ITTO20070401A1 - Vaccino anti-tumorale - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "Vaccino anti-tumorale"
TESTO DELLA DESCRIZIONE
Campo dell'invenzione
La presente invenzione concerne un vaccino anti-tumorale, in particolare, un vaccino comprendente un antigene tumore specifico che permette di effettuare una immuno-terapia attiva diretta esclusivamente verso cellule tumorali, dotata di bassa tossicità ed efficace nel contenere la progressione tumorale.
Sfondo -tecnico dell'invenzione
Il gene del tumore di Wilms ( WT1 ) fu isolato la prima volta nell'omonima neoplasia renale pediatrica<1>. Esso . codifica per un fattore di trascrizione (zinc finger) coinvolto nella regolazione della proliferazione, differenziazione e apoptosi cellulare<2-7>.
Questo gene, formato da dieci esoni localizzati sul cromosoma llplB<1>, ha un ruolo ancora non del tutto chiaro. Esso inibisce la trascrizione di diversi- fattori di crescita tra cui PDGF<8>, M-CSF<3>, IGF-II<3>, di recettori di fattori di crescita come IGF- IR<10>e EGFR<4>e di altri geni tra cui RAR-a<b>, cmyc<16>, c-myb<11>, N-myc<12>e bel -2<6>, ma può anche attivare la trascrizione dello stesso bcl-2<13>e di altri geni come Dax-1<14>e RbAp46<15>.
WT1 è espresso durante il periodo dell 'organogenesi in cui svolge un ruolo cruciale. Topi knock-out per il gene WT1 muoiono a livello embrionale, probabilmente a causa di uno scompenso cardiaco e presentano alterazioni a livello dell'apparato urogenitale<16>.
Inizialmente, a guesto gene è stato dato un ruolo oncosoppressore in quanto sono state trovate delezioni o mutazioni nel tumore di Wilms, mutazioni nelle linee germinali in pazienti che presentavano una predisposizione allo sviluppo di leucemie e determina, inoltre, la soppressione della crescita del tumore di Wilms<17-21>. Al contrario di altri oncosoppressori come Rb e p53, che sono espressi in tutti i tessuti, l'espressione del gene WT1, oltre ad avere valori molto bassi, è limitata solo alle cellule delle gonadi, dell'utero, dei reni, della milza, dei mesoteli e dei progenitori ematopoietici<22-25>. Recentemente, è stato però proposto per la forma wild-type del gene WTl un ruolo pro-oncogenico in quanto si sono accumulate evidenze di elevati livelli di espressione in varie neoplasie maligne ematologiche e in diversi tumori solidi. Il gene WTl è iperespresso nella leucemia mieloide acuta, nella leucemia linioblastica acuta, nella leucemia mieloide cronica, nelle sindromi mielodisplastiche, nei disordini mieloproliferativi Ph negativi, in alcuni linfomi non-Hodgkin e anche nel tumore del polmone, nel mesotelioma, nel tumore della mammella, nel carcinoma squamoso del collo e testa, nel sarcoma dei tessuti molli, nell'osteosarcoma, nei tumori della tiroide, nell'adenocarcinoma del colon-retto e nel glioblastoma . Inoltre, l'espressione di WTl nella leucemia mieloide acuta e nella leucemia linfoblastica acuta è altamente correlata con la progressione della malattia. WTl si è, infatti, dimostrato un ottimo indicatore per monitorare la malattia residua dopo trattamento chemioterapico nei pazienti con leucemia acuta. Nelle sindromi mielodisplastiche i livelli di espressione di WTl aumentano con la progressione della malattia e sono un indicatore precoce di evoluzione in leucemia mieloide acuta25-39
WT1 appare quindi coinvolta nella genesi tumorale e nel mantenimento del fenotipo neoplastico .
La risposta immunitaria antitumorale viene classicamente associata con l'azione svolta dai linfociti T citotossici CD8+: essi riconoscono i peptidi endogeni processati sul complesso di immunoistocompatibilità di classe I e sono in grado di determinare direttamente la morte della cellula tumorale<40>.
