DE69534162T2 - Fusion-glykoprotein von hcmv und hsv - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Cytomegalovirusproteine, insbesondere Fusionsproteine, die einen Teil eines humanen Cytomegalovirus-(HCMV)-Proteins und einen Teil eines Proteins aus dem Herpes simplex-Virus (HSV) umfassen, und ihre Expression in eukaryontischen Zellen. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Konstruktion und Expression der Fusionsproteine, Zwischenstufen zur Verwendung darin und rekombinante Protein, die aus den Zwischenstufen erhalten werden können. Rekombinante Proteine der Erfindung besitzen potentiellen Nutzen in der Entwicklung von Impfstoffen zur Prävention von HCMV-Infektion und/oder HSV-Infektion.
  • HCMV ist ein humanes DNA-Virus, das zur Familie der Herpesviren gehört. Gemeinsam mit anderen herpetischen Viren (wie das Herpes simplex-Virus (HSV) oder Varicella zoster-Virus (VZV)) ist HCMV aus einem DNA-Kern, einem äußeren Kapsid und umhüllt von einer Lipidmembran aufgebaut, die virusspezifische Glycoproteine beinhaltet.
  • Das humane Cytomegalovirus ist endemisch in den meisten Teilen der Welt. Die Primärinfektion führt jedoch normalerweise zu einer subklinischen Erkrankung, worauf das Virus latent wird, wobei es die Fähigkeit zur Reaktivierung zu jedem Zeitpunkt beibehält. In zwei Populationen ist HCMV jedoch für ernsthafte medizinische Zustände verantwortlich. HCMV ist eine Hauptursache für angeborene Defekte in Neugeborenen. Ebenfalls verbunden mit einer Infektion in solchen Kleinkindern sind Gehörverlust und eine schwache intellektuelle Leistung. Die zweite gefährdete Population sind immunbeeinträchtigte Patienten, wie diejenigen, die an einer HIV-Infektion leiden, und diejenigen Patienten, die Transplantationen erfahren. In dieser Situation wird das Virus ein oportunistisches Pathogen und verursacht eine schwere Krankheit mit hoher Morbidität und Mortalität. Die klinische Krankheit verursacht eine Vielzahl von Symptomen, einschließlich Fieber, Hepatitis, Pneumonitis und infektiöser Mononukleose.
  • Die erklärt daher die umfassenden Anstrengungen der Fachleute und die Bedeutung von Untersuchungen, die sich der Biologie dieser Viren widmen. Jedoch ist derzeit kein wirksamer Impfstoff gegen HCMV verfügbar.
  • Deshalb besteht noch immer eine Nachfrage nach Antigenen, die effektiv gegen eine Exposition mit dem HCMV-Virus schützen werden.
  • Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Fusionsprotein oder ein immunogenes Derivat davon bereitgestellt, das einen Teil des gB-Glycoproteins von HCMV umfaßt, fusioniert an einen Teil des gD-Glycoproteins von HSV, worin der Teil des gB-Glycoproteins wenigstens eine antigene Determiante enthält, die eine für HCMV spezifische Immunreaktion hervorrufen kann, und worin der Teil des gD-Glycoproteins wenigstens die Signalsequenz des HSV-Glycoproteins enthält.
  • Mit einem Teil eines gB-HCMV-Glycoproteins ist ein Teil des Proteins gemeint, der wenigstens eine antigene Determinante enthält, die eine für HCMV spezifische Immunreaktion hervorrufen kann.
  • Mit einem Teil eines gD-Glycoproteins von HSV ist ein Teil des Proteins gemeint, das wenigstens die Signalsequenz des Glycoproteins und gegebenenfalls zusätzliche Teile des Proteins enthält, die wenigstens eine antigene Determinante, die eine für HSV spezifische Immunreaktion hervorrufen kann, und/oder eine Sequenz enthalten, die die Sezernierung des Proteins bei geeigneter Expression steigert. Ein bevorzugtes HSV-Glycoprotein ist HSV Typ 2gD.
  • Das gB-Protein von HCMV Stamm AD 169 enthält 906 Aminosäurereste; die Aminosäuren 1 bis 24 entsprechen dem Signalpeptid und Reste 712 bis 776 der Membran-Ankerdomäne. Die Moleküle stellen 19 potentielle Orte für die Glycosylierung dar. Allein zur Immunisierung verwendet erzeugt das gB-Protein eine Immunreaktion, die unzureichend ist, um Schutz gegen eine Exposition mit dem Virus zu verleihen.
  • Das Protein gD aus dem Herpes simplex-Virus (HSV) ist aus 394 Aminosäuren zusammengesetzt; seine Membranankerdomäne tritt im C-terminalen Ende des Moleküls zwischen den Aminosäureresten 339 und 365 auf.
