ES2353134T3 - Forma no escindible de la proteina gb de hcmv. - Google Patents

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Abstract

Una forma no escindible de la proteína gB de HCMV, que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de escisión de la proteína, en la que la proteína es una proteína truncada que carece del dominio de anclaje a la membrana.

Description

La presente invención se refiere a proteínas de citomegalovirus recombinante, más particularmente a formas no escindibles de una proteína de citomegalovirus humano (HCMV), y a su expresión en células eucariotas. La invención se refiere además a procedimientos para construir y expresar dichas proteínas, a intermedios para su uso en los mismos y a proteínas recombinantes que pueden obtenerse a partir de los intermedios. Las proteínas recombinantes de la invención tienen utilidad potencial en el desarrollo de vacunas para la prevención de la infección por HCMV.
El HCMV es un virus de ADN humano que pertenece a familia de los herpesvirus. En común con otros virus herpéticos (tales como el Virus Herpes Simplex (HSV) y el Virus Varicella Zoster (VZV)) el HCMV está constituido por un núcleo de ADN y una cápsida externa y está cubierto por una membrana lipídica que incorpora glicoproteínas específicas de virus.
El citomegalovirus humano es endémico en la mayoría de las partes del mundo. Sin embargo, la infección primaria normalmente tiene como resultado una enfermedad subclínica después de la cual el virus permanece latente conservando la capacidad de reactivarse en cualquier momento. Sin embargo, en dos poblaciones, el HCMV es responsable de situaciones médicas graves. El HCMV es una causa importante de defectos congénitos en recién nacidos. También están asociados con la infección en estos bebés la pérdida auditiva y un bajo rendimiento intelectual. La segunda población de riesgo son pacientes inmunocomprometidos tales como los que padecen infección por VIH y los pacientes que se han sometido a trasplantes. En esta situación, el virus se convierte en un patógeno oportunista y produce una enfermedad grave con una alta morbilidad y mortalidad. La enfermedad clínica produce una diversidad de síntomas que incluyen fiebre, hepatitis, neumonitis y mononucleosis infecciosa.
Esto, por lo tanto, explica los amplios esfuerzos de los expertos en la materia y la importancia de los estudios dedicados a la biología de estos virus. Sin embargo, actualmente no se dispone de ninguna vacuna eficaz contra el HCMV.
Por lo tanto, aún existe la necesidad de antígenos que protejan eficazmente contra la exposición al virus HCMV.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una forma no escindible de proteína gB de HCMV que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de escisión de la proteína y que es una proteína truncada que carece del dominio de anclaje a la membrana.
La proteína gB de HCMV cepa AD 169 contiene 906 restos de aminoácidos; los aminoácidos 1 a 24 corresponden al péptido señal y los restos 712 a 776 el dominio de anclaje a la membrana. La molécula presenta 19 sitios potenciales para la glicosilación. Usada sola para inmunización, la proteína gB genera una respuesta inmune que es insuficiente para conferir protección contra la exposición al virus.
Spaete y col. (J. Virol, 64(6): 2922-31, 1990) notificaron que mutaciones en gB de HCMV de la cepa Towne bloquean la escisión de gB. La proteína gB de HCMV de la invención comprende una forma no escindible de gB de HCMV. Convenientemente, esto se consigue cambiando uno o más aminoácidos en un sitio de escisión de la proteína. Preferentemente, esto se hace cambiando la Arg 458 y la Arg 459 por Glu y Thr respectivamente. La forma no escindible y truncada de gB que carece del dominio de anclaje a la membrana es nueva y es el objeto de la invención. Presenta la ventaja de tener una proteína gB con mayor secreción cuando se expresa de forma adecuada.
