DE3703702C2 - Vakzine gegen Melanome - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Melanom-assoziierte
p97-Antigene und immunogene Mittel, die diese enthalten,
rekombinante Viren, die Melanom-assoziierte p97-Antigene
exprimieren können und Vakzin-Formulierungen, die diese
Viren enthalten, rekombinante DNA-Vektoren, mit denen
Melanom-assoziierte p97-Antigene exprimiert werden können
und Zellen, Bakterien und Viren, die diese Vektoren enthalten.
Die Erfindung betrifft Vakzin-Formulierungen, die in der Lage
sind, eine Immunantwort auszulösen, welche Melanomzellen in
einem mit dem Vakzin behandelten Individuum selektiv zerstört.
Es wird daher nicht-denaturiertes Melanom-assoziiertes p97-
Antigen mittels rekombinanter DNA-Techniken und/oder
chemischer Synthesemethoden in großen Mengen hergestellt. Das
erfindungsgemäße Peptid oder Protein kann man als Immunogen in
einer Vakzin-Formulierung verwenden. Bei bestimmten
Ausführungsformen, bei denen das Melanom-assoziierte p97-Antigen
durch ein rekombinantes Virus exprimiert wird, kann
man das rekombinante Virus selbst als Immunogen in einer
Vakzin-Formulierung verwenden. Die Erfindung betrifft auch
Verfahren unter Anwendung rekombinanter DNA-Techniken sowie
chemische Synthesemethoden, welche die Herstellung des
Melanom-assoziierten p97-Antigens in großen Mengen erlaubt.
Erfindungsgemäß verwendet man als Immunogene nicht-denaturierte
Melanom-assoziierte p97-Antigene, wobei p97 ein monomeres
Sialoglykoprotein der Zelloberfläche bezeichnet, das ein
scheinbares Molekulargewicht von etwas weniger als 97 000
Daltons aufweist und das ein Bestandteil der Oberfläche von
Melanomzellen ist.
Tierversuche, insbesondere mit Nagetieren, haben ergeben,
daß die meisten durch onkogene Viren ausgelösten Tumore
Antigene exprimieren, die im viralen Genom kodiert sind.
Weiter hat sich gezeigt, daß eine Immunisierung mit diesen
Antigenen zu der Abwehr eines anschließenden, durch das
gleiche Virus induzierten Challenges der Tumorzellen führen
kann. Obwohl ein großer Teil dieser Arbeit mit Labor-Virusstämmen,
wie SV40, Polyomavirus und Friend-Moloney- oder
Rauscher-Murinleukämieviren, durchgeführt wurde, wurde doch
auch die horizontale und vertikale Transmission onkogener
Viren in der Natur gezeigt; so ist heute ein Vakzin gegen
Virus-induzierte Gallenleukämie und gegen Virus-induziertes
Gallensarkom im Handel erhältlich.
Dagegen wurde die virale Etiologie der meisten Krebsformen
beim Menschen noch nicht aufgezeigt. Beachtenswerte Ausnahmen
sind das Hepatitis-Virus (Hepatom), Herpes-Simplex-Virus
(Zervikal-Carcinom) und Epstein Barr-Virus (Nasopharyngeal-
Carcinom). Während der letzten beiden Jahrzehnte hat sich
jedoch herausgestellt, daß einige menschliche Tumorzellen
Tumor-Antigene exprimieren, d. h. Antigene, die die Tumorzellen
von ihren normalen zellulären Gegenstücken unterscheiden.
Bei einigen Patienten kommt es zu einer zellvermittelten
oder humoralen Immunantwort gegen diese Antigene (Hellstrom
et. al. 1968, Nature, 220:1352; Morton et al., 1968, Science
162: 1279-1281; Shiku et al. 1976, J. Exp. Med. 144: 873-881).
Targets dieser Immunantworten sind unter anderem
onkofetale oder Differenzierungsantigene, die im Humangenom
kodiert sind (Hellstrom et al., 1970, Int. J. Cancer 6: 346-351).
Bis vor kurzem war die Molekularstruktur von Tumorantigenen
nicht bekannt und der Grad der Tumorspezifität immunologischer
Reaktionen war unklar. Versuche, diese Information zur
Entwicklung von Krebsdiagnose-Assays oder zur Krebstherapie
zu verwenden, blieben weitgehend erfolglos. Da spontane
Tumorregressionen äußerst selten sind, kann man auch den
Schluß ziehen, daß die in-vitro demonstierten Immunantworten
in-vivo nicht wirksam sind; beispielsweise können Antikörper
und Lymphozyten, die man von einem Krebspatienten
erhalten hat, in-vitro wirksam Tumorzellen abtöten, während
die Immunantwort des gleichen Krebapatienten in-vivo ohne
Wirkung bleibt.
Die Einführung der Methode mit monoklonalen Antikörpern
durch Kohler und Milstein (1975, Nature 256: 495-497) führte
zur intensivierten Suche nach menschlichen Tumorantigenen,
da durch diese Methode die Mittel geschaffen wurden, derartige
Antigene sowohl im molekularen Bereich als auch hinsichtlich
der Spezifität zu definieren (Hellstrom and Brown,
1979, In "The Antigens", M. Sela, ed., Academic-Press, Vol.
V: 1-66). Im Laufe der letzten Jahre wurde eine große Zahl
Tumor-assoziierter Antigene beschrieben, von denen die
meisten mittels monoklonaler Antikörper von Mäusen definiert
wurden, Reisfeld and Sell, Herausgeber: Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy, UCLA Symposia on Molecular
and Cellular Biology, New Series, Vol. 27, Alan R. Liss,
Inc. New York, 1985, Seiten 1-609. Obwohl sich im wesentlichen
alle genau charakterisierten Antigene als Onkofetal- oder
als Differenzierungsantigene erwiesen haben und sich ihre
Tumorspezifität als quantitativ und nicht qualitativ gezeigt
hat, sind einige Antigene ausreichend spezifisch gegenüber
neoplastischen Zellen im Vergleich zu normalen Zellen
(im allgemeinen um einen Faktor 10 bis 1000), um potentiell
zur Identifizierung von Tumorzellen und zur Therapie verwendet
zu werden. Menschliche monoklonale Antikörper gegenüber
Tumorantigenen wurden ebenfalls erhalten (Cote et al., 1983,
Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026-2030). Dies bestätigt die
obige Aussage, daß es bei einigen Krebspatienten zu einer
Immunreaktion gegenüber ihren Tumoren kommt.
Mehr als die Hälfte der bisher identifizierten Tumor-assoziierten
Zelloberfläche-Antigene sind Proteine oder Glykoproteine,
die im menschlichen Genom (und nicht durch endogene
oder exogene Viren) kodiert sind. Die restlichen Antigene
sind Glykolipide, die aus abnormaler Expression oder Regulation
von Glykosyl-Transferasen resultieren.
Das p97-Antigen ist ein Tumor-assoziiertes Antigen, das
zuerst in einem menschlichen Melanom unter Anwendung
monoklonaler Antikörper identifiziert wurde (Brown et al.,
1980, J. Biol. Chem. 255: 4980-4983; Dippold et al., 1980,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6114-6118, Woodbury et al.,
1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2183-2187). Das p97-Antigen
wurde intensiv hinsichtlich seiner Expression in
normalen und neoplastischen Geweben untersucht. Es ist in
den meisten Melanomen beim Menschen und in bestimmten fötalen
Geweben vorhanden, es findet sich jedoch nur in Spuren in
normalen Geweben bei Erwachsenen (Brown et al., 1981,
J. Immunol. 127: 539-546; Brown et al., 1981, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 78: 539-543; Garrigues et al., 1982, Int.
J. Cancer 29: 511-515). p97 wurde als Target verwendet, um
in klinischen Versuchen beim Menschen Melanome zu Diagnosezwecken
sichtbar zu machen (Larson et al., 1983, J. Clin.
Invest. 72: 2101-2114).
p97 ist ein monomeres Zelloberflächen-Sialoglykoprotein mit
einem scheinbaren Molekulargewicht (MW) von etwas weniger
als 97 000 Daltons, bestimmt mittels Natriumdodecylsulfat-
Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE). Monoklonale
Antikörper haben drei wesentliche antigene Stellen, die auf
einem stabilen tryptischen Fragment von 40 000 Dalton vorhanden
sind (Brown et al., 1981, J. Immunol. 127: 539-546); die
vollständige Sequenz von p97 ist jedoch noch nicht beschrieben.
Wenigstens zwei weitere unabhängig charakterisierte
menschliche Melanom-assoziierte Antigene, nämlich gp95
(Dippold et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6114-6118)
und gp 97 (Khosravi et. al., 1985, Int. J. Cancer 35: 73-80),
scheinen bei Analyse mittels sequentieller Immunfällung
identisch mit p97 zu sein.
Die N-terminale Aminosäuresequenz von p97 ist homolog zu
Transferrin. Wie Transferrin bindet p97 Eisen (Brown et al.,
1982, Nature, London, 296: 171-173). Eine Analyse somatischer
Zellhybride und in situ-Hybridisierung hat gezeigt, daß das
p97-Gen, wie die Gene für Transferrin und für den Transferrin-
Rezeptor, im chromosomalen Bereich 3q21-3q29 lokalisiert
ist (Plowman et al., 1983, Nature, London, 303: 70-72; Yang
et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2752-2756). Diese
Beobachtungen deuten darauf hin, daß p97 eine Rolle beim
Eisenmetabolismus spielt.
Die Isolierung eines von p97 m-RNA abgeleiteten
c-DNA-Klons für humanes Melanom-assoziiertes p97-Antigen wird
von Brown et al. in Molecular Biology of Tumor Cells, ed.
B. Wahren et al., Raven Press, New York, 1985, Seiten 157-167,
beschrieben.
Tierversuche, üblicherweise an Mäusen, haben gezeigt, daß
eine Immunisierung mit lebenden oder abgetöteten Krebszellen
zur Abwehr eines anschließenden Challenges lebensfähiger
Krebszellen führen kann. Immunisierungsversuche mit zellfreiem
Material gelangen im allgemeinen weniger, obwohl
einige Erfolge beschrieben wurden (siehe
Hellstrom and Brown, 1979, in The Antigens, M. Sela ed.
Academic Press, Vol. V: 1-66). In vielen Fällen waren die
für den Schutzeffekt verantwortlichen Target-Antigene viral
kodiert, in vielen anderen Fällen jedoch war der Aufbau des
Antigens, das die den Schutz bewirkende Immunantwort verursacht,
nicht bekannt.
Versuche am Menschen sind weit schwieriger, und die Wirksamkeit
von Krebs-Vakzinen ist trotz einiger Erfolge umstritten.
In vielen Fällen waren die Vakzin-Zusammensetzungen bestrahlte
Tumorzellen oder Tumorzellen, welche durch Einwirkung
bestimmter chemischer Agenzien abgetötet wurden. Da reine
menschliche, Tumor-assoziierte Antigene nicht zur Verfügung
standen, ist ihre Anwendung in Vakzinen nicht beschrieben.
Ein wesentlicher theoretischer Einwand gegen die vorgeschlagene
Anwendung von Krebs-Vakzinen bei Menschen besteht darin,
daß bei Menschen, die beispielsweise mit abgetöteten Krebszellen
oder zellfreien Präparationen "geimpft" wurden, keine
Immunantwort erfolgt, weil die Tumorantigene, die die Targets
für die Immunantwort darstellen, in einigen normalen Zellen,
wenn auch nur in geringen Mengen, vorhanden sind, und daher
vom Immunsystem als "Eigenmaterial" erkannt werden. Die
meisten, wenn nicht alle, Tumor-assoziierten Antigene, die
in menschlichen Tumoren mit Hilfe monoklonaler Antikörper
gefunden wurden, sind auch in einigen normalen Geweben vorhanden.
Es gibt nur wenige Anzeichen dafür, daß Krebspatienten
auf diese Antigene wirksam in vivo ansprechen. Es gibt
Hinweise, daß Suppressorzellen eine wesentliche Rolle dabei
spielen, die Immunantwort auf Tumorantigene herabzuregulieren
(Nepom et al., 1983, Experientia, 39: 235-242). Darüber hinaus
kann eine durch einen Set an Tumorantigenen ausgelöste Antwort
von Suppressorzellen die Induktion eines effektiven
Tumor-zerstörenden Ansprechens auf einen weiteren Set auf
Tumor-Antigene verhindern, welche selbst keine Suppression
induzieren würden (Hellstrom et al., 1983, in Biomembranes,
A. Nowotny ed., Plenum Press, Seiten 365-388).
Die Anwendung der rekombinanten DNA-Technologie für die Herstellung
von Subunit-Vakzinen zum Schutz gegen Infektionen
umfaßt molekulares Klonen und Expression genetischer Information
in einem geeigneten Vektor, die für Proteine codiert,
welche eine Immunantwort gegen das Protein in einem Wirtstier
auslösen können. Vor kurzem wurde ein neuer Weg gefunden,
der möglicherweise für die Produktion von Subunit-Vakzinen
brauchbar ist (Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci.
79: 7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Virol. 49: 857-864;
Panicali, D. und Paoletti, E., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci.
79: 4927-4931). Dieser Weg umfaßt den Einsatz von Vaccinia-Viren
als Vektor, um fremde Gene, die in das Genom des Virus
eingesetzt wurden, zu exprimieren. Nach Einführung in Wirtstiere
exprimieren die rekombinanten Vaccinia-Viren das eingesetzte
fremde Gen und verursachen dadurch eine Immunantwort
des Wirts auf derartige Gene. Da lebende rekombinante
Vaccinia-Viren als Vakzin verwendet werden können, umfaßt
der angesprochene Weg sowohl die Vorteile eines Subunit-Vakzins
als auch eines Vakzins auf Basis von lebendem Material.
Vaccinia-Viren enthalten ein lineares, doppelsträngiges
DNA-Genom von ungefähr 198 kilobasen Paaren und sie replizieren
im Cytoplasma infizierter Zellen. Diese Viren enthalten ein
vollständiges Transkriptions-Enzymsystem (einschließlich
der Capping-, mehtylierenden und polyadenylierenden Enzyme)
im Viruskern, was für die Virusinfizierbarkeit erforderlich
ist. Transkriptions-Regulatorsequenzen der Vaccinia-Viren
(Promotoren) ermöglichen die Initiierung der Transkription
durch Vakzina-RNA-Polymerase, nicht jedoch durch Zell-RNA-
Polymerase des Wirts.
Die Expression fremder DNA in rekombinanten Vaccinia-Viren
erfordert die Bindung von Vaccinia-Promotoren an Protein-
kodierenden DNA-Sequenzen des fremden Gens. Plasmid-Vektoren,
die auch als Insertionsvektoren bezeichnet werden, wurden
konstruiert, um Chimären-Gene in Vaccinia-Viren einzusetzen.
Eine Art der Insertionsvektoren besteht aus: (a) einem
Vaccinia-Viruspromotor einschließlich der Transkriptions-
Initiierungsstelle; (b) mehreren Restriktions-Endonuklease-
Klonierungsstellen, die abwärts von der Transkriptionsstartstelle
für die Insertion fremder DNA-Fragmente lokalisiert
sind; (c) einer nicht-essentiellen Vaccinia-Virus DNA (wie
das TK-Gen), die den Promotor und die Klonierungsstellen flankiert,
welche die Insertion der Chimären-Gene in den homologen,
nicht-essentiellen Bereich des Virusgenoms steuern; und (d)
einem bakteriellen Replikationsursprung und antibiotischen
Resistenz-Marker zur Replikation und Selektion in E. coli.
Beispiele derartiger Vektoren wurden von Mackett beschrieben
(Mackett et al., 1984, J. Virol. 49: 857-864).
Rekombinante Vaccinia-Viren werden hergestellt, indem man
rekombinante, bakterielle Insertionsplasmide, welche das
fremde Gen enthalten, in Zellen transfektiert, die zuvor mit
dem Vaccinia-Virus infiziert wurden. Es erfolgt dann eine
Rekombination mit den infizierten Zellen, die zu einer
Insertion des fremden Gens in das virale Genom führt. Die
infizierten Zellen können mittels immunologischer Techniken
untersucht werden, z. B. DNA-Plaque-Hybridisierung oder
genetische Selektion auf rekombinante Viren, welche
anschließend isoliert werden können. Diese Vaccinia-
Rekombinanten haben ihre wesentlichen Funktionen und ihre
Infektivität beibehalten. Sie können so aufgebaut werden, daß
sie ungefähr 35 Kilobasen fremder DNA aufnehmen können.
Die Expression des fremden Gens kann mitttels enzymatischer
oder immunologischer Assays (beispielsweise Immunfällung,
Radioimmunoassay oder Immunblotting) festgestellt werden.
Natürlich vorkommende Membran-Glykoproteine, die aus rekombinanten
mit Vaccinia-Viren infizierten Zellen hergestellt
wurden, sind glykosyliert und können an die Zelloberfläche
transportiert werden. Durch die Verwendung starker Promotoren
oder durch Klonieren von mehrfachen Kopien eines einzelnen
Gens kann man einen hohen Expressionsgrad erzielen.
Cochran et al. beschreiben in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.
82, 1985, Seiten 19-23, ein eukaryotisches transientes
Expressionssystem, bei dem Zellen mit Wild-Typ Vaccinia-Viren
infiziert und anschließend durch Transfektion mit einem
rekombinanten Plasmid zur Expression eines Gens geführt
werden, welches durch besagte Plasmide eingefügt worden ist.
Es werden Vakzin-Formulierungen beschrieben, die zur Auslösung
einer Immunantwort verwendet werden können, welche Melanom-
Zellen in geimpften Individuen selektiv zerstören. Die
erfindungsgemäßen Vakzin-Formulierungen umfassen ein
Immunogen, das eine Immunantwort induziert, die gegen ein
Melnom-assoziiertes p97-Antigen gerichtet ist.
Erfindungsgemäß sind eine Reihe von Vakzin-Formulierungen
möglich. Das Immunogen eines
erfindungsgemäßen "Subunit-Vakzins" (Untereinheit-Vakzin) umfaßt
das beanspruchte Peptid oder Protein als Melanom-assoziiertes p97-Antigen, das
mit einem geeigneten Adjuvans formuliert werden kann.
