PT2155243E - Composição e métodos compreendendo os antigénios klk3, psca ou folh1 - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

COMPOSIÇÃO E MÉTODOS COMPREENDENDO OS ANTIGÉNIOS KLK3, PSCA OU FOLH1

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona peptideos recombinantes KLK3, moléculas de nucleotideos recombinantes que codificam os mesmos, estirpes recombinantes de Listeria compreendendo os mesmos, e usos imunogénicos e terapêuticos dos mesmos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A estimulação de uma resposta imune é dependente da presença de antigénios reconhecidos como estranhos pelo sistema imune do hospedeiro. Antigénios bacterianos, tais como Salmonella enterica e Mycobacterium bovis BCG permanecem no fagossoma e estimulam as células T CD4+ via a apresentação de antigénios através de moléculas principais de histocompatibilidade da classe II. Em contraste, os antigénios de bactérias como a Listeria monocytogenes saem do fagossoma no citoplasma. A fuga fagolisossomal de L. monocytogenes é um mecanismo único, que facilita a apresentação de antigénios de histocompatibilidade principal da classe I de antigenos listeriais. Esta fuga é dependente da citolisina ativada por sulfidrilo formadora de poros, listeriolisina 0 (LLO).

ActA é uma proteina listerial associada à superfície, e age como um andaime em células hospedeiras infetadas para facilitar a polimerização, a montagem e a ativação dos polímeros da actina hospedeira, a fim de propulsionar o organismo Listeria através do citoplasma. Pouco depois da entrada no citosol de células de mamifero, a L. monocytogenes induz polimerização de filamentos de actina hospedeira e usa a força gerada pela polimerização de actina para se mover, em primeiro lugar intracelularmente e, em seguida, a partir de uma célula para outra. Uma única proteina bacteriana, ActA, é responsável por mediar a nucleação de actina e a motilidade à base de actina. A proteina ActA fornece vários sitios de ligação para componentes do citoesqueleto hospedeiro, agindo assim como um andaime para montar a maquinaria da polimerização celular de actina. 0 terminal NH2 de ActA liga-se à actina monomérica e atua como um fator de promoção de nucleação constitutivamente ativo, estimulando a atividade de nucleação intrínseca da actina. ActA e hly são ambas membros do grupo de genes de 10 kb regulado pela transcrição do ativador PrfA, e é regulado para cima cerca de 226 vezes no citoplasma dos mamíferos. O cancro da próstata é o tipo mais frequente de cancro em homens americanos e é a segunda causa mais importante de morte relacionada ao cancro nessa população. Prostate Specific Antigen (PSA) é um marcador para o cancro da próstata, que é altamente expresso por tumores da próstata. Existe uma grande necessidade sentida para desenvolver composições e métodos para melhorar a imunogenicidade de antigénios, antigénios especialmente úteis na prevenção e tratamento de tumores e patogénios intracelulares.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona uma estirpe de Listeria recombinante expressando um péptido de fusão de uma peptidase 3 (KLK3) relacionada com a calicreina, que está operacionalmente ligada a um peptideo do terminal Nterminal de listeriolisina não-hemolitica (LLO) , compreendendo o referido péptido de fusão a sequência da SEQ ID N° : 54 ou uma sequência pelo menos 99% homóloga da mesma, em que o referido péptido LLO do terminal N aumenta a imunogenicidade do péptido de fusão, e em que o péptido KLK3 não contém uma sequência de sinal. Numa forma de realização, a estirpe recombinante de Listeria é passada através de um animal hospedeiro. A estirpe recombinante Listeria pode ser uma estirpe auxotrófica de Listeria ou uma estirpe recombinante de Listeria monocytogenes. A estirpe auxotrófica de Listeria pode ser um mutante dal/dat ou ainda compreender uma deleção no gene endógeno ActA. A estirpe auxotrófica de Listeria pode compreender um vetor de expressão episómico compreendendo uma enzima metabólica que complementa a auxotrofia da estirpe auxotrófica de Listeria, e a enzima metabólica pode ser uma enzima de alanina racemase ou uma enzima de transferase de D-aminoácido. A presente invenção também proporciona um polipéptido recombinante que compreende um péptido de fusão de um péptido KLK3 que está operacionalmente ligada a um péptido do terminal N de LLO, em que o referido polipéptido recombinante compreende a sequência de SEQ ID N°: 54 ou uma sequência pelo menos 99% homóloga da mesma, em que o referido péptido LLO do terminal N aumenta a imunogenicidade do péptido de fusão, e em que o péptido KLK3 não contém uma sequência de sinal. A invenção também proporciona uma molécula de nucleótidos que codifica o polipéptido recombinante, e um vetor de vacina recombinante que codifica o polipeptideo recombinante ou compreendendo a molécula de nucleótidos que codifica o polipéptido recombinante. A presente invenção também fornece uma vacina compreendendo a estirpe recombinante de Listeria, o polipeptideo recombinante ou a molécula de nucleótidos que codifica o polipéptido recombinante, e um adjuvante. A invenção proporciona a estirpe recombinante de Listeria, ou uma composição imunogénica compreendendo o polipéptido recombinante, ou as sequências de nucleótidos recombinantes, para utilização como um medicamento. A invenção proporciona ainda a estirpe recombinante de Listeria, ou uma composição imunogénica compreendendo o polipeptideo recombinante ou o nucleótido recombinante, para utilização na indução de uma resposta imune anti-KLK3 num sujeito. A invenção também proporciona a estirpe recombinante de Listeria, o polipéptido recombinante, ou as sequências de nucleótidos recombinantes, para utilização no tratamento, inibição ou supressão de uma peptidase 3 relacionada com a calicreina (KLK3) que expressa o cancro da próstata num indivíduo, em que o sujeito monta uma resposta imune contra o cancro da próstata expresso pela proteína KLK3. 0 polipéptido recombinante pode ser produzido por um processo compreendendo o passo de conjugação química de um polipéptido compreendendo o péptido KLK3 para um polipéptido compreendendo o péptido LLO do terminal N.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Lm-E7 e Lm-LL0-E7 usam diferentes sistemas de expressão para expressar e segregar E7. Lm-E7 foi gerado através da introdução de uma cassete de genes no dominio orfZ do genoma de L. monocytogenes (A) . 0 promotor hly conduz a expressão da seguência de sinal hly e os cinco primeiros aminoácidos (AA) de LLO seguidos de HPV-16 E7. B) Lm-LL0-E7 foi gerado pela transformação da estirpe prfA“ XFL-7 com o plasmideo PGG-55. PGG-55 tem a expressão conduzida do promotor hly de uma fusão não-hemolitica de LL0-E7. pGG-55 também contém o gene prfA para selecionar para a retenção de plasmideo por XFL-7 in vivo.

Figura 2. Lm-E7 e Lm-LL0-E7 segregam E7. Lm-Gag (pista 1), Lm-E7 (pista 2), Lm-LLO-NP (pista 3), Lm-LL0-E7 (pista 4), XFL-7 (pista 5), e 10403S (pista 6) foram cultivados durante a noite a 37°C em caldo de Luria-Bertoni. Números eguivalentes de bactérias, tal como determinado por OD a 600 nm de absorvância, foram sedimentadas e 18 ml de cada sobrenadante foi precipitado com TCA. A expressão de E7 foi analisada por Western blot. A mancha foi sondada com um mAb anti-E7, seguido por conjugado com HRP anti-ratinho (Amersham) e, em seguida desenvolvida utilizando reagentes de deteção ECL.

Figura 3. A. Eficácia imunoterapêutica tumoral de fusões LLO-E7. O tamanho do tumor em milímetros em ratinhos é mostrado em 7, 14, 21, 28 e 56 dias pós-inoculação do tumor. Ratinhos normais: triângulos abertos; Lm-LLO-E7: circulos preenchidos; Lm-E7: diamantes cheios; Lm-Gag: X's; e Lm-LLO-NP: sinais +. B. eficácia imunoterapêutica tumoral de fusões LLO-Ova.

Figura 4. Os esplenócitos de ratinhos imunizados com Lm-LL0-E7 proliferam quando expostos a células TC-1. Ratinhos C57BL/6 foram imunizados e reforçados com Lm-LL0-E7, Lm-E7, ou estirpes de controlo rLm. Os esplenócitos foram recolhidos 6 dias após o reforço e revestidos com células CT-1 irradiadas com as proporções ilustradas. As células foram pulsadas com 3H-timidina e colhidas. Cpm é definida como (cpm experimental) - (sem TC-1 de controlo).

Figura 5. Eficácia imunoterapêutica tumoral do antigénio NP expresso em LM. 0 tamanho do tumor em milímetros em ratinhos é mostrado em 10, 17, 24, e 38 dias pós-inoculação do tumor. Ratinhos normais: X's; ratinhos administrados com Lm-LLO-NP: diamantes preenchidos; Lm-NP: quadrados; Lm-Gag: circulos preenchidos.

Figura 6. Representação de construções de virus vaccinia que expressam as diferentes formas da proteina E7 de HPV16.

Figura 7. VacLLOE7 provoca regressão a longo prazo de tumores estabelecidos a partir de 2 x 105 células TC-1 injetados sc em ratinhos C57BL/6. Os ratinhos foram injetados ip 11 e 18 dias após a inoculação do tumor com 107 UFP de VacLLOE7, VacSigE7LAMP-l, ou VacE7/rato ou foram deixados sem tratamento (normal). Utilizaram-se oito ratos por grupo de tratamento, e a secção transversal de cada tumor (média de duas medições) é mostrado para os dias indicados após a inoculação do tumor.

Figura 8. A. Representação esquemática dos insertos de plasmideo utilizados para criar vacinas 4 LM. Inserção Lm-LLO-E7 contém todos os genes de Listeria utilizados. Contém o promotor hly, os primeiros 1,3 kb do gene hly (que codifica a proteina LLO), e o gene HPV-16 E7. O primeiro de 1,3 kb de hly inclui a sequência de sinal (SS) e a região PEST. Lm-PEST-E7 inclui o promotor hly, a sequência de sinal e as sequências PEST e E7, mas exclui o restante do gene truncado LLO. Lm-APEST-E7 exclui a região PEST, mas contém o promotor hly, a sequência de sinal, E7, e o restante do LLO truncado. Lm-E7epi tem apenas o promotor hly, a sequência de sinal, e E7. B. Representação esquemática do sistema de expressão pActA-E7 utilizado para expressar e segregar E7 a partir de bactérias recombinantes de Listeria. 0 promotor hly (Phly) conduz a expressão, o gene prfA é utilizado para selecionar a retenção de plasmideo por Listeria recombinante in vivo. C. Painel superior: construções de Listeria contendo regiões PEST induzem a regressão do tumor. Triângulos fechados: ratinhos normais; circulos: Lm-LL0-E7; quadrados: Lm-E7epi; sinais +: Lm-APEST-E7; triângulos abertos: Lm-PEST-E7. D. Tamanhos médios dos tumores no dia 28 de desafio pós-tumor em duas experiências separadas. E. Construções de Listeria contendo regiões PEST induzem uma maior percentagem de linfócitos específicos de E7 no baço. Média e SE de dados de três experiências são retratadas.

Figura 9. Tamanho do tumor em ratinhos que receberam Lm-ActA-E7 (quadrados abertos), Lm-E7 (circulos a cheio), Lm-LL0-E7 (X), e os ratinhos normais (não vacinados; triângulos a cheio).

Figura 10. A. Indução de E7 especifica de IFN-gama secretoras de células T CD8+ nos baços e os números de penetração dos tumores, em ratinhos que receberam células tumorais TC-1 e subsequentemente foi administrado Lm-E7, Lm-LLO-E7, Lm-ActA-E7, ou nenhuma vacina (normal). B. Indução e penetração de E7 especifico nas células CD8+ nos baços e os tumores dos ratos descritos para (A).

Figura 11. Construções de Listeria que contêm regiões PEST induzem uma percentagem mais elevada de linfócitos específicos de E7 dentro do tumor. A. Dados representativos de uma experiência. B. média e SE de dados a partir de todas as três experiências.

Figura 12. Mapa esquemático de pAdv34 em pGG55. CAT (G-) , cloranfenicol acetiltransferase para E. coli; CAT (G +) , cloranfenicol acetiltransferase para Lm; Ori, região de replicação; prfA, Lm fator A de regulação de patogenicidade; LLO-PSA, fusão entre o gene que codifica um listeriolisina 0 do terminal C truncado, incluindo o seu promotor, e o gene que codifica a PSA humana.

Figura 13. Expressão e secreção de proteína de fusão de LLO-PSA por Lm-llo-PSA. As bactérias foram crescidas durante a noite e os sobrenadantes celulares foram precipitados na presença de TCA a 10% a 4°C. As proteínas foram separadas por SDS-PAGE e colocadas a hibridar com anticorpos anti-PSA (A) e anti-LLO (B). O controlo positivo de PSA foi um lisado Bsci de células infetadas com PSA/vaccinia. A estirpe bacteriana parental XFL7 e duas estirpes irrelevantes Lm que expressam fragmentos de antigénio Her2/neu humano foram usadas como controlos negativos.

Figura 14. Absorção e crescimento de Lm-LLO-PSA em macrófagos. Murinos macrófagos como células (J774A.1) foram infetados in vitro com MOI de 1:1 com Lm-LLO-PSA, o Lm XFL7 parental ou estirpes do tipo selvagem Lm 10403s. O crescimento intracelular foi monitorizado durante 8 horas por colheita de amostras em duplicado a cada outra hora a partir das células, seguida por titulação das bactérias em placas de BHI. UFC: unidades formadoras de colónia.

Figura 15. Regressão do tumor após imunização I«zn-LLO-PSA.

Grupos de 8 ratinhos foram inoculados sc com 5 x 106 células T-PSA23 no dia 0 e imunizados três vezes com intervalos de uma semana, ip com Lm-LLO-PSA, Lm-LL0-E7 ou não receberam nenhuma imunização (normal). Os tumores foram monitorizados semanalmente utilizando um paquímetro eletrónico e são expressos como a média dos dois diâmetros perpendiculares. Os ratinhos foram sacrificados quando os tumores atingiram um tamanho de 15-18 mm de diâmetro. Os resultados estão representados como o tamanho do tumor a partir de cada ratinho individual. A tabela mostra o número de ratinhos em cada grupo que estavam livres do tumor (painel superior) ou sobreviveram (painel inferior) em relação ao número total de ratos por grupo de uma semana ou 7-8 semanas pós-inoculação do tumor. Esta experiência foi repetida três vezes mostrando resultados semelhantes.

Figura 16. Células PSA especificas T CD8+ nos baços e tumores. As células T-PSA23 foram implantadas sc como uma mistura com matrigel. Os ratos foram imunizados duas vezes com Lm-LLO-PSA ou Lm-LLO-El ou foram deixados normais. Os baços e os tumores foram extraídos 6 dias após a segunda imunização e testados para a presença de células T CD8+ positivas/tetrâmero PSA por análise de FACS. As imunizações com Lm-LLO-PSA resultaram na geração de células especificas de PSA T CD8+ em ambos os baços (painel superior) e tumores (painel inferior). Os números em cada canto indicam a% de células positivas de PSA ao longo do número total de células T CD8+ em cada tecido.

Figura 17. Efeito da vacinação com vacinas Lm na presença de Tregs no baço e tumores. Esplenócitos isolados e TILs extraídos de 3 ratinhos portadores de tumor da experiência anterior, foram reunidos e corados para CD4, CD25 e FoxP3 para elucidar o efeito de imunização com Lm-LLO-PSA na presença de Tregs nestes tecidos. Cada coluna apresenta a% de população de células CD25+/FoxP3+ T em relação ao número total de células T CD4+ em cada conjunto.

Figura 18. Secreção de IFN-γ estimulada por vacinação com Lm-ILLO-PSA detetada por ensaio ELISpot. Os ratinhos foram imunizados três vezes com 0,1 LD50 de Lm-LLO-PSA. Esplenócitos isolados foram preparados e incubados durante a noite na presença de um 1 μΜ de péptido H2Db especifico para PSA, HCIRNKSVIL. A secreção de IFN-γ por células isoladas foi detetada utilizando o kit de ELISpot de Mabtech e expresso como células formadoras de manchas (SFC)/milhão de células. Os esplenócitos de ratinhos imunizados com Lm-LLO-WTl ou ratinhos normais foram usados como controlos negativos. (*Indica a significância estatística com os grupos normais com p <0,0001).

Figura 19. Produção de IFN-γ estimulada por vacinação com Lm-LLO-PSA detetada por coloração intracelular. Os ratinhos foram imunizados três vezes com 0,1 LD50 de Lm-LLO-PSA. Esplenócitos isolados foram preparados e incubados durante 5 horas na presença de um péptido H2Db especifico para PSA. A produção de IFN-γ por células T CD8+ foi determinada tal como descrita nos métodos. Esplenócitos de ratinhos imunizados com Lm-LLO-WTl ou ratinhos normais foram usados como controlos negativos.

Figura 20. Respostas citotóxicas especificas de PSA em ratinhos. Os animais foram imunizados três vezes com 0,1 LD50 de Lm-LLO-PSA, Lm-LLO-HPVl6E7E6 (como controlo negativo Lm) ou foram deixados normais. Esplenócitos isolados foram preparados e incubados com PSA expressando células estimuladoras, durante 5 dias. Ensaio de CTL foi realizado durante 4 horas por incubação das células efectoras (E) com células alvo EL4 pulsadas com péptido PSA H2Db: A) a uma proporção E:T/concentração de péptido fixo diferente (1 μΜ); ou Β) a uma proporção E:T fixa de 1:25, mas diferentes concentrações de péptido.

Figura 21. Comparação dos efeitos anti-tumorais de Lm-LLO-PSA com outras vacinas baseadas em PSA. Grupos de 8 ratinhos foram inoculados sc com 5 x 106 células T-PSA23 no dia 0 e imunizados duas vezes com intervalos de uma semana, com Lm-LLO-PSA, vaccinia-PSA ou pADN (PSA + GM-CSF) ou não receberam qualquer imunização (normal). Os tumores foram monitorizados semanalmente utilizando um paquímetro eletrónico e são expressos como a média dos dois diâmetros perpendiculares. Os ratinhos foram sacrificados quando os tumores atingiram um tamanho de 20 mm de diâmetro. Os resultados estão representados como o tamanho do tumor a partir de cada ratinho individual (A) . A tabela mostra o número de ratinhos em cada grupo que estavam livres do tumor ou sobreviveram durante 8 semanas pós-inoculação do tumor. B) Média dos tamanhos dos tumores de cada grupo. Quando os tumores atingiram um tamanho de 20 mm, os ratos foram sacrificados. Foi-lhes dado um valor de 20 mm para a criação da curva média. Esta experiência foi repetida duas vezes e mostrou resultados semelhantes.

Figura 22. Estabilidade de Lm-PSA. Lm-PSA foi cultivado e passado por 7 dias consecutivos, in vitro. O ADN do plasmideo foi purificado a partir de amostras bacterianas tomadas todos os dias durante o crescimento in vitro e testadas através da amplificação do gene de PSA por PCR (A) ou por mapeamento de restrição do plasmideo EcoRI/Hindlll (B) .

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona péptidos de fusão KLK3-LL0, polipéptidos recombinantes compreendendo os mesmos, moléculas recombinantes de nucleótidos que codificam os mesmos, estirpes recombinantes de Listeria compreendendo os mesmos, métodos imunogénicos e terapêuticos utilizando os mesmos.

Especificamente, a presente invenção proporciona uma estirpe recombinante de Listeria expressando um péptido de fusão de uma peptidase 3 (KLK3) relacionada com o péptido calicreina, que está operacionalmente ligada a um peptideo do terminal N de listeriolisina não-hemolitica (LLO), compreendendo o referido péptido de fusão a sequência de SEQ ID N° : 54 ou uma sequência pelo menos 99% homóloga da mesma, em que o referido péptido LLO do terminal N aumenta a imunogenicidade do péptido de fusão, e em que o péptido KLK3 não contém uma sequência de sinal. Numa forma de realização, a estirpe recombinante de Listeria pode ter sido passada através de um animal hospedeiro. A estirpe recombinante de Listeria pode ser uma estirpe auxotrófica de Listeria ou uma estirpe recombinante de Listeria monocytogenes. A estirpe auxotrófica de Listeria pode ser um mutante dal/dat ou ainda compreender uma deleção no gene endógeno ActA. A estirpe auxotrófica de Listeria pode compreender um vetor de expressão episómico compreendendo uma enzima metabólica que complementa a auxotrofia da estirpe auxotrófica de Listeria, e a enzima metabólica pode ser uma enzima de alanina racemase ou uma enzima de transferase de D-aminoácido. A presente invenção também proporciona um polipéptido recombinante que compreende um péptido de fusão de um péptido KLK3 que está operacionalmente ligada a um peptideo do terminal N de LLO, em que o referido polipéptido recombinante compreende a sequência de SEQ ID N°: 54 ou uma sequência pelo menos 99% homóloga da mesma, em que o referido péptido do terminal N de LLO aumenta a imunogenicidade do péptido de fusão, e em que o péptido KLK3 não contém uma sequência de sinal. A invenção também proporciona uma molécula de nucleótidos que codifica o polipéptido recombinante, e um vetor de vacina recombinante que codifica o polipeptideo recombinante ou compreendendo a molécula de nucleótidos que codifica o polipéptido recombinante. A presente invenção também fornece uma vacina compreendendo a estirpe recombinante de Listeria, o polipeptideo recombinante ou a molécula de nucleótidos que codifica o polipéptido recombinante, e um adjuvante. A invenção proporciona a estirpe recombinante de Listeria, ou uma composição imunogénica compreendendo o polipéptido recombinante, ou as sequências de nucleótidos recombinante, para utilização como um medicamento. A invenção proporciona ainda a estirpe recombinante de Listeria, ou uma composição imunogénica compreendendo o polipeptideo recombinante ou o nucleótido recombinante, para utilização na indução de uma resposta imune anti-KLK3 num sujeito. A invenção também proporciona a estirpe recombinante de Listeria, o polipéptido recombinante, ou as sequências de nucleótidos recombinante, para utilização no tratamento, inibição ou supressão de uma peptidase 3 relacionada com a calicreina (KLK3) do cancro da próstata num indivíduo, em que o sujeito monta uma resposta imune contra a proteina KLK3 que expressa o cancro da próstata. 0 polipéptido recombinante pode ser produzido por um processo compreendendo o passo de conjugação quimica de um polipéptido compreendendo o péptido KLK3 para um polipéptido compreendendo o péptido do terminal N de LLO.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona uma estirpe recombinante de Listeria expressando um péptido de fusão duma peptidase 3 (KLK3)-LL0 relacionada com a calicreina, compreendendo o referido péptido de fusão a sequência de SEQ ID N°: 54 ou uma sequência pelo menos 99% homóloga da mesma. Numa outra forma de realização, a sequência do péptido KLK3 na proteina de fusão é selecionada a partir de SEQ ID N°s: 25, 32, 34, e 39. Noutra forma de realização, a sequência do péptido KLK3 compreende uma sequência selecionada a partir de SEQ ID N°s: 25, 32, 34, e 39. Numa outra forma de realização, o péptido KLK3 é um fragmento imunogénico de um péptido KLK3 maior, em que a sequência do péptido KLK3 maior é uma sequência selecionada a partir de SEQ ID N°s: 25, 32, 34, e 39. Numa outra forma de realização, a sequência do péptido KLK3 compreende um fragmento imunogénico de uma sequência selecionada a partir de SEQ ID N°s: 25, 32, 34, e 39.

Ao "péptido KLK3" falta o péptido de sinal KLK3. Numa outra forma de realização, o termo refere-se a uma proteína KLK3 que contém a sequência inteira de KLK3 exceto o péptido de sinal KLK3. "Sequência sinal KLK3" refere-se, numa outra concretização, a qualquer sequência de sinal encontrado na natureza numa proteína KLK3. Numa outra forma de realização, uma proteína KLK3 dos métodos e composições da presente invenção não contém qualquer sequência de sinal.

Numa forma de realização, "variante" refere-se a um aminoácido ou sequência de ácido nucleico (ou em outras formas de realização, um organismo ou tecidos), que é diferente da maioria da população, mas ainda é suficientemente semelhante ao modo comum para ser considerado um deles, por exemplo, as variantes de splicing.

Numa forma de realização, "isoforma" refere-se a uma versão de uma molécula, por exemplo, uma proteína, apenas com ligeiras diferenças em relação à outra isoforma, ou versão, da mesma proteína. Numa forma de realização, as isoformas podem ser produzidas a partir de genes diferentes, mas relacionados, ou noutra forma de realização, pode surgir a partir do mesmo gene por processamento alternativo. Numa outra forma de realização, as isoformas são causadas por polimorfismos de um único nucleótido.

Numa forma de realização, "fragmento" refere-se a uma proteína ou polipéptido que é menor ou compreende menos aminoácidos do que a proteína de comprimento completo ou polipéptido. Numa outra forma de realização, refere-se a um fragmento de ácido nucleico que é menor ou compreende menos nucleótidos que o ácido nucleico de comprimento total. Numa outra forma de realização, o fragmento é um fragmento do terminal N. Numa outra forma de realização, o fragmento é um fragmento do terminal C. Numa forma de realização, o fragmento é uma secção intrasequential da proteina, péptido, ou ácido nucleico. Numa forma de realização, o fragmento é um fragmento funcional. Numa outra forma de realização, o fragmento é um fragmento imunogénico. Numa forma de realização, um fragmento tem 10-250 ácidos nucleicos ou aminoácidos.

Numa forma de realização, um "homólogo" refere-se a uma sequência de ácido nucleico ou de aminoácido, o qual partilha uma determinada percentagem de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico ou de aminoácido em particular. Numa outra forma de realização, uma sequência útil na composição e métodos como aqui proporcionada pode ser um homólogo de qualquer sequência aqui descrita. Numa forma de realização, um homólogo partilha pelo menos 99% de identidade com uma sequência particular. Numa forma de realização, é para ser entendido que um homólogo de qualquer uma das sequências tal como aqui proporcionada e/ou como aqui descrito é considerado como sendo uma parte da presente invenção.

Numa forma de realização, "heterólogo", tal como aqui utilizado descreve um ácido nucleico, aminoácido, péptido, polipéptido, proteina, etc. derivado de uma espécie diferente da espécie de referência. Assim, por exemplo, uma estirpe de Listeria que expressa um polipéptido heterólogo, numa forma de realização, expressaria um polipéptido que não é nativo ou endógeno com a estirpe de

Listeria, ou em uma outra forma de realização, um polipeptídeo que não é normalmente expresso pela estirpe de Listeria, ou noutra forma de realização, um polipéptido a partir de uma fonte diferente da estirpe de Listeria.

Numa forma de realização, "endógeno", como aqui utilizado descreve um ácido nucleico, aminoácido, péptido, polipéptido, proteína, etc., que se tenha desenvolvido ou originado dentro do organismo de referência ou surgido de causas dentro do organismo de referência. Numa outra forma de realização, refere-se a endógeno nativo.

Numa outra forma de realização, a peptidase 3 relacionada com a calicreína (proteína KLK3) que é a fonte de um péptido KLK3 dos métodos e composições da presente invenção é uma proteína de PSA.

Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é uma proteína KLK3 madura. Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é uma proteína pró-KLK3. Numa outra forma de realização, a sequência líder foi removida a partir de uma proteína KLK3 madura dos métodos e composições da presente invenção. Um exemplo de uma proteína KLK3 madura é codificado por aa378-1088 da SEQ ID N° : 40.

Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 que é a fonte de um péptido KLK3 dos métodos e composições da presente invenção é uma proteína KLK3 humana.

Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 tem a sequência de SEQ ID N° : 25 (número de acesso GenBank X14810) . Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é um fragmento da SEQ ID N°: 25.

Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é codificada por uma molécula tendo a sequência de nucleótidos de SEQ ID N° : 26 (número de acesso GenBank X14810) . Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é codificada pelos resíduos 401-446, 1688-1847, 3477-3763, 3907-4043, 5413-5568, ou uma combinação dos mesmos, de SEQ ID N°: 26. Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é codificado por um homólogo da SEQ ID N° : 26. Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é codificada por uma variante de SEQ ID N°: 26. Numa outra forma de realização, a proteína KLK3é codificada por uma isoforma da SEQ ID N°: 26. Em outra forma de realização, a proteína KLK3 é codificada por um fragmento da SEQ ID N°: 26.

Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 tem a sequência da SEQ ID N°: 32 (número de acesso GenBank NM 001648) . Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é um fragmento da SEQ ID N°: 32.

Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é codificada por uma molécula tendo a sequência de nucleótidos da SEQ ID N°: 33 (número de acesso GenBank NM_001648). Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é codificada pelos resíduos 42-827 da SEQ ID N°: 33. Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é codificada por um homólogo da SEQ ID N°: 33. Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é codificada por uma variante da SEQ ID N°: 33. Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é codificada por uma isoforma da SEQ ID N° : 33. Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é codificada por um fragmento da SEQ ID N°: 33.

Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 tem a sequência da SEQ ID N° : 34 (número de acesso GenBank BC056665). Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é um fragmento da SEQ ID N°: 34.

Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é codificada por uma molécula tendo a sequência de nucleótidos da SEQ ID N° : 35 (número de acesso GenBank BC056665). Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é codificada pelos resíduos 47-832 da SEQ ID N°: 35. Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é codificada por um homólogo da SEQ ID N°: 35. Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é codificada por uma variante da SEQ ID N°: 35. Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é codificada por uma isoforma da SEQ ID N° : 35. Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é codificada por um fragmento da SEQ ID N°: 35.

Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 tem a sequência da SEQ ID N° : 39 (número de acesso GenBank AJ459783). Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é um fragmento da SEQ ID N°: 39.

Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é codificada por uma molécula tendo a sequência de nucleótidos da SEQ ID N° : 40 (número de acesso GenBank X07730). Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é codificada pelos resíduos 67-1088 da SEQ ID N° : 40. Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é codificada por um homólogo da SEQ ID N°: 40. Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é codificada por uma variante da SEQ ID N°: 40. Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é codificada por uma isoforma da SEQ ID N°: 40. Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é codificada por um fragmento da SEQ ID N°: 40.

Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 tem uma sequência definida num dos seguintes Números de Acesso do GenBank: BC005307, AJ310938, AJ310937, AF335478, AF335477, M27274, e M26663. Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é codificada por uma sequência apresentada num dos acima Números de Acesso do GenBank.

Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 é codificada por uma sequência apresentada num dos seguintes Números de Acesso do GenBank: NM_001030050, NM_001030049, NM_001030048, AJ459782, AJ512346, ou AJ459784.

Numa outra forma de realização, a proteína KLK3 tem a sequência que compreende uma sequência estabelecida num dos seguintes Números de Acesso do GenBank: X13943, X13942, X13940, XI3941, e X13944.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma vacina compreendendo uma estirpe recombinante de Listeria da presente invenção e um adj uvante.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição imunogénica compreendendo um recombinante Listeria estirpe da presente invenção.

Numa outra forma de realização, a estirpe recombinante de Listeria expressa um polipéptido recombinante que compreende um péptido de fusão KLK3:LLO. Numa outra forma de realização, a estirpe recombinante de Listeria compreende um polipéptido recombinante, em que o péptido recombinante compreende um péptido de fusão KLK3:LLO. Numa outra forma de realização, a estirpe recombinante de Listeria compreende um nucleótido recombinante que codifica para o polipéptido recombinante. 0 péptido de fusão KLK3:LLO expresso pela Listeria recombinante aumenta a imunogenicidade do péptido KLK3. 0 péptido não-KLK3/não-F0LHl no péptido de fusão da presente invenção é um péptido LLO, que em outra forma de realização, pode ser um péptido de LLO não hemolítico

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma estirpe recombinante de Listeria compreendendo um polipéptido recombinante da presente invenção. Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma estirpe recombinante de Listeria compreendendo um nucleótido recombinante que codifica para um polipéptido recombinante da presente invenção. Numa outra forma de realização, a estirpe da vacina Listeria é uma estirpe da espécie Listeria monocytogenes (LM) . Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo a estirpe de Listeria. Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição imunogénica que compreende a estirpe de Listeria.

Numa outra forma de realização, a estirpe de Listeria é uma estirpe recombinante de Listeria seeligeri. Numa outra forma de realização, a estirpe de Listeria é uma estirpe recombinante de Listeria grayi. Numa outra forma de realização, a estirpe de Listeria é uma estirpe recombinante de Listeria ivanovii. Numa outra forma de realização, a estirpe de Listeria é uma estirpe recombinante de Listeria murrayi. Numa outra forma de realização, a estirpe de Listeria é uma estirpe recombinante de Listeria welshimeri. Numa outra forma de realização, a estirpe de Listeria é uma estirpe recombinante de quaisquer outras espécies de Listeria conhecidas na técnica.

Numa outra forma de realização, uma estirpe recombinante de Listeria da presente invenção terá sido passada através de um animal hospedeiro. A passagem pode maximizar a eficácia da estirpe como um vetor de vacina, estabilizar a imunogenicidade da estirpe de Listeria, estabilizar a virulência da estirpe de Listeria, aumentar a imunogenicidade da estirpe de Listeria, aumentar a virulência da estirpe de Listeria, remover subestirpes instáveis da estirpe de Listeria, e/ou reduzir a prevalência de subestirpes instáveis da estirpe de Listeria. Numa outra forma de realização, a estirpe de Listeria contém uma inserção genómica do gene que codifica o péptido KLK3. Numa outra forma de realização, a estirpe de Listeria transporta um plasmideo compreendendo o gene que codifica o péptido de fusão recombinante KLK3:LLO. Métodos para passar uma estirpe recombinante de Listeria por meio de um animal hospedeiro, são bem conhecidos na técnica, e são descritos, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente US 2006/0233835. Numa outra forma de realização, a passagem é realizada por qualquer outro método conhecido na técnica.

Numa outra forma de realização, a estirpe recombinante de Listeria utilizada nos métodos da presente invenção foi armazenada num banco de células congeladas ou num banco de células liofilizadas. O banco de células pode ser um banco de células mestre, um banco de células de trabalho, e/ou um banco de células de Good Manufacturing Practices (GMNP). Ο banco de células pode ser destinado à produção de material de grau clinico e/ou está em conformidade com as práticas de regulação para uso humano. "Good Manufacturing Practices" são definidas, em outra modalidade, pelo Código de Regulamentos Federais dos Estados Unidos (21 CFR 210-211). Numa outra forma de realização, "Good Manufacturing Practices" são definidas por outras normas de produção de material de grau clinico ou para consumo humano; por exemplo, as normas de um pais que não seja os Estados Unidos.

Numa outra forma de realização, uma estirpe recombinante de Listeria utilizada na presente invenção é de um lote de doses de vacina, ou seja a partir de um banco ou uma reserva congelada ou liofilizada produzida por um método aqui descrito.

