NO178931B - Fremgangsmåte for fremstilling av et hovedsakelig rent, terapeutisk aktivt antigent protein, og ekspresjonssystem bestående av et rekombinant virus - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av et peptid eller protein som er beslektet med et melanoma-forbun-det antigen i store mengder via rekombinant-DNA-teknikk. Peptidet eller proteinet kan anvendes som immunogen i en vaksineformulering.

Foreliggende oppfinnelse er belyst ved hjelp av et eksempel hvor det som immunogener anvendes peptider beslektet med p97 som er et monomert celleoverflate-sialoglycoprotein med en tilsynelatende molekylvekt på litt under 97.000 dalton, som er en celleoverflatebestanddel av melanomaceller.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Tumor- assosierte antigener

Arbeid med forsøksdyr, særlig gnagere, har vist at de fleste tumorer som fremkalles av oncogene vira, ved ekspresjon produserer antigener som er innkodet av det virale genom, og at immunisering med disse antigener kan føre til avvisning av en etterfølgende infeksjon méd tumorceller som er fremkalt av samme virus. Skjønt meget av dette arbeide er blitt utført med laboratoriestammer av virus slik som SV40, polyomavirus og Friend, Moloney eller Rauscher murin leukemi-vira, er horison-tal og vertikal transmisjon blitt påvist for oncogene vira i naturen, og faktisk er en vaksine mot virus-ihdusert felin-leukemi og sarcoma nå kommersielt tilgjengelig.

Derimot er det ikke blitt påvist en viral etologi

for de fleste humane cancertyper. Bemerkelsesverdige unntag-elser er hepatitisvirus (hepatoma), herpes simplex virus (cervikal carcinoma) og Epstein Barr virus (nasofaryngeal carcinoma). I løpet av de siste 20 år er det imidlertid blitt fastslått at enkelte humane tumorceller ved ekspresjon frembringer tumorantigener, dvs. antigener som adskiller tumor-cellene fra disses normale cellulære motparter, idet enkelte pasienter opparbeider celle-formidlede eller humorale immunreaksjoner mot disse antigener (Hellstrom et al., 1968, Nature, 220:1352; Morton et al., 1968, Science 162:1279-1281; Shiku et al., 1976, J. Exp. Med. 144:873-881). Enkelte av målene for disse immunreaksjoner er oncoføtale eller differ-ensierende antigener som innkodes av det humane genom (Hellstrom et al., 1970, Int. J. Cancer 6:346-351).

Inntil nylig var den molekylære beskaffenhet av tumorantigenene ukjent, og graden av tumorspesifisitet for de immunologiske reaksjoner var uklar. Forsøk på å utnytte denne informasjon i forbindelse med utvikling av cancer-diagnostiske prøver eller cancerterapi har stort sett vært forgjeves. Da spontane tumorregresjoner er ekstremt sjeldne, kan det også konkluderes med at de in vitro påviste immunreaksjoner er virkningsløse in vivo da eksempelvis antistoffer og lymfocytter tilveiebragt fra en cancerpasient, kan være effektive til bekjempelse av tumorceller in vitro, har immunreaksjonen hos samme cancerpasienter ingen virkning in vivo.

Kohler og Milsteins innføring av den monoklonale antistoffteknikk (1975, Nature 256:495-497) førte til for-sterket søken etter humane tumorantigener, da denne teknikk gjorde det mulig å definere slike antigener både på molekylært nivå og med hensyn til spesifisitet (Hellstrom og Brown,

1979, i "The Antigens", M. Sela, red., Academic Press,

bind V:1-66). I løpet av de senere år er det beskrevet et stort antall tumor-assosierte antigener hvorav de fleste er definert ved hjelp av monoklonale museantistoffer (Reisfeld og Seil, red., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,

UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series,

bind 27, Alan R. Liss, Inc., New York, 1985, s. 1-609).

Skjønt praktisk talt alle de antigener som er blitt grundig karakterisert, har vist seg å være oncoføtale eller differ-ensierende antigener, og skjønt disse antigeners spesifisitet overfor tumorer har vist seg å være kvantitativ snarere enn kvalitativ, er adskillige antigener tilstrekkelig spesifikke overfor neoplastiske celler sammenlignet med normale celler (i alminnelighet svarende til en faktor på 10-1000 ganger) til å bli anvendt som potensielle mål med henblikk på identifisering av tumorceller, og til terapi. Monoklonale humane antistoffer overfor tumorantigener er også blitt oppnådd (Cote et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. 80:2026-2030). Oppnåelse av disse antistoffer understøtter det ovenfor angitte tegn på at enkelte cancerpasienter opparbeider en immunreaksjon overfor deres tumorer.

Mer enn halvparten av de hittil identifiserte tumor-assosierte celleoverflateantigener er proteiner eller glyco-proteiner som er innkodet av det humane genom (snarere enn av endogene eller exogene vira), idet de resterende antigener er glycolipider som stammer fra abnorm ekspresjon eller reguler-ing av glycosyltransferaser.

Melanoma- assosiert p97 antigen

p97-antigenet er et tumor-assosiert antigen som først ble identifisert i human melanoma ved anvendelse av monoklonale antistoffer (Brown et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:4980-4983; Dippold et al., 1980, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77:6114-6118; Woodbury et al., 1980, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77:2183-2187). p97-antigenet har vært underkastet grundig undersøkelse med hensyn til ekspresjonen derav i normale og neoplastiske vev og er til stede i de fleste humane melanomaer og i visse føtalvev, men finnes kun i spormengder i normalt voksent vev (Brown et al., 1981, J. Immunol. 127:539-546; Brown et al., 1981, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78:539-543; Garrigues et al., 1982, Int. J. Cancer 29:511-515). p97 har vært anvendt som et mål for diagnostisk avbildning av melanomaer ved kliniske forsøk på mennesker (Larson et al.,

1983, J. Clin. Invest., 72:2101-2114).

p97 er et monomert celleoverflate-sialoglycoprotein med en tilsynelatende molekylvekt (MW) ifølge måling ved natrium-dodecylsulfatpolyacrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) på litt under 97.000 dalton. Monoklonale antistoffer har definert tre betydningsfulle antigene seter som finnes på et stabilt 40.000 dalton tryptisk fragment (Brown et al., 1981, J. Immunol. 127:539-546), men den komplette p97-sekvens er ikke blitt beskrevet. Minst to andre uavhengig karakteriserte humane melanoma-assosierte antigener gp95 (Dippold et al., 1980,

Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77:6114-6118) og gp87 (Khosravi et al., 1985, Int. J. Cancer 35:73-80) synes identiske med p97 ifølge analyse ved sekvensvis immunoutfelling.

N-terminalaminosyresekvensen av p97 er homolog med transferrin, og som transferrin binder p97 jern (Brown et al., 1982, Nature, London, 296:171-173). Analyse av somatiske cellehybrider og in situ hybridisering har vist at p97-genet som genene for transferrin og transferrinreseptor er lokalisert i kromosomområdet 3q21-3q29 (Plowman et al., 1983, Nature, London, 303:70-72; Yang et al., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:2752-2756). Disse iakttagelser antyder at p97 spiller en rolle i jernmetabolismen.

Cancervaksiner

Undersøkelser med forsøksdyr, vanligvis mus, har vist at immunisering med levende eller drepte cancerceller kan føre til avvisning av en etterfølgende infeksjon med levende cancerceller. Forsøk på å immunisere med cellefritt materiale har i alminnelighet vært mindre vellykket, men enkelte gunstige resultater er beskrevet. (For en redegjørelse av dette hen-vises det til Hellstrom og Brown, 1979, i The Antigens, M. Sela red., Academic Press, bind V:1-66). I mange tilfeller har de for de beskyttende virkninger ansvarlige målantigener vært viralt innkodet, men i mange andre tilfeller er arten av det antigen som fremkaller en beskyttende immunreaksjon, ukjent.

Undersøkelser av mennesker er langt mer vanskelig, og effektiviteten av cancervaksiner er bestridt til tross for enkelte rapporter om suksess. I mange tilfeller har vaksine-preparatene bestått av bestrålte tumorceller eller tumorceller som er drept ved å være utsatt for visse kjemiske midler. Da rene humane tumor-assosierte antigener ikke har vært tilgjengelige, er det ingen rapporter om anvendelse herav i vaksiner.

En teoretisk hovedinnvending mot den foreslåtte anvendelse av cancervaksiner til mennesker er at mennesker som er "vaksinert", f.eks. med drepte cancerceller eller cellefrie preparater, vil være immunologisk passive da tumorantigenene, som kan være målene for immunreaksjonen, er til stede kun i spormengder i enkelte normale celler og således vil være opp-fattet av immunsystemet som "ens eget jeg". De fleste, om ikke alle, tumor-assosierte antigener som påvises i humane tumorer ved hjelp av monoklonale antistoffer, finnes også i enkelte normale vev, og det er bare små tegn på at cancerpasienter reagerer effektivt på dette in vivo. Det er tegn på at suppressorceller spiller en hovedrolle i nedreguleringen av immunreaksjonen overfor tumorantigener (Nepom et al.,

1983, Experientia, 39:235-242). Enn videre kan en suppressor-cellereaksjon som er fremkalt av et sett tumorantigener, mot-virke fremkallelse av en effektiv tumor-ødeleggende reaksjon på et annet sett tumorantigener som i seg selv ikke ville fremkalle suppresjon (Hellstrom et al., 1983, i Biomembranes,

A. Nowotny red., Plenum Press, s. 365-388).

Rekombinante DNA- teknikker og vaksinevirus

Anvendelse av rekombinant-DNA-teknologi for fremstilling av subelementvaksiner til beskyttelse mot infeksjoner omfatter molekylær kloning og ekspresjon i en passende vektor med genetisk informasjon som koder for proteiner som kan fremkalle en immunreaksjon mot proteinet i vertsdyret. Nylig er en hittil ukjent fremgangsmåte blitt beskrevet, hvilken fremgangsmåte er potensielt nyttig ved fremstilling av subelementvaksiner (Mackett et al., 1982, Proe. Nati. Acad. Sei., 79:7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Virol., 49:857-864;

D. Panicali, og E. Paoletti, 1982, Proe. Nati. Acad. Sei., 79:4927-4931). Denne fremgangsmåte omfatter anvendelse av vaccinia-virus som en vektor til ekspresjon av fremmede gener som er innføyet i dets genom. Etter innføring i vertsdyr underkastes det innføyede fremmede gen i omhandlede rekombinant-vaccinia-virus ekspresjon, og fremkaller derved en immunreak-

sjon overfor slike genprodukter hos verten. Da levende rekombinant-vaccinia-virus kan anvendes som vaksine, kombinerer denne fremgangsmåte fordelene ved både subelementvaksiner og levende vaksiner.

Vaccinia-virus inneholder et lineært dobbeltstrenget DNA-genom bestående av ca. 187 kilobase par og replikerer inne

i infiserte cellers cytoplasma. Disse vira inneholder et komplett transkripsjons-enzymsystem (herunder kappe-dannende-methylerende og polyadenylerende enzymer) inne i viruskjernen, hvilket system er nødvendig for virusinfeksjonsevnen. De transkripsjonsregulerende sekvenser (promotorer) hos vaccinia-virus tillater initiering av transkripsjon ved hjelp av vaccinia RNA-polymerase, men ikke ved hjelp av vertcelle-RNA-polymerase.

Ekspresjon av fremmed DNA i rekombinant-yaccinia-vira krever ligering av vaccinia-promotorer til protein-kodende DNA-sekvenser av det fremmede gen. Til innføyelse av kimære

gener i vaccinia-virus er det blitt konstruert plasmidvektorer som også kalles innføyelsesvektorer. En innføyelsesvektortype er sammensatt av: (a) en vaccinia-virus-promotor som omfatter et transkripsjons-initieringssete, (b) forskjellige entydige restriksjonsendonuklease-kloningsseter som befinner seg på nedstrømssiden av transkripsjonsstartsétet for innføyelse av fremmede DNA-fragmenter, (c) ikke-essensiell vaccinia-virus-DNA (slik som TK-genet), som flankerer promotoren og kloningssetene, og som dirigerer innføyelsen av det kimære gen i det homologe ikke-essensielle område av virusgenomet,

og (d) en bakteriell replikasjonsopprinnelse og antibiotisk resistensmarkør til replikasjon og utvelgelse i E. coli.

Eksempler på slike vektorer er beskrevet av MacKett (Macket

et al., 1984, J. Virol. 49:857-864).

Rekombinant-vaccinia-vira produseres ved transfeksjon med bakterielle innføyelses-rekombinantplasmider inneholdende det fremmede gen, av celler, som på forhånd er infisert med vaccinia-virus. Homolog rekombinasjon finner sted i de infiserte celler og resulterer i innføyelse av fremmed gen i det virale genom. De infiserte celler kan screenes under anvendelse av immunologiske metoder, DNA-plakk-hybridisering eller genetisk utvelgelse med hensyn til rekombinant-vira som deretter kan isoleres. Disse vaccinia-rekombinanter bibeholder deres essensielle funksjoner og infeksjonsevne og kan inn-rettes til å romme ca. 35 kilobaser av fremmed DNA.

Fremmed genekspresjon kan påvises ved hjelp av enzymatiske eller immunologiske prøver (f.eks. immunoutfelling, radioimmunoprøving eller immunoblotting). Naturlig forekommende membranglycoproteiner produsert av rekombinant-vacciniainfiserte celler, glycolyseres og kan transporteres til celleoverflaten. Det kan oppnås høye ekspresjonsnivåer ved å anvende sterke promotorer eller ved kloning av et antall kopier av et enkelt gen.

