DE602004001395T2

DE602004001395T2 - Rhesus-karzinoembryonales antigen, dieses codierende nukleotide und verwendungen davon

Info

Publication number: DE602004001395T2
Application number: DE602004001395T
Authority: DE
Inventors: Aurisicchio; Irbm c/o; Ciliberto; Lahm; Monica La; Monaci; Palombo
Original assignee: Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P Angeletti SpA
Current assignee: Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P Angeletti SpA
Priority date: 2003-02-13
Filing date: 2004-02-09
Publication date: 2007-08-09
Anticipated expiration: 2024-02-10
Also published as: JP2006518202A; WO2004072287A1; ATE331796T1; DE602004001395D1; US20060228335A1; EP1597370B1; EP1597370A1; CA2514969A1; AU2004211481A1; ES2267046T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Behandlung von Krebs bzw. die Krebstherapie. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Rhesusaffenhomologe des Tumor assoziierten karzinoembryonalen Polypeptid-Antigens, hierin als rhCEA bezeichnet, isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche für dieses Protein codieren, und rekombinante Vektoren und Wirtszellen, welche DNA umfassen, die für dieses Protein codiert. Diese Erfindung betrifft auch Adenovirusvektorkonstrukte, die rhCEA tragen, und deren Verwendung in Vakzinen und pharmazeutischen Zubereitungen zur Prävention und Behandlung von Krebs.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Immunoglobulinüberfamilie (IgSF) besteht aus zahlreichen Genen, die für Proteine mit unterschiedlichen Funktionen codieren, wobei eine dieser Funktionen die interzelluläre Adhäsion ist. IgSF-Proteine enthalten zumindest eine Ig-bezogene Domäne, welche von Bedeutung ist für die Aufrechterhaltung von geeigneten intermolekularen Bindungswechselwirkungen. Da solche Wechselwirkungen bezüglich der unterschiedlichen biologischen Funktionen der IgSF-Mitglieder notwendig sind, wurden Spaltung oder anormale Expression von vielen IgSF-Adhäsionsmolekülen mit zahlreichen menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht.
Das karzinoembryonale Antigen (CEA) gehört zu der Unterfamilie der Ig-Überfamilie, welche aus Zelloberflächenglycoproteinen besteht. Mitglieder der CEA-Unterfamilie sind als CEA-bezogene Zelladhäsionsmoleküle (CEACAM) bekannt. In der jüngeren wissenschaftlichen Literatur wurden die CEA-Gene in CEACAM5 umbenannt, obwohl hinsichtlich der Nomenklatur des Proteins CEA beibehalten wurde. Hinsichtlich ihrer Funktion wurde gezeigt, dass die CEACAM's sowohl als homotypische wie auch als heterotypische interzelluläre Adhäsionsmoleküle fungieren (Benchimol et al., Cell 57: 327–334 (1989)). Zusätzlich zu der Zelladhäsion inhibiert CEA den Zelltod, welcher aus der Ablösung von Zellen von der extrazellulären Matrix resultiert, und kann zur Zelltransformation, welche mit bestimmten Protoonkogenen wie z.B. Bcl2 und C-Myc verknüpft ist, beitragen (siehe Berinstein, J. Clin Oncol. 20(8):2197–2207 (2002)).
Die normale Expression von CEA wurde während der fötalen Entwicklung und in der Dickdarmschleimhaut von Erwachsenen detektiert. Die CEA-Überexpression wurde erstmals vor über dreißig Jahren in menschlichen Dickdarmtumoren entdeckt (Gold und Freedman, J. Exp. Med.121:439–462 (1965)) und wurde seitdem in nahezu allen kolorektalen Tumoren gefunden. Weiterhin ist die CEA-Überexpression in einem hohen Prozentsatz der Adenokarzinome der Bauchspeicheldrüse, Brust und Lunge nachweisbar. Aufgrund der Prävalenz der CEA-Expression in diesen Tumortypen wird CEA in weitem Umfang klinisch bei der Verfolgung und Prognose dieser Krebsarten verwendet.
Die Korrelation zwischen CEA-Expression und Metastasenwachstum hat auch zur Identifizierung als ein Target für die molekulare und immunologische Intervention für kolorektale Krebsbehandlung geführt. Ein therapeutischer Ansatz für die Umsetzung der CEA-Targetfunktion ist die Verwendung von Anti-CEA-Antikörpern (siehe Chester et al., Cancer Chemother, Pharmacol. 46 (Suppl): S8–S12 (2000)), während ein anderer Ansatz darin besteht, das Immunsystem zu aktivieren, um CEA-exprimierende Tumore unter Verwendung von Vakzinen auf CEA-Basis zu attackieren (hinsichtlich einer Übersicht, siehe Berinstein, oben).
Sequenzen, die für humanes CEA codieren, wurden kloniert und charakterisiert (US Patent Nr. 5 274 087, US Patent Nr. 5 571 710 und US Patent Nr. 5 843 761; siehe auch Beauchemin et al., Mol Cell Biol 7:3221–3230 (1987): Zimmerman et al, Proc. Natl. Acad. Scl., USA 84:920 924 (1987), Thompson et al Proc. Natl. Acad. Scl. USA 84(9):2965–69 (1987)). Trotz der Isolierung und Identifizierung dieser CEA-Gene, wäre es wünschenswert, weitere Säugergene, die für CEA codieren, zu identifizieren, um die Entwicklung eines Krebsvakzins zu ermöglichen, welches wirksam ist und nicht durch Eigentoleranz behindert ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte oder gereinigte Nukleinsäuremoleküle (Polynukleotide), welche eine Nukleotidsequenz umfassen, die für ein neues karzinoembryonales Rhesusaffen-Antigen codieren (nachfolgend als rhCEA bezeichnet), wie es in SEQ-ID-Nr. 2 und SEQ-ID-Nr. 8 festgelegt ist. Die hierin offenbarten DNA-Moleküle können in eine Wirtszelle eigener Wahl transfiziert werden, wobei die rekombinante Wirtszelle eine Quelle für wesentliche Anteile an exprimiertem funktionalem rhCEA-Protein bereitstellt (SEQ-ID-Nr. 2 und SEQ-ID-Nr. 8).
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für mRNA codiert, welche ein neues Rhesusaffen-CEA-Protein exprimiert, wobei dieses DNA-Molekül die Nukleotidsequenz umfasst, wie sie hierin als SEQ-ID-Nr. 1 offenbart wird. Nukleotidsequenzen, welche für Rhesus-CEA codieren, werden hierin als rhCEACAM5 bezeichnet. Ein bevorzugter Aspekt dieses Teils der vorliegenden Erfindung wird in 1A offenbart, welche ein DNA-Molekül (SEQ-ID-Nr. 1) zeigt, das für ein neues rhCEA-Protein (SEQ-ID-Nr. 2) codiert.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung betrifft ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für ein neues Rhesusaffen-CEA-Protein (SEQ-ID-Nr. 8) codiert, wobei das Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz umfasst, wie sie in 1B gezeigt und in SEQ-ID-Nr. 5 angegeben wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Vektoren und rekombinante Wirtszellen, sowohl prokaryotische als auch eukaryotische, welche die in dieser Beschreibung offenbarten Nukleinsäuremoleküle enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren für die Expression eines Rhesusaffen-CEA-Proteins in einer rekombinanten Wirtszelle, umfassend (a) das Einführen eines Vektors, welcher eine Nukleinsäure gemäß SEQ-ID-Nr. 1 oder SEQ-ID-Nr. 5 umfasst, in eine geeignete Wirtszelle und (b) die Kultivierung der Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des Rhesusaffen-CEA-Proteins ermöglichen.
Ein bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine im Wesentlichen gereinigte Form eines Rhesusaffen-CEA-Proteins, welches aus der in 2A offenbarten Aminosäuresequenz besteht (SEQ-ID-Nr. 2).
Ein weiterer bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine im Wesentlichen gereinigte Form eines Rhesusaffen-CEA-Proteins, welches aus der in 2B offenbarten Aminosäuresequenz besteht (SEQ-ID-Nr. 8).
Ein weiterer bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein im Wesentlichen gereinigtes, vollständig verarbeitetes (einschließlich proteolytischer Verarbeitung, Glycosylierung und/oder Phosphorylierung) voll entwickeltes rhCEA-Protein, erhalten aus einer rekombinanten Wirtszelle, welche einen DNA-Expressionsvektor enthält, der eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ-ID-Nr. 1 oder SEQ-ID-Nr. 5 dargelegt, umfasst, die das rhCEA-Protein exprimiert. Es ist insbesondere bevorzugt, dass die rekombinante Wirtszelle eine eukaryotische Wirtszelle ist, z.B. eine Säugerzelllinie.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung betrifft ein Verfahren zum Verhindern bzw. zur Prävention oder Behandlung von Krebs, umfassend die Verabreichung eines Vakzinvektors an einen Säuger, wobei der Vakzinvektor ein isoliertes Nukleinsäuremolekül umfasst und das isolierte Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz umfasst, welche für ein karzinoembryonales Rhesusaffen-Antigen (rhCEA)-Protein gemäß SEQ-ID-Nr. 2 oder SEQ-ID-Nr. 8 codiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Adenovirusvakzinvektor, umfassend ein Adenovirusgenom mit einer Deletion in der E1-Region und einem Insert in der E1-Region, wobei das Insert eine Expressionskassette umfasst, umfassend (a) ein Polynukleotid, welches für ein Rhesusaffen-CEA-Protein codiert; und (b) einen Promotor in funktionsfähiger Verknüpfung mit dem Polynukleotid.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Vakzinplasmid, umfassend einen Plasmidanteil und einen Expressionskassettenanteil, wobei der Expressionskassettenanteil (a) ein Polynukleotid, welches für ein Rhesusaffen-CEA-Protein codiert, und (b) einen Promotor in funktionsfähiger Verknüpfung mit dem Polynukleotid umfasst.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Schutz eines Säugers vor Krebs oder zur Behandlung eines Säugers, welcher an Krebs leidet, umfassend (a) das Einfügen eines ersten Vektors in das Säugetier, der erste Vektor umfassend i) ein Polynukleotid, welches für ein Rhesusaffen-CEA-Protein codiert und ii) einen Promotor in funktionsfähiger Verknüpfung mit dem Polynukleotid, (b) Verstreichen lassen einer vorbestimmten Zeitspanne, (c) Einfügen eines zweiten Vektors in das Säugetier, der zweite Vektor umfassend i) ein Polynukleotid, welches für ein Rhesusaffen-CEA-Protein codiert, und ii) einen Promotor in funktionsfähiger Verknüpfung mit dem Polynukleotid.
Gemäß ihrer Verwendung in der Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen, beinhalten die Singularformen "ein/eine" und "der/die/das" die Bezugnahme auf die Pluralformen, sofern sich aus dem Zusammenhang nichts anderes ergibt.
Hinsichtlich ihrer Verwendung in der Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen gelten die folgenden Definitionen und Abkürzungen:
Der Begriff "Promotor" bezieht sich auf eine Erkennungsstelle auf einem DNA-Strang, an die sich eine RNA-Polymerase bindet. Der Promotor bildet einen Initiationskomplex mit der RNA-Polymerase, um die Transkriptionsaktivität auszulösen und anzutreiben. Der Komplex kann durch aktivierende Sequenzen, welche als "Verstärker" ("enhancer") bezeichnet werden, oder durch inhibierende Sequenzen, welches als "Unterdrücker" („silencer") bezeichnet werden, modifiziert werden.
