ES2267046T3 - Antigeno carcinoembrionico rhesus, nucleotidos que lo codifican de los mismos. - Google Patents
Antigeno carcinoembrionico rhesus, nucleotidos que lo codifican de los mismos. Download PDFInfo
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico aislada, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína del antígeno carcinoembriónico de mono rhesus (rhCEA), según se expone en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:8.
Description
Antígeno carcinoembriónico rhesus, nucleótidos
que lo codifican y usos de los mismos.
La presente invención generalmente se relaciona
con la terapia del cáncer. Más específicamente, la presente
invención se relaciona con el antígeno carcinoembriónico polipéptido
asociado al homólogo del tumor de mono rhesus, designado aquí
rhCEA, con moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican para
esta proteína, y con vectores recombinantes y células huésped que
contienen DNA que codifica para esta proteína. Esta invención
también se relaciona con constructos vector adenovirales que llevan
rhCEA y con su uso en vacunas y composiciones farmacéuticas para
prevenir y tratar el cáncer.
La superfamilia de las inmunoglobulinas (IgSF)
se compone de numerosos genes que codifican para proteínas con
funciones diversas, una de las cuales es la adhesión intracelular.
Las proteínas IgSF contienen al menos un dominio relacionado con Ig
que es importante para mantener interacciones de unión
intermolecular propias. Como tales interacciones son necesarias
para las diversas funciones biológicas de los miembros de la IgSF,
se ha correlacionado la disrupción o expresión aberrante de muchas
moléculas de adhesión de la IgSF con muchas enfermedades
humanas.
humanas.
El antígeno carcinoembriónico (CEA) pertenece a
una subfamilia de la superfamilia Ig compuesta por glicoproteínas
de superficie celular. Los miembros de la subfamilia de CEA son
conocidos como moléculas de adhesión celular relacionadas con CEA
(CEACAMs). En la literatura científica reciente, el gen de CEA se ha
renombrado CEACAM5, aunque la nomenclatura para la proteína
permanezca como CEA. Funcionalmente, se ha mostrado que los CEACAMs
actúan como moléculas de adhesión intercelular homotípicas y
heterotípicas (Benchimol et al., Cell 57:
327-334 (1989)). Además de la adhesión celular, el
CEA inhibe la muerte celular resultante de la separación de células
de la matriz extracelular y puede contribuir a la transformación
celular asociada a ciertos proto-oncogenes tales
como Bcl2 y C-Myc (ver
Berinstein, J. Clin Oncol. 20(8):
2197-2207 (2002)).
Se ha detectado la expresión normal de CEA
durante el desarrollo fetal y en la mucosa del colon del adulto. La
sobreexpresión de CEA se detectó por primera vez en tumores de colon
humano hace unos treinta años (Gold and Freeman, J. Exp.
Med. 121:439-462 (1965)), y de hecho se ha
encontrado en casi todos los tumores colonorrecta-
les.
les.
Adicionalmente, la sobreexpresión de CEA se
puede detectar en un alto porcentaje de adenocarcinomas de páncreas,
pecho y pulmón. Debido a la prevalencia de la expresión de CEA en
estos tipos de tumores, el CEA se usa clínicamente de forma amplia
en el seguimiento y prognosis de estos cánceres.
La correlación entre la expresión de CEA y el
crecimiento metastático también ha conducido a su identificación
como objetivo de intervención molecular e inmunológica para el
tratamiento del cáncer colonorrectal. Una aproximación terapéutica
que tiene al CEA como objetivo es el uso de anticuerpos
anti-CEA (ver Chester et al., Cancer
Chemoter. Pharmacol. 46 (Suppl): S8-S12
(2000)), mientras que otra es activar el sistema inmune para atacar
tumores que expresan el CEA usando vacunas basadas en el CEA (para
revisión, ver Berinstein, supra).
Se han clonado y caracterizado secuencias que
codifican para el CEA humano (Patente EE.UU. Nº 5,274,087; Patente
EE.UU. Nº 5,571,710; y Patente EE.UU. Nº 5,843,761. Ver también
Beauchemin et al., Mol. Cell. Biol.
7:3221-3230 (1987); Zimmerman et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:920-924
(1987)). A pesar del aislamiento e identificación de estos genes de
CEA, sería deseable identificar genes de mamíferos adicionales que
codifiquen para el CEA para permitir el desarrollo de una vacuna
para el cáncer que sea eficaz y no se obstaculice mediante
auto-tolerancia.
La presente invención se relaciona con moléculas
de ácido nucleico aisladas o purificadas (polinucleótidos) que
contienen una secuencia de nucleótidos que codifican para un
antígeno carcinoembriónico nuevo de mono rhesus (en adelante rhCEA)
según se expone en SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:8. Las moléculas de DNA
reveladas aquí pueden transfectarse a una célula huésped a elección
en la que la célula huésped recombinante proporcione una fuente de
niveles sustanciales de una proteína del rhCEA funcional expresada
(SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:8).
La presente invención se relaciona
adicionalmente con una molécula de ácido nucleico aislada que
codifica para mRNA que expresa una proteína nueva de CEA de mono
rhesus; esta molécula de DNA contiene la secuencia de nucleótido
revelada aquí como SEQ ID NO:1. Las secuencias de nucleótido que
codifican para el CEA de mono rhesus se designan aquí como
rhCEACAM5. Un aspecto preferido de esta parte de la presente
invención se revela en la Figura 1A, que muestra una molécula de
DNA (SEQ ID NO:1) que codifica para una proteína nueva del rhCEA
(SEQ ID NO:2).
Otro aspecto de esta invención es una molécula
de ácido nucleico aislada que codifica para una proteína nueva de
CEA de mono rhesus (SEQ ID NO:8), comprendiendo dicha molécula de
ácido nucleico una secuencia de nucleótidos, como se muestra en la
Figura 1B y según se expone en SEQ ID NO:5.
La presente invención también se correlaciona
con vectores recombinantes y células huésped recombinantes,
procarióticas y eucarióticas, que contienen las moléculas de ácido
nucleico reveladas a través de esta descripción.
La presente invención se relaciona
adicionalmente con un proceso para expresar una proteína de CEA de
mono rhesus en una célula huésped recombinante, que comprende: (a)
introducir un vector que contiene un ácido nucleico según se expone
en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:5 en una célula huésped adecuada; y, (b)
cultivar la célula huésped bajo condiciones que permitan la
expresión de dicha proteína de CEA de mono rhesus.
Un aspecto preferido de la presente invención es
una forma sustancialmente purificada de una proteína de CEA de mono
rhesus que está constituida por la secuencia del amino ácido
revelada en la Figura 2A (SEQ ID NO:2).
Otro aspecto preferido de la presente invención
es una forma sustancialmente purificada de una proteína de CEA de
mono rhesus que está constituida por la secuencia del amino ácido
revelada en la Figura 2B (SEQ ID NO:8).
Otro aspecto preferido de la presente invención
se relaciona con una proteína madura del rhCEA sustancialmente
purificada, completamente procesada (incluyendo procesado
proteolítico, glicosilación y/o fosforilación), obtenida de una
célula huésped recombinante que contiene un vector de expresión de
DNA comprendiendo secuencia de nucleótido según se expone en SEQ ID
NO:1 o SEQ ID NO:5, que expresa la proteína del rhCEA. Se prefiere
especialmente que la célula huésped recombinante sea una célula
huésped eucariota, tal como una línea celular de mamíferos.
Sin embargo otro aspecto de esta invención es un
procedimiento para prevenir o tratar el cáncer que comprender
administrar a un mamífero un vector de vacuna que contiene una
molécula de ácido nucleico aislada, comprendiendo la molécula de
ácido nucleico aislada una secuencia de nucleótidos que codifica
para una proteína antigénica (rhCEA) carcinoembriónica de mono
rhesus según se expone en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:8.
La presente invención se relaciona
adicionalmente con un vector de vacuna de adenovirus que contiene un
genoma adenoviral con una delección en la región E1, y una
inserción en la región E1, en la que la inserción contiene un
casete de expresión que comprende: (a) un polinucleótido que
codifica para una proteína de CEA de mono rhesus; y (b) un promotor
ligado operativamente al polinucleótido.
La presente invención también se relaciona con
un plásmido vacuna que contiene una porción de plásmido y una
porción de casete de expresión, comprendiendo la porción de casete
de expresión: (a) un polinucleótido que codifica para una proteína
de CEA de mono rhesus; y (b) un promotor ligado operativamente al
polinucleótido.
Otro aspecto de la presente invención es un
procedimiento para proteger a un mamífero del cáncer o tratar a un
mamífero que padezca cáncer, que comprende: (a) introducir en el
animal un primer vector comprendiendo: i) un polinucleótido que
codifica para una proteína de CEA de mono rhesus; y ii) un promotor
ligado operativamente al polinucleótido; (b) dejar que pase una
cantidad predeterminada de tiempo; y (c) introducir en el animal un
segundo vector comprendiendo: i) un polinucleótido que codifica para
una proteína de CEA de mono rhesus; y ii) un promotor ligado
operativamente al polinucleótido.
Tal como se usan a través de la descripción y en
las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares
"un/uno/una" y "el/la" incluyen la referencia plural a
menos que el contexto claramente lo dicte de otro modo.
Tal como se usan a través de la descripción y en
las reivindicaciones adjuntas, a las siguientes definiciones y
abreviaturas se aplica:
El término "promotor" se refiere a un lugar
de reconocimiento en una hebra de DNA a la cual se liga la RNA
polimerasa. El promotor forma un complejo de iniciación con la RNA
polimerasa para iniciar y conducir la actividad transcriptora. El
complejo se puede modificar activando secuencias denominadas
"intensificadores" o inhibiendo secuencias denominadas
"silenciadores".
El término "casete" se refiere a la
secuencia de la presente invención que contiene la secuencia de
ácido nucleico que se tiene que expresar. El casete es similar en
concepto a una cinta de casete; cada casete tiene su propia
secuencia. De este modo intercambiando el casete el vector expresará
una secuencia distinta. Debido a los lugares de restricción en
los extremos 5' y 3', el casete puede insertarse, retirarse o
sustituirse fácilmente por otro casete.