  • Bevorzugt ist die Fusion zwischen einer Aminosäure im N-terminalen Teil eines Teils des HCMV-gB-Proteins und einer Aminosäure am C-Terminus eines Teils des HSV-gD-Proteins.
  • Bevorzugt fehlt sowohl den HCMV-gB-Protein- als auch den HSV-gD-Proteinkomponenten des Fusionsproteins der Erfindung eine Membranankerdomäne.
  • Bevorzugt umfaßt der Teil des HCMV-gB-Protein eine nicht-spaltbare Form von HCMV gB. Geeignet wird dies durch Veränderung einer oder mehrerer Aminosäuren an einer Spaltstelle des Proteins erreicht. Bevorzugt erfolgt dies durch Austausch von Arg 458 und Arg 459 gegen Glu bzw. Thr. Eine solche nicht-spaltbare Form von gB ist neu und bildet einen weiteren Aspekt der Erfindung. Ein Vorteil einer nicht-spaltbaren Form von gB besteht darin, daß es eine höhere Sezernierung des Proteins bei geeigneter Expression gibt.
  • Geeignet umfaßt der Teil des HSV-Proteins die Signalsequenz von gD2 und gegebenenfalls die Aminosäuren 26 bis 52 von gD2 und/oder die Sequenz von gD2, die PEDSALLEDPED oder funktionell äquivalente Derivate davon ist, die geringfügig kürzer oder länger sind.
  • Bevorzugt schließt der Teil von gD die Aminosäuren vom Signalteil von gD2 (Aminosäuren 1 bis 25) und die Aminosäurereste 26–52 von HSV2 gD ein.
  • In einer spezifischen Ausführungsform wird ein Fusionsprotein bereitgestellt, das die Aminosäurereste 1–52 des HSV-gD-Proteins umfaßt, fusioniert an die Reste 28–686 des HCMV-gB-Proteins (hier als HCMV gB 685* bezeichnet).
  • Bevorzugt können weitere Sequenzen aus HSV gD an das Fusionsprotein addiert werden, insbesondere am C-Terminus des HCMV-gB-Proteins.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Aminosäuresequenz PEDSALLEDPED, die aus einer internen gD2-Sequenz stammt, am C-terminalen Ende des Proteins HCMV gB 685* eingeschlossen, um das hier als HCMV gB 685** bezeichnete Protein zu erzeugen. Dies Aminosäuresequenz verbessert die Sezernierung des Fusionsproteins bei geeigneter Expression.
  • Die Proteine HCMV gB 685* und HCMV gB 685** haben sich insbesondere als nützlich zur Entwicklung eines HCMV-Impfstoffs erwiesen.
  • Weitere bevorzugte Fusionsproteine sind wie in den Ansprüchen definiert.
  • Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine sind immunogen. Der Begriff immunogenes Derivat, wie hier verwendet, umfaßt jedes Molekül das ein Fusionsprotein ist, das gegenüber Antikörpern immunologisch reaktiv ist, die gegen das Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung oder Teile davon erzeugt werden, oder gegenüber Antikörpern, die das HCMV-gB-Protein, das HSV-gD-Protein, das HCMV-Virus oder das HSV-Virus erkennen, oder das Antikörper hervorruft, die das Fusionsprotein, das HCMV-gB-Protein, das HSV-gD-Protein, das HCMV-Virus oder HSV-Virus erkennen. Insbesondere können immunogene Derivate, die geringfügig länger oder kürzer als das Fusions protein der vorliegenden Erfindung sind, verwendet werden. Solche Derivate können zum Beispiel durch Substitution, Addition oder Umlagerung von Aminosäuren oder durch chemische Modifikationen davon hergestellt werden, einschließlich derjenigen zum Ermöglichen einer Kupplung des Fusionsproteins an andere Trägerproteine, wie Tetanus-Toxoid oder Hepatitis B-Oberflächenantigen. Alle solche Substitutionen und Modifikationen sind den Fachleuten auf dem Gebiet der Peptidchemie allgemein wohlbekannt.
  • Immunogene Fragmente des Fusionsproteins, die nützlich in der Herstellung von Impfstoffen sein können, können durch Expression der geeigneten Genfragmente oder durch Peptidsynthese hergestellt werden, zum Beispiel unter Verwendung der Merrifield-Synthese (The Peptides, Bd. 2, Academic Press, New York, S. 3).