Numa outra forma de realização, um banco de células, lote congelado, ou lote de doses de vacina da presente invenção exibe viabilidade após a descongelação de mais do que 90%. Numa outra forma de realização, o descongelamento segue o armazenamento para criopreservação e armazenamento congelado durante 24 horas. Numa outra forma de realização, o armazenamento é durante 2 dias, 3 dias, 4 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 5 meses, 6 meses, durante 9 meses, ou o armazenamento é por 1 ano.

Numa outra forma de realização, um banco de células, lote congelado, ou lote de doses de vacina da presente invenção são criopreservadas por um método que compreende o cultivo de uma cultura da estirpe de Listeria num meio de nutrientes, congelando a cultura numa solução que compreende glicerol, e armazenar a estipe de Listeria abaixo de -20 graus Celsius. Numa outra forma de realização, a temperatura é de cerca de -70 graus Celsius. Numa outra forma de realização, a temperatura é de cerca de -70 - “ 80 graus Celsius.

Numa outra forma de realização, um banco de células, lote congelado, ou lote de doses de vacina da presente invenção são criopreservadas por um método que compreende o cultivo de uma cultura de estirpe de Listeria num meio definido (como descrito abaixo), congelar a cultura numa solução compreendendo glicerol, e armazenando a estirpe Listeria abaixo de -20 graus Celsius. Numa outra forma de realização, a temperatura é de cerca de -70 graus Celsius. Numa outra forma de realização, a temperatura é de cerca de -70 - “ 80 graus Celsius. Numa outra forma de realização, qualquer meio microbiológico definido pode ser usada neste método.

Numa outra forma de realização, a cultura (por exemplo, a cultura de uma estirpe de vacina de Listeria é usada para produzir um lote de doses de vacina de Listeria) é inoculado a partir de um banco de células. Numa outra forma de realização, a cultura é inoculada a partir de uma massa congelada. Numa outra forma de realização, a cultura é inoculado a partir de uma cultura de partida. Numa outra forma de realização, a cultura é inoculada a partir de uma colónia. Numa outra forma de realização, a cultura é inoculada numa fase de crescimento semi-log. Numa outra forma de realização, a cultura é inoculada, aproximadamente, numa fase de crescimento semi-log. Numa outra forma de realização, a cultura é inoculada numa outra fase de crescimento. A solução utilizada para congelação pode conter um outro aditivo coligativo ou aditivo com propriedades anti-congelação, em lugar de ou em adição ao glicerol. Numa outra forma de realização, o aditivo é o manitol, DMSO, sacarose, ou qualquer outro aditivo coligativo ou aditivo com propriedades anticongelantes que é conhecido na técnica. 0 meio nutriente utilizado para o cultivo de uma cultura de estirpe de Listeria pode ser LB, TB, ou Terrific Broth modificado, livre de produto animal. Numa outra forma de realização, o meio nutriente é um meio definido. Numa outra forma de realização, o meio nutriente é um meio definido da presente invenção. Numa outra forma de realização, o meio nutriente é qualquer outro tipo de meio nutriente conhecido na técnica. 0 passo de cultura pode ser realizado num agitador rotativo, tal como um frasco agitador, um fermentador descontínuo, um tanque ou balão agitado, um fermentador com elevação de ar, um reator em descontínuo com alimentação, um reator celular contínuo, ou um reator de células imobilizado.

Numa outra forma de realização, um valor de pH é mantido constante durante o crescimento da cultura (por exemplo, num fermentador de lote). Numa outra forma de realização, o pH é mantido a cerca de 7,0, cerca de 6, cerca de 6,5, cerca de 7,5, ou o pH é cerca de 8. Numa outra forma de realização, o pH é 6,5-7,5. Numa outra forma de realização, o pH é 6-8. Numa outra forma de realização, o pH é 6-7. Numa outra forma de realização, o pH é 7-8.

Numa outra forma de realização, é mantida uma temperatura constante durante o crescimento da cultura. Numa outra forma de realização, a temperatura é mantida a cerca de 37 °C. Numa outra forma de realização, a temperatura é de 37 °C, 25 °C, 27 °C, 30°C, 34°C, 36°C, 38°C, ou numa outra forma de realização, a temperatura é de 39°C.

Numa outra forma de realização, uma concentração de oxigénio dissolvido é mantido constante durante o crescimento da cultura. Numa outra forma de realização, a concentração de oxigénio dissolvido é mantida a 20% de saturação. Numa outra forma de realização, a concentração é de 15% de saturação, ou 16% de saturação, ou 18%, ou 22%, ou 25%, ou 30%, ou 35%, ou 40%, ou 45%, ou 50%, ou 55%, 60%, ou 65%, ou 70%, ou 75%, ou 80%, ou 85%, ou 90%, ou 95%, ou 100% de saturação, ou próximo de 100% de saturação.

Numa outra forma de realização, a cultura de Listeria é em azoto líquido, seguido por armazenamento à temperatura final de congelamento. Numa outra forma de realização, a cultura é congelada de forma mais gradual; por exemplo, por colocação num frasco de cultura na temperatura de armazenamento final.

Numa outra forma de realização, a temperatura de armazenamento da cultura situa-se entre 20 e ” 80 graus Celsius (°C). Numa outra forma de realização, a temperatura é significativamente inferior ” 20°C. Numa outra forma de realização, a temperatura não é mais quente do que ”70°C, ou é ”70°C ou é de cerca de ”70°C. Numa outra forma de realização, a temperatura é de ”20°C ou cerca de ”20°C, 30 °C, ”40 °C, ”50 °C, ”60 °C, ”80°C, -30 - ”70°C, -40 - ”70°C, -50 - -7 0 °C, -60 - '7 0 °C, -30 - "80°C, -40 - "80°C, -50 - ' 80°C, ”60 - ”80°C, -70 - ”80°C, ou a temperatura é mais fria do que ” 70°C ou mais fria do que ”80°C.

Os métodos para a liofilização e criopreservação de estirpes recombinantes de Listeria são bem conhecidos dos peritos na técnica. A composição contendo Listeria é, num outro enquadramento, uma composição imunogénica. Numa outra forma de realização, a composição é inerentemente imunogénica em virtude de compreender uma estirpe de Listeria da presente invenção. Numa outra forma de realização, a composição compreende ainda um adjuvante.

Em algumas formas de realização, o termo "compreendendo" refere-se à inclusão de outros polipéptidos recombinantes, sequências de aminoácidos, ou sequências de ácidos nucleicos, bem como a inclusão de outros polipéptidos, sequências de aminoácidos, ou sequências de ácidos nucleicos, que podem ser conhecidos na técnica, que numa forma de realização pode compreender antigénios ou polipéptidos de Listeria, sequências de aminoácidos, ou sequências de ácidos nucleicos. Em algumas formas de realização, o termo "consistindo essencialmente em" refere-se a uma composição para utilização nos métodos aqui proporcionados, como a que contém o polipéptido recombinante específico, sequência de aminoácidos, ou sequência de ácido nucleico, ou seu fragmento. No entanto, outros polipéptidos, sequências de aminoácidos, ou sequências de ácidos nucleicos podem ser incluídos que não estão envolvidos diretamente na utilidade do polipéptido recombinante (s). Em algumas formas de realização, o termo "consistindo em" refere-se a uma composição para utilização nos métodos aqui proporcionados tendo como um polipéptido recombinante, em particular, a sequência de aminoácidos, ou sequência de ácido nucleico, ou um fragmento ou combinação de polipéptidos recombinantes, as sequências de aminoácidos, ou as sequências de ácidos nucleicos ou seus fragmentos como aqui descrito.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona um polipéptido recombinante, que compreende um péptido KLK3 operacionalmente ligado a um péptido a LLO o qual aumenta a imunogenicidade do péptido KLK3.

Tal como se prevê, uma estirpe recombinante de Listeria que expressa uma fusão LL0-KLK3 protege os ratos de tumores e provoca formação de CTL específica do antigénio. Assim, as estirpes de Listeria que expressam antigénios específicos da próstata (por exemplo, antigénio específico/KLK3 da próstata) são antigénicas e eficazes em métodos de vacinação. Além disso, as fusões de LLO e seus fragmentos, para os antigénios específicos da próstata (por exemplo, antigénio específico da próstata/KLK3) são antigénicos e eficazes em métodos de vacinação.

Além disso, como aqui proporcionado, Lm-LL0-E7 induz a regressão de tumores imortalizados HPV-16 subcutâneos estabelecidos a partir de ratinhos C57B1/6 (Exemplo 1) . Além disso, como aqui proporcionado, Lm-LLO-NP protege os ratinhos de RENCA-NP, um carcinoma de célula renal (Exemplo 3). Além disso, como aqui divulgado, a fusão de antígenos a sequências ActA e semelhantes a PEST produz resultados semelhantes. Assim, LLO não hemolítico, ActA, e sequências semelhantes a PEST são todas eficazes em aumentar a imunogenicidade dos peptídeos KLK3, PSCA e F0LH1.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma vacina que compreende um polipéptido de fusão recombinante da presente invenção e um adjuvante.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição imunogénica que compreende um polipéptido de fusão recombinante da presente invenção.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona um vetor de vacina recombinante que codifica um polipéptido de fusão recombinante da presente invenção.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma molécula de nucleótidos que codifica um polipéptido de fusão recombinante da presente invenção.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma vacina compreendendo uma molécula de nucleótidos da presente invenção e um adjuvante.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição imunogénica que compreende uma molécula de nucleótidos da presente invenção.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona um vetor de vacina recombinante que compreende uma molécula de nucleótidos da presente invenção.

Em outras formas de realização, o adjuvante dos métodos e composições da presente invenção é o Montanide ISA 51. Montanide ISA 51 contém um óleo metabolizável natural e um agente emulsionante refinado. Numa outra forma de realização, o adjuvante é GM-CSF. Numa outra forma de realização, o adjuvante é KLH. GM-CSF recombinante é uma proteína humana cultivada, em outra forma de realização, numa levedura (S. cerevisiae) do vetor. GM-CSF promove a expansão clonal e a diferenciação de células hematopoiéticas progenitoras, APC e as células dendríticas e as células T. 0 adjuvante pode ser um factor de crescimento de citoquina, uma população de células, QS21, adjuvante incompleto de

Freund, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, BCG, alum, uma interleucina, um oligonucleótido CpG não metilado, glicósidos de pena, monofosforil-lípido A, lipossomas, um mitogénio bacteriano, uma toxina bacteriana, ou uma quimiocina. Numa outra forma de realização, o adjuvante é qualquer outro tipo de adjuvante conhecido na técnica. Noutra concretização, a vacina da presente invenção compreende dois dos adjuvantes acima. Noutra concretização, a vacina compreende mars do que dois dos adjuvantes acima.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo uma estirpe recombinante de Listeria da presente invenção para utilização na indução de uma resposta imune anti-KLK3 num sujeito.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo uma estirpe recombinante de Listeria da presente invenção, para utilização no tratamento de um tumor que expressa KLK3 num sujeito. Numa outra forma de realização, o tumor que expressa KLK3 é um cancro da próstata expressando KLK3. Noutra concretização, o tumor que expressa KLK3 é um carcinoma da próstata expressando KLK3.

Numa concretização, "tratamento" refere-se tanto a tratamento terapêutico como a medidas profiláticas ou preventivas, em que o objeto consiste em evitar ou diminuir a condição ou distúrbio patológico alvo, tal como aqui descrito. Assim, numa forma de realização, o tratamento pode incluir afetar directamente ou curar, suprimir, inibir, prevenir, reduzir a gravidade de, retardar o surgimento de, redução dos sintomas associados com a doença, distúrbio ou condição, ou uma combinação dos mesmos. Assim, numa concretização, "tratamento" refere-se, inter alia, a retardar a progressão, acelerar a remissão, induzir a remissão, aumentar a remissão, acelerar a recuperação, aumentando ou diminuindo a eficácia de resistência aos agentes terapêuticos alternativos, ou uma combinação dos mesmos. Numa forma de realização, "prevenir" ou "impedir" refere-se, inter alia, a atrasar o aparecimento dos sintomas, prevenção da recaida de uma doença, diminuindo o número ou frequência de episódios recorrentes, aumentando a latência entre os episódios sintomáticos, ou uma combinação dos mesmos. Numa forma de realização, "suprimit" ou "inibir" ou "proteger contra" referem-se, inter alia, a reduzir a gravidade dos sintomas, reduzindo a gravidade de um episódio agudo, reduzindo o número dos sintomas, reduzindo a incidência de sintomas relacionados com a doença, reduzir a latência dos sintomas, melhorar os sintomas, reduzindo sintomas secundários, reduzindo as infeções secundárias, prolongar a sobrevivência do paciente, ou uma combinação dos mesmos.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo uma estirpe recombinante de Listeria da presente invenção para utilização na proteção de um sujeito humano contra um tumor que expressa KLK3. Numa outra forma de realização, o tumor que expressa KLK3 é um cancro da próstata expressando KLK3. Noutra concretização, o tumor que expressa KLK3 é um carcinoma da próstata expressando KLK3.

Os métodos para avaliar a eficácia de vacinas contra o cancro da próstata são bem conhecidos na técnica, e são descritos, por exemplo, em Dzojic H et ai. (Adenovirus-mediated CD40 ligand therapy induces tumor cell apoptosis and systemic immunity in the TRAMP-C2 mouse prostate cancer model. Prostate. 2006 Jun 1,-66(8):831-8), Naruishi K et al. (Adenoviral vector-mediated RTVP-1 gene-modified tumor cell-based vaccine suppresses the development of experimental prostate cancer. Cancer Gene Ther. 2006 Jul; 13 (7) : 658-63) , Sehgal I et al. (Cancer Cell Int. 2006 Aug 23,-6:21), and Heinrich JE et al. (Vaccination against prostate cancer using a live tissue factor deficient cell line in Lobund-Wistar rats. Cancer Immunol Immunother 2007,-56 (5) :725-30) .

Numa outra forma de realização, o modelo de cancro da próstata utilizado para os métodos de ensaio e as composições da presente invenção é o modelo de tumor ratinho que expressa PSA TRAMP-C1 (TPSA23). Numa outra forma de realização, o modelo de cancro da próstata é um modelo de célula 178-2 BMA. Numa outra forma de realização, o modelo de cancro da próstata é um modelo de células de adenocarcinoma PAIII. Numa outra forma de realização, o modelo de cancro da próstata é um modelo de PC-3M. Numa outra forma de realização, o modelo de cancro da próstata é de outro modelo de cancro da próstata conhecido na técnica.

Numa outra forma de realização, a vacina é testada em seres humanos, e a eficácia é monitorizada utilizando métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, medindo diretamente respostas de células CD4+ e CD8+ T, ou medindo a progressão da doença, por exemplo, por determinação do número ou tamanho de metástases tumorais, ou monitorizando sintomas da doença (tosse, dor no peito, perda de peso, etc.) . Os métodos para avaliar a eficácia de uma vacina contra o cancro da próstata em sujeitos humanos são bem conhecidos na técnica, e são descritos, por exemplo, em Uenaka A et ai. (T cell immunomonitoring and tumor responses in patients immunized with a complex of cholesterol-bearing hydrophobized pullulan (CHP) and NY-ESO-1 protein. Cancer Immun. 2007 Apr 19;7:9) and Thomas-Kaskel AK et al. (Vaccination of advanced prostate cancer patients with PSCA and PSA peptide-loaded dendritic cells induces DTH responses that correlate with superior overall survival. Int J Cancer. 2006 Nov 15; 119 (10) : 2428-34) .

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição imunogénica que compreende um polipéptido de fusão recombinante da presente invenção para utilização na indução de uma resposta imune anti-KLK3 num sujeito.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição imunogénica que compreende um polipéptido de fusão recombinante da presente invenção para utilização no tratamento de um tumor que expressa KLK3 num sujeito. Numa forma de realização, o tumor que expressa KLK3 é um cancro da próstata expressando KLK3. Noutra concretização, o tumor que expressa KLK3 é um carcinoma da próstata expressando KLK3.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição imunogénica que compreende um polipéptido de fusão recombinante da presente invenção para utilização na proteção de um sujeito humano contra um tumor que expressa KLK3. Numa outra forma de realização, o tumor que expressa KLK3 é um cancro da próstata expressando KLK3. Noutra concretização, o tumor que expressa KLK3 é um carcinoma da próstata expressando KLK3.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma molécula de nucleótidos da presente invenção para utilização na indução de uma resposta imune anti-KLK3 num sujeito.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição imunogénica que compreende uma molécula de nucleótidos da presente invenção para utilização no tratamento de um tumor que expressa KLK3 num sujeito. Numa outra forma de realização, o tumor que expressa KLK3 é um cancro da próstata expressando KLK3. Noutra concretização, o tumor que expressa KLK3 é um carcinoma da próstata expressando KLK3.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição imunogénica que compreende uma molécula de nucleótidos da presente invenção para utilização na proteção de um sujeito humano contra um tumor que expressa KLK3. Numa outra forma de realização, o tumor que expressa KLK3 é um cancro da próstata expressando KLK3. Noutra concretização, o tumor que expressa KLK3 é um carcinoma da próstata expressando KLK3.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo uma estirpe recombinante de Listeria, em que a estirpe compreende um polipéptido de fusão recombinante da presente invenção, para utilização na indução de uma resposta imune anti-KLK3 num sujeito.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo uma estirpe recombinante de Listeria, em que a estirpe compreende um polipéptido de fusão recombinante da presente invenção, para utilização no tratamento de um tumor que expressa KLK3 num sujeito. Noutra concretização, o tumor que expressa KLK3 é um cancro da próstata expressando KLK3. Noutra concretização, o tumor que expressa KLK3 é um carcinoma da próstata expressando KLK3.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo uma estirpe recombinante de Listeria, em que a estirpe compreende um polipéptido de fusão recombinante da presente invenção para utilização na proteção de um sujeito humano contra um tumor que expressa KLK3. Noutra concretização, o tumor que expressa KLK3 é um cancro da próstata expressando KLK3. Noutra concretização, o tumor que expressa KLK3 é um carcinoma da próstata expressando KLK3.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo uma estirpe recombinante de Listeria da presente invenção para utilização em impedir um crescimento de um tumor do cancro da próstata expressam KLK3 num sujeito.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo uma estirpe recombinante de Listeria da presente invenção para utilização em superar uma tolerância imunitária de um sujeito a um tumor do cancro da próstata expressando KLK3. Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma combinação de tratamentos, que numa forma de realização compreende o início com Listeria e o reforço com o polipéptido.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição imunogénica que compreende um polipéptido de fusão recombinante da presente invenção para utilização em impedir o crescimento de um tumor do cancro da próstata expressando KLK3 num sujeito.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição imunogénica que compreende um polipéptido de fusão recombinante da presente invenção para uso em superar uma tolerância imunitária de um sujeito a um tumor do cancro da próstata expressando KLK3.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição imunogénica que compreende uma molécula de nucleótidos da presente invenção para utilização em impedir o crescimento de um tumor do cancro da próstata expressando KLK3 num sujeito.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição imunogénica que compreende uma molécula de nucleótidos da presente invenção para utilização em superar uma tolerância imunitária de um sujeito a um tumor do cancro da próstata expressando KLK3. "Tolerância", refere-se, numa outra forma de realização, a uma falta de capacidade de resposta do hospedeiro a um antigénio. Numa outra forma de realização, o termo refere-se a uma falta de capacidade de resposta detetável do hospedeiro a um antigénio. Numa outra forma de realização, o termo refere-se a uma falta de imunogenicidade de um antigénio num hospedeiro. Numa outra forma de realização, a tolerância é medido pela falta de capacidade de resposta a um ensaio de CTL in vitro. Numa outra forma de realização, a tolerância é medida pela falta de capacidade de resposta num ensaio de hipersensibilidade do tipo retardado. Numa outra forma de realização, a tolerância é medida pela falta de capacidade de resposta em qualquer outro ensaio adequado conhecido na técnica. Numa outra forma de realização, a tolerância é determinada ou medida como descrito nos Exemplos aqui apresentados. "Superar" refere-se, numa outra concretização, a uma tolerância reversível com uma vacina. Numa outra forma de realização, o termo refere-se a atribuição da resposta imune detetável por uma vacina. Numa outra forma de realização, a superação da tolerância imunológica é determinada ou medida como descrito nos Exemplos aqui apresentados.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona um estirpe de Listeria expressando KLK3 da presente invenção para utilização no tratamento, ou impedir a progressão de, hiperplasia benigna da próstata (BPH) num sujeito.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma estirpe de Listeria expressando KLK3 da presente invenção para utilização no tratamento ou impedir a progressão da neoplasia intra-epitelial prostática (PIN) num sujeito.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona um péptido de fusão contendo KLK3 da presente invenção para utilização no tratamento ou impedir a progressão da BPH num sujeito.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona um péptido de fusão contendo KLK3 da presente invenção para utilização no tratamento ou impedir a progressão da PIN num sujeito

Numa outra forma de realização, a presente invenção fornece proteínas de fusão KLK3 codificando uma molécula de nucleótidos da presente invenção para utilização no tratamento ou impedir a progressão da BPH num sujeito.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma proteina de fusão KLK3 codificando uma molécula de nucleótidos da presente invenção para utilização no tratamento ou impedir a progressão da neoplasia intra-epitelial da próstata num sujeito.

Noutra concretização, as proteínas de fusão da presente invenção não precisam de ser expressas por LM, mas sim podem ser expressas e isoladas a partir de outros vetores e sistemas de células utilizadas para a expressão da proteína e o isolamento.

Como aqui fornecidas, fusões LL0-E7 apresentam eficácia terapêutica significativa. Nestas experiências, foi construído um vetor de vaccinia que expressa E7 como uma proteína de fusão com uma forma truncada não-hemolítica de LLO. A expressão do produto de fusão LL0-E7 por uma placa de vaccinia purificada foi verificada por Western Blot utilizando um anticorpo dirigido contra a sequência da proteína de LLO. Vac-LL0-E7 foi demonstrado produzir células CD8+ T específicas para LLO e E7, conforme determinado utilizando os epítopos de LLO (91-99) e E7 (49— 57) de ratinhos Balb/c e C57/BL6, respetivamente. Os resultados foram confirmados por um ensaio de CTL (Exemplo 4) .

Assim, a expressão de um antigénio, por exemplo, KLK3, PSCA ou F0LH1, como uma proteína de fusão com uma forma truncada não-hemolítica de LLO, ActA, ou uma sequência semelhante a PEST em sistemas de células hospedeiras em Listeria e sistemas de células hospedeiras que não Listeria resulta numa maior imunogenicidade do antigénio. Embora as experiências comparativas tenham sido realizadas com vaccinia, são conhecidos uma multiplicidade de outros plasmídeos e sistemas de expressão podem ser usados para expressar estas proteínas de fusão. Por exemplo, os vetores bacterianos úteis na presente invenção incluem, mas não estão limitados a Salmonella sp. , Shigella sp., BCG, L. monocytogenes e S. gordonii. Além disso, as proteínas de fusão podem ser entregues por vetores bacterianos recombinantes modificados para escapar à fusão fagolissossomal e viver no citoplasma da célula. Os vetores virais úteis na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, vaccinia, avipox, adenovirus, AAV, virus da vacina NYVAC, estirpe de vaccinia modificada Ankara (MVA), virus da Floresta Semliki, virus da encefalite equina Venezuelana, virus do herpes, e retrovirus. Vetores de ADN nus podem também ser utilizados.

Numa outra forma de realização, uma proteina KLK3 expressa pelas células tumorais alvo partilha a homologia completa com o péptido KLK3 (ao longo do comprimento do péptido) expressa pelo vetor Listerial. Numa outra forma de realização, a proteina KLK3 é altamente homóloga (ao longo do comprimento do péptido) com o péptido KLK3 expresso pelo vetor Listerial. "Altamente homólogo" refere-se, numa outra forma de realização, a uma homologia superior a 90%. Numa outra forma de realização, o termo refere-se a uma homologia superior a 92%. Numa outra forma de realização, o termo refere-se a uma homologia superior a 93%. Numa outra forma de realização, o termo refere-se a uma homologia superior a 94%. Numa outra forma de realização, o termo refere-se a uma homologia superior a 95%. Numa outra forma de realização, o termo refere-se a uma homologia superior a 96%. Numa outra forma de realização, o termo refere-se a uma homologia superior a 97%. Numa outra forma de realização, o termo refere-se a uma homologia superior a 98%. Numa outra forma de realização, o termo refere-se a uma homologia superior a 99%. Numa outra forma de realização, o termo refere-se a uma homologia de 100%. 0 péptido KLK3 da proteína de fusão da presente invenção tem, em outro modelo de realização, 240-261 aminoácidos (AA) de comprimento. Numa outra forma de realização, o comprimento é de 250-261 AA. Numa outra forma de realização, o comprimento é de cerca de 240 AA. Numa outra forma de realização, o comprimento é de cerca de 260 AA.

Numa outra forma de realização, o fragmento KLK3 consiste em cerca de 90% da proteína KLK3. Numa outra forma de realização, o fragmento consiste em cerca de 95% da mesma. Numa outra forma de realização, o fragmento consiste em cerca de 100% da mesma.

Numa outra forma de realização, um peptídeo de fusão KLK3 da presente invenção é um péptido imunogénico. "Imunogénico" refere-se, numa outra forma de realização, a uma capacidade para induzir uma resposta imunitária quando administrado a um sujeito. Numa outra forma de realização, o sujeito é um sujeito humano. Numa outra forma de realização, a resposta imunitária provocada é uma resposta de células T. Numa outra forma de realização, a resposta imunitária provocada é uma resposta de linfócitos T citotóxicos (CTL). Numa outra forma de realização, a resposta imunitária provocada é detetável. Numa outra forma de realização, a resposta imunitária provocada é detetável por um ensaio in vitro. Numa outra forma de realização, o ensaio é um ensaio de libertação de citoquina (por exemplo, fluorescência de células ativada por triagem; ou FACS). Numa outra forma de realização, o ensaio é um ensaio de libertação de crómio ou outro ensaio de citotoxicidade in vitro.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma vacina, composição imunogénica, ou um vetor recombinante compreendendo uma estirpe de Listeria da presente invenção para utilização na redução do tamanho de um tumor que expressa KLK3. Numa outra forma de realização, uma célula do tumor expressa KLK3.

Numa outra forma de realização, a presente invenção fornece uma quantidade eficaz de uma vacina compreendendo: (a) uma estirpe recombinante de Listeria compreendendo um fragmento do terminal N de uma proteína de LLO fundida com um péptido KLK3; ou (b) um nucleótido recombinante que codifica o polipéptido recombinante para utilização em suprimir a formação de um tumor que expressa KLK3.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma vacina, composição imunogénica, ou vetor que compreende um polipéptido de fusão recombinante do presente invenção para utilização na redução de um tamanho de um tumor que expressa KLK3. Numa outra forma de realização, uma célula do tumor expressa KLK3.

Numa outra forma de realização, a presente invenção fornece uma quantidade eficaz de uma vacina compreendendo: (a) um polipéptido recombinante compreendendo um fragmento do terminal N de uma proteína de LLO fundido com um péptido KLK3; ou (b) um nucleótido recombinante que codifica o polipéptido recombinante para utilização em suprimir a formação de um tumor que expressa KLK3.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma vacina, composição imunogénica, ou vetor que compreende uma molécula de nucleótidos recombinante da presente invenção para utilização na redução de um tamanho de um tumor que expressa KLK3. Numa outra forma de realização, uma célula do tumor expressa KLK3.

Numa outra forma de realização, a presente invenção fornece uma quantidade eficaz de uma vacina compreendendo: (a) uma molécula de nucleótidos recombinante compreendendo um fragmento do terminal N de uma proteína de LLO fundido com um péptido KLK3; ou (b) um nucleótido recombinante que codifica o polipéptido recombinante para utilização em suprimir a formação de um tumor que expressa KLK3.

Na presente invenção, o péptido de fusão recombinante das utilizações médicas e composições da presente invenção é um péptido de fusão de LL0-KLK3 compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID N°: 54. Em outra forma de realização, o péptido de fusão tem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 54. Numa outra forma de realização, o péptido de fusão é homólogo à sequência apresentada na SEQ ID N°: 54, e tem uma percentagem de identidade com a SEQ ID N°: 54 maior do que 99%. A sequência da proteína de LLO utilizada para construir as vacinas da presente invenção é, em outro modelo de realização, um fragmento da SEQ ID N°: 17 (número de acesso GenBank P13128 ; a sequência de ácido nucleico é apresentada no número de acesso GenBank X15127). Os primeiros 25 aminoácidos da pró-proteína correspondente a esta sequência é a sequência de sinal e são cortados a partir de LLO quando é segregado pela bactéria. Assim, nesta forma de realização, a proteina ativa de comprimento completo LLO é de 504 residuos de comprimento.

Numa outra forma de realização, "péptido LLO" e "fragmento de LLO" referem-se a um fragmento do terminal N de uma proteina de LLO. Numa outra forma de realização, os termos referem-se a uma proteina LLO de comprimento completo mas não hemolitica. Numa outra forma de realização, os termos referem-se a uma proteina não-hemolitica que contém uma mutação de ponto na cisterna 484 da sequência ID N°: 17 ou um residuo correspondente da mesma numa proteina homóloga LLO.

Numa outra forma de realização, o fragmento do terminal N-de uma proteina de LLO utilizado em composições e métodos da presente invenção tem a sequência da SEQ ID N°: 18.

Tal como aqui divulgado, estirpes recombinantes de Listeria que expressam as fusões de sequências de antigénio semelhantes a PEST induzem imunidade anti-tumor (Exemplo 5) e geram células T infiltrantes tumorais especificas para o antigénio (Exemplo 6).

Numa outra forma de realização da presente invenção, "ácidos nucleicos" ou "nucleótido" refere-se a uma cadeia de, pelo menos, duas combinações de base açúcar-fosfato. O termo inclui, numa forma de realização, ADN e ARN. "Nucleótidos" refere-se, numa forma de realização, às unidades monoméricas dos polímeros de ácido nucleico. O ARN pode ser, numa forma de realização, sob a forma de um tARN (ARN de transferência), snARN (ARN nuclear pequeno), rARN (ARN ribossómico), mARN (ARN mensageiro), ARN antessentido, ARN inibitório pequeno (siARN), micro ARN (miARN) e ribozimas. Foi descrito o uso de siRNA e miARN (Caudy AA et ai, Genes & Devei. 16:2491-96 e as referências ai citadas). 0 ADN pode estar na forma de ADN de plasmideo, ADN virai, ADN linear, ADN cromossómico ou derivados destes grupos. Além disso, estas formas de ADN e ARN podem ser de cadeia simples, duplas, triplas, ou quádruplas. 0 termo também inclui, noutra concretização, os ácidos nucleicos artificiais que podem conter outros tipos de estruturas, mas as mesmas bases. Numa forma de realização, o ácido nucleico artificial é um PNA (ácido nucleico peptidico). 0 PNA contém estruturas peptidicas e bases de nucleótidos e são capazes de se ligar, numa forma de realização, a ambas as moléculas de ADN e ARN. Numa outra forma de realização, o nucleótido é oxetano modificado. Numa outra forma de realização, o nucleótido é modificado por substituição de uma ou mais ligações fosfodiéster com uma ligação fosforotioato. Numa outra forma de realização, o ácido nucleico artificial contém qualquer outra variante da estrutura de fosfato de ácidos nucleicos nativos conhecidos na técnica. A utilização de ácidos nucleicos fosforotioato e PNA são conhecidos para os peritos na técnica, e são descritos em, por exemplo, Nielsen PE, Curr Opin Struct Biol 9:353-57; e Raz NK et ai. Biochem Biophys Res Commun. 297:1075-1084. A produção e utilização de ácidos nucleicos são conhecidas dos peritos na técnica e está descrita, por exemplo, em Molecular Cloning, (2001) , Sambrook e Russell, eds. e Methods in Enzymology: Methods for molecular cloning in eukaryotic cells (2003) Purchio e CG Fareed. É também aqui descrito um kit compreendendo um reagente utilizado na realização da presente invenção. Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona um kit compreendendo uma composição, ferramenta ou instrumento da presente invenção.

Noutra concretização, o fragmento de LLO é ligado ao péptido KLK3 por conjugação quimica. Numa outra forma de realização, é utilizado paraformaldeido para a conjugação. Numa outra forma de realização, é utilizada maleimida para a conjugação. Numa outra forma de realização, a conjugação é realizada utilizando qualquer método adequado conhecido na técnica.

Numa outra forma de realização, o tumor alvo expressando KLK3 por composições da presente invenção é um cancro da próstata expressando KLK3. Noutra concretização, o tumor que expressa KLK3 é um carcinoma da próstata expressando KLK3.

Tal como aqui divulgado, o aumento da imunidade mediada por células foi demonstrado para as proteínas de fusão que compreendem um antigénio e LLO truncado contendo a sequência de aminoácidos semelhante a PEST, SEQ ID N°: 1. A ALLO utilizado em alguns dos Exemplos era de 416 aminoácidos de comprimento (seguinte à clivagem do péptido de sinal), como 88 residuos do terminal carboxilo, que é inclusivo do dominio de ativação contendo cisterna 484 foram truncados. No entanto, é evidente a partir da presente divulgação que outra ALLO sem o dominio de ativação, e em particular cisterna 484, são eficazes nos métodos da presente invenção.

Como aqui fornecido, a fusão de um antigénio a uma forma truncada não hemolitica da listeriolisina 0 (LLO) melhora a imunogenicidade. Um vetor de LM que expressa e segrega um produto de fusão da estirpe do virus do papiloma humano (HPV) 16 E7 e LLO era um imunoterapêutico do cancro mais potente para tumores imortalizadas por HPV do que LM segregando a proteína E7 sozinho. Além disso, um vírus de vaccinia recombinante que transporta o gene para a proteína de fusão E7-LL0 é um imunoterapêutico do cancro mais potente para tumores imortalizadas por HPV do que uma estirpe isogénica da vaccinia que transporta o gene para a proteína E7 sozinho. Em comparação, uma proteína de fusão curta Lm-AZ/-E7 compreendendo o antigénio E7 fundido com o promotor, sequência de sinal e os primeiros sete resíduos de AA de LLO era um imunoterapêutico antitumoral ineficaz. Esta proteína de fusão curta termina diretamente antes da sequência semelhante a PEST e não a contém. "Proteína de fusão" refere-se, numa outra forma de realização, a uma proteína que compreende duas ou mais proteínas ligadas entre si por ligações peptídicas ou outras ligações químicas. Numa outra forma de realização, as proteínas são diretamente ligados entre si por um peptídeo ou outra ligação química. Numa outra forma de realização, as proteínas são ligados em conjunto com um ou mais aminoácidos (por exemplo, um "espaçador") entre as duas ou mais proteínas.

