JPS62294698A - 黒色腫に対するワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）発明の分野 本発明は予防接種した個体中に黒色腫細胞を選択的に破
壊する免疫応答を生ずることができるワクチン配合物を
指向する。従って、黒色腫関連抗・原に関連するペプチ
ドまたはタンパク質は組換えＤＮＡ技術および（または
）化学合成法により多量に製造される。本発明のペプチ
ドまたはタンパク質はワクチン配合物中の免疫原として
使用できる。一定態様において、黒色腫関連抗原に関連
するペプチドまたはタンパク質は組換え体ウィルスによ
り発現され、ｆ、［ｌ　ｉＡえ体ウィルス自体はワクチ
ン配合物中に免疫原として使用できる。本発明はまた、
黒色腫関連抗原に関連するペプチドまたはタンパク質を
多量に生成できる組換え体ＤＮＡ技術並びに化学合成法
の使用を含む方法を備えている。

本発明は、ｐ９７に関連する免疫原ペプチドとして、黒
色腫細胞の細胞表面成分である９７，０００ドルトンよ
り多少低い見掛は分子量を有する単量体黒色腫細胞表面
シアロ糖タンパク質を使用する例により例示される。

（２）発明の背景 （２，１）腫瘍関連抗原 実験動物、殊に奮歯動物、を用いた研究はＩｌｌ瘍ウィ
ルスにより誘発された腫瘍の大部分がウィルスのゲノム
によりエンコードされた抗原を発現すること、およびこ
れらの抗原による免疫処置が同様のウィルスにより誘発
された腫瘍細胞のその後の攻撃の拒絶を生ずることがで
きるこ止を示した。

この研究の多くがウィルスの研究室株、例えばＳ　Ｖ　
１．　Ｏ、ポリオーマウィルス、およびフレンド、モロ
ニーまたはラウシャーマウス白血病ウィルスでなされた
けれども、事実上腫瘍ウィルスの水平および垂直伝播が
示され、事実ウィルス誘発ネコ白血病および肉腫に対す
る市販ワクチンが現在入手できる。

対照的に、大部分のヒト癌腫のウィルス病因は実証され
なかった。顕著な例外は肝炎ウィルス（肝癌）、ヘルペ
ス単純ウィルス（頚部癌）、およびエプスタインバーウ
ィルス（鼻咽頭癌）である。しかし、過去２０年の間に
若干のヒト腫瘍細胞が腫瘍抗原、すなわち腫瘍細胞をそ
の正常細胞等個物と識別する抗原、を発現することが証
明され、若干の患者はこれらの抗原に対して細胞媒介ま
たは体液免疫応答を（ｉＲえる〔ヘルストロム（Ｉｌｅ
ｌ　Ｉｓ　ｔｒｏｍ）ほか、１９６８、ネーチャ（Ｎａ
　ｔｕｒｅ）、２２０：１３５２；モートン（Ｍｏｒ　
ｔｏｎ　）ほか、１９６８、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）１６２　　：　　１２７９〜１２８１；シク　（Ｓ
ｈｉｋｕ）ほか、１９７６、ジャーナル・オブ・エクス
ベリメンタル・バイオロジー　（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅ
’ｄ、）　、１４４　：　８７３〜８８１）。

これらの免疫応答の標的の若干はヒトゲノムによりエン
コードされたオンコツエタル（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ）ま
たは分化抗原である〔ヘルストロム（Ｉｌｅｌｌｓｔｒ
ｏｍ）ほか、１９７０、インタナショナル・ジャーナル
・オブ・カンサー（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ）　
、６　：　３４６〜３５１〕。

最近まで、腫瘍抗原の分子性質が未知であり、免疫反応
の腫瘍特異性の程度は明らかでなかった。

癌診断検定または癌療法の開発におけるこの情報を利用
する試みは大部分は不成功であった。自然腫瘍退行が非
常に稀であるので、試験管内で示された免疫応答が生体
内で有効でなかったこともまた結論でき、例えば癌患者
から得られた抗体およびリンパ球が試験管内で腫瘍細胞
の殺害に有効であることができるけれども、同じ癌患者
の免疫応答は生体内で効果を有さない。

コーラ−ほか（Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ　）による単クローン性抗体技術の導入（１９７５、
Ｎａｔｕｒｅ、２５６　：　４９５〜４９７）は、それ
が上記抗原を分子レベルおよび特異性に関してともに規
定する方法を与えるのでヒト腫瘍抗原に対する研究を強
化した〔ヘルストロムはか（ｌｌｅｌｌｓｔｒｏｍ　ａ
ｎｄ　Ｂｒｏｗｎ）、１９７９、「抗原（Ｔｈｅ　Ａｎ
ｔｉｇｅｎｓ）　ｊ　、セラ（？’ｌ。

５ｅｌａ）　’ｔＱ、アカデミツク・フ゛レス（八ｃａ
ｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ　）　、Ｖｏｌ、Ｖ　：　１〜６
６）　＊過去数年にわたり、多数の腫瘍関連抗原が記載
され、その大部分はマウス単クローン性抗体により規定
された、レイスフェルドほか（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ　ａｎ
ｄ　５ｅｌｌ　）　’ｆ１４、単クローン性抗体および
癌療法（Ｍｏｎｏｃ　１ｏｎａ　１Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ　）　、分
子および細胞生物学に関するＵＣＬＡシンポジウム（Ｉ
ＪＣＬＡＳｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ニ
ュー・シリーズ、Ｖｏｌ、　２７、アラン・アール・リ
ス社（八Ｉａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ
　Ｙｏｒｋ）、１９８５、ｐｐ１〜６０９゜十分確認さ
れた抗原の事実上すべてがオンコツエタルまたは分化抗
原であると証明され、１ＩＩｆｆｉに対するそれらの特
異性が定性的よりもむしろ定量的であると認められたけ
れども、若干の抗原は正常細胞に比較して腫瘍細胞に対
し、腫瘍細胞の同定および治療に対する可能な標的とし
て使用されるのに十分な（一般に１０〜ｉ、ｏｏ。

倍の力価に相当する）特異性である。腫瘍抗原に対ずろ
ヒ１−単りローン性抗体もまた得られた〔コー）　（Ｃ
ｏｔｅ）ほか、１９８３、プロシーディング・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　　８０　：
　２０２６〜２０３０）。これは若干の癌患者が彼らの
腫瘍に対する免疫反応を（ｌｉｆｉえていることの前記
証拠を支持する。

同定された限り腫瘍関連細胞表面抗原の半数以上がヒト
ゲノムにより（内因性または外因性ウィルスによるより
も）エンコードされたタンパク質または糖タンパク質で
あり、残りはグリコジルトランスフェラーゼの異常発現
または調節から生ずる糖脂質である。

（２，２）黒色腫関連ｐ９７抗原 ｐ９７抗原は単クローン性抗体の使用によりヒト黒色腫
中に最初に同定された腫瘍関連抗原である〔ブラウン（
Ｂｒｏｗｎ　）ほか、１９８０、ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）　、２５５　：　４９８０
〜４９８３　；ジボルド（Ｄｉｐｐｏｌｄ　）ほか、１
９８０　、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ、　７７
　：　６　ｔ　１４〜６１１８　；ウソドパーグ（Ｗｏ
ｏｄｂｕｒｇ）ほか、１９８０、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｃｌ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、
　７　７　　：　　２　１　８　３　〜２１８７３　　
。

ｐ９７抗原は正常およびＩｈＩＸ瘍のｍ織中のその発現
に関して広く研究され、大部分のヒト黒色腫中および一
定胎児Ｍｉ織中に存在するが、しかし正常成人ｍ織中に
単に痕跡量認められる。〔ブラウン（Ｂｒｏｗｎ　）ほ
か、１９８１、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、
　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　　１２７　：　５３９〜：５３
９〜５４６ｉブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ほか、１９８１、
Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、
　　ＵＳＡ、　　７８　：　５３９〜５４３；ガリーグ
ス（Ｇａｒｒｉｇｕｅｓ　）ほか、１９８２、Ｉｎｔ、
　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　２９　：　５１１〜５１５）
　、　ｐ９７はヒ）　ＦＷ床試験における腫瘍の診断検
出に対する標的として使用された〔ラーソン（Ｌａｒｓ
ｏｎ）ほか、１９８３、ジャーナル・オブ・クリニカル
・インへスティゲーション（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖ
ｅｓｔ、）　７２　：２１０１〜２１１４）。

ｐ９７は単量体細胞表面シアロ塘タンパク質であり、ド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定して９７，０００ド
ルトンより多少低い見掛は分子量（ＭＷ）を存する。単
クローン性抗体は安定な４０，０００ドルトンのトリプ
シン消化フラグメント上に存在する３つの主要抗原部位
を規定した〔ブラウン（Ｂｒｏｗｎ　）ほか、１９８１
、Ｊ。

Ｌｖｗｕｎｏｌ、、１２７；５３９〜５４６）；Ｌかし
、ｐ９７の完全な配列は報告されなかった。少（とも２
つの他の別個に確認されたヒト黒色腫関連抗原ｇｐ９５
　（ジボルド（Ｄｉｐｐｏｌｄ　）ほか、１９８０、Ｐ
ｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　
　ＵＳＡ、　　７７：６１１４　〜６１１８）およびｇ
ｐ８７　（コースラビ（にｈｏｓｒａｖｉ）ほか、１９
８５、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ。

３５ニア３〜８０）が逐次免疫沈降により分析するとｐ
９７に一致すると思われる。

ｐ９７のＮ末端アミノ酸配列はトランスフェリンに相同
であり、トランスフェリンのようにｐ９７は鉄を結合す
る（ブラウン（Ｂｒｏｗｎ　）ほか、１９８２、Ｎａｔ
ｕｒｅ、　Ｌｏｎｄｏｎ、　２９６　：　１７１〜１７
３）　、体細胞ハイブリッドの分析およびイン・シトウ
（ｉｎｓｉｔｕ　）ハイブリッド形成法はＰ９７遺伝子
が、トランスフェリンおよびトランスフェリン受容体に
対する遺伝子のように染色体領域３ｑ２１〜３ｑ２９上
に配置されることを示した〔プロラマン（Ｐｌｏｗｍａ
ｎ）ほか、１９８３　、Ｎａｔｕｒｅ、　ｌ、ｏｎｄｏ
ｔ＋。

３０３ニア０〜７２；ヤング（Ｙａｎｇ）ほか、１９８
４、Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃ
ｉ、　　ＵＳＡ％　　８１　　：　　２７５２〜２７５
６）。これらの観察はｐ９７が鉄代謝において役割を果
たすことを示唆する。

（２，３）癌ワクチン 実験動物、通常マウス、における研究は生または列席細
胞による免疫処置が生育可能な癌細胞の後の攻撃の拒絶
を生ずることができることを示した。細胞を含まない物
質による免疫の試みは一般に成功することが少なかった
が、しかし若干の成功が報告された〔総説に対しへルス
トロムはか（Ｉｌｅｌｌｓｔｒｏｍ　ａｎｄ　Ｂｒｏｗ
ｎ）　、１９７９、抗原（ＴｈｅＡｎｔｉｇｅｎｓ）　
、ｖｏｌ、　Ｖ　：　１〜６６参照〕。多くの場合に、
防？ｌＩＩ効果に関与する標的抗原がウィルスにエンコ
ードされたが、しかし他の多くの場合に防御免疫応答を
誘出する抗原の性質は知られていない。

ヒトにおける研究は一層困難であり、若干の成功＋Ｕ告
にもかかわらず癌ワクチンの有効性が論争されている。

多くの場合に、ワクチンＩｎ製物は照射腫ｍ細胞または
一定化学薬品にさらすことにより殺した腫瘍細胞から構
成された。純粋なヒ）ｌｌｆｆｉ瘍関連抗原を入手でき
なかったので、ワクチンにおけるその使用の報告はない
。

ヒトにおける癌ワクチンの提案された使用に対する主理
論的難点は、例えば列席細胞または細胞を含まない調製
物により「予防接種」されるヒＩ−が、免疫応答の標的
であることができる肺癌抗原が若干の正常細胞中に単に
微量とはいえ存在することができ、従って免疫系により
「自己」として認識されるので、免疫学的に感受性が鈍
いことである。すべてでなくても、単クローン性抗体に
よりヒト腫瘍中に検出される大部分の腫瘍関連抗原はま
た若干の正常組織中に存在し、癌患者が生体内でそれら
に有効に応答する証拠がほとんどない。

サプレッサー細胞が腫瘍抗原に対する免疫応答のダウン
レギレーションに主要役割を果たす証拠がある〔ネボム
（Ｎｅｐｏｍ）ほか、１９８３、エクスペリメンテイア
（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｉａ）　、３９　：　２３５〜
２４２〕。さらに１組の腫瘍抗原により誘発されたサプ
レッサー細胞応答が、他の■のそれ自体サプレッション
を誘発しない腫瘍抗原に対する有効な腫瘍破壊応答の誘
発を妨げることができる〔ヘルムストロムはか（Ｉｌｅ
ｌｌｓｔｒｏｍ）ほか、１９８３、バイオメンブランズ
（Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ）　、ノボトリー　（Ａ、
　Ｎｏｗｏｔｒｙ）　ｋｌｇ、プリナム・プレス（Ｐｌ
ｅｎｕｍＰｒｅｓｓ）　、ｐＩ）　３６５〜３８８）。

（２，４）組換えＤＮＡ技術およびワクシニアウィルス 感染を防御するサブユニットワクチンの製造に対する組
換えＤＮＡ技術の使用は受容者動物中のタンパク質に対
する免疫応答を誘出できるタンパク質をコードする遺伝
情報の適当なベクター中の分子クローニングおよび発現
を含む。最近、サブユニットワクチンの製造に潜在的に
有用である新規な方法が記載された〔マケ７　ト（Ｍａ
ｃｋｅｔｔｅ）ほか、１９８２　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　　７９　ニア４１５〜
７４１９；マケフト（Ｍａｃｋｅ　ｔ　Ｌｅ　）ほか、
１９８４、ジャーナル・オブ・ピロロジー（Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、）　　４　！　　：　８５７〜８６４　；
パニカリほか（Ｐａｎｉｃａｌｉ、　Ｄ、　ａｎｄ　Ｐ
ａｏｌｅｔｔｉ、　Ｅ、）　、１９８２、Ｐｒｏｃ、　
　Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、、７　９　　
：　　４　９　２　７〜４９３１）　　。

この方法にはゲノムに挿入された外来遺伝子の発現にベ
クターとしてワクシニアウィルスの使用が含まれる。受
容者動物に導入されると組換え体ワクシニアウィルスが
挿入された外来遺伝子を発現し、それによりそのような
遺伝子生成物に対する受容者免疫応答を誘出する。止組
換え体ワクシニアウィルスがワクチンとして使用できる
ので、この方法はサブユニットおよび生ワクチンの両方
の利点を組合せる。

ワクシニアウィルスは約１８７キロベースの線状二重鎖
ＤＮＡゲノムを含み、感染細胞の細胞質内に複製する。

これらのウィルスは完全転写酵素系（キャッピング、メ
チル化およびポリアデニル化酵素を含む）をウィルス感
染力に必要なウィルスコア内に含有する。ワクシニアウ
ィルス転写調節配列（プロモーター）はワクシニアＲＮ
Ａポリメラーゼによるが、しかし受容者細胞ＲＮＡポリ
メラーゼによらない転写の開始に備える。

＆ＩＩｉえ体ワクシニアウィルス中の外来ＤＮＡの発現
は外来遺伝子のタンパク質コーディングＤＮＡ配列に対
するワタシニアプロモーターの連結ヲ要する。プラスミ
ドベクターはまた挿入ベクターと称され、ワクシニアウ
ィルスへのキメラ遺伝子の挿入のために構築される。挿
入ベクターの１型は（ａ１転写開始部位を含むワクシニ
アウィルスプロモーター；（ｂ）外来ＤＮＡフラグメン
トを挿入する転写開始部位から下流に位置する若干の特
有の制限エンドヌクレアーゼクローニング部位；（Ｃ）
プロモーターをフランキングしウィルスゲノムの相同非
必須領域中ヘキメラ遺伝子を挿入させる部位をクローニ
ングする非必須ワクシニアウィルスＤＮＡ（例えばＴＫ
遺伝子）；および（ｄ１大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中の複
製および選択のための細菌由来の複製および抗生物質耐
性標識からなる。そのようなベクターの例はマケットに
より記載されている〔マケッ１−　（Ｍａｃｋｅｔｔｅ
）ほか、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　４９　：　８５７〜８
６４〕。

組換え体ワクシニアウィルスは外来遺伝子を含む組換え
体細菌挿入プラスミドを、ワクシニアウィルスで予め感
染した細胞中へトランスフエクショすることにより生成
される。相同組換え体は感染細胞で生じ、ウィルスゲノ
ム中への外来遺伝子の挿入を生ずる。感染細胞は免疫技
術、ＤＮＡプラークハイブリ、ソド形成または後に分離
できる組換え体ウィルスに対する遺伝子選択を用いてス
クリーンすることができる。これらのワタシニア組換え
体はその必須機能および感染力を保持し、外来ＤＮＡの
約３５キロベースを収容するように溝築することができ
る。

外来遺伝子発現は酵素または免疫検定（例えば免疫沈降
、ラジオイムノアッセイ、またはイムノブロッティング
）により検出できる。組換え体ワタシニア感染細胞から
生じた天然存在脱糖タンパク質はグリコジル化され、細
胞表面に移動させることができる。高い発現レベルは強
プロモーターの使用により、または単一遺伝子の多重コ
ピーのクローニングにより得ることができる。

（３）発明の概要 予防接種した個体中で黒色腫細胞を選択的に破壊する免
疫応答の誘発に使用できるワクチン配合物が記載される
。より詳しくは、本発明のワクチン配合物は黒色腫関連
抗原例えば黒色腫関連ｐ９７抗原を指向する免疫応答を
誘発する免疫源を含む。

本発明によれば、多くのワクチン配合物が可能である。

例えば、本発明の「サブユニットワクチン」の免疫原は
ｐ９７に関連するペプチドまたはタンパク質を含み、適
当なアジュバントと配合することができる。そのような
ペプチドまたはタンパク質は実質的に第３図に示される
ようにｐ９７のアミノ酸配列のすべてまたは一部から誘
導され、機能的に等しいアミノ酸配列がサイレント変化
中に生ずる配列内残基の置換された改変アミノ酸配列、
および（または）修飾またはプロセッシングされたアミ
ノ酸配列例えばグリコジル化アミノ酸配列、ホスホリル
化アミノ酸配列など、あるいは化学修飾アミノ酸配列を
含むアミノ酸配列を含む。以下、改変、非改変、修飾ま
たは非修飾のいずれであっても、黒色腫関連ｐ９７抗原
に関連する本発明のペプチドまたはタンパク質が「ｐ９
７関連ペプチド」として示される。ｐ９７関連ペプチド
がハプテンである（すなわち、抗原性であるがしかし免
疫原でない）場合に、ハプテンは免疫原性を与える担体
分子に接合させることができる。

本発明のｐ９７関連ペプチドは組換えＤＮＡ技術および
（または）化学合成法を用いて製造することができる。

ｐ９７関連ペプチドが化学的に合成されると、そのよう
な合成ｐ９７関連ペプチドは抗原性であると予期される
ｐ９７の領域から誘導されるアミノ酸配列を含むことが
できる〔ホップほか（ｌｌｏｏｐ　ａｎｄ　Ｗｏｏｄｓ
）　、１９８１　、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ、　　７
８　：　３８２４〜３８２８）。

