DE3703702A1 - Vakzine gegen melanome - Google Patents

Description

1. Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Vakzinformulierungen, die in der Lage sind, eine Immunantwort auszulösen, welche Melanomzellen in einem mit dem Vakzin behandelten Individium selektiv zerstört. Es wird daher ein Peptid oder ein Protein, das einem Melanom-assoziierten Antigen angehört, mittels rekombinanter DNA-Techniken und/oder chemischer Synthesemethoden in großen Mengen hergestellt. Das erfindungsgemäße Peptid oder Protein kann man als Immunogen in einer Vakzinformulierung verwenden. Bei bestimmten Ausführungsformen, bei denen das zu einem Melanom-assoziierten Antigen gehörende Peptid oder Protein durch ein rekombinantes Virus exprimiert wird, kann man das rekombinante Virus selbst als Immunogen in einer Vakzinformulierung verwenden. Die Erfindung betrifft auch Verfahren unter Anwendung rekombinanter DNA-Techniken sowie chemische Synthesemethoden, welche die Herstellung des Peptides oder des Proteins, das dem Melanom-assoziierten Antigen angehört, in großen Mengen erlaubt.

Zur beispielhaften Erläuterung der Erfindung verwendet man als Immunogene Peptide, die zu p97 gehören, ein monomeres Sialoglykoprotein der Zelloberfläche, das ein scheinbares Molekulargewicht von etwas weniger als 97 000 Daltons aufweist und das ein Bestandteil der Oberfläche von Melanomzellen ist.

2. Allgemeiner Stand der Technik 2.1. Tumor-assoziierte Antigene

Tierversuche, insbesondere mit Nagetieren, haben ergeben, daß die meisten durch onkogene Viren ausgelösten Tumore Antigene exprimieren, die im viralen Genom kodiert sind. Weiter hat sich gezeigt, daß eine Immunisierung mit diesen Antigenen zu der Abwehr eines anschließenden, durch das gleiche Virus induzierten Challenges der Tumorzellen führen kann. Obwohl ein großer Teil dieser Arbeit mit Labor-Virusstämmen, wie SV40, Polyomavirus und Friend-Moloney- oder Rauscher-Murinleukämieviren, durchgeführt wurde, wurde doch auch die horizontale und vertikale Transmission onkogener Viren in der Natur gezeigt; so ist heute ein Vakzin gegen Virus-induzierte Gallenleukämie und gegen Virus-induziertes Gallensarkom im Handel erhältlich.

Dagegen wurde die virale Etiologie der meisten Krebsformen beim Menschen noch nicht aufgezeigt. Beachtenswerte Ausnahmen sind das Hepatitis-Virus (Hepatom), Herpes-Simplex-Virus (Zervikal-Carcinom) und Epstein Barr-Virus (Nasopharyngeal- Carcinom). Während der letzten beiden Jahrzehnte hat sich jedoch herausgestellt, daß einige menschliche Tumorzellen Tumor-Antigene exprimieren, d. h. Antigene, die die Tumorzellen von ihren normalen zellulären Gegenstücken unterscheiden. Bei einigen Patienten kommt es zu einer zellvermittelten oder humoralen Immunantwort gegen diese Antigene (Hellstrom et al. 1968, Nature, 220:1352; Morton et al., 1968, Science 162: 1279-1281; Shiku et al. 1976, J. Exp. Med. 144: 873- 881). Targets dieser Immunantworten sind unter anderem onkofetale oder Differenzierungsantigene, die im Humangenom kodiert sind (Hellstrom et al., 1970, Int. J. Cancer 6: 346- 351).

Bis vor kurzem war die Molekularstruktur von Tumorantigenen nicht bekannt und der Grad der Tumorspezifität immunologischer Reaktion war unklar. Versuche, diese Information zur Entwicklung von Krebsdiagnose-Assays oder zur Krebstherapie zu verwenden, blieben weitgehend erfolglos. Da spontane Tumorregressionen äußerst selten sind, kann man auch den Schluß ziehen, daß die in-vitro demonstrierten Immunantworten in-vivo nicht wirksam sind; beispielsweise können Antikörper und Lymphozyten, die man von einem Krebspatienten erhalten hat, in-vitro wirksam Tumorzellen abtöten, während die Immunantwort des gleichen Krebspatienten in-vivo ohne Wirkung bleibt.

Die Einführung der Methode mit monoklonalen Antikörpern durch Kohler und Milstein (1975, Nature 256: 495-497) führte zur intensivierten Suche nach menschlichen Tumorantigenen, da durch diese Methode die Mittel geschaffen wurden, derartige Antigene sowohl im molekularen Bereich als auch hinsichtlich der Spezifität zu definieren ((Hellstrom and Brown, 1979, In "The Antigens", M. Sela, ed., Academic-Press, Vol. V: 1-66). Im Laufe der letzten Jahre wurde eine große Zahl Tumor-assoziierter Antigene beschrieben, von denen die meisten mittels monoklonaler Antikörper von Mäusen definiert wurden, Reisfeld and Sell, Herausgeber: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series, Vol. 27, Alan R. Liss, Inc. New York, 1985, Seiten 1-609. Obwohl sich im wesentlichen alle genau charakterisierten Antigene als Onkofetal- oder als Differenzierungsantigene erwiesen haben und sich ihre Tumorspezifität als quantitativ und nicht qualitativ gezeigt hat, sind einige Antigene ausreichend spezifisch gegenüber neoplastischen Zellen im Vergleich zu normalen Zellen (im allgemeinen um einen Faktor 10 bis 1000), um potentiell zur Identifizierung von Tumorzellen und zur Therapie verwendet zu werden. Menschliche monoklonale Antikörper gegenüber Tumorantigenen wurden ebenfalls erhalten (Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026-2030). Dies bestätigt die obige Aussage, daß es bei einigen Krebspatienten zu einer Immunreaktion gegenüber ihren Tumoren kommt.

Mehr als die Hälfte der bisher identifizierten Tumor-assoziierten Zelloberfläche-Antigene sind Proteine oder Glykoproteine, die im menschlichen Genom (und nicht durch endogene oder exogene Viren) kodiert sind. Die restlichen Antigene sind Glykolipide, die aus abnormaler Expression oder Regulation von Glykosyl-Transferasen resultieren.

2.2. Melanom-assoziiertes p97-Antigen

Das p97-Antigen ist ein Tumor-assoziiertes Antigen, das zuerst in einem menschlichen Melanom unter Anwendung monoklonaler Antikörper identifiziert wurde (Brown et al., 1980, J. Biol Chem. 255: 4980-4983; Dipold et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6114-6118; Woodbury et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2183-2187). Das p97- Antigen wurde intensiv hinsichtlich seiner Expression in normalen und neoplastischen Geweben untersucht. Es ist in den meisten Melanomen beim Menschen und in bestimmten fötalen Geweben vorhanden, es findet sich jedoch nur in Spuren in normalen Geweben bei Erwachsenen (Brown et al., 1981, J. Immunol. 127: 539-546; Brown et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 539-543; Garrigues et al., 1982, Int. J. Cancer 29: 511-515). p97 wurde als Target verwendet, um in klinischen Versuchen beim Menschen Melanome zu Diagnosezwecken sichtbar zu machen (Larson et al., 1983, J. Clin. Invest. 72: 2101-2114).

P97 ist ein monomeres Zelloberflächen-Sialoglykoprotein mit einem scheinbaren Molekulargewicht (MW) von etwas weniger als 97 000 Daltons, bestimmt mittels Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE). Monoklonale Antikörper haben drei wesentliche antigene Stellen, die auf einem stabilen tryptischen Fragment von 40 000 Dalton vorhanden sind (Brown et al., 1981, J. Immunol. 127: 539-546); die vollständige Sequenz von p97 ist jedoch noch nicht beschrieben. Wenigstens zwei weitere unabhängig charakterisierte menschliche Melanom-assoziierte Antigene, nämlich gp95 (Dippold et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6114- 6118) und gp97 (Khosravi et al, 1985, Int. J. Cancer 35: 73- 80), scheinen bei Analyse mittels sequentieller Immunfällung identisch mit p97 zu sein.

Die N-terminale Aminosäuresequenz von p97 ist homolog zu Transferrin. Wie Transferrin bindet p97 Eisen (Brown et al., 1982, Nature, London, 296: 171-173). Eine Analyse somatischer Zellhybride und in situ-Hybridisierung hat gezeigt, daß das p97-Gen, wie die Gene für Transferrin und für den Transferrin- Rezeptor, im chromosomalen Bereich 3q21-3q29 lokalisiert ist (Plowman et al., 1983, Nature, London, 303: 70-72; Yang et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2752-2756). Diese Beobachtungen deuten darauf hin, daß p97 eine Rolle beim Eisenmetabolismus spielt.

2.3. Krebs-Vakzine

Tierversuche, üblicherweise an Mäusen, haben gezeigt, daß eine Immunisierung mit lebenden oder abgetöteten Krebszellen zur Abwehr eines anschließenden Challenges lebensfähiger Krebszellen führen kann. Immunisierungsversuche mit zellfreiem Material gelangen im allgemeinen weniger, obwohl einige Erfolge beschrieben wurden. (Siehe Hellstrom and Brown, 1979, in The Antigenes, M. Sela ed. Academic Press, Vol. V: 1-66). In vielen Fällen waren die für den Schutzeffekt verantwortlichen Target-Antigene viral kodiert, in vielen anderen Fällen jedoch war der Aufbau des Antigens, das die den Schutz bewirkende Immunantwort verursacht, nicht bekannt.

Versuche am Menschen sind weit schwieriger und die Wirksamkeit von Krebs-Vakzinen ist trotz einiger Erfolge umstritten. In vielen Fällen waren die Vakzin-Zusammensetzungen bestrahlte Tumorzellen oder Tumorzellen, welche durch Einwirkung bestimmter chemischer Agenzien abgetötet wurden. Da reine menschliche, Tumor-assoziierte Antigene nicht zur Verfügung standen, ist ihre Anwendung in Vakzinen nicht beschrieben.

Ein wesentlicher theoretischer Einwand gegen die vorgeschlagene Anwendung von Krebs-Vakzinen bei Menschen besteht darin, daß bei Menschen, die beispielsweise mit abgetöteten Krebszellen oder zellfreien Präparationen "geimpft" wurden, keine Immunantwort erfolgt, weil die Tumorantigene, die die Targets für die Immunantwort darstellen, in einigen normalen Zellen, wenn auch nur in geringen Mengen, vorhanden sind, und daher vom Immunsystem als "Eigenmaterial" erkannt werden. Die meisten, wenn nicht alle, Tumor-assoziierten Antigene, die in menschlichen Tumoren mit Hilfe monoklonaler Antikörper gefunden wurden, sind auch in einigen normalen Geweben vorhanden. Es gibt nur wenige Anzeichen dafür, daß Krebspatienten auf diese Antigene wirksam in vivo ansprechen. Es gibt Hinweise, daß Suppressorzellen eine wesentliche Rolle dabei spielen, die Immunantwort auf Tumorantigene herabzuregulieren (Nepom et al., 1983, Experientia, 39: 235-242). Darüber hinaus kann eine durch einen Set an Tumorantigenen ausgelöste Antwort von Suppressorzellen die Induktion eines effektiven Tumor-zerstörenden Ansprechens auf einen weiteren Set auf Tumor-Antigenes verhindern, welche selbst keine Suppression induzieren würden (Hellstrom et al., 1983, in Biomembranes, A. Nowotny ed., Plenum Press, Seiten 365-388).

2.4. Rekombinante DNA-Techniken und Vaccinia-Virus

Die Anwendung der rekombinanten DNA-Technologie für die Herstellung von Subunit-Vakzinen zum Schutz gegen Infektionen umfaßt molekulares Klonen und Expression genetischer Information in einem geeigneten Vektor, die für Proteine codiert, welche eine Immunantwort gegen das Protein in einem Wirtstier auslösen können. Vor kurzem wurde ein neuer Weg gefunden, der möglicherweise für die Produktion von Subunit-Vakzinen brauchbar ist (Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Virol. 49: 857-864; Panicali, D. und Paoletti, E., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 4927-4931). Dieser Weg umfaßt den Einsatz von Vaccinia- Viren als Vektor, um fremde Gene, die in das Genom des Virus eingesetzt wurden, zu exprimieren. Nach Einführung in Wirtstiere exprimieren die rekombinanten Vaccinia-Viren das eingesetzte fremde Gen und verursachen dadurch eine Immunantwort des Wirts auf derartige Gene. Da lebende rekombinante Vaccinia-Viren als Vakzin verwendet werden können, umfaßt der angesprochene Weg sowohl die Vorteile eines Subunit-Vakzins als auch eines Vakzins auf Basis von lebendem Material.

Vaccinia-Viren enthalten ein lineares, doppelsträngiges DNA-Genom von ungefähr 198 kilobasen Paaren und sie replizieren im Cytoplasma infizierter Zellen. Diese Viren enthalten ein vollständiges Transkriptions-Enzymsystem (einschließlich der Capping-, methylierenden und polyadenylierenden Enzyme) im Viruskern, was für die Virusinfizierbarkeit erforderlich ist. Transkriptions-Regulatorsequenzen der Vaccinia-Viren (Promotoren) ermöglichen die Initiierung der Transkription durch Vakzin-RNA-Polymerase, nicht jedoch durch Zell-RNA- Polymerase des Wirts.

Die Expression fremder DNA in rekombinanten Vaccinia-Viren erfordert die Bindung von Vaccinia-Promotoren an Proteinkodierenden DNA-Sequenzen des fremden Gens. Plasmid-Vektoren, die auch als Insertionsvektoren bezeichnet werden, wurden konstruiert, um Chimären-Gene in Vaccinia-Viren einzusetzen. Eine Art der Insertionsvektoren besteht aus: (a) einem Vaccinia-Viruspromotor einschließlich der Transkriptions- Initiierungsstelle; (b) mehreren Restriktions-Endonuklease- Klonierungsstellen, die abwärts von der Transkriptionsstartstelle für die Insertion fremder DNA-Fragmente lokalisiert sind; (c) einer nicht-essentiellen Vaccinia-Virus DNA (wie das TK-Gen, die den Promotor und die Klonierungsstellen flankiert, welche die Insertion der Chimären-Gene in den homologen, nicht-essentiellen Bereich des Virusgenoms steuern; und (d) einem bakteriellen Replikationsursprung und antibiotischen Resistance-Marker zur Replikation und Selektion in E. coli. Beispiele derartiger Vektoren wurden von Mackett beschrieben (Mackett et al., 1984, J. Virol. 49: 857-864).

Rekombinante Vaccinia-Viren werden durch Transfektion rekombinanter, bakterieller Insertionsplasmide hergestellt, welche das fremde Gen in Zellen enthalten, die zuvor mit dem Vaccinia-Virus infiziert wurden. Es erfolgt dann eine Rekombination mit den infizierten Zellen, die zu einer Insertion des fremden Gens in das virale Genom führt. Die infizierten Zellen können mittels immunologischer Techniken untersucht werden, z. B. DNA-Plaque-Hybridisierung oder genetische Selektion auf rekombinante Viren, welche anschließend isoliert werden können. Diese Vaccinia-Rekombinanten haben ihre wesentlichen Funktionen und ihre Infektivität beibehalten. Sie können so aufgebaut werden, daß sie ungefähr 35 Kilobasen fremder DNA aufnehmen können.

Die Expression des fremden Gens kann mittels enzymatischer oder immunologischer Assays (beispielsweise Immunfällung, Radioimmunoassay oder Immunblotting) festgestellt werden. Natürlich vorkommende Membran-Glykoproteine, die aus rekombinanten mit Vaccinia-Viren infizierten Zellen hergestellt wurden, sind glykosyliert und können an die Zelloberfläche transportiert werden. Durch die Verwendung starker Promotoren oder durch Klonieren von mehrfachen Kopien eines einzelnen Gens kann man einen hohen Expressionsgrad erzielen.

3. Zusammenfassende Beschreibung der Erfindung

Es werden Vakzin-Formulierungen beschrieben, die zur Auslösung einer Immunantwort verwendet werden können, welche Melanom-Zellen in geimpften Individuen selektiv zerstört. Die erfindungsgemäßen Vakzin-Formulierungen umfassen ein Immunogen, das eine Immunantwort induziert, die gegen ein Melanom-assoziiertes Antigen, wie das Melanom-assoziierte p97-Antigen, gerichtet ist. Erfindungsgemäß sind eine Reihe von Vakzin-Formulierungen möglich. Beispielsweise umfaßt das Immunogen eines erfindungsgemäßen "Subunit-Vakzins" (Untereinheit-Vakzin) ein Peptid oder Protein, das p97 angehört und mit einem geeigneten Adjuvans formuliert werden kann. Derartige Peptide oder Proteine umfassen Aminosäuresequenzen, die sich von der vollständigen oder von einem Teil der Aminosäuresequenz von p97 ableiten und im wesentlichen der in Fig. 3 gezeigten Sequenz entsprechen. Darin eingeschlossen (ohne jedoch darauf begrenzt zu sein) sind abgeänderte Aminosäuresequenzen, in denen funktionell äquivalente Aminosäurereste durch Reste innerhalb der Sequenz ersetzt sind, die einen "silent change" ergeben, und/ oder modifizierte oder weiterverarbeitete Aminosäuresequenzen, beispielsweise glykosylierte Aminosäuresequenzen, phosphorilierte Aminosäuresequenzen etc. oder chemisch-modifizierte Aminosäuresequenzen. Im folgenden werden die erfindungsgemäßen Peptide oder Proteine, die zu dem Melanom-assoziierten p97-Antigen gehören, gleich ob sie in abgeänderter, nicht-geänderter, modifizierter oder nicht-modifizierter Form vorliegen, als "(zu) p97 (an) gehörende Peptide" bezeichnet. Wenn ein p97 angehörendes Peptid ein Hapten (d. h. Antigen aber nicht Immunogen) ist, kann das Hapten an ein Trägermolekül konjugiert sein, das Immunogenität verleiht.

