ES2387999T3 - ARNsi específico de la isoforma WT1 17AA(-) y uso del mismo - Google Patents

Abstract

Un polinucleOtido de 15 a 49 bases de longitud que tiene al menos 15 bases contiguas en la secuencianucleotidica de la SEQ ID NO: 26 y que incluye la secuencia nucleotidica de la SEQ ID NO: 27, donde elpolinucleOtido puede proporcionar un ARNsi que puede inhibir especificamente una expresi6n de la isoforma VVT117AA( -) sin inhibir una expresi6n de la isoforma VVT1 17AA( + ).

Description

ARNsi ESPECIFICO DE LA ISOFORMA VVT1 17AA( —) Y USO DEL MISMO

5 Campo tecnico

La presente invenciOn se refiere a un ARNsi que act0a sabre un gen VVT1, y uso del ARNsi. Especificamente, la presente invenciOn se refiere a una supresi6n del crecimiento de un tumor sOlido, y a una inducci6n de muerte celular en el tumor sOlido, por medio de un ARNsi que suprime una expresi6n de la isoforma VVT1 17AA( — ).

10 Tecnica anterior

El gen del tumor de VVilms (gen VVT1) es un gen que codifica un factor de transcripci6n con dedos de cinc. En el gen VVT1, se sabe que tiene lugar un splicing alternativo en el sitio de 17 aminoacidos (17AA) compuesto par un ex6n 5

15 en el gen VVT1 y en el sitio de 3 aminoacidos (KTS) que existe entre un dedo de cinc 3 y un dedo de cinc 4 a fin de que se generen cuatro isoformas (17AA( + )KTS( +), 17AA( + )KTS( — ), 17AA( — )KTS( + ) y 17AA( — )KTS( — )). Las cuatro isoformas se expresan en un tumor sOlido humano y una celula leucernica (veanse los Documentos 1 y 2, que no corresponden a una patente, par ejemplo).

20 El gen VVT1 se ha considerado coma un gen supresor de tumor. Sin embargo, recientemente se ha descubierto que el gen VVT1 funciona coma un oncogen. Par ejemplo, los inventores de la presente invenciOn han informado que un gen VVT1 de tipo silvestre que no incluye una mutaci6n en el mismo se expresa altamente en casi todas las celulas leucernicas, y un nivel de la expresi6n tiene una correlaciOn inversa con el pron6stico de un paciente con leucemia (veanse los Documentos 3 y 4 que no corresponden a una patente, par ejemplo). Tambien se ha informado par los

25 inventores de la presente invenciOn que un crecimiento de la celula leucernica se suprime especificamente transduciendo un ADN no codificante de VVT1 en la celula leucernica (vease el Documento que no corresponde a una patente 5, par ejemplo), y la diferenciaci6n de una celula precursora mieloide normal de rat6n y una linea celular precursora mieloide 32D cI3 en un neutrOfilo se suprimen mediante una expresi6n forzada del gen VVT1 para crecer de forma proliferativa (vease el Documento que no corresponde a una patente 6, par ejemplo). En base a lo anterior,

30 los inventores de la presente invenciOn han indicado que el gen VVT1 es el responsable de que una celula de linaje hematopoyetico sea leucernica. Adernas, los inventores de la presente invenciOn han informado que el gen VVT1 de tipo natural se expresa altamente en diversos tumores sOlidos (veanse los Documentos 7 a 14 que no corresponden a una patente, par ejemplo).

35 Se considera que las cuatro isoformas que se han mencionado anteriormente tienen diferentes funciones, respectivamente. Par ejemplo, se considera que la isoforma VVT1 17AA( + )KTS( + ) contribuye al crecimiento de celulas cancerosas (vease el Documento que no corresponde a una patente 15). Se considera que la isoforma VVT1 17AA( + )KTS( —) es responsable de la formaci6n de un tumor de linfoma maligno (vease el Documento 16 que no corresponde a una patente).

40 En los Oltimos arms los inventores de la presente invenciOn han demostrado que el ARNsi especifico de la isoforma VVT1 17AA( + ) induce la apoptosis de una celula leucernica que expresa el gen VVT1 (vease el Documento 17 que no corresponde a una patente).

45 [Documento 1 que no corresponde a una patente] Oji Y. y col., Int. J. Cancer 100: 297 (2002) [Documento 2 que no corresponde a una patente] Siehl J. M. y col., Ann. Hematol. 83: 745 (2000) [Documento 3 que no corresponde a una patente]

50 Inoue K. y col., Blood 84: 3071 (1994) [Documento 4 que no corresponde a una patente] Inoue K. y col., Blood 89: 1405 (1997) [Documento 5 que no corresponde a una patente] Yamaguchi T. y col., Blood 87: 2828 (1996)

55 [Documento 6 que no corresponde a una patente] Inoue K. y col., Blood 91: 2969 (1998) [Documento 7 que no corresponde a una patente] Oji Y. y col., Japanese Journal of Cancer Research 90: 194 (1999) [Documento 8 que no corresponde a una patente]

Oji Y. y col., Int J Cancer; 100: 297-303(2002) [Documento 9 que no corresponde a una patente] Ueda T. y col., Cancer Science 94: 271 (2003) [Documento 10 que no corresponde a una patente]

5 Oji Y. y col., Cancer Science 94: 523 (2003) [Documento 11 que no corresponde a una patente] Oji Y. y col., Cancer Science 94: 606 (2003) [Documento 12 que no corresponde a una patente] Oji Y. y col., Cancer Science 94: 712 (2003)

10 [Documento 13 que no corresponde a una patente] Oji Y. y col., Neoplasma 51: 17 (2004) [Documento 14 que no corresponde a una patente] Oji Y. y col., Jpn. J. Clin. Oncol. 34: 74 (2004) [Documento 15 que no corresponde a una patente]

15 Hubinger G. y col., Exp Hematol 10: 1226-1235 (2001) [Documento 16 que no corresponde a una patente] Li H. y col., Int J Hematol 77: 463-470 (2003) [Documento 17 que no corresponde a una patente] Ito K. y col., Oncogene; Mar 6: 1 (2006)

20 [Documento 18 que no corresponde a una patente] Englert C. y col., Cancer Res 8: 1429— 1434 (1997) [Documento 19 que no corresponde a una patente] Loeb D. M. y col., Leukemia 17: 965— 971 (2003)

25 Descripci6n de la invenciOn

Como se ha descrito anteriormente, se considera que es posible aplicar una terapia de alcance molecular especificamente a una celula cancerosa suprimiendo una funci6n de VVT1 que tiene una funci6n coma oncogen. Sin embargo, una tecnica que usa oligo-ADN no codificante o una ribozima, que se usa coma un procedimiento

30 convencional para la supresi6n de una expresi6n del gen VVT1, podria no alcanzar una alta eficacia en la supresi6n de la expresi6n del gen VVT1, o una alta especificidad, en una medida suficiente.

La presente invenciOn se realiza en vista de los problemas anteriores, y un objeto de la presente invenciOn es conseguir una terapia de alcance molecular especifica de las celulas cancerosas que controle con exito la funci6n 35 del VVT1.

Como se ha mencionado anteriormente, se ha indicado que la isoforma VVT1 17AA( + ) tiene una funci6n de oncogen. Sin embargo, no se ha determinado una funci6n de la isoforma VVT1 17AA( — )KTS( +). Mientras tanto, se ha informado que la isoforma 17AA( — )KTS( — ) induce un arresto en G1 en una celula de osteosarcoma (/ease el

40 Documento 18 que no corresponde a una patente), y promueve una diferenciaci6n mediante la inhibici6n de la transici6n G1/S en una celula de linea celula precursora mieloide 320 cI3 (/ease el Documento 19 que no corresponde a una patente). Adernas, un ARNsi especifico de la isoforma VVT1 17AA( —) no induce la apoptosis de una linea celular leucernica que expresa VVT1 o una linea celular de linfoma que no expresa VVT1 (/ease el Documento 17 que no corresponde a una patente).

Los inventores de la presente invenciOn han demostrado en primer lugar que, en una celula de un tumor sOlido, la isoforma VVT1 171AA( — )KTS( —) cumple una funci6n coma oncogen para cambiar un citoesqueleto controlando un nivel de expresi6n de una proteina de uni6n a actina (cofilina, actinina y gelsolina) para inducir un cambia en la forma de la celula, una mejora en el desplazamiento celular in vitro, y una mejora en la capacidad de la invasiOn

50 celular. Adernas, los inventores de la presente invenciOn han descubierto que puede inducirse una muerte celular especificamente en una celula tumoral inhibiendo especificamente una expresi6n de la isoforma VVT1 17AA( — ). Basandose en lo anterior se realiza la presente invenciOn.

Es decir, el polinucleOtido de acuerdo con la presente invenciOn es un polinucleOtido de acuerdo con las

55 reivindicaciones y que tiene al menos 15 bases contiguas en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 26 y que incluye la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 27. Es preferible una disposici6n para que el polinucleOtido tenga la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 26.

Con la disposici6n, el polinucleOtido de acuerdo con la presente invenciOn puede proporcionar un ARNsi que puede

inhibir especificamente una expresi6n de la isoforma VVT1 171AA( —) sin inhibir una expresi6n de la isoforma VVT1 17AA( +)

La composici6n medica de acuerdo con la presente invenciOn es una composici6n medica para el tratamiento de un

5 tumor sOlido de acuerdo con las reivindicaciones, que comprende uno cualquiera de: un ARN de doble helice compuesto por (i) un primer ARN codificado por un ADN complementario con respecto a un polinucleOtido que tiene al menos 15 bases contiguas en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 26 y que incluye la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 27, y (ii) un segundo ARN capaz de emparejarse con el primer ARN; un ADN que codifica el ARN de doble helice; y un vector en el que se inserta el ADN.

Teniendo en cuenta los informes anteriores acerca de la isoforma VVT1 17AA( — ), podria no haberse esperado que el ARNsi que inhibe especificamente una expresi6n de la isoforma VVT1 17AA( — ), que se ha considerado que funciona como un gen supresor de tumor, cumpla una funci6n supresora de tumor.

15 Es preferible disponer la composici6n medica de acuerdo con la presente invenciOn de manera que el ADN que codifica el segundo ARN hibride en una condici6n rigurosa con el polinucleOtido que tiene al menos 15 bases contiguas en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 26 y que incluye la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 27.

Es preferible disponer la composici6n medica de acuerdo con la presente invenciOn de manera que el segundo ARN 20 incluya al menos 15 bases contiguas en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 29.

Es preferible disponer la composici6n medica de acuerdo con la presente invenciOn de manera que el primer ARN incluya al menos 15 bases contiguas en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 30.

25 Es preferible disponer la composici6n medica de acuerdo con la presente invenciOn de manera que el ADN que codifica el ARN de doble helice incluya la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 27.

Es preferible disponer la composici6n medica de acuerdo con la presente invenciOn de manera que el ARN de doble helice este compuesto por un emparejamiento de ARN que incluye la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 29 30 incluyendo el ARN la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 30.

Es preferible que la celula a la cual la composici6n medica de acuerdo con la presente invenciOn puede aplicarse, se seleccione entre un grupo que incluye cancer de vejiga, cancer renal, cancer de celulas escamosas de la piel, cancer de cabeza y cuello (cancer de celulas escamosas de la piel de la cabeza y el cuello, por ejemplo), cancer de

35 pulmOn (cancer de pulmOn de celulas no pequerias (CPCNP), por ejemplo), tumor en el canal alimentario (tumor esofagico, cancer de est6mago, tumor del intestino delgado, tumor del intestino grueso), glioma, tumor mesotelial, y similares.

El kit medico de acuerdo con la presente invenciOn es un kit medico de acuerdo con las reivindicaciones para el

40 tratamiento de un tumor sOlido, que comprende uno cualquiera de: un ARN de doble helice compuesto por (i) un primer ARN codificado por un ADN complementario con respecto a un polinucleOtido que tiene al menos 15 bases contiguas en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 26 y que incluye la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 27, y (ii) un segundo ARN capaz de emparejarse con el primer ARN; un ADN que codifica el ARN de doble helice; y un vector en el que se inserta el ADN. La presente invenciOn tambien se refiere al uso de ARN de doble helice de

45 acuerdo con las reivindicaciones.

Tambien se describe un procedimiento que no forma parte de la presente invenciOn que es un procedimiento para tratar un tumor sOlido, que comprende la etapa de administrar, a una celula que forma el tumor sOlido, un ARN de doble helice compuesto por (i) un primer ARN codificado por un ADN complementario con respecto a un

50 polinucleOtido que tiene al menos 15 bases contiguas en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 26 y que incluye la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 27, y (ii) un segundo ARN capaz de emparejarse con el primer ARN, de tal manera que el ARN de doble helice se expresara en la celula.

Es preferible disponer el procedimiento de manera que la etapa de administraci6n se realice transduciendo, en la 55 celula diana, un vector en el que se inserta un polinucleOtido que incluye el primer ARN y el segundo ARN.

Tambien se describe un agente inductor de muerte celular que es un agente inductor de muerte celular para tratar un tumor sOlido, que comprende uno cualquiera de: un ARN de doble helice compuesto por (i) un primer ARN codificado por un ADN complementario con respecto a un polinucleOtido que tiene al menos 15 bases contiguas en

la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 26 y que incluye la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 27, y (ii) un segundo ARN capaz de emparejarse con el primer ARN; un ADN que codifica el ARN de doble helice; y un vector en el que se inserta el ADN.

5 Es preferible disponer el agente inductor de muerte celular de manera que el ADN que codifica el segundo ARN hibride en una condici6n rigurosa con el polinucleOtido que tiene al menos 15 bases contiguas en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 26 y que incluye la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 27.

Es preferible disponer el agente inductor de muerte celular de manera que el segundo ARN incluya al menos 15 10 bases contiguas en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 29.

Es preferible disponer el agente inductor de muerte celular de manera que el primer ARN incluya al menos 15 bases contiguas en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 30.

15 Es preferible disponer el agente inductor de muerte celular de manera que el ADN que codifica el ARN de doble helice incluya la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 27.

Es preferible disponer el agente inductor de muerte celular de manera que el ARN de doble helice este compuesto par un emparejamiento del ARN que incluye la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 29 can el ARN que incluye la

20 secuencia de bases de la SEQ ID NO: 30.

Es preferible que la celula a la que el agente inductor de muerte celular puede aplicarse se seleccione entre un grupo que incluye cancer de vejiga, cancer de rifiOn, cancer de celulas escamosas de la piel, cancer de cabeza y cuello (cancer de celulas escamosas de la piel de la cabeza y el cuello, par ejemplo), cancer de pulmOn (cancer de

25 pulmOn de celulas no pequefias (CPCNP), par ejemplo), tumor en el canal alimentario (tumor esofagico, cancer de est6mago, tumor del intestino delgado, tumor del intestino grueso), glioma, tumor mesotelial y similares.

Tambien se describe un kit inductor de muerte celular que es un kit inductor de muerte celular para inducir la apoptosis de una celula que forma un tumor sOlido, que comprende uno cualquiera de: un ARN de doble helice

30 compuesto par (i) un primer ARN codificado par un ADN complementario con respecto a un polinucleOtido que tiene al menos 15 bases contiguas en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 26 y que incluye la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 27, y (ii) un segundo ARN capaz de emparejarse con el primer ARN; un ADN que codifica el ARN de doble helice; y un vector en el que se inserta el ADN.

35 Tambien se describe un procedimiento para inducir una muerte celular que es un procedimiento para la inducci6n de la apoptosis de una celula que forma un tumor sOlido, que comprende la etapa de administrar, a la celula, un ARN de doble helice compuesto par (i) un primer ARN codificado par un ADN complementario con respecto a un polinucleOtido que tiene al menos 15 bases contiguas en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 26 y que incluye la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 27, y (ii) un segundo ARN capaz de emparejarse con el primer ARN, de tal

40 manera que el ARN de doble helice se expresara en la celula.

Es preferible disponer el procedimiento para inducir una muerte celular de manera que la etapa de administraci6n se realice transduciendo, en la celula diana, un vector en el que se inserta un polinucleOtido que incluye el primer ARN y el segundo ARN.

Para un entendimiento mas completo de los otros objetos, caracteristicas y ventajas de la presente invenciOn, debe hacerse referencia a la siguiente descripci6n detallada. Las ventajas de la presente invenciOn pueden especificarse con la descripci6n tomada en conjunto con los dibujos adjuntos.

50 Breve descripci6n de los dibujos

[Figura 1 (a)] La figura 1 (a) es una vista que muestra un cambia morfolOgico de una celula TYK de cancer de ovario inducido par una expresi6n constitutive de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). La figura 1 (a) muestra, coma ejemplo, los

55 resultados de la transferencia Western que muestran la presencia o ausencia de expresiones de proteinas VVT1 en cuatro lineas celulares TYK (estando cada una transducida con una de cuatro isoformas VVT1 diferentes).

[Figura l(b)] La figura 1(b) es una vista que muestra un cambia morfolOgico de una celula TYK de cancer de ovario inducido par

una expresi6n constitutiva de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). La figura 1(b) muestra, coma ejemplo, un cambia en la morfologia celular provocada par expresiones estables de cada isoforma VVT1 en celulas TYK.