Derartige Peptide oder Proteine umfassen Aminosäuresequenzen,
die sich von der vollständigen oder von einem Teil der
Aminosäuresequenz von p97 ableiten, welche im wesentlichen
der in Fig. 3 gezeigten Sequenz entspricht. Erfindungsgemäße
nicht-denaturierte Melanom-assoziierte p97-Antigene umfassen
die Aminosäuresequenz der Aminosäurereste 21 bis
738 gemäß Fig. 3. Darin eingeschlossen (ohne jedoch darauf
begrenzt zu sein) sind abgeänderte Aminosäuresequenzen, in
denen funktionell
äquivalente Aminosäurereste durch Reste innerhalb der Sequenz
ersetzt sind, die einen "silent change" ergeben, und/oder
modifizierte oder weiterverarbeitete Aminosäuresequenzen,
beispielsweise glykosylierte Aminosäuresequenzen,
phosphorilierte Aminosäuresequenzen etc. oder chemisch-modifizierte
Aminosäuresequenzen. Im folgenden werden die erfindungsgemäßen
nicht-denaturierten Melanom-assoziierten
p97-Antigene, gleich ob sie in abgeänderter,
nicht-geänderter, modifizierter oder nicht-modifizierter
Form vorliegen, als p97-Antigene bezeichnet.
Wenn ein p97-Antigen ein Hapten (d. h. Antigen
aber nicht Immunogen) ist, kann das Hapten an ein Trägermolekül
konjugiert sein, das Immunogenität verleiht.
Die erfindungsgemäßen p97-Antigene kann man
unter Anwendung rekombinanter DNA-Techniken und/oder chemischer
Synthesemethoden herstellen. Wenn man
p97-Antigene chemisch synthetisiert, können derartige synthetische
Peptide diejenigen Aminosäurensequenzen
umfassen, die aus Bereichen von p97 stammen, von denen man
annimmt, daß sie antigen sind (Hopp and Woods) 1981, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 78: 3824-3828). Wenn die erfindungsgemäßen
Peptide unter Anwendung rekombinanter
DNA-Techniken hergestellt werden, wird eine Nukleotidsequenz,
die vollständig oder teilweise für p97 kodiert, in einem
rekombinanten Expressionsvektor, beispielsweise ein Virus
oder ein Plasmid, insertiert. Dieser Vektor kann in einem
geeigneten Wirt die Expression eines
p97-Antigene herbeiführen, das aus dem Kulturmedium isoliert
werden kann. Die insertierte Nukleotidsequenz leitet sich
von der vollständigen oder teilweisen p97-Sequenz ab, welche
im wesentlichen der in Fig. 3 gezeigten Sequenz entspricht,
einschließlich (aber nicht darauf begrenzt) der
Nukleotidsequenzen, in denen funktionell äquivalente
Nukleotidcodons
durch Codons innerhalb der Sequenz ersetzt sind, die zu einem
"silent change" führen; mit anderen Worten, unterschiedliche
Codons, die für die gleiche Aminosäure oder deren
funktionelles Äquivalent kodieren, können innerhalb der in
Fig. 3 gezeigten Sequenz substituiert werden. Wenn ein
Plasmid-Expressionsvektor zur Anwendung kommt, ist ein zur
Expression in eukaryontischen Zellen geeigneter Vektor bevorzugt,
ein prokaryontischer Expressionsvektor kann jedoch
ebenfalls verwendet werden.
Gemäß einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform, bei
der der Expressionsvektor ein rekombinantes Virus ist, kann
das Vakzin als virales Vakzin formuliert werden. Das
Immunogen umfaßt dabei das rekombinante Virus, das ein
p97-Antigen exprimiert. In Abhängigkeit von der
Art des als Immunogen verwendeten rekombinanten Virus kann
man entweder ein Vakzin auf Basis inaktivierter Viren oder
auf Basis von Lebendviren formulieren. Eine in geeigneter
Weise mit den erfindungsgemäßen Vakzin-Formulierungen durchgeführte
Immunisierung kann zur Induktion einer Immunantwort
führen, die zur Zerstörung von Melamonzellen in dem immunisierten
Individuum führt.
Erfindungsgemäß wird auch ein System beschrieben, nach dem
die Vakzin-Formulierung getestet werden kann und das angibt,
wie der Test durchgeführt werden soll. Die Wirksamkeit der
Vakzin-Formulierungen kann beispielsweise in Tiermodellen
bewertet werden, zunächst bei Nagetieren, anschließend bei
Primaten, ausgenommen Menschen,
und schließlich bei Menschen, vorzugsweise bei Patienten,
bei denen eine Remission zu beobachten ist und bei denen
aber trotzdem ein Wiederauftreten des Melanoms aufgrund von
Mikrometastasen sehr wahrscheinlich ist.
Fig. 1 zeigt ein Autoradiogramm der durch SDS-PAGE
aufgetrennten zellfreien Translationsprodukte
der p97-mRNA. In Fig. 1A zeigt die Spur 1
die Translationsprodukte von p97 angereicherter
mRNA, während Spur 2 die Translationsprodukte
unangereicherter mRNA zeigt, jeweils
erhalten aus 0,5 µl Gesamttranslationsprodukte
von 5 ng mRNA. In Fig. 1B zeigt
Spur 1 die Translationsprodukte von p97 angereicherter
mRNA, während Spur 2 die Translationsprodukte
nicht angereicherter mRNA
zeigt, jeweils erhalten aus 5 µl Translationsprodukte
von 5 ng mRNA, erhalten durch
Immunfällung mit anti-p97-Serum.
In Fig. 2 ist die Struktur von p97 mRNA in Form eines
Diagramms dargestellt. Es wird der Aufbau des
codierenden Bereichs (von der Signalsequenz zur
Verankerungssequenz) und des nicht-kodierenden
Bereichs (3′UT) sowie die verdoppelte
Domänenstruktur des p97 Precursors (open bar)
gezeigt. die Lokalisierung verschiedener
Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme
ist oberhalb der mRNA angegeben. Die relative
Position von vier cDNA-Klonen ist unterhalb
der mRNA-Struktur angegeben. Der cDNA-Klon
p97-3a2fl (3a2fl) wurde aus einer cDNA-
Sammlung isoliert, in der die cDNAs auf
oligo(T)-primierte p97-angereicherte mRNAs transkribiert
und in pBR322 kloniert wurden; die
cDNA-Klone p97-2fl (2fl), p97-1jl 1jl), und
p97-10al (10al) wurden durch priming
cDNA-Synthese mit Oligonucleotiden, die für
p97-Exonsequenzen codieren, und Klonen der
erhaltenen cDNA-Fragmente in Lambda-gt10 erhalten.
In Fig. 2A sind die Genomklone B15, H17, B6.6 und E7.7,
die in Lambda L 47.1 kloniert wurden, in Form
eines Diagramms dargestellt.
Fig. 3 zeigt die Nukleotidsequenz menschlicher p97-
Precursor-cDNA und deren abgeleitete Aminosäuresequenz. Die N-terminalen aminosäurereste,
die zuvor durch Proteinsequenzierung
bestimmt wurden, waren identisch mit den aus
der Nukleotidsequenz vorhergesagten Resten
(Aminosäurereste Nummern 21-30). Die potentiellen
Glykosylierungsstellen an den Aminosäureresten
38, 135 und 515 (Doppelstrich) und der
Membranankerbereich am C-Terminus (ausgezogener Strich)
sind angegeben. Ein Polyadenylierungssignal
(AATAAA angegeben in einem Kasten) wurde bei
Position 3847 gefunden, was 50 Basenpaare
Upstream von einem polyadenylierten Bereich
ist.
Fig. 4 zeigt einen Vergleich der vorhergesagten Aminosäuresequenz
des p97-Precursors mit derjenigen
von Human-Serotransferrin (Yang et al., 1984,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2752-2756;
Davis et al., 1985, J. Mol. Biol. 181: 111-121).
Die erhalten gebliebenen Reste wurden eingerahmt.
Die Tyrosin-, Histidin- und Argininreste,
die an der Bindung von Eisen durch
Transferrin beteiligt sind (Mertz-Boutigue et.
al., 1984, Eur. J. Biochem. 145: 659-676) sind
durch einen Stern (*) gekennzeichnet.
Fig. 5 zeigt in Form eines Diagramms ein zweidimensionales
Modell der Struktur von
p97, basierend auf der Anwesenheit von
Cysteinresten, die unter den zur Transferrin-Superfamilie
zählenden Mitgliedern
erhalten geblieben sind. Die drei
potentiellen Glykosylierungsstellen
sind durch Sterne (*) gekennzeichnet.
Die hydrophobe Membranankerdomäne ist
am C-Terminus von p97 (COOH) sichtbar.
Fig. 6 zeigt in Form eines Diagramms die genetische
Struktur von: p97 cDNA-Klonen
und das Fragment des Genomklons Lambda
E7.7, welche zur Konstruktion des p97-
Expressionsvektors verwendet werden;
sowie den pSV2p97a-Expressionsvektor.
Es werden die folgenden Abkürzungen
verwendet: E, EcoRI; P, PvuII; Sal.
SalI; S, SstI; B, BamHI.
Fig. 7 zeigt die Ergebnisse der Gelelektrophorese
bei der Charakterisierung und Immunreinigung
von rekombinantem p97-Protein.
Ein transfektierter CHO-Klon (CHO3+)
und SK-MEL-28 Human-Melanomzellen wurden
mit ³⁵S-Cystein in Gegenwart (+TM) oder
in Abwesenheit (-TM) von Tunicamycin
(TM) markiert. Man gab die Zellen auf
100 mm² Platten und ließ sie nahezu
zusammenfließen. Man entfernte das
Medium und ersetzte es durch 3 ml-cysteinfreies
Medium mit oder ohne Zugabe
von 1 µg/ml-Tunicamycin. Nach
30 Minuten bei 37°c gab man 250 µCi pro ml
L-³⁵S-Cystein (1016 Ci pro Mmol; New England
Nuclear) weitere 6 Stunden zu. Das Ernten der
Zellen, die Herstellung von Zelllysaten, die
Immunpräzipitation und die SDS-PAGE erfolgten
wie oben beschrieben. Die Extrakte wurden
einer Immunpräzipitation mit gegen p97 spezifischen
Antikörpern unterzogen. Die Proteine
wurden mittels SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
(SDS-PAGE) analysiert. (a) Mit
Coomassie blau gefärbtes SDS-Polyacrylamidgel.
Spur 1, Proteinmarker; Spur 2, immungereinigtes
p97 aus transfektierten Maus-B16-Zellen;
Spur 3, SK-MEL 28 Zellen+TM; Spur 4, SK-MEL
28 Zellen -TM; Spur 5, CHO3+ Zellen +TM;
Spur 6, CHO3+ Zellen -TM. (b) Autoradiogramm
des gleichen Gels wie bei (a).
Fig. 8 zeigt die Ergebnisse der Radioimmunpräzipitation
von exprimiertem p97 in transfektierten
Zellen oder in Vp97a-NY-infizierten Zellen.
BSC-Zellen wurden über Nacht mit Vaccinia-Viren
vom Wildtyp oder mit p97-rekombinanten
Vaccinia-Viren infiziert. Diese Viren oder
die transfektierte Zellinie CHO-p97.A wurden
mit ³⁵S-markiertem Methionin und Cystein mit
oder ohne Zugabe von 2 µg/ml Tunicamycin (Sigma)
inkubiert. Sechs Stunden später wurden die
Zellen lysiert, mit monoklonalen Antikörpern
96.5 präzipitiert und durch Elektrophorese an
einem 10%igen Polyacrylamidgel getrennt.
Das Gel wurde über Nacht autoradiographiert.
Die Ergebnisse für die mit Tunicamycin behandelten
Gruppen sind jeweils rechts dargestellt.
Fig. 9 zeigt die Serum-Antikörpertiter von
Mäusen, die mit p97-Vakzinen immunisiert
wurden. Die Werte für Tp97 wurden von
fünf Mäusen erhalten, die mit 5×10⁶
bestrahlten M2svp97a. A. Zellen (syngene
Tumorzellen, die transfektiert wurden
und die Oberflächen-p97 exprimieren) in
komplettem Freund′s-Adjuvans immunisiert
und mit der gleichen Anzahl an
Zellen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung
erneut behandelt wurden. Die
p97-Werte wurden mit einer Gruppe von
fünf Mäusen erhalten, die mit 100 µg gereinigtem
p97-Protein in komplettem
Freund′s Adjuvans immunisiert und mit
50 µg wäßrigem Protein erneut behandelt
wurden. Die Vp97-Werte wurden mit einer
Gruppe von fünf Mäusen erhalten, die
immunisiert und mit 10⁷-Plaque-Forming-units
an Vp97a-NY durch Schwanzskarifikation
erneut behandelt wurden.
Fig. 10 zeigt den therapeutischen Effekt einer
Impfung von Tumor-challenged Mäusen mit
rekombinanten p97-Vaccinia-Viren (Vp97a-NY).
Bei den Mäusen wurde mit 10⁵ oder
10⁴ p97-exprimierenden Tumorzellen
(M2SVp97a.E) intravenös ein Challenge
hervorgerufen. Zwei Tage später wurden
die Mäuse durch Schwanzskarifikation
entweder mit Vp97a-NY oder Vwt-NY inokuliert.
Das Inokulieren mittels
Schwanzskarifikation wurde wöchentlich
wiederholt und die Überlebenszeit der
Mäuse wurde bestimmt.
Die Erfindung betrifft die Herstellung von Vakzinen zur
vorbeugenden Behandlung oder zur Behandlung von Melanomen. Die
Erfindung beruht auf der Beobachtung, daß Melanome Tumor-assoziierte
Zelloberflächenantigene besitzen, wie das p97-
Antigen, die in den Melanomzellen in größeren Mengen vorhanden
sind als in normalen Geweben. Erfindungsgemäß werden die beanspruchten Melanom-
assoziierte p97-Antigene unter Anwendung rekombinanter DNA-
Techniken und/oder chemischer Synthesenmethoden hergestellt.
Die erfindungsgemäßen nicht-denaturierten Melanom-assoziierten
p97-Antigene umfassen Aminosäuresequenzen, die sich
vollständig oder teilweise von der Aminosequenz von p97
herleiten, die im wesentlichen in Fig. 3 gezeigt ist.
Erfindungsgemäße p97-Antigene umfassen die
Aminosäuresequenz der Aminosäurereste 21 bis 738 gemäß
Fig. 3. Sie umfassen von Fig. 3 abgeleitete
Aminosäuresequenzen, die durch Substitution von einem oder
mehreren aminosäureresten innerhalb der Sequenz durch eine
andere Aminosäure ähnlicher Polarität, die als funktionelles
Äquivalent fungiert und deshalb eine "stille" Änderung
bewirkt, abgeändert sind. Substitute für eine Aminosäure
innerhalb der Sequenz kann man aus anderen Mitgliedern der
Klasse auswählen, zu der die Aminosäure gehört. Zu nichtpolaren
(hydrophoben) Aminosäuren zählen beispielsweise Alanin,
Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und
Methionon. Zu polaren,
neutralen Aminosäuren gehören Glycin, Serin, Threonin,
Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Positiv geladene
(basische) Aminosäuren umfassen Arginin, Lysin und Histidin.
Zu negativ geladene (sauren) Aminosäuren zählen Asparaginsäure
und Glutaminsäure. Die erfindungsgemäßen
Peptide, unverändert oder verändert durch Substitution
von Aminosäureresten, können durch Glykosylierung,
Phosphorylierung etc. oder durch chemische Modifizierung
weiter modifiziert oder prozessiert werden. Diese
Peptide kann man als Immunogene in Vakzin-Formulierungen,
die eine Immunantwort gegen die in dem geimpften
Patienten vorhandenen Melanomzellen auslösen, verwenden.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung verwendet man
rekombinante DNA-Techniken, um Nukleotidsequenzen, die für das
p97-Antigen kodieren, in Expressionsvektoren einzusetzen, die
die Expression der p97-Antigene in geeigneten Wirtszellen
steuern. Die für das p97-Antigen codierenden
Nukleotidsequenzen umfassen Nukleotidsequenzen, die von der
vollständigen p97-Nukleotidsequenzen oder von Teilen davon
abgeleitet sind, welche im wesentlichen in Fig. 3 dargestellt
ist. Die erfindungsgemäßen Melanom-assoziierten p97-Antigene
besitzen einen DNA-Code, umfassend die Nukleotide 61 bis 2214
gemäß Fig. 3. Aufgrund der Degeneration des DNA-Codes für
Aminosäuren (d. h. die meisten Aminosäuren können durch mehr
als einen Kodon codiert werden) kann man funktionell
äquivalente Kodons (d. h. unterschiedliche Kodons, die für die
gleiche Aminosäure oder deren funktionelles Äquivalent
codieren) innerhalb der in Fig. 3 gezeigten p97-Sequenz
substituieren, unter der Voraussetzung, daß die Substitution
eine "stille" Änderung ergibt. Die Expressionsvektor-Wirtszellsysteme,
die eine Nukleotidsequenz enthalten, die für
das vollständige p97 oder einen Teil davon codiert, kann man
zur Herstellung größerer Mengen von reinem p97-Antigen invitro
verwenden. In diesem Fall können die Gen-Produkte aus
den Zellkulturen gereinigt und als Immunogene
in Subunit-Vakzinformulierungen verwendet werden. Die Reinigung
des Peptids kann unter Anwendung verschiedener
biochemischer Methoden, einschließlich der
Immunoaffinitätsreinigung unter Verwendung monoklonaler
Antikörper, erfolgen. Daneben kann man die Reinigung der
Peptide durch Modifizierung der DNA-Sequenzen
erleichtern, die für p97-Antigene codieren,
so daß für die Verankerung des Proteins an der Plasmamembran
verantwortlichen Sequenzen entfernt werden, die für
den Transport des Proteins an die Zellmembran verantwortlichen
Sequenzen dagegen nicht entfernt werden. Auf diese Weise
wird ein verkleinertes antigenes Molekül durch die Wirtszelle
in das Kulturmedium sekretiert. Bei p97-
Antigenen, die durch prokaryontische Zellen produziert werden,
kann das Fehlen geeigneter posttranslationaler Modifizierungen
zu einem Antigen-inaktiven Produkt führen, das durch
geeignete chemische oder sonstige Behandlung aktiviert werden
muß.