As proteínas de fusão compreendendo um péptido KLK3 são, em outra forma de realização, preparadas por qualquer método adequado. Numa outra forma de realização, uma proteína de fusão é preparada por clonagem e restrição de sequências apropriadas ou por síntese química direta por métodos discutidos abaixo. Numa outra forma de realização, são clonadas subsequências e as subsequências apropriadas clivadas utilizando enzimas de restrição apropriadas. Os fragmentos são então ligados, em outra forma de realização, para produzir a sequência de ADN desejada. Noutra concretização, o ADN que codifica o péptido KLK3 é produzido usando métodos de amplificação de ADN, por exemplo, reação em cadeia da polimerase (PCR). Primeiro, os segmentos de ADN nativo em ambos os lados dos novos terminais são amplificados separadamente. A extremidade 5' de uma sequência amplificada codifica o péptido ligante, enquanto a extremidade 3' da outra sequência amplificada também codifica o peptideo ligante. Uma vez que a extremidade 5' do primeiro fragmento é complementar à extremidade 3' do segundo fragmento, os dois fragmentos (após purificação parcial, por exemplo em agarose LMP) podem ser utilizados como um modelo de sobreposição numa terceira reação de PCR. A sequência amplificada contém codões, o segmento do lado carboxi do local da abertura (formando agora a sequência de aminoácidos), o ligante, e a sequência de aminoácidos no lado do local da abertura (formando agora a sequência carboxilo). 0 gene de codificação do péptido KLK3 é então ligado a um plasmideo.

Numa outra forma de realização, o péptido KLK3 é conjugado com a proteina truncada LLO por qualquer um de uma série de meios bem conhecidos dos peritos na técnica. Numa outra forma de realização, o péptido KLK3 é conjugado, quer diretamente ou através de um ligante (espaçador), para a proteina. Numa outra forma de realização, em que tanto o péptido KLK3 e a proteina LLO são polipéptidos, a molécula quimérica é expressa de forma recombinante como uma proteina de fusão de cadeia simples.

Numa outra forma de realização, os péptidos e proteínas da presente invenção são prontamente preparados por, síntese do péptido em fase sólida padrão bem estabelecido (SPPS) , como descrito por Stewart et al. em Solid Phase Peptide Synthesis, 2a Edição, 1984, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois; e tal como descrito por Bodanszky e Bodanszky (The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, Nova Iorque). No início, um resíduo de aminoácido adequadamente protegido é ligado através do seu grupo carboxilo a um derivado de suporte polimérico, insolúvel, tal como poliestireno reticulado ou resina de poliamida. "Adequadamente protegido" refere-se à presença de grupos de proteção em ambos o grupo alfa-amino do aminoácido, e em quaisquer grupos funcionais de cadeia lateral. Os grupos protetores da cadeia lateral são geralmente estáveis com os solventes, reagentes e condições de reação utilizadas ao longo da síntese, e são removíveis sob condições que não afetam o produto final do péptido. A síntese do oligopeptídeo em passos é realizada pela remoção do grupo protetor de N a partir do aminoácido inicial, a par da mesma da extremidade carboxilo do aminoácido seguinte na sequência do péptido desejado. Este aminoácido é também adequadamente protegido. 0 carboxilo do aminoácido de entrada pode ser ativado para reagir com o terminal N do aminoácido ligado ao suporte por formação num grupo reativo, tal como a formação numa carbodiimida, um anidrido de ácido simétrico ou um grupo "éster ativo" tal como hidroxibenzotriazole ou ésteres de pentafluorofenil.

Exemplos de métodos de síntese de péptidos em fase sólida incluem o método BOC que utilizou terc-butiloxcarbonil como o grupo protetor de alfa-amino, e o método FMOC que utiliza 9-fluorenilmetiloxcarbonil para proteger o alfa-amino dos resíduos de aminoácidos, ambos os métodos são bem conhecidos pelos peritos na técnica. A incorporação de grupos de bloqueio N e/ou C também pode ser conseguida usando protocolos convencionais para métodos de síntese em fase sólida de péptidos. Para a incorporação de grupos de bloqueio do terminal C, por exemplo, a síntese do péptido desejado é tipicamente efetuada usando, como fase sólida, uma resina de suporte que foi modificada quimicamente de modo a que a clivagem a partir da resina resulte num péptido tendo o grupo de bloqueio do terminal C desejado. Para fornecer péptidos nos quais o terminal C suporta um grupo de bloqueio de amina primária, por exemplo, a síntese é efeituada usando uma resina p-

metilbenzidrilamina (MBHA) de modo que, quando a síntese de péptido estiver completa, o tratamento com ácido fluorídrico liberta o péptido amidado do terminal C desejado. Do mesmo modo, a incorporação de um grupo de bloqueio de N-metilamina no terminal C é conseguida usando N-metilaminoetil-DVB derivatizada, a resina, o qual após tratamento com HF liberta um péptido tendo um grupo N-metilamidado do terminal C. 0 bloqueio do terminal C por esterificação também pode ser conseguido utilizando procedimentos convencionais. Isto implica a utilização de resina/combinação de grupo de bloqueio que permite a libertação de péptido de cadeia lateral a partir da resina, para permitir por reação subsequente com o álcool desejado, para formar a função éster. Grupo de proteção FMOC, em combinação com resina DVB derivatizada com álcool metoxialcoxibenzil ou ligante equivalente, pode ser usado para este propósito, com a clivagem do suporte a ser efetuada por TFA em diclorometano. A esterificação da função carboxilo adequadamente ativada, por exemplo, com DCC, pode então prosseguir pela adição do álcool desejado, seguido pela desproteção e isolamento do produto de péptido esterifiçado. A incorporação de grupos de bloqueio do terminal N pode ser conseguida enquanto o péptido sintetizado ainda está ligado à resina, por exemplo por tratamento com um anidrido e nitrilo adequado. Para incorporar um grupo bloqueador acetilo no terminal N, por exemplo, a resina acoplada ao péptido pode ser tratada com 20% de anidrido acético em acetonitrilo. O produto do péptido bloqueado em N pode então ser clivado a partir da resina, desprotegido e subsequentemente isolado.

Numa outra concretização, para assegurar que o péptido obtido a partir de qualquer técnica de sintese quimica ou biológica é o péptido desejado, é realizada a análise da composição de péptido. Numa outra forma de realização, a análise da composição de aminoácido é conduzida utilizando espectrometria de massa de alta resolução para determinar o peso molecular do péptido. Alternativamente, ou adicionalmente, o teor de aminoácidos do péptido pode ser confirmado por hidrólise do péptido em ácido aquoso, separação, identificação e quantificação dos componentes da mistura utilizando HPLC, ou um analisador de aminoácidos. Sequenciadores de proteínas, que degradam sequencialmente o péptido e identificam os aminoácidos por ordem, podem também ser utilizados para determinar definitivamente a sequência do péptido.

Numa outra forma de realização, antes da sua utilização, o péptido é purificado para remover os contaminantes. A este respeito, será apreciado que o peptideo será purificado, de modo a cumprir as normas estabelecidas pelos órgãos e diretrizes regulamentares adequadas. Qualquer um de um número de procedimentos de purificação convencionais pode ser utilizado para atingir o nivel desejado de pureza, incluindo, por exemplo, cromatografia liquida de alta pressão de fase inversa (HPLC) utilizando uma coluna de silica alquilada tal como silica C4-, Cs_ ou Cis-. Uma fase móvel em gradiente de teor orgânico crescente é geralmente usada para atingir a purificação, por exemplo, acetonitrilo num tampão aquoso, usualmente contendo uma pequena quantidade de ácido trifluoroacético. Cromatografia de permuta iónica pode também ser utilizada para separar péptidos com base na sua carga. É usada a sintese em fase sólida no qual o AA do terminal C da sequência é ligado a um suporte insolúvel, seguido pela adição sequencial dos aminoácidos restantes da sequência, numa outra forma de realização, para a sintese quimica dos polipeptideos desta invenção. As técnicas para a sintese em fase sólida são descritas por Barany e Merrifield em Solid-Phase Peptide Synthesis; pp 3-284 em The Peptides: Analysis, Sinthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Parte A., Merrifield et al. J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963), e Stewart et al. , Solid Phase Peptide Synthesis, 2a ed. Pierce Chem. Co., Rockford, 111. (1984).

Numa outra forma de realização, os péptidos da presente invenção podem incorporar residuos de AA que são modificados sem afetar a atividade. Por exemplo, os terminais podem ser derivatizados para incluir grupos de bloqueio, ou seja, os substituintes quimicos adequados para proteger e/ou estabilizar os terminais N e C a partir de "degradação indesejável", um termo que pretende abranger qualquer tipo de degradação enzimática, quimica ou bioquímica do composto nos seus terminais, que é suscetível de afetar a função do composto, isto é, a degradação sequencial do composto a uma extremidade terminal do mesmo.

Numa outra forma de realização, grupos de bloqueio incluem grupos de proteção convencionalmente utilizados na arte da quimica de péptidos que não irão afetar adversamente as atividades do péptido in vivo. Por exemplo, grupos de bloqueio do terminal N adequados podem ser introduzidos por alquilação ou acilação do terminal N. Exemplos de grupos de bloqueio do terminal N adequados incluem grupos alquilo Ci -C5 ramificados ou não ramificados, grupos acilo tais como grupos formilo e acetilo, assim como as formas substituídos dos mesmos, tais como o grupo acetamidometilo (Acm). Análogos sesamino de aminoácidos são também grupos de bloqueio do terminal N úteis, e qualquer um pode ser acoplado ao terminal N do péptido ou usado em lugar do residuo do terminal N. Grupos de bloqueio do terminal C adequados, em que o grupo carboxilo do terminal C ou é incorporado ou não, inclui ésteres, cetonas ou amidas. Éster ou cetona formando grupos alquilo, particularmente grupos alquilo inferiores, tais como metilo, etilo e propilo, e os grupos amino de formação de amida, tais como aminas primárias (-NH2) , e grupos amino mono- e di-alquilo, tal como metilamino, etilamino, dimetilamino, dietilamino, metiletilamino e similares são exemplos de grupos de bloqueio do terminal C. Análogos de aminoácidos descarboxilados, tais como agmatina são também grupos de bloqueio do terminal C úteis e podem ser acoplados a qualquer residuo do péptido do terminal C ou utilizados em lugar do mesmo. Além disso, será apreciado que os grupos livres amino e carboxilo nos terminais podem ser removidos completamente a partir do péptido para se obter formas desamino e descarboxilado sem efeito sobre a atividade do péptido.

Numa outra forma de realização, outras alterações foram incorporadas sem afetar adversamente a atividade. Numa outra concretização, tais modificações incluem, mas não estão limitados a, substituição de um ou mais dos aminoácidos na forma natural L-isomérica com os aminoácidos na forma D-isomérica. Assim, o péptido pode incluir um ou mais de resíduos de D-aminoácido, ou pode compreender os aminoácidos que estão todos na forma-D. Formas retro-inversas de péptidos em conformidade com a presente invenção são também contempladas, por exemplo, péptidos invertidos em que todos os aminoácidos são substituídos com formas D-aminoácidos.

Numa outra forma de realização, sais de adição de ácido dos péptidos da presente invenção são utilizados como seus equivalentes funcionais. Numa outra concretização, um péptido de acordo com a presente invenção tratado com um ácido inorgânico tal como ácido clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, e semelhantes, ou um ácido orgânico, tal como um ácido acético, propiónico, glicólico, pirúvico, oxálico, málico, malónico, sucínico, maleico, fumárico, tatárico, cítrico, benzóico, cinâmico, mandélico, metanossulfónico, etanossulfónico, p-toluenossulfónico, salicílico e semelhantes, para proporcionar um sal solúvel em água do péptido é adequado para uso na invenção.

Numa outra forma de realização, as modificações (que normalmente não alteram a sequência primária) incluem a derivação química de polipéptidos in vivo, ou in vitro , por exemplo, acetilação, ou carboxilação. Também estão incluídas as alterações da glicosilação, por exemplo, aquelas feitas por modificação dos padrões de glicosilação de um polipeptídeo durante a sua síntese e processamento, ou em outros passos de processamento; por exemplo, através da exposição do polipeptídeo a enzimas que afetam a glicosilação, por exemplo, glicosilação de mamífero ou de enzimas de desglicosilação. Também englobadas são sequências que tenham resíduos de aminoácidos fosforilados, por exemplo, fosfotirosina, fosfoserina, ou fosfotreonina.

Em outra forma de realização os polipéptidos são modificados utilizando técnicas comuns de biologia molecular, de modo a melhorar a sua resistência à degradação proteolítica ou para otimizar as propriedades de solubilidade ou torná-los mais adequados como um agente terapêutico. Os análogos de tais polipeptídeos incluem aqueles que contêm resíduos diferentes de L-aminoácidos que ocorrem naturalmente, por exemplo, D-aminoácidos ou aminoácidos sintéticos que não ocorrem naturalmente. Os péptidos da invenção não estão limitados aos produtos de qualquer um dos processos exemplificativos específicos aqui listados.

Numa outra forma de realização, as proteínas de fusão quiméricas da presente invenção são sintetizadas utilizando metodologia de ADN recombinante. Geralmente isto envolve a criação de uma sequência de ADN que codifica a proteína de fusão, colocando o ADN numa cassete de expressão, tal como o plasmídeo da presente invenção, sob o controlo de um promotor/elemento regulador específico, e que expressam a proteína. 0 ADN que codifica uma proteína de fusão da presente invenção é preparado, em outra forma de realização, por qualquer método adequado, incluindo, por exemplo, a clonagem e a restrição de sequências adequadas e a síntese química direta por métodos tais como o método do fosfotriéster de Narang et al. (1979, Meth Enzymol 68:90-99); o método do fosfodiéster de Brown et al. (1979, Meth Enzymol 68:109-151); o método da dietilfosforamidite de Beaucage et al. (1981, Tetra Lett., 22:1859-1862); e o método em suporte sólido da Patente US 4458066. A síntese química produz um oligonucleótido de cadeia simples. Este é convertido, num outro modelo de realização, em ADN de cadeia dupla por hibridização com uma sequência complementar, ou por polimerização com uma polimerase de ADN utilizando a cadeia simples como um modelo. Um perito na técnica reconhecerá que enquanto a síntese química de ADN está limitada a sequências de cerca de 100 bases, sequências mais longas podem ser obtidas por ligação de sequências mais curtas.

Numa outra forma de realização, "ácido nucleico isolado" inclui uma sequência de ARN ou de ADN que codifica uma proteína de fusão da invenção, e quaisquer suas formas modificadas, incluindo a modificação química do ADN ou ARN que tornem a sequência de nucleótidos mais estável quando está livre de células ou quando está associada com uma célula. As modificações químicas de nucleótidos também podem ser usadas para melhorar a eficiência com a qual uma sequência de nucleótidos é absorvida por uma célula ou a eficiência com que é expressa numa célula. Tais modificações são detalhadas aqui noutro local. Qualquer e todas as combinações das modificações das sequências de nucleótidos são contemplados na presente invenção.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona um ácido nucleico isolado que codifica um péptido KLK3 operativamente ligado a uma sequência de LLO não hemolitica, em que o ácido nucleico isolado compreende adicionalmente um promotor/sequência reguladora, de tal forma que o ácido nucleico é de preferência capaz de dirigir a expressão da proteina codificada pelo ácido nucleico. Assim, a invenção abrange os vetores de expressão e métodos para a introdução de ADN exógeno em células com expressão concomitante do ADN exógeno nas células, tais como os descritos, por exemplo, em Sambrook et ai. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque), e em Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque).

Numa outra forma de realização, um nucleótido da presente invenção está operativamente ligado a um promotor/ sequência reguladora que dirige a expressão do péptido codificado na estirpe de Listeria. Promotores/sequências reguladoras úteis para dirigir a expressão constitutiva de um gene são bem conhecidas na técnicae incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, a PhiyA, PActA/ e promotores P60 de Listeria, o promotor Streptococcus bac, o promotor Streptomyces griseus SGIA, e o promotor B. thuringiensis phaZ. Assim, será apreciado que a invenção inclui a utilização de qualquer promotor/sequência reguladora que é capaz de expressão condutora da proteina desejada operacionalmente ligada aos mesmos.

Expressando um péptido KLK3 operativamente ligado a uma sequência LLO não-hemolitica utilizando um vetor permite o isolamento de grandes quantidades de proteína produzida de forma recombinante. São bem dentro da perícia do perito escolher promotores particulares/sequências reguladoras e ligar operativamente essas sequências reguladoras do promotor com uma sequência de ADN que codifica um polipéptido desejado. Tal tecnologia é bem conhecida na técnica e está descrita, por exemplo, em Sambrook et ai. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque), e em Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque).

Numa outra forma de realização, a presente invenção fornece um vetor compreendendo um ácido nucleico isolado que codifica um péptido KLK3 operativamente ligado a uma sequência LLO não-hemolitica. A incorporação de um ácido nucleico desejado num vetor e a escolha de vetores é bem conhecida na técnica tal como descrito em, por exemplo, Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque) , e em Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque).

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona células, vírus, provírus, e semelhantes, contendo estes vetores. Os métodos para produzir células que compreendem vetores e/ou ácidos nucleicos exógenos são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque), e em Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque).

Numa outra forma de realização, os ácidos nucleicos que codificam para um péptido KLK3 operativamente ligado a uma sequência LLO não-hemolitica são clonados num vetor de plasmideo. Numa outra forma de realização, uma estirpe recombinante de Listeria é transformada com o vetor de plasmideo.

Uma vez armado com a presente invenção, é rapidamente evidente para um perito na técnica que outros ácidos nucleicos que codificam para um péptido KLK3 operativamente ligado a uma sequência LLO não-hemolitico podem ser obtidos seguindo os procedimentos aqui descritos na secção pormenores experimentais para a geração de outras proteínas de fusão, tal como aqui descritos (por exemplo, mutagénese dirigida ao local, mutações por desvio de enquadramento, e semelhantes), e os procedimentos da técnica.

Os métodos para a geração de formas derivadas ou variantes das proteínas de fusão são bem conhecidos na técnica, e incluem, inter alia, a utilização de metodologias de ADN recombinante bem conhecidas na técnica, tais como, por exemplo, descrito em Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque) e Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, verde & Wiley, New York), e em outros lugares aqui.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona um ácido nucleico que codifica um péptido KLK3 operativamente ligado a uma sequência de LLO não hemolítica, em que um ácido nucleico que codifica um polipéptido marcador é covalentemente ligado ao mesmo. Isto é, a invenção abrange um ácido nucleico quimérico em que a sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido marcador é covalentemente ligado ao ácido nucleico que codifica uma proteína contendo o péptido KLK3. Tais marcadores de polipéptidos são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, a proteína fluorescente verde (GFP) , myc, myc-piruvato-quinase (PK-myc), His6, proteína de fixação da maltose (MBP), polipéptido marcador de hemaglutinina do vírus da gripe, polipéptido marcador flag (FLAG), e polipéptido marcador de glutationa-S-transferase (GST) . No entanto, a invenção não deve, de modo algum, ser interpretada de forma a limitar-se aos ácidos nucleicos que codificam os polipéptidos marcadores acima listados. Em vez disso, qualquer sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido que pode funcionar de uma maneira substancialmente semelhante a estes polipéptidos marcadores deve ser interpretada de forma a ser incluída na presente invenção.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona um péptido de fusão KLK3 com imunogenicidade melhorada. Isto é, como os dados aqui apresentados demonstram, um péptido KLK3 fundido com uma proteína LLO não-hemolítica truncada, quando administrada a um animal, provoca uma folga de tumores existentes e a indução de linfócitos citotóxicos específicos de antigénios capazes de se infiltrar no tumoral ou células infetadas. Quando armado com a presente revelação, e as utilizações médicas e composições aqui descritas, o perito na técnica irá prontamente perceber que a presente invenção é passivel de tratamento e/ou prevenção de uma variedade de doenças.

Numa outra forma de realização, um plasmideo disponível comercialmente é usado na presente invenção. Tais plasmídeos estão disponíveis a partir de uma variedade de fontes, por exemplo, Invitrogen (Carlsbad, Calif.), Stratagene (La Jolla, Calif.), Clontech (Paio Alto, Calif.), ou podem ser construídos utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Um plasmideo disponível comercialmente, tal como pET (Gibbstown, NJ) , que é um vetor de expressão procariota com uma origem procariótica de replicação e promotor/elementos reguladores para facilitar a expressão, num organismo procariota. A presente invenção compreende ainda a transformação de uma tal estirpe de Listeria com um plasmideo que compreende (a) um péptido KLK3; e (b) um ácido nucleico isolado que codifica para uma proteína LLO truncada. Numa outra forma de realização, se uma estirpe de vacina LM compreende uma deleção no gene prfA ou no gene actA, o plasmideo compreende um prfA gene ou actA a fim de complementar a mutação, restaurando assim a função da estirpe de vacina de L. monocytogenes. Como descrito aqui noutro local, métodos para transformar as bactérias são bem conhecidos na técnica, e incluem métodos competentes à base de células de cloreto de cálcio, métodos de electroporação, transdução mediada pelo bacteriófago, técnicas de transformação químicas, e físicas (de Boer et ai, 1989, Cell. 56:641-649; Miller et ai, 1995, FASEB J., 9:190-199; Sambrook et ai. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque; Ausubel et al. , 1997,

Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque; Gerhardt et al. , Eds., 1994, Methods for General and Molecular Bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, DC; Miller, 1992, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). 0 plasmideo da presente invenção compreende, numa outra forma de realização, o promotor/sequência reguladora operacionalmente ligado a um gene que codifica uma proteina de fusão.

Os plasmideos e outros vetores de expressão úteis na presente invenção são descritos aqui noutro local, e podem incluir caracteristicas tais como um promotor/sequência reguladora, uma origem de replicação para bactérias gram positivas e/ou gram negativas, e um ácido nucleico isolado que codifica uma proteina de fusão. Além disso, o ácido nucleico isolado codifica uma proteina de fusão que tem o seu próprio promotor adequado para a expressão de condução de um ácido nucleico isolado. Os promotores úteis para a expressão de condução num sistema bacteriano são bem conhecidos na técnica, e incluem o bacteriófago lambda, o promotor bla do gene da beta-lactamase de pBR322, e o promotor CAT do gene da cloranfenicol-acetiltransferase de pBR325. Outros exemplos de promotores procarióticos incluem os promotores principais esquerdo e direito do bacteriófago lambda (PL e PR) , os promotores trp, recA, lacZ, lacd, e promotores gal de E. coli, a alfa-amilase (Ulmanen et al, 1985. J. Bacteriol. 162:176-182) e os promotores específicos de S28 de B. subtilis (Gilman et al, 1984 Gene 32:11-20), os promotores dos bacteriófagos de Bacillus (Gryczan, 1982, In: The Molecular Biology of the Bacilli,

Academic Press, Inc., New York) e promotores Streptomyces (Ward et al, 1986, Mol. Gen. Genet. 203:468-478). Promotores procarióticos adicionais contemplados na presente invenção são revistos em, por exemplo, Glick (1987, J. Ind Microbiol. 1:277-282); Cenatiempo, (1986, Biochimie, 68: 505-516); e Gottesman, (1984, Ann Rev. Genet. 18:415-442). Outros exemplos de promotores/ elementos reguladores contempladas na presente invenção incluem, mas não estão limitados ao promotor prfA Listerial (GenBank Acc. No. Y07639), o promotor hly Listerial (GenBank Acc. No. X15127), e o promotor p60 Listerial (GenBank Acc. No. AY126342), ou seus fragmentos.

Numa outra forma de realização, uma estirpe de Listeria da presente invenção contém um gene integrado que codifica um péptido que compreende um péptido de fusão KLK3.

Numa outra forma de realização, uma estirpe de Listeria da presente invenção é criada usando um vetor de integração especifica de sitio. Numa outra forma de realização, uma estirpe de Listeria contendo um gene integrado é criada usando recombinação homóloga. Numa outra forma de realização, uma estirpe de Listeria contendo um gene integrado é criada usando qualquer outro método conhecido na técnica da integração de um gene no cromossoma de Listeria.

Numa outra forma de realização, o vetor de integração compreende um local PSA attPP'. Numa outra forma de realização, o vetor de integração compreende um gene que codifica uma integrase de PSA. Numa outra forma de realização, o vetor de integração compreende um local attPP U153'. Numa outra forma de realização, o vetor de integração compreende um gene que codifica uma integrase U153. Numa outra forma de realização, o vetor de integração compreende um local attPP A118'. Numa outra forma de realização, o vetor de integração compreende um gene que codifica uma integrase A118. Numa outra forma de realização, o vetor de integração compreende qualquer outro local attPP' conhecido na técnica. Numa outra forma de realização, o vetor de integração compreende qualquer outra integrase do fago conhecida na técnica.

Numa outra forma de realização, uma estirpe de Listeria de métodos e composições da presente invenção contém uma mutação ou uma auxotrofia no gene metabólico. Numa outra forma de realização, uma estirpe de Listeria de métodos e composições da presente invenção compreende ainda uma mutação no gene endógeno ActA. Numa outra forma de realização, um plasmídeo portador de um péptido de fusão KLK3 compreende um gene metabólico que complementa a mutação ou auxotrofia. Numa outra forma de realização, um péptido de fusão KLK3 que codifica o vetor de integração ou construção utilizada para a integração no cromossoma de Listeria contém um gene que complementa a mutação ou a auxotrofia. Numa outra forma de realização, o gene metabólico é utilizado para seleção em vez de um gene de resistência a antibiótico. Numa outra forma de realização, o gene metabólico é utilizado para seleção, em adição a um gene de resistência ao antibiótico.

Numa outra forma de realização, o gene metabólico é um gene que codifica uma enzima do metabolismo de aminoácidos. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é uma enzima de alanina-racemase (dal). Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é a enzima de transferase de D-aminoácido (dat).

Numa outra forma de realização, a enzima metabólica metaboliza um aminoácido (AA), que é usado para um processo de crescimento bacteriano. Numa outra forma de realização, o produto AA é utilizado para um processo de replicação. Numa outra forma de realização, o produto AA é utilizado para a sintese da parede celular. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica catalisa a formação de um aminoácido utilizado para a sintese da parede celular. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é uma enzima do metabolismo de aminoácidos. Numa outra forma de realização, o produto AA é utilizado para a sintese de proteínas. Numa outra forma de realização, o produto AA é utilizado para o metabolismo de um ácido gordo. Numa outra forma de realização, o produto AA é utilizado para qualquer outro processo de crescimento ou replicação conhecidos na técnica.

Numa outra forma de realização, a enzima metabólica catalisa a formação de um AA usado na sintese da parede celular. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica catalisa a sintese de um AA usado na sintese da parede celular. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica está envolvida na sintese de um AA usado na sintese da parede celular. Numa outra forma de realização, o AA é usado em biogénese da parede celular.

Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é uma enzima sintética para o ácido D-glutâmico, um componente da parede celular.

Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por um gene alanina-racemase (dal). A síntese de ácido D-glutâmico é controlada em parte pelo gene dal, que está envolvido na conversão de D-glu + pyr +para alfa-cetoglutarato + D-ala, e a reação inversa.

Numa outra forma de realização, a proteína dal dos métodos e composições da presente invenção tem a sequência da SEQ ID N°: 56 (número de acesso GenBank AF038438) . Numa outra forma de realização, a proteína dal é homóloga à SEQ ID N°: 56. Em outra forma de realização, a proteína dal é uma variante da SEQ ID N°: 56. Numa outra forma de realização, a proteína dal é uma isoforma da SEQ ID N°: 56. Numa outra forma de realização, a proteína dal é um fragmento da SEQ ID N°: 56. Numa outra forma de realização, a proteína dal é um fragmento de um homólogo da SEQ ID N°: 56. Numa outra forma de realização, a proteína dal é um fragmento de uma variante da SEQ ID N°: 56. Numa outra forma de realização, a proteína dal é um fragmento de uma isoforma da SEQ ID N°: 56.

Numa outra forma de realização, a proteína dal é qualquer outra proteína de Listeria dal conhecida na técnica. Numa outra forma de realização, a proteína dal é qualquer proteína dal de Bacillus subtilis conhecida na técnica. Numa outra forma de realização, a proteína é dal qualquer outra proteína dal gram-positiva conhecida na técnica. Numa outra forma de realização, a proteína dal é qualquer outra proteína dal conhecida na técnica. A proteína dat dos métodos e composições da presente invenção é codificada, em outra forma de realização, pela sequência da SEQ ID N° : 57 (número de acesso GenBank AF038439). Numa outra forma de realização, a proteina dat é homóloga à SEQ ID N°: 57. Em outra forma de realização, a proteina dat é uma variante da SEQ ID N° : 57. Numa outra forma de realização, a proteina dat é uma isoforma da SEQ ID N°: 57. Numa outra forma de realização, a proteina dat é um fragmento da SEQ ID N°: 57. Numa outra forma de realização, a proteina dat é um fragmento de um homólogo da SEQ ID N° : 57. Numa outra forma de realização, a proteina dat é um fragmento de uma variante da SEQ ID N° : 57. Numa outra forma de realização, a proteina dat é um fragmento de uma isoforma da SEQ ID N°: 57.

Numa outra forma de realização, a proteina dat é qualquer outra proteina dat de Listeria conhecida na técnica. Numa outra forma de realização, a proteina dat é qualquer outra proteina dat gram-positiva conhecida na técnica. Numa outra forma de realização, a proteina dat é qualquer outra proteina dat conhecida na técnica.

Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é um gene de sintese de ácido D-glutâmico. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por dga. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por um gene alr (alanina racemase) . Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é qualquer outra enzima que se sabe na técnica que está envolvida na sintese da alanina.

Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por serC, uma aminotransferase fosfosserina. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por asd (beta-semialdeido de aspartato desidrogenase), envolvida na sintese do ácido diaminopimélico constituinte da parede celular. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por gsaB-glutamato-l-semialdeido aminotransferase, que catalisa a formação de 5-aminolevulinato de (S)-4-amino-5-oxopentanoato. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por HemL, que catalisa a formação de 5-aminolevulinato de (S)-4-amino-5-oxopentanoato. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por aspB, um aspartato aminotransferase que catalisa a formação de oxalozcetate e L-glutamato a partir de L-aspartato e de 2-oxoglutarato. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por argF-1, envolvido na biossintese da arginina. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por aroE, envolvido na biossintese de aminoácidos. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por aroB, envolvido na biossintese de 3-dehidroquinato. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por aroD, envolvido na biossintese de aminoácidos. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por aroC, envolvido na biossintese de aminoácidos. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por hisB, envolvido na biossintese de histidina. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por hisD, envolvido na biossintese de histidina. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por hisG, envolvido na biossintese de histidina. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por metX, envolvido na biossintese de metionina. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por proB, envolvido na biossintese de prolina. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por ArgR, envolvido na biossíntese de arginina. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por argj, envolvido na biossíntese de arginina. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por thii, envolvido na biossíntese de tiamina. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por LMOf2365_1652, envolvido na biossíntese do triptofano. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por aroA, envolvido na biossíntese do triptofano. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por ilvD, envolvido na biossíntese de valina e isoleucina. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por ilvC, envolvida na biossíntese de valina e isoleucina. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por leuA, envolvida na biossíntese de leucina. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por dapF, envolvida na biossíntese de lisina. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por thrB, envolvida na biossíntese de treonina (todos do número de acesso GenBank NC_002973).

Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é uma sintetase de tARN. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada pelo gene trpS, que codifica sintetase de triptofaniltARN. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é qualquer outra sintetase de tARNt conhecida na técnica.

Numa outra forma de realização, a estirpe de bactérias hospedeiras é A(trpS aroA), e ambos os marcadores estão contidas no vetor de integração.

Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por murE, envolvido na síntese de ácido diaminopimélico (n° de acesso GenBank NC_003485).

Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por LMOf2365_2494, envolvido na biossíntese do ácido teicóico.

Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por WecE (proteína de biossíntese do lipopolissacarídeo rffA; n° de acesso GenBank AE014075.1). Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por amiA, uma N-acetilmuramoil-L-alanina amidase. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é aspartato aminotransferase. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é histidinol-fosfato-aminotransferase (número de acesso GenBank NP_466347). Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é a parede celular da proteína de glicosilação do ácido teicóico GtcA.

Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é uma enzima sintética para um componente ou precursor peptidoglicano. Numa outra forma de realização, o componente é a UDP-N-acetilmuramil-pentapéptido. Numa outra forma de realização, o componente é a UDP-N-acetilglucosamina. Numa outra forma de realização, o componente é MurNAc-(pentapéptido)-pirofosforil-undecaprenol. Numa outra forma de realização, o componente é GlcNAc-A-(1,4)-MurNAc-(pentapéptido)-pirofosforil-undecaprenol. Numa outra forma de realização, o componente é qualquer outro componente ou precursor peptidoglicano conhecido na técnica.

Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por murG. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por murD. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por murA-1. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é codificada por murA-2 (todos apresentados no número de acesso GenBank NC_002973). Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é qualquer outra enzima sintética para um componente ou precursor peptidoglicano.

Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é uma trans-glicosilase. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é trans-peptidase. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é uma carboxipeptidase. Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é qualquer outra classe de enzima metabólica conhecida na técnica.

Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é qualquer outra enzima metabólica de Listeria monocytogenes conhecida na técnica.

Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é qualquer outra enzima metabólica de Listeria conhecida na técnica.

Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é qualquer outra enzima metabólica de bactérias gram-positivas conhecida na técnica.

Numa outra forma de realização, a enzima metabólica é qualquer outra enzima metabólica conhecida na técnica.

Numa outra forma de realização, o vetor de integração é qualquer outro vetor de integração específico do sítio conhecido na técnica que é capaz de infetar a Listeria.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona composições para aumentar a imunogenicidade de um antigénio KLK3 por meio da fusão do antigénio a uma forma truncada não-hemolítica de LLO ("ALLO"), tal como a SEQ ID N°: 1 de LLO. A presente invenção proporciona ainda métodos e composições para aumentar a imunogenicidade de um antigénio KLK3 por fusão do antigénio a uma proteína LLO truncada. Como demonstrado pelos dados aqui divulgados, um antigénio fundido com uma proteína ActA elicia uma resposta imunitária que apura tumores existentes e resulta na indução de linfócitos citotóxicos específicos de antigénios.