Las proteínas de la presente invención son inmunogénicas. La expresión derivado inmunogénico, como se usa en la presente invención, incluye cualquier molécula que es una proteína que es inmunológicamente reactiva con anticuerpos inducidos contra la proteína de la presente invención o partes de la misma o con anticuerpos que reconocen la proteína gB de HCMV o el virus HCMV, o que induce a anticuerpos que reconocen la proteína, la proteína gB de HCMV o el virus HCMV. En particular, pueden usarse derivados inmunogénicos que son ligeramente más largos o más cortos que la proteína de la presente invención. Estos derivados pueden prepararse, por ejemplo, por sustitución, adición o reordenación de aminoácidos o por modificaciones químicas de los mismos incluyendo las que permiten el acoplamiento de la proteína de fusión a otras proteínas de soporte, tales como el toxoide tetánico o el antígeno de superficie de la hepatitis B. Todas estas sustituciones y modificaciones generalmente son bien conocidas para los expertos en la materia de la química de péptidos.
Los fragmentos inmunogénicos de la proteína de la presente invención que pueden ser útiles en la preparación de vacunas pueden prepararse por expresión de los fragmentos génicos apropiados o por síntesis de péptidos, por ejemplo, usando la síntesis de Merrifield (The Peptides, Vol 2., Academic Press, Nueva York, p3).
En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un ADN recombinante que codifica la proteína de la invención. El ADN recombinante de la invención puede formar parte de un vector, por ejemplo, un plásmido, especialmente un plásmido de expresión a partir del cual puede expresarse la proteína de la invención. Estos vectores también forman parte de la invención, así como las células hospedadoras en las que se han introducido los vectores.
Para construir el ADN que codifica una proteína de acuerdo con la invención, puede manipularse un ADNc que contiene las secuencias codificantes completas de la proteína gB de HCMV usando técnicas convencionales [véase, por ejemplo, Maniatis T. y col Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y. (1982)] como se describe
adicionalmente más adelante en la presente invención.
En el transcurso de la realización de las técnicas descritas anteriormente, pueden obtenerse fragmentos codificantes de ADN recombinante de la proteína gB de HCMV, que también forman parte de la presente invención.
En particular, los segmentos de ADN que codifican una forma no escindible de gB de
HCMV y la proteína truncada gB de HCMV (gB que
carece del dominio de anclaje a la
membrana) son intermedios importantes y son un objeto de la presente invención.
Los
vectores que comprenden dicho ADN, los huéspedes transformados de esta
manera y las propias proteínas truncadas, expresadas como se describe más adelante en el presente documento, forman parte de la invención.
Para la expresión de las proteínas de la invención, pueden construirse plásmidos que sean adecuados para la transferencia en vaccinia virus o la transfección en células de Ovario de Hámster Chino (CHO) o células Vero. Más adelante se describen vectores de expresión adecuados.
Para la expresión en vaccinia, puede usarse un plásmido de transferencia de vaccinia tal como pULB 5213 que es un derivado de pSC11 (Chakrabati y col. Molecular and Cellular Biology 5, 3403 -3409, 1985). En un aspecto, la proteína puede expresarse bajo el control del promotor P7.5 de vaccinia.
Para la expresión en células CHO-K1, convenientemente puede usarse un vector de glutamina sintetasa (GS) tal como pEE14 de forma que la proteína se exprese bajo el control del promotor temprano inmediato principal del citomegalovirus humano (hCMV-MIE). Como alternativa, convenientemente puede usarse un vector que permita la expresión del módulo codificante como un transcrito policistrónico con el gen de selección neo. En un aspecto preferido, el módulo codificante está bajo el control del promotor de la Repetición Terminal Larga (LTR) del Sarcoma de Rous.
Preferentemente, el plásmido para la expresión en células CHO-K1 lleva un casete de expresión de GS adecuado para la amplificación génica usando metionina sulfoximina (MSX). Como alternativa, el plásmido para la expresión en células CHO-K1 lleva un casete de expresión de DHFR adecuado para la amplificación génica usando metotrexato (MTX).
La expresión de las proteínas de la presente invención se realiza en presencia de butirato sódico y/o dimetil sulfóxido (DMSO) que, según se ha descubierto, aumentan la expresión génica.
En otro aspecto más de la invención se proporciona una composición de vacuna que comprende una proteína de acuerdo con la invención en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, una proteína de acuerdo con la invención para su uso en la vacunación de un huésped y el uso de una proteína de acuerdo con la invención en la preparación de una vacuna.
