンはまた、非ワクチン接種患者と比較した場合に、ワクチン接種した患者において改善された臨床結果(例えば、より頻繁な完全または部分的寛解、あるいはより長い無疾患および/または全体的生存)を導く免疫応答を引き起こし得るべきである。一般的に、1以上のポリペプチドを含む薬学的組成物およびワクチンについて、1用量に存在する各ポリペプチドの量は、約100μg〜5mgの範囲である。適切な用量サイズは、患者のサイズに伴って変化するが、代表的には、約0.1mL〜5mLの範囲である。
【0104】
一般的には、適切な投薬量および治療レジメンは、治療的および/または予防的利点を提供するに十分な量で活性な化合物を提供する。このような応答は、改善された臨床的な結果(例えば、より頻繁な完全または部分的寛解、またはより長く疾患がないこと、および/もしくは全体的な生存)を達成することによって、処置されていない患者と比較して処置された患者においてモニターされ得る。前から存在するWT1に対する免疫応答の増加は、一般的に、改善された臨床的な結果と相関する。このような免疫応答は、一般的に、標準的な増殖、細胞傷害性、またはサイトカインアッセイを使用して評価され得る。これらは、処置の前後に患者から得られたサンプルを使用して実行され得る。
【0105】
さらなる局面において、WT1発現と関連する悪性疾患の発症を阻害するための方法は、上記のように、WT1ポリペプチドまたはWT1発現APCに応答して活性化された自系のT細胞の投与を包含する。このようなT細胞は、CD4+および/またはCD8+であり得、そして上記のように増殖され得る。T細胞は、悪性疾患の発症を阻害するに有効な量で個体に投与され得る。代表的には、約1×109〜1×1011T細胞/M2が、静脈内、腔内、または切除された腫瘍のベッド中で投与される。細胞の数および投与の頻度が患者の応答に依存することは、当業者に明白である。
【0106】
特定の実施形態において、T細胞は、自系の骨髄移植の前に刺激され得る。このような刺激は、インビボまたはインビトロで行われ得る。インビトロの刺激については、患者から得られた骨髄および/または末梢血(または骨髄もしくは末梢血の画分)は、上記のようなT細胞の刺激を可能にするに十分な条件下および時間の間、WT1ポリペプチド、WT1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および/またはWT1ポリペプチドを発現するAPCと接触され得る。次いで、骨髄、末梢血幹細胞、および/またはWT1特異的T細胞は、標準的な技術を使用して患者に投与され得る。
【0107】
関連する実施形態において、関連するドナーまたは関連しないドナーのT細胞は、同系または同種異系の(関連するかまたは関連しない)骨髄移植の前に刺激され得る。このような刺激は、インビボまたはインビトロで行われ得る。インビトロの刺激については、関連するドナーまたは関連しないドナーから得られた骨髄および/または末梢血(または骨髄もしくは末梢血の画分)は、上記のようなT細胞の刺激を可能にするに十分な条件下および時間の間、WT1ポリペプチド、WT1ポリヌクレオチド、および/またはWT1ポリペプチドを発現するAPCと接触され得る。次いで、骨髄、末梢血幹細胞、および/またはWT1特異的T細胞は、標準的な技術を使用して患者に投与され得る。
【0108】
他の実施形態において、本明細書中に記載されるWT1特異的T細胞は、自系の骨髄、末梢血、または骨髄もしくは末梢血の画分(例えば、患者への投与前のCD34+富化末梢血(PB))からWT1を発現する細胞を取り除くために使用され得る。このような方法は、WT1を発現する細胞を、骨髄または末梢血中での骨髄細胞またはリンパ細胞の総数に対して10%未満まで、好ましくは5%未満まで、そしてより好ましくは1%未満までの減少させることを可能にするに十分な条件下で、またはそれを可能にするに十分な時間、骨髄またはPBをそのようなT細胞と接触されることによって実行され得る。このような細胞が取り除かれた程度は、例えば、定性的および定量的PCR分析、形態学、免疫組織化学、およびFACS分析のような標準的な方法によって容易に決定され得る。次いで、骨髄またはPB(またはそれらの画分)は、標準的な技術を使用して、患者に投与され得る。
【0109】
(診断的方法)
本発明はさらに、WT1発現と関連する悪性疾患を検出するための方法、およびそのような疾患のための免疫または治療の有効性をモニタリングするための方法を提供する。このような方法は、WT1タンパク質に特異的な免疫応答がこのような疾患に罹患した患者において検出され得、そしてこのような免疫応答を増強する方法は、予防的または治療的利点を提供し得るという、本発明における発見に基づく。
【0110】
WT1発現に関連する悪性疾患の存在または非存在を決定するために、患者は、WT1に特異的なT細胞のレベルについて試験され得る。特定の方法において、患者から単離されたCD4+および/またはCD8+T細胞を含む生物学的サンプルは、WT1ポリペプチド、WT1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および/またはWT1ポリペプチドを発現するAPCとともにインキュベートされ得、そして本明細書中に記載されるように、T細胞の特異的活性化の存在または非存在が検出される。適切な生物学的サンプルには、単離されたT細胞が含まれるが、これには限定されない。例えば、T細胞は、慣用的な技術によって(例えば、末梢血リンパ球のFicoll/Hypaque密度勾配遠心分離によって)患者から単離され得る。T細胞は、インビトロで、WT1ポリペプチド(例えば、5〜25μg/ml)と37℃で、2〜9日間(代表的には4日間)インキュベートされ得る。コントロールとして機能するために、WT1ポリペプチドの非存在下でT細胞サンプルの別のアリコートをインキュベートさせることが所望され得る。CD4+T細胞については、活性化は、好ましくはT細胞の増殖を評価することによって検出される。CD8+T細胞については、活性化は、好ましくは細胞溶解活性を評価することによって検出される。疾患を有しない患者における、少なくとも2倍多い増殖のレベルおよび/または少なくとも20%多い細胞溶解性活性のレベルは、WT1発現に関連する悪性疾患の存在を示す。増殖のレベルおよび/または細胞溶解性活性と、治療に対する予想された応答との間のさらなる相関は、当該分野で周知の方法を用いて作製され得る。特に、より高い抗体応答、増殖応答、および/または溶解性応答を示す患者は、治療に対するより高い応答を示すことが予測され得る。
【0111】
他の方法において、患者から得られた生物学的サンプルは、WT1に特異的な抗体のレベルについて試験される。生物学的サンプルは、免疫複合体を形成するに十分な条件下および時間の間、WT1ポリペプチド、WT1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および/またはWT1ポリペプチドを発現するAPCとともにインキュベートされる。次いで、WT1ポリペプチドに特異的に結合する生物学的サンプル中でWT1ポリペプチドと抗体との間に形成された免疫複合体が、検出される。このような方法における使用のための生物学的サンプルは、抗体を含むことが予想される患者から得られた任意のサンプルであり得る。適切な生物学的サンプルには、血液、血清、腹水、骨髄、胸水、および脳脊髄液を含む。
【0112】
生物学的サンプルは、WT1ポリペプチドと、WT1に特異的な抗体との間で免疫複合体を形成するに十分な条件下および時間の間、反応混合液中で、WT1ポリペプチドとともにインキュベートされる。例えば、生物学的サンプルおよびWT1ポリペプチドは、4℃で24〜48時間インキュベートされ得る。
【0113】
インキュベーション後、反応混合液は、免疫複合体の存在について試験される。WT1ポリペプチドと、生物学的サンプル中に存在する抗体との間に形成された免疫複合体の検出は、種々の公知の技術(例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)および酵素結合免疫吸着検定法(ELISA))によって達成され得る。適切なアッセイは、当該分野で周知であり、そして科学文献および特許文献に十分に記載される(例えば、HarlowおよびLane、Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。使用され得るアッセイには、以下が含まれるがこれらに限定されない:Davidら(米国特許第4,376,110号)の二重モノクローナル抗体サンドイッチムノアッセイ技術;モノクローナル−ポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ(Wideら、KirkhamおよびHunter編,Radioimmunoassay Mathods,E.and S.Livingstone,Edinburgh,1970);Gordonらの「western blot」法(米国特許第4,452,901号);標識したリガンドの免疫沈降(Brownら、J.Biol.Chem.255:4980−4983,1980);例えば、RainesおよびRoss(J.Biol.Chem.257:5154−5160,1982)によって記載される酵素結合免疫吸着検定法(ELISA);蛍光色素の使用を含む免疫細胞化学技術(Brooksら、Clin,Exp.Immunol.39:477,1980);および活性の中和(Bowen−Popeら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81;2396−2400,1984)。他のイムノアッセイには以下の米国特許に記載されるものが含まれるが、これらに限定されない:米国特許第3,817,827号;同第3,850,752号;同第3,901,654号;同第3,935,074号;同第3,984,533号;同第3,996,345号;同第4,034,074号;および同第4,098,876号。
【0114】
検出目的のために、WT1ポリペプチドは、標識されるか、または標識されないかのいずれかであり得る。標識されないWT1ポリペプチドは、凝集アッセイにおいて、または免疫複合体に結合する標識された検出試薬(例えば、WT1ポリペプチドに特異的に結合する抗体に結合し得る、抗免疫グロブリン、プロテインG、プロテインA、もしくはレクチンおよび二次抗体、またはそれらの抗原結合フラグメント)と組み合わせて使用され得る。WT1ポリペプチドが標識される場合、レポーター基は、当該分野で公知の、任意の適切なレポーター基であり得、これらは、放射性同位元素、蛍光基、発光基、酵素、ビオチン、および色素粒子であり得る。
【0115】
特定のアッセイにおいて、標識していないWT1ポリペプチドは、固体支持体上に固定化される。この固体支持体は、ポリペプチドが結合され得る、当業者にとって公知の任意の物質であり得る。例えば、この固体支持体は、マイクロタイタープレート中の試験ウェルまたはニトロセルロースもしくは他の適切なメンブレンであり得る。あるいは、その支持体は、ビーズまたはディスク(例えば、ガラス、ガラス繊維、ラテックス、または、ポリスチレンもしくはポリビニルクロライドのようなプラスチック材料)であり得る。この支持体はまた、磁気粒子または光ファイバーセンサー(例えば、米国特許第5,359,681号に開示されるもののような)であり得る。ポリペプチドは、特許文献および科学文献に十分に記載される、当業者に公知である種々の技術を用いて、固体支持体上に固定化され得る。本発明の文脈において、用語「固定化」とは、非共有結合的な結合(例えば、吸着)および共有結合的な結合(これは、抗原と支持体上の官能基との間の直接的な連結であり得るか、または架橋剤による連結であり得る)の両方をいう。マイクロタイタープレート中のウェルまたはメンブレンへの吸着による固定化が好ましい。このような場合において、吸着は、適切な緩衝液中で、適切な時間の間、WT1ポリペプチドを固体支持体と接触されることによって達成され得る。接触時間は温度によって変動し得るが、代表的には、約1時間と約1日間との間である。一般的に、プラスチックマイクロタイタープレート(例えば、ポリスチレンまたはポリビニルクロライド)のウェルを、約10ng〜約10μg、および好ましくは約100ng〜約1μgの量の範囲のポリペプチドと接触させることが、適切な量のポリペプチドを固定化するために十分である。
【0116】
固定化後に、支持体上の残存するタンパク質結合部位は、代表的にはブロックされる。当業者に公知である任意の適切なブロッキング剤(例えば、ウシ血清アルブミン、Tween20TM(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、熱不活化正常ヤギ血清(NGS)、またはBLOTTO(脱脂粉乳の緩衝化溶液であり、これはまた、保存剤、塩、および消泡剤も含む))。次いで、その支持体は、特異的な抗体を含むことが疑われる生物学的サンプルとともにインキュベートされる。そのサンプルは、巧みに適用され得るか、または、より頻繁には、それは、通常、少量(重量で0.1%〜5.0%)のタンパク質(例えば、BSA、NGS、またはBLOTTO)を含む緩衝溶液中で希釈され得る。一般的に、適切な接触時間(すなわち、インキュベーション時間)は、そのような抗体を含むサンプル中でWT1を特異的に結合する抗体の存在を検出するに十分である時間の間である。好ましくは、その接触時間は、結合した抗体と結合していない抗体との間の平衡において達成される、少なくとも約95%の結合である結合のレベルを達成するに十分である。当業者は、平衡を達成するに十分な時間が、時間の間にわたって生じる結合のレベルをアッセイすることによって容易に決定され得ることを理解する。室温においては、約30分間のインキュベーション時間が一般的に十分である。
【0117】
次いで、結合していないサンプルは、適切な緩衝液(例えば、0.1% Tween20TMを含むPBS)で固体支持体を洗浄することによって除去され得る。次いで、免疫複合体を結合し、そしてレポーター基を含む検出試薬が添加され得る。その検出試薬は、結合抗体を検出するに十分な時間の間、免疫複合体とともにインキュベートされる。適切な時間の長さは、一般的に、時間の間にわたって生じる結合のレベルをアッセイすることによって決定され得る。次いで、結合していない検出試薬が除去され、そして結合した検出試薬が、レポーター基を用いて検出される。レポーター基を検出するために用いられる方法は、レポーター基の性質に依存する。放射活性基については、シンチレーション計数またはオートラジオグラフィー法が一般に適切である。分光学的な方法は、色素、発光基、および蛍光基を検出するために使用され得る。ビオチンは、異なるレポーター基(一般に、放射活性基もしくは蛍光基、または酵素)に結合されたアビジンを用いて検出され得る。酵素レポーター基(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびグルコースオキシダーゼ)は、一般に、基質の添加(一般に、特定の時間の間)によって検出され得、続いて、反応生成物の分光学的分析または他の分析によって検出され得る。利用される特定の方法に関わらず、バックグラウンド(すなわち、疾患を有しない個体から得られた生物学的サンプルについて観察されたレベル)よりも少なくとも2倍大きい結合した検出試薬のレベルは、WT1発現に関連する悪性疾患の存在を示す。
【0118】
一般的に、免疫または治療の有効性をモニタリングするための方法は、患者におけるWT1に特異的な抗体またはT細胞のレベルの変化をモニタリングする工程を含む。抗体レベルがモニタリングされる方法は、以下の工程を含み得る:(a)患者から得られた第1の生物学的サンプルを、治療および免疫の前に、WT1ポリペプチドとともにインキュベートする工程、ここで、このインキュベーションは、免疫複合体が形成するに十分な条件下および時間の間、行われる;(b)WT1ポリペプチドと、WT1ポリペプチドに特異的に結合する、生物学的サンプル中の抗体との間で形成された免疫複合体を検出する工程;(c)治療または免疫後の患者から取られた第2の生物学的サンプルを用いて、工程(a)および(b)とを反復する工程;ならびに(d)第1および第2の生物学的サンプル中で検出される免疫複合体の数を比較する工程。あるいは、WT1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはWT1ポリペプチドを発現するAPCが、WT1ポリペプチドの代わりに利用され得る。このような方法において、ポリヌクレオチドによってコードされるか、またはAPCによって発現されWT1ポリペプチドと、生物学的サンプル中の抗体との間の免疫複合体が検出される。