本発明のｐ９７関連ペプチドが組換えＤＮＡ技術の使用
により生成される場合に、ｐ９７の全部または一部をエ
ンコードするヌクレオチド配列は、適当な宿主中で培養
基から精製できるｐ９７関連ペプチドの発現を指向する
ことができる〜：ｎ　換え体発現ベクター例えばウィル
スまたはプラスミド中へ挿入される。挿入されるヌクレ
オチド配列は実質的に第３図に示されるｐ９７配列の全
部または一部から誘導され、機能的に等しいヌクレオチ
ドコドンがサイレント変化中に生ずる配列内のコドン、
換言すれば同一アミノ酸をエンコードする異なるコドン
、を置換するか、またはその機能等漬物を第３図に示さ
れる配列内で置換できるヌクレオチド配列を含むが、し
かしそれに限定されない。

プラスミド発現ベクターを用いるとき直核細胞中の発現
に適するものが好ましいが、しかし原核発現ベクターも
また使用できる。

発現ベクターがＭｉ換え体ウィルスである発明の他の態
様において、ワクチンはウィルスワクチンとして配合す
ることができ、その場合に免疫原はｐ９７関連ペプチド
を発現する組換え体ウィルスを含む。免疫原として用い
る組換え体ウィルスの性質により、不活性化ウィルスワ
クチンまたは生ウィルスワクチンを配合することができ
る。本発明のワクチン配合物による適当な免疫処置は、
免疫処置被験体中で黒色腫細胞の破壊を生ずる免疫応答
の誘発を生ずることができる。

