HU209144B - Method for producing vaccina and active agent against melanome - Google Patents

Description

A találmány vakcina készítményekkel foglalkozik, amelyek olyan immunválaszt indukálnak, amely szelektíven elroncsolja a melanóma sejteket a vakcináit egyénekben. Következésképpen egy melanómához társult antigénhez közel álló pepiidet vagy fehérjét állítunk elő nagy mennyiségben rekombináns DNS technika és/vagy szintetikus kémiai módszerek révén. A jelen találmány szerinti peptidet vagy fehérjét immunogénként lehet alkalmazni vakcina készítményekben. Bizonyos kiviteli módokban, ahol a melanómához társult antigénhez közel álló peptidet vagy fehérjét rekombináns vírus segítségével fejezzük ki, magát a rekombináns vírust alkalmazhatjuk immunogénként a vakcinakészítményben. A találmány eljárásokat nyújt, amelyek közt megtalálható a rekombináns DNS technika alkalmazása, valamint szintetikus kémiai eljárások is, ezek az eljárások lehetővé teszik a melanómához társult antigénhez közel álló peptidek vagy fehérjék előállítását nagy mennyiségben.

A találmány bemutatására példaként a p97-hez közel álló immunogén peptideket alkalmazzuk; a p97 monomer sejtfelületi szialo-glikoprotein, amelynek látszólagos molekulatömege 97 000 daltonnál valamivel kisebb, és amely a melanóma-sejtek sejtfelületi komponense.

2. A TECHNIKA ÁLLÁSA

2.1 TUMORRAL TÁRSULT ANTIGÉNEK

Kísérleti állatokkal, főleg rágcsálókkal végzett kísérletek azt mutatják, hogy legtöbb, onkogén vírusok által indukált tumor vírus genom által kódolt antigéneket fejez ki; és az ezekkel az antigénekkel végzett immunizálás az azonos vírus által indukált tumor sejtek ezt követő kihívásának elfojtásához vezethet. Bár ennek a munkának nagy részét vírusok laboratóriumi törzseivel, mint pl. SV40, polióma vírus, Friend-, Moloney- vagy Rauscher-rágcsáló leukémia vírus, végezték, a természetben előforduló onkogén vírusok horizontális és vertikális átvitelét is bemutatták már; sőt már rendelkezésre áll kereskedelmi forgalomban levő vakcina vírus-indukált macska leukémia és szarkóma ellen.

Ezzel ellentétben a legtöbb emberi rák vírus-etiológiáját eddig nem mutatták ki. Jelentős kivételek a hepatitisz vírus (hepatóma), a herpesz szimplex vírusa (méhnyakkarcinóma), és az Epstein-Barr vírus (orr-garati karcinóma). Az elmúlt két évtized során azonban megállapították, hogy bizonyos humán tumor sejtek tumor antigéneket fejeznek ki, azaz olyan antigéneket, amelyek megkülönböztetik a tumor sejteket normális celluláris partnereiktől; bizonyos betegek sejt-közvetített vagy humorális immunválaszt mutatnak ezek ellen az antigének ellen [Hellstrom és munkatársai: Natúré, 220, 1352 (1968); Morton és munkatársai: Science, 162, 1279-1281 (1968); Shiku és munkatársai: J. Exp. Med. 144,873-881 (1976)]. Ezeknek az immunválaszoknak a célpontjai közül néhány az emberi genom által kódolt onkofetális vagy differenciációs antigének [Hellstrom és munkatársai; Int. J. Cancer 6,346-351 (1970)].

Jelenleg még a tumor antigének molekuláris természete nem ismert, és az immunológiai reakciók tumorfajlagosságának mértéke nem világos. Azok a próbálkozások, hogy ezt az információt rák-diagnosztikai vizsgálatok kifejlesztésében, vagy a rák terápiájában alkalmazzák, nagymértékben sikertelenek voltak. Mivel a spontán tumor visszafejlődések rendkívül ritkák, arra a következtetésre lehet jutni, hogy az in vitro kimutatott immunválaszok in vivő hatástalanok; így pl. miközben egy rákos betegből kapott antitestek és limfociták hatásosak lehetnek tumorsejtek elpusztításában in vitro, ugyanannak a rákos betegnek az immunválasza nem hat in vivő.

Amióta Kohler és Milstein bevezették a monoklonális antitest technikát [Natúré, 256, 495-497 (1975)], intenzív kutatás kezdődött a humán tumor antigének irányában, mivel ez eszközt nyújt az ilyen antigének meghatározására mind a molekuláris szinten, mind a fajlagosság tekintetében [Hellstrom és Brown: a „The Antigens” (Az antigének) c. kiadványban, M. Sela szerkesztésében; kiadó; Academic Press;

V. kötet, 1-66. oldal (1979)]. Az elmúlt néhány évben nagy számban írtak le tumorhoz társult antigéneket, legtöbbjüket egér monoklonális antitestekkel határozták meg [Reisfeld és Sell kiadásában: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Monoklonális antitestek és a rák terápiája), UCCA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series, 27. kötet; kiadó: Alán R. Liss, Inc., New York; 1985; 1-609 oldal]. Bár tulajdonképpen az összes olyan antigén, amelyet jól jellemeztek, onkofetális vagy differenciációs antigénnek bizonyult, és tumorra való fajlagosságukról úgy találták, hogy inkább kvantitatív, mint kvalitatív, számos antigén megfelelően fajlagos a neoplazma sejtekre a normál sejtekkel szemben (általában 10-1000-szeres tényezőnek megfelelően), amelyeket lehetséges célként alkalmazhatunk tumor sejtek kimutatásához és terápiához. Tumor antigénekhez való humán monoklonális antitesteket is kaptak már [Cote és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 2026-2030 (1983)]. Ez támogatja azt a korábban idézett bizonyítást, hogy bizonyos rákos betegek immunreakciót létesítenek tumorukkal szemben.

Az eddig azonosított humán genom által (és nem az endogén vagy exogén vírusok által) kifejezett, tumorhoz társult sejtfelületi antigének több mint fele fehérje vagy glikoprotein, a többi pedig glikolipid, amely a glikozil-transzferázok rendellenes kifejeződésének vagy szabályozásának következménye.

2.2 MELANÓMÁVAL TÁRSULTp97 ANTIGÉN

A p97 antigén olyan tumorral társult antigén, amelyet először azonosítottak humán melanómában, monoklonális antitesteket alkalmazva [Brown és munkatársai: J. Bioi. Chem. 255, 4980-4983 (1980); Dippoldés munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 6114— 6118 (1980); Woodbury és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77,2183-2187 (1980)]. Ap97 antigént kiterjedten tanulmányozták kifejeződésére való tekintettel normál és neoplazmás szövetekben; és ez jelen

HU 209 144 Β van legtöbb humán melanómában és bizonyos embriószövetekben, de csak nyomokban található normális felnőtt szövetekben [Brown és munkatársai: J. Immunoi. 127, 539-546 (1981); Brown és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78,539-543 (1981); Garrigues és munkatársai: Int. J. Cancer 29, 511-515 (1982)]. A p97-et cél-anyagként alkalmazták a melanómák diagnosztikai leképezéséhez humán klinikai kísérletekben [Larson és munkatársai: J. Clin. Invest. 72, 2101-2114(1983)].

A p97 monomer sejt-felületi szialo-glikoprotein, amelynek látszólagos molekulatömege (MT) nátriumdodecil-szulfát-poliakril-amid-gél elektroforézissel (SDS-PAGE) mérve valamivel kevesebb, mint 97 000 dalton. A monoklonális antitestek három fő antigén helyet határoztak meg, amelyek egy stabil, 40000 daltonos tripszines fragmensen vannak jelen [Brown és munkatársai: J. Immunoi. 127,539-546 (1981)]; a p97 teljes szekvenciáját azonban eddig még nem írták le. Legalább két másik, egymástól függetlenül jellemzett humán melanómához társult antigén, a gp95 [Dippold és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 6114— 6118 (1980)] és a gp87 [Khosran és munkatársai: Int. J. Cancer 35, 73-80 (1985)] tűnik azonosnak a p97-tel szekvenciális immun-precipitációs elemzés alapján.

A p97 N-terminális aminosav-szekvenciája homológ a transzferrinnel, és a transzferrinhez hasonlóan a p97 is köti a vasat. Brown és munkatársai: Natúré (London), 296, 171-173 (1982). A szomatikus sejthibridek elemzése és az in situ hibridizálás azt mutatja, hogy a p97 gén a transzferrin és a transzferrin-receptor génjéhez hasonlóan a 3q21-3q29 kromoszomális területen helyezkedik el [Plowman és munkatársai: Natúré (London), 303, 70-72 (1983): Yang és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 2752-2756 (1984)]. Ezek a megfigyelések azt sugallják, hogy a p97 szere-, pet játszik a vas metabolizmusban.

2.3 RÁK VAKCINÁK

A kísérleti állatokon, elsősorban egereken végzett tanulmányok azt mutatják, hogy az élő vagy elölt ráksejtekkel végzett immunizálás élő ráksejtek ezt követő szaporodásának visszafojtásához vezethet. Azok a próbálkozások, hogy sejtmentes anyaggal immunizáljanak, általában kevésbé sikeresek, bár bizonyos sikerekről számoltak be [lásd pl. ezzel kapcsolatban Hellstrom és Brown összefoglaló tanulmányát a „The Antigens” (Az antigének) című kiadványban (szerkesztő: Sela M., kiadó: Academic Press). V. kötet, 1-66. oldal]. Több esetben a védő hatásért felelős cél antigének virális úton kódolódnak, de sok más esetben az antigénnek, amely védő immunválaszt idéz elő, a szerkezete ismeretlen.

Az emberekben végzett tanulmányok még sokkal nehezebbek, és a rák vakcinák hatásossága vitatott, számos, sikerekről szóló beszámoló ellenére. Sok esetben a vakcina-készítmények besugárzott tumor-sejtekből, vagy bizonyos kémiai szerek hatásának kitevéssel elölt tumor-sejtekből állnak. Mivel tiszta, humán, tumorral társult antigének eddig még nem állnak rendelkezésre, nem találhatók beszámolók ezek használatáról vakcinákban.

A rák-vakcinák javasolt alkalmazásának emberekben legfőbb elméleti ellenvetése az, hogy azok az emberek, akik „vakcináltak” pl. elölt ráksejtekkel vagy sejtmentes készítményekkel, immunológiailag nem válnak fogékonnyá, mivel azok a tumor antigének, amelyek az immunválasz célpontjai lehetnek, jelen vannak, ha nyomnyi mennyiségben is csupán, bizonyos normális sejtekben, és így az immunrendszer révén „saját”-ként érzékelődnek. Legtöbb, hacsak nem minden, tumorhoz társult antigén, amelyet monoklonális antitestekkel mutatunk ki humán tumorokban, jelen van bizonyos normál szövetekben is, és kevés bizonyosság van ama, hogy a rákos betegek hatásosan válaszolnak ezekre in vivő. Van bizonyosság arra nézve, hogy a szupresszor (elfojtó) sejtek fő szerepet játszanak az immunválasz alulszabályozásában tumor-antigénekre [Nepom és munkatársai: Experimentia 39, 235-242 (1983)], Ezen kívül tumor-antigének egyik készlete által indukált szupresszor sejt immunválasz megakadályozhatja egy hatásos tumor-roncsoló válasz indukcióját tumor antigének egy másik készletére, amely önmagában nem indukálna szupressziót [Hellstrom és munkatársai: a „Biomembranes” c. kiadványban (szerkesztő: Nowothny A., kiadó: Plenum Press), 365-388 oldal (1983).

2.4 REKOMBINÁNS DNS TECHNIKÁK ÉS

VACCINIA VÍRUS

A rekombináns DNS technológia alkalmazása fertőzések elleni védelemre szolgáló alegység-vakcinák előállítására magában foglalja a molekuláris klónozást és olyan fehérjéket kódoló genetikai információ kifejeződését megfelelő vektorban, amelyek immunválaszt váltanak ki az adott fehérje ellen a gazdaszervezetben. Nemrégiben új megközelítést írtak le, amely potenciálisan használható alegység-vakcinák előállításához [Mackett és munkatársai: Proc. Acad. Sci. 79, 74157419 (1982); Mackett és munkatársai: J. Virol. 49, 857-864 (1984); Panicali D. és Paoletti E.: Proc. Natl. Acad. Sci. 79, 4927-4931 (1982)]. Ez a megközelítés magában foglalja a Vaccinia vírus mint vektor alkalmazását genomjába beiktatott idegen gének kifejezésére. A gazda-állatba való bevezetésre a rekombináns Vaccinia vírus kifejezi a beiktatott idegen gént, és ezáltal kiváltja a gazdaszervezet immunválaszát az ilyen géntermékre. Mivel élő rekombináns Vaccinia vírust alkalmazhatnak vakcinaként, ez a megközelítés egyesíti az alegység-vakcinák és az élő vakcinák előnyeit.

A Vaccinia vírus mintegy 187 kilobázispáros, lineáris kettős szálú DNS genomot tartalmaz, és a fertőzött sejtek citoplazmáján belül replikálódik. Ezek a vírusok teljes átíró enzimrendszert (beleértve a javító, metilező és poliadenilező enzimeket) tartalmaznak a vírus belső magján belül, amely szükséges a vírus fertőzőképességéhez. A Vaccinia vírus átírás-szabályozó szekvenciái (promotorok) lehetővé teszik a Vaccinia RNS polimeráz által kiváltott átírás beindítását, de ugyanez nem vonatkozik a gazdasejt RNS polimerázára.

HU 209 144 Β

Az idegen DNS kifejeződése rekombináns Vaccinia vírusban igényli a Vaccinia promotorok ligálását az idegen gén fehérjekódoló DNS szekvenciáihoz. Plazmid vektorokat, amelyeket beiktató vektoroknak is neveznek, alkottak meg, hogy kiméra géneket iktassanak be Vaccinia vírusba. A beiktató vektorok egyik típusa a következőkből áll: (a) Vaccinia vírus promotor, beleértve az átírás beindító helyet; (b) számos egyedi restrikciós endonukleáz klónozó hely, az átírási starthelytől „lefelé” elhelyezve, az idegen DNS fragmensek beiktatásához; (c) nem eszenciális Vaccinia vírus DNS-ek (mint pl. TT gén), amelyek szegélyezik a promotort és a klónozó helyeket, és amelyek irányítják a kiméria gén beiktatását a vírus genom homológ nem-eszenciális területébe; és (d) egy bakteriális replikációs origó és antibiotikum rezisztencia marker az E. coliban való replikációhoz és szelekcióhoz. Az ilyen vektorokra MacKett írt le példákat [MacKett és munkatársai: J. Virol. 49,857-864(1984)].

Rekombináns Vaccinia vírusokat lehet előállítani idegen géneket tartalmazó rekombináns bakteriális beiktató plazmidokkal való átfertőzéssel olyan sejtekbe, amelyek előzőleg Vaccinia vírussal voltak fertőzve. Homológ rekombináció megy végbe a fertőzött sejtekkel, és ez az idegen gén beiktatását eredményezi a vírus-genomba. A fertőzött sejteket át lehet vizsgálni rekombináns vírusokra immunológiai technikákat, DNS tarfolt-hibridizálást vagy genetikai szelekciót alkalmazva; ezeket a vírusokat ezt követően azután izolálhatjuk. Ezek a Vaccinia rekombinánsok megőrzik lényeges funkcióikat és fertőzőképességüket, és úgy alkothatok meg, hogy mintegy 35 kilobázisos idegen DNS-t fogadjanak be.

Az idegen gén kifejeződését enzimes vagy immunológiai vizsgálatokkal lehet kimutatni (pl. immun-precipitálás, radioimmunassay, vagy immun-foltképzés). Természetesen a rekombináns Vacciniával fertőzött sejtekből előállított membrán glikoproteinek glikozilezettek és átvihetők a sejt felületére. Nagy kifejeződési szinteket lehet elérni erős promotorokat alkalmazva vagy egy egyedi gén többszörös kópiáit klónozva.

3. A TALÁLMÁNY RÖVID ÖSSZEFOGLALÁSA

Vakcina-készítményeket írunk le, amelyeket arra lehet használni, hogy olyan immun-választ indukáljanak, amely szelektíven roncsolja a melanóma-sejteket a vakcináit egyénekben. Részletesebben, a jelen találmány szerinti vakcina készítmény egy olyan immunogént tartalmaz, amely egy melanómához társult antigén, mint pl. a métenómához társult p97 antigén ellen irányuló immunválaszt indukál. A találmány szerint számos vakcina-készítmény lehetséges. így pl. egy, a jelen találmány szerinti „alegység vakcina” immunogénje egy p97-hez közel álló peptidet vagy fehérjét tartalmaz, amely megfelelő adjuvánssal együtt lehet kiszerelve. Az ilyen peptidek vagy fehérjék a p97 aminosav-szekvenciáját tartalmazza, amint ezt a 3. ábrában bemutatjuk.

A jelen találmány szerinti p97 peptidet rekombináns DNS technikákkal és/vagy szintetikus kémiai módszerekkel lehet előállítani. Amikor a p97-hez közel álló peptideket kémiai úton szintetizáljuk, az ilyen szintetikus, p97-hez közel álló peptidek tartalmazhatják a p97-nek azokból a területeiből származó aminosav-szekvenciákat, amelyeket antigénnek vélünk [Hopp és Woods: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78,38243828 (1981)]. Amikor a jelen találmány szerinti peptideket rekombináns DNS technikát alkalmazva állítjuk elő, egy olyan nukleotid szekvenciát, amely a p97 egészét vagy egy részét kódolja, iktatunk be egy rekombináns kifejeződő vektorba, pl. egy vírusba vagy plazmidba, ez megfelelő gazdaszervezetben irányíthatja egy p97-hez közel álló peptid kifejeződését, amelyet azután a tenyészközegből lehet tisztítani. A beiktatott nukleotid szekvencia a p97 szekvencia egészéből vagy egy részéből származik, lényegében úgy, ahogyan ezt a

3. ábrában bemutatjuk, ezek közé beleértve (de nemcsak ezekre korlátozva) azokat a nukleotid-szekvenciákat, amelyekben funkcionálisan ekvivalens nukleotid kodonok helyettesítenek bizonyos kodonokat a szekvencián belül, csak „néma” változásokat eredményezve; más szóval: eltérő kodonok, amelyek ugyanazt az aminosavat, vagy funkcionális ekvivalensét kódolják, lehetnek helyettesítők a 3. ábrában ábrázolt szekvencián belül. Amikor plazmid kifejeződő vektort alkalmazunk, előnyösek azok a plazmidok, amelyek eukarióta sejtekben való kifejeződésre alkalmasak, de lehet alkalmazni prokarióta kifejeződő vektorokat is.