[Figura 1(c)]

5 La figura 1(c) es una vista que muestra un cambia morfolOgico de una celula TYK de cancer de ovario inducido par una expresi6n constitutiva de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). La figura 1(c) muestra los promedios de las areas relativas de ocho o mas celulas individuales obtenidas de tres clones celulares.

[Figura 2(a)]

10 La figura 2(a) es una vista que muestra un cambia morfolOgico de diversos tipos de celulas cancerosas inducido par una expresi6n constitutiva de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). En la figura 2(a), se analizaron morfolOgicamente diversos tipos de celulas cancerosas (ZR-75, HT-1080, MKN28, SKBr3 y TE10, par ejemplo), en las que la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) marcada can GFP se expres6 de forma transitoria, usando un microscopio confocal de 48 a 72 horas despues de la transfecci6n.

15 [Figura 2(b)] La figura 2(b) es una vista que muestra un cambia morfolOgico de diversos tipos de celulas cancerosas inducido par una expresi6n constitutiva de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). La figura 2(b) muestra los promedios de las areas relativas de nueve o mas celulas individuales.

20 [Figura 3(a)] La figura 3(a) es una vista que muestra una supresi6n de la adhesi6n celular a un sustrato inducida par una expresi6n astable de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). Las celulas TYK transducidas con la isoforma VVT1 171AA(

— )/KTS( — ) y las celulas TYK transducidas con un vector de control se analizaron con respecto a la adhesiOn celular 25 a un sustrato usando un ensayo de uni6n celular.

[Figura 3(b)] La figura 3(b) es una vista que muestra una supresi6n de la adhesi6n celular a un sustrato inducida par una expresi6n astable de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). Las celulas TYK transducidas con la isoforma VVT1 171AA(

30 — )/KTS( —) y las celulas TYK transducidas con un vector de control se analizaron con respecto a la resistencia de la adhesi6n celular a un sustrato usando un ensayo de desprendimiento celular.

[Figura 4(a)] La figura 4(a) es una vista que muestra una mejora de la migraci6n celular inducida par una expresi6n constitutiva de

35 la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). Se registraron los desplazamientos de las celulas TYK individuales que expresaban la isoforma GFP-VVT1 17AA( — )/KTS( —) y las celulas TYK individuales que no expresaban la isoforma GFP-VVT1 17AA( — )KTS( —) durante 5 horas a intervalos de 2 minutos usando un grabador de video con lapso de tiempo. Se calcul6 la velocidad de los desplazamientos de las celulas.

40 [Figura 4(b)] La figura 4(b) es una vista que muestra una mejora de la migraci6n celular inducida par una expresi6n constitutiva de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). Las celulas TYK (.) transducidas con un vector de expresi6n de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) y las celulas TYK (o) transducidas con un vector de control se analizaron con respecto a la migraci6n colectiva usando un ensayo de curaci6n de herida.

45 [Figura 4(c)] La figura 4(c) es una vista que muestra una mejora de la migraci6n celular inducida par una expresi6n constitutiva de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). Las celulas TYK (.) transducidas con un vector de expresi6n de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) y las celulas TYK (o) transducidas con un vector de control se analizaron con respecto a la

50 quimiotaxis hacia media de Eagle modificado par Dulbecco que incluye FBS al 5 % usando un ensayo de migraci6n Transwell.

[Figura 5(a)] La figura 5(a) es una vista que muestra un cambia de expresiones de la actina filamentosa (actina F) y las proteinas

55 de uni6n a actina (ABP) inducido par una expresi6n constitutiva de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). La figura 5(a) muestra un resultado de una tinci6n inmunohistoquimica para la actina F, la vinculina (proteina de adhesi6n focal) y los nOcleos en una celula TYK transducida con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ) y en una celula TYK transducida con un vector de control.

[Figura 5(b)] La figura 5(b) es una vista que muestra un cambia de expresiones de la actina fibrosa (actina F) y las proteinas de uni6n a actina (ABP) inducido par una expresi6n constitutiva de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). El lisado (hileras 1 y 2) de celulas individuales transducidas can un vector de control y el lisado (hileras 3 y 4) de celulas

5 individuales transducidas can la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ) se sometieron a inmunotransferencia can anticuerpos especificos de actina total, actina F, a-tubulina y GAPH, respectivamente.

[Figura 5(c)] La figura 5(c) es una vista que muestra un cambio de expresiones de la actina fibrosa (actina F) y las proteinas de

10 uni6n a actina (ABP) inducido par una expresi6n constitutiva de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). Las expresiones del ARNm en clones celulares TYK aislados individualmente (n = 3, hileras 1 a 3) transducidos can un vector de control y en clones celulares TYK aislados individualmente (n = 3, hileras 4 a 6) transducidos can la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) se analizaron par RT-PCR en una condici6n descrita en la Tabla 1.

15 [Figura 5(d)] La figura 5(d) es una vista que muestra un cambia de expresiones de la actina fibrosa (actina F) y las proteinas de uni6n a actina (ABP) inducido par una expresi6n constitutiva de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). Los clones celulares TYK (hileras 1 y 2) transducidos can un vector de control y el clan celular TYK (hileras 3 y 4) transducido can la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ) se sometieron a inmunotransferencia can anticuerpos especificos de a

20 actinina 1, cofilina y gelsolina, respectivamente.

[Figura 5(e)] La figura 5(e) es una vista que muestra un cambia de expresiones de la actina fibrosa (actina F) y las proteinas de union a actina (ABP) inducido por una expresiem constitutiva de la isoforma WTI 17AA( — )/KTS( — ). Se realize) la

25 tinci6n inmunohistoquimica de a-actinina 1, cofilina y gelsolina en celulas TYK transducidas can la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ) o can un vector de control. Al mismo tiempo, se tineron los nOcleos celulares can yoduro de propidio.

[Figura 5(f)]

30 La figura 5(f) es una vista que muestra un cambia de expresiones de la actina fibrosa (actina F) y las proteinas de uni6n a actina (ABP) inducido par una expresi6n constitutiva de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). Los clones celulares HT-1080 transducidos can un vector de control o can la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) se sometieron a

inmunotransferencia can anticuerpos especificos de a-actinina 1, cofilina y gelsolina, respectivamente.

35 [Figura 5(g)] La figura 5(g) es una vista que muestra un cambia de expresiones de la actina fibrosa (actina F) y las proteinas de uni6n a actina (ABP) inducido par una expresi6n constitutiva de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). Los clones celulares TE10 transducidos can un vector de control o can la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) se sometieron a inmunotransferencia can anticuerpos especificos de a-actinina 1, cofilina y gelsolina, respectivamente.

40 [Figura 6(a)] La figura 6(a) es una vista que muestra que un fenotipo de una celula TYK, en la que las expresiones estables de la

a-actinina y la cofilina se indujeron transduciendo la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ), se restaure) en un fenotipo de su celula TYK precursora. Un vector de expresi6n de a-actinina y un vector de expresi6n de cofilina (TW/ACTN-CFL)

45 o un vector de control se cotransfectaron en celulas TYK transducidas con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). La figura 6(a) muestra los niveles de expresiOn de la a-actinina y la cofilina, que se determinaron mediante transferencia Western.

[Figura 6(b)] 50 La figura 6(b) es una vista que muestra que un fenotipo de una celula TYK, en la que las expresiones estables de la a-actinina y la cofilina se indujeron transduciendo la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ), se restaure) en un fenotipo de su celula TYK precursora. Un vector de expresi6n de a-actinina y un vector de expresi6n de cofilina (TW/ACTN-CFL)

o un vector de control se cotransfectaron en celulas TYK transducidas con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). La figura 6(b) muestra las celulas tenidas con May Grunwald-Giemsa.

55 [Figura 6(c)] La figura 6(c) es una vista que muestra que un fenotipo de una celula TYK, en la que las expresiones estables de la a-actinina y la cofilina se indujeron transduciendo la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) se restaure) en un fenotipo de

su celula TYK precursora. Un vector de expresi6n de a-actinina y un vector de expresi6n de cofilina (TW/ACTN-CFL)

o un vector de control se cotransfectaron en celulas TYK transducidas con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). La figura 6(c) muestra areas celulares calculadas mediante el software NIH Image (1: clon celular TW/Mock; 2 y 3: clones celulares TW/ACTN-CFL diferentes, respectivamente).

5 [Figura 6(d)] La figura 6(d) es una vista que muestra que un fenotipo de una celula TYK, en la que las expresiones estables de la

a-actinina y la cofilina se indujeron transduciendo la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ), se restaur6 en un fenotipo de su celula TYK precursora. Un vector de expresi6n de a-actinina y un vector de expresi6n de cofilina (TW/ACTN-CFL) 10 o un vector de control se cotransfectaron en celulas TYK transducidas con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). La figura 6(d) muestra una adhesi6n celular a un sustrato determinado por un ensayo de desprendimiento.

[Figura 6(e)] La figura 6(e) es una vista que muestra que un fenotipo de una celula TYK, en la que las expresiones estables de la 15 a-actinina y la cofilina se indujeron transduciendo la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) se restaur6 en un fenotipo de su celula TYK precursora. Un vector de expresi6n de a-actinina y un vector de expresi6n de cofilina (TW/ACTN-CFL)

o un vector de control se cotransfectaron en celulas TYK transducidas con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). La figura 6(e) muestra una migraci6n celular colectiva analizada por un ensayo de curaci6n de herida. La migraci6n celular se representa como un promedio de la proporci6n (porcentaje) de la longitud de las protrusiones con respecto

20 a la anchura del primer desprendimiento de celulas en tres sitios diferentes.

[Figura 6(f)] La figura 6(f) es una vista que muestra que un fenotipo de una celula TYK, en la que las expresiones estables de la a-actinina y la cofilina se indujeron transduciendo la isoforma WTI 17AA( — )/KTS( — ), se restaur6 en un fenotipo de

25 su celula TYK precursora. Un vector de expresi6n de a-actinina y un vector de expresi6n de cofilina (TW/ACTN-CFL)

o un vector de control se cotransfectaron en una celula TYK transducida con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). La figura 6(f) muestra un nivel de expresi6n de gelsolina, que se determin6 mediante transferencia Western.

[Figura 7(a)]

30 La figura 7(a) es una vista que muestra que una supresi6n de la expresi6n de gelsolina redujo una migraci6n celular, sin embargo, no afectO a la morfologia celular ni a una adhesi6n celular a un sustrato. Un vector de ARNsi especifico de gelsolina (TW/GSNsiRNA) o un vector de control (TW/siMock) se transdujo en celulas TYK transducidas con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). La figura 7(a) muestra un nivel de expresi6n de la proteina gelsolina, que se determin6 por transferencia Western.

35 [Figura 7(b)] La figura 7(b) es una vista que muestra que una supresi6n de la expresi6n de gelsolina redujo una migraci6n celular, sin embargo, no afectO a la morfologia celular ni a una adhesi6n celular a un sustrato. Un vector de ARNsi especifico de gelsolina (TW/GSNsiRNA) o un vector de control (TW/siMock) se transdujo en las celulas TYK transducidas con

40 la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). La figura 7(b) muestra las celulas tenidas con May Grunwald-Giemsa.

[Figura 7(c)] La figura 7(c) es una vista que muestra que una supresi6n de la expresi6n de gelsolina redujo una migraci6n celular, sin embargo, no afectO a la morfologia celular ni a una adhesi6n celular a un sustrato. Un vector de ARNsi especifico

45 de gelsolina (TW/GSNsiRNA) o un vector de control (TW/siMock) se transdujo en las celulas TYK transducidas con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). La figura 7(c) muestra las areas del clon celular TW/Mock y el clon celular TW/GSNsiRNA, que se calcularon mediante el software NIH Image.

[Figura 7(d)]

50 La figura 7(d) es una vista que muestra que una supresi6n de la expresi6n de gelsolina redujo una migraci6n celular, sin embargo, no afectO a la morfologia celular ni a una adhesi6n celular a un sustrato. Un vector de ARNsi especifico de gelsolina (TW/GSNsiRNA) o un vector de control (TW/siMock) se transdujo en las celulas TYK transducidas con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). La figura 7(d) muestra una adhesi6n celular a un sustrato determinada por un ensayo de desprendimiento.

55 [Figura 7(e)] La figura 7(e) es una vista que muestra que una supresi6n de la expresi6n de gelsolina redujo una migraci6n celular, sin embargo, no afectO a la morfologia celular ni a una adhesi6n celular a un sustrato. Un vector de ARNsi especifico de gelsolina (TW/GSNsiRNA) o un vector de control (TW/siMock) se transdujo en las celulas TYK transducidas con

la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). La figura 7(e) muestra un desplazamiento celular colectivo analizado por un ensayo de curaci6n de herida.

[Figura 7(f)]

5 La figura 7(f) es una vista que muestra que una supresi6n de la expresi6n de gelsolina redujo una migraci6n celular, sin embargo, no afect6 a la morfologia celular ni a una adhesi6n celular a un sustrato. Un vector de ARNsi especifico de gelsolina (TW/GSNsiRNA) o un vector de control (TW/siMock) se transdujo en las celulas TYK transducidas con

la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). La figura 7(f) muestra los niveles de expresi6n de la a-actinina 1 y la cofilina, que se determinaron por transferencia Western.

10 [Figura 8] La figura 8 es una vista que muestra una posibilidad de funci6n de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) en el control de la dinamica citoesqueletica.

15 [Figura 9] La figura 9 es una vista esquematica que muestra un sitio diana de un vector de ARNsi para suprimir especificamente una expresi6n de la isoforma VVT1 17AA( — ).

[Figura 101

20 La figura 10 es una vista que muestra la presencia o ausencia de inducci6n de apoptosis provocada por la transducci6n de un vector de ARNsi especifico de la isoforma VVT1 17AA( —) en celulas que expresan VVT1 o celulas que no expresan VVT1.

[Figura 11]

25 La figura 11 es una vista que muestra la supresi6n de una formaci6n tumoral en un rat6n trasplantado por via subcutanea con una celula de tumor humano provocado por la supresiOn de una expresiOn de la isoforma VVT1 17AA( — ).

Mejor modo de realizar la invenciOn 30

[1] ARNsi especifico de la isoforma VVT1 171AA( —)

La presente invenciOn se refiere a un polinucleOtido para proporcionar un ARNsi especifico de la isoforma VVT1 17AA( — ).

35 Recientemente, llama mucho la atenciOn una tecnica de interferencia de ARN (ARNi) como terapia de alcance molecular. El ARNi, que se inicia con ADN de doble helice (ADNdh), es un procedimiento silenciador postranscripcional del gen en el que el ARNsi provoca una degradaci6n de su ARN homOlogo, que se realize especificamente en la secuencia.

40 Es necesario que el ARNsi sea lo suficientemente largo para realizar una supresi6n de expresi6n especifica del gen. Al mismo tiempo, es necesario que el ARNsi sea lo suficientemente corto para evitar influencias adversas sobre una celula mamifera. For lo tanto, el ARNsi es preferentemente un par de bases nucleotidicas que tiene de 15 a 49 bases de longitud, mas preferentemente un par de bases nucleotidicas que tienen de 15 a 30 bases de longitud.

45 For lo tanto, el polinucleOtido de acuerdo con la presente invenciOn tiene al menos 15 bases contiguas en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 26 e incluye la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 27. Como se ha mencionado anteriormente, se sabe que un splicing alternativo tiene lugar en dos sitios en un gen VVT1 a fin de que se generen cuatro isoformas, que son 17AA( + )KTS( + ) (SEQ ID NO: 32 y 33), 17AA( + )KTS( —) (SEQ ID NO: 34 y

50 35), 17AA( — )KTS( + ) (SEQ ID NO: 36 y 37) y 17AA( — )KTS( —) (SEQ ID NO: 38 y 39). Ya que las secuencias de bases de la SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27 se generan por un splicing alternativo en el sitio 17AA, el polinucleOtido de acuerdo con la presente invenciOn puede proporcionar, con la disposici6n anterior, un ARNsi capaz de inhibir especificamente una expresi6n de la isoforma VVT1 17AA( —) sin inhibir una expresi6n de la isoforma VVT1 17AA( +)

55 Cuando se usa en la presente memoria descriptive, el termino "polinucleOtido" se refiere a un polimero de nucleOtidos, y se usa de forma intercambiable con "gen", "acido nucleico" o "molecule de acido nucleico". Ademas, la expresi6n "secuencia de bases" que se usa en la presente memoria descriptive se refiere a una secuencia de desoxirribonucleOtidos (abreviados como A, G, C y T), y se usa de forma intercambiable con "secuencia de acido

nucleico" o "secuencia nucleotidica".

El polinucleOtido de acuerdo can la presente invenciOn puede existir en forma de ARN (ARNm, par ejemplo) o ADN (ADNc o ADN gen6mico, par ejemplo). El ADN puede ser de doble helice o de una sole helice. El ADN de una sole 5 helice o el ARN de una sole helice puede ser una hebra codificante (conocida coma hebra de sentido directo) o una hebra no codificante (conocida coma una hebra de sentido contrario).

Un polinucleOtido corto se representa coma un dinucleOtido (dimero) y un trinucleOtido (trimero). Un polinucleOtido largo se representa usando el nOrnero de nucleOtidos polimerizados, coma 30 mer o 100 mer. El polinucleOtido de 10 acuerdo can la presente invenciOn puede producirse coma un fragmento de un polinucleOtido mas largo o puede sintetizarse quimicamente.