Der Begriff "Kassette" bezieht sich auf die Sequenz der vorliegenden Erfindung, welche die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz enthält. Die Kassette ähnelt dem Konzept eines Kassettenbandes, jede Kassette hat ihre eigene Sequenz. Folglich wird der Vektor durch Austausch der Kassette eine unterschiedliche Sequenz exprimieren. Aufgrund der Restriktionsstellen an den 5'- und 3'-Enden kann die Kassette problemlos eingefügt, entfernt oder durch eine andere Kassette ersetzt werden.
Der Begriff "Vektor" bezieht sich auf Mittel, durch die DNA-Fragmente in einen Wirtsorganismus oder ein Wirtsgewebe eingeführt werden können. Es gibt unterschiedli che Arten von Vektoren, einschließlich Plasmid, Virus (einschließlich Adenovirus), Bakteriophagen und Cosmide.
Der Begriff "erste Generation", wie er in Bezugnahme auf Adenovirusvektoren verwendet wird, beschreibt die Adenovirusvektoren, welche replikationsdefekt sind. Adenovirusvektoren der ersten Generation haben üblicherweise eine gelöschte oder inaktivierte E1-Genregion und haben bevorzugt eine gelöschte oder inaktivierte E3-Genregion.
Die Bezeichnung "pV1J-rhCEA" bezieht sich auf ein hierin offenbartes Plasmidkonstrukt, umfassend den humanen CMV schnell-früh-Promotor (immediate-early promotor) mit Intron A, ein Rhesus-CEA-Gen vollständiger Länge, vom Rinderwachstumshormon abgeleitete Polyadenylierungs- und Transkriptionsterminierungssequenzen und ein minimales pUC-Grundgerüst.
Die Bezeichnungen "pMRK-Ad5-rhCEA" und "MRK-rhCEA" beziehen sich auf ein hierin offenbartes Konstrukt, welches ein Ad5-Adenovirusgenom mit gelöschten E1- und E3-Regionen umfasst. In diesem Plasmid ist die E1-Region ersetzt durch ein Rhesus-CEA-Gen in einer E1-parallelen Orientierung unter der Kontrolle eines menschlichen CMV-Promotors ohne Intron A, gefolgt von einem Rinderwachstumshormon-Polyadenylierungssignal.
Die Bezeichnung "pBS-rhCEA" bezieht sich auf ein hierin offenbartes Konstrukt, welches das pBluescriptll KS(+)-Plasmid und ein rhCEA-Gen vollständiger Länge umfasst.
Der Begriff "effektive Menge" bedeutet, dass eine ausreichende Vakzinzusammensetzung eingeführt wird, um den geeigneten Polypeptidlevel zu erzeugen, so dass eine Immunreaktion erfolgt. Der Fachmann erkennt, dass dieser Level variieren kann.
"Im Wesentlichen frei von anderen Nukleinsäuren" bedeutet zumindest 90%, bevorzugt 95%, bevorzugter 99% und noch bevorzugter 99,9% frei von anderen Nukleinsäuren. Die Begriffe "im Wesentlichen frei von anderen Nukleinsäuren", "im We sentlichen gereinigt", "isolierte Nukleinsäure" oder "gereinigte Nukleinsäure" sind untereinander austauschbar und beziehen sich auch auf DNA-Moleküle, welche eine Codierungsregion für ein Rhesus-CEA-Protein umfassen, welches von anderen Zellbestandteilen abgereinigt wurde. Folglich enthält eine Rhesus-CEA-DNA-Zubereitung, welche im Wesentlichen frei ist von anderen Nukleinsäuren, in Prozent ihres gesamten Nukleinsäuregehaltes nicht mehr als 10%, bevorzugt nicht mehr als 5%, bevorzugter nicht mehr als 1% und noch bevorzugter nicht mehr als 0,1% an Nukleinsäuren, welche keine Rhesus-CEA-Nukleinsäuren darstellen. Ob eine gegebene Rhesus-CEA-DNA-Zubereitung im Wesentlichen frei ist von anderen Nukleinsäuren, kann durch herkömmliche Techniken für die Bewertung der Nukleinsäurereinheit bestimmt werden, z.B. durch Agarosegel-Elektrophorese, kombiniert mit geeigneten Färbungsmethoden, z.B. Ethidiumbromidfärbung, oder durch Sequenzbestimmung.
"Im Wesentlichen frei von anderen Proteinen" oder "im Wesentlichen gereinigt" bedeutet zumindest 90%, bevorzugt 95%, bevorzugter 99% und noch bevorzugter 99,9% frei von anderen Proteinen. Folglich enthält eine Rhesusaffen-CEA-Proteinzubereitung, welche im Wesentlichen frei ist von anderen Proteinen, in Prozent ihres Gesamtproteingehaltes nicht mehr als 10%, bevorzugt nicht mehr als 5%, bevorzugter nicht mehr als 1% und noch bevorzugter nicht mehr als 0,1% an Proteinen, die keine Rhesusaffen-CEA-Proteine sind. Ob eine gegebene Rhesusaffen-CEA-Proteinzubereitung im Wesentlichen frei ist von anderen Proteinen, kann durch herkömmliche Techniken der Bewertung der Proteinreinheit bestimmt werden, z.B. durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), kombiniert mit geeigneten Detektionsverfahren, z.B. Silberfärbung oder Immunoblotting.
Die Begriffe "im Wesentlichen frei von anderen Proteinen" oder "im Wesentlichen gereinigt" oder "isoliertes Rhesusaffen-CEA-Protein" oder "gereinigtes Rhesusaffen-CEA-Protein" sind untereinander austauschbar und beziehen sich auch auf ein Rhesusaffen-CEA-Protein, das aus einer natürlichen Quelle isoliert wurde. Die Verwendung des Begriffs "isoliert" oder "gereinigt" zeigt an, dass das Rhesusaffen-CEA-Protein aus seiner normalen zellulären Umgebung entfernt wurde. Folglich kann ein isoliertes Rhesusaffen-CEA-Protein in einer zellfreien Lösung vorliegen oder kann in eine zelluläre Umgebung gegeben werden, die sich von derjenigen unterscheidet, in der es natürlicherweise vorkommt. Der Begriff "isoliert" besagt nicht, dass ein isolier tes Rhesusaffen-CEA-Protein als einziges Protein vorliegt, sondern besagt vielmehr, dass ein isoliertes rhCEA-Protein im Wesentlichen frei ist von anderen Proteinen und Nicht-Aminosäurematerial (z.B. Nukleinsäuren, Lipide, Kohlenhydrate), welche natürlicherweise mit dem rhCEA-Protein in vivo assoziiert sind. Folglich ist ein Rhesusaffen-CEA-Protein, welches rekombinant in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle exprimiert wird und im Wesentlichen von dieser Wirtszelle, welche natürlicherweise (d.h. durch Intervention) nicht dieses rhCEA-Protein exprimiert, gereinigt ist, selbstverständlich ein "isoliertes Rhesusaffen-CEA-Protein" unter allen Umständen, auf die hierin Bezug genommen wird. Wie oben ausgeführt, ist eine rhCEA-Proteinzubereitung, welche ein isoliertes oder gereinigtes rhCEA-Protein darstellt, im Wesentlichen frei von anderen Proteinen und enthält in Prozent seines Gesamtproteingehalts nicht mehr als 10%, bevorzugt nicht mehr als 5%, bevorzugter nicht mehr als 1% und noch bevorzugter nicht mehr als 0,1% an Proteinen, die keine Rhesusaffen-CEA-Proteine sind.
Eine "konservative Aminosäuresubstitution" bezieht sich auf den Ersatz eines Aminosäurerestes durch einen anderen, chemisch ähnlichen Aminosäurerest. Beispiele solcher konservativen Substitutionen beinhalten die Substitution eines hydrophoben Rests (Isoleucin, Leucin, Valin oder Methionin) durch einen anderen hydrophoben Rest, Substitution eines polaren Rests durch einen anderen polaren Rest der gleichen Ladung (z.B. Arginin für Lysin, Glutaminsäure für Asparaginsäure).
"rhCEA" bezieht sich auf karzinoembryonales Rhesusaffen-Antigen.
Der Begriff "Säuger" bezieht sich auf jedes Säugetier, einschließlich eines Menschen.
Die Abkürzung "Ag" bezieht sich auf ein Antigen.
Die Abkürzungen "Ab" und "mAb" beziehen sich auf einen Antikörper bzw. auf einen monoklonalen Antikörper.
Die Abkürzung "ORF" bezieht sich auf einen offenen Leserahmen eines Gens.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt Nukleotidsequenzen der Rhesusaffen-CEA-cDNA-Moleküle gemäß SEQ-ID-Nr. 1 (Feld A) und SEQ-ID-Nr. 5 (Feld B). Siehe BEISPIEL 2.
2 zeigt die vorhergesagten Aminosäuresequenzen des ersten Rhesusaffen-CEA-Proteins gemäß SEQ-ID-Nr. 2 (Feld A) und des zweiten Rhesusaffen-CEA-Proteins gemäß SEQ-ID-Nr. 8 (Feld B). Die beiden Aminosäurenunterschiede zwischen dem ersten und dem zweiten Rhesus-CEA-Protein sind in Feld B fettgedruckt und unterstrichen.
3 zeigt eine Anordnung der nicht-translatierten 5'-Region der humanen CEACAM-Familienmitglieder. Die gezeigten Sequenzen wurden verglichen und verwendet, um Degenerationsprimer gemäß BEISPIEL 2 zu entwickeln. Nukleotide, die den entsprechenden Nukleotiden in anderen CEACAM-Familienmitgliedern entsprechen, sind hervorgehoben. Bindestriche zeigen an, dass Abstände bzw. Intervalle eingefügt wurden, um die Anordnung der Sequenzen zu erleichtern. Die Nukleotidanzahl jeder cDNA-Sequenz, wie sie in der Genbank offenbart wird, wird in Klammern angegeben.
4 zeigt die Expression des Rhesus-CEA-Proteins. HeLa-Zellen wurden mit Phagemiden transfiziert, welche durch Screening der Lambda-CEA-Bibliothek erhalten wurden, und ein Western-Blot wurde unter Verwendung polyklonaler Kaninchenantikörper gegenüber menschlichem CEA-Protein durchgeführt. Die Expression von 2 der 15 Klone wird gezeigt.
5 zeit eine schematische Darstellung der Rhesus-CEA-Codierungsregion. Interne Wiederholungen werden angegeben und Restriktionsstellen für Genfragmentierung und Sequenz werden offenbart.
6 zeigt eine Anordnung der humanen (SEQ-ID-Nr. 6) und Rhesus (SEQ-ID-Nr. 1)-CEACAM-5-Nukleotidsequenzen. Nukleotidunterschiede zwischen den beiden CEACAM-5-Sequenzen sind fettgedruckt.
7 zeigt eine Anordnung des humanen (SEQ-ID-Nr. 7) und Rhesus (SEQ-ID-Nr. 2)-CEACAM-5 offenen Leserahmens. Aminosäureunterschiede zwischen den beiden CEACAM-5-Sequenzen sind fettgedruckt.
8 zeigt die humorale Reaktion gegenüber humanem CEA in transgenen CEA-Mäusen. Der durchschnittliche Antikörpertiter wird für zwei Gruppen von Mäusen angegeben, wobei eine Gruppe mit Rhesus-CEA immunisiert wurde, und die andere Gruppe mit humanem CEA immunisiert wurde (BEISPIEL 7).
9 zeigt die Zellen vermittelte Immunreaktion gegenüber humanem CEA in transgenen CEA-Mäusen. Transgene CEA-Mäuse wurden entweder mit hCEA-Expressionsvektoren oder mit rhCEA-Expressionsvektoren geimpft (Beispiel 9).