A jelen találmány egy másik kiviteli módjában, ahol a kifejeződő vektor rekombináns vírus, vírus-vakcina formájú vakcinát lehet készíteni; ebben az esetben az immunogén olyan rekombináns vírust tartalmaz, amely egy p97-hez közel álló peptidet fejez ki. Az immunogénként alkalmazott rekombináns vírus természetétől függően vagy inaktivált vírus vakcinát, vagy élő vírus vakcinát állíthatunk elő. A jelen találmány szerinti vakcinával végzett megfelelő immunizálás immunválasz indukcióját eredményezheti, amely a melanóma sejtek elroncsolásához vezet az immunizált egyénben.

A találmány leír egy olyan rendszert is, amelyben a vakcinakészítményt vizsgálni lehet, és körvonalazza, hogyan kell a vizsgálatot elvégezni. így pl. a vakcina készítményeket lehet hatékonyságra értékelni állati modelleken, először rágcsálókon, majd nem ember főemlősökön és végül embereken, előnyösen olyan betegeken, akik átmeneti javulásban (remisszióban) vannak, de akiknél mikrometasztázis következtében nagy valószínűsége van a kiújulásnak.

4. AZ ÁBRÁK RÖVID LEÍRÁSA

Az 1. ábra a p97 mRNS sejtmentes transzlációs termékének autoradiográfiáját mutatja meg, SDS-PAGE-vel (nátrium-dodecil-szulfát-pobakrilamid gélelektroforézis) felbontva. Az 1A ábrában az 1. csík p97-tel dúsított mRNS transzlációs termékeit mutatja be, míg a 2. csík a nem dúsított mRNS transzlációs termékeit mutatja be, mindkét csík 5 ng mRNS 0,5 μΐ teljes transzlációs termékéből származik. Az IB ábrában az 1. csík a p97-tel dúsított mRNS transzlációs termékeit

HU 209 144 Β mutatja be, míg a 2. csík a nem dúsított mRNS tarnszlációs termékeit mutatja be, mindkét csík 5 ng, antip97 szérummal immun-kicsapott mRNS 5 μΐ transzlációs termékéből származik.

A 2. ábra a p97 mRNS szerkezetének diagram-jellegű bemutatása. A p97 prekurzor (nyitott vonal) kódoló területeinek (a szignál szekvenciától a „horony” szekvenciáig), nem-kódoló kerületének (3’UT), valamint a megkettőzött tartomány szerkezetének átrendeződését tüntetjük fel. A különböző restrikciós enzim felismerő szekvenciák elhelyezkedését az mRNS fölött mutatjuk be. A négy cDNS klón relatív helyzetét az mRNS szerkezet alatt tüntetjük fel. A p973a2f 1 (3a2f 1) cDNS kiónt egy olyan cDNS könyvtárból izoláljuk, amelyben a cDNS-eket oligo(T)-vel beindított p97-tel dúsított mRNS-eken írjuk át és pBR322ben klónozzuk; míg a p97-2fl(2f 1), p97—ljt(ljt) és p97-10al(10al) cDNS kiónokat úgy izoláljuk, hogy a cDNS szintézist olyan oligonukleotidokkal indítjuk be, amelyek p97 exon szekvenciákat kódolnak, és az így létrejött cDNS fragmenseket lambda-gt 10-be klónozzuk. A 2A ábra a B15, H17, B6.6 és E7.7 genom kiónok diagram formájú ábrázolása, amelyeket lambda L47.1-ben klónoztunk.

A 3., 3A és 3B ábra mutatja be a humán p97 prekurzor cDNS nukleotid szekvenciáját és ennek kikövetkeztetett aminosav-szekvenciáját. A fehérjeszekvenciaelemzéssel korábban meghatározott N-terminális aminosav-gyökök azonosak azokkal, amelyet a nukleotid-szekvenciából jósoltunk (21-30. számok közti aminosav-gyökök). A lehetséges glikozilező helyek a 38., 135. és 515. aminosav-gyököknél és a membrán „horgony” terület a C-terminálisnál van. Egy poliadenilező jelet (AATAAA) a 3847. helyzetnél találtunk, amely 50 bázispárral van „lefelé” a poliadenilezett területtől.

A 4. ábra összehasonlítást mutat be a p97 prekurzor megjósolt aminosav-szekvenciája és a humán szerotranszferrin aminosav-szekvenciája között [Yang és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 27522756 (1984); Davis és munkatársai: J. Mól. Bioi. 181,

111-121 (1985)]. A megőrzött területek keretbe vannak foglalva. A transzferrin vas kötésében érintett tirozin, hisztidin és arginin gyököket csillaggal (*) jelöljük.

Az 5. ábra a p97 szerkezetének kétdimenziós modelljének diagram-szerű ábrázolása, a transzferrin főcsalád tagjai közt megőrzött cisztein gyökök jelenlétére alapozva. A három lehetséges glikozilező helyet csillaggal (*) jelöljük. A hidrofób membrán „horgony” terület a p97 C-términálisánál (COOH) jelenik meg.

A 6. ábra az alábbiak genetikai szerkezetének diagramszerű bemutatása: a p97 cDNS kiónok és a p97 kifejeződő vektor magalkotásához alkalmazott lambda E7.7 genom klón fragmense; és a pSV2p97a kifejeződő vektor. A következő rövidítéseket alkalmazzuk: E: EcoRI; P: PvuII; Sál: Sáli; S: Sstl: B: BamHI.

A 7. ábra a gélelektroforézis eredményeit mutatja be a rekombináns p97 fehérje jellemzésében és immun-tisztításában. Atfertőzött CHO kiónt (CHO3t) és SK-MEL 38 humán melanóma sejteket jelzünk ³⁵Sciszteinnel tunikamicin (TM) jelenlétében (+TM) vagy távollétében (-TM). A sejteket 100 mm² területű lemezekre oltjuk és hagyjuk, hogy csaknem elérje a teljes összefolyást. A tápközeget eltávolítjuk és 3 ml ciszteinmentes tápközeggel helyettesítjük 1 pg/ml tunikamicin hozzáadásával vagy anélkül. 30 perc után 37 °C hőmérsékleten, 25 pCi/ml L-³⁵S-ciszteint (1016 Ci/mmól; New England Nuclear) adunk hozzá további 6 órára. A sejtek kinyerését, a sejt-lizátumok elkészítését, az immun-kicsapást, és az SDS-PAGE-t úgy végezzük, ahogyan korábban leírtuk. Az extraktumokat p97-re fajlagos antitestekkel immun-precipitáljuk, és a fehérjéket SDS-poliakrilamid-gél-elektroforézissel (SDS-PAGE) elemezzük, (a) Coomassie-kékkel festett SDS-poliakrilamid gél. 1. csík: fehérje-markerek; 2. csík: átfertőzött egér B16 sejtekből kibocsátott, immun-tisztított p97; 3. csík: SK-MEL 28 sejtek +TM: 4. csík: SK-MEL 28 sejtek -TM; 5. csík: CHO3 + sejtek +TM; 6. csík: CHO3 + sejtek -TM, (b) ugyanannak a gélnek, amelyet az (a)-ban bemutattunk, az autoradiogramja.

A 8. ábra mutatja a kifejezett p97 radioimmun-precipitálásának eredményeit átfertőzött sejtekben vagy Vp97a-NY fertőzött sejtekben. BSC sejteket fertőzünk egy éjszakán át vad típusú Vaccinia vírussal vagy p97 rekombináns Vaccinia vírussal. Ezeket a vírusokat vagy az átfertőzött CHO-p97.A sejtvonalat ³⁵S-jelzett metioninnal és ciszteinnel inkubáljuk 2 pg/ml tunikamicinnel (Sigma) vagy anélkül. A sejteket hat órával később lizáljuk, 96.5 monoklonális antitesttel kicsapjuk, és 10%-os poliakrilamid gélen végzett elektroforézissel elkülönítjük. A gélt egy éjszakán át autoradiográfiának vetjük alá. A tunikamicinnel kezelt csoport az egyes csoportok jobb oldalán van.

A 9. ábra a szérum antitest titereket ábrázolja p97 vakcinákkal immunizált egérekben. A Tp97 5 egeret képvisel, amelyeket 5xl0⁶, besugárzott M2svp97a.A sejttel (átfertőzött és p97 felületet kifejező színgén tumor sejtek) immunizáltunk komplett Freund-adjuvánsban, és amelyeknek azonos számú sejttel emlékeztető immunizálást adtunk foszfáttal pufferolt sóoldatban. A p97 5 egérből álló csoport, amelyeket 100 pg tisztított p97 fehérjével immunizáltunk komplett Freund-adjuvánsban, és amelynek 50 pg vizes fehérjével emlékeztető immunizálást adtunk. A Vp97 5 egérből álló csoport, amelyeket Vp97a-NY 10⁷ tarfoltképző egységgel immunizáltunk és ugyanezzel kaptak emlékeztető immunizálást farokmetszéssel.

A 10. ábra a tumor-kihívásnak alávetett egerek rekombináns p97 Vaccinia vírussal (Vp97a-NY) végzett vakcinálásának terápiás hatását mutatja be. Az egereket 10⁵ vagy 10⁴ p97-kifejező tumorsejt (M2SVp97a.E) kihívásának vetjük alá intravénásán. Két nappal később az egereket farokmetszéssel inokuláljuk vagy Vp97a-NY-nal vagy Vwt-NY-nal. A hetenkénti inokulálást farokmetszéssel megismételjük, és a túlélő egerek számát rögzítjük.

5. A TALÁLMÁNY RÉSZLETES LEÍRÁSA

A jelen találmány melanómák megelőzésére vagy

HU 209 144 Β kezelésére szolgáló vakcinák előállítására irányul. Ez azon a megfigyelésen alapul, hogy a melanómák rendelkeznek tumorral társult felületi antigénekkel, mint pl, a p97 antigénnel, amely nagyobb mennyiségben van jelen a melanóma sejtekben, mint a normál szövetekben. A jelen találmány szerint a melanómához társult p97 antigénhez közel álló peptideket vagy fehérjéket (azaz a „p97-hez közel álló peptidek”-et) rekombináns DNS technikákat és/vagy szintetikus vegyi technikákat alkalmazva állítjuk elő.

A jelen találmány egyik kiviteli módjában rekombináns DNS technikát alkalmazunk p97 antigént kódoló nukleotid beiktatására olyan kifejeződő vektorba, amely a p97-hez közel álló peptidek kifejeződését irányítja megfelelő gazdasejtekben. A p97 antigént kódoló nukleotid szekvenciák a p97 nukleotid szekvencia részéből vagy egészéből származó nukleotid szekvenciákat tartalmaznak, lényegében ahogyan a 3. ábrában ábrázoljuk. A DNS kód degenerációja miatt az aminosavak kódolásánál (azaz a legtöbb aminosavat több, mint egy kodon képes kódolni) funkcionálisan ekvivalens kodonokat (azaz különböző olyan kodonokat, amelyek azonos aminosavakat vagy ezek funkcionális ekvivalenseit kódolják) helyettesíthetünk a 3. ábrában bemutatott p97 szekvencián belül, feltéve, ha a helyettesítés „néma” változást eredményez. A kifejeződő vektor-gazdasejt rendszereket, amelyek magukban foglalják a p97 egészét vagy egy részét kódoló nukleotidszekvenciát, lehet alkalmazni nagy mennyiségű tiszta, p97-hez közel álló peptid előállítására in vitro, amely esetben a géntermékeket ki lehet tisztítani a tenyészetben levő sejtekből és fel lehet használni immunogénként alegység vakcina készítményekben.

Más kiviteli módokban, ahol a kifejeződő vektor valamilyen vírus, a vírust magát lehet kiszerelni vakcinaként. Ilyen esetekben inaktivált rekombináns vírus vakcinákat lehet készíteni. Ahol a kifejeződő vektor fertőző rekombináns vírus, amely nem okoz betegséget a gazdaszervezetben, vagy inaktivált vírus vakcina, vagy élő vírus vakcina készítményeket lehet előállítani, amelyek jelentős immunitást biztosítanak. Ebből a célból különösen hasznos kifejeződő vektor egy olyan rekombináns Vaccinia vírus, amely a jelen találmány szerinti, p97-hez közel álló peptideket fejezi ki. Ebből a célból a p97 antigén részét vagy egészét kódoló nukleotid szekvenciát iktatunk be olyan Vaccinia vírus vektorba, amely képes irányítani a szekvencia kifejeződését megfelelő gazdaszervezetben. A találmány magában foglalja más vírus kifejező vektorok, elsősorban adenovírusok alkalmazását is vakcinaként.

A jelen találmány egy további kivitelF módjában a p97 kikövetkeztetett aminosav-szekvenciáját vizsgálhatjuk meg olyan szekvenciákra, amelyek bizonyos tulajdonságokkal, főleg hidrofilitással rendelkeznek, amely szekvenciákról valószínűsíthető, hogy a fehérjemolekula felületén vannak jelen, és valószínűleg antigenicitással és/vagy immunogenicitással rendelkeznek. Ezeket a p97-hez közel álló peptideket vegyi úton szintetizáljuk, és immunogénként alkalmazzuk vakcina készítményekben.

A találmányt példák útján világítjuk meg, amelyekben leírjuk a p97-alapú humán melanóma elleni vakcinák megalkotását.

5.1 A MELANÓMÁHOZ TÁRSULT p97 ANTIGÉN

SZEKVENCIA-ELEMZÉSE

A p97-et kódoló gén nukleotid-szekvenciáját és az ebből leszármaztatott aminosav-szekvenciát a 3. ábrában mutatjuk be. A funkcionálisan ekvivalens szekvenciák is a jelen találmány oltalmi körén belül vannak. Ezek magukban foglalják (de nem csak ezekre korlátozódnak) azokat a 3. ábrában bemutatott nukleotid-szekvenciákat is, amelyekben eltérő kodonok helyettesítenek bizonyos kodonokat, ahol ezek az eltérő kodonok ugyanazt az aminosav-gyököt vagy egy funkcionálisan ekvivalens aminosav-gyököt kódolnak, így csak „néma” változást idézve elő; valamint azokat a 3. ábrában ábrázolt aminosav-szekvencia részéhez vagy egészéhez képest megváltozott aminosav-szekvenciákat is, amelyekben funkcionálisan ekvivalens aminosav-gyökök helyettesítenek bizonyos aminosav-gyököket a szekvencián belül, csak „néma” változásokat eredményezve, és módosított vagy átdolgozott aminosav-szekvenciákat is, pl. glikozilezett aminosav-szekvenciákat, foszforilezett aminosav-szekvenciákat, vagy kémiailag módosított szekvenciákat.

Az alábbi alpontok leírják a stratégiát, amelyet a 3. ábrában bemutatott p97 szekvenciájának meghatározásához használunk, valamint egyéb technikákat, amelyeket p97 vagy más tumor antigének, amelyek vakcina-készítéshez használhatók, szekvenciájának meghatározásához használhatunk.

5.1.1 A MELANÓMÁHOZ TÁRSULTp97 ANTIGÉN AZONOSÍTÁSA ÉS JELLEMZÉSE

A melanómával társult p97 antigén aminosav-szekvenciája és aktivitása nem volt ismeretes; ennek megfelelően a p97 antigén azonosítását p97 ellen irányuló monoklonális antitestekkel hajtjuk végre. Számos technikát lehet alkalmazni, hogy p97-re fajlagos monoklonális antitesteket hozzunk létre. így pl. a Kohler és Milstein által kifejlesztett hibridóma technikát [Natúré, 250, 485-497 (1975)] a következőképpen alkalmazhatjuk: egereket vagy patkányokat immunizálunk humán melanóma sejtekkel, és az immunizált állatokból összegyűjtött limfocitákat mielóma sejtekkel fuzionáljuk; egy másik módszer szerint melanómás betegek limfocitáit lehet fuzionálni mielóma sejtekkel [Cote és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 2026 (1983); Haspel és munkatársai: Cancer Rés. 45, 3951 (1985)], vagy monoklonális antitestekhez szolgáló Epstein-Barr vírust alkalmazó technikát lehet alkalmazni p97 ellen irányuló monoklonális antitestek létrehozására [Colé és munkatársai: „The EBV-Hybridoma Technique and its Application to Humán Lung Cancer” (Az EBV-hibridóma technika és alkalmazása emberi tüdőráknál), a „Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy” (Monoklonális antitestek és rák terápia) c. kiadványban (Alán R. Liss Inc. kiadásában), 77-96 oldal]. Bármelyik módszer esetében a létrejövő hibri6

HU 209 144 Β dómákat átvizsgáljuk olyan antitestek előállítására, amelyek kötődnek a melanóma sejtekhez, de nem kötődnek normál sejtekhez.