  • In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird rekombinante DNA bereitgestellt, die das Fusionsprotein der Erfindung codiert. Die rekombinante DNA der Erfindung kann einen Teil eines Vektors bilden, zum Beispiel eines Plasmids, speziell eines Expressionsplasmids, aus dem das Fusionsprotein exprimiert werden kann. Solche Vektoren bilden ebenfalls einen Teil der Erfindung, ebenso wie Wirtszellen, in die die Vektoren eingeführt wurden.
  • Zur Konstruktion der DNA, die ein Fusionsprotein gemäß der Erfindung codiert, kann cDNA, die die vollständigen codierenden Sequenzen der HCMV-gB- und HSV-gD-Proteine enthält, unter Verwendung von Standardtechniken manipuliert werden [siehe zum Beispiel T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y. (1982)], wie nachfolgend weiter beschrieben wird.
  • Im Verlauf der Durchführung der oben beschriebenen Techniken kann rekombinante DNA, die Fragmente der HCMV-gB- und HSV-gD-Proteine codiert, erhalten werden, die einen weiteren Teil der vorliegenden Erfindung bildet.
  • Insbesondere sind DNA-Segmente, die eine nicht-spaltbare Form von HCMV gB, das trunkierte Protein HCMV gB (gB, dem die Membranankerdomäne fehlt) und das trunkierte Protein HSV gD (gD, dem die 5'-Membranankerdomäne fehlt) codieren, wichtige Zwischenstufen.
  • Vektoren, die solche DNA umfassen, dadurch transformierte Wirte und die trunkierten oder Hybridproteine selbst, exprimiert wie hier nachfolgend beschrieben, bilden alle einen Teil der Erfindung.
  • Zur Expression der Proteine der Erfindung können Plasmide konstruiert werden, die geeignet sind entweder für die Übertragung in das Vakziniavirus oder zur Transfektion in Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) oder Verozellen. Geeignete Expressionsvektoren werden nachfolgend beschrieben.
  • Zur Expression in Vakzinia kann ein Vakziniatransferplasmid wie pULB 5213, das ein Derivat von pSC11 ist (Chakrabati et al., Molecular und Cellular Biology 5, 3403–3409, 1985), verwendet werden. In einem Aspekt kann das Protein unter der Kontrolle des Vakzinia p7.5-Promotors exprimiert werden.
  • Zur Expression in CHO-K1-Zellen kann in geeigneter Weise ein Glutaminsynthetase-(GS)-Vektor wie pEE14 verwendet werden, so daß das Protein unter der Kontrolle des hauptsächlichen unmittelbaren frühen Promotors des humanen Cytomegalovirus (hCMV-MIE) exprimiert wird. Alternativ kann in geeigneter Weise ein Vektor verwendet werden, der die Expression des codierenden Moduls als ein polycistronisches Transkript mit dem neo-Selektionsgen erlaubt. In einem bevorzugten Aspekt ist das codierende Modul unter der Kontrolle des Rous Sarcoma Long Terminal Repeat-(LTR)-Promotors.
  • Bevorzugt trägt das Plasmid zur Expression in CHO-K1-Zellen eine GS-Expressionskassette, die geeignet zur Genamplifikation unter Verwendung von Methioninsulfoximin (MSX) ist. Alternativ trägt das Plasmid zur Expression in CHO-K1-Zellen eine DHFR-Expressionskassette, die zur Genamplifikation unter Verwendung von Methotrexat (MTX) geeignet ist.
  • Bevorzugt wird die Expression der Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung in Gegenwart von Natriumbutyrat und/oder Dimethylsulfoxid (DMSO) durchgeführt, von denen festgestellt wurde, daß sie die Genexpression steigern.
  • In noch einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine Impfstoffzusammensetzung bereitgestellt, die ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt, ein erfindungsgemäßes Protein zur Verwendung in der Impfung eines Wirtes und die Verwendung eines erfindungsgemäßen Proteins in der Herstellung eines Impfstoffs.
  • Es ist bekannt, daß die Aminosäuren 1–23 von reifem gD in Tieren eine schützende und neutralisierende Reaktion gegen eine lethale Exposition hervorrufen können, außerdem daß dieses Peptid, wenn es geeignet formuliert wird, eine CTL-Reaktion hervorrufen kann (Watari et al., Zitat im nachfolgenden Beispiel 2).
  • Entsprechend bieten die Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung, die dieses Peptid enthalten, nicht nur eine Schutzreaktion für eine HCMV-Infektion, sondern bieten ebenfalls eine Schutzreaktion für eine HSV-Infektion, wodurch ein neuer bifunktioneller Impfstoff bereitgestellt wird.