El término "vector" se refiere a algunos
medios mediante los cuales se pueden introducir fragmentos de DNA
en un organismo huésped o tejido huésped. Hay varios tipos de
vectores incluyendo plásmidos, virus (incluyendo adenovirus),
bacteriófagos y cósmidos.
El término "primera generación", tal como
se usa en referencia a los vectores adenovirales, describe dichos
vectores adenovirales que son de replicación defectuosa. Los
vectores adenovirus de primera generación tienen típicamente una
región génica E1 suprimida o inactivada, y preferiblemente tienen
una región génica E3 suprimida o inactivada.
La designación "pV1J-rhCEA"
se refiere a un constructo de plásmido revelado aquí que comprende
el promotor CMV temprano-inmediato (IE) humano con
intrón A, un gen de CEA de longitud completa del rhesus, secuencias
de poliadenilación derivadas de la hormona de crecimiento bovina y
de terminación transcriptora, y una columna vertebral pUC
mínima.
Las designaciones
"pMRK-Ad5-rhCEA" y
"MRK-rhCEA" se refieren a un constructo,
revelado aquí, que comprende un genoma adenoviral Ad5 suprimido de
las regiones E1 y E3. En este plásmido, la región E1 se sustituye
por un gen de CEA del rhesus en una orientación paralela de la E1
bajo el control de un promotor CMV humano sin intrón A, seguido de
una señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento
bovina.
La designación "pBS-rhCEA"
se refiere a un constructo revelado aquí que comprende el plásmido
pBluescriptII KS (+) y un gen del rhCEA de longitud completa.
El término "cantidad eficaz" significa que
la composición de vacuna suficiente se introduce para producir los
niveles adecuados de polipéptido, para que cause una respuesta
inmune. Alguien cualificado en la técnica reconoce que este nivel
puede variar.
"Sustancialmente libre de otros ácidos
nucleicos" significa al menos el 90%, preferiblemente el 95%, más
preferiblemente el 99%, e incluso más preferiblemente el 99,9%,
libre de otros ácidos nucleicos. Tal como se usan recíprocamente,
los términos "sustancialmente libre de otros ácidos nucleicos",
"sustancialmente purificado", "ácido nucleico aislado" o
"ácido nucleico purificado" también se refieren a moléculas de
DNA que comprenden una región que codifica para una proteína de CEA
de rhesus que ha sido purificada a partir de otros componentes
celulares. De este modo, una preparación de DNA de CEA que esté
sustancialmente libre de otros ácidos nucleicos contendrá, como un
porcentaje de su ácido nucleico total, no más del 10%,
preferiblemente no más del 5%, más preferiblemente no más del 1%, e
incluso más preferiblemente no más del 0,1%, de ácidos nucleicos de
CEA que no sean de rhesus. El que una preparación de DNA de CEA de
rhesus dada esté sustancialmente libre de otros ácidos nucleicos
puede determinarse mediante técnicas tan convencionales de
valoración de pureza del ácido nucleico como, p. ej.,
electroforesis en gel de azarosa combinada con procedimientos de
tinción adecuados, p. ej., tinción con bromuro de etidio, o
mediante secuenciación.
"Sustancialmente libre de otras proteínas"
o "sustancialmente purificado" significa al menos el 90%,
preferiblemente el 95%, más preferiblemente el 99%, e incluso más
preferiblemente el 99,9%, libre de otras proteínas. De este modo,
una preparación de proteína de CEA de mono rhesus que esté
sustancialmente libre de otras proteínas contendrá, como un
porcentaje de su proteína total, no más del 10%, preferiblemente no
más del 5%, más preferiblemente no más del 1%, e incluso más
preferiblemente no más del 0,1%, de proteínas de CEA que no sean de
mono rhesus. El que una preparación de proteína de CEA de mono
rhesus dada esté sustancialmente libre de otras proteínas puede
determinarse mediante técnicas tan convencionales de valoración de
pureza de proteína como, p. ej., electroforesis en gel de
poliacrilamida de sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE)
combinada con procedimientos de detección adecuados, p. ej.,
tinción de plata o inmunomarcaje.
Tal como se usan recíprocamente, los términos
"sustancialmente libre de otras proteínas", o
"sustancialmente purificado", o "proteína de CEA de mono
rhesus aislada" o "proteína de CEA de mono rhesus
purificada" también se refieren a proteína de CEA de mono rhesus
que se haya aislado de una fuente natural. El uso del término
"aislado" o "purificado" indica que la proteína de CEA de
mono rhesus se ha retirado de su ambiente celular normal. De este
modo, una proteína de CEA de mono rhesus aislada puede estar en una
solución libre de células o situada en un ambiente celular distinto
de aquel en el que aparece naturalmente. El término aislada no
implica que una proteína de CEA de mono rhesus aislada sea la única
proteína presente, sí significa en cambio que una proteína de rhCEA
aislada esté sustancialmente libre de otras proteínas y material no
amino-acídico (p. ej., ácidos nucleicos, lípidos,
carbohidratos) asociado naturalmente con la proteína del rhCEA
in vivo. De este modo, una proteína de CEA de mono rhesus
que se exprese recombinantemente en una célula procariota o
eucariota y esté sustancialmente purificada de esta célula huésped
que no expresa naturalmente (es decir, sin intervención) esta
proteína del rhCEA de mono rhesus por supuesto que es "proteína
del rhCEA de mono rhesus aislada" bajo cualquiera de las
circunstancias aquí referidas. Como se apuntaba anteriormente, una
preparación de proteína de rhCEA que sea una proteína del rhCEA
aislada o purificada estará sustancialmente libre de otras
proteínas y contendrá, como un porcentaje de su proteína total, no
más del 10%, preferiblemente no más del 5%, más preferiblemente no
más del 1%, e incluso más preferiblemente no más del 0,1%, de
proteínas de CEA que no sean de mono rhesus.
Una "sustitución de aminoácido
conservativa" se refiere al reemplazo de un residuo de aminoácido
por otro residuo de aminoácido químicamente similar. Ejemplos de
tales sustituciones conservativas son: sustitución de un residuo
hidrofóbico (isoleucina, leucina, valina, o metionina) por otro;
sustitución de un residuo polar por otro residuo polar de la misma
carga (p. ej., arginina por lisina; ácido glutámico por ácido
aspártico).
"rxCEA" se refiere a un antígeno
carcinoembriónico de mono rhesus.
El término "mamífero" se refiere a
cualquier mamífero, incluyendo al ser humano.
La abreviatura "Ag" se refiere a un
antígeno.
Las abreviaturas "Ab" y "mAb" se
refieren a un anticuerpo y un anticuerpo monoclonal,
respectivamente.
La abreviatura "ORF" se refiere a la
estructura de lectura abierta de un gen.
La Figura 1 muestra secuencias de nucleótidos de
moléculas de cDNA de CEA de mono rhesus, según se expone en SEQ ID
NO:1 (Panel A) y SEQ ID NO:5 (Panel B). Ver Ejemplo 2.
La Figura 2 muestra las secuencias de
aminoácidos predichas de la primera proteína de CEA de mono rhesus,
según se expone en SEQ ID NO:2 (Panel A) y de la segunda proteína de
CEA de mono rhesus, según se expone en SEQ ID NO:8 (Panel B). Las
dos diferencias de aminoácidos entre la primera y la segunda
proteínas de CEA de rhesus se destacan y subrayan en el Panel
B.
La Figura 3 muestra una alineación de la región
5' no traducida de miembros de la familia CEACAM humana. Se
compararon las secuencias mostradas y se usaron para diseñar
cebadores degenerados como se describe en el Ejemplo 2. Se destacan
los nucleótidos que son lo mismo que el nucleótido correspondiente
en otros miembros de la familia CEACAM. Los guiones indican que se
añadieron espacios para facilitar la alineación de las secuencias.
El número de nucleótido de cada secuencia de cDNA, según se revela
en GenBank, aparece entre paréntesis.
La Figura 4 muestra la expresión de la proteína
de CEA de rhesus. Se transfirieron células HeLa con fagémidos
obtenidos por exploración de la biblioteca de
CEA-lambda y se desarrolló un WESTERN BLOT usando un
anticuerpo policlonal de conejo contra proteína de CEA humano. Se
muestra la expresión de 2 de entre 15 clones.
La Figura 5 muestra una representación
esquemática de la región codificadora de CEA de rhesus. Se indican
las repeticiones internas y se señalan los lugares de restricción
para la fragmentación génica y la secuencia.
La Figura 6 muestra una alineación de las
secuencias de nucleótidos CEACAM-5 humana (SEQ ID
NO:6) y de rhesus (SEQ ID NO:1). Los nucleótidos que son distintos
entre las dos secuencias CEACAM-5 se muestran
destaca-
dos.
dos.
La Figura 7 muestra una alineación de las
estructuras de lectura abierta CEACAM-5 humana (SEQ
ID NO:7) y de rhesus (SEQ ID NO:2). Los aminoácidos que son
distintos entre las dos secuencias CEACAM-5 se
muestran destacados.
La Figura 8 muestra la respuesta humoral contra
el CEA humano en ratones de CEA transgénico. Se ofrece el grado de
anticuerpo medio para dos grupos de ratones: uno inmunizado con CEA
de rhesus y uno inmunizado con CEA humano (Ejemplo 7).
La Figura 9 muestra la respuesta inmune mediada
por célula contra el CEA humano en ratones de CEA transgénico. Se
vacunaron ratones de CEA transgénico con vectores que expresan hCEA
o con vectores que expresan rhCEA (Ejemplo 9).
La Figura 10 muestra la respuesta inmune mediada
por célula contra péptidos de CEA humano en ratones de CEA
transgénico inmunizados con CEA humano o de rhesus.
El gen que codifica para el antígeno
carcinoembriónico (CEA) se asocia comúnmente con el desarrollo de
adenocarcinomas. La presente invención se relaciona con
composiciones y procedimientos para ELICIT o acrecentar la inmunidad
del producto proteínico expresado por el antígeno CEA asociado a
tumor, en el que la expresión aberrante de CEA se asocia con el
carcinoma o su desarrollo. La asociación de la expresión aberrante
de CEA con un carcinoma no requiere que la proteína de CEA se
exprese en tejido tumoral en todos los momentos de su desarrollo, ya
que la expresión anormal de CEA puede estar presente en el inicio
del tumor y no ser detectable después en la progresión del tumor o
vice-versa.