Sammendrag av oppfinnelsen

I det foreliggende er det beskrevet ekspresjons-systemer som kan anvendes til å fremstille et protein som kan fremkalle en immunreaksjon som selektivt destruerer melanomaceller i vaksinerte individer. Nærmere bestemt omfatter ekspresjonssystemene ifølge oppfinnelsen en DNA-sekvens som koder for et immunogen som fremkaller en immunreaksjon som er rettet mot et melanoma-assosiert antigen slik som det melanomaassosierte p97-antigen. Immunogenet i en "sub-element-vaksine" omfatter eksempelvis et peptid eller protein som er beslektet med p97 og som kan formuleres med en passende adjuvans. Slike peptider eller proteiner omfatter aminosyresekvenser som stammer fra hele eller en del av aminosyresekvensen av p97 slik som den i alt vesentlig er avbildet i figur 3, men ikke begrenset til endrede aminosyresekvenser hvori aminosyrerester er erstattet med funksjonelle ekvivalente, aminosyrerester, for oppnåelse av en passiv forandring og/eller modifiserte eller behandlede aminosyresekvenser som f.eks. glycosylerte aminosyresekvenser, fosforylerte aminosyresekvenser, etc, eller kjemisk modifiserte aminosyresekvenser. I det følgende vil peptider eller proteiner ifølge oppfinnelsen som er beslektet med det melanoma-assosierte p97-antigen, uansett om de er endret, uendret, modifisert eller umodifisert, bli betegnet som "p97-beslektede peptider". Når det p97-beslektede peptid er et hapten (dvs. antigent, men ikke immunogent), kan haptenet konjugeres med et bærermolekyl som bibringer immunogenitet.

Oppfinnelsen angår således en fremgangsmåte for fremstilling av et i alt vesentlig rent, udenaturert, terapeutisk aktivt, antigent p97-protein med en aminosyresekvens som i alt vesentlig omfatter den i figur 3A og 3B avbildede aminosyresekvens fra aminosyrerest nr. 21 til 738, eller en antigen del derav, hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved at en celle transformeres med en ekspresjonsvektor som inneholder nukleotidsekvensen i figur 3A og 3B fra nukleotid nr. 60 til 2214, og en promoter som regulerer genekspresj onen slik at det antigene p97-protein produseres ved ekspresjon av den genetisk manipulerte, dyrkede vertscelle, hvoretter det udenaturerte, antigene p97-protein renses. Når de p97-beslektede peptider fremstilles ved å anvende rekombinant-DNA-

teknikk, innføyes en nukleotidsekvens som innkoder hele p97

eller en del derav i en rekombinant-ekspresjonsvektor slik som et virus eller et plasmid som i en passende vert kan lede ekspresjonen av et p97-beslektet peptid som kan renses fra dyrkningsmediet. Den innsatte nukleotidsekvens stammer fra hele

eller deler av p97-sekvensen slik som den i alt vesentlig er avbildet i figur 3, men ikke begrenset til nukleotidsekvenser hvori funksjonelt ekvivalente nukleotidkodoner erstatter kodoner i sekvensen for oppnåelse av en passiv forandring, hvilket med andre ord vil si at kodoner i den i figur 3 avbildede sekvens kan erstattes med avvikende kodoner som koder for samme aminosyre, eller med en funksjonell ekvivalent derav. Når det anvendes en plasmid-ekspresjonsvektor, foretrekkes en vektor som er egnet til ekspresjon i eukaryotiske celler, men en prokaryotisk ekspresjonsvektor kan også an-

vendes.

Oppfinnelsen angår enn videre et ekspresjonssystem bestående av et rekombinant virus som ved fremgangsmåten dirigerer ekspresjonen av et antigent peptid eller et protein beslektet med det melanoma-assosierte p97-antigen, eller et antigent protein derav, i en vertcelle som er infisert med angjeldende rekombinant-virus, hvilket system er kjennetegnet ved at et rekombinant-virus-genom omfatter en nukleotidsekvens som koder for et antigent peptid eller protein som er beslektet med det melanoma-assosierte p97-antigen, eller en antigen del derav, hvilken nukleotidsekvens er under kontroll av en promoter som regulerer genekspresjonen således, at et peptid eller et protein beslektet med det melanoma-assosierte p97-antigen dannes ved ekspresjon i den infiserte vertcelle, og hvor nukleotidsekvensen som innkoder det antigene peptid eller ° protein som er beslektet med det melanoma-assosierte p97-antigen, i alt vesentlig omfatter den i figur 3A og 3B avbildede nukleotidsekvens, eller en del derav, som koder for et antigent peptid eller protein.

Eksempelvis kan vaksineformuleringene med hensyn til effektivitet vurderes i dyremodeller, først ved hjelp av gnagere, deretter i ikke-humane primater, og til slutt i mennesker, fortrinnsvis i pasienter som er i delvis bedring, men hvor muligheten for tilbakefall er høy som følge av mikrometastaser.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 avbilder en autoradiograf av SDS-PAGE-oppløste, cellefrie translasjonsprodukter av p97-mRNA. I figur IA forestiller spor 1 translasjonsproduktene av p97-anriket mRNA,

mens spor 2 forestiller translasjonsproduktene av uberiket mRNA, idet hvert spor stammer fra 0,5 ul totalt inneholdende 5 ng mRNA-translasjonsprodukter. I figur IB forestiller spor 1 translasjonsproduktene av p97-anriket mRNA, mens spor 2 forestiller translasjonsproduktene av uberiket mRNA, idet hvert spor stammer fra 5 ul translasjonsprodukter av 5 ng mRNA som er immunoutfelt med anti^p97-serum.

Figur 2 er en diagrammessig angivelse av strukturen p97-mRNA. Arrangementet av det kodende område (fra signal-sekvensen til ankersekvensen) og det ikke-kodende område

(3'UT) såvel som den duplikerte områdestruktur av p97-forløperen (åpen bjelke) er angitt. Plasseringen av forskjellige restrik-sjonsenzymgjenkjenhelsessekvenser er indikert ovenfor mRNA.

De relative posisjoner av fire cDNA-kloner er angitt nedenfor mRNA-strukturen. cDNA-klonet p97-3a2fl (3a2fl) ble isolert fra et cDNA-bibliotek hvor cDNA var transkribert på oligo(T)-primet p97-beriket mRNA og klonet i pBR322, mens cDNA-klonene p97-2fl (2fl), p97-ljl (ljl) og p97-10al (10al) ble isolert ved å prime cDNA-syntese med oligonukleotider som innkoder p97-exonsekvenser, og klone de resulterende cDNA-fragmenter i lambda-gtlO. Figur 2A er en diagrammessig angivelse av genomkloner B15, H17, B6.6 og E7.7 som ble klonet i lambda L47.1. Figur 3 forestiller nukleotidsekvensen av human p97-forløper-cDNA og den avledede aminosyresekvens derav. De ved proteinsekvensoppdeling på forhånd bestemte N-terminalamino-syrerester var identiske med de ut fra nukleotidsekvensen for-utsette rester (aminosyrerest nr. 21-30). De potensielle glycosyleringsseter i aminosyrerestene 38, 135 og 515 (åpen bjelke) og membranankerområdet ved C-terminalenden (utfylt bjelke) er angitt. Et polyadenyleringssignal (AATAAA angitt i en kasse) ble påvist ved stilling 3847, hvilket er 50 basepar på oppstrømssiden av et polyadenylert område. Figur 4 forestiller en sammenligning av de to forutsagte aminosyresekvenser av p97-forløperen, og aminosyre-sekvensene av human serotransferrin (Yang et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81:2752-2756; Davis et al., 1985, J. Mol.

Biol., 181:111-121). Bevarte rester er blitt innrammet i blokker. Tyrosin-, histidin- og argininrester som inngår i transferrins jernbinding (Metz-Boutique et al., 1984, Eur.

J. Biochem., 145:659-676) er angitt med stjerner (<*>). ;Figur 5 er en diagrammessig angivelse av en todimen-sjonal modell av strukturen av p97, hvilken modell er basert på nærvær av bevarte cysteinrester mellom transferrin^super-familiemedlemmer. De tre potensielle glycosyleringsplasser er indikert med stjerner (<*>). Det hydrofobe membranankerom-

råde fremgår ved C-terminalenden av p97 (COOH).

Figur 6 er en diagrammessig angivelse av den genetiske struktur av p97-cDNA-klonene og fragmenter av genomklon lambda E7.7 som anvendes til oppbygning av p97-ekspresjonsvektoren og pSV2p97a-ekspresjonsvektoren. Følgende forkort-elser anvendes: E, EcoRI; P, PvuII; Sal, Sali; S, Ssti; B,

BamHI.

Figur 7 viser resultatene av gelelektroforese ved karakterisering og immunorensing av rékombinant-p97-protein.

En transfisert CHO-klon (CH03+) og SK-MEL 28 humane melanomaceller ble merket med <35>S-cystein i nærvær (+TM) eller fravær (-TM) av tunicamycin (TM). Celler ble podet i 100 mm<2>

plater og fikk lov nesten til å nå sammensmeltning. Mediet ble fjernet og erstattet med 3 ml cystein-fritt medium, med eller uten tilsetning av 1 ug/ml tunicamycin. Etter 30 min-

o 35

utter ved 37 C ble det tilsatt 250 yCi pr. ml L- -cystem (1016 Ci pr. mmol, New England Nuclear) i ytterligere 6 timer. Høsting av celler, fremstilling av cellelysater, immunoutfelling og SDS-PAGE ble utført som ovenfor beskrevet. Ekstrakter ble immunoutfelt med p97-spesifikke antistoffer, og proteiner ble analysert ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). (a) Coomassie-blue-farvet SDS-polyacrylamidgel. Spor 1, proteinmarkør, spor 2, immunorenset p97 utskilt fra transfiserte muse-B16-celler, spor 3, SK-MEL 28 celler +TM, spor 4, SK-MEL 28 celler -TM, spor 5, CH03+-celler +TM, spor 6, CH03+-celler -TM. (b) Autoradiogram av samme gel som i (a).

Figur 8 viser resultatene av radioimmunofelling ved ekspresjon produsert p97 i transfiserte celler, eller Vp97a-NY-infiserte celler. BSC-celler ble infisert natten over med vaccinia-virus av villtype eller p97-rekombinant-vaccinia-virus. Disse vira eller den transfiserte cellelinje CHO-p97.A ble inkubert med <35>S-merket methionin og cystein, med eller uten tunicamycin, ved en konsentrasjon på 3 ug/ml (Sigma). Cellene ble lysert 6 timer senere, ble utfelt med monoklonalt antistoff 96,5 og ble separert ved hjelp av elektroforese på

3n 10% polyacrylamidgel. Gelen ble autoradiografert natten over. Den tunicamycin-behandlede gruppe befinner seg til høyre for hver gruppe.

Figur 9 avbilder serumantistofftiteren i mus immunisert med p97-vaksiner. Tp97 representerer fem mus immunisert med 5 x IO<6> bestrålte M2svp9 7a.A-celler (syngeniske tumorceller

transfisert med og ved ekspresjons-produserende overflate-

p97) i Freunds komplette adjuvans og booster-behandlet med samme antall celler i fosfatbuffer-modifisert saltvann. p97 er en gruppe bestående av fem mus immunisert med 100 ug renset p97-protein i Freunds komplette adjuvans, og booster-behandlet med 50 ug vandig protein. Vp97 er en gruppe av fem mus immunisert med og booster-behandlet med 10 7 plakkdannende enheter av Vp97a-NY ved hjelp av halescarifikasjon.

Figur 10 avbilder en terapeutisk virkning av vaksinering av tumorinfiserte mus med en rekombinant-p97-vaccinia-virus (Vp97a-NY). Mus ble infisert intravenøst med 10<5> eller 10 4 p97-ekspresjonsproduserende tumorceller (M2SVp97a.E).

To dager senere ble musene inokulert ved halescarifikasjon enten med Vp97a-NY eller Vwt-NY. Ukentlige inokuleringer ved halescarifikasjon ble gjenopptatt, og museoverlevelsen ble registrert.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår produksjonen av vaksiner til motvirkning eller behandling av melanoma. Oppfinnelsen er basert på den iakttagelse at melanomaer utviser tumor-assosierte celleoverflate-antigener slik som p97-antigenet, som er til stede i større mengder i melanomaceller enn i de normale vev. Ifølge foreliggende oppfinnelse produseres peptider eller proteiner beslektet med det melanoma-assosierte p97-antigen (dvs. p97-beslektede peptider) under anvendelse av rekombinant-DNA-teknikk. De p97-beslektede peptider omfatter aminosyresekvenser som stammer fra hele eller deler av aminosyresekvensen av p97, i alt vesentlig slik som den er avbildet i figur 3. Disse peptider omfatter aminosyresekvenser som stammer fra figur 3 og som er blitt endret ved substitusjon av én eller flere aminosyrerester inne i sekvensen med en annen aminosyre som har en tilsvarende polaritet, og som virker som en funksjonell ekvivalent og således resulterer i en passiv endring. Substitutter for en aminosyre inne i sekvensen kan velges blant andre medlemmer av den klasse hvortil aminosyren tilhører. Eksempelvis omfatter de ikke-polare (hydrofobe) aminosyrer alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenyl-alanin, tryptofan og methionin. De polare, nøytrale aminosyrer omfatter glycin, serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin og glutamin. De positivt ladede (basiske) aminosyrer omfatter arginin, lysin og histidin. De negativt ladede (sure) aminosyrer omfatter asparaginsyre og glutaminsyré. Ytterligere kan de p97-beslektede peptider, enten de

er endret ved substitusjon av aminosyrerester eller ikke, ytterligere modifiseres eller behandles ved glycosylering, fosforylering, etc, eller underkastes kjemiske modifikasjoner. Disse p97-beslektede peptider kan anvendes som immunogener ved vaksineformuleringer som fremkaller en immunreaksjon rettet mot melanomaceller som forefinnes i den vaksinerte pasient.

I overensstemmelse med oppfinnelsen anvendes rekombinant-DNA-teknikk til å innføye nukleotidsekvenser som koder for p97-antigenet i ekspresjons-

vektorer, som i passende vertceller vil rette ekspresjonen mot p97-beslektede peptider. Nukleotidsekvensene som innkoder p97-antigenet, omfatter nukleotidsekvenser som stammer fra hele eller deler av p97-nukleotidsekvensen, i alt vesentlig slik som den er avbildet i figur 3. Som følge av degenerering av DNA-koden for aminosyrer (dvs. de fleste aminosyrer kan innkodes av mere enn én kodon) kan funksjonelt ekvivalente kodoner (dvs. forskjellige kodoner som innkoder samme aminosyre eller dens funksjonelle ekvivalent) substitueres inne i p97-sekvensen,

slik som den er avbildet i figur 3, under forutsetning av at substitusjonen resulterer i en passiv forandring. Ekspresjonsvektor-vertcellesystemene som inneholder en nukleotidsekvens som innkoder hele eller en del av p97, kan anvendes til å produsere store mengder av rene p97-beslektede peptider in vitro, i hvilket tilfelle genproduktene kan opprenses fra celler i kultur og anvendes som immuhogener i sub-element-vaksineformuleringer. Rensing av det p97-beslektede peptid kan oppnås under anvendelse av forskjellige biokjemiske metoder, omfattende immunoaffinitetsrensing under anvendelse av monoklonale antistoffer. Dessuten kan rensing av det p97-beslektede peptid lettes ved å modifisere DNA-sekvensene som innkoder de p97-beslektede peptider slik at sekvensene som er ansvarlige for forandring av proteinet i plasmamembranen, fjernes på en slik måte at sekvensene som er ansvarlige for transport av proteiner til cellemembranen, ikke fjernes, slik at et avkortet antigenmolekyl utskilles i dyrkningsmediet av

vertcellen. I tilfelle av p97-beslektede peptider fremstilt av prokaryotiske celler, kan mangel på passende post-translasjon-ale modifikasjoner resultere i antigent inaktive produkter som må aktiveres ved hjelp av passende kjemisk eller annen behandling.