Bei Ausführungsformen, bei denen der Expressionsvektor ein
Virus ist, kann das Virus selbst als Vakzin formuliert
werden. Man kann dann inaktivierte, rekombinante Virusvakzine
herstellen. Wenn der Expressionsvektor ein infektiöses,
rekombinantes Virus ist, das im Wirt keine Erkrankung verursacht,
kann man entweder eine inaktivierte virale Vakzinzusammensetzung
oder eine Vakzinzusammensetzung auf Basis von
Lebendviren formulieren, wobei diese Zusammensetzungen eine
starke Immunität bewirken. Ein für diesen Zweck besonders
brauchbarer Expressionsvektor ist ein rekombinantes
Vaccinia-Virus, das die erfindungsgemäßen
p97-Antigene exprimiert. Zu diesem Zweck insertiert man eine
Nukleotidsequenz, die für das vollständige p97-Antigen oder
einen Teil davon codiert, in einen Vaccinia-Virusvektor,
der in der Lage ist, die Expression der Sequenz in einem
geeigneten Wirt zu steuern. Die Erfindung betrifft auch die
Verwendung anderer Virusexpressionsvektoren als Vakzine,
insbesondere Adenoviren.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die
von p97 abgeleitete Aminosäuresequenz auf Sequenzen hin
untersucht, und zwar auf der Grundlage von Eigenschaften,
insbesondere der Hydrophilie, welche auf die Anwesenheit
dieser Sequenz an der Oberfläche des Proteinmoleküls und
auf dessen wahrscheinliche Antigenität und/oder Immunogenität
hinweisen. Die p97-Antigene kann man chemisch
synthetisieren und als Immunogene in Vakzin-Formulierungen
verwenden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Produktion
von p97-Antigenen, das auch für andere Zwecke
als für die Vakzinproduktion verwendet werden kann. Die
Peptide kann man zur Immunisierung von Tieren
verwenden, um Antiseren oder monoklonale Antikörper herzustellen,
die für die jeweils interessierenden Melanomzellen
spezifisch sind. Sie können dann als Komponente in Diagnoseassays
oder zur Affinitätsreinigung radiomarkierter, an Arzneimittel
oder Toxine-gebundener Antikörper für die Krebstherapie
verwendet werden.
Die Erfindung wird anhand von Beispielen erläutert, in denen
die Herstellung eines auf p97 basierenden Vakzins gegen
menschliche Melanome beschrieben wird. Die im Rahmen der
vorliegenden Erfindung beschriebenen Methoden und Zusammensetzungen
sind jedoch nicht auf die Konstruktion von Vakzinen
unter Verwendung von p97 beschränkt, sondern sie können auch
auf andere Tumor-assoziierte Antigene angewandt werden.
Nachfolgend wird die Erfindung folgendermaßen beschrieben:
(a) die Nukleotid- und Aminosäuresequenz von p97;
(b) p97-Antigene, die durch chemische Synthesemethoden
hergestellt wurden; (c) p97-Antigene,
die durch Expressionsvektor-Wirtsysteme hergestellt wurden;
(d) immunologische Charakterisierung der p97-Antigene;
und (e) Formulierung von Vakzinen.
Die Nukleotidsequenz des für p97 codierenden Gens und dessen
davon abgeleitete Aminosäuresequenz sind in Fig. 3 gezeigt.
Funktionell äquivalente Sequenzen fallen in den Rahmen der
vorliegenden Erfindung. Dazu zählen, ohne darauf beschränkt
zu sein, Nukleotidsequenzen, die die in Fig. 3 gezeigte
Nukleotidsequenz vollständig oder teilweise umfassen und
die durch Substitution unterschiedlicher Kodone abgeänderten,
welche für den gleichen oder einen funktionell äquivalenten
Aminosäurerest codieren, wodurch eine "stille"
Änderung erzeugt wird. Ferner zählen dazu Aminosäuresequenzen,
die die in Fig. 3 gezeigte Aminosäuresequenz vollständig
oder teilweise umfassen und die durch Substitution
funktionell äquivalenter Aminosäurereste innerhalb der
Sequenz unter Erzeugung einer "stillen" Änderung abgeändert
sind, sowie die beispielsweise durch Glykosylierung, Phosphorylierung
etc. oder durch andere chemische Änderungen
modifizierten oder prozessierten Derivate davon.
In den folgenden Abschnitten werden die Strategie, die zur
Bestimmung der in Fig. 3 dargestellten Sequenz von p97 herangezogen
wurde, sowie alternative Techniken beschrieben,
die zur Bestimmung der Sequenz von p97 oder anderer für
Vakzin-Formulierungen geeigneter Tumorantigene brauchbar
sind.
Die Aktivität und die Aminosäuresequenz des Melanom-assoziierten
p97-Antigens war nicht bekannt; die Identifizierung
des p97-Antigens erfolgte Anwendung monoklonaler Antikörper
gegen p97. Man kann eine Reihe von Methoden zur Erzeugung
monoklonaler Antikörper, die spezifisch auf p97 sind,
verwenden. Beispielsweise kann die von Kohler und Milstein
(1975, Nature 250: 495-497) entwickelte Hybridomtechnik folgendermaßen
angewandt werden: Man immunisiert Mäuse oder
Ratten mit menschlichen Melanomzellen und verschmilzt die
aus den immunisierten Tieren erhaltenen Lymphozyten mit
Myelomzellen; in alternativer Weise kann man Lymphozyten
von Melanompatienten mit Myelomzellen verschmelzen (Cote,
et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026; Haspel et al.,
1985, Cancer res. 45: 3951). Weiter kann man für die Erzeugung
von monoklonalen Antikörpern gegen p97 die Methode zur
Produktion monoklonaler Antikörper unter Verwendung des
Epstein-Barr-Virus einsetzen (Cole et al., 1985, The EBV-
Hybridoma Technique and its Application to Human Lung Cancer,
in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,
Inc., Seiten 77-96). In jedem Fall untersucht man die erhaltenen
Hybridome auf die Produktion von Antikörpern hin, die
an Melanomzellen, nicht aber an normale Zellen binden.
Die oben beschriebenen, gegen p97 gerichteten monoklonalen
Antikörper kann man auf vielfältige Weise benutzen, um die Identifizierung,
Charakterisierung, Klonierung und Expression
von Nukleotidsequenzen zu erleichtern, welche die Herstellung
der p97-Antigene
in großen Mengen erlauben. Beispielsweise kann man die monoklonalen
Antikörper dazu benutzen, das p97-Antigen weiter
zu charakterisieren, indem man alle von der Tumorzelle erzeugten
Proteine radiomarkiert, eine Immunpräzipitation der
Tumorproteine mit den zur Identifizierung des p97-Antigens
eingesetzten monoklonalen Antikörper durchführt und die bei
der Immunpräzipitation gefällten Proteine mittels Gelelektrophorese
fraktioniert. Die Proteinantigene werden als Einzelbanden
auf dem erhaltenen Autoradiogramm identifiziert
(Brown et al., 1980, J. Biol. Chem. 255: 4980-4983).
Monoklonale Antikörper gegen p97 kann man darüber hinaus
zur Erleichterung des Klonierens in folgender Weise verwenden:
(a) zur Immunreinigung von Polysomen, um mRNA-Transkripte,
die in den für das p97-Antigen codierenden Melanomzellen
vorhanden sind, zu identifizieren und zu erhalten;
(b) zur Identifizierung von Klonen in einer cDNA Expressionsbank,
welche die p97-Antigene
exprimiert; (c) zur Reinigung des p97-Antigens, um weitere
monoklonale Antikörper oder Antisera herzustellen, die für
die beiden voranstehenden Anwendungsmöglichkeiten eingesetzt
werden können; oder (d) zur Identifizierung von Zellen, in
die das Gen für das p97-Antigen durch Transfektion eingeführt
worden ist.
Die monoklonalen Antikörper kann man auch zur Erleichterung
der strukturellen und immunochemischen Charakterisierung des
p97-Antigens verwenden, um die extrazellulären und antigenen
Domänen des Moleküls zu identifizieren und das Molekül
zur Aminosäuresequenzanalyse zu reinigen (Brown et al., 1981,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 539-543; Brown et al., 1982,
Nature, London, 296: 171-173).
Die weitere Charakterisierung von p97 umfaßt die Bestimmung
der zellulären Lokalisierung und der Kartierung antigener
Determinanten und funktioneller Domänen. Die subzelluläre
Lokalisierung kann man durch Immunofluoreszenz-Mikroskopie
und durch zelluläre Fraktionierungsexperimente bestimmen.
Antigene, wie p97, die auf der Zelloberfläche vorhanden sind,
sind zur Vakzinherstellung bevorzugt, obwohl auch intrazelluläre
Antigene brauchbar sind. Wenn multiple monoklonale
Antikörper zur Verfügung stehen, können die antigenen Determinanten
durch Kompetitionsexperimente kartiert werden, wobei
jeder Antikörper radiomarkiert und in Kompetition mit jedem
der anderen Antikörper getestet wird. Die Domänen des Moleküls
kann man durch limitierte Verdauung mit Proteasen und
einer anschließenden SDS-PAGE identifizieren. Zusammen sollten
diese Daten die Identifizierung von Bereichen des Moleküls
ermöglichen, die am stärksten immunogen sind. Wenn die monoklonalen
Antikörper durch Immunisierung mit intakten Zellen
erhalten worden sind, dann sind diese Molekülbereiche sehr
wahrscheinlich extrazellulär und zur Vakzinkonstruktion brauchbar.
Die Aminosäuresequenzanalyse ermöglicht die eindeutige Identifizierung
eines Proteins und dessen Vergleich mit anderen
Proteinen (Brown, et al., 1982, Nature, London, 296: 171-173).
Wenn das Protein mehr als 50 Aminosäurereste umfaßt, ist
es möglich, nur einen Teil der Aminosäuresequenz, am häufigsten
den N-Terminus, zu bestimmen. Proteinantigene zur
Sequenzierung von Aminosäuren können aus Zelllysaten durch
Immunoaffinitätschromatographie mit monoklonalen Antikörpern
und anschließend durch präparative SDS-PAGE gereinigt werden.
Die N-terminale Aminosäuresequenz des gereinigten Proteins
bestimmt man dann unter Verwendung eines automatischen Aminosäuresequenzanalysators,
wobei man zur Erzielung größter
Sensitivität vorzugsweise ein Gasphasengerät verwendet.
Erste Klonierungsuntersuchungen befaßten sich mit häufig
vorkommenden Proteinen, wie Globin und Ovalbumin, deren
mRNAs häufig 10 bis 50% der gesamten mRNA ausmachten.
Diese mRNAs konnten bis zur Homogenität durch Größenfraktio
nierung gereinigt werden. Reine cDNA-Sonden wurden dazu ver
wendet, Gen-Banken von mehreren hundert Klonen durch Kolonie-
Hybridisierung zu screenen. Bei Proteinen, deren mRNAs
1 bis 10% der gesamten mRNA ausmachen, kann man die
differentielle Hybridisierung mit zwei cDNA-Sonden verwen
den, wobei eine der cDNA-Sonden die interessierende Sequenz
enthält und die andere als negative Kontrolle fungiert.
Messenger RNAs, die für selten vorkommende Proteine codieren,
(wie Tumor-assoziierte Antigene) und die nur 0,01% der
zellulären mRNA ausmachen, sind wesentlich schwieriger
zu klonen, weil zehntausende von Klonen gescreent werden
müssen und cDNA-Sonden kein spezifisches Hybridisierungs
signal ergeben. Beide Probleme kann man durch Anreichern
der mRNA für die interessierende Sequenz verringern.
Nachfolgend werden einige Möglichkeiten beschrieben, die
zur Klonierung von DNA verwendet wurden, welche für
menschliche Melanom-assoziierte p97-Antigene kodiert. Die
erhaltenen Klone werden analysiert, um ein Klon oder
Klone zu identifizieren, das den gesamten kodierenden Bereich
von p97 überspannt. Die p97-Nukleotid-Insertionen der so
identifizierenden Klone kann man anschließend anhand von
bekannten Methoden sequenzieren. Die verschiedenen Möglich
keiten werden nachfolgend detailliert beschrieben.
Bei dieser Methode werden Polysomen (die aus mRNA, Ribosomen
und naszierenden Polypeptidketten bestehen) gereinigt durch
Immunoaffinitätschromatographie mit Antikörpern, die auf
den naszierenden Ketten vorhandene antigene Determinanten
erkennen. In vielen Fällen erkennen monoklonale Antikörper,
die durch Immunisierung mit intakten Zellen oder Zellextrak
ten erhalten wurden, die Antigene in ihrer nativen Konforma
tion. Es kann jedoch sein, daß die Antikörper nicht zur Poly
som-Immunreinigung geeignet sind, weil die Möglichkeit signi
fikannt ist, daß die erkannten antigenen Determinanten nicht
auf naszierenden Ketten vorhanden sind. Da die Translation
am N-Terminus des Polypeptids beginnt, sind die nahe am
C-Terminus vorliegenden Epitope auf der Mehrzahl der naszie
renden Ketten nicht vorhanden. Dieses Problem vermeidet man
entweder durch Verwendung von Antikörpern, die N-terminale
Epitope erkennen oder durch die Herstellung von Polysomen
aus Zellen, die mit einem Proteinsyntheseinhibitor behandelt
wurden, der die Termination blockiert.
Ein größeres Problem besteht darin, daß die reifen Proteine
sich von den naszierenden Ketten aufgrund post-translationaler
Modifikationen unterscheiden. Dieses Problem ist besonders
akut bei Zelloberflächenproteinen, die durch Entfernung der
Signalpeptide, Anfügen der Kohlenhydratseitenketten und Bil
dung der Disulfidbrücken stärker modifiziert sind. Wenn ein
polyklonales Antiserum zur Polysom-Immunreinigung verwendet
wird, haben die Antigenitätsunterschiede zwischen naszieren
den Ketten und reifen Proteinen geringe Folgen, weil während
der Immunisierung das Kaninchen oder ein anderes Tier nicht
nur dem nativen Problem, sondern auch teilweise oder voll
ständig denaturierten Formen davon ausgesetzt ist, insbeson
dere wenn man Freund's Adjuvans verwendet. Selbst wenn diese
Antikörper nur einen kleinen Teil der Antikörperpopulation
darstellen, können noch immer genügend davon vorhanden sein,
um die naszierenden Ketten zu binden. Die Herstellung polyklo
naler Antiseren gegen in geringen Mengen vorhandene Proteine kann
äußerst schwierig sein. Auch wenn man monoklonale Antikörper
zur Reinigung von Antigenen für weitere Immunisierungen
verwenden kann, ergibt jedes Gramm kultivierter Zellen häufig
nur ein Mikrogramm Antigen. Dies ist zwar zur Immunisierung
mehrerer Mäuse ausreichend, es ist jedoch kaum ausreichend
für ein Kaninchen.
Eine weitere Lösung dieses Problems besteht darin, monoklonale
Antikörper zu erzeugen, die auf naszierenden Ketten
vorhandene antigene Determinanten erkennen, indem man dena
turiertes p97-Antigen als Immunogen zur Herstellung der mono
klonalen Antikörper verwendet. Bei dem erfindungsgemäßen
Beispiel standen eine Reihe monoklonaler Antikörper zur Verfü
gung, welche drei unterschiedliche Epitope an der N-termi
nalen Domäne (mit einem Molekulargewicht von 40 000 Dalton)
des p97-Moleküls erkennen konnten. Es wurde ein Pool mono
klonaler Antikörper verwendet, von denen jeder unterschied
liche Spezifität besaß, in der Erwartung, daß einer oder
mehrere davon an die naszierenden Ketten binden würde. Die
gewählten Antikörper waren insofern hoch spezifisch auf
p97, als jeder davon zu einer Immunpräzipitation einer einzel
nen p97-Bande aus einem radiomarkierten Gesamtzell-Lysat
führte und sie hohe Bindungsaffinitäten besaßen. Zum Klonieren
wurden drei IgG2a-Antikörper gewählt, wobei einer spezifisch
gegenüber jedem der drei Epitope war. Die Erfolgschancen
kann man im allgemeinen erhöhen, indem man mehrere Antikörper
gegen unterschiedliche Epitope einsetzt.
Bei der Verwendung von monoklonalen Antikörpern bleibt die
Frage offen, wie man voraussagen kann, ob ein gegebener
monoklonaler Antikörper oder eine Kombination von Antikörpern
die naszierenden Ketten erkennen wird und somit zur Anwendung
bei der Polysom-Immunreinigung geeignet sein wird. Eine Mög
lichkeit ist zu bestimmen, ob der monoklonale Antikörper
das Antigen immunpräzipitiert, das in das Reticulocyten-Lysat
system translatiert worden ist. Es beruht auf der Annahme,
daß die nicht-prozessierten in-vitro-Translationsprodukte
den naszierenden Ketten ähneln. Eine andere Möglichkeit ist
die Polysom-Immunpräzipitation in geringem Maße durchzu
führen und dann die in-vitro-Translation heranzuziehen,
um zu bestimmen, ob die interessierende mRNA-Spezies ange
reichert worden ist.
Bei der Anwendung der Polysom-Immunreinigung ist es wichtig,
die Reinigung durch Bestimmung der mRNA-Aktivität zu kontrol
lieren. Dies kann durch Translation der mRNA in ein Reticulo
cyten-Lysatsystem und Analyse der Translationsprodukte
mittels SDS-PAGE erfolgen. Auch wenn die Menge an Tumor
assoziierten Antigen als Komponente der Translationsprodukte
der nicht angereicherten mRNA zu gering ist, um unter den
hunderten von häufiger vorkommenden Spezies entdeckt zu
werden, so sollte es dennoch in den Translationsprodukten
nachweisbar sein, die von den angereicherten mRNA-Proben
stammen.
In alternativer Weise kann man das Xenopus oocyt-Transla
tionssystem verwenden, wenn ein sensitiver Immunoassay zum
Nachweis des translatierten, Tumor-assoziierten Antigens
zur Verfügung steht. Für p97 kam zu diesem Zweck ein hoch
sensitiver Doppeldeterminanten-Immunoassay (DDIA) zur Anwendung,
bei dem zwei monoklonale Antikörper eingesetzt werden,
die spezifisch gegen zwei verschiedene p97-Epitope sind.
Zur Polysom-Immunreinigung kann man an Sepharose gebundenes
Protein A verwenden. Das Protein-A-Adsorbens wird bei diesem
Verfahren zweifach angewandt. Die erste Anwendung dient zur
Reinigung der monoklonalen Antikörper aus den rohen Ascites
flüssigkeiten, wodurch die kontaminierende Ribonukleaseaktivi
tät entfernt wird. Das Protein-A-Adsorbens kommt dann in
Verbindung mit den gereinigten Antikörpern zur Immunreinigung
der Polysome, die die spezifische nasierende Kette enthalten,
zur Anwendung.