Vi sono chiare evidenze cliniche dell'efficacia della risposta immunitaria antitumorale. Ciò si può evincere dalla graft-versus-leukemia che viene contrastata attraverso il trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche nel trattamento delle leucemie per riuscire ad ottenere la guarigione del paziente<41>: le cellule del sistema immunitario del donatore sono, infatti, in grado di riconoscere ed eliminare la neoplasia in una discreta percentuale di casi.
Questa reazione immunitaria non è diretta, però, unicamente verso le cellule malate, ma colpisce anche i tessuti sani determinando vari danni d'organo (graft-versus-host disease); ciò è difficilmente prevedibile e controllabile una volta che si è instaurata anche ricorrendo a farmaci immunosoppresson .
Per sfruttare ulteriormente l'attività antitumorale del sistema immunitario, già dagli inizi degli anni '90, si è iniziata l'infusione di linfociti del donatore come trattamento della ricaduta dopo trapianto allogenico, anche se, a fronte di un possibile beneficio di questa procedura, si è aumentata ulteriormente la possibilità di sviluppare gravi danni d'organo {graft-versus-host disease)<60>.
La vaccinazione con un antigene tumorespecifico, invece, ha lo scopo di indirizzare l'attività del sistema immunitario del paziente selettivamente verso le cellule neoplastiche che esprimono 1'antigene tumore-specifico riducendo drasticamente la tossicità verso i tessuti sani.
La proteina WT1 presenta un potenziale immunogenico elevato. È stata, infatti, osservata nell'uomo la formazione spontanea di linfociti T CD8+ verso 1'antigene WT1 in pazienti affetti da leucemia mieloide acuta e sindrome mielodisplastica, ma anche in pazienti con tumore del polmone e della mammella<44-45>. La proteina WTl è in grado di stimolare già fisiologicamente in vivo una risposta sia citotossica T CD8+ sia umorale. Un approccio di vaccinazione potrebbe amplificare questa reazione immunitaria in modo tale da renderla efficace nel distruggere le cellule tumorali. Quindi la proteina WT1 possiede due caratteristiche che la rendono un antigene ideale per un approccio di immunoterapia onco-ematologica attiva: alto potenziale immunogenico ed elevato grado di associazione tumore- specifico.
Partendo da queste osservazioni si è cominciato a valutare il possibile ruolo di WT1 come antigene contro cui l'organismo potrebbe indirizzare il proprio sistema immunitario nel tentativo di eliminare le cellule tumorali.
Attualmente, sono in corso sperimentazioni che impiegano peptidi derivati dalla sequenza ammninoacidica della proteina WT1. Questi peptidi che si legano al complesso maggiore di immunoistocompatibilità di classe I (MHC I) sono caratterizzati da sequenze comuni di 8-9 aminoacidi e sono in grado di legarsi con specifici MHC I.
In uno studio preclinico 1'inoculo di questi peptidi nel topo determina la formazione di linfociti T citotossici CD8+ specifici verso 1'antigene WT1: in vitro questi linfociti sono in grado di uccidere selettivamente cellule tumorali che ipe<'>resprimono WT1. I topi immunizzati con questi peptidi rigettano l'inoculazione di cellule tumorali iperesprimenti WT1 e sopravvivono per lungo tempo. Inoltre, nessun topo vaccinato con questi peptidi mostra segni di tossicità d'organo da parte dei linfociti T citotossici CD84- specifici verso l'antigene WT1<42>. La risposta immunitaria diretta contro WT1 è, quindi, in grado di colpire solo le cellule tumorali che contengono elevati livelli di questa proteina e risparmiare i tessuti sani.
In un altro studio i peptidi vengono disegnati in modo da potersi legare anche al complesso maggiore di immunoistocompatibilità di classe II (MHC II). Si cerca in questo caso di sfruttare anche il versante umorale della risposta immunitaria che sembra essere responsabile del mantenimento della risposta antitumorale a lungo termine. La vaccinazione dei topi con questi peptidi induce la formazione sia di linfociti T citotossici CD8+ sia di anticorpi specifici verso 1'antigene WTl. Anche in questo caso non si registra alcun segno di tossicità a livello istopatologico, confermando l'assenza di autoaggressione ai tessuti sani dell'organismo da parte del sistema immunitario cellulo-mediato e umorale, stimolato verso 1'antigene WTl<43>.