A fentebb leírt, p97 ellen irányuló monoklonális antitesteket sokféle módon lehet alkalmazni az azonosítás, jellemzés, klónozás és nukleotid-szekvencia kifejeződés megkönnyítésére, amely lehetővé teszi a p97hez közel álló peptidek és fehérjék előállítását nagy mennyiségben. így pl. a monoklonális antitesteket lehet alkalmazni a p97 antigén további jellemzésére olyan módon, hogy a tumor sejtek által készített összes fehérjét radioaktívan jelezzük, a p97 antigén azonosításához alkalmazott monoklonális antitestekkel a tumor fehérjét immun-kicsapásnak vetjük alá, és az immunkicsapásnak alávetett fehérjéket gélelektroforézissel frakcionáljuk. A fehérje antigéneket elkülönült csíkokként azonosítjuk a létrejövő autoradiogramon [Brown és munkatársai: J. Bioi. Chem. 255, 4980-4983 (1980)]. Ezen kívül a p97 ellen irányuló monoklonális antitesteket a következőképpen lehet alkalmazni a klónozás megkönnyítésére: (a) poliszómákat vetünk alá immun-tisztításnak abból a célból, hogy a melanóma sejtekben levő mRNS átiratokat azonosítsuk és megkapjuk, amelyek a p97 antigént kódolják; (b) olyan kiónokat azonosítunk egy cDNS kifejeződő könyvtárban, amelyek p97 antigénhez közel álló peptideket vagy fehérjéket fejeznek ki; (c) a p97 antigént megtisztítjuk, hogy további monoklonális antitesteket vagy antiszérumokat készítsünk az előző két alkalmazásban való felhasználáshoz; vagy (d) olyan sejteket azonosítunk, amelyekbe a p97-hez tartozó gént átfertőzéssel bevezettük.

A monoklonális antitesteket lehet alkalmazni arra is, hogy megkönnyítsük a p97 antigén szerkezeti és immunkémiai jellemzését, és így azonosítsuk a molekula extracelluláris és antigén tartományait, és megtisztítsuk a+molekulát az aminosav szekvencia-elemzéshez [Brown és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 539-543 (1981)]; Brown és munkatársai: Natúré (London), 296,171-173 (1982)].

A p97 jellemzése magában foglalja a sejten belüli elhelyezkedés meghatározását, és az antigén determinánsok és funkcionális tartományok feltérképezését. A szubcelluláris elhelyezkedést immunfluoreszcens mikroszkópiával és sejtfunkcionális kísérletekkel határozhatjuk meg. Azok az antigének, mint pl. a p97, amelyek a sejt felületén vannak jelen, előnyösek a vakcina megalkotásához, bár az intracelluláris antigének is alkalmazhatók. Ha összetett antigén áll rendelkezésre, az antigén-determinánsokat versengési kísérletekkel lehet meghatározni, amelyekben mindegyik antitestet radioaktívan jelezzük és megvizsgáljuk versengés szempontjából a további antitestek mindegyikével. A molekula tartományait proteázokkal végzett korlátozott emésztéssel azonosíthatjuk, amelyet SDS-PAGE követ. Ezekkel az adatokkal kiegészítve lehetővé válik a molekula azon területeinek azonosítása, amelyek a leginkább immunogének. Ha a monoklonális antitesteket érintetlen sejtekkel végzett immunizálással kapjuk, akkor a molekulának ezek a területei a legnagyobb valószínűséggel extracellulárisak lesznek és alkalmazhatók vakcina kialakításához.

Az aminosav szekvenciaelemzés lehetővé teszi a fehérje egyértelmű azonosítását, és összehasonlítását más fehérjékkel [Brown és munkatársai: Natúré (London), 296, 171-173 (1982)]. Ha a fehérje több mint 50 aminosav-gyököt tartalmaz, ésszerű az aminosav-szekvenciának csak egy részét, leggyakrabban az N-terminálist meghatározni. Az aminosav-szekvencia meghatározáshoz a fehérje antigént a sejt-lizátumokból monoklonális antitestekkel végzett immunoaffmitáskromatográfiával lehet tisztítani, amelyet preparatív SDS-PAGE követ. A tisztított fehérje N-terminális aminosav-szekvenciáját azután automatikus aminosavszekvencia-elemzővel, előnyösen gázfázisú készülékkel határozzuk meg a legnagyobb érzékenység érdekében.

5.1.2 A MELANÓMÁVAL TÁRSULTp97 ANTIGÉNT KÓDOLÓ DNS AZONOSÍTÁSA, KLÓNOZÁSA ÉS SZEKVENCIA-ELEMZÉSE

A korábbi klónozási tanulmányok olyan gazdagon előforduló fehérjékre összpontosultak, mint a globin és ovalbumin, amelyeknek mRNS-ei gyakran a teljes mRNS 10—50%-át teszik ki. Ezeket az mRNS-eket homogén állapotig lehet tisztítani méret-frakcionálással, és tiszta cDNS vizsgáló mintákat lehet alkalmazni néhány száz klón könyvtárának átvizsgálására telephibridizálással. Olyan fehérjéknél, amelyek mRNS-ei a teljes mRNS 1-10%-át feszi ki, két cDNS vizsgáló mintával végzett differenciál-hibridizálást alkalmazhatunk, amelyben a cDNS vizsgáló minták egyike a szóban forgó szekvenciát tartalmazza, és a másik a negatív kontroll. A kis gyakorisággal előforduló fehérjéket, mint pl. a tumorral társult antigéneket, kódoló hírvivő RNS-eket, amelyek a celluláris mRNS-nek 0,01%-át vágy még kisebb részét-alkotják, még nehezebb klónozni, mivel kiónok tízezreit kell átvizsgálni, és a cDNS vizsgáló minták nem adnak fajlagos hibridizáló jelet. Mindkét problémát lehet enyhíteni az mRNS dúsításával a szóban forgó szekvenciára.

Számos alkalmazott megközelítést írunk le az alábbiakban humán melanómához társult p97 antigént kódoló DNS klónozására. Az így létrejött kiónokat elemezzük abból a célból, hogy olyan kiónt vagy kiónokat azonosítsunk, amely átéri a p97 teljes kódoló területét. Az így azonosított kiónok p97 nukleotid beiktatásait azután szekvencia-elemzésnek vetjük alá a szakterületen ismert bármely módszerrel. A különböző megközelítéseket az alábbiakban részletesebben írjuk le.

s (a) mRNS IZOLÁLÁSA POLISZÓMÁK IMMUN-TISZTÍTÁSÁVAL

Ebben a technikában poliszómákat (amelyek mRNS-ből, riboszómákból és naszcens polipeptid láncokból állnak) tisztítunk immun-affinitás kromatográfiával, amelyet olyan antitestekkel végzünk, amelyek felismerik a naszcens láncokon jelen levő antigén determinánsokat. Legtöbb esetben az érintetlen sejtekkel vagy sejt-extraktumokkal végzett immunizálással ka7

HU 209 144 Β pott monoklonális antitestek felismerik az antigéneket aktív konformációjukban, de ezek nem megfelelők a poliszómák immun-tisztításához, mivel jelentős esély van arra, hogy a felismert antigén determináns nincs jelen a naszcens láncokban. Ezt a problémát úgy lehet megkerülni, hogy vagy olyan antitesteket alkalmazunk, amelyek N-terminális epitópokat ismernek fel, vagy egy fehérje-szintézis gátlóval, amely a befejezést gátolja, kezelt sejtekből készítünk poliszómákat.

Komolyabb probléma az, hogy az érett fehérjék különböznek a naszcens láncoktól a transzláció utáni módosulások miatt. Ez a probléma különösen kritikus a sejt-felületi fehérjéknél, amelyek erőteljesebben módosulnak a szignál-peptidek eltávolításával, szénhidrátoldalláncok hozzáadásával, és diszulfid hidak képződésével. Ha poliklonális antiszérumot alkalmazunk poliszómák immun-tisztításához, az antigenicitásban levő különbségek a naszcens láncok és az érett fehérjék között kevesebb következménnyel járhatnak, mivel az immunizálás során a nyúl vagy más állat nem csak a natív fehérjének van kitéve, hanem ennek részlegesen vagy teljesen denaturált formáinak is, különösen, ha Freund-féle adjuvánst alkalmazunk. Még ha ezek az antitestek csak kis részét is képezik az antitest-populációnak, lehet elegendő jelen ahhoz, hogy kötődjék a naszcens láncokhoz. Sajnos poliklonális antiszérum előállítása kis gyakorisággal előforduló fehérjékhez rendkívül nehéz. Bár egy monoklonális antitestet lehet alkalmazni az antigén tisztításához további immunizáláshoz, 1 g tenyésztett sejtből gyakran csak 1 gg antigén kitermelés érhető el. Ez elegendő néhány egér immunizálásához, de alig elegendő egyetlen nyúlhoz.

A probléma egy másik megoldása olyan monoklonális antitest nyerése, amely a naszcens láncokon jelen levő antigén determinánsokat ismeri fel, erre a célra immunogénként denaturált p97 antigént alkalmazunk monoklonális antitestek készítésére. Á jelen találmány példájában monoklonális antitestek panelje áll rendelkezésre, amely három különböző epitópot ismer fel a p97 molekula 40000 molekulatömegű N-terminális tartományán, és monoklonális antitestek készletét alkalmazzuk, amelyek mindegyike eltérő fajlagosságú, abban a reményben, hogy ezek közül egy vagy több kötődik a naszcens láncokhoz. A kiválasztott antitestek nagymértékben fajlagosak p97-re, amennyiben mindegyikük p97-nek egyedi csíkját immun-precipitálja egy radioaktívan jelzett teljes sejt-lizátumból, és ezek nagy kötési aktivitással rendelkeznek. A klónozási tervhez három IgG2a antitestet választunk ki, amelyek a három epitóp mindegyikére fajlagosak. Általában a sikerre való esély növekedhet egy sor, különböző epitópok elleni antitest alkalmazásával.

Amikor monoklonális antitesteket alkalmazunk, fennmarad az a kérdés, hogyan jósolható meg: vajon egy adott monoklonális antitest vagy antitestek kombinációja fogja felismerni a naszcens láncokat és így megfelelő lesz a poliszóma immun-tisztításában való alkalmazáshoz. Az egyik megközelítés az, hogy meghatározzuk: vajon a monoklonális antitest immunprecipitálja-e azt az antigént, amely a retikulocita lizátum rendszerben transzlálódott; ez azon a feltevésen alapul, hogy az in vivő transzlációs termék, amely átalakításon még nem ment át, hasonlít a naszcens láncokhoz. Egy másik megközelítés az, hogy a poliszómák immun-precipitációját kis léptékben hajtjuk végre, majd ezt felhasználjuk in vitro transzlációhoz annak meghatározására: vajon a szóban forgó mRNS fajta feldúsult-e.

Amikor a poliszóma immun-tisztítási technikát alkalmazzuk, fontos követni a tisztítást az mRNS-aktivitás mérésével. Ezt megtehetjük olyan módon, hogy az mRNS-t transzlációnak vetjük alá egy retikulocita lizátum rendszerben, és a transzlációs terméket elemezzük SDS-PAGE-val. Bár a tumorral társult antigén túl kicsiny lehet a nem dúsított mRNS transzlációs termékeinek egy komponenseként ahhoz, hogy látható legyen a sok, gazdagon előforduló fajta százai között, az kimutatható lesz a dúsított mRNS mintákból származó transzlációs termékekben. Egy másik módszer szerint a Xenopus oocita transzlációs rendszert alkalmazhatjuk, ha egy érzékeny immunassay áll rendelkezésre a transzlálódott, tumorral társult antigén kimutatására. A p97-nél egy nagyon érzékeny kettős determináns immunassayt (DDIA), amely a p97 két különböző epitópjára fajlagos két monoklonális antitestet alkalmaz, alkalmazunk erre a célra.

Sepharose-hoz kötött A fehérjét alkalmazhatunk a poliszómák immun-tisztításához. Az A fehérje adszorbens két alkalmazással bír ebben az eljárásban. Az első a monoklonális antitestek tisztítása a nyers ascites folyadékból, ezáltal eltávolítva a szennyező ribonukleáz aktivitást. Az A fehérje adszorbenst azután a tisztított antitesttel együtt alkalmazzuk a fajlagos naszcens láncot hordozó poliszómák immuntisztításához.

Az mRNS transzlációja egy retikulocita lizátum rendszerben lehetővé teszi a transzlációs termék biológiai jellemzését, valamint tisztaságának becslését.

(b) OLIGONUKLEOTID VIZSGÁLÓ MINTÁK < Egy másik módszer, amelyet a találmánnyal összhangban alkalmazni lehet egy tumorral társult antigént, pl. p97-et kódoló cDNS klónozásához, az, hogy meghatározzuk az antigén részleges vagy teljes aminosavszekvenciáját, és az aminosav-szekvenciából kikövetkeztetett nukleotid-szekvenciára alapozva oligonukleotid vizsgáló mintát szintetizálunk. Az oligonukleotidot azután primerként lehet alkalmazni cDNS szintézishez és vizsgáló mintaként lehet alkalmazni az így létrejött cDNS könyvtár átvizsgálásához. Következésképpen a melanómával társult p97 fehérjét kényelmesen lehet tisztítani melanóma sejtek lizátumaiból fajlagos monoklonális antitesttel végzett affinitáskromatográfiával [Brown és munkatársai: Natúré (London) 296, 171173 (1982)]. A meghatározott aminosav szekvencia egy részét kódoló nukleotidszekvenciát azután szintetizáljuk, amelyet primerként és/vagy vizsgáló mintaként alkalmazhatunk. Az egy egyedi kodon vagy két kodon által kódolt aminosav gyököket tartalmazó aminosavszekvencia részei a legalkalmasabbak erre a célra. Az egyik megközelítés az, hogy hosszabb (tipikusan 258

HU 209 144 Β nukleotid) szekvenciákat szintetizálunk, amelyek a legvalószínűbb kódoló szekvenciát képviselik az ismert kodon használati gyakoriság alapján emberekben. Az aminosavszekvencia különböző részein alapuló két szintetikus oligonukleotid alkalmazása megkönnyíti az átvizsgálást, lehetővé téve a hamis pozitív hibridizációs jelek azonosítását. Ezen kívül a hibridizálási körülmények, amelyek minimálisra csökkentik a GC tartalom hatását a DNS hibridek összeolvadási pontjára, alkalmazása szintén megkönnyíti az átvizsgálást. Ha ezzel a módszerrel kapunk egy részleges cDNS kiónt, ezt lehet vizsgáló mintaként alkalmazni, hogy elősegítsük teljes hosszúságú cDNS klón nyerését.

(c) cDNS KIFEJEZŐ KÖNYVTÁR

Klónozó vektorokat fejlesztünk ki, amelyek lehetővé teszik a cDNS beiktatás kifejeződését baktériumokban. Az egyik megközelítés ezért, amelyet tumorral társult fehérjékhez, pl. p97-hez tartozó cDNS kiónok nyeréséhez alkalmazhatunk, az, hogy a melanoma sejtekből a fentiek szerint leírt módon izolált mRNS (dúsított vagy nem dúsított) reverz átírásával cDNS könytárat állítunk elő, az eljáráshoz oligo(T)-nukleotid primereket vagy a fentebb leírt szintetikus oligonukleotid printereket alkalmazva, és ezt a könyvtárat a melanómával társult p97 fehérje ellen irányuló monoklonális antitesttel átvizsgáljuk. Azokat a kiónokat, amelyek az epitópokat kódoló DNS-t tartalmazzák, a monoklonális antitestek felismerik a helyes orientációban, és a leolvasó keret a melanómával társult p97 fehérjéhez közel álló peptideket vagy fehérjéket fejez ki; ezt úgy lehet azonosítani, hogy a kiónok által kifejezett fehérjéket nitrocellulóz szűrőre visszük át és a szűrőt az antitesttel inkubáljuk, ezt követi a kifejlesztés jelzett anti-immunglobulin reagenssel.

Egyik lehetséges probléma az, hogy több monoklonális antitest nem ismeri fel a baktérium által kifejezett fehérjét, mivel sok esetben a cNDS-nek csak egy részét tartalmazza a beiktatás, és a baktérium nem olyan módon fejezi ki a fehérjét, mint ahogyan ezt egy eukarióta sejt teszi. Ez a probléma különösen kritikus a tumor sejt felületi fehérjéknél, amelyek jelentősebben módosulnak a szignál peptidek eltávolításával, szénhidrát-láncok hozzáadásával és diszulfidhidak képzésével. Ezért szükséges olyan monoklonális antitesteket kialakítani, amelyekről ismert, hogy felismerik a denaturált antigéneket, vagy poli-specífikus antiszérumokat készíteni tisztított antigénnel végzett immunizálással.

Amikor egy rekombináns vírust azonosítunk, amelyről úgy véljük, hogy melanómával társult p97 antigénből származó cDNS beiktatást tartalmaz, a cDNS beiktatást lehet alkalmazni további könyvtárak átvizsgálásához abból a célból, hogy azonosítsunk vagy teljes hosszúságú kiónokat, vagy kiónok egy másik csoportját, amelyek átérik a p97-et kódoló cDNS teljes hosszát. A klónozott cDNS azonosságát szekvenciaelemzéssel lehet megállapítani, valamint a kikövetkeztetett N-terminális aminosav-szekvencia összehasonlításával a p97 fehérje közvetlen aminosav-szekvencia elemzésével meghatározott szekvenciájával.

(d) GENOM KLÓNOZÁS

Az itt következő módszer lehetővé teszi DNS klónozását egy olyan antigén determináns ellen irányuló monoklonális antitestet alkalmazva, amely csak a natív fehérjében van jelen, és nincs jelen a naszcens láncokban vagy a baktériumokban kifejezett fehérjékben. Ebből a célból humán melanoma sejtből származó DNS-t átfertőzéssel egér L-sejtekbe vezetünk be. Ezt követően izoláljuk azokat az egérsejteket, amelyek a melanómával társult p97 antigént fejezik ki, vagy fluoreszcenciával aktivált sejt-osztályozást alkalmazva, vagy az olyan telepek immunológia azonosítását alkalmazva, amelyek p97-hez közel álló peptideket termelnek; ez utóbbi azonosításához p97 ellen irányuló, radioaktívan jelzett monoklonális antitesteket alkalmazunk, hogy kimutassuk a közel álló peptideket poliészter szövet szűrőkre átvitt telepek replika-másolatain. Az átfertőzés több mint egymást követő menete szükséges, hogy eltávolítsuk a nem közelálló humán DNS szekvenciákat. Ezután genom-könyvtárat létesítünk lambda fág vektorban, és ezt átvizsgáljuk olyan kiónokra, amelyek olyan humán ismétlődő szekvenciákat tartalmaznak, amelyek a legtöbb gén intronjaiban előfordulnak. Amikor egy genom kódot azonosítunk, ezt felhasználhatjuk hibridizációs vizsgáló mintaként, hogy a p97-et kódoló DNS-t tartalmazó cDNS kiónokat azonosítsuk.