10 zeigt die Zellen vermittelte Immunreaktion gegenüber Rhesus-CEA-Peptiden in transgenen CEA-Mäusen, welche mit Rhesus- oder Human-CEA immunisiert wurden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das Gen, welches für das karzinoembryonale Antigen (CEA) codiert, wird üblicherweise mit der Entwicklung von Adenokarzinomen in Verbindung gebracht. Die vorliegende Erfindung betrifft Zubereitungen und Verfahren zur Auslösung bzw. Erhöhung der Immunität des Proteinprodukts, das durch das Tumor assoziierte CEA-Antigen exprimiert wird, wobei die anormale bzw. aberrierende CEA-Expression mit dem Karzinom oder seiner Entwicklung verknüpft ist. Die Verknüpfung von aberrierender bzw. anormaler CEA-Expression mit einem Karzinom verlangt nicht, dass das CEA-Protein in Tumorgeweben zu allen Zeitpunkten seiner Entwicklung exprimiert wird, da eine abnormale CEA-Expression bei der Tumorentstehung vorliegen kann und bis zu einer späten Phase der Tumorentwicklung nicht detektierbar ist, und umgekehrt.
Zu diesem Zweck werden Polynukleotide, welche für ein karzinoembryonales Rhesusaffen-Antigen (rhCEA) codieren, bereitgestellt. Die Moleküle der vorliegenden Erfindung können in einem rekombinanten Adenovirus oder einem Vakzin auf Plasmidbasis verwendet werden, um eine wirksame Immunprophylaxe gegenüber Adenokarzinomen durch Zellen vermittelte Immunität bereitzustellen. Bei direkter Einführung in vivo in ein Wirbeltier induzieren die erfindungsgemäßen Polynukleotide die Expression von codierten Proteinen innerhalb des Tieres, einschließlich Säuger wie z.B. Primaten, Hunde und Menschen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes Nukleinsäuremolekül (Polynukleotid), umfassend eine Nukleotidsequenz, welche mRNA codiert, die ein neues rhCEA-Protein gemäß SEQ-ID-Nr. 2 oder SEQ-ID-Nr. 8 exprimiert. Die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung sind im Wesentlichen frei von anderen Nukleinsäuren.
Die isolierten Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung können ein Desoxyribonukleinsäuremolekül (DNA), z.B. genomische DNA und komplementäre DNA (cDNA), welche einsträngig (codierender oder nicht-codierender Strang) oder doppelsträngig sein können, sowie synthetische DNA, wie z.B. synthetisiertes, einsträngiges Polynukleotid, beinhalten. Die isolierten Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung können auch ein Ribonukleinsäuremolekül (RNA) beinhalten. Für die meisten Klonierungszwecke ist DNA die bevorzugte Nukleinsäure.
Ein bevorzugtes DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung umfasst die Nukleotidsequenz gemäß SEQ-ID-Nr. 1, gezeigt in 1A, welche für das in 2A gezeigte und als SEQ-ID-Nr. 2 angegebene Rhesus-CEA-Protein codiert.
Ein weiteres bevorzugtes DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung umfasst die Nukleotidsequenz gemäß SEQ-ID-Nr. 5 (nachfolgend bezeichnet als "zweite rhCEA" DNA-Sequenz), gezeigt in 1B, die für das Rhesus-CEA-Protein codiert, welches in 2B gezeigt und als SEQ-ID-Nr. 8 angegeben wird. Diese rhCEA-Nukleinsäuremoleküle wurden mittels RT-PCR identifiziert, wie ausführlich in BEISPIEL 2 beschrieben wird. Die zweite rhCEA-DNA-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 5) unterschiedet sich von der ersten Sequenz durch zwei Nukleotide und wurde aus Dickdarmgewebe von einem unterschiedlichen Rhesusaffen kloniert. Diese DNA-Sequenz codiert für ein Rhesus-CEA-Protein, welches sich von dem ersten Rhesus-CEA-Protein durch zwei Aminosäuren unterscheidet.
Die isolierten cDNA-Klone, assoziierten Vektoren, Wirtszellen, rekombinanten subzellulären Fraktionen und Membranen und die exprimierten und reifen bzw. entwickelten Formen von rhCEA sind für die Entwicklung eines Krebsvakzins verwendbar.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch biologisch aktive Fragmente oder Mutanten von SEQ-ID-Nr. 1 oder 5, welche für mRNA codieren, die neue rhCEA-Proteine exprimiert. Jedes dieser biologisch aktiven Fragmente und/oder Mutanten codiert entweder für ein Protein oder ein Proteinfragment, welches zumindest im Wesentlichen die pharmakologischen Eigenschaften des rhCEA-Proteins imitiert, einschließlich des rhCEA-Proteins gemäß SEQ-ID-Nr. 2 oder SEQ-ID-Nr. 8, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein. Jedes dieser Polynukleotide beinhaltet, ohne darauf beschränkt zu sein, Nukleotidsubstitutionen, Deletionen, Additionen, aminoterminale Abbrüche und carboxyterminale Abbrüche. Die Mutationen der vorliegenden Erfindung codieren für mRNA-Moleküle, die ein funktionales rhCEA-Protein in einer eukaryotischen Zelle exprimieren, um so in der Entwicklung von Krebsvakzinen verwendbar zu sein.
Diese Erfindung betrifft auch synthetische DNA, die für das rhCEA-Protein codiert, wobei sich die Nukleotidsequenz der synthetischen DNA signifikant von der Nukleotidsequenz gemäß SEQ-ID-Nr. 1 und SEQ-ID-Nr. 5 unterscheidet, jedoch nach wie vor für das rhCEA-Protein gemäß SEQ-ID-Nr. 2 oder SEQ-ID-Nr. 8 codiert. Solche synthetischen DNAs liegen im Bereich der vorliegenden Erfindung.
Daher offenbart die vorliegende Erfindung eine Codonredundanz, die zu zahlreichen DNA-Molekülen führen kann, die ein identisches Protein exprimieren. Für die Zwecke dieser Beschreibung wird eine Sequenz, die ein oder mehrere ersetzte Codons trägt, als eine degenerierte Variation definiert. Ebenso im Bereich der vorliegenden Erfindung liegen Mutationen entweder der DNA-Sequenz oder des translatierten Proteins, die die physikalischen Endeigenschaften des exprimierten Proteins im Wesentlichen nicht ändern. Beispielsweise verursacht die Substitution von Valin für Leucin, Arginin für Lysin oder Aspargin für Glutamin keine Änderung hinsichtlich der Funktionalität des Polypeptids.
Es ist bekannt, dass DNA-Sequenzen, die für ein Peptid codieren, geändert werden können, um so für ein Peptid zu codieren, welches Eigenschaften aufweist, die sich von denjenigen des natürlich vorkommenden Peptids unterscheiden. Verfahren zur Abänderung der DNA-Sequenzen beinhalten auf Stellen bzw. Positionen ausgerichtete bzw. positionsgerichtete Mutagenese, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein. Beispiele von geänderten Eigenschaften beinhalten Änderungen der Affinität eines Enzyms für ein Substrat oder Rezeptor für einen Liganden, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet DNA-Sequenzen, welche zu SEQ-ID-Nr. 1 oder SEQ-ID-Nr. 5 unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Ein beispielhaftes Verfahren unter Verwendung von hoher Stringenz ist folgendes: eine Prähybridisierung von Filtern, welche DNA enthalten, wird für 2 Stunden über Nacht bei 65°C in einem Puffer ausgeführt, welcher 6 × SSC, 5 × Denhardt's Lösung und 100 μg/ml denaturiertes Lachssperma-DNA enthält. Die Filter werden für 12 bis 48 Stunden bei 65°C in einer prähybridisierten Mischung hybridisiert, welche 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA und 5–20 × 10⁶ cpm einer ³²P-markierten Probe enthält. Das Waschen der Filter wird durchgeführt bei 37°C für 1 Stunde in einer Lösung, welche 2 × SSC, 0,1% SDS enthält. Vor der Autoradiographie folgt ein Waschschritt in 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C für 45 Minuten. Andere Verfahren unter Verwendung von Bedingungen hoher Stringenz würden entweder einen Hybridisierungsschritt, durchgeführt in 5 × SSC, 5 × Denhardt's Lösung, 50% Formamid bei 42°C für 12 bis 48 Stunden, oder einen Waschschritt, durchgeführt in 0,2 × SSPE, 0,2% SDS bei 65°C für 30 bis 60 Minuten, beinhalten.
Reagenzien, die in den oben erwähnten Verfahren zur Durchführung einer Hybridisierung hoher Stringenz genannt wurden, sind dem Fachmann bekannt. Einzelheiten über die Zusammensetzung dieser Reagenzien finden sich z.B. in Sambrook et. al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989, dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme ein gefügt wird. Zusätzlich zu den oben genannten Bedingungen sind andere Bedingungen hoher Stringenz, die verwendet werden können, dem Fachmann bekannt.
Ein bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine im Wesentlichen gereinigte Form eines Rhesusaffen-CEA-Proteins, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, wie sie in 2A offenbart wird (SEQ-ID-Nr. 2).
Ein weiterer bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine im Wesentlichen gereinigte Form eines Rhesusaffen-CEA-Proteins, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, wie sie in 2B offenbart wird (SEQ-ID-Nr. 8).
Diese Erfindung betrifft auch verschiedene funktionelle Domänen von rhCEA und Hybridmoleküle, die zumindest eine dieser Sequenzen umfassen. Das CEA-Protein umfasst eine aminoterminale Domäne mit einer verarbeiteten bzw. bearbeiteten Leitsequenz und einer hydrophoben carboxyterminierten Domäne. CEA umfasst auch drei Ig-artige interne Domänen. Unterdomänen der N-terminalen Domäne werden für die intrazelluläre Adhäsionsfunktion von CEA benötigt, wie von Taheri et al. gezeigt wurde (J. Biol. Chem. 275(35):26935–26943 (2000)).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch biologisch aktive Fragmente und/oder Mutanten eines rhCEA-Proteins, umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ-ID-Nr. 2 oder SEQ-ID-Nr. 8, einschließlich Aminosäuresubstitutionen, Deletionen, Additionen, aminoterminale Abbrüche und carboxyterminale Abbrüche, ohne auf diese beschränkt zu sein, so dass diese Mutationen Proteine oder Proteinfragmente für die diagnostische, therapeutische oder prophylaktische Verwendung bereitstellen und für die Entwicklung von Krebsvakzinen verwendbar sind.
