ES2239758T3 - Glicoproteina de fusion de cmvh y vhs. - Google Patents

Glicoproteina de fusion de cmvh y vhs.

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ES2239758T3 ES95919447T ES95919447T ES2239758T3 ES 2239758 T3 ES2239758 T3 ES 2239758T3 ES 95919447 T ES95919447 T ES 95919447T ES 95919447 T ES95919447 T ES 95919447T ES 2239758 T3 ES2239758 T3 ES 2239758T3
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Abstract

SE DESCRIBE UNA PROTEINA DE FUSION QUE COMPRENDE UNA PORCION DE UNA GLICOPROTEINA DEL CITOMEGALOVIRUS HUMANO (HCMV) FUSIONADO CON UNA PORCION DE UNA GLICOPROTEINA DEL VIRUS DEL HERPES SIMPLEX (HSV).

Description

Glicoproteína de fusión de CMVH y VHS.
La presente invención se refiere a proteínas recombinantes de citomegalovirus, más en particular a proteínas de fusión que comprenden una porción de una proteína de citomegalovirus humano (CMVH) y una porción de una proteína del virus del herpes simple (VHS) y su expresión en células eucarióticas. La invención se refiere además a procedimientos de construcción y expresión de dichas proteínas de fusión, intermedios para uso en ellos y proteínas recombinantes que pueden obtenerse a partir de intermedios.
Las proteínas recombinantes de la invención tienen utilidad potencial en el desarrollo de vacunas para la prevención de infección por CMVH y/o infección por VHS.
El CMVH es un virus ADN humano que pertenece a la familia de los virus herpes. En común con otros virus herpéticos (tales como el virus del herpes simple (VHS), virus de la varicela zoster (VVZ)), CMVH está compuesto por un núcleo de ADN, una cápside externa y recubierto por una membrana lipídica que incorpora glicoproteínas específicas del virus.
El citomegalovirus humano es endémico en la mayor parte del mundo. Sin embargo, la infección primaria tiene como resultado normalmente una enfermedad subclínica tras la cual el virus se hace latente reteniendo la capacidad para reactivarse en cualquier momento. Sin embargo, CMVH es responsable de afecciones graves en dos poblaciones. CMVH es una causa importante de defectos congénitos en recién nacidos. En estos niños, la infección también se asocia con la pérdida de audición y un pobre rendimiento intelectual. La segunda población de riesgo son los pacientes inmunodeprimidos, tales como aquellos que sufren una infección por VIH o aquellos pacientes sometidos a trasplantes. En esta situación el virus se convierte en un patógeno oportunista y causa una enfermedad grave con alta morbilidad y mortalidad. La enfermedad clínica causa diversos síntomas, incluyendo fiebre, hepatitis, neumonía y mononucleosis infecciosa.
Esto explica, por tanto, el gran esfuerzo de los especialistas en la técnica y la importancia de los estudios dedicados a la biología de estos virus. Sin embargo, actualmente no está disponible una vacuna eficaz frente a CMVH.
Por tanto, aún existe una necesidad de antígenos que protejan eficazmente frente a una exposición al virus CMVH. Según un primer aspecto de la presente invención se proporciona una proteína de fusión o un derivado inmunogénico de la misma que comprende una porción de la glicoproteína gB de CMVH fusionada con una porción de la glicoproteína gD de VHS, en la que la porción de la glicoproteína gB contiene al menos un determinante antigénico capaz de desencadenar una respuesta inmune específica frente a CMVH y en la que la porción de la glicoproteína gD contiene al menos la secuencia señal de la glicoproteína de VHS.
Por una porción de una glicoproteína gB de CMVH se entiende una parte de la proteína que contiene al menos un determinante antigénico capaz de desencadenar una respuesta inmune específica frente a CMVH.
Por una porción de una glicoproteína gD de VHS se entiende una parte de la proteína que contiene al menos la secuencia señal de la glicoproteína y, opcionalmente, partes adicionales de la proteína que contienen al menos un determinante antigénico capaz de desencadenar una respuesta inmune específica frente a VHS y/o contiene una secuencia que aumenta la secreción de la proteína cuando se expresa de manera adecuada. Una glicoproteína de VHS preferida es del tipo 2gD de VHS.