Die erfindungsgemäßen, p97-angehörenden Peptide kann man unter Anwendung rekombinanter DNA-Techniken und/oder chemischer Synthesemethoden herstellen. Wenn man zu p97 gehörende Peptide chemisch synthetisiert, können derartige synthetische p97 angehörende Peptide diejenigen Aminosäuresequenzen umfassen, die aus Bereichen von p97 stammen, von denen man annimmt, daß sie antigen sind (Hopp and Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 3824-3828). Wenn die erfindungsgemäßen p97 angehörenden Peptide unter Anwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt werden, wird eine Nukleotidsequenz, die vollständig oder teilweise für p97 kodiert, in einem rekombinanten Expressionsvektor, beispielsweise ein Virus oder ein Plasmid, insertiert. Dieser Vektor kann in einem geeigneten Wirt die Expression eines zu p97 gehörenden Peptids herbeiführen, das aus dem Kulturmedium isoliert werden kann. Die insertierte Nukleotidsequenz leitet sich von der vollständigen oder teilweisen p97-Sequenz ab und entspricht im wesentlichen der in Fig. 3 gezeigten Sequenz, einschließlich (aber nicht darauf begrenzt) der Nukleotidsequenzen, in denen funktionell äquivalente Nukleotidcodons durch Codons innerhalb der Sequenz ersetzt sind, die zu einem "silent change" führen; mit anderen Worten, unterschiedliche Codons, die für die gleiche Aminosäure oder deren funktionelles Äquivalent kodieren, können innerhalb der in Fig. 3 gezeigten Sequenz substituiert werden. Wenn ein Plasmid-Expressionsvektor zur Anwendung kommt, ist ein zur Expression in eukaryontischen Zellen geeigneter Vektor bevorzugt, ein prokaryontischer Expressionsvektor kann jedoch ebenfalls verwendet werden.

Gemäß einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform, bei der der Expressionsvektor ein rekombinantes Virus ist, kann das Vakzin als virales Vakzin formuliert werden. Das Immunogen umfaßt dabei das rekombinante Virus, das ein zu p97 gehörendes Peptid exprimiert. In Abhängigkeit von der Art des als Immunogen verwendeten rekombinanten Virus kann man entweder ein Vakzin auf Basis inaktivierter Viren oder auf Basis von Lebendviren formulieren. Eine in geeigneter Weise mit den erfindungsgemäßen Vakzin-Formulierungen durchgeführte Immunisierung kann zur Induktion einer Immunantwort führen, die zur Zerstörung von Melanomzellen in dem immunisierten Individuum führt.

Erfindungsgemäß wird auch ein System beschrieben, nach dem die Vakzin-Formulierung getestet werden kann und das angibt, wie der Test durchgeführt werden soll. Die Wirksamkeit der Vakzin-Formulierungen kann beispielsweise in Tiermodellen bewertet werden, zunächst bei Nagetieren, anschließend bei Primaten, ausgenommen Menschen,
und schließlich bei Menschen, vorzugsweise bei Patienten, bei denen eine Remission zu beobachten ist und bei denen aber trotzdem ein Wiederauftreten des Melanoms aufgrund von Mikrometastasen sehr wahrscheinlich ist.

4. Kurzbeschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt ein Autoradiogramm der durch SDS-PAGE aufgetrennten zellfreien Translationsprodukte der p97-mRNA. In Fig. 1A zeigt die Spur 1 die Translationsprodukte von p97 angereicherter mRNA, während Spur 2 die Translationsprodukte unangereicherter mRNA zeigt, jeweils erhalten aus 0,5 µl Gesamttranslationsprodukte von 5 ng mRNA. In Fig. 1B zeigt Spur 1 die Translationsprodukte von p97 angereicherter mRNA, während Spur 2 die Translationsprodukte nicht angereicherter mRNA zeigt, jeweils erhalten aus 5 µl Translationsprodukte von 5 ng mRNA, erhalten durch Immunfällung mit anti-p97-Serum. In

Fig. 2 ist die Struktur von p97 mRNA in Form eines Diagramms dargestellt. Es wird der Aufbau des codierenden Bereichs von der Signalsequenz zur Verankerungssequenz) und des nicht-kodierenden Bereichs (3′UT) sowie die verdoppelte Domänenstruktur des p97 Precursors (open bar) gezeigt. Die Lokalisierung verschiedener Rekognitionssequenzen für Restriktionsenzyme ist oberhalb der mRNA angegeben. Die relative Position von vier cDNA-Klonen ist unterhalb der mRNA-Struktur angegeben. Der cDNA-Klon p97-3a2fl (3a2fl) wurde aus einer cDNA- Sammlung isoliert, in der die cDNAs auf oligo(T)-primed p97-enriched mRNAs transkribiert und in pBR322 kloniert wurden; die cDNA-Klone p97-2fl (2fl), p97-1jl (1jl), und p97-10al (10al) wurden dagegen durch priming cDNA-Synthese mit Oligonucleotiden, die für p97-Exonsequenzen codieren, und Klonen der erhaltenen cDNA-Fragmente in Lambda-gt10 erhalten. In

Fig. 2A sind die Genomklone B15, H17, B6.6 und E7.7, die in Lambda L47.1 kloniert wurden, in Form eines Diagramms dargestellt.

Fig. 3 zeigt die Nukleotidsequenz menschlicher p97- Precursor-cDNA und deren abgeleitete Aminosäuresequenz. Die N-terminalen Aminosäurereste, die zuvor durch Proteinsequenzierung bestimmt wurden, waren identisch mit den aus der Nukleotidsequenz vorhergesagten Resten (Aminosäurereste Nummern 21-30). Die potentiellen Glykosylierungsstellen an den Aminosäureresten 38, 135 und 515 (Doppelstrich) und der Membranankerbereich am C-Terminus (ausgezogener Strich) sind angegeben. Ein Polyadenylisierungssignal (AATAAA angegeben in einem Kasten) wurde bei Position 3847 gefunden, was 50 Basenpaare Upstream von einem polyadenylierten Bereich ist.

Fig. 4 zeigt einen Vergleich der vorhergesagten Aminosäuresequenz p97-Precurcors mit derjenigen von Human-Serotransferrin (Yang et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 81:2752-2756; Davis et al., 1985, J. Mol. Biol. 181: 111-121). Die erhalten gebliebenen Reste wurden eingerahmt. Die Tyrosin-, Histidin-, und Argininreste, die an der Bindung von Eisen durch Transferrin beteiligt sind (Mertz-Boutigue et. al., 1984, Eur. J. Biochem. 145: 659-676) sind durch einen Stern (*) gekennzeichnet.

Fig. 5 zeigt in Form eines Diagramms ein zweidimensionales Modell der Struktur von p97, basierend auf der Anwesenheit von Cysteinresten, die unter den zur Transferrin- Superfamilie zählenden Mitgliedern erhalten geblieben sind. Die drei potentiellen Glykosylierungsstellen sind durch Sterne (*) gekennzeichnet. Die hydrophobe Membranankerdomäne ist am C-Terminus von p97 (COOH) sichtbar.

Fig. 6 zeigt in Form eines Diagramms die genetische Struktur von: p97 cDNA-Klonen und das Fragment des Genomklons Lambda E7.7, welche zur Konstruktion des p97- Expressionsvektors verwendet werden; sowie den pSV2p97a-Expressionsvektor. Es werden die folgenden Abkürzungen verwendet: E, EcoRI; P, PvuII; Sal, SalI; S, SstI; B, BamHI.

Fig. 7 zeigt die Ergebnisse der Gelelektrophorese bei der Charakterisierung und Immunreinigung von rekombinantem p97-Protein. Ein transfektierter CHO-Klon (CHO3+) und SK-MEL-28 Human-Melanomzellen wurden mit ³⁵S-Cystein in Gegenwart (+TM) oder in Abwesenheit (-TM) von Tunicamycin (TM) markiert. Man gab die Zellen auf 100 mm² Platten und ließ sie nahezu zusammenfließen. Man entfernte das Medium und ersetzte es durch 3 ml- cysteinfreies Medium mit oder ohne Zugabe von 1 µg/ml-Tunicamycin. Nach 30 Minuten bei 37°C gab man 250 µCi pro ml L-³⁵S-Cystein (1016 Ci pro Mol; New England Nuclear) weitere 6 Stunden zu. Das Ernten der Zellen, die Herstellung von Zelllysaten, die Immunpräzipitation und die SDS-PAGE erfolgten wie oben beschrieben. Die Extrakte wurden einer Immunpräzipitation mit gegen p97-spezifischen Antikörpern unterzogen. Die Proteine wurden mittels SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) analysiert. (a) Mit Coomassie blau gefärbtes SDS-Polyacrylamidgel. Spur 1, Proteinmarker; Spur 2, immungereinigtes p97 aus transfektierten Maus-B16-Zellen; Spur 3, SK-MEL 28 Zellen +TM; Spur 4, SK-MEL 28 Zellen -TM; Spur 5, CHO3+ Zellen +TM; Spur 6, CHO3+ Zellen -TM. (b) Autoradiogramm des gleichen Gels wie bei (a).

Fig. 8 zeigt die Ergebnisse der Radioimmunpräzipitation von exprimiertem p97 in transfektierten Zellen oder in Vp97a-NY-infizierten Zellen. BSC-Zellen wurden über Nacht mit Vaccinia- Viren vom Wildtyp oder mit p97-rekombinanten Vaccinia-Viren infiziert. Diese Viren oder die transfektierte Zellinie CHO-p97.A wurden mit ³⁵S-markiertem Methionin und Cystein mit oder ohne Zugabe von 2 µg/ml Tunicamycin (Sigma) inkubiert. Sechs Stunden später wurden die Zellen lysiert, mit monoklonalen Antikörpern 96.5 präzipiziert und durch Elektrophorese an einem 10%igen Polyacrylamidgel getrennt. Das Gel wurde über Nacht autoradiographiert. Die Ergebnisse für die mit Tunicamycin behandelten Gruppen sind jeweils rechts dargestellt.

Fig. 9 zeigt die Serum-Antikörpertiter von Mäusen, die mit p97-Vakzinen immunisiert wurden. Die Werte für Tp97 wurden von fünf Mäusen erhalten, die mit 5 × 10⁶ bestrahlten M2svp97a.A. Zellen (syngene Tumorzellen, die transfektiert wurden und die Oberflächen-p97 exprimieren) in komplettem Freund's-Adjuvans immunisiert und mit der gleichen Anzahl an Zellen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung erneut behandelt wurden. Die p97-Werte wurden mit einer Gruppe von fünf Mäusen erhalten, die mit 100 µg gereinigtem p97-Protein in komplettem Freund's Adjuvans immunisiert und mit 50 µg wäßrigem Protein erneut behandelt wurden. Die Vp97-Werte wurden mit einer Gruppe von fünf Mäusen erhalten, die immunisiert und mit 10⁷-Plaque-forming- units an Vp97a-NY durch Schwanzskarifikation erneut behandelt wurden.

Fig. 10 zeigt den therapeutischen Effekt einer Impfung von Tumor-challenged Mäusen mit rekombinanten p97-Vaccinia-Viren (Vp97a- NY). Bei den Mäusen wurde mit 10⁵ oder 10⁴ p97-exprimierenden Tumorzellen (M2SVp97a.E) intravenös ein Challenge hervorgerufen. Zwei Tage später wurden die Mäuse durch Schwanzskarifikation entweder mit Vp97a-NY oder Vwt-NY inokuliert. Das Inokulieren mittels Schwanzskarifikation wurde wöchentlich wiederholt und die Überlebenszeit der Mäuse wurde bestimmt.

5. Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Vakzinen zur vorbeugenden Behandlung oder zur Behandlung von Melanomen. Die Erfindung beruht auf der Beobachtung, daß Melanome Tumorassoziierte Zelloberflächenantigene besitzen, wie das p97- Antigen, die in den Melanomzellen in größeren Mengen vorhanden sind als in normalen Geweben. Erfindungsgemäß werden Peptide oder Proteine, die zu dem Melanom-assoziierten p97- Antigen (d. h. p97-angehörende Peptide) gehören, unter Anwendung rekombinanter DNA-Techniken und/oder chemischer Synthesemethoden hergestellt. Die erfindungsgemäßen p97-angehörenden Peptide umfassen Aminosäuresequenzen, die sich vollständig oder teilweise von der Aminosäuresequenz von p97 herleiten und die im wesentlichen in Fig. 3 gezeigt sind. Sie umfassen von Fig. 3 abgeleitete Aminosäuresequenzen, die durch Substitution von einem oder mehreren Aminosäureresten innerhalb der Sequenz durch eine andere Aminosäure ähnlicher Polarität, die als funktionelles Äquivalent fungiert und deshalb eine "stille" Änderung bewirkt, abgeändert sind. Substitute für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz kann man aus anderen Mitgliedern der Klasse auswählen, zu der die Aminosäure gehört. Zu nicht-polaren (hydroben) Aminosäuren zählen beispielsweise Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Zu polaren, neutralen Aminosäuren gehören Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Positiv geladene (basische) Aminosäuren umfassen Arginin, Lysin und Histidin. Zu negativ geladenen (sauren) Aminosäuren zählen Asparaginsäure und Glutaminsäure. Die erfindungsgemäßen, p97-verwandten Peptide, unverändert oder verändert durch Substitution von Aminosäureresten, können durch Glykosylierung, Phosphorylierung etc. oder durch chemische Modifizierung weiter modifiziert oder prozessiert werden. Diese p97 angehörenden Peptide kann man als Immunogene in Vakzinformulierungen, die eine Immunantwort gegen die in dem geimpften Patienten vorhandenen Melanomzellen auslösen, verwenden.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung verwendet man rekombinante DNA-Techniken, um Nukleotidsequenzen, die für das p97-Antigen kodieren, in Expressionsvektoren einzusetzen, die die Expression der p97 angehörenden Peptide in geeigneten Wirtszellen steuern. Die für das p97-Antigen codierenden Nukleotidsequenzen umfassen Nukleotidsequenzen, die von der vollständigen p97-Nukleotidsequenz oder von Teilen davon abgeleitet sind und die im wesentlichen in Fig. 3 dargestellt sind. Aufgrund der Degeneration des DNA-Codes für Aminosäuren (d. h. die meisten Aminosäuren können durch mehr als einen Kodon codiert werden) kann man funktionell äquivalente Kodons (d. h. unterschiedliche Kodons, die für die gleiche Aminosäure oder deren funktionelles Äquivalent codieren) innerhalb der in Fig. 3 gezeigten p97-Sequenz substituierte, unter der Voraussetzung, daß die Substitution eine "stille" Änderung ergibt. Die Expressionsvektor- Wirtszellsysteme, die eine Nukleotidsequenz enthalten, die für das vollständige p97 oder einen Teil davon codiert, kann man zur Herstellung größerer Mengen von reinem p97 angehörenden Peptiden in-vitro verwenden. In diesem Fall können die Gen-Produkte aus den Zellkulturen gereinigt und als Immunogene in Subunit-Vakzinformulierungen verwendet werden. Die Reinigung des p97 angehörenden Peptids kann unter Anwendung verschiedener biochemischer Methoden, einschließlich der Immunoaffinitätsreinigung unter Verwendung monoklonaler Antikörper, erfolgen. Daneben kann man die Reinigung der p97 angehörigen Peptide durch Modifizierung der DNA-Sequenzen erleichtern, die für p97 angehörende Peptide codieren, so daß die für die Verankerung des Proteins an der Plasmamembran verantwortlichen Sequenzen entfernt werden, die für den Transport des Proteins an die Zellmembran verantwortlichen Sequenzen dagegen nicht entfernt werden. Auf diese Weise wird ein verkleinertes antigenes Molekül durch die Wirtszelle in das Kulturmedium sekretiert. Bei p97 angehörenden Peptiden, die durch prokaryontische Zellen produziert werden, kann das Fehlen geeigneter posttranslationaler Modifizierungen zu einem Antigen-inaktiven Produkt führen, das durch geeignete chemische oder sonstige Behandlung aktiviert werden muß.

Bei Ausführungsformen, bei denen der Expressionsvektor ein Virus ist, kann das Virus selbst als Vakzin formuliert werden. Man kann dann inaktivierte, rekombinante Virusvakzine herstellen. Wenn der Expressionsvektor ein infektiöses, rekombinantes Virus ist, das im Wirt keine Erkrankung verursacht, kann man entweder eine inaktivierte virale Vakzinzusammensetzung oder eine Vakzinzusammensetzung auf Basis von Lebendviren formulieren, wobei diese Zusammensetzungen eine starke Immunität bewirken. Ein für diesen Zweck besonders brauchbarer Expressionsvektor ist ein rekombinantes Vaccinia-Virus, das die erfindungsgemäßen p97 angehörenden Peptide exprimiert. Zu diesem Zweck insertiert man eine Nukleotidsequenz, die für das vollständige p97-Antigen oder einen Teil davon codiert, in einen Vaccinia-Virusvektor, der in der Lage ist, die Expression der Sequenz in einem geeigneten Wirt zu steuern. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung anderer Virusexpressionsvektoren als Vakzine, insbesondere Adenoviren.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die von p97 abgeleitete Aminosäuresequenz auf Sequenzen hin untersucht, und zwar auf der Grundlage von Eigenschaften, insbesondere der Hydrophilie, welche auf die Anwesenheit dieser Sequenz an der Oberfläche des Proteinmoleküls und auf dessen wahrscheinliche Antigenität und/oder Immunogenität hinweisen. Die p97 angehörenden Peptide kann man chemisch synthetisieren und als Immunogene in Vakzinformulierungen verwenden.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Produktion von p97 angehörenden Peptiden, das auch für andere Zwecke als für die Vakzinproduktion verwendet werden kann. Die p97 angehörenden Peptide kann man zur Immunisierung von Tieren verwenden, um Antiseren oder monoklonale Antikörper herzustellen, die für die jeweils interessierenden Melanomzellen spezifisch sind. Sie können dann als Komponente in Diagnoseassays oder zur Affinitätsreinigung radiomarkierter, an Arzneimittel oder Toxine-gebundener Antikörper für die Krebstherapie verwendet werden.