Die Rhesusaffen-CEA-Proteine der vorliegenden Erfindung können in Form eines "reifen" bzw. "entwickelten" Proteins vorliegen oder können ein Teil eines größeren Proteins wie z.B. eines Fusionsproteins sein. Es ist häufig vorteilhaft, eine zusätzliche Aminosäuresequenz einzufügen, welche Sekretor- oder Leitsequenzen, Prosequenzen, Sequenzen, die bei der Reinigung Hilfe leisten, wie z.B. mehrfache Histidinreste, oder eine weitere Sequenz für die Stabilität während des Rekombinationsverfahrens einzufügen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch rhCEA-Fusionskonstrukte, einschließlich Fusionskonstrukte, die einen Teil des Rhesus-CEA-Proteins exprimieren, welches mit verschiedenen Markern verknüpft ist, einschließlich GFP (grün fluoreszierendes Protein), MYC-Epitop, GST und Fc, ohne auf diese beschränkt zu sein. Jedes derartige Fusionskonstrukt kann in der interessierenden Zelllinie exprimiert und verwendet werden, um nach Modulatoren des hierin offenbarten Rhesus-CEA-Proteins zu screenen. Auch berücksichtig sind Fusionskonstrukte, die so gestaltet sind, dass sie die Immunreaktion gegenüber Rhesus-CEA einschließlich DOM und hsp70 verstärken.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin rekombinante Vektoren, die im Wesentlichen gereinigte Nukleinsäuremoleküle umfassen, die in dieser Beschreibung offenbart werden. Diese Vektoren können DNA oder RNA umfassen. Für die meisten Klonierungszwecke werden DNA-Vektoren bevorzugt. Typische Vektoren beinhalten Plasmide, modifizierte Viren, Bakteriophagen, Cosmide, künstliche Hefechromosomen und andere Formen von episomaler oder integrierter DNA, die für ein rhCEA-Protein codieren können. Es liegt ohne weiteres im Bereich des Fachmanns, einen geeigneten Vektor für einen bestimmten Gentransfer oder für eine andere Verwendung zu bestimmen.
Ein Expressionsvektor, der DNA enthält, die für ein rhCEA-Protein codiert, kann für die Expression von rhCEA in einer rekombinanten Wirtszellen verwendet werden. Expressionsvektoren können Klonierungsvektoren, modifizierte Klonierungsvektoren, spezifisch entwickelte Plasmide oder Viren beinhalten, ohne auf diese beschränkt zu sein. Auch können eine Vielzahl von bakteriellen Expressionsvektoren verwendet werden, um rekombinantes rhCEA in Bakterienzellen zu exprimieren, sofern dies erwünscht ist. Weiterhin können eine Vielzahl von Pilzzellen-Expressionsvektoren verwendet werden, um rekombinantes rhCEA in Pilzzellen zu exprimieren. Weiterhin können eine Vielzahl von Insektenzellen-Expressionsvektoren verwendet werden, um das rekombinante Protein in Insektenzellen zu exprimieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Wirtszellen, die mit Vektoren transformiert oder transfiziert sind, welche die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung umfassen. Rekombinante Wirtszellen können prokaryotischer oder eukaryotischer Art sein, einschließlich Bakterien wie E. coli, Pilzzellen wie Hefe, Säugerzellen einschließlich Zelllinien vom Rind, Schwein, Affen und Nager, und Insektenzellen einschließlich Zelllinien, die von Drosophila und von der Seidenraupe erhalten wurden. Solche rekombinanten Wirtszellen können unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden, um rhCEA oder eine biologisch äquivalente Form zu erzeugen.
Wie oben angemerkt, kann ein Expressionsvektor, welcher DNA enthält, die für ein rhCEA-Protein codieren kann, für die Expression von rhCEA in einer rekombinanten Wirtszelle verwendet werden. Daher betrifft ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ein Verfahren für die Expression eines Rhesusaffen-CEA-Proteins in einer rekombinanten Wirtszelle, umfassend (a) das Einführen eines Vektors, der eine Nukleinsäure gemäß SEQ-ID-Nr. 1 oder SEQ-ID-Nr. 5 umfasst, in eine geeignete Wirtszelle und (b) das Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des Rhesusaffen-CEA-Proteins ermöglichen.
Nach der Expression von rhCEA in einer Wirtszelle kann das rhCEA-Protein wieder gewonnen werden, um das rhCEA-Protein in aktiver Form bereitzustellen. Mehrere rhCEA-Proteinreinigungsverfahren sind zugänglich und für die Verwendung geeignet. Rekombinantes rhCEA-Protein kann von Zelllysaten und Extrakten durch verschiedene Kombinationen von Ionenaustauschchromatographie, Größenausschlusschromatographie, Hydroxylapatitadsorptionschromatographie und Chromatographie mit hydrophober Wechselwirkung oder durch die individuelle Anwendung von Salzfraktionierung gereinigt werden. Weiterhin kann rekombinantes rhCEA-Protein von anderen zellulären Proteinen unter Verwendung einer Immunoaffinitätssäule, hergestellt mit monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern, die für das rhCEA-Protein vollständiger Länge oder Polypeptidfragmente des rhCEA-Proteins spezifisch sind, abgetrennt werden.
Die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung können zu einer Expressionskassette zusammengefügt werden, welche Sequenzen umfasst, die entwickelt wurden, um eine wirksame Expression des Proteins in einer menschlichen Zelle bereitzustellen. Die Kassette enthält bevorzugt das rhCEA-Gen vollständiger Länge mit dazu in Beziehung stehenden Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen in funktions fähiger Verknüpfung damit, wie z.B. einen Promotor, und Terminationssequenzen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor der Cytomegaloviruspromotor ohne die Intron-A-Sequenz (CMV), obwohl der Fachmann erkennt, dass eine Vielzahl anderer bekannter Promotoren wie z.B. der starke Immunoglobulinpromotor oder andere eukaryotische Genpromotoren verwendet werden können. Ein bevorzugter Transkriptionsterminator ist der Rinderwachstumshormonterminator, obwohl andere bekannte Transkriptionsterminatoren ebenso verwendet werden können. Die Kombination von CMV-BGH-Terminator ist besonders bevorzugt.
Gemäß dieser Erfindung wird die Rhesus-CEA-Expressionskassette in einen Vektor eingefügt. Der Vektor ist bevorzugt ein Adenovirusvektor, obwohl lineare DNA, verknüpft mit einem Promotor, oder andere Vektoren wie z.B. ein adenoassoziierter Virus oder ein modifizierter Vakzinvirus, ein retroviraler oder lentiviraler Vektor ebenso verwendet werden können.
Wenn es sich bei dem ausgewählten Vektor um einen Adenovirus handelt, ist es bevorzugt, dass der Vektor ein so genannter Adenovirus erster Generation ist. Diese Adenovirusvektoren sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine nicht-funktionelle E1-Genregion aufweisen und bevorzugt eine gelöschte E1-Adenovirusgenregion haben. In einigen Ausführungsformen wird die Expressionskassette in die Position eingefügt, in der das E1-Adenovirusgen normalerweise lokalisiert ist. Weiterhin haben diese Vektoren gegebenenfalls eine nicht-funktionelle oder gelöschte E3-Region. Es ist bevorzugt, dass in dem verwendeten Adenovirusgenom sowohl die E1-Region als auch die E3-Region gelöscht ist (ΔE1ΔE3). Die Adenoviren können in bekannten Zelllinien, welche das virale E1-Gen exprimieren, wie z.B. 293-Zellen oder PERC.6-Zellen oder in Zelllinien, erhalten aus 293- oder PERC.6-Zellen, welche vorübergehend oder in stabiler Weise transformiert werden, um ein zusätzliches Protein zu exprimieren, vervielfacht werden. Wenn beispielsweise Konstrukte verwendet werden, die eine kontrollierte Genexpression aufweisen, wie z.B. ein Tetracyclin regulierbares Promotorsystem, kann die Zelllinie Komponenten exprimieren, die in das Reguliersystem involviert sind. Ein Beispiel einer solchen Zelllinie ist T-Rex-293, weitere Zelllinien sind dem Fachmann bekannt.
Hinsichtlich der Manipulierung des Adenovirusvektors kann der Adenovirus nützlicherweise in einer Shuttleplasmid-Form vorliegen. Diese Erfindung betrifft ebenso einen Shuttleplasmid-Vektor, welcher einen Plasmidanteil und einen Adenovirusanteil umfasst, wobei der Adenovirusanteil ein Adenoviursgenom umfasst, welches eine E1-Deletion und optional eine E3-Deletion aufweist und eine eingefügte Expressionskassette beinhaltet, die Rhesus-CEA umfasst. In bevorzugten Ausführungsformen gibt es eine Restriktionsstelle, die den Adenovirusanteil des Plasmids flankiert, so dass der Adenovirusvektor problemlos entfernt werden kann. Das Shuttleplasmid kann in prokaryotischen Zellen oder eukaryotischen Zellen repliziert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Expressionskassette in das pMRKAdS-HVO-Adenovirusplasmid eingefügt (siehe Emini et al., WO 02/22080, hiermit durch Bezugnahme eingefügt). Dieses Plasmid umfasst ein Ad5-Adenovirusgenom mit gelöschten E1- und E3-Regionen. Das pMRKAdS-HV0-Plasmid wurde gegenüber früheren Adenovektoren verbessert, indem die cis-agierende 5'-Verpackungsregion weiter in das E1-Gen erstreckt bzw. ausgedehnt wurde, um Elemente einzufügen, von denen festgestellt wurde, dass sie hinsichtlich der Optimierung der viralen Verpackung von Bedeutung sind, was zu einer verstärkten Virusamplifikation führt. Vorteilhafterweise ist dieser verbesserte Adenovirusvektor in der Lage, die genetische Stabilität nach hoher Durchgangspropagation aufrechtzuerhalten.
Standardtechniken der Molekularbiologie für die Herstellung und Reinigung von DNA-Konstrukten ermöglichen die Herstellung von Adenoviren, Shuttleplasmiden und DNA-Immunogenen dieser Erfindung.
Die oben beschriebenen Vektoren können in immunogenen Zubereitungen und Vakzinen zur Prävention hinsichtlich der Entwicklung von Adenokarzinomen, welche mit anormaler CEA-Expression verknüpft sind, und/oder für die Behandlung bestehender Krebsarten verwendet werden. Zu diesem Zweck betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Prävention bzw. Verhinderung oder Behandlung von Krebs, umfassend die Verabreichung eines Vakzinvektors an einen Säuger, der Vakzinvektor umfassend ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, wobei das isolierte Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein Rhesusaffen-CEA-Protein gemäß SEQ-ID-Nr. 2 oder SEQ-ID-Nr. 8 codiert.
Gemäß des oben beschriebenen Verfahrens kann der Vakzinvektor zur Behandlung oder Verhinderung von Krebs in einem Säuger verabreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Säuger ein Mensch.
Weiterhin kann der Fachmann für die Verwendung in dem beschriebenen Behandlungsverfahren und Präventionsverfahren jede Art von Vektor auswählen. Bevorzugt handelt es sich beim Vektor um einen Adenovirusvektor oder einen Plasmidvektor. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Vektor ein Adenovirusvektor, der ein Adenovirusgenom mit einer Deletion in der E1-Adenovirusregion und ein Insert in der E1-Adenovirusregion umfasst, wobei das Insert eine Expressionskassette umfasst, diese umfassend (a) ein Polynukleotid, welches für ein Rhesusaffen-CEA-Protein codiert, und (b) einen Promotor in funktionsfähiger Verknüpfung mit dem Polynukleotid.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Adenovirusvakzinvektor, der ein Adenoviursgenom mit einer Deletion in der E1-Region und einem Insert in der E1-Region umfasst, wobei das Insert eine Expressionskassette umfasst, diese umfassend (a) ein Polynukleotid, welches für ein Rhesusaffen-CEA-Protein codiert, und (b) einen Promotor in funktionsfähiger Verknüpfung mit dem Polynukleotid.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses erfindungsgemäßen Aspekts ist der Adenovirusvektor ein Ad-5-Vektor.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Adenovirusvektor ein Ad-6-Vektor.
Gemäß eines weiteren Aspekts betrifft die Erfindung ein Vakzinplasmid, umfassend einen Plasmidanteil und einen Expressionskassettenanteil, der Expressionskassettenanteil umfassend (a) ein Polynukleotid, welches für ein Rhesusaffen-CEA- Protein codiert, und (b) einen Promotor in funktionsfähiger Verknüpfung mit dem Polynukleotid.
