ES2311027T3

ES2311027T3 - Composiciones y metodos para la inmunoterapia especifica de wt1.

Info

Publication number: ES2311027T3
Application number: ES01977493T
Authority: ES
Inventors: Alexander Gaiger; Patricia D. Mcneill; Molly Smithgall; Gus Moulton; Thomas S. Vedvick; Paul R. Sleath; Sally Mossman; Lawrence Evans; A. Gregory Spies; Jeremy Boydston
Original assignee: Corixa Corp
Current assignee: Corixa Corp
Priority date: 2000-10-06
Filing date: 2001-10-03
Publication date: 2009-02-01
Anticipated expiration: 2021-10-03
Also published as: CN100545174C; WO2002028414A1; KR20030081314A; JP4130359B2; CA2425072C; KR100858231B1; EP1328287A4; MXPA03002983A; CA2425072A1; DE60135005D1; EP1328287B1; WO2002028414B1; JP2004510425A; US20030072767A1; NZ540397A; AU2001296608B2; AU9660801A; ATE402189T1; EP1328287A1; CN1505526A

Abstract

Un polipéptido aislado que consiste en los aminoácidos 1-281 del polipéptido WT1 expuesto en ID SEC Nº: 408, y en el que la capacidad de dicho polipéptido de reaccionar con líneas o clones de células T específicas de WT1 no está reducida sustancialmente respecto del polipéptido WT1 expuesto en ID SEC Nº: 408.

Description

Composiciones y métodos para la inmunoterapia específica de WT1.

Esta invención se realizó en parte con ayuda gubernamental con el número de subvención de fase I de SBIR del NIH IR43 CA81752-01A1.

\vskip1.000000\baselineskip

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a la inmunoterapia de neoplasias malignas tales como leucemia y cánceres. La invención se refiere más específicamente a composiciones relacionadas para generar o incrementar una respuesta inmunitaria hacia WT1, y al uso de tales composiciones para prevenir y/o tratar las neoplasias malignas.

Descripción de la técnica relacionada

El cáncer y la leucemia son problemas sanitarios considerables en los Estados Unidos y en todo el mundo. Aunque se han realizado avances en la detección y el tratamiento de tales enfermedades, actualmente no hay disponible ninguna vacuna ni otro método universalmente eficaz para la prevención o el tratamiento del cáncer y la leucemia. El tratamiento de las enfermedades depende actualmente de una combinación de diagnóstico temprano y tratamiento agresivo, que puede incluir uno o más de una diversidad de tratamientos, tales como cirugía, radioterapia, quimioterapia y terapia hormonal. El curso de tratamiento para un cáncer particular se selecciona con frecuencia basándose en una diversidad de parámetros pronósticos, que incluyen un análisis de los marcadores tumorales específicos. Sin embargo, el uso de los marcadores establecidos conduce con frecuencia a un resultado que es difícil de interpretar, y se sigue observando una mortalidad elevada en muchos pacientes de cáncer.

Las inmunoterapias muestran un gran potencial para mejorar sustancialmente el tratamiento y la supervivencia del cáncer y la leucemia. Los datos recientes demuestran que la leucemia se puede curar mediante inmunoterapia en el contexto del trasplante de médula ósea (p.ej., infusiones de linfocitos de donantes). Tales terapias pueden implicar la generación o un incremento de una respuesta inmunitaria hacia un antígeno asociado al tumor (AAT). Sin embargo, hasta la fecha se conocen relativamente pocos AATs, y no se ha demostrado que la generación de una respuesta inmunitaria contra tales antígenos sea terapéuticamente beneficiosa, con escasas excepciones.

Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de métodos mejorados para la prevención y la terapia de la leucemia y el cáncer. La presente invención satisface estas necesidades y además proporciona otras ventajas relaciona-
das.

En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido aislado que consiste en los aminoácidos 1-281 del polipéptido WT1 expuesto en la ID SEC Nº 408, y en el que la capacidad de dicho polipéptido de reaccionar con líneas o clones de células T especificas de WT1 no disminuye sustancialmente respecto del polipéptido WT1 expuesto en la ID SEC Nº 408.

También se proporciona un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido de la presente invención, junto con un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado de la presente invención.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona una célula hospedadora aislada transformada o transfectada con el vector de expresión de la presente invención.

También se proporcionan composiciones farmacéuticas y de vacunas que incluyen el polipéptido de la presente invención.

También se proporciona el polipéptido de la presente invención para el uso en terapia, en particular, para su uso en el tratamiento de neoplasias malignas.

Expuesto brevemente, esta invención proporciona composiciones y su uso en métodos para la terapia de enfermedades tales como la leucemia y el cáncer. En un aspecto, la presente invención proporciona polipéptidos que comprenden una porción inmunógena de un WT1 nativo, o una variante suya que difiere en una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones, de forma que la capacidad de la variante para reaccionar con antisueros y/o líneas o clones de células T específicas del antígeno no disminuye sustancialmente. La porción inmunógena se une preferiblemente a una molécula de clase I y/o clase II del MHC.

En aspectos adicionales, la presente invención proporciona polipéptidos que comprenden una variante de una porción inmunógena de una proteína WT1, en los que la variante difiere de la porción inmunógena debido a sustituciones de entre 1 y 3 posiciones de aminoácidos en la porción inmunógena, de forma que la capacidad de la variante de reaccionar con antisueros y/o líneas o clones de células T específicas del antígeno se incrementa respecto de una proteína WT1 nativa.

La presente invención proporciona además polinucleótidos de WT1 que codifican un polipéptido WT1 de la invención como se describió anteriormente.

En otros aspectos, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas y vacunas. El potenciador de la respuesta inmunitaria para el uso con las vacunas de la presente invención puede ser un adyuvante. Preferiblemente, un potenciador de la respuesta inmunitaria incrementa la respuesta de las células T.

También se describen métodos para incrementar o inducir una respuesta inmunitaria en un paciente, que comprenden administrar a un paciente una composición farmacéutica o vacuna como se describió anteriormente. En ciertas realizaciones, el paciente es un humano.

La presente descripción proporciona además métodos para inhibir el desarrollo de una neoplasia maligna en un paciente, que comprenden administrar a un paciente una composición farmacéutica o vacuna como se describió anteriormente. Las neoplasias malignas incluyen, pero no se limitan a, leucemias (p.ej., mieloide aguda, linfocítica aguda y mieloide crónica) y cánceres (p.ej., cáncer de mama, de pulmón, de tiroides o gastrointestinal, o un melanoma). El paciente puede padecer, pero no necesariamente, la neoplasia maligna, y la administración de la composición farmacéutica o la vacuna puede inhibir el inicio de tal enfermedad, o puede impedir la progresión y/o la metástasis de una enfermedad existente.

La presente descripción proporciona además, entre otros aspectos, métodos para eliminar las células que expresan WT1 de médula ósea y/o sangre periférica o de sus fracciones, que comprenden poner en contacto la médula ósea, sangre periférica o una fracción de médula ósea o de sangre periférica con células T que reaccionan específicamente con un polipéptido WT1, en los que la etapa de puesta en contacto se lleva a cabo en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la eliminación de las células WT1 positivas hasta menos del 10%, preferiblemente menos del 5% y más preferiblemente menos del 1%, del número de células mieloides o linfáticas de la médula ósea, sangre periférica o fracción. La médula ósea, la sangre periférica y las fracciones se pueden obtener de un paciente que padece una enfermedad asociada a la expresión de WT1, o se pueden obtener de un humano o mamífero no humano que no padece tal enfermedad.

En los aspectos relacionados, la presente descripción proporciona métodos para inhibir el desarrollo de una neoplasia maligna en un paciente, que comprenden administrar a un paciente médula ósea, sangre periférica o una fracción de médula ósea o de sangre periférica preparadas como se describió anteriormente. Tal médula ósea, sangre periférica o las fracciones pueden ser autólogas, o pueden proceder de un humano relacionado o no, o de un animal no humano (p.ej., singénico o alogénico).

En otros aspectos, la presente descripción proporciona métodos para estimular (o sensibilizar) y/o para expandir las células T, que comprenden poner en contacto las células T con un polipéptido WT1 en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la estimulación y/o la expansión de las células T. Tales células T pueden ser células T específicas de WT1 autólogas, alogénicas, singénicas o no relacionadas, y se pueden estimular in vitro o in vivo. Las células T expandidas pueden estar presentes, en ciertas realizaciones, en la médula ósea, sangre periférica o en una fracción de médula ósea o de sangre periférica, y pueden ser clonales (pero no necesariamente). En ciertas realizaciones, las células T pueden estar presentes en un mamífero durante la estimulación y/o la expansión. Las células T específicas de WT1 se pueden usar, por ejemplo, en infusiones de linfocitos de donantes.

En los aspectos descritos relacionados, se proporcionan métodos para inhibir el desarrollo de una neoplasia maligna en un paciente, que comprenden administrar a un paciente células T preparadas como se describió anteriormente. Tales células T pueden ser, en ciertas realizaciones, autólogas, singénicas o alogénicas.

La presente descripción proporciona además, en otros aspectos, métodos para monitorizar la eficacia de una inmunización o de una terapia para una neoplasia maligna asociada a la expresión de WT1 en un paciente. Tales métodos se basan en la monitorización de las respuestas de anticuerpos, células T CD4+ y/o células T CD8+ en el paciente. En ciertos aspectos, un método puede comprender las etapas de: (a) incubar una primera muestra biológica con uno o más de: (i) un polipéptido WT1; (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido WT1; o (iii) una célula presentadora de antígenos que expresa un polipéptido WT1, en el que la primera muestra biológica se obtiene de un paciente antes de la terapia o la inmunización, y en el que la incubación se lleva a cabo en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que se formen inmunocomplejos; (b) detectar los inmunocomplejos formados entre el polipéptido WT1 y los anticuerpos de la muestra biológica que se unen específicamente al polipéptido WT1; (c) repetir las etapas (a) y (b) mediante el uso de una segunda muestra biológica obtenida del mismo paciente tras la terapia o la inmunización; y (d) comparar el número de inmunocomplejos detectados en la primera y segunda muestras biológicas, y así monitorizar la eficacia de la terapia o la inmunización en el paciente. En ciertas realizaciones, la etapa de incubar las células T se puede repetir una o más veces.

En otros aspectos, la presente descripción proporciona métodos para inhibir el desarrollo de una neoplasia maligna asociada a la expresión de WT1 en un paciente, que comprende las etapas de: (a) incubar células T CD4+ y/oCD8+ aisladas de un paciente con uno o más de: (i) un polipéptido WT1; (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido WT1; o (iii) una célula presentadora de antígenos que expresa un polipéptido WT1, de forma que las células T proliferan; (b) clonar una o más células que han proliferado; y (c) administrar al paciente una cantidad eficaz de las células T clonadas.

También se describen métodos para determinar la presencia o ausencia de una enfermedad maligna asociada a la expresión de WT1 en un paciente, que comprende las etapas de: (a) incubar células T CD4+ y/oCD8+ aisladas de un paciente con uno o más de: (i) un polipéptido WT1; (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido WT1; o (iii) una célula presentadora de antígenos que expresa un polipéptido WT1; y (b) detectar la presencia o ausencia de la activación específica de las células T, y así determinar la presencia o ausencia de una neoplasia maligna asociada a la expresión de WT1. En ciertas realizaciones, la etapa de detección comprende detectar la presencia o ausencia de proliferación de las células T.

También se describen métodos para determinar la presencia o ausencia de una neoplasia maligna asociada a la expresión de WT1 en un paciente, que comprenden las etapas de: (a) incubar una muestra biológica obtenida de un paciente con uno o más de: (i) un polipéptido WT1; (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido WT1; o (iii) una célula presentadora de antígenos que expresa un polipéptido WT1, en el que la incubación se lleva a cabo en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que se formen inmunocomplejos; y (b) detectar los inmunocomplejos formados entre el polipéptido WT1 y los anticuerpos de la muestra biológica que se unen específicamente al polipéptido WT1; y así determinar la presencia o ausencia de una neoplasia maligna asociada a la expresión de WT1.

En ciertas realizaciones de los métodos descritos anteriormente, la etapa de detección comprende (a) incubar los inmunocomplejos con un reactivo de detección que es capaz de unirse a los inmunocomplejos, en el que el reactivo de detección comprende un grupo indicador, (b) eliminar el reactivo de detección sin unir, y (c) detectar la presencia o ausencia del grupo indicador. El reactivo de detección puede comprender, por ejemplo, un segundo anticuerpo, o su fragmento de unión al antígeno, capaz de unirse a los anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido WT1, o una molécula tal como la proteína A. En otras realizaciones, el grupo indicador está unido al polipéptido WT1, y la etapa de detección comprende eliminar el polipéptido WT1 sin unir y detectar posteriormente la presencia o ausencia del grupo indicador.

En otros aspectos descritos, los métodos para monitorizar la eficacia de una inmunización o terapia para una neoplasia maligna asociada a la expresión de WT1 en un paciente pueden comprender las etapas de: (a) incubar una primera muestra biológica con uno o más de: (i) un polipéptido WT1; (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido WT1; o (iii) una célula presentadora de antígenos que expresa un polipéptido WT1, en el que la muestra biológica comprende células T CD4+ y/o CD8+ y se obtiene de un paciente antes de la terapia o la inmunización, y en el que la incubación se lleva a cabo en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la activación, proliferación y/o lisis específica de las células T; (b) detectar una cantidad de activación, proliferación y/o lisis de las células T; (c) repetir las etapas (a) y (b) mediante el uso de una segunda muestra biológica que comprende células T CD4+ y/o CD8+, en la que la segunda muestra biológica se obtiene del mismo paciente tras la terapia o la inmunización; y (d) comparar la cantidad de activación, proliferación y/o lisis de células T en la primera y segunda muestras biológicas, y así monitorizar la eficacia de la terapia o la inmunización en el paciente.

La presente descripción proporciona además métodos para inhibir el desarrollo de una neoplasia maligna asociada a la expresión de WT1 en un paciente, que comprende las etapas de: (a) incubar células T CD4+ y/o CD8+ aisladas de un paciente con uno o más de: (i) un polipéptido WT1; (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido WT1; o (iii) una célula presentadora de antígenos que expresa un polipéptido WT1, de forma que las células T proliferan; y (b) administrar al paciente una cantidad eficaz de las células T proliferadas, y así inhibir el desarrollo de una neoplasia maligna.

Estos y otros aspectos de la presente invención serán evidentes tras la referencia a la siguiente descripción detallada y a los dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa una comparación de las secuencias de la proteína WT1 de ratón (RA) y humano (HU) (ID SEC Nºs: 320 y 319, respectivamente).

La Figura 2 es una transferencia de Western que ilustra la detección de anticuerpos específicos de WT1 en pacientes con neoplasias malignas hematológicas (LMA). El carril 1 muestra los marcadores de pesos moleculares; el carril 2 muestra un control positivo (línea de células de leucemia humana WT1 positivas inmunoprecipitadas con un anticuerpo específico de WT1); el carril 3 muestra un control negativo (línea de células WT1 positivas inmunoprecipitadas con sueros de ratón); y el carril 4 muestra una línea de células WT1 positivas inmunoprecipitadas con sueros de un paciente con LMA. Para los carriles 2-4, el inmunoprecipitado se separó mediante electroforesis en gel y se analizó con una sonda con un anticuerpo específico de WT1.

La Figura 3 es una transferencia de Western que ilustra la detección de una respuesta de anticuerpos específicos hacia WT1 en ratones B6 inmunizados con TRAMP-C, una línea de células tumorales WT1 positivas. Los carriles 1, 3 y 5 muestran los marcadores de pesos moleculares, y los carriles 2, 4 y 6 muestran un control positivo específico de WT1 (N180, Santa Cruz Biotechnology, polipéptido que abarca 180 aminoácidos de la región N-terminal de la proteína WT1, que migra en la transferencia de Western a 52 kD). El anticuerpo primario usado fue WT180 en el carril 2, sueros de ratones B6 sin inmunizar en el carril 4 y sueros de los ratones B6 inmunizados en el carril 6.

La Figura 4 es una transferencia de Western que ilustra la detección de anticuerpos específicos hacia WT1 en ratones inmunizados con péptidos de WT1 representativos. Los carriles 1, 3 y 5 muestran los marcadores de pesos moleculares, y los carriles 2, 4 y 6 muestran un control positivo específico de WT1 (N180, Santa Cruz Biotechnology, polipéptido que abarca 180 aminoácidos de la región N-terminal de la proteína WT1, que migra en la transferencia de Western a 52 kD). El anticuerpo primario usado fue WT180 en el carril 2, sueros de ratones B6 sin inmunizar en el carril 4 y sueros de los ratones B6 inmunizados en el carril 6.

Las Figuras 5A a 5C son gráficos que ilustran la estimulación de las respuestas de células T proliferativas en ratones inmunizados con péptidos de WT1 representativos. Se llevaron a cabo ensayos de incorporación de timidina mediante el uso de una línea de células T y dos clones diferentes, como se indica, y los resultados se expresan como cpm. Los controles indicados en el eje X fueron sin antígeno (Sin Ag) y B6/medios; los antígenos usados fueron p6-22 humano (p1), p117-139 (p2) o p244-262 humano (p3).

Las Figuras 6A y 6B son histogramas que ilustran la estimulación de las respuestas de células T proliferativas en ratones inmunizados con péptidos de WT1 representativos. Tres semanas después de la tercera inmunización, las células del bazo de los ratones a los que se había inoculado Vacuna A o Vacuna B se cultivaron con medio solo (medio) o células del bazo y medio (B6/sin antígeno), células del bazo de B6 pulsadas con los péptidos p6-22 (p6), p117-139 (p117), p244-262 (p244) (Vacuna A; Figura 6A) o p287-301 (p287), p299-313 (p299), p421-435 (p421) (Vacuna B; Figura 6B) y células del bazo pulsadas con un péptido de control irrelevante (péptido irrelevante) a 25 \mug/ml, y después de 96 h se analizó la proliferación mediante la incorporación de (^{3}H)-timidina. Las barras representan el índice de estimulación (IE), que se calcula como la media de los pocillos experimentales dividida por la media del control (células del bazo de B6 sin antígeno).

Las Figuras 7A-7D son histogramas que ilustran la generación de líneas y clones de células T proliferativas específicas para p117-139 y p6-22. Tras la inmunización in vivo, las tres estimulaciones in vitro iniciales(EIV) se llevaron a cabo mediante el uso de los tres péptidos de Vacuna A o B, respectivamente. Las EIV posteriores se llevaron a cabo como estimulaciones con un único péptido mediante el uso de solamente los dos péptidos relevantes p117-139 y p6-22. Los clones procedieron de las líneas de células T específicas para p6-22 y p117-139, como se indica. Las células T se cultivaron con medio solo (medio) o con células del bazo y medio (B6/sin antígeno), las células de bazo de B6 se pulsaron con los péptidos p6-22 (p6), p1 17-139 (p117) o un péptido de control irrelevante (péptido irrelevante) a 25 \mug/ml, y después de 96 h se analizó la proliferación mediante la incorporación de (^{3}H)-timidina. Las barras representan el índice de estimulación (IE), que se calcula como la media de los pocillos experimentales dividida por la media del control (células de bazo de B6 sin antígeno).

Las Figuras 8A y 8B presentan los resultados del análisis TSITES de WT1 humano (ID SEC Nº:319) para los péptidos que tienen la capacidad de provocar respuestas Th. Las regiones indicadas mediante "A" son puntos medios de bloques AMPHI, "R" indica los residuos que coinciden con el motivo de Rothbard/Taylor, "D" indica los residuos que coinciden con el motivo IAd, y "d" indica los residuos que coinciden con el motivo IEd.

Las Figuras 9A y 9B son gráficos que ilustran la generación de LTC específicos de péptidos de WT1 en ratones inmunizados con péptidos de WT1. La Figura 9A ilustra la lisis de las células seleccionadas como objetivo mediante líneas de células alogénicas, y la Figura 9B muestra la lisis de líneas de células revestidas con péptido. En cada caso, el % de lisis (tal como se determina mediante los ensayos de liberación de cromo estándar) se muestra a las tres proporciones efector:objetivo indicadas. Los resultados se proporcionan para células de linfoma (LSTRA y E10), así como para E10 + p235-243 (E10+P235). Las células E10 también se denominan en esta memoria células EL-4.

Las Figuras 10A-10D son gráficos que ilustran la generación de LTC específicos de WT1, que destruyen líneas de células tumorales WT1 positivas pero que no destruyen las líneas de células WT1 negativas, tras la vacunación de ratones B6 con el péptido de WT1 P117. La Figura 10A ilustra que las células T de ratones B6 sin inmunizar no destruyen las líneas de células tumorales WT1 positivas. La Figura 10B ilustra la lisis de las células seleccionadas como objetivo mediante líneas de células alogénicas. Las Figuras 10C y 10D demuestran la lisis de líneas de células tumorales WT1 positivas, en comparación con líneas de células WT1 negativas en dos experimentos diferentes. Además, las Figuras 10C y 10D muestran la lisis de líneas de células revestidas de péptido (la línea de células E10 WT1 negativas revestidas con el péptido de WT1 relevante P117). En cada caso, el % de lisis (tal como se determina mediante los ensayos de liberación de cromo estándar) se muestra a las tres proporciones efector:objetivo indicadas. Los resultados se proporcionan para células de linfoma (E10), células de cáncer de próstata (TRAMP-C), una línea de fibroblastos transformados (BLK-SV40), así como E10+p117.

Las Figuras 11A y 11B son histogramas que ilustran la capacidad de LTC representativos específicos del péptido P117-139 de lisar las células tumorales WT1 positivas. Tres semanas después de la tercera inmunización, las células del bazo de los ratones a los que se les habían inoculado los péptidos p235-243 o p117-139 se estimularon in vitro con el péptido relevante y se analizó la capacidad de lisar los objetivos incubados con péptidos de WT1, así como células tumorales WT1 positivas y negativas. Las barras representan el % medio de lisis específica en los ensayos de liberación de cromo llevados a cabo por triplicado con una proporción E:O de 25:1. La Figura 11A muestra la actividad citotóxica de la línea de células T específicas de p235-243 contra la línea de células EL-4 WT1 negativas (EL-4, WT1 negativo); EL-4 pulsadas con el péptido relevante p235-243 (usado para la inmunización así como para la reestimulación) (EL-4+p235); EL-4 pulsadas con los péptidos irrelevantes p117-139 (EL-4+p117), p126-134 (EL-4+p126) o p130-138 (EL-4+p130) y las células tumorales WT1 positivas BLK-SV40 (BLK-SV40, WT1 positivo) y TRAMP-C (TRAMP-C, WT1 positivo), como se indica. La Figura 11B muestra la actividad citotóxica de la línea de células T específicas de p117-139 contra EL-4; EL-4 pulsadas con el péptido relevante P117-139 (EL-4+p117) y EL-4 pulsadas con los péptidos irrelevantes p123-131 (EL-4+p123), o p128-136 (EL-4+p128); BLK-SV40 y TRAMP-C, como se indica.

Las Figuras 12A y 12B son histogramas que ilustran la especificidad de la lisis de células tumorales WT1 positivas, tal como se demuestra mediante la inhibición del objetivo sin marcar radiactivamente. Las barras representan el % medio de lisis específica en los ensayos de liberación de cromo llevados a cabo por triplicado con una proporción E:O de 25:1. La Figura 12A muestra la actividad citotóxica de la línea de células T específicas de p117-139 contra la línea de células EL-4 WT1 negativas (EL-4, WT1 negativo); la línea de células tumorales WT1 positivas TRAMP-C (TRAMP-C, WT1 positivo); células TRAMP-C incubadas con un exceso de diez veces (en comparación con el objetivo marcado radiactivamente) de células EL-4 pulsadas con el péptido relevante p117-139 (TRAMP-C + p117, objetivo sin marcar radiactivamente) sin marcar con ^{51}Cr y células TRAMP-C incubadas con EL-4 pulsadas con un péptido irrelevante sin marcar con ^{51}Cr (TRAMP-C + objetivo irrelevante sin marcar radiactivamente), como se indica.

La Figura 12B muestra la actividad citotóxica de la línea de células T específicas de p117-139 contra la línea de células EL-4 WT1 negativas (EL-4, WT1 negativo); la línea de células tumorales WT1 positivas BLK-SV40 (BLK-SV40, WT1 positivo); células BLK-SV40 incubadas con el objetivo relevante sin marcar radiactivamente (BLK-SV40 + p117, objetivo sin marcar radiactivamente) y células BLK-SV40 incubadas con el objetivo irrelevante sin marcar radiactivamente (BLK-SV40 + objetivo irrelevante sin marcar radiactivamente), como se indica.

Las Figuras 13A-13C son histogramas que representan una evaluación del epítopo de LTC 9-mérico de p117-139. La línea de LTC específica de p117-139 se analizó contra péptidos de los aa 117-139 que contenían o carecían de un motivo apropiado de unión a la clase I H-2^{b} y tras la reestimulación con p126-134 o p130-138. Las barras representan el % medio de lisis específica en ensayos de liberación de cromo llevados a cabo por triplicado con una proporción E:O de 25:1. La Figura 13A muestra la actividad citotóxica de la línea de células T específicas de p117-139 contra la línea de células EL-4 WT1 negativas (EL-4, WT1 negativo) y las células EL-4 pulsadas con los péptidos p117-139 (EL-4 + p117), p119-127 (EL-4 + p119), p120-128 (EL-4 + p120), p123-131 (EL-4 + p123), p126-134 (EL-4 + p126), p128-136 (EL-4 + p128), y p130-138 (EL-4 + p130). La Figura 13B muestra la actividad citotóxica de la línea de LTC tras la reestimulación con p126-134 contra la línea de células EL-4 WT1 negativas, células EL-4 pulsadas con p117-139 (EL-4 + p117), p126-134 (EL-4 + p126) y la línea de células tumorales TRAMP-C WT1 positivas. La Figura 13C muestra la actividad citotóxica de la línea de LTC tras la reestimulación con p130-138 contra EL-4, células EL-4 pulsadas con p117-139 (EL-4 + p117), p130-138 (EL-4 + p130) y la línea de células tumorales TRAMP-C WT1 positivas.

La Figura 14 representa la reactividad de los anticuerpos del suero hacia WT1 en 63 pacientes con LMA. La reactividad de los anticuerpos del suero hacia la proteína WT1/N-terminal se determinó mediante ELISA en pacientes con LMA. El primer y el segundo carril representan los controles positivos y negativos, respectivamente. Se usó el anticuerpo específico de WT1 WT180 obtenido comercialmente para el control positivo. Los siguientes 63 carriles representan los resultados mediante el uso de los sueros de cada paciente individual. Los valores de DO representados fueron del ELISA mediante el uso de una dilución de suero 1:500. La figura incluye los datos acumulados de 3 experimentos independientes.

La Figura 15 representa la reactividad de anticuerpos del suero hacia las proteínas WT1 y hacia las proteínas de control en 2 pacientes con LMA. La reactividad de los anticuerpos del suero hacia las proteínas WT1/tamaño completo, WT1/N-terminal, TRX y Ra12 se determinó mediante ELISA en 2 pacientes con LMA. Los valores de DO representados fueron de ELISA mediante el uso de una dilución de suero 1:500. LMA-1 y LMA-2 indican suero de 2 de los pacientes individuales de la Figura 1 con reactividad de anticuerpos demostrada hacia WT1/tamaño completo. La proteína WT1 de tamaño completo se expresó como una proteína de fusión con Ra12. La proteína WT1/N-terminal se expresó como una proteína de fusión con TRX. Las proteínas de control Ra12 y TRX se purificaron de una manera similar. Los resultados confirman que la reactividad de anticuerpos del suero contra las proteínas de fusión de WT1 se dirige contra las porciones de WT1 de la proteína.