Hasta este momento, se proporcionan nucleótidos
que codifican para el antígeno carcinoembriogénico de mono rhesus
(rhCEA). Las moléculas de la presente invención se pueden usar en
una vacuna de adenovirus recombinante o una vacuna basada en
plásmido para proporcionar inmunoprofilaxis eficaz contra
adenocarcinomas a través de inmunidad mediada por células. Cuando
se introduce directamente en un vertebrado in vivo, los
polinucleótidos de la invención inducen la expresión de proteínas
codificadas en el animal, incluyendo mamíferos tales como primates,
perros y humanos.
La presente invención se relaciona con una
molécula de ácido nucleico aislada (polinucleótido) que comprende
una secuencia de nucleótidos que codifican para mRNA que expresa una
proteína rhCEA nueva según se expone en (SEQ ID NO:2) o (SEQ ID
NO:8). Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención
están sustancialmente libres de otros ácidos nucleicos.
Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la
presente invención pueden incluir una molécula de ácido
desoxirribonucleico (DNA), tal como DNA genómico y DNA
complementario (cDNA), que puede ser de cadena sencilla (cadena
codificadora o no codificadora) o doble, así como DNA sintético,
tal como un polinucleótido sintetizado de cadena sencilla. Las
moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención pueden
incluir también una molécula de ácido ribonucleico (RNA). Para la
mayoría de los objetos de clonación, el DNA es un ácido nucleico
preferido.
Una molécula preferida de la presente invención
comprende la secuencia de nucleótido revelada aquí como SEQ ID
NO:1, mostrada en la Figura 1A, que codifica para la proteína de CEA
de rhesus mostrada en la Figura 2A y expuesta como SEQ ID NO:2.
Una molécula preferida de la presente invención
comprende la secuencia de nucleótido revelada aquí como SEQ ID NO:5
(en adelante secuencia de DNA del "segundo rhCEA"), mostrada en
la Figura 1B, que codifica para la proteína de CEA de rhesus
mostrada en la Figura 2B y expuesta como SEQ ID NO:8. Estas
moléculas de ácido nucleico rhCEA se identificaron a través de
RT-PCR como se describe en detalle en el Ejemplo 2.
La secuencia de DNA del segundo rhCEA (SEQ ID NO:5) se diferencia
de la primera por dos nucleótidos y se clonó a partir de tejido del
colon de un mono rhesus distinto. Esta secuencia de DNA codifica
para una proteína de CEA de rhesus que se diferencia de la proteína
de CEA del primer rhesus por dos aminoácidos.
Los clones de cDNA aislados, vectores asociados,
células huésped, fracciones subcelulares recombinantes y membranas,
y las formas expresadas y maduras del rhCEA son útiles para el
desarrollo de una vacuna para el cáncer.
La presente invención también incluye fragmentos
o mutantes de SEQ ID NOs:1 ó 5 biológicamente activos, que
codifican para mRNA que expresa proteínas del rhCEA nuevas.
Cualquier fragmento y/o mutante biológicamente activo codificará
para una proteína o fragmento de proteína que imita al menos
sustancialmente las propiedades farmacológicas de la proteína del
rhCEA, incluyendo pero sin limitarse a la proteína del rhCEA según
se expone en SEQ ID NO:2 ó SEQ ID NO:8. Cualquiera de tales
polinucleótidos incluye aunque no se limita necesariamente a:
sustituciones de nucleótido, delecciones, adiciones, mutilaciones
amino-terminales y mutilaciones
carboxi-terminales. Las mutaciones de la presente
invención codifican para moléculas de mRNA que expresan una proteína
funcional del rhCEA en una célula eucariota para ser útil en el
desarrollo de la vacuna para el cáncer.
La invención también se relaciona con DNA
sintético que codifica para la proteína del rhCEA en la que la
secuencia del nucleótido del DNA sintético se diferencia
significativamente de la secuencia el nucleótido de SEQ ID NO:1 y
SEQ ID NO:5, pero sin embargo codifica para la proteína del rhCEA
según se expone en SEQ ID NO:2 ó SEQ ID NO:8. Tales DNAs sintéticos
están destinados a estar dentro del fin de esta invención.
Por tanto, la presente invención revela una
redundancia del codón que puede causar que numerosas moléculas de
DNA una proteína idéntica. Para objetos de esta descripción, una
secuencia que soporte uno o más codones sustituidos se definirá
como una variación degenerada. También están incluidas dentro del
fin de esta invención mutaciones en la secuencia de DNA o en la
proteína traducida que no alteran sustancialmente las propiedades
físicas fundamentales de la proteína expresada. Por ejemplo, la
sustitución de valina por leucina, arginina por lisina, o
asparagina por glutamina puede que no cause un cambio en la
funcionalidad del polipéptido.
Se sabe que las secuencias de DNA que codifican
para un péptido pueden alterarse para codificar para un péptido que
tenga propiedades que son distintas de aquellas del péptido que
aparece naturalmente. Los procedimientos para alterar las
secuencias de DNA incluyen aunque sin estar limitados a la
mutagénesis dirigida a lugar. Ejemplos de propiedades alteradas
incluyen aunque sin estar limitados a cambios en la afinidad de una
enzima por un sustrato o receptor por un ligando.
Están incluidas en la presente invención
secuencias de DNA que se hibridan con SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:5 bajo
condiciones rigurosas. A modo de ejemplo, y sin limitación, un
procedimiento que usa condiciones de alta rigurosidad es como
sigue:
Se llevó a cabo la prehibridación de filtros
conteniendo DNA durante 2 horas hasta toda la noche a 65ºC en
tampón compuesto por SSC 6x, solución de Denhardt 5x, y 100
\mug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado. Los filtros
se hibridan de 12 a 48 horas a 65ºC en mezcla de prehibridación que
contiene 100 \mug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado
y 5-20 x 10^{6} cpm de sonda marcada con ^{32}P.
El lavado de los filtros se hace a 37ºC durante 1 hora en una
solución que contiene SSC 2x, 0,1% de SDS. A éste le sigue un
lavado en SSC 0,1x, 0,1% de SDS a 50ºC durante 45 min. Antes de la
autorradiografía. Otros procedimientos que usan condiciones de alta
rigurosidad incluirían un paso de hibridación llevado a cabo en SSC
5x, solución de Denhardt 5x, formamida al 50% a 42ºC durante 12 a
48 horas o un paso de lavado llevado a cabo en SSPE 0,2x, SDS al
0,2% a 65ºC durante 30 a 60 minutos.
Los reactivos mencionados en los procedimientos
precedentes para llevar a cabo hibridación de alta rigurosidad se
conocen bien en la técnica. Se pueden encontrar detalles de la
composición de estos reactivos en, p.ej., Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989, que se incorpora
mediante referencia por este medio. Además de las precedentes, otras
condiciones de alta rigurosidad que pueden usarse se conocen bien
en la técnica.
\newpage
Un aspecto preferido de la presente invención es
una forma sustancialmente purificada de la proteína de CEA de mono
rhesus que comprende una secuencia de aminoácidos según se revela en
la Figura 2A (SEQ ID NO:2).
Otro aspecto preferido de la presente invención
es una forma sustancialmente purificada de la proteína de CEA de
mono rhesus que comprende una secuencia de aminoácidos según se
revela en la Figura 2B (SEQ ID NO:8).
La invención también se relaciona con varios
dominios funcionales del rhCEA y con moléculas híbridas que
comprenden al menos una de estas secuencias. La proteína de CEA
comprende un dominio amino-terminal con una
secuencia directora procesada y un dominio
carboxi-terminal hidrofóbico. El CEA también
comprende tres dominios internos a modo de Ig. Taheri et al.
(J. Biol. Chem. 275(35): 26935-26943
(2000)) mostraron que se requieren los subdominios del dominio
N-terminal para la función de adhesión intercelular
de CEA.
La presente invención también incluye fragmentos
o mutantes de una proteína del rhCEA biológicamente activos,
comprendiendo la secuencia de aminoácido según se expone en SEQ ID
NO:2 o SEQ ID NO:8, incluyendo pero sin estar necesariamente
limitados a sustituciones de aminoácidos, delecciones, adiciones,
mutilaciones amino terminales y mutilaciones carboxi terminales
tales que estas mutaciones proporcionan proteínas o fragmentos de
proteína de uso diagnóstico, terapéutico o profiláctico y serían
útiles para el desarrollo de una vacuna para el cáncer.
Las proteínas del rhCEA del mono rhesus de la
presente invención pueden estar en forma de proteína "madura"
o pueden ser una parte de una proteína mayor tal como una proteína
de fusión. A menudo es conveniente incluir una secuencia de
aminoácido adicional que contiene secuencias secretoras o
directoras, pro-secuencias, secuencias que ayudan
en la purificación tales como múltiples residuos de histidina, o una
secuencia adicional para la estabilidad durante la producción
recombinante.
La presente invención también se relaciona con
los constructos de fusión del rhCEA, incluyendo pero sin limitarse
a constructos de fusión que expresan una porción de la proteína de
CEA de rhesus ligada a varios marcadores, incluyendo pero sin estar
limitado en modo alguno a GFP (proteína verde fluorescente), el
epitopo MYC, GST, y Fc. Cualquiera de tales constructos de fusión
debe expresarse en la línea celular de interés y usarse para
explorar en busca de moduladores de la proteína de CEA de rhesus
revelada aquí. También se contemplan los constructos de fusión que
se construyen para acrecentar la respuesta inmune al CEA de rhesus,
incluyendo pero sin estar limitados a: DOM y hsp70.
La presente invención se relaciona
adicionalmente con vectores recombinantes que comprenden las
moléculas de ácido nucleico sustancialmente purificadas reveladas a
través de esta descripción. Estos vectores pueden estar compuestos
de DNA o RNA. Para la mayoría de los objetos de clonación, se
prefieren vectores de DNA. Vectores típicos incluyen plásmidos,
virus modificados, bacteriófagos, cósmicos, cromosomas artificiales
de levadura, y otras formas de DNA episomal o integrado que puede
codificar para una proteína del rhCEA. Es bueno el determinar
dentro del alcance del artesano experimentado un vector apropiado
para la transferencia de un gen particular u otro
uso.
uso.