La proteína gB de la cepa AD 169 de CMVH contiene 906 restos de aminoácidos; los aminoácidos 1 a 24 corresponden al péptido señal y los restos 712 a 776 al dominio de anclaje a membrana. La molécula presenta 19 sitios potenciales para glicosilación. Usada sólo para inmunización, la proteína gB genera una respuesta inmune que es insuficiente para conferir protección frente a una exposición al virus.
La proteína gD del virus del herpes simple (VHS) está compuesta de 394 aminoácidos; su dominio de anclaje a membrana se encuentra en el extremo C-terminal de la molécula, entre los restos de aminoácidos 339 y 365.
Preferiblemente la fusión es entre un aminoácido en la parte N-terminal de una porción de la proteína gB de CMVH y un aminoácido en el C-terminal de una porción de la proteína gD de VHS.
Preferiblemente, ambos componentes de la proteína de fusión de la invención, la proteína gB de CMVH y la proteína gD de VHS, carecen del dominio de anclaje a membrana.
Preferiblemente, la porción de la proteína gB de CMVH comprende una forma no escindible de gB de CMVH. Esto se consigue de manera adecuada cambiando uno o más aminoácidos en un sitio de escisión de la proteína. Preferiblemente esto es mediante intercambio de la Arg 458 y la Arg 459 por Glu y Thr, respectivamente. Dicha forma no escindible de gB es nueva y forma un aspecto más de la invención. Una ventaja de tener una forma no escindible de gB es que hay una mayor secreción de la proteína cuando se expresa de manera adecuada.
De manera adecuada, la porción de la proteína de VHS comprende la secuencia señal de gD2 y opcionalmente los aminoácidos 26 a 52 de gD2 y/o la secuencia de gD2 que es PEDSALLEDPED o los derivados funcionalmente equivalentes de ella que son ligeramente más cortos o más largos.
Preferiblemente, la porción de gD incluye aminoácidos de la porción señal de gD2 (aminoácidos 1 a 25) y los restos de aminoácidos 26 a 52 de gD de VHS2.
En una realización específica, se proporciona una proteína de fusión que comprende los restos de aminoácidos 1 a 52 de la proteína gD de VHS fusionada con los restos 28 a 686 de la proteína gB de CMVH (denominada en este documento gB 685* de CMVH).
Preferiblemente, se pueden añadir secuencias adicionales a la proteína de fusión, en particular en el C-terminal de la proteína gB de CMVH.
En una realización preferida adicional, la secuencia de aminoácidos PEDSALLEDPED, que deriva de una secuencia interna de gD2, se incluye en el extremo C-terminal de la proteína gB 685* de CMVH para producir una proteína denominada en este documento gB 685** de CMVH. Esta secuencia de aminoácidos mejora la secreción de la proteína de fusión cuando se expresa de manera adecuada.
Se ha descubierto que las proteínas gB 685* de CMVH y gB 685** de CMVH son útiles en particular para desarrollar una vacuna frente a CMVH.
Más proteínas de fusión preferidas son como se define en las reivindicaciones.
Las proteínas de fusión de la presente invención son inmunogénicas. Eltérmino derivado inmunogénico como se usa en este documento abarca cualquier molécula que es una proteína de fusión que es inmunológicamente reactiva con anticuerpos obtenidos frente a la proteína de fusión de la presente invención o partes de ella o con anticuerpos que reconocen la proteína gB de CMVH, la proteína gD de VHS, el virus CMVH o el virus VHS, o que obtiene anticuerpos que reconocen la proteína de fusión, la proteína gB de CMVH, la proteína gD de VHS, el virus CMVH o el virus VHS. En particular pueden usarse derivados inmunogénicos que son ligeramente más largos o más cortos que la proteína de fusión de la presente invención. Tales derivados se pueden ser preparar, por ejemplo, por sustitución, adición o reordenamiento de aminoácidos o por modificaciones químicas de los mismos que incluyen aquellas para permitir el acoplamiento de la proteína de fusión a otras proteínas vehículo tales como el toxoide tetánico o el antígeno de superficie de la hepatitis B. Todas estas sustituciones y modificaciones son generalmente bien conocidas por los expertos en la técnica de química de péptidos.