本発明はまたワクチン配合物を試験できるシステムを記
載し、試験を行なう方法を略示する。例えば、ワクチン
配合物を動物モデル中で、初めに奮歯動物、次いで非ヒ
ト霊長類中、最後にヒト中、好ましくは寛解にあるがし
かしミクロ転移に基く再発の高い可能性を有する受容者
中で効力について評価できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分割したｐ９７ｍＲＮ
Ａの細胞を含まない翻訳生成物のオートラジオグラフを
示す。第１Ａ図中、レーン１はｐ９７濃縮ｍＲＮＡの翻
訳生成物を表わし、レーン２は非濃縮ｍＲＮＡの翻訳生
成物を表わし、それぞれ５ｎｇｍＲＮＡの全翻訳生成物
０．５μｌから得られた。第１Ｂ図中、レーン１はｐ９
７濃縮ｍ　ＲＮ　Ａの翻訳生成物を表わし、レーン２は
非濃縮ｍＲＮＡの翻訳生成物を表わし、それぞれ抗ｐ９
７血清で免疫沈降した５ｎｇｍＲＮＡの翻訳生成物５μ
ｅから得られた。 第２図はｐ　９７ｍＲＮＡの構造の線図である。 コーディング領域（シグナル配列からアンカー配列まで
および非コーディング領域（３’　ＵＴ）並びにｐ９７
前駆物質の重複ドメイン構造（空バー）の配列が示され
る。種々の制限酵素認識配列の位置はｍＲＮＡの上に示
される。４つのｃＤＮＡクローンの相対位置はｍＲＮＡ
構造の下に示される。 ｃＤＮＡクローンｐ９７−３ａ２ｆ　１（３ａ２ｆｌ）
はｃＤＮＡがオリゴ（Ｔ）プライムｐ　９７　’ｌｆ４
縮ｍＲＮＡ上に転写され、ｐＢＲ３２２中でクローンさ
れたｃＤＮＡライブラリーから分離され；ｃＤＮＡ’）
Ｏ−ンｐ　９７−２　ｒ　１　　（２ｆ　１）、ｐ９−
１　ｊｌ　（１ｊｌ）およびｐ９７−１０ａｌ（１０ａ
ｌ）はｃＤＮＡ合成を、ｐ９７エキソン配列をエンコー
ドするオリゴヌクレオチドでプライムし、生じたｃＤＮ
Ａフラグメントをλｇｔｌ。 中ヘクローンすることにより分離した。第２Ａ図は！　
Ｌ　４７．１中でクローンしたゲノムクローンＢ１５、
Ｈ１７、Ｂ６．６およびＢ７．７の線図である。 第３図はヒトｐ９７前駆物質ｃＤＮＡのヌクレオチド配
列およびその演鐸アミノ酸配列を表わす。 タンパク質配列により予め決定したＮ末端アミノ酸残基
はヌクレオチド配列（アミノ酸残基数２１〜３０）から
予期したものに一致した。アミノ酸残基３８．１３５お
よび５１５における可能なグリコジル化部位（空バー）
並びにＣ末端における膜アンカー領域（実バー）が示さ
れる。１つのポリアデニル化シグナル（回申に示される
ＡＡＴＴＡＡＡ）が位置３８４７に検出され、それはポ
リアデニル化トラクトの上流５０塩基対である。 第４図はｐ９７前駆物質の予期アミノ酸配列およびヒト
セロトランスフェリンのそれ〔ヤング（Ｙａｎｇ　）ほ
か、１９８４、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ。 ＵＳＡ、８１：２７５２〜２７５６　；デービス（Ｄａ
ｖｉ風）ほか、１９８５、ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　）
１８１：１１１〜１２１〕の比較を示す。保存された残
基は囲に入れた。トランスフェリン〔メーク・ポーティ
グ（Ｍｅｒｔｚ−Ｂｏｕｔｉｇｕｅ　）ほか、１９８４
、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリ
ー（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃ’ｈｅｍ、　）　１４５
　：　６５９〜６７６〕の鉄結合中に包含されるチロシ
ン、ヒスチジンおよびアルギニン残基は星標（＊）によ
り示される。 第５図はトランスフェリンの上材成員間に保持されたシ
スティン残基の存在に基（ｐ９７の構造の二次元モデル
の線図である。３つの可能なグリコジル化部位が星標（
＊）により示される。疎水性膜アンカードメインがｐ９
７のＣ末端（Ｃ００ｔ＋　）に明らかである。 第６図はｐ９７ｃＤＮＡクローンおよびｐ９７発現ヘク
ターの構築に用いるゲノムクローンλＥ７．７のフラグ
メント；並びにｐＳＶ２ｐ９７ａ発現ヘクターの遺伝子
構造の線図である。次の略号：ＩＥ、　　ＥｃｏＲＩ　
；　Ｐ、　　Ｐｖｕｌｌ　；　Ｓａｌ、　　５ａｉｌ　
；　Ｓ。 ５ｓｔＴ　；　Ｂ、ＢａｍＨＩ、が使用されている。 第７図は３■換え体ｐ９７タンパク質の確認および免疫
精製におけるゲル電気永動の結果を示す。 トランスフェクションしたＣＨＯクローン（ＣＨ○３＋
）およびＳＫ−ＭＥＬ２８ヒト黒色ＭＡ細胞はツニカマ
イシン（ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）　　（ＴＭ）の存在
（→−Ｔ　Ｍ　）および不在（−ＴＭ）下にＩＳＳシス
ティンで標識した。細胞は１００ｍｍ２平板中へ接種し
て集密近くへ到達させた。培地を除き、ツニカマイシン
１μｇ　／　ｍ　Ｅを添加または添加しないシスティン
不含培地３　ｒｒｔ　１で置換した。３７°Ｃで３０分
後に、２５０Ｉｌｃｉ毎ｍｌのＬｒ”Ｓシスティン（１
０１６Ｃｉ毎ミリモル；ニュー・イングランド・ニュー
クリア（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ　）製
〕をその後６時間加えた。細胞の回収、細胞溶解物の調
製、免疫沈降および５ＤＳ−ＰＡＧＥは前記のとおりで
あった。抽出物をｐ９７特異性抗体で免疫沈降し、タン
パク質を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓ
　Ｄ　Ｓ　−ＰＡＧＥ）により分析した。（ａ）クーマ
シーブルー染色５ＤＳ−ボ１）アクリルアミドゲル。レ
ーン１、タンパク質マーカー；レーン２、トランスフェ
クトマウスＢ１６細胞から分離した免疫精製ｐ９７；レ
ーン３　：　ＳＫ−ＭＥＬ２８細胞＋ＴＭ；、レーン４
、ＳＫ−ＭＥＬ２８細胞−ＴＭ；レーン５　、ＣｌＩＯ
３＋細胞＋ＴＭ；レーン６、ＣＨＯ３＋細胞−ＴＭゆ山
）、（ａ）と同一のゲルのオートラジオグラム。 第８図はトランスフェクト細胞またはＶｐ９７ａ−ＮＹ
怒染細胞中の発現ｐ９７の放射免疫沈降の結果を示す。 ＢＳＣ細胞は野生型ワクシニアウィルスまたはｐ９７Ｍ
ｉ換え体ワクシニアウィルスで一夜感染させた。これら
のウィルスまたはトランスフェクト細胞系ＣＨＯ−ｐ９
７．Ａはツニカマイシン〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）　）　
２μｇ　／　ｍ　ｌともにまたはなしで３５８標識メチ
オニンおよびシスティンとともにインキュベートした。 ６時間後に細胞を溶解し、単クローン性抗体９６．５で
沈殿させ、１０％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動
により分離した。ゲルを一夜オートラジオグラフにかけ
た。ツニカマイシン処理群は各群について右側である。 第９図はｐ９７ワクチンで免疫処置したマウス中の血清
抗体価を示す。Ｔｐ９７は完全フロインドアジュバント
中の５Ｘ１０’照射Ｍ２ｓｖｐ９７ａ。 Ａ細胞くトランスフェクションし、表面ｐ９７を発現す
る同系腫瘍細胞）で免疫処置し、リン酸塩１．１　ｉｊ
ｉ食塩水中の同数の細胞で追加刺激した５マウスを示す
。ｐ９７は完全フロインドアジュバント中の１００１１
ｇの精％ｐ　９７タンパク質で免疫処置し、５０μｇの
水性タンパク質で追加刺激した５マウスの群である。Ｖ
ｐ９７は尾部乱切によりＶｐ９７ａ−ＮＹＩＯ’プラー
ク形成単位で免疫処置し追加刺激した５マウスの群であ
る。 第１０図は組換え体ｐ９７ワクシニアウィルス（Ｖｐ　
９７　ａ−ＮＹ）による腫瘍攻撃マウスの予防接種の治
療効果を示す。マウスは１０５または１０’のｐ９７発
現腫瘍細胞（Ｍ２ＳＶｐ９７ａ。 Ｅ）で静脈内攻撃した。２日後、マウスに尾部乱切によ
りＶｐ９７ａ−ＮＹまたはＶｎｔ−ＮＹを接種した。毎
週尾部乱切による接種を繰返し、マウスの生存を記録し
た。 （５）発明の詳細な説明 本発明は黒色腫の予防または治療用のワクチンの製造を
指向する。それは黒色腫が正常′ＫＪｌ織中よりも黒色
腫細胞中に多量に存在する腫瘍関連表面抗原例えばｐ９
７抗原を有する観察に基く。本発明によれば、黒色腫関
連ＩＩ）９７抗原に関連するペプチドまたはタンパク質
（すなわち、ｐ９７関連ペプチド）が１ｉＪ１　換えＤ
ＮＡ技術および（または）化学合成技術を用いて製造さ
れる。本発明のｐ９７関連ペプチドは実質的に第３図に
示されるｐ９７のアミノ酸配列の全部または一部から誘
導されたアミノ酸配列を含む。これらはサイレント変化
中にそのように生ずる機能等個物として作用する同様の
極性の他のアミノ酸による配列内の１つまたはそれ以上
のアミノ酸残基の置換により変更された第３図から誘導
されたアミノ酸配列を含む。配列内のアミノ酸の置換は
アミノ酸が属する種類の池のものから選ぶことができる
。例えば無極性（疎水性）アミノ酸にはアラニン、ロイ
シン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラ
ニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。 極性の中性アミノ酸にはグリシン、セリン、トレオニン
、システィン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミ
ンが含まれる。正荷電（塩基性）アミノ酸にはアルギニ
ン、リジンおよびヒスチジンが含まれる。負荷電（酸性
）アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含
まれる。さらに、本発明のｐ９７関連ペプチドはアミノ
酸残基の置換により変化していてもいなくても、グリコ
ジル化、ホスホリル化などにより、または化学修飾によ
りさらに修飾またはプロセッシングすることができる。 これらのｐ９７関連ペプチドは免疫原として、予防接種
した患者中に存在する黒色腫細胞を指向する免疫応答を
誘出するワクチン配合物に使用することができる。 本発明のＩＢ様によれば、組換えＤＮＡ技術は適当な宿
主細胞中のｐ９７関連ペプチドの発現を指向する発現ベ
クター中へｐ９７抗原をエンコードするヌクレオチド配
列を挿入するために用いられる。ｐ９７抗原をエンコー
ドするヌクレオチド配列は実質的に第３図に示されるｐ
９７ヌクレオチド配列の全部または一部から誘ｉｉｊさ
れるヌクレオチド配列を含む。アミノ酸に対するＤＮＡ
コードの縮重（すなわち、大部分のアミノ酸を１つ以上
のコドンによりエンコードできる）のために、殿能等価
コドン（すなわち、同じアミノ酸または機能等個物をエ
ンコードする異なるコドン）を、互換がサイレント変化
を生ずれば第３図に示されるｐ９７配列内で置換するこ
とができる。ｐ９７の全部または一部をエンコードする
ヌクレオチド配列を含む発現ベクター宿主細胞系を用い
て試験管内で多量の純ｐ９７関連ペプチドを生成させる
ことができ、その場合に遺伝子生成物を培養中の細胞か
ら精製し、免疫原としてサブユニソ１−ワクチン配合物
中に使用することができる。ｐ９７関連ペプチドの精製
は単クローン性抗体を用いるイムノアフィニティー精製
を含め、種々の生化学方法を用いて行なうことができる
。さらに、ｐ９７関連ペプチドの精製は、血漿膜中のタ
ンパク質の固定に関与する配列を除去するがなお細胞膜
へのタンパク質の輸送に関与する配列が除去されず截形
抗原分子が宿主細胞により培養基中へ分泌されるように
ｐ９７関連ペプチドをエンコードするＤＮＡ配列を修飾
することにより促進することができる。原核細胞により
生成されたｐ９７関連ペプチドの場合には、適当な翻訳
後の修飾の欠如が抗原的に不活性な生成物を生ずること
ができ、それは適当な化学的または他の処理により活性
化すべきであるかもしれない。 発現ベクターがウィルスである一定の態様において、ウ
ィルス自体をワクチンとして配合することができる。そ
の場合に不活性化組換え体ウィルスワクチンを調製する
ことができる。発現ベクターが受容者に疾患を生じない
感染性組換え体ウィルスである場合に、実質的な免疫性
を与える不活性化ウィルスワクチンまたは生ウィルスワ
クチン調製物を配合することができる。この目的に殊に
有用な発現ベクターは本発明のｐ９７関連ペプチドを発
現する組換え体ワクシニアウィルスである。 このため、ｐ９７抗原の全部または一部をコードするヌ
クレオチド配列を、適切な宿主中で配列の発現を指向で
きるワクシニアウィルスベクター中へ挿入することがで
きる。本発明には他のウィルス発現ベクター、殊にワク
シニアウィルスをワクチンとして使用することが含まれ
る。 本発明の他の態様において、ｐ９７の演鐸アミノ酸配列
はタンパク質分子の表面における配列並びにその可能な
抗原性および（または）免疫原性の存在を予期する性質
、殊に親水性、を有する配列について試験することがで
きる。これらのｐ９７関連ペプチドは化学的に合成し、
ワクチン配合物中に免疫原として使用することができる
。 本発明はまた、ワクチン製造以外の目的に使用できるｐ
９７関連ペプチドの製造方法を提供する。 ｐ９７関連ペプチドは動物の免疫処理に使用し、問題の
黒色１１［細胞に特異性の抗血清または単クローン性抗
体を生成させることができる。これらは診断検定におけ
る成分として、あるいは癌療法に使用する放射性標識薬
物結合またはトキシン結合抗体のアフィニティー精製に
使用することができる。 本発明はヒト黒色腫に対するｐ９７法ワクチン構築を記
載する例によって示される。しかし、こごに記載される
方法および組成物はｐ９７を用いるワクチンの構成に限
定されないで他のＩＩＩ瘍関連抗原に適用できる。 本発明は単に説明を明確にするために次のとおり：（ａ
ｌｐ９７のヌクレオチドおよびアミノ酸配列；（ｂｌ化
学合成法により製造されるｐ９７関連ペプチド；（Ｃ）
発現ベクター宿主系により製造されるｐ９’７関連ペプ
チド；（ｄｌｐ９７関連ペプチドの免疫確認：および（
１１４）ワクチンの配合が与えられる。 （５，１）黒色腫関連ｐ９７抗原の配列分析ｐ９７をコ
ードする遺伝子のヌクレオチド配列およびその誘導アミ
ノ酸配列が第３図に示される。 機能的に等しい配列は本発明の範囲内にある。これらに
は同様または機能的に等しいアミノ酸残基をエンコード
する異なるコドンの置換により改変され、従ってサイレ
ント変化を生ずる第３図に示されるヌクレオチド配列の
すべてまたは一部を含むヌクレオチド配列、並びに配列
内の機能的に等しいアミノ酸残基の置換により改変され
、従ってサイレント変化を生ずる第３図に示されるアミ
ノ酸配列のすべてまたは一部を含むアミノ酸配列、並び
にそれらの例えばグリコジル化、ホスボリル化などによ
り、または他の化学修飾により修ｆｉｌｌまたはプロセ
ッシングされた誘導体が含まれるが、しかしそれらに限
定されない。 以下のサブセクションには第３図に示されるｐ９７の配
列の決定に用いた方策並びにｐ９７の配列またはワクチ
ン配合物に有用な他の腫瘍抗原の決定に使用できる代替
技術が記載される。 （５，１，１）黒色腫関連ｐ９７抗原の同定および確認
黒色腫関連ｐ９７抗原の活性およびアミノ酸配列は知ら
れていなかった；そのためｐ９７抗原の同定は、ｐ９７
を指向する単クローン性抗体を用いて行なった。多くの
技術をｐ９７に特異性の単クローン性抗体の発生に用い
ることができる。例えば、コーラ−ほか（Ｋｏｈｌｅｒ
　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　）（１９７５、Ｎａｔｕ
ｒｅ、２５０　：　４９５〜４９７）により開発された
ハイブリドーマ技術を次のように用いることができ：マ
ウスまたはラットをヒト黒色腫細胞で免疫処置し、免疫
処置動物から採取したリンパ球を骨髄腫細胞と融合させ
；あるいは、黒色腫患者からのリンパ球を骨髄腫細胞と
融合させることができるＣＤ　−１＝　（Ｃｏｔｅ　）
ほか、１９８３、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、＋　　８０　：　２０２６　；ハスペル　（
ｌｌａ！１ｐｅｌ　）ほか、１９８５、カンサー・リサ
ーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　）　４５　：　３９５
１）　、あるいはエプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ
−Ｂａｒｒ　）ウィルスを用いる単クローン性抗体の製
造技術〔コール（Ｃｏ１ｅ　）ほか、１９８５、Ｅ　Ｂ
　Ｖ　ハイブリドーマ技術およびそのヒト肺癌への適用
、「単クローン性抗体および癌療法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔ
ｈｅｒａｐｙ　）Ｊ　％アラン・アール・リス社（Ａｌ
ａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　ＩＮＣ，、）　、ｐｐ７７〜９
６）を用いてｐ９７を指向する単クローン性抗体を発生
させることができる。どの場合にも、生じたハイブリド
ーマは黒色腫細胞に結合するが、しかし正常細胞に結合
しない抗体の生成についてスクリーンされる。 上記ｐ９７を指向する単クローン性抗体を多（の方法に
用いてｐ９７抗原に関連するペプチドおよびタンパク質
の多量の生成に備えるヌクレオチド配列の同定、確認、
クローニングおよび発現を促進することができる。例え
ば、単クローン性抗体を用いてｌ１ｆｆｉｆｆｉ細胞に
より作られた全タンパク質の放射性標識化、ｐ９７抗原
の同定に用いる単クローン性抗体による腫瘍タンパク質
の免疫沈降、および電気泳動による免疫沈降タンパク質
の分画によりさらにｐ９７抗原を’６（ＩＬ’２するこ
とができる。 タンパク質抗原は、生ずるオー１−ラジオグラフ上の明
瞭なハンドとして同定されるＣブラウン（Ｄｒｏｗｎ　
）ほか、１９８０　、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　
）２５５：４９８０〜４９８３）。さらに、ｐ９７を指
向する単クローン性抗体を次のようにクローニングの促
進に用いることができる：（ａ）ｐ９７抗原をエンコー
ドする黒色腫細胞中に存在するｍＲＮＡ転写を同定して
入手するためのポリソームの免疫４１フ製；　（ｂｌ　
ｐ　９７抗原に関連するペプチドまたはタンパク質を発
現するｃＤＮＡ発現ライブラリー中のクローンの同定；
（Ｃ）前の２つの適用に用いる他の単クローン性抗体ま
たは抗血清を調製するためのｐ９７抗原の精製；または
（ｄｉ　ｐ　９７抗原に対する遺伝子を感染により導入
したｉｌ胞の同定。 単クローン性抗体はまたｐ９７抗原の構造および免疫化
学的確認の促進に使用し、分子の細胞外および抗原ドメ
インを同定し、またアミノ酸配列分析のための分子を精
製することができる〔ブラウン（Ｂｒｏｗｎ　）ほか、
１９８１　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。 八ｃａｄ、ｓｏｃ、ＵｓＡ、　　７８：５３９〜５４３
；フ゛ラウン（Ｕｒｏｗｎ　）ほか、１９８２、Ｎａｔ
ｕｒｅ、　Ｌｏｎｄｏｎｅ　。 ２９６：１７１〜１７３〕。 ｐ９７の一層の確認には細胞の局在の決定並びに抗原決
定基および機能性ドメインのマツピングが含まれる。サ
ブセルの局在は免疫螢光顕微鏡法により、および細胞分
画再試験により決定することができる。細胞表面上に存
在する抗原例えばｐ９７はワクチン構成に好ましいけれ
ども、細胞内抗原もまた有用であることができる。多重
単クローン性抗体を入手できれば、抗原決定基は競合試
験によりマツピングすることができ、各１ノ°〔体を放
射性標識し、他の抗体それぞれとの競合について試験す
る。分子のドメインはプロテアーゼによる制限消化、次
いで５ＤＳ−ＰＡＧＥにより同定することができる。こ
れらのデータとともに最も免疫原性である分子の領域の
同定を可能になろう。 単クローン性抗体がインタクト細胞で免疫処置すること
により得られれば、分子のこれらの領域が最も分子外で
あり、ワクチン構成に有用であるようである。 アミノ酸配列分析はタンパク質の疑問の余地のない同定
及び他のタンパク質との比較を可能にする〔ブラウン（
Ｂｒｏｉｙｎ　）ほか、１９８２　、、　Ｎａｔｕｒｅ