Die Translation der mRNA in ein Reticulocyten-Lysatsystem
ermöglicht die biochemische Charakterisierung der Transla
tionsprodukte sowie die Bestimmung ihrer Reinheit.
Eine weitere Methode, die erfindungsgemäß zur Klonierung der
cDNA verwendet werden kann, welche für ein Tumor-assoziiertes
Antigen, wie p97, codiert, besteht darin, die Aminosäure
sequenz des Antigens teilweise oder vollständig zu bestimmen
und eine Oligonukleotidsonde zu synthetisieren, die auf der
von der Aminosäuresequenz abgeleiteten Nukleotidsequenz be
ruht. Das Oligonukleotid kann man dann als Primer für die
cDNA-Synthese und als Sonde zum Screening der erhaltenenen
cDNA-Library verwenden. Dementsprechend kann man das Mela
nom-assoziierte p97-Protein aus Lysaten von Melanomzellen
auf einfache Weise mittels Affinitätschromatographie mit
einem spezifischen monoklonalen Antikörper reinigen (Brown,
et al., 1982, Nature, London 296:171-173). Eine für einen
Teil der bestimmten Aminosäuresequenz codierende Nukleotid
sequenz wird dann synthetisiert und kann als Primer und/oder
Sonde verwendet werden. Teile der Aminosäuresequenz,
die Aminosäurereste enthalten, welche durch ein einziges
Kodon oder durch zwei Kodons codiert sind, sind für diesen
Zweck am geeignetsten. Eine Möglichkeit besteht in der
Synthese einer längeren Sequenz, typischerweise 25 bis 60
Nukleotide, die die wahrscheinlichste Kodierungssequenz dar
stellt, basierend auf der bekannten Häufigkeit, mit der ein
Kodon beim Menschen vorkommt. Die Verwendung von zwei synthe
tischen Oligonukleotiden, die auf unterschiedlichen Teilen
der Aminosäuresequenz basieren, erleichtert das Screening
dadurch, daß die Erkennung von pseudo-positiven Hybridisie
rungssignalen ermöglicht wird. Weiter wird das Screening
auch durch Hybridisierungskonditionen erleichtert, die den
Effekt des GC-Gehalts auf den Schmelzpunkt der DNA-Hybride
minimieren. Sobald mit Hilfe dieser Methode ein partieller
cDNA-Klon erhalten worden ist, kann er als Sonde verwendet
werden und dazu beitragen, einen cDNA-Klon voller Länge
zu erzeugen.
Es wurden Klonierungsvektoren entwickelt, die die Expression
der cDNA-Insertion in Bakterien ermöglichen. Eine Möglichkeit
hierfür, die zur Erzeugung von cDNA-Klonen für Tumor-assozi
ierte Proteine, wie p97, verwendet werden kann, ist die Her
stellung einer cDNA-Library durch reverse Transcription der
mRNA (angereichert oder nicht angereichert), die wie oben
beschrieben aus Melanomzellen isoliert wurde, unter Verwen
dung der oben beschriebenen Oligo(T)-nukleotidprimer oder
der synthetischen Oligonukleotidprimer und das Screening
einer derartigen Library mit einem monoklonalen Antikörper
gegen das Melanom-assoziierte p97-Protein. Klone, die DNA
enthalten, welche für Epitope codiert, die durch die mono
klonalen Antikörper in der korrekten Orientierung und im
richtigen Leserahmen erkannt werden, exprimieren
Melanom-assoziierte p97-Antigene.
Man kann sie identifizieren, indem man die durch die Klone
exprimierten Proteine auf ein Nitrozellulosefilter überführt,
das Filter mit dem Antikörper inkubiert und anschließend
mit einem markierten Anti-Immunglobulinreagens entwickelt.
Ein potentielles Problem besteht darin, daß viele monoklonale
Antikörper das durch die Bakterien exprimierte Protein
nicht erkennen, weil in in vielen Fällen nur ein Teil der cDNA
im Insert enthalten und die Bakterienproteine nicht in der
Weise prozessieren, wie eukaryotische Zellen. Dieses Problem
ist besonders akut bei Tumorzelloberflächenproteinen, die
durch Entfernung der Signalpeptide, Anfügung der Kohlenhydrat
seitenketten und Bildung von Disulfidbrücken stärker modi
fiziert sind. Es kann deshalb erforderlich sein, monoklonale
Antikörper zu erzeugen, von denen bekannt ist, daß sie
denaturierte Antigene erkennen oder polyspezifische Antisera
durch Immunisierung mit gereinigten Antigenen erzeugen.
Sobald ein rekombinantes Virus oder Plasmid identifiziert
ist, von dem man annimmt, daß es ein cDNA-Insert enthält,
das sich von einem Melanom-assoziierten p97-Antigen ableitet,
kann man das cDNA-Insert zum Screening weiterer Gen-Banken
verwenden, um entweder Klone voller Länge oder eine Gruppe
von Klonen zu identifizieren, die die volle Länge der für
p97 codierenden cDNA überspannen. Die Identität der klonierten
cDNA kann nachgewiesen werden durch Sequenzanalyse und
Vergleich der hergeleiteten N-terminalen Aminosäuresequenz
mit derjenigen Sequenz, die durch direkte Analyse der Amino
säuresequenz des p97-Proteins bestimmt wurde.
Die folgenden Methoden ermöglichen das Klonieren von DNA
unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen antigene
Determinanten, die nur in nativen Proteinen, nicht aber in
naszierenden Ketten oder in Proteinen, die in Bakterien ex
primiert sind, vorhanden sind. Zu diesem Zweck wird DNA von
humanen Melanomzellen in L-Mäusezellen durch Transfektion
eingeführt. Anschließend werden die Mäusezellen, die das
Melanom-assoziierte p97-Antigen exprimieren, isoliert und
zwar entweder unter Anwendung fluoreszenz-aktivierter Zell
sorter oder durch immunologische Identifizierung von Kolo
nien, die p97-Antigene produzieren unter Einsatz
radiomarkierter monoklonaler Antikörper gegen p97, um zuge
hörige Peptide auf Kolonierepliken, die auf Polyesterfilter
übertragen wurden, nachzuweisen. Es können mehrere Transfek
tionsrunden erforderlich werden, um nicht zugehörige humane
DNA-Sequenzen zu entfernen. Anschließend wird eine Genom-
Library in einem Lambda-phagen-Vektor hergestellt und einem
Screening auf Klone unterzogen, welche humane repetitive
Sequenzen enthalten, die in den Intronen der meisten Gene
auftreten. Sobald ein Genomklon identifiziert ist, kann
dieser als Hybridisierungssonde zur Identifizierung von
cDNA-Klonen verwendet werden, welche die für p97 kodierende
DNA enthalten.
Synthetische Peptide kann man als Immunogene verwenden, um
eine Immunantwort gegen native Proteine auslösen, die
einen Schutz gegen zahlreiche Pathogene darstellen können.
Derartige Peptidsequenzen wählt man aus der bekannten Amino
säuresequenz von antigenen Proteinen durch Identifizierung
von solchen Aminosäurebereichen, die wahrscheinlich auf der
dem externen Medium ausgesetzten Oberfläche des Protein
moleküls vorhanden sind. Dies wird im allgemeinen durch eine
Computeranalyse der Aminosäuresequenz unter Anwendung fest
stehender Hydropathieparameter für die Aminosäuren erreicht.
Weitere Kriterien, wie die vorhergesagte Sekundärstruktur
oder die Flexibilität, kann man ebenfalls verwenden.
Dementsprechend kann man synthetische Peptide mit 5 bis 50
Aminosäureresten des Melanom-assoziierten p97-Proteins in
Tierversuchen (üblicherweise an Mäusen oder Kaninchen) auf
Immunogenität testen. Derartige synthetische Peptide umfassen
(ohne jedoch darauf begrenzt zu sein) die vollständige
und im wesentlichen in Fig. 3 dargestellte Aminosäuresequenz
oder einen Teil davon einschließlich abgeänderter Sequenzen,
wobei funktionell äquivalente Aminosäurereste durch Reste
innerhalb der Sequenz ersetzt sind, was zu einer stillen
Änderung führt und/oder einschließlich modifizierter oder
prozessierter Sequenzen, wie glykolysierter Sequenzen, phos
phorylierte Sequenzen etc. oder chemisch modifizierter
Sequenzen. Diese Peptide verwendet man ent
weder allein oder gekoppelt an ein Trägerprotein, wie das
Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH). Man kann gegebenenfalls
in jedem Fall ein Adjuvans verwenden, die Verwendung eines
derartigen Adjuvans ist bevorzugt. Die immunisierten Tiere
werden geboostet und auf Antikörper gegen das immunisierende
Peptid getestet. Diejenigen Tiere mit Antipeptid-Antikörpern
werden auf Antikörper getestet, die das native p97-Protein
binden. Bei Tumor-assoziierten Antigenen, wie p97, ist es
auch von Interesse, auf eine zelluläre Immunantwort zu testen,
beispielsweise indem man nach einer verzögerten Hpersensi
tivität (DTH), einer antigen-stimulierten Proliferation
in-vitro, cytolytischen T-Zellen oder Tumorabwehr in einem
geeigneten Modell sucht. Ein geeignetes Modell wäre ein
Mäusetumor, der die humanen Tumor-assoziierten Antigene als
Resultat der Transfektion mit einer geeigneten cDNA-Expres
sionsvektorkonstruktion exprimiert.
Ziel ist die Identifizierung von Peptiden, die eine starke
Immunantwort gegen das Melanom-assoziierte p97-Antigen aus
lösen. Sobald diese Peptide identifiziert sind, kann man
sie in großen Mengen anhand bekannter chemischer Synthese
methoden herstellen. Alternativ kann man die identifizierten
Peptide durch Expression der Nukleotidsequenzen, die für
derartige Peptide in Expressionsvektor-Wirtzellensystemen
codieren, in großen Mengen herstellen.
Proteine und Peptide kann man in großen Mengen herstellen,
indem man für Nukleotide codierende Sequenzen in einen geeig
neten Expressionsvektor einführt, welcher wiederum in geeig
nete Wirtszellen eingeführt wird, zu denen Bakterien, Hefen,
Insektenzellen und Säugetierzellen zählen, ohne jedoch darauf
begrenzt zu sein. Bakterielle Wirte besitzen viele Vor
teile, sie prozessieren aber viele eukaryotische Proteine
nicht in geeigneter Weise und sie sind weniger geeignet als
eukaryotische Zellen zur Expression von Tumor-assoziierten
Proteinen. Rekombinante, in Bakterien produzierte Proteine
sind jedoch zur Induktion eines Ansprechens von T-Zellen
brauchbar, weil man annimmt, daß ein derartiges Ansprechen
die ursprüngliche Degradation des antigenen Prozesses erfor
dert.
Um p97-Antigene in einem Vektor-Wirtsystem zu
exprimieren, insertiert man Nukleotidsequenzen, die für das
Melanom-assoziierte p97-Antigen oder einen Teil davon co
dieren, in einen geeigneten Expressionsvektor. Zu derartigen
Nukleotidsequenzen zählt, ohne darauf begrenzt zu sein, die
vollständige, im wesentlichen in Fig. 3 dargestellte
DNA-Sequenz von p97 oder ein Teil davon, einschließlich ab
geänderter Sequenzen, bei denen ein oder mehrere Kodons
innerhalb der Sequenz durch einen Kodon substituiert sind,
der für den gleichen oder einen funktionell äquivalenten
Aminosäurerest codiert, so daß daraus eine neutrale oder
stille Änderung in der Sequenz resultiert. Der Expressions
vektor enthält die erforderlichen Elemente für die Transkrip
tion und Translation der insertierten Protein-codierenden
Sequenz. Diese Elemente variieren hinsichtlich ihrer Stärke
und Spezifität. In Abhängigkeit von dem zur Anwendung kommen
den Wirt-Vektorsystem kann man viele geeignete Transkrip
tions- und Translationselemente einsetzen. Wenn man beispiels
weise in Säugetierzellensystemen kloniert, kann man Promotoren,
die aus den Genom von Säugetierzellen (z. B. Mäuse-Metallothio
neinpromotor) oder aus Viren isoliert wurden, welche in diesen
Zellen wachsen (z. B. Vaccinia-Virus 7.5K-Promotor) verwenden.
Promotoren, die mittels rekombinanter DNA oder syntheti
scher Methoden hergestellt wurden, kann man ebenfalls für
die Transkription der insertierten Sequenzen verwenden.
Spezifische Startsignale sind für die effiziente Translation
insertierter Protein-codierender Sequenzen ebenfalls erfor
derlich. Diese Signale umfassen das ATG-Startkodon und an
schließende Sequenzen. Wenn entweder die Gen- oder cDNA-
Sequenz in einen geeigneten Expressionsvektor insertiert
wird, braucht man keine weiteren Translationskontrollsignale.
Wenn dagegen nur ein Teil der codierenden Sequenz insertiert
wird, müssen ggf. exogene Translationskontrollsignale, ein
schließlich des ATG-Codons, bereitgestellt werden. Der Start
codon muß darüber hinaus in Phase bezüglich des Leserahmens
der Protein-codierenden Sequenzen sein, um eine Translation
der gesamten Insertion sicherzustellen. Die exogenen Trans
lationskontrollsequenzen und Startkodons können natürlicher
und synthetischer Herkunft sein.
Jede dem Fachmann bekannte Methode zur Insertion von DNA-
Fragmenten in einen Vektor kann benützt werden, um
Expressionsvektoren zu konstruieren, die ein Chimärengen
enthalten, das aus geeigneten Transkriptions- und Transla
tionskontrollsignalen und den Protein-codierenden Sequenzen
besteht. Diese Verfahren umfassen in-vitro-rekombinante DNA-
Techniken, synthetische Methoden und in-vivo-Rekombinations
techniken (genetische Rekombinationen).
Expressionsvektoren umfassen, ohne darauf begrenzt zu sein,
die folgenden Vektoren und ihre Derivate: Vaccinia-Viren,
Adenoviren, Insektenviren, Hefevektoren, bacteriophagen
Vektoren und Plasmid-DNA-Vektoren. Die Klonierung und
Expression von Genen im bakteriellen Systemen ist bekannt.
Beispielsweise beim Klonieren in einem E. coli-Stamm, dessen
Bacteriophagen oder Plasmidpromotoren, wie dem lac-Promotor,
trp-Promotor, recA-Promotor, ribosomalem RNA-Promotor, kann
man die PR- und PL-Promotoren des Coliphagen Lambda und
andere einschließlich (jedoch nicht darauf begrenzt)
lacuv5, trp-lacuv5 (tac)-Hybrid-Promotor, ompF, bla, lpp
und dergleichen verwenden, um einen hohen Grad an Transkrip
tion der anschließenden DNA-Segmente zu erzielen. Aufgrund
von Unterschieden zwischen prokaryotischen und eukaryotischen
Zellen beim Prozessieren kann es bevorzugt sein, die erfin
dungsgemäßen p97-Antigene in eukaryotischen
Zellen zu exprimieren. Die gesichertesten Methoden zur Expri
mierung von Proteinen in eukaryotischen Zellen sind (a) Ein
führung des Gens in Zellen zusammen mit einem Gen für Arznei
mittelresistenz und anschließende Selektion mit dem Arznei
mittel, wobei man vorzugsweise eine Amplifikation herbei
führt, wie mit dem Dihydrofolat-Reduktase-Methotrexatsystem;
(b) Expression der cDNA in einem Plasmidvektor, häufig auf
Basis von pBR322, unter Anwendung eines starken eukaryotischen
Promotors und anderer regulierenden Sequenzen;
(c) Expression der cDNA in einem viralen Vektor, der sich
häufig von SV40 ableitet, ebenfalls unter Anwendung starker
Promotoren, in diesem Fall eines SV40-Promotors. Rekombinante
Plasmidvektoren werden häufig zur Produktion von Zellinien
benutzt, die das Protein während eines längeren Zeitraums
erzeugen, wohingegen SV40-Vektoren häufig dazu eingesetzt
werden, um eine kurzzeitige Expression zu erzielen. Auch
wenn Säugetierzellen am häufigsten als Wirt verwendet wurden,
so sind doch auch Insektenzellen und in einigen Fällen Hefe
zellen geeignet. Einige werden unten genauer beschrieben.
Um ein rekombinantes Vaccinia-Virus zu konstruieren, das
das Melanom-assoziierte p97-Antigen exprimiert, wird die
cDNA-codierende Sequenz an den 7.5K-Promotor des Vaccinia-
Virus zur Bildung eines Chimärengens gebunden. Dieses Chi
märengen wird von einer weiteren Vaccinia-Virussequenz flan
kiert, die homolog zu dem viralen Thymidin-Kinasegen ist,
das sich auf dem Plasmid-DNA-Vektor befindet. Die Konstruk
tion des Chimärengens umfaßt die Anwendung natürlicher und
synthetischer Kontrollsignale zur Transkription und Trans
lation der Tumor-assoziierten Antigensequenz. Das Chimären
gen wird dann in die Vaccinia-Virus-Expressionsvektoren
durch in-vivo-Rekombination zwischen dem homologen Thymidin-
Kinasebereich, der auf dem Plasmidvektor und dem Vaccinia-
Virusgenom vorhanden ist, eingeführt. Die das Chimärengen
enthaltenden rekombinanten Viren sind in der Lage, die Ex
pression von p97-Antigenen in einem infizierten
Wirt zu steuern. Sie können als Komponente des Vakzins Ver
wendung finden.
Bei Verwendung eines Adenovirus als Expressionsvektor wird
die interessierende DNA-Sequenz an den Adenovirus-Transkrip
tions-/Translations-Kontrollkomplex gebunden, d. h. an die
späten Promotor- und Tripartit-Leadersequenzen. Das Chimären
gen wird dann in das Adenovirusgenom mittels in-vitro- oder
in-vivo-Rekombination insertiert. Insertion in einen nicht
essentiellen Bereich des viralen Genoms (d. h. Bereich E1
oder E3) ergibt ein rekombinantes Virus, das lebensfähig
und in der Lage ist, P97-Antigene in infizierten
Wirten zu exprimieren. Es gibt zur Zeit zwei zugelassene
Adenovirenstämme (Typ 4 und 7), die als Vakzin für mili
tärisches Personal verwendet werden und die die wichtigsten
Vertreter zur Anwendung als Vektoren sind, um die insertierte
DNA-Sequenz zu exprimieren.