5.2 A MELANÓMÁVAL TÁRSULTp97 ANTIGÉN

FRAGMENSEINEK SZINTÉZISE, ÉS AZ IMMUNOGENICITÁS ÉRTÉKELÉSE

Szintetikus peptideket alkalmazhatunk immunogénként, hogy natív fehérje elleni immunválaszt váltsunk ki, amely a védelem egy bizonyos fokát nyújthatja számos patogén ellen. Az ilyen peptid-szekvenciákat a fehérje antigének ismert aminosav-szekvenciájából választhatjuk ki az olyan aminosavak kibővítésével, amelyek valószínűleg a fehérje molekula felületén vannak jelen, a külső közegnek kitéve. Ezt leginkább az aminosavszekvencia számítógépes elemzésével lehet elvégezni, az aminosavakhoz tartozó, megállapított hidropátiás paramétereket alkalmazva. További kritériumokat is lehet alkalmazni, mint pl. a megjósolt szekunder szerkezetet vagy hajlékonyságot.

Következésképpen a melanómákhoz társult p97 fehérje 5-50 aminosavgyökét tartalmazó szintetikus peptideket vizsgálhatunk át immunogenicitásra kísérleti állatokban (általában egerekben vagy nyulakban). Az ilyen szintetikus peptidek magukban foglalják (de nem csak ezekre korlátozódnak) lényegében a 3. ábrában bemutatott aminosav-szekvencia egészét vagy részét, beleértve olyan megváltozott szekvenciákat is, amelyekben bizonyos gyököket a szekvencián belül funkcionálisan ekvivalens aminosavak helyettesítenek, „néma” változást idézve elő, és/vagy módosított vagy átdolgozott szekvenciákat is, pl. glikozilezett szekvenciákat, foszforilezett szekvenciákat stb., vagy kémiailag módosított szekvenciákat. Ezeket a p97-hez közel álló peptideket vagy egyedül alkalmazzuk, vagy valamilyen hordozó fehérjéhez kötve, ilyen pl. a „kulcslyuk kagyló hemoeianin” (KLH). Bármelyik esetben kíván9

HU 209 144 Β ság szerint lehet adjuvánsokat alkalmazni, ezek alkalmazása előnyös. Az immunizált állatoknak emlékeztető oltást adunk és megvizsgáljuk az immunizáló peptid ellen irányuló antitestek jelenlétére. Az anti-peptid antitestekkel rendelkező állatokat olyan antitestekre vizsgáljuk, amelyek megkötik a natív p97 fehérjét. A tumorral társult antigének esetében, pl. p97 esetében, érdekes megvizsgálni a celluláris immunválaszt is, pl. késleltetett típusú hiperérzékenység (DTH) megfigyelésével, in vitro burjánzást stimuláló antigénre, citolitikus T-sejtekre, vagy tumor elfojtásra egy megfelelő modellben. Megfelelő modell lehet egy olyan egér tumor, amely humán tumorral társult antigént fejez ki megfelelő cDNS kifejező vektor konstrukcióval végzett átfertőzés eredményeképpen. A cél az, hogy olyan peptideket azonosítsunk, amelyek melanómával társult p97 antigén ellen irányuló élénk immumválaszt váltanak ki. Ha azonosítottuk, ezeket a peptideket nagy mennyiségben lehet előállítani a szakterületen ismert szintetikus vegyi módszerekkel. Egy másik módszer szerint az azonosított peptideket úgy lehet nagy menynyiségben előállítani, hogy kifejező vektor-gazdasejt rendszerekben olyan nukleotid-szekvenciákat fejezünk ki, amelyek ezeket a peptideket kódolják.

5.3 p97-HEZ KÖZEL ÁLLÓ PEPTIDEK ELŐÁLLÍTÁSA KIFEJEZŐ VEKTOR-GAZDASEJT RENDSZEREKBEN

Fehérjéket és peptideket úgy lehet nagy mennyiségben előállítani, hogy kódoló nukleotid-szekvenciákat iktatunk be egy megfelelő kifejező vektorba, amelyet viszont megfelelő gazdasejtekbe iktatunk be, ezek közé értve (de nemcsak ezekre korlátozva) a baktériumokat, élesztőket, rovarsejteket, és emlős sejteket. Bár a bakteriális gazdaszervezetnek sok előnye van, ezek nem alakítanak ki megfelelően sok eukarióta fehérjét, és ezek kevésbé megfelelőek, mint az eukarióta sejtek a tumorral társult fehérjék kifejezéséhez. A baktériumokban termelt rekombináns fehérjék azonban hasznosak lehetnek T-sejt válasz indukálására, mivel ezekről a válaszokról úgy hisszük, hogy a fehérje antigén kezdeti lebontását igénylik.

Abból a célból, hogy a p97-hez közel álló peptideket egy vektor-gazdaszervezet rendszerben kifejezzük, a melanómához társult p97 antigént vagy ennek egy részét kódoló nukleotid szekvenciát megfelelő kifejező vektorba iktatjuk. Az ilyen nukleotid szekvenciák magukban foglalják (de nemcsak ezekre korlátozódnak) a p97 DNS szekvenciájának egészét vagy részét, lényegében úgy, ahogyan ezt a 3. ábrában bemutatjuk, beleértve azokat a megváltozott szekvenciákat is, amelyekben egy vagy több kodont a szekvencián belül olyan kodon helyettesít, amely azonos vagy funkcionálisan ekvivalens aminosavat kódol, ilyen módon egy „semleges”, vagy „néma” változást idézve elő a szekvenciában. A kifejező vektor tartalmazza a beiktatott fehérjekódoló szekvencia átírásához és transzlációjához szükséges elemeket. Ezek az elemek változók erősségükben és fajlagosságukban. Az alkalmazott gazda-vektor renszertől függően egy sor megfelelő átírási és transzlációs elem bármelyike alkalmazható. így pl. amikor emlős sejtrendszerekben klónozunk, emlős sejtek genomjából izolált promotorokat (pl. egér metallotionein promotort) vagy olyan vírusokból származó promotort alkalmazhatunk, amelyek ezekben a sejtekben nőnek (pl. Vaccinia vírus 7,5K promotor). Rekombináns DNS által vagy szintetikus technikákkal előállított promotorokat szintén alkalmazhatunk, hogy a beiktatott szekvenciák átírásáról gondoskodjunk.

Speciális beindító (iniciációs) jelek is szükségesek a beiktatott fehérjék kódoló szekvenciáinak hatékony transzlációjához. Ezek a jelek magukban foglalják az ATG beindító kodont és szomszédos szekvenciákat. Azokban az esetekben, ahol vagy gént, vagy cDNS szekvenciát iktatunk be megfelelő kifejező vektorba, lehet, hogy további transzlációs kontroll jelek nem szükségesek. Azokban az esetekben azonban, ahol a kódoló szekvencia csupán egy részét iktatjuk be, lehet, hogy külső transzlációs kontroll jelekről, beleértve az ATG kodont, kell gondoskodni. Ezen kívül az iniciációs kodonnak fázisban kell lennie a fehérje kódoló szekvenciák leolvasó kerete szempontjából, hogy biztosítsuk a teljes beiktatás transzlációját. Ezek az exogén transzlációs kontroll szekvenciák és iniciációs kodonok különböző eredetűek lehetnek, mind természetes, mind szintetikus eredetűek.

Bármilyen módszert a DNS fragmensek beiktatására valamilyen vektorba, amely ismeretes azok számára, akik a szakterületen jártasak, lehet alkalmazni olyan kifejező vektorok megalkotására, amelyek megfelelő átírási és transzlációs kontroll jelekkel és a fehérjét kódoló szekvenciákkal bíró kiméra gént tartalmaznak. Ezek a módszerek magukban foglalhatják az in vitro rekombináns DNS technikákban alkalmazott módszereket, szintetikus technikákat és in vivő rekombinációkat (genetikai rekombináció).

A kifejeződő vektorok magukban foglalják (de nemcsak ezekre korlátozódnak) a következő vektorokat és származékaikat: Vaccinia vírus, adenovírusok, rovar-vírusok, élesztő vektorok, bakteriofág vektorok, és plazmid DNS vektorok. A gének klónozása és kifejeződése bakteriális rendszerekben jól ismert a szakterületen. így pl. amikor E. coli-ban klónozunk, bakteriofágjaik vagy plazmid promotorjaik, mint a lac promotor, trp prmotor, recA promotor, riboszomális RNS prómotor, a lambda coli fág és mások P_R és P_L promotorjai, ezek közé beleértve (de nemcsak ezekre korlátozva) a Zacuv5-öt, a írp-facuv5(tac)hibrid promotort, az om/?F-et, bla-t, Ipp-t és hasonlókat, alkalmazhatók a szomszédos DNS szegmensek mágás szintű átírásának irányítására. A prokarióta és eukarióta sejtek működése közti különbségek következtében azonban a jelen találmány szerinti, p97-hez közel álló peptidek kifejezésére az eukarióta sejtek előnyösek lehetnek. A fehérjék kifejezésére eukarióta sejtekben a legjobban megalapozott módszerek a következők: (a) a gén bevezetése a sejtbe valamilyen gyógyszer-rezisztencia génnel együtt, ezt követi a szelekció a gyógyszer segítségével, előnyösen sokszorozási érve el, mint pl. a dihidrofolát reduktázmetotrexát rendszerrel; (b) cDNS kifejezése valami10

HU 209 144 Β lyen plazmid vektorban, gyakran pBR322-re alapozva, erős eukarióta promotort és más szabályozó szekvenciákat alkalmazva; (c) cDNS kifejezése valamilyen vírus vektorban, amely gyakran SV40-ből származik, ismét csak erős promotorokat alkalmazva, ebben az esetben valamilyen SV40 promotort. A rekombináns plazmidot gyakran alkalmazzuk olyan sejtvonalak előállítására, amelyek a fehérjét hosszú időtartamon át termelik, míg az SV40 vektorokat gyakran alkalmazzuk, hogy átmeneti kifejeződést érjünk el. Bár gazdaszervezetként leggyakrabban emlős sejteket alkalmazunk, rovarsejtek és bizonyos esetekben élesztősejtek is alkalmasak lehetnek. Néhányat ezek közül az alábbiakban részletesen leírunk.

Abból a célból, hogy a melanómával társult p97 antigént kifejező rekombináns Vaccinia vírust alkossunk meg, a cDNS kódoló szekvenciát a Vaccinia vírus 7,5K promotorjához ligálhatjuk, hogy kiméra gént képezzünk. Ezt a kiméra gént további, a vírus timidin kináz génjével homológ Vaccinia vírus szekvenciák szegélyezik, ezt a gént plazmid DNS vektor hordozza. A kiméra gén megalkotása magában foglalja mind természetes, mint szintetikus kontroll jelek alkalmazását a tumorral társult antigén szekvencia átírásához és transzlációjához. A kiméra gént azután Vaccinia vírus kifejeződő vektorokba vezetjük be in vivő rekombináció révén a homológ timidin kináz területek között, amelyek jelen vannak mind a plazmid vektoron, mind a Vaccinia vírus genomon. Ezek a kiméra gént tartalmazó rekombináns vírusok képesek a p97-hez közel álló peptidek kifejeződésének irányítására egy fertőzött gazdaszervezetben, és használhatók vakcina komponenseiként.

Azokban az esetekben, amikor adenovírust alkalmazunk kifejeződő vektorként, a szóban forgó DNS szekvenciát egy adenovírus átírási/transzlációs kontroll komplexhez ligáljuk, pl. a késői promotor és háromrészes vezető szekvenciához. Ezt a kiméra gént azután az adenovírus genomba iktatjuk in vitro vagy in vivő rekombinációval. A beiktatás a vírus genom valamely nem eszenciális területébe (pl. az El vagy E3 területbe) azt eredményezheti egy rekombináns vírusban, hogy életképes lesz és képes lesz kifejezni a p97-hez közel álló peptidet fertőzött gazdaszervezetekben. Jelenleg két adonovírus törzs van (4. és 7. típus), amelyet kipróbáltak és vakcinaként alkalmaztak katonai személyzetnél. Ezek az első számú jelöltek vektorként való alkalmazáshoz, hogy a beiktatott DNS szekvenciát kifejezzék.

Egy másik kifejező rendszer, amelyet lehet alkalmazni p97-hez közel álló peptidek kifejeződéséhez, valamely rovar rendszer. Az egyik ilyen rendszerben Autographa califomica nukleáris polihedrózis vírust (AcNPV) alkalmazunk vektorként idegen gének kifejezésére. A vírus Spodoptera frugiperda sejtekben nő. A szóban forgó DNS szekvenciát a vírus nem eszenciális területeibe (pl. a polihedrin génbe) lehet klónozni, és egy AcNPV promotor (pl. a polihedrin promotor) szabályozása alá helyezni. A DNS szekvencia sikeres beiktatása a polihedrin gén inaktiválását és nem-bezárt rekombináns vírus (azaz olyan vírus, amelyen a polihedrin gén által kódolt fehérje-szerű burkolat hiányzik) termelését eredményezi. Ezeket a rekombináns vírusokat alkalmazzuk azután Spodoptera frugiperda sejtek fertőzésére, amelyekben a beiktatott gén kifejeződik.

Ezen kívül olyan gazdasejt törzseket választhatunk ki, amelyek módosítják a beiktatott szekvenciák kifejeződését, vagy módosítják és átdolgozzák a kiméra génterméket fajlagosan, kívánt módon. A kifejeződést bizonyos promotorokból növelni lehet bizonyos induktorok jelenlétében (pl. cink és kadmium ionok metallotionein promotorokhoz). Ennek megfelelően a genetikailag megtervezett fehérje kifejeződését szabályozni lehet. Ez fontos, ha a klónozott gén fehérje-terméke letális a gazdasejtekre. Ezen kívül a fehérje termékek módosításai (pl. glikozilezés, foszforilezés stb.) és átdolgozozásai (pl. hasítás) fontosak a fehérje szerkezete és működése szempontjából. Különböző gazdasejtek jellemző és fajlagos mechanizmussal bírnak a fehérjék transzláció utáni átdolgozásához és módosításához. Megfelelő sejtvonalakat vagy gazdaszervezet-rendszereket lehet kiválasztani, hogy biztosítsuk a kifejezett idegen gén korrekt módosítását és átdolgozását.

Az itt p97-hez leírt konkrét kiviteli módban a p97 cDNS szekvenciát egy pBR322-ből származó kifejező plazmid vektorba ligáljuk, amely vektor tartalmazza a metallotionein promotort. A p97 teljes kódoló szekvenciát, amely magában foglalja a szignál peptidet és a membrán „horgony”-t, beiktatjuk a vektorba.

5.3.1 REPLIKÁLÓDÁSRA ÉS A p97 DNS SZEKVENCIÁK KIFEJEZŐDÉSÉNEK IRÁNYÍTÁSÁRA KÉPES REKOMBINÁNS KIFEJEZŐ VEKTOROK AZONOSÍTÁSA

Az idegen gén beiktatást tartalmazó kifejező vektorokat három fő megközelítéssel lehet azonosítani; (a) DNS-DNS hibridizálás; (b) marker gén funkciók jelenléte vagy távolléte, és (c) beiktatott szekvenciák kifejeződése. Az első megközelítésben egy beiktatott idegen gén jelenlétét egy kifejező vektorban DNSDNS hibridizálással lehet kimutatni olyan vizsgáló mintákat alkalmazva, amely az idegen gén beiktatással homológ szekvenciákat tartalmaz. A második megközelítésben a rekombináns vektor/gazdaszervezet rendszert bizonyos „marker” gén funkciók jelenlétére vagy távollétére alapozva lehet azonosítani, amely marker funkciókat a gének vektorba iktatása idézi elő (pl. timidin kináz aktivitás, rezisztencia antibiotikumokra, transzformációs fenotípus stb.). így pl. ha idegen gén van beiktatva a vektor marker gén szekvenciáján belül, a DNS beiktatást tartalmazó rekombinánsokat a marker gén funkció távollétével lehet azonosítani. A harmadik megközelítésben rekombináns kifejező vektorokat úgy lehet azonosítani, hogy a rekombináns által kifejezett idegen génterméket vizsgáljuk meg. Az ilyen vizsgálatok a géntermék fizikai, immunológiai vagy működési tulajdonságain alapulnak.

így pl. amikor egy jelen találmány szerinti rekombináns Vaccinia vírust alkotunk meg, a p97 kódoló szekvenciákat tartalmazó kiméra gént a timidin kináz

HU 209 144 Β génbe iktatjuk, ezáltal inaktiváljuk ezt és a vírust TK⁺ fenotípusúvá tesszük. Az ilyen rekombinánsokat azon képességük alapján választjuk ki, hogy növekednek olyan tápközegben, amely 5-bróm-dezoxi-uridint tartalmaz; ez olyan nukleozid analóg, amely letális a TK⁺ sejtekre, de nem letális a TK sejtekre. A rekombinánsokat továbbá lehet azonosítani DSN-DNS hibridizálással, a tumorral társult fehérjére fajlagos cDNS vizsgáló mintát alkalmazva. A TK^- rekombináns vírust tarfolt-tisztítással lehet izolálni, és készletet lehet előállítani fertőzött, tenyésztett sejtekből. A rekombináns vírust arra a képességére lehet átvizsgálni, hogy indukálja a p97-hez közel álló peptidek szintézisét. Ebből a célból fertőzött törzseket lehet növeszteni radioaktívan jelzett aminosavak jelenlétében; ezután a fertőzött, radioaktívan jelzett sejtek lizátumait és szubcelluláris frakcióit immunprecipitációval lehet átvizsgálni olyan antitestek segítségével, amelyek a natív, melanómával társult p97 antigén ellen irányulnak. Az immunprecipitált termékeket SDS-PAGE-val választjuk szét. A fertőzött sejteket megvizsgálhatjuk immunfluoreszenciával is, monoklonális antitestet alkalmazva.