Es preferible que el ARNsi producido can el polinucleOtido de acuerdo can la presente invenciOn sea ARN de doble helice compuesto par (i) un primer ARN codificado par un ADN complementario can respecto a un polinucleOtido que

15 tiene al menos 15 bases contiguas en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 26 y que incluye la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 27, y (ii) un segundo ARN capaz de emparejarse can el primer ARN. Sin embargo, el ARNsi puede facilitarse coma ADN que codifica el ARN de doble helice o coma un vector en el que se inserta el ADN que codifica el ARN de doble helice.

20 Cuando se usa en la presente memoria descriptive, la expresi6n "ARNsi especifico de la isoforma VVT1 17AA( — )" se usa de forma intercambiable can "ARNsi de 17AA( — )". Proporcionandose el polinucleOtido coma una secuencia diana, el ARNsi de 17AA( —) puede producirse facilmente mediante cualquier procedimiento conocido en la tecnica. El ARNsi de 17AA( —) puede sintetizarse quimicamente o puede producirse mediante una expresi6n recombinante, par ejemplo.

25 Como se ha descrito anteriormente, el ARNsi de 17AA( —) es preferentemente un par de bases nucleotidicas que tienen de 15 a 49 bases de longitud, mas preferentemente un par de bases nucleotidicas que tienen de 15 a 30 bases de longitud. Se ha de observer que, en la presente memoria descriptive, las hebras del ARNsi no tienen que estar completamente emparejadas entre Si, excepto en una regi6n en la que las hebras se emparejen entre Si coma

30 ARNds, y el ARNsi puede incluir sitios sin emparejar que tienen lugar debido a un par de bases que no coinciden y similares.

Adernas, el ARNsi de 17AA( —) puede o no tener una protrusi6n en sus extremos. En el caso de que el ARNsi de 17AA( — ) tenga la protrusi6n, el nOrnero de bases incluidas en la protrusi6n no se limita mientras pueda inducirse un 35 efecto ARNi.

En el ARNsi de 17AA( — ), es preferible que el ADN que codifica el segundo ARN pueda hibridar en una condici6n rigurosa can el polinucleOtido que tiene al menos 15 bases contiguas en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 26 y que incluye la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 27.

40 La hibridaci6n puede realizarse mediante un procedimiento bien conocido, tal coma uno descrito en Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989). En general, cuanto mas alta es la temperatura o cuanto mas alta es la concentraci6n de sal, mayor es la rigurosidad que puede proporcionarse (una condici6n mas dificil de hibridaci6n), lo que permite obtener polinucleOtidos que tengan una homologia mayor.

45 Una temperatura adecuada de hibridaciOn difiere dependiendo de un factor, tal coma una secuencia de bases y la longitud de la secuencia de bases. Par ejemplo, en el caso en el que se use un fragmento de ADN compuesto par 18 bases que codifica 6 aminoacidos coma sonda, es preferible disponer la temperatura a 50 °C o inferior.

Cuando se usa en la presente memoria descriptive, la expresi6n "una condici6n rigurosa de hibridaciOn" se refiere a

50 tal condici6n en la que se incuban los polinucleOtidos durante una noche a 42 °C en una soluciOn de hibridaci6n (formamida al 50 %, 5 x SSC (incluyendo NaCI 150 mM, citrato tris6dico 15 mM), fosfato s6dico 50 mM (pH 7,6), 5 x soluciOn de Denhardt, sulfato de dextrano al 10 %, y 20 jig/m1 de ADN de esperma de salmOn fragmentado y desnaturalizado), y despues un filtro se lava en 0,1 x SSC a aproximadamente 65 °C. Un polinucleOtido que "parcialmente" hibrida en otro polinucleOtido propane un polinucleOtido (ADN o ARN) que hibrida en al menos 15

55 nucleOtidos (nt), preferentemente al menos aproximadamente 20 nt, mas preferentemente al menos aproximadamente 30 nt, de forma adicional preferentemente mas de 30 nt de un polinucleOtido de referencia. El polinucleOtido que "parcialmente" hibrida en otro polinucleOtido es tambien Otil para una sonda de detecci6n.

En el caso de que el ARNsi de 17AA( — ) se proporcione coma ARNds, es preferible que el ARNsi de 17AA( —) este

compuesto par un emparejamiento de ARN que incluya la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 29, incluyendo el ARN la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 30.

En el caso de que el ARNsi de 17AA( —) se proporcione coma un ADN que codifica el ARNsi o coma un vector en el

5 que se inserta el ADN, es preferible que el segundo ARN incluya al menos 15 bases contiguas en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 29, y que el primer ARN incluya al menos 15 bases contiguas en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 30. Adernas, es preferible que el primer ARN y el segundo ARN (o un ADN que codifica el primer ARN o el segundo ARN) se combinen entre sí a traves de un polinucleOtido compuesto par la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 31 para formar la horquilla de ARN (tallo-lazo). Sin embargo, la presente realizaciOn no se limita a

10 esto.

Usando un vector de expresiOn de ARNsi, es decir, un vector de ADN obtenido insertando, en forma de un fragmento de ADN foraneo, un ADN que corresponde al ARNsi, es posible hacer que el ARNsi de 17AA( —) exprese y act0e en el cuerpo de forma eficaz. Par consiguiente, un vector de ADN de este tipo puede seleccionarse entre

15 diversas series de vectores que se conocen en la tecnica. Ha de apreciarse que el fragmento de ADN que corresponde al ARNsi de 17AA( —) puede prepararse facilmente mediante un procedimiento conocido en la tecnica.

Como el vector de expresi6n anterior, se conoce un vector tal coma "del tipo horquillado" o "del tipo tallo-lazo" cuya secuencia de ADN correspondiente a una hebra codificante del ARNsi y la secuencia de ADN correspondiente a una

20 hebra no codificante del ARNsi se codifican con una hebra de ADN en la direcci6n 3 de un promotor. El fragmento de ADN que se inserta en un vector de este tipo produce un ARN del tipo horquillado (del tipo tallo-lazo) despues de que se transcriba en el cuerpo, y produce el ARNsi coma resultado de reacciones enzimaticas.

El vector de expresiOn de ARNsi puede producirse facilmente usando un procedimiento conocido par los expertos en

25 la tecnica. Un vector de expresi6n de este tipo puede ser, pero sin limitaciOn, diversos tipos de vectores viricos (vector adenoviral, vector virico adeno-asociado, y similares), par ejemplo. El vector adenoviral permite transducir un gen en una celula que tiene una velocidad lenta de divisiOn celular (una celula nerviosa y similar, par ejemplo), y consigue una transducciOn de alta eficacia.

30 El propio ARN es una sustancia inestable, y se degrada par una ribonucleasa y similar al inyectarse en la sangre. Sin embargo, el ARNsi de 17AA( — ) puede aplicarse a un tratamiento de tumor sOlido usando un sistema de administraci6n de farmacos (DDS, DrugDeliyetySystem) ,que se conoce en la tecnica, y similares. El ARNsi de 17AA( — ) se encapsula en un vehiculo, tal coma un liposoma funcional, una micela polimerica, y similares, o se modifica con PEG y similares en sus dos extremos para ser estable en la sangre y/o una celula.

[2] Uso del ARNsi especifico de la isoforma VVT1 17AA( —)

(1) Composici6n medica

40 La presente invenciOn proporciona una composici6n medica de acuerdo con las reivindicaciones que comprende un ARNsi especifico de la isoforma VVT1 17AA( —) (ARNsi de 17AA( — )). La composici6n medica de acuerdo con la presente invenciOn es eficaz en el tratamiento de un tumor sOlido.

La composici6n medica de acuerdo con la presente invenciOn comprende uno de: un ARN de doble helice que tiene

45 un primer ARN codificado par un ADN complementario con respecto a un polinucleOtido que esta compuesto par al menos 15 bases contiguas en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 26 y que incluye la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 27, y un segundo ARN capaz de emparejarse con el primer ARN; un ADN que codifica el ARN de doble helice; y un vector en el que se inserta el ADN.

50 "Tumor es conocido coma una neoplasia, y es un nuevo crecimiento que incluye una celula neoplasica. Adernas, la "celula neoplasica" tambien se conoce coma una celula que tiene un problema de crecimiento, y proporciona una celula que crece de forma proliferativa a una velocidad extremadamente alta. La neoplasia es un tejido que crece anormalmente, y en general, forma par separado una agregaci6n. Las agregaciones crecen mas rapidamente que un tejido que crece normalmente. La neoplasia tiene defectos de forma parcial o completamente en la formaci6n de

55 una estructura junto con un tejido normal, y/o en el funcionamiento en cooperaci6n con el tejido normal.

El tumor puede ser benigno (tumor benigno) o maligno (tumor maligno o cancer). El tumor maligno puede clasificarse en tres tipos principales. Un tumor maligno que desarrolla una estructura epitelial se describe coma carcinoma. Un tumor maligno que tiene su origen en los tejidos conectivos, tales coma los mOsculos, tejidos cartilaginosos, grasas o

huesos, se describe como sarcoma. Un tumor maligno que afecta a una estructura hematopoyetica (estructura responsable de la producci6n de glObulos rojos) que incluye componentes del sistema inmune se describe como leucemia o linfoma. Otra neoplasia puede ser, pero sin limitaciOn, neurofibroma.

5 El cancer (tumor) puede dividirse en los dos tipos siguientes: 1) uno que crece al mismo tiempo segOn se mueve constantemente en la sangre despues de convertirse en maligno, y que se extiende a los tejidos hematopoyeticos y otros 6rganos por todo el cuerpo, a pesar de ser un tejido hematopoyetico o un tejido linfatico (por ejemplo, leucemia); 2) uno que existe en un tejido u 6rgano particular como una masa tumoral (por ejemplo, muchos tumores distintos de leucemia). Cuando se usa en la presente memoria descriptiva, la expresi6n "tumor sOlido" se refiere a un

10 tumor distinto de leucemia. El tumor sOlido al que puede aplicarse la composici6n medica de acuerdo con la presente invenciOn se refiere particularmente a un cancer de vejiga, un cancer de ririOn, un cancer de celulas escamosas de la piel, un cancer de cabeza y cuello (cancer de celulas escamosas de la piel de la cabeza y el cuello, por ejemplo), un cancer de pulmOn (cancer de pulmOn de celulas no pequerias (CPCNP), por ejemplo), un tumor en el canal alimentario (tumor esofagico, cancer de est6mago, tumor del intestino delgado, tumor del intestino grueso),

15 glioma, un tumor mesotelial, y similares.

Cuando se usa en la presente memoria descriptiva, el termino "tratamiento" se refiere a un alivio o eliminaciOn de un sintoma, e incluye cualquier procedimiento realizado de forma profilactica (antes de la aparici6n del sintoma) y terapeutica (despues de la aparici6n del sintoma). La expresi6n "tratar un tumor sOlido" se refiere a la supresi6n o

20 prevenciOn del crecimiento (proliferaciOn) del tumor sOlido. La expresi6n "tratar un tumor sOlido" tambien se refiere a que, usando un procedimiento para el procesamiento del tumor sOlido, el tumor sOlido se vuelva mas ligero y mas pequerio que el mismo tumor al que no se aplica el procedimiento. Es preferible que el crecimiento (proliferaciOn) del tumor sOlido se suprima hasta tal punto que el tumor presente una disminuci6n neta de peso y tamario.

25 La composici6n que comprende el ARNsi o el vector de expresi6n de ARNsi como un constituyente activo puede comprender un constituyente arbitrario, tal como un tamp6n y/o adyuvante, que se conoce por los expertos en la tecnica, de acuerdo con un objeto o los constituyentes de la composici6n.

La composici6n medica de acuerdo con la presente invenciOn tiene preferentemente una forma tal que la

30 composici6n pueda existir en una alta concentraci6n en la sangre. Es decir, la composici6n medica tiene preferentemente una "forma inyectable", que es apropiada para una inyecci6n en una vena, un mOsculo, una cavidad abdominal, un estern6n y una articulaciOn, y para una inyecci6n subcutanea. Sin embargo, esta no es la Onica posibilidad. For ejemplo, la composici6n medica puede ser un agente oral, tal como un comprimido, una capsula (incluyendo una capsula blanda y una microcapsula, siendo preferentemente una capsula de liberaciOn prolongada),

35 una medicina en polvo, granulos y un jarabe, o puede ser un agente parenteral, tal como una inyecci6n, un supositorio, una pastilla y gotas. La composici6n medica de acuerdo con la presente invenciOn puede administrarse por via oral y parenteral debido a su baja toxicidad. Cuando se usa en la presente memoria descriptiva, el termino "parenteral" representa un tipo de administraci6n, que incluye una inyecci6n y una infusi6n en una vena, un mOsculo, una cavidad abdominal, un estern6n, una articulaciOn y una inyecci6n e infusi6n subcutanea.

40 La composici6n medica de acuerdo con la presente invenciOn puede administrarse en una ruta apropiada de acuerdo con su forma farmaceutica. El procedimiento para su administraci6n no esta particularmente limitado, y puede realizarse interna y externamente, y tambien puede realizarse por inyecci6n. La soluciOn de inyecci6n puede administrarse en una vena y un mOsculo, y puede administrarse por via intradermica y subcutanea.

45 La composici6n medica de acuerdo con la presente invenciOn puede producirse mediante un procedimiento conocido en el campo farmaceutico. La cantidad del ARNsi de 17AA en la composici6n medica de acuerdo con la presente invenciOn no esta particularmente limitada, con la condici6n de que el ARNsi de 17AA se administre, teniendo en cuenta la forma y el procedimiento de administraci6n, dentro del intervalo que se ha mencionado

50 anteriormente usando la composici6n medica de acuerdo con la presente invenciOn.

Ha de tenerse en cuenta que, en general, una composici6n puede ser cualquier composici6n que comprenda una sustancia A individualmente, una sola composici6n que comprenda la sustancia A y una sustancia B, y una combinaci6n de una composici6n que comprenda la sustancia A individualmente y una composici6n que comprenda 55 la sustancia B individualmente. Estas composiciones pueden comprender constituyentes (tales como un vehiculo que puede estar aceptado como un agente farmaceutico) distintos de las sustancias A y B. Cuando la composici6n que comprende el ARNsi de 171AA( — ) se usa junto con una composici6n que comprende otro constituyente (la sustancia B), estas composiciones no pueden considerarse como una composici6n en conjunto, ya que la composici6n medica de acuerdo con la presente invenciOn esta caracterizada porque comprende el ARNsi de 17A( —

), que se describe coma la sustancia A. Sin embargo, una combinaci6n de composiciones de este tipo puede considerarse coma "kit, que se describira en lo sucesivo en este documento. Se entendera facilmente par los expertos en la tecnica que la combinaci6n puede proporcionarse coma un kit; no coma una composici6n.

5 (2) Kit medico

La presente invenciOn tambien proporciona un kit medico de acuerdo con las reivindicaciones que incluye el ARNsi de 17AA( — ). Cuando se usa en la presente memoria descriptiva, el termino "kit se refiere a un paquete que incluye un recipiente (tal coma una botella, una placa, un tuba y un plato) para contener un material determinado en el 10 mismo. Es preferible que el kit tenga instrucciones para el uso del material. Cuando se use para hacer referencia al kit en la presente memoria descriptiva, la expresi6n "que incluye" se refiere al contenido en uno de los recipientes individuales que constituyen el kit. El kit medico de acuerdo con la presente invenciOn puede ser un paquete para empaquetar varias composiciones diferentes juntas. La composici6n tiene cualquiera de las formas que se han descrito anteriormente, y puede estar contenida en el recipiente cuando se encuentra en forma de soluciOn. El kit 15 medico de acuerdo con la presente invenciOn puede incluir las sustancias A y B en un recipiente o en recipientes separados. Las "instrucciones" pueden tener cualquier forma que este impresa "o" escrita en un papel o en cualquier otro media, o pueden estar grabadas en un media electrOnico, tal coma una cinta magnetica, un disco o cinta legible par ordenador y un CD-ROM. Adernas, el kit medico de acuerdo con la presente invenciOn puede incluir un recipiente que contiene un diluyente, un disolvente, un liquido de lavado u otros reactivos. Adernas, el kit medico de

20 acuerdo con la presente invenciOn puede incluir cualquier instrumento necesario para la aplicaciOn del kit a un procedimiento para un tratamiento medico.

Los expertos en la tecnica, que lean la presente memoria descriptiva, comprenderan facilmente que el ARNsi de 17AA( —) y otras sustancias en el kit medico de acuerdo con la presente invenciOn pueden usarse de acuerdo con la

25 forma de uso de la composici6n.

(3) Procedimiento para un tratamiento medico

Adernas, se describe un procedimiento para un tratamiento medico que no forma parte de la presente invenciOn. El 30 procedimiento incluye una etapa de administraciOn del compuesto de acuerdo con la presente invenciOn a un sujeto.

Los expertos en la tecnica, que lean la presente memoria descriptiva, entenderan facilmente que el ARNsi de 17AA( —) y otras sustancias en el procedimiento pueden usarse de acuerdo con la forma de uso de la composici6n.