  • Gegebenenfalls und vorteilhaft wird der Impfstoff der vorliegenden Erfindung mit anderen Immunogenen kombiniert, um einen polyvalenten Impfstoff zu liefern. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Fusionsprotein mit anderen Unterkomponenten von HSV, z.B. gD, kombiniert.
  • In einem besonderen Aspekt stellt die Erfindung ferner eine Impfstoffzusammensetzung bereit, die ein erfindungsgemäßes Protein zusammen mit einem geeigneten Träger oder Zusatzstoff umfaßt.
  • Die Impfstoffherstellung wird allgemein beschrieben in New Trends and Developements in Vaccines, herausgegeben von Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Die Verkapselung innerhalb von Liposomen wird zum Beispiel beschrieben von Fullerton, US-PS 4 235 877 .
  • Im Impfstoff der vorliegenden Erfindung kann eine wäßrige Lösung des Proteins (der Proteine) direkt verwendet werden. Alternativ kann das Protein mit oder ohne vorhergehende Lyophilisierung mit jedem der verschiedenen bekannten Hilfsstoffe vermischt, absorbiert oder adsorbiert werden. Solche Hilfsstoffe schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Aluminiumhydroxid, Muramyldipeptid und Saponine wie Quil A. Besonders bevorzugte Hilfsstoffe sind MPL (Monophosphoryllipid A) und 3D-MPL (3-desacyliertes Monophosphoryllipid A) [ US-PS 4 912 094 ]. Ein weiterer bevorzugter Hilfsstoff ist als QS21 bekannt, das durch das in US-PS 5 057 540 offenbarte Verfahren erhalten werden kann. Die Verwendung von 3D-MPL wird beschrieben von Ribi et al. in Microbiology (1986), Levie et al. (Hrsg.), Amer. Soc. Microbiol. Wash. D. C., 9–13. Die Verwendung von Quil A wird offenbart von Dalsgaard et al. (1977), Acta Vet. Scand. 18, 349. Die Verwendung von kombiniertem 3D-MPL und QS21 wird beschrieben in WO 94/00153 (SmithKline Beecham Biologicals S. A.).
  • Als eine weitere exemplarische Alternative können die Proteine innerhalb von Mikropartikeln, wie Liposomen, verkapselt oder mit Öl-in-Wasser-Emulsionen assoziiert werden. Die Verkapselung innerhalb von Liposomen wird von Fullerton in US-PS 4 235 877 beschrieben. In noch einer anderen exemplarischen Alternative können die Proteine mit einem immunstimulierenden Makromolekül konjugiert werden, wie zum Beispiel mit abgetötetem Bordetella oder einem Tetanus-Toxoid. Die Konjugation von Proteinen mit Makromolekülen wird zum Beispiel offenbart von Likhite in US-PS 4 372 945 und von Amor et al. in US-PS 4 474 757 .
  • Die Menge des Proteins der vorliegenden Erfindung, die in jeder Impfstoffdosis vorhanden ist, wird als eine Menge ausgewählt, die eine Immunschutzreaktion ohne signifikante nachteilige Nebenwirkungen in typischen Impflingen induziert. Eine solche Menge wird abhängig davon variieren, welches spezifische Immunogen eingesetzt wird, und ob der Impfstoff mit Hilfsstoff versetzt ist oder nicht. Allgemein wird erwartet, daß jede Dosis 1–1000 μg Protein umfassen wird, bevorzugt 1–200 μg. Eine optimale Menge für einen besonderen Impfstoff kann durch Standarduntersuchungen sichergestellt werden, die die Beobachtung von Antikörpertitern und anderen Reaktionen in Probanden beinhalten.
  • Zur klareren Definition der Erfindung wird auf die anhängenden Zeichnungen verwiesen, worin gilt:
  • 1 zeigt das Konstruktionsschema für chimäres gB.
  • 2 zeigt eine Plasmidkarte von pEE14-gB685**.
  • Die Erfindung wird jetzt durch Verweis auf die folgenden Beispiele erläutert.
  • BEISPIEL 1: Konstruktion von chimären gB-Molekülen
  • Die folgenden Konstruktionsschritte wurden durchgeführt, um die unterschiedlichen gD/gB-Fusionsmoleküle zu erzeugen (chimäres gB685* und chimäres gB685**), siehe 1.
  • a) gB685NC (nicht spaltbar)
  • Zur Erzeugung von pUC12-gB685 wurde das gB-Gen von Stamm Ad169 HCMV aus dem genomischen HindIII-F-Fragment als ein EclI-Fragment in den SmaI-Ort von pUC12 subkloniert (C. Yanisch-Perron et al. 1985, GENE 33, 103). Ein Stoppcodon und ein BamHI-Ort wurden in den internen EcoRI-Ort inseriert (Position 2208 von AD 169 gB), was eine Trunkierung bei Aminosäure 685 erzeugte (d.h. das Fehlen des Transmembranankers [Aminosäuren 712–776]). Die HCMV-gB-Sequenz ist aus Cranage et al. bekannt, Embo J. 1986, 5, 3057–3063.