A sejteket, amelybe a plazmid vektort bevezettük átfertőzéssel, könnyen lehet azonosítani FACS elemzéssel vagy a sejttelepek poliészter szöveten kialakított replika-másolatainak kötési vizsgálatával. A jelen levő p97-hez közel álló peptid mennyiségét kvantitatív radioimmunassayval határozhatjuk meg, és szubcelluláris lokalizációjukat celluláris frakcionálással és immunfluoreszcens mikroszkópos vizsgálattal határozhatjuk meg. A kifejezett, p97-hez közel álló peptid szerkezetét SDS-PAGE-vel és aminosav-szekvenciaelemzéssel határozhatjuk meg.

5.3.2 A p97-HEZ KÖZEL ÁLLÓ PEPTID TISZTÍTÁSA A KIFEJEZŐ VEKTOR-GAZDASZERVEZET RENDSZERBŐL

Sok tumorral társult antigén, mint pl. a p97, sejtfelületi glikoprotein, és tartalmaz egy N-terminális szignál pepiidet és egy C-terminális „horgony” pepiidet [Davis és munkatársai: J. Mól. Bioi. 181, 111—121 (1985)]. Amikor megfelelő vektorban kifejeződik, az remélhető, hogy a fehérje áthelyeződik a sejt felületére. Hogy megkönnyítsük a fehérje tisztítását, előnyös kiiktatni a membrán „horgony” területét kódoló DNS szekvenciát úgy, hogy az érett fehérje kibocsátódjék a tenyészközegbe.

A p97-hez közel álló pepiidet a gazdasejtekből detergens lízissel lehet tisztítani, amelyet affinitáskromatográfia követ monoklonális_ antitesteket alkalmazva. Ha egy megcsonkított fehérje tisztítandó a tenyészközegből, előnyös szérum-mentes tápközeget alkalmazni, majd affinitás-kromatográfiát alkalmazni monoklonális antitestekkel. Fontos, hogy az antigént eluálni lehessen az antitest adszorbensről anélkül, hogy akár antigenicitása csökkenjen, akár denaturálódjék. Ezt úgy lehet elérni, hogy pH-ját növeljük vagy csökkentjük, vagy valamilyen kaotrópot alkalmazunk. Szükséges lehet olyan monoklonális antitestet választani, amely az antigént viszonylag enyhe körülmények között elbocsátja. Az affinitással tisztított antigént tovább lehet tisztítani HPLC-vel.

5.4 A p97-HEZ KÖZEL ÁLLÓ PEPTIDEK

IMMUNOLÓGIAI JELLEMZÉSE

A szintetikus vagy rekombináns antigénnek azt a képességét, hogy tumorellenes választ vált ki, először kísérleti állatokban lehet értékelni. Ezt egy modell rendszer megalkotásával lehet elérni, amelyben a humán melanómával társult p97 fehérjét a kísérleti fajok megfelelően kitenyésztett törzseinek sejtjeiben fejezzük ki. Az állatokat azután a jelen találmány szerinti p97-hez közel álló peptiddel immunizáljuk különböző munkamenetek szerint, majd megvizsgáljuk a melanómával társult p97 antigén ellen irányuló antitestek kifejlődését, a sejt-közvetített immunitást, mint pl. a p97 antigénre való késleltetett típusú hiperszenzitivitást, és az állatoknak azt a képességét, hogy kivédik a p97 antigént kifejező élő, színgén tumorsejtek kihívását. Ezen kívül a celluláris immunitás in vitro mérését is el lehet végezni a limfociták burjánzásának mérésével a p97-hez közel álló pepiidre adott válaszban, és az immunizált állatokból vagy humán melanómás betegekből nyert limfociták azon képességének méréséből, hogy elpusztítják a p97 antigént kifejező tumor sejteket. Ezen kívül az egerek egér p97-tel való immunizálásával meg lehet határozni azt a mértéket, amelynél lehetséges immunválaszt indukálni olyan antigénre, amely nyomnyi mennyiségben van jelen normál szövetekben.

Nem-ember főemlősöket lehet alkalmazni a jelen találmány szerinti p97-hez közel álló peptidek biztonságának megállapítására. Erre a célra az állatokat olyan munkamenetet alkalmazva immunizálhatjuk, amelyet etikailag alkalmazhatunk rákos emberi betegeken is, majd megvizsgáljuk a fentebb leírtak szerint, azzal a kivétellel, hogy a tumor'átültetések nem valósíthatók meg, mivel ezek kitenyésztett törzsek alkalmazását igénylik. Az immunizálási eljárás biztonságát úgy vizsgáljuk meg, hogy megnézzük az immunizálás hatását az immunizált állatok általános egészségi állapotára (súlyváltozások, láz, étvágy, viselkedés stb.) és boncolással nézzük meg a patológiás változásokat.

Végül a jelen találmány szerinti, p97-hez közel álló pepiidet rákos emberi betegeken vizsgáljuk meg. Az I. kezdeti fázisú átvizsgálás után, kifejlődött rákkal bíró betegekben, hogy megállapítsuk a toxicitás hiányát, olyan rákos betegeket vizsgálhatunk, akik remissziós állapotban vannak, de betegségük nagy valószínűséggel kiújulhat. Ezek immunválaszát kell kiértékelnünk, amint ezt fentebb a nem-ember főemlősöknél leírtuk, azzal a különbséggel, hogy a kezelés hatását vizsgáljuk megállapított betegségre, vagy a kiújulás gyakoriságára. A p97 melanóma antigén esetében a jóindulatú anyajegyeket (mólákat), amelyek kifejezik az antigént, szintén megvizsgáljuk.

5.5 VAKCINA ELŐÁLLÍTÁSA

A találmány ezen kiviteli módjának az a célja, hogy szintetikus úton vagy rekombináns DNS technikával

HU 209 144 Β olyan szintetikus peptidet, tisztított fehérjét, vagy rekombináns vírust állítsunk elő, amelyet immunogénként lehet alkalmazni, és olyan vakcinát állítsunk elő, amely megvédi a rákos betegeket betegségük kiújulásának nagy kockázata esetén, amely kezeli a megállapított betegséget, és végül amely profílaktikusan vakcinálja a rák nagy kockázatának kitett egyéneket. Valójában a szintetikus vagy rekombináns, melanómával társult p97 antigént más immunogénekkel kombinálva is lehet alkalmazni, hogy multivalens vakcinákat állítsunk elő melanóma és más rákok megelőzéséhez. Különböző vakcina-készítmények példáit az alábbiakban tárgyaljuk meg.

5.5.1 VÍRUS VAKCINA KÉSZÍTMÉNYEK

Amikor a jelen találmány szerinti, p97-hez közel álló peptidet rekombináns vírussal állítjuk elő, vagy élő rekombináns vírus vakcinát, vagy inaktivált rekombináns vakcinát készíthetünk. A választás a p97-hez közel álló peptid kifejezéséhez alkalmazott rekombináns vírus természetétől függ. Amikor a rekombináns vírus fertőző az immunizálandó gazdaszervezetre, de nem okoz betegséget, az élő vakcina az előnyös, mivel a szaporodás a gazdaszervezetben hasonló fajtájú és nagyságú, hosszan tartó ösztönzéshez vezet, mint amely a természetes szubklinikai fertőzésekben előfordul, és ezért ez jelentősen hosszan tartó immunitást ad át. A fertőző rekombináns vírus, gazdaszervezetbe bevezetve, kifejezheti a p97-hez közel álló peptidet kiméra génjéből és ezáltal immunválaszt stimulál. Az élő rekombináns vírust magát lehet alkalmazni megelőző vakcinaként melanóma ellen. Az ilyen rekombináns vírus, amelyet ezekben a készítményekben kívánunk alkalmazni, előállítása magában foglalhatja mind az in vitro (pl. szövettenyészet sejtek), mind az in vivő (pl. természetes gazdaállatok, pl. tehenek) rendszereket. A himlő vakcina készítéséhez és kiszereléséhez szolgáló hagyományos módszereket lehet adaptálni az élő rekombináns vírus vakcina előállításához.

Multivalens élő vírus vakcinákat készíthetünk egyedi vagy néhány fertőző rekombináns vírusból, amelyek különböző tumor vagy rák sejtek antigénjeinek sokaságát fejezik ki. így pl. egy olyan Vaccinia vírust (amely mintegy 35 kilobázis idegen DNS-t tud magában foglalni) tervezhetünk, amely más epitópokat kódoló szekvenciákat tartalmaz; az ilyen rekombináns vírusokat magukat lehet immunogénként alkalmazni multivalens vakcinákban. Egy másik módszer szerint Vaccinia és/vagy más vírusok keverékét, amelyek mindegyike képes eltérő epitópokat kódoló eltérő gén kifejeződésének irányítására, szereljük ki egy multivalens vakcinában.

Akár fertőző a rekombináns vírus a gazdaszervezetre, akár nem, inaktivált vakcina készítményt lehet belőle készíteni. Az inaktivált vakcina „halott” olyan értelemben, hogy fertőzőképességét elpusztítottuk általában formaldehiddel való kezeléssel. Ideális esetben a vírus fertőzőképességét úgy pusztítjuk el, hogy nem hatunk a kapszid vagy borító fehérjékre, amelyek a vírus immunogenicitását hordozzák. Abból a célból, hogy inaktivált vakcinákat készítsünk, nagy mennyiségű rekombinánst kell tenyészetben növesztenünk abból a célból, hogy a szóban forgó antigének szükséges mennyiségét biztosítsuk. Az inaktivált vírusok keverékét, amelyek különböző epitópokat fejeznek ki, lehet alkalmazni „multivalens” vakcinák készítéséhez. Bizonyos esetekben az előnyös lehet az élő vakcina készítményekhez képest, mivel esetleges nehézségek vetődhetnek fel az együtt kiszerelt élő vírusok kölcsönhatása miatt. Bármelyik esetben az inaktivált rekombináns vírust vagy víruskeveréket megfelelő adjuvánssal kell kiszerelni abból a célból, hogy növeljük antigénjeik immunológiai válaszát. A megfelelő adjuvánsok magukban foglalják (de nemcsak ezekre korlátozódnak) az ásványi géleket, pl. alumínium-hidroxidot; a felületaktív anyagokat, pl. lizolecitint; többértékű poliolokat; polianionokat; peptideket; és olajos emulziókat.

Többféle módszert lehet alkalmazni, hogy a fent leírt vakcina készítményeket beadjuk, ezek a módszerek magukban foglalják (de nem csak ezekre korlátozódnak) az intradermális, intramuszkuláris, intraperitoneális, intravénás, szubkután és intranazális utakat.

Amikor élő rekombináns vakcina vírus készítményt alkalmazunk, ezt a szülő vad típusú vírusfertőzésének természetes útján is beadhatjuk, a vad típusú víruson itt azt a vírust értve, amelyet a vakcina készítményben felhasznált rekombináns vírus készítésére alkalmaztunk.

5.5.2 ALEGYSÉG VAKCINA KÉSZÍTMÉNYEK

A vírus vakcinák alternatívájaként a p97-hez közel álló peptidet magát lehet immunogénként alkalmazni alegység vakcina készítményekben. Az alegység vakcinák egyedül a gazdaszervezet immunizálásához szükséges, szóban forgó immunogén anyagot tartalmazzák. Következésképpen a p97-hez közel álló peptidet meg lehet tisztítani azokból a rekombinánsokból, amelyek a peptidet kifejezik. Az ilyen rekombinánsok magukban foglalják a korábban leírt, vírussal fertőzött tenyésztett sejtek, baktériumtranszformánsok, vagy élesztő transzformánsok bármelyikét. A jelen találmány egy másik kiviteli módja szerint a p97-hez közel álló peptideket vagy fehérjéket kémiai úton lehet szintetizálni.

A p97-hez közel álló peptideket akár rekombinánsokból tisztítjuk, akár kémiai úton szintetizáljuk, a végterméket megfelelő koncentrációra kell beállítani, és bármilyen alkalmas vakcina-adjuvánssal kell kiszerelni, és felhasználáshoz becsomagolni. A megfelelő adjuvánsok magukban foglalják (de nem csak ezekre korlátozódnak) az ásványi géleket, pl. alumínium-hidroxidot; felületaktív anyagokat, pl. lizolecitint; több értékű poliolokat; polianionokat; peptideket; és olajos emulziókat. A p97-hez közel álló peptidet be lehet építeni liposzómába is, vagy poliszacharidokkal és/vagy más polimerekkel lehet egyesíteni vakcina készítményekben való felhasználáshoz.

Azokban az esetekben, amikor a p97-hez közel álló peptid haptén, azaz olyan molekula, amely antigén annyiban, hogy szelektíven reagál az azonos eredetű antitestekkel, de nem immunogén annyiban, hogy nem

HU 209 144 Β képes immunválaszt kiváltani, akkor ezt a haptént kovalensen lehet kötni valamely hordóhoz vagy immunogén molekulához, és a haptén-hordozó komplexet lehet kiszerelni vakcinaként való felhasználáshoz; így pl. egy nagy fehérje, pl. szérum albumin fehérje adhat át immunogenicitást annak a hapténnek, amely kötve van hozzá.

6. MÉLÁN ÓMÁVAL TÁRSULT p97 ANTIGÉN

Az alább leírt példában a p97 mRNS-ének különböző területeiből származó cDNS kiónokat kötünk össze és olyan kifejező vektorba iktatjuk, amely a p97-hez közel álló peptid kifejeződését irányítja. A kifejező vektor-gazdasejt rendszer által termelt, p97-hez közel álló peptideket lehet vakcinaként kiszerelni.

6.1 A p97 mRNS TISZTÍTÁSA

SK-MEL28 melanóma sejtekből (ATCC HTB 72) poliszómákat készítünk [Carey és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 3270-3282 (1976)] magnéziumos kicsapással. Ebből a készítményből p97 naszcens láncokat viselő poliszómákat tisztítunk olyan módon, hogy három IgG2a monoklonális antitesttel (96.5; 118.1; 133.2) inkubálunk, amelyek a p97 különböző epitópjaira fajlagosak [Brown és munkatársai: J. Bioi. Chem. 255, 4980-4983 (1980); Brown és munkatársai: J. Immunoi. 127,539-546 (1981); Brown és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 539-543 (1981); Plowman és munkatársai: Natúré (London) 303, 70-72 (1983)], ezt követi az affinitáskromatográfia A fehérjeSepharose-on. A p97-ben dúsított mRNS-t eluáljuk EDTA-t alkalmazva, és affinitáskromatográfiával tisztítjuk oligo(T)-cellulózon (Bethesda Research Labs, Bethesda, Maryland). Egy tipikus kísérletben 150 E₂₆₀ egység poliszóma 260 ng p97-ben dúsított mRNS-t termel, amely a teljes mRNS 0,23%-át képviseli. Árpikor Xenopus oocitákban transzlációnak vetjük alá és p97-re vizsgáljuk, amint ezt másutt leírták [Brown és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 539-543 (1981); Plowman és munkatársai: Natúré (London) 303, 70-72 (1983)], a p97-ben dúsított mRNS 80 pg p97-et termel 1 ng p97-re számítva, míg a p97-ben nem dúsított mRNS csak 0,44 pg p97-et termel 1 ng p97-re számítva, azt mutatva, hogy a p97 mRNS aktivitást 180-szorosára dúsítottuk. A p97 mRNS aktivitás kitermelése 42%. A transzláció a retíkulocita lizátum rendszerben [Pelham és Jackson: Eur. J. Biochem. 67,247256 (1976)] azt mutatja, hogy a p97-ben dúsított mRNS egy 84000 dalton látszólagos molekulatömegű fő polipeptidet kódol, SDS-PAGE-vel elemezve, míg ugyanez nem mutatható ki a nem dúsított mRNS transzlációs termékeiben; az említett fő polipeptid immunprecipitálható a p97-re fajlagos antiszérummal (1. ábra). Arra a következtetésre jutottunk, hogy ez a p97 nem glikozilezett prekurzora.

6.2 cDNS KLÓNOK KÉSZÍTÉSE ÉS MEGALKOTÁSA

Két technikát, amelyeket az alábbiakban leírunk, alkalmazunk a fentebb izolált mRNS templátokból átírt cDNS kiónok megalkotásához. A reakciókat a Molecular Cloning, A laboratory Manual, II. kiadás: Fritsche és Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 szerint végezzük. Az enzimeket a gyártó utasítása szerint alkalmaztuk.

6.2.1 OLIGO(T) ÁLTAL BEINDÍTOTT cDNS KLÓNOK MEGALKOTÁSA

A fentebb előállított, p97-ben dúsított mRNS-t alkalmazzuk templátként az oligo(T) által beindított cDNS szintézishez. A cDNS-t pBR322-ben klónozzuk a következő módon: az első szál cDNS szintézishez p97-ben dúsított mRNS-t, a négy dNTP-t és oligo(T)-t (Collaborative Research, Walthma, Massachussetts) inkubálunk reverz transzkriptázzal (Molecular Genetic Resources). A második szálat úgy szintetizáljuk, hogy a terméket az E. coli DNS polimeráz nagy fragmensével inkubáljuk, és a kettős szálú cDNS-t SÍ nukleázzal emésztjük (Boehringer Mannheim, NSZK). A cDNS-t azután dC farokkal látjuk el terminális dezoxinukleotid transzferázzal (Bethesda Research Labs, Bethesda, Maryland), összeforrasztjuk Pstl-gyel emésztett és dG farokkal ellátott pBR322-vel (Bethesda Research Labs, Bethesda, Maryland) [Villa-Komaroff és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3727-3731 (1978)], és CaCl₂-vel kezelt E. coli RR1 (ATCC 31343) transzformálásához használjuk. A transzformált baktériumok telepeiből származó DNS-t papírhoz kötjük [Taub és Thompson: Anal. Biochem. 126, 222-230 (1982)], és differenciál hibridizálással átvizsgáljuk p97-ben dúsított és nem dúsított mRNS templátokon szintetizált cDNS vizsgáló mintákkal.