In particolare, sono stati individuati vari peptidi in grado di evocare una risposta immunitaria citotossica nell'uomo verso 1'antigene WT1, ma essi devono legarsi selettivamente a specifici MHC I umani. Dai complessi di immunoistocompatibilità più rappresentati nella popolazione giapponese (HLA-A*2402) e caucasica (HLA-A*0201) sono derivati rispettivamente il peptide 9-mer (a.a. 235-243, di sequenza CYTWNQMNL) e Dbl26 (a.a. 126-134, di sequenza RMFPNAPYL), in grado di stimolare la maggiore<'>risposta immunitaria nelle rispettive popolazioni. Cellule mononucleate, prelevate dal sangue periferico di donatori sani con HLA compatibile e pulsate in vitro con i peptidi derivati da WTl, sviluppano specifici linfociti T citotossici CD8+. Questi ultimi sono in grado di uccidere selettivamente cellule leucemiche iperesprimenti WTl<46-49>, non inibendo la formazione di colonie da cellule normali di midollo osseo: ciò indica che i linfociti T citotossici CD8+ evocati tramite esposizione all'antigene WTl non attaccano i progenitori emopoietici normali che esprimono WTl a livelli estremamente bassi<47, 50~51>. Questa osservazione, insieme agli studi fatti sui topi, conferma come anche nell'uomo la stimolazione del sistema immunitario verso 1'antigene WTl non determinerebbe un danno in quei tessuti che esprimono WTl fisiologicamente, probabilmente come conseguenza dei diversi livelli di espressione di WTl in cellule displastiche o neoplastiche rispetto a cellule sane<22~25>.
Sulla base di questi risultati sono iniziati i primi studi clinici di fase I e II su pazienti affetti da leucemia acuta, sindrome mielodisplastica, tumore del polmone e della mammella. I risultati preliminari mostrano che la vaccinazione è molto sicura e priva di tossicità confermando così ciò che avevano già dimostrato gli studi pre-clinici; infatti, non si registra alcun fenomeno di autoimmunità anche verso tutti i tessuti che esprimono fisiologicamente WTl . Inoltre, si osserva che ,la vaccinazione mostra .una buona attività nei confronti dei tumori onco-ematologici: due pazienti affetti da sindrome mielodisplastica mostrano una diminuzione del numero di blasti e dei livelli di espressione di WTl a livello del midollo osseo, un paziente con leucemia mieloide acuta in recidiva ha ottenuto la remissione completa, mentre in altri pazienti con leucemia mieloide acuta in remissione clinica si osserva una riduzione della malattia minima residua, sia come numero di blasti, sia come espressione di WTl . La vaccinazione peptìdica sembrerebbe attiva anche nei confronti dei tùmori solidi: si rilevano risposte cliniche in due pazienti affetti da tumore del polmone e in altri due affetti da tumore della mammella in fase metastatica<52-55>.
Recentemente è stata valutata l'ipotesi che altre due neoplasie possano rispondere alla vaccinazione con antigeni contenuti in WT1: i linfomi non Hodgkin {LNH) e il mieloma multiplo. Nei LNH ciò è giustificato dagli aumentati livelli di espressione a livello immunoistochimico di WT1 delle cellule neoplastiche, mentre nel mieloma multiplo ciò è giustificato dal fatto che si osserva in vitro che i linfociti T citotossici CD8+ specifici verso 1'antigene WT1 lisano le cellule di mieloma multiplo, anche se in queste non è dimostrato un livello di espressione di WTl aumentato<56-57>.
Dati preliminari di studi in fase II sull'uomo confermano un effetto positivo della vaccinazione peptidica sia in pazienti affetti da neoplasie oncoematologiche che da tumori solidi<42>'<52-55>'<58>'<59>. La bontà di tali risultati preliminari è ancor più apprezzabile in virtù del fatto che i pazienti selezionati per studi in fase II sono molto spesso già pluritrattati con vari cicli chemioterapici e in fasi molto avanzate di malattia, con un sistema immunitario molto depresso e quindi normalmente poco suscettibili ad una stimolazione tramite vaccino.