Se pueden preparar fragmentos inmunogénicos de la proteína de fusión que pueden ser útiles en la preparación de vacunas mediante la expresión de fragmentos génicos apropiados o mediante síntesis de péptidos, por ejemplo usando la síntesis de Merrifield (The Peptides, vol. 2, Academic Press, Nueva York, pág. 3).
En un aspecto más de la invención se proporciona ADN recombinante que codifica la proteína de fusión de la invención. El ADN recombinante de la invención puede formar parte de un vector, por ejemplo, un plásmido a partir del cual puede expresarse la proteína de fusión. Tales vectores también forman parte de la invención, como las células huésped en las que se han introducido los vectores.
Para construir el ADN que codifica una proteína de fusión según la invención, el ADNc que contiene la secuencia codificadora completa de las proteínas gB de CMVH y gD de VHS pueden manipularse usando técnicas estándar (véase, por ejemplo, Maniatis y col. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)) como adicionalmente se describe en este documento a continuación.
Durante la realización de las técnicas descritas anteriormente se puede obtener el ADN recombinante que codifica los fragmentos de las proteínas gB de CMVH y gD de VHS que forma parte adicional de la presente invención.
En particular, los segmentos de ADN que codifican una forma no escindible de gB de CMVH, la proteína truncada gB de CMVH (gB que carece del dominio de anclaje a la membrana) y la proteína truncada gD de VHS (gD que carece del dominio 5' de anclaje a la membrana) son intermedios importantes.
Los vectores que comprenden este ADN, los huéspedes transformados con ellos y las proteínas truncadas o híbridas de ellos mismos, expresados como se describe a continuación en este documento, forman parte todos de la invención.
Para la expresión de las proteínas de la invención se pueden construir plásmidos que sean adecuados para transferir en virus vaccinia o para la transfección en células de ovario de hámster chino (CHO) o células Vero. La expresión adecuada de los vectores se describe a continuación en este documento.
Para la expresión en vaccinia se puede usar un plásmido transferido a vaccinia como pULB 5213 que es un derivado de pSC11 (Chakrabatu y col. Molecular and Cellular Biology 5, 3403-3409, 1985). En un aspecto, la proteína se puede expresar bajo el control del promotor P_{7\text{.}5} de vaccinia.
Para la expresión en células de CHO-K1 se puede usar de manera adecuada un vector de glutamina sintetasa (GS) como pEE14 para que así la proteína se exprese bajo el control del promotor principal inmediato temprano del citomegalovirus humano (CMVH-PIT). Alternativamente, se puede usar un vector que permita la expresión del módulo codificador como un transcrito policistrónico con el gen de selección neo. En un aspecto preferido la molécula codificadora está bajo el control del promotor terminal repetido largo (LTR) del sarcoma de Rous.
Preferiblemente, el plásmido para expresión en células CHO-K1 porta un casete de expresión GS adecuado para amplificación génica usando metionina sulfoximina (MSX). Alternativamente, el plásmido para expresión en células CHO-K1 porta un casete de expresión DHFR adecuado para amplificación génica usando metotrexato (MTX).
Preferiblemente, la expresión de las proteínas de fusión de la presente invención están realizadas en la presencia de butirato sódico y/o dimetilsulfóxido (DMSO) que se ha encontrado que aumentan la expresión génica.
Aún en otro aspecto de la invención se proporciona una composición para vacuna que comprende una proteína de fusión según la invención en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, una proteína según la invención para su uso en la vacunación de un huésped y el uso de una proteína según la invención en la preparación de una vacuna.
Se sabe que los aminoácidos 1 a 23 de gD madura puede desencadenar en animales una respuesta protectora y neutralizante frente a una exposición letal, además, cuando este péptido se formula apropiadamente, puede desencadenar una respuesta linfocitotóxica (Watari y col., referencia en el ejemplo 2 a continuación).
Por consiguiente, las proteínas de fusión de la presente invención que contienen este péptido no sólo ofrecen una respuesta protectora frente a infecciones por CMVH, sino que también ofrece una respuesta protectora frente a infecciones por VHS proporcionando con ello una nueva vacuna bifuncional.
Opcionalmente, y de manera ventajosa, la vacuna de la presente invención se combina con otros inmunógenos para proporcionar una vacuna polivalente. En una realización particularmente preferida la proteína de fusión se combina con otros subcomponentes de VHS, por ejemplo gD.