In einigen Ausführungsformen dieser Erfindung werden die hierin offenbarten rekombinanten Adenovirusvakzine in verschiedenen prime/boost-Kombinationen mit einem Polynukleotidvakzin auf Plasmidbasis verwendet, um eine verstärkte Immunreaktion zu induzieren. In diesem Fall werden die beiden Vektoren in einer "prime und boost"-Therapie verabreicht. Beispielsweise wird der erste Vektortyp verabreicht, dann folgt nach einer vorbestimmten Zeitspanne, z.B. 1 Monat, 2 Monate, 6 Monate oder andere geeignete Zeitintervalle, die Verabreichung des zweiten Vektortyps. Bevorzugt tragen die Vektoren Expressionskassetten, die das selbe Polynukleotid oder die selbe Kombination von Polynukleotiden codieren. In der Ausführungsform, in der auch eine Plasmid-DNA verwendet wird, ist es bevorzugt, dass der Vektor einen oder mehrere Promotoren enthält, die durch Säuger oder Insektenzellen erkannt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform würde das Plasmid einen starken Promotor, wie z.B. den CMV-Promotor enthalten, ohne auf diesen beschränkt zu sein. Das Rhesus-CEA-Gen oder andere zu exprimierende Gene würden mit solch einem Promotor verknüpft sein. Ein Beispiel eines solchen Plasmids wäre das Säugerexpressionsplasmid V1Jns, wie beschrieben (J. Shiver et. al. in DNA Vaccines, M. Liu, et al, eds., N.Y. Acad. Sci., N.Y., 772:198–208 (1996), hiermit durch Bezugnahme eingefügt).
Wie oben angemerkt, können ein Adenovirusvakzin und ein Plasmidvakzin an ein Wirbeltier als Teil einer einzigen therapeutischen Maßnahme verabreicht werden, um eine Immunreaktion zu induzieren. Zu diesem Zweck betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Schutz eines Säugers vor Krebs, umfassend (a) das Einführen eines ersten Vektors in einen Säuger, der erste Vektor umfassend i) ein Polynukleotid, welches für ein Rhesusaffen-CEA-Protein codiert, und ii) einen Promotor in funktionsfähiger Verknüpfung mit dem Polynukleotid; (b) Verstreichen lassen einer vorbestimmten Zeitspanne; und (c) Einführen eines zweiten Vektors in den Säuger, der zweite Vektor umfassend i) ein Polynukleotid, welches für ein Rhesusaffen-CEA-Protein codiert; und ii) einen Promotor in funktionsfähiger Verknüpfung mit dem Polynukleotid.
In einer Ausführungsform des Verfahrens zum Schutz vor Krebs, wie es oben beschrieben wurde, ist der erste Vektor ein Plasmid und der zweite Vektor ein Adenovirusvektor. In einer alternativen Ausführungsform ist der erste Vektor ein Adenovirusvektor und der zweite Vektor ein Plasmid.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Behandlung eines Säugers, welcher an einem Adenokarzinom leidet, das Verfahren umfassend (a) das Einführen eines ersten Vektors in einen Säuger, der erste Vektor umfassend i) ein Polynukleotid, welches für ein Rhesusaffen-CEA-Protein codiert, und ii) einen Promotor in funktionsfähiger Verknüpfung mit dem Polynukleotid; (b) Verstreichen lassen einer vorbestimmten Zeitspanne; und (c) Einführen eines zweiten Vektors in den Säuger, der zweite Vektor umfassend i) ein Polynukleotid, welches für ein Rhesusaffen-CEA-Protein codiert, und ii) einen Promotor in funktionsfähiger Verknüpfung mit dem Polynukleotid.
In einer Ausführungsform des oben beschriebenen Behandlungsverfahrens ist der erste Vektor ein Plasmid und der zweite Vektor ein Adenovirusvektor. In einer alternativen Ausführungsform ist der erste Vektor ein Adenovirusvektor und der zweite Vektor ein Plasmid.
Die Menge an exprimierbarer DNA oder transkribierter RNA, die einem Vakzinempfänger zuzuführen ist, hängt teilweise von der Stärke der verwendeten Promotoren und von der Immunogenität des exprimierten Genproduktes ab. Allgemein beträgt eine immunologisch oder prophylaktisch wirksame Dosis etwa 1 ng bis 100 mg und bevorzugt werden 10 μg bis 300 μg eines Plasmidvakzinvektors direkt in das Muskelgewebe verabreicht. Eine wirksame Dosis für den rekombinanten Adenovirus beträgt etwa 10⁶–10¹² Partikel und bevorzugt etwa 10⁷–10¹¹ Partikel. Subkutane Injektion, intradermale Einführung, Impression über die Haut und weitere Arten der Verabreichung wie z.B. intraperitoneale, intravenöse Verabreichung oder Inhalation sind ebenso berücksichtigt. Es ist auch berücksichtigt, dass Verstärkungsimpfungen bzw. Boosterimpfungen bereitgestellt werden können. Parenterale Verabreichung, z.B. intravenöse, intramuskuläre, subkutane oder andere Arten der Verabreichung mit Hilfsstoffen wie z.B. Interleukin-12-Protein, gleichzeitig oder nach der parenteralen Einführung des erfindungsgemäßen Impfstoffes, ist ebenso von Vorteil.
Die Vakzinvektoren dieser Erfindung können nackt sein, d.h. nicht-assoziiert mit anderen Proteinen, Hilfsstoffen oder anderen Agenzien, welche das Immunsystem des Empfängers beeinflussen. In diesem Fall ist es hinsichtlich der Vakzinvektoren erwünscht, dass sie in einer physiologisch vertretbaren Lösung vorliegen, wie z.B. sterile Salzlösung oder sterile gepufferte Salzlösung, ohne auf diese beschränkt zu sein. Alternativ kann es vorteilhaft sein, mit den Vakzinen oder immunogenen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ein immunstimulierendes Mittel, z.B. einen Hilfsstoff, ein Cytokin, ein Protein oder andere Träger zu verabreichen. Daher beinhaltet diese Erfindung die Verwendung solcher immunstimulierenden Mittel in Verbindung mit den Zusammensetzungen und Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung. Ein immunstimulierendes Mittel, wie es hierin verwendet wird, bezieht sich im Wesentlichen auf alles Substanzen, die eine Immunreaktion (vermittelt über Antikörper und/oder Zellen) bezüglich eines exogenen Antigens verstärken oder potenzieren. Diese immunstimulierenden Mittel können in Form von DNA oder eines Proteins verabreicht werden. Eine Vielzahl von immunstimulierenden Mitteln können in Verbindung mit den Vakzinen und immunogenen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, z.B. GM-CSF, IFNα, Tetanustoxoid, IL12, B7.1, LFA-3 und ICAM-1. Solche immunstimulierenden Mittel sind dem Fachmann bekannt. Agenzien, die die zelluläre Aufnahme von DNA unterstützen, wie z.B. Calciumionen, können ebenso verwendet werden. Diese Agenzien werden allgemein als transfektionserleichternde Reagenzien und pharmazeutisch vertretbare Träger bezeichnet. Der Fachmann ist in der Lage, das betreffende immunstimulierende Mittel oder den betreffenden vertretbaren Träger sowie den geeigneten Zeitpunkt und die geeignete Verabreichungsart zu bestimmen.
Eine Vielzahl von Verfahren können verwendet werden, um rhCEA zu klonieren. Diese Verfahren beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein

(1) eine RACE PCR-Klonierungstechnik (Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Si. USA 85:8998–9002 (1988)). 5'- und/oder 3'-RACE kann ausgeführt werden, um eine cDNA-Sequenz vollständiger Länge zu erzeugen. Diese Strategie beinhaltet die Verwendung von genspezifischen Oligonukleotidprimern für die PCR-Amplifikation von rhCEA-cDNA. Diese genspezifischen Primer werden durch Identifizierung einer exprimierten sequenzmarkierten (expressed sequence tag, EST) Nukleotidsequenz erzeugt, welche durch Suche in jeder öffentlich zugänglichen Nukleinsäure- und Proteindatenbank identifiziert wurde.
(2) Direkte funktionelle Expression der rhCEA-cDNA, die der Konstruktion einer rhCEA-haltigen cDNA-Bibliothek in einem geeigneten Expressionsvektorsystem folgt;
(3) Screenen einer rhCEA-haltigen cDNA-Bibliothek, konstruiert in einem Bakteriophagen oder einem Plasmidshuttle-Vektor mit einer markierten, degenerierten Oligonukleotidprobe, entwickelt aus der Aminosäuresequenz des rhCEA-Proteins;
(4) Screenen einer rhCEA-haltigen cDNA-Bibliothek, konstruiert in einem Bakteriophagen oder Plasmidshuttle-Vektor mit einer partiellen cDNA, die für das rhCEA-Protein codiert. Diese partielle cDNA wird durch die spezifische PCR-Amplifikation der rhCEA-cDNA-Fragmente über die Entwicklung von degenerierten Polyoligonukleotidprimern aus der Aminsosäuresequenz erhalten, welche für andere Membranproteine, die in Bezug stehen zu dem rhCEA-Protein, bekannt ist;
(5) Screenen einer rhCEA-haltigen cDNA-Bibliothek, konstruiert in einem Bakteriophagen oder Plasmidshuttle-Vektor mit einer partiellen cDNA oder einem Oligonukleotid mit Homologie zu einem rhCEA-Säugerprotein. Diese Strategie kann auch die Verwendung von genspezifischen Oligonukleotidprimern für die PCR-Amplifikation von rhCEA-cDNA, wie oben beschrieben als ein EST identifiziert, beinhalten;
(6) Erzeugen von genspezifischen 5'- oder 3'-Oligonukleotiden unter Verwendung von SEQ-ID-Nr. 1 als Templat, so dass entweder die cDNA vollständiger Länge durch bekannte RACE-Techniken erzeugt wird oder einen Teil der codierenden Region durch dieselben bekannten RACE-Techniken erzeugt wird, um einen Teil der codierenden Region zu erzeugen und zu isolieren, um diese als eine Probe zu verwenden, um eine von zahlreichen Arten von cDNA und/oder Genombibliotheken zu screenen, um eine Gesamtlängenversion der Nukleotidsequenz, die für rhCEA codiert, zu isolieren.

Es ist für den Fachmann ohne weiteres ersichtlich, dass andere Arten von Bibliotheken sowie Bibliotheken, welche aus anderen Zelltypen oder Speziestypen gebildet wurden, für die Isolierung einer für rhCEA codierenden DNA oder eines rhCEA-Homologen verwendbar sind. Andere Arten von Bibliotheken beinhalten cDNA-Bibliotheken, welche aus anderen Zellen erhalten wurden, ohne auf diese beschränkt zu sein. Die Auswahl von Zellen oder Zelllinien zur Verwendung für die Herstellung einer cDNA-Bibliothek für die Isolierung einer cDNA, welche für rhCEA codiert, kann bewerkstelligt werden, indem zuerst die zellenassoziierte rhCEA-Aktivität unter Verwendung von für solche Zwecke bekannten Analysen bzw. Proben gemessen wird.
Die Herstellung von cDNA-Bibliotheken kann durch Standardtechniken, wie sie dem Fachmann bekannt sind, durchgeführt werden. Bekannte Konstruktionstechniken für eine cDNA-Bibliothek finden sich beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Chloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Komplementäre DNA-Bibliotheken können auch aus zahlreichen kommerziellen Quellen erhalten werden, wie z.B. Clontech Laboratories, Inc. (Palo, Alto, CA) und Stratagene (La Jolla, CA).