Opcional y ventajosamente, la vacuna de la presente invención se combina con otros inmunógenos para producir una vacuna polivalente. En una realización particularmente preferida, la proteína de la invención se combina con otros subcomponentes de HSV, por ejemplo gD.
En un aspecto particular, la invención proporciona además una composición de vacuna que comprende una proteína de acuerdo con la invención junto con un vehículo o adyuvante adecuado.
La preparación de vacuna se describe, en general, en New Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller y col, University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A., 1978. La encapsulación dentro de liposomas se describe, por ejemplo, por Fullerton, en la Patente de Estados Unidos 4.235.877.
En la vacuna de la presente invención, puede usarse directamente una solución acuosa de una o más proteínas. Como alternativa, la proteína, con o sin liofilización previa, puede mezclarse, absorberse o adsorberse con cualquiera de los diversos adyuvantes conocidos. Estos adyuvantes incluyen, pero sin limitación, hidróxido de aluminio, muramil dipéptido y saponinas tales como Quil A. Son adyuvantes particularmente preferidos MPL (monofosforil lípido A) y 3D-MPL (monofosforil lípido A 3 desacilado) [Patente de Estados Unidos 4.912.094]. Otro adyuvante preferido se conoce como QS21, que puede obtenerse por el procedimiento descrito en la Patente de Estados Unidos 5.057.540. El uso de 3D-MPL se describe por Ribi y col, en Microbiology (1986) Levie y col, (eds) Amer. Soc. Microbiol.Wash. D.C., 9-13. El uso de Quil A se describe por Dalsgaard y col, (1977), Acta Vet Scand. 18, 349. El uso de 3D-MPL y QS21 combinados se describe en el documento WO 94/00153 (SmithKline Beecham Biologicals s.a).
Como alternativa ejemplar adicional, las proteínas pueden encapsularse dentro de micropartículas tales como liposomas o asociarse con emulsiones de aceite en agua. La encapsulación dentro de liposomas se describe por Fullerton en la Patente de Estados Unidos
4.235.877. En otra alternativa ejemplar, las proteínas pueden conjugarse con una macromolécula inmunoestimuladora, tal como Bordetella inactivada o un toxoide tetánico. La conjugación de proteínas con macromoléculas se describe, por ejemplo, por Likhite en la Patente de Estados Unidos 4.372.945 y por Armor y col. en la Patente de Estados Unidos
4.474.757.
La cantidad de la proteína de la presente invención presente en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin los efectos secundarios adversos significativos observados en las vacunas típicas. Dicha cantidad variará y puede determinarse por estudios convencionales que implican la observación de los títulos de anticuerpo y otras respuestas en los sujetos.
Para definir la invención, se hace referencia más claramente a los dibujos adjuntos, en los que:
La Figura 1 muestra el esquema de construcción para gB quimérica.
La Figura 2 muestra un mapa plasmídico de pEE14-gB685**
La invención se ilustrará a continuación haciendo referencia a los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1: Construcción de moléculas de gB quiméricas
Las siguientes etapas de construcción se realizaron para crear las diferentes moléculas de fusión gD/gB (gB658* quimérica y gB685** quimérica), véase la fig. 1. a) gB685NC (no escindible)
Para generar pUC12-gB685, el gen gB de la cepa AD169 de HCMV se subclonó a partir del fragmento Hind III F genómico como un fragmento Ecl 1 en el sitio Sma 1 de pUC12 (Yanisch-Perron, C y col 1985 GENE 33, 103). Se insertó un codón de terminación y un sitio BamHI en el sitio EcoRl interno (posición 2208 de gB de AD 169) generando un truncamiento en el aminoácido 685 (es decir, que carece del anclaje transmembrana [aminoácidos 712776]). La secuencia de gB de HCMV se conoce por Cranage y col Embo J. 1986, 5, 30573063.