  • Zum Erhalt einer höheren Sezernierung von trunkiertem gB685-Antigen in den Zellkulturüberstand von CHO-K1-Zellen führten wird zuerst in das zuvor klonierte und trunkierte gB685-Plasmidkonstrukt, pUC12-gB685 (pM7), ebenfalls als pRIT14224 bezeichnet, eine Doppelmutation ein, die die gB-Spaltstelle bei 459/460 (AD169-Stamm) nicht-spaltbar machte. Dies wurde erreicht durch Austauschen (PCR) von Arg458 und Arg459 gegen Glutamin bzw. Threonin. Insbesondere wurde das gB685 NC (nicht spaltbare) Plasmidkonstrukt durch rekombinante PCR (RPCR) gemäß einem in Zitat 1 beschriebenen Verfahren erzeugt. Deshalb wurden zwei DNA-Plasmidzubereitungen von pUC12-gB685 durch HindIII bzw. XmnI verdaut. Beide linearisierten Plasmide wurde getrennt durch PCR amplifiziert (Ampli Taq), wobei die Primerpaare Dir 268, Dir 269 bzw. Dir 270, Dir 271 verwendet wurden. Die amplifizierten Produkte, ca. 10 ng aus jeder PCR-Reaktion, wurden zusammen vermischt, und kompetente E. coli HB101-Zellen wurden transformiert.
  • Dank der erzeugten homologen Enden (75 nct für die pUC-Region bzw. 13 nct für die mutierte gB-Region) können die linearen PCR-Produkte eine Zirkularisierung durch Rekombination in vivo erfahren. Ca. 30% der erhaltenen Klone (0,15% Effizienz) waren ohne Fehler nach der Sequenzierung der ganzen gB-Region. Ein E. coli-Clon pUC12-gB685 NC, ebenfalls als pRIT14225 bezeichnet, wurde ausgewählt und DNA wurde hergestellt. Ein BamHI-Fragment von 2200 bp, das die gB685 NC-Kassette enthielt, wurde gelgereinigt und in den durch BclI geschnittenen Expressionsvektor pEE14 ligiert. Das resultierende rekombinante Plasmid ist pEE14 gB685 NC, auch als pRIT14226 oder pC2 bezeichnet (siehe 1b).
    • (1) D. H. Jones und S. C. Winistorfer 1992, Biotechniques 12: 528–533
  • b) gD/gB-Fusionsprotein (chimäres gB685*)
  • Konstrukt gB685* wurde wie folgt erzeugt (siehe 1c). Die 5'-Leitsequenz (86 bp) und Signalsequenz (Aminosäuren 1 bis 25) von Glycoprotein gD von HSV2 und die reife Sequenz von gD aus den Aminosäuren 26 bis 52 wurde an die Aminosäure 28 des reifen HCMV gB (minus 3 Aminosäuren) fusioniert. Die Konstruktionsschritte waren wie folgt: ein aus Plasmid pEE14-gD2t 1A (ebenfalls als pRIT13832 bezeichnet) stammendes EcoRI-PvuII (240 bp) gD2-Fragment wurde an ein 1980 bp ScaI/BamHI-Fragment aus pUC12-gB685 in Gegenwart des durch EcoRI/BclI geschnittenen pEE19-Vektors ligiert. Dies führte zu pEE14-gB685*, ebenfalls bezeichnet als pRIT14227 oder pC3. Die erhaltenechimäre gB-Expressionskassette wurde durch automatisierte DNA-Sequenzierung verifiziert.
  • Plasmid pEE14-gD2t 1A enthält eine trunkierte gD-codierende Sequenz (HSV2 Stamm G) aus den Aminosäuren 1 → 309 in einem CHOK1-Vektor pEE14 (Zitat 3) unter der Kontrolle des hauptsächlichen unmittelbaren frühen Promotors aus dem humanem Cytomegalovirus (hCMV-MIE). Die HSV2-gD-Sequenz ist bekannt aus Lasky et al., DNA, 1984, 3, 23–29.