Den utledede aminosyresekvens av p97 kan under-søkes med hensyn til sekvenser med egenskaper, i særdeleshet hydrofilisitet, som er indikasjon på nærvær av den sekvens ved proteinmolekylets overflate og dens mulige antigenisitet og/eller immunogenisitet. Disse p97-beslektede peptider kan syntetiseres kjemisk og anvendes som immunogener i vaksineformuleringer.

De p97-beslektede peptider kan anvendes til immunisering av dyr med henblikk på å produsere antisera eller monoklonale antistoffer som er spesifikke overfor de melanomaceller som er av interesse. Disse kan anvendes som en bestand-del ved en diagnostisk prøve eller til affinitetsrensing av radiomerkede legemiddelassosierte eller toxin-assosierte antistoffer som skal anvendes til cancerterapi.

Foreliggende oppfinnelse belyses ved hjelp av eksemp-lene hvori oppbygningen av en p97-basert vaksine mot human melanoma beskrives.

Sekvensanalyse av det melanoma- assosierte p97- antigen

Nukleotidsekvensen av genet som koder for p97, og den derav avledede aminosyresekvens er avbildet i figur. 3. Funksjonelt ekvivalente sekvenser ligger innenfor denne ramme. Disse innbefatter nukleotidsekvenser som omfatter hele eller deler av den i figur 3 avbildede nukleotidsekvens som endres ved å substituere forskjellige kodoner med kodoner som innkoder samme eller funksjonelt ekvivalente aminosyrerester, og således frembringer en passiv forandring, såvel som aminosyresekvenser som omfatter deler eller en del av den i figur 3 avbildede aminosyresekvens som endres ved å substituere aminosyrerester med funksjonelt ekvivalente aminosyrerester innenfor sekvensen, og således frembringe en passiv forandring, samt derivater derav som er modifisert eller behandlet, eksempelvis ved glycosylering, fosforylering etc, eller ved andre kjemiske modifikasjoner.

De etterfølgende avsnitt beskriver strategien som anvendes for bestemmelse av sekvensen av p97 slik den er avbildet i figur 3, såvel som alternative metoder som vil kunne finne anvendelse ved bestemmelse av sekvensen av p9 7 eller andre tumorantigener som vil være nyttige i vaksineformuleringer.

Identifisering og karakterisering av det melanoma-assosierte p97- antigen

Aktiviteten og aminosyresekvensen av det melanoma-assosierte p97-antigen var ikke kjent, og som et resultat herav ble identifiseringen av p97-antigenet utført under anvendelse av monoklonale antistoffer som var rettet mot p97. Et antall metoder kan anvendes til frembringelse av monoklonale antistoffer som er spesifikke for p97. Eksempelvis kan den av Kohler og Milstein (1975, Nature 250:495-497) utviklede hybridomateknikk anvendes som følger: mus eller rotter immuniseres med humane melanomaceller, og lymfocytter oppsamles fra de immuniserte dyr, sammensmeltes med myelomaceller, eller, lymfocytter fra melanomapasienter kan alternativt sammensmeltes med myelomaceller (Cote et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. 80:2026; Haspel et al., 1985, Cancer Res. 45:3951), eller også kan teknikken til frembringelse av monoklonale antistoffer under anvendelse av Epstein-Barr virus (Cote et al., 1985,

The EBV-Hybridoma Technique and its Application to Human Lung Cancer, i Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., s. 77-96) anvendes til frembringelse av monoklonale antistoffer rettet mot p97. I hvert tilfelle screenes de resulterende hybridomer for produksjon av antistoffer som bindes til melanomaceller, men som ikke bindes til normale celler.

De ovenfor beskrevne monoklonale antistoffer rettet mot p97, kan anvendes på et antall måter for å lette identifisering, karakterisering, kloning og ekspresjon av nukleotidsekvenser som i større målestokk tillater at peptider og proteiner beslektet med p97-antigenet, fremstilles. De monoklonale antistoffer kan eksempelvis anvendes til ytterligere karakterisering av p97-antigenet ved radiomerking av alle de av tumorcellen fremstilte proteiner, immunofelling av tumor-proteinet med det til identifisering av p97-antigenet anvendte monoklonale antistoff, og fraksjonering av de immunoutfelte proteiner ved hjelp av gelelektroforese. Proteinantigener identifiseres som tidligere bånd på den resulterende antiradio-graf (Brown et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:4980-4983). Dessuten kan de monoklonale antistoffer rettet mot p97 anvendes til å lette kloningen som følger: (a) til immunorensing av polysomer for å identifisere og oppnå mRNA-transkripter som er til stede i melanomacellen og som innkoder p97-antigenet, (b) til identifisering av kloner i cDNA-ekspresjonsbiblioteket, hvilke kloner ved ekspresjon produserer peptider eller proteiner som er beslektet med p97-antigenet, (c) til rensing av p97-antigenet for å fremstille ytterligere monoklonale antistoffer eller antisera til benyttelse ved de to tidligere anvendelser, eller (d) til identifisering av celler hvori genet for p97-antigenet er innført ved transfeksjon.

De monoklonale antistoffer kan også anvendes til å lette strukturell og immunokjemisk karakterisering av p97-antigenet med henblikk på identifisering av ekstracellulære og antigene områder i molekylet og med henblikk på rensing av molekylet for aminosyresekvensanalyse (Brown et al., 1981, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78:539-543; Brown et.al.., 1982, Nature, London, 296:171-173).

Ytterligere karakterisering av p97 omfatter bestemmelse av cellulær lokalisering og kartlegning av antigene determinanter og funksjonelle områder. Sub-cellulær lokalisering kan bestemmes ved immunofluorescensmikroskopi og ved cellulære fraksjoneringseksperimenter. Antigener slik som p97, som er til stede på celleoverflaten, foretrekkes til vaksineoppbygning, selv om intracellulære antigener også kan være nyttige. Hvis et antall monoklonale antistoffer er tilgjengelige, kan antigene determinanter kartlegges ved konkurranseforsøk, hvorved hvert antistoff radiomerkes og testes i konkurranse med hvert av de andre antistoffer. Områder i molekylet kan identifiseres ved begrenset nedbrytning med proteaser etterfulgt av SDS-PAGE. Sammen vil disse data kunne identifisere de områder i molekylet som er mest immunogene. Hvis monoklonale antistoffer oppnås ved immunisering med intakte celler, er disse områder av molekylet sannsynligvis ekstracellulære og vil være nyttige til vaksineoppbygning.

Aminosyresekvensanalyse tillater entydig identifisering av proteinet og sammenligning derav med andre proteiner (Brown et al., 1982, Nature, London, 296:171-173). Hvis proteinet omfatter mere enn 50 aminosyrerester, kan det. være rimelig bare å bestemme en del av aminosyresekvensen og oftest N-terminaldelen. Proteinantigen for aminosyresekvensanalyse kan renses fra cellelysater ved hjelp av immunoaffinitetskromatografi med det monoklonale antistoff, etterfulgt av pre-parativ SDS-PAGE. N-terminalaminosyresekvensen av det rensede protein bestemmes deretter under anvendelse av en automatisk aminosyresekvensanalysator, fortrinnsvis et gassfaseapparat av hensyn til oppnåelse av størst følsomhet.

Idenfisering, kloning og sekvensanalyse av DNA som koder for det melanoma- assosierte p97- antigen

Tidligere kloningsundersøkelser konsentrerte seg om rikelig forekommende proteiner slik som globin og ovalbumin hvis mRNA ofte utgjorde 10-50% av det totale mRNA. Disse mRNA kunne renses til homogenitet ved hjelp av størrelsesfraksjon-ering, og rene cDNA-prober ble anvendt for screening av biblioteker av noen få hundre kloner ved hjelp av kolonihybridiser-ing. For proteiner hvis mRNA utgjør 1-10% av det totale mRNA-innhold, kan differensiell hybridisering med to cDNA-prober anvendes, ved hvilken hybridisering en av cDNA-probene inneholder den interessante sekvens, og den andre er en negativ kontroll. Budbringer-RNA (mRNA) som koder for proteiner med liten forekomst, slik som tumor-assosierte antigener, som kan utgjøre så lite som 0,01% av cellulært mRNA, er langt mere vanskelig å klone da titusener av kloner må screenes, og cDNA-prober ikke vil gi et spesifikt hybridiseringssignal. Begge problemer kan avhjelpes ved å berike angjeldende mRNA med hensyn til den sekvens som er av interesse.

Flere fremgangsmåter anvendt til kloning av DNA som koder for humant melanoma-assosiert p97-antigen, er beskrevet i det etterfølgende. De resulterende kloner ble analysert for å identifisere en eller flere kloner som spente over hele kodningsområdet av p97. p97-nukleotidinnføyelsene i de således identifiserte kloner kan deretter sekvensoppdeles ved hjelp av kjente metoder innen faget. De forskjellige fremgangsmåter er nærmere beskrevet i det etterfølgende. (a) Isolering av mRNA ved hjelp av polysom immunorensing Ved denne metode renses polysomer (som består av mRNA, ribosomer og dannende polypeptidkjeder) ved immunoaffinitetskromatografi med antistoffer som gjenkjenner antigene determinanter som er til stede på de dannende kjeder. I mange tilfeller gjenkjenner monoklonale antistoffer som oppnås ved immunisering med intakte celler eller celleekstrakter, anti-genene i disses naturlige former, men de behøver ikke være egnet til polysom immunorensing da det er en betydelig sjanse for at de antigene determinanter som gjenkjennes, ikke er til stede i dannende kjeder. Da translasjon starter ved N-terminalenden av polypeptidet, mangler epitoper tett ved C-terminalenden, sannsynligvis i hovedparten av de dannende kjeder. Dette problem unngås enten ved å anvende antistoffer som gjenkjenner N-terminalepitoper, eller ved å fremstille polysomer ut fra celler som er behandlet med en proteinsyntese-inhibitor som blokkerer avslutningen.

Et mer alvorlig problem er at utviklede proteiner av-viker fra dannende kjeder som følge av post-translasjonsmodi-fikasjoner. Dette problem er særlig akutt ved celleoverflate-proteiner som modifiseres i større omfang ved fjerning av signalpeptider, tilsetning av carbohydratsidekjeder og dannelse av disulfidbroer. Hvis et polyklonalt antiserum anvendes til polysom immunorensing, kan forskjellene i antigenisitet mellom dannende kjeder og det utviklede protein være av liten betyd-ning, da kaniner eller andre dyr under immunisering ikke bare utsettes for det naturlige protein, men utsettes også for delvis eller fullstendig denaturerte former, i særdeleshet hvis Freunds adjuvans er blitt anvendt. Selv hvis disse antistoffer bare utgjør en mindre fraksjon av antistoffmengden, kan det stadig forefinnes nok antistoff til å binde dannende kjeder. Uheldigvis kan fremstilling av et polyklonalt antiserum til proteiner som forekommer i lite omfang, være meget vanskelig. Selv om et monoklonalt antistoff kan anvendes til rensing av antigenet med henblikk på ytterligere immuniser-inger, gir hvert gram av dyrkede celler ofte bare et mikrogram antigen. Dette er nok til immunisering av adskillige mus, men nesten ikke tilstrekkelig til en enkelt kanin.

En annen løsning på dette problem er å oppnå et monoklonalt antistoff som gjenkjenner antigene determinanter som forefinnes i dannende kjeder, ved å anvende denaturert p97-antigen som immunogenet som anvendes til fremstilling av det monoklonale antistoff. I nærværende eksempel eksisterte et utvalg av monoklonale antistoffer som gjenkjente tre adskilte epitoper på N-terminalområdet med en molekylvekt på 40.000 dalton av p97-molekylet, og en samling av monoklonale antistoffer som hver utviste en særskilt spesifisitet, ble anvendt i det håp at ett eller flere av disse antistoffer ville bindes til dannende kjeder. De valgte antistoffer var sterkt spesifikke overfor p97, idet hvert av antistoffene immunoutfelte et enkelt bånd av p97 fra et radiomerket lysat av hele celler, og idet antistoffene utviste høye bindingsaffiniteter. Tii klon-ingsprosjektet ble det anvendt tre IgG2a-antistoffer, idet hvert antistoff var spesifikt for en av de tre epitoper. Gen-erelt kan sjansen for suksess økes ved å anvende et antall antistoffer til adskilte epitoper.

Ved anvendelse av monoklonale antistoffer er spørs-målet stadig hvordan det kan forutsis hvorvidt et gitt monoklonalt antistoff eller en kombinasjon av antistoffer, vil gjenkjenne de dannende kjeder, og således være egnet for anvendelse ved polysom immunorensing. En fremgangsmåte er å bestemme hvorvidt det monoklonale antistoff immunoutfeller antigen som er translatert i reticulocytt-lysatsystemet, idet man stoler på den antagelse at in vitro translasjonsproduktet, som ikke gjennomgår utvikling, vil ligne de dannende kjeder. En alternativ fremgangsmåte er å fortsette med polysom immunofelling i liten målestokk og deretter anvende in vitro translasjon til bestemmelse av hvorvidt mRNS-arten av interesse er blitt beriket.