Para obtener más secreción del antígeno gB685 truncado en el sobrenadante de cultivo celular de células CHO-K1, los presentes inventores introdujeron primero en la construcción plasmídica de gB685 previamente clonada y truncada, pUC12-gB685 (pM7) también denominado pRIT14224, una mutación doble que hacía que el sitio de escisión de gB en 459/460 (cepa AD169) fuera no escindible. Esto se consiguió cambiando (PCR) la Arg458 y la Arg459 por Glutamina y Treonina respectivamente. Más específicamente, la construcción plasmídica gB685 NC (no escindible) se generó por PCR recombinante (RPCR) de acuerdo con un procedimiento descrito en la ref. 1. Por lo tanto, dos preparaciones plasmídicas de ADN de pUC 12-gB685 se digirieron respectivamente por HindIII y Xmnl. Los dos plásmidos linealizados se amplificaron por separado por PCR (Ampli Taq) usando respectivamente pares de cebadores Dir 268, Dir 269 y Dir 270, Dir 271. Los productos amplificados, aproximadamente 10 ng de cada reacción de PCR, se mezclaron y se transformaron células E. coli HB101 competentes.
Gracias a los extremos homólogos creados (respectivamente 75 nct para la región pUC y 13 nct para la región de gB mutada), los productos de PCR lineales pueden experimentar circularización por recombinación in vivo. Aproximadamente el 30% de los clones obtenidos (eficacia del 0,15%) carecían de errores después de la secuenciación de la región de gB entera. Se eligió un clon de E. coli pUC12-gB685 NC, también denominado pRIT14225, y se preparó el ADN. Un fragmento BamHI de 2200 pb que contenía el casete de gB685 NC se purificó en gel y se ligó al vector de expresión pEE14 cortado por Bell. El plásmido recombinante resultante es pEE14 gB685 NC denominado pRIT14226 o pC2 (véase la fig. 1b).
(1) Jones D.H. and S.C. Winistorfer 1992 Biotechniques 12: 528-533. b) Proteína de fusión gD/gB (gB685** quimérica)
La construcción gB685** se creó como se indica a continuación (véase la fig. 1c). La secuencia líder 5’ (86 pb) y la secuencia señal (aa1 a 25) de la glicoproteína gD de HSV2 y la secuencia madura de gD desde el aminoácido 26 al 52 se fusionó al aminoácido 28 de gB de HCMV madura (menos 3 aminoácidos). Las etapas de construcción fueron las siguientes: un fragmento EcoRI-PvuII (240 pb) de gD2 procedente del plásmido pEE14-gD2t 1A, también denominado pRIT13832, se ligó a un fragmento ScaI/BamHI de 1980 pb procedente de pUC12-gB685 en presencia del vector pEE14 por EcoRI/BcII. Esto produjo pEE14-gB685*, también denominado pRIT14227 o pC3. El casete de expresión de gB quimérico obtenido se verificó por secuenciación de ADN automática.