ｓＬｏｎｄｏｎ、２９６：１７１〜１７３）、タンパク
質が５０以上のアミノ酸残基を含むならば、それはアミ
ノ酸配列の一部、最もしばしばＮ末端のみを決定するこ
とを可能にすることができる。アミノ酸配列に対するタ
ンパク質抗原は細胞溶解物から単クローン性抗体による
イムノアフィニティークロマトグラフィー、次いで調製
用ＳＯ５−ｒ’ＡＧＥにより精製することができる。精
製したタンパク質のＮ末端アミノ酸配列は次いで自動ア
ミノ酸配列決定装置、好ましくは最大感度気相装置の使
用により決定される。 （５，１，２）黒色腫関連ｐ９７抗原をコードするＤＮ
への同定、クローニングおよび配列決定 初期クローニング研究は豊富なタンパク質例えばｍＲＮ
Ａがしばしば全ｍＲＮＡの１０〜５０％を構成するグロ
ビンおよびオボアルブミンに集中した。これらのｒｎ　
ＲＮ　Ａはサイズ分画により相同性に対して精製し、純
ｃＤＮＡプローブを用いてコロニーハイブリッド法によ
り数百クローンのライブラリーをスクリーンできた。ｍ
ＲＮＡが全ｍＲＮＡの１〜ｌＯ％を構成するタンパク質
にはｃＤＮＡプローブの１つが問題の配列を含み、他が
負の制御である２つのｃＤＮＡプローブを用いることが
できる。低数度タンパク質、例えば腫瘍関連抗原、をコ
ードし、細胞ｍＲＮＡの０．０１％程度を構成すること
ができるメツセンジャーＲＮＡは、数十万のクローンを
スクリーンしなければならず、ｃＤＮＡプローブが特異
性ハイブリッド形成シグナルを与えないのでクローニン
グが一層困難である。両問題は問題の配列に対するｍＲ
ＮＡを濃縮することにより緩和することができる。 ヒト黒色腫ｐ９７抗原をコードするＤＮＡのクローニン
グに用いた若干の方法が次に記載される。 生じたクローンはｒ）９７の全コーディング領域をスパ
ンするクローンまたはクローン類を同定するために分析
した。そのように同定されたクローンのｐ９７ヌクレオ
チド挿入物を次に任意の公知方法により配列決定するこ
とができる。次に種々の方法がより詳細に記載される。 ＋ａｌポリソーム免疫精製によるｍＲＮＡの分離この方
法において、ポリソーム（ｍＲＮＡ、リポソームおよび
新生ポリペプチド鎖）を新生積上に存在する抗原決定基
を認識する抗体を用いるイムノアフィニティークロマト
グラフィーによって精製する。多くの場合にインタクト
細胞または細胞抽出物による免疫処置により得られた単
クローン性抗体はその天然配座中の抗原を認識するが、
しかし認識される抗原決定基が新生鎖中に存在できない
有意な機会があるのでそれらがポリソーム免疫精製に適
切であることができない。翻訳はポリペプチドのＮ末端
で開始されるので、Ｃ末端に隣接するエピトープは新生
鎖の大部分に存在しないようである。この問題はＮ末端
エピトープを認識する抗体の使用により、または終結を
ブロックするタンパク質合成インヒビターで処理した細
胞からポリソームをλ周製することにより回避される。 より重大な問題は成熟タンパク質が翻訳後修飾のために
新生鎖と異なることである。この問題は細胞表面タンパ
ク質に対して一層重大であり、それはシグナルペプチド
の除去、炭水化物（！’ｌｊ　鎖の付加およびジスルフ
ィド架橋の形成により一層広範に修飾される。多クロー
ン性抗血清をポリソーム免疫精製に使用すれば、新生鎖
と成熟タンパク質との間の抗原性の差異は、免疫処置中
にウサギまたは他の動物が天然タンパク質だけでなく、
殊にフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　）アジュバントが
使用されれば一部または完全変性形態もまたさらされる
ので全く重要でないことができる。これらの抗体が抗体
集団の小部分のみに相当するとしても、それらはなお新
生鎖に結合するほど十分に存在することができる。残念
ながら低数度タンパク質に対する多クローン性抗血清の
調製は非常に困難である単クローン性抗体はさらに免疫
処置のための抗原の精製に使用できるけれども、培養細
胞各グラムがしばしばマイクログラムの抗体を生ずるの
みである。これはマウスの若干の免疫に十分であるが１
匹のウサギにやっと十分である。 問題に対する他の解法は新生鎖中に存在する抗原決定基
を認識する単クローン性抗体を単クローン性抗体の調製
に使用する免疫原として変性ｐ９７抗原の使用により得
ることである。本発明の実施例において、ｐ９７のＮ末
端４ｏ、ｏｏｏドルトン分子量ドメイン上の３つの異な
るエピトープを認識する単クローン性抗体のパネルを利
用でき、その１つまたはそれ以上が新生鎖に結合するこ
とを望んで各界なる特異性を有する単クローン性抗体の
プールを用いた。選んだ抗体は、それぞれが放射性標識
した全細胞溶解物からｐ９７の単一バンドを免疫沈降し
、それらが高い結合アフィニティーを有した点でｐ９７
に非常に特異性であった。 クローニング計画のために、３エピトープのそれ、　　
ぞれに特異性である３つのＩｇＧ２ａ抗体を選択した。 一般に成功の機会は、異なるエピトープに対する多（の
抗体の使用により高めることができる。 単クローン性抗体を用いるとき、所与単クローン性抗体
または抗体の組合せが新生鎖を認識し、従ってポリソー
ム免疫精製における使用に適するかどうか予期できる理
由には疑問が残る。１つの方法は試験管内翻訳生成物が
プロセッシングされないで、新生鎖に類似するとの仮定
に頼り、単クローン性抗体が網赤血球溶解物系中で翻訳
された抗原を免疫沈降するか否かを決定することである
。 他の方法は小規模でポリソーム免疫沈降を行ない、次い
で試験管内翻訳を用いて問題のｍＲＮＡ種が’ｔＱ　ｋ
ｌされたかどうかを測定することである。 ポリソーム免疫精製技術を用いるときにｍＲＮＡ活性の
測定により精製をモニターすることが重要である。これ
はｍＲＮＡを網赤血球溶解物系中で關訳し、５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより翻訳生成物を分析することにより行なうこ
とができる。腫瘍関連抗原は少なすぎて非濃縮ｍＲＮＡ
の翻訳生成物の成分を何百もの一層豊富な種の間に認め
ないことができるけれども、それは濃縮ｍＲＮＡ試料か
ら誘導された翻訳生成物中で検出できるであろう。 あるいは鋭敏な免疫検定が翻訳されたｌ１ｆｆｉ瘍関連
抗原の検出に使用できれば、クセノブス（Ｘｅｎｏｐｕ
ｓ　）卵胞子翻訳系を用いることができる。ｐ９７に対
しては、ｐ９７の２つの異なるエピトープに特異性の２
つの単クローン性抗体を用いる高域受性二決定基免疫検
定（ＤＤＩＡ）をこの目的に使用した。 セファロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ　）に結合したタン
パク質Ａはポリソーム免疫検定に使用できる。タンパク
質Ａ吸着剤はこの手順において２つの適用を有する。初
めに粗服水液から単クローン性抗体を精製し、それによ
り汚染リボヌクレアーゼ活性を除去することである。次
にタンパク質Ａ吸着剤を精製抗体とともに用いて特定新
生ｔ３’ｉをもつポリソームを免疫精製する。 網赤血球溶解物系中のｍＲＮＡの翻訳は翻訳生成物の生
化学的確認並びにその純度の評価を可能にする。 （ｂｌオリゴヌクレオチドプローブ 本発明により腫瘍関連抗原例えばｐ９７をコードするｃ
ＤＮＡのクローニングに使用できる他の方法は抗原の部
分または完全アミノ酸配列を決定することおよびアミノ
酸配列から演鐸されるヌクレオチド配列に基くオリゴヌ
クレオチドプローブを合成することである。次いでオリ
ゴヌクレオチドをｃＤＮＡ合成用プライマーとしておよ
び生ずるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに対す
るプローブとして使用できる。従って、黒色腫関連ｐ９
７タンパク質は黒色腫瘍細胞の溶解物から特定車クロー
ン性抗体によるアフィニティークロマトグラフィーによ
り便宜に精製することができる〔ブラウン（Ｂｒｏｗｎ
　）ほか、１９８２　、Ｎａｔｕｒｅ。 Ｌｏｎｄｏｎ、２９６：１７１〜１７３〕、次いで決定
したアミノ酸配列の一部をコードするヌクレオチド配列
を合成し、それをプライマーおよび（または）プローブ
として使用できる。単一コトンまたは２コドンによりコ
ードされたアミノ酸残基を含むアミノ酸配列の部分はこ
の目的に最も適する。 １つの方法はヒト中の公知コドン利用頻度を基にした最
も確率性のコーディング配列を表わす長配列、典型的に
は２５〜６０ヌクレオチドを合成することである。アミ
ノ酸配列の異なる部分に基く２合成オリゴヌクレオチド
の使用は疑似陽性ハイブリッド形成シグナルの同定を可
能にすることによりスクリーニングを促進する。さらに
、ＤＮＡハイブリッドの融点に対するＧＣ含量の効果を
最小化するハイブリッド形成条件の使用もまたスクリー
ニングを促進する。部分ｃＤＮＡクローンがこの方法に
より得られれば、それをプローブとして全長ｃ　ＤＮＡ
クローンを得る補助に使用できる。 ｆｃ）　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ発現ライブラリー細菌中のｃ　
Ｄ　Ｎ　Ａ挿入物の発現に備えるクローニングベクター
が開発された。従って、腫瘍関連タンパク質例えばｐ９
７に対するｃＤＮＡクローンの取得に使用できる１つの
方法は前記オリゴ（Ｔ）−ヌクレオチドプライマーまた
は合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて前記のよ
うに黒色腫細胞から分離されたｍＲＮＡ　（濃縮または
非濃縮）を逆転写することによりｃＤＮＡライブラリー
を調製することおよび黒色腫関連ｐ９７タンパク質を指
向する単クローン性抗体でそのようなライブラリーをス
クリーンすることである。正しい配向において単クロー
ン性抗体により認識されたエピトープをコードし、枠を
読取るＤＮＡを含むクローンは黒色腫関連ｐ９７タンパ
ク質に関連するペプチドまたはタンパク質を発現し、ク
ローンにより発現されたタンパク質をニトロセルロース
フィルターに移し、フィルターを抗体とともにインキュ
ベートし、次に標識した抗免疫グロブリン試薬で展開す
ることにより同定することができる。 潜在的問題は、多くの場合にｃＤＮＡの一部のみが挿入
物中に含まれ、細菌が真核細胞がなすようにタンパク質
をプロセッシングしないので、細菌により発現されたタ
ンパク質を認、識しないことである。この問題は、シグ
ナルペプチドの除去、炭水化物側鎖の付加およびジスル
フィド架橋の形成により一層広範に修飾される腫瘍細胞
表面タンパク質に殊に鋭敏である。従って、変性抗原を
認識することが知られた単クローン性抗体を発生させ、
または精製抗原による免疫処置により多特異性抗血清を
調製することを必要とすることができる。 黒色腫関連ｐ９７抗原から誘導されたｃ　ＤＮＡ挿入物
を含むと思われる組換え体ウィルスまたはプラスミドが
同定された後、ｃＤＮＡ挿入物を、ｐ９７をコードする
ｃＤＮＡの全長をスパンするフルレングスクローンまた
はクローン群を同定するために追加のライブラリーのス
クリーニングに使用できる。クローン化ｃＤＮＡの本性
は配列分析およびｐ９７タンパク質の直接アミノ酸配列
分析により決定された演′ｆ１ＪＮ末端アミノ酸配列の
比較により決定することができる。 ！ｄｌゲノムのクローニング 次の方法は、天然タンパク質中にのみ存在し、新生鎖ま
たは細菌中に発現されたタンパク質中に存在しない抗原
決定基を指向する単クローン性抗体を用いるＤＮＡのク
ローニングを可能にする。 この目的にはヒト黒色腫細胞から誘導されたＤＮＡをマ
ウスｒ−ｍ胞中にトランスフェクションにより導入する
。次に黒色腫関連ｐ９７抗原を発現するマウス細胞を、
螢光活性化細胞選別器の使用により、またはｐ９７を指
向する放射性標識単クローン性抗体を用いてポリエステ
ル布フィルターに移したコロニーのレプリカ上の関連ペ
プチドを検出するｐ９７関連ペプチドを生ずるコロニー
の免疫同定により分離する。トランスフェクションの数
連続回が非関連ヒ）ＤＮＡ配列の除去に必要とすること
ができる。次いでゲノムライブラリーをλフアージヘツ
タ−中に調製し、大部分の遺伝子のイントロン中に生ず
るヒト反復配列を含むクローンをスクリーンする。ゲノ
ムクローンが同定された後、それをハイブリッド形成プ
ローブとして使用しｐ９７をコードするＤ　Ｎ　Ａを含
むｃＤＮＡを同定することができる。 （５，２）黒色腫関連ｐ９７抗原の抗原性フラグメント
の合成および免疫原性の評価 合成ペプチドは免疫原として多くの病原体に対しある程
度の防御を与えることができる天然タンパク質に対する
免疫応答の誘出に使用できる。そのようなペプチド配列
はタンパク質抗原の既知アミノ酸配列から、外部媒質に
さらされたタンパク質分子の表面上に存在すると思われ
るアミノ酸の伸１１′６を同定することにより選択され
る。これはアミノ酸に対して確立された水治法パラメー
ターを使用するアミノ酸配列のコンピューター分析によ
り最も普通に達成される。他の基卓、例えば予期二次構
造または可動性もまた用いることができる。 従って、黒色腫関連ｐ９７タンパク質の５〜５０アミノ
酸残基を含む合成ペプチドを実験ｖＪ物（通常マウスま
たはウサギ）中の免疫原性について試験することができ
る。そのような合成ペプチドは機能的に等しいアミノ酸
残基がサイレント変化で生ずる配列内の残基を置換した
改変配列および（または）修飾またはプロセッシングし
た配列例えばグリコジル化配列、ホスホリル化配列など
あるいは化学修飾配列を含め実質的に第３図に示される
アミノ酸配列のすべてまたは一部を含むが、しかしそれ
に限定されない。これらのｐ９７配列ペプチドは単独で
、または担体タンパク質例えばキーホール・リンペット
・ヘモシアニン（ＫＬＨ）と対にして使用される。どの
場合にも、アジュバントの使用は適宜であるけれども、
好ましい。免疫処置動物を追加免疫処置し、免疫処置ペ
プチドを指向する抗体について試験する。抗ペプチド抗
体を有するものを天然ｐ９７タンパク質を結合する抗体
について試験する。ｌ１ｆｆｉ瘍関連抗原例えばｐ９７
の場合に、細胞の免疫応答について、例えば遅延型過敏
症（Ｄ　Ｔ　Ｉ（）を調べることにより、試験管内の抗
原刺激増殖について、細胞溶解性Ｔ細胞について、また
は適当なモデル中の腫瘍拒絶について試験することもま
た関心深い。適当なモデルは、適当なｃＤＮＡ発現ヘク
ターによるトランスフェクションの結果としてヒト腫瘍
関連１’ｃ原を発現するマウス腫瘍である。 目標は黒色腫関連ｐ９７抗原を指向する激しい免疫応答
を誘出するペプチドを同定することである。同定後、こ
れらのペプチドを既知化学合成法により多量に生成させ
ることができる。あるいは同定したペプチドを、発現ベ
クター宿主細胞系中でそのようなペプチドをコードする
ヌクレオチド配列を発現させることにより多量に生成さ
せることができる。 （５，３）発現ヘククー宿主系によるｐ９７関連ペプチ
ドの生成 ヌクレオチドコーディング配列を適当な発現ベクター中
へ挿入することによりタンパク質およびペプチドを多量
に生成させることができ、それは次に細菌、酵母、昆虫
細胞および哺乳動物細胞を含みそれらに限定されない適
当な宿主細胞中へ導入される。細菌宿主は多くの利点を
有するけれども、それらは適切に多くの真核タンパク質
を有さず、またそれらは［［、関連タンパク質の発現に
対し真核細胞より多少適切でない。しかし、細菌中に生
じた組換え生成物は、応答がタンパク質抗原の初回分解
を必要どすると思われるのでＴ　細胞応答の導入に有用
であることができる。 ｐ９７関連ペプチドをベクター宿主系中に発現させるた
めに、黒色腫関連ｐ９７抗原またはそのタンパク質をコ
ードするヌクレオチド配列は適当に発現ベクター中へ導
入される。そのようなヌクレオチド配列は、配列内の１
つまたはより多くのコドンが同一または）ａ能的に等し
いアミノ酸残基をエンコードし、従って配列中に中性ま
たはサイレント変化を生ずるコドンにより置換された改
変配列を含めて実質上第３図に示されるｐ９７のＤＮＡ
配列のすべてまたは一部を含むが、しかしそれらに限定
されない。発現ベクターは挿入されたタンパク質をコー
ドする配列の転写および６羽訳に必要な要素を含む。こ
れらの要素はそれらの強さおよび特異性で異なる。用い
る宿主ベクター系により、多くの適当な転写および翻訳
要素の任意の１つを用いることができる。例えば咄乳動
物ｔ■胞系中でクローニングするときに哺乳動物細胞の
ゲノム（例えばマウスメタロヂオネインプロモーター）
から、またはこれらの細胞中で成長するつイルス（例え
ばワクシニアウィルス７．５にプロモーター）から分離
したプロモーターを用いることができる。組換えＤＮＡ
または合成法により生成されるプロモーターもまた使用
して挿入配列の転写に備えることができる。 特定開始シグナルもまた挿入タンパク質コーディング配
列の有効翻訳に必要である。これらのシグナルはＡＴＧ
開始コドンおよび隣接配列を含む。 遺伝子またはｃＤＮＡ配列を適当な発現ベクター中へ挿
入する場合に追加の翻訳制御シグナルを何ら必要としな
いことができる。しかし、コーディング配列の一部のみ
を挿入する場合にＡＴＧコドンを含む外因性翻訳制御シ
グナルを与えるべきであることができる。開始コドンは
さらにタンパク質コーディング配列の読取り枠に関する
相中にあり全挿入物の翻訳を保証しなければならない。 これらの外因翻訳制御配列および開始コドンは天然およ
び合成両方の種々の由来であることができる。 ベクター中へのＤＮＡフラグメントの挿入に対して当業
者に知られた任意の方法を用いて適当な転写および翻訳
ｉ１ｉ’Ｊ御シグナルおよびタンパク質コーディング配
列からなるキメラ遺伝子を含む発現ベクターを構築する
ことができる。これらの方法は試験管内組換えＤＮＡ技
術、合成技術および生体内組換え（遺伝子組換え）を含
むことができる。 発現ベクターは次のベクター：ワクシニアウィルス、ア
デノウィルス、昆虫ウィルス、酵母ベクター、バクテリ
オファージおよびプラスミドＤＮＡベクター、並びにそ
れらの誘導体を含むが、しかしそれらに限定されない。 細菌系中の遺伝子のクローニングおよび発現はよく知ら
れている。例えば大腸菌中でクローンするときに、その
バクテリオファージまたはプラスミドプロモーター例え
ばｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｒｅｃ　
Ａプロモーター、リポソームＲＮＡプロモーター、大腸
菌ファージλのＰＲおよびＰＬプロモーターおよび他の
１ａｃＵＶ５、ｔｒｐ　−１ａｃＵ　Ｖ　５　（ｔａｃ
　）ハイブリッドプロモーター、ｏｍｐＦ　Ｘｂｌａ　
、　ｌｐｐなどを含み、しかしそれらに限定されないも
のを用いて隣接ＤＮＡセグメントの高レベルの転写を指
向することができる。しかし、原核細胞と真核細胞との
間のプロセッシング差異のために、本発明のｐ９７関連
ペプチドを真核細胞中に発現させることか好ましいこと
ができる。真核細胞中にタンパク質を発現させる最もよ
く確立された方法は、（ａｌ遺伝子を薬物耐性遺伝子と
ともに細胞中へ導入し、次いで、好ましくはジヒドロ葉
酸レダクターゼ−メト１−レキセード系によるように増
幅を得る薬物による選択；（ｂ）プラスミドベクター中
のしばしばｐＩ３Ｒ３２２に基く強真核プロモーターお
よび他の調節配列を用いるｃＤＮＡの発現；　（Ｃ）　
ＬばしばＳＶ４０から誘導されるウィルスベクター中で
、また強プロモーター、この場合ＳＶ４０プロモーター
、を用いるｃＤＮへの発現、である。組換え体プラスミ
ドベクターは、しばしば長時間タンパク質を生ずる細胞
系統の生成に使用され、ＳＶ４０ベクターはしばしば過
渡発現を得るために使用される。哺乳動物細胞が最もし
ばしば宿主として使用されたけれども、昆虫細胞および
若干の場合に酵母細胞もまた適当であることができる。 若干は次により詳細に説明される。 黒色腫関連ｐ９７抗原を発現する組換え体ワクシニアウ
ィルスを構築するために、ｃ　ＤＮＡコーディング配列
をワクシニアウィルスの７．５にプロモーターに連結し
てキメラ遺伝子を形成することができる。このキメラ遺
伝子は、プラスミドＤＮＡベクター上に支持されるウィ
ルスチミジンキナーゼ遺伝子に相同の追加のワクシニア
ウィルス配列によりフランキングされる。キメラ遺伝子
の構築は腫瘍関連抗原配列の転写および翻訳のための天