Die Erfindung wird anhand von Beispielen erläutert, in denen die Herstellung eines auf p97 basierenden Vakzins gegen menschliche Melanome beschrieben wird. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Methoden und Zusammensetzungen sind jedoch nicht auf die Konstruktion von Vakzinen unter Verwendung von p97 beschränkt, sondern sie können auch auf andere Tumor-assoziierte Antigene angewandt werden.

Nachfolgend wird die Erfindung folgendermaßen beschrieben: (a) die Nukleotid- und Aminosäuresequenz von p97; (b) p97 angehörende Peptide, die durch chemische Synthesemethoden hergestellt wurden; (c) p97 angehörende Peptide, die durch Expressionsvektor-Wirtsysteme hergestellt wurden; (d) immunologische Charakterisierung der p97 angehörenden Peptide; und (e) Formulierung von Vakzinen.

5.1. Sequenzanalyse des Melanom-assoziierten p97-Antigens

Die Nukleotidsequenz des für p97 codierenden Gens und dessen davon abgeleitete Aminosäuresequenz sind in Fig. 3 gezeigt. Funktionell äquivalente Sequenzen fallen in den Rahmen der vorliegenden Erfindung. Dazu zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Nukleotidsequenzen, die die in Fig. 3 gezeigte Nukleotidsequenz vollständig oder teilweise umfassen und die durch Substitution unterschiedlicher Kodone abgeänderten, welche für den gleichen oder einen funktionell äquivalenten Aminosäurerest codieren, wodurch eine "stille" Änderung erzeugt wird. Ferner zählen dazu Aminosäuresequenzen, die die in Fig. 3 gezeigte Aminosäuresequenz vollständig oder teilweise umfassen und die durch Substitution funktionell äquivalenter Aminosäurereste innerhalb der Sequenz unter Erzeugung einer "stillen" Änderung abgeändert sind, sowie die beispielsweise durch Glykosylierung, Phosphorylierung etc. oder durch andere chemische Änderungen modifizierten oder prozessierten Derivate davon.

In den folgenden Abschnitten werden die Strategie, die zur Bestimmung der in Fig. 3 dargestellten Sequenz von p97 herangezogen wurde, sowie alternative Techniken beschrieben, die zur Bestimmung der Sequenz von p97 oder anderer für Vakzin-Formulierungen geeigneter Tumorantigene brauchbar sind.

5.1.1. Identifizierung und Charakterisierung des Melanom-assoziierten p97-Antigens

Die Aktivität und die Aminosäuresequenz des Melanom-assoziierten p97-Antigens war nicht bekannt; die Identifizierung des p97-Antigens erfolgte unter Anwendung monoklonaler Antikörper gegen p97. Man kann eine Reihe von Methoden zur Erzeugung monoklonaler Antikörper, die spezifisch auf p97 sind, verwenden. Beispielsweise kann die von Kohler und Milstein (1975, Nature 250: 495-497) entwickelte Hybridomtechnik folgendermaßen angewandt werden: Man immunisiert Mäuse oder Ratten mit menschlichen Melanomzellen und verschmilzt die aus den immunisierten Tieren erhaltenen Lymphozyten mit Myelomzellen; in alternativer Weise kann man Lymphozyten von Melanompatienten mit Myelomzellen verschmelzen (Cote, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026; Haspel et al., 1985, Cancer res. 45: 3951). Weiter kann man für die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern gegen p97 die Methode zur Produktion monoklonaler Antikörper unter Verwendung des Epstein-Barr-Virus einsetzen (Cole et al., 1985, The EBV- Hybridoma Technique and its Application to Human Lung Cancer, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., Seiten 77-96). In jedem Fall untersucht man die erhaltenen Hybridome auf die Produktion von Antikörpern hin, die an Melanomzellen, nicht aber an normale Zellen binden.

Die oben beschriebenen, gegen p97 gerichteten monoklonalen Antikörper kann man auf vielfältige Weise benutzen, um die Identifizierung, Charakterisierung, Klonierung und Expression von Nukleotidsequenzen zu erleichtern, welche die Herstellung der Peptide und Proteine, die zu dem p97-Antigen gehören, in großen Mengen erlauben. Beispielsweise kann man die monoklonalen Antikörper dazu benutzen, das p97-Antigen weiter zu charakterisieren, indem man alle von der Tumorzelle erzeugten Proteine radiomarkiert, eine Immunpräzipitation der Tumorproteine mit den zur Identifizierung des p97-Antigens eingesetzten monoklonalen Antikörper durchführt und die bei der Immunpräzipitation gefällten Proteine mittels Gelelektrophorese fraktioniert. Die Proteinantigene werden als Einzelbanden auf dem erhaltenen Autoradiogramm identifiziert (Brown et al., 1980, J. Biol. Chem. 255: 4980-4983). Monoklonale Antikörper gegen p97 kann man darüber hinaus zur Erleichterung des Klonierens in folgender Weise verwenden: (a) zur Immunreinigung von Polysomen, um mRNA-Transkripte, die in den für das p97-Antigen codierenden Melanomzellen vorhanden sind, zu identifizieren und zu erhalten; (b) zur Identifizierung von Klonen in einer cDNA Expressionslibrary, welche die zu p97 gehörenden Peptide oder Proteine exprimiert; (c) zur Reinigung des p97-Antigens, um weitere monoklonale Antikörper oder Antisera herzustellen, die für die beiden voranstehenden Anwendungsmöglichkeiten eingesetzt werden können; oder (d) zur Identifizierung von Zellen, in die das Gen für das p97-Antigen durch Transfektion eingeführt worden ist.

Die monoklonalen Antikörper kann man auch zur Erleichterung der strukturellen und immunochemischen Charakterisierung des p97-Antigens verwenden, um die extrazellulären und antigenen Domänen des Moleküls zu identifizieren und das Molekül zur Aminosäuresequenzanalyse zu reinigen (Brown et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 539-543; Brown et al., 1982, Nature, London, 296: 171-173).

Die weitere Charakterisierung von p97 umfaßt die Bestimmung der zellulären Lokalisierung und der Kartierung antigener Determinanten und funktioneller Domänen. Die subzelluläre Lokalisierung kann man durch Immunofluoreszenz-Mikroskopie und durch zelluläre Fraktionierungsexperimente bestimmen.

Antigene, wie p97, die auf der Zelloberfläche vorhanden sind, sind zur Vakzinherstellung bevorzugt, obwohl auch intrazelluläre Antigene brauchbar sind. Wenn multiple monoklonale Antikörper zur Verfügung stehen, können die antigenen Determinanten durch Kompetitionsexperimente kartiert werden, wobei jeder Antikörper radiomarkiert und in Kompetition mit jedem der anderen Antikörper getestet wird. Die Domänen des Moleküls kann man durch limitierte Verdauung mit Proteasen und einer anschließenden SDS-PAGE identifizieren. Zusammen sollten diese Daten die Identifizierung von Bereichen des Moleküls ermöglichen, die am stärksten immunogen sind. Wenn die monoklonalen Antikörper durch Immunisierung mit intakten Zellen erhalten worden sind, dann sind diese Molekülbereiche sehr wahrscheinlich extrazellulär und zur Vakzinkonstruktion brauchbar.

Die Aminosäuresequenzanalyse ermöglicht die eindeutige Identifizierung eines Proteins und dessen Vergleich mit anderen Proteinen (Brown, et. al., 1982, Nature, London, 296: 171-173). Wenn das Protein mehr als 50 Aminosäurereste umfaßt, ist es möglich, nur einen Teil der Aminosäuresequenz, am häufigsten den N-Terminus, zu bestimmen. Proteinantigene zur Sequenzierung von Aminosäuren können aus Zelllysaten durch Immunoaffinitätschromatographie mit monoklonalen Antikörpern und anschließend durch präparative SDS-PAGE gereinigt werden. Die N-terminale Aminosäuresequenz des gereinigten Proteins bestimmt man dann unter Verwendung eines automatischen Aminosäuresequenzanalysators, wobei man zur Erzielung größter Sensitivität, vorzugsweise ein Gasphasengerät, verwendet.

5.1.2. Identifizierung, Klonierung und Sequenzierung von DNA, die für das Melanom-assoziierte p97-Antigen codiert

Erste Klonierungsuntersuchungen befaßten sich mit häufig vorkommenden Proteinen, wie Globin und Ovalbumin, deren mRNAs häufig 10 bis 50% der gesamten mRNA ausmachten. Diese mRNAs konnten bis zur Homogenität durch Größenfraktionierung gereinigt werden. Reine cDNA-Sonden wurden dazu verwendet, Gen-Banken von mehreren hundert Klonen durch Kolonie- Hybridisierung zu screenen. Bei Proteinen, deren mRNAs 1 bis 10% der gesamten mRNA ausmachen, kann man die differentielle Hybridisierung mit zwei cDNA-Sonden verwenden, wobei eine der cDNA-Sonden die interessierende Sequenz enthält und die andere als negative Kontrolle fungiert. Messenger RNAs, die für selten vorkommende Proteine codieren, (wie Tumor-assoziierte Antigene) und die nur 0,01% der zellulären mRNA ausmachen, sind wesentlich schwieriger zu klonen, weil zehntausende von Klonen gescreent werden müssen und cDNA-Sonden kein spezifisches Hybridisierungssignal ergeben. Beide Probleme kann man durch Anreichern der mRNA für die interessierende Sequenz verringern.

Nachfolgend werden einige Möglichkeiten beschrieben, die zur Klonierung von DNA verwendet wurden, welche für menschliche Melanom-assoziierte p97-Antigene kodiert. Die erhaltenen Klone werden analysiert, um ein Klon oder Klone zu identifizieren, das den gesamten kodierenden Bereich von p97 überspannt. Die p97-Nukleotid-Insertionen der so intendifizierten Klone kann man anschließend anhand von bekannten Methoden sequenzieren. Die verschiedenen Möglichkeiten werden nachfolgend detailliert beschrieben.

(a) Isolierung von mRNA durch Polysom-Immunreinigung

Bei dieser Methode werden Polysomen (die aus mRNA, Ribosomen und naszierenden Polypeptidketten bestehen) gereinigt durch Immunaffinitätschromatographie mit Antikörpern, die auf den naszierenden Ketten vorhandene antigene Determinanten erkennen. In vielen Fällen erkennen monoklonale Antikörper, die durch Immunisierung mit intakten Zellen oder Zellextrakten erhalten wurden, die Antigene in ihrer nativen Konformation. Es kann jedoch sein, daß die Antikörper nicht zur Polysom- Immunreinigung geeignet sind, weil die Möglichkeit signifikant ist, daß die erkannten antigenen Determinanten nicht auf naszierende Ketten vorhanden sind. Da die Translation am N-Terminus des Polypeptids beginnt, sind die nahe am C-Terminus vorliegenden Epitope auf der Mehrzahl der naszierenden Ketten nicht vorhanden. Dieses Problem vermeidet man entweder durch Verwendung von Antikörpern, die N-terminale Epitope erkennen oder durch die Herstellung von Polysomen aus Zellen, die mit einem Proteinsyntheseinhibitor behandelt wurden, der die Termination blockiert.

Ein größeres Problem besteht darin, daß die reifen Proteine sich von den naszierenden Ketten aufgrund post-translationaler Modifikationen unterscheiden. Dieses Problem ist besonders akut bei Zelloberflächenproteinen, die durch Entfernung der Signalpeptide, Anfügen der Kohlenhydratseitenketten und Bildung der Disulfidbrücken stärker modifiziert sind. Wenn ein polyklonales Antiserum zur Polysom-Immunreinigung verwendet wird, haben die Antigenitätsunterschiede zwischen naszierenden Ketten und reifen Proteinen geringe Folgen, weil während der Immunisierung das Kaninchen oder ein anderes Tier nicht nur dem nativen Protein, sondern auch teilweise oder vollständig denaturierten Formen davon ausgesetzt ist, insbesondere wenn man Freund's Adjuvans verwendet. Selbst wenn diese Antikörper nur einen kleinen Teil der Antikörperpopulation darstellen, können noch immer genügend davon vorhanden sein, um die naszierenden Ketten zu binden. Die Herstellung polyklonaler Antiseren gegen in geringen Mengen vorhandene Proteine kann äußerst schwierig sein. Auch wenn man monoklonale Antikörper zur Reinigung von Antigenen für weitere Immunisierungen verwenden kann, ergibt jedes Gramm kultivierter Zellen häufig nur ein Mikrogramm Antigen. Dies ist zwar zur Immunisierung mehrerer Mäuse ausreichend, es ist jedoch kaum ausreichend für ein Kaninchen.

Eine weitere Lösung dieses Problems besteht darin, monoklonale Antikörper zu erzeugen, die auf naszierenden Ketten vorhandene antigene Determinanten erkennen, indem man denaturiertes p97-Antigen als Immunogen zur Herstellung der monoklonalen Antikörper verwendet. Bei dem erfindungsgemäßen Beispiel standen eine Reihe monoklonaler Antikörper zur Verfügung, welche drei unterschiedliche Epitope an der N-terminalen Domäne (mit einem Molekulargewicht von 40 000 Dalton) des p97-Moleküls erkennen konnten. Es wurde ein Pool monoklonaler Antikörper verwendet, von denen jeder unterschiedliche Spezifität besaß, in der Erwartung, daß einer oder mehrere davon an die naszierenden Ketten binden würde. Die gewählten Antikörper waren insofern hoch spezifisch auf p97, als jeder davon zu einer Immunpräzipitation einer einzelnen p97-Bande aus einem radiomarkierten Gesamtzell-Lysat führte und sie hohe Bindungsaffinitäten besaßen. Zum Klonieren wurden drei IgG2a-Antikörper gewählt, wobei einer spezifisch gegenüber jedem der drei Epitope war. Die Erfolgschancen kann man im allgemeinen erhöhen, indem man mehrere Antikörper gegen unterschiedliche Epitope einsetzt.

Bei der Verwendung von monoklonalen Antikörpern bleibt die Frage offen, wie man voraussagen kann, ob ein gegebener monoklonaler Antikörper oder eine Kombination von Antikörpern die naszierenden Ketten erkennen wird und somit zur Anwendung bei der Polysom-Immunreinigung geeignet sein wird. Eine Möglichkeit ist zu bestimmen, ob der monoklonale Antikörper das Antigen immunpräzipitiert, das in das Reticulocyten-Lysatsystem translatiert worden ist. Es beruht auf der Annahme, daß die nicht-prozessierten in-vitro Translationsprodukte den naszierenden Ketten ähneln. Eine andere Möglichkeit ist die Polysom-Immunpräzipitation in geringem Maßstab durchzuführen und dann die in-vitro-Translation heranzuziehen, um zu bestimmen, ob die interessierende mRNA-Spezies angereichert worden ist.

Bei der Anwendung der Polysom-Immunreinigung ist es wichtig, die Reinigung durch Bestimmung der mRNA-Aktivität zu kontrollieren. Dies kann durch Translation der mRNA in ein Reticulocyten- Lysatsystem und Analyse der Translationsprodukte mittels SDS-PAGE erfolgen. Auch wenn die Menge an Tumor- assoziiertem Antigen als Komponente der Translationsprodukte der nicht angereicherten mRNA zu gering ist, um unter den hunderten von häufiger vorkommenden Spezien entdeckt zu werden, so sollte es dennoch in den Translationsprodukten nachweisbar sein, die von den angereicherten mRNA-Proben stammen.

In alternativer Weise kann man das Xenopus oocyt-Translationssystem verwenden, wenn ein sensitiver Immunoassay zum Nachweis des translatierten, Tumor-assoziierten Antigens zur Verfügung steht. Für p97 kam zu diesem Zweck ein hochsensitiver Doppeldeterminanten-Immunmoassay (DDIA) zur Anwendung, bei dem zwei monoklonale Antikörper eingesetzt werden, die spezifisch gegen zwei verschiedene p97-Epitope sind.

Zur Polysom-Immunreinigung kann man an Sepharose gebundenes Protein A verwenden. Das Protein-A-Adsorbens wird bei diesem Verfahren zweifach angewandt. Die erste Anwendung dient zur Reinigung der monoklonalen Antikörper aus den rohen Ascitesflüssigkeiten, wodurch die kontaminierende Ribonukleaseaktivität entfernt wird. Das Protein A-Adsorbens kommt dann in Verbindung mit den gereinigten Antikörpern zur Immunreinigung der Polysome, die die spezifische naszierende Kette enthalten, zur Anwendung.

Die Translation der mRNA in ein Reticulocyten-Lysatsystem ermöglicht die biochemische Charakterisierung der Translationsprodukte sowie die Bestimmung ihrer Reinheit.