En un aspecto particular de la invención se proporciona adicionalmente una composición para vacuna que comprende una proteína según la invención junto con un vehículo o adyuvante adecuado.
La preparación de vacunas se describe en general en New Trends and Development in Vaccines, editado por Voller y col. University Park Press, Baltimore, Maryland, EE.UU., 1978. La encapsulación en liposomas se describe, por ejemplo, en Fullerton, patente de Estados Unidos Nº 4.235.877.
En la vacuna de la presente invención se puede usar directamente una disolución acuosa de la proteína o proteínas. Alternativamente, la proteína, con o sin liofilización previa, puede mezclarse, absorberse o adsorberse con cualquiera de los diversos adyuvantes conocidos. Estos adyuvantes incluyen, pero sin limitarse a, hidróxido de aluminio, muramil dipéptido y saponinas tales como Quil A. Adyuvantes particularmente preferidos son MPL (monofosforil lípido A) y MPL-3D (monofosforil lípido A-3 desacetilado) [patente de Estados Unidos Nº 4.912.094]. Un adyuvante adicional preferido se conoce como QS21 que puede obtenerse por el procedimiento descrito en la patente de Estados Unidos Nº 5.057.540. El uso de MPL-3D se describe en Ribi y col. en Microbiology (1986) Levi y col. (editores) Amer. Soc. Microbiol. Wash. D.C., 9-13. El uso de Quil A se describe en Dalsgaard y col., (1977), Acta Vet. Scan., 18, 349. El uso de MPL-3D y QS21 combinados se describe en el documento WO 94/00513 (SmithKline Beecham Biologicals S.A).
Como una alternativa ejemplar adicional, las proteínas se pueden encapsular en micropartículas como liposomas o asociadas con emulsiones de aceite en agua. La encapsulación en liposomas se describe por Fullerton en la patente de Estados Unidos Nº 4.235.877. Aún en otra alternativa ejemplar, las proteínas se pueden conjugar con una macromolécula inmunoestimuladora, tal como Bordetella o un toxoide tetánico. La conjugación de proteínas con macromoléculas se describe, por ejemplo, por Likhite en la patente Nº 4.372.945 y Armor y col. en la patente de Estados Unidos Nº 4.474.757.
La cantidad de proteína de la presente invención presente en cada vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos significativos en vacunas típicas. Dicha cantidad variará dependiendo de qué inmunógeno específico se emplee y si la vacuna contiene adyuvante o no. Generalmente, se espera que cada dosis comprenda de 1 a 1000 \mug de proteína, preferiblemente de 1 a 200 \mug. Una cantidad óptima para una vacuna particular puede determinarse mediante estudios estándar que implican la observación de valores de anticuerpos y otras respuestas en sujetos.
Para definir la invención más claramente se hace referencia a las figuras adjuntas, en las que:
La figura 1 muestra el esquema de construcción para gB quimérica.
La figura 2 muestra un mapa del plásmido de pEE14-gB685**
La invención se ilustrará ahora en referencia a los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1 Construcción de moléculas quiméricas gB
Las siguientes etapas de construcción se realizaron para crear las diferentes moléculas de fusión gD/gB (gB_{685\text{*}} quimérica y gB_{685\text{**}} quimérica), véase la figura 1.
a) gB_{685} NE (no escindible)
Para generar pUC12-gB685, el gen gB de la cepa AD169 de CMVH se subclonó a partir del fragmento genómico F HindIII como un fragmento EclI en el sitio SmaI de pUC12 (Yanish-Perron, C y col. 1985, Gene 33, 103). Se insertaron un codon de parada y un sitio BamHI en el sitio EcoRI interno (posición 2208 de gB de AD169) generando un truncamiento en el aminoácido 685 (es decir, careciendo del anclaje transmembranal [aminoácidos 712 a 776]). La secuencia gB de CMVH se conoce de Cranage y col. Embo J. 1986, 5, 3057-3063.