然および合成シグナル両方の使用を含む。次いでキメラ
遺伝子は、プラスミドベクターおよびワクシニアウィル
スゲノムの両方上に存在する相同チミジンキナーゼ領域
間の生体内組換えによりワクシニアウィルス発現ベクタ
ー中へ導入される。キメラ遺伝子を含むこれらの組換え
体ウィルスは怒染宿主中のｐ９７関連ペプヂドの発現を
指向することができ、ワクチンの成分として使用できる
。 アデノウィルスを発現ベクターとして使用する場合に、
問題のＤ　Ｎ　Ａ配列をアデノウィルス転写／翻訳制御
複合体、例えば後期プロモーターおよび３分節リーダー
配列に連結させる。このキメラ遺伝子は次に試験管内ま
たは生体内組換えによりアデノウィルスゲノム中へ挿入
される。ウィルスのケリムの非必須領域（例えば領域Ｅ
１またはＥ３）中への挿入は、生育し、感染宿主中にｐ
９７関連ペプチドを発現できる組換えウィルスを生ずる
。 現在、承認され、軍人にワクチンとして使用される２種
のアデノウィルス（４型および７型）がある。それらは
挿入ＤＮＡ配列の発現にベクターとして使用される主候
補である。 ｐ９７関連ペプチドの発現に使用できた他の発現系は昆
虫系である。そのような系の１つにおいて、オートグラ
ファ・カリフォルニカ（八ｕ　ｔｏｇｒａｐｈａｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウィルス（Ａ　ｃ　Ｎ　
Ｐ　Ｖ）がベクターとして外来遺伝子の発現に使用され
る。 ウィルスはスボドブテラ・フルジペルダ（Ｓｐｏｄｏ−
ｐｔｅｒａ　ｆｒＢｉｐｅｒｄａ）細胞中で成長する。 問題のＤ　Ｎ　Ａ配列はウィルスの非必須領域（例えば
ポリヘトリン遺伝子）中ヘクローンすることができ、Ａ
ｃＮＰＶプロモーター（例えばポリへドリンプロモータ
ー）の制御下に置かれる。ＤＮＡ配列の良好な挿入はポ
リヘトリン遺伝子の不活性化および非閉鎖組換え体ウィ
ルス（すなわち、ポリヘトリン遺伝子をコードするタン
パク質コートのないウィルス）の生成を生ずる。これら
の組換え体ウィルスは次いで、挿入遺伝子を発現するス
ボドブテラ・フルジベルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆ
ｒｕｇｉｐｅｒｄａ）　ｆｌｌ胞の感染に使用される。 さらに挿入配列の発現の調節、または所望特定形態にキ
メラ遺伝子生成物を修飾またはプロセッシングする宿主
細胞株を選択することができる。 一定プロモーターからの発現は一定誘導物質（例えばメ
タロチオネインプロモーターに対し亜鉛およびカドミウ
ム）の存在下に高めることができる。 従って、遺伝子的に作られるタンパク質の発現を調節す
ることができる。これは、クローン化遺伝子のタンパク
質生成物が宿主細胞に対し致死性であれば重要である。 さらに、タンパク質生成物の修飾（例えばグリコジル化
、ホスホリル化など）およびプロセッシング（例えば開
裂）はタンパク質の構造および機能に対し重要である。 異なる重工細胞はタンパク質の翻訳後プロセッシングお
よび修飾に特有かつ特異的段溝を有する。適当な細胞系
または宿主系を選択して発現された外来タンパク質の正
しい修飾およびプロセッシングを保証することができる
。 ｐ９７　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを、メタロチオネインプロモー
ターを含むｐＢＲ３２２から？Ｆ　Ｒされた発現プラス
ミドベクターに連結した。シグナルペプチドおよび膜ア
ンカーを含むｐ９７の全コーディング配列がベクター中
へ挿入された。 （５，３，１）　　ｐ　９７　ｃＤＮＡ配列の複製およ
び発現指向可能な組換え体発現ヘクターの同 定 外来遺伝子挿入物を含む発現ベクターを３つの一般方法
；　（ａ）　Ｄ　Ｎ　Ａ　　Ｄ　Ｎ　Ａ　ハイブリッド
法、（ｂｌ標識遺伝子機能の存在または不在、および（
Ｃ）挿入配列の発現、により同定できる。第１の方法に
おいて、発現ベクター中へ挿入された外来遺伝子の存在
を外来遺伝子挿入物に相同である配列を含むプローブを
用いてＤＮＡ−Ｄ　Ｎ　Ａハイブリッド法により検出で
きる。第２の方法において、組換え体ベクター／宿主系
をベクター中の遺伝子の挿入により生じた一定「標識」
遺伝子機能（例えばチミジンキナーゼ活性、抗体耐性、
形質転換表現型など）の存在または不在に基いて同定し
、Ｕ　）Ｒすることができる。例えば、外来遺伝子かベ
クターの標識遺伝子配列内に挿入されれば、ＤＮＡ挿入
物を含む組換え体を標識遺伝子機能がないことにより同
定できる。第３の方法において、組換え体発現ベクター
は徂換え体により発現される外来遺伝子生成物の検定に
より同定することができる。 そのような検定は遺伝子生成物の物理的、免疫学的また
は機能的性質に基くことができる。 例えば、組換え体ワクシニアウィルスを本発明により溝
築するとき、ｐ９７コーデイング配列を含むキメラ遺伝
子をチミジンキナーゼ遺伝子中へ挿入し、それによりＴ
Ｋ−表現型を不活性化しウィルス上に与える。そのよう
なｍｌＡえ体は、Ｔ　Ｋ　’細胞に対し致死性であるが
ＴＫ−細胞に対しそうでないヌクレオシドアナログを５
−プロモーデオキシウリジンを含む培地中で成長する能
力により選択される。組換え体はさらに腫瘍関連タンパ
ク質に特異性のｃＤＮＡプローブを用いるＤＮＡ−ＤＮ
Ａハイブリッド法により同定される。ＴＫ−組換え体ウ
ィルスはプラーク精製により分離することができ、スト
ックが感染した培養細胞から調製される。組換え体ウィ
ルスはそのｐ９７関連ペプチドの合成を誘発する能力に
ついて試験することができる。この目的は、感染細胞を
放射性標識アミノ酸の存在下に成長させ、次いで溶解し
、感染放射性標識細胞のサブセル画分を、天然黒色腫関
連ｐ９７抗原を指向する抗体による免疫沈降により試験
する。免疫沈降生成物はＳ　Ｄ　Ｓ　−ＰＡＧＥにより
分割される。感染細胞はまた単クローン性抗体を用いる
免疫蛍光法により試験することができる。 プラスミドベクターをｌ・ランスフエクションにより導
入した細胞はＦＡＣ３分析により、またはポリエステル
布上の細胞コロニーのレプリカの結合検定により容易に
同定することができる。存在するｐ９７関連ペプチドの
量は定量ラジオイムノアッセイにより決定でき、そのサ
ブセルの局在は細胞分画によりおよび免疫蛍光顕微鏡法
により決定することができる。発現されたｐ９７関連ペ
プチドの構造は５ＤＳ−ＰＡＧＥにより、およびアミノ
酸配列分析により決定できる。 （５，３，２）発現ヘクター宿主系からのｐ９７関連ペ
プチドの精製 多くの腫瘍関連抗原例えばｐ９７は細胞表面糖タンパク
質であり、Ｎ末端シグナルペプチドおよびＣ末端アンカ
ーペプチドを含む〔デービス（Ｄａｖｉｓ）ほか、１９
８５、Ｊ、　門ｏ１．　Ｒｉｏｔ、、　１８１：１１１
〜１２１〕。適当なベクター中に発現されるとき、タン
パク質は細胞表面にトランスロケーションされることが
予期される。タンパク質の精製を促進するために、膜ア
ンカー領域をコードするＤＮＡ配列を欠失させ、成μｍ
タンパク質を培養基中へ放出させることが好ましいであ
ろう。 ｐ９７関連ペプチドは宿主細胞から界面活性剤溶菌し、
次に単クローン性抗体を用いるアフィニティークロマト
グラフィーにより精製することができる。銭形タンパク
質を培養基から精製すべきであれば、血清を含まない培
地を用い、次いで単クローン性抗体によるアフィニティ
ークロマトグラフィーを用いることが好ましい。抗原が
その抗体性を低下しまたはそれを変化させることなく抗
体吸着剤から溶離できることが重要である。これはｐｌ
＋の上下により、またはカオトロープの使用により達成
することができる。比較的温和な条件下に抗原を放出す
る単クローン性抗体を選択することが必要であろう。ア
フィニティー精製した抗原ばＩＴ　Ｐ　Ｌ　Ｃによりさ
らに精製することができる。 （５，４）ｐ９７関連ペプチドの免疫学的確認合成また
は組換え体抗原の抗腫瘍応答を誘出する能力は初めに実
験動物中で評価することがきる。 これはヒト黒色腫関連ｐ９７タンパク質を、適当な近交
系の実験動物種の細胞中に発現させるモデル系を構成す
ることにより行なわれる。次いで動物を本発明のｐ９７
関連ペプチドで種々のプロトコルにより免疫処置し、次
に黒色腫関連ｐ９７抗原を指向する抗体の発生について
、ｐ９７抗原に対する細胞媒介免疫例えば遅延型過敏症
についで、およびｐ９７抗原を発現する生育性同系腫瘍
細胞の攻撃を拒絶する能力について試験する。さらに、
細胞免疫の試験管内検定を行なってｐ９７関連ペプチド
に応答したリンパ球の増殖および免疫処置動物またはヒ
ト黒色腫患者のリンパ球のｐ９７抗原を発現する腫瘍細
胞を殺す能力を測定することができる。さらに、マウス
をマウスｐ９７で免疫処置することにより正常Ｍｉ繊織
中痕跡量で存在する抗原に対する免疫応答を誘発できる
程度を決定することができる。 非ヒト霊長類を用いて本発明のｐ９７関連ペプチドの安
全性を決定することができる。この目的のために動物を
ヒト癌患者に倫理的に適用できるプロトコルを用いて免
疫処置し、次いで前記のように試験することができるが
、しかし腫瘍移植実験は、近文系の使用を必要とするの
で容易ではない。免疫処置手順の安全性は免疫処置動物
の一般的健康（体重変化、熱、食欲、行’ｔｄＪなど）
に及ぼす免疫処置の影響および削験で病理学的変化を調
べることにより決定される。 最後に本発明のｐ９７関連ペプチドをヒト癌患者におい
て試験することができる。進行癌患者において初期相Ｉ
試験し、毒性のないことを決定した後、寛解中の、しか
し高い再発可能性のある癌患者に試験することができた
。それらの免疫応答は、決定された患者または再発頻度
に対する治療効果が試験されることを除いて非ヒト霊長
類に対して記載したように評価されよう。黒色腫抗原ｐ
９７の場合に抗原を発現する良性母斑（奇胎）もまた試
験される。 （５，５）ワクチンの配合 発明のこの態様の目的は、合成または組換えＤＮＡ技術
により、免疫原およびワクチンとして疾患再発のおそれ
の高い癌患者の保護に、確定疾、憑の治療に、および結
局は高危険個体の予防的な接種に使用できる合成ペプチ
ド、精製タンパク質または組換え体ウィルスを製造する
ことである。 実際に、合成および組換え体黒色腫関連ｐ９７抗原は他
の免疫原と組合せて使用して黒色腫および他の癌の予防
に対する多価ワクチンを製造することができる。種々の
ワクチン配合物の例は次に論議される。 （５，５，１）ウィルスワクチン配合物本発明のｐ９７
関連ペプチドが組換え体ウィルスにより生成されると、
止組換え体ウィルスワクチンまたは不活性Ｍｉ換え体ウ
ィルスワクチンを配合することができる。その選択はｐ
９７関連ペプチドの発現に用いた組換え体ウィルスの性
質による。Ｍｉ換え体ウィルスが免疫処置される受容者
に対し感染性であるが、しかし疾５屯を生じない場合に
、生ワクチンを受容者中の増殖が同種かつ天然の潜伏性
感染を生ずる大きさの長期刺激を生じ、従って実質的に
長期継続免疫を与えるので好ましい。感染性組換え体ウ
ィルスは受容者中へ導入された後、そのキメラ遺伝子か
らｐ９７関連ペプチドを発現し、それにより免疫応答を
刺激することができる。止組換え体ウィルスそのものを
黒色腫に対する予防ワクチンとして使用することができ
る。これらの配合物中に用いるそのようなＭｉ換え体ウ
ィルスの製造には試験管内（例えばＭｉ織培養細胞）お
よび生体内（例えば天然宿主動物例えばウシ）系の両方
が含まれることができる。痘疹ワクチンの調製および配
合に対する普通の方法が止組換え体ウィルスワクチンの
配合に適用することができる。 多価生ウィルスワクチンは種々の腫瘍または癌細胞の種
々の抗原を発現する単一または数感染性組換え体ウィル
スから製造することができる。例えば、ワクシニアウィ
ルス（外来ＤＮＡ約３５キロベースを収容することがで
きる）を組立て、他のエピトープに対するコーディング
配合を含ませることができ：そのような組換え体ウィル
ス自体を多価ワクチン中の免疫原として使用することが
できる。あるいは、それぞれ異なるエピ１−−プをコー
ドする種々の遺伝子の発現を指向できるワタシニアの混
合物および（またＣま）他のウィルスを多価ワクチンに
配合することができる。 組換え体ウィルスが免疫処置される受容者に対し感染性
であってもなくても、不活性化ワクチン配合物を製造す
ることができる。不活性化ワクチンは、それらの感染性
が通常ホルムアルデヒド処理により破壊されている意味
で「死」である。理想的εこは、ウィルスの感染性がウ
ィルスの免疫原を支持するキャプシドまたはエンヘロー
ブク〉′バク質に影響を及ぼさないで破壊される。不活
性化ワクチンを製造するため、必要量の関連抗原を与え
るために多量の組換え体ウィルスを培養中に成長させね
ばならない。異なるエピトープを発現する不活性化ウィ
ルスの混合物を「多価」ワクチンの配合に用いることが
できる。若干の場合には、これは−緒に投与される生ウ
ィルスの＋１１互干渉による潜在的困難のために生ワク
チン配合物に好ましいかもしれない。どの場合にも、不
活性化組換え体ウィルスまたはウィルスの混合物は、そ
れらの抗原に対する免疫応答を高めるために適当なアジ
ハントとρ己合すべきである。適当なアジュハントには
鉱物ゲル例えば水酸化アルミニウム；界面活性物質例え
ばリソレシチン、プルロニックポリオール；ポリアニオ
ン；ペプチド及び油孔濁液が含まれるが、しかしそれら
に限定されない。 多くの方法を用いて前記ワクチン配合物を与太すること
ができ；これらには皮肉、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮
下及び鼻腔内径路が含まれるが、しかしそれらに限定さ
れない。止組換え体ウィルスワクチン配合物を用いると
き、それを、組換え体ウィルスをワクチン配合物になす
のに用いた親竹性型ウィルスの自然感染経路により導入
することができる。 （５，５，２）サブユニットワクチン配合物ウィルスワ
クチンの代りに、ｐ９７関連ペプチド自体を免疫原とし
てサブユニットワクチン配合物中に用いることができる
。サブユニットワクチンは華に受容者の免疫処置に必要
な関連免疫原物質を含む。従って、ペプチドを発現する
組換え体からｐ９７関連ペプチドを精製することができ
る。 そのような組換え体には前記ウィルス感染培養細胞、ａ
ｔ苗形質転換体、または酵母形質転換体のいずれも含ま
れる。本発明の他の態様において、ｐ９７関連ペプチド
またはタンパク譬を化学的に合成することができる。 ｐ９７関連ペプチドが組換え体から精製されてもまたは
化合物に合成されても、最終生成物を適当な濃度に調製
し、適当なワクチンアジュバントと配合し、使用のため
パッケージすることができる。適当なアジュバントには
：鉱物ゲル例えば水酸化アルミニウム：界面活性物質例
えばリソレシチン；プルロニックポリオール、；ポリア
ニオン；ペプチド；及び油孔濁液が含まれるが、しかし
それらに限定されない。ｐ９７関連ペプチドはまたリポ
ソーム中へ混合し、あるいは多糖および（または）ワク
チン配合物中に使用する他の重合体中へ混合することが
できる。 ｐ９７関連ペプチドがハプテン、すなわち同族抗体と選
択的に反応できる点で抗原性であるが、しかし免疫応答
を誘出できない点で免疫原でない分子、である場合に、
ハプテンを担体または免疫原分子に共有結合させること
ができ、ハプテン−担体をワクチンとして用いるために
配合することができ、例えば大タンパク質例えばタンパ
ク質血清アルブミンはそれに結合したハプテンに免疫原
性を与えろ。 （し）実施ｔ）Ｉｆ　：　１１．’：色腫ＥＪ１迎ｒ＋
９７抗原下記実施（３１＋　１こおいて、ｐ９７ｍＲＮ
Ａの種々の１１頁Ｊ戊力・ら；六）、すしたｃ　Ｄ　Ｎ
　Ａりじ１−ンを１妾合し、ｐ９７に関連するペプチド
を発現させる発現ベクター中へ挿入した。発現ヘクター
宿主細胞により生成されたｐ９７関連ペプチドをワクチ
ンに配合するごとができる。 （６，１）　　ｐ９７ｍＲＮＡの積装 ポリソームをＳＫ−ＭＥＬ２８黒色腫細胞〔カーレー（
（：ａｒｅｙ）ほか、１９７６　、Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ
、Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、、　１ｊｓＡ、７３　：　３２７０〜３２８２
）からマグ矛ンウＪ、沈降により調製した。この調製物
からｐ　９７　’ｌｆｒ生鎖をもつポリソームを、ｐ９
７の異なろエピＩ・−プに′１ν異性の３つのＩ　ｇ　
Ｇ　２　ａ単りローン性１ノ”０体（９６，５，１１８
，１，１３３，２＞Ｃブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ほか、１
９８０、Ｊ　、　ｌ１ｉｏ１．　Ｃｈａｍ、。 ２５５　：　４９８０〜４９８３　；ブラウン（Ｂｒｏ
ｗｎ）ほか、１９８１、Ｊ、　Ｊｍｍｕｎｏｌ、、　　
１２７　：　５３９〜５４６：ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）
ほか、１９８１、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、、ＵＳＡ、　７　８　　；　　５３９〜５４　３　
；プローマン（Ｐｌｏｗｍａｎ）ほか、１９８３、Ｎａ
Ｌｕｒｃ。 Ｌｏｎｄｏｎ、　　３０３　：　７０〜７２〕とのイン
キュベーション、次いでプロティンへ七ファロース上の
アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。 ｐ９７ン農縮ｍＲＮＡをＥＤＴＡを用いて）容ス１［シ
、オリゴ（Ｔ）−セルロース〔ヘセスダ・リサーチ・ラ
ボラトリーズ（ＢｅＬｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
Ｌａｂｓ、。 １１ｅ　ｔｈｅｓｄａ　、　ＭＤ）製〕上のアフィニテ
ィークｌ：］’？ｌ−グラフィーにより精製した。典型
的な試験において、１５０Ｅｚ６ｏ単位のポリソームが
ｐ９１？ｊｌ宿ｍＲＮＡ２６０ｎｇを生じ、それは全ｍ
　ＲＮ　Ａの０．２３％に相当する。クセノプス卯母細
胞中で耐１訳し、記載されたようにｐ９７について険定
〔ブラウン（［ｌｒｏｗｎ）ほか、１９８１　、Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ。 八ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　　７８　：　５３９〜５
４３　：フ′ローマ７　（Ｐｌｏｉｎｍａｎ）ほか、１
９８３　、Ｎａｔｕｒｅ、　Ｌｏｎｄｏｎ。 ３０３ニア０〜７２〕するとｐ９’Ｈ５縮ｍＲＮＡが８
００ｐｇのｐ９７毎ｍＲＮＡｎｇを生じたが、ｐ９７非
？；縮ｍＲＮＡは０．４４ｐｇのｐ９７毎ｍＲＮＡｎｇ
を生じ、ｐ９７ｍＲＮＡ活性が１８０倍高められたこと
を示した。ｐ　９７ｍＲＮＡ活性の収率は４２％であっ
た。網赤血球溶解物系〔ペルハムはか（Ｐｅｌｈａｍ　
＆　Ｊａｃｋｓｏｎ）　、ｉ　９７６、Ｅｕｒ、　Ｊ。 Ｂｉｏｃｈｃｍ、、　　６７　：　２４７〜２５６］中
の翻訳はｐ９ＨＷ縮ｍＲＮＡが５ＤＳ−ＰＡＧＥにより
分析して８４．０００ドルトンの見掛は分子量を有する
主ポリペプチドをコードしたことを示し、それは非？Ｗ
１１ｍＲＮＡの翻訳生成物中に検出できず、ｐ９７に特
異性の抗血清により免疫沈降させた（第１図）。これは
ｐ９７の非グリコジル化前駆物質であると結論された。 （６，２）ｃＤＮＡクローンの調製および構築下記２法
を用いて、分離したｍ　ＲＮ鋳型から転写されるｃＤＮ
Ａクローンを構築した。 （６，２，１）オリゴ（Ｔ）によりブライ１、されたｃ
　Ｄ　Ｎ　Ａクローンの構築 上に調製されたｐ　９７　’Ｉｎ縮ｍＲＮＡをオリゴ（
Ｔ）プライムｃ　ＤＮＡ合成に対する鋳型として用いた
。ｃ　ＤＮＡは次のようにｐＢＲ３２２中でクローンし
た：第１鎖ｃＤＮＡ合成のためにｐ９７濃縮ｍＲＮＡ、
４つのｄＮＴＰおよびオリゴ（Ｔ）〔コラボラティブ・
リサーチ（ＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＲｅｓｅａｒｃ
ｈ、Ｗａｌｔｈｍａ、ＭＡ）製〕を逆転写酵素〔モレキ
ュラー・シネティック・リゾ−セス（Ｍｏ　１ｅｃｕ　