(b) Oligonukleotid-Sonden

Eine weitere Methode die erfindungsgemäß zur Klonierung der cDNA verwendet werden kann, welche für ein Tumor-assoziiertes Antigen, wie p97, codiert, besteht darin, die Aminosäuresequenz des Antigens teilweise oder vollständig zu bestimmen und eine Oligonukleotidsonde zu synthetisieren, die auf der von der Aminosäuresequenz abgeleiteten Nukleotidsequenz beruht. Das Oligonukleotid kann man dann als Primer für die cDNA-Synthese und als Sonde zum Screening der erhaltenen cDNA-Library verwenden. Dementsprechend kann man das Melanom- assoziierte p97-Protein aus Lysaten von Melanomzellen auf einfache Weise mittels Affinitätschromatographie mit einem spezifischen monoklonalen Antikörper reinigen (Brown, et al., 1982, Nature, London 296: 171-173). Eine für einen Teil der bestimmten Aminosäuresequenz codierende Nukleotidsequenz wird dann synthetisiert und kann als Primer und/ oder Sonde verwendet werden. Teile der Aminosäuresequenz, die Aminosäurereste enthalten, welche durch ein einziges Kodon oder durch zwei Kodons codiert sind, sind für diesen Zweck am geeignetsten. Eine Möglichkeit besteht in der Synthese einer längeren Sequenz, typischerweise 25 bis 60 Nukleotide, die die wahrscheinlichste Kodierungssequenz darstellt, basierend auf der bekannten Häufigkeit mit der ein Kodon beim Menschen vorkommt. Die Verwendung von zwei synthetischen Oligonukleotiden, die auf unterschiedlichen Teilen der Aminosäuresequenz basieren, erleichtert das Screening, dadurch daß die Erkennung von pseudo-positiven Hybridisierungssignalen ermöglicht wird. Weiter wird das Screening auch durch Hybridisierungskonditionen erleichtert, die den Effekt des GC-Gehalts auf den Schmelzpunkt der DNA-Hybride minimieren. Sobald mit Hilfe dieser Methode ein partieller cDNA-Klon erhalten worden ist, kann er als Sonde verwendet werden und dazu beitragen, einen cDNA-Klon voller Länge zu erzeugen.

(c) cDNA-Expressions-Genbanken (Libraries)

Es wurden Klonierungsvektoren entwickelt, die die Expression der cDNA-Insertion in Bakterien ermöglichen. Eine Möglichkeit hierfür, die zur Erzeugung von cDNA-Klonen für Tumor-assoziierte Proteine, wie p97, verwendet werden kann, ist die Herstellung einer cDNA-Library durch reverse Transcription der mRNA (angereichert oder nicht angereichert), die wie oben beschrieben aus Melanomzellen isoliert wurde, unter Verwendung der oben beschriebenen Oligo(T)-nukleotidprimer oder der synthetischen Oligonukleotidprimer und das Screening einer derartigen Library mit einem monoklonalen Antikörper gegen das Melanom-assoziierte p97-Protein. Klone, die DNA enthalten, welche für Epitope codiert, die durch die monoklonalen Antikörper in der korrekten Orientierung und im richtigen Leserahmen erkannt werden, exprimieren Peptide oder Proteine, die zu dem Melanom-assoziierten p97 Protein gehören. Man kann sie identifizieren, indem man die durch die Klone exprimierten Proteine auf ein Nitrozellulosefilter überführt, das Filter mit dem Antikörper inkubiert und anschließend mit einem markierten Anti-Immunglobulinreagens entwickelt.

Ein potentielles Problem besteht darin, daß viele monoklonale Antikörper das durch die Bakterien exprimierte Protein nicht erkennen, weil in vielen Fällen nur ein Teil der cDNA im Insert enthalten und die Bakterienproteine nicht in der Weise prozessieren, wie eucaryotische Zellen. Dieses Problem ist besonders akut bei Tumorzelloberflächenproteinen, die durch Entfernung der Signalpeptide, Anfügung der Kohlenhydratseitenketten und Bildung von Disulfidbrücken stärker modifiziert sind. Es kann deshalb erforderlich sein, monoklonale Antikörper zu erzeugen, von denen bekannt ist, daß sie denaturierte Antigene erkennen oder polyspezifische Antisera durch Immunisierung mit gereinigten Antigenen erzeugen.

Sobald ein rekombinanten Virus oder Plasmid identifiziert ist, von dem man annimmt, daß es ein cDNA-Insert enthält, das sich von einem Melanom-assoziierten p97-Antigen ableitet, kann man das cDNA-Insert zum Screening weiterer Gen-Banken verwenden um entweder Klone voller Länge oder eine Gruppe von Klonen zu identifizieren, die die volle Länge der für p97 codierenden cDNA überspannen. Die Identität der klonierten cDNA kann nachgewiesen werden durch Sequenzanalyse und Vergleich der hergeleiteten N-terminalen Aminosäuresequenz mit derjenigen Sequenz, die durch direkte Analyse der Aminosäuresequenz des p97-Proteins bestimmt wurde.

(d) Genomklonieren

Die folgenden Methoden ermöglichen das Klonieren von DNA unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen antigene Determinanten, die nur in nativen Proteinen, nicht aber in naszierenden Ketten oder in Proteinen, die in Bakterien exprimiert sind, vorhanden sind. Zu diesem Zweck wird DNA von humanen Melanomzellen in L-Mäusezellen durch Transfektion eingeführt. Anschließend werden die Mäusezellen, die das Melanom-assoziierte p97-Antigen exprimieren, isoliert und zwar entweder unter Anwendung fluoreszenz-aktivierter Zellsorter oder durch immunologische Identifizierung von Kolonien, die p97 angehörende Peptide produzieren unter Einsatz radiomarkierter monoklonaler Antikörper gegen p97, um zugehörige Peptide auf Kolonierepliken, die auf Polyesterfilter übertragen wurden, nachzuweisen. Es können mehrere Transfektionsrunden erforderlich werden, um nicht zugehörige humane DNA-Sequenzen zu entfernen. Anschließend wird eine Genom- Library in einem Lambda-phagen-Vektor hergestellt und einem Screening auf Klone unterzogen, welche humane repetitive Sequenzen enthalten, die in den Intronen der meisten Gene auftreten. Sobald ein Genomklon identifiziert ist, kann dieser als Hybridisierungssonde zur Identifizierung von cDNA-Klonen verwendet werden, welche die für p97 kodierende DNA enthalten.

5.2. Synthese antigener Fragmente des Melanom-assoziierten p97-Antigens und Bewertung der Immunogenität

Synthetische Peptide kann man als Immunogene verwenden, um eine Immunantwort gegen native Proteine auszulösen, die einen Schutz gegen zahlreiche Pathogene darstellen können. Derartige Peptidsequenzen wählt man aus der bekannten Aminosäuresequenz von antigenen Proteinen durch Identifizierung von solchen Aminosäurebereichen, die wahrscheinlich auf der dem externen Medium ausgesetzten Oberfläche des Proteinmoleküls vorhanden sind. Dies wird im allgemeinen durch eine Computeranalyse der Aminosäuresequenz unter Anwendung feststehender Hydropathieparameter für die Aminosäuren erreicht. Weitere Kriterien, wie die vorhergesagte Sekundärstruktur oder die Flexibilität, kann man ebenfalls verwenden.

Dementsprechend kann man synthetische Peptide mit 5 bis 50 Aminosäureresten des Melanom-assoziierten p97-Proteins in Tierversuchen (üblicherweise an Mäusen oder Kaninchen) auf Immunogenität testen. Derartige synthetische Peptide umfassen (ohne jedoch darauf begrenzt zu sein) die vollständige und im wesentlichen in Fig. 3 dargestellte Aminosäuresequenz oder einen Teil davon einschließlich abgeänderter Sequenzen, wobei funktionell äquivalente Aminosäurereste durch Reste innerhalb der Sequenz ersetzt sind, was zu einer stillen Änderung führt und/oder einschließlich modifizierter oder prozessierter Sequenzen, wie glykolysierte Sequenzen, phosphorylierte Sequenzen etc. oder chemisch modifizierter Sequenzen. Diese p97 angehörenden Peptide verwendet man entweder allein oder gekoppelt an ein Trägerprotein, wie das Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH). Man kann gegebenenfalls in jedem Fall ein Adjuvans verwenden, die Verwendung eines derartigen Adjuvans ist bevorzugt. Die immunisierten Tiere werden geboostet und auf Antikörper gegen das immunisierende Peptid getestet. Diejenigen Tiere mit Antipeptid-Antikörpern werden auf Antikörper getestet, die das native p97-Protein binden. Bei Tumor-assoziierten Antigenen, wie p97, ist es auch von Interesse auf eine zelluläre Immunantwort zu testen, beispielsweise indem man nach einer verzögerten Hypersensitivität (DTH), einer antigen-stimulierten Proliferation in-vitro, cytolytischen T-Zellen oder Tumorabwehr in einem geeigneten Modell sucht. Ein geeignetes Modell wäre ein Mäusetumor, der die humanen Tumor-assoziierten Antigene als Resultat der Transfektion mit einer geeigneten cDNA-Expressionsvektorkonstruktion exprimiert.

Ziel ist die Identifizierung von Peptiden, die eine starke Immunantwort gegen das Melanom-assoziierte p97-Antigen auslösen. Sobald diese Peptide identifiziert sind, kann man sie in großen Mengen anhand bekannter chemischer Synthesemethoden herstellen. Alternativ kann man die identifizierten Peptide durch Expression der Nukleotidsequenzen, die für derartige Peptide in Expressionsvektor-Wirtzellsystemen codieren, in großen Mengen herstellen.

5.3. Produktion von p97-angehörenden Peptiden durch Expressionsvektor-Wirtsysteme

Proteine und Peptide kann man in großen Mengen herstellen, indem man für Nukleotide codierende Sequenzen in einen geeigneten Expressionsvektor einführt, welcher wiederum in geeignete Wirtszellen eingeführt wird, zu denen Bakterien, Hefen, Insektenzellen und Säugetierzellen zählen, ohne jedoch darauf begrenzt zu sein. Bakterielle Wirte besitzen viele Vorteile, sie prozessieren aber viele eukaryotische Proteine nicht in geeigneter Weise und sie sind weniger geeignet als eukaryotische Zellen zur Expression von Tumor-assoziierten Proteinen. Rekombinante, in Bakterien produzierte Proteine sind jedoch zur Induktion eines Ansprechens von T-Zellen brauchbar, weil man annimmt, daß ein derartiges Ansprechen die ursprüngliche Degradation des antigenen Proteins erfordert.

Um p97 angehörende Peptide in einem Vektor-Wirtsystem zu exprimieren, insertiert man Nukleotidsequenzen, die für das Melanom-assoziierte p97-Antigen oder einen Teil davon codieren, in einen geeigneten Expressionsvektor. Zu derartigen Nukleotidsequenzen zählt, ohne darauf begrenzt zu sein, die vollständige, im wesentlichen in Fig. 3 dargestellte DNA-Sequenz von p97 oder ein Teil davon, einschließlich abgeänderter Sequenzen, bei denen ein oder mehrere Kodons innerhalb der Sequenz durch einen Kondon substituiert sind, der für den gleichen oder einen funktionell äquivalenten Aminosäurerest codiert, so daß daraus eine neutrale oder stille Änderung in der Sequenz resultiert. Der Expressionsvektor enthält die erforderlichen Elemente für die Transkription und Translation der insertierten Protein-codierenden Sequenz. Diese Elemente variieren hinsichtlich ihrer Stärke und Spezifität. In Abhängigkeit von dem zur Anwendung kommenden Wirt-Vektorsystem kann man viele geeignete Transkriptions- und Translationselemente einsetzen. Wenn man beispielsweise in Säugetierzellsystemen kloniert, kann man Promotoren, die aus dem Genom von Säugetierzellen (z. B. Mäuse-Metallothioneinpromotor) oder aus Viren isoliert wurden, welche in diesen Zellen wachsen (z. B. Vaccinia-Virus 7.5K-Promotor) verwenden. Promotoren, die mittels rekombinanter DNA oder synthetischer Methoden hergestellt wurden, kann man ebenfalls für die Transkription der insertierten Sequenzen verwenden.

Spezifische Startsignale sind für die effiziente Translation insertierter Protein-codierender Sequenzen ebenfalls erforderlich. Diese Signale umfassen das ATG-Startkodon und anschließende Sequenzen. Wenn entweder die Gen- oder cDNA- Sequenz in einen geeigneten Expressionsvektor insertiert wird, braucht man keine weiteren Translationskontrollsignale. Wenn dagegen nur ein Teil der codierenden Sequenz insertiert wird, müssen ggf. exogene Translationskontrollsignale, einschließlich des ATG-Codons, bereitgestellt werden. Der Startcodon muß darüber hinaus in Phase bezüglich des Leserahmens der Protein-codierenden Sequenzen sein, um eine Translation der gesamten Insertion sicherzustellen. Die exogenen Translationskontrollsequenzen und Startkodons können natürlicher und synthetischer Herkunft sein.

Jede dem Fachmann bekannte Methode zur Insertion von DNA- Fragmenten in einen Vektor kann benützt werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die ein Chimärengen enthalten, das aus geeigneten Transkriptions- und Translationskontrollsignalen und den Protein-codierenden Sequenzen besteht. Diese Verfahren umfassen in-vitro rekombinante DNA- Techniken, synthetische Methoden und in-vivo-Rekombinationstechniken (genetische Rekombination).

Expressionsvektoren umfassen, ohne darauf begrenzt zu sein, die folgenden Vektoren und ihre Derivate: Vaccinia-Viren, Adenoviren, Insektenviren, Hefevektoren, bacteriophagen Vektoren und Plasmid-DNA-Vektoren. Die Klonierung und Expression von Genen in bakteriellen Systemen ist bekannt. Beispielsweise beim Klonieren in einem E. coli-Stamm, dessen Bacteriophagen oder Plasmidpromotoren, wie dem lac-Promotor, trp-Promotor, recA-Promotor, ribosomalem RNA-Promotor, kann man die P_R- und P_L-Promotoren des Coliphagen Lambda und andere einschließlich (jedoch nicht darauf begrenzt) lacuv5, trp-lacuv5 (tac)-Hybrid-Promotor, ompF, bla, lpp und dergleichen verwenden, um einen hohen Grad an Transkription der anschließenden DNA-Segmente zu erzielen. Aufgrund von Unterschieden zwischen prokaryotischen und eukaryotischen Zellen beim Prozessieren kann es bevorzugt sein, die erfindungsgemäßen p97 angehörenden Peptide in eukaryotischen Zellen zu exprimieren. Die gesichertesten Methoden zur Exprimierung von Proteinen in eukaryotischen Zellen sind (a) Einführung des Gens in Zellen zusammen mit einem Gen für Arzneimittelresistenz und anschließende Selektion mit dem Arzneimittel, wobei man vorzugsweise eine Amplifikation herbeiführt, wie mit dem Dihydrofolat-Reduktase-Methotrexatsystem;
(b) Expression der cDNA in einem Plasmidvektor, häufig auf Basis von pBR322, unter Anwendung eines starken eukaryotischen Promotors und anderer regulierender Sequenzen;
(c) Expression der cDNA in einem viralen Vektor, der sich häufig von SV40 ableitet, ebenfalls unter Anwendung starker Promotoren, in diesem Fall eines SV40-Promotors. Rekombinante Plasmidvektoren werden häufig zur Produktion von Zellinien benutzt, die das Protein während eines längeren Zeitraums erzeugen, wohingegen SV40-Vektoren häufig dazu eingesetzt werden, um eine kurzzeitige Expression zu erzielen. Auch wenn Säugetierzellen am häufigsten als Wirt verwendet wurden, so sind doch auch Insektenzellen und in einigen Fällen Hefezellen geeignet. Einige werden unten genauer beschrieben.

Um ein rekombinantes Vaccinia-Virus zu konstruieren, das das Melanom-assoziierte p97-Antigen exprimiert, wird die cDNA-codierende Sequenz an den 7.5K-Promotor des Vaccinia- Virus zur Bildung eines Chimärengens gebunden. Dieses Chimärengen wird von einer weiteren Vaccinia-Virussequenz flankiert, die homolog zu dem viralen Thymidin-Kinasegen ist, das sich auf dem Plasmid-DNA-Vektor befindet. Die Konstruktion des Chimärengens umfaßt die Anwendung natürlicher und synthetischer Kontrollsignale zur Transkription und Translation der Tumor-assoziierten Antigensequenz. Das Chimärengen wird dann in die Vaccinia-Virus-Expressionsvektoren durch in-vivo Rekombination zwischen dem homologen Thymidin- Kinasebereich, der auf dem Plasmidvektor und dem Vaccinia- Virusgenom vorhanden ist, eingeführt. Die das Chimärengen enthaltenden rekombinanten Viren sind in der Lage, die Expression von p97 zugehörigen Peptiden in einem infizierten Wirt zu steuern. Sie können als Komponenten des Vakzins Verwendung finden.

Bei Verwendung eines Adenovirus als Expressionsvektor wird die interessierende DNA-Sequenz an den Adenovirus-Transkriptions-/ Translations-Kontrollkomplex gebunden, d. h. an die späten Promotor- und Tripartit-Leadersequenzen. Das Chimärengen wird dann in das Adenovirusgenom mittels in-vitro oder in-vivo-Rekombination insertiert. Insertion in einen nichtessentiellen Bereich des viralen Genoms (d. h. Bereich E1 oder E3) ergibt ein rekombinantes Virus, das lebensfähig und in der Lage ist, das p97 zugehörige Peptide in infizierten Wirten zu exprimieren. Es gibt zur Zeit zwei zugelassene Adenovirenstämme (Typ 4 und 7), die als Vakzin für militärisches Personal verwendet werden und die die wichtigsten Vertreter zur Anwendung als Vektoren sind, um die insertierte DNA-Sequenz zu exprimieren.