La Figura 16 representa la reactividad de anticuerpos del suero hacia WT1 en 81 pacientes con LMC. La reactividad de los anticuerpos del suero hacia la proteína WT1/tamaño completo se determinó mediante ELISA en pacientes con LMA. El primer y el segundo carril representan los controles positivos y negativos, respectivamente. Se usó el anticuerpo específico de WT1 WT180 obtenido comercialmente para el control positivo. Los siguientes 81 carriles representan los resultados mediante el uso de los sueros de cada paciente individual. Los valores de DO representados fueron del ELISA mediante el uso de una dilución de suero 1:500. La figura incluye los datos acumulados de 3 experimentos independientes.

La Figura 17 representa la reactividad de anticuerpos del suero hacia las proteínas WT1 y hacia las proteínas de control en 2 pacientes con LMC. La reactividad de los anticuerpos del suero hacia las proteínas WT1/tamaño completo, WT1/N-terminal, TRX y Ra12 se determinó mediante ELISA en 2 pacientes con LMC. Los valores de DO representados fueron del ELISA mediante el uso de una dilución de suero 1:500. LMC-1 y LMC-2 indican suero de 2 de los pacientes individuales de la Figura 3 con reactividad de anticuerpos demostrada hacia WT1/tamaño completo. La proteína WT1/tamaño completo se expresó como una proteína de fusión con Ra12. La proteína WT1/N-terminal se expresó como una proteína de fusión con TRX. Las proteínas de control Ra12 y TRX se purificaron de una manera similar. Los resultados confirman que la reactividad de anticuerpos del suero contra las proteínas de fusión de WT1 se dirige contra las porciones de WT1 de la proteína.

La Figura 18 proporciona las características de las proteínas WT1 recombinantes usadas para los análisis serológicos.

La Figura 19A-19E es un gráfico de barras que representa las respuestas de anticuerpos en ratones generadas mediante la vacunación con diferentes dosis de proteína WT1.

La Figura 20A y 20B es un gráfico de barras de las respuestas de células T proliferativas en ratones inmunizados con la proteína WT1.

La Figura 21 es una fotografía de CD humanas, examinadas mediante microscopía de fluorescencia, que expresan WT1 tras la infección con WT1 en adenovirus y WT1 en virus vaccinia.

La Figura 22 es una fotografía que demuestra que la expresión de WT1 en CD humanas es reproducible tras la infección con WT1 en adenovirus, y no se induce mediante una infección con adenovirus de control.

La Figura 23 es un gráfico de un ensayo ELISPOT con IFN-\gamma que demuestra que la sensibilización in vitro con el gen completo de WT1 genera respuestas de células T específicas de WT1.

Descripción detallada de la invención

Como se indicó anteriormente, la presente invención se dirige en general a composiciones y métodos para la inmunoterapia y el diagnóstico de neoplasias malignas. Las composiciones descritas en esta memoria pueden incluir polipéptidos WT1, polinucleótidos de WT1, células presentadoras de antígenos (CPA, p.ej., células dendríticas) que expresan un polipéptido WT1, agentes tales como anticuerpos que se unen a un polipéptido WT1 y/o células del sistema inmunitario (p.ej., células T) específicas para WT1. Los polipéptidos WT1 de la presente invención comprenden en general al menos una porción de un producto del gen del tumor de Wilms (WT1) o una variante suya. Las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención comprenden en general una secuencia de ADN o de ARN que codifica todo o una porción de dicho polipéptido, o que es complementaria a dicha secuencia. Los anticuerpos son en general proteínas del sistema inmunitario, o sus fragmentos de unión al antígeno, que son capaces de unirse a una porción de un polipéptido WT1. Las células T que se pueden emplear en tales composiciones son en general células T (p.ej., CD4^{+} y/o CD8^{+}) que son específicas para un polipéptido WT1. Ciertos métodos descritos en esta memoria emplean además células presentadoras de antígenos que expresan un polipéptido WT1 tal como se proporciona en esta memoria.

La presente invención se basa en el descubrimiento de que una respuesta inmunitaria generada contra un producto del gen del tumor de Wilms (WT) (p.ej., WT1) puede proporcionar un beneficio profiláctico y/o terapéutico a los pacientes que padecen neoplasias malignas caracterizadas por la expresión incrementada del gen WT1. Tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, leucemias (p.ej., leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mieloide crónica (LMC), leucemia linfocítica aguda (LLA) y LLA infantil), así como muchos cánceres tales como los cánceres de pulmón, mama, tiroides y gastrointestinales, y melanomas. El gen WT1 se identificó y se aisló en un principio basándose en una deleción citogenética en el cromosoma 11p13 en pacientes con el tumor de Wilms (véase Call et al., patente de EE.UU. nº 5.350.840). El gen consiste en 10 exones y codifica un factor de transcripción con dedos de zinc, y las secuencias de las proteínas WT1 de ratón y humano se proporcionan en la Figura 1 y en las ID SEC Nºs: 319 y 320.

Polipéptidos WT1

En el contexto de la presente invención, un polipéptido WT1 es un polipéptido que comprende al menos una porción inmunógena de un WT1 nativo (es decir, una proteína WT1 expresada por un organismo que no está modificado genéticamente), o una variante suya, como se describe en esta memoria. Un polipéptido WT1 puede tener cualquier longitud, con tal de que comprenda al menos una porción inmunógena de una proteína nativa o una variante suya. En otras palabras, un polipéptido WT1 puede ser un oligopéptido (es decir, que consiste en un número relativamente pequeño de residuos de aminoácidos, tal como 8-10 residuos, unidos mediante enlaces peptídicos), una proteína WT1 de tamaño completo (p.ej., presente en un humano o animal no humano, tal como un ratón) o un polipéptido de tamaño intermedio. En ciertas realizaciones, se prefiere el uso de los polipéptidos WT1 que contienen un número pequeño de residuos de aminoácidos consecutivos de un polipéptido WT1 nativo. Tales polipéptidos se prefieren para ciertos usos en los que se desea la generación de una respuesta de células T. Por ejemplo, un polipéptido WT1 puede contener menos de 23, preferiblemente no más de 18, y más preferiblemente no más de 15 residuos de aminoácidos consecutivos, de un polipéptido WT1 nativo. Los polipéptidos que comprenden nueve residuos de aminoácidos consecutivos de un polipéptido WT1 nativo son en general adecuados para tales fines. Las secuencias adicionales derivadas de la proteína nativa y/o las secuencias heterólogas pueden estar presentes en cualquier polipéptido WT1, y tales secuencias pueden (pero no necesariamente) poseer propiedades inmunógenas o antigénicas adicionales. Los polipéptidos descritos en esta memoria pueden estar asociados además (de forma covalente o no covalente) con otros polipéptidos o compuestos no polipeptídicos.

Una "porción inmunógena", como se usa en esta memoria, es una porción de un polipéptido que es reconocida (es decir, se une específicamente) por un receptor de antígenos de superficie de una célula B y/o célula T. Ciertas porciones inmunógenas preferidas se unen a una molécula de clase I o clase II del MHC. Como se usa en esta memoria, se dice que una porción inmunógena "se une a" una molécula de clase I o de clase II del MHC si tal unión es detectable mediante el uso de cualquier análisis conocido en la técnica. Por ejemplo, la capacidad de un polipéptido para unirse a la clase I del MHC se puede determinar de forma indirecta mediante la monitorización de la capacidad de estimular la incorporación de \beta2-microglobulina (\beta2m) marcada con ^{125}I en complejos heterotriméricos clase I del MHC/\beta2m/péptido (véase Parker et al., J. Immunol. 152:163, 1994). De forma alternativa, se pueden emplear los análisis competitivos de péptidos funcionales que se conocen en la técnica. Ciertas porciones inmunógenas tienen una o más de las secuencias enumeradas en una o más de las Tablas II - XIV. Las porciones inmunógenas representativas incluyen, pero no se limitan a, RDLNALLPAVPSLGGGG (residuos 6-22 de WT1 humano; ID SEC Nº:1), PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE (residuos 117-139 de WT1 humano y de ratón; ID SEC Nºs: 2 y 3 respectivamente), GATLKGVAAGSSSSVKWTE (residuos 244-262 de WT1 humano; ID SEC Nº:4), GATLKGVAA (residuos 244-252 de WT1 humano; ID SEC Nº:88), CMTWNQMNL (residuos 235-243 de WT1 humano y de ratón; ID SEC Nºs: 49 y 258 respectivamente), SCLESQPTI (residuos 136-144 de WT1 de ratón; ID SEC Nº:296), SCLESQPAI (residuos 136-144 de WT1 humano; ID SEC Nº:198), NLYQMTSQL (residuos 225-233 de WT1 humano y de ratón; ID SEC Nºs: 147 y 284 respectivamente); ALLPAVSSL (residuos 10-18 de WT1 de ratón; ID SEC Nº:255); RMFPNAPYL (residuos 126-134 de WT1 humano y de ratón; ID SEC Nºs: 185 y 293 respectivamente), VLDFAPPGA (residuos 37-45 de WT1 humano; ID SEC Nº:241), o VLDFAPPGAS (residuos 37-46 de WT1 humano; ID SEC Nº:411). En esta memoria se proporcionan porciones inmunógenas adicionales, y otras se pueden identificar en general mediante el uso de técnicas conocidas, tales como las resumidas en Paul, Fundamental Immunology, 3ª ed., 243-247 (Raven Press, 1993) y las referencias citadas en ese documento. Las técnicas representativas para la identificación de porciones inmunógenas incluyen el cribado de los polipéptidos en función de la capacidad de reaccionar con antisueros y/o líneas o clones de células T específicas del antígeno. Una porción inmunógena de un polipéptido WT1 nativo es una porción que reacciona con tales antisueros y/o células T a un nivel que no es sustancialmente menor que la reactividad de WT1 de tamaño completo (p.ej., en un ELISA y/o un análisis de la reactividad de células T). En otras palabras, una porción inmunógena puede reaccionar en tales análisis a un nivel que es similar o mayor que la reactividad del polipéptido de tamaño completo. Tales cribados se pueden llevar a cabo en general mediante el uso de métodos conocidos para las personas de experiencia habitual en la técnica, tales como los descritos en Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

De forma alternativa, las porciones inmunógenas se pueden identificar mediante el uso del análisis informático, tal como con el programa Tsites (véase Rothbard y Taylor, EMBO J. 7:93-100, 1988; Deavin et al., Mol. Immunol. 33:145-155, 1996), que busca motivos peptídicos que tienen la capacidad de provocar respuestas Th. Los péptidos de LTC con motivos apropiados para la unión al MHC de clase I o clase II murino y humano se pueden identificar según BIMAS (Parker et al., J. Immunol. 152:163, 1994) y otros análisis de predicción de la unión de péptidos a HLA. Para confirmar la inmunogenicidad, un péptido se puede analizar mediante el uso de un modelo de ratón transgénico de HLA A2 y/o un ensayo de estimulación in vitro mediante el uso de células dendríticas, fibroblastos o células de sangre periférica.

Como se indicó anteriormente, una composición puede comprender una variante de una proteína WT1 nativa. Un polipéptido "variante", como se usa en esta memoria, es un polipéptido que difiere de un polipéptido nativo en una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones, de forma que la inmunogenicidad del polipéptido se mantiene (es decir, la capacidad de la variante de reaccionar con antisueros y/o líneas o clones de células T específicas del antígeno no disminuye sustancialmente respecto del polipéptido nativo). En otras palabras, la capacidad de una variante de reaccionar con antisueros y/o líneas o clones de células T específicas del antígeno se puede incrementar o puede quedar inalterada, respecto del polipéptido nativo, o se puede disminuir en menos de 50%, y preferiblemente menos de un 20%, respecto del polipéptido nativo. Tales variantes se pueden identificar en general modificando una de las secuencias polipeptídicas anteriores y determinando la reactividad del polipéptido modificado con los antisueros y/o las células T descritas en esta memoria. Se ha descubierto, en el contexto de la presente invención, que un número relativamente pequeño de sustituciones (p.ej., 1 a 3) en una porción inmunógena de un polipéptido WT1 pueden servir para incrementar la capacidad del polipéptido de generar una respuesta inmunitaria. Las sustituciones adecuadas se pueden identificar en general mediante el uso de programas informáticos, como se describió anteriormente, y el efecto se confirma basándose en la reactividad del polipéptido modificado con los antisueros y/o las células T como se describe en esta memoria. Por lo tanto, en ciertas realizaciones preferidas, un polipéptido WT1 comprende una variante en la que se sustituyen 1 a 3 residuos de aminoácidos en una porción inmunógena, de forma que la capacidad de reaccionar con los antisueros y/o las líneas o clones de células T específicas del antígeno es estadísticamente mayor que la del polipéptido sin modificar. Tales sustituciones están localizadas preferiblemente en un sitio de unión al MHC del polipéptido, que se puede identificar como se describió anteriormente. Las sustituciones preferidas permiten incrementar la unión a las moléculas de la clase I o la clase II del MHC.

Ciertas variantes contienen sustituciones conservativas. Una "sustitución conservativa" es una en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de forma que alguien experto en la técnica de la química de péptidos esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido permanezcan sustancialmente inalteradas. Las sustituciones de aminoácidos se pueden llevar a cabo en general basándose en la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia, hidrofilia y/o la naturaleza anfipática de los residuos. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos polares sin carga que tienen valores de hidrofilia similares incluyen leucina, isoleucina y valina; glicocola y alanina; asparagina y glutamina; y serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Otros grupos de aminoácidos que pueden representar cambios conservativos incluyen: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his. Una variante puede contener también, o de forma alternativa, cambios que no son conservativos. Las variantes se pueden modificar también (o de forma alternativa), por ejemplo, mediante la deleción o la adición de aminoácidos que tienen una influencia mínima sobre la inmunogenicidad, la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido.

En una realización preferida, se construye un polipéptido variante del extremo N-terminal de WT1 (aminoácidos 1-249), en el que el polipéptido variante es capaz de unirse a un anticuerpo que reconoce un polipéptido WT1 de tamaño completo y/o el extremo N-terminal de WT1. Un ejemplo no limitante de un anticuerpo es el anticuerpo anti-WT1 WT180 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA).

Como se indicó anteriormente, los polipéptidos WT1 se pueden conjugar a una secuencia señal (o líder) en el extremo N-terminal de la proteína, que dirige la transferencia de la proteína de forma co-traduccional o post-traduccional. Un polipéptido se puede conjugar también, o de forma alternativa, a una secuencia ligadora o de otro tipo para facilitar la síntesis, purificación o identificación del polipéptido (p.ej., poli-His), o para incrementar la unión del polipéptido a un soporte sólido. Por ejemplo, un polipéptido se puede conjugar a una región Fc de una inmunoglobulina.

Se pueden preparar polipéptidos WT1 mediante el uso de una diversidad de técnicas bien conocidas. Los polipéptidos recombinantes codificados por un polinucleótido de WT1 como se describe en esta memoria se pueden preparar fácilmente a partir del polinucleótido. En general, se puede emplear cualquiera de una diversidad de vectores de expresión conocidos para las personas de experiencia habitual en la técnica para expresar los polipéptidos WT1 recombinantes. La expresión se puede llevar a cabo en cualquier célula hospedadora apropiada que se ha transformado o transfectado con un vector de expresión que contiene una molécula de ADN que codifica un polipéptido recombinante. Las células hospedadoras adecuadas incluyen células procarióticas, de levaduras y eucarióticas superiores. Preferiblemente, las células hospedadoras empleadas son E. coli, levaduras o una línea de células de mamíferos tal como COS o CHO. Primero se pueden concentrar los sobrenadantes de los sistemas hospedador/vector adecuados que secretan la proteína o el polipéptido recombinante en los medios de cultivo mediante el uso de un filtro disponible comercialmente. El concentrado se puede aplicar después a una matriz de purificación adecuada tal como una matriz de afinidad o una resina de intercambio iónico. Finalmente, se puede emplear una o más etapas de HPLC en fase inversa para purificar adicionalmente el polipéptido recombinante. Tales técnicas se pueden usar para preparar los polipéptidos nativos o sus variantes. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican una variante de un polipéptido nativo se pueden preparar en general mediante el uso de técnicas de mutagénesis estándar, tales como mutagénesis específica de sitio dirigida por oligonucleótidos, y se pueden eliminar secciones de la secuencia de ADN para permitir la preparación de polipéptidos truncados.

Ciertas porciones y otras variantes se pueden generar también mediante medios sintéticos, con el uso de técnicas bien conocidas para las personas de experiencia habitual en la técnica. Por ejemplo, se pueden sintetizar polipéptidos que tienen menos de alrededor de 500 aminoácidos, preferiblemente menos de alrededor de 100 aminoácidos, y más preferiblemente menos de alrededor de 50 aminoácidos. Los polipéptidos se pueden sintetizar mediante el uso de cualquiera de las técnicas en fase sólida disponibles comercialmente, tales como el método de síntesis en fase sólida de Merrifield, en el que los aminoácidos se añaden secuencialmente a una cadena de aminoácidos en crecimiento. Véase Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963. El material para la síntesis automatizada de polipéptidos está disponible comercialmente de proveedores tales como Applied BioSystems, Inc. (Foster City, CA), y se puede utilizar según las instrucciones del fabricante.

En general, los polipéptidos y polinucleótidos descritos en esta memoria están aislados. Un polipéptido o polinucleótido "aislado" es uno que se ha extraído de su medio original. Por ejemplo, una proteína natural está aislada si está separada de parte o de todo el material coexistente en el sistema natural. Preferiblemente, tales polipéptidos tienen al menos alrededor de un 90% de pureza, más preferiblemente al menos alrededor de un 95% de pureza, y lo más preferiblemente al menos alrededor de un 99% de pureza. Se considera que un polinucleótido está aislado si, por ejemplo, está clonado en un vector que no es parte del medio natural.

En aspectos adicionales, la presente invención proporciona moléculas miméticas de los polipéptidos WT1. Tales moléculas miméticas pueden comprender aminoácidos unidos a una o más moléculas miméticas de aminoácidos (es decir, uno o más aminoácidos en la proteína WT1 pueden estar sustituidos por una molécula mimética de aminoácido), o pueden ser completamente moléculas miméticas no peptídicas. Una molécula mimética de aminoácido es un compuesto que es similar conformacionalmente a un aminoácido, de forma que se puede sustituir por un aminoácido en un polipéptido WT1 sin disminuir sustancialmente la capacidad de reaccionar con antisueros y/o líneas o clones de células T específicas del antígeno. Una molécula mimética no peptídica es un compuesto que no contiene aminoácidos, y que tiene una conformación global que es similar a un polipéptido WT1, de forma que la capacidad de la molécula mimética para reaccionar con antisueros y/o líneas o clones de células T específicas de WT1 no disminuye sustancialmente respecto de la capacidad de un polipéptido WT1. Tales moléculas miméticas se pueden diseñar basándose en técnicas estándar (p.ej., resonancia magnética nuclear y técnicas computacionales) que determinan la estructura tridimensional de una secuencia peptídica. Se pueden diseñar moléculas miméticas en las que una o más de las funciones de las cadenas laterales del polipéptido WT1 están sustituidas por grupos que no tienen necesariamente el mismo tamaño o volumen, pero que tienen propiedades químicas y/o físicas similares que producen respuestas biológicas similares. Se debería entender que, en las realizaciones descritas aquí, una molécula mimética se puede sustituir por un polipéptido WT1.

En otras realizaciones ilustrativas, un polipéptido puede ser un polipéptido de fusión que comprende múltiples polipéptidos como se describe en esta memoria, o que comprende al menos un polipéptido como se describe en esta memoria y una secuencia no relacionada, tal como una proteína tumoral conocida. La pareja de fusión, por ejemplo, puede ayudar a proporcionar epítopos colaboradores T (una pareja de fusión inmunológica), preferiblemente epítopos colaboradores T reconocidos por los humanos, o puede ayudar a expresar la proteína (un potenciador de la expresión) con un rendimiento mayor que la proteína recombinante nativa. Ciertas parejas de fusión preferidas son parejas de fusión tanto inmunológicas como potenciadoras de la expresión. Otras parejas de fusión se pueden seleccionar de forma que incrementen la solubilidad del polipéptido o permitan que el polipéptido se dirija a los compartimentos intracelulares deseados. Aún otras parejas de fusión incluyen etiquetas de afinidad, que facilitan la purificación del polipéptido.

Los polipéptidos de fusión se pueden preparar en general mediante el uso de técnicas habituales, que incluyen la conjugación química. Preferiblemente, un polipéptido de fusión se expresa en forma de un polipéptido recombinante, lo que permite la producción de niveles incrementados, respecto de un polipéptido sin fusionar, en un sistema de expresión. Brevemente, las secuencias de ADN que codifican los componentes polipeptídicos se pueden ensamblar por separado, y ligarse en un vector de expresión apropiado. El extremo 3' de la secuencia de ADN que codifica un componente polipeptídico se liga, con o sin un ligador peptídico, al extremo 5' de una secuencia de ADN que codifica el segundo componente polipeptídico, de forma que los marcos de lectura de las secuencias están en fase. Esto permite la traducción de un único polipéptido de fusión que retiene la actividad biológica de ambos componentes polipeptídicos.

Se puede emplear una secuencia peptídica ligadora para separar el primer y segundo componentes polipeptídicos una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliega en sus estructuras secundarias y terciarias. Tal secuencia polipeptídica ligadora se incorpora en el polipéptido de fusión mediante el uso de métodos habituales bien conocidos en la técnica. Las secuencias peptídicas ligadoras adecuadas se pueden elegir basándose en los siguientes factores: (1) su capacidad de adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad de adoptar una estructura secundaria que podría interaccionar con los epítopos funcionales del primer y segundo polipéptidos; y (3) la carencia de residuos hidrofóbicos o cargados que podrían reaccionar con los epítopos funcionales del polipéptido. Las secuencias peptídicas ligadoras preferidas contienen residuos de Gly, Asn y Ser. También se pueden usar otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala en la secuencia ligadora. Las secuencias de aminoácidos que se pueden emplear provechosamente como ligadores incluyen las descritas en Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986; patente de EE.UU. nº 4.935.233 y patente de EE.UU. nº 4.751.180. La secuencia ligadora en general puede tener una longitud de 1 a alrededor de 50 aminoácidos. Las secuencias ligadoras no son necesarias cuando el primer y segundo polipéptidos tienen regiones de aminoácidos N-terminales no esenciales, que se pueden usar para separar los dominios funcionales y evitar la interferencia estérica.

Las secuencias de ADN ligadas se unen de forma operable a elementos reguladores transcripcionales o traduccionales adecuados. Los elementos reguladores responsables de la expresión del ADN están localizados solamente en posición 5' de la secuencia de ADN que codifica el primer polipéptido. De forma similar, los codones de parada necesarios para finalizar la traducción y la transcripción están presentes solamente en posición 3' de la secuencia de ADN que codifica el segundo polipéptido.

El polipéptido de fusión puede comprender un polipéptido como se describe en esta memoria junto con una proteína inmunógena no relacionada, tal como una proteína inmunógena capaz de generar una respuesta de recuerdo. Los ejemplos de tales proteínas incluyen las proteínas del tétanos, tuberculosis y hepatitis (véase, por ejemplo, Stoute et al. New Engl. J. Med., 336:86-91, 1997).

En una realización preferida, la pareja de fusión inmunológica procede de Mycobacterium sp., tal como un fragmento Ra12 que procede de Mycobacterium tuberculosis. Las composiciones de Ra12 y los métodos para su uso en el incremento de la expresión y/o de la inmunogenicidad de las secuencias polinucleotídicas/polipeptídicas heterólogas se describe en la solicitud de patente de Estados Unidos 60/158.585, cuya descripción se incorpora en esta memoria como referencia en su totalidad. Brevemente, Ra12 se refiere a una región polinucleotídica que es una subsecuencia de un ácido nucleico MTB32A de Mycobacterium tuberculosis. MTB32A es una serín proteasa de un peso molecular de 32 KD codificada por un gen en cepas virulentas y avirulentas de M. tuberculosis. La secuencia nucleotídica y la secuencia de aminoácidos de MTB32A se han descrito (por ejemplo, solicitud de patente de EE.UU. 60/158.585; véase también, Skeiky et al., Infection and Immun. (1999) 67:3998-4007, incorporado en esta memoria como referencia). Los fragmentos C-terminales de la secuencia que codifica MTB32A se expresan a niveles elevados y permanecen como polipéptidos solubles en todo el proceso de purificación. Además, Ra12 puede incrementar la inmunogenicidad de los polipéptidos inmunógenos heterólogos con los que está fusionado. Un polipéptido de fusión de Ra12 preferido comprende un fragmento C-terminal de 14 KD que corresponde a los residuos de aminoácidos 192 a 323 de MTB32A. Otros polinucleótidos de Ra12 preferidos comprenden en general al menos alrededor de 15 nucleótidos consecutivos, al menos alrededor de 30 nucleótidos, al menos alrededor de 60 nucleótidos, al menos alrededor de 100 nucleótidos, al menos alrededor de 200 nucleótidos, o al menos alrededor de 300 nucleótidos que codifican una porción del polipéptido Ra12. Los polinucleótidos de Ra12 pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica un polipéptido Ra12 o una porción suya), o pueden comprender una variante de tal secuencia. Las variantes de los polinucleótidos de Ra12 pueden contener una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones, de forma que la actividad biológica del polipéptido de fusión codificado no disminuye sustancialmente respecto de un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido Ra12 nativo. Las variantes preferiblemente exhiben al menos alrededor de un 70% de identidad, más preferiblemente al menos alrededor de un 80% de identidad, y lo más preferiblemente al menos alrededor de un 90% de identidad respecto de una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido Ra12 nativo o una porción suya.

En otras realizaciones preferidas, una pareja de fusión inmunológica procede de la proteína D, una proteína de superficie de la bacteria gram negativa Haemophilus influenza B (documento WO 91/18926). Preferiblemente, un derivado de la proteína D comprende aproximadamente el primer tercio de la proteína (p.ej., los primeros 100-110 aminoácidos N-terminales), y el derivado de la proteína D puede estar lipidado. En ciertas realizaciones preferidas, los primeros 109 residuos de una pareja de fusión de lipoproteína D están incluidos en el extremo N-terminal para proporcionar al polipéptido epítopos exógenos adicionales para las células T y para incrementar el nivel de expresión en E. coli (por lo que funciona como un potenciador de la expresión). La cola lipídica asegura la presentación óptima del antígeno a las células presentadoras de antígenos. Otras parejas de fusión incluyen la proteína no estructural del virus de la gripe, NS1 (hemaglutinina). Generalmente, se usan los 81 aminoácidos N-terminales, aunque se pueden usar diferentes fragmentos que incluyen epítopos colaboradores T.

En otra realización, la pareja de fusión inmunológica es la proteína conocida como LYTA, o una porción suya (preferiblemente, una porción C-terminal). LYTA procede de Streptococcus pneumoniae, que sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa conocida como amidasa LYTA (codificada por el gen LytA; Gene 43:265-292, 1986). LYTA es una autolisina que degrada específicamente ciertos enlaces del esqueleto de peptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína LYTA es responsable de la afinidad hacia la colina o hacia ciertos análogos de colina tales como DEAE. Esta propiedad se ha aprovechado para el desarrollo de plásmidos que expresan C-LYTA en E. coli útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LYTA en el extremo aminoterminal (véase Biotechnology 10:795-798, 1992). En una realización preferida, se puede incorporar una porción repetida de LYTA en un polipéptido de fusión. Se halla una porción repetida en la región C-terminal comenzando en el residuo 178. Una porción repetida particularmente preferida incorpora los residuos 188-305.