【0119】
T細胞活性化および/またはWT1特異的前駆体の数をモニターする方法は、以下の工程を包含し得る:(a)治療または免疫前の患者から得られたCD4+細胞および/またはCD8+細胞を含む第1の生物学的サンプル(例えば、骨髄、末梢血、またはそれらの画分)を、WT1ポリペプチドと共にインキュベートする工程であって、T細胞の特異的な活性化、増殖、および/または溶解を可能にするに十分な条件および時間で、このインキュベーションを実施する、工程;(b)T細胞の活性化、増殖、および/または溶解の量を検出する工程;(c)CD4+ T細胞および/またはCD8+ T細胞を含み、かつ治療または免疫後の同一患者から採取された第2の生物学的サンプルを使用して、工程(a)および工程(b)を繰り返す工程;ならびに(d)第1の生物学的サンプルおよび第2の生物学的サンプルにおける、T細胞の活性化、増殖、および/または溶解の量を比較する工程。あるいは、WT1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはWT1ポリペプチドを発現するAPCを、WT1ポリペプチドの代わりに使用し得る。
【0120】
このような方法における使用のための生物学的サンプルは、抗体、CD4+ T細胞および/またはCD8+T細胞を含むことが予期される患者から得られる任意のサンプルであり得る。適切な生物学的サンプルとしては、血液、血清、腹水、骨髄、胸水、および脳脊髄液が挙げられる。第1の生物学的サンプルは、治療もしくは免疫の開始前に、または治療もしくはワクチン接種レジメンを通した途中(part way)で獲得され得る。第2の生物学的サンプルは、類似の様式であるが、さらなる治療または免疫後の時点で獲得されるべきである。第2の生物学的サンプルは、第1の生物学的サンプルの単離と第2の生物学的サンプルの単離との間に、治療または免疫の少なくとも一部が行われるという条件で、治療もしくは免疫の完了時またはその途中で獲得され得る。
【0121】
両方のサンプルについてのインキュベーション工程および検出工程を、一般に、上記のように実施し得る。第1のサンプルに対する第2のサンプルにおける免疫複合体の数の統計的に有意な増加は、首尾よい治療または免疫を反映する。
【0122】
以下の実施例は例示のために提供され、制限のためではない。
【0123】
(実施例)
(実施例1)
(血液学的悪性疾患を有する患者における、WT1に対する免疫応答の同定)
本実施例は、血液学的悪性疾患を有する患者において存在する免疫応答の同定を例証する。
【0124】
患者において予め存在するWT1特異的抗体応答を評価するため、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)および重篤な再生不良性貧血を有する患者の血清を、ウェスタンブロット分析を用いて分析した。ヒト白血病性細胞株K562(American Type Culture Collection、Manassas、VA)由来のWT1を免疫沈降する能力について、血清を試験した。各々の場合において、免疫沈降物をゲル電気泳動により分離し、メンブレンに転写し、そして抗WT1抗体であるWT180(Santa Cruz Biotechnology,Inc.、Santa Cruz、CA)でプローブした。このウェスタンブロット分析は、血液学的悪性疾患を有する患者において強力なWT1特異的抗体を同定した。AMLを有する患者についての結果を示す代表的なウェスタンブロットを、図2に示す。この患者の血清を使用して生成された免疫沈降物中の52kDタンパク質を、WT1特異的抗体により認識した。52kDタンパク質は、陽性コントロールと同じサイズに移動した。
【0125】
さらなる研究によって、全長WTタンパク質および切断されたWTタンパク質に対する抗体の存在について、AMLおよびCMLを有する患者の血清を分析した。ヒトWT1/全長(1〜449アミノ酸)、N末端(1〜249アミノ酸)(WT1/N末端)およびC末端(267〜449アミノ酸)(WT1/C末端)領域を表現するcDNA構築物を、改変されたpET28ベクターへとサブクローニングした。このWT1/全長タンパク質およびWT1/N末端タンパク質を、Ra12融合タンパク質として発現した。Ra12は、分泌されたヒト結核菌タンパク質(MTB32Bとして示される)のC末端フラグメントである(Skeikyら、Infect Immun.67;3998、1999)。Ra12−WT1/全長融合領域を、ヒスチジンタグにより改変されたpET28におけるヒスチジンタグの3’側にクローニングした。WT1/N末端領域を、その後にチオレドキシン(TRX)−WT1/N末端融合領域が続きさらに3’ヒスチジンタグが後に続く5’ヒスチジンタグを有する改変されたpET28ベクターへとサブクローニングした。WT1/C末端コーディング領域を、融合パートナーを有さず、5’ヒスチジンタグおよび3’ヒスチジンタグのみを含有し、その後にトロンビンおよびEK部位が続く、改変されたpET28ベクターへとサブクローニングした。
【0126】
BL21 pLysS E.coli(Stratagene、La Jolla、CA)を、3つのWT1発現構築物を用いて形質転換し、一晩生育し、そしてイソプロピル−β−D−チオガラクトシダーゼ(IPTG)を用いて誘導した。WT1タンパク質を、以下のように精製した:細胞を、10mM Tris(pH 8.0)中で、37℃でComplete Protease Inhibitor Tablet(Boehringer Mannheim Biochemicals、Indianapolis、IN)を用いたインキュベーションおよびその後の繰り返しの音波破砕によって収集および溶解した。封入体を、10mM Tris(pH8.0)を用いて2回洗浄した。次いでタンパク質を、ニッケルニトリロトリ酢酸樹脂をわたる(QIAGEN Inc.、Valencia、CA;Hochuliら、Biologically Active Molecules:217、1989)金属キレート親和性クロマトグラフィーニッケルニトリロトリ酢酸樹脂およびその後のSource Qアニオン交換樹脂(Amersham Pharmacia Biotech、Upsala、Sweden)でのクロマトグラフィーによって精製した。WT1タンパク質の同一を、N末端シークエンスによって確認した。
【0127】
デノボ(de nova)AMLまたはCMLを有する成人患者からの血清を、WT1特異的抗体の存在について試験した。組換えタンパク質を、TCマイクロウェルプレート(Nunc、Roskilde、Denmark)に吸着させた。プレートを、PBS/0.5%Tween 20を用いて洗浄し、そして1%BSA/PBS/0.1%Tween 20を用いてブロックした。洗浄後、血清希釈溶液を、添加し、そして4℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄し、そしてDonkey抗ヒトIgG−HRP第2抗体を添加し(Jackson−Immunochem、West Grave、PA)、そして室温にて2時間インキュベートした。プレートを洗浄し、TMBペルオキシダーゼ基質溶液(Kirkegaard and Perry Laboratories、MA)を用いてインキュベートし、1N H2SO4を用いて停止し、そして直ちに計測した(Cyto−Fluor 2350;Millipore、Bedfold、MA)。
【0128】
血清学的調査に関して、ヒト血清を、ELISAによって血清希釈液の1:50〜1:20,000の範囲にわたって試験した。正常なドナーからの血清(n=96)の規定の平均OD値を標準偏差の3倍分(WT1/全長、WT1C末端)超える血清の1:500希釈のOD値として、陽性反応を規定した。正常なドナーにおけるWT1/N末端タンパク質に対するより高いバックグラウンドに起因して、WT1/N末端に対する陽性反応を、正常なドナーからの血清の規定のOD値を標準偏差の4倍分超える血清の1:500希釈のOD値として規定した。患者のAb応答が、WTに対して指向され、かつ、このタンパク質の、Ra12またはTRX融合部分あるいは可能性なるE.coliの夾雑タンパク質に対して指向しないことを確認するために、コントロールは、類似の方法で精製したRa12およびTRXのみを含んだ。Ra12タンパク質および/またはTRXタンパク質に対する反応性を示す試料を、この分析から排除した。
【0129】
WT1に対する免疫性の存在について評価するために、正常な個体および白血病を有する患者の血清中の全長WT1組換えタンパク質および切断されたWT1組換えタンパク質に対する抗体を決定した。抗体反応を、WT1/全長タンパク質、WT1/N末端タンパク質およびWT1/C末端タンパク質に対するELISA反応性によって分析した。
【0130】
96人の正常なドナーのうち2人のみが、WT1/全長タンパク質に反応性の血清抗体を有していた(図18)。これらの個体のうち1人は、WT1/N末端タンパク質に対する抗体を有し、1人は、WT1/C末端タンパク質に対する抗体を有していた。対照的に、63人のAMLを有する患者のうち16人(25%)は、血清抗体WT1/全長タンパク質に対して反応性の血清抗体を有していた。著しく対照的に、63人の患者のうち2人(3%)のみが、WT1/C末端タンパク質に対する反応性を有していた。81人のCMLを有する患者のうち15人(19%)は、WT1/全長タンパク質に反応性の血清抗体を有し、そして81人の患者のうち12人(15%)は、WT1/N末端に反応性の血清抗体を有していた。81人の患者のうち3人のみ(3%)が、WT1/C末端タンパク質に対する反応性を有していた(図16および図17)。
【0131】
これらのデータは、WT1に対する抗体応答が、AMLを有するある患者およびCMLを有する幾人かの患者において検出可能であることを示す。白血病を有する患者における抗体のより高い発生率は、WT1タンパク質に対する免疫が、患者がWT1を発現するか、またはある場合にはWT1を発現した悪性疾患の結果として、生じたことの強力な証拠を提供する。WT1に対する観察された抗体応答がおそらく、患者が彼ら自身の白血病細胞上のWT1に対して免疫性となった結果生じ、そしてこの応答が、WT1が「自分自身の」タンパク質であるにも関らず、WT1が抗原であり得ることの直接的な証拠を提供することが、特定の説に限定されること無く、考えられる。
【0132】
WT1に対する抗体の存在は、ある患者において、同時発生するヘルパーT細胞応答もまた存在することを強く意味する。WT1は、内在性タンパク質である。従って、CTL応答は、白血病治療に関して最も効果的であり、かつ免疫の最も毒性の武器である傾向にある。従って、これらのデータは、WT1に対する治療的なワクチンが、WT1に対する免疫応答を誘発し得ることの証拠を提供する。
【0133】
患者の少数の部分群のみがC末端に対する弱い抗体応答を示した一方で、検出された抗体の多数は、N末端中のエピトープに反応性であった。これは、C末端由来の試験されたペプチドは、抗体応答も、T細胞応答も誘発さないが、N末端より誘導されたペプチドに対する免疫は、抗体応答、ヘルパーT細胞応答およびCTL応答を誘発する、という動物モデルにおける観察と一致する(Gaigerら、Blood 96:1334、2000)。
【0134】
(実施例2)
(WT1発現細胞株で免疫されたマウスにおけるWT1に対する抗体の誘導)
この実施例は、インビボでのWT1特異的抗体応答を誘導するための細胞発現WT1の使用を例示する。
【0135】
白血病を有する患者におけるWT1に対する、存在する抗体の検出は、WT1に対する免疫性を誘発するためにWT1タンパク質に対する免疫し得ることを強く意味する。WT1に対する免疫性がワクチン接種によって生じたか否かを試験するために、マウスに、TRAMP−C(B6起源のWT1陽性腫瘍細胞株)を注入した。すなわち、雄性B6マウスを、皮下に5×106のTRAMP−C細胞を用いて免疫し、そして3週間の間隔で5×106の細胞を2回追加免疫した。最後の免疫の3週間後、血清を得、そして脾臓の単独の細胞懸濁液を、25μMのβ−2−メルカプトエタノール、200U/mlのペニシリン、10mM のL−グルタミン酸、および10%の仔ウシ血清を有するRPMI 1640培地(GIBCO)中に調製した。
【0136】
TRAMP−Cに対する免疫後、免疫化された動物におけるWT1特異的抗体応答は、検出可能であった。代表的なウエスタンブロットを、図3中に示す。これらの結果は、WT1タンパク質に対する免疫化が、WT1タンパク質に対する免疫応答を誘発し得ることを示す。
【0137】
(実施例3)
(WT1ペプチドで免疫したマウスにおけるThおよび抗体応答の誘導)
本実施例は、WT1に特異的な免疫応答を誘発するための、WT1ペプチドでの免疫の能力を例示する。
【0138】
Abおよび増殖性T細胞応答を誘発するために適切なペプチドを、Th応答を誘発する能力を有するペプチドモチーフについて検索するTsitesプログラム(RothbardおよびTaylor、EMBO J.7:93−100、1988;Deavinら、Mol.Immunol.33:145−155、1996)に従って同定した。表Iに示されるペプチドを、合成および配列決定した。
【0139】
(表I)
(WT1ペプチド)
【0140】
【表1】
免疫のために、ペプチドを以下のようにグループ分けした:
群A:p6−22ヒト:1ml中に10.9mg(10μl=100μg)
p117−139ヒト/マウス:1ml中に7.6mg(14μl=100μg)
p244−262ヒト:1ml中に4.6mg(22μl=100μg)
群B:p287−301ヒト/マウス:1ml中に7.2mg(14μl=100μg)
マウスp299−313;1ml中に6.6mg(15μl=100μg)
p421−435ヒト/マウス:1ml中に3.3mg(30μl=100μg)
コントロール:(FBLペプチド 100μg)+CFA/IFA
コントロール:(CD45ペプチド 100μg)+CFA/IFA。
【0141】
群Aは、WT1のアミノ末端部分内に存在するペプチド(エキソン1)を含んだ。そして群Bは、他のDNA結合タンパク質に対する配列相同性を有する4つのジンクフィンガー領域を含むカルボキシ末端内に存在するペプチドを含んだ。群Bの中で、p287−301およびp299−313は、エキソン7(ジンクフィンガー1)由来であり、そしてp421−435は、エキソン10(ジンクフィンガーIV)由来であった。
【0142】
B6マウスを、WT1ペプチドの群またはコントロールペプチドで免疫した。ペプチドを、注射のために1mlの滅菌水中に溶解し、そしてB6マウスを3週間の間隔で3回免疫した。使用したアジュバントは、CFA/IFA、GM−CSF、およびMontinideであった。次いで、WT1に特異的な抗体の存在を、実施例1および2に記載のように決定し、そして増殖性T細胞応答を、標準的なチミジン取りこみアッセイを使用して評価した。このアッセイでは、細胞を抗原の存在下で培養し、そして取りこまれた放射能を測定することにより、増殖を評価した(Chenら、Cancer Res.54:1065−1070、1994)。詳細には、リンパ球を、1ウェルあたり2×105細胞にて96ウェルプレート中で培養し、このウェルは4×105の照射した(3000ラド)同系脾臓細胞および明示されたペプチドを有した。
【0143】
群Aとして明示されたペプチドの群によるマウスの免疫は、WT1に対する抗体応答を誘発した(図4)。ワクチンBに対する免疫後に全く抗体は検出されず、これはワクチンBでの免疫からのヘルパーT細胞応答の欠如と一致する。P117−139は、増殖性T細胞応答を誘発した(図5A〜5C)。刺激指数(SI)は、8と72との間を変動した。他のペプチド(P6−22およびP299−313)もまた、増殖性T細胞応答を誘発することが示された。P6−22での免疫は2.3の刺激指数(SI)を生じ、そしてP299−313での免疫は3.3のSIを生じた。陽性コントロールは、ConA刺激したT細胞、ならびに既知の抗原(例えば、CD45およびFBL)で刺激したT細胞、および同種異系T細胞株(DeBruijnら、Eur.J.Immunol.21:2963−2970、1991)を含んだ。
【0144】
図6Aおよび6Bは、ワクチンA(図6A)およびワクチンB(図6B)において各3つのペプチドについて観察された増殖性応答を示す。ワクチンAは、3と8との間(バルク線)を変動する刺激指数(SI)で、免疫ペプチドp6−22およびp117−139に対する増殖性T細胞応答を誘発した。p244−262に対する増殖応答は検出されなかった(図6A)。