Poiché la vaccinazione tramite antigeni contenuti in WTl si è dimostrata fino ad ora molto sicura e priva di effetti tossici, in futuro si potranno selezionare pazienti in uno stadio di malattia meno avanzato e quindi con un sistema immunitario più efficiente, nei quali si potrà valutare la reale attività ed efficacia di questo approccio immunoterapico.
I vaccini antitumorali contenenti peptidi derivati da WTl attualmente in studio, nonostante le risposte positive in termini di risposta anticorpale presentano alcuni svantaggi molto importanti: 1) determinano una risposta HLA dipendente quindi non possono essere utilizzati in tutti i pazienti, 2} sviluppano solo una risposta linfocitaria di tipo CD8+ verso un solo epitopo dell'intero antigene, e 3) non permettono lo sviluppo di una risposta immunitaria umorale. Per contro l'approccio qui descritto, che prevede l'uso della proteina WTl intera, determina una risposta immunitaria sia di tipo cellulo-mediata sia di tipo<'>umorale. Entrambe sono critiche nel mediare la risposta antitumorale a breve e lungo termine<61>. Inoltre, la vaccinazione con la proteina intera determina una risposta immunitaria diretta verso vari epitopi dell'antigene WTl e questo influenza in modo positivo l'efficacia della risposta antitumorale. Infine, questo tipo di vaccinazione è HLA indipendente e ciò rappresenta una condizione estremamente vantaggiosa per lo sviluppo di un protocollo clinico di vaccinoterapia .
Descrizione generale dell'invenzione
Scopo della presente invenzione è 1'identificazione di un antigene tumore specifico che permetta di effettuare una immuno-terapia attiva diretta esclusivamente verso cellule tumorali e che risolva gli inconvenienti legati all'uso di peptidi.
Secondo la presente invenzione, tale scopo è raggiunto grazie alla soluzione richiamata in modo specifico nelle rivendicazioni che seguono. Le rivendicazioni formano parte integrante dell'insegnamento tecnico qui fornito in relazione all'invenzione.
L'invenzione riguarda l'impiego della proteina WTl di sequenza intera come vaccino per immunoterapia attiva diretta esclusivamente verso cellule tumorali, in particolare, della proteina WTl di origine umana. La sequenza della proteina umana WTl è accessibile nella banca dati di sequenze amminoacidiche Genebank al numero di accesso NP_077744.
Classicamente la risposta linfocitaria di tipo T CD8+ è quella maggiormente implicata nel sopprimere la crescita di cellule neoplastiche, ma vi sono evidenze che sia quella umorale a mantenere nel tempo la risposta immunitaria contro le cellule tumorali<43>. È noto che i vaccini peptidici evocano principalmente una risposta immunitaria di tipo citotossico T CD8+ mediata. È, inoltre, noto che i vaccini peptidici hanno il limite di poter essere somministrati solo in pazienti con specifici MHC I.
Al contrario, il vaccino secondo la presente invenzione è in grado di indurre una buona risposta citotossica da linfociti T CD8+ e di evocare una risposta umorale, in quanto permette di sfruttare l'intero potenziale di reattività del sistema immunitario verso differenti epitopi appartenenti al medesimo antigene. Inoltre, l'attività di tale vaccino è HLA-indipendente, quindi è utilizzabile nella vaccinazione di soggetti aventi HLA diversi.
Tale vaccino è privo di tossicità per i tessuti sani che esprimono fisiologicamente WTl, come i tessuti ematopoietici, rene, milza, gonadi e linfonodi, mentre mostra una sorprendente attività nel ridurre la crescita tumorale.
Breve descrizione delle Figure
Figura 1: SDS-PAGE della curva del siero di albumina bovina (BSA) a concentrazioni di 1 pg, 3 pg, 5 pg, 10 pg e 15 pg.
Figura 2: SDS-PAGE del U sato batterico al tempo 0 dall'induzione (1), dopo 3 ore (2) e dopo 6 ore (3) e del purificato della proteina GST-WT1 {4).