  • c) Chimäres gB685**
  • Das gB685**-Konstrukt (siehe 1d) wurde erzeugt durch Addieren, am C-Ende des oben genannten chimären gB685*-Expressionsmoduls, einer Verlängerung von 12 Aminosäuren (PEDSALLEDPED), die aus einer internen gD2-Sequenz stammten (d.h. das gleiche trunkierte C-Ende des gD2t-Moleküls, das zufällig sehr gut in CHO-K1-Zellen sezerniert wird). Insbesondere wurden die folgenden Konstruktionsschritte durchgeführt. Eine 2002 bp lange HindIII/BglII-Fragment aus pEE14.gB685* (pRIT14277) wurde mit einem 285 bp BglIII/XbaI-Fragment (erzeugt durch PCR unter Verwendung der Primer Dir 287 und Dir 288 an pUC12-gB685 NC) zusammen mit dem durch HindIII/XbaI geschnittenen Vektor pEE14 ligiert. Das resultierende Plasmid ist pEE14-gB685**, ebenfalls bezeichnet als pRIT14229 oder pC4 (siehe 2). Nach Sequenzierung des 3'-Endes der gB685**-Kassette von 10 Klonen wurde Klon # 30 ausgewählt, und DNA wurde durch CsCl-Gradientenreinigung hergestellt.
  • BEISPIEL 2: Expression in eukaryontischen Zellen
  • a) Expression in CHO-Zellen
  • CHO-K1-Zellen wurden klassisch durch die Ca-Phosphatmethode unter Verwendung von jeweils 20 μg DNA der folgenden Expressionsplasmide transfiziert: pEE14-gB685 NC, pEE14-gB685* und pEE14-gB685**. Die Selektion von stabilen Transformantenklonen erfolgte in GMEM-Medium, 10% dialysiertes FBS, dem Glutamin fehlt (siehe Zitat 3). Dieses Selektionsverfahren zur Glutaminsynthetase-Genexpression des pEE14-Vektors (Celltech) beruht auf der Fähigkeit der transfizierten Plasmid-DNA, Resistenz gegen eine niedrige Konzentration von Methioninsulfoximin (MSX) zu verleihen. CHO-K1-Klone wurden durch Klonierungszylinder isoliert (± 26 Klone für das gB685 NC- bzw. gB685*-Konstrukt). CHO-K1-gB685**-Transfektantenklone wurden selektiert/isoliert unter Verwendung eines unterschiedlichen Protokolls. Nach Transfektion (Ca-Phosphat) von ca. 1,4·106 Zellen in F80 cm2 T-Kolben wurden die Zellen auf vier Platten mit 96 Vertiefungen verteilt, und jede Vertiefung wurde mit ± 3500 Zellen beimpft. Nach Selektion für ca. 2–3 Wochen wurden insgesamt 25 Klone erhalten. Sechs Klone wurden weiter in F25 cm2 amplifiziert und durch Wester-Blot-Analyse unter Verwendung von α-gD-Antikörper (mAb 4846) untersucht und ebenfalls durch gB-spezifisches ELISA untersucht (1F10G2/LCT62). Fünf von sechs Klonen sezernierten hohe Mengen von chimärem gB685**-Protein in den Kulturüberstand der CHO-K1-Zellen.
  • Diese CHO-K1-Klone wurden amplifiziert, und Zellfläschchen wurden hergestellt. Klon pC4204.20 wurde zur weiteren Charakterisierung ausgewählt. Der Expressionsgrad von gB685**-Antigen, das in den Kulturüberstand sezerniert wurde, wurde gemäß Western-Blot-Analyse (mAb 4846) unter Verwendung von gereinigtem gD2t als Referenz zu 3–4 μg/ml/5·105 Zellen abgeschätzt.
  • Tabelle I zeigt die Ergebnisse der Expressionscharakterisierungsuntersuchungen, die durch Radioimmunpräzipitationstest (RIPA) an CHO-K1-Zellen durchgeführt wurden, die gB685-, gB685 NC-, gB685*- bzw. gB685**- Antigene exprimieren. Zellextrakte und Kulturüberstände wurden unter Verwendung eines Feldes unterschiedlicher monoklonaler Antikörper (W. Britt) immunpräzipitiert, die gegen gB HCMV (ein sequenzieller mAb 27-156 und zwei Konformations-mAbs 27-39 und mAb 9-3) und ein neutralisierendes humanes α-CMV-Serum (# 243) gerichtet waren, und durch einen sequenziellen monoklonalen Antikörper (mAb 4846) der gegen den NH2-Teil (Aminosäuren 12 bis 23) von HSV2 gD gerichtet waren.