Ein alternatives Expressionssystem, das man zur Exprimie
rung von p97-Antigenen verwenden kann, ist ein
Insektensystem. Bei einem derartigen System verwendet man
Autographa californica Nuclear Polyhedrosius-Virus (acNPV)
als Vektor zur Exprimierung fremder Gene. Dieses Virus wächst
auf spodoptera frugiperda-Zellen. Die interessierende
DNA-Sequenz wird auf die nicht-essentiellen Bereiche des
Virus (beispielsweise das Polyhedringen) kloniert und unter
der Kontrolle eines AcNPV-Promotors (z. B. der Polyhedrin-
Promotor) plaziert. Eine erfolgreiche Insertion der DNA-
Sequenz führt zu einer Inaktivierung des Polyhedringens und
zur Produktion des nicht-occludenten rekombinanten Virus
(d. h. Virus, dem die Proteinhülle fehlt, für die das Poly
hedringen codiert). Diese rekombinanten Viren werden dann
zur Infizierung der Spodoptera frugiperda-Zellen ver
wendet, in denen das insertierte Gen exprimiert wird.
Weiter kann man Stämme an Wirtszellen auswählen, die die Ex
pression der insertierten Sequenzen modulieren oder das Chi
mären-Genprodukt in der gewünschten spezifischen Weise modi
fizieren und prozessieren. Die Expression aus bestimmten
Promotoren wird in Gegenwart bestimmter Induktoren (z. B.
Zink- und Kadmiumionen für Metallothionein-Promotoren)
gesteigert. Die Expression genetisch konstruierter Proteine
kann daher gesteuert werden. Dies ist wichtig, wenn das pro
duzierte Protein des klonierten Gens lethal für die Wirtzellen
ist. Weiter sind Modifikationen (z. B. Glykosylierung,
Phosphorylierung etc.) und das Prozessieren der Proteinpro
dukte, z. B. Spaltung) wichtig für die Struktur und Funktion
des Proteins. Unterschiedliche Wirtszellen haben charakteristi
sche und spezifische Mechanismen für das post-translationale
Prozessieren und die Modifikation der Proteine. Es werden
geeignete Zellinien oder Wirtsysteme gewählt, um eine korrekte
Modifikation und ein korrektes Prozessieren des exprimier
ten fremden Proteins sicherzustellen.
Bei den hier für p97 beschriebenen Ausführungsformen wurden
die p97 cDNA-Sequenz in einen Expressionsplamidvektor gebunden,
der von pBR322 stammt, welches den Metallothioneinpro
motor enthält. Die vollständige Codierungssequenz von p97
einschließlich des Signalpeptids und des Membranankers wurde
in den Vektor insertiert.
Expressionsvektoren kann man anhand von drei allgemeinen
Methoden identifizieren, nämlich durch: (a) DNA-DNA-Hybri
disierung, (b) die Anwesenheit oder das Fehlen von Marker
genfunktionen und (c) Expressionen insertierter Sequenzen.
Bei der ersten Möglichkeit wird die Anwesenheit eines fremden,
in einen Expressionsvektor insertierten Gens durch DNA-
DNA-Hybridisierung unter Anwendung von Sonden nachgewiesen,
welche Sequenzen umfassen, die homolog zu der Fremdgeninser
tion sind. Bei der zweiten Methode wird das rekombinante
Vektor/Wirtsystem identifiziert und selektiert, und zwar
basierend auf der Anwesenheit oder Abwesenheit von bestimmten
"Marker"-Genfunktionen, die durch die Insertion der Gene
in den Vektor (d. h. Thymidin-Kinase-Aktivität, Antibiotikaresistenz,
Transformations-Phenotyp etc.) erzeugt werden.
Wenn beispielsweise das fremde Gen innerhalb der Marker-Gen
sequenz des Vektors insertiert wird, können die DNA-
Insertionen enthaltenden Rekombinanten anhand des Fehlens
der Marker-Genfunktion identifiziert werden. Gemäß der
dritten Methode kann man rekombinante Expressionsvektoren
identifizieren, indem man das durch die Rekombinante expri
mierte Fremdgenprodukt bestimmt. Derartige Assays können
auf den physikalischen, immunologischen oder funktionellen
Eigenschaften des Genprodukts basieren.
Bei der Konstruktion eines erfindungsgemäßen rekombinanten
Vaccinia-Virus insertiert man beispielsweise das Chimärengen,
welches die p97 codierenden Sequenzen enthält, in das Thymi
din-Kinase-Gen, wodurch das Virus inaktiviert und mit einem
TK--Phänotyp versehen wird. Derartige Rekombinanten werden
aufgrund ihrer Fähigkeit selektiert, in einem Medium zu
wachsen, das 5-Brom-deoxyuridin, ein Nukleosidanalogon, ent
hält, das lethal für TK⁺-Zellen, nicht aber für TK--Zellen
ist. Die Rekombinanten werden weiter durch DNA-DNA-Hybridisierung
unter Verwendung einer cDNA-Sonde identifiziert,
die spezifisch auf das Tumor-assoziierte Protein ist. Man
kann TK--rekombinante Viren durch Plaque-Reinigung isolieren
und aus infizierten Zellkulturen einen Vorrat bereit
stellen. Die rekombinanten Viren kann man auf ihre Fähigkeit,
die Synthese der p97-Antigene zu induzieren,
testen. Zu diesem Zweck läßt man infizierte Zellen in Gegen
wart radiomarkierter Aminosäuren wachsen; anschließend testet
man Lysate und subzelluläre Fraktionen der infizierten,
radiomarkierten Zellen mittels Immunpräzipitation mit Anti
körpern gegen native Melanom-assoziierte p97-Antigene. Die
immunpräzipitierten Produkte werden mittels SDS-PAGE aufge
trennt. Die infizierten Zellen können auch durch Immunofluor
eszenz unter Einsatz monoklonaler Antikörper getestet werden.
Zellen, in die ein Plasmidvektor durch Transfektion eingeführt
worden ist, kann man leicht durch FACS-Analyse oder durch
Bindungsassays von Zellkolonien-Replicas am Polyestertuch
identifizieren. Die Menge an vorhandenem
Peptid wird durch quantitativen Radioimmunoassay bestimmt.
Die subzelluläre Lokalisierung des Peptids wird durch zellu
läre Fraktionierung und Immunofluoreszenzmikroskopie be
stimmt. Die Struktur des exprimierten p97-Antigens
kann man mittels SDS-PAGE und Aminosäuresequenzanalyse be
stimmen.
Viele Tumor-assoziierte Antigene, wie p97, sind Zellober
flächenglykoproteine und enthalten ein N-terminales Signal
peptid und ein C-terminales Ankerpeptid (Davis et al., 1985,
J. Mol. Biol. 181: 111-121). Bei der Expression in einem
geeigneten Vektor ist zu erwarten, daß eine Translokation
des Proteins an die Zelloberfläche erfolgt. Zur Erleichterung
der Reinigung des Proteins ist es bevorzugt, die DNA-
Sequenz, die für den Membranankerbereich codiert, zu deletieren,
so daß das reife Protein in das Kulturmedium freige
setzt wird.
Das p97-Antigen kann man aus diesen Wirtszellen
durch Detergens-Lysis und anschließend durch Affinitätschro
matographie unter Anwendung monoklonaler Antikörper reinigen.
Wenn ein verkürztes (truncated) Protein aus dem Kultur
medium gereinigt werden soll, ist es bevorzugt, ein serum
freies Medium einzusetzen und anschließend die Affinitäts
chromatographie mit monoklonalen Antikörpern anzuwenden.
Es ist wichtig, daß das Antigen aus dem Antikörper-Adsorbens,
ohne seine Antigenität zu reduzieren oder es zu denaturieren,
eluiert werden kann. Dies kann durch Erhöhen oder Erniedrigen
des pH′s oder durch Anwendung eines Chaotrops erfolgen.
Es kann erforderlich sein, monoklonale Antikörper zu selek
tieren, die das Antigen unter relativ milden Bedingungen
freisetzen. Das durch Affinitätsreinigung behandelte Antigen
kann durch HPLC weiter gereinigt werden.
Die Fähigkeit des synthetischen oder rekombinanten Antigens,
eine Antitumorantwort auszulösen, kann man zunächst in Tier
versuchen bewerten. Dies erfolgt durch die Konstruktion eines
Modellsystems, bei dem das humane Melanom-assoziierte p97-Protein
in Zellen eines geeigneten, durch Inzucht erzeugten
Stammes der Tiere exprimiert wird. Die Tiere werden dann mit
dem erfindungsgemäßen Peptid nach verschiede
nen Schemata immunisiert und anschließend auf die Entwicklung
von Antikörpern gegen das Melanom-assoziierte p97-Antigen,
auf zellvermittelte Immunität, wie verzögerte Hypersensiti
vität gegen das p97-Antigen und auf ihre Fähigkeiten getestet,
einen Challenge aus lebensfähigen, syngenen Tumorzellen,
die das p97-Antigen exprimieren, abzuwehren. Daneben kann
man in-vitro-Assays der zellulären Immunität durchführen,
um die Lymphozytenproliferation als Antwort auf das
p97-Antigen und um die Fähigkeit der Lympozyten aus
den immunisierten Tieren oder Melanompatienten, die das
p97-Antigen exprimierende Tumorzellen abzutöten, zu bestimmen.
Weiter ist man durch Immunisierung von Mäusen mit Mäuse-
p97 in der Lage zu bestimmen, in welchem Umfang es möglich
ist, eine Immunantwort auf ein Antigen zu induzieren, das
in Spuren in normalen Geweben vorhanden ist.
Primaten, ausgenommen Menschen,
kann man zur Bestimmung der Sicherheit der erfindungsgemäßen
Peptide verwenden. Zu diesem Zweck werden
die Tiere nach Schemata, die auch bei menschlichen Krebs
patienten angewandt werden, immunisiert und anschließend
wie oben beschrieben getestet, wobei jedoch die Tumortrans
plantationsversuche nicht durchführbar sind, weil sie In
zuchtstämme erfordern. Die Sicherheit der Immunisierung wird
bestimmt durch die Beobachtung der Auswirkung der Immunisie
rung auf den allgemeinen Gesundheitszustand der immunisierten
Tiere (Gewichtsveränderung, Fieber, Appetit, Verhalten
etc.) und durch Feststellung der pathologischen Veränderungen
in einer Autopsie.
Schließlich kann das erfindungsgemäße Peptid
an menschlichen Krebspatienten getestet werden. Nach einem
Test in Phase I an Krebspatienten in fortgeschrittenem
Stadium, der dazu dient, das Fehlen von Toxizität festzu
stellen, kann man Krebspatienten testen, die sich in
Remission befinden, bei denen aber ein Wiederauftreten der
Symptome sehr wahrscheinlich ist. Die Immunantwort dieser
Patienten wird wie oben für die Primaten beschrieben bewertet,
wobei jedoch die Auswirkung der Behandlung auf die Krankheit
oder auf die Häufigkeit des Wiederauftretens geprüft wird.
Bei Anwendung des Melanom-Antigens-p97 werden auch benigne
nevi (Moles), die das Antigen exprimieren, untersucht.
Diesem Teil der Erfindung liegt das Ziel zugrunde, mittels
synthetischer oder rekombinanter DNA-Techniken synthetische
Peptide, gereinigte Proteine oder rekombinante Viren zu pro
duzieren, die man Immunogen oder Vakzin zum Schutz von Krebs
patienten mit einem hohen Risiko des Wiederauftretens ihrer
Erkrankung zur Behandlung manifest gewordener Erkrankungen
und zur prophylaktischen Impfung von Risikopatienten verwen
den kann. Das synthetische oder rekombinante Melanom-asso
ziierte p97-Antigen kann man in Kombination mit anderen
Immunogenen zur Herstellung multivalenter Vakzine zur
Prävention vor Melanomen und anderen Krebsarten einsetzen.
Beispiele verschiedener Vakzin-Formulierungen werden nachfolgend
erläutert:
Wenn das erfindungsgemäße Peptid durch rekom
binante Viren produziert wird, ist es möglich, entweder ein
Vakzin auf Basis lebender rekombinanter Viren oder ein
Vakzin auf Basis inaktivierter rekombinanter Viren zu formu
lieren. Die Wahl hängt von der Natur der rekombinanten Viren
ab, die zur Expression des Antigens verwendet
wurden. Wenn die rekombinanten Viren gegenüber dem zu immu
nisierenden Wirt infektiös sind, aber keine Krankheit
verursachen, wird ein Vakzin auf Basis von Lebendmaterial
bevorzugt, weil die Multiplikation im Wirt zu einer längeren
Stimulierung unterschiedlicher Art und Größe - im Vergleich
zu der Stimulierung natürlicher subklinischer Infektionen -
führt. Die Verabreichung eines derartigen Vakzins führt deshalb
zu einer wesentlich länger anhaltenden Immunität. Infek
tiöse rekombinante Viren können nach Einführung in einen
Wirt das Peptid aus dessen Chimärengen expri
mieren und so eine Immunantwort stimulieren. Die lebenden
rekombinanten Viren selbst kann man als Präventivvakzin gegen
Melanome verwenden. Bei der Produktion derartiger in solchen
Formulierungen zur Anwendung kommender, rekombinanter Viren
kann man sowohl von in-vitro-Systemen (z. B. Gewebekulturzellen)
und in-vivo-Systemen (z. B. natürlichen Wirtstieren,
wie Kühen, Gebrauch machen. Herkömmliche Methoden zur Herstellung
und Formulierung von Pockenvakzinen können für die Formu
lierung von Vakzinen auf Basis lebender rekombinanter Viren
angepaßt werden.
Multivalente Lebendvirus-Vakzine kann man aus einem einzigen
oder aus mehreren infektiösen rekombinanten Virenstämmen,
die eine Vielzahl von Antigenen unterschiedlicher Tumor-
oder Krebszellen exprimieren, herstellen. Beispielsweise
kann man Vaccinia-Viren (die ungefähr 35 Kilobasen fremder
DNA umfassen) so konstruieren, daß sie Codesequenzen für
andere Epitope enthalten; derartige rekombinante Viren selbst
kann man als Immunologen in multivalenten Vakzinen einsetzen.
Alternativ ist es möglich, eine Mischung aus Vaccinia-Viren
und/oder anderen Viren, die alle in der Lage sind, die Ex
pression verschiedener Gene, die für verschiedene Epitope
codieren, zu steuern, in einem multivalenten Vakzin zu formu
lieren.
Gleich ob die rekombinanten Viren gegenüber dem zu immuni
sierenden Wirt infektiös sind sind, kann man eine aktivierte
Vakzin-Formulierung herstellen. Inaktivierte Vakzine sind
insofern "tot", als ihre Infektionsfähigkeit im allgemeinen
durch Behandlung mit Formaldehyd zerstört worden ist. Idea
lerweise wird die Infektionsfähigkeit der Viren zerstört,
ohne die Capsid- oder Hüllproteine zu beeinflussen, die die
Immunogenität der Viren tragen. Um inaktivierte Vakzine her
zustellen, müssen große Mengen an rekombinanten Viren in
Kultur gezogen werden, um die erforderliche Menge an rele
vanten Antigenen zu schaffen. Eine Mischung aus inaktivierten
Viren, die verschiedene Epitope exprimieren, kann zur
Formulierung von "multivalenten" Vakzinen verwenden. In einigen
Fällen können diese gegenüber Vakzin-Formulierungen auf
Basis von lebenden Material aufgrund der potentiellen
Schwierigkeiten mit der gegenseitigen Beeinflussung von zu
sammen verabreichten lebenden Viren bevorzugt sein. In jedem
der Fälle sollten die inaktivierten rekombinanten Viren oder
die Mischung an Viren mit einem geeigneten Adjuvans formu
liert werden, um das immunologische Ansprechen auf die Anti
gene zu erhöhen. Geeignete Adjuvantien sind, ohne darauf
beschränkt zu sein, Mineralgele, z. B. Aluminiumhydroxid;
grenzflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin; Pluronic-
Polyole; Polyanionen; Peptide; und Ölemulsionen.
Die Verabreichung der oben beschriebenen Vakzin-Formulierungen
kann auf vielfaltige Weise erfolgen; dazu zählen, ohne
darauf beschränkt zu sein, intradermale, intramuskuläre,
intraperitoneale, intravenöse, subkutane und intranasale
Verabreichung. Bei Anwendung einer Vakzin-Formulierung auf
Basis lebender rekombinanter Viren kann diese auf dem natür
lichen Infektionsweg des Stammvirus (Wildtyp) erfolgen, welcher
zur Herstellung der rekombinanten Viren in der Vakzin-
Formulierung verwendet wurde.
Alternativ zu viralen Vakzinen kann das p97-Antigen
selbst als Immunogen in Subunit-Vakzin-Formulierungen verwendet
werden. Derartige Vakzine umfassen lediglich das zur
Immunisierung eines Wirts erforderliche, relevante immunogene
Material. Dementsprechend kann das p97-Antigen
aus Rekombinanten, die das Peptid exprimieren, gereinigt
werden. Derartige Rekombinationen umfassen alle der zuvor be
schriebenen Virus-infizierten kultivierten Zellen, bakteriellen
Transformanten oder Hefetransformanten. Gemäß einer weiteren
Ausführungsform können die p97-Antigene
auch chemisch synthetisiert sein.
Unabhängig davon, ob die Peptide aus Rekom
binanten gereinigt oder chemisch synthetisiert sind, kann
man die Endprodukte auf eine geeignete Konzentration einstellen
und mit einem geeigneten Vakzin-Adjuvans formulieren
und zur Anwendung verpacken. Geeignete Adjuvantien sind,
ohne darauf begrenzt zu sein: Mineralgele, z. B. Aluminium
hydroxid; grenzflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin;
Pluronic-Polyole; Polyanionen; Peptide; und Ölemulsionen.
Das Peptid kann zur Anwendung in einer Vakzin-
Formulierung auch Liposomen einverleibt werden oder an Poly
saccharide und/oder andere Polymere konjugiert werden.