Se puede usar un vector de expresión conteniendo
DNA que codifica para una proteína del rhCEA para la expresión del
rhCEA en una célula huésped recombinante. Los vectores de expresión
pueden incluir, pero sin limitarse a, vectores de clonación,
vectores de clonación modificados, plásmidos diseñados
específicamente o virus. Además, se puede usar una variedad de
vectores de expresión bacterianos para expresar rhCEA recombinante
en células bacterianas si se desea. Además, se puede usar una
variedad de vectores de expresión de células fúngicas para expresar
rhCEA recombinante en células fúngicas. Adicionalmente, se puede
usar una variedad de vectores de expresión de células e insectos
para expresar proteína recombinante en células de insectos.
La presente invención también se relaciona con
células huésped transformadas o transfectadas con vectores que
comprenden las moléculas de ácido nucleico de la presente invención.
Las células huésped recombinantes pueden ser procariotas o
eucariotas, incluyendo pero sin limitarse a, bacterias tales como
E. coli, células fúngicas tales como levadura, células de
mamífero incluyendo pero sin limitarse a, líneas celulares de origen
bovino, porcino, de mono o de roedor; y células de insectos
incluyendo pero sin limitarse a, líneas celulares derivadas de
Drosophila y del gusano de seda. Se pueden cultivar tales
células huésped recombinantes bajo condiciones adecuadas para
producir rhCEA o una forma equivalente biológicamente.
Como se apuntaba anteriormente, se puede usar un
vector de expresión conteniendo DNA que codifica para una proteína
del rhCEA para la expresión del rhCEA en una célula huésped
recombinante. Por tanto, otro aspecto de esta invención es un
proceso para expresar una proteína de CEA de mono rhesus en una
célula huésped recombinante, que comprende: (a) introducir un
vector que comprende un ácido nucleico según se expone en SEQ ID
NO:1 o SEQ ID NO:5 dentro de una célula huésped adecuada; y, (b)
cultivar la célula huésped bajo condiciones que permitan la
expresión de la mencionada proteína de CEA de mono rhesus.
Siguiendo a la expresión del rhCEA en una célula
huésped, debe recuperarse la proteína del rhCEA para proporcionar
proteína del rhCEA en forma activa. Varios procedimientos de
purificación de proteína del rhCEA están disponibles y son
adecuados para uso. La proteína del rhCEA recombinante debe
purificarse a partir de lisatos y extractos celulares por varias
combinaciones de, o aplicación individual de fraccionamiento de
sales, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de
exclusión por tamaños, cromatografía de adsorción de hidroxilapatito
y cromatografía de interacción hidrofóbica. Además, se puede
separar la proteína del rhCEA recombinante de otras proteínas
celulares mediante el uso de una columna de inmunoafinidad hecha con
anticuerpos monoclonales o policlonales específicos para proteína
del rhCEA de longitud completa, o fragmentos polipeptídicos de
proteína del rhCEA.
Los ácidos nucleicos de la presente invención se
pueden ensamblar en un casete de expresión que comprende secuencias
diseñadas para proporcionar expresión eficaz de la proteína en una
célula humana. El casete contiene preferiblemente el gen del rhCEA
de longitud completa, con secuencias relacionadas de control
transcriptor y de traducciones ligadas operativamente a él, tales
como un promotor y secuencias de terminación. En una forma de
realización preferida, el promotor es el promotor citomegalovirus
sin la secuencia del intrón A (CMV), aunque aquellos experimentados
en la técnica reconocerán que se pueden usar cualquiera de entre una
cantidad de otros promotores conocidos tales como la
inmunoglobulina fuerte, u otros promotores génicos eucariotas. Un
terminador transcriptor preferido es el terminador de la hormona de
crecimiento bovino, aunque también se pueden usar otros
terminadores transcriptores conocidos. Se prefiere particularmente
la combinación de CMV-terminador BGH.
De acuerdo con esta invención, el casete de
expresión del rhCEA de rhesus se inserta en un vector. El vector
preferiblemente es un vector adenoviral, aunque también se pueden
usar DNA lineal ligado a un promotor, u otros vectores, tales como
virus adeno-asociados o un vector de virus vaccinia
modificado, retroviral o lentiviral. Si el vector elegido es un
adenovirus se prefiere que el vector sea un vector adenoviral de los
llamados de primera generación. Estos vectores adenovirales se
caracterizan por tener una región génica E1 no funcional, y
preferiblemente una región génica adenoviral E1 suprimida. En
algunas formas de realización, el casete de expresión se inserta en
la posición en la que el gen adenoviral E1 se localiza normalmente.
Además, estos vectores opcionalmente tienen una región E3 no
funcional o suprimida. Se prefiere que el genoma del adenovirus
usado esté suprimido de ambas regiones E1 y E3
(\DeltaE1\DeltaE3). Los adenovirus pueden multiplicarse en
líneas celulares conocidas que expresen el gen viral E1, tales como
células 293, o células PERC.6, o en líneas celulares derivadas de
células 293 o PERC.6 que se transforman transitoriamente o
establemente para expresar una proteína extra. Por ejemplo, cuando
se usan constructos que tienen una expresión génica controlada,
tales como un sistema de promotor regulable de tetraciclina, la
línea celular puede expresar componentes involucrados en el sistema
regulador. Un ejemplo de una línea celular como tal es
T-Rex-293; se conocen otras en la
técnica.
Por conveniencia al manipular el vector
adenoviral, el adenovirus debe estar en una forma de plásmido
lanzadera. Esta invención también está dirigida a un vector de
plásmido lanzadera que comprende una porción de plásmido y una
porción de adenovirus, comprendiendo la porción del adenovirus un
genoma adenoviral que tiene una E1 suprimida y una supresión
opcional de la E3, y tiene casete de expresión insertado que
comprende CEA de rhesus. En formas de realización preferidas, hay
un lugar de restricción que flanquea a la porción adenoviral del
plásmido para que el vector adenoviral se pueda retirar fácilmente.
El plásmido lanzadera puede replicarse en células procariotas o en
células eucariotas.
En una forma de realización preferida de la
invención, el casete de expresión se inserta en el plásmido del
adenovirus pMRKAd5-HV0 (Ver Emini et
al., WO 02/22080, que se incorpora mediante referencia por este
medio). Este plásmido comprende un genoma adenoviral Ad5 suprimido
de las regiones E1 y E3. Se mejoró el diseño del plásmido
pMRKAd5-HV0 respecto a anteriores adenovectores
extendiendo la región empaquetadora de acción 5'cis más lejos en el
gen E1 para incorporar elementos que se han encontrado que son
importantes para optimizar el empaquetamiento viral, resultando en
amplificación del virus realzada. Convenientemente, este vector
adenoviral realzado es capaz de mantener estabilidad genética
siguiente a la propagación de paso elevado.
Las técnicas estándar de biología molecular para
preparar y purificar constructos de DNA capacitan la preparación de
los adenovirus, plásmidos lanzadera, e inmunógenos de DNA de esta
invención.
Los vectores escritos anteriormente se pueden
usar en composiciones inmunogénicas y vacunas para prevenir el
desarrollo de adenocarcinomas asociados a expresión aberrante de CEA
y/o para tratar cánceres existentes. Hasta este momento, un aspecto
de la invención actual es un procedimiento para prevenir o tratar el
cáncer que comprende el administrar a un mamífero un vector de
vacuna que comprende una molécula de ácido nucleico aislada,
comprendiendo la molécula de ácido nucleico aislada una secuencia de
nucleótidos que codifica para una proteína de CEA de mono rhesus
según se expone en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:8.
De acuerdo con el procedimiento descrito
anteriormente, el vector de vacuna se puede administrar para el
tratamiento o prevención del cáncer en cualquier mamífero. En una
forma de realización preferida de la invención, el mamífero es un
humano.
Además, alguien experimentado en la técnica
puede elegir cualquier tipo de vector para uso en el procedimiento
de tratamiento y prevención descrito. En una forma de realización
preferida de la invención, el vector es un vector adenoviral que
comprende un genoma adenoviral con una delección en la región E1 del
adenovirus, y una inserción en la región E1 del adenovirus, en la
que la inserción comprende un casete de expresión que comprende:
(a) un polinucleótido
que codifica para una proteína de CEA de mono rhesus; y (b) un promotor ligado operativamente al polinucleótido.
que codifica para una proteína de CEA de mono rhesus; y (b) un promotor ligado operativamente al polinucleótido.
La invención presente se relaciona además con un
vector de vacuna de adenovirus que comprende un genoma adenoviral
con una delección en la región E1, y una inserción en la región E1
del adenovirus, en la que la inserción comprende un casete de
expresión que comprende: (a) un polinucleótido que codifica para una
proteína de CEA de mono rhesus; y (b) un promotor ligado
operativamente al polinucleótido.
En una forma de realización preferida de este
aspecto de la invención, el vector de adenovirus es un vector
Ad5.
En otra forma de realización preferida de la
invención, el vector el vector de adenovirus es un vector Ad6.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un plásmido vacuna que comprende una porción de plásmido y una
porción de casete de expresión, comprendiendo la porción de casete
de expresión: (a) un polinucleótido que codifica para una proteína
de CEA de mono rhesus; y (b) un promotor ligado operativamente al
polinucleótido.
En algunas formas de realización de la presente
invención, las vacunas de adenovirus recombinantes reveladas aquí
se usan en varias combinaciones cebar/estimular con una vacuna de
polinucleótido basada en plásmido para inducir una respuesta inmune
realzada. En este caso, los dos vectores se administran en un
régimen "cebar y estimular". Por ejemplo, se administra el
primer tipo de vector, después de una cantidad de tiempo
predeterminado, por ejemplo, 1 mes, 2 meses, 6 meses, u otro
intervalo apropiado, se administra un segundo tipo de vector. Los
vectores llevan preferiblemente casetes de expresión que codifican
para el mismo polinucleótido o combinación de polinucleótidos. En
la forma de realización en que también se usa un DNA de plásmido, se
prefiere que el vector contenga uno o más promotores reconocidos
por células de mamíferos o de insectos. En una forma de realización
preferida, el plásmido contendría un promotor fuerte tal como, pero
sin limitarse a, el promotor CMV. El gen de CEA de rhesus u otros
genes que se vayan a expresar estarían ligados a tal promotor. Un
ejemplo de tal plásmido sería el plásmido de expresión de mamíferos
V1Jns según está descrito (J. Shiver et al., in DNA
Vaccines, M.Liu et al. eds., N.Y. Acad. Sci., N.Y.