Når polysom immunorensemetoden anvendes, er det viktig å overvåke rensingen ved å måle mRNA-aktiviteten. Dette kan utføres ved å translatere mRNA i et retikulocytt-lysatsystem og analysere translasjonsproduktene ved hjelp av SDS-PAGE. Selv om det tumor-assosierte antigen kan være en for liten be-standdel av translasjonsproduktene av uberiket mRNA til å kunne ses blant de hundre eller flere forekommende arter, bør det kunne påvises i translasjonsprodukter som stammer fra de berikede mRNA-prøver. Alternativt kan Xenopus oocytt-transla-sjonssystemet anvendes hvis en følsom immunoprøve til påvisning av det translaterte tumor-assosierte antigen er tilgjengelig. Til dette formål anvendes for p97 en høyfølsom dobbelt determinant-immunoprøve (DDIA), hvorved to monoklonale antistoffer som er spesifikke for to forskjellige epitoper av p97, benyttes.

Protein A, som er bundet til Sepharose<®>, kan anvendes til polysom immunorensingen. Protein A adsorberingsmidlet utviser to anvendelser ved denne fremgangsmåte. Den første er å rense de monoklonale antistoffer fra de urene ascitesvæsker, hvorved forurensende ribonukleaseaktivitet fjernes. Protein A adsorberingsmidlet anvendes så sammen med de rensede antistoffer til å immunorense polysomer som inneholder den spesifikke dannende kjede.

Translasjon av mRNA i et reticulocytt-lysatsystem tillater biokjemisk karakterisering av translasjonsproduktet såvel som en vurdering av dets renhet.

(b) Oligonukleotidprober

En annen metode som kan anvendes i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse til kloning av cDNA som koder for et tumor-assosiert antigen slik som p97, er å bestemme en partiell eller komplett aminosyresekvens av antigenet og syntetisere en oligonukleotidprobe basert på nukleotidsekvensen som kan ut-ledes fra aminosyresekvensen. Oligonukleotidet kan deretter anvendes som en primer for cDNA-syntese og som en probe til screening av det resulterende cDNA-bibliotek. Følgelig kan det melanoma-assosierte p97-protein lett renses fra lysater av melanomaceller ved affinitetskromatografi med et spesifikt monoklonalt antistoff (Brown et al., 1982, Nature, London, 296:171-173). En nukleotidsekvens som koder for en del av den bestemte aminosyresekvens, syntetiseres deretter, hvilken nukleotidsekvens deretter kan anvendes som en primer og/eller probe. Deler av aminosyresekvensen som inneholder aminosyrerester som er innkodet av et enkelt kodon eller to kodoner, er best egnet til dette formål. En fremgangsmåte er å syntetisere en lengre sekvens, typisk bestående av 25-60 nukleotider, hvilken sekvens utgjør den mest sannsynlige kodingssekvens basert på de kjente kodonanvendelsesfrekvenser i mennesker. Anvendelse av to syntetiske oligonukleotider som er basert på forskjellige deler av aminosyresekvensen, letter screeningen ved å tillate at et oligonukleotid identifiserer falske posi-tive hybridiseringssignaler. Anvendelse av hybridiserings-betingelser som begrenser virkningen av GC-innholdet på smelte-punktet av DNA-hybrider, letter også screeningen. Når først en partiell cDNA-klon er oppnådd ved denne metode, kan den anvendes som probe for å oppnå en cDNA-klon av full lengde.

(c) cDNA- ekspresjonsbiblioteker

Det er utviklet kloningsvektorer som tillater ekspresjon av cDNA-innføyelser i bakterier. En fremgangsmåte som derfor kan anvendes for oppnåelse av cDNA-kloner for tumor-assosierte proteiner slik som p97, er å fremstille et cDNA-bibliotek ved revers transkripsjon av mRNA (beriket eller uberiket) som er isolert fra melanomaceller som ovenfor beskrevet, under anvendelse av oligo(T)-nukleotidprimere eller de ovenfor beskrevne syntetiske oligonukleotidprimere, og å screene et slikt bibliotek med et monoklonalt antistoff som er rettet mot det melanoma-assosierte p97-protein. Kloner som inneholder DNA som koder for epitopene, som gjenkjennes av det monoklonale antistoff med den korrekte orientering og leseramme, vil ved ekspresjon produsere peptider eller proteiner beslektet med melanoma-assosiert p97-protein og kan identifiseres ved å over-føre de ved ekspresjon av klonene produserte proteiner til et nitrocellulosefilter og inkubere filteret med antistoffet etterfulgt av fremkallelse med et merket anti-immunoglobulinreagens.

Et potensielt problem er at mange monoklonale antistoffer svikter med hensyn til gjenkjennelse av proteinet som ved ekspresjon produseres av bakterien, fordi en del av angjeldende cDNA i mange tilfeller vil være inneholdt i innføy-elsen og fordi bakterier ikke utvikler proteiner på samme måte som eukaryotiske celler. Dette problem er særlig akutt i forbindelse med tumorcelle-overflateproteiner som er modifisert i større omfang ved fjerning av signalpeptidene, tilføyelse av carbohydratsidekjeder og dannelse av disulfidbroer. Det kan derfor være nødvendig å frembringe monoklonale antistoffer som er kjent for å gjenkjenne det denaturerte antigen, eller å fremstille polyspesifikke antisera ved immunisering med renset antigen.

Når først et rekombinant virus eller et plasmid som formodes å inneholde en cDNA-innføyelse som stammer fra et melanoma-assosiert p97^antigen er identifisert, kan cDNA-inn-føyelsen anvendes til screening av ytterligere biblioteker med henblikk på enten å identifisere kloner av full lengde eller å identifisere en gruppe av kloner som spenner over den fulle lengde av omhandlede cDNA som koder for p97. Identiteten av det klonede cDNA kan fastslås ved hjelp av sekvensanalyse og sammenligning av den utledede N-terminalaminosyresekvens med en ved direkte aminosyresekvensanalyse bestemt sekvens av p97-proteinet.

(c) Genomkloning

Følgende metode tillater kloning av DNA under anvendelse av et monoklonalt antistoff som er rettet mot en antigen determinant som bare forefinnes i det naturlige protein og som ikke er til stede i dannede kjeder eller i proteiner som er produsert ved ekspresjon i bakterier. Til dette formål introduseres DNA-stammene fra humane melanomaceller i muse-L-celler ved transfeksjon. Deretter isoleres museceller som ved ekspresjon produserer melanoma-assosiert p97-antigen, enten ved anvendelse av en fluorescens-aktivert cellesorterings-anordning, eller ved immunologisk identifikasjon av kolonier som produserer p97-beslektede peptider, under anvendelse av radiomerkede monoklonale antistoffer som er rettet mot p97, til påvisning av beslektede peptider på replika av kolonier som er overført til polyesterdukfiltere. Flere etterfølgende transfeksjonsrunder kan være påkrevet for fjerning av ubeslek-tede humane DNA-sekvenser. Et genombibliotek fremstilles så i en lambda fag vektor og screenes for kloner som inneholder humane gjentagelsessekvenser som forekommer i de fleste geners introner. Når først en genom klon er identifisert, kan den anvendes som en hybridiseringsprobe til identifisering av cDNA-kloner som inneholder omhandlede DNA som koder for p97.

Syntese av antigene fragmenter av det melanoma-assosierte p97- antigen og vurdering av immunogenisitet

Syntetiske peptider kan anvendes som immunogener til fremkallelse av en immunreaksjon mot det naturlige protein, hvorved det kan tilveiebringes en grad av beskyttelse mot et antall patogener. Slike peptidsekvenser velges fra den kjente aminosyresekvens av proteinantigenet ved å identifisere aminosyresekvenser som sannsynligvis vil være til stede på protein-molekyloverflaten som vil være utsatt for det ytre medium. Denne utvelgelse oppnås mest vanlig ved computeranalyse av aminosyresekvensen under anvendelse av etablerte hydropati-parametre for aminosyrer. Ytterligere kriterier slik som den forutsagte sekundære struktur eller fleksibilitet, kan også anvendes.

Syntetiske peptider som inneholder 5-50 aminosyrerester av det melanoma-assosierte p97-protein, kan følgelig avprøves med hensyn til immunogenisitet i forsøksdyr (vanligvis mus eller kaniner). Slike syntetiske peptider omfatter, men er ikke begrenset til, hele eller en del av aminosyresekvensen,

i alt vesentlig slik den er avbildet i figur 3, innbefattet endrede sekvenser hvori aminosyrerester innenfor sekvensen er substituert med funksjonelt ekvivalente aminosyrerester, under dannelse av en passiv forandring og/eller modifiserte eller utviklede sekvenser slik som glycosylerte sekvenser, fosforylerte sekvenser etc., eller kjemisk modifiserte sekvenser.

Disse p97-beslektede peptider anvendes enten alene eller koblet til et bærerprotein slik som keyhole limpet hæmocyanin (KLH).

I begge tilfeller er anvendelsen av en adjuvans valgfri, men foretrukket. De immuniserte dyr booster-behandles og testes med hensyn til antistoffer rettet mot det immuniserende peptid. Dyr med antipeptidantistoffer testes for antistoffer som

binder det naturlige p97-protein. I tilfelle av tumor-assosierte antigener slik som p97, er det også av interesse å undersøke for en cellulær immunreaksjon, f.eks. ved å søke etter hypersensibilitet av den forsinkede type (DTH), en antigen-stimulert formering in vitro, cytolyttiske T-celler eller tumor-avvisning i en passende modell. En passende modell vil være en musetumor som ved ekspresjon produserer humant tumor-assosiert antigen som resultat av transfeksjon med en passende cDNA-ekspresjonsvektorkonstruksjon.

Målet er å identifisere peptider som fremkaller en kraftig immunrespons rettet mot det melanoma-assosierte p97-antigen. Når først slike peptider er identifisert, kan de produseres i store mengder ved hjelp av kjente kjemiske syntesemetoder. Alternativt kan de identifiserte peptider fremstilles i store mengder ved ekspresjon av nukleotidsekvensene som koder for slike peptider i ekspresjonsvektor-vertcelle-systemer.

Produksjon av p97- beslektede peptider ved ekspresjon

av vektor- vertsystemer

Proteiner og peptider kan produseres i store mengder

ved å innføye kodende nukleotidsekvenser i en passende ekspresjonsvektor som på sin side innføres i passende vertceller, innbefattet, men ikke begrenset til, bakterier, gjær, insektceller og mammale celler. Selv om bakterieverter utviser mange fordeler, er det mange eukaryotiske proteiner som de ikke utvikler ordentlig, og de er mindre egnede enn eukaryotiske celler til ekspresjon av tumor-assosierte proteiner. Rekombinant-proteiner som produseres i bakterier, kan imidlertid være nyttige til induksjon av T-cellereaksjoner,

da slike reaksjoner formodes å kreve en innledende nedbrytning

av antigenproteinet.

For ved ekspresjon å produsere p97-beslektede peptider

i et vektor-vertsystem, innføyes nukleotidsekvenser som koder for det melanoma-assosierte p97-antigen eller en del derav, i en passende ekspresjonsvektor. Slike nukleotidsekvenser omfatter, men er ikke begrenset til, hele eller en del av DNA-sekvensen av p97, i alt vesentlig slik som den er avbildet i figur 3 innbefattet endrede sekvenser, hvori ett eller flere kodoner innenfor sekvensen er substituert med et kodon som innkoder den samme eller en funksjonelt ekvivalent aminosyrerest, hvilket således resulterer i en nøytral eller passiv endring i sekvensen. Ekspresjonsvektoren inneholder de nødvendige elementer til transkripsjon og translasjon av den innføyede protein-kodende sekvens. Disse elementer varierer med hensyn til styrke og spesifisitet. Avhengig av det anvendte vert-vektorsystem kan et antall passende transkripsjons- og trans-las jonselementer anvendes. Ved kloning i mammale cellesys-temer kan eksempelvis promotorer, isolert fra genomet av mammale celler (f.eks. musemetallothioneinpromotor) eller fra andre vira som gror i disse celler (vaccinia-virus 7.5K promotor) anvendes. Promotorer som produseres ved rekombinant-DNA-metoder eller syntesemetoder, kan også anvendes til å sørge for transkripsjon av de innføyede sekvenser.

Spesifikke initieringssignaler er også nødvendige av hensyn til effektiv translasjon av innføyede protein-kodende sekvenser. Disse signaler omfatter ATG-initieringskodonet og nabosekvenser. I slike tilfeller hvor enten genet eller cDNA-sekvensen er innføyet i en passende ekspresjonsvektor, behøves muligvis ingen ytterligere translasjonskontrollsignaler. I tilfeller hvor bare en del av kodningssekvensen er innføyet, skal det imidlertid muligens tilveiebringes exogene translasjonskontrollsignaler inklusive ATG-kodonet. Initieringskodonet må ytterligere være i fase med hensyn til leserammen av proteinkodningssekvensene for å sikre translasjon av hele innføyelsen. Disse exogene translasjonskontrollsekvenser og initieringskodoner kan være av forskjellig opprinnelse og

være både naturlige og syntetiske.

Enhver av de metoder som er kjent for fagmannen til innføyelse av DNA-fragmenter i en vektor, kan anvendes til oppbygning av ekspresjonsvektorer som inneholder et kimært gen bestående av passende transkripsjons- og translasjonskontrollsignaler samt de protein-kodende sekvenser. Disse metoder kan omfatte de in vitro rekombinant-DNA-metoder, syntesemetoder og in vivo rekombinant-metoder (genetisk rekombinasjon).

Ekspresjonsvektorer omfatter, men er ikke begrenset til, følgende vektorer og derivater derav: vaccinia-virus, adenovira, insektvira, gjærvektorer, bakteriofagvektorer og plasmid-DNA-vektorer. Kloning og ekspresjon av gener i bakterielle systemer er velkjent innen teknikken. Ved kloning i E. coli kan f.eks. dennes bakteriofager eller plasmidpromo-torer slik som lac-promotor, trp-promotor, recA-promotor, ribosomal RNA-promotor, P_- og PT-promotorene av colifag lambda og andre, herunder, men ikke begrenset til, lacuv5, trp- lacuv5 (tac) hybridpromotor; ompF, bla, lpp o.ly anvendes til å styre en høy grad av transkripsjon av nabo-DNA-segmentet. Som følge av utviklingsforskjeller mellom prokaryotiske og eukaryotiske celler kan det imidlertid være å foretrekke ved ekspresjon i eukaryotiske celler å produsere de p97-beslektede. peptider ifølge oppfinnelsen. De mest anerkjente metoder til ekspresjon av proteiner i eukaryotiske celler er (a) innføring av genet i cellen sammen med et legemiddelresistent gen, etterfulgt av utvelgelse med legemiddel, fortrinnsvis under oppnåelse av forsterkning som med dihydrofolatreduktase-metho-trexat-systemet, (b) ekspresjon av cDNA i en plasmidvektor, ofte basert på pBR322 under anvendelse av en sterk eukaryotisk promotor og andre regulerende sekvenser, eller (c) ekspresjon av cDNA i en viral vektor,, ofte stammende fra SV40, igjen under anvendelse av sterke promotorer, i dette tilfelle en SV40-promotor. Rekombinante plasmidvektorer anvendes ofte til å produsere cellelinjer som frembringer proteinet over et langt tidsrom, mens SV40-vektorer ofte anvendes til oppnåelse av forbigående ekspresjon. Selv om mammale celler oftest har vært anvendt som verter, kan insektceller og i enkelte tilfeller gjærceller, også være velegnet. Enkelte verter er beskrevet mer detaljert i det etterfølgende.