Die DNA-Moleküle, RNA-Moleküle und das rekombinante Protein der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um den rhCEA-Level zu screenen und zu messen. Die rekombinanten Proteine, DNA-Moleküle und RNA-Moleküle bieten sich für die Formulierungen eines Bausatzes bzw. eines Kits an, der für den Nachweis und die Typisierung von rhCEA geeignet ist. Solch ein Kit würde einen unterteilten bzw. aufgeteilten Träger umfassen, welcher in der Lage ist, zumindest einen Behälter in enger Beschränkung zu halten. Der Träger wurde weiterhin Reagenzien wie z.B. rekombinante rhCEA- oder Anti-rhCEA-Antikörper umfassen, die zum Nachweis von rhCEA geeignet sind. Der Träger kann auch ein Detektionsmittel umfassen, z.B. markierte Antigen- oder Enzymsubstrate oder Ähnliches.
Nach der Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung mit Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen versteht es sich, dass die Erfindung nicht auf genau diese Ausführungsformen beschränkt ist und dass zahlreiche Änderungen und Modifikationen durch den Fachmann vorgenommen werden können, ohne vom Bereich oder der Lehre der Erfindung, wie sie in den beigefügten Ansprüchen definiert ist, abzuweichen.
BEISPIEL 1
Isolierung von RNA aus Rhesus Macaques
Unter Befolgung von Standardverfahren, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, wurden molekulare Verfahren durchgeführt (siehe z.B. Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology, F.M. 1. Hrg. John Wiley & Sons (1992) und Sambrook et al., Molecular Cloning, A. Laboratory, Manual 2. Hrg. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), hiermit durch Bezugnahme eingefügt).
Um RNA für die Isolierung von Rhesus-CEA-cDNA zu erhalten, wurden Colon-Proben von zwei unterschiedlichen Rhesusaffen (Macaca Mulatta) verwendet. Gefrorenes Gewebe wurde vom Biomedizinischen Zentrum für Primatenforschung (BPRC, Rijswijk, Niederlande) erhalten. Um die gesamte RNA aus den Rhesus-Colonproben zu extrahieren, wurde das Gewebe mechanisch pulverisiert und gemäß den Anweisungen des Herstellers mit dem Ultraspec-RNA-Reagenz kombiniert (Biotecx Laboratories, Houston, TX). Die Unversehrtheit der gereinigten RNA wurde durch Formaldehyd denaturierendes Agarosegel verifiziert. Die Proben wurden aliquotiert und bei –80°C gelagert.
BEISPIEL 2
Amplifikation von Rhesus-CEA-cDNA
Nukleotidsequenzen von den nicht-translatierten 5'- und 3'-Regionen (UTR) aller bekannten Mitglieder der menschlichen CEA-Familie wurden ausgerichtet, um äußerst konservierte Regionen der CEA-DNA zu identifizieren (siehe 3). Basierend auf den identifizierten Homologen der CEA-Genfamilie wurden degenerierte Oligonukleotidprimer erzeugt und die PCR-Bedingungen optimiert, um die Rhesus-CEA-cDNA durch Polymerasekettenreaktion mit reverser Transkriptase (RT-PCR) zu amplifizieren, wie unten beschrieben wird. Die Primer, welche für die Amplifikation der gesamten cDNA verwendet wurden, waren folgende: 5'-RhCEA EcoRI
5'-CCGAATTCCGGACASAGCAGRCAGCAGRSACC-3' (SEQ-ID-Nr. 3)
und CEA-8RhXhoI
5'-CCGCTCGAGCGGCTGCTACATCAGAGCAACCCCAACC-3'
(SEQ-ID-Nr. 4). Die Amplifikation wurde mit dem einstufigen SuperScript RT-PCR mit Platinum-Taq-Kit (Invitrogen; Carlsbad, CA) durchgeführt. Ein Reaktionsvolumen von 100 μl wurde verwendet, welches aus 1 μg RNA, 200 pmol beider Primer und 10% DMSO (Endkonzentration) bestand.
Um den Schritt der reversen Transkription durchzuführen, wurden Proben mit Gesamt-RNA, welche aus jedem der beiden Rhesusaffen isoliert wurden, bei 45°C für 30 Minuten inkubiert, gefolgt von einer Inkubation von 2 Minuten bei 94°C. Die PCR-Amplifikation der resultierenden Template bestand aus 40 Zyklen bei 94°C für 15 Sekunden, 52°C für 30 Sekunden und 68°C für 2 Minuten und 20 Sekunden.
Amplifizierte PCR-Produkte mit etwa 2100 bp, die erwartete Größe für ein CEACAM-5-Homologes, wurden unabhängig voneinander von beiden RNA-Proben erhalten und wurden über Agarosegel gereinigt. Partielle Sequenzanalyse beider PCR-Produkte zeige eine hohe Homologie mit humanem CEACAM-5.
Aufgrund der hohen Homologie interner Wiederholungen wurde die gesamte Gensequenz durch Reinigung von DNA-Fragmenten unter Verwendung von in 5 angegebenen Restriktionsstellen erhalten. Die Rhesus-CEA-Nukleotidsequenzen, welche von jedem Affen erhalten wurden, werden hierin in 1 offenbart, die in SEQ-ID-Nr. 1 (nachfolgend als rhCEACAM-5 bezeichnet) und SEQ-ID-Nr. 5 (nachfolgend als rhCEACAM-5 #2 bezeichnet) angegeben wird. Die Analyse der CEA-Nukleotidsequenzen zeigte einen offenen Leserahmen (ORF) von 2118 Nukleotiden, welche für ein Polypeptid mit 705 Aminosäuren codieren. Ein Vergleich der von den beiden Rhesusaffen erhaltenen rhCEA-Nukleotidsequenzen zeigte, dass zwei unterschiedliche Nukleotide vorlagen (siehe 1A und 1B), welche für zwei unterschiedliche Proteine codieren (siehe 2A und 2B).
Die Rhesus-CEACAM-5-Nukleotidsequenz (SEQ-ID-Nr. 1) wurde auch mit der veröffentlichten humanen CEACAM-5-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 6) verglichen und ergab eine Homologie von 88% auf dem Nukleotidlevel (siehe 6). Ein ähnlicher Vergleich der Rhesus- (SEQ-ID-Nr. 2) und der humanen (SEQ-ID-Nr. 7) CEA-Polypeptidsequenz zeigte eine Identität von 78,9% auf dem Aminosäurelevel (siehe 7). Interessanterweise liegt in dem Carboxylterminus des Rhesus-CEA im Vergleich zu humanem CEA eine Einfügung von drei Aminosäuren vor, welche wahrscheinlich das Signal für die Glycosylphosphatidylinosital (GPI)-Modifikation beinhaltet.
BEISPIEL 3
Erzeugung und Screenen einer spezifischen Bibliothek von Lambda-Rhesus-CEA
Amplifizierte rhCEA-Produkte, welche durch RT-PCR erhalten wurden (siehe BEI-SPIEL 2) wurden mit EcoRI/XhoI verdaut und in den Vektor Lambda ZAP-CMV XR gemäß den Anweisungen des Herstellers eingebunden (Stratagene; La Jolla, CA). Die Bindungsprodukte wurden mit GigapackIII-Gold-Verpackungsextrakt inkubiert und die resultierenden Phagen wurden verwendet, um XL-1 Blue MRF'-Zellen zu infizierten. Diese CEA-spezifische primäre Bibliothek wurde dann amplifiziert unter Erhalt eines Titers von ~1 × 10⁶ pfu/ml. Das Screenen der ~5 × 10³ Plaques wurde durch Aufsammeln auf Nylonfiltern durchgeführt. Die Filter wurden mit zwei unterschiedlichen DNA-Proben hybridisiert, welche die 5'- und 3'-Enden des CEA-Moleküls abdeckten. Zweifach positive Plaques wurden in XL-1 Blue MRF'-Zellen exzidiert und die erhaltenen fadenförmigen bzw. faserförmigen Phagen wurden in XL-OLR-Zellen amplifiziert. Die Phagemiden wurden dann gezüchtet und durch Restriktionsdigestion analysiert. Die Sequenzanalyse und Vergleiche mit der Genbank zeigten die höchste Homologie mit humanem CEACAM-5.
BEISPIEL 4
Plasmidkonstrukte und Adenoviruserzeugung
RhCEA wurde mit PstI/XhoI aus einem pCMV-Script EX Phagemidvektor exzidiert und in einen pBluescript II KS-Vektor unter Erhalt von pBS-RhCEA eingefügt. Die Einfügung wurde vollständig sequenziert und dann als SmaI/XhoI-Fragment im pVIJnsA-Vektor unter Erhalt von pVIJ-RhCEA subkloniert. Das Shuttleplasmid pMRK-RhCEA für die Adenoviruserzeugung wurde durch Subklonierung des selben Fragments in dem PolyMRK-Vektor erhalten. Ein PacI/StuI-Fragment aus pMRK-RhCEA, enthaltend die Expressionskassette für RhCEA und E1-flankierenden Ad5-Regionen, wurde zu ClaI-linearisiertem pAd5 oder pAd6 in BJ5183 E. Coli – Zellen rekombiniert. Die resultierenden Plasmide waren pAd5-RhCEA und pAd6-RhCEA. Beide Plasmide wurden mit PacI geschnitten, um den Adenovirus ITRs freizusetzen, und wurden in PerC-6-Zellen transfiziert. Die virale Amplifikation wurde durch serielle Passagen durchgeführt. Die Reinigung von Ad5-RhCEA und Ad6-RhCEA erfolgte unter Verwendung eines CsCl-Standardreinigungsprotokolls und ausgedehntes Dialysieren gegenüber A105-Puffer (5 mM Tris pH 8,0, 1 mM MgCl2, 75 mM NaCl, 5% Sacharose, 0,005% Tween20).
BEISPIEL 5
In vitro Expression und Detektion von RhCEA
Die Expression von RhCEA durch die erzeugten Vektoren wurde durch Western-Blots und FACS-Analyse verifiziert. Plasmide wurden in HeLa- oder PerC.6-Zellen mit Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, Ca) transfiziert. Die Adenovirusinfektionen wurden in einem serumfreien Medium für 30 Minuten bei 37°C durchgeführt, nachfolgend wurde frisches Medium zugegeben. Nach einer Inkubation von 48 Stunden wurden die gesamten Zelllysate durch Western-Blots unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchenserums gegenüber menschlichem CEA analysiert (Fitzgerald, Verdünnung 1:1500). Alle ausgewählten Rhesus-CEA-Klone exprimierten ein Protein mit 180–200 KDa bei Transfektion in HeLa-Zellen (siehe 4).
Für die FACS-Analyse wurden Zellen mit Trypsin abgelöst und wieder in FACS-Puffer suspendiert (PBS, 1% FCS). Nach einer Inkubation von 30 Minuten mit polyklonalen Anti-CEA-Kaninchenantikörpern mit einer Verdünnung von 1:250 wurden die Zellen gewaschen und für 30 Minuten mit Anti-Kaninchen-IgG-PE inkubiert und schließlich mit einem FACScalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) analysiert.