35 Ya que el gen VVT1 se expresa altamente en una celula cancerosa, una muerte celular inducida par la supresi6n de la expresi6n de la isoforma 17AA( —) tiene lugar especificamente en la celula cancerosa, y no en una celula normal. Par lo tanto, es posible realizar una terapia de alcance molecular especifica de las celulas cancerosas usando la presente invenciOn.

40 En la presente memoria descriptiva, el tratamiento del tumor sOlido se toma coma un ejemplo del uso del ARNsi especifico de la isoforma VVT1 17AA( — ). A la luz del hecho de que el ARNsi especifico de la isoforma VVT1 17AA( — ) induce la apoptosis en una celula formadora del tumor sOlido, los expertos en la tecnica, que lean la presente memoria descriptiva, entenderan facilmente que tambien se describe un agente inductor de muerte celular para inducir la apoptosis en la celula formadora del tumor sOlido, un kit para inducir la muerte celular, y un procedimiento

45 para inducir la muerte celular.

Ejemplo

[Materiales y procedimientos]

[1. Cultivo celular]

Se usaron en el experimento lineas de celulas humanas cancerosas (celulas de cancer de ovario (celulas TYK- nu.CP-r (en lo sucesivo denominadas coma celulas TYK), celulas de cancer de est6mago (celulas MKN28), celulas

55 de cancer de mama (celulas ZR-75 y celulas SKBr3-), celulas de cancer de es6fago (celulas TE10), celulas de cancer de pancreas (celulas MiaPaCa2), celulas de cancer de colon (celulas 5W480 y celulas de cancer cervical (celulas HelaAG)), y linease celulares humanas de fibrosarcoma (celulas HT-1080). Las celulas TE10 y las celulas 5W480 se cultivaron en un media RPMI-1640 complementado par suero bovino fetal al 10 % (FBS). Se cultivaron otras lineas celulares en un media de Eagle modificado par Dulbecco (DMEM) que incluye FBS al 10 %.

[2. Construcci6n del vector]

Se construy6 pcDNA3.1 ( + ) (lnvitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) que incluia una de las cuatro isoformas de

5 VVT1 humano para su uso para la expresi6n de las isoformas VVT1 en una celula TYK. Cada secuencia de las isoformas VVT1, clonadas en un vector pUC19, se amplific6 par PCR usando Pfx Taq polimerese (Invitrogen), y despues se insertaron en un vector pEGFP (Clontech, PaloAlto, CA, Estados Unidos) para usarse para una expresi6n transitoria de una isoforma VVT1 marcada can la proteina verde fluorescente (GFP). Se determin6 mediante un procedimiento de secuenciaci6n directa usando el kit de secuenciaci6n par ciclos BigDye Terminator

10 V1.1 (Applied Biosystems, Branchberg, NI, Estados Unidos) que todas las secuencias amplificadas par PCR no tenian ninguna mutaci6n.

Can el fin de preparar vectores para expresar a-actinina y cofilina, se prepar6 ADNc a partir de ARNm aislado de una celula TYK, y despues se amplificaron secuencias de genes codificantes de a-actinina y cofilina mediante PCR 15 can Pfx Taq polimerese. Las secuencias codificantes de a-actinina y cofilina se insertaron en un vector pcDNA3.1/Zeo( + ) (Invitrogen).

Can el fin de preparar un vector de ARNsi dirigido a gelsolina, se sintetizaron y se hibridaron un par de secuencias de ADN dirigidas a una secuencia de ARNm de gelsolina (5'-UCCAGGAUGAAGCAGUCGCCAUUGUUGAA-3': SEQ

20 ID NO: 25) se sintetizaron (Japan BioScience, Saitama, Jap6n), y despues se insertaron en piGENE tRNA Fur (Clontech), que es un vector de expresi6n de ARNt-ARNhp.

[3. Expresi6n constitutive del vector]

25 Un vector de expresi6n mamifero y un vector ARNsi dirigido a gelsolina se linealizaron par Pvul, y despues se transdujeron en celulas mediante electroporaciOn usando Gene Pulsar II (Bio-Rad, CA, Estados Unidos). Los clones celulares que expresan de forma estable el vector de ARNsi se aislaron usando un antibiOtico adecuado para la selecciOn.

30 [Expresi6n transitoria del vector]

Usando Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN, Estados Unidos) de acuerdo can las instrucciones proporcionadas par el fabricante, el ADN vectorial (2 jig) se transfectO en celulas a una densidad celular de 5 x 104 calulas/ml. Las celulas transfectadas can el ADN vectorial se recogieron en el momenta indicado para someterlas a analisis.

[PCR de transcripci6n inverse]

El ARN total se ais16 usando ISOGEN (Nippon Gene, Tokio, Jap6n), y despues se disolvi6 en agua tratada can pirocarbonato de dietilo (DEPC). El ARN total (2 jig) se convirtiO en ADNc usando transcriptasa inverse del virus de

40 la leucemia murina de Moloney (Promega, Madison, WI, Estados Unidos).

Las secuencias cebadoras y las condiciones de amplificaciOn para someter once proteinas de uni6n a actina (incluyendo gelsolina, profilina, p125fak, paxilina, a-actinina 1, VASP y gliceraldehidos-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH, usado coma control)) a PCR se diseriaron de acuerdo can Salazar R. y col., Exp Cell Res; 249: 22 — 32

45 (1999). Las secuencias cebadoras pare el analisis par PCR de talina, cofilina, ezrina, radixina y moesina se muestran en la Table 1. Los productos de PCR se separaron sabre gel de agarosa al 2 % que incluia bromuro de etidio, y despues se visualizaron mediante luz UV.

[Tabla 1]

SECUENCIACEBADORA (DIRECTA) SECUENCIA CEBADORA (DE SENTIDO

CONTRARIO) GELSOLINA OTT TOO AGOCATATCGOO ACC TTCTOTGOO TOGCTGGOTC PROFILINA GGCCAG AAATGTTOGGTG ACGGGA GGG ATATGG GTA p125fak GAOTCACCTGGGTAOTGG TATG ATCGOTOTT CACCTGTTGATAG PAXILINA CAG TOGCCAAAGGAG TOTG GTAGTCOTT GCGACAGTAGGC a-ACTININA GGA GOO GAAGAAATCGTG CTGCTCGTT CTCCTGGTT G 1 VASP GGAAAGTCAGCAAGOAGG TGTGCGGAAAGG AGAAGO TALINA TGG CTACCTGGAACTGOTGGA C TOO AGOTOTCGTTOO TTCCGAAG COFILINA AGTOTT CAACGCCAGAGGAGG GTGCAG CGG TOO TTGACC TOO T

TG EZRINA AGGAGTTGATGCTGCGGCTGCA GTGGATGATGTCATT GTGGGTC RADIXINA ACC ACC AGTCATTOO TOO AACAG GGCAAGGTGGGATGCATT CCATO MOESINA TGG TGCOTT CAAGAOOTT CACC GTCACC TGA GAG GGTTGA GTAAAC GAPDH GOO AAAAGG GTCATCATCTO GTAGAG GCAGGG ATGATGTTC

Con los pares de cebadores anteriores, los ARNm de las proteinas de uni6n a actina se amplificaron par FOR de transcripci6n inversa (20 ciclos, can una temperatura de hi bridaci6n de 60 °C). 5

[5. Transferencia Western]

Las celulas se lavaron dos veces can una soluciOn sauna tamponada can fosfato (PBS) y despues se disolvieron en un tamp6n de muestra SOS (que incluia Tris-HCI 0,125 M (pH 6,8), ditiotreitol 100 mM, SOS al 4 %, sacarosa al 10 10 % y azul de bromofenol al 0,004 %). El lisado celular se someti6 a SOS-PAGE y se transfiri6 a una membrana de difluoruro de polivinilideno lmmobilon (Millipore, Bedford, MA, Estados Unidos). Despues, el lisado celular se someti6 a inmunotransferencia can anticuerpos especificos de VVT1 (Dakocytomation, Carpinteria, CA, Estados Unidos),

GAPDH, actina (Chemicon, Temecula, CA, Estados Unidos), actina F (Abcam, Cambridge, Reino Unido), a-tubulina, cofilina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, Estados Unidos), gelsolina (Sigma, St Louis, MO, Estados 15 Unidos) y a-actinina 1 (clan AT61172; Upstate Cell Signaling Solutions, Nueva York, NY, Estados Unidos), respectivamente.

[6. lnmunohistoquimica]

20 Las celulas casi confluentes se recogieron y se pusieron en placas a una densidad celular de 5 x 104 calulas/m1 en 1 ml de DMEM que incluia FBS al 10 %, que se proporciona sabre una tapa de vidrio esterilizada (24 x 24 mm) colocada en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Despues de incubarse durante una noche, las celulas sabre la tapa de vidrio se secaron al aire y despues se fijaron can paraformaldehido (al 0,5 % (para la tinci6n de una fibra de estres de actina), o al 4 % (para la tinciOn de otras proteinas)). Despues, las celulas se lavaron dos veces can PBS

25 que incluia Tween 20 al 0,05 %, y posteriormente se hicieron permeables usando PBS que incluia Triton X-100 al 1 % (dejandolo durante 10 minutos). Las celulas se incubaron durante 30 minutos en tamp6n de bloqueo (PBS que incluia BSA al 2 %, Tween 20 al 0,2 %, glicerina al 6,7 % y NaN3 al 0,1 %) y despues se sometieron a inmunotransferencia can un anticuerpo primario especifico de gelsolina, a-actinina 1 o cofilina mediante reacci6n durante una hora. Despues de lavarse can PBS que incluia Tween 20 al 0,05 %, las celulas se incubaron durante

30 una hora can un anticuerpo secundario que corresponda al anticuerpo primario. Despues, la fibra de estres de actina y la vinculina (proteina de adhesi6n focal) se tifieron can un kit de tinci6n FAK100 (Chemicon) de acuerdo can las instrucciones proporcionadas par el fabricante. Las expresiones de estas proteinas se analizaron usando un microscopio confocal (LSM510 ver. 2.8; Carl Zeiss, Alemania).

35 [7. Ensayo de uni6n celular y ensayo de desprendimiento celular]

Se realizO un ensayo de uni6n celular de acuerdo can Yu D. H. y col., J. Biol. Chem. 273: 21 125-131 (1998). El empobrecimiento del suero en DMEM que incluia FBS al 0,5 % se realizO durante una noche. Las celulas (1 x 104 celulas) se pusieron en placas a una densidad celular de 1 x 104 celulas/pocillo en 100 jil del DMEM libre de suero 40 proporcionado en una placa de 96 pocillos que esta recubierta can fibronectina (Sigma) a una concentraci6n de 10

jig/ml, y despues se incubaron a 37 °C durante 30 minutos en presencia de CO2 al 5 %. Despues de lavarse dos veces con PBS, las celulas fijadas al pocillo se trataron con tripsina, y despues se cont6 el nOmero de celulas.

Se realizO un ensayo de desprendimiento celular de acuerdo con Grille S. J. y col., Cancer Res. 63: 2172-8 (2003).

5 Las celulas se colocaron en placas en 1 ml de DMEM que incluia FBS al 10 %, que se proporcion6 en una placa de 24 pocillos, y despues se incubaron durante una noche para que se fijaran al pocillo. Despues, las celulas se trataron con tripsina al 0,25 % (Tacalai Tesque, Kyoto, Jap6n) a temperatura ambiente, y despues se recogieron 2 minutos despues del tratamiento con tripsina.

10 [8. Analisis del desplazamiento celular individual]

Se observ6 un desplazamiento celular individual usando un microscopio con lapso de tiempo. En resumen, las celulas se colocaron en placas sabre un plato de 35 mm con una confluencia del 30 %, y posteriormente se incubaron durante 48 horas. Despues, las celulas se incubaron a 37 °C en presencia de 02 al 5 %, CO2 al 5 % y N2

15 al 90 %, y se observaron durante 5 horas en intervalos de 2 minutos usando el software MetaCAM (Universal Imaging Software, Buckinghamshire, Reino Unido). Se determinaron las posiciones ([X, Y]) de las celulas, trazadas en un punto de tiempo determinado, usando el software Commotion Pro 4.0 (Pinnacle Systems, CA, Estados Unidos) a fin de que se calculara la distancia que se movia la celula cada 2 minutos. La velocidad (pm/h) de los desplazamientos de la celula que se traz6 se determin6 desde una distancia total de un desplazamiento de 5 horas.

[9. Ensayo de curaci6n de herida]

Se realizO un ensayo de curaci6n de herida de acuerdo con Stahle M. y col., J. Cell. Sci.; 116: 3835 — 46 (2003). En resumen, la suspension celular (2 x 105 celulas/2 ml) se puso en placas a una densidad celular de 1 x 105 celulas/m1 25 en 2 ml de DMEM que incluia FBS al 10 %, que se proporcion6 en una placa de 6 pocillos, para crecer hasta confluir. Despues, una monocapa de celulas confluentes se ray6 con un chip de color amarillo para que las celulas rayadas se desprendieran. La monocapa celular restante se lay6 dos veces moderadamente con DMEM libre de suero, y despues se incub6 en DMEM que incluia FBS al 10 %. Las imagenes de un sitio en el que se desprendieron las celulas se tomaron en el momento del raspado y 12 horas despues del raspado. Se descubri6 una migraci6n

30 celular coma una relaciOn media (porcentaje) de la longitud de la protrusi6n con respecto a la longitud del raspado en tres sitios diferentes en varios en lugares de una misma imagen.

[10. Ensayo de migraci6n Transwell]

35 Se realizO un ensayo de invasiOn de quimiotaxis de acuerdo con Yoshioka K. y col., Proc Natl Acad Sci Estados Unidos; 100, 7247 — 52 (2003). Despues de incubarse durante 2 horas en un DMEM libre de suero que incluia BSA al 0,1 %, las celulas (3 x 104 celulas) en 20 pl de DMEM libre de suero que incluia BSA al 0,1 % se aplicaron a una camara superior del Transwell (membrana PET con un tamano de poro de 8 pm; BD Falcon, NJ, Estados Unidos). La camara inferior se Mend con DMEM con suero al 5 % que incluia BSA al 0,1 %. Despues de 18 horas, las celulas

40 que se habian movido a la parte inferior de la membrana PET y la superficie inferior de un pocillo se inmovilizaron con metanol al 70 %, y se cont6 el nOmero de las mismas.

[11. Transducci6n de ARNhp in vivo]

45 Las celulas de tumor humano HT-1080 (5 x 106 celulas) que expresaban VVT1 se suspendieron en 100 pl de PBS. La suspensi6n se mezclO con 50 pl de matrigel (BD), y despues se trasplantaron par via subcutanea en un lado ventral de un rat6n Balb/c nu/nu hembra de 6 semanas de edad. A partir de 3 dias despues del trasplante, se administr6 ARNhp de VVT1 (50 jig) dirigido a la isoforma VVT1 17AA( — ), o un vector de control del ARNhp (50 jig), dos veces a

la semana con anestesia, al sitio en el que se trasplantaron las celulas tumorales. El eje mayor y el eje menor de una 50 masa tumoral en el sitio en el que se transplantaron las celulas se midi6 2 semanas despues del trasplante. El volumen de la masa tumoral se defini6 coma (eje mayor) x (eje menor) x (eje menor)/2.

[12. Analisis estadistico]

55 Se evaluO una diferencia estadisticamente significativa entre los promedios de los grupos de ensayo usando una prueba t con datos independientes.

[13. Descripci6n de los dibujos]

Las figuras 1 son vistas que muestran un cambio morfolOgico de la celula TYK de cancer de ovario inducido par una expresi6n constitutiva de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). La figura 1(a) muestra, coma ejemplo, los resultados de la transferencia Western que muestran la presencia o la ausencia de expresiones de las proteinas VVT1 en cuatro lineas celulares TYK (estando cada una transducida can una de cuatro isoformas VVT1 diferentes). La figura 1(b)

5 muestra, coma ejemplo, un cambia en la morfologia celular provocado par expresiones estables de cada isoforma VVT1 en la celula TYK. La figura 1(c) muestra los promedios de las areas relativas de ocho o mas celulas individuales obtenidas a partir de tres clones celulares. Las areas se calcularon usando el software NIH Image.

Las figuras 2 son vistas que muestran un cambia morfolOgico de diversos tipos de celulas cancerosas inducido par

10 una expresi6n constitutiva de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). La figura 2(a) es una vista que muestra diversos tipos de celulas cancerosas (ZR-75, HT-1080, MKN28, SKBr3 y TE10, par ejemplo), en las que la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) marcada can GFP se expres6 de forma transitoria. Las celulas se analizaron morfolOgicamente usando un microscopio confocal de 48 a 72 horas despues de la transfecci6n. Los panales superiores son imagenes luminosas transmitidas; y los paneles inferiores son imagenes fluorescentes. Las flechas indican celulas que

15 expresan la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) marcada can GFP. Las barras de escala son de 10 pm de largo. La figura 2(b) es una vista que muestra los promedios de las areas relativas de mas de nueve celulas individuales. Las areas se calcularon usando el software NIH Image.