Ein alternatives Expressionssystem, das man zur Exprimierung von p97 angehörenden Peptiden verwenden kann, ist ein Insektensystem. Bei einem derartigen System verwendet man Autographa californica Nuclear Polyhedrosis-Virus (acNPV) als Vektor zur Exprimierung fremder Gene. Dieses Virus wächst auf spodoptera frugiperda-Zellen. Die interessierende DNA-Sequenz wird auf die nicht-essentiellen Bereiche des Virus (beispielsweise das Polyhedringen) kloniert und unter der Kontrolle eines AcNPV-Promotors (z. B. der Polyhedrin- Promotor) plaziert. Eine erfolgreiche Insertion der DNA- Sequenz führt zu einer Inaktivierung des Polyhedringens und zur Produktion des nicht-occludenten rekombinanten Virus (d. h. Virus, dem die Proteinhülle fehlt, für die das Polyhedringen codiert). Diese rekombinanten Viren werden dann zur Infizierung der Spodoptera frugiperda-Zellen verwendet, in denen das insertierte Gen exprimiert wird.

Weiter kann man Stämme an Wirtzellen auswählen, die die Expression der insertierten Sequenzen modulieren oder das Chimären- Genprodukt in der gewünschten spezifischen Weise modifizieren und prozessieren. Die Expression aus bestimmten Promotoren wird in Gegenwart bestimmter Induktoren (z. B. Zink- und Kadmiumionen für Metallothionein-Promotoren) gesteigert. Die Expression genetisch konstruierter Proteine kann daher gesteuert werden. Dies ist wichtig, wenn das produzierte Protein des klonierten Gens lethal für die Wirtzellen ist. Weiter sind Modifikationen (z. B. Glykoxylierung, Phosphorylierung etc.) und das Prozessieren der Proteinprodukte, z. B. Spaltung) wichtig für die Struktur und Funktion des Proteins. Unterschiedliche Wirtzellen haben charakteristische und spezifische Mechanismen für das post-translationale Prozessieren und die Modifikation der Proteine. Es werden geeignete Zellinien oder Wirtsysteme gewählt, um eine korrekte Modifikation und ein korrektes Prozessieren des exprimierten fremden Proteins sicherzustellen.

Bei den hier für p97 beschriebenen Ausführungsformen wurden die p97 cDNA-Sequenz in einen Expressionsplamidvektor gebunden, der von pBR322 stammt, welches den Metallothioneinpromotor enthält. Die vollständige Codierungssequenz von p97 einschließlich des Signalpeptids und des Membranankers wurde in den Vektor insertiert.

5.3.1. Identifizierung rekombinanter Expressions- Vektoren, die zur Replikation und Steuerung der Expression der p97-DNA-Sequenzen in der Lage sind

Expressionsvektoren, kann man anhand von drei allgemeinen Methoden identifizieren, nämlich durch: (a) DNA-DNA-Hybridisierung, (b) die Anwesenheit oder das Fehlen von Markergenfunktionen und (c) Expression insertierter Sequenzen. Bei der ersten Möglichkeit wird die Anwesenheit eines fremden, in einen Expressionsvektor insertierten Gens durch DNA- DNA-Hybridisierung unter Anwendung von Sonden nachgewiesen, welche Sequenzen umfassen, die homolog zu der Fremdgeninsertion sind. Bei der zweiten Methode wird das rekombinante Vektor/Wirtsystem identifiziert und selektiert, und zwar basierend auf der Anwesenheit oder Abwesenheit von bestimmten "Marker"-Genfunktionen, die durch die Insertion der Gene in den Vektor (d. h. Thymidin-Kinase-Aktivität, Antibiotikaresistenz, Transformations-Phenotyp etc.) erzeugt werden. Wenn beispielsweise das fremde Gen innerhalb der Marker-Gensequenz des Vektors insertiert wird, können die die DNA- Insertionen enthaltenden Rekombinanten anhand des Fehlens der Marker-Genfunktion identifiziert werden. Gemäß der dritten Methode kann man rekombinante Expressionsvektoren identifizieren, indem man das durch die Rekombinante exprimierte Fremdgenprodukt bestimmt. Derartige Assays können auf den physikalischen, immunologischen oder funktionellen Eigenschaften des Genprodukts basieren.

Bei der Konstruktion eines erfindungsgemäßen rekombinanten Vaccinia-Virus insertiert man beispielsweise das Chimärengen, welches die p97 codierenden Sequenzen enthält, in das Thymidin- Kinase-Gen wodurch das Virus inaktiviert und mit einem TK^--Phänotyp versehen wird. Derartige Rekombinanten werden aufgrund ihrer Fähigkeit selektiert, in einem Medium zu wachsen, das 5-Brom-deoxyuridin, ein Nukleosidanalogen, enthält, das lethal für TK⁺-Zellen, nicht aber für TK^--Zellen ist. Die Rekombinanten werden weiter durch DNA-DNA-Hybridisierung unter Verwendung einer cDNA-Sonde identifiziert, die spezifisch auf das Tumor-assoziierte Protein ist. Man kann TK^--rekombinante Viren durch Plaque-Reinigung isolieren und aus infizierten Zellkulturen einen Vorrat bereitstellen. Die rekombinanten Viren kann man auf ihre Fähigkeit, die Synthese der p97-zugehörigen Peptide zu induzieren, testen. Zu diesem Zweck läßt man infizierte Zellen in Gegenwart radiomarkierter Aminosäuren wachsen; anschließend testet man Lysate und subzelluläre Fraktionen der infizierten, radiomarkierten Zellen mittels Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen native Melanom-assoziierte p97-Antigene. Die immunpräzipitierten Produkte werden mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Die infizierten Zellen können auch durch Immunofluoreszenz unter Einsatz monoklonaler Antikörper getestet werden.

Zellen, in die ein Plasmidvektor durch Transfektion eingeführt worden ist, kann man leicht durch FACS-Analyse oder durch Bindungsassays von Zellkolonien-Replicas am Polyestertuch identifizieren. Die Menge an vorhandenem p97-zugehörigen Peptid wird durch quantitativen Radioimmunoassay bestimmt. Die subzelluläre Lokalisierung des Peptids wird durch zelluläre Fraktionierung und Immunofluoreszenzmikroskopie bestimmt. Die Struktur des exprimierten p97-zugehörigen Peptids kann man mittels SDS-PAGE und Aminosäuresequenzanalyse bestimmen.

5.3.2. Reinigung des p97-zugehörigen Peptids aus Expressionsvektor-Wirtsystemen

Viele Tumor-assoziierte Antigene, wie p97, sind Zelloberflächenglykoproteine und enthalten ein N-terminales Signalpeptid und ein C-terminales Ankerpeptid (Davis et al., 1985, J. Mol. Biol. 181: 111-121). Bei der Expression in einem geeigneten Vektor ist zu erwarten, daß eine Translokation des Proteins an die Zelloberfläche erfolgt. Zur Erleichterung der Reinigung des Proteins ist es bevorzugt, die DNA- Sequenz, die für den Membranankerbereich codiert, zu deletieren, so daß das reife Protein in das Kulturmedium freigesetzt wird.

Das p97-zugehörige Peptid kann man aus diesen Wirtszellen durch Detergens-Lysis und anschließend durch Affinitätschromatoghraphie unter Anwendung monoklonaler Antikörper reinigen. Wenn ein verkürztes (truncated) Protein aus dem Kulturmedium gereinigt werden soll, ist es bevorzugt, ein serumfreies Medium einzusetzen und anschließend die Affinitätschromatographie mit monoklonalen Antikörpern anzuwenden. Es ist wichtig, daß das Antigen aus dem Antikörper-Adsorbens ohne seine Antigenität zu reduzieren oder es zu denaturieren, eluiert werden kann. Dies kann durch Erhöhen oder Erniedrigen des pH's oder durch Anwendung eines Chaotrops erfolgen. Es kann erforderlich sein, monoklonale Antikörper zu selektieren, die das Antigen unter relativ milden Bedingungen freisetzt. Das durch Affinitätsreinigung behandelte Antigen kann durch HPLC weiter gereinigt werden.

5.4. Immunologische Charakterisierung der p97-zugehörigen Peptide

Die Fähigkeit des synthetischen oder rekombinanten Antigens, eine Antitumorantwort auszulösen, kann man zunächst in Tierversuchen bewerten. Dies erfolgt durch die Konstruktion eines Modellsystems, bei dem das humane Melanom-assoziierte p97- Protein in Zellen eines geeigneten, durch Inzucht erzeugten Stammes der Tiere exprimiert wird. Die Tiere werden dann mit dem erfindungsgemäßen p97-zugehörigen Peptid nach verschiedenen Schemata immunisiert und anschließend auf die Entwicklung von Antikörpern gegen das Melanom-assoziierte p97-Antigen, auf zellvermittelte Immunität, wie verzögerte Hypersensitivität gegen das p97-Antigen und auf ihre Fähigkeit getestet, einen Challenge aus lebensfähigen, syngenen Tumorzellen, die das p97-Antigen exprimieren, abzuwehren. Daneben kann man in-vitro-Assays der zellulären Immunität durchführen, um die Lymphozytenproliferation als Antwort auf das p97- zugehörige Peptid und um die Fähigkeit der Lymphozyten aus den immunisierten Tieren oder Melanompatienten, die das p97-Antigen exprimierenden Tumorzellen abzutöten, zu bestimmen. Weiter ist man durch Immunisierung von Mäusen mit Mäuse- p97 in der Lage zu bestimmen, in welchem Umfang es möglich ist, eine Immunantwort auf ein Antigen zu induzieren, das in Spuren in normalen Geweben vorhanden ist.

Primaten, ausgenommen Menschen, kann man zur Bestimmung der Sicherheit der erfindungsgemäßen p97-zugehörigen Peptide verwenden. Zu diesem Zweck werden die Tiere nach Schemata, die auch bei menschlichen Krebspatienten angewandt werden, immunisiert und anschließend wie oben beschrieben getestet, wobei jedoch die Tumortransplantationsversuche nicht durchführbar sind, weil sie Inzuchtstämme erfordern. Die Sicherheit der Immunisierung wird bestimmt durch die Beobachtung der Auswirkung der Immunisierung auf den allgemeinen Gesundheitszustand der immunisierten Tiere (Gewichtsveränderung, Fieber, Appetit, Verhalten etc.) und durch Feststellung der pathologischen Veränderungen in einer Autopsie.

Schließlich kann das erfindungsgemäße p97-zugehörige Peptid an menschlichen Krebspatienten getestet werden. Nach einem Test in Phase I an Krebspatienten in fortgeschrittenem Stadium, der dazu dient, das Fehlen von Toxizität festzustellen, kann man Krebspatienten testen, die sich in Remission befinden, bei denen aber ein Wiederauftreten der Symptome sehr wahrscheinlich ist. Die Immunantwort dieser Patienten wird wie oben für die Primaten beschrieben bewertet, wobei jedoch die Auswirkung der Behandlung auf die Krankheit oder auf die Häufigkeit des Wiederauftretens geprüft wird. Bei Anwendung des Melanom-Antigens-p97 werden auch benigne nevi (Moles), die das Antigen exprimieren, untersucht.

5.5. Formulierung eines Vakzins

Diesem Teil der Erfindung liegt das Ziel zugrunde, mittels synthetischer oder rekombinanter DNA-Techniken synthetische Peptide, gereinigte Proteine oder rekombinante Viren zu produzieren, die man Immunogen und Vakzin zum Schutz von Krebspatienten mit einem hohen Risiko des Wiederauftretens ihrer Erkrankung zur Behandlung manifest gewordener Erkrankungen und zur prophylaktischen Impfung von Risikopatienten verwenden kann. Das synthetische oder rekombinante Melanom-assoziierte p97-Antigen kann man in Kombination mit anderen Immunogenen zur Herstellung multivalenter Vakzine zur Prävention vor Melanomen und anderen Krebsarten einsetzen. Beispiele verschiedener Vakzinformulierungen werden nachfolgend erläutert.

5.5.1. Virale Vakzinformulierungen

Wenn das erfindungsgemäße p97-verwandte Peptid durch rekombinante Viren produziert wird, ist es möglich, entweder ein Vakzin auf Basis lebender rekombinanter Viren oder ein Vakzin auf Basis inaktivierter rekombinanter Viren zu formulieren. Die Wahl hängt von der Natur der rekombinanten Viren ab, die zur Expression des p97-zugehörigen Peptids verwendet wurden. Wenn die rekombinanten Viren gegenüber dem zu immunisierenden Wirt infektiös sind, aber keine Krankheit verursachen, wird ein Vakzin auf Basis von Lebendmaterial bevorzugt, weil die Multiplikation im Wirt zu einer längeren Stimulierung unterschiedlicher Art und Größe - im Vergleich zu der Stimulierung natürlicher subklinischer Infektionen - führt. Die Verabreichung eines derartigen Vakzins führt deshalb zu einer wesentlich länger anhaltenden Immunität. Infektiöse rekombinante Viren können nach Einführung in einen Wirt das p97-zugehörige Peptid aus dessen Chimärengen exprimieren und so eine Immunantwort stimulieren. Die lebenden rekombinanten Viren selbst kann man als Präventivvakzin gegen Melanome verwenden. Bei der Produktion derartiger in solchen Formulierungen zur Anwendung kommender, rekombinanter Viren kann man sowohl von in-vitro-Systemen (z. B. Gewebekulturzellen) und in-vivo-Systemen (z. B. natürlichen Wirtstieren, wie Kühen, Gebrauch machen. Herkömmliche Methoden zur Herstellung und Formulierung von Pockenvakzinen können für die Formulierung von Vakzinen auf Basis lebender rekombinanter Viren angepaßt werden.

Multivalente Lebendvirus-Vakzine kann man aus einem einzigen oder aus mehreren infektiösen rekombinanten Virenstämmen, die eine Vielzahl von Antigenen unterschiedlicher Tumor- oder Krebszellen exprimieren, herstellen. Beispielsweise kann man Vaccinia-Viren (die ungefähr 35 Kilobasen fremder DNA umfassen) so konstruieren, daß sie Codesequenzen für andere Epitope enthalten; derartige rekombinante Viren selbst kann man als Immunogen in multivalenten Vakzinen einsetzen. Alternativ ist es möglich, eine Mischung aus Vaccinia-Viren und/oder anderen Viren, die alle in der Lage sind, die Expression verschiedener Gene, die für verschiedene Epitope codieren, zu steuern, in einem multivalenten Vakzin zu formulieren.

Gleich ob die rekombinanten Viren gegenüber dem zu immunisierenden Wirt infektiös sind, kann man eine inaktivierte Vakzinformulierung herstellen. Inaktivierte Vakzine sind insofern "tot" als ihre Infektionsfähigkeit im allgemeinen durch Behandlung mit Formaldehyd zerstört worden ist. Idealerweise wird die Infektionsfähigkeit der Viren zerstört ohne die Capsid- oder Hüllproteine zu beeinflussen, die die Immunogenität der Viren tragen. Um inaktivierte Vakzine herzustellen, müssen große Mengen an rekombinanten Viren in Kultur gezogen werden, um die erforderliche Menge an relevanten Antigenen zu schaffen. Eine Mischung aus inaktivierten Viren, die verschiedene Epitope exprimieren, kann zur Formulierung von "multivalenten" Vakzinen verwenden. In einigen Fällen können diese gegenüber Vakzinformulierungen auf Basis von lebenden Material aufgrund der potentiellen Schwierigkeiten mit der gegenseitigen Beeinflussung von zusammen verabreichten lebenden Viren bevorzugt sein. In jedem der Fälle sollten die inaktivierten rekombinanten Viren oder die Mischung an Viren mit einem geeigneten Adjuvans formuliert werden, um das immunologische Ansprechen auf die Antigene zu erhöhen. Geeignete Adjuvantien sind, ohne darauf beschränkt zu sein, Mineralgele, z. B. Aluminiumhydroxid; grenzflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin; Pluronic- Polyole; Polyanionen; Peptide; und Ölemulsionen.

Die Verabreichung der oben beschriebenen Vakzinformulierungen kann auf vielfältige Weise erfolgen; dazu zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane und intranasale Verabreichung. Bei Anwendung einer Vakzinformulierung auf Basis lebender rekombinanter Viren kann diese auf dem natürlichen Infektionsweg des Stammvirus (Wildtyp) erfolgen, welcher zur Herstellung der rekombinanten Viren in der Vakzinformulierung verwendet wurde.

5.5.2. Subunit-Vakzinformulierungen

Alternativ zu viralen Vakzinen kann das p97-zugehörige Peptid selbst als Immunogen in Subunit-Vakzinformulierungen verwendet werden. Derartige Vakzine umfassen lediglich das zur Immunisierung eines Wirts erforderliche, relevante immunogene Material. Dementsprechend kann das p97-zugehörige Peptid aus Rekombinanten, die das Peptid exprimieren, gereinigt werden. Derartige Rekombinanten umfassen alle der zuvor beschriebene Virus-infizierten kultivierten Zellen, bakteriellen Transformanten oder Hefetransformanten. Gemäß einer weiteren Ausführungsform können die p97-zugehörigen Peptide oder Proteine auch chemisch synthetisiert sein.

Unabhängig davon, ob die p97-zugehörigen Peptide aus Rekombinanten gereinigt oder chemisch synthetisiert sind, kann man die Endprodukte auf eine geeignete Konzentration einstellen und mit einem geeigneten Vakzin-Adjuvans formulieren und zur Anwendung verpacken. Geeignete Adjuvantien sind, ohne darauf begrenzt zu sein: Mineralgele, z. B. Aluminiumhydroxid; grenzflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin; Pluronic-Polyole; Polyanionen; Peptide; und Ölemulsionen. Das p97-zugehörige Peptid kann zur Anwendung in einer Vakzinformulierung auch Liposomen einverleibt werden oder an Polysaccharide und/oder andere Polymere konjugiert werden.

Wenn das p97-zugehörige Peptid ein Hapten ist, d. h. ein Molekül, das dadurch antigen ist, daß es selektiv mit den zur Erkennung befähigten Antikörpern reagiert, aber nicht immunogen ist, weil es keine Immunantwort auslösen kann, kann man das Hapten kovalent an einen Träger oder an ein immunogenes Molekül binden. Der Hapten-Träger-Komplex kann dann zur Anwendung als Vakzin formuliert werden; beispielsweise ein großes Protein, wie Serumalbumin, verleiht dem Hapten, an das es gekoppelt ist, Immunogenität.