BEISPIEL 6
Peptide
Um die zellenvermittelte Immunreaktion gegenüber Rhesus-CEA in immunisierten Tieren zu analysieren, wurden 15mer Peptide, überlappend durch 11 Aminosäuren, erzeugt, um das gesamte Protein abzudecken. Liophylisierte Rhesus-CEA-Peptide wurden von Bio-Synthesis, Inc. (Lewisville, TX) bezogen und in DMSO mit 40 mg/ml resuspendiert. Die Peptide wurden in 4 Pools eingeteilt: Pool A (von RhCEA-1 bis RhCEA-34, 34 Peptide), Pool B (von RhCEA-35 bis RhCEA-79, 45 Peptide), Pool C (von RhCEA-80 bis RhCEA-124, 48 Peptide), und Pool D (von RhCEA-125 bis RhCEA-173, 53 Peptide). Die Endkonzentrationen waren folgende: Pool A = 1,176 mg/ml, Pool B = 0,888 mg/ml, Pool C = 0,851 mg/ml, Pool D = 0,769 mg/ml. Die Peptide und Pools wurden bei –80°C gelagert.
BEISPIEL 7
Erzeugung einer CEA-spezifischen zellulären Immunreaktion in Mäusen durch Immunisierung mit rhCEA
CEA.Tg-Mäuse sind transgene Mäuse, die humanes CEA als ein Eigenantigen mit einer Gewebeverteilung, die der humanen Gewebeverteilung ähnlich ist, exprimieren. Wie in weitem Umfang in der wissenschaftlichen Literatur demonstriert, zeigen diese Mäuse keine Reaktion bezüglich CEA, wie durch das Fehlen von detektierbaren CEA-spezifischen Serumantikörpern und die mangelnde Fähigkeit, eine splenische in vitro T-Zellen-Reaktion gegenüber CEA zu starten, gezeigt wird. Viele Berichte haben gezeigt, dass die DNA-Immunisierung mit xenogenen Genen, die für homologe Antigene codieren, Mäuse gegenüber einer Tumorherausforderung mit syngenen Melanomzellen schützt. Um die Fähigkeit der xenogenen DNA-Impfung aufzuzeigen, eine Immunreaktion gegenüber einem Eigenantigen in diesem Modell auszulösen, immunisierten wir CEA.Tg-Mäuse mit Vektoren, welche für Rhesus-CEA (Xeno) codieren.
C57BL/6-Mäuse (H-2^b) wurden von Charles River (Lecco, Italien) bezogen. CEA.tg-Mäuse (H-2^b) wurden durch HL Kaufman (Albert Einstein College of Medicine, New York) bereitgestellt und wurden unter Standardbedingungen gehalten.
Für den Elektrogentransfer (EGT) wurde der Quadriceps der Mäuse entweder chirurgisch freigelegt oder direkt mit 50 μg an pVIJ-RhCEA injiziert und elektrisch stimuliert, wie zuvor beschrieben wurde (Rizzuto et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(11):6417–22 (1999)). Für die Adenovirusinjektion wurden 1 × 10¹⁰ vp an Ad5-RhCEA in den Mäuse-Quadriceps injiziert.
Den Mäusen wurden 50 μg an pVIJ-RhCEA in den Quadricepsmuskel injiziert und nach der Injektion erfolgte einmal pro Woche über 4 Wochen eine Elektrostimulierung. C57BL/6-Mäuse wurden als Kontrolltiere verwendet. Antikörper gegen Rhesus-CEA wurden in Seren dieser Mäuse durch Western-Blots nachgewiesen, was eine humorale Immunreaktion nachweist. Ein monoklonales Maus-Ab gegen hCEA wurde als positive Kontrolle verwendet, während präimmune Seren und scheininfizierte Zellextrakte als negative Kontrollen verwendet wurden (Daten nicht gezeigt). Wichtig ist, dass kreuzreaktive Antikörper gegen humanes CEA-Protein nur im Rhesus-CEA-immunisierten Gruppen (8) mit einem durchschnittlichen Titer von 1:110 gemessen werden konnten. Diese Daten zeigen, dass es in dem transgenen Mausmodell möglich ist, die Toleranz mit xenogener DNA-Impfung zu durchbrechen (gemessen als Anti-CEA-Autoantikörper).
BEISPIEL 8
Antikörper-Detektion und -Titration
Seren für die Antikörpertitration wurden durch retro-orbitales Anzapfen bzw. Ausbluten erhalten. Für den Western-Blot-Nachweis ließ man Extrakte aus HeLa-Zellen, transduziert mit Ad5-rhCEA, auf SDS-Page-Gelen laufen und transferierte diese Extrakte auf Nitrozellulosefilter. Die Seren wurden zusammengefügt und auf 1:50 ver dünnt für die O/N-Inkubierung bei 4°C. Ein Antimaus-IgG-AP-Konjugat (Sigma, 1:2500) wurde für den Nachweis verwendet. Für die Titration wurden Elisa-Platten (Nunc maxisorp) mit 100 ng CEA pro Vertiefung (hochreines CEA; Fitzgerald Industries International Inc., Concord MA) beschichtet, in Beschichtungspuffer verdünnt (50 mM NaHCO₃ pH 9,4) und bei 4°C O/N-inkubiert. Die Platten wurden dann für 1 Stunde bei 37°C mit PBS, enthaltend 5% BSA blockiert. Die Mäuseseren wurden in PBS 5% BSA verdünnt (Verdünnung von 1/50 zur Bestimmung der Serokonversionsrate, Verdünnungen von 1:10 bis 1:31,250 zur Bestimmung des Titerwertes). Präimmune Seren wurden als Hintergrund verwendet. Verdünnte Seren wurden bei 4°C O/N-inkubiert. Gewaschen wurde mit PBS, 1% BSA, 0,05% Tween 20. Detektionsantikörper (Antimaus-IgG-Ziegenperoxidase, Sigma, St. Louis, MO) wurden auf 1/2000 in PBS, 5% BSA verdünnt und für 2 bis 3 Stunden bei Raumtemperatur in einer Schüttelvorrichtung inkubiert. Nach dem Waschen wurden Platten mit 100 μl pro Vertiefung an TMB-Substrat entwickelt (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL). Die Reaktionen wurden mit 25 μl 1 M H₂SO₄-Lösung pro Vertiefung gestoppt und die Platten wurden bei 450 nm/620 nm abgelesen. Anti-CEA-Serumtiter wurden als die Grenzverdünnung berechnet, welche eine Absorption erzeugt, die zumindest um das dreifache größer ist als die Absorption des autologen präimmunen Serums bei der selben Verdünnung.
BEISPIEL 9
IFN-γ-ELISPOT-Analyse
MAIP-Platten mit 96 Vertiefungen (Millipore, Bedford, MA) wurden mit gereinigtem Antimaus-Ratten-IFN-γ (IgGl, Klon, R4-6A2, Pharmingen, San Diego, CA) bei 2,4 μg/ml in sterilem PBS, aliquotiert bei 100 μl pro Vertiefung, beschichtet. Nach dem Waschen mit sterilem PBS wurden die Platten mit 200 μl R10-Medium pro Vertiefung bei 37°C für zumindest 2 Stunden blockiert.
Für die Splenozytenzubereitung wurde die Milz einer getöteten Maus in steriler Weise entfernt und durch Ritzen an einem Gitter aufgetrennt. Osmotische Lysis von roten Blutzellen wurde erhalten, indem 1 ml 0,1 × PBS dem Zellpellet zugegeben wurde und für nicht mehr als 15 Sekunden verwirbelt wurde. 1 ml 2 × PBS wurde dann zugegeben und das Volumen wurde mit PBS 1 × auf 4 ml gebracht. Nach dem Schleudern bei 1200 UpM für 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde das Zellpellet in 1 ml R10-Medium resuspendiert und lebensfähige Zellen wurden gezählt. Splenozyten wurden aufplattiert bei 5 × 10⁵ und 2 × 10⁵/Vertiefung mit 1 μg/ml jedes Peptids in R10 und für 20 Stunden in einem CO₂-Inkubator bei 37°C inkubiert. Concanavalin A (ConA) mit 5 μg/ml wurde als eine positive interne Kontrolle für jede Maus verwendet. Nach Waschen mit PBS, 0,05% Tween 20, wurden die Platten bei 4°C mit 40 μl/Vertiefung an Biotin-konjugiertem Antimaus-Ratten-IFN-γ(Rat IgG1, Klon XMG 1,2, Pharmingen, San Jose, CA), verdünnt auf 1:250 in Probenpuffer (PBS-5% FBS – 0,005% Twenn-20), O/N-inkubiert.
Am nächsten Tag wurden die Platten gewaschen und für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert mit Streptavidin-AP-Konjugat (Pharmingen), verdünnt auf 1:2500 in Probenpuffer. Nach intensivem Waschen wurden die Platten durch Zugabe von 50 μl/NBT/B-CIP (Pierce Biotechnology) pro Vertiefung entwickelt, bis die Entwicklung von Punkten bzw. Flecken unter dem Mikroskop beobachtet wurde. Die Reaktion wurde durch gründliches Waschen der Platten mit destilliertem Wasser gestoppt. Die Platten ließ man an der Luft vollständig trocknen und die Punkte wurden unter Verwendung einer automatisierten ELISPOT-Lesevorrichtung gezählt.
Für die zellenvermittelte Immunreaktion wurden CEA.Tg-Mäuse entweder mit hCEA-Expressionsvektoren oder mit rhCEA-Expressvektoren geimpft. Beide Gruppen wurden analysiert. Die erste Gruppe wurde durch ELISPOT-Analyse 21 Tage nach der letzten DNA-Injektion analysiert, während die zweite Gruppe mit 1 × 10¹⁰ vp an Ad5-hCEA oder Ad5-rhCEA gestärkt und zwei Wochen später analysiert wurde. Die Resultate zeigten, dass nach vier DNA-Injektionen keine signifikante zelluläre Immunreaktion gegenüber hCEA beobachtet wurde, wie durch ELISPOT gemessen wurde (nicht gezeigt). Andererseits zeigten Mäuse, die mit Ad5 gestärkt wurden, eine beträchtliche Zunahme der Reaktion, was mit einem Aufbrechen der Immuntoleranz gegenüber CEA konsistent ist. Diese Beobachtung legt nahe, dass die wiederholte Verabreichung von DNA durch EGT, gefolgt von einer Adenovirusstärkung (gemischte Modalität) ein geeignetes Impfprotokoll für das CEA-Eigenantigen darstellen würde. Von Bedeutung ist, dass die Immunisierung mit Rhesus-CEA eine Kreuzreaktion mit humanen CEA-Peptiden und umgekehrt lieferte, sowohl in Wildtyp-Mäusen als auch in transgenen Mäusen (Daten nicht gezeigt). Insbesondere war die Immunreaktion gegenüber humanem CEA in transgenen Mäusen unter Verwendung von rhCEA als Immunogen viel besser (sieh 9). Diese Ergebnisse zeigen, dass eine gute Reaktion gegenüber CEA in transgenen Mäusen unter Verwendung des Rhesus (Xeno)-Gens erhalten werden konnte. Die Reaktion gegenüber Rhesus-CEA-Peptiden wird in 10 gezeigt.
BEISPIEL 10
Immunisierung von Rhesus-Macaques mit rhCEA
Zur Bewertung der Wirksamkeit der Immunisierung von Rhesus-Macaques (macaca mulatta) mit dem Rhesushomologen des humanen Tumor-Antigens CEA, welches in kolorektalen Karzinomen exprimiert wird, wurden Immunisierungsstudien am Biomedizinischen Zentrum für Primatenforschung (BPRC, Rijswijk, Niederlande) durchgeführt. Solche Immunisierungsstudien wurden entwickelt, um sowohl die B- als auch die T-Zellen-Reaktionen gegenüber der Immunisierung mit dem Rhesus-CEA-Antigen zu bewerten.