Las figuras 3 son vistas que muestran una supresi6n de la adhesi6n celular a un sustrato inducida par una expresi6n

20 estable de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). El nOrnero media de clones celulares TYK transducidos can la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) se representa par (.). El nOrnero media de clones celulares transducidos can un vector de control se representa par (o). En la figura 3(a), las celulas TYK transducidas can la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) y las celulas TYK transducidas can el vector de control se analizaron can respecto a la adhesi6n celular a un sustrato usando un ensayo de uniOn celular. En la figura 3(b), las celulas TYK transducidas can la isoforma VVT1

25 17AA( — )/KTS( — ) y las celulas TYK transducidas can un vector de control se analizaron can respecto a la resistencia de la adhesi6n celular a un sustrato usando un ensayo de desprendimiento celular.

Las figuras 4 son vistas que muestran una mejora del desplazamiento celular inducida par una expresi6n constitutiva de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). En la figura 4(a), los desplazamientos de las celulas TYK individuales que 30 expresaban la isoforma GFP-VVT1 17AA( — )/KTS( —) y las celulas TYK individuales que no expresaban la isoforma GFP-VVT1 17AA( — )KTS( —) durante se grabaron durante 5 horas a intervalos de 2 minutos usando un grabador de video can lapso de tiempo. Se calcul6 la velocidad de los desplazamientos de las celulas. La velocidad media de las celulas que expresaban la isoforma GFP-VVT1 17AA( — )/KTS( —) se representa par (.). La velocidad media de las celulas que no expresan la isoforma GFP-VVT1 17AA( — )KTS( —) se representa par (o). El experimento se realizO 35 diez veces par separado. En la figura 4(b), las celulas TYK (.) transducidas can un vector de expresi6n de la isoforma VVT1 171AA( — )/KTS( — ) y las celulas TYK (o) transducidas can un vector de control se analizaron can respecto a la migraci6n colectiva usando un ensayo de curaci6n de herida. Cada clan celular se aplic6 tres veces par separado al experimento. Se descubri6 la migraci6n celulas coma una relaciOn promedio (porcentaje) de longitud de una protrusi6n can respecto a la anchura del desprendimiento celular realizan en primer lugar mediante un chip en

40 tres sitios diferentes. Las barras de escala son de 50 pm de largo. En la figura 4(c), las celulas TYK (.) transducidas can un vector de expresi6n de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ) y las celulas TYK (o) transducidas can un vector de control se analizaron can respecto a la quimiotaxis hacia media de Eagle modificado par Dulbecco que incluye FBS al 5 % usando un ensayo de migraci6n Transwell. Cada clan celular se aplic6 tres veces par separado. Las celulas que se desplazaron de una camara superior a una camara inferior se tifieron can MayGrunwald-Giemsa, y se

45 cont6 el nOrnero de las mismas. Las barras de escala son de 50 pm de largo.

Las figuras 5 son vistas que muestran un cambia de expresiones de la actina filamentosa (actina F) y las proteinas de uni6n a actina (ABP) inducido par una expresi6n constitutiva de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). La figura 5(a) muestra los resultados de la tinci6n inmunohistoquimica para la actina F, la vinculina (proteina de adhesi6n 50 focal) y los nOcleos en una celula TYK transducida can la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ) y una celula TYK transducida can un vector de control. Las barras de escala son de 10 pm de largo. En la figura 5(b), el lisado (hileras 1 y 2) de las celulas individuales transducidas can un vector de control y el lisado (hileras 3 y 4) de las celulas individuales transducidas can la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ) se sometieron a inmunotransferencia can anticuerpos especificos de actina total, actina F, a-tubulina y GAPH, respectivamente. Las barras de escala son de 55 10 pm de largo. En la figura 5(c), las expresiones del ARNm en clones celulares TYK aislados individualmente (n = 3, hileras 1 a 3) transducidos can un vector de control y en clones celulares TYK aislados individualmente (n = 3, hileras 4 a 6) transducidos can la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ) se analizaron par RT-PCR en una condici6n descrita en la Tabla 1. Las barras de escala son de 10 pm de largo. En la figura 5(d), los clones celulares TYK (hileras 1 y 2) transducidos can un vector de control y los clones celulares TYK (hileras 3 y 4) transducidos can la

isoforma VVT1 171AA( — )/KTS( —) se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos especificos de a-actinina 1, cofilina y gelsolina, respectivamente. En la figura 5(e), se realizO la tinci6n inmunohistoquimica para a-actinina 1, cofilina y gelsolina en celulas TYK transducidas con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) o con un vector de control. Al mismo tiempo, los nOcleos celulares se tifieron con yoduro de propidio. Las barras de escala son de 10 pm de 5 largo. En la figura 5(f), los clones celulares HT-1080 transducidos con un vector de control o con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ), se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos especificos de a-actinina 1, cofilina y gelsolina, respectivamente. En la figura 5(g), los clones celulares TE10 transducidos con un vector de control o con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ), se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos especificos de a-actinina

1, cofilina y gelsolina, respectivamente. 10 Las figuras 6 son vistas que muestran que un fenotipo de una celula TYK en la que se inducen expresiones estables

de a-actinina y cofilina mediante la transducci6n de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ), se restaura en un fenotipo que es su celula TYK precursora. Un vector de expresi6n de a-actinina y un vector de expresi6n de cofilina (TW/ACTN-CFL) o un vector de control se cotransfectaron en celulas TYK transducidas con la isoforma VVT1 17AA( 15 — )/KTS( — ). La figura 6(a) muestra los niveles de expresi6n de la a-actinina y la cofilina, que se determinaron por transferencia Western. La figura 6(b) muestra las celulas teriidas con May Grunwald-Giemsa. La figura 6(c) muestra areas celulares calculadas por el software NIH Image (1: clon celular TW/Mock; 2 y 3: clones celulares TW/ACTNCFL diferentes, respectivamente). Las barras de escala son de 10 pm de largo. Los resultados de las celulas TW/ACTN-CFL se representan por (.); y el resultado de las celulas TW/Mock se representa por (o). La figura 6(d) 20 muestra una adhesi6n celular a un sustrato determinada por un ensayo de desprendimiento. El resultado de las celulas TW/ACTN-CFL se representa por (.); y el resultado de las celulas TW/Mock se representa por (o). La figura 6(e) muestra una migraci6n celular colectiva analizada mediante un ensayo de curaci6n de herida. La migraci6n celular se representa como un promedio de la relaciOn (porcentaje) de la longitud de la protrusi6n con respecto a la anchura del primer desprendimiento de celulas en tres sitios diferentes. El resultado de las celulas TW/ACTN-CFL se

25 representa por (.); y el resultado de las celulas TW/Mock se representa por (o). La figura 6(f) muestra un nivel de expresi6n de gelsolina, que se determin6 por transferencia Western.

Las figuras 7 son vistas que muestran que una supresi6n de la expresi6n de gelsolina redujo una migraci6n celular, sin embargo, no afect6 a la morfologia celular ni a una adhesi6n celular a un sustrato. Un vector de ARNsi especifico 30 de gelsolina (TW/GSNsiRNA) o un vector de control (TW/siMock) se transdujo en las celulas TYK transducidas con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). La figura 7(a) muestra un nivel de expresi6n de la proteina gelsolina, que se determin6 por transferencia Western. Se aplicaron tres clones celulares diferentes al experimento. La figura 7(b) muestra las celulas teriidas con May Grunwald-Giemsa. Las barras de escala son de 10 pm de largo. La figura 7(c) muestra las areas de los clones celulares TW/Mock y los clones celulares TW/GSNsiRNA, que se calcularon 35 mediante el software NIH Image. El resultado de los clones celulares transducidos con el vector de ARNsi especifico de gelsolina se representa por (.); y el resultado de los clones celulares transducidos con el vector de ARNsi Mock se representa por (o). La figura 7(d) muestra una adhesi6n celular a un sustrato determinada por un ensayo de desprendimiento. El resultado de los clones celulares transducidos con el vector de ARNsi especifico de gelsolina se representa por (.); y el resultado de los clones celulares transducidos con el vector de ARNsi Mock se representa

40 por (o). La figura 7(e) muestra un desplazamiento celular colectivo analizado por un ensayo de curaci6n de herida. El resultado de los clones celulares transducidos con el vector de ARNsi especifico de gelsolina se representa por (.); y el resultado de los clones celulares transducidos con el vector de ARNsi Mock se representa por (o). La figura 7(f)

muestra los niveles de expresi6n de la a-actinina 1 y la cofilina, que se determinaron por transferencia Western.

45 La figura 8 es una vista que muestra una posibilidad de que la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ) funcione controlando la dinamica citoesqueletica. Una expresi6n constitutiva de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) realiza una regulaciOn por disminuci6n de tanto la expresi6n de a-actinina 1 como de la expresi6n de cofilina, y una regulaciOn por aumento de una expresiOn de gelsolina. Adernas, la a-actinina 1/cofilina y la gelsolina se regulan entre sí en la serializaciOn en la direcciOn 3 de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). Es decir, las funciones de la

50 isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) (por ejemplo, inducci6n de un cambio morfolOgico en la celula, debilitamiento de la adhesi6n celular a un sustrato, mejora del desplazamiento celular) se realizan completa o parcialmente a traves de regulaciones de la a-actinina 1/cofilina y la gelsolina.

[Ejemplo 1: InducciOn del cambio morfolOgico en diversos tipos de celulas cancerosas por la expresi6n constitutiva 55 de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — )]

Con el fin de examinar c6mo afecta un gen VVT1 a las acciones de una celula cancerosa uno cualquiera de cuatro genes VVT1 se expres6 de forma estable en celulas TYK de cancer de ovario. Despues, se aislaron los clones

celulares TYK en los que se expres6 altamente la isoforma VVT1 transducida (figura 1(a)). En la celula TYK, una expresi6n estable de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ) indujo un cambio morfolOgico caracterizado par una morfologia celular que tenia un pequerio tamario y una forma similar a un fibroblasto (Figuras 1(b) y 1(c)). Par el contrario, las expresiones estables de las isoformas VVT1 distintas de la isoforma 17AA( — )/KTS( — ) no indujeron

5 ningOn cambia morfolOgico en la celula TYK.

Adernas, can el fin examinar si la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ) inducia un cambia morfolOgico en diversas celulas cancerosas distintas de la celula TYK, la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) marcada can GFP se expres6 de forma transitoria en las celulas MKN28, las celulas ZR-75, las celulas SKBr3, las celulas TE10, las celulas 10 MiaPaCa2, las celulas SW480, las celulas HelaAG y las celulas HT-1080 (figura 2). Los resultados de la microscopia confocal indicaron que la expresi6n transitoria de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) marcada can GFP indujo un cambia morfolOgico en las celulas MKN28, las celulas ZR-75, las celulas SKBr3, las celulas TE10 y las celulas HT1080 en cuanto al tamario celular (que es mas pequerio) y la forma tridimensional de las celulas. Par otro lado, una expresi6n de un vector de control de GFP no indujo ningOn cambia morfolOgico en estas lineas celulares. Las tres

15 lineas celulares restantes (celula MiaPaCa2, celula SW480 y celula HelaAG) no mostraron claramente ningOn cambia morfolOgico (no se muestran los datos).

Can el fin de verificar que Onicamente la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) puede inducir el cambia morfolOgico en la celula cancerosa, una cualquiera de las otras tres isoformas VVT1 marcadas can GFP se expres6 de forma transitoria

20 en las celulas HT-1080 y en las celulas TE10, cuyos cambios morfolOgicos se indujeron par la isoforma VVT1 17AA(

— )/KTS( — ). Los resultados de la microscopia confocal indicaron que cualquiera de las tres isoformas VVT1 marcadas can GFP no indujo ningOn cambia morfolOgico en las dos lineas celulares (no se muestran los datos).

[Ejemplo 2: SupresiOn de la adhesiOn celular a un sustrato mediante la expresiOn constitutiva de la isoforma VVT1 25 17AA( — )/KTS( — )]

Can el fin de examinar si un cambia morfolOgico observado en una celula transducida can la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ) se atribuy6 a un cambia en la capacidad de extensi6n de la celula, se analizaron los efectos de una expresi6n constitutiva de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) sabre la adhesi6n celular a un sustrato can respecto a 30 las celulas TYK. Los resultados de un ensayo de uni6n celular indicaron que, en los clones celulares (n = 4) transducidos can la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ), la adhesi6n de las celulas a un sustrato se debilitO significativamente en comparaci6n can los clones celulares (n = 4) transducidos can un vector Mock (figura 3(a)). Adernas, los resultados de un ensayo de desprendimiento celular indicaron que, en los clones celulares (n = 5) transducidos can la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ), la resistencia de la adhesi6n celular a un sustrato se redujo 35 significativamente en comparaci6n can los clones celulares (n = 5) transducidos can el vector Mock (figura 3(b)). En el ensayo de desprendimiento celular, el 53,3 % de las celulas transducidas can la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) se desprendi6 de un sustrato de plastico dos minutos despues de un tratamiento con tripsina. Par otro lado, sOlo el 9,8 % de las celulas transducidas con el vector de control se desprendi6 del sustrato. Es decir, la resistencia de la adhesi6n celular a un sustrato se redujo en la celula transducida con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ), en

40 comparaci6n con la celula transducida con el vector de control.

[Ejemplo 3: Mejora en el desplazamiento celular mediante la expresi6n constitutiva de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — )]

45 Con el fin de examinar c6mo afecta una expresi6n constitutiva de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) a la migraci6n celular, se analizaron las celulas transducidas con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ) con respecto a la migraci6n individual, la migraci6n colectiva y una invasiOn in vitro.

Los desplazamientos de una celula TYK individual transducida con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) se evaluaron

50 usando un microscopio con lapso de tiempo (figura 4(a)). Las migraciones de la celula TYK individual se registraron en intervalos de 2 minutos durante 5 horas con (n = 19) o sin (n = 19) una expresi6n transitoria de la isoforma GFPVVT1 17AA( — )/KTS( —) en la celula. Despues, los desplazamientos celulares se trazaron a fin de que se calculara la velocidad del desplazamiento celular. Los resultados del experimento que se realizO 10 veces par separado indicaron que la velocidad del desplazamiento aleatorio de las celulas TYK que expresaban la isoforma GFP-VVT1

55 17AA( — )/KTS( —) aument6 1,8 veces en comparaci6n con las celulas que no expresaban la isoforma GFP-VVT1 17AA( — )/KTS( — ). Mientras tanto, las migraciones de la celula TYK individual que expresaba un vector GFP-mock no se diferenciaron significativamente de las de las celulas que no expresaban el vector GFP-mock (no se muestran los datos).

Con el fin de aclarar adicionalmente la mejora de la capacidad de desplazamiento de las celulas transducidas con la isoforma GFP-VVT1 17AA( — )/KTS( — ), se analizO una migraci6n celular colectiva usando un ensayo de curaci6n de herida (figura 4(b)). Se descubri6 que la distancia que se movieron los clones celulares (n = 4) transducidos con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) durante 12 horas despues de la herida aument6 1,8 veces en comparaci6n con las

5 celulas (n = 5) transducidas con un vector Mock.

Adernas, la invasiOn in vitro de los clones celulares transducidos con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) se analizO usando un ensayo de migraci6n Transwell (figura 4(c)). El nOrnero de celulas que entran en una membrana para invadirla se cont6 18 horas despues de poner en placas las celulas en una camara superior. Se descubri6 que la

10 quimiotaxis de los clones celulares (n = 4) transducidos con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) hacia FBS mejor6 8 veces en comparaci6n con la de las celulas (n = 5) transducidas con el vector Mock.

[Ejemplo 4: Cambio en la expresi6n de actina filamentosa y la proteina de uni6n a actina mediante la expresi6n constitutiva de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — )]

15 En una celula TYK, una expresi6n constitutiva de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) indujo un cambio morfolOgico en la celula, debilitO una adhesi6n celular a un sustrato y tambien mejor6 un desplazamiento celular. Ya que estos resultados sugieren un cambio en la estructura citoesqueletica, se realizO un analisis de los mismos en base a la inmunocitoquimica. Como se esperaba, en las celulas TYK se redujo una red de la actina filamentosa (actina F) y,

20 adernas, se redujo el desmosoma (figura 5(a)). Se indic6 mediante transferencia Western que el nivel de expresi6n de actina F disminuy6 en celulas transducidas con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ) en comparaci6n con las celulas transducidas con un vector Mock. For otro lado, los niveles de expresi6n totales de actina y a-tubulina no se diferenciaron entre las celulas transducidas con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) y las celulas transducidas con el vector Mock (figura 5(b)). En respuesta a estos resultados, las expresiones del ARNm que codificaban cada una de

25 las once proteinas de uni6n a actina (incluyendo a-actinina 1, cofilina, gelsolina, FAK, profilina, VASP, talina, ezrina, moesina y radixina) en las celulas transducidas con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) se analizaron usando RTFOR. Como se muestra en la figura 5(c), en las celulas transducidas con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ), se suprimieron las expresiones de la a-actinina 1 y la cofilina, y aument6 una expresi6n de gelsolina. Las expresiones reducidas de a-actinina 1 y cofilina, adernas del aumento de la expresi6n de gelsolina se confirmaron en el nivel de

30 proteinas mediante transferencia Western (figura 5(d)). Se indic6 por inmunohistoquimica que, en el citoplasma de las celulas transducidas con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ),se suprimieron las expresiones de la proteina aactinina 1 y la proteina cofilina, y aumentO una expresi6n de gelsolina (figura 5 (e)). Las expresiones de ARNm que codificaba las ocho proteinas de uni6n a actina restantes no se diferenciaban entre las celulas transducidas con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) y las celulas transducidas con el vector Mock (no se muestran los datos). 35

Adernas, con el fin de confirmar que la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) regula las expresiones de gelsolina, aactinina 1 y cofilina, la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) se expres6 de forma estable en una celula HT-1080 y una celula TE10. Como resultado de la transferencia Western, se indic6 que, aunque las expresiones de a-actinina 1 y cofilina disminuyeron, las expresiones de gelsolina aumentaron en la celula transducida con la isoforma VVT1 17AA(

40 — )/KTS( —) en comparaci6n con una celula transducida con un vector pcDNA 3.1/Zeo( + )de control (figuras 5(f) y 5(g)).