Noutra concretização, as proteínas de fusão da presente invenção são produzidas de forma recombinante através da transcrição e tradução, numa bactéria, de uma molécula de plasmídeo ou nucleótido que codifica tanto um péptido KLK3 como um péptido LLO. Numa outra forma de realização, o plasmídeo ou nucleótido é transcrito e/ou traduzido in vitro. Numa outra concretização, o antigénio é quimicamente conjugado com a forma truncada de LLO compreendendo a sequência de AA semelhante a PEST de L. monocytogenes ou uma sequência de AA semelhante a PEST proveniente de outro organismo procariota. "Antigénio" refere-se, numa outra concretização, ao produto do gene nativo KLK3 ou versões truncadas destes que incluem epítopos de células T identificados. Numa outra forma de realização, estas proteínas de fusão são então incorporadas em vacinas para administração a um sujeito, para invocar uma resposta imunitária reforçada contra o antigénio da proteina de fusão. Em outras formas de realização, as proteínas de fusão da presente invenção são entregues como vacinas de ADN, vacinas de ARN ou vacinas que replicam ARN. Como será evidente para os peritos na técnica após esta divulgação, as vacinas que compreendem as proteínas de fusão da presente invenção são particularmente úteis na prevenção e tratamento de doenças infecciosas e neoplásicas. A presente invenção compreende ainda uma composição que compreende uma vacina da presente invenção adequada para administração a um animal ou humano. A composição compreende, entre outras coisas, um veiculo farmaceuticamente aceitável. Numa outra forma de realização, a composição inclui uma estirpe de vacina de Listeria compreendendo uma proteina truncada LLO, ou seu fragmento, fundida com um péptido KLK3, e um veiculo farmaceuticamente aceitável.

Na medida em que os seguintes Exemplos não se relacionam com a fusão de um péptido KLK3 e uma proteina LLO, eles são exemplos comparativos.

SECÇÃO DE DETALHES EXPERIMENTAIS

EXEMPLO 1: FUSÕES DE ANTIGÉNIO LLO INDUZ IMUNIDADE ANTI

TUMOR MATERIAIS E MÉTODOS EXPERIMENTAIS (EXEMPLOS 1-2)

Linhas celulares

Ratinhos C57BL/6 singeneicos foram imortalizados o tumor TC-1 com HPV-16 E6 e E7 e transformado com o oncogene c-Ha-ras. TC-1 expressa a baixos niveis de E6 e E7 e é altamente tumorigénico. TC-1 foi cultivado em meio RPMI 1640, 10% FCS, 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 yg/ ml de estreptomicina, 100 μΜ de aminoácidos não essenciais, 1 mM de piruvato de sódio, 50 micromolar (MCM) 2-ME, 400 microgramas (meg)/ml de G418, e 10% de meio 109 da National Collection Type Culture a 37°C com 10% de CO2. C3 é uma célula de embrião de rato a partir de ratinhos C57BL/6 imortalizados com o genoma completo de HPV 16 e transformados com pEJ-ras. EL-4/E7 é o timoma EL-4 retroviricamente transduzido com E7.

Estirpes de L. monocytogenes e propagação

As estirpes de Listeria utilizadas foram Lm-LLO-E7 (gene de fusão hly-E7 num sistema de expressão episómico; Figura IA), Lm-E7 (de cópia única da cassete do gene de E7 integrado no genoma de Listeria), Lm-LLO-NP ("DP L2028"; gene de fusão hly-NP num sistema de expressão episómico), e Lm-Gag ("ZY-18"; cópia única da cassete do gene VIH-1 Gag integrado no cromossoma).

Para gerar pGG-55, o plasmideo LLO-E7, E7 foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores 51-GGCTCGAG CATGGAGATACACC-3 ' (SEQ ID N° : 8; sitio Xhol está sublinhado) e 5'-GGGGACTAGTTTATGGTTTCTGAGAACA-3' (SEQ ID N° : 9; sitio Spel está sublinhado) e ligados em pCR2.1 (Invitrogen, San Diego, CA) . E7 foi excisada do pCR2.1 por digestão com Xhol/Spel e ligados no PDP-2028 (Ikonomidis G et al. Delivery of a viral antigen to the class I processing and presentation pathway by Listeria monocytogenes. J Exp Med. 1994 1 Dezembro; 180 (6):2209-18) . 0 gene de fusão hly-E7 e o fator de transcrição pluripotencial prfA foram amplificados e subclonados em pAM401, urn plasmideo vaivém de cópias múltiplas (R Wirth et al, J Bacteriol, 165:831, 1986), gerando PGG-55. 0 fragmento de promotor e o gene hly foram amplificados utilizando iniciadores 51-GGGGGCTAGC CCTCCTTTGATTAGTATATTC-3' (SEQ ID N°: 10; o sitio Nhel está sublinhado) e 5'-CTCC CTCGAG ATCATAATTTACTTCATC-3 ' (SEQ ID N° : 11; o sitio Xhol está sublinhado) . O gene prfA foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores 5'- GACTACAAGGACGATGACCGACAAGTGATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT-3' (SEQ ID N° : 12; o sitio Xbal está sublinhado) e 5'-CCC GTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG-3' (SEQ ID N° : 13; o sitio Sail está sublinhado).

No plasmideo resultante, PGG-55, o promotor hly dirige a expressão dos primeiros 441 AA do produto do gene hly, incluindo a sequência de sinal subsequentemente clivada, a qual está unida por sitio Xhol ao gene E7, obtendo-se um gene de fusão hly-E7 que é transcrita e segregado como LLO-E7. Este fragmento LLO não tem o terminal C hemolitico e tem a sequência apresentada na SEQ ID N° : 18. É referido abaixo como "ALLO," e é um ALLO meramente exemplificativo de muitos que poderiam ser utilizados com os métodos e composições da presente invenção. A transformação de uma estirpe negativa de prfA de Listeria, XFL-7 (fornecida pelo Dr. Hao Shen, University of Pennsylvania), com PGG-55 selecionado para a manutenção do plasmideo in vivo (Figuras 1A-B).

Lm-E7 foi gerado através da introdução de uma cassete de expressão contendo o promotor hly e a sequência de sinal dirigindo a expressão e secreção de E7 para o dominio orfZ do genoma LM. E7 foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores 5'-CGGGATCCCATGGAGATACACCTAC-3' (SEQ ID N°: 22; o sitio BamHI está sublinhado) e 51-CGTCTAGA TTATGGTTTCTGAG-3' (SEQ ID N°: 23; o sítio Xbal está sublinhado). E7 foi então ligado ao vetor de transporte PZY-21. A estirpe LM 10403S foi transformada com o plasmídeo resultante, PZY-21-E7, que inclui uma cassete de expressão inserida no meio de uma sequência de 1,6 kb que corresponde ao orfX, Y, domínio Z do genoma LM. 0 domínio de homologia permite a inserção da cassete n gene de E7 para o domínio orfZ por recombinação homóloga. Os clones foram pesquisados quanto à integração da cassete do gene de E7 para o domínio orfZ. As bactérias foram crescidas em meio de infusão de cérebro e coração com (Lm-LL0-E7 e Lm-LLO-NP) ou sem (Lm-E7 e ZY-18) cloranfenicol (20 yg/ml). As bactérias foram congeladas em alíquotas a -80°C. A expressão foi verificada por transferência de western (Figura 2)

Western blotting

As estirpes de Listeria foram cultivadas em meio Luria-Bertoni a 37°C e foram colhidas com a mesma densidade ótica medida a 600 nm. Os sobrenadantes foram precipitados com TCA e ressuspensos em tampão de amostra lx suplementado com 0,1 N de NaOH. Quantidades idênticas de cada sedimento celular ou cada sobrenadante precipitado com TCA foram carregados em 4-20% de géis Tris-glicina de SDS-PAGE (NOVEX, San Diego, CA) . Os géis foram transferidos para difluoreto de polivinilideno e sondados com um anticorpo monoclonal anti-E7 (mAb) (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA) , em seguida, incubados com conjugado HRP anti-ratinho secundário Ab (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Reino Unido), desenvolvido com reagentes de deteção ECL de Amersham, e expostos a Hyperfilm (Amersham Pharmacia Biotech).

Medição do crescimento de tumores

Os tumores foram medidos a cada dois dias com calibradores abrangendo os diâmetros mais curtos e mais longos de superfície. A média destas duas medições foi representada graficamente como o diâmetro médio do tumor em milímetros contra vários pontos de tempo. Os ratinhos foram sacrificados quando o diâmetro do tumor atingiu 20 mm. As medições do tumor para cada ponto de tempo são mostradas apenas para os ratinhos sobreviventes.

Efeitos da Listeria recombinante sobre o crescimento do tumor estabelecido

Ratinhos C57BL/6 de seis a 8 semanas de idade (Charles River) receberam 2 x 105 células TC-1 sc no flanco esquerdo. Uma semana após a inoculação do tumor, os tumores tinham atingido um tamanho palpável de 4-5 mm de diâmetro. Grupos de 8 ratinhos foram, em seguida, tratados com 0,1 LDso ip de Lm-LLO-E7 (107 CFU), Lm- E7 (106 CFU), Lm-LLO-NP (107 CFU), ou Lm-Gag (5 x 105 CFU) nos dias 7 e 14.

Ensaio de libertação de 51Cr

Ratinhos C57BL/6 de 6-8 semanas de idade foram imunizados ip com 0,1 LD50 de Lm-LLO-E7, Lm-E7, Lm-LLO-NP, ou Lm-Gag. Dez dias após a imunização, os baços foram colhidos. Os esplenócitos foram estabelecidos em cultura com células ΟΤΙ irradiadas (100:1, esplenócitos:TC-1) como células de alimentação; estimulados in vitro durante 5 dias, em seguida, utilizados num ensaio de libertação de 51Cr padrão, utilizando os seguintes alvos: EL-4, EL-4/E7, ou EL-4 pulsados com péptido E7 H-2b (RAHYNIVTF). E: indices de células T, realizados em triplicado, foram de 80:1, 40: 1, 20:1, 10:1, 5:1 e 2,5:1. Na sequência de uma incubação de 4 h a 37°C, as células foram sedimentadas, e 50 μΐ de sobrenadante foi removido de cada poço. As amostras foram ensaiadas com um contador de cintilação Wallac 1450 (Gaithersburg, MD) . A percentagem de lise especifica foi determinada como [ (contagens experimentais por minuto contagens espontâneas por minuto)/(total de contagens por minuto - contagens espontâneas por minuto)] x 100.

Proliferação específica de TC-1-

Ratinhos C57BL/6 foram imunizados com 0,1 LD50 e reforçado pela injeção ip 20 dias mais tarde, com um LD50 de Lm-LLO-E7, Lm-E7, Lm-LLO-NP, ou Lm-Gag. Seis dias após o reforço, os baços foram colhidas a partir de ratinhos imunizados e normais. Os esplenócitos foram estabelecidos em cultura de 5 x 105/poço em placas de 96 poços de fundo plano com 2,5 x 104, 1,25 x 104, 6 x 103, ou 3 x 103 células TC-1 irradiadas/poço como uma fonte de E7 Ag, ou sem células TC-1 ou com 10 yg/ml de Con A. As células foram pulsadas 45 h mais tarde com 0,5 yCi de [3H] timidina/poço. As placas foram colhidas 18 h mais tarde, utilizando um coletor Tomtec 96 (Orange, CT) e a proliferação foi avaliada com um contador de cintilação Wallac 1450. A alteração em contagens por minuto foi calculada como contagens por minuto experimentais - contagens não Ag por minuto.

Análise por citometria de fluxo

Ratinhos C57BL/6 foram imunizados por via intravenosa (iv) com 0,1 LD50 de Lm-LLO-E7 ou Lm-E7 e reforçado em 30 dias. Fluxo de citometria de três cores para CD8 (53-6.7, conjugado com PE), ligando CD62 (CD62L; MEL-14, APC conjugada), e tetrâmero E7 H-2Db foi realizado utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur® com software CellQuest® (Becton Dickinson Mountain View, CA). Os esplenócitos colhidos 5 dias após o reforço foram corados à temperatura ambiente (rt) com tetrâmeros H-2Db carregadas com o péptido E7 (RAHYNIVTF) ou um péptido de controlo (HIV-Gag) . Os tetrâmeros foram utilizados a uma diluição 1/200 e foram fornecidos pelo Dr. Larry R. Pease (Mayo Clinic, Rochester, MN) e pelo National Institute of allergy and Infectious Diseases Tetramer Core Facility e os National Institutes of Health AIDS Research and Reference Reagent Program. Foram analisados o Tetrâmero+, células CD8 + , CD62Lbaix0.

Exaustão dos componentes específicos do sistema imunológico Células CD8+, células CD4+ e IFN foram esgotadas em ratinhos sofrendo de TC-1 injetando os ratinhos com 0,5 mg de mAb por ratinho: 2,43, GK1.5, ou xmgl.2, respetivamente, nos dias 6, 7, 8 , 10, 12, e 14 após o desafio do tumor. As populações de células CD4+ e CD8+ foram reduzidas em 99% (análise por citometria de fluxo). As células CD25+ foram esgotadas por injeção ip de 0,5 mg/rato de anti-CD25 mAb (PC61, fornecido por Andrew J. Caton) nos dias 4 e 6. TGF foi esgotada pela injeção ip do anti-TGF-mAb (2G7, fornecido por HI Levitsky), em ratos TC-1 nos dias 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18 e 20. Os ratos foram tratados com 107 de Lm-LLO-E7 ou Lm-E7 no dia 7 seguinte ao desafio do tumor.

Transferência adotiva

Ratinhos C57BL/6 doadores foram imunizados e reforçados 7 dias mais tarde com 0,1 LD50 de Lm-E7 ou Lm-Gag. Os esplenócitos dos dadores foram recolhidos e passados sobre colunas de lã de nylon para enriquecer as células T. As células CD8+ T foram esgotadas in vitro por incubação com 0,1 pg de 2,43 anti-CD8 mAb durante 30 minutos à temperatura ambiente. As células marcadas foram então tratadas com complemento de coelho. Os esplenócitos dos dadores eram> 60% de células CD4+ T (análise de citometria de fluxo). Ratos portadores de tumor TC-1 foram imunizados com 0,1 LD50 7 dias após o desafio do tumor. Esplenócitos CD4+ de dadores enriquecidos (107) foram transferidos 9 dias após o desafio do tumor para ratos recetores por injeção iv.

Experiência B16FO-Ova 24 ratinhos C57BL/6 foram inoculados com 5 x 105 células B16FO-Ova. Nos dias 3, 10 e 17, grupos de 8 ratinhos foram imunizados com 0,1 LD50 de Lm-OVA (106 ufc), Lm-LLO-OVA (108 ufc) e oito animais foram deixados sem tratamento.

Estatística

Para comparações de diâmetros tumorais, média e SD do tamanho do tumor foram determinados para cada grupo, e a significância estatística foi determinada pelo teste t de Student, p < 0,05 foi considerado significativo.

RESULTADOS

Lm-E7 e Lm-LLO-E7 foram comparados para as suas capacidades para ter impacto sobre o crescimento de TC-1. Tumores subcutâneos foram estabelecidos no flanco esquerdo de ratinhos C57BL/6. Sete dias depois, os tumores tinham atingido uma dimensão palpável (4-5 mm). Os ratinhos foram vacinados nos dias 7 e 14 com 0,1 LD50 de Lm-E7, Lm-LLO-E7, ou, como controlos, Lm-Gag e Lm-LLO-NP. Lm-LLO-E7 induziu a regressão completa de 75% dos tumores TC-1 estabelecidos, enquanto os outros dois ratinhos do grupo controlaram o seu crescimento tumoral (Figura 3A). Em contraste, a imunização com Lm-E7 e Lm-Gag não induziu a regressão do tumor. Esta experiência foi repetida várias vezes, sempre com resultados muito semelhantes. Além disso, foram obtidos resultados similares para Lm-LLO-E7 em diferentes protocolos de imunização. Noutra experiência, uma única imunização foi capaz de curar ratinhos com murganhos tumores TC-1 de 5 milímetros estabelecidos.

Noutras experiências, foram obtidos resultados semelhantes com duas outras linhas de células tumorais que expressam E7: C3e EL-4/E7. Para comprovar a eficácia da vacinação com Lm-LL0-E7, os animais que tinham eliminado os seus tumores foram re-desafiados com o CT-1 ou células tumorais EL-4/E7 no dia 60 ou dia 40, respetivamente. Os animais imunizados com Lm-LLO-E7 permaneceram livres de tumor até ao término da experiência (dia 124 no caso de TC-1 e no dia 54 para EL-4/E7).

Uma experiência semelhante foi realizada com o antigénio de ovalbumina de galinha (OVA). Os ratinhos foram imunizados com OVA ou Lm-Lm-LLO-OVA, em seguida, desafiados quer com um timoma EL-4 manipulado para expressar OVA ou a linha de células de melanoma murino muito agressivo B16FO-Ova, que tem muito baixa expressão de MHC de classe I. Em ambos os casos, Lm-LLO-OVA, mas não Lm-OVA, induziu a regressão de tumores estabelecidos. Por exemplo, no final da experiência B16F0 (dia 25), todos os ratinhos no grupo normal e no grupo Lm-OVA tinham morrido. Todos os ratos Lm-LLO-OVA estavam vivos, e 50% deles estavam livres do tumor. (Figura 3B) .

Assim, a expressão de um gene do antigénio como uma proteína de fusão com ALLO aumenta a imunogenicidade do antigénio.

EXEMPLO 2: TRATAMENTO LM-LLO-E7 INDUZ A PROLIFERAÇÃO DE

ESPLENÓCITOS TC-1 ESPECÍFICA

Para medir a indução de células T por Lm-E7 com Lm-LL0-E7, foram avaliadas as respostas proliferativas TC-1 especificas de células de baço de ratinhos imunizados, rLm, uma medida da competência imunológica especifica para o antigénio. Os esplenócitos de ratinhos Lm-LL0-E7-imunizados proliferaram quando expostos a células TC-1 irradiadas como fonte de E7, em proporções de esplenócitos: TC-1 de 20:1, 40:1, 80:1 e 160:1 (Figura 4). Por outro lado, os esplenócitos de Lm-E7 e ratinhos imunizados de controlo rLm exibiram apenas niveis de proliferação de fundo.

Exemplo 3: FUSÃO DE NP PARA LLO AUMENTA A SUA

IMUNOGENICIDADE

MATERIAIS E MÉTODOS EXPERIMENTAL

Lm-LLO-NP foi preparado como representado na Figura 1, exceto que a nucleoproteina da gripe (NP) substitui E7 como antigénio. 32 ratinhos BALB/c foram inoculados com 5 x 105 células tumorais RENCA-NP. RENCA-NP é um carcinoma de células renais retroviricamente transduzidas com nucleoproteina da gripe NP (descrito em Patente US 5830702, que é aqui incorporado por referência). Depois de tumores macroscópicos palpáveis terem crescido no dia 10, 8 animais de cada grupo foram imunizados ip com 0,1 LD50 do respectivo vetor de Listeria. Os animais receberam uma segunda imunização uma semana mais tarde.

RESULTADOS A fim de confirmar a generalidade da constatação de que a fusão de LLO a um antigénio confere imunidade reforçada, foram construídos Lm-LLO-NP e NP-Lm (isogénica com os vetores Lm-E7, mas que expressam o antigénio da gripe), e os vetores foram comparados quanto à capacidade para induzir a regressão do tumor, com Lm-Gag (isogénica com Lm-NP, exceto para o antigénio expresso) como um controlo negativo. Como representado na Figura 5, 6/8 dos ratos que receberam Lm-LLO-NP estavam livres de tumor. Em contrapartida, apenas 1/8 e 2/8 ratos nos grupos Lm-Gag e Lm-NP, respetivamente, estavam livres de tumor. Todos os ratos no grupo normal tinham grandes tumores ou morreram no dia 40. Assim, as estirpes LLO expressando fusões NP e LLO-NP são imunogénicas. Resultados similares foram obtidos por Lm-LLO-E7 sob diferentes protocolos de imunização. Além disso, apenas uma única imunização foi demonstrada para curar ratinhos com TC-1 de 5 mm de diâmetro estabelecido.

EXEMPLO 4: MELHORIA DA IMUNOGENICIDADE PELA FUSÃO DE UM ANTIGÉNIO PARA LLO NÃO REQUER UM VETOR DE LISTERIA MATERIAIS E MÉTODOS EXPERIMENTAL Construção de Vac-SigE7Lamp A estirpe WR de vaccinia foi usada como o destinatário e o gene de fusão foi excisadoa do plasmideo Listerial e inserido em pSCll sob o controlo do promotor p75. Este vetor foi escolhido porque é o vector de transferência usado para as construções de vaccinia Vac SigE7Lamp e Vac-E7 e, portanto, permite a comparação direta com Vac-LLO-E7. Neste modo, todos os três recombinantes de vaccinia seriam expressos sob o controlo do mesmo composto precoce/tardio do promotor P7.5. Além disso, SC11 permite a seleção de placas virais recombinantes para a seleção de TK e rastreio de beta-galactosidase. A Figura 6 representa as várias construções de vaccinia utilizadas nestas experiências. Vac-SigE7Lamp é um virus de vaccinia recombinante que expressa a proteina E7 fundido entre a sequência de sinal da proteina da membrana lisossomal associada (LAMP-1) e a sequência da cauda citoplasmática de LAMP-1. Foi concebido para facilitar o direcionamento do antigénio para a via de MHC de classe II.

As seguintes modificações foram feitas para permitir a expressão do produto do gene de vaccinia por: (a) a sequência T5XT que evita a transcrição precoce de vaccinia foi removida a partir da porção 5 ' da sequência de LL0-E7 por PCR; e (b) um sitio de restrição Xmal foi introduzido por PCR para permitir a inserção definitiva do LL0-E7 em SC11. Introdução bem sucedida destas mudanças (sem perda da sequência original que codifica para LL0-E7) foi verificada por sequenciação. A construção pSCl 1-E7 resultante foi utilizada para transfectar a linha celular TK-ve CV1 que tinha sido infetada com a estirpe de vaccinia de tipo selvagem, WR. Os lisados celulares obtidos a partir da referida passo de coinfecção/transfecção contém recombinantes de vaccinia que foram purificados em placa, 3 vezes. A expressão do produto de fusão LL0-E7 por purificação em placa da vaccinia foi verificada por Western Blot utilizando um anticorpo dirigido contra a sequência da proteina de LLO. Além disso, a capacidade de Vac-LL0-E7 para produzir células CD8+ T especificas para LLO e E7 foi determinada utilizando os epítopos LLO (91-99) e E7 (49-57) de ratinhos Balb/c e C57/BL6, respetivamente. Os resultados foram confirmados num ensaio de libertação de crómio.

RESULTADOS

Para determinar se o aumento da imunogenicidade de um antigénio de fusão de LLO requer um vetor de Listeria, foi construído um vetor de vaccinia que expressa E7 como uma proteina de fusão com uma forma truncada não-hemolitica do LLO (ALLO). Estudos de rejeição de tumor foram realizados com o CT-1 seguindo o protocolo descrito para o Exemplo 1.

Foram realizadas duas experiências com diferentes atrasos antes do tratamento ser iniciado. Numa experiência, os tratamentos foram iniciados quando os tumores tinham cerca de 3 mm de diâmetro (Figura 7). A partir do dia 76, 50% dos ratinhos tratados com Vac-LLO-E7 estavam isentos de tumores, ao passo que apenas 25% dos ratinhos tratados com Vac-SigE7Lamp estavam livres do tumor. Noutras experiências, as fusões de antigénio ALLO foram mais imunogénicas do que o péptido E7 misturado com SBAS2 ou oligonucleótidos CpG não metilados numa comparação lado-a-lado .

Estes resultados mostram que: (a) as fusões de antigénio ALLO são imunogénicas não só no âmbito da Listeria, mas também em outros contextos; e (b) a imunogenicidade de fusões de antigénio ALLO compara favoravelmente com outras abordagens de vacina aceites.

Exemplo 5: FUSÕES DE ANTIGÉNIO ActA E ANTIGÉNIO PEST CONFEREM IMUNIDADE ANTI-TUMORAL MATERIAIS E MÉTODOS EXPERIMENTAL

Constrição de Lm-PEST-E7, Lm-APEST-E7, e Lm-E7epi (Figura 8A)

Lm-PEST-E7 é idêntico ao Lm-LLO-E7, exceto que contém apenas o promotor e a sequência PEST do gene hly, especificamente os primeiros 50 AA de LLO. Para construir Lm-PEST-E7, o promotor hly e as regiões PEST e foram fundidas com o gene E7 de comprimento completo usando a técnica de PCR SOE (splicing do gene por extensão de sobreposição) . O gene E7 e o fragmento do gene hly-PEST foram amplificados a partir do plasmídeo pGG-55, que contém os primeiros 441 AA de LLO, e unidos em conjunto por meio de técnicas de PCR convencionais. Para criar um plasmídeo final, pVS16.5, o fragmento hly-PEST-E7 e o gene prfA foram subclonados no plasmídeo pAM401, que inclui urn gene de resistência ao cloranfenicol para seleção in vitro, e o plasmideo resultante foi usado para transformar XFL-7.

Lm-APEST-E7 é uma estirpe recombinante de Listeria que é idêntico ao Lm-LL0-E7, exceto que não tem a sequência PEST. Foi feito essencialmente como descrito para Lm-PEST-E7, exceto que o sistema de expressão episómico foi construído usando sequências iniciadoras projetadas para remover a região contendo PEST (pb 333-387) a partir do gene de fusão hly-E7. Lm-E7epi é uma estirpe recombinante que segrega E7 sem a região PEST ou LLO. 0 plasmideo utilizado para transformar esta estirpe contém um fragmento do gene do promotor hly e a sequência de sinal fundida com o gene E7. Esta construção difere do original Lm-E7, que expressa uma única cópia do gene E7 integrado no cromossoma. Lm-E7epi é completamente isogénico para Lm-LL0-E7, Lm-PEST-E7, e Lm-APEST-E7, exceto para a forma do antigénio E7 expressa.

Construção de Lm-actA-E7

Lm-actA-E7 é uma estirpe recombinante de LM, que compreende um plasmideo que exprime a proteina E7 fundido com uma versão truncada da proteina actA. Lm-actA-E7 foi gerada pela introdução de um vetor plasmideo PDD-1 construído por modificação de pDP-2028 em LM. pDD-1 compreende uma cassete de expressão que expressa uma cópia do promotor hly 310 bp e a sequência de sinal hly (ss) , que conduz a expressão e secreção de actA-E7; 1170 pb do gene actA que compreende quatro sequências PEST (SEQ ID N°: 16) (o polipéptido ActA truncado consiste nos primeiros 390 AA da molécula, SEQ ID N°: 15); o 300 pb do gene E7 de VPH*; o gene 1019 bp prfA* (controla a expressão dos genes de virulência) ; e o gene CAT (gene de resistência ao cloranfenicol) para a seleção de clones de bactérias transformadas. (Figura 8B).

0 promotor hly (Phly) e fragmento de gene foram amplificados por PCR a partir de pGG-55 (Exemplo 1) utilizando os iniciadores 51-GGGGTCTAGA

CCTCCTTTGATTAGTATATTC-3 ' (o sitio Xba I é sublinhado; SEQ ID N°: 46) e 5'-ATCTTCGCTATCTGTCGCCGCGGC GCGTGCTTCAGTTTGTTGCGC-3' (o sitio Not I está sublinhado; os primeiros 18 nucleótidos são o gene da sobreposição ActA; SEQ ID N° : 47) . 0 gene actA foi amplificado por PCR dos genomas de tipo selvagem 10403s LM com o iniciador 5'-GCGCAACAAACTGAAGCAGCGGCCGCGGCGACAGATAGCGAAGAT-3' (o sitio Notl está sublinhado; SEQ ID N° : 48) e iniciador 5'- TGTAGGTGTATCTCCATGCTCGAGAGCTAGGCGATCAATTTC-3' (o sitio Xhol está sublinhado; SEQ ID N°: 49). O gene de E7 foi amplificado por PCR a partir de pGG55 (pLLO-E7) utilizando o iniciador 5'-GGAATTGATCGCCTAGCTCTCGAG CATGGAGATACACCTACA-3' (o sitio Xho I está sublinhado; SEQ ID N° : 50) e o iniciador 5'-AAACGGATTTATTTAGATCCCGGGTTATGGTTTCTGAGAACA-3' (o sitio Xmal está sublinhado; SEQ ID N°: 51). O gene prfA foi amplificado por PCR dos genomas de tipo selvagem 10403s LM com o iniciador 5'-TGTTCTCAGAAACCATAACCCGGG ATCTAAATAAATCCGTTT-3' (o sitio Xmal está sublinhado; SEQ ID N°: 52) e o iniciador 5'-GGGGG TCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG-3'(o sitio Sail está sublinhado; SEQ ID N°: 53). O promotor hly foi fundida com o gene actA (Phly-actA) foi gerado por PCR e amplificado a partir de ADN Phly purificado e actA ADN purificado utilizando o iniciador a montante pHly (SEQ ID N°: 46) e o iniciador a jusante actA (SEQ ID N°: 49).

O gene E7 fundido com o gene prfA (E7-prfA) foi gerado por PCR e amplificado a partir de E7 ADN purificado e prfA ADN purificado utilizando o iniciador a montante E7 (SEQ ID N°: 50) e iniciador a jusante do gene prfA (SEQ ID N°: 53). O produto de fusão Phly-actA fundido com o produto de fusão E7-prfA foi gerado por PCR e amplificado a partir do produto fundido purificado Phly-actA ADN e o produto de E7-prfA ADN purificado fundido utilizando o iniciador a montante Phly (SEQ ID N° : 46) e o iniciador a jusante do gene prfA (SEQ ID N°: 53) e ligado em pCRII (Invitrogen, La Jolla, Calif.)· Competente E. coli (TOPIO'F, Invitrogen, La Jolla, Calif.) foi transformado com pCRII-ActAE7. Após a lise e isolamento, o plasmídeo foi exibido por análise de restrição usando BamHI (tamanhos de fragmento esperado 770 pb e 6400 pb (ou quando a inserção foi revertida para o vetor: 2500 pb e 4100 pb)) e BstXI (tamanhos dos fragmentos esperado 2800 pb e 3900 pb) e também rastreadas com análise de PCR utilizando o iniciador a montante Phly (SEQ ID N° : 46) e o iniciador a jusante do gene prfA (SEQ ID N°: 53). A inserção de Phly Acta-E7-PrfA ADN foi excisado de pCRII através de digestão dupla com Xbal e Sail e ligado em PDP-2028 também digerido com Xba I e Sal I. Depois de transformar competente E. coli TOPIO'F (Invitrogen, La Jolla, Califórnia) com o sistema de expressão pActAE7, os clones resistentes ao cloranfenicol foram testados por análise de PCR utilizando o iniciador a montante Phly (SEQ ID N° : 46) e o iniciador a jusante do gene PrfA (SEQ ID N°: 53) . Um clone transportando Phly-ACTA-E7 foi cultivado em infusão em meio de coração e cérebro com 20 mcg (microgramas)/ml (mililitro) de cloranfenicol (Difco, Detroit, MI), e pActAE7 foi isolada a partir da célula bacteriana utilizando um kit de sistema de purificação de ADN Midiprep (Promega, Madison, Wis.). Tratada com penicilina a estirpe de Listeria XFL-7 foi transformada com pActAE7, e os clones foram selecionados para a retenção do plasmideo in vivo. Os clones foram cultivados em infusão de cérebro e coração com cloranfenicol (20 mcg/ml) a 37°C. As bactérias foram congeladas em aliquotas a -80°C.

RESULTADOS

Para comparar a imunidade anti-tumoral induzida por Lm-ACTA-E7 contra Lm-LLO-E7, 2 x 105 células tumorais TC-1, foram implantados subcutaneamente em ratinhos e deixadas crescer até um tamanho palpável (aproximadamente 5 milímetros [mm]). Os ratos foram imunizados ip com um LD50 de qualquer Lm-ACTA-E7 (5 xlO8 CFU), (cruzes) Lm-LLO-E7 (108 CFU) (quadrados) ou Lm-E7 (106 CFU) (circulos) nos dias 7 e 14. Ao dia 26, todos os animais no Lm-LLO-E7 e Lm-ActA-E7 estavam livres de tumores e mantiveram-se assim, ao passo que em todos os animais normais (triângulos) e animais imunizados com Lm-E7 cresceram tumores grandes (Figura 9). Assim, a vacinação com fusões ActA-E7 provoca a regressão do tumor.

Além disso, Lm-LLO-E7, Lm-PEST-E7, Lm-APEST-E7, e Lm-E7epi foram comparados quanto à sua capacidade para provocar a regressão de tumores que expressam E7. Tumores TC-1 sc foram estabelecidos no flanco esquerdo de 40 ratos C57BL/6. Após os tumores terem atingido 4-5 mm, os ratinhos foram divididos em 5 grupos de 8 ratos. Cada grupo foi tratado com 1 de 4 vacinas recombinantes LM, e um grupo foi deixado sem tratamento. Lm-LLO-E7 e Lm-PEST-E7 induziram a regressão de tumores estabelecidos em 5/8 e 3/8 dos casos, respetivamente. Não houve diferença estatística entre o tamanho médio do tumor de ratinhos tratados com Lm-PEST-E7 ou Lm-LLO-E7 em qualquer ponto do tempo. No entanto, as vacinas que expressam E7 sem as sequências PEST, Lm-APEST-E7 e Lm-E7epi, falharem em causar a regressão do tumor em todos os ratinhos, exceto uma (Figura 8C). Isto foi representativo de duas experiências, em que foi observada uma diferença estatisticamente significativa em tamanhos médios de tumor no dia 28 entre os tumores tratados com Lm-LL0-E7 ou Lm-PEST-E7 e aqueles tratados com Lm-E7epi ou Lm-APEST-E7; P <0,001, teste t de Student; Figura 8D). Além disso, o aumento da percentagem de esplenócitos tetrâmero-positivo foram observados de forma reprodutível ao longo de três experiências nos baços de ratinhos vacinados com vacinas contendo PEST (Figura 8E). Assim, a vacinação com fusões PEST-E7 provoca a regressão do tumor. EXEMPLO 6: FUSÃO DE E7 PARA LLO, ActA, OU UMA SEQUÊNCIA SEMELHANTE A PEST AUMENTA A IMUNIDADE ESPECÍFICA DO ANTIGÉNIO E GERA UM TUMOR INFILTRANDO E7 ESPECÍFICO DAS CÉLULAS CD8+

MATERIAIS E MÉTODOS EXPERIMENTAIS 500 mel (microlitro) de Matrigel®, compreendendo 100 mel de 2 x 105 células tumorais TC-1 em tampão fosfato salino (PBS), mais 400 mel de Matrigel® (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) foram implantadas subcutaneamente no lado esquerdo do flanco de 12 ratinhos C57BL/6 (n = 3) . Os ratinhos foram imunizados por via intraperitoneal no dia 7, 14 e 21, e os baços e os tumores foram colhidos no dia 28. MATRIGELs tumorais foram removidas dos ratinhos e incubados a 4°C durante a noite em tubos contendo 2 mililitros (ml) de meio RP 10 sobre gelo. Os tumores foram picados com pinças, cortados em blocos de 2 mm, e incubaram-se a 37°C durante 1 hora com 3 ml de mistura de enzimas (0,2 mg/ml de colagenase-P, 1 mg/ml de DNAse-1 em PBS) . A suspensão de tecido foi filtrado através de malha de nylon e lavada com 5% de soro fetal de bovino + 0,05% de NaN3 em PBS para coloração do tetrâmero e de IFN-gama.