Figura 3: istologia del linfonodo, della milza, dell'ovaio e del rene di un GST+AD (1, 3, 5 e 9) e di un WT1+AD (2, 4, 6 e 10) colorati in ematossilina-eosina e strisci di sangue midollare di un GST+AD (7) e di un WT1+AD (8) colorati con Giemsa e Wright.
Figura 4: Dot blot di diluizioni crescenti di sièro murino vaccinato con GST+AD [1/500 (1), 1/2000 (2), 1/3000 (3) e bianco (4)] e di siero murino vaccinato con la proteina WTl associata all'adiuvante [1/500 (5), 1/2000 (6), 1/3000 (7) e bianco (8)].
Figura 5 : valori di luminescenza a varie diluizioni decrescenti di siero osservati con la metodica del dot blot corrispondenti alla presenza di Ig antì WTl nel gruppo di topi vaccinato con GST+AD.
Figura 6 : valori di luminescenza a varie diluizioni decrescenti di siero osservati con la metodica del dot blot corrispondenti alla presenza di Ig anti WTl nel gruppo di topi inoculati con la proteina WTl associata all/adiuvante.
Figura 7: Dot blot di sieri di topi inoculati con la proteina WTl associata all'adiuvante (1, 2, 3, 7, 8 e 9), con solo PBS (4 e 10) e con GST associata all'adiuvante (5, 6, 11 e 12).
“Figura 8: valori di luminescenza osservati con la metodica del dot blot corrispondenti alla presenza di Ig anti WTl nel gruppo di topi iniettati con la proteina WTl associata all'adiuvante (WT1+AD), con solo la proteina WTl (WTl), con solo PBS (PBS) e con GST associata all'adiuvante (GST+AD).
Figura 9: citotossicità media nei gruppi di topi trattati.
Figura 10: valutazione della superficie (A) e della massa (B) tumorale nei gruppi di topi vaccinati (WTl+AD) e nei controlli (CTRL) trattati con GST+AD e PBS
Descrizione dettagliata dell'invenzione
L'invenzione sarà ora descritta in modo dettagliato, a puro titolo di esempio non limitativo.
Preparazione della proteina, di fusione GST -WTl
La sequenza completa codificante di WTl murino (NM_144783), 1339 basi azotate, è stata amplificata mediante PCR da un classico vettore di espressione per mammiferi contenente il cDNA di WTl guidato da un promotore forte quale il CMV, gentilmente concesso dal Dott. Hastie, tramite i seguenti primers: forward primer: 5'-CGGAATTCATGGGTTCCGACGTGCGGGAC-3' (SEQ ID:1)
reverse primer : 5'-CCGCTCGAGTCAAAGCGCCACGTGGAGTTTGG-3' (SEQ ID:2)
Il risultante frammento di DNA è stato tagliato al 5' e al 3' rispettivamente dagli enzimi di restrizione EcoR I e Xho I e clonato nello stesso sito di restrizione del vettore pGEX-4T-l (Amersham Biosciences) che contiene la proteina glutatione-S-transferasi (GST), sotto il controllo di un promotore inducibile dalla isopropil-B-D-tiogalattoside(IPTG, VWR) . Il costrutto è stato trasformato in E. Coli (JM109) per produrre la proteina di fusione GST-WT1. Gli E. Coli trasformati con il costrutto sono stati incubati a 37 “C in terreno di coltura di Luria Bertani (LB) e ampicillina [100 pg/ml] partendo da un O.D. 600 > 0,8 e in presenza di ImM di IPTG per 6 ore. I batteri vengono quindi lavati due volte con 10 mi di PBS IX freddo e risospesi in 3 mi di buffer di lisi (3 mi di PBS IX; PMSF<■>[100 pg/ml], aprotinina [1 pg/ml] e DTT [1 mM] ). Le cellule sono state "sonicate" 3 volte per 45'' con pause di 5', inoltre la terza volta viene aggiunto l'l% di Triton X-100 (VWR). Il U sato è stato centrifugato per 15' a 13000 rpm e il surnatante trasferito in provette pulite. Il prodotto della lisi è stato incubato con biglie coniugate al glutatione [100 μΐ di biglie ogni 100 mi di coltura batterica] (Amersham Biosciences) per 30' a 4 °C in agitazione e le biglie sono state poi lavate con 1 mi di RIPA buffer {TRIS HC1 pH 8 [50 mM] , NaCl [150 mM], NP40 [1%], DOC [0,5%] e SDS [0,1%]) per 3 volte e una quarta volta con PBS IX. La proteina GST-WT1 è stata staccata dalle biglie mediante bollitura a 100°C per 5'. Il prodotto della purificazione è stato controllato e quantificato mediante SDS-PAGE.