Aún otra realización ilustrativa implica los polipéptidos de fusión, y los polinucleótidos que los codifican, en los que la pareja de fusión comprende una señal de selección de objetivo capaz de dirigir un polipéptido hacia del compartimento endosómico/lisosómico, como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.633.234. Un polipéptido inmunógeno de la invención, cuando se fusiona a su señal de selección de objetivo, se asociará de forma más eficaz a las moléculas de clase II del MHC, y por lo tanto proporcionará una estimulación in vivo incrementada de las células T CD4^{+} específicas del polipéptido.

La invención proporciona formas truncadas de los polipéptidos WT1 que se pueden expresar de forma recombinante en E. coli sin la adición de una pareja de fusión. Los ejemplos de estas formas truncadas se muestran en las ID SEC Nºs: 342-346, y están codificadas por polinucleótidos mostrados en las ID SEC Nºs:337-341. En las variaciones de estos truncamientos, los primeros 76 aminoácidos de WT1 pueden estar fusionados al extremo C-terminal de la proteína, por lo que se crea una proteína recombinante que es más fácil de expresar en E. coli. También se pueden usar otros hospedadores además de E. coli, tales como, por ejemplo, B. megaterium. La proteína se puede preparar además sin una etiqueta de histidinas.

En otras realizaciones, las diferentes subunidades se pueden producir y fusionar entre sí en un orden que difiere del de WT1 nativo. Además, las fusiones se pueden hacer, por ejemplo, con Ra12. Las proteínas de fusión ejemplares se muestran en las ID SEC Nºs: 332-336, y pueden estar codificadas por los polinucleótidos mostrados en las ID SEC Nºs: 327-331.

Polinucleótidos de WT1

Cualquier polinucleótido que codifica un polipéptido WT1 como se describe en esta memoria es un polinucleótido de WT1 abarcado por la presente invención. Tales polinucleótidos pueden ser monocatenarios (codificantes o complementarios) o bicatenarios, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, cADN o sintético) o ARN. Puede haber presentes, pero no necesariamente, secuencias codificantes o no codificantes adicionales en un polinucleótido de la presente invención, y el polinucleótido puede estar unido, pero no necesariamente, a otras moléculas y/o materiales de soporte.

Los polinucleótidos de WT1 pueden codificar una proteína WT1 nativa, o pueden codificar una variante de WT1 como se describe en esta memoria. Las variantes polinucleotídicas pueden contener una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones, de forma que la inmunogenicidad del polipéptido codificado no disminuye respecto de la proteína WT1 nativa. En efecto de la inmunogenicidad del polipéptido codificado se puede determinar en general como se describe en esta memoria. Las variantes preferidas contienen sustituciones, deleciones, inserciones y/o adiciones de nucleótidos en no más de un 20%, preferiblemente no más de un 10%, de las posiciones nucleotídicas que codifican una porción inmunógena de una secuencia de WT1 nativa. Ciertas variantes son sustancialmente homólogas a un gen nativo, o a una porción suya. Tales variantes polinucleotídicas son capaces de hibridar en condiciones moderadamente rigurosas con una secuencia de ADN natural que codifica un polipéptido WT1 (o una secuencia complementaria). Las condiciones moderadamente rigurosas adecuadas incluyen el prelavado en una disolución de SSC 5X, 0,5% de SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0); la hibridación a 50ºC-65ºC, SSC 5X, durante la noche; seguido por el lavado dos veces a 65ºC durante 20 minutos con SSC 2X, 0,5X y 0,2X que contiene un 0,1% de SDS). Tales secuencias de ADN de hibridación están también dentro del alcance de esta invención.

Las personas de experiencia habitual en la técnica apreciarán que, como resultado de la degeneración del código genético, hay muchas secuencias nucleotídicas que codifican un polipéptido WT1. Algunos de estos polinucleótidos albergan una homología mínima con la secuencia nucleotídica de cualquier gen nativo. Sin embargo, los polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso de los códones están contemplados específicamente por la presente invención.

Una vez que se ha identificado una porción inmunógena de WT1, como se describió anteriormente, se puede preparar un polinucleótido de WT1 mediante el uso de una diversidad de técnicas. Por ejemplo, un polinucleótido de WT1 se puede amplificar a partir de cADN preparado a partir de células que expresan WT1. Tales polinucleótidos se pueden amplificar por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para esta aproximación, se pueden diseñar cebadores específicos de secuencia basándose en la secuencia de la porción inmunógena, y se pueden adquirir o sintetizar. Por ejemplo, los cebadores adecuados para la amplificación mediante PCR de un gen WT1 humano incluyen: primera etapa - P118: 1434-1414: 5' GAG AGT CAG ACT TGA AAG CAGT 3' (ID SEC Nº:5) y P135: 5' CTG AGC CTC AGC AAA TGG GC 3' (ID SEC Nº:6); segunda etapa - P136: 5' GAG CAT GCA TGG GCT CCG ACG TGC GGG 3' (ID SEC Nº:7) y P137: 5' GGG GTA CCC ACT GAA CGG TCC CCG A 3' (ID SEC Nº:8). Los cebadores para la amplificación mediante PCR de un gen WT1 de ratón incluyen: primera etapa - P138: 5' TCC GAG CCG CAC CTC ATG 3' (ID SEC Nº:9) y P139: 5' GCC TGG GAT GCT GGA CTG 3' (ID SEC Nº:10), segunda etapa - P140: 5' GAG CAT GCG ATG GGT TCC GAC GTG CGG 3' (ID SEC Nº:11) y P141: 5' GGG GTA CCT CAA AGC GCC ACG TGG AGT TT 3' (ID SEC Nº:12).

Una porción amplificada se puede usar después para aislar un gen de tamaño completo a partir de una biblioteca de ADN genómico humano o a partir de una biblioteca de cADN adecuada, mediante el uso de técnicas conocidas. De forma alternativa, se puede construir un gen de tamaño completo a partir de múltiples fragmentos de PCR. Los polinucleótidos de WT1 se pueden preparar también sintetizando componentes oligonucleotídicos, y ligando los componentes entre sí para generar el polinucleótido completo.

Los polinucleótidos de WT1 se pueden sintetizar también mediante cualquier método conocido en la técnica, que incluye la síntesis química (p.ej., síntesis química mediante fosforamidita en fase sólida). También se pueden introducir modificaciones en una secuencia polinucleotídica mediante el uso de técnicas de mutagénesis habituales, tales como la mutagénesis específica de sitio dirigida por oligonucleótidos (véase Adelman et al., DNA 2:183, 1983). De forma alternativa, se pueden generar moléculas de ARN mediante la transcripción in vitro o in vivo de secuencias de ADN que codifican un polipéptido WT1, con tal de que el ADN esté incorporado en un vector con un promotor adecuado para la ARN polimerasa (tal como T7 o SP6). Se pueden usar ciertas porciones para preparar un polipéptido codificado, como se describe en esta memoria. Además, o de forma alternativa, se puede administrar una porción a un paciente de forma que el polipéptido codificado se genere in vivo (p.ej., transfectando células presentadoras de antígenos, tales como células dendríticas, con una construcción de cADN que codifica un polipéptido WT1, y administrando las células transfectadas al paciente).

Los polinucleótidos que codifican un polipéptido WT1 se pueden usar en general para la producción del polipéptido, in vitro o in vivo. Los polinucleótidos de WT1 que son complementarios a una secuencia codificante (es decir, polinucleótidos complementarios) se pueden usar también como una sonda o para inhibir la expresión de WT1. Las construcciones de cADN que se pueden transcribir a ARN complementario se pueden introducir también en células de tejidos para facilitar la producción del ARN complementario.

Cualquier polinucleótido se puede modificar adicionalmente para incrementar la estabilidad in vivo. Las modificaciones posibles incluyen, pero no se limitan a, la adición de secuencias flanqueantes en los extremos 5' y/o 3'; el uso de fosforotioato o 2'-O-metilo en vez de enlaces de fosfodiesterasa en el esqueleto; y/o la inclusión de bases no tradicionales tales como inosina, queosina y wybutosina, así como acetil- metil-, tio- y otras formas modificadas de adenina, citidina, guanina, timina y uridina.

Las secuencias nucleotídicas descritas en esta memoria se pueden unir a una diversidad de otras secuencias nucleotídicas mediante el uso de técnicas establecidas de ADN recombinante. Por ejemplo, se puede clonar un polinucleótido en cualquiera de una diversidad de vectores de clonado, que incluyen plásmidos, fagémidos, derivados de fago \lambda y cósmidos. Los vectores de interés particular incluyen los vectores de expresión, los vectores de replicación, los vectores de generación de sondas y los vectores de secuenciación. En general, un vector contendrá un origen de replicación funcional en al menos un organismo, sitios para endonucleasas de restricción adecuadas y uno o más marcadores seleccionables. Otros elementos dependerán del uso deseado, y serán evidentes para las personas de experiencia habitual en la técnica.

En ciertas realizaciones, los polinucleótidos se pueden formular para permitir la entrada en una célula de un mamífero, y la expresión en ella. Tales formulaciones son particularmente útiles para fines terapéuticos, como se describe más adelante. Las personas de experiencia habitual en la técnica apreciarán que hay muchas maneras de conseguir la expresión de un polinucleótido en una célula seleccionada como objetivo, y se puede emplear cualquier método adecuado. Por ejemplo, se puede incorporar un polinucleótido en un vector viral tal como, pero sin limitarse a, adenovirus, virus adenoasociado, retrovirus, o virus vaccinia u otro poxvirus (p.ej., virus de la viruela aviar). Las personas de experiencia habitual en la técnica conocen bien los métodos para la incorporación de ADN en tales vectores. Un vector retroviral puede transferir o incorporar adicionalmente un gen de un marcador seleccionable (para ayudar en la identificación o la selección de las células transducidas) y/o un resto de selección de objetivo, tal como un gen que codifica un ligando para un receptor en una célula específica seleccionada como objetivo, para hacer que el vector sea específico del objetivo. La selección del objetivo también se puede llevar a cabo mediante el uso de un anticuerpo, mediante métodos conocidos para las personas de experiencia habitual en la técnica. Las construcciones de cADN en tal vector se pueden usar, por ejemplo, para transfectar líneas de células humanas o animales para el uso en el establecimiento de modelos tumorales WT1 positivos, que se pueden usar para llevar a cabo la protección contra el tumor, y experimentos de inmunoterapia adoptiva para demostrar la inhibición del crecimiento del tumor o de la leucemia o la lisis de tales células.

Otras formulaciones terapéuticas para los polinucleótidos incluyen sistemas de dispersión coloidales, tales como complejos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas, esferas, y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones aceite en agua, micelas, micelas mixtas, y liposomas. Un sistema coloidal preferido para el uso como vehículo de administración in vitro e in vivo es un liposoma (es decir, una vesícula de membrana artificial). La preparación y el uso de tales sistemas se conocen bien en la técnica.

Anticuerpos y sus fragmentos

La presente invención también proporciona agentes de unión, tales como anticuerpos y sus fragmentos de unión al antígeno, que se unen específicamente a un polipéptido WT1. Como se usa en esta memoria, se dice que un agente "se une específicamente" a un polipéptido WT1 si reacciona a un nivel detectable (por ejemplo, en un ELISA) con un polipéptido WT1, y no reacciona de forma detectable con proteínas no relacionadas en condiciones similares. Como se usa en esta memoria, la "unión" se refiere a una asociación no covalente entre dos moléculas distintas, de manera que se forma un "complejo". La capacidad de unirse se puede estudiar, por ejemplo, determinando una constante de unión para la formación del complejo. La constante de unión es el valor obtenido cuando la concentración del complejo se divide por el producto de las concentraciones de los componentes. En general, se dice que dos compuestos "se unen", en el contexto de la presente invención, cuando la constante de unión para la formación del complejo supera aproximadamente 10^{3} L/mol. La constante de unión se puede determinar mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica.

Cualquier agente que satisfaga los requisitos anteriores puede ser un agente de unión. En una realización preferida, un agente de unión es un anticuerpo o un fragmento suyo de unión al antígeno. Ciertos anticuerpos están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). De forma alternativa, los anticuerpos se pueden preparar mediante cualquiera de una diversidad de métodos conocidos para las personas de experiencia habitual en la técnica. Véase, p.ej., Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En general, los anticuerpos se pueden producir mediante técnicas de cultivo celular, que incluyen la generación de anticuerpos monoclonales como se describe en esta memoria, o por medio de la transfección de genes de anticuerpos en hospedadores celulares bacterianos o mamíferos adecuados, para permitir la producción de los anticuerpos recombinantes. En una técnica, se inyecta inicialmente un inmunógeno que comprende el polipéptido en cualquiera de una amplia variedad de mamíferos (p.ej., ratones, ratas, conejos, ovejas o cabras). En esta etapa, los polipéptidos de esta invención pueden servir como inmunógeno sin modificación. De forma alternativa, en especial para polipéptidos relativamente cortos, se puede generar una respuesta inmunitaria superior si el polipéptido se une a una proteína portadora, tal como albúmina de suero bovino o hemocianina de lapa californiana. El inmunógeno se inyecta en el hospedador animal, preferiblemente según un calendario predeterminado que incorpora una o más inmunizaciones de refuerzo, y se extrae sangre a los animales periódicamente. Los anticuerpos policlonales específicos para el polipéptido se pueden purificar después a partir de tales antisueros, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad con el uso del polipéptido acoplado a un soporte sólido adecuado.

Los anticuerpos monoclonales específicos para el polipéptido antigénico de interés se pueden preparar, por ejemplo, mediante el uso de la técnica de Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976, y las mejoras de la misma. Brevemente, estos métodos implican la preparación de líneas celulares inmortales capaces de producir anticuerpos que tienen la especificidad deseada (es decir, reactividad con el polipéptido de interés). Tales líneas celulares se pueden producir, por ejemplo, a partir de células de bazo obtenidas de un animal inmunizado como se describió anteriormente. Las células de bazo se hacen inmortales después, por ejemplo, mediante fusión con una pareja de fusión de célula de mieloma, preferiblemente una que es singénica con el animal inmunizado. Se puede emplear una diversidad de técnicas de fusión. Por ejemplo, las células de bazo y las células de mieloma se pueden combinar con un detergente no iónico durante unos minutos, y después se colocan en placas a una densidad baja en un medio selectivo que mantiene el crecimiento de las células híbridas, pero no el de las células de mieloma. Una técnica de selección preferida usa la selección mediante HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Tras un tiempo suficiente, normalmente alrededor de 1 a 2 semanas, se observan colonias de híbridos. Se seleccionan las colonias independientes, y se analiza en los sobrenadantes de sus cultivos la actividad de unión hacia el polipéptido. Se prefieren los hibridomas que tienen una reactividad y especificidad elevadas.

Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar de los sobrenadantes de las colonias de hibridomas en cultivo. Además, se pueden emplear diversas técnicas para incrementar el rendimiento, tales como la inyección de la línea celular de hibridoma en la cavidad peritoneal de un hospedador vertebrado adecuado, tal como un ratón. Los anticuerpos monoclonales se pueden recoger después del líquido ascítico o de la sangre. Los contaminantes se pueden eliminar de los anticuerpos mediante técnicas convencionales, tales como cromatografía, filtración en gel, precipitación y extracción. Los polipéptidos de esta invención se pueden usar en el proceso de purificación, por ejemplo, en una etapa de cromatografía de afinidad.

En ciertas realizaciones, se puede preferir el uso de fragmentos de unión al antígeno de los anticuerpos. Tales fragmentos incluyen los fragmentos Fab, que se pueden preparar mediante el uso de técnicas habituales. Brevemente, las inmunoglobulinas se pueden purificar a partir de suero de conejo mediante cromatografía de afinidad en columnas de esferas de proteína A (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), y digerirlas mediante papaína para producir los fragmentos Fab y Fc. Los fragmentos Fab y Fc se pueden separar mediante cromatografía de afinidad en columnas de esferas de proteína A.

Los anticuerpos monoclonales y sus fragmentos se pueden acoplar a uno o más agentes terapéuticos. Los agentes terapéuticos, a este respecto, incluyen trazadores radiactivos y agentes quimioterápicos, que se pueden usar, por ejemplo, para purgar la médula ósea autóloga in vitro. Los agentes terapéuticos representativos incluyen radionucleidos, inductores de la diferenciación, fármacos, toxinas, y sus derivados. Los radionucleidos preferidos incluyen ^{90}Y, ^{123}I, ^{125}I, ^{131}I, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{211}At y ^{212}Bi. Los fármacos preferidos incluyen metotrexato, y los análogos de pirimidina y purina. Los inductores de la diferenciación preferidos incluyen ésteres de forbol y ácido butírico. Las toxinas preferidas incluyen ricina, abrina, toxina de la difteria, toxina del cólera, gelonina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de Shigella, y proteína antiviral de Phytolacca. Para fines diagnósticos, se puede usar el acoplamiento de agentes radiactivos para facilitar la localización de las metástasis o para determinar la localización de tumores WT1 positivos.

Un agente terapéutico se puede acoplar (p.ej., unir de forma covalente) a un anticuerpo monoclonal adecuado directa o indirectamente (p.ej., por medio de un grupo ligador). Una reacción directa entre un agente y un anticuerpo es posible cuando cada uno posee un sustituyente capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleófilo, tal como un grupo amino o sulfhidrilo, en uno de ellos puede ser capaz de reaccionar con un grupo que contenga un carbonilo, tal como un anhídrido o un haluro de ácido, o con un grupo alquilo que contenga un grupo saliente adecuado (p.ej., un haluro) en el otro.

De forma alternativa, puede ser deseable acoplar un agente terapéutico y un anticuerpo por medio de un grupo ligador. Un grupo ligador puede funcionar como espaciador para distanciar el anticuerpo del agente para evitar la interferencia con la capacidad de unión. El grupo ligador puede servir también para incrementar la reactividad química de un sustituyente en un agente o un anticuerpo, y así incrementar la eficacia del acoplamiento. Un incremento de la reactividad química puede facilitar también el uso de agentes, o grupos funcionales de los agentes, que de otra manera no sería posible.

Será evidente para los expertos en la técnica que se puede emplear una diversidad de reactivos bifuncionales o polifuncionales, tanto homo- como hetero-funcionales (tales como los descritos en el catálogo de Pierce Chemical Co., Rockford, IL), como grupo ligador. El acoplamiento se puede llevar a cabo, por ejemplo, por medio de grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo o residuos de carbohidratos oxidados. Existen numerosas referencias que describen tales metodologías, p.ej., en la patente de EE.UU. nº 4.671.958, de Rodwell et al.

Cuando un agente terapéutico es más potente cuando está libre de la porción de anticuerpo de los inmunoconjugados de la presente invención, puede ser deseable usar un grupo ligador que sea escindible durante o tras la interiorización en una célula. Se han descrito varios grupos ligadores escindibles diferentes. Los mecanismos para la liberación intracelular de un agente de estos grupos ligadores incluyen la escisión mediante la reducción de un enlace disulfuro (p.ej., la patente de EE.UU. nº 4.489.710, de Spitler), mediante la irradiación de un enlace fotolábil (p.ej., la patente de EE.UU. nº 4.625.014, de Senter et al.), mediante la hidrólisis de las cadenas laterales de aminoácidos derivatizados (p.ej., la patente de EE.UU. nº 4.638.045, de Kohn et al.), mediante la hidrólisis mediada por el complemento sérico (p.ej., la patente de EE.UU. nº 4.671.958, de Rodwell et al.), y la hidrólisis catalizada por ácidos (p.ej., la patente de EE.UU. nº 4.569.789, de Blattler et al.).

Puede ser deseable acoplar más de un agente a un anticuerpo. En una realización, se acoplan múltiples moléculas de un agente a una molécula de anticuerpo. En otra realización, se puede acoplar más de un tipo de agente a un anticuerpo. Independientemente de la realización particular, se pueden preparar los inmunoconjugados con más de un agente de varias formas. Por ejemplo, se puede acoplar más de un agente directamente a una molécula de anticuerpo, o se pueden usar ligadores que proporcionan sitios múltiples para la unión. De forma alternativa, se puede usar un portador. Un portador puede albergar los agentes de varias formas, que incluyen la unión covalente directa o por medio de un grupo ligador. Los portadores adecuados incluyen proteínas tales como albúminas (p.ej., la patente de EE.UU. nº 4.507.234, de Kato et al.), péptidos y polisacáridos tales como aminodextrano (p.ej., la patente de EE.UU. nº 4.699.784, de Shih et al.). Un portador puede albergar también un agente mediante unión no covalente o mediante encapsulación, tal como dentro de una vesícula liposómica (p.ej., las patentes de EE.UU. nºs 4.429.008 y 4.873.088). Los portadores específicos para agentes de radionucleidos incluyen las moléculas pequeñas radiohalogenadas y los compuestos quelantes. Por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.735.792 describe moléculas pequeñas radiohalogenadas representativas y su síntesis. Se puede formar un quelato de radionucleido a partir de compuestos quelantes que incluyen los que contienen átomos de nitrógeno y azufre como átomos donantes para la unión del radionucleido metálico, u óxido del metal. Por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.673.562, de Davison et al., describe compuestos quelantes representativos y su síntesis.

Se puede usar una diversidad de vías de administración para los anticuerpos y los inmunoconjugados. Generalmente, la administración será intravenosa, intramuscular, subcutánea o en el lecho de un tumor resecado. Será evidente que la dosis precisa del anticuerpo/inmunoconjugado variará dependiendo del anticuerpo usado, la densidad del antígeno en el tumor, y la velocidad de eliminación del anticuerpo.

También se proporcionan en esta memoria anticuerpos anti-idiotípicos que imitan la porción inmunógena de WT1. Tales anticuerpos se pueden generar contra un anticuerpo, o su fragmento de unión al antígeno, que se une específicamente a una porción inmunógena de WT1, mediante el uso de técnicas bien conocidas. Los anticuerpos anti-idiotípicos que imitan una porción inmunógena de WT1 son aquellos anticuerpos que se unen a un anticuerpo, o su fragmento de unión al antígeno, que se une específicamente a una porción inmunógena de WT1, como se describe en esta memoria.

Células T

Las composiciones inmunoterapéuticas pueden comprender también, o de forma alternativa, células T específicas para WT1. Tales células se pueden preparar en general in vitro o ex vivo, mediante el uso de procedimientos habituales. Por ejemplo, las células T pueden estar presentes en (o aislarse de) médula ósea, sangre periférica o una fracción de médula ósea o de sangre periférica de un mamífero, tal como un paciente, mediante el uso de un sistema de separación de células disponible comercialmente, tal como el sistema CEPRATE^{TM}, disponible de CellPro Inc., Bothell WA (véase también la patente de EE.UU. nº 5.240.856; la patente de EE.UU. nº 5.215.926; los documentos WO 89/06280; WO 91/16116 y WO 92/07243). De forma alternativa, las células T pueden proceder de humanos relacionados o no relacionados, animales no humanos, líneas celulares o cultivos.

Las células T se pueden estimular con un polipéptido WT1, un polinucleótido que codifica un polipéptido WT1 y/o una célula presentadora de antígenos (CPA) que expresa un polipéptido WT1. Tal estimulación se lleva a cabo en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la generación de células T que son específicas para el polipéptido WT1. Preferiblemente, un polipéptido o polinucleótido de WT1 está presente en un vehículo de administración, tal como una microesfera, para facilitar la generación de células T específicas de antígenos. Brevemente, las células T, que se pueden aislar de un paciente o de un donante relacionado o no relacionado mediante técnicas rutinarias (tales como centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll/Hypaque de linfocitos de sangre periférica), se incuban con polipéptido WT1. Por ejemplo, las células T se pueden incubar in vitro durante 2-9 días (generalmente 4 días) a 37ºC con polipéptido WT1 (p.ej., 5 a 25 \mug/ml), o con células que sintetizan una cantidad comparable de polipéptido WT1. Puede ser deseable incubar por separado una alícuota de una muestra de células T en ausencia de polipéptido WT1 para que sirva como control.

Se considera que las células T son específicas para un polipéptido WT1 si las células T destruyen células seleccionadas como objetivo revestidas con un polipéptido WT1 o que expresan un gen que codifica tal polipéptido. La especificidad de las células T se puede determinar mediante el uso de una diversidad de técnicas habituales. Por ejemplo, en un análisis de liberación de cromo o en un análisis de proliferación, un índice de estimulación con un incremento de más del doble en la lisis y/o la proliferación, en comparación con los controles negativos, indica la especificidad de las células T. Tales ensayos se pueden llevar a cabo, por ejemplo, como se describió en Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994. De forma alternativa, la detección de la proliferación de las células T se puede llevar a cabo mediante una diversidad de técnicas conocidas. Por ejemplo, la proliferación de las células T se puede detectar midiendo una velocidad incrementada de síntesis de ADN (p.ej., marcando de forma pulsátil cultivos de células T con timidina tritiada y midiendo la cantidad de timidina tritiada incorporada en el ADN). Otras maneras de detectar la proliferación de las células T incluye medir los incrementos de la producción de interleucina-2 (IL-2), el flujo de Ca^{2+}, o la absorción de colorante, tal como 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio. De forma alternativa, se puede medir la síntesis de linfocinas (tales como interferón-\gamma), o se puede cuantificar el número relativo de células T que pueden responder a un polipéptido WT1. El contacto con un polipéptido WT1 (200 ng/ml - 100 \mug/ml, preferiblemente 100 ng/ml - 25 \mug/ml) durante 3 - 7 días debería dar como resultado un incremento de al menos el doble en la proliferación de las células T, y/o el contacto como se describió anteriormente durante 2-3 horas debería dar como resultado la activación de las células T, medida mediante el uso de ensayos de citocinas habituales en los que un incremento del doble del nivel de liberación de citocinas (p.ej., TNF o IFN-\gamma) es indicativo de la activación de las células T (véase Coligan et al., Current Protocols in Immunology, vol. 1, Wiley Interscience (Greene 1998)). Las células T específicas de WT1 se pueden expandir mediante el uso de técnicas habituales. En las realizaciones preferidas, las células T proceden de un paciente o de un donante relacionado o no relacionado, y se administran al paciente tras la estimulación y la expansión.

Las células T que se han activado en respuesta a un polipéptido WT1, polinucleótido o CPA que expresa WT1, pueden ser CD4^{+} y/o CD8^{+}. La activación específica de las células T CD4^{+} o CD8^{+} se puede detectar de una diversidad de maneras. Los métodos para detectar la activación de células T específicas incluyen detectar la proliferación de las células T, la producción de citocinas (p.ej., linfocinas), o la generación de actividad citolítica (es decir, la generación de células T citotóxicas específicas para WT1). Para las células T CD4^{+}, un método preferido para detectar la activación de las células T específicas es la detección de la proliferación de las células T. Para las células T CD8^{+}, un método preferido para detectar la activación de las células T específicas es la detección de la generación de actividad citolítica.