【0145】
引き続くインビトロ刺激を、p6−22およびp117−139のみを使用する単一ペプチド刺激として実施した。p117−139でのワクチンA特異的T細胞株の刺激は、p6−22に対する応答を伴わずに、p117−139に対する増殖を生じた(図7A)。この株由来のクローンは、p117−139に特異的であった(図7B)。対照的に、p6−22でのワクチンA特異的T細胞株の刺激は、p117−139に対する応答を伴わずに、p6−22に対する増殖を生じた(図7C)。この株由来のクローンは、p6−22に特異的であった(図7D)。
【0146】
これらの結果は、WT1ペプチドでのワクチン接種が、WT1タンパク質に対する抗体応答および免疫ペプチドに対する増殖性T細胞応答を誘発し得ることを示す。
【0147】
(実施例4:WT1ペプチドで免疫したマウスにおけるCTL応答の誘導)
本実施例は、WT1ペプチドのCTL免疫を誘発する能力を例示する。
【0148】
クラスI MHCへの結合に適切なモチーフを有するペプチド(9マー)を、BIMAS HLAペプチド結合予測分析(Parkerら、J.Immunol.152:163,1994)を用いて同定した。このような分析で同定したペプチドを、表II〜XLIVに示す。これらの表の各々において、スコアは、示したMHC分子に対するペプチドの理論的結合親和性(解離の半減期)を反映する。
【0149】
Th応答を誘発する能力を有するペプチドモチーフを検索する、Tsitesプログラム(RothbardおよびTaylor,EMBO J. 7:93−100,1988;Deavinら、Mol.Immunol.33:145−155,1996)を用いて同定したペプチドを、図8Aおよび8B、ならびに表XLVにさらに示す。
【0150】
(表II:ヒトHLA A1に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0151】
【表2】
(表III:ヒトHLA A 0201に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0152】
【表3】
(表IV:ヒトHLA A 0205に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0153】
【表4】
(表V:ヒトHLA A24に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0154】
【表5】
(表VI:ヒトHLA A3に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0155】
【表6】
(表VII:ヒトHLA A68.1に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0156】
【表7】
(表VIII:ヒトHLA A 1101に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0157】
【表8】
(表IX:ヒトHLA A 3101に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0158】
【表9】
(表X:ヒトHLA A 3302に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0159】
【表10】
(表XI:ヒトHLA B14に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0160】
【表11】
(表XII:ヒトHLA B40に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0161】
【表12】
(表XIII:ヒトHLA B60に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0162】
【表13】
(表XIV:ヒトHLA B61に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0163】
【表14】
(表XV:ヒトHLA B62に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0164】
【表15】
(表XVI:ヒトHLA B7に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0165】
【表16】
(表XVII:ヒトHLA B8に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0166】
【表17】
(表XVIII:ヒトHLA B 2702に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0167】
【表18】
(表XIX:ヒトHLA B 2705に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0168】
【表19】
(表XX:ヒトHLA B 3501に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0169】
【表20】
(表XXI:ヒトHLA B 3701に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0170】
【表21】
(表XXII:ヒトHLA B 3801に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0171】
【表22】
(表XXIII:ヒトHLA B 3901に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0172】
【表23】
(表XXIV:ヒトHLA B 3902に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0173】
【表24】
(表XXV:ヒトHLA B 4403に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0174】
【表25】
(表XXVI:ヒトHLA B 5101に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0175】
【表26】
(表XXVII:ヒトHLA B 5102に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0176】
【表27】
(表XXVIII:ヒトHLA B 5201に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0177】
【表28】
(表XXIX:ヒトHLA B 5801に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0178】
【表29】
(表XXX:ヒトHLA CW0301に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0179】
【表30】
(表XXXI:ヒトHLA CW0401に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0180】
【表31】
(表XXXII:ヒトHLA CW0602に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0181】
【表32】
(表XXXIII:ヒトHLA CW0702に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0182】
【表33】
(表XXXIV:マウスMHC クラスI Dbに対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0183】
【表34】
(表XXXV:マウスMHC クラスI Ddに対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0184】
【表35】
(表XXXVI:マウスMHC クラスI Kbに対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0185】
【表36】
(表XXXVII:マウスMHC クラスI Kdに対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0186】
【表37】
(表XXXVIII:マウスMHC クラスI Kkに対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0187】
【表38】
(表XXXIX:マウスMHC クラスI Ldに対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0188】
【表39】
(表XL:ウシHLA A20に対するヒトWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0189】
【表40】
(表XLI:マウスMHC クラスI A 0201に対するマウスWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0190】
【表41】
(表XLII:マウスMHC クラスI Dbに対するマウスWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0191】
【表42】
(表XLIII:マウスMHC クラスI Kbに対するマウスWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0192】
【表43】
(表XLIV:マウスMHC クラスI Kdに対するマウスWT1ペプチドの結合についての、BIMAS HLAペプチド結合予測分析の結果)
【0193】
【表44】
(表XLV:ヘルパーT細胞応答を誘発し得るヒトWT1ペプチドについての、TSITESペプチド結合予測分析の結果)
【0194】
【表45】
特定のCTLペプチド(表XLVIに示す)を、さらなる研究のために選択した。表XLVI中に各ペプチドについて、BIMAS HLAペプチド結合予測分析を用いて得られたスコアを、提供する。
【0195】
(表XLVI:WT1ペプチド配列およびHLAペプチド結合予測)
【0196】
【表46】
C57B1/6マウスMHCに結合するペプチドを、Ljunggrenら、Nature 346:476−480,1990に記載されるように、白血病細胞株RMA−Sを用いて確認した。簡単には、RMA−S細胞を、1%FCSを補充した完全培地中で26℃にて7時間培養した。合計106のRMA−S細胞を、24ウェルプレートの各ウェルに添加し、そして単独か、または指定したペプチド(25μg/ml)と共にのいずれかで26℃にて16時間インキュベートし、そして完全培地中で37℃にてさらに3時間インキュベートした。次いで、細胞を3度洗浄し、そしてフルオレセインイソチオシアネート結合体化抗Db抗体または抗Kb抗体(PharMingen,San Diego,CA)で染色した。標識した細胞を2度洗浄し、再懸濁し、そして1%パラホルムアルデヒドを有する500μlのPBS中で固定し、そしてフローサイトメーター(Becton−Dickinson FACSCalibur(登録商標))において蛍光強度について分析した。RMA−S細胞の表面上でのDbまたはKb分子の増加の割合を、培地単独でインキュベートした細胞の蛍光強度と比較した、ペプチドと共にインキュベートした細胞の平均蛍光強度の増加により測定した。
【0197】
マウスをマウスクラスI MHCに結合し得るペプチドで免疫した。免疫の後、脾臓細胞をインビトロで刺激し、そしてWT1ペプチドと共にインキュベートした標的を溶解する能力について試験した。CTLを、標準的なクロム放出アッセイ(Chenら、Cancer Res.54:1065−1070,1994)で評価した。106の標的細胞を37℃にて150μCiのナトリウム51Crと共に90分間、特定のペプチドの存在下または非存在下でインキュベートした。細胞を3回洗浄し、そして5%ウシ胎仔血清を有するRPMI中に再懸濁した。このアッセイのために、104の51Cr標識化標的細胞を、U底96ウェルプレートにおいて200μlの最終容量で異なる濃度のエフェクター細胞と共にインキュベートした。上清を、37℃にて4〜7時間後に取り除き、そして特異的溶解の%を、以下の式により決定した:
比溶解の割合=100×(実験の放出−自発的放出)/(最大の放出−自発的放出)。
【0198】
表XLVIIに示される結果は、いくつかのWT1ペプチドが、CTLを生成するために不可欠であるクラスI MHC分子に結合し得ることを示す。さらに、このペプチドのいくつかは、クロム放出アッセイを用いて決定されるように、ペプチド特異的CTL(図9Aおよび9B)を誘発し得た。CTLペプチドである、p10−18ヒト、p136−144ヒト、p136−144マウスおよびp235−243に対する免疫の後、ペプチド特異的CTL株を産生し、そしてクローンを樹立した。これらの結果は、ペプチド特異的CTLがWT1を発現する悪性細胞を死滅させ得ることを示す。
【0199】
(表XLVII:マウスB6クラスI抗原に対するWT1 CTLペプチドの結合)
【0200】
【表47】
(実施例5:マウスにおいてWT1特異的CTLを誘発するためのWT1ポリペプチドの使用)
本実施例は、WT1陽性腫瘍細胞株を死滅させ得るCTL免疫を誘発するための、代表的なWT1ポリペプチドの能力を例示する。
【0201】
クラスI MHCおよびクラスII MHCへの結合に適切なモチーフを有するペプチドである、p117−139を、TSITESおよびBIMAS HLAペプチド結合予測分析を用いて上記のように同定した。マウスを、実施例3に記載されるように免疫した。免疫の後、脾臓細胞をインビトロで刺激し、そしてWT1ペプチド、ならびにWT1陽性腫瘍細胞および陰性腫瘍細胞と共にインキュベートした標的を溶解する能力について試験した。CTLを、標準的なクロム放出アッセイで評価した。図10A〜10Dに示されるこの結果は、P117が、WT1陽性腫瘍細胞を死滅させ得るWT1特異的CTLを誘発し得るが、WT1陰性細胞の死滅は観察されなかったことを示す。これらの結果は、ペプチド特異的CTLが、実際にWT1を発現する悪性細胞を死滅させること、およびワクチンおよびT細胞治療が、WT1を発現する悪性腫瘍に対して有効であることを実証する。
【0202】
類似の免疫を、9マーのクラスI MHC結合ペプチドである、p136−144、p225−233、p235−243、ならびに23マーペプチドである、p117−139を用いて行った。免疫の後、脾臓細胞をインビトロで4つのペプチドの各々を用いて刺激し、そしてWT1ペプチドと共にインキュベートした標的を溶解する能力について試験した。CTLは、p136−144、p235−243、およびp117−139に特異的に生成されたが、p225−233については生成されなかった。p235−243およびp117−139についてのCTLデータを、図11Aおよび図11Bに示す。ペプチドp136−144およびp225−233についてのデータは示さない。
【0203】
CTL溶解は、標的WT1ペプチドが、腫瘍細胞クラスI MHC分子に関連して、内因的にプロセシングおよび提示されることを要求する。上記のWT1ペプチド特異的CTLを、WT1陰性腫瘍細胞株と対比してWT1陽性腫瘍細胞株を溶解する能力について試験した。p235−243に特異的なCTLは、p235−243ペプチドともにインキュベートした標的を溶解したが、WT1タンパク質を発現した細胞株を溶解することに失敗した(図11A)。著しく対照的に、p117−139に特異的なCTLは、p117−139ペプチドと共にインキュベートした標的を溶解し、そしてWT1を発現する悪性細胞もまた溶解した(図11B)。陰性コントロールとして、p117−139に特異的なCTLは、WT1陰性EL−4(本明細書中でE10ともいわれる)を溶解しなかった。
【0204】
WT1特異的溶解の特異性を、非放射性標的阻害によって確認した(図12A〜12B)。エフェクター細胞を、種々のエフェクター:標的比で、96ウェルU底プレートにプレートした。10倍過剰(放射性標的と比べて)の51Cr標識を有さない示されたペプチドをコートした標的を、添加した。最終的に、1ウェルあたり104の51Cr標識化標的細胞を添加し、そしてプレートを37℃にて4時間インキュベートした。1ウェルあたりの総容量は、200μlであった。