ｌ　ａ　ｒＧｅｎｅｔｉｃ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅｓ）製〕
とともにインキュへ−１・した。第２鎖は大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼ〔ヘセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（
Ｂｅ　ｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌｔｄｓ、Ｂｅ
ｔｈｅｓｄａ、ＭＯ）製〕の大フラグメントとのインキ
ュベーションにより合成し、二重鎖ｃＤＮＡをＳ■ヌク
レアーゼ〔ザ・フィード・ハソチンセン・カンサー・リ
サーチ・センター（Ｔｈｅ　Ｆｅｅｄ　Ｈｕｔｃｈｉｎ
ｓｅｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅ
ｒ。 ５ｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）のダーナム（Ｄ、Ｄｕｒｎａｍ
）寄Ｑｉ　）で）′白化した。次いでｃＤＮＡを末端デ
オキシヌクレオチジルトランスフエラーゼＣヘセスダ・
リナーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ、。 １１ｅＬｈｅｓｄａ、　ＭＤ）製〕でｄＣテーリングし
、ＰｓｔＩン肖化ｄ白化−ルｐＢＲ３２２（ベセスダ・
リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ、。 Ｂｅ　ｔｈｅｓｄａ　、　ＭＤ）製〕とともにアニーリ
ングし〔ビラーコマロフ（シｉ１１ａ−Ｋｏｍａｒｏｆ
ｆ）ほか、１９７８Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、ＵＳＡ、７　５　　：　　３　７　２　７　〜３
７３１）　　、Ｃａ（Ｊ！２処理大腸菌ＲＲＩの形質転
換に用いた。 形質転換細菌のコロニーからのＤＮＡを紙に結合させ〔
タウブ・アンド・トンプソン（Ｔａｕｂ　＆Ｔｈｏｍｐ
ｓｏｎ）、　１９８２．７ナリテイカル・バイオケミス
トリー　（八ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、　　１２６
　：　２２２〜２３０）　、ｒ）　９　ＨＨｔｌおよび
非）農縮ｍ　ＲＮ　Ａ鋳型上に合成したｃ　ＤＮＡプロ
ーブによる差次ハイプリント法によりスクリーンした。 ２４３塩基対（ｂｐ）クローン、ｐ　９７　３ａ２ｆｌ
、が同定され、それはｐ９７濃ｊｉｌ　ＣＤ　Ｎ　Ａに
ハイブリッド形成したが、非濃縮ＣＤ　Ｎ　Ａに対し検
定可能にハイブリッド形成せず、またハイブリッド選）
尺６１Ｊ　＋ｓ尺試駐においてｆ）９７ｍＲＮＤを選１
尺した。 ポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡ）およびポリ　（
Ａ）トラクトはｃＤＮＡの３′に存在した（第２図参照
）。ニックトランスレートしたｐ９７−３ａ２ｆｌは非
濃縮黒色腫ｍＲＮＡより１００倍も強＜ｐ９７？Ｈ縮ｍ
ＲＮＡにハイブリッド形成し、繊維芽細胞ｍＲＮＡに対
し検出可能に形成しなかった。プローブとしてクローン
化ｃＤＮＡによるノザンブロソト分析は約４キロヘース
（ｋｂ　）のｒｎ　ＲＮ　Ａを同定し、それはｓＫ−Ｍ
ｇＬ２ｓ黒色腫中黒色在中たが、繊維芽細胞に存在しな
かった。 （６，２，２）　ｐ　９７のゲノムクローニングおよび
ｃＤＮＡ合成のプライムに対する合成 オリゴヌクレオチドの使用 ポリアデニル化部位からｌｋｂ以上延びるｃＤＮ〆へク
ローンを得る試みは、おそら（長い二次構造を有する裔
ＣＣ含量（８０％以上）の領域のためＣ二不成功であっ
た。ゲノムクローニングを用いてこの問題を回避した。 ４重複ゲノムクローンを、′１１１定ｐ９７制限フラグ
メントを濃縮した１ナイズ分画ＳＫ−ＭＥＬ　２８　Ｄ
ＮＡを含むλＬ　４７．１のライブラリーから分離した
。この４ゲノムクローンは２８ｋｂをスパンし、遺伝子
の調節領域を含めてｐ９７の全コーディング領域を含む
。５′から３′まで逐次配列したゲノムクローンは：λ
Ｂ１５、λ■］１７、λＢ６．６およびλＢ７．７、で
ある。命名法はフラグメントの発生に用いた制限酵素を
示す文字およびλＬ　４７．１中ヘクローンしたフラグ
メントのキロヘース大きさを示す数字からなる。 従って、５′末端から出発してλクローンＢ１５はｌ　
５ｋｂＢａｌＩＩＨＩ　ｐ　９７フラグメントを含み、
λクローン■］１７は１７ｋｂＨ４ｎｄ　ＩＩＩ　ｐ９
７フラグメントを含み、λクローンＢ６．６は６．６　
ｋｂ　ＨａｍＨＩ　ｐ　’］　７フラグメントを含み；
λクローンＥ７．７は７．７ｋｂ　Ｅｃｏ　Ｒ１ｐ９７
フラグメントを含む（第２Ａ図参照）。ノザンブロノト
で４ｋｂｐ９７ｍＲＮＡに対しハイブリッド形成したク
ローンの制限フラグメントが配列され、ｐ９７エキソン
を予期コーディング配列とヒトおよびニワトリトランス
フェリンのアミン酸配列との間のコンピュータ補助相同
調査により同定した〔ヤング（Ｙａｎｇ）ほか、１９８
４　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　ｔｌｓＡ。 ８１：２７５２〜２７５６　ｉマギリブレイ（ＭｃＧｉ
ｌｌｉｖａｒｙ）ほか、１９８２、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、１ＪＳＡ、７９　：　２５０４〜２５０８　；
ジェ’７シユ・アンド・チャンポン（Ｊｅｔｓｃｈ　＆
　Ｃｈａｍｂｏｎ）、１９８２、ＩＥｕｒ、　Ｊ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、＋　　１２２　：　２９１〜２９５〕。 ３合成オリゴヌクレオチド、ｐ９７ゲノムエキソン配列
を基にした配列、をＳＫ−ＭＥＬ２８ｍＲＮＡ上のｃＤ
ＮＡ合成のプライムに用い、生じたｃＤＮＡを次のよう
にλ−ｇｔｌｏ中ヘクローンさせた：ｐ９７ｃＤＮＡを
ｄＧテーリングし、架橋剤オリゴヌクレオチド（ＡＡＴ
ＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ）およびＥｃｏＲＩで制限
したλ−ｇｔ１０で連結した。架橋剤オリゴヌクレオチ
ドはλ−ｇ　ｔ　１０のＥｃｏＲＩ部位中へのｄＧテー
ルｃ　ＤＮＡ配列の挿入および連結を可能にした。λフ
ァージをパッケージし〔グロスベルド（Ｇｒｏｓｖｅｌ
ｄ）ほか、１９８１、ジーン（Ｇｅｎｅ）　　１３　：
　２２７〜２３７）、大腸菌Ｃ６゜。ｒＫ−ｍＫ″ｈｆ
ｌ上で平板培養した。λ−ｇｔｌｏ中のｃ　ＤＮＡライ
ブラリーをプラークハイブリッド法〔ヘントン・アンド
・デービス（Ｂｅｎｔｏｎ　＆　Ｄａｖｉｓ）　　１９
７７．５ｃｉｅｎｃｅ、　１９　Ｇ　：１８０〕により
ゲノムエキソンフラグメントをプローブとしてｐ９７挿
入物についてスクリーンした。プローブはｆｆ２Ｐ−Ｔ
ＴＰ　にニュー・イングラン＋；−ニュークリア（ＮＥ
Ｗ　ＩＥｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）製、３２００
ｃｉ／ミリモル〕でニックトランスレーションによ）ｔ
）５〜１ｏｘｌＯ１ｌ　ｃｐｍ／ｐｇの比活性に放射性
標識した。ｐ　９７ｍＲＮＡの２．３６８ヌクレオチド
をスパンし、全コーディング領域を含む３重？１ｃ　Ｄ
　ＮΔクローン（Ｌｏａｆ、ｌ　Ｊ　ｌ、２ｆ１）を、
プローブとしてｐ９７エキソン特異性フラグメントを使
用することにより同定した（第２図）。 （６，３）ｐ９７のＤＮＡ配列分析 ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ挿入物を切り出し、次の増殖および制限
マツピングのために大腸菌中のプラスミドヘクタ−ｐＥ
ＭＩ３Ｌ１８＋（プント（Ｄｅｎ　ｔｅ）ほか、１９８
３、ニュークリック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　、１１　：　１６４５
〜１６５５）中へサブクローンした。ｃ　ＤＮＡはまた
Ｍ１３ｍｐ１８ファージクローニングベクター〔ヤニソ
シューペロン（Ｙａｎｉｓｈ　−Ｐｅｒｒｏｎｅ）ほか
、１９８５、Ｇｅｎｅ、　　３３　：　１０３〜１１９
）中へサブクローンし、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）のジ
デオキシ法〔サンガー　（Ｓａｎｇｅｒ）ほか、１９７
７　、Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、八ｃａｄ　。 Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７４　：　５４６３〜５４６７）を
用いて配列した。大挿入物を含むＭ１３クローンをＤＮ
Ａ５ｅｌ（ホンダ（！ｌｏｎｇ）　、１９８２、Ｊ、Ｍ
ｏｌ。 Ｂｉｏｌ、、　１５８　：　５３９〜５４９）またはエ
キソヌクレアーゼ■〔ヘニコフ（Ｉｌｅｎｉｋｏｆｆ）
　、１９８４、Ｇｅｎｅ、　　２８　：　３５１〜３５
９）を用いる欠失発生により、および合成２１ｍｅｒオ
リゴヌクレオチドプライマーの使用により配列した。 ｐ９７ｃＤＮＡ配列は第３図に示される。２．２１４ヌ
クレオチドの読取り枠は第１　ＡＴＣから伸び、その付
近の配列は位置２，２１５におけるＴＧ八に対してコザ
クにより決定された開始配列に一致するＣコザク　（Ｋ
ｏｚａｋ）　１９８０　、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
Ｒｅｓ、、　　８　：　ｌ　２７〜１４２）　、大部分
の５　’　ｃＤＮＡクローンは開始ＡＴＧの上流にさら
に６０ヌクレオチドを含む。ｐ９７ｍＲＮＡの３′非コ
ーデイング領域はｃＤＮＡクローンとして得られず、Ｌ
　６６７ヌクレオチドを含む単ゲノムエキソンと同定さ
れた。予期アミノ酸配列の残基２０〜３２はｐ９７の既
知Ｎ末端アミノ酸配列に一致し〔ブラウン（Ｂｒｏｗｎ
）ほか、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ、Ｌｏｎｄｏｎ。 ２９６：１７１〜１７３〕、クローン化ｃＤＮＡの本性
を与える。さらに、前駆物質の予期分子量は８０，１９
６ドルトンであり、試験管内翻訳生成物の観測分子量と
よく一敗する。 （６，４）ｐ９７コーデイング配列を含む組換え体発現
プラスミドの構築 大サイズのｐ９７ｉｆｔ伝子は逆転写酵素による黒色腫
ｍＲＮＡの特異的ブライミングにより得られたｃＤＮＡ
クローンとの接合を必要とした。シグナルペプチドから
膜アンカー配列までのコーディング領域を含む３つのｃ
ＤＮＡＡｇ　ｔ　１０　（１０ａ１、ｌｊｌおよび１ｆ
１；第２図参照）を用いた。クローン１０ａ１のｐ９７
挿入物はＥｃｏＲＩで消化することにより切り出し、ｃ
ＤＮＡｌｏａｌの５′端におけるオリゴ（ｄＣ，）配列
はエキソヌクレアーゼ■による消化により除去し、ｐ９
７ブレプロテインの開始メヂオニから３０ｂｐ上流にＨ
ｉｎｄｌ１部位を有するクローン１０ａｌｂを生成させ
た。３ｃＤＮＡクローン１０ａｌｂ、ｌ　ｊｌおよび２
ｆｌのｐ９７挿入物およびゲノムクローンＥ７．７をＰ
ｖｕＩ［，５ｓＬＩおよびＥ　ｃｏＲｌ１ｌｉｌｌ限酵
素部位で接合し、第２図に示すようにプラスミドベクタ
ーｐＥＭＢＬＩ８＋（プント（Ｄｅｎ　ｔｅ）ほか、１
９８３、Ｎｕｃ、Ａｃｒｄ　Ｒｅｓ、、　Ｉ　ｌ　：　
１６４５〜ｌ６５５）のｌ１ｉｎｄ　Ｕｌ　−ＥｃｏＲ
Ｉ部位に接人した。最終構築物ｐ９７ｂはプラスミツド
ベクターｐＥＭＢＬ、１８＋中に４．．１　ｋ　ｂのｐ
９７挿入物を含み、それを大腸菌Ｉ−ＩＢＩＯＩの形質
転換に用いた。ｐ９７ｂ中の挿入物は、５　’　ｌ１ｉ
ｎｄＩ［１部位および３　’　ＥｃｏＲ１部位により結
合された３０ｂｐのｐ　９７ｍＲＮＡの５′非翻訳領域
、全コーディング配列および３′非翻訳領域を含む。 ４．４キロベースのｐ９７挿入物をｐ　９７ｂから旧ｎ
ｄｌＴＩおよびＥｃｏＲＩで切り出し、端を大腸菌ＤＮ
Ａポリメラーゼのフレノウフラグメントを用いて充たし
た。プラント末端フラグメントを、ドクター・リチャー
ド・パルミター（Ｄｒ、Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｐａ１ｍ１ｔ
ｅｒ。 Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、
　５ｅａｔｔｌｅ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）から入手
した真核ｃＤＮＡ発現ベクター１９９５゜１２ｐＵｃ１
３、ベクターｍＴ　ｈＧＩ（−１１２の誘４ｉ３体〔パ
ルミター（Ｐａｌｍｉ　ｔａｒ）ほか、１９８３．５ｃ
ｉｅｎｃｅ、２２２　：　８０９〜１４）中の特有Ｓ　
ｍａｒ部位中へ挿入した。このベクターは真核細胞中に
外来遺伝子を発現するためにマウスメタロチオネインプ
ロモーターを用いる。正しい配向におけるｐ９７挿入物
を有する構築物は制限分析により固定し、ｐＭＴｐ９７
ｂと称した。 ｋｆｌ　ＩＡえ体プラスミドはＬ　Ｍ　Ｔ　Ｋ−細胞中
へ形質転換し、トランスフェクション体をＨＡ　Ｔ　１
９地中の成長により選定した。トランスフェクション皿
からとったクローンを９６ウエルマイクロテストプレー
ト中に広げ、スペント培養基およびレプリカ平板からの
細胞溶解物を２座イミノラジオメトリー検定により検定
した。ザブクローンを広げ再試験した。毎細胞約４，０
００，０００分子のｐ９７を発現するクローンＴＫＭｐ
９７−１２を成長させ、カドミウムで誘発させ、免疫処
置に対するｐ９７源として用いた。 （６，５）ｐ９７関連ペプチドによるマウスの免疫処置 ＴＫＭｐ９７−１２細胞を成長させ、カドミウムで誘発
させ、（１４，４ｇ）を氷上で１０分間７０＋ｎｊ！Ｔ
ＮＥＮ　（２０ｍＭ　）リス（Ｔｒｉｓ）　　−１１Ｃ
ｅ　、　ｐＨ８，Ｏｌｌ　００　ｍＭ−１１ａｃｊ２、
ｌ　ｍ　Ｍ−ＥＤＴ八、０．５％ＮＰ−４０１とともに
インキュベートすることにより熔解させた。溶解物を２
００、ＯＯＯＸｇで４５分間、４°Ｃで超遠心し、溶解
物の半分をｐ９７に特異性の１ｍ１２イムノアフイニテ
イーカラム（セファロースに結合した抗体９６．５のＦ
ａｂフラグメンＩ−）に通した。免疫吸着剤を広範囲に
、初めにＴＩＩＥＮ、最後に２０ｍ　Ｍ　トリス−ＨＣ
Ｊ　、　ｐｌ＋　６．８で洗浄した。 上記のように調製した吸着イムノアフィニティーカラム
０．５ｎ＋ｊ！を２０ｍＭトリスＨＣＮ　、　ｐｌ＋６
．８．０．５ｍｉ！と混合し、完全フロインドアジュバ
ント１ｍｊ２で乳化させた。４　Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　
ｃマウスそれぞれに乳濁液０．５ｍｊ２を腹腔内に与え
た。３週後にマウスにこの里の１／４の、不完全フロイ
ンドアジュバント中の抗原で追加抗原刺激した。対照マ
ウスはｐ９７に関連せず、それ以外は同様に処理した抗
体のイムノアフイニティ力ラムで免疫処置した。ｐ９７
免疫処置マウス４匹および対照マウス２匹を追加免疫刺
激１週後に採血した。血ｔＲを放射性ヨウ素化ＳＫ−Ｍ
ＥＬ黒色腫細胞からの免疫沈降、次に５ＤＳ−ＰＡＧＥ
によりｐ９７に対する抗体について試験した。結果は４
匹のｐ９７免疫処置マウスからの血清はｐ９７を免疫沈
降したが、対照血清は陰性であったことを示した。血清
はまた、グルタルアルデヒド固定化Ｓ　Ｋ　−ＭＥＬ２
８黒色腫細胞（２０，０００細胞毎マイクロテストウエ
ル）上のＥＬＩＳＡ検定を用いてｐ９７を指向する抗体
の存在について試験した。固定した細胞は１／１０，０
００希釈血清０．０５ｍｊｌ！とともに室温で１時間イ
ンキュベートし、洗浄し、次いでホースラディツシュ（
ｈｏｒｓｅｒａｄ　１ｓｈ）ペルオキシダーゼ接合ヤギ
抗マウスＩｇＧ（サザン・バイオチク（Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）製）０．０５１１ｊ！とともに室
温で１時間インキュベートした。ｐ９７免疫処置マウス
からの血清の光学濃度（４９０ｎｍにおける読み）は０
．３５０．０．２４３．０．３４３．０、２００であっ
たが、対照からの血清の光学密度は０．０３６および０
．０５７であった。 （６，６）ｐ９７の確認 （６，６，１）　ｐ　９７の構造 ｐ９７の構造を４構造ドメインを含むｐ９７前駆物質の
アミノ酸配列から決定した。前駆物質配列の残基２０が
成熟ｐ９７のＮ末端に＋Ｈ当するので、アミノ酸残基Ｉ
〜１９はおそらくシグナルペプチドを構成し、その結論
はその長さおよび疎水性により支持される。アミノ酸２
０〜３６１および３６２〜７１３は２つの３４２および
３５２アミノ酸の相同ドメインを含む。可能なＮ連結グ
リコジル化部位はＮ末端ドメイン中の位置３８および１
３５並びにＣ末端ドメイン中の位置５１５に生ずる。最
後にアミノ酸７１４〜７３８は主に未変化で疎水性の残
基の領域、細胞膜中のアンカーｐ９７であり〔デービス
（Ｄａｖｉｓ）ほか、１９８５、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ
、、　１８１　：　１１１〜１２１）　、細胞質中へ伸
びることができると思われる。 ｐ９７のドメイン構造はプロテアーゼ消化試験により支
持される。ｐ９７のトリプシン、パパインによる〔ブラ
ウン（Ｂｒｏｗｎ）ほか、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）１
２７　：　５３９〜５４６〕またはトロンビンによる消
化は分子ｌ杓４０，０００ドルトンのグリコジル化抗原
フラグメン１〜を生じた。フラグメントは３″Ｓ−メチ
オニンまたは２５ｓ−システィンで代謝的に標識したｐ
９７のトロンビン消化から１１′？製し、と記のように
配列決定された〔ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ほか、Ｉ　９
８２　、Ｎａｔｕｒｅ　Ｌｏｎｄｏｎ、　２９６　：　
１７１〜１７３〕。システィン残基は位置７および・１
７に、メチオンニン残基は位置２および２０に同定され
た。同様の結果はインタクトｐ９７で得られ、ｃＤＮＡ
配列から予期されるｐ９７のＮ末端配列と完全に一致す
る。４０．０００ドルトン分子■のプロテアーゼ耐性フ
ラグメントがｐ９７のＮｉ端トドメイン相当すると結論
される。ｐ９７のＣ末端ドメインは、おそらくそれがプ
ロテアーゼ感受性であるので分離できなかった。 （６，６，２）　ｐ　９７とトランスフェリンとの用同
性プロティン・アイデンティフィケーション・リゾ（Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｒｅ５
ｏｕｒｃｅ）　（レリース５．０；ディホフ（Ｄａｙｈ
ｏｆｆ）ぽか、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ、　Ｌｏｎｄｏ
ｎ、　　２９０　：　８　）のアミノ酸配列ライブラリ
ーの調査はｐ９７がトランスフェリンの上材３成員：ヒ
ト血清トランスフェリン、ヒトラクトトランスフェリン
およびニワトリトランスフェリンに強く相同性である（
３７〜３９％相同、第４図参照）。ヒＩ−およびニワト
リトランスフェラーゼは互いに５０％相同を示すので、
ｐ９７は３億年以上１１；ｉに血清トランスフェリンか
ら分岐したにちがいない。ｐ９７は各ドメイン中の相同
位置に位置する１４システイン残基を有する。ヒトトラ
ンスフェリンはこれらのシスティンのすべてを両ドメイ
ン中の相同位置に含み、ヒトラクトトランスフェリンお
よびニワトリトランスフェリンはこれらのシスティン残
基の単に２つを欠く　（それらのＣ末端ドメイン中）。 ｐ９７と異なり、これらのタンパク質はそれらのＣ末端
ドメイン中に４〜７追加システインを含み、それはＮ末
端中に相当するものを有しない。ヒトトランスフェリン
はまたそのＮ末端ドメインに特有の２つのエキストラシ
スティンを含む。ヒト血清トランスフェリン、ラクトト
ランスフェリンおよびニワトリトランスフェリン中のジ
スルフィドの大部分の位置は直接決定された〔マギリブ
レイ　（ＭｃＧ　ｉ　１１　ｉ　ｖｒａｙ）ほか、　　