Para fines terapéuticos, las células T CD4^{+} o CD8^{+} que proliferan en respuesta al polipéptido WT1, polinucleótido o CPA, se pueden expandir en número in vitro o in vivo. La proliferación de tales células T in vitro se puede llevar a cabo de una diversidad de maneras. Por ejemplo, las células T se pueden volver a exponer al polipéptido WT1, con o sin la adición de factores de crecimiento de células T, tales como interleucina-2, y/o células estimuladoras que sintetizan un polipéptido WT1. La adición de células estimuladoras se prefiere cuando se están generando respuestas de células T CD8^{+}. Las células T se pueden cultivar en gran número in vitro con la retención de la especificidad en respuesta a la reestimulación intermitente con polipéptido WT1. Brevemente, para la estimulación in vitro (EIV) primaria, se puede colocar un gran número de linfocitos (p.ej., más de 4 x 10^{7}) en matraces con medios que contienen suero humano. El polipéptido WT1 (p.ej., polipéptido a 10 \mug/ml) se puede añadir directamente, junto con toxoide tetánico (p.ej., 5 \mug/ml). Los matraces se pueden incubar después (p.ej., a 37ºC durante 7 días). Para una segunda EIV, las células T se recogen después y se colocan en matraces nuevos con 2-3 x 10^{7} células mononucleares de sangre periférica irradiadas. El polipéptido WT1 (p.ej., 10 \mug/ml) se añade directamente. Los matraces se incuban a 37ºC durante 7 días. En el día 2 y el día 4 después de la segunda EIV, se pueden añadir 2-5 unidades de interleucina-2 (IL-2). Para una tercera EIV, las células T se pueden colocar en pocillos y se pueden estimular con las propias células B del individuo transformadas con VEB revestidas con el polipéptido. Se puede añadir IL-2 en los días 2 y 4 de cada ciclo. Tan pronto como se demuestre que las células son células T citotóxicas específicas, se pueden expandir mediante el uso de un ciclo de estimulación de 10 días con más IL-2 (20 unidades) en los días 2, 4 y 6.

De forma alternativa, se puede expandir el número de una o más células T que proliferan en presencia de un polipéptido WT1 mediante clonado. Los métodos para clonar células se conocen bien en la técnica, e incluyen la dilución limitante. Las células T que responden se pueden purificar a partir de la sangre periférica de pacientes sensibilizados mediante centrifugación en gradiente de densidad y formación de rosetas con eritrocitos de oveja, y se pueden establecer en cultivo mediante la estimulación con el antígeno nominal en presencia de células de soporte autólogas irradiadas. Para generar líneas de células T CD4^{+}, se usa el polipéptido WT1 como estímulo antigénico, y se usan linfocitos de sangre periférica (LSP) autólogos o líneas de células linfoblastoides (LCL) inmortalizadas mediante infección con el virus de Epstein Barr como células presentadoras de antígenos. Para generar líneas de células T CD8^{+}, se pueden usar células presentadoras de antígenos autólogas transfectadas con un vector de expresión que produce el polipéptido WT1 como células estimuladoras. Las líneas de células T establecidas se pueden clonar 2-4 días después de la estimulación con el antígeno colocando en placas las células T estimuladas a una frecuencia de 0,5 células por pocillo en placas de 96 pocillos de fondo plano con 1 x 10^{6} células LSP o LCL irradiadas e interleucina-2 recombinante (rIL2) (50 U/ml). Los pocillos con crecimiento clonal establecido se pueden identificar aproximadamente 2-3 semanas tras la colocación inicial en las placas, y se pueden reestimular con un antígeno apropiado en presencia de células presentadoras de antígenos autólogas, y después expandirlas posteriormente mediante la adición de dosis bajas de rIL2 (10 U/ml) 2-3 días tras la estimulación con el antígeno. Los clones de células T se pueden mantener en placas de 24 pocillos mediante la reestimulación periódica con antígeno y rIL2 aproximadamente cada dos semanas.

En ciertas realizaciones, las células T alogénicas se pueden sensibilizar (es decir, sensibilizar hacia WT1) in vivo y/o in vitro. La sensibilización se puede llevar a cabo poniendo en contacto las células T con un polipéptido WT1, un polinucleótido que codifica tal polipéptido o una célula que produce tal polipéptido en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la sensibilización de las células T. En general, se considera que las células T están sensibilizadas si, por ejemplo, el contacto con un polipéptido WT1 da como resultado la proliferación y/o la activación de las células T, tal como se mide mediante los análisis de proliferación estándar, de liberación de cromo y/o de liberación de citocinas, como se describe en esta memoria. Un índice de estimulación con un incremento de más del doble en la proliferación o en la lisis, y con un incremento de más del triple en el nivel de citocinas, en comparación con los controles negativos, indica la especificidad de las células T. Las células sensibilizadas in vitro se pueden emplear, por ejemplo, en un trasplante de médula ósea o como infusión de linfocitos de donantes.

Las células T específicas para WT1 pueden destruir células que expresan la proteína WT1. La introducción de genes que codifican las cadenas de los receptores de células T (TCR) para WT1 se usa como un medio para mejorar cuantitativamente y cualitativamente las respuestas hacia las células de leucemia y de cáncer que albergan WT1. Las vacunas para incrementar el número de células T que pueden reaccionar con las células WT1 positivas son un método de seleccionar como objetivo las células que albergan WT1. La terapia con células T específicas para WT1 es otro método. Un método alternativo es introducir las cadenas de los TCR específicos para WT1 en las células T y en otras células con capacidad lítica. En una realización adecuada, las cadenas \alpha y \beta de los TCR se clonan a partir de una línea de células T específicas de WT1, y se usan para la terapia adoptiva con células T, tal como se describe en el documento WO96/30516, incorporado en esta memoria como referencia.

Composiciones farmacéuticas y vacunas

En ciertos aspectos, los polipéptidos, polinucleótidos, anticuerpos y/o células T se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas o vacunas. De forma alternativa, una composición farmacéutica puede comprender una célula presentadora de antígenos (p.ej., una célula dendrítica) transfectada con un polinucleótido de WT1, de forma que la célula presentadora de antígenos expresa un polipéptido WT1. Las composiciones farmacéuticas comprenden uno o más de tales compuestos o células y un vehículo o excipiente fisiológicamente aceptable. Ciertas vacunas pueden comprender uno o más de tales compuestos o células y un potenciador de la respuesta inmunitaria inespecífico, tal como un adyuvante o un liposoma (en el cual se incorpora el compuesto). Las composiciones farmacéuticas y las vacunas pueden contener además un sistema de administración, tal como las microesferas biodegradables que se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. nºs 4.897.268 y 5.075.109. Las composiciones farmacéuticas y las vacunas dentro del alcance de la presente invención pueden contener también otros compuestos, que pueden ser biológicamente activos o inactivos.

En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y las vacunas están diseñadas para generar respuestas de células T específicas para un polipéptido WT1 en un paciente, tal como un humano. En general, las respuestas de células T se pueden favorecer por medio del uso de polipéptidos relativamente cortos (p.ej., que comprenden menos de 23 residuos de aminoácidos consecutivos de un polipéptido WT1 nativo, preferiblemente 4-16 residuos consecutivos, más preferiblemente 8-16 residuos consecutivos y aún más preferiblemente 8-10 residuos consecutivos). De forma alternativa, o además, una vacuna puede comprender un potenciador de la respuesta inmunitaria inespecífico que incrementa preferentemente una respuesta de células T. En otras palabras, el potenciador de la respuesta inmunitaria puede incrementar el nivel de una respuesta de células T hacia un polipéptido WT1 en una cantidad que es proporcionalmente superior que la cantidad en la que se incrementa una respuesta de anticuerpos. Por ejemplo, cuando se compara con un adyuvante basado en aceite estándar, tal como CFA, un potenciador de la respuesta inmunitaria que incrementa preferentemente una respuesta de células T puede incrementar una respuesta proliferativa de células T en al menos el doble, una respuesta lítica en al menos un 10%, y/o la activación de las células T en al menos el doble, en comparación con las líneas de células de control WT1-negativas, a la vez que no incrementa de manera detectable una respuesta de anticuerpos. La cantidad en la que se incrementa una respuesta de células T o de anticuerpos hacia un polipéptido WT1 se puede determinar en general mediante el uso de cualquier método representativo conocido en la técnica, tal como los métodos proporcionados en esta memoria.

Una composición farmacéutica o vacuna puede contener ADN que codifica uno o más de los polipéptidos descritos anteriormente, de forma que el polipéptido se genera in situ. Como se indicó anteriormente, el ADN puede estar presente en cualquiera de una diversidad de sistemas de administración conocidos para las personas de experiencia habitual en la técnica, que incluyen los sistemas de expresión de ácidos nucleicos, los sistemas de expresión bacterianos y virales, y los sistemas de expresión mamíferos. Los sistemas de expresión de ácidos nucleicos apropiados contienen las secuencias de ADN, cADN o ARN necesarias para la expresión en el paciente (tales como un promotor y una señal de terminación adecuadas). Los sistemas de administración bacterianos implican la administración de una bacteria (tal como Bacillus Calmette-Guerin) que expresa una porción inmunógena del polipéptido en su superficie celular. En una realización preferida, el ADN se puede introducir mediante el uso de un sistema de expresión viral (p.ej., vaccinia u otros poxvirus, retrovirus o adenovirus), que puede implicar el uso de un virus apatógeno (incompleto), de replicación competente. Las técnicas para incorporar ADN en tales sistemas de expresión son bien conocidas para las personas de experiencia habitual en la técnica. El ADN puede estar también "desnudo", como se describe, por ejemplo, en Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993 y se resume en Cohen, Science 259:1691-1692, 1993. La captación del ADN desnudo se puede incrementar revistiendo el ADN en esferas biodegradables, que son transportadas de forma eficaz al interior de las células.

Como se indicó anteriormente, una composición farmacéutica o vacuna puede comprender una célula presentadora de antígenos que expresa un polipéptido WT1. Para fines terapéuticos, como se describe en esta memoria, la célula presentadora de antígenos es preferiblemente una célula dendrítica autóloga. Tales células se pueden preparar y transfectar mediante el uso de técnicas habituales, tales como las descritas en Reeves et al., Cancer Res. 56:5672-5677, 1996; Tuting et al., J. Immunol. 160:1139-1147, 1998; y Nair et al., Nature Biotechnol. 16:364-369, 1998). La expresión de un polipéptido WT1 en la superficie de una célula presentadora de antígenos se puede confirmar mediante análisis de estimulación in vitro y de proliferación estándar, así como de liberación de cromo, como se describe en esta memoria.

Aunque se puede emplear cualquier vehículo adecuado conocido para las personas de experiencia habitual en la técnica en las composiciones farmacéuticas de esta invención, el tipo de vehículo variará dependiendo del modo de administración. Las composiciones de la presente invención se pueden formular para cualquier forma de administración apropiada, que incluye, por ejemplo, la administración tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Para la administración parenteral, tal como inyección subcutánea, el vehículo comprende preferiblemente agua, solución salina, alcohol, un lípido, una cera o un tampón. Para administración oral, se puede emplear cualquiera de los vehículos anteriores o un vehículo sólido, tal como manitol, lactosa, almidón, estearato magnésico, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato magnésico. También se pueden emplear microesferas biodegradables (p.ej., polilactato-poliglicolato) como vehículos para las composiciones farmacéuticas de esta invención. Para ciertas aplicaciones tópicas, se prefiere la formulación en forma de una crema o loción, mediante el uso de componentes bien conocidos.

Tales composiciones pueden comprender también tampones (p.ej., solución salina tamponada neutra o solución salina tamponada con fosfato), carbohidratos (p.ej. glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos tales como glicocola, antioxidantes, agentes quelantes tales como EDTA o glutatión, adyuvantes (p.ej., hidróxido de aluminio) y/o conservantes. De forma alternativa, las composiciones de la presente invención se pueden formular en forma de un liofilizado. Los compuestos también se pueden encapsular dentro de liposomas mediante el uso de técnicas bien conocidas. En una realización de la presente invención, las composiciones comprenden un tampón que comprende uno o más carbohidratos que incluyen, pero no se limitan a, trehalosa, maltosa, sacarosa, fructosa y glucosa, cada uno a una concentración generalmente entre alrededor del 1 y el 25%, típicamente entre alrededor del 7 y el 13%. En una realización adicional, la concentración está entre alrededor del 8 y alrededor del 12%. En una realización adicional, la concentración es de alrededor del 10%. En un aspecto adicional de la presente invención, las composiciones pueden comprender etanolamina; cisteína; o polisorbato-80, en general a concentraciones eficaces para incrementar la eficacia, estabilidad y/o solubilidad de la formulación.

Se puede emplear cualquiera de una diversidad de potenciadores inespecíficos de la respuesta inmunitaria, tales como adyuvantes, en las vacunas de esta invención. La mayoría de los adyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger el antígeno del catabolismo rápido, tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulador de las respuestas inmunitarias, tal como lípido A, proteínas derivadas de Bortedella pertussis o Mycobacterium tuberculosis. Los potenciadores inespecíficos de la respuesta inmunitaria adecuados incluyen los adyuvantes basados en alumbre (p.ej., Alhydrogel, Rehydragel, fosfato de aluminio, Algammulin, hidróxido de aluminio); los adyuvantes basados en aceites (adyuvante de Freund (FA), Specol, RIBI, TiterMax, Montanide ISA50 o Montanide ISA 720 (Seppic, Francia); las citocinas (p.ej., GM-CSF o ligando Flt3); las microesferas; los adyuvantes basados en copolímeros en bloque no iónicos; los adyuvantes basados en el bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA) AS-1, AS-2 (SmithKline Beecham); los adyuvantes basados en el sistema del adyuvante de Ribi; QS21 (Aquila); los adyuvantes basados en saponina (saponina bruta, la saponina Quil A); los adyuvantes basados en el dipéptido de muramilo (MDP) tales como SAF (adyuvante Syntex en su forma microfluidizada (SAF-m)); bromuro de dimetil-dioctadecilamonio (DDA); los adyuvantes basados en el complemento humano m. vaccae y derivados; los adyuvantes basados en complejos inmunoestimulantes (iscom); toxinas inactivadas; y agentes infecciosos atenuados (tales como M. tuberculosis).

Los adyuvantes ilustrativos adicionales para el uso en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen SAF (Chiron, California, Estados Unidos), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), la serie de adyuvantes SBAS (p.ej., SBAS-2 o SBAS-4, disponible de SmithKline Beecham, Rixensart, Bélgica), Detox (Enhanzyn®) (Corixa, Hamilton, MT), RC-529 (Corixa, Hamilton, MT) y otros 4-fosfatos de aminoalquil-glucosaminida (AGPs), tales como los descritos en las solicitudes de patente de EE.UU. en tramitación de nºs de serie 08/853.826 y 09/074.720, cuyas descripciones se incorporan en esta memoria como referencia en su totalidad, y adyuvantes de éter de polioxietileno tales como los descritos en el documento WO 99/52549A1.

Otros adyuvantes preferidos incluyen moléculas adyuvantes de fórmula general

(I)HO(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-A-R,

en la que n es 1-50, A es un enlace o -C(O)-, R es alquilo C_{1-50} o fenil-alquilo C_{1-50}.

Una realización de la presente invención consiste en una formulación de vacuna que comprende un éter de polioxietileno de fórmula general (I), en la que n es entre 1 y 50, preferiblemente 4-24, lo más preferiblemente 9; y el componente R es alquilo C_{1-50}, preferiblemente alquilo C_{4}-C_{20} y lo más preferiblemente alquilo C_{12}, y A es un enlace. La concentración de los éteres de polioxietileno debería estar en el intervalo de 0,1-20%, preferiblemente de 0,1-10%, y lo más preferiblemente en el intervalo de 0,1-1%. Los éteres de polioxietileno preferidos se seleccionan del siguiente grupo: polioxietilen-9-lauril éter, polioxietilen-9-estearoil éter, polioxietilen-8-estearoil éter, polioxietilen-4-lauril éter, polioxietilen-35-lauril éter, y polioxietilen-23-lauril éter. Los éteres de polioxietileno tales como polioxietilen-lauril éter se describen en el Merck Index (12ª edición: entrada 7717). Estas moléculas adyuvantes se describen en el documento WO 99/52549.

El éter de polioxietileno según la fórmula general (I) anterior se puede combinar, si se desea, con otro adyuvante. Por ejemplo, una combinación preferida con un adyuvante es preferiblemente con CpG como se describe en la solicitud de patente del R.U. en tramitación GB 9820956.2.

Como se indicó anteriormente, en ciertas realizaciones, los potenciadores de la respuesta inmunitaria se eligen por su capacidad de generar o incrementar preferentemente una respuesta de células T (p.ej., CD4^{+} y/o CD8^{+}) hacia un polipéptido WT1. Tales potenciadores de la respuesta inmunitaria se conocen bien en la técnica, e incluyen (pero no se limitan a) Montanide ISA50, Seppic MONTANIDE ISA 720, citocinas (p.ej., GM-CSF, ligando Flt3), microesferas, adyuvantes basados en el bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA), AS-1 (SmithKline Beecham), AS-2 (SmithKline Beecham), adyuvantes basados en el sistema del adyuvante de Ribi, QS21 (Aquila), adyuvantes basados en saponina (saponina bruta, la saponina Quil A), adyuvante Syntex en su forma microfluidizada (SAF-m), MV, ddMV (Genesis), adyuvantes basados en complejos inmunoestimulantes (iscom) y toxinas inactivadas.

En otro aspecto de la presente invención, las composiciones pueden comprender adyuvantes para provocar predominantemente una respuesta de tipo Th1. Ciertos adyuvantes preferidos para generar predominantemente una respuesta de tipo Th1 incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforil lípido A, preferiblemente monofosforil lípido A des-O-acilado en posición 3, junto con una sal de aluminio. Los adyuvantes MPL®, tales como MPL-SE, están disponibles de Corixa Corporation (Seattle, WA; véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nºs 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 y 4.912.094, incorporadas en esta memoria en su totalidad). Los oligonucleótidos que contienen CpG (en los que el dinucleótido CpG está sin metilar) también inducen predominantemente una respuesta Th1. Tales oligonucleótidos se conocen bien y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 96/02555, WO 99/33488 y en las patentes de EE.UU. nºs 6.008.200 y 5.856.462. Las secuencias de ADN inmunoestimulantes también se describen, por ejemplo, en Sato et al., Science 273:352, 1996. Otro adyuvante preferido comprende una saponina, tal como Quil A, o sus derivados, que incluyen QS21 y QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA); Escina; Digitonina; o saponinas de Gypsophila o Chenopodium quinoa. Otras formulaciones preferidas incluyen más de una saponina en las combinaciones de adyuvantes de la presente invención, por ejemplo combinaciones de al menos dos adyuvantes del siguiente grupo, que comprende QS21, QS7, Quil A, \beta-escina, o digitonina.

Las composiciones y las vacunas descritas en esta memoria se pueden administrar como parte de una formulación de liberación sostenida (es decir, una formulación tal como una cápsula o esponja que lleva a cabo la liberación lenta del compuesto tras la administración). Tales formulaciones se pueden preparar en general mediante el uso de técnicas bien conocidas, y se pueden administrar, por ejemplo, mediante implantación oral, rectal o subcutánea, o mediante implantación en el sitio deseado seleccionado como objetivo. Las formulaciones de liberación sostenida pueden contener un polipéptido, polinucleótido, anticuerpo o célula dispersados en una matriz portadora y/o contenidos dentro de un depósito rodeado por una membrana de control de la velocidad de liberación. Los vehículos para el uso en tales formulaciones son biocompatibles, y pueden ser también biodegradables; preferiblemente, la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación del componente activo. La cantidad de compuesto activo contenida en una formulación de liberación sostenida depende del sitio de implantación, de la velocidad y de la duración esperada de la liberación, y de la naturaleza de la enfermedad a tratar o prevenir.

Terapia de neoplasias malignas

En aspectos adicionales de la presente invención, las composiciones y vacunas descritas en esta memoria se pueden usar para inhibir el desarrollo de neoplasias malignas (p.ej., enfermedades progresivas o metastásicas, o enfermedades caracterizadas por una masa tumoral pequeña, tal como la enfermedad residual mínima). En general, tales métodos se pueden usar para prevenir, retrasar o tratar una enfermedad asociada a la expresión de WT1. En otras palabras, los métodos terapéuticos proporcionados en esta memoria se pueden usar para tratar una enfermedad asociada a WT1 existente, o se pueden usar para prevenir o retrasar el inicio de tal enfermedad en un paciente que no padece la enfermedad, o que padece una enfermedad que todavía no está asociada a la expresión de WT1.

Como se usa en esta memoria, una enfermedad está "asociada a la expresión de WT1" si las células enfermas (p.ej., las células tumorales) en algún momento durante el curso de la enfermedad generan niveles detectables superiores de un polipéptido WT1 respecto de las células normales del mismo tejido. La asociación de la expresión de WT1 con una neoplasia maligna no requiere que WT1 esté presente en un tumor. Por ejemplo, la sobreexpresión de WT1 puede estar implicada en la iniciación de un tumor, pero la expresión de la proteína se puede perder posteriormente. De forma alternativa, una neoplasia maligna que no se caracteriza por un incremento de la expresión de WT1 puede progresar, en un momento posterior, hacia una enfermedad que se caracteriza por una expresión de WT1 incrementada. Por lo tanto, cualquier neoplasia maligna en la que las células enfermas expresaron anteriormente, expresan actualmente, o se espera que expresen posteriormente, niveles incrementados de WT1 se considera que está "asociada a la expresión de WT1".

La inmunoterapia se puede llevar a cabo mediante el uso de una diversidad de técnicas, en las que los compuestos o las células proporcionadas en esta memoria funcionan para eliminar las células que expresan WT1 en un paciente. Tal eliminación puede tener lugar como resultado del incremento o de la inducción en un paciente de una respuesta inmunitaria específica hacia WT1 o hacia una célula que expresa WT1. De forma alternativa, las células que expresan WT1 se pueden eliminar ex vivo (p.ej., mediante tratamiento de una médula ósea autóloga, sangre periférica o una fracción de médula ósea o de sangre periférica). Las fracciones de médula ósea o de sangre periférica se pueden obtener mediante el uso de cualquier método habitual en la técnica.

En tales métodos, se pueden administrar composiciones farmacéuticas y vacunas a un paciente. Como se usa en esta memoria, un "paciente" se refiere a cualquier animal de sangre caliente, preferiblemente un humano. Un paciente puede padecer o no una neoplasia maligna. Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas y vacunas anteriores se pueden usar para prevenir el inicio de una enfermedad (es decir, de forma profiláctica) o para tratar a un paciente que padece una enfermedad (p.ej., para prevenir o retrasar la progresión y/o la metástasis de una enfermedad existente). Un paciente que padece una enfermedad puede tener una enfermedad residual mínima (p.ej., una masa tumoral pequeña en un paciente de leucemia en remisión completa o parcial, o un paciente de cáncer tras la reducción de la masa tumoral después de cirugía, radioterapia y/o quimioterapia). Tal paciente se puede inmunizar para inhibir una recidiva (es decir, prevenir o retrasar la recidiva, o disminuir la gravedad de una recidiva). En ciertas realizaciones preferidas, el paciente padece una leucemia (p.ej., LMA, LMC, LLA o LLA infantil), un síndrome mielodisplásico (SMD) o un cáncer (p.ej., cáncer gastrointestinal, de pulmón, de tiroides, o de mama, o un melanoma), en el que el cáncer o la leucemia es WT1 positivo (es decir, reacciona de manera detectable con un anticuerpo anti-WT1, como se proporciona en esta memoria, o expresa ARNm de WT1 a un nivel detectable mediante RT-PCR, como se describe en esta memoria), o padece una enfermedad autoinmunitaria dirigida contra las células que expresan WT1.

Otras enfermedades asociadas a la sobreexpresión de WT1 incluyen el cáncer de riñón (tal como el carcinoma de células renales, o tumor de Wilms), como se describe en Satoh F., et al., Pathol. Int. 50(6):458-71 (2000), y Campbell C. E. et al., Int. J. Cancer 78(2):182-8 (1998); y mesotelioma, como se describe en Amin, K.M. et al., Am. J. Pathol. 146(2):344-56 (1995). Harada et al., Mol. Urol. 3(4):357-364 (1999), describe la expresión del gen WT1 en los tumores de las células germinales testiculares humanas. Nonomura et al., Hinyokika Kiyo 45(8):593-7 (1999) describe la estadificación molecular del cáncer testicular mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa de los genes específicos del cáncer testicular. Shimizu et al., Int. J. Gynecol. Pathol. 19(2):158-63 (2000) describe la detección inmunohistoquímica del gen del tumor de Wilms (WT1) en los tumores ováricos epiteliales.

La sobreexpresión de WT1 también fue descrita en los tumores desmoplásticos de células redondas pequeñas por Barnoud, R. et al., Am. J. Surg. Pathol. 24(6):830-6 (2000); y Pathol. Res. Pract. 194(10):693-700 (1998). La sobreexpresión de WT1 en glioblastoma y otros tumores fue descrita por Menssen, H.D. et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 126(4):226-32 (2000), "Wilms' tumor gene (WT1) expression in lung cancer, colon cancer and glioblastoma cell lines compared to freshly isolated tumor specimens". Otras enfermedades que muestran una sobreexpresión de WT1 incluyen las enfermedades asociadas al VEB, tales como el linfoma de Burkitt y el cáncer nasofaríngeo (Spinsanti P. et al., Leuk. Lymphoma 38(5-6):611-9 (2000), "Wilms' tumor gene expression by normal and malignant human B lymphocytes".

En Leukemia 14(9):1634-4 (2000), Pan et al. describe el tratamiento in vitro con IL-12 de células mononucleares de sangre periférica de pacientes con leucemia o síndromes mielodisplásicos, y se informa del incremento de la citotoxicidad y la reducción de la expresión del gen WT1. En Leukemia 13(6):891-900 (1999), Patmasiriwat et al. informó de la expresión de WT1 y GATA1 en el síndrome mielodisplásico y la leucemia aguda. En Leukemia 13(3):393-9 (1999), Tamaki et al. informó que el gen del tumor de Wilms WT1 es un buen marcador para el diagnóstico de la progresión de la enfermedad en los síndromes mielodisplásicos. La expresión del gen del tumor de Wilms WT1 en tumores sólidos, y su implicación en el crecimiento de las células tumorales, se discutió en Oji et al., Jpn. J Cancer Res. 90(2):194-204 (1999) con relación a líneas de células de cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, líneas de células de los tumores de las células germinales, líneas de células de cáncer ovárico, cáncer uterino, cáncer de tiroides y carcinoma hepatocelular.

Las composiciones proporcionadas en esta memoria se pueden usar solas o en combinación con regímenes terapéuticos convencionales, tales como cirugía, irradiación, quimioterapia y/o trasplante de médula ósea (autólogo, singénico, alogénico o no relacionado). Como se discute con más detalle más adelante, los agentes de unión y las células T, tal como se proporcionan en esta memoria, se pueden usar para el purgado de las células pluripotenciales autólogas. Tal purgado puede ser beneficioso, por ejemplo, antes del trasplante de médula ósea o la transfusión de sangre o de sus componentes. Los agentes de unión, las células T, las células presentadoras de antígenos (CPA) y las composiciones proporcionadas en esta memoria se pueden usar además para expandir y estimular (o sensibilizar) las células T específicas de WT1 autólogas, alogénicas, singénicas o no relacionadas in vitro y/o in vivo. Tales células T específicas de WT1 se pueden usar, por ejemplo, en infusiones de linfocitos de donantes.