Para obtener más secreción del antígeno truncado gB_{685} en el sobrenadante del cultivo celular de células CHO-K1 se introdujo primero en la construcción del plásmido gB_{685} previamente clonado y truncado, pUC12-gB_{685} (pM7), también denominado pRIT14224, una doble mutación que convierte el sitio de escisión de gB en 459/460 en no escindible (cepa AD169). Esto se realizó intercambiando (por PCR) la Arg458 y la Arg459 por glutamina y treonina, respectivamente. Más específicamente, la construcción del plásmido gB_{685} NE (no escindible) se generó mediante PCR recombinante (R-PCR) según un procedimiento descrito en la referencia 1. Por tanto, dos preparaciones de plásmido ADN de pUC12-gB_{685} se digirieron respectivamente con HindIII y XmnI. Ambos plásmidos linealizados se amplificaron por separado mediante PCR (Ampli Taq) usando respectivamente parejas de cebadores Dir 268, Dir 269 y Dir 270, Dir 271. Los productos amplificados, aproximadamente 10 ng de cada reacción de PCR, se mezclaron y se transformaron células de E. coli HB101 competentes.
Gracias a los extremos homólogos creados (75 nucleótidos para la región pUC y 13 nucleótidos para la región gB mutada, respectivamente) los productos lineales de PCR pueden sufrir circularización mediante recombinación in vivo. Aproximadamente el 30% de los clones obtenidos (0,15% de eficacia) no tenían errores tras la secuenciación de la región gB completa. Se seleccionó un clon de E. coli pUC12-gB_{685} NE, también denominado pRIT14225, y se preparó el ADN. Se purificó en gel un fragmento BamHI de 2200 pb que contenía el casete gB_{685} NE y se ligó en el vector de expresión pEE14 cortado por BclI. El plásmido recombinante resultante es pEE14 gB_{685} NE denominado pRIT14226 ó pC2 (véase la figura 1b).
(1) Jones D. H. and S. C. Winistorfer 1992 Biotechniques 12:528-533.
b) Proteína de fusión gD/gB (gB_{685\text{*}} quimérica)
La construcción gB_{685\text{*}} se creó como sigue (véase la figura 1c). La secuencia líder 5' (86 pb) y la secuencia señal (aa 1 al 25) de la glicoproteína gD de VHS2 y la secuencia madura de gD desde el aminoácido 26 al 52 se fusionaron al aminoácido 28 de la gB madura de CMVH (menos 3 aminoácidos). Las etapas de construcción fueron como sigue: Un fragmento EcoRI-PvuII (240 pb) de gD2 derivado del plásmido pEE14-gD2t 1A, también denominado pRIT13832, se ligó a un fragmento ScaI/BamHI de 1980 pb de pUC12-gB685 en presencia del vector pEE14 cortado por EcoRI/BclI. Esto dio como resultado pEE14-gB_{685\text{*}}, también denominada pRIT14227 o pC3. El casete de expresión de gB quimérica se verificó mediante secuenciación automática de ADN.
El plásmido pEE14-gD2t 1A contiene una secuencia truncada que codifica gD (cepa G de VHS2) desde los aminoácidos 1 al 309 en un vector pEE14 de CHO-K1 (referencia 3) bajo el control del promotor principal inmediato temprano de citomegalovirus humano (CMVH-PIT). La secuencia gD de VHS2 se conoce de Lasky et al, DNA, 1984, 3, 23-29.
c) gB_{685\text{**}} quimérica
La construcción gB_{685\text{**}} (véase la figura 1d) se creó añadiendo una extensión de 12 aminoácidos (PEDSALLEDPED) derivada de una secuencia interna de gD2 (es decir, el mismo C-terminal truncado de la molécula gD2 que se secreta muy bien en células CHO-K1) al C-terminal del módulo de expresión de gB_{685\text{*}} quimérica mencionada anteriormente. Más particularmente se realizaron las siguientes etapas de construcción. Un fragmento HindIII/BglII de 2002 pb de largo de pEE14-gB_{685\text{*}} (pRIT14227) se ligó con un fragmento BglIII/XbaI de 285 pb (generado por PCR usando los cebadores Dir 287 y Dir 288 en pUC12-gB_{685} NE) junto con el vector pEE14 cortado por HindIII/XbaI. El plásmido resultante es pEE14-gB_{685\text{**}}, también denominado pRIT14229 ó pC4 (ver figura 2). Tras secuenciar el extremo 3' del casete gB_{685\text{**}} de 10 clones, se seleccionó el clon número 30 y se preparó el ADN mediante purificación en gradiente de CsCl.