  • Tabelle II zeigt die Western-Blot-Ergebnisse unter Verwendung der gleichen monoklonalen Antikörper und des gleichen humanen α-CMV-Serums (# 243). Die obigen Ergebnisse legen nahe, daß das chimäre gB685**-Antigen eine gesteigerte Sezernierungskapazität in bezug auf das zuvor analysierte gB685-Antigen zeigt, das aus CHO-K1-gB685 stammt (Klon 44). Die obigen Ergebnisse legen ebenfalls nahe, daß gB685*, gB685** und ebenfalls gB685 NC – aber nicht oder zu einem viel geringeren Grad gB685 – sezerniert und in einem Konformationszustand aufgefunden werden, der durch Konformationsantikörper und humanes neutralisierendes CMV-Serum (# 243) gut erkannt wird. Das durch chimäres gB685** und gB685 NC exprimierte Antigen kann eine Konformation besitzen, die sehr derjenigen von nativem gB ähnelt und kann deshalb äußerst nützlich zur Entwicklung eines HCMV-Impfstoffs sein. Es könnte ermutigen, auch das chimäre gB685**-Immunogen als Komponente eine HSV-gD-Impfstoffs zu verwenden. Dies deshalb, weil von Watari et al. 1987 (2) (und Zitate darin) gezeigt wurde, daß die Aminosäuren 1 bis 23 von reifem gD2 ein CTL-Epitop enthalten und eine neutralisierende und Schutzimmunreaktion im Mäusemodell ausüben könnten.
  • Obwohl es keine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung ist, könnte die Verwendung dieser chimären gB685*- und gB685**-Antigene die Isolierung/Reinigung über "gD-Tag" durch Immunaffinitätschromatographie erleichtern (wie es kürzlich von uns gezeigt wurde).
  • Es sollte bemerkt werden, daß alle exprimierten nicht-spaltbaren CHO-K1 gB685-Konstrukte trotz der Gegenwart der mutierten 458/459-Aminosäuren eine (kleine) Proteinbande bei 33–35 kD zeigen (die dem gp33-Teil von gB685 spaltbar ähnelt). Diese Bande wird in Zellextrakten durch WB-Analyse unter Verwendung von mAb 27-156 (α-gp33) erkannt. Dieser Befund legt sehr stark nahe, daß eine alternative nahe Spaltstelle in diesen nicht-spaltbaren rekombinanten gB685-Konstrukten aktiviert ist.
  • Es sollte ebenfalls betont werden, daß wir ein (noch) nicht beschriebenes Reifungsereignis gefunden haben, d.h. eine Reifungsstelle im NH2-Teil des gB-Moleküls (gp92-116). Die Detektion wurde aufgrund des addierten gD- Tags am aminoterminalen Teil des gB685-Moduls möglich gemacht. Eine 34–36kD-Bande wurde in Zellextrakten durch WB-Analyse unter Verwendung eines α-gD monoklonalen Antikörpers mAb4846 detektiert. Ein 69–70kD Proteinfragment, das am wahrscheinlichsten der Carboxy-Hälfte des bp92-116-Teils von gB enstspricht, wurde nur durch RIPA unter Verwendung von gB-spezifischen mAbs detektiert (was eine Kopräzipitation mit dem gp33-Teil nahelegt). Die gleiche 69–70kD-Bande wurde ebenfalls durch humanes neutralisierendes Anti-CMV-Serum #243 in RIPA erkannt (siehe ebenfalls Tabelle I). Diese 69–70kD-Bande wurde rückblickend in allen CHO-K1-gB-Konstrukten (spaltbar oder nicht) detektiert. Diese Spaltung des aminoterminalen Teils von gB (gp92-116) könnte vielleicht von biologischer Bedeutung sein (Fusion), und dieser Befund könnte wichtig für die Impfstoffentwicklung sein.
    • (2) J. Exp. Med. 1987, 165: 459–470.
    • (3) M. I. Cockett, C. R. Bebbington und G. T. Yarranton 1990, Biotechnology 8, 662–667.
  • BEISPIEL 4: Steigerung der gB-Genexpression mit Natriumbutyrat oder DMSO
  • Natriumbutyrat (NaBut) wurde in unterschiedlicher Konzentration (0,5 mM, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM) zu Kulturen von CHO-K1-gB**-Subklonen gegeben. Ein deutlicher Effekt wurde beobachtet (WB-Analyse, mAb 4846), ausgehend von 0,5 mM NaBut, wobei maximale Expressionsgrade bei 2 mM–4 mM NaBut erreicht wurden. Bei höherer (5 mM) Konzentration (mehr Expression pro Zelle wird beobachtet) ist der cytostatische Effekt von NaBut zu betont, und deshalb ist die Gesamtausbeute von gB** nicht sehr erhöht gegenüber der Behandlung mit 2 mM NaBut. Typische Ergebnisse für einen Suklon von gB** waren eine ca. 16-fache Steigerung der Basis-Genexpression von gB** (WB-Analyse), wenn 2 mM NaBut hinzugegeben wurde und wenn sich gB** während 4 Tagen anreicherte. Mit DMSO, hinzugegeben mit 2%, wurde eine 8- bis 12-fache Zunahme beobachtet.