772:198-208 (1996), que se incorpora mediante
referencia por este medio).
Como se apuntaba anteriormente, una vacuna de
vector adenoviral y una vacuna de plásmido pueden administrarse a
un vertebrado como parte de un régimen terapéutico sencillo para
inducir una respuesta inmune. Hasta este momento, la presente
invención se relaciona con un procedimiento para proteger a un
mamífero del cáncer, que comprende: (a) introducir en el mamífero
un primer vector que comprende: i) un polinucleótido que codifica
para una proteína de CEA de mono rhesus; y ii) un promotor ligado
operativamente al polinucleótido; (b) permitir que pase una
cantidad predeterminada de tiempo; y (c) introducir en el mamífero
un segundo vector que comprende: i) un polinucleótido que codifica
para una proteína de CEA de mono rhesus; y ii) un promotor ligado
operativamente al polinucleótido.
En una forma de realización del procedimiento de
protección descrito anteriormente, el primer vector es un plásmido
y el segundo vector es un vector de adenovirus. En una forma de
realización alternativa, el primer vector es un vector de
adenovirus y el segundo vector es un plásmido.
La invención actual se relaciona además con un
procedimiento para tratar a un mamífero que sufra de un
adenocarcinoma, que comprende: (a) introducir en el mamífero un
primer vector que comprende: i) un polinucleótido que codifica para
una proteína de CEA de mono rhesus; y ii) un promotor ligado
operativamente al polinucleótido; (b) permitir que pase una
cantidad predeterminada de tiempo; y (c) introducir en el mamífero
un segundo vector que comprende: i) un polinucleótido que codifica
para una proteína de CEA de mono rhesus; y ii) un promotor ligado
operativamente al polinucleótido.
En una forma de realización del procedimiento de
tratamiento descrito anteriormente, el primer vector es un plásmido
y el segundo vector es un vector de adenovirus. En una forma de
realización alternativa, el primer vector es un vector de
adenovirus y el segundo vector es un plásmido.
La cantidad de DNA expresable o de RNA
transcrito que se introducirá en un receptor de la vacuna dependerá
parcialmente de la fuerza de los promotores usados y de la
inmunogenicidad del producto génico expresado. En general, una
dosis inmunológicamente o profilácticamente eficaz de alrededor de 1
ng hasta 100 mg, y preferiblemente entre 10 \mug y 300 \mug de
un vector de vacuna de plásmido se administra directamente en el
tejido muscular. Una dosis eficaz para adenovirus recombinante es
de aproximadamente 10^{6}-10^{12} partículas y
preferiblemente entre 10^{7}-10^{11}
partículas. También se contemplan la inyección subcutánea,
introducción intradermal, impresión a través de la piel, y otros
modos de administración tal como distribución intraperitoneal,
intravenosa o inhalación. También se contempla que puedan
proporcionarse vacunaciones de refuerzo. También es conveniente la
administración parenteral, tal como la intravenosa, intramuscular,
subcutánea u otros medios de administración con adyuvantes tales
como proteína interleukina 12, simultáneamente o subsiguientemente a
la introducción parenteral de la vacuna de esta invención.
Los vectores de vacuna de esta invención deben
ser desnudos, es decir, no asociados con proteínas, adyuvantes u
otros agentes que afecten al sistema inmune del receptor. En este
caso, es deseable que los vectores de la vacuna estén en una
solución fisiológicamente aceptable, tal como, pero sin limitarse a,
salina estéril o salina estéril tamponada. Alternativamente, puede
ser conveniente administrar un inmunoestimulante, tal como un
adyuvante, citosina, proteína, u otro vehículo con las vacunas o
composiciones inmunogénicas de la presente invención. Por tanto,
esta invención incluye el uso tales inmunoestimulantes en conjunción
con las composiciones y procedimientos de la presente invención. Un
inmunoestimulante, tal como se usa aquí, se refiere esencialmente a
cualquier sustancia que realce o potencie una respuesta inmune
(mediada por anticuerpo y/o célula) a un antígeno exógeno. Dichos
inmunoestimulantes pueden administrarse en forma de DNA o de
proteína. Cualquiera de entre una variedad de inmunoestimulantes se
puede emplear en conjunción con las vacunas y composiciones
inmunogénicas de la presente invención, incluyendo, pero sin
limitarse a: GM-CSF, IFN\alpha, toxoide de
tétanos, IL12, B7.1, LFA-3 y ICAM-1.
Dichos inmunoestimulantes se conocen bien en la técnica. También se
pueden usar agentes que ayudan en la entrada celular de DNA, tales
como, pero sin limitarse al ion calcio. Estos agentes son
referidos generalmente como reactivos facilitadores de la
transfección y vehículos farmacéuticamente aceptables. Aquellos
experimentados en la técnica podrán determinar el vehículo
inmunoestimulante o farmacéuticamente aceptable particular así como
el tiempo apropiado y modo de administración.
Se puede usar cualquiera entre una variedad de
procedimientos para clonar rhCEA. Estos procedimientos incluyen,
pero sin limitarse a, (1) una técnica de clonación RACE PCR (Forman
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:
8998-9002 (1988)). Puede desarrollarse el RACE en 5'
y/o en 3' para generar una secuencia de cDNA de longitud completa.
Esta estrategia requiere usar cebadores de oligonucleótido
específicos de gen para la amplificación PCR del cDNA del rhCEA.
Estos cebadores específicos de gen se diseñan a través de la
identificación de una secuencia de nucleótido con marca de
secuencia expresada (EST) que se ha identificado buscando en una
cantidad de bases de datos de ácidos nucleicos y proteínas
disponibles públicamente; (2) expresión funcional directa del cDNA
del rhCEA siguiente a la construcción de una biblioteca de cDNA que
contiene rhCEA en un sistema de vector de expresión apropiado; (3)
explorar una biblioteca de cDNA que contiene rhCEA construida en un
vector de bacteriófago o lanzadera de plásmido con una sonda de
oligonucleótido degenerado marcada diseñada a partir de la
secuencia del aminoácido de la proteína del rhCEA; (4) explorar una
biblioteca de cDNA que contiene rhCEA construida en un vector de
bacteriófago o lanzadera de plásmido con un cDNA parcial que
codifica para la proteína del rhCEA. Este cDNA parcial se obtiene
mediante la amplificación PCR específica de fragmentos de cDNA del
rhCEA a través del diseño de cebadores de oligonucleótido degenerado
a partir de la secuencia de aminoácido conocida para otras
proteínas de membrana que están relacionadas con la proteína del
rhCEA; (5) explorar una biblioteca de cDNA que contiene rhCEA
construida en un vector de bacteriófago o lanzadera de plásmido con
un cDNA parcial u oligonucleótido con homología respecto a una
proteína del rhCEA de mamíferos. Esta estrategia también puede
requerir el uso de cebadores de oligonucleótido específicos de gen
para la amplificación PCR de cDNA del rhCEA identificado como un
EST según se describe anteriormente; ó (6) diseñar oligonucleótidos
específicos de gen 5' y 3' usando SEQ ID NO:1 como modelo para que
el cDNA de longitud completa se pueda generar mediante técnicas
RACE conocidas, o se puede generar una porción de la región
codificadora mediante estas mismas técnicas RACE conocidas para
generar y aislar una porción de la región codificadora para usar
como una sonda para explorar uno de los numerosos tipos de cDNA y/o
bibliotecas genómicas para aislar una versión de longitud completa
de la secuencia de nucleótido que codifica para el rhCEA.
Es fácilmente aparente para aquellos
experimentados en la técnica que otros tipos de bibliotecas, así
como bibliotecas construidas a partir de otros tipos de células o
tipos de especies, pueden ser útiles para asilar un DNA que
codifica para rhCEA o un homólogo del rhCEA. Otros tipos de
bibliotecas incluyen, pero sin limitarse a, bibliotecas de DNA
derivadas de otras células. La selección de células o líneas
celulares para uso en la preparación de una biblioteca de cDNA para
aislar un cDNA que codifica para rhCEA puede hacerse midiendo
primero la actividad de rhCEA asociado a célula usando cualquier
ensayo conocido disponible para tal objeto.
La preparación de bibliotecas de cDNA se puede
desarrollar mediante técnicas estándar bien conocidas en la
técnica. Se pueden encontrar técnicas de construcción de bibliotecas
de cDNA bien conocidas por ejemplo, en Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989. También se pueden
obtener bibliotecas de DNA complementarias de numerosas fuentes
comerciales, incluyendo pero sin limitarse a Clontech Laboratorios,
Inc. (Palo Alto, CA) y Stratagene (La Jolla, CA).
Las moléculas de DNA, moléculas de RNA, y la
proteína recombinante de la presente invención se pueden usar para
explorar y medir niveles de rhCEA. Las proteínas recombinantes,
moléculas de DNA y moléculas de RNA se prestan a la formulación de
kits adecuados para la detección y tipificación del rhCEA. Tal kit
comprendería un vehículo compartimentado adecuado para mantener en
estrecho confinamiento al menos un contenedor. El vehículo
comprendería además reactivos tales como rhCEA o anticuerpos
anti-rhCEA adecuados para detectar rhCEA. El
vehículo también puede contener un medio para detección tal como
antígeno marcado o sustratos de enzima o similares.
Habiendo descrito formas de realización
preferidas de la invención con referencia a los esquemas
acompañantes, debe entenderse que la invención no se limita a
aquellas precisas formas de realización, y que pueden realizarse
varios cambios y modificaciones en ella por alguien experimentado en
la técnica sin salirse del fin o espíritu de la invención según se
define en las reivindicaciones adjuntas.