In dieser Studie (CV-1) wurde eine Gruppe von Affen (bestehend aus 2 männlichen Tieren und 2 weiblichen Tieren) mit einem Plasmid-DNA-Vektor und einem Adenovirusvektor, Rhesus-CEACAM-5 exprimierend, immunisiert. Die Tiere wurden mit einer Plasmid-DNA, welche rhCEA exprimiert, in den Wochen 0, 4, 8, 12 und 16 durch Injektion von DNA, der eine elektrische Stimulierung folgte, intramuskulär geimpft. Die DNA-Injektion bestand aus einer Lösung von 1 ml (aufgeteilt auf zwei Stellen mit 0,5 ml pro Stelle), enthaltend 5 mg Plasmid-DNA für Tiere mit einem Gewicht von 2–5 Kilogramm. Die Injektion der Tiere erfolgte im anästhesierten Zustand (Gemisch von Ketamin/Xylazin).
Für die Elektrostimulierung wurden 2 Züge von 100 bipolaren Rechteckimpulsen (jeweils 1 Sekunde) jede andere Sekunde für eine Gesamtbehandlungszeitspanne von 3 Sekunden bereitgestellt. Die Impulslänge betrug 2 msec/Phase mit einer Impulsfrequenz von 100 Hz und einer Amplitude von 100 mA (konstanter Strommodus).
Für die Messung der Immunreaktion gegenüber CEA unter Verwendung des obigen Immunisierungsprotokolls wurden Blutproben alle vier Wochen gesammelt. Die zellenvermittelte Reaktion wurde durch IFNγ-Elispot-Analyse gemessen und die humorale Reaktion wurde durch ELISA-Untersuchung gemessen. Da in Woche 16 keine signifikante Immunreaktion erhalten wurde, wurden zwei weitere Injektionen (Woche 24 und 28) unter Verwendung von Ad5, das rhCEA exprimiert, durchgeführt. Durch die Ad5-Injektion wurde eine messbare Immunreaktion gegenüber rhCEA für zwei Affen (RI137 und CO12) detektiert, den Peptidpool C bzw. den Pool B + C abdeckend. Die zellenvermittelte Immunreaktion begann bei beiden Affen in Woche 35 abzunehmen.
Die humorale Immunreaktion wurde nach der DNA-Injektion in Abhängigkeit von der Zeit verfolgt. Drei Affen (CO12, RI311 und RI002) zeigten einen guten Anti-CEA-Antikörpertiter, welcher im Bereich von 1:143 bis 1:2099 lag und zwischen den Wochen 12 und 16 nach der ersten Injektion ein Maximum erreichte.
Diese Daten zeigen, dass genetische Vektoren, die für rhCEA codieren, in der Lage waren, die Immuntoleranz gegenüber diesem Tumorantigen in Primaten aufzubrechen. Sowohl zellenvermittelte (50% der behandelten Affen) als auch humorale (75% der behandelten Affen) Immunität war an der Immunreaktion beteiligt.
BEISPIEL 11
Immunisierung von Rhesus-Macaques mit Rhesushomologen von humanen tumorassoziierten Antigenen
Eine zweite Reihe von Immunisierungsstudien wurden durchgeführt, um die Wirksamkeit der Immunisierung von Rhesus-Macaques (Macaca mulatta) mit Rhesushomologen der humanen Tumorantigene HER2/neu, Ep-CAM und CEA, welche alle in kolorektalen Karzinomen exprimiert werden, zu bewerten. Protokolle wurden entwickelt, um sowohl die B- als auch die T-Zellen-Reaktionen gegenüber diesen Tumorantigenen in Kombination zu bewerten.
In dieser Studie wurde eine zweite Gruppe von 4 Rhesusaffen (2 männliche und 2 weibliche Tiere) mit einem Gemisch aus drei Plasmid-DNA-Vektoren, welche die Rhesushomologen der humanen Tumorantigene Ep-CAM (pV1J-rhEpCAM), CEA (pV1J-rhCEA) und HER2/neu (pV1J-rhHER2) exprimieren, immunisiert.
Die Tiere erhielten durch intramuskuläre Injektion in den Wochen 0, 4, 8, 12 und 16 Plasmid-DNA, gefolgt von Elektrostimulierung. Die DNA-Injektion bestand aus einer Lösung von 1 ml (aufgeteilt auf 2 Stellen mit 0,5 ml/Stelle), welche 6 mg Plasmid-DNA für Tiere mit einem Gewicht von 2–5 Kilogramm enthielt. Die Injektion der Tiere erfolgte im anästhesierten Zustand (Gemisch von Ketamin/Xylazin).
Für die Elektrostimulierung wurden 2 Züge von 100 bipolaren Rechteckimpulsen (jeweils 1 Sekunde) jede andere Sekunde für eine Gesamtbehandlungszeit von 3 Sekunden bereitgestellt. Die Impulslänge betrug 2 msec/Phase mit einer Impulsfrequenz von 100 Hz und einer Amplitude von 100 mA (konstanter Strommodus).
Die gleiche Tiergruppe wurde durch Injektion eines Gemisches aus drei Ad5-exprimierenden Rhesus-CEA (Ad5-rhCEA), Rhesus-HER2/neu (Ad5-rhHER2) und Rhesus-EpCAM (Ad5-rhEpCAM) gestärkt. Eine Gesamtmenge von 3 × 10¹¹ Viruspartikeln (vp) wurde intramuskulär in den Wochen 23 und 27 injiziert (1 × 10¹¹ vp für jeden der drei Viren).
Für die Messung der Immunreaktion gegenüber den drei Tumorantigenen unter Verwendung des obigen Immunisierungsprotokolls wurden Blutproben alle vier Wochen gesammelt. Die zellenvermittelte Immunreaktion wurde durch IFN-γ + ELISPOT-Analyse gemessen, wohingegen die humorale Reaktion durch ELISA gemessen wurde.
Die Affen RI449 und RI519 zeigten eine nachweisbare HER2-spezifische zellenvermittelte Reaktion, wie durch IFN-γ-ELISPOT-Analyse gemessen wurde. Eine ähnliche Analyse zeigte keine signifikante Reaktion gegenüber rhCEA und rhEpCAM.
In einer dritten Studie wurden 4 Rhesusaffen mit einem Gemisch von Ad5rhHER2, Ad5-rhCEA und Ad5-rhEpCAM durch intramuskuläre Injektion von Ad5-Derivaten in den Wochen 0, 2 und 4 immunisiert. Eine Lösung von 1 ml (aufgeteilt auf 2 Stellen mit 0,5 ml pro Stelle), enthaltend 3 × 10¹¹ vp (10¹¹ für jeden der drei Ad5-Viren), wurde an Tiere in anästhesiertem Zustand (Gemisch von Ketamin/Xylazin) mit einem Gewicht von 2–5 Kilogramm verabreicht.
Die zellenvermittelte Reaktion wurde durch IFNγ-ELISPOT-Analyse gemessen. Bezüglich Her2/Neu zeigten drei von vier Affen eine nachweisbare Reaktion. Keine signifikanten, zellenvermittelten Reaktionen wurden für rhCEA und rhEpCAM gemessen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das oben diskutierte Immunisierungsprotokoll hinsichtlich der Induzierung einer spezifischen Immunreaktion gegenüber rhHER2/neu in Rhesusaffen wirksam war. Es ist unklar, warum die Co-Immunisierung mit Vektoren, welche drei unterschiedliche Tumorantigene tragen, im Vergleich zur Studie 1, welche nur rhCEA als Immunogen verwendet, hinsichtlich einer Induzierung einer Immunreaktion gegenüber rhCEA nicht wirksam war. Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, ist es möglich, dass die Expression von rhHER2/Neu und die Anwesenheit von immunodominanten Epitopen die Erzeugung und die Expansion von subdominanten rhCEA-spezifischen T-Zellen begrenzte.
Sequenzliste

Claims

Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche für ein karzinoembryonales Rhesusaffen-Antigen (rhCEA)-Protein wie in SEQ-ID-Nr. 2 oder SEQ-ID-Nr. 8 angegeben codiert.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure DNA ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure mRNA ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure cDNA ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei die Nukleotidsequenz die in SEQ-ID-Nr. 1 oder SEQ-ID-Nr. 5 angegebene Nukleotidsequenz umfasst.
Vektor, umfassend das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1.
Wirtszelle, umfassend den Vektor nach Anspruch 6.
Verfahren zur Expression eines karzinoembryonalen Rhesusaffen-Antigen (rhCEA)-Proteins in einer rekombinanten Wirtszelle, umfassend: a) Einführen eines Vektors, welcher die Nukleinsäure nach Anspruch 1 umfasst, in eine geeignete Wirtszelle; und b) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Expression des Rhesusaffen-CEA-Proteins erlauben.
Verfahren zur Expression eines karzinoembryonalen Rhesusaffen-Antigen (rhCEA)-Proteins in einer rekombinanten Wirtszelle, umfassend: a) Einführen eines Vektors, welcher die Nukleinsäure nach Anspruch 5 umfasst, in eine geeignete Wirtszelle; und b) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Expression des Rhesusaffen-CEA-Proteins erlauben.
Isoliertes und gereinigtes karzinoembryonales Rhesusaffen-Antigen (rhCEA)-Protein, umfassend eine Aminosäuresequenz wie in SEQ-ID-Nr. 2 oder SEQ-ID-Nr. 8 angegeben.
Verwendung eines Vakzinvektors, umfassend ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, wobei das isolierte Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz umfasst, welche für ein karzinoembryonales Rhesusaffen-Antigen (rhCEA)-Protein wie in SEQ-ID-Nr. 2 oder SEQ-ID-Nr. 8 angegeben codiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Verhütung oder Behandlung von Krebs bei einem Säuger.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei der Säuger ein Mensch ist.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei der Vektor ein Adenovirusvektor oder ein Plasmidvektor ist.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei der Vektor ein Adenovirusvektor ist, welcher ein Adenovirusgenom mit einer Deletion in der Adenovirus-E1-Region und einem Insert in der Adenovirus-E1-Region umfasst, wobei das Insert umfasst eine Expressionskassette, umfassend: a) ein Polynukleotid, codierend für das Rhesusaffen-CEA-Protein; und b) einen Promotor in funktionsfähiger Verknüpfung mit dem Polynukleotid.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei der Vektor ein Plasmid-Vakzinvektor ist, welcher umfasst einen Plasmidanteil und eine exprimierbare Kassette, umfassend: a) ein Polynukleotid, codierend für das Rhesusaffen-CEA-Protein; und b) einen Promotor in funktionsfähiger Verknüpfung mit dem Polynukleotid.
Adenovirus-Vakzinvektor, umfassend ein Adenovirusgenom mit einer Deletion in der E1-Region und einem Insert in der E1-Region, wobei das Insert umfasst eine Expressionskassette, umfassend: a) ein Polynukleotid, codierend für ein karzinoembryonales Rhesusaffen-Antigen (rhCEA)-Protein wie in SEQ-ID-Nr. 2 oder SEQ-ID-Nr. 8 angegeben; und b) einen Promotor in funktionsfähiger Verknüpfung mit dem Polynukleotid.
Adenovirusvektor nach Anspruch 16, welcher ein Ad5- oder Ad6-Vektor ist.
Vakzinplasmid, umfassend einen Plasmidanteil und einen Expressionskassettenanteil, wobei der Expressionskassettenanteil umfasst: a) ein Polynukleotid, codierend für ein karzinoembryonales Rhesusaffen-Antigen (rhCEA)-Protein wie in SEQ-ID-Nr. 2 oder SEQ-ID-Nr. 8 angegeben; und b) einen Promotor in funktionsfähiger Verknüpfung mit dem Polynukleotid.