１　９　８　２　　、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　　　７　９　　：２５０４〜２５
０８　；メソッ・ブティーグ（門ｅｔｚ−Ｂｏｕｔｉｇ
ｕｅ）ほか、１９８４　、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、。 １４５コロ５９〜６７６；マズリール（Ｍａｚｕｒｉｅ
ｒ）ほか、１９８３、エクスペリエンティア（Ｅｘｐｅ
ｒｉ−ｅｎｔｉａ）　（Ｂａｓａｌ）　　３９　：　１
３５〜ｌ　４１　；マギリプレイ　（ＭａｃＧｉｌｌｉ
ｖｒａｙ）ほか、１９８３　、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、、２５８　：　３５４３〜３５５３　；ウィリアムズ
（Ｗｉ　ｌ　ｌ　ｉａｍｓ）ほか、ｌ　９８２　、Ｅｕ
ｒｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、。 １２２：２９７〜３０３；ウィリアムズ（Ｗｉ　Ｉ　ｌ
　ｉａｍｓ）ほか、１９７４、バイオケミカル・ジャー
ナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、）　、１４１　；　７４５
〜７５２）。 従ってｐ９７の各ドメイン中の７ジスルフイド結合の存
在を予期することができる（第５図参照）。 ｐ９７のドメイン間のアミノ酸の相同性（４６％−９残
基の７ｇａｐの挿入により達成された）はヒトトランス
フェリン（４６％−１６ｇａｐ、４５残基）またはニワ
トリトランスフェリン（３５％１２ｇａｐ、４９残基）
中にみられたより一層顕著である。Ｉ）９７とトランス
フェリンとの間の広範な配列相同性およびシスティンの
保存に基く明らかに類似の折りたたみパターンが与えら
れたので、トランスフェリンのこの低分解Ｘ線構造〔ボ
リンスキー（Ｇｏｒｉｎｓｋｙ）ほか、１９７９　、二
１ａＬｕｒｅ。 Ｌｏｎｄｏｎ、　　２８１　：　１５７〜ｌ　５８）を
精密にできれば、ｐ９７の三次元構造を演鐸することが
可能であろう。 （６，６，３）　　ｐ　９７の機能 トランスフェリン上材中のその帰属関係、その鉄を結合
する能力〔ブラウン（Ｂｒｏ匈ｎ）、１９８２、Ｎａｔ
ｕｒｅ、　Ｌｏｎｄｏｎ、　２９６　：　１７１〜ｌ　
７３）　、並びにトランスフェリンおよびトランスフェ
リン受容体によるその普通の染色体局在〔ブロウマン（
Ｐｌｏｗｍａｎ）ほか、１９８３　、Ｎａｔｕｒｅ、　
Ｌｏｎｄｏｎ。 ３０３　：　７０〜７２　；ヤング（Ｙａｎｋ）ほか、
１９８４、Ｐｒｏｃ、Ｎａ口、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＩＪ
ＳＡ、　　　８　１　　：　　２　７　５　２　〜２７
５６）はすべて鉄輸送におけるｐ９７の役割を支持する
。 トランスフェリンの銖結合ポケットは２−３チロシン、
１−２ヒスチジンおよび工１（ハイカーボネート結合ア
ルギニンを含むと思われる〔メノッーブティーグ（Ｍｅ
ｔｚ−Ｂｏｕｔ弓ｕｅ）ほか、１９８４、［Ｅｕｒ。 Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　、１４５　：　６５９〜６７
Ｇ］　、　ｐ９７中のこれらのアミノ酸の保存は鉄代謝
中の提案役割を支持する（第１１図参照）。ｐ９７は結
合トランスフェリンｉη分子を結合した膜であり、トラ
ンスフェリン受容体との相同性を有しない〔シュナイダ
−（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ほか、Ｌ　９８４　、Ｎａｔ
ｕｒｅ。 Ｌｏｎｄｏｎ、　　３１１　：　６７５〜６７８）ので
、細胞の鉄代謝におけるその役割は血清トランスフェリ
ンの循環およびトランスフェリンに対する■胞の受容体
により与えられるものとは異なるであろう。 真核細胞中のクローンｐ９７ｃＤＮＡの発現はその機能
特性の実験試験を可能にする。 （６，６，４）結論 これらのデータに基き、黒色腫関連ｐ９７に対するｃＤ
Ｎ八構へ物が得られたこと、およびこれらを哺乳動物細
胞中に有効に発現させ多量の抗原性ｐ９７を生成できる
ことが明らかである。 （７）クローン化ｐ９７の発現およびワクチン試験ここ
に詳記する試験は、クローン化ｐ９７タンパク質の発現
およびそのワクチン試験の説明である。分泌された形態
（トランスフェクトマウスｉｉ：１胞クローンＢ１６ｓ
ｖ　ｐ９７ａ、ｌＩｔによる）！こおけるｐ９７タンパ
ク質の発現はフルレングスｐ９７タンパク質のミリグラ
ム■の積装を可能にした。 精製形態におけるタンパク質をｒｌｉｌ胞性免痴性免疫
ビトロ誘発試験およびサブユニットワクチンとしてのそ
の可能性の試験に用いた。ｐ　９７　ｉｆｔ伝子生成物
はまた転移マウス黒色腫細胞の細胞表面上に発現させ、
同系系中の腫瘍成長の予防におけるワクチンの有効性を
試験するモデルを与えた。 有効細胞性免疫を発生できるワクチン配合物として使用
するためにｐ９７遺伝子を生ワタチシニア組換え体ウィ
ルス中へ挿入した。組換え体ワクシニアウィルス、Ｖｐ
９７ａ−ＮＹ、を体液性および細胞性免疫を示す種々の
検定を用いてそのマウス中に免疫性を生ずる能力につい
て評価した。 上記同系マウス腫瘍モデルを用いてＶｐ９７ａ−ＮＹ組
換え体ウィルスワクチンは腫瘍細胞攻撃からの防御効果
を与えることが示された。ワクチンはまた成長肺転移が
存在するマウス中に治療効果を与え、その性質は腫瘍が
存在するヒト黒色腫患者中の免疫治療抗腫瘍応答を生成
させるワクチンの’１２Ｎされた使用に類似する。 ヒトｐ９７とマウス相同性タンパク質との間に（試験し
た領域にわたる）僅か９１％の相同性があるマウスの研
究に加えて、Ｖｐ９７ａ　−ＮＹワクチンはまた非ヒト
霊長類で試験した。ヒ）ｐ９７とサル型のタンパク質と
の間には（単クローン性抗体レベルで交差反応により示
されるように）非常に密接な相同性がある。「自己」タ
ンパク質に対する免疫応答の発生の潜在的な困難のため
に、非常に関連するマカク　（Ｍａｃａｑｕｅ）サルを
用いてＶｐ９７ａ　−ＮＹワクチンの免疫原性を試験し
た。 組換え体ワクシニアワクチンをサルで試験し、ｐ９７タ
ンパク質を指向する体液性免疫を誘発することが示され
た。従って、止組換え体ワクチンウィルス２接種を受入
れた後６週間の期間にわたり、ずっとサルがワクチンに
対する暴露から有害な副作用の顕著な症候を示さなかっ
た。 （７，１）プラスミドの発現 ＳＶ４０初朋プロモーターＳＶ２により駆動された発現
プラスミドは、全３’ＵＴＦＪ域が用いられることを除
いてプラスミドｐ９７ｂに類似するＣＤＮＡプラスミド
クローンｐ９７ａから構築された（第６図）。すべての
ｃＤＮＡクローンは、前記のように初めに合成ＥｃｏＲ
Ｉ−ｄＧで（９〜１７）リンカ−を有するλｇｔｌｏラ
イブラリーから分離された。挿入体はＥｃｏＲＩにより
切出され、次の増殖およびｆｌ’（ｌ　ｚ＝のためにｐ
ＥＭＩ３Ｌ１８＋中へサブクローンした。クローン１０
ａ１はＭ　１３ｍｐ　１８中ヘサブクローンし、ＲＦ形
態をＢａｍｆｌＴおよび５ｐｈｌで消化し、短時間エキ
ソヌクレアーゼ■で処理し、Ｓ１ヌクレアーゼでプラン
トし、フレノウで処理し、再び連結した。君子のプラー
クを分離して配列決定すると、その１つはｄＧ尾部が除
去され、Ｍ１３ｍｐ１８のＨｉｎｄ［１部位中へ挿入さ
れた３３ｂｐのｒ＋９７　５’非翻訳領域を保持した。 このサブクローンのＲＦ（１０ａｌａ）はインタクトｐ
９７ｃＤＮＡの発生に用い、そうでなければ全フラグメ
ントをプラスミドサブクローンから分離した。１０ａｌ
ａからの５５０ｂｐＨｉｎｄ　ＩＩＩ−Ｐｖｕ！Ｔフラ
グメントおよびＩＪＩからの７３５ｂｐ　Ｐｖｕ（Ｔ−
３ａｌ　ＩフラグメントをＬＭＩ’アガロースゲルから
分離し、ｐＥＭＢＬｌＢ−←中へ５ａｌｌおよびＨｉｎ
ｄ１１１部位で連結し、ｐ５’ｐ９１を生成させた。ｐ
ＥＭＢＬ１８＋中のＥ７．７ゲノムクローンをＥｃｏＲ
Ｉで完全に消化し、５ｓｔｌで部分消化し、４．５ｋｂ
フラグメントを０．８％ＬＭＰアガロースによる分画に
より分離した。この４．５ｋｂ３’フラグメントは２ｆ
ｌからの４（１４ｂρＳｓｔ　ｒフラグメントおよびｌ
ｊｌからの５３５ｂｐＢａｍＨＩ　−Ｓｓｔ　Ｉフラグ
メントでｐＥＭＢＬ１８＋中へＳａｌ　ＩおよびＥｃｏ
ＲＩ部位で連結してｐ３’ｐ９７を生成させた。次いで
ｐ５’ｐ９７の１２８５ｂｐ　Ｈｉｎｄ　ｍ−３ａｌ　
Ｉフラグメントをｐ３’ｐ９７中へ連結させ、ｐｐ９７
ａを生成させた。このクローンからのＥｃｏＲＩ一部分
ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをｐＳＶ２ｎｅｏ　　（サ
ザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ほか、１９８２、ジエー・モ
ル・アブ・ジネト（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐ、　Ｇｅｎ
ｅｔ、）、　　１　：　３２７〜３４１〕中へ■ｌ１ｎ
ｄ■およびＥｃｏＲＩ部位で挿入し、ネオマイシンコー
ディング領域およびＳＶ４０スプライス／ポリＡ配列を
排除するがＳＶ４０初朋プ初子プロモーター７２ｂｐエ
ンハンサ−１３３ｂｐ　ｐ９７　５’ＵＴＲ，全ｐ９７
コーディング領域、３　’　ＵＴＲおよび１．４ｋｂ３
’フランキングＤＮＡを保持した。生じたプラスミドを
ｐＳＶｐ９７ａと称した。 ＳＶ２駆動プラスミドはリン酸カルシウム沈降により種
々の真核細胞系中へトランスフェクションし、発現細胞
を優性選択性マーカーの同時トランスフェクションを用
いてクローンし、選択した。 これを行なうためにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＩ
ＩＯ）細胞を、１５％ウシ胎仔血清（Ｆ　ＣＳ）、４ｍ
ＭＬグルタミン、１．３　ｍ　Ｍプロリンおよび抗生物
質を含むハンクスＦｌ培地中で培養した。 Ｂ１６細胞は、０．１５％重炭酸塩およびＤＭＥＭ培地
〔ギブコ（Ｇｉｂｃｏ　）　）中の１７３５細胞を含み
１５％ＦＣ３および抗生物質の両方を補足したＲＰＭＩ
培地中で培養した。細胞は変形リン酸カルシウム法〔ウ
ィグラー　（Ｗｉｒｉｅｒ、　ｌ’１．）ほか、１９７
８、セル（Ｃｅｌｌ）　、１４　：　７２５〜７３１）
により、ｐＳＶ２ｐ９７ａプラスミドＤＮＡ２０μｇ毎
プレートおよびｐ　Ｓ　Ｖ　２　Ｄ　ＨＦ　ＲまたはＩ
）ＳＶ２ｎｅｏそれぞれ０．５μｇでトランスフェクシ
ョンした。プラスミドはすべてＥｃｏＲＩで線状化され
た。安定なトランスフェクション体をヒボキザンチン陰
性（ＨＡ　Ｔ　−）培地を用いてＣＩＩ　Ｏ細胞につい
て、または０．５μｇ／　ｍ　Ｉ２ゲヱチシン（Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｉｎ）　　ＣＧ４１８．ギプコ（Ｇｉｂｃｏ）
を用いてＢ１６および１７３５細胞について選択した。 生存細胞はトランスフェクション７日後に可視コロニー
の形成が開始され、ガラスピーズにより適所に保持され
た無菌ポリエステルフィルターで覆った。フィルターを
５日間適所に保持して細胞をポリエステルマトリックス
中へ成長させ、プレート上にコロニーのレプリカを生成
させた。次いでフィルターをとり出し、ヨウ素化抗ｐ　
９７　ｒｉｌ−クローン性抗体による生細胞結合検定に
用いた。標識した単クローン性抗体１０ミクログラムを
２０フイルターまでとともにＦＣ３１０ｒｒ＋ｊ！中で
４℃で１時間インキュベートした。フィルターをリン酸
塩緩衝食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）中で広く洗浄し、乾燥し、
−７０°Ｃで一夜ＸＡＲ−５フィルムに暴露した。 次にフィルターを７％メチレンブルーで染色して細胞コ
ロニーを可視化した。Ｂ１６マウス系を除いて、用いた
全細胞系において発現細胞はその細胞表面上に抗原性ｐ
９７タンパク質を含有した。 Ｂ１６トランスフエクト細胞において、ｐ９７が培地中
へｉｆｔ’ｆ４され、この所見はこの細胞型に特有であ
る。ｐ９７の分泌は細胞の培地からフルレングスｐ９７
タンパク質の精製を可能にした。りｏ−７Ｂ１６ＳＶｐ
９７ａ、１４はスペント培地　。 中にｐ９７約４μｇ　／　ｍ　（！を発現した。Ｍｉ喚
え体ｐ９７は、培地中へ多量のｐ９７抗原を分離するト
ランスフェクトクローンＢ１６ＳＶｐ９７ａ。 １４のスペント培地から精製された。小量の新培地を連
続的に加えることにより８５０　ｃ！＋！ローラーボト
ル中に細胞を集密近くに（１０”細胞）に維持した。細
胞は何個も分離するごとなく抗原を分離し、続け、スペ
ント培地の連続的な回収および凍結を可能にした。ｐ９
７の精製はイムノアフィニティクロマトグラフィーによ
り、単クローン性抗体９６．５のＦａｂフラグメントに
結合したセファロースを用いて行なった。ごのためスペ
ント−培地３１を一連の３つの３０ｍ１カラム上で行な
った。 第１カラムはＧ−２５超微粒セファデックス〔ファルマ
シア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製）１５ｍｆを含み、第２
カラムはセファロース４ｂＣフアルマシア（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ　）製）２０ｍｆｆを含み、第３カラムは単ク
ローン性抗体９６．５のＦａｂフラグメント（１０■タ
ンパク’ｉｌｉ／セフアロ一スｍｐ）に接合した臭化ア
ミン活性化セファロース〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）製〕を
含有した。次いでアフィニティーカラムを冷ＰＢＳで広
範に洗浄し、抗原を０．１　Ｍクエン酸塩、ｐ１１５．
３０ｍ１および０゜１Ｍクエン酸塩、ｐｌ＋４．３０ｍ
ｎで溶離させた。これらの条件は抗原の免疫反応性を変
えず、単クローン性抗原９６．５からの抗原の完全溶離
が達成されたことを示した。 ２゛）容離をそれぞれ３．０　ｍ　１２および４．５　
ｍ　ｌ！の２〜４トリス、ｐ１１８で中和した。精製溶
ｆｆ１ｌｔ液はアミコン（八ｍ１ｃｏｎ）装置を用いて
ＰＭＩＯフィルターで、゛農１宿し、ＰＢＳ　Ｉ　０ｍ
ｆｆ　２容で洗浄し、プラトフォルト（Ｂｒａｄｆｏｒ
ｄ）　検定〔バイオラド（旧ｏｒａｄ）　）により測定
して４．５　ｍ　ｌ中に・１，９５１■の最終収■が残
された。生成物１５μｇを５ＤＳ−ＰＡＧＥで試験しく
第７図）、クーマシーブルーおよび恨の両染色により可
視化した。二重決定基免疫検定（ＤＤＩＡ）　　（ブラ
ウン（Ｂｒｏｗｎ）　ほか、１９８１゜Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　　７８　：　５３９
）はモル■の精製タンパク質の独立確認を与えた。対照
調製物を親Ｂ１６ｉ１ｉｌ胞系からのスペント培地で平
行して行ない、検出可能なタンパク質が示されなかった
。その後の調製において、９５％純ｐ９７タンパク質３
０■をセファロースに接合した単クローン性抗体９６．
５Ｆａｂフラグメント３００■から精製した。↑ｌ’？
製ｐ９７タンパク質は免疫原性であり、セクション（７
，３）に記載されるように、タンパク質で免疫処置した
マウスに強い抗体応答を生じた。 （７，２）Ｋ：ＩＩ換え体ｐ９７ワクシニアウィルスの
構築および発現 ｐ９７のコーティング領域をｐ　９７ａをｌ１ｉｎｄＩ
［Ｉで切り、端部をプラント端に転化し、Ｓｍａ１部位
で開いたワクシニア挿入ヘククーｐＧＳ−２０〔マケッ
ト　（Ｍａｃｋｃ４ｔ）ほか、１９８４．　Ｊ、　Ｖｉ
ｒｏｔ。 ４９１５７〜８６４〕中へ連結した。ＰＧＳ−２０ヘク
ターは７．５にプロモーターを利用し、ワクシニアチミ
ジンキナーゼ（ＴＫ）Ｉ生成からのフランキング配列を
含む。組換え体ウィルスはマケッ）　（Ｍａｃｋｅｔｔ
）ほかの前掲の方法により生成させて、感染細胞に正し
い大きさおよびグリコンル化のｐ９７タンパク質の発現
を生ずるＶｐ９７ａ−ＮＹを分離した（第８図）。ｐ９
７の表面発現はまた下記Ｍｉ換え体ｐ９７ウィルスで感
染した細胞中に確認された（第１表）。 夫−一一一上 Ｍ２ＳＶｐ９７ａ　、Ａ　　　　　　なし　　　　　　
３，２１０，０００Ｍ２ＳＶｐ９７ａ、Ｅ／Ｆ２　　　
　　なし　　　　　　　４３４，０００Ｍ２親　　　　
　　　　なし　　　　　　　　２，０００−ＢＳＣなし
　　　　　　　　５，５９０１３　Ｓ　ＣＶｗｔ−ＮＹ
　’７クシ＝７　　　　　５，２２０１）細胞は短時間
トリプシン処理し、洗浄し、管中へ分取し１０３．１０
’までまたは１０５細胞を入れた。非発現担体細胞は、
合計１０５ｆＪｉ！胞が筒管に使用されるように低細胞
数を管に加えた。１Ｘｌｏ’ｃｐｍのヨウ素化ｉ１【ク
ローン性抗体９６．５　　（１２３ｎｇ）を全ｆｆｉ　
５０　ｐ　１中で細胞とともに氷上で６０分間・インキ
ュへ−１・した。 ｔｎ＋胞を洗浄し、ＰＢＳ＋１０％ウシ胎仔血清中で４
回回転し、次いで再：す副し、マイクロメゾインク（Ｍ
　ｉｃｒｏｍｅｄｉｃ）　４　／　６００プラスガンマ
カウンター中で計数した。（−）は（未満）を示す。 （７，３）組換え体ｐ９７ワクシニアウィルスはマウス
中で免疫原性である Ｖｐ９７ａ　−ＮＹによるマウスの接種は刺体液性抗体
応答を生じた。マウスは１回免疫処置し、４週に１回追
加刺激し、次いで５週に採血した。 力価はＥＬ　Ｉ　ＳＡにより抗原被覆プレート、および
検出試薬としてボースラブイノシュペルオキシダーゼに
接合したプロティンＡを用いて検定した。 データは抗ｐ　９７　ｉ￥Ｌクローン性抗体１３３．２
を用いて生じたＥＬ　Ｉ　ＳＡ結合に対する標ｉｔ曲腺
と比較することにより単りローン性抗体当■に転換した
。結果は血清抗体の強い誘発を示した（第９図）。 細胞免疫性はインビトロ増殖検定を用い、刺激抗原とし
て精製ｐ９７タンパク質で検出した（表■）。 退−一−１ Ｃｏｎ　　Ａ　　　（１０μｇ／ｍ　１）　　　　　　
　　　　７　１　　　　　　　　　　　　５　０ｐ９７
タンパク質 （３μｇ／ｍり　　　　　　　２７　　　　　　　２（
１０μｇ／ｍｊり　　　　　　　　４３　　　　　　　
　２（２０μｇ／ｍｊり　　　　　　　　　５６　　　
　　　　　２（５０μｇ／ｍβ）　　　　　　　　４４
　　　　　　　３１）　肺臓細胞は、尾部乱切により１
０　’　ｐｆｕ　Ｖｐ９７ａ−Ｎ　Ｙ　％Ｊｌ換え体ウ
ィルスを接種し、同用里で１月後追加刺激し、その１週
後に殺したマウスから分離した。無経験牌細胞をこの実
験に対照として用いた。１０５細胞を０．５％正常マウ
ス血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、グルタミン
、重炭酸塩および２．５Ｘ１０５Ｍ２−メルカプトエタ
ノールを補足した０、２２ｍｌ！ＲＰＭＩ中で９６ウエ
ル丸底プレート中の毎ウェルに培養させた。培養は第４
日に２５μＣｉ　／ウェルのトリチウム化チミジンにニ
ュー・イングランド・ニュークリア（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ
ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）製〕で６時間パルス標識し、
Ｐ　ｌ−Ｉ　Ｄ細胞ハーベスタ−で回収し、ベックマン
（Ｂｅｃｋｍａｎ）　Ｌ　Ｓ　３８０１カウンター中で
オブティフルオル（Ｏｐｔｉｆｌｕｏｒ）を用いて計数
した。増殖指数は各抗原で刺激した４重ウェルのｃｐｍ
平均値を対照（培地）の下表Ｈに示される結果はＴ細胞
がｐ９７タンパク質抗原に応答して増殖していることを
示す。 ヘルパー細胞もまた免疫処置マウスからの１１．！　臓
細胞中の組換え体ウィルスにより刺激されたかどうかを
ｆ（Ｉ　ｉｐするために、細胞をインビ１−口で刺激し
、上澄みをインターロイキン２（ＩＬ−２）、ヘルパー
Ｔ細胞因子、の生成について検定した。 肺臓細胞は、予め組換え体Ｖｐ９７ａ　−ＮＹワクシニ
アまたは親ワクシニアで２回免疫処置したマウスから培
養した。１０５細胞を、増殖検定に用いたものに等しい
培地０．２　ｍ　ＩＬ中で、９６ウエル九底プレート中
、刺激抗原の存在または不在下に４８時間インキユヘー
トした。上澄みを採集し、４・シェルからプールし、Ｉ
Ｌ−２検定前に凍結した。ＩＬ−２検定は、クリック（