Egy 243 bázispáros (bp) kiónt, a p97-3a2fl-et, azonosítunk, amely hibridizálódik a p97-tel dúsított cDNS-hez, de kimutathatóan nem hibridizálódik a nem dúsított cDNS-hez, és p97 mRNS-t választ ki a hibridizációval szelektált transzlációs kísérletekben. Egy poliadenilező jel (AATAA) és egy poli(A) terület van jelen a cDNS 3’ végénél (lásd a 2. ábrát). A nick-transzlációnak alávetett p97-3a2fl 100-szor erősebben hibridizál a p97-ben dúsított mRNS-hez, mint a nem dúsított melanóma mRNS-hez, és nem mutatható ki, hogy hibridizálna fibroblaszt mRNS-hez. A klónozott cDNSsel, mint vizsgáló mintával végzett Northem-folt elemzés egy mintegy 4 kilobázisos (kb) mRNS-t azonosít, amely az SK-MEL28 melanóma sejtekben jelen van, míg a fibroblasztokból hiányzik.

6.2.2 GENOMIÁLIS p97 KLÓNOZÁSA ÉS A SZINTETIKUS OLIGONUKLEOTIDOK ALKALMAZÁSA A cDNS SZINTÉZIS BEINDÍTÁSÁHOZ

Azok a kísérletek, hogy a poliadenilező helytől több mint 1 kb-vel kiterjedő cDNS kiónokat kapjunk, sikertelenek, valószínűleg a nagy GC tartalmú terület (több mint 80%) miatt. Az alábbi genom klónozást alkalmazunk, hogy megkerüljük ezt a problémát: Négy átfedő genom kiónt izolálunk lambda L41.1 könyvtárából, amely fajlagos p97 restrikciós fragmensben dúsított, méret-frakcionált SK-MEL 28 DNS-t tartalmaz. Ez a négy genom klón 28 kb-t ér át, és tartalmazza a p97 teljes kódoló területét, beleértve a gén szabályozó

HU 209 144 Β területét is. A genom klón, ahogyan sorrendben elrendeződik az 5’-től a 3’ felé, a következő: lambda B15, lambda H17, lambda B6.6, és lambda E.7.7. A nevezéktan egy betűből áll, amely a fragmens kialakításához alkalmazott restrikciós enzimre utal, és a számjegy annak a fragmesnek kilobázis méretét jelzi, amelyet a lambda L47.1-be klónozunk. így az 5’ terminálistól indulva a lambda B15 klón egy 15 kb-s BamHI p97 fragmenst tartalmaz; a lambda B6.6 klón egy 6,6 kb-s BamHI p97 fragmenst tartalmaz; és a lambda E7.7 klón egy 7,7 kb-s EcoRI p97 fragmenst tartalmaz (lásd a 2A ábrát). Azoknak a kiónoknak a restrikciós fragmenseit, amelyek Northern-foltképzésben a 4 kb-s p97 mRNS-hez hibridizálnak, szekvenciaelemzésnek vetjük alá, és a p97 exonokat a megjósolt kódoló szekvenciák és az emberi és csirke transzferrin közti, számítógéppel segített homológiakutatással azonosítjuk [Yang és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 27522756 (1984); McGillivray és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 2504-2508 (1982); Jetsch és Chambon: Eur. J. Biochem. 722,291-295 (1982)].

Három szintetikus oligonukleotidot, amelyek szekvenciája p97 genom exon szekvencián alapul, alkalmazunk, hogy beindítsuk a cDNS szintézist SK-MEL 28 mRNS-en, és az így létrejövő cDNS-t lambda gtlO-be klónozzuk a következőképpen: a fenti „Molecular Cloning” eljárásait követve: a p97 cDNS-t dG farokkal látjuk el és ligáljuk egy hídképző oligonukleotidhoz és előzőleg EcoRI-gyel hasított lambda-gt 10-hez [Meth. Enzymol. 152: 359-71 (1987)]. A hídképző oligonukleotid lehetővé teszi a dG-farokkal ellátott cDNS szekvencia beiktatását és ligálását a lambda gtlO EcoRI helyébe. A lambda fágot „csomagoljuk” [Grosveld és munkatársai: Gene, 13, 227-237 (1981)], és E. coli c₆₀₀'rK^-mK⁺hfl-re (ATCC 33955) szélesztjük. A cDNS könyvtárat a lambda gtlO-ben p97 beiktatásra átvizsgáljuk tarfolt hibridizálással [Benton és Davis: Science, /Só 180 (1977)], vizsgáló mintaként genomiális exon fragmensekkel. A vizsgáló mintákat radioaktív jelzéssel látjuk el ³²P-TTP-vel (New England Nuclear, 3200 Ci/mól) nick-transzlációval, 5-lOxlO⁸ cpm/ pg fajlagos aktivitásra. Három átfedő cDNS kiónt (lOal, ljl, 2fl), amelyek a p97 mRNS 2.368 nukleotidját érik át, beleértve a teljes kódoló területet, azonosítunk, vizsgáló mintaként p97 exon fajlagos fragmenseket alkalmazva (2. ábra).

6.3. A p97 DNS SZEKVENCIA-ELEMZÉSE cDNS beiktatásokat metszünk ki és szubklónozunk pEMBL18⁺ plazmid vektorba [Dente és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 11, 1645-1655 (1983)] E. coliban az ezt követő szaporításhoz és restrikciós térképezéshez. A cDNS-t szubklónozzuk M13mpl8 fág klónozó vektorba is [Yanish-PeiTone és munkatársai: Gene, 33, 103-119 (1985)] és szekvencia-elemzésnek vetjük alá Sanger didezoxi módszerét alkalmazva [Sanger és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 54635467 (1977)]. A nagy beiktatásokat tartalmazó Ml3 kiónokat szekvencia-elemzésnek vetjük alá, deléciókat alakítva ki DN-áz I-et [Hong: J. Mól. Bioi. 158, 539—

549 (1982)] vagy exonukleáz Ill-at [Henikoff: Gene, 28,351-359 (1984)], és szintetikus 21-mer oligonukleotid prímért alkalmazva. Az enzimeket a gyártó utasítása szerint használtuk.

A p97 cDNS szekvenciát a 3. ábrán mutatjuk be. A 2.214 nukleotidos nyitott leolvasó keret az első ATGtől, ahol a körülötte levő szekvencia a Kozák által meghatározott konszenzus iniciációs szekvenciának felel meg [Kozák: Nucleic Acids Rés. 8, 127-142 (1980)], a 2.215 helyzetnél levő TGA-ig terjed. A legtöbb 5’ cDNS klón további 60 nukleotidot tartalmaz az iniciáló ATG-től felfelé. A p97 mRNS 3’ nem-kódoló területet, amelyet cDNS klónként nem kapunk meg, 1667 nukleotidot tartalmazó egyedi genom exonként azonosítjuk. A megjósolt aminosavszekvencia 20-32 gyöke azonos a p97 ismert N-terminális aminosavszekvenciájával [Brown és munkatársai: Natúré (London) 296, 171-173 (1982)], bizonyítva a klónozott cDNS azonosságát. Ezen kívül a prekurzor jósolt molekulatömege 80196 dalton, ez jó egyezésben van az in vitro transzlációs termék megfigyelt molekulatömegével.

6.4 p97 KÓDOLÓ SZEKVENCIÁT TARTALMAZÓ REKOMBINÁNS KIFEJEZŐ PLAZMID MEGALKOTÁSA

A p97 gén nagy mérete szükségessé teszi, hogy összeállítsuk azokat a cDNS kiónokat, amelyeket melanóma mRNS reverz transzkriptázzal végzett fajlagos beindításával kapunk. A három cDNS lambda gtlO kiónt (lOal, ljl és Ifi, lásd a 2. ábra) alkalmazzuk, amelyek felölelik a kódoló területet a szignál pepiidtől a membrán „horgony” szekvenciáig. A lOal klón beiktatását EcoRI-gyel végzett emésztéssel kihasítjuk, és a lOal cDNS 5’ végénél levő oligo(dG) szekvenciát exonukleázIII-mal (Boehringer Mannheim, NSZK) végzett emésztéssel eltávolítjuk, így alakítva ki a lOalb kiónt, egy HindlII hellyel 30 bp-vel felfelé a p97 preprotein beindító metioninjától felfelé. A három klón, a lOalb, az ljl és a 2fl p97 beiktatásait és az E7.7 genomiális kiónt együtt ligáljuk a PvuII, SstI és EcoRI restrikciós enzim helyeknél, és beiktatjuk a pEMBL18⁺ plazmid vektor HindlII-EcoRI helyeibe [Dente és munkatársai: Nuc. Acid. Rés. 11, 1645-1655 (1983)], amint ezt a 2. ábrában bemutatjuk. A végső konstrukció, a p97b, tartalmazza a 4,4 kb-s p97 beiktatást a pEMBL18⁺ plazmid vektorban, amelyet az E. co1ÍHB101 (ATCC 33694) transzformálására alkalmazunk. A p97b-ben levő beiktatás tartalmazza a p97 mRNS 5’, transzlációnak alá nem vetett területének 30 bp-jét, a teljes kódoló szekvenciát, és a 3’, transzlációnak alá nem vetett területet, egy 5’ HindlII hely és egy 3’ EcoRI hely által kötve.

A 4,4 kilobázisos p97 beiktatást HindlII-mal és EcoRI-gyel kimetsszük a p97b-ből, és a végeket betöltjük, az E. coli DNS polimeráz Klenow-fragmensét alkalmazva. A tompa végű fragmenst a 1995.12 pUC13 eukarióta cDNS kifejeződő vektorban levő egyedi Smal helybe iktatjuk be, ez a vektor az mThGH vektor származéka [Palmiter és munkatársai: Science, 222,

HU 209 144 Β

809-814 (1983)] kaptunk. Ez a vektor az egér metallotionein promotort tartalmazza, idegen gének kifejezésére eukarióta sejtekben. A p97 beiktatást korrekt orientációban tartalmazó konstrukciót restrikciós elemzéssel azonosítjuk, és pMTp97b-nek nevezzük.

A rekombináns plazmidot LMTKr sejtekbe (ATCC CCL 1.3) fertőzzük át, és a transzfektánsokat HAT tápközegen való növekedés alapján választjuk ki. Az átfertőzött edényről felszúrt kiónokat 96 üreges mikrotitráló lemezekre terjesztjük szét, és a kialakult tenyészetek közegeit és a replikáit lemezekről kapott sejt-lizátumokat p97-re megvizsgáljuk két helyes immun-radiometriás vizsgálattal. Szubklónokat terjesztünk szét és újból megvizsgáljuk. A TKM_p97-12 kiónt, amely mintegy 4000000 molekulát fejez ki sejtenként, kinövesztjük, kadmiummal indukáljuk, és p97 forrásként alkalmazzuk immunizáláshoz.

6.5 EGEREK IMMUNIZÁLÁSA p97-HEZ KÖZELÁLLÓ PEPT1DEKKÉL

A TKMp97-12 sejteket kinövesztjük, kadmiummal indukáljuk, és (14,4 g-ot) lizálunk 10 percen át jégen végzett inkubálással 70 ml TNEN-nel (20 mmól/1 triszHC1, pH 8,0, 100 mmól/1 NaCl, 1 mmól/1 EDTA, 0,5% NP-40). A lizátumot ultracentrifugálásnak vetjük alá 200000 g-nél 45 percen át 4 °C hőmérsékleten, és a lizátum felét átengedjük egy I ml-es, p97-re fajlagos immun-affinitás oszlopon (96.5 antitest Fab fragmens Sepharose-hoz kötve). Az immunadszorbenst erőteljesen mossuk, először a fenti TNEN-nel, végül 20 mmól/1 trisz-HCl-lel (pH 6,8).

Az immunizáláshoz 0,5 ml, a fentebb leírt módon készített, aszorbeált immunaffinitás oszlopot összekeverünk 0,5 ml 20 mmól/l-es trisz-HCl-lel (pH 6,8), és emulzióba visszük 1 ml komplett Freund-féle adjuvánssal. Négy BALB/c egér mindegyike 0,4 ml emulziót kap intraperitoneálisan. Három héttel később az egerek emlékeztető oltást kapnak az antigén fenti mennyiségének egynegyedével inkomplett Freund-féle adjuvánssal. Kontroll egereket immunizálunk p97-hez nem közel álló antitest immunaffinitás oszlopával, amelyet egyébként azonos módon kezelünk. Négy p97tel immunizált egeret és két kontroll egeret elvéreztetünk egy héttel az emlékeztető oltás után. A szérumot megvizsgáljuk p97 elleni antitestekre, radio-jódozott SK-MEL melanóma sejtekből kapott immunprecipitációval, majd ezt követő SDS-PAGE-val. Az eredmények azt mutatják, hogy a négy, p97-tel immunizált egérből származó szérumok immunprecipitálják a p97et, míg a kontroll szérumok negatívak. A szérumokat megvizsgáljuk p97 ellen irányuló antitestek jelenlétére is, ELISA vizsgálatot alkalmazva glutáraldehiddel rögzített SK-MEL 28 melanómás sejteken (20000 sejt/mikrovizsgáló üreg). A rögzített sejteket 0,05 ml, 1/10000 arányban hígított szérummal inkubáljuk 1 órán át szobahőmérsékleten, mossuk, majd 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk 0,05 ml, tormaperoxidázzal konjugált kecske anti-egér IgG-vel (Southern Biotech). A p97-tel immunizált egerekből kapott szérumok optikai sűrűségei (490 nm-nél leolvasva)

0,350; 0,243 ; 0,343; 0,200, míg a kontroliokból származó szérumok optikai sűrűsége 0,036 és 0,057.

6.6 Λ p97 JELLEMZÉSE

6.6.1 Λ p97 SZERKEZETE

A p97 szerkezetét a p97 prekurzor aminosav-szekvenciájából határozzuk meg, amely négy szerkezeti tartományt tartalmaz. Mivel a prekurzor szekvencia 20. gyöke felel meg az érett p97 N-terminálisának, az 1-19. aminosav gyökök valószínűleg egy szignál pepiidnek felelnek meg; ez olyan következtetés, amelyet ennek hossza és hidrofób természete támaszt alá. A 20-361. és 362-713. aminosavak két homológ tartományt képeznek 342 és 352 aminosavval. Lehetséges N-kötésű glikozilező helyek fordulnak elő a 38. és 135. helyeknél az N-terminális tartományban és az 515. helynél a C-terminális tartományban. Végül úgy véljük, hogy a 714-738. aminosavak, amelyek zömmel töltés nélküli és hidrofób gyökök területét képezik, horgonyozzák le a p97-et a sejtmembránban [Davis és munkatársai: J. Mól. Bioi. 181, 111-121 (1985)], és tovább nyúlhatnak a citoplazmába.

A p97 tartomány szerkezetét támogatják a proteázos emésztési kísérletek. A p97 emésztése tripszinnel, papainnal [Brown és munkatársai: J. Immunoi. 127, 539-546 (1981)] vagy trombinnal egy mintegy 40000 dalton molekulatömegű, glikozilezett antigén fragmenst termel. A fragmenst az előzőleg ³⁵S-metioninnal vagy ³⁵S-ciszteinnel metabolikus úton jelzett p97 trombinos emésztéséből tisztítjuk és szekvencia-elemzésnek vetjük alá, amint ezt Brown leírta [Brown és munkatársai: Natúré (London) 296, 171-173 (1982)]. Cisztein gyököket azonosítunk a 7. és 17. helyeknél, és metionin gyököket a 2. és 20. helyeknél. Azonos eredményeket kapunk az ép p97-tel is, és ezek tökéletes egyezésben vannak a cDNS szekvenciából jósolt p97 N-terminális szekvenciával. Arra a következtetésre jutunk, hogy a 40000 dalton molekulatömegű proteázrezisztens fragmens megfelel a p97 N-terminális tartományának. Nem vagyunk képesek viszont izolálni a p97 C-terminális tartományát, valószínűleg ennek proteáz-érzékenysége miatt.

6.6.2 A p97 HOMOLÓGIÁJA TRANSZFERRINNEL

A Protein Identification Resource [Fehérje Azonosítási Készlet; 5.0 Közlemény; Dayhoff és munkatársai: Natúré (London) 290, 8 (1981)] aminosavszekvencia könyvtárának kutatása azt mutatja, hogy a p97 rendkívüli mértékben hasonlít a transzferrin főcsalád három tagjához; a humán szérum transzferrinhez, a humán laktotranszferrinhez és a csirke transzferrinhez (37%-39% homológia, lásd 4. ábra). Mivel a humán és csirke transzferrin 50%-os homológiát mutatnak egymáshoz, a p97-nek a szérum transzferrintől több mint 300 millió évvel ezelőtt el kellett ágaznia. A p97 14 cisztein gyökkel rendelkezik, homológ helyzetekben elhelyezkedve mindegyik tartományban. A humán transzferrin mindezeket a ciszteineket tartalmazza homológ helyzetekben mindkét tar16

HU 209 144 Β tományban, míg a humán laktotranszferrinben és csirke transzferrinben csak kettő hiányzik ezekből a ciszteinekből (C-terminális tartományaikban). A p97-tel ellentétben ezek a fehérjék 4-7 további ciszteint tartalmaznak C-terminális tartományaikban, amelyeknek nincs megfelelő tagja az N-terminális tartományban. A humán transzferrin szintén tartalmaz két extra ciszteint, amelyek egyediek N-terminálisukra. A diszulfidok legnagyobb részének helyzeteit a humán transzferrinben, laktotranszferrinben és csirke transzferrinben közvetlenül határozták meg [McGillivray és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 2504—2508 (1982); Metz-Boutique és munkatársai: Eur. J. Biochem. 145, 659-676 (1984); Mazurier és munkatársai: Experientia (Basel) 39, 135-141 (1983); MacGillivray és munkatársai: J. Bioi. Chem. 258, 3543-3553 (1983); Williams és munkatársai: Eur. J. Biochem. 722, 297-303 (1982); Williams: Biochem. J. 141, 745-752 (1974)]. Ilyenformán 7 diszulfid kötés jelenléte jósolható meg a p97 mindegyik tartományában (lásd 5. ábra).