【0205】
p117−139特異的CTLによるTRAMP−Cの溶解を、関連性のあるペプチドp117−139と共にインキュベートしたEL−4によって、58%〜36%をブロックしたが、無関係なペプチドと共にインキュベートしたEL−4ではブロックしなかった(図12A)。同様に、BLK−SV40の溶解は、関連性のあるペプチドp117−139と共にインキュベートしたEL−4によって、18%〜0%をブロックした(図12B)。結果は、WT1ペプチド特異的CTLが、プロセスしたWT1の認識により、悪性の細胞を特異的に死滅させることを確認する。
【0206】
推定のCTLモチーフを有するいくつかのセグメントは、p117−139内に含まれる。CTLエピトープの正確な配列を決定するために、p117−139内の全ての潜在的な9マーペプチドを合成した(表XLVIII)。これらのペプチドの2つ(p126−134およびp130−138)は、H−2bクラスI分子に結合することを示した(表XLVIII)。p117−139での免疫により生成したCTLは、p126−134およびp130−138と共にインキュベートした標的を溶解したが、p117−139内の他の9マーペプチドでは溶解しなかった(図13A)。
【0207】
p117−139特異的CTL株を、p126−134またはp130−138のいずれかで再刺激した。p126−134またはp130−138で再刺激した後、両方のT細胞株は、ペプチド比溶解を実証したが、p130−138特異的CTLのみが、WT1陽性腫瘍細胞株の溶解を示した(図13Bおよび13C)。従って、p130−138は、天然でプロセスされるエピトープであるように思われる。
【0208】
(表XLVIII:p117−139内のWT1 CTL 9マーペプチドのマウスB6クラスI抗原に対する結合)
【0209】
【表48】
(実施例6:マウス腫瘍細胞株におけるWT1特異的mRNAの同定)
本実施例は、細胞および細胞株においてWT1特異的mRNAを検出するための、RT−PCRの使用を例示する。
【0210】
単核細胞を、密度勾配遠心分離により単離し、そして直ちに凍結し、そしてWT1特異的mRNAの存在についてRT−PCRにより分析するまで、−80℃で保存した。RT−PCRを、一般に、Fraizerら、Blood 86:4704−4706,1995に記載されるように行った。総RNAを、標準的な手順に従って107の細胞から抽出した。RNAペレットを、25μLジエチルピロカルボネート処理した水に再懸濁し、そして逆転写に直接用いた。ジンクフィンガー領域(エキソン7〜10)を、330bpのマウスcDNAとしてPCRにより増幅した。増幅を、サーマルサイクラーにおいて、PCRの1回、または、必要な場合、連続した2回の間、行った。50μlの総反応容量において、AmpliTaq DNA Polymerase(Perkin Elmer Cetus,Norwalk,CT)、2.5mM MgCl2、および20pmolの各プライマーを用いた。PCR産物の20μLのアリコートを、臭化エチジウムで染色した2%アガロースゲル上で電気泳動した。このゲルを、Polaroidフィルム(Polaroid 667,Polaroid Ltd.Hertfordshire,England)で写真撮影した。KwokおよびHiguchi、Nature 339:237−238,1989の推奨に従って、相互汚染に対する予防策を取った。陰性コントロールは、各実験において、cDNAの代わりに水を含有するcDNA試薬およびPCR試薬混合物を含んだ。偽陰性を避けるために、インタクトなRNAおよび適切なcDNA産生の存在を、各サンプルについて、β−アクチンプライマーを用いるコントロールPCRによって評価した。これらのプライマーで増幅されなかったサンプルを、分析から除いた。
【0211】
マウス細胞株における、WT1の増幅のためのプライマーは、以下であった:P115:1458−1478:5’ CCC AGG CTG CAA TAA GAG ATA 3’(順方向プライマー;配列番号21);およびP116:1767−1787:5’ ATG TTG TGA TGG CGG ACC AAT 3’(逆方向プライマー;配列番号22)(Inoueら、Blood 88:2267−2278,1996;Fraizerら、Blood 86:4704−4706,1995を参照のこと)。
【0212】
コントロール反応に用いたβアクチンプライマーは、以下であった:5’ GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA 3’(センスプライマー;配列番号23);および5’ GTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC 3’(アンチセンスプライマー;配列番号24)。
【0213】
ヒトWT1を増幅するのに使用するためのプライマーは、以下を含む:P117:954−974:5’ GGC ATC TGA GAC CAG TGA GAA 3’(配列番号25);およびP118:1434−1414:5’ GAG AGT CAG ACT TGA AAG CAGT 3’(配列番号5)。ネスティッド(nested)RT−PCRについて、プライマーは、以下であり得る:P119:1023−1043:5’ GCT GTC CCA CTT ACA GAT GCA 3’(配列番号26);およびP120:1345−1365:5’ TCA AAG CGC CAG CTG GAG TTT 3’(配列番号27)。
【0214】
表XLVIIIは、マウス腫瘍細胞株のWT1 PCR分析の結果を示す。表IVにおいて、(+++)は、RT−PCRの第1工程における、強いWT1 PCR増幅産物を示し、(++)は、WT1 RT−PCRの第1工程により検出可能であるWT1増幅産物を示し、(+)は、WT1 RT PCRの第2工程においてのみ検出可能である、産物を示し、そして(−)は、WT1 PCR陰性を示す。
【0215】
(表XLIX:マウス腫瘍細胞株におけるWT1 mRNAの検出)
【0216】
【表49】
(実施例7)
(E.coliにおけるWT1 TRX融合構築物の発現)
短縮された、WT1のオープンリーディングフレーム(WT1B)を、以下のプライマーを用いてPCR増幅した:
アミノ酸2から始まる順方向プライマー
【0217】
【化1】
終止コドンの後にEcoRI部位を作製する逆方向プライマー
【0218】
【化2】
このPCRは、以下の条件下で実施した:
10μl 10× Pfu緩衝液
1μl 10mM dNTP
2μl 10μM 各オリゴ
83μl 滅菌水
1.5μl Pfu DNA ポリメラーゼ(Stratagene、La Jolla、CA)
50ng DNA(pPDM FL WT1)
96℃2分
96℃20秒 63℃15秒 72℃3分×40サイクル
72℃4分
このPCR産物をEcoRI制限酵素を用いて消化し、ゲル精製し、次いでpTrx 2Hベクター(N末端上のTrx融合およびTrx融合周辺の2つのHisタグによって改変されたpET28ベクター。Trx融合の後にトロンビンおよびエンテロキナーゼについてのプロテーアーゼ開裂部位が存在する)にクローニングした。このpTrx2H構築物を、StuI制限酵素およびEcoRI制限酵素を用いて消化した。正しい構築物を、DNA配列分析によって確認し、次いでBL21(DE3)pLysSおよびBL21(DE3)CodonPlus発現宿主細胞に形質転換した。
【0219】
(実施例8)
(E.coliにおけるWT1 A Hisタグ融合構築物の発現)
WT1のN末端オープンリーディングフレーム(WT1A)を、以下のプライマーを用いてPCR増幅した:
アミノ酸2から始まる順方向プライマー
【0220】
【化3】
アミノ酸249の後に配置された人工的終止コドンの後にEcoRI部位を作製する逆方向プライマー
【0221】
【化4】
このPCRは、以下の条件下で実施した:
10μl 10× Pfu緩衝液
1μl 10mM dNTP
2μl 10μM 各オリゴ
83μl 滅菌水
1.5μl Pfu DNA ポリメラーゼ(Stratagene、La Jolla、CA)
50ng DNA(pPDM FL WT1)
96℃2分
96℃20秒 63℃15秒 72℃1分20秒×40サイクル
72℃4分。
【0222】
このPCR産物を、EcoRI制限酵素を用いて消化し、ゲル精製し、次いでEco72IおよびEcoRI制限酵素を用いて消化されている、pPDM(インフレームでHisタグを有する改変されたpET28ベクター)へとクローニングした。このPCR産物をまた、pTrx 2Hベクターにも形質転換した。このpTrx2H構築物を、StuI制限酵素およびEcoRI制限酵素を用いて消化した。正しい構築物を、DNA配列分析によって確認し、次いでBL21(DE3)pLys SおよびBL21(DE3)CodonPlus発現宿主細胞へと形質転換した。
【0223】
(実施例9)
(E.coliにおけるWT1 B Hisタグ融合構築物の発現)
WT1の切断されたオープンリーディングフレーム(WT1A)を、以下のプライマーを用いてPCR増幅した:
アミノ酸250から始まる順方向プライマー
【0224】
【化5】
終止コドンの後にEcoRI部位を作製する逆方向プライマー
【0225】
【化6】
このPCRは、以下の条件下で実施した:
10μl 10× Pfu緩衝液
1μl 10mM dNTP
2μl 10μM 各オリゴ
83μl 滅菌水
1.5μl Pfu DNA ポリメラーゼ(Stratagene、La Jolla、CA)
50ng DNA(pPDM FL WT1)
96℃2分
96℃20秒 63℃15秒 72℃1分30秒×40サイクル
72℃4分。
【0226】
このPCR産物を、EcoRI制限酵素を用いて消化し、ゲル精製し、次いでEco72IおよびEcoRI制限酵素を用いて消化されている、pPDM(インフレームでHisタグを有する改変されたpET28ベクター)へとクローニングした。このPCR産物をまた、pTrx 2Hベクターにも形質転換した。このpTrx 2H構築物を、StuIおよびEcoRI制限酵素を用いて消化した。正しい構築物を、DNA配列分析によって確認し、次いでBL21(DE3)pLys SおよびBL21(DE3)CodonPlus発現宿主細胞へと形質転換した。
【0227】
実施例7〜9について、以下の配列番号を開示する:
配列番号327は、Trx_WT1_Bについて決定したcDNA配列である。
配列番号328は、Trx_WT1_Aについて決定したcDNA配列である。
配列番号329は、Trx_WT1について決定したcDNA配列である。
配列番号330は、WT1_Aについて決定したcDNA配列である。
配列番号331は、WT1_Bについて決定したcDNA配列である。
配列番号332は、配列番号327によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
配列番号333は、配列番号328によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
配列番号334は、配列番号329によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
配列番号335は、配列番号330によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
配列番号336は、配列番号331によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
【0228】
(実施例10)
(E.coliにおいて発現されたWT1の切断された形態)
WT1の3つのリーディングフレームを、以下のプライマーを用いたPCRによって増幅した:
【0229】
【化7】
。
【0230】
このPCRは、以下の条件下で実施した:
10μl 10× Pfu緩衝液
1μl 10mM dNTP
2μl 10μM 各オリゴ
83μL 滅菌水
1.5μl Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene、La Jolla、CA)
50ng DNA(pPDM FL WT1)
96℃2分
96℃20秒 63℃15秒 72℃30秒×40サイクル
72℃4分。
【0231】
このPCR産物を、EcoRI制限酵素を用いて消化し、ゲル精製し、次いでEco72I制限酵素およびEcoRI制限酵素を用いて消化されているpPDM His(インフレームで5’末端にて、Hisタグで改変されたpET28ベクター)へとクローニングした。この構築物が正しいことを、配列分析を通じて確認し、そしてBL21 pLys SおよびBL21 CodonPlus細胞、またはBLR pLys SおよびBLR CodonPlus細胞へと形質転換した。
【0232】
(実施例11)
(E.coliにおけるWT1 C(アミノ酸71〜437)およびWT1 D(アミノ酸91〜437)の発現)
WT1 Cリーディングフレームを、以下のプライマーを用いたPCRによって増幅した:
【0233】
【化8】
このPCRは、以下の条件下で実施した:
10μl 10× Pfu緩衝液
1μl 10mM dNTP
2μl 10μM 各オリゴ
83μL 滅菌水
1.5μl Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene、La Jolla、CA)
50ng DNA(pPDM FL WT1)
96℃2分
96℃20秒 63℃15秒 72℃2分×40サイクル
72℃4分。
【0234】
このPCR産物を、EcoRIを用いて消化し、次いでEco72IおよびEcoRI制限酵素を用いて消化されているpPDM Hisへとクローニングした。この構築物を、配列分析を通じて確認し、次いでCodonPlus RPを用いて同時形質転換(co−transform)されたBLR pLys SおよびBLRへと形質転換した。
【0235】
(実施例12)
(重複するオリゴのアニーリングによるWT1 TR−1の合成的産生)
本実施例を、発現におけるプロリンコドン使用頻度を変化する効果を決定するために実施した。
【0236】
以下のオリゴの対をアニーリングした:
【0237】
【化9】
。
【0238】
各々のオリゴの対を、別々に組み合わせ、次いでアニーリングした。次いでこの対を、1つにライゲーションし、そして1μlのライゲーション混合物を以下のPCR条件で用いた:
10μl 10× Pfu緩衝液
1μl 10mM dNTP
2μl 10μM 各オリゴ
83μL 滅菌水
1.5μl Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene、La Jolla、CA)
96℃2分
96℃20秒 63℃15秒 72℃30秒×40サイクル
72℃4分。
【0239】
このPCR産物を、EcoRI制限酵素を用いて消化し、次いでEco72IおよびEcoRI制限酵素を用いて消化されているpPDM Hisへとクローニングした。この配列を、確認し、次いでCodonPlus RPを用いて同時形質転換されたBLR pLys SおよびBLRへと形質転換した。
【0240】
実施例10〜12について、以下の配列番号を開示する:
配列番号337は、WT1_Tr1について決定したcDNA配列である。
配列番号338は、WT1_Tr2について決定したcDNA配列である。
配列番号339は、WT1_Tr3について決定したcDNA配列である。
配列番号340は、WT1_Tr4について決定したcDNA配列である。
配列番号341は、WT1_Cについて決定したcDNA配列である。
配列番号342は、配列番号337によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
配列番号343は、配列番号338によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
配列番号344は、配列番号339によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
配列番号345は、配列番号340によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
配列番号346は、配列番号341によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