El plásmido pEE14-gD2t 1A contiene una secuencia codificante de gD truncada (HSV2 cepa G) de los aminoácidos 1 → 309 en un vector CHOK1 pEE14 (ref. 3) bajo el control del promotor temprano inmediato principal del citomegalovirus humano (hCMV-MIE). La secuencia de gD de HSV2 se conoce por Lasky y col, DNA, 1984, 3, 23-29. c) gB685** quimérica
La construcción gB685** (véase la fig. 1d) se creó añadiendo en el extremo C del módulo de expresión de gB685* quimérica mencionada anteriormente, una extensión de 12 aminoácidos (PEDSALLEDPED) procedente de una secuencia de gD2 internamente (es decir, el mismo extremo C truncado de la molécula de gD2t que resulta que se secreta en las células CHOK1). Más particularmente, se realizaron las siguientes etapas de construcción. Un fragmento HindIII/BgIII de 2002 pb de longitud procedente de pEE14.gB685* (pRIT14227) se ligó con un fragmento BglIII/XbaI de 285 pb (generado por PCR usando los cebadores Dir 287 y Dir 288 en puC12-gB685 NC) junto con el vector pEE14 cortado por HindIII/Xbal. El plásmido resultante es pEE14-gB685**, también denominado pRIT14229 o pC4 (véase la fig. 2). Después de la secuenciación del extremo 3’ del casete de gB685** de 10 clones, se eligió el clon nº 30 y se preparó el ADN por purificación en gradiente de CsCl. Ejemplo 2: Expresión en células eucariotas a) Expresión en células CHO
Se transfectaron células CHO-K1 de la forma clásica por el procedimiento de fosfato-Ca usando respectivamente 20 µg de ADN de los siguientes plásmidos de expresión, pEE14-gB685 NC, pEE14-gB685 * y pEE14-gB685**. La selección de los clones transformantes estables se realizó en medio GMEM, FBS dializado al 10% que carecía de glutamina (véase la ref. 3). El procedimiento de selección para la expresión del gen de glutamina sintetasa del vector pEE14 (Celltech) se basa en la capacidad del ADN plasmídico introducido en la transfección de conferir resistencia a un bajo nivel de metionina sulfoximina (MSX). Los clones de CHO-K1 se aislaron por cilindros de clonación (imagen1 26 clones respectivamente para la construcción gB685 NC y gB685*). Los clones transfectantes CHO-K1 gB685 ** se seleccionaron/aislaron usando un protocolo diferente. Después de la transfección (fosfato-Ca) de aproximadamente 1,4 x 106 células en un matraz T F80 cm2, las células se distribuyeron en 4 placas de 96 pocillos y cada pocillo se sembró con ± 3500 células. Después de la selección durante aproximadamente 2-3 semanas, se obtuvo un total de 25 clones. Seis clones se amplificaron adicionalmente en F25 cm2 y se ensayaron por análisis de transferencia de Western usando anticuerpo α-gD (mAb 4846) y también se ensayaron por Elisa específico de gB (1F10G2/LCT62). Cinco de seis clones secretaron altos niveles de proteína gB685** quimérica en el sobrenadante de cultivo de células CHO-K1.
Estos clones de CHO-K1 se amplificaron y se prepararon viales de células. Se eligió el clon pC4204.20 para la caracterización adicional. El nivel de expresión de antígeno gB685 ** secretado en el sobrenadante se cultivo se estimó a 3-4 µg/ml/5x105 células por análisis de transferencia de Western (mAb 4846) usando gD2t purificado como referencia.
La Tabla I muestra los resultados de los estudios de caracterización de expresión realizados por ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) en células CHO-K1 que expresan respectivamente los antígenos gB685, gB685 NC, gB685 * y gB685**. Los extractos celulares y sobrenadantes de cultivo se inmunoprecipitaron usando un panel de diferentes anticuerpos monoclonales (W. Britt) dirigidos contra gB de HCMV (un mAB 27-156 secuencial y dos mAb conformacionales 27-39 y mAb 9-3) y un suero de α-CMV humano neutralizante (nº 243) y mediante un anticuerpo monoclonal secuencial (mAb 4846) dirigido contra la parte NH2 (aa12 a 23) de gD de HSV2.
La Tabla II muestra los resultados de transferencia de Western usando los mismos anticuerpos monoclonales y suero de α-CMV humano (nº 243). Los resultados anteriores sugieren que el antígeno gB685** quimérico presenta una mayor capacidad de secreción con respecto al antígeno gB685 analizado previamente procedente de gB685 de CHO-K1 (clon 44). Los resultados anteriores sugieren también que se secretan gB685*, gB685** y también gB685 NC -pero no, o en una medida mucho menor, gB685 -y se encuentran en un estado conformacional, bien reconocido por anticuerpos conformacionales y suero de CMV neutralizante humano (nº 243). El antígeno expresado quimérico gB685** y gB685 NC puede tener una conformación que se parece mucho a la de la gB nativa y, por lo tanto, puede ser extremadamente útil para el desarrollo de una vacuna de HCMV. Podría subrayarse también el uso de el inmunógeno gB685** quimérico como componente de una vacuna de gD de HSV. Esto es así porque se demostró por Watari y col. 1987 (2) (y referencias citadas en dicho documento) que el aa 1 a 23 de la gD2 madura contiene un epítopo de CTL y podría inducir una respuesta inmune neutralizante y protectora en un modelo de ratón.