For å oppbygge et rekombinant vaccinia-virus som ved ekspresjon produserer det melanoma-assosierte p97-antigen,

kan den cDNA-kodende sekvens være ligert med 7.5K promotoren fra vaccinia-virus, under dannelse av et kimærgen. Dette kimære gen er omgitt av ytterligere vaccinia-virus-sekvens-homologer til det virale thymidinkinasegen som bæres på plasmid-DNA-vektoren. Denne oppbygning av det kimære gen innbefatter anvendelse av både naturlige og syntetiske kontrollsignaler til transkripsjon og translasjon av den tumor-assosierte antigensekvens. Det kimære gen innføres deretter i vaccinia-virus-ekspresjonsvektorer via in vivo rekombinasjon mellom det homologe thymidinkinaseområde som er til stede i både plasmid-vektoren og vaccinia-virusgenomet. Disse rekombinante vira som inneholder det kimære gen, er i stand til å dirigere ekspresjonen av p97-beslektede peptider i en infisert vert og kan anvendes som bestanddeler av en vaksine.

I tilfeller hvor et adenovirus anvendes som en ekspresjonsvektor, ligeres DNA-sekvensen av interesse til et adenovirus-transkripsjons/transiasjonskontrollkompleks, eksempelvis den sene promotor og tredelte førersekvenser. Dette kimære gen innføyes deretter i adenovirus-genomet in vitro eller in vivo rekombinasjon. Innføyelsen i et ikke-essensielt område av det virale genom (f.eks. område El eller E3) vil resultere i et rekombinant-virus som er levedyktig og i stand til ved ekspresjon å produsere det p97-beslektede peptid i infiserte verter. For tiden er det to stammer av adenovirus (type 4 og type 7) som er godkjent og anvendes som vaksine til militært personell. Disse vira er hovedemner for anvendelse som vektorer til ekspresjon av de innføyede DNA-sekvenser.

Et alternativt ekspresjonssystem som vil kunne anvendes til ved ekspresjon å produsere de p97-beslektede peptider, er et insektsystem. I et av disse systemer anvendes Autographa californica nukleær polyhedrosis virus (AcNPV) som en vektor til ekspresjon av fremmede gener. Dette virus vokser i Spodoptera frugiperda-celler. DNA-sekvensen av interesse kan klones i ikke-essensielle områder (f.eks. polyhedringenet) av angjeldende virus, og anbringes under kontroll av en AcNPV-promotor (f.eks. polyhedrinpromotoren). Vellykket innføyelse av DNA-sekvensen vil resultere i inaktivering av polyhedringenet og produksjon av ikke-tillukket rekombinant-virus (dvs. virus som mangler det proteinaktige overtrekk som polyhedringenet koder for). Disse rekombinante vira anvendes deretter til å infisere Spodoptera frugiperda-celler, hvori det inn-føyede gen underkastes ekspresjon.

I tillegg kan det velges vertcellestammer som modulerer ekspresjonen av de innføyede sekvenser eller modifiserer og utvikler det kimære genprodukt på en spesifikk, ønsket måte. Ekspresjon fra visse promotorer kan heves i nærvær av visse induktorer (f.eks. sink- og kadmium-ioner i forbindelse med metallothioneinpromotorer). Ekspresjon av genetisk konstruert protein kan derfor kontrolleres. Dette er viktig hvis det klonede gens proteinprodukt er letalt for vertcellene. Modifikasjoner (f.eks. glycosylering, fosforylering etc.) og behandling (f.eks. spaltning) av proteinproduktene er enn videre av stor viktighet for strukturen og funksjonen av proteinet. Forskjellige vertceller utviser.karakteristiske og spesifikke mekanismer for post-translasjonell behandling og modifisering av proteiner. Egnede cellelinjer eller vertsystemer kan velges for å sikre den korrekte modifikasjon og behandling av det ved ekspresjon produserte, fremmede protein.

I overensstemmelse med en beskrevet særlig utførelses-form av fremgangsmåten for fremstilling av p97, ligeres p97-cDNA-sekvensen i en ekspresjonsplasmidvektor avledet fra pBR322 som inneholder metallothioneinpromotoren. Hele p97-kodningssekvensen inklusive signalpeptidet og membranforand-ringen ble innføyet i vektoren.

Identifisering av rekombinant- ekspresjonsvektorer som er i stand til å replikere og dirigere ekspresjonen av p97- DNA- sekvensene

Ekspresjonsvektorer som inneholder fremmede geninn-føyelser, kan identifiseres ved tre generelle fremgangsmåter: (a) DNA-DNA-hybridisering, (b) nærvær eller fravær av markør-genfunksjoner, og (c) ekspresjon av innføyede sekvenser. Ifølge den første fremgangsmåte kan nærvær av fremmed gen-innføyelse i en ekspresjonsvektor påvises ved DNA-DNA-hybridisering under anvendelse av prober som omfatter sekvenser som er homologe med den fremmede geninnføyelse. Ifølge den andre fremgangsmåte kan rekombinant-vektor/vertsystemet identifiseres og utvelges på basis av nærvær eller fravær av visse "markør"-genfunksjoner som skyldes innføyelsen av gener i vektoren (f.eks. thymidinkinaseaktivitet, resistens overfor antibiotika, transformasjonsfenotype, etc.). Hvis det fremmede gen eksempelvis innføyes i vektorens markørgensekvens, kan rekombinanter som inneholder DNA-innføyelsen, identifiseres ved hjelp av fravær av markørgenfunksjonen. I forbindelse med den tredje fremgangsmåte kan rekombinant-ekspresjonsvektorer identifiseres ved analyse av det fremmede genprodukt som ved ekspresjon produseres av rekombinanten. Slike analyser kan baseres på de fysiske, immunologiske eller funksjonelle egenskaper av genproduktet.

Ved oppbygning av et rékombinant-vaccinia-virus ifølge oppfinnelsen innføyes f.eks. det kimære gen som inneholder de p97-kodende sekvenser i thymidinkinasegenet, hvorved angjeldende virus inaktiveres og bibringes en TK -fenotype. Slike rekombinanter velges under hensyntagen til deres evne til å vokse i medier inneholdende 5-brom-deoxyuridin, som er en nukleotidanalog som er letal overfor TK<+->celler, men ikke overfor TK~-celler. Rekombinantene identifiseres ytterligere ved DNA-DNA-hybridisering under anvendelse av en cDNA-probe som er spesifikk for det tumor-assosierte protein. TK - rekombinant virus kan isoleres ved plakkrrensing, og forråd kan fremstilles ut fra infiserte dyrkede celler. Angjeldende rekombinant-virus kan testes med hensyn til dets evne til å fremkalle syntese av p97-beslektede peptider. Til dette formål kan infiserte celler dyrkes i nærvær av radiomerkede aminosyrer, hvorpå lysater og sub-cellulære fraksjoner av de infiserte radiomerkede celler testes ved hjelp av immunoutfelling med antistoffer som er rettet mot det naturlige melanoma-assosierte p97-antigen. De immunoutfelte produkter separeres ved hjelp av SDS-PAGE. Infiserte celler kan også testes ved hjelp av immunofluorescens under anvendelse av monoklonalt antistoff.

Celler hvori det er innført en plasmidvektor ved transfeksjon, kan lett identifiseres ved hjelp av FACS-analyse eller bindingsforsøk med replika av cellekolonier på poly-esterduk. Mengden av nærværende p97-beslektet peptid kan bestemmes ved hjelp av en kvantitativ radioimmunoprøve, og dens sub-cellulære lokalisering kan bestemmes ved hjelp av cellulær fraksjonering og immunofluorescensmikroskopi. Strukturen av det ved ekspresjon produserte p97-beslektede peptid kan bestemmes ved SDS-PAGE og ved aminosyresekvensanalyse.

Rensing av det p97- beslektede peptid fra ekspresjonsvektor- vertsysterner

Mange tumor-assosierte antigener slik som p97, er celleoverflateglycoproteiner og inneholder et N-terminalt sig-nalpeptid og et C-terminalt ankerpeptid (Davis et al., 1985,

J. Mol. Biol. 181:111-121). Ved ekspresjon i en passende vektor forventes det at proteinet vil translokeres til celleoverflaten. For å lette rensing av proteinet kan det være fordel-aktig å stryke DNA-sekvensen som koder for membranankerområdet slik at det utviklede protein frigjøres i dyrkningsmediet.

Det p97-beslektede peptid kan renses fra disse vertceller ved detergent lysering etterfulgt av affinitetskromatografi under anvendelse av monoklonale antistoffer. Hvis et avkortet protein skal renses fra dyrkningsmediet, foretrekkes det å anvende serumfritt medium og derpå anvende affinitetskromatografi med monoklonale antistoffer. Det er viktig at antigenet kan elueres fra antistoff-adsorberingsmidlet uten hverken å redusere dets antigenisitet eller denaturere det. Dette kan oppnås ved å heve eller senke pH-verdien, eller ved

å anvende en chaotrop. Det kan være nødvendig å velge et monoklonalt antistoff som vil frigjøre antigenet under forholds-vis milde betingelser. Det affinitetsrensede antigen kan ytterligere renses ved hjelp av HPLC.

Immunologisk karakterisering av p97- beslektede peptider

Evnen hos det syntetiske eller rekombinerte antigen

til å fremkalle en antitumorreaksjon kan først evalueres i for-

søksdyr. Evalueringen foretas ved å bygge opp et modellsystem hvori det humane melanoma-assosierte p97-protein ved ekspresjon produseres i celler av den utvalgte innavlede stamme av angjeldende forsøksdyreart. Dyrene immuniseres deretter med det p97-beslektede peptid ifølge oppfinnelsen i overensstemmelse med forskjellige fremgangsmåter og testes deretter for utvikling av antistoffer rettet mot det melanoma-assosierte p97-antigen, for celleformidlet immunitet slik som hypersensibilitet av den forsinkede type overfor p97-antigenet, og for deres evne til å avvise et angrep med levende, syngeniske tumorceller som ved ekspresjon produserer p97-antigenet. Her-til kommer at det kan foretas in vitro avprøvinger av cellulær immunitet for måling av formering av lymfocytter som reaksjon på det p97-beslektede peptid og evnen hos lymfocytter fra immuniserte dyr eller humane melanomapasienter til å drepe tumorceller som ved ekspresjon produserer p97-antigenet. Ved immunisering av mus med muse-p97 er det enn videre mulig å bestemme i hvilken utstrekning det er mulig å fremkalle en immunreaksjon overfor et antigen som er til stede i spormengder i normalt vev.

Ikke-humane primater kan anvendes til å fastslå sikkerheten ved de p97-beslektede peptider.

For dette formål kan dyrene immuniseres under anvendelse av betingelser som etisk vil kunne anvendes overfor humane cancerpasienter, og dyrene underkastes de ovenfor beskrevne forsøk, bortsett fra at tumortransplantasjonsforsøk ikke vil kunne gjennomføres da disse krever anvendelse av innavlede stammer. Sikkerheten ved immuniseringsprosedyren bestemmes ved å under-søke virkningen av immuniseringen på den generelle helse av de immuniserte dyr (vektforandringer, feber, appetitt, opp-førsel, etc.) og lete etter patologiske forandringer ved obduk-sjon.

Endelig kan det p97-beslektede peptid

avprøves på humane cancerpasienter. Etter den innledende fase I-testing i pasienter med fremskreden cancer for å påvise mangel på toksisitet, vil det p97-beslektede peptid kunne testes i cancerpasienter under bedring, men med en høy sannsyn-

lignet for tilbakefall. Pasientenes immunreaksjon vil kunne vurderes som ovenfor beskrevet i forbindelse med ikke-humane primater, bortsett fra at virkningen av behandlingen på påvist sykdom eller på tilbakefallsfrekvensen vil bli undersøkt. I tilfelle av melanoma-antigen p97 vil godartede naevi (moder-merker) som ved ekspresjon produserer antigenet, også bli undersøkt.

Formulering av en vaksine

Formålet med denne utførelsesform er ved hjelp av syntesemetoder eller rekombinant-DNA-metoder å produsere et syntetisk peptid, et renset protein eller en rekombinant-virus som kan anvendes som immunogen, og en vaksine til beskyttelse av cancerpasienter med høy risiko for sykdomstilbakefall, til behandling av påvist sykdom og endelig til profylaktisk vaksinering av individer med høy cancerrisiko. Det syntetiske eller rekombinerte melanoma-assosierte p97-antigen kan faktisk anvendes i kombinasjon med andre immunogener til fremstilling av multivalente vaksiner til motvirkning av melanoma og andre cancertyper. Eksempler på forskjellige vaksineformuleringer er angitt i det etterfølgende.

Subelement vaksineformuleringer

Det p97-beslektede peptid kan anvendes som immunogen i subelement vaksineformuleringer. Subelementvaksiner omfatter bare det relevante immunogene materiale som er nødvendig til immunisering av en vert. Følgelig kan det p97-beslektede peptid renses fra rekombinanter som ved ekspresjon produserer peptidet. Slike rekombinanter omfatter enhver av de ovenfor beskrevne virusinfiserte dyrkede celler, bakterielle transfor-manter eller gjærtransformanter. I en annen utførelsesform kan de p97-beslektede peptider eller proteiner syntetiseres kjemisk.

Hvorvidt de p97-beslektede peptider er renset fra rekombinanter eller er syntetisert kjemisk, kan sluttproduktet innstilles til en. passende konsentrasjon og formuleres med en hvilken som helst egnet vaksineadjuvans og emballeres for anvendelse. Egnede adjuvanser omfatter mineralgeler, f.eks. aluminiumhydroxyd, overflateaktive stoffer slik som lysoleci-thin, pluroniske polyoler, polyanioner, peptider og oljeemul-sjoner. Det p97-beslektede peptid kan også inkorporeres i liposomer eller konjugeres med polysaccharider og/eller andre polymerer for anvendelse i en vaksineformulering.