【0241】
このWT1 C配列は、TR2、TR3およびTR4のコード領域を有するポリヌクレオチドを表現する。
このWT1 TR−1合成配列は、そこでプロリンの代替的なコドンがネイティブのコドンに代わり置換され、E.coliにおいてWT1 TR−1を発現し得るポリヌクレオチドを産生した、ポリヌクレオチドを表す。
【0242】
(実施例13)
(マウスにおけるWT1免疫の全身性の組織病理学的および毒物学的効果の評価)
本実施例の目的は、WT1タンパク質免疫の免疫原性および潜在的な全身性の組織病理学的および毒物学的効果を、マウスにおける複数投与の滴定において分析することである。
【0243】
WT1タンパク質を用いたマウスの免疫についての実験の設計を、表Lに略説する。
【0244】
(表L)
(マウスにおけるWT1免疫の実験的設計)
【0245】
【表50】
雌性C57/B6マウスにおける複数投与滴定の研究(投与量は、WT1タンパク質、25μg、100μgから1000μgで変化する)において、MPL−SEをアジュバントとして用いたWT1タンパク質に対するワクチン接種は、強いWT1特異的抗体応答(図19)および細胞性のT細胞応答(図20)を誘発した。
【0246】
WT1タンパク質を用いた免疫の全身性の組織病理学的および毒物学的効果は、全く観察されなかった。以下の組織において、毒性についての組織学的な証拠は、全く見られなかった:副腎腺、脳、盲腸、結腸、十二指腸、眼、大腿骨および大腿骨骨髄、胆嚢、心臓、回腸、空腸、腎臓、喉頭、涙腺、肝臓、肺、リンパ節、筋肉、食道、卵巣、膵臓、上皮小体、唾液腺、胸骨および胸骨骨髄、脾臓、胃、胸腺、気管、甲状腺、膀胱ならびに子宮。
【0247】
潜在的な造血毒性の評価に、特別重きを置いた。胸骨および大腿骨における骨髄/赤血球の比率は、正常であった。全ての評価可能な血液細胞数および血液化学(BUN、クレアチニン、ビリルビン、アルブミン、グロブリン)は、通常の範囲内であった(表LI)。
【0248】
WT1に対して存在する免疫性が、何人かの白血病を有する患者において存在することおよびWT1タンパク質に対するワクチン接種が、マウスにおいて、正常な組織に対する毒性を有することなくWT1特異的Ab応答および細胞性T細胞応答を誘発し得ることが得られ、これらの実験は、腫瘍/白血病ワクチンとしてWT1を確認した。
【0249】
(表LI)
(臨床化学的および血液学的分析)
(表LI:WT1投与滴定研究)
(臨床化学分析および血液学的分析)
【0250】
【表51】
(表LI:WT1投与滴定研究)
(臨床化学分析および血液学的分析)
【0251】
【表52】
(表LI:WT1投与滴定研究)
(臨床化学分析および血液学的分析)
【0252】
【表53】
(表LI(続き):WT1投与滴定研究)
(臨床化学分析および血液学的分析)
【0253】
【表54】
(表LI(続き):WT1投与滴定研究)
(臨床化学分析および血液学的分析)
【0254】
【表55】
(表LI(続き):WT1投与滴定研究)
(臨床化学分析および血液学的分析)
【0255】
【表56】
(表LI(続き):WT1投与滴定研究)
(臨床化学分析および血液学的分析)
【0256】
【表57】
(略語)
WBC:白血球;RBC:赤血球;Hg.:血色素(ヘモグロビン);HCT:ヘマトクリット;MCV:平均赤血球容積(mean corpuscular volume);MCH:平均赤血球血色素量(mean corpuscular hemoglobin);MCHC:平均赤血球血色素濃度(mean corpuscular hemoglobin concentration);Plt:血小板;Abs:純粋な;Baso:好塩基球;Eos:好酸球;Abs.Bands:未熟好中球;Polys:多核型細胞;Lymph:リンパ球;Mono:単球;BUN:血液尿素窒素。
【0257】
(実施例14)
(インビトロでの全遺伝子の初回免疫によるヒトWT1特異的T細胞応答の誘発)
本実施例は、WT1特異的T細胞応答が、正常な個体の血液より惹起され得ることを実証する。
【0258】
樹状細胞(DC)を、10%のヒト血清、50ng/mlのGMCSFおよび30ng/mlのIL−4を含有するRPMI培地中での4〜10日間の増殖によって正常なドナーのPBMC由来の単球培養物より分化した。培養の後、DCを、組換えWT1発現ワクシニアウイルスを5回のM.O.I.で用いて16時間か、または組換えWT1発現アデノウイルスを10回のM.O.I.で用いて3日間インフェクトした(図21および22)。ワクシニアウイルスを、U.V.照射によって不活性化した。CD8+T細胞を、磁気ビーズを用いた陽性選択によって単離し、そして培養物の初回免疫(priming)を、96ウェルプレートにおいて開始した。培養物を、WT1を発現するようにアデノウイルスまたはワクシニアルスで感染させた自己の樹状細胞を用いて、7〜10日間毎に再刺激した。3〜6回の刺激の周期の後、自己のWT1発現樹状細胞または線維芽細胞を用いて刺激された場合にインターフェロン−γを特異的に産生するCD8+株を、同定し得た。これらの株のWT1特異的活性を、さらなる刺激の周期の間、維持し得た。これらの株が、アデノWT1またはワクシニアWT1で感染された自己の樹状細胞を特異的に認識するが、アデノEGFPまたはワクシニアEGFPで感染された自己の樹状細胞を認識しないことを、Elispotアッセイによって実証した(図23)。
【0259】
(実施例15)
(注射のためのRA12−WT1の処方:凍結乾燥した産生物を安定化するための賦形剤の使用)
本実施例は、凍結乾燥したRal12−WT1の完全な可溶化を可能とする処方を記載する。
【0260】
以下の処方は、組換えタンパク質Ra12−WT1を、「凍結乾燥により乾燥された後に、水性培地に溶解させ得た。
【0261】
組換えRa12−WT1濃度:0.5〜1.0mg/ml;緩衝液:10〜20mMエタノールアミン(pH10.0);1.0〜5.0mMシステイン;0.05% Tween−80(Polysorbate−80);糖:10%トレハロース(T5251、Sigma、MO) 10%マルトース(M9171、Sigma、MO) 10%スクロース(S7903,Sigma、MO) 10%フルクトース(F2543、Sigma、MO) 10%グルコース(G7528、Sigma、MO)。
【0262】
糖賦形剤と共に凍結乾燥したタンパク質が、その糖賦形剤を伴わないものより十分に多く溶解し得ることを見出した。クマシー染色されたSDS−PAGEによる分析によって、この溶解されたこの物質中に残存する固体のサインは示されなかった。
【0263】
(実施例16)
(WT1タンパク質ワクチンの処方)
本実施例は、WT1タンパク質および2つの異なるアジュバントの処方物による免疫後のWT1特異的応答の誘導を記載する。
【0264】
本実施例に従って、MPL−SEと組み合わせたWT1タンパク質は、WT1に対する、強いAb応答およびインターフェロン−γ(IFN−γ)応答を誘導する。以下に詳述されるのは、C57/B6マウスにおいてアジュバントとしてMPL−SEまたはEnhanzynを用いた、WT1タンパク質免疫後にWT特異的な免疫応答を誘導するために用いる方法である。
【0265】
C57BL/6マウスを、MPL−SEまたはEnhanzynアジュバントのいずれかを組み合わせた20μgのrRa12−WT1を用いて免疫した。3回の筋肉内(IM)免疫を、3週間間隔で与えた。一群のコントロールマウスを、アジュバントを伴わずにrRAl12−WT1を用いて免疫し、そして一群を、生理食塩水のみを用いて免疫した。脾臓および血清を、最後の免疫後2週間に収集した。血清を、Ra12−WT1融合、Ral12またはWT1TRXでコートしたプレート上で、ELISAによって、抗体応答について分析した。同様のレベルのIgG2aおよびIgG1抗体滴定量を、Ra12−WT1+MPL−SEおよびRa12−WT+Enhanzynを用いて免疫したマウスにおいて、観察した。アジュバントを伴わずにrRa12−WT1を用いて免疫したマウスは、低レベルのIgG2a抗体を示した。
【0266】
CD4応答を、インビトロでrRa12−WT1、rRa12またはp6、p117、およびp287のWT1ペプチドを用いた球状赤血球の刺激後のインターフェロン−γ産生を測定することによって評価した。両方のアジュバントは、rRA12−WT1を単独で用いて免疫したマウスよりもCD4応答を改善した。さらに、この結果は、rRA12−WT1+MPL−SEがrRA12−WT1+Enhanzynが誘導するよりも強いCD応答を誘導することを示した。IFN−γ ODの読み値は、rRA12−WT1+Enhanzanを用いて免疫したマウスにおいて1〜1.2であるのに対し、rRA12−WT1+MPL−SEを用いて免疫したマウスにおいては1.4〜1.6で変化する。ペプチド応答は、p117に対してのみ観察され、そしてそれはrRA12−WT1+MPL−SEを用いて免疫したマウスにおいてのみであった。陽性コントロール(ConA)に対する強いIFN−γ応答を、全てのマウスにおいて観察した。生理食塩水を用いて免疫した陰性コントロールマウスにおいては、ConAに対してのみ応答を、観察し、これはこの応答がrRA12−WT1に特異的であることを示した。
【0267】
(実施例17)
(不規則な突然変異WT1ライブラリーの構築)
ヒトWT1の核酸配列を、8−oxo dGTPおよびdPTPの存在下でポリメラ−ゼ連鎖反応を用いて、不規則に突然変異させた(journal of Molecular Biology 1996;255:589−603)。スプライシングされていない完全なヒトWT1遺伝子を配列番号380に開示し、対応するタンパク質配列を配列番号404に開示する。WT1のスプライス改変体を、PCR反応のためのテンプレートとして用い、そして配列番号381(DNA)および配列番号408(タンパク質)に開示する。条件を、核酸の変化の頻度が、アミノ酸配列の標的とする変化を導くように(通常はPCR産物の5〜30%)、選択した。次いでこの突然変異PCR産物を、ヌクレオチドアナログの非存在下で、4つの正常なdNTPを用いて増幅した。このPCR産物を、免疫のための哺乳動物の発現ベクターおよびウイルスベクターへとサブクローニングした。従って、このライブラリーは、不規則に突然変異したWT1クローンの混合された集団を含有する。複数のクローンを、選択および配列決定した。この突然変異WT1改変体DNA配列を、配列番号377〜379に開示し、この改変体の予測されるアミノ酸配列を、配列番号405〜407に示す。これらの変化した配列(およびライブラリーからの他の配列)を、癌細胞におけるWT1タンパク質に対する強いT細胞応答を誘導するための免疫原として用い得る。
【0268】
(実施例18)
(WT1−LAMP融合物の構築)
3つの部分からなる融合物を、ポリメラーゼ連鎖反応ならびにヒトリソソーム関連膜タンパク質−1(LAMP−1)配列およびヒトWT1配列スプライス改変体の所望の結合部を含有する合成オリゴヌクレオチドを用いて構築した。これらの融合物に用いたWT1のスプライス改変体およびLAMP−1配列を、配列番号381および383に開示する。詳細には、LAMP−1のシグナルペプチド(LAMPの塩基対1〜87)を、ヒトWT1オープンリーディングフレーム(1,290塩基対長)の5’末端に融合し、次いでLAMP−1の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン(LAMPの塩基対1161〜1281)をWT1配列の3’末端に融合した。得られたWT−LAMP構築物の配列を、配列番号382(DNA)および配列番号409(タンパク質)に開示する。この構築物を、それが真核生物細胞中で発現された場合に、シグナルペプチドが、このタンパク質を小胞体(ER)に指向し、ここで、LAMP−1の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン中の局在化シグナルが、リソソーム位置へのこの融合タンパク質の輸送を指向し、ここで、ペプチドが、クラスIIMHC分子に充填されるように設計した。
【0269】
(実施例19)
(増強されたMHCクラスI表現のためのWT1ユビキチン融合物の構築)
ヒトユビキチンオープンリーディングフレーム(配列番号384)を、最後のアミノ酸をコードするヌクレオチドがグリシンの代わりにアラニンをコードするように突然変異させた。この突然変異オープンリーディングフレームを、ヒトWT1(配列番号381および408(各々DNAおよびタンパク質))スプライス改変体の最初のコドンの直前に、インフレームでクローニングした。G−>A突然変異は、翻訳の間に通常ポリユビキチンをプロセシングするプロテアーゼによるなり始めのタンパク質の同時翻訳開裂を除去する。この得られる構築物のDNA配列および予想されるアミノ酸配列を、各々配列番号385および410に示す。得られたタンパク質は、ヒト細胞中で発現された場合に、減少された細胞性細胞毒性を示した。ネイティブのWT1を発現する安定株を産生することは、不可能だが、融合タンパク質を発現する細胞株は、容易に得られた。得られたタンパク質が、付加されたユビキチン分子によってプロテオソームの標的とされることが予想される。これが、WT1特異的CD8+T細胞によるタンパク質のより効率的な認識を生じるのは当然である。
【0270】
(実施例20)
(ヒトWT1発現アデノウイルスベクターの構築)
全長ヒトWT1遺伝子(配列番号381)のスプライス改変体を、E1およびE3欠失アデノウイルス血清型5ベクターへとクローニングした。WT1遺伝子の発現は、高レベルのWT1タンパク質発現を媒介するCMVプロモータによって制御される。この試薬でのヒト細胞の感染は、高レベルのWT1タンパク質の発現を導く。宿主細胞へと導入され、そして感染に続いて低レベルで産生されたアデノウイルスタンパク質の抗原性の性質は、免疫学的標的としてのWT1の免疫学的監視および免疫学的認識を増加するように作用し得る。このベクターもまた、ヒト被験者に接種された場合、WT1タンパク質に対する免疫応答を惹起するために用いられ得る。これらの被験者が、WT1発現腫瘍細胞について陽性である場合、この免疫応答は、疾患の過程において治療的効果または治癒的効果を有し得る。
【0271】
(実施例21)
(ヒトWT1発現ワクシニアウイルスベクターの構築)
全長ヒトWT1遺伝子(配列番号381)のスプライス改変体を、pSC11シャトルベクターを用いて、ワクシニアウイルスのWestern Reserve株のチミジンキナーゼ位置へとクローニングした。WT1遺伝子は、ワクシニアウイルス感染の過程を通じて遺伝子発現を媒介するハイブリッドワクシニアウイルスプロモーターの制御下にある。この試薬は、インビボまたはインビトロで、ヒト細胞におけるWT1タンパク質を発現するために用いられ得る。WT1は、いくつかのヒト腫瘍細胞上で過剰発現される自己のタンパク質である。従って、タンパク質として送達されたWT1に対する免疫応答は、主要組織適合性クラスI(MHCクラスI)を媒介するWT1の認識を導く傾向にはない。しかし、ワクシニアウイルスベクターによる細胞内部分におけるタンパク質の発現は、高レベルのMHCクラスI表現およびCD8+T細胞によるWT1タンパク質の認識を可能とし得る。ワクシニアウイルスベクターによるWT1タンパク質発現はまた、MHCクラスIIと関連するWT1ペプチドの表現も導き、従ってCD4+T細胞による認識も導き得る。
【0272】
本発明の使用は、癌ワクチンとしてのその使用を含む。WT1陽性腫瘍を保有しているヒト被験者の免疫は、治療的または治癒的な応答を導き得る。細胞内でのWT1の発現は、CD4陽性T細胞およびCD8陽性T細胞の両方によるタンパク質の認識を導き得る。
【0273】
(実施例22)
(細胞全体の初回免疫を用いたWT1特異的CD8+T細胞クローンの産生)
樹状細胞(DC)を、10%ヒト血清、50ng/mg GM−CSFおよび30ng/ml IL−4を含有するRPMI培地中で4〜6日間増殖することによって正常な患者のPBMC由来の単球培養物より分化した。培養後、DCを、組換えWT1発現ワクシニアウイルス(実施例21に記載)を5回の感染多重度(multiplicity of infection)(MOI)で用いて16時間か、または組換えWT1発現アデノウイルスを10回のMOIで用いて3日間、感染した。ワクシニアウイルスをU.V.照射によって不活性化した。CD8+ T細胞を、磁気ビーズを用いた陰性除去によって単離し、そして培養物の初回免疫を、96ウェルプレートにおいて開始した。培養物を、WT1を発現するように操作されたアデノウイルスまたはワクシニアルスで感染した自己の樹状細胞を用いて、7〜10日間毎に再刺激した。4〜5回の刺激の周期の後、CD8+ T細胞株が、自己のWT1発現樹状細胞または線維芽細胞を用いて刺激された場合にインターフェロン−γを特異的に産生することを同定し得た。これらの株をクローニングし、そしてこれらの株が、EGFP形質導入された線維芽細胞ではなく、WT1形質導入された自己の線維芽細胞を特異的に認識することをElispotアッセイによって実証した。