Os esplenócitos e as células de tumor foram incubados com 1 micromole (mcm) de péptido E7 durante 5 horas na presença de brefeldina A a 107 células/ml. As células foram lavadas duas vezes e incubadas em 50 mel do sobrenadante do recetor anti-Fc de ratinho (2,4 G2) durante 1 hora ou durante a noite a 4°C. As células foram coradas para moléculas de superfície CD8 e CD62L, permeabilizadas, fixadas utilizando o kit de permeabilização de Golgi-Stop® ou Golgi-Plug® (Pharmingen, San Diego, Calif.), e coradas para IFN-gama. Foram adquiridos 500000 eventos utilizando um citómetro a laser fluxo duplo FACSCalibur e analisados utilizando o software Cellquest (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Percentagens de IFN-gama que segregam no interior das células ativadas (CD62Lbaix0) CD8+ T foram calculadas.

Para a coloração de tetrâmero, tetrâmero H-2Db foi carregado com ficoeritrina (PE) conjugado a péptido E7 (RAHYNIVTF, SEQ ID N°: 24), corados à temperatura ambiente durante 1 hora, e corados com anti-aloficocianina (APC) conjugada MEL-14 (CD62L) e FITC-CD8 conjugado a 4°C durante 30 min. As células foram analisadas por comparação do tetrâmero7 de células CD8 + CD62Lbaix0 no baço e no tumor.

RESULTADOS

Para analisar a capacidade de Lm-ActA-E7 para aumentar a imunidade específica do antigénio, os ratos foram implantados com células tumorais 1-TC e imunizados com Lm-LLO-E7 (1 x 107 UFC), Lm-E7 (1 x 106 CFU), ou Lm-ActA-E7 (2 x 108 UFC) , ou não foram tratados (normal) . Os tumores dos ratinhos dos grupos Lm-LL0-E7 e Lm-ActA-E7 continham uma percentagem mais elevada de IFN-gama secretoras de células CD8+ T (Figura 10A) e específicos do tetrâmero de células CD8+ (Figura 10B) do que em Lm-E7 ou ratinhos normais.

Numa outra experiência, aos ratinhos portadores de tumor foram administrados Lm-LL0-E7, Lm-PEST-E7, Lm-APEST-E7, ou Lm-E7epi, e foram medidos os niveis de linfócitos específicos de E7 dentro do tumor. Os ratinhos foram tratados nos dias 7 e 14 com 0,1 LD50 das quatro vacinas. Os tumores foram colhidos no dia 21 e corados com anticorpos para a CD62L, CD8, e com o tetrâmero E7/Db. Um aumento da percentagem de linfócitos do tetrâmero positivo dentro do tumor foi observado em ratinhos vacinados com Lm-LLO-E7 e Lm-PEST-E7 (Figura 11a). Este resultado foi reprodutível ao longo de três experiências (Figura 11b).

Assim, Lm-LLO-E7, Lm-ActA-E7, e Lm-PEST-E7 são cada eficaz na indução de tumor infiltrante nas células CD8+ T e na regressão do tumor.

EXEMPLO 7: CRIAÇÃO E VERIFICAÇÃO DE CONSTRUÇÕES DE

LISTERIA-LLO-PSA

MATERIAIS E MÉTODOS EXPERIMENTAL

Oligos e pCDNA3.1 foram adquiridos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA) e a sequenciação de ADN foi realizada por Genewiz Inc (Plainfield, NJ). Os péptidos foram sintetizados por EZbiolabs (Westfield, IN). Os reagentes da citometria de fluxo foram adquiridos de Becton Dickinson (BD) Biosciences (San Diego, CA). Meios de cultura celular e suplementos eram de Gibco/Invitrogen. Os anticorpos foram adquiridos a partir de ELISpot Mabtech AB (Cincinnati, OH).

Outros reagentes, a menos que indicado, foram da Sigma (St. Louis, MO) . PSA/vaccinia foi gentilmente cedido pelo Dr. Schlom pelo National Cancer Institute, Bethesda, MD.

Ratos, linhagens celulares e meio

Ratinhos C57BL/6 machos foram adquiridos a Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) . Ratos foram mantidos nas instalações para animais do Cook Campus na Universidade de Rutgers, New Brunswick, NJ. Experiências em ratinhos foram realizadas de acordo com os regulamentos de Institutional Animal Care and Use Committee da Universidade de Rutgers. Todas as linhas celulares foram adquiridas a partir da ATCC (Manassas, VA) . A linha celular TRAMPC-1 (^Transgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate), derivado de um rato C57BL/6, foi anteriormente descrito. As células foram cultivadas e mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco com 4 mM de L-glutamina ajustado para conter 1,5 g/L de bicarbonato de sódio e 4,5 g/L de glicose, suplementado com 5 pg/ml de insulina bovina, 10 nM de dehidroisoandrosterona, 5% de soro fetal bovino e 5% Nu-Soro IV. Células do fibrossarcoma MC57G (a partir de ratinhos C57BL/6 de fundo) foram mantidas em meio essencial minimo de Eagle (EMEM) com 2 mM de L-glutamina e BSS de Earle ajustado para conter 1,5 g de bicarbonato de sódio/L, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, e 1,0 mM de piruvato de sódio e 10% de soro fetal bovino. As células do linfoma EL4 foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco com 4 mM de L-glutamina ajustado para conter 1,5 g/L de bicarbonato de sódio e 4,5 g/L de glucose, 10% de soro fetal bovino. J774A.1, uma linha celular de macrófagos de murino foi mantida em meio RPMI 1640 com 4 mM de L-glutamina ajustado para conter 1,5 g/L de bicarbonato de sódio e 4,5 g/L de glucose e 10% de soro fetal bovino. RPMI completo (RPMI-C) continha meio RPMI 1640 complementado com glutamina 2 mM, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, e 1,0 mM de piruvato de sódio e 10% de soro fetal bovino.

Construção de vacina PSA/pCDNA3.1

Toda a estrutura de leitura aberta de PSA, incluindo a sua sequência de sinal foi clonada no vetor de estrutura pcDNA3.1(_) (Invitrogen) nos sitios Xbal e Xhol. Neste plasmideo, a expressão de PSA estava sob o controlo do promotor CMV e confirmado por transfecção transitória em linha celular 293 (ATCC) . A secreção de PSA por células transfectadas foi confirmada no sobrenadante de cultura de células utilizando um estojo de ELISA de anti-PSA (American Qualex, San Clemente, Califórnia). O plasmideo GM-CSF/ pCDNA foi um presente do Dr. Vonderheide, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA.

Construção de vacina Lm-LLO-PSA

O gene que codifica para a PSA humano (excluindo a sua sequência de sinal de secreção) foi amplificado utilizando polimerase pfx, oligo: gtgCTCGAGattgtgggaggctgggagtg (SEQ ID N° : 58), e o oligo de sentido inverso: gatACTAGTtta ggggttggccacgatgg (SEQ ID N°: 59). Os dois sitios de restrição Xho I e Spe I, que foram utilizados para a clonagem em grelha de PSA como uma fusão para LLO em pGG55 são indicados em letras maiúsculas. O códão de parada para terminar a tradução da proteina de fusão LLO-PSA é sublinhado no oligo inverso. PSA amplificada foi clonada no plasmideo Lm pGG55, como uma proteina de fusão para os primeiros 441 aminoácidos no terminal N de LLO (pAdv34,

Figura 12), entre os sitios de restrição Xhol e Spel. O plasmideo resultante foi sequenciado para assegurar a ausência de mutações. O plasmideo pAdv34 foi electroporado na estirpe Lm XFL7 (que não tem o gene prfA genómico) e foi originalmente derivado a partir da estirpe resistente a estreptomicina Lm 10403s. Listeriae contendo o plasmideo (Lm-LLO-PSA) foram selecionados utilizando cloranfenicol (34 yg/ml) e 250 yg/ml de estreptomicina em placas de Brain Heart Infusion (BHI/Chl/S). As colónias foram rastreadas por PCR para confirmar a presença do gene de PSA.

Subclonagem de LLO-PSA

Uma estrutura de leitura aberta de PSA truncada (GenBank Número de Acesso NM_001648), sem a sequência de sinal de secreção, os primeiros 24 AA, foi amplificada utilizando os iniciadores: Adv60-PSA (Xhol-nenhuma ATG) F:

gtgCTCGAGattgtgggaggctgggagtg (SEQ ID N° : 58) e Adv61-PSA (Spel-Stop) R: gatACTAGTttaggggttggccacgatgg (SEQ ID N° : 59) e foi subclonado em-quadro com os primeiros 441 aminoácidos de LLO (Figura 12) . A estrutura do plasmideo, pGG55 (Exemplo 1) também tem uma cópia do gene de virulência da Listeria prfA, e dois genes de cloranfenicol-acetil-transferase, que o tornam resistente ao cloranfenicol em ambas as estirpes bacterianas Gram-positivas e Gram-negativas. A sequência de AA do LLO-PSA é como se segue:

MKKIMLVFrrLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKK.HADEÍDK.YlC

GLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIWEKKJCKSINQNNADIQVVNAISSLTYP

GALVKANSEI.VENQPDVLPVKRDSLTLSIDI.PGMTNQDNKTVVKNATKSNVNNAVNTLVER

WNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMA.YSESQLTAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVIS FKQn:rYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNA£NPPAYISSVAYGRQVYLKl.STNSHS1

KVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQ1IDGNLGDLRDÍLKKGATF

NRETPGVPÍAYTTNFLRDNELAVINNNSEYIBTTSKAYTDGKiNIDHSGGYVAQFNISWDEVN

YPLEIVGGWECEKHSOPWOYLVASRGRAVCGGVLVHPOWYXTAAHCIRNKSVILLGRHSLF

HPEPTGOVFOVSfíSFPHPLYPMSLLKNRFLRPGPDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPT

OEPAI.ljTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLOCVDLHVISNDV(::AOVí:iP(:)ltVlKfMI.CAGRYTG

GKSTCSGDSGGPLVCYGVLOGITSWGSEPCAÍJERPSLYTKWHYRK.WIKDTIVANP (SEQ II

No: 54; PSA sequence is underlined) Há uma diferença AA entre esta PSA e a sequência em NM_001648, na posição N 221 Y) . pGG55-LLO-PSA foi electroporado em L. monocytogenes XFL-7 (Exemplo 1).

Crescimento e armazenagem de estirpes de vacinas bacterianas

Listeria-PSA recombinante foi cultivada num meio isento de produtos de origem animal (Terrific Broth modificado), na presença de 34 yg/ml de cloranfenicol e 250 yg/ml de estreptomicina a 37 °C numa incubadora agitadora. Depois de atingir uma densidade óptica (OD6oo) de 0,5, o que indicou uma fase logarítmica de crescimento, as bactérias foram recolhidas por centrifugação, e o sedimento foi lavado duas vezes em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e ressuspensas em PBS contendo 2% de glicerol, em seguida aliquotado e armazenado a -80°C. Uma aliquota foi descongelada um dia mais tarde e titulada para determinar (unidades formadoras de colónias/ml) o titulo bacteriano. Vacinas de Listeria armazenadas deste modo são estáveis durante até 1 ano. Estas aliquotas foram descongeladas, em seguida, diluiu-se a 1 x 107 UFC/dose e utilizadas para os estudos de imunogenicidade como se segue.

Expressão de LLO-PSA por Lm-LLO-PSA

Colónias Lm-LLO-PSA foram cultivadas em caldo BHI/Chl/S a 37°C e 225 rpm durante 8 horas. As bactérias foram separadas do meio de cultura por centrifugação a 10000 g durante 5 min e os sobrenadantes recuperados. As proteínas presentes no sobrenadante de cultura foram precipitadas durante pelo menos 1 hora na presença de 10% v/v de ácido tri-cloroacético, a 4°C e separados num gel de 4-20% por SDS-PAGE. Depois de transferir as proteínas para membranas de PVDF, foi detetada a proteina de fusão de LLO-PSA por imunotransferência com anticorpos policlonais de coelho ou anti-LLO (feito em casa) ou anticorpos anti-PSA (Sigma). Os sinais foram desenvolvidos utilizando o kit cromogénico Western Breeze (Invitrogen).

Passagem de Lm-LLO-PSA in vivo.

Lm-LLO-PSA foi passado in vivo duas vezes. Resumidamente, uma dose de 1 x 106 CFU de Lm-LLO-PSA foi injetada por via intraperitoneal (ip) em ratos de 6-8 semanas de idade. Os baços foram colhidos 3 dias após a injeção; suspensões de células individuais foram preparadas a partir dos baços e semeadas em placas BHI/Chl/S para selecionar para crescimento de Lm-LLO-PSA. Este procedimento foi repetido mais uma vez utilizando uma colónia positiva de LLO-PSA a partir da primeira passagem. Colónias Lm-LLO-PSA recuperadas após duas passagens in vivo foram testadas quanto à secreção de LLO-PSA. Um único clone foi escolhido para ser utilizado para a sequenciação de ADN de plasmideo, estudos de tumor e outros ensaios funcionais.

Estudo de virulência in vivo

Um estudo de virulência foi realizado para determinar a dose segura de Lm-LLO-PSA em ratinhos. Dois grupos de 4 ratinhos C57BL/6 machos (7 semanas de idade) foram injetados ip com duas doses diferentes de Lm-PSA: 1 x 108 e 5 x 107 CFU/dose. Os ratos foram monitorizados para sinais de doença até 5 dias após a inoculação.

Sequenciamento do plasmideo

Lm-LLO-PSA foi crescida durante a noite em 200 ml de BHI/Chl/S a 37°C e 225 rpm. As bactérias foram separadas a partir do caldo de cultura por centrifugação a 10000 g a 4°C durante 10 min. O sedimento bacteriano foi tratado com lisozima (2 mg/ml) a 37°C durante 30 min para quebrar a parede celular. O plasmideo pAdv34 foi purificado usando ο kit de plasmideo PureLink Midiprep (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante e completamente sequenciado pelo método de terminação da cadeia dideoxi.

RESULTADOS A estirpe Listeria foi criada para expressar um LLO não hemolitico fundido com uma PSA truncada (peptidase-3 relacionada com a calicreina). A estirpe recombinante de Listeria resultante segrega uma proteina do tamanho previsto para LLO-PSA (75 Kd) , que é detetada tanto por anti-LLO como por anticorpos anti-PSA, mostrando que a proteina de LLO-PSA foi expressa e segregada (Figura 13).

Geração de L. monocytogenes recombinante expressando PSA. Ο gene que codifica para a PSA humano foi clonado como proteina de fusão com um segmento truncado, não-hemolitico do LLO, que contém uma sequência PEST conservada no seu terminal N (Figura 12). A estrutura do plasmideo pGG55 como descrita anteriormente, permite a expressão e secreção de proteínas de fusão LLO a partir de uma origem episómica pela estirpe Lm XFL7atenuada, que não tem o fator de virulência genómico prfA. O gene prfA é necessário para a sobrevivência de Lm in vivo e assim, é complementado por uma cópia transportada no plasmideo. A sequência de sinal de PSA foi suprimida para evitar qualquer intervenção desta sequência com a secreção adequada da proteina de fusão LLO-PSA, que é mediada pela sequência de sinal de secreção LLO em Lm-LLO-PSA. .Lzn-LLO-PSA pode expressar e segregar a proteína de fusão LLO-PSA. A expressão e a secreção da proteína de fusão LLO-PSA a partir de Lm foram testadas nos sobrenadantes de cultura de células após o crescimento das bactérias in vitro. Foram testadas quatro colónias de Lm-LLO-PSA e todas foram capazes de segregar a proteína de fusão de LLO-PSA como detetado tanto com anti-LLO como com anticorpos anti-PSA (Figura 13) . Esta secreção foi mantida em bactérias isoladas após duas passagens em ratinhos in vivo (dados não mostrados), sugerindo que o plasmídeo é estável e mantido in vivo durante pelo menos três dias. De modo a confirmar a estabilidade, pAdv34 foi extraído de Lm-LLO-PSA passado e foi completamente sequenciado. Não foram detetadas mutações na estrutura do plasmídeo ou no gene de PSA depois de duas passagens in vivo, em comparação com a do plasmídeo pGG55 de referência e a sequência do gene de PSA humano (NCBI: NM_001648). Para determinar uma dose segura de Lm-LLO-PSA para ser utilizada para os estudos animais, duas doses desta construção foram testadas em ratinhos por injeção ip (1 x 108 e 5 x 107 UFC/dose). A dose utilizada nas experiências com animais (lxlO7 UFC/ratinho) foi definida como um décimo da dose mais baixa observada como tendo efeito deletério sobre os ratinhos imunizados.

Para testar a estabilidade de Lm-PSA in vitro, a estirpe foi crescida e passadas durante 7 dias consecutivos em Terrific Broth modificado. Após este tempo, as bactérias ficaram retidas no plasmídeo, o plasmídeo continha o gene de PSA e não houve deleções ou rearranjos no plasmídeo, indicando estabilidade do plasmídeo (Figura 22).

Para testar a estabilidade de Lm-PSA in vivo, a estirpe foi passada duas vezes através de ratinhos. 0 plasmídeo foi, em seguida, sequenciado por Genewiz™ e verificou-se ter a seguinte sequência:

AATrCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTT GT GCTFÀTTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGT AAT atcc agct g aacggt ctggtt a TAGGTÂCATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGAT atatcaacggtggtatatccagtgatttttttctccattttagcttccttagctcctgaaa

AtctcgATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGG

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CCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACAAGCATCACGAAATCTGACGCTCAAAl’CAG

TGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGCGGCTCCCTC

GTGCGCTCTCCTGTTCCTGCCTTTCGGTTTACCGGTGTCATTCCGCTGTTATGGCCGCGTTT

GTCTCATTCCACGCCTGACACTCAOTTCCGGGTAGGCAGTTCGCTCCAAGOTGGACTGTA.T

GCACGAACCCCCCGTrCAGTCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCO

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AGCGAATTTCGCCAATAOATAATrATCAAAAGAGAGGGGTGGCAAACGGTATTTGGCAT

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AAAGTCGATTrCA'ITAATTCCGTTAAATCAATTGGAGATATTTCTCTAATCAATTTTTTAA

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EXEMPLO 8: CONSTRUÇÕES DE LISTERIA-LLO-PSA ELICIAM LINFÓCITOS T CITOTÓXICOS ESPECÍFICOS DO ANTIGÉNIO E FORNECEM PROTEÇÃO TUMORAL-1 MATERIAIS E MÉTODOS EXPERIMENTAIS CTL ensaios

Ratinhos C57BL/6 machos foram imunizados ip quer com 0,1 DL50 de Lm-PSA ou 0,1 DL50 de Lm-HPVl6E7E6TM e reforçados uma vez após 2 semanas. Os baços foram colhidos 6 dias após o reforço. Esplenócitos isolados foram preparados e estimulados por 5 dias com mitomicina tratada, infetados com PSA-vaccinia, células MC57G como alimentadores. Na primeira experiência, foi realizado um ensaio de CTL utilizando péptido PSA H2Db (1 μΜ, HCIRNKSVIL; SEQ ID N° : 60) pulsado com células EL4 como alvos marcados com 100 μΜ de európio (Sigma), utilizando a seguinte proporção E:T: 25:1, 8:1, 2,8:1, 0,9:1, 0,3:1, 0,1:1 e 0,03:1. Após uma incubação de 4 horas de alvos mistos e efectores, as células foram separadas do sobrenadante da cultura por centrifugação. O európio libertado a partir de células Usadas no sobrenadante foi determinado como se segue: 10 yL de sobrenadante foram adicionados a 100 μΐ solução de melhoria de európio (Delfia). A absorvância foi lida a 590 nm utilizando o espectrofotómetro Victor II (Perkin Elmer). A libertação máxima de európio foi determinada a partir do sobrenadante de células alvo marcadas com 1% de triton X-100 e a libertação espontânea foi determinada a partir das células alvo incubadas na ausência de células efectoras. Na segunda experiência, a proporção E:T foi mantida constante a 25:1, e as concentrações de péptido foram variando como indicado. Lise específica percentual foi determinado como [ (libertação experimental - libertação espontânea)/ (libertação máxima - libertação espontânea)] x 100.

Ensaios de secreção de citoquinas

Ratos C57BL/6 machos foram imunizados com qualquer Lm-PSA ou Listeria expressando diferentes fragmentos de antigénio de tumor de Wilm (controlo negativo) ou deixados não-imunizados. Os ratinhos foram reforçados uma vez depois de duas semanas e os baços foram colhidos 6 dias após o reforço. Esplenócitos isolados foram preparados e estimulados in vitro durante a noite na presença de 1 μΜ de péptido PSA H2Db. A secreção de IFN-γ pelos esplenócitos isolados foi determinada por ensaio ELISpot.

Cultura de células, materiais e reagentes Células de adenocarcinoma de próstata de rato TRAMP-C1 derivadas de um tumor da próstata do rato C57BL/6 foram adquiridas a partir de ATCC. Esta linha celular é negativa para a expressão do PSA. As células foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco com 4 mM de L-glutamina ajustado para conter 1,5 g/L de bicarbonato de sódio e 4,5 g/L de glicose, suplementado com 0,005 mg/ml de insulina bovina e 10 nM de dehidroisoandrosterona, 90%; soro fetal bovino, 5%; Nu-Soro IV, 5%. O gene que codifica para a proteína de comprimento completo do PSA humano, incluindo a sua sequência sinal, foi subclonado num plasmídeo pUV6/v5 (Invitrogen). Após confirmação da sequência correta, o plasmídeo foi linearizado e transfectado em células TRAMP-C1 usando Lipofectamine 2000™ (Invitrogen). Os clones positivos foram selecionados na presença de 10 yg/ml de blasticidina. Vários clones que expressam estavelmente PSA foram isolados e testados para a secreção de PSA humano no meio de cultura de células.

Inoculação do tumor subcutâneo

Dois clones diferentes de células TRAMP-Cl-expressando PSA foram novamente suspensas, a 5 x 106 células por dose de 200 mel. Ratinhos C57BL/6 machos (8 por grupo, 6-8 semanas de idade) foram inoculados por via sc no flanco esquerdo.

Estudos de regressão tumoral

Sete dias após a inoculação do tumor, os ratos são imunizados com 0,1 LD50 de Lm-PSA (107 CFU) , 0,1 LD50 de Lm- HPV16E7, ou PBS. Dois reforços impulsos foram administrados nos dias 15 e 25 pós-inoculação do tumor. Os tumores são monitorizados durante 90 dias. O tamanho do tumor é definido como a média dos dois diâmetros perpendiculares.

Injeção ortotópica de células tumorais da próstata

Ratos C57BL/6 machos, com seis semanas de idade, são anestesiados com 2% de isoflurano. Num campo estéril, é feita uma incisão na linha média inferior para aceder à próstata. 0 lobo esquerdo da próstata dorsal é injetado com 1 x 105 células tumorais TRAMPC-l/PSA a partir de uma suspensão de uma única célula em PBS, utilizando-se uma agulha de calibre 27 montado sobre uma seringa de 50 pL de Hamilton. Os ratos são suturados, e as suturas são removidas de 10 dias após a cirurgia. Sete dias depois, os ratos são imunizados iv com Lm-PSA, LmHPV16E7 ou PBS. Os ratinhos são sacrificados em diferentes pontos de tempo, as próstatas são removidas cirurgicamente e pesadas para determinar o crescimento do tumor.

Estudos de protecção tumoral

Ratinhos C57BL/6 são imunizados e reforçados com Lm-PSA, LmHPV16E7, ou PBS, como descrito no Exemplo anterior. Sete dias após o reforço, os ratinhos foram injetados com 5 x 106 de TRAMPC-l/células tumorais PSA. O crescimento dos tumores é monitorizado por medição com um compasso de calibre por 90 dias.

Inibição de metástases do cancro da próstata

Para a inoculação do tumor ortotópico, ratinhos C57BL/6 do sexo masculino de 8-10 semanas de idade (laboratórios Jackson) são anestesiados com isoflurano. É feita uma incisão na pele abdominal baixa para as glândulas prepuciais, e as vesículas seminais são cuidadosamente exteriorizadas para expor a próstata dorso-lateral. Usando uma seringa de insulina de calibre 29, 5 x 105 de TRAMPC-1/ células PSA suspensas em PBS são injetados no dorso-lateral da próstata num volume de 20 L. As vesículas seminais e da próstata são mantidas durante um minuto, para permitir que as células injetadas se adaptem à glândula e, em seguida, substituídas suavemente para dentro da cavidade abdominal. As feridas da parede do corpo e da pele são fechadas com 5-0 PDS e fio de nylon 5-0, respetivamente.

Os tumores podem desenvolver durante 50 dias. O tumor primário é removido durante a necropsia e fixado em formalina, e, em seguida, embebido em parafina, seccionado e corado com H&E. O aumento dos gânglios linfáticos da região para-lombar é visualizado em microscópio cirúrgico e então dissecados, fixos, embutidos, para análise histológica das células cancerosas da próstata.

Imuno-coloração de tecido

Tecidos tumorais da próstata fixados em formalina são embebidos em parafina, seccionados, aplicados em Plus Slides™ (VWR Corp.), e depois corados usando um sistema Dako Autostainer. As lâminas são pré-tratadas com 3,0% de peróxido de hidrogénio, durante 10 minutos, em seguida, lavadas e tratadas com 10 yg/mL de solução de proteinase K, durante 3 minutos para aumentar a recuperação de antigénios. Os sítios de ligação não-específicos são bloqueados pela adição de soro de cabra normal durante 30 minutos, e, em seguida, 10 yg/mL de solução de anticorpo de coelho anti-humano de PSA (Sigma) ou de antigénio nuclear de célula de coelho anti-humano em proliferação (AB15497, anticorpos Abeam) é aplicado ao tecido por 30 minutos. O anticorpo primário é removido por lavagem, e o anticorpo secundário de rábano marcado com peroxidase adequado é aplicado durante um período de 30 minutos e detetado utilizando substrato NovaRed™ (Vector Labs, Burlingame, CA) numa incubação de 8 minutos. As lâminas são contra-coradas com hematoxilina antes da secagem. Células das lâminas das secções primárias e de nó linfático são pontuadas como positivo ou negativo para o PSA humano. Quatro regiões de cada lâmina foram selecionados aleatoriamente, e 20 células de cada região são pontuados. Coloração PSA em tumores é comparada com metástases linfáticas, a partir do mesmo rato.

Estirpes de Listeria

As vacinas de Listeria são preparadas e armazenadas como descrito no Exemplo anterior.

RESULTADOS

Para testar a imunogenicidade de LLO-PSA, ratinhos C57BL/6 de 6-8 semanas de idade (Jackson Laboratories) foram imunizados ip com qualquer Lm-PSA (0,1 LD50, 1 x 1 07 UFC/ dose) ou Lm-HPVl 6E7E6TM (controlo negativo, 0,1 LD50, 1 x 106UFC/dose) ou deixados não-imunizados. Os esplenócitos de ratinhos vacinados foram testados quanto à capacidade de reconhecer e lisar células que apresentam péptido de PSA in vitro num ensaio de CTL. Os esplenócitos de ratinhos imunizados foram capazes de reconhecer e lisar peptidicos PSA pulsados com células tumorais com alta eficiência (Figura 20A). Além disso, a resposta era dependente da dose no que respeita à quantidade de antigénio apresentado pelas células alvo (Figura 20B).

Em ensaios adicionais, os ratinhos foram imunizados com Lm-PSA ou estirpes que expressam fragmentos de antigénio de tumor de Wilm (controlo negativo), e foi determinada a secreção de citoquinas, em resposta à incubação com o péptido de PSA. Os esplenócitos de ratinhos vacinados exibiram elevados niveis de secreção de IFN-γ (Figura 18).

Assim, as estirpes LM que expressam PSA e fusões LLO-PSA são eficazes na indução de CTL especifico para o antigénio e são capazes de lise de células alvo e secreção de IFN-γ. Assim, as estirpes LM que expressam PSA e fusões LLO-PSA são eficazes na vacinação terapêutica e profilática contra o cancro da próstata que expressa PSA.

As vacinas de Listeria descritas no Exemplo anterior são utilizadas em experiências de proteção do tumor num modelo animal do carcinoma da próstata ortotópico. Os ratos são imunizados com Lm-PSA, LmHPV16E7, ou PBS, em seguida injetados com TRAMPC-1, Lm-PSA protege os ratos da formação de tumores.

Em experiências adicionais, os ratos são injetados primeiro com TRAMPC-l/células cancerosas PSA prostáticas, vacinados com Lm-PSA, LmHPV16E7, ou PBS 4 dias mais tarde, e reforço com a mesma vacina. Lm-PSA impede o crescimento de metástases da próstata.

Assim, as estirpes LM produtoras de PSA e fusões LLO-PSA induzem a proteção do tumor.

EXEMPLO 9: CONSTRUÇÕES DE LISTERIA-LLO-PSA ELICIAM

LINFÓCITOS T CITOTÓXICOS ESPECÍFICOS DO ANTIGÉNIO E FORNECEM PROTEÇÃO TUMORAL-II MATERIAIS E MÉTODOS EXPERIMENTAIS

Estudo da invasão de macrófagos in vitro. Células do tipo de macrófagos de murino J774A.1 foram plaqueadas a 1 x 106 células por poço em placas de 24 poços. No dia seguinte, as células foram infetadas a uma MOI de 1:1 com diferentes estirpes Lm durante 1 hora na ausência de antibióticos. As bactérias extracelulares foram eliminadas por lavagem e incubação das células em meio contendo 50 pg/ml de gentamicina durante 30 min a 37°C e 5% de CO2. O crescimento bacteriano intracelular foi monitorizado por recolha de amostras em diferentes momentos durante até 8 horas, seguido por titulação das bactérias em placas de BHI após lise das células com dH20.

Eficácia anti-tumoral. TRAMPC-1 é uma linha celular de adenocarcinoma de tumor da próstata de murino no rato C57BL/6 e foi utilizado para construir um modelo de tumor da próstata que segrega PSA para testar a eficácia de Lm-LLO-PSA como uma vacina. A grelha de leitura aberta completa do PSA humano, incluindo a sua sequência de sinal de secreção no terminal N da molécula foi clonada sob o controlo do promotor UbC no plasmídeo pUB6/V5 (Invitrogen). O plasmídeo resultante (pAdv63) foi sequenciado, para confirmar a sequência do gene de PSA correto e em seguida transfectado na linha celular TRAMPC-1, utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen). As células transfectadas foram selecionadas por cultura das células em meio contendo 10 yg/ml de blasticidina (Invitrogen). Os clones individuais foram isolados pelo método da diluição limitante e foram rastreados para a secreção de PSA para o meio de cultura extracelular utilizando um kit de ELISA anti-PSA humano. Vários clones positivos foram obtidos, expandidos e armazenados em azoto liquido. Um clone (T-PSA23) foi selecionado para estudos posteriores.

Estudo de regressão do tumor. Três grupos de 8 ratos machos C57BL/6 (6-8 semanas de idade) foram inoculados por via sc no flanco direito com 5 x 106 células T-PSA23. Sete dias mais tarde, quando os tumores atingiram um diâmetro médio de 4-5 mm, foram imunizados ip com Lm-LLO-PSA (1 x 107 UFC/ dose), Lm-LL0-E7 (1 x 108 CFU/dose) ou não foram tratados. Foi construído Lm-LLO-El anteriormente descrito por Gunn et ai., da mesma forma como Lm-LLO-PSA, mas em vez de PSA, que expressa HPV16E7 e foi utilizado nesta experiência como um irrelevante Lm de controlo. As imunizações foram repetidas duas vezes com intervalos de 1 semana. Os tumores foram controlados semanalmente, durante sete semanas. Amostras de sangue de todos os animais experimentais foram colhidas no dia 40 pós-inoculação do tumor a partir da veia da cauda e a presença da proteína de PSA no soro foi testada utilizando o kit de ELISA de PSA. Para estudos de comparação, as células de tumor foram injetadas como descrito acima. Os ratinhos foram imunizados duas vezes com Lm-LLO-PSA (1 x 107 UFC/dose, em 200 μΐ de PBS) , um PSA-vaccinia recombinante (1 x 107 PFU/dose em 200 μΐ de PBS, ip) ou uma vacina de pADN compreendendo uma mistura de PSA/ pCDNA3.1 (100 pg) com GM-CSF/pCDNA3.1 (100 pg) num volume de 50 pi, por injeção intramuscular, nos quadriceps esquerdo. Os tumores foram monitorizados uma vez por semana com um paquímetro eletrónico e os tamanhos dos tumores foram expressos como a média dos dois diâmetros perpendiculares.

Estudos de imunogenicidade em ratinhos

Ensaio ELISpot: Grupos de 4-5 ratos C57BL/6 machos (6-8 semanas de idade) foram imunizados três vezes com qualquer Lm-LLO-PSA ou uma construção semelhante contendo um antigénio irrelevante como controlo negativo (Lm-LL0-WT1), ou não foram imunizados (normal). Seis dias após o reforço, os baços foram colhidos e processados para uma suspensão de células individuais. Os glóbulos vermelhos foram lisados por 2 minutos de incubação com solução de lise ACK seguido por duas lavagens com meio C-RPMI. Os esplenócitos isolados foram plaqueados a 2 x 105 células/poço na presença de 1 μΜ de péptido PSA65-74 (epitopo PSA H2Db restrito HCIRNKSVIL) em placas ELISpot previamente revestidas com anticorpo de rato IFN-γ (mAb AN18). As placas foram incubadas durante a noite a 37°C. As células formadoras de manchas (SFC) foram detetadas de acordo com as instruções do fabricante (Mabtech AB). As manchas foram contadas utilizando um microscópio de dissecação.

Coloração intracelular para o IFN-γ. Os esplenócitos isolados a partir dos ratinhos de controlo imunizados, ou normais foram estimulados a 2xl06 células/poço durante 5 h em placas de 96 poços de fundo redondo com 1 μΜ quer de peptidicos PSA65-74 ou péptidos de controlo, na presença de IL-2 (50 U/ml) e monensina A (StopGolgi, BD Biosciences) . As células incubadas em meio sem péptido foram utilizadas como controlo negativo. Após a incubação, as células foram coradas com anti-CD8-FITC do rato, CD3-PerCP-Cy5.5 e anticorpos APC- CD62L. Subsequentemente, as células foram permeabilizadas e coradas com anticorpo anti-ratinho de IFN-y-PE e analisadas num citómetro de FACS Calibur (BD Biosciences) . Os dados foram analisados utilizando o software CellQuest Pro. As células foram fechadas como CD3+, CD8+ e CD62Lbaix0 o número de células IFN-γ positivas expressas como uma percentagem do total de células fechadas.