Aunque no es una realización preferida de la presente invención, el uso de estos antígenos quiméricos gB685* y gB685** podría facilitar el aislamiento/purificación a través de un “marcador-gD” por cromatografía de inmunoafinidad (como se demostró recientemente por los presentes inventores).
Debe indicarse que todas las construcciones de gB685 de CHO-K1 no escindibles expresadas, a pesar de la presencia de los aminoácidos 458/459 mutados, presentan una banda proteica (pequeña) a 33-35 kD (que se parece a la parte de gp33 de gB685 escindible). Esta banda se reconoce en extractos celulares por análisis WB usando el mAb 27-156 (αgp33). Este descubrimiento sugiere firmemente que en estas construcciones de gB685 recombinante no escindibles está activado un sitio de escisión próximo alternativo.
También debe subrayarse que los presentes inventores han descubierto un suceso de procesamiento no descrito (todavía), es decir, un sitio de procesamiento en la parte NH2 de la molécula de gB (gp92-116). La detección se hizo posible debido al marcador gD añadido en la parte amino-terminal del módulo de gB685. Se detectó una banda de 34-36 kD en extractos celulares por análisis WB usando el anticuerpo monoclonal de α-gD mAb4846. Se detectó un fragmento proteico de 69-70 kD que muy probablemente corresponde a la mitad carboxi de la parte gp92-116 de gB sólo por RIPA usando mAb específicos de gB (lo que sugiere la coprecipitación con la parte de gp33). Esta misma banda de 69-70 kD también se reconoció por el suero anti-CMV neutralizante humano nº 243 en RIPA (véase también la tabla I). Esta banda de 69-70 kD se ha detectado retrospectivamente en todas las construcciones de gB de CHOK1 (escindibles o no). Esta escisión de la parte amino terminal de gB (gp92-116) podría tener relevancia biológica (fusión) y este descubrimiento podría ser importante para el desarrollo de vacunas.
(2)
J. Exp. Med. 1987, 165:459-470.
(3)
Cockett, M.I. Bebbington, C.R. y Yarranton, G.T. 1990 Biotechnology 8·662-667.
Ejemplo 4: Potenciación de la expresión del gen de gB con butirato sódico o DMSO
Se añadió butirato sódico (But Na) a diferentes concentraciones (0,5 mM, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM) a cultivos de subclones de gB** de CHOK1. Se observó un claro efecto (análisis WB, mAb 4846) empezando desde ButNa 0,5 mM, consiguiéndose los niveles de expresión máximos a una concentración de ButNa de 2 mM-4 mM. A una concentración mayor (5 mM) (se observa más expresión por célula), el efecto citostático del ButNa es demasiado pronunciado y, por lo tanto, el rendimiento total de gB** no aumenta mucho frente al tratamiento con ButNa 2 mM. Los resultados típicos para un subclón de gB** fueron un
5 aumento de aproximadamente 16 veces de la expresión basal del gen de gB** (análisis WB) cuando se añadió ButNa 2 mM y cuando se acumuló gB** durante 4 días. Al añadirse DMSO al 2% se observó un aumento de 8-12 veces.