【0274】
ウィルムス腫瘍(WT1)遺伝子は、白血病誘発物の一員であり、そしてほとんどのヒト白血病および複数の固形腫瘍において過剰発現される。ヒトに関する以前の研究は、研究されたAML患者の16/63(25%)およびCML患者の15/81(19%)においてWT1特異的な抗体(Ab)応答の存在を実証した。マウスに関する以前の研究は、WT1ペプチドに基づくワクチンが、WT1特異的な、Ab、ThおよびCTL応答を誘発することを示した。ヒトにおけるワクチンとしてのペプチドの使用は、それらのHLA制限、およびペプチド特異的応答を誘発しかつ少数の患者においてのみCTLを誘発する傾向によって制限される。全遺伝子免疫の利点は、いくつかのヘルパーおよびCTLエピトープが単一のワクチン中に含まれ、従って特定のHLA型に対するワクチンを制限し得ないことである。明細書中に開示されるデータは、インビトロでの全遺伝子の初回免疫を用いたWT1特異的免疫応答の誘導、そしてWT1特異的CD8+ T細胞クローンを産生し得たこと、を実証する。WT1に対して存在する免疫性が、白血病を有する何人かの患者において存在すること、ならびにマウスおよびヒトのWT1が、アミノ酸レベルで96%同一でありそしてWT1タンパク質、WT1 DNAまたはWT1ペプチドに対するワクチン接種が、マウスにおける正常な組織に対する毒性を有すること無くWT1特異的Ab、および細胞性T細胞応答を誘発し得ることから、これらインビトロでのヒト初回免疫実験は、腫瘍/白血病ワクチンとしてのWT1のさらなる確認を提供する。さらに、WT1特異的CD8+ T細胞クローンを産生する能力は、遺伝子的に操作したT細胞を用いた、WT1過剰発現に関連する悪性疾患の処置を導き得る。
【0275】
(実施例23)
(WT1の臨床的製造のための組換え構築物)
5つの構築物を、以下に詳述するように、臨床的グレードのWT1の産生のために作製した。
【0276】
Ral12/WT−E(配列番号388(cDNA)および391(タンパク質))およびHisタグを有さないWT−1E(配列番号386(cDNA)および395(タンパク質))の設計:
WT1 Eリーディングフレームを、非His非融合構築物のための以下のプライマーを用いてPCR増幅した:
【0277】
【化10】
以下のPCRサイクル条件を用いた:10μlの10×Pfu緩衝液、1μlの10mM dNTP、2μlの10μM各オリゴ、83μL滅菌水 1.5μlのPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene、La Jolla、CA)、50ngのDNA(pPDMRa12 WT−1 非His)。反応を、最初96℃で2分間変性し、その後96℃で20秒間、62℃で15秒間および72℃で1分40秒間を40サイクル続けた。この後72℃で4分間の最後の伸長を続けた。このPCR産物を、NdeIおよびEcoRIを用いて消化し、次いでNdeIおよびEcoRIで消化されているpPDM His(改変されたpET28ベクター)へとクローニングした。この構築物を、配列分析を通して確認し、次いでBLR(DE3)pLys S細胞およびHMS 174(DE3)pLys S細胞へと形質転換した。次いでこの構築物−pPDM WT−1を、NcoIおよびXbalを用いて消化し、そしてpPDM Ral12 Wt−1 F(以下を参照のこと)からのNcoIおよびXbaI挿入のためのベクターの基幹部として用いた。この構築物を、配列分析を通じて確認し、次いでBLR(DE3)pLYs SおよびHMS 174(DE3)pLys S細胞へと形質転換した。タンパク質発現を、クマシー染色したSDS−PAGEおよびN末端タンパク質配列分析によって確認した。
【0278】
Hisタグを有さないRa12−WT−1−F(a.a.1〜281)(配列番号389(cDNA)および393(タンパク質))の設計:
Ra12 WT1リーディングフレームを、以下のプライマーを用いてPCR増幅した:
【0279】
【化11】
以下のPCRサイクル条件を用いた:10μlの10×Pfu緩衝液、1μl 10mMのdNTP、2μl 10μMの各オリゴ、83μLの滅菌水 1.5μlのPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene、La Jolla、CA)、50ngのDNA(pPDMRa12 WT−1 His非含有)。この反応を、最初96℃で2分間変性し、その後96℃で20秒間、58℃で15秒間および72℃で3分間を40サイクル続けた。この後72℃で4分間の最後の伸長を続けた。このPCR産物を、NdeIを用いて消化し、そしてNdeIおよびEco72Iで消化されているpPDM Hisへとクローニングした。この配列を、配列分析を通じて確認し、次いでBLR(DE3)pLys S細胞およびHMS 174(DE3)pLysS細胞へと形質転換した。タンパク質発現を、クマシー染色したSDS−PAGEおよびN末端タンパク質配列分析によって確認した。
【0280】
(Hisタグを有さないRa12−WT−1(配列番号390(cDNA)および392(タンパク質))の設計:)
Ra12 WT−1リーディングフレームを以下のプライマーを用いてPCR増幅した:
【0281】
【化12】
以下のPCRサイクル条件を用いた:10μlの10×Pfu緩衝液、1μl 10mMのdNTP、2μl 10μMの各オリゴ、83μLの滅菌水 1.5μlのPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene、La Jolla、CA)、50ngのDNA(pPDMRa12 WT−1 His非含有)。この反応を、最初96℃で2分間変性し、その後96℃で20秒間、68℃で15秒間および72℃で2分30秒間の40サイクルを続けた。この後72℃で4分間の最後の伸長を続けた。このPCR産物を、NdeIおよびNotIを用いて消化し、次いでNdeIおよびNotIで消化されているpPDM Hisへとクローニングした。この配列を、配列分析を通じて確認し、次いでBLR(DE3)pLys S細胞およびHMS 174(DE3)pLysS細胞へと形質転換した。タンパク質発現を、クマシー染色したSDS−PAGEおよびN末端タンパク質配列分析によって確認した。
【0282】
Hisタグを有さないE.coliにおけるWT−1 C(a.a.69〜430)の設計(配列番号387(cDNA)および394(タンパク質)):
WT−1 Cリーディングフレームを、以下のプライマーを用いてPCR増幅した:
【0283】
【化13】
以下のPCRサイクル条件を用いた:10μlの10×Pfu緩衝液、1μl 10mMのdNTP、2μl 10μMの各オリゴ、83μLの滅菌水 1.5μlのPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene、La Jolla、CA)、50ngのDNA(pPDMRa12 WT−1 His非含有)。反応を、最初96℃で2分間変性し、その後96℃で20秒間、62℃で15秒間および72℃で2分間の40サイクルを続けた。この後72℃で4分間の最後の伸長を続けた。このPCR産物を、NdeIを用いて消化し、次いでNdeIおよびEco72Iで消化されているpPDM Hisへとクローニングした。この配列を、配列分析を通じて確認し、次いでBLR(DE3)pLys S細胞およびHMS 174(DE3)pLysS細胞へと形質転換した。タンパク質発現を、クマシー染色したSDS−PAGEおよびN末端タンパク質配列分析によって確認した。
【0284】
(実施例24)
(遺伝子全体の初回免疫を用いたWT1特異的CD8+T細胞クローンの産生およびHLA−A2制限WT1エピトープの同定)
本実施例において、アデノ送達ビヒクルおよびワクシニアウイルス送達ビヒクルを、WT1特異的T細胞株を産生するために用いた。この株由来のT細胞クローンが、WT1特異的であることを示し、そしてさらにこのクローンによって認識されるエピトープを同定した。
【0285】
樹状細胞(DC)を、10%のヒト血清、50ng/mlのGM−CSFおよび30ng/mlのIL−4を含有するRPMI培地中での4〜6日間の増殖によって、正常なドナーのPBMC由来の単球培養物より分化した。培養の後、DCを、5回の感染多重度(MOI)で、組換えWT1発現ワクシニアウイルスを用いて16時間か、または3〜10回のMOIで、組換えWT1発現アデノウイルスを用いて2〜3日間で感染させた。ワクシニアウイルスを、UV照射によって不活性化した。CD8+T細胞を、CD4、CD14、CD16、CD19およびCD56+細胞に対する抗体を用いる陰性欠失によって、およびその後の、これらのAbのFc部位に特異的な磁性ビーズによって単離した。
【0286】
培養物の初回免疫を、96ウェルプレートにおいて開始した。培養物を、WT1を発現するように操作されたアデノウイルスまたはワクシニアウイルスでインフェクトした自己の樹状細胞を用いて、7〜14日間毎に再刺激した。4〜5回の周期の刺激の後、自己のWT1発現する、樹状細胞または線維芽細胞を用いて刺激された場合にインターフェロン−γ(IFN−γ)を特異的に産生するCD8+株を、同定し得た。これらの株をクローニングし、そしてWT1形質導入した自己の線維芽細胞を特異的に認識するが、コントロール形質導入した樹状細胞を制御しないことを、Elispotアッセイによって実証した。
【0287】
これらのWT1特異的CD8+T細胞クローンのHLA制限をさらに分析するために、T細胞クローンが樹立されるドナー(D349)とHLA−A2対立遺伝子のみを共有する、さらなるドナー(D475)由来の線維芽細胞を、
WT1を用いて形質導入した。ELISPOT分析は、T細胞クローンによるこれらD475標的細胞の認識を実証した。HLA A2制限をさらに実証し、そしてこのエピトープが、(悪性形質転換の一部として)WT1を「天然で」過剰発現する腫瘍細胞によって発現されることを実証するために、白血病細胞株K562を、試験した。K562を、HLA A2分子を用いて形質導入し、そしてHLA−A2陰性K562細胞を、非特異的IFN−γの放出についてのコントロールとして用いた。ELISPOT分析は、T細胞がA2陽性K562細胞株を認識するが、A2陰性K562細胞を認識しないことを実証した。この認識の特異性およびHLA−A2制限のさらなる証拠を、HLA−A2抗体ブロッキング実験によって実証した。
【0288】
さらにWT1エピトープを規定する為に、4つの切断したWT1レトロウイルス構築物を、産生した。次いで、ドナー475線維芽細胞を、これらの構築物を用いて、形質導入した。ELISPOTアッセイは、WT1 Tr1構築物(aa2〜aa92)を用いて形質導入されたD475線維芽細胞の認識を実証し、従って、WT1エピトープが、WT1タンパク質の最初の91N末端アミノ酸中に配置されていることを実証した。エピトープのマップを詳細にするために、11アミノ酸が重複する、WT1タンパク質の15マーペプチドを、合成した。WT1特異的T細胞クローンは、2つの重複する15マーペプチド(ペプチド9(QWAPVLDFAPPGASA)(配列番号412)およびペプチド10(VLDFAPPGASAYGSL)(配列番号413))を認識した。認識される最小限のエピトープをさらに特徴づけるために、これらの15マーペプチドのうち共有される9マーおよび10マーペプチド(合計5種)を、このクローンの特異性を分析するために用いた。このクローンは、9マー(VLDFAPPGA(配列番号241)、および10マー(VLDFAPPGAS(配列番号411))を特異的に認識した。
【0289】
(実施例25)
(WT1に特異的なCD8 T細胞由来の、TCRα鎖およびTCRβ鎖のクローニングおよび配列決定)
WT1特異的CD8+T細胞クローン由来のT細胞レセプター(TCR)のα鎖およびβ鎖をクローニングする。配列分析を、TCRのα鎖およびβ鎖のファミリーの起源を実証する為に実施する。さらに、独特の多様性および結合セグメント(これは応答の特異性に寄与する)を同定する。
【0290】
WT1特異的CD8+ T細胞クローンからの2×106細胞からの総mRNAを、Trizol試薬を用いて単離し、そしてcDNAをReady−to−goキット(Pharmacia)を用いて合成した。クローン中のVαおよびVβ配列を決定するために、VαおよびVβサブタイプ特異的プライマーのパネルを(Clontech、Palo Alto、CAによって産生されたプライマー配列に基づいて)合成し、そして各々のクローンから産生されたcDNAを用いるRT−PCR反応に用いる。このRT−PCR反応によって、各々のクローンによってVβ配列およびVα配列のどちらが発現されるかが実証される。
【0291】
クローンから全長TCRαおよび全長TCRβ鎖をクローニングするために、開始因子および終末因子をコードするTCRヌクレオチドをつなぐプライマーを設計する。標準的な35サイクルのRT−PCR反応を、CTLクローンから合成されたcDNAおよび上記のプライマーを用い、プルーフリーディング熱安定性ポリメラーゼPWO(Roche、Basel、Switzerland)を用いて確立する。この生じた特異的バンド(αについては約850bpそしてβについては約950bp)を、PCR平滑ベクター(Invitrogen、Crlsbad、CA)へとライゲーションし、そしてE.coliへと形質転換した。全長のα鎖および全長β鎖を含むプラスミドで形質転換したE.coliを同定し、対応するプラスミドの大規模調製をおこなった。次いで全長のTCRα鎖およびTCRβ鎖を含むプラスミドを、標準的な方法を用いて配列決定した。このようにして、TCRの特異性に寄与する多様性結合(DJ)領域を決定した。
【0292】
前述から、本発明の特定の実施形態は、例示の目的のために本明細書中に記載されたが、種々の改変は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、なされ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除き、限定されない。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、マウス(MO)およびヒト(HU)のWT1タンパク質配列(それぞれ配列番号320および319)の比較を示す。
【図2】
図2は、血液学的な悪性疾患(AML)を有する患者におけるWT1特異的抗体の検出を示すウエスタンブロットである。レーン1は、分子量マーカーを示す;レーン2は、陽性コントロール(WT1特異的抗体を用いて免疫沈降されたWT1陽性ヒト白血病細胞株)を示す;レーン3は、陰性コントロール(マウス血清を用いて免疫沈降されたWT1陽性細胞株)を示す;そしてレーン4は、AMLを有する患者の血清を用いて免疫沈降されたWT1陽性細胞株を示す。レーン2〜4に関して、免疫沈降は、ゲル電気泳動によって分離し、そしてWT1特異的抗体によってプローブされた。
【図3】
図3は、TRAMP−C(WT1陽性腫瘍細胞株)を用いて免疫されたB6マウスにおけるWT1特異的抗体応答の検出を示すウエスタンブロットである。レーン1、3および5は、分子量マーカーを示し、そしてレーン2、4および6は、WT1特異的陽性コントロール(N180、Santa Cruz Biotechnology、WT1タンパク質のN末端領域の180アミノ酸におよぶポリペプチド、ウエスタンブロット上で52kDに移動する)を示す。用いた一次抗体は、レーン2においてはWT180であり、レーン4においては免疫していないB6マウスの血清であり、そしてレーン6においては免疫したB6マウスの血清である。
【図4】
図4は、代表的なWT1ペプチドを用いて免疫されたマウスにおけるWT1特異的抗体の検出を示すウエスタンブロットである。レーン1、3および5は、分子量マーカーを示し、そしてレーン2、4および6は、WT1特異的陽性コントロール(N180、Santa Cruz Biotechnology、WT1タンパク質のN末端領域の180アミノ酸におよぶポリペプチド、ウエスタンブロット上で52kDに移動する)を示す。用いた一次抗体は、レーン2においてはWT180であり、レーン4においては免疫していないB6マウスの血清であり、そしてレーン6においては免疫したB6マウスの血清である。