SDS -PAGE
Il U sato totale o il prodotto.della purificazione è stato dissolto nel 3X SDS sample buffer (Bio-Labs), bollito per 5 minuti a 95°C e caricato su gel di poliacrilammide al 10%.
Il gel viene fatto correre a voltaggio costante (100V), poi colorato per 30' con blu di Comassie e infine decolorato per tutta la notte in una soluzione di etanolo [5%] e acido acetico [7%]. Viene anche costruita una curva con il siero di albumina bovina {BSA) al fine di quantificare il prodotto della purificazione, come mostrato in figura 1 e 2.
Dot Blot per rilevare la presenza, di anticorpi diretti contro l 'antigene WT1
Lo strumento dot blot è stato preparato con due strati di carta assorbente {M3 Whatman) su cui è stata posizionata la membrana dì nitrocellulosa (Amersham Biosciences) dopo averla reidratata. Lo strumento viene avviato e vengono "spottati" in ogni pozzetto 0,5 pg di proteina GST-WTl (7,15 pg di proteina per cm<2>di membrana di nitrocellulosa).
La membrana viene lasciata per 30' in camera umida e successivamente fatta saturare con siero di albumina bovina (BSA, Sigma) al 5%. Vengono fatti 3 lavaggi con TBS-Tween 0,1% (Sigma) e dopo la membrana viene di nuovo posizionata nello strumento dot blot dove vengono "spottati" 20 μΐ di siero diluito in acqua 1:500.
La membrana viene poi nuovamente lasciata per 30' in camera umida. Vengono fatti 3 lavaggi da 15' con TBS-Tween 0,1%. A questo punto la membrana viene incubata per 60' con anti-mouse coniugato con la perossidasi (Santa Cruz Biotechnology) e poi viene lavata 4 volte per 10' con TBS-Tween 0,1%.
Il prodotto della reazione viene rilevato mediante la soluzione ECL (Amersham Biosciences) e letto al luminometro (Viktor, Perkin Elmer).
Gruppi di topi adoperati nello studio
I topi utilizzati in questo studio sono 54 femmine del ceppo C57BL/6J dell'età di 8 settimane suddivise in 3 gruppi come mostrato in tabella 1.
Tabella 1.
(*) WTl+AD = proteina WTl associata all'adiuvante
(**) GST+AD = GST associata all'adiuvante
(***} PBS = solo PBS
Schema di. somministrazione del vaccino proteico WTl I vari gruppi di topi sopra elencati sono stati vaccinati a livello subcutaneo con il protocollo di vaccinazione riportato in tabella 2 della durata di 4 settimane.
Tabella 2
(*} WTl+AD = proteina WT1 associata all'adiuvante
(**) GST+AD = GST associata all'adiuvante
(***) PBS = solo PBS
Linee cellulari murine utilizzate
La linea cellulare TRAMP-C2 (ATCC, CRL-2731, USA) viene mantenuta nel terreno di coltura Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Cambrex) con 10% di Fetal Bovin Serum (FBS, Invitrogen) e 4 mM di L-glutamina. Le TRAMP-C2 sono cellule di adenocarcinoma prostatico murino derivante da topi C57BL/6J e presentano elevati livelli di espressione di WTl<43>. La linea cellulare C1498 viene mantenuta nel terreno di coltura Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) con 10% di Fetal Bovin Serum (FBS) e 4 mM di L-glutamina. Le C1498 sono cellule di leucemia acuta murina derivante da topi C57BL/6J.