[Ejemplo 5: Restauraci6n del fenotipo de las celulas transducidas con la isoforma WT-1 17AA( — )/KTS( —) mediante expresiones constitutivas de tanto a-actinina 1 como cofilina, o mediante la supresi6n de gelsolina con ARNsi

45 especifico de gelsolina]

Con el fin de determinar si una disminuci6n de las expresiones de a-actinina 1 y cofilina provoca, en una celula TYK transducida con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ), un cambio morfolOgico, una reducci6n del desmosoma, y una mejora en la migraci6n celular, un vector a-actinina 1/pcDNA3.1/Zeo( + ) y un vector cofilina/pcDNA3.1/Z( + ) se co50 transdujeron en las celulas TYK transducidas con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). Despues, se aislaron los clones celulares (celula TW/ACTN-CFL) en los que la a-actinina 1 y la cofilina se expresaron en la misma medida que en una celula TYK precursora (figura 6(a)). Las caracteristicas de las celulas TW/ACTN-CFL se compararon con las de las celulas TYK (TW/Mock) transducidas con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ) y con un vector pcDNA3.1/Zeo( + ) de control. Como resultado, las celulas TW/ACTN-CFL mostraron cambios morfolOgicos con 55 respecto a la forma celular muy extendida similar a la celula TYK precursora. For otro lado, las celulas TW/Mock no cambiaron de forma (figuras 6(b) y 6(c)). Se demostr6 mediante un ensayo de desprendimiento celular que el nOrnero de celulas desprendidas en los clones celulares TW/ACTN-CFL (n = 3) dos minutos despues de un tratamiento con tripsina disminuy6 en comparaci6n con el nOrnero de las mismas en las celulas TW/Mock (n = 3)

para ser similar al nOrnero de las mismas en las celulas TYK precursoras (figura 6(d)). Adernas, se demostr6 mediante un ensayo de curaci6n de herida que el desplazamiento celular de los clones celulares TW/ACTN-CFL (n = 3) se redujo en comparaci6n con el de los clones celulares TW/Mock (n = 3) para ser similar al de las celulas TYK precursoras (figura 6(e)). For el contrario, las celulas TYK transducidas con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ), en

5 la que una de la cofilina y la a-actinina 1 se expres6 de forma constitutiva, no presentaban las mismas caracteristicas que las celulas TYK precursoras (no se muestran los datos). Esto demuestra que la a-actinina 1 y la cofilina act0an en corporaci6n en la regulaciOn de la forma y la acci6n de las celulas TYK.

Con el fin de determinar si un aumento en el nivel de expresi6n de gelsolina afecta al cambio morfolOgico, el

10 debilitamiento de la adhesi6n celular a un sustrato, y la mejora del desplazamiento celular en las celulas TYK transducidas con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ), un vector de ARNsi especifico de gelsolina o un vector Mock se transdujo en las celulas TYK transducidas con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ). Despues, se aislaron los clones celulares en los que se expres6 gelsolina en una misma medida que en las celulas TYK precursoras (TW/GSNsiRNA) (n = 3) (figura 7(a)). Las celulas TYK transducidas con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( —) en las

15 que se suprimi6 una expresi6n de gelsolina por el vector de ARNsi especifico de gelsolina no indujeron ning0n cam bio morfolOgico en las celulas TYK transducidas con la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ) y con un vector de ARNsi Mock (TW/siMock) (n = 3) (figuras 7(b) y 7(c)). Los resultados de un ensayo de desprendimiento indicaron que las celulas TW/GSNsiRNA no se diferenciaban en la resistencia de una adhesi6n celular a un sustrato de las celulas TW/siMock (figura 7(d)). Mientras tanto, los resultados de un ensayo de curaci6n de herida indicaron que se

20 redujeron los desplazamientos celulares de las celulas TW/GSNsiRNA en comparaci6n con los de las celulas TW/siMock, y disminuyeron extremadamente acompanados por la expresi6n suprimida de gelsolina para ser similares a una migraci6n celular de las celulas TYK precursoras (figura 7(e)).

Ademas, con el fin de determinar cam° se correlacionan las expresiones de actinina/cofilina a las de gelsolina, se

25 determinaron los niveles de expresi6n de la proteina gelsolina en celulas TW/ACTN-CFL y celulas TI/V/Mock. Como resultado, las expresiones constitutivas de a-actinina 1 y cofilina suprimieron la expresi6n de gelsolina (figura 6(f)). For el contrario, una expresi6n suprimida de la gelsolina provoc6 un aumento en las expresiones de a-actinina 1 y cofilina (figura 7(f)).

30 En resumen, una expresi6n constitutiva de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ) realiza una regulaciOn por disminuci6n de tanto la expresi6n de a-actinina 1 como de cofilina, y una por aumento de una expresi6n de gelsolina. Adernas, la expresi6n de a-actinina 1/cofilina y la expresi6n de gelsolina se regulan entre sí en la sefializaciOn en la direcci6n 3 de la isoforma VVT1 171AA( — )/KTS( — ). Es decir, las funciones de la isoforma VVT1

17AA( — )/KTS( —) (por ejemplo, la inducci6n de un cambio morfolOgico en la celula, el debilitamiento de la adhesi6n 35 celular a un sustrato, la mejora de la migraci6n celular) se realizan completa o parcialmente a traves de las regulaciones de la a-actinina 1/cofilina y la gelsolina.

En base a los resultados anteriores, se descubri6 que la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ) cumple una funci6n de oncogen en una celula formadora de un tumor sOlido.

40 [Ejemplo 6: InducciOn de la apoptosis en un tumor sOlido mediante la supresi6n de la expresi6n de la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — )]

Se construy6 un vector de ARNsi que suprime especificamente una expresi6n de la isoforma VVT1 171AA( — ).

45 Concretamente, como se muestra en la figura 9, el ARNsi se construy6 para dirigirse a una secuencia 5'AGCCACCTTAAAGGGCCACAG-CACAGGGTA-3' (SEQ ID NO: 26) en la isoforma VVT1 17AA( —) a fin de que una regi6n formada por el splicing de una regi6n 17AA externa se convierta en una secuencia diana. Se sintetiz6 dicho oligo-ADN cuyos sitios de restricci6n se anadieron a ambos extremos de un oligonucleOtido (SEQ ID NO: 27) compuesto por una hebra codificante (5'-agccaccuuaaagggccgcgguauagggua (una secuencia en la que una hebra

50 codificante de la secuencia diana muta en una parte subrayada) -cttcctgtca (una secuencia bucle de pre-miR-23 humano) -uacccugugcuguggcccuuuaagguggcu (una hebra no codificante de la secuencia diana)), y un oligo-ADN que es complementario al oligo-ADN anterior (Japan Bio Service). Despues de una hibridaci6n, estos oligo-ADN se insertan en un sitio en la direcci6n 3' de un promotor ARNeal en el vector piGENEtRNA Fur (Clonetech), obteniendo de este modo un vector de ARNsi de WRI-17AA( —) que transcribe ARNdh que incluye la secuencia de bucle.

55 Las lineas celulares que expresan VVT1 (las celulas de fibrosarcoma HT-1080, las celulas de cancer de est6mago AZ-521 y las celulas de glioma A172) y una linea celular que no expresa VVT1 (las celulas de cancer de pulmOn PC14) se incubaron en presencia de CO2 al 5 % a 37 °C en un medio DMEM que incluia FBS al 10 %.

Un vector de expresi6n de ARNsi de VVT1 o un vector Mock (2 jig) se transdujo, mediante un procedimiento de lipofecciOn usando FuGENE6 (Roche), en las celulas (con una cantidad de 2 x 105 celulas) que se colocaron en placas en una placa de 6 pocillos, y despues se incubaron durante un dia. Las celulas se trataron con tripsina tres dias despues de la transducci6n. Se cont6 el nOrnero de celulas, y despues las celulas se sometieron a un analisis

5 de citometria de flujo.

Despues lavarse con PBS, las celulas con una cantidad de 1,0 x 105 se tifieron mediante la reacciOn con Annexin VFITC y PI a la temperatura ambiente durante 15 minutos con el uso de un kit de apoptosis MEBCYTO (Medical and Biological Laboratories CO., Ltd, Nagoya, Jap6n). Las celulas se analizaron usando un analisis de citometria de flujo

10 FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). Una celula Annexin V-FITC positivo/PI negativo se consider6 como una celula apoptOtica.

En las celulas que expresan VVT1 (la celula HT-1080, la celula AZ-521 y la celula A172), se indujo la apoptosis debido a la transducci6n de un vector WRI-17AA( — ) especifico de la isoforma VVT1 17AA( — ). Por otro lado, la 15 apoptosis no se indujo en la linea celular PC-14 que no expresaba VVT1, aunque se transdujo el WRI-17AA( — ) (figura 10).

[Ejemplo 7: Supresi6n de la formaci6n de un tumor sOlido in vivo mediante la supresi6n de la isoforma VVT1 17AA( — )1

20 La figura 11 muestra los tamarios de los tumores, formados por celulas HT-1080 inyectadas, en dos fuera de un grupo de ratones administrados con VVT1-ARNhp (WRI) dirigido a la isoforma VVT1 17AA( —) y en dos fuera de un grupo de ratones administrados con un vector de ARNhp de control (mock). Como se muestra en la figura 11, se suprimi6 in vivo un crecimiento tumoral mediante la supresiOn de una expresiOn de la isoforma VVT1 171AA( — ). Ha de

25 observarse que el tamario promedio en cada grupo se muestra en la figura 11.

Como se ha descrito anteriormente, mediante la aplicaciOn del ARNsi que suprime especificamente una expresi6n de la isoforma VVT1 17AA( —) con respecto a una celula de tumor sOlido en la que la isoforma VVT1 17AA( — )/KTS( — ) cumple una funci6n como oncogen, puede inducirse una muerte celular que tiene lugar especificamente en la

30 celula tumoral. Es decir, puede lograrse una funci6n anticancerosa.

Mediante el uso de la presente invenciOn, es posible inducir la apoptosis especificamente en una celula formadora de un tumor sOlido. Por lo tanto, es posible tratar el tumor sOlido.

35 Las realizaciones o ejemplos especificos puestos en practica en la secci6n MEJOR MODO DE REALIZAR LA INVECCION Y EJEMPLO, Onicamente muestran caracteristicas tecnicas de la presente invenciOn y no pretenden limitar el alcance de la invenciOn. Pueden realizarse variaciones dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

40 APLICABILIDAD INDUSTRIAL

Ya que un gen VVT1 se expresa altamente de forma especifica en una celula cancerosa, la muerte celular inducida por la supresi6n de una expresi6n de la isoforma VVT1 17AA( — ) esta provocada especificamente en la celula cancerosa, pero no en una celula normal. Por lo tanto, la presente invenciOn es bastante Otil en los campos de

45 medicina y farmacia como una tecnologia fundamental para el desarrollo de una terapia objetiva molecular especifica para las celulas cancerosas.

LISTA DE SECUENCIAS

50 < 110 > INTERNATIONAL INSTITUTE OF CANCER IMMUNOLOGY, INC.

< 120 > ARNsi especifico de la isoforma VVT1 17AA( — ) y uso del mismo

< 130 > G20060108 55

<

140 > PCT/JP2007/056667

<

141 > 2007-03-28

<

150 > JP2006-092214

<151 >2006-03-29

<160 > 39

5 < 170 > PatentIn Ver. 2.1

< 210 > 1 <211 >21

<212 > ADN 10 <213 > Secuencia Artificial

<

220 >

<

223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ADN Sintetizada Artificialmente

15 < 400 > 1 ctttccagcc atatcgccaa c 21

<210>2

<211 >19 20 < 212 > ADN

<213 > Secuencia Artificial

< 220 >

<

223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ADN Sintetizada Artificialmente 25

<400 > 2 ttctctgcct cgctggctc 19

<

210 > 3 30 < 211 > 18

<212 > ADN

<213 > Secuencia Artificial

<

220 > 35 < 223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ADN Sintetizada Artificialmente

<400 > 3 ggccagaaat gttcggtg 18

40 < 210 > 4 <211 >18

<212 > ADN

<213 > Secuencia Artificial

45 < 220 >

< 223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ADN Sintetizada Artificialmente

<400 > 4

acgggaggga tatgggta 18 50

<210 > 5 <211 >22

<212 > ADN

<213 > Secuencia Artificial 55

<

220 >

<

223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ADN Sintetizada Artificialmente

<400 > 5

gactcacctg ggtactggta tg 22

<210>6 <211 >22 5 < 212 > ADN

<213 > Secuencia Artificial

< 220 >

< 223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ADN Sintetizada Artificialmente 10

<400 > 6 atcgctcttc acctgttgat ag 22

<210>7 15 < 211 > 19

<212 > ADN

<213 > Secuencia Artificial

< 220 > 20 < 223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ADN Sintetizada Artificialmente

<400 > 7 cagtcgccaa aggagtctg 19

25 < 210 > 8 <211 >21

<212 > ADN

<213 > Secuencia Artificial

30 < 220 >

< 223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ADN Sintetizada Artificialmente

<400 > 8

gtagtccttg cgacagtagg c 21 35

<210 > 9 <211 >18

<212 > ADN

<213 > Secuencia Artificial 40

<

220 >

<

223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ADN Sintetizada Artificialmente

<400 > 9 45 ggagccgaag aaatcgtg 18

< 210 > 10 <211 >19

<212 > ADN 50 <213 > Secuencia Artificial

<

220 >

<

223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ADN Sintetizada Artificialmente

55 < 400 > 10 ctgctcgttc tcctggttg 19

< 210 > 11 <211 >18

<212 > ADN

<213 > Secuencia Artificial

< 220 > 5 < 223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ADN Sintetizada Artificialmente

< 400 > 11 ggaaagtcag caagcagg 18

10 < 210 > 12 <211 >18

<212 > ADN

<213 > Secuencia Artificial

15 < 220 >

<

223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ADN Sintetizada Artificialmente

<

400 > 12

tgtgcggaaa ggagaagc 18 20

< 210 > 13 <211 >22

<212 > ADN

<213 > Secuencia Artificial 25

<

220 >

<

223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ADN Sintetizada Artificialmente

< 400 > 13 30 tggctacctg gaactgctgg ac 22

< 210 > 14 <211 >23

<212 > ADN 35 <213 > Secuencia Artificial

<

220 >

<

223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ADN Sintetizada Artificialmente

40 < 400 > 14 tccagctctc gttccttccg aag 23

< 210 > 15

<211 >23 45 < 212 > ADN

<213 > Secuencia Artificial

< 220 >

<

223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ADN Sintetizada Artificialmente 50

< 400 > 15 agtcttcaac gccagaggag gtg 23

<

210 > 16 55 < 211 > 22

<212 > ADN

<213 > Secuencia Artificial

< 220 >

<

223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ADN Sintetizada Artificialmente

<

400 > 16

gtgcagcggt ccttgacctc ct 22 5

< 210 > 17 <211 >22

<212 > ADN

<213 > Secuencia Artificial 10

<

220 >

<

223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ADN Sintetizada Artificialmente

< 400 > 17 15 aggagttgat gctgcggctg ca 22

< 210 > 18 <211 >22

<212 > ADN 20 <213 > Secuencia Artificial

<

220 >

<

223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ADN Sintetizada Artificialmente

25 < 400 > 18 gtggatgatg tcattgtggg tc 22

< 210 > 19

<211 >23 30 < 212 > ADN

<213 > Secuencia Artificial

< 220 >

< 223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ADN Sintetizada Artificialmente 35

< 400 > 19 accaccagtc attcctccaa cag 23

<210>20 40 < 211 > 23

<212 > ADN

<213 > Secuencia Artificial

< 220 > 45 < 223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ADN Sintetizada Artificialmente

<400 > 20 ggcaaggtgg gatgcattcc atc 23

50 < 210 > 21 <211 >22

<212 > ADN

<213 > Secuencia Artificial

55 < 220 >

< 223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ADN Sintetizada Artificialmente

<400 > 21 tggtgccttc aagaccttca cc 22

26

<210>22 <211 >24

<212 > ADN 5 <213 > Secuencia Artificial

<

220 >

<

223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ADN Sintetizada Artificialmente

10 < 400 > 22 gtcacctgag agggttgagt aaac 24

<210>23 <211 >20 15 < 212 >ADN

<213 > Secuencia Artificial

< 220 >

<

223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ADN Sintetizada Artificialmente 20