Las vías y la frecuencia de la administración, así como la dosis, variarán de individuo a individuo, y se pueden establecer fácilmente mediante el uso de técnicas habituales. En general, las composiciones farmacéuticas y las vacunas se pueden administrar mediante inyección (p.ej., intracutánea, intramuscular, intravenosa o subcutánea), de forma intranasal (p.ej., mediante aspiración) u oral. En algunos tumores, las composiciones farmacéuticas o las vacunas se pueden administrar de forma local (por ejemplo, mediante rectocolonoscopia, gastroscopia, videoendoscopia, angiografía u otros métodos conocidos en la técnica). Preferiblemente, se pueden administrar entre 1 y 10 dosis durante un período de 52 semanas. Preferiblemente, se administran 6 dosis a intervalos de 1 mes, y se pueden administrar vacunas de refuerzo periódicamente más adelante. Los protocolos alternativos pueden ser apropiados para pacientes individuales. Una dosis adecuada es una cantidad de un compuesto que, cuando se administra como se describió anteriormente, es capaz de estimular una respuesta inmunitaria anti-tumoral que es al menos un 10-50% superior al nivel basal (es decir, sin tratar). Tal respuesta se puede monitorizar midiendo los anticuerpos anti-tumorales en un paciente, o mediante la generación dependiente de la vacuna de células efectoras citolíticas capaces de destruir las células tumorales del paciente in vitro. Tales vacunas también deberían ser capaces de provocar una respuesta inmunitaria que conduce a un resultado clínico mejorado (p.ej., remisiones completas o parciales más frecuentes, o una supervivencia sin enfermedad y/o global más larga) en los pacientes vacunados en comparación con los pacientes sin vacunar. En general, para las composiciones farmacéuticas y vacunas que comprenden uno o más polipéptidos, la cantidad de cada polipéptido presente en una dosis oscila de alrededor de 100 \mug a 5 mg. Los volúmenes adecuados de las dosis variarán con el tamaño del paciente, pero oscilarán generalmente de alrededor de 0,1 mL a alrededor de 5 mL.

En general, una dosis y un régimen de tratamiento apropiados proporcionan el/los compuesto(s) activo(s) en una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico y/o profiláctico. Tal respuesta se puede monitorizar estableciendo un resultado clínico mejorado (p.ej., remisiones completas o parciales más frecuentes, o una supervivencia sin enfermedad y/o global más larga) en los pacientes tratados en comparación con los pacientes sin tratar. Los incrementos de las respuestas inmunitarias preexistentes hacia WT1 se correlacionan en general con un resultado clínico mejorado. Tales respuestas inmunitarias se pueden estudiar en general mediante el uso de los análisis habituales de proliferación, citotoxicidad o citocinas, que se pueden llevar a cabo mediante el uso de las muestras obtenidas de un paciente antes y después del tratamiento.

En aspectos adicionales, los métodos para inhibir el desarrollo de una neoplasia maligna asociada a la expresión de WT1 implican la administración de células T autólogas que se han activado en respuesta a un polipéptido WT1 o una CPA que expresa WT1, como se describió anteriormente. Tales células T pueden ser CD4^{+} y/o CD8^{+}, y se pueden hacer proliferar como se describió anteriormente. Las células T se pueden administrar al individuo en una cantidad eficaz para inhibir el desarrollo de una neoplasia maligna. Generalmente, se administran alrededor de 1 x 10^{9} a 1 x 10^{11} células T/M^{2} de forma intravenosa, intracavitaria o en el lecho de un tumor resecado. Será evidente para los expertos en la técnica que el número de células y la frecuencia de administración dependerán de la respuesta del paciente.

En ciertas realizaciones, las células T se pueden estimular antes de un trasplante de médula ósea autólogo. Tal estimulación puede tener lugar in vivo o in vitro. Para la estimulación in vitro, la médula ósea y/o sangre periférica (o una fracción de médula ósea o sangre periférica) obtenida de un paciente se puede poner en contacto con un polipéptido WT1, un polinucleótido que codifica un polipéptido WT1 y/o una CPA que expresa un polipéptido WT1, en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la estimulación de las células T como se describió anteriormente. Las células pluripotenciales de médula ósea, sangre periférica y/o las células T específicas de WT1 se pueden administrar después a un paciente mediante el uso de técnicas habituales.

En las realizaciones relacionadas, las células T de un donante relacionado o no relacionado se pueden estimular antes de un trasplante de médula ósea singénico o alogénico (relacionado o no relacionado). Tal estimulación puede tener lugar in vivo o in vitro. Para la estimulación in vitro, la médula ósea y/o la sangre periférica (o una fracción de médula ósea o de sangre periférica) obtenida de un donante relacionado o no relacionado se puede poner en contacto con un polipéptido WT1, un polinucleótido de WT1 y/o CPA que expresan un polipéptido WT1, en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la estimulación de las células T como se describió anteriormente. Las células pluripotenciales de médula ósea, sangre periférica y/o las células T específicas de WT1 se pueden administrar después a un paciente mediante el uso de técnicas habituales.

En otras realizaciones, se pueden usar células T específicas de WT1 como se describe en esta memoria para eliminar las células que expresan WT1 de médula ósea autóloga, sangre periférica o una fracción de médula ósea o de sangre periférica (p.ej., sangre periférica (SP) enriquecida en CD34^{+} antes de la administración a un paciente). Tales métodos se pueden llevar a cabo poniendo en contacto la médula ósea o SP con tales células T, en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la reducción de las células que expresan WT1 hasta menos del 10%, preferiblemente menos del 5%, y más preferiblemente menos del 1%, del número total de células mieloides o linfáticas en la médula ósea o la sangre periférica. El grado en el que tales células se han eliminado se puede determinar fácilmente mediante métodos habituales tales como, por ejemplo, análisis de PCR cualitativa y cuantitativa, morfología, inmunohistoquímica y análisis de FACS. La médula ósea o la SP (o una fracción suya) se pueden administrar después a un paciente mediante el uso de técnicas habituales.

Métodos de diagnóstico

La presente invención proporciona demás métodos para detectar una neoplasia maligna asociada a la expresión de WT1, y para monitorizar la eficacia de una inmunización o terapia para tal enfermedad. Tales métodos se basan en el descubrimiento, en la presente invención, de que se puede detectar una respuesta inmunitaria específica hacia la proteína WT1 en pacientes que padecen tales enfermedades, y que los métodos que incrementan tales respuestas inmunitarias pueden proporcionar un beneficio preventivo o terapéutico.

Para determinar la presencia o ausencia de una neoplasia maligna asociada a la expresión de WT1, se puede analizar en un paciente el nivel de células T específicas para WT1. En ciertos métodos, una muestra biológica que comprende células T CD4^{+} y/o CD8^{+} aisladas de un paciente se incuba con un polipéptido WT1, un polinucleótido que codifica un polipéptido WT1 y/o una CPA que expresa un polipéptido WT1, y se detecta la presencia o ausencia de activación específica de las células T, como se describe en esta memoria. Las muestras biológicas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células T aisladas. Por ejemplo, las células T se pueden aislar de un paciente mediante técnicas rutinarias (tales como centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll/Hypaque de linfocitos de sangre periférica). Las células T se pueden incubar in vitro durante 2-9 días (generalmente 4 días) a 37ºC con polipéptido WT1 (p.ej., 5 - 25 \mug/ml). Puede ser deseable incubar otra alícuota de una muestra de células T en ausencia de polipéptido WT1 para que sirva como control. Para las células T CD4^{+}, la activación se detecta preferiblemente determinando la proliferación de las células T. Para las células T CD8^{+}, la activación se detecta preferiblemente determinando la actividad citolítica. Un nivel de proliferación que es al menos dos veces mayor y/o un nivel de actividad citolítica que es al menos un 20% mayor que en los pacientes libres de enfermedad indica la presencia de una enfermedad maligna asociada a la expresión de WT1. Se pueden hacer correlaciones adicionales, mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica, entre el nivel de proliferación y/o actividad citolítica y la respuesta predicha a la terapia. En particular, se puede esperar que los pacientes que exhiben una respuesta superior de anticuerpos, proliferativa y/o lítica muestren una respuesta mayor a la terapia.

En otros métodos, se analiza el nivel de anticuerpos específicos para WT1 en una muestra biológica obtenida de un paciente. La muestra biológica se incuba con un polipéptido WT1, un polinucleótido que codifica un polipéptido WT1 y/o una CPA que expresa un polipéptido WT1 en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que se formen inmunocomplejos. Después se detectan los inmunocomplejos formados entre el polipéptido WT1 y los anticuerpos de la muestra biológica que se unen específicamente al polipéptido WT1. Una muestra biológica para el uso en tales métodos puede ser cualquier muestra obtenida de un paciente de la que se esperaría que contuviese anticuerpos. Las muestras biológicas adecuadas incluyen sangre, suero, líquido ascítico, médula ósea, derrame pleural, y líquido cefalorraquídeo.

La muestra biológica se incuba con el polipéptido WT1 en una mezcla de reacción en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que se formen inmunocomplejos entre el polipéptido y los anticuerpos específicos para WT1. Por ejemplo, una muestra biológica y un polipéptido WT1 se pueden incubar a 4ºC durante 24-48 horas.

Tras la incubación, se analiza en la mezcla de reacción la presencia de inmunocomplejos. La detección de los inmunocomplejos formados entre el polipéptido WT1 y los anticuerpos presentes en la muestra biológica se puede llevar a cabo mediante una diversidad de técnicas conocidas, tales como radioinmunoanálisis (RIA) y ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA). Los análisis adecuados se conocen bien en la técnica, y se describen ampliamente en la bibliografía científica y de patentes (p.ej., Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Los análisis que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, la técnica de inmunoanálisis en sándwich con doble anticuerpo monoclonal de David et al. (patente de EE.UU. 4.376.110); análisis en sándwich con anticuerpo monoclonal-policlonal (Wide et al., en Kirkham y Hunter, eds., Radioimmunoassay Methods, E. y S. Livingstone, Edimburgo, 1970); el método de "transferencia de Western" de Gordon et al. (patente de EE.UU. 4.452.901); la inmunoprecipitación de un ligando marcado (Brown et al., J. Biol. Chem. 255:4980-4983, 1980); ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas como describen, por ejemplo, Raines y Ross (J. Biol. Chem. 257:5154-5160, 1982); técnicas inmunocitoquímicas, que incluyen el uso de fluorocromos (Brooks et al., Clin. Exp. Immunol. 39: 477, 1980); y la neutralización de la actividad (Bowen-Pope et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81:2396-2400, 1984). Otros inmunoanálisis incluyen, pero no se limitan a, los descritos en las patentes de EE.UU. nºs 3.817.827; 3.850.752; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; y 4.098.876.

Para fines de detección, el polipéptido WT1 puede estar marcado o sin marcar. El polipéptido WT1 sin marcar se puede usar en ensayos de aglutinación o en combinación con reactivos de detección marcados que se unen a los inmunocomplejos (p.ej., anti-inmunoglobulina, proteína G, proteína A o una lectina y anticuerpos secundarios, o sus fragmentos de unión al antígeno, capaces de unirse a los anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido WT1). Si el polipéptido WT1 está marcado, el grupo indicador puede ser cualquier grupo indicador adecuado conocido en la técnica, que incluye radioisótopos, grupos fluorescentes, grupos luminiscentes, enzimas, biotina y partículas de colorante.

En ciertos ensayos, el polipéptido WT1 sin marcar se inmoviliza en un soporte sólido. El soporte sólido puede ser cualquier material conocido para las personas de experiencia habitual en la técnica al que se puede unir el polipéptido. Por ejemplo, el soporte sólido puede ser un pocillo de ensayo de una placa de microtitulación o una membrana de nitrocelulosa o de otro tipo adecuado. De forma alternativa, el soporte puede ser una esfera o disco, tal como de vidrio, fibra de vidrio, látex o un material plástico tal como poliestireno o poli(cloruro de vinilo). El soporte puede ser también una partícula magnética o un sensor de fibra óptica, tal como los descritos, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.359.681. El polipéptido se puede inmovilizar en el soporte sólido mediante el uso de una diversidad de métodos conocidos para los expertos en la técnica, que se describen ampliamente en la bibliografía científica y de patentes. En el contexto de la presente invención, el término "inmovilización" se refiere tanto a la asociación no covalente, tal como la adsorción, como a la unión covalente (que puede ser un enlace directo entre el antígeno y los grupos funcionales del soporte, o puede ser un enlace por medio de un agente de entrecruzamiento). Se prefiere la inmovilización mediante la adsorción en un pocillo de una placa de microtitulación o en una membrana. En tales casos, la adsorción se puede llevar a cabo poniendo en contacto el polipéptido WT1, en un tampón adecuado, con un soporte sólido durante una cantidad de tiempo adecuada. El tiempo de contacto varía con la temperatura, pero es generalmente de entre alrededor de 1 hora y alrededor de 1 día. En general, el poner en contacto un pocillo de una placa de microtitulación de plástico (tal como poliestireno o poli(cloruro de vinilo)) con una cantidad de polipéptido que oscila de alrededor de 10 ng a alrededor de 10 \mug, y preferiblemente alrededor de 100 ng a alrededor de 1 \mug, es suficiente para inmovilizar una cantidad adecuada de polipéptido.

Tras la inmovilización, generalmente se bloquean los sitios de unión de la proteína restantes del soporte. Se puede usar cualquier agente de bloqueo adecuado conocido para las personas de experiencia habitual en la técnica, tal como albúmina de suero bovino, Tween 20^{TM} (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), suero de cabra normal (NGS) inactivado por calor, o BLOTTO (solución tamponada de leche deshidratada descremada que también contiene un conservante, sales, y un agente antiespumante). El soporte se incuba después con una muestra biológica que se sospecha que contiene un anticuerpo específico. La muestra se puede aplicar sola, o, con más frecuencia, se puede diluir, habitualmente en una solución tamponada que contiene una pequeña cantidad (0,1%-5,0% en peso) de proteína, tal como BSA, NGS, o BLOTTO. En general, un tiempo de contacto apropiado (es decir, el tiempo de incubación) es un período de tiempo que es suficiente para detectar la presencia de un anticuerpo que se une específicamente a WT1 en una muestra que contiene tal anticuerpo. Preferiblemente, el tiempo de contacto es suficiente para conseguir un nivel de unión que es al menos alrededor del 95% del que se consigue en el equilibrio entre el anticuerpo unido y sin unir. Las personas de experiencia habitual en la técnica reconocerán que el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio se puede determinar fácilmente analizando el nivel de unión que se da a lo largo de un período de tiempo. A temperatura ambiente, en general es suficiente un tiempo de incubación de alrededor de 30 minutos.

La muestra sin unir se puede eliminar después lavando el soporte sólido con un tampón apropiado, tal como PBS que contiene un 0,1% de Tween 20^{TM}. Después se puede añadir un reactivo de detección que se une a los inmunocomplejos y que comprende un grupo indicador. El reactivo de detección se incuba con el inmunocomplejo durante un período de tiempo suficiente para detectar el anticuerpo unido. La cantidad de tiempo apropiada se puede determinar en general analizando el nivel de unión que se da a lo largo de un período de tiempo. El reactivo de detección sin unir se elimina después, y el reactivo de detección unido se detecta mediante el uso del grupo indicador. El método empleado para detectar el grupo indicador depende de la naturaleza del grupo indicador. Para los grupos radiactivos, son apropiados en general los métodos de recuento de centelleo o autorradiográficos. Los métodos espectroscópicos se pueden usar para detectar colorantes, grupos luminiscentes y grupos fluorescentes. La biotina se puede detectar mediante el uso de avidina, acoplada a un grupo indicador diferente (normalmente un grupo radiactivo o fluorescente o una enzima). Los grupos indicadores con enzimas (p.ej., peroxidasa de rábano, \beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina y glucosa oxidasa) se pueden detectar en general mediante la adición del sustrato (en general, durante un período de tiempo específico), seguido del análisis espectroscópico o de otro tipo de los productos de reacción. Independientemente del método específico empleado, el nivel de reactivo de detección unido que es al menos dos veces mayor que el de referencia (es decir, el nivel observado para una muestra biológica obtenida de un individuo libre de enfermedad) indica la presencia de una neoplasia maligna asociada a la expresión de WT1.

En general, los métodos para monitorizar la eficacia de una inmunización o terapia implican monitorizar los cambios del nivel de anticuerpos o de células T específicas para WT1 en el paciente. Los métodos en los que se monitorizan los niveles de anticuerpos pueden comprender las etapas de: (a) incubar una primera muestra biológica, obtenida de un paciente antes de la terapia o inmunización, con un polipéptido WT1, en la que la incubación se lleva a cabo en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que se formen inmunocomplejos; (b) detectar los inmunocomplejos formados entre el polipéptido WT1 y los anticuerpos de la muestra biológica que se unen específicamente al polipéptido WT1; (c) repetir las etapas (a) y (b) mediante el uso de una segunda muestra biológica obtenida del paciente tras la terapia o la inmunización; y (d) comparar el número de inmunocomplejos detectados en la primera y segunda muestras biológicas. De forma alternativa, se puede emplear un polinucleótido que codifica un polipéptido WT1, o una CPA que expresa un polipéptido WT1 en lugar del polipéptido WT1. En tales métodos, se detectan los inmunocomplejos entre el polipéptido WT1 codificado por el polinucleótido, o expresado por la CPA, y los anticuerpos de la muestra biológica.

Los métodos en los cuales se monitoriza la activación de las células T y/o el número de precursores específicos de WT1 pueden comprender las etapas de: (a) incubar una primera muestra biológica que comprende células CD4+ y/o CD8+ (p.ej., médula ósea, sangre periférica o una fracción suya), obtenida de un paciente antes de una terapia o inmunización, con un polipéptido WT1, en la que la incubación se lleva a cabo en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la activación, proliferación y/o lisis específica de las células T; (b) detectar una cantidad de activación, proliferación y/o lisis de las células T; (c) repetir las etapas (a) y (b) mediante el uso de una segunda muestra biológica que comprende células T CD4+ y/o CD8+, tomada del mismo paciente tras la terapia o la inmunización; y (d) comparar la cantidad de activación, proliferación y/o lisis de células T en la primera y segunda muestras biológicas. De forma alternativa, se puede emplear un polinucleótido que codifica un polipéptido WT1, o una CPA que expresa un polipéptido WT1 en lugar del polipéptido WT1.

Una muestra biológica para el uso en tales métodos puede ser cualquier muestra obtenida de un paciente que se esperaría que contuviese anticuerpos, células T CD4+ y/o células T CD8+. Las muestras biológicas adecuadas incluyen sangre, suero, líquido ascítico, médula ósea, derrame pleural y líquido cefalorraquídeo. Una primera muestra biológica se puede obtener antes del inicio de la terapia o la inmunización, o en mitad de un régimen de terapia o de vacunación. La segunda muestra biológica se debería obtener de una manera similar, pero en un momento tras la terapia o inmunización adicional. La segunda muestra biológica se puede obtener al final de, o a mitad de, la terapia o la inmunización, con tal de que al menos una parte de la terapia o de la inmunización tenga lugar entre el aislamiento de la primera y la segunda muestras biológicas.

Las etapas de incubación y detección para ambas muestras se pueden llevar a cabo en general como se describió anteriormente. Un incremento estadísticamente significativo del número de inmunocomplejos en la segunda muestra respecto de la primera muestra refleja una terapia o inmunización eficaz.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración, y no a modo de limitación.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos

Ejemplo 1

Identificación de una respuesta inmunitaria hacia WT1 en pacientes con neoplasias malignas hematológicas

Este ejemplo ilustra la identificación de una respuesta inmunitaria existente en pacientes con una neoplasia maligna hematológica.

Para determinar la presencia de respuestas de anticuerpos específicos hacia WT1 preexistentes en los pacientes, se analizaron los sueros de pacientes con leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfoide aguda (LLA), leucemia mieloide crónica (LMC) y anemia aplásica grave mediante el uso de análisis de transferencia de Western. Se analizó la capacidad de los sueros de inmunoprecipitar WT1 de la línea de células de leucemia humana K562 (American Type Culture Collection, Manassas, VA). En cada caso, los inmunoprecipitados se separaron mediante electroforesis en gel, se transfirieron a una membrana y se analizaron con una sonda con el anticuerpo anti-WT1 WT180 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Este análisis de transferencia de Western identificó anticuerpos específicos de WT1 potenciales en pacientes con neoplasias malignas hematológicas. Se muestra una transferencia de Western representativa que muestra los resultados para un paciente con LMA en la Figura 2. El anticuerpo específico de WT1 reconoció una proteína de 52 kD en el inmunoprecipitado generado mediante el uso de los sueros de los pacientes. La proteína de 52 kD migró al mismo tamaño que el control positivo.

Los estudios adicionales analizaron la presencia de anticuerpos hacia proteínas WT1 de tamaño completo y truncadas en los sueros de los pacientes con LMA y LMC. Las construcciones de cADN que representan la región de WT1 humano/tamaño completo (aa 1-449), el extremo N-terminal (aa 1-249) (WT1/N-terminal) y el extremo C-terminal (aa 267-449) (WT1/C-terminal) se subclonaron en vectores pET28 modificados. Las proteínas WT1/tamaño completo y WT1/N-terminal se expresaron como proteínas de fusión con Ra12. Ra12 es el fragmento C-terminal de una proteína secretada de Mycobacterium tuberculosis, indicada como MTB32B (Skeiky et al., Infect. Immun. 67;3998, 1999). La región de fusión Ra12-WT1/tamaño completo se clonó en posición 3' respecto de una etiqueta de histidinas en un vector pET28 modificado con una etiqueta de histidinas. La región WT1/N-terminal se subclonó en un vector pET28 modificado que tiene una etiqueta de histidinas en posición 5', seguida por la región de fusión con tiorredoxina (TRX)-WT1/N-terminal, seguida por una etiqueta de histidinas en posición 3'. La región codificante de WT1/C-terminal se subclonó en un vector pET28 modificado sin una pareja de fusión que contenía solamente las etiquetas de histidinas en posición 5' y 3', seguida por un sitio de trombina y EK.

\global\parskip0.900000\baselineskip

Se transformó E. coli BL21 pLysS (Stratagene, La Jolla, CA) con las tres construcciones de expresión de WT1, se cultivaron durante la noche y se indujeron con isopropil-\beta-D-tiogalactósido (IPTG). Las proteínas WT1 se purificaron como sigue: Las células se recogieron y se lisaron mediante incubación en Tris 10 mM, pH 8,0 con comprimidos de inhibidores de proteasas completos (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianápolis, IN) a 37ºC, seguido por ciclos repetidos de sonicación. Los cuerpos de inclusión se lavaron dos veces con Tris 10 mM, pH 8,0. Las proteínas se purificaron después mediante cromatografía de afinidad con quelato metálico con una resina de níquel-ácido nitrilotriacético (QIAGEN Inc., Valencia, CA; Hochuli et al., Biologically Active Molecules: 217, 1989), seguido de cromatografía en una resina de intercambio aniónico Source Q (Amersham Pharmacia Biotech, Upsala, Suecia). La identidad de las proteínas WT1 se confirmó mediante secuenciación N-terminal.

Se estudió en los sueros de pacientes adultos con LMA o LMC de novo la presencia de Ab específicos de WT1. Las proteínas recombinantes se adsorbieron en placas TC Microwell (Nunc, Roskilde, Dinamarca). Las placas se lavaron con PBS/0,5% de Tween 20 y se bloquearon con 1% de BSA/PBS/0,1% de Tween 20. Después de lavar, se añadieron las diluciones de suero y se incubaron durante la noche a 4ºC. Las placas se lavaron y se añadió anticuerpo secundario anti-IgG humano-HRP de burro (Jackson-Immunochem, West Grove, PA) y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron, se incubaron con disolución de sustrato TMB Peroxidase (Kirkegaard and Perry Labo-
ratories, MA), se pararon con H_{2}SO_{4} 1 N, y se leyeron inmediatamente (Cyto-Fluor 2350; Millipore, Bedford, MA).

Para el estudio serológico, los sueros humanos se analizaron mediante ELISA a lo largo de un intervalo de diluciones en serie desde 1:50 hasta 1:20.000. Una reacción positiva se definió como un valor de DO de un suero diluido 1:500 que superó el valor medio de DO de los sueros de los donantes normales (n=96) en tres desviaciones estándar (WT1/tamaño completo, WT1/C-terminal). Debido a un valor de referencia mayor en los donantes normales hacia la proteína WT1/N-terminal, una reacción positiva hacia WT1/N-terminal se definió como un valor de DO de un suero diluido 1:500 que superó el valor medio de DO de los sueros de los donantes normales en cuatro desviaciones estándar. Para verificar que la respuesta de Ab de los pacientes se dirigía contra WT1 y no contra la parte de la fusión con Ra12 o TRX de la proteína o de posibles proteínas contaminantes de E. coli, los controles incluyeron las proteínas Ra12 y TRX solas purificadas de una manera similar. Las muestras que mostraron reactividad contra las proteínas Ra12 y/o TRX se excluyeron de los análisis.

Para determinar la presencia de inmunidad hacia WT1, se determinaron los Ab hacia las proteínas WT1 recombinantes de tamaño completo y truncadas en los sueros de los individuos normales y de los pacientes con leucemia. La reactividad de los anticuerpos se analizó mediante la reactividad en ELISA hacia la proteína WT1/tamaño completo, la proteína WT1/N-terminal y la proteína WT1/C-terminal.

Solamente 2 de 96 donantes normales tuvieron anticuerpos séricos reactivos con la proteína WT1/tamaño completo (Figura 18). Uno de esos individuos tuvo anticuerpos hacia la proteína WT1/N-terminal y uno tuvo anticuerpos hacia la proteína WT1/C-terminal. En cambio, 16 de 63 pacientes (25%) con LMA tuvieron anticuerpos séricos reactivos con la proteína WT1/tamaño completo. En cambio, de forma notable, solamente 2 de 63 pacientes (3%) tuvieron reactividad hacia la proteína WT1/C-terminal. Quince de 81 pacientes (19%) con LMC tuvieron anticuerpos séricos reactivos con la proteína WT1/tamaño completo y 12 de 81 pacientes (15%) tuvieron anticuerpos séricos reactivos con WT1/N-
terminal. Solamente 3 de 81 pacientes (3%) tuvieron reactividad hacia la proteína WT1/C-terminal (Figuras 16 y 17).

Estos datos demuestran que las respuestas de Ab hacia WT1 son detectables en algunos pacientes con LMA y LMC. La mayor incidencia de anticuerpos en los pacientes de leucemia proporciona pruebas evidentes de que la inmunización hacia la proteína WT1 se dio como resultado de que los pacientes albergaban una neoplasia maligna que expresa o que en cierto momento expresó WT1. Sin limitarse a una teoría específica, se cree que las respuestas de anticuerpos observadas hacia WT1 muy probablemente son el resultado de que los pacientes se hacen inmunes hacia la WT1 de sus propias células de leucemia, y proporcionan una prueba directa de que WT1 puede ser inmunógena a pesar de ser una proteína "propia".

La presencia de anticuerpos hacia WT1 implica claramente que también hay presentes respuestas de células T colaboradoras concurrentes en los mismos pacientes. WT1 es una proteína interna. Así, las respuestas de LTC probablemente son las más eficaces en cuanto a la terapia de la leucemia, y la rama más tóxica de la inmunidad. Así, estos datos proporcionan pruebas de que las vacunas terapéuticas dirigidas contra WT1 serán capaces de generar una respuesta inmunitaria hacia WT1.

La mayoría de los anticuerpos detectados fueron reactivos con los epítopos del extremo N-terminal, mientras solamente un pequeño subgrupo de pacientes mostró una respuesta de anticuerpos débil hacia el extremo C-terminal. Esto es coherente con las observaciones en el modelo animal, en el que la inmunización con péptidos derivados del extremo N-terminal generaron respuestas de anticuerpos, células T colaboradoras y LTC, mientras ninguno de los péptidos analizados del extremo C-terminal generaron respuestas de anticuerpos o de células T (Gaiger et al., Blood 96:1334, 2000).

Ejemplo 2

Inducción de anticuerpos hacia WT1 en ratones inmunizados con líneas celulares que expresan WT1

Este ejemplo ilustra el uso de células que expresan WT1 para inducir una respuesta de anticuerpos específicos hacia WT1 in vivo.