10 celulares CHO-K1 que expresan diferentes antígenos gB685 recombinantes. Los lisados celulares se obtuvieron en tampón de RIPA y los sobrenadantes de cultivo celular (SN) se analizaron con un panel de diferentes anticuerpos monoclonales dirigidos contra gB y un suero de α-CMV humano neutralizante nº 243

Tabla I: Resumen de los resultados de Radioinmunoprecipitación (RIPA) en diferentes líneas
mAb27.156
mAb27.39 mAb9.3 mAb48.46 Suero de αCMV nº 243
Células gB685:
110 kD
+ + + - +
82 kD
± ± ± - ±
69-70 kD
+++ +++ ++++ - +++
33-35 kD
+++ +++ ++++ - +++
SN: 120-125 kD
+ + - - ±
Células gB685NC
110 kD
++ ++ +++ - ++(+)
69-70 kD
+ + ++ - +
33-35 kD
+ + ++ - +
SN: 120-125 kD
+++ ++++ ++++ - ++++
Células gB685*:
115 kD
+ - + + +
69-70 kD
+ + + - +
33-35 kD
+ + + + +
SN: 130 kD
+ + + + ±
Células gB685**:
125 kD
++++ +++ +++ +++ +++
69-70 kD
+++ ++ +++ - ++
34-36 kD
+++ ++ +++ - ++
SN: 130 kD
+++ ++(+) ± ++++ +++
Tabla II: Resumen de los análisis de transferencia de Western realizados con un panel de diferentes anticuerpos monoclonales contra gB y un suero de α-CMV humano neutralizante nº 243
mAb27.156
mAb27.39 mAb9.3 mAb48.46 Suero de αCMV nº 243
Células gB685:
110 kD
++ - ++ - ±
33-33 kD
++ - +++ - -
SN: 120 kD
- - - - -
Células gB685NC
+++ - +++ - +
110-115 kD
30-33 kD
++ - +++ - -
SN: 125 kD
++ - ± - -
Células gB685*:
120 kD
+ - ± ++++ -
30-33 kD
± - + - -
SN: 130 kD
± - ± +++ -
Células gB685**:
125 kD
++ - ++ ++++ -
33-34 kD
± - ++ ++++ -
SN: 130 kD
+ - ± ++++ -
Tabla III: Oligonucleótidos cebadores y condiciones de PCR usadas para generar las diferentes construcciones de gB685 quiméricas
A) gB685NC (no escindible) Dir268 : 5’ GGA CCC AAA CAA GTA CGA GTG Dir269 : 5’ CGC TGG TGA AAG TAA AAG ATG C Dir270 : 5’ GTA CTT GTT TGG GTC CTA TG Dir271 : 5’ CCG CTG TTG AGA TCC AGT TCG
Condiciones de reacción de PCR:
en pUC12-gB685 linealizado con 0,5 µg de HindIII o Xmnl 25 ciclos: 2 min a 94ºC, 2 min a 55ºC, 2 min a 72ºC 1 ciclo: 2 min a 94ºC, 2 min a 55ºC, 15 min a 72ºC
con pares de cebadores Dir268, Dir269 y por separado con pares de cebadores Dir270, Dir 271 B) gB685** quimérico
Dir287 : 5’ GCC TCA AGA TCT TCA TCG CCG GGA ACT CG 3’
XbaI Stop D E P D Dir288 : 5’T AGC TCT AGA TTA ATC CTCGGG ATC CTC TAA GAG GGC CGA GTC CTC GGG GGA ATT CGC 3’
EL LASDEP EcoRI
PCR: en 0,1 µg de ADN de plásmido pUC12-gB685 NC 25 ciclos: 2 min a 95ºC, 2 min a 55ºC, 2 min a 72ºC seguido de 2 min a 95ºC, 2 min a 55ºC, 15 min a 72ºC
LISTA DE SECUENCIAS
1) INFORMACIÓN GENERAL 5 (i) SOLICITANTE:
(A)
NOMBRE: SmithKline Beecham Biologicals sa.