Ejemplo 2 Expresión en células eucarióticas a) Expresión en células CHO
Las células CHO-K1 se transfectaron de forma clásica por el procedimiento de fosfato de calcio usando respectivamente 20 \mug de ADN de los siguientes plásmidos de expresión, pEE14-gB_{685} NE, pEE14-gB_{685\text{*}} y pEE14-gB_{685\text{**}}. La selección de los clones transformantes estables se realizó en medio GMEM, STF al 10% dializado sin glutamina (véase la referencia 3). El procedimiento de selección para la expresión del gen de glutamato sintetasa del vector pEE14 (Celltech) depende de la capacidad del plásmido de ADN transfectado para conferir resistencia a un nivel bajo de metionina sulfoximina (MSX). Los clones CHO-K1 se aislaron mediante cilindros de clonación (\pm 26 clones para las construcciones gB_{685} NE y gB_{685\text{*}}, respectivamente). Los clones transfectantes CHO-K1 gB685** se seleccionaron/aislaron usando un protocolo diferente. Tras la transfección (fosfato de calcio) de aproximadamente 1,4 x 10^{6} células en matraces T de 80 cm^{2}, las células se distribuyeron en 4 placas de 96 pocillos y cada pocillo se sembró con \pm 3.500 células. Tras la selección durante aproximadamente 2 a 3 semanas se obtuvieron un total de 25 clones. Seis clones se amplificaron adicionalmente en matraces de 25 cm^{2} y se ensayaron mediante análisis por inmunotransferencia usando el anticuerpo anti-gD (AcMo 4846) y también mediante ELISA específico para gB (1F10G2/LCT62). Cinco de los seis clones secretaban altos niveles de proteína gB_{685\text{**}} en el sobrenadante del cultivo de células CHO-K1.
Estos clones de CHO-K1 se amplificaron y se hicieron viales de células. El clon pC4204.20 se seleccionó para una caracterización adicional. El nivel de expresión del antígeno gB_{685\text{**}} secretado en el sobrenadante del cultivo se estimó en 3 a 4 \mug/ml/5 x 10^{5} células mediante el análisis por inmunotransferencia (AcMo 4846) usando gD2 purificado como referencia.
La tabla I muestra los resultados de los estudios de caracterización de expresión realizados mediante ensayos de radioinmunoprecipitación (RIPA) en células CHO-K1 que expresan respectivamente los antígenos gB_{685}, gB_{685\text{*}} y gB_{685\text{**}}. Los extractos celulares y los sobrenadantes del cultivo se inmunoprecipitaron usando un panel de diferentes anticuerpos monoclonales (W. Britt) dirigidos frente a gB de CMVH (un AcMo secuencial 27-156 y dos AcMo conformacionales 27-39 y AcMo 9-3) y un suero humano neutralizante anti-CMV (Nº 243) y por un anticuerpo monoclonal secuencial (AcMo 4846) dirigido frente a la parte NH_{2} (aa 12 a 23) de gD de VHS2.
La tabla II muestra los resultados de la inmunotransferencia usando los mismos anticuerpos monoclonales y el suero humano anti-CMV (Nº 243). Los resultados anteriores sugieren que el antígeno gB_{685\text{**}} quimérico manifiesta una capacidad de secreción aumentada respecto al antígeno gB_{685} previamente analizado derivado de CHO-K1 gB_{685} (clon 44). Los resultados anteriores sugieren que gB_{685\text{*}}, gB_{685\text{**}} y también gB_{685} NE (pero no, o en mucho menor grado, gB_{685}) son secretados y se encuentran en un estado conformacional, reconocido adecuadamente por anticuerpos conformacionales y el suero humano neutralizante anti-CMV (Nº 243). Los antígenos quiméricos gB_{685\text{**}} y gB_{685} NE expresados pueden tener una conformación que se asemeja mucho a gB nativa, y de ese modo puede ser extremadamente útil para el desarrollo de una vacuna frente a CMVH. Se puede recomendar también el uso del inmunógeno gB_{685\text{**}} quimérico como componente de una vacuna frente a gD de VHS. Esto es porque Watari y col. 1987 (2) (y referencias contenidas en ella) demostraron que los aa 1 a 23 de gD2 madura contienen un epítopo LCT y puede desencadenar una respuesta inmune neutralizante y protectora en un modelo en ratones.