La detección de los anticuerpos existentes hacia WT1 en pacientes con leucemia implicó claramente que es posible inmunizar hacia una proteína WT1 para generar inmunidad hacia WT1. Para analizar si la inmunidad hacia WT1 se puede generar mediante vacunación, se inyectó a los ratones TRAMP-C, una línea de células tumorales WT1 positivas de origen B6. Brevemente, se inmunizaron ratones B6 con 5 x 10^{6} células TRAMP-C de forma subcutánea y se reforzaron dos veces con 5 x 10^{6} células a intervalos de tres semanas. Tres semanas después de la inmunización final, se obtuvieron los sueros y se prepararon suspensiones de células individuales de los bazos en medio RPMI 1640 (GIBCO) con \beta-2-mercaptoetanol 25 \muM, 200 unidades de penicilina por ml, L-glutamina 10 mM, y un 10% de suero bovino fetal.

Tras la inmunización hacia TRAMP-C, fue detectable una respuesta de anticuerpos específicos hacia WT1 en los animales inmunizados. Se muestra una transferencia de Western representativa en la Figura 3. Estos resultados demuestran que la inmunización hacia la proteína WT1 puede generar una respuesta inmunitaria hacia la proteína WT1.

Ejemplo 3

Inducción de respuestas TH y de anticuerpos en ratones inmunizados con péptidos de WT1

Este ejemplo ilustra la capacidad de la inmunización con péptidos de WT1 de generar una respuesta inmunitaria específica para WT1.

Los péptidos adecuados para generar respuestas de Ab y de células T proliferativas se identificaron según el programa Tsites (Rothbard y Taylor, EMBO J. 7:93-100, 1988; Deavin et al., Mol. Immunol. 33:145-155, 1996), que busca motivos peptídicos que tienen la capacidad de generar respuestas Th. Se sintetizaron y se secuenciaron los péptidos mostrados en la Tabla I.

TABLA I

1

\newpage

Para la inmunización, los péptidos se agruparon como sigue:

Grupo A:: p6-22 humano: 10,9 mg en 1 ml (10 \mul = 100 \mug)

\quad: p117-139 humano/ratón: 7,6 mg en 1 ml (14 \mul = 100 \mug)

\quad: p244-262 humano: 4,6 mg en 1 ml (22 \mul = 100 \mug)

Grupo B:: p287-301 humano/ratón: 7,2 mg en 1 ml (14 \mul = 100 \mug)

\quad: p299-313 ratón: 6,6 mg en 1 ml (15 \mul = 100 \mug)

\quad: p421-435 humano/ratón: 3,3 mg en 1 ml (30 \mul = 100 \mug)

Control:: (péptido FBL 100 \mug) + CFA/IFA

Control:: (péptido CD45 100 \mug) + CFA/IFA

El Grupo A contuvo péptidos presentes en la porción aminoterminal de WT1 (exón 1), y el Grupo B contuvo péptidos presentes en el extremo carboxiterminal, que contiene una región de cuatro dedos de zinc con homología de secuencia hacia otras proteínas de unión al ADN. En el grupo B, p287-301 y p299-313 procedieron del exón 7, dedo de zinc 1, y p421-435 procedió del exón 10, dedo de zinc IV.

Los ratones B6 se inmunizaron con un grupo de péptidos de WT1 o con un péptido de control. Los péptidos se disolvieron en 1 ml de agua estéril para inyección, y los ratones B6 se inmunizaron 3 veces a intervalos de tiempo de tres semanas. Los adyuvantes usados fueron CFA/IFA, GM-CSF, y Montinide. La presencia de anticuerpos específicos para WT1 se determinó después como se describió en los Ejemplos 1 y 2, y las respuestas de células T proliferativas se estudiaron mediante el uso de un ensayo de incorporación de timidina estándar, en el que las células se cultivaron en presencia del antígeno y la proliferación se estudió midiendo la radiactividad incorporada (Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994). En particular, los linfocitos se cultivaron en placas de 96 pocillos a 2x10^{5} células por pocillo con 4x10^{5} células de bazo singénicas irradiadas (3000 rad) y el péptido designado.

La inmunización de los ratones con el grupo de péptidos denominado Grupo A generó una respuesta de anticuerpos hacia WT1 (Figura 4). No se detectaron anticuerpos tras la inmunización con la Vacuna B, lo cual es coherente con la carencia de una respuesta de células T colaboradoras a partir de la inmunización con la Vacuna B. P117-139 generó respuestas de células T proliferativas (Figuras 5A-5C). Los índices de estimulación (IE) variaron entre 8 y 72. También se demostró que otros péptidos (P6-22 y P299-313) generaron respuestas de células T proliferativas. La inmunización con P6-22 dio como resultado un índice de estimulación (IE) de 2,3, y la inmunización con P299-313 dio como resultado un IE de 3,3. Los controles positivos incluyeron células T estimuladas con ConA, así como células T estimuladas con antígenos conocidos, tales como CD45 y FBL, y líneas de células T alogénicas (DeBruijn et al., Eur. J. Immunol. 21:2963-2970, 1991).

Las Figuras 6A y 6B muestran la respuesta proliferativa observada para cada uno de los tres péptidos de la vacuna A (Figura 6A) y de la vacuna B (Figura 6B). La vacuna A generó respuestas de células T proliferativas hacia los péptidos de inmunización p6-22 y p117-139, con índices de estimulación (IE) que variaban entre 3 y 8 (líneas gruesas). No se detectó una respuesta proliferativa hacia p244-262 (Figura 6A).

Las estimulaciones in vitro posteriores se llevaron a cabo como estimulaciones con péptidos simples mediante el uso de solamente p6-22 y p117-139. La estimulación de la línea de células T específicas de la Vacuna A con p117-139 dio como resultado la proliferación hacia p117-139 sin respuesta hacia p6-22 (Figura 7A). Los clones derivados de la línea fueron específicos para p117-139 (Figura 7B). En cambio, la estimulación de la línea de células T específicas de la Vacuna A con p6-22 dio como resultado la proliferación hacia p6-22 sin respuesta hacia p117-139 (Figura 7C). Los clones derivados de la línea fueron específicos para p6-22 (Figura 7D).

Estos resultados demuestran que la vacunación con péptidos de WT1 puede generar respuestas de anticuerpos hacia la proteína WT1 y respuestas de células T proliferativas hacia los péptidos de inmunización.

Ejemplo 4

Inducción de respuestas de LTC en ratones inmunizados con péptidos de WT1

Este ejemplo ilustra la capacidad de los péptidos de WT1 para generar inmunidad de LTC.

Los péptidos (9-meros) con motivos apropiados para la unión a la clase I del MHC se identificaron mediante el uso de un análisis BIMAS de predicción de la unión de péptidos a HLA (Parker et al., J. Immunol. 152:163, 1994). Los péptidos identificados en tales análisis se muestran en las Tablas II - XLIV. En cada una de estas tablas, la puntuación refleja la afinidad de unión teórica (semivida de disociación) del péptido a la molécula del MHC indicada.

Los péptidos identificados mediante el uso del programa Tsites (Rothbard y Taylor, EMBO J. 7:93-100, 1988; Deavin et al., Mol. Immunol. 33:145-155, 1996), que busca los motivos peptídicos que tienen la capacidad de generar respuestas Th, se muestran además en las Figuras 8A y 8B, y en la Tabla XLV.

\global\parskip1.000000\baselineskip

TABLA II

2

3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA III

4

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA IV

7

8

TABLA V

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA VI

11

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA VII

14

15

TABLA VIII

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA IX

18

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA X

21

22

TABLA XI

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA XII

25

26

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA XIII

28

29

TABLA XIV

30

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA XV

32

33

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA XVI

35

36

TABLA XVII

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA XVIII

39

40

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA XIX

42

43

TABLA XX

44

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA XXI

46

47

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA XXII

49

50

TABLA XXIII

51

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA XXIV

53

54

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA XXV

56

57

TABLA XXVI

58

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA XXVII

60

61

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA XXVIII

63

64

TABLA XXIX

65

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA XXX

67

68

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA XXXI

70

71

TABLA XXXII

72

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA XXXIII

74

75

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA XXXIV

77

78

TABLA XXXV

79

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA XXXVI

81

82

83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA XXXVII

84

85

TABLA XXXVIII

86

87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA XXXIX

88

89

90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA XL

91

92

TABLA XLI

93

94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA XLII

95

96

97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA XLIII

98

99

TABLA XLIV

100

101

TABLA XLV

102

Ciertos péptidos de LTC (mostrados en la Tabla XLVI) se seleccionaron para un estudio adicional. Para cada péptido de la Tabla XLVI, se proporcionan las puntuaciones obtenidas mediante el uso del análisis BIMAS de predicción de la unión de péptidos a HLA.

TABLA XLVI

104

\vskip1.000000\baselineskip

La unión peptídica al MHC murino de C57BI/6 se confirmó mediante el uso de la línea de células de leucemia RMA-S, como describió Ljunggren et al., Nature 346:476-480, 1990. Brevemente, las células RMA-S se cultivaron durante 7 horas a 26ºC en medio completo enriquecido con un 1% de FCS. Se añadió un total de 10^{6} células RMA-S en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y se incubaron solas o con el péptido designado (25 \mug/ml) durante 16 horas a 26ºC y 3 horas adicionales a 37ºC en medio completo. Las células se lavaron después tres veces y se tiñeron con anticuerpo anti-D^{b} o anti-K^{b} conjugado con isotiocianato de fluoresceína (PharMingen, San Diego, CA). Las células marcadas se lavaron dos veces, se resuspendieron y se fijaron en 500 \mul de PBS con un 1% de paraformaldehído, y se analizó la intensidad de la fluorescencia en un citómetro de flujo (FACSCalibur® de Becton-Dickinson). El porcentaje de incremento de las moléculas D^{b} o K^{b} en la superficie de las células RMA-S se midió mediante la intensidad de fluorescencia media incrementada de las células incubadas con el péptido, en comparación con la de las células incubadas en medio solamente.

Los ratones se inmunizaron con los péptidos capaces de unirse al MHC de clase I murino. Tras la inmunización, las células del bazo se estimularon in vitro y se analizó la capacidad de lisar los objetivos incubados con péptidos de WT1. Los LTC se estudiaron con un análisis de liberación de cromo estándar (Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994). Se incubaron 10^{6} células seleccionadas como objetivo a 37ºC con 150 \muCi de ^{51}Cr-cromato sódico durante 90 minutos, en presencia o ausencia de los péptidos específicos. Las células se lavaron tres veces y se resuspendieron en RPMI con un 5% de suero bovino fetal. Para el análisis, se incubaron 10^{4} células seleccionadas como objetivo marcadas con ^{51}Cr con diferentes concentraciones de células efectoras en un volumen final de 200 \mul en placas de 96 pocillos de fondo en U. Los sobrenadantes se eliminaron después de 4 a 7 horas a 37ºC, y se determinó el porcentaje de lisis específica mediante la fórmula:

% de lisis específica = 100 x (liberación experimental - liberación espontánea)/ (liberación máxima - liberación espontánea).

Los resultados, presentados en la Tabla XLVII, demuestran que algunos péptidos de WT1 se pueden unir a las moléculas del MHC de clase I, lo cual es esencial para generar LTC. Además, varios péptidos fueron capaces de generar LTC específicos hacia los péptidos (Figuras 9A y 9B), tal como se determinó mediante el uso de los análisis de liberación de cromo. Tras la inmunización hacia los péptidos de LTC p10-18 humano, p136-144 humano, p136-144 de ratón y p235-243, se generaron líneas de LTC específicas y se establecieron clones. Estos resultados indican que los LTC específicos de los péptidos pueden destruir células malignas que expresan WT1.

TABLA XLVII

106

Ejemplo 5

Uso de un polipéptido wt1 para generar LTC específicos de WT1 en ratones

Este ejemplo ilustra la capacidad de un polipéptido WT1 representativo para generar inmunidad de LTC capaces de destruir líneas de células tumorales WT1 positivas.

P117-139, un péptido con motivos apropiados para la unión al MHC de clase I y clase II, se identificó como se describió anteriormente mediante el uso de los análisis TSITES y BIMAS de predicción de la unión de péptidos a HLA. Los ratones se inmunizaron como se describió en el Ejemplo 3. Tras la inmunización, las células del bazo se estimularon in vitro y se analizó la capacidad de lisar objetivos incubados con péptidos de WT1, así como células tumorales WT1 positivas y negativas. Los LTC se estudiaron con un análisis de liberación de cromo estándar. Los resultados, presentados en las Figuras 10A-10D, demuestran que P117 puede generar LTC específicos de WT1 capaces de destruir células tumorales WT1 positivas, a la vez que no se observó la destrucción de células WT1 negativas. Estos resultados demuestran que los LTC específicos de los péptidos destruyen de hecho células malignas que expresan WT1, y que la vacuna y la terapia con células T son eficaces contra las neoplasias malignas que expresan WT1.

Se llevaron a cabo inmunizaciones parecidas mediante el uso de los péptidos 9-méricos de unión al MHC de clase I p136-144, p225-233, p235-243 así como el péptido 23-mérico p117-139. Tras la inmunización, las células del bazo se estimularon in vitro con cada uno de los 4 péptidos y se analizó la capacidad de lisar los objetivos incubados con los péptidos de WT1. Se generaron LTC específicos para p136-144, p235-243 y p117-139, pero no para p225-233. Los datos de los LTC para p235-243 y p117-139 se presentan en las Figuras 11A y 11B. Los datos para los péptidos p136-144 y p225-233 no están representados.

La lisis mediante LTC requiere que los péptidos de WT1 seleccionados como objetivo se procesen de forma endógena y se presenten en asociación con las moléculas del MHC de clase I de las células tumorales. Se analizó la capacidad de lisar líneas de células tumorales WT1 positivas frente a las negativas por parte de los LTC específicos para los péptidos de WT1 anteriores. Los LTC específicos para p235-243 lisaron los objetivos incubados con los péptidos p235-243, pero no lisaron las líneas celulares que expresaban proteínas WT1 (Figura 11A). En cambio, de forma notable, los LTC específicos para p117-139 lisaron los objetivos incubados con los péptidos p117-139, y también lisaron las células malignas que expresaban WT1 (Figura 11B). Como control negativo, los LTC específicos para p117-139 no lisaron las EL-4 (también denominadas en esta memoria E10) WT1 negativas.

La especificidad de la lisis específica de WT1 se confirmó mediante inhibición del objetivo sin marcar radiactivamente (Figuras 12A-12B). Las células efectoras se colocaron en diversas proporciones de efector:objetivo en placas de 96 pocillos de fondo en U. Se añadió un exceso de diez veces (en comparación con el objetivo marcado radiactivamente) del objetivo revestido con el péptido indicado sin marcar con ^{51}Cr. Finalmente, se añadieron 10^{4} células objetivo marcadas con ^{51}Cr por pocillo, y las placas se incubaron a 37ºC durante 4 horas. El volumen total por pocillo fue 200 \mul.

La lisis de TRAMP-C por los LTC específicos de p117-139 se bloqueó del 58% al 36% mediante EL-4 incubadas con el péptido relevante p117-139, pero no con EL-4 incubadas con un péptido irrelevante (Figura 12A). De forma similar, la lisis de BLK-SV40 se bloqueó del 18% al 0% mediante EL-4 incubadas con el péptido relevante p117-139 (Figura 12B). Los resultados dan validez a que los LTC específicos de péptidos de WT1 destruyen específicamente las células malignas mediante el reconocimiento del WT1 procesado.

Varios segmentos con motivos supuestamente de LTC están contenidos en p117-139. Para determinar la secuencia exacta del epítopo de LTC se sintetizaron todos los péptidos 9-méricos potenciales de p117-139 (Tabla XLVIII). Se demostró que dos de estos péptidos (p126-134 y p130-138) se unían a las moléculas de clase I H-2^{b} (Tabla XLVIII). Los LTC generados mediante inmunización con p117-139 lisaron los objetivos incubados con p126-134 y p130-138, pero no los otros péptidos 9-méricos de p117-139 (Figura 13A).

La línea de LTC específica de p117-139 se reestimuló con p126-134 o p130-138. Tras la reestimulación con p126-134 o p130-138, ambas líneas de células T mostraron una lisis específica del péptido, pero solamente los LTC específicos de p130-138 mostraron la lisis de una línea de células tumorales WT1 positivas (Figuras 13B y 13C). Así, p130-138 parece ser un epítopo procesado de forma natural.

TABLA XLVIII

107

108

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6

Identificación de ARNm específico de WT1 en líneas de células tumorales de ratón

Este ejemplo ilustra el uso de la RT-PCR para detectar ARNm específico de WT1 en células y líneas celulares.

Se aislaron células mononucleares mediante centrifugación en gradiente de densidad, y se congelaron y se almacenaron inmediatamente a -80ºC hasta que se analizó mediante RT-PCR la presencia de ARNm específico de WT1. La RT-PCR se llevó a cabo en general como se describe en Fraizer et al., Blood 86:4704-4706, 1995. Se extrajo el ARN total de 10^{7} células según procedimientos habituales. Los sedimentos de ARN se suspendieron en 25 \muL de agua tratada con pirocarbonato de dietilo y se usaron directamente para la transcripción inversa. La región de los dedos de zinc (exones 7 a 10) se amplificó mediante PCR en forma de un cADN de ratón de 330 pb. La amplificación se llevó a cabo en un termociclador durante una o, si fue necesario, dos rondas secuenciales de PCR. Se usó la ADN polimerasa AmpliTaq (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), MgCl_{2} 2,5 mM y 20 pmol de cada cebador en un volumen total de reacción de 50 \mul. Se sometieron a electroforesis alícuotas de 20 \mul de los productos de PCR en geles de agarosa del 2% teñidos con bromuro de etidio. Los geles se fotografiaron con papel Polaroid (Polaroid 667, Polaroid Ltd., Hertfordshire, Inglaterra). Se tomaron precauciones contra la contaminación cruzada siguiendo las recomendaciones de Kwok e Higuchi, Nature 339:237-238, 1989. Los controles negativos incluyeron las mezclas de reactivos de cADN y de PCR con agua en vez de cADN en cada experimento. Para evitar falsos negativos, se determinó la presencia de ARN intacto y la generación adecuada de cADN para cada muestra mediante una PCR de control con el uso de cebadores para \beta-actina. Las muestras que no amplificaron con estos cebadores se excluyeron del
análisis.

Los cebadores para la amplificación de WT1 en las líneas de células de ratón fueron: P115: 1458-1478: 5' CCC AGG CTG CAA TAA GAG ATA 3' (cebador directo; ID SEC Nº:21); y P116: 1767-1787: 5' ATG TTG TGA TGG CGG ACC AAT 3' (cebador inverso; ID SEC Nº:22) (véase Inoue et al, Blood 88:2267-2278, 1996; Fraizer et al., Blood 86:4704-4706, 1995).

Los cebadores para \beta-actina usados en las reacciones de control fueron: 5' GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA 3' (cebador directo; ID SEC Nº:23); y 5' GTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC 3' (cebador inverso; ID SEC Nº:24).

Los cebadores usados en la amplificación de WT1 humano incluyen: P117: 954-974: 5' GGC ATC TGA GAC CAG TGA GAA 3' (ID SEC Nº:25); y P118: 1434-1414: 5' GAG AGT CAG ACT TGA AAG CAGT 3' (ID SEC Nº:5). Para la RT-PCR anidada, los cebadores pueden ser: P119: 1023-1043: 5' GCT GTC CCA CTT ACA GAT GCA 3' (ID SEC Nº:26); y P120: 1345-1365: 5' TCA AAG CGC CAG CTG GAG TTT 3' (ID SEC Nº:27).

La Tabla XLIX muestra los resultados del análisis mediante PCR de WT1 de líneas de células tumorales de ratón. En la Tabla XLIX, (+++) indica un producto intenso de amplificación mediante PCR de WT1 en la primera etapa de la RT-PCR, (++) indica un producto de amplificación de WT1 que es detectable mediante la primera etapa de la RT-PCR de WT1, (+) indica un producto que es detectable solamente en la segunda etapa de la RT-PCR de WT1, y (-) indica una PCR de WT1 negativa.

TABLA XLIX

109

\newpage

Ejemplo 7

Expresión en E. coli de la construcción de fusión WT1-TRX

El marco de lectura abierto truncado de WT1 (WT1B) se amplificó mediante PCR con los siguientes cebadores:

Cebador directo que comienza en el aminoácido 2

P-37 (ID SEC Nº:342): 5' ggctccgacgtgcgggacctg 3' Tf 64ºC

\vskip1.000000\baselineskip

Cebador inverso que crea un sitio de EcoRI tras el codón de parada

P-23 (ID SEC Nº:343): 5' gaattctcaaagcgccagctggagtttggt 3' Tf 63ºC

\vskip1.000000\baselineskip

La PCR se llevó a cabo en las siguientes condiciones:

10 \mul de tampón Pfu 10X

1 \mul de dNTPs 10 mM

2 \mul de cada oligonucleótido 10 \muM

83 \mul de agua estéril

1,5 \mul de Pfu ADN polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA)

50 ng de ADN (pPDM FL WT1)

\vskip1.000000\baselineskip

2 minutos a 96ºC

20 segundos a 96ºC	15 segundos a 63ºC	3 minutos a 72ºC x 40 ciclos

4 minutos a 72ºC

\vskip1.000000\baselineskip

El producto de PCR se digirió con la enzima de restricción EcoRI, se purificó en gel y después se clonó en el vector pTrx 2H (un vector pET28 modificado con una fusión con Trx en el extremo N-terminal y dos etiquetas de His que rodean a la fusión con Trx. Después de la fusión con Trx existen sitios de escisión de proteasas para trombina y enteroquinasa). La construcción pTrx2H se digirió con las enzimas de restricción StuI y EcoRI. Las construcciones correctas se confirmaron mediante análisis de la secuencia del ADN y después se transformaron en células hospedadoras para la expresión CodonPlus BL21 (DE3) pLys S y BL21 (DE3).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8

Expresión en E. coli de construcciones de fusión WT1 A-etiqueta de HIS

El marco de lectura abierto N-terminal de WT1 (WT1A) se amplificó mediante PCR con los siguientes cebadores:

Cebador directo que comienza en el aminoácido 2

P-37 (ID SEC Nº:344): 5' ggctccgacgtgcgggacctg 3' Tf 64ºC

\vskip1.000000\baselineskip

Cebador inverso que crea un sitio de EcoRI tras un codón de parada artificial colocado después del aminoácido 249.

PDM-335 (ID SEC Nº:345): 5' gaattctcaaagcgccagctggagtttggt 3' Tf 64ºC

\newpage

\global\parskip0.980000\baselineskip

La PCR se llevó a cabo en las siguientes condiciones:

10 \mul de tampón Pfu 10X

1 \mul de dNTPs 10 mM

2 \mul de cada oligonucleótido 10 \muM

83 \mul de agua estéril

1,5 \mul de Pfu ADN polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA)

50 ng de ADN (pPDM FL WT1)

\vskip1.000000\baselineskip

2 minutos a 96ºC

20 segundos a 96ºC	15 segundos a 63ºC	1 minuto 20 segundos a 72ºC x 40 ciclos

4 minutos a 72ºC

\vskip1.000000\baselineskip

El producto de PCR se digirió con la enzima de restricción EcoRI, se purificó en gel y después se clonó en pPDM, un vector pET28 modificado con una etiqueta de His en el marco de lectura, que se había digerido con las enzimas de restricción Eco72I y EcoRI. El producto de PCR se transformó también en el vector pTrx 2H. La construcción pTrx2H se digirió con las enzimas de restricción StuI y EcoRI. Las construcciones correctas se confirmaron mediante análisis de la secuencia del ADN y después se transformaron en células hospedadoras para la expresión CodonPlus BL21 (DE3) pLys S y BL21 (DE3).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9

Expresión en E. coli de construcciones de fusión WT1 B-etiqueta de HIS

El marco de lectura abierto truncado de WT1 (WT1A) se amplificó mediante PCR con los siguientes cebadores:

Cebador directo que comienza en el aminoácido 250

PDM-346 (ID SEC Nº:346): 5' cacagcacagggtacgagagc 3' Tf 58ºC

\vskip1.000000\baselineskip

Cebador inverso que crea un sitio de EcoRI tras el codón de parada

P-23 (ID SEC Nº:347): 5'gaattctcaaagcgccagctggagtttggt 3' Tf 63ºC

\vskip1.000000\baselineskip

La PCR se llevó a cabo en las siguientes condiciones:

10 \mul de tampón Pfu 10X

1 \mul de dNTPs 10 mM

2 \mul de cada oligonucleótido 10 \muM

83 \mul de agua estéril

1,5 \mul de Pfu ADN polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA)

50 ng de ADN (pPDM FL WT1)

\vskip1.000000\baselineskip

2 minutos a 96ºC

20 segundos a 96ºC	15 segundos a 63ºC	1 minuto 30 segundos a 72ºC x 40 ciclos

4 minutos a 72ºC

\vskip1.000000\baselineskip

\global\parskip1.000000\baselineskip

El producto de PCR se digirió con la enzima de restricción EcoRI, se purificó en gel y después se clonó en pPDM, un vector pET28 modificado con una etiqueta de His en el marco de lectura, que se había digerido con las enzimas de restricción Eco72I y EcoRI. El producto de PCR se transformó también en el vector pTrx 2H. La construcción pTrx 2H se digirió con las enzimas de restricción StuI y EcoRI. Las construcciones correctas se confirmaron mediante análisis de la secuencia del ADN y después se transformaron en células hospedadoras para la expresión CodonPlus BL21 (DE3) pLys S y BL21 (DE3).

\vskip1.000000\baselineskip

Para los Ejemplos 7-9, se describen las siguientes ID SEC Nºs:

ID SEC Nº:327 es la secuencia de cADN determinada para Trx_WT1_B

ID SEC Nº:328 es la secuencia de cADN determinada para Trx_WT1_A

ID SEC Nº:329 es la secuencia de cADN determinada para Trx_WT1

ID SEC Nº:330 es la secuencia de cADN determinada para WT1_A

ID SEC Nº:331 es la secuencia de cADN determinada para WT1_B

ID SEC Nº:332 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por ID SEC Nº:327

ID SEC Nº:333 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por ID SEC Nº:328

ID SEC Nº:334 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por ID SEC Nº:329

ID SEC Nº:335 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por ID SEC Nº:330

ID SEC Nº:336 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por ID SEC Nº:331

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 10

Formas truncadas de WT1 expresadas en E. coli

Se amplificaron mediante PCR tres marcos de lectura de WT1 mediante el uso de los siguientes cebadores:

Para WT1 Tr2:
PDM-441 (ID SEC Nº:348)	5' cacgaagaacagtgcctgagcgcattcac 3' Tf 63ºC
PDM-442 (ID SEC Nº:349)	5' ccggcgaattcatcagtataaattgtcactgc 3' Tf 62ºC

Para WT1 Tr3:
PDM-443 (ID SEC Nº:350)	5' caggctttgctgctgaggacgccc 3' Tf 64ºC
PDM-444 (ID SEC Nº:351)	5' cacggagaattcatcactggtatggtttctcacc 3' Tf 64ºC

Para WT1 Tr4:
PDM-445 (ID SEC Nº:352)	5' cacagcaggaagcacactggtgagaaac 3' Tf 63ºC
PDM-446 (ID SEC Nº:353)	5' ggatatctgcagaattctcaaagcgccagc 3' Tf 63ºC

\vskip1.000000\baselineskip

La PCR se llevó a cabo en las siguientes condiciones:

10 \mul de tampón Pfu 10X

1 \mul de dNTPs 10 mM

2 \mul de cada oligonucleótido 10 \muM

83 \mul de agua estéril

1,5 \mul de Pfu ADN polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA)

50 ng de ADN (pPDM FL WT1)

\vskip1.000000\baselineskip

2 minutos a 96ºC

20 segundos a 96ºC	15 segundos a 63ºC	30 segundos a 72ºC x 40 ciclos

4 minutos a 72ºC

\vskip1.000000\baselineskip

Los productos de PCR se digirieron con EcoRI y se clonaron en pPDM His (un vector pET28 modificado con una etiqueta de His en el marco de lectura en el extremo 5'), que se había digerido con Eco72I y EcoRI. Se confirmó que las construcciones eran correctas por medio del análisis de la secuencia y se transformaron en células CodonPlus BL21 pLys S y BL21 o en células CodonPlus BLR pLys S y BLR.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 11

Expresión de WT1 C (aminoácidos 76-437) y WT1 D (aminoácidos 91-427) en E. coli

El marco de lectura de WT1 C se amplificó mediante PCR con el uso de los siguientes cebadores:

PDM-504 (ID SEC Nº:354)	5' cactccttcatcaaacaggaac 3' Tf 61ºC
PDM-446 (ID SEC Nº:355)	5' ggatatctgcagaattctcaaagcgccagc 3' Tf 63ºC

\vskip1.000000\baselineskip

La PCR se llevó a cabo en las siguientes condiciones:

10 \mul de tampón Pfu 10X

1 \mul de dNTPs 10 mM

2 \mul de cada oligonucleótido 10 \muM

83 \mul de agua estéril

1,5 \mul de Pfu ADN polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA)

50 ng de ADN (pPDM FL WT1)

\vskip1.000000\baselineskip

2 minutos a 96ºC

20 segundos a 96ºC	15 segundos a 63ºC	2 minutos a 72ºC x 40 ciclos

4 minutos a 72ºC

\vskip1.000000\baselineskip

El producto de PCR se digirió con EcoRI y se clonó en pPDM His, que se había digerido con Eco72I y EcoRI. La secuencia se confirmó por medio del análisis de la secuencia y después se transformó en BLR pLys S y BLR, que se co-transforman con CodonPlus RP.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 12

Producción sintética de WT1 TR-1 mediante hibridación de oligonucleótidos solapantes

Este ejemplo se llevó a cabo para determinar el efecto del cambio del uso del codón de prolina sobre la expresión.