【図5】
図5A〜5Cは、代表的なWT1ペプチドを用いて免疫されたマウスにおける増殖性T細胞応答の刺激を示すグラフである。チミジン取り込みアッセイを、表示されたように一つのT細胞株および二つの異なるクローンを用いて実施し、そして結果を、cpmとして表現した。X軸上に示されるコントロールは、抗原なし(Agなし)およびB6/培地であり;用いられた抗原はヒトのp6〜22(p1)、ヒトのp117−139(p2)またはヒトのp244−262(p3)であった。
【図6】
図6Aおよび6Bは、代表的なWT1ペプチドを用いて免疫されたマウスにおける増殖性T細胞応答の刺激を図示するヒストグラムである。三回目の免疫の三週間後に、ワクチンAまたはワクチンBを接種したマウスの脾臓細胞を、培地のみ(培地)または脾臓細胞および培地(B6/抗原なし)、ペプチドp6−22(p6)、p117−139(p117)、p244−262(p244)(ワクチンA;図6A)またはp287−301(p287)、p299−313(p299)、p421−435(p421)(ワクチンB;図6B)でパルスしたB6脾臓細胞、および25μg/mlの無関係のコントロールペプチド(無関係のペプチド)でパルスした脾臓細胞とともに培養し、そして(3H)チミジン取り込みによって96時間後に増殖についてアッセイした。棒は、コントロール(抗原なしのB6脾臓細胞)の平均値によって除算した実験ウェルの平均値として計算された刺激指数(SI)を示す。
【図7】
図7A〜7Dは、p117−139およびp6−22に特異的な増殖性T細胞株およびクローンの産生を図示したヒストグラムである。インビボの免疫に続いて、最初の3回のインビトロでの刺激(IVS)を、それぞれワクチンAまたはBの3つのペプチドすべてを用いて実施した。引き続くIVSを、二つの関連したペプチドp117−139およびp6−22のみを用いた単一ペプチド刺激として実施した。クローンを、示されるようにp6−22特異的T細胞株およびp117−139特異的T細胞株の両方から誘導した。T細胞を、培地のみ(培地)または脾臓細胞および培地(B6/抗原なし)、25μg/mlのペプチドp6−22(p6)、p117−139(p117)または無関係のコントロールペプチド(無関係のペプチド)でパルスしたB6脾臓細胞と共に培養し、そして(3H)チミジン取り込みによって96時間後に増殖についてアッセイした。棒は、コントロール(抗原なしの、B6脾臓細胞)の平均値によって除算された実験ウェルの平均値として計算された刺激指数(SI)を示す。
【図8】
図8Aおよび8Bは、Th応答を誘発する能力を有するペプチドについてヒトWT1(配列番号319)のTSITES分析の結果を示す。「A」と示された領域は、ブロックのAMPHI中間点であり、「R」は、Rothbard/Taylorモチーフと一致する残基を示し、「D」は、IAdモチーフと一致する残基を示し、そして「d」は、IEdモチーフと一致する残基を示す。
【図9】
図9Aおよび9Bは、WT1ペプチドを用いて免疫されたマウスにおけるWT1ペプチド特異的CTLの誘発を示すグラフである。図9Aは、同種異系細胞株による標的細胞の溶解を示し、そして図9Bは、ペプチドでコートされた細胞株の溶解を示す。各々の場合において、%溶解(標準的クロム放出アッセイによって決定されるような)は、3つの示したエフェクター:標的比で示される。結果は、リンパ腫細胞(LSTRAおよびE10)ならびにE10+p235−243(E10+P235)について提供される。E10細胞はまた、本明細書中でEL−4細胞とも呼ばれる。
【図10A】
図10Aは、WT1ペプチドP117を用いたB6マウスのワクチン接種後に、WT1陽性腫瘍細胞株を殺傷するがWT1陰性細胞株を殺傷しないWT1ペプチド特異的CTLの誘発を示すグラフである。図10Aは、免疫しないB6マウスのT細胞がWT1陽性腫瘍細胞株を殺傷しないことを示す。各々の場合において、%溶解(標準的クロム放出アッセイによって決定されたような)は、三つの示したエフェクター:標的の比において示される。結果は、リンパ腫細胞(E10)、前立腺ガン細胞(TRAMP−C)、形質転換された繊維芽細胞株(BLK−SV40)ならびにE10+P117について提供される。
【図10B】
図10Bは、WT1ペプチドP117を用いたB6マウスのワクチン接種に引き続き、WT1陽性腫瘍細胞株を殺傷するがWT1陰性細胞株を殺傷しないWT1ペプチド特異的CTLの誘発を図示するグラフである。図10Bは、同種異系細胞株による標的細胞の溶解を図示する。各々の場合において、%溶解(標準的クロム放出アッセイによって決定されたような)は、三つの示したエフェクター:標的の比において示される。結果は、リンパ腫細胞(E10)、前立腺ガン細胞(TRAMP−C)、形質転換された繊維芽細胞株(BLK−SV40)ならびにE10+P117について提供される。
【図10C】
図10Cは、WT1ペプチドP117を用いたB6マウスのワクチン接種に引き続き、WT1陽性腫瘍細胞株を殺傷するがWT1陰性細胞株を殺傷しないWT1ペプチド特異的CTLの誘発を図示するグラフである。図10Cおよび図10Dは、異なる二つの実験におけるWT1陰性細胞株と比べたWT1陽性腫瘍細胞株の溶解を実証する。さらに、図10Cは、ペプチドにコートされた細胞株(関連したWT1ペプチドP117によってコートされたWT1陰性細胞株E10)の溶解を示す。各々の場合において、%溶解(標準的クロム放出アッセイによって決定されたような)は、三つの示したエフェクター:標的の比において示される。結果は、リンパ腫細胞(E10)、前立腺ガン細胞(TRAMP−C)、形質転換された繊維芽細胞株(BLK−SV40)ならびにE10+P117について提供される。
【図10D】
図10Dは、WT1ペプチドP117を用いたB6マウスのワクチン接種に引き続き、WT1陽性腫瘍細胞株を殺傷するがWT1陰性細胞株を殺傷しないWT1ペプチド特異的CTLの誘発を図示するグラフである。図10Cおよび図10Dは、異なる二つの実験におけるWT1陰性細胞株と比べたWT1陽性腫瘍細胞株の溶解を実証する。さらに、図10Dは、ペプチドにコートされた細胞株(関連したWT1ペプチドP117によってコートされたWT1陰性細胞株E10)の溶解を示す。各々の場合において、%溶解(標準的クロム放出アッセイによって決定されたような)は、三つの示したエフェクター:標的の比において示される。結果は、リンパ腫細胞(E10)、前立腺ガン細胞(TRAMP−C)、形質転換された繊維芽細胞株(BLK−SV40)ならびにE10+P117について提供される。
【図11A】
図11Aは、代表的なペプチドP117−139特異的CTLがWT1陽性腫瘍細胞を溶解する能力を示したヒストグラムである。3回目の免疫の3週間後に、ペプチドp235−243またはp117−139を接種したマウスの脾臓細胞を、関連するペプチドを用いてインビトロにおいて刺激し、そしてWT1ペプチドならびにWT1陽性および陰性の腫瘍細胞と共にインキュベートされた標的を溶解する能力について試験した。棒は、25:1のE:T比で三連で実施されたクロム放出アッセイにおける平均%比溶解を示す。図11Aは、示されるように、WT1陰性細胞株EL−4(EL−4、WT1陰性);関連する(免疫ならびに再刺激のために用いた)ペプチドp235−243でパルスしたEL−4(EL−4+p235);無関連のペプチドp117−139をパルスしたEL−4(EL−4+p117)、p126−134をパルスしたEL−4(EL−4+p126)またはp130−138をパルスしたEL−4(EL−4+p130)ならびにWT1陽性腫瘍細胞BLK−SV40(BLK−SV40、WT1陽性)およびTRAMP−C(TRAMP−C、WT1陽性)に対する、p235−243特異的T細胞株の細胞傷害性活性を示す。
【図11B】
図11Bは、代表的なペプチドP117−139特異的CTLがWT1陽性腫瘍細胞を溶解する能力を示したヒストグラムである。3回目の免疫の3週間後に、ペプチドp235−243またはp117−139を接種したマウスの脾臓細胞を、関連するペプチドを用いてインビトロにおいて刺激し、そしてWT1ペプチドならびにWT1陽性および陰性の腫瘍細胞と共にインキュベートされた標的を溶解する能力について試験した。棒は、25:1のE:T比で三連で実施されたクロム放出アッセイにおける平均%比溶解を示す。図11Bは、示されるように、EL−4;関連するペプチドP117−139をパルスしたEL−4(EL−4+p117)および無関連のペプチドp123−131をパルスしたEL−4(EL−4+p123)、またはp128−136をパルスしたEL−4(EL−4+p128);BLK−SV40およびTRAMP−Cに対するp117−139特異的T細胞株の細胞傷害性活性を示す。
【図12A】
図12Aは、非放射性標的阻害によって実証されたような、WT1陽性腫瘍細胞の溶解の特異性を示すヒストグラムである。棒は、25:1のE:T比で三連で実施されたクロム放出アッセイにおける平均%比溶解を示す。図12Aは、示されるように、WT1陰性細胞株EL−4(EL−4、WT1陰性);WT1陽性腫瘍細胞株TRAMP−C(TRAMP−C、WT1陽性);51Cr標識なしの関連するペプチドp117−139を適用した(放射性標的と比べて)10倍過剰のEL−4細胞とともにインキュベートされたTRAMP−C細胞(TRAMP−C+p117非放射性標的)および51Cr標識なしの無関連のペプチドをパルスしたEL−4細胞とともにインキュベートされたTRAMP−C細胞(TRAMP−C+無関係の非放射性標的)に対するp117〜139特異的T細胞株の細胞傷害性活性を示す。
【図12B】
図12Bは、非放射性標的阻害によって実証されたような、WT1陽性腫瘍細胞の溶解の特異性を示すヒストグラムである。棒は、25:1のE:T比で三連で実施されたクロム放出アッセイにおける平均%比溶解を示す。図12Bは、示されるように、WT1陰性細胞株EL−4(EL−4、WT1陰性);WT1陽性腫瘍細胞株BLK−SV40(BLK−SV40、WT1陽性);関連する非放射性標的とともにインキュベートされたBLK−SV40細胞(BLK−SV40+p117非放射性標的)および無関連の非放射性標的とともにインキュベートされたBLK−SV40細胞(BLK−SV40+無関係の非放射性標的)に対するp117−139特異的T細胞株の細胞傷害性活性を示す。
【図13A】
図13Aは、p117−139内の9マーのCTLエピトープの評価を示すヒストグラムである。p117−139腫瘍特異的CTL株を、アミノ酸117〜139内に適切なH−2bクラスI結合モチーフを含むかまたは欠如するペプチドに対して試験し、続いてp126−134またはp130−138を用いて再刺激した。棒は、25:1のE:T比で三連で実施されたクロム放出アッセイにおける平均%比溶解を示す。図13Aは、WT1陰性細胞株EL−4(EL−4、WT1陰性)およびペプチドp117−139をパルスしたsEL−4細胞(EL−4+p117)、ペプチドp119−127をパルスしたEL−4細胞(EL−4+p119)、ペプチドp120−128をパルスしたEL−4細胞(EL−4+p120)、ペプチドp123−131をパルスしたEL−4細胞(EL−4+p123)、ペプチドp126−134をパルスしたEL−4細胞(EL−4+p126)、ペプチドp128−136をパルスしたEL−4細胞(EL−4+p128)およびペプチドp130−138をパルスしたEL−4細胞(EL−4+p130)に対するp117−139特異的T細胞株の細胞傷害性活性を示す。
【図13B】
図13Bは、p117−139内の9マーのCTLエピトープの評価を示すヒストグラムである。p117−139腫瘍特異的CTL株を、アミノ酸117−139内に適切なH−2bクラスI結合モチーフを含むかまたは欠如するペプチドに対して試験し、続いてp126−134またはp130−138を用いて再刺激した。棒は、25:1のE:T比で三連で実施されたクロム放出アッセイにおける平均%比溶解を示す。図13Bは、WT1陰性細胞株EL−4、p117−139をパルスしたEL−4細胞(EL−4+p117)、p126−134ををパルスしたEL−4細胞(EL−4+p126)およびWT1陽性腫瘍細胞株TRAMP−Cに対してp126−134を用いた再刺激後のCTL株の細胞傷害性の活性を示す。
【図13C】
図13Cは、p117−139内の9マーのCTLエピトープの評価を示すヒストグラムである。p117−139腫瘍特異的CTL株を、アミノ酸117−139内に適切なH−2bクラスI結合モチーフを含むかまたは欠如するペプチドに対して試験し、続いてp126−134またはp130−138を用いて再刺激した。棒は、25:1のE:T比で三連で実施されたクロム放出アッセイにおける平均%比溶解を示す。図13Cは、EL−4、p117−139を適用したEL−4細胞(EL−4+p117)、p130−138を適用したEL−4細胞(EL−4+p130)およびWT1陽性腫瘍細胞株TRAMP−Cに対するp130−138を用いた再刺激後のCTL株の細胞傷害性活性を示す。
【図14】
図14は、AMLを有する63人の患者における、WT1に対する血清抗体反応性を示す。WT1/N末端タンパク質に対する血清抗体の反応性は、AMLを有する患者においてELISAによって評価された。第1のレーンおよび第1および第2のレーンは、それぞれ、陽性コントロールおよび陰性コントロールを表す。第1のレーンおよび第1および第2のレーンは、それぞれ、陽性コントロールおよび陰性コントロールを表す。市販されているWT1特異的抗体WT180を陽性コントロールについて使用した。次の63レーンは、患者個体由来の血清を使用した結果を表す。示されたOD値は、1:500の血清希釈を使用するELISAによった。この図は、3つの別個の実験からの累積データを含む。
【図15】
図15は、AMLを有する2人の患者におけるWT1タンパク質およびコントロールタンパク質に対する血清抗体反応性を示す。WT1/全長、WT1N−末端、TRXタンパク質およびRa12タンパク質に対する、血清抗体の反応性は、AMLを有する2人の患者においてELISAによって評価された。示されたOD値は、1:500の血清希釈を使用するELISAによった。AML−1およびAML−2は、WT/全長に対する実証された抗体反応性を有する、図1における患者個体のうちの2人に由来する血清を示す。このWT1全長タンパク質は、Ra12との融合タンパク質として発現された。このWT1/N末端タンパク質は、TRXとの融合タンパク質として発現された。このコントロールRa12タンパク質およびTRXタンパク質は、類似の様式で精製される。この結果によって、WT1融合タンパク質に対する血清抗体反応性は、このタンパク質のWT1部分に指向されることが確認される。
【図16】
図16は、CMLを有する81人の患者におけるWT1に対する血清抗体反応性を示す。WT1/全長タンパク質に対する血清抗体の反応性は、AMLを有する患者においてELISAによって評価された。この第1のレーンおよび第2のレーンは、それぞれ陽性コントロールおよび陰性コントロールを示す。市販されるWT1特異的抗体WT180を陽性コントロールのために使用した。次の81のレーンは、患者個体各々に由来する血清を使用した結果を表す。示されるOD値は、1:500の血清希釈を使用するELISAによった。この図は、3つの別個の実験からの累積データを含む。
【図17】
図17は、CMLを有する2人の患者におけるWT1タンパク質およびコントロールタンパク質に対する血清抗体反応性を示す。WT1/全長タンパク質、WT1/N末端タンパク質、TRXタンパク質およびRa12タンパク質に対する血清抗体反応性は、CMLを有する2人の患者においてELISAによって評価された。示されたOD値は、1:500で血清希釈を使用するELISAによった。CML−1およびCML−2は、WT1/全長に対する実証された抗体反応性を有する図3における患者個体のうちの2人の血清を示す。このWT1/N末端タンパク質は、Ra12との融合タンパク質として発現された。このWT1/全長タンパク質は、TRXとの融合タンパク質として発現された。このコントロールのRa12タンパク質およびTRXタンパク質を類似の様式において精製した。この結果によって、WT1融合タンパク質に対する血清抗体反応性がこのタンパク質WT1部分に対して指向されることが確認される。
【図18】
図18は、血清学的分析に使用される組換えWT1タンパク質の特徴を提供する。
【図19A】