I tilfeller hvor det p97-beslektede peptid er et hapten, dvs. et molekyl som er antigent ved at det kan reagere selektivt med beslektede antistoffer, men ikke er immunogent ved at det ikke kan fremkalle en immunreaksjon, kan haptenet bindes covalent til en bærer eller et immunogent molekyl, og hapten-bæreren kan formuleres for anvendelse som en vaksine, idet f.eks. et stort protein slik som proteinserumalbumin, vil gi haptenet det er koblet til, immunogenisitet.

Eksempel: Melanoma- assosiert p97- antigen

I det etterfølgende eksempel ble cDNA-kloner som stammet fra forskjellige områder av p97 mRNA, sammensatt og innføyd i en ekspresjonsvektor som dirigerer ekspresjonen av et peptid som er beslektet med p97. De av ekspresjonsvektor-vertcellen produserte p97-beslektede peptider, kan formuleres i en vaksine.

Rensing av p9 7 mRNA

Polysomer ble fremstilt ut fra SK-MEL2 8 melanomaceller

(Carey et al., 1976, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 73:3270-3282)

ved magnesiumutfelling. Fra dette preparat ble det renset polysomer inneholdende dannende p97-kjeder ved inkubering med 3 IgG2a monoklonale antistoffer (96,5, 118,1, 133,2) som er

spesifikke for adskilte epitoper i p97 (Brown et al., 1980,

J. Biol. Chem. 255:4980^4983; Brown et al., 1981, J. Immunol. 127:539-546; Brown et al., 1981, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78:539-543; Plowman et al., 1983, Nature, London 303:70-72), etterfulgt av affinitetskromatografi på protein A Sepharose®. Det p9 7-berikede mRNA ble eluert under anvendelse av EDTA og ble renset ved affinitetskromatografi på oligo(T)-cellulose (Bethesda Research Labs, Bethesda MD). Ved et typisk forsøk ga 150 E2gQ-enheter av polysomer 260 ng p97-beriket mRNA, hvilket representerer 0,23% av den samlede mRNA-masse. Ved translasjon i Xenopus oocytter og analyse for p97 som beskrevet (Brown et al., 1981, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78:539-543; Plowman et al., 1983, Nature, London 303:70-72) ga p97-beriket mRNA 80 pg p97 pr. ng mRNA, mens p97-uberiket mRNA bare ga 0,44 pg p97 pr. ng mRNA, hvilket viser at p97 mRNA-aktiviteten var blitt øket 180 ganger. Utbyttet av p97 mRNA-aktivitet var 42%. Translasjon i reticulocytt-lysatsystemet (Pelham & Jackson, 1976, Eur. J. Biochem. 67:247-256) viste at p97-beriket mRNA koder for et hovedpoly-peptid med en tilsynelatende molekylvekt på 84.000 dalton ifølge analyse på SDS-PAGE, hvilket polypeptid ikke var påvis-bart i de translasjonene produkter fra uberiket mRNA, og polypeptidet ble immunoutfelt ved hjelp av antiserum som var spesifikt for p97 (figur 1). Herav ble det utledet at dette polypeptid var den uglycosylerte forløper for p97.

Fremstilling og oppbygning av cDNA- kloner

De to nedenfor beskrevne metoder ble anvendt til oppbygning av cDNA-kloner som var transkribert fra de ovenfor isolerte mRNA-templater.

Oppbygning av oligo( T)- primede cDNA- kloner

Ovennevnte p97-beriket mRNA ble anvendt som templat for oligo(T)-primet cDNA-syntese. cDNA ble klonet i pBR322 som følger. Ved første cDNA-strengsyntese ble p97-beriket mRNA, de fire dNTP'er og oligo(T) (Collaborative Research, Walthma, MA) inkubert med revers transkriptase (Molecular Genetic Resources). Den andre streng ble syntetisert ved inkubering med det store fragment av E. coli DNA polymerase (Bethesda Research Labs, Bethesda, MD) , og den dobbeltstrengede cDNA ble nedbrutt med sl-nuklease (gave fra D. Duram fra The Fred Hutch-insen Cancer Research Center, Seattle, WA). Angjeldende cDNA ble deretter forsynt med dC-hale ved hjelp av terminal deoxy-nukleotidyltransferase (Bethesda Research Labs, Bethesda, MD), ble normalisert med Pstl-nedbrutt pBR322 med dG-hale (Bethesda Research Labs, Bethesda, MD) (Villa-Komaroff et al., 1978, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75:3727-3731) og ble anvendt til transformering av CaCl2-behandlet E. coli RR1. DNA fra kolonier av transformerte bakterier ble bundet til papir (Taub & Thompson, 1982, Anal. Biochem. 126:222-230) og ble screenet ved hjelp av differensiell hybridisering med cDNA-prober som var syntetisert på p97-berikede mRNA-templater.

En 243 basepar (bp) klon, p97-3a2fl, ble identifisert, idet den hybridiserte med p97-beriket cDNA, men hybridiserte ikke i påviselig grad med uberiket cDNA, og utvalgte også

p97 mRNA ved hybrid-utvalgte translasjonsforsøk. Et polyadenyleringssignal (AATAA) og et poly(A) område forefantes ved 3'-enden av angjeldende cDNA (se figur 2). Skår-translatert p97-3a2fl hybridiserte 100 ganger sterkere med p97-beriket mRNA enn med uberiket melanoma-mRNA og hybridiserte ikke i påviselig grad med fibroblast-mRNA. Northern blot analyse under anvendelse av omhandlede, klonede cDNA som probe identifiserte en mRNA med ca. 4 kilobaser (kb), hvilket mRNA forefantes i SK-MEL 2 8 melanomaceller, men ikke i fibroblaster.

Genomkloning av p97 og anvendelse av syntetiske oligonukleotider til priming av cDNA- syntese

Forsøk på å oppnå cDNA-kloner som utstrakte seg lengre enn 1 kb fra polyadenyleringsplassen, mislyktes, sannsynligvis som følge av et område med høyt GC-innhold (større, enn 80%) med omfattende sekundær struktur. Genomkloning ble anvendt for å løse dette problem. Fire overlappende.genomkloner ble isolert fra biblioteker av lambda L47.1 som inneholdt størr-elsesfraksjonert SK-MEL 28 DNA som var beriket med hensyn til et spesifikt p97-restriksjonsfragment. Disse fire genomkloner rekker over 28 kb og inneholder hele p97-kodningsområdet, inklusive det regulerende område i genet. De genome kloner plassert i rekkefølge fra 5' til 3', er: lambda B15, lambda H17, lambda B6.6 og lambda E7.7. Nomenklaturen består av en bokstav som henviser til det til frembringelse av fragmentet anvendte restriksjonsenzym, og nummeret angir kilobasestørr-elsen av fragmentet som klones i lambda L47.1. Fra 5<1->enden inneholder lambda klon B15 et 15kb BamHI p97-fragment, lambda klon H17 et 17kb Hinddlll p97-fragment, lambda klon B6.6 et 6.6kb BamHI p97-fragment og lambda klon E7.7 et 7.7kb EcoRI p97-fragment (se figur 2A). Restriksjonsfragmenter av kloner som hybridiserer med 4 kb p97 mRNA på Northern blot, ble sekvensoppdelt, og p97-exoner ble identifisert ved hjelp av en computer-støttet homologiundersøkelse mellom de forutsagte kodningssekvenser og aminosyresekvensen av humant og hønse-transferrin (Yang et al., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:2752-2756; McGillivray et al., 1982, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79:2504-2508; Jetsch & Chambon, 1982, Eur. J. Biochem. 122-291-295).

Tre syntetiske oligonukleotider hvis sekvenser var basert på p97 genome exonsekvenser, ble anvendt til priming av cDNA-syntese på SK-MEL 28 mRNA, og det resulterende cDNA ble klonet i lambda-gtlO som følger: angjeldende p9 7 cDNA ble forsynt med dG-hale og ble ligert med et utfyllings-oligonukleotid (AATTCCCCCCCCCCCC) og lambda-gtlO som var blitt restrik-sjonsbehandlet med EcoRI. Utfyllings-oligonukleotidet tillot innføyelse og ligering av den med dG-hale forsynte cDNA-sekvens i EcoRI-området av lambda gtlO. Lambda-fagen ble pakket (Grosveld et al., 1981, Gene 13:227-237) og plate-dyrket på E. coli CgQ0 rK mK+ hf1. cDNA-bibliotekene i lambda-gtlO ble screenet med hensyn til p97-innføyelser ved hjelp av plakk-hybridisering (Benton & Davis, 1977, Science 196:180) med genome exonfragmentér som prober. Probene ble radiomerket med <32>P-TTP (New England Nuclear, 3200 Ci/mmol) ved hjelp av skår-translatering til en spesifikk aktivitet på 5-10 x 10 8 cpm/ug. Tre overlappende cDNA-kloner (10al, ljl, 2fl) som strakte seg over 2.368 nukleotider .i p97 mRNA, inklusive hele kodningsområdet, ble identifisert under anvendelse av p97-exonspesifikke fragmenter som prober (figur 2).

DNA- sekvensanalyse av p97

cDNA-innføyelser ble utklippet og subklonet i plasmidvektor pEMBLl8+ (Dente et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11:1645-1655) i E. coli med henblikk på etterfølgende propagering av restriksjonskartlegning. cDNA ble subklonet også i M13mpl8 fag-kloningsvektor (Yanish-Perrone et al., 1985,

Gene 33:103-119) og ble sekvens-oppdelt under anvendelse av dideoxymetoden ifølge Sanger (Sanger et al., 1977, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74:5463-5467). Ml3-kloner som inneholdt store innføyelser, ble sekvensoppdelt ved frembringelse av stryk-ninger under anvendelse av DNAse I (Hong, 1982, J. Mol. Biol. 158:539-549) eller exonuklease III (Henikoff, 1984, Gene 28:351-359) og ved anvendelse av syntetiske 21-mer oligonukleotidprimere.

p97-cDNA-sekvensen er vist i figur 3. En åpen leseramme omfattende 2.214 nukleotider, strekker seg fra den første ATG-sekvens, idet sekvensrekkefølgen omkring denne stemmer overens med den etter alminnelig oppfatning normale begynnelses-sekvens som er bestemt av Kozak (Kozak, 1980, Nucleic Acids Res. 8:127-142), til TGA-sekvensen i stilling 2.215. De fleste 5<1->cDNA-kloner inneholder ytterligere 60 nukleotider på opp-strømssiden fra ATG-startsekvensen. Det ikke-kodede 3'-område av p97 mRNA som ikke ble oppnådd som cDNA-klon, ble identifisert som et enkelt genomexon inneholdende 1.667 nukleotider. Rest 20-32 av den forutsagte aminosyresekvens er identisk med den kjente N-terminale aminosyresekvens av p97 (Brown et al., 1982, Nature, London 296:171-173), hvilket beviser identiteten av det klonede cDNA. Enn videre er den forutsagte molekylvekt av forløperen 80.196 dalton, hvilket stemmer godt overens med den iakttatte molekylvekt av in vitro translasjonsproduktet.

Oppbygning av et rekombinant- ekspresjonsplasmid inneholdende den p97- kodende sekvens

Det store omfang av p97-genet nødvendiggjorde sammen-stykning av cDNA-klonene som ble oppnådd med spesifikk priming av melanoma mRNA med revers transkriptase. De tre cDNA lambda gtlO kloner (10al, ljl og lfl, se figur 2) som omfattet kodningsområdet fra signalpeptidet til membranforankringssekvensen, ble anvendt. p97-innføyelsen i klon lOal ble isolert etter nedbrytning med EcoRI, og oligo(dG)-sekvensen ved 5'-enden av cDNA lOal ble fjernet ved nedbrytning med exonuklease III, hvilket frembragte klon lOalb, med en Hindlll-plass 30 bp på oppstrøms-siden fra start-methioninet i p97-preproteinet. p97-innføy-elsene i de tre cDNA-kloner lOalb, ljl og 2fl og genomklon E7.7 ble ligert sammen ved PvuII-, Satl- og EcoRI-restriksjons-enzymsetene og ble innføyd i Hindlll- EcoRI-området av plasmidvektor pEMBLl8+ (Dente et al., 1983, Nuc. Acid Res. 11:1645-1655) som vist i figur 2. Den endelige oppbygning, p97b, inneholder 4,4 kb p97-innføyelsen i plasmidvektor PEMBL18+ som ble anvendt til transformering av E. coli HB101. Innføyelsen i p97b inneholder 30 bp av det utranslaterte 5'-område av p97 mRNA, hele kodningssekvensen og det utranslaterte 3'-område avgrenset av et 5' Hindlll-sete og et 3' EcoRI-sete.

4,4 kilobase p97-innføyelsen ble utklippet fra p97b

med Hindlll og EcoRI, og endene ble utfylt under anvendelse av Klenow-fragmentet av E. coli DNA-polymerase II. Fragmentet med overheng ble innføyd på det entydige Smal-sete i den eukaryote cDNA-ekspresjonsvektor 1995.12 pUC13som er avledet av vektor mThGH-112 (Palmiter et al., 1983, Science 222:809-14), hvilken ekspresjonsvektor ble erholdt fra dr. Richard Palmiter (University of Washington, Seattle, Washington). Denne vektor anvender muse-metallothionein-promotoren til ekspresjon av fremmede gener i høyere eukaryote vertsceller. Oppbygningen med p97-innføyelsen og med korrekt orientering ble identifisert ved restriksjonsanalyse og ble betegnet pMTp97b.

Rekombinant-plasmidet ble transfisert i LMTK -celler,

og transfektantene ble utvalgt etter vekst i HAT-medium. Kloner oppsamlet fra transfeksjonsskålen, ble utviklet på mikrotest-plater med 96 brønner, og brukt kulturmedium og cellelysater fra replikatplater ble analysert med hensyn til p97 ved hjelp av en dobbelt-plass immunoradiometrisk prøve. Subkloner ble utviklet og igjen testet. Klon TKMp97-12 som ved ekspresjon produserer ca. 4.000.000 molekyler p97 pr. celle, ble dyrket, indusert med kadmium og anvendt som en kilde for p97 til immunisering.