Se hibridaron los siguientes pares de oligonucleótidos:

1.	PDM-505 (ID SEC Nº:356)	5' ggttccgacgtgcgggacctgaacgcactgctg 3'
	PDM-506 (ID SEC Nº:357)	5' ctgccggcagcagtgcgttcaggtcccgcacgtcggaacc 3'

2.	PDM-507 (ID SEC Nº:358)	5' ccggcagttccatccctgggtggcggtggaggctg 3'
	PDM-508 (ID SEC Nº:359)	5' cggcagtgcgcagcctccaccgccacccagggatggaa 3'

\global\parskip0.930000\baselineskip

3.	PDM-509 (ID SEC Nº:360)	5' cgcactgccggttagcggtgcagcacagtgggctc 3'
	PDM-510 (ID SEC Nº:361)	5' cagaactggagcccactgtgctgcaccgctaac 3'

4.	PDM-511 (ID SEC Nº:362)	5' cagttctggacttcgcaccgcctggtgcatccgcatac 3'
	PDM-512 (ID SEC Nº:363)	5' cagggaaccgtatgcggatgcaccaggcggtgcgaagtc 3'

5.	PDM-513 (ID SEC Nº:364)	5' ggttccctgggtggtccagcacctccgcccgcaacgcc 3'
	PDM-514 (ID SEC Nº:365)	5' ggcggtgggggcgttgcgggcggaggtgctggaccacc 3'

6.	PDM-515 (ID SEC Nº:366)	5' cccaccgcctccaccgcccccgcactccttcatcaaacag 3'
	PDM-516 (ID SEC Nº:367)	5' ctaggttcctgtttgatgaaggagtgcgggggcggtgga 3'

7.	PDM-517 (ID SEC Nº:368)	5' gaacctagctggggtggtgcagaaccgcacgaagaaca 3'
	PDM-518 (ID SEC Nº:369)	5' ctcaggcactgttcttcgtgcggttctgcaccaccccag 3'

8.	PDM-519 (ID SEC Nº:370)	5' gtgcctgagcgcattctgagaattctgcagat 3'
	PDM-520 (ID SEC Nº:371)	5' gtgtgatggatatctgcagaattctcagaatgcg 3'

\vskip1.000000\baselineskip

Cada par de oligonucleótidos se combinó por separado y después se hibridó. Los pares se ligaron después entre sí y se usó un \mul de la mezcla de ligadura con las condiciones de PCR siguientes:

10 \mul de tampón Pfu 10X

1 \mul de dNTPs 10 mM

2 \mul de cada oligonucleótido 10 \muM

83 \mul de agua estéril

1,5 \mul de Pfu ADN polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

El producto de PCR se digirió con EcoRI y se clonó en pPDM His, que se había digerido con Eco72I y EcoRI. La secuencia se confirmó y después se transformó en BLR pLys S y BLR, que se co-transforman con CodonPlus RP.

\vskip1.000000\baselineskip

Para los Ejemplos 10-12, se describen las siguientes ID SEC Nºs:

ID SEC Nº:337 es la secuencia de cADN determinada para WT1_Tr1

ID SEC Nº:338 es la secuencia de cADN determinada para WT1_Tr2

ID SEC Nº:339 es la secuencia de cADN determinada para WT1_Tr3

ID SEC Nº:340 es la secuencia de cADN determinada para WT1_Tr4

ID SEC Nº:341 es la secuencia de cADN determinada para WT1_C

ID SEC Nº:342 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por ID SEC Nº:337

ID SEC Nº:343 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por ID SEC Nº:338

ID SEC Nº:344 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por ID SEC Nº:339

ID SEC Nº:345 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por ID SEC Nº:340

ID SEC Nº:346 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por ID SEC Nº:341

\global\parskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

La secuencia WT1 C representa un polinucleótido que tiene las regiones codificantes de TR2, TR3 y TR4.

La secuencia sintética WT1 TR-1 representa un polinucleótido en el que los codones alternativos de prolina fueron sustituidos por los codones nativos, lo que produjo un polinucleótido capaz de expresar WT1 TR-1 en E. coli.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 13

Evaluación de los efectos histopatológicos y toxicológicos sistémicos de la inmunización con WT1 en ratones

El propósito de este ejemplo es analizar la inmunogenicidad y los efectos histopatológicos y toxicológicos sistémicos potenciales de la inmunización con proteína WT1 en un ajuste de dosis múltiple en ratones.

El diseño experimental para la inmunización de ratones con la proteína WT1 se resume en la Tabla L.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA L

111

\vskip1.000000\baselineskip

La vacunación hacia la proteína WT1 mediante el uso de MPL-SE como adyuvante, en un estudio de ajuste de dosis múltiple (dosis que oscilan de 25 \mug, 100 \mug a 1000 \mug de proteína WT1) en ratones C57/B6 hembra, generó una respuesta intensa de anticuerpos específicos hacia WT1 (Figura 19) y respuestas de células T (Figura 20).

No se observaron efectos histopatológicos o toxicológicos sistémicos de la inmunización con la proteína WT1. No se observó ninguna prueba histológica de toxicidad en los siguientes tejidos: glándula suprarrenal, cerebro, ciego, colon, duodeno, ojo, fémur y médula, vesícula biliar, corazón, íleon, yeyuno, riñón, laringe, glándula lacrimal, hígado, pulmón, nódulo linfático, músculo, esófago, ovario, páncreas, paratiroides, glándula salival, esternón y médula, bazo, estómago, timo, tráquea, tiroides, vejiga y útero.

Se puso un énfasis especial en el estudio de la toxicidad hematopoyética potencial. La proporción mieloide/eritroide en médula de esternón y fémur fue normal. Todos los recuentos de células sanguíneas evaluables y la bioquímica sanguínea (BUN, creatinina, bilirrubina, albúmina, globulina) estuvieron dentro de los intervalos normales (Tabla LI).

Dado que la inmunidad existente hacia WT1 está presente en algunos pacientes de leucemia y que la vacunación hacia la proteína WT1 puede generar Ab específicos de WT1 y respuestas de células T en ratones sin toxicidad hacia los tejidos normales, estos experimentos dan validez a WT1 como una vacuna contra tumores/leucemia.

TABLA LI Análisis de bioquímica clínica y hematología

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

112

113

114

115

116

117

118

119

120

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 14

Generación de respuestas de células T específicas de WT1 humano mediante sensibilización in vitro con el gen completo

Este ejemplo demuestra que se pueden generar respuestas de células T específicas de WT1 a partir de la sangre de individuos normales.

Se diferenciaron células dendríticas (CD) a partir de cultivos de monocitos que procedían de CMSP de donantes normales, mediante cultivo durante 4-10 días en medio RPMI que contenía un 10% de suero humano, 50 ng/ml de GMCSF y 30 ng/ml de IL-4. Tras el cultivo, las CD se infectaron 16 horas con virus vaccinia que expresaba WT1 recombinante a una M.D.I. de 5, o durante 3 días con un adenovirus que expresaba WT1 recombinante a una M.D.I. de 10 (Figuras 21 y 22). El virus vaccinia se inactivó mediante irradiación U.V. Las células T CD8+ se aislaron mediante selección positiva con el uso de esferas magnéticas, y se iniciaron los cultivos de sensibilización en placas de 96 pocillos. Los cultivos se reestimularon cada 7-10 días mediante el uso de células dendríticas autólogas infectadas con adenovirus o virus vaccinia para que expresasen WT1. Después de 3-6 ciclos de estimulación, se pudieron identificar las líneas CD8+ que producían específicamente interferón-\gamma cuando se estimulaban con las células dendríticas o fibroblastos autólogos que expresaban WT1. La actividad específica de WT1 de estas líneas se pudo mantener tras los ciclos de estimulación adicionales. Se demostró que estas líneas reconocían específicamente las células dendríticas autólogas infectadas con WT1 en adenovirus o virus vaccinia, pero no las células dendríticas autólogas infectadas con EGFP en adenovirus o virus vaccinia mediante ensayos de Elispot (Figura 23).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 15

Formulación de RA12-WT1 para inyección: uso de excipientes para estabilizar el producto liofilizado

Este ejemplo describe la formulación que permite la solubilización completa de Ra12-WT1 liofilizado.

La siguiente formulación permitió disolver la proteína recombinante Ra12-WT1 en un medio acuoso después de liofilizarla hasta sequedad:

Concentración de Ra12-WT1 recombinante: 0,5 - 1,0 mg/ml; tampón: etanolamina 10-20 mM, pH 10,0; cisteína 1,0 - 5,0 mM; 0,05% de Tween-80 (Polisorbato-80); carbohidratos: 10% de trehalosa (T5251, Sigma, MO) 10% de maltosa (M9171, Sigma, MO) 10% de sacarosa (S7903, Sigma, MO) 10% de fructosa (F2543, Sigma, MO) 10% de glucosa (G7528, Sigma, MO).

Se descubrió que la proteína liofilizada con el excipiente de carbohidratos se disolvía significativamente más que sin el excipiente de carbohidratos. El análisis mediante SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie no mostró indicios de sólidos restantes en el material disuelto.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 16

Formulación de una vacuna de proteína WT1

Este ejemplo describe la inducción de respuestas inmunitarias específicas de WT1 tras la inmunización con la proteína WT1 y 2 formulaciones de adyuvantes diferentes.

Según este ejemplo, la proteína WT1 en combinación con MPL-SE induce una respuesta intensa de Ab e interferón-\gamma (IFN-\gamma) hacia WT1. A continuación se describen con detalle los métodos usados para inducir respuestas inmunitarias específicas de WT1 tras la inmunización con la proteína WT1 mediante el uso de MPL-SE o Enhanzyn como adyuvante en ratones C57/B6.

Los ratones C57BL/6 se inmunizaron con 20 \mug de rRa12-WT1 combinados con los adyuvantes MPL-SE o Enhanzyn. Un grupo de ratones de control se inmunizó con rRa12-WT1 sin adyuvante, y un grupo se inmunizó con solución salina solamente. Se administraron tres inmunizaciones intramusculares (IM) a intervalos de tres semanas. Se recogieron los bazos y los sueros 2 semanas tras la finalización de la inmunización. Se analizaron las respuestas de anticuerpos en los sueros mediante ELISA en placas revestidas con la fusión Ra12-WT1, Ra12 o WT1TRX. Se observaron niveles similares de títulos de anticuerpos IgG2a e IgG1 en los ratones inmunizados con Ra12-WT1+MPL-SE y Ra12-WT1+Enhanzyn. Los ratones inmunizados con rRa12-WT1 sin adyuvante mostraron niveles más bajos de anticuerpos IgG2a.

Las respuestas de CD4 se determinaron midiendo la producción de interferón-\gamma tras la estimulación de los esplenocitos in vitro con rRa12-WT1, rRa12 o con los péptidos de WT1 p6, p117 y p287. Ambos adyuvantes mejoraron las respuestas de CD4 respecto de los ratones inmunizados solamente con rRA12-WT1. Además, los resultados indican que rRA12-WT1+MPL-SE indujo una respuesta de CD4 más intensa que la inducida por rRA12-WT1+Enhanzyn. Las lecturas de DO de IFN-\gamma oscilaron en 1,4-1,6 en los ratones inmunizados con rRA12-WT1+MPL-SE, en comparación con 1-1,2 en los ratones inmunizados con rRA12-WT1+Enhanzyn. Solamente se observaron respuestas a los péptidos hacia p117, y solamente en los ratones inmunizados con rRa12-WT1+MPL-SE. Se observaron respuestas intensas de IFN-\gamma hacia el control positivo, ConA, en todos los ratones. Solamente se observaron respuestas hacia ConA en los ratones de control negativo inmunizados con solución salina, lo que indica que las respuestas fueron específicas para rRA12-WT1.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 17

Construcción de una biblioteca de WT1 mutado aleatoriamente

La secuencia de ácido nucleico de WT1 humano se mutó aleatoriamente mediante el uso de un método de reacción en cadena de la polimerasa en presencia de 8-oxo dGTP y dPTP (Journal of Molecular Biology 1996; 255:589-603). El gen WT1 humano completo sin eliminación de intrones se describe en la ID SEC Nº:380, y la secuencia de la proteína correspondiente se expone en la ID SEC Nº:404. Se usó una variante de corte y empalme de WT1 como molde para las reacciones de PCR, y se describe en las ID SEC Nºs:381 (ADN) y 408 (proteína). Las condiciones se seleccionaron de forma que la frecuencia de las alteraciones del ácido nucleico condujeron a un cambio seleccionado en la secuencia de aminoácidos, normalmente el 5-30% del producto de PCR. El producto de PCR mutado se amplificó después en ausencia de los análogos de nucleótidos mediante el uso de los cuatro dNTPs normales. Este producto de PCR se subclonó en vectores de expresión de mamíferos y en vectores virales para la inmunización. Esta biblioteca, por lo tanto, contiene una población mixta de clones de WT1 mutados aleatoriamente. Se seleccionaron varios clones y se secuenciaron. Las secuencias de ADN variantes de WT1 mutado se describen en las ID SEC Nºs:377-379, y las secuencias de aminoácidos predichas de las variantes se exponen en las ID SEC Nºs:405-407. Estas secuencias alteradas, y otras de la biblioteca, se pueden usar como inmunógenos para inducir respuestas de células T más intensas contra la proteína WT1 en las células cancerosas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 18

Construcción de fusiones WT1-LAMP

Se construyó una fusión tripartita mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa y de oligonucleótidos sintéticos que contenían las uniones deseadas de la proteína de membrana asociada a lisosomas 1 humana (LAMP-1) y una variante de corte y empalme de la secuencia de WT1 humano. La variante de corte y empalme de WT1 y la secuencia de LAMP-1 usada para estas fusiones se describen en las ID SEC Nºs:381 y 383. De forma específica, el péptido señal de LAMP-1 (pares de bases 1-87 de LAMP) se fusionó al extremo 5' del marco de lectura abierto de WT1 humano (longitud de 1.290 pares de bases), después se fusionó el dominio transmembrana y citoplasmático de LAMP-1 (pares de bases 1161 a 1281 de LAMP) al extremo 3' de la secuencia de WT1. La secuencia de la construcción WT1-LAMP resultante se expone en la ID SEC Nº:382 (ADN) e ID SEC Nº:409 (proteína). La construcción se diseñó de forma que cuando se expresó en las células eucarióticas, el péptido señal dirige la proteína al retículo endoplásmico (RE), en donde las señales de localización del dominio transmembrana y citoplasmático de LAMP-1 dirigen el transporte de la proteína de fusión a la localización lisosómica en la que los péptidos se cargan en las moléculas del MHC de clase II.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 19

Construcción de fusiones WT1-ubiquitina para la presentación incrementada a la clase I del MHC

Se mutó el marco de lectura abierto de la ubiquitina humana (ID SEC Nº:384), de forma que los nucleótidos que codifican el último aminoácido codifiquen una alanina en vez de una glicocola. Este marco de lectura abierto mutado se clonó en el marco de lectura justo en posición 5' del primer codón de una variante de corte y empalme de WT1 humano (ID SEC Nºs:381 y 408, ADN y proteína, respectivamente). La mutación G->A evita la escisión co-traduccional de la proteína naciente por las proteasas que normalmente procesan la poli-ubiquitina durante la traducción. El ADN y la secuencia de aminoácidos predicha para la construcción resultante se exponen en las ID SEC Nºs:385 y 410, respectivamente. La proteína resultante mostró una citotoxicidad celular disminuida cuando se expresó en células humanas. Aunque no fue posible generar líneas estables que expresasen WT1 nativo, se obtuvieron fácilmente líneas celulares que expresaban la proteína de fusión. Se predice que la proteína resultante se dirigirá al proteosoma debido a la molécula de ubiquitina añadida. Esto debería dar como resultado un reconocimiento más eficaz de la proteína por las células T CD8+ específicas de WT1.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 20

Construcción de un vector de adenovirus que expresa WT1 humana

Se clonó una variante de corte y empalme de WT1 humano (ID SEC Nº:381) en un vector de adenovirus de serotipo 5 con deleción de E1 y E3. La expresión del gen WT1 está controlada por el promotor de CMV, que actúa como mediador de un nivel elevado de la expresión de la proteína WT1. La infección de células humanas con este reactivo conduce a un nivel elevado de expresión de la proteína WT1. La naturaleza antigénica de las proteínas adenovirales introducidas en la célula hospedadora durante la infección y producidas a niveles bajos tras la infección puede actuar incrementando la vigilancia inmunitaria y el reconocimiento inmunitario de WT1 como objetivo inmunológico. Este vector se puede usar también para generar respuestas inmunitarias contra la proteína WT1 cuando se inocula en sujetos humanos. Si estos sujetos son positivos para las células tumorales que expresan WT1, la respuesta inmunitaria podría tener un efecto terapéutico o curativo sobre el curso de la enfermedad.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 21

Construcción de un vector de virus vaccinia que expresa WT1 humano

Se clonó una variante de corte y empalme del gen WT1 humano de tamaño completo (ID SEC Nº:381) en el locus de timidina quinasa de la cepa Western Reserve del virus vaccinia mediante el uso del vector transportador pSCl I. El gen WT1 está bajo control de un promotor de virus vaccinia híbrido que actúa como mediador en la expresión del gen durante todo el curso de la infección por el virus vaccinia. Este reactivo se puede usar para expresar la proteína WT1 en células humanas in vivo o in vitro. WT1 es una proteína propia que se sobreexpresa en algunas células tumorales humanas. Así, es poco probable que las respuestas inmunológicas hacia la WT1 administrada en forma de una proteína lleven al reconocimiento mediado por la clase I del complejo de histocompatibilidad principal (clase I del MHC) de WT1. Sin embargo, la expresión de la proteína en el compartimento intracelular mediante el vector del virus vaccinia permitirá una presentación de la clase I del MHC de nivel elevado, y el reconocimiento de la proteína WT1 por parte de las células T CD8+. La expresión de la proteína WT1 mediante el vector del virus vaccinia también conducirá a la presentación de los péptidos de WT1 en el contexto de la clase II del MHC, y así al reconocimiento por parte de las células T CD4+.

Los usos de esta invención incluyen su uso como una vacuna contra el cáncer. La inmunización de sujetos humanos que tienen tumores WT1 positivos podría conducir a una respuesta terapéutica o curativa. La expresión de WT1 dentro de la célula conducirá al reconocimiento de la proteína por parte de las células T CD4 y CD8 positivas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 22

Generación de clones de células T CD8+ específicas de WT1 mediante el uso de sensibilización con el gen completo

Se diferenciaron células dendríticas (CD) a partir de cultivos de monocitos que procedían de CMSP de donantes normales, mediante un cultivo durante 4-6 días en medio RPMI que contenía un 10% de suero humano, 50 ng/ml de GM-CSF y 30 ng/ml de IL-4. Tras el cultivo, las CD se infectaron 16 horas con el virus vaccinia que expresaba WT1 recombinante (descrito en el Ejemplo 21) a una multiplicidad de infección (MDI) de 5, o durante 3 días con un adenovirus que expresaba WT1 recombinante a una MDI de 10. El virus vaccinia se inactivó mediante irradiación U.V. Las células T CD8+ se aislaron mediante eliminación negativa con el uso de esferas magnéticas, y se iniciaron los cultivos de sensibilización en placas de 96 pocillos. Los cultivos se reestimularon cada 7-10 días mediante el uso de células dendríticas autólogas infectadas con adenovirus o virus vaccinia modificados para que expresasen WT1. Después de 4-5 ciclos de estimulación, se pudieron identificar las líneas de células T CD8+ que producían específicamente interferón-\gamma cuando se estimulaban con células dendríticas o fibroblastos autólogos que expresaban WT1. Estas líneas se clonaron, y se demostró que reconocían fibroblastos autólogos transducidos con WT1, pero no fibroblastos transducidos con EGFP mediante ensayos de Elispot.

El gen del tumor de Wilms (WT1) participa en la leucemogénesis, y se sobreexpresa en la mayoría de leucemias humanas, así como en varios tumores sólidos. Los estudios previos en humanos han demostrado la presencia de respuestas de anticuerpos (Ab) específicos de WT1 en 16/63 (25%) pacientes de LMA y en 15/81 (19%) pacientes de LMC estudiados. Los estudios previos en ratones han demostrado que las vacunas basadas en péptidos de WT1 generan respuestas Th, de LTC y de Ab específicos de WT1. El uso de los péptidos como vacunas en humanos es limitado debido a su restricción de HLA y a la tendencia a generar respuestas específicas de los péptidos y solamente en una minoría de los LTC específicos del tumor del paciente. La ventaja de la inmunización con genes completos es que se pueden incluir varios epítopos de LTC y colaboradores en una única vacuna, por lo que no se restringe la vacuna a tipos de HLA específicos. Los datos descritos en esta memoria demuestran la inducción de respuestas inmunitarias específicas hacia WT1 mediante el uso de la sensibilización in vitro con genes completos, y que se pueden generar clones de células T CD8+ específicas de WT1. Dado que la inmunidad existente hacia WT1 está presente en algunos pacientes de leucemia y que la WT1 murina y humana son un 96% idénticas con respecto a los aminoácidos, y que la vacunación con la proteína WT1, el ADN o los péptidos puede generar respuestas de Ab y de células T específicas para WT1 en ratones sin toxicidad para los tejidos normales de los ratones, estos experimentos de sensibilización in vitro en humanos proporcionan una validación adicional de WT1 como vacuna para tumores/leucemia. Además, la capacidad de generar clones de células T CD8+ específicas de WT1 puede conducir al tratamiento de neoplasias malignas asociadas a la sobreexpresión de WT1 mediante el uso de células T modificadas genéticamente.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 23

Construcciones recombinantes para la fabricación clínica de WT1

Se hicieron cinco construcciones como se describe con detalle a continuación, para la producción de WT1 de grado clínico.

Diseño de Ra12/WT-E (ID SEC Nºs:388 (cADN) y 391 (proteína)) y WT-1 E (ID SEC Nºs:386 (cADN) y 395 (proteína)) sin etiqueta de His:

El marco de lectura de WT-1 E se amplificó mediante PCR con los siguientes cebadores para la construcción sin His y sin fusión

PDM-780 (ID SEC Nº:396)	5' gacgaaagcatatgcactccttcatcaaac 3' Tf 60ºC
PDM-779 (ID SEC Nº:397)	5' cgcgtgaattcatcactgaatgcctctgaag 3' Tf 63ºC

Se usaron las siguientes condiciones en los ciclos de la PCR: 10 \mul de tampón Pfu 10X, 1 \mul de dNTPs 10 mM, 2 \mul de cada oligonucleótido 10 \muM, 83 \mul de agua estéril, 1,5 \mul de Pfu ADN polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA), 50 ng de ADN (pPDMRa12 WT-1 sin His). La reacción se desnaturalizó inicialmente a 96ºC durante 2 minutos, seguido de 40 ciclos a 96ºC durante 20 segundos, 62ºC durante 15 segundos, y 72ºC durante 1 minuto y 40 segundos. Esto fue seguido por una extensión final a 72ºC durante 4 minutos. El producto de PCR se digirió con NdeI y EcoRI y se clonó en pPDM His (un vector pET28 modificado) que se había digerido con NdeI y EcoRI. La construcción se confirmó por medio del análisis de la secuencia y después se transformó en células BLR (DE3) pLys S y HMS 174 (DE3) pLys S. Esta construcción pPDM WT-1 E se digirió con NcoI y XbaI y se usó como el esqueleto del vector para el inserto de NcoI y XbaI de pPDM Ra12 WT-1 F (véase más adelante). La construcción se confirmó por medio del análisis de la secuencia y después se transformó en células BLR (DE3) pLys S y HMS 174 (DE3) pLys S. La expresión de la proteína se confirmó mediante SDS-PAGE con tinción de Coomassie y análisis de la secuencia de la proteína N-terminal.

Diseño de Ra12-WT-1-F (aa. 1-281) sin etiqueta de His (ID SEC Nºs:389 (cADN) y 393 (proteína)):

El marco de lectura de Ra12 WT-1 se amplificó mediante PCR con los siguientes cebadores:

PDM-777 (ID SEC Nº:398)	5' cgataagcatatgacggccgcgtccgataac 3' Tf 66ºC
PDM-779 (ID SEC Nº:399)	5' cgcgtgaattcatcactgaatgcctctgaag 3' Tf 63ºC

Se usaron las siguientes condiciones en los ciclos de la PCR: 10 \mul de tampón Pfu 10X, 1 \mul de dNTPs 10 mM, 2 \mul de cada oligonucleótido 10 \muM, 83 \mul de agua estéril, 1,5 \mul de Pfu ADN polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA), 50 ng de ADN (pPDMRa12 WT-1 sin His). La reacción se desnaturalizó inicialmente a 96ºC durante 2 minutos, seguido de 40 ciclos a 96ºC durante 20 segundos, 58ºC durante 15 segundos, y 72ºC durante 3 minutos. Esto fue seguido por una extensión final a 72ºC durante 4 minutos. El producto de PCR se digirió con NdeI y se clonó en pPDM His que se había digerido con NdeI y EcoR72I. La secuencia se confirmó por medio del análisis de la secuencia y después se transformó en células BLR (DE3) pLys S y HMS 174 (DE3) pLys S. La expresión de la proteína se confirmó mediante SDS-PAGE con tinción de Coomassie y análisis de la secuencia de la proteína N-terminal.