Wenn das p97-Antigen ein Hapten ist, d. h. ein Molekül,
das dadurch antigen ist, daß es selektiv mit den zur
Erkennung befähigten Antikörpern reagiert, aber nicht immu
nogen ist, weil es keine Immunantwort auslösen kann, kann
man das Hapten kovalent an einen Träger oder an ein immuno
genes Molekül binden. Der Hapten-Träger-Komplex kann dann
zur Anwendung als Vakzin formuliert werden; beispielsweise
ein großes Protein, wie Serumalbumin, verleiht dem Hapten,
an das gekoppelt ist, Immunogenität.
In dem nachfolgend beschriebenen Beispiel werden cDNA-Klone,
die aus unterschiedlichen Bereichen der p97-mRNA stammen,
verknüpft und in einen Expressionsvektor insertiert, der
die Expression eines p97-Antigene steuert. Die
durch die Expressionsvektor-Wirtszelle produzierten Peptide
kann man zu einem Vakzin formulieren.
Polysome werden aus SK-MEL28-Melanom-Zellen (Carey et al.,
1976, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 3270-3282) durch Magne
siumpräzipitation hergestellt. Aus diesem Präparat werden
diejenigen Polysome, die p97-nasierende Ketten tragen, durch
Inkubation mit 3 IgG2a monoklonalen Antikörpern (96.5, 118.1.
133.2), die spezifisch gegen unterschiedliche p97-Epitope
sind, (Brown et al., 1980, J. Biol. Chem. 255: 4980-4983;
Brown et al., 1981, J. Immunol. 127: 539-546; Brown et al.,
1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 539-543; Plowman et al.,
1983, Nature, London 303: 70-72) und anschließend durch
Affinitätschromatographie an Protein-A-Sepharose gereinigt.
Die p97-angereicherte mRNA wird unter Verwendung von EDTA
eluiert und durch Affinitätschromatographie an Oligo(T)-
Cellulose (Bethesda Research Labs, Bethesda MD) gereinigt.
Dabei ergeben 150 E260 Polysomeinheiten 260 ng p97-angerei
cherter mRNA, die 0,23% der gesamten mRNA ausmachen. Bei
Translation in Xenopus Oocyten und Durchführung eines Assays
auf p97 wie beschrieben (Brown et al., 1981, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 78: 539-543; Plowman et al., 1983, Nature,
London 303: 70:72), ergibt die p97-angereicherte mRNA 80 pg
p97 pro mg mRNA, wohingegen p97 nicht angereicherte mRNA
lediglich 0,44 pg p97 pro ng mRNA ergibt. Dies zeigt, daß
die p97 mRNA-Aktivität um das 180fache angereichert ist.
Die Ausbeute an p97 mRNA-Aktivität beträgt 42%. Eine Trans
lation in das Reticulocyten-Lysatsystem (Pelham & Jackson,
1976, Eur. J. Biochem. 67: 247-256) zeigt, die p97-ange
reicherte mRNA, für ein Hauptpolypeptid mit einem schein
baren Molekulargewicht von 84 000 Daltons (bestimmt mittels
SDS-PAGE) codiert, das in den Translationsprodukten nicht
angereicherter mRNA nicht nachzuweisen war und durch ein
Antiserum immunpräzipitiert wird, das spezifisch auf p97 ist
(Fig. 1). Daraus kann geschlossen werden, daß es sich um
den nichtglykolisierten Precursor von p97 handelt.
Die nachfolgend beschriebenen beiden Techniken werden zur
Konstruktion von cDNA-Klonen verwendet, die aus den oben
isolierten mRNA-Templaten transkribiert wurden.
Die wie oben beschrieben hergestellte p97-angereicherte mRNA
wurde als Templat für die Oligo(T)-primierte cDNA-Synthese
verwendet. Die cDNA wurde in pBR 322 folgendermaßen kloniert:
Für die Synthese des ersten cDNA-Strangs wurden p97-angereicherte
mRNA, die vier dNTPs und Oligo(T) (Collaborative Re
search, Walthma, MA) mit reverser Transkriptase (Molecular
Genetic Resources) inkubiert. Der zweite Strang wurde durch
Inkubation mit dem großen Fragment der E. coli DNA-Polymerase
(Bethesda Research Labs, Bethesda MD) synthetisiert. Die
doppelsträngige cDNA wurde mit S1-Nuklease (Geschenk von
D. Durnam of The Fred Hutchinsen Cancer Research Center,
Seattle, WA) digestiert. Mit der cDNA wurde dann ein dC-Tail
ling mit terminaler Deoxynukleotidyl-Transferase (Bethesda
Research Labs, Bethesda, MD) durchgeführt, das Produkt wurde
dann mit PstI-digestiertem, dG-tailed pBR322 (Bethesda Re
search Labs, Bethesda, MD; Villa-Komaroff et al., 1978, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731) verbunden und dazu verwendet,
CaCl₂-behandelte E. coli RR1 zu transformieren. DNA
aus Kolonien transformierter Bakterien wurde an Papier gebunden
(Taub & Thompson, 1982, Anal. Biochem. 126: 222-230) und
einem Screening mittels differentieller Hybridisierung mit
cDNA-Sonden unterzogen, welche aus p97-angereicherten und
nichtangereicherten m RNA-Templaten synthetisiert worden waren.
Es wurde ein 243-Basenpaar (bp)-Klon, p97-3a2f1, identifi
ziert, der zu p97-angereicherter cDNA, in nachweisbarer Weise
aber nicht zu nichtangereicherter cDNA hybridisierte und
der auch p97-mRNA in Hybrid-Selektions-Translations-Experimenten
selektierte. Ein Polyadenylierungssignal (AATAA) und
ein Poly(A)-Trakt waren am 3′-Ende der cDNA vorhanden (siehe
Fig. 2). Nick-translatierte p97-3a2f1 hybridisierte 100fach
stärker zu p97 angereicherter mRNA als zu nicht-angereicherter
Melanom-mRNA und es hybridisiert in nachweisbarer
Weise nicht zu Fibroblasten-mRNA. Mit Hilfe eines
Northern-Blot mit geklonter cDNA als Sonde wurde eine mRNA
mit ungefähr 4 Kilobasen (kb) identifiziert, die in SK-MEL 28
Melanomzellen vorhanden war und in Fibroblasten fehlte.
Versuche, cDNA-Klone zu erhalten, die sich mehr als 1 kb
von der Polyadenylierungsstelle erstrecken, waren nicht erfolgreich,
möglicherweise aufgrund eines Bereiches an hohem GC-Gehalt
(größer als 80%) mit extensiver Sekundärstruktur.
Um dieses Problem zu vermeiden, wurde auf Genom-Klonierung
zurückgegriffen. Vier überlappende Genom-Klone wurden aus
Lambda L47.1-Genbanken isoliert, die größenfraktionierte
SK-MEL-28-DNA, die um ein spezifisches p97-Restriktionsfragment
angereichert war, enthielten. Diese vier Genom-Klone
überspannen 28 kb und enthalten den gesamten Kodierungsbereich
von p97, einschließlich des Gen-Regulationsbereichs.
Die von 5′ nach 3′ sequentiell angeordneten Genom-Klone sind:
Lambda B15, Lambda H17, Lambda B6.6 und Lambda E7.7. Die
Nomenklatur besteht aus einem Buchstaben, der sich auf das
Restriktionssystem bezieht, das zur Erzeugung des Fragments
verwendet wurde. Die Zahl gibt die Kilobasengröße des Fragments
an, das in Lambda-L47.1 kloniert wurde. Ausgehend
vom 5′-Terminus enthält der Lambda-Klon ein 15 kb-BamHI p97-Fragment;
der Lambda-Klon H17 ein 17 kb HindIII p97-Fragment;
der Lambda-Klon B6.6 ein 6.6kb BamHI p97-Fragment und der
Lambda-Klon E7.7 ein 7.7 kb EcoRI p97-Fragment (siehe Fig. 2A).
Die Restriktionsfragmente der Klone, die zu der 4 kb-
p97mRNA im Northern-Blot hybridisierte, waren sequenziert,
und die p97-Exone wurden durch eine Computer-unterstützte
Homologie-Suche zwischen den vorhergesagten Codierungssequenzen
und der Aminosäuresequenz von humanem und Hühner-Transferrin
identifiziert (Yang et al., 1984, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81: 2752-2756; McGillivray et al., 1982, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 79: 2504-2508, Jetsch & Chambon, 1982, Eur.
J. Biochem. 122: 291-295).
Drei synthetische Oligonukleotide, deren Sequenzen auf p97-
Genom-Exonsequenzen basierten, wurden zur Primierung der
cDNA-Synthese an SK-MEL-28-mRNA verwendet. Die erhaltene
cDNA wurde folgendermaßen in Lambda-gt10 kloniert: Die p97-
cDNA wurde einem dG-Tailing unterworfen und mit einem Brückenoligonukleotid
(AATTCCCCCCCCCCCC) und Lambda-gt10, das
mit EcoRI einer Restriktion unterworfen wurde, verknüpft.
Das Brücken (Bridger)-Oligonukleotid ermöglicht hier die
Insertion und die Verknüpfung der dG-tailed cDNA-Sequenz
in die EcoRI-Stelle von Lambda gt10. Der Lambdaphage wurde
verpackt (Grosveld et al., 1981, Gene 13: 227-237) und auf
E. coli c₆₀₀ rk- mK⁺hfl-Platten gegeben. Die cDNA-Genbanken
in Lambda-gt10 wurden auf die p97-Insertion durch Plaque-
Hybridisierung (Benton & Davis, 1977, Science 196:180) mit
Genom-Exon-Fragmenten als Sonden einem Screening unterzogen.
Die Sonden wurden mit ³²P-TTP (New England Nuclear, 3200 Ci/mmole)
durch Nick-Translation auf eine spezifische Aktivität
von 5-10×10⁸ cpm/µg radiomarkiert. Drei überlappende
cDNA-Klone (10a1, lj1, 2f1) die 2368 Nukleotide der p97 mRNA
überspannen, einschließlich des gesamten Kodierungsbereiches,
wurden unter Anwendung von p97-exonspezifischen
Fragmenten als Sonden identifiziert (Fig. 2).
cDNA-Insertionen wurden exzisiert und in den Plasmidvektor
pEMBL18+ (Dente et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11: 1645-1655)
in E. Coli zur anschließenden Propagierung und Restriktionskartierung
subkloniert. cDNA wurde auch in den M13mp18-Phagen-
Klonierungsvektor (Yanish-Perrone et al., 1985, Gene 33:103-119)
subkloniert und unter Anwendung der Dideoxymethode von Sanger
(Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467)
sequenziert. Die M13-Klone, die große Insertionen enthielten.
wurden durch Erzeugung von Deletionen unter Verwendung
von DNAse I (Hong, 1982, J. Mol. Biol. 159: 539-549)
oder Exonuklease III (Henikoff, 1984, Gene 28: 351-359), und
durch Verwendung synthetischer 21mer Oligonukleotide-Primer
sequenziert.
Die p97-cDNA-Sequenz ist in Fig. 3 gezeigt. Ein offener
Leserahmen der 2214 Nukleotide erstreckt sich von der ersten
ATG bis zu TGA bei Position 2215, wobei die Sequenz um
ATG in der von Kozak (Kozak, 1980, Nucleic Acids Res. 8: 127-142)
bestimmten Konsensus-Initiierungssequenz konform ist.
Der Großteil des 5′cDNA-Klons enthält weitere 60 Nukleotide
upstream von der Start-ATG. Der 3′-nicht-kodierende Bereich
der p97-mRNA, der nicht als cDNA-Klon erhalten wurde, wurde
als einzelnes, 1667 Nukleotide enthaltendes Genom-Exon
identifiziert. Die Reste 20-32 der vorausgesagten Aminosäuresequenz
sind identisch mit der bekannten N-terminalen Aminosäuresequenz
von p97 (Brown et al., 1982, Nature, London 296:
171-173), was die Identität des klonierten cDNa zeigt. Weiter
ist das vorausgesagte Molekulargewicht des Precursors von
80 196 Daltons in guter Übereinstimmung mit dem beobachteten
Molekulargewicht des in vitro-Translationsproduktes.
Die Größe des p97-Gens erforderte ein Zusammenstückeln der
cDNA-Klone, die durch spezifisches Priming von Melanom-mRNA
mit reverser Transkriptase erhalten worden sind. Es kamen die
drei cDNA-Lambda gt10-Klone (10a1, 1j1 und 1f1; siehe Fig. 2),
die den kodierenden Bereich von Signalpeptid bis zur Membranaktersequenz
umfaßten, zur Anwendung. Die p97-Insertion
des Klons 10a1 wurde durch Verdauung mit EcoRI exzisiert und
die Oligo(dG)-Sequenz am 5′-Ende von cDNA 10a1 wurde durch
Verdauung mit Exonuklease III entfernt, wodurch der Klon
10a1b mit einer HindIII-stelle 30 bp upstream vom Start-
i Methionin des p97-Präproteins erzeugt wurde. Die p97-Insertionen
der drei cDNA-Klone 10a1b, 1j1, und 2f1 und der Genomklon
E7.7 wurden zusammen an den PvuII, SstI und EcoRI-
Restriktions-Enzymstellen verbunden und in HindIII-EcoRI-Stellen
des Plasmidvektors pEMBL18+ (Dente, et al., 1983, Nuc.
Acid Res. 11: 1645-1655) wie in Fig. 2 gezeigt, insertiert.
Das endgültige Konstruktionsprodukt, p97b, enthält die
4.4 kb p97-Insertion im Plasmidvektor pEMBL18+, der zur Transformation
von E. coli HB101 benutzt wurde. Die Insertion in
p97b enthält 30 bp des 5′-untranslatierten Bereichs von p97-
mRNA, die gesamte kodierende Sequenz, den 3′-untranslatierten
Bereich, der über eine 5′-HindIII-Stelle gebunden ist und
eine 3′-EcoRI-Stelle.
Die 4.4-Kilobasen-p97-Insertion wurde aus p97b mit HindIII
und EcoRI exzisiert. Die Enden wurden unter Verwendung des
Klenow-Fragments von E. coli DNA-Polymerase eingefüllt. das
stumpfendige Fragment wurde in die einzige SmaI-Stelle in dem
eukaryotischen cDNA-Expressionsvektor 1995.12 pUC13,
einem Derivat des Vektors mThGH-112,
(Palmiter et al., 1983, Science 32116 00070 552 001000280000000200012000285913200500040 0002003703702 00004 31997 222: 809-14), der von
Dr. Richard Palmiter (University of Washington, Seattle,
Washington) erhalten worden ist, insertiert. Dieser Vektor
verwendet den Mäuse-Metallothionein-Promotor, um fremde Gene
in eukaryotischen Zellen zu exprimieren. Das Gebilde mit der
p97-Insertion in korrekter Orientierung wurde durch Restriktionsanalyse
identifiziert und als pMTp97b bezeichnet.
Das rekombinante Plasmid wurde in LMTK--Zellen transfektiert.
Die Transfektanten wurden durch Wachstum in HAT-Medium selektiert.
Die Klone wurden von den Transfektionsschalen
in 96-Well-Mikrotestplatten gegeben. Das verbrauchte
Kulturmedium und die Zelllysate aus den Replika-Platten
wurden auf p97 mittels eines zweiseitigen immunoradiometrischen
Assays untersucht. Die Subklone wurden expandiert und
erneut getestet. Die Klon TKMp97-12, der ungefähr 4 000 000
Moleküle p97 pro Zelle exprimiert, ließ man wachsen, man induzierte
ihn mit Kadmium und verwendete ihn als p97-Quelle
für die Immunisierung.
Die TKMp97-12-Zellen ließ man wachsen. Sie wurden mit Kadmium
(14,4 g) induziert und durch 10minütige Inkubation auf Eis
mit 70 ml TNEN (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM
EDTA, 0,5% NP-40) lysiert. Das Lysat wurde bei 200 000×g
45 Minuten bei 4°C ultrazentrifugiert. Die Hälfte des Lysats
wurde über eine 1 ml auf p97-spezifische Immunoaffinitätssäule
(Fab-Fragment des Antikörpers 96.5, gekoppelt an Sepharose)
gegeben. Das Immunoadsorbens wurde ausgiebig gewaschen, zuerst
mit TNEN und anschließend mit 20 mM Tris-HCl, pH 6,8.
Für die Immunisierung wurden 0,5 ml der wie oben beschrieben
hergestellten adsorbierten Immunoaffinitätssäule mit 0,5 ml
20 mM Tris-HCl, pH 6,8 gemischt und mit 1 ml komplettem
Freund's Adjuvans emulgiert. Vier BALB/c-Mäuse erhielten jeweils
0,4 ml der Emulsion intraperitoneal. Drei Wochen später
wurden die Mäuse mit einem Viertel der Antigenmenge in inkompletten
Freund's Adjuvans erneut geimpft. Die Kontrolltiere
wurden mit Antikörpern, die nicht zu p97 gehören und die identisch
behandelt und an einer Immuno-Affinitätssäule adsorbiert
waren, immunisiert. Vier der p97-immunisierten Mäuse und zwei
der Kontrolltiere ließ man eine Woche nach der erneuten
Impfung ausbluten. Die Sera wurden mittels Immunpräzipitation
aus mit Jod radioaktiv markierten SK-MEL-Melanomzellen und anschließend
mittels SDS-PAGE getestet. Die Ergebnisse zeigten,
daß die Sera von den vier p97-immunisierten Mäusen p97 immunpräzipierten,
wohingegen die Sera der Kontrolltiere negativ
waren. Die Sera wurden auch auf die Anwesenheit von Antikörpern
gegen p97 unter Anwendung eines ELISA-Assays an Glutaraldehyd-
fixierten SK-MEL-28-Melanomzellen (20 000 Zellen pro
Mikrotestloch) getestet. Die Zellen wurden mit 0,05 ml Serum,
das im Verhältnis 1/10 000 verdünnt wurde, eine Stunde bei
Raumtemperatur inkubiert, gewaschen und anschließend eine
Stunde bei Raumtemperatur mit 0,05 ml Meerrettichperoxidase-
konjugiertem Ziege-Antimaus IgG (Southern Biotech) inkubiert.
Die optische Dichte der Sera (abgelesen bei 490 nm) der p97-
immunisierten Mäuse war 0,243, 0,343, 0,200, wohingegen die
optische Dichte der Sera der Kontrolltiere 0,036 und 0,057
war.