6. Beispiele Melanom-assoziiertes p97-Antigen

In dem nachfolgend beschriebenen Beispiel werden cDNA-Klone, die aus unterschiedlichen Bereichen der p97-mRNA stammen, verknüpft und in einen Expressionsvektor insertiert, der die Expression eines p97-zugehörigen Peptids steuert. Die durch die Expressionsvektor-Wirtszelle produzierten Peptide kann man zu einem Vakzin formulieren.

6.1. Reinigung der p97 mRNA

Polysome werden aus SK-MEL28-Melanom-Zellen (Carey et al., 1976, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 3270-3282) durch Magnesiumpräzipitation hergestellt. Aus diesem Präparat werden diejenigen Polysome, die p97-naszierende Ketten tragen, durch Inkubation mit 3 IgG2a monoklonalen Antikörpern (96.5, 118.1. 133.2), die spezifisch gegen unterschiedliche p97-Epitope sind, (Brown et al., 1980, J. Biol. Chem. 255: 4980-4983; Brown et al., 1981, J. Immunol. 127: 539-546; Brown et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 539-543; Plowman et al., 1983, Nature, London 303: 70-72) und anschließend durch Affinitätschromatographie an Protein-A-Sepharose gereinigt. Die p97-angereicherte mRNA wird unter Verwendung von EDTA eluiert und durch Affinitätschromatographie an Oligo(T)- Cellulose (Bethesda Research Labs, Bethesda MD) gereinigt. Dabei ergeben 150 E₂₆₀ Polysomeinheiten 260 ng p97-angereicherter mRNA, die 0,23% der gesamten mRNA ausmachen. Bei Translation in Xenopus oocytes und Durchführung eines Assays auf p97 wie beschrieben (Brown et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 539-543; Plowman et al., 1983, Nature, London 303: 70-72), ergibt die p97-angereicherte mRNA 80 pg p97 pro mg mRNA, wohingegen p97 nicht angereicherte mRNA lediglich 0,44 pg p97 pro ng mRNA ergibt. Dies zeigt, daß die p97 mRNA-Aktivität um das 108fache angereichert ist. Die Ausbeute an p97 mRNA-Aktivität beträgt 42%. Eine Translation in das Reticulocyten-Lysatsystem (Pelham & Jackson, 1976, Eur. J. Biochem. 67: 247-256) zeigt, daß die p97-angereicherte mRNA, die für ein Hauptpolypeptid mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 84 000 Daltons, (bestimmt mittels SDS-PAGE) codiert, das in den Translationsprodukten nicht angereicherter mRNA nicht nachzuweisen war und durch ein Antiserum immunpräzipitiert ist, das spezifisch auf p97 ist (Fig. 1). Daraus kann geschlossen werden, daß es sich um den nichtglykosylierten Precursor von p97 handelt.

6.2. Herstellung und Konstruktion von cDNA-Klonen

Die nachfolgend beschriebenen beiden Techniken werden zur Konstruktion von cDNA-Klonen verwendet, die aus den oben isolierten mRNA-Templaten transkribiert wurden.

6.2.1. Konstruktion der durch Oligo(T) primierten cDNA-Klone

Die wie oben beschrieben hergestellte p97-angereicherte mRNA wurde als Templat für die Oligo(T)-primierte cDNA-Synthese verwendet. Die cDNA wurde in pBR322 folgendermaßen kloniert:
Für die Synthese des ersten cDNA-Strangs wurden p97-angereicherte mRNA, die vier dNTPs und Oligo(T) (Collaborative Research, Walthma, MA) mit reserver Transkriptase (Molecular Genetic Resources) inkubiert. Der zweite Strang wurde durch Inkubation mit dem großen Fragment der E. coli DNA-Polymerase (Bethesda Research Labs, Bethesda MD) synthetisiert. Die doppelsträngige cDNA wurde mit S1-Nuklease (Geschenk von D. Durnam of The Fred Hutchinsen Cancer Research Center, Seattle, WA) digestiert. Mit der cDNA wird dann ein dC-Tailling mit terminaler Deoxynukleotidyl-Transferase (Bethesda Research Labs, Bethesda, MD) durchgeführt, das Produkt wurde dann mit PstI-digestiertem, dG-tailed pBR322 (Bethesda Research Labs, Bethesda, MD; Villa-Komaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731) verbunden und dazu verwendet, CaCl₂-behandelte E. coli RR1 zu transformieren. DNA aus Kolonien transformierter Bakterien wurde an Papier gebunden (Taub & Thompson, 1982, Anal. Biochem. 126: 222-230) und einem Screening mittels differentieller Hybridisierung mit cDNA-Sonden unterzogen, welche aus p97-angereicherten und nichtangereicherten mRNA-Templaten synthetisiert worden sind.

Es wurde ein 243-Basenpaar (bp)-Klon, p97-3a2fl, identifiziert, der zu p97-angereicherter cDNA, in nachweisbarer Weise aber nicht zu nichtangereicherter cDNA hybridisierte und der auch p97-mRNA in Hybrid-Selektions-Translations-Experimenten selektierte. Ein Polyadenylierungssignal (AATAA) und ein Poly(A)-Trakt waren am 3′-Ende der cDNA vorhanden (siehe Fig. 2). Nick-translatierte p97-3a2fl hybridisierte 100fach stärker zu p97 angereicherter mRNA als zu nichtangereicherter Melanom-mRNA und es hybridisiert in nachweisbarer Weise nicht zu Fibroblasten-mRNA. Mit Hilfe eines Northern-Blot mit geklonter cDNA als Sonde wurde eine mRNA mit ungefähr 4 Kilobasen (kb) identifiziert, die in SK-MEL 28 Melanomzellen vorhanden war und in Fibroblasten fehlte.

6.2.2. Genom-Klonierung von p97 und Anwendung synthetischer Oligonukleotide zur Primierung der cDNA-Synthese

Versuche, cDNA-Klone zu erhalten, die sich mehr als 1 kb von der Polyadenylierungsstelle erstrecken, waren nicht erfolgreich, möglicherweise aufgrund eines Bereiches an hohem GC- Gehalt (größer als 80%) mit extensiver Sekundärstruktur. Um dieses Problem zu vermeiden, wurde auf Genom-Klonierung zurückgegriffen. Vier überlappende Genom-Klone wurden aus Lambda L47.1-Genbanken isoliert, die größenfraktionierte SK-MEL-28-DNA, die um ein spezifisches p97 Restriktionsfragment angespeichert war, enthielten. Diese vier Genom-Klone überspannen 28 kb und enthalten den gesamten Kodierungsbereich von p97, einschließlich des Gen-Regulationsbereichs. Die von 5′ nach 3′ sequentiell angeordneten Genom-Klone sind:
Lambda B15, Lambda H17, Lambda B6.6 und Lambda E7.7. Die Nomenklatur besteht aus einem Buchstaben, der sich auf das Restriktionssystem bezieht, das zur Erzeugung des Fragments verwendet wurde. Die Zahl gibt die Kilobasengröße des Fragments an, das in Lambda-L47.1 kloniert wurde. Ausgehend vom 5′-Terminus enthält der Lambda-Klon ein 15 kb-BamHI p97- Fragment; der Lambda-Klon H17 ein 17 kb HindIII p97-Fragment; der Lambda Klon B6.6 ein 6.6 kb BamHI p97-Fragment und der Lambda-Klon E7.7 ein 7.7 kb EcoRI p97-Fragment (siehe Fig. 2A). Die Restriktionsfragmente der Klone, die zu der 4 kb- p97mRNA im Northern-Blot hybridisierte, waren sequenziert und die p97-Exone wurden durch eine Computer-unterstützte Homologie-Suche zwischen den vorhergesagten Codierungssequenzen und der Aminosäuresequenz von humanem und Hühner-Transferrin identifiziert (Yang et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2752-2756; McGillivray et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 2504-2508, Jetsch & Chambon, 1982, Eur. J. Biochem. 122: 291-295).

Drei synthetische Oligonukleotide, deren Sequenzen auf p97- Genom-Exonsequenzen basierten, wurden zur Primierung der cDNA-Synthese an SK-MEL-28-mRNA verwendet. Die erhaltene cDNA wurde folgendermaßen in Lambda-gt10 kloniert: Die p97 cDNA wurde einem dG-Tailing unterworfen und mit einem Brückenoligonukleotid (AATTCCCCCCCCCCCC) und Lambda-gt10, das mit EcoRI einer Restriktion unterworfen wurde, verknüpft. Das Brücken ((Bridger)-Oligonukleotid ermöglicht hier die Insertion und die Verknüpfung der dG-tailed cDNA-Sequenz in die EcoRI-Stelle von Lambda gt10. Der Lambdaphage wurde verpackt (Grosveld et al., 1981, Gene 13: 227-237) und auf E. coli c₆₀₀ rk^-mK⁺hfl-Platten gegeben. Die cDNA-Genbanken in Lambda-gt10 wurden auf die p97-Insertion durch Plaque- Hybridisierung (Benton & Davis, 1977, Science 196: 180) mit Genom-Exon-Fragmenten als Sonden einem Screening unterzogen. Die Sonden wurden mit ³²P-TTP (New England Nuclear, 3200 Ci/ mmole) durch Nick-Translation auf eine spezifische Aktivität von 5-10 × 10⁸ cpm/µg radiomarkiert. Drei überlappende cDNA-Klone (10a1, 1jl, 2fl) die 2368 Nukleotide der p97 mRNA überspannen, einschließlich des gesamten Kodierungsbereiches, wurden unter Anwendung von p97 exonspezifischen Fragmenten als Sonden identifiziert (Fig. 2).

6.3. DNA-Sequenzanalyse von p97

cDNA-Insertionen wurden exzistiert und in den Plasmidvektor pEMBL18+ (Dente et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11: 1645-1655) in E. Coli zur anschließenden Propagierung und Restriktionskartierung subkloniert. cDNA wurde auch in den M13mp18-Phagen- Klonierungsvektor (Yanish-Perrone et al., 1985, Gene 33: 103- 119) subkloniert und unter Anwendung der Dideoxymethode von Sanger (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463- 5467) sequenziert. Die M13-Klone, die große Insertionen enthielten, wurden durch Erzeugung von Deletionen unter Verwendung von DNAse I (Hong, 1982, J. Mol. Biol. 158: 539-549) oder Exonuklease III (Henikoff, 1984, Gene 28: 351-359), und durch Verwendung synthetischer 21-mer Oligonukleotide-Primer sequenziert.

Die p97-cDNA-Sequenz ist in Fig. 3 gezeigt. Ein offener Leserahmen der 2214 Nukleotide erstreckt sich von der ersten ATG bis zu TGA bei Position 2215, wobei die Sequenz um ATG in der von Kozak (Kozak, 1980, Nucleic Acids Res. 8: 127- 142) bestimmten Konsensus-Initiierungssequenz konform ist. Der Großteil des 5′cDNA-Klons enthält weitere 60 Nukleotide upstream von der Start-ATG. Der 3′-nicht-kodierende Bereich der p97-mRNA, der nicht als cDNA-Klon erhalten wurde, wurde als einzelnes, 1667 Nukleotide enthaltendes Genom-Exon identifiziert. Die Reste 20-32 der vorausgesagten Aminosäuresequenz sind identisch mit der bekannten N-terminalen Aminosäuresequenz von p97 (Brown et al., 1982, Nature, London 296: 171-173), was die Identität des klonierten cDNA zeigt. Weiter ist das vorausgesagte Molekulargewicht des Precursors von 80 196 Daltons in guter Übereinstimmung mit dem beobachteten Molekulargewicht des in vitro-Translationsproduktes.

6.4. Konstruktion eines Rekombinanten Expressionsplasmides, das die p97-Kodierungssequenz enthält

Die Größe des p97-Gens erforderte ein Zusammenstückeln der cDNA-Klone, die durch spezifisches Priming von Melanom-mRNA mit reverser Transkriptase erhalten worden sind. Es kamen die drei cDNA-Lambda gt10 Klone (10a1, 1jl, und 1fl; siehe Fig. 2), die den kodierenden Bereich vom Signalpeptid bis zur Membranaktersequenz umfaßten, zur Anwendung. Die p97-Insertion des Klons 10a1 wurde durch Verdauung mit EcoRI exzisiert und die Oligo(dG)-Sequenz am 5′-Ende von cDNA 10a1 wurde durch Verdauung mit Exonuklease III entfernt, wodurch der Klon 10a1b mit einer HindIII-Stelle 30 bp upstream vom Start- Methionin des p97-Präproteins erzeugt wurde. Die p97-Insertionen der drei cDNA-Klone 10a1b, 1jl, und 2fl und der Genomklon E7.7 wurden zusammen an den PvuII, SstI und EcoRI- Restriktions-Enzymstellen verbunden und in HindIII-EcoRI-Stellen des Plasmidvektors pEMBL18+ (Dente, et al., 1983, Nuc. Acid Res. 11: 1645-1655) wie in Fig. 2 gezeigt, insertiert. Das endgültige Konstruktionsprodukt, p97b, enthält die 4.4 kb p97-Insertion im Plasmidvektor pEMBL18+, der zur Transformation von E. coli HB101 benutzt wurde. Die Insertion in p97b enthält 30 bp des 5′-untranslatierten Bereichs von p97- mRNA, die gesamte kodierende Sequenz, den 3′-untranslatierten Bereich, der über eine 5′-HindIII-Stelle gebunden ist und eine 3′-EcoRI-Stelle.

Die 4.4-Kilobasen-p97-Insertion wurde aus p97b mit HindIII und EcoRI exzisiert. Die Enden wurden unter Verwendung des Klenow-Fragments von E. coli DNA-Polymerase eingefüllt. Das stumpfendige Fragment wurde in die einzige SmaI-Stelle in dem eukaryotischen cDNA-Expressionsvektor 1995.12 pUC13, einem Derivat des Vektors mThGH-112, (Palmiter et al., 1983, Science 222: 809-1222: 809-14), einem Derivat des Vektors mThGH-112, (Palmiter et al., 1983, Science 222: 809-14), der von Dr. Richard Palmiter (University of Washington, Seattle, Washington) erhalten worden ist, insertiert. Dieser Vektor ver 34602 00070 552 001000280000000200012000285913449100040 0002003703702 00004 34483wendet den Mäuse-Metallothionein-Promotor, um fremde Gene in eukaryotischen Zellen zu exprimieren. Das Gebilde mit der p97-Insertion in korrekter Orientierung wurde durch Restriktionsanalyse identifiziert und als pMTp97b bezeichnet.

Das rekombinante Plasmid wurde in LMTK^--Zellen transfektiert. Die Transfektanten wurden durch Wachstum in HAT-Medium selektiert. Die Klone wurden von den Transfektionsschalen in 96-Well-Mikrotestplatten gegeben. Das verbrauchte Kulturmedium und die Zelllysate aus den Replika-Platten wurden auf p97 mittels eines zweiseitigen immunoradiometrischen Assays untersucht. Die Subklone wurden expandiert und erneut getestet. Den Klon TKMp97-12, der ungefähr 4 000 000 Moleküle p97 pro Zelle exprimiert, ließ man wachsen, man induzierte ihn mit Kadmium und verwendete ihn als p97-Quelle für die Immunisierung.

6.5. Immunisierung von Mäusen mit p97-zugehörigen Peptiden

Die TKMp97-12-Zellen ließ man wachsen. Sie wurden mit Kadmium (14,4 g) induziert und durch 10-minütige Inkubation auf Eis mit 70 ml TNEN (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40) lysiert. Das Lysat wurde bei 200 000 × g 45 Minuten bei 4°C ultrazentrifugiert. Die Hälfte des Lysats wurde über eine 1 ml auf p97-spezifische Immunoaffinitätssäule (Fab-Fragment des Antikörpers 96.5, gekoppelt an Sepharose) gegeben. Das Immunoadsorbens wurde ausgiebig gewaschen, zuerst mit TNEN und anschließend mit 20 mM Tris-HCl, pH 6,8.

Für die Immunisierung wurden 0,5 ml der wie oben beschrieben hergestellten adsorbierten Immunoaffinitätssäule mit 0,5 ml 20 mM Tris-HCl, pH 6,8 gemischt und mit 1 ml komplettem Freund's Adjuvans emulgiert. Vier BALB/c-Mäuse erhielten jeweils 0,4 ml der Emulsion intraperitoneal. Drei Wochen später wurden die Mäuse mit einem Viertel der Antigenmenge in inkompletten Freund's Adjuvans erneut geimpft. Die Kontrolltiere wurden mit Antikörpern, die nicht zu p97 gehören und die identisch behandelt und an einer Immuno-Affinitätssäule adsorbiert waren, immunisiert. Vier der p97-immunisierten Mäuse und zwei der Kontrolltiere ließ man eine Woche nach der erneuten Impfung ausbluten. Die Sera wurden mittels Immunpräzipitation aus mit Jod radioaktiv markierten SK-MEL-Melanomzellen und anschließend mittels SDS-PAGE getestet. Die Ergebnisse zeigten, daß die Sera von den vier p97-immunisierten Mäusen p97 immunpräzipizierten, wohingegen die Sera der Kontrolltiere negativ waren. Die Sera wurden auch auf die Anwesenheit von Antikörpern gegen p97 unter Anwendung eines ELISA-Assays an Glutaraldehyd- fixierten SK-MEL-28-Melanomzellen (20 000 Zellen pro Mikrotestloch) getestet. Die Zellen wurden mit 0,05 ml Serum, das im Verhältnis 1/10 000 verdünnt wurde, eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, gewaschen und anschließend eine Stunde bei Raumtemperatur mit 0,05 ml Meerrettichperoxidase- konjugiertes Ziege-Antimaus IgG (Southern Biotech) inkubiert. Die optische Dichte der Sera (abgelesen bei 490 nm) der p97- immunisierten Mäuse war 0,243, 0,343, 0,200, wohingegen die optische Dichte der Sera der Kontrolltiere 0,036 und 0,057 war.