Diseño de Ra12-WT-1 sin etiqueta de His (ID SEC Nºs:390 (cADN) y 392 (proteína)):

PDM-777 (ID SEC Nº:400)	5' cgataagcatatgacggccgcgtccgataac 3' Tf 66ºC
PDM-778 (ID SEC Nº:401)	5' gtctgcagcggccgctcaaagcgccagc 3' Tf 70ºC

Se usaron las siguientes condiciones en los ciclos de la PCR: 10 \mul de tampón Pfu 10X, 1 \mul de dNTPs 10 mM, 2 \mul de cada oligonucleótido 10 \muM, 83 \mul de agua estéril, 1,5 \mul de Pfu ADN polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA), 50 ng de ADN (pPDMRa12 WT-1 sin His). La reacción se desnaturalizó inicialmente a 96ºC durante 2 minutos, seguido de 40 ciclos a 96ºC durante 20 segundos, 68ºC durante 15 segundos, y 72ºC durante 2 minutos y 30 segundos. Esto fue seguido por una extensión final a 72ºC durante 4 minutos. El producto de PCR se digirió con NotI y NdeI y se clonó en pPDM His que se había digerido con NdeI y NotI. La secuencia se confirmó por medio del análisis de la secuencia y después se transformó en células BLR (DE3) pLys S y HMS 174 (DE3) pLys S. La expresión de la proteína se confirmó mediante SDS-PAGE con tinción de Coomassie y análisis de la secuencia de la proteína N-
terminal.

Diseño de WT-1 C (aa. 69-430) en E. coli sin etiqueta de His (ID SEC Nºs:387 (cADN) y 394 (proteína)):

El marco de lectura de WT-1 C se amplificó mediante PCR con los siguientes cebadores:

PDM-780 (ID SEC Nº:402)	5' gacgaaagcatatgcactccttcatcaaac 3' Tf 60ºC
PDM-778 (ID SEC Nº:403)	5' gtctgcagcggccgctcaaagcgccagc 3' Tf 70ºC

Se usaron las siguientes condiciones en los ciclos de la PCR: 10 \mul de tampón Pfu 10X, 1 \mul de dNTPs 10 mM, 2 \mul de cada oligonucleótido 10 \muM, 83 \mul de agua estéril, 1,5 \mul de Pfu ADN polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA), 50 ng de ADN (pPDMRa12 WT-1 sin His). La reacción se desnaturalizó inicialmente a 96ºC durante 2 minutos, seguido de 40 ciclos a 96ºC durante 20 segundos, 62ºC durante 15 segundos, y 72ºC durante 2 minutos. Esto fue seguido por una extensión final a 72ºC durante 4 minutos. El producto de PCR se digirió con NdeI y se clonó en pPDM His que se había digerido con NdeI y Eco72I. La secuencia se confirmó por medio del análisis de la secuencia y después se transformó en células BLR (DE3) pLys S y HMS 174 (DE3) pLys S. La expresión de la proteína se confirmó mediante SDS-PAGE con tinción de Coomassie y análisis de la secuencia de la proteína N-terminal.

\newpage

Ejemplo 24

Generación de clones de células T CD8+ específicas de WT1 mediante el uso de sensibilización con gen completo E identificación de un epítopo de wt1 restringido a HLA-A2

En este ejemplo, se usaron los vehículos de administración de adenovirus y virus vaccinia para generar líneas de células T específicas de WT1. Se demostró que un clon de células T de la línea fue específico para WT1, y además se identificó el epítopo reconocido por este clon.

Se diferenciaron células dendríticas (CD) a partir de cultivos de monocitos que procedían de CMSP de donantes normales, mediante un cultivo durante 4-6 días en medio RPMI que contenía un 10% de suero humano, 50 ng/ml de GM-CSF y 30 ng/ml de IL-4. Tras el cultivo, las CD se infectaron 16 horas con el virus vaccinia que expresaba WT1 recombinante a una multiplicidad de infección (MDI) de 5, o durante 2-3 días con un adenovirus que expresaba WT1 recombinante a una MDI de 3-10. El virus vaccinia se inactivó mediante irradiación U.V. Las células T CD8+ se aislaron mediante eliminación negativa con el uso de anticuerpos hacia células CD4, CD14, CD16, CD19 y CD56+, seguido de esferas magnéticas específicas para la porción Fc de estos Abs.

Los cultivos de sensibilización se iniciaron en placas de 96 pocillos. Los cultivos se reestimularon cada 7-14 días mediante el uso de células dendríticas autólogas infectadas con adenovirus o virus vaccinia modificados para que expresasen WT1. Después de 4-5 ciclos de estimulación, se pudieron identificar las líneas de células T CD8+ que producían específicamente interferón-\gamma (IFN-\gamma) cuando se estimulaban con células dendríticas o fibroblastos autólogos que expresaban WT1. Estas líneas se clonaron, y se demostró que reconocían específicamente fibroblastos autólogos transducidos con WT1, pero no fibroblastos transducidos de control mediante ensayos de Elispot.

Para analizar adicionalmente la restricción de HLA de estos clones de células T CD8+ específicas de WT1, se transdujeron con WT1 fibroblastos derivados de un donante adicional (D475), que compartía solamente el alelo HLA-A2 con el donante (D349) a partir del cual se estableció el clon de células T. Los análisis de ELISPOT demostraron el reconocimiento de estas células seleccionadas como objetivo de D475 por el clon de células T. Para demostrar adicionalmente la restricción de HLA-A2 y demostrar que este epítopo se expresa en las células tumorales que sobreexpresan WT1 "de manera natural" (como parte de su transformación maligna), se analizó la línea de células de leucemia K562. K562 se transdujo con la molécula HLA-A2, y las células K562 HLA-A2 negativas se usaron como controles para la liberación inespecífica de IFN-\gamma. Los análisis de ELISPOT demostraron que las células T reconocieron la línea de células K562 A2 positivas, pero no las células K562 A2 negativas. Se documentaron pruebas adicionales de la especificidad y de la restricción de HLA-A2 del reconocimiento mediante experimentos de bloqueo con anticuerpos de HLA-A2.

Para definir adicionalmente el epítopo de WT1, se generaron 4 construcciones retrovirales de WT1 truncada. Después se transdujeron fibroblastos del donante 475 con estas construcciones. Los análisis de ELISPOT demostraron el reconocimiento de los fibroblastos de D475 transducidos con la construcción WT1 Tr1 (aa 2-aa 92), lo que demuestra que el epítopo de WT1 está localizado en los primeros 91 aminoácidos N-terminales de la proteína WT1. Para cartografiar mejor el epítopo, se sintetizaron péptidos 15-méricos de la proteína WT1, que se solapaban en 11 aminoácidos. El clon de células T específicas de WT1 reconoció dos péptidos 15-méricos solapantes, el péptido 9 (QWAPVLDFAPPGASA) (ID SEC Nº: 412) y el péptido 10 (VLDFAPPGASAYGSL) (ID SEC Nº: 413). Para caracterizar adicionalmente el epítopo mínimo reconocido, se usaron péptidos 9-méricos y 10-méricos compartidos de los 15-meros (5 en total) para analizar la especificidad del clon. El clon reconoció específicamente el 9-mero, VLDFAPPGA (ID SEC Nº:241), y el 10-mero, VLDFAPPGAS (ID SEC Nº:411).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 25

Clonado y secuenciación de las cadenas \alpha y \beta de TRC derivadas de una célula T CD8 específica de WT1

Se clonan las cadenas \alpha y \beta del receptor de células T (TCR) de los clones de células T CD8+ específicas de WT1. Se lleva a cabo el análisis de la secuencia para demostrar el origen de la familia de las cadenas \alpha y \beta del TCR. Además, se identifican los segmentos de diversidad y de unión únicos (que contribuyen a la especificidad de la respuesta).

Se aísla el ARNm total de 2 x 10^{6} células de un clon de células T CD8+ específicas de WT1 mediante el uso del reactivo Trizol, y se sintetiza el cADN mediante el uso de equipos Ready-to-go (Pharmacia). Para determinar las secuencias de V\alpha y V\beta en un clon, se sintetiza un panel de cebadores específicos del subtipo V\alpha y V\beta (basados en las secuencias de cebadores generadas por Clontech, Palo Alto, CA), y se usan en reacciones de RT-PCR con cADN generado a partir de cada clon. Las reacciones de RT-PCR demuestran qué secuencias de V\alpha y V\beta son expresadas por cada clon.

Para clonar las cadenas \alpha y \beta de TCR de tamaño completo a partir de cada clon, se diseñan cebadores que abarcan los nucleótidos de TCR que codifican los iniciadores y los terminadores. Se establecen reacciones de RT-PCR estándar de 35 ciclos mediante el uso del cADN sintetizado a partir del clon de LTC y los cebadores anteriores con el uso de la polimerasa termoestable con corrección de errores PWO (Roche, Basilea, Suiza). Las bandas específicas resultantes (\sim850 pb para \alpha y \sim950 para \beta) se ligan en el vector romo de PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se transforman en E. coli. Se identifican las E. coli transformadas con los plásmidos que contienen las cadenas \alpha y \beta de tamaño completo, y se generan preparaciones a gran escala de los plásmidos correspondientes. Los plásmidos que contienen las cadenas \alpha y \beta de TCR de tamaño completo se secuencian después mediante el uso de métodos habituales. Así, se determina la región de diversidad-unión (DJ) que contribuye a la especificidad del TCR.

A partir de lo anterior se apreciará que, aunque en esta memoria se han descrito realizaciones específicas de la invención con fines ilustrativos, se pueden hacer diversas modificaciones sin desviarse del alcance de la invención. Por lo tanto, la invención no está limitada, excepto por las reivindicaciones adjuntas.

\global\parskip0.000000\baselineskip

<110> Corixa Corporation

\hskip1cm

Gaiger, Alexander

\hskip1cm

McNeill, Patricia D.

\hskip1cm

Smithgall, Molly

\hskip1cm

Moulton, Gus

\hskip1cm

Vedvick, Thomas S.

\hskip1cm

Sleath, Paul R.

\hskip1cm

Mossman, Sally

\hskip1cm

Evans, Lawrence

\hskip1cm

Spies, A. Gregory

\hskip1cm

Boydston, Jeremy

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA INMUNOTERAPIA ESPECÍFICA DE WT1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 210121.46501PC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> PCT

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 03-10-2001

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 413

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

121

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

122

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

123

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

124

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\hskip1cm

125

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\hskip1cm

126

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\hskip1cm

127

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm

128

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm

129

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\hskip1cm

130

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\hskip1cm

131

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\hskip1cm

132

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

133

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

134

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\hskip1cm

135

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\hskip1cm

136

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\hskip1cm

137

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\hskip1cm

138

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\hskip1cm

139

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\hskip1cm

140

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\hskip1cm

141

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\hskip1cm

142

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\hskip1cm

143

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\hskip1cm

144

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\hskip1cm

145

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\hskip1cm

146

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\hskip1cm

147

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\hskip1cm

148

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\hskip1cm

149

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\hskip1cm

150

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\hskip1cm

151

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\hskip1cm

152

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\hskip1cm

153

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\hskip1cm

154

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\hskip1cm

155

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\hskip1cm

156

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\hskip1cm

157

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\hskip1cm

158

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\hskip1cm

159

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\hskip1cm

160

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\hskip1cm

161

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\hskip1cm

162

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\hskip1cm

163

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\hskip1cm

164

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\hskip1cm

165

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\hskip1cm

166

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\hskip1cm

167

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\hskip1cm

168

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\hskip1cm

169

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\hskip1cm

170

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\hskip1cm

171

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\hskip1cm

172

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\hskip1cm

173

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\hskip1cm

174

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\hskip1cm

175

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\hskip1cm

176

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\hskip1cm

177

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\hskip1cm

178

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\hskip1cm

179

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\hskip1cm

180

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\hskip1cm

181

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\hskip1cm

182

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\hskip1cm

183

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\hskip1cm

184

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\hskip1cm

185

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9.

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\hskip1cm

186

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\hskip1cm

187

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\hskip1cm

188

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\hskip1cm

189

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\hskip1cm

190

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\hskip1cm

191

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\hskip1cm

192

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\hskip1cm

193

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\hskip1cm

194

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\hskip1cm

195

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\hskip1cm

196

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\hskip1cm

197

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\hskip1cm

198

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\hskip1cm

199

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\hskip1cm

200

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\hskip1cm

201

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\hskip1cm

202

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\hskip1cm

203

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\hskip1cm

204

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\hskip1cm

205

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\hskip1cm

206

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\hskip1cm

207

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\hskip1cm

208

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\hskip1cm

209

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\hskip1cm

210

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\hskip1cm

211

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\hskip1cm

212

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\hskip1cm

213

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\hskip1cm

214

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\hskip1cm

215

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\hskip1cm

216

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\hskip1cm

217

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\hskip1cm

218

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\hskip1cm

219

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\hskip1cm

220

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\hskip1cm

221

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\hskip1cm

222

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\hskip1cm

223

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\hskip1cm

224

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\hskip1cm

225

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\hskip1cm

226

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\hskip1cm

227

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\hskip1cm

228

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\hskip1cm

229

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\hskip1cm

230

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\hskip1cm

231

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\hskip1cm

232

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\hskip1cm

233

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\hskip1cm

234

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\hskip1cm

235

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\hskip1cm

236

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\hskip1cm

237

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\hskip1cm

238

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

\hskip1cm

239

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\hskip1cm

240

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\hskip1cm

241

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

\hskip1cm

242

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

\hskip1cm

243

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

\hskip1cm

244

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\hskip1cm

245

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

\hskip1cm

246

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

\hskip1cm

247

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

\hskip1cm

248

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 129

\hskip1cm

249

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 130

\hskip1cm

250

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 131

\hskip1cm

251

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 132

\hskip1cm

252

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 133

\hskip1cm

253

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 134

\hskip1cm

254

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 135

\hskip1cm

255

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 136

\hskip1cm

256

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 137

\hskip1cm

257

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 138

\hskip1cm

258

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 139

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 139

\hskip1cm

259

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 140

\hskip1cm

260

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 141

\hskip1cm

261

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 142

\hskip1cm

262

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 143

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 143

\hskip1cm

263

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 144

\hskip1cm

264

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 145

\hskip1cm

265

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 146

\hskip1cm

266

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 147

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 147

\hskip1cm

267

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 148

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 148

\hskip1cm

268

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 149

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 149

\hskip1cm

269

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 150

\hskip1cm

270

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 151

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 151

\hskip1cm

271

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 152

\hskip1cm

272

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 153

\hskip1cm

273

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 154

\hskip1cm

274

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 155

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 155

\hskip1cm

275

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 156

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 156

\hskip1cm

276

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 157

\hskip1cm

277

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 158

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 158

\hskip1cm

278

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 159

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 159

\hskip1cm

279

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 160

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 160

\hskip1cm

280

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 161

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 161

\hskip1cm

281

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 162

\hskip1cm

282

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 163

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 163

\hskip1cm

283

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 164

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 164

\hskip1cm

284

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 165

\hskip1cm

285

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 166

\hskip1cm

286

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 167

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 167

\hskip1cm

287

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 168

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 168

\hskip1cm

288

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 169

\hskip1cm

289

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 170

\hskip1cm

290

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 171

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 171

\hskip1cm

291

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 172

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 172

\hskip1cm

292

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 173

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 173

\hskip1cm

293

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 174

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 174

\hskip1cm

294

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 175

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 175

\hskip1cm

295

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 176

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 176

\hskip1cm

296

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 177

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 177

\hskip1cm

297

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 178

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 178

\hskip1cm

298

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 179

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 179

\hskip1cm

300

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 180

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 180

\hskip1cm

301

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 181

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 181

\hskip1cm

302

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 182

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 182

\hskip1cm

303

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 183

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 183

\hskip1cm

304

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 184

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 184

\hskip1cm

305

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 185

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 185

\hskip1cm

306

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 186

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 186

\hskip1cm

307

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 187

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 187

\hskip1cm

308

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 188

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 188

\hskip1cm

309

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 189

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 189

\hskip1cm

310

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 190

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 190

\hskip1cm

311

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 191

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 191

\hskip1cm

312

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 192

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 192

\hskip1cm

313

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 193

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 193

\hskip1cm

314

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 194

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 194

\hskip1cm

315

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 195

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 195

\hskip1cm

316

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 196

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 196

\hskip1cm

317

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 197

\hskip1cm

318

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 198

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 198

\hskip1cm

319

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 199

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 199

\hskip1cm

320

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 200

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 200

\hskip1cm

321

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 201

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 201

\hskip1cm

322

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 202

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 202

\hskip1cm

323

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 203

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 203

\hskip1cm

324

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 204

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 204

\hskip1cm

325

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 205

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 205

\hskip1cm

326

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 206

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 206

\hskip1cm

327

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 207

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 207

\hskip1cm

328

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 208

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 208

\hskip1cm

329

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 209

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 209

\hskip1cm

330

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 210

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 210

\hskip1cm

331

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 211

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 211

\hskip1cm

332

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 212

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 212

\hskip1cm

333

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 213

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 213

\hskip1cm

334

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 214

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 214

\hskip1cm

335

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 215

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 215

\hskip1cm

336

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 216

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 216

\hskip1cm

337

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 217

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 217

\hskip1cm

338

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 218

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 218

\hskip1cm

339

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 219

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 219

\hskip1cm

340

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 220

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 220

\hskip1cm

341

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 221

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 221

\hskip1cm

342

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 222

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 222

\hskip1cm

343

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 223

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 223

\hskip1cm

344

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 224

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 224

\hskip1cm

345

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 225

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 225

\hskip1cm

346%

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 226

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 226

\hskip1cm

347

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 227

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 227

\hskip1cm

348

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 228

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 228

\hskip1cm

349

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 229

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 229

\hskip1cm

350

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 230

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 230

\hskip1cm

351

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 231

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 231

\hskip1cm

352

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 232

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 232

\hskip1cm

353

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 233

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 233

\hskip1cm

354

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 234

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 234

\hskip1cm

355

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 235

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 235

\hskip1cm

356

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 236

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 236

\hskip1cm

357

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 237

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 237

\hskip1cm

358

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 238

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 238

\hskip1cm

359

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 239

\hskip1cm

360

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 240

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 240

\hskip1cm

361

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 241

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 241

\hskip1cm

362

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 242

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 242

\hskip1cm

363

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 243

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 243

\hskip1cm

364

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 244

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 244

\hskip1cm

365

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 245

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 245

\hskip1cm

366

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 246

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 246

\hskip1cm

367

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 247

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 247

\hskip1cm

368

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 248

\hskip1cm

369

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 249

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 249

\hskip1cm

370

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 250

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 250

\hskip1cm

371

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 251

\hskip1cm

372

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 252

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 252

\hskip1cm

373

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 253

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 253

\hskip1cm

374

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 254

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 254

\hskip1cm

375

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 255

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 255

\hskip1cm

376

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 256

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 256

\hskip1cm

377

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 257

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 257

\hskip1cm

378

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 258

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 258

\hskip1cm

379

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 259

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 259

\hskip1cm

380

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 260

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 260

\hskip1cm

381

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 261

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 261

\hskip1cm

382

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 262

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 262

\hskip1cm

383

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 263

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 263

\hskip1cm

384

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 264

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 264

\hskip1cm

385

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 265

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 265

\hskip1cm

386

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 266

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 266

\hskip1cm

387

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 267

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 267

\hskip1cm

388

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 268

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 268

\hskip1cm

389

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 269

\hskip1cm

390

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 270

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 270

\hskip1cm

391

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 271

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 271

\hskip1cm

392

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 272

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 272

\hskip1cm

393

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 273

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 273

\hskip1cm

394

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 274

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 274

\hskip1cm

395

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 275

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 275

\hskip1cm

396

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 276

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 276

\hskip1cm

397

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 277

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 277

\hskip1cm

398

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 278

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 278

\hskip1cm

399

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 279

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 279

\hskip1cm

400

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 280

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 280

\hskip1cm

401

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 281

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 281

\hskip1cm

402

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 282

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 282

\hskip1cm

403

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 283

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 283

\hskip1cm

404

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 284

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 284

\hskip1cm

405

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 285

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 285

\hskip1cm

406

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 286

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 286

\hskip1cm

407

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 287

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 287

\hskip1cm

408

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 288

\hskip1cm

409

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 289

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 289

\hskip1cm

410

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 290

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 290

\hskip1cm

411

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 291

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 291

\hskip1cm

412

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 292

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 292

\hskip1cm

413

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 293

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 293

\hskip1cm

414

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 294

\hskip1cm

415

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 295

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 295

\hskip1cm

416

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 296

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 296

\hskip1cm

417

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 297

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 297

\hskip1cm

418

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 298

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 298

\hskip1cm

419

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 299

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 299

\hskip1cm

420

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 300

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 300

\hskip1cm

421

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 301

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 301

\hskip1cm

422

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 302

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 302

\hskip1cm

423

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 303

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 303

\hskip1cm

424

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 304

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 304

\hskip1cm

425

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 305

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 305

\hskip1cm

426

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 306

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 306

\hskip1cm

427

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 307

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 307

\hskip1cm

428

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 308

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 308

\hskip1cm

429

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 309

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 309

\hskip1cm

430

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 310

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 310

\hskip1cm

431

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 311

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 311

\hskip1cm

432

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 312

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 312

\hskip1cm

433

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 313

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 313

434

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 314

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 314

435

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 315

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 315

\hskip1cm

436

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 316

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 316

\hskip1cm

437

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 317

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 317

438

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 318

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 318

439

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 319

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 449

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 319

440

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 320

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 449

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 320

\vskip1.000000\baselineskip

441

442

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 321

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens y Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 321

\hskip1cm

443

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 322

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens y Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 322

\hskip1cm

444

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 323

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens y Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 323

\hskip1cm

445

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens y Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 324

\hskip1cm

446

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 325

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens y Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 325

\hskip1cm

447

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 326

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens y Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 326

\hskip1cm

448

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 327

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1029

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 327

\vskip1.000000\baselineskip

449

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 328

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1233

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 328

450

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 329

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1776

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 329

451

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 330

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 771

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 330

\vskip1.000000\baselineskip

452

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 331

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 567

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 331

\vskip1.000000\baselineskip

453

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 332

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 342

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 332

454

455

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 333

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 410

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 333

456

457

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 334

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 591

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 334

458

459

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 335

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 256

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 335

460

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 336

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 188

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 336

461

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 337

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 337

462

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 338

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 462

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 338

463

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 339

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 405

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 339

464

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 340

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 339

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 340

465

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 341

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 341

466

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 342

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 342

\vskip1.000000\baselineskip

467

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 343

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 343

\vskip1.000000\baselineskip

468

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 344

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 344

\vskip1.000000\baselineskip

469

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 345

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 345

\vskip1.000000\baselineskip

470

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 346

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 369

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 346

471

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 347

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 347

\hskip1cm

600

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 348

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 348

\hskip1cm

472

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 349

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 349

\hskip1cm

473

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 350

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 350

\hskip1cm

474

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 351

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 351

\hskip1cm

475

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 352

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 352

\hskip1cm

476

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 353

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 353

\hskip1cm

477

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 354

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 354

\hskip1cm

478

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 355

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 355

\hskip1cm

479

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 356

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 356

\hskip1cm

480

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 357

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 357

\hskip1cm

481

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 358

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 358

\hskip1cm

482

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 359

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 359

\hskip1cm

483

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 360

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 360

\hskip1cm

484

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 361

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 361

\hskip1cm

485

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 362

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 362

\hskip1cm

486

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 363

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 363

\hskip1cm

487

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 364

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 364

\hskip1cm

488

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 365

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 365

\hskip1cm

489

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 366

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 366

\hskip1cm

490

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 367

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 367

\hskip1cm

491

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 368

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 368

\hskip1cm

492

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 369

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 369

\hskip1cm

493

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 370

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 370

\hskip1cm

494

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 371

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 371

\hskip1cm

495

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 372

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 372

\hskip1cm

496

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 373

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 373

\hskip1cm

497

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 374

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 374

\hskip1cm

498

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 375

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 375

\hskip1cm

499

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 376

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 376

\hskip1cm

500

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 377

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1292

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 253,256,517,518,520,521,522,743,753,754, 758

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A,T,C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 377

501

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 378

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1291

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 378

502

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 379

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1281

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 379

503

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 380

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3020

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 380

504

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 381

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1291

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 381

\vskip1.000000\baselineskip

505

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 382

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1491

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 382

\vskip1.000000\baselineskip

506

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 383

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1251

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 383

\vskip1.000000\baselineskip

507

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 384

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 228

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 384

\vskip1.000000\baselineskip

508

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 385

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1515

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 385

\vskip1.000000\baselineskip

509

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 386

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 648

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 386

\vskip1.000000\baselineskip

510

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 387

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1089

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 387

\vskip1.000000\baselineskip

511

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 388

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1035

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 388

\vskip1.000000\baselineskip

512

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 389

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1263

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 389

513

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 390

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1707

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 390

514

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 391

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 344

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 391

515

516

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 392

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 568

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 392

517

518

519

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 393

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 420

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 393

520

521

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 394

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 362

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 394

522

523

524

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 395

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 214

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 395

525

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 396

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 396

\hskip1cm

526

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 397

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 397

\hskip1cm

527

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 398

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 398

\hskip1cm

528

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 399

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 399

\hskip1cm

529

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 400

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 400

\hskip1cm

530

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 401

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 401

\hskip1cm

531

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 402

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 402

\hskip1cm

532

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 403

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 403

\hskip1cm

533

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 404

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 449

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 404

534

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 405

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 428

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 405

535

536

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 406

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 414

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 85, 86, 172, 173, 242, 245, 246, 247

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Cualquier Aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 406

537

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 407

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 417

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 407

538

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 408

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 429

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 408

539

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 409

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 495

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 409

540

541

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 410

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 504

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 410

542

543

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 411

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 411

\hskip1cm

544

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 412

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 412

\hskip1cm

545

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 413

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 413

\hskip1cm

546

Claims

1. Un polipéptido aislado que consiste en los aminoácidos 1-281 del polipéptido WT1 expuesto en ID SEC Nº: 408, y en el que la capacidad de dicho polipéptido de reaccionar con líneas o clones de células T específicas de WT1 no está reducida sustancialmente respecto del polipéptido WT1 expuesto en ID SEC Nº: 408.

2. Un polipéptido que comprende una fusión del polipéptido aislado de la reivindicación 1 con una pareja de fusión.

3. El polipéptido de la reivindicación 2, en el que dicha pareja de fusión se selecciona del grupo que consiste en Ra12, proteína D, LYTA, una etiqueta de HIS, y una señal de selección de objetivo capaz de dirigir un polipéptido hacia el compartimento endosómico/lisosómico.

4. El polipéptido de la reivindicación 3, en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en ID SEC Nº:393.

5. Un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 5 unido de manera operable a un promotor.

7. Una célula hospedadora aislada transformada o transfectada con el vector de expresión según la reivindicación 6.

8. Una composición que comprende el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

9. Una vacuna que comprende el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en combinación con un agente inmunoestimulante.

10. Una composición que comprende el polinucleótido de la reivindicación 5 en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

11. Una vacuna que comprende el polinucleótido aislado según la reivindicación 5 en combinación con un agente inmunoestimulante.

12. La vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 11, en la que el agente inmunoestimulante incrementa una respuesta de células T en un paciente.

13. La vacuna según la reivindicación 12, en la que el agente inmunoestimulante se selecciona del grupo que consiste en MPL, RC-529, AGPs, Seppic Montanide ISA 720, una citocina, una microesfera, AS-2, QS21, adyuvantes basados en el sistema del adyuvante de Ribi, adyuvantes basados en saponina, y adyuvantes basados en complejos inmunoestimulantes (iscom).

14. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para el uso en terapia.

15. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para el uso en la prevención o el tratamiento de una neoplasia maligna.

16. El uso del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la fabricación de un medicamento para el uso en la prevención o la terapia de una neoplasia maligna.

17. El polipéptido o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16, en el que la neoplasia maligna se selecciona del grupo que consiste en leucemia, que incluye la leucemia mieloide aguda, linfocítica aguda y mieloide crónica, y cáncer que incluye el cáncer de mama, pulmón, tiroides, gastrointestinal o melanoma.