Az aminosav homológiája a p97 tartományai között (46% - 9 gyök 7 kiesésének beiktatásával végrehajtva) szorosabb, mint amely a humán transzferrinben (43% 16 kiesés, 45 gyök) vagy a csirke transzferrinben (35% - 12 kiesés, 39 gyök) látható. A p97 és transzferrin közti jelentős szekvencia-homológiát és a nyilvánvalóan hasonló összehajtogatási formát - amely a ciszteinek megőrzésén alapul - figyelembe véve úgy véljük, hogyha a transzferrin jelenlegi kis felbontású röntgensugár-vizsgálati szerkezetét [Gorinsky és munkatársai: Natúré (London) 281, 157-158 (1979)] finomítani tudjuk, lehetővé válhat a p97 háromdimenziós szerkezetének kikövetkeztetése.

6.6.3 A p97 MŰKÖDÉSE

A p97 transzferrin főcsaládban való tagsága, vaskötési képessége [Brown és munkatársai: Natúré (London) 296, 171-173 (1982)] és a transzferemnél és transzferrin receptorral való közös kromoszomális elhelyezkedése [Plowman és munkatársai: Natúré (London) 303, 70-72 (1983); Yang és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 2752-2756 (1984)] mind alátámasztják a p97 szerepét a vas-transzportban. A transzferrin vaskötő „zseb”-ről úgy vélik, hogy 2-3 tirozint, 12 hisztidint és egy egyedi bikarbonát-kötő arginint tartalmaz [Metz-Boutique és munkatársai: Eur. J. Biochem. 745, 659-676 (1984)]. Ezeknek az aminosavaknak a fennmaradása a p97ben támogatja annak feltételezett szerepet a vas-metabolizmusban (lásd 4. ábra). Mivel a p97 membránkötött, transzferein-szerű molekula, és nincs homológiája a transzferrin receptorral [Schneider és munkatársai: Natúré (London) 311, 675-678 (1984)], ennek szerepe a celluláris vas-metabolizmusban különbözhet attól, amelyet a szérumtranszferrin cirkulálása és a transzferrinhez szolgáló celluláris receptor szolgáltat. A klónozott p97 cDNS kifejeződése eukarióta sejtekben lehetővé teszi majd a p97 működési tulajdonságainak kísérleti vizsgálatát. ’

6.6.4 KÖVETKEZTETÉS

Ezekre az adatokra alapozva világos, hogy melanómához társult p97-hez tartozó cDNS konstrukciókat kapunk, és hogy ezeket hatásosan ki lehet fejezni emlős sejtekben, hogy nagy mennyiségű, antigén jellegű p97-et termeljünk.

7. KLÓNOZOTT p97 KIFEJEZŐDÉSE, ÉS VAKCINA VIZSGÁLAT

Az itt részletezett kísérletek leírják a klónozott p97 fehérje kifejeződését és vakcinájának vizsgálatát. A p97 kifejeződése kiválasztott formában (az átfertőzött B16svp97a.l4 egérsejt klón révén - lásd 7.1. példa) lehetővé teszi a teljes hosszúságú p97 fehérje milligrammnyi mennyiségének tisztítását. A tisztított formájú fehérjét alkamazzuk a celluláris immunitás indukciójának vizsgálatára és alegység-vakcinaként való felhasználási lehetőségeinek vizsgálatára. A p97 génterméket kifejezzük a metasztatikus rágcsáló melanóma sejtek sejtfelületén is, modellt szolgáltatva a vakcinák hatékonyságának vizsgálatához tumor-növekedés megelőzésében, egy színgén rendszerben.

A p97 gént élő Vaccinia rekombináns vírusba iktatjuk hatásos celluláris immunitás kialakítására képes vakcina készítményhez való felhasználáshoz (lásd a 7.2. példát). A Vp97a-NY rekombináns Vaccinia vírust arra a képességére értékeljük, hogy immunitást alakít ki egerekben, ehhez egy sor vizsgálati módszert, alkalmazunk, amelyek a humorális és celluláris immunitást demonstrálják. A fentebb leírt színgén rágcsáló tumor modellt alkalmazva a Vp97a-NY vírusról kimutatjuk, hogy védőhatást nyújt a tumorsejt szaporodása ellen. A vakcina gyógyhatást is nyújt olyan egerekben, amelyek meglevő, növekvő tumor-áttétellel rendelkeznek, ez olyan tulajdonság, amely analóg a vakcina javasolt felhasználásával, vagyis immunterápiás anit-tumor válasz előidézésével meglevő tumorral rendelkező emberi melanómás betegekben.

Az egér-tanulmányokon kívül, ahol csak 91%-os homológja áll fenn a humán p97 és a homológ egér fehérje között (az eddig ilyen módon vizsgált területek mentén), a Vp97a-NY vakcinát megvizsgáljuk nem-ember főemlősökben is. Itt sokkal szorosabb a homológia a humán p97 és a fehérje majom-formája között (amint ezt kereszt-reaktivitással felismerjük monoklonális antitest szinten). Egy lehetséges nehézség miatt „saját” fehérje elleni immun-válasz kiváltásában, a közeli rokon Makako-majmokat alkalmazzuk a Vp97a-NY vakcina immunogenicitásának vizsgálatára. A rekombináns Vaccinia vakcinát majmokban vizsgáljuk meg, és kimutatjuk, , hogy a p97 fehérje ellen irányuló humorális immunitást indukál. Az eddig elvégzett vizsgálatok szerint a majmok nem mutatják káros mellékhatások észrevehető tüneteit a vakcinának kitéve hat hetes időtartamon át megfigyelve, miután az élő rekombináns Vaccinia vírus két inokulálását megkapták.

7.1 PLAZMID KIFEJEZŐDÉS

Az SV-40 sv2 korai promotorja által irányított kiféjező plazmidot a p97a cDNS plazmid klónból

HU 209 144 Β alkotjuk meg, amely a p97b-hez hasonló azzal a kivétellel, hogy a teljes 3’UT terület hasznosul (6. ábra). Az összes cDNS kiónt eredetileg lambda gtlO könyvtárakból izoláljuk szintetikus EcoRI-dG(9-17) kapcsolókkal, amint ezt fentebb leírtuk. A beiktatásokat kimetszük EcoRI-gyel és szubklónozzuk pEMBL18⁺ba az ezt követő szaporításhoz és jellemzéshez. (Maniatis szerint, 4.33-4.38 oldalak) A lOal kiónt M13mpl8-ba [Gene, 33:103-119 (1985)] szubklónozzuk és egy RF (replikatív) formát BamHI-gyel és SphI-gyel emésztünk, röviden kezelünk exonukleázIII-mal, tompavégűvé alakítjuk SÍ nukleázzal, kezeljük Klenow-fragmenssel, és újra ligáljuk. Számos tarfoltot izolálunk és szekvencia-elemzésnek vetünk alá, amelyek egyikéről a dG farok eltávolítódott és a p97 5’transzlációnak alá nem vetett területének viszszamaradt 33 bp-jét (lásd 3A és 3B ábra) az M13mpl8 Hindlll helyébe iktatjuk. Ennek a szubklónnak (lOala) RF-jét alkalmazzuk az ép p97 cDNS kialakításához; egyébként az összes fragmenst a plazmid szubklónokból izoláljuk. Az 550 bp-s Hindlll— Pvull fragmenst a lOala-ból és a 735 bp-s PvuII-SalI fragmenst az lj 1-ből izoláljuk LMP agaróz gélekből, és pEMBL18⁺-ba ligáljuk a Sáli és Hindlll helyeken, a p5’p97-et alakítva ki. Az E7.7 genomális kiónt a pEMBL18⁺-ban teljesen emésztjük EcoRI-gyel és részlegesen emésztjük Sstl-gyel, és a 4,5 kb-s fragmenst 0,8%-os LMP agarózon végzett frakcionálással különítjük el. Ezt a 4,5 kb-s 3’ fragmenst a 2fl-ből származó 404 bp-s SstI fragmenssel és az ljl-ből származó 535 bp-s BamHI-SstI fragmenssel ligáljuk pEMBL18⁺-ba a Sáli és EcoRI helyeknél, a p3’p97-et alakítva ki. A p5’p97 1285 bp-s HindlII-Sall fragmensét azután p3’p97-be ligáljuk, a pp97a-t alakítva ki. Az EcoRI-részleges Hindlll fragmenst ebből a klónból beiktatjuk pSV2-neo-ba [Southern és munkatársai; J. Mól. App. Génét. 77, 327-341 (1982)] a Hindlll és EcoRI helyeknél, eltüntetve a neomicin kódoló területet és az SV40 összeillesztési poliA szekvenciákat, míg megtartva az SV40 korai promotort és a 72 bp-s fokozót, a 33 bp-s p97 5’UTR-t, a teljes p97 kódoló területet, a 3’UTR-t és az 1,4 kb-s 3’ szegélyező DNS-t. Az így létrejövő plazmidot pSVp97a-nak nevezzük.

Az sv2-vel irányított plazmidot kalcium-foszfátos kicsapással átfertőzzük egy sor eukarióta sejtvonalba, és a kifejező sejteket klónozzuk és kiválasztjuk, domináns, szelektálható marker együttfertőzését alkalmazva. Hogy ezt végrehajtsuk, kínai hörcsög petefészek (CHO) sejteket tenyésztünk 15% borjúembrió-szérumot (FCS), 4 mmól/1 L-glutamint, 1,3 mmól/1 prolint és antibiotikumokat tartalmazó, Hank-féle FI tápközegben. B16 sejteket (ATCC CRL 6322) tenyésztünk RPMI tápközegben (Gibco), amely még 0,15% bikarbonátot is tartalmaz, és 1735. sejteket DMEM tápközegben (Gibco), mindkét tápközeg ki van egészítve 15% FCS-sel és antibiotikumokkal. A sejteket módosított kalcium-foszfátos technikával [Wigler M. és munkatársai: Cell, 14, 725-731 (1978)] fertőzzük át, lemezenként 20 pg pSV2p97a plazmid DNS-sel, és vagy

0,5 g pSV2 DHFR-rel, vagy 0,5 pg pSV2neo-val. Az összes plazmidot az EcoRI helyen linearizáljuk. Stabil transzfektánsokat választunk ki, hipoxantin negatív (HAT) tápközeget alkalmazva a CHO sejtekhez, vagy 0,5 pg/ml geneticint (G418, Gibco) alkalmazva a B16 és 1735. sejtekhez. A túlélő sejtek 7 nappal az átfertőzés után kezdenek látható telepeket képezni, és ezeket steril poliészter szűrőkkel takarjuk le, üveggyöngyökkel helyben tartva. A szűrőket ezen a helyen tartjuk öt napon át, lehetővé téve a sejtek számára, hogy kinőjenek a poliészter mátrixon, a telepek másolatát alakítva ki a lemezen. A szűrőket azután eltávolítjuk és felhasználjuk élő sejt kötési vizsgálathoz jódozott anti-p97 monoklonális antitesttel. 10 mikrogramm jelzett monoklonális antitestet inkubálunk legfeljebb 20 szűrőn 10 ml FCS-ben 4 °C hőmérsékleten 1 órán át. A szűrőket élénken mossuk foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldatban (PBS), szárítjuk, és XAR-5 filmnek tesszük ki egy éjszakán át -70 °C hőmérsékleten. A szűrőket ezt követően 7%-os metilénkékkel festjük, hogy láthatóvá tegyük a sejt-telepeket. Az összes alkalmazott sejtvonalban, a B16 egér vonal kivételével, a kifejező sejtek a p97 antigén fehérjét setjfelületükön tartalmazzák.

A B16-tal átfertőzött sejtekben a p97 a közegbe bocsátódik ki, ez olyan észlelés, amely egyedi erre a sejttípusra nézve. A p97 kiválasztása lehetővé teszi a p97 fehérje tisztítását teljes hosszban a sejtek tápközegéből. A Bl6SVp97a.l4 mintegy 4 pg/ml p97-et fejez ki az elhasznált tápközegben. A rekombináns p97-et az átfertőzött B16SVp97a.l4 klón elhasznált tápközegéből tisztítjuk, amely nagy mennyiségű p97 antigént választ ki a tápközegbe. A sejteket csaknem az összefolyásig (10⁹ sejt) tartjuk fennn 850 cm²-es gördülő palackokban, folyamatosan adagolva friss tápközeg kis mennyiségeit. Ezek folytatják az antigén kiválasztását elkülönítés nélkül heteken át, így lehetővé téve a folyamatos kinyerést és az elhasznált tápközeg lefagyasztását. A p97 tisztítását immun-affinitás kromatográfiával hajtjuk végre, 96.5 monoklonális antitest [J. Immunoi. 127:539-546 (1981)] Sepharose-hoz kötött Fab fragmenseit alkalmazva. Ebből a célból 3 liter elhasznált tápközeget futtatunk keresztül egy sor 30 ml-es oszlopon. Az első 15 ml G-25 szuper-finom Sephadexet (Pharmacia) tartalmaz, a második 20 ml Sepharose 4 b-t (Pharmacia) tartalmaz, és a harmadik 8 ml cianogén-bromiddal aktivált Sepharose-t tartalmaz,

96.5 monoklonális antitest Fab fragmenseihez konjugálva (10 mg fehérje/ml Sepharose). Ezt követően az affinitás oszlopot élénken mossuk hideg PBS-sel, és az antigént eluáljuk 30 ml 0,1 mól/1 citráttal (pH 5) és 30 ml 0,1 mól/1 citráttal (pH 4). Ezekről a körülményekről kimutattuk, hogy nem változtatják az antigén immun-reaktivitását, miközben végrehajtják az antigén teljes eluálását a 96.5 monoklonális antitestről. A két eluátumot 3,0 ml, illetve 4,5 ml 2 mól/l-es trisz-szel (pH 8) semlegesítjük. A tisztított eluátumot Amicon berendezést alkalmazva koncentráljuk, PM10 szűrővel (Schleicher és Schüll, NSZK), és 2x10 ml PBS-sel mossuk, 4,95 mg végső kitermelést hagyva 4,5 ml-ben,

HU 209 144 Β amint ezt Bradford vizsgáló készlettel (Biorad) meghatározzuk. 15 g terméket futtatunk SDS-PAGE-n (7. ábra) és láthatóvá tesszük mind Coomassie kékkel, mind ezüstfestéssel. Kettős determináns immunassay (DDIA) [Brown és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci 78, 539 (1981)] a tisztított fehérje moláris mennyiségének független bizonyítását szolgáltatja. Kontroll preparálásokat hajtunk végre párhuzamosan szülői B16 sejtvonalból származó elhasznált tápközeggel, és nem mutatunk ki észlelhető fehérjét. Egy további preparálásban 30 mg 95%-ig tiszta p97 fehérjét tisztítunk ki 300 mg, Sepharose-hoz kötött 96.5 monoklonális antitest Fab fragmensből. A tisztított p97 fehérje immunogén, amely erős antitest választ vált ki a fehérjével immunizált egerekben, amint ezt a későbbiekben, a 7.3 fejezetben leírjuk.

7.2 REKOMBINÁNS p97 VACCINIA VÍRUS MEGALKOTÁSA ÉS KIFEJEZŐDÉSE A p97 kódoló területét p97a HindlII-mal végzett hasításával, a végek tompa végekké való alakításával, és ligálással beiktatjuk pGS-20 Vaccinia beiktató vektorba [Mackett és munkatársai: J. Virol. 49, 857-864 (1984)], amelyet előzőleg az Smal helyen felnyitottunk. A PGS-20 vektor felhasználja a 7.5K promotort, és tartalmaz szegélyező szekvenciákat a Vaccinia timidin kináz (TK) génből. A rekombináns vírust Mackett és munkatársai fentebb idézett módszerével alakítjuk ki, és a Vp97a-NY-t izoláljuk, amely azt idézi elő, hogy a fertőzött sejtek (lásd I. táblázat) korrekt méretű és glikozilezett fehérjét fejeznek ki (8. ábra). A p97 felületi kifejeződését igazoljuk a rekombináns p97 vírussal fertőzött sejtekben is, lásd az alábbi I. táblázatot.

/. táblázat

Átfertőzött egérsejtek és rekombináns vaccinia vírussal fertőzött sejtek felületi p97 kifejeződése¹

Sejttípus	A sejt fertőzésére alkalmazott vírus	Kifejezett p97 molekulák sejtenként
M2SVp97a.A	Nincs	3210000
M2svp97a.E/F2	Nincs	434000
M2 szülősejt	Nincs	2000-
BSC	Nincs	5590
BSC	Vwt-NY Vaccinia	5520
BSC	Vp972~NY Vaccinia	1 140000

¹ A sejteket rövid ideig tripszinezzük, mossuk·, és alikvotokat mérünk be csövekbe, amelyek 10³, 10⁴ vagy 10⁵ sejtet tartalmaznak. Nem kifejeződő hordozó sejteket adunk a csövekhez kis sejtszámokkal úgy, hogy összesen 10⁵ sejtet alkalmazzunk csövenként. lxlO⁶ cpm jódozott 96.5 monoklonális antitestet (123 ng) inkubálunk 50 ml teljes térfogatban a sejtekkel 60 percen át jégen. A sejteket mossuk és négyszer centrifugáljuk PBS+10% borjúszérum-albuminban, majd újra szuszpendáljuk és Micromedic 4/600 Pilis gamma számlálóban számláljuk.

(-) azt jelenti, hogy „kevesebb, mint”.