Aunque no es una realización preferida de este documento, el uso de estos antígenos gB_{685\text{*}} y gB_{685\text{**}} quiméricos podría facilitar el aislamiento/purificación por medio de "etiqueta-gD" mediante cromatografía por inmunoafinidad (como hemos demostrado recientemente).
Debe apreciarse que todas las construcciones CHO-K1 gB_{685} no escindibles expresadas a pesar de la presencia de los aminoácidos 458/459 mutados muestran una banda de proteína (pequeña) de 33 a 35 kDa (que se asemeja a la parte gp33 de gB_{685} escindible). Esta banda es reconocida en extractos celulares mediante análisis por inmunotransferencia usando el AcMo 27-156 (anti-gp33). Este descubrimiento sugiere en gran medida que un sitio de escisión alternativo cercano está activado en estas construcciones gB_{685} recombinantes no escindibles.
Debe destacarse que hemos descubierto un caso de procesamiento no descrito (aún), es decir, un sitio de procesamiento en la parte NH_{2} de la molécula gB (gp92-116). La detección fue posible debido a la etiqueta gD añadida en la parte aminoterminal del módulo gB_{685}. En los extractos celulares se detectó una banda de 34 a 36 kDa mediante análisis por inmunotransferencia usando el anticuerpo monoclonal anti-gD AcMo 4846. Un fragmento proteico de 69 a 70 kDa correspondiente muy probablemente a la mitad carboxilo de la parte gp92-116 de gB se detectó sólo mediante RIPA usando AcMo específicos frente a gB (sugiriendo la coprecipitación con la parte gp33). Esta misma banda de 69 a 70 kDa también era reconocida por el suero humano neutralizante anti-CMV Nº 243 en RIPA (véase también la tabla I). Esta banda de 69 a 70 kDa se ha detectado retrospectivamente en todas las construcciones de CHO-K1 gB (escindibles o no). Esta escisión de la parte aminoterminal de gB (gp92-116) podría tener importancia biológica (fusión) y este descubrimiento podría ser importante para el desarrollo de vacunas.
(2) J. Exp. Med. 1987, 165: 459-470.
(3) Cockett, M. I. Bebbington, C. R. and Yarranton, G. T. 1990 Biotechnology 8: 662-667.
Ejemplo 4 Aumento de la expresión del gen de gB con butirato sódico o DMSO
Se añadió butirato sódico (NaBut) a diferentes concentraciones (0,5 mM, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM) a cultivos de subclones de CHO-K1 gB**. Se observó un claro efecto (análisis por inmunotransferencia, AcMo 4846) comenzando desde NaBut 0,5 mM, alcanzando los máximos niveles de expresión a 2 mM-4 mM de NaBut. A concentraciones superiores (5 mM) (se observa mayor expresión por célula) el efecto citotóxico de NaBut es demasiado pronunciado y por tanto el rendimiento de gB** no se aumenta mucho comparado con el tratamiento con NaBut 2 mM. Los resultados típicos para un subclón de gB** fueron de aproximadamente un aumento de 16 veces la expresión génica basal de gB** (análisis por inmunotransferencia) cuando se añadía NaBut 2 mM y cuando gB** se acumulaba durante 4 días. Con DMSO añadido al 2% se observó un aumento de 8 a 12 veces.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(tabla pasa a página siguiente)
\newpage
TABLA I
Resumen de los resultados de radioinmunoprecipitación (RIPA) en diferentes líneas celulares de CHO-K1 que expresan diferentes antígenos recombinantes gB_{685}. Los lisados celulares se hicieron en tampón de RIPA y los sobrenadantes celulares (SN) se analizaron con un panel de diferentes anticuerpos monoclonales dirigidos frente a gB y un suero humano neutralizante anti-CMV Nº 243.