6.6. Charakterisierung von p97 6.6.1. Struktur von p97

Die Struktur von p97 wurde aus der Aminosäuresequenz des p97-Präkursors ermittelt, der vier strukturelle Domänen enthält. Da der Rest 20 Prekursorsequenz dem N-Terminus von reifem p97 entspricht, stellen die Aminosäurereste 1-19 wahrscheinlich ein Signalpeptid dar, was sich aus dessen Länge und hydrophober Natur schließen läßt. Die Aminosäuren 20-361 und 362-713 umfassen zwei homologe Domänen von 342 und 352 Aminosäuren. Potentielle N-verknüpfte Glykosylierungsstellen liegen an den Positionen 38 und 135 in der N-terminalen Domäne und an der Position 515 in der C-terminalen Domäne vor. Schließlich wird angenommen, daß die Aminosäuren 714-738, ein Bereich mit überwiegend ungeladenen und hydrophoben Resten, p97 in der Zellmembran verankern (Davis et al., 1985, J. Mol. Biol. 181: 111-121) und sich in das Cytoplasma erstrecken können.

Die Domänenstruktur von p97 wird durch Verdauungsexperimente mit Protease bestätigt. Die Verdauung von p97 mit Trypsin, Papain (Brown et al., 1981, J. Immunol. 127: 539-546) oder Thrombin ergab ein glykosyliertes antigenes Fragment mit einem Molekulargewicht von etwa 40 000 Daltons. Das Fragment wurde aus einer Thrombinverdauung von p97, das metabolisch mit ³⁵S-Methoden oder ³⁵S-Cystein markiert wurde, gereinigt und wie beschrieben sequenziert (Brown et al., 1982, Nature, London 296: 171-173). Die Cysteinreste wurden an den Positionen 7 und 17 liegend und die Methioninreste an den Positionen 2 und 20 liegend, identifiziert. Identische Ergebnisse wurden mit intaktem p97 erhalten und stehen in Übereinstimmung mit der N-terminalen Sequenz von p97, die aus der cDNA-Sequenz vorhergesagt wurde. Daraus kann geschlossen werden, daß das Protease-beständige Fragment mit einem Molekulargewicht von 40 000 Dalton der N-terminalen Domäne von p97 entspricht. Es war nicht möglich, die C-terminale Domäne von p97 zu isolieren, vermutlich weil sie Protease-sensitiv ist.

6.6.2. Homologie von p97 mit Transferrin

Eine Recherche der Aminosäuresequenz-Genbank der Protein Identification Resource (Release 5,0; Dayhoff et al., 1981, Nature, London 290: 8) zeigte, daß p97 homolog ist mit den drei Mitgliedern der Transferrin-Superfamilie: Humanes Serum-Transferrin, humanes Lactotransferrin und Hühner-Transferrin (37-39% Homologie, siehe Fig. 4). Da humanes und Hühnertransferrin zu 50% homolog sind, muß sich p97 aus Serumtransferrin vor mehr als 300 Millionen Jahren abgezweigt haben. P97 hat 14 Cysteinreste, die in homologen Positionen in jeder Domäne lokalisiert sind. Humanes Transferrin enthält diese Cysteinreste in homologen Positionen in beiden Domänen, während humanem Lactrotransferrin und Hühnertransferrin lediglich zwei dieser Cysteinreste (in ihren C-terminalen Domänen) fehlen. Im Gegensatz zu p97 enthalten diese Proteine 4-7 zusätzliche Cysteine in ihren C-terminalen Domänen, die kein entsprechendes Teil in der N-terminalen Domäne haben. Humanes Transferrin enthält ebenfalls zwei weitere Cysteinreste zusätzlich zu der N-terminalen Domäne. Die Positionen der meisten Disulfide in Humanserum-Transferrin, Lactotransferrin und Hühnertransferrin wurden direkt bestimmt (McGillivray et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 2504-2508; Metz-Boutique et al., 1984, Eur. J. Biochem. 145: 659-676; Mazurier et al., 1983, experientia (Basel) 39: 135-141; MacGillivray et al., 1983, J. Biol. Chem. 258: 3543-3553; Williams et al., 1982, Eur. J. Biochem. 122: 297-303; Williams, 1974, Biochem. J. 141: 745-752). Man kann das Vorliegen von 7 Disulfidbindungen in jeder Domäne von p97 voraussagen (siehe Fig. 5).

Die Aminosäurehomologie der p97-Domänen (46% - erzielt durch Insertion von 7 gaps der 9 Reste) ist stärker als bei Humantransferrin (43% - 16 gaps, 45 Reste) oder Hühnertransferrin (35% - 12 gaps, 49 Reste). Unter der Voraussetzung der extensiven Sequenzhomologie zwischen p97 und Transferrin und der offensichtlich ähnlichen Faltungsmuster, basierend auf der Beibehaltung der Cysteine, kann man annehmen, daß es möglich ist, die dreidimensionale Struktur von p97 herzuleiten, wenn die vorhandene Röntgenstruktur von Transferrin mit niedriger Auflösung (Gorinsky et al., 1979, Nature, London 281: 157-158) verfeinert werden kann.

6.6.3. Funktion von p97

Die Zugehörigkeit zu der Transferrin-Superfamilie, die Fähigkeit Eisen zu binden (Brown et al., 1982, Nature London 296: 171-173) und die übliche chromosomale Lokalisierung mit Transferrin und dem Transferrinrezeptor (Plowman et al., 1983, Nature, London, 303: 70-72; Yang et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2752-2756) sprechen dafür, daß p97 eine Rolle beim Eisentransport spielt. Man nimmt an, daß die Eisenbindungstasche von Transferrin 2-3 Tyrosine, 1-2 Histidine und ein einzelnes Bicarbonat-bindendes Arginin (Metz-Boutique et al., 1984, Eur. J. Biochem. 145: 659-676) enthält. Die Beibehaltung dieser Aminosäuren in p97 bestätigt dessen Rolle beim Eisenmetabolismus (siehe Fig. 4). Da p97 ein Membran-gebundenes, Transferrin-ähnliches Molekül ist und zum Transferrinrezeptor nicht homolog ist (Schneider et al., 1984, Nature, London, 311: 675-678), ist es möglich, daß sich seine Rolle im zellulären Eisenmetabolismus von demjenigen Metabolismus unterscheidet, der sich durch Zirkulieren von Serumtransferrin und des zellulären Rezeptors für Transferrin ergibt. Die Expression der klonierten p97-cDNA in eukaryotischen Zellen ermöglicht die experimentelle Untersuchung seiner funktionellen Eigenschaften.

6.6.4. Schlußfolgerung

Auf der Grundlage dieser Daten ist es klar, daß cDNA-Konstruktionen für Melanom-assoziiertes p97 erhalten wurden und daß diese effizient in Säugetierzellen exprimiert werden können, um große Mengen an antigenem p97 zu produzieren.

7. Expression von kloniertem p97 und dessen Testung als Vakzin

Die im folgenden näher erläuterten Versuche beschreiben die Expression von kloniertem p97-Protein und dessen Testung als Vakzin. Die Expression von p97-Protein in sequentierter Form (durch den transfektierten Mäusezellklon B16svp97a.14) ermöglicht die Reinigung von Milligrammengen an p97-Protein, das volle Länge besitzt. Das gereinigte Protein wurde dazu verwendet, in-vitro die Induktion von zellulärer Immunität und die Wirkung als Subunit-Vakzin zu testen. Das p97-Genprodukt wurde auch auf der Oberfläche von metastatischen Murin-Melanomzellen exprimiert. Dadurch wird ein Modell zum Testen der Wirksamkeit von Vakzinen bei der Verhinderung des Tumorwachstums in einem syngenen System zur Verfügung gestellt.

Das p97-Gen wurde in lebende, rekombinante Vaccinia-Viren zur Anwendung als Vakzin-Formulierung, welche eine effektive zelluläre Immunität zu erzeugen in der Lage ist, insertiert. Die Fähigkeit der rekombinanten Vaccinia-Viren Vp97a-NY, Immunität bei Mäusen zu erzeugen, wurde unter Anwendung verschiedener Assays zur Demonstration humoraler und zellulärer Immunität bewertet. Unter Verwendung des oben beschriebenen syngenen Murin-Tumormodells wurde gezeigt, daß das Vakzin auf Basis des Vp97a-NY-rekombinanten Virus einen Schutzeffekt gegenüber einem Tumorzellen-Challenge ausübt. Das Vakzin hat auch einen therapeutischen Effekt bei Mäusen mit vorhandenen wachsenden Lungenmetastasen zur Folge. Diese Eigenschaft ist analog zu dem bei Anwendung des Vakzins erzielbaren immunotherapeutischen Anti-Tumor-Ansprechen bei menschlichen Melanom- Patienten mit einem vorhandenen Tumor.

Zusätzlich zu den Untersuchungen an Mäusen mit nur 91%iger Homologie zwischen Human-p97 und dem homologen Mäuseprotein (in den bisher untersuchten Bereichen) wurde das Vp97a-NY- Vakzin auch an nicht-Human-Primaten getestet. Es besteht eine wesentlich stärkere Homologie zwischen Human-p97 und der bei Affen auftretenden Form des Proteins (wie durch Kreuzreaktivität bei monoklonalen Antikörpern gezeigt). Aufgrund der potentiellen Schwierigkeit, eine Immunantwort gegen ein "Eigen"- Protein zu erzeugen, wurden die eng verwandten Makakenaffen dazu verwendet, die Immunogenität des Vp97a-NY-Vakzins zu testen. Das rekombinante Vaccinia-Vakzin wurde an Affen getestet und es konnte gezeigt werden, daß es humorale Immunität gegen das p97-Protein induziert. Nach zwei Inoculierungen mit dem lebenden rekombinanten Vaccinia-Virus waren während eines Zeitraums von sechs Wochen keine beachtenswerten Symptome bei den Affen zu beobachten, die auf schädliche Nebenwirkungen des Vakzins zurückzuführen wären.

7.1. Plasmidexpression

Das durch den frühen SV-40 Promotor sv2 gesteuerte Expressionsplasmid wurde aus dem cDNA-Plasmidklon p97a konstruiert, welcher ähnlich dem Plasmid p97b ist, wobei jedoch der gesamte 3′UT-Bereich Anwendung findet (Fig. 6). Alle cDNA-Klone wurden ursprünglich aus Lambda gt10-Libraries mit synthetischen EcoRI-dG (9-17)-Linkern wie oben beschrieben isoliert. Die Insertionen wurden durch EcoRI exzisiert und in pEMBL18+ zur anschließenden Propagierung und Charakterisierung subkloniert. Der Klon 10a1 wurde in M13mp18 subkloniert und eine RF-Form wurde mit BamHI und SphI verdaut, kurz mit Exonuklease III behandelt, mit S1-Nuklease abgerundet, mit Klenow behandelt und religiert. Mehrere Plaques wurden isoliert und sequenziert, eine davon hatte den dG-Schwanz entfernt und 33 bp des p97 5′-untranslatierten Bereichs, der in die HindIII-Stelle von M13mp18 insertiert war, beibehalten. Ein RF dieses Subklons (10a1a) wurde dazu verwendet, intakte p97 cDNA zu erzeugen; ansonsten wurden alle Fragmente aus den Plasmid-Subklonen isoliert. Das 550 bp HindIII- PvuII-Fragment aus 10a1a und das 735 bp PvuII-SalI-Fragment aus 1jl wurden aus LMP-Agarose-Gelen isoliert und in pEMBL18+ an den SalI- und HindIII-Stellen unter Erzeugung von p5′p97 ligiert. Der E7.7 Genomklon in pEMBL18+ wurde mit EcoRI vollständig verdaut und mit SstI teilweise verdaut. Das 4.5 kb-Fragment wurde mittels Fraktionierung an 0,8% LMP- Agarose abgetrennt. Das 4,5 kb 3′-Fragment wurde mit dem 404 bp SstI-Fragment aus 2fl und das 535 bp BamHI-SstI-Fragment aus 1jl in pEMBL18+ an den SalI- und EcoRI-Stellen unter Erzeugung von p3′p97 ligiert. Das 1285 bp HindIII-SalI-Fragment von p5′p97 wurde anschließend in p3′p97 unter Herstellung von pp97a ligiert. Das EcoRI-HindIII-Teilfragment aus diesem Klon wurde in psV2neo (Southern, et al., 1982, J. Mol. App. Genet. 1: 327-341) an dem HindIII- und EcoRI-Stellen insertiert, wobei der Neomycin-kodierende Bereich und die SV40-Spleiß-/polyA-Sequenzen entfernt und der frühe SV40-Promotor und 72 bp-Enhancer, 33 bp p97 5′UTR, der vollständige p97-codierende Bereich, 3′-UTR und die 1.4 kb 3′ flankierende DNA beibehalten wurden. Das erhaltene Plasmid wurde mit pSVp97a bezeichnet.

Das sv2 gesteuerte Plasmid wurde durch Calciumphosphat-Präzipitation in eine Vielzeit eukaryotischer Zellinien transfektiert. Die exprimierenden Zellen wurden geklont und unter Anwendung von Co-Transfektion eines dominanten selektierbaren Markers selektiert. Zu diesem Zweck wurden Ovariumzellen eines chinesischen Hamsters (CHO) in Hank's Fl-Medium, das 15% fötales Kälberserum (FCS), 4mM L-Glutamin, 1,3 mM Prolin und Antibiotika enthält, kultiviert. B16-Zellen wurden in RPMI-Medium kultiviert, das 0,15% Bicarbonat und 1735 Zellen in DMEM-Medium (Gibco), beide mit 15% FCS ergänzt, und Antibiotika enthält. Die Zellen wurden mittels einer modifizierten Calciumphosphattechnik (Wigler M., et al., 1978, Cell 14: 725-731) mit 20 µg pro Platte mit pSV2p97a Plasmid DNA und 0,5 µg psV2DHFR oder pSV2neo transflektiert. Alle Plasmide wurden an der EcoRI-Stelle linearisiert. Stabile Transfektanten wurden unter Verwendung von Hypoxanthin-negatives (HAT-)-Medium für CHO-Zellen oder unter Verwendung von 0,5 µg/ml Geneticin (G418, Gibco) für B16- und 1735-Zellen selektiert. Die überlebenden Zellen begannen 7 Tage nach der Transfektion sichtbare Kolonien zu bilden. Darauf wurden sterile Polyesterfilter gelegt, die durch Glasperlen fixiert wurden. Die Filter blieben fünf Tage auf den Kolonien, so daß die Zellen in die Polyestermatrix wachsen und eine Koloniereplika auf der Platte erzeugen konnten. Die Filter wurden anschließend entfernt und für einen Lebendzell-Bindungsassay mit jodiertem anti-p97-monoklonalen Antikörper verwendet. Zehn µg markierter monoklonaler Antikörper wurden mit bis zu 20 Filtern in 10 ml FCS bei 4°C eine Stunde inkubiert. Die Filter wurden gründlich in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, getrocknet und über Nacht bei -70°C einem SAR-5-Film ausgesetzt. Die Filter wurden anschließend mit 7%igem Methylenblau gefärbt, um die Zellkolonien sichtbar zu machen. Bei allen zur Anwendung gebrachten Zellinien, außer der p16-Mäusezellinie, enthielten die exprimierten Zellen antigenes p97-Protein an der Zelloberfläche.

Bei den B16-transfektierten Zellen wurde p97 in das Medium freigesetzt. Es handelte sich dabei um einen für diesen Zelltyp ungewöhnlichen Befund. Die Sekretion von p97 ermöglichte die Reinigung des p97-Proteins voller Länge aus dem Zellmedium. Der Klon B16SVp97a.14 exprimierte ungefähr 4 µg/ml p97 in verbrauchtem Medium. Rekombinantes p97 wurde aus verbrauchtem Medium des transfektierten Klons B16SVp97a.14, der große Mengen an p97-Antigen in das Medium abgegeben hat, gereinigt. Die Zellen wurde nahezu konfluent (10⁹ Zellen) in 850 cm² Rollflaschen gehalten, indem fortwährend geringe Mengen an frischem Medium zugegeben wurden. Die Zellen gaben ohne nachzulassen wochenlang weiteres Antigen ab, so daß ein fortwährendes Ernten und Abkühlen des verbrauchten Mediums möglich war. Die Reinigung von p97 erfolgte durch Immunoaffinitätschromatographie unter Anwendung der an Sepharose gebundenen Fab-Fragmente der monoklonalen Antikörper 96.5. Zu diesem Zweck wurden drei Liter an verbrauchtem Medium über drei 30 ml-Säulen geschicht. Die erste Säule enthielt 15 ml G-25 superfeines Sephadex (Pharmacia), die zweite enthielt 20 ml Sepharose 4b (Pharmacia) und die dritte enthielt 8 ml Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose (Sigma) konjugiert an Fab-Fragmente monoklonaler Antikörper 96.5 (10 mg Protein/ml Sepharose). Anschließend wurde die Affinitätssäule gründlich mit kaltem PBS gewaschen und das Antigen wurde mit 30 ml 0,1 M Citrat, pH 5 und 30 ml 0,1 M- Citrat, pH 4 eluiert. Unter diesen Bedingungen änderte sich die Immunoreaktivität des Antigens nicht, dagegen erfolgte eine vollständige Eluierung des Antigens von den monoklonalen Antikörpern 96.5. Die beiden eluierten Fraktionen wurden mit 3.0 ml bzw. 4,5 ml 2 M Tris vom pH 8 neutralisiert. Die gereinigten Eluate wurden unter Verwendung einer Amicon-Vorrichtung mit einem Pm10-Filter konzentriert und mit zwei 10 ml-Volumina PBS gewaschen, wobei man eine Ausbeute von 4,95 mg in 4,5 ml, bestimmt mittels Bradford-Assay (Biorad), erhielt. Fünfzehn µg des Produkts wurden an SDS-PAGE entwickelt (Fig. 7), die Sichtbarmachung erfolgte mittels Coomassie-Blau- und Silberfärbung. Ein Doppeldeterminanten- Immunoassay (DDIA) (Brown, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 539) lieferte eine unabhängige Bestätigung der molaren Menge an gereinigtem Protein. Kontrollzubereitungen wurden parallel zu mit verbrauchtem Medium aus der B16-Stammzellinie hergestellt, Protein war darin nicht nachzuweisen. In einem weiteren Versuch wurden 30 mg 95%iges p97-Protein aus 300 mg an Sepharose konjugierten Fab-Fragmente der monoklonalen Antikörper 96.5 gereinigt. Das gereinigte p97-Protein war immunogen und führte zu einem starken Ansprechen auf Antikörper bei Mäusen, die mit dem Protein wie nachfolgend unter 7.3. beschrieben, immunisiert wurden.