Die Struktur von p97 wurde aus der Aminosäuresequenz des
p97-Präkursors ermittelt, der vier strukturelle Domänen
enthält. Da der Rest 20 der Prekursorsequenz dem N-Terminus von
reifem p97 entspricht, stellen die Aminosäurereste 1-19 wahrscheinlich
ein Signalpeptid dar, was sich aus dessen Länge
und hydrophober Natur schließen läßt. Die Aminosäuren 20-361
und 362-713 umfassen zwei homologe Domänen von 342 und 352
Aminosäuren. Potentielle N-verknüpfte Glykosylierungsstellen
liegen an den Positionen 38 und 135 in der N-terminalen Domäne
und an der Position 515 in der C-terminalen Domäne vor.
Schließlich wird angenommen, daß die Aminosäuren 714-738, ein
Bereich mit überwiegend ungeladenen und hydrophoben Resten,
p97 in der Zellmembran verankern (Davis et al., 1985, J. Mol.
Biol. 181: 111-121) und sich in das Cytoplasma erstrecken können.
Die Domänenstruktur von p97 wird durch Verdauungsexperimente
mit Protease bestätigt. Die Verdauung von p97 mit Trypsin,
Papain (Brown et al., 1981, J. Immunol. 127: 539-546) oder
Thrombin ergab ein glykosyliertes antigenes Fragment mit einem
Molekulargewicht von etwa 40 000 Daltons. Das Fragment wurde
aus einer Thrombinverdauung von p97, das metabolisch mit
³⁵S-Methionin oder ³⁵S-Cystein markiert wurde, gereinigt und
wie beschrieben sequenziert (Brown et al., 1983, Nature,
London 296: 171-173). Die Cysteinreste wurden an den Positionen
7 und 17 liegend und die Methioninreste an den Positionen 2
und 20 liegend, identifiziert. Identische Ergebnisse wurden
mit intaktem p97 erhalten und stehen in Übereinstimmung mit
der N-terminalen Sequenz von p97, die aus der cDNA-Sequenz vorhergesagt
wurde. Daraus kann geschlossen werden, daß das
Protease-beständige Fragment mit einem Molekulargewicht von
40 000 Dalton der N-terminalen Domäne von p97 entspricht. Es war nicht möglich
die C-terminale Domäne von p97 zu isolieren,
vermutlich weil sie Protease-sensitiv ist.
Eine Recherche der Aminosäuresequenz-Genbank der Protein
Identification Rexource (Release 5,0; Dayhoff et al., 1981,
Nature, London 290: 8) zeigte, daß p97 homolog ist mit den drei
Mitgliedern der Transferrin-Superfamilie: Humanes Serum-Transferrin,
humanes Lactotransferrin und Hühner-Transferrin
(37-39% Homologie; siehe Fig. 4). Da humanes und Hühnertransferrin
zu 50% homolog sind, muß sich p97 aus Serumtransferrin
vor mehr als 300 Millionen Jahren abgezweigt haben. P97 hat
14 Cysteinreste, die in homologen Positionen in jeder Domäne
lokalisiert sind. Humanes Transferrin enthält diese Cysteinreste
in homologen Positionen in beiden Domänen, während humanem
Lactrotransferrin und Hühnertransferrin lediglich zwei
dieser Cysteinreste (in ihren C-terminalen Domänen) fehlen.
Im Gegensatz zu p97 enthalten diese Proteine 4-7 zusätzliche
Cysteine in ihren C-terminalen Domänen, die keinen entsprechenden
Teil in der N-terminalen Domäne haben. Humanes Transferrin
enthält ebenfalls zwei weitere Cysteinreste zusätzlich zu
der N-terminalen Domäne. Die Positionen der meisten Disulfide
in Humanserum-Transferrin, Lactotransferrin und Hühnertransferrin
wurden direkt bestimmt (McGillivray et al., 1982, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 79: 2504-2508; Metz-Boutique et al., 1984,
Eur. J. Biochem 145: 659-676; Mazurier et al., 1983, experientia
(Basel) 39: 135-141; MacGillivray et al., 1983, J. Biol.
Chem. 258: 3543-3553; Williams et al., 1982, Eur. J. Biochem.
122: 297-303; Williams, 1974, Biochem J. 141: 745-752). Man kann
das Vorliegen von 7 Disulfidbindungen in jeder Domäne von
p97 voraussagen (siehe Fig. 5).
Die Aminosäurehomologie der p97-Domänen (46% - erzielt durch
insertion von 7 gaps der 9 Reste) ist stärker als bei Humantransferrin
(43% - 16 gaps, 45 Reste) oder Hühnertransferrin
(35% - 12 Gaps, 49 Reste). Unter der Voraussetzung der extensiven
Sequenzhomologie zwichen p97 und Transferrin und der
offensichtlich ähnlichen Faltungsmuster, basierend auf der
Beibehaltung der Cysteine, kann man annehmen, daß es möglich
ist, die dreidimensionale Struktur von p97 herzuleiten, wenn
die vorhandene Röntgenstruktur von Transferrin mit niedriger
Auflösung (Gorinsky et al., 1979, Natur, London 281: 157-158)
verfeinert werden kann.
Die Zugehörigkeit zu der Transferrin-Superfamilie, die Fähigkeit
Eisen zu binden (Brown et al., 1982, Nature London 296:
171-173) und die übliche chromosomale Lokalisierung mit Transferrin
und dem Transferrinrezeptor (Plowman et al., 1983,
Nature, London, 303: 70-72; Yang et al., 1984, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81: 2752-2756) sprechen dafür, daß p97 eine Rolle
beim Eisentransport spielt. Man nimmt an, daß die Eisenbindungstasche
von Transferrin 2-3 Tyrosine, 1-2 Histidine und
ein einzelnes Bicarbonat-bindendes Arginin (Metz-Boutique et
al., 1984, Eur. J. Biochem. 145: 659-676) entält. Die Beibehaltung
dieser Aminosäuren in p97 bestätigt dessen Rolle beim
Eisenmetabolismus (siehe Fig. 4). Da p97 ein Membran-gebundenes,
Transferrin-ähnliches Molekül ist und zum Transferrinrezeptor
nicht homolog ist (Schneider et al., 1984, Nature,
London, 311: 675-678), ist es möglich, daß sich seine Rolle im
zellulären Eisenmetabolismus von demjenigen Metabolismus unterscheidet,
der sich durch Zirkulieren von Serumtransferrin und
des zellulären Rezeptors für Transferrin ergibt. Die Expression
der klonierten p97-cDNA in eukaryotischen Zellen ermöglicht
die experimentelle Untersuchung seiner funktionellen Eigenschaften.
Auf der Grundlage dieser Daten ist es klar, daß cDNA-Konstruktionen
für Melanom-assoziiertes p97 erhalten wurden und daß
diese effizient in Säugetierzellen exprimiert werden können,
um große Mengen an antigenem p97 zu produzieren.
Die im folgenden näher erläuterten Versuche beschreiben
die Expression von kloniertem p97-Protein und dessen Testung
als Vakzin. Die Expression von p97-Protein in sequentierter
Form (durch den transfektierten Mäusezellklon
B16svp97a.14) ermöglicht die Reinigung von Milligrammengen
an p97-Protein, das die volle Länge besitzt. Das gereinigte
Protein wurde dazu verwendet, in-vitro die Induktion von
zellulärer Immunität und die Wirkung als Subunit-Vakzin
zu testen. Das p97-Genprodukt wurde auch auf der Oberfläche
von metastatischen Murin-Melanomzellen exprimiert. Dadurch
wird ein Modell zum Testen der Wirksamkeit von Vakzinen
bei der Verhinderung des Tumorwachstums in einem syngenen
System zur Verfügung gestellt.
Das p97-Gen wurde in lebende, rekombinante Vaccinia-Viren
zur Anwendung als Vakzin-Formulierung, welche eine effektive
zelluläre Immunität zu erzeugen in der Lage ist, insertiert.
Die Fähigkeit der rekombinanten Vaccinia-Viren Vp97a-NY,
Immunität bei Mäusen zu erzeugen, wurde unter Anwendung verschiedener
Assays zur Demonstration humoraler und zellulärer
Immunität bewertet. Unter Verwendung des oben beschriebenen
syngenen Murin-Tumormodells wurde gezeigt, daß das Vakzin auf
Basis des Vp97a-NY-rekombinanten Virus einen Schutzeffekt
gegenüber einem Tumorzellen-Challenge ausübt. Das Vakzin hat
auch einen therapeutischen Effekt bei Mäusen mit vorhandenen
wachsenden Lungenmetastasen zur Folge. Diese Eigenschaft ist
analog zu dem bei Anwendung des Vakzins erzielbaren immunotherapeutischen
Anti-Tumor-Ansprechen bei menschlichen Melanom-
Patienten mit einem vorhandenen Tumor.
Zusätzlich zu den Untersuchungen an Mäusen mit nur 91%iger
Homologie zwischen Human-p97 und dem homologen Mäuseprotein
(in den bisher untersuchten Bereichen) wurde das Vp97a-NY-
Vakzin auch an nicht-Human-Primaten getestet. Es besteht eine
wesentliche stärkere Homologie zwischen Human-p97 und der bei
Affen auftretenden Form des Proteins (wie durch Kreuzreaktivität
bei monoklonalen Antikörpern gezeigt). Aufgrund der potentiellen
Schwieirigkeit, eine Immunantwort gegen ein "Eigen"-
Protein zu erzeugen, wurden die eng verwandten Makakenaffen
dazu verwendet, die Immunogenität des Vp97a-NY-Vakzins zu
testen. Das rekombinante Vaccinia-Vakzin wurde an Affen getestet,
und es konnte gezeigt werden, daß es humorale Immunität
gegen das p97-Protein induziert. Nach zwei Inoculierungen
mit dem lebenden rekombinanten Vaccinia-Virus waren
während eines Zeitraums von sechs Wochen keine beachtenswerten
Symptome bei den Affen zu beobachten, die auf schädlichen Nebenwirkungen
des Vakzins zurückzuführen wären.
Das durch den frühen SV-40 Promotor sv2 gesteuerte Expressionsplasmid
wurde aus dem cDNA-Plasmidklon p97a konstruiert,
welcher ähnlich dem Plasmid p97b ist, wobei jedoch der gesamte
3′UT-Bereich Anwendung findet (Fig. 6). Alle cDNA-Klone
wurden ursprünglich aus Lambda gt10-Libraries mit synthetischen
EcoRI-dG (9-17)-Linkern wie oben beschrieben isoliert.
Die Insertionen wurden durch EcoRI exzisiert und in
pEMBL18+ zur anschließenden Propagierung und Charakterisierung
subkloniert. Der Klon 10a1 wurde in M13mp18 subkloniert und
eine RF-Form wurde mit BamHI und SphI verdaut, kurz mit Exonuklease
III behandelt, mit S1-Nuklease abgerundet, mit
Klenow behandelt und religiert. Mehrere Plaques wurden isoliert
und sequenziert, eine davon hatte den dG-Schwanz entfernt
und 33 bp des p97 5′-untranslatierten Bereichs, der
in die HindIII-Stelle von M13mp18 insertiert war, beibehalten.
Ein RF dieses Subklons (10a1a) wurde dazu verwendet,
intakte p97 cDNA zu erzeugen; ansonsten wurden alle Fragmente
aus den Plasmid-Subklonen isoliert. Das 550 bp HindIII-PvuII-Fragment
aus 10a1a und das 735 bp PvuII-SalI-Fragment
aus 1j1 wurden aus LMP-Agarose-Gelen isoliert und in pEMBL18+
an den SalI- und HindIII-Stellen unter Erzeugung von p5′p97
ligiert. Der E7.7 Genomklon in pEMBL18+ wurde mit EcoRI
vollständig verdaut und mit SstI teilweise verdaut. Das 4,5 kb-
Fragment wurde mittels Fraktionierung an 0,8% LMP-
Agarose abgetrennt. Das 4,5 kb 3′-Fragment wurde mit dem
404 bp SstI-Fragment aus 2f1 und das 535 bp BamHI-SstI-Fragment
aus 1j1 in pEMBL18+ an den SalI- und EcoRI-Stellen unter
Erzeugung von p3′p97 ligiert. Das 1285 bp HindIII-SalI-Fragment
von p5′p97 wurde anschließend in p3′p97 unter Herstellung
von pp97a ligiert. Das EcoRI-HindIII-Teilfragment
aus diesem Klon wurde in psV2neo (Southern, et al.,
1982, J. Mol. App. Genet. 1: 327-341) an dem HindIII- und
EcoRI-Stellen insertiert, wobei der Neomycin-kodierende Bereich
und die SV40-Spleiß-/polyA-Sequenzen entfernt und der
frühe SV40-Promotor und 72 bp-Enhancer, 33 bp p97 5′UTR,
der vollständige p97-codierende Bereich, 3′-UTR und die
1,4 kb 3′ flankierende DNA beibehalten wurden. Das erhaltene
Plasmid wurde mit pSVp97a bezeichnet.
Das sv2-gesteuerte Plasmid wurde durch Calciumphosphat-Präzipitation
in eine Vielzahl eukaryotischer Zellinien transfektiert.
Die exprimierende Zellen wurden geklont und unter
Anwendung von Co-Transfektion eines dominanten selektierbaren
Markers selektiert. Zu diesem Zweck wurden Ovariumzellen
eines chinesischen Hamsters (CHO) in Hank's Fl-Medium,
das 15% fötales Kälberserum (FCS), 4 mM L-Glutamin, 1,3 mM
Prolin und Antibiotika enthält, kultiviert. B16-Zellen
wurden in RPMI-Medium kultiviert, das 0,15% Bicarbonat und
1735 Zellen in DMEM-Medium (Gibco), beide mit 15% FCS ergänzt,
und Antibiotika enthält. Die Zellen wurden mittels
einer modifizierten Calciumphosphattechnik (Wigler M., et
al., 1978, Cell 14: 725-731) mit 20 µg pro Platte mit
pSV2p97a Plasmid DNA und 0,5 µg psV2DHFR oder pSV2neo
transfektiert. Alle Plasmide wurden an der EcoRI-Stelle
linearisiert. Stabile Transfektanten wurden unter Verwendung
von Hypoxanthin-negativem (HAT-)Medium für CHO-Zellen oder
unter Verwendung von 0,5 µg/ml Geneticin (G418, Gibco) für
B16- und 1735-Zellen selektiert. Die überlebenden Zellen
begannen 7 Tage nach der Transfektion sichtbare Kolonien
zu bilden. Darauf wurden sterile Polyesterfilter gelegt,
die durch Glasperlen fixiert wurden. Die Filter blieben
fünf Tage auf den Kolonien, so daß die Zellen in die
Polyestermatrix wachsen und eine Koloniereplika auf der Platte
erzeugen konnten. Die Filter wurden anschließend entfernt und für
einen Lebendzell-Bindungsassay mit jodiertem anti-p97-monoklonalen
Antikörper verwendet. Zehn µg markierter monoklonar
Antikörper wurden mit bis zu 20 Filtern in 10 ml FCS
bei 4°C eine Stunde inkubiert. Die Filter wurden gründlich
in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, getrocknet
und über Nacht bei -70°C einem SAR-5-Film ausgesetzt.
Die Filter wurden anschließend mit 7%igem Methylenblau
gefärbt, um die Zellkolonien sichtbar zu machen. Bei
allen zur Anwendung gebrachten Zellinien, außer der p16-Mäusezellinie,
enthielten die exprimierenden Zellen antigenes
p97-Protein an der Zelloberfläche.
Bei den B16-transfektierten Zellen wurde p97 in das Medium
freigesetzt. Es handelte sich dabei um einen für diesen Zelltyp
ungewöhnlichen Befund. Die Sekretion von p97 ermöglichte
die Reinigung des p97-Proteins voller Länge aus dem Zellmedium.
Der Klon B16SVp97a.14 exprimierte ungefähr 4 µg/ml
p97 in verbrauchtem Medium. Rekombinantes p97 wurde aus verbrauchtem
Medium des transfektierten Klons B16SVp97a.14,
der große Mengen an p97-Antigen in das Medium abgegeben hat,
gereinigt. Die Zellen wurden nahezu konfluent (10⁹ Zellen)
in 850 cm² Rollflaschen gehalten, indem fortwährend geringe
Mengen an frischem Medium zugegeben wurden. Die Zellen gaben
ohne nachzulassen wochenlang weiteres Antigen ab, so daß
ein fortwährendes Ernten und Abkühlen des verbrauchten Mediums
möglich war. Die Reinigung von p97 erfolgte durch
Immunoaffinitätschromatographie unter Anwendung der an
Sepharose gebundenen Fab-Fragmente der monoklonalen Antikörper
96.5. Zu diesem Zweck wurden drei Liter an verbrauchtem
Medium über drei 30-ml-Säulen geschickt. Die erste Säule
enthielt 15 ml G-25 superfeines Sephadex (Pharmacia), die
zweite enthielt 20 ml Sepharose 4b (Pharmacia) und die
dritte enthielt 8 ml Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose
(Sigma) konjugiert an Fab-Fragmente monoklonaler Antikörper
96.5 (10 mg Protein/ml Sepharose). Anschließend wurde die
Affinitätssäule gründlich mit kaltem PBS gewaschen und das
Antigen wurde mit 30 ml 0,1 M Citrat, pH 5 und 30 ml 0,1 M-
Citrat, pH 4 eluiert. Unter diesen Bedingungen änderte sich
die Immunoreaktivität des Antigens nicht, dagegen erfolgte
eine vollständige Eluierung des Antigens von den monoklonalen
Antikörpern 96.5. Die beiden eluierten Fraktionen wurden
mit 3,0 ml bzw. 4,5 ml 2 M Tris vom pH 8 neutralisiert. Die
gereinigten Eluate wurden unter Verwendung einer Amicon-Vorrichtung
mit einem Pm10-Filter konzentriert und mit zwei
10 ml-Volumina PBS gewaschen, wobei man eine Ausbeute von
4,95 mg in 4,5 ml, bestimmt mittels Bradford-Assay (Biorad),
erhielt. Fünfzehn µg des Produkts wurden an SDS-PAGE entwickelt
(Fig. 7), die Sichtbarmachung erfolgte mittels
Coomassie-Blau- und Silberfärbung. Ein Doppeldeterminanten-
Immunoassay (DDIA) (Brown, et al. 1981, Proc. Natl. Acad.
Sci. 78: 539) lieferte eine unabhängige Bestätigung der molaren
Menge an gereinigten Protein. Kontrollzubereitungen
wurden parallel zu mit verbrauchtem Medium aus der B16-Stammzellinie
hergestellt, Protein war darin nicht nachzuweisen.