1
TABLA II
Resumen de los análisis de inmunotransferencia llevados a cabo con un panel de diferentes anticuerpos monoclonales frente a gB y un suero humano neutralizante anti-CMV Nº 243
\vskip1.000000\baselineskip
2 
\newpage
TABLA III
Oligonucleótidos cebadores y condiciones de PCR usadas para generar las diferentes construcciones quiméricas gB_{685}
A) gB_{685} NE (No escindible)
100
Condiciones de la reacción de PCR:
En 0,5 \mug de pUC12-gB_{685} linearizado con HindIII o XmnI
25 ciclos: 2 min a 94ºC, 2 min a 55ºC, 2 min a 72ºC
1 ciclo: 2 min a 94ºC, 2 min a 55ºC, 15 min a 72ºC
con las parejas de cebadores Dir 268, Dir 269
y por separado con las parejas de cebadores Dir 270, Dir 271
B) gB_{685}** quimérico
101
PCR: en 0,1 \mug de ADN de plásmido pUC12-gB_{685} NE
25 ciclos: 2 min a 95ºC, 2 min a 55ºC, 2 min a 72ºC
seguido de 2 min a 95ºC, 2 min a 55ºC y 15 min a 72ºC.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: SmithKline Beecham Biologicals S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 79 Rue de L'Institut
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Rixensart
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Bélgica
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): B-1330
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: 00-32-2-6568111
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
TELEFAX: 00-32-2-6568114
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevos Compuestos
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 7
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM compatible con PC
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: PatentIn Release Nº 1.0, versión Nº 1.30 (EPO).
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Citomegalovirus humano
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: AD 169
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: Dir 268
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGACCCAAAC AAGTACGAGT G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Citomegalovirus humano
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: AD 169
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: Dir 269
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCTGGTGAA AGTAAAAGAT GC 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Citomegalovirus humano
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: AD 169
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: Dir 270
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTACTTGTTT GGGTCCTATG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Citomegalovirus humano
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: AD 169
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: Dir 271
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCGCTGTTGA GATCCAGTTC G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Citomegalovirus humano
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: AD 169
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: Dir 287
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCCTCAAGAT CTTCATCGCC GGGAACTCG 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 58 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Citomegalovirus humano
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: AD 169
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: Dir 288
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAGCTCTAGA TTAATCCTCG GGATCCTCTA AGAGGGCCGA GTCCTCGGGG GAATTCGC 
\hfill
58 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Citomegalovirus humano
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: AD 169
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: Dir 288
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Glu Pro Asp Glu Leu Leu Ala Ser Asp Glu Pro}

Claims (14)

1. Una proteína de fusión o un derivado inmunogénico de la misma que comprende una porción de la glicoproteína gB de CMVH fusionada con una porción de la glicoproteína gD de VHS, en la que la porción de glicoproteína gB contiene al menos un determinante antigénico capaz de desencadenar una respuesta inmune específica para CMVH y en la que la porción de glicoproteína gD contiene al menos la secuencia señal de la glicoproteína de VHS.
2. Una proteína o derivado como se reivindica en la reivindicación 1, en la que la fusión es entre un aminoácido de la parte N-terminal de una porción de la proteína gB de CMVH y un aminoácido del extremo C de una porción de la proteína gD de VHS.
3. Una proteína como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 en la que la porción de la proteína CMVH no es escindible.
4. Una proteína como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la que la porción de la proteína VHS comprende la secuencia señal de gD2, y opcionalmente los aminoácidos 26 a 52 de gD2 y/o la secuencia de gD2 que es PEDSALLEDPED.
5. ADN recombinante que codifica una proteína de fusión o un derivado inmunogénico de la misma como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Un vector de expresión que comprende ADN recombinante como se ha definido en la reivindicación 5.
7. Un huésped transformado con un vector como se define en la reivindicación 6.
8. Una composición para vacuna que comprende una proteína como se define en una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 4 o un derivado inmunogénico de la misma mezclado con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
9. Una composición para vacuna como se reivindica en la reivindicación 8 que comprende además monofosforil lípido A-3D y/o QS-21.
10. Una composición para vacuna según se reivindica en una cualquiera de la reivindicaciones 8 a 9 en la que el vehículo es una emulsión de aceite en agua.
11. Una proteína de fusión o un derivado inmunogénico de la misma como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 de uso en medicina.
12. Una composición para vacuna como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9 para su uso en medicina.
13. Un procedimiento para la producción de una proteína de fusión como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 cuyo procedimiento comprende la expresión de una secuencia de ADN que codifica dicha proteína en una célula huésped y recuperación de la proteína.
14. Uso de una proteína o un derivado inmunogénico de la misma como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de infecciones víricas.
ES95919447T 1994-05-18 1995-05-11 Glicoproteina de fusion de cmvh y vhs. Expired - Lifetime ES2239758T3 (es)

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GB9409962A GB9409962D0 (en) 1994-05-18 1994-05-18 Novel compounds
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