7.2. Konstruktion und Expression des rekombinanten p97-Vaccinia-Virus

Der codierende Bereich von p97 wurde durch Schneiden von p97a mit HindIII insertiert, wobei die Enden abgestumpft wurden, und in den Vaccinia-Insertionsvektor pGS-20 (Mackett et al., 1984, J.Virol. 49: 857-864) ligiert, der an der SmaI- Stelle geöffnet worden ist. Der PGS-20-Vektor macht vom 7,5 K-Promotor Gebrauch und enthält flankierende Sequenzen vom Vaccinia-Thymidin-Kinase (TK)-Gen. Ein rekombinantes Virus wurde mittels des Verfahrens von Mackett et al., (siehe oben) erzeugt. Es wurde Vp97a-NY isoliert, das infizierte Zellen zur Exprimierung von p97-Protein korrekter Größe und Glykosylierung (Fig. 8) veranlaßt. Die Oberflächenexpression von p97 wird auch an Zellen bestätigt, die mit dem rekombinanten p97-Virus (siehe unten) infiziert wurden. (Tabelle I).

Tabelle I

7.3. Das rekombinante p97-Vaccinia-Virus ist bei Mäusen Immunogen

Die Inokulierung von Mäusen mit Vp97a-NY erzeugte ein starkes humorales Ansprechen gegen Antikörper. Man immunisierte die Mäuse einmal, impfte nach vier Wochen ein weiteres Mal und ließ sie nach fünf Wochen ausbluten. Die Titer wurden mittels ELISA unter Anwendung von Antigen-beschichteten Platten und Protein A, konjugiert an Meerrettich- Peroxidase, als Detektionsmittel bestimmt. Die Daten wurden in Äquivalente an monoklonalen Antikörpern durch Vergleich mit einer Standardkurve für das Bindungsverhalten im ELISA-Test unter Verwendung von anti-p97-monoklonalen Antikörpern 133.2 umgewandelt. Die Ergebnisse zeigten eine starke Induktion von Serumantikörpern (Fig. 9). Die zelluläre Immunität wurde unter Verwendung eines in vitro- Proliferationsassays mit gereinigtem p97-Protein als stimulierendem Antigen bestimmt (Tabelle II).

Tabelle II

Proliferationsassay von Murin-Milz-Zellen¹)

Die Ergebnisse sind Tabelle II zusammengestellt und zeigen, daß die T-Zellen als Antwort auf das antigene p97 Protein proliferieren.

Um zu ermitteln, ob auch die Helferzellen durch das rekombinante Virus in Milzzellen aus immunisierten Mäusen stimuliert wird, wurden die Zellen in-vitro stimuliert und die Überstände auf ihre Produktion von Interleukin-2 (IL-2), einem Helfer-T-Zellfaktor, untersucht. Man kultiviert die Milzzellen aus Mäusen, die vorher zweimal mit dem rekombinanten Vp97a-NY Vaccinia- oder dem Stamm-Vaccinia-Virus immunisiert worden sind. 10⁵-Zellen wurden 48 Stunden in 0,2 ml eines Mediums, das identisch mit dem für die Proliferations- Assays verwendeten Medium war, in 96-well-Rundbodenplatten in Anwesenheit oder in Abwesenheit des Stimulationsantigens inkubiert. Die Überstände wurden gesammelt, diejenigen von vier Vertiefungen vereinigt und vor dem IL-2-Assay eingefroren. Für den IL-2-Assay verwendete man 10⁴ zuvor IL-2 ausgehungerte Mäuse-T-Zellinie CTLL-Zellen, die in jeder Vertiefung mit unterschiedlichen Verdünnungen des Assayüberstandes Click's mit Medium dreifach inkubiert wurden. Es wurde eine Standardkurve mit rekombinantem IL-2 erstellt, das von Genentech, California, erhalten wurde. Die CTLL-Zellen wurden mit Thymidin gemäß der üblichen Proliferationsassay-Technik in den letzten sechs Stunden der 24-stündigen Inkubationszeit pulsmarkiert, anschließend geerntet und wie oben für den Proliferationsassay beschrieben, gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt, sie zeigen, daß die IL-2-Produktion aus Milzzellen von Mäusen, die mit dem rekombinanten p97-Vaccinia-Virus immunisiert worden sind, in vitro durch p97 stimuliert wird.

Tabelle III

Stimulierung der IL-2-Produktion durch p97 immune Milzzellen

Darüber hinaus wurde das verzögerte Hypersensitivitäts- Ansprechen bei mit Vp97a-NY inokulierten Mäusen mit Hilfe eines Assays, bei dem das Anschwellen der Fußballen bestimmt wird, gemessen. Fünf Mäuse (C3H/Hen-Stamm) pro Gruppe wurden durch Schwanzskarifikation mit rekombinanten Vaccinia-Viren oder mit Vaccinia-Viren vom Elternstamm inokuliert. Sechs Tage später wurden die Hinterpfoten jeder Maus einem Challenge durch Inokulierung von 20 µl PBS oder 20 µl-Zellen in PBS (5 × 10⁵ Zellen pro Maus) ausgesetzt. Die Pfoten wurden 24 Stunden später in einem Doppelblindversuch, unter Verwendung eines Fowler-Mikrometers gemessen. Die Dicke des mit PBS-injizierten Fußballens wurde von der gemessenen Dicke des für den Versuch herangezogenen Ballens jeder Maus subtrahiert. Die mittlere durch Schwellung verursachte Zunahme des Ballens sowie die Standardabweichung davon wurden berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt. Sie zeigen, daß ein p97-spezifisches verzögertes Hypersensitivitätsansprechen bei Mäusen, die mit rekombinanten p97- Vaccinia-Viren immunisiert sind, erfolgt.

Tabelle IV

Antigen-spezifisches Anschwellen des Fußballens bei p97-immunisierten Mäusen

7.4. Schutz und Therapie mit p97- Vaccinia-Viren im Murin-Tumormodell

Um die Wirksamkeit des Vakzins zu bestimmen, wurden Mäuse nach unterschiedlichen Schemata unter Anwendung der erfindungsgemäßen rekombinanten p97 Vaccinia-Viren geimpft und anschließend einem Challenge mit p97-transfektierten syngenen Tumorzellen (M2SVp97a.2E) ausgesetzt. Zu diesem Zweck wurden Mäuse mit Vp97a-NY rekombinanten lebenden Vaccinia-Viren oder dem elterlichen Stamm (Vwt-NY) durch Schwanzskarifikation oder mit 100 µg gereinigtem p97 Protein oder mit 5 × 10⁶ bestrahlten M2-K1735 Tumorzellen intraperitoneal in komplettem Freund's Adjuvans immunisiert. Zwei Wochen nach der letzten Impfung wurde ein intravenöser Tumorzell- Challenge verabreicht durch Injektion von M2SVp97a.2E, einem metastatischen Tumorklon, der hergestellt wurde aus M2-K1735 (einem Murin-Melanom-Modell) durch Transfektion mit der Human-p97-codierenden Sequenz, die in einem durch den frühen SV40-Promotor gesteuerten Expressionsplasmid enthalten ist. Es wurden eine Vielzahl exprimierender Klone selektiert und der für den Tumorchallenge verwendete Klon M2SVp97a.2E exprimiert im Durchschnitt ungefähr 400 000 Moleküle p97 pro Zelle oder Äquivalent Human-Melanom-p97- Antigen-Dichte. Es wurden zwei Dosen intravenöser Tumor- Challenges verwendet, 5 × 10⁵ oder 1 × 10⁵ Zellen, die in die Schwanzvene syngener C3H/Hen-Mäuse injiziert wurden. Die Mäuse wurden 16 Tage nach dem Tumor-Challenge getötet, die Lungen wurden entfernt. Eine Maus wurde als positiv bewertet, wenn mit bloßem Auge Tumore auf der Lunge, die mit Tusche angefärbt wurden, sichtbar waren. Die Ergebnisse sind in der Tabelle V gezeigt.

Tabelle V

Challenge vakzinierter Mäuse mit syngenen p97-transfektierten Melanomzellen

Die in Tabelle V zusammengestellten Ergebnisse zeigen, daß ein beträchtlicher Schutzeffekt mit zwei Immunisierungen mit Vp97a.NY zu erzielen ist. Dagegen ist kein Schutzeffekt mit gereinigtem p97-Protein-Vakzin (trotz der gefundenen, extrem hohen Antikörpertiter) zu beobachten. Die Fähigkeit der rekombinanten Viren, zelluläre Immunität herbeizuführen, kann für deren Tumorschutzeffekt (Tumorimmunität) verantwortlich sein.

In einem Therapieversuch wurden Mäuse mit einer niedrigen Dosis von p97-exprimierenden Tumorzellen und zwei Tage später mit dem rekombinanten Vaccinia-Vakzin inokuliert. Die Mäuse wurden intravenös einem Challenge mit 10⁵ oder 10⁴ p97-exprimierenden Tumorzellen ((M2SVp97a.E) ausgesetzt. Zwei Tage später wurden die Mäuse durch Schwanzskarifikation entweder mit Vp97a-NY oder Vwt-NY inokuliert. Die Inokulierungen durch Schwanzskarifikation wurden wöchentlich wiederholt und die Zahl der überlebenden Mäuse bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 10 dargestellt und zeigen den therapeutischen Effekt einer Impfung mit rekombinanten p97 Vaccinia-Viren bei Mäusen mit vorhandenen Lungenmetastasen.

7.5. Rekombinante p97-Vaccinia-Viren sind Immunogen bei Makaken-Affen

Zwei Macaca fasicularis (Makaken)-Affen wurden entweder mit 2 × 10⁸ Plaque-forming-Units (pfu) an Vp97a-NY rekombinantem Vakzin oder mit der gleichen Dosis Vakzin auf Basis des elterlichen Stamms skarifiziert. Zwei Wochen später wurden die Sera mittels ELISA auf Vaccinia- und p97-Titer getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengestellt. Sie zeigen, daß humorale Antikörper gegen p97 zwei Wochen nach Einzelinokulierung mit Vp97a-NY nachweisbar sind.

Tabelle VI

Serum-Antikörpertiter bei Vaccinia-Inokulierten Affen

Hinterlegung der Mikroorganismen

Die folgenden E. coli-Stämme, die die dabei aufgeführten Plasmide enthalten, wurden bei der American Type Culture Collection ATCC Rockville, Maryland hinterlegt. Sie haben die folgende Hinterlegungsnummer (accession number) erhalten:

Die folgenden rekombinanten Vaccinia-Viren wurden bei der American Type Culture Collection, ATTC, Rockville, Maryland, hinterlegt. Sie haben die folgende Hinterlegungsnummer (accession number) erhalten:

Die folgenden Zellinien, die die dabei aufgeführten Plasmide enthalten, wurden bei der American Type Culture Collection ATCC Rockville, Maryland, hinterlegt. Sie haben die folgende Hinterlegungsnummer (accession number) erhalten:

Die Erfindung ist nicht auf die hinterlegten Mikroorganismen und Zellen beschränkt, weil die hinterlegten Ausführungsformen lediglich beispielhaft sind. Vielmehr zählen alle funktionell äquivalenten Mikroorganismen-Zellen zu der vorliegenden Erfindung. Weiter zählen zu der Erfindung alle Modifikationen des Erfindungsgegenstandes.

Die für die Nukleotide angegebenen Größen der Basenpaare stellen ungefähre Werte dar und sind beispielhaft gebracht.

Claims (33)

1. Im wesentlichen reine antigene Peptide oder Proteine, die zu dem Melanom-assoziierten p97-Antigen gehören.

2. Peptid oder Protein nach Anspruch 1, umfassend die nachfolgende Aminosäuresequenz und deren parallel dazu angegebenen DNA-Code oder einen antigenen Teil davon:

3. Peptide oder Proteine nach Anspruch 1 oder 2, rein erhältlich aus einer Zellkultur, die eine für die Peptide oder Proteine kodierende Nukleotidsequenz enthält, welche sich unter der Kontrolle einer zweiten Nukleotidsequenz befindet, die die Genexpression reguliert, so daß die Peptide oder Proteine durch die Zellkultur exprimiert werden.

4. Peptide oder Proteine nach Anspruch 3, wobei die Zellkultur einen Mikroorganismus umfaßt.

5. Peptide oder Proteine nach Anspruch 4, wobei der Mikroorganismus ein Bakterium ist.

6. Peptide oder Proteine nach Anspruch 4, wobei der Mikroorganismus eine Hefe ist.

7. Peptide oder Proteine nach Anspruch 3, wobei die Zellkultur eine Tierzellinie umfaßt.

8. Peptide oder Proteine nach Anspruch 3, wobei die Zellkultur eine Insektenzellinie umfaßt.

9. Peptide oder Proteine nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Peptide oder Proteine chemisch synthetisiert sind.

10. Rekombinantes Virus, dessen Genom eine Nukleotidsequenz umfaßt, die für ein antigenes Peptid oder Protein codiert, das zu dem Melanom-assoziierten p97-Antigen gehört, oder ein antigener Teil davon, die von einer zweiten, die Genexpression regulierenden Nukleotidsequenz kontrolliert wird, so daß in einem mit dem Virus infizierten Wirt ein Peptid oder Protein, das zu dem Melanom-assoziierten p97-Antigen gehört, exprimiert wird.

11. Virus nach Anspruch 10, wobei die Nukleotidsequenz, die für ein antigenes Peptid oder Protein kodiert, das zu dem Melanom-assoziierten p97-Antigen gehört, im wesentlichen die in Fig. 3 gezeigte Nukleotidsequenz oder einen für ein antigenes Peptid oder Protein kodierenden Teil davon umfaßt.

12. Virus nach Anspruch 10 oder 11, umfassend ein Virus mit einer Umhüllung (envelop).

13. Virus nach Anspruch 12, umfassend ein Vaccinia-Virus.

14. Virus nach Anspruch 10 oder 11, umfassend ein nacktes Virus.

15. Virus nach Anspruch 14, umfassend ein Adenovirus.

16. Virus nach Anspruch 10 oder 11, umfassend ein nukleares Polyhedrosis-Virus.

17. Virus nach Anspruch 16, umfassend ein Baculovirus.

18. Virus nach Anspruch 10 oder 11, umfassend ein Bacteriophagen.

19. Virus nach Anspruch 18, umfassend einen Lambda-phagen.

20. Subunit-Vakzin-Formulierung, wobei das Immunogen eine wirksame Dosis der Peptide oder Proteine nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in Kombination mit einem pharmazeutischen Träger umfaßt.

21. Vakzin-Formulierung auf Basis von Lebendviren, enthaltend ein rekombinantes Virus nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei das Virus infektiös ist ohne eine Erkrankung bei dem zu impfenden Wirt zu verursachen.

22. Vakzin-Formulierung auf Basis inaktivierter Viren, enthaltend eine wirksame Dosis der rekombinanten Viren nach einem der Ansprüche 10 bis 18 in nicht-infektiösem Zustand, in Kombination mit einem pharmazeutischen Träger.

23. Rekombinanter DNA-Vektor, umfassend p97b.

24. Einzelliger Organismus, enthaltend den rekombinanten DNA-Vektor nach Anspruch 23.

25. Bakterium, enthaltend den rekombinanten DNA-Vektor nach Anspruch 23.

26. Bakterium nach Anspruch 25, enthaltend Escherichia coli (ATCC Nr. 53403) oder einen Mutanten, ein rekombinantes oder gentechnologisch konstruiertes Derivat davon.

27. Rekombinanter DNA-Vektor, umfassend pMTp97b.

28. Zellinie, enthaltend den rekombinanten DNA-Vektor nach Anspruch 27.

29. Zellinie nach Anspruch 27, umfassend TKMp97-12 (ATCC Nr. CRL 8985) oder einen Mutanten, ein rekombinantes oder gentechnologisch konstruiertes Derivat davon.

30. Rekombinanter DNA-Vektor, umfassend pSVp97a.

31. Zellinie, enthaltend den rekombinanten DNA-Vektor nach Anspruch 30.

32. Zellinie nach Anspruch 31, umfassend B16SVp97a.14 (ATCC Nr. CRL 9304) oder einen Mutanten, ein rekombinantes oder gentechnologisch konstruiertes Derivat davon.

33. Virus nach Anspruch 13, umfassend das Virus Vp97a-NY (ATCC Nr. VR 2159) oder einen Mutanten, ein rekombinantes oder gentechnologisch konstruiertes Derivat davon.