Immunisering av mus med p97- beslektede peptider TKMp97-12-celler ble dyrket, indusert med kadmium og (14,4 g) lysert ved inkubering i 10 minutter på is med 70 ml TNEN (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40). Lysatet ble ultrasentrifugert ved 200.000 x g i 45 minutter ved 4°C, og halvparten av lysatet ble overført til en 1 ml immuno-affinitetskolonne som var spesifikk for p97 (Fab-fragment av antistoff 96.5 koblet til Sepharose<®>). Immuno-adsorberingsmidlet ble vasket grundig, først med TNEN og til slutt med 20 mM Tris-HCl, pH 6,8.

Til immunisering ble 0,5 ml av den adsorberte immune— affinitetskolonne, fremstilt som ovenfor beskrevet, blandet med 0,5 ml 20 mM Tris-HCl, pH 6,8, og ble emulgert med 1 ml av Freunds fullstendige adjuvans. Fire BALB/c-mus mottok hver intraperitonealt 0,4 ml av emulsjonen. 3 uker senere ble musene booster-behandlet med en fjerdedel av denne mengde antigen i Freunds ufullstendige adjuvans. Kontrollmus ble immunisert med et antistoff på en immuno-affinitetskolonne, hvilket antistoff var ubeslektet med p97, men var ellers behandlet identisk.

Fire av de p97-immuniserte mus og to kontrollmus ble tappet for blod 1 uke etter booster-behandlingen. De angjeldende sera ble testet for antistoffer mot p97 ved immunoutfeining fra radio-joderte SK-MEL melanomaceller etterfulgt av SDS-PAGE. Resultatene viste at sera fra de fire p97-immuniserte mus immunoutfelte p97, mens angjeldende kontrollsera var negative. Angjeldende sera ble testet også for nærvær av antistoffer rettet mot p97 under anvendelse av eh ELISA-prøve på glutaraldehyd-fikserte SK-MEL 28 melanomaceller (20.000 celler pr. mikrotest-brønn). De fikserte celler ble inkubert med 0,05 ml serum fortynnet 1/10.000 i 1 time ved romtemperatur, ble vasket og deretter inkubert i 1 time ved romtemperatur med 0,05 ml pepperrotperoxydase-konjugert geite-anti-mus-IgG (Southern Biotech). Den optiske tetthet (avlest ved 490 nm) av sera fra de p97-immuniserte mus var 0,350, 0,243, 0,343, 0,200, mens den optiske tetthet av sera fra kontrollmus var 0,036 og 0,057.

Karakterisering av p97

Struktur av p97

Strukturen av p97 ble bestemt ut fra aminosyresekvensen av p97-forløperen som omfatter fire strukturelle områder. Da rest 20 av forløpersekvensen svarer til N-terminalenden av utviklet p97, utgjør aminosyrerester 1-19 sannsynligvis et signal-peptid, hvilken konklusjon understøttes av lengden og den hydrofobe natur derav. Aminosyrer 20-361 og 362-713 omfatter to homologe områder med 342 og 353 aminosyrer. Potensielle N-bundne glycosyleringsseter forekommer i stillingene 38 og 135 i N-terminalområdet og stilling 515 i C-terminalområdet. Endelig formodes det at aminosyrer 714-738 som utgjør et område av hovedsakelig uladede og hydrofobe rester, som forankrer p97 i cellemembranen (Davi et al., 1985, J. Mol. Biol. 181:111-121) og kan strekke seg inn i cytoplasmaet.

Områdestrukturen av p9 7 ble understøttet av protease-nedbrytningsforsøk. Nedbrytning av p97 med trypsin, papain (Brown et al., 1981, J. Immunol. 127:539-546) eller trombin,

ga et glycosylert antigenfragment med en molekylvekt på ca. 40.000 dalton. Fragmentet ble renset fra en trombinnedbryt-

35

ning av p97 som var metabolisk merket med S-methionin eller 35S-cystem, og ble sekvensbehandlet som beskrevet (Brown et al., 1982, Nature, London 296:171-173). Cysteinrestene ble identifisert i stilling 7 og 17, og methioninrestene i stilling 2 og 20. Identiske resultater ble oppnådd med intakt p97 og stemmer fullstendig overens med den N-terminalsekvens av p97 som er forutsagt ut fra cDNA-sekvensen. Det ble fastslått at det protease-resistente fragment med en molekylvekt på 40.000 svarer til N-terminalområdet av p97. Det har ikke vært mulig å isolere C-terminalområdet av p97, muligens fordi det er proteasefølsomt.

Homologi av p97 med transferrin

En gjennomgang av aminosyresekvensbiblioteket i Protein Identification Resource (Release 5,0: Dayhoff et al., 1981, Nature, London 290:8) viste at p97 er påfallende homologt med tre medlemmer av transferrin-superfamilien: humant serumtransferrin, humant lactotransferrin og hønsetransferrin (37-39% homologi, se figur 4). Da humant og hønsetransferrin utviser en innbyrdes homologi på 50%, må p97 ha fjernet seg fra serumtransferrin for mere enn 300 millioner år siden. p97 inneholder 14 cysteinrester som befinner seg i homologe stillinger i hvert område. Humant transferrin inneholder alle disse cysteinrester i homologe stillinger i begge områder, mens humant lactotransferrin og hønsetransferrin bare mangler to av disse cysteinrester (i C-terminalområdene derav). Til for-skjell fra p97 inneholder disse proteiner 4-7 ytterligere cysteinrester i deres C-terminalområder, hvilke rester ikke har tilsvarende rester i N-terminalområdet. Humant transferrin inneholder også to ekstra cysteinrester som er entydige for N-terminalområdet derav. Stillingene av de fleste av disul-fidene i humant serumtransferrin, lactotransferrin og hønse-transferrin, er blitt bestemt direkte (McGillivray et al., 1982, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79:2504-2508; Metz-Boutique et al., 1984, Eur. J. Biochem. 145:659-676; Mazurier et al., 1983, Experientia (Basel) 39:135-141; MacGillivray et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:3543-3553; Williams et al., 1982,

Eur. J. Biochem. 122:297-303; Williams, 1974, Biochem. J. 141:745-752). Nærvær av 7 disulfidbindinger i hvert område av p97 kan således forutsis (se figur 5).

Aminosyrehomologien mellom områder av p97 (46% - 7 gab, 9 rester) er mere slående enn homologien i humant transferrin (43% - 16 gab, 45 rester) eller hønsetransferrin (35% - 12 gab, 49 rester). Under hensyntagen til den omfattende sekvenshomo-logi mellom p97 og transferrin og de tilsynelatende lignende foldningsmønstre basert på bevarelsen av cysteinrester, formodes det at hvis foreliggende lavoppløsning-røntgenstruktur av transferrin (Gorinsky et al., 1979, Nature, London 281:157-159) kan forbedres, vil det være mulig å utlede den tredimen-sjonale struktur av p97.

Funksjon av p97

Medlemskapet av transferrin-superfamilien, evnen til

å binde jern (Brown et al., 1982, Nature, London 296:171-173) og den med transferrin og transferrin-reseptoren felles kromo-somale lokalisering (Plowman et al., 1983, Nature, London, 303:70-72; Yang et al., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:2752-2756) støtter at p97 har en rolle i forbindelse med jerntransport. Jernbindingslommen i transferrin formodes å inneholde 2-3 thyrosinrester, 1-2 histidinrester og en enkelt bicarbonat-bindende argininrest (Metz-Boutique et al., 1984, Eur. J. Biochem. 145:659-676). Bibeholdelse av disse aminosyrer i p97 støtter formodningen om at p97 har en rolle i forbindelse med jernmetabolisme (se figur 4). Da p97 er et mem-branbundet transferrin-lignende molekyl og ikke har noen homo-

logi med transferrin-reseptoren (Schneider et al., 1984, Nature, London, 311:675-678), kan rollen derav ved cellulær jernmetabolisme avvike fra den rolle som sirkulerende serumtransferrin og den cellulære reseptor for transferrin spiller. Ekspresjon av klonet p97 cDNA i eukaryotiske celler vil tillate eksperimentell testing av de funksjonelle egenskaper derav.

Konklusjon

Basert på disse data er det klart at cDNA-oppbygninger for melanoma-assosiert p9 7 er blitt oppnådd, og at store mengder av antigent p97 effektivt kan produseres ved ekspresjon i mammale celler.

Ekspresjon av klonet p97 og vaksinetesting

I det etterfølgende beskrives ekspresjonen av det klonede p97-protein nærmere, og testingen derav som vaksine. Ekspresjon av p97-proteinet i en utsondret form (av den transfiserte musecelleklon B16svp97a.14) muliggjorde rensing av milligram-mengder av den fulle lengde av p97-proteinet. Proteinet i renset form ble anvendt til in vitro testing av induksjon av cellulær immunitet og til testing av dets evne som sub-elementvaksine. p97-genproduktet ble også produsert ved ekspresjon på celleoverflaten av metastatiske murine melanomaceller, hvilket tilveiebragte en modell for testing av effektiviteten av vaksiner for motvirkning av tumorvekst i et syngen-isk system.

p97-genet ble innføyet i et levende rekombinant vaccinia-virus for anvendelse som en vaksineformulering som var i stand til å frembringe effektiv cellulær immunitet. Rekombinant-vaccinia-virus Vp97a-NY ble vurdert med hensyn til evnen til å frembringe immunitet i mus under anvendelse av et antall forskjellige prøver til påvisning av humoral og cellulær immunitet. Under anvendelse av den ovenfor beskrevne syngeniske murine tumormodell ble det påvist at Vp9 7a-NY-rekombinant-virusvaksine tilveiebragte en beskyttende virkning mot tumor-celleangrep. Vaksinen tilveiebragte også en terapeutisk virkning i mus med eksisterende, voksende lungemetastaser, en egen-

skap som er analog med den foreslåtte anvendelse av vaksinen for frembringelse av en immunoterapeutisk antitumorreaksjon i humane melanomapasienter med eksisterende tumorer.

Foruten museundersøkelsene hvor det bare er 91% homo-

logi mellom humant p97 og det homologe muse-protein (over de hittil undersøkte områder), har Vp97a-NY-vaksinen også vært testet i ikke-humane primater. Det er langt tettere homologi mellom humant p97 og apeformen av proteinet (hvilket er påvist ved hjelp av kryssreaktivitet på det monoklonale antistoff-

nivå). På grunn av den potensielle vanskelighet ved frembringelse av en immunreaksjon mot et "eget"-protein, ble den nært beslektede makaque-ape anvendt for testing av immunogenisiteten av Vp97a-NY-vaksinen. Rekombinant-vaccinia-vaksine ble testet i aper og viste seg å fremkalle humoral immunitet rettet mot p97-proteinet. Hittil har apene ikke utvist merkbare symptomer,

på skadelige bivirkninger fra eksponering for vaksinen etter å

ha mottatt to inokuleringer av levende rekombinant-vaccinia-

virus over et tidsrom på 6 uker.

Plasmidekspresjon

Ekspresjonsplasmidet som påvirkes av den tidligere SV40-promotor SV2, ble oppbygget ut fra cDNA-plasmidklonet p97a som svarer til plasmid p97b, bortsett fra at hele 3'UT-området anvendes (figur 6). Alle cDNA-kloner ble opprinnelig isolert fra lambda gtlO-biblioteker med syntetiske EcoRI-dG (9-17)

linkere som ovenfor beskrevet. Innføyelser ble utklippet med EcoRI og subklonet i pEMBL18+ for etterfølgende propagering

og karakterisering. Klon lOal ble subklonet i M13mpl8, og en RF-form ble nedbrutt med BamHI og SphI, ble kort behandlet med Exonuklease III, ble forsynt med jevne ender med Sl-nuklease, ble behandlet med Klenow og religert. Adskillige plakker ble isolert og sekvensanalysert, og fra en av disse var dG-halen fjernet og 33 bp av det utranslaterte 5<1->område av p97 innføyet i HindiII-området av Ml3mpl8 bibeholdt. En RF-form av denne sub-klon (lOala) ble anvendt til frembringelse

av det intakte p97 cDNA, idet ellers alle fragmenter ble isolert fra plasmid-subklonene. 550 bp fra Hindlll- PvuII-

fragmentet fra lOala og 735 bp PvuII- Sall-fragmentet fra ljl ble isolert fra LMP-agarosegeler og ble ligert i pEMBL18+

ved Sali- og Hindlll-setene til frembringelse av p5'p97.

E7.7 genomklonet i pEMBL18+ ble fullstendig nedbrutt med EcoRI og delvis nedbrutt med Sstl, og 4,5 kb-fragmentet ble separert ved fraksjonering gjennom 0,8% LMP-agarose. Dette 4,5 kb 3'-fragment ble ligert med 404 bp S_stl-fragmentet fra 2fl og 535 bp BamHI-Sstl-fragmentet fra ljl i pEMBLl8+ ved Sali- og EcoRI-setene til frembringelse av p3'p97. 1285 bp Hindlll-Sall-fragmentet av p5'p97 ble deretter ligert i p3'p97 til frembringelse av pp97a. EcoRI-partielt HindiII-fragmentet fra denne klon ble innføyd i pSV2neo (Southern et al., 1982, J. Mol. App. Genet. 1:327-341) ved Hindlll- og EcoRI-setene til eli-minering av det neomycin-kodende område og SV40-spleisings/polyA-sekvensene, under bibeholdelse av den tidlige SV40-promotor og 72 bp forøkeren, 33 bp p97 5'UTR, det fullstendige p97-kodningsområde, 3'UTR og 1,4 kb 3' tilstøtende DNA. Det resulterende plasmid ble betegnet som pSVp97a.