(B)
CALLE: 79 Rue de I'Institut
(C)
CIUDAD: Rixensart
(D)
PAÍS: Bélgica 10 (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): B-1330
(G)
TELÉFONO: 00-32-2-6568111
(H)
TELEFAX: 00-32-2-6568114
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevos Compuestos 15 (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 7
(iv) FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
(A) TIPO DE SOPORTE: Disco flexible
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible 20 (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.30 (EPO)
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(iii) HIPOTÉTICA: NO
(iv)
ANTISENTIDO: NO
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
(A)
ORGANISMO: citomegalovirus humano
(B)
CEPA: AD 169
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: Dir 268
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(iii) HIPOTÉTICA: NO
(iv)
ANTISENTIDO: NO
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
(A)
ORGANISMO: citomegalovirus humano
(B)
CEPA: AD 169
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: Dir 269
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(iii) HIPOTÉTICA: NO
(iv)
ANTISENTIDO: NO
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
(A)
ORGANISMO: citomegalovirus humano
(B)
CEPA: AD 169
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: Dir 270
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(iii) HIPOTÉTICA: NO
(iv)
ANTISENTIDO: NO
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
(A)
ORGANISMO: citomegalovirus humano
(B)
CEPA: AD 169
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: Dir 271
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(iii) HIPOTÉTICA: NO
(iv)
ANTISENTIDO: NO
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
(A)
ORGANISMO: citomegalovirus humano
(B)
CEPA: AD 169
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: Dir 287
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 58 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(iii) HIPOTÉTICA: NO
(iv)
ANTISENTIDO: NO
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
(A)
ORGANISMO: citomegalovirus humano
(B)
CEPA: AD 169
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: Dir 288
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácidos
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
imagen2
imagen2
imagen2
imagen2
imagen2
imagen2
(iii) HIPOTÉTICA: NO
(iv)
ANTISENTIDO: NO
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
(A)
ORGANISMO: citomegalovirus humano
(B)
CEPA: AD 169
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: Dir 288
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7
imagen2
LISTA DE SECUENCIAS
<110> smithkline beecham biological s.a.
<120> glicoproteína de fusión de HCMV y HSV
<130> B45063div
<140> ep05075216.1
<141> 18-05-1994
<160> 7
<170> FastSEQ para windows versión 4.0
<210> 1
<211> 21
<212> ADN
<213> cepa AD169 de citomegalovirus humano
<400> 1
imagen2
<210> 2
<211> 22
<212> ADN
<213> AD169 de CITOMEGALOVIRUS HUMANO
<400> 2
imagen2
<210> 3
<211> 20
<212> ADN
<213> cepa AD169 de citomegalovirus humano
imagen3
<210> 4
<211> 21
<212> ADN
<213> cepa AD169 de citomegalovirus humano
<400> 4
imagen2
<210> 5
<211> 29
<212> ADN
<213> cepa AD169 de citomegalovirus humano
imagen4
<210> 6
<211> 58
<212> ADN
<213> cepa AD169 de citomegalovirus humano
<400> 6
imagen2
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> cepa AD169 de citomegalovirus humano
<400> 7
imagen2

Claims (13)

1.
Una forma no escindible de la proteína gB de HCMV, que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de escisión de la proteína, en la que la proteína es una proteína truncada que carece del dominio de anclaje a la membrana.
2.
Una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la Arg 458 y la Arg 459 se cambian por Glu y Thr respectivamente.
3.
Una proteína de acuerdo con la reivindicación 2, que está truncada en el aminoácido 685 (gB685 NC).
4.
Una proteína de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en la que la proteína gB procede de la cepa AD169 de HCMV.
5.
ADN recombinante que codifica una forma no escindible de la proteína gB de HCMV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6.
Un vector de expresión que comprende ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 5.
7.
Un huésped transformado con un vector de acuerdo con la reivindicación 6.
8.
Un procedimiento para la producción de una forma no escindible de la proteína gB de HCMV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo dicho procedimiento la expresión de una secuencia de ADN que codifica dicha proteína en una célula huésped y la recuperación de la proteína.
9.
Una composición de vacuna que comprende una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un derivado inmunogénico de la misma, mezclada con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
10.
Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende además monofosforil lípido A 3D y/o QS-21.
11.
Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10, en la que el vehículo es una emulsión de aceite en agua.
12. Una forma no escindible de la proteína gB de HCMV de acuerdo con una cualquiera de 5 las reivindicaciones 1 a 4 o un derivado inmunogénico de la misma para su uso en medicina.
13. Una composición de vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 para su uso en medicina.
10 14. Uso de una forma no escindible de la proteína gB de HCMV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un derivado inmunogénico de la misma, en la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de infecciones virales.
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