In einem weiteren Versuch wurden 30 mg 95%iges p97-Protein
aus 300 mg an Sepharose konjugierten Fab-Fragmente der monoklonalen
Antikörper 96.5 gereinigt. Das gereinigte
p97-Protein war immunogen und führte zu einem starken Ansprechen
auf Antikörper bei Mäusen, die mit dem Protein wie nachfolgend
unter 7.3. beschrieben, immunisiert wurden.
Der codierende Bereich von p97 wurde durch Schneiden von
p97a mit HindIII insertiert, wobei die Enden abgestumpft
wurden, und in den Vaccinia-Insertionsvektor pGS-20 (Mackett
et al., 1984, J. Virol. 49: 857-864) ligiert, der an der SmaI-
Stelle geöffnet worden ist. Der PGS-20-Vektor macht vom
7,5 K-Promotor Gebrauch und enthält flankierende Sequenzen
vom Vaccina-Thymidin-Kinase (TK)-Gen. Ein rekombinantes
Virus wurde mittels des Verfahrens von Mackett et al.,
(siehe oben) erzeugt. Es wurde Vp97a-NY isoliert, das infizierte
Zellen zur Exprimierung von p97-Protein korrekter
Größe und Glykosylierung (Fig. 8) veranlaßt. Die Oberflächenexpression
von p97 wird auch an Zellen bestätigt, die mit
dem rekombinanten p97-Virus (siehe unten) infiziert wurden
(Tabelle I).
¹) Die Zellen wurden kurz trypsiniert, gewaschen und in
aliquoten Teilen auf Röhrchen aufgeteilt, enthaltend
10³-, 10⁴- oder 10⁵-Zellen. Nicht-exprimierende Trägerzellen
wurden zu den Röhrchen mit einer geringeren Anzahl
an Zellen gegeben, so daß insgesamt 10⁵ Zellen pro
Röhrchen vorhanden waren. 1×10⁶ cpm des jodierten
monoklonalen Antikörpers 96.5 (123 ng) wurden in einem
Gesamtvolumen von 50 µl mit den Zellen 60 Minuten in
Eis inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und 4mal
in PBS+10% fötalem Kälberserum zentrifugiert, anschließend
erneut suspendiert und in einer Mikromedic
4/600 plus-gamma Zählvorrichtung gezählt.
(-) bedeutet weniger als.
(-) bedeutet weniger als.
Die Inokulierung von Mäusen mit Vp97a-NY erzeugte ein
starkes humorales Ansprechen gegen Antikörper. Man immuni
sierte die Mäuse einmal, impfte nach vier Wochen ein weiteres
Mal und ließ sie nach fünf Wochen ausbluten. Die Titer
wurden mittels ELISA unter Anwendung von Antigen-beschich
teten Platten und Protein A, konjugiert an Meerrettich-
Peroxidase, als Detektionsmittel bestimmt. Die Daten wurden
in Äquivalente an monoklonalen Antikörpern durch Vergleich
mit einer Standardkurve für das Bindungsverhalten im
ELISA-Test unter Verwendung von anti-p97-monoklonalen
Antikörpern 133.2 umgewandelt. Die Ergebnisse zeigen eine
starke Induktion von Serumantikörpern (Fig. 9). Die
zelluläre Immunität wurde unter Verwendung eines in-vitro-
Proliferationsassays mit gereinigtem p97-Protein als
stimulierendem Antigen bestimmt (Tabelle II).
¹) Milzzellen wurden aus Mäusen isoliert, die durch Schwanz
skarifikation mit 10⁷ pfu an Vp97a-NY rekombinantem Virus
inokuliert, ein Monat später mit der gleichen Dosis erneut
geimpft und eine Woche darauf getötet wurden. Native Milz
zellen wurden bei diesem Versuch als Kontrolle verwendet.
10⁵ Zellen pro Vertiefung wurden in 96-well Rundbodenplatten
in 0,22 ml RPMI, ergänzt mit 0,5% normalem Mäuseserum,
Penicillin/Streptomycin, Glutamin, Bicarbonat und 2,5×
10⁵ M 2-Mercaptoäthanol kultiviert. Die Kulturen wurden
am vierten Tag mit 25 µCi/Vertiefung tritiierten Thymidin
(New England Nuclear) Puls-markiert, mit einem PHD-Cell
harvester geerntet und unter Verwendung eines Optifluors in
einem Beckman LS 3801 counter gezählt. Die Proliferations
indizes wurden berechnet, indem die cpm-Mittelwerte quadrupli
zierter mit jedem Antigen stimulierter Vertiefungen durch
die mittleren cpm-Kontrollwerte (Medien) dividiert werden.
Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt und zeigen,
daß die T-Zellen als Antwort auf das antigene p97-Protein
proliferieren.
Um zu ermitteln, ob auch die Helferzellen durch das rekom
binante Virus in Milzzellen aus immunisierten Mäusen stimu
liert wird, wurden die Zellen in-vitro stimuliert und die
Überstände auf ihre Produktion von Interleukin-2 (IL-2),
einem Helfer-T-Zellfaktor, untersucht. Man kultiviert die
Milzzellen aus Mäusen, die vorher zweimal mit dem rekombi
nanten Vp97a-NY Vaccinia- oder dem Stamm-Vaccinia-Virus immu
nisiert worden sind. 10⁵-Zellen wurden 48 Stunden in 0,2 ml
eines Mediums, das identisch mit dem für die Proliferations-
Assays verwendeten Medium war, in 96-well-Rundbodenplatten
in Anwesenheit oder in Abwesenheit des Stimulationsantigens
inkubiert. Die Überstände wurden gesammelt, diejenigen von
vier Vertiefungen vereinigt und vor dem IL-2-Assay einge
froren. Für den IL-2-Assay verwendete man 10⁴ zuvor IL-2
ausgehungerte Mäuse-T-Zellinie CTLL-Zellen, die in jeder
Vertiefung mit unterschiedlichen Verdünnungen des Assayüber
standes Click's mit Medium dreifach inkubiert wurden. Es wurde
eine Standardkurve mit rekombinantem IL-2 erstellt, das von
Genentech, California, erhalten wurde. Die CTLL-Zellen wurden
mit Thymidin gemäß der üblichen Proliferationsassay-Technik
in den letzten sechs Stunden der 24-stündigen Inkubations
zeit pulsmarkiert, anschließend geerntet und wie oben für
den Proliferationsassay beschrieben, gezählt. Die Ergebnisse
sind in Tabelle III zusammengestellt, sie zeigen, daß die
IL-2-Produktion aus Milzzellen von Mäusen, die mit dem rekom
binanten p97-Vaccinia-Virus immunisiert worden sind, in vitro
durch p97 stimuliert wird.
Darüber hinaus wurde das verzögerte Hypersensitivitäts-
Ansprechen bei mit Vp97a-NY inokulierten Mäusen mit Hilfe
eines Assays, bei dem das Anschwellen der Fußballen bestimmt
wird, gemessen. Fünf Mäuse (C3H/Hen-Stamm) pro Gruppe wurden
durch Schwanzskarifikation mit rekombinanten Vaccinia-Viren
oder mit Vaccinia-Viren vom Elternstamm inokuliert. Sechs
Tage später wurden die Hinterpfoten jeder Maus einem Challenge
durch Inokulierung von 20 µl PBS oder 20-µl-Zellen in PBS
(5×10⁵ Zellen pro Maus) ausgesetzt. Die Pfoten wurden
24 Stunden später in einem Doppelblindversuch, unter Verwen
dung eines Fowler-Mikrometers gemessen. Die Dicke des mit
PBS-injizierten Fußballens wurde von der gemessenen Dicke
des für den Versuch herangezogenen Ballens jeder Maus sub
trahiert. Die mittlere durch Schwellung verursachte Zunahme
des Ballens sowie die Standardabweichung davon wurden be
rechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.
Sie zeigen, daß ein p97-spezifisches verzögertes Hypersen
sitivitätsansprechen bei Mäusen, die mit rekombinanten p97-
Vaccinia-Viren immunisiert sind, erfolgt.
Um die Wirksamkeit des Vakzins zu bestimmen, wurden Mäuse
nach unterschiedlichen Schemata unter Anwendung der er
findungsgemäßen rekombinanten p97-Vaccinia-Viren geimpft
und anschließend einem Challenge mit p97-transfektierten
syngenen Tumorzellen (M2SVp97a.2E) ausgesetzt. Zu diesem
Zweck wurden Mäuse mit Vp97a-NY rekombinanten lebenden
Vaccinia-Viren oder dem elterlichen Stamm (Vwt-NY) durch
Schwanzskarifikation oder mit 100 µg gereinigtem p97-Protein
oder mit 5×10⁶ bestrahlten M2-K1735 Tumorzellen intraperi
toneal in kompletten Freund's Adjunvans immunisiert. Zwei
Wochen nach der letzten Impfung wurde ein intravenöser Tumorzell-
Challenge verabreicht durch Injektion von M2SVp97a.2E,
einem metastatischen Tumorklon, der hergestellt wurde aus
M2-K1735 (einem Murin-Melanom-Modell) durch Transfektion
mit der Human-p97-codierenden Sequenz, die in einem durch
den frühen SV40-Promotor gesteuerten Expressionsplasmid
enthalten ist. Es wurden eine Vielzahl exprimierender Klone
selektiert und der für den Tumorchallenge verwendete Klon
M2SVp97a.2E exprimiert im Durchschnitt ungefähr 400 000
Moleküle p97 pro Zelle oder Äquivalent Human-Melanom-p97-
Antigen-Dichte. Es wurden zwei Dosen intravenöser Tumor-
Challenges verwendet, 5×10⁵ oder 1×10⁵ Zellen, die in
die Schwanzvene syngener C3H/Hen-Mäuse injiziert wurden. Die
Mäuse wurden 16 Tage nach dem Tumor-Challenge getötet, die
Lungen wurden entfernt. Eine Maus wurde als positiv bewertet,
wenn mit bloßem Auge Tumore auf der Lunge, die mit Tusche
angefärbt wurden, sichtbar waren. Die Ergebnisse sind in
der Tabelle V gezeigt.
Die in Tabelle V zusammengestellten Ergebnisse zeigen, daß
ein beträchtlicher Schutzeffekt mit zwei Immunisierungen
mit Vp97a.NY zu erzielen ist. Dagegen ist kein Schutzeffekt
mit gereinigtem p97-Protein-Vakzin (trotz der gefundenen,
extrem hohen Antikörpertiter) zu beobachten. Die Fähigkeit
der rekombinanten Viren, zelluläre Immunität herbeizuführen,
kann für deren Tumorschutzeffekt (Tumorimmunität) verantwort
lich sein.
In einem Therapieversuch wurden Mäuse mit einer niedrigen
Dosis von p97-exprimierenden Tumorzellen und zwei Tage später
mit dem rekombinanten Vaccinia-Vakzin inokuliert. Die Mäuse
wurden intravenös einem Challenge mit 10⁵ oder 10⁴ p97-expri
mierenden Tumorzellen (M2SVp97a.E) ausgesetzt. Zwei Tage
später wurden die Mäuse durch Schwanzskarifikation entweder
mit Vp97a-NY oder Vwt-NY inokuliert. Die Inokulierungen durch
Schwanzskarifikation wurden wöchentlich wiederholt und die
Zahl der überlebenden Mäuse bestimmt. Die Ergebnisse sind
in Fig. 10 dargestellt und zeigen den therapeutischen Effekt
einer Impfung mit rekombinanten p97 Vaccinia-Viren bei Mäusen
mit vorhandenen Lungenmetastasen.
Zwei Macaca fasicularis (Makaken)-Affen wurden entweder
mit 2×10⁸ Plaque-forming-Units (pfu) an Vp97a-NY rekom
binantem Vakzin oder mit der gleichen Dosis Vakzin auf Basis
des elterlichen Stamms skarifiziert. Zwei Wochen später wurden
die Sera mittels ELISA auf Vaccinia- und p97-Titer getestet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengestellt. Sie
zeigen, daß humorale Antikörper gegen p97 zwei Wochen nach
Einzelinokulierung mit Vp97a-NY nachweisbar sind.
Die folgenden E.coli-Stämme, die die dabei aufgeführten
Plasmide enthalten, wurden bei der American Type Culture
Collection ATCC Rockville, Maryland hinterlegt. Sie haben
die folgende Hinterlegungsnummer erhalten:
Die folgenden rekombinanten Vaccinia-Viren wurden bei
der American Type Culture Collection, ATTC, Rockville,
Maryland, hinterlegt. Sie haben die folgende Hinterlegungs
nummer erhalten:
Virus |
Hinterlegungs-Nr. |
Vp 97a-NY |
VR 2159 |
Die folgenden Zellinien, die die dabei aufgeführten Plasmide
enthalten, wurden bei der American Type Culture Collection
ATCC Rockville, Maryland, hinterlegt. Sie haben die folgende
Hinterlegungsnummer erhalten:
Die Erfindung ist nicht auf die hinterlegten Mikroorganismen
und Zellen beschränkt, weil die hinterlegten Ausführungs
formen lediglich beispielhaft sind. Vielmehr zählen alle
funktionell äquivalenten Mikroorganismen-Zellen an der vor
liegenden Erfindung. Weiter zählen zu der Erfindung alle
Modifikationen des Erfindungsgegenstandes.
Die für die Nukleotide angegebenen Größen der Basenpaare
stellen ungefähre Werte dar und sind beispielhaft gebracht.
Claims (32)
1. Nicht-denaturiertes Melanom-assoziiertes p97-Antigen, um
fassend die Aminosäuresequenz der Aminosäurereste 21 bis
738 gemäß Fig. 3, die Bestandteile dieses Anspruchs ist.
2. Antigen nach Anspruch 1 mit dem DNA-Code, umfassend die
Nukleotide 61 bis 2214 gemäß Fig. 3, die Bestandteil dieses
Anspruchs ist.
3. Antigen nach Anspruch 1 oder 2, rein erhältlich aus einer
Zellkultur, die eine kodierende Nukleotidsequenz mit den
Nukleotiden 61 bis 2214 gemäß Fig. 3 enthält, welche
unter der Kontrolle einer zweiten Nukleotidsequenz steht,
die die Genexpression reguliert, so daß das Antigen durch
die Zellkultur exprimiert wird, wobei Fig. 3 Bestandteil
dieses Anspruchs ist.
4. Antigen nach Anspruch 3, wobei die Zellkultur einen Mikro
organismus umfaßt.
5. Antigen nach Anspruch 4, wobei der Mikroorganismus ein
Bakterium ist.
6. Antigen nach Anspruch 4, wobei der Mikroorganismus eine
Hefe ist.
7. Antigen nach Anspruch 3, wobei die Zellkultur eine Tier
zellinie umfaßt.
8. Antigen nach Anspuch 3, wobei die Zellkultur eine Insekten
zellinie umfaßt.
9. Antigen nach Anspruch 1 oder 2 in chemisch synthetisierter
Form.
10. Rekombinantes Virus, dessen Genom die in Fig. 3 gezeigte
Nukleotidsequenz oder einen für ein antigenes Fragment
kodierenden Teil davon umfaßt, die von einer zweiten, die
Genexpression regulierenden Nukleotidsequenz kontrolliert
wird, so daß in einem mit dem Virus infizierten Wirt das
Melanom-assoziierte p97-Antigen oder ein antigenes Frag
ment davon exprimiert wird, wobei Fig. 3 Bestandteil dieses
Anspruch ist.
11. Virus nach Anspruch 10, umfassend ein Virus mit einer Hülle.
12. Virus nach Anspruch 11, umfassend ein Vaccinia-Virus.
13. Virus nach Anspruch 12, umfassend das Virus Vp97a-NY (ATCC
Nr. VR 2159) oder eine Mutante, ein rekombinantes oder
gentechnologisch konstruiertes Derivat davon.
14. Virus nach Anspruch 10, umfassend ein nacktes Virus.
15. Virus nach Anspruch 14, umfassend ein Adenovirus.
16. Virus nach Anspruch 10, umfassend ein Nuclear-Polyhedrosis-
Virus.
17. Virus nach Anspruch 16, umfassend ein Baculovirus.
18. Virus nach Anspruch 10, umfassend einen Bacterio-Phagen.
19. Virus nach Anspruch 18, umfassend einen Lambda-Phagen.
20. Immunogenes Mittel, wobei das Immunogen eine wirksame Dosis
eines Antigens nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in
Kombination mit einem pharmazeutischen Träger umfaßt.
21. Vakzin-Formulierung auf Basis von Lebendviren, enthaltend
ein rekombinantes Virus nach einem der Ansprüche 10 bis
15, wobei das Virus infektiös ist ohne eine Erkrankung bei
dem zu impfenden Wirt zu verursachen.
22. Vakzin-Formulierung auf Basis inaktivierter Viren, enthaltend
eine wirksame Dosis der rekombinanten Viren nach einem
der Ansprüche 10 bis 18 in nicht-infektiösem Zustand,
in Kombination mit einem pharmazeutischen Träger.
23. Rekombinanter DNA-Vektor, umfassend p97b (ATCC Nr. 53 403).
24. Einzelliger Organismus, enthaltend den rekombinanten DNA-
Vektor nach Anspruch 23.
25. Bakterium, enthaltend den rekombinanten DNA-Vektor nach
Anspruch 23.
26. Bakterium nach Anspruch 25, umfassend Escherichia coli
(ATCC Nr. 53 403) oder eine Mutante, ein rekombinantes
oder gentechnologisch konstruiertes Detail davon.
27. Rekombinanter DNA-Vektor, umfassend pMTp97b (ATCC Nr. CRL
8985).
28. Zellinie, enthaltend den rekombinanten DNA-Vektor nach
Anspruch 27.
29. Zellinie nach Anspruch 27, umfassend TKMp97-12 (ATCC Nr.
CRL 8985) oder eine Mutante, ein rekombinantes oder gen
technologisch konstruiertes Derivat davon.
30. Rekombinanter DNA-Vektor, umfassend pSVp97a (ATCC Nr. CRL
9304).
31. Zellinie, enthaltend den rekombinanten DNA-Vektor nach
Anspruch 30.
32. Zellinie nach Anspruch 31, umfassend B16SVp97a.14 (ATCC
Nr. CRL 9304) oder eine Mutante, ein rekombinantes oder
gentechnologisch konstruiertes Derivat davon.
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