Ｃ１ｉｃｋ）培地で検定上澄みの希釈度を変えて３重に
各ウェル中でインキュへ−１−した予めｚ、−２ｆｉＪ
ｔｆａしたマウスＴ細胞系ＣＴＬＬ細胞２０’を用いた
。標準曲線はゲネンテク（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、　ＣＡ
）から入手した組換え体ＩＬ−２で構成した。ＣＴＬＬ
細胞は２４時間イン：）−ユヘーションの最後の６時間
に通常の増殖検定技術によりチミジンでパルス＋５識し
、次いで回収し、増殖検定ｔ１′：に記載したように計
数した。 表■に示される結果は組換え体ｐ９７ワクシニアウィル
スで免疫処置したマウスの肺臓細胞からのＩＬ−２生成
がｐ’１７によりインビトロ刺激されることを示す。 夫−一一則 Ｕ二し免麗性肺臓細胞によるＩ　＋−−２生成の刺激Ｖ
　ｐ９７ａ　−ＮＹ　　　　　　　培　　　地　　　　
　　　　　０．２５Ｖ　ｗｔ　−ＮＹ　　　　　　　　
培　　　地　　　　　　　　　０．２５さらに、遅延型
過敏症応答をＶｐ９７ａ　−ＮＹ接種マウス中の足み（
膨潤検定を用いて測定した。 毎群５マウス（Ｃ３Ｈ／１（ａｎ系）を尾部乱切により
組換え体または親株τノクシニアウィルスで接種した。 ６Ｅ（ｉｌ（、各マウスの後足を２０μｌのＰ［（Ｓま
たは２０μＣ０ＰＢＳ中のキ■胞（５ｘｌＯ’ｔＪｉｌ
胞毎マウス）の接種により攻撃させた。足蹴は２４時間
後に二重盲検方式でフオ力う−（Ｆｏｗｌｅｒ）マ、イ
ク口メーターを用いて測定した。ｐ１３ｓ注人足力代の
足踪厚さを、各マウスから試験足の測定厚さから差引き
、増分足随膨潤の平均、並びに標準偏差を計算した。表
■に示した結果は組換え体ｐ９７ワクシニアウィルスで
免疫処置したマウス中のｐ９７特異的遅延型過敏症応答
の誘発を示す。 変−一一立 （７，４）マウス１ＴｆＦ、モデル中のｐ９７ワクシニ
アウィルスによる防１コ■および治療 予防接種の有効性を評価するために、マウスを種々のプ
ロトコルで本発明の組換え体ｐ９７ワクシニアウィルス
を用いて予防接種し、次いでｐ９７トランスフエクト同
系腫瘍細胞（Ｍ２ＳＶｐ９７ａ。 ２Ｅ）で攻撃した。このため、マウスをＶｐ９７ａ−Ｎ
Ｙ組換え体止ワクシニアウィルスまたは親株（Ｖｗｔ−
ＮＹ）で尾部乱切により；あるいは１００μｇ精製ｐ９
７タンパク質または５Ｘ１０”照射Ｍ２−に１７３５腫
瘍細胞で腹腔内で完全フロインドアジュバント中で免疫
処置した。静脈内腫瘍細胞攻撃は最後の予防接種の２週
後にＭ　２　Ｓ　Ｖｐ９１ａ−２Ｅ、ＳＶ４０初期ブロ
モ−クーにより駆動された表現プラスミド中に含まれた
ヒＩ・ｐ９７コーテイング配列でトランスフエフｌ〜す
ることによりＭ２−に１７３５　　（マウス黒色η重モ
デル）から調製した転移腫瘍クローンの注入により与え
た。種々の発現クローンを選択し、腫瘍攻撃に用いたも
の、クローンＭ２ＳＶｐ９７ａ２Ｅ、は培地水準、約４
００，０００分子毎細胞またはヒト黒色腫ｐ９７抗原密
度に等しいｐ９７を発現する。静脈内腫瘍攻撃の２用１
５　Ｘ　１０５またはｌ　Ｘ　１０’細胞を用いて、そ
れを同系Ｃ３Ｈ／ｆ−１ｅｎマウスの尾静脈中へ注入し
た。マウスは腫瘍攻撃１６日後に殺し、肺をとり出した
。墨汁で染色した計上に肉眼可視腫瘍が存在すれば陽性
と記録した。結果は表■に示される。 表　　　　■ Ｖｐ９７ａ−ＮＹ　　２　５Ｘｔｏ’　　１１５１　　
〃２／４ Ｖｗｔ−ＮＹ　　２　　９／１０ ｐ９７タンパク質　２　　　　　　　　　３／３Ｖｐ９
７ａ−ＮＹ　　　　　２　　　　１　Ｘ　１０５０／　
１表■に示される結果はＶｐ９７ａ、ＮＹの２免疫処置
で顕著な防’＜１’Ｊ効果があったが、しかし↑１１製
ｒ＋９７タンパク質ワクチンで（非常に高い抗体価を誘
出したにもかかわらず）防御効果が認められなかったこ
とを示す。Ｍｌ換え体ウィルスの細胞性免疫を誘発する
能力はその防御腫瘍免疫性に関与することができる。 治療試験において、マウスにｐ９７発現腫瘍細胞低用量
で、次いで２日後’＋ＨｔＡえ体ワクシニアヮクヂンで
接種した。マウスは、１０５または１０４のｐ９７発現
腫瘍細胞（Ｍ２ＳＶｐ９７ａ、Ｅ）で静脈内攻撃した、
２日後にマウスに尾部乱切によりＶｐ９７ａ　−ＮＹま
たはＶｗｔ−ＮＹを接種した。毎週尾部乱切により接種
を繰返し、マウスの生存を記録した。結果は第１０図に
示され、肺転移が存在するマウス中の組換え体ワタシニ
アウィルス予防接種の治療効果を示す。 （７，５）　Ｍｌｌｏえ体ｐ９７ワクシニアウィルスは
マカクサル中で免疫原性である ２マカカ°フアシクラリス（Ｍａｃａｃａ　ｆａｓｉｃ
ｕｌａｒｉｓ）（マカク）サルをＶｐ９７ａ−ＮＹＭＬ
換え体ワクシニア２Ｘ１０８プラーク形成単位（ｐｒｕ
）または同用量の親株ワタシニアで乱切した。２週後に
血清をＥＬ　Ｉ　ＳＡによりワタシニアおよびｐ９７に
対する力価について試験した。表■に示される結果はｐ
９７に対する体液性抗体がＶｐ９７−ＮＹの１回接種の
２週後に検出可能であったことを示す。 ワタシェフす種サル中の良ｆ？ｔ　！’；Ｃ（ｌｉｔＶ
ｐ９７ａ−ＮＹ／週０　　　　１／２０　　　　　　０
．５４Ｖｐ９７ａ−ＮＹ／週２　　　　１／２０００　
　　　　６．５４Ｖｗｔ−ＮＹ／週０　　　　　１／２
０　　　　　　０．５０（８）微生物の寄託 示したプラスミドを運ぶ次の大腸Ｗ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）
株はニー・ティー・シー・シー（Ａ　Ｔ　ＣＣ’＋　Ｒ
ｏｃｋ−ｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　）に寄託され、次の寄託
番号を指定された： 次の組換え体ワクシニアウィルスはニー・ティー・シー
・シー（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＯ）に寄
託され、次の寄託番号を指定された：示したプラスミド
を運ぶ次の細胞系がニー・ティー・シー・シー（ＡＴＣ
Ｃ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）に寄託され、次の寄
託番号を指定された：寄託した態様は本発明の１観点の
単なる例示として意図されているので本発明は寄託した
微生物および細胞により範囲を限定されるべきでなく、
機能的に等しい微生物または細胞はいずれも本発明の範
囲内にある。事実、ここに示され、記載されたものに加
えて本発明の種々の変形は、前記記載および図面から当
業者に明らかになろう。そのような変形は特許請求の範
囲内に属するものである。 ヌクレオチドに対して示した塩基対の大きさはすべて近
似値であり、説明のために用いられていることもまた理
解すべきである。 ４、図面の簡単な説明 第１図は５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分割したｐ９７ｍＲＮ
Ａの細胞を含まないδＩＩ訳生酸生成物−トラジオグラ
フであり、第１Ａ図はｍ　ＲＮ　ｔＸ全翻訳生成物、第
１Ｂ図は抗ｐ９７血清で免疫沈降したｍＲＮ八翻へ生成
物に関し、レーン１はｐ９ＨＱ縮ｍＲＮＡの翻訳生成物
を、レーン２は非ン農縮ｍＲＮＡの翻訳生成物を表わし
、 第２図はｒ）　９７　ｍＲＮへの構造の線図であり、第
２Ａ図はλＬ　４７．１中でクローンしたゲノムクロー
ンｌ３１５．１Ｉｉ７、Ｂ６．６およびＥ７．７の線図
であり、 第３図はヒトｐ９７前駆物質ｃＤＮＡのヌクレオチド配
列およびその演鐸アミノ酸配列を表はす図であり、 第４図はｐ９７前駆物質の予期アミノ酸配列およびヒト
セロトランスフェリンのそれの比較を示す図であり、 第５図はトランスフェリンの工科成員間に保持されたシ
スティン残基の存在に５（ｐ９７の構造の二次元モデル
の線図である。 第６図はｐ９７ｃＤＮＡクローンおよびｐ９７発現ベク
ターの構築に用いるゲノムクローンλＥ７．７（７）７
−７グメント：並びにｐＳＶ２ｐ９７ａ発現ベクターの
遺伝子構造の線図であり、第７図は組換え体ｐ９７タン
パク質の確認および免疫精製における電気泳動の結果を
示す図であり、Ａはクーマシーブルー染色５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル、Ｂはオートラジオグラフである。 第８図はトランスフェクト細胞またはＶｐ９７ａ−ＮＹ
怒染細胞中の発現ｐ９７の放射免疫沈降の結果を示す図
であり、 第９図はｐ９７ワクチンで免疫処置したマウス中の血清
抗体価を示すグラフであり、 第１０図は組換え体ｐ９７ワクシニアウィルス（Ｖｐ　
９７　ａ−ＮＹ）による腫瘍攻撃マウスの予防接種の治
療効果を示すグラフである。 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＪＧ、ＩＡ　　　ＦＩＧ、旧 ３０酬−〒 ＧＣＧ　　ＣＡＣ〒τＣＣＴＣＧ（ｉＡ　　ＣＣＣＧＯ
ム　□：ＣＣＡＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＧ　ＧＣＣＣＣＡ
　ＧＣＣＡｌ：ＣＣＣＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣ（τＣＣＡ
Ｇ　　ＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣＴＣ丁ＧＣＣＴＣＣＧＧ　
　（ｉｃｃ　　ＡＣＣＴＣＣＣＣＣ１８０＋ｌａ　Ｇｆ
　Ｉ’ｒｏ　　Ｓｉｒ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｃｙｓ　Ｖａ
ｌ　Ａｒｇ　ＧＬｙτｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｌｍ　　　　６
０の１ ＴＡＣＴＡＧ　　ＣＴに　　ＧＴＧ　　ＣＣＣＩＪＧ　
　ＣＴＣ，ＡＣＡ　　ＣにＧ　　ＧＡＣＡＧＣＴＣＣＣ
ＡＣＣＣＣ丁ＴＣｋＣＣＴＴｆ　　ＧＡＴ 丁ｙｒ　　τｙｒ　　Ｖａｔ　　Ｖａｌ　　＾１ｍ　　
Ｖａｌ　Ｖａｔ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ　　Ａｓｐ　　　
Ｓａｒ　　Ｓａｒ　　ＨＬａ＠　Ａｌａ　Ｐｈｅτｈｒ
　　Ｌａｕ　　＾１ｐＧＣＣＣＣＧ　Ｃ；ＣＡ　　ＣＴ
Ｔ　　ＴＣＣＧＣＩＩ；　　ＧＣＧ　　ＣＣＣＴＣＴ　
　ＣＣＣＣＣＴ　　ＧＣＣＣＡＡ　　ＴＣＣＡＧＡ＠　
Ａ２Ｇ　　ＡＡＴ２　　ＣＴＣ ＧＡＣＣＡＴ　　ＴＧＣＴＴＧ　　ＣＴＴ　　ＴＴＴ　
　ＴＣＡ　　ＡＡＡ　　ＧＯＧ　　ＡＣＴ　　　ＴＴＴ
　　ＣＴＣＣｆｌ；Ｇ　　？Ａ　　ＧＡＡ　　ＣＴＧ　
　ＴＧＴ　　丁ＴＣＴＧＡ　　ＡＧＯＴＧＴ　　ＣＧＣ
ＣＴＧ　　ＣＧＴ　　ＧＧＧ　　ＴＣＧ　　ＡＣＴ　　
Ｇ丁Ａ　　　ＡＧＴ　　ＧＡＣＧＣＴ　　にＧＡ＠　Ｔ
ＴＣＴＣＡ　　Ｃ，ＣＴ　　Ｃ，ＣＣＡＴＣＴＴＩＩ；
　　ＣＴＴ　　ＧＣＴ　　ＴＴＣＴＡＡ　　ＡＡＴ　　
ＡＡＡ　　ＧＣＣＡＡＡ　　　ＣＡＡ　　ＧＣＣＡＧＣ
ＡＣＡ　　嘯モｂＣＧＡ　　ＣＧＣＴＴＧ ＱＣに　　Ａ、、　　　＋、、　　、、、　　、、、　
　、、、　　、、、　　、、、　　、、、　　、、、　
　、、、　　、、、　　　　Ｑ］０８ τＣＴ　　ＣＴＣにＣＴ　　ＡＡＣ丁１：Ｔ　　にＧＧ
　　Ｃ丁＾　ＣＣＧ　ＴＣＣＣＣＴ　　にＧＣＣＡＴ　
　　　３６７８ＡＣＣＡにＧ　　　ＬＡに　　ＣＣＣＣ
ＴＣＣＴＧ　　ＴＧＴ　　ＣＡＣＴＣＣＴＡＡ　ＴＣＡ
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　　　　　　　　エ メリカ合衆国　ワシントン州　９８０５２　　レツドモ
ンドンハンドレッドアンドセブンテイーフイフス　ノー
ス−スト　１４１２８ メリカ合衆国　ワシントン州　９８１９９　　シアトル
　トランティファースト　ウェスト　３４００昭和　　
年　　月　　日 ３．　）ｉｌｉ正をする者 事件との関係　　出頭人 名称　オンコーゲン ４、代理人 氏　名（５９９５）弁理士　中　　村　　　　　稔　　
　。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）黒色腫関連ｐ９７抗原に関連する実質的に純粋な
   抗原性ペプチドまたはタンパク質。 （２）実質的に第３図に示されるアミノ酸配列を含むア
   ミノ酸配列またはその任意の抗原部分を有する、特許請
   求の範囲第（１）項記載のペプチドまたはタンパク質。 （３）ペプチドまたはタンパク質がペプチドまたはタン
   パク質をエンコードするヌクレオチド配列を含む培養細
   胞から精製され、ペプチドまたはタンパク質が培養細胞
   により発現されるように遺伝子発現を調節する第２ヌク
   レオチド配列の制御下にある、特許請求の範囲第（１）
   項または第（２）項記載のペプチドまたはタンパク質。 （４）培養細胞が微生物を含む、特許請求の範囲第（３
   ）項記載のペプチドまたはタンパク質。 （５）微生物が細菌を含む、特許請求の範囲第（４）項
   記載のペプチドまたはタンパク質。 （６）微生物が酵母を含む、特許請求の範囲第（４）項
   記載のペプチドまたはタンパク質。 （７）培養細胞が動物細胞系を含む、特許請求の範囲第
   （３）項記載のペプチドまたはタンパク質。 （８）培養細胞が昆虫細胞系を含む、特許請求の範囲第
   （３）項記載のペプチドまたはタンパク質。 （９）ペプチドまたはタンパク質が化学的に合成された
   、特許請求の範囲第（１）項または第（２）項記載のペ
   プチドまたはタンパク質。 （１０）ゲノムが黒色腫関連ｐ９７抗原に関連する抗原
   性ペプチドまたはタンパク質、あるいはそれらの抗原部
   分をエンコードするヌクレオチド配列を含み、黒色腫関
   連ｐ９７抗原に関連するペプチドまたはタンパク質がウ
   ィルスで感染された受容者中に発現されるように遺伝子
   発現を調節する第２ヌクレオチド配列の制御下にある組
   換え体ウィルス。 （１１）黒色腫関連ｐ９７抗原に関連する抗原性ペプチ
   ドまたはタンパク質が実質的に第３図に示されるヌクレ
   オチド配列あるいはその抗原性ペプチドまたはタンパク
   質をエンコードする任意の部分を含む、特許請求の範囲
   第（１０）項記載の組換え体ウィルス。 （１２）エンベロープウィルスを含む、特許請求の範囲
   第（１０）項または第（１１）項記載のウィルス。 （１３）ワクシニアウィルスを含む、特許請求の範囲第
   （１２）項記載のウィルス。 （１４）裸のウィルスを含む、特許請求の範囲第（１０
   ）項または第（１１）項記載のウィルス。 （１５）アデノウィルスを含む、特許請求の範囲第（１
   ４）項記載のウィルス。 （１６）多面体病ウィルスを含む、特許請求の範囲第（
   １０）項または第（１１）項記載のウィルス。 （１７）バキュロウィルスを含む、特許請求の範囲第（
   １６）項記載のウィルス。 （１８）バクテリオファージを含む、特許請求の範囲第
   （１０）項または第（１１）項記載のウィルス。 （１９）λファージを含む、特許請求の範囲第（１８）
   項記載のウィルス。 （２０）免疫原が、製剤担体と混合された有効量の特許
   請求の範囲第（１）項または第（２）項記載のペプチド
   またはタンパク質を含むサブユニットワクチン配合物。 （２１）免疫原が、製剤担体と混合された有効量の特許
   請求の範囲第（３）項記載のペプチドまたはタンパク質
   を含むサブユニットワクチン配合物。 （２２）免疫原が、製剤担体と混合された有効量の特許
   請求の範囲第（４）項記載のペプチドまたはタンパク質
   を含むサブユニットワクチン配合物。 （２３）免疫原が、製剤担体と混合された有効量の特許
   請求の範囲第（５）項記載のペプチドまたはタンパク質
   を含むサブユニットワクチン配合物。 （２４）免疫原が、製剤担体と混合された有効量の特許
   請求の範囲第（６）項記載のペプチドまたはタンパク質
   を含むサブユニットワクチン配合物。 （２５）免疫原が、製剤担体と混合された有効量の特許
   請求の範囲第（７）項記載のペプチドまたはタンパク質
   を含むサブユニットワクチン配合物。 （２６）免疫原が、製剤担体と混合された有効量の特許
   請求の範囲第（８）項記載のペプチドまたはタンパク質
   を含むサブユニットワクチン配合物。 （２７）免疫原が、製剤担体と混合された有効量の特許
   請求の範囲第（９）項記載のペプチドまたはタンパク質
   を含むサブユニットワクチン配合物。 （２８）ウィルスが予防接種される受容者に疾患を生ず
   ることなく感染性である、特許請求の範囲第（１０）項
   または第（１１）項記載の組換え体ウィルスを含む生ウ
   ィルスワクチン配合物。 （２９）組換え体ウィルスがエンベロープウィルスを含
   む、特許請求の範囲第（２８）項記載の生ウィルスワク
   チン配合物。 （３０）エンベロープウィルスがワクシニアウィルスを
   含む、特許請求の範囲第（２９）項記載の生ウィルスワ
   クチン配合物。 （３１）組換え体ウィルスが裸のウィルスを含む、特許
   請求の範囲第（２８）項記載の生ウィルスワクチン配合
   物。 （３２）裸のウィルスがアデノウィルスを含む、特許請
   求の範囲第（３１）項記載の生ウィルスワクチン配合物
   。 （３３）製剤担体と混合された有効量の特許請求の範囲
   第（１０）項または第（１１）項記載の組換え体ウィル
   スを非感染状態で含む不活性化ウィルスワクチン配合物
   。 （３４）製剤担体と混合された有効量の特許請求の範囲
   第（１２）項記載の組換え体ウィルスを非感染状態で含
   む不活性化ウィルスワクチン配合物。 （３５）製剤担体と混合された有効量の特許請求の範囲
   第（１３）項記載の組換え体ウィルスを非感染状態で含
   む不活性化ウィルスワクチン配合物。 （３６）製剤担体と混合された有効量の特許請求の範囲
   第（１４）項記載の組換え体ウィルスを非感染状態で含
   む不活性化ウィルスワクチン配合物。 （３７）製剤担体と混合された有効量の特許請求の範囲
   第（１５）項記載の組換え体ウィルスを非感染状態で含
   む不活性化ウィルスワクチン配合物。 （３８）製剤担体と混合された有効量の特許請求の範囲
   第（１６）項記載の組換え体ウィルスを非感染状態で含
   む不活性化ウィルスワクチン配合物。 （３９）製剤担体と混合された有効量の特許請求の範囲
   第（１７）項記載の組換え体ウィルスを非感染状態で含
   む不活性化ウィルスワクチン配合物。 （４０）製剤担体と混合された有効量の特許請求の範囲
   第（１８）項記載の組換え体ウィルスを非感染状態で含
   む不活性化ウィルスワクチン配合物。 （４１）ｐ９７ｂを含む組換え体ＤＮＡベクター。 （４２）特許請求の範囲第（４１）項記載の組換え体Ｄ
   ＮＡベクターを含む単細胞生物。 （４３）特許請求の範囲第（４１）項記載の組換え体Ｄ
   ＮＡベクターを含む細菌。 （４４）ＡＴＣＣに寄託され、受託番号５３４０３号を
   指定された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
   ）を含む、特許請求の範囲第（４３）項記載の細菌、そ
   の突然変異体、組換え体、または遺伝子工学誘導体。 （４５）ｐＭＴｐ９７ｂを含む組換え体ＤＮＡベクター
   。 （４６）特許請求の範囲第（４５）項記載の組換え体Ｄ
   ＮＡベクターを含む細胞系。 （４７）ＡＴＣＣに寄託され、受託番号ＣＲＬ８９８５
   を指定されたＴＫＭｐ９７−１２を含む、特許請求の範
   囲第（４５）項記載の細胞系、その突然変異体、組換え
   体、または遺伝子工学誘導体。 （４８）ｐＳＶｐ９７ａを含む組換え体ＤＮＡベクタ（
   ４９）特許請求の範囲の範囲第（４８）項記載の組換え
   体ＤＮＡベクターを含む細胞系。 （５０）ＡＴＣＣに寄託され、寄託番号ＣＲＬ９３０４
   を指定されたＢ１６ＳＶｐ９７ａ．１４を含む、特許請
   求の範囲第（４９）項記載の細胞系、あるいはその突然
   変異体、組換え体または遺伝子工学誘導体。 （５１）ＡＴＣＣに寄託され、寄託番号ＶＲ２１５９を
   指定されたウィルスＶｐ９７ａ−ＮＹを含む、特許請求
   の範囲第（１３）項記載のウィルス、あるいはその突然
   変異体、組換え体または遺伝子工学誘導体。