Test di citotossicità o del rilascio del cromo
I topi sono stati sacrificati mediante dislocazione cervicale ed i linfociti ottenuti mediante omogeneizzazione della milza.
Le cellule tumorali esprimenti WTl (TRAMP-C2) sono state previamente trattate con Mytomicina-C (Sigma) per 30 minuti al fine di bloccarne la crescita ed in seguito messe a contatto con i linfociti prelevati dai topi in un rapporto 1:20 in 10 mi di RPMI 10% FBS, in presenza di interleuchina-2 [1 ng/ml] (Listarfish).
I linfociti sono stati incubati con le cellule tumorali per 6 giorni e dopo questo tempo sono stati fatti reagire con le cellule tumorali marcate con<51>Cr -SOpCi- (Perkin Elmer) in piastre da 96 pozzetti. Le piastre vengono lasciate a 37°C per 4 ore e poi centrifugate: il surnatante viene trasferito in piastre LumaPlate (Perkin Elmer) per la lettura allo scintillatore.
Infezione di cellule di leucemia acuta murina (C1498) con vettore lentivirale esprimente WTl
Il vettore lentivirale esprimente WT1 di seguito denominato LV-WT1 è stato costruito clonando la sequenza completa codificante di NTl tra i siti BamHI e Sali del vettore pCCL (United States Patent 6924144).
Aliquote contenenti alto titolo lentivirale sono state prodotte in cellule HEK-293-T (ATCC, CRL-1573, USA) in seguito a co-trasfezione, con vettori esprimenti i geni codificanti per le proteine necessarie all'impacchettamento virale, mediante la tecnica del calcio fosfato. I supernatanti di queste cellule sono stati raccolti 36 ore dopo la trasfezione, filtrati (0,22 pm diametro dei pori), e direttamente adoperati per infettare cellule C1498 in crescita esponenziale.
Analisi statistica
Per l'analisi statistica sono stati utilizzati il test T student per dati indipendenti e il suo analogo non parametrico: il test di Mann Withney.
ESEMPI.
Esempio 1
Valutazione della tossicità d'organo nei topi vaccinati
Il gruppo di topi C57BL/6J nei quali è stata iniettata la proteina WT1 in associazione all'adiuvante (WTl+AD}, i topi trattati con solo GST e adiuvante (GST+AD) e quelli con solo PBS (PBS) sono stati sacrificati e valutati sia mediante analisi istologica sia esame emocromocitometrico per escludere una possibile tossicità d'organo.
In particolare l'analisi istologica condotta su sezione di tessuto renale, linfonodi, milza, gonadi e su sezioni trasversali dell'osso femorale non ha evidenziato alterazioni patologiche (figura 3). Lo striscio di sangue midollare non ha evidenziato significative anomalie qualitative e quantitative a livello dei progenitori emopoietici.
L'emocromo eseguito nei topi vaccinati, come mostrato nella tabella 3, non mostra differenze statisticamente significative nei valori di Hb (p>0,05), globuli bianchi (p>0,05), formula e piastrine (p>0,05) rispetto ai gruppi di controllo. Tabella 3.
(*) WTl+AD = proteina WT1 associata all'adiuvante
(**} GST+AD = GST associata all'adiuvante
(***) PBS = solo PBS
Esempio 2
Valutazione dello sviluppo di anticoxpi anti-WTl dopo vaccinazione con la proteina
Nel gruppo di topi C57BL/6J vaccinati la proteina WT1 in associazione all'adiuvante, topi trattati con solo GST e adiuvante e con solo PBS è stata valutata la presenza di anticorpi totali diretti contro WT1 mediante la tecnica dot blot, vedi figure 4, 5, 6 e 7.
I topi trattati con solo PBS o GST e adiuvante non sviluppano anticorpi. I topi inoculati con l'intera proteina WT1 con 1'adiuvante sviluppano significativi livelli di anticorpi, come mostrato nella figura 8.