図19Aは、異なった用量のWTタンパク質でワクチン接種をすることによって誘発されたマウスにおける抗体応答を示す棒グラフである。
【図19B】
図19Bは、異なった用量のWTタンパク質でワクチン接種をすることによって誘発されたマウスにおける抗体応答を示す棒グラフである。
【図19C】
図19Cは、異なった用量のWTタンパク質でワクチン接種をすることによって誘発されたマウスにおける抗体応答を示す棒グラフである。
【図19D】
図19Dは、異なった用量のWTタンパク質でワクチン接種をすることによって誘発されたマウスにおける抗体応答を示す棒グラフである。
【図19E】
図19Eは、異なった用量のWTタンパク質でワクチン接種をすることによって誘発されたマウスにおける抗体応答を示す棒グラフである。
【図20A】
図20Aは、WT1タンパク質で免疫されたマウスにおける増殖性T細胞応答の棒グラフである。
【図20B】
図20Bは、WT1タンパク質で免疫されたマウスにおける増殖性T細胞応答の棒グラフである。
【図21】
図21は、蛍光顕微鏡によって検査されたヒトDCの写真であり、このヒトDCは、アデノWT1感染およびワクシニア感染の後にWT1を発現する。
【図22】
図22は、ヒトDCにおけるWT1発現が、アデノWT1感染の後に再現可能であり、かつこのコントロールアデノ感染によって誘導されないことを実証する写真である。
【図23】
図23は、WT1全遺伝子のインビトロでの初回免疫によって、WT1特異的T細胞応答が誘発されることを示す、IFN−γ ELISPOTアッセイのグラフである。
Claims (44)
- 単離されたポリヌクレオチドであって、以下:
(a)配列番号327〜331、337〜341、および377〜390に提供される配列;
(b)配列番号327〜331、337〜341、および377〜390に提供される配列の相補体;
(c)配列番号327〜331、337〜341、および377〜390に提供される配列の少なくとも20連続した残基からなる配列;
(d)中程度にストリンジェントな条件下で、配列番号327〜331、337〜341、および377〜390に提供される配列にハイブリダズする配列;
(e)配列番号327〜331、337〜341、および377〜390の配列に対して少なくとも75%の同一性を有する配列;
(f)配列番号327〜331、337〜341、および377〜390の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列;ならびに
(g)配列番号327〜331、337〜341、および377〜390に提供される配列の縮重改変体;
からなる群より選択される配列を含む、ポリヌクレオチド。 - 単離されたポリペプチドであって、以下:
(a)請求項1に記載のポリヌクレオチドによってコードされる配列;
(b)請求項1に記載のポリヌクレオチドによってコードされる配列に対して少なくとも70%の同一性を有する、配列;および
(c)請求項1に記載のポリヌクレオチドによってコードされる配列に対して少なくとも90%の同一性を有する、配列;
(d)配列番号241、332〜336、342〜346、391〜395、および404〜413に示される配列;
(e)配列番号241、332〜336、342〜346、391〜395、および404〜413に示される配列に対して少なくとも70%の同一性を有する、配列;および
(f)配列番号241、332〜336、342〜346、391〜395、および404〜413に示される配列に対して少なくとも90%の同一性を有する、配列;
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。 - 発現制御配列に作動可能に連結される、請求項1に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
- 請求項3に記載の発現ベクターで形質転換されたか、またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
- 請求項2に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体、またはその抗原結合フラグメント。
- 患者における癌の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)該患者からの生物学的サンプルを得る工程;
(b)請求項2に記載のポリペプチドに結合する結合因子と該生物学的サンプルを接触させる工程;
(c)該サンプル中において、該結合因子に結合するポリペプチドの量を検出する工程;および
(d)該ポリペプチドの量と予め決定されたカットオフ値とを比較し、それによって該患者における癌の存在を決定する工程;
を包含する、方法。 - 請求項2に記載の少なくとも1つのポリペプチドを含む、融合タンパク質。
- 中程度にストリンジェントな条件下で、配列番号327〜331、337〜341、および377〜390に示される配列にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド。
- 腫瘍タンパク質に特異的なT細胞を刺激および/または拡大するための方法であって、該方法は、T細胞を刺激および/または拡大することを可能にするのに十分な条件および時間で、
以下:
(a)請求項2に記載のポリペプチド;
(b)請求項1に記載のポリヌクレオチド;および
(c)請求項1に記載のポリヌクレオチドを発現する、抗原提示細胞
からなる群より選択される少なくとも1つの成分とT細胞を接触させる工程
を包含する、方法。 - 請求項9に記載の方法に従って調製されたT細胞を含む、単離されたT細胞集団。
- 生理学的に受容可能なキャリアおよび免疫賦活剤からなる群より選択される第1の成分、ならびに第2の成分を含む、組成物であって、
ここで、該第2の成分は、以下:
(a)請求項2に記載のポリペプチド;
(b)請求項1に記載のポリヌクレオチド;
(c)請求項5に記載の抗体;
(d)請求項7に記載の融合タンパク質;
(e)請求項10に記載のT細胞集団;および
(f)請求項2に記載のポリペプチドを発現する抗原提示細胞;
からなる群より選択される、組成物。 - 患者における免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、
請求項11に記載の組成物を、該患者に投与する工程を包含する、方法。 - 患者における癌の処置のための方法であって、該方法は、請求項11に記載の組成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
- 患者における癌の存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)該患者から生物学的サンプルを得る工程;
(b)請求項8に記載のオリゴヌクレオチドと該生物学的サンプルを接触させる工程;
(c)該サンプル中において、該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を検出する工程;および
(d)該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの量と予め決定されたカットオフ値とを比較し、それによって該患者における、癌の存在を決定する工程;
を包含する、方法。 - 少なくとも1つの請求項8に記載のオリゴヌクレオチドを備える、診断キット。
- 少なくとも1つの請求項5に記載の抗体および検出試薬を備える、診断キットであって、ここで、該検出試薬は、レポーター基を含む、診断キット。
- 患者における癌の発生を阻害する方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)(i)請求項2に記載のポリペプチド;(ii)請求項1に記載のポリヌクレオチド;および(iii)請求項2に記載のポリペプチドを発現する抗原提示細胞からなる群より選択される、少なくとも1つの成分と、患者から単離された、CD4+T細胞および/またはCD8+T細胞をインキュベートし、その結果、T細胞が増殖する、工程;
(b)該増殖したT細胞の有効量を該患者に投与し、そして、それによって該患者における癌の発生を阻害する工程;
を包含する、方法。 - 緩衝液中に再懸濁されたWT1ポリペプチドを含む組成物であって、該組成物は、約7%と約13%との間の濃度で、トレハロース、マルトース、スクロース、フルクトースおよびグルコースからなる群より選択される少なくとも1つの糖を含有する、組成物。
- 前記の濃度が、約8%と約12%との間である、請求項18に記載の組成物。
- 前記の濃度が、約10%である、請求項18に記載の組成物。
- 緩衝液中に再懸濁されたWT1ポリペプチドを含む組成物であって、該組成物は、約7%と約13%との間の濃度で、トレハロース、マルトース、スクロース、フルクトースおよびグルコースからなる群より選択される少なくとも2つの糖を含有する、組成物。
- 前記の濃度が、約8%と約12%との間である、請求項21に記載の組成物。
- 前記の濃度が、約10%である、請求項21に記載の組成物。
- 緩衝液中に再懸濁されたWT1ポリペプチドを含む組成物であって、該組成物は、約7%と約13%との間の濃度で、トレハロース、マルトース、スクロース、フルクトースおよびグルコースからなる群より選択される少なくとも3つの糖を含有する、組成物。
- 前記の濃度が、約8%と約12%との間である、請求項24に記載の組成物。
- 前記の濃度が、約10%である、請求項24に記載の組成物。
- 緩衝液中に再懸濁されたWT1ポリペプチドを含有する組成物であって、該組成物は、以下:
(a)約7%と約13%との間の濃度の、トレハロース、マルトース、スクロース、フルクトースおよびグルコースからなる群より選択される、少なくとも1つの糖;
(b)エタノールアミン;
(c)システイン;および
(d)Polysorbate−80
を含む、組成物。 - 前記濃度が約8%と約12%との間である、請求項27に記載の組成物。
- 前記濃度が約10%である、請求項27に記載の組成物。
- 前記WT1ポリペプチドが、Ra12−WT1融合ポリペプチドを含む、請求項18〜29のいずれか1項に記載の組成物。
- WT1ポリペプチドおよびMPL−SEを含む、組成物。
- 前記WT1ポリペプチドが、Ra12−WT1融合ペプチドを含む、請求項31に記載の組成物。
- WT1ポリペプチドおよびEnhanzynを含む、組成物。
- 前記WT1ポリペプチドはRa12−WT1融合ポリペプチドを含む、請求項33に記載の組成物。
- 非特異的免疫応答エンハンサーと組み合わせて請求項2に記載のポリペプチドを含む、ワクチン。
- 前記免疫応答エンハンサーがアジュバントである、請求項35に記載のワクチン。
- 請求項35に記載のワクチンであって、ここで、前記免疫免疫応答エンハンサーが、以下:
ミョウバンベースのアジュバント、オイルベースアジュバント、Specol、RIBI、TiterMax、Montanide ISA50もしくはMontanide ISA 720、GM−CSF、非イオン性ブッロックコポリマーベースアジュバント、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDA)ベースのアジュバントAS−1、AS−2、Ribi Adjuvant系ベースのアジュバント、QS21、Quil A、SAF(微小流動体化形態にあるSyntexアジュバント(SAF−m))、ジメチル−ジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDA)、ヒト補体ベースのアジュバントm.vaccae、ISCOMS、MF−59、SBAS−2、SBAS−4、Enhanzyn(登録商標)、RC−529、AGPs、MPL−SE、QS7、Escin;Digitonin;およびGypsophila、Chenopodium quinoaサポニン
からなる群より選択される、ワクチン。 - aおよびbを含む、ワクチンであって、
該aは、請求項2に記載のWT1ポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドは、WT1の免疫原性部分を含む、WT1ポリペプチドであり;そして
該bは、患者においてT細胞応答を優勢に増強する非特異的免疫エンハンサーである、ワクチン。 - 請求項38に記載のワクチンであって、ここで、前記免疫応答エンハンサーは、以下:
ミョウバンベースのアジュバント、オイルベースアジュバント、Specol、RIBI、TiterMax、Montanide ISA50もしくはMontanide ISA 720、GM−CSF、非イオン性ブッロックコポリマーベースアジュバント、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDA)ベースのアジュバントAS−1、AS−2、Ribi Adjuvant系ベースのアジュバント、QS21、Quil A、SAF(微小流動体化形態にあるSyntexアジュバント(SAF−m))、ジメチル−ジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDA)、ヒト補体ベースのアジュバントm.vaccae、ISCOMS、MF−59、SBAS−2、SBAS−4、Enhanzyn(登録商標)、RC−529、AGPs、MPL−SE、QS7、Escin;Digitonin;およびGypsophila、Chenopodium quinoa サポニン
からなる群より選択される、ワクチン。 - 非特異的免疫応答エンハンサーと組み合わせて、請求項1に記載のポリヌクレオチドを含む、ワクチン。
- 前記免疫応答エンハンサーが、アジュバントである。請求項40に記載のワクチン。
- 請求項40に記載のワクチンであって、前記免疫応答エンハンサーは、以下:
ミョウバンベースのアジュバント、オイルベースアジュバント、Specol、RIBI、TiterMax、Montanide ISA50もしくはMontanide ISA 720、GM−CSF、非イオン性ブッロックコポリマーベースアジュバント、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDA)ベースのアジュバントAS−1、AS−2、Ribi Adjuvant系ベースのアジュバント、QS21、Quil A、SAF(微小流動体化形態にあるSyntexアジュバント(SAF−m))、ジメチル−ジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDA)、ヒト補体ベースのアジュバントm.vaccae、ISCOMS、MF−59、SBAS−2、SBAS−4、Enhanzyn(登録商標)、RC−529、AGPs、MPL−SE、QS7、Escin;Digitonin;およびGypsophila、Chenopodium quinoaサポニン
からなる群より選択される、ワクチン。 - cおよびdを含む、ワクチンであって、
該cは、請求項1に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドは、WT免疫原性部分をコードしいる、ポリヌクレオチドであり;そして、
該dは、患者においてT細胞応答を優勢に増強する、非特異的免疫応答エンハンサーである、
ワクチン。 - 請求項43に記載のワクチンであって、ここで、前記免疫応答エンハンサーは、以下:
ミョウバンベースのアジュバント、オイルベースアジュバント、Specol、RIBI、TiterMax、Montanide ISA50もしくはMontanide ISA 720、GM−CSF、非イオン性ブッロックコポリマーベースアジュバント、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDA)ベースのアジュバントAS−1、AS−2、Ribi Adjuvant系ベースのアジュバント、QS21、Quil A、SAF(微小流動体化形態にあるSyntexアジュバント(SAF−m))、ジメチル−ジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDA)、ヒト補体ベースのアジュバントm.vaccae、ISCOMS、MF−59、SBAS−2、SBAS−4、Enhanzyn(登録商標)、RC−529、AGPs、MPL−SE、QS7、Escin;Digitonin;およびGypsophila、Chenopodium quinoa サポニン
からなる群より選択される、ワクチン。
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