Ensaio de citotoxicidade. A atividade citotóxica das células T em resposta à vacinação com Lm-LLO-PSA foi medida por um ensaio de CTL específico de PSA. Grupos de quatro ratos machos C57BL/6 foram injetados ip com três doses de Lm-LLO-PSA (1 x 107 UFC) ou uma Listeria que expressam um antigénio irrelevante (HPV16E7E6), com intervalos de uma semana. 0 Grupo normal não recebeu qualquer imunização. Os baços dos ratinhos imunizados e normais foram colhidos 6 dias após o último reforço. Os esplenócitos foram incubados durante 5 dias em meio RPMI-C, contendo 20 U/ml de IL-2 de rato (Sigma), na presença de células MC57G infetadas com PSA/vaccinia (MOI de 5 para 4 horas) e tratadas com mitomicina C, a uma proporção efector:estimulador de 1:20. O ensaio de citotoxicidade foi realizado durante 4 horas por incubação das células efectoras, com células alvo EL4, pulsadas durante 1 hora com o H2Db, péptido PSA65_74 e marcadas com európio. O európio libertado a partir das células lisadas foi medido por mistura de uma amostra de sobrenadante da cultura de células com uma solução de melhoramento de európio (Delfia / Perkin Elmer, Waltham, MA) e uma leitura de absorvância a 590 nm (Perkin Elmer / Wallac, VictorlI) . Dois conjuntos de testes foram realizados: a) utilizando diferentes proporções efector: alvo (E:T) a uma concentração fixa de péptido de 1 μΜ; e b) utilização de diferentes concentrações do peptídeo PSA com uma proporção E:T fica de 25:1. Os valores SC50 foram calculados como a concentração de péptido necessária para 50% do valor da concentração de péptido máxima utilizada (1 μΜ) menos o nível de fundo a 0 μΜ.

Análise de linfócitos infiltrados no tumor (TIL): células T-PSA23 embutidas em matrigel foram inoculados sc no flanco direito de ratinhos C57BL/6 do sexo masculino, que foram imunizados nos dias 7 e 14 com Lm-LLO-PSA, uma vacina Lm de controlo ou não tratados. No dia 20, os tumores foram excisados cirurgicamente, lavou-se em PBS gelado e triturou-se com um bisturi. O tumor foi incubado em solução de recuperação de células de matrigel (BD Biosciences) durante 2 horas em gelo. TILs foram ainda libertados por rutura mecânica do tecido com um coador de células utilizando uma seringa de imersão. As células isoladas foram coradas com um tetrâmero-PE PSA65-74 H-2Db e anticorpos anti-rato CD8-FITC, CD3-PerCP-Cy5.5 e CD62L-APC para caracterizar CTLs específicos para o epítopo PSA. Para analisar as células T reguladoras no tumor, TILs também foram corados com CD4-FITC, CD3-PerCP-Cy5.5 e CD25-APC. As células foram, subsequentemente, permeabilizadas e coradas com anticorpo anti-Foxp3-PE (Milteny Biotec). As células foram analisadas num citómetro de FACS Calibur (BD Biosciences). Os dados foram analisados utilizando o software CellQuest Pro. As células T reguladoras foram definidas como células CD3+ CD4+ CD25+ Fop3+.

Análise estatística: Foram utilizados testes não-paramétricos de Mann-Whitney e Kruskal-Wallis para comparar os tamanhos dos tumores entre os diferentes grupos de tratamento. Os tamanhos dos tumores foram comparados no dia 40 para análise estatística, porque este era o último ponto de tempo com o maior número de ratos em cada grupo. O teste t de Student foi utilizado para comparar as médias nas experiências ELISpot. Um valor-p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo nestas análises.

RESULTADOS

Lm-LLO-PSA é capaz de infetar macrófagos in vitro. A absorção pelas células apresentadoras de antigénios, tais como células dendríticas e macrófagos é um requisito essencial para as vacinas Lm para distribuir com sucesso e antigénios presentes com base no sistema imunitário. Esta propriedade pode ser testada in vitro através da infeção de macrófagos de murídeo da linha celular semelhante J774A.1 e quantificar o crescimento bacteriano intracelular, o qual é uma indicação de que a estirpe de vacina Lm foi capaz de introduzir corretamente as células e multiplicar. Neste ensaio, Lm-LLO-PSA foi mostrado ser capaz de invadir os macrófagos e crescer de uma maneira semelhante à estirpe Lm 10403s do tipo selvagem. Em contraste, a estirpe Lm XFL7, carece de prfA e não escapa do fagolisossoma, não é capaz de proliferar em células J774A.1 e o seu título permanece constante várias horas após a infeção (Figura 14). A complementação do prfA em estirpe Lm XFL7 com o plasmídeo pAdv34 resultou na restauração das propriedades invasivas da estirpe in vitro e esta foi comparável à da estirpe do tipo selvagem.

Lm-LLO-PSA provoca a regressão de tumores expressando PSA pré-estabelecidos em ratinhos. A eficácia de Lm-LLO-PSA em regredir tumores expressando PSA foi testado num modelo de ratinho utilizando uma linha celular TRAMPC-1 transfectada de PSA. TrampC-1, células derivadas originalmente a partir de um adenocarcinoma da próstata de murino, foram estavelmente transfectadas com o gene de PSA humano sob o controlo do promotor humano da ubiquitina C. A secreção de PSA por células transfectadas foi confirmada por ELISA. Quatro clones foram expandidos e passadas para 25 gerações na ausência do marcador de seleção de antibiótico, blasticidina. Os sobrenadantes de cultura de células foram testados para os níveis de secreção de PSA que se mostraram ser comparáveis entre as células em passagem precoce e da passagem 25 (dados não mostrados) . Um desses clones reteve a tumorigenicidade in vivo e formou tumores sólidos após inoculação sc em ratinhos C57BL/6 machos. Uma passagem precoce deste clone foi utilizada para os estudos de tumor e que é referido como t-PSA23. Três grupos de 8 ratinhos foram inoculados sc com 5 x 106 células T-PSA23 e foram monitorizados diariamente para o crescimento do tumor. Após 7 dias, uma massa tumoral sólida de 4-5 mm de diâmetro foi detetada em 7 de 8 ratos em cada grupo (Figura 15) . Nesta altura os ratinhos foram imunizados com Lm-LLO-PSA (1 x 107 UFC/ratinho), Lm-LL0-E7 (lx 108 UFC/ratinho) ou deixados sem tratamento. A imunização primária foi seguida por duas doses de reforço em intervalos de 1 semana, com a mesma dose da primeira. Os ratinhos (7 de 8) em cada um dos grupos de controlo desenvolveram tumores de crescimento lento, que atingiram um diâmetro de 2 cm em 7 semanas após a inoculação (Figura 15), altura em que foram sacrificados. Um rato em cada grupo não mostrou quaisquer sinais de tumor a qualquer momento. Cinco dias após a primeira imunização, a redução do tumor foi observada em 7 de 8 do grupo imunizado com Lm-LLO-PSA e a regressão completa do tumor foi observada em 5 destes ratinhos após 1 semana. Um dos tumores no grupo imunizado com Lm-LLO-PSA manteve-se estável até à terceira imunização. No entanto, uma semana após a terceira vacinação, este tumor regrediu e também se tornou indetetável. Outro rato neste grupo desenvolveu um tumor de crescimento lento que atingiu um tamanho de 18-20 mm no prazo de 7 semanas e foi sacrificado. No final do estudo de 8 semanas pós-inoculação do tumor, 7 de 8 ratinhos no grupo imunizado com Lm-LLO-PSA estavam ainda livres de tumor. Esta experiência foi repetida duas vezes com resultados semelhantes. A análise estatística não paramétrica de Kruskal-Wallis foi realizada sobre os tamanhos dos tumores no dia 40, antes dos ratinhos normais e em grupos _Lm-LLO-E7 serem sacrificados. Não houve diferenças estatisticamente significativas entre os tamanhos dos tumores dos ratos do grupo normal e os ratos imunizados com Lm-LLO-E7 (p = 0,613) . No entanto, a imunização com Lm-LLO-PSA foi mostrada ter um impacto significativo no crescimento do tumor t-PSA23 (p = 0,002). As amostras de soro a partir de controlos e ratinhos imunizados com Lm-LLO-PSA foram colhidas no dia 40 pós-desafio do tumor e testadas para a presença de PSA utilizando um kit de ELISA de PSA anti-humano (American Qualex). Níveis significativos de PSA (5-10 ng/ml) foram detetados no soro de ratinhos de controlo e no rato do grupo Lm-LLO-PSA que apresentavam tumores. Nenhum PSA foi encontrado no soro de ratinhos imunizados com Lm-LLO-PSA após a regressão do tumor. .Lzn-LLO-PSA gera respostas imunitárias celulares contra o PSA em tanto nos baços como nos tumores. Para elucidar se a vacinação com LM-LLO-PSA induzida com CTL específica de PSA capaz de infiltrar o tumor, os ratinhos foram implantados sc com uma mistura de células T-PSA23 + matrigel e imunizados com duas doses de Lm-LLO-PSA, Lm-LLO-E7 ou nenhum. Os baços e os tumores foram colhidos 6 dias após a última imunização e testados para a presença de tetrâmero de células T positivas CD8 + /PSA65-74 (H2Db restrito) por análise de FACS. Não foram observadas respostas significativas anti-PSA em baços de animais normais (0,05%) ou ratinhos vacinados com Lm-LLO-El (0,09%) (Figura 16, painel superior). No entanto, após a imunização com Lm-LLO-PSA, um número significativo de células CD8+ T específicas de PSA foram encontradas nos baços. Interessantemente, quando se testaram os tumores excisados de ratinhos para estas presenças de TILs, foi identificado um baixo número de células CD8+ T especificas de PSA tanto nos ratinhos normais como nos em ratinhos imunizados com Lm-LLO-El (1,5% e 0,51% respetivamente). A imunização com Lm-LLO-PSA causou um aumento considerável neste número como 16,1% de todas as células CD8+ TILs foram mostrados para ser específicos de PSA55-74 (Figura 16 painel inferior) .

A imunização com Am-LLO-PSA provoca uma diminuição nas células T reguladoras em tumores, mas não no baço. A presença de células tumorais infiltrantes T reguladoras CD4 + /CD25+/FoxP3+ T (Treg) tem sido mostrada estarem associadas com aumento da possibilidade de progressão tumoral. Portanto, examinámos a presença desta população de células T em tumores de ratos imunizados com Lm-LLO-PSA ou de controlo. Curiosamente, a imunização com qualquer Lm-LLO-PSA ou Lm-LLO-E7 provocou uma diminuição considerável na frequência de Tregs nos tumores, em comparação com os tumores de ratos normais (Figura 17) . Na verdade, Lm-LLO-PSA teve um pouco mais impacto do que Lm-LLO-E7 na frequência de tumor infiltrado com Tregs. Por outro lado, não houve diferenças significativas entre as percentagens de células CD4+/CD25+/Foxp3 + T isoladas a partir dos baços de ratinhos Lm-LLO-PSA ou de controlo. A imunização com Lzn-LLO-PSA resulta em fortes respostas imunitárias celulares contra o PSA. As respostas imunitárias induzidas por vacinas baseadas em Lm foram mostradas para resultar em respostas celulares em vez de humorais. Foi investigada a ativação e a funcionalidade de células CD8+ T induzida por Lm-LLO-PSA em baços de ratinhos imunizados.

Secreção de citoquinas. A secreção de IFN-γ por células T ativadas em resposta a uma estimulação com péptido de H2Db PSA in vitro foi testada por ELISpot e coloração de citoquinas intracelulares. Os ratos foram imunizados três vezes com Lm-LLO-PSA ou Lm-LLO-WT-1 (Lm-LLO, antigénio de tumor de Wilm oomo controle negativo) ou não foram imunizados (normais). Esplenócitos isolados foram depois preparados e incubados com o péptido de PSA e as células CD8+ secretoras de IFN-γ foram quantificadas. Em ambos os ensaios, os ratos imunizados com Lm-LLO-PSA apresentaram um número significativamente maior de células secretoras de IFN-γ em resposta a impulsos de péptido do que os controlos negativos (p <0,001). O número de células secretoras de IFN-γ medido por ensaio ELISpot, foram aproximadamente 11 vezes maior do que os controlos (Figura 18). Quando testado por coloração de citoquinas intracelulares para IFN-γ, foi detetado um aumento de 30 vezes no número de células CD8+ CD62Lbaix0 células secretoras de IFN-γ de ratinhos imunizados com Lm-LLO-PSA em comparação com o controlo (4,22% para Lm-LLO-PSA versus 0,15% para normais) (Figura 19) .

Ensaio de citotoxicidade. A fim de determinar a atividade funcional das células T específicas para o PSA, os esplenócitos de ratinhos imunizados ou ingénuos foram testados num teste de CTL contra células pulsadas com o péptido H2Db PSA. Usando a concentração de péptido fixo (1 μΜ) , esplenócitos de ratinhos imunizados com Lm-LLO-PSA apresentaram uma lise específica máxima de 60%, que foi reduzida em relação à proporção de E:T (Figura 20A) . Este resultado era dependente da concentração de péptido no ensaio de lise com um valor máximo em atingir uma concentração de péptido de apenas 0,1 μΜ (Figura 20B) . O valor SC50 da população policlonal, que é uma medida útil da avidez média de células T foi de aproximadamente 1 pM. Os resultados desta experiência também confirmaram que a imunização com Lm-LLO-PSA gerou células T citolíticas específicas de elevada avidez, capazes de lisar as células que apresentam o antigénio PSA alvo.

Comparação dos efeitos anti-tumorais de Ijn-LLO-PSA com outras modalidades de vacinação com base em PSA.

Finalmente, para avaliar ainda mars a vacina Lm-LLO-PSA foi comparada a sua eficácia anti-tumor com duas outras vacinas baseadas PSA que têm sido descritos na literatura, isto é, um ADN recombinante e uma vacina baseada em vaccinia. Para isso, o quadro de leitura aberto completo de PSA foi clonado em pCDNA3.1 sob o controlo do promotor hCMV (pAdv40.1) . Uma vacina de ADN semelhante foi descrita anteriormente por Roos et al. , utilizando um vetor de estrutura semelhante, ou seja, pVax (Invitrogen). A diferença entre as duas estruturas do vetor pcDNA3.1 (e pVax) é apenas no seu marcador de seleção de antibiótico. pAdv40.1 foi injetado im como uma mistura com GM-CSF/ pCDNA, que tem sido utilizado como um adjuvante eficaz para outras vacinas de ADN. Expressão de PSA de PSA/plasmídeo pCDNA foi confirmada por transfecção in vitro na linha celular 293FT (dados não mostrados). PSA-vaccinia recombinante foi previamente descrito por Hudge et al. Os ratinhos foram implantados com células tumorais t-PSA23 como descrito acima e, em seguida imunizados duas vezes com cada uma das vacinas de dose e via de administração ótima como citado na literatura. A imunização com PSA/vaccinia não tem qualquer impacto sobre o crescimento de tumores T-PSA23 uma vez que todos os ratinhos normais e imunizados com PSA/ vaccinia desenvolveram tumores que atingiram um tamanho de 20 cm dentro de 7-8 semanas e tiveram que ser sacrificados (Figura 21b ). Contudo 1 de 8 ratos imunizados com a vacina PSA/ADN e 3 de 8 ratinhos vacinados com Lm-LLO-PSA permaneceram livres de tumores para mais de 90 dias, no momento em que o estudo foi encerrado (Figura 21A e a inserção de tabela). Esta experiência foi repetida duas vezes mostrando resultados semelhantes. Assim, Lm-LLO-PSA foi provado ser a vacina mais eficaz das três modalidades vacinais de PSA em regredir tumores estabelecidos expressando PSA. Tem de ser notado que nos estudos de comparação, devido à disponibilidade limitada das outras duas vacinas foram administradas apenas duas doses.

Portanto, Lm-LLO-PSA foi mostrado ser menos eficaz (regressão completa do tumor foi observada apenas em 3 de 8) do que quando injetado três vezes (em 7 de 8 tumores regrediram, como visto na Figura 15) . Esta observação foi confirmada em vários outros estudos (dados não mostrados).

EXEMPLO COMPARATIVO 10: CONSTRUÇÕES DE HIDROLASE 1 DE

LISTERIA-hhO EM FOLATO (FOLH1) E ANTIGÉNIO DE CÉLULAS ESTAMINAIS PROSTÁTICAS DE LISTERIA-LLO (PSCA) ELICIAM LINFÓCITOS T CITOTÓXICOS ESPECÍFICOS DO ANTIGÉNIO MATERIAIS E MÉTODOS EXPERIMENTAIS

Crescimento e armazenamento de estirpes de vacinas bacterianas

Listeria-LLO-FOLH 1 recombinante e Listeria-LLO-PSCA são cultivadas e mantidAs como descrito para Lister-in-PSA no Exemplo 7 acima.

RESULTADOS

Um gene que codifica um F0LH1 truncado, que contém a moldura de leitura aberta completa de F0LH1, exceto para a sua sequência de sinal de secreção, está fundido com um gene que codifica um fragmento truncado não hemolitico da listeriolisina 0, de um modo semelhante ao descrito para o KLK3 em Exemplo 7 acima. Do mesmo modo, um gene que codifica um PSCA truncado, que contém uma moldura de leitura aberta completa de PSCA, exceto para a sua sequência de sinal de secreção, está fundido com um gene que codifica um fragmento truncado não hemolitico da listeriolisina 0. Cada gene é clonado no plasmideo de Listeria pGG55 e electroporação em LM XFL-7. A proteina LL0-F0LH1 e a proteina LLO-PSCA são assim expressas e segregadas epissomicamente a partir de estirpes separadas de Listeria recombinante.

Para testar a imunogenicidade de LL0-F0LH1 e LLO-PSCA, ratinhos foram re-imunizados com Lm-LL0-F0LH1, Lm-LLO-PSCA, ou LmWTIA (antigénio irrelevante de controlo) ou PBS (controlo negativo), como descrito para LL0-KLK3 no Exemplo 7 acima. Após cultura com células estimuladoras infetadas com vaccinia-PSA durante 5 dias, esplenócitos de ratinhos vacinados com F0LH1 são capazes de reconhecer e lisar células tumorais pulsados com péptido F0LH1 com alta eficiência num ensaio de CTL e os esplenócitos dos ratinhos vacinados com PSCA são capazes de reconhecer e lisar pulsadas células tumorais com péptido PSCA com alta eficiência num ensaio de CTL. Além disso, os esplenócitos apresentam elevados niveis de secreção de IFN-γ, em resposta à incubação com o péptido FOLHlou o péptido PSCA, respetivamente.

Assim, as estirpes LM que expressam F0LH1, as estirpes LM que expressam PSCA, fusões LLO-PSCA e fusões LL0-F0LH1 são eficazes na indução de CTL especifico para o antigénio que são capazes de lise de células alvo e a secreção de IFN-γ. Assim, estirpes LM expressando F0LH1, estirpes LM queexpressam PSCA, fusões LLO-PSCA e fusões LL0-F0LH1 são eficazes na vacinação terapêutica e profilática contra o cancro da próstata que expressa PSA. EXEMPLO COMPARATIVO 11: CONSTRUÇÕES DE LISTERIA-LLQ-FOLH1

FORNECEM PROTEÇÃO TUMORAL

As vacinas de Listeria descritas no Exemplo anterior são utilizadas em experiências de proteção do tumor no modelo ortotópico de carcinoma da próstata dos animais descritos nos Exemplos 8 e 9 acima. Os ratos são imunizados com Lm-F0LH1, Lm-PSCA, LmWTIA, ou PBS, então injetados com células-PC3M LN4 ou 22Rvl. Lm-F0LH1 e Lm-PSCA protegem os ratinhos da formação de tumores.

Em experiências adicionais, os ratos são injetados primeiro com células de cancro da próstata PC-3M, como descrito para os Exemplos 8 e 9 acima, vacinados com Lm-F0LH1, Lm-PSCA, LmWTIA, ou PBS 4 dias mais tarde, e um reforço com a mesma vacina. Lm-F0LH1 e Lm-PSCA impedem as metástases da próstata.

Assim, as estirpes Lm produzidas por F0LH1 e PSCA e fusões Lm-F0LH1 e Lm-PSCA induzem a proteção tumoral.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<11Q> The Trustees of the university of Pennsylvania ADVAXIS

<120> COMPOSITIONS AND METHODS COMPRISING KLK3, PSCA, OR FOLH1 ANTIGEN <13Q> P-7769-PC2 <150> 11/798,177 <151 >2007-05-10 <160> 64 <17G> Patentln version 3.3

<21G> 1 <211> 32 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 1

Lys Glu Asn Ser ile Ser ser Met Ala Pro Pro Ala ser Pro Pro Ala 15 10 15

Ser Pro Lys Thr Pro lie Gin Lys Lys His Ala Asp Glu lie Asp Lys 20 25 30

<21Q> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400>2

Lys Thr Glu Glu Gin Pro ser Glu val Asn Thr Gly Pro Arg 15 10

<210>3 <211> 28 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <4G0>3

Lys Ala Ser val Thr Asp Thr Ser Glu Gly Asp Leu Asp Ser Ser Met 15 10 15

Gin Ser Ala Asp Glu Ser Thr pro Gin Pro Leu tys 20 25

<210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 4

Lys Asn Glu Glu val Asn Ala Ser Asp Phe Pro pro Pro Pro Thr Asp 1 5 10 15

Glu Glu Leu Arg 20

<21Q>5 <211> 33 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 5

Arg Gly Gly He Pro Thr ser Glu Glu Phe Ser Ser Leu Asn Ser Gly 15 10 15

Asp Phe Thr Asp Asp Glu Asn ser Glu Thr Thr Glu Glu Glu lie Asp 20 25 30

Arg

<210» 6 <211> 17 <212» PRT <213> Streptococcus pyogenes <400 6 tys Gin Asn Thr Ala Ser Thr Glu Thr Thr Thr Thr Asn Glu Gin Pro 1.5 10 15

Lys

<210» 7 <211» 17 <212> PRT <213> Streptococcus equisimiiis <400>7

Lys Gin Asn Thr Ala Asn Thr Glu Thr Thr Thr Thr Asn Glu Gin Pro 15 10 15

Lys <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213» Artificial <220> <223> chemically synthesized <400» 8 ggctcgagca tggagataca ce 22 <210> 9 <211> 28 <212» DNA <213> Artificial <220> <223> chemically synthesized <400>9 ggggactagt ttatggtttc tgagaaca 28 <210 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220 <223> chemically synthesized <400> 10 gggggctagc cctcdttga ttagtalatt c. 31 <210 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificiai <220> <223> chemically synthesized <400> 11 ctccctcgag atcataattt acitcatc 28 <210> 12 <211> 55 <212> DNA <213> Artificiai <220 <223> chemically synthesized <400> 12 gactacaagg acgatgaccg acaagtgala acccgggatc taaataaatc cgltt 55 <210> 13 <210 27 <212> DNA <213> Artificial <220 <223> chemically synthesized <40G> 13 cccgtcgacc agctcttctt ggtgaag 27

<210> 14 <211> 100 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 14

Met Arg Ala Met Met val val Phe lie Thr Ala Asti Cys lie Thr He 15 10 15

Asn Pro Asp lie lie Pile Ala Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu 20 25 30

Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Gin Pro Ser Glu 35 40 45

Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala Arg Glu val Ser ser Arg 50 55 60

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Ala Asp Leu lie Ala Met Leu Lys Glu Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asrs 85 90 95 lie Asn Asn Asn 100

<?':(}> 15 <211> 390 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 15

Met Arg Ala Met Met val Val Phe lie Thr Ala Asn cys lie Thr lie 1 5 10 15

Asn Pro Asp lie lie Phe Ala Ala Thr Asp Ser Glu Asp ser ser Leu 20 25 30

Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Gin Pro Ser Glu 35 40 45 val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala Arg Glu val Ser ser Arg 50 55 60

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Ala Asp Leu lie Ala Met Leu Lys Glu Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn S5 90 95 lie Asn Asn Asn Asn Ser Glu Gin Thr Glu Asn Ala Ala lie Asn Glu 100 105 110

Glu Ala Ser Gly Ala Asp Arg Pro Ala lie Gin val Glu Arg Arg His 115 120 125

Pro Gly Leu Pro Ser Asp Ser Ala Ala Glu lie Lys Lys Arq Arg Lys 130 135 140

Ala lie Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu ser Leu Thr Tyr Pro Asp % f Í IN·*. I I S I tiu WCfc.MTm S.nk 145 150 155 160

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Asp Ala ser Glu ser Asp Leu Asp ser Ser Met Gin Ser Ala Asp Glu 180 185 190

Ser ser Pro Gin pro Leu Lys Ala Asn Gin Gin pro Phe Phe Pro Lys 195 200 205 val Phe Lys Lys lie Lys Asp Ala Gly Lys Trp val Arg Asp Lys lie 210 215 220

Asp Glu Asn Pro Glu val Lys Lys Ala lie val Asp Lys Ser Ala Gly 225 230 235 240

Leu lie Asp Gin Leu Leu Thr Lys Lys tys Ser Glu Glu val Asn Ala 245 250 255 ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu 260 265 270

Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala Thr Ser Glu 275 280 285

Pro Ser ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg 290 295 300

Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala 305 310 315 320

Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Glu Asp 325 330 335

Glu Leu Glu lie lie Arg Glu Thr Ala ser Ser Leu Asp Ser Ser Phe 340 345 350

Thr Arg Gly Asp Leu Ala ser Leu Arg Asn Ala lie Asn Arg His Ser 355 360 365

Gin Asn Phe Ser Asp Phe Pro Pro lie Pro Thr Glu Glu Glu Leu Asn 370 375 380

Gly Arg Gly Gly Arg Pro 385 390

<210 16 <21t> 1170 <212> DNA <213> Listeria monocytogenes <400> 16 atgcgtgcga tgatggtggt tttcattact gccaattgca ttacgattaa ccccgacata 60 atatttgcag cgacagatag cgaagattct agtctaaaca cagatgaatg ggaagaagaa 120

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<21Q> 17 <211> 529 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400 17

Met Lys Lys lie Met Leu val Phe lie Thr Leu lie Leu val Ser Leu 1 S 10 15

Pro lie Ala Gin Gin Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys 20 25 30

Glu Asn Ser lie ser ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser 35 40 45

Pro Lys Thr Pro lie Glu Lys Lys His Ala Asp Glu lie Asp Lys Tyr 50 55 60 lie Gin Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn val Leu Val Tyr His Gly 65 70 75 80

Asp Ala Val Thr Asn val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn 85 90 95

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Ala Leu val Lys Ala Asn ser Glu Leu val Glu Asn Gin Pro Asp val 130 135 140

Leu Pro Val Lys Arg Asp ser Leu Thr Leu ser lie Asp Leu Pro Gly 145 150 155 160

Met Thr Asn Gin Asp Asn Lys lie Val val Lys Asn Ala Thr Lys Ser 165 170 175

Asn val Asn Asn Ala val Asn Thr Leu val Glu Arg Trp Asn Glu Lys 180 185 190

Tyr Ala Gin Ala Tyr Pro Asn val Ser Ala Lys lie Asp Tyr Asp Asp 195 200 205

Glu Met Ala Tyr ser Glu ser Gin Leu lie Ala Lys Phe Gly Thr Ala 210 215 220

Phe Lys Ala val Asn Asn ser Leu Asn val Asn Phe Gly Ala lie ser 225 230 235 240

Glu Gly Lys Met Gin Glu Glu val lie Ser Phe Lys Gin lie Tyr Tyr 245 250 255

Asn val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg phe Phe Gly Lys 260 265 270

Ala Val Thr Lys Glu Gin Leu Gin Ala Leu Gly val Asn Ala Glu Asn 275 280 285

Pro Pro Ala Tyr lie ser ser val Ala Tyr Gly Arg Gin Val Tyr Leu 290 295 300

Lys Leu Ser Thr Asn ser His Ser Thr Lys val Lys Ala Ala Phe Asp 305 310 315 320

Ala Ala val ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp val Glu Leu Thr Asn 325 330 335

He lie Lys Asn Ser ser phe Lys Ala val lie Tyr Gly Gly Ser Ala 340 345 350 tys Asp Glu val Gin lie lie Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp 355 360 365 lie Leu tys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly val Pro 370 375 380 lie Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys asp Asn Glu Leu Ala val lie 385 390 395 400

Lys Asn Asn Ser Glu Tyr lie Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp 405 410 415

Gly Lys lie Asn lie Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gin Phe Asn 420 425 430 lie Ser Trp Asp Glu val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu He val 435 440 445

Gin His Lys Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe 450 455 460

Thr ser ser lie Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn lie Asn val Tyr 465 470 475 480

Ala Lys Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr val lie 485 490 495

Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu val Lys Asn Arg Asn lie Ser lie Trp 500 505 510

Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys val Asp Asn Pro He 515 520 525

Glu

<210> 18 <211> 441 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400 18

Met Lys Lys lie Met Leu Val Phe lie Thr Leu lie Leu val Ser Leu 1 5 10 15

Pro lie Ala Gin Gin Thr Glu Ala Lys Asp Ala ser Ala Phe Asn Lys 20 25 30

Glu Asn Ser lie ser ser val Ala Pro Pro Ala ser Pro Pro Ala ser 35 40 45

Pro Lys Thr Pro lie Glu Lys Lys His Ala Asp Glu lie Asp Lys Tyr SO 55 60 lie Gin Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn val Leu val Tyr His Gly 65 70 7S 80

Asp Ala val Thr Asn val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn 85 90 95

Glu Tyr lie val val Glu Lys Lys Lys Lys Ser lie Asn Gin Asn Asn 100 105 110

Ala Asp lie Gin Val val Asn Ala lie Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly 115 120 125

Ala Leu val Lys Ala Asn ser Glu Leu Val Glu Asn Gin Pro Asp val 130 135 140

Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu ser lie Asp Leu Pro Gly 145 150 155 160

Met Thr Asn Gin Asp Asn Lys lie Val val Lys Asn Ala Thr Lys ser 165 170 175

Asn val Asn Asn Ala val Asn Thr Leu val Glu Arg Trp Asn Glu Lys 180 185 190

Tyr Ala Gin Ala Tyr ser Asn val Ser Ala Lys lie Asp Tyr Asp Asp 195 200 205

Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gin Leu lie Ala Lys Phe Gly Thr Ala 210 215 220

Phe Lys Ala val Asn Asn Ser Leu Asn val Asn Phe Gly Ala He ser 225 230 235 240

Glu Gly Lys Met Gin Glu Glu val He Ser Phe Lys Gin lie Tyr Tyr 245 250 255

Asn Val Asn val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg phe Phe Gly Lys 260 265 270

Ala val Thr Lys Glu Gin Leu Gin Ala Leu Gly val Asn Ala Glu Asn 275 280 285

Pro Pro Ala Tyr lie Ser Ser val Ala Tyr Gly Arg Gin val Tyr Leu 290 295 300

Lys Leu Ser Thr Asn ser His Ser Thr Lys val Lys Ala Ala Phe Asp 305 310 315 320

Ala Ala val Ser Gly Lys ser vaf ser Gly Asp vaf Glu Leu Thr Asn 325 330 335 lie He Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala val lie Tyr Gly Gly Ser Ala 340 345 350

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Lys Asn Asn Ser Glu Tyr lie Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp 405 410 415

Gly Lys lie Asn lie Asp His Ser Gly Gly Tyr val Ala Gin Phe Asn 420 425 430 lie ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp 435 440

<210> 19 <211> 416 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <4G0> 19

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Glu Tyr lie Val val Glu Lys Lys Lys Lys ser lie Asn Gin Asn Asn 100 105 110

Ala Asp lie Gin val val Asn Ala lie Ser ser Leu Thr Tyr pro Gly 115 120 125

Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu val Glu Asn Gin Pro Asp val 130 135 140

Leu Pro val Lys Arg Asp ser Leu Thr Leu Ser lie Asp Leu Pro Gly 145 150 155 160

Met Thr Asn Gin Asp Asn Lys lie val val Lys Asn Ala Thr Lys ser 165 170 175

Asn val Asn Asn Ala val Asn Thr Leu val Glu Arg irp Asn Glu Lys 180 185 190

Tyr Ala Gin Ala Tyr ser Asn val ser Ala Lys lie Asp ryr Asp Asp 195 200 205

Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gin Leu lie Ala Lys Phe Gly Thr Ala 210 215 220

Phe Lys Ala val Asn Asn Ser Leu Asn val Asn Phe Gly Ala lie Ser 225 230 235 240

Glu Gly Lys Met Gin Glu Glu val lie ser Phe Lys Gin lie Tyr Tyr 245 250 255

Asn val Asn val Asn Glu Pro Thr Arg Pro ser Arg Phe Phe Gly Lys 260 265 270

Ala val Thr Lys Glu Gin Leu Gin Ala Leu Gly val Asn Ala Glu Asn 275 280 285

Pro Pro Ala Tyr He Ser ser val Ala Tyr Gly Arg Gin val Tyr Leu 290 295 300

Lys Leu ser Thr Asn ser His Ser Thr Lys val Lys Ala Ala Phe Asp 305 310 315 320

Ala Ala val Ser Gly Lys Ser val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn 325 330 335

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Lys Asp Glu Val Gin lie lie Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp 355 360 365 lie Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly val Pro 370 375 380 lie Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala val lie 385 390 ' 395 ' 400

Lys Asn Asn ser Glu Tyr lie Glu Thr Thr ser Lys Ala Tyr Thr Asp 405 410 415

<210= 20 <211> 19 <212> PRT <213> Listeria seeiigeri <400= 20

Arg Ser Glu vai Thr ile Ser Pro Ala Glu Thr Pro Glu Ser Pro Pro 1 5 10 15

Ala Thr Pro

<21Q> 21 <211> 19 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400= 21

Lys Glu Asn ser ile ser Ser Met Ala Pro Pro Ala ser Pro Pro Ala 1 5 10 15

Ser Pro Lys <210= 22 <211> 25 <212= DNA <213= Artificia! <220= <223> chemically synthesized <400=· 22 gcggatccca tggagataca cctac 25 <210 23 <211 >25 <212= DNA <210 Artificia! <220= <223> chemically synthesized <400= 23 gcggatccca tggagataca cctac 25 <210= 24 <211=9

<21:2= PRT <213> Human papillomavirus <400 24

Arg Ala His Tyr Asn lie Val Thr Phe 1 5 <210> 25 <211> 261

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25

Met Trp val Pro val val Phe Leu Thr Leu Ser val Thr Trp lie Gly 1 5 10 15

Ala Ala Pro Leu lie Leu ser Arg lie Val Gly Gly Trp Glu cys Glu 20 25 30

Lys His Ser Gin Pro Trp Gin val Leu val Ala ser Arg Gly Arg Ala 35 40 45

Val Cys Gly Gly val Leu Val His Pro Gin Trp val Leu Thr Ala Ala 50 55 60

His Cys He Arg Asn Lys Ser val lie Leu Leu Gly Arg His Ser Leu 65 70 75 80

Phe His pro Glu Asp Thr Gly Gin Val Phe Gin val Ser His Ser Phe 85 90 95

Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg 100 105 110

Pro Gly Asp Asp ser ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu 115 120 125

Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys val Met Asp Leu Pro Thr Gin 130 135 140

Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser lie 145 150 155 160

Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr pro Lys Lys Leu Gin cys val Asp Leu 165 170 175

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Ser Leu Tyr Thr Lys val Val His Tyr Arg Lys Trp lie Lys Asp Thr 245 250 255 lie Val Ala Asn Pro 260 <210> 26 <211> 5873 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 ggtgtcttag gcacactggt cttggagtgc aaaggatcta ggcacgtgag gctttgtatg 60 aagaatcggg gatcgtaccc aecccctgtt tctgtttcat cctgggcatg tctcctctgc 120 ctttgtcccc tagatgaagt ctccatgagc tacaagggcc tggtgcatce agggtgatct 180 agtaattgca gaacagcaag tgctagctct ccctcccctt ccacagctct gggtgtggga 240 gggggttgtc cagcctccag cagcatgggg agggccttgg tcagcctctg ggtgccagca 300 gggcaggggc ggagtcctgg ggaatgaagg ttttataggg ctcctggggg aggctcccca 360 gccccaagct taccacctgc acccggagag ctgtgtcacc atgtgggtcc cggttgtctt 420 cctcaccctg tccgtgacgt ggattggtga gaggggccat ggttgggggg atgcaggaga 480 gggagccagc cctgactgtc aagctgaggc tctttccccc ccaacccagc accccagccc 540 agacagggag ctgggctctt ttctgtctct cccagcccca cttcaagccc atacccccag 600 tcccctccat attgcaacag tcctcactcc cacaccaggt ccccgctccc tcccacttac 660 cccagaactt tcttcccatt tgcccagcca gctccctgct cccagctgct ttactaaagg 720 ggaagttcct gggcatctcc gtgtttctct ttgtggggct caaaacctcc aaggacctct 780 ctcaatgcca ttggttcctt ggaccgtatc actggtccat ctcctgagcc cctcaatcct 840 atcacagtct actgactttt cccattcagc tgtgagtgtc caaccctatc ccagagacct 900 tgatgcttgg cctcccaatc ttgccctagg atacccagat gccaaccaga cacctccttc 960 tttcctagcc aggctatctg gcctgagaca acaaatgggt ccctcagtct ggcaatggga 1020 ctctgagaac tcctcattcc ctgactctta gccccagact cttcattcag tggcccacat 1080 tttccttagg aaaaacatga gcatccccag ccacaactgc cagctctctg agtccccaaa 1140 tctgcatcct tttcaaaacc taaaaacaaa aagaaaaaca aataaaacaa aaccaactca 1200 gaccagaact gttttctcaa cctgggactt cctaaacttt ccaaaacctt cctcttccag 1260 caactgaacc tcgccataag gcacttatcc ctggttccta gcacccctta tcccctcaga 1320 atccacaact tgtaccaagt ttcccttctc ccagtccaag aecccaaatc accacaaagg 1380 acccaatccc cagactcaag atatggtctg ggcgctgtct tgtgtctcct accctgatcc 1440 ctgggttcaa ctctgctccc agagcatgaa gcctctccac cagcaccagc caccaacctg 1500 caaacctagg gaagattgac agaattccca gcetttccca gctccccctg cccatgtccc 1560 aggactccca 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accagcctgg ccaactggtg aaaccccatc tctactaaaa atacaaaaaa 2460 ttagccaggc gtggtggcgc atgcctgtag tcccagctac tcaggagctg agggaggaga 2520 attgcattga acctggaggt tgaggttgca gtgagccgag accgtgccac tgcactccag 2580 cctgggtgac agagtgagac tccgcctcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaga 2640 aaagaaaaga aaagaaaagg aagtgtttta tccctgatgt gtgtgggtat gagggtatga 2700 gagggcccct ctcactccat tccttctcca ggacatccct ccactcttgg gagacacaga 2760 gaagggctgg ttccagctgg agctgggagg ggcaattgag ggaggaggaa ggagaagggg 2820 gaaggaaaac agggtatggg ggaaaggacc ctggggagcg aagtggagga tacaaccttg 2880 ggcctgcagg caggctacct acccacttgg aaacccacgc caaagcçgca tctacagctg 2940 agccactctg aggcctcccc tccccggcgg tccccactca gctccaaagt ctctctccct 3000 tttctctccc acactttatc atcccccgga ttcctctcta cttggttctc attcttcctt 3060 tgacttcctg cttccctttc tcattcatct gtttctcact ttctgcctgg ttttgttctt 3120 ctctctctct ttctctggcc catgtctgtt tctctatgtt tctgtctttt ctttctcatc 3180 ctgtgtattt tcggcteacc ttgtttgtca ctgttctccc ctctgccctt tcattctctc 3240 tgccctttta ccctcttcct tttcccttgg ttctctcagt tctgtatctg cccttcaccc 3300 tctcacactg ctgtttccca actcgttgtc tgtattttgg cctgaactgt gtcttcccaa 3360 ccctgtgttt tctcactgtt tctttttctc ttttggagcc tcctccttgc tcctctgtcc 3420 cttctctctt tccttatcat cctcgctcct cattcctgcg tctgcttcct ccccagcaaa 3480 agcgtgatct tgctgggtcg gcacagcctg tttcatcctg aagacacagg ccaggtattt 3540 caggtcagcc acagcttccc acacccgctc tacgatatga gcctcctgaa gaatcgattc 3600 ctcaggceag gtgatgactc cagccacgae cteatgctgc tccgcctgtc agagcctgcc 3660 gagctcacgg atgctgtgaa ggtcatggac ctgcccaccc aggagccagc actggggacc 3720 acctgctacg cctcaggctg gggcagcatt gaaccagagg agtgtacgcc tgggccagat 3780 ggtgcagccg ggagcccaga tgcctgggtc tgagggagga ggggacagga ctcctgggtc 3840 tgagggagga gggccaagga accaggtggg gtccagccca caacagtgtt tttgcctggc 3900 ccgtagtctt gaccccaaag aaacttcagt gtgtggacct ccatgttatt tccaatgacg 3960 tgtgtgcgca agttcaccct cagaaggtga ccaagttcat gctgtgtgct ggacgctgga 4020 cagggggcaa aagcacctgc teggtgagtc atccctactc ccaagatctt gagggaaagg 4080 tgagtgggac cttaattctg ggctggggtc tagaagccaa caaggcgtct gcctcccctg 4140 ctccccagct gtagccatgc cacctccccg tgtctcatct cattccctcc ttccctcttc 4200 tttgactccc tcaaggcaat aggttattct tacagcacaa ctcatctgtt cctgcgttca 4260 gcacacggtt actaggcacc tgctatgcac ccagcactgc cctagagcct gggacatagc 4320 agtgaacaga cagagagcag cccctccctt ctgtagcccc caagccagtg aggggcacag 4380 gcaggaacag ggaccacaac acagaaaagc tggagggtgt caggaggtga tcaggctctc 4440 ggggagggag aaggggtggg gagtgtgact gggaggagac atcctgcaga aggtgggagt 4500 gageaaacac ctgcgcaggg gaggggaggg cctgcggcac ctgggggagc agagggaaca 4550 gcatctggcc aggcctggga ggaggggcct agagggcgtc aggagcagag aggaggttgc 4620 ctggctggag tgaaggatcg gggcagggtg cgagagggaa caaaggacec ctcctgcagg 4680 gcctcacctg ggccacagga ggacactgct tttcctctga ggagtcagga actgtggatg 4740 gtgctggaca gaagcaggac agggcctggc tcaggtgtcc agaggctgcg ctggcctcct 4800 atgggatcag actgcaggga gggagggcag cagggatgtg gagggagtga tgatggggct 4860 gacctggggg tggctccagg cattgtcccc acctgggccc ttacccagcc tccctcacag 4920 gctcctggcc ctcagtctct cccctccact ccattctcca cctacccaca gtgggtcatt 4980 ctgatcaccg aactgaecat gccagccctg ccgatggtcc tccatggctc cctagtgccc 5040 tggagaggag gtgtctagtc agagagtagt cctggaaggt ggcctctgtg aggagccacg 5100 gggacagcat cctgcagatg gtcctggccc ttgtcccacc gacctgtcta caaggactgt 5160 cctcgtggac cctcccctct gcacaggagc tggaccctga agtcccttcc taccggccag 5220 gactggagcc cctacccctc tgttggaatc cctgcccacc ttcttctgga agtcggctct 5280 ggagacattt ctctcttctt ccaaagctgg gaactgctat ctgttatctg cctgtccagg 5340 tctgaaagat aggattgccc aggeagaaac tgggactgac ctatctcact ctctccctgc 5400 ttttaccctt agggtgattc tgggggccca cttgtctgta atggtgtgct tcaaggtatc 5460 aegtcatggg gcagtgaaec atgtgccctg cccgaaaggc cttccctgta caccaaggtg 5520 gtgcattacc ggaagtggat caaggacacc atcgtggcca acccctgagc acccctatca 5580 agtccctatt gtagtaaact tggaaccttg gaaatgacca ggccaagact caagcctccc 5640 cagttctact gacctttgtc cttaggtgtg aggtccaggg ttgctaggaa aagaaatcag 5700 cagacacagg tgtagaccag agtgtttctt aaatggtgta attttgtcct ctctgtgtcc 5760 tggggaatac tggccatgcc tggagacata tcactcaatt tctctgagga cacagttagg 5820 atggggtgtc tgtgttattt gtgggataca gagatgaaag aggggtggga tcc 5873 <210> 27 <211=> 238

<212> PRT <213> Homo sapiens <4Q0> 27

Met Trp vai Pro vai vai Phe Leu Thr Leu ser vai Thr Trp lie 6ly 15 10 15

Ala Ala Pro Leu lie Leu ser Arg lie vai Gly Gly Trp Glu Cys Glu 20 25 30

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His cys ile Arg Asn Lys Ser val lie Leu Leu Gly Arg His Ser Leu 65 70 75 80

Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gin val Phe Gin val ser His ser Phe 85 90 95

Pro His Pro Leu Tyr Asp Met ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg 100 105 110 pro Gly Asp Asp Ser ser His Asp teu Met Leu Leu Arg Leu ser Glu 115 120 125

Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala val Lys val Met Asp Leu Pro Thr Gin 130 135 140

Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser lie 145 150 155 160

Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr pro Lys Lys Leu Gin Cys Val Asp Leu 165 170 175

His Val lie Ser Asn Asp val Cys Ala Gin val His Pro Gin Lys val 180 185 190

Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr 195 200 205

Cys Ser rrp val lie Leu lie Thr Glu Leu Thr Met pro Ala Leu Pro 210 215 220

Met val Leu His Gly Ser Leu val Pro Trp Arg Gly Gly val 225 230 235 <210 28 <211> 1906 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 agccecaagc ttaccacctg cacccggaga gctgtgtcac catgtgggtc ccggttgtct 60 tcctcaccct gtccgtgacg tggattggtg ctgcacccct catcctgtct cggattgtgg 120 gaggctggga gtgcgagaag cattcccaac cctggcaggt gcttgtggcc tctcgtggca 180 gggcagtctg cggcggtgtt ctggtgcacc cccagtgggt cctcacagcl gcccactgca 240 tcaggaacaa aagcgtgatc ttgctgggtc ggcacagcct gtttcatcct gaagacacag 300 gccaggtatt tcaggtcagc cacagcttcc cacacccgct ctacgatatg agcctcctga 360 agaatcgatt cctcaggcca ggtgatgact ccagccacga cctcatgctg ctccgcctgt 420 cagagcctgc cgagctcacg gatgctgtga aggtcatgga cctgcccacc caggagccag 480 cactggggac cacctgctac gcctcaggct ggggcagcat tgaaccagag gagttcttga 540 ccccaaagaa acttcagtgt gtggacctcc atgttatttc caatgacgtg tgtgcgcaag 600 ttcaccctca gaaggtgacc aagttcatgc tgtgtgctgg acgctggaca gggggcaaaa 660 gcacctgctc gtgggtcatt ctgatcaccg aactgaccat gccagccctg ccgatggtcc 720 tccatggctc cctagtgccc tggagaggag gtgtctagtc agagagtagt cctggaaggt 780 ggcctctgtg aggagccacg gggacagcat cctgcagatg gtcctggccc ttgtcccacc 840 gacctgtcta caaggactgt cctcgtggac cctcccctct gcacaggagc tggaccctga 900 agtcccttcc ccaccggcca ggactggage ccctacccct ctgttggaat ccctgcccac 960 cttcttctgg aagtcggctc tggagacatt tctctcttct tccaaagctg ggaactgcta 1020 tctgttatct gcctgtccag gtctgaaaga taggattgcc caggcagaaa ctgggactga 1080 cctatctcac tctctccctg cttttaccct tagggtgatt ctgggggccc acttgtctgt 1140 aatggtgtgc ttcaaggtat cacgtcatgg ggcagtgaac catgtgccct gcccgaaagg 1200 ccttccctgt acaccaaggt ggtgcattac cggaagtgga tcaaggacac catcgtggcc 1260 aacccctgag cacccctatc aaccccctat tgtagtaaac ttggaacctt ggaaatgacc 1320 aggccaagac tcaagcctcc ccagttctac tgacctttgt ccttaggtgt gaggtccagg 1380 gttgctagga aaagaaatca gcagacacag gtgtagacca gagtgtttct taaatggtgt 1440 aattttgtcc tctctgtgtc ctggggaata ctggccatgc ctggagacat atcactcaat 1500 ttctctgagg acacagatag gatggggtgt ctgtgttatt tgtggggtac agagatgaaa 1560 gaggggtggg atccacactg agagagtgga gagtgacatg tgctggacac tgtccatgaa 1620 gcactgagca gaagctggag gcacaacgca ccagacactc acagcaagga tggagctgaa 1680 aacataaccc actctgtcct ggaggcactg ggaagcctag agaaggctgt gagccaagga 1740 gggagggtct tcctttggca tgggatgggg atgaagtaag gagagggact ggaccccctg 1800 gaagctgatt cactatgggg ggaggtgtat tgaagtcctc cagacaaccc tcagatttga 1860 tgatttccta gtagaaetca cagaaataaa gagctgttat actgtg . 1906 <210> 29 <211> 69

<212> PRT <213> Homo sapiens <4Q0> 29

Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp lie Gly 1 5 10 15

Ala Ala Pro Leu lie Leu Ser Arg lie val Glv Gly Trp Glu Cys Glu 20 25 30

Lys His Ser Gin Pro Trp Gin val Leu val Ala Ser Arg Gly Arg Ala 35 40 45 val Cys Gly Gly Val Leu val His Pro Gin Trp val Leu Thr Ala Ala 50 55 60

His Cys lie Arg Lys 65 <21Q> 30 <211>220 <212> PRT <213> Homo sapiens <4GQ> 30

Met Trp val Pro val val Phe Leu Thr Leu ser val Thr Trp lie Gly 15 10 15

Ala Ala Pro Leu lie Leu Ser Arg lie Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu 20 25 30

Lys His Ser Gin Pro Trp Gin val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala 35 40 45

Val Cys Gly Gly val Leu Val His Pro Gin Trp Val Leu Thr Ala Ala 50 55 60

His cys lie Arg ash Lys Ser val lie Leu Leu Gly Arg His Ser Leu

65 70 75 SO

Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gin val Phe Gin val Ser His Ser Phe 85 90 95

Pro His Pro Leu Tyr Asp Met ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe teu Arg 100 105 110

Pro Gly Asp Asp Ser Ser lie Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys 115 120 125

Lys Leu Gin Cys val Asp Leu His val lie Ser Asn Asp val Cys Ala 130 135 140

Gin val His Pro Gin Lys val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg 145 150 155 160

Trp Thr Gly Gly Lys ser Thr cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu 165 170 175

Val Cys Asn Gly val Leu Gin Gly lie Thr ser Trp Gly ser Glu Pro 180 185 190

Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro ser Leu Tyr Thr Lys Val val His Tyr 195 200 205

Arg Lys Trp lie Lys Asp Thr lie val Ala Asn Pro 210 21$ 220 <210> 31 <211> 218

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31

Met Trp val Pro Val val Phe Leu Thr Leu ser val Thr Trp lie Gly 15 10 15

Ala Ala Pro Leu lie Leu Ser Arg lie val Gly Gly Trp Glu Cys Glu 20 25 30

Lys His Ser Gin Pro Trp Gin val Leu val Ala Ser Arg Gly Arg Ala 35 40 45

Val Cys Gly Gly val Leu val His Pro Gin Trp val Leu Thr Ala Ala 50 55 60

His Cys lie Arg Lys Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu 65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala val Lys Val Met 85 90 95

Asp Leu Pro Thr Gin Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser 100 105 110

Gly Trp Gly Ser lie Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu 115 120 125

Gin cys val Asp Leu His val lie Ser Asn Asp val Cys Ala Gin val 130 135 140

His Pro Gin Lys Val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr 145 150 155 160

Gly Gly Lys Ser Thr cys ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys 165 170 175

Asn Gly Val Leu Gin Gly lie Thr ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala 180 185 190

Leu Pro Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr Lys val val His Tyr Arg Lys 195 200 205

Trp lie Lys Asp Thr lie val Ala Asn Pro 210 215 <210> 32 <211> 281 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32

Met Trp val Pro Val val Phe Leu Thr Leu Ser val Thr Trp lie Gly 1 5 10 15

Ala Ala Pro Leu lie Leu Ser Arg lie val Gly Gly Trp Glu Cys Glu 20 25 30

Lys His Ser Gin Pro Trp Gin Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala 35 40 45 val Cys Gly Gly Val Leu val His Pro Gin Trp val Leu Thr Ala Ala 50 55 60

His cys lie Arg Asn Lys ser val lie Leu Leu Gly Arg His ser Leu 65 70 75 80

Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gin val Phe Gin Val Ser His ser Phe 85 90 95

Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys A$n Arg Phe Leu Arg 100 105 110

Pro Gly Asp Asp Ser ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu 115 120 125

Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala val Lys val’ Met Asp Leu Pro Thr Gin 130 135 140

Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala ser Gly Trp Gly Ser lie 145 150 155 160

Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gin Cys Val Asp Leu 165 170 175

His Val lie Ser Asn Asp Val Cys Ala Gin val His Pro Gin Lys Val 180 185 190

Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys ser Thr 195 200 205

Cys Ser Gly Asp ser Gly Gly Pro Leu val Cys Asn Gly val Leu Gin 210 215' 220

Gly lie Thr ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro 225 230 235 240

Ser Leu Tyr Thr Lys Val val His Tyr Arg Lys Trp lie Lys Asp Thr 245 250 255 lie val Ala Asn Pro 260 <210> 33 <211> 1464 <212> DNA <213> Homo sapiens <4Q0> 33 agccccaagc ttaccacctg cacccggaga gctgtgtcac catgtgggtc ccggttgtct 60 tcctcaccct gtccgtgacg tggattggtg ctgcacccct catcctgtct cggattgtgg 120 gaggctggga gtgcgagaag cattcccaac cctggcaggt gcttgtggcc tctcgtggca 180 gggcagtctg cggcggtgtt ctggtgcacc cccagtgggt cctcacagct gcccactgca 240 tcaggaacaa aagcgtgatc ttgctgggtc ggcacagcct gtttcatcct gaagacacag 300 gccaggtatt tcaggtcagc cacagcttcc cacacccgct ctacgatatg agcctcctga 360 agaatcgatt cctcaggcca ggtgatgact ccagccacga cctcatgctg ctccgcctgt 420 cagagcctgc cgagctcacg gatgctgtga aggtcatgga cctgcccacc caggagccag 480 cactggggac cacctgctac gcctcaggct ggggcagcat tgaaccagag gagttcttga 540 ccccaaagaa acttcagtgt gtggacctcc atgttatttc eaatgacgtg tgtgcgcaag 600 ttcaccctca gaaggtgacc aagttcatgc tgtgtgctgg acgctggaca gggggcaaaa 660 geacctgctc gggtgattct gggggcccac ttgtctgtaa tggtgtgctt caaggtatca 720 cgtcatgggg cagtgaacca tgtgccctgc ccgaaaggcc ttccctgtac accaaggtgg 780 tgcattaccg gaagtggatc aaggacacca tcgtggccaa cecctgagca cecctatcaa 840 ccccctattg tagtaaactt ggaaccttgg aaatgaccag gccaagactc aagcctcccc 900 agttctactg acctttgtcc ttaggtgtga ggtccagggt tgctaggaaa agaaatcagc 960 agacacaggt gtagaccaga gtgtttctta aatggtgtaa ttttgtcctc tctgtgtcct 1020 ggggaatact ggccatgcct ggagacatat cactcaattt ctctgaggac acagatagga 1080 tggggtgtct gtgttatttg tggggtacag agatgaaaga ggggtgggat ccacactgag 1140 agagtggaga gtgacatgtg ctggacactg tccatgaagc actgagcaga agctggaggc 1200 acaacgcaec agacactcac agcaaggatg gagctgaaaa cataacccac tctgtcctgg 1260 aggcactggg aagcctagag aaggctgtga gccaaggagg gagggtctcc ctttggcatg 1320 ggatggggat gaagtaagga gagggactgg accccctgga agctgattca ctatgggggg 1380 aggtgtattg aagtcctcca gacaaccctc agatttgatg atttcctagt agaactcaca 1440 gaaataaaga gctgttatac tgtg 1464 <210> 34 <211> 281 <212> PRT <213> Homo sapiens <40G> 34 wet Trp Val Pro val val Phe Leu Thr Leu ser val Thr Trp lie Gly 15 10 15

Ala Ala Pro Leu lie Leu Ser Arg lie Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu 20 25 30

Lys His Ser Gin Pro Trp Gin val Leu val Ala Ser Arg Gly Arg Ala 35 40 45 val Cys Gly Gly val Leu Val His Pro Gin Trp val Leu Thr Ala Ala 50 55 60

His Cys lie Arg Asn Lys Ser val lie Leu Leu Gly Arg His Ser Leu 65 70 75 80

Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gin Val Phe Gin val Ser His Ser phe 85 90 95

Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg 100 105 110

Pro Gly Asp Asp Ser ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu 115 120 125

Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala val Lys val Met Asp Leu Pro Thr Gin 130 135 140

Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser lie 145 150 155 160

Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gin Cys val Asp Leu 165 170 175

His val lie Ser Asn Asp val cys Ala Gin val His Pro Gin Lys val 180 185 190

Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr 195 200 205

Cys ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu val cys Asn Gly val Leu Gin 210 215 220

Gly lie Thr ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro 225 230 235 240

Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp lie Lys Asp Thr 245 250 255 lie val Ala Asn Pro 260 <210* 35 «211* 1495 «212> DNA <213* Homo sapiens «409* 35: gggggagccc caagcttaec açctgcaccc ggagagctgt gtcaccatgt gggtcccggt 60 tgtcttcctc accctgtccg tgacgtggat tggtgctgca cccctcatéc tgtctcggat 120 tgtgggaggc tgggagtgeg agáagcattc ccaatcctgg caggtgcttg tggcctctcg 180 tggçagggça gtctgcggeg gtgttctggt gcacccccag tgggtcctca cagctgccca 240 ctgcatcagg aacaaaagcg tgatcttgct gggtcggcac agcctgtttc atcctgaaga 300 cacaggccag gtãtttcagg tcagccacag cttçccacac ccgctctacg atatgagcct 360 ectgaagaat cgattcctca ggccaggtga tgact.cxagc caegacctcà tgctgctccg 420 cctgteagag cetgccgagc tcacggatgc tgtgaaggíc atggaeetgc ccacccagga 480 gcGagcactg gggaccaett getacgcctc ãggctggggc ageattgaac cagaggagtt 540 cttgacccca aagaaaettc agtgtgtgga cctccatgtt atttecaatg acgtgtgtgc 600 gcaagttcac cctcagaagg tgaccaagtt catgctgtgt gctggacgct ggacaggggg 660 caaaagcacc tgctcgggtg attctggggg cccacttgtc tgtaatggtg tgcttcaagg 720 tatcacgtca tggggcagtg aaeeatgtge cctgcccgaa aggccttccc tgtacaccaa 780 ggtggtgeat taccggaagt ggatcaagga caccatcgtg geeaacccct gagcacccct 840 atcaactccc tattgtagta aacttggaac cttggaaatg aecaggccaa gactcaggec 900 tccccagttc tactgacctt tgtccttagg tgtgaggtcc agggttgcta ggaaaagaàa 960 tcagcagaca caggtgtaga ccagagtgtt tcttaaatgg tgtaattttg tcGtçtetgt 1020 gtcctgggga atactggcea tgectggaga catatcactc aatttctctg aggacacaga 1080 taggatgggg tgtctgtgtt atttgtgggg tacagagatg aaagaggggt gggatccaça 1140 eigagagagt ggagagtgac atgtgctgga cactgtcear gaagcactga gcagaagctg 1200 gaggeaeaac gcaceagaca ctcacagcaa ggatggagct gaaaacataa cccactctgt 1260

Gctggaggça ctgggaagcc tagagaaggc tgtgagccaa ggagggãggg tcttectttg 1320 gcatgggatg gggatgaagt agggagaggg actggacccc ctggaagctg attcactatg 1380 gggggaggtg tattgaagtc ctccagacaa ccctcagatt tgatgatttc ctagtagaae 1440 tcacagaaat aaagagctgt tatactgcga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1495 «210* 36 «211> 218: <212* PRT «213> Homo sapisps; <400? 36

Met Trp Val Pro val Val Phe Leu Thr Leu Set val Thr Trp lie Gly 1 5 10 15

Ala Ala Pro Leu lie Leu ser Arg lie val Gly Gly Trp Glu cys Glu 20 25 30

Lys His Ser Girt Pro Trp Gin Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala 35 40 45 val Cys Gly Gly Val Leu val His Pro Gin Trp val Leu Thr Ala Ala 50 5$ 60

His Cys lie Arg Asn Lys Ser Val lie Leu Leu Gly Arg His set Leu 65 70 75 80

Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gin val Phe Gin val ser His Set Phe 85 90 95 pro His pro Leu Tyr Asp Met ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg 100 1Q5 110

Pro Gly Asp Asp Ser Ser lie Glu Pro Glu Glu Phe Leu rhr Pro Lys 115 120 175 lys Leu Gin Cys Val Asp Leu His val lie Ser Asn Asp Val Cys Ala 130 135 140

Gin Val His Pro Gin Lys val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg 345 3 50 155 160

Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr cys Set Gly Asp ser Gly Gly Pro Leu 165 170 175 val cys Asn Gly val Leu Gin Gly lie Thr ser Trp Gly ser Glu Pro 180 185 190

Cys Ala Leu Pro Glu Arg pro ser Leu Tyr Thr Lys val val His Tyr 195 200 205

Arg Lys Trp lie Lys Asp Thr lie val Ala 210 215 <2lQ> 37 <211 > 227 <•212-' PRT <213> Hama sapiens <4Q0> 37

Met Trp val Pro val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp lie Gly 1 5 10 15

Ala Ala Pro Leu lie Leu Ser Arg He val Gly Gly Trp Glu Cys Glu 20 25 30

Lys His ser Gin Pro Trp Gin val Leu val Ala Ser Arq Gly Arq Ala 35 40 45 val Cys Gly Gly val Leu val His Pro Gin Trp val Leu Thr Ala Ala 50 55 60

His cys lie Arg Asn Lys ser val lie Leu Leu Gly Arg His ser Leu

65 70 75 SO

Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gin Val Phe Gin val Ser His Ser Phe 85 90 95

Pro His Pro Leu Tyr Asp Met ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg 100 105 110

Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu 115 120 125

Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala val Lys val Met Asp Leu pro Thr Gin 130 135 140

Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser lie 145 150 155 160

Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gin Cys val Asp Leu 165 170 175

His val lie ser Asn Asp val cys Ala Gin val His Pro Gin Lys val 180 185 " 190

Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr 195 200 205

Cys Ser val Ser His Pro Tyr Ser Gin Asp Leu Glu Gly Lys Gly Glu 210 215 220

Trp Gly Pro 225 <210 38 <211> 104 <212> PRT <213> Homo sapiens

Met Trp val Pro val va'i Phe ten Thr Ley ser vaT Thr Trp lie Gly 1 5 10 15 <4t50> 36

Glu Arg Gly His Gly Trp Gly Asp Ala Gly Glu Gly Ala ser Pro Asp 20 25 30

Cys Gin Ala Glu Ala Leu Ser Pro Pro Thr Gin His Pro ser Pro Asp 35 40 45

Arg Gly Ley Gly Ser Phe teu Ser Leu Pro Ala Pro Leu Gin Ala HiS 50 55 60

Thr Pro Ser Pro ser lie Leu Girt Girt ser ser Leu Pro His Gin Val 65 70 75 80

Pro Ala Pro Ser His Leu Pro Gin Asn Phe Leu Pro life Ala Gin Pro 85 90 95

Ala Pro Cys ser Gin Leu Leu Tyr 100 <210> 39 <211>261

<212> PRT <213> Homo sapiens <400 39

Met Trp val Pro val val phe Leu Thr Leu Ser val Thr Trp lie Gly 1 5 10 15

Ala Ala Pro Leu lie Leu Ser Arg lie val Gly Gly Trp Glu cys Glu 20 25 30

Lys His ser Gin Pro Trp Gin val teu val Ala Ser Arg Gly Arg Ala 35 40 45'

Vai cys Gly Gly val Leu Vai Mis Pro Gin Trp Vai Leu Thr Alá Ala 50 55 60

Mis cys ile Arg Asn Lys ser vai tie Leu Leu Gly Arg Mis Ser Leu 65 70 75 80

Phe His Pro Glu Asp Thr Gly GÍn vai Phe Gin vai ser His ser Phe 85 90 95

Pro His Pro Leu Tyr Asp wet Ser Leu teu tys Asn Arg Phe Leu Arg 100 105 110

Pro Gly Asp Asp ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu ser Glu 115 120 125

Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys val Met Asp teu Pro Thr Gin 130 135 140

Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr cys Tyr Ala ser Gly Trp Gly ser lie 145 150 155 160

Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gin Cys val Asp Leu 165 170 175

His Val lie Ser Asn Asp val Cys Ala Gin val His Pro Gin Lys Val 180 185 190

Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr 195 200 205 cys Ser Gly Asp ser Gly Gly pro Leu val Cys Asn Gly Val Leu Gin 210 215 220

Gly lie Thr ser Trp Gly ser Glu Pro Cys Ala i.eu Pro Glu Arg Pro 225 230 235 240

Ser Leu Tyr Thr Lys val val His Tyr Arg Lys Trp lie Lys Asp Thr 245 250 255 lie val Ala Asn Pro 2b0 <21Θ> 40 <211> 1729 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 aagtttccct tctcccagtc caagacccca aatcaccaca aaggacccaa teeeeagact 60 caagaratgg tctgggcgct gtcttgtgte tectaccctg atccetgggt tcaactctgc 120 tcccagagca tgaagcctct ccaecagcac eagecaccaa cctgeaaacc tagggaagat 180 tgacagaatt cccagccttt cccagctccc ecigcccatg tcccaggact cccagecttg 240 gttctctgcc cccgtgtctt ttcaaaccca catcctaaat ccatctceta tccgagtccc 300 ccagttcctc ctgtcaaccc tgattcccct gatctagcac ceectctgca ggtgctgcac 360 ccctcatcct gtctcggatt gtgggaggct gggagtgcga gaagcattcc caaccctggc 420 aggtgcttgt agcctctcgt ggcagggcag tctgcggtgg tgttctggtg cacccccagt: 480 gggtcctcac agetacccae tgeatcagga acaaaagcgt gatcttgctg ggtcggcacã 540 gçctgtttca tcctgaagac acaggccagg tatttcaggt cagccacagc ttcccacacc 600 cgctctacga tatgagcctc ctgaagâate gattcctcag gccaggtgat gactccagcc 660 aegaccteat gctgctccgc etgteagagc ctgccgagct cacggatgct atgaaggtcâ 720 tggacctgcc caeccaggag ccagcactgg ggaccacctg ctacgcctca ggctggggca 780 gcattgaacc agaggagttG ttgaccccaa agaaacttca gtgtgtggac ctccatgtta 840 tttccaatga egtgtgtgcg caagttcaec ctcagaaggt gaccaagttc atgctgtgtg 900 ctggacgctg gacagggggc aaaagcacct getcgggtga ttctgggggc ccacttgtet 960 gtaatggtgt gcttcaaggt atcacgtcat ggggcagtga aecatgtgec ctgcccgaaa 1020 ggcctteeet gtacaceaag gtggtgcatt accggaagtg gatcaaggac aecgtGQtgg 10S0 ccaacccctg agcaccccta teaactccct attgtágtaa acttggaacc ttggaaatga 1140 ccaggccaag actcaggcct ccccagttet aetgaccttt gtccttaggt gtgaggtcca 1200 gggttgctag gaaaagaaat cagcagacac aggtgtagac eagagtgttt cttaaatggt 1260 gtaattttgt ectctctgtg tcctggggaa tactggccat gcctggagac atatcactca 1320 atttctctga ggacacagat aggatggggt gr.ctgt:gtta trtgtggggt acagagatga 1380 aagaggggtg ggatccacac tgagagagtg gagagtgaca tgtgctggac actgtccatg 1440 aagcactgag cagaagctgg aggcacaacg caccagacac tcacagcaag gatggagctg 1500 aaaacataac ccactctgtc ctggaggcac. tgggaagcct agagaaggct gtgaaccaag 1560 gágggagggt cttcctttgg catgggacgg ggatgaagta aggagaggga ctgaeecect 1Ê20 ggaagctgat tcac.tatggg gggaggtgta ttgaagtcct ccagacaaec ctxagatttg 1680 atgatttcct agtagaacte acagaaataa agagctgtta tactgtgaa 1729 «210 41 <211> 719:

<2i2> PRT <213> Homo sapiens <4004!