<400 > 23 gccaaaaggg tcatcatctc 20

<

210 > 24 25 < 211 > 21

<212 > ADN

<213 > Secuencia Artificial

<

220 > 30 < 223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ADN Sintetizada Artificialmente

<400 > 24 gtagaggcag ggatgatgtt c 21

35 < 210 > 25 <211 >29

<212 > ARN

<213 > Secuencia Artificial

40 < 220 >

< 223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ARN Sintetizada Artificialmente

<400 > 25 uccaggauga agcagucgcc auuguugaa 29

45 <210>26 <211 >30

<212 > ADN

<213 > Secuencia Artificial 50

<

220 >

<

223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ADN Sintetizada Artificialmente

<400 > 26 55 agccacctta aagggccaca gcacagggta 30

<210>27 <211 >10

<212 > ADN

<213 > Secuencia Artificial

< 220 >

<

223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ADN Sintetizada Artificialmente 5

<400 > 27 aagggccaca 10

<

210 > 28 10 < 211 > 70

<212 > ARN

<213 > Secuencia Artificial

<

220 > 15 < 223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ARN Sintetizada Artificialmente

<400 > 28

agccaccuua aagggccgcg guauagggua cttcctgtca uacccugugc uguggcccuu 60 uaagguggcu 70

20 < 210 > 29 <211 >30

<212 > ARN

<213 > Secuencia Artificial

25 < 220 >

< 223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ARN Sintetizada Artificialmente

<400 > 29

agccaccuua aagggccgcg guauagggua 30 30

< 210 > 30 <211 >30

<212 > ARN

<213 > Secuencia Artificial 35

<

220 >

<

223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ARN Sintetizada Artificialmente

<400 > 30 40 uacccugugc uguggcccuu uaagguggcu 30

< 210 > 31 <211 >10

<212 > ARN 45 <213 > Secuencia Artificial

<

220 >

<

223 > Descripci6n de la Secuencia Artificial: Secuencia de ARN Sintetizada Artificialmente

50 < 400 > 31 cttcctgtca 10

< 210 > 32

<211 >3029 55 < 212 > ADN

< 213 > humano

<400 > 32

ccaggcagct ggggtaagga gttcaaggca gcgcccacac ccgggggctc tccgcaaccc 60 gaccgcctgt ccgctccccc acttcccgcc ctccctccca cctactcatt cacccaccca 120 cccacccaga gccgggacgg cagcccaggc gcccgggccc cgccgtctcc tcgccgcgat 180 cctggacttc ctcttgctgc aggacccggc ttccacgtgt gtcccggagc cggcgtctca 240 gcacacgctc cgctccgggc ctgggtgcct acagcagcca gagcagcagg gagtccggga 300 cccgggcggc atctgggcca agttaggcgc cgccgaggcc agcgctgaac gtctccaggg 360

ccggaggagc cgcggggcgt cegggtotga gccgcagcaa atgggctccg acgtgcggga 420 cctgaacgcg ctgctgcccg ccgtcccctc cctgggtggc ggcggcggct gtgccctgcc 480 tgtgagcggc gcggcgcagt gggcgccggt gctggacttt gcgcccccgg gcgcttcggc 540 ttacgggtcg ttgggcggcc ccgcgccgcc accggctccg ccgccacccc cgccgccgcc 600 gcctcactcc ttcatcaaac aggagccgag ctggggcggc gcggagccgc acgaggagca 660 gtgcctgagc gccttcactg tccacttttc cggccagttc actggcacag ccggagcctg 720 tcgctacggg cccttcggtc ctcctccgcc cagccaggcg tcatccggcc aggccaggat 780 gtttcctaac gcgccctacc tgcccagctg cctcgagagc cagcccgcta ttcgcaatca 840 gggttacagc acggtcacct tcgacgggac gcccagctac ggtcacacgc cctcgcacca 900 tgcggcgcag ttccccaacc actcattcaa gcatgaggat cccatgggcc agcagggctc 960 gctgggtgag cagcagtact cggtgccgcc cccggtctat ggctgccaca cccccaccga 1020 cagctgcacc ggcagccagg ctttgctgct gaggacgccc tacagcagtg acaatttata 1080 ccaaatgaca tcccagcttg aatgcatgac ctggaatcag atgaacttag gagccacctt 1140 aaagggagtt gctgctggga gctccagctc agtgaaatgg acagaagggc agagcaacca 1200 cagcacaggg tacgagagcg ataaccacac aacgcccatc ctctgcggag cccaatacag 1260 aatacacacg cacggtgtct tcagaggcat tcaggatgtg cgacgtgtgc ctggagtagc 1320 cccgactctt gtacggtcgg catctgagac cagtgagaaa cgccccttca tgtgtgctta 1380 cccaggctgc aataagagat attttaagct gtcccactta cagatgcaca gcaggaagca 1440 cactggtgag aaaccatacc agtgtgactt caaggactgt gaacgaaggt tttctcgttc 1500 agaccagctc aaaagacacc aaaggagaca tacaggtgtg aaaccattcc agtgtaaaac 1560 ttgtcagcga aagttctccc ggtccgacca cctgaagacc cacaccagga ctcatacagg 1620 taaaacaagt gaaaagccct tcagctgtcg gtggccaagt tgtcagaaaa agtttgcccg 1680 gtcagatgaa ttagtccgcc atcacaacat gcatcagaga aacatgacca aactccagct 1740 ggcgctttga ggggtctccc tcggggaccg ttcagtgtcc caggcagcac agtgtgtgaa 1800 ctgctttcaa gtctgactct ccactcctcc tcactaaaaa ggaaacttca gttgatcttc 1860 ttcatccaac ttccaagaca agataccggt gcttctggaa actaccaggt gtgcctggaa 1920 gagttggtct ctgccctgcc tacttttagt tgactcacag gccctggaga agcagctaac 1980 aatgtctggt tagttaaaag cccattgcca tttggtgtgg attttctact gtaagaagag 2040 ccatagctga tcatgtcccc ctgacccttc ccttcttttt ttatgctcgt tttcgctggg 2100 gatggaatta ttgtaccatt ttctatcatg gaatatttat aggccagggc atgtgtatgt 2160 gtctgctaat gtaaactttg tcatggtttc catttactaa cagcaacagc aagaaataaa 2220 tcagagagca aggcatcggg ggtgaatctt gtctaacatt cccgaggtca gccaggctgc 2280 taacctggaa agcaggatgt agttctgcca ggcaactttt aaagctcatg catttcaagc 2340 agctgaagaa aaaatcagaa ctaaccagta cctctgtata gaaatctaaa agaattttac 2400 cattcagtta attcaatgtg aacactggca cactgctctt aagaaactat gaagatctga 2460 gatttttttg tgtatgtttt tgactctttt gagtggtaat catatgtgtc tttatagatg 2520 tacatacctc cttgcacaaa tggaggggaa ttcattttca tcactgggag tgtcottagt 2580 gtataaaaac catgctggta tatggcttca agttgtaaaa atgaaagtga ctttaaaaga 2640 aaatagggga tggtccagga tctccactga taagactgtt tttaagtaac ttaaggacct 2700 ttgggtctac aagtatatgt gaaaaaaatg agacttactg ggtgaggaaa tccattgttt 2760 aaagatggtc gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgttgtgtt gtgttttgtt 2820 ttttaaggga gggaatttat tatttaccgt tgettgaaat tactgtgtaa atatatgtct 2880 gataatgatt tgctctttga caactaaaat taggactgta taagtactag atgcatcact 2940 gggtgttgat cttacaagat attgatgata acacttaaaa ttgtaacctg catttttcac 3000 tttgctctca attaaagtct attcaaaag 3029

< 210 > 33 <211 >449

< 212 > PRT 5 < 213 > humano

<400 > 33

Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro 1 5 10 15

Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala 20 25 30

Gin Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr 35 40 45

Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro 50 55 60

Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gin Glu Pro Ser Trp Gly Gly 65 70 75 80

Ala Glu Pro His Glu Glu Gin Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe 85 90 95

Ser Gly Gin Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe 100 105 110

Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gin Ala Ser Ser Gly Gin Ala Arg Met Phe 115 120 125

Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gin Pro Ala Ile 130 135 140

Arg Asn Gin Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr 145 150 155 160

Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe 165 170 175

Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gin Gly Ser Leu Gly Glu Gin Gin 180 185 190

Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser 195 200 205

Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp 210 215 220

Asn Leu Tyr Gin Met Thr Ser Gln Leu G u Cys Met Thr Trp Asn Gin 225 230 235 240

Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser 245 250 255

Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gin Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu 260 265 270

Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gin Tyr Arg Ile 275 280 285

His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gin Asp Val Arg Arg Val Pro 290 295 300

Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys 305 310 315 320

Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys 325 330 335

Leu Ser His Leu Gin Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro 340 345 350

Tyr Gin Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp 355 360 365

Gin Leu Lys Arg His Gin Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gin 370 375 380

Cys Lys Thr Cys Gin Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr 385 390 395 400

His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys 405 410 415

Arg Trp Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val 420 425 430

Arg His His Asn Met His Gin Arg Asn Met Thr Lys Leu Gin Leu Ala 435 440 445

Leu

< 210 > 34

<211 >3020 5 < 212 > ADN

< 213 > humano

<400 > 34

ccaggcagct ggggtaagga gttcaaggca gcgcccacac ccgggggctc tccgcaaccc 60 gaccgcctgt ccgctccecc acttcccgcc ctccctccca cctactcatt cacccaccca 120 cccacccaga gccgggacgg cagcccaggc gcccgggccc cgccgtctcc tcgccgcgat 180 cctggacttc ctcttgctgc aggacccggc ttccacgtgt gtcccggagc cggcgtctca 240 gcacacgctc cgctccgggc ctgggtgcct acagcagcca gagcagcagg gagtccggga 300 cccgggcggc atctgggcca agttaggcgc cgccgaggcc agcgctgaac gtctccaggg 360 ccggaggagc cgcggggcgt ccgggtctga gccgcagcaa atgggctccg acgtgcggga 420 cctgaacgcg ctgctgcccg ccgtccectc cctgggtggc ggcggcggct gtgccctgcc 480 tgtgagcggc geggcgcagt gggcgccggt gctggacttt gcgcccccgg gcgcttcggc 540 ttacgggtcg ttgggcggcc ccgcgccgcc accggctccg ccgccacccc cgccgccgcc 600 gcctcactcc ttcatcaaac aggagccgag ctggggcggc gcggagccgc acgaggagca 660 gtgcctgagc gccttcactg tccacttttc cggccagttc actggcacag ccggagcctg 720 tcgctacggg cccttcggtc ctcctccgcc cagccaggcg tcatccggcc aggccaggat 780 gtttcctaac gcgccctacc tgcccagctg cctcgagagc cagcccgcta ttcgcaatca 840 gggttacagc acggtcacct tcgacgggac gcccagctac ggtcacacgc cctcgcacca 900 tgcggcgcag ttccccaacc actcattcaa gcatgaggat cccatgggcc agcagggctc 960 gctgggtgag cagcagtact cggtgccgcc cccggtctat ggctgccaca cccccaccga 1020 cagctgcacc ggcagccagg ctttgetgct gaggacgccc tacagcagtg acaatttata 1080 ccaaatgaca tcccagcttg aatgcatgac ctggaatcag atgaacttag gagccacctt 1140 aaagggagtt gctgctggga gctccagctc agtgaaatgg acagaagggc agagcaacca 1200 cagcacaggg tacgagagcg ataaccacac aacgcccatc ctctgcggag cccaatacag 1260 aatacacacg cacggtgtct tcagaggcat tcaggatgtg cgacgtgtgc ctggagtagc 1320 cccgactctt gtacggtcgg catctgagac cagtgagaaa cgccccttca tgtgtgctta 1380 cccaggctgc aataagagat attttaagct gtcccactta cagatgcaca gcaggaagca 1440 cactggtgag aaaccatacc agtgtgactt caaggactgt gaacgaaggt tttctcgttc 1500 agaccagctc aaaagacacc aaaggagaca tacaggtgtg aaaccattcc agtgtaaaac 1560 ttgtcagcga aagttctccc ggtccgacca cctgaagacc cacaccagga ctcatacagg 1620 tgaaaagccc ttcagctgtc ggtggccaag ttgtcagaaa aagtttgccc ggtcagatga 1680 attagtccgc catcacaaca tgcatcagag aaacatgacc aaactccagc tggcgctttg 1740 aggggtctcc ctcggggacc gttcagtgtc ccaggcagca cagtgtgtga actgctttca 1800 agtctgactc tccactcctc ctcactaaaa aggaaacttc agttgatctt cttcatccaa 1860 cttccaagac aagataccgg tgcttctgga aactaccagg tgtgcctgga agagttggtc 1920 tctgccctgc ctacttttag ttgactcaca ggccctggag aagcagctaa caatgtctgg 1980 ttagttaaaa gcccattgcc atttggtgtg gattttctac tgtaagaaga gccatagctg 2040 atcatgtocc cctgaccctt cccttctttt tttatgetcg ttttcgctgg ggatggaatt 2100 attgtaccat tttctatcat ggaatattta taggccaggg catgtgtatg tgtctgctaa 2160 tgtaaacttt gtcatggttt ccatttacta acagcaacag caagaaatavatcagagagc 2220 aaggcatcgg gggtgaatct tgtctaacat tcccgaggtc agccaggctg ctaacctgga 2280 aagcaggatg tagttctgcc aggcaacttt taaagctcat gcatttcaag cagctgaaga 2340

aaaaatcaga actaaccagt acctctgtat agaaatctaa aagaatttta ccattcagtt 2400 aattcaatgt gaacactggc acactgctct taagaaacta tgaagatctg agattttttt 2460 gtgtatgttt ttgactcttt tgagtggtaa tcatatgtgt ctttatagat gtacatacct 2520 ccttgcacaa atggagggga attcattttc atcactggga gtgtccttag tgtataaaaa 2580 ccatgctggt atatggcttc aagttgtaaa aatgaaagtg actttaaaag aaaatagggg 2640 atggtccagg atctccactg ataagactgt ttttaagtaa cttaaggacc tttgggtcta 2700 caagtatatg tgaaaaaaat gagacttact gggtgaggaa atccattgtt taaagatggt 2760 cgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgttgtgt tgtgttttgt tttttaaggg 2820 agggaattta ttatttaccg ttgcttgaaa ttactgtgta aatatatgtc tgataatgat 2880 ttgctctttg acaactaaaa ttaggactgt ataagtacta gatgcatcac tgggtgttga 2940 tcttacaaga tattgatgat aacacttaaa attgtaacct gcatttttca ctttgctctc 3000 aattaaagtc tattcaaaag 3020

< 210 > 35 <211 >446

<

212 > PRT

<

213 > humano

<400 > 35

Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro 1 5 10 15

Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala 20 25 30

Gin Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr 35 40 45

Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro 50 55 60

Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gin Glu Pro Ser Trp Gly Gly 65 70 75 80

Ala Glu Pro His Glu Glu Gin Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe 85 90 95

Ser Gly Gin Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe 100 105 110

Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gin Ala Ser Ser Gly Gin Ala Arg Met Phe 115 120 125

Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile 130 135 140

Arg Asn Gin Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr 145 150 155 160

Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gin Phe Pro Asn His Ser Phe 165 170 175

Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gin Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gin Gin 180 185 190

Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly. Cys His Thr Pro Thr Asp Ser 195 200 205

Cys Thr Gly Ser Gin Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp 210 215 220

Asn Leu Tyr Gin Met Thr Ser Gin Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gin 225 230 235 240

Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser 245 250 255

Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gin Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu 260 265 270

Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gin Tyr Arg Ile 275 280 285

His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gin Asp Val Arg Arg Val Pro 290 295 300

Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys 305 310 315 320

Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys 325 330 335

Leu Ser His Leu Gin Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro 340 345 350

Tyr Gin Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp 355 360 365

Gin Leu Lys Arg His Gin Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gin 370 375 380

Cys Lys Thr Cys Gin Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr 385 390 395 400