Det sv2-påvirkede plasmid ble transfisert ved hjelp

av calciumfosfatutfelling i forskjellige eukaryote cellelinjer, og ekspresjonsceller ble klonet og utvalgt under anvendelse av co-transfeksjon av en dominerende valgbar markør. For oppnåelse av dette ble ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO-celler) dyrket i Hanks Fl-medium inneholdende 15% kalvefosterserum (FCS), 4 mM L-glutamin, 1,3 mM prolin og antibiotika. Bl6-celler ble dyrket i RPMI-medium inneholdende 0,15% bicarbonat og 1735 celler i DMEM-medium (Gibco), begge supplert med 15% FCS, og antibiotika. Celler ble transfisert ved hjelp av en modifisert calciumfosfatteknikk (M. Wigler et al., 1978, Cell 14:725-733) med 10 pg pSV2p97a-plasmid-DNA pr. plate og enten 0,5 pg av enten pSV2DHFR eller pSV2neo. Samtlige plasmider ble linearisert ved EcoRI-setet. Stabile transfektanter ble utvalgt under anvendelse av hypoxanthin-negativt medium (HAT-) for CHO-celler eller 0,5 ug/ml "Geneticin" (G418, Gibco) for B16 og 1735 celler. Overlevende ceiler begynte å danne synlige kolonier 7 dager etter trans-fisering og ble dekket med sterile polyesterfiltre som ble

fastholdt med glassperler. Filtrene forble på plass i 5 dager, hvilket tillot cellene å vokse opp i polyestermatriksen under dannelse av en kopi av koloniene på platen. Filtrene ble deretter fjernet og anvendt til en levende celle-bindings-prøve med jodert anti-p97 monoklonalt antistoff. 10 ug merket monoklonalt antistoff ble inkubert med opp til 20 filtre i 10 ml FCS ved 4°C i 1 time. Filtrene ble vasket grundig i fosfatbuffer-holdig saltvann (PBS), ble tørket og eksponert på XAR-5-film natten over ved -70°C. Filtrene ble deretter farvet med 7% methylenblått for visualisering av cellekolonier. I alle de anvendte cellelinjer, bortsett fra B16 muselinjen, inneholdt ekspresjonscellene antigent p97-protein på celleover-flatene derav.

I de Bl6-transfiserte celler ble p97 frigjort i mediet, hvilken oppdagelse er unik for denne celletype. Utskillelsen av p97 muliggjorde rensing av p97-proteinet i full lengde fra mediet av cellene. Klon B16SVp97a.l4 ga ved ekspresjon ca. 4 ug/ml p97 i det brukte medium. Rekombinant-p97 ble renset fra det brukte medium for det transfiserte klon Bl6SVp97a.l4 som utskilte store mengder p97-antigen i mediet. Det ble opprettholdt en høy konsentrasjon av celler (10 9 celler) i 850 cm 2rulleflasker under kontinuerlig tilsetning av små mengder friskt medium. Cellene fortsatte med å utskille antigen i uker uten utskiftning, hvilket tillot kontinuerlig høst-ing og nedfrysing av brukt medium. Rensing av p97 ble fore-tatt ved immunoaffinitetskromatografi under anvendelse av sepharose bundet til Fab-fragmenter av monoklonalt antistoff 96,5. Til dette formål ble 3 1 brukt medium ført gjennom en serie av 30 ml kolonner. Den første kolonne inneholdt 15 ml superfin G-25 Sephadex<®> (Pharmacia), den andre kolonne inneholdt 20 ml Sepharose<®> 4b (Pharmacia), og den tredje kolonne inneholdt 8 ml cyanogenbromid-aktivert Sepharose<®> (Sigma) som var konjugert med Fab-fragmenter av monoklonalt antistoff 96,5 (10 mg protein/ml Sepharose<®>). Deretter ble affinitets-kolonnen grundig vasket med kald PBS, og antigenet ble eluert med 30 ml 0,1 M citrat, pH 5, og 30 ml 0,1 M citrat, pH 4.

Det ble påvist at disse betignelser ikke endret antigenets

immunreaktivitet, men det ble oppnådd fullstendig eluering

av antigenet fra monoklonalt antistoff 96,5. De to eluer-inger ble nøytralisert med hhv. 3,0 ml og 4,5 ml 2 M Tris,

pH 8. Det rensede eluat ble konsentrert under anvendelse av et "Amicon"-apparat med et PM10-filter og ble vasket med. to 10 ml volumer PBS, hvilket ga et sluttutbytte på 4,95 mg i 4,5 ml, ifølge bestemmelse ved Bradford-analyse (Biorad). 15 pg av produktet ble undersøkt på SDS-PAGE (figur 7) og ble visualisert både ved Coomassie Blue og ved sølvfarving. En dobbelt deter-minantimmunoprøve (DDIA) (Brown et al., 1981, Proe. Nati.

Acad. Sei. 78:539) ga en uavhengig bekreftelse på den molare mengde av renset protein. Kontrollpreparater ble utført paral-lelt med brukt medium fra Bl6-cellelinjestamformen og utviste intet påviselig protein. Ved en etterfølgende fremstilling

ble 30 mg 95% rent p97-protein renset fra 300 mg monoklonalt antistoff 96,5-Fab-fragmenter konjugert med Sepharose<®>. Det rensede p97-protein var immunogent, idet det frembragte en sterk antistoffreaksjon i mus som ble immunisert med proteinet som beskrevet i det etterfølgende.

Oppbygning og ekspresjon av rekombinant- p- 97- vaccinia-virus

Kodningsområdet av p97 ble innføyd ved å klippe p97

av med Hindlll, omdanne endene til stumpe ender og ligere i vaccinia-kloningsvektoren pGS-20 (Mackett et al., 1984,

J. Virol. 49:857-864) som var åpnet ved Smal-setet. PGS-20-vektoren utnytter 7,5 K-promotoren og inneholder tilstøtende sekvenser fra vaccinia-thymidin-kinasegenet (TK). Et rekombinant-virus ble frembragt ved den av Mackett et al. (se ovenfor) beskrevne metode, og Vp97a-NY ble isolert, hvilket be-virket at infiserte celler ved ekspresjon produserte p97-protein med korrekt størrelse og glycosylering (figur 8).

.Overflateekspresjon av p97 ble også bekreftet i celler infisert med den nedenfor angitte (tabell I) rekombinant-p97-virus.

Celler ble kort trypsinbehandlet, vasket, og aliguoter

3 4 5

inneholdende 10 til 10 eller 10 celler ble anbragt i reagensglass. Bærerceller uten ekspresjon ble tilsatt til glass med lavere celleantall slik at det i alt ble anvendt 10<5> celler pr. glass. 1 x IO<6> cpm jodert, monoklonalt antistoff 96,5 (123 ng) ble inkubert i et samlet volum på 50 ul med cellene i 60 minutter på is. Cellene ble vasket og om-hvirvlet fire ganger i PBS + 10% kalvefosterserum, ble deretter resuspendert og tellet i en "Micromatic 4/600plus" gammateller. (-) betyr mindre enn.

Immunogenisitet av rekombinant- p97- vaccinia- virus i mus

Inokulering av mus med Vp9 7a-NY frembragte en sterk humoral antistoffreaksjon. Mus ble immunisert én gang, ble booster-behandlet én gang etter 4 uker, og blod ble tappet etter 5 uker. Titrene ble undersøkt ved hjelp av ELISA under anvendelse av antigen-belagte plater og med et til pepperrotperoxydase konjugert protein A som påvisningsreagens. De erholdte data ble omsatt til monoklonale antistoff-ekvivalenter ved sammenligning med en standardkurve for ELISA-binding som var frembragt under anvendelse av anti-p97-monoklonalt antistoff 133,2. Resultatene viste en sterk induksjon av serum-antistoff (figur 9). Cellulær immunitet ble påvist under anvendelse av en in vitro celledelingsprøve med renset p97-protein som det stimulerende antigen (tabell II).

Miltceller ble isolert fra mus som var inokulert ved hjelp av hale-scarifikasjon med 10 7 pfu Vp97a-NY rekombinant-virus, booster-behandlet 1 måned senere med samme dose og avlivet 1 uke deretter. Naturlige miltceller ble anvendt som kontroll 5

ved dette forsøk. 10 celler ble dyrket pr. brønn i rundbunnede plater med 96 brønner i 0,22 ml RPMI supplert med 0,5% normalt museserum, penicillin/streptomycin, glutamin, bicarbonat og 2,5 x 10<5> M 2-mercaptoethanol. Kulturer ble puls-merket i 6 timer på dag 4 med 25 uCi-tritiert thymidin/brønn (New England Nuclear), ble høstet med en PHD-

cellehøster og tellet under anvendelse av Optifluor® i en "Beckman LS 3801"-teller. Celledelingsindeks ble beregnet ved å dividere gjennomsnitt cpm for firedoble brønner som var stimulert med antigen med gjennomsnittlig cpm for kontroll (mediet).

De i tabell II viste resultater indikerer at T-celler deler seg som reaksjon på p97-protein-antigenet.

For å sikre hvorvidt hjelpeceller også stimuleres av rekombinant-virus i miltceller fra immuniserte mus, ble cellene stimulert in vitro, og supernatantene ble undersøkt med hensyn til produksjon av interleucin-2 (IL-2) som er en T-hjelpecellefaktor. Miltceller fra mus som på forhånd var immunisert to ganger med rekombinant-Vp97a-NY-vaccinia eller vaccinia-stamform, ble dyrket. 10 celler ble inkubert i 48 timer i 0,2 ml medium som var identisk med det som ble anvendt ved celledelingsundersøkelsene, i rundbunnede plater med

96 brønner i nærvær eller fravær av det stimulerte antigen. Supernatanter ble oppsamlet, forenet fra fire brønner og ble nedfrosset før IL-2-prøven. Til IL-2-prøven ble det anvendt 10^ muse-T-cellelinje CTLL-celler som på forhånd var berøvet for IL-2, og cellene ble inkubert i hver brønn in triplo med varierende fortynninger av prøvesupernatant med Clicks medium. Det ble konstruert en standardkurve med rekombinant-IL-2 erholdt fra Genentech, CA., USA. CTLL-cellene ble puls-merket med thymidin i overensstemmelse med den vanlige celle-delingsprøveteknikk de siste seks timer av inkuberingen på 24 timer, ble deretter høstet og tellet som beskrevet under celledelingsforsøksmetoden. Resultatene vist i tabell III, indikerer at IL-2-produksjonen fra miltceller fra mus som er immunisert med rekombinant-p97-vaccinia-virus, ble stimulert in vitro med p97.

En hypersensibilitetsreaksjon av den forsinkede type ble dessuten målt under anvendelse av en tredeputehevelses-te.st med Vp97a-NY-inokulerte mus. 5 mus (C3H/Hen-stamme) pr. gruppe ble inokulert ved halescarifikasjon med rekombinant-vaccinia-virus eller vaccinia-virus av stamformen. 6 dager senere ble bakpotene på hver mus behandlet ved inokulering med 20 ul PBS eller 20 ul celler i PBS (5 x IO<5> celler pr. mus). Tredeputene ble målt 24 timer senere ved et dobbelt blindfor-søk under anvendelse av et "Fowler"-mikrometer. Tredepute-tykkelsen av den PBS-injiserte tredepute ble subtrahert fra den målte tykkelse av den eksperimentelt behandlede fot fra hver mus, og gjennomsnitts- såvel som standardavvik for den forøkede hevelse av tredeputene ble beregnet. Resultatene som fremgår fra tabell IV, viser induksjonen av en p97-spesifikk hypersensibilitetsreaksjon av den forsinkede type hos mus som er immunisert med rekombinant p97-vaccinia-virus.

Immunogenisitet av rekombinant- p97- vaccinia- virus i makaque- aper

To Acaca fasicularis (makaque-aper) ble scarifisert med enten 2 x 10 <8>plakk-dannende enheter (pfu) av Vp97a-NY-rekombinant-vaccinia eller samme dose vaccinia-stamform. To uker senere ble sera fra apene testet ved hjelp av ELISA med hensyn til titeren overfor vaccinia og p97. Fra de resultater som er vist i tabell VI, fremgår det at humorale antistoffer overfor p97 var påviselige to uker etter en enkelt inokulering med Vp97a-NY.

Deponering av mikroorganismer

Følgende E. coli-stamme som bærer det anførte plasmid, er deponert ved American Type Culture Collection (ATCC) i Rockville, MD, USA, og ble gitt følgende deponeringsnummer:

Følgende rekombinant-vaccinia-virus er blitt deponert ved American Type Culture Collection (ATCC) i Rockville, MD, USA, og er blitt gitt følgende deponeringsnummer:

Følgende cellelinjer som bærer de angitte plasmider,

er deponert ved American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA, og er blitt gitt følgende deponeringsnumre:

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et i alt vesentlig rent, udenaturert, terapeutisk aktivt, antigent p97-protein med en aminosyresekvens som i alt vesentlig omfatter den i figur 3A og 3B avbildede aminosyresekvens fra aminosyrerest nr. 21 til 738, eller en antigen del derav, karakterisert ved at en celle transformeres med en ekspresjonsvektor som inneholder nukleotidsekvensen i figur 3A og 3B fra nukleotid nr. 60 til 2214, og en promoter som regulerer genekspresjonen slik at det antigene p97-protein produseres ved ekspresjon av den genetisk manipulerte, dyrkede vertscelle, hvoretter det udenaturerte, antigene p97-protein renses.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den dyrkede vertscelle er en bakterie som er i stand til å produsere det antigene peptid.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at bakterien omfatter Escherichia coli som deponert ved ATCC under deponeringsnummer 53403.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den dyrkede celle omfatter en dyrecellelinje som er i stand til å produsere det antigene peptid.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at dyrecellelinjen omfatter musecellelinje TKMp97-12 som deponert ved ATCC under deponeringsnummer CRL 8985.

6. Ekspresjonssystem bestående av et rekombinant virus som ved fremgangsmåten ifølge krav 1-5, dirigerer ekspresjonen av et antigent peptid eller et protein beslektet med det melanoma-assosierte p97-antigen, eller et antigent protein derav, i en vertcelle som er infisert med angjeldende rekombinant-virus, karakterisert ved at et rekombinant-virus-genom omfatter en nukleotidsekvens som koder for et antigent peptid eller protein som er beslektet med det melanoma-assosierte p97-antigen, eller en antigen del derav, hvilken nukleotidsekvens er under kontroll av en promoter som regulerer genekspresjonen således, at et peptid eller et protein beslektet med det melanoma-assosierte p97-antigen dannes ved ekspresjon i den infiserte vertcelle, og hvor nukleotidsekvensen som innkoder det antigene peptid eller protein som er beslektet med det melanoma-assosierte p97-antigen, i alt vesentlig omfatter den i figur 3A og 3B avbildede nukleotidsekvens, eller en del derav, som koder for et antigent peptid eller protein.

7. Ekspresjonssystem ifølge krav 6, karakterisert ved at nevnte virus omfatter et innkapslet virus.

8. Ekspresjonssystem ifølge krav 7, karakterisert ved at det innkapslede virus omfatter et vaccinia-virus.