Se desarrollaron procedimientos moleculares
siguiendo procedimientos estándar bien conocidos en la técnica
(Ver, p. ej., Ausubel et al. Short Protocols in Molecular
Biology, F.M., -2^{nd}. ed., John Wiley & Sons, (1992) and
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, -2^{nd}. Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1989), que se incorporan mediante referencia por este medio).
Para obtener RNA para el aislamiento de cDNA de
CEA de rhesus, se usaron muestras de colon de dos monos rhesus
(Macaca mulatta) distintos. Se obtuvieron tejidos congelados
del Centro de Investigación Biomédica del Primate (BPRC, Rijswijk,
Holanda). Para extraer el RNA total de las muestras de colon, se
pulverizaron mecánicamente los tejidos y se combinaron con el
reactivo de RNA Ultraspec (Biotecx Laboratorios; Houston, TX) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se comprobó la
integridad del RNA purificado mediante gel de agarosa
desnaturalizante de formaldehído. Se hicieron alícuotas de las
muestras y se almacenaron a -80ºC.
Se alinearon secuencias de nucleótidos de las
regiones no traducidas 5' y 3' (UTR) de todos los miembros conocidos
de la familia de CEA humano para identificar regiones de DNA de CEA
altamente conservadas (ver Figura 3). Basadas en las homologías de
la familia génica de CEA identificadas, se diseñaron cebadores de
oligonucleótido degenerados y se optimizaron las condiciones de PCR
para amplificar el cDNA de CEA de rhesus mediante la reacción de
cadena de la polimerasa transcriptasa inversa
(RT-PCR), descrita a continuación. Los cebadores
usados para amplificar todo el cDNA fueron como sigue:
5'-RhCEA EcoRI 5'- C C G A A T T C C G G A C A S A G
C A G R C A G C A G R S A C C -3' (SEQ ID NO:3) y
CEA-8 RhXhoI 5'- C C G C T C G A G C G G C T G C T A
C A T C A G A G C A A C C C C A A C C -3' (SEQ ID NO:4). La
amplificación se desarrolló con el SuperScript
One-Step RT-PCR con el Platinum Taq
kit (Invitrogen; Carlsbad, CA). Se usó un volumen de reacción de 100
\mul que estaba constituido por 1 \mug de RNA, 200 pmoles de
ambos cebadores, y DMSO al 10% (concentración final).
Para desarrollar el paso de transcriptasa
inversa, se incubaron muestras de RNA total aisladas de cada uno de
los dos monos rhesus a 45ºC durante 30 min, siguiendo una incubación
de 2 min a 94ºC. La amplificación por PCR de los modelos
resultantes estuvo constituida por 40 ciclos de 94ºC durante 15 seg,
52ºC durante 30 seg y 68ºC durante 2 min y 20 seg.
Los productos amplificados por PCR de
aproximadamente 2100 bp, el tamaño esperado para un homólogo de
CEACAM-5, se obtuvieron independientemente de ambas
muestras de RNA y se purificaron a partir de gel de azarosa. El
análisis de secuencia parcial de ambos productos del PCR reveló alta
homología con el CEACAM-5 humano.
Debido a la alta homología de las repeticiones
internas, toda la secuencia génica se obtuvo purificando fragmentos
de DNA usando los lugares de restricción indicados en la Figura 5.
Las secuencias de nucleótido de CEA de rhesus obtenidas de cada
mono se revelan aquí en la Figura 1, según se expone en SEQ ID NO:1
(en adelante rhCEACAM-5) y SEQ ID NO:5 (en adelante
rhCEACAM-5 #2). El Análisis de secuencias de
nucleótido de CEA reveló una estructura de lectura abierta (ORF) de
2118 nucleótidos, que codifica para un polipéptido de 705
aminoácidos. La comparación de las secuencias de nucleótido de
rhCEA obtenidas de los dos monos rhesus indicó que había dos
diferencias en los nucleótidos (ver Figuras 1A y 1B), que codifican
para dos proteínas distintas (ver Figuras 2A y 2B).
La secuencia de nucleótido de
CEACAM-5 (SEQ ID NO:1) también se comparó con la
secuencia de CEACAM-5 humano publicado (SEQ ID
NO:6), que reveló un 88% de homología al nivel de nucleótido (ver
Figura 6). Una comparación similar de la secuencias de polipéptido
de CEA (SEQ ID NO:2) de rhesus y del (SEQ ID NO:7) humano mostraron
una identidad del 78,9% al nivel de aminoácido (ver Figura 7).
Interesantemente, una inserción de tres aminoácidos está presente
en el extremo carboxil de CEA de rhesus comparado con el CEA humano,
requiriendo probablemente la señal para la modificación del
glicosilfosfatidilinositol (GPI).
Productos amplificados del rhCEA obtenidos
mediante RT-PCR (ver Ejemplo 2) se digirieron con
EcoRI/XhoI y se ligaron en el vector lambda
ZAP-CMV XR (Stratagene; La Jolla, CA), de acuerdo
con las directrices del fabricante. Los productos de ligado se
incubaron con extracto dorado de empaquetamiento Gigapack III y los
fagos resultantes se usaron para infectar células
XL-1 Blue MRF. Esta biblioteca primaria específica
de CEA se amplificó después, obteniendo una graduación de
\sim1x10^{6} placas por unidad/ml. Se desarrolló la exploración
de 5x10^{3} placas levantando sobre filtros de nailon. Los
filtros se hibridaron con dos sondas de DNA distintas que cubrían
los extremos 5' y 3' de la molécula de CEA. Se escindieron placas
positivas dobles en células XL-1 Blue MRF y los
fagos filamentosos derivados se amplificaron en células
XL-OLR. Entonces se cultivaron los fagémidos y se
analizaron mediante digestión de restric-
ción. Los análisis de secuencia y comparaciones Genbank revelaron la alta homología con el CEACAM-5 humano.
ción. Los análisis de secuencia y comparaciones Genbank revelaron la alta homología con el CEACAM-5 humano.
Se escindió rhCEA con PstI/XhoI
del vector fagémido pCMV-script EX y se insertó en
vector pBluescript II KS, obteniendo pBS-RhCEA. La
inserción se secuenció totalmente y después se subclonó como
fragmento SmaI/XhoI en vector pVIJnsA, obteniendo
pVIJ-RhCEA. El plásmido lanzadera
pMRK-RhCEA para generación de adenovirus se obtuvo
subclonando el mismo fragmento en el vector poliMRK. Se recombinaron
un fragmento PacI/StuI del pMRK-RhCEA
que contiene el casete de expresión para RhCEA y las regiones Ad5
que flanquean a E1 con pAd5 ó pAd6 linealizado con ClaI en
células BJ5183 de E. coli. Los plásmidos resultantes fueron
pAd5-RhCEA y pAd6-RhCEA. Ambos
plásmidos se cortaron con PacI para liberar los ITRs de
adenovirus y se transfirieron a células PerC-6.
La amplificación viral se llevó a cabo a través
de pases en serie. Ad5-RhCEA y
Ad6-RhCEA se purificaron usando un protocolo de
purificación estándar de CsCl y se dializaron ampliamente contra
tampón A105 (Tris 5 mM pH 8,0, MgCl_{2} 1 mM, NaCl 75 mM, sucrosa
al 5%, Tween 20 al 0,005%).
Se comprobó la expresión de RhCEA por los
vectores generados mediante WESTERN BLOT y análisis FACS. Se
transfirieron plásmidos en células HeLa o PerC.6 con Lipofectamina
2000 (Life Technologies;Carlsbad, CA). Se desarrollaron infecciones
de adenovirus en medio libre de suero durante 30 min a 37ºC, después
se añadió medio fresco. Después de 48 horas de incubación, se
analizaron lisatos de células completas mediante WESTERN BLOT usando
suero policlonal de conejo contra CEA humano (Fitzgerald, dilución
1:1500). Todos los clones de CEA de rhesus selec-
cionados expresaron una proteína de 180-200 kDa cuando fueron transfectados en células HeLa (ver Figura 4).
cionados expresaron una proteína de 180-200 kDa cuando fueron transfectados en células HeLa (ver Figura 4).
Para el análisis FACS, se separaron las células
con tripsina y se resuspendieron en tampón FACS (PBS, FCS al 1%).
Después de incubar durante 30 min con anticuerpo policlonal de
conejo anti-CEA diluido 1:250, se lavaron las
células y se incubaron durante 30 min con una IgG-PE
anti-conejo y finalmente se analizaron con un
FACScalibur (Bevton Dickinson, San José, CA).
Para analizar la respuesta inmune mediada por
célula contra el CEA de rhesus en animales inmunizados, se diseñaron
15 mer péptidos solapados por 11 aminoácidos para cubrir toda la
proteína. Se adquirieron péptidos liofilizados de CEA de rhesus en
Bio-Synthesis, Inc. (Lewisville, TX) y se
resuspendieron en DMSO a 40 mg/ml. Se agruparon péptidos en 4
grupos: grupo A (de RhCEA-1 a
RhCEA-34, 34 péptidos); grupo B (de
RhCEA-35 a RhCEA-79, 45 péptidos);
grupo C (de RhCEA-80 a RhCEA-124, 48
péptidos); y grupo D (de RhCEA-125 a
RhCEA-173, 53 péptidos). Las concentraciones
finales fueron las siguientes: grupo A=1,176 mg/ml; B=0,888 mg/ml;
grupo C=0,851 mg/ml; grupo D=0,769 mg/ml. Los péptidos y grupos se
almacenaron a -80ºC.
Los ratones CEA.Tg son ratones que expresan CEA
humano como un antígeno propio con una distribución tisular similar
a la de humanos. Como se ha demostrado ampliamente en la literatura
científica, estos ratones no responden al CEA, como se muestra por
la falta de anticuerpos de suero específicos de CEA detectables y
por la incapacidad para preparar una respuesta esplénica in
vitro de células T al CEA. Muchos informes han mostrado que la
inmunización de DNA con genes xenogénicos que codifican para
antígenos homólogos protege a los ratones contra el desafío del
tumor con células singénicas de melanoma. Para demostrar la
capacidad de vacunación del DNA xenogénico para obtener una
respuesta inmune contra un antígeno propio en este modelo,
inmunizamos ratones CEA.Tg con vectores que codificaban para CEA de
rhesus (xeno).