7.3 REKOMBINÁNS _P97 VACCINIA VÍRUS IMMUNOGÉN EGEREKEN

Egerek inokulálása Vp97a-NY-nal erős humorális antitest választ alakít ki. Az egereket egyszer inokuláljuk, és egyszer emlékeztető oltást kapnak a negyedik héten, majd elvéreztetjük ezeket az ötödik héten. A litereket ELISA módszerrel becsüljük meg, antigénnel borított lemezeket és torma peroxidázhoz mint kimutató reagenshez konjugált A fehérjét alkalmazva. Az adatokat monoklonális anitest ekvivalensekre alakítjuk át, összehasonlítva a 133.2 jelű, p97 elleni monoklonális antitestet alkalmazva kialakított ELISA kötéshez tartozó standard görbével. Az eredmények a szérum antitest erős indukációját mutatják (9. ábra). Acelluláris immunitást in vitro burjánzást vizsgálatot alkalmazva mutatjuk ki tisztított p97 fehérjével, mint stimuláló antigénnel (II. táblázat).

II. táblázat

Rágcsáló lépsejtek burjánzást vizsgálata¹

Stimuláló antigén	A vp97 rekombináns immun lépsejtek burjánzás! indexe	A kontroll lépsejtek burjánzást indexe
ConA(10 pg/ml)	71	50
p97 fehérje (3 pg/ml (10 pg/ml (20 pg/ml (50 pg/ml	27 43 56 44	2 2 2 3
UV-vel inaktivált Vaccinia vírus (107 pfu/ml)	91	2
p97-tel átfertőzött,, besugárzott színgén tumor sejtek (104	86	2
Besugárzott szülői tumorsejtek (104)	3	1

I 7

A lépsejteket olyan egerekből inokuláljuk, amelyeket 10 pfu

Vp97a-NY rekombináns vírussal inokuláltunk farokmetszéssel, majd amelyeknek egy hónappal később ugyanilyen adaggal emlékeztető oltást adtunk, és ezt követően egy héttel megöltünk. Natív lépsejteket alkalmazunk kontrollként ezekben a kísérletekben. 10⁵ sejtet tenyésztünk üregenként 96 üreges, kerekfenekű lemezeken 0,22 ml RPM1 tápközegben, amelyet 0,5% normál egér szérummal, penicillin/sztreptomicin antibiotikumokkal, glutaminnal, bikarbonáttal és 2,5xl0⁵ mól/I 2-merkapto-etanollal egészítünk ki. A tenyészeteket impulzus-jelzéssel látjuk el hat órán át a 4. napon 25 pCi/üreg triciált timidinnel (New England Nuclear), kinyerjük PHD sejt-kinyerő berendezéssel, és megszámoljuk Optifluor-t alkalmazva Beckman LS 3801 számlálóban. A burjánzást indexet úgy számoljuk ki, hogy az egyes antigénekkel stimulált üregek cpm átlagait (négy párhuzamosból) elosztjuk a kontroll (tápközeg) cpm átlagaival.

pfu = tarfolt-képző egység

A Π. táblázatban bemutatott eredmények azt jelzik, hogy T sejtek burjánzanak a p97 fehérjére való válaszban.

HU 209 144 Β

Abból a célból, hogy kiderítsük, vajon segítő sejtek is stimulálódnak-e a rekombináns vírus révén az immunizált egerekből származó lépsejtekben, a sejteket in vitro stimuláljuk és a felülúszót interleukin2 (IL-2), egy segítő T sejt faktor, termelésére vizsgáljuk. Lépsejteket tenyésztünk olyan egerekből, amelyeket előzőleg kétszer immunizáltunk rekombináns Vp97a-NY Vaccinia vírussal vagy szülővírussal. 10⁵ sejtet inkubálunk 48 órán át 0,2 ml tápközegben (amely azonos azzal, amelyet a burjánzási vizsgálatokban alkalmaztunk) egy 96 üreges kerekfenekű lemezen, stimuláló antigén jelenlétében vagy távollétében. A felülúszókat összegyűjtjük négy üregből képezve készleteket, és az IL-2 vizsgálat előtt lefagyasztjuk. Az IL-2 vizsgálat 10⁴, előzőleg IL-2-re „kiéheztetett” CTLL egér T sejtvonalat alkalmaz, amelyben mindegyik üreget inkubálunk a mérési felülúszó különböző hígításaival Click-féle tápközeggel három párhuzamosban. Standard görbét alkotunk meg a Genetechtől (Kalifornia) kapott rekombináns IL-2-vel. A CTLC sejteket impulzus-jelzéssel látjuk el timidinnel a szokásos burjánzás-mérési technika szerint a 24 órás inkubálás utolsó 6 órájában, majd kinyerjük és megszámláljuk, amint ezt a burjánzás-mérési módszereknél leírtuk. Az eredményeket a III. táblázatban mutatjuk be, ezek azt jelzik, hogy az IL-2 termelést a rekombináns p97 Vaccinia vírussal immunizált egerek lépsejtjeiből a p97 in vitro stimulálja.

lll. táblázat

Az IL-2 termelés stimulálása p97 immun lépsejtekkel

Vakcináló immunogén	In vitro serkentő	Termelt IL·—2 egység
Vp97a-NY	p97 fehérje (20 pg/ml)	4,4
Vp97a-NY	tápközeg	0,25
Vwt-NY	p97 fehérje (20 pg/ml)	0,25
Vwt-NY	tápközeg	0,25

Ezen kívül késleltetett típusú hiperérzékenységi választ mérünk, a mancs-duzzadási vizsgálatot alkalmazva Vp97a-NY-nal inokulált egerekben. Csoportonként 5 egeret (C3H/Hen törzs) inokulálunk farokbemetszéssel rekombináns vagy szülő Vaccinia vírussal. Hat nappal később az egyes egerek hátsó mancsát 20 μΐ PBS-sel vagy 20 μΐ sejttel (PBS-ben; 5xlO⁵ sejt/egér) kihívásnak vetjük alá. A mancsokat 24 órával később mérjük kettős vak beállításban, Fowler-mikrométert alkalmazva. A PBS-sel injektált mancs vastagságát kivonjuk a mért kísérleti mancsvastagságból az egyes egereknél, és a megnövekedett mancs-duzzadás átlagát, valamint a standard deviációkat kiszámítjuk. A IV. táblázatban bemutatott eredmények egy p97-re fajlagos, késleltetett típusú hiperérzékenységi válasz indukcióját mutatják rekombináns p97 Vaccinia vírussal immunizált egerekben.

IV. táblázat

Antigén-fajlagos mancs-duzzadás p97-immun egerekben

Vakcináló immunogén	Kihívást jelentő angitén	Mancs-duzza- dás (mmxlO-2)
Vp97a- NY	p97-tel átfertőzött színgén tumor sejtek	40,3 (+6,8)
Vp97a- NY	szülő színgén tumor	3,0 (±2,8)
Vwt-NY	p97-tel átfertőzött színgén tumor sejtek	1,5(+2,3)
Vwt-NY	szülő színgén tumor sejtek	5,5 (±5,0)

7.4. VÉDELEM ÉS TERÁPIA p97 VACCINIA VÍRUSSAL RÁGCSÁLÓ TUMOR MODELLBEN Abból a célból, hogy á vakcinálás hatékonyságát felbecsüljük, egereket vakcinálunk különböző munkamenet szerint a találmány szerinti rekombináns p97 Vaccinia vírust alkalmazva, és p97-tel átfertőzött színgén tumor sejtekkel (M2SVp97a.2E) kihívásnak vetjük alá. Ebből a célból egereket Vp97aNY rekombináns élő Vaccinia vírussal vagy a szülő törzzsel (Vwt-NY) immunizálunk farok bemetszéssel; vagy 100 pg tisztított p97 fehérjével, vagy 5xl0⁶ besugárzott M2-K1735 tumorsejtekkel intraperitoneálisan komplett Freund-féle adjuvánsban. Intravénás tumorsejt kihívást alkalmazunk két héttel az utolsó vakcinálás után M2SVp97a.2E injekciójával; ez olyan metasztatikus tumor klón, amelyet M2K1735-ből (rágcsáló melanóma modell) készítünk az SV40 korai promotor által hajtott valamely kifejező plazmidban levő humán p97 kódoló szekvenciával végzett átfertőzéssel. Különböző kifejező klónókat szelektálunk, és az egyik az M2SVp97a.2E klón, amelyet tumor kihíváshoz alkalmazunk, közepes szinten fejez ki p97-et, mintegy 400000 molekulát sejtenként, vagy a humán melanóma p97 antigén sűrűséggel ekvivalens mennyiséget. Két adag intravénás tumor kihívást alkalmazunk, 5xl0⁵ vagy lxlO⁵ sejtet, amelyet színgén C3H/Hen egerek farokvénájába injektálunk. Az egereket 16 nappal a tumor kihívás után megöljük és a tüdőket eltávolítjuk. Egy egeret akkor nyilvánítunk pozitívnak, ha puszta szemmel látható tumorok vannak a tüdőn, India-tintával festve. Az eredményeket az V. táblázatban mutatjuk be.

HU 209 144 Β

V táblázat

Vakcináit egerek kihívása színgén, p97-tel átfertőzött melanóma sejtekkel

VI. táblázat

Szérum antitest titerek vacciniával inokulált majmokban

Vakcina	Az immunizálások száma	Kihívó sejtadag	Az egerek száma nyilvánvaló tüdő metasztázissal
Vp97a-NY	2	5x105	1/5
1	5x105	2/4
Besugárzott színgén melanóma sejtek	2	5x105	0/4
Vwt-NY	2	5x105	9/10
p97 fehérje	2	5x105	3/3
Vp97a-NY	2	lxlO5	0/1
Vp97a-NY	1	lxlO5	0/4
Natív	0	lxlO5	5/6

Az V. táblázatban bemutatott eredmények azt demonstrálják, hogy jelentős védő hatás létezik Vp97aNY két immunizálásával, bár védőhatás nem látható tisztított p97 fehérje vakcinával (a kiváltott rendkívül nagy antitest titer ellenére). A rekombináns vírusnak az a képessége, hogy celluláris immunitást vált ki, lehet a felelős tumor ellen védő immunitásáért.

Terápiás kísérletben egereket inokulálunk p97-kifejező tumorsejtek kis dózisával, majd két nappal később inokuláljuk a rekombináns Vaccinia vakcinával. Egereket vetünk alá 10⁵ vagy 10⁴ p97-et kifejező tumor sejt (M2SVp97a.E) kihívásának intravénásán. Két nappal később egereket inokulálunk farok bemetszéssel vagy Vp97a-NY-nal, vagy Vwt-NY-nal. Hetenként ismételjük az inokulálást farok-bemetszéssel, és az egerek túlélését rögzítjük. A 10. ábrában bemutatott eredmények jelzik a rekombináns p97 Vaccinia vírus vakcinálás terápiás hatását egerekben, amelyeknek meglevő tüdő metasztázisa van.

7.5 A REKOMBINÁNS p97 VACCINIA VÍRUS IMMUNOGÉN MAKAKÓ MAJMOKBAN

Két Macaca fasicularis (makakó) majmot bőrbemetszéssel beoltunk vagy 2xl0⁸ tarfoltképző egység (pfu) Vp97a-NY rekombináns Vacciniával, vagy azonos dózisú szülőtörzs vakcinával.

Két héttel később a szérumot ELISA módszerrel megvizsgáljuk Vaccinia és p97 titerre. A VI. táblázatban bemutatott eredmények azt demonstrálják, hogy p97-re való humorális antitestek mutathatók ki két héttel a Vp97a-NY-nal végzett egyedi inokulálás után.

Immunogén/hét	Anti-Vaccinia titer (szérum hígítás kétszeres háttérrel)	p97 elleni titer (pg/ml monoklonális antitest ekvivalens)
Vp97a-NY/0. hét	1/20	0,54
Vp97a-NY/2. hét	1/2000	6,54
Vwt-NY/0. hét	1/20	0,50
Vwt-NY/2. hét	1/2000	0,34

8. MIKROORGANIZMUSOK LETÉTBE HELYEZÉSE

Az említett plazmidot hordozó alábbi E. coli törzset az ATCC-nél letétbe helyeztük (ATCC, Rockville, Maryland), ahol ez a következő letéti számot kapta:

E. coli törzs	Plazmid	Letéti szám
E. coli HB101	p97b	53403

Az alábbi rekombináns Vaccinia vírust helyeztük letétbe az ATCC-nél (ATCC, Rockville, Maryland), ahol ez a következő letéti számot kapta:

Vírus	Letéti szám
Vp97a-NY	VR 2159

Az említett plazmidot hordozó alábbi sejtvonalakat helyeztük letétbe az ÁTCC-nél (ATCC, Rockville, Maryland), ahol ezek a következő letéti számokat kapták:

Sejtvonal	Plazmid	Letéti szám
TKMp97-12 (egérsejt)	PMTp97b	CRL 8985
B16SVp97a.l4(egér melanóma sejt)	pSVp97	CRL 9304

A jelen találmány nem korlátozódik a deponált mikroorganizmusok és sejtek által behatárolt oltalmi körre, mivel a deponálással kapcsolatos kiviteli módot csupán a találmány egyik szempontja illusztrációjának szánjuk, és bármely mikroorganizittüs vagy sejt, amely funkcionálisan ekvivalens, a jelen találmány oltalmi körén belül van. A találmánynak az itt leírtakon és bemutatottakon kívül számos módosítása nyilvánvaló lehet azok számára, akik a szakterületen jártasak, a megelőző leírásokból és az azt kísérő ábrákból. Az ilyen módosítások szándékunk szerint belül vannak a mellékelt igénypontok oltalmi körén.

Azt is meg lehet érteni, hogy a nukleotidokra adott összes bázispár-méret hozzávetőleges, és csak a leírás céljából használjuk ezeket.

Claims (24)

1. Eljárás a melanómához társult p97 antigén peptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a p97 antigén pepiidet kódoló expressziós vektort tartalmazó emlős sejteket tenyésztjük, és a kifejezett pepiidet elválasztjuk, és adott esetben tisztítjuk.

(Elsőbbsége: 1986. 02.07.)

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 3A és 3B ábra szerinti szekvenciát tartalmazó rekombináns nukleinsavat tartalmazó emlős sejteket tenyésztjük.

(Elsőbbsége: 1986.02. 07.)

3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan sejteket tenyésztünk, melyek a rekombináns nukleinsavat a sejtbe beépített plazmid részeként tartalmazzák.

(Elsőbbsége: 1986.02. 07.)

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan sejteket tenyésztünk, melyek a rekombináns nukleinsavat a sejtbe bevitt vírus részeként tartalmazzák.

(Elsőbbsége: 1986.02.07.)

5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekonbináns nukleinsavat tartalmazó vakcina vírussal fertőzött sejteket tenyésztünk.

(Elsőbbsége: 1986. 02. 07.)

6. Eljárás rekombináns DNS vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy a 3A és 3B ábra szerinti szekvenciát tartalmazó vagy azzal egyenértékű kódoló nukleotid szekvenciát egy második, génkifejezést szabályozó nukleotid szekvenciával ligálunk, és a kapott szakaszt egy megfelelő hordozó vektorba inszertáljuk. (Elsőbbsége: 1987.01.27.)

7. Eljárás a gazdaszervezetre fertőző, nem-patogén rekombináns vírus előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) a melanómához társult p97 antigén pepiidet kódoló nukleotid-szekvenciát és egy, a peptid kifejezését szabályozó második nukleotid-szekvenciát összekapcsolunk, és (iv) az előállított kimer gént egy vírus genomba inszertáljuk.

(Elsőbbsége: 1986. 02. 07.)

8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kódoló nukleotid-szekvenciaként a 3 A és 3B ábra szerinti nukleotid-szekvenciát ligáljuk.

(Elsőbbsége: 1986.02.07.)

9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kimer gént egy burokkal rendelkező vírus genomába építjük be.

(Elsőbbsége: 1986.02.07.)

10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vírusként Vaccinia vírust használunk. (Elsőbbsége: 1986. 02. 07.)

11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy második nukleotid-szekvenciaként a Vaccinia vírus 7,5 kb promoterét használjuk.

(Elsőbbsége: 1986.02. 07.)

12. Eljárás rekombináns emlős sejt előállítására, azzal jellemezve, hogy a sejtet a 6. igénypont szerint előállított rekombináns DNS vektorral átfertőzzük. (Elsőbbsége: 1987.01. 27.)

13. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns DNS vektorként p97b vektort használunk.

(Elsőbbsége: 1987. 01.27.)

14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns DNS vektorként pMTp97b vagy pSVp97 vektorral fertőzünk.

(Elsőbbsége: 1987. 01. 27.)

15. Eljárás alegység vakcina készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított p97 antigén pepiidet legalább egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal összekeverjük. (Elsőbbsége: 1986. 02. 07.)

16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 2. igénypont szerint előállított antigén pepiidet legalább egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal összekeverjük.

(Elsőbbsége: 1986.02. 07.)

17. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 3. igénypont szerint előállított antigén pepiidet legalább egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal összekeverjük.

(Elsőbbsége: 1986. 02. 07.)

18. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 4. igénypont szerint előállított antigén pepiidet legalább egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal összekeverjük.

(Elsőbbsége: 1986.02,07.)

19. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 5. igénypont szerint előállított antigén pepiidet legalább egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal összekeverjük.

(Elsőbbsége: 1986.02.07.)

20. Eljárás élő vírus vakcina készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a 7. igénypont szerint előállított rekombináns vírust legalább egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal összekeverjük. (Elsőbbsége: 1986.02.07.)

21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 8. igénypont szerint előállított rekombináns vírust keverjük a hordozóanyaggal.

(Elsőbbsége: 1986. 02. 07.)

22. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 9. igénypont szerint előállított rekombináns vírust keverjük a hordozó anyaggal.

(Elsőbbsége: 1986. 02. 07.)

23. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 10. igénypont szerint előállított rekombináns vírust keverjük a hordozóanyaggal.

(Elsőbbsége: 1986. 02.07.)

24. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy all. igénypont szerint előállított rekombináns vírust keverjük a hordozóanyaggal.