  • Tabelle I: Zusammenfassung der Radioimmunpräzipitations-(RIPA)-Ergebnisse an unterschiedlichen CHO-K1-Zellinien, die unterschiedliche rekombinante gB685-Antigene exprimieren. Zelllysate wurden in RIPA-Puffer hergestellt, und die Zellkulturüberstände (SN) wurden mit einem Feld unterschiedlicher monoklonaler Antikörper analysiert, die gegen gB und ein neutralisierendes humanes α-CMV Serum # 243 gerichtet waren.
    Figure 00120001
  • Tabelle II: Zusammenfassung der Western-Blot-Analyseen, durchgeführt mit einem Feld von unterschiedlichen monoklonalen Antikörpern gegen gB und ein neutralisierendes humanes α-CMV-Serum # 243.
    Figure 00130001
  • Tabelle III: Primer-Oligonukleotide und PCR-Bedingungen, die zur Erzeugung der unterschiedlichen chimären gB685-Konstrukte verwendet wurden A) gB685NC (nicht spaltbar)
    Figure 00140001
    • PCR-Reaktionsbedingungen: an 0,5 μg HindIII- oder XmmI-linearisiertem pUC12-gB685
    • 25 Zyklen: 2 min 94°C, 2 min 55°C, 2 min 72°C
    • 1 Zyklus: 2 min 94°C, 2 min 55°C, 15 min 72°C mit Primerpaaren Dir 268, Dir 269 und separat mit Primerpaaren Dir 270, Dir 271
  • B) Chimäres gB685**
    Figure 00140002
    • PCR: an 0,1 μg DNA von pUC12-gB685 NC-Plasmid
    • 25 Zyklen: 2 min 95°C, 2 min 55°C, 2 min 72°C gefolgt von 2 min 95°C, 2 min 55°C und 15 min 72°C.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00150001
  • Figure 00160001
  • Figure 00170001
  • Figure 00180001

Claims (14)

  1. Fusionsprotein oder immunogenes Derivat davon, das einen Teil des gB-Glycoproteins von HCMV umfasst, fusioniert an einen Teil des gD-Glycoproteins von HSV, worin der Teil des gB-Glycoproteins wenigstens eine antigene Determinante enthält, die eine für HCMV spezifische Immunreaktion hervorrufen kann, und worin der Teil des gD-Glycoproteins wenigstens die Signalsequenz des HSV-Glycoproteins enthält.
  2. Protein oder Derivat gemäss Anspruch 1, worin die Fusion zwischen einer Aminosäure im N-terminalen Teil eines Teils des HCMV-gB-Proteins und einer Aminosäure am C-Terminus eines Teils des HSV-gD-Proteins besteht.
  3. Protein gemäss einem der Ansprüche 1 oder 2, worin der Teil des HCMV-Proteins nicht-spaltbar ist.
  4. Protein gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Teil des HSV-Proteins die Signalsequenz von gD2 und gegebenenfalls die Aminosäuren 26 bis 52 von gD2 und/oder die Sequenz von gD2, die PEDSALLEDPED ist, umfasst.
  5. Rekombinante DNA, die ein Fusionsprotein oder ein immunogenes Derivat davon wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert codiert.
  6. Expressionsvektor, der rekombinante DNA wie in Anspruch 5 definiert umfasst.
  7. Wirt, der mit einem Vektor wie in Anspruch 6 definiert transformiert ist.
  8. Impfstoffzusammensetzung, die das Protein wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert oder ein immunogenes Derivat davon im Gemisch mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
  9. Impfstoffzusammensetzung gemäss Anspruch 8, die ferner 3D-Mono-phosphoryllipid A und/oder QS-21 umfasst.
  10. Impfstoffzusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 8 bis 9, worin der Träger eine Öl-in-Wasser-Emulsion ist.
  11. Fusionsprotein oder immunogenes Derivat davon wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert zur Verwendung in der Medizin.
  12. Impfstoffzusammensetzung wie in einem der Ansprüche 8 oder 9 definiert zur Verwendung in der Medizin.
  13. Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, wobei das Verfahren das Exprimieren einer DNA-Sequenz, die das Protein codiert, in einer Wirtszelle und das Gewinnen des Proteins umfasst.
  14. Verwendung eines Proteins oder eines immunogenen Derivats davon wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Behandlung von viralen Infektionen.
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