Se adquirieron ratones C57BL/6
(H-2^{b}) a partir de Charles River (Lecho,
Italia). Los ratones CEA.Tg (H-2^{b}) fueron
proporcionados por HL Kaufman (Albert Einstein Collage of Medicine,
New York) y se mantuvieron en condiciones estándar.
Para la transferencia electrogénica (EGT) se
expusieron quirúrgicamente cuadriceps de ratones o se les inyectó
directamente 50 \mug de pVIJ-RhCEA y se les
estimuló eléctricamente como se había descrito previamente (Rizzuto
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96(11):
6417-22 (1999)). Para la inyección de adenovirus, se
inyectaron 1x10^{10} vp de Ad5-RhCEA en
cuadriceps de ratones.
Se inyectó a los ratones en el músculo del
cuadriceps 50 \mug de pVIJ-RhCEA y se les
electroestimuló inmediatamente después de la inyección una vez a la
semana durante 4 semanas. Se usaron ratones C57BL/6 como controles.
Se detectaron anticuerpos anti CEA de rhesus en sueros de estos
ratones mediante WESTERN BLOT, demostrando una respuesta inmune
humoral. Se usó un anticuerpo monoclonal de ratón contra hCEA como
control positivo, mientras se usaron sueros
pre-inmunes y extractos de células falsamente
infectados como controles negativos (no se muestran los datos).
Pretendidamente, sólo se podrían medir anticuerpos de reacción
cruzada contra proteína de CEA humano en grupos inmunizados de CEA
de rhesus (Figura 8) con una graduación media de 1:110. Estos datos
indican que, en el modelo de ratón transgénico, es posible romper la
tolerancia con vacunación de DNA xenogénico (medida como
autoanticuerpos anti-CEA).
Se obtuvieron sueros para la graduación de
anticuerpo mediante extracción de sangre
retro-orbital. Para la detección WESTERN BLOT, se
dejaron fluir extractos de células HeLa transducidos con
Ad5-rhCEA en geles SDS-page y se
transfirieron sobre filtros de nitrocelulosa. Los sueros se
reunieron y se diluyeron 1:50 para incubación en O/N a 4ºC. Se usó
un conjunto de IgG-AP anti-ratón
(Sigma, 1:2500) para la detección. Para la graduación, se
revistieron portaobjetos ELISA (Nunc maxisorp) con 100 ng/pocillo de
CEA (CEA altamente puro; Fitzgerald Industries International Inc.,
Concord MA), se diluyeron en tampón de revestimiento (NaHCO_{3} 50
mM, pH 9,4) y se incubaron en O/N a 4ºC. Entonces se bloquearon los
portaobjetos con PBS que contenía BSA al 5% durante 1 hora a 37ºC.
Los sueros de ratón se diluyeron en PBS con BSA al 5% (dilución 1/50
para evaluar la tasa de seroconversión; diluciones desde 1:10 hasta
1:31,25 para evaluar el valor de graduación). Se usaron sueros
pre-inmunes como fondo. Los sueros diluidos se
incubaron en O/N a 4ªc. Se llevaron a cabo lavados con PBS, BSA al
1%, Tween 20 al 0,05%. Se diluyó anticuerpo detector (Peroxidasa IgG
de cabra anti-ratón, Sigma, San Luis, MO) 1/2000 en
PBS, con BSA al 5%, y se incubó durante 2-3 horas a
temperatura ambiente en un agitador. Después de lavar, se cargaron
los portaobjetos con 100 \mul/pocillo de sustrato TMB (Pierce
Biotechnology, Inc., Rockford,IL). Las reacciones se detuvieron con
25 \mul/pocillo de solución de H_{2}SO_{4} 1M y los
portaobjetos se leyeron a 450 nm/620 nm. Se calcularon las
graduaciones de los sueros anti-CEA como la dilución
limitante de suero que produce una absorbancia al menos 3 veces
mayor que la absorbancia del suero pre-inmune
autólogo a la misma dilución.
Se revistieron portaobjetos MAIP de 96 pocillos
(Millipore, Bedford, MA) con IFN-\gamma de rata
anti-ratón purificados (IgG1, clon
R4-6ª2, Pharmingen, San Diego, CA) a 2,5 \mug/ml
en PBS estéril, dividido en alícuotas de 100 \mul por pocillo.
Después de lavar con PBS estéril, se bloquearon los portaobjetos con
200 \mul por pocillo de medio R10 a 37ºC durante al menos 2
horas.
Para la preparación de esplenocitos, se retiró
el bazo de un ratón sacrificado de una forma estéril y se disgregó
raspando a través de una rejilla. Se obtuvo lisis osmótica de los
glóbulos rojos añadiendo 1 ml de PBS 0,1X al peleteado celular y
agitando en vórtex durante no más de 15 seg. Después se añadió 1 ml
de PBS 2X y se elevó el volumen hasta 4 ml con PBS 1X. Después de
centrifugar a 1200 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente,
se resuspendió el peleteado celular en 1 ml de medio R10 y se
contaron las células viables. Se depositaron los esplenocitos en
portaobjetos a razón de 5x10^{5} y 2x10^{5}/pocillo con 1
\mug/ml de cada péptido en R10 y se incubaron durante 20 h en un
incubador de CO_{2} a 37ºC. Se usó concanavalina A (ConA) a 5
\mug/ml como un control interno positivo para cada ratón. Después
de lavar con PBS, Tween 20 al 0,05%, los portaobjetos se incubaron
en O/N a 4ºC con 50 \mul/pocillo de con
IFN-\gamma de rata anti-ratón
conjugado con biotina (IgG1 de rata, clon XMG 1.2, Pharmingen, San
José, CA) diluido 1:250 en tampón de ensayo (PBS con FBS al 5%,
Tween 20 al 0,005%).
Al día siguiente, se lavaron e incubaron los
portaobjetos durante 2 h a temperatura ambiente con conjugado
AP-Estreptavidina (Pharmingen) diluido 1:2500 en
tampón de ensayo. Después de lavar ampliamente, los portaobjetos se
cargaron mediante adición de 50 \mul/pocillo de
NBT/B-CIP (Pierce Biotechnology) hasta que se
observase el desarrollo de manchas bajo el microscopio. La reacción
se detuvo lavando los portaobjetos enteramente con agua destilada.
Se dejó que los portaobjetos se secaran al aire completamente, y las
manchas se contaron usando un lector automático ELISPOT.
Para la respuesta inmune mediada por célula, se
vacunaron ratones CEA.Tg con vectores que expresan el hCEA o con
vectores que expresan el rhCEA. Se analizaron dos grupos: el primer
grupo se analizó mediante ensayo ELISPOT 21 días después de la
última inyección de DNA, mientras el segundo grupo se estimuló con
1x10^{10} vp de Ad5-hCEA o
Ad5-RhCEA, y se analizó dos semanas más tarde. Los
resultados demostraron que tras cuatro inyecciones de DNA, se
observó una respuesta inmune celular no significativa contra el hCEA
según se midió mediante ELISPOT (no se muestra). Por otra parte,
los ratones que fueron estimulados con Ad5 manifestaron una
respuesta aumentada considerablemente, consistente con la ruptura de
inmunotolerancia al CEA. Esta observación sugiere que un protocolo
útil de vacunación para el antígeno propio del CEA sería la
administración repetida de DNA mediante EGT, seguida de un estímulo
de adenovirus (modalidad mixta). De manera importante, la
inmunización con CEA de rhesus proporcionó reacción cruzada con
péptidos de CEA humano y vice-versa en el tipo
silvestre y en ratones transgénicos (no se muestran los datos). En
particular, la respuesta inmune contra el CEA humano fue mucho
mejor en ratones transgénicos usando rhCEA como inmunógeno (ver
Figura 9). Estos resultados muestran que se podría obtener una
buena respuesta contra el CEA en ratones transgénicos usando el
(xeno) gen de rhesus. En la Figura 10 se muestra la respuesta
contra péptidos de CEA de rhesus.
Para evaluar la eficacia de inmunización de
macacos rhesus (Macaca mulatta) con el homólogo de rhesus del
antígeno homólogo del tumor humano CEA, que se expresa en
carcinomas colonorrectales, se desarrollaron estudios de
inmunización en el Centro de Investigación Biomédica del Primate
(BPRC, Rijswijk, Holanda). Tales estudios de inmunización se
diseñaron para evaluar respuestas de células B y T a la inmunización
con el antígeno CEA de rhesus.
En este estudio (CV-1), 1 grupo
de monos (constituido por 2 machos y 2 hembras) se inmunizó con un
vector de DNA de plásmido y un vector de adenovirus que expresan el
CEACAM-5 de rhesus. Para el priming, los animales
se vacunaron intramuscularmente con DNA de plásmido que expresa
rhCEA en las semanas 0, 4, 8, 12 y 16 mediante inyección de DNA
seguida por estimulación eléctrica. La inyección de DNA estuvo
constituida por una solución de 1 ml (vertida sobre 2 lugares, con
0,5 ml/lugar) que contenía 5 mg de DNA de plásmido para animales que
pesaban 2-5 kilos. Se inyectó a los animales bajo
anestesia (mezcla de ketamina/xilazina).
Para la electroestimulación, se descargaron dos
trenes de 100 pulsos bipolares cuadrados (1 seg cada uno) cada
nuevo segundo para un tiempo total de tratamiento de 3 seg. La
longitud de pulso fue de 2 mseg/fase con una frecuencia y amplitud
de pulso de 100 Hz y 100 mA (modo de corriente continua),
respectivamente.
Para medir la respuesta inmune al CEA usando el
protocolo de inmunización anterior, se recogieron muestras de
sangre cada cuatro semanas. Se midió la respuesta mediada por célula
mediante ensayo IFN-\gamma Elispot y la respuesta
humoral se midió mediante ensayo ELISA. Como no se obtuvo respuesta
inmune significativa en la semana 16, se llevaron a cabo dos
inyecciones adicionales (semana 24 y 28) usando rhCEA que expresa
Ad5. Tras la inyección de Ad5, se detectó una respuesta inmune
medible contra rhCEA para dos monos (RI137 y CO12) que abarcaba el
conjunto C y el conjunto B + C peptídico, respectivamente. La
respuesta inmune mediada por célula comenzó a declinar en ambos
monos en la semana 35.