His Thr Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro 405 410 415

•Ser Cys Gin Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His 420 425 430

Asn Met His Gin Arg Asn Met Thr Lys Leu Gin Leu Ala Leu 435 440 445

< 210 > 36

<211 >2978 5 < 212 > ADN

< 213 > humano

<400 > 36

ccaggcagct ggggtaagga gttcaaggca gcgcccacac ccgggggctc tccgcaaccc 60 gaccgcctgt ccgctccccc acttcccgcc ctccctocca cctactcatt cacccaccca 120 cccacccaga gccgggacgg cagcccaggc gcccgggccc cgccgtctcc tcgccgcgat 180 cctggacttc ctcttgctgc aggacceggc ttccacgtgt gtcccggagc cggcgtctca 240 gcacacgctc cgctccgggc ctgggtgcct acagcagcca gagcagcagg gagtccggga 300 cccgggcggc atctgggcca agttaggcgc cgccgaggcc agcgctgaac gtotccaggg 360 ccggaggagc cgcggggcgt ccgggtctga gccgcagcaa atgggctccg acgtgcggga 420 cctgaacgcg ctgctgcccg ccgtcccctc cctgggtggc ggcggcggct gtgccctgcc 480 tgtgagcggc gcggcgcagt gggcgccggt gctggacttt gcgcccccgg gcgcttcggc 540 ttacgggtcg ttgggcggcc ccgcgccgcc accggctccg ccgc6acccc cgccgccgcc 600 gcctcactcc ttcatcaaac aggagccgag ctggggcggc geggagccgc acgaggagca 660 gtgcctgagc gccttcactg tccacttttc cggccagttc actggcacag ccggagcctg 720 tcgctacggg cccttcggtc ctcctccgcc cagccaggcg tcatccggcc aggccaggat 780

gtttcctaac gcgccctacc tgcccagctg cctcgagagc cagcccgcta ttcgcaatca 840 gggttacagc acggtcacct tcgacgggac gcccagctac ggtcacacgc cctcgcacca 900 tgcggcgcag ttccccaacc actcattcaa gcatgaggat cccatgggcc agcagggctc 960 gctgggtgag cagcagtact cggtgccgcc cccggtctat ggctgccaca cccccaccga 1020 cagctgcacc ggcagccagg ctttgctgct gaggacgccc tacagcagtg acaatttata 1080 ccaaatgaca tcccagettg aatgcatgac ctggaatcag atgaacttag gagccacctt 1140 aaagggccac agcacagggt acgagagcga taaccacaca acgcccatcc tctgcggagc 1200 ccaatacaga atacacacgc acggtgtctt cagaggcatt caggatgtgc gacgtgtgcc 1260 tggagtagcc ccgactcttg tacggtcggc atctgagacc agtgagaaac gccccttcat 1320 gtgtgcttac ccaggctgca ataagagata ttttaagctg tcccacttac agatgcacag 1380 caggaagcac actggtgaga aaccatacca gtgtgacttc aaggactgtg aacgaaggtt 1440 ttetcgttca gaccagctca aaagacacca aaggagacat acaggtgtga aaccattcca 1500 gtgtaaaact tgtcagcgaa agttctcccg gtccgaccac ctgaagaccc acaccaggac 1560 tcatacaggt aaaacaagtg aaaagccctt cagctgtcgg tggccaagtt gtcagaaaaa 1620 gtttgcccgg tcagatgaat tagtccgcca tcacaacatg catcagagaa acatgaccaa 1680 actccagctg gcgctttgag gggtctccct cggggaccgt tcagtgtccc aggcagcaca 1740 gtgtgtgaac tgctttcaag tctgactetc cactcctcct cactaaaaag gaaacttcag 1800 ttgatcttct tcatccaact tccaagacaa gataccggtg cttctggaaa ctaccaggtg 1860 tgcctggaag agttggtctc tgccctgcct acttttagtt gactcacagg ccctggagaa 1920 gcagctaaca atgtctggtt agttaaaagc ccattgccat ttggtgtgga ttttctactg 1980 taagaagagc catagctgat catgtccccc tgacccttcc cttctttttt tatgctcgtt 2040 ttcgctgggg atggaattat tgtaccattt tctatcatgg aatatttata ggccagggca 2100 tgtgtatgtg tctgctaatg taaactttgt catggtttcc atttactaac agcaacagca 2160 agaaataaat cagagagcaa ggcatcgggg gtgaatcttg tctaacattc ccgaggtcag 2220 ccaggctgct aacctggaaa gcaggatgta gttctgccag gcaactttta aagctcatgc 2280 atttcaagca gctgaagaaa aaatcagaac taaccagtac ctctgtatag aaatctaaaa 2340 gaattttacc attcagttaa ttcaatgtga acactggcac actgctctta agaaactatg 2400 aagatctgag atttttttgt gtatgttttt gactcttttg agtggtaatc atatgtgtct 2460 ttatagatgt acatacctcc ttgcacaaat ggaggggaat tcattttcat cactgggagt 2520 gtccttagtg tataaaaacc atgctggtat atggcttcaa gttgtaaaaa tgaaagtgac 2580 tttaaaagaa aataggggat ggtccaggat ctccactgat aagactgttt ttaagtaact 2640 taaggacctt tgggtctaca agtatatgtg aaaaaaatga gacttactgg gtgaggaaat 2700 ccattgttta aagatggtcg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgttgtgttg 2760 tgttttgttt tttaagggag ggaatttatt atttaccgtt gcttgaaatt actgtgtaaa 2820

• tatatgtctg ataatgattt gctctttgac aactaaaatt aggactgtat aagtactaga 2880 tgcatcactg ggtgttgatc ttacaagata ttgatgataa cacttaaaat tgtaacctgc 2940 atttttcact ttgctctcaa ttaaagtcta ttcaaaag 2978

< 210 > 37

<211 >432 < 212 > PRT < 213 > humano

5

< 400 > 37

Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Vol Pro 1 5 10 15

Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala 20 25 30

Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr 35 40 45

Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro 50 55 60

Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gin Glu Pro Ser Trp Gly Gly 65 70 75 80

Ala Glu Pro His Glu Glu Gin Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe 85 90 95

Ser Gly Gin Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe 100 105 110

Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gin Ala Ser Ser Gly Gin Ala Arg Met Phe 115 120 125

Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gin Pro Ala Ile 130 135 140

Arg Asn Gin Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr 145 150 155 160

Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gin Phe Pro Asn His Ser Phe 165 170 175

Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gin Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gin Gin 180 185 190

Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser 195 200 205

Cys Thr Gly Ser Gin Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp 210 215 220

Asn Lou Tyr Gin Met Thr Ser Gin Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gin 225 230 235 240

Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser 245 250 255

Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg lie His 260 265 270

Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gin Asp Val Arg Arg Val Pro Gly 275 280 285

Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg 290 295 300

Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu 305 310 315 320

Ser His Leu Gin Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr 325 330 335

Gin Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp Gin 340 345 350

Leu Lys Arg His Gin Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gin Cys 355 360 365

Lys Thr Cys Gin Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His 370 375 380

Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Set Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg 385 390 395 400

Trp Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg 405 410 415

His His Asn Met His Gin Arg Asn Met Thr Lys Leu Gin Leu Ala Leu

< 210 > 38 <211 >2969

<212 > ADN 5 < 213 > humano

<400 > 38

ccaggcagtt ggggtaagga gttcaaggca gcgcccacac ccgggggctc tccgcaaccc 60

gaccgcctgt ccgctccccc acttcccgcc ctccctccca cctactcatt cacccaccca 120

cccacccaga gccgggacgg cagcccaggc gcccgggccc cgccgtctcc tcgccgcgat 180

cctggacttc ctettgctgc aggacccggc ttccacgtgt gtcccggagc cggcgtctca 240

gcacacgctc cgctccgggc ctgggtgcct acagcagcca gagcagcagg gagtccggga 300

cccgggcggc atctgggcca agttaggcgc cgccgaggcc agcgctgaac gtctccaggg 360

ccggaggagc cgeggggegt ccgggtctga gccgcagcaa atgggctccg acgtgcggga 420

cctgaacgcg ctgctgcccg ccgtcccctc cctgggtggc ggcggcggct gtgccctgcc 480

tgtgagcggc gcggcgcagt gggcgccggt gctggacttt gcgcceccgg gcgcttcggc 540

ttacgggtcg ttgggcggcc ccgcgccgcc accggctccg ccgccacccc cgccgccgcc 600

gcctcactcc ttcatcaaac aggagccgag ctggggcggc gcggagccgc acgaggagca 660

gtgcctgagc gccttcactg tccacttttc cggccagttc actggcacag ccggagcctg 720

tcgctacggg cccttcggtc ctcctccgcc cagccaggcg tcatccggcc aggccaggat 780

gtttcctaac gcgccctacc tgcccagctg cctcgagagc cagcccgcta ttcgcaatca 840

gggttacagc acggtcacct tcgacgggac gcccagctac ggtcacacgc cctcgcacca 900

tgcggcgcag ttccccaacc actcattcaa gcatgaggat cccatgggcc agcagggctc 960

gctgggtgag cagcagtact cggtgccgcc cccggtctat ggctgccaca cccccaccga 1020 cagctgcacc ggcagccagg etttgctgct gaggacgccc tacagcagtg acaatttata 1080 ccaaatgaca tcccagcttg aatgcatgac ctggaatcag atgaacttag gagccacctt 1140 aaagggccac agcacagggt acgagagcga taaccacaca acgcccatcc tctgcggagc 1200 ccaatacaga atacacacgc acggtgtctt cagaggcatt caggatgtgc gacgtgtgcc 1260 tggagtagcc ccgactcttg tacggtcggc atctgagacc agtgagaaac gccccttcat 1320 gtgtgcttac ccaggctgca ataagagata ttttaagctg tcccacttac agatgcacag 1380 caggaagcac act ggtgaga aaccatacca gtgtgacttc aaggactgtg aacgaaggtt 1440 ttctcgttca gaccagctca aaagacacca aaggagacat acaggtgtga aaccattcca 1500 gtgtaaaact tgtcagcgaa agttctoccg gtccgaccac ctgaagaccc acaccaggac 1560 tcatacaggt gaaaagccct tcagctgtcg gtggccaagt tgtcagaaaa agtttgcccg 1620 gtcagatgaa ttagtccgcc atcacaacat gcatcagaga aacatgacca aactccagct 1680 ggcgctttga ggggtctccc tcggggaccg ttcagtgtcc caggcagcac agtgtgtgaa 1740 ctgctttcaa gtctgactct ccactcctcc tcactaaaaa ggaaacttca gttgatcttc 1800 ttcatccaac ttccaagaca agataccggt gcttctggaa actaccaggt gtgcctggaa 1860 gagttggtct ctgccctgcc tacttttagt tgactcacag gccctggaga agcagctaac 1920 aatgtctggt tagttaaaag cccattgcca tttggtgtgg attttctact gtaagaagag 1980 ccatagctga tcatgtcccc ctgacccttc ccttcttttt ttatgetcgt tttcgctggg 2040 gatggaatta ttgtaccatt ttctatcatg gaatatttat aggccagggc atgtgtatgt 2100 gtctgctaat gtaaactttg tcatggtttc catttactaa cagcaacagc aagaaataaa 2160 tcagagagca aggcatcggg ggtgaatctt gtctaacatt cccgaggtca gccaggctgc 2220 taacctggaa agcaggatgt agttctgcca ggcaactttt aaagctcatg catttcaagc 2280 agctgaagaa aaaatcagaa ctaaccagta cctctgtata gaaatctaaa agaattttac 2340 cattcagtta attcaatgtg aacactggca cactgctctt aagaaactat gaagatctga 2400 gatttttttg tgtatgtttt tgactctttt gagtggtaat catatgtgtc tttatagatg 2460 tacatacctc cttgcacaaa tggaggggaa ttcattttca tcactgggag tgtccttagt 2520 gtataaaaac catgctggta tatggcttca agttgtaaaa atgaaagtga ctttaaaaga 2580 aaatagggga tggtccagga tctccactga taagactgtt tttaagtaac ttaaggacct 2640 ttgggtctac aagtatatgt gaaaaaaatg agacttactg ggtgaggaaa tccattgttt 2700 aaagatggtc gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgttgtgtt gtgttttgtt 2760 ttttaaggga gggaatttat tatttaccgt tgcttgaaat tactgtgtaa atatatgtct 2820 gataatgatt tgctctttga caactaaaat taggactgta taagtactag atgcatcact 2880 gggtgttgat cttacaagat attgatgata acacttaaaa ttgtaacctg catttttcac 2940 tttgctctca attaaagtct attcaaaag 2969

< 210 > 39 <211 >429 5 < 212 > PRT

< 213 > humano

<400 > 39

Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro 1

5 10 15

Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala 20 25 30

Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr 35 40 45

Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro 50 55 60

Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly 65 70 75 80

Ala Glu Pro His Glu Glu Gin Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe 85 90 95

Ser Gly Gin Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe 100 105 110

Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gin Ala Ser Ser Gly Gin Ala Arg Met Phe 115 120 125

Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gin Pro Ala Ile 130 135 140

Arg Asn Gin Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr 145 150 155 160

Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gin Phe Pro Asn His Ser Phe 165 170 175

Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gin Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gin Gin 180 185 190

Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser 195 200 205

CYS Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp 210 215 220

Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gin Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gin 225 230 235 240

Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser 245 250 255

Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gin Tyr Arg Ile His 260 265 270

Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly 275 280 285

Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg 290 295 300

Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu 305 310 315 320

Ser His Leu Gin Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr 325 330 335

Gin Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp Gin 340 345 350

Leu Lys Arg His Gin Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gin Cys 355 360 365

Lys Thr Cys Gin Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His 370 375 380

Thr Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser 385 390 395 400

Cys Gin Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn 405 410 415

Met His Gin Arg Asn Met Thr Lys Leu Gin Leu Ala Leu 420 425

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1. UnpolinucleOtido de 15 a 49 bases de longitud que tiene al menos 15 bases contiguas en la secuencia nucleotidica de la SEQ ID NO: 26 y que incluye la secuencia nucleotidica de la SEQ ID NO: 27, donde el

   5 polinucleOtido puede proporcionar un ARNsi que puede inhibir especificamente una expresi6n de la isoforma VVT1 17AA( —) sin inhibir una expresi6n de la isoforma VVT1 17AA( + ).
2. 2. UnpolinucleOtido que consiste en la secuencia nucleotidica de la SEQ ID NO: 26.

   10 3. Unacomposici6n medica para tratar un tumor sOlido, que comprende uno cualquiera de ARN de doble helice, ADN que codifica el ARN de doble helice; y un vector en el que se inserta el ADN, donde:

   el ARN de doble helice puede inhibir especificamente una expresi6n de la isoforma VVT1 17AA( —) sin inhibir una expresi6n de la isoforma VVT1 17AA( + ), y este compuesto por (i) un primer ARN y (ii) un segundo ARN capaz de

   15 emparejarse con el primer ARN; donde el primer ARN es codificado por un ADN complementario a un polinucleOtido que tiene al menos 15 bases contiguas en la secuencia nucleotidica de la SEQ ID NO: 26 e incluye la secuencia nucleotidica de la SEQ ID NO: 27.
3. 4. Lacomposici6n medica de acuerdo con la reivindicaciOn 3, donde el ADN que codifica el segundo

   20 ARN hibrida en una condici6n astringente con un polinucleOtido que tiene al menos 15 bases contiguas en la secuencia nucleotidica de la SEQ ID NO: 26 y que incluye la secuencia nucleotidica de la SEQ ID NO: 27.
4. 5. Lacomposici6n medica de acuerdo con la reivindicaciOn 3, donde el segundo ARN incluye al menos

   15 bases contiguas en la secuencia nucleotidica de la SEQ ID NO: 29. 25
5. 6. Lacomposici6n medica de acuerdo con la reivindicaciOn 3, donde el primer ARN incluye al menos 15 bases contiguas en la secuencia nucleotidica de la SEQ ID NO: 30.
6. 7. Lacomposici6n medica de acuerdo con la reivindicaciOn 3, donde el ADN que codifica el ARN de 30 doble helice incluye la secuencia nucleotidica de la SEQ ID NO: 27.
7. 8. Lacomposici6n medica de acuerdo con la reivindicaciOn 3, donde el ARN de doble helice este compuesto por un emparejamiento de ARN que incluye la secuencia nucleotidica de la SEQ ID NO: 29 con ARN incluyendo la secuencia nucleotidica de la SEQ ID NO: 30.

   35
8. 9. Unkit medico para tratar un tumor sOlido, que comprende uno cualquiera de un ARN de doble helice, ADN que codifica el ARN de doble helice; y un vector en el que se inserta el ADN, donde:

   el ARN de doble helice puede inhibir especificamente una expresi6n de la isoforma VVT1 17AA( —) sin inhibir una

   40 expresi6n de la isoforma VVT1 17AA( + ), y este compuesto por (i) un primer ARN y (ii) un segundo ARN capaz de emparejarse con el primer ARN; donde el primer ARN este codificado por un ADN complementario a un polinucleOtido que tiene al menos 15 bases contiguas en la secuencia nucleotidica de la SEQ ID NO: 26 e incluye la secuencia nucleotidica de la SEQ ID NO: 27.

   45 10. Usode un ARN de doble helice, ADN que codifica el ARN de doble helice, o un vector en el que se inserta el ADN, para fabricar un medicamento para el tratamiento de un tumor sOlido, donde:

   el ARN de doble helice puede inhibir especificamente una expresi6n de la isoforma VVT1 17AA( —) sin inhibir una expresi6n de la isoforma VVT1 17AA( + ), y este compuesto por (i) un primer ARN y (ii) un segundo ARN capaz de

   50 emparejarse con el primer ARN, donde el primer ARN este codificado por un ADN complementario a un polinucleOtido que tiene al menos 15 bases contiguas en la secuencia nucleotidica de la SEQ ID NO: 26 e incluye la secuencia nucleotidica de la SEQ ID NO: 27.
9. 11. UnARN de doble helice que este compuesto por (i) un primer ARN y (ii) un segundo ARN capaz de 55 emparejarse con el primer ARN, donde

   el primer ARN este codificado por un ADN complementario a un polinucleOtido que tiene al menos 15 bases contiguas en la secuencia nucleotidica de la SEQ ID NO: 26; y donde el polinucleOtido incluye la secuencia nucleotidica de la SEQ ID NO: 27,

   donde el ARN de doble helice puede inhibir especificamente una expresi6n de la isoforma VVT1 17AA( —) sin inhibir una expresi6n de la isoforma VVT1 17AA( +)