Met Trp Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala val Ala Thr Ala Arg X 5 10 15

Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe 20 25 30

Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe lie Lys ser Ser ash Glu 35 40 45

Ala Thr Asn lie Thr Pro Lys His Asn Met lys Ala Phe Leu Asp Gl u 50 55 60

Leu Lys Ala Glu Asrt He Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Gin lie

65 70 75 SO

Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gin Asn Phe Gin Leu Ala Lys Gin lie 85 90 95

Gin ser Gin Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp ser val Glu Leu Ala His 100 105 110

Tyr Asp val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr lie 115 120 125 ser lie He Asn Glu Asp Gly Asn Glu lie Phe Asn Thr Ser Leu Phe 130 135 140

Glu Pro Pro Pro pro Gly Tyr Glu Asn val ser Asp lie val pro pro 145 150 155 160

Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gin Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr 165 170 175 val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met 180 185 190

Lys lie Aso Cys ser Gly Lys lie val lie Ala Arg Tyr Gly Lys Val 195 200 205 phe Arg Gly Asn tys val lys Asn Ala Gin Leu Ala Gly Ala Lys Gly 210 215 220 val lie teu Tyr ser Asp pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly val Lys 225 230 235 240

Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly val Gin Arg Gly 245 250 255

Asn lie Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr pro Gly Tyr 260 265 270 pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Are Gly He Ala Glu Ala Val Gly 275 280 285

Leu Pro Ser He Pro Val His Pro He Gly Tyr Tyr Asp Ala Gin Lys 290 29$ 300 teu Leu Glu Lys Met Gly Gly set Ala Pro Pro Asp Ser ser trp Arg 305 310 315 320

Gly ser Leu Lys val Pro Tyr Asn val Gly Pro Gly Phe Thr Gly Asn 325 330 335 phe Ser thr Gin Lys val Lys wet Hi s lie His ser Thr Asn Glu val 340 345 350 thr Arg lie Tyr ash val tie Gly Thr Leu Arg Gly Ala Val Glu Pro 355 360 365

Asp Arg Tyr val lie Leu Gly Gly His Arg Asp Ser Trp val Phe Gly 370 375 380

Gly He Asp Pro Gin ser Gly Ala Ala val val His Glu lie val Arg 385 300 395 400 ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly trp Arg pro Arg Arg thr Tie 405 410 415

Leu Phe Ala ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr 420 425 430

Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gin Glu Arg Gly Val Ala 435 440 445 tyr lie Asn Ala Asp Ser ser lie Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg val 450 455 460

Asp Cys Thr pro Leu Met Tyr Ser Leu val His Asn Leu Thr Lys Glu 465 470 475 480

Leu Lys Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Glu ser 485 490 495

Trp Thr Lys Lys ser Pro ser pro Glu Phe Ser Gly wet Pro Arg lie 500 505 510

Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu val Phe phe Gin Arg Leu SIS 520 525

Gly lie Ala ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr tys Asn trp Glu Thr Asn 530 535 540 tys Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Set val Tyr Glu Thr Tyr Glu 545 550 555 560

Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val 565 570 575

Ala Gin val Arg Gly Gly Met val Phe Glu Leu Ala Asn ser lie val 580 585 590

Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp ryr Ala val val Leu Arg Lys Tyr Ala 595 600 605

Asp Lys lie Tyr ser lie Ser Met Lys His Pro Gin Glu Met Lys Thr 610 615 620

Tyr Ser val Ser phe Asp ser Leu Phe Ser Ala val Lys Asn Phe Thr 625 630 635 640

Glu lie Ala Ser Lys Phe ser Glu Arg Leu Gin Asp Phe Asp Lys ser 645 650 655

Lys His val lie Tyr Ala Pro Ser ser Hi's Asn Lys Tyr Ala Gly Glu 660 665 670

Ser Phe Pro Gly lie Tyr Asp Ala Leu Phe Asp lie Glu Ser Lys Val 675 680 685

Asp Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gin lie Tyr val Ala 690 695 700

Ala Phe Thr val Gin Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser Glu val Ala 705 710 715 <210> 42 <211> 2472 <212> DMA <213> Homo sapiens <40Q> 42 ctggacccca ggtctggagc gaattccagc ctgcagggct gataagcgag gcattagtga 60 gattgagaga gactttaccc cgccgtggtg gttggagggc gcgcagtaga gcagcagcac 120 aggcgcgggt cccgggaggc cggctctgct cgcgccgaga tgtggaatct ccttcacgaa 180 accgactcgg ctgtggccac cgcgcgccgc ccgcgctggc tgtgcgctgg ggcgctggtg 240 ctggcgggtg gcttctttct cctcggcttc ctcttcgggt ggtttataaa atcctccaat 300 gaagctacta acattactce aaagcataat atgaaagcat ttttggatga attgaaagct 360 gagaacatca agaagttctt atataatttt acacagatac cacatttagc aggaacagaa 420 caaaactttc agcttgeaaa gcaaattcaa tcccagtgga aagaatttgg cctggattct 480 gttgagetag cacattatga tgtcctgttg tcctacccaa ataagactca tcccaactac 540 atctcaataa ttaatgaaga tggaaatgag attttcaaca catcattatt tgaaccacct 600 cctccaggat atgaaaatgt ttcggatatt gtaccacctt tcagtgcttt ctctcctcaa 660 ggaatgccag agggcgatct agtgtatgtt aactatgcac gaactgaaga cttctttaaa , 720 ttggaacggg acatgaaaat caattgctct gggaaaattg taattgccag atatgggaaa 780 gttttcagag gaaataaggt taaaaatgcc cagetggcag gggccaaagg agtcattctc 840 tactccgacc etgetgacta ctttgctcct ggggtgaagt cctatccaga tggttggaat 900 cttcctggag gcggtgtcea gcgtggaaat atcctaaatc tgaatggtgc aggagaccct 960 cteacaccag gttactcagc aaatgaatat gcttataggc gtggaattgc agaggctgtt 1020 ggtcttccaa gtattcctgt tcatccaatt ggatacitatg atgcacag^a gctcctagaa 1080 aaaatgggtg getcagcacc accagatagc agctggagag gaagtctraa agtgccctae 1140 aatgttggac ctggctttae tggaaacttt tctaracaaa aagtcaagat gcacatecac 1200 tetaccaatg aagtgacaag aatttaeaat gtgataggta ctctcagagg agcagtggaa 1260 ccagaCagat atgteattet gggaggtcac egggaetcat gggtgtttgg tggtattgac 1320 éctcagagtg gagcagctgt tgttcatgaa attgtgagga getrtfgaac actgaaaaag 1380 gaagggtgga gacctagaag aacaattttg tttgcaagct gggatgeaga agâatttggt 1440 cttcttggtt etactgagtg ggcagaggag aartcaagac tccttcaaga gcgtggcgtg 1500 gettatatta atgctgactc atetatagaa ggaaactaca ctctgagagt tgattgtaca 1560 ctgctgatgt acagcttggt acacaaccta acaaaagagc tgaaaagcçc tgatgaággç 1620 tttgaaggea aatctettta tgaaagttgg actaaaaaaa gtccttcccc agagttcagt 1680 ggcatgceea ggataageaa attgggatct ggaaatgatt ttgaggtgtt cttccaacga 1740 cttggaattg ettcaggeag ageaeggtat actaaaaatt gggaaacaaa caaattcagc 1800 ggctatccac tgtatcacag tgtctatgaa acatatgagt tggtggaaaa gttttatgat 1860 ccaatgttta aatatcaect cactgtggce eaggttcgag gagggatggt gtttgagcta 1920 gccaattcca tagtgctccc ttttgattgt egagattatg ctgta-gtttt aagaaagtat 1980 gctgacaaaa tctacagtat ttctatgaaa catccacagg aaatgaagac atacagtgta 2040 tcanttgatt cactttcttt tgcagtaaag aattttacag aaattgette caagttcagt 2100 gagagactcc aggactttga caaaagcaag catgtcatct atgctccaag cagccacaac 2160 aagtatgcag gggagteatt cccaggaarc tatgatgctc tgtttgatat tgaaagcaaa 2220 gtggaccctt ccaaggcctg gggagàagtg aagagacaga tttatgttgc agccttcaca 2280 gtgcaggcag ctgcagagac tttgagtgaa gtagcctaag aggattettt agagaatccg 2340 taxtgaattt gtgtggtatg ttactcagaa agaategtaa tgggtatatt gataaatttt 2400 aaaattggta tacttgaaat aaagttgaat attatatata aaaaaaáaaa aaaáaaaaaa 2460 aaaaaaaaaa aa 2472 43 <211 >719 «2ΐ2> PRT •<213* Hornô sapiens <400> 43

Met T'pp Asa Leu Leu His Glu Thr Asp ser Ala vai Ala Thr Ala Arg 1 5 10 ' ~ 15

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taatgtctgg ctttattgat acagaaacat cggttggcta ttataattta gaagtcatta 4200 gcgagcaggc taccgcatac gttatcaaaa taaacgaact aaaágaacta ctgagcaaaa 4260 atcttacgca ctttttctat gttttccaaa ccctacaaaa acaagtttca tacagcctag 4320 ctaaatttaa tgatttttcg attaacggga agcttggctc tatttgcggt caacttttaa 4380 tcctgaccta tgtgtatggt aaagaaactc ctgatggcat caagattaca ctggataatt 4440 taacaatgca ggagttagga tattcaagtg gcatcgcaca tagctcagct gttagcagaa 4500 ttatttccaa attaaagcaa gagaaagtta tcgtgtataa aaattcatgc ttttatgtac 4560 aaaatcgtga ttatctcaaa agatatgccc ctaaattaga tgaatggttt tatttagcat 4620 gtcctgctac ttggggaaaa ttaaattaaa tcaaaaacag tattcctcaa tgaggaatac 4680 tgttttatat tttattcgaa taaagaactt acagaagcat tttcatgaac gcgtacgatt 4740 gcttcaecaa gaagagctgg tcgaccgatg cccttgagag ccttcaaccc agtcagctcc 4800 ttccggtggg cgcggggcat gactatcgtc gccgcactta tgactgtctt ctttatcatg 4860 caactcgtag gacaggtgtc ggcagcgctc tgggtcattt tcggcgagga ecgetttcgc 4920 tggagcgcga cgatgatcgg cctgtcgctt gcggtattcg gaatcttgca cgccctcgct 4980 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atcattaaaa caatcattcc agtaatcaac catatctctt tttaattcaa cttctacacg 8400 ccataaatgt tcagacacaa cttcaacatc tgcgttatct ttacgttctt gttttttatt 8460 ataaattcta ataaatctat cactatcacg gacaccaaaa tattttgttt ctggcttgcc 8520 attacgacca taaaaaacag ttttcttaac tgctttatca gtcattgcat agtaatcgct 8580 caaatcatct tcaaaatcaa aagctaagtc taatcttgta aaaccgtcat cttccatgta 8640 gtcgataata ttttgtttta accaaatcat ttcttcatgt gtgagtttat tgggattaaa 8700 ttcaacacgc atattacgtc tatcccaagt atctgctttt actttgtcat attcgatata 8760 aactttttct tgaagtgcct tagctttaaa ctttgtttga agtatatccc aaagtcgtat 8820 ttgtggctct acactcataa agtcagatag ctttttagca ttagttttgt tcaaatttcc 8880 aacgattgtc atggcatcaa aacttaatgc gggttgagat tttcccaaag tttgaccact 8940 taaccggcta ttatttaacc ggctattaga gacggaacta actcaacgct agtagtggat 9000 ttaatcccaa atgagccaac agaaccagaa ccagaaacag aacaagtaac attggagtta 9060 gaaatggaag aagaaaaaag caatgatttc gtgtgaataa tgcacgaaat cattgcttat 9120 ttttttaaaa agcgatatac tagatataac gaaacaacga actgaataaa gaatacaaaa 9180 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tgccagttga tctaacgtgc aatcattttg ggattgctcg tataccaaga acggacaatg 10080 tagaattttt tgatcccaat taccgttatt ctttcaaaga atggcaagat tggtctttca 10140 aacaaacaga taataagggc tttactcgtt caagtctaac ggttttaagc ggtacagaag 10200 gcaaaaaaca agtagatgaa ccctggttta atctcttatt gcacgaaacg aaattttcag 10260 gagaaaaggg tttagtaggg cgcaatagcg ttatgtttac cctctcttta gcctacttta 10320 gttcaggcta ttcaatcgaa acgtgcgaat ataatatgtt tgagtttaat aatcgattag 10380 atcaaccctt agaagaaaaa gaagtaatca aaattgttag aagtgcetat tcagaaaact 10440 atcaaggggc taatagggaa tacattacca ttctttgcaa agcttgggta tcaagtgatt 10500 taaccagtaa agatttattt gtccgtcaag ggtggtttaa attcaagaaa aaaagaagcg 10560 aacgtcaacg tgttcatttg tcagaatgga aagaagattt aatggcttat attagcgaaa 10620 aaagcgatgt atacaagcct tatttagcga cgaccaaaaa agagattaga gaagtgctag 10680 gcattcctga acggacatta gataaattgc tgaaggtact gaaggcgaat caggaaattt 10740 tctttaagat taaaccagga agaaatggtg gcattcaact tgctagtgtt aaatcattgt 10800 tgetatcgat cattaaatta aaaaaagaag aacgagaaag ctatataaag gcgctgacag 10860 cttcgtttaa tttagaacgt acatttattc aagaaactct aaacaaattg gcagaacgcc 10920 ccaaaacgga cccacaactc gatttgttta gctacgatac aggctgaaaa taaaacccgc 10980 actatgccat tacatttata tctatgatac gtgtttgttt ttctttgctg tttagtgaat 11040 gattagcaga aatatacaga gtaagatttt aattaattat tagggggaga aggagagagt 11100 ageccgaaaa cttttagttg gcttggactg aacgaagtga gggaaaggct actaaaacgt 11160 cgaggggcag tgagagcgaa gcgaacactt gatcttttaa gttgctatca tttataggtc 11220 aatagagtat acctatttgt cctaatatga ttttagcagt ataattgact tggtgaatag 11280 gtcatttaag ttgggcataa taggaggagt aaaatgaaaa aatttattta tcgagtttta 11340 gaaaatgacg aagtggtggc tatttttaat gagcaacaat atgcgcaaga ttttatcgct 11400 tacgaaaaga caatttctga taagcaattt gaaattgaaa aagtagatat tgctgattgg 11460 ttattgcaac cgagagaatt ttagaggttg gttgaaaatg gctaaaattg gttatgcacg 11520 tgtcagtagc aaagaacaga acttagatcg gcaattacaa gcgttacagg gcgtttctaa 11580 ggtcttttca gaeaaattaa gcggtcaatc ggtcgaacgc ccacaattac aagctatgct 11640 taactatatt cgtgaagggg atattgttat tgttactgaa ttãgatcgat taggacgaaa 11700 taataaagaa ttaacagaat tgatgaatca aattcaaatt aagggggcaa ccctggaagt 11760 cttaaattta ccctcaatga atggtattga agatgaaaat ttaaggcgtt tgattaatag 11820 ccttgtcatt gaattgtaca agtatcaagc agaatcagaa cgaaaaaaaa ttaaggaacg 11880 tcaggcacaa ggaatcgaaa ttgctaagaa aaaaggcaaa ttcaaaggtc gtcagcataa 11940 atttaaagaa aatgatccac gtttaaagtc gggcagcgtt gggtcctggc cacgggtgcg 12000 catgatcgtg ctcctgtcgt tgaggacccg gctaggctgg cggggttgcc ttactggtta 12060 gcagaatgaa tcaccgatac gcgagcgaac gtgaagcgac tgctgctgca aaacgtctgc 12120 gacctgagca acaacatgaa tggtcttcgg tttccgtgtt tcgtaaagtc tggaaacgcg 12180 gaagtcccct acgtgctgct gaagttgcce gcaacagaga gtggaaccaa ccggtgatac 12240 cacgatacta tgactgagag tcaacgccat gagcggcctc atttcttatt ctgagttaca 12300 acagtccgca ccgctgccgg tagctccttc cggtgggcgc ggggcatgac tatcgtcgcc 12360 gcacttatga ctgtcttctt tatcatgcaa ctcgtaggac aggtgccggc agcgcccaac 12420 agtcccccgg ccacggggcc tgccaccata cccacgccga aacaagcgcc ctgcaccatt 12480 atgttccgga tctgcatcgc aggatgctgc tggctaccct gtggaacacc tacatctgta 12540 ttaacgaagc gctaaccgtt tttatcaggc tctgggaggc agaataaatg atcatatcgt 12600 caattattac ctccacgggg agagcetgag caaactggcc tcaggcattt gagaagcaca 12660 cggtcacact gcttccggta gtcaataaac cggtaaacca gcaatagaca taagcggcta 12720 tttaacgacc ctgccctgaa ccgacgaccg ggtcgaattt gctttcgaat ttctgccatt 12780 catccgctta ttatcactta ttcaggcgta geaaccaggc gtttaagggc accaataact 12840 gccttaaaaa aattacgccc cgccctgcca ctcatcgcag tactgttgta attcattaag 12900 cattctgccg acatggaagc catcacaaac ggcatgatga acctgaatcg ccagcggcat 12960 cagcaccttg tcgccttgcg tataatattt gcccatggtg aaaacggggg cgaagaagtt 13020 gtccatattg gccacgttta aatcaaaaet ggtgaaactc acccagggat tggctgagac 13080 gaaaaacata ttctcaataa accctttagg gaaataggcc aggttttcac cgtaacacgc 13140 cacatcttgc gaatatatgt gtagaaactg ccggaaateg tcgtggtatt cactccagag 13200 cgatgaaaac gtttcagttt gctcatggaa aacggtgtaa caagggtgaa cactatccca 13260 tatcaccagc tcaccgtctt tcattgccat acgg 13294

<210 56 <211> 368 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400 56

Met val Thr Gly Trp His Arg Pro Thr Trp He Glu lie Asp Arg Ala 15 10 15

Ala lie Arg Glu Asn lie Lys Asn Glu Gin Asn Lys Leu Pro Glu ser 20 25 30 val Asp Leu Trp Ala val val Lys Ala Asn Ala Tyr Gly His Gly 2le 35 40 45 lie Glu val Ala Arg Thr Ala Lys Glu Ala Gly Ala Lys Gly Phe Cys 50 55 60 val Ala lie Leu Asp Glu Ala Leu Ala Leu Arg Glu Ala Gly Phe Gin 65 70 75 80

Asp Asp Phe He Leu val Leu Gly Ala Thr Arg Lys Glu Asp Ala Asn 85 90 95

Leu Ala Ala Lys Asn His lie Ser Leu Thr val Phe Arg Glu Asp Trp 100 105 110

Leu Glu Asn Leu Thr Leu Glu Ala Thr Leu Arg lie His Leu Lys val 115 120 125

Asp Ser Gly Met Gly Arg Leu Gly lie Arg Thr Thr Glu Glu Ala Arg 130 135 140

Arg lie Glu Ala Thr ser Thr Asn Asp His Gin Leu Gin Leu Glu Gly 145 150 155 160 lie Tyr Thr His Phe Ala Thr Ala Asp Gin Leu Glu Thr Ser Tyr Phe 165 170 175

Glu Gin Gin Leu Ala Lys Phe Gin Thr lie Leu Thr ser Leu Lys Lys 180 185 190

Arg Pro Thr Tyr Val His Thr Ala Asn Ser Ala Ala Ser Leu Leu Gin 195 200 205

Pro Gin lie Gly Phe Asp Ala lie Arg Phe Gly lie ser Met Tyr Gly 210 215 220

Leu Thr Pro ser Thr Glu lie Lys Thr ser Leu Pro Phe Glu Leu Lys 225 230 235 240 pro Ala Leu Ala Leu Tyr Thr Glu Met val His val Lys Glu Leu Ala 245 250 255 pro Gly Asp ser val ser Tyr Gly Ala Thr Tyr Thr Ala Thr Glu Arg 260 265 270

Glu Trp val Ala Thr Leu Pro lie Gly Tyr Ala Asp Gly Leu lie Arg 275 280 285

His Tyr Ser Gly Phe His Val Leu Val Asp Gly Glu Pro Ala Pro lie 290 295 300 lie Gly Arg Val Cys Met Asp Gin Thr lie lie Lys Leu Pro Arg Glu 305 310 315 320

Phe Gin Thr Gly Ser Lys val Thr lie lie Gly Lys Asp His Gly Asn 325 330 335

Thr val Thr Ala Asp Asp Ala Ala Gin Tyr Leu Asp Thr lie Asn Tyr 340 345 350

Glu val Thr Cys Leu Leu Asn Glu Arg He Pro Arg Lys Tyr lie His 355 360 365

<210> 57 <211 >289 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 57

Met Lys val Leu val Asn Asn His Leu val Glu Arg Glu Asp Ala Thr 15 10 15

Val Asp He Glu Asp Arg Gly Tyr Gin Phe Gly Asp Gly val Tyr Glu 20 25 30 val val Arg Leu Tyr Asn Gly Lys Phe Phe Thr Tyr Asn Glu His lie 35 40 45

Asp Arg Leu Tyr Ala ser Ala Ala Lys lie Asp Leu val lie Pro Tyr 50 55 60

Ser Lys Glu Glu Leu Arg Glu Leu Leu Glu tys Leu val Ala Glu Asn 65 70 75 80

Asn lie Asn Thr Gly Asn Val Tyr Leu Gin val Thr Arg Gly val Gin 85 90 95

Asn Pro Arg Asn His val lie Pro Asp Asp Phe Pro Leu Glu Gly Val 100 105 110

Leu Thr Ala Ala Ala Arg Glu Val Pro Arg Asn Glu Arg Gin Phe val 115 120 125

Glu Gly Gly Thr Ala lie Thr Glu Glu Asp val Arg Trp Leu Arg Cys 130 135 140

Asp lie Lys Ser Leu Asn Leu Leu Gly Asn lie Leu Ala Lys Asn Lys 145 150 155 160

Ala His Gin Gin Asn Ala Leu Glu Ala lie Leu His Arg Gly Glu Gin

t if VJ » V.·. «rwvi I 1 h I tiu ^ 1«.^ « vn V 165 170 175 val Thr Glu cys ser Ala ser ash val ser lie lie Lys Asp Gly val 180 185 190

Leu Trp Thr His Ala Ala Asp Asn Leu lie Leu Asn Gly lie Thr Arg 195 200 205

Girt val lie lie Asp val Ala Lys Lys Asn Gly lie Pro val Lys Glu 210 215 220

Ala Asp Phe Thr Leu Thr Asp Leu Arg Glu Ala Asp Glu val Phe lie 225 230 235 240 ser ser Thr Thr lie Glu lie Thr pro lie Thr His xle Asp Gly val 245 250 255

Gin Val Ala Asp Gly Lys Arg Gly Pro lie Thr Ala Gin Leu His Gin 260 265 270

Tyr Phe val Glu Glu He Thr Arg Ala Cys Gly Glu Leu Glu Phe Ala 275 280 285

Lys <210 58 <211>29 <212> DNA <213> Artificial <220 <223> ehemicaiiy synthesized <400 58 gtgetcgaga ttgtgggagg ctgggagtg 29 <210> 59 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220 <223> chemically synthesized <400> 59 gatactagtt taggggttgg ccacgatgg 29 <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60

His cys lie Arg Asn lys ser val lie Leu 15 10

<21G> 61 <211 >390 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <4Q0> 61

Met Arg Ala Met Met val val Phe lie Thr Ala Asn Cys lie Thr lie 1 5 10 15

Asn Pro Asp lie lie Phe Ala Ala Thr Asp ser Glu Asp Ser Ser Leu 20 25 30

Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Gin Pro Ser Glu 35 40 45 val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala Arg Glu val Ser Ser Arg 50 55 60

Asp lie Glu Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys 65 70 75 80

Ala Asp Leu lie Ala Met Leu Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn 85 90 95

Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu Girt Thr Gly Asn val Ala lie Asn Glu 100 105 110

Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg Pro Thr Leu Gin val Glu Arg Arg His 115 120 125

Pro Gly Leu ser ser Asp ser Ala Ala Glu lie Lys Lys Arg Arg Lys 130 135 140

Ala lie Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp 145 150 155 160

Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys Arg Lys Val Ala Lys Glu Ser val Val 165 170 175

Asp Ala ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser ser Met Gin Ser Ala Asp Glu 180 185 190

Ser Thr Pro Gin Pro Leu Lys Ala Asn Gin Lys Pro Phe Phe Pro Lys 195 200 205 val Phe Lys Lys lie Lys Asp Ala Gly Lys Trp val Arg Asp Lys lie 210 215 220

Asp Glu Asn Pro Glu val Lys Lys Ala lie val Asp Lys ser Ala Gly 225 230 235 240 teu lie Asp Gin Leu Leu Thr Lys lvs Lys ser Glu Glu Val Asn Ala 245 250 255

Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu 260 265 270

Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Thr Pro Ser Glu 275 280 285

Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg 290 295 300

Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala 305 3X0 315 320

Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Glu Asp 325 330 335

Glu Leu Glu lie Met Arg Glu Thr Ala pro ser Leu Asp ser ser Phe 340 345 350

Thr ser Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg ser Ala lie Asn Arg His ser 355 360 365

Glu Asn Phe Ser Asp Phe Pro Leu lie Pro Thr Glu Glu Glu Leu Asn 370 375 380

Gly Arg Gly Gly Arg Pro 385 390

<210> 62 <211=- 1170 <212=- DNA <213> Listeria monocytogenes <400> 62 atgcgtgcga tgatggtagt tttcattact gccaactgca ttacgattaa ccccgacata 60 atatttgcag cgacagatag cgaagattcc agtctaaaca cagatgaatg ggaagaagaa 120 aaaacagaag agcagccaag cgaggtaaat acgggaccaa gatacgaaac tgcacgtgaa 180 gtaagttcac gtgatattga ggaaetagaa aaatcgaata aagtgaaaaa tacgaacaaa 240 gcagacctaa tagcaatgtt gaaagcaaaa gcagagaaag gtccgaataa caataataac 300 aacggtgagc aaacaggaaa tgtggctata aatgaagagg cttcaggagt cgaccgacca 360 actctgcaag tggagcgtcg tcatccaggt ctgtcatcgg atagcgcagc ggaaattaaa 420 aaaagaagaa aagccatagc gtcgtcggat agtgagcttg aaagccttac ttatccagat 480 aaaccaacaa aagcaaataa gagaaaagtg gcgaaagagt cagttgtgga tgcttctgaa 540 agtgacttag attctagcat gcagtcagca gacgagtcta caccacaacc tttaaaagca 600 aatcaaaaac catttttccc taaagtattt aaaaaaataa aagatgcggg gaaatgggta 660 cgtgataaaa tcgacgaaaa tcctgaagta aagaaagcga ttgttgataa aagtgcaggg 720 ttaattgacc aattattaac caaaaagaaa agtgaagagg taaatgcttc ggacttcccg 780 ccaccaccta cggatgaaga gttaagactt gctttgccag agacaccgat gcttctcggt 840 tttaatgctc ctactccatc ggaaccgagc tcattcgaat ttccgccgcc acctacggat 900 gaagagttaa gacttgcttt gccagagacg ccaatgcttc ttggttttaa tgctcctgct 960 acatcggaac cgagctcatt cgaatttcca ccgcctccaa cagaagatga actagaaatt 1020 atgcgggaaa cagcaccttc gctagattct agttttacaa gcggggattt agctagtttg 1080 agaagtgcta ttaatcgcca tagcgaaaat ttctctgatt tcccactaat cccaacagaa 1140 gaagagttga acgggagagg cggtagacca 1170 <210 63 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <4GO 63

Met lys Ala val Leu Leu Ala Leu Leu Met Ala Gly Leu Ala Leu Gin 1 S 10 15

Pro Gly Thr Ala Leu Leu cys Tyr ser cys Lys Ala Gin val ser Asn 20 25 30

Glu Asp Cys Leu Girt val Glu Asn Cys Thr Gin Leu Gly Glu Gin Cys 35 40 45

Trp ihr- Ala Arg xle Arg Ala val Gly Leu Leu Thr val lie ser Lys SO 55 60

Gly Cys Ser Leu Asn Cys Val Asp Asp Ser Gin Asp Tyr Tyr Val Gly 65 70 75 80

Lys Lys Asn lie Thr Cys Cys Asp Thr Asp Leu Cys Asn Ala ser Gly 85 90 95

Ala Mis Ala Leu Gin Pro Ala Ala Ala Tie Leu Ala Leu Leu Pro Ala 100 105 110

Leu Gly leu Leu Leu Trp Gly Pro Gly Gin Leu 115 120 <210 64 <210 990 <212» QNA <·-213> Horns sapiens <220> <221» misc_ feature <222» (543),.(543) <223> π is: a, c, g, or t <220> <221 > miscjeatufe. <222> (580)..(580) <223» n is a, c, g. or t «220» <221 > miscjeatufe <222> (584),.(584) <223» n is a. c, g. ort. <220» <221» miscjaature <222» (604),.(604) <223» n is a, c, g, art <220» <221» mrscjeature <222> ¢608). (608) <223» n is a, c, g, sr t <220» <221> miscjeeture <222> (615)..(615) <223> n is a, c, g, or i <220> <221 > misc_ feature <222> (636)..(636) <223> n is a, c, g, or t <220 <221 > miscjeature <222> ¢640)..(640) <223> n is a, c, g, or t <220 <221 > misc_feature <222> (646)..(646) <223> n is a, c, g, or t <220 <221 > miscjeature <222> ¢697)..(697)

<223> n is a, c, g, or S <220> <221 > miscjeature <222> (926)..(926) <223> n is a, c, g, or i <400 64 agggagaggc agtgaccatg aaggctgtgc tgcttgccct gttgatggca ggcttggccc 60 tgcagccagg cactgccctg ctgtgctact cctgcaaagc ccaggtgagc aacgaggact 120

gcctgcaggt ggagaactgc acccagctgg gggagcagtg ctggaccgcg cgcatccgcg ISO cagttggcct cctgaccgtc atcagcaaag gctgcagctt gaactgcgtg gatgactcac 240 aggactacta cgtgggcaag aagaacatca cgtgctgtga caccgacttg tgcaacgcca 300 gcggggccca tgccctgcag ccggctgccg ccatccttgc gctgctccct gcactcggcc 360 tgctgctctg gggacccggc cagctatagg ctctgggggg ccccgctgca gcccacactg 420 ggtgtggtgc cccaggcctt tgtgccactc ctcacagaac ctggcccagt gggagcctgt 480 cctggttcct gaggeacatc ctaacgcaag tttgaccatg tatgtttgca ccccttttcc 540.. ccnaaccctg accttcccat gggccttttc caggattccn accnggcaga tcagttttag '600 tganacanat ccgcntgcag atggcccctc caaccntttn tgttgntgtt tccatggccc 660 agcattttcc acccttaacc ctgtgttcag gcacttnttc ccccaggaag ccttccctgc 720 ccaccccatt tatgaattga gccaggtttg gtccgtggtg tcccccgcac ccagcagggg 780. acaggcaate aggagggccc agtaaaggct gagatgaagt ggactgagta gaactggagg 840 acaagagttg acgtgagttc etgggagttt ccagagatgg ggcctggagg cctggaggaa 900 ggggccaggc ctcacatttg tggggntccc gaatggcagc ctgagcacag cgtaggccct 960 taataaacac ctgttggata agccaaaaaa 990

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Estirpe recombinante de Listeria expressando um péptido de fusão de uma peptidase-3 de um péptido relacionado com a calicreina (KLK3), que está operacionalmente ligado a um péptido de listeriolisina não-hemolitica do terminal N (LLO), compreendendo o referido péptido de fusão a sequência de SEQ ID N°: 54 ou uma sequência pelo menos 99% homóloga da mesma, em que o referido péptido LLO do terminal N aumenta a imunogenicidade do péptido de fusão, e em que o péptido KLK3 não contém uma sequência de sinal.
2. 2. Estirpe recombinante de Listeria de acordo com a reivindicação 1, em que a estirpe recombinante de Listeria é uma estirpe de Listeria auxotrófica ou uma estirpe de Listeria monocytogenes recombinante.
3. 3. Estirpe de Listeria recombinante de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a estirpe auxotrófica de Listeria ser um mutante dal/dat ou compreender ainda uma deleção no gene endógeno ActA.
4. 4. Estirpe de Listeria recombinante de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a estirpe auxotrófica de Listeria compreender um vetor de expressão episómico compreendendo uma enzima metabólica que complementa a auxotrofia da estirpe de Listeria auxotrófica.
5. 5. Estirpe de Listeria recombinante de acordo com a reivindicação 4, em que a enzima metabólica é uma enzima de alanina racemase ou uma enzima de transferase de D-aminoácido.
6. 6. Estirpe de Listeria recombinante de acordo com a reivindicação 1, em que a estirpe de Listeria recombinante foi passada através de um animal hospedeiro.
7. 7. Polipeptideo recombinante compreendendo um péptido de fusão de um péptido KLK3 que está operacionalmente ligada a um peptideo LLO do terminal N, em que o referido polipéptido recombinante compreende a sequência de SEQ ID N°: 54 ou uma sequência pelo menos 99% homóloga da mesma, em que o referido péptido LLO do terminal N aumenta a imunogenicidade do péptido de fusão, e em que o péptido KLK3 não contém uma sequência de sinal.
8. 8. Molécula de nucleótidos que codifica o polipéptido recombinante de acordo com a reivindicação 7.
9. 9. Vacina compreendendo a estirpe de Listeria recombinante de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, o polipéptido recombinante de acordo com a reivindicação 7 ou a molécula de nucleótidos de acordo com a reivindicação 8, e um adjuvante.
10. 10. Vetor de vacina recombinante que codifica o polipéptido recombinante de acordo com a reivindicação 7 ou compreendendo a molécula de nucleótidos de acordo com a reivindicação 8.
11. 11. Estirpe de Listeria recombinante de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, uma composição imunogénica compreendendo o polipéptido recombinante de acordo com a reivindicação 7, ou as sequências de nucleótidos de acordo com a reivindicação 8, para utilização na indução de uma resposta imune anti-KLK3 num sujeito.
12. 12. Estirpe de Listeria recombinante de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, o polipéptido recombinante de acordo com a reivindicação 7, ou as sequências de nucleótidos de acordo com a reivindicação 8, para utilização no tratamento de uma proteína de peptidase-3 relacionada com a calicreína 3 (KLK3) que expressa cancro da próstata num sujeito, em que o sujeito tem uma resposta imunitária contra a proteína KLK3 que expressa o cancro da próstata.
13. 13. Estirpe de Listeria recombinante de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, o polipéptido recombinante de acordo com a reivindicação 7, ou os nucleótidos de acordo com a reivindicação 8, para utilização na inibição ou supressão de um cancro da próstata que expressa proteína KLK3 num indivíduo, através do qual o sujeito monta uma resposta imune contra a proteína KLK3 que expressa o cancro da próstata, inibindo assim ou suprimindo a proteína KLK3 que expressa o cancro da próstata num sujeito.
14. 14. Polipeptídeo recombinante de acordo com a reivindicação 7, feito por um processo compreendendo o passo de conjugação química de um polipéptido compreendendo o péptido KLK3 para um polipéptido compreendendo o péptido LLO do terminal N.
15. 15. Estirpe de Listeria recombinante de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, uma composição imunogénica compreendendo o polipéptido recombinante de acordo com a reivindicação 7, ou as sequências de nucleótidos de acordo com a reivindicação 8, para utilização como um medicamento.