Esempio 3
Valutazione dell 'attività T citotossica nei topi vaccinati
Sugli stessi gruppi di topi descritti sopra è stata valutata l'attività dei linfociti T citotossici mediante il test di rilascio del<51>Cr. Il test ha dimostrato che i topi vaccinati (gruppo WT1+AD) sviluppano un livello di citotossicità di circa il 30% come valore medio, che invece raggiunge un valore solo di circa il 5% nel gruppo GST+AD e solo di circa il 2% nel gruppo PBS, come mostrato in figura 9.
Esempio 4
Effetto azititnrnnrale del vaccino
Due settimane dopo l'ultima immunizzazione sono state inoculate sottocute 75xl0<3>cellule di C1498 (esprimenti elevati livelli di WT1) nei gruppi di topi trattati con WT1+AD, GST+AD e PBS. A distanza di 2 settimane dall'inoculo si osserva una massa tumorale palpabile. Dopo 8 settimane dall'inoculo la massa tumorale raggiunge dimensioni ragguardevoli e a questo punto i topi sono stati sacrificati e le masse analizzate. Il gruppo di topi immunizzati con WT1+AD mostrano masse e superfici tumorali con dimensioni significativamente ridotte rispetto ai gruppi di controllo GST+AD e PBS ( p<0,03 e p<0,01 rispettivamente) come mostrato in figura 10.
Naturalmente, i particolari di realizzazione e le forme di attuazione potranno essere ampiamente variati rispetto a quanto descritto ed illustrato senza per questo uscire dall'ambito di protezione della presente invenzione, così come definito dalle rivendicazioni annesse.
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Claims (14)
- Rivendicazioni 1. Vaccino per immunoterapia attiva per la prevenzione e/o il trattamento di tumori nell'uomo caratterizzato dal fatto che comprende la proteina WTl codificata dal gene dì Wilms a sequenza intera.
- 2. Vaccino secondo la rivendicazione 1, in cui la proteina WTl è di origine umana.
- 3. Vaccino secondo la rivendicazione 1 o la rivendicazione 2, in cui la proteina WTl è associata ad un adiuvante.
- 4. Vaccino secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la proteina WTl è prodotta con la tecnologia del DNA ricombinante.
- 5. Vaccino secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la proteina WTl è una proteina di fusione.
- 6. Vaccino secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il tumore è selezionato fra leucemia mieloide acuta, leucemia linfoblastica acuta, leucemia mieloide cronica, sìndromi mielodisplastiche, disordini mieloproliferativi Ph negativi, linfoma non-Hodgkin, mieloma multiplo, tumore del polmone, mesotelioma, tumore della mammella, carcinoma squamoso del collo e testa, sarcoma dei tessuti molli, osteosarcoma, tumore della tiroide, adenocarcinoma del colon-retto e glioblastoma.
- 7 . Vaccino secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il vaccino è adatto alla somministrazione per via sottocutanea, intradermica, intravenosa, intramuscolare, o per infusione venosa.
- 8. Uso della proteina WTl codificata dal gene del tumore di Wilms a sequenza intera per la produzione di un vaccino per la prevenzione e/o immunoterapia di tumori nell'uomo.
- 9. Uso secondo la rivendicazione 8, in cui la proteina WTl è di origine umana.
- 10. Uso secondo la rivendicazione 8 o la rivendicazione 9, in cui la proteina WTl è associata ad un adiuvante.
- 11. Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 8 a 10, in cui la proteina WTl è prodotta con la tecnologia del DNA ricombinante.
- 12. Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 8 a 11, in cui la proteina WTl è una proteina di fusione.
- 13. Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 8 a 12, in cui il tumore è selezionato fra ■leucemia mieloide acuta, leucemia linioblastica acuta, leucemia mieloide cronica sindromi mìelodisplastiche, disordini mieloproliferativi Ph negativi, linfoma non-Hodgkin, mieloma multiplo, tumore del polmone, mesotelioma, tumore della mammella, carcinoma squamoso del collo e testa, sarcoma dei tessuti molli, osteosarcoma, tumore della tiroide, adenocarcinoma del colon-retto e glioblastoma.
- 14. Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 8 a 13, in cui il vaccino è adatto alla somministrazione per via sottocutanea, intradermica, intravenosa, intramuscolare, o per infusione venosa.
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