Se siguió la respuesta inmune humoral en el
tiempo tras la inyección de DNA. Tres monos (CO12, RI311 y RI002)
mostraron un buen grado de anticuerpo anti-CEA,
variando de 1:143 a 1:2099 y alcanzando un pico entre las semanas
12 y 16 después de la primera inyección.
Estos datos muestran que vectores genéticos que
codifican para rhCEA fueron capaces de romper la inmunotolerancia a
este antígeno tumoral en primates. La inmunidad mediada por célula
(50% de monos tratados) y la humoral (75% de monos tratados)
estuvieron involucradas en la respuesta inmune.
Se desarrolló una segunda serie de estudios de
inmunización para evaluar la eficacia de inmunización de macacos
rhesus (Macaca mulatta) con los homólogos de rhesus de
antígenos asociados a tumores humanos HER2/neu,
Ep-CAM y CEA, expresándose todos en carcinomas
colonorrectales. Se diseñaron protocolos para evaluar las respuestas
de células B y T a estos antígenos tumorales en combinación.
En este estudio, un segundo grupo de 4 monos
rhesus (2 machos y 2 hembras) fueron inmunizados con una mezcla de
tres vectores de DNA de plásmido que expresan los homólogos de
rhesus de antígenos tumorales humanos Ep-CAM
(pV1J-rhEpCAM), CEA (pV1J-rhCEA), y
HER2/neu (pV1J-rhHER2).
Se introdujeron los cebadores a los animales
mediante inyección intramuscular de DNA de plásmido en las semanas
0, 4, 8, 12 y 16, seguida por electroestimulación.
La inyección de DNA estuvo constituida por una
solución de 1 ml (vertida sobre 2 lugares, con 0,5 ml/lugar) que
contenía 6 mg de DNA de plásmido para animales que pesaban
2-5 kilos. Se inyectó a los animales bajo anestesia
(mezcla de ketamina/xilazina).
Para la electroestimulación, se descargaron dos
trenes de 100 pulsos bipolares cuadrados (1 seg cada uno) cada
nuevo segundo para un tiempo total de tratamiento de 3 seg. La
longitud de pulso fue de 2 mseg/fase con una frecuencia y amplitud
de pulso de 100 Hz y 100 mA (modo de corriente continua),
respectivamente.
Se estimuló al mismo grupo de animales mediante
inyección de una mezcla de tres Ad5 que expresan CEA de rhesus
(Ad5-rhCEA), HER2/neu de rhesus
(Ad5-rhHER2), y EpCAM de rhesus
(Ad5-rhEpCAM). Se inyectó una cantidad total de
3x10^{11} partículas víricas (pv) intramuscularmente en las
semanas 23 y 27 (1x10^{11} pv para cada uno de los tres
virus).
Para medir la respuesta inmune a los tres
antígenos tumorales usando el protocolo de inmunización anterior, se
recogieron muestras de sangre cada cuatro semanas. Se midió la
respuesta mediada por célula mediante ensayo
IFN-\gamma +Elispot, mientras la respuesta humoral se midió mediante ensayo ELISA.
IFN-\gamma +Elispot, mientras la respuesta humoral se midió mediante ensayo ELISA.
Los monos RI449 y RI519 mostraron una respuesta
mediada por célula específica de HER2 detectable, como se midió
mediante análisis IFN-\gamma ELISPOT. Un análisis
similar no detectó ninguna respuesta significativa contra rhCEA y
rhEpCAM.
En un tercer estudio, 4 monos rhesus se
inmunizaron con una mezcla de Ad5-rhHER2,
Ad5-rhCEA y Ad5-rhEpCAM mediante
inyección intramuscular de derivados de Ad5 en las semanas 0, 2 y 4.
Se administró una solución de 1 ml (vertida sobre 2 lugares, con
0,5 ml/lugar) que contenía 3x10^{11} pv (10^{11} para cada uno
de los tres virus Ad5) a animales que pesaban 2-5
kilos. Se inyectó a los animales bajo anestesia (mezcla de
ketamina/xilazina).
Se midió la respuesta mediada por célula
mediante ensayo IFN-\gamma Elispot. Para HER2/neu,
tres de cuatro monos mostraron una respuesta detectable. No se
midieron respuestas mediadas por célula significativas para rhCEA y
rhEpCAM.
En resumen, el protocolo de inmunización
discutido anteriormente fue eficaz al inducir una respuesta inmune
específica contra rhHER2/neu en monos rhesus. No está claro por qué
la co-inmunización con vectores que llevaban tres
antígenos tumorales distintos no fue eficaz induciendo una respuesta
inmune específica contra rhCEA, en comparación con el estudio 1,
que solamente usó rhCEA como inmunógeno. Aunque sin esperar estar
limitados por la teoría, es posible que la expresión de rhHER2/neu
y la presencia de epitopos inmunodominantes limitara la generación
y la expansión de células-T subdominantes
específicas de rhCEA.
<110> Luigi Aurisicchio
\hskip1cmFabio Palombo
\hskip1cmPaolo Monaci
\hskip1cmNicola La Monica
\hskip1cmGennaro Ciliberto
\hskip1cmArmin Lahm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ANTÍGENO CARCINO EMBRIÓNICO DE
RHESUS, NUCLEÓTIDOS QUE CODIFICAN AL MISMO, Y USOS DEL MISMO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> ITR0045 PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/447,203
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-02-13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2118
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Macaca mulatta
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 705
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Macaca mulatta
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer del PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> S = C or G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> R=A or G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgaattccg gacasagcag rcagcagrsa cc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Primer del PCR
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<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgctcgagc ggctgctaca tcagagcaac cccaacc
\hfill37
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 2118
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<212> DNA
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<213> Macaca mulatta
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 2109
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 708
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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<210> 8
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<211> 705
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Macaca mulatta
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 81
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Secuencia de consenso
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 81
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcacagagga gaacacgcag gcagcagaga ccatggggcc catctcagcc cctt
\hfill54
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 78
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 15
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<210> 16
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<211> 76
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (18)
1. Una molécula de ácido nucleico aislada, que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una
proteína del antígeno carcinoembriónico de mono rhesus (rhCEA),
según se expone en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:8.
2. La molécula de ácido nucleico aislada de la
reivindicación 1 en la que el ácido nucleico es DNA.
3. La molécula de ácido nucleico aislada de la
reivindicación 1 en la que el ácido nucleico es mRNA.
4. La molécula de ácido nucleico aislada de la
reivindicación 1 en la que el ácido nucleico es cDNA.
5. La molécula de ácido nucleico aislada de la
reivindicación 1 en la que la secuencia de nucleótidos comprende la
secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:5.
6. Un vector que comprende la molécula de ácido
nucleico de la reivindicación 1.
7. Una célula huésped que comprende el vector
de la reivindicación 6.
8. Un procedimiento para expresar una proteína
del antígeno carcinoembriónico de mono rhesus (rhCEA) en una célula
huésped recombinante, que comprende:
- (a)
- introducir un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1 en una célula huésped adecuada; y,
- (b)
- cultivar la célula huésped bajo condiciones que permitan la expresión de dicha proteína de CEA de mono rhesus.
9. Un procedimiento para expresar una proteína
del antígeno carcinoembriónico de mono rhesus (rhCEA) en una célula
huésped recombinante, que comprende:
- (a)
- introducir un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 5 en una célula huésped adecuada; y,
- (b)
- cultivar la célula huésped bajo condiciones que permitan la expresión de dicha proteína de CEA de mono rhesus.
10. Una proteína del antígeno carcinoembriónico
de mono rhesus (rhCEA) aislada y purificada que comprende una
secuencia de aminoácidos según se expone en SEQ ID NO:2 o SEQ ID
NO:8.
11. El uso de un vector de vacuna que comprende
una molécula de ácido nucleico aislado, comprendiendo la molécula
de ácido nucleico aislado una secuencia de nucleótidos que codifica
para una proteína del antígeno carcinoembriónico de mono rhesus
(rhCEA) según se expone en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:8, para la
fabricación de un medicamento para prevenir o tratar el cáncer en
un mamífero.
12. Uso de acuerdo con la reivindicación 11 en
la que el mamífero es humano.
13. Uso de acuerdo con la reivindicación 11 en
la que el vector es un vector de adenovirus o un vector de
plásmido.
14. Uso de acuerdo con la reivindicación 11 en
la que el vector es un vector adenoviral que comprende un genoma
adenoviral con una delección en la región E1 del adenovirus, y una
inserción en la región E1 del adenovirus, en la que la inserción
comprende un casete de expresión que comprende:
- (a)
- un polinucleótido que codifica para la proteína de CEA de mono rhesus; y
- (b)
- un promotor ligado operativamente al polinucleótido.
15. Uso de acuerdo con la reivindicación 11 en
la que el vector es un vector de vacuna de plásmido, que comprende
una porción de plásmido y un casete expresable que comprende:
- (a)
- un polinucleótido que codifica para la proteína de CEA de mono rhesus; y
- (b)
- un promotor ligado operativamente al polinucleótido.
16. Un vector de vacuna de adenovirus que
comprende un genoma adenoviral con una delección en la región E1, y
una inserción en la región E1 del adenovirus, en la que la inserción
comprende un casete de expresión que comprende:
- (a)
- un polinucleótido que codifica para una proteína del antígeno carcinoembriónico (rhCEA) de mono rhesus según se expone en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:8.
- (b)
- un promotor ligado operativamente al polinucleótido.
17. Un vector de adenovirus de acuerdo con la
reivindicación 16 que es un vector Ad5 ó Ad6.
18. Un plásmido vacuna que comprende una
porción de plásmido y una porción de casete, comprendiendo la
porción de casete:
- (a)
- un polinucleótido que codifica para una proteína del antígeno carcinoembriónico (rhCEA) de mono rhesus según se expone en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:8.
- (b)
- un promotor ligado operativamente al polinucleótido.
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